(57)【要約】      （修正有）【課題】育種に時間が長く掛からなく、花粉の飛散による自然界への遺伝子の伝播の問題のないポプラを得るためのポプラ葉緑体形質転換方法を提供する。【解決手段】少なくとも１５００ｂｐの塩基配列を有する、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）で示される塩基配列を含むＤＮＡを有することを特徴とするヤナギ目植物の葉緑体形質転換用ベクター；（ａ）ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの遺伝子から選択される少なくとも２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡの塩基配列；（ｂ）上記非コード領域と、当該非コード領域の５’及び３’末端から上記２種類の構造遺伝子側にそれぞれ少なくとも５０ｂｐを有する当該構造遺伝子の部分配列とを有する塩基配列；（ｃ）上記（ａ)または、（ｂ）の塩基配列と相補的な配列；又は（ｄ）上記（ａ）または(ｂ）の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を示す塩基配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１５００ｂｐの塩基配列を有する、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）で示される塩基配列を含むＤＮＡを有することを特徴とするヤナギ目植物の葉緑体形質転換用ベクター；
（ａ）ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの遺伝子から選択される少なくとも２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡの塩基配列；
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と相補的な配列；
（ｃ）上記（ａ）の塩基配列と少なくとも５０％の相同性を示す塩基配列；
（ｄ）上記非コード領域と、当該非コード領域の５’及び３’末端から上記２種類の構造遺伝子側にそれぞれ少なくとも５０ｂｐを有する当該構造遺伝子の部分配列とを有する塩基配列；
（ｅ）上記（ｄ）の塩基配列と相補的な配列；又は
（ｆ）上記（ｄ）の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を示す塩基配列。
【請求項２】
２種類の構造遺伝子に挟まれた非コード領域のＤＮＡの塩基配列、該塩基配列と相補的な配列又は非コード領域のＤＮＡの塩基配列と少なくとも５０％の相同性を示す塩基配列の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも５０ｂｐ離れた位置に、さらに、被導入有用遺伝子含むＤＮＡが挿入されていることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
構造遺伝子が、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードする遺伝子、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））遺伝子、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））遺伝子、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））遺伝子、ｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））遺伝子、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））遺伝子及び３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子から選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
２種類の構造遺伝子が、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットをコードする遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニット遺伝子とが非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする請求項４に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１の第６６３番目から第２６７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されていることを特徴とするヤナギ目植物。
【請求項７】
ヤナギ目植物がポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）であることを特徴とする請求項６に記載の植物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターを、ヤナギ目植物の葉細胞に導入することを特徴とするヤナギ目植物葉緑体の形質転換方法。
【請求項９】
ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする請求項８に記載の形質転換方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターを、ヤナギ目植物の葉細胞に導入し、前記ヤナギ目植物の葉細胞をカルス誘導培地で培養してカルスを得て、カルスを再分化誘導培地で培養して再分化することを特徴とする形質転換植物体の製造方法。
【請求項１１】
カルス誘導培地にゲランガムが含有され、再分化誘導培地に寒天が含有されていることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポプラ葉緑体ゲノムとの相同組み換えに用いるポプラ葉緑体ゲノム由来の遺伝子を含む葉緑体形質転換用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
植林に適した樹木の作出は交配による古典的育種法が主流であるが、この方法は育種に長い時間がかかり全く新規な外来遺伝子の導入が出来ない。そこで迅速に新規な遺伝子を導入できる技術の開発が望まれてきた。樹木の核ゲノムに遺伝子導入した形質転換樹木も作出されているが花粉による導入遺伝子の拡散が心配される等の課題点が残されていた。そのような中、植物葉緑体形質転換方法がＭａｌｉｇａらによってタバコで実用化された（非特許文献1参照。）。
高等植物の葉緑体は、成葉１細胞あたり１００個程度存在し、葉緑体１個あたり１００コピーの葉緑体ゲノム遺伝子が存在する（非特許文献２参照。）。
このことは、もし１コピーの外来遺伝子を葉緑体ゲノムに挿入した場合、形質転換体においては細胞あたり１万コピー存在することになり、コピー数の多さから導入遺伝子の高発現が期待できる（非特許文献３参照。）。
【０００３】
さらに、葉緑体形質転換は、相同組み換えを利用するため、これまで行われてきた植物核ゲノムへの形質転換と比較して核への挿入時に見られる位置効果（形質転換植物における外来導入遺伝子発現レベルのばらつき）がおこらず、安定した遺伝子発現が行われる。また、葉緑体ゲノムは母性遺伝をするため、花粉を介した導入遺伝子の水平伝播の可能性が低い等、葉緑体への遺伝子導入は利点が多いと考えられている。
また、その他に葉緑体が大量のタンパク質を生産、蓄積する能力を有することや葉緑体のポリシストロニックな制御を活かした多重遺伝子発現が可能なことも葉緑体形質転換方法の特徴となっている。
