(57)【要約】【課題】  微小な標的物質を磁性粒子で回収する際に、磁性粒子のサイズが小さいと微小物質を捕獲しやすくなるが、駆動するために大きな磁界を要求され制御が難しくなり、磁性粒子のサイズを大きくすると駆動はしやすくなるが、捕獲効率が低下するという問題があった。また、磁性粒子の大きさに対して比較的大きい空間で結合させることが多いため、磁性粒子と標的核酸が接触する確率が小さく回収効率確保が課題となっていた。【解決手段】  複数個の磁性粒子を内包した集合体を構成し、集合体の状態で駆動を行ない、標的物質との結合の際は集合体が分解し磁性粒子が放出される。また、標的物質を有すると思われる物質内部に集合体を投入して、その限られた空間内で結合を行ない、結合して得られた複合体を任意面に保持した状態で物質を破壊する構成として結合および回収効率を向上させる。【選択図】  図３
2006042621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を基材内に複数個内包して集合させた内包型の微粒子集合体であって、
前記内包された微粒子の放出を制御可能であることを特徴とする微粒子集合体。
【請求項２】
前記標的物質が核酸であり、前記微粒子は表面に前記核酸と結合可能な修飾が施されていることを特徴とする請求項１項に記載の微粒子集合体。
【請求項３】
前記微粒子集合体には前記微粒子と前記標的物質の結合反応を促進する結合反応促進剤を内包していることを特徴とする請求項１または２に記載の微粒子集合体。
【請求項４】
前記微粒子集合体はその内部で前記微粒子と前記反応促進剤が反応の順に多層に内包され、反応の順に放出されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の微粒子集合体。
【請求項５】
前記標的物質が核酸であり、前記微粒子表面に施された前記核酸と結合可能な修飾はコーティングされたシリカ層であり、前記反応促進剤がカオトロピック物質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の微粒子集合体。
【請求項６】
標的物質の内包領域を有する被処理物の構造を破壊可能な薬品を内包した集合体であって、前記集合体は前記反応場に投入されてから前記薬品を放出することを特徴とする集合体。
【請求項７】
内部に標的物質を有する第一の物質を反応場に投入する手段と、
請求項１〜５に記載の微粒子集合体を前記反応場に投入する手段と、
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する手段と、
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部で分解し内包された微粒子を放出する手段と、
前記第一の物質内部で前記微粒子と標的物質と結合させる手段と、
前記微粒子と前記標的物質が結合した複合体を回収する手段と、
前記複合体から前記標的物質を回収する手段とを有することを特徴とする標的物質抽出装置。
【請求項８】
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する手段が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項７記載の標的物質抽出装置。
【請求項９】
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する手段が、
前記第一の物質を穿孔する穿孔手段と、
前記第一の物質の穿孔部分から前記微粒子集合体を導入する手段とからなることを特徴とする請求項７記載の標的物質抽出装置。
【請求項１０】
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する手段が、
前記微粒子集合体と前記第一の物質を衝突させ前記第一の物質を穿孔する手段と、
前記第一の物質の穿孔部分から前記微粒子集合体を投入する手段とからなることを特徴とする請求項７記載の標的物質抽出装置。
【請求項１１】
前記第一の物質内部で前記微粒子と標的物質とを結合させる手段が、前記第一の物質内で前記微粒子を駆動する手段を含むことを特徴とする請求項７に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１２】
前記駆動手段が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項１１に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１３】
前記微粒子が前記標的物質と結合し前記複合体を形成した後、前記微粒子が前記第一の物質に内包されたまま前記複合体を所定位置まで駆動し保持する手段を有することを特徴とする請求項７に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１４】
前記微粒子が前記第一の物質に内包されたまま前記複合体を所定位置まで駆動し保持する手段が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項１３に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１５】
前記複合体を前記所定位置に保持した後、少なくとも前記第一の物質の構造を破壊する破壊手段を有することを特徴とする請求項１２または１３に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１６】
前記破壊手段が、請求項６に記載の前記第一の物質の構造を破壊可能な薬品を内包した集合体であることを特徴とする請求項１５に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１７】
前記集合体を前記第一の物質もしくは前記反応場内の前記第一の物質近傍で衝突させることにより分解させ、内包された薬品を前記反応場に放出することを特徴とする請求項１６に記載の標的物質抽出装置。
