(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプル中の標的核酸（ＴＮＡ）配列を、高度の感受性および特異性をもって検出および配置する、組成物および方法の提供。【解決手段】ＴＮＡを検出および配置するために、ＴＮＡに特異的なプローブ核酸の使用、核酸結合領域の産生、および核酸標的結合集合体（ＴＢＡ）の使用を含み、ＴＢＡは特定の塩基配列を持つ核酸認識配列からなる組成物及び方法。該方法により、各特異的結合事象によって産生されるシグナルが高度に増幅される。特に、サンプル中のHIVおよびHPV核酸の検出のための方法および組成物。これらの方法および組成物は、疾患の診断、遺伝子モニター、法医学および核酸混合物の分析で使用される。検出法で用いられる新規組成物のいくつかは、病原状態の予防または治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ハイブリダイズする条件下で、標的核酸中(TNA)に存在する1/2 TBRとハイブリッドTBRを形成できる一本鎖配列である1/2 TBRと、
(b)ハイブリダイズする条件下で、ブースター核酸(BNA)中に存在する約0〜10個の1/2 BBRとハイブリッドBBRを形成できる一本鎖配列である1/2 BBRと、
(c)付属の支持体および／もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSAとを含む、プローブ核酸(PNA)であって、
ここで、TBRは高親和性でTBAに結合可能であり、TBAは対形成TBRと不対ヌクレオチドを有するTBRとを識別できる物質であり、さらに、BBRはBBAに対して高親和性で結合可能であり、BBAは対形成BBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別できる物質である、プローブ核酸(PNA)。
【請求項２】
(a)PNAまたはその他のBNA中の1/2 BBR配列に相補的な配列を有し、ハイブリダイズ条件下でPNAとハイブリッドBBRを形成可能な1/2 BBRと、
(b)付属の支持体もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSAと、
(c)別のBNAとハイブリダイズするための別のハイブリダイゼーション部位、1/2 BBRとを含む、ブースター核酸(BNA)であって、
ここで、該BBRは高親和性でBBAに結合可能であり、該BBAは対形成BBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別可能な物質である、ブースター核酸(BNA)。
【請求項３】
BBAと結合可能なBBRを形成するBNAに結合する一方、ハイブリダイズ条件下で、ヘアピンを形成可能な一本鎖配列1/2 BBRを含むヘアピン核酸（HNA）において、該BBAが高親和性でBBAに結合可能であり、該BBAは完全なBBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別可能な物質である、ヘアピン核酸(HNA)。
【請求項４】
TBRが、核酸結合蛋白、DNA結合蛋白、DNA-RNAハイブリッド結合蛋白またはRNA結合蛋白に対する１つ以上の認識部位を含む、請求項１記載のPNA。
【請求項５】
TBRが病原体のゲノム中に存在する核酸結合蛋白認識部位であるか、または脊椎動物ゲノムにおける病原状態に関連する結合部位であるか、または発酵過程で汚染した微生物のゲノム中に存在する核酸結合蛋白認識部位である、請求項４記載のPNA。
【請求項６】
TBRがHIV-LTRまたはその一部である、請求項４記載のPNA。
【請求項７】
以下の工程を含む特異的TNA配列の検出または配置法：
(a)該TNAと請求項１記載のPNAとをハイブリダイズする工程；
(b)PNA中の1/2 BBR配列と相補的である1/2 BBRを含有するBNAと、該PNAとをハイブリダイズする工程；
(c)TBRおよびBBRを含有する工程(a)および(b)の産物を、TBAを含有する表面、液体、またはその他の培地に付加する工程；
(d)以下を含むBBAを工程(c)の混合物に加える工程：
(i)  選択的にBBRに結合可能な分子または分子の一部；
(ii) 検出可能なインジケータ；および
(e)BBAに接着したインジケータによって産生されるシグナルを検出する工程。
【請求項８】
インジケータが、反応を触媒して着色反応産物を産生させることが可能な酵素を含む蛋白、放射性核種、着色ビーズである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む特異的標的核酸TNAの存在をサンプル中に検出する方法：
(a)PNAが該サンプル中に存在する場合に該TNAとのハイブリダイゼーションに基づいて、標的結合集合体TBAと結合可能な標的結合領域TBRを形成するプローブ核酸PNAと該サンプルを接触させる工程；および
(b)すでに該PNAと接触させた該サンプルを、サンプル中の該PNAと該TNAとのハイブリダイゼーションによって形成されるいかなるTBRに対しても結合可能なTBAと接触させる工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む高度の感受性および特異性を有する特異的核酸配列の検出または配置法：
(a)PNAおよびTNA中にそれぞれ存在する相補的1/2 TBRのハイブリダイゼーションによって形成される標的結合領域TBRを有する複合体を形成するため、1/2 BBRおよび1/2 TBRを含有するPNAを、1/2 TBR配列を含むTNAを含有する、または含有する可能性のあるサンプルに加える工程；
(b)TBA-TNA-PNA複合体を形成するため、工程(a)で形成されたTBRを固定化TBAに結合させる工程；
(c)BBRを形成するため、ブースター結合領域1/2 BBRを含有するブースター核酸BNAを、BNA中の1/2 BBRがPNA中に存在する1/2 BBR配列とハイブリダイズするように、工程(b)で形成された複合体に加える、またはTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ複合体が形成されるように、すでにPNAに結合したBNA中に存在する1/2 BBRに加える工程；
(d)1/2 BBR配列を含有するヘアピン核酸HNAを、HNA中の1/2 BBRが工程(c)の複合体のBNA中に存在する利用可能ないかなる1/2 BBR配列ともハイブリダイズするように、工程(c)で形成された複合体に加え、それによってTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ-HNA複合体を形成するように工程(c)のTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ複合体上へのBNAの伸長をキャッピングする工程；
(e)TBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)ｎ-HNA複合体を形成するように、インジケータ部分に結合したブースター結合集合体BBAを、工程(d)で形成されたTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ-HNA複合体に加える工程；および
(f)工程(e)のTBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)ｎ-HNA複合体中のTBA、PNA、BNA、BBAまたはHNAと結合したインジケータ部分によって産生されるシグナルを検出する工程；
TNAには以下が含まれる：
(i)  特定のサンプル中のその有無を確認すべき１つ以上の特異的1/2 TBR核酸配列；
PNAには以下が含まれる：
(i)  ハイブリダイズ条件下で、標的核酸(TNA)中に存在する1/2 TBRとハイブリッドTBRを形成可能な一本鎖配列1/2 TBR；
(ii)ハイブリダイズ条件下で、ブースター核酸(BNA)中に存在する1/2 BBRとハイブリッドBBRを形成可能な一本鎖配列1/2 TBR；
(iii)付属の支持体および／もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSA；
BNAには以下が含まれる：
(i)  PNA中の1/2 BBR配列と相補的な配列を有し、ハイブリダイズ条件下で、PNAとハイブリッドBBRを形成可能な、図１(IIb)に示す1/2 BBR；
(ii) 付属の支持体もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSA；
(iii)その他のBNAに対する別のハイブリダイゼーション部位、1/2BBR；ならびに
(iv)PNAにすでにハイブリダイズしたBNAにハイブリダイズ可能な配列1/2 BBR；
BBAには以下が含まれる：
(i)  選択的にBBRに結合可能な分子または分子の一部；および
(ii) 付属の支持体および／もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSA；
およびTBAには以下が含まれる：
(i)  選択的にTBRに結合可能な分子または分子の一部；および
(ii) 付属の支持体および／もしくはインジケータを有さない、または、付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段。
【請求項１１】
以下の工程を含む標的ポリヌクレオチドの存在を検出する固相ハイブリダイゼーション法：試験サンプル中に存在する場合、捕獲部位での固相上に、直接または中間捕獲構造を通じて標的ポリヌクレオチドを固定化する工程；該固定化の前、間、または後に、検出可能な標識を、存在する場合には該標的ポリヌクレオチドに接着させる工程；および存在する場合には、該捕獲部位で該標識の検出する工程；改変には以下の工程が含まれる：
(a)該標的ポリヌクレオチドの固定化を得る手段として、標的結合集合体TBAを用いる工程であって、ここで該TBAは、該TBAによって認識可能な完全な標的結合領域TBRが形成されるように、特異的プローブ核酸PNAと該標的核酸との間に形成される独自のハイブリッドにのみ結合する工程；および
(b)PNA中の1/2 BBRとのハイブリダイゼーションに基づき、標識したブースター結合集合体BBAを結合可能なBBRを形成する一本鎖相補的1/2 BBRを含有するブースター核酸BNAを結合可能な一本鎖配列1/2 BBRをPNA中に含む工程。
【請求項１２】
少なくとも１つの核酸認識単位、ならびに任意でリンカー配列、集合体配列、非対照配列、核配置シグナル配列(NLS)およびOSAから成る群より選択される配列を１つまたは全て含む、標的結合集合体TBAまたはブースター結合集合体BBA。
【請求項１３】
核酸認識単位が、NF-kB結合単位、SP1結合単位、TATA結合単位、ヒト乳頭腫ウイルスE2結合単位、HPV LTR結合単位、HIV LTR結合単位、およびTatから成る群より選択される、請求項12記載のTBA。
【請求項１４】
核酸認識単位が、配列番号：63、配列番号：64、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：80、配列番号：81、配列番号：82、配列番号：83、配列番号：84、配列番号：93、配列番号：94、配列番号：95、配列番号：96、配列番号：97、配列番号：98、および配列番号：118から成る群より選択される配列を有する、請求項13記載のTBA。
【請求項１５】
リンカー配列が核酸認識単位の核酸認識機能を阻害せず、TBAの残りの部分から核酸認識単位の空間の安定性および制御を提供するオリゴペプチドである、請求項12記載のTBA。
【請求項１６】
リンカー配列が、構造蛋白のドメイン間一次配列からのオリゴペプチド配列である、請求項15記載のTBA。
【請求項１７】
集合体配列が核酸認識単位の折り畳みおよび会合を指向するオリゴヌクレオチド配列である、請求項12記載のTBA。
【請求項１８】
集合体配列がバクテリオファージλcro蛋白またはCI蛋白に由来し、配列番号：104、配列番号：105、配列番号：106、配列番号：107、および配列番号：108から成る群より選択される、請求項17記載のTBA。
【請求項１９】
非対称配列が核酸認識および集合体配列を既定の順序で指向する請求項12記載のTBA。
【請求項２０】
非対称配列がインスリン、性腺刺激ホルモン、FSH、HCG、LH、ACTH、またはリラキシンに由来する、請求項19記載のTBA。
【請求項２１】
非対称配列が、配列番号：85、配列番号：86、配列番号：87、配列番号：88、配列番号：89、配列番号：90、配列番号：91、および配列番号：92から成る群より選択される、請求項20記載のTBA。
【請求項２２】
NLSが、該NLSと会合する蛋白または複合体の細胞核中への移動および取り込みを指向するオリゴペプチドである、請求項12記載のTBA。
【請求項２３】
NLSが、配列番号：72および配列番号：103から成る群より選択される、請求項22記載のTBA。
【請求項２４】
HIV検出I〜IVまたはHPV検出I〜IVである、請求項12記載のTBA。
【請求項２５】
配列番号：109、配列番号：110、配列番号：111、配列番号：112、配列番号：113、配列番号：114、配列番号：115、および配列番号：116から成る群より選択される配列を有する、請求項12記載のTBA。
【請求項２６】
以下の工程を含む標的核酸サンプル中の特定の核酸配列と結合する請求項12記載のTBAを用いる方法：
(a)標的核酸サンプル中の核酸を断片化する工程；
(b)ハイブリダイズ条件下で、断片化核酸を特定の関係核酸配列と相補的なプローブ核酸と接触させる工程において、該プローブ核酸は、特定の該関係核酸配列とのハイブリダイゼーションにより、それに対して該TBAが特異的に結合する標的核酸領域を形成する工程。
【請求項２７】
プローブ核酸が、特定の該関係核酸配列に相補的な配列に加えて、ブースター核酸が結合してブースター結合部位を形成することができる別の配列を有する請求項26記載の方法であって、このブースター結合部位に標識ブースター結合集合体が結合して、関係標的核酸配列に対するプローブ核酸の結合を示して増強するシグナルを提供することができる方法。
【請求項２８】
TBAを、該TBAの治療的または予防的有効量による治療を必要とする患者に対し投与する方法であって、精製蛋白複合体の形態で、または患者の体内に入って、TBAが特定の核酸配列と結合して望ましい予防的もしくは治療的結果が得られるようにTBAを発現可能な組換えベクターの形態で投与する工程を含む、請求項12記載のTBAを用いる方法。
【請求項２９】
TBAを、配列番号：109、配列番号：110、配列番号：111、配列番号：112、配列番号：113、配列番号：114、配列番号：115、および配列番号：116から成る群より選択され、患者がHIVまたはHPVに感染している、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
さらに以下の工程を含む、請求項26記載の方法：
(c)サンプル中の特定の断片に対するTBAの結合が断片の移動度を修飾するように、サイズの機能として標的核酸サンプル中の核酸の移動度シフトをモニターする工程。
【請求項３１】
以下を含む特異的配列組成物を有する核酸をサンプル中に検出するための診断的または法医学的検査キット：
(a)その存在を試験サンプル中で確認すべき特異的配列組成を有する核酸に相補的な第一の核酸プローブで、第一の該核酸プローブおよび特異的配列組成を有する該核酸が、ハイブリダイゼーションにより、第一核酸結合蛋白の結合部位を形成し、および第一の該核酸プローブがさらに、第二の核酸プローブに相補的なさらなる配列を含む第一の核酸プローブ；
(b)第一の該核酸プローブと特異的配列組成を有する該核酸とのハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖に特異的な第一核酸結合蛋白；
(c)第一および第二の該核酸プローブのハイブリダイゼーションに基づき、第二の核酸結合蛋白に対する結合部位が形成される第一の該核酸プローブ中の別の該配列に相補的な第二の核酸プローブ；
(d)第一の該核酸プローブと第二の該核酸プローブとのハイブリダイゼーションに基づき形成される二本鎖に対して特異的に結合し、第二の該核酸結合蛋白が検出可能な標識で標識される第二の核酸結合蛋白。
【請求項３２】
第一の該核酸プローブとHIV LTRとのハイブリダイゼーションに基づき、NF-kB、またはそのサブユニット、SP1、TATA結合蛋白、HIV-検出I、II、IIIもしくはIV、またはHIV-ロックに対する結合部位が形成されるように、第一の該核酸プローブがHIV LTRに相補的である、請求項31記載の診断的または法医学的検査キット。
【請求項３３】
第一の核酸結合蛋白が、NF-kB、またはそのサブユニット、SP1、TATA結合蛋白、HIV-検出I、II、IIIもしくはIV、またはHIV-ロックである、請求項32記載の診断的または法医学的検査キット。
【請求項３４】
第一および第二の核酸プローブのハイブリダイゼーションに基づき、バクテリオファージλCIリプレッサー蛋白、バクテリオファージλcro蛋白、またはその誘導体もしくは相同体に対する結合部位が形成されるように、第一の核酸プローブが、HIV-LTRに相補的であることに加えて、バクテリオファージλの左または右オペレータをコードする配列を含み、第二の核酸プローブが、第一の該核酸プローブ中のバクテリオファージλの左または右オペレータ配列と相補的な配列を含む、請求項33記載の診断的または法医学的検査キット。
【請求項３５】
第二の核酸結合蛋白がバクテリオファージλCIリプレッサー蛋白、バクテリオファージλcro蛋白、またはその誘導体もしくは相同体である、請求項34記載の診断的または法医学的検査キット。
【請求項３６】
HIV-ロックまたはHIV-ロックおよび薬学的に許容される担体をコードする組換えベクターを含む、組成物。
【請求項３７】
以下の工程を含む病原状態と相関した核酸配列に対する核酸結合蛋白の異なる結合法：
(a)試験サンプル中に存在する場合、核酸配列のその特定の配置とハイブリダイズするプローブ核酸を設計するために、および利用可能な核酸結合蛋白の結合部位が、該プローブ核酸と標的として選択した核酸配列の特定の該配置とのハイブリダイゼーションに基づいて確実に形成させるために、標的配列として病原状態と相関する核酸配列中に存在する核酸結合蛋白配列の特定の配置を選択する工程；
(b)病原状態と相関する核酸結合蛋白配列の選択した特定の配置に特異的に結合するが、該病原状態と相関しない配列には結合しない核酸結合蛋白を選択する工程；
(c)病原状態と相関する核酸配列中に存在する核酸結合蛋白配列の特定の該配置を含有する可能性のある試験サンプルと、該プローブ核酸とをハイブリダイズする工程；
(d)該核酸結合蛋白を工程(b)で形成されたいかなるハイブリッドとも接触させる工程；ならびに
(e)該核酸結合蛋白の該ハイブリッドとのいかなる結合も検出する工程。
【請求項３８】
核酸結合蛋白配列の特定の該配置を、病原状態の発症における必要な段階または制御点から選択する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
方法が自動的に行われる、請求項９記載の方法。
【請求項４０】
方法がアボット・ラボラトリーズIMx装置で実施される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
マイクロタイタープレートで実施される、請求項９記載の方法。
【請求項４２】
PNA-TNAハイブリッドに対するBNAの結合、およびBNAに対する標識BBAの結合を含むTNAに対する請求項１記載のPNAの結合を通じて得られるシグナルの増幅法。
【請求項４３】
核酸結合複合体の成分の会合または非会合を指向する非対称配列を用いることを含む、核酸結合複合体の集合法。
【請求項４４】
バクテリオファージλcroまたはCIに由来する集合体配列を用いて核酸結合複合体の会合成分を集合させることを含む、核酸結合複合体の集合法。
【請求項４５】
集合体、非対称、またはパイロット配列を用いて、多量体蛋白複合体の中に取り込むべきサブユニットを、該集合体、非対称またはパイロット配列と結合させ、該多量体複合体を回収することを含む、多量体蛋白複合体の集合方法。
【請求項４６】
配列番号：105、配列番号：106、または配列番号：108を含む組成物。
【請求項４７】
請求項12記載のTBAまたはBBAをコードする核酸。
【請求項４８】
TBAのアミノ酸配列が、セットA、セットB、およびセットCから成る群より選択され、該セットが以下のようにして含まれる、請求項12記載のTBAまたは該TBAをコードする核酸：
セット 群からのリンク配列
A          I + II + III
B          IV +V + III
C          IV + III
ここで、I〜IV群は以下より選択される配列からなる：
グループ    配列からの選択
I           配列番号：85〜92のいかなるものでもよい。
II          各々が配列番号：99に結合した配列番号：104〜106のいずれにも結合するMet Ser。
III         配列番号：75〜84もしくは94〜98のいずれにも結合する配列番号：100；
配列番号：74もしくは配列番号：93のいずれかに結合する配列番号：101；または
配列番号：74もしくは配列番号：93に結合する配列番号：102；または
配列番号：72、103、73、もしくは63〜71のいずれか。
IV          配列番号：104〜108のいずれも。
V           配列番号：99。
【請求項４９】
成分TBAを共有結合または非共有結合で接着した蛋白または二層小胞を利用して細胞内に導入することを含む、または各成分TBAのDNA認識単位を通じて、細胞内の核もしくはその他の場所で遭遇する核酸配列に対する近位結合に基づき、成分発現TBAが該集合体および非対称配列を通じて多量体TBAに集合するように、各々がDNA認識単位、集合体配列、非対称配列、核配置シグナル配列、および最適リンカー配列を含む該成分TBAをコードする核酸を細胞に導入することによる、インビボまたはインサイチューで多量体TBAを集合する方法。
【請求項５０】
以下の工程を含む標的結合集合体またはブースター結合集合体の調製のための核酸結合分子の同定法：
a.標的核酸を含有するサンプルを得る工程；
b.核酸を露出し、サンプル中に含まれる核酸のサイズの複雑性を低下させるためにサンプルを断片化する工程；
c.断片化核酸の最初の部分試料を対照緩衝液に接触させ、断片化核酸の第二の部分試料を既知プロフィールの核酸結合分子を含有する対照緩衝培地に接触させる工程；
d.２つの部分試料を分析して、対照緩衝培地に接触させた部分試料に対して、標的結合分子と接触させた部分試料で挙動の変化を示した断片を特定する工程；
e.核酸結合分子と接触させたときに挙動の変化を示した断片を同定および単離し、ならびに既知の核酸結合分子モチーフが存在するか否かを決定するために、核酸断片を配列決定する、または核酸に結合した核酸結合分子を直接的に同定する工程；
f.集合体、非対称核配置および任意でリンカー配列を用いて、挙動の変化を示した核酸結合分子を含むTBAを合成する工程。
【請求項５１】
以下の工程を含むサンプル中の特異的核酸配列の同定法：
a.該サンプル中の核酸を断片化して、核酸を露出し、核酸のサイズの複雑性を低下させる工程；
b.該TBAは、各々がTBR内のその核酸認識単位に対して比較的弱い結合を示すが、組み合わせると完全なTBRに対して強い結合を提供する２つ以上の核酸結合成分を含むTBAをサンプルと接触させる工程；
c.個々の認識単位を含有する同類核酸に対して比較的強い結合親和性を有するが、TBAの結合親和性と比較すると比較的結合が弱い核酸結合成分の過剰量にサンプルを接触させ、２つ以上の該核酸結合成分を有するTBRを完成させることを含む、個々の認識単位を含有する同類核酸に対するTBAの結合によって生じる「クロストーク」を消失させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、密接に関連があるが異なる核酸の存在下においても、忠実かつ正確に試料中の特異的標的核酸配列を結合、検出、および検出を増幅するために用いる方法および構成を提供する。結合は、プローブ核酸と標的核酸配列とのハイブリダイゼーションにより形成される標的結合領域に特異的に結合する標的結合集合体の中に、シャペロニングと特異的分子集合体を含んでもよい。増幅は、プローブ核酸、標的核酸、またはその他のブースター核酸と、ブースター核酸とのハイブリダイゼーションにより形成されたブースター結合領域に特異的に結合するブースター結合アセンブリの中に、シャペロニングおよび／または特異的分子集合体を含んでもよい。方法、およびヘアピン核酸を含む構成もまた、この増幅で用いられる特異的または非特異的に伸長したブースター核酸のサイズおよびブースター結合集合体の制御を可能にするために提供される。検出には、プローブ核酸、標的結合集合体、ブースター核酸、ブースター結合集合体、またはヘアピン核酸に関連した放射性、光-もしくは蛍光-放出、酵素的またはその他の検出可能もしくはシグナル産生分子を含む、１つ以上の検出可能標識を提供することが含まれる。方法は、プローブ核酸ならびにその断片および／または有機体に独自のTBAを作成するために、TBA組成結合部位を有する有機体からの核酸断片の単離のために示されている。標的結合集合体の治療的および予防的利用法ならびにそのように使用するための構成についても提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の背景および説明
