(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥＢＮＡ−２、特にリン酸化の度合いが低いＥＢＮＡ−２を検出することができ、ウイルスのタイプを問わずＥＢウイルスを検出することができる手段を提供すること。【解決手段】ＥＢＮＡ−２と結合し特定の配列のアミノ酸番号：１〜５８からなる領域のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片；ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７のハイブリドーマ；該抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、該抗体又はその抗体断片とＥＢＮＡ−２との複合体の形成の有無を検出する、ＥＢＮＡ−２若しくはＥＢウイルスの検出方法又はＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法；並びに該抗体又はその抗体断片を含有した、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）と結合し、該ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）からなる領域のポリペプチドと結合する、モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項３】
ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１−１１６（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１１６）からなるポリペプチドに対して生じさせたものである、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項４】
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生される、請求項１〜３いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項５】
ＥＢＮＡ−２に対して、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体。
【請求項６】
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマ。
【請求項７】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢＮＡ−２の検出方法。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの検出方法。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有してなる、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）に対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、及びＥＢＮＡ−２の検出方法、ＥＢウイルスの検出方法ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法及びＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＢ〔エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）〕ウイルスは、幼少期に不顕性で感染し、終生体内に潜伏感染をするヒトヘルペスウイルスの１つである。また、前記ＥＢウイルスは、試験管内で、ヒトの初代Ｂ細胞に感染して増殖し、形質転換、いわゆる、「試験管内発癌」を起こすウイルスであり、ヒトのリンパ腫などの悪性腫瘍との関連が疑われている癌ウイルスでもある（非特許文献１）。
【非特許文献１】「微生物学・免疫学」、第２４２頁、株式会社医学教育出版社、１９９８年４月２４日改訂第２版発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、１つの側面では、ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）、特にリン酸化の度合いが低いＥＢＮＡ−２を検出すること、ウイルスのタイプを問わずＥＢウイルスを検出すること、ＥＢウイルスに関連する疾患を検査すること、ＥＢウイルスに関連する疾患の検査のための試薬を製造すること、ＥＢＮＡ−２の構造及び機能の研究を行なうこと等の少なくとも１つを可能にする、モノクローナル抗体又はその抗体断片を提供することに関する。また、本発明は、他の側面では、前記モノクローナル抗体を効率よく産生させることができる、ハイブリドーマを提供することに関する。さらに、本発明は、別の側面では、ＥＢＮＡ−２を、高感度、かつ簡便に検出することができる、被験試料中のＥＢＮＡ−２の検出方法を提供することに関する。また、本発明は、他の側面では、被験試料中のＥＢウイルスの存在を、ウイルスのタイプを問わず、高感度かつ簡便に検出することができる、被験試料中のＥＢウイルスの検出方法を提供することに関する。さらに、本発明は、別の側面では、ＥＢウイルスを含む被験試料を、高感度かつ簡便に検出することができる、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法を提供することに関する。本発明は、さらに別の側面では、ＥＢＮＡ−２の検出、ＥＢウイルスの検出及びＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別を、高感度かつ簡便に行なうことができる、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）と結合し、該ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）からなる領域のポリペプチドと結合する、モノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔２〕  配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合する、前記〔１〕記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔３〕  ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１−１１６（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１１６）からなるポリペプチドに対して生じさせたものである、前記〔１〕又は〔２〕記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔４〕  受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生される、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔５〕  ＥＢＮＡ−２に対して、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体、
