(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することを課題とする。【解決手段】本発明は、図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチドまたはこのポリペプチドの活性なフラグメント、アナログまたは誘導体；ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８番に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチドまたは該ポリペプチドの活性なフラグメント、アナログまたは誘導体；をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、ＶＥＧＦ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮細胞増殖因子２（ＶＥＧＦ２）である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【背景技術】
【０００２】
新たな血管の形成、すなわち脈管形成は、胚の発生、それに続く成長、および組織修復のために必須である。脈管形成は、ヒト固形ガン（ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）の成長の必須な部分である。そして異常な脈管形成は、慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症などの他の疾患に関連する（Ｆｏｌｋｍａｎ，  Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，  Ｍ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２−４４７，  （１９８７））。
【０００３】
いくつかの因子が脈管形成に関与する。内皮細胞および他の細胞タイプのためのマイトジェンである酸性および塩基性両方の線維芽細胞増殖因子分子。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）およびアンジオジェニンは脈管形成を誘導し得るが、これらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，  Ｊ．，  １９９３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５３−１７０頁，  Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ）。高度に選択的な血管内皮細胞のためのマイトジェンは、血管内皮細胞増殖因子すなわちＶＥＧＦである（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １３：１９−３２，  （１９９２））。血管内皮細胞増殖因子は、その標的細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているようである、分泌される脈管形成マイトジェンである。マウスＶＥＧＦ遺伝子は、特徴付けられ、そして胚形成におけるその発現パターンが解析された。ＶＥＧＦの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細胞において（例えば、脈絡叢および腎糸球体において）観察された。このデータは、ＶＥＧＦの内皮細胞の増殖および分化の多機能性レギュレーターとしての役割に一致する。Ｂｒｅｉｅｒ，  Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １１４：５２１−５３２  （１９９２）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、脈管形成を促進し得る。ＶＥＧＦは、ヒト血小板由来増殖因子、ＰＤＧＦαおよびＰＤＧＦβと配列相同性を共有する（Ｌｅｕｎｇ，  Ｄ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １３０６−１３０９，  （１９８９））。相同性の程度は、それぞれ約２１％および約２４％である。８つのシステイン残基が、これら３つのすべてのメンバーの間で保存されている。これらは類似しているが、ＶＥＧＦとＰＤＧＦとの間には特異的な差異がある。ＰＤＧＦは結合組織のための主要な増殖因子である一方、ＶＥＧＦは内皮細胞に高度に特異的である。ＶＥＧＦは、血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＶＰＭ）および星状ろ胞由来増殖因子（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｌｌａｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）としても知られる。これはヘパリン結合性二量体ポリペプチドである。
【０００５】
ＶＥＧＦは、オルタナティブスプライシングによる、１２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、可溶性でありそして脈管形成を促進し得る。一方ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は、細胞表面中のヘパリン含有プロテオグリカンに結合している。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管の生理学的増殖に相関していた（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，  Ｃ．Ｍ．，およびＣａｒｂｏｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １３９：５７０−５７９，  （１９８９）；  ＭｃＮｅｉｌ，  Ｐ．Ｌ．，  Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ，
Ｌ．，  Ｗａｒｄｅｒ，  Ｅ．，  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，  Ｐ．Ａ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，  １０９：８１１−８２２，  （１９８９）  ）。その高親和性結合部位は、組織切片中の内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊａｋｅｍａｎ，  Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８９：２４４−２５３，  （１９８９））。この因子は下垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そしてある種のヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔｅ，  Ｋ．Ｈ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４５−８４８，  （１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与える（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１：１６０−１７０，  （１９９３））。最後に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、免疫欠損マウスにおける腫瘍成長を阻害することが示された（Ｋｉｍ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４，  （１９９３））。
【０００６】
血管透過性因子（ＶＥＧＦとしても知られる）はまた、傷害の休止の後でさえも血漿タンパク質に対する持続的な微小血管高透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な特性である）を担うことが見出されている。これは、ＶＰＦ（またはＶＥＧＦ）が、創傷治癒における重要な因子であることを示唆する。Ｂｒｏｗｎ，  Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７６：１３７５−９  （１９９２）。
