(57)【要約】【課題】簡易な手法により、チップ上に固定化された物質における反応率、特に固定化された基質ペプチドのリン酸化効率を定量化できるバイオチップを提供する。【解決手段】２種以上の物質からなる混合物が複数種基板の表面に固定化されてなるバイオチップであって、かつ該固定化された混合物を構成する物質の混合比率が２種類以上存在することを特徴とするバイオチップ。特にＳＰＲによる解析によって、チップ上に固定化された基質のリン酸化反応率を定量化するのに有用なバイオチップ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の物質からなる混合物が複数種基板の表面に固定化されてなるバイオチップであって、かつ該固定化された混合物を構成する物質の混合比率が２種類以上存在することを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
混合物を構成する物質の少なくとも一方の物質のみが、混合物と同一の基板の表面に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
混合物がペプチドの混合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。
【請求項４】
混合物がリン酸化されたアミノ酸残基を有するペプチドを含むことを特徴とする請求項３に記載のバイオチップ。
【請求項５】
表面が金であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項６】
基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項８】
固定化された混合物を構成するいずれか1種の物質に関わる反応性を定量するための検量線を得るために用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項９】
基質のリン酸化率を定量するための検量線を得るために用いることを特徴とする請求項８に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チップ上に固定化された物質の反応割合、例えばリン酸化の割合を定量化する新規な方法に関するものである。より具体的には、特に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと示すこともある。）による分析技術を用いることにより、そのシグナルに基づき固定化基質におけるリン酸化率を数値化するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップを用いた解析技術は、プロテオミクスにおける解析手段・ツールとして広く用いられている。例えば、蛋白質の翻訳後修飾、特に蛋白質のリン酸化に関するネットワークの解析は、細胞において営まれる生命現象を理解する上で重要である。そのためには、リン酸化修飾による活性調節、機能調節を含めて網羅的に詳細に解析する手段が求められている。近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、増殖因子やサイトカインにより活性化した細胞表面の受容体からどのように核へシグナルが伝達されるかはもとより、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生死などを制御する様々なシグナル伝達経路の実態が明らかになってきた。これらのシグナル伝達経路は独立して機能しているのではなく、互いにクロストークしあうことによってシステムとして機能している。そして、癌をはじめ色々な疾病の原因がこれらのシグナル伝達経路の異常として説明されるようになってきた。
【０００３】
上述したシグナル伝達経路においては、様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析して、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待される。しかしながら、これまでには簡便で効率よく種々のプロテインキナーゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術は、未だ十分なレベルのものが確立されていないのが現状である。ましてや、蛋白質のプロテインキナーゼによるリン酸化に関する定量化に関しては、未だほとんど実現されていないのが現状である。
【０００４】
既に報告されている関連する技術としては、例えばペプチドアレイを用いてチロシンキナーゼの一種であるｃＳｒｃキナーゼの活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ｐ６０チロシンキナーゼやプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡとも示す。）などに関して、おのおのの基質ペプチドをガラススライドに固定化したアレイを用いて、蛍光標識された抗体を用いたリン酸化反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献２及び３参照）や、あるいは放射性物質（［γ32Ｐ］ＡＴＰ）を用いたアレイ上でのキナーゼ反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献４，５及び６参照）がある。しかしながら、いずれの先行技術においても種々のプロテインキナーゼの動態を同時に効率的にプロファイリングための方法としては、十分な技術が開示されているものではない。また上記いずれの方法においても、蛍光性物質や放射性物質を用いる必要があり、解析に手間を要する点や、取り扱いの困難性、特殊な技術や施設の必要性などの点で大きな問題がある。
【０００５】
また、上述したようなリン酸化に関するプロファイリングに際しては、その目的に応じて定性的なレベルのみならず定量的な視点からも評価する必要性がある。しかしながら、アレイ化した場合の個々の基質がそれぞれどの程度のリン酸化を受けているのかを同時に定量化することは非常に困難な技術であり、これまで報告されている技術においてはほとんど実現されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２０巻、第２７０〜２７４頁（２００２年３月発行）
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第１２巻、第２０８５〜２０８８頁（２００２年発行）
【非特許文献３】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第１２巻、第２０７９〜２０８３頁（２００２年発行）
【非特許文献４】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第１３巻、第３１５〜３２０頁（２００２年発行）
【非特許文献５】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２７７巻、第２７８３９〜２７８４９頁（２００２年発行）
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８９巻、第１７６０〜１７６３頁（２０００年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アレイ上において得られたシグナル強度から、簡単な計算処理を行うことによりその反応効率を定量化するための方法を提供しようとするものである。例えば、アレイ上に固定化された蛋白質やペプチドにおけるリン酸化効率を定量するための有用な手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、特に定量したい固定化基質におけるシグナル変化量と、標準基質として予めリン酸化されている基質におけるシグナル変化量との比を算出することが、固定化基質のリン酸化割合を定量化する上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明は以下のような構成からなる。
１．２種以上の物質からなる混合物が複数種基板の表面に固定化されてなるバイオチップであって、かつ該固定化された混合物を構成する物質の混合比率が２種類以上存在することを特徴とするバイオチップ。
２．混合物を構成する物質の少なくとも一方の物質のみが、混合物と同一の基板の表面に固定化されていることを特徴とする１のバイオチップ。
３．混合物がペプチドの混合物であることを特徴とする１又は２のバイオチップ。
