(57)【要約】  【課題】本発明の目的は、生体検体や食品などの微量検体から脂質および/または脂肪酸を抽出し、同定、定量分析するため、迅速、簡便、安価、高精度に多検体を測定する方法および分析システムを提供する。  【解決手段】所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出する第１工程、溶媒中で該脂質を脂肪酸に分解する第２工程、脂肪酸を分析する第３工程を含む、微量検体中の脂肪酸の測定方法、およびそのための分析システム。【選択図】図１
2006258761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出する第１工程、溶媒中で該脂質を脂肪酸に分解する第２工程、脂肪酸を分析する第３工程を含む、微量検体中の脂肪酸の測定方法。
【請求項２】
第２工程で得られた脂肪酸を溶媒中で化学修飾する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化学修飾脂肪酸を溶媒で抽出する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第２工程と前記化学修飾工程を同時に行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
上記の少なくとも１つの工程の後で溶媒を除去する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
化学修飾が脂肪酸のエステル化である、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
エステル化がメチルエステル化である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
メチルエステル化を塩酸-メタノール中で行う、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抽出を溶媒抽出装置を用いて行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
検体が生物由来または食品由来のものである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
検体が血液である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
検体が血漿、血清、赤血球、血小板または白血球である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
検体が生体組織である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
検体が脂肪組織または細胞膜である、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
検体が脂肪または油脂である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
検体量が100μL以下である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
各工程が自動化されている、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
微量検体から脂質および/または脂肪酸を抽出するための溶媒抽出部、脂質を脂肪酸に分解するための加熱・冷却可能な反応部、および脂肪酸を測定するための分析部を含む、微量検体中の脂肪酸の分析システム。
【請求項１９】
反応部が同時に脂肪酸の化学修飾を可能にするものである、請求項１８記載のシステム。
【請求項２０】
溶媒抽出部が、少なくとも抽出セル、オーブン、ポンプ、溶媒タンク、溶媒コントローラ、抽出物捕集容器、不活性ガス供給源、オートサンプラー、導管、およびバルブを含む、請求項１８記載のシステム。
【請求項２１】
抽出セルが、セルボディと、セルボディを上下から固定するための２つのセルキャップとからなり、底側のセルキャップの内側の底部に取り外し可能に、または取り外し不能に、メンブランフィルターが敷設されている、請求項２０記載のシステム。
【請求項２２】
メンブランフィルターが、セルボディと底側セルキャップとの間に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されている、請求項２１記載のシステム。
【請求項２３】
メンブランフィルターが、セルボディおよび/または底側セルキャップの内部に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されている、請求項２１記載のシステム。
【請求項２４】
反応部が試薬および/または溶媒供給系を含む、請求項１８または１９記載のシステム。
【請求項２５】
反応部が溶媒除去系をさらに含む、請求項１８、１９または２４記載のシステム。
【請求項２６】
分析部が気相または液相クロマトグラフィー装置を含む、請求項１８記載のシステム。
【請求項２７】
分析部がオートサンプラーをさらに含む、請求項１８または２６記載のシステム。
【請求項２８】
ライン全体またはその一部の洗浄を可能にする洗浄系を含む、請求項１８〜２７のいずれか一項記載のシステム。
【請求項２９】
オートサンプラーから溶媒抽出部に検体が供給され、溶媒コントローラを介して溶媒が供給され、溶媒抽出部にて脂質および/または脂肪酸の抽出が行われたのち、抽出液が反応部に給送され、反応部にて溶媒除去が行われ、さらに反応部に脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸を化学修飾するための試薬が導入されて脂質から脂肪酸への分解および脂肪酸の化学修飾が同時に行われ、ついでその反応液は溶媒抽出部に給送されて化学修飾脂肪酸の抽出が行われたのち、抽出液は反応部に給送され、反応部にて溶媒除去が行われ、その残渣に、残渣を溶解する計量された溶媒が供給され、得られた溶液は分析部に給送され、オートサンプラーを介して多数の検体の自動分析が行われることを含むシステムからなる、請求項１８〜２８のいずれか一項記載のシステム。
【請求項３０】
システムの一部または全体が自動化されている、請求項１８〜２９のいずれか一項記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体検体、食品などの検体中の脂肪酸を定性的または定量的に測定するための新規方法に関する。具体的には、本発明は、効率的溶媒抽出法を利用して、微量の検体から、迅速、簡便、安価、高精度に、多検体の脂肪酸を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脂質および/または脂肪酸の過剰摂取やアンバランス摂取による健康への影響が、国内外を問わず疾病予防の対策あるいは政策を確立する上で重要な問題となっている。すなわち、１) 日本人の脂質摂取の増加や脂肪酸摂取の質的変化は、大腸がんや乳がん、糖尿病などの多くの疾病の増加と関連していると報告されている、２) 脂質摂取量の多い欧米人では、これらの疾病の罹患率や有病率は以前から高いが、米国在住日系移民の罹患率や有病率は米国人と同レベルか、むしろ高くなっており、脂肪酸摂取のバランスも米国人に類似している、３) 欧米諸国では、肥満の著しい増加に対し、脂質摂取量を抑制する政策が施行されており、脂質を構成する脂肪酸の種類に着目した食生活の見直しが推進されている。わが国においても、食生活変容による疾病予防の方法を確立することが急務となっている。
【０００３】
生活習慣の改善による疾病の一次予防対策において、個々人の食生活習慣の情報は、一般的に、調査票調査または食事記録法により実施されることが多く、対象者本人の回答に基づいて食品や栄養素の摂取頻度や摂取量が算出される。同時に、食生活行動に関する調査内容が含まれることもある。しかし、食事調査には妥当性(正確さ)に関する方法論的な限界があるだけでなく、食品や栄養の摂取頻度や摂取量に対する適切な生体指標(バイオマーカー)を用いるなどして、客観的な指標で整合性を検討することなく、対象者に食生活習慣を改善するなどの指導が実施されている。そのため、対象者の多くは、食生活習慣の行動変容には結び付いていないと思われる。健診・検診機関や医療機関などでは、医師、看護師、栄養士や管理栄養士等と伴に食事調査が行われる場合があるが、この時も、対象者の回答に基づいている。血液中の生化学指標として血清脂質 (総コレステロール、トリグリセライド、HDL-コレステロール)などが一般的に測定されているが、脂質および/または脂肪酸摂取などとの相関関係には種々の異論があり、相関ありとする主張となしとする主張と対立しており一貫性がない。このように、現行の食事調査や食事療法では、
【０００４】
１）対象者の食生活の現状を十分把握できていない、
２）対象者に行動変容を促す動機付けが十分にできていない。
３）対象者の行動変容に結びついていない、
４）対象者の行動変容を十分に評価できない。
【０００５】
