(57)【要約】      （修正有）【課題】  インターナライジング受容体システムの融合タンパクおよび細胞特定の細胞マーカーに結合する部分、同システムに対する毒素とリガンドの複合体、および複合体と同システムに使用する腫瘍治療方法を提供する。【解決手段】毒素とサイトカインの複合体、および悪性細胞に特有の細胞マーカーに対する第１特異性とＩＬ−１５αの領域に対する特異性を有する二重特異性抗体を含む融合タンパクは、各々、場合に応じて放射核種をさらに含み、白血病およびリンパ腫を治療するための有用な治療用試薬となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非免疫原性毒素または治療用放射性核種と細胞特異的サイトカインとの複合体。
【請求項２】
前記毒素がＲＮａｓｅであることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記サイトカインがＩＬ−１５であることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記毒素がオンコナーゼであることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
診断用放射性核種をさらに含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
請求項１に記載の複合体と、医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項７】
前記サイトカインに結合した診断用放射核種をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
悪性細胞に特有の細胞マーカーに対する第１特異性とＩＬ−１５αの領域に対する第２特異性を有する二重特異性抗体を含む融合タンパク。
【請求項９】
前記二重特異性抗体がｓｃＦvであることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク。
【請求項１０】
前記ｓｃＦvが個々ｓｃＦv分子２個の融合物であることを特徴とする、請求項９に記載の融合タンパク。
【請求項１１】
前記細胞マーカーがＢ細胞限定抗原であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク。
【請求項１２】
前記細胞マーカーがＣＤ２０であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１５αの領域がＩＬ−１５α細胞外ドメインであることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク。
【請求項１４】
請求項８に記載の融合タンパクと医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１５】
オンコナーゼとＩＬ−１５の複合体と、悪性細胞に特有の細胞マーカーに対する第１特異性とＩＬ−１５αの領域に対する第２特異性を有する二重特異性抗体を含む融合タンパクとを含むキット。
【請求項１６】
悪性細胞に特有の細胞マーカーに対する第１特異性とＩＬ−１５αの領域に対する特異性を有する二重特異性抗体を含む融合タンパクを、悪性腫瘍被験者に最初に投与するステップと、次いでオンコナーゼとＩＬ−１５の複合体の治療有効量を前記被験者に投与するステップとを含む悪性腫瘍を治療する方法。
【請求項１７】
化学療法および放射線療法の少なくとも１つを、腫瘍細胞がＤＮＡ修復機構を活性化するのを防止するのに十分な量で投与するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞マーカーがＢ細胞限定抗原であり、前記被験者がＢ細胞悪性腫瘍を有することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞マーカーがＣＤ２０であり、前記被験者がリンパ性白血病、非ホジキン型リンパ種、毛状細胞性白血病または急性骨髄製白血病を有することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターナライジング受容体システムの成分の融合タンパクおよび細胞上の特定の細胞マーカーに結合する部分、インターナライジング受容体システムに対する毒素とリガンドの複合体、および複合体とインターナライジング受容遺体システムを使用する腫瘍治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、リンパ種治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用に関してかなり多くの経験があり、且つ増大している。異なるＢ細胞限定ＣＤ（分化抗原）抗原を対象にした幾つかの研究で、有望な結果が証明された。これらの研究は放射標識したｍＡｂおよびさほどではないｍＡｂ毒素複合体を使用し、ＣＤ１９〜ＣＤ２２、ＣＤ３７およびＨＬＡ−ＤＲを対象としている。たとえば、ＣＤ２２は効率のよいインターナリゼーションならびにインターナリゼーション後の抗原の再発現を示す。しかし、ＣＤ２２は、大抵のＢ細胞悪性腫瘍上で発現レベルが比較的低く、広く発現されない、たとえば、Ｂ細胞リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の症例の３０〜５０％のみに発現される。
【０００３】
本発明者は、抗ＣＤ２２ｍＡｂ、ＬＬ２を研究した。ＮＨＬの治療および撮像のために131Ｉ標識したＬＬ２を使用した予備試験では、３０〜９０＋％の応答率が得られ、完全応答のパーセンテージは変化し、応答の永続性には差があった。より高い応答率およびより長い無発症生存は、通常は自己骨髄レスキューまたは末梢幹細胞レスキューを必要とする抗体および放射性核種の総用量と関連していた。勇気づけられる結果であるが、治療効果を高め、毒性、特に骨髄毒性を下げることが望まれる。