〔６〕  受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマ、
〔７〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢＮＡ−２の検出方法、
〔８〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの検出方法、
〔９〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法、並びに
〔１０〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有してなる、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キット、
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片によれば、ＥＢＮＡ−２、特にリン酸化の度合いが低いＥＢＮＡ−２を検出することができ、ウイルスのタイプを問わずＥＢウイルスを検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片によれば、ＥＢウイルスに関連する疾患を検査することができ、ＥＢウイルスに関連する疾患の検査のための試薬を製造することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のハイブリドーマによれば、前記モノクローナル抗体を効率よく産生させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の被験試料中のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、ＥＢＮＡ−２を、高感度、かつ簡便に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の被験試料中のＥＢウイルスの検出方法によれば、被験試料中のＥＢウイルスの存在を、ウイルスのタイプを問わず、高感度かつ簡便に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法によれば、ＥＢウイルスを含む被験試料を、高感度かつ簡便に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の検出用キットによれば、本発明のＥＢＮＡ−２の検出、ＥＢウイルスの検出及びＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別を、高感度かつ簡便に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の１つの側面は、ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）に対するモノクローナル抗体又はその抗体断片であり、より具体的には、ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）と結合し、該ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）からなる領域のポリペプチドと結合する、モノクローナル抗体又はその抗体断片である。
【０００７】
前記ＥＢＮＡ−２は、潜伏ＥＢウイルス感染Ｂリンパ球に発現した核抗原であり、ＥＢウイルスのゲノムにコードされた６つの核抗原の１つである。また、前記ＥＢＮＡ−２は、細胞及びウイルス遺伝子の転写をアップレギュレートし、ＥＢウイルス感染細胞の増殖形質転換に役割を果たしうる。さらに、前記ＥＢＮＡ−２は、例えば、１０重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が約８５ｋＤａであり、スクロース密度勾配沈降解析により、感染細胞のライゼートにおいて約１３Ｓ及び３４Ｓの複合体として、ダイマー又はテトラマーとして検出されるものである。
【０００８】
前記ＥＢＮＡ−２としては、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチド等が挙げられる。
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体によれば、前記ＥＢＮＡ−２を、高い特異性で、効率よく、高い感度で検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合するという抗原認識特異性を示す。
【００１１】
また、本発明のモノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ1である。
【００１２】
本明細書において、前記「特異性」は、抗原に対する交差反応性及び抗原との親和性により評価される。また、前記「抗原に対する交差反応性」は、例えば、ＥＢＮＡ−２、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチド、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチド等を抗原として用い、ＥＬＩＳＡ法、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法等により、評価されうる。具体的には、例えば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片について、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドと、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドとを用いてＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法を行なうことにより、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとの沈降線を示さず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドとの沈降線を示すこと；本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片について、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドと、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドとを用いたＥＬＩＳＡ法を行なうことにより、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとの抗体の結合に基づく蛍光が検出されず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドとの抗体の結合に基づく蛍光が検出されること等により、前記「抗原に対する交差反応性」を評価することができる。また、前記「抗原との親和性」は、モノクローナル抗体と抗原との結合速度定数、解離速度定数等により評価されうる。
