(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ配列を逆転写する方法、および、連結型逆転写／増幅反応に特に有効な改良型逆転写方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む突然変異型耐熱性DNAポリメラーゼを、特にマグネシウムイオン緩衝液中で使用することを特徴とするｃＤＮＡ増幅方法。また、増幅にＭｎ２＋を使用するときは、突然変異型酵素の使用により天然型酵素使用の場合よりも高い効率が実現し、より低Ｍｎ２＋濃度での反応の実施が可能となり、忠実性に対するＭｎ２＋濃度の有害な影響を最小限に抑えることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAを単一酵素逆転写／増幅反応を使用して逆転写／増幅するための、次のステップを含む方法：
(a) 前記RNA、プライマー、Mg+2、および突然変異型熱活性DNAポリメラーゼを含む逆転写反応混合物であって、前記の突然変異型DNAポリメラーゼが
i) その天然型において前記DNAポリメラーゼがDNAポリメラーゼドメイン内に配列番号5、配列番号6または配列番号7であるアミノ酸配列を含むこと、
ii) 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が前記天然型配列に比してアミノ酸C、F、H、I、K、L、M、S、T、V、WまたはYへと突然変異していること、
を特徴とする逆転写反応混合物を用意すること；
(b) 前記反応混合物を、前記突然変異型DNAポリメラーゼが前記プライマーの伸長産物の合成を開始させるに足る温度で処理して、前記RNAに対して相補的であるcDNA分子を提供すること；および
(c) 前記cDNAを増幅すること。
【請求項２】
RNAを単一酵素逆転写／増幅反応を使用して逆転写／増幅するための、次のステップを含む方法：
(a) 前記RNA、プライマー、Mn+2、および突然変異型熱活性DNAポリメラーゼを含む逆転写反応混合物であって、前記の突然変異型DNAポリメラーゼが
i) その天然型において前記DNAポリメラーゼがDNAポリメラーゼドメイン内に配列番号5、配列番号6または配列番号7であるアミノ酸配列を含むこと、
ii) 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が前記天然型配列に比してアミノ酸C、F、H、I、K、L、M、S、T、V、WまたはYへと突然変異していること、
を特徴とする逆転写反応混合物を用意すること；
(b) 前記反応混合物を、前記突然変異型DNAポリメラーゼが前記プライマーの伸長産物の合成を開始させるに足る温度で処理して、前記RNAに対して相補的であるcDNA分子を提供すること；および
(c) 前記cDNAを増幅すること。
【請求項３】
前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸がF、K、LまたはYである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ステップ(c)の増幅がポリメラーゼ連鎖反応法を使用して行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
突然変異型DNAポリメラーゼが耐熱性である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に、特にリボ核酸（RNA）配列の逆転写と増幅のための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
「逆転写酵素」はRNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴づけられる種類のポリメラーゼをいう。既知の逆転写酵素はすべて、RNA鋳型からのDNA転写産物の合成に際しプライマーを必要とする。従来、逆転写酵素は主にmRNAのcDNAへの転写に使用されてきたが、cDNAはその後ベクターに導入してクローン化し、いっそうの操作に備えることができる。
【０００３】
「DNAポリメラーゼ」はDNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴づけられる種類のポリメラーゼをいう。DNAポリメラーゼはその生体内機能から予想されるように、RNA鋳型の使用を強く差別する。それにもかかわらず、ある種のDNAポリメラーゼはRNAの生体外逆転写能をもつことをいくつかの研究所がすでに立証している（Karkas, 1973, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70: 3834-3838; Gulati et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71: 1035-1039; Wittig and Wittig, 1978, Nuc. Acids Res. 5:1165-1178）。Gulati他はE. coli Pol Iを使用すればオリゴ(dT)10をプライマーとして用いてQβウィルスRNAを転写しうることを発見した。WittigおよびWittigはE. coli Pol Iを使用すれば、オリゴ(dA)であらかじめ酵素的に伸長させたtRNAを逆転写しうることを立証した。しかし、Gulati他が示したように、酵素所要量および少量のcDNA産物を考えるとE coli Pol の逆転写酵素活性には実際的な価値があまりないようである。
【０００４】
耐熱性DNAポリメラーゼのテルムス・アクアティクス（T. aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼは二価金属イオンとしてMg+2を使用してcDNAを合成するが効率は低いと報告されている（Jones and Foulkes, 1989, Nuc. Acids. Res. 176:8387-8388）。TseおよびForget, 1990「Gene」88:293 -296およびShaffer他、1990、「Anal. Biochem.」190-292-296はTaq DNAポリメラーゼとMg+2イオンを使用するRNA増幅法について記載しているが、この方法は非効率的で感受性も鈍い。
【０００５】
RNA、DNA両核酸配列の増幅法は米国特許第4,683,195号、4,683,202号および4,965,188号に記載されているが、これらの各特許は参照により本書に組み込まれる。好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法であり、これは一般に、各サイクルで増幅産物の変性に使用する温度に耐えられるTaq DNAポリメラーゼなどのような耐熱性DNAポリメラーゼを使用して行われる。PCRは今日では技術上周知であり、学術文献にも広く記載されている。たとえば、PCR Applications, 1999（Innis et al., eds., Academic Press, San Diego）; PCR Strategies, 1995（Innis et al., eds., Academic Press, San Diego）; PCR Protocols, 1990（Innis et al., eds., Aademic Press, San Diego）; PCR Technology, 1989（Erlich, ed., Stockton Press, New York）を参照（いずれも参照により本書に組み込まれる）。PE Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティー）などのような業者はPCR試薬を販売し、PCRプロトコールを刊行している。増幅法の概説はAbramsonおよびMyers、1993、「Current Opinion in Biotechnology」4:41-47に出ており、これもまた参照により本書に組み込まれる。
【０００６】
Taq DNAポリメラーゼとマグネシウムイオン緩衝液を使用する逆転写はあまりに非効率的で実用的ではないため、当初はRNA鋳型で開始するPCR増殖が、たとえばモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（MoMuLV RT）またはAMV-RTなどのような非耐熱性ウィルス逆転写酵素を使用してターゲットRNAをまず逆転写し、次いで得られたcDNAを、耐熱性DNAポリメラーゼを使用して増幅するという方法で行われた。
【０００７】
