(57)【要約】【課題】  遺伝子構造に基く品種特性の観点から、試験米がきわめて少量であっても、究極的にはたった１粒の試料であっても、また、どの品種であっても、迅速かつ精度良く食味を推定するための技術を提供すること、及び、米の主要な食味要因であるデンプンやタンパク質の量や質に関係するＤＮＡを効率良く増幅させることができ、前記食味推定技術を実施するために有用なプライマーを提供すること。【解決手段】  米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果及び／又は米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果に基づいて米の食味を推定することを特徴とする米のＤＮＡ食味推定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果及び／又は米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果に基づいて米の食味を推定することを特徴とする米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項２】
米のデンプン合成酵素遺伝子が、デンプン粒結合型デンプン合成酵素遺伝子、可溶性デンプン合成酵素遺伝子、デンプン枝作り酵素遺伝子、及びデンプン枝切り酵素遺伝子のうちの１種類又は２種類以上である請求項１記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項３】
米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーが、ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、及びＭ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）である、請求項１又は２記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項４】
米のタンパク質組成が、グルテリン及び／又はプロラミンである請求項１〜３のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項５】
米のタンパク質組成に関係するプライマーが、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列表の配列番号４２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）である請求項１〜４のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項６】
ＰＣＲの結果に基づく米の食味の推定にあたり、食味関連特性と正或いは負の相関を示す識別用増幅ＤＮＡのＰＣＲによる出現の有無を２値化して変数とし、多変量解析によって食味を推定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項７】
多変量解析の際にあたり、試料米の食味関連特性を目的変数とし、識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化したものを説明変数として食味関連特性を目的とする食味推定式を作成し、該食味推定式を利用して試料米の食味を推定することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項８】
試料米が籾或いは玄米であり、試料籾或いは玄米を短軸方向に半裁し、その胚芽を含まない側の半粒から抽出したＤＮＡを試料米ＤＮＡとして食味を推定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法。
【請求項９】
請求項８に記載の食味推定方法により選抜された良食味系統の籾、あるいは玄米の胚芽を含む側の半裁種子を播種して次世代稲を育成することを特徴とするＤＮＡによる半粒良食味米の選抜技術。
【請求項１０】
ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｍ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列表の配列番号４２に示される��基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）からなる群のうちの１種類、あるいは２種類以上のプライマーを用いて試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、日本型米とインド型米とを識別する方法。
【請求項１１】
ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｍ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列表の配列番号４２に示される��基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）からなる群のうちの１種類、あるいは２種類以上の組み合わせからなるプライマー・セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米のＤＮＡ食味推定方法に関し、詳しくは、多種類の品種かつきわめて少量の試験米を対象として、迅速かつ精度良く食味を推定する試料米の食味を、試料が少量であっても精度良く推定するための米のＤＮＡ食味推定方法、該方法を利用して１粒の試料米を有効活用することができる半粒良食味米の選抜技術、該食味推定方法を実施するために有用であると共に日本型米とインド型米の識別にも有用なプライマー・セット、並びに該プライマー・セットを用いた日本型米とインド型米の識別方法を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
従来、米の食味評価は、官能検査と物理化学的測定によって行われてきた。
官能検査の分野では、試食者の選抜や訓練の必要性が要求されると共に、動的官能検査法、２点比較法、分析型官能検査法等の進歩が見られた。
一方、物理化学測定の分野では、澱粉の微細構造や蛋白質の組成等が食味に関係するとの報告がなされ、酵素活性や細胞壁構造等の新しい食味要因の提案もされている。また、米飯物性や糊化特性の機器分析のための測定装置も改良されており、分光測定装置や味認識装置等が登場してきた。
しかし、これらの食味評価方法は、少なくとも数十グラム、通常は数百グラムの試料を必要とするため、育種初期の段階や流通加工の末端段階のように、多種類の米を対象に、きわめて少量の試料米で食味判別するには適していない。さらに、一粒の試料米で食味を推定する技術が必要とされている。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、各種の試料米の遺伝子を抽出し、適正なプライマー共存下でＰＣＲを行うことにより、米の品種判別が可能であることを報告してきた（非特許文献１参照）。また、これらの品種判別に有用なプライマーを用いるＰＣＲ結果を２値化して変数とし、重回帰分析することによって、米の食味の判別がある程度可能であることを報告してきた（非特許文献２参照）。
しかしながら、これまでの方法は、品種判別用に開発してきたプライマーを用いたＰＣＲの結果を解析したものであり、米の食味要因との関係が明確ではなかった。
【０００４】
最近、世界各国でＤＮＡマーカーが分子育種に利用されるようになっており、米国やタイでは、香り米の香り成分に関係するＤＮＡマーカーが開発され、ＰＣＲ法による香り米の選抜が行われている（非特許文献３参照）。
しかし、米の食味の主要な要因は、香りよりは米飯の硬さや粘り、味などであるとされており、これらの主要要因に関係するＰＣＲ用プライマーの開発と米の食味推定技術の開発が必要とされている。
また、米の食味には、澱粉、タンパク質等の主要成分含量やそれらの組成も関係しているとされている。そのため、米の主要な食味要因であるとされる澱粉やタンパク質の量や質に関係するプライマーを開発し、それらを用いたＰＣＲの結果を利用して米の食味を推定することによる、従来に比べて画期的に優れた食味判別技術の開発が必要とされていた。
【０００５】
【非特許文献１】大坪  研一ら，農化，vol．76，ｐ388-397，2002
【非特許文献２】大坪  研一ら，食科工、vol．50，ｐ122-132，2003
【非特許文献３】Garland，S．ら，Theor．Appl．Genet．，101，364-371，2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子構造に基く品種特性の観点から、試験米がきわめて少量であっても、究極的にはたった１粒の試料であっても、また、どの品種であっても、迅速かつ精度良く食味を推定するための技術を提供することを目的とすると共に、米の主要な食味要因であるデンプンやタンパク質の量や質に関係するＤＮＡを効率良く増幅させることができ、前記食味推定技術を実施するために有用なプライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意検討を重ね、その過程で、様々な品種の米の、デンプン合成酵素やタンパク質組成に関係するＤＮＡを比較して、デンプン合成酵素やタンパク質組成に関連する数種のプライマーを開発した。そして、これらのプライマーを組み合わせてＰＣＲを行ったところ、米の食味に関連する特性と正又は負の相関関係を有する識別用増幅ＤＮＡを増幅することが明らかとなった。
また、該識別用増幅ＤＮＡ出現の有無と、試料米の実際の食味関連特性との間で多変量解析すると、より精度の高い食味の推定を行うことができることが明らかとなった。
更に、多変量解析の結果、食味関連特性を目的とする食味推定式を確立すれば、任意の試料米について前記プライマーを用いたＰＣＲを行い、その結果としての識別用増幅ＤＮＡの有無を該食味推定式に代入することにより、食味を推定できることが明らかとなった。
【０００８】
そして、米の主要な食味要因であるデンプンやタンパク質の量や質は、米の食味に強く関わっていることから、日本型米とインド型米との間で、デンプンやタンパク質に関連する遺伝子を調べたところ、両者に変異部分が存在することが明らかとなった。そこで、上記のデンプン合成酵素やタンパク質組成に関連する数種のプライマーについて、日本型米とインド型米の各種試料米ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うと、両者に特徴的な変異部分が観察されたことから、日本型米とインド型米の識別にも有用であることが明らかとなった。
従って、デンプン合成酵素やタンパク質組成に関連する数種のプライマーは、食味推定用、かつ日本型米とインド型米の識別用のプライマー・セットとして有用性が高いことが判明した。
本発明者らは、係る知見に基き本発明に到達した。
【０００９】
請求項１記載の本発明は、米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果及び／又は米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果に基づいて米の食味を推定することを特徴とする米のＤＮＡ食味推定方法。
請求項２記載の本発明は、米のデンプン合成酵素遺伝子が、デンプン粒結合型デンプン合成酵素遺伝子、可溶性デンプン合成酵素遺伝子、デンプン枝作り酵素遺伝子、及びデンプン枝切り酵素遺伝子のうちの１種類又は２種類以上である請求項１記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
【００１０】
請求項３記載の本発明は、ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、及びＭ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）である、請求項１又は２記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
【００１１】
請求項４記載の本発明は、米のタンパク質組成が、グルテリン及び／又はプロラミンである請求項１〜３のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
請求項５記載の本発明は、米のタンパク質組成に関係するプライマーが、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列表の配列番号４２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）である請求項１〜４のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
