(57)【要約】    【課  題】  好気性コリネ型細菌を用いて効率的にジカルボン酸を製造する方法を提供する。    【解決手段】  乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖し、得られた菌体またはその処理物を用いて還元条件下の反応培地でジカルボン酸を製造する方法において、培養増殖のための培地中の炭素源として、酢酸および／または酢酸塩を用いることを特徴とする高効率なジカルボン酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖し、得られた菌体またはその処理物を用いて還元条件下の反応培地でジカルボン酸を製造する方法において、培養増殖のための培地中の炭素源として、酢酸および／または酢酸塩を用いることを特徴とする高効率なジカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
培養増殖後、分離回収した好気性コリネ型細菌の菌体またはその処理物と糖類とを還元条件下の反応培地で反応させ、生成するジカルボン酸を採取することからなる請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
好気性コリネ型細菌がコリネバクテリウム属菌またはブレビバクテリウム属菌であることを特徴とする請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌が、コリネバクテリウム  グルタミカムＲ／△１ｄｈ（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３２）であることを特徴とする請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
酢酸塩が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムより選ばれる化合物であることを特徴とする請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムより選ばれる化合物が、酢酸と対応する塩基性化合物との反応により培養増殖培地の中で形成されるものであることを特徴とする請求項５記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項７】
糖類が、グルコース、キシロース、アラビノース、セロビオース、シュークロース、マルトースおよびデキストリンから選ばれることを特徴とする請求項２記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項８】
還元条件下の反応培地が、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有し、生成するジカルボン酸が、コハク酸、フマール酸およびリンゴ酸から選ばれることを特徴とする請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【請求項９】
還元条件下の反応培地の酸化還元電位が、−２００ｍＶ〜−５００ｍＶであることを特徴とする請求項１記載のジカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好気性コリネ型細菌によるコハク酸、フマール酸等のジカルボン酸の製造方法に関する。さらに詳しくは、好気性コリネ型細菌を用いて特定の製造条件、方法による高効率なジカルボン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸、フマール酸等のジカルボン酸およびこれらの誘導体は、高分子合成原料、化粧品用途、医薬原料そして食品添加剤用途など広い分野で使用されている。例えば、コハク酸は生分解性プラスチック原料として、そしてそのエステル誘導体は環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤として今後その需要が拡大するものとして期待されている。
一方において、これらジカルボン酸は、現在、石油化学資源原料を用いる化学合成法により製造されているが、再生可能資源であるグルコース等の糖類を原料とする生物的製造方法は、より環境調和型製造技術であるとの観点からもその実用化が強く望まれているものである。
【０００３】
生物的製造方法によるジカルボン酸等の有機酸製造技術については、従来から、多くの方法が提案されている。例えば、大腸菌を好気的雰囲気下にインキュベートし、該菌体を急速増殖させた後、嫌気的雰囲気下の嫌気的代謝反応による炭素源からのカルボン酸の製造方法において、好気的増殖培地および嫌気的反応培地における炭素源濃度を規定することによるカルボン酸生産物収量を向上させる方法（特許文献１参照）、好気性細菌であるコリネ型細菌による好気的雰囲気下の有機酸製造方法において、好気的反応培地の炭素源（原料糖質）濃度や反応温度を規定する方法（特許文献２および３参照）等も知られている。
【０００４】
有機酸製造に使用する菌体を多量に得るために、好気的雰囲気で培養増殖するに際しては、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン等の菌体の増殖に必要な栄養源を含む合成または
天然培地で培養することが広く行われている。
炭素源としては、通常一般に、グルコース、ショ糖、フルクトース等の糖類、エタノール等のアルコール類、グルタミン酸等のアミノ酸類が用いられている。
しかしながら、好気的条件下での培養増殖時に用いる炭素源として、本発明のごとく、酢酸および／または酢酸塩を使用すれば、通常のグルコース等の炭素源を用いる場合よりも、還元条件下の反応で得られるジカルボン酸の生産性が向上し、高効率なジカルボン酸の製造技術となることはこれまで見出されていない。
【０００５】
このような効果は、本発明で用いられる好気性コリネ型細菌でのみ認められるものであり、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を消失していない好気性コリネ型細菌では、好気的条件下での培養増殖時に用いる炭素源としてのグルコースと酢酸および／または酢酸塩ではジカルボン酸の生産性に関して殆どその差異は認められない（後記参照）。
【特許文献１】特表２０００−５１５３８９号公報
【特許文献２】特開２００３−２３５５９２号公報
【特許文献３】特開２００３−２３５５９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖し、増殖した菌体による還元条件下の反応培地でジカルボン酸を製造する方法において、ジカルボン酸生成反応が従来技術よりも高効率に実施できるジカルボン酸の製造方法を提供するものである。
ここで云う「高効率」とは、ジカルボン酸生成反応工程における糖類からのジカルボン酸への生成速度が速く、かつ、生成反応培地における到達ジカルボン酸濃度が高くなることを意味する。
