(57)【要約】【課題】細胞生かした状態で細胞内の特定生体物質を採取するための生体試料チップを提供し、細胞内の特定物質を測定する方法を提供すること。【解決手段】生体試料チップは尖った先端を有する針構造を有し、該針の前記細胞に挿入される部分の直径は前記細胞の大きさに対して１／５以下であり、前記針の細胞に挿入されるプローブ領域に前記特定生体物質に親和性のある物質が固定される。固定された物質にナノ粒子を標識した第２の親和性物質プローブとして反応させ、粒子をカウントする。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の特定生体物質を採取するための生体試料チップであって、該生体試料チップは尖った先端を有する針構造の生体試料チップ先端部を有し、前記生体試料チップ先端部の細胞に挿入されるプローブ領域に前記特定生体物質に親和性のある物質が固定された生体試料チップ。
【請求項２】
前記生体試料チップ先端部の最先端部に細胞に挿入される部分にＴｉＯ２が固定された請求項１記載の生体試料チップ。
【請求項３】
前記特定生体物質に親和性のある物質に加えて（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）が前記生体試料チップ先端部の細胞に挿入されるプローブ領域に固定された請求項１記載の生体試料チップ。
【請求項４】
前記生体試料チップ先端部の根元部分にホルダを有し、該ホルダは操作基板に連結された請求項１ないし３記載の生体試料チップ。
【請求項５】
特定生体物質に親和性のある物質を固定した生体試料チップ先端部のプローブ領域を細胞に刺し、前記生体試料チップのプローブ領域に固定された物質に親和性のある物質を前記プローブ領域に捕捉した後、ナノ粒子を標識したプローブを前記プローブ領域に捕捉された前記細胞内の生体物質に反応させてハイブリダイズさせ、前記プローブ領域に捕捉された前記細胞内の生体物質にハイブリダイズした前記プローブのナノ粒子の数を計数する細胞内の特定物質の測定方法。
【請求項６】
特定生体物質に親和性のある物質と（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）を固定した生体試料チップ先端部のプローブ領域を細胞に刺し、前記生体試料チップのプローブ領域に固定された物質に親和性のある物質を前記プローブ領域に捕捉した後、ナノ粒子を標識したプローブを前記プローブ領域に捕捉された前記細胞内の生体物質に反応させてハイブリダイズさせ、前記プローブ領域に捕捉された前記細胞内の生体物質にハイブリダイズした前記プローブのナノ粒子の数を計数する細胞内の特定物質の測定方法。
【請求項７】
前記特定生体物質がｍＲＮＡである請求項５または６記載の細胞内の特定物質の測定方法。
【請求項８】
前記特定生体物質がタンパク質である請求項５または６記載の細胞内の特定物質の測定方法。
【請求項９】
前記生体試料チップ先端部を刺す場所が細胞の細胞核である請求項５から８の何れかに記載の細胞内の特定物質の測定方法。
【請求項１０】
前記生体試料チップ先端部を刺す場所が細胞の細胞質である請求項５から８の何れかに記載の細胞内の特定物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は種々の検査項目を一度に検査するプローブチップすなわち多項目センサーに関するもので、対象はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質で、例えば、最近注目をあつめているＤＮＡ検査用のＤＮＡチップに関するもので、生きた細胞内から細胞内の特定物質の採取の可能な生体試料チップおよび細胞内の特定物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体をプローブ）としてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成して行く方法（Science 251, 767-773(1991)），あるいはDNAプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)）などがある。
【０００４】
