(57)【要約】【課題】核酸皮膚外用製剤【解決手段】  本発明は、高分子である核酸をアルギン酸ナトリウム、あるいは大豆リン脂質とワセリンとの混合物を用いて製剤化することによって、高い皮膚透過性を持つ核酸皮膚外用製剤を提供するものである。本核酸皮膚外用製剤は高い皮膚透過性を有するため、効率よく有効成分である核酸を患部に送達できる。用いる核酸は低用量でよく、安全性、経済性にも優れている。また、現在用いられている皮膚の抗炎症剤の有効成分である低分子化合物とは作用メカニズムが異なるため、低分子医薬が効かないケースにも効果を期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮または表皮組織の細胞内に核酸系薬剤を送逹するための、核酸系薬剤および浸透促進剤からなる医薬組成物。
【請求項２】
核酸系薬剤が遺伝子またはその類似体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
遺伝子またはその類似体がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドがデコイ(おとり分子)、アンチセンス、リボザイム、アプタマーまたはsiRNAである、請求項１ないし３記載の組成物。
【請求項５】
デコイが転写因子阻害作用を有する、請求項１ないし４記載の組成物。
【請求項６】
デコイがNF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、Ets、E2Fデコイオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし５記載の組成物。
【請求項７】
デコイが配列番号１で表されるNF-κBデコイオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし６記載の組成物。
【請求項８】
核酸系薬剤を0.01〜5重量%含む、請求項１ないし７記載の組成物。
【請求項９】
核酸系薬剤を0.1〜1重量%含む、請求項１ないし８記載の組成物。
【請求項１０】
浸透促進剤が、粘性多糖類、または尿素系化合物およびリン脂質である、請求項１ないし９記載の組成物。
【請求項１１】
粘性多糖類がアルギン酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１ないし１０記載の組成物。
【請求項１２】
粘性多糖類がアルギン酸ナトリウムである、請求項１ないし１１記載の組成物。
【請求項１３】
粘性多糖類を0.01〜10重量%含む、請求項１ないし１２記載の組成物。
【請求項１４】
粘性多糖類を0.1〜5重量%含む、請求項１ないし１３記載の組成物。
【請求項１５】
さらにリン酸塩を含む、請求項１ないし１４記載の組成物。
【請求項１６】
リン酸塩がリン酸二水素ナトリウムである、請求項１ないし１５記載の組成物。
【請求項１７】
リン酸塩を0.01〜10重量%含む、請求項１ないし１６記載の組成物。
【請求項１８】
リン酸塩を0.1〜5重量%含む、請求項１ないし１７記載の組成物。
【請求項１９】
尿素系化合物が尿素または環状尿素である、請求項１ないし１８記載の組成物。
【請求項２０】
尿素系化合物が尿素である、請求項１ないし１９記載の組成物。
【請求項２１】
尿素系化合物を0.01〜10重量%含む、請求項１ないし２０記載の組成物。
【請求項２２】
尿素系化合物を0.1〜5重量%含む、請求項１ないし２１記載の組成物。
【請求項２３】
リン脂質がホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)またはスフィンゴミエリン(SPM)から選ばれた１種以上である、請求項１ないし２２記載の組成物。
【請求項２４】
リン脂質がホスファチジルコリンである、請求項１ないし２３記載の組成物。
【請求項２５】
リン脂質が大豆由来ホスファチジルコリンである、請求項１ないし２４記載の組成物。
【請求項２６】
リン脂質を0.1〜20重量%含む、請求項１ないし２５記載の組成物。
【請求項２７】
リン脂質を1〜16重量%含む、請求項１ないし２６記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１ないし２７記載の組成物からなる皮膚疾患の予防、改善、治療剤。
【請求項２９】
皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎または乾癬である、請求項２８記載の予防、改善、治療剤。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を含む医薬品製剤に関する。さらに詳しくは、核酸オリゴヌクレオチドを含有する皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
軟膏やローションといった塗布製剤の治療効果は、有効成分（主剤）の適切な透過性コントロールが必要とされる。例えば、多くの皮膚疾患の場合、主剤を皮膚組織の上皮および真皮まで透過させる必要があるが、その際の障壁として、角質・上皮組織で構成される、いわゆる皮膚バリアが挙げられる。一般的に皮膚バリアを通過しやすい主剤の物理化学的性質として、高脂溶性と低分子量（分子量800程度まで）が求められる。例えば、ステロイドやビタミンD等は、皮膚バリアを効率よく透過することが知られているが、これらは比較的低分子かつ高脂溶性である。一方で、高い水溶性かつ高分子量の分子は皮膚バリアを通過することがかなり難しいことが知られている。製剤的な研究も行われているが、十分な透過性を有する製剤はほとんど知られていなかった。
【０００３】
近年、バイオテクノロジーの進歩に伴って、遺伝子発現を制御することで病気を治療する新しい医薬品の開発が盛んに行われてきている。その１つとしてオリゴヌクレオチド等を用いた核酸医薬が挙げられるが、その多くが分子量5,000以上の高分子であり、また水溶性もきわめて高い。例えばアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に対して、こういった高水溶性・高分子量の核酸医薬を主剤とした塗布製剤を開発する際、前述のように、皮膚透過性の優れた製剤は報告されておらず、その開発が望まれていた。
【０００４】
皮膚疾患は、その患部が外部に露出することから、肉体的のみならず、精神的にもダメージを受けやすい疾患である。例えば、近年増加しているアトピー性皮膚炎は、患部が体の広範囲にわたることも多く、難治性で患者は長期間悩まされる。これは小児から大人まで幅広い年齢層にみられるアレルギー疾患である。皮膚には体を外部の物質や刺激から保護するバリアの役割があるが、アトピー性皮膚炎ではこの皮膚のバリア機能が低下すると，ダニなどの環境抗原が皮膚に侵入しやすくなり、その結果アレルギー反応が生じる。しかし、アトピー性皮膚炎の治療によく用いられるステロイド軟膏は、アレルギー反応は抑えるが、この皮膚のバリア機能を低下させる危険性もあり、長期の使用には適していない。
【０００５】
皮膚外用剤は皮膚を透過して薬効を発揮するため、このバリアを破って真皮に浸透することが必須である。しかし、皮膚外用剤の有効成分が、例えば核酸のような巨大分子である場合、そのまま皮膚に浸透させることは更に難しかった。このような理由から、核酸のような巨大分子を有効成分とする皮膚外用剤の開発は困難であった。
【０００６】
以上のような背景から、皮膚のバリア機能は保持したまま皮膚に浸透し、薬効を発揮する薬剤の開発が望まれていた。
