(57)【要約】    【課題】      製造コストが低廉で、かつ、品質制御が容易で、かつ、培養細胞についてウィルス感染のおそれがないという合成高分子の利点を活かしつつ、ポリアクリル酸からなる網目構造を有するゲルを用いた場合より、培養細胞が短時間で伸展し、かつ、単位面積あたりに吸着する培養細胞の数が多い合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材を提供すること。    【解決手段】  パラスチレンスルホン酸ナトリウム塩（ＮａＳＳ）又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＮａＡＭＰＳ）等のスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子を含有するゲルを細胞培養用基材として使用する。  【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材。
【請求項２】
前記スルホン酸基を有する単量体が、芳香族化合物である請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
前記スルホン酸基を有する単量体が、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩である請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
前記合成高分子において、構造単位としてのパラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率が６ｍｏｌ％以上である請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項５】
前記合成高分子において、構造単位としての２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率が３０ｍｏｌ％以上である請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項６】
前記合成高分子は、架橋度が０．１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である請求項３記載の細胞培養用基材。
【請求項７】
前記合成高分子からなる網目構造が、前記ゲルの最表面層に存在する請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項８】
架橋構造を有する高分子からなる網目構造に、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造が侵入した相互侵入網目構造、或いは前記合成高分子が線状高分子であり、線状の前記合成高分子が侵入したセミ相互侵入網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材。
【請求項９】
前記架橋構造を有する高分子からなる網目構造が、バクテリアセルロースである請求項８記載の細胞培養用基材。
【請求項１０】
スルホン酸基を有する単量体が共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを生成する際に、前記スルホン酸基を有する単量体に対する共重合に係る他の単量体の存在比率を調節することにより、前記ゲルの表面電位を調節する細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１１】
請求項１から請求項９のいずれかに記載の細胞培養用基材を用いる細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成高分子を含む網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材、その製造方法及びそれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養用基材には、ポリスチレン等のプラスチックにコラーゲンをコーティングしたものが広く用いられている。コラーゲンは、多細胞生物における結合組織を構成する繊維状タンパク質であり、自然界に広く存在する生体高分子であるが、生体細胞又は生体組織から単離して精製するまでに要するコストが高く、また生体細胞又は生体組織由来であるため、由来する細胞や組織が異なると品質も異なる、ウィルス感染のおそれがある、等の問題がある。
【０００３】
そこで、本発明者らは、製造コストが低廉で、かつ、品質を制御でき、かつ、培養細胞についてウィルス感染のおそれのない合成高分子をコラーゲンの代替品として使用することを発案し、複数の合成高分子の中でも特にポリアクリル酸（ＰＡＡ：Poly-Acryl Acid）からなる網目構造を有するゲルであれば、そのゲルの表面に牛の内皮細胞が吸着し伸展することを見出し、このゲルを細胞培養用基材として使用する技術を開発した（例えば非特許文献１参照）。この非特許文献１に記載された技術によれば、細胞の増殖を促進する因子で表面修飾されていないＰＡＡを有するゲル上で内皮細胞等をコンフルエント又はサブコンフルエントにまで培養することができる。
【非特許文献１】陳  咏梅、外７名，「ポリアクリル酸ゲルの構造制御による内皮細胞培養」，社団法人  高分子学会，第５２回  高分子討論会  予稿集，平成１５年９月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、非特許文献１に記載された技術では、コラーゲンを用いて内皮細胞を培養する場合と比較して、内皮細胞の伸展速度が遅く、かつ、内皮細胞がコンフルエント又はサブコンフルエントに達するまでの培養時間が長い、という問題がある。
