(57)【要約】【課題】レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入における、遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率よく行う改良方法を提供すること。【解決手段】レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入において、使用するレトロウイルスを、担体に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する機能性物質に結合させ、ついで洗浄操作を施すか、標的細胞結合活性を有する物質として、細胞を特異的に認識する抗体や、ラミニンまたは高マンノース型糖鎖を使用するか、標的細胞に前処理を施してトランスレフェリンレセプターを活性化するか、機能性物質に新たな官能基を導入することにより、遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率よく行う改良方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とするレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上方法：
（１）担体上に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する機能性物質にレトロウイルスを含有する溶液を３時間以上にわたって接触させる工程、
（２）レトロウイルスの結合した担体を洗浄してウイルス感染阻害活性を除去する工程、および
（３）レトロウイルスの結合した担体を標的細胞と接触させてインキュベートする工程。
【請求項２】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質が、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストランおよびこれらのフラグメントから選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質が、標的細胞結合活性を有するものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質と標的細胞結合活性を有する他の機能性物質が固定化された担体を使用する請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
標的細胞結合活性を有する機能性物質が、細胞接着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖および炭水化物から選択されるものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
担体として、細胞培養用の容器または粒子状の担体を使用する請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
レトロウイルスを含有する溶液が、レトロウイルス産生を促進する物質の共存下に得られたレトロウイルス産生細胞の培養上清である請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
レトロウイルスを含む溶液が、酪酸ナトリウムの共存下に得られた培養上清である請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞への遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率良く行うことを可能にする方法およびそれに関連する一連の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数のヒト疾病についてその機構が解明され、また、組換えＤＮＡ技術、および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、近年、重篤な遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロトコールの開発が進められている。また、最近では遺伝病のみならずＡＩＤＳのようなウイルス感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しようという試みがなされている。
【０００３】
これまでにヒトでの臨床への応用が研究されてきた遺伝子治療の多くは組換えレトロウイルスベクターを用いて細胞への遺伝子導入を行うものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。該ベクターは遺伝子導入された生物に悪影響を与えないように様々な工夫が施されている。例えば、遺伝子導入に用いられたベクター自体が細胞内で複製を行い、無制限な感染（遺伝子導入）を繰り返さないよう、ベクター中の複製機能は欠損させてある。
【０００４】
これらのベクター（複製能欠損レトロウイルスベクター）は自己複製できないため、一般的にはレトロウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を使用してウイルス粒子に包まれたレトロウイルスベクターを調製する。標的細胞に高効率で遺伝子導入を行うための最も単純な方法は、このレトロウイルス産生細胞と標的細胞とを共培養するというものである。しかしながら、この方法では生体に移植される、遺伝子導入された標的細胞にレトロウイルス産生細胞が混入するおそれがある。
【０００５】
最近、細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンやそのフラグメントをレトロウイルスによる遺伝子導入時に共存させることにより、細胞への遺伝子導入効率が上昇することが報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、第９３巻、第１４５１〜１４５７頁（１９９４年）、ブラッド（Blood）、第８８巻、第８５５〜８６２頁（１９９６年）］。また、遺伝子工学的に生産されたフィブロネクチンフラグメントも同様の性質を有しており、これを利用して造血幹細胞に効率よく外来遺伝子を導入させることが可能であることも示された（ＷＯ９５／２６２００号）。こうしたフィブロネクチンによる遺伝子導入効率の向上には、フィブロネクチン中のヘパリン結合領域と、レトロウイルスとの結合が関与していることが示唆されている。
【０００６】
また、ＷＯ９７／１８３１８号公報には線維芽細胞増殖因子のようなフィブロネクチン以外の機能性物質が遺伝子導入効率を向上させることが示されている。さらに、同公報にはレトロウイルス結合活性を有する機能性物質と、細胞結合活性を有する他の機能性物質とを混合して使用した場合にも同様な遺伝子導入効率の向上が見られることが示されている。
【０００７】
こうした機能性物質による遺伝子導入方法は、レトロウイルス産生細胞と標的細胞との共培養を行わずに高効率で遺伝子導入を行うことを可能にする。該方法による遺伝子導入効率の向上は、機能性物質がレトロウイルスと標的細胞とを近接した状態に共配置し、両者の相互作用の機会が増加することに起因すると考えられている。
【０００８】
このようにレトロウイルスを用いた遺伝子導入においては、レトロウイルスの標的細胞への感染の結果として遺伝子の導入が起こる。しかしながら、レトロウイルスによる遺伝子導入効率は、実際の臨床への応用を考えた場合には今なお満足できるものではなく、感染効率のさらなる向上が強く望まれている。
【０００９】
感染効率、すなわち遺伝子導入効率を向上させる手段としては、用いるウイルス液（ウイルス上清）中のレトロウイルスの濃度（タイター）を高くすることが考えられるが、通常、高タイターのウイルス産生能力を有するウイルス産生細胞の構築および樹立には多大な労力を要する。ＶＳＶウイルスのエンベロープタンパクを利用したシュードタイプウイルスベクター［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第９０巻、第８０３３〜８０３７頁（１９９３年）］は遠心分離によって濃縮することが可能であるが、これはこのベクターに限って使用可能な方法であり、汎用性にかける。
【００１０】
また、遺伝子導入の際に、レトロウイルスの感染を標的細胞に特異的に起こるようにできれば、標的細胞の純度が低い場合でも高い遺伝子導入効率が得られると考えられるが、現在の技術水準では簡便でかつ効率のよい方法は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような事情に鑑み、本発明の主な目的はレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入における、遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率よく行う改良方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的および本発明の利点を、添付の図面を参照して、以下に明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、標的細胞への感染を行う前に、担体上に固定化されたウイルス結合活性を有する機能性物質とレトロウイルスとを接触させ、ついで該担体に洗浄操作を施すことにより、遺伝子導入効率が向上することを見い出した。
【００１４】
また、レトロウイルスの標的細胞への感染時に標的細胞特異的な抗体、ラミニン、ラミニン由来の糖鎖、高マンノース型糖鎖等の機能性物質を共存させることにより、目的とする標的細胞に特異的な、および／または高効率での遺伝子導入が可能なことを見い出した。
【００１５】
さらに、遺伝子導入に供する前の標的細胞に、適当な前処理を施すことにより、遺伝子導入効率を向上させることが可能であることを見い出した。
【００１６】
さらにまた、ウイルス結合活性を有する機能性物質を化学修飾してその塩基性を上げることにより、その遺伝子導入への効果を改善できることを見い出した。
【００１７】
本発明は、これら本発明者らの新たな知見に基づいて完成されたものである。
【００１８】
すなわち、本発明の第一の態様は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において下記工程を包含することを特徴とする。
（１）担体上に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する機能性物質にレトロウイルスを含有する溶液を接触させる工程、
（２）レトロウイルスの結合した担体を洗浄する工程、および
（３）レトロウイルスの結合した担体を標的細胞と接触させてインキュベートする工程。
【００１９】
上記の（１）の工程は、特に限定するものではないが、例えば、１時間以上実施され、好ましくは、３時間以上実施される。また、レトロウイルスとレトロウイルス結合物質との接触の頻度を物理的に高めることによって実施される。
【００２０】
本発明に使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質には特に限定はなく、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、これらのフラグメント、あるいはこれらと同等のレトロウイルス結合活性を有する物質が使用できる。また、上記の機能性物質として標的細胞結合活性を有するものを使用するか、あるいは上記の機能性物質を標的細胞結合活性を有する他の機能性物質と組み合わせて使用してもよい。標的細胞結合活性を有する機能性物質にも特に限定はなく、例えば、細胞接着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物または代謝物等を使用することができる。
【００２１】
本発明において遺伝子導入に使用されるレトロウイルスには、例えば、レトロウイルス産生細胞の培養上清を使用することができる。この培養上清はレトロウイルス産生を促進する物質、例えば、酪酸ナトリウムの共存下に得られたものでもよい。
【００２２】
本発明の第二の態様は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において下記の２種の機能性物質の存在下でレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。
（１）レトロウイルス結合活性を有する機能性物質、および
（２）標的細胞特異的な抗体。
【００２３】
