(57)【要約】  【課題】  細胞内におけるROS量の増加を抑制し、細胞に対する酸化ストレスの影響を低減する細胞培養方法を提供する。  【解決手段】  目的の細胞に、以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子を導入し、培養を行う。前記遺伝子は、例えば、ベクターに組み込んだ組換えベクターにより前記細胞に導入することができる。（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ROSの増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する方法であって、
細胞に対する酸化ストレスの影響を低減するために、細胞の培養に先立って、前記細胞に、以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子を導入する工程を含む、細胞の培養方法。
（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、活性酸素種の増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
yfiDの塩基配列が、配列番号１で表される、請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
yggBの塩基配列が、配列番号３で表される、請求項１記載の培養方法。
【請求項４】
yggEの塩基配列が、配列番号５で表される、請求項１記載の培養方法。
【請求項５】
yfiD、yggBおよびyggEが、Eschericia coli由来の遺伝子である、請求項１記載の培養方法。
【請求項６】
前記遺伝子が、配列番号７および配列番号８で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１記載の培養方法。
【請求項７】
前記遺伝子が、配列番号９および配列番号１０で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１記載の培養方法。
【請求項８】
前記遺伝子が配列番号１１および配列番号１２で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１記載の培養方法。
【請求項９】
PCR増幅産物が、Eschericia coliのゲノムDNAを鋳型としたPCRによって得られる産物である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１０】
細胞に遺伝子を導入する手段が、ベクターに前記遺伝子を組み込んだ組換えベクターを前記細胞に導入する手段である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の記載の培養方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクターおよびウィルスベクターからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０記載の培養方法。
【請求項１２】
好気条件下で前記細胞の培養を行う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１３】
細胞中の活性酸素種含有量を低減することにより、酸化ストレスの影響を低減する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記細胞が、微生物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の記載の培養方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞の培養方法に使用する遺伝子であって、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、活性酸素種の増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１６】
yfiD遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１７】
yggB遺伝子の塩基配列が、配列番号３で表される、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１８】
yggE遺伝子の塩基配列が、配列番号５で表される、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１９】
yfiD、yggBおよびyggEが、Eschericia coli由来の遺伝子である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項２０】
前記遺伝子が、配列番号７および配列番号８で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項２１】
前記遺伝子が、配列番号９および配列番号１０で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項２２】
前記遺伝子が配列番号１１および配列番号１２で表されるプライマーを用いたPCR法によって得られるPCR増幅産物である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項２３】
PCR増幅産物が、Eschericia coliのゲノムDNAを鋳型としたPCRによって得られる産物である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞の培養方法に使用する組換えベクターであって、ベクターに遺伝子が組み込まれており、前記遺伝子が、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２５】
細胞に組換えベクターが導入された形質転換体であって、前記組換えベクターが請求項２４記載の組換えベクターであることを特徴とする、形質転換体。
【請求項２６】
前記細胞が、微生物である、請求項２５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌等の微生物をはじめとする各種細胞を培養する方法、およびそれに用いる遺伝子、組換えベクターならびに形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
好気性生物は、増殖のためのエネルギーを効果的に得るために、呼吸において、最終電子受容体として分子酸素を優先的に利用している。このため、好気性生物にとって酸素は必須要素といえる。
【０００３】
しかしながら、一方で酸素は、細胞にダメージを与える酸化ストレスにも関与している。すなわち、酸素の一部は、細胞内における種々の代謝過程で発生する電子を受容し、例えば、スーパーオキシドアニオン（O2-）、過酸化水素、ヒドロキシラジカルのような反応性に富む活性酸素種（ROS：reactive oxygen species）に変換される。変換されたROSは、DNA破壊、酵素の不活性化、膜脂質の酸化等を引き起こす、細胞の機能低下や細胞破壊の原因として知られており、これによって細胞がダメージを受ける（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
従来、好気性細胞の培養については、酸素を効果的に細胞に供給するための操作論やバイオリアクター設計等の検討がなされている。また、培養時の酸素条件に関しては、酸素が必須要素であるため、一般的に高酸素雰囲気に設定される（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、好気性細胞を高酸素雰囲気下で培養しても、培養効率は必ずしも向上せず、例えば、増殖速度や細胞収率の極端な低下がしばしば確認されている。
【非特許文献１】Finkel, T. and N. J. Holbrook. 2000. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408:239-247.
