(57)【要約】【課題】酸素電流に基づく微生物の個体数を、早期に評価できる手法を提案する。【解決手段】ステップＳ１００ではフローチャートに沿った処理において使用する種々の設定をリセットする。ステップＳ１０１では酸素電流Ｉnewの測定を行う。ステップＳＡでは酸素電流の傾斜を求める。ステップＳＢでは当該傾斜が安定したと判断してよいか否かを判定する。ステップＳＣでは第１測定時間を決定する。ステップＳＢにおいて傾斜の安定について判定するためには、順次に酸素電流Ｉnewの測定を行い、安定したと判断されるまで酸素電流の傾斜を更新して求める。よってステップＳＢは二つの行き先が指定されている。傾斜が安定したと判断された場合にステップＳＢからステップＳＣへと処理が進み、そうでないと判断された場合には更に酸素電流Ｉnewの測定を行うべくステップＳ１０１へと戻る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定し（Ｓ１０１，Ｓ１１２）、前記酸素電流が第１の閾値（ＩP）を所定回数（Ｚ２）越えて低下するまでに要した時間である第１測定時間（ｔｓ）を求める方法であって、
（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）と、
（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）と、
（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、直近の前記測定期間に測定された前記酸素電流（Ｉ1〜ＩZ+1）に基づく値に依存し、かつ当該値よりも低く前記第１の閾値を設定する工程（Ｓ１１４ａ，Ｓ１１４ｂ）と
を備える微生物数の測定方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）から所定の閾値（Δ）を差し引いて設定される、請求項１に記載の微生物数の測定方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）に、０より大きく１未満の係数（ｑ）を乗じて設定される、請求項１に記載の微生物数の測定方法。
【請求項４】
前記係数（ｑ）は０．８に設定される、請求項３記載の微生物数の測定方法。
【請求項５】
初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定し（Ｓ１０１，Ｓ１１２）、前記酸素電流の減少が閾値（Ｅ３）を超えて緩やかとなる第１測定時間（ｔｕ）を求める方法であって、
（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）と、
（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）と、
（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、その後に測定された前記差分値（Ｋnew）が工程（ｂ）における前記差分値(Ｋold)に対して、前記閾値を超えた増分で増大する場合、直近で測定した前記測定期間に基づいて前記測定時間を決定する工程（ＳＣ）と
を備える微生物数の測定方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の絶対値（｜Ｋnew｜）が所定範囲（Ｅ２）内に所定期間において収まる（Ｓ１０８ｂ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する、請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の時間に対する変動（｜Ｋnew−Ｋold｜／Δｔ）の絶対値が所定範囲（Ｅ１）内に所定期間収まる（Ｓ１０８ａ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する、請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項８】
前記所定範囲（Ｅ１）は電流密度に換算して０．６ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2であり、
前記所定回数（Ｚ２）は１０回であり、
前記所定期間は前記酸素電流の測定が連続して５回（Ｚ１）行われる長さである、請求項７記載の微生物数の測定方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、所定の不感時間が経過してから、前記時間差分値が安定したか否かが判定される、請求項１乃至請求項８のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項１０】
前記不感時間は２００分に設定される、請求項９記載の微生物数の測定方法。
【請求項１１】
（ｄ）前記酸素電流が第２の閾値（Ｉd）を越えて低下するまでに要した時間である第２測定時間（ｔｔ）を求める工程
を更に備える、請求項１乃至請求項１０のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項１２】
前記第２の閾値（Ｉd）は電流密度に換算して６０ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2である、請求項１１記載の微生物数の測定方法。
【請求項１３】
前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについての前記第１測定時間と当該既知の初期個数との関係から、当該微生物及び当該培地について求められた検量線に基づき、
前記微生物についての前記初期個数が未知である前記同一種の前記培地について前記第１測定時間を求めて、未知であった前記初期個数を算出する、請求項１乃至請求項１２のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項１４】
前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについて前記第１測定時間を求め、
複数の当該既知の前記初期個数と複数の当該第１測定時間との関係から、当該微生物及び当該培地についての前記検量線を求める、請求項１乃至請求項１２のいずれか一つに記載の微生物数の測定方法。
【請求項１５】
初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定（Ｓ１０１，Ｓ１１２）する酸素電流測定部（２０１）と、
前記酸素電流が第１の閾値（ＩP）を所定回数（Ｚ２）越えて低下するまでに要した時間である第１測定時間（ｔｓ）を求める評価部（２０２）と
を備え、
前記評価部は、
（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）と、
（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）と、
（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、直近の前記測定期間に測定された前記酸素電流（Ｉ1〜ＩZ+1）に基づく値に依存し、かつ当該値よりも低く前記第１の閾値を設定する工程（Ｓ１１４ａ，Ｓ１１４ｂ）と
を実行する微生物数の測定装置。
【請求項１６】
前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）から所定の閾値（Δ）を差し引いて設定される、請求項１５に記載の微生物数の測定装置。
【請求項１７】
前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）に、０より大きく１未満の係数（ｑ）を乗じて設定される、請求項１５に記載の微生物数の測定装置。
【請求項１８】
前記係数（ｑ）は０．８に設定される、請求項１７記載の微生物数の測定装置。
【請求項１９】
初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定する酸素電流測定部（２０１）と、
前記酸素電流の減少が閾値（Ｅ３）を超えて緩やかとなる第１測定時間（ｔｕ）を求める評価部（２０２）と
を備え、
前記評価部は、
（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）と、
（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）と、
（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、その後に測定された前記差分値（Ｋnew）が工程（ｂ）における前記差分値(Ｋold)に対して、前記閾値を超えた増分で増大する場合、直近で測定した前記測定期間に基づいて前記測定時間を決定する工程（ＳＣ）と
を実行する微生物数の測定装置。
【請求項２０】
前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の絶対値（｜Ｋnew｜）が所定範囲（Ｅ２）内に所定期間において収まる（Ｓ１０８ｂ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する、請求項１５乃至請求項１９のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【請求項２１】
