(57)【要約】【課題】  ＰＣＲ全サイクルにおいて、ＲｅｃＡを活性化し、その生物学的機能を維持できる方法の提供。ひいては、より特異的かつ効率的に非特異的な増幅を抑制して所望の核酸のみを増幅できる核酸増幅方法並びに核酸増幅用キットの提供。【解決手段】  高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質存在下で行われるポリメラーゼ連鎖反応において、ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸はデオキシヌクレオチド５´−三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）を添加して反応を行うことによって、ＲｅｃＡタンパク質を活性化するポリメラーゼ連鎖反応中における高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の活性化方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質存在下で行われるポリメラーゼ連鎖反応において、
ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸はデオキシヌクレオチド５´−三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）を添加して反応を行うことによって前記ＲｅｃＡタンパク質を活性化する、ポリメラーゼ連鎖反応中における高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の活性化方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択される請求項１に記載の活性化方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸である請求項２に記載の活性化方法。
【請求項４】
前記高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の活性化方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応を、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質およびヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸は、デオキシヌクレオチド５´三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）の存在下で行なうことにより標的核酸を増幅する核酸増幅方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択される請求項５に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸である請求項６に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質である請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記標的核酸が阻止的または抑制的２次構造の区域を有する請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応である請求項５〜９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の核酸増幅方法によって増幅された増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出する、一塩基多型の検出方法。
【請求項１２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド５´−三リン酸、
高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質と、
ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸は、デオキシヌクレオチド５´三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）と、を含む核酸を増幅するための核酸増幅用キット。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択される請求項１２に記載の核酸増幅用キット。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸である請求項１３に記載の核酸増幅用キット。
【請求項１５】
前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質である請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の核酸増幅用キット。
【請求項１６】
前記核酸の増幅がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応に基づく請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増幅反応における高度好熱菌由来タンパク質の活性化方法並びに、それを利用した核酸増幅方法および核酸増幅用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略する場合がある。）は、目標とする特定のＤＮＡ領域を短時間で１０万倍以上に増幅できる画期的な技術である。しかしながら、その反応を最適化することは難しい。つまり、プライマーが標的配列以外にアニールする、あるいはプライマー同士がアニールする等のミスプライミングに起因する非特異的な増幅が生じることが問題となっているからである。そこで、標的ＤＮＡを特異的に増幅できる技術の確立が求められているが、そのためには、ＰＣＲサイクルの各段階でミスプライミングがおこらないようにＰＣＲをコントロールする必要がある。
【０００３】
そこでヌクレオチド５´−三リン酸、非特異的増幅を起こりにくくするための方法としてホット・スタート（hot start）法が知られている。かかる方法はアニーリング温度以上になるまで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行わないようにするものである。具体的は、ＤＮＡポリメラーゼに抗体を結合させ活性を阻害する等の方法によって行われる。
【０００４】
また、最近になって、本発明者らは、高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質（以下、単に「ＲｅｃＡ」と称する場合がある。）が、鋳型やプライマーと相互作用して特定の鋳型配列にのみプライマーの結合を促進でき、それにより、ミスプライミングを抑制できることを報告した（例えば、特許文献１を参照のこと。）。上述のホット・スタート法では、そこで働いている抗体タンパクはＰＣＲの最初の加熱サイクルで変性し失活する。しかしながら、ＲｅｃＡはＰＣＲの全サイクルを通して活性を失わずにミスプライミングを抑制し、特異的なＰＣＲ産物のみの増幅を可能とした。
【０００５】
ここで、ＲｅｃＡとは、単鎖核酸に協同的に結合し、該単鎖核酸と二本鎖核酸との間で相同領域を検索し、核酸の相同組換えを行うタンパク質である。ＲｅｃＡについては大腸菌について種々の研究がなされている（例えば非特許文献１、２を参照のこと。）。例えば、ＲｅｃＡは、その鎖置換活性のためにＡＴＰ又はｄＡＴＰを要求し、ＲｅｃＡとＤＮＡとの強固な複合体の形成を必要とすることが報告されている。さらに、アデノシン５´−Ｏ−３−チオ三リン酸がＲｅｃＡの鎖置換活性に影響を与え、かかるヌクレオチドのγ位における化学基とタンパク質との接触がＲｅｃＡ−ＤＮＡ複合体の安定性に影響を与えることも報告されている。
【０００６】
しかしながら、これらはすべて大腸菌由来ＲｅｃＡに関するものであり、本発明者らが報告した上述のＰＣＲ技術において使用される高度好熱菌由来のＲｅｃＡについての研究報告が殆ど無いのが現状である。また、高度好熱菌由来のＲｅｃＡと大腸菌由来のＲｅｃＡは、その性質、例えば、変性剤に対する耐性、耐熱性、耐ｐＨ性、アミノ酸配列等は著しく相違する。したがって、大腸菌由来のＲｅｃＡに関する技術をそのまま高度好熱菌由来のＲｅｃＡに適用する事はできなかった。
【０００７】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ  ２００４／０２７０６０
【非特許文献１】Watanabe R.等著、Ｉnteraction of Escherichia coli RecA protein with ATP and its analogues.（ＡＴＰとそのアナログと、大腸菌ＲｅｃＡとの相互作用）J Biochem. 1994年11月、第116巻、第5号、第960-966頁
【非特許文献２】Ellouze C.等著、Difference between active and inactive nucleotide cofactors in the effect on the DNA binding and the helical structure of RecA filament dissociation of RecA-DNA complex by inactive nucleotides.（ＤＮＡ結合に対する、活性および不活性なヌクレオチドコファクター間の相違および不活性ヌクレオチドによるＲｅｃＡ−ＤＮＡ複合体のＲｅｃＡフィラメント解離の螺旋構造）Eur J Biochem. 1999年５月、第262巻、第１号、第88-94頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＰＣＲは高温下での熱変性を繰り返し、また、アニーリング温度が高いため、高度好熱菌由来のＲｅｃＡであっても耐熱性が充分ではない。そして、本発明者らの以前報告した上述の発明においても、ＰＣＲの初期でＲｅｃＡの有する生物学的機能が低下し、サイクルを経る毎に徐々に非特異的増幅が生じることが判明した。また同時に、ＲｅｃＡはＰＣＲ反応液によっても、その生物学的機能が低下することが判明した。その結果、特に、ＰＣＲサイクルの後期段階でミスプライミングが起こり非特異的な増幅が生じていた。したがって、ＰＣＲの各段階において更に適切にＰＣＲを制御できる技術の確立が依然として求められていた。
そこで、本発明は以上の実情を鑑みて、本発明者らの以前の方法を改良し、ＰＣＲ全サイクルにおいて、ＲｅｃＡを活性化し、その生物学的機能を維持できる方法を提供することを目的とする。ひいては、かかるＲｅｃＡの生物学的機能の維持することで、より特異的かつ効率的に非特異的な増幅を抑制して所望の核酸のみを増幅できる核酸増幅方法並びに核酸増幅用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、ＲｅｃＡに加えてＮＴＰの存在下でＰＣＲを行なうことで非特異的結合を効果的に抑制でき、所望の核酸のみを特異的に増幅できるとの知見を得た。更に鋭意研究を行ったところ、ＮＴＰの存在により、ＰＣＲ中においてＲｅｃＡは活性化されて、その生物学的機能を良好に保持できるとの知見を得た。これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため本発明は、高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質存在下で行われるポリメラーゼ連鎖反応において、
ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸はデオキシヌクレオチド５´−三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）を添加して反応を行うことによって前記ＲｅｃＡタンパク質を活性化する、ポリメラーゼ連鎖反応中における高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の活性化方法を提供する。
そして、好ましくは前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択され、特に好ましくは、前記ヌクレオチド５´−三リン酸がアデノシン５´−三リン酸である。
更に、前記高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質であることが好ましい。
【００１１】
また、上記目的を達成するため本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質およびヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸は、デオキシヌクレオチド５´三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）の存在下で行なうことにより標的核酸を増幅する核酸増幅方法を提供する。
そして、好ましくは、前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択され、更に好ましくは、前記ヌクレオチド５´−三リン酸がアデノシン５´−三リン酸である。
【００１２】
また、好ましくは、前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質であり、
好ましくは、前記標的核酸が阻止的または抑制的２次構造の区域を有する。
【００１３】
更に、前記ポリメラーゼ連鎖反応がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応であることが好ましい。
【００１４】
そして、上記目的を達成するため本発明は、上述した本発明の核酸増幅方法によって増幅された増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出する、一塩基多型の検出方法を提供する。
【００１５】
また、上記目的を達成するため本発明は核酸増幅用キットを提供する。本発明の核酸増幅用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド５´−三リン酸、
高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質と、
ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸は、デオキシヌクレオチド５´三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）と、を有する核酸増幅用キットである。
そして、好ましくは、前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸およびシチジン５´−三リン酸からなる群から選択され、特に好ましくは、前記ヌクレオチド５´−三リン酸が、アデノシン５´−三リン酸である。
更に、前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＲｅｃＡタンパク質であることが好ましい。
【００１６】
そして、前記核酸増幅がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応に基づくものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のポリメラーゼ連鎖反応中における高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の活性化方法により、高度好熱菌由来ＲｅｃＡをＰＣＲの全サイクルにおいて、その生物学的機能が活性化され更にその活性を良好に保持することが可能となった。その結果、ＰＣＲ中でＲｅｃＡがその生物学的機能を効果的に発揮しミスプライミングをより効果的に抑制する。それにより、より効率的かつ特異的な核酸増幅が可能となった。
したがって、上述した本発明の活性方法を利用する本発明の核酸増幅方法により、ミスプライミングをより効果的に抑制することができ、その結果、非特異的な増幅を抑制することが可能となる。その結果、より効率的かつ特異的な核酸増幅が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００１９】
本発明は、高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下で行われるＰＣＲ中において、前記ＲｅｃＡを活性化する方法を提供する。活性化は、ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸はデオキシヌクレオチド５´−三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）を添加して反応を行うことによって行なわれる。本明細書おいて使用される「ＲｅｃＡの活性化」とは、ＲｅｃＡの安定性が向上し、ＲｅｃＡの有する生物学的機能を十分に発揮できる状態に維持されてあることを意味する。また、以下の本明細書中「ヌクレオチド５´−三リン酸」との文言には特に注記がない場合には、デオキシヌクレオチド５´−三リン酸およびヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸を含まないものであるとする。また、以下の本明細書中、ヌクレオチド５´−三リン酸は「ＮＴＰ」と略する場合がある。また、デオキシヌクレオチド５´−三リン酸は「ｄＮＴＰ」と略する場合があり、ヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸は「ＮＴＰγＳ」と略する場合がある。
【００２０】
ここで、ＰＣＲについて説明する。ＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて連鎖反応的にＤＮＡを増幅する方法である。そしてＰＣＲの原理は、プライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、３段階の温度変化をｎサイクル繰り返すことにより増幅対象核酸（以下、標的核酸と略する場合がある。）を２ｎ倍に増幅するものである。
【００２１】
本発明においてＰＣＲ反応液は、ＮＴＰとＲｅｃＡ存在の下、標的ＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰ、並びに適当な緩衝液を含んで調製される。ここで、プライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰは必要に応じて検出のため適当な標識物質により標識していても良い。このような標識物質は公知であるので当業者は適宜選択して使用できる。
【００２２】
ここで、ＲｅｃＡとは、単鎖核酸に協同的に結合し、該単鎖核酸と二本鎖核酸との間で相同領域を検索し、核酸の相同組換えを行うタンパク質である。本発明において使用されるＲｅｃＡは、高度好熱菌由来タンパク質である。本発明の使用に適したＲｅｃＡとしては、サーマス（Thermus）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）属、サーモトーガ（Thermotoga）属等由来のＲｅｃＡが例示される。具体的には、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＲｅｃＡが例示される。特に、好ましくは、サーマス・サーモフィラス由来である。
【００２３】
これらのＲｅｃＡは、天然由来のＲｅｃＡの他、化学合成的もしくは遺伝子工学的に人工的に合成されたＲｅｃＡも包含する。具体的には、常法に従って、高度好熱菌から抽出したものを利用することができる。更に、既知の大腸菌等の宿主・発現ベクター系を利用して、容易に精製することができる。例えば、当該ＲｅｃＡをコードする遺伝子を公知の方法により導入した発現ベクターにより宿主である大腸菌を形質転換して培養し、当該ＲｅｃＡを発現させる。そして、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＲｅｃＡ以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＲｅｃＡを可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００２４】
このとき、当該ＲｅｃＡは高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
【００２５】
尚、宿主細胞は大腸菌に限らず、例えば、酵母（Saccharomyces cerevisiae）や昆虫（Ｓｆ９細胞）などの真核生物細胞を利用することが可能である。また、発現ベクターは、プロモーター配列、高度好熱菌のＲｅｃＡをコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
【００２６】
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されない。例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、及び、ネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能である。さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００２７】
更に、上記したようなＲｅｃＡと類似の構造を有し、かつ、機能的に同等なタンパク質をも含む。したがって、自然界に存在するＲｅｃＡ類似タンパク質の他、人為的な変異誘発または遺伝子組換えにより改変されたタンパク質をも含むことが意図される。例えば、上記した天然由来のＲｅｃＡのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記したＲｅｃＡと生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の生物学的機能が維持される限り制限されない。
【００２８】
ここで、アミノ酸配列に対する改変は、改変しようとするアミノ酸配列に部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10、pp6487、1982年）等の公知の変異操作手段を用いて人工的に行うことができる。更には、自然界におけるアミノ酸の変異によって生じた改変体をも含む。
【００２９】
ＮＴＰとは、核酸残基がＤ−リボフラノースの１位にβグルコシド結合したヌクレオチドのリボースの５位ヒドロキシル基に３分子のリン酸が連続してエステル結合したものである。アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸、シチジン５´−三リン酸が好ましく例示される。ただし、本発明の使用においては、ＮＴＰには、ｄＮＴＰを含めるものではない。したがって、デオキシアデノシン５´−三リン酸、デオキシチミジン５´−三リン酸、デオキシグアノシン５´−三リン酸、デオキシシチジン５´−三リン酸は本発明への適用を除外する。更に、ＮＴＰの非加水分解性アナログであるヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸も、同様に本発明への適用を除外する。したがって、そのような適応除外となるアナログとしては、アデノシン５´−三リン酸のアナログであるアデノシン５´−Ｏ−３−チオ三リン酸等が挙げられる。