耐熱性DNAポリメラーゼを使用する場合でもDNA鋳型使用のプライマー伸長法で好まれるようにマグネシウム（Mg+2）緩衝液ではなくマンガン（Mn+2）緩衝液中で反応させればRNA鋳型を効率的に逆転写させうることが判明するに至り、飛躍的な前進が図られた。耐熱性DNAポリメラーゼを使用する効率的なMn+2活性化逆転写法については米国特許第5,310,652号、5,322,770号、5,407,800号、5,641,864号、5,561,058号および5,693,517号に記載されているが、これらの特許はすべて参照により本書に組み込まれる。RNA鋳型からのcDNA合成とDNA鋳型からのDNA合成のどちらもMn+2緩衝液中で行えるため、Mn+2緩衝液を使用すれば単一酵素の連結型逆転写／増幅反応が可能になる（Myers and Sigua, 1995, PCR Strategies(前掲)所収、第5章をも参照）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、耐熱性DNAポリメラーゼを使用してRNA配列を逆転写する方法を提供する。本発明はさらに、好ましくは単一の耐熱性DNAポリメラーゼを使用して連結型のワンチューブ反応でRNA配列を逆転写、増幅する方法を提供する。本発明の方法では先行技術の高温逆転写法に比して逆転写（RT）効率が向上する。
【０００９】
好ましい実施態様において、本発明はマグネシウム（Mg+2）緩衝液中でRNA配列を逆転写する方法を、またさらにMg+2緩衝液中で単一の耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、好ましくは連結型のワンチューブ反応で、RNA配列を逆転写、増幅する方法を提供する。Mg+2緩衝液を使用して行われるこれらの方法では、耐熱性DNAポリメラーゼのマンガン（Mn+2）活性化に依存する在来法に比して忠実性が向上する。
【００１０】
本発明の方法は、フルオレセイン系またはシアニン系の色素で標識したジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を取り込むDNAポリメラーゼの能力に影響を及ぼすと従来説明されてきた決定的アミノ酸位置に点突然変異を含む突然変異型熱活性（好ましくは耐熱性）DNAポリメラーゼを使用する。本発明は、これらの突然変異型DNAポリメラーゼが特にMg+2緩衝液中で逆転写能の著しい向上をも示すという意外な発見に由来している。
【００１１】
本発明の方法に有用な突然変異型DNAポリメラーゼは欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米国出願第09/146,631号、およびPCT国際特許公開第WO 98/40496号に記載されており、これらの文献はいずれも参照により本書に組み込まれる。これらの突然変異型DNAポリメラーゼはフルオレセイン系およびシアニン系色素で標識したヌクレオチドを、デオキシヌクレオチド（dNTP）や塩基類似体、たとえばジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を含めて、取り込む能力が高いと説明されている。これらの突然変異型DNAポリメラーゼは本書では便宜上、「フルオレセイン系色素取り込み型(Fluorescein family Dye Incorporating)」DNAポリメラーゼ、略して「FDI」 DNAポリメラーゼという。FDI DNAポリメラーゼの最大の効用とされるものは、フルオレセインまたはシアニン系色素で標識した色素ターミネーター（色素標識ddNTP）を使用するDNA配列決定反応にある。野生型DNAポリメラーゼはヌクレオチド類似体を、また標識ヌクレオチド類似体をなおさら、差別するため、色素ターミネーター配列決定反応は一般に過剰な色素ターミネーターを使用して行われた。FDI DNAポリメラーゼは標識色素ターミネーターに対する差別を弱めることにより、色素ターミネーター濃度を著しく下げて配列決定反応を行えるようにする。
【００１２】
本発明の方法に使用するDNAポリメラーゼ中の突然変異させた決定的アミノ酸位置は、フルオレセインおよびシアニン系色素で標識したジデオキシヌクレオチドを取り込むDNAポリメラーゼの能力に影響を及ぼすのと同じアミノ酸であるが、欧州特許公開第0 902,035号および同時係属米国出願第09/146,631号では、天然型に見られる保存配列モチーフ内の位置によって識別している。その中の表1には多数のDNAポリメラーゼに見られるこの配列モチーフの例が記されている。この配列モチーフと決定的アミノ酸は以下でも実質的に同じ方法で識別する。
【００１３】
天然型DNAポリメラーゼに見られるこの決定的モチーフは、アミノ酸の標準1文字表記法を用いて最も一般的に表すと次のようなアミノ酸配列を含む：
LXXXXXXXXXE（配列番号1）
配列中、位置2のXはSまたはA、位置3、4、6、7、8、9および10のXは任意のアミノ酸、また位置5のXはLまたはIである。
【００１４】
もっと特殊な態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LSXELXIPYEE（配列番号2）
配列中、位置3のXはQまたはG、位置6のXはSまたはAである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は好熱性細菌テルムス（Thermus）属に由来するDNAポリメラーゼである。
【００１５】
好ましい態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LSQELAIPYEE（配列番号3）
このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は、テルムス（Thermus）種アクアティクス（aquaticus）、テルモフィルス（thermophilus）、ZO5およびカルドフィルス（caldophilus）に由来するDANポリメラーゼである。
もう1つの好ましい態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LSXELSIPYEE（配列番号4）
配列中、位置3のXはQまたはGである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はテルムス（Thermus）種フラブス（flavus）、sps17およびフィリホルミス（filiformis）に由来するDNAポリメラーゼである。
【００１６】
もう1つのもっと特殊な態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LSVRLGXPVKE（配列番号5）
配列中、位置7のXはVまたはIである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は超好熱性細菌テルモトガ（Thermotoga）種マリティマ（maritima）とネオポリタナ（neopolitana）に由来するDANポリメラーゼである。
【００１７】
もう１つのもっと特殊な態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LSKRIGLSVSE（配列番号6）
このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はテルモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）に由来するDNAポリメラーゼである。
【００１８】
もう１つのもっと特殊な態様では、天然型DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含む：
LAQNLNIXRKE（配列番号7）
配列中、位置8のXはSまたはTである。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はバシラス（Bacillus）種カルドテナクス（caldotenax）およびステアロテルモフィルス（stearothermophilus）に由来するDNAポリメラーゼである。
【００１９】
以上特定した各決定的モチーフでは、位置4のアミノ酸が決定的アミノ酸である。