【０００４】
ＣＤ２０抗原は、ＣＤ２２抗原とは対照的に、急性リンパ腫（ＡＬＬ）から、さらに分化したＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＣＬＬ）および非ホジキン型リンパ腫（ＮＨＬ）まで、さらに毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）までの範囲の広範囲のＢ細胞悪性腫瘍上に発現される、かなり高率で発現されるＢ細胞限定抗原である。一般に、ＣＤ２０抗原はこれらの悪性腫瘍症例の大多数の細胞上に高抗原密度で発現される。ＣＤ２の主な欠点は、ゆっくりインターナライズする抗原であることである。ＣＤ２０に向けたＲＡＩＴの場合、この特徴は問題ではないかもしれないが、毒素を使用する治療にＣＤ２０を使用することに対して著しく影響する。
【０００５】
ＣＤ２０のさらなる問題は、非リンパ腫腫瘍細胞と比較して、Ｂ細胞悪性腫瘍は、結合した抗ＣＤ２０ｍＡｂが表面から迅速に解離することである。このことから、Ｂ細胞限定抗原、特に緩徐なインターナリゼーションを特徴とするものへの結合を使用する治療は成功しないであろうと考えられる。
【０００６】
in vitro実験でもヒト治験でも、様々なｍＡｂ毒素構造物が試験されてきた。これらの試験では、これらの試薬の強力で且つ特異的な効果が証明された。使用されてきた毒素分子は、その大部分が植物起源または細菌起源に由来し、したがって患者にアレルギー性感作を惹起する。このため、治療持続期間が厳しく制限される。
【０００７】
Ｂ細胞悪性腫瘍、たとえばＮＨＬやＢ−ＣＬＬの治療は大きく進歩したが、最適化学療法に一次耐性を示したり、最適化学療法後に再発するかなりの数のＢ細胞悪性腫瘍患者が残っている。長期間にたって、殆どの、または全てのＢ細胞悪性腫瘍患者に有効な治療が求められている。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第３，９２７，１９３号
【特許文献２】米国特許第４，３３１，６４７号
【特許文献３】米国特許第４，３４８，３７６号
【特許文献４】米国特許第４，３６１，５４４号
【特許文献５】米国特許第４，４６８，４５７号
【特許文献６】米国特許第４，４４４，７４４号
【特許文献７】米国特許第４，４６０，４５９号
【特許文献８】米国特許第４，４６０，５６１号
【発明の開示】
【０００９】
したがって、本発明の目的はより効果的で且つ毒性の低い抗腫瘍療法、特にＢ細胞悪性腫瘍、たとえば、ＮＨＬやＢ−ＣＬＬを治療するための治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、リンパ細胞表面に結合した抗体が細胞表面から迅速に解離する経口を克服することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、Ｂ細胞限定抗原、特にＣＤ２０抗原を、抗腫瘍療法に使用することである。
【００１２】
本発明のこれらの目的および他の目的は、白血病およびリンパ腫を治療するのに有用な治療用試薬であり、各々、場合に応じて診断用放射性核種を含む、毒素または治療用放射性核種とＩＬ−１５との複合体、および悪性細胞に特有の細胞マーカーに対する第１特異性とＩＬ−１５Ｒαの領域に対する第２特異性を有する二重特異性抗体抗体を含む融合タンパクを提供することによって達成される。
【００１３】
本発明の他の目的、特徴および長所は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかし、この詳細な説明から本発明の修正および範囲内の様々な変更および修正が当業者に明白になるため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、例示のためであることを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
意外なことに、表面抗原を高親和力インターナライジング受容体システムに機能的に結合することによって、抗原性標的としての表面抗原の価値を著しく高められることがわかっている。本発明は、インターナライズしない表面抗原やゆっくりインターナライズする表面抗原の場合に特に有利である。高親和力インターナライジング受容体システムの好ましい例はＩＬ−１５受容体システムである。ＩＬ−１５受容体システムを使用するとき、ＩＬ−１５受容体システムは、ＩＬ−１５受容体のβ／γc鎖を含む全ての悪性細胞と一緒に使用することができる。細胞上にＩＬ−１５のβ／γc鎖が存在すると、表面抗原、特にゆっくりインターナライズする抗原に架橋することができる、連続的にインターナライズする受容体システムの基礎が、二重特異性融合タンパクおよび同族リガンドとして提供される。本発明による方法を使用すると、細胞毒性リガンドの悪性細胞への細胞間デリバリーが増加する。本発明は、放射性核種を悪性細胞に固く結合させ、標的薬剤が細胞表面から解離するのを減少させることによって、放射性核種を治療薬として使用する方法論を改良する。
【００１５】
本発明によれば、融合タンパクを悪性細胞にプレターゲットする。融合タンパクはＩＬ−１５α、好ましくは細胞外ドメインおよび悪性細胞マーカーに特有の細胞マーカーに特有の細胞マーカーに対する第１の特異性とＩＬ−１５αの領域に対する第２の特異生を備えた二重特異性抗体または抗体フラグメントを含む。悪性細胞によって発現される表面抗原を使用して、融合タンパクを悪性細胞上の適所に置く。代替実施態様では、融合タンパクはin situで形成される。いずれの場合にも、毒素または放射性核種で武装したＩＬ−１５リガンドを含む武装リガンドに加えると、ＩＬ−１５受容体のα鎖が表面抗原およびＩＬ−１５／毒素および／または放射性核種複合体に付着したＩＬ−１５受容体のβ／γc鎖のトリマー複合物が生じる。あるいは、融合タンパクとトリマー複合の両者をin situで形成することができる。この方法を使用すると、毒素および／または放射性核種は悪性細胞内に迅速にインターナライズされる。インターナリゼーションは治療用放射性核種が有効であるために必要ではないが、トリマー複合体を使用すると悪性細胞への固い結合が得られ、その結果、モダリティも改良される。