【非特許文献２】田口久治、微生物培養工学（田口久治・永井史郎編）、5章発酵槽への酸素供給、ｐ153-199、1985年、共立出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、本来必須要素である酸素を十分量供給したにも関わらず、このような培養効率に低下が見られるのは、酸化ストレスの発生、すなわち、酸素から変換された細胞内ROSの発生に原因があると推測した。また、絶対嫌気性細胞を培養する場合や、嫌気性発酵を行う場合には、酸素量が極めて低い条件、特に酸素非存在での培養が望まれている。しかし、そのような環境設定の実現は、培養スケールが大きくなるに従って困難性が増すため、発明者らは、前述と同様に酸素から変換されるROSが原因となる酸化ストレスによって、細胞の増殖が影響を受ける場合があると推測した。
【０００６】
したがって、本発明は、細胞内におけるROS量の増加を抑制し、細胞に対する酸化ストレスの影響を低減する細胞培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞に対する酸化ストレスの影響を低減するために、細胞の培養に先立って、前記細胞に、以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子を導入する工程を含む。
（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ROSの増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００８】
また、本発明の遺伝子は、前記本発明の細胞培養方法に使用する遺伝子であって、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ROSの増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００９】
さらに、本発明の組換えベクターは、前記本発明の細胞培養方法に使用する組換えベクターであって、ベクターに遺伝子が組み込まれており、前記遺伝子が、前記本発明の遺伝子であることを特徴とする。また、本発明の形質転換体は、細胞に組換えベクターが導入された形質転換体であって、前記組換えベクターが前記本発明の組換えベクターであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞培養方法によれば、メカニズムは不明であるが、予め前述のような本発明の遺伝子を細胞に導入することによって、酸化ストレスの影響を抑制しながら細胞を培養することができる。なお、yfiD、yggBおよびyggEは、それぞれ発現タンパク質の機能は報告されていないが、このように細胞への導入によって酸化ストレスの影響を回避する働きを奏することは、本発明者らがはじめて見出したことである。また、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子がベクターに組み込まれているため、目的の細胞に前記組換えベクターを導入し、その形質転換体を使用することによって、本発明の培養方法を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞培養方法は、前述のように、細胞に対する酸化ストレスの影響を低減するために、細胞の培養に先立って、前記細胞に、本発明の遺伝子、すなわち、以下の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子を導入する工程を含む。
（ａ）  yfiD、yggBおよびyggEからなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、ROSの増加を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１２】
前記（ｂ）に示すように、前記ＤＮＡは、細胞への導入によって、細胞内ROSの増加を抑制できるものであれば、前記（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列であってもよい。ここで、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、40塩基に対して、欠失・付加で、1個〜6個であり、1個〜3個が好ましく、より好ましくは1個〜2個であり、置換で、1個〜4個であり、1個〜2個が好ましく、より好ましくは1個である。
【００１３】
また、前記（ｂ）に示すＤＮＡとしては、前述のような欠失、置換または付加された塩基数には限定されず、例えば、前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡや、前記（ａ）のＤＮＡとの相同性が90％以上であるもの、好ましくは95％以上、より好ましくは97.5％以上であるものがあげられる。前記ハイブリダイズは、従来公知の方法で行うことができ、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、前記（ａ）のＤＮＡ塩基配列の融解温度（Ｔｍ値）に対して、±10℃があげられる。
