(57)【要約】【課題】花部を含む植物の組織および器官において、発光が認められる観賞用バラ科植物を提供すること。【解決手段】この発明の形質転換バラ科植物は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが生物学的に活性であるバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の形質転換植物であって、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入する工程、および該ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞より植物体を再生させる工程、を包含する方法によって得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ、該遺伝子から発現して発光することができる形質転換バラ科植物。
【請求項２】
前記バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）に属する植物がバラ属（Ｒｏｓａ）に属することを特徴とする請求項１に記載の形質転換バラ科植物。
【請求項３】
ルシフェリンを供給することにより植物体の器官または組織が発光することを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換バラ科植物。
【請求項４】
花部を含む器官が発光することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換バラ科植物。
【請求項５】
バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）に属する植物の細胞内に、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子を導入することと、該細胞中においてルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光することができる形質転換バラ科植物の作製方法。
【請求項６】
バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）に属する植物の細胞内に、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子を導入することと、該細胞中においてルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光することを特徴とする形質転換バラ科植物の発光方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、遺伝子組換えにより形質転換された発光バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物に関する。更に詳細には、この発明は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を細胞中に導入し発現させて発光し得る形質転換バラ科植物に関する。
【背景技術】
【０００２】  バラ科の植物は、観賞用植物として、切り花などとして広く愛用されている。もし暗い環境下で、照明を照らすことなく観賞または装飾の目的を果たすことが可能になれば、鑑賞用植物としての価値が格段と高まることになり、商品価値を一段と高めることができることになる。【０００３】  発光能を有する生物としては、ホタルおよびウミホタルなどが代表的なものとして知られている。これらの発光は、酸化酵素であるルシフェラーゼがルシフェリンを酸化することにより生起されていることが知られている。かかるホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼは、その酵素学的性質およびその遺伝子の塩基配列は解明されていて、約６万の分子量を有し、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および酸素の存在下でルシフェリンをオキシルシフェリンに酸化して、５６２ｎｍに極大を有する光を発する（非特許文献１）。【０００４】  ホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入された形質転換タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の根部、茎部および葉部において発光することが報告されている（例えば、非特許文献２）。しかしながら、形質転換されたタバコにおける発光はいずれも花部では認められていない上に、その発光の程度も観賞用植物としては不十分であった。【０００５】  最近、花部を含む植物の組織および器官において、肉眼で発光が認められる観賞用植物を作製することができる技術が示されている（特許文献１）。この形質転換植物は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ、該遺伝子から発現したルシフェラーゼが生物学的に活性であるナデシコ科の形質転換植物であることが開示されている。この特許文献には、この技術は、Ｒｏｓａ属（例えば、バラ）などのバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の植物にも適用できると記載されている。しかしながら、この技術をそのまま適用してもバラ科植物に対しては所定の作用効果が発揮されない。
【非特許文献１】Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５：５−１３，１９８８
【非特許文献２】Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９，１９９６