【００１６】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５の受容体複合体は３種の主たる鎖を有する。β鎖およびγc鎖は両受容体に共通であり、３つは個々特有のα鎖、ＩＬ−２αおよびＩＬ−１５Ｒαである。ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体システムは、少なくとも３つのサブユニット、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγcから成る。このマルチサブユニット受容体は、リガンドと高親和力を結びつけることができ、リガンド／受容体複合体は迅速にインターナライズされる（ｔ1/2＝１５分）。ＩＬ−２Ｒαは、他の２本の鎖が存在しない条件下で発現したときは、ゆっくりインターナライズし、それだけで発現したときは信号を伝達することができない。ＩＬ−２Ｒαが、リガンドの存在によって、他のサブユニットと並んでいる場合、リガンド／αβγ複合体全体が、ＩＬ−２Ｒβ／γcダイマーに固有の高速でインターナライズする。このように、ＩＬ−２Ｒαはβ／γc複合体の親和力をＫa＝約１０9から約１０11Ｍ-1に上昇させた。
【００１７】
ＩＬ−１５ＲαはＩＬ−２Ｒαと構造的に類似しており、類似したサイズである。ＩＬ−２Ｒαと比較したとき、ＩＬ−１５Ｒαの、その同族リガンドに対する親和力は、ＩＬ−２Ｒαの、そのリガンドに対する親和力より少なくとも２桁大きい。ＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−２Ｒαと同様、短いサイトプラスト内ドメインを有し、それだけで発現したとき、信号を伝達することができない。このように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲシステムはＩＬ−２／ＩＬ／２Ｒシステムと同様の様式で作用し、その受容体成分３種全てをインターナライズする。
【００１８】
ＩＬ−１５αを含有する融合タンパクに対する抗原は、悪性細胞タイプに特有のものに固定される。好ましい実施態様では、抗原は高密度Ｂ細胞限定抗原である。本願明細書からわかるように、ＩＬ−１５受容体のβ鎖およびγc鎖は悪性Ｂ細胞に発現され、受容体は殆どまたは全く発現されない。悪性Ｂ細胞上にＩＬ−１５受容体のβ／γc鎖が存在すると、特に毒素および場合に応じて放射性核種を悪性Ｂ細胞内に導入するための、Ｂ細胞限定抗原と一緒に使用することができる連続的にインターナライズする受容体システムの基礎が形成される。このシステムは、インターナライズした受容体を再利用するか、合成しなおして発現することができるため、自己増幅型であってもよい。
【００１９】
高密度ＣＤ２０抗原は、ＮＨＬ、Ｂ−ＣＬＬ、ＨＣＬおよびＡＬＬの治療に特に適した表面抗原である。ＡＬＬまたは多発性骨髄腫にはＣＤ３８が適するが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄製白血病（ＣＭＬ）にはＣＤ１５抗原を使用することができる。さらに、様々な充実性腫瘍表面抗原が記載されており、本発明によれば、これらのいずれを使用してもよい。
【００２０】
二重特異性抗体を基礎とする分子、好ましくはＭａｂを、ＩＬ−１５受容体のα鎖を標的細胞の表面に配置するのに使用する。ＩＬ−１５受容体のβ／γc鎖を既に発現している細胞上に多量のＩＬ−１５Ｒαを配置すると、武装ＩＬ−１５リガンドの添加後、既に細胞上に存在するＩＬ−１５受容体のβ鎖とγc鎖との相互作用によって、このリガンド／受容体複合体のインターナリゼーションが惹起される。
【００２１】
ネズミＭａｂは往々にしてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を誘導する。このようなＭａｂを本発明に使用するとき、キメラ化またはヒト化のいずれかを使用してネズミＭａｂを遺伝子操作することによって、この免疫原性の問題は最小限に抑えられる。両戦術は、ネズミ配列の一部とヒト免疫グロブリン配列との置換を含む。キメラ法では、定常領域を相応するヒト配列と置換する。ヒト化を使用する場合、さらに、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の可変領域内のフレームワーク配列も置換する。事実、上記方法は両者とも、免疫原性の低いＭａｂを招来した。たとえば、同時係属出願番号第０８／２８９，５７６号（引用することによりその全体を本願明細書の一部をなすものとする）に開示されている通り、ＬＬ２抗体が抗原に結合してインターナライズする生得の能力を保有した、ＬＬ２抗体がヒト化されている。
【００２２】
Ｍａｂ操作技術は、別のクラスの抗体分子、すなわち、一本鎖抗体ｓｃＦの製作に使用されてきた。この分子は、関心事のＭａｂ由来のＶHセグメントおよびＶLセグメントをクローニングし、その間に挟まれている短いリンカー領域とスプライシングすることによって製作される。これらの分子は、適切なデザインと復元の後、親Ｍａｂの抗原結合活性を保持し、E. coliに基礎を置く発現システムに高レベルで発現することができる。これらの構造物を使用すると、第２抗原性標的を第１抗原性標的に結合してエフェクター細胞または分子に目標を改めて向かわせることができる二機能一本鎖分子を操作するための基盤が得られる。
