(57)【要約】【課題】タンパク質やRNAなどの生体高分子のハイスループットな試験管内合成反応法のシステム技術を開発する。【課題を解決するための手段】  鋳型物質を原料にする合成系であって、以下の手段、その制御手段、又はその組合せを含むことを特徴とする無細胞系合成システム；１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応系に導く。２）合成速度の略低下前後又は合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応系を合成反応系外におき溶液の希釈処理をする。３）希釈処理に続いて、濃縮処理を行う。４）反応系を合成反応系に戻す。又は１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応に導く。２）合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応系を合成反応系外におき溶液を濃縮処理する。３）濃縮処理に続いて希釈処理を行う。４）希釈された反応系を合成反応系に戻す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型物質を原料にする合成系であって、以下の手段、その制御手段、又はその組合せを含むことを特徴とする無細胞系合成システム；
１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応に導く。
２）合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液を希釈処理する。
３）希釈処理に続いて濃縮処理を行う。
４）濃縮された反応系によって合成反応をおこなう。
又は
１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応に導く。
２）合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液を濃縮処理する。
３）濃縮処理に続いて希釈処理を行う。
４）希釈された反応系によって合成反応をおこなう。
【請求項２】
濃縮処理で、副産物を反応系外に除去する請求項１のシステム。
【請求項３】
希釈処理で、基質、エネルギー源及び／又は鋳型物質の反応系内への補充が行われる請求項１又は２のシステム。
【請求項４】
１）〜４）の手段を複数回繰返すことを特徴とする請求項１のシステム。
【請求項５】
鋳型物質が、転写鋳型である請求項１〜４の何れか一に記載のシステム。
【請求項６】
鋳型物質が、翻訳鋳型である請求項１〜４の何れか一に記載のシステム。
【請求項７】
反応溶液が、細胞抽出物を含む請求項６のシステム。
【請求項８】
請求項５のシステムで得られる転写産物産生系と請求項６又は７のシステムで得られる翻訳産物産生系を組合わせる無細胞系合成システム。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成方法。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成用装置。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成方法に用いる試薬の少なくとも１を含む合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型物質からの無細胞系合成システムに関する。さらに詳しくは、鋳型物質を原料にして物質を合成するに際して、合成反応の最大の効率化のためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やRNAなどの生体高分子を生体外で合成する手段として、それらの反応に必要な基質、イオン類、緩衝液、細胞抽出液、及び重合酵素を試験管内に調製し反応をおこなう、いわゆるバッチ方式が古くから利用されてきた。しかしこのバッチ反応法は、その反応原理に起因するものとして、反応の進行に伴う基質濃度の低下と、リン酸やピロリン酸などの副生成物の濃度上昇などのため、合成反応が短時間のうちに停止し、その結果、目的の生成産物量が低いという大きな限界があった。旧ロシアのA. Spirinらは、限外ろ過膜、透析膜、又は樹脂に翻訳鋳型を固定化したカラムクロマトグラフィー法等を利用することによって、アミノ酸やATP、GTPなどのエネルギー源及び基質の連続的な供給と同時に連続的な目的生成物および副生成物の反応系からの除去を可能とさせる連続式無細胞タンパク質合成法を発表している（非特許文献１）。しかし、これらの半透膜や限外ろ過カラムを用いる連続法は、複雑な装置の組立が必要とされ、さらに処理が煩雑なことから充分な経験も必要とされた。そして、この方式は同時に反応システムの自動化においても大きな難点となっていた。
【０００３】
遠藤らは、これらの問題を解決する方法として、半透膜を用いることなく基質の供給と副産物の除去を連続的におこなうことが可能な、接触界面拡散法を発明している（特許文献１）。この方法により、特別な反応装置を用いることなく大量のタンパク質を合成することが可能となった。しかし、該方法は、分子の拡散原理にもとづいているために、必要量のタンパク質を合成するために長時間を要するという欠点があり、その解決がまたれていた。
【０００４】
さらに、試験管内におけるRNA合成法、とりわけ、無細胞タンパク質合成反応に必須な翻訳鋳型であるmRNAのハイスループット合成法においてもタンパク質の無細胞合成法に見られる問題点が課題として残されていた。遠藤等はRNAの合成法の研究として、透析膜を利用する連続合成法を開発し、この方式がバッチ法の性能を大幅にうわまわる極めて合成収量の高いRNA合成法であることを見出している（特許文献２）。しかし、この半透膜等を用いるRNA連続合成法は、複雑な装置の組立が必要であり、そして処理が煩雑なことから充分な作業経験も必要とされた。さらに、この方式は反応システムの自動化においても大きな難点となっていた。
【０００５】
ポストゲノム時代の今日のタンパク質やRNAなどの生体高分子のハイスループット合成法に要求される要件としては、以下が考えられる。１）短時間内に大量合成が可能であること、２）短時間内に多種類の分子が合成可能であること、及び３）単純原理にもとづき、反応装置の自動化に向けた要素技術となり得ること、などである。特に、１）及び２）の要件は、単に合成の低価格化の観点からのみならず、比較的不安定な物性を持つタンパク質の活性を保有した状態で調製するために極めて重要である。
【特許文献１】WO02/24939
【特許文献２】WO01/27260
【非特許文献１】Spirin, A.  et al. (1993) Meth. in Enzymol., 217, 123-142）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、半透膜などの複雑な装置を利用する連続式合成法の原理とは完全に異なった、タンパク質やRNAなどの生体高分子のハイスループットな試験管内合成反応法のシステム技術を提供することである。このことによって、遺伝子産物であるRNAやタンパク質などの構造・機能の解析のための網羅的調製や大量生産を簡便且つ効率的に行うことのできる自動合成装置開発に利用しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、書面の走査位置またはその直前（直後）を常に目視可能とするため、書面に垂直な方向に対して傾斜した光路で受光することを最も主要な特徴とする。
【０００８】
すなわち本発明は以下のとおりである。
１．鋳型物質を原料にする合成系であって、以下の手段、その制御手段、又はその組合せを含むことを特徴とする無細胞系合成システム；
１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応に導く。
２）合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液を希釈処理する。
３）希釈処理に続いて濃縮処理を行う。
４）濃縮された反応系によって合成反応をおこなう。
又は
１）鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応に導く。
２）合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液を濃縮処理する。
３）濃縮処理に続いて希釈処理を行う。
４）希釈された反応系によって合成反応をおこなう。
２．濃縮処理で、副産物を反応系外に除去する前項１のシステム。
３．希釈処理で、基質、エネルギー源及び／又は鋳型物質の反応系内への補充が行われる前項１又は２のシステム。
４．１）〜４）の手段を複数回繰返すことを特徴とする前項１のシステム。
５．鋳型物質が、転写鋳型である前項１〜４の何れか一に記載のシステム。
６．鋳型物質が、翻訳鋳型である前項１〜４の何れか一に記載のシステム。
７．反応溶液が、細胞抽出物を含む前項６のシステム。