【特許文献１】特開平１１−５６１４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明者は、バラ科植物、特にその花部を発光させる技術を開発すべく鋭意検討研究した結果、バラ科植物の花部をも発光させることができる技術を見出して、この発明を完成するに到った。【０００７】  この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科植物ならびにその作製方法およびその発光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記目的を達成するために、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科植物を提供する。【０００９】  また、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の植物を作製する方法を提供する。
更に、この発明は、特に花部を含むバラ科植物体の種々の器官または組織を発光させることからなる形質転換バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物の発光方法を提供する。【００１０】  この発明は、その１つの態様として、バラ（Ｒｏｓａ）属などに属する形質転換バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物であって、その器官または組織、好ましくはその花部を含む器官が発光する形質転換バラ科植物を提供する。
この発明は、その１つの実施態様として、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を有し、かつ該遺伝子から発現したルシフェラーゼが活性化して、特にその花部を含む組織や器官などが発光するバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の形質転換植物を提供する。【００１２】  この発明は、その別の態様として、ルシフェラーゼを発現して発光する形質転換バラ科植物の作製方法を提供する。
この発明は、その１つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェラーゼ遺伝子を発現させて発光させることからなる形質転換バラ科植物を調製する方法を提供する。【００１３】  この発明は、その更に別の態様として、ルシフェリンを供給して発光させることからなる形質転換植物の発光方法を提供する。
この発明は、その１つの実施態様として、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をその細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェフーゼ遺伝子を発現させて、ルシフェリンを供給して発光させることからなる形質転換バラ科植物の発光方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  この発明に係る形質転換バラ科植物は、特に花部を含む種々の器官または組織が発光し得る形質転換したバラ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）科の植物である。この発明において、バラ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）科の植物には、バラ（Ｒｏｓａ）属などに属する植物が挙げられる。【００１５】  この発明に係る発光可能な形質転換バラ科植物の作製方法は、バラ科植物の細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科にその植物細胞に導入し、その細胞中において該ルシフェラーゼ遺伝子を発現させることから構成される。【００１６】  この発明に使用することができるルシフェラーゼ遺伝子は、特に限定されるものではなく、バラ科植物の細胞中で発現して発光することができるものであればいずれも使用することができる。【００１７】  かかるルシフェラーゼ遺伝子としては、例えば、ホタルなどの昆虫（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、発光細菌（例えば、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、海洋性甲虫類（例えば、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ）、および藻類（例えば、Ｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｐｏｌｙｅｄｒａ）などの生物に由来するルシフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、５６２ｎｍに発光極大を有するホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｉｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子が好ましい。またホタルの発光と異なる色調（すなわち、異なる発光波長）を得るためには、例えば、４７０ｎｍに発光極大を有するウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ）ルシフェフーゼをコードする遺伝子を使用することもできる。【００１８】  上記のルシフェラーゼ遺伝子は単離されていて、そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子配列登録機関に登録されている。当業者は、遺伝子配列登録機関または遺伝子配列登録機関の登録配列に基づく各種のデータベース（例えば、ＤＮＡＳＩＳＴＭ）から、ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を入手することができる。【００１９】  この発明に使用することができるルシフェラーゼ遺伝子は、公知のヌクレオチド配列に基づいて、当業者に周知の方法を用いて発光生物から直接単離することもできるし、あるいは、既に単離され、クローン化されているルシフェラーゼ遺伝子を使用することもできる。さらに、公知のヌクレオチド配列に基づいて化学合成した遺伝子も使用することができる。【００２０】  更に詳細には、この発明において発光生物からのルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販の各種のキットを用いて単離することができる。