(57)【要約】【課題】Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニングに有用な新たなＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル動物を提供すること。【解決手段】本発明は、特定の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体を改変することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法を提供する。該方法によって製造されたＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物、特にＧｒｏｇｇｙラットは、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニングや、該疾患の処置方法のスクリーニングに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列、若しくは塩基番号７５２のアデニンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるその部分配列、又はそれらの相補配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドを特異的に認識し、
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のメチオニンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるそれらの部分配列を含むポリペプチドを認識しない抗体。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得るように染色体を改変することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法。
【請求項８】
該非ヒト脊椎動物はラットである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に被検物質を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
該非ヒト脊椎動物はラットである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に処置を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該処置の効果を検定することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の処置方法のスクリーニング方法。
【請求項１７】
該非ヒト脊椎動物はラットである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法。
【請求項２２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法。
【請求項２３】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬。
【請求項２６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出する手段を含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬。
【請求項２７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することを含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法。
【請求項２８】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異を検出することを含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法。
【請求項２９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用試薬。
【請求項３０】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異を検出する手段を含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用試薬。
【請求項３１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチドを含有するＣａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを特異的に認識する抗体、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の処置方法のスクリーニング方法、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法、Ｇｒｏｇｇｙラットの同定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
「Ｇｒｏｇｇｙラット」は愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所で維持されていたＷｉｓｔａｒラットコロニーから発見され、確立された、運動失調を主な特徴とするラットである。Ｇｒｏｇｇｙラットは、妊娠４日目のＳｃｌ：Ｗｉｓｔａｒラットにメチルニトロソウレアを投与し、産仔に生じた運動失調を主症状とするミュータントラットに由来する。
Ｇｒｏｇｇｙラットは、通常、生後１５日頃より歩行異常が見られ、後肢を引きずったり、絡めたりする運動失調が見られる。生後２０日頃から不活発となり、転倒や後肢の伸展が観察される。これらの表現形質は常染色体性劣性遺伝し、原因遺伝子はgroggy(gry)と名づけられている。
病理学的には、生後４０日頃までは、Ｇｒｏｇｇｙラットの脳に明らかな肉眼的な所見は認められないが、生後６０日頃以降では、Ｇｒｏｇｇｙラットの小脳は対照（健常ラット）と比較して小さい。また、生後２０日頃から６０日頃にかけて、多数の神経線維変性が錐体路、毛帯、三叉神経脊髄路、前庭系、脊髄小脳路、脳神経など、脳の各所に見られる。生後６０日頃にかけて、線条体に多数の神経細胞変性が認められる。また、電子顕微鏡では、小脳核、前庭核、薄束核の軸索終末部やシナプス全軸索（特に小脳プルキンエ細胞軸索）に同心円状ラメラ小体が観察される。生後１８０日以上の高齢Ｇｒｏｇｇｙラットでは、小脳核に多数のプルキンエ細胞の軸索の腫大が見られる（非特許文献１−７参照）。
一方、カルシウムチャネルサブユニットα１ａ（以下、Ｃａｃｎａ１ａ、ＣＡＣＮＡ１Ａ等とも呼ぶ場合がある）は、電位依存性Ｐ／Ｑタイプカルシウムチャネルポアを形成するタンパク質で、Ｃａｃｎａ１ａによりコードされる。カルシウムチャネルサブユニットα１ａは、６回膜貫通部位（Ｓ１〜Ｓ６）をそれぞれ有する４つの繰り返し構造（ドメインＩ〜ＩＶ）から構成される。
Ｐ／Ｑタイプカルシウムチャネルは、高閾値活性型（ＨＶＡ）カルシウムチャネルであり、神経系、特に小脳プルキンエ細胞や顆粒細胞の前シナプス末端、樹状突起膜に発現し、神経伝達物質の放出、細胞の興奮伝達、細胞骨格、細胞内代謝、遺伝子発現等の様々な機能を調節することが知られている。
また、Ｐ／Ｑタイプカルシウムチャンネルの遺伝子変異と様々な疾患との関連が示唆されており、例えば、家族性片麻痺性偏頭痛 (Familial Hemiplegic Migraine, ＦＨＭ)、脊髄小脳性失調症タイプ６ (Spinocerebellar Ataxia 6, ＳＣＡ６)、発作性失調症タイプ２ (Episodic Ataxia 2, ＥＡ２)、特発性全般てんかん (Idioplathic Generalized Epilepsy)等の疾患はＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異により引き起こされる（非特許文献８）。
このうち、家族性片麻痺性偏頭痛（ＦＨＭ）は、頭痛に前後して、麻痺、感覚異常といった前兆が現れる片麻痺性偏頭痛のうち家族性のものをいう。家族性片麻痺性偏頭痛の家系においては、小脳萎縮を伴う家系や、進行性小脳失調症を伴う患者も報告されている。家族性片麻痺性偏頭痛の患者又は家族の約半数にＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異が認められている（非特許文献９）。
脊髄小脳性失調症とは、運動失調を主症状とし、小脳、脊髄に病変の首座を有する変性疾患の総称をいい、特定疾患に認定されている。このうちタイプ６（ＳＣＡ６）はＣａｃｎａ１ａ遺伝子のＣＡＧリピートの増大が病因として考えられている（非特許文献１０）。ＳＣＡ６においては、眼振、小脳症状がみられる。
発作性失調症タイプ２（ＥＡ２）は、発作性の眼振を伴う運動失調を特徴とする疾患で、小児に多く発症する。約半数以上の患者に、めまい、悪心、嘔吐がみられる。発作は、ストレスや感情の高揚によって誘発される。ＥＡ２患者においては、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の一塩基置換によるミスセンス変異、ナンセンス変異の他、ＣＡＧリピートの異常が報告されている（非特許文献１１）。眼振、めまい、反復発作性の失調症状は、ＦＨＭ又はＳＣＡ６患者にもみられることがある。
全般てんかんとは、両側の大脳半球全体から同時に始まるとみなされる発作の総称であり、このうち生まれつきの素因が関係するものを特発性全般てんかんという。特発性全般てんかんは、てんかん全体の約６０％を占める。全般てんかん発作のなかで、数秒間に渡って意識が中断するてんかんを欠神発作という。近年、欠神発作を示すてんかん患者にＣａｃｎａ１ａ遺伝子の点突然変異が発見され、Ｐ／Ｑタイプカルシウムチャンネルの機能異常が、てんかんの発症に関係することが示唆されている（非特許文献１２）。
このように、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の変異は様々な疾患を引き起こし、種々の疾患のモデルマウスとして有用な、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子に変異を有する幾つかのマウス系統が確立されている。
例えば、「Totteringマウス」は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のドメインＩＩ pore-linking領域にミスセンス変異（Ｐ→Ｌ）を有し、発作性運動異常症、欠神発作、cortical spike-wave discharge等の症状を呈する（非特許文献１３）。
「Leanerマウス」は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のドメインＩＶ カルボキシル末端において点変異を有し、スプライシング異常が起こる。Leanerマウスは、運動失調、欠神発作、cortical spike-wave discharge、小脳神経細胞消失等の症状を呈する（非特許文献１３）。
「Rollingマウス」は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のドメインＩＩＩＳ４においてミスセンス変異（Ｒ→Ｇ）を有し、運動失調、小脳神経細胞消失等の症状を呈する（非特許文献１４）。
「Rockerマウス」は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のドメインＩＩＩＳ５−Ｓ６膜貫通部においてミスセンス変異（Ｔ→Ｋ）を有し、運動失調、欠神発作、cortical spike-wave dischargeなどの症状を呈する（非特許文献１５）。
しかしながら、マウスは、体の大きさが小さいため経時的な観察や外科的処置に適さない場合があること、行動、学習能力等の観察に適さない場合があること等の問題点を有するため、より高等で体の大きさの大きなＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル動物の開発が望まれていた。
【非特許文献１】タケウチ，ＩＫら著、アクタ  ニューロパソロジカ (Acta Neuropathologica)、（ドイツ）、第１０２巻、第２号、ｐ．１９１−１９４、２００１年
【非特許文献２】タケウチ，ＩＫら著、ブレイン  リサーチ(Brain Research)、（オランダ）、第８３１巻、ｐ．２９２−２９６、１９９９年
【非特許文献３】タケウチ，ＩＫら著、アクタ  ニューロパソロジカ (Acta Neuropathologica)、（ドイツ）、第９５巻、第５号、ｐ．４８３−４９２、１９９８年
【非特許文献４】タケウチ，ＩＫら著、ジャーナル  オブ  エレクトロン  マイクロスコピー (Journal of Electorn Microscopy)、（日本）、第４４巻、第３号、ｐ．１４０−１４４、１９９５年
【非特許文献５】タケウチ，ＩＫら著、アクタ  ニューロパソロジカ (Acta Neuropathologica)、（ドイツ）、第９０巻、第５号、ｐ．４８６−４９２、１９９８年
【非特許文献６】タケウチ，ＩＫら著、アクタ  ニューロパソロジカ (Acta Neuropathologica)、（ドイツ）、第８７巻、第６号、ｐ．６２８−６３４、１９９４年
【非特許文献７】タケウチ，ＩＫら著、エクスペリメンティア (Experimentia)、（スイス）、第４７巻、ｐ．１２１５−１２１８、１９９１年
【非特許文献８】水澤英洋著、「脊髄小脳変性症とＣａチャンネル異常」、脳と神経、医学書院、第５３巻、第１号、ｐ．１４−２４、２００１年
【非特許文献９】デゥクロス,Ａ (Ducros, A)、ランセット  ニューロロジー (Lancet Neurology)、（英国）、第１巻、ｐ．２８５−２９３、２００２年
【非特許文献１０】ズシェンコ,Ｏ (Zuchenko, O)ら著、ネイチャー  ジェネティクス (Nature Genetics)、（英国）、第１５巻、ｐ．６２−６９、１９９７年
【非特許文献１１】オフォフ,ＲＡ (Ophoff, RA)ら著、セル (Cell)、（米国）、第８７巻、ｐ．５４３−５５２、１９９６年
【非特許文献１２】チオザ,Ｂ (Chioza, B)ら著、ニューロロジー (Neurology)、（米国）、第５６巻、ｐ．１２４５−１２４６、２００１年
