(57)【要約】【課題】  花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、植物の雄性不稔体を生産する技術を提供する。【解決手段】  花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が花器形成に関与する遺伝子の発現を優性に抑制する結果、正常な花粉形成ができない、植物の雄性不稔体が生産される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、以下の（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質、
に記載のタンパク質からなる転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することを特徴とする植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項２】
上記植物の雄性不稔体は、少なくとも雄蕊の形成が阻害されていることを特徴とする、請求項１に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項３】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１または２に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項４】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項１〜３に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項５】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項３または４に記載の植物の雄性不稔体の生産方法、
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列の第２１６位から第８９０位からなる塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｅ）上記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記植物は単子葉植物である請求項１〜５に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項７】
上記植物はイネである請求項１〜６に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｆ）又は（ｇ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｇ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１３】
上記機能性ペプチドが、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１４】
上記機能性ペプチドが、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、植物の雄性不稔体。
【請求項１６】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１５に記載の植物の雄性不稔体。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物の雄性不稔体生産キット。
【請求項１８】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１７に記載の植物の雄性不稔体生産キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術に関し、特に、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、単子葉植物の雄性不稔体を生産する生産方法およびこれを用いて得られる植物体、ならびにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
異なる品種間で交配させ、雑種を作ると、両親より優れた形質が子供に現れる。これを雑種強勢という。この雑種強勢を利用した交配により、農産物をハイブリッド化して優良品種を作出することが、現在、一般的になっている。例えば、主要な野菜や穀物の優良品種のほとんどは、こうした交配により品種改良されている。
【０００３】
雑種強勢の利益を受けるためには、互いに異なった品種間で交配させる必要がある。このため、交配を行う品種において、自家受粉が行われないようにする必要がある。ここで、トウモロコシなどの、雄花と雌花が離れた植物では、雄花を人為的に刈り取ることにより、自家受粉を避けることができる。しかし、この作業は、多大な人的労力を有し非常に手間となる。また、イネに代表される自殖性植物では、多数の花が集合していたり、雌蕊と雄蕊が花弁を包み込んでいたりする。そのため、人為的に雄花を刈り取ることすら困難であり、自家受粉を避けることは非常に難しい。
【０００４】
したがって、雑種強勢を利用した交配を行うためには、正常な花粉形成ができない、いわゆる雄性不稔体を利用することが望ましい。事実、これまで、トマトやキュウリなどの多くの植物において、雄性不稔体が得られ、品種改良に利用されてきた。
【０００５】
しかし、一方、雄性不稔体が確立されていない植物品種もまた、多数、存在することも事実である。これらの植物において、雄性不稔体を、突然変異によって新たに得る場合、成果を偶然性に委ねざるをえないため、長期にわたる交配が必要となる。したがって、労力もコストも多大に必要となり、現在の農業において、その取り組みは現実的に困難である。
【０００６】
そこで、遺伝子組み換え技術を利用して、人為的に雄性不稔体を確立する試みが、これまでいくつか報告されている
非特許文献１には、核内遺伝子による雄性不稔を人為的に引き起こす技術が開示されている。この技術では、ペニチュアにカルコンシンターゼのアンチセンス遺伝子を導入して、カルコンシンターゼの活性を抑制する。これにより、フラボノイドの生合成的前駆体であるカルコンの生合成が抑えられ、形質転換されたペニチュアは雄性不稔体となる。
【０００７】
非特許文献２には、毒性物質によりタバコの葯を消失させることで、雄性不稔体を作出する技術が開示されている。この技術では、Ｎ−アセチル−Ｌ−オルニチンデアセチラーゼを転写・翻訳産物とする、ａｒｇＥ遺伝子を、タペート組織において特異的に機能するＴＡ２９プロモーターに類似するＤＮＡ配列に融合させた形で、タバコに導入する。次に、このタバコに、毒性のないＮ−アセチル−Ｌ−フォスフィノスリシンを投与する。すると、葯において発現されたＮ−アセチル−Ｌ−オルニチンデアセチラーゼによって、Ｎ−アセチル−Ｌ−フォスフィノスリシンが脱アセチル化され、毒性のある、Ｌ−フォスフィノスリシンとなる。この毒性物質によって、葯がネクローシスを起こして消失するため、形質転換されたタバコは、花粉が形成されない雄性不稔体となる。
【０００８】
また、非特許文献３には、細胞質雄性不稔を人為的に引き起こす技術が開示されている。この技術では、コムギ由来の、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアatp9遺伝子を、タバコ細胞に導入する。これにより、不活性のＡＴＰ９タンパク質が発現されて、ミトコンドリアに移行する。その結果、ミトコンドリアの機能が阻害されるため、形質転換されたタバコは雄性不稔体となる。
【０００９】
さらに、非特許文献４には、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアａｔｐ９遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入した別の形質転換タバコを作成し、これと、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアａｔｐ９遺伝子を導入した形質転換タバコとを交配することによって、次世代で稔性が回復する形質転換タバコを作出する技術が開示されている。
