(57)【要約】      （修正有）【課題】新規のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、及びＣＬＬＤ７の単離された核酸配列、又はこれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はそれらの断片及び該核酸配列のアトピー関連への使用方法を提供する。【解決手段】２以上の前記遺伝子から得られるハイブリッド核酸配列を備えた配列。核酸発現ベクター、ポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、ヒト以外のトランスジェニック動物、及び薬学的組成物、及び物質。医療及び研究における前記核酸配列及び／又はタンパク質の使用、疾病に対する素因又は疾病の重篤度を診断又は決定する方法、疾病を予防又は治療する方法、前記方法で使用するためのキット、ＩｇＥ媒介性疾患及び非アトピー性喘息を治療又は予防する上での前記核酸配列及びタンパク質の使用、前記方法で使用するための新規物質を同定するためのスクリーニングにおける前記核酸配列及びタンパク質の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＮＧＥ  ｍＲＮＡ配列を含む単離された核酸配列若しくは組換え核酸配列、若しくはそれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はそれらの断片。
【請求項２】
ＣＬＬＤ７  ｍＲＮＡ配列を含む単離された核酸配列若しくは組換え核酸配列、若しくはそれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はそれらの断片。
【請求項３】
ＣＬＬＤ８  ｍＲＮＡ配列およびＡＮＧＥ  ｍＲＮＡ配列を含む単離された組換えハイブリッドｍＲＮＡ配列、若しくはそれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はそれらの断片。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の単離された核酸配列若しくは組換え核酸配列であって、前記配列がヒトポリペプチド若しくはそれに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列又はそれらの断片をコードする、核酸配列。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の単離された核酸配列若しくは組換え核酸配列であって、前記配列がマウスポリペプチド若しくはそれに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列又はそれらの断片をコードする、核酸配列。
【請求項６】
ＡＮＧＥ１のエキソンを１以上備えた、請求項１又は３に記載の単離された核酸配列若しくは組換え核酸配列、若しくはそれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列又はそれらの断片。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の核酸配列中に単ヌクレオチド多型を有する単離された核酸配列又は組換え核酸配列。
【請求項８】
図５の配列１の一部を有し、且つ表１に列記されている図５の位置に対応する位置にＳＮＰを１以上有する、請求項７に記載されている単離された核酸配列又は組換え核酸配列。
【請求項９】
図５の１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５２ｂ５＿３、４３２１０１７ｂ３８＿１位に対応する位置に、又は図５の４３２１０３１ｂ４３＿１位に対応する位置に、ＳＮＰを有する単離された核酸配列又は組換え核酸配列。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件下で、請求項１乃至９の何れか１項の配列にハイブリダイズする単離された核酸配列又は組換え核酸配列。
【請求項１１】
表１のＳＮＰを有する対立遺伝子を識別することが可能である、請求項１０に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列。
【請求項１２】
表４に記載されているプライマー配列。
【請求項１３】
請求項１乃至１１のうち何れか１項の単離された核酸配列を備えたベクターであって、請求項１乃至１１の何れか１項の単離された核酸配列又は組換え核酸配列をインビトロ又はインビボで発現させることができるベクター。
【請求項１４】
請求項１乃至１１の何れか１項の単離された核酸配列又は組換え核酸配列によってコードされるポリペプチド配列若しくはそれらと実質的に相同な配列又はそれらの断片。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが翻訳後に修飾される、請求項１４に記載のポリペプチド配列。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが分泌シグナルに作用可能に連結されている、請求項１４又は請求項１５に記載のポリペプチド配列。
【請求項１７】
請求項１４、１５、又は１６の何れか１項に記載のポリペプチド配列であって、前記ポリペプチドがヒスチジンタグを有するポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが担体に連結されている、請求項１４乃至１７の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１４乃至１８の何れか１項のポリペプチド又は請求項１乃至１１の何れか１項の単離された核酸配列に対して特異的な抗体。
【請求項２０】
前記抗体がキメラ抗体であるか、又はヒト化されており若しくは二機能性である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
試料中に存在する請求項１４乃至１８の何れか１項のポリペプチドを検出又は測定するためのアッセイにおける、請求項１９または２０の抗体の使用。
【請求項２２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載された核酸配列を調製するための方法であって、連続するヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド残基を互いに連結することを備えた方法。
【請求項２３】
請求項１４乃至１８の何れか１項に記載されたポリペプチドを調製するための方法であって、連続するアミノ酸及び／又はオリゴペプチド残基を互いに連結することを備えた方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが無細胞系で産生される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１３のベクターを備えた宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２３のベクターを備えた宿主細胞であって、請求項１４乃至１８に記載されたポリペプチドを作製するための宿主細胞又は請求項１４乃至１８のポリペプチドの制御若しくは分析において使用するための宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１３のベクターを備えたヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２８】
疾病をもたらす請求項１乃至１１の何れか１項の単離された核酸配列を備える、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
請求項１乃至１１の何れか１項の単離された核酸配列を実質的に発現しない、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３０】
アトピーに対する被験体の素因若しくは感受性を診断若しくは測定する方法又は個体における疾病の重篤度を予測する方法であって、バリアント型のＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子、又はＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの存在を測定することを備えた方法。
【請求項３１】
ある個体がアトピー性であることを診断する方法であって、表１のＳＮＰマーカーの１以上と関連し且つ前記マーカーと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰと必要に応じて関連する対立遺伝子の個体における有無を明らかにすることを備えた方法。
【請求項３２】
疾病に対する素因を診断し、又は測定する方法であって、１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５２ｂ５＿３、又は４３２１０１７ｂ３８＿１位のＳＮＰマーカーを有する対立遺伝子の有無を明らかにすることを備え、前記対立遺伝子が存在すれば、疾病又は疾病に対する素因があると診断される方法。
【請求項３３】
異常な血清ＩｇＥレベルを有する個体を診断する方法であって、ＳＮＰマーカー１８５７５２ｂ４＿２と関連し且つ前記マーカーと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰと必要に応じて関連する対立遺伝子の個体における有無を明らかにすることを備えた方法。
【請求項３４】
５ｍｍを超えるＳＴＩを個体が有することを診断する方法であって、ＳＮＰマーカー４３２１０１７ｂ３８＿１と関連し且つ前記マーカーと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰと必要に応じて関連する対立遺伝子の個体における有無を明らかにすることを備えた方法。
【請求項３５】
個体がアトピー性であると診断する方法であって、ハプロタイプ１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５２ｂ５＿３、４３２１０３１ｂ４３＿１と関連し且つこれらのマーカーのうち任意の１つと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰと必要に応じて関連する対立遺伝子の個体における有無を明らかにすることを備えた方法。
【請求項３６】
請求項３０乃至３５の何れか１項に記載の方法であって、
（１）前記個体から適切な試料を準備することと、
（２）前記試料から核酸を調製することと、
（３）前記対立遺伝子の有無について前記核酸試料を分析することと、
を備えた方法。
【請求項３７】
分析に先立って、前記ＳＮＰマーカーを含む領域を増幅する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載の方法であって、前記ＳＮＰの何れかの側の領域に、ストリンジェントな条件下で、各々がハイブリダイズするプライマーの対を使用することを備えた方法。
【請求項３９】
前記プライマーが表４に示されているオリゴヌクレオチド配列を含んでいる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＩｇＥ媒介性疾患、アトピー、アトピー性疾患の一形態、若しくは非アトピー性喘息を診断する方法、又は疾病の重篤度若しくは疾病に対する素因を予測する方法において使用するための前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子のスプライスバリアント。
【請求項４１】
アトピー、アトピー性疾患の一形態を診断する方法又は疾病の重篤度若しくは疾病に対する素因を予測する方法において使用するための診断剤の製造における、前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子のスプライスバリアントの使用。
【請求項４２】
ＩｇＥ媒介性疾患、アトピー、アトピー性疾患の一形態、若しくは非アトピー性喘息を診断する方法、又は疾病の重篤度を予測する方法において使用するための請求項４１のスプライスバリアントを備えたキットであって、個体における前記スプライスバリアントの有無を測定することを備えたキット。
【請求項４３】
２以上のスプライスバリアントをアレーの形態で又はチップ上に備えた、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥ遺伝子の活性を阻害又は増強する物質のスクリーニングにおける、図５に示されているポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項４５】
表１のリスク対立遺伝子の有無を測定する手段を備えた疾病又は疾病に対する素因を診断するためのキットであって、前記リスク対立遺伝子が疾病若しくは疾病に対する素因又は疾病の重篤度の診断指標となるキット。
【請求項４６】
請求項７乃至１１の何れか１項に記載の多型を有する１以上のリスク対立遺伝子の有無を測定するための手段を備えた請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
疾病を治療するための化合物を同定する方法であって、（ａ）表１に列記されている位置にＳＮＰを有する単離された核酸分子を含む組織に化合物を投与することと、（ｂ）前記化合物が前記ＳＮＰの下流効果をモジュレートするかどうかを測定することを備えた方法。
【請求項４８】
喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患の予防又は治療に使用するための物質又は抗体。
【請求項４９】
喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患の予防又は治療に使用するための医薬の製造における物質の使用。
【請求項５０】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載された核酸又は請求項１４乃至１８の何れか１項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項５１】
請求項１９又は２０の何れか１項に記載された抗体を含む薬学的組成物。
【請求項５２】
被験体の疾病を予防又は治療する方法であって、前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの前記被験体における活性、発現、半減期、又は翻訳後修飾をモジュレートすることを備えた方法。
【請求項５３】
前記疾病が、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５２又は５３に記載された疾病を治療又は予防する方法であって、１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５ｂ５＿３、４３２１０ｂ４３＿１位、又は４３２１０１７ｂ３８＿１位にＳＮＰマーカーを有するリスク対立遺伝子の有無を測定することを備え、リスク対立遺伝子が存在すれば、前記疾病を予防、遅延、又は軽減させるために治療を施す方法。
【請求項５５】
前記発病対立遺伝子の効果をモジュレートすることができる物質を被験体に投与することを備えた、請求項５２乃至５４の何れか１項に記載された方法。
【請求項５６】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子の発現に影響を与えることができる物質であって、個体のＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息を予防又は治療する方法において使用するための物質。
【請求項５７】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子プロモータ又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子プロモーターの活性に影響を与えることができる請求項５６に記載の物質。
【請求項５８】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子のＲＮＡスプライシングに影響を与えることができる、請求項５６又は５７に記載の物質。
【請求項５９】
ＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息の予防又は治療で使用するための医薬の製造における、請求項５６乃至５８の何れか１項に記載された物質の使用。
【請求項６０】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項１４乃至１８の何れか１項に記載されたポリペプチド配列を準備することと、
基質を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記基質の加工を測定することによって前記検査すべき物質が前記ポリペプチドの活性をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニング。
【請求項６１】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項１４乃至１８の何れか１項に記載されたポリペプチド配列を準備することと、
細胞を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記細胞の表面への接着を測定することによって前記検査すべき物質が前記ポリペプチドの活性をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニング。
【請求項６２】
前記表面がさらに別の細胞の表面である、請求項６１に記載のスクリーニング。
【請求項６３】
請求項６１又は６２の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記表面が非生物分子であるスクリーニング。
【請求項６４】
請求項６１乃至６３の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記表面が生物分子であるスクリーニング。
【請求項６５】
請求項６１乃至６４の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記１以上の細胞が固定化されているスクリーニング。
【請求項６６】
請求項６１乃至６５の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記１以上の細胞がＢ−リンパ球であるスクリーニング。
【請求項６７】
前記細胞のうち１以上が、請求項１３のベクターをトランスフェクトされた細胞であるか又は請求項２５若しくは２６の宿主細胞である、請求項６１乃至６６の何れか１項に記載されたスクリーニング。
【請求項６８】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子の活性、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子の活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項１４乃至１８の何れか１項に記載のポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
細胞を準備することと、
前記細胞の分化又は増殖の変化を測定することと、
を備えたスクリーニング。
【請求項６９】
前記細胞が、請求項１４乃至１８の何れか１項に記載のポリペプチドを１以上発現している、請求項６８に記載のスクリーニング。
【請求項７０】
細胞の分化の変化が細胞シグナル伝達因子の発現の変化を伴う、請求項６８又は６９に記載のスクリーニング。
【請求項７１】
前記細胞シグナル伝達因子が免疫調節物質又はペプチド制御因子である、請求項７０に記載のスクリーニング。
【請求項７２】
請求項６８乃至７１の何れか１項に記載のスクリーニングであって、患者又は実験動物から採取された後に前記細胞が培養されるスクリーニング。
【請求項７３】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子の活性、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子の活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項２５又は２６に記載のトランスジェニック動物を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
検査すべき前記物質に前記トランスジェニック動物を接触させることと、
前記トランスジェニック動物の表現型の変化を検出することと、
を備えたスクリーニング。
【請求項７４】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子の活性、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子の活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質の使用に伴う副作用を検出するためのスクリーニングであって、