特異的配列を含有する核酸、以後標的核酸（TNA）と呼ぶ、を試料中に検出するのに重要な状況は、ますます増加している。最小のプロセシング工程数で、最も単純な組成で、および他の同類ではあるが異なる核酸、以後同類核酸（CNAs）と呼ぶ、を除外しつつTNAを検出できることが望ましい。増幅またはその他の検出後プロセシングの必要もなく、検出試料中に全てのCNAsを残らず除外しつつ、特異的TNAを検出できることが望ましい。
【０００３】
固定化核酸または標識核酸をTNAのプローブとして用いる方法は無数にある。しかし、既知の方法を用いても、プローブ核酸（PNA）と結合したTNAを、PNAに結合したCNAに対して識別することは困難である。たとえば、PNAとCNAとの間に１箇所以上の塩基の不対合があっても、TNA-PNAハイブリダイゼーションとほとんど識別不可能なCNA-PNAハイブリダイゼーションがなおも生じうる。したがって、ハイブリダイゼーション単独では、PNAが独自のTNAにハイブリダイズされたことを示す最適な指標とはならない。
【０００４】
CNAsを含有する可能性がある試料中にTNAが存在するか否かを判定するためにPNAを用いる状況は多くある。この状況では、いかなるCNAに対するPNAのハイブリダイゼーションも、PNAがTNAの検出に対して有する可能性がある、さらなる確認を必要としない、診断的価値が制限される。さらに、多くのCNAsコピーを含有する可能性がある試料では、TNAの別のコピーを作成する必要なく、少ないコピー数でTNAを検出および配置できることが望ましい。同様に、試料中のCNAsとTNAとを分離する必要なく、TNAとは無関係にCNAsの存在を確認できることが望ましいだろう。
さらに、生成率の低い特定のTNA-PNAのハイブリダイゼーションのシグナルを増幅できることが望ましいだろう。この目的に関して、標識、以後ブースター核酸（BNA）と呼ぶ、の多数のコピーをTNA-PNA上に重合化する方法が望ましい。
【０００５】
本発明は、前述の望ましい目的を達成するための方法および構成を提供する。以下の総説から明らかなように、本構成および方法は、当技術分野においてこれまで報告または示唆されていない。核酸検出の技術の現状に関する一般的および包括的総説は、「非特許文献１」に提供されている。
【０００６】
PNAがTNAではなくてCNAとハイブリダイズしたか否かを明らかにするため、化学的手段によって塩基不対合を検出する方法が報告されている。特許文献１では、単一の塩基不対合を含有するDNA断片をその完全に対になった同族体と識別する方法が論じられている。二本鎖断片内の一本鎖領域をカルボジイミドで修飾し、これがDNA中の対になっていないグアニン（G）及びチミン（T）残基と反応する。直鎖状二本鎖DNA分子は反応しないが、単一の塩基不対合があるDNA分子は定量的に反応する。カルボジイミドによる反応の後、修飾および非修飾断片が識別できるように、DNA分子を高含有量のポリアクリルアミドゲル上で分画する。フォードらは、表現型の変動および遺伝疾患の原因となるDNA配列の違いの位置を特定し、精製するためにこの技法を応用した。この方法は、遺伝子材料における以下の変動にとって有用であるが、工程数が多く、費用の高い成分を必要とし、しかもPNAが試料中のCNAsを除いてTNAとハイブリダイズされたか否かを決定する直接的手段を提供していない。
【０００７】
PNAと別の核酸との少なくとも一部のハイブリダイゼーションが相補的であることを保証するために、いくつかの試みがなされている。一つの方法は、PNAが十分に核酸とハイブリダイズして、プローブに含まれるプロモーター部位から転写された場合に産生される転写産物のモニタリングを含む。ダッタグプタ（Dattagupta）に対する特許文献２は、ヘアピンプローブを用いた特異的核酸配列の増幅法を開示しており、ヘアピンプローブは、標的配列とのハイブリダイゼーションおよびリガーゼ結合によって転写することが可能である。プローブは一本鎖自己相補的配列から成るが、この配列はハイブリダイゼーション条件下では、機能的プロモーター領域を有するヘアピン構造を形成し、さらにヘアピン配列の３'末端から伸長する一本鎖プローブ配列から成る。プローブ配列と相補的な標的配列とのハイブリダイゼーション、およびハイブリダイズした標的配列の３'末端とヘアピンプローブの５’末端とのリガーゼ結合時に、標的配列は適切なRNAポリメラーゼおよび適当なリボヌクレオシド３燐酸（rNTPs）の存在下で転写可能となる。増幅は、望ましいTNA配列とプローブとのハイブリダイゼーション、TNAのPNAとのリガーゼ結合、RNAポリメラーゼおよびrNTPsを分離したハイブリッドに加え、そして望ましい量のRNA転写物が蓄積するまで転写を進行させることによって達成される。本方法は、一般的および特異的に、標的配列をアニール化するために、一本鎖不対末端とともに形成されたヘアピンDNAの利用を含む。標的配列が結合すれば、RNA転写産物の産生が可能になる。このように、本方法は、標的配列を直接固定化および／または配置するために、核酸結合集合体を利用するよりむしろ二次的な転写産物の検出を含む。CNAはプローブに容易に結合することが可能で、相補性が欠如していてもCNA-PNAハイブリッドの形成は必ずしも妨害されず、その後このハイブリッドが望まない転写産物の産生を持続させうる。
【０００８】
PNAに結合したCNAは、相補性の欠如によってハイブリッドCNA-PNA対が制限エンドヌクレアーゼによって切断される感受性が妨害される場合、検出される可能性がある。特許文献３および特許文献４において、核酸分析物を測定する新規方法が提供されており、ここでは分析物中の対象配列と実質的に相同なオリゴヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを採用しており、ここでは既定の厳密性でのハイブリダイゼーションの有無が支持体からの標識の放出を規定する。支持体に標識を結合させるためには、様々な技法が採用されているが、一本または二本鎖のいずれかが開裂すると、標識は支持体から放出される可能性がある。標識の放出は、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在の指標として検出することができる。しかし、本技法は、たとえ不対合があっても、不対合がエンドヌクレアーゼの認識領域外であれば、CNA-PNA対が制限エンドヌクレアーゼによって切断されうるという欠点を有する。このために、この測定法ではCNA-PNAハイブリッドを同定することができない。
【０００９】
別の方法では、核酸を検出するために分枝鎖DNAプローブを用いる。特許文献５は、直鎖または分枝鎖オリゴヌクレオチドマルチマーが、（１）対象とする一本鎖オリゴヌクレオチド配列（TNA）に相補的な少なくとも１つの最初の一本鎖オリゴヌクレオチド単位（PNA）、および（２）一本鎖標識オリゴヌクレオチドに相補的な二次的な一本鎖オリゴヌクレオチド単位の多重性から成る生化学測定法において増幅剤として有用であることを開示している。増幅されたサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションおよびマルチマーを用いた免疫測定法が記述されているが、この方法は、PNA-CNAハイブリダイゼーションが起こりうる、そしてその結果望まないシグナルが産生されるという限界を有する。
【００１０】
TNAの同定法に加えて、このDNAの増幅に関する方法が開示されている。特許文献６では、ハイブリダイゼーション条件下で分析物ポリヌクレオチドを捕獲プローブ（PNA）と接触させることによって、分析物配列（TNA）を有する分析物ポリヌクレオチド鎖がポリヌクレオチドを含有する試料中に検出され、ここでは捕獲プローブは、TNAに特異的な第一結合パートナーと、固相第三結合パートナーに特異的な第二結合配列を有する。次に、得られた二本鎖を結合パートナー間の特異的結合によって固定化し、非結合ポリヌクレオチドを結合種から分離する。分析物ポリヌクレオチドを固相から随意に外して、PCRによって増幅する。PCRプライマーはそれぞれ、分析物ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド領域を有し、少なくとも１つのプライマーはさらに、固相結合パートナーと結合可能な別の結合パートナーを有する。次に、増幅産物を結合パートナー間の特異的結合によって反応混合物から分離し、増幅産物を検出する。特定の核酸がPNAとハイブリダイズされたことを（PCRによって）確認することは可能であるが、確認は費用が高く、多数の工程を含む。
【００１１】
二本鎖核酸とDNA結合蛋白との相互作用に関連した報告に関して、単一の蛋白に対する結合部位を有する非固定化DNAの配列を用いて、その蛋白を精製する方法が記述されている。特許文献７は、特定の蛋白と特異的に結合する塩基配列を有するDNA鎖、およびいかなる蛋白も、化学結合によって互いに結合した担体およびDNA鎖も吸収しない粒子径が0.01 μmより大きく50 μmを越えない担体からなるDNA固定化ミクロスフェア、および該ミクロスフェアを用いた蛋白の精製に関する過程を開示している。これは蛋白の精製法であるので、TNAの検出法も開示せず、特異的TNA配列の検出および配置を目的として、１つ以上の蛋白が二本鎖核酸に結合する方法も開示しない。
【００１２】
特許文献８では、試料中のポリヌクレオチド標的配列を検出する方法が記述されており、ここではTNAの配列は、第一および第二PNAのTNAとのハイブリダイゼーションによって検出される。該第一および第二PNAのそれぞれが予め生成された二本鎖配列または鎖の伸長によって生成され、ヌクレオチド配列特異的結合蛋白と結合可能な二本鎖を含有した。PNAとTNAとの間に二本鎖が生成された場合に限って、ヌクレオチド特異的結合蛋白をTNAとPNAとの間に形成された二本鎖に結合させる方法は、開示も示唆もされていない。
【００１３】
特許文献９では、試料中の特異的ヌクレオチド配列の非放射性検出法が開示されており、これにはDNA結合蛋白特異的配列を含有するプローブのハイブリダイゼーションが含まれる。しかし、この開示は、PNA中に存在する配列とTNA中に存在する配列との間に二本鎖が形成される場合に限って、ヌクレオチド特異的結合蛋白をTNAとPNAとの間に形成される二本鎖に結合させる方法を、教示も示唆もしなかった。
【００１４】
【特許文献１】フォード（Ford）らの米国特許第4,794,075号
【特許文献２】米国特許第5,215,899号
【特許文献３】ウルデア（Urdea）の米国特許第5,118,605号
【特許文献４】ウルデアの米国特許第4,775,619号
【特許文献５】ウルデアらの米国特許第5,124,246号
【特許文献６】ウルデアの米国特許第5,200,314号
【特許文献７】カワグチ（Kawaguchi）らの米国特許第5,122,600号
【特許文献８】欧州特許第0 453 301号
【特許文献９】米国特許第4,556,643号
【非特許文献１】Keller,H., M.M.Manak（1989）DNAプローブ（DNA Probes）, Stockholm Press.
【発明の開示】
【００１５】
発明の簡単な概要
特異的標的核酸（TNA）配列とのハイブリダイズにより標的結合集合体（TBA）と結合可能となるプローブ核酸（PNA）を用いてTNAを検出する方法を開示する。各TBAは、PNA-TNAハイブリッド対の少なくとも１つの特異的領域、すなわち標的結合領域（TBR）に結合する。TBAは１つ以上の分子、すなわち特異的および配列または構造依存的に、TBR配列と結合しうる１つ以上の分子から成る；TBAは１つ以上の「PILOTS」または「非対称配列」と呼ばれる試験的配列から成ってもよく、これはTBAのヌクレオチド結合成分を特異的結晶構造へと集めて拘束する。PILOTSは、特異的核酸領域単位、または特異的核酸認識単位を既定の様式でTBAに取り付けるその他の試験的単位を集めるように作用する。TBAも同様に、TBAを固定または配置する１つ以上の分子を含んでもよい。独自の明確な特徴を有する新規TBAは、TBAを診断のツールばかりでなく、予防的または治療的化合物として驚くほど有用なものにするが、これも開示する。診断および法医学試験キットの成分としてのそれらの利用、および予防または治療剤としての新規TBAの利用を含めたPNA、TBR、TBA、およびTBA PILOTSを利用する方法および構成を開示する。
【００１６】
TNA特異的配列に加えてPNAもまた、１つ以上の配列、1/2 BBRを含んでもよく、ブースター核酸（BNA）において相補的1/2 BBRとハイブリダイズすることが可能である。加えたBNAとPNA中に存在するスターター1/2 BBRとのハイブリダイゼーションを通じて、PNAの伸長は、PNA-BNAの形で、そして次にBNA-BNAハイブリッドの形で行われる。これらの伸長は、１つ以上のブースター結合領域（BBR）を含むことができる。各BBRは、ブースター結合集合体（BBA）と結合することが可能である。BBAは、特異的および配列または立体構造依存的にBBRに結合することができる一つ以上の分子を含む。BBAは「PILOTS」または「非対称配列」と呼ばれる１つ以上の試験的配列を含んでいてもよく、これはTBAのヌクレオチド結合成分を特異的結晶構造へと集めて拘束する。PILOTSは、特異的核酸領域単位、または特異的核酸認識単位を既定の様式でBBAに取り付けるその他の試験的単位を集めるように作用する。BBAは、BBAを固定して配置する、または結合したBBAとこれによって今度はそれらが結合するTBA-TNA-PNA複合体の検出を可能にする分子を含有してもよい。診断および法医学試験キットの成分としてのそれらの利用を含めた、1/2 BBR、BNA、BBR、BBA、およびBBA PILOTSの利用に関する方法および構成を開示する。
【００１７】
キャッピング構造としてのヘアピン核酸（HNA）の利用に関する方法および構成を開示する。HNAは、PNAまたはその他のBNA上へのBNAの伸長を終了させるために、自己ハイブリダイズ領域、およびハイブリダイズ条件下でPNA中の1/2 BBRまたはすでにPNAに結合したBNA中の1/2 BBRに直接ハイブリダイズできる一本鎖1/2 BBRを含有する。
【００１８】
ヒト細胞、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、ならびにウイルス及びバクテリアを含むその他の核酸含有システムにおいて形成される核酸配列を含む特異的核酸配列を、検出、配置、そして区別するために、PNA、TBA、TBR、BNA、BBR、BBA、およびHNAを含有する試験キットの試験方法および産生に関する方法および構成を開示する。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、密接に関連があるが異なる核酸配列の存在下においても、忠実かつ正確に試料中の特異的標的核酸配列を結合、検出、および検出を増幅するために用いる方法および構成を提供することである。
したがって、本発明の目的は、プローブ核酸と標的核酸配列とのハイブリダイゼーションによって形成される標的結合領域に特異的に結合する標的結合集合体を作成するための方法および構成を提供することである。
【００２０】
プローブ核酸、ブースター核酸、およびヘアピン核酸とブースター核酸配列とのハイブリダイゼーションによって形成されるブースター結合領域に特異的に結合するブースター結合集合体を作成するための方法および構成を提供することも、本発明のもう一つの目的である。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、PNA-TNAハイブリダイゼーションの増幅に用いられる特異的または非特異的に伸長するブースター核酸のサイズおよびブースター結合集合体の制御を可能にするヘアピン核酸を含有する方法および構成を提供することである。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、それぞれが核酸結合識別能力を有する特異的分子の、標的およびブースター結合集合体への選択、集合、および／またはシャペロニングに用いる方法および構成を提供することである。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、ブースター結合集合体およびブースター核酸を用いて、標的結合領域に結合した標的結合集合体の検出の増幅に用いる方法および構成を提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、放射性標識、光放出、蛍光、酵素的またはその他のシグナル産生分子に限定した一つ以上の検出可能な標識の使用を可能にする方法および構成を提供することである。これらの標識は、プローブ核酸、標的結合集合体、ブースター結合集合体、ブースター核酸またはヘアピン核酸に関連して用いられる。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、その断片または有機体にとって独自のプローブ核酸およびTBAを作成するために、TBA組成結合部位を有する有機体からの核酸断片を単離するための方法を提供することである。
【００２６】
配列の簡単な説明
配列番号:１は図５-Ia-１に対応し、クラス１MHC NF-kB結合部位を示す。
配列番号:２は図５(Ia)に対応し、B2-ミクログロブリンNF-kB結合部位を示す。
配列番号:３は図５(Ia)に対応し、カッパ免疫グロブリンNF-kB結合部位を示す。
配列番号:４は図５(Ia)に対応し、HIV NF-kB結合部位の一つを示す。
配列番号:５は図５(Ia)に対応し、HIV NF-kB結合部位の一つを示す。
配列番号:６は図５(Ia)に対応し、c-myc NF-kB結合部位を示す。
配列番号:７は図５(IIa)に対応し、二重HIV NF-kB結合部位を示す。
配列番号:８は図５(IIa)に対応し、二重HIV NF-kB結合部位を示す。
配列番号:９〜16は、図５(IIa)に対応し、１つの部位がHIV NF-kB結合部位、およびもう１つの部位がHIV SP1結合部位である二重の結合部位を示す。
配列番号:17〜18は、図５(IIa)に対応し、二重HIV SPI結合部位を示す。
配列番号:19〜31は、図５(IIIa)に対応し、二重HIV NF-kB結合部位およびHIV SP1結合部位を示す。
配列番号:32〜33は、図５(IVa)に対応し、２つがHIV NF-kB結合部位、および２つがHIV SP1結合部位である４重の結合部位を示す。
配列番号:34は図５(VIa)に対応し、２つがHIV NF-kB結合部位で、３つがHIV SP1結合部位である５重の結合部位を示す。
配列番号:35は1/2 BBRの例で、この場合、介入配列を含むバクテリオファージラムダ左オペレータのOL1、OL2およびOL3要素である。
配列番号:36は1/2 BBRの例で、この場合、介入配列を含むバクテリオファージラムダ右オペレータのOR1、OR2およびOR3要素である。
配列番号:37は、HIV LTRである。
配列番号:38は、HIV LTRのPNAに相補的なPNAである。
配列番号:39は、配列番号:38のHIV LTRの異なるPNAに相補的なPNAである。
配列番号:40は、HIV LTRの一部に相補的なPNAで、これは1/2 BBR、およびBNAをPNA上に重合するための突出配列も含有する。
配列番号:41は、配列番号:40の1/2 BBRに相補的なBNAである。
配列番号:42は、配列番号:41のBNA上に重合するBNAで、これは配列番号:40および41と共にPstI認識部位を作成する。
配列番号:43は、配列番号:42のBNAに相補的なBNAで、これはBamHI認識部位を完成させる。
配列番号:44は、増大しつつあるポリマーに対して、配列番号:42および43によって作成されるBamHI認識部位とハイブリダイズするBamHI認識部位を有するHNAである。
配列番号:45は、配列番号:40と同様、HIV LTRの一部と相補的であるが、配列番号:40と同じ配列には相補的でない第二PNAである。配列番号:45も同様に、1/2 BBR、およびSph1認識部位からBNAの重合化を開始させる突出をコードする。
配列番号:46〜62は、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)特異的PNAであり、これはHPV配列とのハイブリダイゼーション時にHPV DNA結合蛋白に結合するTBRを形成する。
配列番号:63〜71は、TBAへの取り込みのためのNF-kB DNA認識部位である。
配列番号:72は、核配置配列である。
配列番号:73は、SP1配列認識単位である。
配列番号:74は、TATA結合蛋白認識単位である。
配列番号:75〜84は、乳頭腫ウイルスE2 DNA認識単位である。
配列番号:85〜92は、非対称配列である。
配列番号:93は、アラビドプシス(arabidopsis)TATA結合蛋白認識単位である。
配列番号:94は、HPV-16-E2-1 DNA結合蛋白認識単位である。
配列番号:95は、HPV-16-E2-2 DNA結合蛋白認識単位である。
配列番号:96は、HPV-18-E2 DNA結合蛋白認識単位である。
配列番号:97は、HPV-33-E2 DNA結合蛋白認識単位である。
配列番号:98は、ウシ乳頭腫ウイルスE2 DNA結合蛋白認識単位である。
配列番号:99〜102は、典型的なリンカー配列である。
配列番号:103は、典型的な核配置シグナル配列(NLS)である。
配列番号:104〜108は、典型的なシャペロン配列である。
配列109〜116は、典型的に集合したTBA配列である。
配列117は、コンセンサスNF-kB結合部位である。
配列118は、HIV Tatアミノ酸配列である。
【００２７】
略語
2006320326.tif 000002
一本鎖核酸
2006320326.tif 000003
二本鎖核酸
2006320326.tif 000004
核酸上の結合領域
2006320326.tif 000005
支持体もしくは指標、または固相支持体、もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着、またはインジケータ＝OSAを含むがこれに限定しないその他の配置手段なし。
BBA   ブースター結合集合体
BBR   ブースター結合領域
BNA   ブースター核酸
CNA   同類核酸
1/2 BBR  HNAまたはBNAからの相補的配列とハイブリダイズすれば、BBAに結合可能な一本鎖領域
1/2 TBR  TNAからの相補的配列とハイブリダイズすれば、TBAと結合可能なPNAの一本鎖領域
OSA   随意の支持体または付属物、箱つきの円
PNA   プローブ核酸
TBA   標的結合集合体
TBR   標的結合領域
TNA   標的核酸
HNA   ヘアピン核酸
【００２８】
定義
標的結合集合体(TBA)、ブースター結合集合体(BBA)、DNA結合蛋白、核酸結合蛋白またはRNA結合蛋白などの用語について言及する場合、目的は、それらが由来する結合分子の範疇の特異性に関わらず、DNAまたはRNA標的核酸配列(TNA)に結合する分子を含む構成であることは、後に述べる開示からも理解されるはずである。したがって、例えば、ヒト免疫不全ウイルス配列に結合するよう適合させたTBAは、DNA配列に典型的に結合するNF kB転写因子に対して最も類似している可能性がある。
【００２９】
しかし、本明細書で用いられるように、TBAは特定の配列組成または構造のRNA配列に対して結合するように、最適に用いられるように適合させてもよいことは理解されるであろう。
【００３０】
本明細書で開示される検出法の忠実性は、特定の核酸モチーフに対するTBAおよびBBAの選択的結合にかなりの程度依存する。本開示を通じて、関連配列(同類核酸またはCNAs)からのTNAのTBAおよびBBA識別の基盤は、正確なプローブ核酸(PNA)-標的核酸(TNA)ハイブリッドセグメント(PNA-TNAハイブリッド)の形成であいうることは理解されるはずである。しかし、識別の基盤は特定の構造の形成であるほうがよく、TNA-PNAハイブリッド中に不適正塩基対が完全にない必要はない。したがって、TBAまたはBBA操作の基盤は、所定のPNAと接触させた試験サンプル中に形成される可能性があるPNA-CNAハイブリッドによって示される何らかの特性に対抗して、TNA-PNAハイブリッドの独特の特性の識別に依存することが理解されるはずである。
【００３１】
発明の詳細な開示
本発明は、特異的核酸結合蛋白を取り込む標的結合集合体(TBA)を用いることによって、サンプル中の標的核酸(TNA)を特異的に同定する方法を提供する。所定のTNA配列に対して特異的なプローブ核酸(PNA)、およびハイブリッドTNA-PNA配列の形成に基づいて形成される二重標識結合領域(TBR)に特異的なTBAを用いることによって、安定なTBA-TNA-PNA複合体が形成される。TBAによって認識されるTBRの形成に特異的に寄与する配列に加えて、PNA中の特異的増幅可能配列をさらに提供することによって、PNAのTNAに対する結合が検出され、検出が増幅される。この目的に関して、ポリメラーゼ連鎖反応、または各分枝が検出可能な標識を含有する分枝鎖DNAの利用を含む多くの核酸増幅システムのいずれを用いてもよい。特に、PNAの増幅可能部分がその上にブースター核酸(BNA)を重合しうる配列を含有する新規増幅法を本明細書に記述する。各BNA-PNAハイブリッドの形成に基づき、ブースター結合集合体(BBA)が特異的に結合するブースター結合領域(BBR)が形成される。検出可能に標識されていれば、BBAまたはBNAは、最初のTNA-PNA結合事象の基本的に無制限の増幅を提供する。
