(57)【要約】【課題】神経成長因子作用増強剤を提供する。【解決手段】神経成長因子作用増強剤はイソチオシアネート化合物またはその配糖体を含有するものとする。イソチオシアネート化合物は、アブラナ科に属する植物由来のイソチオシアネートを用いることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソチオシアネート化合物またはその配糖体を含有する、神経成長因子作用増強剤。
【請求項２】
前記イソチオシアネート化合物は、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物を含む、請求項１に記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項３】
前記イソチオシアネート化合物は、アリルイソチオシアネート、アリールアルキルイソチオシアネートおよびスルフィニルアルキルイソチオシアネートから選択される１種あるいは２種以上である、請求項１または２に記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項４】
前記イソチオシアネート化合物は、メチルスルフィニルアルキル基（ただし、アルキル基は炭素数４以上８以下の直鎖アルキル基である。）である、請求項３に記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項５】
アブラナ科植物から選択される１種あるいは２種以上の植物の抽出物あるいは該植物抽出物から得られる画分を含有している、請求項１〜４のいずれかに記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項６】
アブラナ科に属する植物から選択される１種あるいは２種以上の植物の抽出物あるいは該抽出物から得られる画分を含有する、神経成長因子作用増強剤。
【請求項７】
前記アブラナ科に属する植物は、キャベツ、チンゲン菜、ラディッシュ、クレソン、ブロッコリー、ハクサイ、コマツナ、カラシナ、ミズナ、ダイコン、カリフラワー、芽キャベツおよびワサビからなる、請求項６に記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項８】
前記アブラナ科に属する植物は、チンゲン菜、ミズナおよびワサビからなる、請求項７記載の神経成長因子作用増強剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の神経成長因子作用増強剤を有効成分として含有する、神経成長因子作用増強組成物。
【請求項１０】
神経成長因子を含有する、請求項９に記載の神経成長因子作用増強組成物。
【請求項１１】
食品組成物である、請求項９又は１０に記載の神経成長因子作用増強組成物。
【請求項１２】
前記神経成長因子作用増強剤を有効量含有する、神経成長因子作用の増強が必要とされる疾患の治療用あるいは予防用の医薬組成物である、請求項９又は１０に記載の神経成長因子作用増強組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子の作用を増強する神経成長因子作用増強剤及び該増強剤を含有する神経成長因子作用増強組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症やパーキンソン病などのいわゆる神経変性疾患の予防・治療方法の開発が強く要望されている。神経変性疾患とは、病理学的に特定の神経細胞群の神経細胞変性を主体とし、現時点において血管障害性、感染性、代謝障害などの病因を特定できないものである。アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症およびパーキンソン病の変性主体はそれぞれ、大脳皮質ニューロン、脊髄前角運動ニューロン、中脳黒質ドーパミンニューロンとされている。また、これらの神経変性疾患と同様、他の疾患や老化に起因するとされる末梢神経障害などの神経の変性・脱落を伴う神経疾患についても同様に予防・治療方法の開発が望まれている。
【０００３】
神経成長因子（Nerve Growth Factor；ＮＧＦ）は、いくつか知られた神経栄養因子の一つであって、分子量１３万、a2b2サブユニット構造を備えるタンパク質である。神経成長因子は、中枢神経系および抹消神経系における神経細胞の生存維持、分化、成熟、機能発現等多様の薬理作用を有していることが知られ、シナプス形成を標的側のニューロン細胞あるいは非ニューロン細胞から導く神経突起伸長作用の実体とされている（非特許文献１）。神経成長因子は、各種の神経変性疾患を含む神経疾患との関連が知られている。したがって、神経成長因子を利用した各種の神経疾患の予防・治療方法の開発が期待されている。
【０００４】
このための試みの一つとして、神経変性疾患等の患者に対して神経成長因子を投与する試みがなされているが（非特許文献２）、神経成長因子がタンパク質であって脳血液関門を通過できないことなど、標的器官へのターゲッティングに関して難点があるため、現段階では十分な結果は得られていない。また、ターゲティングの問題を克服するために、神経成長因子様の作用を発現する低分子化合物も探索されており、スタウロスポリン様アルカロイド、イムノフィリンリガンド、シクロペンテノン型プロスタグランジンなどが見出されている（非特許文献１）。しかしながら、それ自体が有するホルモン様の作用、免疫抑制作用等が有効な治療法の確立を妨げている。したがって、これらの神経疾患に対する有効な予防・治療方法は未だ見出されていないのが現状である。
