(57)【要約】【課題】  プロテアソームサブユニット遺伝子を大量発現させた形質転換イネ、及び、その形質転換イネを用いてアブシジン酸等のストレス誘導性物質を蓄積させる方法を提供する。【解決手段】プロテアソームは代謝調節タンパク質の多くを高速分解するペプチド分解酵素である。本実施例では、イネ由来のプロテアソームサブユニットに高発現プロモーターを付加し、再びイネに導入して形質転換イネを作製した。この形質転換イネは多くのストレス条件下に耐性を示した。このことから、上記形質転換イネはストレス誘導性物質を大量に体内に蓄積させることに利用できる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子が高発現し、ストレス耐性を有する形質転換イネ。
【請求項２】
前記遺伝子は、イネの染色体上において遺伝的に発現する量に比べ、１．２倍以上多く発現していることを特徴とする請求項１記載の形質転換イネ。
【請求項３】
ｐＭＬＨ７１３３‐ＧＵＳプラスミドのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ Ｉ部位に、配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子を導入して形質転換を行い、前記プロテアソームサブユニット遺伝子を高発現させた形質転換イネを製造する方法。
【請求項４】
ｐＭＬＨ７１３３‐ＧＵＳプラスミドのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ Ｉ部位に、配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子を導入して形質転換を行い、前記プロテアソームサブユニット遺伝子を高発現させた形質転換イネを製造し、
前記形質転換イネにストレスを与えて育成し、
前記形質転換イネからアブシジン酸を抽出するアブシジン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換させたイネに関し、更にはそれを用いて誘導物質を蓄積させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアソームはペプチド分解酵素の一つであり、ＡＴＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）分解により生成されるエネルギーを利用して高速にペプチド分解を行う点や遺伝子の発現制御を行う点において他のペプチド分解酵素よりも処理能力が高く、細胞分裂や環境応答などの生存に必須なタンパク質の多くはプロテアソームによる分解制御を受けている。
【０００３】
１９９６年、プロテアソームは２０Ｓの沈降係数をもつ分子量７００ｋＤａの複合体として単離された。その翌年、ウサギ網状赤血球において、ＡＴＰのエネルギーを使用してユビキチン化タンパク質を分解するプロテーゼとして、２６Ｓの沈降係数をもつ分子量２０００ｋＤａのプロテアーゼ複合体が単離された。その後、ウサギ以外にもヒト、アフリカツメガエル、ホウレンソウ、酵母など多くの真核生物における２６Ｓプロテアソームの存在が確認されている。なおユビキチン化タンパク質とは、分解対象となる標準タンパク質にユビキチンが付加したタンパク質である。ユビキチンは、７６個のアミノ酸からなる分子量８．６ｋＤａのタンパク質からなり、標準タンパク質に付加しプロテアソームにこのタンパク質を運ぶ機能を有する。なおこのシステムはユビキチンシステムと呼ばれる。
【０００４】
一方で、プロテアソームによるタンパク質の分解は細胞内の異常タンパク質ストレスに関与していることが報告されており、酵母菌のプロテアソームサブユニットを欠損させるとアミノ酸アナログに対して感受性になるという報告がなされている（下記非特許文献１参照）。また、コケについても同様な報告がなされている（下記非特許文献２、３参照）。
【非特許文献１】ヴァン  ノッカーら、「マルチユビキチン鎖結合タンパク質Ｍｃｂ１は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロテアソームの構成要素であり、タンパク質の代謝回転において不可欠であり、基質特異的に作用する」モリキュラー  セル  バイオロジー、第１６（１１）巻、６０２０−６０２８頁
【非特許文献２】ギロッドら、「コケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  Ｐａｔｅｎｓ）の２６Ｓプロテアソームのマルチユビキチン鎖結合サブユニットＭｃｂ１（Ｒｐｎ１０）は生育に必要である」プラントセル、第１１（８）巻、１４５７−７２頁
【非特許文献３】スマルら、「アラビドプシスの成育における２６ＳプロテアソームサブユニットＲｐｎ１０の多面的な役割はアブシジン酸に対する応答における基質特異的な機能をサポートしている」プラントセル、第１５（４）巻、９６５−９８０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし残念なことに、上記いずれの報告もプロテアソームサブユニットを欠損させることにとどまり、反対に高発現させることでどのような効果が得られるのかについては検討が及んでいない。また上記非特許文献の報告は何れもアミノ酸アナログに対する感受性についての報告であって、ストレス耐性についての報告ではない。
