(57)【要約】      （修正有）【課題】異なるＤＮＡ集団間で一方にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片を検出するための新規方法を提供する。【解決手段】ＨＳＲＤＡ（High Speed Representational difference analysis）法は、二本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる段階において、二本鎖ＤＮＡの変性の段階とアニーリングの段階を繰り返すことにより、従来法では相補鎖を形成できずに反応後除去されていた一本鎖ＤＮＡを再度結合させ、これにより、最終二本鎖ＤＮＡの合成効率を著しく高め、しかも、短時間で一連の工程を完了させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの異なるＤＮＡ集団において、一方の集団をテスターとし、他方の集団をドライバーとした場合に、ドライバー中には存在しないがテスター中に存在するＤＮＡ断片を取得する方法であって、
（ａ）両集団に含まれるＤＮＡを同一の方法で断片化して、テスター中に存在するテスターＤＮＡ断片およびドライバー中に存在するドライバーＤＮＡ断片を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたテスターＤＮＡ断片の両端を５’末端が脱リン酸化された平滑末端にし、工程（ａ）で得られたドライバーＤＮＡ断片の両端を５’末端がリン酸化された状態にする工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたテスターＤＮＡ断片を、工程（ｂ）で得られた過剰量のドライバーＤＮＡ断片と混合する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物中の二本鎖ＤＮＡが完全に一本鎖に変性する温度でインキュベートし、混合物中の相補的なＤＮＡ鎖同士がアニーリングするのに十分な温度まで該混合物の温度を低下させ、低下させた温度で該混合物をインキュベートする段階を繰り返し行う工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物を、５’末端にリン酸を持つ一本鎖ＤＮＡを特異的に分解する第１のＤＮＡ分解酵素および一本鎖ＤＮＡを特異的に分解する第２のＤＮＡ分解酵素の混合物で処理する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）で得られた分解酵素処理後のＤＮＡ混合物中に存在する前記第１のＤＮＡ分解酵素および第２のＤＮＡ分解酵素を失活させる工程、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）の断片化を制限酵素による完全消化によって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）が、片側が平滑末端であって該平滑末端になる側の５’末端を脱リン酸化した二重鎖ＤＮＡであるアダプターを、連結後に平滑末端が末端になるように前記工程（ａ）で得られたテスターＤＮＡ断片に連結させる段階を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプターを連結させたテスターＤＮＡ断片のアダプター領域にアニールすることができ、かつ、５’末端がリン酸化されていないプライマーを用いて、該アダプターを連結させたテスターＤＮＡ断片をさらにＰＣＲ増幅することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）が、連結後に両末端になる側の５’末端をリン酸化したアダプターを、前記工程（ａ）で得られたドライバーＤＮＡ断片に連結させる段階を含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アダプターを連結させたドライバーＤＮＡ断片のアダプター領域にアニールすることができ、かつ、５’末端がリン酸化されているプライマーを用いて、該アダプターを連結させたドライバーＤＮＡ断片をさらにＰＣＲ増幅することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｄ）における繰り返しの数が、２〜４０回である請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｄ）において、前記混合物中の二本鎖ＤＮＡが完全に一本鎖に変性する温度が９０〜９５℃で、インキュベート時間が１〜２分間であり、低下させた温度が５０〜７０℃、インキュベート時間が２〜５分間である、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１のＤＮＡ分解酵素が、λエキソヌクレアーゼであり、前記第２のＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレーゼＩである、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
