(57)【要約】【課題】蛍光試料の分光学的又は顕微鏡的検査において、観察されるべき現象と、必然的に生起する暗状態とを一義的ないし明確に区別可能にすること。【解決手段】とりわけ蛍光着色されたタンパク質（複数）を有する蛍光処理試料の分光学的又は顕微鏡的検査の際の暗状態の検出方法であって、励起光の励起／照明体積及び従って強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に、変化されること、及びその際観察される時定数が変化するか否かを検出すること、及び時定数が変化しなかった場合、暗状態の存在が結論されることを特徴とする。【選択図】図１
2006234815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光試料の分光学的又は顕微鏡的検査の際の暗状態の検出方法であって、
励起光の励起／照明体積及び従って強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に、変化されること、及び
その際観察される時定数が変化するか否かを検出すること、及び
時定数が変化しなかった場合、暗状態の存在が結論されること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記励起／照明体積は、互いに独立の測定（複数）の際に変化されること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記励起／照明体積は、アパーチャの変化を介して影響を受け、該励起／照明体積は、該アパーチャに対して反比例の関係にあること
を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記励起／照明体積は、照明ビーム路（４）に配されたホール絞りを介して、変化されること
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記励起／照明体積は、照明ビーム路（４）に配された色選択性絞り（１６）を介して変化されること
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定（複数）は、同じ光強度の励起光で実行されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記励起／照明体積の異なる複数の調整状態に基づいて光強度が変化される場合、該光強度は、相応の値に追随調整されること
を特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
光源と、検出装置とを有する、蛍光試料の分光学的又は顕微鏡的検査のための装置であって、
前記光源と前記試料との間に照明ビーム路が延在し、かつ前記試料と前記検出装置との間に検出ビーム路が延在するよう構成された装置において、
前記励起光の前記励起／照明体積及び従って前記強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に、変化されること、及び
その際観察される時定数が変化されるか否かを検出されること、及び
時定数が変化されなかった場合、暗状態が存在するものと結論されること
を特徴とする装置。
【請求項９】
前記励起／照明体積を変化するために、前記照明ビーム路（４）に、ホール絞りが配設されること
を特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記ホール絞りは、虹彩絞り（９）として構成されること
を特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記ホール絞りは、少なくともほぼ平行な光ビームを有する前記照明ビーム路（４）の領域に配設されること
を特徴とする請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記ホール絞りは、主ビームスプリッタ（１０）又はＡＯＢＳに前置されること
を特徴とする請求項９〜１１の何れか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記励起／照明体積を変化するために、前記照明ビーム路（４）に、色選択性絞り（１６）が配設されること
を特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１４】
複数の色選択性絞り（１６）が、選択のために配設されること、及び
前記複数の色選択性絞り（１６）は、フィルタターレット（１９）に配されかつ選択的にビーム路に旋回挿入可能に構成されること
を特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記色選択性絞り（１６）は、照明光の方向、即ち試料（１）に向かう方向では、その都度の励起波長に応じて部分透過性であり、かつ検出光の方向、即ち検出装置（３）へ向かう方向では、完全に透過性であること
を特徴とする請求項１３又は１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記色選択性絞り（１６）は、前記照明光の２又は３以上の波長のために、それぞれの波長に応じてそれぞれ異なる照明径が、実現されるように構成されること
