(57)【要約】【課題】  リン脂質の改質に使用したホスホリパーゼを、より簡便な手段で回収・再生する方法を提供すること。【解決手段】  本発明のホスホリパーゼの再生方法は、リン脂質、ホスホリパーゼ、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および、該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質、ホスホリパーゼ、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および
該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程；
を含む、ホスホリパーゼの再生方法。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、リゾホスホリパーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン脂質、ホスホリパーゼ、水、水混和性の極性有機溶媒、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物から、水混和性の極性有機溶媒を除去する工程；
該極性有機溶媒を除去した反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および
該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程；
を含む、ホスホリパーゼの再生方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、リゾホスホリパーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質の改質に使用したホスホリパーゼを再生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、生体細胞の構成成分として、自然界に広く分布しており、動物の脳、神経、内臓、血液、卵、植物の種子などの種々の部位に多く含まれている。また、生体内の様々な場所において、細胞組織の保護、情報の伝達、物質移動の制御など、生命維持のための多くの機能を果たしている重要な物質である。リン脂質の一種であるリゾリン脂質は、一般的に強い溶血性を示す。そのため、リン脂質やリゾリン脂質は、天然の乳化剤や界面活性化剤として、食品、化粧品、塗料などの工業用途だけでなく、医薬、健康食品用途にも使用されている。
【０００３】
このように産業用途で使用されるリン脂質は、主にホスホリパーゼ処理により改質（加水分解、エステル交換など）されており、工業化のための種々の方法が検討されている。例えば、リン脂質の酵素処理を２相系で行うことにより、酵素処理したリン脂質をより高収率で回収できることが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
しかし、例えば、リン脂質をホスホリパーゼで処理した場合、通常行われている方法で得られたリン脂質には、ホスホリパーゼや生成した遊離脂肪酸が残存している。そのため、工業用途の製品中に残存しているホスホリパーゼ活性が、品質の劣化や異臭の発生の原因となる恐れがあり、大きな課題となっていた。これまでに、加熱やプロテアーゼ処理によってホスホリパーゼを失活させること（特許文献２）、および煩雑な溶媒抽出操作によってホスホリパーゼを除去すること（特許文献３）が報告されている。現状では、このような酵素反応に使用して除去されたホスホリパーゼは、再生されることなく廃棄されている。
【特許文献１】特開平３−４７９５号公報
【特許文献２】特公平６−７７５０６号公報
【特許文献３】特公平２−１１２３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、リン脂質の改質に使用したホスホリパーゼを、より簡便な手段で回収・再生する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ホスホリパーゼの再生方法を提供し、該方法は、
リン脂質、ホスホリパーゼ、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および
該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程；
を含む。
【０００７】
本発明はまた、ホスホリパーゼの別の再生方法を提供し、該方法は、
リン脂質、ホスホリパーゼ、水、水混和性の極性有機溶媒、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物から、水混和性の極性有機溶媒を除去する工程；
該極性有機溶媒を除去した反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および
該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程；
を含む。
【０００８】
上記のいずれの方法においても、１つの実施態様では、上記ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、リゾホスホリパーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、リン脂質の改質に使用したホスホリパーゼを、簡便な手段で回収して、再生利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（定義）
本発明に用いられるリン脂質は、その起源は特に限定されず、天然物由来（例えば、抽出物、濃縮物）であってもよく、または化学的に合成されたものでもよい。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）などが挙げられ、これらの混合物であってもよい。あるいは、予めホスホリパーゼＤなどのホスホリパーゼで酵素処理（例えば、加水分解）されていてもよい。
【００１１】
これらのリン脂質の構成脂肪酸は、同一または異種の炭素数８〜２４の飽和または不飽和脂肪酸である。このような脂肪酸としては、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−およびγ−リノレイン酸、エルシン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸などが挙げられる。
【００１２】