【非特許文献１３】フレッシャー,ＣＦ（Fletcher, CF）ら著、セル (Cell)、（米国）、第８７巻、ｐ．６０７−６１７、１９９６年
【非特許文献１４】モリ,Ｙら著、ザ  ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス (The Journal of Neuroscience)、（米国）、第２０巻、ｐ．５６５４−５６６２、２０００年
【非特許文献１５】ズウィングマン,ＴＡ (Zwingman TA)ら著、ザ  ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス (The Journal of Neuroscience)、（米国）、第２１巻、ｐ．１１６９−１１７８、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニングに有用な新たなＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル動物を提供することである。また、本発明の別の目的は、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の簡便且つ高感度な検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、Ｇｒｏｇｇｙラットの疾患原因遺伝子がＣａｃｎａ１ａ遺伝子であり、該ラットがＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル動物として極めて有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に関する。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチド。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
（３）配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列、若しくは塩基番号７５２のアデニンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるその部分配列、又はそれらの相補配列を含むポリヌクレオチド。
（４）上記（２）又は（３）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（５）上記（４）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドを特異的に認識し、
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のメチオニンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるそれらの部分配列を含むポリペプチドを認識しない抗体。
（７）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得るように染色体を改変することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法。
（８）該非ヒト脊椎動物はラットである、上記（７）に記載の方法。
（９）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、上記（７）に記載の方法。
（１０）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、上記（７）に記載の方法。
（１１）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に被検物質を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
（１２）該非ヒト脊椎動物はラットである、上記（１１）に記載の方法。
（１３）該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫である、上記（１１）に記載の方法。
（１４）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、上記（１１）に記載の方法。
（１５）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、上記（１１）に記載の方法。
（１６）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に処置を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該処置の効果を検定することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の処置方法のスクリーニング方法。
（１７）該非ヒト脊椎動物はラットである、上記（１６）に記載の方法。
（１８）該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫である、上記（１６）に記載の方法。
（１９）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、上記（１６）に記載の方法。
（２０）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、上記（１６）に記載の方法。
（２１）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法。
（２２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法。
（２３）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は、偏頭痛、脊髄小脳性失調症、発作性失調症、てんかん、運動失調、小脳萎縮、神経線維変性、神経細胞変性、同心円状ラメラ小体形成、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射及び小脳神経細胞消失からなる群より選択される疾患である、上記（２１）又は（２２）に記載の方法。
（２４）該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性である、上記（２１）又は（２２）に記載の方法。
（２５）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬。
（２６）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出する手段を含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬。
（２７）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することを含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法。
（２８）配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異を検出することを含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法。
（２９）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用試薬。
（３０）配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異を検出する手段を含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用試薬。
（３１）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチドを含有するＣａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療剤。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る脊椎動物、特にＧｒｏｇｇｙラットは、種々のＣａｃｎａ１ａ関連疾患のモデル動物として有用であり、当該モデル動物を用いることにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質等をスクリーニングすることが可能である。また、Ｇｒｏｇｇｙラットに見出されたＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異と同様の変異を検出することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患を検査することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列（「Ｍ２５１Ｋ」と略記する場合がある）を含むポリペプチド（「本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド」と略記する場合がある）、又はアミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる、Ｍ２５１Ｋの部分配列を含むポリペプチド（「本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａの部分ペプチド」と略記する場合がある）である。
【０００７】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドは、例えば脊椎動物の細胞又は該細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官に由来するポリペプチドであってもよく、また、後述のように、化学的に、もしくは無細胞タンパク質合成系を用いて生化学的に合成されたポリペプチドであってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを導入された形質転換体から産生される組換えポリペプチドであってもよい。
【０００８】
脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物及び爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、特に限られないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。
【０００９】
細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞などが挙げられる。
【００１０】
組織もしくは器官としては、例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋、尾、つめ、粘膜などが挙げられる。
【００１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、配列番号２における第２５１番目のアミノ酸（即ちメチオニン）が保存されており、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸及び類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら,Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48：444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
実質的に同質の活性としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（「ラットＣａｃｎａ１ａポリペプチド」と略記する場合がある）と同様の電位依存性Ｐ／Ｑタイプカルシウムチャンネル活性などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に（例：生理学的に、又は薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）。
【００１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば(1) 配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号２で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号２で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4) 配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列であって、配列番号２における第２５１番目のアミノ酸（即ちメチオニン）が保存されており、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するような配列も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、アミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を損なわない限り、特に限定されない。
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上述の脊椎動物におけるＣａｃｎａ１ａオルソログのポリペプチドのアミノ酸配列が挙げられる。
【００１４】
「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンが保存されている」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して上述のアルゴリズム等でアラインした場合に、配列番号２における第２５１番目のメチオニンに対応するアミノ酸がメチオニンであることを意味する。アミノ酸番号２５１のメチオニンは、上述の脊椎動物におけるＣａｃｎａ１ａオルソログ間で極めて高度に保存されている。
【００１５】
