(57)【要約】【課題】  本発明は、新規な組換えタンパク質の産生方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明の組換えタンパク質の産生方法は、遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法であり、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ結合能または２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含んでいる。ここで、限定されるわけではないが、植物として、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子断片を結合する組換えベクターにおいて、
前記遺伝子断片は、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含む
ことを特徴とする組換えベクター。
【請求項２】
植物は、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１記載の組換えベクター。
【請求項３】
植物は、シロイヌナズナである
ことを特徴とする請求項１記載の組換えベクター。
【請求項４】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１記載の組換えベクター。
【請求項５】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１記載の組換えベクター。
【請求項６】
遺伝子断片の結合工程を有する、組換えベクターの作製方法において、
前記遺伝子断片は、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含む
ことを特徴とする組換えベクターの作製方法。
【請求項７】
植物は、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項６記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項８】
植物は、シロイヌナズナである
ことを特徴とする請求項６記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項９】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項６記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項１０】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項６記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項１１】
遺伝子断片を結合する組換えベクターから産生される組換えタンパク質において、
前記遺伝子断片は、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含む
ことを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項１２】
植物は、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１１記載の組換えタンパク質。
【請求項１３】
植物は、シロイヌナズナである
ことを特徴とする請求項１１記載の組換えタンパク質。
【請求項１４】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１１記載の組換えタンパク質。
【請求項１５】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１１記載の組換えタンパク質。
【請求項１６】
遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法において、
前記遺伝子断片は、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含む
ことを特徴とする組換えタンパク質の産生方法。
【請求項１７】
植物は、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１６記載の組換えタンパク質の産生方法。
【請求項１８】
植物は、シロイヌナズナである
ことを特徴とする請求項１６記載の組換えタンパク質の産生方法。
【請求項１９】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１６記載の組換えタンパク質の産生方法。
【請求項２０】
遺伝子断片は、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１６記載の組換えタンパク質の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な組換えベクターに関する。また、本発明は、この新規な組換えベクターの作製方法に関する。また、本発明は、新規な組換えタンパク質に関する。また、本発明は、この新規な組換えタンパク質の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、２１塩基から２８塩基の低分子ＲＮＡを媒介とする遺伝子発現制御（ジーンサイレンシング又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。）は、学術分野のみならず医療分野、分子農業分野及び産業界においても強く求められているところである。
【０００３】
ここで、ＲＮＡｉとは、様々な生物や細胞種に二本鎖ＲＮＡ（以下、ｄｓＲＮＡという。）が取り込まれることにより相補的なｍＲＮＡが分解され、これにより遺伝子の発現抑制が起こることをいう（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
ＲＮＡｉの発現機構は、以下のように説明される。まず、細胞内に取り込まれた長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ダイサーであるリボヌクレアーゼにより短い２１塩基から28塩基のsmall interfering RNA（以下、ｓｉＲＮＡという。）に切断される。
【０００５】
さらに、この切断されたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）を構成しているタンパク質とともにＲＩＳＣに取り込まれ、取り込まれた二本鎖ｓｉＲＮＡはほどけて一本鎖ＲＮＡとなる。ｓｉＲＮＡが取り込まれることによって活性化されたＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とｍＲＮＡ間の塩基対相互作用により相補的な転写物に結合し、ＲＩＳＣが結合したｍＲＮＡの分解により、遺伝子の発現抑制が起こることになる。
【０００６】
ＲＮＡｉに関与している２１塩基から２８塩基の低分子ＲＮＡであるsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を分解するが、一本鎖ＲＮＡはほとんど分解しない性質を有するＲＮＡ（リボヌクレアーゼ）（以下、ＲＮａｓｅという。）を分解酵素とし、二本鎖ＲＮＡを分解することにより生産される。
【０００７】
例えば、特許文献１には、二本鎖ＲＮＡを特異的に分解する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を植物染色体中に組み込んで発現させることにより、ＲＮＡウィルスに対して抵抗性を持つ植物を作出する方法が開示されている。
【０００８】
しかしながら、上記作出方法において、使用される二本鎖ＲＮＡｓｅとしては、大腸菌由来のＲＮＡｓｅＩＩＩ及び酵母由来のｐａｃI遺伝子にコードされたＲＮＡ分解酵素が開示されているに過ぎないものであり、植物由来の二本鎖ＲＮＡｓｅは全く開示されていない（例えば、特許文献１参照。）。したがって、上記作出方法においては、大腸菌や酵母由来の分解酵素を植物に適用して、ｓｉＲＮＡを生産し、これをＲＮＡｉに使用しなければならないという問題点があった。
【０００９】
また、ＲＮＡｉを誘導できるｓｉＲＮＡとして、ショウジョウバエｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いて得られる１９〜２３塩基という短いＲＮＡ断片が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら、上記ｓｉＲＮＡは、従来から使用されているｓｉＲＮＡとして確立されているショウジョウバエｉｎ  ｖｉｔｒｏ系やヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養系（Ｈｅｌａ細胞）を使用して得られるものであり、植物由来の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を分解して得られるものではない。
【００１０】
一方、植物体中に存在するダイサー様タンパク質（ＤＣＬ）が、二本鎖ＲＮＡを分解すること知られている（例えば、非特許文献２，３参照。）。しかしながら、二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡとの同一性の領域内でしか相同性ＲＮＡの特異的分解を示さないものであり、二本鎖ＲＮＡの分解活性に必要な領域等の最適な条件については何ら記載されておらず、その解明が切に望まれているところである。
【００１１】
なお、発明者は、本発明に関連する技術内容を開示している（非特許文献４〜７参照。）。これらのうち非特許文献６、７は、特許法第３０条第１項を適用できるものと考えられる。
【非特許文献１】McMacnus MT and Sharp PA (2002) Gene Silencing in mammals by small iｎｔerfering ＲＮＡs.  Nature Rev. Genet.3:737747
【非特許文献２】Park, W., Li, J., Song, R., Messing, J. and Chen, X. 2002. CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microＲＮＡ metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 12: 1484-1495.