【０００５】
また、非特許文献１に記載された技術では、ＰＡＡの架橋度を少なくとも４ｍｏｌ％未満という限られた範囲内に収めなければ、ＰＡＡを有するゲル上で内皮細胞等をコンフルエント又はサブコンフルエントにまで培養することができない、という問題もある。
【０００６】
さらに、非特許文献１に記載された技術では、細胞培養用基材として必要な強度をゲルに付与する場合に、前述のとおりＰＡＡの架橋度を高めることができないため、例えばＰＡＡからなる網目構造に他の高分子からなる網目構造を絡み付けたりしなければならず、ゲルの製造工程が複雑になる、という問題もある。
【０００７】
本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、製造コストが低廉で、かつ、品質制御が容易で、かつ、培養細胞についてウィルス感染のおそれがないという合成高分子の利点を活かしつつ、ポリアクリル酸からなる網目構造を有するゲルを用いた場合より、培養細胞が短時間で伸展し、かつ、単位面積あたりに吸着する培養細胞の数が多い合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る細胞培養用基材は、スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有する構成を採る。
【０００９】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記スルホン酸基を有する単量体が、芳香族化合物である構成を採る。
【００１０】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記スルホン酸基を有する単量体が、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩である構成を採る。
【００１１】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記合成高分子において、構造単位としてのパラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率が６ｍｏｌ％以上である構成を採る。
【００１２】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記合成高分子において、構造単位としての２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率が３０ｍｏｌ％以上である構成を採る。
【００１３】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記合成高分子は、架橋度が０．１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である構成を採る。
【００１４】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記合成高分子からなる網目構造が、前記ゲルの最表面層に存在する構成を採る。
【００１５】
本発明に係る細胞培養用基材は、架橋構造を有する高分子からなる網目構造に、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造が侵入した相互侵入網目構造、或いは前記合成高分子が線状高分子であり、線状の前記合成高分子が侵入したセミ相互侵入網目構造を有するゲルを含有する、構成を採る。
【００１６】
本発明に係る細胞培養用基材は、前記発明において、前記架橋構造を有する高分子からなる網目構造が、バクテリアセルロースである構成を採る。
【００１７】
本発明に係る細胞培養用基材の製造方法は、スルホン酸基を有する単量体が共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを生成する際に、前記スルホン酸基を有する単量体に対する共重合に係る他の単量体の存在比率を調節することにより、前記ゲルの表面電位を調節するようにした。
【００１８】
本発明に係る細胞培養方法は、前記発明に係る細胞培養用基材を用いるようにした。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有するため、製造コストが低廉で、かつ、単位面積あたりの収量（培養された細胞数）の多い細胞培養用基材を提供することができる。
【００２０】
また、本発明によれば、例えばパラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩を重合又は共重合することにより、合成高分子からなる網目構造が形成されるため、その合成高分子における架橋度の許容範囲を拡げることができる。
【００２１】
また、本発明によれば、前記ゲルを用いて細胞培養するため、品質が均一で、ウィルス感染のおそれのない培養細胞を短時間で大量に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の骨子は、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩例えばパラスチレンスルホン酸ナトリウム塩（ＮａＳＳ：p-styrene sulfonic acid sodium salt）又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩例えば２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＮａＡＭＰＳ：2-acrylamide-2-methylpropane sulfonic acid sodium salt）等のスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子を含有するゲルを細胞培養用基材として使用することである。
