(57)【要約】      （修正有）【課題】再生医療分野で応用可能な、人工構築組織および器官の製造方法の提供、特に再生医療として細胞移植に応用するための膵島（インシュリン分泌機能を有する）の人工製造のために必要不可欠である細胞集塊を大量に形成し、長期間培養できる細胞集塊形成法の提供。【解決手段】ｎ軸回転するクリノスタットを用いる三次元培養装置を用いて細胞培養し、クリノスタット搭載型循環システムを使用することにより糖尿病治療用人工膵島を形成する細胞集塊形成法。【選択図】図３
2006304791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
n軸回転するクリノスタットを用いる三次元培養装置を用いて細胞培養し、クリノスタッ
ト搭載型循環システムを使用することにより糖尿病治療用人工膵島を形成することを特徴
とする細胞集塊形成法。
【請求項２】
培養液循環システムをクリノスタット内部に搭載することにより、培養液を循環すること
を特徴とする請求項１記載の細胞集塊形成法。
【請求項３】
クリノスタットの各軸の回転を１分間に２rpm以下とすることを特徴とする請求項１記載
の細胞集塊形成法。
【請求項４】
細胞は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞集塊形
成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元培養による細胞培養方法、特に、n軸回転するクリノスタットを用い
る三次元培養装置を用いて、均一なサイズの細胞集塊を大量に形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において再生医療への期待が高まっている。再生医療とは人工的に構築
した組織及び器官を使用して、疾患や損傷している組織又は器官の機能を修復する医療方
法で、将来、医学を担う重要な技術の一つである。
【０００３】
従来、細胞の浮遊培養方法として、細胞を搭載した培養容器を回転させる方法が知られ
ている（特許文献1〜3）。また、クリノスタット（三次元培養装置）及びこの装置を用い
て人工臓器を製造する方法が知られている（特許文献4〜5）。
【０００４】
【特許文献１】特開2002-45173号公報
【特許文献２】特開2003-289851号公報
【特許文献３】特開2003-304866号公報
【特許文献４】特開2003-70458号公報
【特許文献５】特開2003-70464号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
再生医療の実現化に大きな期待が寄せられている疾患の一つとして、糖尿病が挙げられ
る。中でも１型糖尿病は、インスリン分泌能を有する膵β細胞がほとんど失われることに
より、血糖値の制御が困難となるために発症する疾患である。現時点における唯一の根本
的な治療法として、膵臓移植（pancreas transplantation）、及び移植時の侵襲が膵臓移
植よりも少ない膵島移植（islet    tarnsplantation）が挙げられる。しかし、いずれも
ドナーの絶対的な不足が問題となっており、移植を待望する多くの患者への治療に必要な
膵臓及び膵島を、限られたドナー膵臓から得ることは現時点では不可能である。
【０００６】
そこで、糖尿病の治療を目標とした、再生医学的アプローチによる膵島の人為的な創出
技術が、緊急、かつ、重要な医療技術の開発課題として大きな注目を集めるようになって
きた。すなわち、生体外の培養環境において膵島という小さな高次組織エレメントを作製
するための基盤技術の開発が求められている。
【０００７】
膵島は、大きさが0.1 mm〜0.3 mmの球状の塊を形成しており、膵臓内に成人一人当たり
約100万個が存在する。この膵島を生体外の環境において大量に構築することができれば1
型糖尿病患者への医療応用が可能となる。
【０００８】
再生医療を実現する上では、細胞から立体構造を有する細胞集塊を製造することが必要
不可欠である。さらに、医療現場での応用を想定すると、製造した細胞集塊を人体に移植
する際には機能面においても移植の際の技術面においても、さらに多くの患者への供給に
関しても、多数の細胞集塊を製造する必要がある。あわせて、必要に応じた細胞集塊サイ
ズの調整ができることが望ましい。細胞集塊の数及びサイズの調節ができれば医療現場で
の細胞移植が可能となる。
【０００９】
特許文献５にはクリノスタットを用いてカエルの細胞、つまり両生類の細胞の培養を行
った実験が記載されているが、製造する人工臓器の「数」及び「サイズ」についての記載
はみられない。また、従来のクリノスタットを用いた細胞培養では長期間の培養が困難で
あった。
【００１０】
