(57)【要約】      （修正有）【課題】  皮膚の発毛メカニズムを解明し、従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤及びそれを含有する育毛料の提供。【解決手段】  育毛剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞に適用し、当該毛乳頭細胞のプロスタグランジンＦシンターゼ及びカルボニルリダクターゼ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法を提供する。更に、上記スクリーニング方法により選定された薬剤、Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを含有する育毛料。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
育毛剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞に適用し、当該細胞のプロスタグランジンＦシンターゼ及びカルボニルリダクターゼ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞が毛乳頭細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の前記生理活性物質の発現の亢進が、当該細胞から抽出されたプロスタグランジンＦシンターゼ及び／又はカルボニルリダクターゼ−１をコードするmRNAの量を測定することにより決定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを含有する育毛料。
【請求項５】
Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドにより細胞におけるプロスタグランジンＦシンターゼ及びカルボニルリダクターゼ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる方法。
【請求項６】
Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを頭皮に塗布することによりプロスタグランジンＦシンターゼ及びカルボニルリダクターゼ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させることを特徴とする、育毛方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）及び／又はカルボニルリダクターゼ−１（ＣＢＲ−１）を指標とした育毛剤のスクリーニング方法、並びにそのような方法によりスクリーニングされた育毛剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は美的外観上極めて重要視される。従って、先天的又は後天的要因による脱毛は多くの人々、特に男性にとって深刻な悩みである。特に高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な後天的な原因により、脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、発毛や毛髪の太毛化の促進を含む育毛効果を発揮するより優れた育毛剤を提供すべく、様々な試みがなされている。育毛については、毛包に関する研究をはじめ、様々な試みがなされている。しかしながら、発毛のメカニズムについては生化学・分子生物学レベルにおいて未だ解明に至っておらず、その結果、発毛活性の維持・促進に有効な薬剤を含有する発毛料・育毛料の研究・開発も模索段階にあるといえよう。発毛のメカニズムが十分に解明できれば、既存の発毛料・育毛料に比べ一層顕著な効果を奏するものの提供が可能となり得る。
【０００３】
生体内においては、アラキドン酸を中心に、いく筋もの滝が流れるように生理活性物質が作られるアラキドン酸カスケードと呼ばれる反応系が存在する。このカスケードにおいて、高度不飽和脂肪酸の一つであるアラキンドン酸を前駆体として、プロスタグランジンをはじめ、トロンボキサチン、ロイコトリエン、リポキシンなどのオキエイコサノイドといった種々の生理活性物質が生合成される。生理活性物質であるプロスタグランジン（ＰＧＦ）にはＡからＪの１０種類の存在が知られおり、そのうちのＰＧＦ2αには育毛効果があることで知られる（特表2001-51155号公報）。ＰＧＦ2αはアラキドン酸カスケードにおいてＰＧＥ2、ＰＧＤ2、ＰＧＨ2など、様々な前駆体から生合成されることができ、ＰＧＤ2から合成される場合、その合成はプロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）により触媒され、ＰＧＥ2から合成される場合、その合成はカルボニルリダクターゼ−１（ＣＢＲ−１）により触媒されることまでは知られている。しかしながら、ＰＧＦＳやＣＢＲ−１が発毛メカニズムに関与しているかどうかまでは全く解明されていない。
【０００４】
【特許文献１】特表2001-51155号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、皮膚の発毛メカニズムを解明し、従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤及びそれを含有する育毛料の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、アラキドン酸カスケードに包含されるプロスタグランジン合成酵素であるＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１について、新規の育毛剤のスクリーニングのための指標となるかどうかを検討した。本発明者は、毛乳頭細胞においてＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現をin vitroで亢進させることのできた薬剤について、育毛効果の有無を実際にin vivoで調べたところ、そのような薬剤が育毛効果を有することを見出した。
【０００７】
従って、第一の観点において、本発明は育毛剤のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、候補薬剤を細胞に適用し、当該細胞のＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする。好ましくは、前記細胞は毛乳頭細胞、特に好ましくは不死化毛乳頭細胞である。
【０００８】
好適な態様において、前記細胞の前記生理活性物質の発現の亢進は、細胞から抽出されたＰＧＦＳ及び／又はＣＢＲ−１をコードするmRNAの量を、例えばＰＣＲ法、特に好ましくはリアルタイムＰＣＲ法により測定され、判定される。
