(57)【要約】【課題】自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置に有効なモノクローナル抗体の提供。【解決手段】本発明は、以下の特性：ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識し、ヒトＩ型 IFNの生物学的特性に対する中和能力を有するという特性を特徴とするヒトＩ型インターフェロン受容体(IFN-R）に対するモノクローナル抗体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
(a) ヒトＩ型インターフェロン受容体（ヒトＩ型IFN-R）のアミノ酸配列27〜427 上のエピトープを認識し、
(b) ヒトＩ型インターフェロン（ヒトＩ型IFN）の抗増殖活性又は抗ウィルス活性に対する中和能力を有する、
という特性を特徴とするヒトＩ型IFN-Rに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト病態Ｉ型 IFNの IFN-Rとの結合を阻止する能力を特徴とする請求項１記載のヒトＩ型 IFN-Rに対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
骨髄腫細胞と可溶性形態のヒト IFN-Rで予め免疫化した動物からの脾臓細胞との融合により調製されるハイブリドーマ細胞から得られる請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
100μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型 IFNのヒト細胞性 IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
50μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型 IFNのヒト細胞性 IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
20μｇ／ml以下の抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型 IFNのヒト細胞性 IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
約 0.5〜２μｇ／mlの抗体濃度でhu-IFN-Rを保有する細胞と同時インキュベートされる場合に、ヒトＩ型 IFNのヒト細胞性 IFN-Rとの結合をin vitroで阻止することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ヒトＩ型 IFNに対し反応性である細胞に対するヒトＩ型 IFNの抗増殖活性をin vitro で中和することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記細胞がDaudi細胞であり、そして前記抗体の濃度が１〜10μｇ／mlである、請求項８記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記細胞がLy28細胞であり、そして前記抗体の濃度が50〜100 μｇ／mlである、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
IFNガンマのヒト受容体と結合しないことを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
ヒトＩ型 IFNに対し反応性である細胞に対するヒトＩ型 IFNの抗ウィルス活性をin vitro で中和することを特徴とする、請求項１〜11のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記細胞がDaudi細胞であり、そして前記抗体の濃度が１〜10μｇ／mlである、請求項12記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記細胞がLy28細胞であり、そして前記抗体の濃度が50〜100 μｇ／mlである、請求項１〜13のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ｎ′92022605の下に1992年２月26日に ECACCに寄託された抗体 64G12であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
抗体重鎖及び軽鎖の可変部又は相補的決定領域がヒト抗体のフレームワーク及び定常部にグラフトされることを特徴とする請求項16記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