【請求項１８】
内部に標的物質を有する第一の物質を反応場に投入する工程と、
請求項１〜５に記載の微粒子集合体を前記反応場に投入する工程と、
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する工程と、
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部で分解させ内包された微粒子を放出する工程と、
前記第一の物質内部で前記微粒子と標的物質と結合させる工程と、
前記微粒子と前記標的物質が結合した複合体を回収する工程と、
前記複合体から前記標的物質を回収する工程とを有することを特徴とする標的物質抽出方法。
【請求項１９】
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する工程が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項１８記載の標的物質抽出方法。
【請求項２０】
前記微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する工程が、
前記第一の物質を穿孔する穿孔工程と、
前記第一の物質の穿孔部分から前記微粒子集合体を導入する工程とからなることを特徴とする請求項１８記載の標的物質抽出方法。
【請求項２１】
前記第一の物質を穿孔する穿孔工程が、前記微粒子集合体と前記第一の物質を衝突させ前記第一の物質を穿孔することを特徴とする請求項１８に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２２】
前記第一の物質内部で前記微粒子と標的物質とを結合させる工程が、前記第一の物質内で前記微粒子を駆動する工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２３】
前記駆動する工程が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項２２に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２４】
前記微粒子が前記標的物質と結合し前記複合体を形成した後、前記微粒子が前記第一の物質に内包されたまま前記複合体を所定位置まで駆動し保持する工程を有することを特徴とする請求項１８に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２５】
前記微粒子が前記第一の物質に内包されたまま前記複合体を所定位置まで駆動し保持する工程が、前記反応場に印加される磁界であることを特徴とする請求項２４に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２６】
前記複合体を前記所定位置に保持した後、少なくとも前記第一の物質の構造を破壊する破壊工程を有することを特徴とする請求項２３または２４に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２７】
前記破壊工程が、請求項６に記載の前記第一の物質の構造を破壊可能な薬品を内包した集合体から放出される前記薬品であることを特徴とする請求項２６に記載の標的物質抽出方法。
【請求項２８】
前記集合体を前記第一の物質もしくは前記反応場内の前記第一の物質近傍で衝突させることにより分解させ、内包された薬品を前記反応場に放出させることを特徴とする請求項２７に記載の標的物質抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁界により位置制御可能な粒子を用いて試料の中から標的物質を抽出装置およびその方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
磁界に反応する粒子を用いて試料の中から標的物質を抽出する方法が一般に知られている。
【０００３】
これはカオトロピック物質の存在下で核酸がシリカに結合することを利用して試料の中から核酸を磁気回収し分離するものである。
【０００４】
磁性粒子に微小物質を保持させる場合、磁性粒子のサイズが小さいと体積に対する表面積の比が増えるので同体積または同重量の磁性粒子を用いると微小物質を捕獲しやすくなるが、磁性粒子１個あたりの磁性量が少ないので磁界の影響力が小さく、駆動するために大きな磁界を要求され、制御が難しくなるという問題があった。
【０００５】
磁性粒子のサイズを大きくすると磁性量が多いので磁界の影響力が大きくなり、駆動もしやすくなるが、体積に対する表面積の比が減少するので、同体積または同重量の磁性粒子を用いると微小物質を捕獲しにくくなり捕獲効率が低下するという問題があった。
【０００６】
こういった問題を解決するために表面の多数の穴、凹凸に磁性粒子のように遠隔操作できる遠隔作用体と、検査の目的物質を保持した担体が提案されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平９−３２９６０２号広報
【非特許文献１】Ｎａｗａｌ  Ｋｉｓｈｏｒ  Ｍａｌ（ナワル・キショール・マル）、藤原正浩、田中裕子，”化学物質の出入りが自由自在なカプセル材料”，［ｏｎｌｉｎｅ］、平成１５年１月２３日、独立行政法人  産業技術総合研究所、［平成１５年１月２３日検索］＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｉｓｔ＿ｊ／ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅ／ｐｒ２００３／ｐｒ２００３０１２３／ｐｒ２００３０１２３．ｈｔｍｌ＞、英科学誌ネーチャー、２００３年１月２３日号、Ｎａｗａｌ  Ｋｉｓｈｏｒ  Ｍａｌ（ナワル・キショール・マル），  Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｆｕｊｉｗａｒａ（藤原正浩）  ａｎｄ  Ｙｕｋｏ  Ｔａｎａｋａ（田中裕子），”Ｐｈｏｔｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｇｕｅｓｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ”、Ｎａｔｕｒｅ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示された技術は、担体表面に穴、凹凸を形成して目的物質の捕獲効率向上をはかっているが担体自体の外形は比較的大きく、体積に対する表面積の比が小さい、という問題に対する完全な解決策とはいえない。また遠隔作用体が表面に露出しているため保存状態で磁気凝集する可能性がある。