【０００６】
そこで本発明は、上記プロテアソームサブユニットを高発現させることによる植物への影響を研究することを通じ、有用な形質転換体、更にはそれを利用した種々有用な技術の提案を行う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記について鋭意検討を行った結果、配列番号１で示されるＲｐｎ１０遺伝子を高発現させることで、低温、亜硝酸などのストレス、およびそのストレスによって生じるアブシジン酸、に対して耐性を有することを発見し、この遺伝子を高発現した形質転換体を提案するに至った。即ち、第一の手段として配列表の配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子が高発現し、ストレス耐性を有する形質転換イネとする。これにより、アブシジン酸、低温、亜硝酸などのストレスに強い形質転換体を得ることができる。なおこの場合において、より効果を明確にできる範囲として、この遺伝子は、イネの染色体上において遺伝的に発現する量に比べ、１．２倍以上多く発現していることが望ましいといえる。
【０００８】
また、第二の手段として、形質転換体を製造する方法として、ｐＭＬＨ７１３３‐ＧＵＳプラスミドのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ Ｉ部位に、配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子を導入して形質転換を行い、このプロテアソームサブユニット遺伝子を高発現させることを特徴とする。
【０００９】
また、第三の手段として、アブシジン酸を抽出するアブシジン酸の製造方法において、ｐＭＬＨ７１３３‐ＧＵＳプラスミドのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ Ｉ部位に、配列番号１に示されるプロテアソームサブユニット遺伝子を導入して形質転換を行い、このプロテアソームサブユニット遺伝子を高発現させた形質転換イネを製造し、この形質転換イネにストレスを与えて育成し、この形質転換イネからアブシジン酸を抽出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
以上により、低温、亜硝酸のストレスに耐性を有する形質転換体を得ることができ、また、この形質転換体を用いてアブシジン酸を安価で大量に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に限定して解釈されるものではない。
【００１２】
まず我々は、プロテアソームサブユニットであるＲｐｎ１０遺伝子のＤＮＡ配列を高発現プロモーターのＤＮＡ配列と組み合わせ、植物に導入することによって、Ｒｐｎ１０遺伝子を高発現させることに成功した。さらに、上記形質転換体の性質を調べたところ、この形質転換体がアブシジン酸を始め様々なストレスに対する耐性を持つことを発見した。なおアブシジン酸は低温や亜硝酸など様々なストレス応答によって誘導されるとする物質で、ストレスを受けた細胞が自ら細胞死を誘導させる過程に関与する物質として知られているものである。
【００１３】
つまり、本実施形態により得られる形質転換体は、正常な野生株では生育に異常をきたす環境下（アブシジン酸が大量に蓄積された環境下）においても、安定して生産を行うことができ有用なものとなる。
【００１４】
また一方で、アブシジン酸は植物の成長を制御する調整物質として有用であり、この活用が期待されるが、この殆どが化学合成による工業的生産又は微生物を用いた生物学的な合成によって作られており、これらの生産工程には多くのエネルギーやコストを必要とする。そこで、アブシジン酸のような細胞に害のある物質をイネの体内に多く蓄積させ、これを成長させ収穫することが可能となれば、必要なエネルギーやコストを抑えた有用なアブシン酸の製造方法となる。なおイネの成長のさせ方は通常通り行うことができるが、本発明の有するイネは各種ストレスに耐性があるためより容易に育てることができるという利点もある。
【００１５】
以下、本発明の実施例について、図面を用いて詳細に説明する。
【実施例】
【００１６】
本実施例では、Ｒｐｎ１０遺伝子が高発現したイネの例について説明する。
まず、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を単離した。配列番号１に示す遺伝子は、イネ由来のＲｐｎ１０遺伝子のｃＤＮＡであり、プロテアソームのサブユニットの一つである。このｃＤＮＡの塩基配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬに登録されており、容易に単離することができる。なおこのｃＤＮＡの塩基配列のアクセッション番号は、ＡＢ０１０７４０である。
【００１７】