【００２３】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒαの領域に結合したＭａｂまたはＦｃフラグメントを含む融合タンパクを用いた抗原性標的のプレターゲッティングを利用する。この方法では、抗原性標的に対して反応性である無毒の第１試薬を与えることによって、ＭａｂまたはＦｃフラグメントの腫瘍／正常細胞比が高くなる。この後、腫瘍によるこの第１試薬の取り込みおよび正常細胞からのそのクリアランスが可能な腫瘍ターゲッティング／ウォッシュアウト間隔が続き、その後、有毒な複合体を与える。
【００２４】
ＩＬ−１５αの領域を含む融合タンパクでプレターゲッティングする前に、アビジンおよびビオチンと一緒にストレプトアビジン複合抗体またはビオチニル化抗体で細胞をプレターゲットしてもよい。たとえば、ビオチニル化抗ＣＤ−２０抗体を投与し、続いてアビジンを投与すると、さらなる結合部位が得られる。次に、ビオチニル化ＩＬ−１５Ｒαを投与し、アビジン部位に付ける。
【００２５】
アビジン−ビオチン化学を利用する２工程法および３工程法の両者を使用することができる。一般に、これらの方法は、具体的なプロトコールによって、アビジン複合ｍＡｂまたはビオチン複合ｍＡｂのいずれかを投与する。この後、１〜３日の間隔をおいて、結像用のγ放射放射性核種または治療用のαエミッタまたはβエミッタで標識したビオチンまたはアビジンを注入する。３工程法は、プレターゲッティング工程とターゲッティング工程の間に浄化工程を挿入する。この工程は、循環している残余プレターゲッティング剤のクリアランスを促進し、その結果、このプールを減少させ、その後のターゲッティング剤のアクセスを促進する。このシステムでは、アビジンを投与してクリアランスを促進する。アビジンの消失動力学はｔ1/2が１分という非常に迅速な初期層を示し、これが全体の大部分を占め、第２層はｔ1/2が約３０分である。
【００２６】
ビオチンおよびアビジンを使用する方法は、活性な複合体の結合用部位の数を増加するが、これらの改善は、アビジンも代替タンパクであるストレプトアビジンも共に免疫原性であることによって弱められる。患者の３０％より幾らか少しにアビジンに対する抗体が現れ、患者の少なくとも７０％にストレプトアビジンに対する抗体が現れた。したがって、ビオチン／アビジンを用いたプレターゲッティングを使用することはあまり好ましくない。
【００２７】
したがって、本発明による好ましい実施態様では、ＩＬ−１５α融合タンパクの領域を含む融合タンパクのみを、その最適のヒト化型で使用して悪性細胞をプレターゲットする２工程手順を使用する。本発明による融合タンパクは、免疫原性の可能性が低い。プレターゲッティング剤は、リガンドに対して高い親和力を有するヒトＩＬ−１５Ｒαを担持する。この融合タンパクは、分子量が比較的低いため、（７０ｋＤａに対して、もとのままのＩｇＧでは１５０ｋＤａ）腫瘍内部に浸透する能力が高い。
【００２８】
第２工程の試薬であるＩＬ−１５構造物は、同様に免疫原性の可能性が低く、低分子量（E. coli由来のｒＩＬ−１５の分子量は１３ｋＤａ）であり、腫瘍浸透および非腫瘍部位からのクリアランスを助ける。ＩＬ−１５構造物は、プレターゲッティング後に投与する。ＩＬ−１５Ｒα融合タンパクは悪性細胞上に局在し、循環から実質的に取り除かれている。このシステムは、第３の工程、すなわち、間にあるプレクリアランスが必要であれば、これを含むように改変することも可能であろう。これは、ＩＬ−１５リガンドのガラクトシル化によって行われる。より高いガラクトース置換では、ＩＬ−１５をアシアロフェチュインに共有結合的に架橋することができる。
【００２９】
ＩＬ−１５リガンドを、放射性核種または毒素で武装することができる。放射性核種は診断用放射性核種であっても治療用放射性核種であってもよい。好ましい実施態様では、ＩＬ−１５リガンドを使用して放射性核種と毒素の両者を投与する。同じＩＬ−１５リガンドを放射性核種と毒素の両者で武装してもよく、あるいは、別々のＩＬ−１５リガンドを放射性核種と毒素で武装してもよい。放射性核種と毒素で武装した別々のＩＬ−１５リガンドを使用するとき、一緒に投与しても逐次投与してもよい。
【００３０】
ＩＬ−１５リガンドを毒素で武装するとき、好ましい毒素はリボヌクレアーゼ、たとえば、オンコナーゼである。オンコナーゼは、Rana opipiens卵母細胞由来の非哺乳類ＲＮａｓｅである。ヒト膵臓癌に対する抗腫瘍活性を有することが臨床治験で証明されているが、Ｂ細胞悪性腫瘍、たとえば、B細胞リンパ性白血病に対しては最小限の抗腫瘍活性であった。
【００３１】
融合タンパクおよび武装リガンド複合体は、医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物で投与される。この点に関して、医薬的に許容できるキャリヤーは、不活性であるか、そうでなくても医学的に許容でき、融合タンパクまたは武装リガンドと相容性であるため、融合タンパクまたは武装リガンドを投与するための媒体として使用することができる物質である。
【００３２】
この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者に明白になるであろう。たとえば、ＩＬ−１５受容体のβ／γc鎖はＩＬ−２受容体のβ／γc鎖と同じであるから、融合タンパクを使用してＩＬ−２Ｒαを悪性細胞上に誘導し、続いてＲＮase−ＩＬ−２複合体を投与することができる。さらに、融合パートナーが抗ＣＤ−２０抗体以外の抗体である、ＩＬ−１５ＲαかＩＬ−２Ｒαのいずれかの融合タンパクを製作することができる。これによって、特異的マーカーを担持する任意の腫瘍をプレターゲッティングできるようになる。腫瘍または感染性病変によって産生されたマーカーあるいは腫瘍または感染性病変と関連したマーカーと特異的に結合する多くの抗体および抗体フラグイメントが、特にHansenらに付与された米国特許第３，９２７，１９３号（特許文献１）およびGoldenbergに付与された米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，４６０，４５９号および第４，４６０，５６１号（特許文献２〜８）に開示されている。腫瘍がＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体のβ／γc鎖をさらに含むとき、融合タンパクは迅速にインターナライズされる。