生成速度の向上は反応装置当たりのジカルボン酸生産能力の増大をもたらし、到達ジカルボン酸濃度を高くできればその下流の生成物の分離・生成工程の合理化を図ることが出来るので、経済的にも生産エネルギー消費的にも本発明による工業化実施上の効果は非常に大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために種々研究を重ねた結果、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖し、増殖した菌体による還元条件下の反応培地でジカルボン酸を製造する方法において、培養増殖のための培地中の炭素源として、酢酸および／または酢酸塩を用いることにより、ジカルボン酸を高効率に製造できることを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖し、得られた菌体またはその処理物を用いて還元条件下の反応培地でジカルボン酸を製造する方法において、培養増殖のための培地中の炭素源として、酢酸および／または酢酸塩を用いることを特徴とする高効率なジカルボン酸の製造方法、
（２）培養増殖後、分離回収した好気性コリネ型細菌の菌体またはその処理物と糖類とを還元条件下の反応培地で反応させ、生成するジカルボン酸を採取することからなる前記（１）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（３）好気性コリネ型細菌がコリネバクテリウム属菌またはブレビバクテリウム属菌であることを特徴とする前記（１）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（４）乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型が、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△１ｄｈ（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３２）であることを特徴とする前記（１）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（５）酢酸塩が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムより選ばれる化合物であることを特徴とする前記（１）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（６）酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムより選ばれる化合物が、酢酸と対応する塩基性化合物との反応により培養増殖培地の中で形成されるものであることを特徴とする前記（５）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（７）糖類が、グルコース、キシロース、アラビノース、セロビオース、シュークロース、マルトースおよびデキストリンから選ばれることを特徴とする前記（２）に記載のジカルボン酸の製造方法、
（８）還元条件下の反応培地が、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有し、生成するジカルボン酸が、コハク酸、フマール酸およびリンゴ酸から選ばれることを特徴とする前記（１）に記載のジカルボン酸の製造方法、および
（９）還元条件下の反応培地の酸化還元電位が、−２００ｍＶ〜−５００ｍＶであることを特徴とするに前記（１）記載のジカルボン酸の製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、高分子合成原料、化粧品用途、医薬原料そして食品添加剤用途など広い分野で使用され、今後の需要の拡大が期待されているコハク酸、フマール酸、リンゴ酸等のジカルボン酸などの高効率な生物的製造が可能となる。このため、本発明は経済的にも生産エネルギー消費的にも工業化実施上の効果が非常に大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で使用される微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌である。
まず、好気性コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（Ｂａｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ８，  ５９９、１９７４）〕に定義されている、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌微生物であり、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物等が挙げられる。
具体的には、コリネバクテリウム  グルタミカムＲ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒ：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６），ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、等が挙げられる。
また、好気性コリネ型細菌は、自然界に存在する野性株の変異株（例えば、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７７、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７８  特開２００４−８９０２９号公報記載）であってもよい。
【００１１】
本発明の効果を実現するための要件の一つは、これら好気性コリネ型細菌の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失されていることである。
ここで、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失」とは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がその遺伝子機能が失われていたり（遺伝子破壊＝乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又はその一部が破壊、変異されたり、該遺伝子のプロモーターやリボソームバインディングサイト等の該遺伝子発現ユニットの改変又は除去により、乳酸デヒドロゲナーゼ発現活性を有していないことを意味する）、その発現形である乳酸デヒドロゲナーゼ酵素蛋白の形成もしくはその機能が失われていることを意味する。
【００１２】
なお、本発明においては、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失されている限り、ジカルボン酸生成に好ましい公知の形質転換技術を付加的に用いることも出来る。
本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊は、相同性組換え法、トランスポゾン挿入法および変異原導入法から選ばれる方法により実施できるが、トランスポゾン挿入法および変異原導入法は染色体上の遺伝子のランダムな破壊であり、ターゲットとする乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊を効率よく実施するには相同性組換え法が好ましい。