【００３２】
本発明にしたがい、TNAは特異的核酸配列を含むものと理解される。TBAは、特異的におよび厳密に結合してTNA-PNAハイブリッドを形成することができる分子集合体であると理解される。TBAは、その配列がTBRに結合するのに十分な１つ以上の分子を含有する。既知の核酸結合ドメインを、TBAの成分として直接用いるか、または本明細書に提供する教示に従って修飾することができる。そのような配列を有する最も容易に利用できる分子は、DNA結合蛋白のDNA結合ドメインである。特に、多くのDNAまたはRNA結合蛋白は、既知の、非修飾蛋白として直接用いることができることが知られており、またはTBAは本明細書に提供される特異的な教示に従って修飾される核酸結合蛋白であってもよい。後者の場合、望ましい特異的な修飾には、結合親和性の最適化、望ましくない活性の除去(ヌクレアーゼ活性およびTBAの成分に対する親和性を有するその他の分子の存在下でのTBAの再認識など)、密接に関連する配列に対する標的配列の選択性の最適化、及び安定性の最適化が含まれる。
【００３３】
本発明に従って用いることが可能なDNA結合蛋白の例は、転写因子NF-kB(p50およびp65)、NF-IL6、NF-AT、rel、TBP、乳頭腫ウイルスE2蛋白、SP1、リプレッサーcro、及びバクテリオファージラムダからのCIのDNA結合部分であり、同類蛋白はDNA結合部分が単離、クローニング、配列決定、及び特徴付けがなされている周知の蛋白である。さらに、その他のDNA結合蛋白またはTBRハイブリッドまたはBBRに結合するために必要かつ十分な蛋白の一部が含まれる。これには一つの蛋白から別の蛋白へのDNA結合認識ヘリックスの交換などの、DNA結合特異性が変化して作成された蛋白とともに、蛋白、またはDNA結合活性が変化した野生型蛋白の一部が含まれる。さらに、制限エンドヌクレアーゼなどの核酸結合およびその他の核酸機能を示す蛋白を核酸結合機能として用いることができる。RNA-RNAハイブリッドと同様に、DNA-RNAハイブリッドの標識領域に結合する蛋白が含まれる(例えばシ(Shi)1995、デステファノ(DeStefano)1993、ズ(Zhu)1995、ゴンザレス(Gonzales)1994、サラザール(Salazar)1993、ジャイシュリー(Jaishree)1993、ワン(Wang)1992、ロバーツ(Roberts)1992、カインツ(Kainz)1992、サラザール(Salazar)1993(b)参照)。結合集合体は、特異的成分の組み合わせおよび結合構造が得られるように、結合集合体の部分をシャペロニングする分子を用いて構成してもよい。ここで、この分子をPILOTと命名する。Pilotsは、組み合わせの選択を達成し、および／またはTBAもしくはBBAの構成物質の間に特異的結合構造を誘導する蛋白または有機および無機材料の組み合わせを含む。シャペロンは、自然発生の核酸結合蛋白の望ましくない特性を同時に消失させると同時に、TBAまたはBBAの正確な構造が提供されるように、その上にTBAまたはBBAを構築しうる安定な骨格である。この態様の特異的な例として、シャペロンとして改変バクテリオファージラムダcro蛋白を用いて、多面発現転写因子の修正版であるNF-kBを提供する。各NF-kB結合二量体は、同時に結合集合体がいくつかの有利な製造、安定性、および特異性特徴を示しながら、NF-kB結合部位に対し、ピコモルの結合親和性を保持する。前述を考慮して、本発明の様々な局面および態様を下記に詳細に記述する。
【００３４】
１. プローブ核酸（PNA）およびその調製。本発明のPNAは、少なくとも３つの原則部分を互いに組み合わせて含む。図面の図１(I)に関して、PNAの最初の部分は１つ以上の塩基配列で、これを「1/2 TBR」と呼ぶ。図面の図１(IおよびIIa)に関して、PNA中の1/2 TBRはサンプル中の関係配列、すなわち1/2 TBRを含有するTNAに対して相補的である。図面の図１(IIIa)に関して、TNAは、ハイブリダイズ条件下でPNAに加えると、TBRを含有するPNA-TNAハイブリッドを形成する。図面の図１(I)に関して、PNAの第二部分は「1/2 BBR」と呼ばれる塩基配列である。図面の図(I、IIb、IIc、およびIVa)に関して、PNA中の1/2 BBRは、BNAまたはHNAに含まれる1/2 BBRに対して相補的である。図面の図１(IIIb、IIIc、およびVa)に関して、BNAまたはHNAは、ハイブリダイズ条件下でPNAに加えると、BBRを含有するPNA-BNAハイブリッドまたはPNA-HNAハイブリッドをそれぞれ形成する。図面の図１(I)に関して、PNAの第三部分はOSAで、箱つき円と呼ぶ。OSAは、支持体および／またはインジケータ、もしくは固相支持体、またはビーズ、ポリマーへの接着、およびPNAに共有結合、または非共有結合するが特異的に関連する表面への接着および／またはインジケータを含むが、これに限定しないその他の配置手段を有しない。OSAは、放出された粒子または光の吸着または画像化を含むがこれに限定しない、様々な物理的手段によって検出できる固相支持体結合グループまたは標識などの分離および／または配置に役立つ原子または分子であってもよい。インジケータをオリゴヌクレオチドに接着する方法、またはオリゴヌクレオチドを固相支持体に固定化する方法は、当技術分野において周知である(ケラー(Keller)およびマナーク(Manak)前記参照、参考文献によって本明細書に取り入れる）。
【００３５】
本発明のPNAは適当な方法で調製することができる。そのような方法には、一般に、複製可能なベクターにおけるオリゴヌクレオチドの合成およびクローニングが含まれる。核酸合成法は当技術分野でよく知られている。クローニングまたは合成の際、純粋なPNAとして産物を利用するためには、鎖の生成および分離が必要となる可能性がある。RNAプローブの調製法はよく知られている(例えば、ブレイス(Blais)1993、ブレイス(Blais)1994参照、これは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを取り込むPCR反応からのインビトロ転写を用いている)。
【００３６】
PNAの長さおよび特異的配列は、TNA中に検出される長さおよび配列、ならびに使用される特定のTBAの堅固なおよび特異的結合を得るための制限に依存することは、当業者には理解されると思われる(下記のTBAに関する考察参照)。一般に、配列の長さが約10から約300ヌクレオチドの間のPNAが適当で、本明細書に特に例証された態様の多くでは、約15〜100ヌクレオチドの長さが望ましい。
【００３７】
PNAは、PNAおよびTNAのハイブリダイゼーションによって、新規二重および多重TBA(これらの新規TBAに関しては下記の説明参照)によって認識される複合TBRと共に、１つ以上の同じまたは異なるTBAに対し、１つ以上の1/2 TBRを含有し、１つ以上のTBRを産生するように構築してもよい。図５は、１つ以上の1/2 TBRを含有する特異的PNAを図示している。図５(Ia、IIa、IIIa、IVa、およびVa)に図示される1/2 TBR配列に対応する特異的配列は、配列番号:1〜34である（上記の配列の説明参照）。
【００３８】
図２aおよび２bに示すように、1/2 TBRを含有するPNAは、1つ以上のBNAとハイブリダイズしてもよく(下記の説明参照)、BNAの鎖を、TNA-PNAハイブリダイゼーション事象の増幅にとって望ましい可能性がある長さに重合してもよい。好ましくはPNAに約０から約10の間の1/2 BBRが存在する。
【００３９】
図６aおよび６bに示すように、PNAは、TNA中のいくつかの1/2 TBRとハイブリダイズできる同じまたは異なるいくつかの1/2 TBRを含んでもよい。PNA中の1/2 TBRがTNA中の1/2 TBRにマッチする毎に、TBAと結合可能な標的結合領域TBRが形成される。さらに、TBRの全てが単一の隣接するPNA上にあることは必須ではない。したがって、本発明の一つの態様において、特定のTNA上の配列を検出するために、２つの異なるPNAを用いる。本発明のこの局面の図示として、図７は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の末端反復配列(LTR)の一つの表現を示す。当技術分野において知られているように、HIV LTRは２つのNF-kB結合部位および極めて隣接した３つのSP1結合部位を含み、ここでNF-kBおよびSP1は既知のDNA結合蛋白である。図７は２つのPNA、すなわちPNA1(配列番号:38)およびPNA2(配列番号:39)を提供し、そのそれぞれがTNA(配列番号:37)として示される反対鎖に対して相補的で、TNAはHIV LTRの２つのNF-kB結合部位および３つのSP1結合部位を示す。本発明のこの局面によれば、PNA1は、図７に示される塩基が「＋」マークで強調されたTNAの部分と特異的にハイブリダイズし、PNA2は、図７で示される塩基が「＝」マークで強調されたTNAの部分と特異的にハイブリダイズする。PNA1またはPNA2のそれぞれはまた、BNAの1/2 BBR配列(下記参照)とハイブリダイズする配列(「＃」または「＊」によって示される)を含有してもよい。さらに、PNA1およびPNA2のそれぞれを、フルオレセインまたはロダミン標識などのフルオロフォアのように、OSAによって異なる標識をしてもよく、それにより両プローブがTNAに結合するようになることを確認できるだろう。唯一つの標識しか検出されない場合、または標識が検出されない場合、TNAは試験サンプル中に存在しないと結論付けられる。
【００４０】
図７に示した態様のさらなる局面において、本測定法の特異性を変化させる方法が示される。PNA1とPNA2との間のギャップの長さを、残りの非ハイブリダイズTNAの領域が変化するように変化させることによって、実際の１つの本発明は、測定法の識別を変化させることができる。
【００４１】
発明のこの局面をより明らかに例証するために、TBRが螺旋構造を有してもよいことを強調する必要がある。このように、PNA1は螺旋の一つの「面（face）」上にTBRを作成するが、PNA2は各TBRの中心との距離に応じて(図７の下線)同じまたは異なる螺旋の面上にTBRを作成する。各結合部位の中央部が10.5塩基離れた組み込み産物であれば、TBRは螺旋の同じ側にあり、10.5塩基離れた非組み込み産物ではTBRは螺旋の反対側に位置するだろう。このようにして、PNA1 TBRを認識するTBAおよびPNA2 TBRを認識するTBAによる結合の協同性を操作することができる（ホッシュチャイルド(Hochschild),A.、M.タシュネ(Ptashne)[1986] Cell 44:681〜687参照、DNA螺旋中の互いに異なる距離に位置するバクテリオファージラムダリプレッサーの２つの異なるオペレーター部位に対する結合に関するこの効果を示している）。パーキンス(Perkins)ら([1993]EMBO J.12:3551〜3558)が記述しているように、HIV LTRの活性化を得るためには、NF-kBとSP1部位との間の協同性が必要である。しかし、本発明の目的に関して、部位間のスペースが幾何的に可能である場合に限り、両部位を同時に結合できる単一の新規結合蛋白を提供することによって、HIV LTRにおける二重NF-kB-三重SP1結合部位のモチーフを利用してもよい。これは、選択したTBAの構造および用いたPNAの双方によって制御される。したがって、図７において例証した態様において、NF-kBおよびSP1結合部位が螺旋の反対側にあっても、TBAの結合構造が得られるようにDNAが曲がってねじれることができるよう、プローブ間の一本鎖領域が十分柔軟な「ヒンジ」を提供するように、残る一本鎖DNAのプローブ間領域が十分大きい２つのプローブを用いてもよい。もしくは、DNAが曲がるのみでねじれないように、プローブ間の距離を狭めてより厳密な測定法を設計してもよい。最後に、DNAが曲がることができるがねじれないようにプローブを密接に配置するか、または単一のPNAを用いてもよい。このように、この図は、同様の配列を有するが、これらの配列の並置が異なる標的核酸について所定の望ましい程度の識別を有する検出システムの産生を例証および可能にする。
【００４２】
HIVの診断的または法医学的キットに関して、当業者は本発明の先に述べた局面により、いかなる場合でもHIVの優勢な株もしくは他の病原体または疾患状態に関して知られている内容と適合するように、診断的または法医学的キットの成分を調製できることを理解するであろう。またHIV感染症の検出は本発明の唯一の利用ではなく、HIVゲノムの変異性により、これがそのような診断にとっておそらく最も複雑な試験環境の一つであることは当業者によって認識されるであろう。しかし、非常に密接に関連した配列を識別できる能力と併せて、本方法が柔軟であることが最も明確に認識されるのは、まさにそのような変異可能な環境においてである。変異可能性が低い環境では、本発明が影響を受けやすいいくつかの複雑化を利用する必要はない。したがって、乳頭腫ウイルス感染症の診断キットにおいては、BNAおよびBBAを用いてシグナルを増幅できる能力と共に、TBA-TBR相互作用の識別特徴の全てが利用できるが、独自の乳頭腫ウイルス配列を特定し、乳頭腫ウイルスE2蛋白または切断されたそのDNA結合部分などのTBAに結合することが知られている、配列番号:46〜62のいずれか一つなどのように単一の単純なPNAを用いてもよい(「ヘッジ(Hedge)ら[1992]Nature 359:505〜512」；「モニーニ(Monini)ら[1991]J.Virol.65;2124〜2130」参照)。
【００４３】
悪性黒色種、肝腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵癌、または卵巣癌の進行に関連する特定の核酸が存在するか否かを評価する目的で、本方法を特定のTNAの検出に適用するために、癌細胞を含有することが疑われる臓器および体液から採取した生検材料から、TNAを得てもよい。遺伝子欠損の検出では、罹患細胞を含有する患者のサンプルからTNAを得てもよい。発酵汚染物および食物、化学もしくはバイオテクノロジー産物の製造産物、またはごみの生物改善産物における検出では、TNAは発酵または処置過程において様々な段階で採取されるサンプルから得てもよい。食物または薬物の病原体もしくは汚染物質の検出では、食品または薬物、食物または食物と接触した表面の綿棒採取物、食物と接触した液体、加工材料、ならびに食物または薬物等と接触したサンプルから採取した食品、薬物、または生物サンプルの製造に関連した、またはこれに接触した液体等から、TNAサンプルを得てもよい。
【００４４】
２. ブースター核酸(BNA)、ブースター結合領域(BBR)およびそれらの調製。本発明のBNAは、OSAと結合した少なくとも１つ以上の1/2 BBRを含む。1/2 BBRはPNA、他のBNAまたはHNAに含有される相補的1/2 BBRとハイブリダイズすることができる。
【００４５】
図面の図１(I、IIbおよびIIIb)に関して、最も単純なBNAには２つの部分が含まれる。図面の図１(IIb)に関して、最も単純なBNAの第一部分は、「1/2 BBR」と命名されたPNA中の配列に相補的な塩基配列である。図面の図１(IIb)に関して、最も単純なBNAの第二部分はOSAで、これは箱つき円として呼ばれる。OSAは、支持体および／またはインジケータまたは固相支持体、もしくはビーズ、ポリマーおよび表面への接着および／またはBNAに共有結合、または非共有結合であるが特にBNAに関連するインジケータを含むが、これに限定されない配置手段を何ら有さない。
【００４６】
図面の図２a(IIおよびIII)に関して、BNAは１つ以上の1/2 BBR配列を含んでもよい。図３(II)に図示したBNAは、図３(I)に図示したPNAに対する相補的配列および２つの他の1/2 BBR配列を含む。図３(III)に示すBNAは、図３(II)に図示したBNA中の２つの1/2 BBR配列と相補的な２つの1/2 BBR配列に加えて、別のBNAの重合化のためにさらに「n」個までの1/2 BBRを含有する。
【００４７】
ハイブリダイズ条件下では、図３(II)に図示するBNAは、図３(I)に図示するようにPNAと組み合わせると、図３(IVa)に示すような、BBRおよびさらに２つの1/2 BBR配列または「ブースター」配列によるハイブリダイズされていない伸長部分を含有するPNA-BNAハイブリッドを形成する。該ハイブリダイゼーションによって作成されたBBRは、配列において同一、同様、または異なっていてもよい。該ハイブリダイゼーションによって作成されたBBRは、同一の、同様の、または異なるBBA(下記参照)と結合可能である。BNAはPNAと同類に調製してもよい。
【００４８】
ハイブリダイズ条件下では、図３(IVb)に示すBNA-BNAハイブリッドは、図３(Vb)に示すPNAと組み合わせると、図３(VI)に示すような、BBR、BBRを含有する２つの別のBNA-BNAハイブリッド、及び別の1/2 BBR配列、すなわち「ブースター」配列によるハイブリダイズされていない伸長部分を含有するPNA-BNAハイブリッドを形成する。該ハイブリダイゼーションによって作成されたBBRは、配列において同一、同様、または異なっていてもよい。該ハイブリダイゼーションによって作成されたBBRは、同一の、同様の、または異なるBBAと結合できる(下記参照)。BNAは、PNAの調製と同類の方法で調製してもよい。
【００４９】
３. 標的核酸(TNA)およびその調製。本発明方法によれば、特定のTNAの検出を通じて産生されるシグナルを検出し増幅する第一工程は、適当な混合物中でのPNAと該標的とのハイブリダイゼーションである。そのようなハイブリダイゼーションは、当技術分野でよく知られている適当な条件下で行われる。
【００５０】
意図するTNAを含有することが疑わしいサンプル、または知られているサンプルは、様々な供給源から得られる。それは、生物サンプルであってもよく、食物または農業サンプル、環境サンプル等であってもよい。医学的診断または法医学目的で、本発明方法を特定のTNAの検出に適用するためには、生検サンプル、体液、または尿、血液、母乳、脳脊髄液、喀痰、唾液、便、肺吸引液、喉もしくは泌尿器綿棒採取サンプル等の浸出液からTNAを得てもよい。さらに、検出はインサイチューであってもよい(例えば、エンブレッソン(Embretson)1993；パッターソン(Patterson)1993；アダムス(Adams)1994参照)。
【００５１】
したがって、脊椎動物(哺乳類およびヒトを含む)、または以下の関係する微生物のいずれかもしくは全てに特異的なPNAを想定し、本発明方法に従って用いてもよい：
コリネバクテリウム属
コリネバクテリウム・ジフテリア菌
バチルス属
バチルス・シューリングレンシス(Bacillus thuringlensis)
肺炎球菌
肺炎双球菌
連鎖球菌
化膿連鎖球菌
唾液連鎖球菌
ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌
白色ブドウ球菌
シュードモナス属
シュードモナス・スタッツェン(Pseudomonas stutzen)
ナイセリア属
髄膜炎菌
淋菌
腸内細菌
大腸菌
アエロバクテリア・アエロゲンス(Aerobacteria aerogenes)
肺炎桿菌                                大腸菌型バクテリア
チフス菌
豚コレラ菌                              サルモネラ菌
ネズミチフス菌
志賀赤痢菌
シゲラ・シュミッチ(Shigellae schmitzii)
シゲラ・アラビノラーダ(Shigellae arabinorarda)
フレクスナー赤痢菌                      赤痢菌
ボイド赤痢菌
ゾンネ赤痢菌
その他の腸内細菌
プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)
プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)       プロテウス種
プロテウス・モルガーニ(Proteus morganii)
緑膿菌
アルカリゲンス・ファカリス(Alcaligenes faecalis)
コレラ菌
ヘモフィルス-ボルデテラ属
インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ダクリ(H.ducryi)
ヘモフィルス・ヘモフィルス(Hemophilus hemophilus)
エジプトヘモフィルス
パラインフルエンザ菌
百日咳菌
パスツレラ属
ペスト菌
野兎病菌
ブルセラ属
マルタ熱菌
ウシ流産菌
ブタ流産菌
好気性胞子形成バクテリア
炭そ菌
古草菌
巨大菌
バチルス・セレウス(Bacillus sereus)
嫌気性胞子形成バクテリア
ボツリヌス菌
破傷風菌
ウェルチ菌
ノーヴィ菌
悪性水腫菌
ヒストリチクス菌
クロストリジウム・テルチウム(Clostridium tertium)
クロストリジウム・ビフェルメンタンス(Clostridium bifermentans)
スポロゲネス菌
マイコバクテリウム属
結核菌
ウシ型結核菌
鳥型結核菌
らい菌
パラ結核菌
放線菌属(真菌様バクテリア)
イスラエル放線菌
ウシ放線菌
ネスルンド放線菌
ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)
ノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis)
スピロヘータ属
梅毒トレポネーマ
フランベジアトレポネーマ
トレポネーマ・カラテウム(Treponema carateum)
スピリルム・ミナス(Spirillum minus)
ストレプトバチルス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)
回帰熱ボレリア
レプトスピラ・イクテロヘモファギア(Leptospira icterohemorrhagiae)
レプトスピラ・カニコラ(Leptospira canicola)
トリパノソーマ属
マイコプラズマ属
肺炎マイコプラズマ
その他の病原体
リステリア菌
豚丹毒菌
ストレプトバチルス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)
ドンバニア・グラニュロマチス(Donvania granulomatis)
桿菌状バルトネラ
リケッチア(バクテリア様寄生虫)
発疹チフスリケッチア
リケッチア・モーセリ(Rickettsiae mooseri)
斑点熱リケッチア
リケッチア・コノリ(Rickettsiae conori)
リケッチア・オーストラリス(Rickettsiae australis)
リケッチア・シビリカス(Rickettsiae sibiricus)
痘瘡リケッチア
ツツガムシ病リケッチア
リケッチア・ブルネッティ(Rickettsiae burnetti)
リケッチア・キンタナ(Rickettsiae quintana)
クラミジア属(分類不可能な寄生虫バクテリア／ウイルス)
クラミジア・エージェンツ(Chlamydia agents)(名称は不確定)
真菌
クリプトコックス・ネオフォルマンス
ブラストマイセス・デルマチジス(Blastomyces dermatidis)
ヒストプラスマ・カプスラーツム
コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)
ブラジル・パラコクシジオイデス
鵞口瘡カンジダ
アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)
ムコア・コリムビフェラ(Mucor corymbifera)(Absidia corymbifera)
リゾプス・オリザ(Rhizopus oryzae)
リゾプス・アリザス(Rhizopus arrhizus)        藻菌類
リゾプス・ニグリカンス(Rhizopus nigricans)
スポロトリクム・シェンキ(Sporotrichum schenkii)
フォンセセア・ペドロソイ(Fonsecaea pedrosoi)
フォンセセア・コンパクト(Fonsecaea compact)
フォンセセア・デルマチジス(Fonsecaea dermatidis)
クラドスポリジウム・カリオーニ(Cladosporium carrioni)
フィアロフォラ・ベルルコーサ(Phialophora verrucosa)
アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)
マズレラ・マイセトーミ(Madurella mycetomi)
マズレラ・グリセア(Madurella grisea)
アレッシェリア・ボイディ(Allescheria boydii)
フィアロフォラ・ジーンセルメイ(Phialophora jeanselmei)
石膏状小胞子菌
毛瘡白癬菌
ケラチノマイセス・アジェロイ(Keratinomyces ajelloi)
イヌ小胞子菌
紅色白癬菌
オードアン小胞子菌
ウイルス
アデノウイルス
ヘルペスウイルス
単純ヘルペス
水痘
帯状疱疹
B型ウイルス
サイトメガロウイルス
