(57)【要約】【課題】遺伝情報を担っているＤＮＡやＲＮＡを人為的に操作するために、核酸分子を物理的に効率よく切断する技術を提案する。【解決手段】核酸分子を含む溶液を、その内部を通過させる間に該核酸分子を切断する細管において、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m以上のセラミック被膜を被覆する。【選択図】図３
2006304641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む溶液を、その内部を通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項２】
核酸分子を含む溶液を、その内部を通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項３】
核酸分子を含む溶液を、その内部を通過通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【請求項７】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項８】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項９】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項１２】
請求項７〜11のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項１３】
請求項７〜12のいずれかにおいて、前記細管内における前記溶液の通過速度を0.1〜100m/minの範囲内の一定速度としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。
【請求項１４】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【請求項１５】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【請求項１６】
核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【請求項１７】
請求項14〜16のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【請求項１８】
請求項14〜16のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【請求項１９】
請求項14〜18のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝情報を担っているＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）に大別される核酸分子を効果的に切断するための細管ならびにそれを用いた核酸分子の切断方法および切断装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡを主とする遺伝情報に関する分子生物学の進歩は目ざましく、ＤＮＡの組み替え技術を利用して新製品の開発が盛んに行われるようになってきている。ＤＮＡは、図１の模式図（例えば、生命科学のコンセプト「分子生物学」小関治男ほか著、化学同人、p.28参照）に示すように、太さが約20Å（図では2.3nmとなっている）で非常に長い（例えば細菌ウイルスの一種であるラムダ（λ）ファージでは約17μm の長さをもつ）鎖状の高分子であるが、物理的に適当なサイズに切断することは簡単ではない。
【０００３】
現在、このようなＤＮＡの切断は、例えば非特許文献１に記載されているように、酵素を用いて行われるのが一般的であるが、その操作は複雑で長時間を要すること、また任意の位置で切断するには適切な酵素を選択しなければならないこと、などの問題がある。
【非特許文献１】Sambrook,J.,E.F.Fritsch，and T.J.Maniatis.1989.Molecular cloning:a laboratory manual,２nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y
【０００４】
上記の問題を解決するものとして、発明者らは、先に、特許文献１において「核酸分子を切断するに当たり、金属製針の表面の少なくとも一部に、抵抗率ρが105Ω・m以上の絶縁性のセラミック被膜を形成した、穿刺針を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法」を、また特許文献２において「核酸分子を細管の内側に通して切断するに当たり、該細管に、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が105Ω・m以上の絶縁性セラミックスを被覆したものを用いることを特徴とする核酸分子の切断方法」を提案した。
【特許文献１】特願2004-91193号明細書