【０００９】
第二の観点において、本発明は上記スクリーニング方法により選定された薬剤、具体的にはＮ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを含有する育毛料を提供する。
【００１０】
第三の観点において、本発明は上記スクリーニング方法により選定された薬剤、具体的にはＮ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドにより細胞におけるＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる方法を提供する。
【００１１】
第四の観点において、本発明は上記スクリーニング方法により選定された薬剤、具体的にはＮ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを頭皮に塗布することによりＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させることを特徴とする育毛方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規の育毛剤のスクリーニングが可能となり、従来技術に比べ、顕著に有利な育毛料の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＰＧＦＳ
プロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ；別名「ＰＧＤ１１−ケトリダクターゼ」）は322個のアミノ酸より成る分子量36,517の単純タンパク質であり、広い基質特異性を示し、種々のカルボニル化合物を還元する能力を有する。ＰＧＨ2からはＰＧＦ2αを合成することができ、ＰＧＤ2からはＰＧＦ2αの立体異性体（９α、１１β−ＰＧＦ2）を生成することができる。尚、ＰＧＨ2よりＰＧＦ2αを生成する活性部位と、ＰＧＤ2より９α、１１β−ＰＧＦ2を生成する活性部位は異なる。ＰＧＦＳはヒト肝臓アルデヒド還元酵素及びラットレンズアルドース還元酵素と６５％の相同性を示す。カルボニル還元酵素の一種であり、アルド−ケト還元酵素群の活性部位との類似性が示唆されている。ヨーロッパ赤ガエルの眼（レンズ）の主要構造タンパク質rho−クリスタリンと77％の相同性も示す。
【００１４】
ＣＢＲ−１
カルボニルリダクターゼ−１（ＣＢＲ−１；別名「ＰＧＥ９−ケトリダクターゼ」）はアルド−ケト還元酵素群に分類される分子量約36,000を有する還元酵素であり、ＰＧＦＳと同様に広い基質特異性を示し、種々のカルボニル化合物を還元する能力を有する。ＣＢＲ−１はＰＧＥ2からＰＧＦ2αを合成することができる。胎盤や脳の細胞質に多く存在し、ＮＡＤやＮＡＤＰ存在下で15−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００１５】
育毛剤のスクリーニング方法
本発明は育毛剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、候補薬剤をＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現及び／又は活性を亢進する能力について評価し、当該能力を有する候補薬剤を育毛剤として選定することを特徴とする。
【００１６】
詳しくは、このスクリーニング方法は、候補薬剤を細胞に適用し、当該細胞のＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする。好ましくは、当該細胞は毛乳頭細胞、特に好ましくは不死化毛乳頭細胞である。細胞はヒト由来でも、非ヒト由来、例えばラット、マウス、ウサギなどの様々な哺乳動物に由来するものであってもよい。
【００１７】
皮膚中の上記生理活性物質の発現は、例えば皮膚細胞からRNAを抽出し、当該生理活性物質をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。また、ヒトＰＧＦＳ(GENBANK/AB032154)及びヒトＣＢＲ−１(NCBI/CD580553)をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列情報に基づき、当業者であればそれぞれの遺伝子の増幅に適当であるプライマーを適宜選定することができるであろう。本明細書実施例において、ヒトＰＧＦＳ及びヒトＣＢＲ−１それぞれのリアルタイムＰＣＲ増幅のために適当なプライマーを使用しているが、増幅プライマーはそれらに限定されるものではない。
【００１８】
他に、上記生理活性物質の発現は、細胞中の当該生理活性物質の量を直接測定することにより決定することができる。例えば、この測定は生理活性物質に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。
【００１９】
上記育毛効果について確認する工程は、この候補薬剤をモデル動物に適用して実施することができる。動物としてはマウス、ラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、この薬剤の溶液、例えば水溶液を調製してからモデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、発毛状態を評価することで、育毛効果の有無を判定することができる。
【００２０】
本発明は更に、上記スクリーニング方法により選定された薬剤、具体的には、下記の化学構造式で表されるＮ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを含有する育毛料を提供する。
【化１】
2006223144.tif 000003
【００２１】
上記化合物は、例えばZagorevskii, V. A., Zykov, D. A., Vinokurov, V. G.、Zhurnal Obshchei Khimii (1959), 29, 2302-6に記載の方法により製造することができる。
【００２２】
本発明の育毛料は、例えば水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形剤などの形態で適用される。従来から公知の方法でこれらの形態に調製したうえで、ローション製剤、乳液製剤、クリーム製剤、軟膏製剤、硬膏製剤、ハップ製剤、エアゾール製剤、水−油２層系、水−油−粉末３層系、注射製剤などとして、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、挿入することができる。当該育毛料は上記薬剤を、特に限定することなく、育毛料全量に基づき例えば０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度含有するであろう。
