(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なDNA結合性物質を迅速に同定し、また、公知のDNA結合性物質におけるDNA結合能を迅速に評価する方法を提供する。【解決手段】ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるビーズに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程と、上記ビーズを洗浄する工程と、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対照物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズとを分離する工程とを含むDNA結合物質の同定方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるビーズに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、
検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程と、
上記ビーズを洗浄する工程と、
上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対象物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズと分離する工程とを含む
DNA結合性物質の同定方法。
【請求項２】
上記ビーズを洗浄する工程は、上記DNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域では解離させる条件で実施することを特徴とする請求項１記載のDNA結合性物質の同定方法。
【請求項３】
上記ビーズに固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする請求項１記載のDNA結合性物質の同定方法。
【請求項４】
上記分離する工程の後、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に結合した検査対象物質を回収する工程をさらに含む請求項１記載のDNA結合性物質の同定方法。
【請求項５】
ゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるビーズに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、
検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程と、
上記ビーズを洗浄する工程と、
上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対象物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズと分離する工程とを含む
検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【請求項６】
上記ビーズを洗浄する工程は、上記DNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする請求項５記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【請求項７】
上記ビーズに固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする請求項５記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【請求項８】
上記分離する工程の後、上記検査対象物質が結合した領域の塩基配列を決定する工程をさらに含む請求項５記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAを固定化したビーズを用いたDNA結合性物質の同定方法及び検査対象物質のDNA結合能検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現やゲノムの複製等には、所定の塩基配列を認識してDNAに結合するDNA結合タンパク質が関与していることが知られている。例えば、癌細胞と正常細胞においては、DNA結合タンパク質の一種である転写因子が相違することが知られている。よって、転写因子等のDNA結合性タンパク質の相違を検出することで、癌細胞を検出できたり、癌の診断を行うことができる。また、DNA結合タンパク質に限らずDNAに結合する物質（DNA結合性物質）を新たに同定することによって、細胞の癌化メカニズムを解明したり、薬剤の開発に寄与する事が可能となる。
【０００３】
DNA結合性物質を解析する際、アフィニティクロマトグラフィの原理を応用することが考えられる。すなわち、アフィニティカラムにリガンドとして二重鎖DNAを充填して、カラムにアプライする試料に含まれるDNA結合性物質を回収することができる。しかしながら、アフィニティカラム等を用いた回収方法では、1種類のリガンド（この場合は二重鎖ＤＮＡ）しか使用できないということと、そのリガンドに結合したか否かは、回収した溶液を調べない限りは判定が不可能であるといった不都合がある。
【０００４】
そこで、DNA結合性物質を効率よく検出する手法は、十分に開発されておらず新たな手法が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２８４５５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、新規なDNA結合性物質を同定できたり、また、公知のDNA結合性物質におけるDNA結合能を評価することができるDNA結合性物質の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
(1)ゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるビーズに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程と、上記ビーズを洗浄する工程と、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対象物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズと分離する工程とを含むDNA結合性物質の同定方法。
【０００８】
(2)上記ビーズを洗浄する工程は、上記DNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域では解離させる条件で実施することを特徴とする(1)記載のDNA結合性物質の同定方法。
【０００９】
(3)上記ビーズに固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする(1)記載のDNA結合性物質の同定方法。
【００１０】
(4)  上記分離する工程の後、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に結合した検査対象物質を回収する工程をさらに含む(1)記載のDNA結合性物質の同定方法。
【００１１】
(5)ゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるビーズに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程と、