この単離操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８７）などの当該分野の標準的な実験マニュアル、ならびに使用するキットの使用説明書に記載された条件および手順に従って実施することができる。【００２１】  また、この発明に使用されるルシフェラーゼ遺伝子は、上記のように既にクローン化された遺伝子を含有するベクターから適切な制限酵素を用いて切断して分離することもできる。かかるクローン化ルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターとしては、例えば、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｉｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼのコード領域を含有するｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、細菌発現用）、ｐＭＡＮｎｅｏ−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、動物細胞用）などが挙げられる。これらのベクターからのルシフェラーゼ領域の取り出しは、使用説明書に従って適切な制限酵素を用いた消化などの当該技術分野で慣用されている方法に従って実施することができる。【００２２】  このようにして得られたルシフェラーゼ遺伝子は、必要に応じて、その活性および特異性を変更するため、あるいはその後の遺伝子組換え操作を容易にするためにその配列の一部または領域を改変することができる。このような改変は、部位特異的変異誘発法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当業者に周知の方法を用いて行うことができる。このようなヌクレオチド配列の改変により、１つ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列領域が変更されることは当業者にとっては周知である。これらの標準的な方法や条件などは、上記の実験マニュアルに記載されている。【００２３】  植物細胞内でルシフェラーゼを効率的に発現させるための発現ユニットは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域以外に、ルシフェラーゼ遺伝子をｍＲＮＡに転写するためのプロモーター領域、そして必要に応じてプロモーターに作用してその転写活性を調節するエンハンサー領域、および転写されたｍＲＮＡの安定性に関与しているターミネーター領域から構成されている。【００２４】  このようなプロモーターとしては、導入された植物細胞内でルシフェラーゼ遺伝子をｍＲＮＡに転写することができるものであれば、いずれのプロモーターも使用することができ、特に限定されるものではない。かかるプロモーターとしては、例えば、非植物に由来するプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、またはオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）のプロモーター）であっても、また植物に由来するプロモーター（例えば、カルコン合成酵素などの二次代謝系の酵素のプロモーター、またはグリシニンなどの貯蔵タンパク質のプロモーターなど）であってもよい。植物の種々の組織において発光を可能にするために好適なプロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用することができる。上記ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＣａＭＶＣＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などのベクター中にクローン化されているものが挙げられる。この発明においては、形質転換植物の細胞内でのルシフェラーゼ遺伝子の発現のために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用するのが好ましい。【００２５】  この発明において導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、エンハンサー領域を導入することにより変化させることができる。このエンハンサー領域は、イントロンなどの非翻訳領域またはプロモーター領域内の特定の領域部分に存在し、用いるプロモーター領域の５’または３’、あるいはその両方に配置されることができる。かかるエンハンサー領域としては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の−３４３〜−９０の領域（Ｋａｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２９９−１３０２，１９８７）、Ω配列と呼ばれるタバコモザイクウイルスの５’非翻訳領域（Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１５：３２５７−３２７２，１９８７）、およびアルファルファモザイクウイルスの５’非翻訳領域（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５，１９８７）などがある。これらのエンハンサー領域は、単独で使用しても、複数個で使用してもよく、また互いに組み合わせて使用してもよい。この発明においては、好ましくは、タバコモザイクウイルスΩ配列またはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の領域を使用するのが好ましく、またその両方を使用するのがより好ましい。また、その両方のエンハンサー配列をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと組み合わせて使用する場合には、Ω配列はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコア領域（−９０〜−１）に対して３’側に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の領域のエンハンサー領域は５’側に配置するのが好ましい。