請求項１４乃至１８の何れか１項に記載されたポリペプチド配列を実質的に発現していない細胞を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記検査すべき物質を前記細胞と接触させることと、
前記物質によって前記細胞にもたらされた何らかの副作用を測定することと、を備えた方法。
【請求項７５】
前記副作用が細胞分化の変化を伴う、請求項７４に記載のスクリーニング。
【請求項７６】
前記副作用が細胞増殖の変化を伴う、請求項７４に記載のスクリーニング。
【請求項７７】
請求項７４乃至７６の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記細胞がトランスジェニック動物の一部であるスクリーニング。
【請求項７８】
請求項７４乃至７７の何れか１項に記載のスクリーニングであって、前記副作用が表現型の変化の計測であるスクリーニング。
【請求項７９】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子の活性、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子の活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の単離された核酸配列を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記物質と前記核酸の試料との相互作用を測定することによって前記検査すべき物質が前記単離された核酸の活性をモジュレートするかを測定することと、
を備えた方法。
【請求項８０】
請求項７９に記載のスクリーニングであって、該スクリーニングが、前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの転写を測定するインビトロ転写アッセイであるスクリーニング。
【請求項８１】
前記ＡＮＧＥ若しくはＣＬＬＤ７遺伝子、又は前記ＣＬＬＤ８およびＡＮＧＥ遺伝子、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質のスクリーニングにおける、請求項１乃至１１の何れか１項に記載された核酸配列又は請求項１４乃至１８の何れか１項に記載されたポリペプチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、及びＣＬＬＤ７の単離された核酸配列、又はそれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はそれらの断片に関する。２以上の前記遺伝子から得られるハイブリッド核酸配列を含む配列も提供される。核酸発現ベクター、ポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、宿主細胞、ヒト以外のトランスジェニック動物、及び薬学的組成物、及び物質も提供される。医療及び研究における前記核酸配列及び／又はタンパク質の使用、疾病に対する素因若しくは疾病の重篤度を診断若しくは測定する方法、疾病を予防又は治療する方法、前記方法で使用するためのキット、ＩｇＥ媒介性疾患及び非アトピー性喘息の治療若しくは予防における前記核酸及びタンパク質の使用並びに前記方法で使用するための新規物質を同定するためのスクリーニングにおける使用も提供される。
【０００２】
アトピー性疾患又は免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性疾患には、喘息、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性鼻炎などがある。これらの疾患は、児童及び青年の主な病因である(Jarvis,D. & Bureney,P.British Medical Journal 316,607-10(1998)[BMJ 1998 Apr 4;316(7137)：１０７８に、正誤表が掲載されている。］、及びCookson,W. Nature 402、B5-11(1999))。
【０００３】
アトピーや喘息は、強い環境因子と遺伝因子の相互作用によって生じる(Cookson,W.Nature 402,B5-11(1999))。喘息は、標準的な症状調査票によって疫学的に、又は医師の診断によって、認められるのが一般的である(O’Connor,G. T. & Weiss, S.T. Am J Respir Crit Care Med 149,S21-8;discussion S29-30(1994))。
【０００４】
アトピーは、皮膚穿刺試験、又はＲＡＳＴ若しくはＥＬＩＳＡ技術を用いたアレルゲンに対する特異的血清ＩｇＥ力価の測定によって、又は総血清ＩｇＥの定量によって検出される。量的形質を調べることは、連鎖解析や関連分析一般に多大な利点を与えるとともに(Risch,N.J. & Zhang, H. Am J Hum Genet 58,836-43(1996))、喘息症例の連鎖解析や関連分析に対しても多大な利点を与える(Cookson, W. & Palmer,L. Clin Exp Allergy 28 Suppl 1,(1996))。喘息及びアトピーの基礎には、総血清ＩｇＥ濃度、皮膚検査指標（STI、Skin Test Index）、ＲＳＴ指標、及びメタコリンに対する気管支の反応性の用量反応勾配（ＤＲＳ）を含む数多くの量的形質が存在する(Daniels,S.E. et al. Nature(383,247-50(1996)。総血清ＩｇＥは対数正規分布を示し、高い遺伝性を有する(Gerrard, J., Rao, D. & Morton, N. Am J Hum Genet 30, p46-58 (1978)) and Palmer, L. J. et al.Am J Respir Crit Care Med 161,1836-43 (2000))。総血清ＩｇＥは、ＤＲＳ及びＳＴＩと不完全に重なり合う遺伝的効果によって影響を受ける。
【０００５】
医師が診断した喘息の遺伝度は６０−７０％であり７、（対数正規）総血清ＩｇＥ濃度の遺伝度は４０−５０％である８，９。ＳＴＩの遺伝度はこれより低く、約３０％である９。分類形質より量的形質(categorical trait)を調べる方が、連鎖解析や関連分析一般に対しても１０、また喘息症例の連鎖解析や関連分析に対しても、多大な利点がある１１。総血清ＩｇＥは、標準化された測定プロトコールを用いると、対数正規分布を示し、年齢と性別の影響も十分に確定されている１２。このために、本発明者らは、アトピーと喘息の原因遺伝子をマッピングするための量的形質として、総血清ＩｇＥを用いてきた。
【０００６】
同じ家族でも、異なるアトピーの指標が上昇することがあり得る(Cookson,W. O. C. M. & Hopkin, J. M. Lancet 1,86-88 (1988) and Young, R.P., Lynch, J., Sharp, P. A. & et al. Journal of Medical Genetics 29,236-238(1992))。ＲＡＳＴと皮膚検査の反応は、総血清ＩｇＥより遅い幼児期にピークに達し、その後は、総血清ＩｇＥに比べて遅い速度で減少する(Cline,M.G.&Burrows,B.B.Thorax 44,425-431(1989))。かかる表現型の不均一性（多面作用）を補償するために、「アトピー」の分類形質は、ＳＴＩ、ＲＡＳＴ指標、及び総血清ＩｇＥの組み合わせに基づいている(Daniels,S.E. et al. Nature 383,247-50(1996) and Cookson,W.O.C.M & Hopkin,J.M. Lancet 1.86-88(1988))。
【０００７】
アトピーは、遺伝的因子と環境的因子の相互作用によって生じる。遺伝的因子は、喘息への素因をもたらす遺伝子の発現又は機能レベルを変化させるＤＮＡ構造のバリアント（「多型(polymorphism)」）であると考えられている。ある特定の部位（「遺伝子座(locus)」）に位置するＤＮＡ配列のバリアントは、「対立遺伝子(allele)」として知られている。アトピー及び喘息関連表現型への連鎖のスキャンがゲノム全域にわたって実施されている(Daniels,S.E. et al. Nature 383.247-50(1996))。本発明者らの最初のゲノムスクリーニングの時に、別の家族群にアトピー表現型の染色体１３ｑ１４への強い連鎖が観察、確認された。これ以前の研究によって、染色体１３ｑ１４上のエステラーゼＤ（ＥＳＤ）タンパク質多型への総血清ＩｇＥの連鎖が見出されていた(Eiberg,H., et al. Cytogenetics. And Cell Genetics 40,622(1985))。
【０００８】
該領域への連鎖は、日本の家族の単一遺伝子座研究によっても確認されている(Kimura,K. et al. Hum Mol Genet 8,1487-90(1999))。米国のハッテライト家族での２段階スクリーニングによって、第２段階の家族に１３ｑ２１への喘息の連鎖が見出された(Ober, C. et al. The Collaborative Study on the Genetics of Asthma. Hum Mol Genet 7,1393-8 (1998))が、第２段階の家族では見出されなかった。１３ｑ１４への連鎖は、喘息を有する子供でイエダニアレルギーに対しても観察され(Hizawa,N. et al. Collaborative Study on the Genetics of Asthma (CSGA). J Allergy Clin Immunol 102, p436-42 (1998))、アトピー性皮膚炎の子供に対しても観察された(Beyer K, W. U et al J Allergy Clin Immunol 101, 152 (1998))。これらの結果は、１３番染色体に重要なアトピー遺伝子座が含まれていることを示唆している。最近、染色体１３−１３ｑ１４の同じ領域に、アトピー性皮膚炎の遺伝子座がマッピングされた。「Susceptibility loci for atopic dermatitis on chromosomes 3,13,15,17 and 18 in a Swedish population:  Bradley M, Soderhall C, Luthman H, Wahlgren CF, Kockum I, Nordenskjold M Hum Mol Genet 2002 JUN 15;11(13): 1539-48」。
【０００９】
ある対立遺伝子と疾病の表現型の関連を検出することによって、発症遺伝子の位置を詳細に決定し得る。短いＤＮＡの区画の中では、特定の多型を有する特殊な対立遺伝子が、隣接する多型を有する対立遺伝子と非偶発的な関連を示すことがある。「連鎖不均衡」として知られるこの現象は、典型的には、５０−５００キロ塩基（Ｋｂ）のＤＮＡにわたって起こる(Jorde,L.B. Am J Hum Genet 54, 884-98(1994);Collins,A.,Lonjou,C.& Morton, N.E.Proc Natl Acad Sci USA 96,15173-7(1999) and Abecasis,G.R. et al. Am J Hum Genet 68,191-197(2001))、多型と疾病の関連は、５００Ｋｂ超に及ぶことは一般に少ない。連鎖不均衡は、個体の研究と家族の研究とによって検出することができる。
【００１０】
発症対立遺伝子は、同じ染色体のセグメントから得られる非機能的多型と連鎖不均衡にあるであろう。従って、病状の基礎を成す正確な多型と遺伝子を特定せずに、ある染色体セグメントから、疾病と対立遺伝子との関連を検出することが可能である。
【００１１】
従って、対立遺伝子関連の検出によって、ある個体における疾病への感受性についての情報を与えることができる。さらに、対立遺伝子関連は、対立遺伝子の何れかの方向から限られた距離のＤＮＡ中に、発症遺伝子が存在することの指標となる。
【００１２】
発症遺伝子を同定すれば、発症前に（例えば、生後直後に）アトピーのリスクがある子供を特定して、疾病を予防できる可能性がある。遺伝子とその活性を知ることができれば、疾病のタイプ（すなわち、喘息、皮膚炎、又はアレルギー）、疾病の臨床経過（例えば、軽症ではなく重症）、又は特定の治療への応答に関して予測を行うことが可能となるだろう。この診断情報は、保健医療、医薬、及び保険産業にとって有用であろう。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の第１の側面によれば、図５に示されている配列、又は図３ａに記載されたエキソンを１以上除去した配列、又はこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片を具備する単離された核酸配列又は組換え核酸配列が提供される。図５の配列には、ヒトＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８ヌクレオチド配列が含まれている。図５ａ（ｉ）は、２つの選択的な第１エキソンを含むＡＮＧＥ遺伝子のエキソン配列を示し、図５ａ（ｉｉ）は、ＡＮＧＥ  ｍＲＮＡの配列を示し、図５ａ（ｉｉｉ）は翻訳されたタンパク質配列を示している。ＮＹ−ＲＮＥ−３４  ｍＲＮＡ配列は、図５ｂ（ｉ）に示されており、ＮＹ−ＲＥＮ−３４のタンパク質配列が図５ｂ（ｉｉ）に、選択的ＮＹ−ＲＥＮ−３４タンパク質配列が図５ｂ（ｉｉｉ）に示されている。
【００１４】
本発明において、ＡＮＧＥ遺伝子は、従来技術においてＮＹ−ＲＥＮ−３４として知られていた遺伝子であり、ＢＡＣ  ｂＡ１０３Ｊ１８．０３５４８のヌクレオチド３１３６４９−３４６５０９として示されている（図５）。本出願においてＡＮＧＥ遺伝子という場合には、図５のＡＮＧＥ遺伝子と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１５、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を示し、且つ好ましくはＡＮＧＥ遺伝子と１以上の機能的特性を共有するバリアント配列が含まれる。
【００１５】
ＡＮＧＥ核酸配列は、図３ａ、５ａ（ｉ）、及び表５のエキソンを１以上任意に組み合わせたもの又はこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片を備えることができる。これらの組み合わせは、ヒト及びマウスを含む全てのＡＮＧＥ配列に対して当てはまる。
【００１６】
本発明の全ての配列は単離されるか、あるいは組換えることができる。
【００１７】
単離されたとは、精製されており、且つ他のタンパク質及び核酸が実質的に存在しない核酸又はポリペプチド配列を意味する。このような配列は、ＰＣＲ増幅、クローニング技術、又は合成機での合成によって取得することができる。組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）とは、人の手で組み換えられた核酸配列を意味する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、又はＰＮＡ又は当業者に公知の他の核酸類縁体であり得る。本発明において、遺伝子産物には、ポリヌクレオチド配列とタンパク質が含まれる。ポリペプチド配列という場合には、タンパク質とペプチドが含まれる。
【００１９】
ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８、及びＮＹ−ＲＥＮ−３４のｍＲＮＡ配列に対する公開ドメインのＲＥＦＳＥＱエントリーは、それぞれ、ＮＭ＿０１８１９１．２、ＮＭ＿０３１９１５．１、及びＮＭ＿０１６１１９．１である。これらは、上記した配列に対するヌクレオチドレベルでの僅かな差異を示している。しかしながら、ＮＹ−ＲＥＮ−３４の場合、これらの変化は、以下に示されている本発明者らの配列に比べて、末端切断されたタンパク質をもたらすものと予想される。
【００２０】
本出願において、相補的な配列又は実質的に相同な配列とは、ストリンジェントな条件下で、所定の配列又はその遺伝子産物にハイブリダイズする配列である。このように、例えば、基準となる核酸に対して実質的に相同な核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、基準となる核酸の遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズすることができるであろう。相補的な配列とは、ストリンジェントな条件下で、核酸配列自体にハイブリダイズすることができる配列である。本発明では、実質的に相同な配列の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も提供される。実質的に相同な配列は、好ましくは、所定の配列と、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は１００％の配列同一性を有する。実質的に相同であるというこの定義は、核酸配列とポリペプチド配列の両方に対して適用される。このように、構造又は機能に影響を与えない保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチド配列も含まれる。全てのＤＮＡ配列について、相補的な配列という場合には、対応するｍＲＮＡ配列及びこのようなＲＮＡ配列に由来する任意のｃＤＮＡ配列が含まれる。
【００２１】
「％同一性」とは、２つの核酸又はポリペプチド配列を比較することによって求められる、２つの核酸又はポリペプチド配列の関連性の指標である。一般的には、配列間に最大の相関を与えるように、比較すべき２つの配列を併置する。２つの配列を併置して調べ、アミノ酸又はヌクレオチドが正確に一致している位置の数を求めて、併置した配列の全長で除し、その結果に１００を乗ずることによって、％同一性が得られる。％同一性は、比較すべき配列の全長にわたって調べてもよいし（同じ若しくは似通った長さの配列、又は高い相同性の配列の場合に特に適している）、これより短い所定の長さにわたって調べてもよい（長さが等しくない配列及び相同性が低い配列の場合に適している）。
【００２２】
２以上の配列の同一性を比較する方法は、本分野において公知である。例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package version 9.1(Devereux J et al., Nucl Acid Res 12 387-395 (1984), available from Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA)で入手できるＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰなどのプログラムを用いることができる。
【００２３】
BESTFITは、SmithとWatermanの「局所的相同性」アルゴリズム(Advances in Applied Mathematics、2:482-489、1981)を用いており、２つの配列の間で最も類似性の高い領域を１つ見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列を比較するのにより適している（本プログラムは、短い方の配列が、長い方の配列の一部を成していると仮定している）。これに比べて、ＧＡＰは、２つの配列を並列させて、NeddlemanとWunsch(J.Mol.Biol.48:443-354、1970)のアルゴリズムに従って、「最大の類似性」を見出す。ＧＡＰは、概ね長さが同じ配列を比較するのに適しており、全長にわたってアライメントを行うことを想定している。各プログラムで使用するパラメータ「Gap Weight」と「Length Weight」は、ポリヌクレオチド配列の場合、それぞれ５０と３、ポリペプチド配列の場合１２と４であることが好ましい。好ましくは、％同一性と類似性は、比較する二つの配列を最適に並列して決定する。
【００２４】
配列間の同一性及び／又は類似性を決定するためのその他のプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ類のプログラム(Altschul et al, J.Mol.Biol.,215:403-410、(1990)、Altschul et al, Nuc Acids Res.,25:289-3402(1997)、National Center for Biotechnology Information(NCB)、Bethesda、Maryland、USAから入手可能、ＮＣＢＩのホームページ(www.ncbi.nlm.nih.gov)からアクセスできる）やＦＡＳＴＡ(Pearson W.R. and Lipman D.J., Proc. Nat. Acac. Sci.,USA,85:2444-2448(1988)、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能）も本分野において公知である。好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス(Henikoff S. and Henikoff J.G.,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,89:10915-10919,(1992))は、ポリペプチド配列の比較（比較の前に、ヌクレオチド配列をまずアミノ酸配列に翻訳する場合を含む）で使用される。