【０００５】
一方、近年、キャベツ、ブロッコリー、わさびなどのアブラナ科植物の抽出物あるいはこれらの植物に辛味成分として含まれているイソチオシアネート化合物のがん予防効果が疫学及び動物実験により示唆され、これらはがんの化学予防作用が最も期待される食品因子の一つとして注目されている。イソチオシアネート化合物としては、ワサビに含まれるアリルイソチオシアネートや６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、キャベツやクレソンなどに含まれるベンジルイソチオシアネートやフェネチルイソチオシアネート、ブロッコリーに含まれるスルフォラファンなどがある。古くからこれらのイソチオシアネート化合物は、抗菌作用を有することが知られていたが、そのがん予防効果は、発がん物質の代謝活性化、あるいはその結果生成した発がん物質の無毒化にあるとされている。前者は、phase Ｉ酵素（チトクロームP450）の抑制、後者は、phase II酵素（キノンレダクターゼ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ；GST）の誘導に由来している。イソチオシアネート化合物については、この他、発がん抑制に関連する生理作用としてアポトーシス誘導作用を有することも報告されている。しかしながら、アブラナ科植物由来の成分と神経成長因子の神経突起伸長作用などの作用との関連については未だ報告はなく、また、両者の関連についての示唆も全くされていない。
【非特許文献１】佐藤択巳「神経栄養因子様低分子プローブ」、日本薬理学会誌 第１２０巻、p.327−334（2002）
【非特許文献２】荒川義弘、伊賀立二「創薬を目指した神経栄養因子研究」、組織培養工学27、p.506-510、ニューサイエンス社（2001）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
各種の神経疾患を予防、治療ないし改善する観点からは、疾患部位において有効量の神経成長因子を発現あるいは到達させることのみならず、疾患部位あるいはそれ以外の部位において神経成長因子の作用を効果的に増強できる化合物が望まれる。また、こうした化合物は、被検者において持続的に摂取可能な化合物であることが好ましい。
【０００７】
そこで、本発明は、神経成長因子作用増強剤および該増強剤を含有する神経成長因子作用増強組成物を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、食品因子に由来する神経成長因子作用増強剤および該増強剤を含有する神経成長因子作用増強組成物を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アブラナ科植物に着目し、アブラナ科植物の抽出物につき神経突起伸長作用を検討したところ、この抽出物が神経成長因子の神経突起伸長を増強することを見出し、さらに、イソチオシアネート化合物が該増強作用に寄与していることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００９】
本発明の一つの形態によれば、イソチオシアネート化合物またはその配糖体を含有する、神経成長因子作用増強剤が提供される。この形態においては、前記イソチオシアネート化合物は、アリルイソチオシアネート、アリールアルキルイソチオシアネートおよびスルフィニルアルキルイソチオシアネートから選択される１種あるいは２種以上であることが好ましい態様である。また、前記イソチオシアネート化合物は、メチルスルフィニルアルキル基（ただし、アルキル基は炭素数４以上８以下の直鎖アルキル基である。）であることがさらに好ましい態様であり、より好ましくはメチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートである。さらにまた、これらのＮＧＦ作用増強剤は、アブラナ科に属する植物から群から選択される１種あるいは２種以上の抽出物あるいは該植物抽出物から得られる画分を含有していることが好ましい態様である。
【００１０】
本発明の他の一つの形態によれば、アブラナ科に属する植物からなる群から選択される１種あるいは２種以上の植物抽出物あるいは該抽出物から得られる画分を含有する、神経成長因子作用増強剤が提供される。この形態においては、前記アブラナ科に属する植物は、キャベツ、チンゲン菜、ラディッシュ、クレソン、ブロッコリー、ハクサイ、コマツナ、カラシナ、ミズナ、ダイコン、カリフラワー、芽キャベツおよびワサビからなることが好ましい態様である。該植物は、より好ましくは、チンゲン菜、ミズナおよびワサビからなる。また、この形態においては、前記植物抽出物あるいは前記画分は、メチルスルフィニルアルキル基（ただし、アルキル基は炭素数４以上８以下の直鎖アルキル基である。）を含有することが好ましい態様であり、より好ましくはメチルスルフィニルへキシルイソチオシアネートである。
【００１１】