【非特許文献３】Xie, Z., Johansen, L.K., Gustafson, A.M., Kasschau, K.D., Lellis, A.D., Zilberman, D., Jacobsen, S.E. and Carrington, J.C. 2004. Genetic and functional diversification of small ＲＮＡ pathways in plaｎｔs. PLoS Biol. 2: 1-11.
【非特許文献４】「近藤直子・伊藤陸・平栗章弘・村井祐介・相澤大輔・福原敏行 (2003) シロイヌナズナにおける２本鎖ＲＮＡ結合蛋白質のＲＮＡ分解活性」第26回日本分子生物学会年会予稿集Ｐ５３７、神戸、（２００３年１２月１３日）
【非特許文献５】東京農工大学研究シーズ集２００４（発刊日：平成１６年３月、編集発行：国立大学法人東京農工大学  産官学連携・知的財産センター、「福原敏行 ジーンサイレンシング(ＲＮＡｉ)に関する研究」、 Ｐ５３〜５６
【非特許文献６】「近藤直子・平栗章弘・野村泰子・村井祐介・伊藤陸・相澤大輔・福原敏行 (2004) ＲＮＡse IIIモチーフを含むシロイヌナズナのタンパク質ＲＴＬ2の機能解析」第27回日本分子生物学会年会予稿集Ｐ４７７、（２００４年１２月８日）
【非特許文献７】「野村泰子・近藤直子・平栗章弘・伊藤陸・福原敏行、シロイヌナズナDicer様タンパク質の生化学的解析」第27回日本分子生物学会年会予稿集Ｐ４８５、（２００４年１２月８日）
【特許文献１】特開２０００−２８７５６９号公報
【特許文献２】特開２００４−５２６４２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、植物に由来する遺伝子断片を結合する新規な組換えベクターを提供することを目的とする。
また、本発明は、この新規な組換えベクターの作製方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、遺伝子断片を結合する組換えベクターより産生する新規な組換えタンパク質を提供することを目的とする。
また、本発明は、この新規な組換えタンパク質の産生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明の組換えベクターは、遺伝子断片を結合する組換えベクターにおいて、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むことを特徴とする。
【００１５】
ここで、限定されるわけではないが、植物として、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。また、限定されるわけではないが、遺伝子断片として、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の組換えベクターの作製方法は、遺伝子断片の結合工程を有する、組換えベクターの作製方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、限定されるわけではないが、植物として、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。また、限定されるわけではないが、遺伝子断片として、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の組換えタンパク質は、遺伝子断片を結合する組換えベクターから産生される組換えタンパク質において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むことを特徴とする。
【００１９】
ここで、限定されるわけではないが、植物として、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。また、限定されるわけではないが、遺伝子断片として、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の組換えタンパク質の産生方法は、遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むことを特徴とする。
【００２１】
ここで、限定されるわけではないが、植物として、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、および観賞用植物からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。また、限定されるわけではないが、遺伝子断片として、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、およびＲＴＬ２遺伝子からなる群から選択されるものを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
【００２３】
本発明は、遺伝子断片を結合する組換えベクターにおいて、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えベクターを提供することができる。
【００２４】
本発明は、遺伝子断片の結合工程を有する、組換えベクターの作製方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えベクターの作製方法を提供することができる。
【００２５】
本発明は、遺伝子断片を結合する組換えベクターから産生される組換えタンパク質において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えタンパク質を提供することができる。
【００２６】