IgG１抗体であることを特徴とする請求項１〜14のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項１〜16のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ細胞。
【請求項２１】
請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＩ型 IFNに対する拮抗剤特性を有する組成物。
【請求項２２】
適切な薬剤ビヒクルと一緒に請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２３】
適切な薬剤ビヒクルと一緒に請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、増殖性細胞活性及び／又はウィルス細胞感染に関連した病態の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２４】
ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力及びヒトＩ型 IFNの IFN-Rとの結合を阻止する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
(a)IFN-Rを保有できるヒト細胞を用いて確定濃度の請求項１〜19のいずれかに記載の精製モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を予インキュベートし；
(b)確定濃度の標識化ヒトＩ型 IFNを上記予インキュベーション中の培地に加え；
(c)ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型 IFNを含有する培地を細胞性 IFN-Rを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方ではＩ型 IFNとの間に平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートし；
(d)細胞を洗浄し；
(e)付着標識化Ｉ型 IFNの量を計数することによりヒト細胞とＩ型 IFNとの間の結合複合体の生成を確定する；
工程を特徴とする方法。
【請求項２５】
ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞に対するＩ型 IFNの抗増殖活性を中和する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
(a)ヒトＩ型IFNの存在下で、且つ確定濃度の請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体の存在下で細胞を増殖させ；
(b)ヒトＩ型IFNの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する；
工程を特徴とする方法。
【請求項２６】
ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有し、そしてヒト細胞に対する非病態性又は病態性のＩ型 IFNの抗ウィルス活性を中和する能力を有するモノクローナル抗体の選択方法であって、以下の：
(a)Ｉ型 IFN及び請求項１〜19のいずれかに記載のモノクローナル抗体を確定濃度で用いてモノクローナル抗体とヒト細胞の IFN-Rとの間、及び／又はＩ型 IFNとヒト細胞の IFN-Rとの間に複合体を生成させるのに十分な時間インキュベートし；
(b)上記インキュベート細胞を確定濃度のウィルスに感染させ；
(c)細胞を洗浄し；
(d)細胞を培地中に再懸濁し；
(e)ウィルスを複製させるのに十分な時間インキュベートし；
(f)細胞を溶解し；
(g)ウィルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する；
工程を特徴とする方法。
【請求項２７】
64G12の免役結合特性を有するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の詳細な説明
インターフェロン(IFN）は広範な生物学的活性を示し、脊椎動物細胞中に抗ウイルス状態を誘発するその能力を特徴とする分泌蛋白質の一群を構成する（I. Gresser and M.G. Tovey, Biochem. Biophys. Acta 516 : 231, 1978)。 IFNには３種類の抗原性種がある：即ちアルファ（α）、ベータ（β）及びガンマである。 IFNα及び IFNβはともにＩ型インターフェロンとして公知である。
天然Ｉ型ヒトインターフェロンは、高度の構造的相同性を有する別個の遺伝子によりコードされる12又はそれ以上の非常に関連した蛋白質から成る（Weissmann and Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol.33 : 251, 1986) 。
【０００２】