相同性組換え法によるコリネ型細菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株作製方法の一つの例を、実施例で詳記するが、通常、以下の操作方法、手順で行なうことができる。
【００１３】
Ａ）微生物からのＤＮＡ抽出；
コリネ型細菌からのゲノムＤＮＡ抽出法は、４ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで３７℃、３０分間菌体を事前に処理する以外は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）により行うことができる。
【００１４】
Ｂ）ターゲットとなる乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローン化と破壊用プラスミド作製；
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングは、既知乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子間の保存アミノ酸配列からデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法や、既知乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いたハイブリダイゼーションにより行うことができるが、最も効率的な方法としては、ゲノム配列［コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の場合、全ゲノム配列（野中  寛、中田  かおり、岡井  直子、和田  真利子、佐藤  由美子、Ｋｏｓ  Ｐｅｔｅｒ、乾  将行、湯川  英明「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒ  ゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０  参照）が決定されているので、利用できる］からプライマーをデザインし、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の全長を含む遺伝子をＰＣＲにより増幅・取得することができる。一方、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株の作成は、コリネ型細菌内で複製不可能なｐＨＳＧ３９８等の大腸菌ベクター等に、ＰＣＲで増幅した乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をクローニング後、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央に位置するユニークな制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性遺伝子（遺伝子破壊する際のマーカー遺伝子として利用）を挿入した、遺伝子破壊用プラスミドを作製する。
【００１５】
Ｃ）プラスミド導入による相同組換え法；
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成は、上記遺伝子破壊用プラスミドを、コリネ型細菌への高効率遺伝子導入法［電気パルス法（Ｙ．  Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７，１９９０、およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５，１９９３）の方法］により細胞内に導入し、染色体への相同性組換えにより、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することにより行うことができる。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊の確認は、遺伝子レベルではＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片に加えて、カナマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片が染色体に挿入されていることで、また、蛋白質レベルでは、乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が消失していることにより確認できる。
【００１６】
かくして得られる乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失されたコリネ型細菌株としては、例えばコリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ｌｄｈが挙げられ、この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３２（受託日：平成１７年５月１０日）として寄託されている。
【００１７】
なお、本明細書および特許請求の範囲において記載した△１ｄｈは、
【化１】
2006320278.tif 000002
を意味するものとする。
【００１８】
本発明に係わるジカルボン酸の製造方法においては、まず上記の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌を好気条件下で培養増殖する。
この好気的培養増殖は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン等の細菌の増殖に必要な栄養源を含む合成または天然培地で通気条件下培養することで好都合に実施できる。
【００１９】
本発明においては、好気的培養増殖培地の炭素源として、酢酸および／または酢酸塩を用いることが必須である。酢酸塩は酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムより選ばれることが好ましいが、炭素源として酢酸を用いて培地の中和のために使用される塩基性化合物との反応により培地中で形成される上記の如き塩類であってもよい。
【００２０】
窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等が一般に使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸またはビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
【００２１】
培養は、通気攪拌または振盪等の好気的条件下、約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃の温度で行うことが出来る。酢酸および／または酢酸塩の炭素源濃度は、約１〜２０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは約２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は通常１〜７日間程度である。
【００２２】
