(57)【要約】【課題】  極微量のＤＮＡで実行でき、しかも特別な装置・器具を必要としない、ＤＮＡ中の制限酵素反応部位または変異部位の検出方法を提供する。【解決手段】  ゲノムＤＮＡにおける制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検出方法であって、（ｉ）試験すべき細胞からゲノムＤＮＡを得て、これを制限酵素または部位特異的酵素で処理し、該酵素で処理されたゲノムＤＮＡを鋳型としてロングＰＣＲを行い、（ｉｉ）上記増幅生成物を鋳型としてショートＰＣＲを行い、次いで（ｉｉｉ）該酵素処理した試料と該酵素処理しなかった試料のショートＰＣＲの結果を比較することを特徴とし、さらに（ｉｖ）変異の検出の場合には、正常細胞に関して上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡにおける制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検出方法であって、
（ｉ）試験すべき細胞からゲノムＤＮＡを得て、これを制限酵素または部位特異的酵素で処理し、該酵素で処理されたゲノムＤＮＡを鋳型としてロングＰＣＲ（long PCR）を行い、
（ｉｉ）上記増幅生成物を鋳型としてショートＰＣＲ（short PCR）を行い、次いで
（ｉｉｉ）該酵素処理した試料と該酵素処理しなかった試料のショートＰＣＲの結果を比較することを特徴とし、さらに
（ｉｖ）変異の検出の場合には、正常細胞に関して上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することを特徴とする方法。
【請求項２】
ロングＰＣＲ用のプライマーとして繰り返し配列またはアービトラリープライマー（arbitrary primers）を用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ロングＰＣＲが約２ｋｂ以上のＤＮＡを増幅するものであり、ショートＰＣＲが約２ｋｂ未満のＤＮＡを増幅するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
修飾がＤＮＡのメチル化である請求項１記載の方法。
【請求項５】
下記工程：
（ｉ）細胞を適切なバッファー中に集め、
（ｉｉ）ミネラルオイル中で該細胞と低融点アガロース溶液と混合し、凝固させ、
（ｉｉｉ）凝固した低融点アガロース混合物をプロテイナーゼで処理し、次いで
（ｉｖ）適切なバッファーで洗浄する
を特徴とする方法により細胞からゲノムＤＮＡを得るものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法を用いて制限酵素反応部位または変異部位を検出するためのキットあって、ロングＰＣＲ用器具および試薬、ならびにショートＰＣＲ用器具および試薬を必須として含むキット。
【請求項７】
さらに請求項５記載の方法を用いてゲノムＤＮＡを調製するための器具および試薬を含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
ゲノムＤＮＡのメチル化を検索するための、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法あるいは請求項６または７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の分析の分野に関する。詳細には、極微量の細胞から行えるゲノムワイドな制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検索法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムワイドな制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検出方法として、Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS)法（非特許文献１参照）があり、これは一旦ある制限酵素でゲノムＤＮＡを切断した後、末端を標識し、アガロースゲルでの電気泳動後、ゲル中で他の酵素で切断し、アクリルアミドゲルで２次元的に電気泳動をする事により、制限酵素サイトの有無を視覚化する方法である。しかし、ＲＬＧＳ法は、大量のゲノムＤＮＡ（数十μｇ）を必要とし、また、それ用の２次元電気泳動層や、放射性同位元素も必要とする。
【０００３】