本発明は、再生医療分野で応用可能な、人工構築組織及び器官の製造に関する方法の開
発、特に、再生医療として細胞移植に応用するための膵島（インシュリン分泌機能を有す
る）の人工製造のために必要不可欠である細胞集塊を大量に形成するための培養手段の開
発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、循環システムを搭載したクリノスタット（三次元培養装置）を用いてヒト
細胞及びマウス細胞について、多数の細胞集塊を製造するとともに、その多数の細胞集塊
のサイズの調整を行うことができる培養手段を見出した。
【００１２】
また、本発明は、クリノスタット（三次元培養装置）を用いて細胞培養する際に、細胞
培養器に搭載する細胞数を調節することにより、細胞集塊のサイズを調節することができ
ることを特徴とする。
【００１３】
本発明の方法において、クリノスタットの各軸の回転を１分間に２rpm以下とすること
が好ましい。２rpmという低速回転にすることにより、培養液中の細胞は重力方向へ沈下
する傾向となり、細胞培養器内底部において細胞の密度が高い領域が発生し、細胞同士の
接触頻度が増し、細胞集塊が大量（1000個以上）に形成されることとなる。つまり、2rpm
を超えると、培養液中の細胞の拡散性が高まり、細胞間の接触頻度が減少し細胞集塊の形
成率は低下するため2rpm以下が望ましい。また、培養液を循環することが好ましい。また
、培養液の粘性および質量は、細胞を添加し静置させた際に細胞が沈下するものとするこ
とが好ましい。本発明の方法により哺乳動物細胞の集塊を形成することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、培養液循環システムを搭載することにより、哺乳動物細胞の培養を可能とす
る。培養系において樹立している体細胞を、クリノスタットを用いて培養し、細胞集塊を
数又はサイズの調節を伴って1回の培養において1000個以上の細胞集塊を作製することが
できる。本発明の方法により、哺乳動物の細胞について細胞集塊の大量製造、細胞集塊サ
イズの調節が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
細胞培養方法に使用されるクリノスタットを備えた細胞培養装置自体は、公知であり、
また、市販されているものもあるが、本発明の方法を遂行するにあたりそれらは循環シス
テムをクリノスタット内部に搭載していないため、これらのものを使用することはできな
い。本発明の方法は、従来知られている方法とは異なる。特許文献５に示されている細胞
培養装置は、図１０に示すように、本体１５に支柱１６aと支柱１６bで支持された外側フ
レーム１７と内側フレーム２２を備えた３次元クリノスタット１１を備えている。ロータ
リージョイント１８は、外側フレーム１７を回転可能に支持する。内側フレーム２２には
、培養容器１２が接続される。
【００１６】
文献5に示される培養容器は図４に示すように、培養容器１２は、回転軸１８aと回転軸
２０aとの交点の近傍にある。クリノスタット１１は、培養容器１２をｎ軸回転する。培
養容器１２は、内側フレーム２２と同体に回転する。外側フレーム１７と内側フレーム２
２とがそれぞれ回転されると、培養容器１２は、n軸回転する。培養液タンク１３から培
養容器１２への培養液の供給は、外部に設置されたポンプ１４によりロータリージョイン
ト１８とロータリージョイント２０とを介して行われる。培養容器１２に供給された培養
液は、培養液タンク１３に戻される。細胞塊を培養する培養液は、循環的に使用されるこ
とになる。
【００１７】
文献5に示される培養容器は図１１に示されるように、培養容器１２の内部には、培養
液と、培養される細胞塊とが封入される。培養容器（１２）がn軸回転されることにより
、培養細胞に働く重力方向が分散され、各細胞があらゆる方向に向けて増殖・伸展するこ
とができるようになり、培養細胞の３次元的な培養が可能になる。
【００１８】
図１に、本発明の細胞培養方法における細胞搭載ユニットの概略全体構成を示す。図１
に示すように、細胞培養器９は細胞を搭載する培養層１と培養液を循環させる培地層２に
中間隔膜３によって分離されている。この中間隔膜３は、培養液を浸透させるが細胞は通
過しない構造となっている(孔密度105〜6×106pore/cm3)。さらに、各層の外側にはガス
透過膜４があり、ガスの供給と排出が行なわれる。細胞培養器９の培地層２の内の培養液
が電源ボックス７で操作される培養液循環ポンプ５により、培養液を溜めている培地バッ
ク６へと流れ込み、それと同時に培地バック６に溜めてある培養液が培養液循環ポンプ５
によりポンプチューブ８を介して細胞培養器９の培地層２へと流れ込む循環システムにな
っている。培地層２の培養液は中間隔膜３を通過して培養層１へと流れ込み細胞への養分