本発明に使用される標的細胞特異的な抗体には特に限定はなく、例えば、標的細胞表面に存在する生体物質を認識するものがあげられる。
【００２４】
本発明の第三の態様は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において下記の２種の機能性物質の存在下でレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。
（１）レトロウイルス結合活性を有する機能性物質、および
（２）ラミニン、ラミニンフラグメント、ラミニン由来糖鎖あるいは高マンノース型糖鎖。
【００２５】
本発明の第二の態様および第三の態様に使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質には特に限定はなく、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、これらのフラグメント、あるいはこれらと同等のレトロウイルス結合活性を有する物質を使用することができる。該機能性物質は標的細胞結合活性を有するものであってもよい。また、使用される機能性物質は適当な担体上に固定化された状態で使用されてもよい。
【００２６】
本発明の第四の態様は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において、レトロウイルスとの接触に先立って標的細胞をFe濃度を低下させた培地中で培養することを特徴とする。本発明に使用される培地には特に限定はなく、例えば、デフェロキサミンを含有する培地等を使用することができ、好ましくは、機能性物質の存在下に行う。
【００２７】
本発明の第五の態様は、ペプチドまたはタンパクのレトロウイルス結合活性を向上させる方法に関し、ペプチドまたはタンパクを化学的に修飾することを特徴とする。上記の化学的修飾に特に限定はないが、例えば、ペプチドまたはタンパクのアミノ酸残基の活性化や塩基性の残基の導入を挙げることができる。アミノ酸残基の活性化に用いられる方法には特に限定はなく、例えば、水溶性カルボジイミドによる処理、ならびに水溶性カルボジイミドとジアミノ化合物とによる処理が好適である。該方法により得られた、化学的に修飾されたペプチドまたはタンパクはレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に好適に使用することができる。
【発明の効果】
【００２８】
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入における、遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率よく行う改良方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の遺伝子導入方法には、通常、組換えレトロウイルスベクターが使用され、特に、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中にベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。
【００３０】
本発明では、細胞に導入しようとする外来遺伝子は、適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、組換えレトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、効率よい外来遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。
【００３１】
レトロウイルスベクターに挿入される外来遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体(例えば、ＷＯ９４／０２６１０号参照)、増殖因子、アンチセンス核酸、リボザイム、フォルスプライマー（例えば、ＷＯ９０／１３６４１号参照）等をコードするものを使用することができる。
【００３２】
本発明で用いるレトロウイルスベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子等が利用できる。
【００３３】
本発明に使用できるベクターとしては、例えば、ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５４）、α−ＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５５），ＬＸＳＮベクター［バイオテクニクス（BioTechniques）、第７巻、第９８０〜９９０頁（１９８９年）］等のレトロウイルスベクターがある。ＰＭ５ｎｅｏベクター［エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Exp. Hematol.）、第２３巻、第６３０〜６３８頁（１９９５年）］をはじめとして、本願明細書の実施例において使用されたレトロウイルスベクターは、マーカー遺伝子としてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有している。したがって、該ベクターによって遺伝子導入された細胞は、そのＧ４１８に対する耐性を指標として確認することができる。
【００３４】
また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４２）やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８年）に記載のψＣＲＩＰ等の細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。
【００３５】
パッケージング細胞にレトロウイルスベクターを導入して作製されたウイルス産生細胞および標的細胞の培養には、公知の培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコブ改変ダルベッコ培地等が使用でき、これらは、例えば、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社から市販品として入手することができる。これらの培地には、遺伝子導入の標的となる細胞の種類やその他の目的に応じて種々の成分を添加して用いることができる。例えば、標的細胞の生育や分化を促進、あるいは抑制する目的で血清や各種のサイトカイン類を添加して使用することができる。血清としては、例えば、仔牛血清（ＣＳ）や牛胎児血清（ＦＣＳ）等を使用することができる。また、サイトカインとしては、インターロイキン類（ＩＬ−３、ＩＬ−６等）、コロニー刺激因子類（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチンや種々の細胞増殖因子等があり、その多くのものについてヒト由来のものが市販されている。これらのサイトカイン類を使用するにあたっては、目的に応じた作用を有するものを選択し、また必要に応じてこれらを組み合わせて使用すればよい。
【００３６】
本発明の遺伝子導入方法には、レトロウイルスを含有する試料、例えば、ウイルス産生細胞の培養液上清が使用され、その調製方法には特に限定はない。例えば、酪酸ナトリウムをウイルス産生細胞の培養時に添加することにより、上清中に産生されるウイルス粒子が増加することが知られているが［ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）、第６巻、第１１９５〜１２０２頁（１９９５年）］、本発明の遺伝子導入方法を使用することにより、こうして調製された高いタイターのウイルス上清も問題なく使用することができる。
【００３７】
本発明はレトロウイルス結合部位を有する機能性物質の共存下にレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。これらの機能性物質の有効量の存在下にレトロウイルスを細胞に感染させることにより、高い効率で遺伝子導入細胞を得ることができる。また、該機能性物質を使用してウイルス上清中に存在するウイルス感染阻害物質を簡単に除去することも可能である。さらに、標的細胞結合活性を有する機能性物質を共存させておくことにより、より高い特異性および／または効率で遺伝子導入を行うことができる。
【００３８】
本明細書において、有効量とはレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入により標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量であり、用いる機能性物質および標的細胞の種類により適切な量を選択する。この量は、例えば、本明細書記載の方法により遺伝子導入効率を測定し、決定することができる。また、本明細書における標的細胞結合活性とは、実質的に細胞に結合する活性のみならず、溶液中において標的細胞に接触した状態を維持できる活性を有するものを包含する。この活性も、上記のようにその遺伝子導入効率への寄与から測定することができる。さらに、遺伝子導入効率とは、形質転換効率を意味する。
【００３９】
上記の機能性物質は溶液中に溶解した状態で、あるいは適当な担体上に固定化された状態で使用することができる。機能性物質を固定化する担体には特に限定はないが、通常、細胞培養用の容器やビーズ状の担体が用いられる。
【００４０】
なお、担体上に固定されたウイルス結合活性を有する機能性物質を用いた場合、下記に例示するような工程によってさらに遺伝子導入の効率を向上させることができる。
【００４１】
まず、レトロウイルスを含有する液体試料、例えば、ウイルス上清をレトロウイルス結合活性を有する機能性物質が固定化された担体と接触させる。この担体を洗浄した後、該担体をそのまま標的細胞と接触させることによって、あるいは適当な方法で担体から溶離させたウイルス粒子を標的細胞に添加することによって、高い効率で遺伝子導入を行うことができる。ここで使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質は標的細胞結合活性を有するものであってもよく、また、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質と標的細胞結合活性を有する機能性物質とを組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
レトロウイルスを含有する液体試料とレトロウイルス結合活性を有する機能性物質が固定化された担体とを接触させる工程は、特に限定するものではないが、例えば、１時間以上、好ましくは３時間以上にわたり実施される。温度等の条件にも特に限定はなく、例えば、室温、あるいは３７℃で行うことができる。ウイルスの安定性等によっては４℃前後の低温でもよい。機能性物質を固定化する担体もその目的に応じて適宜選択すればよいが、細胞培養用の容器を用いれば標的細胞を添加するだけで遺伝子導入工程を開始できる。また、担体の洗浄には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水やハンクスの生理食塩水の他、標的細胞の培養に使用する液体培地等も使用することができる。
【００４３】
さらに、レトロウイルスとレトロウイルス結合活性を有する機能性物質との接触の頻度を物理的に高めることにより、レトロウイルスを当該機能性物質により効率よく結合させることができる。このような物理的手段としては、特に限定するものはないが、例えば、振盪、ろ過または遠心力を利用することができる。遠心力を利用する方法は、具体的には、その底部にレトロウイルス結合活性を有する機能性物質を固定化した遠心管にレトロウイルスを含有する液体試料を添加したうえ、当該遠心管を遠心分離操作に供する方法が挙げられる。この遠心の際、レトロウイルスは遠心力によって遠心管の底部に沈降するため、レトロウイルスとレトロウイルス結合活性を有する機能性物質との接触の頻度が増加し、その結合の効率が向上する。上記方法は、遠心力によりウイルスを細胞上に沈降させて感染させる方法（ＷＯ９５／１０６１９号公報）のように細胞に物理的なストレスを与えることがなく、より高い遺伝子導入効率を得られる方法である。
【００４４】
