(57)【要約】  【課題】  タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物を見出し、これにタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供する。  【解決手段】  枯草菌のaprX遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌のaprX遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項２】
更に枯草菌のaprX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とは異なるプロテアーゼをコードする１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を宿主とする請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
枯草菌のaprX遺伝子又は当該aprX遺伝子に相当する遺伝子とは異なるプロテアーゼをコードする遺伝子が、枯草菌のaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子並びに当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれるものである請求項２記載の組換え微生物。
【請求項４】
枯草菌のaprX、aprE及びnprEの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する３種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた微生物を宿主とする請求項３記載の組換え微生物。
【請求項５】
枯草菌のaprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた微生物を宿主とする請求項３記載の組換え微生物。
【請求項６】
微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項８】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したものである請求項７記載の組換え微生物。
【請求項９】
分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項７又は８記載の組換え微生物。
【請求項１０】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項８記載の組換え微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg  No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
しかしながら、微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質等の工業的生産においては、必ずしも効率的であるとは言えない状況であった。特に、微生物はタンパク質を分解して窒素及び炭素源として利用するために多種のタンパク質分解酵素を持っており、これらが目的のタンパク質等を分解し、外来タンパク質等の生産において大きな障害になっていた。
【０００５】
こうしたタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼなど）の遺伝子を欠損させることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みは古くから行われており、特に枯草菌においては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE、或いは中性プロテアーゼであるNprEをコードする遺伝子、或いはそれら両遺伝子の欠損（非特許文献１、２及び３参照）を初めとして、計８種類（後記表１参照）の細胞外や細胞壁結合型のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子について遺伝子欠損微生物、更にはこれら８種類のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子が全て欠損した枯草菌株の報告例も知られていた(非特許文献４参照）。しかしながら、これら８種類のタンパク質分解酵素遺伝子を欠損させた微生物菌株においても培養液中にタンパク質分解酵素の活性が認められ、目的タンパク質の分解が引き起こされていることが本発明者らの解析等によって明らかにされた。このため、原因となるタンパク質分解酵素及びその遺伝子の特定が望まれていた。
【０００６】
枯草菌のaprX遺伝子は、推定菌体内のセリンプロテアーゼAprXをコードするものとして報告されている(非特許文献５参照)が、このAprXが培地中に存在して、有用酵素やタンパク質の分泌生産時に、当該酵素、タンパク質を分解してそれらの収量を低下させることについては全く報告されていない。
【特許文献１】特許第２８８９０９号公報
【特許文献２】特許第３２１０３１５号公報
【特許文献３】特表２００１−５２７４０１号公報
【非特許文献１】J. Bacteriol., 158, 411, (1984)
【非特許文献２】J. Bacteriol., 160, 15, (1984)
【非特許文献３】J. Bacteriol., 160, 442, (1984)
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., 68, 3261, (2002)
【非特許文献５】Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、特にタンパク質分解酵素の生産量を低減化することにより、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物を作成し、当該宿主微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物を提供すること、並びに当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、微生物を用いて有用なタンパク質又はポリペプチドの生産する場合に不要或いは有害な働きをするタンパク質分解酵素を探索したところ、枯草菌の推定菌体内セリンプロテアーゼAprXが、培地中に存在して、有用酵素やタンパク質の分泌生産時に、当該酵素、タンパク質を分解してそれらの収量を低下させることを見出した。そして、枯草菌のaprX遺伝子を欠失又は不活性化した微生物菌株を宿主微生物として用いることにより、外来の有用酵素やタンパク質の分解を大幅に防ぐことができ、効率的な酵素・タンパク質の生産が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、枯草菌のaprX遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の組換え微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１３】
