(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の遺伝子診断に用いられる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、特定の配列で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３１〜３５４０残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３〜３６２残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の予測または診断に用いるための、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異を検出するためのプライマーペアであって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項９】
ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の予測または診断に用いるための、請求項８に記載のプライマーペア。
【請求項１０】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の変異を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予測または検出する方法であって、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを用いて、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８または９に記載のプライマーペアを含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の予測または診断のためのキット。
【請求項１２】
ＣＹＰ２Ｃ９酵素の解毒代謝活性を増強する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞を用意する工程、
（ｂ）該細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｃ）被験化合物を接触させた細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を検出する工程、および
（ｄ）被験化合物を接触させない細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性と比較して、工程（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
一般に、薬物療法において、薬物は、患者の示す疾患、症状等に応じて投与されるものである。しかしながら、個々の患者の薬物に対する反応性には差違があり、そのような個々人の薬物感受性を予測し、これに応じて薬物を投与することは困難である。
【０００３】
通常、投与された薬物は、肝臓の薬物代謝酵素によってより水溶性の物質へと変換され、体外に排出される。このような薬物代謝酵素として、ヘムタンパク質であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）が知られており、これは、薬物、ステロイド、発癌物質、毒素などの外因性の化学物質、ならびにステロイド、脂肪酸などの内因性の化合物等の酸化代謝を触媒する。
【０００４】
ヒト肝臓中には、２０種以上のＣＹＰの分子種が含まれている。ＣＹＰは多くの薬物の代謝に関与し、薬物の体内での動態を律速している。従って、薬物の薬効と安全性を知るためには、特定の薬物がＣＹＰのどの分子種により代謝されるのか、また、いずれかの分子種の活性を阻害もしくは誘導するか否かについて正確に知ることが重要である。
【０００５】
遺伝子解析技術の進歩に伴い、薬物に対する特定の患者の反応性とその患者の遺伝子型との関連についての研究が進行している。ＣＹＰ遺伝子については、一塩基多型（ＳＮＰ）によりチトクロームの代謝活性が弱められたり、増強されたりすることが報告されている（非特許文献１：Ingelman-Sundberg M. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20, 342-349, 1999）。
【０００６】
ＣＹＰ遺伝子の一種であるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、染色体１０ｑ２４に位置し（非特許文献２：Gray I.C. et al., Genomics. 28, 328-332, 1995）、９個のエクソンから構成されている（非特許文献３：de Morais S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 194, 194-201, 1993）。この型のＣＹＰは主として肝臓で発現しているが、小腸、腎臓、副腎、精巣等を含む肝臓以外の組織でも発現することが示されている（非特許文献４：Klose T.S. et al., J. Biochem. Mol. Toxicol. 13, 289-295, 1999）。ＣＹＰ２Ｃ９は、現在使用されている薬剤の約１６％の代謝に関与している。このような薬剤としては、抗凝固剤であるワルファリン（Ｓ体）、糖尿病薬であるトルブタミド、グリメピリド、およびグリベンクラミド、抗てんかん薬であるフェニトイン、降圧薬であるロサルタン、ならびにイブプロフェンおよびジクロフェナックをはじめとする多くの非ステロイド性抗炎症薬の代謝に重要な役割を果たしている（非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。特に、ワルファリン（Ｓ体）やフェニトインは、治療濃度域が狭く、ＣＹＰ２Ｃ９の活性予測が特に重要となる薬剤であり、ＣＹＰ２Ｃ９の活性異常により副作用が引き起こされることが知られている（非特許文献６：Steward D.J. et al., Pharmacogenetics. 7, 361-367, 1997；非特許文献７：Ninomiya H. et al., Ther. Drug Monit. 22, 230-232, 2000）。
【０００７】
ＣＹＰ２Ｃ９については、これまでに活性変化をもたらす５種の遺伝子多型が知られている（非特許文献８：http://www.imm.ki.se/CYPalleles/）。Ａｒｇ１４４Ｃｙｓのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊２は、酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は、白人で約１０％、黒人で約３％、日本人を含むアジア人種では０％である（非特許文献９：Lee C.R. et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002；非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。Ｉｌｅ３５９Ｌｅｕのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊３は、ＣＹＰ２Ｃ９＊２よりも大きな酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は、白人で約１０％、黒人で約３％、日本人を含むアジア人種では約２％である（非特許文献９：Lee C.R. et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002；非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。Ｉｌｅ３５９Ｔｈｒのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊４も、酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は日本人で０．５％以下である（非特許文献１０：Imai J. et al., Pharmacogenetics 10, 85-89, 2000；非特許文献１１：Ieiri I. et al., Ther. Drug Monit. 22, 237-244, 2000）。ＣＹＰ２Ｃ９＊５および＊６は黒人のみで見いだされており、それぞれ酵素活性の低下をもたらすＡｓｐ３６０Ｇｌｕのアミノ酸変化および酵素活性の喪失を引き起こす一塩基欠失（８１８ｄｅｌＡ）を有しており、その頻度は、黒人でそれぞれ約２％および０．６％である（非特許文献１２：Dickmann L.J. et al., Mol. Pharmacol. 60, 382-387, 2001；非特許文献１３：Kidd R.S. et al., Pharmacogenetics 11, 803-808, 2001）。
