(57)【要約】【課題】  化学物質の感作性強度の評価方法を提供する。【解決手段】  （１）被検化学物質を媒体に溶解又は分散させた被検液を被検用マウス群に、前記被検液に使用した媒体を対照用マウス群に塗布する工程と、（２）所定期間経過後、被検用マウス群と対照用マウス群の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、（３）対照用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程とを有する被検化学物質の感作性強度の評価方法であって、被検用及び対照用マウス群にＣＢＡ／Ｎ系統のマウスを使用する化学物質の感作性強度の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被検化学物質を媒体に溶解又は分散させた被検液を被検用マウス群に、前記被検液に使用した媒体を対照用マウス群に塗布する工程と、
（２）所定期間経過後、被検用マウス群と対照用マウス群の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、
（３）対照用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程と
を有する被検化学物質の感作性強度の評価方法であって、被検用及び対照用マウス群にＣＢＡ／Ｎ系統のマウスを使用することを特徴とする化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項２】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節質量である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項３】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節細胞数である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項４】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＲＩ標識化合物量である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項５】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＢｒｄＵ量である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項６】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節浮遊液のＡＴＰ量である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質の感作性強度を評価する方法に関する。詳細には、特定のマウスを使用することにより、感作性強度の感度を高め、精度良く化学物質の感作性強度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは現代病として社会問題になっており、化学物質によって誘発されるアレルギーを予測することは極めて重要な課題となっている。
【０００３】
アレルギーの原因となる感作性物質をスクリーニングする方法としては、ギニーピッグマキシミゼーションテスト（Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、ビューラーテスト（Ｂｕｅｈｌｅｒ  ｔｅｓｔ）等の皮膚感作性試験がある。これらの皮膚感作性試験は試験動物を用いて遅延性過敏症の発症を観測するものであって、動物飼育期間だけでも１ヶ月以上を要し、より短期間で試験をすることのできる代替試験法の開発が要求されている。
【０００４】
近年では、ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ（ＬＬＮＡ）、非特許文献１参照）が開発され、従来の皮膚感作性試験とともに用いられるようになっている。
【０００５】
ＬＬＮＡは、試験動物に化学物質を投与し、所定期間が経過した後、リンパ節を採取して細胞増殖の程度を評価することにより化学物質の感作性を評価する方法である。この方法は初回抗原刺激によるリンパ球の増殖を利用する方法で、アレルギー反応の初期段階を検出するため、従来の皮膚感作性試験と比較して短期間で行うことができる。
【非特許文献１】武吉正博等(Takeyoshi, M. et al.)，トキシコロジー  レターズ(Toxicology Letters)，119, 203-208 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＬＬＮＡによる感作性強度の評価方法では、まず被検化学物質を溶解又は分散した種々の濃度の被検液と被検液の調製に使用した媒体とをそれぞれ試験動物群に投与して、各動物群の化学物質による感作の程度を示す指標、例えばリンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する。次いで、媒体対照群の３倍の感作性を示す被検液の濃度（ＥＣ３）を求め、ＥＣ３の値から被検化学物質の感作性強度を決定する方法が提案されている。
【０００７】
特定の物質に対するＥＣ３の値は、測定する指標等による違いの他、使用する試験動物の遺伝的要因、飼育方法などの環境的要因等によっても変動する。
【０００８】
経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）では、ＬＬＮＡが化学物質の安全性評価方法のひとつとして新ガイドライン（ＴＧ４２９）に登録され、ＬＬＮＡの標準法が定められている。この標準法では、試験動物として感作性の感度が優れる８〜１２週令のＣＢＡ／Ｃａ又はＣＢＡ／Ｊ系統の雌性マウスが推奨されている。
【０００９】
一方、リンパ節の細胞増殖程度を示す指標は種々の指標が知られている。例えば、3Ｈ−チミジン等のＲＩ標識化合物を化学物質で感作させた被検動物に投与し、リンパ節に取り込まれた標識化合物量を測定することにより化学物質の感作性強度を評価することができる。ＲＩ標識化合物を用いる方法は、ＯＥＣＤにより標準法として推奨される方法である。この方法は感作の検出感度に優れるものの、放射性物質を使用することから試験できる施設が限られ、廃液処理等の問題がある。
【００１０】