【実施例】
【００３３】
下記の例は本発明を例証するものであるが、限定するものと考えてはならない。
【００３４】
［例１．悪性細胞タイプによるＩＬ−２／ＩＬ−１５のβ／γc鎖の決定］
５種のＢリンパ腫細胞系ならびに非Ｂ細胞系（ＩＬ−２Ｒβ／γｃを発現することが判明しているＴ細胞系、ＭＬＡ １４４、およびＡＭＬ由来の細胞系、ＭＢ−０２）の、ＩＬ−１５およびＩＬ−２結合を分析した。125Ｉ標識したｒＩＬ−１５を使用した。ＩＬ−１５Ｒαの全結合への分布の推定を可能にするために、ＩＬ−２とＩＬ−１５の両者を用いて寒冷リガンド阻害を実施した。
【００３５】
洗浄細胞（２×１０6）を結合緩衝液（増殖培地）中に懸濁した。この試験管に緩衝液または１５０倍モル濃度過剰な冷ｒＩＬ−１５または５００倍過剰な冷ｒＩＬ−２を４℃で１５分間加えた。次いで、125Ｉ−ＩＬ−１５を最終濃度１．５ｎＭで加えた。結合を４℃で９０分間進行させ、その細胞を０．４ｍｌの試験管に移し、８０／２０のジブチルフタレート／オリーブ油のクッションを介してスピンさせた。先端を切り取り、ガンマカウンターでカウントした。表１に結果を示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
試験した全てのＢリンパ腫系は低いが一貫した標識ＩＬ−１５の特異的結合を示し、これは冷ＩＬ−１５によって阻害された。ＩＬ−２はＩＬ−１５とＩＬ−２Ｒβ／γcへの結合で競合するが、ＩＬ−１５ＲαへのＩＬ−１５結合と競合しない。両未標識リガンドによって同程度に阻害されることから、β鎖およびγ鎖はＩＬ−１５Ｒαにまさること、すなわち、細胞における結合は、その大部分がＩＬ−２Ｒβ／γc二量体を介することがわかる。飽和条件下で結合したｃｐｍに基づく推定値および非放射能測定値から誘導したヨウ素置換の程度から、これらの細胞上のＩＬ−１５受容体数は５０〜５００部位／細胞の範囲であることがわかった。この量は、Ｂ−ＣＬＬ細胞上およびＮＨＬ細胞上で以前に確認されたＩＬ−２Ｒβ／γc部位の数と類似している。β／γが存在すると、少数であっても、二重特異性抗体融合タンパクおよび同族リガンドとしての、細胞マーカー抗原に架橋することができる連続的なインターナライジング受容体システムの可能性が認められる。
【００３８】
［例２．毒素のＢ細胞悪性腫瘍に対する効果の評価］
３種の異なるｍＡｂ、すなわち、クラスII非変異鎖ＬＬ１、抗ＣＤ２２抗体ＬＬ２、および抗トランスフェリン受容体抗体を、２種のＲＮａｓｅスーパーファミリー毒素、すなわちオンコナーゼおよびEDNに結合させた。結果として生じる複合体を、３種のＢリンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、ＣＡ−４６、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびヒトＴ細胞系ＨｕＴ１０２を含む細胞系団で試験した。結果から、ＬＬ２−オンコナーゼは、試験した全ての複合体の中で最低のＩＣ50値を有することがわかった。オンコナーゼを主成分とする免疫毒素の、Ｂリンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉに対する毒性は、オンコナーゼとＬＬ２複合体でさらに証明された。ＬＬ２はＣＤ２２に対する抗体であり、効率よくインターナライズする抗原である。全ＩｇＧ複合体とＦａｂ(複合体の両者を調製し、ナノモル濃度未満の範囲でこの細胞系を阻害することを確認した。過剰の冷抗体で阻害作用がほぼ消失するため、その効果は、複合体のＣＤ２２反応性次第であることが証明された。
【００３９】
［例３．可溶性ＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦ融合タンパクの構築］
ハイブリドーマ１Ｆ５、ＩｇＧ2a ｋは、RockvilleのAmerican Type Culture Collectionから入手できる。このハイブリドーマーを使用し、組織培養および／または腹水でのハイブリドーマの成長、およびその後のプロテインＡ−アガロースによる精製によってｍＡｂを作る。これを、２ｍＬ Ｌ−グルタミンおよび各５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０中で培養する。
【００４０】
１Ｆ５のＶH遺伝子およびＶL遺伝子の場合、全ＲＮＡの単離に３×１０7個の細胞を使用する。これは、洗浄細胞ペレットをTrizol試薬（Gibco/BRL, Grand Island, NY）に可溶化し、続いて酸−グアニジウムフェノール−クロロホルム法でＲＮＡを単離することによって実施される。全ＲＮＡ５ｇを、Boehringer-Mannheim (Indianapolis, IN)のＡＭＶ逆転写酵素ベースキットを使用したＩst鎖ｃＤＮＡ産生用鋳型として使用する。このようにして得られた反応生成物の２〜５％をＶH遺伝子およびＶL遺伝子のＰＣＲ増幅用鋳型として使用する。
【００４１】
Oriandiら(1989)が記載している普遍プライマーをＰＣＲ反応に使用する。これらのプライマーは、ＶHではＶＨ１ＦＯＲおよびＶＨ１ＢＡＣＫであり、κＶＬではＶＫ１ＦＯＲおよびＶＫＢＡＣＫ１である。あるいは、ＬＬ２ｍＡＢおよびＭＮ１４ｍＡＢのキメラ化およびヒト化に首尾よく使用された、Leugら(1993)に記載のプライマーを使用する。標準ＰＣＲ条件とルーチンのＴｒｉｓＨＣl／ＫＣl／セラチン緩衝液に溶解した０．５μＭプライマー、１．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、0.２５ｍＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2を使用する。９２℃で４分間の初回変性と、５０℃で４５秒間のアニーリング、７２℃で４５秒間の重合、およびその後の９４℃で３０秒間の変性から成るサイクルで、ＰＣＲを３０サイクル実施する。