これらのチップは、いずれもスライドガラスなどの平面状に区画を区切り、多数のプローブをアレー状に整列させた構造をしている。いずれの方法も、試料としては、細胞や組織を破砕して細胞内に存在するＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質を抽出し、プローブチップと反応させ、チップ上に捕捉した物質を何らかの方法で標識して検出するのが一般的である。特にＤＮＡやＲＮＡの分析には、一旦、このようにして抽出したＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲなどで増幅する前処理を行い、この段階で、試料ＤＮＡ或いはＲＮＡを転写したｃＤＮＡに蛍光標識を行うのが一般的である。
【０００５】
検出に関しては、チップ基板上のプローブに蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどの試料ポリヌクレオチド（以下単に試料ポリヌクレオチド）をハイブリダイズさて基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接して試料ポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴをライゲーション反応で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入する蛍光体を検出するのが主流である。
【０００６】
最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを捕捉した後、質量分析機で分析したり、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。高感度で定量的な検出を目的とした検出法としては、通常の顕微鏡検出が可能な７００  μｍ程度の粒子を標識に用いて、反応した粒子数をカウンターでカウントして目的物質を定量検出するイムノアッセイの報告がある（Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)
【非特許文献４】Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現状のチップ技術、特にＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップでは、検出感度が十分ではないために、ＰＣＲなどの増幅工程を前処理として行うのが一般的である。ＰＣＲは理想的には反応サイクルをｎ回行うことで特定配列領域が２ｎ倍になるといわれている。サンプルとして抽出したＤＮＡないしＲＮＡが必要なため、元の試料である細胞や組織が死んでしまう欠点がある。このため、同一細胞や組織を経時的に解析することはできない。もちろん十分に多量の細胞試料があり、その一部を取り出してその都度ＰＣＲを行えば、見かけ上連続して解析した結果が得られるが、実際は同一の細胞の状態を経時的に追いかけているわけではない。
【０００９】
昨今の生物学では、個々の細胞が外界や隣接する細胞とどのような影響を与え合いながら機能しているかを調べる研究が盛んになりつつあるが、このような目的には、従来の細胞を破壊してそのＲＮＡなどを調べる方法は適切ではない。また、再生医療に用いるエンブリオニックステムセルのような基本的に１細胞の取り扱いが必要な場合は、元の細胞を分析のために破壊することはできない。これらは分化誘導して利用するわけであるが、分裂初期の段階からの細胞状態の追跡とコントロールが必要となる。
【００１０】
さらに、ＰＣＲの重大な問題点はその定量性の低さにある。特にｍＲＮＡの分析は多種類の同時測定もさることながら、定量解析が重要な課題である。ｍＲＮＡは細胞が外界から受ける刺激や細胞の周期によって大きく変動するものが多いからである。
【００１１】
ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレー）では、定量性が悪いため、一般にディファレンシャルハイブリダイゼーションとか競争ハイブリダイゼーションと呼ばれる技術を用いるのが一般的である。これは、２系統のサンプルＡとＢがあるときに、ＡとＢそれぞれに異なる波長の蛍光体をラベルし、両サンプルを混合する。混合状態で同一ＤＮＡチップに競争的にハイブリダイズさせる、両者の量比に応じて２種の蛍光体の強度比が検出される。この方法では、定量性が悪く、再現性に乏しいＤＮＡチップにおいても、とりあえずのデータを得ることができる。
【００１２】
