(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＡＤＳボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変することにより、新たな美的価値を有する植物を作出する。【解決手段】下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子が導入され、花型が改変された植物を提供する。（ａ）特定なる配列に記載された塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子（ｂ）特定なる配列に記載された塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子（ｃ）特定なる配列に記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子（ｄ）特定なる配列に記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子が導入され、花型が改変された植物。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子
（ｃ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子
（ｄ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子
【請求項２】
前記植物の花型の改変は、雌ずいの雄ずいへの転換、雄ずいの雌ずいへの転換、花弁のがく片への転化、二次花の形成、がく片様花弁様構造の形成、の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の植物。
【請求項３】
下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子が導入され、花型が改変された植物。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子から転写されるＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子から転写されるＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードする遺伝子
（ｃ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子由来のタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子から転写されるＲＮＡと相補的名アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子
（ｅ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子から転写されるＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードする遺伝子
（ｆ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子からなる遺伝子由来のタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項４】
前記植物の花型の改変は、雌ずいの雄ずいへの転換、雄ずいの雌ずいへの転換、花弁のがく片への転化、二次花の形成、がく片様花弁様構造の形成、の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の植物。
【請求項５】
植物の花形を改変する下記（ａ）、（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡを含有してなる組み換えベクター。
【請求項７】
請求項２に記載の組み換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項８】
請求項２に記載の組み換えベクターを含有する植物。
【請求項９】
野生型植物と比較して花型が改変されている、請求項８記載の植物。
【請求項１０】
前記植物の花型の改変は、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項９記載の植物体。
【請求項１１】
花型が改変された植物を生産する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子または該遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する工程、を有する植物を生産する方法。
【請求項１２】
前記植物細胞から植物体を再生させる工程、を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記植物における花型の改変は、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
下記（ａ）、（ｂ）のいずれかに記載の遺伝子が導入された組み換えベクター。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子
【請求項１５】
請求項１４に記載の組み換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組み換えベクターを含有する植物。
【請求項１７】
野生型植物と比較して花型が改変されている、請求項１４記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を利用した花の形態の改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
花の形態が従来知られたものと異なる植物は江戸時代より珍重され、その品種は長く維持されてきた。花の形態は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つである。