【００４２】
臭化エチジウム染色２％アガロースゲルで、ＰＣＲ生成物の部分標本を分析する。２％低融点アガロースゲルで適当なＰＣＲ−増幅フラグメントを単離し、臭化エチジウムで染色する。フラグメントを切除し、ゲル片を融解し、βアガラーゼで消化し、エタノールで沈澱させる。ゲル精製物の部分標本をＴＡクローニングベクターｐＣＲII（Invitrogen, San Diego）にクローニングし、recA−菌株ＸＬ１Blue（Invitrogen）にトランスフォームし、36Ｓ標識前駆体を用いた標準ジデオキシ法で配列決定する。
【００４３】
この構造物は、多様な１本鎖Ｆv抗体（ｓｖＦv）に有効なリンカー、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）3を使用し、これに軽鎖肱領域由来の３種のアミノ酸を加えて溶解性を改良し、Ｆvのモノマー形を安定化する。制限部位、EcoRIを有するオリゴヌクレオチド、または適当な代替的酵素について、ＶH及びＶL配列を検査した後、必須の５４ｂｐのリンカー配列をスパンするオーバーハング（張り出し部）を合成して、アニールさせた。このオリゴヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡリガーゼで、EcoRI切断してゲル精製したＶHフラグメントに結合させる。同じ様式でＶLフラグメントを切断して精製し、ＶHリンカーフラグメントに結合させる。
【００４４】
１Ｆ５ｓｃＦvをＰＣＲIIプラスミドに再度結合させ、細菌にトランスフォームし、配列決定する。確認したｓｃｆv配列をＩＬ−１５Ｒαの細胞外領域に結合する。配列を検証した後、融合分子の２つの結合領域を結合分析法で試験した。Ｆv部分に十分な抗原結合活性がない場合、５(に位置するＶLからＶHまでと、同じリンカー配列を用いて、別のＦvをデザインする。
【００４５】
ＰＣＲプライマーは、１本の鎖上の成熟タンパクのＮＨ2末端で開始し、貫膜領域および細胞質内領域を除く最も近い細胞外傍膜領域によって反対の鎖上で範囲が定められる、発表されているｈＩＬ−１５Ｒαのヌクレオチド配列に基づいて選択される。これらのプライマーは、細菌の発現ベクターに対する適合性のため、EcoRIおよびNcoIによる逐次的な制限消化を可能にするアダプター配列を含む。ＩＬ−１５ＲαのＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施する。ＩＬ−１５Ｒα高発現細胞系、たとえば、ＨｕＴ １０２Ｂ２由来の全ＲＮＡを用いて、正確なサイズのフラグメントをｐＣＲIIプラスミドにクローニングし、上述の通り配列決定する。配列を確認したフラグメントをEcoRIとNcoIで消化し、１Ｆ５ｓｃＦvフラグメントに結合する。このようにして得られた定位を以下に示す。
ｓＩＬ−１５Ｒα−ＶＨ−ＧＧＧＧＳＱＰＫ（ＧＧＧＧＳ）2−ＶＬ
【００４６】
ｓＩＬ−１５Ｒαの傍膜領域は、ＩＬ−２Ｒαに類似していることにより、ＩＬ−１５結合領域がＮＨ2末端付近であると予想されるため、ｓＩＬ−１５Ｒαの膜近傍領域をリンカーとして選択する。さらに、幾つかの末端を切った形のＩＬ−１５ＲαはＩＬ−１５ならびに野生型全長形に結合することが明らかにされている。最適結合を得るために、配列の末端を切除して試験する。
【００４７】
次いで融合配列をｐＥＴ２ＩＤベクター（Novagen, Madison, WI）に結合し、ＸＬＩBlue宿主にトランスフォームする。細菌クローンを採取し、Ｔ７プライマーおよびＳｐ６プライマーと内部特異的プライマーとを併用して配列決定する。真正配列を含むクローンを発育させ、プラスミドを単離し、ＡＤ４９４（ＤＥ３）E. coli発現宿主にトランスフォームする。この宿主菌株はチオレドキシン還元酵素遺伝子に突然変異を担持し、その結果、相対的酸化条件を作り、これがジスルフィド結合形成を促進する（Novagen）。
【００４８】
［例４．ｓＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦ融合タンパク］
形質転換コロニーを採取し、ＬＢブロス中でＯＤ600＝約０．５まで発育させる。次いでこれを、０．４mM ＩＰＴＧを用いて３７℃で３〜６時間、発現タンパクに導入する。小規模培養由来の細菌細胞をペレット化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶解し、遠心分離で崩壊物(debris)を除去し、部分標本を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する。ゲルの一部を切り取り、クマシーブルー（Coomassie Blue）で染色し、その残りをImmobilon-P膜にトランスブロットする。この膜を、ヘキサヒスチジンタグを認識するニッケル−アルカリホスファターゼ複合体（Qiagen, Chatsworth, CA）か、免疫グロブリンを検出するためのヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD）のいずれかで染色する。ブロットをＥＣＬ基質ＣＳＰＤで展開し、写真フィルムに曝露する。
【００４９】
いったん良好な生成物が確認されたら、培養をスケールアップする。初回スケールアップは、約１リットルの培養までである。細菌細胞をペレット化させ、３００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ＝８．０中で洗浄し、次いで同じ緩衝液中に再懸濁して０．５mg/mlリソチームで、氷上で２０分間処理する。この懸濁液を氷上で超音波処理し、３０秒破裂を３回行う。不溶性物質を１４，０００×ｇで５分間ペレット化させる。ペレットを含有する封入体を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ＝８．０／２００ｍＭ、ＮａＣｌ／０．２％、Triton Ｘ−１００で１回洗浄する。