また、本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの神経成長因子作用増強剤を含有する、神経成長因子作用増強組成物が提供される。この組成物においては、神経成長因子を含有することが好ましく、食品組成物であることが好ましい態様であり、さらに、前記神経成長因子作用増強剤を有効量含有する、神経成長因子作用の増強が必要とされる疾患の治療用あるいは予防用の医薬組成物であることも好ましい態様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＮＧＦ作用増強剤は、イソチオシアネート化合物またはその配糖体を含有していることを特徴としている。イソチオシアネート化合物は、アブラナ科植物に特有の辛味成分として知られている。本発明者らによれば、ＮＧＦの共存下、ＮＧＦの典型的作用である神経突起伸長作用を増強することを見出した。イソチオシアネート化合物は、従来、ＮＧＦ作用増強剤として知られている化合物とは構造が大きく異なっている。イソチオシアネート化合物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導作用を有するが、本発明におけるＮＧＦ作用は、これらの生理活性とは全く異なるものである。イソチオシアネート化合物によるＮＧＦ作用増強効果の作用機作は必ずしも明らかではないが、ＮＧＦ作用増強効果が植物由来の食品因子に見出されたことにより、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与に適したＮＧＦ作用増強剤が提供されることになる。
【００１３】
以下、本発明の一形態であるＮＧＦ作用増強剤について説明するとともに、該増強剤を含有するＮＧＦ作用増強組成物ならびにその用途について説明する。
【００１４】
（イソチオシアネート化合物）
本発明におけるイソチオシアネート化合物は、イソチオシアネート基を有しＮＧＦ作用増強効果を有する限りその構造は限定されないが、好ましくは、アルキルイソチオシアネート、アルケニルイソチオシアネート、アリールアルキルイソチオシアネート、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが挙げられる。
【００１５】
アルキルイソチオシアネートとしては、アルキル基として、例えば、炭素数１〜６の直鎖アルキル基あるいは分岐状アルキル基を有するアルキルイソチオシアネートが挙げられ、具体的には、メチルイソチオシアネート、エチルイソチオシアネート、ｎ−プロピルイソチオシアネート、イソプロピルイソチオシアネート、ｎ−ブチルイソチオシアネート、イソブチルイソチオシアネート、アミルイソチオシアネート、イソアミルイソチオシアネート、ヘキシルイソチオシアネートが挙げられる。
【００１６】
また、アルケニルイソチオシアネートとしては、例えば、炭素数が３以上８以下の直鎖アルケニル基を有するアルケニルイソチオシアネートが挙げられ、具体的には、アリルイソチオシアネート、３−ブテニルイソチオシアネート、５−へキセニルイソチオシアネート、４−ペンテニルイソチオシアネート、６−ヘプテニルイソチオシアネートなどが挙げられる。
【００１７】
アリールアルキルイソチオシアネートとしては、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、ｐ−ハイドロオキシベンジルイソチオシアネートなどが挙げられる。さらに、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートとしては、例えば、アルキル基の炭素数が４以上８以下のものが挙げられ、具体的には、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート、５−メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、７−メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネート、８−メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートが挙げられる。
【００１８】
これらのイソチオシアネート化合物のなかでも、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが好ましい。メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートにおいては、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートである。
【００１９】
また、イソチオシアネート化合物としては、これらの各種イソチオシアネートの誘導体も好ましく用いることができる。誘導体としては、これらの各種イソチオシアネート化合物において、水素原子が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アリールアルキル基などの炭化水素基、水酸基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエーテル基などの置換基によって置換されたものを挙げることができる。炭化水素基としては、好ましくは、炭素数１〜５程度の直鎖状あるいは分岐状炭化水素基である。
【００２０】
本増強剤におけるイソチオシアネート化合物としては、これらのイソチオシアネートを１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