本発明の微生物を構築するための宿主微生物（以下、「親微生物」ともいう）としては、枯草菌のaprX遺伝子（Nature, 390, 249-256, (1997)、及びJAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB、http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年6月17日更新)に於ける遺伝子番号  BG12567）、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものが望ましく、またこれらは、野生型のものでも変異を施したものでものよい。具体的には、枯草菌などのバチルス(Bacillus)属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌が好ましい。
【００１４】
本発明において欠失又は不活性化の対象となる遺伝子は、枯草菌の推定菌体内セリンプロテアーゼAprXをコードすることが報告されたaprX遺伝子 (Microbiology, 145, 3121, (1999)、遺伝子番号  BG12567 (Nature, 390, 249-256, (1997)及びJAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillussubtilis (BSORF DB、http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年6月17日更新)）、又は当該遺伝子に相当する遺伝子である。
【００１５】
aprX遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌のaprX遺伝子と同じ機能を有する、又はaprX遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来の遺伝子が挙げられ、具体的な例としては、BacillushaloduransのBH1930遺伝子（aprX遺伝子）やOceanobacillus iheyensisのOB2375遺伝子などが挙げられる。
【００１６】
本発明においては、上記の遺伝子内に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって目的遺伝子を不活性化することによっても達成できるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方法がより望ましい。
【００１７】
また、欠失又は不活性化させる遺伝子はaprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子に加え、細胞外に分泌又は細胞表層に結合していることが知られる他のプロテアーゼ類をコードする１以上の遺伝子欠失を組み合わせても良い。更に本発明の微生物の構築には、プロテアーゼ以外の遺伝子群の欠失又は不活性化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。枯草菌のaprX遺伝子又は当該aprX遺伝子に相当する遺伝子とは異なるプロテアーゼをコードする遺伝子であって、aprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子と組み合わせて欠失又は不活性化させることにより効果が期待される遺伝子を表１に記載した。この場合、aprX遺伝子に加えて、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子より選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させるのが好ましい。またaprX遺伝子に加えて、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE及び中性プロテアーゼであるNprEをそれぞれコードするaprE及びnprE遺伝子又は当該遺伝子に相当する３種類の遺伝子を欠失又は不活性化させることがより好ましく、更にはaprX遺伝子に加えて、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させるのが特に好ましい。
【００１８】
【表１】
2006174707.tif 000002
【００１９】
遺伝子群の欠失又は不活性化の手順としては、aprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子、更には表１に示したプロテアーゼ遺伝子を計画的に欠失又は不活性化させる方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行うことによっても、目的遺伝子群を欠失又は不活性化することができる。
【００２０】
標的遺伝子の欠失又は不活性化には、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子変異部位の外側２ヶ所領域、又は標的遺伝子外側２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化させた遺伝子断片と置換することが可能である。或いは、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断することによって不活性化することも可能である。
【００２１】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化させる方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990)等）、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２２】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２３】
以下、より具体的にSOE (splicing by overlap extension)-PCR法（Gene, 77, 61, (1989)）によって調製される欠失導入用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２４】
本方法で用いる欠失導入用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.2〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.2〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２５】
次いで、１回目に調製した３種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２６】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットと適当な鋳型DNAを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press, pp251 (1993)、Gene, 77, 61, (1989)等）に示される通常の条件によりSOE-PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失導入用DNA断片が得られる。