血清脂質は高脂血症などの診断指標になっており、脂質および/または脂肪酸摂取に関する食事療法が、薬物療法、運動療法、および、それらの併用療法などとともに有効な結果をもたらすこともある。さらに、青身魚に多く含まれている脂肪酸の一種であるイコサペンタエン酸(IPA)（（注）従来の命名法による「エイコサペンタエン酸」(EPA)に相当する。）は、高脂血症の治療薬として使用されている。一方、血液や脂肪組織などの脂肪酸レベルは、脂肪酸摂取と相関関係があり、脂質および/または脂肪酸摂取のバイオマーカーとして有用であることから、疾病のリスク評価を行うことが可能である。しかしながら、従来の測定方法は、手作業であり、測定者による間のバラツキが大きく、検査を依頼した場合費用が高額となる。このような手作業による脂肪酸の抽出と分析は、例えばイヌイット人とデンマーク人の循環器疾患の発症率の差が血液中の脂肪酸レベルによるものであることが1975年に報告されて以来長年その疫学調査や臨床研究で実施されている。しかし、生体検体中の脂肪酸を測定した報告は数少なく、またそれらの結果は比較的少数の対象者に基づいた結果である。例えば、K. Kurikiら, Eur. J. Clin. Nutr. 56: 524-531, 2002（非特許文献１）; W. EM Lands, Am J Clin Nutr, 61(suppl): 721S-5S, 1995（非特許文献２）; N. Imaedaら, J. Epidemiol., 12(1): 45-53, 2002（非特許文献３）; K. Kurikiら, J. Nutr.：3643-3650, 2003（非特許文献４）; S. Tokudomeら, Jpn J Clin Oncol, 32(12):550-553, 2002（非特許文献５）、J. Dyerbergら, Am. J. Clin. Nutr. 28:958-966, 1975（非特許文献６）、W. Willett原著（田中平三監訳）食事調査のすべて−栄養疫学−第一出版1996年（非特許文献９）、F.E. Thompson原著（徳留信寛監訳）食事評価法マニュアル,医歯薬出版1997年（非特許文献10）を参照のこと。
【０００６】
血液や脂肪組織などの生体検体中の脂肪酸の測定は、２種に大きく分けることができる。１)血液では、血漿、血清、白血球、赤血球などに遠心分離した後に、必要に応じて遠心分離により血小板分画に分けた後に、もしくは、脂肪組織などでは、適切な緩衝液と伴にホモジナイズした溶液を作成した後に、薄層クロマトグラフィーにより遊離脂肪酸、リン脂質、トリグリセライドおよびコレステロールエステルなどの分画に分ける。その後、薄層クロマトグラフィーのシリカゲルなどの固定相固体から各種の脂肪酸を含む脂質を抽出する。２)血漿、血清はそのまま直接、赤血球は低張の塩濃度の緩衝液により溶血させた後、生理食塩水などで数回リンスしてヘモグロビンを除去し、赤血球膜ゴーストにして、脂質を抽出する。脂肪組織は、ホモジナイズ溶液から、脂質を抽出する。このようにして得られた各分画や脂質からの脂肪酸の分析は、抽出した脂質、緩衝液 (水溶液)、抗酸化剤および内部標準物質とともに試験管に入れ、さらに、抽出溶媒を加えて攪拌し、遠心分離により水−溶媒の２層で脂質を溶媒に移行して、新しい試験管に移す。水層が残った試験管に、新しく同量の溶媒を加えて脂質を抽出する作業を２回繰り返し、合計3回脂質を抽出する。脂肪酸の分析は、脂質を脂肪酸に分解し、メチルエステル化剤などにより化学修飾して、その化学修飾脂肪酸に抽出溶媒を加えて同様に３回抽出した後に、高感度に分析できるガスクロマトグラフィー(GC)で測定することが一般的である。例えば、A. Ohtaら, LIPIDS, 25(11):742-747, 1990（非特許文献７）; H.A. Schwertnerら, CLIN. CHEM., 39(4): 659-663, 1993（非特許文献８）を参照のこと。
【０００７】
上記の各方法にはそれぞれ問題点がある。１)の方法において、薄層クロマトグラフィーのRf(＝原線からスポットの中心までの距離/原線から溶媒先端までの距離)値は、必ずしも高い再現性が得られない。そのため、遊離脂肪酸、リン脂質、トリグリセライドおよびコレステロールエステル分画に分けた後、その各分画を含む固定相固体から、脂質を抽出して、脂肪酸の定量分析を行うことは困難を伴うことが多い。また、脂肪酸の定量分析において、１)および２)の方法はともに、脂質および/または脂肪酸の抽出は手作業であり、非常に手間を要し、作業効率が著しく悪く、そればかりか、かなりの身体的疲労を伴う。具体的には、水層-溶媒の２層をよく混和し、遠心分離によって検体中の脂質および/または脂肪酸を溶媒に移行し、遠心分離にて完全に２層に分けた後、下層の溶媒をパスツールピペットで、新しい試験管に移す。上層の水層には、１回目の抽出で抽出されなかった脂質および/または脂肪酸が残っている可能性があるので、新たに溶媒を加え同様に抽出して合計３回の抽出を行う。両層とも透明の液体であるため、その境界を常に目線の位置に保ちながら、パスツールピペットで溶媒を移す作業を検体の３倍数行うため、手間がかかる。さらに、化学修飾脂肪酸の抽出では、上層の溶媒を同様に移す作業を合計３回繰り返す。この間、姿勢を維持してこの作業に集中しなければならないからである。
【０００８】
【非特許文献１】K. Kurikiら, Eur. J. Clin. Nutr. 56: 524-531, 2002
【非特許文献２】W. EM Lands, Am J Clin Nutr, 61(suppl): 721S-5S, 1995
【非特許文献３】N. Imaedaら, J. Epidemiol., 12(1): 45-53, 2002
【非特許文献４】K. Kurikiら, J. Nutr.：3643-3650, 2003
【非特許文献５】S. Tokudomeら, Jpn J Clin Oncol, 32(12):550-553, 2002
【非特許文献６】J. Dyerbergら, Am. J. Clin. Nutr. 28:958-966, 1975
【非特許文献７】A. Ohtaら, LIPIDS, 25(11):742-747, 1990
【非特許文献８】H.A. Schwertnerら, CLIN. CHEM., 39(4): 659-663, 1993
【非特許文献９】W. Willett原著（田中平三監訳）,食事調査のすべて−栄養疫学−,第一出版1996年
【非特許文献１０】F.E. ThompsonおよびT. Byers原著（徳留信寅監訳）,食事評価法マニュアル,  医歯薬出版1997年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、微量の検体から脂質および/または脂肪酸を抽出し、脂肪酸を定性または定量分析する、迅速、簡便、安価、高精度に脂肪酸を測定する方法を提供することである。この方法によって、多検体からの脂肪酸を同時にまたは連続的に効率よく分析することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の特徴を有する。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出する第１工程、溶媒中で該脂質を脂肪酸に分解する第２工程、脂肪酸を分析する第３工程を含む、微量検体中の脂肪酸の測定方法を提供する。
【００１２】
第一の実施形態において、本発明の方法は、第２工程で得られた脂肪酸を溶媒中で化学修飾する工程をさらに含むことができる。化学修飾は、脂肪酸を高感度分析し易くするためのものである。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の方法は、化学修飾脂肪酸を溶媒で抽出する工程をさらに含むことができる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の方法は、第２工程と前記化学修飾工程を同時に行うことができる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明の方法は、上記の少なくとも１つの工程の後で溶媒を除去することができる。
【００１６】
別の実施形態において、本発明の上記化学修飾が脂肪酸のエステル化である。脂肪酸を例えばメチルエステル化することによって、気相または液相クロマトグラフィー（GCまたはHPLC）による高感度分析が可能になる。
【００１７】
別の実施形態において、本発明のエステル化がメチルエステル化である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明のメチルエステル化をメタノール-塩酸中で行うことができる。
【００１９】
別の実施形態において、本発明の抽出を溶媒抽出装置を用いて行うことができる。溶媒抽出は、高められた温度および圧力下での溶媒による効率的かつ迅速な抽出を意味し、市販の高速溶媒抽出装置を用いて実施できる。
【００２０】
別の実施形態において、本発明で実施可能な検体が生物由来または食品由来のものである。生物には、ヒトを含む動物（脊椎動物、無脊椎動物）、植物、微生物（細菌、酵母、糸状菌、担子菌など）、藻類などが含まれる。
【００２１】
別の実施形態において、検体が血液である。