本培養増殖工程では、菌の増殖に伴い培地中に酸性物質が産生ないし分泌されるので、培地のｐＨを５〜９付近、好ましくは６．５〜８．５に調整する。中和のために使用される塩基性化合物としては、アンモニア、水酸化アンモニウム、ナトリウムやカリウムの水酸化物、炭酸化合物、重炭酸化合物またはこれらの混合物が用いられる。これらの内、ナトリウムまたはカリウムの水酸化物、炭酸化合物および重炭酸化合物が好ましい。
これらの塩基性化合物の溶液濃度は培地のｐＨが上記範囲で調製される限り、適宜定め使用することが出来る。
【００２３】
ついで、本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体を回収する。培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の手段を用いることができる。
回収された培養菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化する等の処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いることも出来る。
上記の如くして培養増殖工程より得られた菌体は、次の還元条件下の反応培地でのジカルボン酸製造工程に供せられる。
【００２４】
本発明の還元条件下の生化学反応によるジカルボン酸製造工程に於いては、本発明の好気性コリネ型細菌の増殖分裂が抑制され、増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することが出来る。この観点からは、培養増殖工程から回収された菌体またはその菌体処理物が反応培地に供せられるときには、好気性コリネ型細菌細胞内外の好気培養増殖時の環境状態が反応培地にもたらされない方法や条件を用いることが推奨される。つまり、目的とするジカルボン酸生成反応培地は、好気的培養増殖工程で生成し、菌体内外に存在する物質を実質的に含有しないことが好ましい。より具体的には、培養増殖工程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、および培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、ジカルボン酸生成反応培地に実質的に存在しない状態であることが推奨される。このような状態は、例えば、培養増殖後の培養液を遠心分離、膜分離等により除去すること、および／または培養後培養液から分離された菌体を還元条件下で２時間ないし１０時間程度放置することで実現される。
【００２５】
本工程においては、還元条件下の反応培地を用いる。反応培地は、還元条件下にあれば、固体状、半固体状または液体状等いずれの状態であってもよい。
本工程における還元条件下とは、反応系の酸化還元電位で規定され、反応培地の酸化還元電位が、好ましくは約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度、より好ましくは約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶ程度であることである。
【００２６】
本発明のジカルボン酸の生成反応において、生成反応系の酸化還元電位の規定が目的とするジカルボン酸の効率的な生産に関してなぜ有効であるかの理由は明らかではないが、下記にその推定理由を記す。ただし、本発明はその推定理由になんら限定されるものではない。
【００２７】
本発明の目的生産物であるジカルボン酸は細菌の代謝機能に基づく生化学反応により産生される化合物である。微生物細胞内の生化学反応には各種の酸化還元反応が関与しており、電子の授受移動が行われている。酸化還元電位は反応系での電子の受容性、供与性の難易度を示す尺度の一つであるが、この電位は微生物細胞内で起こっている代謝経路を構成する各種反応（酸化還元反応）の状態や細胞内外との電子授受の状態を反映している。電位差計により直接測定される酸化還元電位は反応溶液と電極との電位であるが反応溶液の電位は細胞膜を介してある電位勾配を持って細胞内で生じている反応と相関している。即ち、酸化還元電位は細胞内外を含む反応系全体の酸化還元反応の総和を反映（各種反応の内容やその頻度等も含めて）したものである。
【００２８】
反応系の酸化還元電位に影響する因子としては、反応系雰囲気ガスの種類と濃度、反応温度、反応溶液ｐＨ、反応液中に存在する目的有機化合物生成のために使用される無機および有機の各種化合物濃度と組成等が考えられる。本発明における反応培地の酸化還元電位とは上記各種影響因子が統合されて示されるものである。従って、目的とするジカルボン酸への代謝経路には各種化学反応が関与し、これら化学反応は上記因子群の影響下にあるが、単一の酸化還元電位なる反応状態を規定する尺度により、効率的に目的ジカルボン酸が生成され得る。
【００２９】
反応培地の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹ  ＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いて測定する。本発明においては、反応培地に菌体またはその処理物を添加した直後からジカルボン酸を採取するまでの間、還元条件を維持していることが好ましいが、反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地が還元条件下に保たれていることが望ましい。
【００３０】
還元条件下にある反応培地の調製方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、培養培地の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応培地用水溶液を使用してもよく、反応培地用水溶液の調製方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法（Ｐｆｅｎｎｉｇ，Ｎ  ｅｔ．ａｌ．（１９８１）：Ｔｈｅ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｈａｂｉｔａｔｓ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｅｄ．ｂｙ  Ｓｔａｒｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ｐ．９２６−９４０，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」）などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることが出来る。
【００３１】
反応培地用水溶液の調製方法として、より具体的には反応培地用水溶液を加熱処理や減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的には、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは５〜４０分程度、反応培地用水溶液を処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応培地用水溶液を作成することができる。
【００３２】
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンそして硫化ソーダ等）を添加して還元条件下の反応培地用水溶液を調製することも出来る。また、場合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件下の反応培地用水溶液を調製する方法となる。