８．前項５のシステムで得られる転写産物産生系と前項６又は７のシステムで得られる翻訳産物産生系を組合わせる無細胞系合成システム。
９．前項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成方法。
１０．前項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成用装置。
１１．前項１〜８の何れか一に記載のシステムを利用する鋳型物質からの無細胞系合成方法に用いる試薬の少なくとも１を含む合成キット。
。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、高品質のタンパク質を短時間に効率よく合成することが可能であり、ならびに、目的タンパク質の単離にも極めて有効である。また、本発明の原理はインビトロでのＲＮＡの効率的な合成にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、鋳型物質を原料にする一般的なバッチ式もしくは拡散連続バッチ式の、反応速度の高い合成反応初期相の特性を最大限に利用することを特徴とする合成法である。
【００１１】
その手段は、合成速度の略低下前後又は合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液の希釈処理又は濃縮処理を行う。この希釈処理又は濃縮処理で、鋳型物質を原料とする合成に必要とされる基質、エネルギー源、イオン類、緩衝液及び鋳型物質などの成分が補充又は濃縮される。
この希釈又は濃縮された反応溶液は、ついで、希釈された場合は濃縮処理、濃縮処理された場合は希釈処理をする。この処理で、反応溶液は元の反応至適濃度にもどされる。該濃縮処理で、反応溶液中成分が除去もしくは分離され、反応産物及び/又は反応副産物は、回収及び/又は除去がなされる。該濃縮又は希釈によって合成反応の各要素は再び至適濃度に調製される。そして、この希釈及び濃縮処理は、不連続に繰り返しおこなうことで、大量のタンパク質を合成可能とする。本発明は、鋳型物質による合成反応を、希釈及び濃縮を不連続に繰り返し行う合成法を原理とするものである。
【００１２】
本発明において、鋳型物質を原料にする合成系の一は、mRNAを鋳型とするタンパク質の翻訳合成系、特に細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を細胞から取り出し利用するタンパク質合成用細胞抽出液を使う無細胞タンパク質合成系である。その他の一は、RNAポリメラーゼを酵素として用いる転写鋳型による試験管内転写反応によるRNA合成系を意味する。
【００１３】
（無細胞タンパク質合成系）
無細胞タンパク質合成系のなかでも、コムギ胚芽抽出物を利用したものは、大腸菌抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系に比べて特に核酸分解酵素活性が低く、さらに、翻訳活性が安定で且つ高い特性を持っている（Ｍａｄｉｎ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，５５９−５６４）ため、プラスミドを鋳型とした転写・翻訳系で高効率のタンパク質合成が可能である（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８）。以下、本発明においては、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系及び該合成系において機能し得る転写鋳型の合成法を例として説明するが、本発明の基本原理は他の微生物や動物細胞由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系及びそれに用いる転写鋳型の合成系にも応用できる。
【００１４】
（細胞抽出物）
細胞抽出物の市販品としては、大腸菌由来のE.coli  S30  extract  system(Promega)、RTS  500  Rapid  translation  System(Roche)、ウサギ網状赤血球由来のRabbit  Reticulocyte  Lysate  System(Promega)、小麦胚芽由来のProteios(TM)(TOYOBO)等がある。このうち特に植物種子由来の胚芽抽出物を用いることが好ましく、小麦、大麦、稲、コーン、ほうれん草の種子等が例示され、小麦胚芽抽出液を用いる系が最適である。
【００１５】
（無細胞タンパク質合成系）
ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。
【００１６】
（コムギ胚芽抽出液）
本発明の細胞抽出物含有液としては、このうちコムギ胚芽抽出液を用いたものが好適である。
【００１７】
コムギ胚芽抽出液の調製法としては、コムギ胚芽の単離方法として、例えばJohnston,F.B.et al.,Nature, 179,160-161(1957)に記載の方法等が用いられ、また単離した胚芽からの細胞抽出物含有液の抽出方法としては、例えば、Erickson,A.H.et al.,(1996)Meth.In Enzymol., 96,38-50等に記載の方法を用いることができる。その他、特願２００２−２３１３９、特願２００２−２３１３４０の方法が例示される。
【００１８】
本発明で好適に利用される胚芽抽出物は、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、mRNA、tRNA、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
【００１９】
上記胚芽抽出物は、細胞抽出物含有液由来および必要に応じて別途添加されるタンパク質を含有する。その含有量は、特に限定されないが、凍結乾燥状態での保存安定性、使い易さ等の点から、凍結乾燥前の組成物おいて、当該組成物全体の好ましくは1〜10重量%、より好ましくは2.5〜5重量%であり、また、凍結乾燥後の凍結乾燥組成物において、当該凍結乾燥組成物全体の好ましくは10〜90重量％、より好ましくは25〜70重量％である。なお、ここでいうタンパク質含有量は、吸光度（260, 280, 320 nm）を測定することにより算出されるものである。
【００２０】
（微生物の除去）
細胞抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を除去しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の除去手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が除去可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。
【００２１】
さらに、細胞抽出物含有液の調製工程の何れかの段階において低分子合成阻害物質の除去工程、および／または還元剤濃度の低減工程を加えることにより特定の効果を有する無細胞タンパク質合成を行うための細胞抽出物含有液とすることができる。
【００２２】
（細胞抽出物含有液から低分子合成阻害物質の除去方法）
細胞抽出物含有液は、タンパク質合成阻害活性を有する低分子の合成阻害物質（以下、これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含んでおり、これらを取り除くことにより、タンパク質合成活性の高い細胞抽出物含有液を取得することができる。具体的には、細胞抽出物含有液の構成成分から、低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画除去する。低分子合成阻害物質は、細胞抽出物含有液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子のうち最も小さいもの以下の分子量を有する分子として分画することができる。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものとして分画、除去し得る。
【００２３】
低分子合成阻害物質の細胞抽出物含有液からの除去方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には、透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。
【００２４】
透析による低分子合成阻害物質の除去操作に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の除去分子量を有するものが挙げられる、具体的には除去分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（Viskase Sales,Chicago製）や、除去分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（SPECTRUM LABOTRATORIES INC.,CA,USA製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の細胞抽出物含有液等を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