【０００８】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子多型の影響について、抗凝固薬ワルファリン（Ｓ体）を例にとると、本剤の１日あたりの投与量は個体によって１００倍以上の差があることが知られている。その個人にとっての過剰量の薬剤を投与されると、体内薬物濃度の上昇により臓器内出血等の副作用が引き起こされる。ワルファリンは通常ラセミ体として投与されるが、薬効はＳ体の方が強く、このＳ体を解毒代謝する酵素はＣＹＰ２Ｃ９である。酵素活性が低くなるＣＹＰ２Ｃ９＊２やＣＹＰ２Ｃ９＊３を有する患者では、副作用の出現頻度が高く、また、必要投与量も低いことが知られている（非特許文献１４：Higashi M.K. et al., JAMA 287, 1690-1698, 2002；非特許文献１５：Scordo M.G. et al., Clin. Pharmacol. Ther. 72, 702-710, 2002）。
【０００９】
【非特許文献１】Ingelman-Sundberg M. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20, 342-349, 1999
【非特許文献２】Gray I.C. et al., Genomics. 28, 328-332, 1995
【非特許文献３】de Morais S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 194, 194-201, 1993
【非特許文献４】Klose T.S. et al., J. Biochem. Mol. Toxicol. 13, 289-295, 1999
【非特許文献５】Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003
【非特許文献６】Steward D.J. et al., Pharmacogenetics. 7, 361-367, 1997
【非特許文献７】Ninomiya H. et al., Ther. Drug Monit. 22, 230-232, 2000
【非特許文献８】http://www.imm.ki.se/CYPalleles/
【非特許文献９】Lee C.R. et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002
【非特許文献１０】Imai J. et al., Pharmacogenetics 10, 85-89, 2000
【非特許文献１１】Ieiri I. et al., Ther. Drug Monit. 22, 237-244, 2000
【非特許文献１２】Dickmann L.J. et al., Mol. Pharmacol. 60, 382-387, 2001
【非特許文献１３】Kidd R.S. et al., Pharmacogenetics 11, 803-808, 2001
【非特許文献１４】Higashi M.K. et al., JAMA 287, 1690-1698, 2002
【非特許文献１５】Scordo M.G. et al., Clin. Pharmacol. Ther. 72, 702-710, 2002
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子において、第１２６番目のコドンが翻訳終止コドンとなり、その結果、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の機能が欠損すると考えられる遺伝子変異を見出した。この変異を有するヒトにおいては、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の発現量が減少するため、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による薬物の解毒代謝が抑制される。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子の提供を目的とする。
【００１２】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチドである。
【００１３】
さらに、本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１４】
本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における上記変異を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予測または診断することができる。これにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物を患者に投与する際に、上記変異を有する患者に投与する薬物の量を減少させ、該薬物による副作用を低減させることが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書において「ＣＹＰ２Ｃ９」とは、シトクロムＰ−４５０に属する酵素であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＣＹＰ２Ｃ９酵素は様々な薬物の解毒代謝に関与することが知られており、このような薬物としては、例えば、抗凝固剤であるワルファリン（特にＳ体）、糖尿病薬であるトルブタミド、グリメピリド、およびグリベンクラミド、抗てんかん薬であるフェニトイン、降圧薬であるロサルタン、ならびにイブプロフェンおよびジクロフェナックをはじめとする多くの非ステロイド性抗炎症薬が挙げられる。また、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質を発現するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、例えば、配列番号１で表されるゲノム配列、および配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列を有することが知られている。
【００１６】
本発明により検出されるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子中の変異は、第１２６番目のコドンが終止コドンとなるもの（以下「Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異」という）である。このような変異としては、例えば、該遺伝子のアミノ酸コード配列中、翻訳開始コドンから数えて第３５３〜３６２残基（配列番号１中では第３５３１〜３５４０残基、配列番号２中では第３５３〜３６２残基）の欠失が挙げられる。ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は４９０個のアミノ酸からなるため、前記変異により、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の約７４％のアミノ酸残基が欠失することとなる。特に、欠失するＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の第１２６〜４９０アミノ酸残基には、酵素活性に必須の基質認識部位およびヘム結合部位が存在するため（Graham EG and Peterson J.A., Arch. Biochem. Biophys. 