【００１４】
前記yfiDの塩基配列は、例えば、配列番号１で表され、yggBの塩基配列は、例えば、配列番号３で表され、yggEの塩基配列は、例えば、配列番号５で表される。また、細胞内への導入によってROSの増加を抑制する活性を示す範囲内であれば、これらの配列番号で表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基の欠失、置換もしくは付加を行ってもよい。なお、配列番号１、３、５で表される塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６で表される。
【００１５】
yfiD、yggBまたはyggEの塩基配列としては、例えば、Eschericia coli由来であるyfiD、yggBまたはyggEの塩基配列があげられる。前述した配列番号１、３、５の塩基配列は、それぞれE.coli K-12 W3110由来のyfiD、yggBおよびyggEの配列である。また、前記配列番号５に記載の塩基配列は、例えば、5'末端が「GTG」に代えて「ATG」であってもよい。
【００１６】
本発明の遺伝子において、yfiD、yggBまたはyggEの塩基配列としては、E.coliの塩基配列には制限されず、例えば、他の生物由来であるyfiD、yggBまたはyggEの塩基配列であってもよい。yfiD、yggBおよびyggEの塩基配列は、例えば、GenoBase（http://ecoli.aist-nara.ac.jp/GB5/search.jsp）や、NCBI Entrez（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html）等より取得できる。
【００１７】
また、既知であるyfiD、yggBまたはyggEの塩基配列を基にプライマーを作製し、これを用いてPCR法によって得られるPCR増幅産物を、本発明の遺伝子として使用することもできる。なお、PCRは常法に従って行うことができる。
【００１８】
前記プライマーとしては、例えば、yfiD、yggBまたはyggEの塩基配列における開始コドンまたは終止コドンを含む断片に対して、相補的な塩基配列であることが好ましい。前記プライマーの長さは特に制限されないが、例えば、10〜40mer、好ましくは15〜40mer、好ましくは20〜30merの範囲である。yfiD、yggBおよびyggEに対するプライマーの具体例を以下に示すが、これには何ら制限されない。
(yfiD)
forward primer : 配列番号７    5'-ATGATTACAGGTATC-3'
reverse primer : 配列番号８    5'-TTACAGGCTTTCAGT-3'
(yggB)
forward primer : 配列番号９    5'-ATGGAAGATTTGAAT-3'
reverse primer : 配列番号１０  5'-TTACGCAGCTTTGTC-3'
(yggE)
forward primer : 配列番号１１  5'-ATGAAGTTCAAAGTT-3'
reverse primer : 配列番号１２  5'-TTATTGTGCTGCAGG-3'
【００１９】
前記PCRの鋳型DNAとしては特に制限されず、例えば、E.coli等の各種細菌、古細菌、菌類、藻類等の微生物等のゲノムDNA、cDNA等が使用できる。具体的には、yfiDの鋳型DNAとしては、例えば、Shigella flexneri, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Serratia liquefaciens, Vibrio vulnificus, Photobacterium profundum等のゲノムDNAがあげられ、yggBの鋳型DNAとしては、Shigella flexneri, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa等のゲノムDNAがあげられ、yggEの鋳型DNAとしては、Shigella flexneri, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Edwardsiella ictaluri, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus等のゲノムDNAがあげられる。なお、これらには制限されない。
【００２０】
本発明の培養方法において、この方法を適用できる細胞は、特に制限されず、酸化ストレスにより何らかの影響を受ける細胞であれば、本発明の培養方法により効果が得られる。したがって、例えば、大腸菌、Salmonella属をはじめとする細菌、古細菌、菌類等の微生物の他にも、植物細胞や動物細胞等へも適用可能である。なお、本発明において培養の対象である「細胞」とは、単細胞生物や多細胞生物だけでなく、培養可能な組織、器官等であってもよい。
