(57)【要約】【課題】  植物の脂溶性二次代謝産物のより簡便な生合成促進・効率的吸着回収方法を確立する。【解決手段】  植物細胞から産生される脂溶性フラボノイド類などの脂溶性二次代謝産物を回収するために、多孔性ポリウレタン樹脂の切断片からなる吸着材を用いる。植物細胞を培養する培地中へ前記吸着材を添加しておき、該切断片に前記植物細胞から産生される脂溶性二次代謝産物を吸着させる。そしてこの切断片を培地から取り出して、目的の脂溶性二次代謝産物を回収する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞から産生される脂溶性二次代謝産物を回収するための吸着材であって、多孔性ポリウレタン樹脂の切断片からなる植物二次代謝産物吸着材。
【請求項２】
前記多孔性ポリウレタン樹脂は、軟質性ポリウレタン樹脂であることを特徴とする請求項１記載の植物二次代謝産物吸着材。
【請求項３】
前記脂溶性二次代謝産物は、脂溶性フラボノイド類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の植物二次代謝産物吸着材。
【請求項４】
植物細胞を培養する培地中へ多孔性ポリウレタン樹脂の切断片を添加し、該切断片に前記植物細胞から産生される脂溶性二次代謝産物を吸着させて回収するようにした植物細胞二次代謝産物の回収方法。
【請求項５】
前記多孔性ポリウレタン樹脂は、軟質性ポリウレタン樹脂であることを特徴とする請求項４記載の植物細胞二次代謝産物の回収方法。
【請求項６】
前記脂溶性二次代謝産物は、脂溶性フラボノイド類であることを特徴とする請求項４又は５に記載の植物細胞二次代謝産物の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞から産生される二次代謝産物の回収技術に関する。より詳しくは、植物細胞の培養培地へ添加した多孔性ポリウレタン樹脂の切断片に、脂溶性フラボノイド類などの脂溶性二次代謝産物を吸着させて回収する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は様々な脂溶性二次代謝産物を生合成し、これを細胞外に蓄積している。これらの脂溶性二次代謝産物の多くは種々の生理活性を有しているため、医薬品製造原料や新薬開発におけるリード化合物として用いられている。
【０００３】
例えば、マメ科植物クララ（Sophora flavescens Aiton）が生産するプレニルフラボノイド類は、抗菌性、抗真菌性、抗ガン作用、抗酸化作用、抗不整脈作用、cAMP phosphatase活性阻害、phospholipase Cg1活性阻害、cyclooxygenaseおよびlipoxygenase活性阻害、tyrosinase活性阻害などを有することが報告されている。
【０００４】
具体的には、プレニルフラボノイド類の抗菌性については非特許文献１、抗真菌性については非特許文献２、抗ガン作用については非特許文献３、抗酸化作用については非特許文献４、抗不整脈作用については非特許文献５、免疫賦活作用については非特許文献６、抗AIDSウイルス作用については非特許文献７、cAMP phosphatase活性阻害については非特許文献８、phospholipaseCg1活性阻害については非特許文献９、cyclooxygenaseおよびlipoxygenase活性阻害については非特許文献１０、tyrosinase活性阻害については非特許文献１１に、それぞれ報告されている。その他、抗男性ホルモン作用、殺昆虫作用に関する報告もある。また、これらの生理活性の発現には、フラボノイド骨格へのプレニル側鎖の存在が重要であることも明らかにされつつある(非特許文献１２から１４)。
【０００５】
ここで、本願発明者らは、本願に先立って、前記プレニルフラボノイド類の効率的生産系の確立を目的として、クララ液内振盪培養細胞系におけるその生産について検討を行い、プレニルフラボノイドの一種であるsophoraflavanone G生産培養細胞系の確立、ならびに、市販されているコルクシートをこのクララ培養細胞系に添加することにより、sophoraflavanone G生産の増大、およびその大部分の添加したコルクシートからの効率的回収に成功している（非特許文献１５から１８）。
【非特許文献１】Yamaki, M., Asogawa, T., Kashihara, M., Ishiguro, K., Takagi, S. (1988) Shoyakugaku Zasshi 42, 153-155.
【非特許文献２】Yagi, A., Fukunaga, H., Okuzato, N., Mifuchi, I., Kawamoto, F. (1988) Shoyakugaku Zasshi 43, 343-347.