また、葉緑体は光合成の場であることから葉緑体は光合成能力の向上等を行うのに有用な系として注目されている。これまでに報告されている植物葉緑体ゲノムへ遺伝子が導入された例として、先に開発された上記タバコに続き、ポテト・トマト等草本類の例が知られている。しかしながら、樹木においては葉緑体形質転換方法に関する報告が全く見られない。
【非特許文献１】マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）他２名、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９０年、第８７巻、ｐ．８５２６−８５３０
【非特許文献２】ベンディッヒ・エー・ジェイ（Ｂｅｎｄｉｃｈ，Ａ．Ｊ．）、バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）、１９８７年、第６巻、ｐ．２７９−２８２
【非特許文献３】マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第１１巻、ｐ．１０１−１０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、育種に時間が長くかからず、且つ花粉飛散による自然界への遺伝子伝播の問題がないポプラ等のヤナギ目植物を得るためのヤナギ目植物葉緑体形質転換用ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意研究した結果、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉緑体ゲノムＤＮＡ、例えばＲｕｂｉｓｃｏ大サブユニット（以下、ｒｂｃＬと略記する。）遺伝子及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのベータサブユニット（以下、ａｃｃＤと略記する。）遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡを含有するベクターが、ポプラ等のヤナギ目植物葉緑体ゲノムとの相同組み換えによってポプラ等のヤナギ目植物の葉緑体に挿入され得ることを見出した。さらに、本発明者らは研究をすすめ、前記ベクターには例えば光合成に関与する酵素をコードする被導入有用遺伝子等を挿入することができることを知見した。そのようなベクターによって、形質転換されたヤナギ目植物の生育が早められる等、上記課題を解決し得ることを見出した。本発明者らは、これら知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］  少なくとも１５００ｂｐの塩基配列を有する、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）で示される塩基配列を含むＤＮＡを有することを特徴とするヤナギ目植物の葉緑体形質転換用ベクター；
（ａ）ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの遺伝子から選択される少なくとも２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡの塩基配列；
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と相補的な配列；
（ｃ）上記（ａ）の塩基配列と少なくとも５０％の相同性を示す塩基配列；
（ｄ）上記非コード領域と、当該非コード領域の５’及び３’末端から上記２種類の構造遺伝子側にそれぞれ少なくとも５０ｂｐを有する当該構造遺伝子の部分配列とを有する塩基配列；
（ｅ）上記（ｄ）の塩基配列と相補的な配列；又は
（ｆ）上記（ｄ）の塩基配列と少なくとも５０％以上の相同性を示す塩基配列、
［２］  ２種類の構造遺伝子に挟まれた非コード領域のＤＮＡの塩基配列、該塩基配列と相補的な配列又は非コード領域のＤＮＡの塩基配列と少なくとも５０％の相同性を示す塩基配列の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも５０ｂｐ離れた位置に、さらに、被導入有用遺伝子含むＤＮＡが挿入されていることを特徴とする前記［１］に記載のベクター、
［３］  構造遺伝子が、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードする遺伝子、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））遺伝子、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））遺伝子、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））遺伝子、ｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））遺伝子、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））遺伝子及び３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子から選択される遺伝子であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載のベクター、
［４］  ２種類の構造遺伝子が、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットをコードする遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードする遺伝子であることを特徴とする前記［３］に記載のベクター、
［５］  Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニット遺伝子とが非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする前記［４］に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１の第６６３番目から第２６７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
［６］  前記［４］〜［５］のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されていることを特徴とするヤナギ目植物、
［７］  ヤナギ目植物がポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）であることを特徴とする前記［６］に記載の植物、
［８］  前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターを、ヤナギ目植物の葉細胞に導入することを特徴とするヤナギ目植物葉緑体の形質転換方法、
［９］  ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする前記［８］に記載の形質転換方法、
［１０］  前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターを、ヤナギ目植物の葉細胞に導入し、前記ヤナギ目植物の葉細胞をカルス誘導培地で培養してカルスを得て、カルスを再分化誘導培地で培養して再分化することを特徴とする形質転換植物体の製造方法、及び