【００２７】
かくして得られた欠失導入用DNA断片を、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失導入用DNA断片を導入した場合、スペクチノマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、目的の遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたPCR法などによって確認すれば良い。
【００２８】
また、本発明に於けるaprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子を含むプロテアーゼ遺伝子の欠失方法としては、SOE-PCR法によって調製される欠失導入用DNA断片を挿入した欠失導入用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いることもできる。以下、その方法について説明する。
【００２９】
本方法で用いる欠失導入用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.2〜3kb断片、同じく下流に隣接する約0.2〜3kb断片が結合したDNA断片である。また当該DNA断片の下流或いは上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させたDNA断片を用いることもできる。まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、結合対象となるDNA断片の末端10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを用いる。例えば、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させる場合、上流断片の下流末端に下流断片の上流側10〜30塩基対配列、また下流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いれば良い（図２）。
【００３０】
次に１回目に調製した各PCR断片を混合して鋳型とし、目的とする結合断片においてそれぞれ最上流側及び最下流側となる1対のプライマーを用いて２回目のPCRを行うことにより、目的の欠失導入用DNA断片を調製することができる。具体的には例えば、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させる場合、上流断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端に付加した下流断片との相同配列において、また下流断片の下流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子断片との相同配列においてアニーリングが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片、下流側断片と薬剤耐性マーカー遺伝子断片が結合した欠失導入用DNA断片が得られる（図２）。
【００３１】
更に、上述の方法などによって得られる欠失導入用DNA断片を、通常の制限酵素とDNAリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されないプラスミドDNA、又は温度感受性プラスミド等、容易に除去できるプラスミドDNAに挿入することによって、欠失導入用プラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミドDNAの例としては、例えば枯草菌を宿主とする場合、pUC18、pUC118、pBR322などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
次いで、欠失導入用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）などによって行い、プラスミドに挿入された上流断片或いは下流断片とゲノム上の相同領域間での１重交差の相同組換えによって欠失導入用プラスミドが宿主菌ゲノムDNA内に融合した形質転換体を得る（図２）。形質転換体の選択には欠失導入用プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に行えば良い。
【００３３】
かくして得られる形質転換体のゲノム上にはaprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子などの欠失すべき遺伝子の上流領域及び下流領域の配列について、宿主菌ゲノム由来と欠失導入用プラスミドに由来するものが重複して存在している。この上流領域又は下流領域のうち、形質転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異なる領域でゲノム内相同組換えを起こさせることにより、薬剤耐性マーカー遺伝子を含む欠失導入用プラスミド由来の領域と共にaprX遺伝子又はaprX遺伝子に相当する遺伝子など欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる（図２）。ゲノム内の相同組換えを起こさせる方法としては、例えばコンピテンスを誘導する方法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）が挙げられるが、単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同組換えが生じる。目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性マーカー遺伝子を欠失して薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌株より選択することができる。こうした菌株からゲノムDNAを抽出し、PCR法などによって目的遺伝子の欠失を確認すれば良い。
【００３４】
目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択することは難しく、またゲノム内での相同組換えは約10-4以下の低い頻度で生じるものと考えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比率を高めるなどの工夫を施すことが望ましい。薬剤感受性株の濃縮方法としては、例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法（Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970)）などが挙げられる。アンピシリンなどによる濃縮を行う場合、例えばクロラムフェニコールなどの様に宿主細胞に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子を欠失導入用プラスミドの薬剤耐性マーカー遺伝子として用いる必要がある。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしない。この様な条件下において適当な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しようとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