本発明に用いられるホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、リゾホスホリパーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である。これらの起源は、特に限定されないが、一般的には微生物起源のホスホリパーゼが用いられる。このような微生物は、特に限定されず、例えば、ストレプトマイセス属、シュードモナス属、バチラス属、マイコバクテリウム属、エスケリチア属、またはリゾープス属に属する微生物が挙げられる。また、微生物は、天然に存在する野生型あるいは形質転換体のいずれであってもよい。ホスホリパーゼは、一般的には、微生物から単離または抽出された精製酵素または粗精製酵素として用いられる。
【００１３】
本発明において用いられる水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水などが挙げられる。あるいは、必要に応じて、塩類（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）が加えられていてもよい。あるいは、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、酢酸緩衝液（ｐＨ４〜７）、トリス緩衝液（ｐＨ７〜９．５）などであってもよい。
【００１４】
本発明において、炭素数１〜６の低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールなどが挙げられる。
【００１５】
本発明において、炭素数１〜５の低級脂肪酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などが挙げられる。
【００１６】
本発明においては、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステルが用いられる。このようなエステルとしては、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチルなどが挙げられる。なお、本発明においては、このようなエステルの代わりに、水混和性の極性有機溶媒（例えば、アセトン）を用いてもよい。
【００１７】
本発明に用いるリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒は、通常、融点が４０℃以下であり、本発明の方法において使用する温度で液体であり、そして水に対する溶解度が５％以下である炭化水素が好ましい。このような有機溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、オクタンなどの脂肪族飽和炭化水素；ヘキセン、デセンなどの脂肪族不飽和炭化水素；シクロヘキサン、シクロヘプタンなどの脂環式炭化水素；炭素数１〜８の直鎖または分岐アルカンのハロゲン化物などが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独でまたは２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
（本発明のホスホリパーゼの再生方法）
本発明のホスホリパーゼの再生方法は、リン脂質、ホスホリパーゼ、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を回収する工程；および、該沈殿物からホスホリパーゼを回収する工程を含む。
【００１９】
上記反応混合物において、上記エステルと上記水不混和性有機溶媒との混合物（以下、有機混合溶媒という場合がある）の混合比率は、エステル１容量部に対して、水不混和性有機溶媒が、通常０．１〜１００容量部、あるいは０．２〜２０容量部、あるいは０．５〜５容量部、最も一般的には約１容量部であることが適切である。
【００２０】
リン脂質は、上記有機混合溶媒に、一般的には０．１〜５０ｗ／ｖ％、あるいは１〜３０ｗ／ｖ％の濃度で溶解する。
【００２１】
この反応混合物中、有機混合溶媒と水との混合比率は、水１容量部に対して、有機混合溶媒が、通常１〜２０容量部、あるいは１．２〜５容量部である。
【００２２】
ホスホリパーゼの使用量は、リン脂質１ｇに対して、０．０１〜１００００ユニットであり、あるいは０．１〜３０００ユニットである。ここで、酵素活性の１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのホスファチジルコリンを加水分解する酵素量を表す。
【００２３】
この反応混合物は、通常は、酵素が失活しない温度、例えば、５〜７０℃、通常には約２０〜５０℃にて、通常、２〜７２時間にわたって酵素反応が行われている。
【００２４】
本発明の方法においては、まず、この反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する。低級アルコールの添加量は、反応混合物に対して、約１／１０〜約１０／１０容量が適切である。なお、酵素反応において、反応混合物中のエステルの代わりに、例えば、アセトンを用いた場合は、酵素反応終了後、一旦アセトンを減圧下で除去し、除去したアセトンの１／５〜２／１容量のエステルを新たに添加した後、低級アルコールを添加する。低級アルコールの添加後、一般的には、室温にて１０分〜３時間撹拌する。この低級アルコールの添加により、反応混合物中に沈殿物が生成する。
【００２５】
次いで、この生成した沈殿物を、吸引濾過、遠心分離などによって回収する。この沈殿物には、上記の反応に使用したホスホリパーゼおよび遊離した脂肪酸が含まれている。
【００２６】
次いで、回収した沈殿物から、ホスホリパーゼを回収する。具体的には、沈殿物を水（例えば、蒸留水）に分散させて、水層を回収することによって、酵素液として回収され得る。適切には、沈殿物１質量部に対して、約１〜１０倍容量の水を用いる。必要に応じて、さらに凍結乾燥してもよい。
【００２７】
こうして回収されたホスホリパーゼは、上記反応混合物におけるホスホリパーゼ活性の、少なくとも１０％、好適には１５％以上、より好適には２０〜５０％の活性を示し得る。回収されたホスホリパーゼは、再度上記反応混合物中に加えられて、酵素反応に供することができる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