【００１０】
ところで、ＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子であるシロイヌナズナＡＰＥＴＡＬＡ３遺伝子は花器形成に関与するホメオティック遺伝子であることが知られている。このＡＰＥＴＡＬＡ３遺伝子が欠損した突然変異体では花弁ががく片に転換しており、雄蕊がその内側にできるべき雌蕊に転換する。
【００１１】
また、同様にＭＡＤＳ−ｂｏｘ遺伝子であるイネのＳＰＷ１遺伝子は、ＡＰＲＴＡＬＡ３遺伝子のホモログ（オルソログ）であることが報告されている（例えば、非特許文献５参照）。さらにこのイネＳＰＷ１遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することにより、そのＡＰＲＴＡＬＡ３遺伝子のホモログとしての機能を解析したことについての報告がなされている（例えば、非特許文献６）。
【００１２】
ここで、本発明者は、転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献７、８参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Ingrid M. van der Meer, Maike E. Stam, Arjen J. van Tunen, Joseph N. M. Mol, and Antoine R. Stuitje. The Plant Cell, Vol 4, pp 253-262, March, 1992
【非特許文献２】G. Kriete, K. Niehaus, A.M. Perlick, A. Puehler and I. Broer, The Plant Journal, Vol 9, pp 809-818, 1996
【非特許文献３】Michel Hernould, Sony Suharsono, Simon Litvak, Alejandro Araya, and Armand Mouras., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 90, pp. 2370-2374, March, 1993
【非特許文献４】Eduardo Zabaleta, Armand Mouras, Michel Hernould, Suharsono, and Alejandro Araya., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, Vol 93, pp 11259-11263, October, 1996
【非特許文献５】Nagasawa,N., Miyoahi,M., Sano,Y., Satoh,H., Hirano,H., Sakai,H., Nagato,Y., Development 130, 705-718, 2003
【非特許文献６】Xiao,H., Wang,Y., Liu,D., Wang,W., Li,X., Zhao,X., Xu,J., Zhai,W., Zhu,L., Plant Mol Biology 52, 957-966. 2003
【非特許文献７】Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
【非特許文献８】Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、上記非特許文献６で報告されている、ＳＰＷ１の発現をＲＮＡｉによって抑制させる方法では、1つの形質転換個体で調べた１８５個の花の内、野生型の植物体が有する６つの雄蕊のうち、１つの雄蕊が心皮に変化した花の数は７０個、２つの雄蕊が心皮に変化した花は３０個、3つの雄蕊が心皮に変化した花は４個にすぎず、残り８１個の花は正常であることが報告されている。また、４つ以上の雄蕊が心皮に変化した花は見られなかった。このように、ＳＰＷ１の発現をＲＮＡｉによって抑制する方法では完全な雄性不稔の個体を得ることはできない。
【００１４】
また、従来、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を植物体で生産させることによって、植物の雄性不稔体を生産する技術は知られていない。
【００１５】
本発明は、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を植物体で生産させることによって、効率よく雄性不稔体を生産する、植物の雄性不稔体の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子の１つであるＳＰＷ１タンパク質を転写抑制因子に転換することによって、ほとんどすべての植物体の花で雄蕊の形成が阻害されている雄性不稔植物体を生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法は、上記課題を解決すべく、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、以下の（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質、
に記載のタンパク質からなる転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することを特徴としている。上記生産方法では、植物の雄性不稔体は、少なくとも雄蕊の形成が阻害されたものであることが好ましい。
【００１８】
これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、上記キメラタンパク質が生産された植物体が雄性不稔体となるという効果を奏する。
【００１９】
また、上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。
【００２０】
また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００２１】
これにより、上記キメラタンパク質を形質転換された上記植物細胞内で発現させることができる。それゆえ、該キメラタンパク質が標的遺伝子の転写を抑制し、植物体が雄性不稔体となるという効果を奏する。
【００２２】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子。（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列の第２１６位から第８９０位からなる塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｅ）上記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかと相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【００２３】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
【００２４】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｆ）又は（ｇ）記載のペプチドであってもよい。（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。（ｇ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【００２６】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２７】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２８】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００２９】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００３０】
