(57)【要約】【課題】  食品中に配合されたときに、生体機能との関係において有用な効果を発揮する成分を見出すこと。【解決手段】  γ−ＧＴＰに特異的に結合する抗γ−ＧＴＰ抗体を有効成分とする機能性食品（抗体食品）を提供する。食品に配合された抗γ−ＧＴＰ抗体は、歯周炎発症や進行の予防に係わる有効成分、口腔又は／及び消化器系における抗炎症に係わる有効成分、あるいはピロリ菌による胃の上皮細胞破壊防止に係わる有効成分として機能する。  【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗γ−ＧＴＰ抗体を有効成分とする機能性食品。
【請求項２】
前記抗γ−ＧＴＰ抗体は、歯周炎の発症又は進行の予防に係わる有効成分であることを特徴とする請求項１記載の機能性食品。
【請求項３】
前記抗γ−ＧＴＰ抗体は、口腔又は／及び消化器系における抗炎症に係わる有効成分であることを特徴とする請求項１記載の機能性食品。
【請求項４】
前記抗γ−ＧＴＰ抗体は、ピロリ菌による胃の上皮細胞破壊を防止する有効成分であることを特徴とする請求項１記載の機能性食品。
【請求項５】
菓子であることを特徴とする請求項１記載の機能性食品。
【請求項６】
前記菓子は、ガム又は飴であることを特徴とする請求項５記載の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いわゆる「機能性食品」に関する。より詳しくは、抗γ−ＧＴＰ抗体を有効成分として用いる機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の抗原抗体反応の仕組みを利用した「抗体医薬」が広く知られている。この「抗体医薬」は、標的となる細胞を、該細胞の抗原タンパク質に対応する抗体タンパク質で特異的に攻撃できることから、高い効果や副作用の軽減が期待されている。特に、癌細胞の治療法や感染したウイルスや細菌に対する治療法として、有望視されている。
【０００３】
また、「抗体食品」という分野が近年創出されつつある。この抗体食品は、免疫系を司る抗体そのものを食品含有成分として口から取り入れることを特徴とする。現在提案されている主な抗体食品として、免疫ミルクや免疫たまごなどを挙げることができる。
【０００４】
「免疫ミルク」は、乳牛に人感染が起こり易い多種類の病原菌の死菌をワクチンとして繰り返し接種することで、牛乳中に人に対して有効な抗体を産生させるという技術を利用している。「免疫たまご」は、抗体産生応答の特に高い鶏に抗原を接種し、それに対する抗体を卵黄内に産生させた機能性の食品である。
【０００５】
また、特許文献１には、病原体又はその代謝物から選ばれた一種又は二種以上の抗原で感作させた抗体を体内に産生させたウシ科動物から搾取した抗体含有乳を含む食品が開示されている。
【０００６】
特許文献２には、う蝕の原因であるストレプトコッカスミュータンスの口腔内への定着を抑制する抗ｒＰＡｃ抗体を配合した口腔内組成物、ガム、キャンディ、冷菓等のう蝕予防機能食品が開示されている。
【０００７】
また、特許文献３や特許文献４にも、ストレプトコッカスミュータンスの口腔内への定着を抑制し、う蝕にかかり難くするためのう蝕予防食品が開示されている。
【０００８】
特許文献５には、ピロリ菌による消化性潰瘍を抑制する抗体組成物を有効成分とする飲食物が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−１９１２８７号公報。
【特許文献２】特開平０５−２６８９８０号公報。
【特許文献３】特開平０５−２２７９１６号公報。
【特許文献４】特開平１０−１０８６４８号公報。