「アミノ酸番号２５１のメチオニン」とは、配列番号２における第２５１番目のメチオニン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列中における、配列番号２における第２５１番目のメチオニンに対応するメチオニンを意味する。
「アミノ酸番号２５１のリジン」とは、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されて生じたリジンをいう。
【００１６】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を有するラット変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド等が挙げられる。
【００１７】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａの部分ペプチドとしては、Ｍ２５１Ｋにおけるアミノ酸番号２５１のリジンを含む少なくとも５アミノ酸、例えば８アミノ酸、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは５０アミノ酸、より一層好ましくは１００アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる部分配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
本明細書においてアミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチドは、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例：メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合ポリペプチドなども含まれる。
【００１９】
本発明のポリペプチドの塩も、本発明の範囲内である。本発明のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２０】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドは、該変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現する上述の脊椎動物の細胞又は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物の組織又は細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現する脊椎動物は、例えば、下記のＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法に従って製造することが出来る。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky 及び M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) Schroeder及びLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York(1965年)
(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
(4) 矢島治明 及び榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
【００２２】
本発明のポリペプチドの合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質又は部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチド又はそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか又は、対称酸無水物又はＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２３】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸又はアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２４】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、及びその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基又は公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化又はエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２５】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００２６】
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質又は部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質又は部分ペプチドとを製造し、これらのポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質又はペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質又はペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２７】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａの部分ペプチドは、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られる本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
【００２８】
このようにして得られた本発明のポリペプチドは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にポリペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含むポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養して本発明のポリペプチドを生成せしめ、得られる培養物から該ポリペプチドを分離・精製することによって製造することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含むポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含有するものであればいかなるものでもよい。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含むＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、本発明のポリペプチドを発現する上記の脊椎動物の細胞又は該細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡ及びｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製した染色体ＤＮＡ画分及び全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡ及びｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製した染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製される染色体ＤＮＡライブラリー及びｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法又はＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００３０】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列（以下、「Ｔ７５２Ａ」と略記する場合がある）を含有するポリヌクレオチド、あるいはＴ７５２Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、塩基番号７５２のアデニンが保存され、前記した本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。
Ｔ７５２Ａを含有するポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、Ｔ７５２Ａと約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
本明細書におけるヌクレオチド配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００３２】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列を含有するラット変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチド、若しくはそのアレル変異体等である。
【００３３】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａの部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含むポリヌクレオチドは、Ｍ２５１Ｋにおいて、アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、染色体ＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において配列番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列の塩基番号７５２のアデニンを含む、１５塩基、好ましくは３０塩基、より好ましくは１５０塩基、より一層好ましくは３００塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるそれら部分配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３４】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、又は適当な発現ベクターに組み込んだポリヌクレオチドを、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするヌクレオチド断片もしくは合成核酸を標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３５】
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、又はアミノ酸番号２５１のメチオニンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って、アミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンを、リジンをコードするコドンへ変換することによっても得ることが出来る。
【００３６】
クローン化されたポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成核酸アダプターを用いて付加することができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその相補配列）を含むポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。
該発現ベクターは、例えば、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから目的とする核酸断片を切り出し、該核酸断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例：ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例：ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のプロモーター等が用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子のプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３８】
発現ベクターとしては、上記のプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードするヌクレオチド配列（シグナルコドン）を、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端側に付加してもよい。
【００３９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１，ＪＭ１０３，ＪＡ２２１，ＨＢ１０１，Ｃ６００などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４，２０７−２１などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００４０】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
【００４１】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００４２】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１
９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞及び昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００４３】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外に本発明のポリペプチドを生成させることができる。
【００４４】