更に、エンハンサー配列の数は形質転換を行う植物に依存する。その上、この発明に用いられるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内のエンハンサー領域は、通常２個用いるのが好ましいが、この数は特に限定されない。【００２６】  この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子以外に、形質転換された植物細胞または植物体を容易に選択することができるようにするための選択マーカーとなる耐性などの形質を付与する遺伝子を含有しているのがよい。かかる形質付与遺伝子としては、例えば、カナマイシンおよびネオマイシンの両抗生物質に対する耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ならびにハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子などが挙げられる。これらの選択マーカーとしての遺伝子は、単独でも、または２つ以上を組合せて使用してもよい。この発明において、ルシフェラーゼ発現ベクターは、選択マーカー遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子およびＨＰＴ遺伝子を含有するのが好ましい。これらの遺伝子は、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターまたはｎｏｓプロモーターなどの上記のプロモーターの制御下にあり、また代表的なプロモーターは、ｎｏｓターミネーターをその３’に有している。その結果、得られる形質転換植物は、カナマイシンおよびハイグロマイシンの両方に対して耐性を有することになる。【００２７】  また、この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、必要に応じて、植物細胞内で安定に発現可能なルシフェフーセ遺伝子および選択マーカー遺伝子を含む領域を植物細胞の染色体内に組み込むための領域や、植物細胞内に発現ベクターを導入するために使用され��細菌内での複製に必要な領域をさらに含んでいてもよい。ルシフェラーゼ遺伝子および選択マーカー遺伝子を含む領域を植物細胞の染色体内に組み込むための領域としては、例えば、土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の感染による腫瘍誘発に関係するＴｉプラスミドのＲＢ配列領域およびＬＢ配列領域などが挙げられる。さらに、このようなベクター上での遺伝子組換え操作を容易に行うために、かかる発現ベクターには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での複製および選択を可能にするマーカー、例えば、アンピシリン耐性遺伝子領域などが含まれているのがよい。したがって、この発明に使用することができる発現ベクターとしては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、薬剤耐性選択マーカー遺伝子、植物細胞の染色体内への組み込みを可能にするＲＢおよびＬＢ配列領域、土壌細菌内での複製に必要な領域、および大腸菌での複製ならびに選択マーカー遺伝子領域を含むのが好ましい。【００２８】  上記発現ベクターは、上記配列領域を含む発現ベクターであって、例えば、Ｔｉプラスミドに由来するｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの植物用の発現ベクターを用いて構築することができる。この発現ベクターｐＢＩ１２１は、ＬＢ配列とＲＢ配列に挟まれた領域内に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびＮｏｓプロモーター制御下のＮＰＴＩＩ遺伝子の２つの発現ユニットを有している。【００２９】  この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、例えば、ｐＢＩ１２１のＧＵＳ領域をルシフェラーゼのコード領域に置換することによっても得ることができる。この発現ベクターは、例えば、制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）消化によりＧＵＳ領域を除いたｐＢＩ１２１に、制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）消化によりｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣから得られたルシフェラーゼのコード領域を挿入することによって作製することができる。エンハンサー配列は、例えば、ｐＬ１１Ａ−Ａ２５（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：５５８５−５５９０，１９８５）および上記のｐＢＩ１２１から制限酵素による消化、またはこれらをテンプレートとして、適切なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た後、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５’側に、および／またはＢａｍＨＩ部位を用いてその３’側に導入することによって得るできる。【００３０】  また、この発明に使用することができるルシフェラーゼ発現ベクターは、他のクローニングベクター、例えば、ｐＵＣ１８およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で、必要な領域の所定の部分、例えば、エンハンサー配列を伴うプロモーター領域、コード領域とプロモーター領域またはターミネーター領域とを組み合わせた領域、またはそれらの一部を構築することによっても作製することができる。そのような部分領域を、例えば、ｐＢＩ１２１などの植物細胞発現用ベクターへ置換などすることにより導入して、目的とする最終の植物細胞導入用のルシフェラーゼ発現ベクターを構築することもできる��発現ベクターの構築方法は、上記の手順に限定されることなく、当業者に慣用されているいずれの手順に従っても容易に行なうことができる。