【特許文献５】特開２００２−２３４８４９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、食品中に配合されたときに、生体機能との関係において有用な効果を発揮する新規抗体を見出すことを技術的課題とし、この抗体を有効性成分とする機能性食品を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
γ-ＧＴＰと称されるγ-グルタミルトランスペプチターゼは、グルタチオンをはじめとするγ-グルタミルペプチを加水分解するとともに、γ-グルタミル基を他のアミノ酸やペプチドに転移させる酵素として広く知られており、γ-ＧＴと称されることも多い。
【００１１】
このγ-ＧＴＰの生体内機能に関して、本願発明者らは長年にわたって、医薬あるいは検査診断薬の開発の側面から鋭意追究を続けてきた結果、本願より先に、γ-ＧＴＰの破骨細胞の分化誘導活性を見出し（特開平１１-９４８３６号公報参照）、このγ-ＧＴＰをマーカーとする慢性関節リウマチの検査診断技術を提供した（特開２００３-２４０９９号公報参照）。また、γ-ＧＴＰがその酵素活性に依存することなく、骨髄間質細胞におけるreceptor activator of nuclear factor-kB(RANKL)の発現誘導し、破骨細胞形成を促進することを確認し、γ-ＧＴＰの破骨細胞形成機能を抑制しても副作用が少ないことを明らかにした（特開平２００４−１９６７７１号公報）。さらに、本願発明者らは、歯肉溝滲出液に含まれるγ-ＧＴＰを検出又は測定することによって、歯槽骨の吸収を伴う歯周炎の発症を判定する方法を提供した（特許第３５９９２８３号公報参照）。
【００１２】
ここで、同一の成分あるいは素材であっても、医薬形態として体内に投与される場合と食品として口に入れられる場合では、体内への吸収性や吸収形態の相違、あるいは製造加工課程での機能変化等により、同様の機能や効果を発揮するとは限らない。また、医薬有効成分を食品として投与する場合、その投与量や代謝の予測が困難である。
【００１３】
しかし、今般、本願発明者は、従来の医薬的又は検査診断的アプローチから発想を大きく転換し、抗γ−ＧＴＰ抗体（γ-ＧＴＰに特異的に結合する抗体）を食品形態を想定して口腔内へ入れる試みを行ったところ、抗γ−ＧＴＰ抗体が歯周炎発症病予防機能を有効に発揮し、また、口腔を含む消化器系全般における抗炎症機能を発揮する可能性が高いことを突き止めた。さらには、胃潰瘍等の原因であるピロリ菌がγ-ＧＴＰを分泌して、胃の上皮細胞にアポトーシスを誘導して該細胞を破壊するという知見（Shibayama,K. et. al., Mol Microbiol.、４７、４４３−５１（２００３））を勘案すると、食品成分として胃に投与された抗γ−ＧＴＰ抗体は、ピロリ菌による胃の上皮細胞破壊防止に係わる有効成分として機能させることができると考えられる。
【００１４】
そこで、本発明では、γ-ＧＴＰの生体内機能を食品側面から特に着目し、まず、抗γ−ＧＴＰ抗体を有効成分とする機能性食品、特に、この抗γ−ＧＴＰ抗体が歯周炎の発症又は進行の予防に係わる有効成分となる機能性食品、また、抗γ−ＧＴＰ抗体が口腔を含む消化器系全般における抗炎症に係わる有効成分となる機能性食品、さらには、抗γ−ＧＴＰ抗体がピロリ菌による胃の上皮細胞破壊防止に係わる有効成分となる機能性食品を提供する。なお、本発明において「機能性食品」とは、生体において有用な機能を発揮する食品を意味する。
【００１５】
食品の形態は、特に限定されず、菓子、飲料、加工食品などを広く含み、あるいは、液状、粒状、粉末状、カプセル状、スプレー方式などの種々の形状をなす食品も本発明の範囲である。歯周炎予防を想定した場合では、口腔内に長く滞留するような食品、例えば、ガムや飴などが好適であり、粘性等の物性についても、その用途に適したものを選択すれば、より効果的である。
【００１６】