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、本発明のポリペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれる本発明のポリペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００４５】
かくして得られる本発明のポリペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該ポリペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体又は他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られる本発明のポリペプチドの存在は、特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００４６】
さらに、本発明のポリペプチドは、それをコードするポリヌクレオチド（特にＲＮＡ）を鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.ら, “Transcription and Tranlation”, Hames B.D.及びHiggins S.J.編, IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。
【００４７】
「本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその相補配列」を含むポリヌクレオチドとは、前述の本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドをインフレームでコードするポリヌクレオチドだけではなく、コドンの読み枠の合わない部分ヌクレオチド配列（又はその相補配列）をも含む意味で用いられる。
目的ポリヌクレオチドの標的領域と相補的なヌクレオチド配列（相補配列）を含むポリヌクレオチド、即ち、目的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、該目的ポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的ポリヌクレオチドの標的領域と相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該目的ポリヌクレオチドに対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」又は「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性又は相補性を有することをいう。
【００４８】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチド（以下、「アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチド」ともいう）は、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチドは、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする遺伝子の複製又は発現を阻害することができる。即ち、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）又は機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
【００４９】
アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドの標的領域は、アミノ酸番号２５１のリジンをコードする領域を含み、アンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、結果として本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ又は初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする核酸の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループ等が標的領域として選択しうるが、アミノ酸番号２５１のリジンをコードする領域を含む限り、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡである本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００５０】
アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。
【００５１】
アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００５２】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、染色体ＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードする ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００５３】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。
【００５４】
本発明はまた、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドに対する抗体（以下、「抗変異Ｃａｃｎａ１ａ抗体」と略記する場合がある）を提供する。抗変異Ｃａｃｎａ１ａ抗体は、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドを特異的に認識するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該抗体は、変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００５５】
本発明の抗体は、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを特異的に認識するが、正常Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を認識しないことを特徴とする。従って、該抗体の製造に用いる抗原としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列の部分配列であって、該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる部分配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００５６】
モノクローナル抗体の作製においては、本発明のポリペプチドを、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、マウス及びラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、自体公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ法等により行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００５７】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別及び育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分離精製することができる。
【００５８】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド又はその部分ペプチドに対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（例えば本発明のポリペプチド）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から抗変異Ｃａｃｎａ１ａ抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体の製造等に有用である。
また、本発明のポリヌクレオチドは、（１）本発明のポリペプチドの製造（２）Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造（３）Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬（４）Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療剤（５）Ｇｒｏｇｇｙラットの同定等に有用である。
また、本発明の抗体は、（１）Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬（２）Ｇｒｏｇｇｙラットの同定等に有用である。
【００６０】
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得るように染色体を改変することを含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデル非ヒト脊椎動物の製造方法を提供する。
【００６１】
染色体を改変する方法は、結果として非ヒト脊椎動物が配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る範囲において特に限定されない。該方法としては、例えば、
（１）生殖細胞に変異原性因子を作用させることにより染色体を改変し、該生殖細胞に由来する子孫において本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る個体を見出す方法（方法Ｉ）；
（２）生殖細胞の染色体に本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入し、該生殖細胞に由来する子孫において本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る個体を獲得する方法（方法ＩＩ）；
（３）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の染色体に本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入し、該ＥＳ細胞に由来する子孫において本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る個体を獲得する方法（方法ＩＩＩ）；
等が挙げられる。以下、各方法について述べる。
【００６２】
上記方法Ｉにおいて、変異原性因子としては、Ｎ-エチル-Ｎ-ニトロソウレア、メチルニトロソウレア、塩酸プロカルバジン、トリエチレンメラミン、アクリルアミドモノマー、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、ジエチルスルフェート、エチルメタンスルホネート、メチルメタンスルホネート、６−メルカプトプリン、マイトマイシンＣ、プロカルバジン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、３Ｈ２０、ウレタン、紫外光、Ｘ線、γ線等が挙げられるが、好ましくは、Ｎ-エチル-Ｎ-ニトロソウレア又はメチルニトロソウレアである。
【００６３】
方法Ｉにおいて、生殖細胞としては、特に限定されないが、好ましくは雄性生殖細胞である。雄性生殖細胞としては、精子及びその前駆細胞（精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等）等が挙げられる。
【００６４】
生殖細胞に変異原性因子を作用させる方法としては、特に限定されないが、好ましくは、生殖細胞を有する非ヒト脊椎動物に変異原性因子を投与することにより、変異原性因子を生殖細胞に接触させ、作用させる。該脊椎動物としては、ヒトを除く上述の脊椎動物のいずれを用いてもよいが、好ましくは該脊椎動物はげっ歯類であり、より好ましくはラットである。
また、該脊椎動物は好ましくは雄である。
【００６５】
変異原性因子の非ヒト脊椎動物への投与は、自体公知の方法、例えば(Nat. Biotechnol., vol. 21, p. 645-651, 2003)等に記載された方法等に従って行うことができ、非ヒト脊椎動物中の生殖細胞の染色体を適切な頻度で改変し得る用量の変異原性因子が非ヒト脊椎動物に投与される。これによってランダムに染色体が改変された生殖細胞を有する非ヒト脊椎動物を得ることが出来る。
【００６６】
次に染色体が改変された生殖細胞を有する非ヒト脊椎動物を野生型動物と交配し、該生殖細胞に由来する子孫を獲得する。該子孫動物の体細胞及び生殖細胞には、改変された染色体が伝達される。該交配は自然交配又は人工授精（顕微受精、ＩＶＦ等）であり得るが、操作の簡易性を考えると自然交配により行うことが好ましい。
【００６７】
更に、得られた子孫の中から、内在性のＣａｃｎａ１ａ遺伝子に変異が導入され、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る様になった個体を選択する。
【００６８】
該選択においては、例えば、まず得られた子孫動物に由来する上述の細胞又は該細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官より調製した染色体ＤＮＡ画分及び全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法によって該動物のＣａｃｎａ１ａ遺伝子を増幅する。増幅されたＣａｃｎａ１ａ遺伝子を単離し、そのヌクレオチド配列をダイレクトシークエンス又は適当なベクターにサブクローニングした後で解析することにより、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る様な変異が導入されたか否かを決定し、目的とするポリペプチドを発現し得る様になった個体を選択する。
【００６９】