【００１２】
請求項６記載の本発明は、ＰＣＲの結果に基づく米の食味の推定にあたり、食味関連特性と正或いは負の相関を示す識別用増幅ＤＮＡのＰＣＲによる出現の有無を２値化して変数とし、多変量解析によって食味を推定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
請求項７記載の本発明は、多変量解析の際にあたり、試料米の食味関連特性を目的変数とし、識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化したものを説明変数として食味関連特性を目的とする食味推定式を作成し、該食味推定式を利用して試料米の食味を推定することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
【００１３】
請求項８記載の本発明は、試料米が籾或いは玄米であり、試料籾或いは玄米を短軸方向に半裁し、その胚芽を含まない側の半粒から抽出したＤＮＡを試料米ＤＮＡとして食味を推定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の米のＤＮＡ食味推定方法である。
請求項９記載の本発明は、請求項８に記載の食味推定方法により選抜された良食味系統の籾、あるいは玄米の胚芽を含む側の半裁種子を播種して次世代稲を育成することを特徴とするＤＮＡによる半粒良食味米の選抜技術である。
【００１４】
請求項１０記載の本発明は、ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｍ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列��の配列番号４２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）からなる群のうちの１種類、あるいは２種類以上のプライマーを用いて試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、日本型米とインド型米とを識別する方法である。
【００１５】
請求項１１記載の本発明は、ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｍ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列��の配列番号４２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）からなる群のうちの１種類、あるいは２種類以上の組み合わせからなるプライマー・セットである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＤＮＡを用いて育種選抜の初期段階から試料米の食味を精度良く推定することが可能となる。
特に、試料米がごく少量であっても食味を推定することが可能となるので、官能検査や物理化学的測定などの従来の食味判別技術で必要とされてきた試料の量についての問題を解決することができる。
特に、試料米が籾あるいは玄米半粒やそれ以下であっても適用可能であるので、胚芽を含まない側の半裁種子について食味推定を行って良食味系統を選抜し、胚芽を含む側の半裁種子を播種して効率良く次世代稲を育成することが可能となり、育種の分野における有用性が期待される。
本発明により、米の食味関連要因に対し正又は負の相関関係を示す識別用増幅ＤＮＡを効率良く出現させることのできるプライマー・セットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の米のＤＮＡ食味推定方法は、請求項１に記載するように、米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果及び／又は米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果に基づいて米の食味を推定することを特徴とする。
すなわち、（１）米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果のみを用いて米の食味を推定する場合、（２）米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果に基いて米の食味を推定する場合、及び、（３）米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果と、米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上用いて試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果とを組み合わせて米の食味を推定する場合、の３通りに分類される。
【００１８】
ここで、ＰＣＲとは、Polymerase Chain Reactionを指し、鋳型であるＤＮＡを、約９４℃の高温で加熱して１本鎖に分離する工程（変性）、プライマーを加えて約３６℃〜約７２℃で反応させて、当該ＤＮＡとプライマーとを結合させる工程（アニーリング）、及び約７２℃でＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマー結合部位から当該ＤＮＡを合成・伸長させる工程（伸長）の３つの工程からなる反応を指す。
ＰＣＲを実施する際には、通常の市販の装置を用いることができる。例えば、タカラバイオ、ＡＢＩ、パーキンエルマー、アステック、ストラタジーン、イワキガラス等の各社の製造するサーマルサイクラーを用いることができる。
【００１９】
試料米ＤＮＡとは、ＤＮＡ食味推定の対象である試料米に由来する２本鎖ＤＮＡであり、上記ＰＣＲの鋳型として用いられる。試料米からのＤＮＡの抽出・精製方法としては、試料米である籾、玄米、精米、精米粉、発芽玄米、米飯、餅、米菓等から通常のセチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法、アルカリフェノール法、市販キット法、酵素法（特許第３０４８１４９号）等を挙げることができる。
【００２０】
プライマーとは、前述のＰＣＲにおいて、鋳型である試料米ＤＮＡに相補的に結合する１対のＤＮＡ断片のことであり、本発明においては、米のデンプン合成酵素に関係するプライマーや、米のタンパク質組成に関係するプライマーを用いる。
ここで、米のデンプン合成酵素とは、米に含まれるデンプンの合成に関与する種々の酵素を指す。中でも、デンプン粒結合型デンプン合成酵素、可溶性デンプン合成酵素、デンプン枝作り酵素、及びデンプン枝切り酵素が作用することにより、デンプンのアミロース含量やアミロペクチンの鎖長分布が決定され、デンプン特性や米飯物性に強く影響を与えると考えられていることから、本発明においては、米のデンプン合成酵素に関係するプライマーとして、これらの酵素のうちの１種類又は２種類以上に関係するものを用いることが好ましい。
【００２１】
デンプン粒結合型デンプン合成酵素（Granule bound starch synthase、ＧＢＳＳ）とは、デンプン粒に結合して存在し、α−１，４グリコシド結合を伸長することによって、アミロース含量を増加させたり、アミロペクチンの長鎖を伸ばす酵素である。可溶性デンプン合成酵素（Soluble starch synthase、ＳＳ）は、細胞質に存在する可溶性酵素であり、デンプン粒結合型デンプン合成酵素と同様に、α−１，４グリコシド結合を伸長することによってアミロペクチンの長鎖を伸ばす酵素である。デンプン枝作り酵素（Starch branching enzyme、ＳＢＥ）は、α−１，６結合を作ることによってアミロペクチンの分岐を作る酵素である。デンプン枝切り酵素（Starch debranching enzyme、ＤＢＥ）とは、デンプン枝作り酵素とは逆に、α−１，６グリコシド結合を切断することによってアミロペクチンの分岐を減らす酵素である。
【００２２】
本発明において、米のデンプン合成酵素に関係するプライマーとは、上述したような米のデンプン合成酵素をコードする遺伝子の少なくとも一部に対し高いホモロジーを示し、かつ、試料米ＤＮＡと結合して後述の識別用増幅ＤＮＡの有無を容易に検出させるようなプライマーを意味する。
米のデンプン合成酵素をコードする遺伝子については、文献やデータベース（例えば、T．Babaら：Plant Physiol．103，565-573，1993；Y．Nakamuraら：Starch，54，117-131，2002；H．Francesら：Plant Mol．Biol．，8，407-415，1998；P．B．Franciscoら：Biochim．Biophys．Acta．87，469-477，1998；L．Youら：NCBI ACCESION L36605，1994等）に記載されているものを利用することもできる。
【００２３】
このような米のデンプン合成酵素に関係するプライマーとして、具体的には、ＳＢＥ（配列表の配列番号２４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ３（配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＧＢＳＳ４（配列表の配列番号１３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  ＩＩ（配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＮＳＳ  Ｉ（配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｊ（配列表の配列番号１９に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２２に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＤＢＥ−Ｉ（配列表の配列番号１５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号１７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号１８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、ＮＫ４（配列表の配列番号２６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号２８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、及びＭ１Ａ（配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）が挙げられる。ＳＢＥはデンプン枝作り酵素の部分塩基配列（配列表の配列番号２３参照）に、ＧＢＳＳ３及びＧＢＳＳ４はデンプン粒結合型デンプン合成酵素の部分塩基配列（ＧＢＳＳ３については配列表の配列番号９、ＧＢＳＳ４については配列表の配列番号１２参照）に、ＮＳＳ  ＩＩは可溶性デンプン合成酵素ＩＩの部分塩基配列（配列表の配列番号６参照）に、ＮＳＳ  Ｉは可溶性デンプン合成酵素Ｉの部分塩基配列（配列表の配列番号１参照）に、ＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉはデンプン枝切���酵素の塩基配列に、ＮＫ４及びＭ１Ａはその他のデンプン合成酵素遺伝子に、それぞれ関係するプライマーである。これらのプライマーの設計をどのようにして行ったかについては、実施例１にて後述する。
【００２４】
一方、米のタンパク質組成に関係するプライマーとは、米の主要貯蔵タンパク質であるプロラミンやグルテリン等をコードする遺伝子の少なくとも一部に対し高いホモロジーを示し、かつ、試料米ＤＮＡと結合して後述の識別用増幅ＤＮＡの有無を容易に検出させるようなプライマーを意味する。
米のタンパク質をコードする遺伝子については、文献やデータベース（例えば、L．Youら、NCBI ACCESSION L36605（1994））、S．Shaら、NCBI ACCESSION D63901（2002）、H．Washidaら、Plant Molecular Biology，40，1-12，1999等）に記載されているものを利用することもできる。