痘瘡ウイルス
天然痘
ワクシニア
ウシ天然痘ウイルス
パラワクシニア
伝染性軟属腫
ピコナウイルス
ポリオウイルス
コクサッキーウイルス
ECHOウイルス
ライノウイルス
ミクソウイルス
インフルエンザ(A、B、およびC)
パラインフルエンザ(1〜4)
ムンプスウイルス
ニューカッスル病ウイルス
麻疹ウイルス
牛疫ウイルス
イヌジステンパーウイルス
RSウイルス
風疹ウイルス
アルボウイルス
東部ウマ脳炎ウイルス
西部ウマ脳脊髄炎ウイルス
シンビスウイルス(Sindbis virus)
チクングニヤウイルス
センリキ森ウイルス(Semliki forest virus)
マヨラウイルス(Mayora virus)
セントルイス脳炎ウイルス
カリフォルニア脳炎ウイルス
コロラドダニ熱ウイルス
黄熱病ウイルス
デング熱ウイルス
レオウイルス
レオウイルス１〜３型
レトロウイルス
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)
ヒトT細胞リンパ球指向性ウイルスI&II(HTLV)
肝炎
A型肝炎ウイルス
B型肝炎ウイルス
非A非B型肝炎ウイルス
C,D,E型肝炎ウイルス
腫瘍ウイルス
ローシャー白血病ウイルス
グロスウイルス
マロネー白血病ウイルス
ヒト乳頭腫ウイルス
【００５２】
特定のTNAを含有することが疑わしいサンプルは、PNAと容易にハイブリダイズできる断片を産生するような方法で処理することが一般的に必要であることは、当業者によって理解されるであろう。血液またはその他の細胞を低張環境に曝すこと、もしくはより激しい手段を用いてサンプルを崩壊させることなどによって、ハイブリダイゼーションのためにTNAを放出または抽出するために、試験サンプルを処理することが必要であるかも知れない。TNAが二本鎖の形で存在すると考えられる場合、一本鎖の形態でTNAをハイブリダイズ可能にするためにハイブリダイゼーションを起こさせよう一本鎖PNAの付加により中和されうる、加熱またはアルカリ条件への制限的暴露を含む、しかしこれに限定されない当技術分野でよく知られている方法によって、鎖を分離することが当然望ましいだろう。RNA標的の調製法はよく知られている(ウォーターハウス(Waterhouse)1993、ミッチェル(Mitchell)1992参照)。
【００５３】
TNAを含有する核酸サンプルの断片化には通常、サンプルの粘度を低下させ、TNAのPNAに対する近づき易さを増加させることが必要である。そのような断片化は、当技術分野で知られている無作為または特異的手段によって達成される。したがって、例えば、既知の平均的分子サイズの断片を生成するために、分析すべき特定のゲノムを特定の頻度で切断することが知られている特異的なヌクレアーゼを用いてもよい。さらに、この目的のために補正可能な全ての方法は、他のヌクレアーゼ、フォスフォジエステラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ、物理的応力ならびに超音波処理である。これらのプロセスは当技術分野でよく知られている。DNAを断片化するために制限酵素を使用することが一般的には好ましい。しかし、DNAはまた、以下の種類の試薬の使用などの様々な化学的手段によって断片化することも可能である。EDTA-Fe(II)(「ストローベル(Stroebel)ら[1988] J. Am Chem.Soc.110:7297」；「ダーバン(Dervan)[1986] Science 232；464」による)；Cu(II)-フェナンスロリン(phenanthroline)(チェンおよびシグマン(Chen and Sigman)[1987]Science 237:1197による)；クラスIIS制限酵素(キム(Kim)ら[1988] Science 240:504による)；ハイブリッドDNアーゼ(コーレイ(Corey)ら[1989] Biochem.28:8277による)；ブレオマイシン(ウメザワ(Umezawa)ら[1986] J.Antibiot.(東京)Ser.A,19:200による)；ネオカルジオスタチン(neocarzinostatin)(ゴールドバーグ(Golberg)ら[1981]第二回癌研究におけるブリストル-マイヤーズシンポジウム(Second Annual Bristol-Myers Symposium in Cancer Reserch), Academic Press, New York；p.163)；およびメチジウムプロピル-EDTA-Fe(II)(ヘルツバーグ(Hertzberg)ら[1982] J.Am.Chem.Soc.104:313による)。プロテアーゼを用いる処理によるような蛋白の除去も一般的に望ましく、核酸が検知可能な程損失することなく、核酸サンプルからの蛋白の除去を行う方法は、当技術分野でよく知られている。
【００５４】
本発明のTNAは十分長いため、TBAが未結合の断片末端によって乱されることなく結合できるような、TBRの側面に十分量の二本鎖ハイブリッドが存在するはずである。典型的には約10ヌクレオチド〜約100,000ヌクレオチドの範囲の断片、好ましくは約20ヌクレオチド〜約1,000ヌクレオチドの範囲の断片を、TNA断片の平均サイズとして用いる。検出可能な特異的TNA配列の例は、正常細胞の核酸配列、異常細胞の核酸配列(活性化腫瘍遺伝子、取り込まれた外来遺伝子、遺伝的欠損遺伝子におけるように)、および特異的な核酸結合蛋白が既知の、または本開示において記述される方法に従って産生することが可能な病原体特異的な核酸配列を検出するために、本明細書に記載するPNA配列に相補的な配列である。図７に関して、特異的HIV関連TNAを配列番号: 37に示す。
【００５５】
４. BNA、その調製物およびシグナル増幅を用いたPNAの伸長。ハイブリダイズ条件下では、PNA、PNA-BNAハイブリッド、BNAおよび／またはBNA-BNAハイブリッドにハイブリダイズするBNAを加えることができる。前述の添加は、既知の次数のBNAで、ベクターによらない重合様式で、またはベクターによる様式で実施できる。
【００５６】
図２aに関して、単純なブースターを提示する。ブースターポリマーは、図２a(IbおよびIc)に図示するように、２つのBNAを加えることによって産生され、これはPNAとのハイブリダイズ条件下では、図２a(IIa、IIb、IIc、およびIId)に図示するように、少なくとも１つの不対1/2 BBR配列を残すPNAおよび「ブースター伸長部」を含むPNA-BNA-BNAハイブリッドを形成する。図２a(IIa、IIb、IIc、およびIId)に図示するように、各不対1/2 BBR配列は、加えたBNAとハイブリダイズしてさらなる「ブースター」伸長部を形成することができる。各不対1/2 BBR配列は、図２a(IIa、IIb、IIc、およびIId)に示すように、別の「ブースター」伸長部を形成するため別のBNAとハイブリダイズできる。各不対1/2 BBR配列は、図２a(IIIaおよびIIIb)に図示するように、加えたHNAとハイブリダイズできる。加えたBNAとハイブリダイズできないHNAのハイブリダイゼーションは、図２a(IVa、IVb、IVc、およびIVd)に図示するように、BNAの付加部分をPNA上に「キャップする」ように作用する。
【００５７】
図２bに関して、PNAに対する伸長の順序および成分を制御し、明記することが可能である。単一のBBRを必要とする場合には、単一のBBRを産生し、PNAの「ブースター」伸長部を「キャップする」ために、PNA中の1/2 BBRに対する相補的配列を含有するHNAをPNAに加える。PNAにさらなるBBRを加えれば、制御されたPNA伸長を得ることができる。
【００５８】
図２bに関して、単純なブースターを提示する。ベクターによるポリマーの伸長は、図２b(IaおよびIIa)に示すように、PNAに特異的なBNAを加えることによって達成され、ハイブリダイズ条件下でPNAと結合させると、PNAおよび「ブースター」伸長部を含むPNA-BNA-BNAハイブリッドを形成する。これらの伸長部は、OSAで標識すると、サンプル中のTNAに対するPNAの結合に基づいて産生されるシグナルを大きく増幅させる方法が提供される。さらに、標識BBAをポリマー中のBBRに結合することによって、さらなる増幅が得られる。
【００５９】
例えば、既知の化学による合成、または組換えDNA産生法による合成を含めた多くの方法のいくつかをBNAの調製に用いてもよい。後者の方法では、例えば、突出末端を有する制限部位が側面に位置する特異的BNA配列の多数の反復配列を有するプラスミドDNAの原核生物(例えば大腸菌)での産生によって、本質的に無限数のBNAを単純かつ安価に産生しうる。このように、例えば、バクテリオファージλの左もしくは右オペレータ部位、またはその他のDNA、もしくはDNAまたはRNA結合蛋白などの特定のBBAに特異的かつ堅固に結合することが知られているその他の核酸配列は、本質的に無制限のコピーに産生してもよく、各コピーの側面には、EcoRI、PstI、BamHIまたはその他の共通制限ヌクレアーゼ部位が位置する。または、反復部位でのポリマーは、ポリマーに存在しない独自の制限部位によって削り取ってもよい。これらの配列の多数のコピーを有する大量のpBR322、pUCプラスミドまたはその他のプラスミドを、当技術分野に周知の方法によって産生し、重合部位の側面に位置する制限酵素によってプラスミドを切断し、遊離したオペレータの多数のコピーは、クロマトグラフィーまたは当技術分野で周知のその他の簡便な手段によって単離する。次にBNAは、使用前に鎖を分離した後、1/2 BBRとして、オペレータの一本鎖相補的コピーをコードするPNA上への重合化を受ける。BNAは、異なる制限酵素を用いてBNAの多数のコピー産生に用いるプラスミドにポリマーの各反復配列を側面に配置することによって、ベクターによりPNA上へ重合してもよい。またはBNAポリマーは、鎖を分離して各BNAセグメントをアニール化する必要なく、BNAポリマーの一端または両端での突出部分を通じてPNAとハイブリダイズしてもよい。特異的BNA配列の例は、上記の「配列の説明」と題した章で、配列番号:35〜36として提供する。BNAポリマーを安定化するため、DNAリガーゼを用いてハイブリダイズしたBNAと共有結合させてもよい。
【００６０】
５. ヘアピン核酸(HNA)およびその調製。本発明のHNAは、互いに結合した少なくとも２つの基本部分を含む。１つは1/2 BBRと相補的な一本鎖配列、およびもう１つはハイブリダイズ条件下で、HNA内部の自己相補的配列の自己関連によって形成される二本鎖核酸領域である。図面の図１(IIc)に関して、HNA中の1/2 BBRは、PNA中の1/2 BBR配列に相補的となるように構成してもよい。図面の図１(I、IIcおよびIIIc)に関して、前術のHNAは、ハイブリダイズ条件下でPNAに加えると、BBRを含有するPNA-HNAハイブリッドを形成する。図面の図１(IIIc、IVcおよびVc)に関して、PNA-HNAハイブリッドは、ハイブリダイズ条件下で、TNAの添加により、TBRおよびBBRを含有するTNA-PNA-HNAハイブリッドを形成することができる。
【００６１】
図２aおよび２bに関して、HNAは、PNAに対するBNA伸長の付加反応を「キャップする」または終了させるために用いることができる。図２a(IbおよびIc)の２つのBNAは、会合して図３(IVb)で示されるハイブリッドを形成することができ、または図２a(Ia〜c、IIa〜d)に図示するように、直接的におよび個々にPNAに対してハイブリダイズすることができる。(図２a(IIIaおよびbIII)に示す)２つのHNAは、図２a(IVa〜d)に図示するように、PNAから伸長する他のBNAに対するBNAのハイブリダイゼーションを終了させることができる。図２a(IIIa)に示すHNAは、図２a(IIbおよびIId)に示すPNA-BNAハイブリッド、および図２a(IIIa)に図示するようにHNA中の1/2 BBRに相補的な一本鎖1/2 BBRを有するPNA-BNAハイブリッドを終了させることができる。同様に、図２a(IIIb)のHNAは、図２a(IIaおよびIIc)に示すPNA-BNAハイブリッド、および図２a(IIIb)に図示するHNA中の1/2 BBRに相補的な一本鎖1/2 BBRを２つ有するPNA-BNAハイブリッドを終了させることができる。
【００６２】
HNAは、図(２b)に図示するように、PNAに対するBNAの連続付加反応から構成されるPNA-BNAハイブリッドを終了させるように構成される。図２b(Ia、IIIa、VaおよびVIIa)に図示する一本鎖1/2 BBR配列は、図２b(Ib、IIIb、VbおよびVIIb)に図示する一本鎖1/2 BBR配列と特に相補的で、図２b(Ic、IIIc、VcおよびVIIc)に図示する独特のキャップされたPNA-BNA-HNAハイブリッドを産生する。
【００６３】
HNA中の自己相補的配列、および自己相補的ヘアピン配列とリンクするループ配列は、それらが、HNAの一部を含む一本鎖1/2 BBRの発現を、HNAによって実質的に妨害または阻害しない限り、またはBBAもしくはTBAに選択的に結合しない限り、いずれの構成および長さにもなりうる。ループ配列は、ループの形成がヘアピンの形成を妨害しないように選択すべきである。本出願において有用なHNAの例を、配列番号:44として提示する(上記の「配列の説明」参照)。
【００６４】
６. 標的結合集合体(TBA)およびその調製。TBAは、以下の最少属性を有さなければならないという条件付きで、特定のTNAおよびPNAのハイブリダイゼーションによって形成される特定のTBRに結合するいかなる物質であってもよい：
【００６５】
(a) TBAは目的のTBRに対して非常に特異的な様式でTBR(s)に結合しなければならない。すなわち、TBAはTNA-PNAハイブリッド中に存在するTBRと、PNA-CNAハイブリッドによって形成される同様の二本鎖配列とを識別しなければならない。TBAは、TBA-TNA-PNA複合体の洗浄時に、PNA-CNAハイブリッドが置換されてPNA-TNAハイブリッドは置換されないように、十分に低い親和力でPNA-CNAハイブリッドと結合しなければならない。
【００６６】
(b) TBAは、TNAとPNAとのハイブリダイゼーションによって作成されるTBR(s)に強固に結合しなければならない。10−5〜約10−12以上の範囲での結合親和性が一般に十分と見なされる。以下に示すように、いくつかの例では、特定のTBRに対する親和性は非常に低いが、多数のTBRの特定の配置が、各TBRについてTBAの親和性の二乗がその特定のTBAに対して関連する親和性となるように、提供されている場合には、非常に親和性が増加するような特定のTBAを利用することが望ましい。
【００６７】
NF-kBを含むがこれに限定されないTBAの形成に有用なDNA結合成分の例は、乳頭腫ウイルスE2蛋白、転写因子SP1、不活性制限酵素、抗体等である。これらの蛋白の各々は、特定の核酸配列に結合する配列を含有することは、当技術分野で認識されており、これらの相互作用の親和性もわかっている。当然、本発明の方法は、これらの既知のDNA結合蛋白またはその断片の使用に制限されない。本開示から、少なくとも上記の必要な属性を示す新規TBAの使用に本方法を容易に適応できることは、通常の技術者の目にも明白である。このように、例えば、国際公開第92/20698号において、三重形成オリゴヌクレオチドに対するDNA結合薬の共有結合によって形成されるオリゴヌクレオチド共役物を含む配列特異的DNA結合分子について記述した。このように形成されたTBAが上述の基準に合致すれば、本開示に従って使用する新規TBAを産生するために本開示の方法を用いることができる。さらに、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,096,815号、第5,198,346号および国際公開第88/06601号の方法を、本発明の方法に従って使用する新規TBAの産生に用いてもよい。特異的抗体またはその一部を用いることができる(例えば、ブレイス(Blais)1994参照)。
【００６８】
TBAが蛋白、または蛋白複合体である場合には、TBAを産生するために当技術分野で慣習的な多くの方法のいずれを用いてもよいと認識される。TBAは、その自然に起こる自然環境から単離してもよく、それが実現できない場合には、分子生物学の標準的な技術によって産生してもよい。このように、NF-kBを例として用いると、p50またはp65サブユニットのDNA結合部分を用いて、この結合集合体は、当技術分野で既知の組換え法に従って産生することができる(例えば、ゴーシュ(Ghosh)[1990] Cell 62:1019〜1029、NF-kBのp50DNA結合サブユニットのクローニングならびにrelおよびdorsalに対するその蛋白の相同性について記述)。
【００６９】
本発明によれば、TBAとして、またはTBAの中で用いることができる多くのDNAおよび他の核酸結合蛋白が知られている。DNA、RNA：DNA、RNAまたはその他の核酸結合蛋白のアミノ酸配列が判明すれば、蛋白をコードする適当なDNA配列を合成的手段によって調製することができるか、または適当な組織源からの蛋白をコードするmRNAのcDNAコピーを用いることができる。さらに、蛋白をコードするゲノムコピー、および当技術分野で既知の方法に従ってスプライシングされるイントロンを得てもよい。さらに、TBAは化学的に合成してもよい。
【００７０】
適当なコード配列が得られれば、もとの核酸結合蛋白の結合特徴より望ましい特徴を示す変異核酸結合蛋白を産生するために、コードされるアミノ酸配列を変化させるよう、部位特異的突然変異誘発を用いてもよい。このプロセスの例として、NF-kBのDNA結合部分のアミノ酸配列は、より堅固にNF-kB結合部位に結合するNF-kB'分子を産生するために変化させることができる(下記の実施例参照-HIV-検出およびHIV-解除)。
【００７１】
本発明のこの面にさらなる洞察を与えるために、以下の検討を記す。NF-kBを例として用いる場合、TBAは天然のNF-kB分子を用いて調製してもよい。しかし、この分子は細胞中に極めて少量しか存在せず、およびDNA結合蛋白のサブユニットがクローニングされているため、この蛋白についてすでになされている組換えDNA手段を通じて大量のこの複合体を調製することが、より合理的であると思われる(例えば、ゴーシュ(Ghosh)[1990] Cell 62:1019〜1029参照)。NF-kBは、一次病原性刺激(ウイルス、バクテリア、またはストレス)または二次病原性刺激(炎症性サイトカイン)に対する免疫、炎症、そして増殖制御反応に関係する遺伝子の多面発現誘発因子である。NF-kBはp50またはp65サブユニットを含む二量体のDNA結合蛋白で、その双方が特異的DNA配列に接触および結合している。不活化状態では、NF-kBは細胞質に存在し、特異的阻害剤I-kBと複合体を形成して、細胞質ヘテロ二量体を形成する。活性化されると、阻害剤が外れ、p50-p65二量体が特異的核移動シグナル(NLS)を通じて細胞核へと移動し、ここでこれはDNAに結合可能で、無数の遺伝子の転写活性化剤としての役割を発揮する(グリム(Grimm)およびバウアーレ(Baeuerle)[1993] Biochem.J.：290：297〜308、NF-kBに関する技術の現状の再調査、参照)。
【００７２】
p50-p65二量体は、コンセンサスGGGAMTNYCC(配列番号:117)に適合する配列に対して、ピコモルの親和性で、正確な配列によってはわずかに異なる親和性で結合する。p50およびp65のホモ二量体も同様に起こることが認められることは注目に値する。これらのホモ二量体は、上記コンセンサス内部およびこれと類似したわずかに異なる結合親和性と共に、異なる生化学特性を示す。このように、TBAの望ましい結合特徴により、p50-p65へテロ二量体、p50-p50ホモ二量体、またはp65-p65ホモ二量体または上記二量体の断片を用いてもよい。
【００７３】
本発明にしたがい使用するために産生してもよい様々な新規TBAの１方法を図９に図式的に示す。TBAの核酸認識単位は、「シャペロン」を通じて同類のまたは異なるTBA核酸認識単位を集めて会合させてもよい。シャペロンは、その上に様々なTBA認識エレメントを構築し、核酸認識単位に望ましい特性を与える構造である。シャペロンは、同じまたは異なる核酸認識単位を互いに密接にかつ安定に会合させるような集合体配列を提供するいかなる配列をも含む。このように、例えば、NF-kB TBRに堅固に結合するよう設計されたTBAの場合、TBAは、NF-kB p50またはp65のいずれかに対する核酸結合配列にリンクするλcro配列を集合配列として提供することによって集められる。p50またはp65核酸結合配列は、croのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかで、およびp50またはp65の核酸認識単位のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかでcro配列と結合する。リンク配列は、最適なTBR結合に対して核酸認識単位に適当な空白が得られるよう、選択的に提供される。
【００７４】
croおよびCI配列(配列番号:104〜108)によって上記に例示した集合体配列は、自然にかつ強力に同類配列に結合する安定ないかなるオリゴペプチドをも含む。このように、croの場合、croの二量体はバクテリオファージλオペレータ部位に結合することは周知の通りである(アンダーソン(Anderson)ら[1981] Nature 290:754〜758；ハリソン(harrison)およびアガーウォール(Aggarwal)[1990] Ann. Rev.Biochem 59:933〜969)。croの一量体単位は、互いに堅固にかつ特異的に会合する。このように、DNA認識単位配列をcro配列に結合させることによって、密接かつ堅固な会合が得られる。
【００７５】
最適なリンカー配列には、TBA集合体または核酸の結合を妨害せず、核酸認識単位を完全なTBAから遊離させるために不安定でないアミノ酸配列が含まれる。リンカー配列は、他の結合集合体組成物と共有結合していることが望ましいが必須ではない。会合は、集合体および結合集合体の製造に役立つように特異的でなければならない。そのような配列の例には、構造的蛋白の様々なドメインを結合することが判明した周知の配列などが含まれるが、これに限定されない。このように、例えば、λリプレッサー蛋白では、DNA結合ドメインとこの目的に有用な二量化ドメインとの間にリンク配列がある。そのような配列はほかにも多く知られており、その正確な配列は、慣習的な実験を実施して、標的核酸結合の安定性および非妨害性が保証されれば、本発明にとって重要ではない。そのような配列の例をMet Serおよび配列番号:99〜102として本明細書に提供する。特異的な既知の蛋白溶解部位をこれらのリンカーに挿入することも同様に、本発明の肝要な部分である。リンカー配列におけるそのような部位の存在によって、異なる分子をシャペロン骨格上に集合させることができるという、製造上の利点が得られる。
【００７６】
核酸認識単位、選択的リンク配列、および集合体配列に加えて、本発明の新規TBAは選択的に、非対称配列またはPILOTS TNA配列および１つ以上のOSA単位を有する。非対称配列は一定の望ましいまたは望ましくない会合を促進または予防するために提供される。例えば、ホモ二量体p50 DNA認識単位を有するTBAが望ましい場合、非対称配列は、集合体配列のp50サブユニット結合を崩壊せずに、NF-kB p50サブユニットおよびp65サブユニットの自然により強い関係を崩壊させるために提供される。そのような配列の例は、本明細書に配列番号:85〜92および配列番号:105および106として提供する。
【００７７】
異なる配置では、NF-kB p50サブユニット配列は、転写因子SP1 DNA認識単位配列と密接に会合する。これは、少なくとも６つのDNA結合蛋白認識部位のモチーフ、すなわち２つのNF-kB、３つのSP1、および１つのTATA部位が存在することがわかっているHIV LTRのように、NF-kB/SP1結合モチーフが重要である場合には望ましい。同様に、第二のNF-kBおよび第一のSP1部位はHIV転写の制御に重要であることがわかっている(パーキンス(Perkins)ら[1993] Embo J. 12:3551〜3558)ため、TBAの特定の配置はHIV検出ばかりでなく、HIV感染に対する治療または予防としても有用である(下記参照)。同様に、ヒト乳頭腫ウイルスのロング・コントロール領域(long control region)も、本方法によるプローブ作成のための主要な制御領域として用いてもよい。
【００７８】
会合しうる異なるエレメント、カセット様式を考慮して、本TBA形成法にしたがい、本質的に無限種類のTBAが産生される。図10では、「HIV-検出I-IV」と呼ばれる一連の異なる分子を例示するが、ここで「CHAP」はシャペロン、「nfkb」はNF-KBサブユニット、「sp1」はsp1転写因子の核酸認識単位、そして「TATA」は、TATA結合蛋白またはTBPとしても知られるTATA配列DNA結合結合蛋白(TBP)のDNA認識単位の二量体を指す。これらの配置はさらに、下記によって例証し、全てが本発明の肝要な部分である。
【００７９】