別の実施形態において、検体が血漿、血清、赤血球、血小板または白血球である。
別の実施形態において、検体が生体組織である。
別の実施形態において、検体が脂肪組織または細胞膜である。
別の実施形態において、検体が油脂または脂肪である。
別の実施形態において、検体量が100μL以下である。
【００２２】
検体量は、例えば、90μL以下、80μL以下、70μL以下、60μL以下、50μL以下、40μL以下、30μL以下、20μL以下、10μL以下である。
【００２３】
別の実施形態において、本発明の各工程が自動化されていることが好ましい。自動化されることによって、検体中の脂質および/または脂肪酸の抽出から脂肪酸の分析までを自動的に行うことができ、低コストと顕著な省力化に寄与することができる。
【００２４】
第２の態様において、本発明はさらに、微量検体から脂質および/または脂肪酸を抽出するための溶媒抽出部、脂質を脂肪酸に分解するための加熱・冷却可能な反応部、および脂肪酸を測定するための分析部を含む、微量検体中の脂肪酸の分析システムを提供する。
【００２５】
第一の実施形態において、本発明の反応部が同時に脂肪酸の化学修飾を可能にするものである。
【００２６】
別の実施形態において、本発明の溶媒抽出部が、抽出セル、オーブン、ポンプ、溶媒タンク、溶媒コントローラ、抽出物捕集容器、不活性ガス供給源、オートサンプラー、導管、およびバルブを含むことができる。その他、エアーコンプレッサーも含むことができる。
【００２７】
別の実施形態において、抽出セルが、セルボディと、セルボディを上下から固定するための２つのセルキャップとからなり、底側のセルキャップの内側の底部に取り外し可能に、または取り外し不能に、メンブランフィルターが敷設されているものである。
【００２８】
別の実施形態において、メンブランフィルターが、セルボディと底側セルキャップとの間に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されていてもよいものである。
【００２９】
あるいは、別の実施形態において、メンブランフィルターが、セルボディおよび/または底側セルキャップの内部に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されていてもよい。
【００３０】
別の実施形態において、本発明の反応部が試薬および/または溶媒供給系をさらに含む。
【００３１】
別の実施形態において、本発明の反応部が溶媒除去系（例えば溶媒蒸発系）をさらに含む。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の分析部が気相または液相クロマトグラフィー装置を含む。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の分析部がオートサンプラーをさらに含む。
【００３４】
別の実施形態において、本発明のシステムはライン全体またはその一部の洗浄を可能にする洗浄系を含むことが好ましい。
【００３５】
別の実施形態において、本発明のシステムは、オートサンプラーから溶媒抽出部に検体が供給され、溶媒コントローラを介して溶媒が供給され、溶媒抽出部にて脂質および/または脂肪酸の抽出が行われたのち、抽出液が反応部に給送され、反応部にて溶媒除去が行われ、さらに反応部に脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸を化学修飾するための試薬が導入されて、脂質から脂肪酸への分解および脂肪酸の化学修飾が同時に行われ、ついでその反応液は溶媒抽出部に給送されて化学修飾脂肪酸の抽出が行われたのち、抽出液は反応部に給送され、反応部にて溶媒除去が行われ、その残渣に、残渣を溶解する計量された溶媒が供給され、得られた溶液は分析部に給送され、オートサンプラーを介して多数の検体の自動分析が行われることを含むシステムからなる。
【００３６】
別の実施形態において、本発明のシステムは、１回目の溶媒抽出部、反応部および２回目の溶媒抽出部が１つの共通の部からなっていてもよい。
【００３７】
別の実施形態において、本発明のシステム一部または全体、好ましくは全体、が自動化されている。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によって、生体検体や食品などの微量の検体からの各脂肪酸を迅速、簡便、安価、高精度に、かつ多検体を自動化測定することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００４０】
脂肪酸および検体
脂肪酸は、炭素鎖と１以上のカルボキシル基とからなる疎水性の強い低分子化合物であり、その分子内に二重結合を含むか否かによって飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とがある。天然の脂肪酸は通常偶数個の炭素をもちＣ４〜Ｃ２４の鎖長であり、不飽和脂肪酸の二重結合の数は１〜６個（一般に、モノエン酸、ジエン酸、トリエン酸、テトラエン酸、ペンタエン酸、ヘキサエン酸と呼ばれる）である。本発明の方法では、それらのいずれの脂肪酸も測定可能であり、例えば、ミリスチン酸 (MA)、パルミチン酸 (PA)、パルミトオレイン酸 (POA)、ステアリン酸 (SA)、オレイン酸 (OA)、リノール酸 (LA)、γ-リノレン酸 (HGLA)、α-リノレン酸 (ALA)、γ-ジホモリノレン酸 (DGLA)、アラキドン酸 (AA)、イコサペンタエン酸(IPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)などを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明方法における脂肪酸の測定（分析）工程での脂肪酸分析用カラムの種類に応じて、種々の脂肪酸の測定が可能になる。
【００４１】
本発明においては、上記の脂肪酸類あるいは脂肪酸を構成成分とする脂質（例えばリン脂質、糖脂質、油脂、脂肪、コレステロールエステル、セラミド、トリグリセライドなど）を含むものであればいずれの検体も、脂肪酸の分析のために使用できる。脂質と脂肪酸が混合された検体でもよい。脂質を含む検体は、酸もしくはアルカリなどの存在下に化学的にあるいはリパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコシダーゼ、セラミダーゼなどの酵素の存在下で酵素的に処理したのち、生成された脂肪酸を分析する。そのような検体として、例えば生物および食品由来のものが含まれる。生物由来の検体は、例えば体液、細胞、組織、それらの抽出液もしくは破砕液、などであり、特に、血漿、血清、赤血球、白血球、血小板などの血液成分、尿、塗末標本（例えば、消化管スミア、子宮頚部スミア、子宮膣部スミア、喀痰スミアなど）、腫瘍組織もしくは細胞、脂肪組織、細胞膜などを例示することができる。あるいは、微生物や植物などの生物の細胞壁、細胞質膜なども検体としうる。あるいは、薄層クロマトグラフィーにより遊離脂肪酸、リン脂質、トリグリセライド、コレステロールエステルなどに分画したシリカゲルも検体としうる。また、食品由来の検体は、乳製品、動物、魚介類、もしくは植物由来の脂質類などである。
【００４２】
本発明の方法は、高効率の溶媒抽出法のため、マイクロリットル（μL）レベルの微量の検体中の脂肪酸の分析が可能である。検体量は、例えば100μL以下、90μL以下、80μL以下、70μL以下、60μL以下、50μL以下、40μL以下、30μL以下、20μL以下、10μL以下である。しかし、本発明では、この特定量より多くてもよく、例えば100〜200μL、100〜300μL、100〜400μL、100〜500μL、500μL以上であっても、本発明方法による脂肪酸測定が可能であるが、ただしこの場合、作業効率が著しく低下するため、迅速さなどの効果を得られないことがある。本発明は、100μL以下の微量の検体量であっても脂肪酸の測定が可能であることに特徴の１つを有している。このような微量の検体の脂肪酸を簡便に、かつ高精度に測定する方法は十分に確立されていなかったが、本発明は、これを可能にしたことから、例えばバイオマーカーとしての脂肪酸の濃度や構成割合を測定することを可能にし、脂質および/または脂肪酸の過剰摂取やアンバランス摂取に起因する疾患（例えば高脂血症）の予防や食事療法を含む治療などのために有用である。
【００４３】
検体が血液成分である場合、血漿、血清、赤血球、血小板、白血球などを検体として用いて、それらに含まれるまたはそれらを構成する脂肪酸を分析することができる。
【００４４】
赤血球はリン酸緩衝液で完全に溶血させ、リンスにより赤色色素であるヘモグロビンを除去し、白色〜淡い桃色の赤血球膜に遠心分離する。個人により、赤血球の大きさ、容積、個数が異なるため絶対濃度 (mg/dl) で評価することは困難を伴うために、全脂肪酸に占める各脂肪酸の構成割合(例えばwt%)で評価するのがよい。赤血球膜の調製および測定精度の点で、測定に使用される赤血球の適量は、約25〜約60μL、好ましくは約50μLである。赤血球の量を多くすると、赤血球膜の調製時にリンスおよび遠心分離の操作回数が増えるため、作業効率が低下することになる。
