(57)【要約】【課題】  核酸増幅方法において、時間的労力及び経済的負担のかからない増幅産物の標識方法を提供すること。【解決手段】  （ａ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、並びに（ｂ）上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を含みかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチド、を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、増幅産物の標識方法。【選択図】  図１
2006174806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、並びに
（ｂ）上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を含みかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチド
を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、増幅産物の標識方法。
【請求項２】
（ａ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、
（ｂ）上記タグ配列を含むが、（ａ）と同一又は異なる鋳型にアニーリング可能でありかつ（ａ）とは異なる配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、並びに
（ｃ）上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチド
を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、増幅産物の標識方法。
【請求項３】
（ｉ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセットを用いて、鋳型から核酸増幅反応を行うステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）により生成された核酸増幅産物に、上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを結合させるステップ、
（ｉｉｉ）上記標識を検出するステップ、
を含む、増幅産物の検出方法。
【請求項４】
標識が蛍光標識である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
タグ配列が配列番号１に示される塩基配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
鋳型にアニーリング可能な配列とタグ配列を有する少なくとも１つのプライマーがリバースプライマーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
タグ配列を連結したプライマーを用いて得られる核酸増幅産物を標識するための、タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１に示される塩基配列を有する、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
プライマーに連結するためのタグ配列を有するオリゴヌクレオチド、及び該タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅産物の標識用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応における増幅産物の標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅反応においては、目的とする増幅産物が得られているかどうかを確認するため、標識したプライマーを使用し、その標識に基づいて増幅産物を検出することが一般的に行われている（例えば非特許文献１参照）。そのためには、使用する鋳型特異的プライマーごとに標識を付す必要がある。しかしながら、このような反応に用いられる標識（蛍光など）は高価なものであり、また通常の研究・開発の実験においては多種類の標識プライマーを使用するため、多額の経費が必要になる。また、通常の研究室レベルで標識プライマーを入手するためには、非標識プライマーと比較して約３倍の時間がかかる。
【０００３】
そのため、時間的労力及び経済的負担のかからない標識方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】牧野鈴子、増幅産物の検出と標識、６．ＰＣＲ産物の標識、「ＰＣＲ法最前線」蛋白質 核酸 酵素  第41巻第５号、第494〜498頁、1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、核酸増幅方法において、時間的労力及び経済的負担のかからない増幅産物の標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、核酸増幅反応において、プライマーにタグ配列を付加し、また該タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を付したオリゴヌクレオチドを使用して増幅反応を行ったところ、増幅産物が標識され、増幅産物を検出することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（ａ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、並びに
（ｂ）上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を含みかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチド
を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、増幅産物の標識方法である。
【０００７】
また、本発明は、
（ａ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、
（ｂ）上記タグ配列を有するが、（ａ）と同一又は異なる鋳型にアニーリング可能でありかつ（ａ）とは異なる配列を含む少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセット、並びに
（ｃ）上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチド
を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、増幅産物の標識方法である。
【０００８】
また本発明は、増幅産物の検出方法であって、例えば以下のステップ：
（ｉ）鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマー、を含むプライマーセットを用いて、鋳型から核酸増幅反応を行うステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）により生成された核酸増幅産物に、上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを結合させるステップ、
（ｉｉｉ）上記標識を検出するステップ、
を含む方法である。
【０００９】
ここで、標識としては、例えば蛍光標識を用いることができる。また、タグ配列の好ましい例は、配列番号１に示される塩基配列を有するものである。
【００１０】
また、鋳型にアニーリング可能な配列とタグ配列を有する少なくとも１つのプライマーは、リバースプライマーとすることができる。
【００１１】
また本発明は、タグ配列を連結したプライマーを用いて得られる核酸増幅産物を標識するための、タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含むオリゴヌクレオチドである。ここで、該オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１に示される塩基配列を有するものとすることができる。
【００１２】
さらに本発明は、プライマーに連結するためのタグ配列を有するオリゴヌクレオチド、及び該タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅産物の標識用キットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、核酸増幅反応における増幅産物の標識を、時間的労力及び経済的負担なく行うことができる。従って、本発明の方法は、核酸増幅を行うあらゆる方法に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、核酸増幅方法において増幅産物を標識するための方法に関し、鋳型にアニーリング可能な配列と、該鋳型にアニーリングすることのできないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセットと、該タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を含みかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするものである。
【００１５】
核酸増幅方法は、一般的にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用している。ＰＣＲ法の原理は、まず、鋳型となるＤＮＡ２本鎖を加熱して変性させて１本鎖にし（変性）、次に、増幅しようとする標的領域のＤＮＡ鎖の両方の鎖に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げて、プライマーとＤＮＡ鎖の相補的な部位とが２本鎖を形成するようにし（アニーリング）、そしてこの状態でＤＮＡ合成基質であるデオキシヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼとを作用させると、ポリメラーゼがプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく（伸長）という、３段階からなるＤＮＡ合成反応を繰り返して行うことにある。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、核酸断片を指数関数的に増幅させることができる。
【００１６】
本発明においては、上記核酸増幅反応において、増幅対象の鋳型に対してアニーリングすることができるプライマー、一般的にはフォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）を使用する（図１Ａ）。ここで、フォワードプライマー又はリバースプライマーの少なくとも一方には、タグ配列が付加される（図１においては、リバースプライマーにタグ配列が付加されている）。また、増幅反応においては、タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有する共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）を使用する。この共通オリゴヌクレオチドは任意の標識（例として星印で示す）を含む。これらのプライマーと共通オリゴヌクレオチドを使用して増幅反応を行った場合には、まず、図１Ｂに示されるように、プライマーが鋳型にアニーリングし、そのプライマーからポリメラーゼによる伸張反応が起こる（図１Ｂにおいて破線で示す）。続いて、そのように伸張して生成された産物（増幅産物）が鋳型となって、プライマーがアニーリングし、伸張反応が起こる（図１Ｃ、リバースプライマーにより生成された増幅産物を鋳型として示す）。このようなサイクルを繰り返すことによって鋳型の塩基配列が増幅されることになるが、本発明の標識方法においては、リバースプライマーにタグ配列が付加されているため、リバースプライマーが伸張して生成された産物を鋳型として伸張反応が起こる場合には、図１Ｃに示すように、タグ配列に相補的な配列も増幅される。共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）はタグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有するため、タグ配列に相補的な配列を有する増幅産物は、共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）とハイブリダイズ可能であり、共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）は増幅産物に結合する。その結果、増幅産物は、共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）の標識を有することとなるため、標識に基づいて増幅産物を検出することが可能となる。また、この共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）がプライマーとして機能し、増幅産物を鋳型とした伸張反応が起こり、さらなる増幅産物が生成されてもよい（図１Ｄ）。