ヒト IFNα遺伝子座は２つの亜科から成る。第一の亜科は、14個の非対立遺伝子と４個の偽遺伝子から成り、少なくとも80％の相同性を有する。第二の亜科、即ちαII又はオメガ（ω）は、５個の偽遺伝子及び１個の機能遺伝子を含有し、 IFNα遺伝子との70％の相同性を示す（Weissmann and Weber, 1986)。
IFNαのサブタイプは異なる特異的活性を有するが、しかしそれらは同一の生物学的範囲を有し(Streuli et al.,PNAS-USA 78：2848,1981)、同一細胞受容体を有する(Agnet M. et al., in "Interferon 5" Ed. I. Gresser P.1-22, Acadimic Press, London 1983)。
インターフェロンβ(IFNβ）は、 IFNα遺伝子と約50％の相同を有する。
インターフェロンαサブタイプ及びインターフェロンβは、細胞表面の同一受容体と結合する。
【０００３】
インターフェロンγ(IFNγ）も単一コピーによりコードされ、 IFNα及び IFNβの遺伝子とほとんど相同でない。 IFNγに対する受容体はα及びβインターフェロンとは異なっている。
本発明のために、 IFNのα及びβ種の受容体を IFN-Rと呼ぶ。これは天然Ｉ型受容体に相当する。天然インターフェロンαを構成する蛋白質群を IFNαと呼び、Ｉ型 IFNは天然 IFNα，IFN ω及び IFNβに相当する。
インターフェロンが有効な抗ウイルス剤であるという事実にもかかわらず、上気道感染のような急性ウイルス疾患の多数の特徴的症状はインターフェロンアルファの過剰産生によって引き起こされることを示唆するかなりの証拠がある。さらに、 IFNアルファは実験動物におけるある種の慢性ウイルス感染の病因に関与することが示されており、有用な証拠は、これを麻疹ウイルスによるもののようなある種のヒト慢性ウイルス疾患に関する症例であることを示唆する。
【０００４】
インターフェロンαはさらにポリクローナルＢ細胞活性科を刺激し、NK細胞細胞毒性を増強し、Ｔ細胞機能を阻害し、そして多数の組織適合性複合体(MHC）１型抗原の発現を調節する有力な免疫調節分子であり、これらはすべて、自己免疫の誘発及び移植片拒否反応に関係する。インターフェロンαの異常産生は、多数の自己免疫疾患及び炎症性疾患を伴い、その例としては全身性エリテマトーデス(SLE）、Ｉ型糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び重傷複合型免疫不全が挙げられる。全身性エリテマトーデス患者の血清中のインターフェロンαの存在は、疾患活性増大の臨床的及び体液性徴候の両方に相関する。 HIVウイルス陽性被験者におけるインターフェロンαの産生は疾患進展をも高度に予測する。
インターフェロンαの投与は、乾癬及び多発性硬化症患者における根本的疾患を悪化させ、自己免疫疾患の既往症のない患者に SLE様症状を誘発することが報告されている。インターフェロンαはさらに正常マウスに糸球体腎炎を誘発し、 NZB／Ｗマウスの特発性自己免疫疾患の発症を促進することも示されている。
【０００５】
インターフェロンαはまた、全身性移植片対宿主疾患（GVHD）の特徴であるNK細胞活性増強と平行してGVDHの経過中に産生される。インターフェロンαはNK細胞細胞毒性の主要モジュレーターであって、インターフェロンαの投与は正常マウスのGVDHの小腸で生じる結果を増強することが示されている。
本発明の目的は、ヒトＩ型 IFNの生物学的活性に対する新規の拮抗薬を提供することである。これらの拮抗薬は、Ｉ型IFN (IFNα／β）が異常に産生され、この異常産生が病的症状を伴う場合の予防を含めた治療目的に用い得る。このような拮抗薬は種々の疾患の診断に、あるいはこのような疾患の進展の研究に用いることもできる。
このような拮抗薬を定義するために、本発明人は、ヒト天然Ｉ型 IFNが実際インターフェロン（亜種）の混合物で構成され、そして異なるサブタイプのインターフェロンのこの集まりの組成が量質ともに変化するという事実を考慮した。
【０００６】
Namalwa 細胞から分泌されるもの（Namalwa インターフェロン）又は白血球から分泌されるもの（白血球インターフェロン）といったようないくつかの天然インターフェロンは詳細に研究されており（N.B. Finter and K.H. Fautes, Interferon 2, 1980, P.65-79 I. Gresser Editor Academic Press ; K. Cantell et al., Interferon1, 1979 p.2-25, I. Gresser Academic Press)、天然Ｉ型インターフェロンを定義するために本発明人が用いた。
AIDSのようないくつかの病例において、何らかの特定の特性を有するインターフェロンが記載されている（O.T. Preble et al., Annals of New-York Academy of Science p.65-75)。このインターフェロンはAIDSのような病例に関与するが、にもかかわらず上記と同様の受容体と結合する。