【００１３】
さらに、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片によれば、予想外にも、ウイルスのタイプ（例えば、タイプ１、タイプ２）を問わず、ＥＢウイルスを検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００１４】
したがって、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片によれば、ＥＢウイルスに関連する疾患の検査のための試薬が提供されうる。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１−１１６（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１１６）からなるポリペプチドに対して生じさせたモノクローナル抗体である。
【００１６】
また、本発明のモノクローナル抗体は、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。
【００１７】
なお、本発明には、前記受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する（すなわち、同一のエピトープを特異的に認識する）抗体も含まれる。前記抗体は、別の側面では、ＥＢＮＡ−２に対して、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体である。かかる抗体としては、ＥＢＮＡ−２に対して、前記ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合するものであれば、ハイブリドーマや免疫する動物の種類等により限定されるものではなく、より具体的には、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合するモノクローナル抗体等が挙げられる。
【００１８】
本発明の抗体断片は、ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１−５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）に反応するものであればよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）と命名・表示され、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７として、２００４年１１月２９日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されているハイブリドーマより、慣用の方法により、製造されうる。
【００２０】
なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する前記受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマも本発明に含まれる。本発明のハイブリドーマによれば、本発明のモノクローナル抗体を効率よく産生させることができる。
【００２１】
前記ハイブリドーマは、保護剤、例えば、１０体積％  ＤＭＳＯ／１５体積％  ウシ胎仔血清−ＲＰＭＩ１６４０培地等に、２．５×１０6細胞／０．７ｍｌ／保存用チューブとなるように懸濁し、凍結、例えば、一旦、−８０℃で凍結させ、ついで、液体窒素中で凍結させることにより、凍結保存されうる。凍結保存されたハイブリドーマは、ウォーターバス中３７℃でインキュベーションし、前記保護剤を該ハイブリドーマの培養に用いるに適した培地に交換することにより、適宜使用され得る。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えば、
１）前記受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマを適切な培地中、５体積％  ＣＯ2、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得る工程、及び
２）該培養上清から、モノクローナル抗体を精製する工程、
を行なうことにより得られうる。
【００２３】
前記工程１）において、ハイブリドーマの培地としては、本発明のハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるに適した慣用の栄養培地又は慣用の基本培地の改変培地等が挙げられる。
【００２４】
前記基本培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。また、培地のｐＨは、７．０〜８．０であることが望ましい。なお、前記基本培地は、目的に応じて、例えば、血清、ホルモン、サイトカイン等をさらに含有してもよい。
【００２５】
本発明のハイブリドーマの培養に用いられうる培地としては、具体的には、例えば、０．０３重量％  Ｌ−グルタミンと０．２重量％  炭酸水素ナトリウムと０．０００５３％  フェノールレッドと１０重量％  ウシ胎仔血清と１０ｍｇ/Ｌ  ゲンタマイシンとを含有したＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。
【００２６】
前記工程１）におけるハイブリドーマの培養条件としては、例えば、５体積％  ＣＯ2、３７℃で数日間のインキュベーション等が挙げられる。
【００２７】
前記工程２）において、モノクローナル抗体の精製は、前記工程１）で得られた培養上清を、硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー（例えば、抗イムノグロブリンカラムクロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等）に供すること等により行なうことができる。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、プロテインＡアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製されうる。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＥＢＮＡ−２、ＥＢウイルス等の検出、ＥＢウイルスに関連する疾患、例えば、伝染性単核球症、バーキットリンパ腫、上咽頭がん、胃ガン、臓器移植後のリンパ球増殖性疾患、慢性活動性ＥＢウイルス感染症、伴性リンパ増殖症候群等の検査等に用いられうる。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片によれば、ＥＢウイルスに関連する疾患の検査のための試薬を製造することができる。
【００２９】