（ｇ）前記工程（ｆ）で得られたＤＮＡ集団に、前記工程（ｂ）で得られた過剰量のドライバーＤＮＡ断片をさらに加え、前記工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）を繰り返し行う工程を、さらに、含んで成る請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｇ）における繰り返しの数が１〜１０回である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法により得られたＤＮＡ断片を、該ＤＮＡ断片の両端領域に相補的なプライマーを用いてさらにＰＣＲ増幅する請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法により取得されたＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なるＤＮＡ集団の一方にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異なる生物ゲノムを比較すると、その構成において少なからず相違が見出され、２つのゲノムが完全に同一であるということは、かなり希なことである。例えば、生物の免疫システムにおける多様性を維持するために、イムノグロブリン遺伝子座は様々に再編成を行い、結果的に、個体間においてイムノグロブリン遺伝子座は大きく異なるものとなっている。また、癌などの疾患を発症している個体と正常な個体間において、癌組織と対応する正常組織中のゲノム構成を比較した場合には、癌組織由来のゲノムには、特定の遺伝子領域に欠失、挿入などが確認される場合が多い。さらには、表現型には現れていなくても、２つのゲノム集団を比較した場合に何らかの相違が見出される場合が多く、このような相違は、将来的に発症が予想される疾患の診断を行う上で重要な手掛かりになることも少なくない。
このように、２つのＤＮＡ集団を比較した場合に、一方のＤＮＡ集団に存在する特定のＤＮＡ配列領域における欠失、挿入、変異などを検出することは、疾患の診断、未知の病原体の検出、あるいは、特定の多型マーカーの単離を行う上で重要となってくる。
【０００３】
従来、二種類の生物ゲノムから一方に特異的なＤＮＡ断片を回収する方法として、差引きハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、ＲＤＡ法などが知られている。
ＲＤＡ法は、比較するゲノムＤＮＡの相違を検出するためのサブトラクション効率を上げるために、ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎと呼ばれる工程と、ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔと呼ばれる工程とから構成される。ゲノムＤＮＡ間でサブトラクションを行う場合には、ゲノムの複雑度（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を減少させると効率よく行うことができる。ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎとは、比較的短いＤＮＡ断片（０．１〜１．５ｋｂ）がＰＣＲによって優先的に増幅されることを利用し、ゲノムの複雑度を下げる方法である。ＲＤＡ法は、この工程でゲノムの複雑度を減少させた後、調べる対象であるＤＮＡ集団に由来する少量のＤＮＡ断片と、比較するＤＮＡ集団に由来する過剰のＤＮＡ断片の間でハイブリダイゼーションを行わせ、アダプター付加等を行い、特異的な配列を有するＤＮＡ断片を選択的に濃縮する方法である（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。さらに、ＲＤＡ法の変法もいくつか報告されている（非特許文献３、特許文献３）。
【０００４】
これまでに知られているＲＤＡ法およびその変法において、相補的な配列を持つ二本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、一般に二種類の一本鎖ＤＮＡを混合し、９０〜９５℃で一本鎖ＤＮＡを一度変性させ徐々に冷却させることにより行われてきた。また、これまでは、いかに多くの量の二本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることができるかという点に重点が置かれ、一度ハイブリダイゼーションさせた後に再度変性させるような処理は行わないのが一般的であった。そのため、一度で多量の一本鎖ＤＮＡが必要になり、二本鎖ＤＮＡの合成効率は非常に低いものとなっていた。また、アニーリング過程の他、ＰＣＲによる増幅工程が数回含まれているため、全行程を終了するまでに長時間を要していた。
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９４６−９５１，１９９３