【０００７】
本発明者らは、これらの課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、意外にも粘性多糖類、または尿素系化合物およびリン脂質が浸透促進剤として優れることを見いだし、さらに化粧品において保湿剤として使用されているアルギン酸またはその薬理学的塩が最も効果的に目的を達成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
アルギン酸は海藻由来の多糖類で、増粘剤や被覆剤、保湿剤として食品や化粧品に用いられているが、浸透促進剤としての効果は全く知られていなかった。
【０００９】
【特許文献１】特表2001-521887号公報この特許文献では、非ステロイド性抗炎症剤（non-steroid anti-inflammatory drug (NSAID)）のアルギナート等の多糖類ガム製剤を開示している。しかしこれは低分子化合物をアルギナート（アルギン酸塩）との混合製剤としているが、核酸のような高分子化合物の皮膚透過性について検討していなかった。
【００１０】
【特許文献２】WO02/066077号公報本件は、アルギン酸とオリゴヌクレオチドを組み合わせた肺の徐放製剤について開示している。これはアルギン酸と核酸の製剤ではあるが、肺を対象とした薬剤であり、皮膚の透過性については言及していなかった。
【００１１】
近年、遺伝子・核酸医薬が注目され、数々の遺伝子治療が試みられている。しかし、皮膚疾患治療薬として確立された核酸医薬品はなく、これが実現すれば、従来の薬剤では効果がなかった疾患にも適用できる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、核酸を有効成分とした皮膚外用製剤を提供することである。特にこれは皮膚バリア機能を保護しながら高い皮膚透過性を持つ必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、NF-κB  デコイオリゴヌクレオチド等の核酸系薬剤を用い、それをアルギン酸ナトリウム、あるいは大豆リン脂質とワセリンの混合製剤とすることで、オリゴヌクレオチドが高い皮膚透過性を示すことを見出した。即ち、本発明は核酸を有効成分とする高皮膚透過性の皮膚外用製剤を提供するものである。
【００１４】
その要旨は、
（１）真皮または表皮組織の細胞内に核酸系薬剤を送逹するための、核酸系薬剤および浸透促進剤からなる医薬組成物、
（２）核酸系薬剤が遺伝子またはその類似体である、（１）記載の組成物、
（３）遺伝子またはその類似体がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、（１）または（２）記載の組成物、
（４）オリゴヌクレオチドがデコイ(おとり分子)、アンチセンス、リボザイム、アプタマーまたはsiRNAである、（１）〜（３）記載の組成物、
（５）デコイが転写因子阻害作用を有する、（１）〜（４）記載の組成物、
（６）デコイがNF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、Ets、E2Fデコイオリゴヌクレオチドである、（１）〜（５）記載の組成物、
（７）デコイが配列番号１で表されるNF-κBデコイオリゴヌクレオチドである、（１）〜（６）記載の組成物、
（８）核酸系薬剤を0.01〜5重量%含む、（１）〜（７）記載の組成物、
（９）核酸系薬剤を0.1〜1重量%含む、（１）〜（８）記載の組成物、
（１０）浸透促進剤が、粘性多糖類、または尿素系化合物およびリン脂質である、（１）〜（９）記載の組成物、
（１１）粘性多糖類がアルギン酸またはその薬理学的に許容される塩である、（１）〜（１０）記載の組成物、
（１２）粘性多糖類がアルギン酸ナトリウムである、（１）〜（１１）記載の組成物、
（１３）粘性多糖類を0.01〜10重量%含む、（１）〜（１２）記載の組成物、
（１４）粘性多糖類を0.1〜5重量%含む、（１）〜（１３）記載の組成物、
（１５）さらにリン酸塩を含む、（１）〜（１４）記載の組成物、
（１６）リン酸塩がリン酸二水素ナトリウムである、（１）〜（１５）記載の組成物、
（１７）リン酸塩を0.01〜10重量%含む、（１）〜（１６）記載の組成物、
（１８）リン酸塩を0.1〜5重量%含む、（１）〜（１７）記載の組成物、
（１９）尿素系化合物が尿素または環状尿素である、（１）〜（１８）記載の組成物、
（２０）尿素系化合物が尿素である、（１）〜（１９）記載の組成物、
（２１）尿素系化合物を0.01〜10重量%含む、（１）〜（２０）記載の組成物、
（２２）尿素系化合物を0.1〜5重量%含む、（１）〜（２１）記載の組成物、
（２３）リン脂質がホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)またはスフィンゴミエリン(SPM)から選ばれた１種以上である、（１）〜（２２）記載の組成物、
（２４）リン脂質がホスファチジルコリンである、（１）〜（２３）記載の組成物、
（２５）リン脂質が大豆由来ホスファチジルコリンである、（１）〜（２４）記載の組成物、
（２６）リン脂質を0.1〜20重量%含む、（１）〜（２５）記載の組成物、
（２７）リン脂質を1〜16重量%含む、（１）〜（２６）記載の組成物、
（２８）（１）〜（２７）記載の組成物からなる皮膚疾患の予防、改善、治療剤、
（２９）皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎または乾癬である、（２８）記載の予防、改善、治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の核酸皮膚外用製剤は、高い皮膚透過性を有するため、効率よく有効成分である核酸を患部に送達できる。皮膚透過性が高いため、核酸は低用量でよく、安全性、経済性にも優れている。また、現在用いられている抗炎症剤である低分子医薬とは作用メカニズムが異なるため、低分子医薬が効かないケースにも効果を期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は真皮または表皮組織の細胞内に核酸系薬剤を送達するための、核酸系薬剤および浸透促進剤からなる医薬組成物を提供するものである。
【００１７】
本発明で使用される核酸系薬剤は、通常はデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ―、siRNAなどが対象となるが、好ましくはデコイである。デコイとは、転写調節因子が核酸に結合するとき、その核酸結合配列と競合する二本鎖オリゴヌクレオチドのことをいう。デコイ、デコイオリゴヌクレオチド、デコイODNは同義に用いられる。核酸系薬剤は単独又は二種以上を混合して用いることができ、本発明の皮膚外用剤に０．０１〜５重量％（以下、「％」で示す）、特に０．１〜１％配合されるのが好ましい。
【００１８】