上記の操作により、レトロウイルスを含有する試料中に含まれる、その存在が遺伝子導入に好ましくない物質を除去したうえで遺伝子導入を実施することができる。本発明の方法により除去される物質としては、例えば、ウイルス上清に含まれているパッケージング細胞由来のレトロウイルス感染阻害物質［ヒューマン・ジーン・セラピー、第８巻、第１４５９〜１４６７頁（１９９７年）、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J. Virol.）第７０巻、第６４６８〜６４７３頁（１９９６年）］や、レトロウイルス産生細胞の培養時にレトロウイルスの産生の促進を目的として添加される物質、例えば、ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＴＰＡ）やデキサメサゾン［ジーン・セラピー（Gene Therapy）、第２巻、第５４７〜５５１頁（１９９５年）］の他、上記の酪酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４５】
本発明に使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質としては、特に限定はなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン−II結合領域、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン等があり、またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
【００４６】
これらの機能性物質を化学的に修飾することにより、そのウイルス結合活性を増強することが可能である。化学的修飾の方法としては、使用する機能性物質上のアミノ酸残基を活性化する方法や、該物質に塩基性の残基を導入する方法が挙げられる。例えば、ペプチド、あるいはタンパクからなる機能性物質中の遊離のカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩）で修飾することにより、該カルボキシル基を活性化し、レトロウイルス結合活性を高めることができる。さらに、こうして活性化されたカルボキシル基を利用して、機能性物質上に塩基性の残基、例えば、アミノ基を導入することにより、レトロウイルス結合活性を高めることもできる。
【００４７】
また、本発明に使用される標的細胞結合活性を有する機能性物質も、特に限定はないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質、ホルモンやサイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質や糖脂質由来の糖鎖、あるいは標的細胞の代謝物などが挙げられる。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物質の機能的同等物等を使用することもできる。
【００４８】
標的細胞に特異的に結合する抗体は、特定の細胞に特異的に、かつ高い効率で遺伝子を導入するうえで特に有用である。本発明に使用できる抗体としては特に限定はなく、遺伝子を導入しようとする標的細胞で発現されている抗原に対する抗体を適宜選択し、使用することができる。該抗体は公知の方法によって作製することができるが、現在では多くの抗体が市販されており、これらを使用することもできる。これらの抗体は細胞特異性等所望の性質を有しているものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えば、ヒト化抗体、Ｆabフラグメント、一本鎖抗体等を使用することもできる。
【００４９】
ＣＤ抗原として知られている白血球抗原は、各抗原について種々の細胞における発現が詳細に調べられている。したがって、目的の標的細胞に発現しているＣＤ抗原を認識する抗体を選び、これを本発明の遺伝子導入方法に用いることにより、標的細胞に高い特異性で遺伝子を導入することができる。例えば、抗ＣＤ４抗体を使用した場合にはヘルパーＴ細胞に、また抗ＣＤ３４抗体を使用した場合には造血幹細胞に、それぞれ遺伝子導入を方向づけることができる。
【００５０】
また、標的細胞結合活性を有する機能性物質として糖タンパク質であるラミニンを使用することにより、種々の標的細胞、例えば、血液系の細胞に効率よく遺伝子を導入することができる。本発明に使用できるラミニンは、標的細胞に対する結合活性を有していればマウス由来でもヒト由来でもよく、また、そのフラグメントであってもよい。下記実施例に示すように、ラミニンを使用した遺伝子導入ではその糖鎖が重要な役割を果たしている。したがって、ラミニンより公知の方法で切り出した糖鎖も本発明の方法に使用することができる。また、ラミニンと同様の高マンノース型のN−結合型糖鎖を有する糖タンパク質や、これより切り出した糖鎖、さらに化学的に合成した該糖鎖を本発明に使用することもできる。さらに、上記の糖鎖をタンパク等の物質に結合させたものを使用することもでき、例えば、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質に結合させたものは遺伝子導入に好適に使用できる。
【００５１】
上記した高マンノース型糖鎖としては、分子内に１〜２０残基のマンノースを有するものであれば特に限定はないが、その非還元末端にマンノース残基を有するものが本発明の方法には好ましい。当該糖鎖は、これ以外の適当な分子、例えば単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質のような生体分子の他、合成高分子のような人工の物質と結合させて使用することもできる。
【００５２】
生体由来の高マンノース型糖鎖としては、その代表的なものに（Mannose）n−（GlucNAc）2の構造を有するものがある［タンパク質・核酸・酵素、第４３巻、第２６３１〜２６３９頁（１９９８年）］。特に限定するものではないが、例えば上記構造を有し、その分子内に９個のマンノース残基を含む糖鎖である（Mannose）9−（GlucNAc）2（図１に当該糖鎖の構造を示す）は本発明の遺伝子導入方法に好適に使用することができる。
【００５３】
上記のような機能性物質は天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、組換えＤＮＡ技術や化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。また、ＷＯ９７／１８３１８号公報に記載のように、これらの機能性物質を使用して遺伝子導入を実施する場合にはレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的細胞結合部位を有する他の機能性物質とを混合して使用するか、あるいはレトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する機能性物質を使用することができる。なお、これらの機能性物質としては、これらが天然において共存している他のタンパク質を実質的に含有していないものが使用される。さらに、これらの機能性物質あるいは機能性物質の組み合わせは、標的細胞の培養に使用する培地、細胞増殖因子等と組み合わせて遺伝子導入のためのキットとすることもできる。
【００５４】
本発明の方法に使用されるフィブロネクチンやそのフラグメントは、例えば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Biol. Chem.）第２５６巻、第７２７７頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J. Cell. Biol.）、第１０２巻、第４４９頁（１９８６年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、第１０５巻、第４８９頁（１９８７年）に記載の方法によって、天然起源の材料から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、米国特許第５,１９８,４２３号に記載の方法により、組換えＤＮＡ技術を利用製造することもできる。特に、レトロウイルス結合部位であるヘパリン−II領域を含むフィブロネクチンフラグメント、例えば、下記実施例で使用されるＣＨ−２９６、およびＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１等の組換えポリペプチド、ならびにこれらを取得する方法はこの特許に詳細に記載されている。これらのフラグメントは上記公報に記載されているように、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６)(原寄託日：平成１年５月１２日)、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１)（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６）（原寄託日：平成１年５月１２日）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）（原寄託日：平成１年１月３０日）の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培養することによって入手することができる。また、これらのフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは上記の大腸菌に保持されているプラスミドを公知の遺伝子組換え手法で改変することにより、作製することができる。なお、上記のフィブロネクチンフラグメントのうち、Ｈ−２９６はＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドを、ＣＨ−２７１はＶＬＡ−５への結合領域ペプチドを、また、ＣＨ−２９６はその両方を有している［ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）、第２巻、第８７６〜８８２頁（１９９６年）］。
【００５５】
上記の機能性物質の存在下で標的細胞にレトロウイルスを感染させることにより、遺伝子が導入された細胞を効率よく得ることができる。レトロウイルスの感染は通常の方法、例えば、３７℃、炭酸ガス濃度５％の条件でのインキュベーションによって行うことができる。この条件やインキュベーションの時間は標的細胞や目的に応じて適宜変更してよい。
【００５６】
標的細胞がＧ0期の細胞である場合にはレトロウイルスが感染しないため、予備刺激によって細胞周期に誘導することが好ましく、この目的で、レトロウイルスの感染に先立って、標的細胞を適当な標的細胞増殖因子の存在下で培養する。例えば、骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行う場合の予備刺激には各種のサイトカイン、例えばインターロイキン−３、インターロイキン−６や幹細胞因子等が使用される。
【００５７】
細胞へのレトロウイルスの感染には、細胞表面に存在するレセプターが関与していることが知られている。塩基性アミノ酸トランスポーター、リン酸トランスポーターは、それぞれエコトロピックウイルス、アンフォトロピックウイルスのレセプターとして機能することが知られており［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第９３巻、第１１４０７〜１１４１３頁（１９９６年）］、これらのトランスポーターの発現、代謝回転を活発にさせるために、塩基性アミノ酸あるいはリン酸やこれらの塩、前駆体を低減させた培地中で標的細胞を前処理することによって、当該細胞をウイルスに感染し易い状態とすることができる。
【００５８】
驚くべきことに、ウイルス感染との関連は知られていなかったトランスフェリンレセプターを活性化させた場合にもレトロウイルスの感染効率、すなわち、遺伝子導入効率が上昇することを本発明者らは見い出した。トランスフェリンレセプターの活性化は、特に限定するものではないが、Ｆe濃度を制限した培地中で標的細胞を処理することによって行うことができ、例えば、デフェロキサミンを添加して培地中のＦeをキレートさせた培地を使用することができる。
【００５９】
好ましくは、トランスフェリン活性化による遺伝子導入も、上記の機能性物質の存在下で行う。
【００６０】
本発明の方法による遺伝子導入の標的となる細胞も特に制限はなく、例えば、幹細胞（stem cells）、造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細胞、胎児性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（primordial germ cell）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、ＣＤ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞等を使用することができる。血液や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、またその培養や維持の手法が確立されていることから、本発明の方法を利用するのに好適である。特に導入された遺伝子の長期にわたる発現が目的の場合には造血幹細胞、ＣＤ３４陽性細胞、Ｃ−ｋｉｔ陽性細胞、多能性造血前駆細胞等の血液系の前駆細胞が標的細胞に適している。