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２４】
本発明に係る細胞培養用基材は、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳ等のスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含んで構成される。また、図１に、ＮａＳＳ及びＮａＡＭＰＳの構造式と、参考としてジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ：Dimethyl Acryl Amide）の構造式と、を併せて示す。
【００２５】
ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳ等のスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルの表面では、後述の実施例で実証されるとおり、アクリル酸（ＡＡ）やＤＭＡＡｍを重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルの表面より、培養細胞が速やかに伸展し、コンフルエント又はサブコンフルエントにまで短時間で達する。
【００２６】
このような現象が生じる具体的な機構は明らかでないが、本発明者らは、細胞培養にはゲル表面の電荷密度が重要であり、スルホン酸基を有する単量体を用いることにより、この単量体を重合又は共重合した合成高分子の表面電位が細胞培養に適した範囲となるからである、と推測している。細胞は接着タンパク質を介して他の細胞に接着し増殖することが一般に知られており、このような接着タンパク質としてはフィブロネクチン、ラミニン又はビトロネクチン等が公知である。ここで、ラミニンに着目して行った本発明者らの実験により、細胞接着率又は細胞増殖率の高いゲルほど、その表面に多くのラミニンを吸着することが確認されている。この実験結果に基づいて、本発明者らは、ゲルの表面がマイナスに帯電している場合には、細胞培養の際に使用する血清中に存在していた接着タンパク質がゲルの表面に吸着され、この吸着により、細胞場接着が促進され、さらに細胞培養に好適な環境が形成されるものと推定している。
【００２７】
ここで、細胞培養にはゲル表面の電荷密度が重要であるという点に鑑みれば、本発明を次のような側面から特定することができる。即ち、本発明は、「スルホン酸基を有する単量体が共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを生成する際に、スルホン酸基を有する単量体に対する共重合に係る他の単量体の存在比率を調節することにより、ゲルの表面電位を調節する」という側面から特定することができる。なお、前述の「スルホン酸基を有する単量体に対する共重合に係る他の単量体」とは、例えばＤＭＡＡｍである。また同様に、本発明を次のような側面から特定することができる。即ち、本発明は、「スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルにおいて、その合成高分子からなる網目構造が最表面層に存在する」という側面から特定することができる。
【００２８】
また、この合成高分子において、構造単位としてのパラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩（モノマー）の存在比率は６ｍｏｌ％以上であることが好ましく、また構造単位としての２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩（モノマー）の存在比率は３０ｍｏｌ％以上であることが好ましい。スルホン酸基は、強電解質であるため、その存在比率が６ｍｏｌ％又は３０ｍｏｌ％と比較的低くても、合成高分子の表面特性に支配的な影響を与えて、その表面を細胞の吸着及び伸展に適した電荷密度にすることができる。ここで、合成高分子におけるパラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率の好適範囲の下限が２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩の存在比率の好適範囲の下限よりも低いのは、後述の実施例の実験結果からの帰結であるが、パラスチレンスルホン酸アルカリ金属塩がスルホン酸基の結合した芳香族化合物であることが主な要因であると考えられる。つまり、ＮａＳＳのようなスルホン酸基の結合した芳香族化合物では、ベンゼン環とスルホン酸基との相互作用による電子の非局在化が生じるため、アルカリ金属イオンが電離し易くなるとともに接着タンパク質の吸着する足場が増えることから、ベンゼン環を含まない２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩よりも少量で細胞の吸着及び伸展に適した合成高分子の表面状態が形成されると考えられる。従って、この実験結果からの推論に基づけば、この合成高分子におけるスルホン酸基を有する単量体は、芳香族化合物であることが好ましいと言える。
【００２９】