また、食品中に、抗γ-ＧＴＰ抗体の機能をより効果的発揮させるための補助的成分を配合するように工夫してもよい。例えば、歯周炎予防を想定した場合では、歯肉部位に抗γ-ＧＴＰ抗体がより長く定着させることができる補助的成分を配合するように工夫してもよい。可逆的にゾル−ゲル相転移する物質、例えば、体温程度の温度を境にゲルへ転移する物質などを配合してもよい。
【００１７】
また、当該食品を製造する加工課程において、抗γ-ＧＴＰ抗体が変性を受けないようにするためのタンパク変性防止成分を配合し、あるいは、加工過程そのものについても、抗γ-ＧＴＰ抗体の機能を保護する観点から加熱条件等を工夫すると、本食品の機能をより有効に発揮させることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る機能性食品は、歯周炎の発症又は進行の予防、口腔を含む消化器系全般における抗炎症作用、ピロリ菌による胃の上皮細胞破壊を防止する。
【実施例１】
【００１９】
＜γ-ＧＴＰ発現上昇が歯槽骨破壊のリスクファクターであることの確認試験＞。
【００２０】
歯周炎局所において、γ-ＧＴＰ発現上昇があれば歯槽骨破壊のリスクファクターとなる可能性があることを突き止めたことから、本試験では、ラット歯肉溝へγ-ＧＴＰを直接投与した際の辺縁歯周組織に惹起される組織変化について、破骨細胞数を中心に経時的に検討した。
【００２１】
試験方法。７週齢ウィスター系雄性ラットの両側上顎臼歯歯肉溝へ、５０μg／ｍｌの濃度で蒸留水に溶かしたヒトγ-ＧＴＰ溶液をマイクロピペットにて２μlずつ１０分毎に１時間にわたって投与し、歯肉溝からのγ-ＧＴＰの浸透を行った。
【００２２】
投与開始後３時間，１日、２日、３日及び７日後に、上顎臼歯部を顎骨ごと採取した。ＰＬＰ固定液で４℃，８時間固定後，１０％ＥＤＴＡ溶液中で５日間低温脱灰した。
【００２３】
ＡＭｅＸ法にてパラフィン包埋後，４．５μｍ厚のパラフィン切片を作製し、組織学的に観察するとともに、歯槽頂から１ｍｍの範囲の歯根膜側歯槽骨縁に沿って出現する破骨細胞数を組織計測学的に測定した。なお、測定対照区として、未処置の材料も同様に観察した。この観察測定の結果を図１と図２に示す。
【００２４】
γ-ＧＴＰ非投与群（未処置コントロール群）では、接合上皮内にごく少数の好中球が遊走し，歯根膜側歯槽骨縁にはわずかに破骨細胞が観察される程度であった(破骨細胞数：１．８±０．５cells/ｍｍ)。
【００２５】
γ-ＧＴＰ投与群では、γ-ＧＴＰ投与は投与開始３時間後に、歯槽骨骨縁に沿って活発な骨吸収を営む破骨細胞数が有意に増加した(破骨細胞数６．５±１．０cells/mm，p<0.01)。なお、投与１日後には，破骨細胞数は一旦減少した(１．８３±０．６５cells/mm)。
【００２６】
この時期に見られる破骨細胞は、骨縁から離れ位置する不活性なものが多かった。その後、破骨細胞数は２日目に５．１±０．９４cells/mm、３日目に６．８±１．１０cells/mmと、再び有意な増加(p<0.01)を示した。投与７日後には、破骨細胞増加は観察されなくなった。
【００２７】
接合上皮領域での好中球浸潤や血管拡張は、γ-ＧＴＰ投与直後にはあまり目立たなかったが、投与後２，３日後では、好中球浸潤や血管拡張の目立つものもみられた。
【００２８】
以上の結果から、まず、γ-ＧＴＰ投与によって、歯槽骨の骨縁に沿って出現する破骨細胞が増加することを確認できた。従って、歯周炎局所でのγ-ＧＴＰ発現上昇は、破骨細胞性骨吸収を直接誘導する因子となることを検証できた。
【００２９】
その際，破骨細胞増加は、投与後３時間と２〜３日目にピークを有する２相性増加を示したことより、γ-ＧＴＰによる破骨細胞性骨吸収刺激作用には、骨芽細胞によるRANKL発現誘導を介した直接的作用（投与３時間後）と歯周組織構成細胞からのサイトカインの発現誘導を介した間接的作用（投与2〜3日後）の２つの経路が働く可能性が示唆された。
【００３０】