【００２５】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列配列に対する被検ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の％同一性を決定するために使用し、被検配列と基準配列を最適に並列して、プログラムのパラメータは初期値に設定する。
【００２６】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールで用いられる洗浄条件を意味する。一般に、洗浄条件は、研究対象たる核酸のＴｍの計算値を変性温度が約５−２０℃下回るように、温度と塩濃度を組み合わせなければならない。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍは、短いオリゴヌクレオチドについてのＷａｌｌａｃｅ則に従って、標準条件（１Ｍ  ＮａＣｌ）下で、［４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ａ＋Ｔ）］と計算される。これより長いＤＮＡ断片の場合、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、ＰＮＡＳ  ８３：３７４６−３７５０（１９８６）に記載されている法則に従って、固体熱力学と実験データを組み合わせた直近隣接法(nearest neighbor method)を用いることができる。ハイブリダイゼーション用の最適な塩及び温度条件は、フィルター上に固定化されたＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズさせた後に、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で容易に決定することができる。ＰＣＲ用の条件は標準条件と異なってもよく、プライマーの予測相対安定度の指標としてＴｍを使用し得る。約１４ヌクレオチドの短いプライマーの場合、４４℃−５０℃前後の低いアニーリング温度が用いられる。前記温度は、使用するプライマー配列の塩基組成に応じてさらに高くしてもよい。好適には、ストリンジェントな条件は、（例えば、ＤＰＰ１０コード配列でない配列への）非特異的ハイブリダイゼーションが回避される条件である。２１マーのオリゴヌクレオチドプローブの場合、好適なストリンジェント条件は、０．５×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ／５８℃／３０分である。
【００２７】
本発明の前記相補的配列（本明細書では、「アンチセンス」と表記することもある）は、プローブ若しくはプライマーとして、又はＡＮＧＥ発現の制御において有用であり得る。好ましくは、前記プライマー配列は、ＡＮＧＥ遺伝子の全部又は一部を増幅することができる。好ましいプライマー配列は、実施例と表４に開示されている。遺伝子、又はその対立遺伝子、又はそれらのバリアントの全部又は一部を増幅するためのプライマー対は、本発明の別の側面を構成する。同様に、ＡＮＧＥプローブは、被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）から得た試料内での、ＡＮＧＥ、又はそのバリアント形態の存在又は発現レベルを検出するのに有用であろう。前記プローブは、被験体におけるＡＮＧＥの発現パターンを解析するのにも有用であろう。
【００２８】
本出願において、断片とは、連続する任意の１０残基の配列、又はこれより大きな２０、３０、４０、若しくは５０残基等の配列である。好ましくは、核酸又はポリペプチド配列の断片は、ＡＮＧＥ若しくはその遺伝子と１以上の機能的特徴を共有するか、又はこのような機能的特徴をモジュレート（すなわち、阻害又は増強）することができる。本実施態様に係る断片の新規性は、該断片のヌクレオチド又はポリペプチド配列を、優先日にＧｅｎｅｂａｎｋ等のデータベースに掲載されている配列と比較することによって、又はＤＮＡＳＩＳ(Hitachi Engineering Inc)若しくはGenetic Computer Group(Madison、ＵＳＡ）のＷｏｒｄ  Ｓｅａｒｃｈ若しくはＦＡＳＴＡ等のコンピュータプログラムを使用することによって容易に確認することができる。
【００２９】
前記断片は、様々な診断法、予後診断法、又は治療法において使用することができ、又は（例えば、スクリーニングにおける）研究用のツールとして有用であり得る。前記第１の側面の配列又はそれらの相補配列の断片は、上述のように、プライマー配列として使用することができる。
【００３０】
本発明の第２の側面では、図５に示されている配列、又は図５ｄ（ｉ）及び表５に記載されたエキソン配列を１以上除去した図５に示されている配列、又はこれらと相補的な配列若しくはこれらと実質的に相同な配列、又はそれらの断片を具備する単離された核酸配列又は組換え核酸配列が提供される。ＣＬＬＤ８のｍＲＮＡ配列は図５ｄ（ｉｉ）に、ＣＬＬＤ８のタンパク質配列は図５ｄ（ｉｉｉ）に示されている。図５のヌクレオチド２９４７２７−３０９８０３は、ヒトＣＬＬＤ８核酸配列である。
【００３１】
本発明の第３の側面では、図５に示されている配列、又は図５ｃ（ｉ）及び表に記載されたエキソン配列を１以上除去した図５に示されている配列を具備する単離された核酸配列又は組換え核酸配列が提供される。ＣＬＬＤ７のｍＲＮＡ配列は図５ｃ（ｉｉ）に、ＣＬＬＤ７のタンパク質配列は図５ｃ（ｉｉｉ）に示されている。図５のヌクレオチド３４９６３４−４１０８４６は、ヒトＣＬＬＤ７核酸配列である。
【００３２】
本発明の第４の側面では、図５に示されている配列を備えた請求項２に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ヌクレオチド２９４７２７−３０９８０３）（ＣＬＬＤ８）と隣接する、図５に示されている配列を備えた請求項１に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ヌクレオチド３１３６４９−３４６５０９）（ＡＮＧＥ）、又はこれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はこれらの断片が提供される。
【００３３】
あるいは、ＣＬＬＤ８遺伝子とＡＮＧＥ遺伝子を備える単離されたポリヌクレオチド配列又は組換えポリヌクレオチド配列であって、両遺伝子が単一の制御要素の調節下にあるポリヌクレオチド配列が提供される。好ましくは、前記制御要素はプロモーターである。より好ましくは、前記制御要素はＣＬＬＤ８プロモーターである。
【００３４】
あるいは、ドメイン構造、プレ−ＳＥＴ−ＳＥＴ−ポスト−ＳＥＴ−ＰＨＤ−ＰＨＤを有するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド配列又は組換えポリヌクレオチド配列が提供される。好ましくは、前記ドメイン構造は、ＣｐＧＢＤ−プレ−ＳＥＴ−ＳＥＴ−ポスト−ＳＥＴ−ＰＨＤ−ＰＨＤである。ＳＥＴとＰＨＤドメインは、当業者に公知であろう。
【００３５】
好ましくは、前記第４の側面のポリヌクレオチド配列は、ＣＬＬＤ８とＡＮＧＥの両方を備えた単一の遺伝子産物をコードする。この複合遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８プロモーターの制御下で、ＣＬＬＤ８遺伝子のスプライシング産物として産生され、ＡＮＧＥ遺伝子産物を備える。この複合ＣＬＬＤ８−ＡＮＧＥ遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８とＡＮＧＥ遺伝子を共にスプライシングすることによって得られ、アトピーに関与していることが示されている。
【００３６】
本発明の第５の側面では、図５に示されている配列（ヌクレオチド３４９６３４−４１０８４６）を備えた請求項３に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＣＬＬＤ７）と隣接する、図５に示されている配列（ヌクレオチド３１３６４９−３４６５０９）を備えた請求項１に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＡＮＧＥ）、又はこれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はこれらの断片が提供される。
【００３７】
あるいは、ＡＮＧＥ遺伝子とＣＬＬＤ７遺伝子を備える単離されたポリヌクレオチド配列又は組換えポリヌクレオチド配列であって、両遺伝子が単一の制御要素の調節下にあるポリヌクレオチド配列が提供される。好ましくは、前記制御要素はプロモーターである。より好ましくは、前記制御要素はＡＮＧＥプロモーターである。
【００３８】
好ましくは、前記第５の側面のポリヌクレオチド配列は、ＡＮＧＥとＣＬＬＤ７の両方を備えた単一の遺伝子産物をコードする。この複合遺伝子産物は、ＡＮＧＥプロモーターの制御下で、ＡＮＧＥ遺伝子のスプライシング産物として産生され、ＣＬＬＤ７遺伝子産物を備える。この複合ＣＬＬＤ７−ＡＮＧＥ遺伝子産物は、ＣＬＬＤ７とＡＮＧＥ遺伝子を共にスプライシングすることによって得られ、アトピーに関与していることが示されている。
【００３９】
本発明の第６の側面では、図５に示されている配列（ヌクレオチド３４９６３４−４１０８４６）を備えた請求項３に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＣＬＬＤ７）と隣接する、図５に示されている配列を備えた請求項１に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ヌクレオチド２９４７２７−３０９８０３）（ＣＬＬＤ８）、又はこれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はこれらの断片が提供される。
【００４０】
あるいは、ＣＬＬＤ８遺伝子とＣＬＬＤ７遺伝子を備える単離されたポリヌクレオチド配列又は組換えポリヌクレオチド配列であって、両遺伝子が単一の制御要素の調節下にあるポリヌクレオチド配列が提供される。好ましくは、前記制御要素はプロモーターである。より好ましくは、前記制御要素はＣＬＬＤ７プロモーターである。
【００４１】
好ましくは、前記第６の側面のポリヌクレオチド配列は、ＣＬＬＤ８とＣＬＬＤ７の両方を備えた単一の遺伝子産物をコードする。この複合遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８プロモーターの制御下で、ＣＬＬＤ８遺伝子のスプライシング産物として産生され、ＣＬＬＤ７遺伝子産物を備える。この複合ＣＬＬＤ８−ＣＬＬＤ７遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８とＣＬＬＤ７遺伝子を共にスプライシングすることによって得られ、アトピーに関与していることが示されている。
【００４２】
本発明の第７の側面では、図５に示されている配列（ヌクレオチド２９４７２７−３０９８０３）を備えた請求項２に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＣＬＬＤ８）と隣接し且つ図５に示されている配列（ヌクレオチド３４９６３４−４１０８４６）を備えた請求項３に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＣＬＬＤ７）と隣接する、図５に示されている配列（ヌクレオチド３１３６４９−３４６５０９）を備えた請求項１に記載の単離された核酸配列又は組換え核酸配列（ＡＮＧＥ）、又はこれらに相補的な配列若しくは実質的に相同な配列、又はこれらの断片が提供される。
【００４３】
あるいは、ＡＮＧＥ遺伝子とＣＬＬＤ８遺伝子とＣＬＬＤ７遺伝子とを備える単離されたポリヌクレオチド配列又は組換えポリヌクレオチド配列であって、全遺伝子が単一の制御要素の調節下にあるポリヌクレオチド配列が提供される。好ましくは、前記制御要素はプロモーターである。より好ましくは、前記制御要素はＣＬＬＤ８プロモーターである。
【００４４】
好ましくは、前記第７の側面のポリヌクレオチド配列は、ＣＬＬＤ８、ＡＮＧＥ、及びＣＬＬＤ７を備えた単一の遺伝子産物をコードする。この複合遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８プロモーターの制御下で、ＣＬＬＤ８遺伝子のスプライシング産物として産生され、ＡＮＧＥ及びＣＬＬＤ７遺伝子産物を備える。この複合ＣＬＬＤ８−ＡＮＧＥ−ＣＬＬＤ７遺伝子産物は、ＣＬＬＤ８、ＡＮＧＥ、及びＣＬＬＤ７遺伝子を共にスプライシングすることによって得られ、アトピーに関与していることが示されている。
【００４５】
「ＡＮＧＥ」、「ＣＬＬＤ７」、及び「ＣＬＬＤ８」という用語は、完全な遺伝子産物、又はそれらの１若しくは複数の一部の何れかを意味する。前記遺伝子産物の一部は、好ましくは、スプライスバリアントであり、好ましくは、少なくとも１つのエキソン、又は少なくとも１つのエキソンから産生される又は転写物が含まれる。このように、前記第４乃至第７の側面の遺伝子産物には、ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８、及びＡＮＧＥの少なくとも１つのエキソン又はエキソンの一部が含まれる。
【００４６】
本発明の第８の側面では、図５の配列の少なくとも一部を有し且つ表１に列記されている図５の位置に対応する位置にＳＮＰを１以上有する、単離された核酸配列又は組換え核酸配列が提供される。
【００４７】
具体的な単離された核酸分子には、表２ｃに示されているように、
図５の１８５７５２ｂ４＿２位に対応する位置にＳＮＰを有する核酸分子、
図５の１８５７５２ｂ５＿３位に対応する位置にＳＮＰを有する核酸分子、
図５の４３２１０１７ｂ３８  １位に対応する位置にＳＮＰを有する核酸分子
が含まれる。
【００４８】
本発明の第８の側面の単離された核酸分子又は組換え核酸分子は、図５の「野生型」又は「基準」配列とは異なる。
【００４９】
本発明の該側面は、アンチセンス配列も提供する。このような配列は、典型的には、一本鎖であって、ストリンジェントな条件下で、本発明の上記核酸配列又は図５の配列にハイブリダイズすることが可能である。好ましいアンチセンス配列は、本発明の多型を有する対立遺伝子にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列であり、最も好ましくは、（表１の）多型を有する対立遺伝子を識別することができるアンチセンス配列である。ストリンジェントな条件は、以下に定義されている。前記アンチセンス配列は、合成によって調製してもよいし、あるいはニック翻訳によって調製してもよく、好ましくは単離されるか又は組換えられる。
【００５０】
前記アンチセンス配列には、例えば、本発明の前記方法に使用するためのプライマー及びプローブが含まれる。プライマー配列は、当業者に公知であると思われる適切な条件下において、テンプレートで誘導される核酸合成用の開始部位として作用することができる。プローブは、ある核酸配列の検出、同定、及び単離において有用である。プローブ及びプライマーの長さは、好ましくは１５乃至３０ヌクレオチドである。
【００５１】
増幅を行う場合には、ペアとプライマーを準備する。これらには、増幅すべき核酸配列の５’末端にハイブリダイズする５’プライマーと、増幅すべき核酸の３’末端の相補鎖にハイブリダイズする３’プライマーとが含まれる。
【００５２】
好ましいプライマーは、表４に記載されているプライマー配列。
【００５３】
例えば、検出を可能にするために、プローブとプライマーには、標識を施してもよい。適切な標識には、例えば、引き続きサザンブロット操作において可視化するための、例えば、放射標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識が含まれる。標識されたプローブ又はプライマーは、試料のＤＮＡ又はＲＮＡと反応して、相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡの領域がプローブとハイブリダイズして、ＤＮＡ又はＲＮＡ自体が標識されることになるであろう。標識された領域は、例えば、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。
【００５４】
前記プローブ及び／又はプライマーは、「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするのが好ましく、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールで用いられる洗浄条件を意味する。プローブ用のハイブリダイゼーション条件は、プローブの結合時に、多型を有する別の対立遺伝子を識別できるように十分ストリンジェントであることが好ましい。一般に、洗浄条件は、研究対象となっている核酸のＴｍの計算値を変性温度が約５−２０℃下回るように、温度と塩濃度を組み合わせなければならない。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍは、短いオリゴヌクレオチドに関するＷａｌｌａｃｅ則に従って、標準条件（１Ｍ  ＮａＣｌ）下で、［４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ａ＋Ｔ）］と計算される。これより長いＤＮＡ断片の場合、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、ＰＮＡＳ  ８３：３７４６−３７５０（１９８６）に記載されている法則に従って、固体熱力学と実験データを組み合わせた直近隣接法を用いることができる。ハイブリダイゼーション用の最適な塩及び温度条件は、フィルター上に固定化されたＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズさせた後に、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で容易に決定することができる。ＰＣＲ用の条件は標準条件と異なってもよく、プライマーの予測相対安定度の指標としてＴｍを使用し得る。約１４ヌクレオチドの短いプライマーの場合、４４℃−５０℃前後の低いアニーリング温度が用いられる。前記温度は、使用するプライマー配列の塩基組成に応じてさらに高くしてもよい。典型的には、塩濃度は１Ｍにすぎず、温度は少なくとも２５℃である。適切な条件は、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣＩ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）、２５−３０℃の温度である。
【００５５】
ＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息に影響を与える遺伝子又は遺伝的要素の同定における表１の１以上のＳＮＰマーカーの使用も含まれる。ＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息の診断、予防、又は治療に使用するための医薬における又はＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息の診断、予防、又は治療に使用するための物質の同定における、前記１以上のＳＮＰマーカーの使用などである。
【００５６】
好ましい実施態様では、前記ＳＮＰマーカーは、表２ｃに示されているもの、又は１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５２ｂ５＿３、４３２１０３ｂ４３＿１、若しくは４３２１０１７ｂ３８＿１、又は表１から選択されるＳＮＰマーカーと連鎖不均衡にある任意のＳＮＰである。前記第１乃至第８の側面のポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介性疾患若しくは非アトピー性喘息を有する個体の診断、又はこのような疾病を有する個体の治療において使用される。前記ポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介性疾患若しくは非アトピー性喘息を有する個体を診断するための診断薬（diagnostic）の製造において、又はこのような疾病を有する個体の治療においても使用することができる。
【００５７】
本発明の第９の側面では、本発明の単離された核酸配列は、前記第１乃至第８の何れかの側面に係る単離された核酸配列をインビトロ又はインビボで発現させることができるようにするために、ベクターの形態で提供することができる。ベクターには、プラスミド、染色体、人工染色体、及びウイルスが含まれ、核酸配列をインビトロ又はインビボで発現させることができる発現ベクター、核酸配列をある環境から別の環境へ移行させることができる形質転換ベクターであり得る。本発明の前記核酸分子は、プロモーターを含む１以上の制御要素に作用可能に連結させてもよい。
【００５８】