を特徴とする請求項１３〜１５の何れか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記絞りは、該絞り（１６）を通過しない照明光が該絞り（１６）によって吸収されるように構成されること
を特徴とする請求項１５又は１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記絞り（１６）を通過しない照明光は、該絞り（１６）によって反射されかつ前記検出ビーム路（５）から外へフィルタ除去されること
を特徴とする請求項１５又は１６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ蛍光処理されたタンパク質（複数）を有する蛍光試料の分光学的又は顕微鏡的検査の際の暗状態の検出方法に関する。本発明は、更に、光源と、検出装置とを有し、前記光源と前記試料との間に照明ビーム路が延在し、かつ前記試料と前記検出装置との間に検出ビーム路が延在するよう構成された、とりわけ蛍光処理されたタンパク質（複数）を有する蛍光試料の分光学的又は顕微鏡的検査のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明に関連する分光学的又は顕微鏡的検査の分野では、ごく一般的に、観察可能なフルオロフォアの光化学的性質が問題となる。例えば、後掲特許文献１のとりわけ第９欄第２７行〜第５０行及び第５図及び第１４図参照。
【０００３】
【特許文献１】ＵＳ５，７４２，４３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生物学的試料の検査では、生細胞の観察が問題となることがしばしばある。その際、目的の細胞タンパク質（複数）を遺伝子工学的に蛍光標識するために、蛍光（標識）化（蛍光処理）されたタンパク質（複数）が使用される。相応の標識により、当該タンパク質の生細胞中における運動が観察及び分析可能となる。
【０００５】
ところで、その際問題となるのは、フルオロフォアの極めて特殊な現象、即ち、三重項遷移、異性化、プロトン化等によって引き起こされる明滅ないしまばたき現象（Blinken）とも称されるいわゆる暗状態（Dunkelzustaende）の生起である。このような暗状態の生起ないし（出現）頻度及びその寿命は、多くの要因、例えばフルオロフォアの周囲（環境）に依存するが、とりわけ励起光の光強度にも依存する。必ずといっていい程に生起する暗状態に関連して、暗状態の時定数（Zeitkonstanten）が拡散時間の範囲内にある場合、この２つの現象の間で最早区別を行うことができないという、生物学的試料の観察時に重大な問題が生じる。換言すれば、観察された状態が、暗状態なのか、細胞からの拡散が生起した結果なのかを区別することができない。
【０００６】
それゆえ、本発明の課題は、上記問題点を出発点とした上で、観察されるべき現象と必然的に生起する暗状態との間で一義的ないし明確に区別できるような、蛍光（標識）試料の分光学的又は顕微鏡的検査の際の暗状態の認識方法を提供することである。更に、上述の問題点を回避しつつ、とりわけ蛍光着色タンパク質等の生物学的試料の検査にとりわけ適する、蛍光（標識）試料の分光学的又は顕微鏡的県のための装置も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明の第１の視点により、とりわけ蛍光処理（標識）されたタンパク質（複数）を有する蛍光（標識）試料の分光学的又は顕微鏡的検査の際の暗状態（Dunkelzustaenden）の検出方法が提供される。この方法において、励起光の励起／照明体積（空間）（Anregungs-/Beleuchtungsvolumen）及び従って強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に、変化されること、及びその際観察される時定数（Zeitkonstanten）が変化するか否かを検出すること、及び時定数が変化しなかった場合、暗状態が存在するものと結論されることを特徴とする（形態１・基本構成１）。
更に、上記の課題を解決するために、本発明の第２の視点により、とりわけ本発明の方法を使用するための、光源と、検出装置とを有する、とりわけ蛍光処理（標識）されたタンパク質（複数）を有する蛍光（標識）試料の分光学的又は顕微鏡的検査のための装置であって、前記光源と前記試料との間に照明ビーム路が延在し、かつ前記試料と前記検出装置との間に検出ビーム路が延在するよう構成された装置が提供される。この装置において、前記励起光の前記励起／照明体積及び従って前記強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に、変化されること、及びその際観察される時定数が変化するか否かを検出すること、及び時定数が変化しなかった場合、暗状態が存在するものと結論されることを特徴とする（形態８・基本構成２）。