また、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳを重合又は共重合した合成高分子における架橋度は０．１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下であることが好ましい。この架橋度が０．１ｍｏｌ％未満の場合は、固体としてのゲル状態を維持するために必要な網目構造が形成され難く、また仮にこのような網目構造が形成されたとしても、その網目構造を有するゲルでは、弾性率が低いため、細胞が接着、変形及び移動する際に必要となる抵抗力を提供できない。一方で１０ｍｏｌ％を超える場合には、この合成高分子からなる網目構造を有するゲルが非常に硬くなって変形に対して極めて弱くなるため、ゲルの力学強度が不足することから、その取り扱いが困難になる。
【００３０】
また、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳを共重合して合成高分子を生成する際に使用する架橋剤としては、その種類を特に限定されるものではないが、例えばＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）やエチレングリコールジメタクリレートが挙げられる。図２に、参考として、ＭＢＡＡの構造式を示す。なお、ＭＢＡＡ等の架橋剤を使用する場合には、ラジカル重合によって合成高分子からなる網目構造が形成されることになるが、この合成高分子からなる網目構造の形成方法としては、その他に、高濃度の高分子溶液に二官能性又は複数の官能基を持つ架橋剤を添加して、この高分子同士を分子間架橋する方法、或いはガンマ線照射によってゲルを合成する方法等が例示される。
【００３１】
また、このゲルは、脱イオン水中における膨潤度についてはどのような値であってもよいが、バッファ溶液（例えば、N-[2-Hydroxyethyl] piperazine -N’-[2-ethanesulfonic acid]：Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ溶液）中における膨潤度については１０〜４５であることが好ましい。バッファ溶液中における膨潤度が１０〜４５であるゲルは、適度な弾力と柔軟性を備えており、カッターナイフ等で形状加工を行ったり、ピンセット等で持ち運んだりする際にも壊れない程度の丈夫さを有するため、その取り扱いが容易である。なお、このバッファ溶液は、細胞培養に用いる血清とほぼ同等のイオン強度であることが好ましい。このような緩衝液であれば、細胞培養直前にゲルに血清を加える際にも、そのゲルの膨潤度の変化を最小限に抑えられるからである。
【００３２】
また、このゲルは、架橋構造を有する高分子からなる網目構造に、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳ等のスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造が侵入した相互侵入網目構造、或いはこの合成高分子が線状高分子であり、この線状の合成高分子が侵入したセミ相互侵入網目構造を有することが好ましい。相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を有するゲルであれば、力学強度が極めて高いため、その取り扱いが容易になる（例えば国際公開第０３／０９３３３７号参照）。また、相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を有するゲルであれば、繰り返し利用が可能となる等その耐久性が向上する他に、振動を加えたり加圧したりする環境下でも細胞培養を行うことができるようになり、さらにその形状加工が容易になる。なお、「相互侵入網目構造」とは、ベースとなる網目構造に他の網目構造が絡み付いた網目構造を指し、また「セミ相互侵入網目構造」とは、ベースとなる網目構造に線状高分子が絡み付いた網目構造を指す。
【００３３】
このように、相互侵入網目構造やセミ相互侵入網目構造を有するゲルは、「ベースとなる網目構造」に「他の網目構造又は線状高分子」が絡み付いたものであるため、その最表面層は前記「他の網目構造又は線状高分子」でほぼ覆われることになる。従って、このようなゲルの最表面層の特性は、前記「他の網目構造又は線状高分子」の特性が支配的となる。そこで、このようなゲルにおいて、前記「他の網目構造又は線状高分子」としてスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子を用いれば、そのゲルの最表面層を細胞の吸着及び伸展に適した状態にすることができる。さらには、前記「他の網目構造又は線状高分子」を生成するためにスルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合させる際に、例えば紫外線照射によってラジカル重合を生じさせる場合には、その紫外線照射を行う範囲や形状を予め設定しておけば、このようなゲルの最表面層において、所望の範囲及び所望の形状で細胞を培養することができる。
【００３４】