368, 24-29, 1999；"Guide to cytochrome P450, structure and function" by Lewis D.F.V., published by Taylor and Francis Inc (London)., 2001）、前記変異によりＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の機能は消失する。よって、前記変異は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の基質となる薬物の濃度上昇を招くことから、該薬物による副作用を増強するものと考えられる。従って、上記の変異を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の予測または診断が可能となる。特に、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物の投与前にこの変異を検出することにより、該変異を有する患者に対する薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能となる。
【００１７】
変異型ポリヌクレオチド
Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためには、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００１８】
Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３１〜３５４０残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドとされる。
【００１９】
また、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３〜３６２残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２０】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００２１】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の活性を増強する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２２】
核酸分子およびこれを用いた解毒代謝異常の予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。また、あるヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、そのヌクレオチド分子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、そのヌクレオチド分子に相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２４】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２５】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２６】
本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００２７】
本明細書において「変異において変更される配列」とは、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を有するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子（変異型）と該変異を有さないＣＹＰ２Ｃ９遺伝子（野生型）との間でヌクレオチド配列を比較した場合に、野生型ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子には見られない変異型ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子中のヌクレオチド配列をいう。例えば、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異が第１２６番目のコドン中のヌクレオチド残基の置換によって引き起される場合には、変異において変更される配列は、置換された残基およびその周辺の配列、特に置換された残基およびこれに隣接する２つの残基とされる。また、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異が翻訳開始コドンから数えて第３５３〜３６２残基（配列番号１中では第３５３１〜３５４０残基、配列番号２中では第３５３〜３６２残基）の欠失によって引き起される場合には、変異において変更される配列は、欠失した残基の周辺の配列、特に欠失した残基に隣接していた２つの残基とされる。
【００２８】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００２９】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００３０】
また、本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３１】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチドとする。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３３】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３４】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の有無を検出することができ、これにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断することができる。
【００３５】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。
【００３６】
この方法による解毒代謝異常の予測または診断に当たっては、例えば、被験者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３７】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３８】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
フォワード：5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3'（配列番号１０）；および
リバース：5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3'（配列番号１１）
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。あるいは、シークエンスプライマーとして以下のプライマーを用いてもよい：
フォワード：5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3'（配列番号２８）；
リバース：5'-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3'（配列番号２９）。
【００３９】
また、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【００４０】
さらに、上述のような核酸増幅法によって得られた増幅断片につき、その増幅断片中に何らかの変異が存在するか否かを簡便な方法により調べ、変異を有すると判断されたサンプルについてのみ、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異の検出を行なうこともできる。
【００４１】