【００２５】
（細胞抽出物含有液の安定化）
低分子合成阻害物質の除去を行う際、細胞抽出物含有液に不溶性成分が生成される場合には、この生成を阻害する（以下、これを「細胞抽出物含有液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液のタンパク質合成活性を高めることができる。細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液の安定化の具体的な方法としては、上述した低分子合成阻害物質の除去を行う際に、細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液として行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
【００２６】
これらの成分は、予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の除去工程に供してもよいし、低分子合成阻害物質の除去に透析法を用いる場合には、透析外液にも安定化成分を添加して透析を行って低分子合成阻害物質の除去を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
【００２７】
安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、細胞抽出物含有液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出物含有液に添加し、適当な時間の後に低分子阻害物質の除去工程を行い、取得された処理後細胞抽出物含有液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出物含有液を用いて無細胞タンパク質合成を行い、タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上述の選択方法において、細胞抽出物含有液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出物含有液中の不溶性成分量や、得られた細胞抽出物含有液のタンパク質合成活性等により選択する方法も挙げられる。
【００２８】
このようにして選択された細胞抽出物含有液の安定化条件の例として、具体的には、透析法により低分子合成阻害物質の除去工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出物含有液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、細胞抽出物含有液のタンパク質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
【００２９】
また、低分子合成阻害物質の除去を細胞抽出物含有液として調製した後に行えば、上記安定化成分を細胞抽出物含有液にさらに添加する必要はない。
【００３０】
（ｍRNAの調製）
鋳型物質としてのmRNAは、目的タンパク質をコードするものであれば、その調製法を制限されるものではなく、自体公知の如何なる方法も用いることができる。無論、本発明の手段によって鋳型物質としてのDNAから調製されたもの、さらには、これを一連の系の中で連続的に使用することが特に好ましい。
【００３１】
（翻訳反応用溶液の調製）
mRNAからタンパク質の合成は、リボゾームを含むタンパク質合成用細胞抽出液に、基質となるアミノ酸（20種の必須アミノ酸又は目的に応じたアナログもしくは変異体アミノ酸を用いる）、エネルギー源（ATP及び/又はGTP）、必要に応じて各種イオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン等）、緩衝液（HEPES-KOH、Tris-酢酸等）、ATP再生系（ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合せ、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼの組合せ等）、核酸分解酵素阻害剤（リボヌクレア-ゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター等）、tRNA、還元剤（ジチオスレイトール等）、ポリエチレングリコール、3',5'-cAMP、葉酸、抗菌剤（アジ化ナトリウム、アンピシリン等）等の翻訳反応に好適な成分を含有する溶液（翻訳反応溶液）を無細胞タンパク質合成手段に適した濃度に添加し、これに翻訳鋳型のmRNAを添加して、翻訳反応液を調製する。この翻訳反応液を翻訳反応に適した温度に調製して、翻訳反応をおこない、目的とするタンパク質を合成する。
【００３２】
（転写反応）
転写鋳型は、本発明者が既に報告する汎用性ある鋳型分子の構築法（WO  01/27260、02/18586）に準じて調製すればよく、例えばプラスミドベクターpEUに所望の構造遺伝子を導入し、SP6RNAポリメラーゼ処理で転写を行う方法等が好適に例示されるが、無論mRNAの調製法はこれに限定されない。転写鋳型を、転写鋳型中のプロモーターに適合するRNAポリメラーゼやRNA合成用の基質（4種類のリボヌクレオシド三リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液（転写反応溶液ともいう）と混合し、これを約20〜約60℃、好ましくは約30〜約42℃で、約30分〜約16時間、より好ましくは約2〜5時間インキュベートして転写反応をおこなう。
【００３３】
（合成反応）
本発明の無細胞系合成システムにおいては、以下の手段、手段の制御、又はこれらの組合せを含むシステムが遂行される。
必須の手段の１は、鋳型物質、基質、及び反応溶液を接触させて合成反応系に導くことである。前記記載の鋳型物質、基質、及び反応溶液（転写反応溶液又は翻訳反応溶液）を至適濃度及び至適温度に調製し、最適な合成反応を行う。合成反応は、通常、約10分〜2時間、より好ましくは20分〜1時間行う。この時間は、各系に応じて変更可能であり、実験的繰り返しにより最適時間は調製可能である。本発明の、不連続繰り返し合成法にあっては、特にこのワンクールの処理時間は比較的短持間であることが好ましい。
【００３４】
（希釈又は濃縮）
必須の手段の２は、上記反応時間として、合成速度の略低下前後又は合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応系に対して希釈又は濃縮することである。合成速度の略低下前後とは、経時的にmRNA又はタンパク質の時間当たり合成量が、最大量から減少傾向がみえるタイミングを意味し、一般には点ではなく線として理解される。また、合成反応の略停止前後とは、合成量が実質的に検出できない程度に落ちたレベルをいうが、この場合も一般には点ではなく線として理解される。それらの途上とは、合成速度が低下をはじめ、合成反応が停止するまでの間をいう。なお、より好ましい合成効率を得るためには、合成速度の略低下前後に反応系に対して希釈又は濃縮処理をおこなうことである。この時間としては、最適には10分〜1時間である。
【００３５】
反応系に対する希釈又は濃縮は以下のように行われる。
希釈は、反応系に約1〜20倍、好ましくは約2〜10倍容量の水溶液を添加して行う。水溶液には、鋳型物質、基質、反応溶液を所望により含有させる。特に好適には、鋳型物質、基質、エネルギー源等を含む溶液が用いられる。各成分の添加濃度は、次の処理の濃縮後に合成至適濃度に調製されるべく選択される。この希釈によって、反応系は著しくその合成能力は低下された状態となる。この状態をもって、本発明は不連続と呼ぶ。
濃縮は、自体公知のあらゆる濃縮手段を利用可能である。好適には、限外ろ過膜を使ったろ過処理、遠心分離機による処理、ゲルろ過処理、液相もしくは気相に圧力差を発生させる方法等が例示される。この処理にあっては、膜の通過口径を調節することで、遠心分離操作、或は分子篩によって、反応産物、反応副産物を分離・除去する。膜の分子量カットサイズ、遠心速度、ゲルろ過条件は、自体公知の処理目的産物の物性によって最適調製可能である。本発明では、好適には10,000〜100,000  Daの分子量カットの膜が好適に利用される。この濃縮処理で、反応溶液は、元の容量の1/5〜2/3容量にまで濃縮され、その結果、各合成因子の合成至適濃度が大きくずれることとなる。この濃縮によって、反応系は著しくその合成能力は低下された状態となる。この状態をもって、本発明は不連続と呼ぶ。
【００３６】
（合成反応の再活性化）
必須の手段の３は、合成反応の再活性化である。前段階で希釈処理されたものは濃縮され、濃縮処理されたものは希釈処理が施される。