このように、ＰＣＲの定量性の低さが加わるため、ＤＮＡチップで定量的な検討を行う場合はデータに対する十分な注意が必要である。ＰＣＲでは一回の増幅ごとに理想的には標的配列部分が２回になる反応である。しかし、増幅すべき標的がｍＲＮＡのように複数ある場合は各々のｍＲＮＡが独立事象で増幅しないことが定量性を低くする原因である。即ち、限られた量の基質とＤＮＡポリメラーゼで増幅を行うのであるから全ての反応は複数の種類の標的ｍＲＮＡでの競争反応となる。増幅しやすいｍＲＮＡが優先して増幅する上に、各ｍＲＮＡのスタート量がサンプルごとにまちまちであるので、増幅後は各ｃＤＮＡの比率はスタートのｍＲＮＡの量比を反映しないばかりか、多い少ないが逆転してしまうことも頻繁に起きている。これらを回避するには、増幅を行わないで直接細胞一個一個のｍＲＮＡを分析するほか手立てはない。
【００１３】
これらの問題点を解決するために、本発明では、細胞１個からの経時的な情報を逐次得ることのできる手段を提供することにある。細胞は使いきりではなく生かしたまま、逐次複数種のｍＲＮＡやタンパク質の解析ができる方法を提案することを目的とする。このためのチップ形状、チップに使用するケミストリーと測定方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
細胞を生かしたまま、その内容物を解析するには、ｉｎ  ｖｉｖｏで解析を行うか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う両方が考えられる。本発明では、細胞を殺さずに核或いは細胞質に存在するｍＲＮＡやタンパク質を回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析を行う方法である。細胞を殺さないために先端直径が２ｎｍ以下の生体試料チップ先端部を細胞に刺して内容物を回収する。生体試料チップ先端部先端にはｍＲＮＡを釣り上げるオリゴＴが固定されている。或いは、生体試料チップ先端部の先端部分をサジタル方向にいくつかのエリアに区切り、各々にオリゴＴの３’末端側に２から４程度の異なる配列のオリゴを固定してｍＲＮＡをポリＡに隣接する２から４塩基の配列で分類しながら分取する。
【００１５】
このときに用いるプローブは、通常のリン酸ジエステル結合で作られているポリヌクレオチドでは細胞内のエンドヌクレア−ゼで分解を受けやすいのと、ホールディングしやすいｍＲＮＡのプロービング配列部分が塞がれてしまうことを回避するために、ＰＮＡやそれに類してマイナス荷電をプローブに持たない人工ポリヌクレオチドを用いる。特定のタンパク質解析に関しては、抗体を生体試料チップ先端部先端に固定したものを用いて特定タンパク質を釣り上げる。
【００１６】
細胞に生体試料チップ先端部を刺す場合は、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端部分（細胞に挿入される部分）の直径を細胞の大きさに対して１／５以下とする。また、酸化チタンＴｉＯ２をコートして置く。あるいは酸化チタンＴｉＯ２のコートに代えて、細胞に挿入される部分全体にアルギニンをコートしておき、細胞表面の細胞膜のりん脂質とのインタラクションを容易とし、スムーズに生体試料チップ先端部が細胞に差し込まれるようにする。必要なら、さらに、細胞に挿入される部分全体にアルギニンをコートしておき、先端部のみに酸化チタンＴｉＯ２をコートして置く。
【００１７】
細胞に生体試料チップ先端部を刺してプローブ先端表面に測定対象物を捕捉した生体試料チップ先端部を細胞から引き抜き、表面に捕捉されている特定物質の量を測定するわけであるが、先ず、特定物質に対していわゆるサンドイッチ反応を用いてナノ粒子を結合させる。生体試料チップ先端部表面に残るナノ粒子を走査型電子顕微鏡でスキャンすることで、どのような物質がどのくらい回収されたかを定量的に測定する。或いは生体試料チップ先端部の上に残っているナノ粒子を原子間力顕微鏡で計測する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞を破壊せずに中に含まれる生体物質を回収し、解析できるようになるので同一の細胞の状態をモニターできるようになる。従来は困難であった細胞を破壊せずにｍＲＮＡや核内タンパク質の定量解析が可能となる。細胞を殺さないので、解析した細胞そのものを培養して利用することが可能となる。これにより、再生医療の最大のボトルネックであるステムセルの素性を解析し、目的に合った細胞のみを分化誘導し、利用することが可能となる。分化誘導中においても分裂細胞を殺さずに細胞内生体物質を解析できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（実施例１）