４．混合物がリン酸化されたアミノ酸残基を有するペプチドを含むことを特徴とする３のバイオチップ。
５．表面が金であることを特徴とする１〜４のいずれかのバイオチップ。
６．基板が透明基板であることを特徴とする１〜５のいずれかのバイオチップ。
７．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いることを特徴とする１〜６のいずれかのバイオチップ。
８．固定化された混合物を構成するいずれか1種の物質に関わる反応性を定量するための検量線を得るために用いることを特徴とする１〜７のいずれかのバイオチップ。
９．基質のリン酸化率を定量するための検量線を得るために用いることを特徴とする８のバイオチップ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオチップは、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便な方法により、アレイ上に固定化された物質の反応性などを定量化することを可能にするものである。特にチップ上に固定化された基質のリン酸化割合を定量化する上で有用であり、様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行ううえで非常に有用な手法である。本発明は、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的な解析、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態のプロファイリングに適用することができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、２種以上の物質からなる混合物が複数種基板の表面に固定化されてなるバイオチップにおいて、固定化された混合物を構成する物質の混合比率が２種類以上、好ましくは５種類以上、更に好ましくは１０種類以上存在することを特徴とするものである。より好ましくは、混合物を構成する物質の少なくとも一方の物質のみが、ポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして混合物と同一の基板の表面に固定化される。混合物を構成する物質は特に限定されるものではなく、核酸、蛋白質、ペプチド、糖、脂質などの一般的な生体分子に適用することができるが、特にペプチドに適用されるのが好ましい。なかでも、予めリン酸化されたペプチド（以下、「リン酸化ペプチド」とも示す。）と通常のペプチドとの混合物（以下、「混合ペプチド」と示すこともある。）の系に適用されるのが特に好ましく、リン酸基による修飾の有無以外に同じアミノ酸配列からなるペプチドの対からなる混合ペプチドを用いるが最も効果的である。この場合、リン酸基の有無により両方のペプチドの基板への固定化効率に関しては、基本的にほとんど差異は生じないものと考えられるので定量化に用いるには非常に好都合である。
【００１２】
本発明における基板上における作用に関する検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことが可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。ＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能である点でより好ましい。
【００１３】
なかでも、ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を本発明のアレイ上に適用して行うことができる。最適なリン酸化反応条件はプロテインキナーゼの種類に応じて変動するが、例えば、反応バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ2+，Ｃａ2+、リン脂質などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させるのがよい。
【００１４】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できるが、特に限定されるものではない。
【００１５】
ここでペプチドをプロテインキナーゼの基質として用いる場合は、１種類のペプチドは１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが理想的であり好ましい。プロテインキナーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。あるいは、バイオインフォマティクスの手法を駆使することにより、特にリン酸化を受けやすいアミノ酸配列の基質ペプチドを設計して用いてもよい。
【００１６】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１７】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω1 と周波数ω2）が媒質中で混合され、ω1＋ω2、あるいはω1−ω2の光が発生する現象である。特にω1として可視光を用い、ω2として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１８】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のリン酸化割合の混合ペプチドにおけるリン酸基とリン酸基に特異的な作用を示す何らかの検出プローブとの相互作用を解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲは蛍光物質、放射性物質などによるラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１９】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２０】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップの場合、好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２１】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【００２２】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２３】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、まず上述したような種々の混合割合のリン酸化ペプチド及び非リン酸化ペプチド（この場合、リン酸基による修飾の有無以外は同じアミノ酸配列を有している。）からなる混合ペプチドを固定化したアレイに対して、リン酸基に対する検出プローブを作用させた際のシグナル強度を、好ましくはＳＰＲにより測定して、リン酸化割合とシグナル強度との間のキャリブレーション曲線を作成する。この場合において、各リン酸化ペプチドの配合比を有する混合ペプチドにおけるシグナル強度と１００％リン酸化された基質ペプチドにおけるシグナル強度との比を算出して、この値をリン酸化割合に対してプロットすることによりキャリブレーション曲線を得る方法が好ましい。このような手法を採ることにより、非常に再現性に優れたリン酸化率に関するキャリブレーション曲線を得ることができる。
【００２４】
その後、実際の測定用アレイにおけるｏｎ  ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼ反応によるチップ上の基質に関するリン酸化率を、上記キャリブレーション曲線を用いることによって定量化することが可能となる。上記混合ペプチドを構成するリン酸化基質ペプチド及び非リン酸化基質ペプチドが少なくとも固定化されたアレイを用い、且つ該アレイに例えば細胞破砕液等のプロテインキナーゼを含有する溶液を作用させ、さらに検出プローブを作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲにより検出する。ここで用いるペプチドは、プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドである。このようにして得られた非リン酸化基質ペプチドにおけるシグナル上昇とリン酸化基質ペプチドにおけるシグナル上昇との比を算出し、上記のキャリブレーション曲線に当てはめることにより、リン酸化率を求めることが可能である。