一方で、相互侵入網目構造やセミ相互侵入網目構造を有するゲルにおいて、前記「ベースとなる網目構造」は、細胞の吸着及び伸展に関して直接的な影響を及ぼさないため、スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子である必要はなく、例えばＤＭＡＡｍからなる中性の合成高分子であってもよい。また、前記「ベースとなる網目構造」は、このようなゲルの強度を高める機能を有することが好ましく、この機能を有する網目構造として、例えばバクテリアセルロース（ＢＣ）が挙げられる。ここで、ＢＣは、特定の酢酸菌によって生成されるハイドロゲルであり、ＤＭＡＡｍ等の通常の合成高分子からなる網目構造と比べると、網目間隔が広く、かつ、網目構造を構成する繊維が太く、かつ、絡み合いや水素結合等の物理架橋を有する、という特徴を有する。また、静置培養で培養したＢＣは、その内部で極細繊維が層構造を形成するため、力学強度に異方性があり、その層と平行方向に高い引っ張り強度を示す。具体的には、本発明者らがＢＣとゼラチンとを組み合わせたゲルを創製したところ、このゲルは、最大で圧縮応力について初期弾性率４ＭＰａ及び破断応力５ＭＰａ、引張り応力について初期弾性率２１ＭＰａ及び破断応力４ＭＰａ、という高い力学物性値を示した。
【００３５】
また、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳを重合又は共重合させる際には、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳにおけるスルホン酸基の対イオンをナトリウム以外のものに置換し、合成高分子を生成した後に、イオン交換等によって前記対イオンをナトリウムに再置換するようにしてもよい。
【００３６】
また、本発明に係る細胞培養用基材は、上述のゲルを含有するものであれば、その形態を特に限定されるものではなく、例えばシャーレ内にこのゲルが配置されているだけでもよい。また、上述のゲルを微粒子状又は多孔質状に加工することも可能であり、このように加工したゲルを用いて細胞培養用基材を構成すれば、ゲルの表面を細胞培養の足場として三次元的に利用できるようになるため、細胞培養の効率を格段に向上させることができる。このような三次元的な細胞培養方法は、特に、高密度での培養に適した細胞に用いることが好ましい。
【００３７】
また、本発明に係る細胞培養用基材は、様々な種類の細胞の培養用培地として利用することができる。本発明者らは、本発明に係る細胞培養用基材を用いて、ウシ胎児大動脈血管内皮細胞(Bovin fetal aorta endothelial cell；BFAEC)、ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Human Umbilical Vein Endothelial Cell）及びウサギ滑膜の線維芽細胞を実際に培養した。その結果、本発明に係る細胞培養用基材を用いれば、確実にコンフルエントにまでこれら３種の細胞を伸展させられることが確認された。
【００３８】
また、本発明に係る細胞培養方法では、細胞の増殖に適した液性因子をゲル内部に含有させて細胞培養に利用することが好ましい。このようにして細胞を培養すれば、細胞培養における伸展速度をさらに速めることができる。この場合、適切な液性因子を選ぶことで、内皮細胞に限定されることなく、様々な細胞培養に適した培養方法を提供することができる。
【００３９】
なお、ＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳを重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルには、培養細胞の吸着を促進するための特別な加工処理は本質的に不要であるが、本発明はこのような特別な加工処理を排除するものではなく、例えばＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳを重合又は共重合した合成高分子にアルギニン・グリシン・アスパラギン酸の順で結合したＲＧＤペプチドを反応させて、ゲルに対する培養細胞の吸着を促進させてもよい。
【００４０】
また、本発明では、スルホン酸基を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルについて説明したが、上述のように、ゲルの表面がマイナスに帯電している場合には細胞培養に好適な環境が形成されると推定されることから、本発明は、「硫酸基」若しくは「リン酸基」を有する単量体を重合又は共重合した合成高分子からなる網目構造を有するゲルを含有する細胞培養用基材という発明に応用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により、本発明に係る細胞培養用基材及び細胞培養方法について具体的に説明する。
【００４２】
（実施例１）
１ｍｏｌ／ＬのＮａＳＳ（Ｍｗ＝２０６．２０、東京化成工業社製）溶液をメタノール再結晶により精製した。精製したＮａＳＳを４つ取り分け、それぞれのＮａＳＳに対して架橋剤ＭＢＡＡ（和光純薬社製）が４、６、８及び１０ｍｏｌ％となるように混合した。続いて、これらのＮａＳＳ及びＭＢＡＡの混合物と、開始剤Potassium peroxodisulfate（Ｋ２Ｓ２Ｏ８）（Ｍｗ＝２７０．３２、関東化学社製）と、を規定の濃度となるように純水に溶かし十分撹拌した後、窒素（Ｎ２）バブリングを３０分間行った。続いて、これらの溶液をそれぞれガラス板に流し込み、水が入らないようにジップロックに入れてウォーターバス中で１２時間熱重合させることにより、架橋度が４、６、８又は１０ｍｏｌ％であるＮａＳＳとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子からなる網目構造を有するゲルをそれぞれ生成した。そして、これらの生成したゲルを大量の純水中で約一週間膨潤させて、平衡膨潤状態にした。
【００４３】