実際、歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液中γ-ＧＴＰ量が、健常及び歯肉炎部位と比較し有意に高い値を示すことから、歯肉溝γ-ＧＴＰ値が歯周炎における歯槽骨破壊のマーカーになる可能性が高い。
【００３１】
以上から、歯肉溝からγ-ＧＴＰを局所投与することによって、歯槽骨の破骨細胞性骨吸収が誘導されることが明らかとなった。従って、γ-ＧＴＰは、歯周炎の際の歯槽骨破壊のリスクファクターの１つと考えられることから、γ-ＧＴＰをターゲットとした歯槽骨破壊制御が可能となる。
【実施例２】
【００３２】
＜抗γ-ＧＴＰ抗体を用いた動物試験＞。
【００３３】
本試験は、γ-ＧＴＰ誘導歯周炎モデルマウスを作成し、抗γ-ＧＴＰポリクローナル抗体を該モデルマウスの歯肉溝に直接投与し、歯周組織切片における破骨細胞数と組織変化を観察することを目的とする試験である。
【００３４】
より詳しくは、抗γ-ＧＴＰポリクローナル抗体を直接、前記モデルマウスの歯肉溝に投与し、十分に浸透したことを確認した後、γ-ＧＴＰを同様に歯肉溝に投与して歯周炎を惹起させた。評価は、歯周組織切片における破骨細胞数の減少を主体として確認した。
【００３５】
具体的な試験方法。７週齢のウィスター系雄性ラットの両側上顎臼歯歯肉溝に、抗ラットγ-ＧＴＰヤギポリクローナル抗体（５００μｇ／ｍｌ）をマイクロピペットにて２μＬずつ１０分毎に１時間にわたって投与し、歯肉溝からの抗体を浸透させた。
【００３６】
この浸透を確認した後に、ヒトγ-ＧＴＰ（５０ｍｇ／ｍＬ）を同様に２μＬずつ投与し、歯肉溝からのγ-ＧＴＰの浸透を図った。この抗体/γ-ＧＴＰ投与群（III）について、投与開始から３日後に、上顎臼歯部を顎骨ごと採取した。
【００３７】
採取したサンプルをＰＬＰ固定液で４℃、８時間の条件で固定した後、１０％ＥＤＴＡ溶液中で、５日間低温脱灰した。ＡＭｅＸ法にてパラフィン包埋後、４．５μｍ厚のパラフィン切片を作製し、組織学的に観察した。また、歯槽頂から１ｍｍの範囲の歯根膜側歯槽骨縁に沿って出現する破骨細胞数を組織計測学的に測定した。
【００３８】
対照区として、未処置コントロール群（I）とγ-ＧＴＰ投与群（抗γ-ＧＴＰ抗体は未投与）（II）についても、同様の観察を行った。なお、試験は、各群３匹ずつとした。なお、各投与群（Ｉ）から（ＩＩＩ）の投与スケジュールは、図３に示すとおりである。
【００３９】
組織学的観察の結果を次の「表１」に示す。
【００４０】
【表１】
2006121956.tif 000003
【００４１】
各群の組織顕微鏡写真を示す図４〜６に基づいて、詳しく説明する。
【００４２】
図４から図６は、実施例２に係わる試験において、該試験で用いたモデルマウスの歯槽骨周辺の組織状態を観察することを目的で撮影した顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【００４３】
図４は未処理コントロール群（I）、図５はγ‐ＧＴＰ投与群(II)、図６は抗体／γ‐ＧＴＰ投与群（III）にそれぞれ対応した図面代用写真である。また、図４〜６の（Ａ）は歯槽骨周辺を広く撮影した写真、（Ｂ）は歯と歯槽骨の境界部分を拡大して撮影した写真、（Ｃ）は歯周ポケット近傍の組織を拡大して撮影した写真を示している。
【００４４】
まず、未処理群（I）においては、図４に示すように、骨細胞が顕著に観察され、破骨細胞は出現していないことが認識できる（特に図４（Ｂ）参照）。また、歯周炎の発症も認識できない。
【００４５】
次に、γ‐ＧＴＰ投与群(II)においては、図５の写真に示すように、骨細胞に比してサイズが大きいことが知られている破骨細胞（（Ｂ）写真の丸囲い部分参照）が顕著に出現していることがわかる。また、図５の写真（Ｃ）を見ると、歯周炎を発症していることから、細胞組織が繊維状の形態を失い、炎症系細胞が湿潤していることがわかる。従って、γ‐ＧＴＰは、歯槽骨における破骨細胞（骨吸収に関与する細胞）の発現を誘導するファクターであることが明らかである。