【００３０】
ここで、大腸菌ＲｅｃＡについて知見を示す上述の非特許文献１、２等において検討されている通り、ヌクレオチド類のＲｅｃＡの機能に与える影響は様々である。同様に高度好熱菌由来ＲｅｃＡに関してもヌクレオチド類のＲｅｃＡの機能に与える影響は様々であるものと推定され、それを経験的に推測する事はできない。また、本発明は、基質としてＰＣＲ中に合成核酸に取り込まれて消費されるｄＮＴＰに加え、更にＮＴＰを添加することによってＲｅｃＡを効果的に活性化するものである。また、ＡＴＰγＳ等の非加水分解性のＮＴＰγＳは、効率的な核酸増幅の観点から本発明の使用に適するものではない。
【００３１】
ここで以下の本明細書中においては、アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸、シチジン５´−三リン酸を夫々、「ＡＴＰ」、「ＵＴＰ」、「ＧＴＰ」、「ＣＴＰ」と略する場合がある。また、デオキシアデノシン５´−三リン酸、デオキシチミジン５´−三リン酸、デオキシグアノシン５´−三リン酸、デオキシシチジン５´−三リン酸を夫々、「ｄＡＴＰ」、「ｄＴＴＰ」、「ｄＧＴＰ」、「ｄＣＴＰ」と略する場合がある。また、アデノシン５´−Ｏ−３−チオ三リン酸は「ＡＴＰγＳ」と略する場合がある。
【００３２】
本発明において増幅対象となる標的核酸は、その起源、長さ及び塩基配列等に対する制限なく、また、一本鎖、二本鎖を問わず、いかなる核酸であってもよい。具体的には、生物のゲノムＤＮＡでもよく、或いは、該ゲノムＤＮＡを物理的手段若しくは制限酵素消化により切断された断片であっても良い。更に、ＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ等に挿入したものに対しても好適に利用できる。さらに、核酸を含む可能性のある試料から調製、あるいは単離したものであってもよい。また、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成されたＤＮＡ断片、ｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡ断片等の人工的産物等、いずれも標的核酸となり得る。
【００３３】
また、本発明の方法は、一般的なＰＣＲを行った場合に核酸の増幅が阻止又は抑制される二次構造を形成する区域を有する核酸の増幅にも好適に利用できる。
例えば、ＧＣ含量が高い鋳型核酸や短い繰り返し配列を有する鋳型核酸等を挙げられる。これらは、熱変性により一本鎖となると高次構造を生じ核酸増幅の際の阻害要因となっていた。本発明の方法によれば、ＮＴＰによりその生物学的機能が良好に保持されたＲｅｃＡが鋳型核酸に結合する。それにより、このような高次構造が解き、効率的に鋳型核酸を増幅することができる。
【００３４】
プライマーは、標的核酸の特定配列に対して相補的になるように設計されるものである。特には、増幅すべき標的配列のその両端に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。もっとも単純な系ではプライマーが２つ要求されるが、マルチプレックスＰＣＲ（Multiplex  ＰＣＲ）等を行う場合は３つ以上でもよく、また、１のプライマーのみでの増幅反応にも好適に利用可能である。プライマーの設計は、ランダムプライマーを用いる場合を除いて、標的核酸の配列を予め調査し決定される。そして、標的核酸の塩基配列の調査には、GeneBank、EBI等のデータベースを好適に利用できる。
【００３５】
プライマーは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味し、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、２０〜５０塩基長である。
【００３６】
ここで、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて使用できる耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであれば、特に制限はない。例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のT.th.ポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcuslitoralis）由来のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼ他、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcusfuriosus）由来のＰｆｕポリメラーゼ等の好熱古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３７】
ｄＮＴＰとしては、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に夫々対応する４種類のデオキシヌクレオチドが使用される。特には、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰの混合物が好ましく使用される。更に、ＰＣＲで合成され伸長されるＤＮＡ分子中に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る限りにおいては、デオキシヌクレオチドの誘導体をも含み得る。そのような誘導体として、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ等が例示され、例えば、夫々ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰに代えて、若しくは、双方を共在させて使用することができる。したがって、核酸合成に必要なアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類が含まれる限り、いかなる誘導体の使用を排除するものではない。
【００３８】
緩衝液としては、一般的には、適当な緩衝成分およびマグネシウム塩等を含んで調製される。緩衝成分としては、トリス酢酸、トリス塩酸、リン酸ナトリウム並びにリン酸カルシウム等のリン酸塩が好適に使用でき、特にはトリス酢酸の使用が好ましい。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜100ｍＭの範囲で調製される。また緩衝液のｐＨは好ましくはｐＨ６.０〜９.５、特に好ましくはｐＨ７．０〜８・０の範囲内で調製される。また、マグネシウム塩としては特に制限はないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等を適宜使用でき、特には酢酸マグネシウムが好ましい。更に、必要に応じて、ＫＣｌ等のカリウム塩、ＤＭＳＯ、グリセロール、ベタイン、ゼラチン、Triton等を添加することができる。また、市販のＰＣＲ用耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液を用いることができる。緩衝液の組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜変更することができる。特には、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等のイオン強度の影響、ＤＭＳＯ、グリセロール等のＤＮＡの融解温度に影響を与える各種添加物並びにそれらの濃度を勘案して、適宜設定することができる。特に本発明の方法は、実施例２において示す通り、ＰＣＲ反応液に対するＲｅｃＡの耐性を向上できるものである。したがって本発明においては広範なＰＣＲ反応液組成の使用が可能である。
【００３９】
そして、反応液は容量１００μｌ以下、特には、１０〜５０μｌの範囲で調製することが好ましい。各成分の濃度としてヌクレオチド５´−三リン酸は反応系において少なくとも５０μＭ以上有することが好ましく、特に好ましくは４００μＭ以上であるが、経済性等の観点から１ｍＭ以下に調製することが好ましい。ＲｅｃＡは好ましくは反応溶液中に０．００４〜０．０２μｇ／μｌの濃度で含まれるよう使用される。ＲｅｃＡ以外の各成分の濃度は、ＰＣＲは公知であることから、当業者は適宜設定することができる。例えば、標的核酸は、好ましくは１００μl当り１０ｐｇ〜１μｇの濃度で、プライマーＤＮＡは好ましくは、最終濃度０．０１〜１０μＭ、特には０．１〜１μＭの濃度に調製される。更に、ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは１００μｌあたり０．１〜５０Ｕｎｉｔ、特には１〜５Ｕｎｉｔの範囲の濃度で使用する。そして、ｄＮＴＰは、好ましくは最終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍに調製する。また、マグネシウム塩は最終濃度で０．１〜５０ｍＭ、特には、１〜５ｍＭの範囲に調製することが好ましい。
【００４０】
ＰＣＲは、以下の工程に従って実行され、これらの工程はＲｅｃＡ並びにＮＴＰの存在下で行なわれる。
（１）鋳型核酸の熱変性
（２）プライマーのアニーリング
（３）耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応
【００４１】
上記（１）〜（３）からなる三段階の温度変化を１サイクルとする反応を、適切なサイクルを繰り返すことによって、プライマーが起点となって標的核酸を鋳型として、相補性を有するもう一本の核酸鎖の合成が開始される。その結果、ｎサイクルの反応で標的核酸は２ｎ倍に増幅される。サーモサイクル数は、鋳型となる標的核酸の種類、量およびその純度等に応じて決定されるが、非特異的増幅を抑制し効率的な核酸増幅の観点から２０〜４０サイクル、特には、３２〜３６サイクルで行うことが好ましい。特に、本発明の方法はＰＣＲサイクル数を経てもＲｅｃＡの機能を良好に維持して、その活性を保つことができる。したがって、高サイクルのＰＣＲに対しても適用できる。
【００４２】
以下に各工程について詳細に説明する。
（１）鋳型核酸の熱変性
二本鎖核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、９２〜９８℃で１０〜６０秒行われる。また、長いＤＮＡ領域を増幅する場合には、鋳型ＤＮＡの分解を防止するため、一番初めの熱変性のみを低温度（例えば、９２℃程度）に設定することができる。
【００４３】
（２）プライマーのアニーリング
温度を下げることにより上記（１）において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは３０〜６０秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのＴｍを推定し、このＴｍをアニーリング温度として設定することが好ましい。通常は、５０〜７０℃で行われる。
【００４４】
（３）耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応