【００１７】
共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）は、タグ配列を連結したプライマーを使用する限り、プライマーセットの配列や種類、増幅しようとする鋳型の配列や種類に関係なく使用することができる。従って、高価な標識を付した共通オリゴヌクレオチドは、種々の増幅反応において使用することができるため、個々のプライマー毎に標識を付加する場合と比べて無駄がなく、経済的負担が少ない。また、プライマーの調製は、標識を付加することなく単にオリゴヌクレオチドを合成するだけでよいため、時間的労力を省くことができる。
【００１８】
２．プライマーセット及び共通オリゴヌクレオチドの設計
本発明においては、核酸増幅反応を行うためのプライマーセットを設計する。上述したように、核酸増幅反応においては、プライマーは増幅しようとする標的領域に特異的にアニーリングする必要があるため、プライマーは標的領域の塩基配列に基づいて設計する。ここで、増幅対象となる鋳型は、核酸であればＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいし、またその由来も特に限定されるものではない。
【００１９】
プライマーには、フォワードプライマーとリバースプライマーがあり、本発明においては、フォワードプライマー又はリバースプライマーの少なくとも一方が後述するタグ配列を有するものとする。プライマーは、増幅対象となる標的領域の配列又は該配列に対し相補的な配列に基づいて設計されたものであれば、どのような塩基配列を有するものでも用いることができる。ここでプライマーは、設計時に鋳型として使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。
【００２０】
簡単に説明すると、プライマーは、鋳型に対してアニーリング可能な配列を含む。ここで「アニーリング可能な配列」とは、鋳型の配列に対して完全に相同な又は相補的な配列、及び鋳型の配列に対して完全には相同又は相補的ではないが、増幅反応において増幅しようとする鋳型の標的領域と特異的にアニーリングすることができる程度に部分的に相同又は相補的な配列も含む。また、プライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する必要がある。そのため、プライマーは、増幅対象の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と特異的にアニーリングする配列を含む必要があり、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に起こし、非特異的な増幅が起こらないようにする。
【００２１】
例えば、プライマーの長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型とプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。
【００２２】
また本発明において、プライマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよいし、ＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリッド核酸であってもよい。また、プライマーは、核酸類縁体（例えばＤＮＡ類縁体）であってもよい。
【００２３】
また本発明においては、プライマーセットのうち少なくとも１つは、アニーリング可能な配列のほか、さらにタグ配列を有する。「タグ配列」とは、タグ配列に対して相補的な増幅産物が生成された場合に、共通オリゴヌクレオチドがその増幅産物に対してハイブリダイズ可能なように、共通オリゴヌクレオチドの配列と実質的に同一の配列を有するものである。ここで「実質的に同一」とは、完全に同一の配列のみならず、生成される増幅産物（タグ配列の相補配列）に対して共通オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズ可能な程度の同一性を有する配列が含まれる。例えば、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されているタグ配列は、それに基づいて生成された増幅産物に対して共通オリゴヌクレオチドが結合する限り、その共通オリゴヌクレオチドの配列と実質的に同一であるといえる。
【００２４】
このようなタグ配列は、特に限定されるものではないが、標的の鋳型と直接アニーリングするような配列であってはならない。従って、タグ配列は、できる限り短く、かつ増幅対象の鋳型には存在しない配列を含むように設計することが好ましい。例えば、タグ配列の塩基長は、約１５〜３０ｂｐ、好ましくは約１７〜２５ｂｐであり、アニーリング可能な配列より短い方が好ましい。また、タグ配列の塩基組成は、結合の強度の点からＧＣ含量が多いことが好ましい。上記基準を満たすタグ配列として、cccccccccccccctga（配列番号１）を例示することができる。配列番号１に示される塩基配列を有するタグ配列は、特にシロイヌナズナのＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行う場合に好ましい。
【００２５】
また、プライマーにおいては、アニーリング可能な配列とタグ配列との間に鋳型とはアニーリングしない別の塩基が含まれていてもよい。
【００２６】
さらに、本発明においては、共通オリゴヌクレオチドを使用する。共通オリゴヌクレオチドとは、増幅産物に結合し、増幅産物を標識するために使用することができるものである。従って、共通オリゴヌクレオチドは、上記プライマーのタグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有する。これにより、プライマーのタグ配列に基づく増幅産物が生成された場合に、そのタグ配列に相補的な配列を含む増幅産物に対して、共通オリゴヌクレオチドは結合することができる。共通オリゴヌクレオチドは、タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能であれば、さらに別の塩基が付加されたものであってもよいし又はタグ配列よりも短くてもよく、全体として塩基長が約１５〜３０ｂｐ、好ましくは約１７〜２５ｂｐとなるように設計する。
【００２７】