【００４５】
血漿、血清の場合、約35〜約55μL、好ましくは約50μLが最適量である。この量以上にすると、溶媒抽出の際、検体を入れた抽出セルの排出口で凝固した可溶性タンパク質が目詰まりを起し易くなり、溶媒抽出機器を停止させることになる。血漿中の脂肪酸の分析は、構成割合(wt%)だけでなく絶対濃度 (mol/L、mg/mlなど) で評価することができる。
【００４６】
脂肪組織などの生体組織は、ホモジナイズ溶液を測定検体とする。
【００４７】
検体が食品である場合、例えば食用油（例えば約10〜約50μL）を有機溶媒（例えばn-デカン）（例えば約２mL）に溶解させて検体とすることができる。ラードなどの固体の場合、必要であれば密栓した試験管内で加温して完全に溶解させる。また、食品からは、ソックスレー法などの公知の手法を用いて脂質を抽出することもできる。その後、脂質を構成する脂肪酸を分析する。
【００４８】
脂肪酸の分析
以下に、図面を参照しながら、本発明の方法を説明する。
本発明は、図１に示すように、所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出する第１工程、溶媒中で該脂質を脂肪酸に分解する第２工程、脂肪酸を分析する第３工程を含む、微量検体中の脂肪酸の測定方法を提供する。測定は、定性的または定量的測定のいずれでもよい。
【００４９】
本発明では、脂肪酸を直接分析にかけてもよいし、あるいは脂肪酸を一旦化学修飾したのち分析にかけてもよい。
【００５０】
化学修飾は、脂質から脂肪酸への分解と別個に行ってもよいし、あるいは１つの容器内で、すなわちワンポットで、脂質から脂肪酸への分解と同時に行ってもよい。さらに、化学修飾の後で、化学修飾脂肪酸を含む反応液から溶媒を蒸発させて除去するか、あるいは溶媒抽出することによって、化学修飾脂肪酸を回収する。通常、反応液中に水を含む場合には、溶媒抽出が好ましいが、真空または減圧下で加温するならば水さえも容易に蒸発させることが可能であるので、必ずしも溶媒抽出を行わなくてもよい。
【００５１】
本発明の方法では、必要ならば、少なくとも１つの工程の後で溶媒を除去する工程を含むことができる。溶媒を除去する方法は、限定されないが、例えば処理液を含む容器に窒素などの不活性ガス（酸素は含まない）を吹き付けて、必要なら加温しながら溶媒を蒸発させる方法、真空または減圧下で加温しながら溶媒を蒸発させる方法などが含まれる。
【００５２】
本発明の上記の各工程は自動化されていることが好ましい。検体の添加および脂質および/または脂肪酸の抽出から、脂肪酸の分析までの全体またはその一部、好ましくは全体、を自動化するならば、測定時間の短縮、低コスト、省力化などに大いに寄与することになる。
【００５３】
図２には、本発明の１つの実施形態を示した。この方法例では、所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出し、抽出液から溶媒を除去した後、脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸の化学修飾を同時に行い、さらにその後、化学修飾脂肪酸を溶媒で抽出し、溶媒を除去し、濃度調整の後で、化学修飾脂肪酸を分析することを含む。この図では、溶媒の除去を窒素の吹き付け（「窒素乾固」）によっているが、これに限定されず、上記のように真空または減圧下で加温しながら溶媒を蒸発させて除去する方法でもよい。
【００５４】
以下に、上記の各工程について、さらに詳しく説明する。
【００５５】
（Ａ）脂質および/または脂肪酸の抽出
本発明の方法の第１工程は、所定の温度および圧力下で溶媒と微量検体とを接触させて該検体中の脂質および/または脂肪酸を抽出することを含む。
【００５６】
具体的には、一定の温度に保持された溶媒を含む容器に検体を加え、溶媒に一定の圧力を加えながら検体中の脂質および/または脂肪酸を溶媒中に移行し、抽出液を回収する。抽出は、溶媒抽出装置を用いて実施するのが好ましい。
【００５７】
溶媒抽出装置は、少なくとも抽出セル、オーブン、ポンプ、溶媒タンク、溶媒コントローラ、抽出物捕集容器（捕集バイアルおよび捕集バイアルトレー）、不活性ガス供給源、オートサンプラー（または抽出セルトレー）、導管、およびバルブを含み、さらに送液センサー、ディスプレイ、キーボードを含むことができる。抽出セル の容量は、限定されないが、例えば約0.5〜約5mLである。各工程の操作を時間短縮するためには、できる限り小容量のセルサイズが好ましい。この装置の自動化機能には、1)抽出セルの順次選択、2)抽出セルのオーブンへの移動、3)抽出セルへの溶媒の送液、4)抽出セルの加圧/加熱、5)抽出液の捕集、6)抽出セルおよび導管の洗浄がある。抽出方法のパラメーター機能には、加熱 (抽出セル内の検体が設定温度で平衡化される時間)、静置 (初期加熱時間後の溶媒静置時間)、フラッシュ％ (静置加熱後、新たに抽出セルに送液する溶媒量)、パージ (不活性ガスで抽出セル内をパージする時間)、サイクル数（抽出回数） 、圧力 (抽出セル内圧力)、温度 (抽出セル内を加熱する温度)などが含まれる。このような装置として、例えば高速溶媒抽出装置ASE-200（日本ダイネオクス、大阪）が挙げられる。
【００５８】
溶媒抽出装置の操作手順は、所定量の検体を抽出セルに添加すること、ポンプで抽出セルに溶媒を満たし加圧し、同時にオーブンで加熱すること、圧力、温度状態を保持し、静置抽出すること、抽出後に溶媒をバイアルに捕集（すなわち、回収）すること、および抽出セルを不活性ガスでパージすることを含む
抽出温度は、約60〜90℃、好ましくは約65〜90℃、さらに好ましくは約70〜85℃、特に約75〜85℃の範囲であるが、回収率や測定精度に影響を与えなければ、上記の温度以外の範囲も使用し得る。本方法では、約75℃が至適温度である。
【００５９】
抽出圧力は、約80〜3000psi、約100〜2500psi、約150〜2000psi、約200〜2000psi、約300〜2000psi、約500〜2000psi、約700〜2000psi、約1000〜2000psiの範囲で使用し得るが、この範囲に限定されない。圧力は、抽出セルの耐圧能に依存するため、2000psiを超える耐圧能のセルを使用するならば、2000psiを超える圧力、例えば2200psi、2500psi、2700psi、3000psiなどの圧力でも使用可能である。後述の実施例では1500psiが使用され、良好な抽出結果が得られているので、本発明のためには、1500psi程度の圧力で十分であろう。具体的には、ポンプを用いて溶媒を抽出セルに送液することによって、抽出セル内部に一定の圧力がかかるようにする。別の加圧手段として、例えば窒素などの不活性ガスによる加圧も挙げられる。この場合、溶媒タンクに一定の圧力をかけることによって抽出セル内部が加圧される。本発明の方法では、圧力手段は、特に限定されないものとし、上記以外の任意の手段も使用できる。
【００６０】
抽出時間は、例えば約1分以上、約２分以上、約３分以上、例えば約３〜約10分、約４〜約６分、約4.5〜5.5分、約５分などであるが、これらに限定されない。ここで、抽出時間とは抽出時の静置時間のことである。「静置」とは、検体と溶媒を含む抽出セル内の温度と圧力が所定の値に達した直後に静止バルブが閉じてセルに所定圧力がかかり、静止状態で検体と溶媒がセル内に保持されることをいう。抽出時間は、特に抽出効率や再現性を考慮して最適の時間を選択することができ、上記の範囲に限定されない。静止時間経過後に、静止バルブが開放され、同時に圧力が開放されて抽出物捕集容器に抽出物が捕集される。
【００６１】
抽出溶媒としては、脂肪酸の抽出が可能な有機溶媒であればいずれの溶媒も使用できる。例えばメタノールとクロロホルムの混合液である。メタノール：クロロホルムの混合比は、例えば１：１〜２：１（体積比）である(J. Folchら, J. Biol. Chem. 226:497-509, 1957)。クロロホルムの量を増すと、その沸点がより高いために抽出液からの溶媒の除去に時間がかかり、作業効率が著しく低下するので好ましくない。好ましくは、メタノール：クロロホルムは２：１（体積比）である。
【００６２】
サイクル数（抽出回数）は、通常１回で十分である。しかし、脂肪酸の抽出効率が低い検体の場合には、２回以上の抽出も可能である。
【００６３】
検体の特性に合わせて、抽出溶媒などの物理化学的特性、たとえば沸点、溶媒の混合比、抽出温度や圧力、抽出時間などの要素を組合わせて至適な抽出条件を見出すことができる。
【００６４】
抽出液は、ついで、溶媒の除去にかけられる。例えば真空もしくは減圧下での蒸発、窒素などの不活性ガスなどの吹き付けによる蒸発、などの蒸発法を利用して、溶媒を除くことができる。好ましくは高温にならない程度に加温（例えば35〜45℃）しながら蒸発除去操作が行われる。
【００６５】