耐熱性ポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が３´末端において行われる。伸長反応温度は、耐熱性ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、６５〜７５℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が１ｋｂ以下のときは１分程度で十分であり、それより長い場合には、１ｋｂにつき１分の割合で長くすることが好ましい。
【００４５】
以上のように構成する事により、高度好熱菌由来ＲｅｃＡ存在下で行われるＰＣＲにおいて、前記ＲｅｃＡの活性化が達成されてＲｅｃＡの生物学的機能が維持される。これは、ＮＴＰの存在により、ＲｅｃＡの外的要因に対する生物学的機能の安定性を向上させることができることに起因するものと考えられる。特には、ＮＴＰがＲｅｃＡの熱安定性の向上、ＰＣＲ反応液に対する耐性の向上等の役割を有しているものと考えられる。つまり、ＰＣＲ中にＮＴＰが存在することにより、高度好熱菌由来のＲｅｃＡの機能がＰＣＲの全サイクルにおいて良好に維持され、効率的かつ特異的な核酸の増幅が可能となる。
【００４６】
したがって、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を、高度好熱菌由来のＲｅｃＡおよびＮＴＰ（ただし、前記ＮＴＰは、ｄＮＴＰおよびＮＴＰγＳではない）の存在下で行なうことにより標的核酸を増幅する核酸増幅方法をも提供する。
【００４７】
本発明の核酸の増幅方法により、全サイクルにおいて非特異的な増幅を抑制できると共に効率的な核酸の増幅が可能となる。これは、上述したようにＮＴＰの存在により、ＲｅｃＡの外的要因に対する生物学的機能の安定性を向上させることができるものと考えられる。特には、ＮＴＰがＲｅｃＡの熱安定性の向上、ＰＣＲ反応液に対する耐性の向上等の役割を有しているものと考えられる。つまり、ＮＴＰが存在することにより、ＲｅｃＡの機能がＰＣＲの全サイクルにおいて良好に維持、活性化される。したがって、全ＰＣＲサイクルにおいて鋳型核酸へのプライマーの配列特異性を向上した状態を維持できる。その結果、ＰＣＲの全サイクルにおいてＲｅｃＡの働きにより、プライマーが標的配列以外にアニールする、あるいはプライマー同士がアニールする等のミスプライミングに起因する非特異的な増幅を抑制できる。また、ＮＴＰの存在によりＰＣＲ中におけるｄＮＴＰの消費をも最小限に抑制することができ、効率的なＰＣＲ増幅が可能となる。
【００４８】
そして本発明の増幅方法は、様々な用途に利用可能である。例えば、医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等の多岐にわたる用途に利用可能である。具体的には、医療分野での利用として、一塩基多型性の検出をはじめとする遺伝子診断、ＳＡＲＳ、インフルエンザ等のウイルスや細菌等の病原体の検出等が例示される。また、生物化学分野での利用として、個人の同定、偽ブランド食物の検定等の生物種の同定が挙げられる。そして、環境分野における利用においては、環境中における細菌、ウイルス等の病原体検出等の環境測定、新規有用微生物の探索等が例示される。さらに、食品分野における利用としては、遺伝子組み換え作物含有の判定等が例示される。しかしながら、これに限定されるものではない。ＰＣＲの適用可能な用途であれば、制限されることなく本発明の方法を適用できる。
【００４９】
なかでも、本発明は一塩基多型の検出方法をも提供する。本発明の一塩基多型の検出方法は、上述した本発明の核酸増幅方法によって増幅された増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出するものである。本発明の増幅方法は、ＲｅｃＡに加えてＮＴＰの存在下で核酸を増幅することにより、プライマーの鋳型ＤＮＡ並びにプライマー同士の非特異的な結合を抑制することができる。その効果はＰＣＲ全サイクルによって保持されるため、効果的にプライマーのミスプライミングを抑制できる。したがって、所望の一塩基多型を有する核酸に相補的なプライマーを用いることにより、かかる一塩基多型を有する核酸が効率的に増幅できる。その一方で、かかる一塩基多型を有しない核酸は増幅されないか、または増幅が抑制されることから、かかる一塩基多型を有する核酸を特異的に増幅することが可能となる。これにより、一塩基多型を感度良く、かつ、効率的に検出することができる。
【００５０】
また、本発明はＰＣＲにより核酸を増幅させるための核酸増幅用キットを提供する。本発明の核酸増幅用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、高度好熱菌由来ＲｅｃＡ、ＮＴＰを含んで構成される。更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等のＰＣＲに必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の核酸をもって病原体等を検出するためのキットのような場合には、所望の核酸増幅に特異的な任意のプライマー等を含ませてもよい。このようにＰＣＲ増幅に必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速なＰＣＲ増幅が可能となる。
【００５１】
（別実施の形態）
本発明の核酸増幅方法は、様々なＰＣＲの変法に利用可能である。たとえば、アダプター付加ＰＣＲ、アレル特異的増幅法（ＭＡＳＡ法）、非対称ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法）、アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、ＲＡＣＥ、マルチプレックスＰＣＲ（multiplex  ＰＣＲ）等が挙げられる。しかしながら、これらに限定するものではなく、あらゆるＰＣＲの変法に利用可能である。
【００５２】
特に、マルチプレックスＰＣＲへの利用が好適に例示される。本発明の方法は相同組換えタンパク質であるＲｅｃＡを活性維持させた状態でＰＣＲ増幅可能となるため、鋳型ＤＮＡのプライマーへの配列特異性が向上する。したがって、特異的に標的核酸の存在に対応して増幅が可能となるため、複数のプライマーを使用するマルチプレックスＰＣＲに好適に利用できる。マルチプレックスＰＣＲとは、標的核酸の複数の標的配列を一の反応容器内で同時に増幅するものである。各標的配列を増幅し得るプライマーセットを一反応容器に入れて単一のＰＣＲ操作により増幅させる。複数の標的配列を増幅し得るプライマーセットを利用することにより、単一ＰＣＲに比べて標的ＤＮＡの増幅に要する時間、労働力及び試薬コストを大きく低減させることが可能となる。また、微量試料をも対象とすることができる共に、操作が簡便であることから現場レベルでの対応が可能となる。
【００５３】
また、本発明は、マルチプレックスＰＣＲ反応に供するための核酸増幅用キットを提供する。かかる核酸増幅用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、高度好熱菌由来ＲｅｃＡ、ＮＴＰを含んで構成される。更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等のＰＣＲに必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の核酸をもって病原体等を検出するためのキットのような場合には、所望の核酸増幅に特異的な任意のプライマー等を含ませてもよい。また、更に必要な検出装置を含ませてもよい。このようにマルチプレックスＰＣＲ増幅に必要な成分をキットして構成することにより、更に簡便且つ迅速なＰＣＲ増幅が可能となり、医療現場等における利用性が向上する。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示し、さらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（試薬）
下記の実験で使用した試薬について説明する。
鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（Promega社製：Human genomic DNA  カタログ番号G3041）を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼは、ｒＴａｑ−ＨＳポリメラーゼ（Takara−Bio社製）、ＥｘＴａｑ−ＨＳポリメラーゼ（Takara−Bio社製）若しくはT.th.ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems社製：製品番号N8080187）を使用した。
ＲｅｃＡとして、サーモス・サーモフィラス由来のＲｅｃＡ（以下、T.th.ＲｅｃＡと略する。）を使用した。T.th.ＲｅｃＡは、Masui R, Mikawa T, Kato R, Kuramitsu S.著、Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament.,Biochemistry.1998年１０月２０日、第37巻、第４２号、第14788〜14797頁の記載を参照して本発明の発明者が調製したものを使用した。
また、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ並びにＣＴＰはRoche Diagnostics社製（ 製品番号1277057）を使用した。
【００５６】
ここで使用したプライマーセットの配列を以下に示す。
プライマーセット１：
5’-ACAATGGGCTCACTCACCC  （配列認識番号１）
5’-CTAAGACCAATGGATAGCTG  （配列認識番号２）
定義：Human DNA sequence from clone RP11-392N11 on 
chromosome 9
GenBank Acc. No. AL359181
プライマーセット２：
5’-GCTCAGCATGGTGGTGGCATAA-3’（配列認識番号３）
5’-CCTCATACCTTCCCCCCCATTT-3’（配列認識番号４）
定義：Homo sapiens CYP21 gene
GenBank Acc. No. M12792 M23280
プライマーセット３：
5’-GACTACTCTAGCGACTGTCCATCTC-3’（配列認識番号５）
5’-GACAGCCACCAGATCCAATC-3’（配列認識番号６）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット４：
5’-AACCTCACAACCTTGGCTGA-3’（配列認識番号７）
5’-TTCACAACTTAAGATTTGGC-3’（配列認識番号８）
定義：Homo sapiens chromosome 8
GenBank Acc. No. AC103819
プライマーセット５：
5’-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3’（配列認識番号９）
5’-CAGGGAGCGTGTCCATAGG-3’（配列認識番号１０）
定義：Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate 
dehydrogenase (GAPD) gene
GenBank Acc. No. AY340484
プライマーセット６：
5’-CTGCTGAAAGAGATGCGGTGG-3’（配列認識番号１１）
5’-AGGAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’（配列認識番号１２）
定義：Human beta globin region on chromosome 11.