供給をおこなう。  
【００１９】
本発明は特許文献５記載の方法とは異なり、循環システムは回転軸内部に搭載しており
、ｎ軸回転部を介さないため、既存する培養液循環システム付きクリノスタットで問題と
されていた培養液詰まりやコンタミネーションおよび培養液漏れ等が全く生じない。
【００２０】
本発明の方法では、培養液循環システムを使用することにより常時、安定して養分の供
給を行なうことができる。つまり、臓器製造のために不可欠な長期間培養と３次元培養を
複合して行うことができる。
【００２１】
図２に、本発明の細胞培養方法におけるクリノスタットのＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸の回転軌道
を示す。細胞集塊の創出のための培養は、水平軸（X軸）を外側の軸とし、例えば、１０
分間に１５回転、垂直軸(Y軸)を内側の軸とし１０分間に１７回転とする軌道制御運転を
行いX, Y, Zの各軸の重力分散が1：1：1となるように回転させる。その結果、回転中心部
は重力の分散により模擬微小重力環境となり細胞は培養液中に一見浮遊した状態となる。
【００２２】
図３に、本発明の細胞培養方法におけるクリノスタットの回転中心部と細胞培養器の配
置の関係を示す。クリノスタットは重力をX、Y、Z軸方向に分散（模擬微小重力環境）さ
せることで細胞を浮遊した状態とし３次元培養をおこなう装置であり、重力が最も分散さ
れる箇所は回転軸Ｘと回転軸Ｙの交差する回転中心部Ｃである。したがって、細胞培養器
９を回転中心部Ｃ付近に搭載することにより、培養細胞への重力が分散される。
【００２３】
細胞搭載時の媒体としては、一般的に汎用されている培養液を選択して使用できる。こ
の培養液の粘性及び質量は細胞よりも低い。したがって、クリノスタットの回転を1分間
に2 rpm以下という低速回転とし重力を分散することにより遠心力の作用は低くなり、ク
リノスタットによる3次元培養を行った際、細胞は地球の重力方向へ沈下する傾向となる
。
【００２４】
細胞が細胞集塊を形成するには個々の細胞が増殖した母娘細胞同士の結合のほかに、浮
遊状態にある他の細胞との結合が必要である。細胞同士の結合は細胞の互いの接着性によ
り行なわれる。ただし、結合するための前段階として細胞間の出会いが必要である。また
、細胞間の接着が行なわれても、静置培養を行った際に形成される２次元的なシート状の
接着ではなく、３次元を有した球状の集塊を効率よく作製する必要がある。
【実施例】
【００２５】
よって、本発明では回転中心部付近に細胞培養器を搭載し、重力を分散させながら細胞
を培養するものの、2rpmという低速回転で、一般的に使用されている細胞培養液を用いる
ことにより、通常培養液よりも比重が高い動物細胞は重力方向へ沈下し、細胞培養器内に
おいて細胞が底部に偏在することとなる。さらに、培養器は常に２rpm以下のn軸回転をし
ていることから、細胞は回転中の培養器内壁の底部にあたる部分を転がりながら培養され
ることとなる。これらのことから、細胞同士の接触頻度が、培養液中に分散されている状
態の細胞接触頻度よりも増し、大量（1000個以上）の細胞集塊を形成するようになる。
【００２６】
以下の、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限
定されるものではない。
１．三次元培養
（試験方法）培養液循環システムを搭載したクリノスタットを用いて細胞の三次元培養を
行った。培養期間は48時間（短期培養）及び144時間（6日間、長期培養）とした。長期培
養においては本クリノスタットが搭載している培養液（培地）循環システムを使用した。
このシステムは１分あたり約1 μl（１日約1.44 ml）の培養液を循環することができるよ
う設定されている。クリノスタットの運転条件は、平均重力レベルを1ｘ10-2 Ｇ以下、重
力分散値をＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸のいずれも0.333となるように設定した。運転モードは軌
道制御設定とし、1周期の回転時間は10分、回転数は内側軸では17回転/周期、外側軸では
15回転/周期とした。この軌道制御設定により、運転中のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸の平均重力(
G)値はそれぞれ-0.000Ｇ、-0.001Ｇ及び-0.000Ｇとなる。
【００２７】
２. 培養条件
培養中の気相はAir 95％（O2約20％）、CO2 5%、とし、培養温度は37℃とした。培養液
は10％ Fetal Bovine Serum (FBS: GIBCO, California, USA)及び1％Penicillin-Strepto