本発明は、遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えタンパク質の産生方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、組換えベクターおよびその作製方法、ならびに、組換えタンパク質およびその産生方法にかかる発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００２８】
本発明の組換えベクターは、遺伝子断片を結合する組換えベクターにおいて、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むものである。
【００２９】
本発明において、上記遺伝子断片は、植物に由来することを特徴とするものであり、該植物としては、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を有する植物であれば特に限定されるものでなく、穀類、豆類、イモ類、油脂作物、食用果樹、樹木、イネ、野菜、山菜、花木、緑化樹、観賞用植物等の植物を採択することができる。植物として、シロイヌナズナ、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソバ、トマト、トウガラシ、ピーマン、ナタネ、アルファルファ、ダイズ、ソラマメ、インゲンマメ、ホワイトクローバー、ワタ、ジャガイモ、サツマイモ、ナガイモ、キュウリ、ナス、ダイコン、カブ、テンサイ、カラシナ、ホウレンソウ、ニンジン、セリ、タバコ、ツルムラサキ、ヒマワリ、クワ、サクラ、アマモ、ハネモ、オオハネモ、およびミルからなる群から選択されるものを採用することができる。
【００３０】
ここで、本発明において上記遺伝子断片とは、植物由来のリコンビナントタンパク質であって、２本鎖ＲＮＡ分解能を有するものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、ダイサーライクプロテイン（ＤＣＬ）、ＲＮＡｓｅＩＩＩライクプロテイン（ＲＴＬ）等を例示することができる。上記これらのＤＣＬやＲＴＬは、大腸菌、酵母、ヒトにおいて既に公知となっているダイサーやＲＮＡｓｅＩＩＩ等の核酸とほぼ同様な塩基配列を有する酵素である。
上記遺伝子断片において、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位は、使用する遺伝子断片の種類、長さ等の諸性質によりそれぞれ異なるものであるが、例えば、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子では３９７４ｎｔ-５７３０ｎｔ（図１）、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子では２３３８ｎｔ-４１６１ｎｔ（図２）、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子では２７３７ｎｔ-４７１３ｎｔ（図３）、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子では２９２３ｎｔ-５１０９ｎｔ(図４)、ＲＴＬ２遺伝子では１ｎｔ-１１７６ｎｔ（図５）となる。
【００３１】
具体的に上記遺伝子断片としては、ＤＣＬ１−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ２−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ３−Ｃ遺伝子、ＤＣＬ４−Ｃ遺伝子、ＲＴＬ１遺伝子、ＲＴＬ２遺伝子、ＲＴＬ３遺伝子およびＲＴＬ４遺伝子からなる群から選択されるものを採用することができる。
【００３２】
遺伝子断片は、これらにいろいろなアミノ酸置換、欠損、付加、挿入が加わっても、二本鎖ＲＮＡを特異的に切断する活性を保持している限り、本発明に用いることができる。
【００３３】
本発明の組換えベクターの作製方法は、遺伝子断片の結合工程を有する、組換えベクターの作製方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むものである。
【００３４】
本発明の組換えタンパク質は、遺伝子断片を結合する組換えベクターから産生される組換えタンパク質において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むものである。
【００３５】
本発明の組換えタンパク質の産生方法は、遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むものである。
【００３６】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、遺伝子断片を結合する組換えベクターにおいて、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えベクターを提供することができる。
【００３７】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、遺伝子断片の結合工程を有する、組換えベクターの作製方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えベクターの作製方法を提供することができる。
【００３８】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、遺伝子断片を結合する組換えベクターから産生される組換えタンパク質において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えタンパク質を提供することができる。