米のタンパク質組成に関係するプライマーとして、具体的には、Ｐｒｏ１３（配列表の配列番号４０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐｒｏ１０（配列表の配列番号３５に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３６に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号３７に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３８に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）、Ｐｒｏ１３ＦＮ（配列表の配列番号４２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、及びＧｌｕ（配列表の配列番号４４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのロングプライマーセット、又は、配列表の配列番号４６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのショートプライマーセット）が挙げられる。Ｐｒｏ１３及びＰｒｏ１３ＦＮは分子量１３ｋＤａのプロラミンの塩基配列（配列表の配列番号３９参照）に、Ｐｒｏ１０は分子量１０ｋＤａのプロラミンの塩基配列（配列表の配列番号３４参照）に、Ｇｌｕはグルテリンに、それぞれ関係するプライマーである。これらのプライマーの設計をどのようにして行ったかについては、実施例１にて後述する。
【００２５】
また、本発明においては、上記具体例として示した米のデンプン合成酵素に関係するプライマーや米のタンパク質組成に関係するプライマーの他にも、品種判別用のプライマーとして表１に示すＢ４３（配列表の配列番号４８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、ＷＫ９Ａ（配列表の配列番号５０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｍ１１（配列表の配列番号５３に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｐ５（配列表の配列番号５４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｇ２２（配列表の配列番号５６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｆ６（配列表の配列番号５８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｓ１３Ｆ（配列表の配列番号６０に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号６１に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）、Ｅ３０（配列表の配列番号６２に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号６３に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）及びＪ６（配列表の配列番号６４に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号６５に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）のものを用いることができる。
【００２６】
【表１】
2006042608.tif 000002
【００２７】
本発明において、米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーや、米のタンパク質組成に関係するプライマーを１種類又は２種類以上適宜組み合わせて用いることができ、品種識別用プライマーも適宜組み合わせて用いることができる。特に、アミロース含量、米飯物性等の食味特性は、複数の遺伝子の制御を受ける可能性が高いことから、米のデンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマー及び米のタンパク質組成に関係するプライマーについては２種類以上を組み合わせて用いることが好ましい。尚、本発明において、上記各種のプライマーを複数組み合わせて用いる場合は、それらを混合して１回のＰＣＲで行うこともできるが、識別用増幅ＤＮＡの出現の有無を明確に確認できる点で、各プライマーごとにＰＣＲを行うことが好ましい。
【００２８】
本発明において、実際にどのプライマーを用いるかについては、食味推定の際に参照する食味関連特性によって定められる。すなわち、任意の食味関連特性に正又は負の相関関係を有する識別用増幅ＤＮＡを効率良く増幅させることのできるプライマーを選択して用いる。
例えば、アミロース含量の推定を行う場合には、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＳＳ  ＩＩ、ＮＳＳ  Ｉ、及びＤＢＥの３種類のプライマー、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３及びＧｌｕの２種類のプライマー、並びに、Ｐ５、Ｅ３０、及びＳ１３の３種類のプライマーを組み合わせて用いることができる。
タンパク質含量の推定を行う場合には、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＳＳ  ＩＩ及びＭ１Ａ、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＧｌｕ、品種識別用プライマーとしてＪ６を組み合わせて用いることができる。
米飯物性の推定を行う場合には、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＫ４、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３及びＧｌｕ、並びに、品種識別用プライマーとしてＰ５、Ｂ４３、Ｍ１１及びＧ２２を組み合わせて用いることができる。また、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＤＢＥ−Ｉ、ＮＳＳ  ＩＩ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４及びＳＢＥ、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１０及びＧｌｕを組み合わせて用いることもできる。更に、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＤＢＥ−Ｉ、ＮＳＳ  ＩＩ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４及びＳＢＥを組み合わせて用いることもできる。
精米粉糊化特性のうちコンシステンシーの推定を行う場合には、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＧＢＳＳ４、ＤＢＥ−Ｉ、Ｍ１Ａ、及びＳＢＥ、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３ＦＮ及びＧｌｕ、並びに、品種識別用プライマーとしてＧ２２、Ｓ１３及びＷＫ９Ａを組み合わせて用いることができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡ食味推定方法においては、上記したようなＰＣＲの結果に基づいて米の食味を推定する。
特に、食味関連特性と正或いは負の相関を示す識別用増幅ＤＮＡのＰＣＲによる出現の有無を２値化して変数とし、多変量解析によって食味を推定すると、食味をより精度良く推定することができる点で好ましい。
すなわち、上記ＰＣＲを行った後に、識別用増幅ＤＮＡが出現した場合を１、出現しなかった場合を０として２値化して、これを多変量解析による処理の変数として使用して食味を推定することが好ましい。
【００３０】
食味関連特性とは、米の食味に影響を与える特性を意味し、官能検査や物理化学的測定によって客観的に定められるものが好ましい。具体的には、わが国の消費者の嗜好と比較的相関が高い点で、アミロース含量、タンパク質含量、米飯物性測定値（Ｌ３）及び精米粉糊化特性値（コンシステンシーなど）のいずれかであることが好ましい。識別用増幅ＤＮＡが具体的にどの食味関連特性に対して正又は負の相関を示すかは、用いるプライマーによって異なる。
【００３１】
多変量解析とは、重回帰分析、クラスター分析、主成分分析、非線形回帰分析等を指す。
一般に、回帰分析は、説明したいある１つの変数と、その現象の原因となっていると思われる特性（例えば、食味関連特性）との間に、因果関係があると仮定して表現した数式モデルを用いる分析である。原因を表す変数（本発明の場合、食味関連特性）を説明変数と呼び、食味などの結果を表す変数を目的変数と呼び、説明変数も目的変数も量的変数を用いる。説明変数と目的変数の関係を直線で表す回帰分析を線形回帰といい、曲線で表す場合を非線形回帰という。一般的に、「回帰分析」といえば前者の線形回帰を指し、ＥＸＣＥＬ、ＳＰＳＳといった標準的な統計ソフトウエアでも扱える。
【００３２】
重回帰分析の場合は、まず、ある試料米の食味関連特性を目的変数とし、該試料米について上記ＰＣＲを行いその結果としての識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化したものを説明変数として食味関連特性を目的とする食味推定式を作成する。そして、該食味推定式を利用して、別の試料米（食味関連特性が未知）のＰＣＲの結果としての識別用増幅ＤＮＡの有無を説明変数として上記食味推定式に代入し、食味関連特性の予想値を算出すると共に、食味推定式の適用性を検定する。
具体的に説明すると、以下のとおりである。
【００３３】
まず、食味関連特性を目的とする食味推定式を作成する。食味推定式とは、重回帰式の一種である。その原理を説明すると、例えば、下記式（Ｉ）：
（数１）
ｙ＝ａ×ｘ            ・・・（Ｉ）
〔式（Ｉ）中、ｙは食品物性値、ａは変換係数、ｘは食味関連特性の測定値を表す。〕
で表されるように、食味関連特性の測定値（例えば、糊化測定値）に一定の係数を乗じて食味推定の基準としての食品物性値を得ることを可能とするものである。
また、下記式（ＩＩ）：
（数２）
ｙ＝ａ１×ｘ１＋ａ２×ｘ２−ａ３×ｘ３＋ａ０      ・・・（ＩＩ）
〔式（ＩＩ）中、ｙは食品物性値、ａ１、ａ２及びａ３はそれぞれ変換係数、ａ０は定数項、ｘ１、ｘ２及びｘ３はそれぞれ糊化測定値である。〕
で表されるように、複数の糊化測定値を加減乗除することにより食味推定の基準としての食品物性値を得ることを可能とするものである。
さらに、下記式（ＩＩＩ）：
（数３）
ｙ＝ａ１×ｘ１＋ａ２×ｘ２＋ａ３×ｘ３＋ａ０      ・・・（ＩＩＩ）
〔式（ＩＩＩ）中、ｙは食品物性値、ａ１、ａ２及びａ３は偏回帰係数、ａ０は定数項、ｘ１、ｘ２及びｘ３はそれぞれ糊化特性値である。ａ１、ａ２及びａ３の偏回帰係数は、最小２乗法により、実測値と推定理論値の差の総和を示す残差２乗和を最小にするように決定される数値である。〕
で表されるように、食品物性値を目的変数とし、糊化特性値を説明変数として重回帰分析を行うことにより、食味推定の基準としての食品物性値を、各糊化特性値の線形回帰式として表現することを可能とするものである。
【００３４】
ここで、本発明では、特定のプライマーによるＰＣＲを行った結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無が、実際の食味関連特性（上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の場合は、糊化特性値）と正又は負の相関を示すことに基き、そのようなプライマーに由来する識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化したもの（すなわち、識別用増幅ＤＮＡが出現した場合は１、出現しない場合は０）を、説明変数（ｘ１、ｘ２及びｘ３）とするものである。
従って、食味推定式の作成は、まず、実際の食味関連特性と正又は負の相関を示す特定のプライマーを特定し、次に食味関連特性を実際に予め測定しておいた試料米について、上記各プライマーによるＰＣＲを行って識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を二値化し、最小２乗法により、食味関連特性の実測値と推定理論値（識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を二値化したもの）の差の総和を示す残差２乗和を最小にするようにａ１、ａ２及びａ３の偏回帰係数、及び定数項ａ０を求めて行うことができる。