【非特許文献３】Miranda, C.L., Stevens, J.F., Helmrich, A., Henderson, M.C., Rodriguez, R.J., Yang, Y.H., Deinzer, M.L., Bames, D.W., Buhler, D.R. (1999) Food Chem. Toxicol.37, 271-285.
【非特許文献４】Pieta, P.G. (2000) J. Nat. Prod. 63, 1035-1039.
【非特許文献５】Zhang, B.H., Su, Y., Ma, L, Li, Q.H. (1979) Yao HsuehHsueh Bao 14, 449-454.
【非特許文献６】Iinuma, M., Tanaka, T., Sakakibara, N., Mizuno, M., Matsuda, H., Shiomoto, H., Kubo, M. (1990) Yakugaku Zasshi 110, 179-185.
【非特許文献７】Meragelman, K.M., McKee, T.C., Boyd, M.R. (2001) J. Nat. Prod. 64, 546-548.
【非特許文献８】Ohmoto, T., Aikawa, R., Nikaido, T., Sankawa, U., Wu, L.J., Ueno, A, Fukushima, S. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34, 2094-2099.
【非特許文献９】Lee, H.S., Ko, H.R., Ryu, S.Y., Oh, W.K., Kim, B.Y., Ahn, S.C., Mheen, T.I., Ahn, J.S. (1997) Planta Medica 63, 266-268.
【非特許文献１０】Chi, Y.S., Jong, H.G., Son, K.H., Chang, H.W., Kang, S.S., Kim, H.P. (2001) Biochemical Pharmacology 62, 1185-1191.
【非特許文献１１】Kim, S.J., Son, K.H., Chang, H.W., Kang, S.S., Kim, H.P. (2003) Biol. Pharm. Bull. 26, 1348-1350.
【非特許文献１２】Homans, A.L., Fuchs, A. (1970) J. Chromagr. 1, 327.
【非特許文献１３】Adensaya, S.A., O’Neill, M.J., Roberts, M.F. (1986) Physiol. Mol. Plant Pathol. 29, 95-103.
【非特許文献１４】Lane, G.A., Biggs, D.R., Russell, G.B., Sutherland, O.R.W., Williams, E.M., Maindonald, J.H., Donnell, D.J. (1985) J. Chem. Ecol. 11, 1713-1735.
【非特許文献１５】Yamamoto, H., Yamaguchi, M., Inoue, K. (1996) Phytochem. 43, 603-608.
【非特許文献１６】Yamamoto, H., Yatou, A., Yazaki, K., Hayashi, H., Taguchi, G., Inoue, K. (2001) Biosci. Biotech. Biochem.65, 853-860.
【非特許文献１７】Kirakosyan, A.B., Vardapetyan, R.R., Charchoglyan, A.G., Yamamoto, H., Hayashi, H., Inoue, K. (2001) Russian J Plant Physiol. 48, 816-819.
【非特許文献１８】Zhao, P., Iwamoto, Y., Kouno, I., Egami, Y. Yamamoto, H. (2004) Phytochem. 65, 2455-2461.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、植物の脂溶性二次代謝産物をできるだけ手間をかけずに効率よく回収することができる技術が求められている。特に、有用な生理活性を有している脂溶性フラボノイド類などの脂溶性二次代謝産物の効率的回収技術の開発ニーズが高まっている。
【０００７】