【００３９】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、遺伝子断片を結合する組換えベクターを用いる、組換えタンパク質の産生方法において、前記遺伝子断片が、植物由来であり、２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位を含むので、新規な組換えタンパク質の産生方法を提供することができる。しかも、本発明の組換えタンパク質の産生方法により得られたタンパク質は、植物由来の遺伝子断片を結合する組み換えベクターを使用しているので、ターゲットとする特定の遺伝子の発現がきわめて制御されたものとなる。すなわち、本発明によれば、植物由来二本鎖ＲＮＡ分解酵素を植物に適用することができ、その遺伝子発現抑制作用により、所望の植物のみならず、様々な動植物、生物及び細胞種等を作出することができる。
【００４０】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００４１】
つぎに、本発明にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００４２】
シロイヌナズナ由来の2本鎖RNA分解酵素（DICER様タンパク質またはRTL2タンパク質）の産生方法
【００４３】
ＤＣＬ1-C発現ベクターの作製
シロイヌナズナの遺伝子情報を元に、ダイサー様タンパク質１（以下ＤＣＬ1）のコード領域（全長5730ｎｔ）のうち、２本鎖ＲＮＡ結合能を有する部位と２本鎖ＲＮＡ分解能を有する部位（開始コドンから３９７４ｎｔ番目から５７３０ｎｔ番目まで  添付資料１）を、ＰＣＲ法によりシロイヌナズナcＤＮＡライブラリー（インビトロジェン社製）から増幅しクローニングした。
【００４４】
本発明の遺伝子断片であるＤＣＬ1遺伝子とは、ヒト、ショウジョウバエ、線虫などから発見されているダイサー遺伝子と相同性があり、これらダイサー遺伝子は、遺伝子の後半（３’末端側もしくはＣ末端側）にＲＮＡse  III領域（２本鎖ＲＮＡ分解能を有する）および2本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（2本鎖ＲＮＡ結合能を有する）を含んでいることを特徴とするものである。本発明のＤＣＬ1遺伝子等も、ヒト等から発見された既知のダイサー遺伝子と同様に、遺伝子の後半（３’末端側もしくはＣ末端側）にＲＮＡse  III領域および２本鎖ＲＮＡ結合モチーフを含んでいる遺伝子である。上記ＲＮＡse  III領域および２本鎖ＲＮＡ結合モチーフは、開始コドンから３９７４ｎｔ番目から５７３０番目までに含有されるものである。
【００４５】
このように、本発明においては、遺伝子断片の特定部位にＲＮＡse III領域および２本鎖ＲＮＡ結合モチーフを採択することに、２本鎖ＲＮＡ結合を特異的に分解することが可能とするものである。
また、本発明においては、大腸菌、酵母、ヒト等でタンパク質を生産可能とするために、上記遺伝子断片の長さを適切な長さとしている。遺伝子断片の長さは、タンパク質を生産することができれば、特に制限されるものではない。
【００４６】
PCRのプライマーとして、５´側はCCGAGGTGCTCAGAGGTTAC（DCL1-C-P1、3974nt−3993nt）、３´側はCGTTGAAGAGAGTAAAAGAATCA（DCL1-C-P2、5708nt−5730nt）を用いた。PCR反応は94℃、30秒間→50℃、30秒間→74℃、3分間を30サイクル繰り返した。反応溶液は50μｌとし、KOD  DNA  ポリメラーゼを2.5U、鋳型となるcＤＮＡを100ng、ｄNTP濃度を0.2mM、ＭｇＣl２濃度を１ｍM、反応緩衝液として、(NH4)2SO2を６ｍM、KClを10mM、Tris-HCl（ｐH8.0）を120mM、TritonX-100を0.1%、BSAを0.001%用いた。
【００４７】
得られたcＤＮＡ断片（1757nt）はＤＣＬ１−Ｃと命名した。このＤＣＬ１−Ｃ断片は、プラスミドpUC18を制限酵素SmaIで処理して、平滑末端化し、ＢＡＰ（アルカリフォスファターゼ）処理により脱リン酸化したベクターにライゲーション反応させて結合させた（図１参照）。その後、このベクターを大腸菌への形質転換を定法を用いて行い、増殖、精製した後に、制限酵素SalIとEcoRIで切断反応を行い、ｐＵＣ１８由来の制限酵素SalI、XhoI、BamHIサイトとSacI、EcoRIサイトを両端に有するＤＣＬ１−Ｃ断片を、pGEX-6P-2（アマシャムバイオサイエンス製）のEcoＲＩ、およびSalIサイトに挿入して、ＤＣＬ１−Ｃタンパク質発現ベクターを完成させた（図１参照）。
【００４８】
pGEX-6P-2ベクターを用いたタンパク質産物はすべてＮ末端上流域にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下ＧＳＴと略す）を有しており、ＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌内で産生される（添付資料２、添付資料３参照）。ＧＳＴとグルタチオンとの特異的な結合を利用して、グルタチオンを固定した樹脂またはビーズを用い、これら融合タンパク質の分離精製が可能となる。
【００４９】
DCL2-C発現ベクターの作製
シロイヌナズナの遺伝子バンクArabidopsis Biological Resource Center（以下ARBCと略す）からDCL2遺伝子のC末端領域（以下DCL2-Cと略す。2066nt、689aa）をクローニングしたプラスミド（整理番号：M57B9）の分譲を受け、本実験の材料とした。DCL2-CはｐBlueScriptSK(-)にクローニングされているが、大腸菌内でGST融合タンパク質として発現させるために、pＧＥＸ-6Ｐ2にサブクローニングした。サブクローニングの方法としては、ｐBlueScriptSK(-)のマルチクローニングサイト上にある制限酵素KpnIサイトを切断し、その後この切断サイトをT4ポリメラーゼ（タカラ社製）で平滑化し、続いてDCL2のC末端領域内にある制限酵素SpeIサイトで切断した後に、この切断サイトをKlenow  Fragment（タカラ社製）で平滑化した。この両側末端を平滑化されたDCL2のC末端領域を含む断片をアガロースゲル電気泳動後にGeneCleanII(フナコシ社製)で回収した。ｐＧＥＸ−6P２のマルチクローニングサイトをSmaIサイトで切断後、CIAP（タカラ社製）処理を施した後に、DCL2-C遺伝子断片をライゲーションさせて、GST融合タンパク質としてDCL2-Cを発現するベクターを完成させた（図２参照）。
