(57)【要約】【課題】  高密度で酵素を担持可能であり、かつ電流密度の向上を図ることができる酵素電極を提供すること。【解決手段】  酵素と、酵素との電子の受け渡しを行うための第１のメディエータを少なくとも一種類と、第１のメディエータとの電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを少なくとも一種類と、を担体を介して前記第１のメディエータ及び前記第２のメディエータの少なくとも一方との電子の受け渡しを行うための導電性部材に固定して、センサ、燃料電池、電気化学反応装置などの電極として有用である酵素電極を得る。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性部材と、酵素と、第１及び第２のメディエータと、を有する酵素電極であって、
前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとが担体によって、前記導電性部材に固定化されており、且つ前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとは、互いに酸化還元電位が異なることを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記第１のメディエータの酸化還元電位は、前記第２のメディエータの酸化還元電位よりも負の電位側にあり、且つ前記第２のメディエータと前記導電性部材との間の電子移動反応速度が、前記第１のメディエータと前記導電性部材
との間の電子移動反応速度よりも速いことを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記第１のメディエータの酸化還元電位は、前記第２のメディエータの酸化還元電位よりも正の電位側にあり、且つ前記第２のメディエータと前記導電性部材との間の電子移動反応速度が、前記第１のメディエータと前記導電性部材との間の電子移動反応速度よりも速いことを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
【請求項４】
前記第１のメディエータは、前記酵素との電子の受け渡しを行うためのメディエータであり、前記第２のメディエータが前記第１のメディエータと電子の受け渡しを行うためのメディエータであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項５】
前記第１のメディエータの酸化還元電位が、前記第２のメディエータより負の電位側であり、アノードとして用いられる請求項１に記載の酵素電極。
【請求項６】
前記第２のメディエータの酸化還元電位が、前記第２のメディエータより正の電位側であり、カソードとして用いられる請求項１に記載の酵素電極。
【請求項７】
前記導電性部材が、多孔質構造を有していることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項８】
前記第１のメディエータと前記第２のメディエータが、金属錯体、キノン類、複素環式化合物、ニコチンアミド誘導体及びフラビン誘導体から選ばれる少なくとも１種からなる請求項１〜７のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とするセンサ。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を、アノード及びカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする燃料電池。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を反応極として用いることを特徴とする電気化学反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極に関し、より詳細には、導電性部材に担体、酵素、メディエータを固定化した酵素電極、酵素電極を用いたセンサ、燃料電池ならびに酵素電極の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞内で作られる蛋白質性の生体触媒である酵素は、通常の触媒と比べて温和な条件下で強力に作用する。また酵素の作用を受けて化学反応を起こす物質である基質の特異性が高く、一般に各酵素は、一定基質の一定反応のみを触媒する。酵素のこれらの特性を、電極における酸化還元反応に理想的に利用できれば、低過電圧、高選択性の電極が作成可能となる。しかし、多くの酸化還元酵素の活性中心は、一般に、糖蛋白質の３次元構造の奥深いところに閉じ込められた形態で利用されている場合が多く、酸化還元酵素と電極との間で直接、高速の電子移動を行うことが困難であった。このため、酵素と電極間をメディエータと呼ばれる物質によって電子的に繋ぐ手法が提案されてきた。研究の初期段階では、酵素、およびメディエータは、実験系の簡便性、それぞれの移動の自由度の確保のため電解質溶液中に溶解されていたが、それらの有効利用、電極外への漏出防止、および、電極の連続、長期使用の要請にこたえるため、電極に固定化する手法が提案されてきた。酵素、メディエータを導電性部材に固定化する手法としては、吸着法、包括法、架橋法、共有結合法が挙げられる。これらの中でも、適当な化合物を用いて酵素、メディエータを導電性部材に固定化する、包括法、架橋法、共有結合法の三法は、吸着法と比較して、一般に酵素、メディエータの保持能が高く、系外への流出を防止し、酵素電極の繰返し使用を可能にする。さらに、この中でも包括法は、酵素、メディエータの保持容量が高いため好適に用いられる。
【０００３】
酵素電極の性能を表現する重要な値のひとつとして、導電性部材の投影面積あたりの電流値である電流密度が挙げられる。この値が高いと、例えば、電流値の検知を原理とするセンサの場合には、検出感度の向上、測定部位の簡便化、検知部位の小型化を図ることができ、燃料電池の電極として用いる場合には、出力の向上を図ることができ、電気化学反応装置として使用する場合には、反応速度の向上を図ることができる、といった利点がある。この酵素電極の電流密度を向上させる手法としては、（１）単位時間に酵素一分子が変換する基質分子の数である酵素のターンオーバー数の増加、（２）酵素／メディエータ間の電子移動速度および効率の向上、（３）メディエータの電子輸送効率の向上、（４）メディエータ／導電性部材間の電子移動速度および効率の向上、そして（５）導電性部材の投影面積あたりの酵素担持量である酵素担持密度を高めること、などによって高くすることができる。
【０００４】
前記項目（５）の実現のためには、酵素の保持容量の高い固定化方法が有利であり、前記の包括法が有力な選択肢である。包括法は、担体中に酵素、メディエータを包括し、導電性部材表面上に固定化する手法である。この包括法による酵素の固定化状態を模式的に図１に示す。この場合、導電性部材４（導電性基板）上に、酵素１及びメディエータ２が担体３中に包括されている。
【０００５】
包括法においては、酵素／基質反応で酵素上に生じた電荷が、酵素の酸化還元中心から、担体中のメディエータに移動し、メディエータ間の電子ホッピングにより導電性部材近傍まで輸送され、最終的にメディエータと導電性部材間の電荷の授受により外部回路において検出される（図１に電荷の流れが矢印で示されている）。このため、酵素を酵素の専有面積を導電性部材の実効表面積で割った量以上に固定しても、担体を通じて電極と酵素間の電荷輸送が可能であるため、導電性部材の投影面積あたりの酵素の担持密度を向上させることができる。この包括法の例として米国特許第６，５３１，２３９号明細書（Ｈｅｌｌｅｒら）では、メディエータを分子内に含むポリマーによって、酵素を包括的に固定した酵素電極からなる燃料電池が開示されている。
【０００６】
ここで、一般的に酵素とメディエータ−の電子移動速度は、酵素の酸化還元中心と、メディエータの電子移動距離の増加に従い指数関数的に低下する事が知られている。包括法の場合、酵素とメディエータは、距離、配向を持って配置されていないために、酵素／メディエータ間の電子移動は、酵素とメディエータがそれぞれのランダムな分子運動の結果、電子移動可能な距離にまで近接したときにはじめて起こるものと考えられる。このため、この酵素／メディエータ間の電子移動速度は、それぞれの分子運動に依存するため、必ずしも充分でなく、酵素電極の電流密度の制限要因となる可能性があった。
【０００７】
一方、共有結合法の一例として、導電性基材上にメディエータを結合し、そのメディエータに酵素の酸化還元中心を結合、さらに、酸化還元中心を除いた酵素を、メディエータに結合した酸化還元中心に結合させる手法がある。共有結合法による酵素の固定状態を図２に模式的に示す。図２の例では、導電性部材４（導電性基板）の表面に担体としての化合物を介してメディエータ６及び酵素１が共有結合により固定されており、電荷の流れを矢印で示してある。
【０００８】
ＫＡＴＺらは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６年１１８巻１０３２１−１０３２２頁においてメディエータとしてピロロキロリンキノンに結合したフラビンアデニンジヌクレオチドに酸化還元中心を除去したアポグルコースオキシダーゼを再構成した酵素電極を報告している。この手法は、酵素の酸化還元中心に対し、メディエータを充分に速い電子移動が可能な距離に近接、配向を持って配置可能なため、酵素／メディエータ間の高速の電子移動が可能となる。この手法は、メディエータ、酵素対を導電性部材上に単分子様に結合しているため、酵素を単層以上に固定化させることが困難であるため、酵素の担持密度に限界があり、酵素電極の電流密度の向上に限界があった。
【特許文献１】米国特許第６,５３１,９３９号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６年１１８巻１０３２１−１０３２２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、電流密度の向上を図ることができる酵素電極を提供するものである。また、本発明は、かかる酵素電極を利用したセンサ、電気化学的反応装置、燃料電池などを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る酵素電極は、導電性部材と、酵素と、第１及び第２のメディエータと、を有する酵素電極であって、
前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとが担体によって、前記導電性部材に固定化されており、且つ前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとは、互いに酸化還元電位が異なることを特徴とする。
【００１１】