上記ビーズを洗浄する工程と、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対象物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズと分離する工程と上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程と含む検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【００１２】
(6)上記ビーズを洗浄する工程は、上記DNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする(5)記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【００１３】
(7)上記ビーズに固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする(5)記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【００１４】
(8)上記分離する工程の後、上記検査対象物質が結合した領域の塩基配列を決定する工程をさらに含む(5)記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、DNA結合性物質の新規な同定方法を提供することができる。本発明に係るDNA結合性物質の同定方法によれば、ゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるビーズを使用するため、未知のDNA結合物質を迅速に同定することが可能となる。
【００１６】
また、本発明により、検査対象物質のDNA結合能を検定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るDNA結合性物質の同定方法は、図１に示すように、ゲノムを断片化したDNA断片を固定してなるビーズにプローブをハイブリダイズさせる工程１（図１中“Ｓ１”と表記する。以下同様。）と、検査対象物質を含む溶液を上記ビーズに接触させる工程２と、上記ビーズを洗浄する工程３と、上記DNA断片と上記プローブとハイブリダイズした領域に上記検査対象物質が結合してなるビーズを、上記検査対象物質が結合してないビーズと分離する工程４と、分離したビーズに結合したDNA結合性物質を回収する工程５とを備える。
【００１８】
本DNA結合性物質の同定方法において、ビーズとしては、DNAを結合する能力を有するビーズであれば何ら限定されることなく使用することができる。使用可能なビーズの例としては、磁性ビーズ、ラテックスポリマービーズの表面にストレプトアビジンが化学的に結合したもの、等を挙げることができる。より具体的に、使用可能なビーズとしては、市販されている、ポリサインス社のポリビーズ（http://www.technochemical.com/polymer/beads/polybead/plbead.htm）、マグナバインド社の磁性ビーズ（http://www.technochemical.com/pierce/protein/purification/mgnabeads/magnbead.htm）等を挙げることができる。
【００１９】
本DNA結合性物質の同定方法においては、先ず、図２に示すように、DNA断片２を固定化したビーズを含む溶液を準備する。DNA断片２は、ゲノムの領域毎に固定化される。すなわち、１つのビーズ１は、ゲノムの所定の領域に由来するDNA断片２が固定化されている。DNA断片２の鎖長は、100〜1000merであることが好ましい。DNA断片２が100mer未満である場合にはビーズ１に対して固定化することが困難であり、また、DNA断片２が1000merを超える場合にはプローブが結合した位置の検出精度が低下する虞がある。従って、DNA断片２の鎖長を100〜1000merとすることによって、優れた検出精度でDNA結合性物質を同定することができる。DNA断片２としては、化学的に合成したものでも、ＰＣＲ等の生化学的増幅したものでも特に問わない。
【００２０】
次に、本DNA結合性物質の同定方法においては、図３に示すように、ビーズ１に固定化されたDNA断片２に対してプローブ３をハイブリダイズさせる（工程１）。本DNA結合性物質の同定方法においてプローブ３は、４〜２０merであることが好ましい。プローブ３が４mer未満である場合には、DNA結合タンパク質等のDNA結合性物質が当該プローブ３を認識することができず、結合しない虞がある。また、プローブ３が２０merを超える場合には、DNA結合性物質の認識配列を繰り返し含むことがあり、好ましくない。したがって、プローブ３を４〜２０merとすることで、DNA結合タンパク質等のDNA結合性物質の当該プローブ３に対する結合能を確実に評価することができる。
【００２１】
また、プローブ３の塩基配列は、特に限定されず、いかなる塩基配列であっても良い。例えば、ランダム合成によって合成されたプローブを使用することができる。また、プローブ３の塩基配列としては、４種類の塩基全ての組合せの塩基配列を設計してもよい。さらに、プローブ３としては、既知のDNA結合性タンパク質が認識して結合する既知の配列の一部又は全部を含む塩基配列であってもよい。
【００２２】
また、プローブ３には、標識物質４が結合していることが好ましい。標識物質４としては、蛍光標識物質、磁気標識物質及び放射性同位元素標識物質等を挙げることができるが、これらに限定されず如何なる標識物質であっても良い。好ましくは、蛍光標識物質としてCy5またはCy3を結合したプローブを使用することができる。
【００２３】
工程１において、DNA断片２にプローブ３をハイブリダイズさせるには、例えば、２５℃の４ｘＳＳＣ溶液にて5分間の条件とすることができる。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、これに限定されない。工程１によって、DNA断片２とプローブ３とからなる２本鎖を形成することができる。
【００２４】
次に、本DNA結合性物質の同定方法においては、図４に示すように、プローブ３がハイブリダイズしたDNA断片２を固定化したビーズ１を含む溶液に、検査対象物質を添加する（工程２）。工程２において、タンパク質等の検査対象物質は、溶液として添加されることが好ましい。検査対象物質としては、DNAに結合することが知られている既知のDNA結合性物質であっても良いし、DNAに対する結合能が未知である物質であっても良い。ここで、物質とは、タンパク質、有機化合物、無機化合物、高分子化合物、低分子化合物のいずれに属する物質であっても良い。検査対象物質としては、タンパク質であることが好ましい。
【００２５】
また、検査対象物質を含む溶液は、精製した検査対象物質を含む溶液であっても良いし、クルード状態のタンパク質混合物を含む溶液であっても良く、特に限定されない。精製した検査対象物質を含む溶液を使用する場合、タンパク質濃度は1nM〜1mMが好ましい。
検査対象物質にDNA結合性物質５が含まれている場合には、工程２によって、工程１で形成された２本鎖に当該DNA結合性物質５が結合した複合体が形成されることとなる（図３参照）。
【００２６】