［１１］  カルス誘導培地にゲランガムが含有され、再分化誘導培地に寒天が含有されていることを特徴とする前記［１０］に記載の形質転換植物体の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の形質転換されたヤナギ目植物、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）は、導入された外来遺伝子の機能の種類に応じて生育が早く、製紙原料等を大量生産できる早生樹木資源として最適である。すなわち、ヤナギ目植物、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）は、生育が早く、その産業的植林方法が確立されているので、本発明のベクターにより形質転換されたヤナギ目植物、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）は、野生株よりもさらに生育を早められる。その結果これまでよりもより早く、低コストで木質資源の生産システムの構築が可能となる。
本発明の形質転換植物の場合は、被導入遺伝子が核ゲノムにではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子の花粉による拡散の恐れがない。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界へ悪影響を与える等の環境汚染の心配がない。
本発明の形質転換方法によれば、機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、例えば二酸化炭素固定に重要な役目を果たす光合成に関与する酵素をコードする遺伝子等を植物に導入できるので、該遺伝子を発現するヤナギ目植物は、大気中の二酸化炭素の取り込み効率を高めることができ、よって大気中の二酸化炭素濃度を低減できるので、該植物の栽培は、地球温暖化の抑制にも貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、「葉緑体」とは、ヤナギ目植物の、葉その他の緑色組織にある主に光合成を行う細胞小器官をいう。
また、本発明において「遺伝子」又は「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの全てが含まれる。
【０００９】
「少なくとも１５００ｂｐの塩基配列」とは、本発明の形質転換用ベクターに挿入されるＤＮＡ塩基配列のうち、ヤナギ目植物の葉緑体ゲノムとの相同的組換えに必要な塩基の長さの最小単位をいう。
【００１０】
例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）等のポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡは、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）を、例えば新生化学実験講座第２巻  核酸１分離精製（日本生化学会編）東京化学同人、ｐｐ．２９−３２（１９９１）に記載の方法やＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法等に従って抽出し、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９７７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第７４巻，ｐ．５４６３）等よって、その塩基配列を決定することができる。このようにして決定されたヤナギ目植物の葉緑体ゲノムＤＮＡ、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉緑体ゲノムＤＮＡは、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬに登録（登録番号：ＡＰ００８９５６）されている。
【００１１】
本発明における「構造遺伝子」とは、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡのうち、タンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードしている領域をいう。構造遺伝子としては、例えば光合成にかかわる酵素であるＲｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードする遺伝子（以下、ｒｂｃＬ遺伝子という。）、及び植物において脂肪酸合成に関与している酵素のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｃｃＤ遺伝子という。）等が好ましく挙げられる。また、ｒｂｃＬ遺伝子やａｃｃＤ遺伝子以外のポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの構造遺伝子としては、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））、ｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））又は３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子等が挙げられる。
なお、上記ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの構造遺伝子は、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡの構造遺伝子の塩基配列とポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの塩基配列との相同性を利用して決定され得る。
【００１２】
「非コード領域」とは、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ上でのタンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードしている領域以外の領域をいう。非コード領域には、遺伝子発現調節領域（例えばプロモーター、ターミネーター等）などを含む。
【００１３】
ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの遺伝子から選択される少なくとも２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域（以下、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域という。）のＤＮＡとしては、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭとがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡ、ｔｒｎＩとｔｒｎＡとがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡ、３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶとがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡ等を好ましく挙げることができる。とりわけ好ましくは、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡである。