【００３５】
以上の様な方法により構築される枯草菌のaprX遺伝子、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を含む１以上のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物変異株に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３６】
本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断等の各種産業用酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素 (Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、さらには、当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３７】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号61で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
更に、本発明により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒトＣ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2などが挙げられる。
【００３８】
また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
【００３９】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００４０】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培地の成分・組成などは特に限定されないが、好ましくは、炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が得られる。
【００４１】
以上より、表１に示される枯草菌の遺伝子のいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれた１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物変異株、及び当該変異株を用いて組換え微生物を構築することができ、これを用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。
【００４２】
以下、枯草菌のaprX遺伝子（BG12567）を含む計9種類のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた微生物の構築、並びに当該微生物を宿主として用いたセルラーゼ生産又はヒトＢ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2生産について、また主要な2つの細胞外プロテアーゼをコードするaprE遺伝子（BG10190）とnprE遺伝子（BG10448）に加え、aprX遺伝子（BG12567）を含む計3種類のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた微生物の構築、並びに当該微生物を宿主として用いたヒトＢ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2生産について、以下実施例にて具体的に説明する。
【実施例】
【００４３】
【表２−１】
2006174707.tif 000003
【００４４】
【表２−２】
2006174707.tif 000004
【００４５】
【表３】
2006174707.tif 000005
【００４６】
実施例１  epr遺伝子欠失用プラスミドの構築
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したeprfw1とeprUpr、及びeprDNfとeprrv-repの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のepr遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片（A）、及び下流に隣接する0.5kb断片（B）をそれぞれ調製した。また別途プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）由来のrepU遺伝子のプロモーター領域（Nucleic Acids Res. 17, 4410 (1989)）を連結した1.2kb断片（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）3断片を混合して鋳型とし、表２のプライマーeprfw2とCmrv2を用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（A）（B）（C）の順になる様に結合させ、2.2kbのDNA断片を得た（図２参照）。このDNA断片の末端を平滑化及び5’-リン酸化し、プラスミドpUC118（Methods Enzymol. 153, 3 (1987)）のSmaI制限酵素部位に挿入してepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔeprを構築した。尚、上記1.2kb断片（C）は、repUfwとrepUr-Cmのプライマーセット（表２）及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片（D）と、CmUf-repとCmrv1のプライマーセット（表２）及び鋳型としてプラスミドpC194を用いて調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.8kb断片（E）とを混合して鋳型とし、表２に示したプライマーrepUfwとCmrv1を用いたSOE-PCRを行なうことによって調製した。
【００４７】
実施例２  欠失用プラスミドを用いたepr遺伝子欠失株の構築