制御要素（regulatory element）という用語には、反応要素、コンセンサス部位、メチル化部位、遺伝子座制御領域、翻訳後修飾、スプライスバリアント、ホメオボックス、誘導性因子、ＤＮＡ結合ドメイン、エンハンサー配列、開始コドン、分泌シグナル、及びポリＡ配列が含まれる。プロモーターの活性を制御する、プロモーターの上流又は下流の領域（エンハンサーなど）も制御要素である。
【００５９】
前記ベクターは、複製起点、ポリヌクレオチド分子に隣接してインサートをクローニングできるようにするための適切な制限部位、マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位と転写終結領域、ポリメライゼーション部位、又は前記ポリヌクレオチド分子のクローニング及び／又は発現を促進することができる分泌シグナル等の他のあらゆる要素も備えることができる。
【００６０】
ベクターの中で、前記遺伝子は、ヒスチジンタグ、Ｖ５エピトープタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、ＭＨＣタグ、又は当業者に公知である他のこのようなタグ等の発現タンパク質タグの上流又は下流に発現させ得る。このようなタグの使用により、タグ部分に対する抗体を用いて、融合タンパク質の容易な位置決定、アフィニティー精製、及び検出が可能となる。
【００６１】
本発明の核酸分子を２つ以上同一のベクターに導入する場合には、固有の制御配列によって各々を制御してもよいし、同一の制御配列によって全ての分子を制御してもよい。同様に、各分子が３’ポリアデニル化部位を備えてもよい。適切なベクターの例は、当業者に公知であり、pBluescript II、lambdaZap、及びpCMV-Script(Stratagene Cloning Systems、La Jolla、USA)が含まれるであろう。
【００６２】
適切な制御要素、とりわけプロモーターは、通常、発現ベクターを挿入すべき宿主細胞に応じて変わるであろう。微生物の宿主細胞を使用する場合には、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はファージλプロモーター系等のプロモーターが適切である。酵母細胞を使用する場合には、好ましいプロモーターにはアルコール脱水素酵素Ｉ又は解糖プロモーターが含まれる。哺乳類の宿主細胞では、好ましいプロモーターは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターである。様々な宿主細胞での使用に適したプロモーターは、当業者であれば自明であろう（例えば、Ausubelら編、Ｗｉｌｅｙ刊、Current Protocols in Molecular Biologyを参照）。さらに、所望の発現パターンを実現するために、前記制御要素は、例えば、制御要素をさらに加えることによって改変してもよい。
【００６３】
作用可能に連結(operably linked)とは、ベクター又は配列の成分が、所期の機能を発揮する関係にあることを意味する。
【００６４】
これらのベクターは、宿主細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）を形質転換するために使用できる。これらの細胞は、前記第１乃至第８の側面に係る単離された核酸配列から産生される組換え遺伝子産物の生成、又は前記第１乃至第８の側面に係る核酸配列の制御若しくは解析に使用することができる。形質転換された宿主細胞は、本発明の一部を成す。好ましい細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、好ましくは、不死化したマウス、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、又はジャーカット細胞株、ヒト及びサル等の細胞株、及びそれらの誘導物が含まれる。
【００６５】
本発明の第１０の側面によれば、本発明の前記第１乃至第８の側面に係る核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を備えたポリペプチド配列が提供される。好ましくは、前記ポリペプチド配列は、図５の核酸配列によってコードされる。
【００６６】
本発明の第１０の側面には、図５ａ（ｉｉｉ）、５ａ（ｖ）、５ｂ（ｉｉ）、５ｂ（ｉｉｉ）、５ｃ（ｉｉｉ）、５ｄ（ｉｉｉ）の何れか１つに示されているポリペプチド配列、若しくはこれらに相同な配列、又はこれらの断片を備えたポリペプチド配列が含まれる。図５ａ（ｉｉｉ）、５ａ（ｖ）、５ｂ（ｉｉ）、５ｂ（ｉｉｉ）、５ｃ（ｉｉｉ）、５ｄ（ｉｉｉ）の配列は、それぞれ、予想されるヒトＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８ポリペプチド配列である。
【００６７】
ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８ポリペプチド又はこれらに実質的に相同な配列又はこれらの断片に、翻訳後修飾を施すこともできる。本明細書において、翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、タンパク分解による切断（例えば、シグナル配列の除去又はチモーゲンの活性化によるプレタンパク質、プロタンパク質、又はプレプロタンパク質の切断）によって翻訳後にタンパク質を修飾することを含むものとして定義される。ＰＴＭには、炭水化物をタンパク質に付着させることも含まれ、付着させる主な糖には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ＧａｌＮＡＣ、ＧｌｃＮＡＣ、及びＮＡＮＡが含まれる。前記炭水化物は、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合の何れかによってタンパク質に連結させることができる（例えば、グリコシル化）。アシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、及びプレニル化も含まれる。プロリンやリジンの水酸化等のビタミンＣ依存性修飾、カルボキシ末端のアミド化、グルタミン残基のカルボキシル化等のビタミンＫ依存性修飾や、セレノシステインとしてタンパク質中にセレンを添加することも含まれる。
【００６８】
ゴルジ装置から細胞の別の部分への分泌を補助するために、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８ポリペプチドを分泌シグナルに作用可能に連結してもよい。適切な分泌シグナルは、ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）等の組換えベクターによって供与することができる。このようなベクターから発現されたタンパク質は、マウスＩｇκ鎖リーダー配列のＮ末端に融合される。前記分泌シグナルは、組換えＤＮＡ技術を含む本分野で利用可能な技術を用いて、可溶性ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８ポリペプチド配列に連結してもよい。前記ポリペプチドは、ヒスチジンタグ、Ｖ５エピトープタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、ＭＨＣタグ、若しくは当業者に公知である他のタグ、又は当業者に公知の担体分子に連結してもよい。
【００６９】
前記第１０の側面のポリペプチド配列は、好ましくは機能的であり、薬物スクリーニング、診断、又は治療において有用であってもよい。ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８の機能的断片とは、完全長の膜結合型又は可溶型ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８と免疫学的又は機能的な特徴を共有する断片である。断片は、断片は少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは１５、２０、２５、３０、３５、４０又は５０アミノ酸長であり得る。好ましくは、前記ポリペプチド配列は単離される。
【００７０】
本発明の第１１の側面では、前記第１０の側面に係るポリペプチド配列の抗原若しくは前記第１乃至第８の側面に係る単離された核酸の抗原、若しくは何れかの側面の断片に対して特異的である抗体、又は前記第１０の側面に係るポリペプチド配列若しくは前記第１乃至第８の側面に係る単離された核酸の抗原、若しくは何れかの側面の断片と反応する抗体が提供される。本明細書において、「反応する」という用語は、抗体がポリペプチド又は単離された核酸と相互作用することができることを意味する。「に対して特異的である」という用語は、抗体がポリペプチド又は単離された核酸と特異的に反応することを意味する。
【００７１】
抗体は、標準的な操作(Harlow and Lane,“Antibodies;A Laboratory manual” Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Spring Harbour,New York,1998)に記されている操作によって作製することができる。要約すると、免疫反応を惹起するのに十分な量と間隔で、精製された抗原を動物に注入することができる。抗体は直接精製することもできるし、あるいは、脾臓細胞を動物から取得することもできる。次いで、前記細胞を不死化した細胞株と融合し、抗体の分泌をスクリーニングする。抗体は、抗原を分泌する細胞をＤＮＡクローンライブラリーからスクリーニングするために使用することができる。次いで、例えば、Kellyら、Bio/Technology 10:163/167(1992)及びBebbingtonら、Bio/Technology 10:169/175(1992)に記載されているように、これらの陽性クローンを配列決定することができる。好ましくは、検出される抗原及び／又はある抗体を得るために使用される抗原は、第１０の側面に記載のポリペプチド配列又は第１乃至第８の側面に記載の単離された核酸配列を含むであろう。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくは二種特異性抗体、又は上述した全てのものの断片であり得る。二種特異性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、２つの異なる抗原に結合することができる抗体であり、これらの抗原はＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８ポリペプチド若しくは単離された核酸中に存在する、異なる抗原であってもよいし、あるいは、例えば、細胞の抗原と組み合わせたＡＮＧＥ，ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８の抗原であってもよい。
【００７２】
好ましい実施態様では、表５に示されているペプチド断片に対してポリクローナル抗体が作製される。
【００７３】
とりわけ、前記抗体は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８の特定のドメインに対して生じさせることができる。このような抗体は、本発明の診断及び治療的な側面において有用であろう。とりわけ、該抗体は、試料中のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８を個別に又はスプライシングされたハイブリッドとして検出又は測定するためのアッセイを開発する上で有用であろう。
【００７４】
本発明の第１２の側面では、上述した核酸配列を調製する方法であって、連続するヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド残基を互いに連結することを備えた方法が提供される。このような方法は、化学的な合成法を用いて、又は酵素的な触媒を用いることによって実施することができる。あるいは、適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を適切な宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞中に所望の配列を産生させてもよい。
【００７５】
本発明の第１３の側面では、上述したポリペプチドを調製する方法であって、連続するアミノ酸及び／又はオリゴヌクレオチドを互いに連結することを備えた方法が提供される。このような方法は、化学的な合成法を用いて、又は酵素的な触媒を用いることによって実施することができる。あるいは、適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を適切な宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞中に所望の配列を産生させてもよい。前記ポリペプチドは、無細胞系中で産生させることもできる。
【００７６】
第１４の側面では、上述した側面に記載のベクター又は単離された核酸分子若しくは組換え核酸分子を備えた宿主細胞が提供される。該宿主細胞は、発現ベクターを備えてもよいし、又は本発明の核酸分子をコードする裸のＤＮＡを備えてもよい。種々の適切な宿主細胞（真核細胞と原核細胞の両方）を使用することができる。例として、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、好ましくは、不死化したマウス、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ミエローマ、又はジャーカット細胞株、ヒト及びサル等の細胞株、及びそれらの誘導物が含まれる。前記宿主細胞は、好ましくは、前記核酸配列を発現させて遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）を与えることが可能である。このような宿主細胞は、前記第１０の側面のポリペプチドを制御若しくは分析するための薬物スクリーニング系、又は疾患を有する個体若しくは疾患に感受性がある個体の診断若しくは治療に使用するための物質を同定するための薬物スクリーニング系において有用である。
【００７７】
前記核酸分子を宿主細胞中に導入する方法は、ベクター／ＤＮＡと標的細胞の両方の性質に依存するのが通常であり、当業者に公知の方法が含まれるであろう。適切な公知の方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているような、融合、抱合、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、トランスフェクション、トランスダクション、電気穿孔、又は注入などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
本発明の第１５の側面では、本発明の上述した側面の核酸配列を含むヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。このようなヒト以外のトランスジェニック動物は、一塩基多型及びそれらの表現型効果の解析に有用であり、従って、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、及びＣＬＬＤ８遺伝子クラスターとその表現型効果の解析に有用である。ヒト以外のトランスジェニック動物での本発明のポリヌクレオチド配列の発現は、通常、前記ポリヌクレオチドをプロモーター及び／又はエンハンサー配列に作用可能に連結して、好ましくは、上述した側面のベクターを作製し、マイクロインジェクション技術により宿主動物の胚性幹細胞中にこれを導入することによって行う(Hogan et al.,A Laboratory Manual,Cold Spring harbour and Capecchi Science (1989) 244:1288-1292)。次いで、導入遺伝子構築物は、宿主の内在性遺伝子との相同的組換えを行うことになるはずである。所望の核酸配列を含んだ胚性幹細胞は、通常、マーカー遺伝子の発現をモニターすることによって選択することができ、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために使用し得る。好ましい宿主動物には、マウス、ウサギ、及びその他の齧歯類が含まれる。
【００７９】
導入される核酸配列は、宿主動物にとって本来存在するものでなくてもよい（すなわち、外来のものであってもよい）。このようなトランスジェニック動物は、本分野で公知の方法を用いてトランスジェニック動物ではない固有の動物と区別することができる。例えば、トランスジェニック動物から得た核酸試料を固有の動物から得た核酸試料と比較すればよく、トランスジェニック動物は、外来プロモーター、マーカー遺伝子等の核酸配列を有しているであろう。あるいは、動物の表現型を比較することもできる。
【００８０】
疾病を研究するために前記第１５の側面に係るヒト以外のトランスジェニック動物を使用することが望ましい場合には、動物に導入される核酸は、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎をもたらすＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８のバリアントをコードすることが望ましいであろう。固有のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子の任意の組み合わせ、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントを全く発現しない、ヒト以外のトランスジェニック動物を産生することもできる。これらの動物は、「ノックアウト」と称されることがある(Manipulating The Mouse Embryo-A Laboratory Manual,Hogan et al 1986)。ある場合には、外来核酸及び／又は固有の遺伝子の発現を時間又は空間的にモジュレートすることが望ましいであろう。固有の遺伝子の発現が全組織で停止されれば、このアプローチによって、生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の問題は取り除かれる。
【００８１】
最も好ましい実施態様では、バリアント形態のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８をコードする核酸、又はこれらの遺伝子の任意の組み合わせ、又は喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎若しくはアレルギー性鼻炎、又は非アトピー性喘息を引き起こす前記遺伝子の任意のスプライスバリアントを具備するトランスジェニックマウスが提供される。最も好ましくは、前記核酸分子は、表２ｃに示されている１以上の位置に、又は図５の１８５７２ｂ４＿２位、１８５７５２ｂ５＿３位、及び／又は４３２１０１７ｂ３８＿１位に対応する位置にＳＮＰを有する。
【００８２】
好ましくは、相同的組換え技術を用いて時間的及び／又は空間的に適切な態様で、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は２以上の該遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントを発現しないか、あるいは、トランスジェニック操作の結果、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は２以上の該遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントを過剰発現させてタンパク質を産生するように、前記マウスをモジュレートする。
【００８３】
表４ｃに示されているように、ＡＮＧＥ（例えば、ＡＮＧＥ１Ｘ３Ｃ１４８Ｔ）、ＣＬＬＤ７（例えば、ＣＬ０７０３）、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子の中に、又は該遺伝子を２以上任意に組み合わせたものの中に、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの中に機能的な多型（すなわち、「突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」）が同定されれば、この多型を含有する構築物をマウスの生殖系列に導入して（すなわち、ノックイン）、タンパク質をノックアウトするのではなく、タンパク質の病理的バリアントを作製することができる。あるいは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は該遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの病理的バリアントは、過剰発現させてもよい。
【００８４】
本発明において、アトピー性疾患には、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は該遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの過剰発現に起因する疾患、又はバリアント型のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は該バリアント遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記バリアント遺伝子の任意のスプライスバリアントの存在に起因する疾患が含まれる。具体的には、このような疾患には、喘息（アトピー性及び非アトピー性）、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアトピー性鼻炎が含まれる。