前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の時間に対する変動（｜Ｋnew−Ｋold｜／Δｔ）の絶対値が所定範囲（Ｅ１）内に所定期間収まる（Ｓ１０８ａ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する、請求項１５乃至請求項１９のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【請求項２２】
前記所定範囲（Ｅ１）は電流密度に換算して０．６ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2であり、
前記所定回数（Ｚ２）は１０回であり、
前記所定期間は前記酸素電流の測定が連続して５回（Ｚ１）行われる長さである、請求項２１記載の微生物数の測定装置。
【請求項２３】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、所定の不感時間が経過してから、前記時間差分値が安定したか否かが判定される、請求項１５乃至請求項１９のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【請求項２４】
前記不感時間は２００分に設定される、請求項２３記載の微生物数の測定装置。
【請求項２５】
前記評価部（２０１）は、
（ｄ）前記酸素電流が第２の閾値（Ｉd）を越えて低下するまでに要した時間である第２測定時間（ｔｔ）を求める工程
を更に実行する、請求項１５乃至２４のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【請求項２６】
前記第２の閾値（Ｉd）は電流密度に換算して６０ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2である、請求項２５記載の微生物数の測定装置。
【請求項２７】
前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについての前記第１測定時間と当該既知の初期個数との関係から、当該微生物及び当該培地について求められた検量線に基づき、
前記微生物についての前記初期個数が未知である前記同一種の前記培地について前記第１測定時間を求めて、未知であった前記初期個数を算出する、請求項１５乃至請求項２６のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【請求項２８】
前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについて前記第１測定時間を求め、
複数の当該既知の前記初期個数と複数の当該第１測定時間との関係から、当該微生物及び当該培地についての前記検量線を求める、請求項１５乃至請求項２６のいずれか一つに記載の微生物数の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は微生物の個体数を算出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の個体数を算出する方法が種々提案されている。例えば公定法として採用されている方法には、培地において細菌を増菌培養し、所定時間経過後にコロニーを計数して初期菌数を求める手法がある。
【０００３】
しかし、コロニーが目視できる程度にまで増菌培養を行うには二十時間近く要してしまう。そこで、微生物が培養される培地での溶存酸素濃度を測定する手法が提案されている。例えば酸素電極に流れる電流（以下「酸素電流」と称する）を測定することによって培地での溶存酸素濃度が測定される。かかる手法は例えば特許文献１に開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２３５５９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１で示される手法では、酸素電流が所定のしきい値に到達するまでの時間を計測する。本発明は酸素電流に基づく微生物の個体数を、より早期に評価できる手法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明にかかる微生物の測定方法の第１の態様は、初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定し（Ｓ１０１，Ｓ１１２）、前記酸素電流が第１の閾値（ＩP）を所定回数（Ｚ２）越えて低下するまでに要した時間である第１測定時間（ｔｓ）を求める方法であり、下記工程（ａ）〜（ｃ）を備える。即ち（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）；（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）；（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、直近の前記測定期間に測定された前記酸素電流（Ｉ1〜ＩZ+1）に基づく値に依存し、かつ当該値よりも低く前記第１の閾値を設定する工程（Ｓ１１４ａ，Ｓ１１４ｂ）；である。
【０００７】
この発明にかかる微生物の測定方法の第２の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様であって、前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）から所定の閾値（Δ）を差し引いて設定される。
【０００８】
この発明にかかる微生物の測定方法の第３の態様は、微生物数の測定方法の第２の態様であって、前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）に、０より大きく１未満の係数（ｑ）を乗じて設定される。
【０００９】
微生物の測定方法の第３の態様において望ましくは、前記係数（ｑ）は０．８に設定される。
【００１０】
この発明にかかる微生物の測定方法の第４の態様は、初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定し（Ｓ１０１，Ｓ１１２）、前記酸素電流の減少が閾値（Ｅ３）を超えて緩やかとなる第１測定時間（ｔｕ）を求める方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を備える。即ち（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）；（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）；（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、その後に測定された前記差分値（Ｋnew）が工程（ｂ）における前記差分値(Ｋold)に対して、前記閾値を超えた増分で増大する場合、直近で測定した前記測定期間に基づいて前記測定時間を決定する工程（ＳＣ）；である。
【００１１】
この発明にかかる微生物の測定方法の第５の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第４の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の絶対値（｜Ｋnew｜）が所定範囲（Ｅ２）内に所定期間において収まる（Ｓ１０８ｂ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する。
【００１２】
この発明にかかる微生物の測定方法の第６の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第５の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の時間に対する変動（｜Ｋnew−Ｋold｜／Δｔ）の絶対値が所定範囲（Ｅ１）内に所定期間収まる（Ｓ１０８ａ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する。
【００１３】
微生物の測定方法の第６の態様において望ましくは、前記所定範囲（Ｅ１）は電流密度に換算して０．６ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2であり、前記所定回数（Ｚ２）は１０回であり、前記所定期間は前記酸素電流の測定が連続して５回（Ｚ１）行われる長さである。
【００１４】
この発明にかかる微生物の測定方法の第７の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第６の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、所定の不感時間が経過してから、前記時間差分値が安定したか否かが判定される。
【００１５】
この発明にかかる微生物の測定方法の第８の態様は、微生物数の測定方法の第７の態様であって、前記不感時間は２００分に設定される。
【００１６】
この発明にかかる微生物の測定方法の第９の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第８の態様のいずれかであって、（ｄ）前記酸素電流が第２の閾値（Ｉd）を越えて低下するまでに要した時間である第２測定時間（ｔｔ）を求める工程を更に備える。
【００１７】
この発明にかかる微生物の測定方法の第１０の態様は、微生物数の測定方法の第９の態様であって、前記第２の閾値（Ｉd）は電流密度に換算して６０ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2である。
【００１８】