実施例で示すように、決定的アミノ酸の（実施例で使用した天然型DNAポリメラーゼ中に存在する）E、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸への突然変異はRT効率を向上させた。そこで本発明の方法では、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1〜7よりなる群から選択される配列モチーフを含み、同モチーフの位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸へと突然変異していることを特徴とする突然変異型DNAポリメラーゼを使用する。好ましくは、決定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ以外の任意のアミノ酸へと、もっと好ましくはE、A、G、P、QまたはD以外の任意のアミノ酸へと突然変異させる。
【００２０】
本発明の一態様は、本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを使用して逆転写反応を行わせるステップを含むRNAの逆転写方法に関連する。好ましくは、これらの方法は次のステップを含む：
(a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して十分に相補的であるプライマーと本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼとを含む反応混合物を提供すること；および
(b) 前記反応混合物を適当な条件の下で処理して、1本鎖cDNAを提供すること。
【００２１】
好ましい態様において、ステップ(a)の反応は適当な緩衝液中で行われるようにし、緩衝液にはMg+2が含まれるようにする。
本発明のもう1つの態様は、本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを使用して単一酵素による連結型逆転写／増幅反応を行わせるステップを含むRNAの増幅方法に関連する。好ましくは、これらの方法は次のステップを含む：
(a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して十分に相補的である第1プライマー、前記cDNAへとハイブリダイズし延長産物の合成を開始するためのターゲットRNAに対して十分に相同的である第2プライマー、および本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを適当なMg+2緩衝液中に含んでなる反応混合物を提供すること；
(b) 前記反応混合物を適当な条件の下で処理して、1本鎖cDNAを提供すること；および
(c) ステップ(b)の反応混合物を適当な条件の下で処理して、ステップ(b)のcDNAを増幅すること。
【００２２】
好ましい態様において、この逆転写および増幅は本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、Mg+2を含む緩衝液中で、単一酵素による連結型逆転写／増幅反応として行われるようにする。
本発明の理解に資する意味で、以下に用語の定義をしておく。
「熱活性DNAポリメラーゼ」は本書では高温の反応至適条件をもつDNAポリメラーゼをいう。本発明に使用するこの熱活性酵素は60〜90℃の温度範囲でプライマーの伸長を最大限に触媒する。
【００２３】
「耐熱性DANポリメラーゼ」は熱に対して安定的な、つまり2本鎖核酸の変性処理に必要な時間にわたり高温にさらされても不可逆的な変性（失活）を起こさないDNAポリメラーゼをいう。核酸の変性処理に必要な加熱条件は技術上周知である。本書でいう耐熱性ポリメラーゼは、参照により本書に組み込まれる米国特許第4,965,188号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅などのような温度サイクル反応への使用に適する。
【００２４】
「高温逆転写反応」は本書では、少なくとも40℃の、好ましくは40℃〜80℃の、さらに好ましくは50℃〜70℃の温度で行われる逆転写反応をいう。
「遺伝子」は回収可能な生体活性ポリペプチドまたは前駆物質の産生に必要な調節およびコード配列を含むDNA配列をいう。
「天然型」は天然源から単離される遺伝子または遺伝子産物をいう。この用語はまた、分子生物学的手法によって産生される組み換え型の天然タンパク質であって、天然型と同じアミノ酸配列をもつものをいう。
【００２５】
「突然変異型」は、核酸配列に変異のある遺伝子またはアミノ酸配列に変異のある遺伝子産物であって、天然型または野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に機能的性質に変異が生じている可能性のあるものをいう。その種の変異には点突然変異、欠失および挿入が含まれる。
アミノ酸配列の「点突然変異」は本書では単一アミノ酸の置換または単一アミノ酸の欠失のいずれかをいう。点突然変異は好ましくはコードDNA中の適当なコドン変更によりアミノ酸配列に導入される。
【００２６】
ある配列中の個別アミノ酸は本書ではANとして表記する。その場合、Aは配列中のアミノ酸であり、Nは配列中の位置である。あるアミノ酸配列中の置換型点突然変異は本書ではA1NA2として表記する。その場合、A1は突然変異前のタンパク質配列中のアミノ酸、A2は突然変異後のタンパク質配列中のアミノ酸、Nはアミノ酸配列中の位置である。アミノ酸表記には1文字記号か3文字記号のいずれかを用いる（Lehninger, BioChemistry 2nd ed., 1975, Worth Publishers, Inc. New York, NY: pp. 73-75を参照。これは参照により本書に組み込まれる）。たとえば、G46D突然変異はアミノ酸位置46でグリシンがアスパラギン酸に変化したことを示す。アミノ酸位置の番号付けは、突然変異を包含する領域の由来源となっているタンパク質の完全長を土台にしている。DNA配列中のヌクレオチドおよび点突然変異の表記も同様である。
【００２７】
「核酸」と「オリゴヌクレオチド」は検出対象のプライマー、プローブ、およびオリゴマー断片をいい、（2-デオキシ-D-リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、（D-リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、およびプリンまたはピリミジン塩基もしくは修飾プリンまたはピリミジン塩基のNグリコシドであるその他任意のタイプのポリヌクレオチドの総称とする。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」を長さで区別する意図はなく、これらの用語は互換的に使用されることになろう。これらの用語は分子の一次構造を指すだけであり、したがって2本鎖および1本鎖RNAだけでなく、2本鎖および1本鎖DNAをもいう。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは任意の適当な方法により調製することができる。この調製方法にはたとえば、然るべき配列のクローニングと制限および直接化学合成などが含まれ、直接化学合成にはNarang他、1979、「Meth. Enzymol.」68:90-99のリン酸トリエステル法、Brown他、1979、「Meth. Enzymol.」68:109-151のリン酸ジエステル法、Beaucage他、1981、「Tetrahedron Lett.」22:1859-1862のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第4,458,066号の固相担体法などがあるが、これらの各文献は参照により本書に組み込まれる。シアノエチルホスホラミダイト化学を使用する自動合成が好ましい。試薬と器具はたとえばPE Biosystems（Applied Biosystems−カリフォルニア州フォスターシティー）やPharmacia（ニュージャージー州ピスカタウェイ）などから市販されている。
【００２９】
「プライマー」という用語は本書では、プライマー伸長開始条件下に置いたときに合成起点として機能しうるオリゴヌクレオチドをいい、天然、合成を問わない。プライマーは好ましくは1本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適正な長さは意図するプライマーの用途次第であるが、一般に15〜35ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子では一般に、鋳型と十分に安定的なハイブリッド複合体を形成するには温度を低くめにする必要がある。プライマーは正確な鋳型配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズしてプライマーの伸長を起こすためには鋳型に対して十分に相補的でなければならない。
【００３０】