なお、抽出液を回収後に抽出セルを洗浄するが、このとき洗浄プログラムを作成することで、作業時間の短縮並びに作業効率の向上が可能である。例えば、抽出の第１工程の終了後から化学修飾脂肪酸の抽出工程までの間、抽出装置を使用しない時間があれば、この間に抽出セルを自動洗浄することができる。また、同時に、静置時間0分、抽出装置の導管を洗浄する機能をOFFにするなどのプログラムを作成して、このプログラムを実行することで、抽出溶媒の使用量を削減することも可能である。さらにまた、装置に溶媒コントローラを接続するときには、溶媒の自動切換えが可能となり好ましい。
【００６６】
（Ｂ）脂肪酸の化学修飾
抽出された脂肪酸は、溶媒の除去後、所定量の適する溶媒に溶解し、直接分析にかけてもよいし、あるいは高感度分析を可能にする化学修飾脂肪酸に変換し分析にかけてもよい。
【００６７】
例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって、脂肪酸および化学修飾脂肪酸のいずれも分析可能である。また、ガスクロマトグラフィー（GC）による分析の場合には、脂肪酸を例えばエステル化（例えば、メチルエステル化）した後に、脂肪酸エステルの形態で分析にかけることができる。
【００６８】
抽出された脂質は、例えば塩酸等の酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリの存在下で化学的に、あるいはリパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコシダーゼ、セラミダーゼなどの酵素の存在下で酵素的に処理して脂肪酸に分解することができる。
【００６９】
次いで、脂肪酸は、化学修飾にかけることができる。化学修飾には、例えばエステル化、アミド化、アシル化などを含む、カルボキシル基の一般的な化学反応によって得られる化学修飾が挙げられる。あるいは、HPLCによる検出感度の向上のための修飾、例えばp-メトキシアニリン、２−ナフトアシルブロミド、フェナシルブロミド、４−ブロモメチル−７−メチルクマリンなどの脂肪酸誘導体化試薬との反応による化学修飾が挙げられる（日本生化学会編、新生化学実験講座４、脂質I、東京化学同人、1993年、特に1.3.3）。化学修飾に際しては、簡単な操作でかつ反応効率がよく、安定な修飾化合物を得ることができるような条件を選択するのがよい。好ましい化学修飾は、低級アルキルエステル化であり、特に好ましくはメチルエステル化である。
【００７０】
メチルエステル化に用いられる試薬としては、例えば、10％塩酸-メタノール (塩酸濃度5-15％; 東京化成) が挙げられる。他の例として、塩酸により抽出液を酸性にし、カリウムメトキシド/メタノールおよび3-フッ化ホウ素メタノール混合液を用いることもできる。あるいは、ジアゾメタン/エーテル溶液を用いることもできる。
【００７１】
メチルエステル化の具体的例は、第1工程で得られた抽出液から溶媒を除去したのち、約1mLの10％塩酸-メタノールを加え、密封下で高温（例えば90〜100℃）で約30分〜約１時間加熱する。その後、室温まで冷却し、溶媒抽出部や導管などの腐食を防ぐために、弱アルカリ水（例えば炭酸ナトリウム水、炭酸水素ナトリウム水など）でｐH約７に中和することを含む。
【００７２】
このとき、化学修飾脂肪酸には、全くもしくはほとんど影響を及ぼすことなく脂肪酸を分析することができることを確認した。
【００７３】
（Ｃ）化学修飾脂肪酸の抽出
この工程は、必要に応じて実施され得る。化学修飾の際に反応系に、またはその後に処理した溶液に、水を含む場合には、この抽出工程を実施するのが好ましい。あるいは、真空または減圧下で加温するならば水さえも容易に蒸発させることが可能であるので、必ずしも溶媒抽出を行わなくてもよい。しかし、作業時間の短縮や作業効率を向上させたいのであれば、この抽出工程を実施することが好ましいであろう。
【００７４】
抽出は、溶媒抽出装置(例えばASE-200、日本ダイオネクス製)を使用した上記（Ａ）に記載の抽出手順に従って行うことができる。抽出溶媒としては、水と混和し難くかつ比較的低沸点の有機溶媒、例えば石油エーテルが好ましく使用される。
【００７５】
抽出液を回収し、蒸発により溶媒を除去し、化学修飾脂肪酸を分析にかける。
【００７６】
（Ｄ）化学修飾または未修飾脂肪酸の測定
脂肪酸の測定は、化学修飾されたまたは未修飾のいずれの脂肪酸についても行うことができる。分析は、脂肪酸について一般的に行われている分析法に従って行うことができる。そのような方法には、例えば気相または液相クロマトグラフィー法、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフィー（GC）である。HPLCを使用する場合、化学修飾および未修飾脂肪酸のいずれもHPLCによって分析可能であるが、GCを使用する場合、一般に脂肪酸メチルエステルの形態で分析にかけられる。
【００７７】
HPLCによる遊離脂肪酸の分析の場合、例えば、シリカゲル系逆相ODSカラム、アセトニトリル−水系の移動相と段階的グラジエント（例えば約60:約40→約80:約20体積％）、流速２mL/分、UV検出192nmの条件を使用することができる(M.I. Avwldanoら, J. Lipid Res., 24:83 (1983))。HPLCによる化学修飾脂肪酸の分析の場合、例えば脂肪酸メチルエステルの場合、シリカゲル系逆相ODSカラム、移動相アセトニトリル、流速１mL/分、UV検出192nmからなる分析条件(M.I. Avwldanoら、上記)、脂肪酸誘導体化試薬による化学修飾脂肪酸の分析の場合、シリカゲル系逆相ODSカラム、移動相アセトニトリル-水系、流速２mL/分、UV検出254nm、または蛍光検出、励起360nm、検出410nm；励起303nm、検出376nm；励起360nm、検出440nm；励起345nm、検出416nmなどの分析条件(日本生化学会編、新生化学実験講座４、脂質I、東京化学同人、1993年、特に1.3.3)を使用することができる。
【００７８】
GCによるメチルエステル脂肪酸の分析の場合、シリカキャピラリーカラム（30m×0.25mmI.D.）、カラム温度140→180℃(20℃/分)、180→240℃(3℃/分)、240℃（34分）からなる分析条件が例示される（A. Ohta ら, Lipids 25, 742-747, 1990）。キャピラリーカラムとしては、化学結合タイプ、WCOTタイプ、SCOTタイプ、BCLタイプなどが知られており、特に化学結合タイプのものが、安定性などの点でよく使用されている(日本生化学会編、新生化学実験講座４、脂質I、東京化学同人、1993年、特に1.2.1)。本発明の方法では、検体の起源、含有脂肪酸の種類などに応じて、適するカラムを選択すればよい。
【００７９】
GC装置やHPLC装置は、特に制限されず、任意のものを使用することができる。特にこれらの分析機器には、分析部以外に、パーソナルコンピューター (PC)、データ処理を行う専用アプリケーション、オートサンプラー、レコーダーなどを含むものが好ましい。
【００８０】
本発明の方法によって、微量検体、例えば生体検体（血漿、赤血球、脂肪組織など）や食品中の脂質および/または脂肪酸の構成割合を定性的または定量的に測定することができるばかりでなく、微量で、迅速、簡便、安価、高精度に、かつ多検体の脂肪酸の測定が可能であるという格別の利点を提供する。本発明によって、健診・検診機関、医療機関や食品産業の分野での脂肪酸の迅速測定が可能となり、特に脂質および/または脂肪酸の過剰摂取やアンバランス摂取に関わる病気の予防、治療、予後の管理のために有用であるし、さらにまた、牛・豚の肉や魚介類などの産地や種類の特定などにも利用できることが期待される。
【００８１】
脂肪酸の分析システム
本発明はさらに、微量検体から脂質および/または脂肪酸を抽出するための溶媒抽出部、脂質から脂肪酸に分解するための加熱冷却可能な反応部、および脂肪酸を測定するための分析部を含む、微量検体中の脂肪酸の自動分析システムを提供する。
【００８２】
図３〜図７を参照しながら、本発明のシステムを以下に説明する。
【００８３】
本発明のシステムにおいて、溶媒抽出部は、溶媒抽出装置からなる。このような装置は市販品、例えばASE-200（日本ダイオネクス製)を好ましく使用できる。溶媒抽出部は、例えば抽出セル、オーブン、ポンプ、溶媒タンク、溶媒コントローラ、抽出物捕集容器、不活性ガス供給源、オートサンプラー、導管、およびバルブを含むことができる。
【００８４】
抽出セルは、検体から脂質および/または脂肪酸、あるいは化学修飾脂肪酸などを溶媒で抽出するための容器であり、耐圧性の金属（好ましくは耐腐食性）、樹脂、ガラスなどの材質からなる。
【００８５】
オーブンは、抽出セルを加熱するための炉である。セルを均一に加熱するために、炉の形態が好ましい。オーブンの材質は、金属、耐熱性鉱物（例えば粘土）などである。
【００８６】
ポンプは、溶媒を抽出セルに給送するためのものである。所定のポンプ圧によって、抽出セル内部に所定の圧力をかけることができる。
【００８７】
溶媒タンクは、抽出溶媒を貯留する容器である。溶媒は、このタンクからポンプを介して抽出セルに送られる。
【００８８】
溶媒コントローラは、溶媒の流速、種類を設定および/または制御する（あるいは、される）ためにコンピュータライズされる装置である。
【００８９】
抽出物捕集容器は、抽出液を捕集するための容器である。
【００９０】