【非特許文献２】Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２５４：２９１−３０４，１９９５
【非特許文献３】ＨｕｂａｎｋおよびＳｃｈａｔｚ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：５６４０−５６４８，１９９４
【特許文献１】米国特許第５，４３６，１４２号
【特許文献２】米国特許第５，５０１，９６４号
【特許文献３】米国特許第５，９５８，７３８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑み、異なるＤＮＡ集団の一方にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片をより効率よく検出する方法について鋭意研究を行った結果、一本鎖ＤＮＡの効率の良いアニーリング過程を実現させることに成功し、本発明に至った。
本発明は、異なるＤＮＡ集団の一方にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片を検出する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）本発明における第１の実施態様は、「二つの異なるＤＮＡ集団において、一方の集団をテスターとし、他方の集団をドライバーとした場合に、ドライバー中には存在しないがテスター中に存在するＤＮＡ断片を取得する方法であって、
（ａ）両集団に含まれるＤＮＡを同一の方法で断片化して、テスター中に存在するテスターＤＮＡ断片およびドライバー中に存在するドライバーＤＮＡ断片を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたテスターＤＮＡ断片の両端を５’末端が脱リン酸化された平滑末端にし、工程（ａ）で得られたドライバーＤＮＡ断片の両端を５’末端がリン酸化された状態にする工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたテスターＤＮＡ断片を、工程（ｂ）で得られた過剰量のドライバーＤＮＡ断片と混合する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物中の二本鎖ＤＮＡが完全に一本鎖に変性する温度でインキュベートし、混合物中の相補的なＤＮＡ鎖同士がアニーリングするのに十分な温度まで該混合物の温度を低下させ、低下させた温度で該混合物をインキュベートする段階を繰り返し行う工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物を、５’末端にリン酸を持つ一本鎖ＤＮＡを特異的に分解する第１のＤＮＡ分解酵素および一本鎖ＤＮＡを特異的に分解する第２のＤＮＡ分解酵素の混合物で処理する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）で得られた分解酵素処理後のＤＮＡ混合物中に存在する前記第１のＤＮＡ分解酵素および第２のＤＮＡ分解酵素を失活させる工程、
を含んで成る方法。」である。
（２）本発明における第２の実施態様は、「前記工程（ａ）の断片化を制限酵素による完全消化によって行うことを特徴とする上記（１）に記載の方法。」である。
（３）本発明における第３の実施態様は、「前記工程（ｂ）が、片側が平滑末端であって該平滑末端になる側の５’末端を脱リン酸化した二重鎖ＤＮＡであるアダプターを、連結後に平滑末端が末端になるように前記工程（ａ）で得られたテスターＤＮＡ断片に連結させる段階を含むことを特徴とする上記（１）または（２）に記載の方法。」である。
（４）本発明における第４の実施態様は、「前記アダプターを連結させたテスターＤＮＡ断片のアダプター領域にアニールすることができ、かつ、５’末端がリン酸化されていないプライマーを用いて、該アダプターを連結させたテスターＤＮＡ断片をさらにＰＣＲ増幅することを特徴とする上記（３）に記載の方法。」である。
（５）本発明における第５の実施態様は、「前記工程（ｂ）が、連結後に両末端になる側の５’末端をリン酸化したアダプターを、前記工程（ａ）で得られたドライバーＤＮＡ断片に連結させる段階を含むことを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。」である。
（６）本発明における第６の実施態様は、「前記アダプターを連結させたドライバーＤＮＡ断片のアダプター領域にアニールすることができ、かつ、５’末端がリン酸化されているプライマーを用いて、該アダプターを連結させたドライバーＤＮＡ断片をさらにＰＣＲ増幅することを特徴とする上記（５）に記載の方法。」である。
（７）本発明における第７の実施態様は、「前記工程（ｄ）における繰り返しの数が、２〜４０回である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。」である。