前者の場合、希釈処理に続いて、濃縮処理を行う。ここで濃縮とは、希釈によって増量された反応系の液量を、元の液量に戻すことを意味する。濃縮手段は、特に限定されるものではなく、自体公知のあらゆる濃縮手段を利用可能である。好適には、限外ろ過膜を使ったろ過処理、遠心分離機による処理、ゲルろ過処理、液相もしくは気相に圧力差を発生させる方法等が例示される。この処理あっては、膜の通過口径を調節することで、遠心分離操作、或は分子篩によって、反応産物、反応副産物を分離・除去する。膜の分子量カットサイズ、遠心速度、ゲルろ過条件は、自体公知の処理目的産物の物性によって最適調製可能である。本発明では、好適には10,000〜100,000  Daの分子量カットの膜が好適に利用される。
後者の場合、濃縮処理に続いて、希釈処理を行う。ここで希釈とは、濃縮によって減量された反応系の液量を、元の液量に戻すことを意味する。希釈水溶液には、鋳型物質、基質、反応溶液を所望により含有させる。特に好適には、鋳型物質、基質、エネルギー源等を含む溶液が用いられる。各成分の添加濃度は、希釈後に合成至適濃度に調製されるべく選択される。
【００３７】
かくして、反応系の至適濃度に復活した反応系は、再び温度を反応至適温度に調製され、反応系が再活性化される。至適温度は、１５〜２５℃である。
【００３８】
なお、反応産物及び/又は反応副産物の分離・回収・除去等のためには、処理対象物との親和性に基づく処理も好適に実施可能である。親和性に基づくとは、親和性物質を固定化しておき、これと目的物質を接触させて結合させ、その後目的物質を溶離・回収する方法が例示される。親和性物質とは、例えば回収物質がタンパク質であれば、タンパク質に対する抗体、受容体に対するリガンド、転写因子に対する核酸等が例示される。なお、目的産物を適当なタグ・マーカーで修飾し（例えば、ストレプトアビジン、ヒスチジンタグ、GST,マルトース等）、この修飾物質と特異的に結合しうる物質（例えば、ビオチン、2価金属イオン、グルタチオン、マルトース等）を使って精製することも可能である。
【００３９】
本発明では、希釈及び濃縮の処理を不連続に複数回繰返すことが可能であり、この繰り返しによって、無細胞合成系の再生を複数回達成する。この再生により、タンパク質の大量合成が達成されるのである。
【００４０】
本発明では、希釈及び濃縮の処理を、一連の工程として制御手段と組合わせて遂行可能である。この制御のためには、駆動源（モータ、空圧・油圧機器、その他の動作制御可能なアクチュエータ等）及びコンピュータ制御による制御回路、シーケンス制御回路等により、動作のオン・オフ、動作の程度、動作スピード、動作間隔が調節される。また、信号転送用ドライバー、動作確認用センサー、動作制御用スイッチ、タイマー等は適宜所望により装備可能である。
【００４１】
本発明は上記説明のように、希釈と濃縮を不連続に複数回繰返すことによって、無細胞合成系の再生を達成するものであるが、より具体的にその効果を説明すると以下となる。
【００４２】
（希釈濃縮バッチ式無細胞タンパク質合成法）
本合成法では、合成反応容器は、従来使用されてきた限外ろ過膜や透析膜を装着した濃縮を可能とする容器をバッチ反応容器として合成反応を開始することが可能である。無細胞タンパク質合成手段を使い至適条件下タンパク質の合成反応後、例えば合成反応停止の前後に、反応系を再活性化するために、基質やエネルギー源となるアミノ酸、ATP, GTP,の他緩衝液やイオン類などタンパク質合成に必要とされる成分（Madin K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA  (2000), 97, 559-556に記載した透析外液のことで以下基質溶液と略す）及び鋳型物質のmRNAを含む溶液を、反応液の１から２０倍容量に一度に添加し、希釈する（希釈処理）。その後、反応容器を例えば遠心機にかけ遠心することによってろ過膜をとおして容器内の増加した溶液を排出させてもとの反応液容量に戻す（濃縮処理）。この濃縮処理は、遠心力によらず液相もしくは気相に圧力差を発生させることによっても可能である。この希釈及び濃縮処理によって、新鮮な基質溶液を反応系に供給すると同時に、合成反応で生じた翻訳反応を阻害する副生成物質を排除することができる。このように例えば合成反応の停止前後におこなう基質等を含む溶液による反応液の希釈と濃縮を不連続に繰り返すことによって、反応系の再活性化が達成され、長時間にわたってタンパク質の合成が可能となる。この方法はSpirinらの開発した半透膜を使い連続的に基質、エネルギー源の補給と代謝産物の廃棄をおこなう、いわゆる連続法とはその原理を異にし、その合成の効果は、数十から数千倍に達する（本発明の方法では、半透膜をつかった方法で約30時間かけて得られる生産量を約2〜3時間で得られる）もので質において大きな差異をもつ。なお、本原理を用いるタンパク質合成手段において、使用するろ過膜の分画分子量サイズを選択することによって、副生成物の排除と同時に合成タンパク質を選択的に反応系から分画単離することを可能となる。すなわち、本原理を利用することによって、タンパク質の合成と合成産物の精製が同時に可能となる。なお、同様の効果は、濃縮を行った後に希釈を行う順序を変えた場合にも達成可能である。
【００４３】
（希釈濃縮バッチ試験管内RNA合成法）
ファージRNA合成酵素を用いる一般的なRNA合成反応液組成、反応方法および合成RNAの分析方法は、WO01/27260及びWO02/18586に記載した方法に準じた。本発明合成法では従来の限外ろ過膜や透析膜を装着した濃縮を可能とする容器をバッチ反応容器として合成反応を開始することが可能である。使用する限外ろ過膜の分画分子量はRNAが通過しないサイズを選ぶ。合成反応停止の前後に、基質となる４種類のリボヌクレオチド三リン酸、イオン類や緩衝液などのRNA合成に必要とされる成分を含む溶液（WO01/27260及びWO02/18586に記載した方法に準じて調製した透析外液のことで以下RNA基質溶液と略す）を、反応液の１から２０倍容量を添加し希釈する。反応容器を遠心機にかけ遠心することによってろ過膜をとおして容器内の増加した溶液を排出させ、もとの反応液容量に濃縮する。この過程の処理は遠心力によらず液相もしくは気相に圧力差を発生させることによっても可能である。これら処理によって、新鮮な基質溶液を反応系に供給すると同時に、バッチRNA合成反応で生じたモノヌクレオチドとピロリン酸を系から排除することによって、化学平衡の原理によって事実上停止していたRNA合成反応を、平衡をずらすことによって再開せしめる。この反応停止前後におこなう基質による反応液の希釈とろ過濃縮を繰り返すことによって、長時間にわたるRNA合成が可能となる。この方法は先に遠藤らが発明した透析法によるRNA連続合成法（WO00/68412）とはその原理を異にする。本原理を用いるタンパク質合成手段において、合成後の反応液を水（あるいは所望する溶液）による希釈とろ過膜等を介した濃縮を繰り返すことによって、ヌクレオチド類、緩衝液成分やイオン類を含まないRNAを水（又は目的とする成分を含む溶液）として回収することができる。すなわち、この方法においては、鋳型となるDNA分子種を選択することによって、高速に、高収量且つ低価格（高価であるRNA合成酵素の使用量は通常のバッチ系で必要とされる量しか用いないので）で所望するmRNAを溶液として調製することが可能となる。
なお、同様の効果は、濃縮を行った後に希釈を行う順序を変えた場合にも達成可能である。
【００４４】
以下で本発明を実施例及び実験例によって説明する。これらは、最良態様の一例を示すもので本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４５】
（無細胞タンパク質合成法）
１）DNAからmRNAの反応（転写反応）
転写反応溶液〔最終濃度、８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１６ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  スペルミジン、２．５ｍＭ  ４ＮＴＰｓ（４種類のヌクレオチド三リン酸）、０．８Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤、０．１μｇ／μｌ  ＤＮＡ〔プラスミドＧＦＰ（Green fluorescent protein）〕、１．６Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ〕を調製し、３７℃で３時間反応させた。反応後4℃にて１２，０００rpm１時間遠心を行い、遠心後上清を集め、これにエタノール終濃度約７０％、酢酸アンモニウムを終濃度約０．２７Ｍになるように加え、４℃１０分氷上で静置後３、０００rpm３０分間遠心した（エタノール沈殿）。このエタノール沈殿を３回行った後、適量の透析バッファー（最終濃度、３５ｍＭ  HEPES-KOH  pH７．８、３．１ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０３ｍＭ  酢酸カリウム、１６ｍＭ  クレアチン、１．２ｍＭ  ATP、 ０．２６ｍＭ  GTP、 ２．５ｍＭ  DTT、０．４３ｍＭ  スペルミジン、０．３ｍＭの各種アミノ酸）でRNA濃度が約５〜１０ｍｇ/ｍｌになるように調製した。