【００１４】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターに使用される、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域のＤＮＡの塩基配列は、その全配列を有していなくてもよい。すなわち部分配列でもよい。部分配列は、当該選択領域に含まれる非コード領域へ挿入される被有用導入遺伝子（以下、被導入遺伝子という。）の挿入位置から各構造遺伝子側にそれぞれ約７５０〜１５００程度の塩基対の長さを有し、葉緑体ゲノムＤＮＡの遺伝子から選択された２種類の各構造遺伝子とそれぞれ相同組換えし得る配列を有すればよい。
さらに、上記部分配列は、２種類の構造遺伝子に挟まれる非コード領域と、当該非コード領域の５’及び３’末端から２種類の構造遺伝子側に、それぞれ少なくとも約５０ｂｐ（好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、さらに好ましくは約２００〜８００ｂｐ）を有する当該構造遺伝子の部分配列とを含む塩基配列（以下、選択領域の部分配列という。）を有するＤＮＡであれば好ましく用いることができる。
【００１５】
本発明において「相補的な配列」とは、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡにおいて、そのポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列又は選択領域の部分配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１６】
本発明において「相同性を示す配列」とは、例えばポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列又は選択領域の部分配列との一致の度合いが少なくとも約５０％、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、とりわけ好ましくは約９５％以上である塩基配列、又は完全な相補性はないが、安定な構造をとるのに十分な塩基対が形成される塩基配列をいう。
このような配列としては、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列又は選択領域の部分配列中の１個又は複数個の塩基、例えば、１〜約１００個の塩基が欠失されるか、又は別の塩基に置換されるか、又は１〜約１００個の別の塩基が付加されるかして改変されたＤＮＡが、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列又は選択領域の部分配列と上記相同性を示す、約１５００ｂｐ以上、好ましくは約１５００〜３０００ｂｐ程度の塩基配列を有する配列であれば、好ましく用いることができる。
【００１７】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、２種類の遺伝子に挟まれた非コード領域のＤＮＡの塩基配列、該塩基配列と相補的な配列又は非コード領域のＤＮＡの塩基配列と少なくとも約５０％の相同性を示す塩基配列の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐ（好ましくは１００〜１０００ｂｐ、より好ましくは約２００〜５００ｂｐ）離れた位置に、さらに被導入遺伝子を含むＤＮＡが挿入される。
【００１８】
被導入遺伝子としては、その種類は特に限定されず、ヤナギ目植物固有の遺伝子でも、また外来遺伝子でもよい。具体的な被導入遺伝子としては、例えば光合成に関与する酵素（例．フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、トランスケトラーゼ等）をコードする遺伝子；植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例．カロテノイド生合成酵素等）をコードする遺伝子；病虫害耐性タンパク質（例．バチルス・チューリンゲス毒素等）をコードする遺伝子；又は除草剤耐性タンパク質（例．５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等）をコードする遺伝子等が挙げられる。
また上記被導入遺伝子としては、例えば薬理活性を有する医療用タンパク質（例．インスリン、インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ヒトソマトスタチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター等）をコードする遺伝子又は工業用材料等として有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素（例．セルラーゼ、ニトリルヒドラターゼ等）をコードする遺伝子等も挙げられる。
さらに、上記被導入遺伝子としては、ファイトレメディエーションのための例えば有害重金属イオンと結合するメタロチオネインをコードするメタロチオネイン遺伝子等や実験的に有用な緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）をコードする遺伝子（ｇｆｐ）等も挙げることができる。
【００１９】
被導入遺伝子を含むＤＮＡが葉緑体ゲノム中に導入される位置は、例えばポプラ葉緑体ゲノムのｔｒｎＧとｔｒｎｆＭの間、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間、ｔｒｎＩとｔｒｎＡの間、３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶの間の非コード領域であり、それぞれの構造遺伝子から充分な距離を置いた非コード領域が望ましい。前記充分な距離とは、構造遺伝子末端から少なくとも約５０ｂｐ以上、好ましくは約１００〜１０００ｂｐ程度、より好ましくは約２００〜５００ｂｐ程度である。
【００２０】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、被導入遺伝子を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に、リボゾーム結合部位を挿入してもよい。該導入遺伝子を含むＤＮＡの上流にリボソーム結合部位を置くことにより、被導入遺伝子に基づくタンパク質を高発現させることができる。該リボゾーム結合部位は被導入遺伝子の翻訳開始点に連続して上流にあってもよいが、翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることが好ましく、約９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの略称であり、約４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５'−ＡＧＧＡＧＧＴ−３’の一部又は全部である。
【００２１】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、被導入遺伝子を含むＤＮＡの５’側上流に植物細胞由来のプロモーターを挿入することが好ましい。該プロモーターとしては、例えば、ｐｓｂＡプロモーター、ｒｒｎプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓｂＤプロモーター、ａｔｐＢプロモーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノム由来のプロモーターが好ましく、ポプラ葉緑体ゲノム由来のプロモーターがより好ましい。なお、上記リボゾーム結合部位を、被導入遺伝子を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に挿入する場合には、該リボゾーム結合部位のさらに上流に前記プロモーターを挿入するのがよい。この場合、該プロモーターは、リボゾーム結合部位の上流であれば、リボゾーム結合部位に連続してもよく、約１〜３０ｂｐ程度上流にあってもよい。