【０００７】
Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発行された米国特許第５，０７３，４９２号は、適切な環境において内皮細胞増殖を相乗的に増強するための方法を開示する。この方法は、環境に、ＶＥＧＦ、エフェクターおよび血清由来因子を添加する工程を包含する。また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮＡは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとしても存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そして、１９９２年９月３０日に公開された欧州特許出願第９２３０２７５０．２号に開示されるように、それ自体、血管の発達および修復の促進のために有用である。
【０００８】
本発明の１つの局面に従って、  ＶＥＧＦ２ならびにそのフラグメント、アナログおよび誘導体である、新規な成熟ポリペプチドが提供される。本発明のＶＥＧＦ２は、ヒト起源である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生である。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮細胞増殖因子２（ＶＥＧＦ２）である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＶＥＧＦ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、
図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチドまたはこのポリペプチドの活性なフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８番に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチドまたは該ポリペプチドの活性なフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される。
【００１１】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００１２】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【００１３】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡである。
【００１４】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２をコードする。
【００１５】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８番のｃＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦ２ポリペプチドをコードする。
【００１６】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、図１に示されるＶＥＧＦ２のコード配列を有する。
【００１７】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８番として寄託されるＶＥＧＦ２のコード配列を有する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、上記ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、上記宿主細胞から上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、このポリペプチドを産生するためのプロセスを提供する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記ベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセスを提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、上記ＤＮＡにハイブリダイズ可能でありかつＶＥＧＦ２活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡを提供する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、（ｉ）  図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチドならびにその活性なフラグメント、アナログおよび誘導体、および（ｉｉ）
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８番のｃＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦ２ポリペプチドならびに該ポリペプチドの活性なフラグメント、アナログおよび誘導体、からなる群から選択されるポリペプチドを提供する。
【００２４】
１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドに対する抗体を提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、ＶＥＧＦ２を必要とする患者の処置方法を提供し、この方法は、患者に治療有効量の上記ポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００２８】
別の局面において、本発明は、ＶＥＧＦ２を阻害する必要を有する患者の処置方法を提供し、この方法は、患者に上記ポリペプチドに対する治療有効量のアンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供する。
【００３０】
１つの実施形態において、上記治療有効量ポリペプチドが、患者にこのポリペプチドをコードするＤＮＡを提供しそしてこのポリペプチドをインビボで発現させることにより投与される方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の局面に従って、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。
【００３２】
本発明のさらに別の局面に従って、そのようなポリペプチドを組換え技術により産生するためのプロセスが提供される。
【００３３】
本発明のまたさらなる局面に従って、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、損傷された骨および組織の増殖を促進しそして内皮形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を促進するための治療目的（例えば、創傷治癒剤として）、ならびに腫瘍の診断、ガン治療およびＶＥＧＦ２の未知のレセプターを同定および単離するために利用するためのプロセスが提供される。
【００３４】
本発明のまた別の局面に従って、ＶＥＧＦ２に対する抗体およびそのような抗体を産生するためのプロセスが提供される。
【００３５】
本発明のまた別の局面に従って、ＶＥＧＦ２に対するアンタゴニスト／インヒビターが提供される。これは、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために（例えば、腫瘍脈管形成を防止するために）使用され得る。
【００３６】
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生が提供される。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮細胞増殖因子２（ＶＥＧＦ２）である。本発明によれば、そのようなポリペプチドの作用を阻害することもまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは に対するＡＴＣＣ寄託番号７５６９８として、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託されたクローンのｃＤＮＡにコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚（８〜９週）骨巨細胞腫、成人心臓またはいくつかの乳ガン細胞株から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、初期のヒト９週胚由来ｃＤＮＡライブラリー中に発見された。これは、ＶＥＧ