上記の簡便法としては、例えば、一本鎖高次構造多型（single-strand conformation polymorphism）を利用した方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282）が挙げられる。この方法では、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで、この一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。この方法において増幅するＤＮＡ断片の鎖長は２００〜４００ｂｐとすることが好ましい。
【００４２】
上記の簡便法としては、また、変性剤濃度勾配ゲル法（denaturant gradient gel electrophoresis：ＤＧＧＥ法）を用いることもできる。この方法では、増幅したＤＮＡをＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。このような方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば適切に実施することができる。
【００４３】
本発明による解毒代謝異常の予測または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００４４】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４５】
この方法による解毒代謝異常の予測または診断に当たっては、例えば、被検者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【００４６】
本発明による核酸分子をハイブリダイゼーション法による変異の検出においてプローブとして用いる場合、本発明による核酸分子を基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験者由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子を基板上に固定してなる、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２５ヌクレオチドとする。このようなＤＮＡチップを用いて変異を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、２０００年）、当業者であれば、本発明による核酸分子を用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００４７】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４９】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、変異部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記変異部位に対合するものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５０】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような変異部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５１】
さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００５２】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)）においては、変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、変異型アレルおよび野生型アレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の変異部位における遺伝子型が容易に決定される。
【００５３】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出に用いることのできる他の方法としては、質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)；「遺伝子医学」vol.4, No.1, メディカルドゥ社発行、pp44-51およびpp68-72 (2000)）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の変異を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。
【００５４】
本発明による解毒代謝異常の予測または診断法において、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異が存在すると評価されたサンプルは、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝機構が作動しにくいものと判断することができる。従って、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を有すると評価された被験者はＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝を受ける薬物に対して感受性が高いものと判断され、その被験者に対する前記薬物の投与量を予め調節することが可能となる。これにより、前記被験者における前記薬物による副作用を低減することが可能となる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５５】
以上のような解毒代謝異常の予測または診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００５６】
さらに、本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の解毒代謝活性を増強する化合物のスクリーニング方法が提供される。該方法は、（ａ）本発明による変異型ポリヌクレオチドを発現する細胞を用意する工程、（ｂ）該細胞に被験化合物を接触させる工程、（ｃ）被験化合物を接触させた細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を検出する工程、および（ｄ）被験化合物を接触させない細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性と比較して、工程（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程、を含んでなる。
【００５７】
本発明によるスクリーニング方法において用いられる細胞は特に制限されるものではないが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられる。また、前記細胞により発現される本発明による変異型ポリヌクレオチドは、内因性のポリヌクレオチドであってもよいし、あるいは、発現可能な形で該細胞に導入された外因性のポリヌクレオチドであってもよい。外因性の本発明によるポリヌクレオチドを発現する細胞は、例えば、該ポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを該細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００５８】
被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、およびペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００５９】
前記細胞への被験化合物の接触は、例えば、該細胞の培養物に被験化合物を添加することによって行なうことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、該タンパク質を発現するベクターを該細胞へ導入し、これを発現させることもできる。
【００６０】