さらに、これらのゲルをｐＨ７．４のバッファ溶液中(ＮａＣｌ  １１７ｍＭ＋ＨＥＰＥＳ(N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])(Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ、Ｍｗ＝２３８．３))  ５ｍＭ＋ＮａＨＣＯ３  １５ｍＭ)に浸漬して溶媒交換した。続いて、必要量のゲルをシャーレに移して、オートクレーブ滅菌(１２１℃、２０分)した。続いて、滅菌済みのシャーレをクリーンベンチに移し、溶媒を吸引し、無血清培地を加えて３７℃インキュベータで１日以上ねかせた。また、別途３７℃恒温槽で血清培地、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝食塩水）及びトリプシン溶液を保温した。
【００４４】
前述のシャーレそれぞれのゲル上に、継代培養したウシ胎児大動脈血管内皮細胞(Bovin fetal aorta endothelial cell；BFAEC)を播いた。続いて、Ｔ７５フラスコから培地をパスツールピペットで吸引してこれを前記シャーレにそれぞれ添加し、さらにＰＢＳ６ｍｌを１０ｍｌ駒込ピペットで前記シャーレにそれぞれ添加して前記内皮細胞を洗浄した後に、これらのシャーレからＰＢＳを吸引して取り除いた。続いて、トリプシン溶液３ｍｌを１０ｍｌ駒込ピペットでこれらのシャーレに添加し、数十秒ほど静置した後に、これらのシャーレからトリプシンをパスツールピペットで吸引して取り除いた。続いて、これらのシャーレに血清培地１０ｍｌを加え、十分にピペッティングした。
【００４５】
そして、この時点における前記内皮細胞の濃度（Ｘ×１０４コ／ｍｌ）を血球計算盤を用いて測定した。また、シャーレ内のゲル上に前記内皮細胞を播いてから６時間後に、それぞれのシャーレにおける内皮細胞の培養の様子を位相差顕微鏡（オリンパス社製  ＩＸ７１）で観察すると伴に、デジタルカメラ（オリンパス社製  ＤＰ１２−Ｂ）で写真撮影した。この撮影写真に基づいて、培養された内皮細胞が紡錘状又は星状に偽足を出した状態であれば、その内皮細胞を伸展細胞として計上し、一方で丸い状態であれば、吸着細胞として計上することにより、すべての撮影写真について［伸展細胞数］と［吸着細胞数］とを測定した。さらに、前記位相差顕微鏡と前記デジタルカメラとを用いて、凡そ２４時間毎に内皮細胞の培養の様子を観察し続けた。
【００４６】
図３に、これらの架橋度が異なるゲル上において、測定時間に伴って前記内皮細胞の伸展細胞数が変化する様子を示す。図３の凡例において、ＮａＳＳ４は架橋度が４ｍｏｌ％のゲルを、同様にＮａＳＳ６は架橋度が６ｍｏｌ％のゲルを、ＮａＳＳ８は架橋度が８ｍｏｌ％のゲルを、ＮａＳＳ１０は架橋度が１０ｍｏｌ％のゲルをそれぞれ示す。また、図５に、ＮａＳＳ１０についての伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す（図５中の■）。
【００４７】
（実施例２）
前記実施例１において、ＮａＳＳの代わりにＮａＡＭＰＳ（東京化成工業社製）を用いて、またそれぞれのＮａＡＭＰＳに対して架橋剤ＭＢＡＡが１、２、３、４、５及び６ｍｏｌ％となるように混合した以外は同様にして、ゲルを作製し、内皮細胞についての伸展細胞数を測定した。図４に、それぞれのゲルについて測定した結果を示す。また、図５に、ＮａＡＭＰＳ６についての伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す（図５中の◆、点線）。
【００４８】
（比較例１）
前記実施例１において、ＮａＳＳの代わりにＡＡ（Ｍｗ＝７２．０１、ｄ＝１．０５ｇ／ｍｌ、東京化成工業社製）を用いて、またＡＡに対して架橋剤ＭＢＡＡが２ｍｏｌ％となるように混合した以外は同様にして、ゲルを作製し、内皮細胞についての伸展細胞数を測定した。図５に、架橋度が２ｍｏｌ％であるＡＡとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子（図５ではＰＡＡ２、▲）からなる網目構造を有するゲルについて、そのゲル上における伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す。
【００４９】
（比較例２）
前記実施例１において、ＮａＳＳの代わりにＤＭＡＡｍを用いて、またＤＭＡＡｍに対して架橋剤ＭＢＡＡが４ｍｏｌ％となるように混合した以外は同様にして、ゲルを作製し、内皮細胞についての伸展細胞数を測定した。図５に、架橋度が４ｍｏｌ％であるＤＭＡＡｍとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子（図５ではＤＭＰＡＡｍ４、▼）からなる網目構造を有するゲルについて、そのゲル上における伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す。
【００５０】
（比較例３）
前記実施例１において、ＮａＳＳの代わりにビニルアルコール（和光純薬社製）を用いて、またビニルアルコールに対して架橋剤ＭＢＡＡが６ｍｏｌ％となるように混合した以外は同様にして、ゲルを作製し、内皮細胞についての伸展細胞数を測定した。図５に、架橋度が６ｍｏｌ％であるビニルアルコールとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子（図５ではＰＶＡ６、◆、一点鎖線）からなる網目構造を有するゲルについて、そのゲル上における伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す。
【００５１】
（参考例）