【特許文献２】特願2004-115685号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した特許文献１，２に開示の技術の開発により、ＤＮＡの切断操作を、従来の酵素を用いる切断方法に比較して、はるかに簡便にまた再現性よく行えるようになった。
本発明は、上記したＤＮＡの切断技術の改良に係わるものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＤＮＡの切断操作を、再現性よく、より効果的に行うことができる核酸分子切断用の細管を、それを用いた核酸分子の切断方法および切断装置と共に提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さて、発明者らは、ＤＮＡの切断操作の一層の向上を目的として鋭意研究を重ねた結果、電気抵抗が105Ω・m以上の絶縁性セラミック被膜中に、Al，Cr，Ti、さらにはFe等の置換型固溶元素を適量含有させることによって、極めて再現性良くＤＮＡの切断が可能になることの知見を得た。
また、絶縁性セラミック被膜中に上記したような置換型固溶元素を適量含有させた場合、長い二本鎖の高分子ＤＮＡは、鎖の端部よりもむしろ中心部の切断によって不活性となることも新たに見出した。
本発明は、上記の知見に立脚するものである。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨構成は、次のとおりである。
（１）核酸分子を含む溶液を、その内部を通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【０００９】
（２）核酸分子を含む溶液を、その内部を通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【００１０】
（３）核酸分子を含む溶液を、その内部を通過通過させる間に該核酸分子を切断する細管であって、該細管の内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜をそなえることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【００１１】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【００１２】
（５）上記（１）〜（３）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【００１３】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子切断用の細管。
【００１４】
（７）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１５】
（８）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１６】
（９）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する核酸分子の切断方法において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１７】
（10）上記（７）〜（９）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１８】
（11）上記（７）〜（９）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００１９】
（12）上記（７）〜（11）のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００２０】
（13）上記（７）〜（12）のいずれかにおいて、前記細管内における前記溶液の通過速度を0.1〜100m/minの範囲内の一定速度としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。
【００２１】
（14）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【００２２】
（15）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Feを固溶比率で５〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【００２３】
（16）核酸分子を含む溶液を、細管内を通過させる間に該核酸分子を切断する装置において、該細管として、その内周面および外周面のうち少なくとも該溶液と接触する領域に、Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％含有し、かつ電気抵抗が105Ω・m 以上のセラミック被膜を形成した細管を用いることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【００２４】
