(57)【要約】【課題】  励振電極上にリガンドを形成し、その上で発生する反応の状態を、質量の変化として検出する集積型微少質量検出チップの引き出し電極に関するもので、容易にＤＮＡの検査ができるようにすることを目的とする。【解決手段】  課題を解決するために、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、前記凹部を形成する圧電単結晶基板の一部に溝部の流路を形成し、前記流路から試薬を注入することで目的を達成する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの該反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、
前記凹部を形成する圧電単結晶基板の一部に溝部の流路を形成し、前記流路から試薬を注入することを特徴とする微少質量検出チップ。
【請求項２】
請求項１記載の微少質量検出チップにおいて、個々の微少質量検出チップの前記圧電単結晶基板に形成する流路凹部内側の一方には、２稜線に略１２０°拡がる流路があり、他方の溝部の流路にも２稜線に略１２０°拡がる流路により他方の流路に連結した微少質量検出チップが連続していることを特徴とする微少質量検出チップ。
【請求項３】
請求項１記載の微少質量検出チップにおいて、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ルを形成し前記スルーホールを介して対面側に引き出したことを特徴とする微少質量検出チップ。
【請求項４】
請求項３記載の微少質量検出チップにおいて、電気的特性・気密性を維持するため、スルーホ−ルをシール材で埋めたことを特徴とする微少質量検出チップ。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４に記載の微小質量検出チップにおいて、凹部の反応膜下の基板部位を反応膜の厚みと同等にまでへこませて加工し、反応側凹部底面を平らにしたことを特徴とする微少質量検出チップ。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５に記載の微少質量検出チップにおいて、複数の励振電極（反応側電極）上に、それぞれ異なる塩基配列のＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片が固定されたことを特徴とする微少質量検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、励振電極上にリガンドを形成し、その上で発生する反応の状態を、質量の変化としてリアルタイムに検出する集積型微少質量検出チップの薬液を注入する流路形状に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本明細書の使用方法を説明するにあたり、ＤＮＡチップを一例として説明する。近年、人の遺伝子構造がほぼ解明され、テーラーメイド医療などを目的に解明された遺伝子の持つ機能の調査，研究が本格化してきている。この遺伝子の機能解明の一手法として、ＤＮＡチップが用いられている。ＤＮＡは、Ａ（アデニン），Ｔ（チミン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）の４つの塩基により形成された２本の分子鎖が、螺旋状に結合して形成されている。４つの塩基は、それぞれ結合することが可能で、その組み合わせはＡとＴ、ＣとＧとなっている。
【０００３】
従来、ＤＮＡチップは、平板のガラスやシリコンなどの基板上に、高密度にＤＮＡ分子の断片を固定したものである。そして、検体となるＤＮＡを被検者の血液から抽出液中に抽出し、その溶液中のＤＮＡを１本鎖に分離切断した後、抽出溶液を含めてＤＮＡチップの表面に滴下すると、ＤＮＡチップ上に構成されたＤＮＡ配列に対応して検体ＤＮＡが結合するので、その結合状態を蛍光変化として判定している。
【０００４】
則ち、現在実用化されているＤＮＡチップを用いた検出方式で、レーザを照射して蛍光を測定する蛍光検出方式である。この方式では、検体となるＤＮＡに予め蛍光色素で標識をつけ、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に結合した検体ＤＮＡの有無を、レーザ光照射による蛍光色素の発光により検出する方法で、判定までには多くの時間を必要とし、医療現場など緊急判断には問題である。（非特許文献１参照）。
【０００５】
これに対して本願出願人は、リアルタイム計測を目的として既に出願している特許文献１に示す様な水晶基板を用いたＤＮＡチップを提案している。
このＤＮＡチップは水晶基板に形成された各々分離した複数の例えば凸部、凹部ら成る島部（セル）と、その上に構成された電極膜に構築された特有の塩基配列を持つＤＮＡ群から構成され、このＤＮＡチップを溶液中で交流電圧を印加して励振させ、その励振周波数を確認しながら、検体から検出されたＤＮＡを含む溶液を注入するとＤＮＡ相互間の結合の状態により、電極上の質量が微小変化するため、励振周波数が変化する。また、この結合の様子は周波数を繰り返し計測することでリアルタイムに観測することが可能となる。
【０００６】
このとき、各セルの励振電極はそれぞれ独立した引き出し電極により端子に接続とれており、各セルが独立で励振できるような配線構造をとっている。以上のように、圧電式微小質量計測センサは、例えば水晶振動子表面に電極を形成し、この膜表面上で物質を脱着することにより質量変化を周波数変化として捉える手法であり、この現象をサブレーの式から算出している。
【０００７】
【非特許文献１】原田  学，佐藤  高遠，米田  英克、「ＤＮＡチップの現状と展望」、応用物理、第６９巻、第１２号（２０００）