Ｆ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に関連している。これは、約３５０アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この最初のおよそ２４アミノ酸残基がリーダー配列であるようであり、その結果成熟タンパク質は３２６アミノ酸を含む。そしてこのタンパク質は、血管内皮細胞増殖因子に対する最大の相同性を示し（３０％の同一性）、ＰＤＧＦα（２３％）およびＰＤＧＦβ（２２％）がそれに続く（図３を参照のこと）。８つすべてのシステインがファミリーの４つのメンバー内すべてで保存されていることは特に重要である（図２の四角で囲んだ領域を参照のこと）。さらに、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの特徴であるＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮが、ＶＥＧＦ２において保存されている（図２参照のこと）。ＶＥＧＦ２、ＶＥＧＦおよび２つのＰＤＧＦの間の相同性は、タンパク質配列レベルである。ヌクレオチド配列の相同性は検出され得ない。それゆえ、ＶＥＧＦ２を低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションのような単純なアプローチで単離することは困難であろう。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する）の形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複性または縮重の結果として、図１のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【００４１】
図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および随意のさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’非コード配列）。
【００４２】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドおよびさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００４３】
本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの非天然の改変体であり得る。
【００４４】
従って本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体および付加または挿入改変体を包含する。
【００４５】
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００４６】
本発明はまたポリヌクレオチドを包含し、ここで成熟ポリペプチドのコード配列は宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの制御された輸送のための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じ読みとり枠内で融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そして宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
【００４７】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じ読みとり枠で融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。また例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグはインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する。（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，  ３７：７６７  （１９８４））。
【００４９】
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％および好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが配列間に少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００５０】
本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜上提供されるのみであり、そして米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
【００５１】
本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ２ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
【００５２】
用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含する。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００５４】
図１のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）そこで１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であり得るかあり得ないもの、または（ｉｉ）そこで１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、または（ｉｉｉ）そこで成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているもの、または（ｉｖ）そこでリーダー配列または分泌配列もしくは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質の精製に用いられる配列のようなさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体またはアナログであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【００５５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
【００５６】
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されているわけではなく、しかし天然の系において共存する物質の幾らかまたは全部と分離されている同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ、あるいはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、それにもかかわらずそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離されている。
【００５７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００５８】
宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるまたは形質転換されるまたはトランスフェクトされる）。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＶＥＧＦ２遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って例えば、ポリヌクレオチド配列は、種々の発現媒介物のいずれか１つ、特にポリペプチドを発現するためのベクターまたはプラスミドに含まれ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。このようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。