この発明にかかる微生物の測定方法の第１１の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第１０の態様のいずれかであって、検量線に基づき、前記微生物についての前記初期個数が未知である前記培地について前記第１測定時間を求めて、未知であった前記初期個数を算出する。当該検量線は、前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である前記培地のそれぞれについての前記第１測定時間と当該既知の初期個数との関係から、当該微生物及び培地について求められている。当該検量線で前記第１測定時間の測定対象となった前記培地は、未知であった前記初期個数を算出する際の前記培地と同一種である。但し、当該方法の第１１の態様において、前記検量線に基づいて前記微生物の未知の前記初期菌数が算出されるものの、当該検量線を作成することまでは要求されない。
【００１９】
この発明にかかる微生物の測定方法の第１２の態様は、微生物数の測定方法の第１の態様乃至第１１の態様のいずれかであって、前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについて前記第１測定時間を求め、複数の当該既知の前記初期個数と複数の当該第１測定時間との関係から、当該微生物及び当該培地についての前記検量線を求める。
【００２０】
この発明にかかる微生物の測定装置の第１の態様は、初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定（Ｓ１０１，Ｓ１１２）する酸素電流測定部（２０１）と、前記酸素電流が第１の閾値（ＩP）を所定回数（Ｚ２）越えて低下するまでに要した時間である第１測定時間（ｔｓ）を求める評価部（２０２）とを備える。そして前記評価部は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実行する。即ち（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）；（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）；（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、直近の前記測定期間に測定された前記酸素電流（Ｉ1〜ＩZ+1）に基づく値に依存し、かつ当該値よりも低く前記第１の閾値を設定する工程（Ｓ１１４ａ，Ｓ１１４ｂ）；である。
【００２１】
この発明にかかる微生物の測定装置の第２の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様であって、前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）から所定の閾値（Δ）を差し引いて設定される。
【００２２】
この発明にかかる微生物の測定装置の第３の態様は、微生物数の測定装置の第２の態様であって、前記工程（ｃ）において前記第１の閾値（ＩP）は、直近に測定された前記酸素電流（ＩZ+1）に、０より大きく１未満の係数（ｑ）を乗じて設定される。
【００２３】
微生物の測定装置の第３の態様において望ましくは、前記係数（ｑ）は０．８に設定される。
【００２４】
この発明にかかる微生物の測定装置の第４の態様は、初期個数が測定対象となる微生物を含む培地において、酸素量に応じて流れる電流たる酸素電流（Ｉnew）を順次に測定する酸素電流測定部（２０１）と、前記酸素電流の減少が閾値（Ｅ３）を超えて緩やかとなる第１測定時間（ｔｕ）を求める評価部（２０２）とを備える。そして前記評価部は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実行する。即ち（ａ)前記酸素電流の、単位時間当たりの差分である時間差分値（Ｋnew）を、所定の測定期間の前記酸素電流の測定値から求める工程（ＳＡ）；（ｂ）前記工程（ａ）で求められた前記時間差分値が、安定したか否かを判定する工程（ＳＢ）；（ｃ）前記工程（ｂ）における判定が肯定的な場合に、その後に測定された前記差分値（Ｋnew）が工程（ｂ）における前記差分値(Ｋold)に対して、前記閾値を超えた増分で増大する場合、直近で測定した前記に基づいて前記測定時間を決定する工程（ＳＣ）；である。
【００２５】
この発明にかかる微生物の測定装置の第５の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第４の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の絶対値（｜Ｋnew｜）が所定範囲（Ｅ２）内に所定期間において収まる（Ｓ１０８ｂ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する。
【００２６】
この発明にかかる微生物の測定装置の第６の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第５の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記時間差分値の時間に対する変動（｜Ｋnew−Ｋold｜／Δｔ）の絶対値が所定範囲（Ｅ１）内に所定期間収まる（Ｓ１０８ａ，Ｓ１０９）ことを以て、前記時間差分値が安定したと判定する。
【００２７】
微生物の測定装置の第６の態様において望ましくは、前記所定範囲（Ｅ１）は電流密度に換算して０．６ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2であり、前記所定回数（Ｚ２）は１０回であり、前記所定期間は前記酸素電流の測定が連続して５回（Ｚ１）行われる長さである。
【００２８】
この発明にかかる微生物の測定装置の第７の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第６の態様のいずれかであって、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、所定の不感時間が経過してから、前記時間差分値が安定したか否かが判定される。
【００２９】
この発明にかかる微生物の測定装置の第８の態様は、微生物数の測定装置の第７の態様であって、前記不感時間は２００分に設定される。
【００３０】
この発明にかかる微生物の測定装置の第９の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第８の態様のいずれかであって、前記評価部（２０１）は、（ｄ）前記酸素電流が第２の閾値（Ｉd）を越えて低下するまでに要した時間である第２測定時間（ｔｔ）を求める工程を更に実行する。
【００３１】
この発明にかかる微生物の測定装置の第１０の態様は、微生物数の測定装置の第９の態様であって、前記第２の閾値（Ｉd）は電流密度に換算して６０ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2である。
【００３２】
この発明にかかる微生物の測定装置の第１１の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第１０の態様のいずれかであって、検量線に基づき、前記微生物についての前記初期個数が未知である前記培地について前記第１測定時間を求めて、未知であった前記初期個数を算出する。当該検量線は、前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である前記培地のそれぞれについての前記第１測定時間と当該既知の初期個数との関係から、当該微生物及び培地について求められている。当該検量線で前記第１測定時間の測定対象となった前記培地は、未知であった前記初期個数を算出する際の前記培地と同一種である。但し、当該装置の第１１の態様において、前記検量線に基づいて前記微生物の未知の前記初期菌数が算出されるものの、当該検量線を作成することまでは要求されない。
【００３３】
この発明にかかる微生物の測定装置の第１２の態様は、微生物数の測定装置の第１の態様乃至第１１の態様のいずれかであって、前記微生物についての前記初期個数が相互に異なって既知である同一種の前記培地のそれぞれについて前記第１測定時間を求め、複数の当該既知の前記初期個数と複数の当該第１測定時間との関係から、当該微生物及び当該培地についての前記検量線を求める。
【発明の効果】
【００３４】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第１の態様も、培地を酸素量に応じて流れる電流を測定して微生物の初期個数を求める手法において、当該手法に必要な時間を短縮する。
【００３５】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第２の態様も、工程（ｃ）における第１の閾値を設定する。
【００３６】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第３の態様も、それぞれの第２の態様で設定された第１の閾値を用いて第１測定時間を得る際に、従来の方法による結果との一致率を高める。
【００３７】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第４の態様も、培地を酸素量に応じて流れる電流を測定して微生物の初期個数を求める手法において、当該手法に必要な時間を短縮する。
【００３８】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第５の態様も、工程（ｂ）における時間差分値の安定を判定する。