「プライマー対」は本書では、PCRなどのような増幅反応で所望のターゲット配列を増幅する機能を果たすよう選択された第1および第2プライマーをいう。たとえば、ターゲットRNAの増幅を目的とした連結型逆転写／増幅反応に使用する場合、プライマー対は、RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して十分に相補的である第1プライマー、および前記cDNAとハイブリダイズし延長産物の合成を開始するためのターゲットRNAに対して十分に相同的である第2プライマーからなる。核酸配列増幅用のプライマー対の設計は技術上周知である。
【００３１】
プライマーは、もしも望むなら、分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段による検出が可能な標識を組み込むことにより標識することができる。たとえば、有用な標識は32P、蛍光色素、電子密度試薬、（ELISAアッセイで一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、または対応する抗血清またはモノクローナル抗体が得られるハプテンおよびタンパク質などである。
【００３２】
「cDNA」は本書ではリボ核酸鎖（RNA）を鋳型として使用して合成されるコピーDNA分子をいう。このRNAはmRNA、tRNA、rRNAでも、またはウィルスRNAなどのような他形態のRNAでもよい。cDNAは1本鎖でも2本鎖でもよいし、またRNA/cDNAハイブリッドの場合のように相補的RNA分子に水素結合したものでもよい。
「逆転写反応混合物」という用語はターゲットRNAの逆転写に使用される種々の試薬を含んだ水溶液をいう。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、オリゴヌクレオチドプライマー、ターゲット核酸およびヌクレオシド三リン酸を含む。この混合物は文脈次第で完全または不完全逆転写反応混合物のいずれかである。
【００３３】
「増幅反応混合物」という用語はターゲット核酸の増幅に使用される種々の試薬を含んだ水溶液をいう。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、増幅用プライマー、ターゲット核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。この混合物は文脈次第で完全または不完全増幅反応混合物のいずれかである。本発明の好ましい態様において、増幅反応はPCRであり、増幅反応混合物はPCR混合物である。増幅反応混合物は本書では連結型逆転写／増幅反応の場合のようなRNA増幅用の反応混合物を包含する。
【００３４】
「緩衝液」は本書では、緩衝剤または緩衝剤ミックス、および随意に二価陽イオンまたは一価陽イオンを含む溶液をいう。
分子生物学と核酸化学の在来手法は技術の熟練の範囲内に収まるものであり、文献に詳しく記載されている。たとえば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Nuclei Acid Hybridization(B.D. Hames and S.J. Higgins. eds., 1984); Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier, NY); Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY); およびMethods in Enzymology(Academic Press, Inc.)シリーズを参照。これらの文献はすべて参照により本書に組み込まれる。本書で触れる特許、特許出願および刊行物は前述、後述を問わずすべて、参照により本書に組み込まれる。
【００３５】
本発明の方法に使用される突然変異型DNAポリメラーゼは、欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米国出願第09/146,631号、およびPCT国際特許公開第WO 98/40496号で特定された決定的アミノ酸位置での点突然変異を含む。欧州特許公開第0 902,035号と同時係属米国出願第09/146,631号は決定的アミノ酸を天然型DNAポリメラーゼ配列に見られる決定的保存配列モチーフ内の位置によって識別している。PCT国際特許公開第WO 98/40496号はTaq DNAポリメラーゼ中の決定的アミノ酸を位置番号（E681）で、また他DNAポリメラーゼ中の決定的アミノ酸をTaq DNAポリメラーゼに対するアミノ酸配列相同性によって識別している。どちらの方法も同じ決定的アミノ酸位置を特定している。本書では説明を明確にする意味で、決定的アミノ酸を決定的保存配列モチーフ内の位置によって表す。
【００３６】
表1は本質的に欧州特許公開第0 902,035号と同時係属米国出願第09/146,631号の表1の再掲であるが、多数の代表的DNAポリメラーゼ中に見られる決定的モチーフを、全酵素配列内の決定的アミノ酸の位置と共に示している（決定的アミノ酸は強調表示にしてある）。複数の位置番号を示したのは、同じ種に由来するDNAポリメラーゼについてアミノ酸配列に若干の差異が文献で報告されている場合である。
【００３７】
【表１】
2006304804.tif 000002
【００３８】
欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米国出願第09/146,631号およびPCT国際特許公開第WO 98/40496号には決定的モチーフを含む熱活性DNAポリメラーゼをもつ多数の種が記載されている。本発明への使用に好ましいDNAポリメラーゼはテルムス（Thermus）種に由来する。
本発明の方法に使用される突然変異型DNAポリメラーゼは、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1〜7よりなる群から選択される配列モチーフを含み同モチーフの位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任意のアミノ酸へと突然変異していることを特徴とする熱活性の、好ましくは耐熱性の突然変型DNAポリメラーゼである。好ましくは、この決定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ以外の任意のアミノ酸へと、さらに好ましくはE、A、G、P、QまたはD以外の任意のアミノ酸へと突然変異している。
【００３９】
突然変異型DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼドメインに決定的モチーフを有する熱活性DNAポリメラーゼをもつ任意の種から得ることができる。決定的モチーフは同酵素のポリメラーゼドメイン内の特定の機能領域を特定し、またその機能にとって決定的である同モチーフ内のアミノ酸を特定する。実施例では、テルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）DNAポリメラーゼという広く使用されている耐熱性DNAポリメラーゼのこの部位における可能な突然変異のそれぞれについて、Mg+2活性化逆転写効率への効果について説明する。この部位のアミノ酸変異が決定的保存モチーフを有するほぼすべてのDNAポリメラーゼでフルオレセインまたはシアニン系色素で標識したジデオキシヌクレオチド（ddNTP）の取り込み効率に影響を及ぼすのとまったく同じように、この部位のアミノ酸変異は決定的保存モチーフを有するほぼすべてのDNAポリメラーゼのMg+2活性化逆転写効率にも影響を及ぼすものと期待される。
【００４０】
DNAポリメラーゼと機能的保存ドメインの存在との構造的関連性は周知のとおりである（たとえば、Ito and Braithwaite, 1991, Nucl. Acids Res. 19(15):4045-4047; Blanco et al., 1991, Gene 100:27-38; Gutman and Minton, 1993, Nucl. Acids Res. 21(18): 4406-4407; Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3(6):461-467を参照。各文献は参照により本書に組み込まれる）。機能的保全ドメイン内の決定的アミノ酸の突然変異は一般に、他のDNAポリメラーゼに導入した場合には類似の作用を及ぼすものと期待される（たとえば、Xu et al., 1997, J. Mol. Biol. 268:284-302; 米国特許第5,466,591; 5,795,762号; 5,939,292号; 5,614,365号などを参照。各文献は参照により本書に組み込まれる）。