このようなイソチオシアネート化合物の少なくとも一部は、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物である。また、これらのイソチオシアネート化合物の多くはその誘導体である。アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物としては、アリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート、５−メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、７−メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネート、８−メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートなどが挙げられる。アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物はそれぞれ異なる構造を有しているが、いずれも、ＮＧＦ作用増強効果を有している。したがって、本発明の増強剤の一形態として、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物を含有するものとしてもよい。ここで、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物とは、アブラナ科植物から得られうることを意味するものである。
【００２２】
アブラナ科植物においては、イソチオシアネート化合物は、シニグリン（ワサビ中のアリルイソチオシアネートの配糖体）やシナルビン（洋カラシ中のパラハイドロオキシイソチオシアネートの配糖体）などの配糖体（グルコシノレート）として細胞内に存在している。イソチオシアネート化合物は、配糖体が細胞破壊によってミロシナーゼ等の酵素と接触することにより生成される。かかる配糖体は、ヒトを含む動物の腸内においてもイソチオシアネート化合物に変換されることが知られている。したがって、本発明の増強剤は、イソチオシアネート化合物に替えてあるいは該化合物とともにイソチオシアネート化合物の配糖体を含有することができる。イソチオシアネート化合物の配糖体は、アブラナ科植物から抽出することができる。イソチオシアネート化合物の配糖体は、イソチオシアネート化合物の独特の辛みを有していない。したがって、食品、飼料あるいは医薬用途に本増強剤を用いる場合に有用である。
【００２３】
したがって、本増強剤の一形態として、本増強剤は、アブラナ科植物の植物体の全体、あるいはその一部である果実、種子、種皮、花、茎、葉、根および／または根茎をそのまま、あるいはこれらを粉砕、乾燥等の処理を施した処理物を含有することができる。さらに、こうしたアブラナ科植物の全体、その一部あるいは処理物を原料とするアブラナ科植物の抽出物あるいは該抽出物から得られる画分とすることもできる。なお、いわゆる野菜として供給されているアブラナ科植物であっても、一般的に食用に供される可食部位のほか、非可食部位も部位、その処理物さらにはこれらの抽出物等も、本増強剤に含めることができる。
【００２４】
アブラナ科植物としては、カブ、キャベツ、チンゲン菜、ラディッシュ、クレソン、ブロッコリー、ハクサイ、コマツナ、カラシナ、ミズナ、ダイコン、カリフラワー、芽キャベツおよびワサビなどが挙げられる。本増強剤の原料としては、１種あるいは２種以上のアブラナ科植物から得ることができる。なかでも、カブ、キャベツ、チンゲン菜、ラディッシュ、クレソン、菜の花、ブロッコリー、カラシナ、ミズナ、ダイコン、カリフラワー、ワサビが好ましく用いられ、より好ましくは、チンゲン菜、ミズナおよびワサビである。
【００２５】
また、イソチオシアネート化合物として、アリルイソチオシアネートを主として含む増強剤は、ワサビ、キャベツおよびセイヨウカラシナ等のアブラナ科植物を原料とすることができる。また、アリールアルキルイソチオシアネートを主として含有する増強剤は、キャベツ、クレソンおよびカブ等を原料とすることができる。さらに、ルフィニルアルキルイソチオシアネートを主として含有する増強剤は、ワサビ、ブロッコリーおよびカリフラワー等を原料とすることができる。
【００２６】
なお、アブラナ科植物からのイソチオシアネート化合物の抽出は、例えば、アブラナ科植物においてイソチオシアネート化合物が生成するような前処理、例えば、すりおろしなどによる破砕あるいは粉砕ないし細断をした後、必要に応じてイソチオシアネート化合物が十分に生成される時間経過後において適当な溶媒で抽出することにより行うことができる。抽出溶媒としては、アブラナ科植物の種類にもよるが、水、クロロホルム、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、アミルアルコールなどのアルコール類、あるいはアルコールと水との混液、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどの溶媒を用いることができる。抽出溶媒は、好ましくは、酢酸エチルである。抽出原料に対する抽出溶媒の比率は特に限定しないで適宜決定することができる。また、抽出時間および温度等は、適宜決定することができる。