【００２３】
これらの剤型の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム製剤、軟膏製剤、硬膏製剤、ハップ製剤、エアゾール製剤などの皮膚外用剤が、本発明の目的に適する剤型である。なお、ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品（軟膏剤など）、化粧料が含まれる。
【００２４】
本発明の育毛料においては、所望する剤型に応じて従来公知の賦形剤や香料などをはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料などの粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤などが適宜配合される。さらにこの他の薬効成分を本発明の育毛料に配合することは、その配合により所期の効果を損なわない範囲内で可能である。
【００２５】
本発明は更に、上記スクリーニング方法により選定された薬剤、具体的にはＮ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドにより細胞におけるＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１から成る群から選ばれる少なくとも１種の生理活性物質の発現を亢進させる方法を提供する。特に好ましい態様は、Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミドを、例えば上記育毛料の剤型において頭皮に塗布することにより、当該生理活性物質の少なくとも１種の発現を亢進させる育毛方法である。対象となる皮膚細胞は、好ましくは頭皮における毛乳頭細胞など、発毛の所望される部位に位置する細胞であってよい。
【００２６】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
定量ＰＣＲ実験によるＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現亢進の検討
実験１  不死化細胞を用いる発現亢進の検討
１）細胞の培養
ヒト不死化毛乳頭細胞は、特開平11-895656号公報の記載に従い、ＳＶ  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子によるヒト毛乳頭細胞（dermal papilae cell; ＤＰＣ）の形質転換により得た。ヒト毛乳頭細胞は、整形手術の副産物として生じた頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた34歳女性由来のＤＰＣを用いた。細胞密度が1.0〜1.5×104個／cm2になるように播種し、ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋10％ＦＢＳ中、37℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。２回／週の割合で培地交換を行い、細胞が集密に達したときは（播種から10日〜20日後）0.25％トリプシンで細胞をディッシュから剥がして回収し、再び1.0〜1.5×104個／cm2の密度で播種した。
【００２８】
２）培養細胞の薬剤処理
解凍後１〜３回継代・培養したＤＰＣを24ウェルプレ−トに4.0×104個／ウェルの密度で播種し、４日後、亜集密の細胞に、育毛効果を有することが周知の各薬剤の溶解されたＭＥＭ（血清無添加）に交換した。尚、育毛効果を有する薬剤としてアデノシン、ミコフェノール酸、ピペロキサンを用い、コントロールとしてＤＭＳＯを用いた。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
各薬剤の添加の24時間後、ＭａｇＮＡＰｕｒｅＬＣ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で培養細胞から抽出し、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のキットを用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを鋳型にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で二重鎖ＤＮＡの副溝に結合する蛍光色素ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲにより発現量の比較を行った。詳しくは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスタ−ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、添付のマニュアルに従って全量20μｌの反応液（ＭｇＣｌ2  ２ｍＭ、下記のフォワード及びリバースプライマー各0.25μＭ）を調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでＰＣＲ反応（酵素活性化95℃／10分、熱変性95℃／15秒、アニーリング58℃／５秒、伸長反応72℃／10秒、熱変性〜伸長反応サイクルを40回）を行い、各サイクルの伸長反応終了時の蛍光強度をモニタリングした。この蛍光強度はその時点におけるＰＣＲ産物量を反映している。遺伝子の発現量は、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量ＡのＰＣＲ産物ＹがＰＣＴのサイクル数Ｘに対してＹ＝Ａ×２Xを満たしながら増幅されるものとして仮定して、一定量のＰＣＲ産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出し、Ｇ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドログナーゼ）の発現量で補正した。
【００２９】
ＰＧＦＳのプライマー
フォワードプライマー：5'-CCGTATTTCAACCGGAT-3' （配列番号１）
リバースプライマー：  5'-CAGAGGACATGAAAGCCAT-3' （配列番号２）
ＣＢＲ−１のプライマー
フォワードプライマー：5'-GTCCAAAGGGCATTTACAA-3' （配列番号３）
リバースプライマー  ：5'-AGCAACCTACGCACTCATG-3' （配列番号４）
Ｇ３ＰＤＨのプライマー
フォワードプライマー：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'