上記機能性ペプチドが、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の転写（発現）を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００３１】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産された雄性不稔植物体であることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００３２】
また、本発明にかかる植物の雄性不稔体生産キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記植物の雄性不稔体生産キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法では、以上のように、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する。したがって、上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子で目的の植物を形質転換すれば雄性不稔植物を生産することができ、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に目的の植物を雄性不稔化することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００３５】
本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術であって、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させるものである。これによって得られる植物体では、正常な花粉形成ができないため、本発明により、雄性不稔植物体を生産できる。
【００３６】
ここで、正常な花粉形成ができなくなることは、次のようにして起こる。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花器形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、例えば雄蕊の形成が阻害されるなどして、正常な花粉形成ができない雄性不稔植物体を得ることが出来る。
【００３７】
本発明の生産方法で生産される植物の雄性不稔体（本雄性不稔体）は、正常な花粉形成ができないものである。すなわち、本雄性不稔体の例には、雄蕊の形成が阻害され、花粉がまったく形成されないものや、雄蕊は形成されるが、葯が形成されないために、花粉が形成されないものや、雄蕊も葯も形成されるが、形成される花粉の量が少なく、葯の開裂に至らないものや、形成された花粉が肥大化して互いにくっついてしまい、全く飛散しないもの、などがある。
【００３８】
なお、本雄性不稔体では、雌蕊は稔性を有している。このため、本雄性不稔体に他種の花粉を授粉できる。したがって、雑種強勢を利用した交配により、一代雑種を得ることが出来る。
【００３９】
また、本雄性不稔体では、正常な花粉形成ができなくなることに加えて、他の組織の形成が正常に行われなくなっていてもよい。例えば、本雄性不稔体は、花弁、がく、鱗被、内穎、外穎等が通常とは異なる形に形成されるものや、あるいは全く形成されていないものでもよい。例えば、花弁、がく、鱗被、内穎、外穎等がまったく形成されなければ、雌蕊が露出するため、他種の花粉を授粉する際の手間（花弁、がく、鱗被、内穎、外穎等を除去する等）を簡略化できる。
【００４０】
以降の説明では、本発明にかかる雄性不稔植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用について、それぞれ説明する。
【００４１】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。
【００４２】
また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものである。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質は、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、該当する転写因子が制御する、花器形成に関わる遺伝子の発現を、一様に抑制できる。そのため、遺伝子導入可能なあらゆる植物を、雄性不稔体に容易に形質転換できる。
【００４３】
以下では、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００４４】
（Ｉ−１）花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質からなる転写因子であれば特に限定されるものではない。花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子は多くの植物に保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有するタンパク質が含まれる。
【００４５】
このような転写因子としては、ＭＡＤＳ−Ｂｏｘを含んだ転写因子であるＳＰＷ１タンパク質、ＳＩ１（ＳＹＬＫＹ１）タンパク質、コムギＷＡＰ３タンパク質（Plant J, 29(2), 169-181, Murai,K. et al.2002)、オオムギＨＶＡＰ３タンパク質（ＡＹ５４１０６５）等を挙げることができるが、上記転写因子はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、イネＳＰＷ１タンパク質を挙げることができる。イネＳＰＷ１タンパク質は、例えば配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、上述したように、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であることが知られている。また、イネでは、このＳＰＷ１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＳＰＷ１遺伝子と称する）の突然変異株ｓｐｗ１において、鱗被と雄蕊の形成が阻害されることが知られている。本発明では、例えば、このイネＳＰＷ１タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるイネＳＰＷ１タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００４７】
上述したように、イネＳＰＷ１遺伝子に変異が起こると雄蕊の形成が阻害されることは知られている。しかし、例えば、ＳＰＷ１遺伝子が雄蕊の形成が阻害されるという表現型の原因遺伝子であることがわかっていても、一般的にかかる表現型を有する植物体を遺伝子操作を用いて生産させようとする場合、期待どおりの効果を得ることが難しいことが知られている。その理由として遺伝子操作の対象となる制御因子に重複因子が存在していることや、別の経路（バイパスの存在）にて補足されてしまうことが挙げられる。
【００４８】
従って、例えばＳＰＷ１タンパク質が促進する転写を抑制するのみでは、雄蕊の形成を阻害することは通常困難である。本発明にかかる方法では、上記機能性タンパク質を例えばＳＰＷ１タンパク質と融合させることにより、かかる困難性を克服することに成功した。
【００４９】
また、ＲＮＡｉ法によりＳＰＷ１遺伝子の働きを抑える方法では、上述したように、雄蕊の形成の阻害は十分ではなかった。これに対して、本発明にかかる方法では、上記転写因子をコードする遺伝子に上記機能性ペプチドをコードする遺伝子を結合したキメラ遺伝子を植物体に導入することによって、非常に効率的に目的の植物の雄蕊の形成を阻害することが可能となる。
【００５０】
本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるＳＰＷ１タンパク質に限定されるものではなく、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５１】
また、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列に対して、５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％または８０％以上の相同性を有するタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なおここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。