本発明のセンサは、上記構成の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とするセンサである。また、本発明の燃料電池は、上記構成の酵素電極を、アノード及びカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする燃料電池である。また、本発明の電気化学的反応装置は、上記構成の酵素電極を反応極として用いることを特徴とする電気化学反応装置である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、酵素を導電性部材に固定化した構成において、導電性部材の実効表面積当たりの酵素担持密度を高くすることが可能である。本発明においては、酵素との間で高速の電子移動を行うことが可能な第１のメディエータに加えて、第１のメディエータと導電性部材間の電荷輸送を行う第２のメディエータを更に使用する形態とした場合には、酵素と高速の電子移動を行うことが可能であり、その結果、酵素電極電流密度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
本発明に係る酵素電極は、導電性部材と、酵素と、第１及び第３のメディエータと、を有する酵素電極であって、第１のメディエータと第２のメディエータとが担体によって、導電性部材に固定化されており、且つ第１のメディエータと第２のメディエータとは、互いに酸化還元電位が異なることを特徴とする。
【００１５】
ここで、２つのメディエータの組合せの一態様として、第１のメディエータの酸化還元電位が、第２のメディエータの酸化還元電位よりも負の電位側にあり（図４の場合）、且つ第２のメディエータと導電性部材との間の電子移動反応速度が、第１のメディエータと前記導電性部材との間の電子移動反応速度よりも速い材料を選択することが好ましい。
【００１６】
また、２つのメディエータの組合せの他一態様として、第１のメディエータの酸化還元電位は、第２のメディエータの酸化還元電位よりも正の電位側にあり（図５の場合）、且つ第２のメディエータと導電性部材との間の電子移動反応速度が、第１のメディエータと前記導電性部材との間の電子移動反応速度よりも速い材料を選択することが好ましい。
【００１７】
本発明は、以下のような場合にとりわけ有用である。即ち、あるメディエータが酵素との電子の受け渡しは効率的に行えるが、その後当該メディエータと導電性部材間の電子の受け渡しが効率的に行えない場合である。
【００１８】
ここで、電子移動反応速度の大小は、それぞれのメディエータの電極反応における標準速度定数を比較することで決定することができる。この標準速度定数は、電極反応の速度論的容易さの目安である。標準速度定数は、例えば、インピーダンス測定を行うことで測定可能な電荷移動抵抗から算出することができる。（逢坂哲彌、小山昇、大坂武男著、電気化学法基礎測定マニュアル、講談社サイエンティフィク）
本発明の好ましいひとつの形態における酵素電極は、酵素と、酵素との電子の受け渡しを行うための第１のメディエータの少なくとも一種類と、第１のメディエータとの電子の受け渡しを行うための第２のメディエータの少なくとも一種類と、酵素、前記第１のメディエータ及び前記第２のメディエータを固定化するための担体と、担体を接触し、且つ、第１のメディエータまたは第２のメディエータとの電子の受け渡しを行うための導電性部材とを有することを特徴とする。酵素と導電性部材の電子の受け渡しは、少なくとも第１のメディエータ及び第２のメディエータを介して行なわれ、更に、酵素と導電性部材の間のメディエータを介さない電子の受け渡し、並びに、第１のメディエータと導電性部材の間の第２のメディエータを介さない電子の受け渡しの一方、あるいは両方が生じているものであってもよい。
【００１９】
本発明にかかる酵素電極では、酵素の固定化に担体を使用することで、酵素を導電性部材に安定に固定化することが可能であり、また、導電性部材の実効表面積当たりの酵素担持密度を高くすることが可能である。さらに、酵素との間で高速の電子移動を行うことが可能な第１のメディエータと第１のメディエータと導電性部材間の電荷輸送を行う第２のメディエータを使用することで、酵素と高速の電子移動を行うことが可能であり、その結果、酵素電極の安定性、電流密度を向上させることができる。本発明における第１のメディエータは、第２のメディエータと比較して、酵素との間の電子移動反応速度が高いものであり、その結果、第２のメディエータのみを使用する酵素電極と比較して、高い電流密度を得ることができる。一方、本発明における第２のメディエータは、第１のメディエータと比較して電荷の輸送能が高い、かつ、または、電極との間の電子移動反応速度が高いものであり、その結果、第１のメディエータのみを使用する酵素電極と比較して高い電流密度を得ることができる。本発明における、酵素、第１のメディエータ、第２のメディエータ、担体の配合割合の最適値は、第一のメディエータの割合が酵素との間での電子移動が充分に行われる程度に高く、第二のメディエータの割合が酵素／導電性部材間の電荷輸送が充分に行われる程度に高く、担体の割合が酵素、メディエータを充分に保持できる程度に高く、かつ、酵素の担持密度を充分高く保つことを目的として、これらの相関により決定される。この例としては、酵素の重量を１として第一のメディエータの重量が０．０００１から１、より好ましくは、０．０００２から０．１、第二のメディエータの重量が０．０１から２、より好ましくは、０．３から１、また担体の重量が０．０５から３、より好ましくは、０．３から１が挙げられる。
【００２０】
図３に、本発明の酵素電極における酵素、第１及び第２のメディエータの固定状態の一例を示す。この例では、導電性部材（導電性基板）４の表面の担体からなる層に、酵素１、第１のメディエータ８及び第２のメディエータ９が包括されている。電子の流れの一例を矢印で示してある。
【００２１】
また、酵素との間で高速の電子移動を行うことが可能な第１のメディエータは、第１のメディエータと導電性部材間の電荷輸送を行う第２のメディエータ間の効率的な電子移動を確保するために、この酵素電極を陽極または負極として用いる場合に、第１のメディエータの酸化還元電位が、第２のメディエータより負の電位側であること（図４）、また、陰極または正極として用いる場合には、第１のメディエータの酸化還元電位が、第２のメディエータの酸化還元電位より正の電位側であること（図５）、が好ましい。なお、図４及び５において、Ｅで示す矢印の方向（上方）が負電位側であり、その逆方向（下方）が正電位側である。
【００２２】
本発明の好ましいひとつの形態であるセンサは、酵素電極を物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、酵素電極を作用電極として、参照電極及び対極とセットで使用して、酵素電極で（電極に固定した酵素の機能により）検知可能な電流を検知して、これらの電極が接している液体中の物質の検出に利用する構成を挙げることができる。具体例として図６に示す構成のセンサを挙げることができる。図６のセンサは、アノード（陽極）１５、白金線電極１６、また必要に応じて、銀塩化銀参照電極１７を有して構成され、それぞれの電極にはリード線１８〜２０が配線され、ポテンショスタットと接続されている。このセンサを、蓋１３で密閉可能なウォータージャケットセル１２内の電解質１４の貯溜領域に配置する。作用電極に電位を印加して定常電流を測定することで、電解質中での基質の検出を行なうことができる。なお、不活性ガス雰囲気での測定が必要な場合は、ガスチューブ２３の外部末端のガス吹き込み口２２から窒素などの不活性ガスを導入する。また、温度は、温調水流入口２４及び温調水排出口２５を利用した温度調節用の液体の供給により行うことができる。
【００２３】
本発明にかかるセンサの構成は、酵素電極での検知が可能であるものであれば特に制限されない。このセンサは、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の基質の高い選択性に加え、担体と複数のメディエータを用いた酵素電極による、高い安定性、電流密度によって、センサの繰返し、長期使用、検出装置の簡略化、測定部位の小型化が可能となる。この場合、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。このセンサは、酵素電極に用いた酵素の基質に対応する物質の検知を行うことができ、その用途の例としては、グルコースセンサ、フルクトースセンサ、ガラクト−スセンサ、アミノ酸センサ、アミンセンサ、コレステロールセンサ、アルコールセンサ、乳酸センサ、酸素センサ、過酸化水素センサ等が挙げられ、より具体的な応用例としては、血中のグルコース濃度や、乳酸濃度を測定するセンサ、果物の糖度を測定するセンサ、呼吸気中のアルコール濃度を測定するセンサ等が挙げられる。
【００２４】
本発明の好ましいひとつの形態である燃料電池は、酵素電極をアノードまたはカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。更に、積層構造とした場合に、積層方向にアノードとカソードを所定の配列に配置してもよい。代表的な構成としては、燃料となる物質を含む電解液を貯溜し得る反応槽と、反応槽中に所定の間隔で配置されたアノードとカソードとを有し、このアノード及びカソードの少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いた構成を挙げることができる。なお、この燃料電池は電解液を補充あるいは循環させるタイプや、電解液の補充や循環しないタイプとすることができる。この燃料電池は、酵素電極が使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。この際、酵素電極の触媒として用いられている酵素は、一般に電気化学の分野で用いられている、貴金属触媒（例えば白金）と比較して、高い基質選択性を有するため、一方の電極と、他方の電極における反応物質を隔離する機構を必要とせず、その結果、デバイスを簡素化することが可能となる。この燃料電池は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の高い触媒作用によって、物質を低い過電圧で酸化還元できることにより、高い駆動電圧を得ることが可能であり、担体と複数のメディエータを用いた酵素電極による、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。
【００２５】
燃料電池の一例を図７に示す。この燃料電池のセルの構成は先に図６に示したセンサでの基質測定用装置とほぼ同一であり、同一部材には同じ番号を付している。図６で示したセンサの代わりに、アノード１５とカソード２７を多孔質ポリプロピレンフィルム２６を介して積層した構成の電極ユニットを用い、チューブ２３を介して酸素ガスをセル内に導入して、燃料電池として作用させる。
【００２６】