【０００３】
一方、近年の遺伝子工学の発達は目覚しく、花の形態が従来知られたものとは異なる植物の品種が有する遺伝子を遺伝子工学的手法によって導入できれば、従来の交配育種で行われていた品種育成に比べ短時間で多様な品種を作製することができる。
【０００４】
この観点から、過去十数年に亘り花の形態の発生に関する遺伝的制御機構が研究されており、特に２種の双子葉植物(シロイヌナズナ、キンギョソウ)を中心に研究されている。そしてこれらの研究によると、高等植物における花の形態の発生はＡＢＣモデルによって説明することが提案されている。このモデルは、遺伝子をＡ、Ｂ、Ｃの３つのクラスに分類し、Ａ、Ｂ、Ｃのクラスの遺伝子それぞれが隣接するクラスの遺伝子に作用することで花の形態が変化する、と考えるモデルである。なおこのモデルによると、Ａクラスの遺伝子が活性になると最初の輪生器官が萼片に、ＡクラスとＢクラスの遺伝子が活性になると２番目の輪生器官を花弁に、ＢクラスとＣクラスの遺伝子が活性になると３番目の輪生器官が雄ずいに、Ｃクラスの遺伝子が活性になると４番目の輪生器官が雌ずいに、それぞれ決定される。なおＡクラスとＣクラスの遺伝子が活性になると２番目の輪生器官と３番目の輪生器官の境界で相互に拮抗すると考えられている。例えばシロイヌナズナでは、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）とＡＰＥＴＡＬＡ（ＡＰ２）はＡクラスに、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）とＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）はＢクラスに、そしてＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）はＣクラスに、それぞれ分類される。
【０００５】
一方、上記ＡＢＣモデルの各クラスに分類された遺伝子の多くは同時にＭＡＤＳボックス遺伝子でもあることが判明している。ＭＡＤＳボックス遺伝子とはＭＡＤＳドメインと呼ばれる約６０個のアミノ酸の保存的配列を共通に持つ遺伝子ファミリーであり、その保存的配列の多くは転写制御を介して植物の形態形成や器官形成を制御していると考えられているため、ＡＢＣモデルとの相関を考慮した研究が進められてきている（例えば下記特許文献１、２参照）。
【０００６】
また現在、ＭＡＤＳボックス遺伝子はモデル植物だけでなく多様な植物群にも存在することが確認されている。そして更にコケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物へと生殖器官が複雑化するにつれて生殖器官形成に関与するＭＡＤＳボックス遺伝子の数も遺伝子重複により増加し、より機能的・発現領域的に分化していることも分かっている。
従って、被子植物の花の体制はＭＡＤＳボックス遺伝子の遺伝子重複による余剰的な機能獲得や発現制御における変化、またそれらの組み合わせなど複雑な進化によって確立され、多様化してきたと考えられている。
【非特許文献１】酒井一  花の形態形成の分子遺伝学  新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）１５０−１６３頁、２０００年
【非特許文献２】後藤弘爾  花の形態形成−花開く植物分子遺伝学−  「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）５２−６１頁、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、スイレン科植物は被子植物の中でアンボレラ科に次いで２番目に原始的であるものの、これらのＭＡＤＳボックス遺伝子の解析は行われていない。これらのＭＡＤＳボックス遺伝子の解析を行うことで、双子葉類、単子葉類双方の特徴を併せ持つ花の創生や、より多様な花の改変などの可能性をもつと考えられる。
そこで本発明は、ＭＡＤＳボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変することにより、新たな美的価値を有する植物を作出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の課題を鑑み、まず科内で花の形態が多様化しているスイレン科についてのＭＡＤＳボックス遺伝子の解析を試みた。スイレン科は、同花被花で各器官が輪生配列する単子葉類的特徴を持つジュンサイ、ハゴロモモを含むハゴロモモ亜科と異花被花で螺旋配列のオニバス、コウホネ、ヒツジグサを含むヒツジグサ亜科に分けられる。
スイレン科植物であるヒツジグサ、オニバス、ハゴロモモ、ジュンサイ、コウホネから単離されたＭＡＤＳボックス型転写因子の一つであるＮｔＰＩ（ヒツジグサ）、ＥｆＰＩ（オニバス）、ＣｃＰＩ（ハゴロモモ）、ＢｓＰＩ（ジュンサイ）、ＮｊＰＩ（コウホネ）、ＮｔＡＰ３（ヒツジグサ）、ＥｆＡＰ３（オニバス）、ＣｃＡＰ３（ハゴロモモ）、ＢｓＡＰ３（ジュンサイ）、ＮｊＡＰ３（コウホネ）は、花の器官の特異性決定に関与するホメオティック遺伝子である。なおこれらはその構造から花のＡＢＣモデルではＢクラスに属するとされている。
従来ＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子は花器官形成過程で花弁と雄ずいに発現するといわれてきたが、本発明者らはあるスイレン科植物のＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子は、その発現が花弁と雄ずいに限定されないことを発見した。
そこで、本発明者らは、まずこのような組織特異性をもつスイレン科各種のＢクラス遺伝子（ＡＰ３、ＰＩ）の単離を試み、各種の花芽から目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡを単離することに成功した。