また、共通オリゴヌクレオチドは標識を含む。本発明において使用可能な標識は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、放射性同位体、発光物質などを用いることができる。蛍光物質としては、限定するものではないが、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、テトラメチルローダミン、６−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、マラカイトグリーン、リアクティブレッド４などが挙げられる。放射性同位体としては、32Ｐ、125Ｉ、35Ｓなどを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。本発明においては、その取り扱い及び検出の簡便性の点から蛍光物質を使用することが好ましい。また、２種類の蛍光を使用して増幅産物を区別して標識し、可視的に区別して検出することもできる。
【００２８】
これら標識の種類や標識の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識の導入方法としては、放射性同位体を用いるエンドラベリング法が挙げられる。
【００２９】
３．増幅反応
上述の通り設計したプライマーセット及び共通オリゴヌクレオチドを用いて、増幅反応を行う。
【００３０】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等を挙げることができる。
【００３１】
例えば、ＰＣＲ法は、ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３２】
またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。
【００３３】
なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、本発明に従って標識された増幅産物の定量的な検出が可能となる。例えば競合ＰＣＲ法は、同じプライマーを用いて、定量の内部標準となる競合的鋳型から得られる増幅産物と標的の鋳型から得られる増幅産物との量を比較することにより、標的の鋳型の存在量を定量することができる。
【００３４】
増幅反応における鋳型は、増幅しようとする核酸であれば任意の核酸を使用することができ、またその調製方法も周知である。例えば、天然の細胞からＤＮＡを調製する場合には、例えばフェノール・クロロホルム法を使用することができる。また、鋳型は化学合成により調製してもよい。さらに、増幅反応に使用するポリメラーゼ、基質（ｄＮＴＰ等）なども適宜選択して使用することができる。
【００３５】
増幅反応の条件もまた特に限定されるものではなく、当業者であれば、採用する増幅手法に最適な増幅条件を設定することができる。好ましくは、増幅反応においては、プライマーと共通オリゴヌクレオチドの添加濃度を、タグ配列を有するプライマーと共通オリゴヌクレオチドの添加濃度と他のプライマーの添加濃度が同程度になるように設定する。より好ましくは、タグ配列を有するプライマー：他のプライマー：共通オリゴヌクレオチドプライマーの添加濃度が約１〜１００：１００：１００となるように設定する。
【００３６】
また本発明においては、１種類のプライマーセットだけではなく、複数の異なるプライマーセットを用いた増幅反応を行い、そのそれぞれのプライマーセットに由来する増幅産物を、１種の共通オリゴヌクレオチドを使用して標識することができる。すなわち、一のプライマーセットは、鋳型にアニーリング可能な配列、及び該鋳型にアニーリングすることができないタグ配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むように設計し、別のプライマーセットは、上記タグ配列を有するが、（ａ）と同一又は異なる鋳型にアニーリング可能でありかつ（ａ）とは異なる配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むように設計する。これらのプライマーセットを用いて同時に核酸増幅反応を行った場合、いずれのプライマーセットから増幅された産物にも、上記タグ配列と相補的な配列が含まれることになる。従って、核酸増幅反応において上記タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を含みかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを添加すると、両方のプライマーセットから増幅された産物に共通オリゴヌクレオチドが結合し、増幅産物が標識される。
【００３７】
増幅反応を実施した後、標識に基づいて増幅産物を検出するには、上述した標識を検出するための当技術分野で公知の方法を使用することができる。例えば、標識として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。また標識として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。
【００３８】
本発明はさらに、上述の増幅産物の標識を簡便に行うため、プライマーに連結するためのタグ配列を有するオリゴヌクレオチドと、該タグ配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列を有しかつ標識を含む共通オリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅産物の標識用キットを提供する。このキットにより、適切に設計したプライマーセットの少なくとも１つのプライマーにキットに含まれるタグ配列を有するオリゴヌクレオチドを連結し、核酸増幅反応において共通オリゴヌクレオチドと共に使用することによって、簡便かつ迅速に増幅産物を標識することができる。
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
本実施例においては、プライマーセット及び共通オリゴヌクレオチドを作製することを試みた。
【００４１】
蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社  モデル３１００）のＤＮＡ鎖長解析機能を用いて増幅産物を解析するために、増幅産物を蛍光標識できるようなプライマーセット及び共通オリゴヌクレオチドを作製した。本実施例においては、増幅産物の一方に蛍光標識が付されるように、プライマーセットのうち一方のプライマー（リバースプライマー；Ｒ）の５’末端側に結合することができる共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）を設計した（図１）。
【００４２】
共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）の配列は、出来るだけ短く、確実に反応できる配列であることが好ましいため、表１に示すように、cccccccccccccctga（配列番号１）を設計した。共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）の配列には蛍光標識を付加した（ABI社へ合成依頼）。