（17）上記（14）〜（16）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、Ti，Al，ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【００２５】
（18）上記（14）〜（16）のいずれかにおいて、前記セラミック被膜が、ダイアモンドライク・カーボンからなることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【００２６】
（19）上記（14）〜（18）のいずれかにおいて、前記細管の内径が0.01〜5.0mmであることを特徴とする核酸分子の切断装置。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ＤＮＡの切断操作を従来に比較して極めて再現性よく効率的に行うことができる。
すなわち、従来の酵素を使用した切断方法では、切断片が細かくなり適当に長い切断片が得にくいという問題があったが、本発明によれば、長い均一なＤＮＡを再現性よく得ることが可能であり、従ってＤＮＡを「切断して繋ぐ」というＤＮＡテクノロジーの基本操作を正確かつ広範囲に行うことができる。
従って、本発明は、医療、医薬品の研究開発、遺伝子組み換え技術を利用した動植物の品種改良、その他生化学分野などに利用して偉功を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を具体的に説明する。
図２に、本発明に従う核酸分子の切断に用いて好適なＤＮＡ切断装置を模式で示す。
なお、ここでは、ＤＮＡを切断する場合について説明するが、本発明は、ＲＮＡを切断する場合についてもＤＮＡの切断の場合と同様に適用できることはいうまでもない。また、図１では、切断装置が縦型の場合について例示するが、本発明の装置は、横型としても何ら問題はない。
【００２９】
図２において、符号１は、例えば符号２の矢印方向に回転する可変速のステップ回転モーターであり、ここでの回転運動を、ジョイント３を介して上下の往復動４に変換し、例えばゴム製のピストン５をシリンダ６内で上下動させることができる。また、シリンダ６の底面には、支持体７を介してＤＮＡ切断用の細管８の基端が接続されており、またこの細管８の先端はＤＮＡ溶液９中に浸漬されている。この細管８をＤＮＡ溶液９が通過する際に、ＤＮＡはいわゆるシアリングフォース（Shearing force）によって切断される。図中、９aは、ＤＮＡ切断後の溶液である。
【００３０】
上記の装置を用いて、ＤＮＡの切断実験を行った。この実験において、ＤＮＡ切断用の細管８としては、本発明に従う絶縁性セラミック被膜を被覆した細管および通常のステンレス鋼製の細管の２種類を用いた。
【００３１】
なお、かような細管は、次のようにして作成した。
Ｃ：0.03mass％，Si：0.12mass％，Mn：0.22mass％，Cr：18.1mass％，Ni：10.2mass％，Ｐ：0.007mass％およびＳ：0.008mass％を含有し、残部はFeおよび不可避的不純物の組成になるオーステナイト系ステンレス鋼素材を、連続鋳造し、ついで熱間圧延−冷間圧延−光輝焼鈍後、さらに微細加工により、外径：0.78mm，内径：0.5mm，長さ：100mmの細管に仕上げた。
このステンレス鋼製の細管の一部はそのまま、ＤＮＡ切断用の細管として使用した。
また、このステンレス鋼製の細管の残りの一部は、その内周面および外周面に、マグネトロン・スパッタ法により、固溶比率でAl：1.0％、Cr：1.5％、Fe：6.0％を含有するSiNXセラミック被膜（膜厚：1.0μm）を被覆した。
【００３２】
上記したSiNXセラミック被覆細管(a)およびステンレス鋼製細管(b)を、図２に示した切断装置に装着し、ＤＮＡ溶液（λファージＤＮＡ（４×106分子/ml）の出し入れを行った（シリンダーの回転数：15回転／min、すなわち４秒／１ストローク）ときの、細菌ウイルスの数の相対変化（対数目盛り）について調べた結果を、出し入れ回数との関係で図３に比較して示す。
同図に示したとおり、SiNXセラミック被覆細管(a)を使用した場合には、細菌ウイルスの相対数が、ステンレス鋼製細管(b)を使用した場合よりも、約10〜50倍程度と極めて少ないことが分かる。この実験結果は、先に提案した特許文献１，２の同様のデータに比較しても、２〜３倍程度ＤＮＡの切断性に優れている。
ここで、細菌ウイルスの相対数が少ないということは、適正位置（中央部）で切断された（従って不活性）ＤＮＡが多いということ、換言すれば切断位置の再現性に優れていることを意味する。
なお、ＤＮＡの切断がなされていることはアガロースゲルの電気泳動法で確認した。
【００３３】
次に、表１に示す種々の細管を用いること以外は、上記の実験と同様にして、ＤＮＡの切断実験を行った場合の切断比について調べた結果を、表１に比較して示す。