さらに別の配置では、完全に異なる病原体の検出およびまたは治療もしくは予防を行うために、図９に示すモジュラー構造を採用する。図11では、上記「HIV-検出I-IV」分子と同様の様式で、一連の「HPV-検出I-IV」分子が産生される。この態様では、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)のE2蛋白のDNA結合特性を利用している。さらに、HPVゲノム中のこれらの配列に結合するよう適合させた特異的DNA認識単位を提供することによって、SP1およびTBPの役割が利用される。HPV感染の検出に用いるE2-特異的TBAの形成では、E2 DNA認識単位として配列番号:75〜84または：93〜98のいずれかを用いることが望ましいと思われる。ウシE2二量体およびヒトE2二量体DNA結合ドメインを含有するTBAは、特に有用であると思われる。
【００８０】
上記の様々な配列は、純粋なオリゴペプチド開始材料を用いて化学的に結合させるか、または周知の遺伝コード、様々なサブエレメントを通じて組換え型核酸コードの規定によって結合させてもよい。組換え型産生の場合には、TBAを形成するためにcroコード配列を核酸認識単位の配列と結合させることは、croがシャペロン中の集合体配列として作用するばかりでなく、核酸認識エレメントの適当な折り畳みを指向するように作用するため、有利である。シャペロンの典型的配列を、本明細書に配列番号:104〜108として提供する。さらに、五量体NF-kB/NF-kB/SP1/SP1/SP1 TBAのように、多数の結合部位を含むより高次の構造が望ましい場合には、非対称配列の適当な設計によりそのような構造にすることが可能になる。
【００８１】
前述の様式で、その同種の結合部位に対して高親和性で結合するTBAを調製する。例えば、図10のTBAのNF-kB DNA結合成分は、約10−8〜10−12モル濃度の間の親和性でHIV-LTRに結合すると予想される。DNA認識単位として有用な配列を配列番号:63〜71、73〜84、93〜98、および104〜108として提供し、さらに下記に例示する。
【００８２】
集合体および非対称(またはパイロット的)配列を用いた核酸結合蛋白の指向集合体に関する先の記述を考慮すれば、一般的適用可能な蛋白構造の集合法が本発明によって提供されることを、当業者は認識するであろう。本発明方法の一般性は、検討、望ましい構造の集合体における抗体-エピトープ相互作用の利用に関する今後の実施例を通じて、さらに証明される。特異性によって、NF-kB p50サブユニットを環状(ジスルフィド結合によって)メラノサイト刺激ホルモン(MSH)などの抗原に結合させることによって、DNA結合蛋白構造を集合させてもよい。次に、抗原および抗体が集合体配列として作用する新規核酸結合集合体を提供するためにこのプロMSH分子を抗MSH抗体と結合させてもよい。
【００８３】
図９に提供するモジュラー構造から、成分の異なる結合を用いて多様なTBAを集合させうることが明らかである。このように、本一般構造に関する代表的な態様を配列番号:109〜116に提供する。
【００８４】
７. ブースター結合集合体(BBA)およびその調製。BBAは、BBAが少なくとも以下の属性を有していれば、多数のBNA(「n個」以下のBNA、すなわちBNAｎ、ここで「n個」は理論的には０〜∞であるが、実際には約０〜100個である)を、シグナル増幅のためにPNA上に重合する場合を含む、特定のPNAとBNAとのハイブリダイゼーションによって形成される特定のBBRと結合するいかなる物質であってもよい：
(a)  BBAは目的のBBRに対して非常に特異的な様式でBBRに結合しなければならない。すなわち、BBAは、PNA-BNAハイブリッド中に存在するBBRと、BNA-CNAハイブリッドまたはその他のCNAs中の同様の二本鎖配列とを識別しなければならない。したがって、たとえ１箇所の塩基の不適正または塩基の不適正を有するもしくは有さない構造的違いが、PNA-BNAｎまたはPNA-BNAｎ-HNAハイブリッドの産生時に起こる場合でも、TBA-TNA-PNA-BNAｎ複合体の洗浄時に、BBAがCNA配列と置換されるが、BBR配列は置換されないように、BBAは十分低い親和性によってハイブリッドと結合しなければならない。
(b)  BBAはBBR(s)に強力に結合しなければならない。10−５〜約10−９の範囲以上の結合親和性が一般的に十分と見なされる。
【００８５】
BBAの例として、cro、およびバクテリオファージλリプレッサー蛋白CIが含まれるがこれに限定されない。さらに、参照として本明細書に組み入れられ、その他のDNA配列ならびにリプレッサー、ヒストン、DNA修飾酵素、および異化遺伝子活性化蛋白などの特異的結合蛋白を示す米国特許第4,556,643号を参照のこと。同様に、参照として本明細書に組み入れられ、テトラサイクリンリプレッサー、lacリプレッサー、およびトリプトファンリプレッサーなどの多数のヌクレオチド配列特異的結合蛋白(NSSBPs)を示す欧州特許出願第0 453 301号も参照のこと。これらのBBAのそれぞれは、特定の既知の核酸配列に結合することが当技術分野で認識されており、これらの相互作用の親和性は知られている。本発明の方法が、これらの既知のBBAの利用に限ったものでないことは言うまでもない。本開示から、普通の技術の１つによって、上記の最少必要属性を示す新規BBAの利用を、本発明方法に容易に適用することができる。
【００８６】
本発明のこの局面による有用な新規BBAの例として、既知のDNAもしくはRNA、またはcroもしくはλCIリプレッサー蛋白などのDNA:RNA結合蛋白のモチーフに基づく新規蛋白が含まれる。好ましくは本発明のこれらの成分の取り扱いを改善するために、そのような修正を行う。したがって、高濃度のcroをアッセイに加えることが望ましいと思われる。croの負の性質の一つは、高濃度ではそのDNA標的に対するcroの結合がcro-cro相互作用と競合するというである。したがって、例えば、この欠点を有さないシャペロンまたは変異croを産生してもよい。そのような変更シャペロンの例は、配列番号:105〜106および108である。そのような新規BBAを前述の新規TBAと共に産生するため多彩な核酸集団および特定の予め選択した標的(すなわち、いわゆるフェーズ・ディスプレイ技術、新規TBAの産生に関しては上記の考察参照)に対するバクテリオファージの結合の選択を用いた、新規標的結合蛋白の産生などの当技術分野に既知の方法を用いてもよい。
【００８７】
BBAが蛋白、または蛋白複合体である場合、BBAを産生させるために当技術分野で慣習的な多くのいずれの方法を用いてもよいことは認識されるであろう。BBAはその自然発生環境から単離してもよく、またはこれが実行できない場合には分子生物学の標準的な方法によって産生してもよい。したがって、例えば、cro蛋白の配列は既知であるため、バクテリオファージλのいかなる分子クローンを用いて、その組換え産物のためにcroをコードする適当な核酸を得てもよい。さらに、TBRおよびBBRを結合させるために異なるTBAを用いるのであれば、本明細書に記述されたTBAをBBAとして用いてもよい。
【００８８】
８. PNA-TNA-TBA複合体を配置し、その配置を増幅するためのBBAおよびBBRの利用(図８参照)。本発明の１つの態様において、増幅可能な核酸サンドイッチアッセイを行うために核酸結合成分を含むTBAの非常に特異的かつ極めて堅固な結合を用いてもよい。本態様の１つの局面にしたがい、固相支持体を最初のTBAでコーティングして固定化TBAを作成する。溶液中では、PNAおよびTNAはハイブリダイズ条件下で接触し、次に固定化TBAと接触する。TBA-TBR複合体が結合した固相表面の洗浄時にも、固定化TBAによって認識される特異的TBRを形成するそれらのPNA-TNA相互作用のみが保持される。
【００８９】
結合TBRの検出は、ハイブリダイズ条件下でPNA上に存在する1/2 BBRに対するブースター核酸、BNAの結合を通じて得られる。このようにして、固定化TBAへの結合がたとえ単一のTBA-TBR複合体に過ぎなくとも、多数のBNAを固定化TNAに重合することによって、大きい増幅シグナルを産生しうる。TNAに結合する各BNAにより、固相表面に固定化されたTBAのように、特定の核酸構造に対するその非常に堅固かつ特異的結合のために選択されるBBAが結合できるBBRが形成される。したがって、本態様によれば、固定化TBAは、NF-kBのDNA結合部分を含有していてもよく、この部分はTNAとPNAとのハイブリダイゼーションに基づき形成されるNF-kB結合部位に対して非常に特異的かつ堅固に結合して、そのような部位を形成する。
【００９０】
正常なヒトゲノムおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長末端反復配列のいずれにもNF-kB結合部位が存在することは周知であるため、本発明は、「正常な」ヒト部位とHIV感染による細胞に存在する部位との識別法を提供する。したがって、ヒトDNAサンプル中のHIV DNAの存在の有無を明らかにするよう設計された試験では、HIV NF-kB結合部位をTNAと見なし、正常なヒトNF-kB結合部位をCNAsと見なしてもよい。本発明の方法によれば、これらのTNAとCNAsとの識別は、同じ配列を有する細胞性NF-kB結合部位はタンデムに存在しないが、HIV LTRでは、２つのNF-kB結合部位があってその次に３つのSPI部位がある(例えば、コーケン(Koken)ら[1992] Virology 191:968〜972参照)、という事実を利用することによって得られる。
【００９１】
TNAが１つ以上の1/2 TBRを含有し、TBAの治療的および予防的適用を追求することが望ましい場合には、それぞれがTNA-PNA複合体中のTBRと結合する能力を有する１つ以上のTBAを利用することが望ましいと思われる。この場合、野生型のDNA結合ドメインまたはRNA結合ドメインより、そのTBRに対する親和性が低いDNA結合ドメインまたはRNA結合ドメインを、TBAの成分として選択することが有利であると思われる。多数のTBRに対する結合に関与するTBAが、TBRとの結合前に共に集合するか、またはそれらのTBRとの結合後に集合することが可能であれば、集合したTBA複合体とTBRが空間的に結合できるのでなければ、個々のTBAは標的ゲノム以外のゲノム中の対応するTBRをブロックしないだろう。特に本明細書に本発明の一部として請求されているTBAの多量体集合体の１つの特徴は、そのような多量体集合体は、TNA内部の単一の部位に対する親和性がはるかに低下していると予想されるという点である。しかし、結合はいずれのTBAと比較しても劇的に増大するため、TBA複合体は、インサイチューで、対応する無傷の蛋白に対するいかなる単一のTBRの結合にも競合するのではなく、TBA中に集められる核酸結合成分のそれぞれに関してTBR含有PNA-TNAハイブリッド中の配列と堅固に結合すると予想される。TBA複合体中に含まれる核酸結合領域がこれらの標的に同時に到達して結合できるように、TBA集合体を集め、個々のTBAにおいてリンカーを調整しなければならない。
【００９２】
TNA-PNAハイブリッドが形成され、固定化TBAと接触させると、未結合核酸が固定化表面から洗浄され、固定化ハイブリッドが検出される。これは、いくつかある方法のいずれの一つにおいても達成される。本発明の１つの局面において、PNAは、放射性核種、着色ビーズ、または着色反応産物を形成できる酵素などのOSAで標識する。さらに、１つ以上の1/2 TBRを有することに加えて、PNAも、少なくとも１つの1/2 BBRを含有していてもよい。BNA中の独自の1/2 BBR配列に相補的であるように、1/2 BBR配列を選択する。上記の態様において、例えば、TBAがNF-kBで、TNA-PNAハイブリダイゼーションに基づいて形成されるTBRが１つ以上のNF-kB結合部位である場合には、1/2 BBRは、左右バクテリオファージλオペレータ(例えば、タシュネ(Ptashne)[1982] Scientific American 247:128〜140、およびこれらのオペレータの配列に関する参照をここに引用)のハイブリダイズ可能な(すなわち一本鎖、相補的)配列を提供するかも知れない。これらは、「n個」までのBBRを提供するベクター様式（図２及び図３参照）でPNA 1/2 BBR上に重合してもよく、各BBRはcro結合部位を形成する。酵素的、放射性的またはこれ以外の方法で標識したcroを、TBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ複合体と接触させる。この様式では、非常に選択的な増幅されたシグナルが生成する。単一の1/2 TBRを有するPNAを用いてシグナルが産生されれば、TBA-TBR結合およびBNAの重合化を得るアッセイの成功を示し、細胞部位(すなわち、CNAs)からシグナルが産生される。二量体化TBAを用いた場合にシグナルが存在しなければ、TNAには二重NF-kB結合部位と共にHIV LTRsも存在しないことを示している。一方で、二量体NF-kBを用いてシグナルが存在すれば、HIV感染症を示す。本発明のこの態様に関する先の記載の特異的な例として、HIV検査キットを記述する実施例６を参照のこと。
【００９３】
当業者は、PNA、TNA、TBA、BNA、およびBBAの選択に当たって、先の記述にいくつかの修正を行ってもよいことを認識するであろうことは言うまでもない。さらに、HIV以外の系においては、上記の一般法も同様に適用可能であることを当業者は認識するであろう。しかし、用いたTBAは正常細胞部位のいずれも認識しない可能性があるために、これらのその他の適用は上記の方法より単純であるかも知れず、それ故二量化に訴える手段、またはTNAとCNAsとを識別する別の方法はあまり重要でない可能性がある。これらのその他の系のためのプローブおよび結合集合体の設計において、以下の原則および検討により熟練技術者に手引きする。
【００９４】
上記の態様において、NF-kB蛋白のDNA結合部分をTBAとして、およびNF-kB認識結合エレメントをTBRとして用いる際の注目点は、これらのエレメントがHIVの複製にとって重要な「制御点」を形成することである。すなわち、HIVはその複製生活における重要な特徴としてNF-kBを使用する必要があることが知られている。本明細書に記載の方法によれば、他の病原体についても同様の制御点を選択し、検出の基盤として用いる。
【００９５】
本発明の一般的特徴およびその操作様式に関する先の記述から、当業者は、本発明を実施する特異的様式に多様性があることを認識するであろう。例によって、本発明の方法は、米国特許第4,690,691号および第5,310,650号('691号および'650号特許)に記載のクロマトグラフィー検査キットを用いた方法および装置に対して適合させることができる。それらの特許では、TNAまたは捕獲プローブのいずれかを固定化するために多孔性培地を用い、TNAが固定化されている場合には標識PNA、または捕獲プローブが固定化されている場合にはTNAを含有する移動相を「捕獲域」に輸送させるために溶媒を用いた。TNAを捕獲域に一度結合すると、直接的な固定化によって、または捕獲のいずれかを通じて、捕獲域を通じて標識PNAをクロマトグラフし、いかなる結合標識をも検出した。
【００９６】
本発明をそのような系に適合させることにより、捕獲域における標的結合集合体の使用が改善され、したがって、先に記述したTBAによるTNAとCNAsとの感度の高い識別のために、完全に適合したTBR配列に限った捕獲、またはTNA-PNA二本鎖内のTBAが特異的に結合した核酸配置を示すその他のTBRの捕獲が改善される。
【００９７】
TNA-PNAハイブリッドが固定化TBAに一度結合すると、シグナルは、BNAを加えることによって、または捕獲域を通じてのBNAのクロマトグラフィーによって増幅される。最後に、BBAを加えることによって、または標識BBAのクロマトグラフィーによって、シグナルをさらに増幅してもよい。この様式において、第'691号および第'650号特許に記載の分析工程の行い易さは、本明細書に基づいて、特異性、および増幅によってそれらの特許に記載の方法の感受性を増加させる別の能力の提供によって改善される。第'691号および第'650号特許の開示は、方法の詳細を示す目的で、および該発明に提供される、本発明の組成物および方法が適用可能な特異的操作条件に関する教示のために、参照として本明細書に組み入れられる。
【００９８】
当業者はまた、本発明の方法がマイクロタイタープレートでの操作または自動化を受けやすいことを認識するだろう。したがって、本発明の方法を取り入れる機器の使用が、本開示およびこれに付随する請求の範囲内に含まれることは言うまでもない。このように、例えば本発明は、イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ(Abbott Laboratories')IMx 卓上アナライザーのような機器での使用に適合される。IMxは現在、蛍光偏光イムノアッセイ(FPZA、キール(Kier)[1983] KCLA 3:13〜15参照)および微小粒子酵素イムノアッセイ(MEZA、Laboratory Medicine,Vol.20, No.1,1989年１月、47〜49頁参照)の両アッセイを行うよう設計されている。MEZA法は、溶液中に懸濁したミクロン下サイズ(平均<0.5 μm)の微小粒子上にコーティングした捕獲分子としてTBAを用いることによって、本発明を用いる核酸検出法に容易に変更される。TBAをコーティングした微小粒子を反応細胞にピペッティングする。次にIMxは、サンプル(ハイブリダイズしたPNA-TNA)を反応細胞中にピペッティングし、TBAによる複合体を形成する。適当なインキュベーション期間の後、粒子が強力な親和性を有し、および微小粒子が接着する不活性のグラスファイバーマトリクスに溶液を移す。反応混合物をグラスファイバーマトリクスに濾過する前後のいずれかに、BNAおよびBBAを加える、またはTNA-PNAハイブリッドの特異的形成に依存する別のシグナル増幅および検出手段を用いる。固定化複合体を洗浄し、未結合材料をグラスファイバーマトリクスから流す。
【００９９】
結合複合体は、アルカリフォスファターゼ標識BBAまたはそれ以外による(放射性的、酵素的、蛍光的)標識BBAによって検出される。アルカリフォスファターゼ標識BBAの場合、蛍光基質4-メチル・アンベリフェリル・フォスフェートまたは同類試薬を加えてもよい。または、この試薬、もしくは同類試薬によってBBAを直接標識することによって酵素を迂回してもよい。いずれの場合でも、蛍光またはその他のシグナルは、存在するPNA-TNAハイブリッドの量に比例する。
【０１００】
蛍光は、IMxの製造元によって記述されているように、正表面蛍光測定計によってマトリクス表面上に検出される。慣習的な実験を通じてわずかに調整を行って、IMxのような機器を、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸TBA相互作用に対して最適化することにより、本発明は、TNAサンプルの自動化分析に対して完全に適合可能となる。
【０１０１】
９. 本発明のその他の診断的適用。前述の記載により、多くの異なる様式における本発明の利用が可能となるが、本発明には他にも多くの利用法があることは、例えば移動度妨害システムにおいて容易に認識される。
【０１０２】
本発明の態様において、周知の電気泳動移動度シフト測定法(EMSA)の改変を、以下のように実施した(図12aおよび12b参照)。
DNAサンプルを、無作為開裂、または特異的制限エンドヌクレアーゼ処理のいずれかによって断片化する。次にサンプル中のDNAを２等分し、最初の部分試料に特異的TNAを加え、２番目の部分試料には加えない。次に、第一および第二部分試料をアクリルアミドゲルまたはアガロース寒天上で電気泳動し、電気泳動前に、臭化エチジウム、または放射標識によって、DNAバンドのパターンを肉眼で検知できるようにし、２つの部分試料を比較する。TBAが特異的な結合部位を有するDNA断片は、電気泳動培地中の移動度が遅れる。適当なTBAを用いることによって、いかなる数のDNAまたはその他の核酸配列もこの様式でたどってもよい。
上述のEMSAの改変において、断片化TNAをPNAとハイブリダイズして、一次元的に分画する。次に分画したDNAを適当なTBAと反応させ、DNA断片の移動度の変化を記す。上述のように、BBAを加えれば移動の遅れを増強することが可能である。(例えば、Vijgおよび本発明を応用しうる二次元核酸電気泳動の既知の技術に関して該発明に引用された参考文献参照)。
【０１０３】
１０. 治療応用。本明細書に記載の新規TBAの非常に堅固かつ選択的な核酸結合特徴のため、これらの化合物の診断的利用に加えて治療応用を企図する。このように、HIV-LTRに対する堅固かつ特異的結合を有するTBAは、NF-kB p50およびSP1 DNA認識単位を密接に会合しているため(図10、HIV-検出II参照)、HIV-LTRを結合させるのに有用で、よってHIVゲノムのこの重要なエレメントからの転写を防止する。TBAの集合体配列の独特の特徴により、組換えベクターがTBAなどをコードするDNAを細胞内に導入でき、発現配列の適当な折り畳みが可能となる。細胞内部で、一度p50サブユニットの核配置シグナルがTBAを核に向けて輸送すれば、そこでTBAはいかなる導入HIVのLTRに対しても堅固に結合し、病原体を有効に排除する。予防モードでは、HIV暴露の可能性が懸念される人に対し、人の体内に入る可能性があるいかなるHIVも封じるために、TBAを発現可能な十分量のTBAまたは組換えベクターを投与する。このモードにおいて、TBAの利用は、特異的免疫グロブリンによる受動的保護と同様である。治療モードまたは予防モードでは、診断モードで用いるOSAsの代わりにNLS配列を用いる。典型的なNLS配列は、配列番号:72および103(ハインツィンガー(Heinzinger)1994およびブキンスキー(Bukinsky)1993、それぞれHIV Vprおよびgag蛋白のNLS配列を記述、も参照)に提供されている。いずれにせよ、TBAは、無菌塩類溶液もしくはリポソームに関連した、または組換えベクターの形態で、当技術分野で既知の、薬学的に許容される担体を用いて投与し、好ましくは選択した細胞タイプにおいて、または蛋白輸送システムによってTBAの発現を指向する。
【０１０４】
１１. 発明の態様
先の記述および後に続く実施例を考慮して、本開示により本発明に関する以下のような様々な態様が可能となることを当業者は認識するだろう：
【０１０５】
１. 以下を含むプローブ核酸(PNA)：
(a) ハイブリダイズ条件下で、標的核酸(TNA)中に存在する1/2 TBRとハイブリッドTBRを形成できる一本鎖配列、1/2 TBR；
(b) ハイブリダイズ条件下でブースター核酸(BNA)中に存在する1/2 BBRとハイブリッドBBRを形成できる、０個、１個以上、および好ましくは１〜10個の一本鎖配列、1/2 BBR；ならびに
(c) 付属の支持体および／またはインジケータを有さない、または付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータなどのその他の配置手段を有するOSA；
ここで、該TBRはTBAに対して高親和性で結合可能であり、該TBAは、対形成TBRと不対ヌクレオチドを有するTBRとを識別可能な物質であり、さらに、該BBRは高親和性でBBAに対して結合可能であり、該BBAは、対形成BBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別可能な物質である。本態様には、HIV LTR、およびその一部を先に記したその他の病原体におけるその他の核酸結合蛋白認識部位などの核酸結合蛋白認識部位であるTBRが含まれる。本発明の態様のPNAは、病原体のゲノム中に存在する核酸結合蛋白認識部位であるTBR、もしくはヒトゲノムまたは発酵過程での汚染物質中の発病条件に関連する結合部位であるTBRを産生しうる。
【０１０６】
２. 以下を含むブースター核酸(BNA)：
(a) すでにPNAにハイブリダイズしたPNAまたはその他のBNA中の1/2 BBR配列に相補的な配列、およびハイブリダイズ条件下で、PNAとハイブリッドBBRを形成可能な配列を有する1/2 BBR；
(b) 付属支持体またはビーズ、ポリマー、および表面への接着および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSA；ならびに
(c) 加えたBNAとのハイブリダイゼーションのための別のハイブリダイズ部位、1/2 BBR；、
ここで、該BBRはBBAに対して高親和性で結合可能であり、該BBAは対形成BBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別できる物質である。
【０１０７】
３. BNAに結合してBBAと結合可能なBBRを形成する一方、ハイブリダイズ条件下でヘアピンを形成可能な一本鎖配列、1/2 BBRを含むヘアピン核酸(HNA)、ここで該BBRは高親和性でBBAに結合可能であり、該BBAは対形成BBRと不対ヌクレオチドを有するBBRとを識別できる物質である。
【０１０８】
４. 以下の工程を含む特異的TNA配列の検出法：
(a) 上述のように該TNAをPNAとハイブリダイズする；
(b) 該PNAを、その配列がPNA中の1/2 BBR配列に相補的な1/2 BBRを含有するBNAとハイブリダイズする；
(c) TBRおよびBBRを含有する工程(a)および(b)の産物を、TBAを含有する表面、液体、またはその他の培地に加える；
(d) BBAを工程(c)の混合物に加える、ここで該BBAには以下が含まれる：
(i)   選択的にBBRに結合可能な分子または分子の一部；および