即ち、本発明は、スイレン科各種由来のＢクラスＭＡＤＳ遺伝子の機能の昂進または抑制による植物の花形の改変に関し、具体的には以下の手段を採用する。
【０００９】
まず、第一の手段として、下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子が導入され、花型が改変された植物とする。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子
（ｃ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の一部又は全部の塩基が欠失し又は置換された遺伝子。
（ｄ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列に一個若しくは複数個の塩基が付加された遺伝子
また、この場合において、植物の花型の改変は、雌ずいの雄ずいへの転換、雄ずいの雌ずいへの転換、花弁のがく片への転化、二次花の形成、がく片様花弁様構造の形成、の少なくともいずれかであることが望ましい。
なお、本明細書において「花型が改変されている」とは、野生型植物の花型と比較して対象植物の花型が相違し、この相違が人為的に生じたものであることを意味する。本発明における花型の改変には、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成が含まれる。
なお、本明細書において「雄ずい」とは、種子植物の花の器官の１種で、雄性生殖器官であり、花糸の先端に葯がついた構造を有する器官を意味する。
また、本明細書において「花弁」とは、花冠(corolla)を構成している裸花葉を意味する。また、本明細書において、「二次花」とは、花の内部に生じ、本来の（外の）花と同様の構造をしている構造体を意味する。
また、本明細書において、「がく片様花弁様構造」とは、一つの花器官の中にがく片の特徴を示す部分と花弁の特徴を示す部分とをモザイク状に含む構造体を意味する。
なお本手段では、一部又は全部の塩基が欠失することにより、これら遺伝子が発現せず、花型の改変が生じた植物を得ることができる。ここで一部とは、本遺伝子が発現しない程度の範囲をいうが、もとの遺伝子に対し概ね相同性が９０％以下である場合、遺伝子が発現しない程度と認めることができる（以下手段において同様である）。
【００１０】
また、第二の手段として、下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子が導入され、花型が改変された植物とする。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子から転写されるＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子から転写されるＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードする遺伝子
（ｃ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子由来のタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子から転写されるＲＮＡと相補的名アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子
（ｅ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子から転写されるＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードする遺伝子
（ｆ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子からなる遺伝子由来のタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子
また、この場合において、植物の花型の改変は、雌ずいの雄ずいへの転換、雄ずいの雌ずいへの転換、花弁のがく片への転化、二次花の形成、がく片様花弁様構造の形成、の少なくともいずれかであることが望ましい。
なお、本明細書において「ドミナントネガティブの形質を有するたんぱく質」とは、遺伝子本来の動きを阻害するたんぱく質を意味する。また、本明細書において「リボザイム」とは、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子であって、「リボザイム活性」とは、このリボザイムによって特異的に切断される性質を意味する。
【００１１】
また、第三の手段として、植物の花形を改変する下記（ａ）、（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡとする。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ。
なお、この場合において、このＤＮＡを含有してなる組み換えベクターとすること、更に、この組み換えベクターを含有する形質転換体とすること、さらに、この組み換えベクターを含有する植物とすること、また野生型植物と比較して花型が改変されていることとすること、更には、植物の花型の改変は、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つであることとすることも望ましい。
【００１２】
また、第四の手段として、花型が改変された植物を生産する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子または該遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する工程、を有する植物を生産する方法とすることも望ましい。なおこの場合において、植物細胞から植物体を再生させる工程、を含むこととするのも望ましく、また、この植物における花型の改変は、雄ずいの花弁への転化、二次花の形成、およびがく片様花弁様構造の形成からなる群より選択される少なくとも一つであるとすることも望ましい。