【００５０】
DCL3-C発現ベクターの作製
シロイヌナズナの遺伝子バンクであるかずさDNA研究所からDCL３遺伝子全長(4713nt)をpBlueScriptIISK(-)にクローニングしたプラスミド（整理番号：AV546529）の分譲を受け、本実験の材料とした。分譲されたプラスミドにはDCL3遺伝子の全長がクローニングされているが、本実験ではそのうちC´末端側に位置する領域、塩基配列としては開始コドンから2737番目から4713番目までの領域をｐGEX−６P2（アマシャムバイオサイエンス製）へのサブクローニング遺伝子断片として用いた。
【００５１】
まず、pBlueScriptIISK(-)にクローニングされたDCL3の遺伝子配列において、開始コドンから2737番目に存在する制限酵素SalIサイトを利用して、この酵素で当該プラスミドを切断し、その後KlenowFragment処理にて平滑化し、次にpBlueScriptIISK(-)のマルチクローニングサイト上に存在する制限酵素KpnIサイトを切断し、DCL3遺伝子のN末端部分(１nt〜2736nt)を取り除いた後にT4DNAポリメラーゼで平滑化させて、セルフライゲーションさせた。尚、この一連の処理においてSalIサイトはKlenowFragment処理で正常に復活しており、再度SalIで切断することが可能である。次にセルフライゲーションさせたDCL3遺伝子のC末端領域を含む遺伝子断片（以下DCL3-Cと略す）を、SalIとpBlueScriptIISK(-)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素NotIサイトをNotIで切断して、DCL3-Cを切り出し、アガロースゲル電気泳動後にGeneCleanIIによりDCL3-C遺伝子断片を回収した。ｐＧＥＸ−6P２のマルチクローニングサイトに存在するSalIサイトとNotIサイトを制限酵素SalIとNotIを用いて切断し、線状化したベクターをアガロースゲル電気泳動後にGeneCleanIIで回収した。最後にこのプラスミドとDCL３-C遺伝子断片を制限酵素サイトSalIとNotIでライゲーションさせて、GST融合タンパク質としてDCL３-Cを発現するベクターを完成させた（図３参照）。
【００５２】
DCL4-C発現ベクターの作製
シロイヌナズナの遺伝子バンクであるかずさDNA研究所からDCL４遺伝子全長(5109bp)のうち、C末端側領域（2032ntから5109ntまでの3078nt、1026アミノ酸残基）をpBlueScriptIISK(-)にクローニングしたプラスミド（整理番号：AV547573）の分譲を受け、本実験の材料とした。本実験ではそのうちC´末端側に位置する領域、塩基配列としては本来のDCL4遺伝子の開始コドンから2923番目から5109番目までの領域をｐGEX−６P2（アマシャムバイオサイエンス製）へのサブクローニング遺伝子断片として用いた。
【００５３】
まず、pBlueScriptIISK(-)にクローニングされたDCL４の遺伝子配列において、開始コドンから2923番目に存在する制限酵素EcoRVサイトを利用して、この酵素で当該プラスミドを切断し、次にpBlueScriptIISK(-)のマルチクローニングサイト上に存在する制限酵素SmaIサイトを切断し、DCL4遺伝子の一部分(2032nt〜2923nt)を取り除いた後に、セルフライゲーションさせた。次にセルフライゲーションさせたDCL４遺伝子のC末端領域を含む遺伝子断片（以下DCL４-Cと略す）を、pBlueScriptIISK(-)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素XbaIサイトで切断して、KlenowFragment処理して平滑化した後に、pBlueScriptIISK(-)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素KpnIで切断した後にT4DNAポリメラーゼで平滑化して、DCL4-C遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動後にGeneCleanIIを用いて回収した。ｐＧＥＸ−6P２のマルチクローニングサイトに存在するSmaIサイトを制限酵素SmaIを用いて切断し、CIAP処理によりSmaI酵素による切断部分を脱リン酸化処理した後に、線状化したベクターをアガロースゲル電気泳動後にGeneCleanIIで回収した。最後にこのプラスミドとDCL４-C遺伝子断片をSmaIサイトでライゲーションさせて、GST融合タンパク質としてDCL4-Cを発現するベクターを完成させた（図４参照）。
【００５４】
RTL2発現ベクターの作製
シロイヌナズナの遺伝子バンクArabidopsis Biological Resource Center（以下ARBCと略す）からRTL2遺伝子をクローニングしたプラスミド（整理番号：BE522666）の分譲を受け、本実験の材料とした。RTL2はｐBlueScriptSK(-)にクローニングされているが、大腸菌内でGST融合タンパク質として発現させるために、pＧＥＸ-6Ｐ2にサブクローニングした。サブクローニングの方法としては、ｐBlueScriptSK(-)のマルチクローニングサイト上にある制限酵素EcoRIサイトと、制限酵素XhoIサイトで切断した後に、アガロースゲル電気泳動後にGeneCleanII(フナコシ社製)でRTL2遺伝子断片を回収した。ｐＧＥＸ−6P２のマルチクローニングサイトに存在するEcoRIサイトと、XhoIサイトで切断した後に、線状化したベクターをアガロースゲル電気泳動後にGeneCleanIIで回収した。最後にこのプラスミドとRTL2遺伝子断片をEcoRIサイトと、XhoIサイトでライゲーションさせて、GST融合タンパク質としてRTL2を発現するベクターを完成させた（図５参照）。