【００２１】
本発明において、遺伝子を細胞に導入する手段は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。一例として、前記遺伝子をベクターに組み込んだ本発明の組換えベクターを使用する方法があげられる。このように本発明の組換えベクターを使用すれば、常法によって、細胞内に本発明の遺伝子を導入できるため、得られた形質転換体を培養すれば容易に本発明を実施できる。
【００２２】
前記ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等があげられ、これらは、例えば、組換えベクターを導入する細胞の種類等に応じて適宜決定できる。また、組換えベクターの導入法も、特に制限されず、導入する細胞の種類に応じて、塩化カルシウム処理法やエレクトロポレーション法等、従来公知の方法が採用できる。
【００２３】
本発明において、前記細胞の培養条件は、特に制限されず、例えば、好気条件、嫌気条件、酸素供給量、温度、攪拌等の種々の条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。中でも、本発明の培養方法は、従来では細胞成育に酸化ストレスの影響が発生していた条件において、極めて有用である。例えば、従来の方法では、好気性細菌等の生育促進を目的として過剰の酸素を供給した場合、前述のように、酸化ストレスによって反対に生育が阻害されるおそれがある。しかしながら、このような条件下であっても、本発明の培養方法を適用すれば、酸化ストレスの影響が低減されるため、供給された酸素を十分に利用することが可能となり、生育を促進できる。また、例えば、嫌気性細菌等を嫌気的に培養する場合、従来と同様の培養条件であっても、本発明を適用することによって、さらに生育を安定化することができる。これは、嫌気的な培養条件に加えて、細胞への本発明の遺伝子導入によって、さらに酸素（酸化ストレス）の影響を抑制できるためである。
【００２４】
なお、細胞内におけるROS含量は、従来公知の方法によって測定でき、特に制限されないが、例えば、商品名CM-H2DCF-DA（Moleculer Probes社製）により測定できる。
【００２５】
以下に、参考例を示す。
【００２６】
（参考例１）
１．酸化ストレス条件下における大腸菌IM303-I4の生育促進
（菌体）
大腸菌としてE.coli IM303-I4を使用した。このIM303-I4は、関西大学工学部生物工学科土戸教授より提供されたE.coli IM303からの単離菌である。E.coli IM303は、ROSであるスーパーオキシドアニオンを除去するためのSOD（スーパーオキシドジスムターゼ）を欠損しているため、細胞内でROSが発生しても、通常、それを除去することができず、生育が損なわれるとされている。
【００２７】
（培地）
8g/L グルコースおよび5mg/L チアミンを含むM9改良培地に、アミノ酸mixtureを添加して使用した。前記アミノ酸mixtureとして、1Lあたり0.25g Met、0.25g Arg、0.30g Tyr、0.60g Lys、0.80g Ile、0.40g Phe、1.5g Val、0.50g Asp、2.0g Thr、0.80g Gluおよび3.75g Serを添加した（以下、「2068 mixture」という）。なお、このアミノ酸mixtureは、American Type Culture Collection（ATCC）のカタログにATCC2068用合成培地として記載されている。
【００２８】
（培養条件）
酸化ストレスを与える条件下で、E.coli IM303-I4を培養した。酸化ストレスは、培地に添加した酸化チタンに光照射を行い、励起した酸化チタンから活性酸素を発生させることによって与えた。具体的には、10mg/LとなるようにTiO2粒子(商品名Degussa P25：日本アエロジル社製)を添加した前記M９改良培地10ｍLをL型試験管に入れ、これにE.coli IM303-I4を接種し、37℃、45ストローク/min（spm）の条件下で振とう培養した。なお、酸化チタンを励起させるために、培養の間、前記L型試験管を暗幕で覆い、前記L型試験管に有効波長300-420nmの20Wブラックライト蛍光ランプ(商品名Type FL-20S BL-B：松下電器産業社製)を用いて、入射光強度I=12.5W/m2で光照射した。一方、コントロールとして、TiO2粒子無添加の前記M9改良培地を使用し、且つ、ブラックライト蛍光ランプによる光照射なしで、前述と同様にしてIM303-I4の培養を行った（通常の培養条件）。そして、各培養液について波長660nmの光学密度（OD660）を測定し、これを細胞密度として経時的変化を確認した。この結果を図１（A）の生育曲線のグラフに示す。