（８）本発明における第８の実施態様は、「前記工程（ｄ）において、前記混合物中の二本鎖ＤＮＡが完全に一本鎖に変性する温度が９０〜９５℃で、インキュベート時間が１〜２分間であり、低下させた温度が５０〜７０℃、インキュベート時間が２〜５分間である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の方法。」である。
（９）本発明における第９の実施態様は、「前記第１のＤＮＡ分解酵素が、λエキソヌクレアーゼであり、前記第２のＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレーゼＩである、上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の方法。」である。
（１０）本発明における第１０の実施態様は、「（ｇ）前記工程（ｆ）で得られたＤＮＡ集団に、前記工程（ｂ）で得られた過剰量のドライバーＤＮＡ断片をさらに加え、前記工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）を繰り返し行う工程を、さらに、含んで成る上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の方法。」である。
（１１）本発明における第１１の実施態様は、「前記工程（ｇ）における繰り返しの数が１〜１０回である上記（１０）に記載の方法。」である。
（１２）本発明における第１２の実施態様は、「上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の方法により得られたＤＮＡ断片を、該ＤＮＡ断片の両端領域に相補的なプライマーを用いてさらにＰＣＲ増幅する上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の方法。」である。
（１３）本発明における第１３の実施態様は、「上記（１）ないし（１２）に記載のいずれかの方法により取得されたＤＮＡ断片。」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る方法を用いることにより、異なるＤＮＡ集団間において一方にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片を、非常に効率よく、しかも従来法に比べて（例えば、一晩程度の時間を要する）、短時間（２〜３時間程度）で合成することが可能となる。
さらに、エキソヌクレアーゼカクテル（５’末端にリン酸をもつ一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼおよび一本鎖ＤＮＡ特異的なヌクレアーゼの混合物）による不要なＤＮＡ断片を除去する段階を組合わせることで、ＰＣＲ増幅の過程における偽増幅物の除去を簡便に行うことができる。
さらにまた、λエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＩの混合物を使用すると、一度で酵素反応が行えるうえに熱による失活のみで次のステップに進めるため、従来の二種類のエキソヌクレアーゼを使用した場合に必要であったＤＮＡ断片の精製が不要となり、従来法で要していた時間（およそ３時間程度）を短縮する（およそ１時間程度）ことが可能となる。
また、本発明に係る方法を用いることで、目的のＤＮＡ断片を効率よく迅速に調製することができるため、ＤＮＡマイクロアレイの作成および人工ＤＮＡ断片の作成の効率化も期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明により、二つの異なるＤＮＡ集団を比較した場合、一方の集団にのみ特異的に存在するＤＮＡ断片（「特異的ＤＮＡ断片」と称する）を、効率的かつ迅速に取得する方法が提供される。この方法は、従来技術であるＲＤＡ法およびその変法と目的は同じであるが、これらの技術と比較するとその効率および迅速性において顕著にすぐれた技術である（ＨＳＲＤＡ法；High Speed Representational difference analysis）。ＨＳＲＤＡ法の概略を図１に示す。
本発明において使用されるバッファー等は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの誘導体の処理を行うために適するものであれば、いかなるものを使用してもよい。詳細については、Sambrookら, Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY. 1989などの基本書を参照のこと。
１．ＤＮＡ集団の調製
本発明に係る「ＤＮＡ集団」とは、異なる核酸配列からなるＤＮＡの集まりのことである。「ＤＮＡ集団」には、あらゆる起源のＤＮＡ集団が含まれてよく、限定はしないが、例えば、正常細胞のゲノム、感染細胞のゲノム、がん細胞のゲノム、病的状態にある細胞のゲノム、特定の状態に分化した細胞のゲノムなどが含まれる。また、前記ゲノムの代わりにｃＤＮＡであってもよい。「ＤＮＡ集団」の起源には、あらゆる生物が含まれ、限定はしないが、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、大腸菌、枯草菌などの原核細胞などが含まれる。さらに、ウィルスも含まれる。また、「ＤＮＡ集団」の起源には、自然界由来のもの以外にも、人工的にランダムに合成したＤＮＡ配列集団も含まれる。