【００２７】
また、必要に応じて、無水硫酸ナトリウムなどの脱水剤を用いて抽出液を脱水後、溶媒を留去することにより、アブラナ科植物の抽出物、すなわち、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物（ただし、多くの場合、混合物の状態として得られる。すなわち、少なくとも１種あるいは２種以上のイソチオシアネートを含有するが、他の抽出成分をも含有することがある。）を得ることができる。こうして得られるアブラナ科植物の抽出物は、さらに液体クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、抽出、分別沈殿等によって適宜に分画し分取することができる。得られる抽出物の画分を抽出物に替えて用いることもできる。なお、該画分は、かならずしも単一のイソチオシアネート化合物を含有するものでなくてもよい。該画分は、さらに、液液分配法、クロマトグラフィー法、分子蒸溜、精留等、任意の方法によって精製され単離されてもよい。
【００２８】
ＮＧＦ作用増強効果は、本発明者らよりアブラナ科植物由来の各種のイソチオシアネート化合物に見出されたことから、イソチオシアネート基に依存していると考えられる。したがって、各種のイソチオシアネート化合物をＮＧＦ作用増強効果を指標として探索することにより容易にＮＧＦ作用増強効果を有するイソチオシアネート化合物を取得することができる。イソチオシアネート化合物は、化学合成により得ることができる他、既に述べたようにアブラナ科植物から常法に基づいて抽出することもできる。化学合成方法の一例としては、Kiaer等の方法(Kiaer etal. Acta chem.Scand ・11、1298、1957年）を挙げることができる。この方法は、以下の操作によってメチルスルフィニルイソチオシアネートを得ることができる。まず、出発物質としてω−クロロアルケノールを用い、ＣＨ3 −ＳＮａと還流してω−メチルチオアルケノールを得、これにＳＯＣｌ2 を作用させてω−クロロアルケノールメチルサルフアイドを得る。次に、Gabriel 法を用いてアミノ基を導入し、Ｎ−（ω−メチルチオアルキル）−フタルイミドを生成し、これにヒドラジン水化物を加えて還流し、ω−メチルチオアルキルアミンを得る。さらに、Li等の方法（Lietal.J.Org.Chem., 62，4539、1997年）に従い、チウラムジスルフイドを経て得られたω−メチルチオアルキルイソチオシアネートをｍＣＰＢＡでメチルチオ基を酸化し、ω−メチルスルフイニルアルキルイソチオシアネートを得ることができる。
【００２９】
こうして得られた各種イソチオシアネート化合物について、ＰＣ１２細胞などのＮＧＦの作用を確認可能なアッセイ系を用いてＮＧＦ作用増強効果を確認する。ＮＧＦ作用増強効果はＮＧＦの存在下でイソチオシアネート化合物のＮＧＦ作用増強効果を、コントロールとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを用いて評価することができる。ＤＭＳＯよりも高いＮＧＦ作用増強効果を有する場合において、本発明のＮＧＦ作用増強剤として用いるイソチオシアネート化合物であると評価できる。
【００３０】
本増強剤は、上記した各種の形態でＮＧＦ作用増強効果を有するイソチオシアネート化合物を含有する。したがって、本増強剤は、ＮＧＦと神経細胞とが存在する部位において、該神経細胞に対するＮＧＦの作用を増強することができる。特にＮＧＦの各種作用のなかでも、神経突起伸長作用を増強することができる。かかる神経突起伸長作用は、神経細胞の分化に関連し、各種神経疾患の治療、改善、予防において重要な作用である。また、本増強剤は、生体内において到達された部位において内在性のＮＧＦあるいは投与されたあるいは摂取された外来性のＮＧＦの存在下でＮＧＦ作用増強効果を発揮する。このため、ＮＧＦ作用増強効果を発現手法において多様な手法を提供することができる。さらに、本増強剤は、ＮＧＦと異なる低分子化合物であるため、ＮＧＦの場合とは異なり脳内に到達させるための手法に大きな困難性はない。このために、ＮＧＦ作用を脳内において発現させるのに好ましいものとなっている。
【００３１】
また、本増強剤は、食品因子そのもの、食品因子由来化合物、あるいは食品因子から得られる化合物の誘導体を含有する。したがって、ＮＧＦが関連し、ＮＧＦ作用増強が有効であるとされるヒトあるいは非ヒト動物の神経系疾患に対する予防目的あるいは症状の改善目的で持続的に投与あるいは摂取される形態の用途に好ましく用いられる。また、ひいてはヒトあるいは非ヒト動物の健康維持目的あるいは健康改善目的において持続的に摂取される用途に好ましく用いられる。以上のことから、本増強剤は、医薬品、医薬部外品、食品、飲料、栄養補助食品（サプリメント）、飼料および動物用医薬品、あるいはこれらの原材料として有用である。なお、本増強剤が配糖体を含有する場合には、ミロシナーゼなどのイソチオシアネート化合物配糖体からイソチオシアネート化合物を生成させる酵素を、本組成物に含めることができる。なお、ミロシナーゼなどの酵素は、本組成物の摂取時あるいは投与時以降において配糖体に作用することが好ましい。このためには、本組成物が摂取または投与される前までは、酵素が作用しないよう水分が排除されるか両者がマイクロカプセル等により製剤的に隔離されている必要がある。