本発明の核酸系薬剤は、例えばNF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、Ets、E2F等のデコイを挙げることができるが、NF-κBが好適対象である。好ましいデコイの例としては、5’-ccttgaagggatttccctcc-3’（配列番号１）（NF-κBデコイ）、5’-gatctagggatttccgggaaatgaagct-3’ （配列番号２）（STAT-1デコイ）、5’-agcttgagatagagct-3’ （配列番号３）（GATA-3デコイ）、5’-gatcaagaccttttcccaagaaatctat-3’ （配列番号４）（STAT-6デコイ）、5’-agcttgtgagtcagaagct-3’ （配列番号５）（AP-1デコイ）、5’-aattcaccggaagtattcga-3’ （配列番号６）（Etsデコイ）、5’-ctagatttcccgcg-3’ （配列番号７）（E2Fデコイ）、またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物が挙げられる。オリゴヌクレオチドはDNAでもRNAでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および/または擬核酸を含むものであってもよい。これらの核酸系薬剤は上記核酸配列を一つまたは複数含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。
【００１９】
また、本発明における浸透促進剤としては、通常、粘性多糖類、リン酸塩、尿素、リン脂質等が用いられるが、好ましくは粘性多糖類、リン酸塩、またはリン脂質を単独あるいは二種以上を混合して用いる。さらに好ましくは粘性多糖類とリン酸塩の混合物を用いる。
【００２０】
粘性多糖類は通常アルギン酸、ラミラナン、カラギーナン、フルセフラン、ポルフィラン、グラテロピラン、グルサン、フコイダン、ヒアルロン酸などを用いることができるが、好ましくはアルギン酸、およびカラギーナン、より好ましくはアルギン酸を用いる。アルギン酸はアルギン酸またはその薬理学的に許容される塩を用いることができるが、通常アルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸は「キミカアルギン」（キミカ製）などの市販されているものを使用することができる。
【００２１】
これらの粘性多糖類は単独又は二種以上を混合して用いることができ、本発明の皮膚外用剤に０．０１〜１０重量％（以下、「％」で示す）、特に０．１〜５％配合されるのが好ましい。
【００２２】
リン酸塩は、通常はリン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素カルシウム 、リン酸三カリウム 、リン酸三カルシウム 、リン酸水素二アンモニウム 、リン酸水素二カリウム 、リン酸水素二ナトリウム 、リン酸三ナトリウム 、リン酸二水素カルシウム、などを用いるが、好ましくはリン酸二水素ナトリウムを用いる。これらのリン酸塩は、単独又は二種以上を混合して用いることができ、本発明の皮膚外用剤に０．０１〜１０重量％、特に０．１〜５％配合されるのが好ましい。
【００２３】
リン脂質は、通常はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンを用いるが、好ましくはホスファチジルコリン、さらに好ましくは大豆由来ホスファチジルコリンを用いる。これらのリン脂質は単独又は二種以上を混合して用いることができ、本発明の皮膚外用剤に０．０１〜２０重量％、特に１〜１６％配合されるのが好ましい。
【００２４】
好ましくはリン脂質に加え尿素を0.01％から10％用いる。より好ましくは尿素を0.1％から５％用いる。尿素は尿素でも環状尿素でもよい。環状尿素は、通常５員環のものが好ましく、窒素原子が低級アルキルで置換されていてもよい。具体的には、例えばエチレン尿素、N,N′-ジメチルエチレン尿素、N,N′-ジエチルエチレン尿素などを挙げることができる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分の他、必要に応じて本発明の効果に影響しない質的、量的範囲内で、水、油剤、ワックス、シリコーン、界面活性剤、アルコール、多価アルコール、水溶性高分子増粘剤、pH調節剤、香料、酸化防止剤、キレート剤、色素、顔料、防腐剤、他の薬効成分、紫外線吸収剤等、医薬品、化粧品に用いられる成分の他、無機あるいは有機成分も配合することができる。
【００２６】
本発明の皮膚外用剤の対象疾患は、例えば皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎または乾癬などである。
【００２７】
本発明の皮膚外用剤は、上記必須成分と必要に応じた任意成分を用い、常法に従って調製することができ、液剤、ローション、油剤、クリーム、軟膏等、様々な剤型とすることができる。
【００２８】
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等によって異なるが、通常は患部を覆うことが出来る量を、一日あたり１〜３回塗布する。
【００２９】
続いて本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００３０】
１．皮膚透過性試験1-1.  ラットにおけるNF-κB デコイオリゴヌクレオチド単回経皮投与時の皮膚透過性について明らかにするため、35Sで標識した35S- NF-κBデコイオリゴヌクレオチド（以後35S -NF-κBデコイと略す）を用いて、血液，皮膚中放射能濃度を測定した。
35S-NF-κBデコイの化学構造およびラベル位置を以下に示す。
35S-5'-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3'
35S-3'-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5'
【００３１】
35S-NF-κBデコイは、Agrawalらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595-7599, 1991）に従い、次のように調製した。目的の塩基配列のH-phosphonate型オリゴヌクレオチドを作成、脱保護前に35S8（elemental sulfur）にてH-phosphonateのHを35Sに酸化、通常の脱保護反応を行い、目的の35S標識オリゴヌクレオチドを得た。
【００３２】
(1) 投与製剤の調製
所定量の35S-NF-κB デコイ原液および非標識NF-κB デコイをメノウ乳鉢上あるいはポリ容器内に採取したのち，大過剰のエタノールを加えてNF-κB デコイを沈殿させた。ついで，上清を除去後，窒素ガス気流下にて溶媒を完全に除去し，35S- NF-κB デコイ原体を調製した。
【００３３】
製剤Ａ (ワセリン単独)   
35S-NF-κB デコイ           0.5％    2.0 mg
ステアリルアルコール        5.0％   20.0 mg
白色ワセリン               94.5％  378.0 mg
───────────────────────────
計                        100.0％  400.0 mg
【００３４】
予め，所定分量のステアリルアルコールおよび白色ワセリンを70〜80℃の水浴中で溶融混合し，室温になるまで放冷したものを混合基剤とした。先に調製した35S- NF-κB デコイ原体に規定量の混合基剤を少量ずつ加えながら混和し，NF-κB デコイとして0.4 mg（非標識NF-κB デコイの含量：78.88％）/500 kBq/100 mgの製剤Ａを調製した。
【００３５】
製剤Ｂ (1%リン脂質製剤)
35S-NF-κB デコイ            0.5％    2.0 mg
注射用蒸留水                30.0％  120.0 mg