また、本発明による、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作によるmRNA合成は実験例７にしたがって行った。
２）翻訳反応用溶液の調製
胚芽抽出液を、翻訳反応溶液〔最終濃度３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１０３ｍＭ  酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）、３．１ｍＭ  酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＯＡｃ）２）、１６ｍＭクレアチンフォスフェート、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２６ｍＭ  ＧＴＰ、  ２．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．４３ｍＭ  スペルミジン、０．３ｍＭ  ＡＡｓ（２０種類のＬ型アミノ酸の混合物）、１．０３ｍｇ/ｍｌ  クレアチンキナーゼ〕を用い、翻訳反応時における胚芽抽出液の濃度（Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ）が４０から１２０になるように調製して使用した。
３）翻訳反応
上記胚芽抽出液を含む翻訳反応溶液に上記調製したｍＲＮＡ溶液を、胚芽抽出液の翻訳反応時における濃度に応じて添加して反応を行った。すなわち、胚芽抽出液の翻訳反応時におけるＯ．Ｄ．２６０ｎｍが100の場合の添加するmRNA量を０．８ｍｇ/ｍｌとし、比例計算にて加えるｍＲＮＡ量を調製した。
上記調製した反応溶液を２０℃で反応させた。反応開始から一定経過後（１０分〜３時間）に２〜３倍容量の上記翻訳反応液を用い反応溶液を希釈し、次いで分子量カット30,000Ｄａの限外ろ過膜で濃縮して、反応溶液を希釈前と同量に戻した。この操作を複数回繰返した。或は、先に約1/2〜1/3容量に濃縮し、その後上記翻訳反応液を用い元の容量に希釈した。
ｍＲＮＡをバッチ操作で翻訳反応溶液に追加添加する場合は、１）で調製した転写反応液（エタノール沈殿前のもの）、もしくはエタノール沈殿操作を経て調製したｍＲＮＡ溶液を、上記小麦胚芽液の濃度に応じて加え行った。
４）タンパク質合成効果の確認
合成タンパク質量の測定は、Madin K et al らの報告（Madin K. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA  (2000),  97, 559-556,）、に記載した方法に準じて行った。
５）コムギ胚芽抽出液の形態
なお、本検討で用いたコムギ胚芽抽出液、無細胞タンパク質合成反応液組成、mRNAの調製法、バッチ式無細胞タンパク質合成法は、Madin K et al.らの報告（Madin K. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA  (2000),  97, 559-556,）、特許第3255784号、特開平2000-236896号、WO00/68412号、Sawasaki T. et al.らの報告（ Proc. Natl.  Acad. Sci.  USA (2002),  99, 14652-14657）に記載した方法に準じて調製した。
【００４６】
（装置例）
本発明の希釈及び濃縮操作を複数回可能にし、また合成反応を不連続に行うための系の模式図を図４に示した。希釈及び濃縮操作をろ過膜と送液ポンプとを有するような構成で実現される場合、たとえば、図４に模式的に示すような機構の利用が例示される。ろ過膜を有するろ過濃縮器１と、送液ポンプ２とを組み合わせた機構を利用することで、反応槽３内での翻訳反応の終了の前後に（ＲＮＡ）基質溶液で（転写または）翻訳反応液を稀釈した後に、ろ過濃縮器１によって副生成物をろ過し、容器６に排出する。一方、濃縮された（転写または）翻訳反応液を再び反応槽３に戻し、反応を再開せしめることが可能となる。
図４に示す系では、（ＲＮＡ）基質溶液を収容した容器４と反応槽３とがチューブＴ１、送液切換バルブ５およびチューブＴ２を介して連結され、この送液切換バルブ５に、チューブＴ３、送液ポンプ２、チューブＴ４、ろ過濃縮器１、チューブＴ５を介して反応槽３が連結される。このようにして、送液切換バルブ５が、（ａ）反応槽３内へ送液しない状態（バルブが閉じた状態）、（ｂ）送液ポンプ２の作動により、（ＲＮＡ）基質溶液を収容した容器４から、（ＲＮＡ）基質溶液を汲み上げて、直接反応槽３内へ送液し得る状態、（ｃ）送液ポンプ２の作動により、反応槽３内の（転写または）翻訳反応液を汲み上げ、ろ過濃縮器１を通過させた後に反応容器３内に戻すように（転写または）翻訳反応液を循環させ得る状態、（ｄ）送液ポンプ２の作動により、基質溶液を収容した容器４から、（ＲＮＡ）基質溶液を汲み上げてろ過濃縮器１を通過させて反応槽３内へ送液し得る状態、の各状態を適宜切換え得るようにした構成とする。
【００４７】
かかる構成を用いて、以下の手順にて操作を行う。
１．反応槽３内で、バッチ反応による（転写または）翻訳反応を行う。この間は、送液切換バルブ５を閉じ〔上記（ａ）の状態〕、送液ポンプ３も停止し、反応槽３内への送液を停止状態とする。
２．（転写または）翻訳反応が停止する前後にいずれかの時点で送液切換バルブ５を切換え〔上記（ｂ）の状態〕、送液ポンプ２を作動させて、（ＲＮＡ）基質溶液を反応槽３内に供給し混合する。
３．送液切換バルブ５を切換え〔上記（ｃ）の状態〕、送液ポンプ２を作動させて反応槽３内の（転写または）翻訳反応液を汲み上げて、ろ過濃縮器１を通過させ、副生成物を容器６に排出するとともに、濃縮された反応液を反応槽３内に戻すように循環させる。
４．送液切換バルブ５を切換え〔上記（ｄ）の状態〕、送液ポンプ２を作動させて容器４内の（ＲＮＡ）基質溶液を汲み上げて、ろ過濃縮器１を通して反応槽３内へと送液し、ろ過濃縮器１内に一部残った（転写または）翻訳反応液を反応槽３内へ洗い流し出す。
５．送液切換バルブ５を切換え〔上記（ｂ）の状態〕、送液ポンプ２を作動させて容器４内の（ＲＮＡ）基質溶液を汲み上げて、反応槽３内へと送液して、反応槽３内の（転写または）翻訳反応液量を元の容量にまで調製した後、送液切換バルブ５を切換えて〔上記（ａ）の状態〕送液を停止する。
６．１に戻り、上述した操作を繰り返す。
かかる系を利用した装置を実現する場合、用いる送液ポンプとしては、従来公知の適宜の送液ポンプを特に制限なく使用することができ、たとえばペリスタルチック式ポンプ〔たとえば、ＬＫＢ−Ｐｕｍｐ−ｐ１(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製)など〕などが例示される。また、ろ過濃縮器としても従来公知のものを特に制限なく使用することができる。具体的には、クロスフローろ過装置、VF05C2型（分子量３万カット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）などが例示される。
【００４８】
上記希釈及び濃縮手段をろ過膜と送液ポンプとを有するような構成で実現した装置によれば、遠心分離機を利用する場合と比較してタンパク質の合成収量が向上され（実験例４を参照。）、また、大規模容量の無細胞タンパク質合成が可能な装置を構築できる。さらに、小型の反応容器とろ過濃縮器とを組み合わせることで小容量型の装置の構築が可能であり、上述した副生成物除去手段としてろ過膜と遠心分離機とを有するような構成とは異なり、必ず装置が大掛かりなものとなるということがない。また、かかるろ過膜と送液ポンプとを有するような構成では、稀釈・濃縮過程の精密な制御が容易であり、種々の目的に合わせた一般的な無細胞タンパク質合成技術の自動化に向けた極めて重要な基幹技術となることが期待できる。
【００４９】
実験例１
図１に本発明の希釈及び濃縮処理を不連続に繰返すバッチ式無細胞タンパク質合成法の一例（実施例１）として、コムギ胚芽抽出液を用いた実験結果を示した。比較例は、バッチ法による従来の無細胞タンパク質合成法による結果である。縦軸は、合成タンパク質量（ｍｇ/ｍｌ）、横軸は、反応時間（時間）を示す。図１において、黒丸を結んだ線（●−●）が本発明の方法、白丸を結んだ線（○−○）が従来のバッチ法の結果である。合成反応には、40Ａ260nm/ml（小麦胚芽抽出液の波長260nmでの吸光度）の濃度の小麦胚芽抽出液と320μｇ/ｍｌのGreen fluorescent protein（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を混合し、２０℃で無細胞タンパク質合成をおこなった。