本発明の好ましいひとつの形態である電気化学反応装置は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の基質の高い選択性、触媒能に加え電気化学反応の特徴である、反応の定量性を得ることが可能で、その結果、高選択的、高効率で定量的に制御可能であり、担体と複数のメディエータを用いた酵素電極による、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。代表的な構成としては、一対の電極と必要に応じて設けられた参照電極とを反応液を貯溜し得る反応層内に配置して、一対の電極間に電流を流して、反応液中の物質に電気化学的反応を起させて目的とする反応生成物、分解物などを得る構成を挙げることができ、一対の電極の少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いる。反応液の種類や反応の条件などにかかる装置構成は、酵素電極が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、酸化還元反応による反応生成物の取得や、目的とする分解物の取得などに利用できる。この電気化学反応装置は、酵素電極に用いた酵素の基質に対応する物質の反応を選択的に行うことができ、その用途の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクト−ス、アミノ酸、アミン、コレステロール、アルコール、乳酸、の酸化や酸素、過酸化水素の還元反応が挙げられ、より具体的な応用例としては、エタノールの存在下、コレステロールの選択的酸化、酸素の低過電圧での還元反応等が挙げられる。
【００２７】
本発明において担体は、少なくとも酵素を導電性部材に固定化するものである。例としては、（１）高分子化合物、（２）無機化合物、及び（３）有機化合物であり、共有結合性の結合部を分子内に有し、少なくとも酵素と導電性部材を結合するもの（酵素同士を結合させる機能が付加されていてもよい）、を挙げることができ、これら三種のうち少なくとも１つを用いることができる。これらの担体は、酵素を電極に固定する上で、電極の使用条件下で酵素が持つ表面電荷と反対の電荷を有していることが好ましい。この担体は、酵素を共有結合、静電的相互作用、空間的閉じ込め等により保持するものであってよく、その結果、電極上、または、電極の粘結に用いるバインダーポリマー等への物理吸着による酵素の保持方法と比較してより安定、かつ高密度に酵素を保持することが可能となる。担体用の高分子化合物の例として、導電性高分子化合物の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類、その他の高分子の例としては、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニル硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ポリリシン、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペクチン、シリコーン樹脂、セルロース、アガロース、デキストラン、キチン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ナイロンが挙げられる。担体用の無機化合物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒから選択される少なくとも１つの元素を含む金属カルコゲナイド化合物が挙げられる。有機化合物であり、共有結合性の結合部を分子内に有し、酵素と導電性部材、かつ／または、酵素と酵素を結合する担体用有機化合物の例としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基及びチオ尿素基のうちから選択される少なくとも１つの官能基を含む化合物があげられる。代表例としては、グルタルアルデヒド、 ポリエチレングリコールジグリシデルエーテル、塩化シアヌール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルー３、３'−ジチオプロピオニミデート塩酸塩、３、３'−ジチオ−ビス（サルホスクシンイミジルプロピオネート）、シスタミン、アルキルジチオール、ビフェニレンジチオール、ベンゼンジチオールが挙げられる。
【００２８】
本発明において導電性部材は、酵素、メディエータおよびそれらを固定するための担体を保持し、酵素電極の使用時には、外部回路と電気的に接続されるものである。この導電性部材は、導電性を有し、保存、測定時に充分な剛性を有し、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料であればよい。導電性部材に用いられる材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、炭素材料を挙げることができる。この金属の例としては、例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｉｒ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｖ、Ｎｂ、Ｚｒ、Ｓｎ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｍｇ、Ｐｂ、Ｓｉ、Ｗのうち少なくとも一種類の元素を含むものがあげられ、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。この導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類のうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。この金属酸化物は、他の導電性材料によって導電性を向上、もしくは、付与されていてよい。金属酸化物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒのうち、少なくとも一種類の元素を含むものがあげられる。この際の導電性材料の例としては、金属、導電性高分子、炭素材料が挙げられる。この炭素材料は、他の導電性材料によって導電性を向上、もしくは、付与されていてよい。炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。また、本発明では、導電率が、0.1 S/cm 以上 700000 S/cm 以下の導電性材料が好ましい。例えば、1 S/cm 以上 100000 S/cm 以下の材料、あるいは100 S/cm 以上 100000 S/cm 以下の材料を用いることができる。なお、S （ジーメンス）は、オームの逆数 （1/Ω）である。酵素電極に多孔質構造を用いる場合においても、上記範囲の導電性部材とすることが望ましい。
【００２９】
導電性部材は、互いに連通した多数の空隙を有し、かつこれらの空隙が直接に、または他の空隙を介して間接的に前記導電性部材の外部と連通している構造を有し、空隙内に酵素、第１及び第２のメディエータを固定できるものが好ましい。かかる導電性部材は、外部と連通する多数の空隙が内部に形成されたものであり、空隙を仕切る壁が構成材料から一体的に形成されている構造や、空隙を仕切る壁を構成する材料同士が強固に結合しているものが好ましい。このような導電性部材の構成材料としては、先に挙げた導電性の金属、高分子、金属酸化物及び炭素材料など用いることができる。この導電性部材の有する多数の空隙は、一次元、二次元、もしくは三次元的に連結したもので、これらの連結形態の２以上が混在しているものであってもよい。一次元に連結した空隙の例としては柱状の空隙、二次元に連結した空隙の例としては、網状の空隙、三次元に連結した空隙の例としては、スポンジ状、微小粒子を接合した後に生じる空隙、またそれらをテンプレートにして作成した構造材料の空隙が挙げられる．それらの空隙は、酵素が導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に大きく、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に小さい必要がある。空隙の平均径の例としては、５ｎｍから、５００μｍの範囲、より好ましくは、１０ｎｍから１０μｍが挙げられる。また、空隙を有する導電性部材の厚さは、酵素が導電性部材の深部まで均一に導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に小さく、導電性部材の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい必要があり、この空隙を有する導電性部材の厚さの例としては、１００ｎｍから１ｃｍ、より好ましくは、１μｍから５ｍｍが挙げられる。この空隙を有する導電性部材の投影面積に対する実効表面積の比は、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい必要があり、その例としては、１０倍以上、より好ましくは、１００倍以上が挙げられる。また、この空隙を有する導電性部材の気孔率は、導電性部材の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に、かつ／または、充分な酵素、担体量が導入できる程度に、かつ／または、基質の流動、拡散が充分に行われる程度に大きく、充分な機械的強度が得られる程度に小さい必要があり、その例としては、２０％以上９９％以下、より好ましくは、３０％以上９８％以下が挙げられる。また、酵素固定後の気孔率は、電解液の流動、基質の拡散が充分行われる程度に大きく、担体、酵素の高い充填率が得られる程度に小さい必要があり、その例としては、１５％以上９８％以下、より好ましくは、２５％以上９５％以下が挙げられる。
【００３０】
多数の空隙を有する金属製導電性部材の形成材料としては、発泡金属、電析金属、電解金属、焼結金属、繊維状金属、あるいは、これらの内の単数、もしくは、複数の種別に該当する材料が挙げられる。また、空隙を有する導電性高分子の製造方法の例としては、空隙となる部分を構成する鋳型としての物質を導電性高分子中に配置して所定の形状に成形した後、鋳型しての物質を除く方法；導電性高分子の前駆体中に空隙となる部分の鋳型としての物質を含有させ、前駆体を重合させて高分子とした後、鋳型としての物質を除く方法；空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子を充填して層を形成し、この層から粒子を除去する方法；空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子の前駆体を充填して層を形成し、前駆体を重合させて高分子層としてから粒子を除去する方法；など、多孔質樹脂の製造に利用されて方法を挙げることができる。
【００３１】