かくして、上記の区別が可能となる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法の発明に係る独立請求項１及び装置の発明に係る独立請求項８により、上記課題に対応する効果がそれぞれ達成される。即ち、本発明の方法により、観察されるべき現象と、必然的に生起する暗状態とが一義的ないし明確に区別可能となる。更に、本発明の装置では、観察されるべき現象と、必然的に生起する暗状態とが一義的ないし明確に区別可能とされる。
更に、各従属請求項により、付加的な効果がそれぞれ達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の好ましい実施の形態を、上記基本構成１及び２をそれぞれ形態１及び８として示すが、これらは従属請求項の対象でもある。
（形態１）  上掲・基本構成１。
（形態２）  上記形態１の方法において、前記励起／照明体積は、互いに独立の、好ましくは順次実行される測定（複数）の際に変化されることが好ましい。
（形態３）  上記形態１又は２の方法において、前記励起／照明体積は、アパーチャの変化を介して影響を受け、該励起／照明体積は、該アパーチャに対して反比例の関係にあることが好ましい。
（形態４）  上記形態１〜３の方法において、前記励起／照明体積は、照明ビーム路に配された好ましくは可変的に調整可能なホール絞りを介して、とりわけ主ビームスプリッタ又はＡＯＢＳ（音響光学ビームスプリッタ）に前置された虹彩絞りを介して、変化されることが好ましい。
（形態５）  上記形態１〜３の方法において、前記励起／照明体積は、照明ビーム路に、とりわけ対物レンズ瞳に配された色選択性（Farbselektiv）絞りを介して変化されることが好ましい。
（形態６）  上記形態１〜５の方法において、前記測定（複数）は、同じ光強度の励起光で実行されることが好ましい。
（形態７）  上記形態１〜６の方法において、前記励起／照明体積の異なる複数の調整状態に基づいて光強度が変化される場合、該光強度は、好ましくはＡＯＴＦ（音響光学チューナブルフィルタ）を介して、相応の（対比可能な：vergleichbar）値に追随調整されることが好ましい。
（形態８）  上掲・基本構成２。
（形態９）  上記形態８の装置において、前記励起／照明体積を変化するために、前記照明ビーム路に、好ましくは可変のホール絞りが配設されることが好ましい。
（形態１０）  上記形態９の装置において、前記ホール絞りは、好ましくは調整可能な虹彩絞りとして構成されることが好ましい。
（形態１１）  上記形態９又は１０の装置において、前記ホール絞りは、少なくともほぼ平行な光ビームを有する前記照明ビーム路の領域に配設されることが好ましい。
（形態１２）  上記形態９〜１１の装置において、前記ホール絞りは、主ビームスプリッタ又はＡＯＢＳ（音響光学ビームスプリッタacusto-optical beam splitter）に前置されることが好ましい。
（形態１３）  上記形態８の装置において、前記励起／照明体積を変化するために、前記照明ビーム路に、好ましくは対物レンズ瞳に、色選択性絞りが配設されることが好ましい。
（形態１４）  上記形態１３の装置において、複数の色選択性絞りが、選択のために、配設されること、及び前記複数の色選択性絞りは、フィルタターレットに配されかつ選択的にビーム路に旋回挿入可能に構成されることが好ましい。
（形態１５）  上記形態１３又は１４の装置において、前記色選択性絞りは、照明光の方向、即ち試料に向かう方向では、その都度の励起波長に応じて部分透過性であり、かつ検出光の方向、即ち検出装置へ向かう方向では、完全に透過性であることが好ましい。
（形態１６）  上記形態１３〜１５の装置において、前記色選択性絞りは、前記照明光の２又は３以上の波長のために、それぞれの波長に対してそれぞれ異なる照明径が、それぞれの波長に応じて、実現されるように構成されることが好ましい。
（形態１７）  上記形態１５又は１６の装置において、前記絞りは、該絞りを通過しない照明光が該絞りによって吸収されるように構成されることが好ましい。
（形態１８）  上記形態１５又は１６の装置において、前記絞りを通過しない照明光は、該絞りによって反射されかつ前記検出ビーム路から外に（フィルタ）除去されることが好ましい。
【００１０】
本発明の本質は、例えば遺伝子工学的に標識された細胞性タンパク質（複数）は、より大きな励起／観察体積（空間）を有する照明ビームの領域では、「より細い」ビームよりもより長い滞留時間（Verweilzeit）を有するという知見に基づいている。これに応じて、より小さい励起／観察体積（空間）とより大きい励起／観察体積（空間）とによる２つの測定を順次実行する場合、観察（内容）に変化がなければ、いずれにせよ拡散は存在することはない、と結論することができる。そのような場合、暗状態（の存在）が認識（ないし検知）されることは、極めて明白である。これに対し、観察（内容）に変化がみられる場合、ここで選択された例に、拡散（の存在）が推論され得る。というのは、変化する観察（内容）は、照明体積（空間）中における互いに異なる滞留期間（Verweildauer）の結果として生じるからである。つまり、共焦点的分光学的検査又は顕微鏡検査の枠内において、励起／観察体積（空間）の拡大に応じ、即ち共焦点的照明体積（空間）の拡大に応じて、観察される時定数（複数）もまた大きくなる場合、それに属するないし認識（検知）されたプロセスは拡散である。これに対し、時定数（複数）が依然として同じである場合、即ち、観察（内容）に変化が生じない場合は、固有の性質即ち使用されたフルオロフォアの暗状態に関することとなる。