【００８５】
本発明の第１６の側面では、アトピーに対する被験体の素因若しくは感受性を診断若しくは測定する方法、又は個体の疾病の重篤度を予測する方法が提供される。前記方法は、病状と関連することが知られているバリアント型のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は該遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの存在を測定すること、又はＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又は該遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントのレベルを測定することを備え得る。バリアント型のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８、又はこれらの遺伝子のうち少なくとも２つを任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントには、核酸バリアントとアミノ酸バリアントの両方が含まれる。バリアントには、（例えば、ヒトの）野生型からの変化をもたらす任意のＳＮＰ（図５／表１）又は野生型から生じたその他の突然変異若しくは変化が含まれる。
【００８６】
例えば、上述したプローブ又はプライマーは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８、又はこれらの遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子若しくはそれらのバリアントの任意のスプライスバリアントをコードする核酸を検出する上で有用であろう。存在するＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８、又はこれらの遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの発現パターン又は型に関する情報は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８、又はこれらの遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの発現が変化することによって生じる疾患に対して個体が感受性を有しているかどうかを決定する上で有用であると思われる。
【００８７】
好ましい実施態様では、前記方法は、これに加えて又はこれに代えて、表１のＳＮＰマーカーのうち１以上と関連するリスク対立遺伝子の有無を測定することを備えることができ、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病に罹患していること又は疾病に対して素因があること又は疾病の重篤度の指標となる。前記方法は、公知の多型の遺伝子型を１以上決定することを備えてもよい。このような多型の任意の組み合わせについて遺伝子型を決定してもよい。必要に応じて、前記方法では、連鎖不均衡にある任意のＳＮＰを１以上使用することができる。
【００８８】
本発明のＳＮＰは、表１に列記されており、多型の性質が野生型対立遺伝子／バリアント対立遺伝子の形式で記載されている。ＳＮＰは図５に基づいて位置が決められており、ヌクレオチド位置１が図５では最初のヌクレオチドである。
【００８９】
本発明で同定された残りのＳＮＰに関する対立遺伝子は、表１に記載されている。
【００９０】
上記方法では、当業者に公知の技術を含む任意の技術を使用することができる。これらには、例えばＥＬＩＳＡアッセイ又は免疫局在性における、上述したプローブ若しくはプライマーの使用又は第１１の側面に係る抗体の使用が含まれ得る。好ましくは、前記方法は、まず被験体から試料を採取することを備える。より好ましくは、前記方法は、試料から核酸又はポリペプチド配列を単離することを備える。
【００９１】
とりわけ、この側面で使用する方法には、核酸配列間の相違を同定するための当業者に公知の方法、例えば、直接のプロービング、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、パイロシークエンシング法(Ahmadian A,Gharizadeh B,Gustafsson AC,Sterky F,Nyren P,Uhlen M,Lundeberg J.Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing, Anal Biochem.2000 Apr 10;280(1):103-10;Nordstrom T,Ronaghi M,Forsberg L,de Faire U,Morgenstern R,Nyren P. Direct analysis of single-nucleotide polymorhpism on double-stranded DNA by pyrosequencing.Biotechnol Appl Biochem.2000 Apr;31(Pt 2):107-12)、対立遺伝子特異的増幅(ASA、Allele Specific Amplification)(WO93/22456)、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、一塩基伸長法（米国特許第4,656,127号)、ARMS-PCR、TaqmanTM(米国4683202号、4683195号、及び4965188号)、オリゴライゲーションアッセイ、一本鎖ＤＮＡ高次構造解析((SSCP)Orita et al PNAS 86 2766-2770(1989))、Genetic Bit Analysis(WO 92/15712)、及びRFLPによる直接配列決定を含むPCR手法、質量分析(MALDI-TOF)、及びＤＮＡアレイが含まれる。適切な制限酵素は、もちろん、多型と制限部位に依存し、当業者に公知のものが含まれるであろう。消化された断片の分析は、本分野における任意の方法（例えば、ゲル分析、又はサザンブロット）を用いて行うことができる。
【００９２】
疾病に対する素因又は疾病の重篤度を診断又は測定する方法であって、例えば、表２ｃに示されている位置に、又は図５の１８５７５２ｂ４＿２、１８５７５２ｂ５＿２、若しくは４３２１０１７ｂ３８＿１位にＳＮＰを有する対立遺伝子の有無を明らかにすることを備え、リスク対立遺伝子の存在によって、疾病であること又は疾病に対する素因があること又は疾病の重篤度が診断される方法が提供される。
【００９３】
本発明は、疾病の正確な診断、又は疾病に対する素因若しくは疾病の重篤度の判定を容易にする点で有利である。このように、遺伝子型を決定することによって、個体が疾病を有しているか又は疾病に対して素因を有しているかを明らかにし、疾病の重篤度を明らかにすることができる。これは、ある治療又は予防策が奏功する可能性が高い個体を同定するのに役立つ。このようにして、より効果的な治療又は予防策を与えることが可能となる。
【００９４】
本発明の多型と関連する前記疾病には、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎等のアトピー性疾患と非アトピー性喘息が含まれる。本発明において、疾病に対する素因とは、これらの個体が前記疾病、又はより重い型の前記疾病、又は特定の型の前記疾病を発症するリスクが高いことを意味する。
【００９５】
本発明において、リスク対立遺伝子とは、疾病と関連する又は疾病への素因と関連する多型を有する対立遺伝子である。リスク対立遺伝子は、以下に記載されているように、野生型であってもよいし、バリアント対立遺伝子であってもよい。
【００９６】
「多型」という用語は、複数の形態の配列が共存することを意味する。このため、多型部位とは、配列の多様性が生じる位置のことである。多型の存在によって生じる、異なった型の配列は、「対立遺伝子」と称される。多型部位を包含する領域は、多型領域と称されることがある。
【００９７】
多型を明らかとする手段の例には、制限断片長多型(Botstein et al Am J Hum Genet 32 314-331(1980))、可変的なタンデムリピート数、超可変領域、ミニサテライト、２又は多ヌクレオチドリピート、挿入要素の数の変動、及びヌクレオチド又はアミノ酸の欠失、付加、若しくは置換が含まれる。多型部位の大きさは、一塩基対にすぎないこともあり、これによって、コドンが変化して、コードされるアミノ酸配列に変化が生じ得る。
【００９８】
一塩基多型は、多型部位におけるヌクレオチド残基の置換、欠失、又は挿入によって生じる。このような変化(variation)をＳＮＰと称している。ＳＮＰは、タンパク質コーディング領域に生じる場合があり、この場合には、異なる多型形態の配列はバリアントタンパク質配列をもたらすことがある。他のＳＮＰは、非コード領域に生じ得る。いずれの場合でも、ＳＮＰによって、タンパク質の欠陥又は遺伝子制御の欠陥がもたらされて、病気を引き起こすことがある。他のＳＮＰは、表現型効果を有していないが、病状に連鎖していることがあり、このため、疾病のマーカーとしての役割を果たし得る。ＳＮＰは、典型的には、前述した他の形態の多型に比べて、ゲノム全体により頻繁に発生し、従って、ある病状と関連するＳＮＰを見出す確率が高くなる。
【００９９】
連鎖不均衡とは、２つの対立遺伝子が同時に遺伝する頻度が、各対立遺伝子の個別の頻度から予想される頻度より大きいことをいう。逆に、対立遺伝子が同時に現れるのであれば、対立遺伝子は連鎖均衡にあるといわれる。２つの対立遺伝子が同時に遺伝する予想頻度は、各対立遺伝子の頻度の積である。
【０１００】
異常な血清ＩｇＥレベルを有する個体を診断する方法であって、ＳＮＰマーカー１８５７５２ｂ４＿２と関連する対立遺伝子の前記個体における有無を明らかにすることを備え、且つ前記マーカーと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰの前記個体における有無を必要に応じて明らかにすることを備えた方法、並びに、５ｍｍを超えるＳＴＩを有する個体を診断する方法であって、ＳＮＰマーカー４３２１０１７ｂ３８＿１と関連する対立遺伝子の前記個体における有無を明らかにすることを備え、且つ前記マーカーと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰの前記個体における有無を明らかにすることを必要に応じて備えた方法も提供される。
【０１０１】
２以上の多型の遺伝子型が決定されている場合には、前記方法によって、疾病の指標又は疾病に対する素因の指標となるハプロタイプの有無を判定することが好ましい。本明細書においてハプロタイプとは、集団に受け継がれる、ある配列中に存在する多型部位の集合体（すなわち、互いに連鎖不均衡である）と定義される。疾病の診断でハプロタイプを同定することは、偽陽性の確率を減らすのに役立つ。前記ハプロタイプは、表１の多型を任意に組み合わせたものであり得、必要に応じて１以上の公知の多型と組み合わせてもよい。好ましいハプロタイプは、表２ｃに示されているＳＮＰ、又は図５の185752b4_2、185752b5_3、若しくは4321017b38_1位のＳＮＰの組み合わせである。
【０１０２】
個体がアトピー状態であると診断する方法であって、表２に示されているハプロタイプと関連する対立遺伝子又はハプロタイプ185752b4_2、185752b5_3、若しくは4321031b43_1と関連する対立遺伝子の個体における有無を明らかにすることを備え、且つこれらのマーカーのうち任意の１つと連鎖不均衡にある他の任意のＳＮＰの個体における有無を明らかにすることを必要に応じて備えた方法も提供される。
【０１０３】
第１６の側面の方法は、被験体から採取した試料に対して実施することが好ましい。この目的に関しては、核酸、好ましくは図５の核酸を含有する細胞を含む任意の生物試料が適している。適切な試料の例には、全血、白血球、精液、唾液、涙、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、皮膚、又は毛が含まれる。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質を分析するためには、前記試料は、目的の配列が発現している組織に由来するものでなければならない。血液は、直ちに入手できる試料である。このように、前記第１６の側面の方法は、好ましくは、個体から試料を取得する工程と、該試料から核酸及び／又はタンパク質を調製する工程と、目的の対立遺伝子又は遺伝子若しくは遺伝子の組み合わせ又は特定のスプライスバリアントの有無について前記核酸又はタンパク質試料を分析する工程とを含む。核酸を分析すべき場合には、分析の前に増幅工程を実施することが好ましい。好ましい増幅技術はＰＣＲであるが、他のあらゆる適切な方法を利用することができる。好ましくは、前記方法は、ストリンジェントな条件下で、ＳＮＰの何れかの側の領域にハイブリダイズするプライマーの対を使用する。前記プライマーには、表４に示されているオリゴヌクレオチド配列が含まれ得る。
【０１０４】
前記被験体は、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。前記被験体は、乳幼児、子供、又は成体であり得る。あるいは、前記試料は、例えば、羊水穿刺によって、分娩前の受診者から取得してもよい。
【０１０５】
疾病に対する被験体のリスク因子は、他の公知の遺伝因子、及び／又は臨床、生理、又は食事因子を参照することによっても決定することができる。
【０１０６】
上記の方法には、被験体から得たＤＮＡ試料の増幅が必要とされることがあり、これは、ＰＣＲ等の本分野において公知の技術によって行うことができる(PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY 1992;PCR Protocols:A Guide to methods and Applications(eds. Innis et al.,Academic press,San Diego,CA 1990);Mattila et al.,Nucleic Acids Res. 19 4967(1991);Eckert et al.,PCR Methods and Applications 117(1991)、及び米国特許第4,683,202号を参照）。他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu et al.,Genomics 4 560(1989);Landegran et al.,Science 241 1077(1988))、転写増幅(Kwoh et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86 1173(1989))持続的自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 87 1874(1990))、及び核酸ベース配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。後の２つの方法では、増幅産物として一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＤＮＡの両者を、それぞれ３０又は１００対１の比率で生成する等温性転写に基づく等温反応が用いられる。
【０１０７】
複数の試料を同時に分析することが望ましい場合には、WO95/11995号に記載されているようなアレイを用いることが好ましいかもしれない。アレイは、多数のプローブを含有することができ、各プローブは、試料由来のＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子のバリアント、これらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントを同定するようにデザインされている。
【０１０８】
制限酵素が必要とされる場合には、多型と制限部位の性質に従って制限酵素を選択することができる。適切な酵素は、当業者に公知であろう。消化された断片の分析は、本分野のあらゆる方法、例えば、ゲル分析、又はサザンブロットを用いて実施することができる。
【０１０９】
上記方法を用いた多型を有する対立遺伝子の判定では、通例、アンチセンス配列、すなわち目的の核酸配列に相補的である配列（図５の配列の一部を含むものでもよい）が用いられる。このような配列は、本発明の第１乃至第８の側面に記載されている。
【０１１０】
被験体から得た試料中に複数の一塩基多型、すなわちハプロタイプの存在を同定することが望ましい場合には、アレイを使用することが好ましいかもしれない。アレイは、多数のプローブを含有することができ、各プローブは、本発明の上記一塩基多型を一以上同定するようにデザインされる。
【０１１１】
前記第１６の側面の方法では、先述したような、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子の任意の組み合わせ、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの有無に対する抗体を用いてもよい。試料中の抗原に抗体が結合したことの検出は、一次抗体に結合する二次抗体、又はリガンドの使用等の本分野において公知の方法によって容易となるであろう。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）や酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）やイムノブロッティングを含むイムノアッセイを用いて、抗原の存在を検出することもできる。例えば、ＥＬＩＳＡを使用する場合、前記方法は、前記抗体を基質に結合させることと、抗原を含有する試料に前記結合した抗体を接触させることと、検出可能部分（典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素）に結合された二次抗体にこれを接触させることと、前記酵素の基質にこれを接触させることと、最後に、前記試料中に前記抗原が存在することの指標となる色の変化を観察することとを備え得る。
【０１１２】
この目的に関しては、核酸、核酸又はタンパク質を含有する細胞を含む任意の生物試料が適している。適切な試料の例には、全血、精液、唾液、涙、口腔、皮膚、又は毛が含まれる。ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質を分析するためには、前記試料は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントが発現されている組織から得られた試料でなければならない。末梢血白血球は、直ちに入手できる試料である。
【０１１３】
本発明の第１７の側面では、ＩｇＥ媒介性疾患、アトピー、アトピー性疾患の一形態、若しくは非アトピー性喘息を診断する方法、又は疾病の重篤度若しくは疾病に対する素因を予測する方法において使用するためのＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、又はＣＬＬＤ７のスプライスバリアントが提供される。
【０１１４】
前記スプライスバリアントは、好ましくはＡＮＧＥ又はＣＬＬＤ８又はＣＬＬＤ７の配列の全体又は一部によってコードされるＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡ配列である。前記ＡＮＧＥ遺伝子の転写物及びＡＮＧＥ遺伝子のスプライスバリアントは、本発明のさらなる側面に含まれる。前記第１７の側面のスプライスバリアントには、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、若しくはＣＬＬＤ７の少なくとも１つのエキソン若しくはエキソンの断片、又はＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、及びＣＬＬＤ７遺伝子のうち少なくとも２つから得られる少なくとも１つのエキソン若しくはエキソンの断片の組み合わせが含まれる。特に、ＡＮＧＥのスプライスバリアントには、ＡＢ０１１０３１エキソン１若しくはＡＦ１５５１０５エキソン１を有する転写物、又は少なくともエキソン２を備えた転写物、エキソン２を欠いた転写物、エキソン５と６の間に存在するエキソンＶａ又はＶｂを少なくとも備えた転写物（図４Ｇ）、エキソンＶａ又はＶｂを欠いた転写物、少なくともエキソン４、５、６、７、及び／又は８を備えた転写物が含まれ得る。ＡＮＧＥのイントロン／エキソンマップは、図３に示されている。
【０１１５】
第１８の側面では、アトピー若しくはアトピー性疾患の一形態を診断する方法、又は疾病の重篤度若しくは疾病に対する素因を予測する方法において使用するための診断剤の製造における、ＡＮＧＥ及び／又はＣＬＬＤ８及び／又はＣＬＬＤ７のスプライスバリアントの使用が提供される。あるいは、前記スプライスバリアントは、疾病を治療するための医薬の製造で使用するために又は疾病を治療する方法で使用するために提供される。