「テスター」とは、例えば、特定の状態、例えば、病的な状態または感染状態にある細胞集団に由来するＤＮＡ集団のことであり、「ドライバー」とは、「テスター」中の「特異的ＤＮＡ断片」を特定する上で、対照となるＤＮＡ集団のことである。例えば、「テスター」が感染細胞由来である場合には、「ドライバー」は、同じ細胞型の非感染細胞由来のものが選択される。
ＤＮＡの「断片化」は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、限定はしないが、例えば、制限酵素による方法、化学的な方法、機械的な方法などが利用可能である。また、制限酵素以外の方法で断片化した場合には、得られた断片の両端の形状を揃えるために、ヌクレアーゼ処理などをさらに行ってもよい。
特定の細胞集団からＤＮＡを抽出する方法は当該技術のおける公知技術に基づいて実施することができる。例えば、特定の細胞集団（株化細胞を含む）または組織（例えば、動物、植物などの組織）を適切な方法によって処理し、細胞を破砕し、その後、核を調製し、タンパク質分解酵素処理あるいは有機溶媒による抽出などを行うなどしてＤＮＡを含む核酸画分を抽出することができる。その後、ＤＮＡ以外のＲＮＡを酵素処理などし、フェノール・クロロフォルム処理などをして、目的のＤＮＡ集団を調製することができる。また、ｃＤＮＡ集団については、定法に従ってｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製することができる。詳細については、Sambrookら, Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY. 1989などの基本書を参照のこと。
【００１０】
２．「テスター」および「ドライバー」ＤＮＡ断片の調製
本発明に係る方法においては、「テスター」ＤＮＡ断片の両端を５’末端が脱リン酸化された状態にし、「ドライバー」ＤＮＡ断片の両端を５’末端がリン酸化された状態にする。
本発明の「テスター」ＤＮＡ断片は、適切な「アダプター」を連結させることによっても調製することができる。この「アダプター」は、当該技術分野における通常の知識により把握されるものが含まれる。つまり、「テスター」由来のＤＮＡ断片の末端に結合するのに相応しい形態を有しているものであれば、いかなるものでもよく、例えば、制限酵素処理によって得られたＤＮＡ集団に適用される「アダプター」の場合には、用いた制限酵素の切断部位と結合可能な末端形状を有しているものであればどのようなものでもよい。「アダプター」の末端は粘着末端でも、平滑末端でもよいが、好ましくは、ＤＮＡ断片と連結される側の末端は、粘着末端であり、ＤＮＡ断片と連結されない側の末端は平滑末端である。さらに、「アダプター」のＤＮＡ断片と連結されない側の末端における、５’末端を有するＤＮＡ鎖端は脱リン酸化されている。
本発明の「ドライバー」ＤＮＡ断片は、適切な「アダプター」を連結させることによっても調製することができる。この「アダプター」は、当該技術分野における通常の知識により把握されるものが含まれる。つまり、「ドライバー」由来のＤＮＡ断片の末端に結合するのに相応しい形態を有しているものであれば、いかなるものでもよく、例えば、制限酵素処理によって得られたＤＮＡ集団に適用される「アダプター」の場合には、用いた制限酵素の切断部位と結合可能な末端形状を有しているものであればどのようなものでもよい。「アダプター」の末端は粘着末端でも、平滑末端でもよいが、好ましくは、ＤＮＡ断片と連結される側の末端は、粘着末端である。さらに、「アダプター」のＤＮＡ断片と連結されない側の末端における、５’末端を有するＤＮＡ鎖端はリン酸化されている。
「アダプター」は、二本鎖ＤＮＡであり、その一本鎖部分にアニールすることができる一本鎖ＤＮＡは、「アダプター」が両端に連結されている「テスター」または「ドライバー」ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のための「プライマー」として使用することができる。「プラマ−」は、「テスター」ＤＮＡ断片の増幅のためには５’末端がリン酸化されていないものを用い、「ドライバー」ＤＮＡ断片の増幅のためには５’末端がリン酸化されているものを用いる。