本発明は、別の側面では、モノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢＮＡ−２との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢＮＡ−２の検出方法に関する。
【００３０】
本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が用いられているため、高い感度で、高い特異性で、かつ簡便に、被験試料中のＥＢＮＡ−２を検出することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が用いられているため、ＥＢＮＡ−２が由来するＥＢウイルスのタイプに限定されず、当該ＥＢＮＡ−２を検出することができる。
【００３１】
また、本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が用いられているため、リン酸化度が低いＥＢＮＡ−２を検出することもできる。
【００３２】
本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法においては、まず、被験試料と前記モノクローナル抗体又はその抗体断片とを接触させる。
【００３３】
前記被験試料としては、例えば、細胞ライゼート、タンパク質変性処理をした細胞等が挙げられる。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗体断片とＥＢＮＡ−２との複合体の形成は、例えば、本発明のモノクローナル抗体に対する抗体又は本発明の抗体断片に対する抗体等の二次抗体により、複合体を捕捉することにより検出されうる。ここで、検出を容易にし、かつ感度を向上させる観点から、前記二次抗体は、慣用の標識物質による標識を有するものや、ラテックス等の支持体に担持されたものであることが望ましい。
【００３５】
前記標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、フルオレセイン  イソチオシアネート、ローダミン  イソチオシアネート等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）等が挙げられる。前記標識物質として、蛍光物質を用いる場合、前記複合体は、該蛍光物質に応じた波長での蛍光を指標として検出され、前記標識物質として、酵素を用いる場合、該酵素の基質として酵素の反応により発色する物質を用い、発色を指標として検出されうる。また、前記ラテックスを用いる場合、該ラテックスの凝集度合いを指標として前記複合体を検出できる。
【００３６】
また、本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、ＥＢＮＡ−２の検出を介して、ＥＢウイルスを検出することもできる。
【００３７】
したがって、本発明は、他の側面では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢＮＡ−２との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの検出方法に関する。本発明のＥＢウイルスの検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が用いられているため、被験試料中のＥＢウイルスの存在を、ウイルスのタイプを問わず、高感度かつ簡便に検出することができる。
【００３８】
また、本発明のＥＢＮＡ−２の検出方法によれば、ＥＢＮＡ−２の検出を介して、ＥＢウイルスを含む被験試料を選別することができ、それにより、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料を選別することができる。
【００３９】
したがって、本発明は、さらに別の側面では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢＮＡ−２との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法に関する。本発明のＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が用いられているため、ＥＢウイルスを含む被験試料を、高感度かつ簡便に検出することができ、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料を、迅速に、高感度かつ簡便に選別することができる。また、本発明のＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法によれば、ウイルスのタイプを問わず、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料を選別することができる。
【００４０】
本発明のＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法によれば、例えば、前記ＥＢウイルスに関連する疾患の診断への応用等も可能になる。
【００４１】
本発明は、さらに他の側面では、モノクローナル抗体又はその抗体断片を含有した、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キットに関する。
【００４２】
本発明の検出用キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有しているため、ＥＢＮＡ−２の検出、ＥＢウイルスの検出及びＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別を、高感度かつ簡便に行なうことができる。したがって、本発明の検出用キットは、前記ＥＢＮＡ−２の検出方法、前記ＥＢウイルスの検出方法、前記ＥＢウイルスの検出及びＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法に好適である。
【００４３】
なお、本発明の検出用キットには、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を、前記モノクローナル抗体又はその抗体断片を慣用の支持体に担持させた担体として含有していてもよい。前記支持体としては、ポリスチレンビーズ、セファロース等が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を支持体に担持させるには、例えば、ブロモシアン法等が行なわれうる。
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
ＥＢウイルス核抗原−２のアミノ末端側に対するモノクローナル抗体の作製