【０１１６】
第１９の側面では、前記第１６の側面に係る方法で使用するための前記第１７の側面に係るスプライスバリアントを備えたキットが提供される。好ましくは、２以上のスプライスバリアントは、アレイの形態で又はチップ上に与えられる。
【０１１７】
第２０の側面では、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、若しくはＣＬＬＤ７遺伝子を備えたポリヌクレオチド配列、又は該配列によってコードされるポリペプチド、又はこれらの断片であって、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、又はＣＬＬＤ７の活性を阻害又は増大する物質のスクリーニングで使用するためのポリヌクレオチド配列、ポリペプチド、又は断片が提供される。このような物質をスクリーニングするための方法も提供される。
【０１１８】
本発明の第２１の側面では、表１のＳＮＰを有する対立遺伝子の有無を測定する手段を備えた疾病又は疾病に対する素因を診断するためのキットであって、前記対立遺伝子が疾病若しくは疾病に対する素因又は疾病の重篤度の診断指標となるキットが提供される。  
好ましい実施態様では、前記キットは、第８の側面の多型を有する１以上のリスク対立遺伝子の有無を測定するための手段を備える。特に、前記キットは、表２ｃに示されているＳＮＰ、又は図５の１８５７５２ｂ４＿２位、１８５７５２ｂ５＿３位、及び／又は４３２１０１７ｂ３８＿１位のＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を測定するための手段を備える。
【０１１９】
前記キットは、本発明の第１６の側面に従って、第８の側面のリスク対立遺伝子の有無を測定するために必要な成分を備えるのが好ましいであろう。このような成分には、ＰＣＲプライマー及び／又はプローブ（例えば、上述したもの）、ＰＣＲ酵素、制限酵素、及びＤＮＡ又はＲＮＡ精製手段が含まれる。好ましくは、前記キットは、少なくとも一対のプライマー、又はプローブ、好ましくは、本発明の第８の側面に上記したものを含有するであろう。前記プライマーは、好ましくは、対立遺伝子特異的なプライマーである。他の成分には、標識手段、反応用の緩衝液が含まれる。さらに、野生型又は上述のバリアント核酸配列、又はそのＰＣＲ産物を含む対照核酸試料を含めてもよい。前記キットは、通常、前記診断法を実施するための指示書と、前記結果と疾病の可能性の相関を詳細に示した手がかり（ｋｅｙ）とを備えるであろう。前記キットは、疾病の予防又は治療用物質を備えてもよい。
【０１２０】
本発明の第２１の側面では、疾病を治療するための化合物を同定する方法であって、（ａ）表１に列記されている図５の位置に対応する位置に１以上のＳＮＰを有する核酸分子を含む組織に化合物を投与することと、（ｂ）前記物質が前記ＳＮＰの効果をモジュレートするかどうかを測定することを備えた方法が提供される。
【０１２１】
好ましい実施態様では、前記単離された核酸分子は本発明の第８の側面に係る核酸分子であり、最も好ましくは、表２ｃに示されているＳＮＰ、すなわち図５の１８５７５２ｂ４＿２位、及び／又は１８５７５２ｂ５＿３、及び／又は４３２１０１７ｂ３８＿１位に対応する位置にＳＮＰを有する。
【０１２２】
この側面では、ＳＮＰの効果をモジュレートすることができる物質をスクリーニングするために、本発明の核酸分子、及び／又は上述した側面に係る細胞株を使用し得る。
【０１２３】
候補となり得る物質は、リスク対立遺伝子及び非リスク対立遺伝子との反応が異なる物質である。候補物質には、当業者に公知の物質が含まれ、化学的又は生物的化合物、例えば上述したようなセンス核酸配列又はアンチセンス核酸配列、結合タンパク質、キナーゼ、及び他の任意の遺伝子又は遺伝子産物、アゴニスト又はアンタゴニストが含まれる。前記物質は、発病対立遺伝子の効果をモジュレートできることが好ましいであろう。最も好ましくは、前記物質は、リスク対立遺伝子の有害な効果を軽減することができる物質である。
【０１２４】
このような物質は、予防的な投与にも、又は疾病であると診断された後の投与にも適しているかもしれない。投与経路は、治療すべき疾病又は症状に応じて適切に選択されるが、本発明の物質を投与する典型的な経路には、経口、直腸、静脈内、非経口、筋肉内、皮内経路が含まれる（これらに限定されるものではない）。本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れかとして（従って、遺伝子治療の形態として）投与すべき物質も提供する。前記物質は、リポソーム、ウイルスベクター、及び被覆粒子（遺伝子銃）等の手段によって直接細胞中に送達することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
本発明の第２３の側面では、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎若しくはアトピー性鼻炎、又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患を予防又は治療するのに使用するための上述した本発明の物質又は抗体が提供される。
【０１２６】
ＡＮＧＥ、及び／又はＣＬＬＤ８、及び／又はＣＬＬＤ７遺伝子の発現に影響を与えることができる物質であって、個体のＩｇＥ媒介性疾患、例えばアトピー性又は非アトピー性喘息を治療する方法において使用するための物質も提供される。好ましくは、前記物質（ａｇｅｎｔ）は、ＡＮＧＥ及び／又はＣＬＬＤ８及び／又はＣＬＬＤ７遺伝子プロモーターの活性に影響を与えることができ、及び／又はＡＮＧＥ及び／又はＣＬＬＤ８及び／又はＣＬＬＤ７又はＡＮＧＥとＣＬＬＤ７遺伝子又は前記２以上の前記遺伝子の任意の組み合わせ又は任意のスプライスバリアントのＲＮＡスプライシングに影響を与えることができる。活性に影響を与えること又は活性をモジュレートすることには、阻害若しくは増強すること、又は活性のパターンを変化させることが含まれ得る。前記第２３の側面に係る物質の例には、ＡＮＧＥ／ＣＬＬＤ８プロモーター又はスプライス部位に結合し得るタンパク質（転写因子等）、抗体又は結合対、リボザイム、及びポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
前記遺伝子の発現に影響を与える好ましい物質には、図５の当該ポリヌクレオチド配列に相補的であるポリヌクレオチド配列が含まれる。配列相補性は、本分野で利用可能な従来技術を用いて測定することができる。好ましい相補的（又はアンチセンス）配列は、ストリンジェントな条件下で、前記遺伝子にハイブリダイズする配列である。好適には、ストリンジェントな条件とは、（例えば、ＡＮＧＥ以外の配列への）非特異的なハイブリダイゼーションが回避される条件である。
【０１２８】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールで用いられる洗浄条件を意味する。一般に、洗浄条件は、研究対象となっている核酸のＴｍの計算値を変性温度が約５−２０℃下回るように、温度と塩濃度を組み合わせなければならない。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍは、短いオリゴヌクレオチドに関するＷａｌｌａｃｅ則に従って、標準条件（１Ｍ  ＮａＣｌ）下で、［４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ａ＋Ｔ）］と計算される。これより長いＤＮＡ断片の場合、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、ＰＮＡＳ  ８３：３７４６−３７５０（１９８６）に記載されている法則に従って、固体熱力学と実験データを組み合わせた直近隣接法を用いることができる。ハイブリダイゼーション用の最適な塩及び温度条件は、フィルター上に固定化されたＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズさせた後に、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験で容易に決定することができる。ＰＣＲ用の条件は標準条件と異なってもよく、プライマーの予測相対安定度の指標としてＴｍを使用し得る。約１４ヌクレオチドの短いプライマーの場合、４４℃−５０℃前後の低いアニーリング温度が用いられる。前記温度は、使用するプライマー配列の塩基組成に応じてさらに高くしてもよい。  ストリンジェントな条件下で、ＡＮＧＥ又はＣＬＬＤ８又はＣＬＬＤ７遺伝子にハイブリダイズするアンチセンス配列は、本発明のあらゆる側面においてプライマーとして有用であろう。ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８若しくはＣＬＬＤ７遺伝子、若しくは対立遺伝子、若しくはそれらのバリアントの全部又は一部を増幅するためのプライマーの対は、本発明の別の側面を構成する。
【０１２９】
喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎、又はアレルギー性鼻炎又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患の予防又は治療に使用するための医薬の製造における上記物質又は抗体の使用も提供される。上記側面の物質、特にアンチセンス配列は、アトピーを有する個体を診断する上でも有用であろう。
【０１３０】
本発明の第２４の側面によれば、上述した本発明の核酸配列又はポリペプチド配列を含む薬学的組成物又は医薬が提供される。あるいは、前記薬学的組成物は、上記側面に関して明記した物質又は本発明の第１１の側面に係る抗体を含んでもよい。
【０１３１】
薬学的組成物の投与は、任意の効果的な経路（例えば、経口又は非経口）によって行われる。非経口送達法には、局所、動脈内、皮下、髄内、静脈内、又は鼻腔内投与が含まれる。投与は、羊水穿刺関連技術によっても実施することができる。皮下注射に引き続いて経口投与するのが、好ましい取り込みの経路であろう。長期作用する固定化も使用されるであろう。活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性な化合物を薬学的に使用可能な調製物に加工することを容易にする賦形剤やその他の化合物を具備する薬学的に許容される適切な担体を含有してもよい。調剤と投与のための技術についてさらに詳しく知るには、「REMINGTON‘S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Maack Publishing Co,Easton PA)」の最新版を参照されたい。
【０１３２】
経口投与用の薬学的組成物は、本分野において周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与に適した製剤に調合することができる。このような担体によって、前記薬学的組成物は、患者の摂取に適した錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調合することが可能となる。  本発明での使用に適した薬学的組成物には、前記活性成分が意図する目的を達するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。このように、治療的有効量とは、治療されている疾病の症状を改善又は根絶するのに十分な量のことである。実際に投与される量は、治療を施すべき個体に応じて変動し、重大な副作用を生じずに所望の効果が実現される最適化された量であることが好ましいであろう。治療的有効量の決定は、明らかに当業者の能力の範疇に属する。もちろん、当業者であれば、分割投与や部分投与も本発明の範囲に属することは理解できるであろう。
【０１３３】
何れの化合物の場合でも、治療的有効量は、まず、細胞培養アッセイ又は任意の適切な動物モデルの何れかで推定することができる。これらのアッセイは、下流のプロセシング活性の他に、受容体活性を考慮に入れなければならない。動物モデルは、望ましい濃度範囲や投与経路を達成するためにも使用される。次いで、このような情報は、ヒトでの投与に有用な用量と経路を決定するために使用することができる。
【０１３４】
治療的有効量とは、症候又は症状を改善する物質の量を指す。このような化合物の治療的な有効性と毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的な薬学的手技によって決定することができる（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％で治療的に有効な用量、ＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的な用量）。治療効果と毒性効果の用量比が治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０比で表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイと動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を策定する際に使用される。このような化合物の投薬量は、毒性をほとんど又は全く示さずにＥＤ５０を包含される循環濃度域中に収まることが好ましい。投薬量は、用いる投薬形態、患者の感受性、及び投与経路に応じてこの範囲内を変動する。
【０１３５】
正確な投薬量は、治療を受ける患者を顧慮して、各医師が選択する。投薬量と投与は、十分なレベルの活性部分を与えるように、又は所望の効果を維持するように調節される。考慮に入れなければならないことがあるその他の要素には、病状の重さが含まれる。長期にわたって作用する薬学的組成物は、当該剤形の半減期やクリアランス速度に応じて、３乃至４日毎、１週間毎、又は２週間毎に１度の投与でもよい。投薬量や送達法についての手引きは、文献に記載されている（米国特許第4,657,760号、5,206,344号、及び5,225,212号を参照、本明細書に参考文献として援用される）。
【０１３６】
本発明の第２５の側面によれば、被験体の疾病を予防又は治療する方法であって、ＡＮＧＥ及び／又はＣＬＬＤ７及び／又はＣＬＬＤ８又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの又は前記遺伝子のあらゆるスプライスバリアントの前記被験体における活性、発現、半減期、又は翻訳後修飾をモジュレートすることを備えた方法が提供される。
【０１３７】
さらに、ＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息を有する個体の治療には、アトピーの予防、並びに予防的及び治療的措置が含まれる。
【０１３８】
前記方法は、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性鼻炎又は非アトピー性喘息等のＩｇＥ媒介性疾患に罹患している又は感受性があると診断された被験体に実施するのが好ましい。
【０１３９】
好ましくは、前記方法は、ＩｇＥ媒介性疾患と関連を有するＳＮＰ（例えば、図５の185752b4_2、185752b5_3、及び/又は4321017b38_1）、又は（例えば、表２ｃに示されているような）喘息、アトピー、又はそれらの組み合わせと関連を有するＳＮＰを有するリスク対立遺伝子の有無を測定することと、リスク対立遺伝子が存在すれば、疾病を予防、遅延、又は軽減するために治療を施すこととを備える。
【０１４０】
リスク対立遺伝子の有無を決定する前記工程は、前記第１６の側面に従って実施することが好ましく、それ故、表１のＳＮＰを有するリスク対立遺伝子、又は、例えば上記されているようなそれらの任意の組み合わせの有無を決定することも備える。
【０１４１】
個体のＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息を予防又は治療する方法であって、ＣＬＬＤ８及び／又はＡＮＧＥ及び／又はＣＬＬＤ７遺伝子又は該遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの発現をモジュレートすることを備えた方法も提供される。好ましくは、前記方法は、本発明の前記第１乃至第８の側面に係る遺伝子産物の産生をモジュレートする。特に、前記第２５の側面は、ＣＬＬＤ８プロモーターの活性をモジュレートすることによって、又はＣＬＬＤ８及び／又はＡＮＧＥ遺伝子のスプライシングをモジュレートすることによって行うことができる。
【０１４２】
モジュレートする又は影響を与えるとは、発現を阻害すること、増大すること、又はその他の方法で変化させることを意味する。
【０１４３】
第２５の側面に従って疾病を予防又は治療することには、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又はこれらの遺伝子の断片、前記遺伝子若しくは疾病と関連を有する対立遺伝子の任意のスプライスバリアントの効果をモジュレートすることができる任意の物質を投与することが含まれ得る。好ましくは、前記物質は、リスク対立遺伝子の有害な効果を改善することができる物質である。前記方法には、遺伝子治療技術が含まれるが、これに限定されない。遺伝子治療技術では、通例、リスク対立遺伝子を包含する核酸配列を置換するか、あるいは、リスク対立遺伝子の効果をダウンレギュレートする。前記第１乃至第８の側面の核酸配列又はこれにアンチセンスな配列が、遺伝子治療において有用であろう。
【０１４４】
モジュレートするとは、遺伝子又は遺伝子産物の活性を阻害又は増加させることを意味する。活性は阻害されることが好ましい。前記遺伝子又は遺伝子産物の活性には、核酸配列の転写と翻訳、タンパク質の集合、タンパク質の翻訳後修飾、他の因子との下流での相互作用を含むその産生又は機能に関する全ての側面が含まれる。
【０１４５】
ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性は、多くの態様でモジュレートすることができる。例えば、前記遺伝子の発現は、本発明の第１乃至第８の側面のアンチセンス配列の使用を通じて、又はアンチセンスＲＮＡ配列の産生によって阻害することができる。このような配列は、遺伝子治療によって被験体に導入されると、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子に、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたものである転写物に、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントに、又は１若しくは複数の前記遺伝子から転写されたＲＮＡにハイブリダイズし、その転写又は翻訳を阻害するであろう。他のバリアントに影響を与えることなく、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ、若しくはＣＬＬＤ８のスプライスバリアント、又はこれらの遺伝子の組み合わせのうち一定のものの機能又は発現をモジュレートすることが望ましい場合に、この方法は特に有用であり得る。
【０１４６】
核酸配列の導入には、本分野で公知の方法を含む遺伝子治療法を用いることができる。一般的に、核酸配列は、通常はベクターの形態で、好ましくは薬学的に許容される担体の形態で被験体の標的細胞中に導入されるであろう。組換えゲノムをパッケージングすることができるレトロウイルスベクター系等のウイルスベクターを含む任意の適切な送達媒体を使用し得る。レトロウイルスは、次いで、標的細胞に前記ポリヌクレオチドを感染させ、送達するために使用することもできる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、及びポックス又はワクシニアウイルスベクターの使用を含む、他の送達技術も広く使用できる。Lipofectin(R)、Lipofectamine(R)、(GIBCO-BRL、Inc.Gaitherburg、MD)、Superfect(R)(Qiagen Inc,Hilden,Germany)、及びTransfectam(R)(Promega Biotec Inc,Madison WI)等の市販のリポソーム調製物を含むリポソームを用いてもよい。  ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの生物活性をモジュレートするための他の手段には、それらが相互作用する下流の因子とＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントとの相互作用に影響を与え得る物質を使用することも含まれる。
【０１４７】
ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、又はＣＬＬＤ７遺伝子の発現に影響を与えることができる物質であって、個体のＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息を予防又は治療する方法において使用するための物質も提供される。該物質は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、若しくはＣＬＬＤ７遺伝子プロモーター、又は該遺伝子プロモーターのうち２以上を任意に組み合わせたものの活性に影響を与えることができるのが好ましい。該物質は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ８、若しくはＣＬＬＤ７遺伝子、又は前記遺伝子の転写物のうち２以上を任意に組み合わせたもののＲＮＡスプライシングに影響を与えることができるのが好ましい。物質には、前記第１乃至第８の側面の核酸配列、前記第１０の側面のポリペプチド配列、前記第１１の側面の抗体、本明細書に記載した他の任意の物質が含まれ、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートすることができるものが好ましい。
【０１４８】
前記被験体は、任意の動物であることができ、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。
【０１４９】
被験体の上述したＩｇＥ媒介性疾患又は非アトピー性喘息を予防又は治療する上で使用するための医薬の製造における上述の物質の使用も提供される。
【０１５０】
本発明の第２６の側面によれば、数多くのスクリーニングが提供される。第１のスクリーニングは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するスクリーニングであって、
本発明の前記第１０の側面に記載されたポリペプチド配列を準備することと、
基質を準備することと、検査すべき物質を準備することと、
前記基質の加工を測定することによって前記検査すべき物質が前記ポリペプチドの活性をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１５１】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合され、２以上の基質又はポリペプチドをアッセイの中に含めてもよい。
【０１５２】
前記スクリーニングアッセイでは、前記ポリペプチドは、本発明の第１０の側面に係る任意のポリペプチドであり得る。ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの断片を使用してもよい。１以上のＳＮＰを有するＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアント、前記第１乃至第８の側面に記載されているもののような本発明の核酸配列を使用してもよい。前記ポリペプチドは、精製されていてもよいし、精製されていなくてもよい。前記ポリペプチドは可溶性であり得る。前記ポリペプチドは、ドメインを１以上備え得る。
【０１５３】
検査されている前記物質は、ＩｇＥ媒介性の疾病若しくは疾患又は非アトピー性喘息の予防又は治療で使用するために、同定されている。ＩｇＥ媒介性の疾病若しくは疾患には、喘息、アトピー、花粉症、湿疹、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性鼻炎が含まれる。
【０１５４】
前記基質は、本発明の第１０の側面に係るポリペプチドによって加工される任意の基質であり得る。加工される(processed)とは、測定可能なあらゆる変化を意味する。これらの基質は、加工を容易に検出できるようにするために、蛍光標識又は蛍光修飾し得る。このような標識又は修飾は、当業者に公知である。
【０１５５】
好ましい実施態様では、前記アッセイは、当業者に公知のヒストンメチルトランスフェラーゼの活性又はヌクレオチド交換因子の活性を測定する任意の手段である。例えば、「Hama et al J. Biol. Chem., 274:15284-15291 1999」。
【０１５６】
本発明は、さらに、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するスクリーニングであって、
本発明の第１０の側面に係るポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
細胞を準備することと、
前記細胞の表面への接着を測定することによって前記検査すべき物質が前記ポリペプチドの活性をモジュレートするかどうかを測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１５７】
このようなスクリーニングは、細胞接着スクリーニング（又はアッセイ）と称することができる。前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１５８】
典型的には、細胞接着アッセイで使用される細胞は、懸濁液中に維持することができ、懸濁液の中で、細胞間接着分子の相互作用に起因する細胞の凝集により接着が測定される。あるいは、表面への接着を測定してもよい。表面は、非生物分子（例えば、組織培養プラスチック）であってもよく、あるいは、細胞性又は非細胞性である生物分子であってもよい。非細胞性分子の例には、フィブロネクチン、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分が含まれる。１以上の細胞又はその他の非細胞生物分子を組織培養表面又は細胞外マトリックス成分被覆表面等の表面に付着させてもよい。接着は、表面への細胞の接着を測定することによって判定される。細胞接着のモジュレーションは、細胞接着の増加又は細胞接着の減少の何れかであり得る。ある物質が第１０の側面のポリペプチドの活性又は発現に影響を及ぼせば、その物質は前記ポリペプチドのモジュレーターであると考えられ、これは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの発現のレベルであってもよいし、あるいは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８  ｍＲＮＡ又はポリペプチド分子又は前記遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの半減期を変化させることによるか、あるいは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８ポリペプチド、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたものによってコードされるポリペプチド、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントによってコードされるポリペプチドの翻訳後修飾の状態に影響を及ぼすことによるものであり得る。
【０１５９】
前記細胞は、前記第９の側面のベクターを備えた本発明の第１４の側面に係る宿主細胞であり得る。前記第２６の側面には、物質を同定するためのスクリーニングにおける前記宿主細胞の使用も含まれる。
【０１６０】
本発明のさらなる側面は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子の活性、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたものの活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
本発明の前記第１０の側面に記載のポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
細胞を準備することと、
前記細胞の分化又は増殖の変化を測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１６１】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。  
典型的には、分化は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができ、例えば、Ｂリンパ球の場合、分化の変化はＢ細胞活性化であり得る。前記細胞は、第１０の側面のポリペプチド又は第１４の側面の宿主細胞を１以上発現してもよい。他の細胞種の場合には、免疫調節物質（例えば、サイトカイン又は増殖因子）等の細胞シグナル伝達因子の産生の誘導又は抑制であり得る。前記細胞シグナル伝達因子は、分泌されてもよい。免疫調節物質はペプチド制御因子であり得るし、あるいは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントをモジュレートする物質によって発現が変化を受ける他の任意の生物物質でもあり得る。典型的には、このアッセイは、インビトロで、例えば組織又は臓器培養中で行われ、前記細胞は、患者又は動物又は前記第１５の側面のトランスジェニック動物から採取した後に培養してもよい。
【０１６２】
表現型の変化は任意の変化であり得る。これには、Ｂ細胞表現型の変化が含まれ得る。
【０１６３】
このようなスクリーニングは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子の活性、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたものの活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのインビトロモデルを提供する。  本発明のさらなる側面は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子の活性、又はこれらの遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたものの活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
本発明の第１５の側面に記載のトランスジェニック動物を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
検査すべき前記物質に前記トランスジェニック動物を接触させることと、
前記トランスジェニック動物の表現型の変化を検出することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１６４】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１６５】
前記物質を検査すべき細胞は、懸濁液中に、組織培養中に、臓器の一部として、又は動物の一部として存在することができる。好ましくは、前記動物は、ラット、ウサギ、マウス、又はその他の齧歯類等の実験動物である。
【０１６６】
表現型の変化には、遺伝子発現の変化、又はＲＮＡ若しくはタンパク質の産生の変化、又は細胞の形態若しくは挙動の変化が含まれる。
【０１６７】
本発明のさらなる側面は、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又は該遺伝子のうち２以上を任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質の使用に伴う副作用を検出するためのスクリーニングであって、
本発明の第１乃至第８の側面に係る核酸配列又は本発明の第１０の側面に係るポリペプチドを実質的に発現していない細胞を準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記検査すべき物質を前記細胞と接触させることと、
前記物質によって前記細胞にもたらされた何らかの副作用を測定することと、を備えた方法を提供する。
【０１６８】
前記スクリーニングの成分は、任意の自由な順序で混合される。
【０１６９】
測定すべき前記副作用は任意の副作用であり得、細胞がこれより大きな組織又は動物の一部であるかどうかに依存するであろう。副作用は、細胞分化、又は細胞増殖の変化を伴ってもよい。前記副作用は、臓器又は動物の表現型の変化の指標であり得る。
【０１７０】
本発明のさらなる側面は、本発明の前記第１乃至第８の側面に記載のポリペプチド、又は本発明の前記第１０の側面に記載のポリペプチドの活性をモジュレートする物質を同定するためのスクリーニングであって、
本発明の前記第１乃至第８の側面に記載の単離された核酸又は本発明の前記第１０の側面に記載されたポリペプチドを準備することと、
検査すべき物質を準備することと、
前記物質と前記核酸又はポリペプチドの試料との相互作用を測定することによって、前記検査すべき物質が前記単離された核酸又はポリペプチドの活性をモジュレートするかを測定することと、
を備えたスクリーニングを提供する。
【０１７１】
好ましくは、このスクリーニングは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたもの、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの転写を測定するインビトロ転写アッセイである。
【０１７２】
あるいは、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、又はＣＬＬＤ８遺伝子、又はこれらの遺伝子のうち２以上を組み合わせたものによって産生される転写物、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの理論的又はモデル特性を使用することによって、物質を同定してもよい。機能的又は構造的特性は、タンパク質自体の特性であってもよいし、あるいはコンピュータで作製したモデル、物理的二次元若しくは三次元モデル、又は電気的（例えばコンピュータ）に作製した一次構造、二次構造、若しくは三次構造の特性、並びにファルマコフォア（三次元電子密度マップ）若しくはそのＸ線結晶構造の特性であり得る。
【０１７３】
物質の候補としては、当業者に公知のもの又は新規物質が含まれ、アンチセンスヌクレオチド配列、前記第１０の側面のポリペプチド配列に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体等の化学的又は生物的化合物が含まれる。
【０１７４】
本発明の第２７の側面によれば、ＡＮＧＥ、ＣＬＬＤ７、若しくはＣＬＬＤ８遺伝子の活性、又はこれらの遺伝子を２以上任意に組み合わせたものの活性、又は前記遺伝子の任意のスプライスバリアントの活性をモジュレートする物質のスクリーニングにおける、上述した核酸配列又はポリペプチド配列の使用が提供される。
【０１７５】
前記方法は、好ましくは、本発明の先述した側面に記載の核酸又はポリペプチド配列に物質の候補を接触させることと、前記ヌクレオチド又はポリペプチド配列の発現及び／又は活性をモニタリングすることとを備える。物質の候補は、該物質の不存在下での活性又は発現に比べて、前記ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の活性又は発現を変化させる物質である。本方法は、本発明のヌクレオチド又はポリペプチドを備えた宿主細胞、組織培養、又はヒト以外のトランスジェニック動物に物質の候補を接触させることと、炎症性疾患を呈示する（ｄｉｓｐｌａｙ）こととによって実施し得る。
【０１７６】
前記第２６の側面の方法によって同定された物質も提供される。
【０１７７】
前記第２の側面以降の側面の好ましい特徴は、第１の側面と同様である。
【実験の詳細】
【０１７８】
＜表の説明＞
表１は、ＬｎＩｇＥとＢＡＣ  ｂＡ１０３Ｊ１８．０３５４８、ＢＡＣ  ｂＡ１０１ｄ１１．０１１１６、及びＢＡＣ  ｂＡ２３６ｍ１５．００３０３中に同定されたＳＮＰとの関連を示している。位置は、ＢＡＣ／ＰＡＣコンティグから得られた基準配列の先頭からの塩基対で表されている。
【表１】
2006081547.tif 000002
【０１７９】
2006081547.tif 000003
【０１８０】
2006081547.tif 000004
【０１８１】
2006081547.tif 000005
【０１８２】
表２は、被験者群で、共通のｂ４＿２．ｂ５＿３．ｂ４３＿１ハプロタイプが総ＩｇＥに関連していることを示している。
【０１８３】
ａ）総血清ＩｇＥとのＳＮＰ／マーカー関連
ｂ）被験者群における、共通のｂ４２．ｂ５＿３．ｂ４３＿１ハプロタイプの総ＩｇＥへの関連
ｃ）分類的形質（喘息とアトピー）との関連。
【表２Ａ】
2006081547.tif 000006
【表２Ｂ】
2006081547.tif 000007
【表２Ｃ】
2006081547.tif 000008
2006081547.tif 000009
表３は、図５の１ｍｂ領域から単離された完全長のｃＤＮＡを示している。
【表３】
2006081547.tif 000010
【０１８４】
表４は、ＳＮＰの同定で用いたプライマー対を示している。
【０１８５】
ａ）領域中に同定されたＳＮＰＳ
ｂ）ＲＦＬＰアッセイで用いたプライマー対を示している
ｃ）ＳＮＰ配列
ＣＬＬＤ８のエキソンＸＩＩとＡＮＧＥのエキソンＩＩＩの間でのＰＣＲ増幅。３つのバンドが観察されており（Ａ、Ｂ、及びＣ）それらのスプライス構造が挿入図の中に描かれている。ＡＮＧＥエキソンＩＩを欠如するバンドＢは、ＣＬＬＤ８からＡＮＧＥへと続くオープンリーディングフレームを有している。最も大きな分子量のバンドは、ＩｇＧＦｃ遺伝子座内の相同配列からのプライミングによって生じる。
【表４Ａ】
2006081547.tif 000011
2006081547.tif 000012
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【表４Ｂ】
2006081547.tif 000017
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【表４Ｃ】
2006081547.tif 000019
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表５は、抗体を作製するために使用したペプチド配列を示している。
【表５】
2006081547.tif 000038
【０１８６】
表６は、ＥＭＳＡによって調べた機能的プロモーターＳＮＰの候補を示している。
【表６】
2006081547.tif 000039
【実験例１】
【０１８７】
被験体
ウエスタンオーストラリアの田舎町Busseltonの２３０家族からなる母集団試料から選択した８０核家族の３６４人の被験体について１次のマッピングを実施した３、５１（ＡＵＳ１パネル）。このパネルの家族には、アトピーと非アトピーの両方の構成員が含まれ、３つ以上の同胞群では、アトピーと非アトピーが混在していた。ＡＵＳ２パネルは、母集団試料の残りの１５０核家族からなった。ＵＫ２パネルは、Oxford地域における喘息クリニックに出席した子供を通して採用した８７核家族からなった。この家族には、２１６人の子孫（１４８の同胞対）が含まれていた。ＥＣＺパネルは、既報３０のように、進行中のＡＤに罹っている子供を通して、Great Ormond Street Hospital for Childrenでの皮膚科学クリニックにおいて採用した１５０核家族からなった。
【０１８８】
表現型
ハウスダストダニ（ＨＤＭ）及び花粉混合物に対する（負の対照の応答を除いた）皮膚試験、ＨＤＭ及びオオアワガエリに対する特異的ＩｇＥ力価、及び血清総ＩｇＥを既報(Hill,M.R.、James,A.L.、Faux,J.A.等 British Medical Journal 311、776〜9(1995))のとおり測定した。ＨＤＭ及び草混合物に対する皮膚穿刺試験結果（ＨＤＭ又は花粉又はその両方に対してアトピー反応を示した母集団のうち９５％の個体）の合計として「皮膚試験インデックス（ＳＴＩ）」を計算した。メタコリンに対する気管支反応性を既報のとおり測定した：投与した最大用量は１２μｍｏｌであった。用量−応答曲線の傾斜を、（投与前の一秒量（ＦＥＶ１）−最後のＦＥＶ１）のメタコリン累積用量として計算した。傾きが０のときには、定数０．０１を各測定値に加えてｌｏｇｅ変換ができるようにした。末梢血中の好酸球をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで数え、ｌｏｇｅ値を分析前に変換した。
【０１８９】
「アトピー」を、ＳＴＩ＞５ｍｍ、ＨＤＭ及びオオアワガエリに対するＲＡＳＴスコア＞２、又は血清総ＩｇＥ＞年齢補正した母集団の７／１０として定義した。「正常」を、ＳＴＩが０、ＲＡＳＴインデックスが０、及び血清総ＩｇＥ＜年齢及び性別が同じ母集団の７／１０として定義した。中間の表現型を、未知として分類した。
【０１９０】
既報のように、内容を変更したBritish MRCアンケートを被験体に対して実施した。「あなたは今までに喘息の発作を起こしたことがありますか？」、「発作を起こしたことがある場合、それは２回以上ですか？」という質問に対して肯定した場合を「喘息」と定義した。
【０１９１】
ＳＮＰの発見及び分類
１０００Ｂｐよりも長い非反復ＤＮＡ断片の配列を直接決定してＳＮＰを発見した。各配列反応に対して、５００〜６００ｂｐのゲノム配列をカバーするようにプライマーを設計した。５つの個体試料及び３２の個体についてプールした１枚のＤＮＡパネルの配列を決定した。Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐプログラムによるトレースのアセンブルを行った。ランダムにＳＮＰを発見した後、ＤＮＡ前後の２５０ｂｐを含むすべてのエキソン配列を、その領域にあるすべての遺伝子候補に対して決定した。