【００５２】
なお、特に高等生物では、可変スプライシングの結果生じるスプライシングバリアントが複数存在することが知られており、ＳＰＷ１タンパク質でも、複数のスプライシングバリアントが存在する。従って、上記ＳＰＷ１タンパク質には、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に限られず、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有する転写因子である限り、かかるスプライシングバリアントも含まれる。
【００５３】
また、本発明で用いられる、花器形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、雄性不稔体を生産したい個々の植物体において、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する固有の転写因子やその遺伝子を、必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、イネで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産できると考えられる。
【００５４】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００５５】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＳＰＷ１タンパク質を用いる場合には、このＳＰＷ１遺伝子を挙げることができる。ＳＰＷ１遺伝子は、ＳＰＷ１遺伝子をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列の第２１６位から第８９０位からなる塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子を挙げることができる。もちろん、ＳＰＷ１遺伝子には、さらに非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列を含むものも含まれる。かかるＵＴＲを含むＳＰＷ１遺伝子としては、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５６】
もちろん、本発明で用いられるＳＰＷ１遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１３５に示される塩基配列の第２１６位から第８９０位からなる塩基配列または配列番号１３５に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列の第２１６位から第８９０位からなる塩基配列または配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００５７】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００５８】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５９】
（Ｉ−２）転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチド（特許文献１〜７、非特許文献５・６等参照）であればよい。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【００６０】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６１】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６２】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６３】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００６４】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６５】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６６】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６７】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００６８】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６９】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７０】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００７１】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７２】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６または４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９または５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２または５３に示すアミノ酸配列である。
【００７３】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００７４】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列からなるペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００７５】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００７６】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｆ）又は（ｇ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｇ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【００７７】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００７８】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００７９】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列からなるペプチドに限られず、その部分配列からなるペプチドであってもよい。
【００８０】
その部分配列からなるペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）からなるペプチドが挙げられ、その部分配列からなるペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８１】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。
【００８２】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。
【００８３】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２、３４、１３３、５９、又は６０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８４】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８または３９で表されるアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００８５】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００８６】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。