【００２５】
ペプチドを用いる場合、その長さは特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のものが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産されたペプチドを用いてもよい。また基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させたものを用いるのも有用である。
【００２６】
上記ペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。
【００２７】
その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００２８】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるためには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。
【００２９】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加したペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００３０】
本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするためにリン酸化された基質との結合性を有する検出プローブを用いる。該検出プローブとしては、リン酸化アミノ酸もしくはリン酸化ペプチドを認識する抗体を用いることが可能である。より好ましくはキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３１】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３２】
【化１】
2006170617.tif 000002
【００３３】
上記のような錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ2Ｌ）は、市販の１，３−ビス[ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ2Ｌ−ＣＨ3ＣＯＯ-・２ＣｌＯ4-・Ｈ2Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００３４】
本発明においては、上述のようなポリアミン亜鉛錯体をビオチンにより修飾されたものを用いることが好ましい。直鎖状のリンカー構造を介してビオチン修飾されていることが好ましい。具体的には、式（ＩＩ）に示されるような構造のものが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００３５】
【化２】
2006170617.tif 000003
【００３６】
なお、本発明において作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。
【００３７】
ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させる場合、それだけでもリン酸化を検出することは可能な場合もあるが、特にビオチンが修飾されたものを用いることにより、その後更にアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることにより、その検出感度がより高まるという効果を期待することができる。ストレプトアビジンを作用させる方がより好ましい。作用させるアビジンもしくはストレプトアビジンの濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の場合と同様である。
【００３８】
更に好ましい態様として、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後に、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体いずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。アレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンの場合と同様である。
【００３９】
また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。
【００４０】
こうしたキレート性化合物の適用は、上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応性が依存されにくい点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。
【００４１】
上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４３】
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００４４】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００４５】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤であるＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ピアス製；以下、ＳＳＭＣＣと示す。）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るためマレイミド基を表面に導入することができた。
【００４６】
上記のようにして得られた表面に、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示す）の基質（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，ｐｐ．４８８８−４８９４；１９７７年）に関して、リン酸化基質と非リン酸化基質からなる混合ペプチドを固定化させた。基質の混合比率は１０倍系列で用意した。いずれの基質ともにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、目的の比率で混合した。基質ペプチドのアミノ酸配列並びにその固定化に関する配置は、図１Ａに示す通りである。−はペプチドを固定化しないブランクスポットを示す。調製した基質溶液を、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTMスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００４７】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、ＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、３００μｌをチップ上に注出し、室温で３０分反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００４８】
（アレイ上のリン酸基のＳＰＲによる検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（ＩＩ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所より購入）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４は２５μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。作用は室温で１時間行った。
【００４９】
【化３】
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【００５０】
上記作用させたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、上記と同じ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ストレプトアビジン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製）を同緩衝液に溶解して１０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製し、プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。ストレプトアビジンの結合によるセンサーグラムにおけるシグナル上昇が定常化された時点でランニングバッファーを送液させて洗浄した。