【００５５】
DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質の発現方法
【００５６】
上記の方法で作製したタンパク質発現ベクターの各ベクター、DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-CおよびRTL2をそれぞれ大腸菌JM109株に定法に従い、形質転換し、形質転換体を得た。
【００５７】
その後、形質転換された大腸菌を５００ｍｌのLB培地で20℃で２００ｒｐｍ／分で振とう培養機（タイテック社製  ＢＲ−３０００ＬＦ）を用いて、IPTGを最終濃度１ｍMになるように添加した後に、48時間の培養を行った。培養後は６０００Ｇ、１０分間の遠心分離により大腸菌を集菌して、タンパク質抽出液（以下、ＮＥＴＮＤ溶液とする）１０ｍＬに懸濁した。ＮＥＴＮＤ溶液はＮＥＴＮ溶液と１Ｍ濃度ＤＴＴ（ジチオトレオトール）を等量混ぜ合わせて作製した。ＮＥＴＮ溶液組成は、５０ｍＭTris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl、1mMEDTA、0.5%NP40（界面活性剤）である。
【００５８】
懸濁液は氷中で超音波ホモジナイザー（アストラソン社製  ＸＬ２０２０）を用いて細胞を粉砕した。粉砕条件としては、最大出力１０、１秒間隔で2０回のパルスを施した。従来、細胞の破砕時は破砕チップの先を直接懸濁液に浸してパルスをかけるが、本実施例においては以下に述べる間接パルス法を用いた。破砕チップを３０％グリセロールを張った容器に浸し、この容器内に懸濁液が入った1.5mlマイクロチューブなどを浮かべ、破砕パルスを施した。間接パルス法を用いると、発現産物であるDCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2が破砕処理中に受ける分解を最小限度に抑えることが可能であった。これらの細胞破砕液を10,000Ｇ、25分間、4℃で遠心分離を行い、上澄み画分即ち可溶性画分から目的とするDCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2の各タンパク質の精製を行った。
【００５９】
精製方法としては、融合タンパク質として発現させた各タンパク質のＮ末端上領域にあるＧＳＴに対して特異的に結合するグルタチオンをカップリングさせたＧＳＴ融合タンパク質精製用アフィニティーゲルであるGlutathione Sepharose 4B（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて行った。まず、上記の遠心分離操作で得られた１０ｍｌの上澄み画分即ち可溶性画分に対して、グルタチオンが結合していないSepharose 4B（終濃度が50%になるようにNETND溶液と混合したもの）を２ｍｌ加えて、4℃で30分間転倒混和させた後に、3000rpm、4℃、30秒間遠心分離して、上澄み液を回収する。この操作により、Sepharose 4Bに非特異的に結合するタンパク質を選択的に除くことができる。
【００６０】
次にこの上澄み液をＮＥＴＮＤ溶液で平衡化したGlutathione Sepharose 4B（製品原液266μlに対してＮＥＴＮＤ溶液を10ml加えて数分間転倒混和した後に3000rpm、4℃、30秒間遠心分離の各操作を３回繰り返して行い沈殿物として調整）を加えて、4℃で1時間以上転倒混和させ、3000rpm、4℃、30秒間遠心分離して沈殿物として回収した。目的タンパク質とＧＳＴとの融合タンパク質とGlutathione Sepharose 4Bが結合した沈殿物を、ＮＥＴＮＤ溶液で３回洗浄操作を施した後、リン酸緩衝液(140mM NaCl 2.7mM KCl 10mM Na2HPO4 1.8mM KH2PO4、 pH7.3)で３回洗浄操作を行った。この後、沈殿物を200μlの溶出バッファー（50mM Tris-HClpH8.5, 10mM グルタチオン（還元型）和光純薬製）を加えて溶出し、タンパク質濃度をOD280で測定した後に分注して−80度に保存した。
【００６１】
尚、GSTとの融合タンパク質として発現させた各DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質を、上記の精製工程を経た後に、PreScission  Protease（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてGSTを切断させ各DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質のみにしたサンプルも以下の2本鎖RNA分解活性の測定に用いた。
【００６２】
DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質の2本鎖RNA分解活性の測定
【００６３】
上記方法により精製したタンパク質を用いて、2本鎖RNA分解活性を測定した。分解の基質として用いた2本鎖RNAは、シロイヌナズナ由来のアクチン遺伝子の一部分をクローニングして以下の手順により作製した。
【００６４】
まず、シロイヌナズナから抽出したDNAを鋳型として、2種のプライマー、TTGATCTTGCTGGTCGTGACCTC と  TGGACCCTCCAATCCAGACAGAGを用いて、KOD  DNA  ポリメラーゼによるPCR反応を行い、得られた500bpのDNA断片を、制限酵素EcoRVで処理したpBlueScriptSK(-)（東洋紡）にライゲーション反応（タカラ社製、ライゲーションキットVer.2）を施して結合させてクローニングした。