比較実験の合成反応は分画分子量３万の限外ろ過膜付き濃縮容器（カット分子量30,000kDa）を用いておこなった。従来法のバッチ反応方式においては、蛍光活性を指標としたタンパク質生成量の時間変化は典型的なハイパボリック型を示す。すなわち、反応開始初期における最大速度相を経て反応速度は低下し、反応が停止にちかづく３時間以降においては長時間の保温によっても合成タンパク質量の増加は見られない（○-○）。この結果はこれまでの報告とよく一致している（Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  (2000),  97, 559-556）。この反応停止の原因については完全に解明されているわけではないが、主にエネルギー源であるATPやGTP濃度の低下（エネルギーの枯渇）と、再生できない副生物であるAMPとGMPの蓄積が何らかの機作によってタンパク質合成を抑制しているものと考えられている。
本発明の合成反応は、限外ろ過膜を装着した容器内でおこない、反応速度が高く反応停止前にあたる反応開始２時間後に反応液量の３倍容量のタンパク質合成基質溶液（基質及びエネルギー源を含む）を添加し撹拌する（希釈処理）。次に遠心機によって遠心し、稀釈前の反応溶液容量にまでこの基質溶液で稀釈された溶液を濃縮した（矢じりの示す時点）（濃縮処理）。この希釈及び濃縮の一連の処理を不連続に複数回繰り返すことよって、副生成物を含む低分子物質は限外ろ過膜を介して排除され低濃度化され、一方合成反応で消費されたATP、GTP、アミノ酸は反応開始時のそれぞれの濃度近くにまで回復させた。この濃縮処理によって同時に、コムギ胚芽由来のリボソーム、tRNAやその他のすべての翻訳因子が反応開始時のもとの濃度に濃縮される。このような処理によって、いったん低下していたタンパク質合成反応が再開し、もとの高い初期速度を持つに至った後に、その後再び反応が低下することが確認できる（●-●）。このような不連続的な稀釈・濃縮処理を繰り返すことによって、初期反応速度の高い時間領域の特性を利用することが可能となり、高能率な無細胞タンパク質合成を達成した。図１に示したように、４回の稀釈・濃縮処理の繰り返しによって、ＧＦＰのバッチ方式での１ｍｌの反応容量当たり0.072 mgであった合成量が、0.41mgにまで上昇させることができた。なお、合成タンパク質量は、GFPの蛍光強度測定手技（蛍光極大波長508nm)に従い、1μｇ/ｍｌのGFPは蛍光強度は2.0であるとして計算した。
【００５０】
本処理によって十分な合成効率の達成がなされたが、稀釈及び濃縮処理の繰り返しに伴って、系のタンパク質合成速度が徐々に低下する現象が見られた。この原因として、胚芽由来の翻訳因子（群）のろ液への漏出あるいは限外ろ過膜への吸着等に起因する反応系内からの損失や、mRNAの分解或いは、限外ろ過膜への吸着等による濃度低下、などが推定された。
【００５１】
実験例２
図２は、コムギ胚芽抽出液の濃度を変えた以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った実験結果を示すグラフであり、縦軸は合成されたタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸は反応時間（時間）を示す。図２において、小さな黒丸を結んだ線（・−・）は、コムギ胚芽抽出液の濃度を６０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌ、ＧＦＰｍＲＮＡ濃度を４８０μｇ／ｍｌとした場合（実施例２）の実験結果を示し、大きな黒丸を結んだ線（●−●）は、コムギ胚芽抽出液の濃度を８０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌ、ＧＦＰｍＲＮＡ濃度を６４０μｇ／ｍｌとした場合（実施例３）の実験結果を示す。また図２において、矢尻は上記操作を行った時点を示す。
図２に示すように、実施例２において４回の希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作により無細胞系で合成されたタンパク質は反応液１ｍｌあたり０．６２ｍｇ、実施例３において４回の希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作により無細胞系で合成されたタンパク質は反応液１ｍｌあたり１．１３ｍｇであった。このように、本発明の無細胞タンパク質合成方法によるタンパク質合成量は、反応系の翻訳因子の濃度が高いほど多く、図１に示した従来のバッチ法の実験結果と比較すると著しく向上された。
【００５２】
実験例３
通常のバッチ法における合成速度の低下する時間は反応溶液中の基質濃度の減少および副生成物の蓄積濃度に依存することから、系の翻訳因子濃度と反比例の関係になる。すなわち、系の翻訳因子濃度（コムギ胚芽抽出液濃度）が高いほど反応停止に至る時間が短くなる（Madin Kら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 556-559）。そこで、翻訳因子を高濃度で用いる場合には、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行う時間の間隔を短くすることによって、高い合成速度を維持させることが可能であると考えられ、これによりタンパク質の単位時間内における生産効率を上昇させることが期待できる。
図３Ａは、コムギ胚芽抽出液の濃度を８０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌ、ＧＦＰｍＲＮＡの濃度を６４０μｇ／ｍｌとし、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行う間隔を変化させた以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った実験結果を示すグラフであり、図３Ｂは、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行う間隔の違いによる合成されたＧＦＰの量的差異を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動結果である。
図３Ａのグラフにおいて、縦軸は合成されたタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸は反応時間（時間）、矢尻は希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った時点を示す。また図３Ａにおいて、黒丸を結んだ線（●−●）は上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を反応開始より０．５時間間隔で行った場合（実施例４）の実験結果を示し、白丸を結んだ線（○−○）は上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を反応開始より１時間間隔で行った場合（実施例５）の実験結果を示している。図３Ａにおいて、矢尻は上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った時点を示す。
図３Ｂは、０．５時間の間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った実施例４と、２時間の間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った以外は実施例４と同様に行った場合（実施例６）とを比較して示している。なお図３Ｂにおける矢尻は、ＧＦＰの染色バンドを示している。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、各反応時間（実施例４では、反応開始より０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５時間経過時点、実施例６では、反応開始より０、２、４、６、８、１０、１２、１４時間経過時点）における反応液１μｌをポリアクリルアミド未変性ゲル電気泳動で分離後、タンパク質をクマシーブリリアントブルーにより染色した。
【００５３】
図３Ａ、Ｂに示すように、０．５時間の間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った実施例４は、１時間間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った実施例５、２時間間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った実施例６よりも単位時間あたりの収量が高い。実施例４では、２．５時間の反応で１ｍｌあたり１．１２ｍｇの合成量を得るが、これは同一濃度の反応液で、２時間間隔で上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行い１０時間反応させて得られた収量を上回る。この結果は、反応系の翻訳因子濃度（コムギ胚芽抽出液濃度）が高いほど短時間のうちにエネルギー源などの消費に伴う濃度低下と、同時に副生成物の蓄積濃度が高くなり、反応速度の低下と反応停止に至る時間が短くなることを直接的に示している。したがって、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作の時間設定にあたっては、反応系に含まれるコムギ胚芽抽出液濃度に依存した至適のタイミングを選ぶことによって、最大の合成収量を達成できる。