【００８７】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００８８】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１、５５、又は５７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、２、５６、又は５８に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３、５９、６０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号２０、２１に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００８９】
【表１】
2006042730.tif 000002
【００９０】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００９１】
（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００９２】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００９３】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００９４】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、アクチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、アクチンプロモーターまたはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００９５】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００９６】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００９７】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【００９８】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００９９】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１００】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１０１】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０２】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１０３】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１０４】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１０５】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接、植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Goto,F., Yoshihara,T., Shigemoto,N., Toki,S., and Takaiwa,F.,(1999) Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene, Nature biotechnology 17,282-286に記載の方法を用いることができる。
【０１０６】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１０７】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１０８】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１０９】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１１０】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、成長した植物体において、正常な花粉形成ができないことを基準として選抜してもよい。
【０１１１】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により、花器形成に関与する遺伝子の発現が抑制された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１２】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１１３】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。その際、キメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。
【０１１４】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花器形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、花器形成に変異が生じ、花粉形成が正常に行われなくなる雄性不稔性の植物体を得ることができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる雄性不稔植物体も含まれる。
【０１１５】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
本発明にかかる雄性不稔植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、被子植物であってもよく被子植物であってもよいし、双子葉植物であってもよく単子葉植物であってもよいが、これらの中でも本発明にかかる雄性不稔植物体は単子葉植物であることがより好ましい。その中でも、本発明にかかる雄性不稔植物体は、雄性不稔性を獲得することによりその有用性が高まる植物であることがさらに好ましい。かかる植物としては、例えば、食用、飼料用、工業用に用いられる植物を挙げることができる。具体的には、例えば、イネ、オオムギ、パンコムギ、ライムギ、カラスムギ、ハトムギ、サトウキビ、トウモロコシ、モロコシ、ホシクサ、パイナップル、ショウガ、ミョウガ、ヤマノイモ、イグサ、サトイモ、タマネギ、コンニャク等の植物を挙げることができる。
【０１１６】
また、本発明にかかる雄性不稔植物体は、花や植物体そのものを商品とする観葉植物や花卉植物であってもよい。したがって、本発明にかかる雄性不稔植物体の具体例をさらに挙げると、リュウゼツラン、アヤメ、ハナショウブ、ユリ、チューリップ、ジャノヒゲ、ヤブラン、スイセン、ホテイアオイ、ヒヤシンス、クロッカス、ラン科の植物等の各種の植物を挙げることができる。
【０１１７】
あるいは、本発明にかかる雄性不稔体は、雄性不稔性を獲得することにより、それ自体で、生物農薬として機能しうる雑草であってもよい。かかる植物としては、畑地雑草や水田雑草等の雑草を挙げることができる。具体的には、例えば、イヌビエ、エノコログサ、キンエノコロ、スズメノカタビラ、スズメノテッポウ、ニワホコリ、アキメヒシバ、メヒシバ、カモガヤ、ススキ、チガヤ、チカラシバ、ヨシ等イネ科の雑草、ツユクサ等の植物を挙げることができる。
【０１１８】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明は、植物体に雄性不稔性を付与することにより一定の効果がある分野に有用性がある。具体例を以下にいくつか挙げるが、本発明の有用性は、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