【０００７】
本発明の一目的はヒトＩ型 IFNの生物学的特性を確定程度まで阻止又は中和し得る、言い換えればα，β，ω亜種の混合物をin vivoで中和し得るＩ型 IFNの拮抗薬を提供することである。
したがって、本発明人はＩ型 IFNに対する拮抗薬の有する特性を有する抗体、特にモノクローナル抗体を明確にした。これらの抗体はヒトＩ型 IFN受容体に対するものである。
本発明はしたがってＩ型 IFNの異常産生に伴う症状の治療に有用な製剤組成物の調製のためのモノクローナル抗体の使用に関する。これらのモノクローナル抗体は診断試薬の調製にも適している。
本発明のモノクローナル抗体はヒトＩ型インターフェロン受容体（IFN-R)に対するものであり、以下の：
−ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識し、
−ヒトＩ型 IFNの生物学的特性に対する中和能力を有する
という特性を特徴とする。
【０００８】
Ｉ型 IFNの生物学的特性を中和する能力は、Ｉ型 IFNの抗ウイルス活性を中和するモノクローナル抗体の能力の関数として概算し得る。このような試験は、検定される抗体が本発明の範囲内に含まれるか否かを確定するためには意味があるが、しかしＩ型 IFNの生物学的特性がその抗ウイルス特性に限定されるわけではないことは明らかである。抗ウイルス活性についてのこのような試験を実施できるようにするために、詳細な手順を実施例に示す。試験する細胞は有益には、Ｉ型 IFNに対する親和性が十分公知の Daudi細胞である。このような試験の主要工程は以下の：
−  確定濃度のヒトＩ型 IFNに反応するヒト細胞を、検定される確定濃度のモノクローナル抗体の存在下でヒトＩ型 IFNを用いて、モノクローナル抗体とヒト細胞の IFN-Rとの間、及び／又はＩ型 IFNとヒト細胞の IFN-Rとの間に複合体を生成させるのに十分な時間インキュベートし；
−  インキュベート化細胞を確定濃度の確定ウイルスに感染させ；
−  細胞を洗浄し；
−  細胞を培地中に再懸濁し；
−  ウイルスを複製させるのに十分な時間インキュベートし；
−  細胞を溶解し；
−  ウイルス複製を測定するか又は細胞変性作用の阻止を測定する
工程から成る。
【０００９】
ヒトＩ型 IFNの生物学的特性を中和する本発明のモノクローナル抗体の能力は、使用する抗体容量の関数として調節し得る。したがって、生物学的特性の 100％阻害又は部分阻害が得られる。
本発明の別の態様によれば、ヒトＩ型 IFN受容体に対するモノクローナル抗体はさらに、それらがヒトＩ型 IFNのヒト IFN-Rとの結合を阻止し得るという事実を特徴とする。
【００１０】
ヒト IFN-Rの細胞外ドメインを認識する能力を有する、そしてヒトＩ型 IFNのその受容体との結合を阻止し得るモノクローナル抗体は、以下の：
−   IFN-Rを保有できるヒトを用いて確定濃度の精製モノクローナル抗体又は検定されるモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を予インキュベートし；
−  標識化ヒトＩ型 IFNを確定濃度で上記予インキュベーション中培地に加え；
−ヒト細胞、モノクローナル抗体及び標識化Ｉ型 IFNを含有する培地を細胞性 IFN-Rを用いて一方ではモノクローナル抗体と他方ではＩ型 IFNとの間に平衡を生じさせるのに十分な時間インキュベートし；
−  細胞を洗浄し；
−  付着標識化Ｉ型 IFNの量を計数することによりヒト細胞と標識化Ｉ型 IFNとの間の結合複合体の生成を確定する
工程により選択し得る。
【００１１】
本発明のいくつかのモノクローナル抗体は、ヒトＩ型 IFNの抗増殖特性を中和する能力をも有する。この特性は、 Daudi細胞で以下の：
−  ヒト IFNの存在下で、且つ確定濃度の mABの存在下で細胞を増殖させ；
−  ヒトＩ型 IFNの抗増殖作用の阻止を検出するために細胞を計数する
工程を実行することにより検定し得る。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体の一特性は、ヒト IFN受容体の細胞外ドメインを認識するその能力にある。モノクローナル抗体のこの特性は天然ヒト受容体を保有するヒト細胞で検定し得るが、しかし原核細胞、例えば大腸菌で発現されるような組換え体 IFN-R又は哺乳類細胞、例えば CHO細胞のような真核細胞で発現されるような組換え体 IFN-Rの細胞外ドメインでも検定し得る。
【００１３】