【００３１】  上記のようにして構築されたルシフェラーゼ発現ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、植物に対して感染能を有する土壌細菌、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｚｏｇｅｎｅｓ）などを介する方法、エレクロポレーションによる方法などを用いて実施することができる。【００３２】  上記した植物細胞への導入方法のうち、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌を介する導入方法は、植物細胞への感染に先立って、構築した発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌に導入することが必要である。このような土壌細菌を介する植物細胞への導入は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに対する方法と同様にして、カルシウム処理による導入方法、凍結融解法、またはエレクロポレーンョン法などを用いて行なうことができる。なお、アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌の培養は、例えば、ＬＢ培地またはＹＥＢ培地などの培地を用いて、適切な条件下、例えば、２５〜３０℃で、２４〜３６時間の振盪培養で行うことができる。【００３３】  アグロバクテリウム・ツメファシエンスなどの土壌細菌の感染による発現ベクターの植物細胞内への導入は、例えば、植物の組織片、葉および／または茎の切片と、発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌体もしくはその培養液とを所定の時間接触させることにより行うことができる。例えば、葉の切片を用いる方法は、リーフディスク法として当業者には公知である（例えば、Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９，１９８５）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染する植物の範囲およびその効率は、その菌種によって異なる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株は、双子葉植物、特にタバコに対しては容易に感染するが、イネなどの単子葉植物に対しては容易には感染しない。これに対して、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株は、ＬＢＡ４４０４株と比較して、単子葉植物に対しても十分に高い感染効率を有している。【００３４】  より具体的に説明すると、発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、ＥＨＡ１０１株）の培養液に、葉片などの組織片を浸漬し、一定時間、例えば、１０分間放置する。その後、植物細胞から植物体を分化／誘導させるために、例えば、０．１ｐｐｍインドール酢酸および１ｐｐｍベンジルアデニンならびに糖（通常、３％スクロース）を添加した植物組織培養用培地（例えば、ムラシゲ−スクーグ（ＭＳ）培地、リンスマイヤー−スクーグ（ＬＳ）培地、またはガンボルグＢ５培地など）の寒天培地上に組織片を置いた後、例えば、２７℃で２日間培養する。ここで使用される培地の組成は、形質転換する植物およびその組織に応じて変えることができることは、当業者にとっては周知である。【００３５】  上記の培養後、感染させたアグロバクテリウム・ツメフ��シエンスの除菌処理と合わせて、ルシフェラーゼ遺伝子を含む感染細胞の選択が行われる。なお、この除菌処理は、公知の方法によって行なうことができる。【００３６】  この発明に係る形質転換バラ科植物におけるルシフェラーゼの発現は、種々の方法により定量的または定性的に分析することができる。例えば、形質転換植物の組織、例えば、根、茎、葉などを、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝液などの適切な緩衝液中で破砕し、遠心分離により得られた上清中のルシフェラーゼの酵素活性を発光量としてルミノメーターで定量的に測定することによって、その発現を測定することができる。また、この反応液を暗所中に放置することにより、その発光を定性的に観測することもできる。酵素活性測定用の反応液には、例えば、クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ、ｐＨ５．０）中に１ｍＭルシフェリンおよび１％ＤＭＳＯが含まれていて、さらに、ルシフェラーゼの酵素活性の発現に必要な物質、例えば、金属イオン、ＡＴＰが含まれていてもよい。【００３７】  上記のようにして作製されたこの発明の形質転換植物は、ルシフェリンを植物組織または器官に供給することによって発光することができる。すなわち、形質転換植物の細胞内において、導入ルシフェラーゼ遺伝子に由来する生物学的に活性なルシフェラーゼの酵素機能により、供給されたルシフェリンが酸化され、暗所において肉眼で観察できる十分な強度で発光することができることになる。【００３８】  この発明に係る形質転換バラ科植物は、ルシフェリンまたはその塩、例えば、ナトリウム塩などを含有する溶液、例えば、上記の酵素活性測定用の溶液を、根より吸収させるか、または切り花とした場合には、その切り口、すなわちその茎から吸収させることによって発光させることができる。また、この発明の形質転換植物は、上記のルシフェリン含有溶液を噴霧することによって、または上記のルシフェリン含有溶液中へ浸漬させることによっても発光させることができる。つまり、供給されたルシフェリンがルシフェラーゼを発現している植物の器官および組織に到達すると、そこでルシフェラーゼによる酵素反応により発光する。これにより、例えば、この発明に係る形質転換バラ科植物の茎部、葉部および花部で発光させることができる。
【実施例】