ｐＲＩＴベクター〔ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４、１０７５−１０８０（１９８５）〕を用い、ＥＢＮＡ−２翻訳領域をプロテインＡのＩｇＧ結合領域のＣ末端に挿入して発現ベクターｐＲＩＴ−Ｙ１プラスミドを作製した。得られたｐＲＩＴ−Ｙ１プラスミドを用いて、大腸菌Ｙ１０８９に溶原化した。得られた大腸菌を、３２℃で１×１０8細胞／ｍｌまで増殖させ、ついで、４５℃で２０分培養し、さらに３９℃で９０分間培養した。菌体を回収し、得られた菌体をリゾチームで処理し、凍結融解、超音波処理を行なうことにより、プロテインＡとＥＢウイルス（ＥＢＶ）  タイプ１  Ｂ９５−８株のＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）のアミノ末端側のアミノ酸１−１１６（「ＥＢＮＡ−２（１−１１６）」、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１１６）との融合ポリペプチド〔プロテインＡ−ＥＢＮＡ−２（１−１１６）〕を作製した。
【００４６】
ついで、前記プロテインＡ−ＥＢＮＡ−２（１−１１６）を、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社製）で、３７℃で６０分間処理して切断し、得られた産物を、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供して、独自のドメイン（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）とポリプロリン配列（配列番号：１のアミノ酸番号：５９〜９５）とを有するＥＢＮＡ−２（１−１１６）ポリペプチドを精製し、４０％  飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた。
【００４７】
３匹のｄｄＹマウスと３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスとに対し、前記プロテインＡ−ＥＢＮＡ−２（１−１１６）ポリペプチド  ５０μｇを、１回腹腔内注射し、ついで、１回あたり前記プロテインＡ−ＥＢＮＡ−２（１−１１６）ポリペプチド  ５０μｇを２回皮下注射した。また、５０μｇのＥＢＮＡ−２（１−１１６）ポリペプチドを、皮下注射した。なお、各ポリペプチドは、注射直前に、完全フロイントアジュバントに懸濁した。各マウスに対し、６週間にわたり、２週間毎に免疫した。
【００４８】
しかしながら、１回の免疫では、十分な力価を示す抗体を得ることができなかった。２回目の注射、３回目の注射及び４回目の注射から１週間後、マウスの血液を採取し、ＥＢＮＡ−２アミノ末端領域に対する血清抗体価を定量した。
【００４９】
３回目の免疫及び４回目の免疫から１週間後に３匹のｄｄＹマウスのうちの１匹から採取した試料は、第１回目の血液試料においては、ＥＢＮＡ−２（１−１１６）に対するＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ力価が３００未満であるが、ＥＢＮＡ−２（１−１１６）に対するＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ力価が、１００００以上の増加を示した。他の２匹のｄｄＹマウスは、それぞれ、３０００及び１００００の力価であった。ＥＢＮＡ−２（１−１１６）  ＩｇＧ抗体価は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのうちの１匹では増加しなかったが、残りの２匹は、３０００倍以下のＩｇＧ力価であった。ＥＢＮＡ−２（１−１１６）（>１０，０００）に対して最も高い血清ＩｇＧ力価を有するｄｄＹマウスを、５０μｇのＥＢＮＡ−２（１−１１６）ポリペプチドで、３回以上２週間間隔で注射した。血清ＥＢＮＡ−２（１−１１６）ＩｇＧ力価は、ピーク（(２００００）に達し、４回目の免疫後、もはやさらなる増加は検出されなかった。７回目の免疫から２週間後、ＥＢＮＡ−２(１−１１６)ポリペプチドの最後の注射を行なった。
【００５０】
ｄｄＹマウスの脾細胞を、ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３  Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ供給）と融合させ、得られたハイブリドーマについて、抗体産生をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。１つのハイブリドーマ細胞株Ｆ７９４−２５−７３細胞が得られた。商品名：Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＲＰＮ２９〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕を用いたアイソタイプは、モノクローナル抗体Ｙ１０１のサブクラスは、ＩｇＧ1であることを示した。
【００５１】
その後、腹腔内注射で得られた腹水のハイブリドーマ細胞をマウスから回収した。
【００５２】
得られたハイブリドーマを、０．０３重量％  Ｌ−グルタミンと０．２重量％  炭酸水素ナトリウムと０．０００５３％  フェノールレッドと１０重量％  ウシ胎仔血清と１０ｍｇ/Ｌ  ゲンタマイシンとを含有したＲＰＭＩ１６４０培地中、５体積％  ＣＯ2、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得た。ついで、得られた培養上清を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕に供して、モノクローナル抗体を精製した。
【００５３】
その結果、モノクローナル抗体Ｙ１０１が得られた。また、前記ハイブリドーマＦ７９４−２５−７３細胞は、Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）と命名・表示され、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３０７として、２００２年１１月１日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に、寄託されている。
【実施例２】
【００５４】
モノクローナル抗体Ｙ１０１の抗原認識特異性の検討
ＥＢＶ  タイプ１  Ｂ９５−８株で正常ヒト末梢血リンパ球のインフェクション及び増殖形質転換を行なうことにより、ＩＢ４リンパ芽球状細胞株(ＬＣＬ)を樹立した。ＩＢ４  Ｃ２３細胞クローンは、前記ＩＢ４細胞株由来である。ＨＥ細胞株（国立感染症研究所にて樹立）は、伝染性単核症の日本人患者から自然発生的に樹立されたものである。ＢＪＡＢ細胞株（スウエーデン、カロリンスカ研究所のクライン博士から供与）は、ＥＢＶ−ゲノム陰性アフリカバーキットリンパ腫から得られたものである。Ｊｉｊｏｙｅ細胞株は、北海道大学大里博士から供与されたものであり、バーキットリンパ腫のアフリカ人少年から得られたものであり、ＥＢＶ  タイプ２を保持する。ＭＩＳＰ細胞株（北海道大学、小児科の菊田秀明博士からの供与）は、全身性肥満細胞症の日本人の２０歳の女性患者から得られたものである。ＥＢＮＡ、ＥＡ及びＶＣＡに対する前記日本人の２０歳の女性患者の血清ＩｇＧ抗体価は、それぞれ、８０ｘ、＜１０及び６４０ｘであった。ＶＣＡに対するＩｇＭ力価は、＜１０であった。ＭＩＳＰ細胞株は、ＥＢＶ  タイプ２  ＤＮＡを有し、ＭＩＳＰ  ＥＢＮＡ−２のコード領域は、ＥＢＶ  タイプ２プロトタイプ  ＡＧ８７６株のものと同一である。
【００５５】