この受容体は実際、それが原核又は真核細胞中に産生されるという事実によって、したがって翻訳後成熟が起きるか又は起きないという事実によって異なる特性を示し得る。本発明人はおもしろいことに、本発明のモノクローナル抗体の能力を評価するための、即ち細胞性 IFN-Rを認識するための関連した検定を哺乳類細胞で発現される組換え体受容体で実施し得るということを示した。実際、このような組換え体受容体は、その認識活性に関するかぎり、細胞性受容体と同様の特性を有する。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、完全受容体、図４〜５に示す受容体のアミノ酸配列を特徴とする特定のドメイン又はペプチドを含めた種々の形態の受容体に対して得られる。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば可溶性形態の受容体に対して調製し得る。可溶性形態の IFN-Rに対する水溶性ポリペプチドを図２に説明する。本発明によれば、可溶性形態の IFN-Rは身体中を循環し得るペプチド又はポリペプチドに相応する。
【００１５】
本発明の他のモノクローナル抗体は、図２〜３に説明したような受容体の細胞外ドメインに含まれるペプチドに対して調製してもよい。有益なペプチドは、例えばアミノ酸１とアミノ酸229 との間を構成するアミノ酸配列に相応する。本発明の別の態様によれば、 IFN-Rの非修飾化細胞外ドメインに対する抗体が修飾ポリペプチド又はペプチドを認識するとすれば、抗体は１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換により修飾されるポリペプチドに対して調製し得る。
【００１６】
本発明の好ましいモノクローナル抗体は、 IgG１型のものである。
本発明の抗体のうち、Ｉ型 IFNのその受容体との結合を阻止する能力を有する抗体は、 100μｇ／ml以下、好ましくは50μｇ／ml以下、有益には20μｇ／ml以下、さらに好ましくは約 0.5〜２μｇ／mlの抗体濃度でhu-IFN-Rを有する細胞と同時インキュベートされる場合、好ましくはヒトＩ型 IFNのヒト細胞性 IFN-Rとの結合をin vitro で阻止することを特徴とする。
本発明者は、モノクローナル抗体の高親和性結合能力が、この抗体がヒトＩ型 IFNの IFN-Rとの結合活性を阻害し得ることを保証するには十分でないことを示している。にもかかわらず、Ｉ型 IFNのその細胞性受容体との結合を阻止する抗体の能力をさらに調べるためには、モノクローナル抗体の高親和性結合能力が必要である。
別のモノクローナル抗体は、それが１〜10μｇ／mlの範囲の濃度で、このヒトＩ型 IFNに高度に反応する細胞、例えば Daudi細胞におけるヒトＩ型 IFNの抗増殖活性をin vitroで中和することを特徴とする。
別の態様によれば、モノクローナル抗体はさらに、ヒトＩ型 IFNの抗増殖活性をこのヒトＩ型 IFNにあまり反応しない細胞、例えばLy28細胞上で50〜100 μｇ／mlの範囲の濃度でin vitroに中和することを特徴とする。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体の特定の群は、ヒトＩ型 IFNの抗ウイルス活性を、このヒトＩ型 IFNに高度に反応する細胞、例えば Daudi 細胞において、国際標準 MRC69／19に関して１〜1000単位の範囲のＩ型 IFNの濃度に対して１〜50μｇ／ml、好ましくは１〜20μｇ／mlの範囲の濃度で、in vitroに中和することを特徴とする。
有益には、本発明のモノクローナル抗体は、これらの抗体が IFNγに対するヒト受容体と結合しないものである。
本発明の要件を満たすある特定の抗体は、図２に示すように、それがヒト IFN-Rの細胞外ドメインのアミノ酸27とアミノ酸427 との間を構成するアミノ酸配列上のエピトープに対して向けられるようなものである。
【００１８】
本発明の特に興味深い一モノクローナル抗体は、ｎ′92022605の下に1992年２月26日にECACC (European Collection of Animal Cell Cultures Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 056, United Kingdom)に寄託された 64G12と呼ばれる抗体である。
これらの抗体は、抗体が生成される抗原が IFN-Rの細胞外ドメインあるいはこのドメインのあらゆるポリペプチド又はペプチドで構成されるような条件で、骨髄腫細胞とペプチド抗原で予め免疫化した動物の脾臓細胞との融合によるハイブリドーマ細胞の調製を包含する慣用的方法により調製し得る。
ハイブリドーマは、KohlerとMilstein (Nature, 1974, 256 : 495-497)のプロトコールに従って構築する。例えば、ハイブリドーマは、上記の脾臓細胞と骨髄腫細胞としてNS１マウス（BalbC)HGPRT との融合から得られる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体の産生のための第二の手法は、 Epstein／Barrウイルスで不滅化した血液のＢ細胞と、モノクローナル抗体を生成することを決定する IFN-Rの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触させておいたヒトＢ型リンパ球との間の融合を実行することから成る。モノクローナル抗体を生成することを決定する IFN-Rの細胞外ドメイン又はその断片に予め接触させておいたＢ細胞は、抗原に接触させたin vitro培養により得られ、１回又は何サイクルかの刺激の後にこれらの抗原にコートされたＢ細胞の回収がなされる。