図１は本発明による細胞内生体物質の回収分析法の流れを示す図、図２（Ａ）は本発明に係る生体試料チップ先端部３を模式的に示す拡大図、（Ｂ）は本発明に係る生体試料チップの全体像を模式的に示す斜視図である。
【００２０】
図１において、１は細胞であり、２は、細胞１の核である。３は本発明に係る生体試料チップ先端部である。生体試料チップ先端部３は先端部分が細胞１の大きさに比べ１／５以下の直径の先の鋭い針である。５は生体試料チップ先端部３にコートされた酸化チタンＴｉＯ２、６は３３５ｎｍの紫外線であり、生体試料チップ先端部３を細胞１に刺すときに照射される。生体試料チップ先端部３を細胞１に刺すときに３３５ｎｍの紫外線を照射すると、コートされた酸化チタン５の有機物分解作用により容易に細胞１に刺さる。プレマチュアーなｍＲＮＡ或いは核タンパク質を解析するには生体試料チップ先端部３を細胞１の核２に刺す。
【００２１】
生体試料チップ先端部３に得られた生体試料を、生体試料チップ先端部３を細胞１から抜いた後洗浄し、金ナノ粒子で標識し、洗浄、乾燥の手順を経て測定をする。矢印４は生体試料チップ先端部３が、細胞に対して上下動して操作されることを示す。
【００２２】
図２（Ａ）に示すように生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２にプローブ２１が固定されている。プローブ２１は回収したい細胞内生体物質に親和性のある物質である。プローブ領域２２は、細胞の大きさを考慮して決めれば良いが、たかだか１０μｍ、プローブ領域２２の根元部分で４μｍ程度である。生体試料チップ先端部３には酸化チタンＴｉＯ２５がコートされる。上述したように、生体試料チップ先端部３はきわめて小さいものである。この取り扱いを容易にするために、図２（Ｂ）に示すように、本発明に係る生体試料チップ先端部３は、生体試料チップ先端部ホルダ８を有し、ホルダ８は操作基板７に結合される。ホルダ８は、例えば、１ｍｍφとし、操作基板７は４ｍｍ×５ｍｍとする。細胞１を顕微鏡の対物レンズの下に保持して、操作基板７を保持した操作部で生体試料チップ先端部３を細胞に刺す操作をすることができ、操作を安定、且つ、安全に行うことができる。また、ＳＥＭあるいはＡＦＭで測定する場合にも、操作基板７を保持した操作部で生体試料チップ先端部３を操作することができる。
【００２３】
実施例１では大腸がん切除組織断片の細胞に生体試料チップ先端部を刺して、中に存在する特定ｍＲＮＡの解析に関し説明する。プローブ２１としては２６塩基長のポリＴの３’末端に５塩基長のランダム配列オリゴＤＮＡが結合してある。これは、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。プローブ２１は細胞内のｍＲＮＡと容易にインタラクションするようにＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）でできている。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。
【００２４】
このため、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２が細胞内に挿入されたとき、プローブ２１と細胞内に存在する特定ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。また、生体試料チップ先端部３が細胞膜を通過するときにリン脂質との反発力を生じないのでスムーズに生体試料チップ先端部を刺すことができる。実施例１のようにプローブ領域２２の固相表面上にプローブ２１が高密度に固定されているケースでは、プローブ２１を通常のＤＮＡによるプローブとすると、プローブ領域２２が作るマイナス荷電のバリアーを超えて標的ＤＮＡがプローブ２１に接近する必要があり、反応速度論的にも熱力学的に見ても不利になる。また、標的ｍＲＮＡは必ず１本鎖になる必要があるが、実際は分子内で３次元的にホールディングしており、プローブが結合するプロービングサイトが埋まっているケースがある。
【００２５】
ＰＮＡのようにマイナス荷電を持たないプローブを用いることで、プローブ自体の電荷をなくすことができ、プローブ領域２２マイナス荷電のバリアーを作ることはないので、ハイブリダイゼーションの速度と収率が向上する。さらに、ＰＮＡの電荷を持たない特性は、静電的な反発力を生じないので、標的ＤＮＡが２本鎖であっても競争的に２本鎖に潜りこみ、競争的にハイブリダイゼーションすることができる。
【００２６】