【００２２】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、被導入遺伝子を含むＤＮＡの３’側下流に植物由来のターミネーターを挿入することが好ましい。該ターミネーターは、被導入遺伝子を含むＤＮＡの下流であれば、該被導入遺伝子に連続してもよく、約１〜３０ｂｐ程度下流にあってもよい。該ターミネーターとしては、例えばｐｓｂＡターミネーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノム由来のターミネーターが好ましく、ポプラ葉緑体ゲノム由来のターミネーターがより好ましい。
【００２３】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターが、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種の薬剤耐性遺伝子（以下、ａａｄＡと略記する。）等が挙げられる。より具体的には、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、該ａａｄＡの上流及び下流には、それぞれ該ａａｄＡを発現させるためのプロモーター（以下、ａａｄＡプロモーターと略記する。）及び該遺伝子のターミネーター（以下、ａａｄＡターミネーターと略記する。）を配することが好ましい。該ａａｄＡプロモーター及びａａｄＡターミネーターとして、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。ａａｄＡプロモーター／ａａｄＡ／ａａｄＡターミネーターをａａｄＡカセットということもある。
【００２４】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列もしくは選択領域の部分配列と同じ配列又は相補的配列或いは相同性を有する配列を有するＤＮＡを含有するので、被導入遺伝子が、相同組換えによりヤナギ目植物の葉緑体に組み込まれやすくなるという利点がある。
【００２５】
以下にポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域として、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域を選択し、その選択領域の部分を使用した本発明の葉緑体形質転換用ベクターの作製方法につき、説明する。
【００２６】
ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域のＤＮＡとしては、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列（配列表の配列番号１で示される塩基配列）を有するＤＮＡ等が挙げられる。この配列番号１で示される塩基配列のうち第１番目から１４２８番目の塩基配列がｒｂｃＬ遺伝子に、第２０７２番目から第３５６８番目の塩基配列がａｃｃＤ遺伝子に相当する。非コード領域は、該配列番号１の第１４２９番目から第２０７１番目の塩基配列が相当する。
【００２７】
上記で選択したポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域の当該選択領域の部分配列としては、配列番号１の第１４２９番目から第２０７１番目（非コード領域）と、第１３７９番目から第１４２８番目（非コード領域の５’末端からｒｂｃＬ遺伝子側へ５０ｂｐ；ｒｂｃＬ遺伝子の部分配列）及び第２０７２番目から第２１２１番目（非コード領域の３’末端からａｃｃＤ遺伝子側へ５０ｂｐ；ａｃｃＤ遺伝子の部分配列）を少なくとも含む塩基配列（以下、配列番号１の部分配列という。）が挙げられる。好ましい配列番号１の部分配列としては、例えば配列表の配列番号１の第６６３番目から第２６７９番目の塩基配列等が挙げられる。
【００２８】
また、前記配列番号１で示される塩基配列又は配列番号１の部分配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も、本発明に用いられるＤＮＡである。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、配列番号１に示すＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法又はプラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号１で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳ等により計算される。
【００２９】
上記ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列（例えば配列番号１で示される塩基配列）又は選択領域の部分配列（例えば配列番号１の部分配列）をもつＤＮＡへの上記被導入遺伝子を含むＤＮＡを挿入する方法は、例えば以下の方法により行なうことができる。
（１）まず、被導入遺伝子を挿入する部位（例えば、非コード領域内で構造遺伝子末端から少なくとも５０ｂｐの位置）で、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列又は選択領域の部分配列を２分割した塩基配列をもつＤＮＡを調製する。該調製は、２分割したそれぞれの配列を例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等で増幅する。具体的には、例えば配列表の配列番号１の塩基配列をもつＤＮＡにおいて、例えば該塩基配列の第１６５８番目と第１６５９番目の間に被導入遺伝子を挿入する場合、配列番号１の第１番目から第１３７９番目におけるいずれか任意の位置の塩基から１６５８番目の塩基までの配列からなるＤＮＡ断片、及び第１６５９番目の塩基から、第２１２１番目から第３６５８番目におけるいずれか任意の位置の塩基までの配列からなるＤＮＡを、ＰＣＲ法でそれぞれ増幅する。なお、２種類のＤＮＡ断片の両端には、制限酵素（例えばＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ等）認識部位を有するよう特定の配列を付加することが好ましい。該制限酵素認識部位の配列は、本発明の葉緑体形質転換用ベクターの基となる下記する例えば商業的に入手可能なベクターが有するマルチクローニングサイトに存在する複数の制限酵素サイトのうち、特定の制限酵素サイトと粘着末端を生じる制限酵素の組み合わせや、平滑末端を生じる制限酵素の組み合わせ等となるように構築され得る。
（２）次いで、増幅した上記（１）の２種類のＤＮＡ断片をそれぞれ、例えば商業的に入手可能なベクターのマルチクローニングサイトに存在する複数の制限酵素サイトの異なる制限酵素サイトに挿入する。前記挿入は、２種類のＤＮＡ断片が、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ選択領域の塩基配列と同じ順序となるように実施するのがよい。
【００３０】
商業的に入手可能なベクター（以下、単にベクターという。）としては、複数種の制限酵素認識配列（マルチクローニングサイト）を有するものが好ましく、例えば、細菌性のものではｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋、Ｓｕｐｅｒｃｏｓ  Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はｐＣＣ１ＢＡＣ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）；及び真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）又はｐＹＡＣ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等が挙げられる。また、本発明におけるベクターとして、特開２００２−２７２４７６号公報に記載のプラスミド等を利用することもできる。