本発明においては、テスターＤＮＡ断片の５’末端が脱リン酸化された状態に調製することにより、末端にリン酸を持つＤＮＡを特異的に分解するＤＮＡ分解酵素（以下、本明細書中において第１のＤＮＡ分解酵素と称する）および一本鎖ＤＮＡを特異的に分解するＤＮＡ分解酵素（以下、本明細書中において第２のＤＮＡ分解酵素と称する）によるＤＮＡ消化から、試料ＤＮＡ断片を保護することができる。即ち、本発明のテスターＤＮＡ断片に連結される「アダプター」は、テスターＤＮＡ断片と連結されない側（連結後末端となる側）の５’末端にリン酸が付加されていないため、第１のＤＮＡ分解酵素による分解を受けることがなく、その結果、一本鎖ＤＮＡ領域が露出することがないので、第２のＤＮＡ分解酵素による分解を受けることもない。一方、ドライバーＤＮＡ断片に連結される「アダプター」のＤＮＡ断片と連結されない側（連結後末端となる側）の５’末端はリン酸化されていることから、ドライバーＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片は第１のＤＮＡ分解酵素および／または第２のＤＮＡ分解酵素によって分解され、最終的には全て消化される。さらに、テスターにも、ドライバーにも含まれるＤＮＡ断片は、後述する変性、アニーリングの工程において、テスターとドライバー由来のキメラ二重鎖が生じる結果、最終的には第１のＤＮＡ分解酵素および／または第２のＤＮＡ分解酵素の作用によって完全消化される。
「アダプター」の連結は、当該技術分野において良く知られた方法により行うことができる。一般に、ＤＮＡリガーゼの作用を介して酵素的に結合させることができる。「アダプター」の末端は、粘着末端でも平滑末端でも良いが、転結させる「ＤＮＡ集団」の末端と相補的な配列を持つ粘着末端が好ましい。「アダプター」の連結後は、リガーゼを高温で数分間、例えば、７２℃で５分間程度処理することにより失活させることができる。
【００１１】
３．テスターＤＮＡ集団とドライバーＤＮＡ集団の混合、変性、アニーリング
テスターＤＮＡ断片の両端を脱リン酸化状態にするかもしくはアダプターを連結させたのち、該テスターＤＮＡ集団に対して、末端をリン酸化状態にするかもしくはアダプターを連結させた過剰量のドライバーＤＮＡ集団を混合させる。この「過剰量」の度合いは、「特異的ＤＮＡ断片」存在量等によって左右されるため、必要に応じて、２：１〜１００，０００：１（モル比）の範囲で適宜選択することができ、好ましくは、１０：１である。
テスターＤＮＡ集団とドライバーＤＮＡ集団を混合したのち、変性およびアニーリングの過程を、ハイスピードハイブリダイゼーション法と称する方法によって実施することにより、従来の方法に比べ、「特異的ＤＮＡ断片」の検出において格段顕著な効果を得ることができる。ここで「変性」とは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解離させ、および／または一本鎖ＤＮＡの高次構造を破壊し直鎖状の形態にする過程のことで、「アニーリング」とは、相補的な一本鎖ＤＮＡが、相補的塩基間の水素結合を介して二本鎖構造を形成する過程のことである。ここで「完全に」一本鎖に変性するとは、実質的に全ての二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させることを意味し、当該技術分野の技術常識により容易に理解されることであるが、例えば、９０〜１００％が一本鎖に変性している状態を意味する。
これまでは、互いに相補的な一本鎖ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションは、高温で一本鎖ＤＮＡを変性させたのち、徐々に温度を冷却させることにより行われており、さらに再度高温により変性させる処理は行わないのが一般的であった。本発明において開示されるハイスピードハイブリダイゼーション法は、インキュベーション温度を周期的に変動することが可能な、サーマルサイクラーを使用し、一度では結合しきれなかった、一本鎖ＤＮＡを再結合させる方法である（図２Ｂ）。より具体的には、まず、「変性」の段階を、例えば、８５〜９８℃、好ましくは９０〜９５℃で、３０秒〜５分間、好ましくは１分間行い、一本鎖ＤＮＡの高次構造を壊し直鎖状のＤＮＡにする。次に、温度を、例えば、４５〜７０℃、好ましくは５０℃まで、例えば、３０秒〜９０秒、好ましくは４０秒間かけて、降下させ、数分間、例えば、１分間〜５分間、好ましくは３分間ハイブリダイゼーションを行わせる。ハイブリダイゼーションの後、再度、高温、例えば、８５〜９８℃、好ましくは９０〜９５℃で、１分間処理を行う。これより、一本鎖ＤＮＡは再度直鎖状ＤＮＡになり、その一方で正しく結合された二本鎖ＤＮＡは僅かに変性するだけであるため、正しい結合はそのまま維持される。次に再び温度を急速に降下させてハイブリダイゼーションを行う。この操作は２〜４０回程度、好ましくは１５〜２０回程度、より好ましくは２０回程度繰り返すことにより、二本鎖ＤＮＡを効率よく増加させることができる。アニーリングを行う場合のｐＨは、一般に、中性または中性に近いｐＨで行い、また、イオン強度は、５０ｍＭまたはそれ以上の１価および／または２価のカチオンを含む。１価および２価のカチオンは当該技術分野においてイオン強度を調整する際に使用されるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２などを挙げることができる。
「アニーリング混合物」とは、相補的な配列を有する一本鎖核酸を、アニーリング可能な条件下（ｐＨ、温度、イオン強度）で混合した組成物のことである。
【００１２】
４．アニーリング混合物の分解酵素処理