【００１１】
本発明の方法を実施するためには、変化された（互いに異った）励起／照明体積（空間）を有する少なくとも２つの互いに独立した測定が実行されることが必要とされる。この方法を質的に改善するためには、その都度変化される励起／照明体積（空間）を有する複数の互いに独立した、好ましくは順次行われる測定を実行すること、即ち当該複数の測定の結果として得られる意味内容ないし公言できること即ち認識（Aussage）に関するより大きな確実性（ないし信頼性）を得ることが目的に適う。いずれにせよ、励起／照明体積（空間）の変化によって、蛍光処理（蛍光標識化）タンパク質（複数）の滞留時間は、照明された領域において変化され、それに基づいて、観察された現象を推論する（結論を導く）ことができる。
【００１２】
励起／照明体積（空間）にはアパーチャの変化を介して影響を与えることができるが、励起／照明体積（空間）は、アパーチャとは増減が反比例の関係にある。即ち、アパーチャが小さいほどないし小さく調整されるほど、励起／照明体積（空間）はより大きくなるが、その際、原理的に、焦点又は焦点近傍における強度分布が問題となる。
【００１３】
具体的には、励起／照明体積（空間）は、好ましくは可変的に調整可能なホール絞りを介して、照明ビーム路において変化されるが、この場合、虹彩絞りを主ビームスプリッタ又はＡＯＢＳに前置して使用するのが好都合である。光ビームは、この部位において、少なくともほぼ平行であるべきであり、かつ過度には大きくないビーム径を有するべきである。
【００１４】
或いは、励起／照明体積（空間）は、色選択性絞りを介して、照明ビーム路において変化されるようにすることも可能であるが、この場合、色選択性絞りは対物レンズ瞳に配設されるのが好ましい。この色選択性絞りは、更に好ましい態様では、専ら照明光のみに作用するが、このことによって、瞳の（全体）照明状態を変化することができる。この場合重要なことは、試料（被検対象物）から戻ってくる検出光が、当該試料から到来する信号が減衰されないように、絞りを、常に妨害されることなく通過すべきであるということである。このため、絞りは、例えば２又は３以上の互いに異なる波長領域ないし波長に対して、該絞りが該互いに異なる波長ないし波長領域に対し互いに異なる照明径又は照明（開口）パターンを提供するように構成されることも可能である。絞りによって「遮断される」照明光は、絞りに吸収されるか、又は絞りによって反射された後適切な手段によって検出ビーム路外に（フィルタ）除去される。複数の絞りを例えばフィルタターレットに配設する構成も可能であるが、この場合、その都度所望される絞りを、フィルタターレットを介して、ビーム路に旋回挿入することができる。いずれにせよ重要なことは、絞りは、検出光ないし試料から戻ってくる放出光が減衰されないように構成されるべきであるということである。というのは、試料から到来する光子（フォトン）は、測定ないし目的とされる相関（関係）のために必要とされるからである。
【００１５】
光源と、検出装置とを有し、光源と試料との間に照明ビーム路が延在し、かつ試料と検出装置との間に検出ビーム路が延在するよう構成された、とりわけ蛍光処理（蛍光標識）されたタンパク質（複数）を有する蛍光（蛍光標識化）試料の分光学的又は顕微鏡的検査のための本発明の装置は、とりわけ上述の方法を実施するために有用である。この装置は、励起光の励起／照明体積（空間）及び従って強度分布が、少なくとも２つの互いに独立した測定の際に変化され、その際観察される時定数が変化されるか否かが検出され、及び時定数が変化しなかった場合、暗状態の存在が推論（結論）されることを特徴とする。
【００１６】
本発明の方法の好ましい態様に関して既に説明したように、励起／照明体積（空間）を変化するために、照明ビーム路に、好ましくは可変のホール絞り、例えば虹彩絞りが配設される。その限りで、ホール絞りは、照明ビーム路の、少なくともほぼ平行な光を有する領域に配設されると有利であるが、更に、主ビームスプリッタ又はＡＯＢＳに前置されると一層有利である。
【００１７】
或いは、励起／照明体積（空間）を変化するために、照明ビーム路に、好ましくは対物レンズ瞳に配される色選択性絞りが配設される。複数（個）の色選択性絞りを備えることは、適切な絞りの選択に有用であり得る。この場合、複数（個）の色選択性絞りは、フィルタターレットに配設され、選択的にビーム路に旋回挿入することができる。
【００１８】
色選択性絞りは、例えば、２つの異なる励起波長の通過に有用であり得るが、励起波長が互いに異なる場合、絞りの構成に応じて異なる励起／照明体積（空間）が形成され得る。例えば、絞りは、照明光の方向、即ち試料（被検対象物）に向かう方向では、個々の励起波長に応じて部分透過性であり、また、検出光の方向、即ち検出装置に向かう方向では、十分に多くのフォトンが検出装置に到達できるように、完全に透過性である。