また、得られた個体が、相同染色体の一方にのみ本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る変異が導入されている場合（ヘテロ接合体）、該へテロ接合体の兄妹同士を交雑することにより、相同染色体の両方に、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る変異が導入された動物（ホモ接合体）を得ることができる。
【００７０】
上記方法ＩＩにおいては、上述の非ヒト脊椎動物の受精卵や、未受精卵、精子及びその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などの生殖細胞に、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入する。
【００７１】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを生殖細胞に導入させるにあたっては、目的とするポリペプチドを、対象となる非ヒト脊椎動物の細胞内で発現させ得るプロモーターの下流に連結した遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として用いるのが一般に有利である。
具体的には、上述の非ヒト脊椎動物に由来し、目的とするポリペプチドを発現させうる各種プロモーターの下流に、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを連結したベクターを、対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）等へマイクロインジェクションすることによって、目的とするポリペプチドを高発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出できる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルス又はバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド又は酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
【００７２】
発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、ウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）及び鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ及びＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなど）のプロモーターなどが挙げられる。
好ましくは、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子は通常、神経系、特に小脳プルキンエ細胞や顆粒細胞に特異的に発現しているので、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを神経系、特に小脳プルキンエ細胞や顆粒細胞に特異的に高発現させ得るプロモーターを適宜選択することができる。該プロモーターはＣａｃｎａ１ａ遺伝子自体のプロモーターであり得る。
【００７３】
上記ベクターは、非ヒト脊椎動物において、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、各種哺乳動物及び鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的のポリペプチドをさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
また、上記のベクターは、導入されたポリヌクレオチドが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。
【００７４】
好ましい一実施態様においては、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト脊椎動物の受精卵に導入される。
対象非ヒト脊椎動物の受精卵は、同種の非ヒト脊椎動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト脊椎動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
【００７５】
受精卵へのポリヌクレオチドの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてポリヌクレオチド溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入されるポリヌクレオチドはＣｓＣｌ密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入されるポリヌクレオチドは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００７６】
ポリヌクレオチド導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト脊椎動物の卵管又は子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト脊椎動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよい。受胚用雌非ヒト脊椎動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト脊椎動物と交配させる時期は、非ヒト脊椎動物の種類によりそれぞれ異なる。
【００７７】
通常、移植される初期胚が８細胞期胚以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜４細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌に哺乳させることができる。
【００７８】
受精卵細胞段階における、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの導入は、導入されるポリヌクレオチドが対象非ヒト脊椎動物の生殖系列細胞及び体細胞のすべてに存在するように確保される。導入されるポリヌクレオチドが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト脊椎動物（Ｆ0）の生殖系列細胞の染色体において本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが存在することは、その後代（Ｆ1）の動物全てにおいて、その生殖系列細胞及び体細胞のすべてに目的とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが伝達されることを意味する。
【００７９】
通常、Ｆ0動物は相同染色体の一方にのみ導入されたポリヌクレオチドを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に導入されたポリヌクレオチドを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ1動物を作出し、相同染色体の一方にのみ導入されたポリヌクレオチドを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。
以上の結果、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る非ヒト脊椎動物を獲得することができる。
【００８０】
方法ＩＩＩにおいては、相同組換えにより、ＥＳ細胞の内在性のＣａｃｎａ１ａ遺伝子座に、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択し、該クローンに由来する子孫を獲得する。
【００８１】
具体的には、例えばまず、対象となる非ヒト脊椎動物から内在性Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子をコードする染色体ＤＮＡを常法に従って単離する。そして、そのＯＲＦを含む領域を適当な制限酵素を用いて切除し、かわりに本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、ターゲッティングベクターを構築する。該ターゲッティングベクターは、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の３‘非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入され、更に、標的配列と相同な領域の外側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子などのネガティブ選択用マーカー遺伝子が挿入されていてもよい。
また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列もしくはｆｒｔ配列を配したターゲッティングベクターを用いてもよい。この場合、適当な時期にＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼ又は該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことができる。
【００８２】
このようにして得られたターゲッティングベクターを、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等によりＥＳ細胞に導入する。好ましくは、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。
【００８３】
ターゲッティングベクターにポジティブ選択用薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入されている場合は、ＥＳ細胞を、対応する薬剤を含有する培地中で培養することにより、ターゲッティングベクターが染色体中に導入されたＥＳ細胞を効率よく選択することが可能である。例えばネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲッティングベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８等のネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養する。
【００８４】
また、ターゲッティングベクターにネガティブ選択用薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入されている場合は、ＥＳ細胞を、対応する薬剤を含有する培地中で培養することにより、ランダムにターゲッティングベクターが導入されてしまったＥＳ細胞を除去し、目的とする相同組換えが起こったＥＳ細胞のみを効率よく選択することが可能である。
【００８５】
選択されたＥＳ細胞は、引き続き培養され、その一部から染色体ＤＮＡが単離され、ＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにより、目的とする相同組換えの存在が確認される。
【００８６】
目的とする相同組換えの存在が確認されたＥＳ細胞を宿主胚に導入することによりキメラ胚を得る。宿主の動物種は、導入されるＥＳ細胞の動物種と同一であることが好ましい。胚としては、特に限定されないが、例えば胚盤胞、８細胞期胚等が挙げられる。
胚はホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧ及びＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させることに等より得ることができる。ＥＳ細胞を宿主胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。
【００８７】
キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入しすることにより、キメラ非ヒト脊椎動物を得る。宿主動物は好ましくは偽妊娠動物である。キメラ胚が移入された宿主動物は、妊娠し、キメラ非ヒト脊椎動物を出産する。
【００８８】
更に、当該キメラ非ヒト脊椎動物を正常動物と交配し、次世代（Ｆ１）個体の中から目的とする相同組換えの存在する個体を選択することにより、相同染色体の一方にのみ本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するヘテロ接合体を得ることが出来る。目的とする相同組換えの存在する個体の選択は、様々な形質を指標として用いることができるが、例えば体色や被毛色が指標として用いられる。また、体の一部から染色体ＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選択を行うこともまた可能である。
【００８９】
更に、上述のヘテロ接合体の兄妹同士を交配することにより、相同染色体の両方に本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するホモ接合体を得ることが出来る。
【００９０】
上述の方法Ｉ〜ＩＩＩにおいては、内在性の正常Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド）の発現が除去された個体を得ることが出来る点で、方法Ｉ及びＩＩＩが好ましい。また、高い効率で目的とする個体を得ることが出来る点では方法ＩＩＩが好ましいが、利用可能なＥＳ細胞が入手困難な動物種においても適用可能である点では方法Ｉが好ましい。
【００９１】
上述の方法Ｉ〜ＩＩＩによって得られる好ましい非ヒト脊椎動物として、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得るように染色体が改変されたラットが挙げられる。該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列であり得る。
【００９２】