【０００８】
さらに、一般には磁性粒子と標的核酸の結合を、磁性粒子の大きさに対して比較的大きい空間、例えばチューブやチャンバ内で行なうことが多いため、磁性粒子と標的核酸が接触する確率が小さいため回収効率を確保するために時間を要するという課題があった。
【０００９】
また、大きさがそろった細孔を有するシリカゲルの数ｎｍの細孔出口部分に開閉可能な観音開き状の有機分子のドアを構成したものが開発されている。このドアはある波長の紫外線を照射することにより開閉し、この構造体の内部に化学物質を貯蔵し、必要なときにドアを開けて放出することが提案されている。（非特許文献１参照）
これを応用してシリカゲル内部に粒子を導入して遠隔操作し、必要な場所で放出することが考えられる。
【００１０】
これにより比較的小さな粒子を用いることができるため体積に対する表面積の比が小さい、という問題を解決できる可能性があるが、標的核酸との結合を、磁性粒子の大きさに対して比較的大きい空間で行なう場合は上記と同様の問題が生じる場合がある。
【００１１】
また、有機分子のドアを構成する手間や、ドアの開閉に異なる波長の紫外線を照射する手段が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を基材内に複数個内包して集合させた内包型の微粒子集合体であって、内包された微粒子の放出を制御可能であることを特徴とする微粒子集合体である。
【００１３】
本発明の集合体は、上記の集合体以外に、内部に標的物質を有する第一の物質の構造を破壊可能な薬品を内包し、反応場に投入されてから分解し薬品を放出するものであってもよい。
【００１４】
更に本発明は、内部に標的物質を有する第一の物質を反応場に投入する工程と、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を基材内に複数個内包して集合させた内包型の微粒子集合体であって、内包された微粒子の放出を制御可能である微粒子集合体を反応場に投入する工程と、微粒子集合体を前記第一の物質内部に導入する工程と、微粒子集合体を第一の物質内部で分解させ内包された微粒子を放出する工程と、第一の物質内部で前記微粒子と標的物質と結合させる工程と、記微粒子と標的物質が結合した複合体を回収する工程と、複合体から前記標的物質を回収する工程とを有することを特徴とする標的物質抽出方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の微粒子集合体は、複数個の磁性粒子を内包した構造を有するため磁界の影響力を受けやすく駆動しやすく、かつ標的物質と結合する際には分解して個々の小さな微粒子となって動くので微小物質を捕獲しやすくなる。すなわち従来技術の相反する課題を解決することができる。
（１）  集合体を加熱や酵素処理等の簡単な手段で分解可能に構成したので、装置の構成が簡素である。
（２）  磁性粒子が集合体に内包されているため保存状態での凝集が生じにくい。
（３）  標的物質と磁性粒子の結合が細胞などの被処理物の中の限られた空間で行なわれるため接触の回数も多く、反応（結合）効率が良い。
（４）  標的物質と磁性粒子が結合してできた複合体を細胞などの被処理物内で任意方向に集中させて保持したまま細胞などの被処理物を破壊するので、複合体を比較的広い反応場に浮遊させることがない。したがって回収時間が短く効率も良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の集合体は、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を基材内に複数個内包して集合させた内包型の微粒子集合体であって、内包された微粒子の放出を制御可能であることを特徴とする微粒子集合体である。この際、微粒子集合体には微粒子と標的物質の結合反応を促進する結合反応促進剤を内包していることが好ましく、微粒子集合体はその内部で微粒子と反応促進剤が反応の順に多層に内包され、微粒子と反応促進剤がこの順に放出されることがより好ましい。
【００１７】
標的物質が核酸であり、微粒子は、少なくとも表面の一部にシリカ層がコーティングされ、反応促進剤がカオトロピック物質であることが好ましい。
【００１８】
標的物質が核酸の場合、微粒子は表面に核酸と結合可能な修飾を施しても良い。
【００１９】
更に、集合体は、微粒子の変わりに、内部に標的物質を有する第一の物質の構造を破壊可能な薬品を内包させることで、第一の物質の構造を破壊する際に使用することができる。
【００２０】
集合体の具体的な構成の一例は、外殻を構成するカプセル部分と、カプセル内に複数個の磁界により位置制御可能な微粒子あるいは第一の物質の構造を破壊する薬品が内包されている構成を挙げることができる。
【００２１】
磁界により位置制御可能とするための微粒子としては、磁性微粒子が好ましい。磁性微粒子としては、磁気に反応する金属あるいはフェライトのような材料を用いることができる。磁石からの磁界に対応して磁石に引き寄せられる力は、磁性微粒子が強磁性体であることが好ましい。
【００２２】
磁性微粒子は、カプセルに内包され外部と遮断されているため、保存状態で、複数の集合体間での凝集が生じにくい構成となっている。
