(57)【要約】【課題】血中の中性脂肪を抑制する新たな安全性の高い薬剤を提供すること。さらに、血中の中性脂肪が関与する疾患の治療剤を提供すること。【解決手段】本発明の血中中性脂肪抑制剤および血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する。本発明の血中中性脂肪抑制剤は、血中中性脂肪が関与すると考えられる種々の疾患の治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪抑制剤。
【請求項２】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤。
【請求項３】
前記疾患が、動脈硬化、心血管病、脳血管障害、高脂血症、または代謝異常である、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪濃度制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中中性脂肪抑制剤に関する。より詳細には、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪抑制剤、および血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、血中の中性脂肪やコレステロールの量が標準値よりかなり高くなる症状を高脂血症という。高脂血症は、動物性食品の過剰な摂取、運動不足などが要因であるといわれている。血中の過剰な中性脂肪は、血流を妨げ、代謝を低下させ、血栓の形成を促進するだけでなく、メタボリックシンドロームの要因でもあるため、様々な生活習慣病につながる重要なリスクファクターでもある。また、血中の過剰な中性脂肪は、善玉コレステロール（ＨＤＬ）を減らし、悪玉コレステロール（ＬＤＬ）を増やすとともに、中性脂肪自体も血管壁に蓄積し、高血圧、脳血栓、心筋梗塞などの原因となる動脈硬化を引き起こす。
【０００３】
血中の中性脂肪の量を標準（正常）値に保つことは、上記の疾病の予防になるため、社会的にも関心が高まっている。一旦、高脂血症になると、その治療のために、適度の運動をすること、脂肪の摂取量を減らすこと、植物性の食物を多く摂取することなどが推奨されている。
【０００４】
高脂血症などの、血中脂肪量のバランスが崩れた病態を改善する方法として、リノール酸などの多価不飽和脂肪酸を摂取する方法、クロフィブレートやニコチン酸などによる薬物療法が行われてきた。しかし、多価不飽和脂肪酸は長期連用が必要な上に過剰摂取に問題があり、クロフィブレートは筋けいれんなどの副作用があり、ニコチン酸にも全身紅潮、胃障害等の副作用があるという問題があった。そこで、血中脂肪を抑制し、安全性が高く、かつ長期連用が可能な薬剤について、種々の検討が行われている。例えば、ビート（甜菜）中に多く含まれるベタイン（特許文献１）、ターメリックに含まれるクルクミンの類縁物質（特許文献２）、ミズナラおよびコナラ樹木種実粉末（特許文献３）、アカザ科フダンソウ属植物の水および／または極性有機溶媒抽出物の低極性成分（特許文献４）などの天然物由来成分が知られている。
【特許文献１】特開２００３−２６１４４５号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２７号公報
【特許文献３】特開平１１−２９９４５１号公報
【特許文献４】特開平７−６９９１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血中の中性脂肪を抑制する新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。本発明はさらに、血中の中性脂肪が関与する疾患の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
抗酸化剤として知られているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンが血中の中性脂肪抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪抑制剤を提供する。
【０００８】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤を提供する。
【０００９】
１つの実施態様では、上記疾患は、動脈硬化、心血管病、脳血管障害、高脂血症、または代謝異常である。
【００１０】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、血中中性脂肪濃度制御剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新たな血中中性脂肪抑制剤および血中中性脂肪濃度制御剤が提供される。この血中中性脂肪抑制剤は、血中の中性脂肪が関与すると考えられる動脈硬化、心血管病、脳血管障害、高脂血症、代謝異常などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明の血中中性脂肪抑制剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の血中中性脂肪抑制剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：
【００１３】
【化１】
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【００１４】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。
【００１５】
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。
【００１６】
本発明の血中中性脂肪抑制剤は、血中中性脂肪濃度制御剤としても使用され得る。血中中性脂肪濃度を制御し得るので、血中中性脂肪が関与する疾患または症状を治療または予防するのに有用であり得る。このような疾患または症状としては、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症、心筋梗塞、脳血管障害、脳梗塞、狭心症、膵臓炎、糖尿病、脂肪肝、代謝異常などが挙げられる。