【００３２】
本増強剤は、各種の形態を有することができる。本増強剤の形態としては、特に限定しないが、粉状、固形状、液状、ペースト状のいずれの形状であってもよい。本増強剤を有効成分として使用する本ＮＧＦ作用増強組成物の利用形態に応じて適宜選択される。本増強剤は、また、各種の態様で使用される。すなわち、上記した用途に用いることができるほか、研究用あるいは試験用試薬として用いることができる。
【００３３】
（医薬組成物）
本増強剤によれば、医薬組成物が提供される。本増強剤を含有する医薬組成物によれば、ＮＧＦ作用増強効果の発現が有効であるとされているアルツハイマー病等の老人痴呆症や末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒等による神経機能の修復・再生を要する各種の神経系疾患の治療または予防に有用である。また、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、黄斑変性症等の治療または予防にも有用である。
【００３４】
本医薬組成物は、本増強剤のほか、ＮＧＦを含有することができる。特に、ＮＧＦの標的部位送達性が障害にならない部位における神経疾患、例えば、脊髄や四肢など抹消神経系における神経疾患に対して本医薬組成物を用いるときには、ＮＧＦを同時に含有することで、確実に本医薬組成物の効果を得ることができる。
【００３５】
本医薬組成物は、本増強剤と公知の医薬用担体とを組み合わせて製剤化することにより得ることができる。製剤化は、本増強剤を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることにより達成される。また、使用時において適当なの添加によって液状となし得る用時溶解性の固形品とすることもできるし、外用剤とすることもできる。
【００３６】
医薬用担体は、本医薬組成物の投与形態及び剤型に応じて選択することができる。経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。一方、非経口剤の場合は、常法に従い、本増強剤を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。あるいは、用時においてこれらの希釈剤によって溶解可能な用時溶解の注射剤等の非経口剤として提供することもできる。
【００３７】
本発明の医薬組成物はその剤型に応じて、内用、外用、注射、点滴、注入、吸引等の適切な投与形態で投与される。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。また、例えば、直接、皮下の疾患あるいは変性部位に塗布、散布、注入等により供給することにより本組成物を投与することができる。なお、かかる投与時には、神経細胞や神経幹細胞を同時に疾患部位等に供給することもできる。このとき、神経細胞および神経幹細胞としては、同種、異種、あるいは他家であってもよいが好ましくは自家のものを用いる。さらに、投与時においては、ＮＧＦも同時にあるいは本医薬組成物の投与に前後して疾患部位等に本医薬組成物とは別個に投与されてもよい。
【００３８】
本医薬組成物を治療目的あるいは予防目的で投与する場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明で使用される増強剤の量として、成人１日当り好ましくは０．００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。なお、投与量は、使用する増強剤の種類のほか種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
【００３９】
なお、これらの本医薬組成物の形態は、外用剤、飲料の経口剤等を含む医薬部外品の各種形態に適用される。
【００４０】
（食品組成物）
本増強剤は、食用あるいは栄養補給用として摂取させるための食品組成物とすることができる。本食品組成物によれば、容易に持続的に本増強剤を摂取することができるため、ＮＧＦが関連する神経系疾患の患者に対しては、該神経系疾患の症状進行の抑制、症状の改善、ＱＯＬの向上に有効である。また、健常者など神経疾患の患者でない者に対しては、神経疾患の予防、健康維持あるいは改善に有効である。なお、ここでいう神経系疾患とは、医薬組成物において述べたのと同様の各種の神経系疾患を含んでいる。
【００４１】
本食品組成物は、各種形態を採ることができる。すなわち、従来公知の食品、飲料、調味料等の形態あるいはその原材料の形態を採ることができる他、散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、エキス剤、液剤（飲料を含む）など主として経口栄養剤であるサプリメント形態あるいはその原材料、チューブ等を介して胃や腸、血管に供給する経管栄養剤形態あるいはその原材料を採ることができる。なお、これらの食品組成物においても、ＮＧＦを含有することができる。
【００４２】