しかしながら、上記した従来技術例のように、コルクシートを用いて脂溶性フラボノイド類の生産を行った場合では、使用するコルクシートが天然由来の材料であることからさまざまな不純物を含んでいるので、これを除くための抽出洗浄操作が必要となり、手間がかかるという技術的課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、植物の脂溶性二次代謝産物のより簡便な生合成促進・効率的吸着回収方法を確立することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、「植物二次代謝産物吸着材」と「植物細胞二次代謝産物の回収方法」を提供する。
【００１０】
まず、本発明に係る植物二次代謝産物吸着材は、植物細胞から産生される脂溶性二次代謝産物を回収するための吸着材であって、多孔性ポリウレタン樹脂の切断片からなるものである。
【００１１】
次に、本発明に係る植植物細胞二次代謝産物の回収方法は、植物細胞を培養する培地中へ多孔性ポリウレタン樹脂の切断片を添加し、該切断片に前記植物細胞から産生される脂溶性二次代謝産物を吸着させて回収する方法である。
【００１２】
上記発明で用いる前記多孔性ポリウレタン樹脂は、軟質性のポリウレタン樹脂が特に好適であり、また、回収目的物となる前記脂溶性二次代謝産物は、特に限定はされないが、例えば、脂溶性フラボノイド類を挙げることができる。
【００１３】
ここで、本発明において、「植物二次代謝産物」とは、植物の細胞から産生される物質のうち、糖、アミノ酸、核酸、ＡＴＰ、リグニン、セルロースなどの細胞が生存するために必須となる物質である一次代謝産物に対し、この一次代謝系から派生し、生体(細胞)が生存するために必須ではないと考えられる物質である。一次代謝物は多くの生物にとって共通の化学成分であるのに対して、二次代謝物はそれぞれの生物にとって固有の産物であり、従前から人類が薬などに利用してきた植物の薬効成分はいずれも二次代謝物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、植物の脂溶性二次代謝産物を、より簡便かつ確実に、生合成促進・効率的吸着回収を行うことができる。
【実施例】
【００１５】
＜材料および方法＞。
【００１６】
１．クララ培養細胞系。
クララ培養細胞系は、クララ実生より１μＭ２，４‐Ｄ、１μＭキネチン（kinetin）および３%スクロースを含む０．３％gellan gumで固化させたＭＳ培地上で、暗黒下２５℃で誘導されたカルスを、１０年以上１ヶ月毎に同一培地で継代維持されたものを使用した。
【００１７】
２．液体振盪培養細胞系。
液体振盪培養細胞系は、上記カルス約１ｇを、同一植物ホルモンを含むＭＳ液体培地（２０ｍｌ／１００ｍｌ三角フラスコ）に移植し、暗黒下２２−２６℃、１００ｒｐｍで振盪培養を行うことにより確立した。細胞は、培地２０ｍｌあたり約０．５−１．０ｇを移植し、二週間毎に同一培地にて継代培養した。
【００１８】
＜試料の準備及び調製＞。
【００１９】
１．培地。
１μＭ２，４−Ｄ、１μＭキネチン（kinetin）及び３％スクロースを含むＭＳ液体培地(ｐＨ６．４)２０ｍｌを基本とし、種々の添加物を加えたものを培地として用いた。
【００２０】
２．吸着材。
吸着材は、細胞外へ産生された物質を吸着させるために用いる材料である。まず、比較例となる吸着材として、市販のコルクシート（厚さ２ｍｍ）を５ｍｍ×５ｍｍ四方に切断したものを準備し、これをクロロホルム、メタノール（ＭｅＯＨ）および熱水で、順次、それぞれ抽出液の色が観察されなくなるまで抽出洗浄し、５０℃で一晩乾燥させたものを用いた。
【００２１】
これに対して、ポリウレタンスポンジＡ（株式会社オーエ社製）、ポリウレタンスポンジＢ（株式会社ウィルソン社製）、ポリウレタンスポンジＣ（ソフト99コーポレーション社製）、メラミンフォーム製スポンジ（レック株式会社製）、ポリエチレンスポンジ（株式会社オーエ製のニチレンスポンジのポリエチレン部を使用）、抗菌加工セルローススポンジ（株式会社シジシージャパン社製）をそれぞれ５×５×２ｍｍのサイズに切断したものを準備した。なお、図１は、コルクシート、ポリウレタンスポンジＡ、Ｂ、Ｃを切断して得られた吸着材の様子（培養前の様子）を示す図面代用写真である。
【００２２】
また、本実験では、硬質ポリウレタンフォームを切断加工した吸着材を用いて検証を行った。この吸着材は、Flexible Products Co. (USA)のポリウレタンフォーム合成キット「インサルパックＨＹＰＥＲ＃３０」によって調製後、５ｍｍ×５ｍｍ×２ｍｍのサイズに切断した。
【００２３】