【００６１】
例えば、造血幹細胞を標的細胞とした遺伝子治療は以下のような操作によって実施することができる。
【００６２】
まず、ドナーより造血幹細胞を含有する材料、例えば、骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これらの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能であるが、通常は、密度勾配遠心分離等の方法により造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、さらに、ＣＤ３４および／またはＣ−ｋｉｔといった細胞表面のマーカー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。これらの造血幹細胞を含有する材料について、必要に応じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激を行った後、本発明の方法により目的とする遺伝子を挿入された組換えレトロウイルスベクターを感染させる。こうして得られた遺伝子導入された細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能であり、例えば、臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植が行われる。
【００６３】
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療がこれにあたる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがある。
【００６４】
また、癌の遺伝子治療法としては、癌細胞にサイトカイン類の遺伝子を導入した後にその増殖能力を奪って患者の体内に戻し、腫瘍免疫を増強させる腫瘍ワクチン療法が研究されている［ヒューマン・ジーン・セラピー、第５巻、第１５３〜１６４頁（１９９４年）］。さらに、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の感染するＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（アンチセンス核酸やリボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている［例えば、ジャーナル・オブ・ウイロロジー、第６９巻、第４０４５〜４０５２頁（１９９５年）］。
【００６５】
以上に詳細に説明したように、本発明を使用することにより、高い効率で、かつ標的細胞に対して高い特異性で遺伝子導入を実施することが可能となる。また、本発明の方法は特別な設備、装置を必要とせず、また多種のレトロウイルスベクター、標的細胞について有効である。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を挙げて、さらに詳しく本発明を説明するが、本発明は下記実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００６７】
実施例１
フィブロネクチン由来ポリペプチドの調製
ヒトフィブロネクチン由来のポリペプチド、Ｈ−２７１は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、ｐＨＤ１０１を含有する大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４）より、米国特許第５,１９８,４２３号公報に記載の方法により調製した。
【００６８】
ヒトフィブロネクチン由来のポリペプチド、Ｈ−２９６は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、ｐＨＤ１０２を含有する大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１０２／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０７２１）より、上記の公報に記載の方法にしたがって調製した。
【００６９】
ポリペプチドＣＨ−２７１は以下に示す方法により調製した。
すなわち、大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９）を用い、これを上記の公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣＨ−２７１を得た。
【００７０】
ポリペプチドＣＨ−２９６は以下に示す方法により調製した。
すなわち、大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）を用い、これを上記の公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣＨ−２９６を得た。
【００７１】
ポリペプチドＣ−２７４は以下に示す方法により調製した。
すなわち、大腸菌、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５）を用い、これを米国特許第５,１０２,９８８号公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣ−２７４を得た。
【００７２】
Ｖ型コラーゲン由来のレトロウイルス結合活性を有するポリペプチドであるＣｏｌＶは、国際公開公報 ＷＯ９７／１８３１８号に記載の方法にしたがって調製した。
【００７３】
実施例２
レトロウイルスベクターの構築およびレトロウイルス上清液の調製
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するレトロウイルスプラスミド、ＰＭ５ｎｅｏベクター［エクスペリメンタル・ヘマトロジー、第２３巻、第６３０〜６３８頁、１９９５年］を導入されたＧＰ＋Ｅ−８６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４２）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ社製）ならびに５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシン（共にギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、バイオウイッタカー社製）中で培養した。なお、以降の操作に使用したＤＭＥＭは全て上記抗生物質を含有したものである。ＰＭ５ｎｅｏウイルス含有上清液は上記産生細胞をセミコンフルエントに生育させたプレート（１０cm径のゼラチンコート細胞培養用ディシュ、岩城硝子社製）に１０％ＦＣＳを含有する４mlのＤＭＥＭを添加し、一晩培養した後に採取して調製した。採集した培地上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用時まで−８０℃で保存した。
【００７４】
また、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と増感緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein、ＥＧＦＰ）遺伝子とを含有するレトロウイルスプラスミド、ｐＬＥＩＮ（クロンテック社製）を導入されたエコトロピックパッケージング細胞ＢＯＳＣ２３［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第９０巻、第８３９２〜８３９６頁（１９９３年）］、ならびにアンフォトロピックパッケージング細胞ψＣＲＩＰ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８年）］のそれぞれより、上記同用の操作でウイルス上清液を調製した。以下、ＢＯＳＣ２３細胞より調製されたウイルスをＥｃｏ−ＥＧＦＰ、ψＣＲＩＰ細胞より調製されたウイルスをＡｍｐｈｏ−ＥＧＦＰと記載する。
【００７５】
さらに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するレトロウイルスプラスミド、ＴＫＮｅｏベクター［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）、第１７８巻、第５２９〜５３６頁、（１９９３年）］を含有するＧＰ＋ＥｎｖＡｍ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）より、上記同様の方法でウイルス上清液を調製した。なお、ＤＭＥＭはＦＣＳのかわりに１０％仔ウシ血清（ＣＳ、ギブコ社製）を含有するものを用いた。
【００７６】
上記のウイルス上清液の力価は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）へのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の導入を指標とする標準的な方法［ジャーナル・オブ・ウィロロジー、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁、（１９８８年）］に従って測定した。上清１ml当たりに含まれる感染性粒子数（cfu／ml）を算出し、これを上清液の力価として以降の実験におけるウイルス上清液の添加量を決定した。
【００７７】
実施例３
レトロウイルス結合性機能性物質の作製およびその活性測定
表面未処理細胞培養用９６穴マイクロプレート（ファルコン社製）に、各々８０μg／ml のＨ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ−２７４、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣｏｌＶ、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、プロゲン社製）、テネイシン（Tenascin、ギブコ社製）、表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、宝酒造社製）または２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）を１ウエルにつき５０μl添加し、４℃で一晩静置した後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ローマン工業社製）にて２回洗浄操作した。また、上記同様の処理の後に、滅菌純水で４mg／mlに調整した１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（シグマ社製）溶液を１ウエルにつき０．１ml分注して３７℃で２時間反応させた後、プレートを純水で充分洗浄してカルボジイミド処理プレートを作製した。これらのプレートはウイルス感染実験を行なうまでは４℃で保存しておいた。
【００７８】
１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウィタカー社製）中で生育させたマウス白血病細胞Ｌ１２１０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１９）１０4個と、ＰＭ５ｎｅｏウイルス上清液（１０4cfu／ml）５０μlとを上記マイクロプレート１ウェルに添加した。これを２４時間培養したのち、培地を最終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８（ギブコ社製）を含有するものと交換して、さらに４８時間培養を行なった。Ｇ４１８耐性細胞の検定は、S. Kim らの方法［ジーン・セラピー、第３巻、第１０１８〜１０２０頁（１９９６）］を一部改変し、Premix WST-1試薬（宝酒造社製）の発色を４５０nmにおける吸光度として測定することにより行なった。培養後、１００μlの培養液あたり１０μlのWST-1試薬を添加してさらに３７℃で４時間培養した後、マイクロプレートリーダーにて４５０nm、６５０nmの吸光度を測定しその差（４５０nm−６５０nm）を算出した。また、２％ ＢＳＡコート、カルボジイミド未処理群で得られた値をバックグランドとした。３回の試験の結果をまとめ、その結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】