【００３３】
反応途中における還元条件の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が通常用いられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性コリネ型細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００３４】
反応系の酸化還元電位に影響する因子としては、反応系雰囲気ガスの種類と濃度、反応温度、反応溶液ｐＨ、目的とする有機酸生成のために使用される無機および有機の各種化合物濃度と組成等が考えられる。本発明における反応培地の酸化還元電位とは上記各種影響因子が統合されて示されるものである。
【００３５】
本ジカルボン酸製造工程においても重要なことは、本工程で生成するジカルボン酸や副生の酸性物質等により反応培地のｐＨが低下するので、反応培地のｐＨを５〜９付近、好ましくは６．５〜８．５に調整することであるが、その際にも中和のため塩基性化合物が使用される。これら塩基性化合物は好気条件下の培養増殖工程で用いられるものと同様であってよい。
【００３６】
また、それらの塩基性化合物の溶液濃度もジカルボン酸製造反応培地のｐＨが上記範囲で調整される限り、適宜定め使用することが出来る。
反応培地には、ジカルボン酸生成の原料となる糖類および二酸化炭素ガスや炭酸イオン又は重炭酸イオンが供給される。
【００３７】
糖類としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロースそしてアラビノースなどの単糖類、セロビオース、シュークロースもしくはラクトース、マルトースなどの二糖類、またはデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。この場合、グルコースは０．５〜５００ｇ／Ｌ（リットル）の濃度範囲で使用される。
【００３８】
炭酸イオン又は重炭酸イオンは、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムあるいは炭酸ガスから供給されるものである。これら炭酸イオン又は重炭酸イオンは１〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭの濃度範囲で使用される。炭酸ガスが供給される場合は、５０ｍｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、好ましくは、１００ｍｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌの濃度で溶液中に含有するように供給される。
【００３９】
ジカルボン酸の生成反応に用いられる反応培地組成は、本発明の好気性コリネ型細菌またはその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源と炭酸源の他にも、蛋白質合成に必要な窒素源、その他リン、カリウムまたはナトリウム等の無機塩類、さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含む。これらの添加量は所要反応時間、生成ジカルボン酸の種類または用いられる好気性コリネ型細菌の種類等により適宜定めることが出来る。用いる好気性コリネ型細菌によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、微量金属塩は、公知のもの、例えば培養増殖工程につき例示したものでよい。好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物と糖類との反応は、本発明の好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行われることが好ましく、好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。通常、約２５℃〜３５℃である。ジカルボン酸の生成反応は回分式、連続式いずれの生成方式も可能である。
【００４０】
上述のようにして反応培地で生成したジカルボン酸やその塩類を分離・精製してジカルボン酸を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、ジカルボン酸生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法または電気透析法等があり、生成ジカルボン酸や反応液特性に応じてその分離・精製採取法は適宜定めることが出来る。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例でもって本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
〔実施例１〕
ａ）好気培養増殖
冷凍庫にて−８０℃で保存してある乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失されたコリネ型細菌株（国際公開番号ＷＯ２００５／０１０１８２の実施例１記載の方法を用いて作製）、すなわちコリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ｌｄｈ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３２）を、プレート培養用培地であるＡ酢酸寒天培地（組成：尿素２ｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸７ｇ、硫安７ｇ、第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．５ｇ、第二リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ、硫酸鉄・７水和物６ｍｇ、硫酸マンガン・１水和物４．２ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、酢酸アンモニウム２０ｇ、寒天１．５％（Ｗ／Ｖ）そして蒸留水１Ｌ）に塗布し、３３℃、１２時間暗所に静置した。
【００４３】
上記のプレート上で生育したコリネ型細菌株を、試験管培養用培地であるＡ酢酸培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａ酢酸寒天培地と同一成分組成）１０ｍｌに白金耳でもって植菌し、３３℃、１２ｈｒ、２００ｒｐｍで振盪培養した。
このようにして生育したコリネ型細菌株を、好気培養増殖用培地であるＡ酢酸−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａ酢酸培地と同一成分組成）の５００ｍｌが入っている容量１Ｌのジャーファーメンターに移し、３３℃、１０００ｒｐｍ、滅菌空気を１ｖｖｍで通気して、１３時間好気培養増殖を行なった。
この間、ＮＨ４ＯＨ（５Ｎアンモニア水溶液）を使用してジャーファーメンター槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