【００３５】
この食味推定式の有用性は、散布図を作成し、重相関係数を算出したりすることにより判断することができる。
散布図とは、食味試験結果や米飯物性等の食味関連特性（目的変数）を縦軸に、２値化したＰＣＲの結果を食味推定式に当てはめて算出した値を横軸にプロットし、散布図を作成し、散布図中にプロットした点からの距離の２乗和が最小となるように計算した（すなわち、食味推定式を表す）直線（検量線）を記入したものである。検量線とプロットが一致すれば正の相関が高く、図全体にプロットが点在すれば相関が低いということになる。
重相関係数は高いほうが相関が高く、低い方が相関が低いこととなる。
こうして作成した食味推定式を利用して未知試料米（食味特性関連が未知）の食味の推定を行う場合、例えば食味推定式がｙ＝２ｘ＋３であるとすると、ＰＣＲの結果識別用ＤＮＡが出現した場合は、説明変数ｘが１なので、ｙ＝２×１＋３＝５となり、一方、ＰＣＲの結果識別用ＤＮＡが出現しなかった場合は、ＰＣＲ結果が０なので、ｙ＝２×０＋３＝３となる。
【００３６】
一方、クラスター分析とは、前記したＰＣＲによる識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化したものを説明変数として、類似性の高いもの同士をグループ分けする手法である。すなわち、まず、試料米毎にいくつかの変量に対する数値が与えられたデータ表から、まず個体間の類似性を表す距離行列を作成し、この距離行列を基に、最短距離にある試料米あるいはクラスター（群）同士を統合する。統合するたびに距離行列は変化するが、常に最短距離にあるクラスター同士を統合していく。最後に全ての個体は統合されて１つのクラスターにまとめられ、階層を示すツリーが作成される。このようなクラスター分析の理論としては、石原らの理論（石原辰雄ら：Ｌｏｔｕｓ  １−２−３活用多変量解析，共立出版，東京，pp．228-264，1992）を挙げることができる。
【００３７】
また、主成分分析とは、統計的なデータ解析に基づき、対象とする変量群の中から、群全体の特徴を表す典型的な指標、すなわち主成分をある内的基準に基づいて見いだす手法である。この分析により、多くの変量（すなわち、本発明の場合、様々なプライマーを用いた場合のＰＣＲによる識別用増幅ＤＮＡ出現の有無）を集約して少数の代表的な数量にしたり、変量間に存在する関係を明らかにすることができる。
尚、多変量解析の一連の計算は、Ｅｘｃｅｌ２０００の統計ソフトウエア（Ｅｘｃｅｌ多変量解析（エスミ））、ロータス多変量解析ソフト（オードメイン社）、ＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ社）、ＳｔａｔＶｉｅｗ多変量解析（オーエムエス出版）、ＪＵＳＥ−ＳｔａｔＷｏｒｋｓ／Ｖ４．０  ＭＡ多変量解析セレクト（日科技研）等を利用して行うことができる。
【００３８】
本発明において、試料米が籾或いは玄米の場合は、試料籾或いは玄米を短軸方向に半裁し、その胚芽を含まない側の半粒から抽出したＤＮＡを試料米ＤＮＡとして食味を推定することもできる。ここで、短軸方向に半裁とは、籾または玄米の短径方向（背側から腹側へ、または腹側から背側へ）に切断することを意味する。
この場合、胚芽を含む側の半裁種子を播種して次世代稲を育成することにより、半粒良食味米を効率良く選抜することができる。すなわち、米の食味の官能検査結果や物理化学的測定結果の望ましい系統、すなわち多くの試食者に好まれる食味の米系統を選抜することを指す。
播種して次世代植物を育成する際には、次亜塩素酸ソーダ等による表面殺菌と吸水を行った後に培養土等に播種して育てても良いし、胚芽を含む半裁種子を殺菌した後、アミノ酸やミネラル等の栄養成分を含むアルギン酸ソーダやグアーガム等の含水ゲルに置床し、人工気象器を用いて出芽・苗立ちさせた後に移植して栽培しても良い。
次世代植物を育成後、半粒良食味米を選抜するには、交配した雑種後代の種子からＤＮＡを抽出・精製して鋳型とし、前述した本発明の食味推定方法を利用することができる。
【００３９】
玄米半粒、あるいは籾半粒を用いて良食味米の育種・選抜を行うには次のようにする。すなわち、常法に従って約４０℃の温湯に浸漬して除雄した母本に花粉親の花粉を受粉させた後、ポット栽培等で雑種第一代の種子を得る。これらの種子の籾または玄米の胚芽を含む部分と含まない部分とに半裁し、胚芽を含まない側の玄米／籾の半粒を乳鉢ですりつぶし、上述したＣＴＡＢ法等によりＤＮＡを抽出して試料米ＤＮＡとする。
【００４０】
この試料米ＤＮＡを、上述したように各種のプライマー共存下でＰＣＲに供し、その結果に基づいて米の食味を推定し、良食味であると推定された種子を選抜する。
このようにして選抜された種子の胚芽を含む半粒を上記した方法に従って播種、発芽、移植、生育させた後、成熟種子を得ることができる。このようにして得られた雑種第二代の良食味系統を自殖を重ねて固定化し、籾または玄米半粒から良食味米を選抜育成することができる。
【００４１】
一方、上述したＳＢＥ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、ＮＳＳ  ＩＩ、ＮＳＳ  Ｉ、ＤＢＥ−Ｊ、ＤＢＥ−Ｉ、ＮＫ４、Ｍ１Ａ、Ｐｒｏ１３、Ｐｒｏ１０、Ｐｒｏ１３ＦＮ、及びＧｌｕからなる群のうちの１種類、あるいは２種類以上のプライマーは、食味推定以外の用途にも用いることができる。
まず、試料米が日本型米及びインド型米のいずれであるかを識別するために利用することができる。
すなわち、上記のプライマー、特に、Ｇｌｕ、ＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉを用いて、試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、日本型米とインド型米とを識別することができる。
【００４２】
また、上述のプライマーのうち、Ｐｒｏ１３は、コシヒカリなどの良食味米と朝の光や月の光といった低食味米との識別のために用いることができる。すなわち、Ｐｒｏ１３を用い、良食味米と低食味米の各試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡのうち良食味米と低食味米とで相違する塩基配列部分から良食味米及び低食味米の識別用プライマー（セット）を設計し、該プライマーを用いて未知試料米の試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、良食味米と低食味米とを識別することができる。このような良食味米及び低食味米の識別用プライマー（セット）としては、実施例１１に示すように、良食味米であるコシヒカリと朝の光や月の光その他の低食味米とを識別するためのＰｒｏ１３Ｋｏｓｈｉを挙げることができる。
【００４３】
更にまた、上述のプライマーのうち、Ｍ１Ａは、こがねもちなどの粘りの強い米ときらら３９７のような粘りの弱い米との識別のために用いることができる。すなわち、Ｍ１Ａを用い、粘りの強い米と粘りの弱いの各試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡのうち粘りの強い米と粘りの弱い米とで相違する塩基配列部分から粘りの強い米及び粘りの弱い米の識別用プライマー（セット）を設計し、該プライマーを用いて未知試料米の試料米ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、粘りの強い米と粘りの弱い米とを識別することができる。このような粘りの強い米及び粘りの弱い米の識別用プライマー（セット）としては、実施例１２に示すように、粘りの強い米であるこがねもちときらら３９７のような粘りの弱い米とを識別するためのＭ１ＡＫｏｇａｎｅを挙げることができる。
【００４４】
以下、本発明の実施例を示して本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
本実施例においては、識別用増幅ＤＮＡをもたらすプライマーについて検討を加えた。すなわち、米の食味関連特性と関係の期待される識別用増幅ＤＮＡを増幅するプライマーの開発を行った。
（１）米試料の品種
米試料は、日本型（ジャポニカ）米（温帯ジャポニカ、熱帯ジャポニカ）、インド型（インディカ）米、及び日印交雑種のそれぞれを数品種ずつ用いた。
温帯ジャポニカとしては、台中６５号、スイートライス（Sweet Rice）、滋賀羽二重糯、こがねもち、はくちょうもち、ヒノヒカリ、ひとめぼれ、コシヒカリ、あきたこまち、きらら３９７、初星、ヤマヒカリ、アキニシキ、むつほまれ、フジヒカリ、チヨニシキ、金南風、日本晴、Ilpum、カルモチ（Calmochi）１０１、中粒米（Medium grain）、長粒米（Long grain）、Forbidden Rice、ペルデ（Pelde）、カイーマ（Kyeema）、ドーンガラ（Doongara）、パエリア（Paellea rice）、イラボン（Illabong）、国宝ローズ、田牧米、バッカー（Vaccah）、カルリソ（Calriso）、朝の光、ＬＧＣ−１、ニホンマサリ、月の光及び一品を用いた。
熱帯ジャポニカとしては、エリオ（Elio）、カルナロリ（Carnaroli）、及びアルボリオ（Arborio）を用いた。
インド型米としては、ＥＭ２００３、ジャスミンライス（Jasmin Rice）、カリジラ（Kalijira）、テキサマティ（Texmati）、マスリ（Masuri）、タムソアン（Tamxoan）、バスマティ（Basmati）、カサラス、ＷＡＢ９６、ＷＩＴＡ７、ＷＩＴＡ２３９、南京１１号、ＩＲ３６、ＩＲ２０６１−２１４、ＲＤ２１、ＲＤ２３、ルアンプラトー及び黒米（forbidden rice）を用いた。
日印交雑種としては、夢十色、ホシユタカ、サリークイーン（Salyee queen）、ＪＩＦ２５、ＪＩＦ３０、ＪＩＦ４１、及びＪＩＦ４２を用いた。
尚、日印交雑種のうち、夢十色及びカサラスは、インディカ亜種（インド型米に極めて近い特性を示す日印交雑種）として分類されることもある。
【００４６】
（２）ＤＮＡの調製方法（ＣＴＡＢ法）
前記（１）で示した各品種の精米を、粉砕器（イワタニ製ミルサーＩＦＭ−１００、東京）によって粉砕して得た精米粉末試料０．４ｇから、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出・精製した。
すなわち、ＤＮＡを精米粉末試料０．４ｇ（２ｍｌ容の微量遠心チューブ）に対して２×ＣＴＡＢ液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、２０ｍＭ  エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  トリスヒドロキシルアミノメタン／塩酸緩衝液（トリス緩衝液、ｐＨ８．０））０．６ｍｌに、滅菌水０．２ｍｌを加えた水溶液を加え、６５℃で３０分間抽出した。同液に等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ、ＣＩ）を加え、ローテーター（タイテック製TAITEC RT-50、東京）によって１５分間、緩やかに攪拌した。次いで冷却遠心機（日立製、日立himac CR21F）によって８０００ｇ、１５分間遠心分離し、上層を新しい微量遠心チューブに移した。これに１０％ＣＴＡＢ液０．０８ｍｌと０．８ｍｌのＣＩを加え、ローテーターで１５分間緩やかに攪拌した後に、８０００ｇで１５分間遠心分離し、上層を新しいチューブに移した。この液に２．５倍容の沈殿用緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＣＴＡＢ）を加え、−８０℃で５分間静置し、沈殿を生成させた。沈殿を８０００ｇで１５分間の遠心分離で回収し、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むトリス・ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）０．５ｍｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールを添加した。転倒混和した後、８０００ｇで１５分間遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿を０．２ｍｌのＴＥに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ（ニッポンジーン社製、牛膵臓ＲＮＡｓｅ  Ａ、１０ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え、５５℃で１時間ＲＮＡ分解を行った。
【００４７】