本食品組成物における本増強剤の含有量は特に限定されないが、好ましくは０．０００００１重量％以上、より好ましくは０．００００１〜１００重量％とすることができる。また、本食品組成物は、好ましくは、それらに含有される有効成分が、例えば成人１日当たり好ましくは０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重となるように摂取されうる。なお、摂取量は、使用する増強剤の種類のほか種々の条件によって変動するので、上記摂取量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは上記範囲を超えて必要な場合もある。
【００４３】
（飼料組成物および動物医薬組成物）
本増強剤は、ウシ、ブタ、ヒツジなどの家畜、ニワトリ、七面鳥、ウズラなどの家禽、ブリ、ハマチ、コイ、ウナギなどの養殖魚、エビ、カニなどの甲殻類、ホタテ、カキなどの貝類、イヌ、ネコなどのペット、およびラット、マウス、イヌなどの研究用動物の飼料用組成物あるいは動物医薬組成物とすることができる。これらの組成物によれば、家畜等において、持続的に容易に本増強剤を摂取させることができるため、ＮＧＦ関連の疾患を治療し、症状改善、進行抑制および予防するほか、健康維持あるいは改善に有効である。また、これらの結果として、歩留まりが向上するほか、肉質、風味などの品質が向上される。なお、ここでいうＮＧＦ関連の疾患としては、これらの組成物が哺乳動物を対象とする場合には、医薬組成物において述べたのと同等の各種疾患が含まれうる。また、これらの組成物が魚類等の哺乳類以外の動物を対象とする場合には、ＮＧＦに関連して生じうる疾患が含まれる。なお、飼料としては、飲料も包含される。
【００４４】
本飼料用組成物は、各種形態を採ることができる。本増強剤を含有する飼料添加剤の形態を採ることもできるし、本増強剤を含有する飼料の形態を採ることもできる。また、本動物医薬組成物としては、対象とする動物や投与形態に応じ、注射剤、注入剤、散剤、錠剤、液剤、溶解剤、浸漬剤などの各種形態を採ることができる。なお、これらの組成物においても、対象生物におけるＮＧＦを含有することができる。
【００４５】
これらの組成物において使用される本増強剤は、前記有効成分は通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ摂取あるいは投与される。なお、摂取ないし投与量は、使用する増強剤の種類のほか種々の条件によって変動するので、上記量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは上記範囲を超えて必要な場合もある。
【００４６】
（発現方法、スクリーニング方法、治療方法、予防方法、家畜等の製造方法、飼育方法等）
以上説明した本増強剤、本医薬組成物、本食品組成物、飼料組成物、動物用医薬組成物の使用形態に基づけば、本発明の別の形態として、本増強剤、本医薬組成物および本食品組成物のいずれかを、ヒトに投与あるいは摂取させる供給工程を有する、ＮＧＦ作用の増強方法あるいはＮＧＦ作用の発現方法が提供され、該供給工程を備える神経疾患の治療方法あるいは予防方法が提供される。また、本増強剤、飼料組成物および動物用医薬組成物のいずれかを、非ヒト動物に投与あるいは給餌する供給工程を有する、ＮＧＦ作用の増強方法あるいはＮＧＦ作用増強の発現方法が提供され、該供給工程を備える非ヒト動物の神経疾患の治療方法あるいは予防方法が提供され、さらに、該供給工程を備える家畜等の非ヒト動物の飼育方法、あるいは家畜等の製造方法が提供される。また、本増強剤を用いて、ＮＧＦに関する疾患用医薬品のスクリーニングする方法も提供される。
【００４７】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
（アブラナ科植物抽出物の神経突起伸長作用の評価）
本実施例では、アブラナ科植物に着目し、14 種類のアブラナ科植物の酢酸エチル抽出物についてラット副腎髄質褐色細胞種由来細胞株であるPC12細胞を用いた神経突起伸長活性の評価を行った。
【００４９】
表１に示す14種類のアブラナ科植物の可食部各約５００ｇを秤量し、ホモジナイザーで十分に攪拌粉砕後、酢酸エチル１Ｌを加えて攪拌し、一晩浸漬抽出を行った。抽出後、必要に応じて冷却遠心分離（４℃、３０００×ｇ、１０分）により上層（酢酸エチル）と下層（残渣および水層）に分離し、上層を採取した。この下層には再度、酢酸エチル約１Ｌを加えて攪拌し、さらに一晩浸漬抽出を行い、この抽出液に対しても先と同様に操作して上層（酢酸エチル）を採取した。採取した両酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて一晩脱水乾燥した。ろ過後、エバポレーターにて酢酸エチルが少量残る程度まで濃縮し、この全量をサンプルビンに移してから、窒素ガス気流を静かに吹き付けて残存する酢酸エチル分を除去し、酢酸エチル抽出物を得た。抽出物量を秤量後、ＤＭＳＯに溶解し、冷凍保存した。
【００５０】
ＰＣ１２細胞を２４穴プレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し１０％馬血清、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いてＣＯ２インキュベータ内で３７℃で一晩培養した。翌日、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、各ウェルに対して各抽出物とＮＧＦとを、それそれ５μｇ／ｍｌおよび１．５ｎｇ／ｍｌとなるように投与した。投与後７２時間経過後に顕微鏡を用いて、各ウェル内を観察し、約１００個のＰＣ１２細胞を選択し、細胞の長径よりも長い突起を有する細胞数を計測し、全観察細胞数における神経突起の伸長が認められた細胞の比率（％）を求めた。１ウェルにつき３箇所にてこのような観察を行った。なお、コントロールとして酢酸エチル抽出物の溶解溶媒であるＤＭＳＯを同時に用いた。結果を図１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