【００６０】
上記に記載のように、適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。
【００６１】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰＬプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御すると公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。
【００６２】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する遺伝子を含有する。
【００６３】
上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教示により当業者に公知の範囲内であると考えられる。
【００６４】
さらに詳細には、本発明はまた、上で広範に記載した１以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、それらが宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。
【００６５】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスＩ型メタロチオネインを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル範囲内である。
【００６６】
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９８６）。
【００６７】
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【００６８】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を産生するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。
【００６９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エンハンサーはＤＮＡのシス作用因子であり、通常は約１０〜約３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例は、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００７０】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。随意に異種配列は、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７１】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１以上の表現的な選択マーカー、およびベクターの維持を保証するため、そして所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
【００７２】
代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。
【００７３】
適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により脱抑制され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【００７４】
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【００７５】
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。
【００７６】
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ２３：  １７５  （１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、および任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列をも含有する。ＳＶ４０のウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０オリジン、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。
【００７７】
ＶＥＧＦ２は、以下で使用される方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製される。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。精製の間に低濃度（約０．１〜約５ｍＭ）のカルシウムイオンが存在することが好ましい（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２４４：  ９１７（１９６９））。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質を完全な配置とするために使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得る。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物または化学合成手順の産物であり得るか、または原核宿主または真核宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主により、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核性の糖質でグリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。
【００７９】
ＶＥＧＦ２は、創傷治癒剤として、特に損傷した組織を再血管形成させる必要がある場合、または新たな毛細脈管形成が重要である場合に、有用である。それゆえ、ＶＥＧＦ２はとこずれを包含する皮膚の潰瘍、静脈の潰瘍、および糖尿病性潰瘍のような全層性創傷の処置のために使用され得る。さらにＶＥＧＦ２は、傷害部位中の熱傷に植皮片および皮膚弁を形成するために脈管形成が所望される場合に、全層性熱傷および傷害の処置において使用され得る。この場合、これは部位に直接適用される。同様に、ＶＥＧＦ２は、熱傷
、外傷の後またはさらに美容目的のために再構成が必要な場合に、形成外科において使用され得る。
【００８０】
ＶＥＧＦ２はまた、損傷した骨、歯周組織または靭帯組織の成長を誘導するために使用され得る。ＶＥＧＦ２がメチルセルロースゲル中で疾患歯の歯根に適用される歯周疾患において使用され得、この処置は新たな骨形成およびコラーゲン繊維内殖を有するセメント質の形成を導き得る。ＶＥＧＦ２は、疾患および外傷によって損傷した歯の支持組織（歯糟骨、セメント質および歯周靭帯を含む）の再生のために使用され得る。
【００８１】
脈管形成は創傷を清潔にそして非感染に保つことにおいて重要であるので、ＶＥＧＦ２は外科手術に関連しておよびそれに続く切断の修復において使用され得る。ＶＥＧＦ２は、感染の危険性が高い腹部創傷の処置において特に有用であるはずである。
【００８２】
ＶＥＧＦ２は、血管移植手術において内皮形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）促進のために使用され得る。移植された物質または合成した物質のいずれかを用いた血管移植片の場合、ＶＥＧＦ２は移植片の表面または連結部に適用されて血管内皮細胞の増殖を促進し得る。これの１つの派生は、ＶＥＧＦ２が心筋梗塞および冠状動脈バイパス外科手術が移植された組織の成長の刺激により必要とされるその他の情況の損傷を修復するために使用され得ることである。これに関しては、ＶＥＧＦ２の虚血後の心血管系を修復するための使用が挙げられる。
【００８３】