精製水素添加大豆リン脂質     1.0％    4.0 mg
白色ワセリン                65.5％  262.0 mg
ミリスチン酸イソプロピル     3.0％   12.0 mg
───────────────────────────
計                         100.0％  400.0 mg
【００３６】
35S-NF-κB デコイ原体に所定分量の注射用蒸留水を加えて室温にて溶解後，規定分量の精製水素添加大豆リン脂質を添加し，均一に分散するまで撹拌した。ついで，予め，所定分量の白色ワセリンおよびミリスチン酸イソプロピルを60℃の水浴中で溶融混合し，室温になるまで放冷したものと混合したのち，均一になるように撹拌し，NF-κB デコイとして0.4 mg（非標識NF-κB デコイの含量：78.88％）/500 kBq/100 mgの製剤Ｂを調製した。以下製剤Ｃ〜Ｅを同様の方法で調製した。
【００３７】
製剤Ｃ (2%リン脂質製剤)
35S-NF-κB デコイ              0.5％   2.0 mg
注射用蒸留水                  30.0％ 120.0 mg
精製水素添加大豆リン脂質       2.0％   8.0 mg
白色ワセリン                  64.5％ 258.0 mg
ミリスチン酸イソプロピル       3.0％  12.0 mg
───────────────────────────
計                           100.0％ 400.0 mg
【００３８】
製剤Ｄ (6%リン脂質製剤)
35S-NF-κB デコイ             0.5％   2.0 mg
注射用蒸留水                 30.0％ 120.0 mg
精製水素添加大豆リン脂質      6.0％  24.0 mg
白色ワセリン                 60.5％ 242.0 mg
ミリスチン酸イソプロピル      3.0％  12.0 mg
───────────────────────────
計                          100.0％ 400.0 mg
【００３９】
製剤Ｅ (16%リン脂質製剤)
35S-NF-κB デコイ            0.5％   2.0 mg
注射用蒸留水                30.0％ 120.0 mg
精製水素添加大豆リン脂質    16.0％  64.0 mg
白色ワセリン                50.5％ 202.0 mg
ミリスチン酸イソプロピル     3.0％  12.0 mg
───────────────────────────
計                         100.0％ 400.0 mg
【００４０】
水溶製剤Ａ(1%アルギン酸製剤)
35S-NF-κB デコイ                                0.5％     2.0 mg
アルギン酸基剤（1%アルギン酸ナトリウム/
リン酸二水素ナトリウム水溶液 適量)              99.5％   398.0 mg
────────────────────────────────────
計                                             100.0％   400.0 mg
【００４１】
35S- NF-κB デコイ原体に所定分量のアルギン酸基剤を加えて溶解後，ボルテックスミキサーにて十分撹拌し，その後マイクロピペットにて十分にピペッティングを行い均一に分散させ，35S-NF-κB デコイとして0.4 mg（非標識NF-κB デコイの含量：78.88％）/500 kBq/100 mgの水溶製剤Ａを調製した。
【００４２】
投与製剤調製用媒体には、次に挙げるものを用いた。ステアリルアルコール(Lot No.20714C，日本薬局方収載品，日本油脂)、白色ワセリン(Lot No.662275，日本薬局方収載品，日興製薬)、精製水素添加大豆リン脂質(Lot No.3228，NIKKOL レシノール S-10E，日光ケミカルズ)、ミリスチン酸イソプロピル(Lot No.WAE 5335，化学用，和光純薬工業)、注射用蒸留水(Lot No.3B76N，日本薬局方収載品，大塚製薬)、アルギン酸基剤（1%アルギン酸ナトリウム /リン酸二水素ナトリウム水溶液 適量)。
【００４３】
(2) 動物
動物は7週齢の雄性Crj:CD(SD)ラットを１群１匹ずつ用いた。ラットは体重範囲220〜330gのものを用いた。
【００４４】
(3) 塗布部位の調製
投与前日にラットをエーテル軽度麻酔下において，電気バリカンおよび電気シェーバーを用いて皮膚を傷つけないように剃毛した。なお，投与当日に剃毛部位の確認を行い，炎症や発赤がないことを確認した。これを「正常皮膚」とした。さらに投与当日に剃毛部位をセロファンテープで圧着・剥離する操作を10回行い，角質層を剥離したものを「損傷皮膚」とした。動物を表１に示されたように分けて用いた。
【００４５】
表１
────────────────────
試験動物番号 投与製剤    皮膚の状態  
────────────────────
1            製剤Ａ      正常
2             〃         損傷
3            製剤Ｂ      正常
4             〃         損傷
5            製剤Ｃ      正常
6             〃         損傷
7            製剤Ｄ      正常
8             〃         損傷
9            製剤Ｅ      正常
10            〃         損傷
11           水溶製剤Ａ  正常
12            〃         損傷
────────────────────
【００４６】
(4) 塗布と塗布部位の保護方法
35S-NF-κB デコイ製剤を背部皮膚に、塗布面積が横3cm×縦3cmになるよう塗布した。製剤の投与量は0.4 mg/head、投与製剤量は100 mg/head、投与放射能量は500 kBq/head、投与回数は1回とした。
その後，塗布部を囲むように紙製箱型枠(横4 cm×縦4 cm×高さ1 cm)を置き，粘着性伸縮テープ(エラストポア，ニチバン)を用いて，箱型枠を囲むように固定して塗布部を保護した。塗布時間は24時間とした。
【００４７】
(5) 投与製剤の除去方法
微温水で湿らせたのち，固く搾った脱脂綿(4 cm×5 cm)1枚につき1回ずつ，計5枚を用いて，力を加えない状態で塗布部位の拭い取りを行った。
【００４８】
(6)皮膚中放射能濃度の測定
35S-NF-κB デコイを0.4 mg/headの用量で単回経皮投与した動物をエーテル麻酔死させたのち，投与部位皮膚を採取し，皮膚中放射能濃度を測定した。
【００４９】
投与部位皮膚中放射能濃度は次のように測定した。投与製剤除去後の投与部位皮膚を，中心部より厚さ2 mm，2.5×2.5 cmで摘出後，スライドグラス2枚の間で軽く圧着した状態で，−20℃前後で凍結した。ついで，各切片を1 cm2となるように真皮側より2部位分をパンチしたのち，凍結後の真皮側をOCTコンパウンドで液体窒素下にてステージに固定した。固定後，凍結下にてクライオスタットを用いて，表皮側より厚さ10μmで薄切した。薄切後の切片は4枚毎(40μm相当分)にバイアルに採取したのち，組織溶解剤SOLUENE-350 (2 mL)を加えて加温・溶解後，シンチレーター10 mLを加え，室温で静置したのち，液体シンチレーションカウンターを用いて放射能の計測を行い，得られた値より各層の放射能濃度を算出した。塗布後24時間に塗布部残存製剤の拭い取りを実施した。