さらに、ＰＣＲを介した従来のメチル化変動領域を検索するフットプリント法（methylation sensitive AP-PCR法等）（非特許文献２参照）でも、大量のデノムＤＮＡを必要とし、また、このような１段階のＰＣＲでは比較的狭い範囲にある制限酵素部位の変異（例えば、多型）や修飾（例えば、メチル化）しか、とらえることができなかった。
【非特許文献１】Hayashizaki Y, et al.: Electrophoresis, 14: 251-258, 1993
【非特許文献２】Liang G, et al.: Methods, 27: 150-155, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、極微量のＤＮＡで実行でき、しかも特別な装置・器具を必要としない、ＤＮＡ中の制限酵素反応部位または変異部位の検出方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、極微量の細胞から調製された巨大ゲノムＤＮＡを制限酵素処理し、さらに繰り返し配列、または複数のアービトラリープライマー（arbitrary primers）を利用した、ロングＰＣＲ（long PCR）およびショートＰＣＲ（short PCR）からなる２段階のゲノムＤＮＡ増幅法を組み合わせて行うことにより、特別な機器を用いずに、制限酵素反応部位または変異部位の有無を視覚化させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は下記の（１）〜（８）を提供するものである：
（１）ゲノムＤＮＡにおける制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検出方法であって、
（ｉ）試験すべき細胞からゲノムＤＮＡを得て、これを制限酵素または部位特異的酵素で処理し、該酵素で処理されたゲノムＤＮＡを鋳型としてロングＰＣＲ（long PCR）を行い、
（ｉｉ）上記増幅生成物を鋳型としてショートＰＣＲ（short PCR）を行い、次いで
（ｉｉｉ）該酵素処理した試料と該酵素処理しなかった試料のショートＰＣＲの結果を比較することを特徴とし、さらに
（ｉｖ）変異の検出の場合には、正常細胞に関して上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することを特徴とする方法；
（２）ロングＰＣＲ用のプライマーとして繰り返し配列またはアービトラリープライマー（arbitrary primers）を用いる（１）記載の方法；
（３）ロングＰＣＲが約２ｋｂ以上のＤＮＡを増幅するものであり、ショートＰＣＲが約２ｋｂ未満のＤＮＡを増幅するものである（１）記載の方法；
（４）修飾がＤＮＡのメチル化である（１）記載の方法；
（５）下記工程：
（ｉ）細胞を適切なバッファー中に集め、
（ｉｉ）ミネラルオイル中で該細胞と低融点アガロース溶液と混合し、凝固させ、
（ｉｉｉ）凝固した低融点アガロース混合物をプロテイナーゼで処理し、次いで
（ｉｖ）適切なバッファーで洗浄する
を特徴とする方法により細胞からゲノムＤＮＡを得るものである、（１）記載の方法；
（６）（１）記載の方法を用いて制限酵素反応部位または変異部位を検出するためのキットあって、ロングＰＣＲ用器具および試薬、ならびにショートＰＣＲ用器具および試薬を必須として含むキット；
（７）さらに（５）記載の方法を用いてゲノムＤＮＡを調製するための器具および試薬を含む、（６）記載のキット；
（８）ゲノムＤＮＡのメチル化を検索するための、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法あるいは（６）または（７）記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、極微量の試料（例えば、細胞１０個程度、ＤＮＡにして数十ｐｇ）からのゲノムワイドな制限酵素部位または変異もしくは修飾部位の検索ができる。また、従来のゲノムのフットプリントではアクリルアミドゲルで分離できる狭い範囲しか制限酵素部位の検索ができなかったが、本発明によれば、より広い範囲で検索を行うことができ、検索できる制限酵素部位または変異もしくは修飾部位の幅も広く、より出現頻度が低い制限酵素部位も検索の対象となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下において、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書で使用される用語は、特に断らないかぎり、当該分野において用いられている通常の意味を有するものとする。