図５に、シャーレの表面に斑なくコラーゲンを塗布した場合について、そのシャーレの表面における伸展細胞数が時間経過と伴に変化する様子を示す。
【００５２】
図５において、ＮａＳＳ１０又はＮａＡＭＰＳ６についての伸展細胞数とＰＡＡ２についての伸展細胞数とを比較すると、本発明に係るＮａＳＳ又はＮａＡＭＰＳとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子からなる網目構造を有するゲルであれば、従来のＡＡとＭＢＡＡとの共重合体である合成高分子ＰＡＡ２からなる網目構造を有するゲルよりも、内皮細胞の伸展速度が２倍程度速く、かつ、単位面積あたりに吸着する内皮細胞の数が２倍程度となることが判る。
【００５３】
（実施例３）
この実施例３では、ＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍとを共重合させたゲルを、ＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍとの合計に対するＮａＡＭＰＳの存在比率ＦＮａＡＭＰＳが、０、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１．０となるように調節して作製する。なお、本実施例では、ゲルの架橋度即ちＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍの合計に対する架橋剤ＭＢＡＡが全て４ｍｏｌ％となるように調節し、その他の特に明示しない点については前記実施例１と同様にしてゲルを作製し、その作製したゲルを用いて、内皮細胞についての伸展細胞数等を測定した。
【００５４】
図６Ａに、本実施例で作製したＦＮａＡＭＰＳがそれぞれ異なるゲルについて、内皮細胞を６時間培養した時点における伸展率（「伸展した細胞数／播いた細胞数」の％：図６Ａ中の●）と、１２０時間培養した時点における伸展細胞数（単位はＸ×１０４コ／ｃｍ２：図６Ａ中の○）と、の測定結果を示す。また、図６Ｂに、このＦＮａＡＭＰＳがそれぞれ異なるゲルについて、ＦＮａＡＭＰＳをゼータ電位に換算してプロットし直した結果を示す。
【００５５】
ここで、図６Ａを観察すると、ＦＮａＡＭＰＳが０〜０．３の範囲では、６時間培養した時点において伸展率３０〜４０％で内皮細胞が伸展しているが、１２０時間培養した時点においては、その伸展していた内皮細胞が殆ど死滅していることが判る。一方で、ＦＮａＡＭＰＳが０．３〜１．０の範囲では、１２０時間培養しても、内皮細胞は死滅しないことが判る。従って、図６Ａに示す測定結果に基づけば、ＦＮａＡＭＰＳ＝０．３付近に内皮細胞をコンフルエントにまで培養できるか否かの臨界値があると推測されることから、ＮａＡＭＰＳとＤＭＡＡｍとを共重合させたゲルを用いてウシ胎児大動脈血管内皮細胞を培養する場合には、このゲルにおけるＮａＡＭＰＳの存在比率は３０ｍｏｌ％以上であることが好ましいと言える。なお、ＦＮａＡＭＰＳ＝０．３は、図６Ｂから明らかなように、ゼータ電位−１６ｍＶに相当する。
【００５６】
（実施例４）
この実施例４では、ＮａＳＳとＤＭＡＡｍとを共重合させたゲルを、ＮａＳＳとＤＭＡＡｍとの合計に対するＮａＳＳの存在比率ＦＮａＳＳが、０、０．０５、０．０６、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０となるように調節して作製する。なお、本実施例では、ゲルの架橋度即ちＮａＳＳとＤＭＡＡｍの合計に対する架橋剤ＭＢＡＡが全て４ｍｏｌ％となるように調節し、その他の特に明示しない点については前記実施例１と同様にしてゲルを作製し、その作製したゲルを用いて、内皮細胞についての伸展細胞数等を測定した。
【００５７】
図７に、本実施例で作製したＦＮａＳＳがそれぞれ異なるゲルについて、内皮細胞を６時間培養した時点における伸展率（「伸展した細胞数／播いた細胞数」の％：●）と、１２０時間培養した時点における伸展細胞数（単位はＸ×１０４コ／ｃｍ２：○）と、の測定結果を示す。
【００５８】
ここで、図７を観察すると、ＦＮａＳＳが０．１〜１．０の範囲では、１２０時間培養した時点において、内皮細胞はほぼコンフルエントにまで伸展していることが判る。一方で、ＦＮａＳＳ＝０では、１２０時間培養しても、内皮細胞は全く伸展しないことが判る。従って、図７に示す測定結果に基づけば、ＦＮａＳＳが０〜０．１の範囲に、内皮細胞をコンフルエントにまで培養できるか否かの臨界値があると推測される。そこで、以下の実施例５では、ＦＮａＳＳが０〜０．１の範囲において、内皮細胞の培養に具体的にどのような差異が生じるか検証する。
【００５９】
（実施例５）
この実施例５では、前記実施例４で作製したＮａＳＳとＤＭＡＡｍとの合計に対するＮａＳＳの存在比率ＦＮａＳＳが、０、０．０５、０．０６、０．０７５、０．１のゲルを用いて、内皮細胞を培養し、培養開始から６、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にそれぞれ伸展細胞数を測定した。
【００６０】
図８に、本実施例におけるＦＮａＳＳがそれぞれ異なるゲルについて、ＦＮａＳＳが０（▲）、０．０５（●）、０．０６（○）、０．０７５（■）、０．１（＋）の場合の伸展細胞数（Ｘ×１０４コ／ｃｍ２）の測定結果を示す。
【００６１】
ここで、図８を観察すると、ＦＮａＳＳが０〜０．０５の範囲では、１２０時間培養しても、内皮細胞が伸展も死滅もしないことが判る。一方で、ＦＮａＳＳが０．０６〜０．０７５の範囲では、ＦＮａＳＳ＝０．１の場合に比べて内皮細胞の伸展速度は遅いものの、確実にコンフルエントに向けて伸展し続けていることが判る。従って、図８に示す測定結果に基づけば、ＦＮａＳＳ＝０．０６付近に内皮細胞をコンフルエントにまで培養できるか否かの臨界値があると推測されることから、ＮａＳＳとＤＭＡＡｍとを共重合させたゲルを用いてウシ胎児大動脈血管内皮細胞を培養する場合には、このゲルにおけるＮａＳＳの存在比率は６ｍｏｌ％以上であることが好ましいと言える。