実施例１にて構築したepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔeprをコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）によって枯草菌168株に導入し、epr遺伝子上流領域、或いは下流領域の相当する領域間での1重交差の相同組換えによりゲノムDNAと融合した形質転換株をクロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をLB培地に接種し、37℃にて２時間培養後、再度、コンピテンス誘導操作を行うことにより、ゲノム上で重複して存在するepr遺伝子上流領域、或いは下流領域の間に於けるゲノム内相同組換えを誘導した。図２に示す様に、プラスミド導入の際と異なる領域で相同組換えが起こった場合、プラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子及びpUC118ベクター領域の脱落に伴ってepr遺伝子が欠失することになる。次に、クロラムフェニコール感受性となった株の存在比率を高める為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンピテントセル誘導後の培養液を終濃度5ppmのクロラムフェニコール及び終濃度100ppmのアンピシリンナトリウムを含むLB培地1 mLに600nmにおける濁度（OD600）が0.003になるように接種した。37℃にて5時間培養後、10,000ppmのアンピシリンナトリウム水溶液を10μL添加して更に３時間培養した。培養終了後、2%塩化ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後、1mLの2%塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液100μLをLB寒天培地に塗沫した。37℃にて約15時間インキュベーションし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となったものを選抜した。選抜した菌株のゲノムDNAを鋳型とし、表２に示すプライマーeprfw2とeprrv-repを用いたPCRを行なうことによりepr遺伝子欠失の確認を行ない、epr遺伝子欠失株を取得した。
【００４８】
実施例３  プロテアーゼ遺伝子８重欠失株の構築
epr遺伝子欠失株に対し、次の欠失としてwprA遺伝子の欠失をepr遺伝子欠失と同様に行なった。即ち、実施例１と同様にしてwprA遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔwprAを構築し、構築したプラスミドのゲノムDNAへの導入とそれに続くゲノム内相同組換えによるwprA遺伝子の欠失によりepr遺伝子とwprA遺伝子の２重欠失株を取得した。以降同様の操作を繰り返すことにより、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprEの各遺伝子を順次欠失させ、最終的に８種類のプロテアーゼ遺伝子が欠失したプロテアーゼ８重欠失株を構築し、Kao8株と命名した。各欠失を行う際に用いたプライマーの配列は表２に示し、また各プライマーと実施例１で示したepr遺伝子欠失に用いたプライマーとの対応については表３に示した。
【００４９】
実施例４  aprX遺伝子欠失株の構築（スペクチノマイシン耐性遺伝子による置換）
SOE（splicing by overlap extension）-PCR法（Gene, 77, 61, (1989)）によって調製される欠失導入用DNA断片を用いた二重交差法によりaprX遺伝子欠失株を構築した。まず、表２に示したaprX+5FとaprX+563R、及びaprX+775FとaprX+1320Rの各プライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、aprX遺伝子の上流を含む5’末端側の558 bp断片（F）、及び3’末端側の545 bp断片（G）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpDG1727（Gene, 167, 335, (1995)）のBamHI及びXhoI制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、pBluescript II SK(+)（Stratagene）にBamHI及びXhoI制限酵素切断点に挿入し、pBlueSPRを構築した。PBlueSPRのDNAを鋳型とし、PB-M13-20、PB-M13Rev（表１）のプライマーセットを用いてスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を増幅した（H）。次に（F）、（G）及び（H）のDNA断片鋳型とし、aprX+5F、aprX+1320Rプライマーセットを用いてSOE-PCR法により、(E)（H）(G）の順に結合したDNA断片を調製した。調製したDNA断片を用い、コンピテントセル形質転換法による枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（100μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってaprX遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のaprX遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔaprX(Sp)株と命名した。
【００５０】
実施例５  aprX遺伝子欠失を含むプロテアーゼ遺伝子9重欠失株の構築
実例４に示した(E)（H）(G）の順に結合したDNA断片を用いて、コンピテントセル形質転換法によりプロテアーゼ遺伝子8重欠失株（実施例３、Kao8株）の形質転換を行い、スペクチノマイシン（100μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってaprX遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草菌のaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの8遺伝子の多重欠失に加えて、aprX遺伝子が欠失した菌株を構築し、Kao9株と命名した。
【００５１】
実施例６  aprX遺伝子欠失を含むプロテアーゼ遺伝子9重欠失株のプロテアーゼザイモグラム解析
実施例１−５にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株を100時間培養後、培養液を10,000rpm、5分遠心し、その上清を1×サンプルバッファー（62.5mM Tris-HCl(pH6.8), 5％ 2-メルカプトエタノール, 2% SDS, 5% スクロース, 0.002% BPB（Bromophenol blue））になるように可溶化し、プロテアーゼザイモグラムのサンプルとした。サンプルを煮沸せず、0.1%ゼラチンを含む12％SDS-PAGEを行った後、Renaturation buffer (2.5% Triton X-100)にて室温で30分間振とうし、さらにZymogram Developing buffer (50mM Tris-HCl(pH8.5)、200mM NaCl、5mM CaCl2、0.02% Brij35)にて室温で30分間振とうした。再度Zymogram Developing bufferに置換した後37℃で12時間インキュベートした後、CBB（クマシ染色液）でゲルを染色した。以上の方法によってプロテアーゼのザイモグラム解析を行った（図３）。この結果、8重欠失株（Kao8株）においてもプロテアーゼ活性バンドが検出されたが、aprX遺伝子欠失株では本バンドが消失し、Kao8株で残存するプロテアーゼ活性がAprXであることが明らかになった。また、aprX遺伝子を含むプロテアーゼ遺伝子9重欠失株（Kao9株）ではプロテアーゼ活性バンドが検出されなかった。