【００４１】
決定的モチーフを含む追加の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼおよびその中の決定的アミノ酸の位置は、アミノ酸配列の直接検査によりごく普通に特定することができる。さらに、決定的モチーフおよびアミノ酸は、決定的モチーフを含むことが判明している別のDANポリメラーゼ（たとえば表1に掲げたThermus種に由来するDNAポリメラーゼ）との配列相同性によって特定することができる。アミノ酸および核酸の配列アラインメントプログラムは容易に入手できる。たとえば、「GAP」、「BESTFIT」および「PILEUP」などのような広く使用されている配列アラインメントプログラムはGenetics Computer Group（ウィスコンシン州マジソン）から出ている。一般に、デフォルトパラメーターを使用して配列アラインメントを行うと、表1に掲げたDNAポリメラーゼの1つに見られる決定的アミノ酸と相同であるDNAポリメラーゼ配列中の決定的アミノ酸の特定が容易になる。
【００４２】
新DNAポリメラーゼが得られると、配列番号1によって文字通りには表されていない決定的モチーフの変種を含む配列が発見されようが、それは既知の酵素との配列相同性によって特定することができる。仮定の例として、配列番号3の変種である（位置5のアミノ酸がLまたはI以外であるという点だけが異なる）DNAポリメラーゼドメイン中にあるモチーフをもつ酵素は、いくつかのThermus種酵素の決定的モチーフとの高相同性（この例では11個のアミノ酸のうち10個）にかんがみて決定的モチーフを有すると認識されよう。その種の酵素は本発明への使用上、同等とみなされる。
【００４３】
決定的アミノ酸は天然型酵素を基準にして特定される。しかし、これは突然変異型酵素のアミノ酸配列をそれ以外の点ではすべて天然型酵素と同じものに限定するという意味ではない。本発明の方法に使用される突然変異型DNAポリメラーゼは、その存在が特定の用途にとって好都合であるような追加の突然変異を含んでもよい。たとえば5’→3’エキソヌクレアーゼ活性または3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を除去する突然変異とその用途は周知のとおりである。配列番号1〜7として特定される決定的モチーフの位置3における追加の置換突然変異（たとえばTth DNAポリメラーゼのQ682K、E683K突然変異）は、特にMn+2活性化反応では、Mn+2濃度のいっそうの低下を可能にする、または実用塩濃度の範囲を広げるといった追加の利点をもたらすかもしれない。
【００４４】
本発明の方法に使用する突然変異型DNAポリメラーゼは好ましくは、目的とする特定の突然変異型タンパク質配列を発現するようにコード配列をあらかじめ変更した組み換え発現ベクターから発現させる。発現プラスミドのコード配列に点突然変異を導入する方法は技術上周知であり、参照により本書に組み込まれる特許および学術文献にも記載されている。詳細なプロコールはたとえば、Sambrook他「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor、1989、2版、章15.51『Oligonuleotide-mediated mutagenesis』およびAusebel他「Current Protocols in Molecular Biology (current edition)」に記載されているが、両文献は参照により本書に組み込まれる。欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米国出願第09/146,631号およびPCT国際特許公開第WO 98/40496号は然るべき発現ベクターの構築、およびその結果として生じる突然変異型DNAポリメラーゼの発現と精製について教示している。当業者は引用文献に盛り込まれた指針に従い、また周知技術だけを使用して、本発明の方法に使用するための多様な宿主系突然変異型DNAポリメラーゼのうち任意のものを発現させるのに適した突然変異型遺伝子を含む発現ベクターをいくらでも調製することができよう。
【００４５】
DNAポリメラーゼを本発明の高温逆転写方法に使用するうえで肝心なのは、それが熱活性DNAポリメラーゼであるという点につきる。RNA鋳型からのcDNAの調製は高温での繰り返し変性サイクルを伴わないため、その方法に有用な酵素が熱活性であるとか耐熱性であるとかいうのは非本質的である。実施例で説明する単一酵素による連結型逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応増幅（RT/PCR）法では、耐熱性DNAポリメラーゼを使用するのが好ましい。というのは、その種のDNAポリメラーゼは繰り返し変性サイクルを含むRT条件とPCR条件の両方にさらされるからである。
【００４６】
本発明に基づく逆転写では、反応はRNA鋳型、プライマーおよび熱活性または耐熱性の突然変異型DNAポリメラーゼを含む混合物の中で行われる。この反応混合物は一般に、4種類すべてのデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、および二価陽イオンと一価陽イオンを含む緩衝液を含有する。DNAポリメラーゼは二価陽イオンを触媒活性用に必要とする。DNA鋳型を使用する伸長反応では、好ましい二価陽イオンはMg+2であるが、他の陽イオン、たとえばMn+2またはCo+2などもDNAポリメラーゼを活性化することができる。
【００４７】
熱活性または耐熱性の突然変異型DNAポリメラーゼとDNA鋳型を使用する伸長反応とは対照的に、RNA鋳型を使用する伸長反応すなわち逆転写は本質的に、実用効率を達成するためにMn+2の使用を必要としてきた。たとえば、Tth DNAポリメラーゼによるRNA増幅にMnCl2またはMn(OAc)2を使用するとMgCl2と標準PCR条件を使用する場合と比べて少なくとも106倍も感受性が向上する。
【００４８】
Mn+2の使用は逆転写効率を高めるものの、忠実性の低下も招き、誤って取り込まれるヌクレオチドが増加するという結果になる。Mn+2の使用はDNA増幅の忠実性をも低下させる。そのため、Mn+2使用の単一酵素ワンチューブRNA増幅反応は反応のRNA、DNA両段階で忠実性の低下に見舞われる。したがって、高忠実性のRNA増幅が求められる場合には、反応を2段階に分けて行うのが好ましい。これは、キレート剤、たとえばEDTAまたは好ましくはEGTAを使用して逆転写反応混合物からMn+2を効果的に除去してから適当なMg+2含有DNA増幅反応混合物を加えて反応を完了させるという方法によって実現される。
【００４９】
本発明の方法への突然変異型DNAポリメラーゼの使用は、使用される二価陽イオンに関係なく逆転写反応にプラスとなる。Mn+2反応では、天然型よりも突然変異型のDNAポリメラーゼを使用するほうがRNAの高温逆転写および増幅効率が高まる。さらに、突然変異型DNAポリメラーゼを使用すると低Mn+2濃度での反応の実現が可能になり、それによって忠実性に対するMn+2濃度の有害な影響を少なくすることができる。
【００５０】
特に意外なのは、突然変異型DNAポリメラーゼがMg+2の使用による逆転写の効率を著しく高めることを可能にする点である。同酵素の好みの二価陽イオンであるMg+2の使用は忠実性を著しく高める。そのため、Mg+2反応では突然変異型DNAポリメラーゼを使用するとRNAの高温、高忠実性逆転写および増幅が実用効率で実現する。
【００５１】
二価陽イオンはMgCl2、Mg(OAc)2、MgSO4、MnCl2、Mn(OAc)2またはMnSO4などのような塩の形で供給される。一般にMn+2を使用する反応では、実用陽イオン濃度はトリスHCl緩衝液の場合で0.5〜7 mM MnCl2の範囲、好ましくは0.5〜2 mMであろうし、またビシン／KOAc緩衝液またはトリシン／KOAc緩衝液の場合で0.5〜20 mM Mn(OAc)2の範囲、好ましくは0.5〜5 mMであろう。一般にMg+2を使用する反応では、二価陽イオンの実用濃度はトリスHCl緩衝液の場合で0.5〜10 mM MgCl2の範囲、またビシン／KOAcまたはトリシン／KOAcの場合で0.5〜20 mM Mg(OAc)2の範囲、好ましくは0.5〜5 mMであろう。これらの濃度は通常の反応最適化を実現するための有用な出発条件となる。特定の反応における最適二価イオン濃度は特定の使用酵素だけでなく他の反応成分たとえばdNTP濃度やプライマー配列および濃度などにも左右されよう。当業者には自明であろうが、一般に反応条件、特に二価陽イオン濃度は通常の実験方法を使用して特定の反応に合わせて経験的に最適化することができる。