レシチン（ＡＤＭ社ウルトラレックＰ）を１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／酢酸エチルを１／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／２容量のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）（２００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、３０℃にて２０時間撹拌して反応させた。酵素反応終了後、反応混合物に対して１／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を回収した。得られた沈殿物を５倍容量の蒸留水に分散させた後、吸引濾過によって水層を回収した。この水層について、大豆由来のホスファチジルコリン（AVANTI POLAR LIPIDS, INC）を基質として、コリンエステラーゼＢ−テストワコー（和光純薬社）を用いて、ＰＬＤ活性を測定した。その結果、水層には、元の反応混合物中のＰＬＤ活性の約５０％の活性が回収されたことがわかった。
【００２９】
（実施例２）
ＰＬＤを含む水溶液の代わりに、上記実施例１で得られたＰＬＤを含む水層を酵素液として用いたこと以外は、上記実施例１と同様に酵素反応を行った。酵素反応終了後、反応混合物に対して１／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物と分離した。得られた上清を、上清に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収した。これをさらに真空乾燥させて、ＰＡ含有レシチンが得られたことをＨＰＬＣによって確認した。このことから、回収したＰＬＤを用いて、再度酵素反応を行うことができることがわかった。
【００３０】
（実施例３）
エタノールの代わりにイソプロピルアルコールを用いたこと以外は、上記実施例１と同様に操作を行って、ＰＬＤを回収した。水層には、元の反応混合物中のＰＬＤ活性の約５０％の活性が回収されていた。
【００３１】
（実施例４）
レシチン（ＡＤＭ社ウルトラレックＰ）を１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／アセトンを１／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／２容量のホスホリパーゼＤ（２００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、３０℃にて２０時間撹拌して反応させた。反応液をエバポレーターで２倍濃縮してアセトンを除去した後、酢酸エチルをヘプタンの１／２容量添加した。この反応混合物に対して２／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を回収した。得られた沈殿物を５倍容量の蒸留水に分散させた後、吸引濾過によって水層を回収した。この水層について、大豆由来のホスファチジルコリン（AVANTI POLAR LIPIDS, INC）を基質として、コリンエステラーゼＢ−テストワコー（和光純薬社）を用いて、ＰＬＤ活性を測定した。その結果、水層には、元の反応混合物中のＰＬＤ活性の約５０％の活性が回収されたことがわかった。
【００３２】
（実施例５）
レシチン（ＡＤＭ社ウルトラレックＰ）を１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／酢酸エチルを１／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／２容量のホスホリパーゼＤ（２００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、３０℃にて２０時間撹拌して反応させた。酵素反応終了後、反応混合物に対して１／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を除去した。得られた上清に、１／５容量の１０％塩化ナトリウム水溶液を添加して、３０分間撹拌した後、分液操作によって上層を回収した。得られた上層を、上層に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収し、真空乾燥させて、ＰＡ含有レシチンを得た。
【００３３】
得られたＰＡ含有レシチンを１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／酢酸エチルを２／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／１０容量のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）（１５００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、４０℃にて２０時間撹拌して反応させた。酵素反応終了後、反応混合物に対して３／５容量のエタノールを添加して、３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を回収した。得られた沈殿物を５倍容量の蒸留水に分散させた後、吸引濾過によって水層を回収した。この水層について、ホスファチジルコリン（シグマ社）を基質として、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬社）を用いて、ＰＬＡ２活性を測定した。その結果、水層には、元の反応混合物中のＰＬＡ２活性の約２０％の活性が回収されたことがわかった。
【００３４】
（実施例６）
ＰＬＡ２を含む水溶液の代わりに、上記実施例５で得られたＰＬＡ２を含む水層を酵素液として用いたこと以外は、上記実施例５と同様に酵素反応を行った。酵素反応終了後、反応混合物に対して１／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物と分離した。得られた上清を、上清に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収した。これをさらに真空乾燥させて、ＬＰＡ含有レシチンが得られたことをＨＰＬＣによって確認した。このことから、回収したＰＬＡ２を用いて、再度酵素反応を行うことができることがわかった。
【００３５】
（実施例７）
エタノールの代わりにイソプロピルアルコールを用いたこと以外は、上記実施例５と同様に操作を行って、ＰＬＡ２を回収した。水層には、元の反応混合物中のＰＬＡ２活性の約２０％の活性が回収されていた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法によれば、リン脂質の改質に使用したホスホリパーゼを、非常に簡便な手段で回収して、再使用することができる。そのため、ホスホリパーゼにかかるコストを低減することができ、またリサイクルの面でも有用である。