【０００９】
本発明は、第１の態様において、制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の検出方法を提供する。該方法は、（ｉ）試験すべき細胞からゲノムＤＮＡを得て、これを制限酵素または部位特異的酵素で処理し、該酵素で処理されたゲノムＤＮＡを鋳型としてロングＰＣＲ（long PCR）を行い、（ｉｉ）上記増幅生成物を鋳型としてショートＰＣＲ（short PCR）を行い、次いで（ｉｉｉ）該酵素処理した試料と該酵素処理しなかった試料のショートＰＣＲの結果を比較することを特徴とし、さらに（ｉｖ）変異の検出の場合には、正常細胞に関して上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することを特徴とする。
【００１０】
本発明の方法を実施するにあたり、先ず、細胞からゲノムＤＮＡを得る。細胞はいずれの生物の細胞であってもよいが、好ましくは、繰り返し配列がよく知られている脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくは霊長類細胞である。本発明の方法に使用するゲノムＤＮＡは、目的とする制限酵素部位または変異もしくは修飾部位をできるだけ多く含むことから、できるかぎり大型のゲノムＤＮＡであることが好ましい。そのサイズは１００ｋｂ以上であることが好ましく、１０００ｋｂ以上であることがさらに好ましい。かかる巨大ゲノムＤＮＡの調製方法はいくつか知られており、例えば、パルスフィールドゲル電気泳動法で行われている、低融点アガロース中でのゲノムＤＮＡ調製法をスケールダウンすることにより巨大ゲノムＤＮＡを得てもよい。この方法は、（ｉ）細胞を適切なバッファー中に集め、（ｉｉ）ミネラルオイル中で該細胞と低融点アガロース溶液と混合し、凝固させ、（ｉｉｉ）凝固した低融点アガロース混合物をプロテイナーゼで処理し、次いで（ｉｖ）適切なバッファーで洗浄することを特徴とする。この方法の好ましい具体例を実施例３および図４にて説明する。
【００１１】
本発明により検出できる制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位は様々である。目的とする制限酵素部位または変異もしくは修飾部位を認識する酵素で巨大ゲノムＤＮＡを切断し、本発明の方法に従って増幅反応を行って変異もしくは修飾部位を検出することができる。制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位の配列、変異の種類（例えば、ヌクレオチドの付加、欠失、置換など、あるいは変異ヌクレオチドの数）、修飾の種類（例えば、ヌクレオチドのメチル化など）、ならびに使用する酵素は特に限定されず、いずれのものであってもよい。例えば、酵素は目的の限酵素部位または変異もしくは修飾部位が存在する場合に、その部位あるいはその近傍においてＤＮＡ鎖を切断するものであってもよく、あるいは目的の変異もしくは修飾が存在する場合にＤＮＡを切断し得ないものであってもよい。制限酵素部位を検出することが目的の場合には、対応する制限酵素で巨大ゲノムＤＮＡを切断することができる。また、変異もしくは修飾部位を検出することが目的の場合には、当該変異もしくは修飾部位を特異に認識する酵素（部位特異的酵素）で巨大ゲノムを切断することができる。例えば、本発明の方法を用い、部位特異的酵素としてＤＮＡのメチル化を認識する酵素を用いて、ゲノム上のメチル化変動領域を検索することもできる。かかる方法は、癌その他の疾病の診断に役立つと考えられる。巨大ゲノムＤＮＡを酵素処理する際、対照として酵素処理しない系も作成し、以下に述べる操作を同様に行い、ショートＰＣＲにおける生成物を比較する。ＤＮＡ中の変異を検出する場合には、正常細胞に関しても同様に操作を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することが好ましい。
【００１２】