次に単離したＲｐｎ１０のｃＤＮＡを用いて発現ベクターを構築した。まず、テンプレートとして単離したｃＤＮＡと、ＢａｍＨＩの制限酵素サイトおよびＳａｃ Ｉの制限酵素サイトを含むプライマー（５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧ−３’、５’−ＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧ−３’）と、を用いてＰＣＲ法により増幅した。なおＰＣＲ法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｎａｔｉｖｅ  ｐｆｕポリメラーゼを用い（テンプレートｃDNA濃度：５ｎｇ／μＬ、プライマー濃度：１ｐｉｃｏｍｏｌ／μＬ）、９４℃で４５秒間処理後、ＰＣＲ反応（９４℃４５秒、６０℃４５秒、７２℃２分３０秒）を１８サイクル行い、７２℃で１０分間処理することにより行った。次に、ＢａｍＨＩとＳａｃ Ｉを用い、配列表の配列番号１に示すプロテアソームのサブユニット遺伝子を高発現バイナリーベクターｐＭＬＨ７１３３‐ＧＵＳプラスミドのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ Ｉ部位に導入した（図1参照）。
【００１８】
そして、構築した高発現バイナリーベクターをイネへ導入した。高バイナリーベクターの稲への導入は以下のとおり行った。まず、高発現バイナリーベクターをエレクトロポーレーション法（２５μF、２００Ω、２．５ｋＶ）によりアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株に導入した。ベクター導入後のアグロバクテリウムは、Ｎ６培地を基本とする培地を用いてカルス形成を誘導した５日目のイネ種子と３日間共存培養させて感染させた。これにより高発現バイナリーベクター由来のＲｐｎ１０遺伝子をイネの染色体中に挿入させた。その後、感染させたイネ種子から遺伝子導入が成功したイネ種子のみを選抜するための抗生物質ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌとアグロバクテリウムを死滅させるための抗生物質カルベニシリン５００ｍｇ／Ｌを添加したＮ６培地を基本とする上記と同様の培地で1週間培養（２８℃明条件）し、培地を新しくしてさらに1週間（２８℃明条件）培養した。感染した種子一粒ごとに独立した系統として選抜を行い、ＭＳ培地を基本とする再分化培地（ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌとカルベニシリン５００ｍｇ／Ｌを含む）に移して２週間培養することで植物体を誘導させた。
【００１９】
そして、一粒の種子から由来する独立した系統それぞれに対して導入した遺伝子の存在はゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ解析することにより確認した。まず、ゲノムＤＮＡの抽出には、１．５%ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｙｌ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ)を含む抽出バッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．０５Ｍ  ＮａＣｌ）により核酸を抽出させ、フェノール／クロロホルム混合液により部分精製する方法を用いた。ＰＣＲ解析には、ロシュ・ダイアグノスティックス社のＥｘｐｎａｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔを用い（テンプレートゲノムＤＮＡ濃度：５ｎｇ／μＬ、プライマー濃度：１ｐｉｃｏｍｏｌ／μＬ）、９４℃で２分間処理後、第１ＰＣＲ反応（９４℃１０秒、６２℃３０秒、６８℃３０秒）を１０サイクル、第２ＰＣＲ反応（９４℃１０秒、６２℃３０秒、６８℃３０秒；１サイクルおきに２０秒ずつ反応時間を増加）を２０サイクル、さらに６８℃で１０分間処理した。増幅断片の検出は１．０％アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色により行った。
【００２０】
Ｒｐｎ１０遺伝子の発現変化はノーザンブロット解析を行うことによって確認した。なおイネ由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出には、出穂後の展開した成熟葉約２ｇから０．５％のＳＤＳを含む抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） 、１００ｍＭ  ＮａＣｌ 、１４ｍＭ  ２‐メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ）とフェノール（ｐＨ９．０）の混合液によって抽出し、フェノール／クロロホルム混合液により部分精製する方法を用いた。
【００２１】