【００２３】
更に、内包された微粒子は標的物質（例えば、核酸）と結合するために表面に表面修飾が施されている。
【００２４】
上記の構成以外に、反応場に投入後、標的物質が内包された被処理物、例えば、マクロファージ（大食細胞）の細胞壁を破壊する薬品をカプセル内に内包させ、反応場に投入後集合体のカプセルを分解して薬品を放出する構造も標的物質を抽出する際に使用することができる。
【００２５】
本発明は、少なくとも、内部に標的物質を有する第一の物質を反応場に投入する手段と、上述の、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を複数個内包した集合体を反応場に投入する手段と、微粒子集合体を第一の物質内部に導入する手段と、微粒子集合体を第一の物質内部で分解し内包された微粒子を放出する手段と、第一の物質内部で微粒子と標的物質と結合させる手段と、微粒子と標的物質が結合した複合体を回収する手段と、複合体から標的物質を回収する手段とを有する標的物質抽出装置である。
【００２６】
微粒子集合体を第一の物質内部に導入する手段は、反応場に印加される磁界であっても良い。更に、微粒子集合体を第一の物質内部に導入する手段が、第一の物質を穿孔する穿孔手段と、第一の物質の穿孔部分から微粒子集合体を導入する手段とからなっていても良い。
【００２７】
微粒子集合体を第一の物質内部に導入する手段は、微粒子集合体と第一の物質を衝突させ第一の物質を穿孔する手段と、第一の物質の穿孔部分から微粒子集合体を投入する手段とからなっていても良い。
【００２８】
第一の物質内部で微粒子と標的物質と結合させる手段は、第一の物質内で微粒子を駆動する手段を含むことができる。この駆動手段は、反応場に印加される磁界であっても良い。
【００２９】
微粒子が標的物質と結合し複合体を形成した後、微粒子が第一の物質に内包されたまま複合体を所定位置まで駆動し保持する手段を有することもできる。
【００３０】
微粒子が第一の物質に内包されたまま複合体を所定位置まで駆動し保持する手段は、反応場に印加される磁界であっても良く、複合体を所定位置に保持した後、少なくとも第一の物質の構造を破壊する破壊手段を有することができる。
【００３１】
破壊手段として、反応場に投入後、標的物質が内包された第一の物質、例えば、マクロファージ（大食細胞）の細胞壁を破壊する薬品をカプセル内に内包させ、反応場に投入後集合体のカプセルを分解して薬品を放出するような集合体を使うこともできる。この集合体を使う場合、集合体を第一の物質もしくは反応場内の第一の物質近傍で衝突させることにより分解させ、内包された薬品を反応場に放出することで第一の物質を破壊することができる。
【００３２】
更に、本発明は、内部に標的物質を有する第一の物質を反応場に投入する工程と、磁界により位置制御可能な微粒子が内包されている微粒子集合体を反応場に投入する工程と、微粒子集合体を第一の物質内部に導入する工程と、微粒子集合体を第一の物質内部で分解させ内包された微粒子を放出する工程と、第一の物質内部で微粒子と標的物質と結合させる工程と、微粒子と標的物質が結合した複合体を回収する工程と、複合体から標的物質を回収する工程とを有することを特徴とする標的物質抽出方法である。
【００３３】
微粒子集合体を第一の物質内部に導入する工程は、反応場に印加される磁界であても良く、微粒子集合体を第一の物質内部に導入する工程が、第一の物質を穿孔する穿孔工程と、第一の物質の穿孔部分から微粒子集合体を導入する工程とからなっていても良い。
【００３４】
第一の物質を穿孔する穿孔工程は、微粒子集合体と第一の物質を衝突させ第一の物質を穿孔することができる。
【００３５】
第一の物質内部で微粒子と標的物質と結合させる工程は、第一の物質内で微粒子を駆動する工程を含んでいても良く、駆動する工程は、反応場に印加される磁界であっても良い。
【００３６】
更に、微粒子が標的物質と結合し複合体を形成した後、微粒子が第一の物質に内包されたまま複合体を所定位置まで駆動し保持する工程を有することができ、この微粒子が第一の物質に内包されたまま複合体を所定位置まで駆動し保持する工程は、反応場に印加される磁界であっても良い。
【００３７】
更に、複合体を所定位置に保持した後、少なくとも第一の物質の構造を破壊する破壊工程を有しても良い。この破壊工程は、反応場に投入後、標的物質が内包された第一の物質、例えば、マクロファージ（大食細胞）の細胞壁を破壊する薬品をカプセル内に内包させ、反応場に投入後集合体のカプセルを分解して薬品を放出するような集合体から放出される薬品であっても良い。この際に、集合体を第一の物質もしくは反応場内の第一の物質近傍で衝突させることにより分解させ、内包された薬品を反応場に放出させることができる。
【００３８】
標的物質となる対象の細胞を含む試料が導入された反応場へ、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子（例えば、磁性微粒子）を複数個内包した微粒子集合体（以下、集合体と略す場合がある。）を投入する。反応場の周辺には電極、電磁石が配置されている。電極にパルス電圧印加し、反応場に電界を発生させて対象の細胞に穿孔を行なう。それと同時に電磁石に電流を流し、反応場に磁界を印加して集合体中の微粒子に磁界を作用させて対象の細胞に引き寄せる。細胞近傍まで引き寄せられた微粒子は穿孔部から細胞内に入っていく。この際、電磁石に印加する電流はパルス電流であっても良い。
【００３９】
穿孔は数ミリ秒以内に閉じてしまうため、穿孔が形成されている時間内に電磁石により磁界を発生させ微粒子を効率よく移動させて細胞内に投入させる。また、電気穿孔を行なうパルスの回数や電圧値及びパターン、あるいは電磁石のオン／オフや電流値を調節し最適化することができる。
【００４０】
集合体は細胞内に導入されるとそのカプセル部分が溶解し、磁性微粒子が細胞内に放出される。
【００４１】