mycin (GIBCO, N.Y., USA) を添加した Dalbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, P-4
417: Sigma-Aldrich co, St Louis, Mo, USA)を使用した。
【００２８】
３. 供試細胞
３．１  短期培養（48時間）
膵島構成細胞と同様の内胚葉系臓器由来のヒト肝芽腫由来細胞株であるHep G2及びマウ
ス肝上皮由来細胞株であるMLE 10の2種の細胞を用いて48時間の三次元培養を行った。搭
載細胞密度は2種細胞において、いずれも1ｘ105 cells/ml、2ｘ105 cells/ml及び2ｘ106 
cells/mlとした。 
【００２９】
３．２  長期培養（144時間）
144時間（6日間）の三次元培養はMLE 10細胞を用いて行った。
【００３０】
４.  評価方法
評価項目は短期培養及び長期培養ともにスフェロイド形成の有無、スフェロイド数の測
定、スフェロイドサイズの測定、スフェロイドを構成する細胞数の算出、スフェロイドを
構成する細胞の生存率の算出、培養液中のグルコース濃度及びアルブミン濃度の測定を行
った。
【００３１】
４．１  スフェロイド数の測定はクリノスタット用細胞培養器から回収したスフェロイド
をシャーレ内の中央に集め実体顕微鏡により撮影した画像を用いて算定した。
【００３２】
４．２  スフェロイドサイズの測定は無作為に選択した100個のスフェロイドの長径及び
短径の平均を直径として判定した。
【００３３】
４．３  スフェロイドを構成する細胞数の測定は、まず1部のスフェロイドのサイズを確
認し各個体を認識した上で10% Hoechst 33258 (WAKO Osaka, Japan)を添加したPhosphate
Buffered Saline (PBS: Sigma-Aldrich co, St Louis, MO, USA)にスフェロイドを2分間
曝露し核を染色した。次に、スライドガラス上にスフェロイドを乗せ、カバーガラスでや
や押しつぶすように挟み込みマニキュアで封入した。その後、蛍光顕微鏡により撮影した
スフェロイド画像から核数を算定し、この値をスフェロイド構成細胞数とした。
【００３４】
４．４  スフェロイドを構成する細胞の生存率の算出は死細胞を選択的に染色する0.4% T
rypan Blue Stain (GIBCO, California, USA)を用いて、スフェロイドサイズと構成細胞
数の値から算出した。
【００３５】
４．５  培養液中のグルコース濃度はムタロターゼとグルコースオキシターゼを組み合わ
せた酵素法試薬グルコースＣII−テストワコー(ムタロターゼ・GOD法：Wako, Osaka, Jap
an)を用いた吸光度測定により行った。また、培養液中のアルブミン測定はMouse Albumin
ELISA Quantitation Kit (BETHYL, TX, USA)により行なった。
【００３６】
（１）２種の細胞系（Hep G2及びMLE 10）はともに1ｘ105 cells/ml、2ｘ105 cells/ml及
び2ｘ106 cells/mlの細胞数でクリノスタットに搭載すると細胞集塊を多数形成した。図
４の（a）に示す細胞培養容器内にみられる白色浮遊物は培養液中に浮遊する大量の細胞
集塊である（細胞搭載密度2×106 cells/ml）。（ｂ）は細胞集塊の拡大写真を示す。
【００３７】
（２）Hep G2を1ｘ105 cells/ml、2ｘ105 cells/ml及び2ｘ106cells/mlの細胞数でそれぞ
れ細胞培養器に搭載し、細胞培養器の回転中心部がクリノスタットの回転中心部から2.5
ｃｍはずれるように装着し、１０分間にX軸が１５回転、Y軸が１７回転とした４８時間の
三次元培養を行った。回転速度は X軸は1.5 rpm、Y軸は1.7 rpmとした。その結果、搭載
細胞密度の違いにより、細胞集塊数及び平均サイズに差がみられたことから、搭載細胞密
度により細胞集塊の数とサイズの調整が可能であることが示された。  
【００３８】
Hep G2細胞集塊を図５に示す。トリパンブルー染色写真は青色に染まった細胞が死細胞
であり、白色の細胞が生細胞であることを示している。したがって、細胞集塊の側部を構
成する細胞の多くが生細胞であることが伺える。ヘキスト染色写真は細胞集塊を構成する
細胞数を示す。パラフィン切片,HE染色からは細胞集塊の内部細胞が生細胞であることが
伺える。Hep G2細胞集塊サイズの分布を図６に示す。図６からは細胞の搭載密度が高いほ
ど細胞集塊のサイズが小さくなる傾向が伺える。さらに、2ｘ105 cells/ml及び2ｘ106cel
ls/mlの細胞搭載密度では細胞集塊のサイズが１峰性に分布することが示される。
【００３９】