【特許文献１】特開２００３−２８７５３８号公報  なお出願人は前記した先行技術文献情報で特定される先行技術文献以外には、本発明に関連する先行技術文献を、本件出願時までに発見するに至らなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述したような、従来の技術では、レーザ照射装置など大がかりな装置が必要となり、システムが高価なものとなる。また、この様な手法では、反応状態を定量的に検出することが容易ではない。本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、定量的測定、リアルタイムに容易に異なる複数種のＤＮＡの検出ができるようにすることを目的とし、更なるＤＮＡチップの利便性を高めたＤＮＡチップ構造となっている。
【０００９】
その具体的な特徴としては、圧電素子を使用して、ＤＮＡの合致性、抗原、抗体反応などを質量変化で観測する場合センサ部の片側を溶液中に露出する必要がある。このとき、溶液に接する電極（反応側電極）は、センサ素子の外周部を経由して気相側に引き出した後、気相環境においてリード線を介して発振器や計測機器などに接続される。しかし例えばマトリックス状のセルで構成した集積型反応解析では、それぞれのセルを逆メサ構造で構築することが最も有効な構造と考える。
【００１０】
上述する微少質量検出チップを用いた場合、計測時の試薬、媒質溶液が少量である場合、試薬の流れにムラがあったり、また凹部を備えた圧電単結晶基板の微少質量検出チップの場合にあっては、溶液を入れ替える過程において、凹部の角部に試薬が残存することも考えられ、試薬溶液中の反応が均一に行き渡らないなどの課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述する課題を解決するために本発明は、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、前記凹部を形成する圧電単結晶基板の一部に溝部の流路を形成し、前記流路から試薬を注入することを特徴とする微少質量検出チップである。
【００１２】
そして、その微少質量検出チップにおいては、個々の微少質量検出チップの前記圧電単結晶基板に形成する溝部の流路の凹部内側の一方には、２稜線に略１２０°拡がる流路があり、他方の流路にも２稜線に略１２０°拡がる流路により他方の前記流路に連結した微少質量検出チップが連続した形態を有している。
【００１３】
従って、所定の間隔で各々分離した複数の凹部を備えた水晶基板と、前記凹部に相当部分の表裏には電極を形成し、特有な塩基配列を持つ複数の１本鎖ＤＮＡから構成されており、前記ＤＮＡチップの励振電極を形成する一方の引き出し電極を、前記ＤＮＡチップの主面の一部にスルーホールを形成して対向面側に引き出し電極をＤＮＡチップの一方側に導出した構造であり、実際の測定時にはスルーホールをシール材で埋めた形状となっている。
【００１４】
また、ＤＮＡチップとしては前記凹部上には金薄膜電極が形成され、その表面を親水性にする親水処理を施した領域を構築し、更に前記ＤＮＡ断片は、一端がＳＨ基に置換され、前記ＳＨ基を介して前記ＤＮＡ断片が前記金薄膜に固定されていることを特徴とするＤＮＡチップである。
【００１５】
上述する本発明のＤＮＡ検査方法の原理としては、所定の間隔で各々分離した複数の凸部や凹部などからなるセルを備えた水晶基板を用意し、例えば各々の凹部上に標識された特有の塩基配列から構成されたリガンド（ＤＮＡ）断片を固定し、溶液中でＤＮＡ断片が固定された状態の各々凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第１の測定周波数とし、次ぎに検体となるＤＮＡ（狙いとするＤＮＡ）を含んだ溶液中に所定時間接触させ、各々の凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第２の測定周波数とし、第２の測定周波数と第１の測定周波数との差が発生することにより、検体となるＤＮＡの中から標識されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列のものを検出するようにしたものである。このＤＮＡ検査方法によれば、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの重量を検出することで実現する。
【００１６】
また、反応進行中に繰り返し周波数を計測することにより、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となるほか微少質量検出チップ同士を連続して接続した流路を形成することで、異なる特有の塩基配列のＤＮＡを用意しておき、同一検体ＤＮＡ溶液を流路を介して流すことで、複数の反応結果を得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したように、本発明によれば、試薬溶液の乱流を防止することが出来、溶液残が発生しないので、確実に反応に対して溶液を分離して扱うことができるので計測信頼性が向上する。その結果サブレーの理論に基づいて測定結果を忠実に再現できることにより、公式をそのまま利用して精度良く計測が可能となる。また、凹部の液導入出口壁面を１２０°に開く形態を有する微少質量検出チップは、凹部角部に残留する試薬を無くすことにより、使用する試薬の変換量が少量でも液の置換が確実になり、精度の良い計測が可能となるため測定効率を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における微小質量検出チップ（ＤＮＡチップ）の構成を示す斜視図（ａ）と断面図（ｂ）である。このＤＮＡチップは、一辺が２０〜２５ｍｍ程度、板厚０．１ｍｍ程度のＡＴカットの水晶基板１上に、直径１ｍｍ程度，深さ５０〜６０μｍ程度の複数の凹部２が、２ｍｍ間隔でマトリクス状に形成され、これら複数の凹部２上に、励振電極として金を表面を表面とするが、チタン−金合金の薄膜を形成し、励振時の周波数別に２５〜４０ＭＨｚ程度になるように凹部を加工し、形成された金薄膜３の表面に、リガンド（ＤＮＡ断片）が各々固定されているものである。