細胞増殖程度を示す指標となる標識化合物としては、ＲＩ標識化合物以外にも、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等のＥＬＩＳＡ法により定量可能な化合物が使用できる。この標識化合物を使用する方法は、従来ＣＢＡ／ＪＮ系統のマウスが使用されており、放射性物質を取り扱う必要がないことから、簡便で、安全性が高い点で好ましい方法である。ところが、ＣＢＡ／ＪＮ系統のマウスを使用した場合、ＲＩ標識化合物に比較して試験動物に高濃度の被検液を投与した場合でないと化学物質によるリンパ球の増殖反応が検知できず、検出感度が悪いという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意研究の結果、試験動物として従来使用されているＣＢＡ／ＪＮ系統のマウスに代えてＣＢＡ／Ｎ系統のマウスを使用することにより、ＬＬＮＡにおいてＥＬＩＳＡ法により定量する標識化合物を使用する場合であっても高い感度で被検化学物質の感作性強度が評価できることを見出し本発明を完成するに到った。
【００１２】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１３】
〔１〕  （１）被検化学物質を媒体に溶解又は分散させた被検液を被検用マウス群に、前記被検液に使用した媒体を対照用マウス群に塗布する工程と、
（２）所定期間経過後、被検用マウス群と対照用マウス群の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、
（３）対照用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用マウス群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程と
を有する被検化学物質の感作性強度の評価方法であって、被検用及び対照用マウス群にＣＢＡ／Ｎ系統のマウスを使用することを特徴とする化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１４】
〔２〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節質量である〔１〕に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１５】
〔３〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節細胞数である〔１〕に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１６】
〔４〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＲＩ標識化合物量である〔１〕に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１７】
〔５〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＢｒｄＵ量である〔１〕に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１８】
〔６〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節浮遊液のＡＴＰ量である請求項１に記載の化学物質の感作性強度の評価方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、ＬＬＮＡにより化学物質の感作性強度を評価する方法において、試験動物として従来用いられていないＣＢＡ／Ｎ系統のマウスを使用するようにするので、高い感度で化学物質の感作性強度を評価することができる。この系統のマウスを用いることにより、ＢｒｄＵ等のＥＬＩＳＡ法で定量を行う標識化合物を使用した場合であっても、ＲＩ標識化合物と同等のＥＣ３の値が得られるので、ＲＩ標識化合物を用いて測定したＥＣ３の値との比較が可能となる。本発明は、アレルギーの原因となる感作性物質をスクリーニングする方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の評価方法は、以下の手順で行う。
【００２１】
まず、被検化学物質を媒体に溶解又は分散した被検液と、対照用として被検液の調製に使用した媒体とを準備する。
【００２２】
使用する媒体としては、例えばアセトン・オリーブ油混液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド、メチルエチルケトン、プロピレングリコール、ジメチルスルホキサイド等を挙げることができる。
【００２３】
被検液は、必ずしも被検化学物質が媒体に溶解している必要はないが、溶液の濃度調整が容易であることから、溶解していることが好ましい。
【００２４】
被検液の濃度は被検化学物質の感作性強度により、適度なリンパ球の増殖反応、例えば媒体のみを投与した場合に比べて３倍程度の増殖反応を引き起こす濃度を含む範囲を選択することが好ましい。
【００２５】
調製した被検液又は媒体を、それぞれＣＢＡ／Ｎ系統の被検用マウス群又は対照用マウス群のマウスの耳介に、１日１〜数回程度（好ましくは１日１回）、１〜５日間（好ましくは３日間）塗布を行う。
【００２６】
マウスに被検化学物質を投与し、所定期限が経過した後、マウスの耳介リンパ節を採取して細胞増殖程度を示す指標を測定し、被検化学物質の感作性強度を評価する。投与後、耳介リンパ節を採取するまでの期間としては、通常１〜７日程度が好ましい。細胞増殖程度を示す指標としては公知のものを制限なく用いることができるが、例えば、耳介リンパ節に取り込まれた標識化合物量、耳介リンパ節質量、耳介リンパ節総細胞数、耳介リンパ節内の特定の細胞集団の細胞数やその割合、耳介リンパ節浮遊液のＡＴＰ量等を挙げることができる。
【００２７】
耳介リンパ節に取り込まれた標識化合物量を指標とする場合には、試験動物に予め標識化合物を投与し、標識化合物の投与から数時間〜数日経過した後、試験動物の耳介リンパ節を採取して標識化合物量を測定する。標識化合物の投与は、腹空内投与、静脈内投与とすることが可能で、投与の際には浸透圧ポンプを使用してもよい。標識化合物としては、リンパ球数の増加とともに試験動物の耳介リンパ節に取り込まれる化合物であって、耳介リンパ節に取り込まれた量が測定可能なものであればいずれの化合物を用いることもできる。標識化合物としては、例えば、3Ｈ−チミジンや125Ｉ−ヨードデオキシウリジン等のＲＩ標識化合物等を挙げることができる。また、ＥＬＩＳＡ法により定量可能な５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）やフローサイトメーター等により検出可能なカルボキシフルオレセインスクシイミジルエステル（ＣＦＳＥ）等の蛍光基質も標識化合物として使用できる。更に、リンパ節内の特定の細胞集団を染色するＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体等の蛍光標識抗体も標識化合物として使用できる。