ＶＥＧＦ２の同定は、血管内皮細胞増殖因子の特定のインヒビターの生成のために使用され得る。脈管形成および血管新生は固形ガン成長における必須の工程であるので、血管内皮細胞増殖因子の脈管形成活性の阻害は、固形ガンのさらなる成長の防止、遅延、または退縮においてすら非常に有用である。ＶＥＧＦ２の発現レベルは乳房を含む正常組織において非常に低いが、ＶＥＧＦ２は悪性腫瘍に由来する少なくとも２つの乳ガン細胞株において中等レベルで発現されていることが見出され得る。それゆえ、ＶＥＧＦ２が腫瘍の脈管形成および成長に関与する可能性がある。
【００８４】
ＶＥＧＦ２は、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用され得る。ここでＶＥＧＦ２は、馴化培地に１０  ｐｇ／ｍｌ〜１０  ｎｇ／ｍｌの濃度で添加され得る。
【００８５】
本発明のポリペプチドはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。
【００８６】
従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はポリペプチドで処置される患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【００８７】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するこれらの方法または他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現媒介物は、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達媒介物と組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され得る。
【００８８】
本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のタンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを包含するが、これに限定されない。処方は、投与方法に合わせるべきである。
【００８９】
本発明はまた、１以上の本発明の薬学的組成物の成分が満たされた１以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知を伴い得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療的化合物と併用して用いられ得る。
【００９０】
薬学的組成物は、経口経路および静脈内経路のような便利な方法で投与され得、これは好ましくは局所的に投与される。被験体に投与されるＶＥＧＦ２の量および投与法は、多数の因子（投与方法、処置される症状の性質、処置される被験体の体重および処方する医師の判断など）に依存する。一般的にいえば、これは、例えば少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の治療有効用量で与えられ、そしてほとんどの場合、１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与され、そして好ましくは、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００９１】
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。
【００９２】
簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【００９３】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の方法の大きなゲノムクローンのプールを用いて下部位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。
【００９４】
ｃＤＮＡクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５００または６００塩基という短いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂｐよりも長いクローンの方が、簡便な検出のために充分なシグナル強度でユニークな染色体位置に結合しやすい。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、２，０００ｂｐが良好であり、４，０００ｂｐはより良好であり、そして４，０００ｂｐを超える長さは、良好な結果に時間の合
理的な割合を得るためにおそらく必要でない。この技術の総説としては、Ｖｅｒｍａら，
Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）を参照のこと。
【００９５】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。（このようなデータは、例えば、Ｖ．  ＭｃＫｕｓｉｃｋ，  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ  に見出される（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である））。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【００９６】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。
【００９７】
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する。）
罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、染色体展開物で目視できるか、あるいはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出可能な欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的には、変異の存在を確認し、そして変異を多型から区別するために、数個体由来の遺伝子の完全な配列決定が必要とされる。
【００９８】
本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によるインビボでのＶＥＧＦ２の阻害に関する。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡにより遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、成熟ポリヌクレオチド配列の５’コード部分（これは、本発明のポリペプチドをコードする）が、長さ１０塩基対〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス−Ｌｅｅら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：  ３０７３  （１９７９）；  Ｃｏｏｎｅｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：  ４５６  （１９８８）；  およびＤｅｒｖａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：  １３６０  （１９９１）を参照のこと）、その結果ＶＥＧＦ２の転写および産生を防ぐ。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ２への翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：  ５６０  （１９９１）；  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ  （１９８８）を参照のこと）。
【００９９】
あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡがインビボで発現されて上記の方法でＶＥＧＦ２の産生を阻害し得るように、当該分野の手順により細胞に送達され得る。
【０１００】
それゆえ、ＶＥＧＦ２に対するアンチセンス構築物は、ＶＥＧＦ２の脈管形成活性を阻害し得、そして固形ガンのさらなる成長を防止するかまたは退縮すらさせ得る。なぜなら
、脈管形成および血管新生は固形ガン成長における必須の段階であるからである。これらのアンチセンス構築物はまた、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症（これらはすべて異常な脈管形成により特徴付けられる）を処置するために使用され得る。