タンパク質は、その一般的な物性として不安定性（高い反応性）が挙げられる。したがって、高い品質のタンパク質を得るためには短時間で合成収量を高める技術を構築することが必須条件の一つとなり、図３に証明した本発明の原理は極めて有効なものといえる。
【００５４】
実験例４
図５は、図４に示したろ過膜と送液ポンプとを副生成物の除去に用いる構成を用いて、本発明の無細胞タンパク質合成方法にてタンパク質合成を行った（実施例７）実験結果を示すグラフである。縦軸は合成されたタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸は反応時間（時間）を示す。図５において、黒丸を結んだ線（●−●）が実施例７の実験結果を示し、白丸を結んだ線（○−○）が従来のバッチ法による方法の実験結果を示している。また図５において、矢尻は上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った時点を示す。
実施例７では、ろ過濃縮器としてクロスフローろ過装置（VF05C2型、Sartorius社製、分子量３万カット）を、また送液ポンプとしてはLKB-Pump-P1(Pharmacia社）を用いた。また８０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌの濃度のコムギ胚芽抽出液、６４０μｇ／ｍｌの濃度のＧＦＰｍＲＮＡを含有する以外は実施例１と同様の翻訳反応液を使用し、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を０．５時間間隔で行った。反応容器としては、目盛り付きプラスチック製チューブ（ファルコンチューブ）を用い、反応容量は１５ｍｌとし、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作における稀釈は４５ｍｌの容量の翻訳反応用溶液を用いて行った。
【００５５】
図５に示されるように、副生成物を除去するための手段としてろ過膜と送液ポンプとを有する構成を用いた場合には、実験例１〜３での限外ろ過膜と遠心分離機を利用した装置と同様に、本発明の無細胞タンパク質合成方法に好適に利用できることが確認された。実施例７では、４時間の反応によって反応容量１ｍｌあたり２．１ｍｇと、上記遠心機と限外ろ過膜を利用した装置を用いた場合よりも２倍程度高い合成収量でタンパク質が合成された。
【００５６】
実験例５
図６Aは、６０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌのコムギ胚芽抽出液、４５０μｇ／ｍｌのdihydrofolate reductase（ＤＨＦＲ）のｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いた以外は実施例１と同様の翻訳反応液を用い、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を１時間間隔で２回繰り返した以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った場合（実施例８）の実験結果を示す図である。比較実験として、従来のバッチ法である（希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行わない）以外は同様の条件にて無細胞タンパク質合成を行った。実施例８では、分子量約２０，０００ＫＤａのＤＨＦＲの無細胞系での合成に際し、カット分子量３０，０００Ｄａ（ミリポア社製）の限外ろ過膜を装着した反応容器を用いたものである。
図６Aにおいて、レーン１，２，３はそれぞれ、実施例８の０、１、２回の希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作による反応後の排出溶液（ろ液）、上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作と同様の時点における従来のバッチ法での反応液の各１μｌをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、クマシーブリリアントブルー染色した結果を示す（図中における矢尻は、合成産物であるＤＨＦＲを示す。）。図６A中の矢尻が示すＤＨＦＲのバンドの染色強度から判るように、従来のバッチ法による実験結果（各レーンの左側の「反応液」）では、反応１時間後に微量のＤＨＦＲの合成が確認されるのみであったが、実施例８の実験結果（各レーンの右側の「ろ液」）では、１回、２回の希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作によって、反応系で生成したＤＨＦＲがろ液に効率よく取り出せたことが確認できた。
【００５７】
実験例６
図６Bは、本発明の無細胞タンパク質合成方法にてＮ末端にストレプトアビジンを融合したＧＦＰ融合タンパク質を合成し（実施例９）、ＧＦＰ融合タンパク質を系外に単離する実験の結果を示す電気泳動図である。
本実験における無細胞タンパク質合成自体は、ＧＦＰ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを翻訳鋳型として用い、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を１時間間隔で４回行った以外は、実施例１と同様にして行った。ＧＦＰ融合タンパク質を系外に単離する操作は、まず、1ビオチンを固定化した磁性ビーズを反応溶液に添加し、生成した融合体産物をビオチンとストレプトアビジン間の親和性を利用して磁気ビーズに選択的に捕集する、2融合タンパク質を結合したビーズを磁石によって反応容器外へ選択的に取り出す、という手順にて行った。また、電気泳動および染色は、実験例５と同様に行った。
図６Bに示されるように、単離操作前の反応液中に検出される産物が本操作によって反応液中から消失し（単離後反応液レーンの矢尻）、磁気ビーズを介して効率よく系外に単離されることがわかる（単離産物レーンに示す合成産物）。
【００５８】
実験例７
図７は、本発明のＲＮＡ合成方法（実施例１０）と、バッチ法による従来のインビトロでＲＮＡを合成する方法との実験結果の違いを示す図である。図７において、図７左はバッチ法による従来の方法の結果を、図７右は本発明のＲＮＡ合成方法の結果を示し、矢印はＧＦＰをコードするｍＲＮＡ産物を示している。
それぞれ、クラゲのＧＦＰ遺伝子を、それぞれ小麦胚芽無細胞系専用プラスミドベクターｐＥＵに挿入したものを転写鋳型として、転写反応溶液〔最終濃度、８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１６ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  スペルミジン、２．５ｍＭ  ４ＮＴＰｓ（４種類のヌクレオチド三リン酸）、０．８Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤、０．１μｇ／μｌ  ＤＮＡ〔プラスミドＧＦＰ（Green fluorescent protein）〕、１．６Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ〕を調製し、３７℃で３時間反応させた。
実施例１０でのＲＮＡ合成反応は、反応開始３時間後に転写反応液に３倍量の上記転写反応用溶液を添加して稀釈した後、遠心分離機を用いて低分子をろ過膜を介して反応液系外に排除することによって、転写反応液をもとの濃度にまで濃縮した。その後、３時間の間隔で希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行い、合成反応を進行させた。各希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作時に、転写反応液を分取し、アガロースゲル電気泳動によって分離した転写産物（ｍＲＮＡ）をエチジウムブロマイド染色によって可視化した。
図７に示すように、従来のバッチ法によるインビトロでＲＮＡを合成する方法では、ＲＮＡ合成反応が３時間程度で停止するが、合成速度の高い３時間の反応の後に上記希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行っている実施例１０では、従来の方法の２．４倍の収量でｍＲＮＡを合成することができた。
【００５９】
実験例８