(ii)  検出可能なインジケータ；
ならびに
(e) BBAに接着したインジケータから産生されるシグナルを検出する。本方法は、着色反応産物の産生に至る反応を触媒可能な酵素を含む、蛋白インジケータの使用を含む。これには放射線核種または着色ビーズなどのインジケータが含まれる。
【０１０９】
５. サンプル中に特異的標的核酸、TNAの有無を検出する方法、これには以下が含まれる：
(a) 該サンプルをプローブ核酸、PNAと接触させる、これは、該サンプル中に該TNAが存在すれば、該TNAとのハイブリダイゼーションに基づいて、標的結合集合体、TBAと結合可能である標的結合領域TBRを形成する；
(b) 該PNAとすでに接触している該サンプルを、サンプル中の該PNAおよび該TNAとのハイブリダイゼーションによって形成されるいかなるTBRに対しても結合可能なTBAと接触させる。
【０１１０】
６. 高度の感受性および特異性を有する特異的核酸配列を検出および配置する方法：
(a) 1/2 BBRおよび1/2 TBRを含有するPNAを、1/2 TBR配列を含有するTNAを含有するまたは含有すると思われるサンプルに加え、PNAおよびTNA中にそれぞれ存在する相補的1/2 TBRのハイブリダイゼーションによって形成される、標的結合領域TBRを有する複合体を形成する；
(b) 工程(a)で形成されたTBRを固定化TBAに結合させ、TBA-TNA-PNA複合体を形成する；
(c) ブースター結合領域、1/2 BBRを含有するブースター核酸、BNAを、BNA中の1/2 BBRがPNA中に存在する1/2 BBR配列とハイブリダイズさせるように工程(b)で形成された複合体に加え、またはTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ複合体が形成されるようにすでにPNAに結合したBNA中に存在する1/2 BBRに加える。
(d) 1/2 BBR配列を含有するヘアピン核酸、HNAを、HNA中に存在する1/2 BBR配列が工程(c)の複合体のBNAに存在する利用可能ないかなる1/2 BBR配列ともハイブリダイズするように、工程(c)で形成された複合体に加え、これによってTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ上へのBNAの伸長をキャッピングして、TBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ-HNA複合体を形成する；
(e) インジケータ部分に結合したブースター結合集合体、BBAを、工程(d)で形成されたTBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ複合体に加え、TBA-TNA-PNA-(BNA)ｎ-HNA複合体を形成する；および
(f) 工程(e)のTBA-TNA-PNA-(BNA-BBA)ｎ-HNA複合体中のTBA、PNA、BNA、BBAsまたはHNAに結合したインジケータ部分によって産生したシグナルを検出する；
ここで：
TNAには以下が含まれる：
(i)   特定のサンプル中でその有無を確認する１つ以上の特異的1/2 TBR核酸配列；
PNAには以下が含まれる：
(i)   ハイブリダイズ条件下で、標的核酸(TNA)中に存在する1/2 TBRとハイブリッド、TBRを形成することが可能な、一本鎖配列、1/2 TBR；
(ii)  ハイブリダイズ条件下で、ブースター核酸(BNA)中に存在する1/2BBRとハイブリッドBBRを形成可能な一本鎖配列、1/2 BBR；および
(iii) 付属の支持体および／またはインジケータを有しない、または付属の支持体もしくはビーズ、ポリマーおよび表面への付着、および／またはインジケータを含むがこれに限定されないその他の配置手段を有するOSA；
BNAには以下が含まれる：
(i)   図１(IIb)に示すように、PNA中の1/2 BBR配列に相補的な配列を有し、ハイブリダイズ条件下でPNAとハイブリッドBBRを形成可能な配列を有する1/2 BBR
(ii)  付属の支持体またはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータを含むがこれに限定しないその他の配置手段を有するOSA
(iii) 他のBNAに対する別のハイブリダイゼーション部位、1/2 BBR；ならびに
(iv)  すでにPNAとハイブリダイズしたBNAにハイブリダイズできる配列、1/2 BBR；
BBAには以下が含まれる：
(i)   選択的にBBRに結合可能な分子または分子の一部；および
(ii)  付属の支持体および／またはインジケータを有しない、または付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への付着、および／またはインジケータを含むがこれに限定しないその他の配置手段；
ならびにTBAには以下が含まれる：
(i)   選択的にTBRに結合可能な分子または分子の一部；および
(ii)  付属の支持体および／またはインジケータを有しない、または付属の支持体もしくはビーズ、ポリマー、および表面への付着、および／またはインジケータを含むがこれに限定しないその他の配置手段；
【０１１１】
７. 以下を含む標的ポリヌクレオチドの存在を検出するための固相ハイブリダイゼーション法に対する改変：試験サンプル中に存在する場合、直接、または中間捕獲構造による、捕獲部位における固相上への標的ポリヌクレオチドの固定化；存在する場合、該固定化の前、間、または後での、該標的ポリヌクレオチドに対する検出可能な標識の取り付け；およびもしあれば該捕獲部位での該標識の検出；改変には以下が含まれる：
(a) 該標的ポリヌクレオチドの固定化を得る手段として標的結合集合体TBAを用いる、ここで該TBAは、該TBAによって認識される完全な標的結合領域TBRが形成されるように、特異的プローブ核酸PNAと該標的核酸との間に形成される完全なハイブリッドにのみ結合する；および
(b) ブースター核酸BNAに結合可能で、PNA中の1/2 BBRとのハイブリダイゼーションに基づいて、標識ブースター結合集合体BBAに結合可能なBBRを形成する一本鎖相補的1/2 BBRを含有する一本鎖配列、1/2 BBRをPNA中に含む。
【０１１２】
８. １つ以上の核酸認識単位、リンカー配列、集合体配列、非対称配列、核配置シグナル配列(NLS)およびOSAを含む標的結合集合体TBA。核酸認識単位は、NF-kB結合単位、SP1結合単位、TATA結合単位、ヒト乳頭腫ウイルス結合単位、HIV LTR結合単位、または、その検出が望ましく、TBAとの特異的会合を通じて得ることが可能な特異的配列のその他のいかなる断片に対する結合部位であってもよい。そのような認識単位として、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、および配列番号:73のような本明細書の例示が含まれるがこれに限定されない。核酸認識単位の核酸認識機能を妨害せず、TBAの残りからの核酸認識単位の空間の安定性を提供し、これを制御するオリゴペプチドなどのリンカー配列。そのようなリンカー配列の例は、当技術分野で周知であり、構造的蛋白のドメイン間一次配列からのオリゴペプチドが含まれるがこれに限定されない。集合体配列には、核酸認識単位の折り畳みおよび会合を指向するオリゴペプチドが含まれる。そのような配列の好ましい例は、バクテリオファージλcro蛋白に由来するオリゴペプチドである。非対称配列により、規定の順序での核酸認識と集合体配列との会合が指向される。そのような非対称配列は、配列番号:85〜92を含む、しかしこれに限定しないインスリン、リラキシン、性腺刺激ホルモン、FSH、HCG、LH、ACTHに由来する配列によって例証される。図14および15に関して、配列番号:85は「A」配列、および配列番号:86は「B」配列である；配列番号:87は「A」配列、および配列番号:88は「B」配列である；配列番号:89はヒトリラキシン「A」配列、および配列番号:90はヒトリラキシン「B」配列である；配列番号:91はスケートリラキシン「A」配列、および配列番号:92はスケートリラキシン「B」配列である。さらに、TBAは、核配置シグナル配列NLSを含有してもよく、これは該NLSと会合した蛋白または複合体の細胞核への移動および取り込みを指向する。そのようなNLS配列の例を、配列番号:72および103として提供する。TBAの好ましい態様には、HIV検出I〜IVまたはHPV検出I〜IV、および配列番号:109〜116が含まれるがこれに限定されない。
【０１１３】
９. 以下を含むTBAを用いて標的核酸サンプル中の特定の核酸配列に結合する方法を含むがこれに限定しない本発明の新規NBAsを用いる方法：
(a) 標的核酸サンプル中の核酸の断片化
(b) ハイブリダイズ条件下で、断片化核酸を、特定の関係核酸配列に相補的なプローブ核酸と接触させる、ここで該プローブ核酸は、特定の該関係核酸配列とのハイブリダイゼーションに基づいて、該TBAが特異的に結合する標的結合領域を形成する。
本発明方法では、特定の該関係核酸配列に相補的な配列に加えて、プローブ核酸はまた、ブースター核酸が結合して、標識ブースター結合集合体が結合して、プローブ核酸の関係標的核酸配列への結合を示し、増幅するシグナルを提供するブースター結合部位を形成する別の配列を有してもよい。
【０１１４】
標的核酸の断片化を必要としない本発明の別の局面は、該TBAの治療的または予防的有効量による治療を必要とする患者に対するTBAの投与を含み、そのような治療とは、精製蛋白複合体の形で、または患者の体内に入ってTBAが特定の核酸配列に結合して望ましい予防的または治療的結果が得られるように、TBAを発現できる組換えベクターのいずれかの形によるTBAの投与を含む。これは、慣習的な実験によって、病原体による積極的感染の確立の予防に十分であると決定できる投与量の提供を含んでいてもよい。精製TBAの投与量は、約0.001〜100 mg/kgの範囲であってもよい。TBAのインビボ発現および折り畳みを指向する組換え型発現ベクターとして提供する、特に非病原性ウイルスベクターの形で提供する場合、組換え核酸の投与量は実質的に低い可能性がある。TBAを用いる方法はまた、サンプル中の特定の断片に対するTBAの結合が断片の移動度を修飾するように、サイズの機能としての標的核酸サンプル中の核酸の移動度のシフトのモニターを含む。本方法のこの局面により、転移に関連して発見されうる特定の異常に対する核酸断片を分析する有用な方法が提供される。
【０１１５】
10. 感染の存在、疾患に対する感受性、または特定の核酸を含有するサンプルの起源の決定に有用な診断的または法医学的キット。
【０１１６】
11. 核酸コード成分TBAを細胞内に導入することを含むインビボでの多量体TBAを集める方法。成分TBAはそれぞれが、核酸認識単位、集合体配列、非対称配列、および核配置シグナル配列を含有すべきである。リンカー配列は、TBAフットプリント実験により、多量体TBAの最適な結合構造を得るためにそのようなリンカーが必要とされている場合には、選択的に含まれる。各成分TBAのインビボ発現、および各成分TBAの核酸認識単位を通じての、細胞内の核またはその他の場所で遭遇する核酸配列に対する近位結合に基づき、成分発現TBAは、含まれる集合体および非対称配列を通じて、多量体TBA中に集合するよう指向される。上述のように、そのような多量体TBAは、高親和性で特異的標的配列中のTBRに対して特異的に結合するが、同類核酸に対しては全く結合しない、または結合親和性が非常に低いという利点を有する。
【０１１７】
本発明に関する先の記述により、本発明の最善の形態と共に好ましい態様が可能になることは、当業者によって認識されるであろう。同様の問題を、以後提供する実施例の特異性に限定することなく、本発明の実践法に関して当業者にさらに手引きするために、以下の実施例を提供する。サムブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)、およびマニアチス(Maniatis)の、「分子クローニング（Molecular Cloning）：A Laboratory Manual, 第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY」に開示されている標準的な組換えDNA技法、およびこれらとして開示されていない、より最近のテキストは、現在、通常の熟練技術の範囲内である。
【０１１８】
実施例１- PNAの調製およびPNAの標識
プローブ核酸、PNAは当技術分野に周知の方法によって調製してもよい。このように、明確な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドPNAは、メリフィールド(Merrifield)による固相化学合成を通じて調製してもよい。PNAは、アプライド・バイオシステムズ、ABI、またはその他の製造元によって生産または販売されている残基および機器などの、市販の利用できる技術を用いた自動合成によって調製してもよい。または、既知の組換えDNA法によって、例えば、大腸菌(E.Coli)内で複製可能なベクターに二本鎖PNAをクローニングすることによって、特定のPNA配列をインビボで合成し、大量の二本鎖PNAを調製してもよい。PNA配列の側面に位置する制限断片によるベクターの消化によって、１モルのベクターに関して数モルのPNAが遊離するように、PNAの多量体をベクターに発生させてもよい。合成または組換え産生の後、PNAを、ゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの当技術分野で周知の方法によって精製する。PNAが二本鎖として産生される場合には、標的核酸配列の検出のためにハイブリダイゼーションアッセイで使用する前に、PNAの鎖を加熱または当技術分野で既知の他の方法によって分離する。
【０１１９】
PNAの塩基の特異的配列は、本発明によれば、PNAは、PNAとTNAとのハイブリダイゼーションに基づいてTBRを形成する1/2 BBR配列を含有する、という条件付きで、その配列がTNA中で検出されるように選択される。当技術分野で既知のそのような配列は、基本的に無限数存在するため、PNA配列の選択は、所定のいかなる適応に関しても熟練した研究者による選択の影響を受けやすい。HIV LTR配列は、LTRのPNAコード部分と、HIV LTRをコードするTNAとのハイブリダイゼーションに基づき、NF-kBまたはSP1 DNA結合蛋白に結合可能なTBRが形成されるような１つの配列である。
【０１２０】
ハイブリダイゼーションによってTBRを形成する配列に加えて、PNAも同様に1/2 BBRを含有する。この配列は、ブースター核酸、BNAとのハイブリダイゼーションによって、BBAと結合可能なBBRを形成する配列である。BBAはBBR配列に対して高親和性を有するDNA結合蛋白であることが好ましい。
【０１２１】
この特定の実施例において、ハイブリダイゼーションは、配列番号:４の1/2 TBRを含有するPNAと、配列番号:35として示すその配列の3'末端での1/2 BBR配列との間に起こる。これらの配列をコードするPNAは、当技術分野で既知の方法に従って、標識せずに、またはP３２、S３５、もしくは同様の同位元素などの放射性同位元素によって標識されて用いられる。または、PNAを0.01〜10 μmのビーズに結合させ、肉眼で容易に検出できるように、このビーズを着色してもよい。この標識は、本明細書に記載するようにOSAを形成する。このプローブはHIV LTR配列とハイブリダイズして、NF-kBに結合するTBRを形成する。さらに、PNAは相補的1/2 BBRを有するBNAとハイブリダイズして、croまたはラムダリプレッサー蛋白のいずれかに結合するバクテリオファージλ左オペレータを形成する。
【０１２２】
上述と同様の場合では、1/2 TBRが配列番号:５または配列番号:７〜34、のいずれかであり、配列番号:35または配列番号:36などの1/2 BBRが1/2 TBRの3'末端または5'末端のいずれかの部位に存在するようなPNAを用いる。
【０１２３】
実施例２- BNAの調製および標識
PNAの調製および標識に関する実施例１に記述の方法と同様に、BNAは、当技術分野に既知の方法によって調製および標識される。参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,556,643号に記載のように(詳細は実施例１参照)、特定の核酸結合配列をコードする核酸配列は、複製可能なベクターに組み入れて発現させることにより大量生産してもよい。さらに、その開示と同様に、1/2 TBRおよび1/2 BBR配列は、この様式で共に直鎖状に産生してもよいが、本発明によれば、1/2 TBR配列自身が核酸結合成分認識部位を形成し、1/2 BBRは、核酸結合成分認識部位を形成しながら、同時に、PNAに結合したTNA上へのBNAの重合を提供することによって、TNA中の相補的配列に対する1/2 TBRの結合に基づいて産生されるシグナルの増幅手段をも提供するという点が異なる。これを可能にするため、バクテリオファージλ左オペレータをコードする配列番号:35などの配列は、PNAとのハイブリダイゼーションに基づいてBNAの一端または両端上に突出配列が作成されるように、追加配列を有する。
【０１２４】
特異的な実施例として、TNA上へのBNAのベクターによる重合は、配列番号:40〜43に提供する。この実施例において、配列番号:40は、バクテリオファージλ左オペレータ1/2 BBRを提供する一方、TNA中の２つの1/2 TBRとハイブリダイズして２つのNF-kB結合部位を形成する２つの1/2 TBRをコードしており、1/2 BBRはさらに制限酵素PstIに対する認識部位を有する3'末端で終了している。配列番号:41のBNAを、配列番号:40のPNA上の1/2 BBRに対して相補的な1/2 BBRを加えれば、PstI認識部位を同時に終了させ、別のBNAとのハイブリダイゼーションのために４箇所の塩基突出を残しながら、BBRを完成させる。したがって、配列番号:40と41とのハイブリダイゼーションから残る４箇所の塩基突出に対して相補的で、3'末端で４つの塩基対配列を有する配列番号:42を加える。さらに、配列番号:42は、BamHI認識部位の一部を形成する５塩基配列をその5'末端に有する。BNAの伸長しつつあるポリマーは、配列番号:42に相補的な配列番号:43のBNAを加えることによってさらに伸長し、BamHI認識部位を同時に完成させながら、および４箇所の塩基突出を残しながらBBRを完成させるが、この４つの塩基突出は、相補的配列を有するBNAとさらにハイブリダイズさせてもよい。このように、BNAは、単一のPNA-TNAハイブリダイゼーション事象のシグナルを大きく増幅させるために広範にハイブリダイズさせてもよい。
【０１２５】
実施例１に記載のPNAに関して、BNAは未標識の形で、または当技術分野に既知の方法に従って標識してもよい。同様に、BNAポリマーは、BNAをPNA-TNA複合体に連続的に加えることによって産生するより、BNAポリマーを予め形成してからPNA-TNA複合体に直接加えてもよいことも認識されると思われる。そのようなBNAポリマーを形成する１つの単純な方法は、BNAの多量体がポリマーのいずれかの末端に独自の制限部位を有するようなベクターの組換え産生である。多くのBBRを含有するBNAのこのポリマーをベクターから切り出し、PNAとTNAのハイブリダイゼーションに基づいて、PNA中に残っている一本鎖1/2 BBRにハイブリダイズさせる。これは、BNAが産生ベクターから切り出されるときに、BNAポリマー中に産生される突出配列に相補的な一本鎖配列をPNA中に提供することによって達成される。
【０１２６】
実施例３- HNAの産生およびBNAポリマーのキャッピングへの利用
本発明のHNAは、PNAおよびBNAに関して実施例１および２に記述したように、ポリヌクレオチド産生に関して当技術分野に既知の方法によって産生される。しかし、HNAの産生では、HNA配列は特に、HNAの実質的な部分が自己相補的パリンドロームを形成し、実施例２に記載のBNAの増殖しつつある鎖における一本鎖配列とハイブリダイズ可能な十分な塩基を一本鎖形態中に同時に残しながら、ヘアピンを形成するように設計されている。
【０１２７】
この実施例では、配列番号:44のHNAは、配列番号:43のBNAを加えた後に、実施例２においてPNA上へのBNAの伸長をキャッピングするために提供される。これは、配列番号:44は、安定なヘアピンを形成するパリンドローム配列を有しながら、同様に、配列番号:42と配列番号:43とのハイブリダイゼーションによって形成されるBamHI配列を完成させる配列を、HNAの5'末端に有するため、これが達成される。３個のみのBNAを加えた後でポリマーを終了するのは、本発明を実証するためにすぎないことは、言うまでもない。上述のように、この重合化は基本的に無限に続き、PNA-TNAハイブリダイゼーション事象のシグナルを増幅してもよい。HNAがBNAの伸長しつつある鎖と一度ハイブリダイズすると、ポリマーはキャッピングされ、ポリマーのさらなる伸長は不可能となる。
【０１２８】
実施例４- TBAおよびBBAの調製、その標識、および固定化
本発明にしたがい、用いられるTBAおよびBBAには、TBRおよびPNA、TNA、ならびにBNAのハイブリダイゼーションによって形成されるBBRに特異的に結合可能ないかなる物質も含まれる。DNA結合蛋白の利用は、そのような物質の１例となる。
【０１２９】
この実施例に関して、TBAはp50のDNA結合部分の二量体で、BBAはλcro蛋白である。これらの蛋白は、当技術分野に既知の方法によって産生してもよい。これらの両蛋白の遺伝子はクローニングされている。このように、これらの蛋白は、当技術分野に既知の方法によって、組換えで産生され、精製される。さらに、これらの蛋白は、当技術分野に既知の方法によって、放射性ヨウ素などの放射性同位元素、βガラクトシダーゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素、またはフルオロレジンもしくはローダミンなどの蛍光色素によって標識する。さらに、TBAおよびBBAのいずれかまたは両者を、マイクロタイタープレート表面またはいずれの部位でも直径0.01〜10 μmの着色ビーズなどのビーズ表面のような固相表面上に固定化してもよい。TBAおよびBBAの標識は、同じでも異なっていてもよい。
【０１３０】
本実施例では、p50 DNA結合ドメインを含有するTBAをローダミンで標識し、BBAであるcroはフルオロレジンで標識する。したがって、本特許開示および前述ならびに後述のPNA、TNA、BNA、およびHNAのハイブリダイゼーションに基づいて、核酸ハイブリッドが形成される場合、これらは過剰量の標識TBAおよびcroと接触する。これら標識の蛍光を既知の方法によって測定し、両シグナルが検出される場合、TNA中の1/2 TBR配列の存在が示される。NF-kBおよびcroの蛍光によって生じたシグナルの差が、PNA-TBAハイブリッド上へのPNAの重合の結果生じたシグナル増幅の程度の測定手段である。本発明の方法によれば、１倍〜1000倍以上の増幅が予想される。
【０１３１】
実施例５- ２つのPNAとTNAとのハイブリダイゼーションおよびTNAとCNAとの識別
PNA、すなわち配列番号:40のPNA1、および配列番号:45のPNA2は、試験サンプル中のTNA濃度に対して10倍以上を用いる。この実施例に関して、単離された二本鎖HIV LTR、ここで、一本の鎖は図７に示す配列番号:37の配列を有し、もう一本の鎖は図７に示す配列と相補的であるが、この二本鎖HIV LTRをTNAとして用いる。単離された二本鎖CNAもこの実施例で用いられ、その一本は配列番号:37と同じ配列を有するが、例外は、図７に示す最初のNF-kB結合部位では、結合部位の中央部、すなわち図７の位置１で、「T」の代わりに「A」があるために、その位置で相補鎖は配列番号:40のPNAと不適正になっている、という点である。
【０１３２】
配列番号:40および配列番号:45はいずれも、別々の反応液に加え、最初は上述のTNAを含有し、２番目は上述のCNAを含有する。サンプルを、10 mM トリス(pH 7.5)、1 mM EDTA溶液などの適当なハイブリダイゼーション緩衝液中で可溶化する。サンプル中の二本鎖TNAおよびCNAsの鎖を分離するためにサンプルを約90℃で５分加熱し、次にPNA、TNA、およびCNAsの鎖をアニール化するためにサンプルを冷却する。
【０１３３】
ハイブリダイゼーションが一度終了すると、これは既知の方法による塩基組成に基づくt1/2およびアニール温度を計算することなどの、既知の方法によって求められるが、配列番号:40のPNAは、実施例２に示すように、BNAの付加によって重合され、配列番号:45のPNA2プローブは、Sph1認識部位突出から始まるBNAで重合される。BNAの付加および短いハイブリダイゼーション期間の後、別々のサンプルを共有結合で固定化したNF-kBでコーティングしたビーズに加え、TNAおよびCNAサンプル中で形成されるいかなるTBRに対してもNF-kBを結合させる。約15分の結合の後、10 mMトリス、pH 7.5、100 mM塩化ナトリウム溶液などの適当な洗浄緩衝液、または既定のNF-kBもしくはバクテリオファージλCIリプレッサー蛋白結合活性を妨害しないその他の緩衝液の約３倍容量でサンプルを２回洗浄する。各洗浄後に、ビーズを重力によって、または短い遠心によって沈降させる。これにより、PNA1とTNA配列とのハイブリダイゼーションによって形成される完全なNF-kB結合部位を有しないいかなる核酸も除去される。