【０１０１】
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。
【０１０２】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  １９７５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：  ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
【０１０３】
単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。
【０１０４】
中和抗体が同定され得そして、血管内皮細胞増殖因子をマスクするために適用され得る。そしてこれはＶＥＧＦに対するマウスモデル系において示された。ＶＥＧＦ２はまた、この遺伝子自身内の特定のドミナントネガティブ変異体によって不活性化され得る。ＰＤＧＦαおよびβの両方がヘテロ二量体またはホモ二量体を形成し、そしてＶＥＧＦがホモ二量体を形成することが知られている。同様なＶＥＧＦ２間の相互作用が予測され得る。それゆえこれらの抗体は、ＶＥＧＦ２の脈管形成活性をブロックし、そして固形腫瘍の成長を遅延させるために使用され得る。これらの抗体はまた、ＶＥＧＦ２の存在の結果生じる増加した血管透過性により起こる炎症を処置するために使用され得る。
【０１０５】
これらの抗体はさらに、特定の個体における腫瘍の存在を検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る。エンザイムイムノアッセイを、個体の血液サンプルから実施し得る。ＶＥＧＦ２の上昇したレベルは、ガンの特徴であると考えられ得る。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト／インヒビターに関する。アンタゴニスト／インヒビターは、ポリペプチドの機能を阻害または除去するものである。
【０１０７】
従って、例えば、アンタゴニストは本発明のポリペプチドに結合し、そしてその機能を阻害または除去する。このアンタゴニストは、例えば、ポリペプチドまたはある場合ではオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対する抗体であり得る。インヒビターの例は、ポリペプチドに結合しそしてその触媒部位を占め、それにより触媒部位を基質に接近不能にし、その結果正常な生物学的活性が妨害される、低分子である。低分子の例は、低
分子ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、それらに限定されない。
【０１０８】
ＶＥＧＦ２の短縮型も産生され得る。この短縮型は野生型ＶＥＧＦ２と相互作用して内皮細胞増殖を活性化できない二量体を形成し得、それゆえ内因性ＶＥＧＦ２を不活化し得る。あるいは、変異体型のＶＥＧＦ２は、それ自身で二量体を形成し、そして標的細胞表面上の適切なチロシンキナーゼレセプターのリガンド結合ドメインを占めるが、細胞増殖を活性化できない。
【０１０９】
あるいは、本発明のポリペプチドが正常に結合するレセプターに結合する、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストが用いられ得る。アンタゴニストは、天然のタンパク質のレセプター部位を認識し、そしてそれに結合するが、しかしこれらは天然のタンパク質の不活性形態であり、レセプター部位が占められているのでそれによりＶＥＧＦ２の作用を妨害するような近縁のタンパク質であり得る。これらの方法により、ＶＥＧＦ２の作用が妨害され、そしてアンタゴニスト／インヒビターはＶＥＧＦ２により認識される腫瘍のレセプター部位を占めることにより、またはＶＥＧＦ２自身を不活化することにより、抗腫瘍薬物として治療的に使用され得る。アンタゴニスト／インヒビターはまた、ＶＥＧＦ２の増加した血管透過性作用に起因する炎症を防止するために使用され得る。アンタゴニスト／インヒビターはまた、固形ガン成長、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。
【０１１０】
アンタゴニスト／インヒビターは、例えば本明細書中上記のような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物中で用いられ得る。
【０１１１】
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０１１２】
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および／または用語を記載する。
【０１１３】
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後に大文字および／または数字を示すことにより命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公的に入手可能であり、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０１１４】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の所定の配列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０１１５】
切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：  ４０５７  （１９８０）により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０１１６】
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０１１７】
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０１１８】
記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ａ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４５７  （１９７３）の方法に記載のように実施した。
【実施例１】
【０１１９】
ヒト組織および乳ガン細胞株におけるＶＥＧＦ２の発現パターン
ノーザンブロット解析を、ヒト組織およびヒト組織における乳ガン細胞株におけるＶＥＧＦ２の発現レベルを試験するために行った。全細胞性ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌＴＭ  Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて単離した。各々の特定された乳房組織および細胞株から単離された約１０μｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）。標識反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って５０  ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いて行った。標識したＤＮＡを、５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．からのＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムを用いて精製した。次いでフィルターを、放射性標識全長ＶＥＧＦ２遺伝子を用いて、１，０００，０００  ｃｐｍ／ｍｌで０．５Ｍ
ＮａＰＯ４および７％ＳＤＳ中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、室温で２回および６０℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンとともに−７０℃で一晩曝露した。１．６  Ｋｂのメッセージが２つの乳ガン細胞株において観察された。レーン＃４は、増殖がエストロゲン非依存性である非常に腫瘍形成性の高い細胞株を表す。図４を参照のこと。また、１０のヒト成人組織由来の１０μｇの全ＲＮＡをアガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルターにブロットした。次いでフィルターを放射性標識ＶＥＧＦ２プローブを用いて、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ中で、６５℃で一晩ハイブリダイズした。０．２×ＳＳＣ中で６５℃で洗浄した後、フィルターをフィルムに増感スクリーンとともに−７０℃で２４日間曝露した。図５を参照のこと。