したがって本発明は、上記の特性を有する上記の手法を実行することにより得られるようなヒト抗体に関する。
本発明はさらに、そのＨ及び／又はＬ鎖の可変部又は相補的決定領域がヒト抗体のフレームワーク又は不変部に移植されることを特徴とするモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
本発明はさらに、上記のようなモノクローナル抗体を含有することを特徴とするヒトＩ型 IFNの生物学的特性に対する拮抗剤特性を有する組成物を提供する。
したがって、本発明は、上記のようなモノクローナル抗体を適切な製剤ビヒクルととにも含有することを特徴とする製剤組成物を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、Ｉ型 IFNの過剰産生に伴う病的状態及び症状の治療又は予防のための薬剤の製造のための上記のモノクローナル抗体の使用に関する。
第一の実施例によれば、抗体は同種移植片拒否反応の治療のために製剤組成物中に用い得る。
別の実施例によれば、本発明の抗体は自己免疫及び炎症性疾患の治療のための製剤組成物中の活性成分として用いられる。このような疾患の例としては、全身性エリテマトーデス、ｌ型糖尿病、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ベーチェット病、再生不良性貧血、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び重傷複合型免疫不全が挙げられる。
急性ウイルス疾患の治療も本発明の抗体を用いて実施し得る。上気道感染の例として、麻疹ウイルスによるもののような慢性ウイルス感染が挙げられる。
本発明の抗体は、ヒトＩ型 IFN受容体又は細胞の存在のin vitro診断にも用い得る。
以下の実施例及び図の説明により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１：
可溶性受容体の合成
大腸菌における合成
５個のヒスチジル残基をコードするエキストラシーケンスが終止コドン直前に導入されたヒト IFN-Rの細胞外ドメイン（アミノ酸27〜427)をコードする配列を含有する DNAの断片（図２〜３）を、発現ベクターPkk233-2中でクローン化した。ポリメラーゼ鎖反応(PCR）によりこの断片を生成し、その結果生じたプラスミドをシーケンシングしてShine-Dalgarno配列によるインフレーム挿入及び受容体をコードする適切な配列を確証した。
【００２２】
組換え体蛋白質に導入されるポリヒスチジル尾部は、前に記載されているように（Hochuli E. et al, Bio/technology, 1988, 1321-1325) 、キレート化ニッケル支持体(NTAカラム）上でのアフィニティークロマトグラフィーにより迅速にそれを精製させる。
プラスミドを大腸菌 JM105株に導入し、培地にIPTGをふかして蛋白質合成を誘発した（pKK233-2, tac プロモーター）。
細菌ペレットから蛋白質を抽出し、後述のようなアフィニティークロマトグラフィーにより可溶性受容体を均質に精製した。この手法は、還元条件下で 50kDa辺りに２つの帯として、そして非還元条件下では３つの帯として移動する蛋白質を生成した。異なる手法により得られた蛋白質の最大濃度は約20μｇ／mlであった。
ゲル電気泳動により検出された２つの蛋白質のＮ末端配列は、両蛋白質が受容体の予測断片であることを示した。
【００２３】
【表１】
2006089494.tif 000002
【００２４】
同一 PCRアプローチを用いて、我々は、発現ベクターpXMTに挿入されたＣ末端に付加的５−ヒスチジル残基を有する IFN-Rアミノ酸配列１〜427 をコードする発現ベクターをも構築した。挿入物の正確なヌクレオチド配列も確証した。
【００２５】
その結果生じたプラスミドを一過性発現のために電気穿孔によりCos ７細胞に導入し、アフィニティークロマトグラフィーにより、その後後述するようなモノＱ(Pharmacia）上でのイオン交換クロマトグラフィーにより組換え体蛋白質を精製して均質にした。
【００２６】
【表２】
2006089494.tif 000003
【００２７】
この精製により、Ｎ末端配列がリーダー配列のプロセッシングにおいて何らかの異質を伴う予測受容体配列に相応する 76kDa蛋白質が生じた。
【００２８】
実施例２：