アニーリング混合物のアニーリング処理の後、「特異的ＤＮＡ断片」以外のＤＮＡ鎖を分解するために、ＤＮＡ分解酵素（ヌクレアーゼ）処理を行う。ここで用いられるヌクレアーゼとしては、５’末端にリン酸をもつ一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼ（第１のＤＮＡ分解酵素）および一本鎖ＤＮＡ特異的なヌクレアーゼ（第２のＤＮＡ分解酵素）が好ましい。ここで第１のＤＮＡ分解酵素は、５’末端にリン酸をもつ一本鎖ＤＮＡであれば、該一本鎖ＤＮＡが二重鎖ＤＮＡの一部を構成している場合であっても、該一本鎖ＤＮＡを特異的に分解することができるものである。
「特異的ＤＮＡ断片」の両端は５'末端にリン酸が付加されていないため、第１のＤＮＡ分解酵素による分解は生じない。一方、「テスター」に存在するＤＮＡ断片、５'末端にリン酸が付加されているため、５'末端側からＤＮＡ一本鎖が第１のＤＮＡ分解酵素による分解を受け、その結果、相補的な一本鎖は３'末端が一本鎖として露出するため、この部分が第２のＤＮＡ分解酵素による分解を受けることになる。従って、「ドライバー」に存在するＤＮＡ断片は、第１のＤＮＡ分解酵素および第２のＤＮＡ分解酵素の作用により最終的には完全消化されることになる。ここで「完全消化」とは、ＤＮＡ分解酵素の対照となるＤＮＡ鎖の８０〜１００％がモノヌクレオチドレベルにまで分解されることを意味する。また、「テスター」に存在する「特異的ＤＮＡ断片」以外のＤＮＡ断片は、変性およびアニーリングの過程において「ドライバー」中の相補的一本鎖とアニーリングすることになるため、第１のＤＮＡ分解酵素および第２のＤＮＡ分解酵素の作用により、やはり完全消化されることになる。この結果、「特異的ＤＮＡ断片」が精製されることになる（図３を参照のこと）。
ここで、５’末端にリン酸をもつ一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼ（第１のＤＮＡ分解酵素）としては、当該技術分野において使用可能なものであればいかなるものでも使用することができるが、例えば、λエキソヌクレアーゼが好ましい。また、一本鎖ＤＮＡ特異的なヌクレアーゼ（第２のＤＮＡ分解酵素）としては、当該技術分野において使用可能なものであればいかなるものでも使用することができるが、例えば、エキソヌクレアーゼＩが好ましい。
ヌクレアーゼ処理が完了した後は、ヌクレアーゼを高温で数分間、例えば、８０〜９５℃で１５分間程度処理することで失活させることができる。
【００１３】
５．「特異的ＤＮＡ断片」の精製
得られた「特異的ＤＮＡ断片」に、過剰量の対照ＤＮＡ断片をさらに加え、上記３および４に示した工程を繰り返すことにより、さらに「特異的ＤＮＡ断片」を精製することができる。上記工程を繰り返す回数は、「テスター」中の「特異的ＤＮＡ断片」の存在量にも依存するが、４回程度が好ましい。
【００１４】
６．「特異的ＤＮＡ断片」の増幅
得られた「特異的ＤＮＡ断片」は、ＰＣＲ法によりさらに増幅してもよい。増幅に使用するプライマーは、特異的な配列部分を増幅することができるプライマーであればいかなる配列を有するものであってもよいが、例えば、「アダプター」の配列と相補的なプライマーを好適に使用することができる。
【００１５】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
テスターおよびドライバーの調製
イネＡ系統（テスター）およびイネＢ系統（ドライバー）からゲノムＤＮＡを、ISOPLANT II(ニッポンジーン社)を用いて、CTAB法（大坪ら, 食科工  ４４，ｐ３８６，１９９７；同  ４６，ｐ１１７，１９９９）に従って行なった。テスターのゲノムＤＮＡ１μｇとドライバーのゲノム４０μｇを適当な制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ（ＭｂｏＩ））を用いて切断した。
【００１７】
アダプターの連結
アダプターの調製は、まず、末端が平滑になるように、かつ、張り合わせた段階で末端に制限酵素切断部位との連結が可能な配列を導入した相補的なオリゴＤＮＡ二本を合成した（エキシジェン社）（配列番号１、配列番号２）。このうち、平滑末端になる側に５’末端がある方のオリゴＤＮＡ（配列番号１）は脱リン酸化し、内側の粘着末端側（テスター由来のＤＮＡ断片と連結する側）に５’末端が配置される側のオリゴＤＮＡ（配列番号２）の５’末端はリン酸化した。
調製した二本のオリゴＤＮＡは、ハイスピードハイブリダイゼーション法で、アニーリングさせ、アダプターを作成した。ハイブリダイゼーション反応は、反応液１（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、９５℃で１分間処理してＤＮＡ二本鎖の変性を行い、次に、５０℃まで温度を急速に下げ、３分間ハイブリダイゼーションを行わせた。この変性とハイブリダイゼーションの工程を２０回繰り返して、アダプターを調製した。