なお、図１（A）において、酸化チタン存在下で光照射した結果を「○：TiO2 and light」で表し、コントロールを「●：-TiO2 and - light（normal condition）」で表した。また、最大比増殖速度（μm）、誘導時間（lag time：tL）は、Zwietering, M.H.ら（Zwietering, M.H., L. Jongenburger, F. M. Rombouts and K. van't Riet. 1990 Modeling of the bacterial growth curve. Appl. Environ. Microbiol. 56:1875-1881.）により報告された改良ゴンベルツ方程式（Gompertz equation）に、得られた生育曲線のデータを当てはめることによって算出した。
【００２９】
（ROS含量）
また、OD660=0.2である培養細胞について、細胞内のROS含量を測定した。ROS含量は、前記培養液から培養細胞を回収し、商品名CM-H2DCF-DA（Moleculer Probes社製）を使用してその使用説明書に従って測定した。これらの結果を図１（B）に示す。
【００３０】
図１（A）に示すように、E.coli IM303-I4を、励起された酸化チタンの存在下で培養した場合、コントロール（酸化チタン非存在下、非光照射）と比べて、約２倍の最大比増殖速度（μm）を示した。また、図１（B）に示すように、通常条件で培養したコントロールに比べて、酸化ストレスを与えた場合に、E.coli IM303-I4はROS含量の増加を抑制できた。このように、E.coli IM303-I4は、スーパーオキシドアニオンを除去するSODを欠いており、且つ、コントロールよりも過酷な培養条件であるにも関わらず、ROS含量を低減するという結果を示した。
【００３１】
２．酸化ストレス下におけるE.coli IM303-I4の遺伝子発現の解析
以上の結果に基づき、続いて、酸化ストレスを与えることによる、E.coli IM303-I4における遺伝子発現の変化を確認した。
【００３２】
前述と同様にして、E.coli IM303-I4を培養した。なお、光励起された酸化チタン存在下でのE.coli IM303-I4の最大比増殖速度（μm）は、0.4h-1であり、酸化チタン非存在下で培養したE.coli IM303-I4の最大比増殖速度（μm＝0.16h-1）の2.56倍であった。そして、生育がOD660=0.15に達した時点で、培養液18ｍLをサンプリングし、直ぐに10％フェノールを含む等量の冷エタノールと混合した。この混合液から遠心分離（5分、4℃、5,000(ｇ）により菌体細胞を回収した後、前記フェノール含有冷エタノール溶液で細胞を洗浄し、続いて回収した細胞ペレットよりRNAを抽出した。全RNAは、商品名RNeasy Mini KitとRNase-free DNase Set(QIAGEN Inc.製)とを使用し、その使用説明書に従って全回収細胞から抽出した。抽出したRNAsをフェノール/クロロホルム処理した後、エタノール沈殿によって精製RNAsを再回収した。精製RNAsの全濃度は、波長260nmと280nmにおいて測定した吸光度差より算出した。
【００３３】
標識化cDNAsは、商品名RNA Fluorescence Labeling Core Kit(タカラバイオ社製)、および商品名dUTP-Cy3 fluorescent nucleotideならびに商品名dUTP-Cy5 fluorescent nucleotide(Amersham Biosciences Ltd.製)を使用し、その使用説明書に従って、前述の精製RNAsより調製した。DNAマイクロアレイ分析は、E.coli K-12におけるオープンリーディングフレーム(ORFs)の約80％に相当する3,437種の遺伝子（cDNAs）を固定化したチップ（商品名IntelliGene E.coli CHIP：タカラバイオ社製）を用いて、その使用説明書に従って行った。また、蛍光強度は、商品名GMSTM 418 Array Scanner(Genetic MicroSystems Inc.製)および商品名ImaGeneTM (BioDiscovery Inc.製)を用いたイメージ分析により行った。そして、酸化ストレス存在下で培養された細胞由来の標識化cDNAsおよび酸化ストレス非存在下で培養された細胞由来cDNAsのそれぞれのデータを比較した。具体的には、酸化ストレス非存在下での値を基準として、酸化ストレス存在下での値について、蛍光強度の比を求めた。なお、前記比が3以上を示す遺伝子は、酸化ストレス下において増加調節（up-regulated）された遺伝子であり、0.3未満を示す遺伝子は、酸化ストレス下において低下調節(down-regulated)された遺伝子であると判断した。
【００３４】