【００３９】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第６の態様も、それぞれの第５の態様で時間差分値の安定を判断する際に、従来の方法による結果との一致率を高める。
【００４０】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第７の態様も、測定の当初における電流の乱れが工程（ｂ）の判定に与える影響を除く。
【００４１】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第８の態様も、それぞれの第７の態様で採用された不感時間を用いて第１測定時間を得る際に、従来の方法による結果との一致率を高める。
【００４２】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第９の態様も、工程（ｃ）の判定ができない程に、初期個数が多い場合でも、第２測定時間を用いて当該初期個数を求めることができる。
【００４３】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第１０の態様も、それぞれの第９の態様で採用された第２測定時間を得る際に、従来の方法による結果との一致率を高める。
【００４４】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第１１の態様も、培地を酸素量に応じて流れる電流を測定して微生物の初期個数を求める手法において、当該手法に必要な時間を短縮する。
【００４５】
この発明にかかる微生物数の測定装置及び測定方法のいずれの第１２の態様も、それぞれの第１１の態様で微生物数の初期個数を算出する際に用いられる検量線を作成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
発明の基本的な考え方．
本発明の実施の形態の詳細な説明に移る前に、本発明の基本的な考え方を示す。もちろん、この基本的な考え方も本発明の範疇にある。以下では微生物として細菌を例に取って説明するが、他の微生物に対しても同様に扱える。また酸素電流の値及びこれに関する閾値は酸素電極の面積で正規化して示すので、正確には電流密度として扱うべきであるが、以下では簡単のため、電流として説明する。
【００４７】
図１は測定時間と酸素電流との関係を、初期菌数をパラメタとして例示するグラフである。測定時間中は増菌培養されるので、溶存酸素量が低下し、これに伴って酸素電流も低下する。グラフＬ０は初期菌数が０の場合を、グラフＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５はそれぞれ初期菌数が１０１，１０２，１０３，１０４，１０５（ＣＦＵ／ｍｌ）である場合を例示している。
【００４８】
従来は、酸素電流について低い値にしきい値Ｉthを設定していた。そしてグラフＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５がしきい値Ｉthに至る測定時間（それぞれ測定時間ｔ１０，ｔ２０，ｔ３０，ｔ４０，ｔ５０）を求めていた。そして測定時間ｔ１０，ｔ２０，ｔ３０，ｔ４０，ｔ５０と、既知の初期菌数１０１，１０２，１０３，１０４，１０５（ＣＦＵ／ｍｌ）とから検量線が求められる。よって初期菌数が未知であっても、しきい値Ｉthに至る測定時間と当該検量線とから初期菌数を算出することができる。
【００４９】
しかしながら、グラフＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５に見られるように、酸素電流は測定時間の経過と共に減少するものの、その当初は減少の傾きが小さく、ある時間が経過してから減少の傾きが大きくなり、更にその後減少の傾きが増大する。よってこの、時間に対する酸素電流のグラフの傾斜（換言すれば、単位時間当たりの酸素電流の差分：以下、単に「酸素電流の傾斜」と称す）が変動する時点での測定時間（以下「傾斜変動時間」と称す：グラフＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５に即して言えば減少の傾きが小から大へと移行する測定時間ｔ１１，ｔ２１，ｔ３１，ｔ４１，ｔ５１や、減少の傾きが大から小へと移行する測定時間ｔ１２，ｔ２２，ｔ３２，ｔ４２，ｔ５２）を求め、これと既知の初期菌数とから検量線を作成することができる。
【００５０】
そして、当該検量線と、初期菌数が未知の場合の傾斜変動時間とから、初期菌数を算出することができる。しかも傾斜変動時間ｔ１１，ｔ１２は測定時間ｔ１０よりも短く、傾斜変動時間ｔ２１，ｔ２２は測定時間ｔ２０よりも短く、傾斜変動時間ｔ３１，ｔ３２は測定時間ｔ３０よりも短く、傾斜変動時間ｔ４１，ｔ４２は測定時間ｔ４０よりも短く、傾斜変動時間ｔ５１，ｔ５２は測定時間ｔ５０よりも短い。よって酸素電流の傾斜変動時間を求めれば、初期菌数の算出を早期に行うことができる。これが本発明の基本的な考え方である。
【００５１】
しかし、酸素電流の傾斜の変動を目視で行うことは、作業の自動化を妨げる。また、傾斜変動時間が経過する前のみならず、経過した後のグラフについても測定しなければ、目視で傾斜変動時間を確認することができない。これでは測定時間を短縮することは容易ではない。
【００５２】
そこで、以下に述べる第１乃至第３の実施の形態では、酸素電流の傾斜の変動を厳密に見ることに代わる便法を採用している。即ち、傾斜変動時間ｔ１１，ｔ２１，ｔ３１，ｔ４１，ｔ５１の後に酸素電流の傾斜が安定したら、それ迄に得られたグラフに基づいて第１の閾値を決定する。そして第１の閾値を１回以上超えて酸素電流が低下した測定時間（以下「第１測定時間」と称する）と、既知の初期菌数とに基づいて検量線を作成する。
【００５３】
また、第４の実施の形態では、酸素電流の傾斜が安定したら、その傾斜の絶対値が小さくなる、いわばグラフの屈曲点を与える（第１乃至第３の実施の形態とは別の）第１測定時間（傾斜変動時間ｔ１２，ｔ２２，ｔ３２，ｔ４２，ｔ５２に相当する）と、既知の初期菌数とに基づいて検量線を作成する。
【００５４】
検量線が作成された後は、当該検量線と、第１測定時間とから、未知の初期菌数を算出することができる。
【００５５】
第１の実施の形態．
図２は本発明の第１の実施の形態にかかる微生物数測定方法の一部を示すフローチャートである。ステップＳ１００ではフローチャートに沿った処理において使用するカウンタＳ，Ｆ２や、酸素電流の傾斜Ｋoldを初期値に設定（リセット）する。ステップＳ１０１では酸素電流Ｉnewの測定を行う。ステップＳＡでは酸素電流の傾斜を求める。ステップＳＢでは当該傾斜が安定したと判断してよいか否かを判定する。ステップＳＣでは第１測定時間を決定する。
【００５６】
ステップＳＢにおいて傾斜の安定について判断するためには、順次に酸素電流Ｉnewの測定を行い、安定したと判断されるまで酸素電流の傾斜を更新して求める。よってステップＳＢは二つの行き先が指定されている。傾斜が安定したと判断された場合にステップＳＢからステップＳＣへと処理が進み、そうでないと判断された場合には更に酸素電流Ｉnewの測定を行うべくステップＳ１０１へと戻る。
【００５７】
図３はステップＳＡの詳細を例示するフローチャートである。まずステップＳ１０４においてカウンタＳが１加算される。最初にステップＳ１０４が実行されるまでは、ステップＳ１００によってカウンタＳには値０が設定されている。よって最初にステップＳ１０４が実行されることにより、カウンタＳの値は１となる。
【００５８】
次にステップＳ１０５において酸素電流のデータソーティングが行われる。具体的にはデータＩ2〜ＩZ+1の値がデータＩ1〜ＩZへと代入され、その後にデータＩZ+1へとステップＳ１０１で測定された直近の酸素電流Ｉnewが代入される。
【００５９】
次にステップＳ１０６においてカウンタＳが値Ｚよりも大きいか否かが判定される。ステップＳ１０６の判定が否定的であれば、ステップＳ１０１へと戻って次の酸素電流Ｉnewが測定される。このようにしてステップＳ１０６の判定が肯定的となるまでステップＳ１０１〜Ｓ１０５が繰り返し実行されることにより、データＩ1〜ＩZにはこの順で時系列に並ぶ酸素電流のＺ個の値が設定されることになる。このようにカウンタＳが値Ｚ以下である場合には、例外的にステップＳＡからステップＳ１０１へと処理が戻る。かかる分岐は図２において破線で示されている。
【００６０】
カウンタＳが値Ｚよりも大きくなれば、ステップＳ１０７へと処理が進む。ステップＳ１０７ではデータＩ1〜ＩZ+1についての回帰直線の傾斜Ｋnewを求める。例えばステップＳ１０１での酸素電流Ｉnewの測定を一定の間隔Ｔで行えば、ステップＳ１０１が実行された測定時間は、ステップＳ１０７の実行には特に必要はない。傾斜Ｋnewは例えば最小二乗法を用いて求めることができる。
【００６１】
ステップＳ１０７に代替可能でより簡易なステップとして、データの差（ＩZ+1−Ｉ1）を求め、これをＺ・Ｔで除して傾斜を得ることもできる。いずれにせよ、ステップＳ１０７ではデータＩ1〜ＩZ+1が得られる期間（例えばＺ・Ｔ）を測定期間とし、当該測定期間の酸素電流の測定値から、単位時間当たりの酸素電流の差分である時間差分値として、傾斜Ｋnewが求められる。
【００６２】
ステップＳ１０７の実行後、処理はステップＳＢへと進む。図４はステップＳＢの詳細を例示するフローチャートである。まずステップＳ１０８ａにおいて、酸素電流の傾斜の変動が、所定の許容範囲内に収まるかが求められる。具体的にはステップＳ１０７で求められた傾斜Ｋnewと傾斜Ｋoldとの差の絶対値を、前回の酸素電流の測定時間から、今回の酸素電流の測定時間までの時間間隔Δｔで除した値が、所定値Ｅ１よりも小さいか否かが判定される。そして上記判定が肯定的であればカウンタＦ１が１増加し、否定的であればカウンタＦ１は値０となる。例えば時間間隔Δｔには上述の一定の間隔Ｔが採用される。