集合体に、少なくとも表面の一部が標的物質と結合可能な処理がなされ、磁界により位置制御可能な微粒子を複数個内包させることで、微粒子を小さな磁力で効果的に駆動することができ、かつ細胞内では多数の微粒子により多くの標的物質を捕獲することができる。
【００４２】
細胞内に放出された微粒子の表面に形成された修飾部分が細胞内に存在する標的核酸と結合する。
【００４３】
なお、このときに電磁石により磁界を変化させる、あるいは複数の電磁石を設け、各々の電磁石の磁界を変化させ細胞内で微粒子を動かすことにより、浮遊する微粒子と標的核酸が接触する確率が高くなり結合する数が増えて効率が高くなる。この間、電極にパルス電圧は印加されていないので細胞は閉じていて磁性粒子が細胞外部に漏れることはなく、標的核酸と微粒子を限られた空間内で効率的に反応させることができるので結合効率を上げることができる。
【００４４】
磁性粒子が標的核酸と結合した後、電磁石により磁性粒子−核酸の複合体を細胞の一方に集中させる。集中させる場所は、細胞が動かないように保持できる場所であれば特に制約はない。
【００４５】
複合体を細胞の一方に集中させた後、電極にパルス電圧を印加して穿孔を開始するとともに、反応場に細胞処理する酵素を投入し穿孔部から細胞内に浸入させる。このときは集合体を細胞に投入するときよりも大きな電圧をより短い周期で印加などして細胞膜の穿孔をじょじょに大きくしていくとともに酵素の力によって細胞の破壊を進める。このとき磁界は継続して印加されており磁性粒子−核酸の複合体は任意面に保持されている。
【００４６】
細胞膜の破壊が進行していくと磁性粒子−核酸の複合体が反応場に露出し、磁界が印加されているので磁性粒子−核酸の複合体は保持面固定されたままなので複合体が反応場に浮遊することがないので回収効率が高い。この時点で電極へのパルス電圧の印加を停止する。
【００４７】
細胞膜の破壊が終了したら反応場に水、低塩濃度の緩衝溶液といった溶液を投入して磁性粒子−核酸の複合体から核酸のみを溶出させる。この間、磁界により磁性粒子は任意面に保持されており、溶出液により核酸だけが反応場に浮遊する。この後、核酸を所定位置に回収する。
（第１の実施例）
本実施例では、磁界を印加することによって動かすことができる複数の磁性微粒子を内包した集合体について図面を用いて説明する。
【００４８】
図１、図２、図９及び図１０は、磁界を印加することによって動かすことができる複数の磁性微粒子を内包した集合体の構造を示す断面図である。
【００４９】
図１に示す複数の磁性微粒子を内包した集合体１は、集合体の外殻を構成するカプセル部分２と外部から印加された磁界によって動かされる磁性微粒子３と、磁性微粒子３の表面に形成された核酸と結合させるための表面修飾層４から形成されている。集合体がカプセル構造の場合、外殻や皮膜などのカプセル構造体そのものの、微粒子を結合剤層に分散状態で含む場合の結合剤層などに相当する。
【００５０】
集合体の外殻を構成するカプセル２は、リン脂質からなる数１００ｎｍ程度以下の大きさのリポソ−ム（脂質二重層膜閉鎖小胞）あるいはゼラチン、セルロース、ワックス、その他一般にマイクロカプセルに用いられる材料であっても良い。リポソームによるカプセルの製法はすでに内部に薬剤を内包したドラッグデリバリーシステムで実現されており、それと同じ製造方法で作成する。製法の一例としては特開平０９―０２４２６９に記載されているようなものがある。またその他のカプセルの製法としては界面沈積法、界面反応法といった公知の技術を用いて作成すればよい。磁性微粒子３は、大きさ数ｎｍ〜数１０ｎｍ程度のフェライトやニッケル等の金属微粒子であり、カプセル２の中に複数個内包されている。磁性微粒子３の材料は上記以外であっても、外部磁界で駆動可能であれば良い。表面修飾層４は、本実施例ではシリカコーティングされたものを用いた。以下、磁性微粒子の表面にシリカコーティングを表面修飾層として形成したものをシリカ磁性微粒子と称する。カプセル部分２は、磁性微粒子３の他に緩衝溶液や水を内包させても良い。本実施例では、カオトロピック物質５が内包されている。
【００５１】
本実施例では大きさ１５〜２０μｍのマクロファージ中から核酸を抽出するのに適した、カプセル２、磁性微粒子３の大きさを示しているが、用途に応じて適した大きさにすれば良い。また内包する磁性微粒子３の個数は抽出する対象に応じて適した個数にすれば良い。
【００５２】
図２は集合体１の別の形態を示すものである。カプセルが二重に構成されたもので、セルロース外壁１７、磁性微粒子１８、磁性微粒子１８の表面修飾層１９、セルロース内壁２０およびセルロース内壁２０に内包されるカオトロピック物質２１から構成されている。図２に示すようにカプセルを二重構造にして外側から磁性粒子１８、カオトロピック物質２１の順番に個別にまとめても良い。
【００５３】
製法は特に記載しないが、通常の２重構造のカプセルの製造方法と同様の製法をもちいて製造することができる。
【００５４】
図１および２に示される集合体１はリポソームで構成したカプセルにシリカ磁性微粒子を内包したものであったが、錠剤の形状をした集合体を使うこともできる。
【００５５】
図９は錠剤２２の断面図である。磁性微粒子２４は、結合剤および必要に応じ用いられるその他の成分２３により錠剤２２を構成している。ここで結合剤はセルロースである。
【００５６】
上述の第１の実施例および第２の実施例と同様、磁性微粒子２４は、表面にシリカコーティングが施され、図１における磁性微粒子３および表面修飾層４をまとめて表わしたものである。錠剤２２には磁性微粒子の他にカオトロピック物質も含まれている。
【００５７】
図１０は錠剤２２の別の形態を示すものである。磁性粒子２４、カオトロピック物質２５でありこのように錠剤２２を二重構造にして外側から磁性粒子２４、カオトロピック物質２５の順番で個別にまとめても良い。錠剤は湿式顆粒圧縮法、乾式顆粒圧縮法、直接打錠法といった公知技術を用いて作成することができる。
【００５８】