（３）MLE 10を1ｘ105 cells/ml、2ｘ105 cells/ml及び2ｘ106 cells/mlの細胞数でそれ
ぞれ細胞培養器に搭載し、細胞培養器の中心部がクリノスタットの回転中心部から2.5 cm
はずれるように装着し、１０分間にX軸が１５回転、Y軸が１７回転とした４８時間の三次
元培養を行った。その結果、搭載細胞密度の違いにより、細胞集塊数に差がみられたこと
から、搭載細胞密度により細胞集塊の数の調整が可能であることが示された。
【００４０】
MLE 10細胞集塊を図７に示す。トリパンブルー染色写真は青色に染まった細胞が死細胞
であり、白色の細胞が生細胞であることを示している。したがって、細胞集塊の側部を構
成する細胞の多くが生細胞であることが伺える。ヘキスト染色写真は細胞集塊を構成する
細胞数を示す。凍結切片、HE染色からは細胞集塊の内部細胞が生細胞であることが伺える
。MLE 10細胞集塊サイズの分布を図８に示す。図８からは1ｘ105 cells/mlの細胞搭載密
度では細胞集塊のサイズが１峰性に分布することが示される。
【００４１】
（４）Hep G2を2ｘ105 cells/mllの細胞数で細胞培養器に搭載し、細胞培養器の中心部が
クリノスタットの回転中心部から2.5 cmはずれるように装着し、１０分間にX軸が１５回
転、Y軸が１７回転とした１４４時間の三次元培養を行った。培養期間中は培養液循環シ
ステム使用した。その結果、培養液循環システムを使用した場合において細胞の生存が高
いことが伺え、長期間、大量の細胞集塊を培養することが可能なことが示された。
【００４２】
長期間培養を行ったHep G2細胞集塊を図９に示す。トリパンブルー染色写真は青黒色に
染まった細胞が死細胞であり、白色の細胞が生細胞であることを示している。したがって
、循環システムを使用した場合において、循環システムを使用しなかった場合よりも細胞
集塊を構成する細胞の生存性が良好であることが伺える。凍結切片,HE染色からは循環シ
ステムを使用した場合において、循環システムを使用しなかった場合よりも細胞集塊を構
成する内部細胞の生存性が良好であることが伺える。
以上の結果をまとめて表１に示す。
【００４３】
【表１】
2006304791.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、医療現場において患者へ移植する細胞を効率よく作製することができ、
これまで絶対的に不足していたドナー細胞に代わる移植細胞として使用することができる
。また、人工的に大量生産することでこれまで不足していた移植用細胞を多くの患者に低
価格で提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の細胞培養方法における細胞搭載ユニットの概略全体構成図である。
【図２】本発明の細胞培養方法におけるクリノスタットのＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸の回転軌道を示す図である。
【図３】本発明の細胞培養方法におけるクリノスタットの回転中心部と細胞培養器の配置の関係を示す模式図である。
【図４】実施例１において培養したHep G2スフェロイドの図面代用光学写真（Ａ）及び図面代用顕微鏡写真（Ｂ）である。
【図５】実施例１において培養したHep G2スフェロイドの図面代用顕微鏡写真（Ａ；トリパンブルー染色、Ｂ；ヘキスト染色、Ｃ；パラフィン切片、ＨＥ染色）である。
【図６】Hep G2スフェロイドサイズの分布図である。
【図７】実施例１において培養したMLE 10スフェロイドの図面代用顕微鏡写真（Ａ；トリパンブルー染色、Ｂ；ヘキスト染色、Ｃ；凍結切片、ＨＥ染色）である。
【図８】MLE 10スフェロイドサイズの分布図である。
【図９】培養液循環システムを使用した場合（Ａ）と使用しない場合（Ｂ）のスフェロイドを対比して示す図面代用顕微鏡写真（上； トリパンブルー染色、下； 凍結切片、HE染色 ）である。
【図１０】クリノスタットの一形態の構成を示す斜視図である。
【図１１】図１０に示すクリノスタットに用いる培養容器の一形態の構成を示す斜視図である。
【図１】
2006304791.tif 000004
【図２】
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【図３】
2006304791.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006304791.tif 000010
【図８】
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【図９】
2006304791.tif 000012
【図１０】
2006304791.tif 000013
【図１１】
2006304791.tif 000014