【００６２】
（実施例６）
この実施例６では、相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を有する２種類のゲルを作製し、作製したゲルを用いて内皮細胞を培養し、６時間培養した時点において、それらのゲルの表面を観察して、内皮細胞の吸着率（「吸着した細胞数／播いた細胞数」の％）と伸展率（「伸展した細胞数／播いた細胞数」の％）とを測定した。この２種類のゲルは、以下のようにして作製した。なお、本実施例において、特に明示しない点については、前記実施例１と同様にしてゲルを作製し、内皮細胞を培養し、内皮細胞の吸着率及び伸展率を測定した。
【００６３】
＜ゲル１の作製＞
前記実施例２において、架橋度が４ｍｏｌ％となるようにＮａＡＭＰＳと架橋剤ＭＢＡＡとの混合溶液を作製し、この混合溶液を加熱することにより、ＮａＡＭＰＳとＭＢＡＡとからなる網目構造を有する第一段階のゲルを作製した。この第一段階のゲルを３ｍｏｌ／ＬのＤＭＡＡｍのモノマー溶液中に浸漬して平衡膨潤状態にした後、このＤＭＡＡｍを含浸した第一段階のゲルを加熱してＤＭＡＡｍを熱重合させることにより、第二段階のゲルを作製した。さらに、この第二段階のゲルを前記第一段階のゲルを作製する際に使用した混合溶液中に浸漬し、平衡膨潤状態にした後、この混合溶液を含浸した第二段階のゲルを加熱してＮａＡＭＰＳと架橋剤ＭＢＡＡとを熱重合させることにより、第三段階のゲル即ちゲル１を作製した。
【００６４】
＜ゲル２の作製＞
本実施例におけるゲル１の作製において、第二段階のゲルを、架橋剤ＭＢＡＡが含まれない１ｍｏｌ／ＬのＮａＡＭＰＳのモノマー溶液中に浸漬し、平衡膨潤状態にした後、このＮａＡＭＰＳのモノマー溶液を含浸した第二段階のゲルを加熱してＮａＡＭＰＳを熱重合させることにより、第三段階のゲル即ちゲル２を作製した。従って、本実施例におけるゲル１とゲル２との相違点は、ゲル１ではゲルの最表面層を形成するＮａＡＭＰＳの網目構造（図９の下段に「ＰＮａＡＭＰＳ」と表記する）が架橋度４ｍｏｌ％となるようにＭＢＡＡで架橋されているのに対して、ゲル２ではゲルの最表面層を形成するＮａＡＭＰＳがＭＢＡＡで架橋されていない点である。
【００６５】
図９に、本実施例で作製したゲル１とゲル２の表面に内皮細胞を播いて６時間培養した時点における内皮細胞の吸着率と伸展率との測定結果を、ゲル１とゲル２とについてそれぞれ示す。
【００６６】
図９から明らかなように、ゲル１では内皮細胞が２６％の伸展率を示すまで伸展しているのに対して、ゲル２では内皮細胞が全く伸展していない。このことから、内皮細胞を伸展させるには、ゲルの最表面層を構成する網目構造の特性が重要であり、その網目構造には、ある程度の架橋度が必要であることが判る。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明に係る細胞培養用基材は、例えば軟骨細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞又は上皮細胞等の培地等として有用である。また、本発明に係る細胞培養用基材は、粒子状に加工され又は多孔質化されることにより、ゲルの表面を三次元的に利用できるようになるため、細胞を高密度で培養できるようになることから、高密度での培養時にタンパク質や多糖等の有用な物質を特異的に産生する細胞の培養に有用である。また、本発明に係る細胞培養用基材は、培養細胞を表面に付着させた状態で人工血管等の人工臓器として利用することが可能であるため、医療機器用の複合材料としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】パラスチレンスルホン酸ナトリウム塩又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩の構造式を示す図
【図２】Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの構造式を示す図
【図３】パラスチレンスルホン酸ナトリウム塩を共重合させて生成したゲルについて時間経過に伴って内皮細胞の伸展細胞数が変化する様子をその架橋度毎に示す図
【図４】２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩を共重合させて生成したゲルについて時間経過に伴って内皮細胞の伸展細胞数が変化する様子をその架橋度毎に示す図
【図５】各実施例及び各比較例におけるゲル上において時間経過に伴って内皮細胞の伸展細胞数が変化する様子を示す図
【図６】実施例３におけるＦＮａＡＭＰＳが異なる各ゲルについて、６時間培養時と１２０時間培養時とにおける内皮細胞の伸展状況を示す図
【図７】実施例４におけるＦＮａＳＳが異なる各ゲルについて、６時間培養時と１２０時間培養時とにおける内皮細胞の伸展状況を示す図
【図８】実施例５におけるＦＮａＳＳが異なる各ゲルについて、培養時間経過時毎の内皮細胞の伸展状況を示す図
【図９】実施例６におけるゲル１とゲル２について、６時間培養時における内皮細胞の吸着率と伸展率とを示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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