【００３１】
上記マルチクローニングサイトは、複数（約２〜１０）の制限酵素部位（以下、制限酵素サイトともいう。）を有することが好ましい。制限酵素サイトとしては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイト又はＳａｃＩサイト等が挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ又はＳａｃＩで切断され得る。
【００３２】
マルチクローニングサイトへの挿入は、該サイトに存在する特定の制限酵素サイトを特定の制限酵素によって切断し、その切断部位にＤＮＡ断片の両端に付加された制限酵素サイトを利用して２種類のＤＮＡ断片をそれぞれ挿入する。
【００３３】
（３）同様の手段により前記マルチクローニングサイトの任意の制限酵素部位に被導入遺伝子及びａａｄＡカセット等を含むＤＮＡ等を挿入できる。
このようにして作製された本発明の葉緑体形質転換用ベクターの一実施態様を模式図として図１に示す。
【００３４】
このようにして作製された葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、ヤナギ目植物細胞が好ましく、ヤナギ科植物葉細胞がより好ましく、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉細胞がさらに好ましい。本発明の葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。パーティクルガン法は、ベクターを金又はタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該ベクターの付着した粒子を火薬又は高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００３５】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００３６】
ベクターが導入されたヤナギ目植物の葉細胞、例えばポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉細胞は、まずカルス誘導培地で培養してカルス化し、次いで得られたカルスを再分化誘導培地で培養することにより再分化して植物体とすることができる。カルス誘導培地又は再分化誘導培地の基礎培地としては、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）等が挙げられる。基礎培地としては特にＭＳ培地が好ましい。
【００３７】
カルス誘導培地又は再分化誘導培地には、培地を固めるための支持体等を添加するのがよい。支持体としては、例えば寒天、ゲランガム又はペーパーブリッジ等が挙げられるが、カルス誘導培地においては、ゲランガムが好ましく、再分化誘導培地においては寒天が好ましい。
支持体の濃度は、培地のｐＨ等により異なるが、例えばゲランガムの場合は約０．１〜０．４重量％程度、寒天の場合は約０．８〜１．５重量％程度が好ましい。
【００３８】
前記基礎培地には、所望により植物ホルモンを添加することができる。植物ホルモンとしては、オーキシン（例．ナフタレン酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等）、サイトカイニン（例．カイネチン，ゼアチン、ベンジルアデニン、イソペンテニルアデニン、４−ピリジルフェニル尿素等）などが挙げられる。オーキシン及びサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシン及びサイトカイニンにより異なるが、約０．０１〜１０μＭ、好ましくは約０．１〜２μＭとなるよう基礎培地に添加され得る。
【００３９】
また、上記基礎培地には、アミノ酸（例．グリシン等）、アデニン及び／又はココナツウォーター等を添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウム等でｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００４０】
本発明により形質転換されるヤナギ目植物はいずれの種類であってもよく、例えばポプラ（ギンドロ；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、ポプラ（クロポプラ；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、イヌコリヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｉｎｔｅｇｒａ）、ケショウヤナギ（Ｃｈｏｓｅｎｉａ  ａｒｂｕｔｉｆｏｌｉａ）、ポプラ（Ｐｏｐｌｕｓ  ×ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ポプラ（カロリナポプラ；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ×ｅｕｒｏａｍｅｒｉｃａｎａ）、ドロノキ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚｉｉ）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、シダレヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ）、バッコヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｂａｋｋｏ）、ネコヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｇｒａｃｉｌｉｓｔｙｌａ）、イヌコリヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｉｎｔｅｇｒａ）又はウンリュウヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｍａｔｓｕｄａｎａ）等が挙げられる。
【００４１】
本発明により形質転換されたヤナギ目植物は、上記被導入遺伝子によって発現されるタンパク質を蓄積できる。該タンパク質としては、植物自体が有する酵素、例えば光合成に関与する酵素（例．フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、トランスケトラーゼ等）や植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例．カロテノイド生合成酵素等）、あるいは病虫害耐性タンパク質（例．バチルス・チューリンゲス毒素等）や除草剤耐性タンパク質（例．５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等）などが挙げられる。
また上記タンパク質としては、例えば薬理活性を有する医療用タンパク質（例．インスリン、インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ヒトソマトスタチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター等）又は工業用材料等として有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素（例．セルラーゼ、ニトリルヒドラターゼ等）なども挙げられる。