【０１３４】
最後の洗浄後、放射性ヨウ素などの放射性同位元素、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素、着色ビーズ、または蛍光標識によって標識したバクテリオファージλCIリプレッサー蛋白を各サンプルに加える。次にサンプルを、10 mMトリス、pH 7.5、100 mM塩化ナトリウム溶液などの適当な洗浄緩衝液、または既定の、NF-kBまたはバクテリオファージλCIリプレッサー蛋白結合活性を妨害しないその他の緩衝液の約数倍容量(約２倍)で数回(約３回)洗浄する。各洗浄後、ビーズを重力によって、または短い遠心によって沈降させる。最後の沈降または遠心の後、結合した標識を、結合放射性、酵素的アッセイにおける遊離色素、結合ビーズの着色、または蛍光検出によって定量する。または抗CI抗体を加え、結合リプレッサーを検出するために標準的なサンドイッチ酵素結合イムノアッセイまたはラジオイムノアッセイを実施することもできる。さらに、陰性対照(バックグラウンド)として、固定化NF-kBを有さないビーズを用いるサンプルについて前述の操作を全て実施する。
前述のアッセイの結果として、TNA含有サンプルはバックグラウンドより大きいシグナルを有するが、対照およびCNA含有サンプルのシグナルはいずれも低い。
【０１３５】
実施例６- HIV検出用試験キット
A. キットの内容：
１. マイクロタイタープレート。
２. 組換えで産生されたNF-kBの１mg/mLトリス緩衝生理食塩類溶液。
３. 一本鎖HIV PNAを含有するチューブ(２つのNF-kB 1/2結合部位をコードする予め混合したオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号:７および８の混合物)
４. 配列番号:１の一本鎖ヒトゲノムPNAを含有するチューブ。
５. ヌクレアーゼチューブ(Pst1)。
６. プロテアーゼチューブ。
７. 予め重合したBNA's、すなわちHNAでキャッピングされているが、PNA-TNAハイブリッドに対する結合に利用可能な遊離の1/2 BBRを有するバクテリオファージλOＲを100反復単位含有するチューブ。
８. ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(hrp)共役croのチューブ。
９. hrp着色基質のチューブ
10. トリス緩衝塩類溶液、100 ml。
11. 槍状刀
12. それぞれが蒸留水250μLを含有する反応チューブA、B、C。
13. 医用スポイト。
【０１３６】
B. アッセイ法：
(a) 組換えで産生したNF-kB(項目２)溶液の１ mg/mlトリス緩衝塩類溶液中、４℃で一晩、振とうさせながら、マイクロタイタープレート(項目１)をコーティングする。
(b) 槍状刀で指を刺して、被験者の血液３滴を得て(試薬11)、血液１滴づつを反応チューブA、B、およびCのそれぞれに分配する(試薬12)。
(c) 各チューブにプロテアーゼ溶液１滴(試薬６)を医用スポイト(項目12)で分配し、チューブを攪拌して５分放置する。
(d) 医用スポイトを用いてヌクレアーゼ(項目５)１滴をチューブA〜Cに加えて、10分放置する。
(e) 項目３の１滴をチューブA(試験サンプル)に加える；項目４の１滴をチューブB(陽性対照)に加え；および塩類溶液１滴(項目12)を陰性対照としてチューブCに加える。チューブを温水中で50℃に加熱し、１時間かけて室温まで冷却する。
(f) 工程(d)でハイブリダイゼーションを起こしている間に、工程(a)から過剰量の蛋白を表面およびマイクロタイタープレートから除去し、プレートをトリス緩衝塩類溶液(チューブ10)ですすぐ。
(g) 工程(e)からのチューブA〜Cの内容物をマイクロタイタープレートの３つのウェルに移し、振とうさせながら１時間放置する。
(h) チューブA〜Cの内容物を含有するマイクロタイタープレートウェルをトリス緩衝塩類溶液ですすぎ、空にする。
(i) 項目７の１滴を各ウェルに加え、プレートに結合したいかなる1/2 BBRとも１時間以上ハイブリダイズさせ、トリス緩衝塩類溶液で３回すすぐ。
(j) 項目８の１滴を各ウェルに加え、croをいかなる結合BNA'sとも10分間結合させ、その後トリス緩衝塩類溶液１ mlで５回洗浄する。
(k) hrp基質１滴を各ウェルに加え、着色反応を起こさせる。
【０１３７】
C. 結果：
ウェルAおよびBがいずれも着色を示し、ウェルCが示していなければ、試験は有効で、被験者はHIVに感染している。ウェルAのみが着色を示す場合、またはウェルCが着色反応を示す場合、試験が誤って実施されており、無効である。ウェルAおよびCが着色を示さず、ウェルBが示す場合、試験は有効で、患者はHIVに感染していない。
【０１３８】
実施例７- 様々な新規TBAの産生
本発明によって用いられる新規TBAは以下のように調製する：
(a) NF-kB/NF-kB(HIV-検出I)。配列番号:63〜71のいずれか１つをコードする核酸または同類NF-kB DNA結合蛋白を、NF-kB DNA認識配列がcro配列のアミノ末端またはカルボキシ末端でコードされるように、croなどの集合体配列をコードするヌクレオチド配列にフレーム内で融合する。選択的に、リンカー配列をNF-kB配列とcro配列との間に提供する。その他のcro末端で、配列番号:72などの核配置シグナル配列を選択的に提供する。さらに、NF-kB認識配列によって融合されないcro末端で非対称配列を選択的に提供する。完全なTBAの例を以下に示す。
【０１３９】
(b) NF-kB/SP1(HIV-検出II)。上記(a)と同様の様式で、NF-kB認識ドメインをコードする組換えコード配列を調製する。別々の構成において、配列番号:63〜72の代わりに、SP1のDNA認識部分に対するコード配列を含める。そのような配列は、SP1転写因子がDNA結合を示す部分である配列番号:73の全てまたは機能的部分をコードしなければならない(カドナガ(Kadonaga)ら[1987] Cell 51:1079〜1090参照)。次に、NF-kBコードベクターおよびSP1-コードベクターを共に、当技術分野で周知の適当な発現系中にトランスフェクションさせる。シャペロンによるSP1およびNF-kB認識単位の集合の後に、NF-kB認識二量体を完成させるために、一量体NF-kB認識単位を加える。非対称配列は、NF-kBまたはSP1二量体の形成を阻害し、代わりにNFkB-SP1ヘテロ二量体(すなわちHIV-検出II)を形成し、次にこれを既知の方法によって発現系(哺乳類またはバクテリア細胞)から単離する。
【０１４０】
(c) SP1/SP1 TBA(HIV-検出III)。上記(b)に記載のように、SP1-コードTBA構成物を調製する。しかし、この構成物のみを発現系にトランスフェクションし、およびSP1-SP1二量体の形成を可能にする非対称配列を含める。
【０１４１】
(d) SP1-TATA(HIV-検出IV)。上記(b)に記載のように、SP1-コードTBA組換え物を調製する。さらに、配列番号:74の結合配列を有するTBAコード組換え物 、またはTATA認識単位をコードする同様の配列を、SP1 TBAコード構成物に含まれる配列に相補的な非対称配列と共に調製する。これらの構成物を共にトランスフェクションし、適当なSP1-TATA標的結合領域を有するDNAカラム上でのアフィニティー精製を含む標準的な方法によってヘテロ二量体を単離する。
【０１４２】
(e) SP1-E2(HPV-検出I)。SP1コード構成物は上記(b)のように調製する。E2 TBAコード構成物は、乳頭腫ウイルスE2 DNA認識単位(ヘッジ(Hegde)ら[1992] Nature 359:505〜512)である配列番号:75〜84および94〜98、または同類認識単位のいずれか一つをコードする配列を用いて調製し、SP1 TBAコード構成物と共に形質転換またはトランスフェクションさせる。シャペロンによるE2-SP1認識単位の集合後にE2認識二量体を完成させるため、一量体E2認識単位を加える。ヘテロ二量体HPV-検出Iは、既知の方法によって単離する。
【０１４３】
(f) E2-E2(HPV-検出II)。E2 TBAコード構成物は、E2二量体を形成させる非対称配列を含めること以外は、上記(e)に記載のように調製する。次に発現した二量体を、DNAアフィニティーカラム上で二量体E2結合部位に対する親和性を含む既知の方法で単離する。
【０１４４】
(g) E2-TATA(HPV-検出III)。E2およびTATA結合TBAは(それぞれ)、ホモ二量体よりヘテロ二量体の形成を増強する非対称配列を含めること以外は、上記(e)及び(d)に記載のように調製する。次に、これらの構成物を共に発現させ、ヘテロ二量体を単離する。
【０１４５】
(h) TATA-TATA(HPV-検出IV)。上記(a)および(d)に記載のように、TATA結合TBAコード構成物を、このホモ二量体形成を促進する非対称配列を用いて調製し、ホモ二量体を単離する。
【０１４６】
(i) その他のTBA。HIVおよびHPV TBAに関する上記のように、特異的DNA結合蛋白の同定、ならびに適当なリンカー、集合体、および非対称配列を用いた発現構成物の形成によって、所定のいかなる病原体または疾患状態のTBAを産生してもよい。
【０１４７】
実施例８
実施例５に記載のアッセイと同様の様式で、実施例６によって調製した二本鎖NF-kB-SP1結合蛋白を用いて、より厳密なアッセイが得られる。したがって、プローブ間の距離を短くしそれによってTNA中のDNAの柔軟性を低下させるために、図７に示す実施例５で用いるプローブを長くしてもよい。
【０１４８】
実施例９- 「高次」TBAの産生
非対称配列の適切な使用によって、特定のDNA認識単位の二量体、三量体、四量体、五量体、または六量体のTBAが産生される。この様式では、六量体TBAは、二量体形成を可能にする非対称配列を用いて最初のNF-kB p50二量体TBAを作成することによって産生される。さらに、非対称配列はp50二量体とSP1-SP1二量体との四量体形成を可能にする。最後に、非対称配列を加えれば、核配置配列を示す二量体が六量体形成を指向する。これは、例えば、本質的に六量体を形成するインスリンからの非対称配列を組み入れることによって達成される。この六量体形成は、配列番号:85(A)および86(B)、87(A)および88(B)、89(A)および90(B)、ならびに91(A)および92(B)の配列によって指向される(図13および14参照)。
【０１４９】
多量体TBAを用いて生成可能なHIV LTRに対する極めて高い親和性のために、この構造を有し、この目的に利用できる化合物を、本明細書では「HIV-ロック」と呼ぶ。
【０１５０】
最適なHIV-ロックは、HIV LTR中でTBRに結合したTBAのフットプリント法(当技術分野に周知の方法による)によって定義され、TBAのDNA結合認識単位が由来する本来の標的配列(例えば、CNAs)の親和性に対して、多量体TBA複合体の形成に寄与する各DNA結合蛋白の結合親和性がダウンシフトすることを確認する。HIV TBRの結合親和性のいかなる同時喪失も、下記の多量体の形成に基づく代償より大きい。
【０１５１】
各成分TBAのそのTBRに対する結合と集合体との結合には、多量体を形成する非対称配列による競合がある。これは、これらの競合事象がカップリングされないように、シャペロンと、各TBA成分中の非対称配列との間のリンカーを調整すれば不要となる。TBA非対称および集合体成分に関して拡散の次元性(有効濃度の増加)の減少が起これば、多量体複合体が効果的に形成される。
【０１５２】
フットプリントに基づき、標的HIV配列と本来の配列との最適な識別が達成されるよう、リンカーの長さおよび組成を調節する。この様式では、各成分TBAはCNAおよびTBR配列に対する親和性が低いが、多量体複合体は、なおもCNAsに対する低親和性を維持する一方、多量体複合体によって認識される拡張TBRに対する極めて高い親和性を有すると思われる(多量体TBAの各成分TBAによって認識される各TBRの親和性の二乗)。同じ様式で、HIV-ロックを除く他の多量体TBA複合体を調製する。
【０１５３】
この様式で形成することが可能なTBAは、以下のような蛋白サブユニットまたはこれらのサブユニットをコードする核酸配列のいずれかを結合することによって集合する配列を含む：
【０１５４】
セット グループからのリンク配列
A               I + II + III
B               IV + V + III
C               IV + III
ここで、グループI〜IVは以下から選択した配列を含む：
グループ 配列からの選択
I              配列番号:85〜92のいかなるものでもよい
II             各々が配列番号:99にリンクした配列番号:104〜106のいずれにもリンクするMet Ser。
III            配列番号:75〜84もしくは94〜98のいずれにもリンクする配列番号:100；配列番号:74もしくは配列番号:93のいずれかにリンクする配列番号:101；または配列番号:74もしくは配列番号:93にリンクする配列番号:102；または配列番号:72、103、73、もしくは63〜71のいずれか。
IV             配列番号:104〜106のいかなるものでもよい。
V              配列番号:99。
そのようなTBAの特異的実施例は、以下のように集合した配列番号:109〜116である。
セット 配列番号 リンク配列番号
A       109             85 + Met Ser + 104 + 99 + 100 + 94
A       110             85 + Met Ser + 104 + 99 + 72
A       111             86 + Met Ser + 105 + 99 + 102 + 74
A       112             86 + Met Ser + 106 + 99 + 73
A       113             89 + Met Ser + 106 + 99 + 63
C       114             106 + 64
C       115             105 + 64
B       116             106 + 99 + 73
【０１５５】
この様式において、適当な非対称配列、集合体配列、およびDNA認識単位との間で選択すれば、多くの異なるTBAが形成される可能性がある。さらに、配列番号:114および115などのこれらのセットは、互いに会合するが、配列番号:114または115の二量体は、変異集合体配列では、電荷的反発により形成しない(配列番号:104はcro；配列番号:105は新規変異陰性荷電cro、および配列番号:106は新規変異陽性荷電croである)。
【０１５６】
これらのTBAのアミノ酸配列が得られれば、一般の技術者がこれらをコードする組換え核酸クローンを産生することができるが、そのような組換えクローンも当然本発明の肝要な部分を形成することは言うまでもない。
【０１５７】
実施例10- 「HIV-ロック」を用いたHIV検査
実施例６とほぼ同じ方法において、実施例９によって産生される「HIV-ロック」をTBA、試薬２として用いても同様の結果が得られる。
【０１５８】
実施例11- 献血検査の際の「HIV-ロック」を用いたHIV検査
献血サンプルのHIV汚染の有無を検査する場合のように、検査すべき血液量が限られている場合は、チューブA〜Cの各々に、約５ mlの血液を卓上遠心機で遠心することを除いて、実施例６と同様の検査を実施する。その他の試薬は、サンプル中に存在する大量のTNAを取り扱う必要に応じて量を増やす。
【０１５９】
実施例12- 抗HIV治療薬としての「HIV-ロック」
実施例９によって産生される「HIV-ロック」は、１ mg/ml溶液としてリポソーム中に製剤化し、検査を行ってHIV感染が確認された被験者にこれを静脈内注射する。投与量約0.1 mg〜100 mgの「HIV-ロック」/kg体質量を、24時間かけて注入し、患者の血清中のHIV p24濃度をモニターする。治療は、血清中のp24の上昇が起こった場合などの必要に応じた回数を繰り返す。
【０１６０】
実施例13- HIV-TBA構成物の治療薬としての利用
HIV LTR結合TBAをコードする構成物を感染患者に輸送するために、組換えレトロウイルスまたは同類のベクターを用いる。ベクターは、croなどのシャペロンをコードし、およびp50の結合部分に対してDNAをシークエンスする。その上にSP1 TBAが折り畳まれるシャペロンも、同じベクターによってコードされる。p50-TBAとSP1-TBAが単一のHIV感染細胞中にインビボで共に発現される際に、p50のDNA結合部分と内在性p50またはp65一量体との間のいかなる会合も同時に阻害する一方、これらのTBA間の会合が直ちに生じるように、非対称配列を提供する。NLS配列もまた、二量体形成時にTBAが直ちに細胞核へと移動し、組み込みHIV配列に特異的に結合し、このようにその遺伝子座からのいかなる転写も阻害するように、TBA中に提供する。
【０１６１】
この目的に関して、発現された一量体が本来のヒト配列には結合しないTBAに集合されるように、DNA結合ドメインをコードする配列を選択することが望ましい。このように、TBAの全ての成分間の会合が起こってHIV LTRに堅固にかつ特異的に結合する複合体を形成するのは、TBA成分がその標的配列に結合する場合に限られる。
【０１６２】
実施例14- ヒト乳頭腫ウイルスに対する診断検査キット
ヒト乳頭腫ウイルスに対するこの診断キットは、良性HPVと発癌性HPVとの間の既知の差を利用して、患者の悪性疾患への感受性を示す検査を提供する。乳頭腫ウイルスは、高等脊椎動物における良性扁平上皮細胞腫瘍に関連する小さいDNAウイルスの集団である。少なくとも27種類の明確なヒト型乳頭腫ウイルス(HPVs)が発見されている；これらの多くは特異的臨床病変に関連してきた。これらHPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、およびHPV-33のうち４つが、ヒト泌尿器病変に関連している。一般的に、HPV-6およびHPV-11 DNAsは、泌尿器管の良性病変に関連することがわかっている。HPV-16、HPV-18、およびHPV-33もまた、前悪性段階および悪性病変に関連することがわかっており、子宮頸癌から確立されたほとんどの細胞株に転写されている。HPV-16、HPV-18、およびHPV-33は、悪性ヒト子宮頸癌に関連するHPV DNAsの大きい集団中の２つの要素に過ぎない可能性がある。
【０１６３】
動物モデルは、補助発癌物質の存在下では、良性乳頭腫ウイルス病変が悪性病変へと進行しうることを示した。HPV DNAは子宮頸癌の転移部に認められている。悪性子宮頸癌病変では、HPV DNAは通常、ヒトゲノム内に組み込まれているが、染色体外HPV DNAが存在していてもよい。プロウイルスを形成するようHPVが組み込まれると、通常、ウイルスE2のオープンリーディングフレーム(ORF)の崩壊が起こる。E2 ORFの崩壊にも関わらず、いくつかの子宮頸癌からの細胞株の検査では、HPV-16およびHPV-18が転写的に活性で取り込まれていることが示されている。ヒト子宮頸癌細胞株SiHaおよびCaSkiに存在するHPV-16ゲノムを調べると、HPV-16の組み込みに関して差がある。SiHa株では、単一のHPV-16ゲノムの組み込みは、3132および3384位の塩基で起こり、E1およびE2 ORFsを崩壊させて0.3 kbの欠失を起こす。HPV-16 DNAのさらに50塩基対の欠失により、E2およびE4 ORFsが融合される。崩壊したE2 ORFを含むHPV-16 DNAの5'部分は、連続的なヒト右側面配置配列に結紮される。さらに、単一の別のグアニンが、E1 ORFの中央のヌクレオチド1138位で検出される。この塩基対付加の結果、単一のE1 ORFに対するE1aおよびE1b ORFsの融合が起こる。
【０１６４】
HPV-16の完全なゲノムは、ジーンバンク(Genbank)で寄託番号K02718として得られる；HPV-33の完全なゲノムは、ジーンバンクで寄託番号M12732として得られる；HPV-18の完全なゲノムは、ジーンバンクで寄託番号X05015として得られる。
【０１６５】
予備的スクリーニングとして、HPV感染の事実は、所定の子宮頸部生検サンプルについて、例えば配列番号:46〜53のいずれかのまたは全てのPNA、および上記のE2 TBAを用いた、単純な「はい／いいえ」型の分析によって確立される(すなわち、断片DNA、PNAの結合、TBAとの固定、ならびにBNAおよびBBAによるシグナルの検出)。
【０１６６】
生検サンプルがHPV陽性であることが一度判明すれば、ヒトゲノム中のウイルスの組み込み状態を分析することによって、HPVの悪性度に関するさらなる情報が得られる。
【０１６７】
１. 子宮頸部生検サンプル中のDNAを断片化し、配列番号:60の配列を有するブロッキングプローブとハイブリダイズする。このプローブは、0.3 kbの断片をスプライシングしないDNA中の全ての断片に結合する。
２. 生検サンプル中のDNAを配列番号:61の配列を有するPNAに暴露する。
このプローブは、0.3 kb断片を欠失した断片に結合するのみである(ブロッキングプローブは、大きい欠失部分がもし存在すれば、そのループ形成を阻害する)。
３. 配列番号:62を有するPNAを配列番号:41とハイブリダイズしてBBRを形成し、このBBRは、配列番号:61上のTATA部位とハイブリダイズ可能な一本鎖部分を残しながら、BBAとしてのcroまたはλCIリプレッサーに結合する。これは、大きい欠失の5'末端上にTBRを形成するために加えられる。
４. TBRは、TATA結合蛋白DNA認識単位を有するTBAによって固定化される。
５. BNAおよびBBAを上述のように加えることによって結合断片を検出する。
このアッセイにおけるシグナルの検出は、TNA中に存在するHPVにおいて大きい断片が欠失していることを示す。この欠失は悪性度に相関しているため、このアッセイにより、HPV感染の悪性度に対する洞察が提供される。この結論は、HPV-誘発悪性度にも相関する52塩基対断片の欠失に基づく類似アッセイの実施によって確認できる。
このアッセイに関して、TBAで用いられるTBP認識単位は、例えば、配列番号:70または配列番号:93などの配列から選択してもよい。
【０１６８】
実施例15- 組換えHIV-ロック（登録商標）の産生
第１相 - HIV-ロック（登録商標）を産生するためのDNAの調製。改変の必要があるHIV-ロック（登録商標）の自然発生的クローン化成分のコード領域のインビトロ変異誘発は、ミュータジーン・ファージミド(MutaGene Phagemid)キットで実施する。プロトコルの改変には、各々のHIV-ロック（登録商標）結合成分を含有するブルースクリプト(Blue-script)プラスミドの使用が含まれる。これらをコンピテント細胞に形質転換すると、ウラシル含有ファージミドが増殖する。一本鎖DNAを抽出し、変異誘発鎖の鋳型として用いる。新規制限部位の取り込みを含めた望ましい変異を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPで処理する。キナーゼ処理オリゴヌクレオチドをアニール化して一本鎖鋳型を作成し、シーケナーゼ2.0がポリメラーゼであること以外は、変異誘発鎖をミュータジーンプロトコルに従って合成し、結紮する。導入変異に相補的な配列を含有するg-３２P末端標識ヌクレオチドを用いて、およびプラスミドDNAを単離し、導入制限部位の存在によって変異体を同定することによって、ライブラリをスクリーニングする。変異体はまた、シーケナーゼキットによる配列決定によっても確認する。HIV-ロック（登録商標） DNAを、ポリヘドロンプロモーターを有するバキュロウイルス発現系にクローニングする。
【０１６９】
第２相 - バキュロウイルスを用いたHIV-ロック（登録商標）蛋白の産生。Sf-9細胞を既定の濃度(約１×10６ 細胞/ml、対数増殖期)に培養して、HIV-ロック（登録商標）命令を含有するバキュロウイルスに感染させ、回収してHIV-ロック（登録商標）を含む組換え蛋白を回復させる。規模拡大プロセスでは、培養をフラスコからスピナーに拡大し、その後バイオリアクターへと拡大する。感染に続いて、該細胞を12時間、24時間、36時間、及び48時間後に蛋白について採集した。生存能力の指標を、プロセス全体にわたってモニターする。
【０１７０】
第３相 - HIV-ロック（登録商標）蛋白の精製。回収した蛋白はまず、下流の生成を容易にするためフロースルー超遠心によって微粒子を分離する。次に、遠心産物を濾過滅菌する。次に抽出物を４℃で30分40,000 rpmで遠心し、部分試料を、HIV-ロック（登録商標）成分の一つに対するポリクローナルウサギ抗体により免疫沈殿させる。免疫沈殿蛋白をSDS-10% PAGEゲル上で泳動する。
【０１７１】
第４相 - HIV DNAに対するHIV-ロック（登録商標）蛋白の検査。HIV長末端反復配列のエレメント、ならびにκ軽鎖およびミクログロブリン制御に関連したNFKB結合DNAを含有する断片を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、移動度シフトアッセイを実施する。オリゴヌクレオチドをアニール化して相補鎖にし、g-３２P ATPで末端標識する。