Ｉ型インターフェロン受容体に対するモノクローナル抗体の産生
１）モノクローナル抗体の産生
大腸菌から又はCos ７細胞の培養上清から精製した組換え体可溶性インターフェロン（r sIFN-R）の注入によりマウスを免疫化した。先ずマウスに完全フロイントアジュバントに溶解した精製蛋白質を腹腔内及び皮下注射した。次いで、緩衝食塩溶液で希釈した精製蛋白質をマウスに週１回腹腔内注射した。組換え体蛋白質10μｇを毎回注射した。
４回目の注射の後、血液を採取し、特異的血清抗体の存在を組換え体受容体に対する ELISA及びウエスターンブロットにより調べた。次に最も強い反応体を計10μｇの抗体で二次免疫注射して、その半分を静脈内にそして半分を腹腔内に注入した。
【００２９】
２）細胞融合
追加免疫後４日目に、免疫化動物からの脾臓細胞を採取し、S. Fazekas 等（J. Immunol. Methods 35 : 1-32, 1980)が記載の方法に従ってNS１（マウス)(Balbc) HGPRT骨髄腫細胞と融合させた。手短に言えば、５×107 個の脾臓細胞をポリエチレングリコール溶液１mlに溶解した３×107 個の骨髄腫細胞と融合させて、 HAT（ヒポキサンチン、アミノプロテイン及びチミジン）中の腹膜マクロファージ支持細胞層上の５つの96ウエルプレート中に分布させた。この手順を４回繰り返して、免疫化マウスから20×107 個の脾臓細胞を得た。大型コロニーが培養ウエル中に検出された場合は、特異的ハイブリドーマに対するスクリーニングを試みた。
【００３０】
スクリーニングのためには、特異的抗体の存在を直接 ELISA法により測定した：
ａ）ELISA プレートを PBSに希釈した精製大腸菌発現性又はCos ７発現性sIFN-Rを用いて４℃で一夜コーティングした。 BSAでコーティングしたプレートを用いて非特異的結合を検出した。
ｂ）PBS に溶融した３％ BSAを用いて37℃で１時間インキュベートすることによりプレートを飽和させた。
ｃ） PBS−0.05％ Tween 20 を用いて４対１に希釈したハイブリドーマ上清を用いて室温で４時間プレートをインキュベートした。
ｄ）先ずヤギ抗マウスビオチニル化イムノグロブリンを用いて、その後ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（両方ともにAmershamより入手。 PBS−0.05％ Tween 20 で１／1000に希釈）を用いてインキュベートすることから成る２工程手法により結合抗体を検出した。
陽性抗体分泌ハイブリドーマを脾臓細胞支持細胞層上で24ウエルプレート中で継代接種して、それらの反応性を ELISA及びウエスターンブロットで再び点検した。
【００３１】
３）天然Ｉ型インターフェロン受容体に対する反応性の同定組換え体sIFN-Rを認識するモノクローナル抗体（mAbs）の反応性を、膜蛍光抗体法により Daudi細胞の表面に発現される天然Ｉ種受容体に対して調べた。手短に言えば、５×105 個の Daudi細胞を選択したハイブリドーマの培養上清 100μｌ中で４℃で30分インキュベートした。次に１％ BSAを含有するRPMI培地中で細胞を４回洗浄し、希釈FITC標識化ヤギ抗マウスＦ（ab′)2を用いて４℃で30分間さらにインキュベートした。洗浄後、流動細胞計測法により細胞を最後に分析した。大腸菌組換え体受容体に対して産生された35の試験抗体のうちの１つ、並びに Cos組換え体受容体に対して産生された６つの試験抗体のうち５つは、 Daudi細胞上の天然受容体を認識することが判明した。
次に、希釈を限定することにより、これらのハイブリドーマのクローニングを実行した。イソタイプ特異的抗体を用いた ELISA法により、これらのmAbsのイソタイプを確定した。６つのmAbsのすべてがカッパーＬ鎖を有する IgG１であることが分かった。これら６つのmAbsの反応性の要約を表１に示す。
モノクローナル抗体は蛋白質Ｇクロマトグラフィーにより培養上清から精製した。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
実施例３：
インターフェロンのヒト細胞株との結合の阻止
ヒト細胞と結合するインターフェロンの阻害を以下のように検定した。106 個の細胞を、ハイブリドーマ培養上清又は精製mAbsの種々の希釈液を用いて、又は培地のみを用いて４℃で30分予インキュベートした。 125Ｉ標識化 IFNアルファ８又はアルファ２を 100pMの濃度で加えて、細胞を４℃でさらに２時間インキュベートした。これらのインキュベーションは、20mM HEPES, pH7.4 及び10％ウシ胎仔血清(FCS）を含有するRPMI培地中で実施した。最後に細胞をRPMI−１％ FCSで４回洗浄し、計数して結合放射能を確定した。