まず、本発明の技術により、正常な花粉形成ができない雄性不稔植物体を作出でき、雑種強勢を利用した交配による品種改良に利用できる。本発明の雄性不稔植物体では、正常な花粉形成ができないため、イネ等の自殖性植物であっても、自家受粉が行われない。そのため、他種の花粉を授粉することで、種間の交配を簡便に行える。これにより、雑種強勢を利用した、優良品種の一代雑種の探索を簡便かつ効率的に行うことができる。従って、例えば、本発明の技術を遺伝子組換えイネに用いることによって、作物育種に有用な雄性不稔イネを再現性よく高頻度で作出することができる。それゆえ、育種的に有用な形質を付与したイネを効率的に作出することができる。さらに、コムギやオオムギなどの重要な作物に本技術を応用することによって、雄性不稔植物体を利用した有用作物の育種的作出を行なうことができる。
【０１２０】
また、本発明の技術は、トウモロコシ等の他殖性植物にも適用できる。他殖性植物では、現在、人力で雄蕊を刈り取る作業（除雄作業）により自家受粉を回避し、他品種の花粉を授粉して品種改良を行っている。これに対し、本発明の技術で雄性不稔植物体を生産すれば、このような労力を必要としなくなるため、品種改良に必要な時間やコスト、あるいは優良品種の栽培に必要な手間を、現状に比較して大幅に低減することができる。
【０１２１】
また、本発明の技術は、タマネギ、ユリ、チューリップ、ヒヤシンス、クロッカス、コンニャク、サトイモなど、地下茎を商品とする植物にも応用できる。この種の植物では、受粉が起こると、地下茎の成長が著しく阻害され、商品価値が下がることが知られている。そのため、現在、受粉を回避するために除雄作業が必要となり、そのための手間やコストが非常に大きい。本発明の技術により、地下茎を商品とする植物の雄性不稔体が得られるため、除雄作業を必要とせず、受粉を回避できる。そのため、植物体を育成して商品を生産する際のコストや時間を、現状に比較して大幅に低減できる。
【０１２２】
本発明の技術は、果実や花を商品としない植物体にも好適に応用できる。その一例を挙げると、花粉症の予防がある。すなわち、花粉症の原因となる花粉を大量に撒き散らす植物、例えば、カモガヤ、オオアワガエリ、ナガハグサなどのイネ科植物などの雑草類において、本発明の技術により雄性不稔体を生産すれば、正常な花粉形成ができないため、これらの植物体から花粉が飛散する恐れがない。そのため、これらの雄性不稔体を、自然界の野生型植物体と置き換えてやれば、花粉症の原因となる花粉の飛散が抑えられるため、花粉症を予防できる。
【０１２３】
また、本発明の技術により、花粉を経由するウイルスの感染が原因となる、植物の病気を予防できる。ある種の植物ウイルスは、病的植物の花粉内に存在し、雄蕊を通じて健全植物に伝染して病気を引き起こすことが知られている。本発明の技術により、正常な花粉形成ができない植物体を生産すれば、花粉を媒介するウイルス感染が行われないため、かかる植物の病気を予防できる。
【０１２４】
本発明の技術により、遺伝子改変植物体の自然界への望ましくない拡散を防止できる。一例を挙げると、パルプの原料であるユーカリでは、遺伝子操作により、耐塩性や耐寒性に優れ、樹木が巨大化するなどの、より優れた形質を導入された遺伝子改変植物体が創出され、野外環境下における導入形質の検証実験が行われている。しかし、このような遺伝子改変植物体を野外環境下で育てると、風や昆虫等を媒体とした花粉の拡散を通じて、遺伝子改変植物体が自然界へ広く拡散していき、自然環境が改変される恐れがある。そのため、かかる問題に対処するために、遺伝子改変植物の検証実験を、外界から完全に隔離された、特殊な環境下で行う必要がある。
【０１２５】
しかし、本発明の技術を用いて、遺伝子改変植物体を、正常な花粉形成ができない雄性不稔体に形質転換させておけば、花粉の撒布による遺伝子改変植物体の自然界への拡散は起こらない。そのため、現状に比較して、実際の野外環境下により近い条件で、遺伝子改変植物体の検証試験を行うことができる。これにより、遺伝子改変植物体に導入した形質を、より自然な環境下で検証できる。
【０１２６】
また、本発明の技術を畑地雑草や水田雑草等の雑草に応用すれば、雄性不稔となる雑草を作出することができる。かかる雑草は、自然界の野生型雑草の花粉を受粉するがその次世代の一部は雄性不稔となるため、野生型の雑草の繁殖を抑えることができる。このように、本発明の技術を雑草に用いれば、生物農薬として利用することができる。
【０１２７】
また、本発明の技術を用いれば、萼や雄蕊など、花器の一部が欠損したり、あるいは変形したりした植物体を生産することができる。これにより、従来には存在しなかった特異な形状の花器を有する植物体を生産できるため、これまでにない、新たな観賞植物を得ることが出来る。
【０１２８】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち植物の雄性不稔体化キットを挙げることができる。
【０１２９】
この雄性不稔体化キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【０１３０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３１】
以下、実施例及び図１ないし図５に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３２】
本実施例においては、イネアクチンプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドをイネＳＰＷ１遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをイネにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、イネを形質転換した。
【０１３３】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターｐ３５ＳＧの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１３４】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３９）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１４０）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１４１）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１３５】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１３６】
（３）以下の配列番号１４２、１４３の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４２、１４３の配列からなるＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１４２）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１４３）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１３７】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターｐＡｃｔＧの構築＞
得られたｐ３５ＳＧを用いて、形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐＡｃｔＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（３）のとおりに構築した。
【０１３８】
（１）上記ベクターｐ３５ＳＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化し、電気泳動にてＣａＭＶ３５Ｓ領域を除去し、ａｔｔＬ１断片を回収した。
【０１３９】