次に、酵素処理された巨大ゲノムＤＮＡを増幅する。この段階での増幅は、少ないゲノムＤＮＡを増幅することが目的である。この段階でのＤＮＡ増幅手段としてはＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＭＤＡ（Multiple Displacement Amplification）法等があるが、ＰＣＲによる増幅が好ましく、本発明のような巨大ゲノムの酵素切断物の増幅にはロングＰＣＲが最適である。以下、この段階の増幅方法としてロングＰＣＲに関して説明する。本発明に用いるロングＰＣＲは約２ｋｂ以上のＤＮＡを増幅するものが好ましい。ロングＰＣＲに使用するプライマーはいずれのものであってもよいが、脊椎動物のゲノムＤＮＡ中の制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位を検索する場合には、脊椎動物のゲノム中に多数存在する繰り返し配列を使用することが、検出感度の向上の点から好ましい。アービトラリープライマーを用いてもよく、鋳型ゲノムＤＮＡ中に繰り返し配列を含むことが不明の場合、あるいは含まれない場合に有効である。アービトラリープライマーは種々のものがあるが、ディジェネレイトオリゴヌクレオチドプライマーもアービトラリープライマーに包含される。細胞から得られる鋳型ＤＮＡが極端に少ない場合には、プライマーの自己増幅を抑制する観点からプライマー濃度を低めにすることが好ましい場合もある。
【００１３】
ロングＰＣＲの反応条件は当業者に公知であり、鋳型となるゲノムＤＮＡの起源、目的とする制限酵素部位または変異もしくは修飾部位、使用するプライマー、必要な検出感度等により、当業者が適宜変更あるいは選択することができる。一般的には、設定した反応条件に従って設定したサーマルサイクラーを用いてロングＰＣＲを行う。
【００１４】
前段階の増幅により得られた生成物をさらに増幅する。この段階での増幅は、比較のためのバンドを検出するに十分なＤＮＡを得ることを目的とする。この段階でのＤＮＡの増幅方法としてはＰＣＲが好ましく、特にショートＰＣＲが最適である。以下にこの段階の増幅法としてショートＰＣＲにつき説明する。ショートＰＣＲは約２ｋｂ未満のＤＮＡを増幅するものが好ましい。
【００１５】
前段階の増幅により得られた精製物をアガロースゲル電気泳動にて確認してから、ショートＰＣＲを行ってもよい。ロングＰＣＲ生成物を、例えばカラムにより精製してからショートＰＣＲに供してもよい。ロングＰＣＲ生成物の濃度によっては、希釈してからショートＰＣＲを行ったほうがよい場合もある。ショートＰＣＲの反応条件は一般的なものであってよい。ショートＰＣＲに使用するプライマーとしては、上記のように繰り返し配列またはアービトラリープライマーを用いてもよく、他のプライマーを用いてもよい。当業者は、目的とする検出部位やロングＰＣＲ生成物の種類等に応じて、ショートＰＣＲの条件を適宜変更あるいは選択することができる。一般的には、設定した反応条件に従って設定したサーマルサイクラーを用いてショートＰＣＲを行う。
【００１６】
巨大ゲノムを酵素処理したものと、酵素処理しなかった対照について、ショートＰＣＲの結果を比較する。一般的には、ショートＰＣＲ生成物をアクリルアミドゲル電気泳動にてチェックすることができる。巨大ゲノムを酵素処理したものと、酵素処理しなかった対照の泳動パターンを比較して、両者のパターンに相違がある場合には目的とする制限酵素反応部位または変異もしくは部位がゲノムＤＮＡ中に存在したと判定する。両者のパターンに相違がない場合には目的とする制限酵素反応部位または変異部位がゲノムＤＮＡ中に存在しなかったと判定する。また、上述のごとく、ＤＮＡ中の変異を検出する場合には、正常細胞に関しても同様に操作を行って得られた結果を、試験すべき細胞に関して得られた結果と比較することが好ましい。
【００１７】
電気泳動パターンの検出および比較は、エチジウムブロマイドまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１などの色素類での染色によるのが一般的であるが、鋳型ＤＮＡが極端に少ない、増幅効率があまり高くない場合には、電気泳動に供するＤＮＡに高感度検出に適した標識を付しておいてもよい。ＤＮＡ標識としては放射性標識、蛍光標識等を用いることができる。
【００１８】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法を用いて制限酵素反応部位または変異もしくは修飾部位を検出するためのキットを提供する。該キットは、好ましくは、ロングＰＣＲ用器具および試薬、ならびにショートＰＣＲ用器具および試薬を必須として含む。より好ましくは、本発明の該キットは、上記の巨大ゲノム調製方法（実施例３も参照）を用いてゲノムＤＮＡを調製するための器具および試薬を含むものである。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。かかる本発明のキットの一例は、ゲノムＤＮＡのメチル化の有無を検索するためのキットである。