2006174852.tif 000002
【００８０】
表１に示されるように、公知のウイルス結合活性を有する機能性物質であるＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣｏｌＶ、ｂＦＧＦでの遺伝子導入効率の上昇が見られた。さらに、ウイルス結合活性を有していないＣ−２７４、テネイシン、ＥＧＦ、ＢＳＡにおいてもカルボジイミド処理を施した場合にはＧ４１８耐性細胞の出現率が増加した。
【００８１】
次に、機能性物質としてＣＨ−２９６を使用し、以下の実験を行った。
【００８２】
表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレート（ファルコン社製）に、４０ μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６を１ウェルあたり０．５ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。このプレートをＰＢＳ（ｐＨ５．８）にて洗浄した後、エチレンジアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）2ＮＨ2 、ナカライ社製］、またはトリメチレンジアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）3ＮＨ2 、ナカライ社製］またはプトレスシン［ＮＨ2（ＣＨ2）4ＮＨ2 、ナカライ社製］を種々の濃度で含む１０ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（シグマ社製）のＰＢＳ（ｐＨ５．８）溶液を６２５μlずつ添加し、３７℃、２時間インキュベートした。この操作により、ＣＨ−２９６の分子上のカルボキシル基にカルボジイミドを介してアミノ基の導入を行った。このプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、２％グリシン／ＰＢＳ、２％ ＢＳＡ／ＰＢＳで順次ブロッキングした。
【００８３】
レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＥＩＮを導入したＧＰ＋Ｅ８６細胞を１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、上清を採取した。この上清を１×１０５ｃｆｕ／ｍｌとなるように希釈したウイルス液を上記のプレートの１ウェルあたり０．５ｍｌずつ添加して４時間インキュベートし、さらに１×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を入れて２日間培養を行った。培養終了後、細胞を細胞剥離用緩衝液（バイオウィタカー社製）にて回収し洗浄した後、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ（ベクトンディキンソン社製）を使用したフローサイトメトリー（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１５〜５４５ｎｍ）によりＥＧＦＰ発現細胞の解析を行い、プレートへのウイルス結合能を細胞への遺伝子導入効率によって表した。この結果を図２に示す。
【００８４】
図２に示されるように、アミノ基導入反応に用いるジアミノ化合物の濃度が高くなるにつれてウイルス結合能が上昇した。プトレシン、トリメチレンジアミン、エチレンジアミンをともに２ｍＭで反応に用いると、未処理のＣＨ−２９６に比べて２倍程度のウイルス結合能を示した。
【００８５】
実施例４
ラミニンの遺伝子導入効率増強効果
マウスラミニン（ギブコ社製）またはヒトラミニン（宝酒造社製）とウイルス結合活性を有する機能性物質とを組み合わせて遺伝子導入を実施した。実験に使用した表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレート（ファルコン社製）は次の２つの方法によりこれらの機能性物質でコートした。
カクテル法：２種の機能性物質の混合液をプレートに添加して４℃で一晩静置した後、２％ ＢＳＡによるブロッキング（３７℃、２０分間）を行い、次いでプレートをＰＢＳで洗浄する。
プレコート法：ウイルス結合活性を有する機能性物質溶液をプレートに添加して４℃で一晩静置した後、該溶液を除去する。次いでラミニン溶液を添加して３７℃、２時間インキュベートし、さらに２％ ＢＳＡによるブロッキングを行った後、プレートをＰＢＳで洗浄する。
【００８６】
なお、コート操作に使用する機能性物質溶液は１ウェルあたり０．５ｍｌずつ添加した。
【００８７】
１０５個のＬ１２１０細胞と、０．５ｍｌのＥｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を添加して２４時間培養を続けた。培養終了後、細胞を細胞剥離用緩衝液（バイオウィタカー社製）にて回収し洗浄した後、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ベクトンディキンソン社製）を使用したフローサイトメトリー（励起波長４８８nm、蛍光波長５１５〜５４５nm）によりＥＧＦＰ発現細胞の解析を行い、遺伝子導入効率（全細胞に対するＥＧＦＰ発現細胞の割合）を算出した。実験結果を表２〜５に示す。
【００８８】
【表２】
2006174852.tif 000003
【００８９】
【表３】
2006174852.tif 000004
【００９０】
【表４】
2006174852.tif 000005
【００９１】
【表５】
2006174852.tif 000006
【００９２】
表２および３に示されるように、マウスおよびヒトラミニンをウイルス結合活性を有する機能性物質と組み合わせてレトロウイルスによる遺伝子導入に使用した場合、その固定化方法にかかわらず、標的細胞への遺伝子導入が非常に高い効率で起こることが明らかになった。また表４および５に示されるように、ＣＨ−２９６およびＣＨ−２７１を用い、これらとラミニンとをカクテル法によりコートしたプレートでの遺伝子導入効率を検討したところ、その最適濃度比率は、ＣＨ−２９６／マウスラミニンで８：１（例、８０μg／ml：１０μg／ml）、ＣＨ−２７１／マウスラミニンで１６：１（例、８０μg／ml：５μg／ml）であることが明らかになった。そのときの遺伝子導入効率は、ラミニン無添加時に対してＣＨ−２９６で２．６倍、ＣＨ−２７１で５．１倍に上昇した。
【００９３】
実施例５
ラミニンを使用したマウスＣ−ｋｉｔ陽性骨髄細胞への遺伝子導入
マウスＣ−ｋｉｔ陽性骨髄細胞の調製は以下のように行なった。６〜８週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雌マウス（日本エスエルシー社製）の大腿骨より骨髄細胞を採取し、得られた細胞をフィコールーハイパク（１．０８７５g／ml、ファルマシア社製）を用いた密度勾配遠心分離にかけ、低密度単核細胞画分を調製した。得られた細胞をＰＢＳで洗浄後、Ery-Lysis緩衝液（１５５mM ＮＨ4Ｃｌ、１０mM ＫＨＣＯ3、０．１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で赤血球を溶解させ、さらにＰＢＳで洗浄した。こうして得られた骨髄細胞に抗マウスＣＤ１１７抗体（ファーミンゲン社製）を１０7細胞あたり１μg添加し、氷上で３０分間反応させた。細胞を５mM ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、同じ緩衝液に懸濁した。つぎにマイクロビーズ結合２次抗体（ミルテニーバイオテク社製）を１０7細胞あたり２０μl添加し、４℃で３０分間反応させた後、上記緩衝液で洗浄し再懸濁した。ＭＡＣＳシステム（ミルテニーバイオテク社製）によりマイクロビーズに結合した細胞を回収し、Ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を得た。
【００９４】
ウイルス感染に先立って、マウスＣ−ｋｉｔ陽性骨髄細胞は、Luskey らの方法［ブラッド（Blood）、第８０巻、第３９６〜４０２頁（１９９２年）］を基にして予備刺激を行なった。すなわち、２０％ ＦＣＳ、２０ng／ml組換えマウスインターロイキン−３（ジェンザイム社製）、５０ng／ml組換えヒトインターロイキン−６（ジェンザイム社製）、１００ng／ml組換えマウス幹細胞因子（ジェンザイム社製）、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（バイオウィタカー社製）中で５％炭酸ガス存在下、３７℃で２日間培養した。
【００９５】
表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレートを種々の濃度のマウスラミニンと８０μg／mlのＣＨ−２７１との混合液を用いるカクテル法にてコートした後、２％ ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、さらにＰＢＳで洗浄を行なった。また、対照としてＣＨ−２７１のかわりに２％ ＢＳＡを使用したプレートも作製した。このマイクロプレートに１ウェルあたり１０5個のＣ−ｋｉｔ陽性骨髄細胞と０．５mlのＥｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０5cfu／ml）を添加してウイルス感染を行なった。これを４８時間培養した後、０．５mlの新鮮な培地を添加しさらに２４時間培養を続けた。培養終了後、細胞を細胞剥離用緩衝液にて回収し洗浄した後、実施例４記載の方法により遺伝子導入効率を算出した。２回の実験を行った結果を表６および７に示す。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
【表７】
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【００９８】
表６および７に示されるように、マウスラミニンとウイルス結合活性を有する機能性物質ＣＨ−２７１とをカクテル法にてコートしたプレート上でＣ−ｋｉｔ陽性骨髄細胞をレトロウイルス感染させた場合にも、非常に高い遺伝子導入効率増強効果が認められることが明らかになった。ラミニン併用時の遺伝子導入効率は、ＣＨ−２７１単独使用時に比較して最大で５．７倍上昇した。
さらに、Ｅｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液として、１０7cfu／mlのタイターのものを使用して上記同様の操作を行った。３回の実験で得られた遺伝子導入効率の平均を表８に示す。この場合にも、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質による遺伝子導入効率はラミニンの併用によって向上することが示された。
【００９９】
【表８】
2006174852.tif 000009
【０１００】
実施例６
ラミニンを使用したマウス脾臓細胞由来ＣＤ３陽性Ｔ細胞への遺伝子導入
マウス脾臓細胞由来ＣＤ３陽性Ｔ細胞の調製は以下のように行なった。６〜８週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雌マウスの脾臓より細胞を採取し１００μmメッシュ（ファルコン社製）に通し残渣を除去した。得られた細胞を１０％ ＦＣＳを含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、バイオウィタカー社製）で洗浄後、Ery-Lysis緩衝液で赤血球を溶解させ、さらにＨＢＳＳで洗浄した。得られた細胞を３０μmメッシュ（ミルテニーバイオテク社製）に通し残渣を除去した後、ＣＤ３陽性Ｔ細胞濃縮カラム（アールアンドディーシステムズ社製）にて精製した。ウイルス感染実験に使用するマウスＣＤ３陽性Ｔ細胞は、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８抗体（どちらも、１μg／ml、ファーミンゲン社製）を固定化したシャーレ上で、１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウィタカー社製）中で５％炭酸ガス存在下、３７℃で２日間培養し、予備刺激を行なった。
【０１０１】