【００１９】
本発明の装置の有利な形態に関してここで注意すべきことは、絞りは、絞りを通過しない照明光が絞りによって吸収されるように、構成されると有利であるということである。また、絞りを通過しない照明光が絞りによって反射され、かつ例えば光トラップ（Lichtfallen）等の適切な手段によって、検出ビーム路から外部へ完全に（フィルタ）除去されるように構成することも可能である。
【００２０】
以下に、本発明の実施例を図面を参照して説明する。なお、以下の実施例は、発明の理解の容易化のためのものであり、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・削除・転換等を排除することは意図しない。また、特許請求の範囲に付した図面参照符号も発明の理解の容易化のためのものであり、本発明を図示の態様に限定することは意図しない。これらの点に関しては、補正・訂正後においても同様である。
【実施例】
【００２１】
図１は、蛍光処理ないし着色（蛍光標識）された試料１を顕微鏡検査するための本発明の装置の第１実施例を示す。なお、この試料１にはフルオロフォア（複数）がドープされている、即ち試料１は蛍光着色タンパク質（複数）を含有している。この装置は、本質的に、光源２を有するが、この実施例の光源２は、具体的には、レーザ光源である。更に、この装置は、検出装置３を有する。光源２と試料１との間には、（実線で図示した）照明ビーム路４が延在する。試料１と検出装置３との間には、（破線で図示した）検出ビーム路５が延在する。
【００２２】
照明ビーム路４には、光源２の後方（ないし下流）に、光強度の調整を可能にするＡＯＴＦ６が配設される。レンズ装置７と、該レンズ装置７の構成要素のレンズ間に配設された照明ピンホール（絞り）８とを経由した後、照明光は、調整可能な虹彩絞り９を介して、主ビームスプリッタ１０に到達し、更に、該主ビームスプリッタ１０から、スキャンミラー１２を有するスキャン装置１１を介し、レンズ装置１３を経由し、対物レンズ１４によって試料１に到達する。
【００２３】
図１に示した実施例では、励起光の励起／照明体積（空間）及び従って強度分布が、調整可能な虹彩絞り９によって影響を受けかつ変化されることにより、変化された励起／照明体積（空間）に関する少なくとも２つの互いに独立した測定を行う際に、観察される時定数（複数）が変化するか否かが検出される。時定数が変化されなかった場合、暗状態の存在を結論付けることができる。これに関しては、本書の概説部分において既に詳細に説明したとおりである。
【００２４】
図２は、本発明の装置の第２実施例を示す。この装置では、励起／照明体積（空間）を変化するために、１又は複数の色選択性絞り１６が配設される。図２に示した実施例では、（実線で示した）照明ビーム路４に、光パワー（ないし光強度）を適正化するためのＡＯＴＦ６が、光源２の直ぐ近くに後置される。レンズ１７には、照明ピンホール（絞り）８が後置される。照明光は、主ビームスプリッタ１０を介して、スキャンミラー１２を有するスキャン装置１１に到達し、更に、レンズ装置１３を介し、対物レンズ１４によって試料１に到達する。
【００２５】
試料１から戻ってくる検出光は、（破線で示した）検出ビーム路５にそって進み、主ビームスプリッタ１０及び検出ピンホール１８を介して検出装置３に到達するが、これは図１の実施例と同様である。
【００２６】
対物レンズ１４の対物レンズ瞳には、複数の色選択性絞り１６が配されたフィルタターレット１９が配設される。色選択性絞り１６は、フィルタターレット１９の回転によって、その都度作動位置にもたらすことができる。
【００２７】
図３は、色選択性絞り１６の一例を示すが、これは、図２の実施例では、当該実施例において配設されているフィルタターレット１９に配される。図３に模式的に示した色選択性絞り１６は、互いに異なる２つの励起波長のために構成されている。検出光に対しては、絞り１６は、全面にわたって透過性である。
【００２８】
図からは得ることができない更なる特徴に関しては、繰り返しを避けるため説明を省略したので、本書の概説部分を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の第１実施例の模式図。
【図２】本発明の第２実施例の模式図。
【図３】２つの励起波長のための色選択性絞りの一例の模式図。
【符号の説明】
【００３０】
１    試料
２    光源
３    検出装置
４    照明ビーム路
５    検出ビーム路
６    ＡＯＴＦ
７    （照明ビーム路中の）レンズ装置
８    照明ピンホール（絞り）
９    調整可能な虹彩絞り
１０  主ビームスプリッタ
１１  スキャン装置
１２  スキャンミラー
１３  （照明／検出ビーム路中の）レンズ装置
１４  対物レンズ
１６  色選択性絞り
１７  （照明ビーム路中の）レンズ
１８  検出ピンホール（絞り）
１９  （複数の色選択性絞りを有する）フィルタターレット
【図１】
2006234815.tif 000003
【図２】
2006234815.tif 000004
【図３】
2006234815.tif 000005