【００１９】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２０】
実施例１．ＨｅｌａＳ３細胞ゲノムＤＮＡ中のＭｓｐＩ部位の検索
ＨｅＬａ細胞から常法により得た１ｎｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｓｐＩで処理したもの、およびＭｓｐＩで処理しなかったもの（対照）をそれぞれ調製した。これらを鋳型として、ヒトゲノム中に１００万コピー存在するといわれるＡｌｕエレメントのコンセンサス配列をもとにしたＡｌｕ−ｃ−１プライマー（ＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＣ）（配列番号：１）とＡｌｕ−ｃ−２プライマー（ＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣ）（配列番号：２）により、Ａｌｕに挟まれた約１０ｋｂまたはそれ以上のゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｓｐＩの領域を増幅できる条件でロングＰＣＲを行った。Ａｌｕエレメントはヒトゲノム中に平均約３ｋｂに１つ存在するので、下記条件のロングＰＣＲでヒトゲノムのかなりの領域を網羅することができる。
【００２１】
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、Ａｌｕ−ｃ−１プライマー２ｍＭ、Ａｌｕ−ｃ−２プライマー２ｍＭ、ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）５Ｕ、１ｎｇゲノムＤＮＡ、５％ ＤＭＳＯ
合計体積１００μｌ
９４℃  ３分
３７℃  ５分
７２℃  １２分
９４℃  １分ａ
５０℃  １分
７２℃  １２分ｂ
７２℃  １５分
ａ−ｂ間を１９サイクル行った。
【００２２】
さらに、上記のロングＰＣＲ産物を１００倍希釈し、その１μｌを鋳型にして以下の条件で、Ａｌｕ−ｃ−１プライマーとアーブトラリープライマーを用いてショートＰＣＲを行った。ショートＰＣＲに使用したアービトラリープライマーはＡＰ−１（ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣ）（配列番号：３）およびＡＰ−２（ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧ）（配列番号：４）であった。ショートＰＣＲの反応条件は以下のとおり。
【００２３】
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、Ａｌｕ−ｃ−１プライマー０．２ｍＭ、アービトラリープライマー各０．２ｍＭ、 ＴａｑＧｏｌｄ １Ｕ、１μｌ １００倍希釈ロングＰＣＲ産物、５％ ＤＭＳＯ
合計体積２０μｌ
９５℃  ９分
４０℃  ５分
７２℃  ５分
９４℃  １５秒ｃ
４０℃  ２分
７２℃  １分ｄ
７２℃  ５分
ｃ−ｄ間を２４サイクル行った。
【００２４】
ロングＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像と、ショートＰＣＲ産物の未変性アクリルアミド電気泳動像（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１染色）を図１に示す。ショートＰＣＲの電気泳動像において、ＭｓｐＩ処理試料と対照との間に明確な電気泳動パターンの相違が認められた。例えば、矢印で示すバンドは対照試料において明確に認められたが、ＭｓｐＩ処理試料においては明確に認められなかった。このようにして、本発明の方法により１ｎｇのゲノムＤＮＡから最終的に１００００回のゲノムフットプリントが出来ることになる。
【００２５】
図１のショートＰＣＲの矢印で示したバンドを切り出し、これを常法によりクローニング後、その配列を決定し、データベースからその隣接している配列を得て、それに対応したプライマーを作成した。そのマップ２を図２の上パネルに示す。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った（図２の下パネル）。これにより、本実施例のショートＰＣＲでの対照試料と、ＭｓｐＩ処理試料とのバンドの相違が、バンド近傍のＭｓｐＩ部位の消化の有無に依存していることが確認された。
【実施例２】
【００２６】
実施例２．繰り返し配列が存在しないところの制限酵素部位の検索