【００６３】
最初にステップＳ１０８ａが実行されるまでは、ステップＳ１００によって傾斜Ｋoldには値ＺＫが設定されている。そして値ＺＫは通常の測定で得られる傾斜Ｋnewよりも所定値Ｅ１と時間間隔Δｔとの積を越えて大きな値が採用される。よって最初にステップＳ１０８ａが実行されることにより、必ずカウンタＦ１の値は０となる。
【００６４】
その後、ステップＳ１０９においてカウンタＦ１が所定値Ｚ１に至ったか否かが判定される。まず最初にステップＳ１０９が実行された場合、上述のようにカウンタＦ１の値は０であるので、当該判定は否定的結果となり、ステップＳ１１０へと処理が進む。ステップＳ１１０では、現状で得られている傾斜Ｋnewを傾斜Ｋoldとして採用する。そしてステップＳ１０１へと処理が戻り、再びステップＳＡによって新たに傾斜Ｋnewが求められる。よって上述の間隔Ｔは、ステップＳＡ，ＳＢの両方の処理時間の和よりも長いことが望ましい。
【００６５】
以上のことから、ステップＳ１０８ａでは、順次に測定される直近の酸素電流Ｉnewによって更新される傾斜Ｋnewが、その直前に求められた傾斜Ｋoldと比較されることになる。またステップＳ１０８ａ，Ｓ１０９の処理に鑑みれば、順次に更新される酸素電流の傾斜の変動が、連続してＺ１回、所定値Ｅ１の範囲内に収まることでステップＳＣへと処理が進むことになる。
【００６６】
図５はステップＳＢの他の例について、その詳細を例示するフローチャートである。この例では、図４に示されたフローチャートと比較して、ステップＳ１０８ａをステップＳ１０８ｂと置換し、ステップＳ１１０を削除したフローチャートが採用される。
【００６７】
ステップＳ１０８ｂでは、傾斜Ｋnewの絶対値が所定値Ｅ２よりも小さいか否かが判定される。そして上記判定が肯定的であればカウンタＦ１が１増加し、否定的であればカウンタＦ１は値０となる。
【００６８】
図６はステップＳＣの詳細を例示するフローチャートである。ステップＳＣではまずステップＳ１１１ａにおいて第１の閾値ＩPを設定する。具体的にはステップＳＢからステップＳＣへ進む際のデータＩZ+1のｑ倍（０＜ｑ＜１）の値を第１の閾値ＩPとして採用する。そしてステップＳ１１２において再度、酸素電流を測定して酸素電流Ｉnewを得る。
【００６９】
ステップＳ１１２はステップＳ１０１と同様にして実行することが簡易であり、これらを併せて、間隔Ｔで酸素電流を測定することが望ましい。この場合、間隔ＴはステップＳＡ，ＳＢの両方の処理時間の和に更にステップＳ１１１ａの処理時間を加算した時間よりも長いことが望ましい。このような望ましい態様では、ステップＳ１１１ａにおいて第１の閾値ＩPとして、直近の酸素電流Ｉnewに係数ｑを乗じた値を採用できる。
【００７０】
しかし一般に第１の閾値ＩPは、傾斜を測定するための直近の測定期間における酸素電流に基づく値に依存して決定すればよい。直近に計算された傾斜によって、傾斜が安定したと判断されるからである。例えば第１の閾値ＩPは、直近の測定期間における酸素電流の平均値に基づいて設定することができる。例えば当該平均値に係数ｑを乗じた値を採用できる。
【００７１】
ステップＳ１１２で測定された酸素電流Ｉnewは、ステップＳ１１４ａにおいて第１の閾値ＩPよりも小さいか否かが判定される。この判定の結果が肯定的であればカウンタＦ２の値が１増加する。カウンタＦ２にはステップＳ１００において初期値０が設定されているので、最初にステップＳ１１４ａが実行される前にはカウンタＦ２の値は０である。
【００７２】
その後ステップＳ１１５へと処理が進み、カウンタＦ２の値が所定値Ｚ２（＞１）に至ったか否かが判定される。まず最初にステップＳ１１４ａが実行された場合、カウンタＦ１の値は０または１であるので、当該判定は否定的結果となり、ステップＳ１１２へと処理が戻り、再び酸素電流Ｉnewが求められる。よって間隔Ｔは、ステップＳ１１４ａ，Ｓ１１５の両方の処理時間の和よりも長いことが望ましい。
【００７３】
ステップＳ１１４ａでは、ステップＳ１０８ａ，Ｓ１０８ｂとは異なり、判定結果が否定的な場合にカウンタＦ２をリセットすることはない。よってステップＳ１１２によって順次に更新される酸素電流Ｉnewが、連続しても、連続していなくても、Ｚ２回、第１の閾値ＩPよりも小さければステップＳ１１６へと進む。ステップＳ１１６では、例えば最後に実行されたステップＳ１１２の測定時間を第１測定時間として設定する。
【００７４】
図７はステップＳＣの他の例について、その詳細を例示するフローチャートである。ここではステップＳ１１１ａ，Ｓ１１４ａがそれぞれステップＳ１１１ｂ，Ｓ１１４ｂに置換されている。ステップＳ１１１ｂではステップＳＢからステップＳＣへ進む際のデータＩZ+1から電流低下閾値Δを差し引いた値を第１の閾値ＩPとして採用する。上述のように、一般に、第１の閾値ＩPは直近の測定期間に測定された酸素電流に基づいた値に依存して決定されるので、当該直近の測定期間に測定された酸素電流の平均値から電流低下閾値Δを差し引いた値を第１の閾値ＩPとして採用してもよい。
【００７５】
また、ステップＳ１１４ｂではステップＳ１０８ａ，Ｓ１０８ｂのカウンタＦ１と同様に、条件Ｉnew＜ＩPを満足しなければカウンタＦ２は０にリセットされる。つまり当該条件が連続してＺ２回満足された初めてステップＳ１１６へと至る。
【００７６】
このようにして第１測定時間が得られるので、まず検量線を作成する場合には、初期菌数が既知の場合について上述のように第１測定時間を測定する。そして検量線が得られた後は、初期菌数が未知の場合であっても、第１測定時間を測定することにより、検量線に基づいて初期菌数を算出することができる。
【００７７】
例えば値Ｚ，Ｚ１，Ｚ２としてそれぞれ値３０，５，１０を採用することができる。また間隔Ｔ，Δｔとしてそれぞれ１（分），１（分）を採用し、係数ｑとして０．８を、電流低下閾値Δとして３０ｎＡ／ｍｍ2を、それぞれ採用することができる。また値ＺＫとして１０３（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）を採用し、所定値Ｅ１，Ｅ２としてそれぞれ０．６（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2）、１．２（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2）を採用することができる。このような具体的な値を採用した場合、上記のフローチャートは以下のように説明できる。
【００７８】
まず酸素電流は１分毎に測定される。そして連続した３０分間の酸素電流のデータについて、回帰直線の傾斜を求める。この傾斜は酸素電流を測定するたびに更新され、その安定性が判断される。
【００７９】
例えば安定性の一つの判断手法（図４参照）として、この傾斜が更新されて、その変動の絶対値が０．６（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2）を越える場合には傾斜が安定しているとは判断されない。傾斜の変動の絶対値が連続して５回、０．６（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2）に収まって初めて傾斜が安定していると判断される。
【００８０】
他の安定性の判断手法（図５参照）として、この傾斜の絶対値が１．２（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）を越える場合には傾斜が安定しているとは判断されない。傾斜の絶対値が連続して５回、１．２（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）に収まって初めて傾斜が安定していると判断される。
【００８１】
そして傾斜が安定していると判断された場合の直近の酸素電流に基づいて第１の閾値が設定される。
【００８２】
例えば第１の閾値の一つの設定方法として（図６参照）、当該直近の酸素電流に０．８を乗じた値が第１の閾値として設定される。あるいは他の設定方法として（図７参照）、当該直近の酸素電流から３０ｎＡ／ｍｍ2を引いた値が第１の閾値として設定される。
【００８３】
その後、第１の閾値を１０回下回れば、傾斜変動時間が経過したと見なして第１測定時間を得る。
【００８４】
図８は酸素電流の測定から第１測定時間を求める処理の概要を示すグラフであり、横軸に測定時間を、縦軸に酸素電流を、それぞれ採用している。酸素電流の測定値は白丸で示しており、最後にステップＳＡが実行された際のデータＩZ+1の値を横線で示している。またグラフでの理解をし易くするために、最後にステップＳＡが実行された際のデータＩ1〜ＩZ+1についての回帰直線Ｌを図示している。もちろん、ステップＳＡ，ＳＢで必要なのは回帰直線Ｌ自体ではなく、その傾斜Ｋnewである。
【００８５】
第１の閾値ＩPも横線で示されている。ここでは例えばＺ２の値として１０が設定されており、酸素電流の測定値が第１の閾値ＩPを１０回下回った際の測定時間を第１測定時間ｔｓとしている。
【００８６】
第２の実施の形態．
図８に示されるように、測定時間の当初において傾斜が安定するまでに大きな変動が生じることがある。これはステップＳＢでの処理を不要に繰り返すのみならず、安定した傾斜として誤検出される可能性もある。従って、測定時間の当初において、ステップＳＡ以降を実行させない不感時間ｔ０を設けることが望ましい。
【００８７】