図示しないが、上記のカプセル構造を用い、その中に複数の磁性微粒子を含む集合体以外に、内部に標的物質を有する被処理物の構造を破壊可能な薬品を内包した集合体としても良い。
（第２の実施例）
血液中のマクロファージに含まれる感染症の細菌の核酸を取り出す例について説明する。血液中のマクロファージの大きさは、１５〜２０μｍであるので図１に示す集合体１を用いた。
【００５９】
図３は本発明による核酸抽出装置の第一実施例の概略構成を示す図である。
【００６０】
図３に示した核酸抽出装置は、少なくとも内部に標的物質となる血液の成分を含む被処理物であるマクロファージ６、磁性微粒子や細胞を含む試料などを導入するための流路７、マクロファージ６へ集合体１を導入する反応場８、反応場を挟み込むように配置され、パルス発生電源（不図示）に接続された一対の電極９Ａ、９Ｂ及び反応場に磁界を発生する少なくとも１以上の電流を制御できる電流制御装置（不図示）と接続された電磁石１０が配置されている。電磁石１０は、磁界により集合体１０を移動させる機能を持っているので、集合体１０を移動することでマクロファージ６に形成された電気穿孔から集合体１０をマイクロファージ６内に導入するものである。集合体１０に任意の運動を起こさせるためには複数の電磁石を反応場に設け、複数の電磁石をオン・オフすることで制御することができる。電磁石１０の変わりに永久磁石を用いても良いことは言うまでもない。永久磁石を用いる場合は、永久磁石を反応場から遠ざける、あるいは、少なくとも永久磁石の反応場に面する側に磁場を遮蔽する、例えばアルミニウムのような非磁性体で覆うことで達成される。
【００６１】
マイクロファージ６は、外壁を介して外部と区分された内部領域を内包し、この領域内に内包される標的物質となる血液成分等は移動可能である。
【００６２】
図中、電磁弁２６および２８が排出路２７および２９に形成されている。この電磁弁２６および２８が形成された排出路２７および２９は反応場中に浮遊した核酸および溶出液を流すものである。排出路２９の先には不図示の回収部があり、そこで核酸および溶出液が回収される。なお、電磁弁２６を経由する排出路２７は核酸、溶出液以外の反応場に投入した物質、溶液を流して廃棄する経路となっている。
【００６３】
図４および図８の反応場は図３と同一のものであるので上記の構成の説明は省略する。
【００６４】
次に、核酸抽出装置を用いた核酸抽出方法を説明する。
【００６５】
まず、マクロファージ６を含む試料を流路７から反応場８へ注入する。マクロファージ６を含む試料溶液は水を用い調製した。試料溶液を調製用の媒体としては、水以外に緩衝溶液を用いることができる。マクロファージを含む試料溶液を反応場に導入するとマクロファージ固定プレート１１の表面にマクロファージ６が付着する。
【００６６】
マクロファージ固定プレート１１としては市販されているマクロファージ(単球)純粋分離用特殊コーティングプレートを用いた。
【００６７】
次に、反応場８を挟むように配置された一対の電極９Ａ、９Ｂにパルス電圧を印加する。このとき、細胞膜内外の電位差が１ボルト程度以上になるようにパルス電圧を印加するとマクロファージ６の表面に一過的な穿孔が開く。この現象は電気穿孔と呼ばれ、細胞の両電極に面した細胞膜間の電位差を打ち消すように細胞内でイオンが移動し、それによって発生した細胞膜内外の電位差によって細胞膜の静電破壊が起こるものと考えられている。
【００６８】
集合体１は、試料を反応場８に投入する前から反応場８に入れておいても良いし、試料を反応場８に投入してから投入しても良い。図３に示される核酸抽出装置では反応場８の上部に集合体１を格納する貯蔵部１２が設けられている。試料を反応場に投入する前は弁１３により反応場から遮断されている。
【００６９】
図４はマクロファージ６に電気穿孔を行ないながら集合体１を反応場８に投入している図である。
【００７０】
電極９Ａ、９Ｂにパルス電圧を印加するのとほぼ同時に集合体保持部の弁１３（図３参照）を開放し、電磁石１０を駆動させる。図４のマクロファージ６の外形線が途切れている部分が穿孔部であり、ここから集合体１がマクロファージ６内へ導入される。図４では各マクロファージ６に集合体１が１個ずつ導入された状態を示すもので、予想される標的核酸の数、集合体１内の磁性微粒子３の数、対象細胞（ここではマクロファージ）の大きさによって適正な個数を導入すれば良い。穿孔回数、時間により導入する個数を制御する。１４はマクロファージ６から取り出す標的核酸で感染症の細菌の核酸である。
【００７１】
図１１は、電極９Ａ、９Ｂに印加するパルス電圧と電磁石に印加する電流のタイミングを示すタイミングチャートである。
【００７２】
電磁石に印加するパルス電流は、電極９Ａ、９Ｂに電圧が印加されマイクロファージ６に電気穿孔が生じるタイミングで集合体１が所望の運動量を得るように電流を磁石に印加する（図１１  １参照）必要があり、電極への電圧の印加が終了し、マイクロファージ６に生じた電気穿孔が閉じるタイミング（図１１  ２参照）では、集合体１の運動は停止しても良いので磁石への電流の印加をとめても良い。
【００７３】
穿孔は数ミリ秒以内に閉じてしまうため、その時間内に電磁石１０により磁界を発生させ磁性粒子を効率よく移動させて細胞内に投入させる。また、電気穿孔を行なうパルス回数や電圧及びパターン、あるいは電磁石１０のオン／オフや電流値は任意に調節し最適化することができる。
【００７４】
図５は１個のマクロファージ６の拡大図であり、シリカ磁性微粒子１５は図１の磁性微粒子３および表面修飾層４をまとめて表わしたものである。シリカ磁性微粒子１５がマクロファージ６内を浮遊し、その一部が標的核酸１４と結合している状態を示している。
【００７５】
集合体１のカプセル２（図１参照）は、温度に応答して親水性から疎水性に変化する温度感受性高分子で表面修飾されたリポソ−ムとすることにより、内包したシリカ磁性微粒子１５の放出を温度によって制御できる。例えば４０℃程度で親水性から疎水性へ変化する外膜を有するリポソ−ムを用い、マクロファージ６内に集合体１が投入されてから不図示の加熱手段により反応場８を加熱して集合体１内部のシリカ磁性微粒子１５をマクロファージ６内に放出させる。また、膜融合能を有するリポソ−ムを用いて、集合体１と細胞膜が融合することにより、集合体の中身を細胞の内部に導入しても良い。また、カプセル２は浸透圧で分解するものであっても良い。