ＣＹＰ２Ｃ９酵素の活性は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物、例えば、グリメピリド、フェニトイン、ワルファリン（Ｓ体）、ジクロフェナック等を酸化する活性を測定することにより検出することができる。例えば、ワルファリン（Ｓ体）は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により酸化されて７−ヒドロキシル化物に変換される。また、ジクロフェナックは、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により酸化されて４’−ヒドロキシル化物に変換される。このような活性の測定方法については、例えば、Takahashi K.ら（Pharmacogenetics 10, 95-104, 2000）を参照することができる。
【００６１】
本発明によるスクリーニング方法においては、測定されたＣＹＰ２Ｃ９活性が、被験化合物の非存在下において測定した場合の活性と比較して上昇した化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、糖尿病薬グリメピリド、抗てんかん薬フェニトイン、抗凝固薬ワルファリン（Ｓ体）、抗炎症薬ジクロフェナック、および降圧薬ロサルタン等の、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される治療薬を投与する際に併用することにより、それらの治療薬による副作用を抑制するのに有用である。
【００６２】
本発明によるスクリーニング方法によって取得される化合物は、分子自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。化合物は、例えば、経口投与の場合には、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等とすることができ、経皮投与の場合には、ハップ剤等とすることができる。投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば、経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。これらの化合物がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム等の非ウイルスベクター、または剥き出しのＤＮＡの形態で利用することができる。ＤＮＡの投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００６４】
例１：ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のエクソン配列の解析
ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の全領域にわたる２つの領域をそれぞれ特異的に増幅するための２種類のプライマーペアを、以下のとおり設計した。
【００６５】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子全領域増幅用プライマーセット(Z-Taq Primer)：
（１）エクソン１からエクソン５までの領域を増幅するためのプライマーペア
CYP2C9ZF1：5'-CTATGAAGCTAATCAAGACAGTGTGC-3'（配列番号４）
CYP2C9ZR1：5'-GATGTTTACGCCTTATCTGATAGACAC-3'（配列番号５）
（２）エクソン６からエクソン９までの領域を増幅するためのプライマーペア
CYP2C9ZF2：5'-CTGTGTAGTTTCTCTAGCTATGGC-3'（配列番号６）
CYP2C9ZR2：5'-GATGTTCATGTACACCTGTATCC-3'（配列番号７）
【００６６】
まず、上記のプライマーペア（各０．２μＭ）とZ-Taq（1.25 units；Takara Shuzo, Kyoto, Japan）を用いて、６０人の日本人に由来するゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）について、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の全長をＰＣＲにより増幅した。この際の反応液の全量は１００μｌとし、ＰＣＲの条件は、「９８℃で５秒間、５５℃で５秒間および７２℃で１９０秒間」を２５サイクルとした。
【００６７】
次に、ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、各エクソンを増幅するためのプライマーペアを、以下のとおり設計した。
【００６８】
エクソン増幅用プライマーセット（Ex-Taq Primer）：
（１）エクソン１を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex1F2：5'-CTCCAACCAAGTACAGTGAA-3'（配列番号８）
2C9Ex1R1：5'-GAATCTAACATGCAAAGACCC-3'（配列番号９）
（２）エクソン２および３を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex2-3F1：5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3'（配列番号１０）
2C9Ex2-3R2：5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3'（配列番号１１）
（３）エクソン４を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex4F3：5'-TTGGTTCCTCTCTACTGGTTC-3'（配列番号１２）
2C9Ex4R2：5'-GCAGAAAAAACATTGATGAGGGAG-3'（配列番号１３）
（４）エクソン５を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex5F1：5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3'（配列番号１４）
2C9Ex5R1：5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3'（配列番号１５）
（５）エクソン６を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex6F2：5'-AAGAGCCTGATGAATGGAAT-3'（配列番号１６）
2C9Ex6R1：5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3'（配列番号１７）
（６）エクソン７を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex7F1：5'-GACTTACCCATGCCCCTTTG-3'（配列番号１８）
2C9Ex7R2：5'-ATCTGGAGAACACACACTGC-3'（配列番号１９）
（７）エクソン８を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex8F1：5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3'（配列番号２０）
2C9Ex8R1：5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3'（配列番号２１）
（８）エクソン９を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex9F1：5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3'（配列番号２２）
2C9Ex9R1：5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3（配列番号２３）
【００６９】