【００６５】
さらに基質として分子量の小さな2本鎖RNAを作製することを目的として、先にクローニングしたアクチン遺伝子500ｂｐのうち、5´末端側から116bpに存在する制限酵素HindIIIで切断されるサイトとpBlueScriptSK(-)に存在するHindIIIサイトで切断して、アクチン遺伝子由来の384bpを除いたベクターを作製し、アクチン遺伝子由来の116bpのRNA分子を転写反応により作製に用いた。
【００６６】
この方法でクローニングしたベクターを用いてのアクチン由来の2本鎖RNAを作製は、pBlueScriptSK(-)のマルチクローニングサイトに隣接するT7またはT3プロモーターを利用して、インビトロ転写反応を行い、T7プロモーターから転写された１本鎖RNAと、それとは相補的な配列を有するT3プロモーターから転写された１本鎖RNAをそれぞれ得て、その後2種の１本鎖RNAを混合して、95℃で５分間の熱変性後、40℃のインキュベーターに移しアニーリング操作を行い、2本鎖RNAを得た。インビトロ転写の反応は30μlの系で行い、当該ｐBlueScriptSK(-)を0.1-0.5μg、0.1MDTTを3μl、10mM濃度のATP、GTP、CTP、UTPをそれぞれ1.5μl、１０×転写バッファー（東洋紡）を3μl、RNase阻害剤(40U/μl)を1μl、T3またはT7RNAポリメラーゼを1μl、α32-P-UTP（アマシャムファルマシア製）を3μl加え、蒸留水で30μlにメスアップし、37℃で2.5時間反応させた。
【００６７】
２本鎖ＲＮＡ分解活性の測定には、上記で作製したラジオアイソトープで標識された100nt、または500ntの2本鎖RNAを基質として行い、1nMの標識2本鎖RNA、20nMの組み換えタンパク質（DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2のいずれか）、３０ｍM  Tris-HCl(pH7.0)、10mMNaCl、5mMDTT、0.1mMEDTA、20mMMgCl2で行い、反応系は20μlとした。25℃で1時間反応を行った後に、RNA泳動緩衝液（18％ホルムアルデヒド、57％ホルムアミド、18%グリセリン色素液、１×TBE）を２０μl加えて、95℃で熱変性させて、氷中に２分間置き、その後12％ポリアクリルアミドゲルで構成されるSDS-PAGE（ウレア50%を含む）で、１×TBE(0.089MTris  0.089Mほう酸  0.02MEDTA)バッファー系で２０mＡで1時間電気泳動を行った。グリセリン色素液の組成は50％グリセリン、0.1mg／mlブロモフェノールブルー、0.1mg／mlキシレンシアノール、1mMEDTA)である。泳動後はゲルドライヤーで乾燥させて、BAS１５００（富士フィルム社製）を用いてオートラジオグラフィーにかけて、基質として加えた標識2本鎖RNAの分解を観察し、DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2のそれぞれについてのRNA分解活性の有無や分解活性で生じる２１〜２５ntのsiRNAの産生を検討した。
【００６８】
DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質の2本鎖RNA分解活性測定の結果
【００６９】
各DCL1-C、DCL2-C、DCL3-C、DCL4-C、RTL2タンパク質をGSTとの融合タンパク質として大腸菌JM109を用いて発現させて精製を行った。それぞれについて2本鎖RNA分解活性を測定した。
【００７０】
まずDCL1-Cタンパク質について検討した結果、反応から30分目から分解活性が測定され始め、60分後では、基質として加えたシロイヌナズナアクチン配列由来の100ntを約半分以上分解した。また、ステムループ構造を有し、部分的に2本鎖RNAの構造を持つ前駆体miRNA171を基質とした場合は、反応10分目から分解活性が確認できた。1本鎖RNAを基質とした場合、分解は見られなかった（図６）。
【００７１】
次にＤＣＬ1-Cについて、アクチン配列由来100ｎｔの２本鎖ＲＮＡを基質として分解反応を起こさせ、その際に生じるｓｉＲＮＡの産生を検討した結果、ＤＣＬ1-Cに関しては25ｎｔ付近にｓｉＲＮＡが生じていることを確認できた（図７）。図６では、主に２本鎖ＲＮＡが分解することに重点を置いて解析したが、図７では、２本鎖ＲＮＡが分解したときに生じるｓｉＲＮＡの検出に重点をおいて解析した。図７では、25ｎｔのみならず23ｎｔおよび20ｎｔのｓｉＲＮＡが生じていることが確認できる。
【００７２】
DCL3-Cを基質とした場合、シロイヌナズナアクチン配列100nt由来の2本鎖RNAを基質としたときDCL3-Cにおいて分解活性が見られた（図８）。また、DCL3-Cについて、アクチン配列由来100ntの２本鎖RNAを基質として分解反応を起こさせ、その際に生じるsiRNAの産生を検討した結果、DCL3-Cに関しては21nt付近にsiRNAが生じていることを確認できた。
【００７３】
RTL2においても、アクチン配列100nt由来のｄｓRNAを基質とした場合や、前駆体miRNA171を基質とした場合に2本鎖RNAに対する分解活性が確認された（図９）。RTL２は1本鎖RNAやDNAに対する分解活性は有しないことが、これらのDNAや１本鎖RNAが分解阻害に対する影響がいないことを示す競合実験結果から確認された（図１０）。
【００７４】
図１０において、ＲＴＬ２を加えていない左端のレーンに対しＲＴＬ２を加えると反応３０分でほぼ全てのラジオアイソトープで標識したアクチン配列100ｎｔ由来の２本鎖ＲＮＡが分解されている（０のレーン）。このことから、ＲＴＬ２に２本鎖ＲＮＡ分解活性があることがわかる。この反応系に、ラジオアイソトープで標識していない２本鎖ＲＮＡ(dsＲＮＡ),１本鎖ＲＮＡ(ssＲＮＡ)、および２本鎖ＤＮＡ(DNA)を過剰に加えて、ラジオアイソトープで標識した２本鎖ＲＮＡの分解を検出した。ラジオアイソトープで標識していない２本鎖ＲＮＡ(dsＲＮＡ)を過剰に加えた場合に、ラジオアイソトープで標識した２本鎖ＲＮＡの分解が阻害されていることから、ＲＴＬ２の分解活性は２本鎖ＲＮＡに特異的であることが分かる。