前記細胞のライゼートを、１０重量％  ポリアクリルアミドのＳＤＳ電気泳動に供してＥＢＮＡ−２を含む細胞タンパク質を展開し、を行ない、ニトロセルロース膜に転写させたタンパク質を、商品名：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ〔パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社製〕で検出することによりイムノブロッティングを行なった。
【００５６】
切形型ＥＢＮＡ−２ポリペプチドの免疫沈殿は、以下のように行なった。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１．０体積％  商品名：ＮＰ４０とプロテアーゼインヒビター〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕とを含む緩衝液でトランスフェクト細胞を溶解させ、１００００×ｇ、３０分間遠心分離して不溶性沈殿を除去し、ついで、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロースアフィニティーゲル〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を用いて、上清画分を免疫沈殿させ、その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１５０ｍＭ  ＮａＣｌと０．５体積％  商品名：ＮＰ４０とを含む緩衝液で３回洗浄した。ついで、モノクローナル抗体Ｙ１０１又はＦｌａｇに対するモノクローナル抗体Ｍ２〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を用いたイムノブロッティングにより、抗原−抗体複合体を解析した。
【００５７】
全長ＥＢＮＡ−２タンパク質の免疫沈殿のために、Ｅ２ＦＬ発現ＢＪＡＢ細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１．０％  商品名：ＮＰ４０とを含む緩衝液で溶解させ、遠心分離して、不溶性沈殿を除去した。得られた上清画分の一部を、モノクローナル抗体Ｙ１０１と共にインキュベーションした。また、ＥＢＮＡ−２のＣ末端領域（配列番号：１のアミノ酸番号：３４１〜４６０）を用いて産生させたものであり、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸４２９−４４３（配列番号：１のアミノ酸番号４２９〜４４３）の間のエピトープを認識することが示唆されるモノクローナル抗体ＰＥ２〔ダコ（Ｄａｋｏ）社製〕と共に、前記上清画分と等量の上清画分をインキュベーションした。抗原−抗体複合体を、プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ〔商品名、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に吸着させ、ついで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）と１５０ｍＭ  ＮａＣｌと０．５％  商品名：ＮＰ４０とを含む緩衝液で３回洗浄した。抗原−抗体複合体を、モノクローナル抗体ＰＥ２とＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕とを用いたイムノブロッティングにより解析した。
【００５８】
その結果、図１のパネルａに示されるように、モノクローナル抗体Ｙ１０１及び広く使われているＥＢＮＡ−２モノクローナル抗体ＰＥ２の両方が、ＥＢＶ  タイプ１プロトタイプＢ９５−８株で形質転換されたＩＢ４細胞であるＩＢ４Ｃ２３細胞クローン及びＨＥ  ＬＣＬ細胞で産生されたＥＢＮＡ−２タンパク質を用いた免疫生物学的解析で反応した。さらに、イムノブロットリプロービング試験を行なった。レーン７−１２の６つのレーンに結合したモノクローナル抗体Ｙ１０１分子を、商品名：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ〔ピアース（ＰＩＥＲＣＥ）社製〕でインキュベーションすることにより除去し、ついで、モノクローナル抗体ＰＥ２を用いて剥がしたレーン７−１２をリプローブした、結果を、図１のパネルｂのレーン７’〜１２’に示す。
【００５９】
その結果、モノクローナル抗体Ｙ１０１により、ＩＢ４、ＩＢ４Ｃ２３及びＨＥ  ＬＣＬ細胞中におけるＥＢＮＡ−２の二つのバンドが検出された。モノクローナル抗体Ｙ１０１は、大きいＥＢＮＡ−２タンパク質（リン酸化の度合いが大きいタンパク質）と同程度又はより強く、小さいＥＢＮＡ−２と反応し、モノクローナル抗体ＰＥ２は、大きいＩＢ４  ＥＢＮＡ−２よりも弱く、小さいＩＢ４  ＥＢＮＡ−２と反応した。
【００６０】
また、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、Ｊｉｊｏｙｅ株及びＭＩＳＰ株の両方のＥＢＶ  タイプ２のＥＢＮＡ−２タンパク質と反応した。一方、モノクローナル抗体ＰＥ２は、ＭＩＳＰ  ＥＢＮＡ−２と反応したが、約７５ｋＤａのＪｉｊｏｙｅ  ＥＢＮＡ−２とは同じ条件下では反応しなかった。さらに、モノクローナル抗体ＰＥ２により、ＭＩＳＰ  ＥＢＮＡ−２が強く検出された。
【００６１】
以上の結果より、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、低リン酸化ＥＢＮＡ−２にも結合することが示唆された。また、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、ＥＢウイルス  タイプ１及びタイプ２のいずれにも結合することが示唆された。
【実施例３】
【００６２】
モノクローナル抗体Ｙ１０１により認識されるエピトープの位置の検討
モノクローナル抗体Ｙ１０１により認識されたエピトープの位置を決定するために、モノクローナル抗体と、ＢＪＡＢ細胞で合成されたＦｌａｇタグ切形型ＥＢＮＡ−２ポリペプチドとの反応性を調べた。
【００６３】
ターミネーションコドンのすぐ前にＬＤＴＫＤＡＤＤＤＫＬＬＶ（配列番号：２）の１２アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲによりｐＳＧ５ベクター（ストラタジーン）に挿入することにより、Ｆｌａｇ〔前記配列番号：２中のＤＴＫＤＡＤＤＤＫ〕−タグ全長ＥＢＶ  タイプ１  Ｗ９１株ＥＢＮＡ−２を発現するベクターｐＳＧ−Ｅ２ＦＬを得た。かかるベクターは、ＦｌａｇインサートのはじめにＰｖｕＩＩ部位を有する。
【００６４】