【００２８】
被検化学物質の感作性強度は、対照用マウス群の細胞増殖程度を示す指標量と、被検用マウス群の細胞増殖程度を示す指標量との相対比較により行う。
【００２９】
また、細胞増殖程度を示す指標量から増殖刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＳＩ）を算出し、ＳＩ値の相対比較を行ってもよい。例えば、細胞増殖程度を示す指標としてＢｒｄＵの取り込み量を選択する場合、次式によりＳＩ値が算出できる。ＳＩ値の相対比較から、被検化学物質のヒトあるいは試験動物における感作性強度が推定できる。
【００３０】
ＳＩ＝ ｍ ／ ｍ0
ｍ：被検液を投与したマウスの耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量平均値
ｍ0：媒体のみを投与したマウスの耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量平均値
【実施例】
【００３１】
実施例１
被検化学物質として、2,4-ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ、和光純薬社製）、イソオイゲノール（ＩＥＧ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ、和光純薬社製）、オイゲノール（ＥＧ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、プロピレングリコール（ＰＧ、和光純薬社製）を使用した。これらの被検化学物質を媒体（アセトン／オリーブ油混液（ｖ／ｖ＝４：１））に溶解し、各濃度の被検液を調製した。
【００３２】
ＣＢＡ／Ｎ系統の８週令雌性マウスを４匹／群に分け、各群のマウスの耳介に各濃度の被検液又は媒体を塗布した。被検液又は媒体の塗布は両耳介にそれぞれ１日１回２５μＬずつとし、３日間行った。試験開始から４日後、０．５ｍＬ／匹のＢｒｄＵ（１０ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内投与した。
【００３３】
ＢｒｄＵを投与して２４時間経過した後、各個体の耳介リンパ節を採取し脂肪組織を取り除いた後、耳介リンパ節を一匹分ずつ生理食塩液に入れてすりつぶし、セルストレーナ（ＦＡＬＣＯＮ  ２３５０，ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した。その後、各個体の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量を市販の測定キットＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（ベーリンガー・マンハイム社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。各群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量の平均値を求め、媒体のみを投与した媒体対照用マウス群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量に対する被検用マウス群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量の比をとり、ＳＩ値を算出した。
【００３４】
比較例１
ＣＢＡ／Ｎ系統のマウスに代えてＣＢＡ／ＪＮ系統のマウスを使用して実施例１と同様に化学物質の感作性強度を測定し、ＳＩ値を算出した。
【００３５】
実施例１及び比較例１で測定した各濃度の被検液を投与したときのＳＩ値を化学物質ごとに図１〜５に示す。更に、内分法によりＳＩ値が３となる被検液の濃度、即ちＥＣ３の値を算出した。算出したＥＣ３の値を表１に示す。なお、表１に示す参考例は、ＣＢＡ／Ｃａ系統のマウスを使用してＲＩ標識化合物を用いて測定したＥＣ３の値で、文献から引用したものである。
【００３６】
表  １                            （質量％）
───────────────────────────
系統     HCA    EG     IEG   DNCB   PG
───────────────────────────
実施例１  CBA/N    20.3   10.7   1.9   0.08   >50
比較例１  CBA/JN   45.5   40.6   9.6   0.10   >50
参考例※  CBA/Ca   8.0    13.0   1.3   0.08   >50
───────────────────────────
※バスケッター．ディー．エー．等（Basketter, D.A. et al）, コンタクト  デェアマタイティス（Contact Dermatitics）, 42, 344-348(2000).
【００３７】
実施例１で得られたＥＣ３の値は、感作性強度が低いＰＧを除いていずれの化学物質についても比較例１より小さい値であった。これは、実施例１で使用したＣＢＡ／Ｎ系統のマウス群がＣＢＡ／ＪＮ系統のマウス群に比較して低い濃度で被検化学物質による感作が検知できることを示している。また、実施例１のＥＣ３値はＨＣＡを除いてＲＩ標識化合物を用いて測定した参考例の値とほぼ同等の値であった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】各濃度のＨＣＡ被検液をマウスに投与したときのＳＩ値を示すグラフである。
【図２】各濃度のＥＧ被検液をマウスに投与したときのＳＩ値を示すグラフである。
【図３】各濃度のＩＥＧ被検液をマウスに投与したときのＳＩ値を示すグラフである。
【図４】各濃度のＤＮＣＢ被検液をマウスに投与したときのＳＩ値を示すグラフである。
【図５】各濃度のＰＧ被検液をマウスに投与したときのＳＩ値を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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