図１に示すように、いずれのアブラナ科植物抽出物についても、神経突起伸長作用を認めた。なかでも、チンゲン菜、ミズナ、ワサビなどに高い神経突起伸長作用が観察された。
【実施例２】
【００５３】
（イソチオシアネート化合物の神経突起伸長作用の評価）
本実施例では、アブラナ科植物の酢酸エチル抽出物に豊富に含まれるイソチオシアネートであるアリルイソチオシアネート（AITC）、ベンジルイソチオシアネート（BITC）、フェニルエチルイソチオシアネート（PEITC）、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート（6-HITC）、およびスルホラファン（SUL）について、神経突起伸長作用の評価を行った。各イソチオシアネート1μＭとNGF 1.5 ng/mlとなるように投与する以外は、実施例１と同様に神経突起伸長作用の評価を行った。結果を図２に示す。
【００５４】
図２に示すように、6−HITCが最も伸長作用が高く、次いで、BITC、SUL、PEITCおよびAITCの順であった。
【実施例３】
【００５５】
（6-HITCの神経突起伸長作用の評価）
実施例２で最も高い神経突起伸長作用が高かった6−HITCにつき、NGF存在下、非存在下のそれぞれの条件での神経突起伸長の評価を行った。さらに、ＮＧＦの存在下において6−HITCの濃度を変化させて、神経突起の伸長作用の評価も併せて行った。なお、ＮＧＦ存在下での評価は、アブラナ科植物抽出物に替えて所定濃度で6−HITCを用いる以外は、実施例１と同様に行い、ＮＧＦ非存在下での評価は、さらに、ＮＧＦを添加しない以外は実施例１と同様に行った。結果を図３〜図６に示す。
【００５６】
図３および図４に示すように、ＮＧＦ存在下では6−HITCの神経突起伸長作用が認められたが、ＮＧＦ非存在下6−HITCのみでは、神経突起伸長作用が観察されなかった。また、図５および図６に示すように、ＮＧＦの存在下では、6−HITCの濃度依存的に突起伸長作用が増強されていた。特に、10μＭでは約70 %の作用増強効果を示していた（図５参照）。これらのことから、6−HITC自体は神経突起伸長作用を示さないが、ＮＧＦの神経突起伸長作用を増強する作用を有していることがわかった。
【実施例４】
【００５７】
本実施例では、6−HITCによる神経突起伸長作用の増強と、分化の指標となる細胞骨格系タンパク質であるNF-Lとb-tubulinの発現量との関係を確認した。6−HITCのみ、ＮＧＦのみ、ＮＧＦ＋6−HITCの各条件を設定する以外は実施例１と同様にして神経突起伸長作用の評価を行い、得られた培養細胞に対して上記二種類のタンパク質の抗体を用いて免疫染色を行い、顕微鏡で観察するとともに画像解析した。結果を図７に示す。また、同様の神経突起伸長作用の評価実験を行い、８時間、２４時間、４８時間および７２時間経過後に培養液からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットを行って、２種のタンパク質の発現量の変化を確認した。この結果を図８および図９に示す。
【００５８】
図７に示すように、無添加のコントロールと比較して6−HITCのみもしくはNGFのみ投与したサンプルに関してはわずかな発現量の増加が確認できる程度であったが、NGFと6-HITC同時投与の場合にはこれらのタンパク質の顕著な発現量の増加が認められた。また、図８および図９に示すように、NGF非存在下ではこれらのタンパク質の顕著な増加は認められなかったのに対し、NGF存在下では8−72時間まで持続的な発現量が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】アブラナ科植物抽出物の神経突起伸長作用を示すグラフ図。
【図２】アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物の神経突起伸長作用を示すグラフ図。
【図３】ＮＧＦ存在下および非存在下における6−HITCの神経突起伸長作用を示すグラフ図。
【図４】ＮＧＦ存在下および非存在下における6−HITCの神経突起伸長作用を示す顕微鏡写真図。
【図５】ＮＧＦ存在下における6−HITCの濃度変化と神経突起伸長作用との関係を示すグラフ図。
【図６】ＮＧＦ存在下および非存在下における6−HITCの濃度変化と神経突起伸長作用の関係を示す顕微鏡写真図。
【図７】6-HITCの投与と細胞骨格系タンパク質の発現量との関係を示す免疫染色図。
【図８】6-HITCの投与量と細胞骨格系タンパク質の発現量との関係を示すウェスタンブロットの染色図。
【図９】6-HITCの投与時間と細胞骨格系タンパク質の発現量との関係を示すウェスタンブロットの染色図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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