上述の方法Ｉ〜ＩＩＩによって得られる最も好ましい非ヒト脊椎動物としてＧｒｏｇｇｙラット及びその子孫が挙げられる。「Ｇｒｏｇｇｙラット」は方法Ｉにより得られたラットで、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得るように染色体が改変されたラットであり、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列（ただし、ｃＤＮＡにおける）を、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子座の両方に有する。
【００９３】
Ｇｒｏｇｇｙラットの受精卵は、２００４年１０月２０日に、日本国茨城県つくば市東１−１−３の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受領番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２６１として寄託されている。
【００９４】
「Ｇｒｏｇｇｙラットの子孫」とは、Ｇｒｏｇｇｙラットに由来する子孫であって、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子座の少なくとも一方（好ましくは両方）がＧｒｏｇｇｙラットに由来し、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列（ただし、ｃＤＮＡにおける）を有するラットをいう。
【００９５】
上述の方法Ｉ〜ＩＩＩ等によって得られる、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物は、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患モデルとして極めて有用である。
【００９６】
Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患とはＣａｃｎａ１ａの機能の異常に起因して起こり得る疾患をいう。Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患としては、例えば、偏頭痛（特に家族性片麻痺性頭痛）、脊髄小脳性失調症（特にタイプ６）、発作性失調症（特にタイプ２）、てんかん（特に全般てんかん、突発性全般てんかん、又は欠神発作）、運動失調（例えば歩行異常、転倒、後肢の伸展等）、小脳萎縮、神経線維変性（例えば錐体路、毛帯、三叉神経脊髄路、前庭系、脊髄小脳路、脳神経における）、神経細胞変性（例えば線条体における）、同心円状ラメラ小体形成（例えば小脳核、前庭核、薄束核の軸索終末部、シナプス全軸索、小脳プルキンエ細胞軸索における形成）、プルキンエ細胞の軸索の腫大、小脳失調症（特に進行性小脳失調症）、眼振、小脳症状、めまい、悪心、嘔吐、発作性運動異常症、皮質性スパイク波発射（Cortical spike-wave discharge）、小脳神経細胞消失等が挙げられる。
【００９７】
また、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物が発症するＣａｃｎａ１ａ関連疾患は、劣勢遺伝性であり得る。
従って、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物をＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデルとして用いる場合、該動物は、内在性の正常Ｃａｃｎａ１ａポリペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド）の発現が除去された個体であることが好ましい。より好ましくは、該動物は、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子座の相同染色体の両方に本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するホモ接合体である。
【００９８】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物はＣａｃｎａ１ａ関連疾患モデルとして極めて有用であるため、該動物又はその生体の一部に被検物質を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該物質の効果を検定することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質をスクリーニングすることが出来る。
【００９９】
具体的には、まず、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に被検物質を適用する。「生体の一部」としては、特に限定されず、上述の細胞、組織もしくは器官等が挙げられる。
【０１００】
被検物質は特に限定されず、例えば、核酸分子、ペプチド系化合物、糖質、脂質、低分子有機化合物、無機化合物、またそれらの混合液、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物、天然物や合成品、動植物や菌類、藻類、微生物からの抽出液が挙げられる。
【０１０１】
被検物質が核酸分子である場合は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、その塩基は一般的なＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ以外にも、天然に存在する他のヌクレオチド又は人工的に合成されたヌクレオチドを含んでもよい。また、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）やチオ化ＤＮＡ等の分解抵抗性核酸ミミックを用いてもよい。
【０１０２】
被検物質として用いられるペプチド系化合物としては、天然アミノ酸からなるペプチド、非天然アミノ酸からなるペプチド及び天然アミノ酸・非天然アミノ酸からなるペプチド、並びに抗体及びその断片が挙げられる。非天然アミノ酸としては、天然アミノ酸のＤ体、β-アミノ酸、γ−アミノ酸などが挙げられる。また、被検物質として、これらの混合物も用いることができる。従って、被検物質として、例えば、ランダム・ペプチド・ライブラリーのメンバー(例えば、Lam，K.S.ら、1991，Nature 354:82-84；Houghten，R.ら、1991，Nature 354:84-86参照)、及びD／L-の立体配置アミノ酸からなる組合せの（combinatorial）化学誘導分子ライブラリーを含む可溶性ペプチド、リンペプチド（phosphopeptide）などを用いることができる。
【０１０３】
非ヒト脊椎動物又はその生体の一部への被検物質の適用は、自体公知の方法により行われ、例えば、例えば経口／非経口にて被検物質が非ヒト脊椎動物へ投与される。
【０１０４】
次に、適用された被検物質が、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物又はその生体の一部におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態を治療し得るか否かが検定される。
被検物質が適用された該非ヒト脊椎動物又はその生体の一部におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態が、被検物質が適用されていない該非ヒト脊椎動物又はその生体の一部（陰性コントロール）におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態と比較され、その絶対的又は相対的な有意差に基づいて被検物質の治療効果が検定される。
【０１０５】
比較の結果、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態を改善させる物質を選択することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質を同定することが出来る。更に、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態をより効果的に改善させる物質を、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患に対する予防・治療効果がより高い物質として選択してもよい。
【０１０６】
また、同様に、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に処置を適用し、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態に及ぼす該処置の効果を検定することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の処置方法をスクリーニングすることが出来る。
【０１０７】
具体的には、まず、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物又はその生体の一部に処置を適用する。
該処置としては、特に限定されず、上述の被検物質の投与のほか、外科的手術、麻酔、物理的療養、移植等の医療行為が挙げられる。
【０１０８】
次に、適用された処置が、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得るように染色体が改変された非ヒト脊椎動物又はその生体の一部におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態を治療し得るか否かが検定される。
処置が適用された該非ヒト脊椎動物又はその生体の一部におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態が、処置が適用されていない該非ヒト脊椎動物又はその生体の一部（陰性コントロール）におけるＣａｃｎａ１ａ関連疾患の病態と比較され、その絶対的又は相対的な有意差に基づいて処置の治療効果が検定される。
【０１０９】
比較の結果、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態を改善させる処置を選択することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の処置方法を同定することが出来る。更に、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の病態をより効果的に改善させる処置を、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患に対するより治療効果の高い処置方法として選択してもよい。
【０１１０】
また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列を発現し得る脊椎動物は、上述のＣａｃｎａ１ａ関連疾患を発症し得るので、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することで、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の罹患リスクを判定することが可能である。本発明はこのようなＣａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法を提供する。
【０１１１】
当該変異の検出は、Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドにおける変異を直接検出することによっても、あるいはＣａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出することによっても可能であり、特に限定されない。
【０１１２】
ポリペプチドにおける変異を直接検出する場合は、例えば、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを特異的に認識する抗体（例えば本発明の抗体）を用いた免疫学的手法により、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドの存在が免疫特異的に検出される。
例えば、まず被検脊椎動物から採取した生体試料より、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを測定可能なサンプルを調製する。生体試料としては、上述の細胞、組織又は器官等が用いられるが、Ｃａｃｎａ１ａを発現し得る部位（神経系、小脳プルキンエ細胞、顆粒細胞等）を用いることが好ましい。
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａをＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、スポット法、凝集法、抗体アレイ、表面プラズモン共鳴等の免疫学的方法により検出する場合、通常、生体試料より液体サンプルが調製される。例えば、生体試料が組織や細胞の場合、これらを機械的に破砕したり、可溶化剤で処理すること等により可溶化物を調製する。本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをフローサイトメトリー法や免疫学的組織染色等の免疫学的方法により検出する場合は、組織や細胞等の生体試料は適宜固定等の処理に付され、抗体により染色される。
【０１１３】
上記検出の結果、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドが検出された場合、測定対象の脊椎動物個体はＣａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドが検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体はＣａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクが低いと判定することが出来る。
該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性であり得る。
【０１１４】
Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出する場合は、まず、被検脊椎動物から採取した生体試料から染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。生体試料としては、上述の細胞、組織又は器官等が用いられるが、入手の容易性を考慮すれば、末梢血、毛髪、つめ、皮膚、粘膜等が用いられることが好ましい。また、変異の解析という観点からは、Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る部位（神経系、小脳プルキンエ細胞、顆粒細胞等）を用いることが好ましい。生体試料からの染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの調製は、当該分野で周知の方法によって行なうことができ、また、市販のキットを用いてもよい。
【０１１５】
上述のようにして得られた染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡに含まれる、Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが変異を有するか否かを決定する。該変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異であり得る。メチオニンをコードするコドンは、通常、ＡＴＧである。リジンをコードするコドンは、通常ＡＡＡ又はＡＡＧであるが、好ましくはＡＡＧである。
脊椎動物がラットである場合、当該変異は配列番号１で表されるヌクレオチド配列において塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異であり得る。
【０１１６】
当該変異は周知の方法によって解析することができる。当該方法としては、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法（例えば、Biotechniques, 16, 296-297 (1994)参照）、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（例えば、Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)参照、ダイレクトシークエンス法（例えば、Biotechniques, 11, 246-249 (1991)参照）、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法（例えば、Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)参照）、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法（例えば、Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)参照）、ＲＮａｓｅＡ切断法（例えば、DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)参照）、化学切断法（例えば、Biotechniques, 21, 216-218 (1996)参照）、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法（例えば、Genome Res., 8, 549-556 (1998)参照）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（例えば、Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)参照）、インベーダー法（例えば、Science, 5109, 778-783 (1993); Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999) 参照）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997)参照）、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997))、サザンブロッティング法等が挙げられる。
【０１１７】
例えば上述の本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＳＯハイブリダイゼーション法や、ＲＮａｓｅＡ切断法によって変異の有無を検出することが可能である。或いは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（アミノ酸番号２５１のアミノ酸はメチオニン又はリジンである）において、アミノ酸番号２５１のアミノ酸をコードするコドンを含む領域を増幅しえるプライマーを用いることにより、ダイレクトシークエンス法等によって変異の有無を検出することが可能である。
【０１１８】
上記検出の結果、上記変異が検出された場合、測定対象の脊椎動物個体はＣａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、上記変異が検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体はＣａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクが低いと判定することが出来る。
【０１１９】
また、該Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患は劣性遺伝性であり得るので、上記変異を相同染色体の両方に有する場合は、相同染色体の一方にのみ変異を有する場合と比較して、より一層Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクが高いと判定することが出来る。逆に上記変異を相同染色体の一方にのみ有する場合は、相同染色体の両方に変異を有する場合と比較して、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患を罹患するリスクは低いと判定することができる。
【０１２０】
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用試薬を提供する。該手段は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出する手段であり得る。該検査用試薬を用いることにより、上述のＣａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法を容易に実施することが可能である。
【０１２１】
該手段としては、特に限定されないが、例えば、
（１）本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａを特異的に認識する抗体（例えば本発明の抗体）；
（２）本発明のポリヌクレオチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（アミノ酸番号２５１のアミノ酸はメチオニン又はリジンである）において、アミノ酸番号２５１のアミノ酸をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマー；
等を挙げることが出来る。
【０１２２】
上述の手段に加えて、更に上記検査方法において用いられる種々の試薬（例えば、タンパク質抽出用試薬、標識抗体、染色体ＤＮＡ調製試薬、全ＲＮＡ調製試薬、ｍＲＮＡ調製試薬、酵素、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、反応容器、検査プロトコールを記載した指示書など）を含めることにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査用キットとしてもよい。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくことも出来る。また、必要に応じて保存剤や防腐剤を各要素に加えることも出来る。該検査用キットは、上記Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法を簡便に実施することを可能とするため極めて有用である。
【０１２３】
また、ＧｒｏｇｇｙラットのＣａｃｎａ１ａポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列であるので、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出することで、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫を同定することが可能である。本発明はこのようなＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法を提供する。
【０１２４】
当該変異の検出は、Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドにおける変異を直接検出することによっても、あるいはＣａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出することによっても可能であり、特に限定されない。
【０１２５】
ポリペプチドにおける変異を直接検出する場合は、例えば、上述のＣａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法と同様に、配列番号２で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体（例えば本発明の抗体）を用いた免疫学的手法により、該変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドの存在が免疫特異的に検出される。
【０１２６】
上記検出の結果、該変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドが検出された場合、該個体はＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫と判定することが出来る。反対に、該変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドが検出されなかった場合は、該個体はＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫ではないと判定することが出来る。
【０１２７】
Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける変異を検出する場合は、まず、被検ラットから採取した生体試料から、上述と同様に、染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
【０１２８】
次に、得られた染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡに含まれる、Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが変異を有するか否かを決定する。該変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異であり得る。メチオニンをコードするコドンは、通常、ＡＴＧである。リジンをコードするコドンは、通常ＡＡＡ又はＡＡＧであるが、好ましくはＡＡＧである。
より好ましくは、当該変異は配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異である。
【０１２９】
当該変異は、上述のＣａｃｎａ１ａ関連疾患の検査方法と同様に、周知の方法によって解析することができる。
【０１３０】
例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列、若しくは塩基番号７５２のアデニンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるその部分配列、又はそれらの相補配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＳＯハイブリダイゼーション法や、ＲＮａｓｅＡ切断法によって変異の有無を検出することが可能である。
或いは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（アミノ酸番号２５１のアミノ酸はメチオニン又はリジンである）において、アミノ酸番号２５１のアミノ酸をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマーを用いることにより、ダイレクトシークエンス法等によって変異の有無を検出することが可能である。
更には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、変異により新たに生じる制限部位（例えばＰｓｉＩ部位）を含む領域を増幅し得るプライマーを用いることにより、当該領域を増幅した後に、対応する制限酵素で増幅物が消化され得るか否かを判定することによっても変異の有無を検出することが可能である。
【０１３１】
上記検出の結果、上記変異が検出された場合、該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫であると判定することが出来る。反対に、上記変異が検出されなかった場合、該ラットはＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫ではないと判定することが出来る。
【０１３２】
特に、本同定方法を用いれば、Ｃａｃｎａ１ａ遺伝子の相同染色体の一方にのみ上述の変異を有する場合に、ラットが運動失調等のＧｒｏｇｇｙラットが通常有する表現型を示さなくとも、Ｇｒｏｇｇｙラットの子孫であることを判定することが可能であり、Ｇｒｏｇｇｙラットの維持、保存、戻し交配等において極めて有用である。
【０１３３】
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンのリジンへの変異を検出する手段を含む、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用試薬を提供する。該手段は配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２５１のメチオニンをコードするコドンのリジンをコードするコドンへの変異を検出する手段、或いは配列番号１で表されるヌクレオチド配列における塩基番号７５２のチミンのアデニンへの変異を検出する手段であり得る。該検査用試薬を用いることにより、上述のＧｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法を容易に実施することが可能である。