GenBank Acc. No. U01317
プライマーセット７：
5’-CACATCAATGTTGTTGTTT-3’（配列認識番号１３）
5’-TTCCTTGTCTCCCCAAGTTC-3’（配列認識番号１４）
定義：Homo sapiens chromosome 11, clone RP11-1205H24
GenBank Acc. No. AC129505
プライマーセット８：
5’-ACTTTGTTCTGAGCCTCACA-3’（配列認識番号１５）
5’-GTTGCCCAATCGCCCCTCTC-3’（配列認識番号１６）
定義：Homo sapiens transferrin (TF) gene
GenBank Acc. No. AY308797
プライマーセット９：
5’-AACCTGACTAGAAAAGCTAT-3’（配列認識番号１７）
5’-GAATGAGTGGTTAATTAATT-3’（配列認識番号１８）
定義：Homo sapiens clone NGR0524 mitochondrion, partial genome.
GenBank Acc. No. AF465941
プライマーセット１０：
5’-CTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’（配列認識番号１９）
5’-GACAG CCACCAGATC CAATC-3’（配列認識番号２０）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１１：
5’-GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’（配列認識番号２１）
5’-GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’（配列認識番号２２）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１２：
5’-TTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’（配列認識番号２３）
5’-CATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’（配列認識番号２４）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１３：
5’-GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
（配列認識番号２５）
5’-TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
（配列認識番号２６）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１４：
5’-GTTGT GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
（配列認識番号２７）
5’-AATCT TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
（配列認識番号２８）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１５：
5’-TTCCTGTTGT GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
（配列認識番号２９）
5’-GTTTTAATCT TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
（配列認識番号３０）
定義：Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット１６：
5’-GCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’（配列認識番号３１）
5’-CAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’（配列認識番号３２）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット１７：
5’-TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’（配列認識番号３３）
5’-AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’（配列認識番号３４）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット１８：
5’-CTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’（配列認識番号３５）
5’-CACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’（配列認識番号３６）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット１９：
5’-GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
（配列認識番号３７）
5’-GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
（配列認識番号３８）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット２０：
5’-TCTGG GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
（配列認識番号３９）
5’-GTGGA GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
（配列認識番号４０）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット２１：
5’-CCCTGTCTGG GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
（配列認識番号４１）
5’-ATCGGGTGGA GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
（配列認識番号４２）
定義：Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット２２：
5’-CCCACGATCAATGCCATCAACT-3’（配列認識番号４３）
5’-CGGTGAGAGGCACTGCCAGATT-3’（配列認識番号４４）
定義：Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-124L5
GenBank Acc. No. AC022389
プライマーセット２３：
5’-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAAT-3’（配列認識番号４５）
5’-GCCCTTCATAATATCCCCCAGTTT-3’（配列認識番号４６）
定義：Human beta globin region on chromosome 11.
GenBank Acc. No. U01317
プライマーセット２４：
5’-GTCCTTCCCCCGCTGGAAAC-3’（配列認識番号４７）
5’-GCAGCAGAGATCATCGCGCC-3’（配列認識番号４８）
定義：Homo sapiens MYC gene
GenBank Acc. No. X00364
プライマーセット２５：
5’-GTGGGGGTGCTGGGAGTTTGT-3’（配列認識番号４９）
5’-TCGGACAGAAACATGGGTCTGAA-3’（配列認識番号５０）
定義：Homo sapiens neural retinal-specific leucine zipper protein (NRL) gene
GenBank Acc. No. U95012
プライマーセット２６：
5’-GGTGCTCAGAACCCCCACAATC-3’（配列認識番号５１）
5’-CCTACCGACCCCATTCCACTCT-3’（配列認識番号５２）
定義：Homo sapiens growth hormone locus on chromosome 17.
GenBank Acc. No. NG_001334
プライマーセット２７：
5’-CACAGATTTCCAAGGATGCGCTG-3’（配列認識番号５３）
5’-CGTGCTCTGTTCCAGACTTG-3’（配列認識番号５４）
定義：Homo sapiens interleukin 9 receptor (IL9R) gene
GenBank Acc. No. AY071830 
プライマーセット２８：
5’-CGTCTGGCGATTGCTCCAAATG-3’（配列認識番号５５）
5’-GGGCAGTTGTGATCCATGAGAA-3’（配列認識番号５６）
定義：Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter
GenBank Acc. No. AB044401
プライマーセット２９：
5’-GGCTTGCACCAGCTTAGGAAAG-3’（配列認識番号５７）
5’-CGTTAGGCATAATCAGTGGGATAGT-3’（配列認識番号５８）
定義：Homo sapiens chromosome 11
GenBank Acc. No. AC129505
プライマーセット３０：
5’-GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTCT-3’（配列認識番号５９）
5’-TGTCAACCACCCTTAACCCCTCC-3’（配列認識番号６０）
定義：Homo sapiens p53 gene
GenBank Acc. No. X54156
プライマーセット３１：
5’-TTGGAGGGGTGGGTGAGTCAAG-3’（配列認識番号６１）
5’-GGAGGGGTGGGGGTTAATGGTTA-3’（配列認識番号６２）
定義：Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene
GenBank Acc. No. U72959
プライマーセット３２：
5’-GGAACAAGACACGGCTGGGTT-3’（配列認識番号６３）
5’-AGCAAGGCAGGGCAGGCAAGT-3’（配列認識番号６４）
定義：Human midkine gene
GenBank Acc. No. D10604
プライマーセット３３：
5’-CGGTCCCATTCTCAGGGAATCT-3’（配列認識番号６５）
5’-GCCCAGAGGAAGAAGAAGGAAA-3’（配列認識番号６６）
定義：Human rhodopsin gene
GenBank Acc. No. U49742
【００５７】
実施例１：ＰＣＲ反応液組成によるT.th.Ｒｅｃタンパク質のパフォーマンス低下の改善
ＰＣＲ反応液組成によりT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンスに与える影響を確認すると共に、ＡＴＰの存在によりT.th.ＲｅｃＡタンパク質のパフォーマンスが保持できることを確認した。
【００５８】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット１を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下に示す４種類を調製した。詳細には、反応液Ａは、緩衝液として１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）を使用したものであり、反応液Ｂは、反応液Ａに更にT.th.ＲｅｃＡを添加したものである。反応液Ｃは、緩衝液として、Taq buffer（Takara−Bio社製）を用い、T.th.ＲｅｃＡを添加したものである。そして、反応液Ｄは、反応液Ａに更にT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、ＤＮＡポリメラーゼはｒＴａｑ−ＨＳポリメラーゼ（Takara−Bio社製）を用いた。
【００５９】
反応液Ａ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、１×rTaq buffer に混合して、全量25μlとした。
【００６０】
反応液Ｂ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
以上を含むよう、１×rTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
【００６１】
反応液Ｃ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
以上を含むよう、１×Taq bufferに混合して、全量25μlとした。
【００６２】
反応液Ｄ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
400μM  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００６３】
上記反応液を９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、７２℃、３分、４℃、１０分の１サイクル最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。また、同様の実験を、プライマーセット２、３、４、５、６を用いて行った。
【００６４】
(結果)
結果を図１に示す。
レーン１〜６は、rTaq Buffer中でT.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６により増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ａ）。
レーン７〜１２は、rTaq Buffer中でＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加し、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６により増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｂ）。