【００４３】
また、プライマーセットは、シロイヌナズナのＣｏｌ及びＬｅｒ間で異なる多型を含む領域を特異的に増幅するために、これらの領域の配列に基づいてフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを設計した（表１）。具体的には、図２に示すように、ＣｏｌとＬｅｒにおけるＳＳＬＰ多型（増幅される産物の長さの違いに寄与する多型）を特異的に増幅し、そのＳＳＬＰ多型のために、Ｃｏｌ由来の増幅産物とＬｅｒ由来の増幅産物の長さが異なるように、プライマーセットを設計した。選択したＳＳＬＰ多型は、ｎｇａ１１０７及びｎｇａ１２９である。また、リバースプライマーには、共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）と結合するためのタグ配列（表１において下線で示す）を付加した。
【００４４】
【表１】
2006174806.tif 000003
【実施例２】
【００４５】
本実施例においては、実施例１において作製したプライマーセット及び共通オリゴヌクレオチド（ｕｎｉ）を使用して、ＰＣＲ法により増幅反応を行った。
【００４６】
具体的には、表２に示す割合でプライマー及び共通オリゴヌクレオチドの混合比を変化させて増幅反応を行った。ＰＣＲの反応温度条件は、９５℃５分の後、（９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒）を４０サイクル行い、６０℃４５分、４℃１０分の後、１０℃で保持した。反応液組成は、鋳型０．５μｌ、Amplitag gold PCR Master Mix（ABI社製）５μｌ、表２に示す濃度のプライマー、及び共通オリゴヌクレオチドを加えて１０μｌとした。鋳型は、Ｃｏｌ及びＬｅｒから、標準的な方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出して使用した。
【００４７】
結果を図３〜６に示す。その結果、条件４以外の条件では増幅産物が蛍光標識されており、標識に基づいて増幅産物を検出できることがわかった。特に、増幅産物の長さを正確に判定できるように標識するためには、３の条件が良いことが判った（図３〜６）。
【００４８】
【表２】
2006174806.tif 000004
【実施例３】
【００４９】
実施例２においては、設計したプライマーセット及び共通オリゴヌクレオチドの増幅反応を確認するために、鋳型としてシロイヌナズナＣｏｌとＬｅｒを用いた場合にそれぞれに特有の多型が検出されるか否かを確認した。その結果、多型を検出することができた（図３〜６）。
【００５０】
本実施例においては、Ｃｏｌをバックブランドに持つ変異体（名称；Ｈ３２Ｓ１００７）とＬｅｒを掛け合わせたＦ１植物４個体、及びＦ１植物の次世代であるＦ２植物から変異体表現系を示す９６個体をそれぞれ混ぜて単離した染色体ＤＮＡについて解析を行った。プライマーセットとして、フォワードプライマーはGTGTCTTTTTTTATATGTTTCTCACTCCAAAGTC（配列番号６）及びリバースプライマーはタグを付したcccccccccccccctgaCACATATGACCAAATTAATAAGAAAAA（配列番号７）を使用した。また実施例１で設計した共通オリゴヌクレオチドを使用した。
【００５１】
その結果を図７に示す。図７Ａに示すように、Ｆ１植物のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた場合には、Ｃｏｌの多型由来の増幅産物（増幅産物長１７０ｂｐ）とＬｅｒの多型由来の増幅産物（増幅産物長１７２ｂｐ）を区別して検出することができ、またこれらのピーク比は予想通りほぼ１に近かった。また、Ｆ２植物のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた場合には、Ｃｏｌの多型由来の増幅産物のピークが高かった（図７Ｂ）。以上から、本発明の標識方法を用いることによって、増幅産物の長さの違いや存在量の違いといったわずかな差異でも区別できるような精度で増幅産物を標識できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、核酸増幅反応における増幅産物の標識を、時間的労力及び経済的負担なく行うことができる。従って、本発明の方法は、核酸増幅を行うあらゆる方法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の標識方法の概要を示す。
【図２】シロイヌナズナのＣｏｌ及びＬｅｒのＳＳＬＰ多型を含む断片を増幅するためのプライマーセットの設計を説明する。
【図３】鋳型としてシロイヌナズナＣｏｌ由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーセットＡ及び共通オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応を行った結果を示す。
【図４】鋳型としてシロイヌナズナＣｏｌ由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーセットＢ及び共通オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応を行った結果を示す。
【図５】鋳型としてシロイヌナズナＬｅｒ由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーセットＡ及び共通オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応を行った結果を示す。
【図６】鋳型としてシロイヌナズナＬｅｒ由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーセットＢ及び共通オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応を行った結果を示す。
【図７】鋳型としてＦ１植物及びＦ２植物由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅反応を行った結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１〜７：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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