【００３９】  この発明を実施例によって以下に説明するが、この発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、またこれらの実施例からの改良ならびに改変もしくは修飾などもまたこの発明の範囲に包含されるものと解釈されるべきである。本実施例において用いた遺伝子組換え操作ならびに植物の形質転換の標準的な手順や条件などは、上記の実験マニュアルに記載されている。【００４０】  実施例１：ルシフェラーゼ発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣの構築およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株のリーフディスク法によるバラ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の形質転換【００４１】  ルシフェラーゼ発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｈ−Ｌｕｃの構築は、以下の通りに行った。
カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコア領域（−１〜−９０）は、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。このＰＣＲにおいて、プライマーとしては、Ａ５：５’−ＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧ−３’（配列番号：１）およびＡ３：５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：２）を使用した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間の変性反応、５０℃で６０秒間のアニーリング反応、および７２℃で６０秒間の伸長反応からなるサイクルを２５回行った。Ａ３プライマーは、制限酵素ＳｎａＢＩの認識部位を含み、タバコモザイクウイルスのΩ配列の５’領域と相補的であった。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＥｃｏＲＶおよびＳｎａＢＩの制限酵素で３７℃で１時間消化した後、ＭＥＲＭＡＩＤＴＭＫｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を用いて、その使用説明書に従って精製した。【００４２】  タバコモザイクウイルスのΩ配列は、タバコモザイクウイルスのｃＤＮＡプラスミドｐＬ１１Ａ−Ａ２５（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：５５８５−５５９０，１９８５）を、Ｂ５：５’−ＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号：３）およびＢ３：５’−ＧＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：４）の２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（９５℃で３０秒間の変性反応、５０℃で６０秒間のアニーリング反応、および７２℃で６０秒間の伸長反応からなるサイクルの２５回）。Ｂ５プライマーは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの３’と同じ配列を有し、Ｂ３はポリリンカー配列（ＸｂａＩ．ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩ．ＢｃｌＩおよびＳａｃＩ）を有する。得られたＰＣＲフラグメントを、ＳｎａＢＩおよびＳａｃＩの制限酵素で３７℃で１時間消化した後、ＭＥＲＭＡＩＤＴＭＫｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。【００４３】  上記の制限酵素処理したＰＣＲフラグメント（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコア領域のＥｃｏＲＶ／ＳｎａＢＩおよびΩ配列のＳｎａＢＩ／ＳａｃＩフラグメント）を、ＥｃｏＲＶおよびＳａｃＩの制限酵素で消化したｐＲＥＸ−１（特開平４−１６９１８５号）に１６℃で３０分間処理して連結した。その後、この連結反応混合液を用いて、熱ショック法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布した後、一晩培養（３７℃）して耐性クローンを選択した。耐性クローンに含まれるプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法（１．５ｍｌスケール）により単離し、制限酵素分析により、目的の挿入フラグメントを含むクローン（ｐＥ７１１３）を選択した。ｐＥ７１１３は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサー様配列（−２９０〜−９０）が７個連結した構造を有していた。【００４４】  上記で得られたｐＥ７１１３に、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎ���ｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント）を挿入することによってｐＥ７１１３−ＧＵＳを得た。その後、ｐＥ７１１３−ＧＵＳのエンハンサー様配列の置換を以下のようにして行った。得られたｐＥ７１１３−ＧＵＳをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶの制限酵素で消化し、大きい方のフラグメントを単離した。一方、−４１９〜−９０のエンハンサー様配列を、ｐＦＦ１９Ｇ（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，Ｍ．Ｃ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３３３−３４４，１９９０）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶによる制限酵素消化よって得た。これらの２つのフラグメントを、１６℃で３０分の連結反応により連結した。