２０μg／mlのマウスラミニンと８０μg／mlのＣＨ−２９６の混合液を使用し、実施例５と同様にして２４穴マイクロプレートをコートした。このマイクロプレートに１ウェルあたり１０5個のＣＤ３陽性Ｔ細胞と０．５mlのＥｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０5cfu／ml）を添加して３時間のウイルス感染を行なった。その後、１０％ ＦＣＳ、５００単位／mlの組換えマウスインターロイキン−１α（ジェンザイム社製）、１０ng／mlの組換えマウスインターロイキン−２（ジェンザイム社製）、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を添加しさらに４８時間培養を続けた。培養終了後、細胞を細胞剥離用緩衝液にて回収し洗浄した後、実施例４記載の方法により遺伝子導入効率を算出した。その結果を表９に示す。
【０１０２】
【表９】
2006174852.tif 000010
【０１０３】
表９に示されるように、マウスＣＤ３陽性Ｔ細胞への遺伝子導入効率はラミニンの共存により上昇することが明らかとなった。
【０１０４】
実施例７
遺伝子導入へのラミニン分子中の糖鎖の関与
１ウェルあたり５０μlの５μg／mlのマウスラミニンと８０μg／mlのＣＨ−２７１の混合液を使用し、実施例５と同様にして９６穴マイクロプレートをコートした後、プレートを各種の糖鎖切断活性を有する酵素で処理して、遺伝子導入効率への影響について検討した。
【０１０５】
プレートは以下に示す条件で酵素処理に供した：Ｏ−グリカナーゼ（Endo-α-N-acetylgalactosaminidase、生化学工業社製）、エンドグリコシダーゼＨ（Endo-β-N-acetylglucosaminidase H、生化学工業社製）、エンド−β−ガラクトシダーゼ（Endo-β-galactosidase、生化学工業社製）およびα−マンノシダーゼ（α-Mannosidase、生化学工業社製）は５０mMのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）でそれぞれ５００mU／ml、５００mU／ml、２５０mU／mlおよび２mU／mlの酵素液を調製した。グリコペプチダーゼＦ（Peptide: N-glycosidase F、宝酒造社製）は１００mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）で２５０mU／mlの酵素液を調製した。各酵素液をそれぞれ１ウェルあたり５０μlずつ分注し、３７℃、２０時間反応させた。その後、ＰＢＳにて３回洗浄を行なった後、ウイルス感染実験に用いた。
【０１０６】
１０％ ＦＣＳならびに５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育させたマウス白血病細胞Ｌ１２１０の１０4個とＰＭ５ｎｅｏウイルス上清液５０μl（１０4cfu／ml）とを上記マイクロプレート１ウェルに添加した。これを２４時間培養したのち、培地を最終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８（ギブコ社製）を含有するものと交換して、さらに４８時間培養を行なった。Ｇ４１８耐性細胞を実施例３記載の方法により測定し、その結果を表１０に示す。なお、表１０は３回の実験結果を総合したものである。
【０１０７】
【表１０】
2006174852.tif 000011
【０１０８】
表１０に示すように、ラミニンを併用した場合にはＣＨ−２７１単独に比べてＧ４１８耐性細胞出現率は増加している。このラミニンを用いてコートしたプレートを酵素処理した場合、エンドグリコシダーゼＨ処理によってラミニンによる遺伝子導入促進効果は全く消失してしまった。また、α−マンノシダーゼもしくはグリコペプチダーゼＦ処理でも多少の遺伝子導入効率の低下が認められた。ラミニン分子上の糖鎖についての報告［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophysi. Acta）、第８８３巻、第１１２〜１２６頁（１９８６年）］によると、ラミニン分子上の糖質のほとんどはアスパラギンに結合するＮ−結合型糖鎖であり、ラミニン１分子あたり４３分子のＮ−結合型の糖鎖が結合している。それらの糖鎖のなかでエンドグリコシダーゼＨ処理によって切り出される糖鎖は高マンノース型のアスパラギン−Ｎ−結合型糖鎖である。また、 α−マンノシダーゼ処理によっても遺伝子導入効率の低下が認められたことより、ラミニン分子中の（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnおよび/または（Mannose）6−（GlucNAc）2−Asnのような、α−マンノシダーゼ処理により切断されるα１−２および／またはα１−６結合のマンノース構造を持つ糖鎖が重要な働きをしていると考えられる。このように、ラミニンによる遺伝子導入促進効果はラミニン分子中の糖鎖、特に高マンノース型の糖鎖によることを明らかにできた。
【０１０９】
上記の（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnの遺伝子導入への関与を以下に示す実験により確認した。
【０１１０】
ラクトースを固定化したセファロースＣＬ−２Ｂ（ファルマシア社製）を使用して脱脂大豆粉（シグマ社製）より調製した大豆アグルチニン１ｇを加熱変性後、１０mM塩化カルシウムを含有する２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、２０ｍｇのアクチナーゼＥ（科研製薬社製）を用いて３７℃、２昼夜消化した。酵素を加熱失活させた後、セファデックスＧ−１５（５０ｍｌ）、およびセファデックスＧ−２５（１５０ｍｌ）カラムを用いたクロマトグラフィーを行い、（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnを精製した。図１に（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnのアスパラギン残基を除いた構造を示す。
【０１１１】
ＣＨ−２７１と、上記の（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnとが共有結合で固定化されたマイクロプレートを作成した。すなわち、９６穴カルボプレート（住友ベークライト社製）を４ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド溶液を用いて３７℃、２時間活性化した後、滅菌水で３回洗浄した。２％ＢＳＡ、あるいは８０μｇ／ｍｌのＣＨ−２７１と種々の濃度の（Mannose）9−（GlucNAc）2−Asnとを含む溶液を調製し、その５０μｌずつを活性化した９６穴カルボプレートのウェルに添加し、３７℃、２時間の固定化反応を行った。次いで０．２％グリシン溶液による４℃、１５時間のブロッキングを行い、以下の遺伝子導入実験に用いた。
【０１１２】
上記マイクロプレートの１ウェル当たりに、１０3個のＬ１２１０細胞と０．１ｍｌのＥｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０6cfu／ml）とを添加して４８時間培養後、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン含有）０．１ｍｌを添加してさらに２４時間培養した。細胞を回収、洗浄した後、実施例４記載の方法により遺伝子導入効率を算出した。２回の実験結果の平均を表１１に示す。
【０１１３】
【表１１】
2006174852.tif 000012
【０１１４】
表１１に示されるように、（Mannose）9−（GlucNAc）2−AsnをＣＨ−２７１とともに固定化したウェルでは、使用した糖鎖の濃度依存的に遺伝子導入効率が上昇した。すなわち、ラミニン分子上に存在するものと同じ構造の糖鎖が、遺伝子導入効率の向上に寄与することが確認された。
【０１１５】
実施例８
抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いたＣＤ４陽性細胞に特異的な遺伝子導入
各々１μg／mlの抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ４４モノクローナル抗体（いずれもファーミンゲン社製）と、各々８０μg／mlのＨ−２７１、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６とを組み合わせ、実施例４記載の方法に従い表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレートをコートした。なお、Ｈ−２７１についてはプレコート法、ＣＨ−２７１とＣＨ−２９６についてはカクテル法を用いた。
【０１１６】
このマイクロプレート１ウェルあたりに０．５mlのＥｃｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０7cfu／ml）を添加し、３２℃で３時間インキュベートした後、１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地でプレートを洗浄した。続いて実施例６記載の方法にしたがって調製し、予備刺激したマウス脾臓細胞由来ＣＤ３陽性Ｔ細胞を１ウェルあたり１０5個添加して３時間のウイルス感染を行なった。その後、１０％ ＦＣＳ、５００単位の組換えマウスインターロイキン−１α、１０ng／mlの組換えマウスインターロイキン−２、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を添加しさらに４８時間培養を続けた。培養終了後、細胞を細胞剥離用緩衝液にて回収し洗浄し、細胞をファイコエリスリン（ＰＥ、ファーミンゲン社製）ラベルした抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体（ファーミンゲン社製）およびプロピニウムアイオダイド（ＰＩ、シグマ社製）にて染色した。この細胞についてＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅを使用したフローサイトメトリー（励起波長４８８nm、蛍光波長５１５〜５４５nmおよび５６２〜５８８nm）を行い、生細胞中のＣＤ４抗原の発現とＥＧＦＰの発現の二次元解析を行い、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ４陰性細胞それぞれへの遺伝子導入効率を算出した。この結果を表１２に示す。なお、表１２は４回の実験結果を総合したものである。
【０１１７】
【表１２】
2006174852.tif 000013
【０１１８】
表１２に示されるとおり、モノクローナル抗体とフィブロネクチンフラグメントの両方をコートしたプレート上でレトロウイルス感染を行うと、マウス脾臓細胞由来ＣＤ３陽性T細胞において、遺伝子導入効率の増強効果が認められた。
【０１１９】
とりわけ特筆すべき点は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体とレトロウイルス結合活性を有する機能性物質とを組み合わせてウイルス感染を行なった場合、ＣＤ４陽性細胞への遺伝子導入効率がＣＤ４陰性細胞への効率と比較して非常に高いものであった。例えば、Ｈ−２７１との組み合わせではＣＤ４陽性細胞への遺伝子導入効率が約６０％と非常に高効率であったのに対し、ＣＤ４陰性細胞への遺伝子導入効率は２０％程度にとどまった。フィブロネクチンフラグメントとしてＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６を使用した場合も同様の結果が得られた。
【０１２０】
一方、ＣＤ４４抗原はＣＤ４陽性細胞、ＣＤ４陰性細胞とも９８％以上発現しており、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体を使用して上記同様のレトロウイルス感染を行なった場合、細胞のＣＤ４抗原の発現とは無関係に遺伝子導入効率が上昇すると考えられたが、表１２の結果はそれを裏付けるものであった。
【０１２１】
実施例９
抗ＣＤ８ａモノクローナル抗体を用いたＣＤ８陽性細胞に特異的な遺伝子導入
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質としてＨ−２７１を、抗体として抗マウスＣＤ８ａ（ファーミンゲン社製）、抗マウスＣＤ４４モノクローナル抗体を使用した他は実施例８と同様に行なった。なお、ＣＤ８陽性、陰性細胞の検出にはファイコエリスリン（ＰＥ、ファーミンゲン社製）ラベルした抗マウスＣＤ８ａモノクローナル抗体（ファーミンゲン社製）を使用した。得られた結果を表１３に示す。なお、表１３は２回の実験結果を総合したものである。