実施例１と同じくＨｅＬａ細胞から常法により得た１ｎｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｓｐＩで処理したもの、およびＭｓｐＩで処理しなかったもの（対照）をそれぞれ調製した。繰り返し配列が存在しないところの検索を行うために、４種のアービトラリープライマーを用いてロングＰＣＲを行い、カラム精製（QIA quick(登録商標) PCR purification kitを使用）後、その１μｌを鋳型にし、他のアービトラリープライマー２種でショートＰＣＲを行って、電気泳動バンドの差異を観察した。電気泳動像および使用プライマー（ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−５、ＡＰ−６、ＡＰ−７，ＡＰ−８、ＡＰ−９およびＡＰ−１０、それぞれ配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１および１２）を図３に示す。いずれの反応系においても、ＭｓｐＩ処理試料と対照との間に明確な電気泳動パターンの相違が認められた。なお、ロングＰＣＲおよびショートＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。
【００２７】
ロングＰＣＲ
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、アービトラリープライマー（４種）各２ｍＭ、ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）５Ｕ、１ｎｇゲノムＤＮＡ、５％ ＤＭＳＯ
合計体積１００μｌ
９５℃  ３分
３７℃  ５分
７２℃  ２分
９４℃  １分ｅ
３７℃  ２分
７２℃  ２分ｆ
７２℃  ５分
ｅ−ｆ間を２４サイクル行った。
【００２８】
ショートＰＣＲ
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、アービトラリープライマー（２種）各０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ １Ｕ、１μｌロングＰＣＲ産物、５％ ＤＭＳＯ
合計体積２０μｌ
９５℃  ９分
４０℃  ５分
７２℃  ５分
９４℃  １５秒ｇ
４０℃  ２分
７２℃  １分ｈ
７２℃  ５分
ｇ−ｈ間を２４サイクル行った。
【実施例３】
【００２９】
実施例３．極微量の細胞からのゲノムＤＮＡにおける制限酵素部位の検索
実際に、極微量の細胞から制限酵素反応サイトの検索を行った。できるだけ巨大分子のまま、ゲノムＤＮＡを失わずに得るため、パルスフィールドゲル電気泳動法で行われている、低融点アガロース中でのゲノムＤＮＡ調製法をスケールダウンすることにより応用した（図４に操作方法を示す）。まずキャピラリーで１０個のＨｅｌａ Ｓ３細胞を１μｌ ＰＢＳ中に集め、３μｌの０．７５％ ＧＴＧアガロースを加え、４℃で凝固させた。また、この時ゲルの乾燥を防ぐため、低融点アガロースの凝固はミネラルオイル中にて行う工夫をした。このアガロースの固まりを、以下の条件で１時間プロテイナーゼＫ処理し（プロテイナーゼＫ １ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％ ＳＤＳ）、その後ＴＥで８時間洗った。
【００３０】
このようにして、１０個の細胞から得た巨大分子ＤＮＡを含む体積４μｌの０．５％低融点アガロースの固まり（サンプルブロック）を作成し、その中で制限酵素処理を行い、そのままＡｌｕプライマーを用いたロングＰＣＲを行った。サンプルブロックはＰＣＲの最初の９４℃で３分の条件で容易に溶解し、内部のゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応液中に融かし出す。そのロングＰＣＲ産物をショートＰＣＲに供した。そのロングＰＣＲアガロースゲル電気泳動像およびショートＰＣＲアクリルアミドゲル電気泳動像を図５に示す。
【００３１】
なお、ロングＰＣＲおよびショートＰＣＲの反応条件は下記のとおり。
ロングＰＣＲ
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、Ａｌｕ−ｃ−１プライマー０．２ｍＭ、Ａｌｕ−ｃ−２プライマー０．２ｍＭ、ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）５Ｕ、１ｎｇゲノムＤＮＡ、５％ ＤＭＳＯ
合計体積１００μｌ