【００５２】
従来、混合二価陽イオン（たとえばMn+2とMg+2）緩衝液はRNA鋳型依存性DNA合成を活性化しうるものの、感受性と効率の低下を招くため好まれなかった。混合二価陽イオン緩衝液は本発明の方法には有用であると、また用途によっては好ましいかもしれないと、期待される。混合陽イオンを使用すれば、たとえば高効率、低忠実性Mn+2活性化反応と高忠実性Mg+2反応の兼ね合いが図れるようになるかもしれない。
【００５３】
耐熱性DNAポリメラーゼをMn+2緩衝液中で使用する高温逆転法および連結型逆転写／増幅法は技術上周知である。たとえば米国特許第5,310,652号、5,322,770号、5,407,800号、5,561,058号、5,641,864号および5,693,517号を参照。これらの各特許は参照により本書に組み込まれる。本発明の方法はこれらの先行技術の変更であり、その変更は前述のように突然変異型DNAポリメラーゼの使用を伴う。好ましい態様において、反応はDNAポリメラーゼの活性化を目的に使用される二価陽イオンとしてMg+2を含む緩衝液中で行われる。
【００５４】
本方法の1つの利点は、突然変異型DNAポリメラーゼの使用がRT伸長の高速化につながるように見え、結果的にRT反応の所要時間が短縮されることにある。好ましくは、逆転写反応で生成されるcDNAの量を最大限度にするために、反応が約30分間行われるようにする。用途次第では、特にマンガン反応の場合には、1分以下のRT時間でも満足な結果が得られよう。
【００５５】
本方法の他の利点は、突然変異型DNAポリメラーゼを使用するとより低い酵素濃度でRT効率を高められ、さらにより広範囲の実用塩濃度を実現できることにある。最適反応条件は、たとえば使用する特定酵素に左右されようが、通常の方法で経験的に決定しうるものと見込まれる。
本方法の実施に必要とされる他の態様、たとえばターゲットRNAの選択、試料の調製、プライマー設計、および（DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの活性化に使用される二価陽イオンを除く）試薬と反応条件の選択などは技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。同様に、逆転写を増幅反応と連結する場合でも、DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの活性化に使用される二価陽イオンに関連しない増幅の諸態様も技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。最後に、RNAの逆転写および増幅の用途も技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されている。当業者は本方法を、RNAの逆転写および随意に増幅が求められる任意の用途に応用することができよう。
【００５６】
以下の実施例は説明のために示すだけであり、本発明をいかなる形でも限定する意図はない。
【実施例】
【００５７】
実施例1
突然変異型DNAポリメラーゼの例
「天然型」テルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）(Tth) DNAポリメラーゼから決定的アミノ酸の可能な突然変異を網羅する一連の突然変異型DNAポリメラーゼ19種を構築した。欧州特許公開第0 902,035号と同時係属米国出願第09/146,631号に記載されているように、Tth DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号3として表される決定的配列モチーフを含む（このモチーフは、一般的モチーフ配列番号1のより狭い態様である配列番号2の特定の態様である）。決定的アミノ酸は位置683にある（E683）。
【００５８】
Tth DNAポリメラーゼの配列およびTth DNAポリメラーゼに対応する遺伝子を含むプラスミドは技術上周知である（たとえば米国特許第5,618,711号および5,789,224号を参照。両特許は参照により本書に組み込まれる）。本実施例に使用される特定のプラスミドはあるTth DNAポリメラーゼをコードするが、そのポリメラーゼは、参照により本書に組み込まれる米国特許第5,466,591号に記載されているような酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を除去するG46E点突然変異をも含む。さらに前記プラスミドは、このコードされたアミノ酸配列を変更することなく、コドン678、679、および680の最初のヌクレオチドにまたがるClaI認識・切断部位を導入するようなサイレントヌクレオチド置換を含む。5’→3’エキソヌクレアーゼドメインにおける追加突然変異の存在は、DNAポリメラーゼのMg+2緩衝液中でのRNA逆転写能にはあまり影響しないと考えられる。というのは、G46E突然変異をもつTth DNAポリメラーゼはここでは天然型DNAポリメラーゼとみなされるからである。
【００５９】
発現タンパク質中の点突然変異は、標準手法を使用してコードDNA配列を突然変異させることにより導入した。要するに、コドン683を包含するコード鎖の短い断片を所望の配列を包含する合成断片で置換した。長さ約65ヌクレオチドのこの短い断片は制限酵素ClaIおよびHindIIIでプラスミドを消化して切り出した。合成2本鎖DNAインサートは、切り出した断片と同じアミノ酸配列をコードするがコドン683に所望の突然変異を含むように合成した。次いで、合成断片を消化済みプラスミドに接合して、突然変異コドンを含み、所望の点突然変異をもつ完全長Tth DNAポリメラーゼをコードするプラスミドを得た。
【００６０】
実施例2
逆転写／増幅効率
実施例1で述べた20種のDNAポリメラーゼ（天然型1種、突然変異型19種）について、それぞれの逆転写／増幅反応触媒能を比較した。大体、各DNAポリメラーゼを使用して単一酵素による連結型逆転写／増幅反応を実施した。各反応に同じ初期ターゲットコピー数を使用し、反応中に増幅産物の合成をモニターした。各DNAポリメラーゼについて、反応効率の尺度となる任意（ただし一定）量の増幅産物の生成に要するサイクル数を決定した。初期逆転写ステップは一般に逆転写／増幅反応の決定的律速ステップであるため、総合的な反応効率の改善は初期逆転写ステップの改善をも示唆する。
【００６１】
反応時の増幅核酸の増加は、参照により本書に組み込まれるHiguchi他、1992、「Bio/Technology」10:413-417; Higuchi他、1993、「Bio/Technology」11:1026-1030; HiguchiおよびWatson、「PCR Applications（前掲）」16章; 米国特許第5,994,056号; 欧州特許公開第487,218号および第512,334号に記載されている方法を使用してモニターした。これらの方法は本書では動的PCRと呼ぶが、臭化エチジウム（EtBr）や他のDNA結合色素が2本鎖DNAと結合したときに示す蛍光強度の増加によって反応中の2本鎖DNA量の変化を検出するものである。ターゲット配列の合成に由来する2本鎖DNAの増加は2本鎖DNAに結合した色素の量の増加とそれに付随する検出可能な蛍光強度の増加という結果をもたらす。
【００６２】
増幅は反応に臭化エチジウムを使用して行った。あるいは、反応にSYBR（登録商標）Green I（Molecular Probes社−オレゴン州ユージン）を使用して増幅を行うこともできる。両色素は2本鎖DNAへのインターカレーションまたは結合に伴いその蛍光強度を増加させる。反応は、増幅時に反応混合物の蛍光のモニタリングを可能にする一体型サーマルサイクラー／蛍光検出装置で行う。後述の機器に加えて、適当な任意の機器が使用できることは明らかであろう。
【００６３】
RNAターゲットと増幅プライマー
ターゲットRNAは、ヒトのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子をコードする発現プラスミドを使用して合成した。GAPDH RNAのある領域を、5’→3’方向に示した次のプライマーを使用して増幅した。
P1(配列番号20)    5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA
P2(配列番号21)    5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA
初期ターゲット濃度は標準的な手段で測定した。本書で述べる比較反応では、絶対コピー数は相対コピー数ほど重要ではない。各反応で同じ初期コピー数を確保するために、同じ初期RNAストックの希釈液の等分量を使用した。