【００５０】
可溶化および復元は、個々のｓｃＦvｓ２個の融合物である二重特異性抗体ｓｃＦvと一緒に使用される、Kuruczら(1995)の方法の改変バージョンに従って実施する。簡単に記載すると、洗浄した封入体調製品を、２％ラウロイルサルコシンナトリウム／５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌを含む緩衝液、ｐＨ＝９．０で、タンパク濃度〜２ｍｇ湿潤重量／ｍｌ可溶化する。ＣｕＳＯ4を５０μｍで加え、その混合物を室温の空気中で２４時間酸化させる。不溶性物質をペレット化させ、その物質を、Ｎｉ2+−ＩＤＡ樹脂（TaltonTM、Clontech, Palo Alto, CA）の結合能力に基づいて、Ｎｉ2+−ＩＤＡ樹脂にバッチモードで、室温で２０分間吸着させる。
【００５１】
総タンパク濃度を改良型Bradfordアッセイ（Coomassie PlusTM, Pierce, Rockford, IL）の緩衝液ブランクを含む低レベルモードで決定する。洗浄剤干渉の場合、ビシンコニン酸(bicinconinic acid)を使用する、洗浄剤に鈍感なアッセイを使用する。この洗浄剤を使用すると、Ａ280推定を行うことができる。吸着後、この樹脂をカラムに移し、カラムの２０倍量の可溶化緩衝液で洗浄し、続いてカラムの≧２０倍量の可溶化緩衝液で洗浄するか、Ａ280＜０．０２になるまで８Ｍ 尿素／５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝６．０で洗浄する。結合した生成物を８Ｍ 尿素／３００ｍＭイミダゾール／ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ＝７．４で溶離する。全ての分画を保存し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクマシー染色で分析する。十分な純度の分画を、０．４Ｍアルギニン／５０μＭＣｕＳＯ4／５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣl、ｐＨ＝８．０に対して透析する。
【００５２】
［例５．ｓＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦv融合タンパクの抗原結合活性の分析］
比放射能が２０μＣｉ／μｇを超えないように、ヨードジェン法によって融合タンパクを125Ｉで放射標識することにより、融合タンパクの抗原結合活性を分析する。ＣＤ２０陽性またはＣＤ２０陰性であることが判明しているヒト細胞系の一団を、冷１Ｆ５、冷融合タンパクおよび冷ＩＬ−１５の存在下または非存在下で、標準結合分析法で試験する。結合は、抗ＣＤ２０部分を介して起こる。氷上で１時間後、８０／２０のジブチルフタレート／オリーブ油のクッションを介してスピンさせ、チューブの先端を細胞を切り取ってガンマーカウンターでカウントする。
【００５３】
ＩＬ−１５結合能力を試験するために、細胞結合任背気泡を使用する。ＣＤ２０高発現Ｂ細胞系を使用する。冷受容体−Ｆv融合タンパクを氷上で４０分間結合させる。細胞を２回洗浄し、125Ｉ−ＩＬ−１５を加える。ヨードジェン法で最高７０μＣｉ／μｇまでの比放射能に標識されたＩＬ−１５を、２００倍モル濃度過剰な冷ＩＬ−１５および陰性コントロールとしてのＩＬ−２（ＩＬ−２はＩＬ−１５Ｒαに結合しない）の存在下で、１nMで加える。氷上でさらに４０分後、細胞をオイルクッションを用いてスピンさせ、上述の通りにカウントした。
【００５４】
［例６．ｓＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦv融合タンパクがＣＤ２０をインターナライズする能力のアッセイ］
融合タンパクおよび親１Ｆ５は、同時に125Ｉで標識する。ＣＤ２０＋細胞系ＲＬを使用する。結合は、両標識とも等しい細胞部分標本を用いて、５ｎＭで、氷上で実施する。インターナリゼーションに対する影響を評価するために、冷ＩＬ−１５または冷ＩＬ−２を同じ試験管に加える。細胞をペレット化させ、洗浄することによって、未結合標識を除去する。ｔ0値を求め、残りの部分標本を３７℃に置き、様々な時間間隔で取り出す。異化され、放出された125Ｉは、１０％ＴＣＡで沈澱させることによって、解離した、もとのままのタンパク標識と区別される。冷ＩＬ−１５を標識融合タンパクに加えてコントロールには加えないときにインターナリゼーションの増強が起これば、in vivo状態に近づけるために、標識ＩＬ−１５と未標識融合タンパクを使用した逆の実験を実施する。
【００５５】
残留化標識88Ｙ、111Ｉｎ、125Ｉ−ジラクチトールを使用したin vivo試験も実施する。これらの物質は、治療のために試験すべき放射性核種、すなわち、残留化標識についての90Ｙおよび131Ｉの挙動をよく表す。ＹおよびＩｎ放射性金属の場合、キレート標識のためのプロトコールに従って、ＩＫ−１５をイソチオシアントベンジル−ＤＴＰＡと反応させ、次いで上述の通り冷リガンド阻害アッセイで結合性保持について試験する。簡単に記載すると、ｒＩＬ−１５を０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ＝８．２に対して透析する。これに６倍モル濃度過剰のイソチオシアントベンジル−ＤＴＰＡを加える。反応を室温で２時間実施する。ＰＤ−１０カラムを用いたゲル濾過で、標識したＩＬ−１５と未結合キレートとを分離する。十分な生物活性が保持されなければ、放射性金属の負荷に備えて無金属条件下で、キレート化したＩＬ−１５を０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝６．０中に透析する。