【０１７２】
放射標識HIV LTR DNAの少量(10−１５ M)を、わずかに量の多いHIV-ロック（登録商標）と室温で10分間緩衝液中で混合することにより、フットプリントを実施する。鉄(II)、EDTA、過酸化水素、およびアスコルビン酸ナトリウムを加えて、反応混合物をインキュベートする。消光剤を加えて、変性ゲル電気泳動を用いて該生成物を分析する。これを異なる蛋白濃度について実施する。得られたゲルを燐酸画像化スキャナを用いて画像化し、得られた高解像度画像ファイルを分析して、細胞内DNAに相補的なHIV DNAに関するHIV-ロック（登録商標）の結合親和性を抽出する。
【０１７３】
HIV-ロック（登録商標）と、HIVおよびその他の菌体に対するその他のTBAとの結合を再発見するために、複合設計および検査の繰り返しを用いてもよい。このプロセスにより、結合集合体が、野生型の蛋白とゲノムサンプル中の単一の結合部位を求めて競合しないように、結合集合体を設計することができる。その他の菌体に対するTBAおよびこれらの菌体内の配列に対するTNAの成長は、前述の方法を用いて実施できる。この方法は、DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAハイブリッドおよびこれらのハイブリッドの組み合わせを含む全ての核酸TBRに関する結合集合体を産生する場合に有効である。
【０１７４】
実施例16- 発明のTBAおよびBBAの産生に対する核酸結合分子の同定法：
本発明の方法において、標的結合集合体およびブースター結合集合体は、特定の標的配列と非常に密接な関連配列とを識別するTBAを得るような様式で、核酸結合分子の同定および分子の核酸結合部分の結合によって集合される。核酸結合分子の一つの同定法には、以下の工程が含まれる：
１. 標的核酸を含有する生物サンプルを得る。これは、例えば、菌体または病原体に感染させた組織抽出物である。
２. 核酸を露出し、サンプル中に含有される核酸のサイズの複雑性を低下させるために、サンプルを断片化する。
３. 断片化核酸の最初の部分試料を対照緩衝培地と接触させ、断片化核酸の第二の部分試料を既知のプロフィールの核酸結合分子を含有する対照緩衝培地と接触させる。
４. 標的結合分子に接触させた部分試料において、対照部分試料に対して行動変化を示す断片を同定するために、２つの部分試料を分析する。これは、一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、または核酸結合分子に結合した場合の、核酸断片が未結合の場合に対する核酸断片の異なる行動を明らかにするその他の手段によって得られる。
５. 核酸結合分子と接触しても行動の変化を示さない断片の同定、および単離、既知の核酸結合分子モチーフが存在するか否かを明らかにするための核酸断片の配列決定、または核酸に結合した核酸結合分子の直接の同定。後者は、例えば、電気泳動した核酸の二次元グリッドと、様々な核酸結合分子と結合する標識の異なる抗体との接触によって得ることができる。
【０１７５】
本発明方法において、標的核酸が１つ以上の利用可能な核酸結合分子標的を有する場合には、好ましくは診断または治療目的のいずれかに核酸モチーフを用いる。このようにして、同定された個々の核酸結合成分から集合されたTBAの特異性を増強するために、異なる核酸結合分子モチーフの近位性を利用した複合体標的結合集合体を産生できる。次に、核酸結合分子の様々な核酸結合部分を、上記の例えばHIV-ロック（登録商標）のように完全なTBAの中に集合する。
【０１７６】
実施例17- サンプル中の特異的RNA配列の同定法
本発明において教示する方法および組成物にしたがい、いかなる核酸配列も特異的に同定することができる。サンプル中の標的HIV RNAの同定は、患者の血液またはその他の生物学的液体もしくはHIV RNAを含有する可能性がある抽出物を得て、TAR結合部位の存在に関して検査することによって達成される。Tatは、HIV RNAのTAR領域に結合するHIV複製の陽性制御因子である。HIV-Tatの自然発生的な、十分活性がある最少の形態は、本明細書に配列番号:118として示す72個のアミノ酸である。Tatは少なくとも２つの機能的ドメインを含有し、HIV長末端反復配列(HIV LTR)からの遺伝子発現を変形活性化する。Tatは、TAR中の配列の自己ハイブリダイゼーションによって形成されるRNA基幹ループ構造に結合し、これはHIV LTRの5'にある。HIV TAR RNAは、ジヌクレオチド隆起および２つの基幹ループ構造を形成する(リム(Rhim)ら[1994] Virology:202,202〜211)。Tat(配列番号:118)はこの構造に対し、Ala58がトレオニンである、またはHis65がアスパラギン残基であるTat変種より低い親和性で結合する(ダース(Derse)ら[1993] Virology:194,530〜536)。本発明方法にこれらの事実を利用することは以下によって達成される：
１. 核酸を露出し、核酸のサイズ複雑性を低下させるための生物サンプルの断片化。
２. ハイブリッドTAR結合蛋白配列を同定するサンプルおよびHIVゲノムにおける直前側面配置配列と、TBAとの接触。この目的で用いるTBAは、TatをHIV RNA特異的結合分子として用いて、シャペロンとしてのcro上に集合させる。HIV TAR部位と、サイトメガロウイルスなどのその他の病原体によって存在する可能性がある密接に関連したTAR部位との、クロストーク(cross-talk)のような特異性を提供するため、TBAも同様に、プローブ核酸がHIV LTR RNAに結合する場合に形成されるDNA-RNAハイブリッド標的結合領域を認識する抗体成分を有する。
３. CMV TAR配列のような汚染物質(同類RNAs)のために、より強固に結合するTat変種(Ala58がトレオニン、またはHis65がアスパラギンであるいずれかの変種)の過剰量と反応物とを接触させることによって、HIV RNAのTAR領域に対するTatの結合によって産生されるいずれの「クロストーク」も消失させる。このように、TBAの同類RNAsとの結合による単一の結合事象は、Tat変種による核酸サンプルと競合される。一方で、抗体とTatの結果として得られた二重結合の親和性を適切に選択すれば、TBAは真の標的から置換されることはない。このプロセスを図16に図示する。この同じ方法の別の局面において、TBAは、Tat変種を用いるより、この核酸セグメントを認識する抗体を用い、そして用いるTBAが二重抗体TBAであるものとすることができる。
【０１７７】
本方法の別の版では、HIV LTR RNAとハイブリダイズするプローブ核酸を用いてもよい。したがって、LTR sp1部位の二本鎖セグメントは標的結合領域の一部として作成することができる。HIV RNAのこの領域は、LTRの5'であるがそれに密接した近位に存在するTAR領域の側面に位置する。TatをTARに結合させ、SP1をSP1結合部位に結合させるため、Tatおよび２つのSp1結合単位を含有するTBAをシャペロニングする。次に、適当なBNA、BBAおよびHNAを加えることによって、増幅および検出を実行する。さらに別の変法では、配列番号:38および配列番号:39を有するPNA(図７参照)を用いることができる。１つ以上のSp1結合単位と、サンプルRNAおよび配列番号:38 PNAから産生されるDNA-RNAハイブリッドに結合する抗体単位とを含有するTBAを使用する。次に、シグナルを増幅するため、適切なBNA、BBAおよびHNAを加える。
【０１７８】
当業者は、本明細書に例示する方法を最適化するためにその他のTBAおよびTNAの組み合わせを用いることができることを認識するであろうことは言うまでもない。
【０１７９】
本明細書に記載の実施例および態様は図示の目的に限り、およびそれを考慮した様々な修正または改変が当業者に示唆されること、そして本出願および添付の請求の範囲の範囲内に含められることを理解すべきである。本明細書に提供した配列は、例示にすぎず、これらによって示唆されるその他の同様の配列を本発明の方法において用いることができると理解される。同様に、本明細書に提供したいかなる配列も直鎖状として示されているが、環状またはそれ以外の変更形状で用いることができ、アンチセンスでないものとして設計されていても、コードもしくは非コード形状で、またはコードもしくは非コード相補配列に結合するように用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】以下の例証が図１に含まれている：図１-Iは、1/2 TBRを含有するPNAで、これはTNAおよび1/2 BBR配列に相補的な一本鎖配列である。図１-IIaは、これに図１-Iの構成を加えるTNAで、ハイブリダイズ条件下では、PNAと結合して図１-IIIaの構成、すなわち少なくとも1つのTBRを含有するPNA-TNAハイブリッドを形成する。図１-IVaは図１-IIIaの構成に加えられるBNAで、ハイブリダイズ条件下では図１-IIIaの1/2 BBRに結合して、図１-Vaで示されるBBRを含有するPNA-BNAハイブリッドを形成する。  図１-IIbは、図１-Iの構成に加えられるBNAで、これはハイブリダイズ条件下でPNAに結合して、図１-IIIbの構成、すなわちBBRを含有するPNA-TNAハイブリッドを形成する。図１-IVbは、これに図１-IIIbの構成を加えるTNAで、これはハイブリダイズ条件下では図１-IIIbの1/2 TBRに結合して、図１-Vbに示されるTBRを含有するPNA-BNAハイブリッドを形成する。  図１-IIcは図１-Iの構成に加えられるHNAで、これはハイブリダイズ条件下で、PNAに結合し、図１-IIIcの構成、すなわちBBRを含有するPNA-HNAハイブリッドを形成する。図１-IVcは、図１-IIIcの構成に加えられるTNAで、これはハイブリダイズ条件下で図１-IIIcの1/2 TBRに結合して、図１-Vcに示されるBBRを含有するPNA-BNAハイブリッドを形成する。  TBRおよびBBRを形成するハイブリッドは、本発明において有用である。PNAおよびBNAは、図１に示すように、付属のサポートおよび／またはインジケータ(OSA)、もしくは配置用の付属のサポートまたはビーズ、ポリマー、および表面への接着、および／またはインジケータを含むがこれに限定しないその他の手段を含まなくてもよい。
【図２ａ】BNAのPNAへの重合化およびHNAによるキャッピングの方法のダイヤグラムである。
【図２ｂ】BNAの重合化によるPNA-TNAシグナルの増幅およびHNAによるキャッピングに対する追加方法のダイヤグラムである。
【図２ｃ】BNAの重合化によるPNA-TNAシグナルの増幅およびHNAによるキャッピングに対する追加方法のダイヤグラムである。
【図２ｄ】BNAの重合化によるPNA-TNAシグナルの増幅およびHNAによるキャッピングに対する追加方法のダイヤグラムである。
【図３ａ】１BNA当たり多数の1/2 BBRを含有するBNAの使用を示すダイヤグラムである。
【図３ｂ】図３ａの続きを示すダイヤグラムである。
【図４ａ】TBAおよびBBAのTBRおよびBBRに対する結合、ならびにTBAがTNAとCNAsとを識別する能力を示すダイヤグラムである。この態様によれば、TBAをビーズ、マイクロタイタープレート表面、またはそれ以外の同様の表面上のいずれかに固定化すると、複合体XIなどの複合体を保持、検出することなく、複合体Xなどの複合体のみが保持、検出される。
【図４ｂ】図４aに示されているものと同様であるが、発生の次数がわずかに異なる事象を例証するダイヤグラムである。
【図４ｃ】図４aに示されているものと同様であるが、発生の次数がわずかに異なる事象を例証するダイヤグラムである。
【図５】1/2 BBRを全く含まない１つの1/2 TBRを含むPNA、ならびに1/2 TBRを５つまでおよび1/2 BBRを１つ含有するPNAを例証するダイヤグラムである。
【図６ａ】２つの1/2 TBRを有する特定のTNAを例証するダイヤグラムで、これは適当なPNAと結合すると、２つのTBAに結合可能な２つの密接に関連したTBRを形成する。1/2 BBRも、増幅のために提供する。
【図６ｂ】二重TBAを用いるという点を除いて、図６aと同じ事象を示すダイヤグラムで、ここでは、正常な細胞サンプルで起こる一重TBRが、異常な二重TBRと識別できるように二重TBAを用いる。
【図６ｃ】５つのTBRがTNA中に同定されるという点を除いて、図６aと同じシナリオを示すダイヤグラムである。各TBRは同じTBAに結合してもまたは異なるTBAに結合してもよく、５カ所全ての部位がTNA中に存在することを確認するために各TBAに異なる標識をしてもよい。
【図６ｄ】二重TBAが示されているという点を除いて、図６cと同じ事象に関するダイヤグラムで、図６bで示された内容を二重TBAの使用について発展させたものであるある。図6a、6b、6c、および6dの項目IIに示すTNAの例はHIV一本鎖DNAまたはRNAである。
【図６ｅ】二重TBAが示されているという点を除いて、図６cと同じ事象に関するダイヤグラムで、図６bで示された内容を二重TBAの使用について発展させたものであるある。図6a、6b、6c、および6dの項目IIに示すTNAの例はHIV一本鎖DNAまたはRNAである。
【図７】TNAとしてのHIV LTR、および２つのPNA、ならびにPNAを用いたTNA検出法を示す。
【図８ａ】ハイブリッドTNA-PNAを結合させるために標的結合集合体を用い、重合化BNAを結合させるためにブースター結合集合体を用いる本発明の一つの態様の略図である。
【図８ｂ】図８ａの続きを示す略図である。
【図９】TBAを形成すべく望ましい核酸認識単位を共にシャペロニングするために、集合体配列、リンカー配列、および非対称配列を用いる、モジュラーTBAの略図である。
【図１０】HIV-特異的配列の検出に有用なモジュラーTBAを示す。
【図１１】ヒト乳頭腫ウイルス配列の検出に有用なモジュラーTBAを示す。各E2単位は実際には、E2のDNA結合部分の二量体である。
【図１２ａ】TNA分画およびTBAの結合による移動度におけるシフトの略図である。
【図１２ｂ】TNA分画およびTBAに加えてBBAの結合による移動度におけるシフト増加の略図である。
【図１３】欠失配列に対する検出法である；この方法を用いる例として、ヒト乳頭腫ウイルス同化測定法に対するものがある。
【図１４】HIV LTRの結合部位に特異的な様々な標的結合集合体が形成されるように、核酸認識単位、リンカー、集合体、および非対称配列を利用した高次TBAの集合体を示す。
【図１５】HPVゲノムの結合部位に特異的な様々な標的結合集合体が形成されるように、DNA認識単位、リンカー、集合体、および非対称配列を利用した高次TBAの集合体を示す。
【図１６】複合体TBAを用いることによって得られる識別、および内在性競合物質標的結合分子が、TBAの同類核酸に対する結合を消失させるが、TBAによって認識される１つ以上の部位の適当な方向性を含有するTNAを形成しない能力を示す。
【図１７】特異的に標的とするTBAが配列の不適正部位に結合する能力、および標的となる不適正の全てを含有しない同類部位に対して、それらの部位と優先的に結合する能力を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月11日(2006.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 検出されるべきハイブリッド、またはハイブリダイズしてプローブ-標的ハイブリッドを形成する標的核酸およびプローブ核酸を含む試料を得る工程；および
(b) 工程(a)のハイブリッドを、核酸結合分子または集合体（TBA）と接触させる工程であって、該TBAが、配列特異的な様式でハイブリッドに結合および安定化することができ、さらに該TBAが、プローブおよび標的核酸によって形成されたハイブリッドとプローブおよび密接に関連したまたは関連しない配列によって形成された1つまたは複数の不対合を有するハイブリッドとを識別することができる工程
を含む、核酸を検出する方法。
【請求項２】
工程(a)または工程(b)のハイブリッドを、TBAによって結合された核酸に特異的に結合する1つまたは複数の標識と接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程(a)または工程(b)のハイブリッドを、TBAに特異的に結合する1つまたは複数の標識と接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
標識が、反応を触媒して着色反応産物を産生させることが可能な酵素、放射性核種、フルオロフォア、および着色ビーズからなる群より選択されるインジケータをさらに含む、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】
特異的な標識が、ブースター核酸(BNA)、ブースター結合集合体（BBA）、ならびに、反応を触媒して着色反応産物を産生させることが可能な酵素；放射性核種；フルオロフォア；および着色ビーズからなる群より選択される取り込まれたインジケータをさらに含む、請求項2または3記載の方法。
【請求項６】
(a) 標的核酸試料中の核酸を断片化する工程；
(b) ハイブリダイズ条件下で、断片化核酸を対象となる特定の核酸配列と相補的なプローブ核酸と接触させる工程であって、該プローブ核酸が、該対象となる特定の核酸配列とのハイブリダイゼーションにおいて、該TBAが特異的に結合する標的結合領域を形成する工程
をさらに含む、請求項1、2、3、4または5記載の方法。
【請求項７】
検出されるべき標的ハイブリッドを含む試料を断片化する工程、断片化標的ハイブリッドをTBAと接触させる工程をさらに含み、該TBAが標的ハイブリッド断片に結合および固定化することができ且つ試料中の他の断片に結合することができない、請求項1、2、3、4または5記載の方法。
【請求項８】
試料中の特定の断片に対するTBAの結合が断片の移動度を修飾するように、サイズの機能としての標的核酸試料中の核酸の移動度シフトをモニターする工程をさらに含む、請求項1、2、3、4、5、6または7記載の方法。
【請求項９】
ハイブリッドまたはプローブ標的ハイブリッドが、少なくとも1つのTBAで結合する1つまたは複数の核酸結合蛋白質認識部位を含む、請求項1、2、3、4、5、6、7または8記載の方法。
【請求項１０】
TBAが、1つもしくは複数のDNA結合蛋白質、核酸結合蛋白質、DNA-RNAハイブリッド結合蛋白質、またはRNA結合蛋白質である、請求項1、2、3、4、5、6、7、8または9記載の方法。
【請求項１１】
TBAが、NF-kB、乳頭腫ウイルスE2蛋白質、転写因子SP1、不活性制限酵素、抗体、TATA結合蛋白質、バクテリオファージλCIリプレッサー蛋白質、およびバクテリオファージλcro蛋白質からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ハイブリッドを、標的核酸に結合しないプローブ核酸の一部に結合するブースター核酸と接触させる工程をさらに含む、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載の方法。
【請求項１３】
ハイブリッドを、TBAに結合しない、検出されるべきハイブリッドの一部に結合するBBAと接触させる工程をさらに含む、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載の方法。
【請求項１４】
TBAが、病原体のゲノム中に存在する核酸認識部位、脊椎動物ゲノムにおける病原状態に関連する核酸認識部位、または発酵過程で汚染した微生物のゲノム中に存在する核酸認識部位である、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載の方法。
【請求項１５】
TBAが、病原体のゲノム中に存在する核酸認識部位に結合し、該核酸認識部位がHIV-LTRまたはその一部である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程を含む標的ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法：
試験試料中に存在する場合、該標的ポリヌクレオチドの固定化を達成する手段として、標的結合集合体TBAを用いて、捕獲部位での固相上に、直接または中間捕獲構造を通じて標的ポリヌクレオチドを固定化する工程；
該固定化の前、間、または後に、検出可能な標識を、存在する場合には該標的ポリヌクレオチドに接着させる工程；および
存在する場合には、該捕獲部位で該標識を検出する工程。
【請求項１７】
標的結合集合体TBAまたはブースター結合集合体BBAが、少なくとも1つの核酸認識単位を含み、かつ、リンカー分子または配列、集合体分子または配列、非対照分子または配列、核配置シグナル配列(NLS)、およびOSAからなる群より選択される分子、配列、またはそれらの一部の1つまたは全てを含む、請求項1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、または16記載の方法。
【請求項１８】
核酸結合複合体の成分の会合または非会合を指向する非対称配列を用いることを含む、核酸結合複合体、TBA、またはBBAを集合させる工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
バクテリオファージλcroまたはCIに由来する集合体配列を用いて核酸結合複合体の会合成分を作用させるまたは集合させることを含む、核酸結合複合体、TBA、またはBBAを集合させる工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
該TBA、該BBA、または該TBAと該BBAの両方が、該多量体TBAまたはBBAに取り込まれるべき集合体、非対称またはパイロット分子、配列、またはサブユニットを結合させること、および、該多量体TBAまたはBBAを回収することによって調製される多量体分子または集合体である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
DNA認識単位が、NF-kB結合単位、SP1結合単位、TATA結合単位、ヒト乳頭腫ウイルスE2結合単位、HPV LTR結合単位、およびHIV LTR結合単位からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
DNA認識単位が、配列番号：63、配列番号：64、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：80、配列番号：81、配列番号：82、配列番号：83、配列番号：84、配列番号：93、配列番号：94、配列番号：95、配列番号：96、配列番号：97、および配列番号：98からなる群より選択される配列を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
リンカー配列が、DNA認識単位のDNA認識機能を阻害せず、TBAの残りの部分由来のDNA認識単位の空間の安定性および制御を提供するオリゴペプチドである、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
リンカー配列が、構造蛋白質のドメイン間一次配列由来のオリゴペプチド配列である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
集合体配列がDNA認識単位の折り畳みおよび会合を指向するオリゴペプチド配列である、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
集合体分子または配列が、配列番号：104、配列番号：105、配列番号：106、配列番号：107、および配列番号：108からなる群より選択される、バクテリオファージλcro蛋白質もしくはCI蛋白質またはそれらの誘導体である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
非対称配列がDNA認識および集合体配列の会合を既定の順序で指向する請求項17記載の方法。
【請求項２８】
非対称分子または配列が、インスリン、性腺刺激ホルモン、FSH、HCG、LH、ACTH、もしくはリラキシン、または、非対称分子もしくは配列として作用できるこれらの分子のいずれかの一部である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
非対称配列が、配列番号：85、配列番号：86、配列番号：87、配列番号：88、配列番号：89、配列番号：90、配列番号：91、および配列番号：92からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
NLSが、該NLSと会合する蛋白質または複合体の細胞核中への移動および取り込みを指向するオリゴペプチドである、請求項17記載の方法。
【請求項３１】
NLSが、配列番号：72および配列番号：103からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
TBAが、HIV検出I〜IVまたはHPV検出I〜IVである、請求項17記載の方法。
【請求項３３】
TBAが、配列番号：109、配列番号：110、配列番号：111、配列番号：112、配列番号：113、配列番号：114、配列番号：115、および配列番号：116からなる群より選択される配列を有する、請求項17記載の方法。