【００１３】
また、第五の手段として、下記（ａ）、（ｂ）のいずれかに記載の遺伝子が導入された組み換えベクターとする。
（ａ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列からなる遺伝子。
（ｂ）配列番号１乃至１０のいずれかに記載された塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
また、この組み換えベクターを含有する形質転換体とすること、この組み換えベクターを含有する植物とすること、野生型植物と比較して花型が改変されていること、とすることも望ましい。この場合は、配列番号１乃至１０のいずれかに記載の遺伝子を有する組み換えベクターとし、形質転換体にて高発現させることで、塩基を欠失若しくは置換するのではなく花形の遺伝子を高発現させることで花型の改変を行うことができるものである。ここで高発現とは、野生種に比べ花型が改変される程度の発現量をいう。
【発明の効果】
【００１４】
以上により、ＭＡＤＳボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変することにより、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターに導入したＢクラス遺伝子のトランスジェニックシロイヌナズナはＰＩ、ＡＰ３ともに花芽全体で発現しており、ＡＢＣモデルによると花弁−花弁-雄ずい-雄ずいという形態の花になる。また一方でこのトランスジェニックシロイヌナズナのＰＩのみ花芽全体で発現させると花弁-花弁-雄ずい-雌ずいという形態の花になる。またこれに対し、ＡＰ３のみを花芽全体で発現させるとがく片-花弁-雄ずい-雄ずいという形態の花になる。このように同じＢクラス遺伝子であっても遺伝子により別々の発現制御を受けている。
【００１６】
ＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子の機能昂進による花型改変としてはペチュニアにおけるＡＰ３相同遺伝子ｐＭＡＤＳ１にカリフラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓプロモーターを融合させたｐＭＡＤＳ１（３５Ｓ−ｐＭＡＤＳ１）を野生型に導入した形質転換体ではコサプレッションにより花弁の代わりにがく片が生じるｇｒｅｅｎ  ｐｅｔａｌ変異体（ｇｐ）と同様の表現系が現れた。ｇｒｅｅｎ  ｐｅｔａｌ変異体に３５Ｓ−ｐＭＡＤＳ１を導入し植物体全体で発現させるとがく片状の花弁が野生型の花弁に回復した。３５Ｓ−ｐＭＡＤＳ１の導入によってｐＭＡＤＳ１が植物体全体で発現している形質転換体においてがく片から花弁への部分的な転換が起こった。  またペチュニアの別のＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子であるＰＩ相同遺伝子ｆｂｐ１では３５Ｓプロモーターに融合して野生型に導入した時に現れるコサプレッションによる表現型は雄ずいの心皮への転換および花弁のがく片への部分的な転換であった。
【００１７】
このようにＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子の発現を人為的に制御することにより花形態の改変が可能となる。とくに今回得られた日本産スイレン科のＢクラスＭＡＤＳボックス遺伝子はきわめて原始的なスイレン科の進化的位置と花の多様性（スイレン科は、同花被花で各器官が輪生配列する単子葉類的特徴を持つジュンサイ、ハゴロモモを含むハゴロモモ亜科と異花被花で螺旋配列のオニバス、コウホネ、ヒツジグサを含むヒツジグサ亜科に分けられる。ヒツジグサでは花弁と雄ずいの間に中間的器官（花弁様雄ずい）を持つことも特徴である。）から、がく片を花弁様に改変した花の創生、雄ずいを花弁様に改変した花の創生など従来よりもより多様な種類の花の改変が期待出来、新たな美的価値を持つ花の創生を可能にするものである。
【実施例】
【００１８】
本実施例では上記の全５種類の植物（ヒツジグサ、オニバス、ハゴロモモ、ジュンサイ、コウホネ）に対し、各２種ずつ、全１０種の塩基配列について特定を行った。なお上記いずれにおいても以下の作業をほぼ同じく行った。
【００１９】
（Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡの抽出）
まず、Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡの抽出はμＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて行った。
【００２０】
まず若い花芽１００ｍｇを乳鉢に入れ、液体窒素で凍らせながら細粉状になるまで粉砕し、この粉末試料を１．５ｍｌだけチューブに薬さじで移した。そしてこのチューブにＬｙｓｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを１．０ｍｌ加えて細胞を融解させた（なお細胞を溶解させた後の液を以下単に「細胞溶解液」という）。そしてこの細胞融解液をμＬｉｓａｔｅＣｌｅａｒ  Ｃｏｌｕｍｎがセットされた遠心チューブに移し、遠心分離機を用いて遠心分離させた。なお回転数は１５０００ｒｐｍ、時間は３分間とした。そしてμＬｉｓａｔｅＣｌｅａｒ  Ｃｏｌｕｍｎを遠心チューブから除き、遠心チューブ内の細胞融解液にＯｌｉｇｏ  （ｄＴ）  ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓを５０μｌ加え、泡立てないように２、３回ピペッティングにより混合した。次に、μＭＡＣＳ（マグネット）にＭＡＣＳ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｙｐｅ  μと洗浄液を受けるチューブをセットし、カラム上部からＬｙｓｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを流し入れた後、先ほど得た細胞溶解液を流し入れ、Ｏｌｉｇｏ  （ｄＴ）  ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓを吸着させた。