まず、イネ由来のｔｏｔａｌＲＮＡをＳＤＳ／フェノール法によって成葉から２０μｇ抽出した。そして抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを変性１．２％アガロースゲルで電気泳動させた後、ゲルエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）によるｒＲＮＡ染色および写真撮影を行った。次に泳動後のゲルは、Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｎナイロンメンブレンによる転写に用いた。Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｎナイロンメンブレンによる転写は、ｔｏｔａｌＲＮＡを固定したメンブレンを４２℃で６時間プレハイブリダイゼーションさせた後、３２Pで放射線ラベルしたＲｐｎ１０のＤＮＡプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせることによって行った。メンブレンはその後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃、５分間、２回洗浄した後、さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１ＳＤＳで４２℃、１５分間、２回洗浄し、−８０℃でオートラジオグラフィーを行った。
【００２２】
結果を図２に示す。なお本実施例では高発現バイナリーベクターｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳにＲｐｎ１０のＤＮＡ断片を挿入せず形質転換を行ったものを比較対照として用いている（この形質転換体を「Ｃ１」とする。）。
【００２３】
Ｃ１にはＲｐｎ１０が十分認識できるほど発現していない一方、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ９、Ｓ１０ではＲｐｎ１０が十分多く発現していることが確認された。なお各試料におけるＲｐｎ１０の発現の量は、Ｃ１における画像強度を（基準として）１００とした場合、Ｓ３では１２６、Ｓ４では１４７、Ｓ９では１９１、Ｓ１０では１２７の画像強度であると求めることができた。即ち、ここにいう高発現とは、コントロールである通常のイネ即ちイネの染色体上において遺伝的に発現する量のみより多いことをいい、より好ましくは、オートラジオグラフィーの画像解析の結果に基づいて画像強度比をとった場合、Ｒｐｎ１０のＤＮＡ断片を導入せず形質転換を行ったもの（もしくは形質転換を行わなかったもの）に比べ１．２倍以上の強度を有している場合がよいと考えられる。
【００２４】
次に、これら形質転換イネのストレス耐性について、アブシジン酸処理、低温処理、亜硝酸処理、の３つのストレス処理をそれぞれ行い、そのそれぞれに対する耐性を調べた。なおこれら耐性は、０．８％ガロースゲル中に発芽後３日目の種子を埋め、２４℃（１２時間明期／１２時間暗期）で生育し、一日あたり根の深度がどのくらい変化するのかを基準として評価した。なお、アブシジン酸処理は０．８％アガロースゲル中に５μＭのアブシジン酸を含ませる処理とし、低温処理は０．８％アガロースゲル中に埋めた後、２４時間４℃とし、亜硝酸処理は０．８％アガロースゲル中に１０ｍＭのＫＮＯ２を含ませる処理とした。
【００２５】
結果を図３乃至図５に示す。図３はアブシジン酸に対する根の深度変化を、図４は低温に対する根の深度変化を、図５は亜硝酸に対する根の震度変化をそれぞれ示す。なおＳ３、Ｓ４、Ｓ９、Ｓ１０は一粒の種子から由来する独立した系統それぞれを示すものである。
【００２６】
図３では、Ｒｐｎ１０遺伝子の発現した量に応じて、根の深度変化が大きくなっている。すなわち、ｐｎ１０遺伝子を導入したイネはコントロールと比較して、上述処理による根の身長に対する阻害効果が弱くなっていた。これはＲｐｎ１０遺伝子が発現すればするほどアブシジン酸に対して耐性を有することを示している。
【００２７】
図４においても図３と同様であり、コントロール（Ｃ１）に比べてＲｐｎ１０遺伝子の高発現した形質転換イネの深度変化が大きくなっている。この点だけ見ても、Ｒｐｎ１０遺伝子が発現すればするほど低温に対して耐性を有することを示している。
【００２８】
また、図５においても、Ｒｐｎ１０遺伝子が高発現した形質転換イネは亜硝酸に対する耐性が非常に優れていた。
【００２９】
すなわち、つまり、Ｒｐｎ１０遺伝子を高発現させることによって、これらの処理に対して耐性となった。
【００３０】
以上、Ｒｐｎ１０遺伝子を高発現させることで、アブシジン酸耐性、低温耐性、亜硝酸耐性を有する形質転換イネを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例における高発現バイナリーベクターの構造を示す模式図。
【図２】実施例におけるＲｐｎ１０遺伝子のｍＲＮＡ発現量及びＥｔＢｒによるｒＲＮＡの量を示す図。
【図３】実施例における形質転換イネのアブシジン酸処理に対する根の深度変化を示す図。
【図４】実施例における形質転換イネの低温処理に対する根の深度変化を示す図。
【図５】実施例における形質転換イネの亜硝酸処理に対する根の深度変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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