【００７６】
カプセル２は対象の細胞（ここではマクロファージ）の中に入ってから分解する構成でも良いし、細胞内に入る前からじょじょに分解していく構成であっても良い。例えば投入されてからじょじょに分解し、対象細胞に入る前から内部の微粒子が放出されるものであっても、磁界によって集合体１が近傍まで引き付けられているので、穿孔部から細胞内に必要とされる量のシリカ磁性微粒子１５を投入できるからである。
【００７７】
上述の構成にすることにより磁性微粒子を小さな磁力で効果的に駆動することができ、かつ細胞内では多数の微粒子により多くの標的物質を捕獲することができる。
【００７８】
マクロファージ６内でカプセル２が分解すると内包されていたシリカ磁性微粒子１５とカオトロピック物質が細胞内に放出される。マクロファージ６には細菌の核酸が存在しており、カオトロピック物質の存在下で核酸がシリカに吸着されることを利用してシリカ磁性微粒子１５で細菌の核酸を回収する。カオトロピック物質は集合体１に内包させても良いし、反応場８に試料とともに混合しておいて、穿孔部から浸入することを利用しても良い。
【００７９】
このときに電磁石１０（図４参照）により磁界を変化させてマクロファージ６内でシリカ磁性微粒子１５を動かすことにより、浮遊するシリカ磁性微粒子１５と細菌の核酸１４が接触する確率が高くなり結合する数が増えて結合効率が高くなる。
【００８０】
またこの間、電極９Ａ、９Ｂにパルス電圧は印加されていないのでマクロファージ６は閉じていて外部にシリカ磁性微粒子１５が漏れることはなく、核酸１４とシリカ磁性微粒子１５を限られた空間内で効率的に反応させられることも結合効率を上げることに寄与している。
【００８１】
図６は１個のマクロファージ６の拡大図でシリカ磁性微粒子１５と細菌の核酸１４とが結合したものの一部を示したものである。
【００８２】
シリカ磁性微粒子１５が核酸１４と結合した後、電磁石１０（図４参照）によりシリカ磁性微粒子１５−核酸１４の複合体１６をマクロファージ６内の一方に集中させる。後述する核酸１４の溶出をマクロファージ固定プレート１１上以外の任意面で行なう場合には、マクロファージ６をマクロファージ固定プレート１１から開放して、磁界を印加して複合体を駆動することによりマクロファージ６ごと任意面まで駆動して、任意面上で複合体１６（マクロファージ６）を保持する。
【００８３】
複合体１６を動かないように保持できる面であれば面の場所に特に制約はない。図６では複合体１６をマクロファージ固定プレート面側へ集中させた保持した状態を示している。
【００８４】
図７は１個のマクロファージ６およびマクロファージ固定プレート１１の拡大図で、マクロファージ６を破壊している状態を示している。
【００８５】
複合体１６をマクロファージ６内の一方に集中させた後、電極９Ａ、９Ｂにパルス電圧を印加して穿孔を開始するとともに、反応場８に細胞処理手段、例えば酵素を投入する。このときは集合体１をマクロファージ６に投入するときよりも大きな電圧をより短い周期で印加する等により細胞膜の穿孔をじょじょに大きくしていくとともに酵素の力によってマクロファージ１の破壊を進める。このとき磁界は継続して印加されており複合体１６はマクロファージ固定プレート１１側に集中している。これにより細胞破壊の際に複合体１６が反応場８内に浮遊することを防ぐことができる。細胞壁の破壊が進行していくと複合体１６が反応場８に露出し、磁界が印加されているので複合体１６はマクロファージ固定プレート１１に固定される。この時点で電極９Ａ、９Ｂへのパルス電圧の印加を停止する。
【００８６】
図８は複合体１６が反応場８のマクロファージ固定プレート１１に磁力で保持されている状態を示す。
【００８７】
複合体１６は他の部分より強調するために拡大してある。なおこの時点で弁１３は閉じているので集合体は反応場８から遮断されて貯蔵部１２に格納されている。
【００８８】
次に、反応場８に核酸１４を溶出するために水あるいは低塩濃度の緩衝溶液等の溶出液を投入する。
【００８９】
溶出液を投入することによりカオトロピック物質の濃度が相対的に下がるためシリカ層と核酸１４の結合力が弱くなり分離する。ここでも磁界によりシリカ磁性微粒子１５はマクロファージ固定プレート１１側に引き付けられており、溶出液により核酸１４だけが反応場に浮遊する。電磁弁２７を開放し排出路２９へ浮遊した核酸および溶出液を流す。排出路２９の先には不図示の回収部があり、そこで核酸および溶出液が回収される。なお、電磁弁２６を経由する排出路２７は核酸、溶出液以外の反応場に投入した物質、溶液を流して廃棄する経路となっている。
【００９０】
なお、本実施例ではマクロファージから標的核酸を回収し抽出する方法について記載したが、本発明はマクロファージ、核酸に限定されずあらゆる細胞内に存在する標的物質を回収し抽出する場合も本例の考え方を適用できる。
（第３の実施例）
第２の実施例ではカプセルを温度感受性高分子で表面修飾されたリポソ−ムとすることにより、内包した磁性粒子の放出を温度によって制御したが、本実施例の集合体の形状は図２に示す形状の集合体１を用い、更に、カプセルがセルロース外壁１７有しこれが細胞内で分解することにより磁性微粒子１８を放出する構成である。
【００９１】
セルロース外壁１７を分解するために反応場８（図３参照）にセルロース分解酵素を投入する。図２のようにカオトロピック物質２１がもっとも内側にあるので外側のセルロース１７が酵素反応で分解するときはカオトロピック物質２１がまだ内側のセルロース２０に密閉された状態にある。したがってカオトロピック物質２１が酵素のはたらきを阻害することを防ぐことができるため集合体１内部の磁性粒子１８をすべて放出させてから、セルロース内壁２０が分解され最後にカオトロピック物質が放出される。