表１中、No.１は、前記と同じステンレス鋼製の細管、No.２〜６は、このステンレス鋼製の細管の内周面および外周面に、前記と同じ、固溶比率でAl：1.0％、Cr：1.5％、Fe：6.0％を含有するSiNXセラミック被膜をそれぞれ、0.1μm厚、0.2μm厚、0.5μm厚、0.7μm厚および1.0μm厚被覆したSiNXセラミック被覆細管、No.７はガラス製の細管、そしてNo.８は石英製の細管であり、これらの細管を用いて、４回のストローク後のＤＮＡの切断比を求めた。
ここに、切断比とは、ステンレス鋼製の細管を用いて切断を行った場合に対する、SiNXセラミック被覆細管を用いて切断を行った場合の相対ウイルス数の比であり、この値が小さいほど、切断性に優れているといえる。
【００３４】
【表１】
2006304641.tif 000003
【００３５】
同表に示したとおり、ステンレス鋼製の細管の表面に、置換型固溶元素を有する絶縁性セラミック被膜を被成することによって、単なるステンレス鋼製細管に比べて切断性が向上する。特にセラミック被覆細管の電気抵抗が∞を示すNo.5, 6については、ＤＮＡの切断が格段に容易に行われるようになることが分かる。この点、No.7, 8のガラス製細管および石英製細管では、両者の電気抵抗が∞であるにもかかわらず、これほどの切断性の向上は得られていない。
【００３６】
次に、図４に、本発明の実験に用いたNo.６のセラミック被覆細管SiNx膜について、被膜膜表面から深さ方向にわたるFe, Al, Cr, SiおよびＮの分布をＧＤＳ（Glow Discharge Spectroscopy、グーロー放電分光）法によって調べた結果を示す。
SiNx膜中には、固溶比率でFe：６％, Cr：1.5％, Al：1.0％が分布している。このうちCrとAlは、Ｎと共に、基地表面から0.1μm深さ位置程度にまで基地中に侵入している。この侵入がコーティング被膜と基板との密着性に優れた機能を果たすものと考えられる。
【００３７】
次に図５に、切断処理したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction)により増幅した後、生じた産物をアガロースゲルの電気泳動法で解析した写真を示す。
写真中の左側の濃いＤＮＡ溶液を鋳型として使用した場合には、Ｌ，Ｍ，Ｒの位置でのＰＣＲ産物の相違は認められないが、右側の黒の矢印で示すように、薄いＤＮＡ濃度の鋳型を使用した場合においては、Ｍの位置（中心部分）のＤＮＡ産物が消滅した。このことは、切断処理したＤＮＡでは中心位置でＤＮＡの増幅が見られないこと、つまり中心位置から切断されていることを示している。
【００３８】
ここに、ＰＣＲ法とは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二つのプライマーで挟まれたＤＮＡ部分（鋳型となるＤＮＡ）を連鎖反応的に増幅する方法である。
すなわち、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーから５'→３'の方向へＤＮＡ合成していくということを利用して、ｉ）ＤＮＡの一本鎖への変性→ii）プライマーの結合→iii)ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖ＤＮＡの合成→ｉ）変性→ii）プライマーの結合→・・・というサイクルを繰り返すことにより、目的とする遺伝子領域だけを試験管内で数100万倍まで増幅させることができる。
本実施においては、Ｌ，Ｍ，Ｒの位置での約2000塩基対にわたる領域を挟んで二つのプライマーを用意し、その領域のＤＮＡが切断されていなければＰＣＲで産物ができるし、切断されているとＰＣＲ産物はできないであろうとの論旨で、ＤＮＡの切断点の証明に分子数が少なくても鋭敏かつ正確な判定が可能な本方法を採用している。
【００３９】
本発明によるＤＮＡの切断のメカニズムは、完全に解明されたわけではないが、発明者らは次のように推測している。
ごく最近、SiNxセラミック被膜の高分解能電子顕微鏡(HREM,High Resolution Electron Microscope）観察とEDX（Energy Dispersive X-ray)分析から、高プラズマ雰囲気を利用して作製したSiNxのセラミック薄膜は、ソルト−ペッパー状の典型的なアモルファス構造を示すことが解明された。このセラミック・アモルファス構連中に少量のFe，Cr, Alが均一分散し、その中でも特にセラミック被膜中のCr, Alが密着性の向上に大きな役割を果たしていること、さらに、このようなSi−ターゲットを使用した場合には、高耐久性に優れ高速・高品質・長時間の成膜達成が可能であることも発見されている。従って、本発明の特定のセラミック材料の使用によるＤＮＡ切断のメカニズムは、
１）新たに作製したSiNx被膜それ自体によるもの、または
２）セラミック・アモルファス構造中に含有した少量のAl, Cr, Fe等の置換型固溶原子によるもの、あるいは
３）上記１と２の相乗効果による
ものと考えられる。
【００４０】
本発明に係る細管は、表面にセラミック被膜を被成するので、基材としては金属材料であればいずれもが使用可能であるが、特に好ましくはステンレス鋼やチタン金属である。というのは、これらは、表面が錆びず、また精密加工処理が容易だからである。