不活性ガス供給源は、導管および抽出セルの内部をパージするための圧力容器（ボンベ）である。パージ後に、抽出系が溶媒で洗浄され、次の検体の抽出のための準備をする。不活性ガスは、例えば窒素、ヘリウム、アルゴンなどであり、脂肪酸を酸化する酸素および酸素を含む空気などは実質的に含まない。
【００９１】
オートサンプラーは、複数、好ましくは多数の検体を自動的に順次抽出セルに給送するためのコンピュータライズされた装置である。例えば１検体あたりの抽出完了までに要する時間を入力し、導管の洗浄を実施することによって自動的に次の検体が抽出セルに送られるようにセットすることができる。
【００９２】
導管は、上記のメンバー間を接続する配管であり、通常は、耐圧性、耐腐食性の金属材質のものから作られている。
【００９３】
バルブは、抽出液をセルに保持またはセルから放出させるための静止バルブ、導管（ライン）中の溶媒や抽出セル内の液をバイアルに完全に送るために窒素ガスをラインに流すための切り替えパージバルブを含む。
【００９４】
図３には、高速溶媒装置の例：ASE-200を例示している。装置は、抽出セル、オーブン、ポンプ、溶媒ボトル、不活性ガス（例えば窒素ガス）供給源、捕集バイアル、静止バルブおよびパージバルブからなるバルブ、ならびに、導管を含む。
【００９５】
本発明の実施形態により、抽出セルは、セルボディと、セルボディを上下から固定するための２つのセルキャップとからなり、底側のセルキャップの内側の底部に取り外し可能にメンブランフィルターが敷設されているものである。図４および図５には、ASE-200（日本ダイオネクス製)の抽出セルの構造と、セルの縦方向の断面図、蓋側セルキャップの上面図、底側の底面図、セルボディの横方向の断面図が示されている。また、図４および図６には、底側セルキャップのシーリングの上部にメンブランフィルターが敷設される様子が示されている。
【００９６】
本発明の別の実施形態により、メンブランフィルターは、セルボディと底側セルキャップとの間に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されていてもよいし、あるいは、セルボディおよび/または底側セルキャップの内部に装着および/または脱着可能なカートリッジの内部に取り外し可能に固定されていてもよい。カートリッジ型は、セルへのおよび/またはセルからの装着および/または脱着が可能であり、ディスポーザブル（使い捨て）の形態であってもよいし、あるいはメンブランフィルターの取替えが可能な形態であってもよい。
【００９７】
図６に示すように、従来の抽出セルには、底部セルキャップへのろ紙の敷設はあったが、微量の血漿や血清の可溶性タンパク質が抽出溶媒により凝固して抽出セルの排出口で詰まり、機器が停止するため、特に可溶性タンパク質成分を多く含む検体の分析には問題があった。本発明により、メンブランフィルターおよびろ紙を図に示したようにセル底部に敷設することによって、容易にこの目詰まりの問題が解決されただけでなく、血漿や血清などの液体検体を添加しやすくした。
【００９８】
メンブランフィルターは、Milipore社などから販売される限外濾過用のPTFEメンブランフィルター(例えばOMNIPORE（商標）メンブランフィルター、0.2μm JG)を使用することができる。
【００９９】
本発明のシステムにおいて、反応部は、脂質から脂肪酸への分解のためのものであるが、同時に脂肪酸の化学修飾を可能にするものであってもよい。好ましくは、ワンポットで、脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸の化学修飾とを同時に行うことができる。反応部は、耐圧性かつ耐腐食性の金属、樹脂、ガラスなどの材質からなる容器である。反応部の周囲には加熱するためのオーブンが設置されており、さらに試薬および/または溶媒供給系、溶媒蒸発系を含む。試薬は、脂質から脂肪酸に分解する試薬、脂肪酸を化学修飾する試薬であり、脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸の化学修飾が同一の試薬によって行われてもよい。溶媒の蒸発は、不活性ガスの吹き付けにより蒸発させるために、反応容器には、ガスを吹き付けるノズル（入口）とガスを排出する出口を設けることができる。あるいは、真空または減圧で吸引しうるように、反応部に真空ラインを接続することができる。真空または減圧は、例えば真空ポンプまたはアスピレータによって達成されうる。
【０１００】
本発明のシステムの分析部は、好ましくは気相または液相クロマトグラフィー装置を含む。特にコンピュータライズされたGCまたはHPLCが好ましい。分析部はさらにオートサンプラーを含むのがよい。オートサンプラーを介して、複数、好ましくは多数のサンプルが、１検体毎に自動的に分析装置に試料注入され分析が開始される。
【０１０１】
本発明のシステムはさらに、ライン全体またはその一部の洗浄を可能にする洗浄系を含むことが好ましい。多数の検体を連続的に抽出、分解および/または化学修飾、分析するためには、ラインを自動的に洗浄することが望ましい。洗浄系は、そのような目的のためのものである。
【０１０２】
本発明の実施形態において、本発明のシステムは、オートサンプラーから溶媒抽出部に検体が供給され、溶媒コントローラを介して溶媒が供給され、抽出部にて効率的かつ迅速に溶媒抽出が行われたのち、抽出液が反応部に給送され、反応部にて溶媒除去が行われ、さらに反応部に脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸を化学修飾するための試薬が導入されて脂質から脂肪酸への分解および脂肪酸化学修飾が同時に行われ、ついでその反応液は抽出部に給送されて溶媒抽出が行われたのち、抽出液は反応部に給送され、反応部にて溶媒蒸発が行われ、その残渣に、残渣を溶解する計量された溶媒が供給され、得られた溶液は分析部に給送され、オートサンプラーを介して多数の検体の自動分析が行われることを含むシステムからなる。本発明のシステムは、その全体または一部、好ましくはその全体、が自動化されていることが好ましい。
【０１０３】
図７には、検体が溶媒抽出装置に送られて、脂質および/または脂肪酸が抽出され、不活性ガスノズル付きブロックヒーターで加熱しながら溶媒が除去され、メチルエステル化剤を添加した後、ブロックヒーターで加熱して脂質から脂肪酸への分解と脂肪酸の化学修飾（メチルエステル化）を同時に行い、溶媒抽出装置にて化学修飾脂肪酸を抽出し、再度不活性ガスノズル付きブロックヒーターで加熱しながら溶媒が除去され、濃度調整の後、オートサンプラーでGC分析にかけられる、一連のシステムが記載されている。
【０１０４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、それらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】
【０１０５】
（血漿および赤血球膜中の脂肪酸濃度または脂肪酸構成割合の測定）
この実施例では、本発明方法による、検体としての血漿および赤血球膜中の脂肪酸濃度または脂肪酸構成割合の測定を示す。測定手順の行程は図２に示した。
【０１０６】
脂肪酸の抽出に使用した装置は、高速溶媒抽出装置ASE-200（日本ダイオネクス、大阪）である。該装置および周辺装置の概略は、上で説明した図３〜図７に示した。
【０１０７】
（検体の前処理）
血漿の場合、脂質および/または脂肪酸で抽出する過程で、血漿中の可溶性タンパク質が抽出溶媒により凝固し、加圧時に抽出セルの排出口で目詰まりを起こし、機器を停止させてしまう。また、赤血球の場合、抽出液に脂質および/または脂肪酸とともにヘモグロビンが混入し、本来透明の抽出液が、赤褐色になる。ヘモグロビンには、ヘム鉄という赤色色素が含まれており、この鉄が脂肪酸の酸化分解を誘発するので、ヘム鉄の除去が必須である。
【０１０８】
血漿の場合、第１に、予めマイクロチューブ内で血漿と少量 (150μL) の抽出溶媒と混合して、可溶性タンパク質を凝固させる。第２に、抽出セルボディ内に、内部標準物質、抗酸化剤を入れる。第３に、マイクロチューブ内の全ての液体 (一部はミセルを形成) と固体 (抽出溶媒により凝固したタンパク質) を移す。さらに、50μLの抽出溶媒をマイクロチューブ内に添加し、残っているであろう検体をリンスして回収し、これも抽出セルに移す。内部標準物質と抗酸化剤は予めマイクロチューブ内に入れておいてもよい。
【０１０９】
凝固したタンパク質により機器の停止を防ぐため、図５および図６に示すように、抽出セル（１mL）のセルボディと底側セルキャップとの間にメンブランフィルターを挟み、密接にキャップを取り付ける（図５）。このとき、不十分な取り付けでは液漏れの原因となる。その後セルの口径にあったろ紙を２枚底部に敷き入れ、凝固したタンパク質をろ紙に付着させることにより、抽出セルの排出口での目詰まりを回避することができる（図６）。
【０１１０】
ろ紙を入れる目的は３つある。第1に、測定精度の指標になる内部標準物質、脂肪酸の酸化分解を防ぐための抗酸化剤、および、血漿や赤血球膜などの血液検体は液体もしくは液体と固体の混合液であるため、吸収媒体として入れる。第２に、凝固した可溶性タンパク質が抽出セルの排出口で目詰まりを起こすのを防ぐ。第３に、検体中の水分を吸収し、保持して、抽出液と混合しないようにする役割がある。