一方、金属酸化物からなる多数の空隙を有する導電性部材は、電析、スパッタリング、焼結、化学気相成長法（ＣＶＤ）、電解およびこれらの組合せがなどの方法により得ることができる。また、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体をからなる繊維、粒子などを所定の形状に成形してから焼結することで多数の空隙を有する導電性部材を得ることができる。
【００３２】
多孔質部材の孔径分布に関しては、導電性部材の厚み方向に、多孔質構造における空孔の孔径（あるいは多孔度）が一定の部材を用いることができる。
【００３３】
更に、以下で示すように、多孔質部材の孔径あるいは多孔度に傾斜分布をもたせてもよい。図８（Ａ）から（Ｄ）に導電性部材の構造として多孔質構造を用いる場合の例を示している。同図において、８０１は電解質層、８０２は空孔、８０３が導電性部材である。また、８０４は必要に応じて用いることのできる支持基板である。図のように、導電性部材に設けられている空孔の孔径が、電解質層側で大きく、その内側で小さくなっていることが好ましい。即ち、本発明に適用できる導電性多孔質部材は、該導電性多孔質部材の表面側における孔径は、該導電性多孔質部材の内部における孔径よりも大きいことが望ましい。両者の孔径の差は、２倍以上、より好ましくは４倍以上、更に好ましくは１０倍以上である。上限としては、例えば１０００倍以下である。孔径の異なる２つの領域間で、多孔度は同じであってもよい。より好適には、導電性部材に設けられている空孔の孔径及び多孔度がともに、電解質層側（即ち、導電性部材の外部表面側）で大きく、その内側で小さくなっていることが好ましい。
【００３４】
なお、多孔質体の孔径や多孔度は、、窒素ガス吸着測定（ＢＥＴ(Brunauer-Emmett-Teller)法）にて測定可能である。例えば、AUTOSORB-1 (Quantachrome Instruments製)により測定できる。また、部材表面の孔径を算出する場合は、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真により、いくつか（例えば50-300個程度）の孔径を測定して算出できる。
【００３５】
本発明においてメディエータは、酵素／メディエータ／導電性部材間の電子の受け渡しを促進させるものである。このメディエータは、担体、かつ／または、酵素に化学結合していてもよい。例としては、金属錯体、キノン類、複素環式化合物、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体が挙げられる。この金属錯体としては、中心金属にＯｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｉ、Ｉｒ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｗの内から少なくとも１種類の元素を含むものを用いることができる。また、この金属錯体の配位子としては、窒素、酸素、リン、硫黄、炭素原子を含有し、少なくともこれらの原子を介して中心金属と錯体形成するもの、または、シクロペンタジエニル環を骨格として有する物が挙げられる。例としては、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１、２、３−または１、２、４−トリアゾール、テトラゾール、２、２'−ビイミダゾール、ピリジン、２、２'−ビチオフェン、２、２'−ビピリジン、２、２'：６'、２''−ターピリジン、エチレンジアミン、ポルフィリン、フタロシアニン、アセチルアセトン、キノリノール、アンモニア、シアンイオン、トリフェニルホスフィンオキサイドおよびそれらの誘導体が挙げられる。キノン類の例としては、キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、ナフトキノン、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、テトラシアノキノジメタン、およびそれらの誘導体が挙げられる。複素環式化合物の例としては、フェナジン、フェノチアジン、ビオローゲン、およびそれらの誘導体が挙げられる。ニコチンアミド誘導体の例としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられる。フラビン誘導体の例としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が挙げられる。
【００３６】
本発明において酵素は、酸化還元反応を触媒する酵素であり、複数の酵素の組合せであってもよい。例としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、ＮＡＤＨ−チトクロムｂ５レダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−アドレノキシンレダクターゼ、チトクロムｂ５レダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼが挙げられる。
【００３７】
また、この酵素の基質としては、それぞれの酵素に対応する化合物が挙げられ、有機物、酸素、過酸化水素、水、硝酸イオンが挙げられる。また、この有機物の例としては、糖類、アルコール類、カルボン酸類、キノン類、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体が挙げられる。また、この糖類には、セルロース、デンプン糖の多糖も含まれていてよい。
【００３８】
本発明において担体を固定する工程においては、導電性部材に担体を均一に固定化することが重要である。この担体を固定化する工程には、酵素を固定化する工程かつ／または、メディエータを固定化する工程が同時に含まれていてよい。この担体を固定する工程の例としては、
（１）担体の溶液、または分散液に、空隙を有する導電性部材を浸漬する工程、
（２）担体の溶液、または分散液を、空隙を有する導電性部材に塗布、注入、スプレーする工程、
（３）担体の前駆体の溶液、または、分散液に空隙を有する導電性部材を浸漬、もしくは、担体の前駆体の溶液、または分散液を空隙を有する導電性部材に塗布、注入、スプレーする工程を行い、その後、前駆体の加水分解、重合、架橋反応を行うことで、固定化する工程、
などが挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例等を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００４０】
はじめに、本発明に用いる部材の調製法を記述する。
（調製例１）
市販のシリカコロイド分散液（日産化学、平均粒径１００ｎｍ）をエタノール置換し、その分散溶液中に洗浄した金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）を立て、３０℃でエタノールを蒸発させることで、シリカ球からなる多孔質膜を調製する。この工程を複数回行うことで、シリカ球からなる多孔質膜の膜厚を増大させる（膜厚１００μｍ）。２００℃で３時間加熱した後、エタノールで洗浄し、０．１Ｍの３、４−エチレンジオキシチオフェン、０．１Ｍ過塩素酸リチウムのアセトニトリル溶液中、この多孔質膜を作用極に、白金対極、銀／塩化銀参照電極を用いた三極セルで、ポテンショスタットを用いて、１．１Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）の電位で電解重合を行う。重合時間は、電解電流のプロファイルを参照して、シリカ球多孔質膜の膜厚と同程度になるよう、電解時間を調整した。電解重合後、２０％フッ化水素酸溶液中に２日間浸漬、シリカ球を除去し、導電性ポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン）からなる多数の空隙を有する導電性部材（膜厚１００μｍ）を調製する。
（調製例２）
針状のインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ、住友金属鉱山、３０−１００ｎｍ長、アスペクト比１０以上）をターピノールに分散し、エチルセルロースで粘度を調整し、ＩＴＯペーストを調製する。洗浄済の金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）にスクリーン印刷法で、ＩＴＯペーストを印刷し、４５０℃で１時間焼結し、ＩＴＯの多孔質焼結電極（膜厚１００μｍ）を調製する。さらにこの上にプラズマ化学気層合成（ＣＶＤ）を行い約１０ｎｍのＩＴＯを堆積させ、ＩＴＯからなる多数の空隙を有する導電性部材を調製する。（調製例３）
天然黒鉛粒子（粒径１１μｍ）に黒鉛粒子に対して１０ｗｔ．％のポリフッ化ビニリデンとＮ−メチル−２−ピロリドンを混合し、ポリフッ化ビニリデンを溶解させる。さらに、混練、調製した黒鉛のペーストを直径１１．３ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの膜に成型し６０℃で乾燥させた後、２４０℃で加熱、さらに２００℃で真空乾燥し、互いに結合した多数のグラファイト粒子間に多数の空隙を有する導電性部材を調製する。
（調製例４）
化学式（１）に示すＮ6-（２-アミノエチル）ＦＡＤの調製法について記述する。ＦＡＤの１０％水溶液に等モルのエチレンイミンを加え、ｐＨを６-６．５に調整し、５０℃で６時間反応させる。反応溶液を冷却し、氷浴中のエタノールに加え沈殿を回収する。回収した沈殿を、アニオン交換クロマトグラフィー、逆層高速クロマトグラフィーにかけ、精製された化学式（１）に示すＮ6-（２-アミノエチル）ＦＡＤを得る。
【００４１】
【化１】
2006058289.tif 000002
【００４２】
（調製例５）
化学式（２）に示すフェロセン誘導体の調製法を記述する。２００ｍＬのＤＭＦに、４．７ｇの６−アミノカプロン酸を溶解させ、１００ｍＬのＤＭＦに溶解させた２．１ｇのフェロセンカルボアルデヒドを加え、１００℃で１時間攪拌する。1ｇの水素化ホウ素ナトリウム飽和水溶液を加え室温でさらに１時間攪拌し、溶媒を減圧留去、ジクロロメタン／メタノール＝１０／１溶媒でシリカカラムをかけることで、化学式（２）に示すフェロセン誘導体化合物を得る。化合物の同定は、1Ｈ−ＮＭＲで行われる。
【００４３】
【化２】
2006058289.tif 000003
【００４４】
（調製例６）
化学式（３）に示すオスミウム錯体包含ポリマーの合成法を記述する。６ｍＬの１−ビニルイミダゾールに、０．５０ｇのアゾビスイソブチロニトリルを加え、アルゴン雰囲気下７０℃で２時間反応をおこなう。反応用液を空冷し、生じた沈殿物をメタノールに溶解させ、強攪拌中のアセトンに滴下し、沈殿を濾取し、ポリ−１−ビニルイミダゾールを得る。一方、１．２ｇの４，４'ージメチル−２,２'−ビピリジン、１．４ｇの六塩化オスミウム酸アンモニウムに、５ｍＬのエチレングリコールを加え窒素雰囲気下１４０℃で２４時間反応をおこなう。反応溶液を空冷した後、不純物を濾取、濾液を減圧溜去し、Ｏｓ（４，４'ジメチル−２,２'−ビピリジン）2ジクロライド塩化物塩を得る。０．１３ｇのＯｓ（４,４'ジメチル−２,２'−ビピリジン）2ジクロライド塩化物塩と０．２０ｇのポリビニルイミダゾールを、２００ｍＬのエタノールに加え、窒素雰囲気下３日間還流をおこなう。濾液を濾過した後、強攪拌中の１Ｌジエチルエーテル中に滴下、生成した沈殿物を回収、乾燥し、化学式（３）に示すオスミウム錯体ポリマーを得る。化合物の同定は、元素分析で行われる。