上記のプライマーペア（各０．２μＭ）、Ex-Taq（0.625 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan）、およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の当該エクソンを含む上述の増幅産物（得られた反応液６μｌ）を用いて、各エクソンを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬとした。また、ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間処理した後、「９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で２分間」を３０サイクルとし、その後、７２℃で７分間処理した。その後、得られた各反応液の５μＬに、PCR Product Pre-Sequencing Kit（USB Co.,Cleveland, OH, USA）に含まれるExonuclease I（０．２μＬ）、Shrimp alkaline phosphatase（０．２μＬ）、および精製水（１．６μＬ）を添加し、これを３７℃で１５分間および８０℃で１５分間処理し、その後４℃に冷却した。
【００７０】
次に、ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、各エクソンについてのシークエンス用のプライマーを、以下のとおり設計した。
【００７１】
シークエンス用プライマーセット：
（１）エクソン１を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex1F1：5'-GGAATGTACAGAGTGGACAATG-3'（配列番号２４）
2C9Ex1R2：5'-GACCCAAATCTTTCTCTACT-3'（配列番号２５）
（２）エクソン２を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex2-3F2：5'-TCTTGAACTCCTGACCTTGT-3'（配列番号２６）
2C9Ex2R1：5'-GGAGCTCTGTAAGTCTCTGT-3'（配列番号２７）
（３）エクソン３を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex3F1：5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3'（配列番号２８）
2C9Ex3R3s：5'-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3'（配列番号２９）
（353-362番目のアデニン塩基の欠失を確認するために使用）
（４）エクソン４を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex4F2：5'-CCTTTCCATCTCAGTGCCTT-3'（配列番号３０）
2C9Ex4R1：5'-GCCGTCTTTCCCAGATATTC-3'（配列番号３１）
（５）エクソン５を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex5F1：5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3'（配列番号１４）
2C9Ex5R1：5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3'（配列番号１５）
（６）エクソン６を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex6F1：5'-GCATGGAATAAGGGAGTAGG-3'（配列番号３２）
2C9Ex6R1：5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3'（配列番号１７）
（７）エクソン７を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex7F2s：5'-CCATGCCCCTTTGTTATTTG-3'（配列番号３３）
2C9Ex7R1：5'-AACACACACTGCCAGACACTAG-3'（配列番号３４）
（８）エクソン８を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex8F1：5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3'（配列番号２０）
2C9Ex8R1：5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3'（配列番号２１）
（９）エクソン９を配列決定するためのプライマーペア（１）
2C9Ex9F1：5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3'（配列番号２２）
2C9Ex9R1：5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3（配列番号２３）
（１０）エクソン９を配列決定するためのプライマーペア（２）
2C9Ex9F2s：5'-CTGCAGCTCTCTTTCCTC-3'（配列番号３５）
2C9Ex9R2s：5'-CGAATGTTCACTAGATCTTCAG-3'（配列番号３６）
【００７２】
上述のＰＣＲにより得られた増幅産物の両鎖につき、上記の各プライマーを用いて、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Version 3.1, Applied Biosystems, Foster City, CA）により直接塩基配列決定を行なった。すなわち、計７μＬのＰＣＲ増幅産物に、１μＭのプライマー（１．６μＬ）、BigDye（Ver.3.1）（２μＬ）、５×Sequencing buffer（３μＬ）、および精製水（６．４μＬ）を添加して合計２０μＬとし、「９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間」を２５サイクル行い、その後、４℃に冷却した。過剰な色素をDyeEx96 plate（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて反応産物から除去し、全量２０μＬの溶出液を、ABI Prism 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems）を用いて分析した。その際、溶出液について、９４℃で２分間のヒートショックを行った。
【００７３】
その結果、配列決定した６０例のゲノムＤＮＡのうちの１例から、配列番号１中の第３５３１〜３５４０残基（配列番号２中の第３５３〜３６２残基）の欠失が見出された。この１０ヌクレオチドの欠失によりフレームシフトが生じ、その結果、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質のアミノ酸配列中、第１１８残基からのアミノ酸が置換され、さらに第１２６番目のコドンが終止コドンとなるため、それ以降のアミノ酸残基が欠失する。ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は４９０個のアミノ酸からなるため、この１０ヌクレオチド欠失により、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の約７４％のアミノ酸残基が欠失することとなる。特に、欠失するＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の第１２６〜４９０アミノ酸残基には、酵素活性に必須の基質認識部位およびヘム結合部位が存在するため、上記の１０ヌクレオチド欠失によりＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の機能は消失する。従って、上記１０ヌクレオチド欠失は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の基質となる薬物の濃度上昇を招くことから、該薬物による副作用を増強するものと考えられる。
【配列表】
2006121999000001.app