【０１１１】
血漿中の脂肪酸の分析は、絶対濃度 (mmol/L) および構成割合(wt%)で評価し、35〜50μLで十分に良好な分析が可能である。しかし、疾病のリスク評価もしくは健康増進・維持に有用な脂肪酸の測定に関して、国際比較を考慮すると、50μLが最適な量であるため、測定のために50μLを使用した。
【０１１２】
赤血球の場合、赤血球をリン酸緩衝液で完全に溶血させ、リンスにより赤色色素であるヘモグロビンを除去し、白色〜淡い桃色の脂質膜に遠心分離する。測定には、血液を遠心分離して得た赤血球層25〜60μLを用いた。個人により、赤血球の大きさ、容積、個数が異なるため絶対濃度 (mmol/L)で 評価することに困難を伴うため、全脂肪酸に占める各脂肪酸の構成割合(wt%)で評価した。抽出セルへの検体の添加については、予め抽出セルのセルボディにキャップを密接に取り付けた後、口径の合ったろ紙片を1枚入れ、従来の方法と同様に底部に敷き詰め、その後さらにろ紙片を２枚入れ、最初に１つ入れ、これに内部標準物質と抗酸化剤を吸収させ、その後に２つ目を入れ、これに検体を吸収させてもよいし、あるいは、上記のように、血漿と同様に行ってもよい。
【０１１３】
（抽出工程（図２の工程１））
抽出装置の設定条件は以下のとおりである。
抽出セル: 1mL用
加熱時間:  ０分
静置時間： ５分
温度：    75℃
圧力：    1500psi
抽出溶媒：メタノール/クロロホルム混合液 (2:1v/v%)
フラッシュ: 10％の溶媒溶液
パージ: 30 秒
【０１１４】
内部標準液（n-ヘプタデカン酸；濃度：血漿の場合3.5mM、赤血球膜の場合1.0mmol/L）および抗酸化剤（2,6-di-tert-butyl-p-cresol(butyl hydroxyl toluene(BHT))；濃度0.45mmol/L）の各10μLをマイクロシリンジで、検体をマイクロピペットで抽出セル内に添加した。その後、セルの蓋を閉めて、抽出装置にセットして抽出開始ボタンを押す。抽出装置の操作は、添付の使用説明書の手順に従って行った。
【０１１５】
抽出液は約5.5〜6.0mLであった。1検体当たり、抽出装置の導管の洗浄時間を含め約8.5分を要した。
【０１１６】
（化学修飾工程（図２の工程２））
上記の抽出工程で得られた抽出液を窒素乾固した後、脂質を脂肪酸に分解して、その後、脂肪酸を化学修飾してメチルエステル化した。この化学修飾には、10％塩酸-メタノール (塩酸濃度5-15％; 東京化成)（「メチルエステル化剤」という）を使用した。
【０１１７】
この工程では、抽出液 (抽出装置専用のバイアルに入っている) をガラス製パスツールピペットにて、スクリューキャップで密栓のできる試験管に移し（ここでは栓をしない）、脂肪酸が酸化分解しないよう、暗所で窒素ガスを吹き付けながら37℃で加熱しながら窒素乾固させた。次いで、メチルエステル化剤として1mLの10％塩酸-メタノールを加えて、試験管をスクリューキャップで密栓し、100℃で1時間過熱した。その後、室温まで冷却した。この時、ネジ付試験管 (容量14mL, 直径16×125×9mm) とテフロンライナー付キャップを用いた。
【０１１８】
反応溶液に0.4M炭酸ナトリウム水溶液を約0.8〜2.0mLを加えて、反応溶液のpHを約7.0に中和した。これにより、抽出装置の配管や抽出セルの腐食を防ぐことができる。なお、炭酸ナトリウム水溶液の添加によるpH7.0付近の反応液では、化学修飾脂肪酸の分析に影響を及ぼさないことを確認した。
【０１１９】
（化学修飾脂肪酸の抽出行程（図２の工程３））
上記の抽出工程と同じ抽出装置を用いて、上記の化学修飾工程で得られた反応溶液 (メタノールを含む水溶液) から化学修飾脂肪酸を抽出した。5mLの抽出セルの底側キャップにろ紙を敷く代わりに、底側キャップとセルボディーの間に、メンブランフィルター (OMNIPORE（商標） Membrane filters, 0.2μm JG; ミリポア社) を用いて、しっかりと隙間なく挟み固定した（図５）。メンブランフィルターは図６と同様に取り付けるが、ここではろ紙を装填しない。そこに、化学修飾工程の反応液の全量をガラス製パスツールピペットで直接入れ、さらに、抽出効率を高めるため、化学修飾工程の試験管に残っている残渣に少量 (0.5mL程度) の石油エーテルを入れ、混合して試験管の壁をリンスし、その全量も抽出セルに加えた。セルの蓋側キャップを閉めて、抽出装置にセットした。
【０１２０】
以下の抽出条件を用いて、化学修飾脂肪酸を溶媒抽出した。
抽出セル: 5mL用
加熱時間： ０分
静置時間： ０分
温度：    50℃
圧力：    1500psi
抽出溶媒：石油エーテル
フラッシュ: 10％の溶媒溶液
パージ: 30 秒
【０１２１】
抽出液は約7.5〜8.0mLであった。1検体当たりの操作時間は、静置時間は０分であるが、抽出セルに溶液が送られて50℃、1500psiになるまで機器は稼動して送液しており、この時間および送液の配管のリンス時間を含めて約3.5分を要した。
【０１２２】
抽出液を試験管に移し、窒素ガスを吹き付けながら37℃で加熱しながら窒素乾固させる。そこに、化学修飾脂肪酸（この場合、脂肪酸メチルエステル）の濃度調整のため、石油エーテル0.4mLを正確に入れ、混合した。
【０１２３】
（測定工程（図２の工程４））
化学修飾した脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー (GC) によって測定した。測定条件は以下のとおりである。
【０１２４】
GC装置：Shimadzu GC-2010(島津製作所)（水素炎化検出器（FID-2010）装備）
オートサンプラー：Shimazu AOC-20I
水素ガス発生装置：Shimazu HYDROGEN GENERATOR OPGU-2100S
PCソフト：島津ガスクロマトグラフ用ワークステーション
GC solution ver.2
カラム：シリカキャピラリーカラム(30m×0.25 mm I.D.; DB-225被覆厚さ0.25μm)
カラム温度：140〜240℃
昇温速度：  140→180℃(20℃/分)、180→240℃(3℃/分)、240℃（23分）
サンプル量：3.0μL（スプリットレス）
キャリアーガス:窒素
圧力：200KPa
全流量：10.2mL/分
カラム流量：2.41mL/分
線速度：53.0cm/秒
パージ流量：30mL/分
検出器：260℃
メイクアップ流量：28.0mL/分
水素ガス流量：40.0mL/分
空気流量：400.0mL/分
【０１２５】
（測定精度の検証）
上記の手順を用いて、血漿の脂肪酸の測定精度を調べるためには、同一の100検体を10検体分ずつ10日間分に分注して、1日に10検体を分析し、この作業を10日間繰り返して測定値の一致性を確認する日内変動および日間変動を評価した。赤血球膜の脂肪酸の測定精度も同様に、１日に同一の検体を10検体、10日間にわたって分析した。総数100検体は全て同一ではないので、日間変動は算出できなかった。評価方法は、平均値と標準偏差(SD)から変動係数CV％を算出し、5％以下を高精度とした。精度管理は変動係数CV%の日間変動で示した。なお、血漿は絶対濃度 (mmol/L) と構成割合 (wt％)により、赤血球は一定量（赤血球の個数や赤血球膜の重量）を量りとることが困難であったため定量評価ではなく、構成割合(wt%)で評価した。
【０１２６】
結果
下記の表１〜表８に測定結果を示した。具体的には、
表１には、血漿中脂肪酸濃度 (mmol/L) の日内変動、
表２には、血漿中脂肪酸濃度 (mmol/L) の日間変動、
表３には、血漿中脂肪酸濃度 (mmol/L) の精度管理（変動係数CV%の日間変動）、
表４には、血漿中脂肪酸構成割合 (wt%) の日内変動、
表５には、血漿中脂肪酸構成割合 (wt%) の日間変動、
表６には、血漿中脂肪酸構成割合 (wt%) の精度管理（変動係数CV%の日間変動）、
表７には、赤血球膜中脂肪酸構成割合 (wt%) の日内変動、
表８には、赤血球膜中脂肪酸構成割合 (wt%) の精度管理 （変動係数CV%の日間変動）、
をそれぞれ示した。
【０１２７】
【表１】
2006258761.tif 000003
【０１２８】
【表２】
2006258761.tif 000004
【０１２９】
【表３】
2006258761.tif 000005
【０１３０】
【表４】
2006258761.tif 000006
【０１３１】
【表５】
2006258761.tif 000007
【０１３２】
【表６】
2006258761.tif 000008
【０１３３】
【表７】
2006258761.tif 000009
【０１３４】
【表８】
2006258761.tif 000010
【０１３５】
血漿中脂肪酸レベルの日内変動および日間変動の変動係数CVは、絶対濃度 (mmol/L) と構成割合 (wt%) においてともに5％以下であった。赤血球膜では、主要な脂肪酸の構成割合も同様に、CVは５％以下であった。
【０１３６】