このようにして培養増殖された菌体は、遠心分離（４℃、１０分、５０００ｘＧ）によって回収し、次の還元条件下のコハク酸製造反応に供した。
【００４４】
ｂ）還元条件下のコハク酸製造反応
ａ）の好気培養増殖工程より回収された湿潤菌体１５０ｇ（Ｄｒｙ  Ｃｅｌｌ換算約３０ｇ）を、コハク酸生成反応用溶液であるＢＴ−Ｕ培地（組成：硫安７ｇ、第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．５ｇ、第二リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ、硫酸鉄・７水和物６ｍｇ、硫酸マンガン・１水和物４．２ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、グルコース３６ｇ、重炭酸ソーダ（ＮａＨＣＯ３）１２．６ｇ、蒸留水１Ｌ）５００ｍｌの入っている容量１Ｌの反応槽に加え、３３℃にて緩やかに攪拌し、還元条件下のコハク酸生成反応を４時間実施した。反応時の培地の酸化還元電位は、反応開始後直ちに急激に低下し、その後が約−４００ｍＶに維持してコハク酸生成反応が継続された。
この間、５Ｎ（規定）濃度のＮＨ４ＯＨ（５Ｎアンモニア水溶液）水溶液を使用して反応槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
反応槽内の生成したコハク酸量は逐次少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行い、経時的な生成量の変動を調べた。
【００４５】
その結果を表１に記す。なお、表１における生成速度とは反応開始後０時間から４時間の範囲における生成速度である。
【００４６】
〔参考例１〕
実施例１におけるａ）好気培養増殖工程で使用する培地として、Ａ寒天培地（組成：酢酸アンモニウムが含まれず、グルコースを４０ｇ含むことを除けば上述のＡ酢酸寒天培地と同一成分組成）、Ａ培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａ寒天培地と同一成分組成）、及びＡ−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａ培地と同一成分組成）を用いる以外は、実施例１と同様の条件にて好気培養増殖およびコハク酸製造反応を行なった。
表１にコハク酸製造反応における生成速度を記す。
【００４７】
〔参考例２〕
実施例１におけるａ）好気培養増殖工程で使用する培地として、Ａエタノール寒天培地（組成：酢酸アンモニウムが含まれず、エタノールを２０ ml含むことを除けば上述のＡ酢酸寒天培地と同一成分組成）、Ａエタノール培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａエタノール寒天培地と同一成分組成）、及びＡ−Ｕエタノール培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａエタノール培地と同一成分組成）を用いる以外は、実施例１と同様の条件にて好気培養増殖およびコハク酸製造反応を行なった。
表１にコハク酸製造反応における生成速度を記す。
【００４８】
〔実施例２〕
実施例１におけるａ）好気培養増殖工程で使用する培地として、Ａ寒天培地（組成：酢酸アンモニウムが含まれず、酢酸ナトリウムを２０ｇ含むことを除けば上述のＡ酢酸寒天培地と同一成分組成）、Ａ培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａ寒天培地と同一成分組成）、及びＡ−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａ培地と同一成分組成）を用いる以外は、実施例１と同様の条件にて好気培養増殖およびコハク酸製造反応を行なった。表１にコハク酸製造反応における生成速度を記す。
【００４９】
【表１】
2006320278.tif 000003
【００５０】
〔参考例３〕
冷凍庫にて−８０℃で保存してあるコリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株（実施例１の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に使用した野生株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６として寄託している）を使用することを除けば、すべて実施例１と同様の条件、方法により好気培養増殖、及び還元条件下のコハク酸生成反応を行った。
表２にコハク酸製造反応における生成速度を記す。
【００５１】
〔参考例４〕
参考例３におけるａ）好気培養増殖工程で使用する培地として、Ａ寒天培地（組成：酢酸アンモニウムが含まれず、グルコースを４０ｇ含むことを除けば上述のＡ酢酸寒天培地と同一成分組成）、Ａ培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａ寒天培地と同一成分組成）、及びＡ−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａ培地と同一成分組成）を用いる以外は、実施例１と同様の条件にて好気培養増殖およびコハク酸製造反応を行なった。
表２にコハク酸製造反応における生成速度を記す。
【表２】
2006320278.tif 000004
【００５２】
表１より、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失されたコリネ型細菌においては、好気培養増殖培地中の炭素源として酢酸アンモニウムを用いればグルコース、及びエタノールを炭素源として用いるよりも還元条件下コハク酸生成速度が顕著に向上することが明らかである。
また、実施例２で示されるように、酢酸ナトリウムを用いても、酢酸アンモニウムとほぼ同等な還元条件下コハク酸生成速度を得られることが明らかである。
さらに、表２の参考例３、４よりこのような効果は野生株においては認められないことも明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、コハク酸、フマール酸等のジカルボン酸を効率よく製造できるので、本発明は高分子合成原料、化粧品用途、医薬原料、食品添加剤用途などの広い分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図２】参考例１におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図３】参考例２におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図４】実施例２におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図５】参考例３におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図６】参考例４におけるコハク酸生成およびグルコースの消費の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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