さらに、細胞膜もマイナスに荷電したリン脂質で覆われているため、生体試料チップ先端部表面にマイナス荷電があると、生体試料チップ先端部と細胞の間で反発力がはたらき、生体試料チップ先端部を刺しづらくなる。ＰＮＡでできたプローブを固定した生体試料チップ先端部を用いることでスムーズに細胞に生体試料チップ先端部を刺すことができる。
【００２７】
細胞１に生体試料チップ先端部３を刺し、プローブ領域２２を細胞内に３０秒間置いた後、生体試料チップ先端部３を細胞１から引き抜き、直ちに２×ＳＳＣで洗浄する。次に粒径８．３ｎｍの金ナノ粒子を標識した第２のプローブをプローブ領域２２のプローブ２１にハイブリダイズしたｍＲＮＡと４０℃で５分間ハイブリダイズさせる。ここでは、第２のプローブは特定の配列のオリゴＰＮＡを用いる。ＰＮＡを用いるのは上記理由と同じである。例えば、上皮細胞でガンになると多量に発現するといわれているＥｐＣＡＭに特異的な２８塩基長の配列を用いる。再度洗浄後、純水で洗浄する。実施例１では、ＰＮＡプローブを用いるために、純水で洗浄してもハイブリダイズしたプローブが脱ハイブリダイズすることはない。
【００２８】
第２のプローブに通常のＤＮＡのプローブを用いると、分子同士がリンサンジエステル結合部分のマイナス荷電による反発力のため、ハイブリダイゼーションが、溶媒の誘電率に大きく影響を受ける。このため、高塩濃度でリン酸基同士の反発力を遮蔽しなければハイブリダイゼーションしない。純水中では２本鎖の構造が緩むし、実施例１のようにオリゴＡとオリゴＴのコンプレックスで通常のヌクレオチド構造を用いると安定な２本鎖を維持することが難しい。実施例１では、第２のプローブにＰＮＡを用いるため、プローブと試料ｍＲＮＡの静電反発力が生じない。このため、純水中でもハイブリダイズしたＲＮＡ／ＰＮＡ２本鎖を安定した状態で保持できる。
【００２９】
次に、第２のプローブを標識している金ナノ粒子を生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２の表面上に固定するために乾燥させる。溶液状態では、金ナノ粒子がブラウン運動してしまうので、例えばＡＦＭによる測定は精度が落ちるし、ＳＥＭによる観察はできない。乾燥した生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２をＳＥＭ或いはＡＦＭで観察することでプローブ領域２２の表面に捕捉されている金ナノ粒子数を定量的に測定する。プローブ領域２２の表面に捕捉されている金ナノ粒子の数は、プローブ領域２２の表面に捕捉されているｍＲＮＡの量に依存するし、プローブ領域２２の表面に捕捉されるｍＲＮＡの量はプローブ領域２２のプローブ２１によって細胞内から釣り上げられてくるｍＲＮＡの量に依存するので、細胞の生体試料チップ先端部３が挿入された位置の周りに存在するｍＲＮＡ量と相関する。
【００３０】
以上の方法で、細胞を殺さずに細胞内のＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ量を測定することができる。
【００３１】
図３は大腸ガン組織断片のガン病巣細胞とその線上で隣接する細胞から１細胞ごとに上記方法で得ることのできるＥｐＣＡＭを定量的に比較した図である。大腸ガン組織断片に少しずつ位置を変えながら、新しい生体試料チップと交換して生体試料チップ先端部３を挿入して、各位置でのＥｐＣＡＭ発現量を評価する。ある特定の細胞を境に高発現細胞群３１と低発現細胞群３２に規格化されていることがわかる。ＥｐＣＡＭ発現量が多い部分ががん細胞、少ない部分がガン化していない細胞と推測される。
【００３２】
（実施例２）
実施例２では、実施例１の第２のプローブを複数の粒径の金ナノ粒子で標識した複数の異なる配列のＰＮＡとし、プローブ領域２２表面に捕捉した複数のｍＲＮＡを同時に検出する方法について図４を参照しながら述べる。
【００３３】
図４は、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２の表面に固定されたプローブ２１に複数の粒径の金ナノ粒子で標識した複数の異なる配列のＰＮＡがハイブリダイズしている様子を示す模式図である。
【００３４】
生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２の表面には、実施例１と同様に２６塩基長のポリＴの３’末端に５塩基長のランダム配列オリゴＤＮＡプローブ２１が固定してある。実施例１と同様に、生体試料チップ先端部３を細胞１に差し込み、大腸がん由来の組織片の細胞からプローブ領域２２のプローブ２１にｍＲＮＡを釣り上げ、洗浄する。