【００４１】
例えば、ステンレス鋼にて細管の基体を製造する場合は、ステンレス鋼素材を連続鋳造し、熱間圧延−冷間圧延−光輝焼鈍を行った後、精密加工により外径：0.02〜10.0mm、内径：0.01〜5.0mmおよび長さ：10〜250mm程度の、目的に応じた種々の細管形状に加工処理する。なお、この際の処理工程は、従来技術に従って行えば良い。
【００４２】
ついで、得られた円筒状の細管の表面を、超音波洗浄や電解研磨等によって清浄にしたのち、セラミック膜を形成するわけであるが、かようなセラミックスとして、電気抵抗が105Ω・m以上の絶縁性セラミックを用いることが重要である。というのは、電気抵抗が105Ω・m未満のセラミックでは、採取したＤＮＡへのシアリングフォースの影響が小さいからである。
なお、かようなセラミック膜の被覆は、必ずしも細管の全面に施す必要はなく、細管の内周面全面と、外周面のうち少なくともＤＮＡ溶液と接触する領域に施せばよい。
【００４３】
ここに、電気抵抗が105Ω・m以上のセラミックスとしては、Ti, Al, ＢおよびSiの窒化物、炭化物および酸化物のうちから選んだ少なくとも一種が有利に適合する。さらに、最近使用が可能になったダイヤモンドライク・カーボン（Diamond Like Carbon, DLC）による被膜も有利に適合する。
また、かかるセラミック膜の被覆厚みについては、0.01〜5.0μm程度とすることが好ましい。というのは、セラミック膜厚が0.01μmに満たないと十分な絶縁性の確保が困難であり、一方セラミック膜厚が5.0μmを超えると、セラミック被膜と基板との密着性の確保が困難になるだけでなく、コーティングによるコストアップを招くからである。
【００４４】
そして、本発明では、上記したような絶縁性セラミック被膜中に、
１）Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種の置換型固溶元素を、固溶比率でそれぞれ0.05〜40％含有させる、
２）同じく置換型固溶元素であるFeを、固溶比率で５〜40％含有させる、
３）Al，CrおよびTiのうちから選んだ少なくとも一種を固溶比率でそれぞれ0.05〜40％と、Feを固溶比率で0.05〜40％併せて含有させる
ことが重要である。
【００４５】
かような置換型固溶元素をセラミック被膜中に適量含有させることによって、シアリングフォースが効果的に向上するが、Al，CrおよびTiについては固溶比率がそれぞれ0.05％に満たないと、またFe単独の場合にはその固溶比率が５％に満たないと、その添加効果に乏しく、一方Al，Cr，TiおよびFeについてはいずれも固溶比率がそれぞれ40％を超えると、加工が問題となって細管加工が困難という問題が生じる。なお、置換型固溶元素としてFeを、Al，CrおよびTi等と併用する場合にはFeの含有量の下限は0.05％でよく、またFe単独で使用する場合の好適固溶比率は７〜40％である。
ここに、固溶比率とは、結晶格子の全ての置換可能位置が置換型固溶元素で置き換わった場合を100％として、それに対する実際の置換個数の比率を示すものである。従って、この固溶比率が100％を超えることはない。
【００４６】
さらに、上記のようなセラミック膜の被覆方法としては、高プラズマ中で高イオン化し、比較的高速成膜が可能なマグネトロン・スパッタ法の適用が最適であるが、この手法にさらに高イオン化のためにＲＦ(Radio Frequency)を装着したり、その他ＨＣＤ（Hollow Cathode Discharge、中空陰極放電法）、アーク放電法、プラズマＣＶＤ法、熱ＣＶＤ等のドライコーティングが好適に使用できる。
【００４７】
ちなみに、マグネトロン・スパッタ法による、セラミック被膜被覆の際の好適コーティング条件は次のとおりである。
例えは、SiNxコーティングを行うため、フェロシリコン・ターゲットを使用した場合には、投入パワー：２〜10kW、真空度：1.1×10-2〜4.0×10-1Pa（0.8×10-4〜３×10-3Torr）、Arガス流量：50〜500sccmおよびN2ガス流量：50〜500sccm程度が最適条件である。
【００４８】
なお、本発明で、セラミック被膜中に、Fe, Cr, Al, Ti等の置換型固容元素を適量含有させるためには、これらの元素を予めコーティング・ターゲット中に含有させた状況下でプラズマ・コーティングを行うか、あるいはこれらの元素をガスの状態でコーティング中に挿入する方法が好適である。
【００４９】
そして、かような置換型固容元素を適量含有する絶縁性セラミック被膜を被覆した細管の内径については0.01〜5.0mm程度とすることが好ましい。さらに好ましくは0.1〜2.0mmである。
というのは、この細管の内径は、切断性と密接な関係にあり、切断に際し、この内径と後述する細管内の通加速度を調整することによって、ＤＮＡの切断の再現性を向上させることができるからである。
【００５０】
また、本発明に係る核酸分子の切断方法においては、細管内におけるＤＮＡ溶液の通過速度は、0.1〜100m/minの範囲内の一定速度とすることが好ましい。