処理後、等量の中性フェノールを加えて精製し、８０００ｇで１５分間遠心分離を行い、上層を新しいチューブに移した。これに等量のフェノール／クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）を加え、８０００ｇで１５分間遠心分離を行い、上層を新しいチューブに移した。これに０．２ＭのＮａＣｌと２倍容の氷冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノール５０μｌで洗浄した後、３０μｌの１０倍希釈ＴＥで溶解し、鋳型ＤＮＡとした。
尚、外国産米で試料が極めて少ないものについては本発明者らの酵素法（大坪ら：特許第３０４８１４９号公報参照）によりＤＮＡを調製した。
【００４８】
（３）プライマーの設計
米の主要な食味要因であるとされる澱粉やタンパク質の量や質に関係すると見られるプライマー、すなわち、澱粉合成酵素に関係するプライマー、及びタンパク質組成に関係するプライマーの設計を試みた。
【００４９】
まず、澱粉合成酵素に関係するプライマーとして、具体的には、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、ＮＳＳ  Ｉ、ＮＳＳ  ＩＩ、ＤＢＥ−Ｊ、ＤＢＥ−Ｉ、ＮＫ４、Ｍ１Ａ、及びＳＢＥを以下のようにして設計した。ここで、ＧＢＳＳ３及びＧＢＳＳ４はデンプン粒結合型デンプン合成酵素遺伝子（ＧＢＳＳ）、ＮＳＳ  Ｉ及びＮＳＳ  ＩＩは可溶性デンプン合成酵素遺伝子（ＮＳＳ）、ＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉはデンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）、ＳＢＥはデンプン枝作り酵素遺伝子（ＳＢＥ）にそれぞれ関係するプライマーである。
ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、及びＮＳＳ  ＩＩは、T．Babaらの文献（Plant Physiol．，103，565-573，1993）及びH．Francesらの文献（Plant Mol．Biol．，8，407-415，1998）に記載された澱粉合成酵素遺伝子の塩基配列内を、数個のブロックに分け、各ブロック毎にプライマーを設計し、各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果、増幅ＤＮＡに品種間差異の見いだされた塩基部分から設計したプライマーである。
【００５０】
一方、ＮＳＳ  Ｉ、ＮＫ４、Ｍ１Ａ及びＳＢＥは、品種判別用に当研究室で開発したＳＴＳプライマーであり、開発後に澱粉合成酵素との関係が示唆されたプライマーである。尚、ＳＢＥの開発及びデンプン枝作り酵素との関係については、実施例１３において詳しく述べる。
【００５１】
更に、ＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉは、下記のようにして設計した。
すなわち、P．B．Franciscoらの報告したデンプン枝切り酵素（Biochim．Biophys．Acta，87，469-477，1998）の１５２４１ｂｐからなる領域を６個のブロックに分け、各ブロックごとにプライマーを設計し、各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果、増幅ＤＮＡに品種間差異の認められた部分を見いだした。次いでこの品種間差異の認められた部分、すなわち、識別性の高い領域（P．B．Franciscoらの報告した澱粉枝切り酵素（Biochim．Biophys．Acta，87，469-477，1998）の１２２０４ｂｐ〜１２６９０ｂｐに相当する部分）内の変異を明らかにするため、朝の光、カサラス、こがねもち、コシヒカリ及び夢十色の５品種の試料米ＤＮＡを鋳型として当該識別性の高い領域を特異的に増幅するＰＣＲを行った。クローニングを各試料米ごとに５クローンずつ行って、品種内での一塩基置換ではない部分で塩基配列を決定し、日本型米であるこがねもち及びコシヒカリ、インド型米であるカサラス、インディカ亜種である夢十色、並びに温帯ジャポニカである朝の光の双方に対し特徴的に相違する塩基配列部分で二次プライマーを設計した。
図１に、デンプン枝切り酵素遺伝子のうち識別性の高い領域における日本型米とインド型米の塩基配列の相違を示す。図１中の（Ａ）は、調節遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、（Ｂ）は、構造遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、ａは、ＤＢＥ−Ｊのプライマー部分を、ｂはＤＢＥ−Ｉのプライマー部分を示す。
【００５２】
次に、タンパク質組成に関係するプライマーとして、具体的には、Ｐｒｏ１３、Ｐｒｏ１０、Ｐｒｏ１３ＦＮ、及びＧｌｕを以下のようにして設計した。Ｇｌｕはグルテリンに、Ｐｒｏ１３及びＰｒｏ１３ＦＮは分子量１３ｋＤａのプロラミンに、Ｐｒｏ１０は分子量１０ｋＤａのプロラミンに、それぞれ関係するプライマーである。
Ｐｒｏ１０は、L．Youらの報告するプロラミンの遺伝子（NCBI ACCESSION L36605（1994））のうち３６ｂｐ〜４８８ｂｐからなる領域から設計したプライマーである。
また、Ｐｒｏ１３及びＰｒｏ１３ＦＮは、S．Shaらの文献（NCBI ACCESSION D63901（2002））に記載された米貯蔵タンパク質の遺伝子のうち、それぞれ塩基配列７６１ｂｐ〜１１３０ｂｐの部分及び３４１ｂｐ〜１１３０ｂｐの領域から設計したプライマーである。
【００５３】
一方、Ｇｌｕは、下記のようにして設計した。
すなわち、H．Washidaらの報告するグルテリン遺伝子（Plant Molecular Biology，40，1-12，1999）の調節遺伝子内Ｍ７を構成する塩基配列（tgcaaagt）から構造遺伝子までの６２０ｂｐを一次プライマーとし、朝の光、ＩＲ２０６１−２１４、カサラス、コシヒカリ、ＬＧＣ−１、ニホンマサリ、月の光、ＷＩＴＡ  ７及び夢十色の９種類の試料米のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。得られるＰＣＲ産物について、上記ＤＢＥの場合と同様に、クローニングを各試料米ごとに５クローン行って、品種内での一塩基置換ではない部分で塩基配列を決定し、日本型米であるコシヒカリ、インド型米であるＩＲ２０６１−２１４及びカサラス、インディカ亜種であるＷＩＴＡ  ７及び夢十色、並びに温帯ジャポニカである朝の光、ＬＧＣ−１、ニホンマサリ、及び月の光の双方に対し特徴的に相違する部分の調節遺伝子部分と構造遺伝子部分にかけての領域から、プライマーを設計した。
図２に、グルテリン遺伝子のうち識別性の高い領域における日本型米とインド型米の塩基配列の相違を示す。図２中の（Ａ）は、調節遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、（Ｂ）は、構造遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示す。
尚、上記設計したプライマーにおいて、ロングプライマーセットとショートプライマーセットとの２種類があるものについては、以下の実施例において、Ｐｒｏ１０についてロングプライマーセットを用いた他は、特に断らない限りショートプライマーセットを用いた。
【００５４】
更に、本発明者らの報告（大坪  研一ら：食科工，50，122-132，2003）で使用された品種識別用プライマーの内の一部についても、上記のプライマーと組み合わせることができるかどうかを検討するために選択した。具体的には、Ｇ２２、Ｂ４３、Ｊ６、ＷＫ９Ａ、Ｍ１１、Ｆ６、Ｐ５、Ｅ３０、及びＳ１３である。これらの品種識別性については、先述の表１に示した通りである。
【００５５】
（４）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅と多型の検出
前記（３）で設計されたプライマーを用いて、一方、前記（２）で抽出・調製された試料米ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
すなわち、まず、鋳型ＤＮＡ４００ｎｇ／１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、Taq polymerase、５Ｕ／μｌ、大津）０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ  トリス塩酸、６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．０μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌの混合液に５ｐｍｏｌｅ／μｌのＳＴＳ化対合プライマー０．１〜０．６μｌを加え、滅菌水によって総液量を２０μｌとした。各プライマーのＰＣＲ条件はプライマーによって異なるが、サーマルサイクラー（タカラバイオ製ＭＰ、大津）を用いて、９６℃で１分間変性、５０〜７２℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長というサイクルを３５回繰り返した。
【００５６】
増幅ＤＮＡを含む反応液１５μｌに、ローディング緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、グリセリン３０％、ブロモフェノールブルー０．２５％、滅菌水６９．５％）３μｌを加え、２％アガロースゲル（ニッポンジーン製、Agarose S）にチャージし、電気泳動装置（コスモバイオ製ミューピッド、東京）を用いて直流電圧１００Ｖで３０分間泳動し、エチジウムブロミド（５００ｎｇ／ｍｌ）で１時間染色後、紫外線照射してＤＮＡバンドパターンを撮影した。ＤＮＡ分子量マーカーは、Ｍａｒｋｅｒ  ４（和光純薬製、φＸ１７４ファージＨａｅＩＩＩ）を使用した。
【００５７】
（５）増幅ＤＮＡの切り出し、精製と塩基配列の決定
ＰＣＲ後の電気泳動を行った２％SeaKem GTG agaroseから目的バンドを紫外線照射下で切り出し、３倍容のヨウ化ナトリウムによってＤＮＡを溶出した後、ガラスビーズ吸着法（タカラバイオ製、EasyTrap ver．2、大津）によりＤＮＡを回収した。そのＤＮＡをトポクローニングキット（インビトロジェン製、TOPO XL Cloning Kit）を用いてライゲーションし、大腸菌に組み込んで３７℃で１８時間培養し、アルカリミニプレップ法（キアゲン製QIAprep Spin Miniprep kitを使用）によってＤＮＡを抽出・精製した。
そのＤＮＡをシークエンシング用キット（Applied Biosystems製、big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit、V1-1）を用いて増幅し、自動シークエンサー（Applied Biosystems製370）によって塩基配列を決定した。
【００５８】
（６）ＳＴＳ化プライマーによる各品種のＰＣＲ結果
各品種の精米試料から調製した鋳型ＤＮＡを用い、各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を表２および図３〜図８に示す。図３〜図８中、レーンＮｏ．１〜３９は、１：ＥＭ２００３、２：スイートライス、３：滋賀羽二重糯、４：ひとめぼれ、５：コシヒカリ、６：日本晴、７：イラボン、８：国宝ローズ、９：田牧米、１０：バッカー、１１：エリオ、１２：カルナロリ、１３：カルリソ、１４：アルボリオ、１５：ジャスミンライス、１６：カリジラ、１７：テキサマティ、１８：マスリ、１９：タムソアン、２０：バスマティ、２１：夢十色、２２：ホシユタカ、２３：サリークイーン、２４：台中６５号、２５：こがねもち、２６：ヒノヒカリ、２７：あきたこまち、２８：きらら３９７、２９：一品、３０：カルモチ１０１、３１：中粒米、３２：黒米、３３：ペルデ、３４：カイーマ、３５：パエリア、３６：長粒米、３７：ドーンガラ、３８：南京１１号、３９：ＩＲ２０６１−２１４の各試料米品種を示す。また、ａ〜ｕは、それぞれａ：ＤＢＥ−Ｉ、ｂ：Ｇｌｕ、ｃ：ＳＢＥ、ｄ：ＮＳＳ  ＩＩ、ｅ：Ｐｒｏ１０、ｆ：Ｐ５、ｇ：ＮＳＳ  Ｉ、ｈ：ＧＢＳＳ４、ｉ：Ｐｒｏ１３ＦＮ、ｊ：Ｊ６、ｋ：Ｍ１Ａ、ｌ：ＧＢＳＳ３、ｍ：ＮＫ４、ｎ：Ｐｒｏ１３、ｏ：ＷＫ９Ａ、ｐ：Ｂ４３、ｑ：Ｍ１１、ｒ：Ｇ２２、ｓ：Ｆ６、ｔ：Ｅ３０、ｕ：Ｓ１３の各プライマーを示す。更に、矢印は、ａ〜ｕの各プライマーに由来する識別用増幅ＤＮＡの出現部位を示す。
【００５９】
【表２】
2006042608.tif 000003
【００６０】
【表３】