リバースプライマー  ：5'-TGGGATTTCCATTGATGACA-3'
【００３０】
その結果を図１に示す。その結果から、ミコフェノール酸（特開平７−１１２９２３号公報）、ピペロキサン（特開平６−０５６６３３号公報）などの周知の育毛剤の作用により、不死化毛乳頭細胞においてＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現が亢進されることが示唆された。従って、ＰＧＦＳ及び及び／又はＣＢＲ−１の発現の亢進を指標として、新規の育毛剤をスクリーニングできることが予想された。
【００３１】
実験２  ヒト毛乳頭細胞を用いる発現亢進の検討
実験１と同様に、但し13歳男性由来の毛乳頭細胞を用い、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。
【００３２】
その結果を図２に示す。不死化毛乳頭細胞により得られた結果と同様、アデノシン、ミコフェノール酸、ピペロキサンなどの周知の育毛剤の作用により、ヒト毛乳頭細胞においてＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現が亢進されることが示唆された。従って、この実験からも、ＰＧＦＳ及び／又はＣＢＲ−１の発現の亢進を指標として、新規の育毛剤をスクリーニングできることが予想された。
【００３３】
実験３
ＲＴ−定量ＰＣＲ実験によるＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現亢進効果を有する薬剤のスクリーニング
次に、育毛効果の有無の全く知られていない薬剤を上記と同様にして不死化毛乳頭細胞及びヒト毛乳頭細胞に24時間作用させ、ＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。その結果、Ｎ−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボキサミド（化合物Ａ）が、不死化毛乳頭細胞及びヒト毛乳頭細胞のいずれにおいても、ＰＧＦＳ及びＣＢＲ−１の発現を亢進させる効果を有することが示された。図３（ａ）は、化合物Ａが不死化毛乳頭細胞のＰＧＦＳ発現を有意に亢進させる結果を示している。図３（ｂ）は、化合物Ａがヒト毛乳頭細胞のＣＢＲ−１発現を有意に亢進させる結果を示している。
【００３４】
実験４
化合物Ａの育毛効果の検討
雄のＣ３Ｈマウス（生後60日）を用い、小川らの方法（Normal and Abnormal Epidermal Differentiation M. Seiji and I.A. Bernstein 編集、東大出版会）に従い、実験を行った。マウスの背部を約２×４ｃｍの大きさに剃り、翌日より１日１回ずつ連日サンプル塗布を行い、毛再生が始まった部分の面積の変化を求め、毛再生の早さの比較を行った。試験には対照として75％エタノールを用いた。各試料ともマウス３匹ずつを用いた。その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2006223144.tif 000004
【００３６】
表１の結果から、化合物Ａの濃度を高めることで発毛が促進されることがわかり、化合物Ａは濃度依存式に育毛効果を発揮することが明らかとなった。化合物Ａが実際に育毛効果を発揮することから、ＰＧＦＳ及び／又はＣＢＲ−１の発現を指標とする本発明の方法により、育毛効果を真に発揮する薬剤をスクリーニングできることが実証された。
【００３７】
実験４
他の育毛剤スクリーニング方法による化合物Ａの育毛効果の検討（１）
化合物Ａが公知の他の育毛剤スクリーニング方法（特開2000-89号公報に記載の不死化外毛根鞘細胞増殖試験）により育毛剤としてスクリーニングされるかどうかを検討した。
96ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を播種し（5,000細胞）、Ｋ−ＧＭ（Ｃｏｌｏｎｅｔｉｃｓ）にて24時間、前培養した。次に、ＰＢＳ（−）で１回ウェルを洗った後、化合物Ａを含むＫ−ＢＭ（Ｃｏｌｏｎｅｔｉｃｓ）に培地交換した。なお、ネガティブコントロールとしての培地はＫ−ＢＭ、ポジティブコントロールとしての培地はＫ−ＧＭを用いている。48時間培養した後に、培地の１／10量のアラマーブルー（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに加え、37℃、６時間反応させた後に、マイクロプレートリーダー（ＳＪ  ｅｉａオートリーダーＩＩ；三光純薬）にて570ｎｍ、600ｎｍの吸光度の値をもとに、アラマーブルーの還元率を求め、これを相対的な生細胞数の値とした。
【００３８】
その結果を図４に示す。図４から、特開2000-89号公報に記載の不死化外毛根鞘細胞増殖試験では化合物Ａが育毛剤としてスクリーニングされないことが明らかとなった。
【００３９】
実験５
他の育毛剤スクリーニング方法による化合物Ａの育毛効果の検討（２）
化合物Ａが公知の他の育毛剤スクリーニング方法（特開2000-258408号公報に記載のカスパーゼ３活性阻害実験）により育毛剤としてスクリーニングされるかどうかを検討した。
カセパーゼ−３の活性測定を、合成の蛍光基質アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−メチルクマリンアミド（Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＭＣＡ）を用いて行った。10ｍＭのＡｃ−ＬＥＨＤ−ＭＣＡ  10μｌ、100ｍＭのジチオスレイトール１μｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）５μｌ、蒸留水75μｌを含む緩衝液に４μｌのリコンビナントカスパーゼ−３および化合物Ａ  ５μｌを加えて、37℃で30分間インキュベートした。
【００４０】
反応は、0.1Ｍクロロ酢酸２ｍｌを添加して停止させ、遊離したアミノメチルクマリンの460ｎｍの蛍光強度（励起波長380ｎｍ）をフルオロメーターで測定した。サンプルのカスパーゼ−３阻害活性は、溶媒コントロールに対する値として示す。
その結果を図５に示す。図５から、特開2000-258408号公報に記載のカスパーゼ３活性阻害実験では化合物Ａが育毛剤としてスクリーニングされないことが明らかとなった。
【００４１】
従って、本発明に係る方法により、従来技術では見落とされていた、実際に育毛活性を有する薬剤のスクリーニングが可能となる。
【００４２】
処方例１
育毛料（剤型：透明液状）
本発明に係る育毛効果を発揮する育毛料の処方例を示す。
配合成分                                              ％