【００１９】
凹部２の上へのＤＮＡ断片の固定は、つぎに示すようにする。まず、所望とする１本鎖ＤＮＡ断片の一端をＳＨ基で置換された状態とする。次いで、ＳＨ基で一端が置換されたＤＮＡ断片が分散している溶媒中に、金薄膜３が各凹部２の表面に形成された水晶基板１を浸漬する。このことにより、金薄膜３の上にＳＨ基が引き寄せられて固着する。この結果、金薄膜３の表面にＳＨ基を介してＤＮＡ断片が固定された状態となる。この後、水晶基板１上の溶液はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で置換しておく。
【００２０】
上述するＤＮＡチップの本願発明の特徴には、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成しスルーホールを介して対面側に引き出したことを特徴とする微少質量検出チップである。また、複数個をひとつの圧電基板上に複数の励振電極（反応側電極）上に、それぞれ異なる塩基配列のＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片（リガンド）を固定することで、各種の成分を同時に測定することもできる。
【００２１】
要するに、図１の断面図に示すように、圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、凹部に形成する励振電極を圧電結晶基板の一部にスルーホール４を形成し、裏面へと引き出すことを特徴するものである。なお、図１では個々の素子を表現するために、圧電結晶基板の全体を二点鎖線で示している。
【００２２】
ここで、図１については、リガンドを形成する箇所が圧電結晶基板の凹部の底部に電極を形成したものであり、図２については、同様の構成ながら電極形成部を更に削りリガンドが底部の表面と同一面（高さ）になるようにしたものである。
このチップで使用する電極膜厚は数百ｎｍ程度のものが使用され、計測しようとするＤＮＡ分子数層分の厚みとなる。ここで重量−周波数変換のためのＳａｕｅｂｒｅｙの式（１式）をみると、
【００２３】
ｄＦ＝−（ｄＭＦ２）／（Ａρｋｆ）  ・・・（１式）
ｄＦ２  ：周波数変化
ｄＭ  ：質量変化
Ｆ    ：励振周波数
Ａ    ：電極面積
ρ    ：水晶の密度
ｋｆ   ：水晶のＴＳ−ｍｏｄｅでの音速
であり、電極膜側面部（膜厚）に付着反応した場合は膜厚部分に測定誤差が発生することになる。従って、リガンドの形成表面と凹部底面の表面と同一（平坦になる）にすることで、本願発明の主眼でもある、計測精度の向上と流路６から試料を注入した場合の試料の流れが更に円滑になることで、測定効率を高めることができる。
【００２４】
しかしながら、凹部底面に形成するリガンドの全体高さは僅かであるために、図１で示す形態であっても、図２で示す形態であっても同様に試料の流れの円滑性と、リアルタイムで検体を測定できることには変わりは無い。
【００２５】
そして、図３は図１の形態を例にした場合の断面図である。図３に示すように実際に微少質量検出チップとして動作するときには、電気的特性と気密性を維持するためにスルーホ−ル４をシール材で埋めた構造となっている。ここではシール材５としては金シリコン合金を用いているが、イオン化傾向の小さな材料を使用すれば、金シリコン合金に限るものでは無い。
【００２６】
なお、本願発明の微少質量検出チップでは、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成し、スルーホールを介して反対面に引き出したことを特徴として記述しているが、圧電基板上に形成する凹部に試験薬を貯めるために、凹部側に蓋体を被せた構造と、試料（検体）の量の節約、汚染防止などの効果がある。
【００２７】
図４に示す模式図は蓋体を割愛した図で、本願発明の特徴である流路６の構成と、凹部内の流路６の入口と出口との形態を説明する図である。図４では矢印で示す方向で溶液を流すことを表示したものである。この形態によりその微少質量検出チップにおいては、個々の微少質量検出チップの前記圧電単結晶基板に形成する溝部の流路の凹部内側の一方には、２稜線に略１２０°拡がる流路６があり、他方の流路にも２稜線に略１２０°拡がる流路６により他方の前記流路に連結した微少質量検出チップが連続した形態を有することができ、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となる。なお、１２０°に拡がる流路６のにより、その周辺部の試料の溜まりを防止することができる。
【００２８】
そして同時に、微少質量検出チップ同士を連続して配置し、各々のチップを流路６により接続することで、異なる特有の塩基配列のＤＮＡを用意しておき、同一検体ＤＮＡ溶液を流路６を介して流すことで、複数の反応結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施例を示す斜視図（ａ）と部分断面図（ｂ）である。
【図２】本発明の他の実施例を示す斜視図（ａ）と部分断面図（ｂ）である。
【図３】本発明の微少質量検出チップを個別で見たときの、スルーホール部分をシールで塞いだ概念図を示す模式図である。
【図４】本願発明の要部を説明する拡大図である。
【符号の説明】
【００３０】
１        水晶基板
２        凹部
３        金薄膜（引き出し電極）
４        スルーホール
５        シール材
６        流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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