というのは、上述したとおり、細管内の通過速度と細管の内径は、ＤＮＡ切断に大きく影響し、均一で、かつ再現性が高い切断片ＤＮＡ分子を得るための重要な条件だからである。
【００５１】
また、ＤＮＡの切断に当たって用いるＤＮＡ溶液としては、ＤＮＡの切断を高精度に検出するために、例えば分子数の少ない（濃度が低い）ＤＮＡ溶液（λc1857ファージＤＮＡ：４×106分子／ml）等が好適である。すなわち、ＤＮＡ溶液の濃度が高くなると、シアリングフォースがかかりにくくなる。
【００５２】
さらに、切断装置に関し、前掲図２では、図６(a)に示すようなセラミック被膜を被覆した細管を１本使用した場合について示したが、さらに大量に切断したＤＮＡを採取するためには、図６(b), (c)に示すように、細管を３本または７本集合させて用いることが有効である。
なお、図６中、符号10は細管８の基材、11はこの基材10の内周面および外周面に被覆されたセラミック被膜である。
【実施例１】
【００５３】
Ｃ：0.04mass％, Si：0.15mass％, Mn：0.26mass％, Cr：18.4mass％, Ni：10.8mass％,Ｐ：0.008mass％およびＳ：0.007mass％を含有し、残部はFeおよび不可避的不純物の組成になるオーステナイト系ステンレス鋼の素材を、連続鋳造し、ついで熱間圧延−冷間圧延−光輝焼鈍後、さらに微細加工により、外径：0.78mm, 内径：0.5mm, 長さ：100mmの細管に仕上げた。
ついで、このステンレス鋼製の細管の内周面および外周面に、マグネトロン・スパッタ法により、Al，Cr，Ti，Fe等の置換型固溶元素を含むSiNx, ＢＮ, Al2O3, SiO2, TiO2セラミック被膜を、いずれも膜厚：1.0μmに被覆した。この際、Al，Cr，Ti，Fe等の置換型固溶元素は、予め所定量をターゲット中に含有させておくことにより、各被膜中に表２に示す量を含有させた。
また、プラズマＣＶＤ法により、ダイヤモンドライク・カーボン（DCL）を膜厚：1.0μm に被覆した。この場合も、置換型固溶元素は、予め所定量をターゲット中に含有させておくことにより、被膜中に所定量を含有させた。
【００５４】
かくして得られたセラミック被膜付き細管の電気抵抗、曲げ密着性および細菌ウイルス数（相対比）について調べた結果を表２に併記する。
また、表２には、比較のため、置換型固溶元素を含まない高純度のSiNx, ＢＮ, Al2O3, SiO2, TiO2セラミック被膜を被覆した場合、およびかようなセラミック被膜を被覆しない場合についての実験結果も併せて示す。
【００５５】
なお、細菌ウイルス数（相対比）は、図２に示した切断装置を用い、ＤＮＡ溶液（λファージＤＮＡ（４×106分子/ml）の出し入れを、シリンダーの回転数：15回転／minの条件で４回行ったときの値（細管の通過速度：7.6m/min）で示した。
また、曲げ密着性は、５mm間隔で種々の径を有する丸棒に各セラミック被膜を被覆した試験片を巻き付け、被膜が剥離しない最小径で評価した。
【００５６】
【表２】
2006304641.tif 000004
【００５７】
同表から明らかなように、セラミック被膜の性能と、電気抵抗、曲げ密着性およびＤＮＡ切断実験の細菌ウイルス数とは関連があり、本発明を適用した場合には、ＤＮＡの切断が極めて効率的に行われることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
従来の酵素を使用した切断方法では、切断片が細かくなり適当に長い切断片が得にくいという問題があったが、本発明によれば、長い均一なＤＮＡを再現性よく得ることが可能であり、従ってＤＮＡを「切断して繋ぐ」というＤＮＡテクノロジーの基本操作を正確かつ広範囲に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＤＮＡの構造を示す模式図である。
【図２】ＤＮＡの切断装置を示す図である。
【図３】本発明のセラミック被覆細管を使用した場合(a)とステンレス鋼製の細管(b)を使用した場合のＤＮＡ溶液から採取した細菌ウイルス数（相対比）を比較して示した図である。
【図４】ＧＤＳによるセラミック被膜表面から深さ方向に向かってのFe，Si，Al，CrおよびＮの分布を示す図である。
【図５】ＰＣＲ法により増幅した後、生じた産物をアガロースゲルの電気泳動法で解析した写真である。
【図６】切断装置における細管の設置本数を示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
１  ステップ回転モーター
２  回転方向
３  ジョイント
４  往復動
５  ピストン
６  シリンダ
７  支持体
８  細管
９  ＤＮＡ溶液
９a 切断後のＤＮＡ溶液
10  細管の基材
11  セラミック被膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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