制限酵素で処理したテスターＤＮＡ１μｇにアダプター５．６ｎｇ（５０μMのものを７．５μｌ）を添加し、反応液２（タカラバイオ社製、ライゲーションキットＶｅｒ２（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ；１２．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ；２５μｌ、および滅菌蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を３μｌ加え、全量を５０μｌとした）中で、１６℃、１５分間処理して連結反応を行わせた。
連結反応後、反応液を７２℃で５分間処理して連結酵素を失活させた。
【００１８】
ハイスピードハイブリダイゼーション
アダプターとの連結反応を行わせた反応液の半量（５００ｎｇのＤＮＡ断片を含む）に制限酵素処理したドライバーＤＮＡ１０μｇを加え、さらに、１０ｘＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）を１０μｌ添加したのち、滅菌蒸留水を加えて全量を１００μｌとした。次に、この反応液をサーマルサイクラー（バイオラッド社製、ＭｙＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ）を用いて、ハイスピードハイブリダイゼーション処理を行った。この場合の反応は、９５℃で、１分間処理してＤＮＡ二本鎖の変性を行い、次に、５０℃まで温度を急速に下げ、３分間ハイブリダイゼーションの条件で行った。
【００１９】
ヌクレアーゼ処理
上記、ハイスピートハイブリダイゼーション処理後の反応液に、λエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを１μｌずつ加え、３７℃、３０分間処理した。この処理により、正しくハイブリダイゼーションした末端が脱リン酸化されているテスターＤＮＡのみが切断されず、テスターＤＮＡとドライバーＤＮＡのヘテロ結合体およびドライバーＤＮＡ同士の結合体、ハイブリダイゼーションしなかった一本鎖ＤＮＡは、ヌクレアーゼにより消化される。
３７℃、３０分間の処理の後、８０〜９５℃、１５分間熱処理することにより、λエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩを失活させた。
【００２０】
「特異的ＤＮＡ断片」の精製
ヌクレアーゼを失活させた後、反応液の半量を分取し、制限酵素処理したドライバーＤＮＡ１０μｇを加え、１０ｘＰＣＲバッファーを加え、さらに滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした後、上述のハイスピードハイブリダイゼーション処理の工程を繰り返した。この工程が終わった後、さらにドライバーＤＮＡを加えて、同様にハイブリダーゼション処理を行った。ハイスピートハイブリダイゼーション処理の工程は、合計４回行った。
【００２１】
ハイスピードハイブリダイゼーション法を行った反応液１０μｌにアダプターの調製に使用したオリゴＤＮＡ（配列番号１）をプライマーとしてＰＣＲ増幅を行った。図４には、各回のハイスピードハイブリダイゼーション法後のサンプルをＰＣＲ増幅した増幅産物のアガロース電気泳動（タカラバイオ社製、３％ Ｎｕｓｉｖｅ ３：１  アガロースゲル）の結果を示す。
この結果、４回目のハイスピードハイブリダイゼーション後のＰＣＲ増幅産物中に、矢印で示す特異的ＤＮＡ断片が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明にかかるＨＳＲＤＡ法の概略図を示す。λＥｘｏはλエキソヌクレアーゼを、ＥｘｏＩはエキソヌクレアーゼＩのことである。
【図２】従来のハイブリダイゼーション法（Ａ）とハイスピードハイブリダイゼーション法（Ｂ）の概略図を示す。
【図３】λエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＩによるＤＮＡ消化の概略（Ａ）と、両端にリン酸が付加されている場合と付加されていない場合の消化パターンの概略（Ｂ）を示す。
【図４】本発明のＨＳＲＤＡ法により得られたＤＮＡサンプルのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン左端から、ＤＮＡサイズマーカー（200bp ladder marker）、アダプターを連結させた段階のテスターサンプル（Adapter ligation(control)）、ハイスピードライゲーションを１回行ったサンプル（1st HSRDA）、２回行ったサンプル（2nd HSRDA）、３回行ったサンプル（3rd HSRDA）、４回行ったサンプル（4th HSRDA）、ドライバーのみ（Driver only(control)）を用いて４回ハイスピードライゲーションを行ったサンプル、ＤＮＡサイズマーカー（200bp ladder marker）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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