【００５６】
［例７．ＩＬ−１５／オンコナーゼ免疫毒素の構築］
一般に、ＩＬ−１５とオンコナーゼから成る融合タンパクは、Rybak(1995)に略述されているｍＡｂオンコナーゼ融合タンパクを産生するための手順に従って操作する。簡単に記述すると、成熟ＩＬ−１５タンパクに相応する、配列が確認されたフラグメントを、５(に存在するＩＬ−１５配列でオンコナーゼの配列に結合するが、別の方向を評価することもできる。オンコナーゼ遺伝子を２種以上のカエルからクローン化する。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、融合配列を表す真正フラグメントをｐＥＴ２１ｄベクターに再度サブクローニングする。ＩＬ−１５−オンコナーゼ融合タンパク全部をコード化している全配列を、上述のＸＬ１Blue菌株のｐＥＴベクターで確認する。適当なクローンを生育させて、ＡＤ４９４（ＤＥ３）E. coli発現菌株のトランスフォーメーション用のプラスミドを作る。
【００５７】
形質転換クローンを採取し、小規模培養で生育させる。ＩＰＴＧを用いて導入し、ＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、クマシー染色のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを実施し、抗ＩＬ−１５抗体と抗オンコナーゼ抗体の両者を検出するためにタランスブロットする。封入体の単離および洗浄、その可溶化、復元およびその後の精製は、上に略述した工程を使用して実施する。125Ｉで標識することによって、最終生成物がＩＬ−１５受容体に結合する能力を上述の細胞結合分析法で試験し、同様に標識した等モル濃度のＩＬ−１５と比較する。
【００５８】
ＩＬ−１５に対する過剰な受容体が判明している細胞系、たとえば、ＨｕＴ １０２Ｂ２やＭＬＡ１４４を対象に、結合性を保持する複合体の細胞毒性を試験する。１×１０4個のＨｕＴ１０２Ｂ２細胞またはＭＬＡ１４４細胞を９６ウェルプレートのウェルに二重にプレーティングし、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−オンコナーゼの存在下および非存在下および培地のみで３０時間培養し、その時点で標識を加える、3Ｈロイシン組込みアッセイを実施する。
【００５９】
ＩＬ−２またはＩＬ−１５を融合タンパクと一緒に加えて細胞毒性の阻害を求めることにより、特異性を確認する。ＩＬ−１５は効率よく阻害するはずであるが、ＩＬ−２は部分的に阻害するはずである。６時間の組込み期間の後、タンパクをＢ型ガラスファイバーマット上に回収し、MicroBetaシンチレ−ションカウンター（Wallac, Gainthersburg, MD）でカウントする。
【００６０】
タンパクモデルＮＨＬ細胞系、たとえば、ＲＬを含む細胞毒性融合について、アッセイを繰り返す。この場合、毒性およびより多量の免疫毒素を結合してインターナライズする能力を測定するために、ｓＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦv融合タンパクの存在下および非存在下でアッセイを実施する。各実験条件およびコントロール条件の用量応答曲線を作成する。非特異的毒性に関してコントロールするために、ＣＤ２０細胞系を使用する。過剰な未標識１Ｆ５ｍＡｂ、ＩＬ−１５およびＩＬ−２の添加による毒性の阻害も試験する。
【００６１】
［例８．抗体オンコナーゼ複合体］
オンコナーゼを主成分とする免疫毒素の細胞活性をＢリンパ腫細胞系で評価するために、ＬＬ２−オンコナーゼ複合体を調製し、その作用をDaudi、Ｂリンパ腫細胞系で試験した。全ＩｇＧ複合体とＦａｂ(複合体の両者を調製し、ナノモル濃度未満の範囲でこの細胞系を阻害することを確認した。さらに、過剰の冷抗体によって阻害作用がほぼ消失したことから、この作用は、複合体のＣＤ２２反応依存性であることもわかった。
【００６２】
別のシリーズの実験で、３種類のｍＡｂ（ＬＬ１［クラスII非変異鎖］、ＬＬ２および５Ｅ９［抗トランスフェリン受容体］）と２種のＲＮaseスーパーファミリー毒素（オンコナーゼおよびＥＤＮ）の間で、異なる順列の複合体を、Ｂ−リンパ腫細胞系（Daudi、Raji、CA−４６）、乳癌系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびヒトＴ細胞系ＨｕＴ １０２を含む細胞系の一団で試験した。3Ｈロイシン組込みによって評価されるような、タンパク合成である読み出し情報を用いて用量応答曲線を作成した。ｍＡＢ、毒素、または複合体のの存在下および非存在下で細胞をプレーティングし、１６時間培養した後、１μＣｉ／ウェルの標識を適用した。Ｂ型ガラスファイバーフィルター上に細胞を収穫し、続いてシンチレーションカウンターでカウントすることにより、組込みを測定した。表２からわかるように、ＬＬ２−オンコナーゼは試験した全ての複合体の中で最低のＩＣ50値を示した。
【００６３】
【表２】
2006089491.tif 000003
【００６４】
［例９．Ｂ−ＣＬＬの治療法］
例３および４に従って調製したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の123Ｉ標識融合タンパク、ｓＩＬ−１５Ｒα−１Ｆ５ｓｃＦの目標量を含む無菌の無発熱物質溶液を、Ｂ−ＣＬＬ患者に静脈内注入する。融合タンパクが悪性Ｂ細胞に結合し、ガンマカメラ画像でモニタリングされるように、患者の循環から実質的に取り除かれた後で、例７に従って調製したＩＬ−１５／オンコナーゼ免疫毒素の治療用量を含む無菌の無発熱物質溶液を患者に注入する。その後の標識抗ＣＤ２０を用いた放射免疫検出から、リンパ腫の著明な減少がわかる。