2006042608.tif 000004
【００６１】
表２及び図３〜図８から明らかなように、各プライマーにより、品種間で識別用増幅ＤＮＡの有無を明確に観察できることが明らかとなった。
尚、上記図３〜図８のレーンＮｏ．１〜２４の試料米は検量線作成に、Ｎｏ．２５〜３９の試料米は未知試料として、後述の適用性検定に使用した。
【実施例２】
【００６２】
上述したように、図３〜図８に示された３９種類の試料米を利用して、実施例１で設計したプライマーと、試料米の食味関連特性との相関関係の存在の確認を行った。
（１）アミロース含量およびタンパク質含量の測定
試料米を試験用籾摺り機（サタケ製、ＴＨＵ−３５Ａ、東広島）によって籾摺りし、試験用精米器（ケット化学研究所製パーレスト、東京）で歩留まり９０％に精白して精米を得た。この精米を、サイクロンサンプルミル（Ｕｄｙ製）によって粉砕して試料とした。フリアーノのヨード比色法（B．O．Juliano：Cereal Sci．Today，16，334-340，360，1971）に従って測定した。検量線はポテトアミロース（シグマ社製、Potato amylose III）と米アミロペクチン（脱脂除タンパクしたもち米粉末）を４０／６０、３０／７０、２０／８０、１０／９０、及び０／１００の各割合に混合して作成した。試料粉末のタンパク質含量は燃焼法（ＬＥＣＯ  ＦＰ−５２８型  窒素分析装置）によって全窒素含量を求め、米における窒素タンパク質換算係数５．９５を乗じてタンパク質含量とした。
【００６３】
（２）米飯の調製と物性測定
前記（１）で得た精米を、湿度７０％において水分含量１４．５％±０．５％に調整した。これらの精米試料各１０ｇを外径６．０ｃｍ、底径４．２ｃｍ、高さ５．５ｃｍのプリンカップに秤取し、純水１６ｍｌを加え、２５℃で１時間吸水させた。その後、電気炊飯器（東芝製ＲＣ１８３、東京）に５個並べ、釜に７５ｍｌの純粋を加え、２０分間炊飯した。スイッチが切れた後、１５分間蒸らし、蓋を開けて米飯試料をプリンカップからガラスシャーレに移し、プラスティック袋に密閉して２５℃で２時間静置した。その各３０粒を１粒ずつ、テンシプレッサー（タケトモ電機製、マイボーイ、東京）を用いて岡留らの方法（岡留博司ら：食科工，45，398-407，1998）により物性を測定した。測定項目は、圧縮率２５％による米飯表層部の付着量（Ｌ３）である。
【００６４】
（３）精米粉の調製と米粉糊化特性の測定
前記（１）で得られた精米を、イワタニ製ミルサーによって粉砕し、精米粉を調製した。
この精米粉３．０ｇ（乾物あたり）に２５ｍｌの純水を加え、豊島らの方法（豊島  英親ら：食科工，44，579-584，1997）によりラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ、ニューポートサイエンティフィック社製、Warriewood）で糊化特性を測定した。
すなわち、５０℃で１分間攪拌した後、４分間で５０℃から９３℃まで昇温し、９３℃で７分間攪拌を続けた後、９３℃から５０℃まで４分間で降温し、５０℃で３分間攪拌を続けた後の粘度を採択した。測定項目はコンシステンシー（最終粘度と最低粘度の差）である。
【００６５】
（４）成分測定及び物理特性測定の結果
ヨード比色法で測定したアミロース含量、燃焼法で測定したタンパク質含量、テンシプレッサーによって測定した米飯物性測定値、およびＲＶＡによって測定した精米粉糊化特性値の測定結果を表４に示す。また各プライマーによるＰＣＲ結果と、アミロース含量、タンパク質含量、米飯物性測定値（Ｌ３）、及び精米粉糊化特性値のそれぞれとの相関を表５に示す。
【００６６】
【表４】
2006042608.tif 000005
【００６７】
【表５】
2006042608.tif 000006
【００６８】
この結果、アミロース含量に対して１％有意の相関があったプライマーは、ＮＳＳ  Ｉ、Ｍ１Ａ、Ｐ５、ＤＢＥ−Ｉ、Ｆ６、及びＰｒｏ１０で、デンプン合成酵素遺伝子に関係するプライマーが４個含まれていた。タンパク質含量に対して１％有意または５％有意の相関があったプライマーは、Ｇｌｕ、ＤＢＥ−Ｉ、ＮＳＳ  Ｉ、Ｍ１Ａ、ＮＫ４、Ｍ１１、Ｐ５、及びＪ６で、タンパク質由来のプライマーはＧｌｕのみであった。米飯物性測定値（Ｌ３）に対して１％有意の相関があったプライマーは、ＤＢＥ−Ｉ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ１３、Ｐｒｏ１０、ＮＳＳ  Ｉ、Ｍ１Ａ、ＮＫ４、Ｍ１１、Ｐ５、Ｊ６で相関係数の高い複数要因のプライマーが見出された。精米粉糊化特性値に対して１％有意又は５％有意の相関があったプライマーは、ＮＳＳ  Ｉ、Ｍ１Ａ、ＮＫ４、Ｍ１１、Ｐ５、Ｊ６、ＤＢＥ−Ｉ、Ｇｌｕ、及びＰｒｏ１０で、ＧＢＳＳ由来のプライマーが５個含まれていた。
【実施例３】
【００６９】
ＰＣＲによる識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を２値化して変数とし、これを多変量解析に適用するにあたり用いる食味推定式を作成した。
実施例１にて、品種判別用プライマーであるＦ６、Ｓ１３、Ｅ３０、Ｊ６、Ｂ４３、及びＷＫ９Ａの６種類を用いて行ったＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡの出現の有無を二値化したものを説明変数とし、実施例２で得た米飯物性測定値（表層の付着量であるＬ３）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式（１）が得られた。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
重相関係数Ｒは０．５６であった。
【００７０】
（数４）
Y = 0.85 + 0.34×F6 - 0.50×S13 + 0.11×E30 + 0.52×J6 - 0.30×B43 + 0.11×WK9A
・・・（１）
【００７１】
実施例１にて、デンプン合成酵素に関連するプライマーであるＤＢＥ−Ｉ、ＮＳＳ  Ｉ、ＮＳＳ  ＩＩ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、及びＳＢＥの６種類を用いて行ったＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡの出現の有無を二値化したものを説明変数とし、実施例２で行った米飯物性測定値（表層の付着量であるＬ３）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式（２）が得られた。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
重相関係数Ｒは０．６８であった。
【００７２】
（数５）
Y = 0.85 - 0.32×DBE-I + 0.23×NSSI - 0.29×NSSII - 0.32×GBSS3 + 0.50×GBSS4 + 0.46×SBE
・・・（２）
【００７３】
実施例１にて、デンプン合成酵素に関連するプライマーであるＤＢＥ−Ｉ、ＮＳＳＩＩ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、及びＳＢＥの５種類、並びにタンパク質組成関連のプライマーであるＧｌｕ−ＩとＰｒｏ１０の２種類、合計７種類のプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡの出現の有無を二値化したものを説明変数とし、実施例２で行った米飯物性測定値（表層の付着量であるＬ３）を目的変数として重回帰分析を行った結果、下記の食味推定式（３）が得られた。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
重相関係数Ｒは０．７５であった。
【００７４】
（数６）
Y = 1.13 + 0.25×Glu-I + 0.47×Pro10 - 0.38×DBE−I - 0.49×NSSII - 0.68×GBSS3 + 0.40×GBSS4 + 0.35×SBE
・・・（３）
【００７５】
これらの分析の結果、通常の品種判別用のプライマーによるＰＣＲの結果を用いて重回帰分析を行った場合よりも、澱粉合成酵素に関連するプライマーによるＰＣＲの結果を用いて重回帰分析を行った方が高い重相関係数が得られ、さらに、澱粉合成酵素に関連するプライマーによるＰＣＲの結果およびタンパク質組成に関連するプライマーによるＰＣＲの結果を合わせて使用した重回帰分析の方が、さらに高い重相関係数が得られることが明らかとなった。
【実施例４】
【００７６】
実施例１で設計した各種プライマーを用いて米試料ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、試料米がインド型（インディカ）米と日本型（ジャポニカ）米との識別ができるかどうかの確認を行った。
試料米は、図９に示すとおりである。すなわち、日本型米として、こがねもち、滋賀羽二重糯、はくちょうもち、コシヒカリ、ひとめぼれ、日本晴、初星、ヤマヒカリ、アキニシキ、むつほまれ、きらら３９７、アルボリオ、台中６５号、バッカー、国宝ローズ、エリオ、カルリソ、フジヒカリ、及びチヨニシキを用いた。また、インド型米として、カオドクマリ、カリジラ、ＥＭ２０６１、バスマティ、Ｃ７０、ＩＲ２０６１、ＩＲ３６、夢十色、ＪＩＦ４１、ＪＩＦ４２、テキサマティ、タムソアン、カサラス及びＷＩＴＡ７を用いた。
米試料としての上記インド型米及び日本型米の精米から、前記実施例１（２）と同様の手順で鋳型ＤＮＡを調製し、澱粉合成酵素に関連するプライマーであるＤＢＥ−Ｉ、ＤＢＥ−Ｊ及びＮＳＳ  ＩＩを用いて、実施例１（３）と同様の手順でＰＣＲを行った。図９に、インディカ用（Ａ）ＤＢＥ−Ｉ、及びジャポニカ用（Ｂ）ＤＢＥ−Ｊを用いたＰＣＲの結果を示す。図９（Ａ）中、１〜２９は、それぞれ、１：エリオ、２：カルナロリ、３：アルボリオ、４：カオドクマリ、５：カリジラ、６：ＥＭ２０６１、７：バスマティ、８：Ｃ７０、９：ＩＲ２０６１、１０：ＩＲ３６、１１：こがねもち、１２：はくちょうもち、１３：滋賀羽二重糯、１４：コシヒカリ、１５：ひとめぼれ、１６：あきたこまち、１７：日本晴、１８：金南風、１９：夢十色、２０：イラボン、２１：国宝ローズ、２２：ＪＩＦ２５、２３：ＪＩＦ３０、２４：ＪＩＦ４１、２５：ＪＩＦ４２、２６：テキサマティ ２７：タムソアン、２８：カサラス、２９：ＷＩＴＡ７、３０：ＷＩＴＡ２３９を示し、ＭはＤＮＡ分子量マーカー（和光純薬工業、Ｍａｒｋｅｒ４）を示す。一方、図９（Ｂ）中、１：こがねもち、２：滋賀羽二重糯、３：はくちょうもち、４：コシヒカリ、５：ひとめぼれ、６：日本晴、７：初星、８：ヤマヒカリ、９：アキニシキ、１０：むつほまれ、１１：きらら３９７、１２：カオドクマリ、１３：テキサマティ、１４：マスリ、１５：カリジラ、１６：タムソアン、１７：バスマティ、１８：ＲＤ２１、１９：夢十色、２０：カサラス、２１：ＲＤ２３、２２：アルボリオ、２３：台中６５号、２４：Ｃ７０、２５：バッカー、２６：国宝ローズ、２７：エリオ、２８：カルリソ、２９：ＷＩＴＡ７、３１：ルアンプラトー、３２：フジヒカリ、３３：チヨニシキを示し、ＭはＤＮＡ分子量マーカー（和光純薬工業  Ｍａｒｋｅｒ４）を示す。
図９に示すように、澱粉枝切り酵素ＤＢＥ（pullulanase）に関連するプライマーＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉを用いたＰＣＲによって、インド型米と日本型米を識別することが可能であることが明らかとなった。一方、配列番号７および配列番号８に示すＮＳＳ  ＩＩに関係するプライマーを用いたＰＣＲでは、図９に示すような普遍的な識別を行うことが不可能であった。
このことから、澱粉合成酵素に関連するプライマーとしてＤＢＥ−Ｊ及びＤＢＥ−Ｉを用いたＰＣＲを行うことにより、インド型米と日本型米を識別することが可能であることが証明された。
【００７７】
一般に、日本型米は粘りが強く、インド型米は粘りが弱くパサパサした食感がある。これは、主にアミロース含量の相違によるものと考えられるが、アミロペクチンのクラスター構造の変異も影響すると考えられ、日本型米はＤＰ値（重合度）１０以下の短鎖が多く、ＤＰ値１２〜２１のものは少ない。この構造は疎水性に影響し、澱粉が糊化しやすいという日本型米の特徴の要因と考えられ、ＳＳＳＩＩａ遺伝子の相違が起因すると言われている（Y.Nakamuraら：Starch，54，117-131，2002）。
本発明者らは、九州大育成の変異米ＥＭ７５（sug2、pullulanase減少変異体）と、ＥＭ７５の原品種である金南風とを試料米として、日本型米に特徴的に出現するＤＢＥ−Ｊを用いてＰＣＲを行った結果、ＥＭ７５の場合は、原品種の金南風に比べて明らかな相違が確認された。