【００４５】
【化３】
2006058289.tif 000004
【００４６】
（調製例７）
化学式（４）に示す、含フェロセンポリマーの調製法について記述する。３．０ｍＬのトルエンに１．６ｇの１−ビニルイミダゾール、０．７１ｇの１−ビニルフェロセン、６．２ｍｇのアゾビスイソブチロニトリルを加え、アルゴン雰囲気下７０℃で２時間反応をおこなう。反応用液を空冷し、反応溶液を１Ｌのジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を濾取し、化学式（４）にしめす含フェロセンポリマーを得る。
【００４７】
【化４】
2006058289.tif 000005
【００４８】
（調製例８）
化学式（５）に示す、錯体ポリマーの合成法を記述する。１００ｇの４０％グリオキサール水溶液に氷浴中、３７０ｍＬの濃アンモニア水を滴下、４５℃で２４時間攪拌し、空冷後沈殿物を濾過、５０℃で２４時間真空乾燥し、２、２'−ビイミダゾールを得る。同定は、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー（１０％メタノール／９０％クロロホルム）で行う。１００ｍＬのＮ、Ｎ'−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の２、２'−ビイミダゾール（４．６ｇ）溶液に氷浴中、窒素雰囲気下２．７ｇの水素化ナトリウムを加え、室温で１時間攪拌後、１２．８ｇのパラトルエンスルホン酸メチルのＤＭＦ溶液５ｍＬを２０分かけて滴下、室温で４時間攪拌する。真空下、５０℃で溶媒を留去し、残留した固体を５０ｍＬヘキサンで洗浄、１６０℃で真空乾燥し、Ｎ、Ｎ'−ジメチル−２,２'−ビイミダゾールの無色透明の結晶を得る。同定は、1Ｈ−ＮＭＲで行う。１０ｇの２,２'−ビイミダゾールのＤＭＦ溶液１００ｍＬに、氷浴中、窒素雰囲気下３．３ｇの水素化ナトリウムを加え、氷浴で１時間攪拌後、ヨウ化メチル（４．６ｍＬ）を滴下、氷浴下３０分攪拌、さらに室温で１２時間攪拌する。反応溶液を３００ｍＬの酢酸エチルに注ぎ、濾過した後、溶媒を減圧、真空留去し、残留物を沸騰酢酸エチルに溶かし、濾過する。濾液を再び酢酸エチル中で煮込み、３００ｍＬのヘキサンで飽和させる。冷凍庫で１２時間静置し、結晶を成長させ、吸引濾過で回収し、酢酸エチル／ヘキサン溶媒から再結晶させ、Ｎ−メチル−２,２'−ビイミダゾールを得る。同定は、1Ｈ−ＮＭＲで行う。８０ｍＬのＤＭＦに１ｇのＮ−メチル−２,２'−ビイミダゾールを溶解させ、窒素雰囲気下０．３２ｇの水素化ナトリウムを加え、氷浴で１時間攪拌後、２．５ｇのＮ−（６−ブロモへキシル）フタルイミドと１．０ｇのヨウ化ナトリウムを徐々に加え、窒素雰囲気下、８０℃で２４時間攪拌する。室温まで冷却し、１５０ｍＬの水に注ぎ、１５０ｍＬの酢酸エチルで２度抽出し、塩化ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去を行う。中性のアルミナカラム、（酢酸エチル／ヘキサン１０−４０％）で精製し、Ｎ−メチル−Ｎ'−（６−フタルイミドへキシル）−２,２'−ビイミダゾールを得る。同定は、1Ｈ−ＮＭＲで行う。
【００４９】
２５ｍＬのエタノールに２．５ｇのＮ−メチル−Ｎ'−（６−フタルイミドへキシル）−２,２'−ビイミダゾールを溶解させ、水素化ヒドラジン０．３９ｇを加え、２時間還流、室温まで冷却し、濾過後、シリカゲルカラムにエタノールで、その後１０％アンモニアのアセトニトリル溶液で生成物を回収、減圧留去し、Ｎ−（６−アミノへキシル）−Ｎ'−メチル−２,２'−ビイミダゾールを得る。同定は、1Ｈ−ＮＭＲで行う。１．１ｇのＮ−メチル−２,２'−ビイミダゾールと１．４ｇ六塩化オスミウム酸アンモニウムを４０ｍＬのエチレングリコールに溶かし、窒素雰囲気下１４０℃で２４時間攪拌、０．８ｇのＮ−（６−アミノへキシル）−Ｎ'−メチル−２,２'−ビイミダゾールを溶解させたエチレングリコール５ｍＬを加え、さらに２４時間攪拌後、室温に冷却、濾過する。濾液を２００ｍＬの水で薄め、４０ｍＬの陰イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ（登録商標）１Ｘ４）を加え、空気中で、２４時間攪拌した。溶液を１０．２ｇの六フッ化リン酸アンモニウムの水溶液１５０ｍＬに徐々に注ぎ、沈殿物を吸引ろ過し、アセトニトリルに溶かし、六フッ化リン酸アンモニウム水溶液で再沈殿させ、水洗し、４５℃で２４時間真空乾燥し、オスミウム（ＩＩＩ）（Ｎ、Ｎ'−ジメチル−２,２'−ビイミダゾール）2（Ｎ−（６−アミノへキシル）−Ｎ'−メチル−２，２'−ビイミダゾール）六フッ化リン酸塩をえる。同定は、元素分析でおこなう。
【００５０】
２０ｇポリビニルピリジン（平均分子量１５万）、５．６ｇの６−ブロモヘキサン酸を１５０ｍＬのＤＭＦに加え、攪拌機で９０℃、２４時間攪拌、室温まで冷却し、強攪拌中の酢酸エチル１．２Ｌにゆっくりと注ぐ。溶媒をデカンテーションし、固体をメタノールに溶解させ、濾過、減圧留去で溶媒を２００ｍＬ程度に減らしてから、１Ｌのジエチルエーテル中で再沈殿を行い、５０℃で２４時間真空乾燥、さらに固体を粉砕し、４８時間乾燥し、ポリ（４−（Ｎ−（５−カルボキシペンチル）ピリジニウム）−コ−４−ビニルピリジン）を得る。０．５２ｇのポリ（４−（Ｎ−（５−カルボキシペンチル）ピリジニウム）−コ−４−ビニルピリジン）を１０ｍＬのＤＭＦに分散させ、０．１８ｇのＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）―Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）を加え、１５分間攪拌し、０．１ｍＬのＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加え、８時間攪拌し、０．８９ｇのポリ（４−（Ｎ−（５−カルボキシペンチル）ピリジニウム）−コ−４−ビニルピリジン）を加え、５分間攪拌、さらに、０．１ｍＬのＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で２４時間攪拌し、２００ｍＬの酢酸エチルに加える。沈殿を濾過、回収し、３０ｍＬのアセトニトリルに加え、４０ｍＬのＤＯＷＥＸ（登録商標）１Ｘ４、１００ｍＬの水を加え、３６時間攪拌し、ポリマーを溶解させる。吸引濾過を行った後に、５０ｍＬに濃縮し、分子量１００００カットオフフィルタ（ミリポア）で、２７５ｋＰａの窒素圧で押し出す。さらにＤＯＷＥＸ（登録商標）１Ｘ４のカラムに水溶媒で通し、水中で透析を行い、化学式（５）に示すポリマー（塩化物塩）を得る。
【００５１】
【化５】
2006058289.tif 000006
【００５２】
（調製例９）
化学式（６）に示すオスミウム錯体ポリマーの合成法を記述する。６ｍＬの１−ビニルイミダゾールに０．５ｇのアゾビスイソブチロニトリルを加え、アルゴン雰囲気下７０℃で２時間反応をおこなう。反応溶液を空冷し、生じた沈殿物をメタノールに溶解させ、強攪拌中のアセトンに滴下し、沈殿を濾取し、ポリ−１−ビニルイミダゾールを得る。０．７６ｇの２,２'：６',２''−ターピリジン、１．４２ｇの六塩化オスミウム酸アンモニウムを５ｍＬのエチレングリコールに加えアルゴン雰囲気下１時間還流をおこなう。さらに、この反応用液に０．６０ｇの４、４'ジメチル−２，２'−ビピリジンを加えさらに２４時間還流、反応溶液を空冷した後、不純物を濾取、濾液を減圧留去し、化学式（５）に示す、オスミウム（２,２'：６',２''−ターピリジン）（４，４'−ジメチル−２，２'−ビピリジン）クロライド塩化物塩を得る。０．３８ｇの（２，２'：６'，２''−ターピリジン）（４，４'ジメチル−２、２'−ビピリジン）クロライド塩化物塩と０．２ｇのポリビニルイミダゾールに２００ｍＬのエタノールを加え、窒素雰囲気下３日間還流をおこない、濾液を濾過した後、強攪拌中の１Ｌジエチルエーテル中に滴下、生成した沈殿物を回収、乾燥し、化学式６に示すオスミウム錯体を得る。化合物の同定は、元素分析で行われる。
【００５３】
【化６】
2006058289.tif 000007
【００５４】
（調製例１０）
ＦＡＤを除去した、アポグルコースオキシダーゼの調製法について記述する。グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）をグリセロールを３０％含む０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、３ｍＬ）に溶解する。溶液を０℃に冷却し、グリセロールを３０％含むｐＨ１．１の０．０２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液−硫酸溶液でｐＨ１．７に調整する。この溶液を（Ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)Ｇ−２５）カラムに、グリセロールを３０％含む０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ１．７）を溶媒として通し、２８０ｎｍの波長で検知しながら回収する。デキストラン被覆チャコールを溶液に加え、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えることで、ｐＨ７に調整、その後４℃で１時間攪拌を行う。精製した溶液を遠心分離、０．４５μｍのフィルタで濾過し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用いて透析を行い、アポグルコースオキシダーゼを得る。
（調製例１１）
ＦＡＤを除去した、アポＤ−アミノ酸オキシダーゼの調製法について記述する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ブタ腎臓）を４℃で１Ｍの臭化カリウム、３．０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む、０．１Ｍピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して、４回液を交換しながら２日間透析を行いホロＤ−アミノ酸オキシダーゼの色が消えるのを確認する。ついで、０．１Ｍピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して３回液を交換しながら２日間透析を行うことで、臭化カリウムを除きアポＤ−アミノ酸オキシダーゼを得る。