レーン１３〜１８は、Taq Buffer中でT.th.ＲｅｃＡのみを添加し、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６により増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｃ）。
レーン１９〜２４は、rTaq Buffer中でT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰとを添加し、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６により増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｄ）。
【００６５】
ＲｅｃＡの存在下でＰＣＲ反応液としてrTaq Bufferを使用して増幅した場合（レーン７〜１２）およびＲｅｃＡの存在下でＰＣＲ反応液としてTaq Bufferを使用して増幅した場合（レーン１３〜１８）を比較した。双方において非特異的な増幅が観察されたが、特にレーン７〜１２の方が、ＰＣＲ増幅の際の非特異的増幅が確認された。つまり、ＰＣＲ反応液の組成によってＲｅｃＡのパフォーマンスの低下が生じることあることが判明した。
また、ＡＴＰとT.th.ＲｅｃＡを添加して増幅した場合（レーン１９〜２４）、同一のＰＣＲ反応液中でT.th.ＲｅｃＡのみの存在下でＰＣＲ増幅を行なった場合（レーン７〜１２）を比較した。その結果、ＡＴＰとT.th.ＲｅｃＡの存在によりＰＣＲ増幅に際して非特異的増幅を顕著に軽減できることが確認された。
【００６６】
以上の結果より、T.th.ＲｅｃＡはＰＣＲ反応液の組成により、そのパフォーマンスが低下することが判明した。そして、そのようなパフォーマンスの低下が、ＡＴＰに存在により顕著に軽減でき、非特異的な増幅を抑制して標的核酸のみを特異的に増幅できることが判明した。これは、ＡＴＰがT.th.ＲｅｃＡの反応液組成に対する耐性を向上させることができることによるものと考えられる。したがって、ＡＴＰはT.th.ＲｅｃＡの外的要因によるパフォーマンスの低下を抑制でき、その生物活性保持並びにその活性化に重要な役割を果たしているとの理論が導ける。
【００６７】
実施例２：ＰＣＲ中におけるT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンス低下の改善
ＡＴＰの存在により、ＰＣＲ中におけるT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンス低下を改善できることを増幅サイクルの経過観察を行うことにより確認した。  
【００６８】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット７を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下に示す２種類を調製した。詳細には、反応液Ｅは、T.th.ＲｅｃＡのみを添加したものである。反応液Ｆは、T.th.ＲｅｃＡに加えてＡＴＰを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、ＤＮＡポリメラーゼはｒＴａｑ−ＨＳポリメラーゼを用いた。
【００６９】
反応液Ｅ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
以上を含むよう、１×Taq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００７０】
反応液Ｆ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
400μM  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×Taq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００７１】
上記反応液を９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした２８、３２若しくは３６サイクルの増幅反応を行った後、７２℃、３分、４℃、１０分の１サイクルの最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。また、同様の実験を、プライマーセット８、９を用いて行った。
【００７２】
（結果）
上記の実験結果を図２に示す。
レーン１〜３は、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して２８サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｅ）。
レーン４〜６は、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰとを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して２８サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｆ）。
レーン７〜９は、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して３２サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｅ）。
レーン１０〜１２は、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰとを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して３２サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｆ）。
レーン１３〜１５は、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して３６サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｅ）。
レーン１６〜１８は、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰとを添加して、夫々プライマーセット７、８、９を使用して３６サイクルの増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｆ）。
【００７３】
T.th.ＲｅｃＡのみを添加してＰＣＲ増幅を行なった場合、サイクル数が増す毎に非特異的な増幅産物が生じる事が確認された（レーン１〜３、レーン７〜９とレーン１３〜１５との比較）。
一方、ＡＴＰを添加することにより、そのような非特異的な増幅を抑制する事ができる事が確認された（レーン１〜３とレーン４〜６の比較、レーン７〜９とレーン１０〜１２の比較、レーン１３〜１５とレーン１６〜１８の比較）。そして、サイクル数が増しても非特異的な増幅を効果的に抑制できる事が確認された（レーン４〜６、レーン１０〜１２と、レーン１６〜１８との比較）。
【００７４】
以上の結果より、ＰＣＲ中における熱変性等に起因してT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンスがサイクル数の増加に伴って低下することが判明した。しかしながら、そのようなパフォーマンスの低下は、ＡＴＰの添加により効果的に抑制できる事が確認された。そして、ＡＴＰとT.th.ＲｅｃＡの存在下でＰＣＲ増幅を行なうことにより、非特異的増幅を抑制して標的核酸のみを特異的に増幅できることが確認された。これは、ＡＴＰがT.th.ＲｅｃＡの熱安定性の向上等、外的要因、特には熱に対する生物学的機能の安定性を向上させるものと考えられる。したがって、ＰＣＲサイクル中において、ＡＴＰはT.th.ＲｅｃＡを活性化し、その生物学的機能の維持に重要な役割を果たすことが、ここからも導ける。また、ＡＴＰとT.th.ＲｅｃＡの存在下でＰＣＲ増幅を行なうことにより、反応系に添加したｄＮＴＰの消費を低減でき、それによってもT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンスの低下を抑制できることが判明した。
【００７５】
実施例３：ＥｘＴａｑ  ポリメラーゼでの増幅に対する効果
T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰにより、ＥｘＴａｑ  ポリメラーゼでの増幅においても非特異的増幅を低減する効果を奏せれることを確認した。  
【００７６】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット１を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下に示す２種類を調製した。詳細には、反応液Ｇは、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰいずれも添加しない一般的なＰＣＲ反応液組成である（コントロール）。反応液Ｈは、反応液Ｇに更にT.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、ＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ−ＨＳポリメラーゼを用いた。
【００７７】
反応液Ｇ（コントロール）：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、１×Taq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００７８】
反応液Ｈ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ  
400μM  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×Taq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００７９】
上記反応液を９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３６サイクルの増幅反応を行った後、７２℃、３分、４℃、１０分の１サイクルの最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。また、同様の実験を、プライマーセット２、３、４、５、６、８を用いて行った。
【００８０】
（結果）
上記の実験結果を図３に示す。
レーン１〜７は、T.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して一般的なＰＣＲ反応液中で増幅反応を行った結果を示す（コントロール：反応液Ｇ）。
レーン８〜１４は、T.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｈ）。
【００８１】
ＥｘＴａｑ  ポリメラーゼでの増幅においても、T.th.ＲｅｃＡにＡＴＰを加えると非特異的な増幅が抑制された（レーン１〜７とレーン８〜１４の比較。）。
以上の結果から、ＤＮＡポリメラーゼの種類に依存せず、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加することにより、ＤＮＡポリメラーゼの非特異的増幅を抑制でき標的核酸のみを特異的に増幅できることが判明した。
【００８２】
実施例４．種々のヌクレオチド５´三リン酸による効果確認
種々のヌクレオチド５´三リン酸によっても、ＡＴＰと同様にT.th.ＲｅｃＡの安定化を図れることを、種々のヌクレオチド５´三リン酸とT.th.ＲｅｃＡの存在下でＰＣＲ増幅を行うことにより確認した。
【００８３】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット１を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下に示す７種類を調製した。詳細には、反応液Iは、一般的なＰＣＲ反応溶液であり、T.th.ＲｅｃＡもヌクレオチド５´−三リン酸のいずれをも添加せず調製したものである（コントロール）。反応液Ｊは、反応液ＩにT.th.ＲｅｃＡを添加して調製したものである。そして反応液Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎは夫々、反応液ＪにＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰを添加して調製したものである。また、反応液Ｏは、反応液ＩにＡＴＰのみを添加したものであり、T.th.ＲｅｃＡを添加せず調製されたものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、ＤＮＡポリメラーゼはｒＴａｑ−ＨＳポリメラーゼを用いた。
【００８４】
反応液I(コントロール)：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、rTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
【００８５】
反応液J：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ  
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００８６】
反応液Ｋ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
400μM  ＧＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００８７】
反応液Ｌ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ  
400μM  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００８８】
反応液Ｍ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