次に、本DNA結合性物質の同定方法においては、図５に示すように、洗浄液によってDNAビーズ１を洗浄する（工程３）。詳細には、洗浄液で洗浄することによって、ハイブリダイズしたDNA断片２とプローブ３とを、DNA結合性物質５が結合した領域では解離させず、DNA結合性物質５が結合していない領域で解離させることができる。すなわち、工程３によって、工程２で形成された２本鎖とDNA結合性物質５との複合体は維持されるが、複合体が形成されていない２本鎖領域ではプローブが解離することとなる。その結果、検査対象物質が結合した領域ではDNA断片とプローブとのハイブリダイズが維持されることとなる（図５参照）。工程３で使用可能な洗浄液としては、例えば、純水等を挙げることができる。
【００２７】
次に、本DNA結合性物質の同定方法においては、図６に示すように、DNA断片２とプローブ３とハイブリダイズした領域にDNA結合性物質５が結合しているビーズを、DNA結合性物質５が結合してないビーズと分離する（工程４）。具体的には、プローブ３に付着させた標識物質４の有無に基づいて、DNA結合性物質５が結合しているビーズとDNA結合性物質５が結合していないビーズとを分離する。より具体的に工程４は、セルソータを備えるフローサイトメーターを用いて実施することができる。使用可能なフローサイトメーターとしては、標識物質４を検出することができるとともに、ビーズ１を分離できるものであれば特に限定されない。市販のフローサイトメーターとしては、ベクトンデッキンソン社のファックスキャリバー（http://www.bdj.co.jp/flow/）、やベックマンコールター社（http://www.bc-cytometry.com/index.html）等を使用することができる。
【００２８】
次に、本DNA結合性物質の同定方法においては、図７に示すように、分離したビーズに結合したDNA結合性物質を回収する（工程５）。DNA結合性物質は、溶液の塩濃度を上げることによって、DNA断片２とプローブ３との２本鎖領域から分離することとなる。本工程を経ることによって、工程２で添加した検査対象物質からDNA結合性物質を単離することができる。以上のように、本DNA結合性物質の同定方法によれば、新規なDNA結合性物質を迅速に同定することができる。
【００２９】
一方、検査対象物質として既知のDNA結合性物質を使用した場合、当該既知のDNA結合性物質が結合する新規な領域を同定することができる。この場合、工程５でDNA結合性物質を回収した後、当該DNA結合性物質が結合していた領域の塩基配列を定法に従って決定する。例えば、既知のDNA結合タンパク質に変異を導入してなる変異型DNA結合タンパク質を、検査対象物質とすることで、変異型DNA結合タンパク質のDNA結合能を迅速に評価することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
本実施例では、DNA結合タンパク質としてTRF１タンパク質を使用した。TRF１タンパク質は、TTAGGGの繰り返し配列に対して結合することが知られているDNA結合性物質の一つである。
【００３２】
本例では、先ず、ビーズno.77とno.92（Luminex社製）にそれぞれDNA断片としてgaTagggTTAgggとgTTaggATTAgggの２種類をそれぞれ結合した。また、プローブとしては、上記の配列に対する相補鎖にCy3を結合したものを使用した。これらプローブは、上記DNA断片を固定化したビーズを含む600mMのNaCl水溶液中50μLでハイブリダイゼーションを行い、二重鎖とした。
【００３３】
その後、150mMのNaCl溶液でビーズを洗浄し、同じ濃度のNaCl溶液で100μLに調整した。
【００３４】
次に、上述したように調整したビーズを含む溶液に、50μMの調整済みのTRF１溶液（Chong L, van Steensel B, A human telomeric protein.Science. 1995 Dec 8;270(5242):1663-7.）を10μL添加した。そして、１分間ほどよく攪拌して混合した後、ビーズを純水で３回洗浄した。
【００３５】
上述した実施例の各段階で、Cy3に由来する蛍光強度を測定した測定結果を表１に示す。なお測定にはLuminex社製のフローサイトメーターであるLumienx100測定器にて各ビーズを１００個まで測定した値のλmaxの値を採用した（値の分布図の最大値）。
【００３６】
【表１】
2006284478.tif 000003
【００３７】
表１においてSample.1は、DNA断片を固定化したビーズをそのまま測定した結果である。つまり、本値はバックグランドを示している。したがって、他のサンプルにおいて、最終的に測定値から本値を引いた値が真値となる。
【００３８】
Sample.2は、プローブとDNA断片をハイブリダイズさせた状態のビーズを測定した値である。蛍光強度の相対値であるが、Sample.1と比較すると格段に強度が高いことから、相補鎖が問題なくハイブリダイゼーションしていることが分かる。
【００３９】
Sample.3は、TRF１タンパク質を添加せずに、プローブとDNA断片がハイブリダイゼーションしたビーズを純水で３回洗浄した後に測定した結果である。Sample.4は、プローブとDNA断片がハイブリダイゼーションしたビーズにTRF1タンパク質を作用させ、その後、純水で３回洗浄した後に測定した結果である。
【００４０】
Sample.2及びSample.3の結果を比較すると、純水で洗浄することでハイブリダイゼーションしていた二重鎖DNAが乖離していることが分かる。これに対して、Sample.4は急激に値が上昇していることから、ビーズに固定化された二重鎖DNAにDNA結合性タンパク質がしっかりと結合していることが分かる。
【００４１】
さらに、Sample.4の測定値は、Sampl.2の測定値よりも大幅に高い値を示している。この結果から、これはビーズの周りに浮遊しているCy3標識されたDNA（プローブ）を、DNA結合性タンパク質が存在することでさらに強く取り込んでいる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法のフローチャート。
【図２】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法で使用するビーズを模式的に示す図である。
【図３】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法における工程１を模式的に示す図である。
【図４】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法における工程２を模式的に示す図である。
【図５】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法における工程３を模式的に示す図である。
【図６】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法における工程４を模式的に示す図である。
【図７】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法における工程５を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００４３】
１…ビーズ
２…DNA断片
３…プローブ
４…標識物質
５…DNA結合性物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006284478.tif 000009
【図７】
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