連結反応混合液を用いて上記と同様の操作を行って目的のクローン（ｐＥ２１１３−ＧＵＳ）を得た。【００４５】  次に、ｐＥ２１１３−ＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素で消化したｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することによって、ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳを得た。ｐＦＦ１９（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ．Ｍ．Ｃ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３３３−３４４，１９９０）を制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）で消化することにより、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を単離した。得られたＨＰＴ遺伝子フラグメントの両端を平滑化した後にＳｍａＩリンカーを連結し、そしてＳｍａＩのアイソシゾマーの制限酵素Ｃｆｒ９Ｉで消化した後、このＨＰＴ遺伝子フラグメントをｐＢＥ２１１３−ＧＵＳのＧＵＳ遺伝子の３’に位置するＳｍａＩ（Ｃｆｒ９Ｉ）部位に挿入して、ｐＢＥ２１１３ＧＵＳ−ＨＰＴを得た。【００４６】  続いて、ｐＢＥ２１１３ＧＵＳ−ＨＰＴをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの制限酵素で消化して、ＧＵＳのコード領域を除いた。ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＴ７／Ｔ３−ＬＵＣをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの制限酵素で消化し、ルシフェラーゼのコード領域を単離した。単離したルシフェラーゼのコード領域を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで処理したｐＢＥ２１１３ＧＵＳ−ＨＰＴに挿入し、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣを得た。【００４７】  ルシフェラーゼ発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣのアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株への導入は以下の通りに行った。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株を、５ｍｌのＹＥＢ培地（０．１％酵母抽出物、０．５％肉抽出物、０．５％ペプトン、０．５％スクロース、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で一晩３０℃で振盪培養した。次いで、１リットルフラスコ中で２００ｍｌのＹＥＢ培地に５ｍｌの培養物を加え、さらに３０℃で５〜６時間培養した。続いて、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を集め、集めた菌体を１００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に懸濁した。この懸濁液を上記と同一条件で再度遠心分離を行って得られた菌体を２ｍｌのＹＥＢ培地中に懸濁した。微量遠心チューブ中でこの懸濁液の１００μｌと１μｇのｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣを含む５μｌのＤＮＡ溶液とを混合して、ドライアイス／エタノール浴中で５分間凍結させた。次いで、凍結した溶液を３７℃の温浴中で融解し、２５分間放置した後、１ｍｌのＹＥＢ培地を添加し、１時間３０℃で振盪培養した。このようにして得られた培養液１００μｌをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＢ培地上に塗布し、約３６時間３０℃で培養して耐性クローンを得た。得られた耐性クローン中のルシフェフーゼ発現ベクターｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣをアルカリ−ＳＤＳ法により単離して、制限酵素分析によりその存在および構造を確認した。【００４８】  バラのリーフディスク法による形質転換および植物体の分化ならびに誘導は、以下の手順に従って行なった。
この実験には、無菌下で茎頂培養により誘導したバラの多芽体を用いた。多芽体の誘導は、ムラシゲ−スクーグ（ＭＳ）培地の無機塩（以下、ＭＳ無機塩）、ガンボルグＢ５培地の有機物（以下、Ｂ５有機物）、ベンジルアデニン（１ｐｐｍ）、インドール酢酸（０．０２ｐｐｍ）、スクロース（３％）、およびゲランガム（Ｓｉｇｍａ、０．２５％）からなる培地（基本培地）を用いて行った（温度：２４℃、明期：１６時間、暗期：８時間）。ＭＳ無機塩は、ＫＮＯ３（１９００ｍｇ／ｌ）、ＮＨ４ＮＯ３（１６５０ｍｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７０ｍｇ／ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（４４０ｍｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３７０ｍｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２７．８ｍｇ／ｌ）、Ｎａ２ＥＤＴＡ（３７．３ｍｇ／ｌ）、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ（２２．３ｍｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（８．６ｍｇ／ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（６．２ｍｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５ｍｇ／ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５ｍｇ／ｌ）、ＫＩ（０．８３ｍｇ／ｌ）、およびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５ｍｇ／ｌ）を含む。Ｂ５有機物は、ミオイノシトール（１００ｍｇ／ｌ）、チアミン塩酸塩（１０ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（１ｍｇ／ｍｌ）、およびニコチン酸（１ｍｇ／ｌ）を含んでいた。得られた多芽体は、上記の多芽体誘導培地および条件下で継代培養することにより維持した。【００４９】  ｐＢＥ２１１３Ｈ−ＬＵＣを含有する上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株を、ＬＢ培地中で３０℃で２日間培養した。この培養液に、上記の多芽体から得られた葉片（大きさ：約３ｍｍ×約２０ｍｍ）を約１０分間浸漬した。その後、葉片を共存培地上に置床した。共存培地は、上記の基本培地にオーキシンおよびサイトカイニンを添加した培地である（共存培地１：０．２ｐｐｍチジアズロン＋０．５ｐｐｍインドール酪酸、共存培地２：０．５ｐｐｍベンジルアデニン＋０．５ｐｐｍ１−ナフタレン酢酸、および共存培地３：０．５ｐｐｍベンジルアデニン＋０．５ｐｐｍ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）。培養は、２４℃で、１６時間の明期（５０００ｌｕｘ）および８時間の暗期で、３日、５日、７日、１０日、および１４日の各期間行った。【００５０】  次に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株の除菌と形質転換植物の分化／誘導のために、上記の葉片を、共存培地１〜３にハイグロマイシン（３０μｇ／ｍｌ）およびカルベニシリン（５００μｇ／ｍｌ）を添加した選択培地に移した。培養は、１６時間の明期（５０００ｌｕｘ）および８時間の暗期で、２４℃でさらに１６〜２７日間（上記の共存培地への置床から合計３０日間）行い、不定芽を形成させた。その結果を表１に示す。共存培地２上で形成された不定芽の葉片を上記の不定芽誘導培地に置床することにより不定芽を誘導し、そして３２個体の形質転換体を得た。【００５１】
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【００５２】  選択された不定芽から育成した幼植物体を発根培地（Ｂ５有機物を含まない基本培地）に移し、３０日間培養して根を形成させた。この幼植物体を、バーミキュライト（日本耐火（株））とパーライト（日本セメント（株））との１：１の混合物に移し、１０００倍希釈のハイポネックスＴＭ（ハイポネックスジャパン（株））を液肥として与え馴化処理を行った。この馴化処理は、１６時間照明（２００００ｌｕｘ）の明期（２４℃）および８時間の暗期（２０℃）の人工気象室で３０日間行った。その後、植物体を、土を主体とする用土（クレハ園芸培土：呉羽化学（株））に移植（鉢上げ）し、上記の条件の人工気象室内で栽培した。【００５３】  形質転換されたバラの発光は、不定芽の葉片および鉢上げ直後の植物体の葉を用いてルシフェリン溶液を葉の切り口から吸収させることによって行った。上記の最初に得られた３２個体の形質転換されたバラのうち、１３個において肉眼で明瞭な発光が認められた。次に、これらの１３個体について、開花期の形質転換体の地上部を用いて、茎からルシフェリン溶液を吸収させることによって発光検定を行った。このうちの１個体は、茎、葉および花部が肉眼ではっきりと認められる程度に発光した。残りの１２個体は、かすかに発光するか、または肉眼でその発光を確認することができなかった。【００５３】  上記の発光検定で発光が認められた形質転換体１つの不定芽の葉片を、再度、選択培地に置床することにより不定芽を誘導し、形質転換体をさらに選択した。このようにして得られた２０個体を鉢上げし、上記のように発光検定を行ったところ、鉢上げ直後の２０個体すべての葉には、発光が認められた。また、開花期の地上部は、茎からルシフェリン溶液を吸収させることによって発光検定を行ったところ、２個体において、茎、葉および花部に発光が肉眼ではっきりと認められる程度に認められた。しかし、残りの１８個体においては、かすかに発光を確認することができるか、またはその発光を肉眼で確認することができなかった。【００５４】  これらの形質転換植物については、鉢上げ直後の植物の葉の発光は、５０ｃｍの距離からでも肉眼で充分に観察することが可能であった。特に、茎、葉および花部において最も強い発光強度を有した上記の形質転換体では、２〜３ｍの距離からでも肉眼でその発光が十分に観察できた。この形質転換植物の発光は、茎をルシフェリン溶液に１〜２時間浸すことによって約１２時間持続し、さらに、茎をルシフェリン溶液に浸したままの状態では、最大３日間持続した。【００５５】  発光のために使用したルシフェリン溶液は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、０．２５ｍＭルシフェリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ）、２．５ｍＭ補酵素Ａ三ナトリウム（和光純薬工業（株））、２．５ｍＭ  ＡＴＰ（オリエンタル酵母工業（株））および２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有していた。
【発明の効果】
【００５６】  この発明によれば、植物細胞内で作動可能なルシフェラーゼ遺伝子をバラ科に属する植物の細胞に導入し、導入された植物細胞から分化／誘導された植物体を再生させることにより形質転換植物を得ることができる。この形質転換植物に、ルシフェリンを供給することによって、形質転換植物の組織および器官を発光させることができる。この発明により得られる形質転換植物は、肉眼で十分にその発光が認められ、暗所での観賞に好適である。
【００５７】
【配列表】
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