（調製例１２）
ＰＱＱ修飾ＦＡＤの調製法について記述する。１ｍＭの調製例４に記載のＮ6-（２-アミノエチル）ＦＡＤ、１０ｍＭの１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液溶液（ｐＨ７．３）に、１０ｍＭのＰＱＱを加え２時間攪拌し、限外濾過を行い過剰のＰＱＱを除くことで、ＰＱＱ修飾ＦＡＤを得る。
（調製例１３）
フェロセン修飾ＦＡＤの調製法について記述する。調製例１２のＰＱＱに代えて調製例５に記載のフェロセン誘導体を使用することで、フェロセン修飾ＦＡＤを得る。
（調製例１４）
ＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼの調製法について記述する。４ｍｇ／ｍＬの調製例１０に記述のアポグルコースオキシダーゼの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に０．２ｍｇ／ｍＬの調製例１２に記述のＰＱＱ修飾ＦＡＤを加え、２５℃で４時間、４℃で１２時間攪拌、限外濾過を行うことで過剰のＰＱＱ修飾ＦＡＤを除去し、ＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼを調製する。
（調製例１５）
フェロセン修飾グルコースオキシダーゼの調製法について記述する。調製例１４のＰＱＱ修飾ＦＡＤに代えて調製例１３に記載のフェロセン誘導体を使用することで、フェロセン修飾グルコースオキシダーゼを得る。
（調製例１６）
フェロセン修飾Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの調製法について記述する。調製例１５の調製例１０に記述のアポグルコースオキシダーゼに代えて調製例１１に記載のアポアミノ酸オキシダーゼを使用することで、フェロセン修飾Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを得る。
（調製例１７）
燃料電池に用いるカソード用酵素電極の調製法について記述する。サンプル管中で５ｍＬの水に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製例９に記載のオスミウムポリマーを溶解させ、０．２Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）１ｍＬに加え、さらに３０ｍｇ／ｍＬのラッカーゼ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）水溶液１ｍＬを加える。攪拌した後、１０ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコールジグリシデルエーテル水溶液２ｍＬを加え攪拌を行う。その後、ニッケル合金の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を１ｃｍ角に切断、洗浄、ＵＶオゾン処理を行ったものを先に用意した酵素、オスミウムポリマー溶液に浸漬し、引き上げ、デシケータ中で２日間乾燥させ、酵素電極を調製する。
【００５５】
次に、本発明の酵素電極の作成法について記述する。
（実施例１）
サンプル管中で０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム、調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼの４０ｍｇ／ｍＬ水溶液１ｍＬを調製し、７ｍｇ／ｍＬの過ヨウ酸ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え暗所で１時間攪拌する。これに１０％のポリピロールの水溶液を６ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコールジグリシデルエーテル水溶液０．４ｍＬに、０．４２ｇのヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを加えたものに、金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）を洗浄、ＵＶオゾン処理を行ったものを浸漬し、引き上げ、デシケータ中で２日間乾燥させ、酵素電極を調製する。
（実施例２）
実施例１の１０％ポリピロール溶液に代えて、１０％ポリアニリン溶液を、０．４２ｇのヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムに代えて、０．６３ｇのオクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムをそれぞれ使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例３）
サンプル管中で０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、４０ｍｇ／ｍＬの調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼの水溶液１ｍＬを調製し、７ｍｇ／ｍＬの過ヨウ酸ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え暗所で１時間攪拌する。これに１０ｍｇ／ｍＬの調製例６に示すオスミウム錯体ポリマーの水溶液を６ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコールジグリシデルエーテル０．４ｍＬを加えたものに、金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）を洗浄、ＵＶオゾン処理を行ったものを浸漬し、引き上げ、デシケータ中で２日間乾燥させ、酵素電極を調製する。
（実施例４）
サンプル管中で０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム、調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼの４０ｍｇ／ｍＬ水溶液１ｍＬを調製し、７ｍｇ／ｍＬの過ヨウ酸ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え暗所で１時間攪拌する。これに４ｍｇ／ｍＬの調製例６に記載のポリビニルイミダゾールの水溶液を６ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコールジグリシデルエーテル水溶液０．４ｍＬに、０．４２ｇのヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを加えたものに、金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）を洗浄、ＵＶオゾン処理を行ったものを浸漬し、引き上げ、デシケータ中で２日間乾燥させ、酵素電極を調製する。
（実施例５）
実施例４の０．４２ｇのヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムに代えて、０．６３ｇのオクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムを使用することで、酵素電極を調製する。
【００５６】
（実施例６）
実施例５のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、調製例１５に記載のフェロセン修飾グルコースオキシダーゼを使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例７）
実施例６のフェロセン修飾グルコースオキシダーゼに代えて、調製例１６に記載のフェロセン修飾アミノ酸オキシダーゼを使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例８）
実施例４の調製例６に記載のポリビニルイミダゾールに代えて、ポリビニルピリジン（平均分子量１５万）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例９）
実施例５の調製例６に記載のポリビニルイミダゾールの水溶液に代えて、ポリＬリシン（平均分子量１５万）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１０）
実施例３の調製例６に示すオスミウム錯体ポリマーに代えて、調製例７に記載の含フェロセンポリマーを使用することで、酵素電極を調製する。
【００５７】
（実施例１１）
実施例１の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１２）
実施例２の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１３）
実施例３の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１４）
実施例４の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１５）
実施例５の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
【００５８】
（実施例１６）
実施例６の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１７）
実施例７の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１８）
実施例８の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例１９）
実施例９の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例２０）
実施例１０の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
【００５９】
（実施例２１）
実施例３の金板に代えて、調製例１に記載の、ポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン）電極の空隙を有する導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例２２）
実施例３の金板に代えて、調製例２に記載のＩＴＯ導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例２３）
実施例３の金板に代えて、フッ素ドープ酸化スズの透明導電性ガラス（旭硝子、８Ω／ｓｑ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例２４）