また、上記タンパク質としては、ファイトレメディエーションのための例えば有害重金属イオンと結合するメタロチオネイン等も挙げることができる。
【００４２】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例１】
【００４３】
ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡの塩基配列の決定と解析
ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）生葉から常法に従いｐｅｒｃｏｌ密度勾配遠心によりポプラ葉緑体を単離する。単離した葉緑体からＣＴＡＢ法を用いたＤＮＡ精製法によりポプラ葉緑体のゲノムＤＮＡを精製する。精製ＤＮＡから約２ｋｂの葉緑体ゲノム由来のＤＮＡ断片を持つポプラ葉緑体ゲノムライブラリーを作成する。ゲノムライブラリーのクローン５，０１６個の塩基配列を解読してポプラ葉緑体全ゲノムＤＮＡの塩基配列（１５６，５０５ｂｐ）を決定した。決定した塩基配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬに登録番号ＡＰ００８９５６として登録した。次いで、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノム塩基配列との相同性からポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ（配列表の配列番号１の第１番目から第１４２８番目）とａｃｃＤ（配列表の配列番号１の第２０７１番目から第３５６８番目）をコードしている領域の塩基配列情報（配列表の配列番号１）を取得した。
【実施例２】
【００４４】
ポプラ葉緑体形質転換用プラスミドベクターの作製
ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子の部分配列を含む９９６ｂｐの領域（配列表の配列番号１の第６６３番目から第１６５８番目；以下、ｒｂｃＬ遺伝子領域と略記する。）を有するＤＮＡは以下のフォワードプライマー（配列表の配列番号２）とリバースプライマー（配列表の配列番号３）を用いて増幅した。
フォワードプライマー：
５’−ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＧ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号３）
フォワードプライマーは５’端にＳａｃＩサイト（ＧＡＧＣＴＣ）を含み、リバースプライマーは５’端にＮｏｔＩサイト（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含む。
増幅断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製；以下同じである。）が有するマルチクローニングサイトのＳａｃＩサイト及びＮｏｔＩサイトを用いて導入した。
【００４５】
ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子の部分配列を含む１０２１ｂｐの領域（配列表の配列番号１の第１６５９番目から第２６７９番目；以下、ａｃｃＤ遺伝子領域と略記する。）を有するＤＮＡは以下のフォワードプライマー（配列表の配列番号４）とリバースプライマー（配列表の配列番号５）を用いて増幅した。
フォワードプライマー：
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号４）
リバースプライマー：
５’−ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号５）
フォワードプライマーは５’端にＳａｌＩサイト（ＧＴＣＧＡＣ）を含み、リバースプライマーは５’端にＫｐｎＩサイト（ＧＧＴＡＣＣ）を含む。
増幅断片は、ポプラのｒｂｃＬ遺伝子領域を有するＤＮＡを増幅した断片を組み込んだ前記ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋が有するマルチクローニングサイトのＳａｌＩサイト及びＫｐｎＩサイトを用いて導入した。
このようにしてポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域及びａｃｃＤ遺伝子領域を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＣＢ１を作成した。
【００４６】
別途、タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のプロモーターとターミネーター配列、及びａａｄＡを有するｐＬＤ６にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光タンパク質）をコードする遺伝子（ｇｆｐ）が挿入されたｐＬＤ６ＧＦＰ（配列表の配列番号６）から、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ制限酵素を用いてａａｄＡ／ｇｆｐ遺伝子発現に必要な塩基配列（配列表の配列番号６の第２２２０から第４６４３番の塩基配列）を有するＤＮＡ断片を切り出した。なお、ｐＬＤ６ＧＦＰは、特開２００２−２７２４７６号公報の実施例に記載されている方法により作製されたものを使用した。ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域を有するＤＮＡ及びａｃｃＤ遺伝子領域を有するＤＮＡを導入したｐＣＢ１における、ＮｏｔＩサイト及びＳａｌＩサイトを用いて、前記で切り出したａａｄＡ／ｇｆｐ遺伝子発現に必要な塩基配列を有するＤＮＡ断片をｐＣＢ１に導入した。このようにしてａａｄＡ／ｇｆｐ遺伝子の発現とポプラ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とがその非コード領域を挟んで繋がる領域での相同組み換えを生じさせるポプラ葉緑体形質転換用ベクターを作成した（図１）。
【実施例３】
【００４７】
ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）の形質転換と再分化
ＭＳ培地に植継ぎ後、約４週間無菌栽培したポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）の生葉を遺伝子導入に用いる。
ＭＳ培地は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄ    Ｓｋｏｏｇ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎｅｓ（Ｓｉｇｍａ社）にショ糖（３０ｇ／Ｌ）及びＧｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ（２ｇ／Ｌ）を添加した。ＭＳ培地の組成を蒸留水１Ｌに溶解し、ＫＯＨでｐＨ５．７に調整した。ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）の生葉４〜６枚をカルス誘導培地に置床したプレートを１０枚作成し、カルス誘導培地上で１日間前培養した。カルス誘導培地の組成は、ＭＳ培地に４−ＰＵ（４−ピリジルフェニル尿素；０．１μＭ）及びゲランガム（２ｇ／Ｌ）を添加したものである。直径０．６ミクロンの金粒子２．３ｍｇ、実施例２で作製したポプラ葉緑体形質転換用ベクター２５μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム２５０μＬ及び０．１Ｍスペルミジン５０μＬとを混ぜ、１分毎に懸濁を１０回（懸濁と懸濁の間は氷中に静置）行い、金粒子にベクターを付着させた。金粒子をエタノールで２回洗浄後、６０μＬのエタノールに懸濁した。これは１０回分の打ち込み実験に使用できる量に相当する。前培養したポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）葉に対してパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）の葉細胞に金粒子を打ち込んだ。１回の実験当たり１０回の打ち込みを行った。打ち込み圧力は９００ｐｓｉで行った。打ち込みをして２日後、ベクターを打ち込んだ生葉を３ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を含むカルス誘導培地に置床した。この培地は２週間ごとに交換した。約６〜１０週間で白色化した葉切片から緑色のカルスが生じた。