ｐＳＧ−Ｅ２ＦＬを平滑末端化し、Ｅ２ＦＬリーディングフレーム中の１９４アミノ酸に対応する位置に隣接するＰｖｕＩＩ部位とＳｔｕＩ部位とを用いてライゲーションすることにより、Ｆｌａｇタグ切形型ＥＢＮＡ−２ポリペプチドを発現するプラスミドｐＳＧ−Ｆ１９４、ｐＳＧ−Ｆ１９４ｄ２−９５及びｐＳＧ−Ｆ１９４ｄ５９−９３を得た。前記プラスミドｐＳＧ−Ｆ１９４、ｐＳＧ−Ｆ１９４ｄ２−９５及びｐＳＧ−Ｆ１９４ｄ５９−９３は、それぞれ、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１−１９４（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１９４）からなるポリペプチドの構築物Ｆ１９４、ＥＢＮＡ−２アミノ酸１とアミノ酸９６−１９４とからなるポリペプチドの構築物Ｆ１９４ｄ２−９５、アミノ酸１−５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）と９４−１９４（配列番号：１のアミノ酸番号：９４〜１９４）とからなるポリペプチドの構築物Ｆ１９４ｄ５９−９３を発現しうる。Ｆ１９４ｄ５９−９３は、配列番号：１のアミノ酸番号：５９〜９５のポリプロリン領域の２つのプロリンを除く全部を欠失するものである。
【００６５】
前記プラスミドをトランスフェクトしたＢＪＡＢ細胞を、トランスフェクションから２０時間後、溶解させた。
【００６６】
また、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１−６０（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜６０）をコードする核酸のＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に挿入した。得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地〔組成：１重量％  バクトトリプトン（１０ｇ／Ｌ）、０．５重量％  イーストエクストラクト（５ｇ／Ｌ）、１重量％  塩化ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）〕中、３７℃で光学的密度０．６に至るまで培養し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した。その後、前記形質転換体を、３０℃で２時間培養した後、集菌した。得られた菌体を、終濃度０．５重量％  商品名：ＮＰ４０を含むＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、超音波処理した。超音波処理後の産物を、７０００×ｇで３０分遠心分離し、得られた上清をグルタチオンーセファロースビーズ〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１−６０（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜６０）とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質ＧＳＴ−Ｅ２［１−６０］を回収した。
【００６７】
その結果、図２に示されるように、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、Ｆ１９４及びＦ１９４ｄ５９−９３の両方と反応し、モノクローナル抗体Ｙ１０１により認識されたエピトープは、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）又はアミノ酸９４〜１９４（配列番号：１のアミノ酸番号：９４〜１９４）内にあることが示唆された。
【００６８】
また、アミノ酸２−９５の欠失を有するＦｌａｇタグ切形型ＥＢＮＡ−２ポリペプチドＦ１９４ｄ２−９５とのモノクローナル抗体Ｙ１０１の反応性を同様に調べた。
【００６９】
その結果、図２に示されるように、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、Ｆ１９４ｄ２−９５ポリペプチドと反応しなかった。また、ＥＢＮＡ−２アミノ酸２−１８の欠失を有するＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと融合させたＥＢＮＡ−２アミノ酸１９−４８３とのモノクローナル抗体Ｙ１０１の反応性は、イムノブロットでは検出されなかった。
【００７０】
これらの結果により、モノクローナル抗体により認識されるエピトープは、アミノ酸２〜９５内、おそらくアミノ酸２〜９５内であることが示唆された。
【００７１】
さらに、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１−６０とのモノクローナル抗体Ｙ１０１の反応性を直接的に調べた。
【００７２】
その結果、図３に示されるように、モノクローナル抗体Ｙ１０１は、ＧＳＴ−Ｅ２［１−６０］とイムノブロットで強く反応したが、ＧＳＴとは反応せず、モノクローナル抗体Ｙ１０１により認識されるエピトープが、ＥＢＮＡ−２アミノ酸１−６０（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜６０）内であることが示された。
【００７３】
これらの結果から、モノクローナル抗体Ｙ１０１により認識されるエピトープが、ＥＢＮＡ−２のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）に含まれると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、ＥＢＮＡ−２、ＥＢウイルス等の検出、ＥＢウイルスに関連する疾患の検査等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＥＢウイルス潜伏感染細胞ライゼート中のＥＢＮＡ−２の検出を示す図である。パネルａにおいて、レーン１〜６は、モノクローナル抗体ＰＥ２、レーン７−１２は、モノクローナル抗体Ｙ１０１を用いた場合の結果を示す。パネルｂにおいて、レーン７’〜１２’は、レーン７−１２のメンブレンから反応後のモノクローナル抗体Ｙ１０１をはがし、該メンブレンをモノクローナル抗体ＰＥ２と共にインキュベーションし、ＥＢＮＡ−２の検出を行なった結果を示す。図中、ＢＪＡＢは、陰性対照であるＢリンパ種細胞ＢＪＡＢ細胞、ＩＢ４は、ＥＢウイルス  タイプ１の潜伏感染細胞ＩＢ４細胞、ＩＢ４Ｃ２３は、前記ＩＢ４細胞のクローン細胞、ＭＩＳＰは、日本人患者から樹立されたＥＢウイルス  タイプ２感染細胞株ＭＩＳＰ細胞、ＨＥは、ＥＢウイルス  タイプ１感染細胞、Ｊｉｊｏｙｅは、ＥＢウイルス  タイプ２感染のプロトタイプである。
【００７６】
【図２】図２は、ＥＢＮＡ−２アミノ末端領域欠損変異体に対するモノクローナル抗体の反応性を示す図である。図中、Ｆ１９４は、ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側１９４アミノ酸（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１９４）からなるポリペプチド、Ｆ１９４ｄ２−９５は、アミノ末端側のアミノ酸２〜９５（配列番号：１のアミノ酸番号：２〜９５）を欠損した変異体ポリペプチド、Ｆ１９４ｄ５９−９３は、アミノ末端側のアミノ酸５９〜９３（配列番号：１のアミノ酸番号：５９〜９３）を欠損した変異体ポリペプチドを示す。
【００７７】