実施例３の金板に代えて、調製例３に示すグラファイトの空隙を有する導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
【００６０】
（比較例１）
金板（１ｃｍ角、厚さ０．３ｍｍ、ニラコ）を、洗浄、ＵＶオゾン処理を行ったものを０．０２Ｍのシスタミン水溶液に２時間浸漬し、引き上げ、水洗をおこないシスタミン修飾部材を調製する。３ｍＭのＰＱＱ、１０ｍＭの１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液溶液に、１時間浸漬し、水洗することでＰＱＱ修飾を行う。１ｍＭの調製例４に記載のＮ6-（２-アミノエチル）ＦＡＤ、１０ｍＭの１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液溶液（ｐＨ７．３）に、先のＰＱＱ修飾電極を２時間浸漬し、水洗することでＦＡＤ修飾を行う。さらに４ｍｇ／ｍＬの調製例１０に記述のアポグルコースオキシダーゼの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に２５℃で４時間、４℃で１２時間浸漬、引き上げ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で一時間浸漬することで、酵素電極を調製する。
（比較例２）
実施例１の酵素溶液から、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを除いて酵素電極を調製する。
（比較例３）
実施例１の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで酵素電極を調製する。
（比較例４）
比較例２の１０％ポリピロール溶液に代えて、１０％ポリアニリン溶液を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例５）
比較例３の１０％ポリピロール溶液に代えて、１０％ポリアニリン溶液を、０．４２ｇのヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムに代えて、０．６３ｇのオクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムをそれぞれ使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例６）
実施例４の酵素溶液から、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを除いて酵素電極を調製する。
（比較例７）
実施例３の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例８）
実施例４の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例９）
実施例５の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１０）
実施例６の酵素溶液から、オクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムを除いて酵素電極を調製する。
【００６１】
（比較例１１）
実施例７の酵素溶液から、オクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムを除いて酵素電極を調製する。
（比較例１２）
実施例７の調製例１６に記載のフェロセン修飾アミノ酸オキシダーゼに代えて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ブタ腎臓）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１３）
実施例３の調製例６に記載のオスミウム錯体ポリマーに代えて、調製例８のオスミウム錯体ポリマーを使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１４）
実施例４のヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムに代えて、ヘキサシアノマンガン（ＩＩＩ）酸カリウムを使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１５）
比較例１３の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、調製例１５に記載のフェロセン修飾グルコースオキシダーゼを使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１６）
実施例６のオクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムに代えて、ヘキサシアノマンガン（ＩＩＩ）酸カリウムを使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１７）
比較例６の調製例６に記載のポリビニルイミダゾールに代えて、ポリビニルピリジン（平均分子量１５万）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１８）
比較例８の調製例６に記載のポリビニルイミダゾールに代えて、ポリビニルピリジン（平均分子量１５万）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例１９）
実施例９の酵素溶液から、オクタシアノタングステン（ＩＶ）酸カリウムを除いて酵素電極を調製する。
（比較例２０）
実施例９の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで、酵素電極を調製する。
【００６２】
（比較例２１）
実施例１０の調製例１４に記載のＰＱＱ修飾グルコースオキシダーゼに代えて、グルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２２）
比較例２の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２３）
比較例３の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２４）
比較例４の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２５）
比較例５の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２６）
比較例６の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２７）
比較例７の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２８）
比較例８の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例２９）
比較例９の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３０）
比較例１０の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
【００６３】
（比較例３１）
比較例１１の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３２）
比較例１２の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３３）
比較例１３の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３４）
比較例１４の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３５）
比較例１５の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３６）
比較例１６の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３７）
比較例１７の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３８）
比較例１８の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例３９）
比較例１９の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４０）
比較例２０の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
【００６４】
（比較例４１）
比較例２１の金板に代えて、ニッケル合金製の発泡金属（三菱マテリアル、含有元素Ｎｉ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｂ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｃ、厚み０．５ｍｍ、金めっき厚０．５μｍ、空孔径５０μｍ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４２）
実施例６の金板に代えて、調製例１に記載の、ポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン）電極の空隙を有する導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４３）
実施例７の金板に代えて、調製例１に記載の、ポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン）電極の空隙を有する導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４４）
実施例６の金板に代えて、調製例２に記載のＩＴＯ導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４５）
実施例７の金板に代えて、調製例２に記載のＩＴＯ導電性部材を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４６）
実施例６の金板に代えて、フッ素ドープ酸化スズの透明導電性ガラス（旭硝子、８Ω／ｓｑ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４７）
実施例７の金板に代えて、フッ素ドープ酸化スズの透明導電性ガラス（旭硝子、８Ω／ｓｑ）を使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４８）
実施例６の金板に代えて、調製例３に示すグラファイトの空隙を有する導電性部材使用することで、酵素電極を調製する。
（比較例４９）