【０１２２】
【表１３】
2006174852.tif 000014
【０１２３】
表１３に示されるとおり、抗ＣＤ８ａモノクローナル抗体とフィブロネクチンフラグメントの併用により、マウス脾臓細胞由来ＣＤ３陽性Ｔ細胞への遺伝子導入効率の増強効果が認められた。
【０１２４】
抗ＣＤ８ａモノクローナル抗体の場合も、実施例８の結果と同様に、該抗体が認識するＣＤ８抗原を発現する細胞に対して高い遺伝子導入効率を示した。また、ＣＤ８陽性、陰性両細胞の９８％以上で発現している抗ＣＤ４４モノクローナル抗体を使用した場合にはＣＤ８陽性、陰性細胞間での遺伝子導入効率に差は見られなかった。
【０１２５】
上記の実施例８および９の実験結果の示す意義は非常に大きく、標的細胞特異的な抗体とウイルス結合性機能性物質との混合物質（カクテル）で培養器をコートし、その培養器上で標的細胞を含む細胞群に目的遺伝子を組み込んだレトロウイルスを感染させると、標的細胞特異的に目的遺伝子を導入することが可能であることを証明された。
【０１２６】
実施例１０
抗体を用いた細胞選択的な遺伝子導入
８０μｇ／ｍｌのＣＨ−２７１と各種細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体（抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８、抗−ＣＤ４４、抗−ＣＤ４９ｃ、抗−ＣＤ４９ｄおよび抗−ＣＤ４９ｅ抗体；いずれもファーミンジェン社製）各々１μｇ／ｍｌとを使用し、実施例４記載の方法に従って表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレートをカクテル法によりコートした。
【０１２７】
標的細胞には、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ＨＳＢ−２（ヒト急性リンパ球性白血病細胞、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０．１）、ＭＯＬＴ−３（ヒト急性リンパ球性白血病細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５２）、ＴＦ−１（ヒト赤白血病細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２００３）を用いた。これらの細胞について、ラベルした上記の各種モノクローナル抗体を使用してＦＡＣＳ解析を行い、当該抗体に対応する抗原の発現率を測定した。
【０１２８】
上記のマイクロプレートの１ウェルあたりに０．５ｍｌのＡｍｐｈｏ−ＥＧＦＰウイルス上清液（１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）を添加し、３２℃で３時間インキュベートした後、１０％ＦＣＳ、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。上記培地１ｍｌに上記の各種細胞を各々１×１０５個になるように懸濁してウェルに添加し、ウイルス感染を行なった。さらに３日間培養を行なった後、細胞剥離用緩衝液にて細胞を回収、洗浄し、実施例４に記載のフローサイトメトリー法でＥＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。
【０１２９】
以上の結果を表１４に示す。なお、この結果は３回の実験結果を平均値で表したものである。
【０１３０】
【表１４】
2006174852.tif 000015
遺伝子導入効率は、各々の細胞における抗体無添加での遺伝子導入効率を
１００％とした場合の相対値（％）で表した。
ＣＤ抗原発現率は、ＦＡＣＳ測定における陽性率（％）をそれぞれ以下のよ
うに示した。
−：１０％以下、 ＋／−：１０−３０％、 ＋：３０−６０％、
＋＋：６０−９０％、＋＋＋：９０％以上
【０１３１】
表１４に示されたように、ウイルス結合物質としてＣＨ−２７１、細胞結合物質として各種細胞上の抗原に対する抗体を用いたカクテル法での遺伝子導入において、抗原の発現率と遺伝子導入効率には相関関係が認められた。
さらにレトロウイルス結合能を有する機能性分子として、ＣＨ−２７１にかえて８０μｇ／ｍｌポリリジンを用いた遺伝子導入実験を行った。使用したモノクローナル抗体、細胞、その他の実験条件は上記と同様に行なった。得られた結果を表１５に示す。なお、結果は３回の実験結果を平均値で示したものである。
【０１３２】
【表１５】
2006174852.tif 000016
遺伝子導入効率は、各々の細胞における抗体無添加での遺伝子導入効率を
１００％とした場合の相対値（％）で表した。
ＣＤ抗原発現率は、ＦＡＣＳ測定における陽性率（％）をそれぞれ以下のよ
うに示した。
−：１０％以下、 ＋／−：１０−３０％、 ＋：３０−６０％、
＋＋：６０−９０％、＋＋＋：９０％以上
【０１３３】
表１５に示されたように、ポリリジンをウイルス結合物質として用い、細胞結合物質として各種細胞上の抗原に対する抗体を用いてカクテル法により、遺伝子導入実験を行なったところ、抗原の発現率と遺伝子導入効率には相関関係が認められた。
【０１３４】
以上の２つの実験の結果、標的細胞上に発現している抗原を特異的に認識する抗体を細胞結合物質として用いたカクテル法で遺伝子導入することにより、所望の標的細胞に特異的な遺伝子導入が可能であることが示された。
【０１３５】
実施例１１
デフェロキサミン含有培地で前培養した標的細胞への遺伝子導入
１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養されたヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ―２４０）を、感染実験前日より種々の濃度のデフェロキサミン（deferoxamin、シグマ社製）を含む上記培地に移して、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２０時間前培養を行なった。細胞は使用時にデフェロキサミンを含まない新鮮な培地で洗浄後、２×１０5細胞／mlとなるように調製して以下の感染実験に使用した。
【０１３６】
表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレートに８０μg／mlのＣＨ−２７１を１ウェルあたり０．５ml添加し、４℃で一晩静置した後、２％ ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、さらにＰＢＳで洗浄した。上記マイクロプレート１ウェルあたりに０．５mlのAmpho−ＥＧＦＰウイルス上清液（１０6cfu／ml）を添加し、３２℃で３時間インキュベートした後、１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地でプレートを洗浄した。 続いて前培養したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１０5個添加して４８時間培養した後、１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地０．５mlを添加しさらに２４時間培養を続けた。以降、実施例４と同様の操作により遺伝子導入効率を調べた。結果を表１６および１７に示す。
【０１３７】
【表１６】
2006174852.tif 000017
【０１３８】
【表１７】
2006174852.tif 000018
【０１３９】
表１６および１７に示されるとおり、ＣＨ−２７１単独では遺伝子導入効率が非常に低いＨＬ−６０細胞でも、デフェロキサミンであらかじめ２０時間処理することにより、遺伝子導入効率が向上することが確認された。
【０１４０】
実施例１２
培養上清中のウイルス感染阻害物質の存在の検出
実施例２で調製したＴＫＮｅｏウイルス上清をＤＭＥＭ、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）の培養上清、ψＣＲＩＰ細胞の培養上清のそれぞれで３１２.５cfu／mlとなるよう希釈して以下の操作に使用した。
【０１４１】
表面未処理細胞培養用２４穴マイクロプレートに１ウェルあたり０．５mlの３２μg／mlのＣＨ−２９６を添加して室温に２時間放置した後、２％ ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、さらにＰＢＳで洗浄した。このプレート１ウェルあたりに、上記のウイルス液１ｍｌと２×１０4個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を加え、３７℃で一晩インキュベーションした。その後、０．７５mg／mlのＧ４１８を含む選択培地で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を表１８に示す。
【０１４２】
【表１８】
2006174852.tif 000019
【０１４３】
表１８に示されるように、ウイルスをＤＭＥＭで希釈した場合に比べ、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞培養上清またはψＣＲＩＰ細胞培養上清で希釈した場合は、導入効率は５分の１以下に低下した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞はψＣＲＩＰ細胞や本実験に用いたＴＫＮｅｏウイルスベクター産生細胞の調製に用いられたＧＰ＋ＥｍｖＡｍ１２細胞等、数多くのパッケージング細胞の親株である。該細胞の培養液上清中にレトロウイルスの感染を阻害する活性が見出されたことは、同様のパッケージング細胞を用いて調製されたウイルス上清にも阻害物質が含有されていることを示唆する。
【０１４４】
実施例１３
ウイルス液中に存在するウイルス感染阻害物質の除去
実施例１２で示されたウイルス感染阻害物質を除去するため、以下のような方法を用いた。なお、レトロウイルスを含有する試料としては、実施例２で調製したＴＫＮｅｏウイルス上清をψＣＲＩＰ細胞の培養上清で５０００cfu／mlとなるよう希釈した後、さらにＤＭＥＭで２倍希釈して使用した。
【０１４５】
上記のウイルス液１mlを実施例１１に記載の方法でＣＨ−２９６コートしたプレートのウェルに添加し、１〜５時間インキュベーションしてウイルス粒子をＣＨ−２９６上に接触・保持させた後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、２×１０4個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ１mlを加えた。対照として、上記ウイルス液１mlに２×１０4個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を懸濁したものをただちにＣＨ−２９６でコートしたプレートに移した。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベーションして細胞にウイルスを感染させた。感染後の細胞は、０．７５mg／mlのＧ４１８を含む選択培地で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図３に示す。
【０１４６】
図３に示すようにＣＨ−２９６をコートしたプレートにウイルス粒子を接触・保持させた場合、３時間後には対照の実験区よりも導入効率は高くなった。すなわち、ウイルス液中に存在するウイルス感染阻害活性を上記の操作にて除去できることが示された。
【０１４７】
実施例１４
ウイルス液中に存在する酪酸ナトリウムの除去
レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＥＩＮを、ψＣＲＩＰ細胞に導入して得られた組換えレトロウイルス産生細胞は１０％ ＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。１０cm径のプレートでセミコンフルエントにまで生育したときに、培地を１０％ ＦＣＳを含有する７mlのＲＰＭＩ１６４０、または５mM 酪酸ナトリウム（ナカライテスク社製）と１０％ ＦＣＳとを含有する７mlのＲＰＭＩ１６４０に交換し２４時間培養した後に上清を０．４５ミクロンのフィルターでろ過してウイルス上清とした。ウイルス上清の力価は実施例２に記載の方法で測定した。酪酸ナトリウムを含まないウイルス液の力価は３．３×１０4cfu／ml、５mMの酪酸ナトリウムを含むウイルス液の力価は２×１０6cfu／mlであった。
【０１４８】