その後カルスを再分化誘導培地に移し、カルスから再分化を促して植物個体を再生した。再分化誘導培地は、カルス誘導培地のゲランガムに代えて寒天（１０ｇ／Ｌ）を使用したものである。
【実施例４】
【００４８】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるポプラ葉緑体形質転換体の解析
選抜再分化誘導培地から再生した実施例３のポプラ植物体の葉組織、約５０ｍｇを採取し、チューブ内で、常温で破砕した。破砕したサンプルにＤＮＡ抽出バッファー［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム］を加えて、混合した。イソプロパノールで沈澱後、風乾、１００μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に抽出ＤＮＡを溶かした。ｇｆｐ遺伝子の有無を確認するため、ｇｆｐ遺伝子をＰＣＲで増幅した。前記ＰＣＲではポプラ植物体から抽出したＤＮＡ溶液を鋳型に以下のフォワードプライマー（配列表の配列番号７）とリバースプライマー（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：
５’−ＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴ−３’（配列番号７）
リバースプライマー：
５’−ＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号８）
図２に前記ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した。図中、Ａは非形質転換ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）を、Ｂは本発明の形質転換ポプラの結果を示す。
本結果は、本発明方法により形質転換されたポプラ植物体の葉には、ｇｆｐ遺伝子が存在することを示すものである。これにより、本発明の形質転換方法は、ヤナギ目植物の葉緑体に被導入遺伝子を導入できることが分かった。
【００４９】
また、全葉緑体ゲノムＤＮＡ中の形質転換葉緑体ゲノムＤＮＡの存在比の検討には抽出ＤＮＡ溶液を鋳型に以下のフォワードプライマー（配列表の配列番号９）とリバースプライマー（配列表の配列番号１０）を使用してＰＣＲを行った（図３）。
フォワードプライマー：
５’−ＴＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：
５’−ＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＴＣＣＡＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１０）
図３に前記ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した。図中、Ａは非形質転換体のポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）を、Ｂは形質転換体を示す。
本結果は、形質転換ゲノムの比率が高いことを示すものである。これにより、細胞中の葉緑体ゲノムの多くを形質転換できることが分かった。
【実施例５】
【００５０】
ポプラ葉緑体形質転換体の導入遺伝子の評価
実施例４によりｇｆｐ遺伝子の導入が確認されたポプラ植物体においてｇｆｐ遺伝子が発現しているかどうかを調べるために形質転換ポプラ（図４）より葉をとりその可溶性タンパク質の分析をした（図５）。
葉をタンパク質抽出バッファー［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ：フッ化フェニルメチルスルホニル）］の入ったチューブ中で破砕した。これを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心してその上清を可溶画分とした。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によりタンパク質サイズに従って分離しクマシー染色によりタンパク質の検出を行った。この結果を図５に示した。図中Ａは非形質転換体から、Ｂは形質転換体から抽出したタンパク質の分析結果である。形質転換体には矢印で示した位置に非形質転換体では見られないタンパク質のバンドが観察される。タンパク質の大きさから判断してＧＦＰであると考えられる。また植物体が緑色蛍光を発することも観察された。以上から、本発明の方法により形質転換された植物において、被導入遺伝子が機能あるタンパク質として発現しその産物が可溶性タンパク質として蓄積することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の遺伝子組み換え体を用いて形質転換された植物は、光合成活性が高く、早生、高収量作物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、実施例２で作製したポプラ葉緑体形質転換用ベクターの模式図である。図中ｒｂｃＬはｒｂｃＬ遺伝子領域を、ａｃｃＤはａｃｃＤ遺伝子領域を、Ｐｒｒｎはｒｒｎプロモーターを、ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を、ＴｐｓｂはｐｓｂＡターミネーターを、Ｐｒｐｓはｒｐｓプロモーターを、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、Ｔｒｐｓはｒｐｓターミネーターを示す。
【図２】図２は、本発明の形質転換ポプラでのｇｆｐ遺伝子の確認を行うため、ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動した図である。
【図３】図３は、ポプラ葉緑体ゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の組み換え率の検討を行ったＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動した図である。図中Ａは非形質転換ポプラを、Ｂは本発明の形質転換ポプラの葉組織のＤＮＡをそれぞれ鋳型にしたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図４】図４は、本発明の形質転換ポプラを示す図である。
【図５】図５は、非形質転換ポプラと本発明の形質転換ポプラから抽出したタンパク質を分析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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