また、プライマーＤＢＥ−ＪおよびＤＢＥ−ＩによるＰＣＲの結果、図９に示すように明瞭にインド型米と日本型米が識別されたという結果は、従来報告されているＳＳＳＩＩａ以外にも日本型米とインド型米の相違をもたらしている要因があり、本発明者らの開発したプライマーＤＢＥ−ＪおよびＤＢＥ−Ｉは、pullulanaseに関係している可能性が強い。
【００７８】
また、グルテリンの構造遺伝子内のタンパク質変異を図２に示す。図２に示すように、インド型米と日本型米では、貯蔵タンパク質グルテリンに変異部分があることが示された。構造遺伝子内（図２の（Ｂ））においても、明らかに、インド型米と日本型米とで異なっている部分が数カ所見いだされた。これらの調節遺伝子部分の相違点及び構造遺伝子部分の相違点の配列に基づいて設計したプライマーＧｌｕを用いて、３９種類の試料米（図３〜図８）でＰＣＲを行った結果、日本型米とインド型米をそれぞれ共通的にほぼ識別ができることが示された。
【実施例５】
【００７９】
以下の実施例５〜８においては、実施例１で設計された各種プライマーを用いたＰＣＲの結果を２値化した数値を説明変数とし、一方、食味を表す数値として、わが国の消費者の嗜好と比較的相関の高いアミロース含量、タンパク質含量、米飯物性値（Ｌ３）及び精米粉糊化特性値（コンシステンシー）を選択し、これらのそれぞれを目的変数とした重回帰解析を行い、試料米の食味推定に対する適用性を検討した。
【００８０】
まず、実施例５においては、アミロース含量の推定を行った。
前記の表２に示すプライマーのうち、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＳＳ  ＩＩ、ＮＳＳ  Ｉ、及びＤＢＥ−Ｉの３種類のプライマー、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３及びＧｌｕの２種類のプライマー、並びに、Ｐ５、Ｅ３０、及びＳ１３の３種類のプライマーについて、それぞれの組み合わせによる２４種類の試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果得られる識別用増幅ＤＮＡバンドの出現の有無を２値化した。すなわち、前記実施例３で述べた方法によってバンドが出現した場合を１、出現しなかった場合を０とした。
上記２値化したものを説明変数とし、アミロース含量を目的変数として変数増減法による重回帰分析を行った。統計処理には、Ｅｘｃｅｌ２０００の統計ソフトウエアを使用した。その結果、下記のアミロース含量を目的とする食味推定式（４）を得た。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
この重回帰式の重相関係数（Ｒ）は、０．９２であった。散布図を図１０（Ａ）ａに示す。
【００８１】
（数７）
Y = 29.73−1.50×S13−0.65×DBE-I−15.1×Glu＋4.71×NSSI＋9.46×NSSII−5.96×P5−8.47×E30−7.44×Pro13                                          ・・・（４）
【００８２】
この重回帰分析に基づくアミロース含量を目的とする食味推定式（４）の、未知試料米に対する適用性を検定した。
すなわち、表４に示す１５種類の未知試料米のアミロース含量に対して式（４）を適用した。その結果、重相関係数は０．７２であった。また、この場合の散布図を図１０（Ａ）ｂに示した。
このことから、アミロース含量を目的とする食味推定式（４）により、試料米のアミロース含量を推定できることが分かる。また、推定式（４）ＳＴＳ化プライマーのうちにはＮＳＳ  ＩＩ、ＮＳＳ  Ｉ、及びＤＢＥ−Ｉといったデンプン合成酵素に関連するプライマーが含まれていることは当然と考えられるが、Ｇｌｕ及びＰｒｏ１３といったタンパク質に関連するプライマーも含まれているので、タンパク質組成が日本型米、インド型米等の種類によって異なっている可能性をも示している。
【実施例６】
【００８３】
デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＳＳ  ＩＩ及びＭ１Ａ、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＧｌｕ、品種識別用プライマーとしてＪ６を用いたこと、及び、食味を表す数値としてタンパク質含量を選択したこと以外は、実施例５と同様に行い、下記のタンパク質含量を目的とする食味推定式（５）を得た。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
この重回帰式の重相関係数（Ｒ）は、０．８１であった。散布図を図１０（Ｂ）ａに示す。
【００８４】
（数８）
Y = 7.80−0.53×M1A−1.65×Glu＋0.44×NSSII＋0.39×J6              ・・・（５）
【００８５】
この重回帰分析に基づくタンパク質含量を目的とする食味推定式（５）の、未知試料米に対する適用性を検定した。すなわち、表４に示す１３種類の未知試料米のタンパク質含量に対して式（５）を適用した。その結果、重相関係数は０．６２であった。この場合の散布図を図１０（Ｂ）ｂに示す。
一般に、タンパク質含量の場合は品種特性のみならず、水田の窒素含量や施肥条件も影響するので、タンパク質含量を目的とする食味推定式（５）による解析を行うと共に、上記環境条件を考慮することにより、試料米のタンパク質含量をより正確に推定できることが分かる。
【実施例７】
【００８６】
デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＮＫ４、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３及びＧｌｕ、並びに、品種識別用プライマーとしてＧ２２、Ｂ４３、Ｍ１１、及びＰ５を用いたこと、及び、食味を表す数値として米飯物性測定値を選択したこと以外は、実施例５と同様に行い、下記の米飯物性を目的とする食味推定式（６）を得た。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
この重回帰式の重相関係数（Ｒ）は０．９３であった。散布図を図１０（Ｃ）ａに示す。
【００８７】
（数９）
Y = 0.063＋0.0359×NK4＋0.475×Glu＋0.246×P5＋0.0201×B43＋0.124×M11−0.0848×G22＋0.549×Pro13                                                  ・・・（６）
【００８８】
この重回帰分析に基づく米飯物性を目的とする食味推定式（６）の、未知試料に対する適用性を検定するために、表４に示す１５種類の未知試料米の米飯物性測定値（Ｌ３）に対して式（６）を適用した。その結果、重相関係数は０．８２であった。この場合の散布図を図１０（Ｃ）ｂに示す。
このことから、米飯物性を目的とする食味推定式（６）により、試料米の米飯物性を推定できることが分かる。また、推定式（６）ＳＴＳ化プライマーのうちにはデンプン合成酵素に関連するプライマー、タンパク質に関連するプライマー及び品種識別用プライマーのいずれもが含まれていることから、米飯物性には様々な要因が関係していることがわかった。
【実施例８】
【００８９】
デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＧＢＳＳ４、ＤＢＥ−Ｉ、Ｍ１Ａ、及びＳＢＥ、米のタンパク質組成に関係するプライマーとしてＰｒｏ１３ＦＮ及びＧｌｕ、並びに、品種識別用プライマーとしてＧ２２、ＷＫ９Ａ及びＳ１３を用いたこと、及び、食味を表す数値として精米粉糊化特性のうちコンシステンシーを選択したこと以外は、実施例５と同様に行い、下記のコンシステンシーを目的とする食味推定式（７）を得た。尚、下記式中のプライマー名は、対応するプライマーによるＰＣＲの結果の識別用増幅ＤＮＡ出現の有無を意味する説明変数である。
この重回帰式の重相関係数は０．８４であった。散布図を図１０（Ｄ）ａに示す。
【００９０】
（数１０）
Y = 142−30.2×Glu−11.1×M1A−43×SBE＋18.1×DBE-I＋11.4×G22＋61×S13＋44.2×GBSS4−39.7×Pro13FN＋17.6×WK9A                                    ・・・（７）
【００９１】
この重回帰分析に基づくコンシステンシーを目的とする食味推定式（７）の、未知試料に対する適用性を検定するために、表４に示す１４種類の未知試料米のコンシステンシーに対して式（７）を適用した。その結果、重相関係数は０．７２であった。この場合の散布図を図１０（Ｄ）ｂに示す。
このことから、コンシステンシーを目的とする食味推定式（７）により、試料米のコンシステンシーを推定できることが分かる。また、推定式（７）ＳＴＳ化プライマーのうちにはデンプン合成酵素に関連するプライマー、タンパク質に関連するプライマー及び品種識別用プライマーのいずれもが含まれていることから、米飯粉糊化特性には様々な要因が関係していることが分かった。
【実施例９】
【００９２】
実施例１で設計された各種プライマーを用いたＰＣＲの結果を２値化した数値を説明変数としたクラスター解析を行い、試料米の食味推定に対する適用性を検討した。
すなわち、前記の表２に示すプライマーのうち、デンプン合成酵素に関係するプライマーとしてＭ１１、Ｐ５、Ｇ２２、Ｆ６、Ｓ１３、Ｅ３０、Ｊ６、Ｂ４３、ＷＫ９Ａ、ＤＢＥ−Ｉ、ＤＢＥ−Ｊ、Ｇｌｕ−Ｊ、Ｇｌｕ−Ｉ、Ｐｒｏ１３ＦＮ、Ｐｒｏ１３、Ｐｒｏ１０、ＮＳＳＩ、ＮＳＳＩＩ、ＧＢＳＳ３、ＧＢＳＳ４、Ｍ１Ａ、ＳＢＥ、及びＮＫ４の２３種類のプライマーについて、それぞれの組み合わせによる広範な世界の米２３種類（図６参照）の試料米ＤＮＡを鋳型として行うＰＣＲの結果得られる識別用増幅ＤＮＡバンドの出現の有無を２値化した。すなわち、前記実施例３で述べた方法によってバンドが出現した場合を１、出現しなかった場合を０とした。
上記２値化したものを説明変数とし、クラスター分析を行った。解析結果を図１１に示す。尚、統計解析ソフトはオードメイン社のロータス１−２−３利用の多変量解析を使用し、解析理論は石原らの理論（石原辰雄ら：Lotus 1-2-3活用多変量解析，共立出版，東京，pp．228-264，1992）によった。
図１１から、クラスター分析の結果、インディカ、熱帯ジャポニカ、及び温帯ジャポニカがグループ化され、これは従来の分類とよく一致していた。このことから、クラスター分析によりインディカ米とジャポニカ米の識別が可能となることができることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００９３】
次に、試料米が玄米半粒の場合の半粒良食味米の選抜技術の適用性について検討した。
コシヒカリを母本とし、ハツシモを花粉親とし、コシヒカリを温湯除雄してハツシモを交配し、次世代稲から籾を得た。この雑種第一代の籾を、育苗培土を入れたマグナムポットに播種し、人工気象室（タバイエスペック社製ＴＧＨ−６）において自殖栽培し、雑種第二代の種子を得た。これらの種子を籾摺りした玄米粒を胚芽を含む側と胚芽を含まない側とに半裁し、胚芽を含まない側を半粒ずつ乳鉢で粉砕し、実施例１と同様にＣＴＡＢ法でＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲは実施例１と同様に行った。
ＰＣＲのバンドパターンに基づいて、実施例７の米飯物性を目的とする食味推定式（６）に適用して米飯物性（Ｌ３）の推定値を算出した。これらの胚芽を含む半粒を、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した後、下記の表６に示す組成の培地に置床し、３０℃で７日間発芽させた。
【００９４】
【表６】
2006042608.tif 000007
【００９５】
発芽半粒種子を人工気象器（日本医科器械製作所製バイオトロンＮＣ３５０）に移し、２８℃（光照射）１０時間、２８℃（暗）１４時間のサイクルで培養し、幼苗を緑化させた。次いで、幼苗を前述の培地を含むアグリポットに移植し、７日間生育させた後、育苗培土に移植し、人工気象室で２週間生育させた。
これらの苗を、埴土をいれたマグナムポットに移植し、前述の人工気象室で４ヶ月間栽培し、出穂させた。さらに４０日間成熟させた後に穂を刈り取り、脱穀、籾摺りを行い、各玄米を試験用精米機で精米した。これを、電気釜で炊飯し、４名のパネリストによって食味の官能検査を行った。この米飯物性推定値および官能検査結果を、表７に示す。