【００５０】
結果）皮膚透過性試験（表２〜６、図１〜４参照）
皮膚中放射能濃度は、水溶性ゲルである水溶製剤A（アルギン酸製剤）が製剤A（ワセリン単独製剤）に比べ、顕著に皮膚透過性を高める効果が確認された。また、製剤B〜E（精製水素添加大豆リン脂質（Soybean phosphatidyl choline、SPC)製剤）も、製剤A（ワセリン単独製剤）に比較して皮膚透過性を亢進させる事が判明した。
【００５１】
表２
正常皮膚          放射能 (ng eq. of NF-κB Decoy ODNs/cm3)
───────────────────────────────
深さ（μm)  製剤A    製剤B    製剤C    製剤D    製剤E
───────────────────────────────
40          127723   109155    60207   41009   129858 
80          176569   260189   106498   71782   261867 
120         195258   241277   119444  100643   331157 
160         160645   236509   126704  132561   365296 
200         122080   186778   126413  144684   367088 
240         103637   152236   132612  138648   349545 
280          67479   111365   135825   96451   316355 
320          34559    93319   161536   67699   243472 
360          14894    86309   122965   39964   148861 
400           5278    74650    77955   25426    72110 
440           2269    38523    31019   15169    45368 
480            533    18588    10410   11974    24153 
520            228    11102     4495    4411    12401 
560            165     4944     2098    2069     7742 
600            150     1178     1303    1304     4462 
640            202      355     1032     969     3003 
680              0      275      630     798     1457 
720              0      294      586     667     1123 
760              0      367      510     386     1212 
800              0      382      706     371     1339 
840            125      209      554     334     1353 
880            220      245      341     336     1764 
920            165      274      151     196      764 
960              0      150      159     236      657 
1000             0        0      157     199      581 
1040             0        0      183     145      372 
1080             0        0      260     333      149 
1120             0        0      110     449      273 
1160             0        0        0     580      385 
1200             0        0      178     212      208 
1240             0        0      120     179      101 
1280             0        0      186     155      185 
1320             0      136      183     188      110 
1360             0        0        0       0      172 
1400             0        0        0     182      187 
1440             0        0      153     390      120 
1480           160        0      145       0      193 
1520             0        0      227     140      177 
1560           119        0      206       0      105 
1600             0        0      125       0        0 
1640             0        0      105       0        0 
1680             0        0      144       -        - 
1720             0        0        0       -        - 
1760             0        -        -       -        - 
1800             0        -        -       -        - 
───────────────────────────────
（製剤A：ワセリン単独、製剤B：リン脂質 1%、製剤C：リン脂質 2%、製剤D：リン脂質 6%、製剤E：リン脂質 16%、0：検出限界以下、-：測定せず）
【００５２】
表３
損傷皮膚    放射能 (ng eq. of NF-κB Decoy ODNs/cm3)
───────────────────────────────
深さ（μm） 製剤A    製剤B    製剤C    製剤D    製剤E
───────────────────────────────