400μM  ＵＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００８９】
反応液Ｎ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
400μM  ＣＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００９０】
反応液Ｏ：
0.8μM（最終濃度）  プライマーセット
25ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
400μM  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×rTaq buffer（Takara−Bio社製）に混合して、全量25μlとした。
【００９１】
上記反応液を９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３６サイクルの増幅反応を行った後、７２℃、３分、４℃、１０分の１サイクルの最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。また、同様の実験を、プライマーセット２、３、４、５、６、８を用いて行った。
【００９２】
（結果）
上記の実験結果を図４に示す。
レーン１〜７は、T.th.ＲｅｃＡおよびＮＴＰのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して一般的なＰＣＲ反応液中で増幅反応を行った結果を示す（コントロール：反応液I）。
レーン８〜１４は、いずれのＮＴＰをも添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液J）。
レーン１５〜２１は、T.th.ＲｅｃＡとＧＴＰを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｋ）。
レーン２２〜２８は、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰとを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｌ）。
レーン２９〜３５は、T.th.ＲｅｃＡとＵＴＰとを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｍ）。
レーン３６〜４２は、T.th.ＲｅｃＡとＣＴＰとを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｎ）。
レーン４３〜４９は、T.th.ＲｅｃＡを添加せずＡＴＰのみを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６、８を使用して増幅反応を行った結果を示す（反応液Ｏ）。
【００９３】
ＰＣＲ系にT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加した場合、T.th.ＲｅｃＡのみを添加した場合に比べて非特異的な増幅が抑制できることが確認された（レーン１５〜２１およびレーン８〜１４の比較）。この結果は、上記実施例１〜３の結果を追認するものであった。
また、同様の結果が、ＧＴＰとT.th.ＲｅｃＡを添加した場合（レーン１５〜２１およびレーン８〜１４の比較）、ＵＴＰとT.th.ＲｅｃＡを添加した場合（レーン２９〜３５およびレーン８〜１４の比較）、ＣＴＰとT.th.ＲｅｃＡを添加した場合（レーン３６〜４２およびレーン８〜１４の比較）にも確認された。
なかでも、ＡＴＰとT.th.ＲｅｃＡの組合せが最も非特異的な増幅を抑制することが認められた。
しかしながら、ＡＴＰ単独では、非特異的な増幅を抑制できなかった（レーン４３〜４９）。そして、ＡＴＰ単独ではT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰのいずれを添加しなかった場合と同程度の非特異的な増幅産物の産生が確認された（レーン４３〜４９とレーン１〜７の比較）。
【００９４】
以上の結果から、ＡＴＰのみならず、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等のヌクレオチド５´三リン酸とT.th.ＲｅｃＡの存在下で、ＰＣＲ増幅反応を行うことで非特異的な増幅を抑制できることが判明した。その結果、標的核酸のみを特異的に増幅でき増幅効率が向上する。一方、そのような効果は、ヌクレオチド５´三リン酸単独では認められなかった。
してみると、ＡＴＰと同様、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等のヌクレオチド５´リン酸もT.th.ＲｅｃＡを活性化でき、その機能の安定化に重要な役割を果すことが判明した。これによりＲｅｃＡの外的要因、特には熱に対する生物学的機能の安定性を向上させ、ＲｅｃＡの有する生物活性を活性化することができるものと考えられる。
【００９５】
実施例５：プライマー長による効果−１
使用するプライマーの塩基長による、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡおよびＡＴＰの存在下でのＰＣＲ増幅に対する効果を検討した。
【００９６】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、種々の長さのプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ここで、使用したプライマーセットの長さは、プライマーセット１０、１１、１２、１３、１４および１５、夫々、２０、２５、３０、３５、４０および４５塩基長であった。また、ＰＣＲ反応液は以下に示す２種類を調製した。詳細には、反応液Ｐは、T.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰを添加して調製したものであり、そして、反応液Ｑは、ＡＴＰを添加しないことを除いては反応液Ｐと同様に調製した。各反応液の組成は以下の通りである。なお、ＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ−ＨＳポリメラーゼ（Takara−Bio社製）を用いた。
【００９７】
反応液Ｐ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
0.4mM（最終濃度）  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×ExTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
【００９８】
反応液Ｑ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.7unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.4mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg  T.th.ＲｅｃＡ
以上を含むよう、１×ExTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
【００９９】
上記反応液を９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、９０秒を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、７２℃、３分、４℃、１０分の１サイクル最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。
【０１００】
(結果)
結果を図５に示す。
レーン１〜６は、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰを添加して、夫々プライマーセット１０、１１、１２、１３、１４および１５を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｐ）。
レーン７〜１２は、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加し、夫々プライマーセット１０、１１、１２、１３、１４および１５を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｑ）。
【０１０１】
T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの双方の存在下でＰＣＲ増幅した場合、いずれのプライマーセットを使用した際にも非特異的増幅を顕著に軽減でき鋳型核酸が特異的に増幅されることが確認された（レーン１〜６）。ここで使用した種々のプライマーセットは夫々２０〜４５の異なる塩基長を有するものである。したがって、プライマーの長さに影響されずT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの存在により標的核酸の特異的な増幅が達成できることを確認した。一方、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみの存在下で増幅した場合においては非特異的な増幅産物の産生が確認された（レーン７〜１２）。
【０１０２】
以上の結果は、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰにより非特異的な増幅産物の産生を抑制しＰＣＲ増幅効率が向上するとの上記実施例１〜４の結果に合致するものであった。そして、ＰＣＲ反応における、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰによる標的核酸の増幅効率の向上効果は、プライマーセットの長さに影響されるものではない事が判明した。したがって、使用されるプライマーセットの長さに制限を受けず、いかなるＰＣＲ増幅反応においても本発明が利用可能であることが判明した。
【０１０３】
実施例６：プライマー長による効果−２
実施例５に続き、使用するプライマーの塩基長による、T.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰ存在でのＰＣＲ増幅に対する効果を検討した。
【０１０４】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、種々の長さのプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ここで、使用したプライマーの長さは、プライマーセット１６、１７、１８、１９、２０および２１が、夫々、２０、２５、３０、３５、４０、４５塩基長であった。また、ＰＣＲ反応液として、実施例５で使用したものと同じものを使用した。詳細には、反応液Ｐは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加して調製したものであり、そして、反応液Ｑは、ＡＴＰを添加しないことを除いては反応液Ｐと同様に調製した。なお、ＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ−ＨＳポリメラーゼ（Takara−Bio社製）を用いた。そして、ＰＣＲ反応を実施例５と同じ条件下で行なった後、実施例５の手順に従って電気泳動並びに泳動ゲルの染色を行ない、写真撮影を行った。
【０１０５】
(結果)
結果を図６に示す。
レーン１〜６は、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰを添加して、夫々プライマーセット１６、１７、１８、１９、２０および２１を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｐ）。
レーン７〜１２は、T.th.ＲｅｃＡのみを添加し、夫々プライマーセット１６、１７、１８、１９、２０および２１を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｑ）。
【０１０６】
T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの双方の存在下で増幅した場合、いずれのプライマーセットを使用してもＰＣＲ増幅に際して非特異的増幅を顕著に軽減し、鋳型核酸の特異的な増幅が可能であることが確認された（レーン１〜６）。ここで使用した種々のプライマーは夫々２０〜４５の異なる塩基長を有するものである。つまり、プライマーの長さに影響されずＲｅｃＡとＡＴＰによって特異的な増幅が達成できることが確認された。一方、ＡＴＰを添加せずＲｅｃＡのみの存在下で増幅した場合においては非特異的増幅が確認された（レーン７〜１２）。
【０１０７】
以上の結果は、実施例５の結果と合致するものであり、ＰＣＲ反応における、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰによる標的核酸の増幅効率の向上効果は、プライマーセットの長さに影響されるものではない事が追認された。
【０１０８】
実施例７：T.th.ＤＮＡポリメラーゼとの組合せ効果
T.th.ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅における、T.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰとの組合せに対する影響を検討した。
【０１０９】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット１を用いてT.th.ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下に示す５種類を調製した。詳細には、反応液Ｒは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加して調製したものである。そして、反応液Ｓは、ＡＴＰを添加しないことを除いては反応液Ｒと同様に調製した。また、反応液Ｔは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加しないことを除いては反応液Ｒと同様に調製したものであり、一般的なＰＣＲ反応液組成を示す。そして、反応液Ｕは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加しない代わりにT.th.ＲｅｃＡ storage bufferを添加したことを除いては反応液Ｒと同様に調製した。更に反応液ＶはT.th.ＲｅｃＡを添加しないことを除いては反応液Ｒと同様に調製した。各反応液の組成は以下の通りである。