【００１７】
本発明の血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤は、上記の本発明の血中中性脂肪抑制剤と同様に、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。特に、動脈硬化、心血管病、脳血管障害、高脂血症、および代謝異常の治療に有用である。
【００１８】
本発明の血中中性脂肪抑制剤または血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００１９】
本発明の血中中性脂肪抑制剤または血中中性脂肪が関与する疾患の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。
【００２０】
本発明の血中中性脂肪抑制剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
（調製例１：アスタキサンチンの調製）
アスタキサンチンを次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールでアスタキサンチンを含む油性画分を抽出した。抽出物を減圧濃縮してエタノールを留去し、アスタキサンチンをフリー体換算で９．９％含む抽出物を調製した。
【００２２】
（調製例２：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
【００２３】
（調製例３：アスタキサンチンカプセルの調製）
上記調製例１で得たアスタキサンチンを用いて、１カプセル当たり以下の表１に示す成分を内包するソフトカプセルを調製した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
得られたソフトカプセル１個当たりには、アスタキサンチンをフリー体換算で４ｍｇ含有する。
【００２６】
（実施例１：血中中性脂肪濃度に及ぼす効果）
上記調製例２で得たアスタキサンチンカプセルを、２０歳代〜７０歳代の男女１８名の被験者に、１日１回１カプセルずつ４週間にわたり摂取させた。摂取開始日の朝食前および摂取終了日の翌日の朝食前に、各被験者から採血し、血中の中性脂肪濃度を測定した。中性脂肪濃度は、酵素法によって測定した。酵素法では、トリグリセリド（中性脂肪）を、リポ蛋白リパーゼで加水分解してグリセロールとし、さらにグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼなどの酵素を用いて当該技術分野で通常用いられる酸化系発色剤に導いて、比色法またはＵＶ法で測定する。結果を図１および２に示す。図１は、各被験者についてのアスタキサンチンカプセル摂取前後の血中中性脂肪濃度の変化を示し、そして図２は、平均値を示す。いずれの図においても、縦軸の数値の単位はｍｇ／ｄＬである。
【００２７】
図１からわかるように、１８名の被験者のうち１３名（実線で示す）において、血中中性脂肪濃度が低下していた。また、図２に示すように、被験者全員の中性脂肪濃度の平均値は、アスタキサンチンカプセル摂取前と比較して、１４．７％減少していた。特に、アスタキサンチンカプセル摂取前の中性脂肪濃度が１００ｍｇ／ｄＬ以上であった被験者では、全員が減少しており（図１参照）、平均減少値は３５．２ｍｇ／ｄＬ（摂取前の値を１００％とすると２１．５％）であったことにより、特に中性脂肪濃度が高い被験者において低減効果が高かったことがわかる。一般に、中性脂肪濃度は３５〜１４９ｍｇ／ｄＬが正常値であるが、このように、アスタキサンチンカプセルの摂取により、中性脂肪濃度が高い被験者では、確実に中性脂肪濃度が低下し、一方、中性脂肪濃度が低い被験者では、あまり濃度が低下しなかった。このことから、アスタキサンチンが、中性脂肪濃度を極度に低下させることなく、正常値の範囲に中性脂肪濃度を制御し、安全に作用することがわかった。また、被験者のほぼ全員の値が、摂取後には正常範囲内に収まったことから、アスタキサンチンが血中中性脂肪の濃度を正常範囲へ制御することが示された。
【００２８】
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
【００２９】
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。
【００３０】
一方、上記調製例２で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。
【００３１】
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。
【００３２】
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。
【００３３】
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、新たな血中中性脂肪抑制剤および血中中性脂肪濃度制御剤が提供される。この血中中性脂肪抑制剤は、血中中性脂肪が関与すると考えられる高脂血症、動脈硬化症、高血圧症、心筋梗塞、脳血管障害、脳梗塞、狭心症、膵臓炎、糖尿病、脂肪肝、代謝異常などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明の血中中性脂肪抑制剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは食経験が長く、非常に毒性が低いため、安全性が極めて高い。したがって、医薬品として使用されるだけでなく、健康食品などとして日常的に予防的に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】各被験体についてのアスタキサンチンカプセル摂取前後の血中中性脂肪濃度の変化を示すグラフである。
【図２】アスタキサンチンカプセル摂取前後の被験体の血中中性脂肪濃度の平均値を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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