酪酸ナトリウムには、細胞周期を停止して細胞の増殖を抑制したり、分化を誘導したりする作用があり、感染細胞に悪影響を及ぼす可能性も考えられる。ウイルス液中に含まれる酪酸ナトリウムを除去するために、以下のような方法を用いて評価した。
【０１４９】
標的細胞としてＨＬ−６０細胞を用いた。実施例１２に記載した方法でＣＨ−２９６でコートしたプレート上で、上記のウイルス液を１ウェルあたり０．５ml添加し、３７℃で３時間インキュベーションしてウイルス粒子をＣＨ−２９６上に接触・保持させた。インキュベーション終了後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、５×１０４個のＨＬ−６０細胞を含む１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地０．５mlを加えた。対照として上記ウイルス液０．５mlに５×１０4個のＨＬ−６０細胞を懸濁したものをただちにＣＨ−２９６でコートしたプレートに加えた。３７℃、一晩インキュベーションして細胞に感染させた後、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地１mlを添加してさらに４８時間培養した後、細胞数を計数し、また実施例４に記載のフローサイトメトリー法でＥＧＦＰ発現細胞を検出して遺伝子導入効率を解析した。その結果を表１９に示す。
【０１５０】
【表１９】
2006174852.tif 000020
【０１５１】
表１９に示されるように、対照実験区での遺伝子導入効率は酪酸ナトリウムを添加して調製したウイルス液を使用したものの方が高く、ウイルス調製における酪酸ナトリウムの効果が確認された。しかし、酪酸ナトリウム使用上清での生育細胞数は、使用しないものの１／４以下であり、酪酸ナトリウムによって細胞の生育が抑制されることが確認された。一方、ＣＨ−２９６でコートされたプレートに予めウイルス粒子を接触、保持させた場合には、対照実験区、酪酸ナトリウム使用上清で見られた細胞生育抑制は見られない。また、遺伝子導入効率にも低下は見られず、むしろ上昇していた。このようにウイルスをＣＨ−２９６上に接触させた後、洗浄する操作を施すことによって、酪酸ナトリウムの影響を受けず、しかも高い遺伝子導入効率を得ることができることが示された。
【０１５２】
次に、ＤＥＡＥ−デキストランを使用して同様の実験を行った。
【０１５３】
ＤＥＡＥ−デキストラン（シグマ社製）を１０mg／mlとなるようＰＢＳに溶解後、０．２２ミクロンのフィルターで滅菌ろ過し、プレートのコーティングに供した。細胞培養用表面処理６穴プレート（岩城硝子社製）の１ウェル当たりに、ＰＢＳ １０容と上記のＤＥＡＥ−デキストラン溶液１容とを混合したもの１．１mlずつを添加し、４℃で一晩インキュベートした。プレートよりＤＥＡＥ−デキストラン溶液を除き、２％ＢＳＡ溶液を１ウェルあたり２mlずつ加えて３０分間処理した後、プレートを１ウェルあたり２mlのＰＢＳで３回洗浄した。なお、対照として、ＤＥＡＥ−デキストラン溶液にかえてＰＢＳで同様の操作を行ったプレートを作成した。
【０１５４】
レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＥＩＮをＧＰ＋Ｅ８６細胞［ジャーナル・オブ・ウイロロジー、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８）］に導入した組換えレトロウイルス産生細胞を使用し、酪酸ナトリウムを添加する上記の方法でウイルス上清を調製した。このウイルス上清１容を１０％ ＣＳを含有するＤＭＥＭ２０容で希釈した希釈ウイルス液（１．６×１０６cfu／ml）を１ウェルあたり１mlずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。このプレートを１ウェルあたり２mlのＰＢＳで３回洗浄した後、５×１０4個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で３日間培養した。培養終了後、細胞をトリプシン処理にて回収し、実施例４に記載のフローサイトメトリー法でＥＧＦＰ発現細胞の解析を行い、遺伝子導入効率を調べた。結果を表２０に示す。
【０１５５】
【表２０】
2006174852.tif 000021
遺伝子導入効率は全細胞に対するＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）で示した。
【０１５６】
表２０に示されるように、ＤＥＡＥ−デキストランもレトロウイルス結合活性を有しており、本発明の遺伝子導入方法に使用可能であることが示された。
【０１５７】
実施例１５
遠心法を利用したレトロウイルスと機能性物質との結合
ネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルスプラスミド、ＤＯＬベクター［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第８４巻、第２１５０〜２１５４頁（１９８７年）］が導入されたＣＲＩＰ細胞を１０％ＣＳ、ならびに５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。ＤＯＬウイルス上清は、上記産生細胞をセミコンフルエントに生育させた１０ｃｍ径のプレートについて、培地を１０％ＣＳを含有する５ｍｌのＤＭＥＭに交換し、その２４時間後に採取した上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過して調製した。このウイルス上清の力価は８．７×１０5cfu／mlであった。
【０１５８】
レトロウイルスの細胞への感染に使用する遠心管（５０ｍｌ容ポリプロピレン製コニカルチューブ、ファルコン社製）は以下に示す操作にしたがってＣＨ―２９６で被覆した。すなわち、４０μg／mlのＣＨ−２９６を含む３mlのＰＢＳを静かに遠心管の底に入れ、直立した状態で４℃、１６時間インキュベートした。次に、ＣＨ−２９６溶液を２％のＢＳＡを含む３．５mlのＰＢＳに交換してさらに３０分間室温でインキュベートした後、５mlのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ギブコ社製）で遠心管を洗浄した。
【０１５９】
ＤＯＬレトロウイルスのＣＨ−２９６コート遠心管底部への結合は以下のようにして行った。すなわち、上記のＤＯＬウイルス上清原液、１０倍希釈液、あるいは１００倍希釈液それぞれ５ｍｌを遠心管に入れ、２９００×ｇ、２５℃、３時間遠心することによって、強制的にレトロウイルスをＣＨ−２９６上に結合させた。比較のために、４０μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６を含むＰＢＳを使用し、これを８μｇ／ｃｍ2となるように使用してＣＨ−２９６をコートした表面未処理細胞培養用６穴プレート（ファルコン社製）上に、上記同様のウイルス上清を添加し、３７℃、４時間、静置状態でインキュベートして結合させたものも以下の操作に用いた。
【０１６０】
遠心を実施してレトロウイルスを強制的に結合させたＣＨ−２９６コート遠心管を使用し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入を行った。すなわち、各段階に希釈したウイルス液を遠心した上記のＣＨ−２９６コート遠心管に、１×１０5個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を入れ、３７℃、３時間インキュベートした（以下、遠心法とする）。また、上記のマイクロプレートについても同様の条件でインキュベートを行った（以下、バインディング法とする）。さらに、対照として、ＣＨ−２９６をコートしたマイクロプレートにウイルス液とＮＩＨ／３Ｔ３細胞混合液を加え、３７℃、３時間インキュベートしたものを従来の感染法として比較した（以下、上清法とする）。インキュベーション終了後、回収した細胞への遺伝子導入効率を実施例１３に記載の方法で調べた。その結果を図４に示す。図中、横軸はウイルス上清の希釈率、縦軸は遺伝子導入効率を示す。また、白抜きは上清法、網掛けはバインディング法、黒塗りは遠心法で得られた結果をそれぞれ示す。
【０１６１】
図４に示されるように、遠心法を用いた場合には、従来の上清法はもとより、感染に先立ってウイルスをＣＨ−２９６上に自然吸着させた場合（バインディング法）と比べても高い遺伝子導入効率を得ることができた。すなわち、ウイルスを遠心力によって強制的に沈降させることにより、より多くのウイルス粒子が容器底面のＣＨ−２９６上に結合することが示された。特に、希薄なウイルス液の場合には、遠心による効果が顕著に見られた。
【０１６２】
また、上記の遠心下および静置状態でのウイルス結合操作の後に回収されたウイルス上清の力価測定を行った結果を表２１に示す。
【０１６３】
【表２１】
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【０１６４】
表２１に示されるように、静置状態での場合、回収された上清は操作前の約８割から９割の力価を有するのに対し、遠心下で強制的に結合させた場合には、上清の力価は操作前の１割以下であった。これは、遠心力によって、より多くのウイルス粒子がＣＨ−２９６上に結合したことを示すものである。また、遠心後に遠心管を洗浄したＰＢＳに含まれるウイルス量はもとの液の２％程度であること、この洗浄操作の有無が遺伝子導入効率にほとんど影響を与えないことからも、遠心を利用した場合にはウイルス粒子がＣＨ−２９６上に強固に保持されていることが示唆された。
【０１６５】
さらに、上記の遠心法による遺伝子導入効率を、遠心下に細胞へのウイルス感染を実施する方法と比較した。
【０１６６】
実施例１４記載のＧＰ＋Ｅ８６細胞を使用して調製されたウイルス上清をＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養液上清で１×１０5cfu／mlに希釈したウイルス液５mlを用いて遠心法、および遠心力によりウイルスを細胞上に沈降させて感染させる方法（遠心感染法、ＷＯ９５／１０６１９号公報を参照）のそれぞれでＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入効率を比較した。すなわち、ＣＨ−２９６をコートした遠心管に上記のウイルス液を添加して３０℃で２９００×ｇ、４時間遠心した後に遠心管をＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を加えて３７℃、４時間感染させたもの（遠心法）、ＣＨ−２９６をコートした遠心管に細胞を加えて２時間培養した後にウイルス液を入れ、さらに３０℃で２９００×ｇ、４時間の遠心を行って感染を実施したもの（遠心感染法）のそれぞれで遺伝子導入を実施した。なお、遠心管のＣＨ−２９６によるコートは上記の方法で行い、また、それぞれの遺伝子導入操作には１×１０5個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用した。感染後の細胞を６０mmプレートに播き直し、２日間培養した後に実施例４に記載のフローサイトメトリー法でＥＧＦＰ遺伝子の導入効率を調べた。この結果を図５に示す。
【０１６７】
図５に示されるように、遠心法での遺伝子導入効率は遠心感染法での効率より高いことが示された。これはウイルス液中に存在する感染阻害物質が洗浄操作によって除かれたためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入における、遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率よく行う改良方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】分子内に９個のマンノース残基を含む高マンノース型糖鎖の構造を示す。
【図２】実施例３における化学修飾されたＣＨ−２９６と、それによって得られる遺伝子導入効率（％）を示すグラフである。
【図３】実施例１３におけるウイルス感染阻害物質の除去効果の試験における相対遺伝子導入効率（％）と、接触・結合時間の関係を示すグラフである。
【図４】実施例１５における遠心法を利用したレトロウイルスと機能性物質との結合効果の試験における相対遺伝子導入効率（％）と、各ウイルス結合操作の関係を示すグラフである。
【図５】実施例１５における遠心法と遠心感染法のそれぞれで得られる遺伝子導入効率（％）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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