【０１１０】
反応液Ｒ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μｇ  T.th.ＲｅｃＡ
0.4mM（最終濃度）  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１１１】
反応液Ｓ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μｇ  T.th.ＲｅｃＡ
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１１２】
反応液Ｔ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１１３】
反応液Ｕ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.1μl  T.th.ＲｅｃＡ storage buffer  
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１１４】
ここで使用したT.th.ＲｅｃＡ storage bufferの組成は以下の通りである。
1.5M  ＫＣｌ
50mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）
1.0mM  ＥＤＴＡ
0.5mM  ＤＴＴ
50％グリセロール
【０１１５】
反応液Ｖ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4mM（最終濃度）  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１１６】
上記反応液を９２℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、６８℃、９０秒を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、６８℃、３分、４℃、１０分の１サイクル最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。プライマーセット２、３、４、５、６および８についても同様に増幅反応を行なった。
【０１１７】
(結果)
結果を図７に示す。
いずれもT.th.ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅を行なった結果を示す。
そして、レーン１〜７は、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６および８を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｒ）。
レーン８〜１４は、ＡＴＰを添加せずT.th.ＲｅｃＡのみを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６および８を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｓ）。
レーン１５〜２１は、T.th.ＲｅｃＡ及びＡＴＰのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６および８を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｔ）。
レーン２２〜２８は、T.th.ＲｅｃＡ及びＡＴＰのいずれをも添加せずにT.th.ＲｅｃＡ storage bufferを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６および８を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｕ）。
レーン２９〜３５は、T.th.ＲｅｃＡを添加せずＡＴＰのみを添加して、夫々プライマーセット１、２、３、４、５、６および８を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｖ）。
【０１１８】
T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの双方の存在下でT.th.ＤＮＡポリメラーゼによって増幅した場合、非特異的増幅を顕著に軽減して鋳型核酸が特異的に増幅されることが確認された（レーン１〜７）。一方、いずれをも添加しなかった場合（レーン８〜１４）、T.th.ＲｅｃＡのみ（レーン１５〜２１）、また、ＡＴＰのみの場合（レーン２２〜２８、レーン２９〜３５）においては、非特異的な増幅産物の産生が確認された。
【０１１９】
以上の結果は、上記実施例１〜６の結果と同様、T.th.ＤＮＡポリメラーゼによる増幅においてもT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰによる増幅効率の向上効果が奏される事を追認した。更に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した実施例１〜６の結果と比較してみるに、T.th.ＤＮＡポリメラーゼ増幅において顕著にその効果が奏されることが判明した。したがって、本発明はＰＣＲ増幅において使用するＤＮＡポリメラーゼの種類にその利用が制限されるものではない。また、なかでも、T.th.ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅反応に好適に利用可能であることが判明した。
【０１２０】
実施例８：T.th.ＤＮＡポリメラーゼとの組合せによる、マルチプレックスＰＣＲの効果
T.th.ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅におけるT.th.ＲｅｃＡおよびＡＴＰとの組合せに対する影響、並びに、マルチプレックスＰＣＲにおける影響を検討した。
【０１２１】
（方法）
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、T.th.ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅反応を行った。ここで使用したプライマーセットは、プライマーセット２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、１および２であった。また、これらのプライマーセットをすべて１の反応系に添加して増幅するマルチプレックスＰＣＲをも行なった。そして、反応液は以下に示す２種類を調製した。詳細には、反応液Ｗは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加したものである。そして、反応液Ｘは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰを添加せずにT.th.ＲｅｃＡ storage bufferを添加したことを除いては反応液Ｗと同様に調製した。
【０１２２】
反応液Ｗ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg   T.th.ＲｅｃＡ
0.4mM（最終濃度）  ＡＴＰ
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase buffer（製造業者名）に混合して、全量25μlとした。
【０１２３】
反応液Ｘ：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
20ng  鋳型ＤＮＡ
0.5unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  酢酸マグネシウム
0.1μl  T.th.ＲｅｃＡ storage buffer
以上を含むよう、１×T.th.DNA Polymerase Buffer（Applied Biosystems社製：製品番号N8080187）に混合して、全量25μlとした。ここで使用したT.th.ＲｅｃＡ storage bufferは実施例７において使用したものと同じものであった。
【０１２４】
上記反応液を９２℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、６８℃、２分を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、６８℃、３分、４℃、１０分の１サイクル最終反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液３μｌを、１２．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをサイバーグリーン染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った。
【０１２５】
(結果)
結果を図８に示す。
いずれもT.th.ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅を行なった結果を示す。
レーン１〜１４は、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰを添加して、夫々プライマーセット２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、１および２を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｗ）。
そして、レーン１５は、T.th.ＲｅｃＡ並びにＡＴＰの存在下で上記プライマーセット全部を添加して１の反応系で増幅反応を行なったマルチプレックスＰＣＲの結果を示す（反応液Ｗ）。
レーン１６〜２９は、T.th.ＲｅｃＡstorage buffer存在下で夫々プライマーセット２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、１および２を用いて増幅反応を行なった結果を示す（反応液Ｘ）。
そして、レーン３０は、T.th.ＲｅｃＡ storage buffer存在下で上記プライマーセット全部を添加して１の反応系で増幅反応を行なったマルチプレックスＰＣＲの結果を示す（反応液Ｘ）。
【０１２６】
T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの双方の存在下でT.th.ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した場合、非特異的増幅を顕著に軽減して鋳型核酸が特異的に増幅されることが確認された（レーン１〜１４）。一方、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの不在下においては、非特異的な増幅産物の産生が確認された（レーン１６〜２９）。
また、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの双方の存在下でマルチプレックスＰＣＲを行なった場合、夫々プライマーセットに対応する標的配列が特異的に増幅されていることが確認された（レーン１５、対応する標的配列に関してはレーン１〜１４）。一方、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの不在下においては、非特異的な増幅産物の産生を抑制できず、マルチプレックスＰＣＲの精度が低下することが確認された（レーン３０）。
【０１２７】
以上の結果は、上記実施例７の結果と同様、T.th.ＤＮＡポリメラーゼによる増幅においてもT.th.ＲｅｃＡとＡＴＰによる増幅効率の向上効果が奏されることを追認するものであった。更に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した実施例１〜６の結果と比較してみるに、T.th.ＤＮＡポリメラーゼ増幅の方が顕著にその効果が奏されることも追認された。更に、本実験の結果より、マルチプレックスＰＣＲにおいても夫々のプライマーセットに対応する標的配列の特異的な増幅を可能とし、その信頼性を向上させることが判明した。これは、T.th.ＲｅｃＡとＡＴＰの存在によりプライマー同士のミスプライミングを抑制できると考えられる。このため、複数のプライマーセットを１の反応系で反応させるマルチプレックスＰＣＲにおいてもミスプライミングを効果的に抑制し、標的配列の特異的な増幅を可能とすることができるものと考えられる。したがって、本発明はマルチプレックスＰＣＲにも特に好適に適用できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等において有用な核酸の増幅方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明の方法がＰＣＲ反応液組成によるT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンス低下を改善することを確認した実施例１の結果を示す図
【図２】本発明の方法がＰＣＲ中におけるT.th.ＲｅｃＡのパフォーマンス低下を改善することを確認した実施例２の結果を示す図
【図３】本発明の方法によるＥｘＴａｑポリメラーゼでの増幅に対する効果を検討した実施例３の結果を示す図
【図４】種々のヌクレオチド５´三リン酸とT.th.ＲｅｃＡのＰＣＲ増幅に与える効果を検討した実施例４の結果を示す図
【図５】プライマー長が与える効果を検討した実施例５の結果を示す図
【図６】プライマー長が与える効果を検討した実施例６の結果を示す図
【図７】T.th.ＤＮＡポリメラーゼとの組合せによる効果を検討した実施例７の結果を示す図
【図８】T.th.ＤＮＡポリメラーゼとの組合せによるマルチプレックスＰＣＲの効果を検討した実施例８の結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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