【００６４】
当業者はターゲットの選択が便宜的なものであることを認識しよう。実質的に同じプロトコールに他のRNAターゲットと対応する増幅プライマーを使用することもできよう。反応条件については通常の最適化が期待されよう。
増幅
各RT-PCR増幅は総反応容量100 μlで行った。最終試薬濃度は次のとおりであった。
【００６５】
DNAポリメラーゼ     10単位
GAPDH RNA           106コピー
トリシン            50 mM、pH 8.15
KOAc                50 mM
Mg(OAc)2            2 mM
dATP、dGTP、dCTP    200 μM
dUTP                400 μM
各プライマー        200 nM
グリセロール        8 %
DMSO                1 %
臭化エチジウム      1 μg/ml
UNG*                2単位
* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティー）
臭化エチジウムの代わりにSYBR（登録商標）Green Iを使用しても増幅産物の検出が可能になる。SYBR（登録商標）Green I使用の増幅は（10,000Xとして販売されている）SYBR（登録商標）Green IをDMSOで0.2Xに希釈して行うことができる。
【００６６】
臭化エチジウムを使用する反応は好ましくは、適当な検出波長の選択を可能にするABI PRISM（登録商標）7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を使用して行う。SYBR（登録商標）Green Iを使用する反応は好ましくは、同じ熱サイクル条件でGeneAmp（登録商標）5700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を使用して行う。GeneAmp（登録商標）5700はSYBR（登録商標）Green Iと併用するよう設計してあり、励起および検出波長はこの染料に合わせてあらかじめ設定する。
【００６７】
後述のアッセイは、本質的にGeneAmp（登録商標）PCRシステム9600サーマルサイクラー（PE Biosystems−カリフォルニア州フォスターシティー）からなる、蛍光検出システムを付加した改造型カスタム装置を使用して行った。同装置の蛍光検出システムはGeneAmp（登録商標）5700に採用されているものと類似するが、臭化エチジウムと併用するよう設計してある。このカスタム装置を使用して得られる結果は、好ましい装置の1つを使用して得られる結果に匹敵するものと見込まれよう。
【００６８】
増幅反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを使用して行った。
熱サイクル時間および温度
反応前インキュベーション    50℃、2分間
逆転写                      60℃、30秒間
95℃、1分間
55サイクル：変性            95℃、15秒間
アニール        55℃、30秒間
伸長            72℃、15秒間
最終伸長および保持          72℃
検出
増幅産物の累積を反応中の各サイクルで、反応蛍光強度の増加を測定することにより測定した。各増幅サイクル中に、色素の励起極大付近の波長光で各反応を励起させ、色素の発光を発光極大付近で測定した。
【００６９】
蛍光測定値は、蛍光測定値がサイクル間で比較的一定しているように見受けられる反応初期の一サイクル中に得られた初期蛍光測定値で割って正規化した。初期蛍光測定値を求めるために選んだサイクル番号は比較したすべての反応で同じにし、どの測定値も同じ反応サイクルを基準にした増加を表すようにした。
蛍光が任意蛍光レベル（AFL）を超えるまでに実施した増幅サイクルの数を実測蛍光値から計算した。AFLは基準蛍光レベル近くに、ただし実測蛍光強度のランダム変動範囲を超えるように選び、産物量が幾何級数的に増加する増幅初期段階で反応速度を測定するようにした。この幾何級数的増加段階では、特定の閾値に到達するのに要するサイクル数はもっぱら初期コピー数と反応効率に依存する。各反応は同じ初期ターゲットコピー数を使用して行われるので閾値に到達するまでのサイクル数が反応効率の尺度となる。もっと後段のサイクルでは、増幅産物の累積と試薬の消耗から最終的には反応プラトーに至る。
【００７０】
選択したAFLはどの反応でも1.12とした。PCR増幅は離散型サイクルから成り、また蛍光測定はサイクル当たり1回実施されるため、実測蛍光強度は一般に単一サイクル内でAFL未満からAFL超へと増加する。測定値の精度を高めるために、AFL閾値に到達するまでの「正確な」サイクル数（本書ではCT値と呼ぶ）を、サイクル間の蛍光測定値を補間することによって計算した。
【００７１】
結果
天然型Tth DNAポリメラーゼ（E683）と各突然変異型DNAポリメラーゼ（位置683のアミノ酸(aa)によって識別）を使用して得られたCT値を次表に示す。各CT値は2つの反応で得られた平均値である。比較を容易にするために、天然型と突然変異型のCT値の差（(CT native)−(CT mutant)）も示している。突然変異型DNAポリメラーゼの使用によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到達するまでの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低CT値となる。したがって、CT値の差がプラスであれば効率が高まったことになる。
【００７２】
【表２】
2006304804.tif 000003
【００７３】
以上の結果は、位置683のアミノ酸の、Ala、GlyまたはPro以外の任意のアミノ酸への突然変異が高効率のDNAポリメラーゼをもたらす結果となることを示す。そのうち、AspおよびGln突然変異以外はみなCT値が少なくとも4サイクル少ないという結果になった。
【００７４】
実施例3
逆転写効率
実施例1で述べた特定DNAポリメラーゼについて、逆転写反応触媒能を比較した。逆転写反応は各DNAポリメラーゼで、Mg+2かMn+2を使用して行った。次に、各反応から得られたcDNAを天然型酵素とMg+2を使用して同一条件下で増幅した。このプロトコールは、特に逆転写／増幅反応の逆転写部分に対する酵素の効果の測定を可能にする。
【００７５】
天然型酵素に加えて、アミノ酸位置683がF、K、L、RおよびYへと突然変異したDNAポリメラーゼを使用する反応も行った。これらの突然変異はそれぞれ実施例2で、連結型逆転写／増幅反応の効率を著しく高めることが証明されている。
逆転写
各逆転写は総反応容量100 μlで行った。最終試薬濃度は次のとおりであった。
【００７６】
DNAポリメラーゼ             5単位
GAPDH RNA                   106コピー
トリシン                    50 mM、pH 8.15
KOAc                        50 mM
Mg(OAc)2またはMn(OAc)2      2 mM
dATP、dGTP、dCTP、dUTP      200 μM
各プライマー                200 nM
グリセロール                8 %
DMSO                        1 %
SYBR（登録商標）Green I     0.2 X
UNG*                        1単位
* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティー）
逆転写反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを使用して行った。
【００７７】
逆転写時間および温度
反応前保温インキュベーション
50℃、2分間
逆転写                      60℃、30分間
保持                        4℃
増幅
逆転写後、10 μlの反応産物を10 μl 2mM EGTAに加えて、金属陽イオンをキレートして後続増幅反応から金属陽イオンを効果的に除去するようにした。この混合物を、天然型酵素とMg+2を含むPCR増幅混合物に加えた。こうして、残存突然変異型DNAポリメラーゼを希釈し、どのような影響も無視しうる程度と見込まれるようにした。PCR増幅は総反応容量100 μlで行い、試薬の最終濃度は次のとおりとした。