（第４の実施例）
図９に示す錠剤２２の形状をした集合体を用いて血液中のマクロファージに含まれる感染症の細菌の核酸を取り出す例について説明する。
【００９２】
マクロファージの穿孔および集合体の投入方法は第１実施例と同様、パルス電圧と磁界を同時期に印加することにより穿孔と投入を行なうものである。
【００９３】
このとき反応場にセルロース分解酵素を混合しておき穿孔部分からマクロファージ内部に酵素が浸入できるようにすると、マクロファージ内部に投入された錠剤２２のセルロース層２３が酵素によって分解しやすくなる。酵素を用いる場合は、実施例３と同様に図１０のような二重構造の錠剤２２を用いれば、酵素でセルロース層２３を分解させるときにはカオトロピック物質は放出されていないので、カオトロピック物質２５による酵素反応の阻害を防ぐことができる。
【００９４】
セルロース層２３が分解して錠剤２２内部のシリカ磁性粒子２４およびカオトロピック物質２５が反応場に放出されたらパルス電圧の印加を停止し磁界は継続して印加してマクロファージ内部でシリカ磁性粒子２４をランダムに動かして核酸と接触する確率を高める。
【００９５】
シリカと核酸が結合した後のシリカ磁性粒子−核酸の複合体の集中、マクロファージの破壊、核酸の溶出は第１実施例と同様である。
【００９６】
錠剤化することにより保存状態において磁性粒子は離れた状態にあるので磁性粒子同士が凝集することを防ぐことができる。
（第５の実施例）
上述の実施例では磁性微粒子にシリカが表面修飾されていたが、標的核酸と結合する核酸プローブが固定されていても良い。
【００９７】
磁性微粒子に標的核酸と結合する核酸プローブを固定する方法は、通常の方法で行えることはいうまでもない。また、表面に核酸プローブが固定された磁気微粒子を内包する集合体は、実施例１と同様の製法で製造できるので詳細な説明は省略する。
【００９８】
本実施例においても、集合体が対象細胞（マクロファージ）に投入されて磁性粒子を放出するまでの工程は上述の実施例と同様である。
【００９９】
集合体が対象細胞（マクロファージ）に投入されて磁性粒子を放出後、標的核酸と磁性粒子を結合させるには磁性粒子が放出された後に反応場の温度を上昇させる。マクロファージ内の細菌核酸の２本鎖が１本鎖に分離する温度まで加熱しながら、磁界を変化させて磁性粒子をランダムに動かす。磁性粒子が動きまわることにより表面に固定された核酸プローブが標的とする１本鎖と接触し、水素結合すなわちハイブリダイゼーションにより磁性粒子−核酸プローブ−標的核酸の複合体が形成される。
【０１００】
複合体が形成された後の複合体の集中、マクロファージの破壊は上記実施例と同様である。複合体近傍を加熱してプローブ核酸と標的核酸を分離し、プローブ核酸付き磁性体が保持されたままの状態で溶出液を流して標的核酸を回収する。
【０１０１】
また、シリカによる結合、プローブによる結合以外にも抗原抗体反応を利用して標的核酸を回収しても良い。
（第６の実施例）
上述の実施例ではエレクトロポレーション法で対象細胞を穿孔しているが、パーティクルガン法を用いて細胞内に磁性粒子を内包した集合体を打ちこんでも良い。集合体が対象細胞に衝突したことによって分解し、内包した磁性粒子が放出されても良い。このとき一部の粒子は細胞の近傍で内部に進入する前に集合体から放出されることになるが、打ちこみの際に磁界も印加することにより対象細胞外部に放出された磁性粒子も細胞内に引き込むことができる。
（第７の実施例）
上述の実施例では複合体が形成されて、任意面に保持させた後に対象細胞を破壊する際に反応場にパルス電圧を加えながら酵素を投入しているが、パーティクルガン法を用いて酵素の集合体を対象細胞に衝突させても良い。酵素を内包した集合体を形成しておき、対象細胞と衝突したときの衝撃によって細胞近傍で集合体が分解し、内包されている酵素が放出されて対象細胞を破壊する構成である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】集合体の断面図
【図２】集合体の別の形態を示す断面図
【図３】本発明による核酸抽出方法の第１実施例の概略構成を示す図
【図４】本発明による核酸抽出方法の第１実施例の概略構成を示す図
【図５】マクロファージ内で磁性粒子と核酸が浮遊および一部が結合している図
【図６】複合体がマクロファージ内で一方に集められた図
【図７】マクロファージの細胞壁を破壊した図
【図８】複合体が反応場のマクロファージ固定プレートに保持されている図
【図９】錠剤の断面図
【図１０】錠剤の別の形態を示す断面図
【図１１】電極および電磁石へ印加する電圧および電流のタイミングを示す概略図。
【符号の説明】
【０１０３】
１：  集合体
２：  リポソーム
３：  磁性微粒子
４：  表面修飾層
５：  カオトロピック物質
６：  マクロファージ
８：  反応場
９Ａ、９Ｂ：  電極
１０：  電磁石
１１：  マクロファージ固定プレート
１４：  標的核酸
１５：  シリカシリカ磁性微粒子
１６：  シリカシリカ磁性微粒子−標的核酸の複合体
１７：  セルロース外壁
１８：  磁性粒子
１９：  表面修飾層
２０：  セルロース内壁
２１：  カオトロピック物質
２２：  錠剤
２３：  セルロース層
２４：  磁性粒子
２５：  カオトロピック物質
【図１】
2006042621.tif 000003
【図２】
2006042621.tif 000004
【図３】
2006042621.tif 000005
【図４】
2006042621.tif 000006
【図５】
2006042621.tif 000007
【図６】
2006042621.tif 000008
【図７】
2006042621.tif 000009
【図８】
2006042621.tif 000010
【図９】
2006042621.tif 000011
【図１０】
2006042621.tif 000012
【図１１】
2006042621.tif 000013