40          151237  480991   522326   635059   160513 
80          328816  834599  1151740  1033450   645599 
120         496468  766617  1370503  2164656  1169895 
160         482113  394444   756279  1947898  1549725 
200         300313  135651   339598   987221   994644 
240         200318   42853   143062   523925   508349 
280         126664   18898    40206   281962   153527 
320          69206   12445    17463   189409    50979 
360          32528    7118    11278   112898    17764 
400          14366    5194     9775    68852     6992 
440           6132    3667     6440    40039     3406 
480           3148    3523     4018    24236     2014 
520           1360    3213     3056    15703     2114 
560            731    2460     2247     8663     1534 
600            753    1495     1404     6344     1245 
640            422    1276     1236     4234     1547 
680            546     834     1079     2860     1541 
720            929     746     1456     2152     1321 
760            779     366     1021     1962     1030 
800           2136     206      611     1898      582 
840            923     158      625     2432      402 
880            465     190      234     2118      125 
920            257     216      564     1741      552 
960              0     414      347     1388      331 
1000           150     419      435     1061      934 
1040           131     432      326      517     1649 
1080             0     255      817     2815     1004 
1120             0     116      965      755      645 
1160             0       0      459      341      478 
1200           174       0        0      228      281 
1240             0     240      221      353      256 
1280             0       0        0      819     1068 
1320             0     446      212      591      783 
1360             0     265      230      834      802 
1400           144       0        0      509      560 
1440             0     284        0      527      249 
1480             0     285        0      722      664 
1520           122     232        0      558      133 
1560           144       0      319      483        0 
1600             0     467      267      360      149 
1640             0       0     1386      471      172 
1680           148       0      259      267        0 
1720             -       0      841        0        0 
1760             -       0      137        0      219 
1800             -       0        0      210        0 
1840             -       -        0      105        0 
1880             -       -        -        0        0 
───────────────────────────────
（製剤A：ワセリン単独、製剤B：リン脂質 1%、製剤C：リン脂質 2%、製剤D：リン脂質 6%、製剤E：リン脂質 16%、0：検出限界以下、-：測定せず）
【００５３】
表４
正常皮膚  放射能 (ng eq. of NF-κB Decoy ODNs/cm3)
───────────────────
深さ（μm)   製剤A   水溶製剤A
───────────────────
40          127723   305858 
80          176569   456038 
120         195258   449339 
160         160645   356230 
200         122080   245652 
240         103637   135583 
280          67479    75834 
320          34559    42958 
360          14894    21062 
400           5278     8044 
440           2269     2884 
480            533     1413 
520            228     1130 
560            165      379 
600            150      492 
640            202      285 
680              0      399 