ハイブリドーマ 64G12株が分泌したmAb (mAb 64G12) は、用量依存的に標識化 IFNの細胞との結合を阻止することが本検定において示された。 Daudi細胞との結合の50％阻止（Burkitt リンパ腫細胞；Klein et al., Cancer Research, 28 : 1300-1310, 1968)は、 0.4μｇ／mlの mAb濃度で得られた。同一の阻止はＫ562 細胞で得られた（慢性骨髄性白血病，Lozzio and Lozzio, Cell, 45 : 321-334, 1975)が、しかし50％阻止はHL60細胞（前骨髄細胞性白血病，Collins S.J. et al., Nature, 270 : 347-349, 1977）に関して11μｇ／mlで、Ly28細胞（Klein G. et al., Int. J. Cancer, 10 : 44-57, 1972)に関しては60μｇ／mlで得られた。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
125Ｉ標識化mAb 64G12 及び 34F10の同一細胞株との直接結合、並びにその結果のスキャッチャードプロット分析により、 IFNの結合の50％阻止が得られる mAb濃度の差異を直接調べた。 0.1〜1.5μｇ／mlの濃度範囲では、mAb 34F10 の高親和性結合が全細胞株で観察されたが、一方mAb 64G12 の高親和性結合は Daudi細胞及びＫ562 細胞で検出されただけであった（図１）。
【００３６】
実施例４：
Ｉ型インターフェロンの機能の阻止
組換え体 IFNアルファ２、 IFNベータ及び IFNオメガ、又は精製 Namalwa及び白血球インターフェロンを用いた Daudi細胞に関する抗ウイルス検定で、そして組換え体 IFNアルファを用いた抗増殖検定で、精製mAb 64G12 によるＩ型インターフェロンの機能的阻止を立証した。
【００３７】
＊抗ウイルス活性
記載（M. Dron and M.G. Tovey, J. Gen. Virol. 64 : 2641-2647,1983) 通りに Daudi細胞での抗ウイルス検定を実行した。細胞（0.5×106 ／ml）をインターフェロン及び抗体の存在下で24時間インキュベートした。次に１ml中106 個の細胞を水疱性口内炎ウイルス(VSV）に37℃で１時間感染させた後、３回洗浄して、培地に再懸濁し、37℃で18時間インキュベートした。次に凍結融解により細胞を溶解させて、Ｌ929 細胞での上清の滴定によりウイルス複製を測定した。Ｉ型 IFNの種々の亜型の抗ウイルス活性の用量依存性阻止を、精製mAb 64G12 に関して立証した。
Wish細胞を用いた抗ウイルス検定に関しては、 mAbの存在下で種々の濃度のインターフェロンを用いて細胞を24時間インキュベートした後、 VSVで試験した。この検定では、mAb 64G12 は白血球 IFN (50Ｕ／ml）、組換え体 IFNアルファ２（50Ｕ／ml）及びAIDS患者の血清からのインターフェロン（50，75及び 150Ｕ／ml）の抗ウイルス活性を完全に遮断することが立証された。
【００３８】
＊抗増殖活性
抗増殖検定に関しては、インターフェロン及び精製阻止又は制御抗体の存在下で96ウエルプレート中の１ml当り細胞105 個という濃度で Daudi細胞を植えつけた。次いで、24，48及び72時間後に Coulter計数器を用いて細胞を計数し、トリパンブルー排除試験により生存能力を点検した。精製mAb 64G12 は、インターフェロンアルファ２の抗増殖活性の用量依存性阻止を立証した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】126Ｉ標識化モノクローナル抗体 34F10及び 64G12の下記のものとの結合：  −    Ａ：Daudi 細胞  −    Ｂ：Ly28細胞。  手短に言えば、106 個の細胞を10％ウシ胎仔血清(FCS）を含有するRPMI培地中に希釈した種々の量の標識化抗体の存在下で４℃で２時間インキュベートした。次に細胞をRPMI−１％ FCSで４回洗浄し、結合放射能を計数した。 100倍過剰の冷却抗体を用いてインキュベートし、総計数から消去することにより非特異的結合を測定した。
【図２】ヒト IFN-Rの細胞外ドメインのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列。  モノクローナル抗体は、原核細胞（大腸菌）又は哺乳類細胞系（Cos 細胞）で合成されるヒトインターフェロンα−β受容体の組換え対可溶性形態に対して産生された。これらの可溶性形態は、図２に記載した DNA配列を基礎にしていた。
【図３】図２の続き。
【図４】ヒト IFN-Rのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列。
【図５】図４の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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