【実施例２】
【０１２０】
インビトロでの転写および翻訳によるＶＥＧＦ２の発現
ＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡをインビトロで転写および翻訳して、全長および部分ＶＥＧＦ２
ｃＤＮＡによりコードされる翻訳可能なポリペプチドのサイズを測定した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中のＶＥＧＦ２の全長および部分ｃＤＮＡ挿入物を、以下の３対のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。１）  Ｍ１３逆方向および正方向プライマー；２）  Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ４；３）  Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ５。これらのプライマーの配列は以下のとおりである。
Ｍ１３−２逆方向プライマー：
５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’
この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡ挿入物の５’末端の上流に位置し、そしてｃＤＮＡのアンチセンス方向にある。Ｔ３プロモーター配列がこのプライマーとＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡとの間に位置する。
Ｍ１３−２正方向プライマー：
５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’
この配列は、  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡ挿入物の３’末端の下流に位置し、そしてｃＤＮＡ挿入物のアンチセンス方向にある。
ＶＥＧＦプライマーＦ４：
５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’
この配列は、ＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡ内にアンチセンス方向でｂｐ  １２５９〜１２３９で位置し、これは終止コドンの３’末端から約１６９  ｂｐ離れており、そしてｃＤＮＡの最後のヌクレオチドの約２６６  ｂｐ前である。
【０１２１】
３つすべてのプライマーの対を用いたＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ挿入物の前のＴ３プロモーター配列を有する増幅産物を生成する。第１および第３のプライマーの対は、ＶＥＧＦ２の完全なポリペプチドをコードするＰＣＲ産物を生成する。第２のプライマーの対は、ＶＥＧＦ２ポリペプチドのＣ末端の３６アミノ酸をコードする配列を欠失するＰＣＲ産物を生成する。
【０１２２】
第１のプライマーの対由来の約０．５μｇのＰＣＲ産物、第２のプライマーの対由来の１μｇ、第３のプライマーの対由来の１μｇを、インビトロでの転写／翻訳のために使用した。インビトロでの転写／翻訳反応を、２５μｌの容積中で、ＴＮＴＴＭ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＣＡＴ＃  Ｌ４９５０）を用いて実施した。詳細には、反応物は１２．５μｌのＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物、２μｌのＴＮＴ反応緩衝液、１μｌのＴ３ポリメラーゼ、１μｌの１ｍＭアミノ酸混合物（−メチオニン）、４μｌの３５Ｓメチオニン（＞１０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０  ｍＣｉ／ｍｌ）、１μｌの４０  Ｕ／μｌ；ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター、０．５または１μｇのＰＣＲ産物を含有する。ヌクレアーゼなしのＨ２Ｏを添加して容量を２５μｌとした。反応物を３０℃で２時間インキュベートした。反応産物の５μｌを４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。２５％イソプロパノールおよび１０％酢酸中で固定した後、ゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルムに７０℃で一晩曝露した。
【０１２３】
図６に示すように、全長ＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡおよび３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）中の２６６  ｂｐを欠失するｃＤＮＡを含有するＰＣＲ産物は、同じ長さの翻訳産物を生成し、この分子量は３８〜４０  ｋｄであると見積もられる（レーン１および３）。すべての３’ＵＴＲを欠失し、そしてＣ末端の３６アミノ酸をコードする配列を欠失するｃＤＮＡは、３６〜３８  ｋｄの概算の分子量を有するポリペプチドに翻訳された（レーン２）。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図１Ａ】図１Ａは、ＶＥＧＦ２をコードするポリヌクレオチド配列、および対応する推定のアミノ酸配列（その最初のおよそ２４アミノ酸がリーダー配列を表す３５０アミノ酸残基を含むＶＥＧＦ２完全長ポリペプチド）を示す。標準的な３文字略語を、アミノ酸配列を示すために使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃの続きである。
【図２Ａ】図２Ａは、増殖因子ＰＤＧＦα、ＰＤＧＦβ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ２の間のアミノ酸レベルでの相同性を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの続きである。
【図３】図３は、図表の形式で、ＰＤＧＦα、ＰＤＧＦβ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ２の間の相同性の百分率を示す。
【図４】図４は、乳ガン細胞株におけるＶＥＧＦ２のｍＲＮＡの存在を示す。
【図５】図５は、ヒト成人組織におけるＶＥＧＦ２のノーザンブロット解析の結果を示す。
【図６】図６は、インビトロ転写／翻訳後に泳動したＶＥＧＦ２およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。完全長および部分ＶＥＧＦ２  ｃＤＮＡを、３５Ｓメチオニンの存在下でのカップルした反応において転写して翻訳した。翻訳された産物を、４〜２０％勾配ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析し、そしてＸ線フィルムに曝した。
【０１２５】
（配列表）
【０１２６】
【表１】
2006333865.tif 000002
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【図１Ａ】
2006333865.tif 000017
【図１Ｂ】
2006333865.tif 000018
【図１Ｃ】
2006333865.tif 000019
【図１Ｄ】
2006333865.tif 000020
【図２Ａ】
2006333865.tif 000021
【図２Ｂ】
2006333865.tif 000022
【図３】
2006333865.tif 000023
【図４】
2006333865.tif 000024
【図５】
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【図６】
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