【００５１】
上述に解析結果に基づいてＳＰＲイメージングを行った。これはＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、ストレプトアビジン（以下、ＳＡと示すこともある。）反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。図１Ａに結果を示した。リン酸化基質の混合割合が高いほど濃いスポットが確認されており、リン酸化基質の割合に比例的にＰｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４が特異的に結合していることが確認されている。
【００５２】
（キャリブレーションカーブの作成）
上記のＳＰＲ解析において得られたそれぞれの混合基質におけるシグナル変化量とリン酸化基質におけるシグナル変化量の比を算出した。この値をリン酸化基質の混合割合に対してプロットしたグラフを作成した。その結果を図１Ｂに示した。Ｒ2＝０．９６８６と非常に高い相関性を示す検量線を得ることができた。
【００５３】
［実施例２］
マレイミド基を表面に導入する工程までは実施例１と同様にして行い、アレイをＰＢＳ及び水でアレイを洗浄した。その後上述のＰＫＡ基質に関して、リン酸化基質及び非リン酸化基質を固定化したアレイを６枚作製した。調製したアレイの未反応マレイミド基のブロッキングも、実施例１と同様に行った。ブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で１０分、２０分、３０分、1時間、２時間、４時間の反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）４μｌとした。
【００５４】
それぞれの時間でＰＫＡ反応を行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４を実施例１と同じ条件により作用させた。そのアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。実施例１と同様にストレプトアビジン溶液を１０μｇ／ｍｌ濃度で送液しながら作用させた。その結果得られた各ＰＫＡ反応時間によるセンサーグラムにおけるＰＫＡ基質におけるシグナル変化量とリン酸化ＰＫＡ基質におけるシグナル変化量の比を算出した。この値をＰＫＡ反応時間に対してプロットしたグラフを作成した。その結果、図２に示すようなＰＫＡによるリン酸化に関するタイムコース曲線を得ることができた。
【００５５】
図２に示されるように、固定化されたＰＫＡ基質のリン酸化反応は約２時間でほぼ定常化することが確認された。また、図１Ｂにおけるキャリブレーションカーブより、この基質が受けたリン酸化の割合は約７０％と推定された。図３の右列にＰＫＡ反応時間を変えながら、ＳＰＲイメージングを検討した結果を示した。アレイのスポットパターンは図３下部に示した通りである。ＰＫＡ基質におけるシグナルを経時的に比較すると、特異的に強くなっている様子が確認される。
【００５６】
同じアレイを用いて、オートラジオグラフィにより同様の検討を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃での反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７８μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、γ33Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）１μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、３０分間の露光処理をしてオートラジオグラフィ測定を行った。読み取りはＢＡＳ１８００ＩＩ（富士写真フイルム製）を使用し、専用のＩＰシートを用いて行った。結果は、図３左列に示す通りで、ＰＫＡ基質におけるＲＩの取り込みが経時的に強くなっていることが示されている。この結果より、ＳＰＲ解析において得られたシグナルはリン酸化反応に起因するものであることが検証された。
【００５７】
［実施例３］
実施例１と同様にして、ｃＳｒｃ基質（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，ｐｐ．２０８５−２０８８；２００２年）に関しても、リン酸化基質ペプチドと非リン酸化基質ペプチドからなる混合ペプチドを混合比率は１０倍系列で用意してアレイ化してキャリブレーションを行った。実施例１と同様にしてリン酸化率とシグナル比との間のキャリブレーションを行った。その結果を図４に示した。図１Ｂに示したＰＫＡの場合とは異なる挙動パターンの曲線が得られている。そのために、定量性のあるリン酸化率の領域はかなり狭いものになっている。
【００５８】
次に実施例２と同様にして、ｏｎ  ｃｈｉｐでｃＳｒｃ反応（３０℃）を行い、タイムコースを検討した。ｃＳｒｃ反応溶液（３００μｌをドロップ）の組成は、ｃＳｒｃキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ製；５Ｕ／μｌ）６μｌ、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２７６μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ３μｌとした。タイムコース曲線を得た結果を図５に示した。この場合のリン酸化の進行はあまりシャープな挙動ではないが、経時的にリン酸化が進む様子は示される。約３時間の反応でほぼ定常化になっている。このときのリン酸化率は、図４のキャリブレーション曲線に当てはめると１０％程度とかなり低い値であった。
【００５９】
実施例２と同じくＳＰＲイメージング及びオートラジオグラフィにより、ｃＳｒｃ反応による経時的変化を検討した。アレイは図３に示したものと同じパターンのものを用いた。結果を図６に示した。この場合も、ｃＳｒｃ基質において特異的にリン酸化される様子を、いずれの検出系においても確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のバイオチップは、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便な方法により、アレイ上に固定化された物質の反応性などを定量化することを可能にするものである。特にチップ上に固定化された基質のリン酸化割合を定量化する上で有用であり、様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行ううえで非常に有用な手法である。本発明は、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的な解析、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態のプロファイリングに適用することができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待され、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１におけるＳＰＲイメージングの結果及び得られたリン酸化ＰＫＡ基質に関する検量線を示す図である。
【図２】実施例２において、ＳＰＲ解析により得られたＰＫＡ反応のタイムコースを示す図である。
【図３】実施例２において、ＰＫＡによる基質のリン酸化の進行を、ＳＰＲイメージング及びオートラジオグラフィにより経時的に検証した結果を示す図である。
【図４】実施例３において得られた、リン酸化ｃＳｒｃ基質に関する検量線を示す図である。
【図５】実施例３において、ＳＰＲ解析により得られたｃＳｒｃ反応のタイムコースを示す図である。
【図６】実施例３において、ｃＳｒｃによる基質のリン酸化の進行を、ＳＰＲイメージング及びオートラジオグラフィにより経時的に検証した結果を示す図である。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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