その結果、fruB (313)、fruK (939)、pheA (1161)、fruA (1692)、yfiD (384)、putA (3933)、yghD (532)、blc (534)、spy (486)、ymgD (330)、pheT (2388)、stpA (405)、gltB (4545)、gltD (1419)、gpmI (1545)、yqhC (957)、yggG (885)、nadB (1623)、pheS (984)、yggB (861)、nagB (801)、galP (1395)、arp (2187)、yggE (741)、osmB (219)という２５種類の遺伝子について、酸化ストレス存在下で発現量の増加が見られた。なお、括弧内は、各遺伝子の塩基数を示す。中でも、yfiD、yggBおよびyggEは、大きな発現量の増加が見られ、特にyfiD遺伝子には著しい増加が見られた。以上の結果から、これら２５種類の遺伝子、特に著しい発現量の増加が見られたyfiD、yggBおよびyggEが、ROS含有量の増加抑制に関与していると言える。なお、実際に、これらの遺伝子がROS含量の増加抑制に寄与し、これらを細胞に導入することによってROS増加抑制の効果が得られることについては、以下の実施例において説明する。
【００３５】
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
yfiD、yggBおよびyggEを挿入した組換えプラスミドを使用して、培養時における酸化ストレスの影響回避を確認した。
【００３７】
（組換えプラスミドの構築）
yfiD、yggBおよびyggEを、それぞれ野生株E.coli MM294の染色体DNAから、商品名KOD-Dash DNA polymerase(東洋紡社製)を用いたPCR法によって増幅させた。前記PCR法に使用したプライマーの組み合わせを以下に示す。
【００３８】
（yfiD）
forward primer : 配列番号１３  5'-CCCAAGCTTGATGATTACAGGTATC-3'
reverse primer : 配列番号１４  5'-CGGAATTCTTACAGGCTTTCAGT-3'
(yggB)
forward primer : 配列番号１５  5'-CCCAAGCTTGATGGAAGATTTGAAT-3'
reverse primer : 配列番号１６  5'-CGGAATTCTTACGCAGCTTTGTC-3'
(yggE)
forward primer : 配列番号１７  5'-CCCAAGCTTGATGAAGTTCAAAGTT-3'
reverse primer : 配列番号１８  5'-GCTCTAGATTATTGTGCTGCAGG-3'
【００３９】
なお、これらのPCR増幅用プライマーは、それぞれ5’末端側に制限酵素の認識部位となる塩基配列が付加されている。
【００４０】
PUC19のクローニングサイトを制限酵素で切断し、その切断部位に、商品名Ligation-Convenience Kit(日本ジーン社製)を用いて、前記各増幅産物（yfiD、yggB、yggE）を連結した。なお、制限酵素としては、yfiDおよびyggBについては、HindIIIおよびEcoRI、yggEについては、HindIIIおよびXbaIを使用した。この組換えプラスミドをE.coli DH5aに導入して形質転換を行い、細胞内で増幅したプラスミドDNAsを常法に従って抽出した。このプラスミドDNAsを、商品名Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems(Promega Corp.製)を用いて精製した。得られた組換えプラスミドは、yfiDを挿入したpUC19を「pYFD」、yggBを挿入したpUC19を「pYGB」、yggEを挿入したpUC19を「pYGE」と呼ぶ。
【００４１】
E.coli IM303-I4に、前記組換えプラスミド（pYFD、pYGB、pYGE）をそれぞれ導入し、得られた各形質転換体を培養して、初期指数生育期（OD660=0.2）と中期指数生育期（OD660=0.5）における細胞内のROS含量を測定した。なお、培養は、前記M9改良培地に、酸化チタンを添加せず、50mg/Lのアンピシリンおよび10μmol/LのIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を添加し、また、ブラックライト蛍光ランプによる前記入射強度での光照射を行わなかった以外は、前記参考例１と同様の条件で行った。なお、コントロールとして、E.coli IM303-I4にpUC19を導入した形質転換体を使用し、同様にして培養ならびにROS含量の測定を行った。この結果を図２に示す。
【００４２】
図２に示すように、前記組換えプラスミド（pYFD、pYGB、pYGE）を導入した各形質転換体は、初期および中期指数生育期のいずれにおいてもコントロールより低いROS含有量を示した。特に、pYGEを有するE.coli IM303-I4は、初期指数生育期におけるROSレベルがコントロールの約46％であり、且つ、中期指数生育期において、前記コントロールはROSレベルが増加しているのに対して、さらなるROS含有量の減少を示した。また、pYFDを有するE.coli IM303-I4についても、中期指数生育期においてさらなるROS含有量の減少が見られた。