【００７８】
天然型DNAポリメラーゼ       5単位
トリシン                    50 mM、pH 8.15
KOAc                        50 mM
Mg(OAc)2                    2 mM
dATP、dGTP、dCTP、dUTP      200 μM
各プライマー                200 nM
グリセロール                8 %
DMSO                        1 %
SYBR（登録商標）Green I     0.2 X
増幅反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを使用して行った。
【００７９】
増幅熱サイクル時間および温度
95℃、1分間
55サイクル：変性            95℃、15秒間
アニール        55℃、30秒間
伸長            72℃、15秒間
最終伸長および保持          72℃
【００８０】
結果
逆転写用に天然型Tth DNAポリメラーゼ（E683）と各突然変異型DNAポリメラーゼ（位置683のアミノ酸で識別）を、また増幅用に一律に天然型Tth DNAポリメラーゼを、それぞれ使用して得られたCT値を次表に示す。比較を容易にするために、CT値の差すなわち(CT native)−(CT mutant)も示す。突然変異型DNAポリメラーゼの使用によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到達するまでの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低CT値となる。したがって、CT値の差がプラスなら効率が高まったことになる。
【００８１】
【表３】
2006304804.tif 000004
【００８２】
【表４】
2006304804.tif 000005
【００８３】
これらの突然変異型DNAポリメラーゼはいずれも逆転写／増幅反応の効率を著しく高めた。各反応のDNA増幅部分は等しく天然型酵素で行われたので、これらの結果は各突然変異型DNAポリメラーゼが反応の逆転写部分の効率を高めたことを示している。突然変異型DNAポリメラーゼはいずれの陽イオンを使用する場合でも著しい効率の改善をもたらした。
【００８４】
こうした効率の改善はMg+2を使用すると特に顕著であったし、突然変異型DNAポリメラーゼの使用はMg+2活性化反応を実用的にすることを証明している。従来報告されてきたとおり、天然型酵素の使用によるRNA増幅では、Mg+2を使用した場合にはCT値がほぼ10サイクルも多くなった（33.8−24.6）ことからも明らかなように、実用的な反応効率を実現するためには本質的にMn+2の使用が必要になる。それに対して、たとえばE683Y突然変異型を使用するとMg+2活性化反応の効率は天然型酵素とMn+2を使用して実現される効率に等しくなった。
【００８５】
実施例4
忠実性
特定突然変異型DNAポリメラーゼと天然型酵素の忠実性をいくつかの方法で比較した。Mg+2緩衝液で実施した連結型逆転写／増幅反応の忠実性を、Mn+2緩衝液中で実施した場合の忠実性と比較した。さらに、DNA増幅に使用した場合のDNAポリメラーゼの忠実性も比較した。
【００８６】
DNAポリメラーゼの忠実性は、DNAポリメラーゼを使用して生成された増幅産物の融解温度（Tm）プロフィールの測定によって比較することができる。あるDNAポリメラーゼの忠実性は鎖合成時の誤った取り込み数に反映される。低忠実性酵素の使用による増幅は得られる増幅配列集団の異質性が強まる結果となろう。この異質性を測定するには、増幅産物を変性処理して再アニールさせ、得られる2本鎖DNA分子のTmを測定する。この2本鎖は異質の配列集合からランダムに結合されるため、多数のミスマッチを含む。増幅産物集団内の配列異質性が強ければ強いほど、2本鎖中の平均ミスマッチ数は多くなる。これらのミスマッチは2本鎖DNA分子を不安定にし、実測Tmを引き下げる結果となる。
【００８７】
動的PCR反応の増幅産物に関する融解曲線の決定は、増幅に使用されるサーマルサイクラー／蛍光検出装置を使用して簡便に行うことができる。増幅後、産物の変性温度を包囲するある温度範囲にわたって蛍光と温度の関係を測定する。2本鎖および1本鎖分子の間の移行は色素蛍光強度の変化に反映される。こうして融解曲線が簡便に決定できる。あるいは、反応系の2本鎖DNA量の尺度となる光学密度の温度変化に伴う変化をモニターするのが一般的である標準的な方法で測定を行うこともできる。
【００８８】
天然型DNAポリメラーゼの忠実性を、E683K突然変異とE683N突然変異をそれぞれ含む2つの突然変異型DNAポリメラーゼの忠実性と比較した。連結型逆転写／増幅反応は本質的に実施例2で述べたような、ただし次の点が異なるMn+2緩衝液とMg+2緩衝液の両方でまったく同じように実施した。Mn+2反応では、反応系に2 mMのMn(OAc)2を使用した。すべての反応は25 UのDNAポリメラーゼを使用して行った。
【００８９】
増幅産物の2本鎖ターゲット配列のハイブリダイゼーション安定性プロフィール（融解曲線）を測定するために、増幅後反応混合物の蛍光強度を、少なくとも60℃〜80℃をカバーする温度範囲にわたってモニターした。予想どおり、蛍光測定値はS字状の融解曲線を描く結果となった。TmはこのS字状融解曲線の変曲点の温度と定義されるが、それはターゲットの半分が1本鎖型となる温度に対応する。
【００９０】
結果
Mg+2活性化反応とMn+2活性化反応の増幅産物に関する実測Tm値は次表のとおりである。各測定値は複製反応の平均である。温度の単位はすべて℃である。
増幅産物のTm値
DNAポリメラーゼ Tm、Mg+2 Tm、Mn+2
天然型              80           78
E683K               80           76
E683N               80           76
Mg+2を使用すると、天然型と突然変異型のDNAポリメラーゼに忠実性の差はまったく観測されなかった。20種のDNAポリメラーゼすべてを使用して実施した同様の反応から、Mg+2活性化反応ではどの突然変異型DNAポリメラーゼの忠実性も天然型DNAポリメラーゼの忠実性と同じであることが確認された。
【００９１】
Mn+2緩衝液を使用して得られた結果をMg+2緩衝液を使用して得られた結果と比較すると、Tm値の低下からわかるようにすべてのDNAポリメラーゼの忠実性が低下している。興味深いことに、Mn+2緩衝液を使用すると、少なくともこれらの反応条件の下では2つの突然変異型DNAポリメラーゼが天然型酵素の場合よりも低い忠実性を示した。
【００９２】
忠実性はMn+2濃度の影響を受ける。突然変異型酵素と天然型酵素の忠実性に対するMn+2濃度の影響を比較するために、追加の実験をE683K突然変異を使用してMn+2濃度0.5〜5 mMの範囲で実施した。その結果によれば（データは示していない）、どちらの酵素を使用した反応でも予想どおり最低Mn+2濃度が最高の忠実性をもたらした。突然変異型酵素の忠実性は天然型酵素のそれよりもMn+2濃度上昇の影響を強く受けた。しかし意外にも、少なくともこれらの実験では、最低Mn+2濃度で最高の効率を示したのも突然変異型酵素であった。したがって、突然変異型酵素の使用はより低Mn+2濃度での反応の実施を可能にし、もって忠実性に対するMn+2濃度の有害な影響を最小限に抑える。
【００９３】
さらに、Mn+2活性化反応とMg+2活性化反応のどちらも本質的に前述の要領で実施したが、ただし反応のDNA部分に限った忠実性への影響を観察しやすくする意味でDNA鋳型を使用した。いずれの場合にも、DNA増幅産物のTm値はRNA増幅産物のTm値と見分けがつかなかった。
以上の結果は、前掲実施例の結果と総合すれば、本発明の方法の優位性を証明する。先行技術の高温逆転写および増幅方法は十分な反応効率を実現するためにMn+2を使用して実施されたが、忠実性の低下に見舞われた。本発明はいくつかの選択肢を提供する。RNAの高温逆転写および増幅にMn+2を使用するときは、突然変異型酵素の使用により天然型酵素使用の場合よりも高い効率が実現するし、より低Mn+2濃度での反応の実施が可能になり、もって忠実性に対するMn+2濃度の有害な影響を最小限に抑えることができる。Mg+2を使用するときは、突然変異型酵素の使用により高温、高忠実性のRNA逆転写および増幅が実用効率で実現される。
【配列表】
2006304804000001.app