【００２１】
その後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ２００μｌを２回、カラム上部から通し、たんぱく質やＤＮＡを取り除いた。そして更に、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１００μｌを４回、カラム上部から通し、ｒＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡを除いた。そして最後に６５℃に加温したＤＥＰＣ処理水１２０μｌをカラム上部からに通し、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）  ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓに吸着したｍＲＮＡを溶出させ、Ｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを得た。
【００２２】
（３’ｒａｃｅ法による標的遺伝子の下流部分の単離）
上記作業により抽出したＴｏｔａｌ  ｍＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ・Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて以下の操作によりｃＤＮＡを合成した。
【００２３】
上記作業により抽出したＴｏｔａｌ  ｍＲＮＡを２μｌ、アダプタープライマーを１μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘを１μｌ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水を１０μｌ、０．２ｍｌのチューブに混合し，６５℃で５分間加熱した後氷上に移し急冷した。そして１０×ＲＴｂｕｆｆｅｒを２μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２を４μｌ、０．１ＭのＤＴＴを２．０μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴを１μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを１μl更に加え、５０℃で５０分間インキュベートした後、８５℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた。その後ＲＮａｓｅＨを１μｌ加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２４】
次にｃＤＮＡをテンプレートとして目的の遺伝子の下流部分を単離するためのＰＣＲ反応を行った。プライマーはこれまでに分かっている保存的配列から、ディジェネレートプライマーを設計したものを用い、もう一つのプライマーはｃＤＮＡ合成で使用したアダプタープライマーの一部と同じ配列をもつアブリッジドユニバーサルアンカープライマー（ＡＵＡＰ）を用いた。なお、設計したプライマーは、ＡＴＧＧＧＩＭＧＩＧＧＩＡＡＲ  ＡＴＨＧＡＲＡであった。
【００２５】
ＰＣＲ反応は５ｕｎｉｔ／μｌ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を０．１２５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマーをそれぞれ１μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを２μｌ、更に減菌蒸留水を適量加えて全量を２５μｌとし、９４℃で２分間加熱した後、９４℃を４５秒、５３℃〜５７℃を４５秒、７２℃を２分のサイクルを３５回繰り返した。
【００２６】
アニーリング温度はプライマー配列に従い５３〜５７℃の間の温度を適時用いた。得られたＰＣＲ産物は先に使用したディジェネレートプライマーより下流側に設計したもう一つのディジェネレートプライマーとＡＵＡＰにより再度ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ産物は分子マーカーで２００ｂｐラダーとともにアガロースゲル用いた電気泳動を行い、目的の遺伝子が増幅しているか確認した。目的の位置にＤＮＡのバンドが出ていた場合、ゲルを剃刀で切り出し、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｆｒｅｚｅ  Ｎ
Ｓｑｕｅｅｚｅ  ＤＮＡ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて精製した。ゲルをカラムに入れ、−３０℃の冷凍庫で凍らした後、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、精製した。
【００２７】
次にＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｄｕａｌ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて増幅断片をＰＣＲ・ベクターに導入した。精製した増幅断片を２μｌ、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを０．５μｌ、２５ｎｇ／μｌ  ＰＣＲ・ベクターを１μｌ、滅菌蒸留水を２μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを０．５μｌ混合し、１４℃で４時間以上反応させ、ライゲーション反応を行った。
【００２８】