図９はかかる不感時間の設定を考慮したステップＳＡのフローチャートであり、図３に示されたフローチャートに対して、ステップＳ１０４の前にステップＳ１０３を追加している。ステップＳ１０３では不感時間が経過したか否かが判定される。不感時間が経過していなければステップＳ１０１に戻り、経過していればステップＳ１０４へと進む。
【００８８】
これにより、測定時間の当初における酸素電流の波形の乱れの影響を除去し、酸素電流のデータについての回帰直線の傾斜の、ひいては第１測定時間の誤判定を回避することができる。
【００８９】
第３の実施の形態．
酸素電流の測定結果によっては、酸素電流の値が急速に低下する場合がある。図１０乃至図１２はその種々の態様を示すグラフである。
【００９０】
図１０に示された第１の態様では、酸素電流の傾斜が安定した後、第１の閾値ＩPをＺ２回下回る前に、測定不能となるまで低下している。図１１に示された第２の態様では、酸素電流の傾斜が安定することなく、測定不能となるまで低下している。図１２に示された第３の態様では、不感時間において既に測定不能となるまで低下している。そこで、これらの場合についても検量線の作成や、未知の初期菌数の算出を可能とするため、酸素電流の値が第２の閾値Ｉdを越えて低下した場合には、その時点を第２測定時間ｔｔとする。この第２測定時間についても第１測定時間と同様に扱って、検量線の作成や、未知の初期菌数の算出を行う。
【００９１】
図１３は本発明の第３の実施の形態にかかる微生物数測定方法の一部を示すフローチャートであり、図２に対応している。また図１４及び図１５は本発明の第３の実施の形態におけるステップＳＡの詳細を示すフローチャートであり、それぞれ第１の実施の形態で示された図３と、第２の実施の形態で示された図９とに対応している。
【００９２】
図１３乃至図１５のいずれにおいても、酸素電流Ｉnewが測定された直後に、これが第２の閾値Ｉdよりも大きいか否かが判定されている。具体的にはステップＳ１０１の直後にステップＳ１０２が設けられている。第２の閾値Ｉdとしては例えば６０ｎＡ／ｍｍ2が採用される。
【００９３】
ステップＳ１０２の判定が肯定的であれば、第１の実施の形態で示されたようにステップＳ１０４が（図３、図１４参照）、あるいは第２の実施の形態で示されたようにステップＳ１０３が（図９、図１５参照）、それぞれ実行される。しかしステップＳ１０２の判定結果が否定的であれば、ステップＳ１１７へと処理が進み、そのような酸素電流が測定された時点が第２測定時間として採用される。
【００９４】
図１６は本発明の第３の実施の形態におけるステップＳＣの詳細を示すフローチャートであり、第１の実施の形態で示された図６あるいは図７と対応している。このフローチャートにおいても、酸素電流Ｉnewが測定された直後に、これが第２の閾値Ｉdよりも大きいか否かが判定されている。具体的にはステップＳ１１２の直後にステップＳ１１３が設けられている。図中、ステップＳ１１２は、ステップＳ１１２ａ（図６）とステップＳ１１２ｂ（図７）とを統合して示しており、両者のいずれかが採用される。
【００９５】
ステップＳ１１３の判定が肯定的であれば、第１の実施の形態で示されたようにステップＳ１１４ａが（図６参照）、あるいはステップＳ１１４ｂが（図７参照）、それぞれ実行される（図中、ステップＳ１１２は、ステップＳ１１２ａ（図６）とステップＳ１１２ｂ（図７）とを統合して示しており、両者のいずれかが採用される）。しかしステップＳ１１３の判定結果が否定的であれば、ステップＳ１１７へと処理が進み、そのような酸素電流が測定された時点が第２測定時間として採用される。
【００９６】
本実施の形態ではステップＳＣからステップＳ１１７へと分岐することがあるので、図１３においてはかかる分岐を破線で示している。
【００９７】
図１０に示された第１の態様では、ステップＳ１１５の判定で肯定的な結果が得られることなく（図１６参照）、ステップＳＣからステップＳ１１７へと分岐して第２測定時間ｔｔが求められる。図１１に示された第２の態様では、ステップＳ１０６の判定で肯定的な結果が得られず（図１４、図１５参照）、ステップＳＡからステップＳＢに処理が進むことなく、ステップＳ１０２からステップＳ１１７へと処理が進み、図１３のステップＳＡからの破線で示される分岐に沿って処理が進む。図１２に示された第３の態様では、図１５のステップＳ１０３の判定で肯定的な結果が得られず、ステップＳ１０４にすら処理が進むことなくステップＳ１０２からステップＳ１１７へと処理が進む。
【００９８】
第４の実施の形態．
本実施の形態では、「発明の基本的な考え方．」で説明した、減少の傾きが大から小へと移行する第１測定時間（第１乃至第３の実施の形態に言う「第１測定時間」とは異なる）ｔ１２，ｔ２２，ｔ３２，ｔ４２，ｔ５２を求める。第４実施の形態で求める第１測定時間も、第１乃至第３実施の形態に言う第１測定時間や第２測定時間と同様に、検量線の作成や、未知の初期菌数の算出に供する。
【００９９】
もちろん、本実施の形態においても、第２の実施の形態で示された不感時間を導入してもよいし、第３の実施の形態で示された第２測定時間を導入してもよい。第１乃至第３の実施の形態に言う第１測定時間と区別するため、本実施の形態では第１測定時間を示す符号として“ｔｕ”を用いる。
【０１００】
図１７は本実施の形態において用いられるステップＳＣの詳細を示すフローチャートである。まずステップＳＢによって傾斜が安定したと判断された後、直近の傾斜Ｋnewを一旦、傾斜Ｋoldとして採用する。そしてステップＳ３０２において、新たに酸素電流Ｉnewを測定する。そしてステップＳ３０３においてカウンタＦ２の値が１増加する。カウンタＦ２にはステップＳ１００において初期値０が設定されているので、カウンタＦ２の値はステップＳ３０２が実行された回数を示している。
【０１０１】
そしてステップＳ１０５と同様にしてステップＳ３０４において酸素電流のデータソートを行い、ステップＳ１０６と同様にしてステップＳ３０５においてステップＳ３０２の実行回数が所望の回数（Ｙ＋１）だけ繰り返されたかが判定される。
【０１０２】
これらの動作は図３を用いて説明した動作と同様である。つまりステップＳ３０５の判定の結果が肯定的な場合、データＩ1〜ＩYにはこの順で時系列に並ぶ酸素電流のＹ個の値が設定されることになる。そしてステップＳ３０６ではステップＳ１０７と同様にデータＩ1〜ＩY+1についての新たな回帰直線の傾斜Ｋnewを、単位時間当たりの酸素電流の差分として求める。
【０１０３】
なお、ステップＳＡのステップＳ１０５において既にそれまでに酸素電流Ｉ1〜ＩZ+1が求められているので、ステップＳ３０４でのデータソートでは、ステップＳ１０５の結果を利用することもできる。
【０１０４】
そしてステップＳ３０７においてはステップＳ３０１で設定された傾斜Ｋoldと、ステップＳ３０６で求められた新たな傾斜Ｋnewの大きさが比較される。傾斜Ｋold，Ｋnewはいずれも酸素電流が減少する傾斜であり、負の値であるので、傾斜Ｋoldよりも傾斜Ｋnewが所定の閾値Ｅ３を超えた増分で大きくなった時点を第１測定時間ｔｕ（図１に即して言えば時刻ｔ２２，ｔ３２，ｔ４２，ｔ５２）として採用することができる。
【０１０５】
ステップＳ３０７では判定の便宜上、傾斜Ｋoldの絶対値が傾斜Ｋnewの絶対値よりも閾値Ｅ３を超えた増分で大きいか否かが判定される場合が例示されている。しかしこの判定において、絶対値を採用する必要がないことは明白である。
【０１０６】
ステップＳ３０７における判定の結果が肯定的であればステップＳ３０７へと進み、例えば最後に実行されたステップＳ３０２の測定時間を第１測定時間ｔｕとして設定する。
【０１０７】
上記判定の結果が否定的であれば、ステップＳ３０８においてカウンタＦ２の値をリセット（値０を採用）してから、ステップＳ３０２へと戻り、新たに傾斜を求める。
【０１０８】
ステップＳ３０８の戻り先として、ステップＳ３０２を設定している。つまり酸素電流の傾斜が緩くなったか否かを判定するのに、ステップＳＢにおいて安定したと判断された際の酸素電流の傾斜を基準として採用している。
【０１０９】
ステップＳ３０８の戻り先として、ステップＳ３０１を設定し、酸素電流の傾斜の変化に基づいて第１測定時間ｔｕを求めることも考えられる。しかし酸素電流の傾斜は緩やかに変化するので、ステップＳＢにおいて安定したと判断された際の酸素電流の傾斜を基準とした場合と比較すると第１測定時間ｔｕが長くなり、しきい値Ｉthに至る測定時間（図１参照）よりも早期に測定する効果が小さい。よって早期に測定するという観点からは、ステップＳ３０８の戻り先としてはステップＳ３０１よりもステップＳ３０２を採用する方が望ましい。
【０１１０】
あるいは直近の傾斜Ｋnewを得た測定期間に基づいて第１測定時間ｔｕを決定してもよい。当該直近の測定期間において求められた傾斜によって、それ以前に求められた傾斜Ｋoldよりも傾斜Ｋnewが所定の閾値Ｅ３を超えた増分で大きくなったと判定されるからである。例えば第１測定時間ｔｕは当該直近の測定期間の中央値として決定してもよい。
【０１１１】
以上の種々の実施の形態において得られた第１測定時間及び第２測定時間は、初期菌数が既知である場合に、検量線の作成に供される。そしてこの様にして得られた検量線に基づいて、初期菌数が未知の培地について酸素電流を計測すれば、その初期菌数を算出することができる。
【０１１２】
もちろん、測定の精度を高めるため、検量線を作成する際に初期菌数が既知である微生物の種類と、初期菌数が未知である微生物の種類とは同一であり、また検量線を作成する際に初期菌数が既知である微生物を含む培地の種類と、初期菌数が未知である微生物を含む培地の種類とは同一であることが望ましい。
【０１１３】