【００４６】
次に、抗体／γ‐ＧＴＰ投与群（III）では、図６に示すように、前記γ‐ＧＴＰ投与群（II）の場合と比較すると（図５を比較参照）、破骨細胞の発現が明らかに抑制されていることがわかる。この点については、特に、図５と図６の（Ｂ）写真同士を照らし合わせて見ると、容易に認識できる。また、図６の（Ｃ）写真を見ると、歯周ポケット周辺の組織が繊維状を保持し、歯周炎が抑制され、併せて、細胞の湿潤も抑制されていることが認識できる。
【００４７】
なお、抗体/γ-ＧＴＰ投与群（III）において、骨縁に沿って少数の破骨細胞が見られるが、これらは骨縁から離れて位置するので、アクティブな破骨細胞ではないと考えるのが妥当である。
【００４８】
また、組織変化についても、好中球浸潤と血管拡張は、ラット個体差と部位による差が大きいが、抗γ-ＧＴＰ抗体の投与によって抑制される傾向にあった。
【００４９】
以上の組織学的観察の結果から、投与した抗γ‐ＧＴＰ抗体は、歯周炎発症に伴う歯槽骨破壊のリスクファクターであるγ‐ＧＴＰと特異的に結合し、前記ファクターとしての機能を抑制する。
【００５０】
ここで、破骨細胞数の組織計測学的測定の結果を次の「表２」に示す。
【００５１】
【表２】
2006121956.tif 000004
【００５２】
以上の結果から、γ-ＧＴＰ誘導歯周炎モデルマウスに対して投与された抗γ-ＧＴＰ抗体は、破骨細胞形成をかなり有効に抑制することが明らかになった。即ち、抗γ-ＧＴＰ抗体の歯肉溝への投与によって、歯周炎の発症に伴う歯槽骨破壊を制御できるので、歯周炎の発症又は進行を有効に防止できる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係る機能性食品は、その配合成分である抗γ−ＧＴＰ抗体の機能を介して、歯周炎発症や進行の予防、あるいは、口腔又は／及び消化器系における抗炎症に、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１の試験結果を示す図である。
【図２】実施例１の試験結果を示す別の図である。
【図３】実施例２における試験での投与スケジュールを示す図である。
【図４】実施例２に係わる試験で用いたモデルマウスの歯槽骨周辺の組織状態を観察することを目的で撮影した顕微鏡写真であって、未処理コントロール群（I）に対応する顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【図５】実施例２に係わる試験で用いたモデルマウスの歯槽骨周辺の組織状態を観察することを目的で撮影した顕微鏡写真であって、γ‐ＧＴＰ投与群(II)に対応する顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【図６】実施例２に係わる試験で用いたモデルマウスの歯槽骨周辺の組織状態を観察することを目的で撮影した顕微鏡写真であって、抗体／γ‐ＧＴＰ投与群（III）に対応する顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【図１】
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【図２】
2006121956.tif 000006
【図３】
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【図４】
2006121956.tif 000008
【図５】
2006121956.tif 000009
【図６】
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