これらの吸着材は、培地２０ｍｌあたりそれぞれ５個をオートクレーブ前に添加した。硬質ポリウレタンフォームの脱気処理は、培地に添加、オートクレーブ後、デシケーター内で水流ポンプを用いて、２０分間ずつ３回減圧処理することによって行った。硬質ポリウレタンフォーム粉末は、調製したものをブレンダーで粉砕することによって行った。軟質ポリウレタンフォームの粉末は、ポリウレタンスポンジＡに少量の水を含ませ、液体窒素に凍結させた後粉砕器で粉砕後、５０℃で一晩乾燥させることにより調製した。
【００２４】
ウレタンは、最終濃度の１０倍濃度の水溶液を調製し、メンブランフィルターで濾過滅菌オートクレーブした後培地に２ｍｌずつ添加した。ポリウレタン製造用モノマーであるポリオールおよびシアネートは、上記ポリウレタンフォーム合成キット「インサルパックＨＹＰＥＲ＃３０」よりそれぞれを混和する前に回収することによって入手し、これを最終濃度の１０００倍となるようＤＭＳＯに溶解し、濾過滅菌後オートクレーブした培地に２０μｌずつ添加した。
【００２５】
＜培養方法＞。
【００２６】
上記した培地に、二週間培養した細胞を０．５ｇずつ移植し、暗黒下で２４℃、１００ｒｐｍで二週間振盪培養した後に収穫した。なお、各試験区における検体数はそれぞれ三本とした。
【００２７】
＜プレニルフラボノイドの抽出および定量＞。
【００２８】
添加したコルクシートおよび吸着材の切断片をピンセットにより培養器より取り出した後、培養細胞を吸引濾過により収穫し、それぞれにメタノール（MeOH ）１０ｍｌを加え、室温で９０分間超音波処理を行うことによって抽出し、得られた溶液に内部標準として1-naphthaleneacetic acid溶液(0.5 mg/ml MeOH) 1mlを加え混和した後、8000×（掛ける） gで5分間遠心することにより沈殿を除き、その上清２０ｍｌをＨＰＬＣ分析試料とした。粉末を投与した場合は、細胞との分離が不可能なため、併せて収穫し抽出、定量した。
【００２９】
プレニルフラボノイドの含量は下記の「表１」に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件により分析し、得られたクロマトグラムより、各化合物および内部標準のピークエリアを算出し、内部標準法により計算した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
＜結果および考察＞。
【００３２】
以下、添付した図面を参照しながら、本実施例に係わる実験結果の説明と考察を行う。
【００３３】
図２は、クララ培養細胞系にコルク（コルクシート）を添加した対照区と、ポリウレタン（フォーム）Ａ、メラミン（フォーム）、ポリエチレン、抗菌加工セルロースからなる各スポンジを吸着材として添加した各実験区におけるフラボノイド生産量を示す図面代用グラフである。なお、図２中のコントロール（control）区は、培地へ吸着材を全く添加しなかった実験区を示している。
【００３４】
この図２に示された結果からわかるように、クララ培養細胞系にコルクを添加した場合では、細胞生長にはほとんど影響がなく、次の化学式１〜４に示すような脂溶性フラボノイドの生産が約３-５倍まで増加し、その７０％以上が添加したコルクシートから回収されることがわかった。また、今回使用したスポンジ吸着材の中では、ポリウレタン製のもの（ポリウレタンＡ）にのみ、コルクシートと同等、もしくはそれ以上の生産促進・吸着現象を確認することができた（図２参照）。
【００３５】
なお、化学式１はleachianoneG(以下、略記「ＬＧ」)、化学式２はsophoraflavanone G（以下、略記「ＳＦＧ」）、化学式３はlehmanin（以下、略記ＬＥＨ）、化学式４はlupalbigenin（以下、略記ＬＵＰ）の化学構造をそれぞれ示している。
【００３６】
【化１】
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【００３７】
【化２】
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【００３８】
【化３】
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【００３９】
【化４】
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【００４０】
クララ培養細胞は、脂溶性フラボノイドとしてＳＦＧ以外に、ＬＧ、ＬＥＨ、ＬＵＰを生産するが、ポリウレタンスポンジＡを添加した場合では、いずれもその生産性が顕著に増加し、その大部分がポリウレタンスポンジから回収することができ、一方細胞中のこれらの含量は何も添加していない場合よりも減少していた。