【００５２】
実施例７  アルカリセルラーゼの生産
実施例１−５にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌168株に、バチルス  エスピー（Bacillussp.）KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報、配列番号１）断片（3.1 kb）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で4日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表４に示した様に、aprX遺伝子欠失株であるΔaprX(Sp)株及びプロテアーゼ遺伝子多重欠失株（Kao9株）を用いた場合はいずれも、対照の168株（野生型）の場合と比較してアルカリセルラーゼの高い分泌生産が認められた。
【００５３】
【表４】
2006174707.tif 000006
【００５４】
実施例８  Kao8株及びKao9株によるヒトＢ型肝炎ウィルス抗原認識PreS2ドメインの生産
枯草菌由来のアミラーゼ遺伝子のＮ末側522アミノ酸をコードする領域の下流にヒトＢ型肝炎ウィルス抗原認識PreS2ドメイン断片を結合したDNA断片（165 bp）が挿入された組換えプラスミドpTUBE52-preS2（Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 341 (1993)）を、実施例３及び５にて得られたKao8株とKao9株に通常のコンピテントセル形質転換法によって導入した。得られた形質転換菌株を一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で100時間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清中のアミラーゼ-PreS2タンパク質量を抗PreS2抗体（（株）特殊免疫研究所）を用いたウエスタンブロット解析により求めた。まず、培養上清を1×サンプルバッファー（62.5mM Tris-HCl(pH6.8),5％ 2-メルカプトエタノール, 2% SDS, 5% スクロース, 0.002% BPB（Bromophenol blue））になるよう可溶化し、10％SDS-PAGEを行った後、PVDF（polyvinyl difluoridine membrane:Immobilon; 0.45μm pore size; Millipore）にブロッティングした。一次抗体として抗preS2抗体（Hyb-5520：（株）特殊免疫研究所）を用いた。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（Amersham Pharmacia biotech）を使用した。またECL Plus Western blotting reagent pack (RPN2124; Amersham Pharmacia biotech)により検出した。この結果、図４に示した様に、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Kao9株）では８重欠失株（Kao8株）に比べて明らかに強いアミラーゼ-PreS2バンドが検出され、aprXの欠失によりアミラーゼ-PreS2の大幅な生産向上が認められた。
【００５５】
実施例９  aprE、nprE、及びaprXの3遺伝子を欠失した株の構築
主要な2つの細胞外プロテアーゼをコードするaprE遺伝子とnprE遺伝子に加え、aprX遺伝子を含む計3種類のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた微生物の構築を行なった。実施例１及び２と同様にしてaprE遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔaprEを構築し、構築したプラスミドの枯草菌168株ゲノムDNAへの導入とそれに続くゲノム内相同組換えによるaprE遺伝子の欠失によりaprE遺伝子の単独欠失株を取得した。次いで実施例３と同様にしてaprE、nprE、及びaprXの3遺伝子が欠失したプロテアーゼ遺伝子3重欠失株を構築し、Kao3株と命名した。尚、Kao3株構築においてaprX遺伝子を欠失させる際に用いたプライマーと他のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた際に用いたプライマーとの対応については表３に示した。
【００５６】
実施例１０  Kao3株によるヒトＢ型肝炎ウィルス抗原認識PreS2ドメインの生産
実施例８と同様に、アミラーゼ-PreS2生産用プラスミドpRUBE52-preS2を実施例９にて得られたKao3株、及び対照として枯草菌168株に通常のコンピテントセル形質転換法によって導入した。得られた形質転換菌株を一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で25時間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清中のアミラーゼ-PreS2タンパク質量を抗PreS2抗体（（株）特殊免疫研究所）を用いたウエスタンブロット解析により求めた。図５に示した様に、対照の168株（野生株）の場合には認められなかったアミラーゼ-PreS2のバンドがプロテアーゼ遺伝子3重欠失株において検出され、アミラーゼ-PreS2の生産性向上が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】SOE-PCRによる遺伝子欠失導入用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失（薬剤耐性遺伝子と置換）させる方法を模式的に示したものである。
【図２】SOE-PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、当該DNA断片を用いた遺伝子欠失導入用プラスミドの構築、及び当該プラスミドを用いた標的遺伝子の欠失方法を模式的に示したものである。
【図３】aprX欠失株及びプロテアーゼ遺伝子9重欠失株（Kao9株）、対照として、枯草菌の野生型の168株及びプロテアーゼ遺伝子8重欠失株（Kao8株）の培養上清画分のプロテアーゼ活性をプロテアーゼザイモグラムにより調べた結果を示している。
【図４】プロテアーゼ遺伝子9重欠失株（Kao9株）、対照として、プロテアーゼ遺伝子8重欠失株（Kao8株）のアミラーゼ-PreS2融合タンパク質の生産量を抗PreS2抗体を用いたウエスタンブロットにより調べた結果を示している。
【図５】プロテアーゼ遺伝子3重欠失株（Kao3株）、対照として、枯草菌の野生型の168株のアミラーゼ-PreS2融合タンパク質の生産量を抗PreS2抗体を用いたウエスタンブロットにより調べた結果を示している。
【図１】
2006174707.tif 000007
【図２】
2006174707.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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