【実施例２】
【００４３】
pYGEを導入したE.coli IM303-I4の形質転換体を培養し、その生育曲線を確認した。
【００４４】
実施例１と同様にして、pYGEを導入したE.coli IM303-I4を培養し、その生育を確認した。なお、コントロールとしてpUC19を導入したE.coli IM303-I4についても同様に培養を行った。これらの結果を図３に示す。図３のグラフは生育曲線であり、細胞密度（OD660）の経時的変化を示す。
【００４５】
図３に示すように、pYGEを導入したE.coli IM303-I4は、最大比増殖速度（μm）の平均値が0.06h-1であり、コントロールの約３倍を示した。
【実施例３】
【００４６】
pYGEを導入した野生株E.coli MM294の形質転換体を酸化ストレス下で培養し、その生育曲線を確認した。
【００４７】
前記実施例１と同様にしてpYGEを導入したE.coli MM294形質転換体を調製した。そして、前記実施例１のアンピシリンおよびIPTGを添加したM9改良培地に、10μmol/Lとなるように活性酸素発生剤であるパラコート（PQ）を添加した以外は、前記実施例１と同様にして培養を行い、その生育を確認した。なお、コントロールとしてpUC19を導入したE.coli MM294についても同様に培養を行った。これらの結果を図４に示す。図４のグラフは生育曲線であり、細胞密度（OD660）の経時的変化を示す。
【００４８】
図４に示すように、pYGEを導入した野生株E.coli MM294は、最大比増殖速度（μm）の平均値が0.1h-1であり、コントロールの約５倍であった。このように、野生株に対しても、yggEを有する組換えプラスミドを導入することによって、ROS含量を低下させ、酸化ストレスの影響を抑制して生育の回復・増進を図ることができた。
【実施例４】
【００４９】
pYGEを導入した野生株E.coli MM294の形質転換体を酸化ストレス下で培養し、初期および中期指数生育期における細胞のROS含有量を確認した。
【００５０】
前記実施例３と同様にして、パラコート含有M9改良培地により、pYGEを導入したE.coli MM294の形質転換体を培養した。そして、初期指数生育期（OD660=0.2）と中期指数生育期（OD660=0.5）における培養菌体のROS含有量を測定した。この結果を図５に示す。
【００５１】
同図に示すように、ROS含有量は、初期指数生育期においてコントロールの約54％であり、中期指数生育期においては、コントロールの約34％となった。このように、pYGEを導入したE.coli MM294は、初期および中期指数生育期のいずれにおいてもコントロールよりも低いROS含有量を示し、さらに、コントロールは中期指数生育期においてROS含有量が増加したのに対して、pYGEを導入したE.coli MM294はさらなる減少を示した。この結果から、pYGEの導入により、ROS含有量の増加抑制のみならず、含有量の減少も可能であることがわかる。
【実施例５】
【００５２】
酸化ストレスにより変化するアミノ酸要求性に対するpYGEの影響を確認した。
【００５３】
（A）E.coli IM303-I4形質転換体
pYGEを導入したE.coli IM303-I4の形質転換体を、実施例１と同様の条件でOD660が0.2になるまで培養した。培養液1mLを遠心分離（4℃、10,000(ｇ、5分）に供して培養菌体を回収し、これを生理食塩水で洗浄し、再度遠心分離（4°C、10,000(ｇ、5分）によって回収した後、生理食塩水（9g/L NaCl水溶液）で懸濁した。一方、11種類のアミノ酸（前記2068 mixture）を含むM9改良培地寒天プレートと、前記2068 mixtureからLys、Met、IleおよびThrを除いた7種類のアミノ酸を含むM9改良培地寒天プレートを準備した。前記培養菌体の懸濁液を、前記各寒天プレートに摂取し、37℃で48時間インキュベートした後、各プレートにおけるコロニー数を計測した。そして、各寒天プレートにおけるコロニー数を下記式に代入して、アミノ酸要求比の変化度（Ad）を求めた。なお、第１コントロールとして、pUC19を導入したE.coli IM303-I4形質転換体を使用し、第２コントロールとしてプラスミドを導入しないE.coli IM303-I4を使用し、これらについても同様にしてアミノ酸要求比の算出を行った。
【００５４】
E.coli IM303-I4のAd＝（Na11-Na7）/Na11
前記式において「Na11」は、アミノ酸11種類（2068 mixture）のプレートにおけるコロニー数であり、「Na7」は、アミノ酸7種類のプレートのコロニー数である。これらの結果を図６（A）に示す。なお、Adが大きい程、アミノ酸11種類のプレートに比べて、アミノ酸7種類のプレートでの生育が悪く、要求するアミノ酸の種類が多いと判断でき、Adが小さい程、アミノ酸7種類のプレートでの生育が、アミノ酸11種類のプレートと同程度であって、要求するアミノ酸の種類が少ないと判断できる。