【図３】図３は、ＥＢＮＡ−２アミノ末端側のアミノ酸１−６０からなるポリペプチドに対するモノクローナル抗体Ｙ１０１の反応性を示す図である。図中、ＧＳＴは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｇｓｔ−Ｅ２［１−６０］は、ＧＳＴタグしたＥＢＮＡ−２アミノ末端側のアミノ酸１−６０（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜６０）からなるポリペプチドを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号：２は、Ｆｌａｇタグを含む配列を示す。
【図１】
2006174704.tif 000002
【図２】
2006174704.tif 000003
【図３】
2006174704.tif 000004
【配列表】
2006174704000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月5日(2005.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生される、請求項１〜３いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
ＥＢＮＡ−２に対して、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  ＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）と結合し、該ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１〜５８（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８）からなる領域のポリペプチドと結合する、モノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔２〕  配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合する、前記〔１〕記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔３〕  ＥＢＮＡ−２のアミノ末端側のアミノ酸１−１１６（配列番号：１のアミノ酸番号：１〜１１６）からなるポリペプチドに対して生じさせたものである、前記〔１〕又は〔２〕記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔４〕  受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生される、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片、
〔５〕  ＥＢＮＡ−２に対して、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体、
〔６〕  受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマ、
〔７〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢＮＡ−２の検出方法、
〔８〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの検出方法、
〔９〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を被検試料と接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又はその抗体断片とＥＢウイルス核抗原−２（ＥＢＮＡ−２）との複合体の形成の有無を検出することを特徴とする、ＥＢウイルスの感染の疑いのある個体由来の被験試料の選別方法、並びに
〔１０〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有してなる、ＥＢＮＡ−２又はＥＢウイルスの検出用キット、
に関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、本発明のモノクローナル抗体は、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
なお、本発明には、前記受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する（すなわち、同一のエピトープを特異的に認識する）抗体も含まれる。前記抗体は、別の側面では、ＥＢＮＡ−２に対して、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体である。かかる抗体としては、ＥＢＮＡ−２に対して、前記ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合するものであれば、ハイブリドーマや免疫する動物の種類等により限定されるものではなく、より具体的には、配列番号：１のアミノ酸番号：１とアミノ酸番号：９６〜１９４とからなるポリペプチドとは結合せず、配列番号：１のアミノ酸番号：１〜５８からなるポリペプチドと結合するモノクローナル抗体等が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７として、２００４年１１月２９日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されているハイブリドーマより、慣用の方法により、製造されうる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する前記受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマも本発明に含まれる。本発明のハイブリドーマによれば、本発明のモノクローナル抗体を効率よく産生させることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えば、
１）前記受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７〔識別のための表示：Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）〕のハイブリドーマを適切な培地中、５体積％  ＣＯ2、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得る工程、及び
２）該培養上清から、モノクローナル抗体を精製する工程、
を行なうことにより得られうる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
その結果、モノクローナル抗体Ｙ１０１が得られた。また、前記ハイブリドーマＦ７９４−２５−７３細胞は、Ｙ１００１−３  （Ｆ７９４−２５−７３）と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３０７として、２００２年１１月１日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に、寄託されている。