【０１３４】
該手段としては、特に限定されないが、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体（例えば本発明の抗体）；
（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、塩基番号７５２のチミンがアデニンに置換されたヌクレオチド配列、若しくは塩基番号７５２のアデニンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるその部分配列、又はそれらの相補配列を含むポリヌクレオチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（アミノ酸番号２５１のアミノ酸はメチオニン又はリジンである）において、アミノ酸番号２５１のアミノ酸をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマー；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、変異により新たに生じる制限部位（例えばＰｓｉＩ部位）を含む領域を増幅し得るプライマー及び対応する制限酵素；
等を挙げることが出来る。
【０１３５】
上述の手段に加えて、更に上記同定方法において用いられる種々の試薬（例えば、タンパク質抽出用試薬、標識抗体、染色体ＤＮＡ調製試薬、全ＲＮＡ調製試薬、ｍＲＮＡ調製試薬、酵素、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、反応容器、試験プロトコールを記載した指示書など）を含めることにより、Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定用キットとしてもよい。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくことも出来る。また、必要に応じて保存剤や防腐剤を各要素に加えることも出来る。該同定用キットは、上記Ｇｒｏｇｇｙラット又はその子孫の同定方法を簡便に実施することを可能とするため極めて有用である。
【０１３６】
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２５１のメチオニンがリジンに置換されたアミノ酸配列、又は該アミノ酸番号２５１のリジンを含む５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチド（アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチド）を含有するＣａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療剤を提供する。
【０１３７】
アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用する場合は、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【０１３８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【０１３９】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、上述の脊椎動物に対してその有効量を投与することによって、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患を予防・治療し得る。
【０１４０】
アンチセンス変異Ｃａｃｎａ１ａポリヌクレオチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、Ｃａｃａｎａ１ａ関連疾患のヒト（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、Ｃａｃａｎａ１ａ関連疾患のヒト（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の脊椎動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１４１】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１４２】
〔１〕実験方法
（１）遺伝子マッピング
(Groggy X BN) F1雌ラットとGroggy雄ラットとを交配し、戻し交雑仔766匹を作製した。ホモ(gry/gry)個体は、3-4週齢頃から観察される歩行異常によって識別した。動物の脾臓から染色体ＤＮＡを抽出し、全てのラット染色体をカバーする100個のマイクロサテライトマーカーを用いてポジショナルクローニングを行った。PCR反応はTaq polymerase (Takara)を用いて、35サイクル（変性  94℃、30秒、アニーリング  55℃、1分、伸張反応  72℃、5秒）の条件で行い、PCR産物はエチジウムブロマイド染色を利用して4%のアガロースゲル電気泳動で観察した。
【０１４３】
（２）RT-PCR とシークエンス解析
ISOGEN(NIPPON GENE, Tokyo)を用いて、9週齢のGroggyラットの脳から全RNAを抽出し、このうち5 μgを用いて、Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Leek, Netherland)によって、一本鎖cDNAを合成した。50-μlに溶解したcDNAのうちの1 μlをテンプレートとし、GenBank から検索したrat CACNA1AのcDNA塩基配列 (NM_012918)を基に作製したプライマーを用いてPCR反応を行った(表１)。
【０１４４】
【表１】
2006121953.tif 000002
【０１４５】
PCR産物は、Big Dye Terninator Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City, CArlif)を利用してサイクルシークエンスを行い、Dye ExTM 2.0 Spin Kit (QIAGEN)で精製した。精製物は60%ホルムアルデヒドに溶解し、ABI 3100 genetic analayzer (Applied Biosystems)によりシークエンスした。
【０１４６】
（３）ゲノムシークエンス
gry遺伝子座を挟むプライマーセット(5’-CGTCCTGAAGTCAATCATGAAG-3’（配列番号２９）, 5’-AGTCTCAGCTGCTCTGTGGTT-3’（配列番号３０）)を用いたPCR反応を、Pyrobest (Takara)を用いて30サイクル（変性  98℃、2秒、アニーリング  60℃、30分、伸張反応  72℃、1分）の条件下で行った。テンプレートとして、Groggy親ラット、戻し交雑仔ホモ及びヘテロ個体、ACI、BN、DON、DRH、F344、IS及びWTCラットの染色体ＤＮＡを用いた。得られたPCR産物を上述の方法によりシークエンスした。
【０１４７】
（４）制限酵素反応
染色体ＤＮＡから複製されたPCR産物に制限酵素PSi I(Sib Enzyme)を加え、37℃で14時間放置した。PSi Iによる切断は2%のアガロースゲル電気泳動によって観察した。
【０１４８】
（５）脳波記録
ペントバルビタール麻酔下で、Groggyラットの大脳皮質に脳波記録用電極を埋め込み、 Thermal Array Recorder (Nihon Kohden)と接続するためにミニチュアプラグを頭部正中に設置した。脳波の記録は、手術1週間後より行った。動物は脳波記録用シールド箱(40X40X40 cm)内に30分間放置して馴化させた後、30分間の脳波記録と行動観察を行った。動物の動作停止と一致して出現する脳波上1秒間以上の7-8 Hz棘徐波複合を欠神様発作として、30分間の出現回数と持続時間を測定した。動物の覚醒状態を保持するために、5分ごとにGroggyラットの背部に息を吹きかけて刺激を与えた。
【０１４９】
（６）抗てんかん薬の薬理効果試験
エトスクシミド(SIGMA) 200mg/kg と フェニトイン ナトリウム塩 (SIGMA) 20mg/kgを使用した。これらの抗てんかん薬は臨床使用されており、エトスクシミドによって欠神様発作は抑制されるが、フェニトインでは抑制されない。エトスクシミドはポリエチレングリコールに溶解した後、滅菌水によって希釈し、フェニトインは滅菌水に溶解したものを用いた。対照として、5％ポリエチレングリール液(溶媒)を用意した。抗てんかん薬投与前に、15分間のコントロール脳波記録を行った。次いで、溶媒、エトスクシミド、又はフェニトインを腹腔内投与し、投与後15-30及び45-60分後のおのおの15分間の欠神様発作の回数とその持続時間を測定した(図１)。
【０１５０】
〔２〕結果
（１）gry変異の同定
gry遺伝子の連鎖地図上の位置を決定することを目的に、Groggy X (Groggy X BN)F1から得られた戻し交雑仔766個体を用いて、ラット第1番から第20番染色体までをカバーする80個のマイクロサテライトマーカーを利用してポジショナルクローニングを行った。gry遺伝子座は、マーカーD19rat36と D19Rat25に連鎖した。さらに第19番染色体をカバーする20個のマーカーを用いた連鎖解析によって、gry遺伝子はラット第19染色体上のD19Rat122とD19Rat120の間にマップされた(図２)。この領域には、電位依存型P/QタイプカルシウムチャネルのCav2.1サブユニットをコードしているCalcium channel α1A subunit（Cacna1a）遺伝子がマップされている。Cacna1a遺伝子を、gry変異の有力な候補遺伝子として注目し、ラットCACNA1A  mRNA の塩基配列をカバーするプライマーと、Groggy ラット由来の脳cDNAを用いてRT-PCRを行った。連続したシークエンス解析により、GroggyラットのCacna1a遺伝子のコーディング領域にチミジン(T)からアデニン(A)への点突然変異を発見した。この変異は、CACNA1Aタンパクの第251番目のメチオニンをリジンに置換し(Met251Lys)、この部位は、チャネルのポアを形成するP-loopの細胞外領域に相当していた。ゲノムシークエンスにより、このミスセンス変異は、Groggy親ラット、及び戻し交雑仔個体にのみみられ、Ｇｒｏｇｇyラット特有のものであった(図３A)。それゆえ、gry遺伝子による突然変異形質は、Cacna1a遺伝子のMet251Lys変異によって生じると推定した(図３C)。解析ソフトGENETIXを用いて制限酵素部位の検索を行った結果、gry変異によって、その領域にPsi Iの切断部位が出現することがわかった。このことを確認するために、ゲノムから増幅したPCR産物を用いて、Psi Iによる制限酵素反応を行った結果、gry対立遺伝子をもつ個体でのみPCR産物の切断が確認された(図３B)。
【０１５１】
（２）Groggyラットの欠神様発作
totteringに代表されるようなCACNA1A遺伝子変異マウスでは、行動上の欠神様発作に一致して棘徐波複合が観察されている。そこで、Groggyラットにおいても、同様な形質が疑われ、行動観察と脳波記録を行った。動物は脳波記録中に突然動作を停止し、この時脳波上7-8Hzの棘徐波複合が観察された。この発作頻度は0.47回/分、 30分間の総持続時間は200.3秒であった(表2, 図3)。
【０１５２】
【表２】
2006121953.tif 000003
【０１５３】
表２にはＧｒｏｇｇｙラットにみられた欠神様発作の頻度（Ｏ）と発作１回あたりの持続時間（Ｄ）を示す。
【０１５４】
さらに、抗てんかん薬を用いた薬理効果試験では、Groggyラットの欠神様発作はエトスクシミドにより明らかに抑制され、フェニトインでは抑制されなかった(表 3, 図5)。
【０１５５】
【表３】
2006121953.tif 000004
【０１５６】
表３にはＧｒｏｇｇｙラットの欠神様発作に対する抗てんかん薬の効果を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明の変異Ｃａｃｎａ１ａポリペプチドを発現し得る脊椎動物、特にＧｒｏｇｇｙラットは、種々のＣａｃｎａ１ａ関連疾患のモデル動物として有用であり、当該モデル動物を用いることにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患の予防・治療物質等をスクリーニングすることが可能である。また、Ｇｒｏｇｇｙラットに見出されたＣａｃｎａ１ａ遺伝子の変異と同様の変異を検出することにより、Ｃａｃｎａ１ａ関連疾患を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】Ｇｒｏｇｇｙラットの欠神様発作に対する抗てんかん薬の効果試験のプロトコールを示す。
【図２】ｇｒｙ遺伝子のマッピングを示す。Ａ）は戻し交雑仔７６６個体を利用したラット第１９番染色体のハプロタイプの分布図を示す。黒ボックスはｇｒｙ対立遺伝子ホモ接合子を、白ボックスはヘテロ接合子を示す。Ｂ）はｇｒｙ遺伝子座領域の連鎖地図を示す。
【図３】ｇｒｙ変異の同定を示す。Ａ）はＢＮ及びＷＴＣラット、戻し交雑仔ホモ（ｇｒｙ／ｇｒｙ）及びヘテロ（ｇｒｙ／＋）個体のゲノムシークエンスを示す。Ｂ）はＰｓｉＩによる制限酵素反応を示す。Ｃ）はｇｒｙ変異による第２５１番目のアミノ酸のメチオニン（Ｍｔ）からリジン（Ｌｙ）への置換を示す。
【図４】Ｇｒｏｇｇｙラット（６週齢）の大脳皮質脳波を示す。行動上の欠神様発作に一致して、脳波上に大脳皮質両側性の棘徐波複合が観察される。
【図５】Ｇｒｏｇｇｙラットの欠神様発作に対するエトスクシミド（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与）とフェニトイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．投与）の効果を示す。
【図１】
2006121953.tif 000005
【図２】
2006121953.tif 000006
【図５】
2006121953.tif 000007
【図３】
2006121953.tif 000008
【図４】
2006121953.tif 000009
【配列表】
2006121953000001.app