【００３５】
図４に示すように、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２のプローブ２１にハイブリダイズしている複数のｍＲＮＡ２５−１，２５−２および２５−３に、複数の粒径の金ナノ粒子２６，２７および２８で標識した複数の異なる配列の第２のプローブがハイブリダイズしている。図４で単に参照符号を２５として示したものは、プローブ２１にハイブリダイズしている複数のｍＲＮＡであるが、第２のプローブとハイブリダイズしなかったものである。第２のプローブは、ＥｐＣＡＭ配列を持つオリゴＰＮＡ（２８塩基）、同じくガン細胞での発現が多くなるといわれているＣＤ４４とＣＥＡのｍＲＮＡ配列に対応するそれぞれ２６塩基と２９塩基からなるＰＮＡをプローブ配列として、それらの５’末端にそれぞれ、８．３ｎｍの金ナノ粒子２６、１１ｎｍの金ナノ粒子２７および１７ｎｍの金ナノ粒子２８を連結した。２５−１，２５−２，２５−３はそれぞれ捕捉されているＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＥＡのｍＲＮＡ断片である。
【００３６】
実施例１と、同様にガン病巣細胞近傍の細胞に含まれる３種のｍＲＮＡ量を測定すると、ＥｐＣＡＭとＣＥＡに関しては、図３のような結果を得るが、ＣＤ４４に関してはいずれの細胞も２５０分子／生体試料チップ先端部程度の値になり大きな変化はない。ＣＤ４４に関しては大腸がんではスプライシングバリアントが生じるようになるとの報告があるが、トータルのＣＤ４４のｍＲＮＡ量は変化しないのかもしれない。ここで用いているＣＤ４４用のプローブ配列は、最もポリＡテール側に位置するエキソン内の配列を用いているが、いずれのスプライシングバリアントでも利用されているエキソンかもしれないが、詳細は不明である。
【００３７】
（実施例３）
実施例３は生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２を長さ方向に複数のエリアに分け、それぞれに、異なったプローブを固定した例である。
【００３８】
図５（Ａ）は、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２を長さ方向に、五つのエリア４１，４２，４３，４９および５０に区分し（エリア４９および５０は背面にあるため図５（Ａ）では見えない）、それぞれの面に所定のプローブ４４，４５および４６を固定した状態を模式的に示す図である。図５（Ｂ）は、図５（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【００３９】
４１，４２，４３のエリアには、それぞれに、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＥＡの最終エキソンとその一つ前のエキソンにまたがる相補な配列（それぞれ２８、２６、２９塩基）で固定する。エリア４９はネガティブコントロールとして使用し、何も固定しない。エリア５０はポジティブコントロールとして使用しＴＴＴＴ---Ｔと塩基Ｔを２６塩基固定する。固定法は、シランカップリング反応でグリシドキシ基を生体試料チップ先端部表面に導入し、５’末端にアミノ基を有するＰＮＡを固定する方法で調製している。エリアを区切って異なったＰＮＡを固定するには、固定したいＰＮＡをＤＭＳＯ懸濁して、生体試料チップ先端部３と同程度の鋭さを持った支持片に塗布し、この支持片の先端部で生体試料チップ先端部３表面のプローブ領域２２の１区分の面のみをなぞることで調整する。液の付着した方向を下にし、５０℃で５分間過熱することでプローブを固定することができる。乾燥後、別の面に別のプローブを固定する。これで、異なる４面に異なるプローブを固定することができる。
【００４０】
実施例３のようにプローブを固定する面を分離することで、各面に捉えられる生体試料が特定のものに特化されるので、測定の精度を上げることができる。
【００４１】
（実施例４）
実施例４は、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２にアルギニンが固定されたものである。
【００４２】