【００７５】
以上の結果からＤＣＬ1-C、ＤＣＬ3-C、ＲＴＬ2は２本鎖ＲＮＡ構造を特異的に認識して分解できる酵素であること、またＤＣＬ1-CとＤＣＬ3-Cは21-25ntのsiＲＮＡの産生能を有することが判明した。すなわち、これらＤＣＬ1-C、ＤＣＬ3-C、ＲＴＬ2は、すべてＲＮＡse III領域および2本鎖ＲＮＡ結合モチーフを含む構造を有するタンパク質（遺伝子断片）であり、この特徴的構造は、２本鎖ＲＮＡ構造を特異的に認識して分解し２１ｎｔ-２５ｎｔのsiＲＮＡの産生能を有する酵素であることが知られているヒトのダイサーや大腸菌のＲＮＡse IIIとほぼ一致している。
【００７６】
つまり、本発明の遺伝子断片であるＤＣＬ1-C、ＤＣＬ3-C、ＲＴＬ2は、いずれも２本鎖ＲＮＡ構造を特異的に認識し、分解することができるものであり、２１ｎｔ-２５ｎｔのsiＲＮＡの産生能を有する酵素である。また、ＤＣＬ1-CとＤＣＬ3-Cが、２本鎖ＲＮＡ構造を特異的に認識し結合する酵素であることは本発明者の論文で報告している（Hiraguri, A., Itoh, R., Kondo, N., Nomura, Y., Aizawa, D., Murai, Y., Koiwa, H., Seki, M., Shinozaki, K., Fukuhara T. (2005) Specific interactions between Dicer-like proteins and HYL1/DRB-family dsＲＮＡ-binding proteins in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology 57: 173-188..）。
【００７７】
一方、本発明の遺伝子断片であるＤＣＬ2-C、ＤＣＬ4-Cは、上記遺伝子断片であるＤＣＬ1-C、ＤＣＬ3-Cと極めてよく似た構造を持つ、ＲＮＡse III領域および2本鎖ＲＮＡ結合モチーフを含んでいるタンパク質（遺伝子断片）である。また、これら遺伝子全体の構造はヒトのダイサーに似た構造をもつ。よって、２本鎖ＲＮＡ構造を特異的に認識して分解し21-25ntのｓｉＲＮＡの産生能を有する酵素であると推測できる。
また本発明の組み換えベクターにより産生された２本鎖ＲＮＡ分解酵素を用いることで産生された21ntから25ntのｓｉＲＮＡは、遺伝子解析用のキット構成物としての利用も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、特異的に遺伝子発現をブロックすることができる植物由来の遺伝子断片を結合する組み換えベクターを産生することができるものであり、該組み換えベクターをガン等の病気やエイズ等のウィルス感染症に対する治療法等の医療分野及び農業分野の発展に寄与することができる。また、本発明により産生される遺伝子断片及び組み換えベクターは、抗ウィルス防御、トランスポゾンのサイレンシング、遺伝子制御、セントロメアのサイレンレンシング、ゲノム再編成等の生物学的機能を有するものであり、植物のみならず動物の遺伝子機能解析の画期的なツールとしての遺伝子発現制御の技術革新に寄与することができる。また本発明の組み換えベクターにより産生された２本鎖ＲＮＡ分解酵素を用いることで産生された21ntから25ntのｓｉＲＮＡは、遺伝子解析用のキット構成物としての利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＤＣＬ１−Ｃの作製方法を示す図である。
【図２】ＤＣＬ２−Ｃの作製方法を示す図である。
【図３】ＤＣＬ３−Ｃの作製方法を示す図である。
【図４】ＤＣＬ４−Ｃの作製方法を示す図である。
【図５】ＲＴＬ２の作製方法を示す図である。
【図６】ＤＣＬ１−ＣによるｄｓＲＮＡ分解活性の検出結果を示す図である。
【図７】ＤＣＬ１−ＣによるｓｉＲＮＡ断片の産生の検出結果を示す図である。
【図８】ＤＣＬ３−Ｃによる、ｄｓＲＮＡ分解活性の検出結果、およびｓｉＲＮＡ断片の産生の検出結果を示す図である。
【図９】ＲＴＬ２によるｄｓＲＮＡ分解活性の検出結果を示す図である。
【図１０】コンペティターを用いたＲＴＬ２の基質特異性の検出結果を示す図である。
【図１１】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１２】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１３】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１４】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１５】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１６】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１７】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１８】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１９】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図２０】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図２１】核酸配列とアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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