次にトランスフォーメーションを行うために、ライゲーション反応液２μｌをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２５μｌに加え、ピペットで軽くかき混ぜた。チューブを氷上に３０分間置いた後、４２℃のウォーターバスに３０秒間浮かべ、ヒートショックした後氷上で急冷し、大腸菌へベクターを取り込ませた。その後常温のＳＯＣ（２．０％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％
ＮａＣｌ、０．０２％  ＫＣｌ、０．４％  ＭｇＣｌ２  １２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を２００μｌ加え、３７℃、２２５ｒｐｍで一時間インキュベートした。
【００２９】
そしてこれを１００μｇ／ｍｌアンピシリン濃度のＬＢ培地（１．０％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％  ＮａＣｌ、１．５％  Ｂａｃｔｏ  Ａｇｅｒ）に流し入れ、３７℃で６時間インキュベートした。培養後、滅菌爪楊枝でシングルコロニーを拾い、ナンバリングされたマスタープレートヘと植えかえた。マスタープレートは３７℃で１６時間インキュベートした後、４℃の冷蔵庫で保存した。
【００３０】
シングルコロニーに対しダイレクトＰＣＲを行い、プラスミドヘ組み込まれたｃＤＮＡの長さを確認した。ＰＣＲの反応液組成は１０×Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒを１μl、２．５ｍＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを０．８μｌ、１０ｐｍｏｌ  Ｍ１３＋Ｐｒｉｍｅｒを０．５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｍ１３−Ｐｒｉｍｅｒを０．５μｌ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を０．０５μｌ、滅菌蒸留水を７．２μｌ加え、全量１０μｌの反応液を作り、滅菌爪楊枝を用いてコロニーを反応液に入れたものをＰＣＲ反応液として９４℃で１分、５２℃で１分、７２℃で２分のサイクルを３０回行った。
【００３１】
次に、このＰＣＲ産物を１．０％  ＴＡＫＡＲＡ  ＬＯ３−０．５×ＴＢＥアガロースゲルで２００ｂｐラダーマーカーとともに電気泳動を行い、インサート断片のサイズを確認した。そして目的のサイズのバンドが出たものは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ＿３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたダイレクトシークエンス法で目的領域の塩基配列を決定した。
【００３２】
精製したＰＣＲ産物をテンプレートＤＮＡとし、ＢｉｇＤｙｅ・Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ２．０  １００ＲＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサイクルシークエンスを行った。得られた配列は既知のＭＡＤＳボックス遺伝子のアミノ酸配列と比較してアライメントを行い、アライメントできた配列について既知のＭＡＤＳボックス遺伝子の配列とともにコンピュータアプリケーションソフトＰＨＹＬＩＰ  ｖｅｒ．３．５６に含まれるＰＲＯＴＯＤＩＳＴでＤａｙｈｏｆｆ−ＰＡＭ  ｍａｔｒｉｘに基づく遺伝子距離を算出し、ＮＥＩＧＨＢＯＲを用いて近隣接合法（ＮＪ法）による遺伝子系統樹を構築した。それによりシロイヌナズナのＡＰ３及びＰＩに相同性を持つ遺伝子を選別した。
【００３３】
（５'ｒａｓｅ法による標的遺伝子の上流部分の単離）
先の３３'ｒａｃｅ法は標的遺伝子の後半部分しか得られないため、その前半部分を５'ｒａｃｅ法により単離した。
【００３４】
３'ｒａｃｅ法で得られた標的遺伝子の後半部分の配列を基に遺伝子特異的プライマーを設計した。表１にそのプライマーを示す。
【表１】
2006081493.tif 000002
【００３５】
まずＧＳＰ１を用いて先に単離したｍＲＮＡから新たなｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡに５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ  Ｖ．２．０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いてＴｄＴ−ｔａｉｌｉｎｇ法によりｐｏｌｙ−Ｃ配列の付加を行ったあとＧＳＰ２とキットに添付の５’ｒａｃｅ
Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒにて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。つづいてＧＳＰ３とキットに添付のＡＵＡＰによる２ｎｄ  ＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物は３’ｒａｃｅ法と同様なプロセスを経て塩基配列を決定した。遺伝子全長の単離先の３'ｒａｃｅ法と５'ｒａｃｅ法で得られた配列を基に開始コドンより上流側に一つ、終始コドンより下流側に一つＰＣＲプライマーを設計し、３'ｒａｃｅ法実験時に作成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、目的遺伝子の全長配列を得ることができた。なお、本実施形態において取得した遺伝子の対応は以下のとおりである。
【表２】
2006081493.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３６】
上記のとおり、ＭＡＤＳボックス型転写因子を標的として植物の花型を改変することにより、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することができる。
【配列表】
2006081493000001.app