図６は実施例４の生体試料チップ先端部３を模式的に示す図である。プローブ領域２２の表面には、プローブ２１に加えて、アルギニン４８が固定される。固定するアルギニンはアミノ酸１個でも良いし、オクタマーまでの長さでも良い。固定法はＰＮＡを固定する溶液に１／４０モル比で加えておいて生体試料チップ先端部全体に満遍なく固定している。固定法について述べる。まず、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの０．５％水溶液（酢酸を０．５％添加、シランカップリング剤が溶解しない場合は溶解するまで酢酸を加える）を３０分間室温（２５℃）で放置し、メトキシ基を加水分解し、活性なシラノール基を生成させる。
【００４３】
表面に酸化膜を有するシリコン製の生体試料チップ先端部３を活性化したシランカップリング溶液に浸し、１時間放置する。純水で５秒間リンスする。この時点でシランカップリング剤のシラノール基が部分的に酸化シリコンの表面のシラノール基と脱水縮合したものと、シランカップリング剤のシラノール基と酸化シリコン表面の酸素が水素結合で結合したものの準安定な混合物ができる。次に１０５〜１１０℃、空気中で３０分間加熱する。この操作で、水素結合しているシランカップリング剤のシラノール基とシリコン表面の酸素分子の間で脱水縮合が完結する。また、シリコン表面に存在するシランカップリング剤同士でも脱水縮合が進行する。最終的にシリコン表面にグリシドキシプロピル基が導入される。このうちグリシドキシ基をなす原子団の一部がアミノ基との反応性が高いエポキシ基である。ｐＨ１０の水溶液条件下で５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の上記アミノ基を有するＰＮＡと１．２５μＭのＬ−Ａｒｇ或いはアルギニンオリゴマー（（Ｌ−Ａｒｇ）ｎ（ｎ：２〜８）混合溶液を１時間５０℃で反応させる。この反応でアルギニンを部分的に固定したＰＮＡ固定生体試料チップ先端部を得ることができる。
【００４４】
実施例４で調製した生体試料チップ先端部を用いると細胞に生体試料チップ先端部を刺すときに細胞の保持がほとんど必要がない程度の力で生体試料チップ先端部を刺すことができる。このため、実施例１〜３のように組織細胞以外にも培養細胞のように固定されていない細胞でも比較的容易に生体試料チップ先端部を刺すことができる。ＰＮＡにＥｐＣＡＭのｍＲＡＮ由来の配列を用いることで実施例１と何ら変わりがない結果を得ることができる。
【００４５】
なお、実施例４では、生体試料チップ先端部３に酸化チタンＴｉＯ２５をコートすることには言及しなかったが、これを行えば、より容易に生体試料チップ先端部３を細胞１に刺すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による細胞内生体物質の回収分析法の流れを示す図。
【図２】（Ａ）は本発明に係る生体試料チップ先端部３を模式的に示す拡大図、（Ｂ）は本発明に係る生体試料チップの全体像を模式的に示す斜視図。
【図３】大腸ガン組織断片のガン病巣細胞とその線上で隣接する細胞から１細胞ごとに上記方法で得ることのできるＥｐＣＡＭを定量的に比較した図。
【図４】生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２の表面に固定されたプローブ２１に複数の粒径の金ナノ粒子で標識した複数の異なる配列のＰＮＡがハイブリダイズしている様子を示す模式図。
【図５】（Ａ）は、生体試料チップ先端部３のプローブ領域２２を長さ方向に、五つのエリア４１，４２，４３，４９および５０に区分し（エリア４９および５０は背面にあるため図５（Ａ）では見えない）、それぞれの面に所定のプローブを固定した状態を模式的に示す図、（Ｂ）は、Ａ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図。
【図６】実施例４の生体試料チップ先端部３を模式的に示す図。
【符号の説明】
【００４７】
１…細胞、２…細胞１の核、３…生体試料チップ先端部、５…生体試料チップ先端部３にコートされた酸化チタンＴｉＯ２、６…３３５ｎｍの紫外線、７…操作基板、８…ホルダ、２１，４４，４５および４６…プローブ、２２…プローブ領域、２５−１，２５−２および２５−３…プローブ２１にハイブリダイズしている複数のｍＲＮＡ（ＥｐＣＡＭ，ＣＤ４４，ＣＥＡのｍＲＮＡ断片）、２６，２７および２８…複数の粒径の金ナノ粒子、４１，４２，４３，４９および５０…プローブ領域の区切られた面、４８…アルギニン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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