（２）東京大学より譲渡されたプラスミドｐＡｃｔＦ１／ＴＡ（N.Sentoku, Y.Sato, M.Matsuoka, Develop.Biol.220,358-364(2000))を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩで消化し、電気泳動にてイネアクチンプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を回収した。
【０１４０】
（３）得られたＤＮＡ断片を、ＣａＭＶ３５Ｓを除去した上記ｐ３５ＳＧプラスミド断片のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。これをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し、回収しておいたａｔｔＬ１断片を挿入し、ベクターｐＡｃｔＧを完成させた。
【０１４１】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐＡｃｔＳＲＤＸＧを、図３に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１４２】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号１４４）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号１４５）
（２）ｐＡｃｔＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧを構築した。
【０１４３】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図４に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１４４】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１４５】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。
【０１４６】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１４７】
＜構築用ベクターへのＳＰＷ１遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐＡｃｔＳＲＤＸＧにイネ由来の転写因子ＳＰＷ１タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１４８】
（１）イネから調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くＳＰＷ１遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＳＰＷ１−Ｆ）5'- gggatggggaggggcaagatcga -3'（配列番号１３６）
プライマー２（ＳＰＷ１−Ｒ）5'- tcaaccgaggcgcaggtcgtggt -3'（配列番号１３７）
ＳＰＷ１遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３５および１３４に示す。
【０１４９】
（２）得られたＳＰＷ１コード領域のＤＮＡ断片を、図３に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐＡｃｔＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１５０】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１５１】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるアクチンプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１５２】
（１）まず、イネＳＰＷ１遺伝子のコード領域が順方向に挿入されたｐＡｃｔＳＰＷ１ＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。
【０１５３】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１５４】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１５５】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（５）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸで、イネの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。
【０１５６】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸを、培養後１０％glycerolで洗浄されたアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーション後、リファンピシリン１００ｍｇ／ｍｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上で２８℃、２日間培養することでアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸ）を得た。
【０１５７】
（２）イネの種子を７０％エタノールで1分浸漬し、さらに２％次亜塩素酸ナトリウムに１時間浸漬することにより滅菌した。次いで滅菌水により水洗後、Ｎ６Ｄ固形培地(1リットル当たり: CHU[N6] Basal Salt Mixture(Sigma社製) 3.98g、スクロース 30g、ミオイノシトール 100mg、カザミノ酸 300mg、L-プロリン 2878mg、グリシン 2mg、ニコチン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸 1mg、2,4-D 2mg、ゲルライト 4g、pH 5.8)のプレートに９粒ずつ播種し、２４日間培養しカルスを誘導した。形成された種子約２０粒分のカルスを、新たなＮ６Ｄ固形培地に移植し、さらに３日間培養した。
【０１５８】
（３）一方アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸ）を５ｍｌのリファンピシリン１００ｍｇ／ｍｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｍｌを含むＹＥＰ培地(1リットル当たり: Bacto peptone 10g、Bacto yeast extract 10g、NaCl 5g、MgCl２・6H２O 406mg、pH 7.2)で２８℃で２４時間培養した。このアグロバクテリウムを２０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地(1リットル当たり: MnSO４・5H２O 10mg、H３BO３ 3mg、ZnSO４・7H２O 2mg、Na２MoO４・2H２O 250μg、CuSO４・5H２O 25μg、CoCl２・6H２O 25μg、KI 750μg、CaCl２・2H２O 150mg、MgSO４・7H２O 250mg、Fe-EDTA 40mg、NaH２PO4・2H２O 150mg、ニコチン酸 1mg、チアミン塩酸10mg、ピリドキシン塩酸 1mg、ミオイノシトール 100mg、L-アルギニン 176.7mg、グリシン7.5mg、L-グルタミン 900mg、アスパラギン酸 300mg、KCl 3g、pH 5.2)でＯ．Ｄ．６６０が０．１になるように薄め、２０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を作製した。
【０１５９】