【００４１】
また、ポリウレタンスポンジＡを添加した場合の細胞生長阻害はほとんど観察されず、この細胞のみを引き続いて継代増殖させることが可能であった。一方、メラミン樹脂製スポンジやポリエチレンスポンジの場合は、これらの化合物はスポンジにはほとんど吸着されず、また、細胞中に残存した量もコントロール実験区とほとんど変わらなかった（図２参照）。
【００４２】
この培養細胞は、上述した脂溶性フラボノイド以外に、水溶性フラボノイドである次の化学式５に示すtrifolirhizin 6'-O-malonate（以下、略記ＴＭ）を生合成し、細胞内に蓄積している。コルクシートから得られた吸着材を添加した場合では、前記ＴＭの含量はほとんど増加しなかったが、ポリウレタンスポンジを添加した場合はその含量も増加していた（図２参照）。
【００４３】
【化５】
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【００４４】
また、抗菌加工セルローススポンジを添加した場合は、細胞が枯死し、化合物もほとんど生産されなかった（図２参照）。なお、通常のセルロース（粉末）を投与した場合、細胞生長ならびに化合物生産にはほとんど影響が認められないことはすでに確認報告済みである（Yamamoto, H., Yamaguchi, M., Inoue, K. (1996) Phytochem. 43, 603-608）。
【００４５】
次に培養後の吸着材の状態を示す図面代用写真である図３に示すように、多孔性であるポリウレタンスポンジＡは、その孔の口径サイズが比較的大きいことから、スポンジ内への細胞の侵入ならびに内部での増殖が観察された。
【００４６】
そこで、クララ培養細胞における脂溶性フラボノイドの生産促進現象が、吸着材への固定化現象によって生じていることも考えられるので、これを明らかにするために、孔サイズの異にする、製造メーカーの異なる上記ポリウレタンスポンジＢ、Ｃを用いて、比較検証実験を行った。なお、ポリウレタンＡの孔サイズは、平均０．３８２ｍｍ（最小０．２１２−最大０．６４８ｍｍ）、ポリウレタンＢの孔サイズは、平均０．２８２ｍｍ（最小０．１６０−最大０．４６４ｍｍ）、ポリウレタンＣの孔サイズは、平均０．１５３ｍｍ（最小０．０．０７２-最大０．２６８）である。
【００４７】
図４は、前記比較検証実験の結果を示す図面代用グラフである。この図４に示された結果から明らかなように、孔の口径が大きいポリウレタンスポンジＡでは、細胞の内部への侵入生長が顕著であり、２週間培養後、スポンジは膨潤し、基材本来の色である青色は増殖した細胞のために、ほとんど視認できなかった。
【００４８】
しかし、ポリウレタンスポンジＢからＣへ孔サイズが小さくなるに従って、スポンジ基材への細胞の侵入は減少し、ポリウレタンスポンジＣでは、細胞の侵入は肉眼ではほとんど観察されなかった。
【００４９】
一方、脂溶性フラボノイドの生産は、ポリウレタンスポンジＡ、Ｂ、Ｃを用いたいずれの実験区でも顕著に増加し、またその大部分がポリウレタンスポンジから回収することができた（図４参照）。
【００５０】
次に、ポリウレタンスポンジＡを凍結粉砕することによって、その多孔構造を破壊した粉末を培地へ投与した場合も、これらの化合物の生産は顕著に増加した（図４の最右欄に示す実験区のグラフ参照）。
【００５１】
この結果から、ポリウレタンスポンジの添加による脂溶性フラボノイドの生産促進現象は、スポンジ内部への侵入した細胞の増殖により誘引されるものとは明らかに異なることが示された。
【００５２】
一方、ウレタンを培養細胞に投与した場合（図５参照）やポリウレタン合成に使用されるモノマーであるシアネート、ポリオール化合物のそれぞれを培養細胞に投与した場合（図６参照）、これらのいずれの場合もＳＦＧ生産にはほとんど影響は認められなかった（図６参照）。
【００５３】
これらの結果から、ポリマーであるポリウレタンスポンジの多孔構造が産生された脂溶性フラボノイドの吸着に大きく寄与し、これにより、細胞からの脂溶性フラボノイドの連続産生が行われていることが推定できた。
【００５４】
次に、断熱剤などとして一般に使用されている硬質ポリウレタンフォーム（Hard polyurethane）を吸着材材料として用いた場合では、軟質ポリウレタンフォーム（Soft polyurethane）を用いた場合に比較すると、ＳＦＧなど脂溶性フラボノイドの生産促進・吸着効果は認められなかった(図７参照)。このことから、軟質ポリウレタンフォームにクララ培養細胞における脂溶性プレニルフラボノイドの生産促進・吸着効果があることが確認された。