図１８は、上述のようにして検量線を作成したり、初期菌数を算出したりする技術に適用可能な微生物数算出装置２００の構成を示すブロック図である。微生物数算出装置２００は、培地における酸素電流を測定する酸素電流測定部２０１と、酸素電流測定部２０１の動作を制御し、酸素電流を評価する制御・評価部２０２とを備えている。
【０１１４】
制御・評価部２０２は酸素電流を測定するタイミングを指示する指令Ｄを、酸素電流測定部２０１へと与える。例えば所定期間Ｔ毎に酸素電流を測定させたり、不感時間が経過してから酸素電流を測定させたり、第１測定時間ｔｓ，ｔｕや第２測定時間ｔｔが得られた後に酸素電流の測定を中止させる。酸素電流測定部２０１は主としてステップＳ１０１，Ｓ１１２を実行し、制御・評価部２０２は上述のフローチャートにおいてステップＳ１０１，Ｓ１１２以外のステップを実行する。
【０１１５】
その他：
測定時間と酸素電流との関係を、初期菌数をパラメタとして予め複数記憶し、これらの関係のうち、測定値との相違が最も小さくなるものを与えるパラメタを以て初期菌数を求めることも考えられる。
【０１１６】
例えば図１に示されたグラフＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５を、予め電流データとしてそのまま、あるいは関数形として記憶しておく。そして図８や図１０〜１２に白丸で示されたような測定値と、上記の電流データとの相違を最小とする電流データを特定する。例えば測定時間ごとの測定値と電流データとの差の平方について、測定時間内の少なくとも一部で総和を採った結果を上記相違として採用する。そして上記相違を最小とする電流データと対応した初期菌数を、当該測定値から得られた初期菌数として選定する。
【０１１７】
但し、この手法は検体によってグラフが大きく歪む場合があるので、上記実施の形態に示された手法によって初期菌数を求める方が、確度は高い。
【実施例】
【０１１８】
以下、対照されるべき技術と共に、本件発明の実施例について説明する。表１は対照されるべき技術を説明する表である。
【０１１９】
【表１】
2006177934.tif 000003
【０１２０】
検出条件＃２０１〜＃２０６はいずれも酸素電流を１分毎に測定し、ある時点での酸素電流が３０分（時間間隔）前の酸素電流に対して設定電流の値を５回連続で下回った時点を検出時間として採用する。この検出時間も、初期菌数に依存すると考えられる。但し、いずれの検出条件＃０２１〜＃０２６についても不感時間を設定している。
【０１２１】
例えば検出条件＃２０１では、設定電流の値を３０ｎＡ／ｍｍ2に設定するので、不感時間１００分が経過した後、酸素電流の傾斜が−３０（ｎＡ／ｍｍ2）／３０（ｍｉｎ）＝−１．０（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）よりも小さく（急激に）なることが５回連続で生じた際の測定時間が検出時間として採用される。
【０１２２】
表２は酸素電流の傾斜が安定したことを、酸素電流の傾斜の絶対値が所定の範囲にあることで判断する技術を説明する表である。このような判断は上述の図５で示されたステップＳＢに対応する。
【０１２３】
【表２】
2006177934.tif 000004
【０１２４】
検出条件＃３１１〜＃３１９は酸素電流を１分毎に測定する（この間隔が上述の一定の間隔Ｔに相当）。１０分前（あるいは３０分前）（この期間はカウンタＳについての値Ｚと上記一定の間隔Ｔとの積に相当）の酸素電流を現在の酸素電流から差し引いた結果を、１０分間（あるいは３０分間）で除して傾斜を得る。この傾斜は最小二乗法で求めてはいない点で上述の傾斜Ｋnewとは異なる。この傾斜の絶対値が５回連続して（上述の所定値Ｚ１に相当）、１．２（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）（上述の所定値Ｅ２に相当）よりも小さくなった時点で酸素電流の傾斜が安定したと判断する。そしてこの時点での酸素電流（上述のＩZ+1に相当）よりも電流低下閾値（上述の電流低下閾値Δに相当）だけ小さい値の酸素電流が５回（上述の所定値Ｚ２に相当）連続して観測された時点を第１測定時間として採用する。このような判断は図７に示されたステップＳＣに対応する。このようにして設定された第１測定時間も、初期菌数に依存すると考えられる。但し、いずれの検出条件＃３１１〜＃３１９についても不感時間を設定している。
【０１２５】
例えば検出条件＃３１１では、不感時間１００分が経過した後、酸素電流の傾斜の絶対値が１．２（ｎＡ／ｍｍ2）よりも小さく（平坦に）なることが５回連続で生じた時点で、当該傾斜が安定したと判定する。そしてその安定した時点の酸素電流の値から３０（ｎＡ／ｍｍ2）低下した値を第１の閾値ＩPとして採用し、これよりも小さい酸素電流を５回連続して観測した時点を第１測定時間として採用する。
【０１２６】
表３は酸素電流の傾斜が安定したことを、酸素電流の傾斜の変化の絶対値が所定の範囲にあることで判断する技術を説明する表である。このような判断は上述の図４で示されたステップＳＢに対応する。
【０１２７】
【表３】
2006177934.tif 000005
【０１２８】
検出条件＃３２１〜＃３２９は酸素電流の傾斜を検出条件＃３２１〜＃３２９と同様にして求める。この傾斜の変化量の絶対値（図４のステップＳ１０８ａの｜Ｋnew−Ｋold｜／Δｔに相当）が５回連続して（上述の所定値Ｚ１に相当）、３（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）よりも小さくなった時点で酸素電流の傾斜が安定したと判断する。そしてこの時点での酸素電流（上述のＩZ+1に相当）よりも電流低下閾値（上述の電流低下閾値Δに相当）だけ小さい値の酸素電流が５回（上述の所定値Ｚ２に相当）連続して観測された時点を第１測定時間として採用する。このような判断は図７に示されたステップＳＣに対応する。このようにして設定されたこの第１測定時間も、初期菌数に依存すると考えられる。但し、いずれの検出条件＃３２１〜＃３２９についても不感時間を設定している。
【０１２９】
例えば検出条件＃３２１では、不感時間１００分が経過した後、酸素電流の傾斜の変化量の絶対値が３（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ）よりも小さく（平坦に）なることが５回連続で生じた時点で、当該傾斜が安定したと判定する。そしてその安定した時点の酸素電流の値から３０（ｎＡ／ｍｍ2）低下した値を第１の閾値ＩPとして採用し、これよりも小さい酸素電流を５回連続して観測した時点を第１測定時間として採用する。
【０１３０】
表４〜表６は、上述の検出時間（検出条件＃２０１〜＃２０６）や第１測定時間（検出条件＃３１１〜＃３１９，＃３２１〜＃３２９）を、酸素電流の傾斜の変動を目視で行って傾斜変動時間を得た場合（これを自動的に行った技術が第４の実施の形態に相当する：表ではその結果を「目安点」と表記した）と比較したものである。なお、表４の条件＃１０１は従来の技術を用いて、しきい値Ｉthに至る測定時間を測定した場合である。しきい値Ｉthとして１８０ｎＡ／ｍｍ2を採用し、これを３回下回った時点を検出時間として採用している。また第３の実施の形態で説明した第２の閾値Ｉdによる第２測定時間は採用していない。
【０１３１】
【表４】
2006177934.tif 000006
【０１３２】
【表５】
2006177934.tif 000007
【０１３３】
【表６】
2006177934.tif 000008
【０１３４】
各条件について、傾斜変動時間と各検出条件の測定結果（検出時間や第１測定時間）とを一対の標本として捉え、両者の時間についての一標本ｔ検定による有意差検定を行った（有意水準１％）。従って自由度は観測数から１を減じた値となっている。各検出条件と対をなす標本としての目安点は、それぞれの検出条件の左側の欄に記載している。よって縦二重線を介して隣接する各検出条件と目安点とは比較の対象とはならない。
【０１３５】
但し検体（測定対象となった培地）の総数は３５８個である。各検出条件についての測定結果の観測数が検体の総数よりも少ないのは、各検出条件を用いて得られた測定結果（検出時間や第１測定時間）と、目安点によって求めた傾斜変動時間との、少なくともいずれか一方が非常に大きな値を示す場合があるからである。これはつまり検体がいずれかの測定方法で陰性と判断される場合である。これらの場合は傾斜変動時間と測定結果との間で数値を用いた統計的な比較ができないため、観測数から除いている。
【０１３６】
表４の検出条件＃１０１及びその目安点とのｔ検定の結果、棄却閾確率は１％（＝０．０１）よりも小さい。またｔ値の絶対値はｔ境界値よりも大きい。従って傾斜変動時間の平均値と、従来の酸素電流がしきい値Ｉthに至る測定時間の平均値とは、有意差があることが判る。つまり「Ａ．発明の基本的な考え方．」で述べたように、酸素電流の傾斜変動時間を求めることで、初期菌数の算出を早期に行える。
【０１３７】
一方、表５、表６から、検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９で得られる第１測定時間の平均値と、それぞれと対を成す傾斜変動時間の平均値とは有意差がないという帰無仮説は棄却されない。他方、これら三個の検出条件以外では、当該帰無仮説を棄却でき、有意差がある、と結論づけられる。厳密には、帰無仮説が棄却できないことは帰無仮説が妥当であることにはならないが、一般的にはそのような結論を用いる場合も多い。そこで、表１、表２、表３で示された各種の検出条件のうち、検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９で得られる第１測定時間の平均値のみが、目視で得られた傾斜変動時間の平均値と有意差がない、と判断する。