720              0      163 
760              0      163 
800              0      143 
840            125      143 
880            220        0 
920            165        0 
960              0      118 
1000             0        0 
1040             0        0 
1080             0        0 
1120             0        0 
1160             0        0 
1200             0        0 
1240             0        0 
1280             0        0 
1320             0        0 
1360             0        0 
1400             0        0 
1440             0        0 
1480           160        0 
1520             0        0 
1560           119        0 
1600             0        0 
1640             0        0 
1680             0        0 
1720             0        0 
1760             0        - 
1800             0        - 
───────────────────
（製剤A：ワセリン単独、水溶製剤A：アルギン酸ナトリウム、0：検出限界以下、-：測定せず）
【００５４】
表５
損傷皮膚  放射能 (ng eq. of NF-κB Decoy ODNs/cm3)
───────────────────
深さ（μm)  製剤A     水溶製剤A
───────────────────
40         151237       332272 
80         328816       599862 
120        496468       744654 
160        482113       905723 
200        300313      1227719 
240        200318       958660 
280        126664       602954 
320         69206       214862 
360         32528        38100 
400         14366        10253 
440          6132         5402 
480          3148         3394 
520          1360         6428 
560           731         2011 
600           753         3392 
640           422         3124 
680           546         5698 
720           929         2787 
760           779         2580 
800          2136         4018 
840           923         2534 
880           465         2108 
920           257          651 
960             0          517 
1000          150         381 
1040          131         263 
1080            0         121 
1120            0           0 
1160            0         132 
1200          174         124 
1240            0           0 
1280            0         157 
1320            0           0 
1360            0           0 
1400          144         991 
1440            0         233 
1480            0         879 
1520          122         215 
1560          144        1251 
1600            0         609 
1640            0         172 
1680          148           0 
1720            0           0 
1760            0           0 
1800            0           0 
───────────────────
（製剤A：ワセリン単独、水溶製剤A：アルギン酸ナトリウム、0：検出限界以下、-：測定せず）
【００５５】
表６
放射能濃度 (投与量に対する%) 
─────────────────────────────
製剤の種類       正常皮膚         損傷皮膚
─────────────────────────────
製剤 A       9.18 (0-640 μm)     20.36 (0-920 μm) 
4.65 (121-640 μm)   11.39 (121-800 μm) 
製剤 B      14.97 (0-960 μm)     24.74 (0-1120 μm) 
9.35 (121-800 μm)    5.77 (121-800 μm) 
製剤 C      11.07 (0-1120 μm)    39.68 (0-1160 μm) 
8.47 (121-800 μm)   12.11 (121-800 μm) 
製剤 D       8.95 (0-1320 μm)    73.54 (0-1680 μm) 
6.23 (121-800 μm)   38.44 (121-800 μm) 
製剤 E      24.51 (0-1560 μm)    48.53 (0-1520 μm) 
17.86 (121-800 μm)   30.29 (121-800 μm) 
水溶製剤 A  19.30 (0-840 μm)     52.62 (0-1080 μm) 
8.19 (121-800 μm)   37.03 (121-800 μm)
─────────────────────────────
（各製剤の上段は皮膚に浸透した全放射能を表す。下段は真皮内に浸透した放射能量を表す。）
【００５６】
また、同様の試験をブタ皮膚において行ったところ、以下のような結果が得られた。
【００５７】
表７
放射能濃度 (投与量に対する%) 
─────────────────────────────