なお、血漿と赤血球膜では、脂肪酸の構成割合が異なる（図８および図９）。血漿の脂肪酸は、遊離脂肪酸、トリグリセライド、血小板、コレステロールエステルなどに由来するが、赤血球膜は主としてリン脂質で構成されており、このリン脂質には脂肪酸の取り込みに選択性がある。そのため、赤血球膜では、MA、POA、HGLAおよびALAを除く９種の脂肪酸を主たる脂肪酸とした。
【０１３７】
以上の結果から、本発明の方法は十分に高い再現性があることが確認され、また、信頼性のある測定結果を得た。このように、本発明の方法は、高い精度で脂肪酸を分析することを示した。
【０１３８】
（従来法との比較）
同一の血漿検体の脂肪酸濃度および構成割合を本発明の方法と、異なる２つの方法（方法Aおよび方法B）とで測定して、3つの方法による測定値を比較した。 
【０１３９】
方法A (Kurikiら, Eur J Clin Nutr, 56:524-531, 2002; J Nutr, 133:3643-3650, 2003) は、図２の工程１および工程３を手作業で行う方法であり、工程１において、試験管に検体と生理塩水と抽出溶媒を混合し、攪拌および静置後、遠心分離して抽出液 (上層と下層に分かれた上層) を取り出し、別の試験菅に移す。さらに、抽出高率を高めるため、同量の抽出液を加えて攪拌し、遠心分離により抽出液を取り出す作業を２回繰り返して、抽出液を収集する方法である。工程３も同様に、合計３回の遠心分離により抽出液を収集する。他の全工程は、本発明方法（上記）と同じであるが、GCの装置は本方法で用いたGCの装置の旧型モデルを用いたが、GC分析条件は同じである。
【０１４０】
方法Bは、小沢 ら（分析化学, 31: 87-91, 1982)による方法で、原理および4つの行程は方法Aと同じであり、手作業により遠心分離した抽出液を収集する方法である。実際は、検査会社（株式会社エスアールエル、東京）に依頼し、そこで測定された。この方法は、本方法とは異なるメチルエステル化剤、GCカラム、GC装置を用いて測定された。
【０１４１】
生体検体として、中高年の男女各９人の血漿中脂肪酸濃度および構成割合を測定した。
【０１４２】
結果を表９〜表10に示した。具体的には、表９には、本発明方法、方法ＡおよびＢで測定した血漿中の脂肪酸濃度および構成割合の比較を示した。また、表10には、本発明方法、方法ＡおよびＢで測定した血漿中の脂肪酸濃度および構成割合のピアソンの相関関係を示した。
【０１４３】
表９および表10の結果から、従来の測定方法や、第三者による測定値を比較しても、本方法によって得られた測定値は高い妥当性があり、信頼性のある分析方法であることが示された。
【０１４４】
【表９】
2006258761.tif 000011
【０１４５】
【表１０】
2006258761.tif 000012
【実施例２】
【０１４６】
（食用油中の脂肪酸の測定）
この実施例では、食用油中の脂肪酸の構成割合を実施例１に記載の方法で測定した。その測定結果を、科学技術庁資源調査会編および食品成分研究調査会編「五訂日本食品成分表」第1版、医歯薬出版2001年と比較した。
【０１４７】
市販の胡麻油50μLをn-デカン2.0mLに溶解し、その10μLを内部標準物質（n-ヘプタデカン酸）、抗酸化剤（BHT）および実施例１と同様のメチルエステル化剤とともに試験管に入れ、図２の工程２により脂肪酸を化学修飾した。その反応液を図２の工程４によりGC分析した際のクロマトグラムを図10に示した。また、各脂肪酸の構成割合を日本食品成分表の値と比較した（表11）が、脂肪酸構成割合に本質的な差はなかった。
【０１４８】
数値が若干異なるのは、食用油のメーカー、製造番号、製造所、原料の産地、分析の測定誤差などによると考えられる。
【０１４９】
【表１１】
2006258761.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明による脂肪酸の測定法は、血液成分や食品を含む種々の検体に適用することができる。従来の方法と比べて、微量の検体で各脂肪酸を迅速、簡便、安価、高精度に測定することを可能にするため、健診・検診機関、医療機関や食品産業分野での従来法に代わる新しい方法としての利用が高まることが期待される。
【０１５１】
例えば、血液中のIPAやDHAなどは、その構造からn-3系多価不飽和脂肪酸 (n-3PUFAs) に分類され、これらの脂肪酸摂取の良いバイオマーカーであると報告されていることから (非特許文献４)、健診・検診時の食事指導による疾病の一次予防だけでなく、疾病の治療や再発予防など医療分野で広く活用できると期待されている（非特許文献５）。また、n-3PUFAsは循環器疾患やがんだけでなく、慢性関節リウマチ、アレルギー、糖尿病、痴呆症などの予防や治療との関連が多く報告されていることから、これらの疾病に対しても有用であると期待されている（熊谷朗、EPAの医学−疫学・栄養学から臨床応用まで−中山書房1994年）。このような多くの疾病に対するIPAやDHAの薬理効果や、炎症反応など多くの生理活性を有するプロスタグランジン、ロイコトリエンなどの前駆体であるAAとの関連、さらに、AA/IPAおよびAA/DHAの比と疾病との関連を解明することによって、IPAやDHAは疾病の予防や治療に活用できると考えられる。さらに、IPAのエステル製剤は既に医薬品として循環器疾患の治療薬として使用されていることから、治療効果に対する血液モニタリングが可能である。薬物療法だけでなく、食事療法や運動療法などと併用して治療効果を検討することも可能である。このように、ある特定の疾患のバイオマーカーとしてのn-3PUFAsを生体検体についてモニターする際に、本発明を有効に使用できるだろう。
【０１５２】
さらにまた、ソックスレー法と本発明方法を組み合わせることにより、あるいは本発明の方法単独で、最近の社会問題になっている食品の産地 (和牛と輸入牛など)、牛肉のヒレやロースなどの部位、天然魚もしくは養殖魚などの違いを判別するのに有用である。また、脂質および/または脂肪酸を含む食品で有用である。このような脂肪酸の構成割合の違いは、日本食品成分表 (五訂) に掲載されている各食品の脂肪酸の値と比較することで判別が可能である。また、独自に分析データを蓄積して、科学的証拠に基づいて、判別することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明方法の手順の概略を示す。
【図２】本発明方法の一実施形態を示す。
【図３】溶媒抽出装置を示す。
【図４】溶媒抽出装置の抽出セルの構造を示す。
【図５】溶媒抽出装置の抽出セルの底側セルキャップの底部にメンブランフィルターを敷設する様子を示した図である。
【図６】溶媒抽出装置の抽出セルの底側セルキャップの底部にメンブランフィルターを敷設する本発明の手順と、メンブランフィルターを使用しない従来法の手順とを対比した図である。
【図７】本発明のシステムの概略を示す。
【図８】血漿中の脂肪酸の濃度および構成割合を示すガスクロマトグラム（保持時間０〜17.5分）である。同定した脂肪酸は、ミリスチン酸 (MA)、パルミチン酸 (PA)、パルミトオレイン酸 (POA)、ステアリン酸 (SA)、オレイン酸 (OA)、リノール酸 (LA)、γ-リノレン酸 (HGLA)、α-リノレン酸 (ALA)、γ-ジホモリノレン酸 (DGLA)、アラキドン酸 (AA)、イコサペンタエン酸(IPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)である。また、内部標準物質は、ｎ-ヘプタデカン酸である。
【図９】赤血球膜中の脂肪酸構成割合を示すガスクロマトグラム（保持時間０〜17.5分）である。同定した脂肪酸は、ミリスチン酸 (MA)、パルミチン酸 (PA)、パルミトオレイン酸 (POA)、ステアリン酸 (SA)、オレイン酸 (OA)、リノール酸 (LA)、γ-リノレン酸 (HGLA)、α-リノレン酸 (ALA)、γ-ジホモリノレン酸 (DGLA)、アラキドン酸 (AA)、イコサペンタエン酸(IPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)である。また、内部標準物質は、ｎ-ヘプタデカン酸である。
【図１０】胡麻油中の脂肪酸構成割合を示すガスクロマトグラム（保持時間０〜17.5分）である。同定した脂肪酸は、パルミチン酸 (PA)、パルミトオレイン酸 (POA)、ステアリン酸 (SA)、オレイン酸 (OA)、リノール酸 (LA)、α-リノレン酸 (ALA)である。また、内部標準物質は、ｎ-ヘプタデカン酸である。
【図１】
2006258761.tif 000014
【図２】
2006258761.tif 000015
【図３】
2006258761.tif 000016
【図４】
2006258761.tif 000017
【図５】
2006258761.tif 000018
【図６】
2006258761.tif 000019
【図７】
2006258761.tif 000020
【図８】
2006258761.tif 000021
【図９】
2006258761.tif 000022
【図１０】
2006258761.tif 000023