【０１３８】
さて、このように検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９を採用すれば、目視によって求められる傾斜変動時間を、第１実施の形態や第２実施の形態で示したように作業が自動化される第１測定時間で代替することができそうである。そこで、次に、検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９の第１測定時間と、条件＃１０１の測定時間とについて比較した。表７は測定時間の平均値のｔ検定（有意水準１％）の結果を示し、表８は測定時間のＣＶ値（Coefficient of Variation）の平均値のｔ検定（有意水準５％）の結果を示す。これらの結果も表４、表５、表６と同様に、一標本ｔ検定による有意差検定を行った。
【０１３９】
【表７】
2006177934.tif 000009
【０１４０】
【表８】
2006177934.tif 000010
【０１４１】
表７から、検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９の第１測定時間の平均値と、条件＃１０１の測定時間の平均値とは有意差がある。従って検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９の第１測定時間は、目視による傾斜変動時間と同様に、従来の酸素電流がしきい値Ｉthに至る測定時間に対して、時間を短縮する効果があることが判る。
【０１４２】
また表８から、検出条件＃３１９，＃３２９と、条件＃１０１とは、ＣＶ値に有意差がない、との帰無仮説を棄却できない。このことから、第１測定時間のばらつきが、従来の測定時間のばらつきと同程度であると判断した。また検出条件＃３２６についてはばらつきの点からは効果的ではないと判断した。
【０１４３】
そこで、次に、これら４つの検出条件に基づいて、全部の検体３５８個について、菌の陽性／陰性を判断した。その結果を、寒天培地を用いた手法（以下「寒天手法」と称す）増菌培養によって菌の陽性／陰性を判断した結果と比較した。比較結果を表９に示す。
【０１４４】
【表９】
2006177934.tif 000011
【０１４５】
ここで「偽陽性」とは、各検出条件によって陽性と判断されたが、寒天手法では陰性と判断された場合を指す。また、「偽陰性」とは、各検出条件によって陰性と判断されたが、寒天手法では陽性と判断された場合を指す。よっていずれも寒天手法の結果とは相違する場合である。そして表９には「偽陽性」「偽陰性」と判断された検体数を各検出条件毎に記載し、併せて寒天手法との一致率を記載した。例えば検出条件＃１０１では、「偽陽性」「偽陰性」となった検体数がそれぞれ５個及び２５個であるので、一致率は（３５８−５−２５）／３５８×１００＝９１．６（％）となる。
【０１４６】
表９の結果からは、従来技術である検出条件＃１０１と比較して、若干、寒天手法との一致率が低い。そこで、検出条件＃３２６，＃３２９の基本的な検出手法（ステップＳＢとして図４のフローチャートを採用）を踏襲しつつ、更に寒天手法との一致率を高める工夫を行った。具体的にはステップＳＣとして図７のフローチャートではなく、図６のフローチャートを使用した。ここで係数ｑとして０．８を採用している。また所定値Ｅ１として０．６（ｎＡ／ｍｍ2／ｍｉｎ2）を採用した。所定値Ｚ１，Ｚ２はそれぞれ５，１０とした。この検出条件を＃３３１とする。また不感時間は２００分とした。また酸素電流の傾斜は最小二乗法で求めており、ステップＳ１０７（図３参照）の傾斜Ｋnewに対応する。
【０１４７】
更に、検出条件＃３３１に加えて、実施の形態３で説明した第２の閾値Ｉdをも採用して検出条件＃３３２を設定した。即ち、検出条件＃３３２では図６、図１３、図１４、図１６（但しステップＳ１１１ａ，Ｓ１１４ａを採用）に示されたフローチャートが採用される。ここでは第２の閾値Ｉdを６０ｎＡ／ｍｍ2とし、検出条件＃３３２で得られる測定時間は第１測定時間及び（実施の形態３に言う）第２測定時間の両方を指す。
【０１４８】
検出条件＃３３１，＃３３２と、条件＃１０１について比較した。表１０は測定時間の平均値のｔ検定（有意水準１％）の結果を示し、表１１は測定時間のＣＶ値の平均値のｔ検定（有意水準５％）の結果を示す。これらの結果も表７、表８と同様に、一標本ｔ検定による有意差検定を行った。
【０１４９】
【表１０】
2006177934.tif 000012
【０１５０】
【表１１】
2006177934.tif 000013
【０１５１】
表１０から、検出条件＃３３１，＃３３２の測定時間の平均値と、条件＃１０１の測定時間の平均値とは有意差がある。従って検出条件＃３３１，＃３３２の測定時間は、検出条件＃３１９，＃３２６，＃３２９の測定時間と同様に、従来の酸素電流がしきい値Ｉthに至る測定時間に対して、時間を短縮する効果があることが判る。
【０１５２】
また表１１から、検出条件＃３３１，＃３３２と、条件＃１０１とは、ＣＶ値に有意差があることが判る。つまり検出条件＃３３１，＃３３２を採用すれば、従来の測定時間のばらつきよりも、測定時間のばらつきを改善できることが判る。
【０１５３】
そこで、次に、これら２つの検出条件に基づいて、全部の検体３５８個について、菌の陽性／陰性を判断した。その結果を寒天手法によって菌の陽性／陰性を判断した結果と比較した。比較結果を表１２に示す。
【０１５４】
【表１２】
2006177934.tif 000014
【０１５５】
表９との比較から判るように、寒天手法との一致率は、第２測定時間を導入しない検出条件＃３３１ですら改善されており８８．３％となっている。更に第２測定時間を導入した検出条件＃３３２では、寒天手法との一致率は９１．６％となり、従来の技術による一致率と等しい。しかも偽陰性数は従来の条件＃１０１と比較して小さく、安全上は好ましい傾向にある。
【０１５６】
以上のことから、ステップＳＢとしては図５で示されたものよりも図４で示されたフローチャートを採用することが望ましく、ステップＳＡにおいてはステップＳ１１１ｂ，Ｓ１１４ｂを用いる場合（図７参照）よりもステップＳ１１１ａ，Ｓ１１４ａ（図６参照）を用いる場合の方が望ましく、更には不感時間を設ける場合（図１３参照）が望ましいことが判る。更に、実施の形態３で示されたような第２測定時間をも導入すること（図１６参照）が、より望ましいことが判る。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】測定時間と酸素電流との関係を、初期菌数をパラメタとして例示するグラフである。
【図２】本発明の第１の実施の形態にかかる微生物数測定方法の一部を示すフローチャートである。
【図３】ステップＳＡの詳細を例示するフローチャートである。
【図４】ステップＳＢの詳細を例示するフローチャートである。
【図５】ステップＳＢの他の例について、その詳細を例示するフローチャートである。
【図６】ステップＳＣの詳細を例示するフローチャートである。
【図７】ステップＳＣの他の例について、その詳細を例示するフローチャートである。
【図８】酸素電流の測定から第１測定時間を求める処理の概要を示すグラフである。
【図９】本発明の第２の実施の形態におけるステップＳＡのフローチャートである。
【図１０】酸素電流の値が急速に低下する第１の態様を示すグラフである。
【図１１】酸素電流の値が急速に低下する第２の態様を示すグラフである。
【図１２】酸素電流の値が急速に低下する第３の態様を示すグラフである。
【図１３】本発明の第３の実施の形態にかかる微生物数測定方法の一部を示すフローチャートである。
【図１４】本発明の第３の実施の形態におけるステップＳＡの詳細を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の第３の実施の形態におけるステップＳＡの詳細を例示するフローチャートである。
【図１６】本発明の第３の実施の形態におけるステップＳＣの詳細を例示するフローチャートである。
【図１７】本発明の第４の実施の形態におけるステップＳＣの詳細を例示するフローチャートである。
【図１８】本発明を適用可能な微生物数算出装置の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【０１５８】
Ｉ1〜ＩZ+1，Ｉnew  酸素電流のデータ
Ｉd  第２の閾値
ＩP  第１の閾値
Ｋnew  酸素電流の傾斜
ｑ  係数
ｔｓ  第１測定時間
ｔｔ  第２測定時間
Ｚ１，Ｚ２  所定値
【図１】
2006177934.tif 000015
【図２】
2006177934.tif 000016
【図３】
2006177934.tif 000017
【図４】
2006177934.tif 000018
【図５】
2006177934.tif 000019
【図６】
2006177934.tif 000020
【図７】
2006177934.tif 000021
【図８】
2006177934.tif 000022
【図９】
2006177934.tif 000023
【図１０】
2006177934.tif 000024
【図１１】
2006177934.tif 000025
【図１２】
2006177934.tif 000026
【図１３】
2006177934.tif 000027
【図１４】
2006177934.tif 000028
【図１５】
2006177934.tif 000029
【図１６】
2006177934.tif 000030
【図１７】
2006177934.tif 000031
【図１８】
2006177934.tif 000032