【００５５】
（B）E.coli MM294形質転換体
pYGEを導入したE.coli MM294形質転換体を、前記実施例３と同様にパラコート含有M9改良培地を用いて、OD660が0.2になるまで培養し、前記（A）と同様にして、培養菌体の懸濁液を調製した。寒天プレートとして、11種類のアミノ酸（2068 mixture）を含むM9改良培地寒天プレートと、20種類のアミノ酸（以下、「1904 mixture」という）を含むM9改良培地寒天プレートを使用した以外は、前記（A）と同様にして培養を行いコロニー数を計測した。そして、各寒天プレートにおけるコロニー数を下記式に代入して、アミノ酸要求比の変化度（Ad）を求めた。なお、第１コントロールとして、pUC19を導入したE.coli MM294形質転換体を使用し、第２コントロールとしてプラスミドを導入しないE.coli MM294を使用し、これらについても同様にしてアミノ酸要求比の算出を行った。また、前記「1904 mixture」は、1LあたりLeuを0.45ｇ/L、それ以外のアミノ酸（19種類）をそれぞれ0.225g/L含み、ATCCのカタログにATCC1904用合成培地として記載されている。
【００５６】
E.coli MM294のAd＝（Na20-Na11）/Na20
前記式において「Na20」は、アミノ酸20種類のプレートにおけるコロニー数であり、「Na11」は、アミノ酸11種類のプレートのコロニー数である。これらの結果を図６（B）に示す。なお、Adが大きい程、アミノ酸20種類のプレートに比べて、アミノ酸11種類のプレートでの生育が悪く、要求するアミノ酸の種類が多いと判断でき、Adが小さい程、アミノ酸11種類のプレートでの生育が、アミノ酸20種類のプレートと同程度であって、要求するアミノ酸の種類が少ないと判断できる。
【００５７】
図６（A）に示すように、pUC19を有するE.coli IM303-I4（第１コントロール）のAd値は約73％であったが、pYGEを有するE.coli IM303-I4はAd値が約17％とコントロールの約1/4であった。なお、プラスミドを導入していないE.coli IM303-I4（第２コントロール）のAd値は64％であった。さらに、図６（B）に示すように、パラコートを添加した酸化ストレス条件下で培養したpYGEを有するE.coli MM294のAd値は、9.6％であり、pUC19を有するE.coli MM294（第１コントロール）の約1/15となり、著しく低い値を示した。なお、プラスミドを導入していないE.coli MM294（第２コントロール）のAd値は40％であった。これらの結果から、pYGEの導入によって、酸化ストレスによるアミノ酸要求性の変化を効果的に抑制できたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上のように、本発明によれば、予め前述のような遺伝子を細胞に導入することによって、細胞内のROS含量の増加を抑制し、生育に対する酸化ストレスの影響を低減することができる。このため、本発明の培養方法を利用すれば、例えば、従来と同じ培養条件であっても、培養効率を向上でき、また、酸素供給量の増加に伴う問題を回避することも可能である。したがって、本発明の培養方法は、例えば、発酵プロセスを利用した各種物質の製造等に極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１（ａ）は、本発明の参考例における、E.coli IM303-I4の生育曲線を示すグラフであり、図１（ｂ）は、前記E.coli IM303-I4の細胞内ROS含有量を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例で調製した形質転換体における細胞内ROS含量を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の他の実施例におけるE.coli IM303-I4形質転換体の生育曲線を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の他の実施例におけるE.coli MM294形質転換体の生育曲線を示すグラフである。
【図５】図４は、本発明の他の実施例で調製したE.coli MM294形質転換体における細胞内ROS含量を示すグラフである。
【図６】図６（ａ）は、本発明の他の実施例におけるE.coli IM303-I4形質転換体のアミノ酸要求比を示すグラフであり、図６（ｂ）は、E.coli MM294形質転換体のアミノ酸要求比を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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