米飯物性推定値の判定は、Ｌ３推定値が１．２以上のものを○、１．４以上のものを◎、１．２未満のものを空白として表７に示した。また、ＤＮＡ推定と官能検査の一致度の判定は、官能検査とＤＮＡから推定したＬ３が良く一致しているものを○、中間程度のものを△（試料米Ｎｏ．４はＬ３推定値が１．１５と小さく、軟らかい点は合っていないが、腰がない点はあっている。Ｎｏ．２４は、Ｌ３が１．４と大きく、軟らかい点は合っているが、粘りが少ない点が合っていない。）、一致していないものを×として表７に示した。
【００９６】
【表７】
2006042608.tif 000008
【００９７】
表７に示すように、供試した２８点の交配種子のうち、２０点で米飯物性の推定結果と官能検査結果とが良く一致した。この結果、交配種子を半裁し、胚芽を含まない玄米あるいは籾の半粒からＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲによる米飯物性の推定を行い、胚芽を含む半粒を発芽させて良食味米を選抜することが可能であることが示された。
【実施例１１】
【００９８】
実施例１で開発したプライマーＰｒｏ１３を用い、鋳型として、日本型米の良食味米であるコシヒカリと低食味米である朝の光及び月の光の３品種のＤＮＡを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡをアガロースゲルから切り出してクローニングし、それらの塩基配列を決定した。各品種の増幅ＤＮＡの塩基配列を図１２に示す。
図１２から明らかなように、コシヒカリの増幅ＤＮＡのうち３６４番目から３８６番目の塩基配列部分（図１２の下線部分：tgttggtgaagggcgaattctgc）が、コシヒカリと他の２種類の米とで異なっていることが明らかとなった。この配列部分に基づいてプライマーＰｒｏ１３Ｋｏｓｈｉ（配列表の配列番号６６に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６７に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）を作成し、再度ＰＣＲを行った結果、コシヒカリと朝の光や月の光とをＰＣＲによって明瞭に識別できることが判った。
【実施例１２】
【００９９】
実施例１で開発したプライマーＭ１Ａを用い、鋳型として、粘りの強いこがねもちと、粘りの弱いきらら３９７のＤＮＡを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡをアガロースゲルから切り出してクローニングし、塩基配列を決定した。各品種の増幅ＤＮＡの塩基配列を図１３（フォワード側）と図１４（リバース側）に示す。
図１３及び図１４から明らかなように、こがねもちの増幅ＤＮＡのうちフォワード側の２２番目から４６番目の部分（図１３の下線部分）及びリバース側の２２番目から５１番目の塩基配列部分からプライマーＭ１ＡＫｏｇａｎｅ（配列表の配列番号６８に示される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６９に示される塩基配列からなるリバースプライマーのセット）を作成し、再度ＰＣＲを行った結果、粘りの強いこがねもちと粘りの弱いきらら３９７とをＰＣＲによって明瞭に識別することが可能となった。
【実施例１３】
【０１００】
実施例１で開発したプライマーＳＢＥを用い、鋳型として、日本型米である日本晴のＤＮＡを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡをアガロースゲルから切り出してクローニングし、塩基配列を決定した。その塩基配列を、国立遺伝研究所のデータベース（ＤＤＢＪ）によってホモロジー検索した。ＳＢＥにより増幅したＤＮＡとＤＤＢＪのデンプン枝作り酵素の塩基配列部分との比較を図１５に示す。
図１５から明らかなとおり、増幅したＤＮＡ（図１５の下段）は、ＤＤＢＪのデンプン枝作り酵素の一部（図１５の上段）と高い相同性を示すことが明らかとなった。このことから、ＳＢＥはデンプン枝作り酵素と関係するプライマーであることが明らかとなった。
【実施例１４】
【０１０１】
実施例１で開発したプライマーＳＢＥ、ＮＳＳ  Ｉ、ＧＢＳＳ４、ＮＳＳ  ＩＩ、Ｐｒｏ１０及びＰｒｏ１３ＦＮ、ＮＫ４、Ｍ１Ａ、ＧＢＳＳ３及びＰｒｏ１３を用い、鋳型として、実施例１で用いた各品種の試料米ＤＮＡの一部を用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行った結果を図１６及び図１７に示す。図１６及び図１７中、レーンＮｏ．１〜２４、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ、ｍ、ｋ、ｌ、及びｎについては、図３〜図８と同様である。更に、矢印は、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、ｍ、ｋ、ｌ、及びｎの各プライマーに由来する識別用増幅ＤＮＡの出現部位を示す。
図１６及び図１７から明らかなように、各プライマーにより、食味特性の異なる各品種間の米を明瞭に識別できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、ＤＮＡを用いて育種選抜の初期段階から試料米の食味を精度良く推定することが可能となる。
特に、試料米がごく少量であっても食味を推定することが可能となるので、官能検査や物理化学的測定などの従来の食味判別技術で必要とされてきた試料の量についての問題を解決することができる。
特に、試料米が籾あるいは玄米半粒やそれ以下であっても適用可能であるので、胚芽を含まない側の半裁種子について食味推定を行って良食味系統を選抜し、胚芽を含む側の半裁種子を播種して効率良く次世代稲を育成することが可能となり、育種の分野における有用性が期待される。
本発明により、米の食味関連要因に対し正又は負の相関関係を示す識別用増幅ＤＮＡを効率良く出現させることのできるプライマー・セットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】デンプン枝切り酵素遺伝子のうち識別性の高い領域における日本型米とインド型米の塩基配列の相違を示す。
【図２】グルテリン遺伝子のうち識別性の高い領域における日本型米とインド型米の塩基配列の相違を示す。
【図３】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図４】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図５】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図６】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図７】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図８】各種のＳＴＳ化プライマー単独あるいは複数のＳＴＳ化プライマーを組み合わせて反応液に共存させてＰＣＲを行った結果を示す。
【図９】インディカ用（Ａ）ＤＢＥ−Ｉ、及びジャポニカ用（Ｂ）ＤＢＥ−Ｊを用いたＰＣＲの結果を示す。〜を示す。
【図１０】実施例５〜実施例８で得られた散布図を示す。
【図１１】クラスター分析の結果を示す。
【図１２】Ｐｒｏ１３を用いて、コシヒカリと朝の光及び月の光の３品種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合の結果を示す。
【図１３】Ｍ１Ａを用いて、こがねもちときらら３９７ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合の結果（フォワード側）を示す。
【図１４】Ｍ１Ａを用いて、こがねもちときらら３９７ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合の結果（リバース側）を示す。
【図１５】ＳＢＥにより増幅したＤＮＡとＤＤＢＪのデンプン枝作り酵素の塩基配列部分との比較を示す。
【図１６】各種のプライマーを用いて品種識別のためのＰＣＲを行った結果を示す。
【図１７】各種のプライマーを用いて品種識別のためのＰＣＲを行った結果を示す。
【符号の説明】
【０１０４】
図１中の（Ａ）は、調節遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、（Ｂ）は、構造遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、ａは、ＤＢＥ−Ｊのプライマー部分を、ｂはＤＢＥ−Ｉのプライマー部分を示す。
図２中の（Ａ）は、調節遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示し、（Ｂ）は、構造遺伝子内の識別性の高い領域における相違を示す。
図３〜図８、図１６及び図１７中、レーンＮｏ．１〜３９（但し、図１５及び図１６では、レーンＮｏ．１〜２４）は、１：ＥＭ２００３、２：スイートライス、３：滋賀羽二重糯、４：ひとめぼれ、５：コシヒカリ、６：日本晴、７：イラボン、８：国宝ローズ、９：田牧米、１０：バッカー、１１：エリオ、１２：カルナロリ、１３：カルリソ、１４：アルボリオ、１５：ジャスミンライス、１６：カリジラ、１７：テキサマティ、１８：マスリ、１９：タムソアン、２０：バスマティ、２１：夢十色、２２：ホシユタカ、２３：サリークイーン、２４：台中６５号、２５：こがねもち、２６：ヒノヒカリ、２７：あきたこまち、２８：きらら３９７、２９：一品、３０：カルモチ１０１、３１：中粒米、３２：黒米、３３：ペルデ、３４：カイーマ、３５：パエリア、３６：長粒米、３７：ドーンガラ、３８：南京１１号、３９：ＩＲ２０６１−２１４の各試料米品種を示す。また、ａ〜ｕ（ただし、図１５及び図１６では、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ、ｍ、ｋ、ｌ、及びｎ）は、それぞれａ：ＤＢＥ−Ｉ、ｂ：Ｇｌｕ、ｃ：ＳＢＥ、ｄ：ＮＳＳ  ＩＩ、ｅ：Ｐｒｏ１０、ｆ：Ｐ５、ｇ：ＮＳＳ  Ｉ、ｈ：ＧＢＳＳ４、ｉ：Ｐｒｏ１３ＦＮ、ｊ：Ｊ６、ｋ：Ｍ１Ａ、ｌ：ＧＢＳＳ３、ｍ：ＮＫ４、ｎ：Ｐｒｏ１３、ｏ：ＷＫ９Ａ、ｐ：Ｂ４３、ｑ：Ｍ１１、ｒ：Ｇ２２、ｓ：Ｆ６、ｔ：Ｅ３０、ｕ：Ｓ１３の各プライマーを示す。また、矢印は、ａ〜ｕ（但し、図１５及び図１６では、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ、ｍ、ｋ、ｌ、及びｎ）の各プライマーに由来する識別用増幅ＤＮＡの出現部位を示す。
図９（Ａ）中、１〜２９は、それぞれ、１：エリオ、２：カルナロリ、３：アルボリオ、４：カオドクマリ、５：カリジラ、６：ＥＭ２０６１、７：バスマティ、８：Ｃ７０、９：ＩＲ２０６１、１０：ＩＲ３６、１１：こがねもち、１２：はくちょうもち、１３：滋賀羽二重糯、１４：コシヒカリ、１５：ひとめぼれ、１６：あきたこまち、１７：日本晴、１８：金南風、１９：夢十色、２０：イラボン、２１：国宝ローズ、２２：ＪＩＦ２５、２３：ＪＩＦ３０、２４：ＪＩＦ４１、２５：ＪＩＦ４２、２６：テキサマティ ２７：タムソアン、２８：カサラス、２９：ＷＩＴＡ７、３０：ＷＩＴＡ２３９を示し、ＭはＤＮＡ分子量マーカー（和光純薬工業  Ｍａｒｋｅｒ４）を示す。一方、図９（Ｂ）中、１：こがねもち、２：滋賀羽二重糯、３：はくちょうもち、４：コシヒカリ、５：ひとめぼれ、６：日本晴、７：初星、８：ヤマヒカリ、９：アキニシキ、１０：むつほまれ、１１：きらら３９７、１２：カオドクマリ、１３：テキサマティ、１４：マスリ、１５：カリジラ、１６：タムソアン、１７：バスマティ、１８：ＲＤ２１、１９：夢十色、２０：カサラス、２１：ＲＤ２３、２２：アルボリオ、２３：台中６５号、２４：Ｃ７０、２５：バッカー、２６：国宝ローズ、２７：エリオ、２８：カルリソ、２９：ＷＩＴＡ７、３１：ルアンプラトー、３２：フジヒカリ、３３：チヨニシキを示し、ＭはＤＮＡ分子量マーカー（和光純薬工業  Ｍａｒｋｅｒ４）を示す。
図１０において、（Ａ）〜（Ｄ）の各行は、それぞれ実施例５、実施例６、実施例７及び実施例８の結果を示す。また、ａ及びｂの各列は、それぞれの実施例における、検量線作成用の各品種の試料米を用いて作成した散布図、及び未知試料米から作成した散布図を示す。
図１２において、下線部分は、良食味米と低食味米との配列の相違部分を示す。
図１３及び図１４において、下線部分は、粘りの強い米と粘りの弱い米との配列の相違部分を示し、四角で囲った部分は共通部分を示す。
図１５において、上段はＤＤＢＪのデンプン枝作り酵素の塩基配列部分を、下段はＳＢＥにより増幅したＤＮＡの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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