製剤の種類       正常皮膚         損傷皮膚
─────────────────────────────
製剤 A       4.95 (0-880 μm)      3.35 (0-640 μm) 
2.83 (121-880 μm)    2.73 (121-640 μm) 
製剤 C       3.49 (0-2040 μm)    10.18 (0-960 μm) 
3.08 (121-2040 μm)   4.58 (121-960 μm) 
製剤 E       3.22 (0-1080 μm)    19.75 (0-1560 μm) 
2.69 (121-1080 μm)  12.59 (121-1560 μm) 
水溶製剤 A  33.78 (0-1440 μm)    41.59 (0-2440 μm) 
22.57 (121-1440 μm)  34.76 (121-2440 μm)
─────────────────────────────
（各製剤の上段は皮膚に浸透した全放射能を表す。下段は真皮内に浸透した放射能量を表す。）
【００５８】
以上より、皮膚透過性の観点からは、水溶製剤A（アルギン酸製剤）、製剤E（ワセリン＋SPC16%製剤）がより好ましい。
【００５９】
これらの製剤を用いることによりNF-κB デコイ原薬必要量は製剤Eでは従来の1/5（0.4%濃度）、水溶製剤Aの場合には1/13（0.15%濃度）程度に低減できる。
【００６０】
２．皮膚累積刺激性試験
35S- NF-κB デコイを含有する水溶製剤A（アルギン酸製剤）およびアルギン酸基剤のみを、ウサギの背部皮膚に１４日間投与した時の皮膚累積刺激性を検討した。
【００６１】
(1) 動物
背部を除毛した日本白色雌ウサギ（Kbl:JW, SPF）を北山ラベス（株）箕輪生産場より購入した。薬剤投与時の週齢は１７週齢で体重は3.10〜3.74kgであった。
【００６２】
(2) 塗布部位の調製と塗布
一匹につき、正常部位を損傷部位を二箇所ずつ設け、各投与物質の例数が６匹ずつになるように投与部位を設定した。
【００６３】
投与開始前日に背部の細かい毛生を電気バリカンで除去し、Draize法（Draize, J.H., et al, J. Pharmacol.Exp.Ther.,82, 377-390 (1944)）に従い投与部位を４ヶ所設定した（図５参照）。点対称となる二箇所を正常皮膚とし、残りの二箇所は府川らの方法（府川和永ら、薬学雑誌 102, 89-98 (1982)）に基づき、投与日にシェーバーで軽く剃毛してからセロファンテープでストリッピングして損傷皮膚とした。被験製剤A〜Dに関しては0.2gを秤取して2.5×2.5cmに裁断したリント布に均一に塗り広げて皮膚に塗布し、その上から5×5cmのテーピングテープを貼付して固定した。更に布製カバー（ストッキネット、アルケア(株)）及びチューブ型ネット包帯（プレスネット、アルケア（株））を用いて被覆固定した。水溶製剤基材及び水溶製剤Aに関しては、皮膚への浸透を確認しながらピペット及びスパーテルを用いて0.2mLを投与し、その上から2.5×2.5cmに裁断したリント布及び5×5cmのテーピングテープを貼付して固定した。布製カバー及びチューブ型ネット包帯による被覆固定も同様に行った。投与終了後はリント布及びテーピングテープを除去し、投与部位を微温湯にて清拭した。
【００６４】
なお、投与初日には製剤Ａ〜Ｄの投与量を0.5ｇ、アルギン酸基材および水溶製剤Ａの投与量を0.5mLに設定して投与を開始したが、2.5×2.5cmの区画に投与することが困難であった。そこで、製剤Ａ〜Ｄについては投与２日目から、アルギン酸基材および水溶製剤Ａについては投与初日の途中から、投与量を投与可能な最大量である0.2gおよび0.2mLにそれぞれ変更した。動物番号１３番については、投与初日にアルギン酸基材を正常皮膚および損傷皮膚ともに0.5mL、水溶製剤Ａを正常皮膚に0.5mL、損傷皮膚に0.2mL投与した。他の動物には、アルギン酸基材および水溶製剤Ａ共に、投与初日より正常皮膚および損傷皮膚のいずれにも0.2mL投与した。
【００６５】
(3) 刺激性の判定
毎日の投与前及び最終投与の終了時（投与物質除去１時間後）に肉眼的判定を行った。判定はDraizeの判定基準に準拠して、投与部位の紅斑（痂皮形成）及び浮腫についてそれぞれ評価した。判定結果はDraizeの判定基準に基づいたスコアで記録した。更に正常皮膚と損傷皮膚に分けて、各観察時点の紅斑（痂皮形成）、浮腫およびそれらの合計評点について平均値と標準偏差を算出した。なおスコアは、低いほど刺激性が少ないことを意味する。
【００６６】
結果）アルギン酸基剤のみ（水溶製剤Ａのみ）および水溶製剤Ａ（アルギン酸製剤）はウサギの正常皮膚に対しては刺激性を示さなかった。損傷皮膚では紅斑や浮腫が発現したが、その程度は軽く、投与を継続しても回復する一過性の変化であった。（表８、図６〜７参照）
【００６７】
【表８】
2006089475.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００６８】
高皮膚透過性でかつ低刺激性の核酸皮膚外用製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ラット正常皮膚を用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの皮膚透過性試験の結果を表したグラフである。製剤A、B、C、D、Eを比較している。
【図２】ラット損傷皮膚を用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの皮膚透過性試験の結果を表したグラフである。製剤A、B、C、D、Eを比較している。
【図３】ラット正常皮膚を用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの皮膚透過性試験の結果を表したグラフである。製剤A、水溶製剤Aを比較している。
【図４】ラット損傷皮膚を用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの皮膚透過性試験の結果を表したグラフである。製剤A、水溶製剤Aを比較している。
【図５】ウサギの皮膚累積刺激性試験において用いたDraize法による塗布部位の調製部位を示している。ウサギ背部を上から見た図である。
【図６】ウサギを用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの投与部位の紅斑及び浮腫スコアの平均値を経時的に表したグラフである。水溶製剤Aの基剤のみ（核酸なし）を正常皮膚と損傷皮膚に投与した場合を比較している。図中エラーバーは標準偏差を表す。
【図７】ウサギを用いたNF-κBデコイオリゴヌクレオチドの投与部位の紅斑及び浮腫スコアの平均値を経時的に表したグラフである。水溶製剤Aを正常皮膚と損傷皮膚に投与した場合を比較している。図中エラーバーは標準偏差を表す。
【図１】
2006089475.tif 000003
【図２】
2006089475.tif 000004
【図３】
2006089475.tif 000005
【図４】
2006089475.tif 000006
【図５】
2006089475.tif 000007
【図６】
2006089475.tif 000008
【図７】
2006089475.tif 000009
【配列表】
2006089475000001.app