図８は、エタノール沈殿により純化したｍＲＮＡ、純化していないｍＲＮＡをそれぞれ翻訳鋳型として用いて、本発明の無細胞タンパク質合成方法を行った実験結果を示すグラフであり、縦軸は合成されたタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸は反応時間（時間）を示す。純化したmRNAは、実施例（無細胞タンパク質合成法）１）DNAからmRNAの反応（転写反応）に記載の方法に準じて調製した。純化していないmRNAは、実施例10に記載の方法で調製後12,000rpmにて1時間遠心後、上清を回収し調製した。図８において、黒丸を結んだ線（●−●）は、実施例10で合成したｍＲＮＡを含有する転写反応液を翻訳反応液に１：２の比率で加え、混合後、混合液と同量の透析緩衝液[３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１０３ｍＭ  酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）、３．１ｍＭ  酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＯＡｃ）２）、１６ｍＭ  クレアチンフォスフェート、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２６ｍＭ  ＧＴＰ、２．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．４３ｍＭ  スペルミジン、０．３ｍＭ  ＡＡｓ（２０種類のＬ型アミノ酸の混合物）]を加え希釈後、元の混合液の容量になるまで濃縮し、再び同量の透析緩衝液を加え、同じ操作をもう一度くりかえし、濃縮後クレアチンキナーゼを終濃度約1mg/mlになるように加えタンパク質合成反応を行った場合（実施例１１）の実験結果を示し、白丸を結んだ線（○−○）は、実験例７で合成したｍＲＮＡをエタノール沈殿して純化したものを用いて調製した翻訳反応液でタンパク質合成反応を行った場合（実施例１２）の実験結果を示す。実施例１１、１２では、上記のようなｍＲＮＡをそれぞれ４８０μｇ／ｍｌの濃度で用い、また６０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌの濃度のコムギ胚芽抽出液を用いたこと以外は、実施例４と同様にして行った。
図８に示すように、実施例１１，１２についてタンパク質合成速度を比較したところ、有意な差異は認められなかった。この結果より、本発明の無細胞タンパク質合成方法によれば、ｍＲＮＡを純化することなく転写後の転写反応液を用いて調製した翻訳反応液を用いて行う、簡便な無細胞タンパク質合成方法が実現可能となることが判った。
【００６０】
実験例９
図９は、実験例７の転写反応後の転写反応液を用いて調製した翻訳反応液にて本発明の無細胞タンパク質合成方法を行った実験結果を示すグラフであり、縦軸は合成されたタンパク質量（ｍｇ／ｍｌ）、横軸は反応時間（時間）を示す。図９において、上向きの矢尻は希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行った時点を示す。下向きの矢印は、転写反応後の転写反応液（mRNAを含む）の添加した時点を示す。
翻訳反応液は、８０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌのコムギ胚芽抽出液、転写反応後の転写反応液（ＧＦＰｍＲＮＡ９．６ｍｇを含む）を、実施例１と同様の翻訳反応用溶液１５ｍｌに添加し（ＧＦＰｍＲＮＡの最終濃度６４０μｇ／ｍｌ）、これを液量８ｍｌにまで濃縮した後に、上記翻訳反応用溶液による稀釈とこれに続く濃縮操作を行って翻訳反応液を調製し、翻訳反応を開始した。副生成物を除去する手段としては、図４に示したのと同様にろ過膜と送液ポンプとを有する構成を使用し、反応開始より4時間経過するごとにＧＦＰｍＲＮＡ（翻訳鋳型）の添加、そして30分間隔で基質及びエネルギー源を含む溶液による稀釈・濃縮を、不連続繰り返し操作で行った。
実験結果が示すように、ｍＲＮＡの追加によって、殆ど停止状態にあった翻訳反応が再開始することが確認できる。さらに、この稀釈・濃縮法とｍＲＮＡの追加を組み合わせることによって、長時間に亘ってタンパク質合成を持続させることが可能となることが判る。
【００６１】
以上の説明で明らかなように、反応速度の高い反応初期時間を選択し、希釈と濃縮の不連続繰り返し操作からなる本発明の無細胞タンパク質合成方法が、高品質のタンパク質を短時間に効率よく合成することが可能であること、ならびに、目的タンパク質の単離にも極めて有効であることが判る。また、この原理がインビトロでのＲＮＡの効率的な合成にも有用であることが判る。
さらに、この原理を応用するタンパク質やＲＮＡ合成法が、Ｓｐｉｒｉｎらの連続法にみられる種々の欠点、すなわち、装置としての複雑性、膜の低強度性、運転時における膜の目詰まり、操作の煩雑性などに起因する反応装置を解決できることを示した。加えて特に長時間の合成反応時間を要するという連続法の欠点は、単に時間の浪費だけに留まらず、生産されるタンパク質の品質確保の側面からも解決されなければならない大きな問題点として残されていたが、この欠点については重層法においても未解決の課題であった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
ここに発明した技術は、ポストゲノム時代のタンパク質研究に向けた基盤要素技術を提供することとなろう。特にＲＮＡやタンパク質などの構造・機能の解析のための網羅的調製や大量生産を簡便且つ効率的に可能とする自動合成装置開発に利用できるタンパク質多検体用自動無細胞タンパク質合成ロボットや大量タンパク質合成ロボット開発の要素技術として不可欠であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の無細胞タンパク質合成方法とバッチ法による従来の無細胞タンパク質方法との実験結果の違いを示すグラフである。
【図２】コムギ胚芽抽出液の濃度を変えた以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った実験結果を示すグラフである。
【図３Ａ】コムギ胚芽抽出液の濃度を８０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌ、ＧＦＰｍＲＮＡの濃度を６４０μｇ／ｍｌとし、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行う間隔を変化させた以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った実験結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を行う間隔の違いによる合成されたＧＦＰの量的差異を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動結果である。
【図４】ろ過膜を有する濃縮器と、送液ポンプとを組み合わせて本発明の無細胞タンパク質合成方法における副生成物の除去を実施し得るようにした構成の一例を模式的に示す図である。
【図５】図４に示したろ過膜と送液ポンプとを副生成物の除去に用いる構成を用いて、本発明の無細胞タンパク質合成方法にてタンパク質合成を行った実験結果を示すグラフである。
【図６】Aは、６０Ａ２６０ｎｍ／ｍｌのコムギ胚芽抽出液、４５０μｇ／ｍｌのdihydrofolate reductase（ＤＨＦＲ）のｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いた以外は実施例１と同様の翻訳反応液を用い、希釈及び濃縮の不連続繰り返し操作を１時間間隔で２回繰り返した以外は実施例１と同様にして無細胞タンパク質合成を行った場合の実験結果を示す図である。  Bは、本発明の方法にてＮ末端にストレプトアビジンを融合したＧＦＰ融合タンパク質を合成し、ＧＦＰ融合タンパク質を系外に単離する実験結果を示す電気泳動図である。
【図７】本発明のＲＮＡ合成方法と、バッチ法による従来のインビトロでＲＮＡを合成する方法との実験結果の違いを示す図である。
【図８】エタノール沈殿により純化したｍＲＮＡ、純化していないｍＲＮＡをそれぞれ翻訳鋳型として用いて、本発明の無細胞タンパク質合成方法を行った実験結果を示すグラフである。
【図９】実験例７の転写反応後の転写反応液をそのまま用いて調製した翻訳反応液にて本発明の無細胞タンパク質合成方法を行った実験結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６４】
１：ろ過濃縮器
２：送液ポンプ
３：反応槽
４：（ＲＮＡ）基質溶液を収容した容器
５：送液切換バルブ
６：容器
Ｔ１：チューブＴ１
Ｔ２：チューブＴ２
Ｔ３：チューブＴ３
Ｔ４：チューブＴ４
Ｔ５：チューブＴ５
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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