９４℃  ３分
３７℃  ５分
７２℃  １２分
９４℃  １分ｉ
５０℃  １分
７２℃  １２分ｊ
７２℃  １５分
ｉ−ｊ間を２４サイクル行った。
【００３２】
ショートＰＣＲ
１ＸＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ 各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、アービトラリープライマー４種（各０．２ｍＭ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ １Ｕ、１００倍希釈ロングＰＣＲ産物１μｌ、５％ ＤＭＳＯ
合計体積２０μｌ
９５℃  ９分
４０℃  ５分
７２℃  ５分
９４℃  １５秒ｋ
４０℃  ２分
７２℃  １分ｌ
７２℃  ５分
ｋ−ｌ間を３９サイクル行った。
【００３３】
このショートＰＣＲではアービトラリープライマーのみを使用し、その配列はＡＰ−１（−２Ｎ）（ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＧＮＮ）（配列番号：５）、ＡＰ−２（−２Ｎ）（ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＮＮ）（配列番号：６）、ＡＰ−１７（−２Ｎ）（ＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＮＮ）（配列番号：１３）およびＡＰ−１８（−２Ｎ）（ＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＮＮ）（配列番号：１４）であった。今回はＭｓｐＩ（メチル化非感受性）だけでなく、そのイソシゾマーであり、メチル化感受性酵素であるＨｐａＩも交えて行っている。それぞれのレーンで制限酵素の反応性の違いによりバンドの違いが確認できた（図５）。本実施例の場合、細胞１０個のゲノムＤＮＡから１００００回のフットプリントが可能である。
【００３４】
図５の矢印で示すバンド１とバンド２をクローニングし、配列を決定したところ、それぞれのバンドの配列中にＭｓｐＩ部位が存在した。そのＭｓｐＩ部位を挟むようにプライマーを作成し、ＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩで消化したＨｅｌａ Ｓ３細胞のゲノムＤＮＡ１０ｎｇを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより、バンド１とバンド２の消長の違いが、バンド中の制限酵素部位の状態の違い、すなわちこの場合は、もととなるゲノムＤＮＡ配列のメチル化の違いによることが確認された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、生物学、遺伝学、生化学、遺伝子工学、医学の分野に利用できる。特に、これらの領域で使用される研究用試薬の製造に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、１ｎｇのＨｅｌａ Ｓ３ゲノムＤＮＡを用いた場合の、本発明の方法によるロングＰＣＲ（上パネル）およびショートＰＣＲ（下パネル）の電気泳動像である。
【図２】図２は、１ｎｇのＨｅｌａ Ｓ３ゲノムＤＮＡを用いた場合の、本発明の方法による電気泳動バンドパターンの異なる部分をチェックした結果を示す図である。
【図３】図３は、１ｎｇのＨｅｌａ Ｓ３ゲノムＤＮＡを用いた場合の、繰り返し配列を含まない領域に関する、本発明の方法によるロングＰＣＲ（上パネル）およびショートＰＣＲ（下パネル２つ）の電気泳動像である。
【図４】図４は、１０個のＨｅｌａ Ｓ３細胞からの巨大ゲノムＤＮＡ調製スキームである（実施例３参照）。
【図５】図５は、１０個のＨｅｌａ Ｓ３細胞に由来するゲノムＤＮＡを用いた場合の、本発明の方法によるロングＰＣＲ（上パネル）およびショートＰＣＲ（下パネル）の電気泳動像である。
【図６】図６は、実施例３で用いたゲノムＤＮＡ配列のメチル化の違いを確認した結果を示す電気泳動像である。
【図１】
2006304709.tif 000002
【図２】
2006304709.tif 000003
【図３】
2006304709.tif 000004
【図４】
2006304709.tif 000005
【図５】
2006304709.tif 000006
【図６】
2006304709.tif 000007
【配列表】
2006304709000001.app