化合物Ａ                                            0.5
エタノール                                         60
ジプロピレングリコール                              2
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                      0.5
乳酸                                                適量
乳酸ナトリウム液                                    適量
グリチルリチン酸モノアンモニウム                    0.1
ニコチン酸アミド                                    0.1
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール                        0.1
Ｌ−メントール                                      0.2
色素                                                適量
精製水                                              残余
香料                                                適量
計                                                100
【００４３】
処方例２
育毛料（剤型：透明液状）
本発明に係る育毛効果を発揮する育毛料の処方例を示す。
配合成分                                              ％
化合物A                                             0.5
エタノール                                         80
イソステアリルアルコール                            2
１,３−ブチレングリコール                           3
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                      1
ラウリル硫酸ナトリウム                              0.3
ＤＬ−リンゴ酸                                      適量
β−グリチルレチン酸                                0.2
パントテニルエチルエーテル                          0.1
ニコチン酸ベンジル                                  0.1
ニコチン酸アミド                                    0.1
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール                        0.5
デシルテトラデシルジメチルアミンオキシド液（20％）  5
Ｌ−メントール                                      1
計                                                100
【００４４】
処方例３
育毛料（剤型：透明液状）
本発明に係る育毛効果を発揮する育毛料の処方例を示す。
配合成分                                              ％
化合物Ａ                                            0.5
エタノール                                         70
イソステアリルアルコール                            1
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                  1
乳酸                                                適量
乳酸ナトリウム液                                    適量
センブリ抽出ペースト                                0.2
β−グリチルレチン酸                                0.5
パントテニルエチルエーテル                          0.5
ニコチン酸ベンジル                                  0.02
ニコチン酸アミド                                    0.1
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール                        0.1
Ｌ−メントール                                      0.5
サンショウエキス                                   10
精製水                                              残余
香料                                                適量
計                                                100
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】不死化毛乳頭細胞に各種薬剤を添加して２４時間経過した後のＰＧＦＳ（ａ）及びＣＢＲ−１（ｂ）発現相対量を示す。
【図２】男性由来毛乳頭細胞に各種薬剤を添加して２４時間経過した後のＰＧＦＳ（ａ）及びＣＢＲ−１（ｂ）発現相対量を示す。
【図３】毛乳頭細胞に化合物Ａを添加して２４時間経過した後のＰＧＦＳ（ａ）及びＣＢＲ−１（ｂ）発現相対量を示す。
【図４】化合物Ａについての不死化外毛根鞘細胞増殖試験結果を示す。
【図５】化合物Ａについてのカスパーゼ３活性化阻害試験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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