【００５５】
なお、このポリウレタンスポンジの添加による脂溶性化合物の生産促進現象は、クララ培養細胞だけではなく、脂溶性ホモイソフラボノイドを生合成するマメ科植物のCaessalpinia pulcherrima培養細胞系でも同様に観察された（図８参照）。
【００５６】
軟質ポリウレタンフォームを培養系へ添加することによって、プレニルフラボノイドやホモイソフラボノイドなどの脂溶性二次代謝産物の生産が促進された詳しい理由は、今後の検討課題であるが、ポリウレタンファームの構成モノマーであるポリオールやシアネート、および両化合物の二量体であるウレタンに脂溶性二次代謝産物生産誘導効果が認められなかったことから（図６参照）、ポリウレタンフォーム構成高分子がこれらの生合成酵素活性を誘導したとは考えにくい。
【００５７】
クララ培養細胞は、通常の培養条件ではプレニルフラボノイドが細胞壁に蓄積しているが、ポリウレタンフォームを添加した場合では、これらの脂溶性化合物は容易にポリウレタンフォームに吸着される。従って、細胞壁、さらには細胞内部における生合成の場から、これらの化合物が効率的に取り除かれることとなり、プレニルフラボノイドによるフィードバック阻害による生合成調節が回避されてその生産性が向上したと考えるのが妥当である。
【００５８】
植物液内振盪培養系へ、吸着剤を添加することにより脂溶性二次代謝産物を回収しようとする試みは、ムラサキ（Lithosprermum erythrorhizon）培養細胞における流動パラフィンの添加によるシコニンの回収（Deno, H., Suga, C., Morimoto, T., Fujita, Y. (1987) Plant Cell Rep. 4, 197-199）や化学工業用イオン吸着樹脂を用いた例などが既に報告されている。しかし、これらの方法では、培養容器から粘度が極めて高い流動パラフィンや粒子径が小さい吸着剤の回収は困難であり、実用的であるとは言えない。
【００５９】
一方、今回開発した方法では、培地へ添加するポリウレタンスポンジの切断片のサイズが大きいことから、ピンセット等で容易に培養容器から回収することが可能であり、また、ポリウレタンスポンジも非常に安価で製造・供給されていることから、コスト面でもメリットが大きい。
【００６０】
また、一般に植物培養細胞系による有用物質生産においては、細胞を収穫し、これより化合物を抽出精製するという操作を行う。従って化合物生産用の細胞と継代用の細胞の２系統を常に準備しておく必要があり、そのための操作、培養装置などを別に用意する必要がある。
【００６１】
吸着材としてポリウレタンスポンジの切断片を使用した場合、細胞が生産した脂溶性化合物の大部分はこの切断片から回収でき、一方、容器内の培養細胞は、通常の培養条件下と同様にそのまま継代・増殖させることが可能であるので、生産用、継代用の２系統の細胞を準備する必要がないというメリットがある。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、植物組織培養系による有用脂溶性二次代謝産物の効率的生産の実用化に大きく貢献する。例えば、植物細胞からの脂溶性フラボノイド類の効率的生産に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実施例に係わる実験で用いた吸着材の培養前の様子を示す図面代用写真である。
【図２】吸着材を用いた場合のクララ培養細胞におけるフラボノイド生産の結果を示す図面代用グラフである。
【図３】実施例に係わる実験で用いた吸着材の培養後の様子を示す図面代用写真である。
【図４】孔サイズが異なるポリウレタンスポンジ（Ａ、Ｂ、Ｃ）のフラボノイド吸着量の差異を示す図面代用グラフである。
【図５】ウレタンのフラボノイド生産性への影響を検証した実験結果を示す図面代用グラフである。
【図６】ポリウレタンを構成するポリオールとシアネートのフラボノイド生産への影響を検証した実験結果を示す図面代用グラフである。
【図７】軟質および硬質ポリウレタンフォーム（吸着材）のフラボノイド生産への影響を検証した実験結果を示す図面代用グラフである。
【図８】マメ科植物のCaessalpinia pulcherrima培養細胞系におけるホモイソフラボノイド生産に対する軟質ポリウレタンフォームＡの影響を検証した実験結果を示す図面代用グラフである。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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