実施例７の金板に代えて、調製例３に示すグラファイトの空隙を有する導電性部材使用することで、酵素電極を調製する。
（実施例２５）
実施例１から２４、比較例１から４９に記載の酵素電極を使用して、センサを作成する。酵素電極にリードを取り付けたものを作用電極に、銀塩化銀電極を参照電極に、白金線を対極とした三極セル（図６）を使用し、電解質として、グルコースオキシダーゼを使用する酵素電極では、１５ｍＭのグルコース、０．１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用、一方、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使用する酵素電極では、１５ｍＭのＤ−アラニンを含む０．１Ｍのピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を使用する。測定は、それぞれの電極を、ポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）に接続し、窒素雰囲気下、作用電極に０．５Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加した際の定常電流を記録する。容器には、ウォータージャケットセルを使用し、測定温度は、恒温槽によって３７℃にたもたれる。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2006058289.tif 000008
【００６６】
【表２】
2006058289.tif 000009
【００６７】
【表３】
2006058289.tif 000010
【００６８】
実施例１から２４に記載の、酵素と電子の受け渡しを行うための第１のメディエータと、第１のメディエータと電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを用いた酵素電極を用いたセンサは、いずれも対応する導電性部材、担体、酵素を用いた酵素電極よりも高い電流密度を示す。これは、第１のメディエータの導入により、酵素／メディエータ間の電子移動速度が向上し、かつ、包括固定化を行うことにより導電性部材に固定化された酵素の密度が向上したためであると考えられる。一方、比較例１３−１６の酵素電極で使用した、第２のメディエータの酸化還元電位は、文献値よりそれぞれ、−０．１９Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、実施例１３，１５）、−１．０２Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、実施例１４，１６）であり、それぞれ対応する第１のメディエータの電位（最も負のものでー０．１４ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）よりも負に位置するため、メディエータ１／メディエータ２間の電子移動が行われず、低い電流密度を示すものと考えられる。このことから、酵素と電子の受け渡しを行うための第１のメディエータと、第１のメディエータと電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを用いた酵素電極の導入により、センサを高感度化可能なことが確認される。
【００６９】
（実施例２６）
実施例１から２４、比較例１から４９に記載の酵素電極を使用して、燃料電池を作成する。酵素電極にリードを取り付けたものを作用電極に、調製例１７に記載の酵素電極を対極とし、両電極間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）を挟んだ二極セル構成（図７）で、電解質として、０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、アノード燃料として、グルコースオキシダーゼを使用する酵素電極を用いるセルでは、１５ｍＭのグルコースを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使用する酵素電極を用いるセルでは、１５ｍＭのＤ−アラニン、カソード燃料として、飽和の酸素を用いて測定を行う。測定は、それぞれの電極を、ポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで１ｍＶ／秒の速度で電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定する。容器には、ウォータージャケットセルを使用し、測定温度は、恒温槽によって３７℃にたもたれる。結果を表２に示す。
【００７０】
【表４】
2006058289.tif 000011
【００７１】
【表５】
2006058289.tif 000012
【００７２】
【表６】
2006058289.tif 000013
【００７３】
実施例１から２４に記載の酵素と電子の受け渡しを行うための第１のメディエータと、第１のメディエータと電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを用いた酵素電極を用いた燃料電池は、いずれも対応する導電性部材、担体、酵素を用いた酵素電極よりも高い短絡電流密度を示す。これは、第１のメディエータの導入により、酵素／メディエータ間の電子移動速度が向上し、かつ、包括固定化を行うことにより導電性部材に固定化された酵素の密度が向上したためであると考えられる。一方、比較例１３−１６の酵素電極で使用した、第２のメディエータの酸化還元電位は、文献値よりそれぞれ、−０．１９Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、比較例１３，１５）、−１．０２Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、比較例１４，１６）であり、それぞれ対応するメディエータの電位（最も負のものでー０．１４ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）よりも負に位置するため、メディエータ１／メディエータ２間の電子移動が行われず、低い電流密度を示すものと考えられる。最大出力に関しては、複数種のメディエータを使用することで、電圧のロスが生じるため、一部の実施例に記載の酵素電極を用いた燃料電池においては、対応する導電性部材、担体、酵素を用いた比較例に記載の酵素電極を用いた燃料電池よりも低い出力を示すものもある。しかし、全体的には、実施例に記載の酵素電極を用いた燃料電池においては、対応する導電性部材、担体、酵素を用いた比較例に記載の酵素電極を用いた燃料電池よりも高い出力を示し、このことから、酵素と電子の受け渡しを行うための第１のメディエータと、第１のメディエータと電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを用いたの導入により、燃料電池を高出力化可能なことが確認される。
【００７４】
（実施例２７）
実施例１から２４、比較例１から４９に記載の酵素電極を使用して、電気化学反応装置を作成する．酵素電極を作用電極に、銀塩化銀電極を参照電極に、白金線を対極とした三極セル（図６）を使用し、０．１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＤ−アラニンを含む電解液を使用し、ウォータージャケットセル中窒素雰囲気下０．４ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。結果を表３に示す。
【００７５】
【表７】
2006058289.tif 000014
【００７６】
【表８】
2006058289.tif 000015
【００７７】
【表９】
2006058289.tif 000016
【００７８】
反応電解液からは、比較例１３−１６の酵素電極を使用した電気化学反応装置を除き、グルコースを基質とする酵素を使用する酵素電極を用いた反応装置の反応液からは、グルコノラクトンが検出され、ピルビン酸は検出されず、Ｄ−アラニンを基質とする酵素を使用する酵素電極を用いた反応装置の反応液からはピルビン酸が検出され、グルコノラクトンは検出されず、いずれの酵素電極を用いた反応装置においても、基質選択的に反応が進行していることがわかる。一方、比較例１３−１６で使用した、第２のメディエータの酸化還元電位は、文献値よりそれぞれ、−０．１９Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、比較例１３，１５）、−１．０２Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、比較例１４，１６）であり、それぞれ対応するメディエータの電位（最も負のものでー０．１４ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）よりも負に位置するため、メディエータ１／２間の電子移動が行われず、低い電荷量を示すものと考えられる。このことから、酵素と電子の受け渡しを行うための第１のメディエータと、第１のメディエータと電子の受け渡しを行うための第２のメディエータを用いたの導入により、電気化学反応装置における反応を高速化を高感度化可能なことが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】包括法の酵素電極の概念図である。
【図２】共有結合法の酵素電極の概念図である。
【図３】本発明の酵素電極の概念図である。
【図４】本発明のメディエータの電位関係の概念図（陽極または負極）である。
【図５】本発明のメディエータの電位関係の概念図（陰極または正極）である。
【図６】三極セルの説明図である。
【図７】二極セルの説明図である。
【図８】本発明に適用できる多孔質状の導電性部材の例である。
【符号の説明】
【００８０】
１  酵素
２  メディエータ
３  担体
４  導電性部材
５  電荷の流れ
６  メディエータ
７  担体
８  第１のメディエータ
９  第２のメディエータ
１０  電子の流れ
１１  電位（矢印の向きが負）
１２  ウォータージャケットセル
１３  ウォータージャケットセルのフタ
１４  電解液
１５  アノード（陽極、負極）
１６  白金線電極
１７  銀塩化銀参照電極
１８  アノードリード
１９  カソードリード
２０  参照電極リード
２１  ポテンショスタット
２２  ガス吹込口
２３  ガスチューブ
２４  温調水流入口
２５  温調水排出口
２６  多孔質ポリプロピレンフィルム
２７  カソード
８０１  電解質層
８０２  空孔
８０３  導電性部材
８０４  支持基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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