（４）先述の３日間培養したカルスをアグロバクテリウム懸濁液と1分間混ぜた。その後このカルスを滅菌したペーパータオルに置き余分なアグロバクテリウム懸濁液を除去した。次いで、このカルスを滅菌された濾紙を敷いた２Ｎ６−ＡＳ固形培地(1リットル当たり: CHU[N6] Basal Salt Mixture 3.98g、スクロース 30g、グルコース 10g、ミオイノシトール 100mg、カザミノ酸 300mg、グリシン 2mg、ニコチン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸 1mg、2,4-D 2mg、アセトシリンゴン 10mg、ゲルライト 4g、pH 5.2)の上で２５℃で３日間、暗黒下で培養した。３日間の培養後、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含む３％スクロース水溶液で白濁しなくなるまで十分に洗浄し、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン１０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地上で１週間培養した。その後カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン５０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地に移植して、１８日間培養した。
【０１６０】
（５）さらにこのカルスを再分化培地(1リットル当たり:ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(日本製薬社製) 4.6g、スクロース 30g、ソルビトール 30g、カザミノ酸 2g、ミオイノシトール 100mg、グリシン 2mg、ニコチン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸0.5mg、チアミン塩酸 0.1mg、NAA 0.2mg、カイネチン 2mg、カルベニシリン250mg、ハイグロマイシン50mg、アガロース 8g、pH 5.8)に移植した。1週間ごとに新しい培地に移植し直し、再分化して芽が１ｃｍ程度に生長したものはホルモンフリー培地(1リットル当たり:ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(日本製薬社製) 4.6g、スクロース30g、ソルビトール 30g、カザミノ酸 2g、ミオイノシトール 100mg、グリシン 2mg、ニコチン酸 0.5mg、ピリドキシン塩酸 0.5mg、チアミン塩酸 0.1mg、ハイグロマイシン50mg、ゲルライト 2.5g、pH 5.8)に移植した。ホルモンフリー培地上で８ｃｍ程度に生長した植物体を合成粒状培土ボンソル１号（住友化学社製）を入れた植木鉢に移し、形質転換植物体を育てた。このようにして、アグロバクテリウムを感染させたカルスを再分化・育成させたＴ１植物体を７ライン取得した。
【０１６１】
（４）各ラインについて、これらの植物体から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＰＷ１ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１６２】
（５）得られたＴ１植物体について花を観察した。その結果、現在調査中の２ラインを除く５ラインのＴ１植物体において、ほとんどすべてのＴ１植物体の花で雄蕊が雌蕊化していることが確認された。図５に、５ラインのＴ１植物体について穂及び花を観察した結果を示す。図５（ａ）はコントロールとして、ＳＰＷ１遺伝子と転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を含まない以外は実施例で用いたものと同様のベクターを導入したイネの花を、（ｂ）はその穂を示している。図５（ｃ）は得られたＴ１植物体のライン＃１から得られた花を、（ｄ）はその穂を示している。図５（ｅ）は得られたＴ１植物体のライン＃４から得られた花を、（ｆ）はその穂を示している。図５（ｇ）は得られたＴ１植物体のライン＃５から得られた花を、（ｈ）はその穂を示している。図５（ｉ）は得られたＴ１植物体のライン＃６から得られた花を、（ｊ）はその穂を示している。図５（ｋ）は得られたＴ１植物体のライン＃７から得られた花を示している。なお、図中に示されている花は、内部が見えるように、外穎および内穎（または、形質転換体においては外穎および内穎様の器官）の半分を取り除いたものである。図５に示すように、得られたＴ１植物体では、野生型（コントロール）では６本ある雄蕊が、いずれの例においても雌蕊化し、雄蕊の形成が阻害されていることが確認された。また、６本の雄蕊のすべてが雌蕊化していた。
【０１６３】
また、図５（ｂ）に示すように、コントロールでは、開花後に葯を外に残したまま穎花が閉じている。このように、イネの開花は、穎花が開き、葯が外に突き出し、葯を外に残したまま穎花が閉じるという一連の動きである。これに対して、得られたＴ１植物体では、図５（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）に示すように、外に残された葯が全く観察されない。これは、Ｔ１植物体では、雄蕊（花糸および葯）が形成されないためである。
【０１６４】
また、表２に、Ｔ１植物体について穂の数、葯および花粉が形成されず結実もなかった穂の数、花の異常の有無を示す。なお、ここで「葯および花粉が形成されず結実もなかった」とは、「雄蕊が雌蕊化したために葯が開花後外に残っておらず、結実もしなかった」ことをいう。表２に示すように、Ｔ１植物体のライン＃１、＃４、＃５、＃６、＃７では、全ての穂において葯および花粉が形成されず結実もなかった。また、全ての花に異常が見られた。このように、非特許文献６でＲＮＡｉによってＳＰＷ１の発現を抑制した場合には、少なくとも１つの雄蕊が心皮に変化した花の数が形質転換体の花全体の数に対して５６、２％であったとの報告に対し、本発明の方法では、形質転換体の花全体の数に対して、略１００％の花においてすべての雄蕊が雌蕊に変化した。
【０１６５】
このように、ｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、雄蕊の形成が阻害された、正常な花粉形成が行なわれない変異体であった。なお、この植物体の雌蕊に、野生型の植物体の花粉を受粉すると、種子が形成された。このことから、ｐＢＩＧ−ＳＰＷ１ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、雌蕊が稔性を有した雄性不稔体であることが確認できた。
【０１６６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明によれば、正常な花粉形成が行われないが、雌蕊は稔性を有している、いわゆる雄性不稔植物体を、広範囲の植物で生産できる。それゆえ、本発明は、各種農業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】実施例において用いるベクターｐ３５ＳＧの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いるベクターｐＡｃｔＧの構築方法を示す工程図である。
【図３】実施例において用いるベクターｐＡｃｔＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子と、ＳＰＷ１遺伝子とを組み込む工程図である。
【図４】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図５】図５（ａ）はＳＰＷ１遺伝子と転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を含まないベクターを導入したイネの花を示す図であり、（ｂ）はその穂を示す図であり、（ｃ）は得られたＴ１植物体のライン＃１から得られた花を示す図であり、（ｄ）はその穂を示す図であり、（ｅ）は得られたＴ１植物体のライン＃４から得られた花を示す図であり、（ｆ）はその穂を示す図であり、（ｇ）は得られたＴ１植物体のライン＃５から得られた花を示す図であり、（ｈ）はその穂を示す図であり、（ｉ）は得られたＴ１植物体のライン＃６から得られた花を示す図であり、（ｊ）はその穂を示す図であり、（ｋ）は得られたＴ１植物体のライン＃７から得られた花を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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