【０１９２】
ＰＣＲ及び制限消化によりＳＮＰを分類した。天然の制限酵素切断部位がない場合、１つのプライマーを改変して制限酵素切断部位を作製した。１）１０ｎｇ／μｌ個体ＤＮＡ５μｌと、２）フォワードプライマー及びリバースプライマー５ｐｍｏｌと、３）ＴａｑＧｏｌｄ０．０８ｕと、４）Ｍｇ２＋１．５〜３ｍＭとを含む反応物１０μｌ中でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９４℃１５分、次いで１）９４℃３０秒、２）５０〜６０℃３０秒、３）７２℃４５秒を３５サイクル実施した。ＰＣＲ終了後、このプレートを試験してＰＣＲが成功したかどうかを確認し、次いで制限酵素１〜２ｕを含有する消化溶液５μｌを各反応物に添加した。試料を３〜５時間消化した後、２〜４％アガロースゲルにかけた。Ｂｕｓｓｅｌｔｏｎ及びＵＫ１の組の家族において合計４０個のＳＮＰが分類された。
【０１９３】
関連性の統計分析
Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ誤差に対する試験、及び高密度のＳＮＰマップから起こりそうにない組換え現象を同定するＭＥＲＬＩＮコンピュータプログラム(http://bioinformatics.well.ox.ac.uk/Merlin)によって、ＳＮＰ分類の誤差を検出した。ＭＥＲＬＩＮによりＳＮＰハプロタイプを作製し、個々の対立遺伝子として再コード(recode)した。
【０１９４】
分析における共変動としてマーカー及び表現型が使用可能なＱＴＤＴプログラムによって、量的形質に対する関連性の試験を実施した２９。喘息と分類形質の関連性を、ＱＴＤＴのMonksテストルーチンにより調べた２９、３１。
【０１９５】
配列解析
改変HPREP(G.Micklem、未発表)を用いてゲノム配列を解析した；ＲＥＰＥＡＴＭＡＳＫＥＲ(Smit,A.F.及びGreen,P. http://repeatmasker.genome.washington.edu)を用いてＲｅｐＢａｓｅ５２中の反復領域をスクリーニングした；ヒト、げっ歯類、ＥＳＴ、ＳＴＳ及び他のＤＮＡデータベースに適合させるために、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＴＲＥＭＢＬ及びＴＲＥＭＢＬＮＥＷペプチドデータベース、ＣＰＧ５３を用いたＣｐＧ島、転写因子領域及びＰＲＯＭＯＴＯＲＳＣＡＮ５４を用いた推定プロモーター領域、並びにＧＲＡＩＬ５５、ＧＥＮＳＣＡＮ５６、ＧＥＮＥＰＡＲＳＥＲ５７及びＭＺＥＦ５８を用いたエキソンの予測を使用した。ＡＣｅＤＢ(http://www.acedb.org/)を用いてアノテーションを照合した。ＢＬＡＳＴＮ５９を用いてＥＭＢＬ  ＤＮＡデータベースに対して既知の遺伝子を同定した。機能が未知である転写物の相同体について、ペプチドデータベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＴＲＥＭＢＬ及びＴＲＥＭＢＬＮＥＷをＢＬＡＳＴＸ５９を用いて検索した。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ５９及びＳＭＡＲＴ６０を用いて、残りの転写物の役割を推定した。
【０１９６】
ＩＭＡＧＥクローン配列及び伸長
領域をマッピングしたＩＭＡＧＥクローンをResearch Geneticsから入手し、３７７  ＤＮＡシーケンサーでABI Prism Big Dye Terminator(PE Applied Biosystems)を用いてその配列を決定した。各ＩＭＡＧＥクローンのコンセンサス配列をＧＣＧプログラムにより整列させた。ＩＭＡＧＥクローンの５’及び３’ｃＤＮＡ末端を伸長させるために、ＣＬＯＮＴＥＣＨからMarathon-Ready（商標）ｃＤＮＡ  ＲＡＣＥライブラリを入手した。各コンセンサス配列に対し各方向に２つの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を設計した。ＲＡＣＥ  ＰＣＲからの異なるバンドをゲルから切断し精製した。InvitrogenのZERO Blunt（商標）PCR Cloningキットを用いてこれらのバンドをクローン化した。Big Dye Terminatorを用いて挿入断片の配列を決定し、ＧＣＧによりコンセンサス配列に組み込んだ。
【０１９７】
組織発現
Human Multiple Tissue Northern(MTN(商標))Blots及びHuman Immune System MTNブロットをCLONTECHから入手した。CLONTECHのHuman Multiple Tissue、Human Immune System及びHuman Blood Fractions Multiple Tissues cDNA Panelsを、標的配列のＰＣＲ増幅による発現解析に使用した。
【０１９８】
選択的ＰＣＲ、産物のゲル分離、ZERO Blunt(商標)PCR Cloningキットを用いたクローニング、及びBig Dye Terminatorシークエンシングにより、ＡＮＧＥのスプライスバリアントのエキソン及びイントロン構造を系統的に調べた。
【実験例２】
【０１９９】
染色体１３ｑ１４の飽和遺伝子地図(saturation genetic map)によって、Ｄ１３Ｓ１６１を中心とした７．５ｃＭ領域内にあるアトピー遺伝子座の位置に対してロッドサポートユニット(lod support unit)が１つ同定された１７。１．５ＭｂのＢＡＣ及びＰＡＣコンティグがＤ１３Ｓ２７３を中心として構築された。２つの家族のパネル４において、血清総ＩｇＥとミクロサテライトＵＳＡＴ２４Ｇ１の対立遺伝子とに正の関連性があることが判明した。
【０２００】
疾患とマーカーの連鎖不平衡（ＬＤ）の検出限界から得られる本発明者らの試料サイズは１００Ｋｂ未満である可能性が高く１８、１９、アトピー遺伝子がＵＳＡＴ２４Ｇ１の両方向１００Ｋｂの範囲内にあることが示唆された。一般に、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）では、染色体１３ｑ１４のこの領域が欠失している２０。
【０２０１】
次いで、遺伝子座中央にある１Ｍｂのゲノム配列の決定を優先させるために、本発明者らのＢＡＣ／ＰＡＣコンティグからの骨格配列タグ部位（ＳＴＳ）を用いた。これらのＳＴＳは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化フィンガープリント法とＳＴＳ含量の組み合わせによって構築されたＢＡＣコンティグ上にマップされた２３、２４。階層的なショットガン配列決定戦略２６を用いて、ＲＰＣＩ−１１  ＢＡＣライブラリ２５からの一組の重複するクローンの配列を決定した。この領域の（３ＢＡＣの形の）配列を図５、６及び７に示す。
【０２０２】
連鎖不平衡マッピング
５人の無関係なアトピー患者及び５人の無関係な対照における１．５Ｋｂ長の反復のないコンティグを、３２の無関係な個体からプールしたＤＮＡと共に配列決定することによってＳＮＰを検出した
量的形質に対する関連性
小さな対立遺伝子の出現頻度が＄２０％である、４７のＳＮＰ及び１５ｂｐの欠失−挿入多型が同定された。８０核家族中３６４人の個体からなる本発明者らによる１次のパネルにおいてこれらの遺伝子型が決定された３、４。エラー検査及びハプロタイプの生成をＭＥＲＬＩＮコンピュータプログラム２７により実施した。マーカー間の連鎖不平衡（ＬＤ）を、親のハプロタイプからＤ’を推定することによって評価しｌ８、ＧＯＬＤプログラム２８によって描出した。ＬＤは、３つの主要な島及び１つの副次的な島（Ａ、Ａｉｉ、Ｂ及びＣ）（図ｌａ）に概略分散し、疾患との関連性を局在化し得る領域を画成した。
【０２０３】
Ｌｏｇｅ（ＩｇＥ濃度）（ＬｎＩｇＥ）とＳＮＰの関連性を分散成分分析２９により求めた（表１）。
【０２０４】
ＬｎＩｇＥの関連性は、１８５７５２ｂ４＿２  ＳＮＰ付近に集中し、ＬＤのＡ及びＡｉｉ島内で約１００Ｋｂに及んだ（表１）。ＳＴＩとの関連性はこれよりも不明確に規定されているが、４３２１０１７ｂ３８＿１付近に集中し、１５０ｋｂに及ぶと考えられた。２つのピーク間の距離は約１６０ｋｂであった。
【０２０５】
これらのピークが異なるＱＴＬに対応するのかどうかを試験するために、ＳＴＩを共変動としてＬｎＩｇＥとの関連性を試験し、また、ＬｎＩｇＥを共変動としてＳＴＩとの関連性を試験した（表１）。１８５７５２ｂ４＿２についても共変動として同様に関連性を試験した。各場合において、ＬｎＩｇＥ／１８５７５２ｂ４＿２複合体はＳＴＩ／４３２１０１７ｂ３８＿１複合体とは異なって出現した。
【０２０６】
ＬｎＩｇＥとの関連領域は３遺伝子に及んだ（表１）（図１ｂ）。これらの遺伝子の同定について以下に示す。第１又は第３の遺伝子にマーカーを共変動（ｂｄ＿１又は４４５９３＿１５）として入れても、中央の遺伝子内の関連性が消失しなかったのに対し、この遺伝子にマーカーを共変動（ｂ４＿２）として用いると、外側領域における関連性の形跡が消失した。これらの結果から、ＬｎＩｇＥとの関連性を示すマーカーの中央にＱＴＬが含まれると示唆される。
【０２０７】
複製に対する検査をするために、他の被験体パネルにおいて６つのマーカー（ｂ１１＿２、ｂ４＿２、ｂ５＿３、ｂ４３＿１、ｂ３８＿１及びｂ２８＿２）を分類した。比較する数を最小化するために、これらのマーカーから３マーカーのハプロタイプを構築し、複対立の関連性試験を実施してから個々のハプロタイプを試験した。ｂ４＿２、ｂ５＿３、ｂ４３＿１ハプロタイプは、試験したパネルの各々においてＬｎＩｇＥに対し一貫した関連性を示した（表２）。ｂ４＿２＊２及びｂ５＿３＊１対立遺伝子を含む２つのハプロタイプ（Ａ及びＤ、表２）は、ＬｎＩｇＥに対して負の関連性を示したが、ｂ４３＿１遺伝子座が異なった。アトピー性皮膚炎に罹った家族のパネルにおいて、（ｂ４＿２＊１及びｂ５＿３＊２を含む）Ｃハプロタイプに対して正の関連性が認められた３０。これらの結果から、ＩｇＥレベルに影響を及ぼす多型は、ｂ４＿２及びｂ５＿３の直近にあることがさらに示唆される。
【０２０８】
Ｂｕｓｓｅｌｔｏｎの家族（ＡＵＳ１及びＡＵＳ２）の混合パネルは、一般的な母集団の代表と考えることができる。伝達不平衡テストにより、これらの被験体において喘息とｂ４＿２及びｂ５＿３の各マーカーとに関連性が認められた（それぞれ、ｐ＝０．０２４及びｐ＝０．０１７）３１。
【０２０９】
分類形質との関連性
遺伝子の同定及びドメインの相同性
この領域にある未完成ＢＡＣ配列を集め、アノテーションをつけた。ＥＳＴデータベースを調べ、ｃＤＮＡ選択実験から、発現した配列を系統的に同定した４。これらのソースからの部分配列をｃＤＮＡコンティグに統合し、３’及び５’ＲＡＣＥによってさらに伸長し、ノーザンブロッティングを実施して転写物の大きさを決定し、遺伝子の組織発現について調べた。
【０２１０】
ゲノム配列の１Ｍｂ領域から６つの完全長ｃＤＮＡを同定した（表３）。４つの他の配列をＥＳＴデータベース中に見出したが、それらはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はスプライス構造を持たず、ゲノムきょう雑物（ＵｎｉＧｅｎｅクラスターＨｓ．５８４５２、Ｈｓ．２６８７７３及びＨｓ．２１２１６１）である可能性が高かった。
【０２１１】
最近、染色体１３ｑ１４ＢＣＬＬ遺伝子座セル（ｌｏｃｕｓ  ｃｅｌｌ）の物理的マッピングによって、これらの遺伝子のうち５つが同定された２２。３つは白血病を誘発する新規な遺伝子候補と考えられ、ＣＬＬＤ６、ＣＬＬＤ７及びＣＬＬＤ８と命名された。他の遺伝子は、カリオフェリン−Ａ３（ＫＰＮＡ３）及びＮＹ−ＲＥＮ−３４抗原（ＡＮＧＥ）に対応する遺伝子である。第６の遺伝子は、Ｅｍｏｐａｍｉｌ結合関連タンパク質（ＥＢＲＰ）である。
【０２１２】
３つの末端遺伝子に対する配列相同性からは、アトピー又は喘息における明確な役割は示唆されない。すなわち、ＥＢＲＰは、おそらくコレステロールの生合成においてＤ８−Ｄ７ステロールイソメラーゼとして作用し、ＫＰＮＡ３の配列からはそれが核輸送システムに関与すると示唆され３２、ＣＬＬＤ６はＳＰＲＹドメインを含み微小管結合の可能性が示唆される。残り３つの遺伝子は、ＬｎＩｇＥレベルに関連する領域を含む密なクラスターを形成する（表１）（図１ｂ）。
【０２１３】
ＣＬＬＤ８
最も近位にある遺伝子のＣＬＬＤ８は、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）とＳＥＴドメインの両方を含む２２（図８）。ＭＢＤは、メチル化ＣｐＧを結合するのに必要なアミノ酸を欠いていると考えられるが３３、３４、依然としてＤＮＡを結合している可能性が高い。ＳＥＴドメインは、ヒストンＨ３のメチル化によって遺伝子発現を後成的に調節する。ＣＬＬＤ８は、活性部位と触媒活性に重要である隣接システイン残基の両方を含むことから、Ｈ３メチルトランスフェラーゼである可能性が高い３７。
【０２１４】
ヒストンメチルトランスフェラーゼ
真核生物における遺伝子の発現は、ＤＮＡを利用できるかどうかで決まる。ＤＮＡは、その自然な状態で、１セットのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の周囲にまとまっている。Ｈ１ヒストン及び他の非ヒストンタンパク質との相互作用によって、さらに高密度に圧縮が進行する。この凝縮状態において、クロマチンは転写機構に関与せず、したがってその中に含まれる遺伝子はサイレントである。ヒストンメチルトランスフェラーゼは、遺伝子発現の制御において極めて重要な役割を果たす。哺乳動物細胞において、これらの酵素は、特異的リジン残基においてヒストンＨ３及びＨ４をメチル化することが知られている。このタンパク質ファミリーのうち最も広範に研究されている構成員はＳＬＴＶ３９Ｈ１であり、これは、リジン残基９（Ｋ９）においてヒストンＨ３を選択的にメチル化する。この酵素の触媒作用ドメインは、ＳＥＴドメインとして知られる高度の保存配列内に含まれている。この配列は、２つの隣接システインリッチ配列（プレＳＥＴ及びポストＳＥＴ）と組み合わさってヒストンのメチル化を促進するのに必要とされる。したがって、プレＳＥＴ−ＳＥＴ−ポストＳＥＴドメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼタンパク質の特徴的なサインと見なせる。ＣＬＬＤ８は、拡張ＳＥＴドメイン及びメチル結合ドメイン、メチル化ＤＮＡを認識可能な構造を含む。
【０２１５】
参考文献：Kouzarides,T.「Histone Methylation in transcriptional control」(2002) Curr Opin Genet and Devel 12:198〜209。
【０２１６】
ＡＮＧＥ（ＮＹ−ＲＥＮ−３４）
次の遺伝子は、ＣＬＬＤ８の３’末端から約４Ｋｂ遠位にあり、同じ方向に転写される。この遺伝子は、腎細胞癌に罹った４人の患者からのｃＤＮＡ産物の血清学的解析によって同定されたＮＹ−ＲＥＮ−３４抗原をコードする３８。この遺伝子の転写物は、胃、扁桃及びＢ細胞においても高度に発現される（ＵｎｉＧｅｎｅクラスター２７９７９９）。この遺伝子産物は、２つのＰＨＤ（植物ホメオドメイン）ジンクフィンガーを含み、クロマチンによって媒介される転写調節に関与していることが示唆される３９（図８）。ＰＨＤフィンガーは、通常、システイン残基及びヒスチジン残基を含む２つのＺｎ２＋配位基を有する。しかし、ＮＹ−ＲＥＮ−３４フィンガー対のＮ−末端（５’）は、この２つの配位基のうち１つを欠いている。
【０２１７】
ＮＹ−ＲＥＮ−３４におけるＰＨＤフィンガーの配列は、急性リンパ芽球白血病のいくつかの症例においてその遺伝子が融合しているＡＬＬ−１、ＡＦ１０などのヒトタンパク質に特徴的である４０（図８）。ＡＦ１０４１及びＡＬＬ４２ＰＨＤフィンガーとの類似性から、ＮＹ−ＲＥＮ−３４  ＰＨＤフィンガー対は、ホモ二量化又はタンパク質結合機能又はその両方を有する可能性が高いことが示唆される。ＮＹ−ＲＥＮ−３４は、ＢＣＡＰ（ＢＲＣＡ１−Ｃ末端関連タンパク質）（ＥＭＢＬ受託番号ＡＢ０１１０３１）とも呼ばれ、ＢＲＣＡ１のＢＲＣＴドメインと相互作用する可能性が高い。これらのドメインは、転写を刺激し、クロマチンを再構築し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ヒトヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣなどのヒストン修飾酵素と相互作用することができる４３。
【０２１８】
ＣＬＬＤ７
ＣＬＬＤ７はＡＮＧＥの末端からわずか３Ｋｂの位置にあるが、逆方向に転写される。ＣＬＬＤ７は、ＲＬＧ及びＲＣＣ１（クロマチン凝縮１の制御因子）に極めて類似したタンパク質配列を示す。ＲＣＣ１は、ＤＮＡ及びヒストンＨ２Ａ及びＨ２Ｂに結合する４４。ＣＬＬＤ７は、一般に特異親和性及び異好性の二量体を形成するＢＴＢ／ＰＯＺドメインを含む。
【０２１９】
クロマチン構造の再構築は、ＩｇＥの生成に影響を及ぼす遺伝子の転写調節に重要であり４５、ＣＬＬＤ８、ＡＮＧＥ及びＣＬＬＤ７すべてがアトピープロセスに影響を及ぼす候補と考えられる。しかし、ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥは共に、ＩＬ−５プロモーターＲＥＩＩ領域結合タンパク質（ＲＥ−ＩＩＢＰ）４６、並びに白血病（ＡＬＬ）４０及び多発性骨髄腫（ＭＭＳＥＴ）４６、４７において見られる遺伝子に相同なドメインを含む（図８）。これは、免疫調節及び免疫グロブリン生成におけるある役割を示唆するものである。
【０２２０】
ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥ（ＮＹ−ＲＥＮ−３４）の共発現
ＣＬＬＤ８とＡＮＧＥのゲノムが近似していることから、両方の遺伝子の発現又はＲＥ−ＩＩＢＰ４６に類似した複合遺伝子産物の発現を調整できる可能性がある。ＣＬＬＤ８のエキソンＸＩＩとＡＮＧＥのエキソンＩＩＩとのＰＣＲによって、ほとんどの組織において発現される３つのバンド（Ａ、Ｂ及びＣ）が同定された（図１０）。各バンドは、特異的スプライス構造（図３）を含むが、本発明者らの配列からは、これらのバンドのいずれにおいても拡張オープンリーディングフレームが認められなかった。オープンリーディングフレームがないにもかかわらず、非ランダムスプライス構造から、調節し得る特定の機能が示唆される。
【０２２１】
組織発現及びスプライスの変動
本発明者らは、ＣＬＬＤ８、ＡＮＧＥ及びＣＬＬＤ７のノーザンブロットを調べた。ＡＮＧＥのノーザンブロットから、多型の高分子量バンドが示された（図１０）。高分子量バンドはＣＬＬＤ８でも見られたが、ＡＮＧＥにおいて類似のバンドが見られた組織にこれらは適合しなかった（図２）。ＣＬＬＤ６及びコンティグのその他の遺伝子は、組織に均一かつ広範に分布する予想サイズのバンドを示した。
【０２２２】
ＡＮＧＥ遺伝子は、１０個のエキソンを含んでいる。公開データベースを検討することによって、タンパク質翻訳のためのオルターナティブな開始メチオニンを含むオルターナティブな第１のエキソンがいくつか同定された（ＥＭＢＬ：ＡＦ１５５１０５、ＡＬ５５２２１５、Ｂ１４６３０２９、ＢＧ７５９１２４）。本発明者らは、ｃＤＮＡパネルから特異的ＰＣＲ産物の配列を決定することによってこれらのバリアントすべてを同定することができた（データ示さず）。また、数種類のｃＤＮＡではエキソンＩＩの読み飛ばしが起こることが判明した（ＥＳＴＨＵＭ：ＢＦ６６２９２７及びＢＥ７８７１７７、ＥＭＢＬ：ＡＬ５５２２１５）。ＡＬ５５２２１５バリアントは、不完全な第１のＰＨＤドメインとなったが、これが機能することは期待できなかった。
【０２２３】
複数の組織パネルからのｃＤＮＡのエキソン特異的ＰＣＲによって、エキソンＩＩ読み飛ばしバリアントが、すべての組織においてほぼ同じ濃度で存在することが確認された（図４ａ）。
【０２２４】
エキソンＶとＶＩの間の（エキソンＶａ及びＶｂと称する）別のエキソンを含む極めて組織特異的なスプライスバリアントが見出された。これらのバリアントは、５４ｂｐだけ異なり、肺及び末梢血白血球（ＰＢＬ）中に存在した（図４ｂ）。ＰＢＬ画分を調べて、スプライスバリアントが、失活したＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞中に存在するが、活性な細胞中には存在しないことがわかった。両方のエキソンは、プリマチュア終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）となる。プリマチュア終止コドンを含む選択的スプライシングは、転写の負の対照に対する機序として以前に確認されており４８、これらのバリアントのネガティブな役割は、不活性なＴ細胞及びＢ細胞におけるそれらの発現と一致する。
【０２２５】
エキソンＶＩＩとＶＩＩＩの間にイントロンＶＩＩが保持され、活性なＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球において最も強く発現されるスプライスバリアント（ＥＳＴＨＵＭ：ＢＥ１４１７３０）が認められた（図４ｃ）。このバリアントもプリマチュア終止コドンになる。
【０２２６】
ＡＮＧＥ
位置クローニングによるＡＮＧＥ（ＮＹ−ＲＥＮ−３４）の同定は、３つの証拠、すなわち、遺伝子の局在、組織発現、及び推測又は実証された遺伝子機能に基づく。今回のケースでは、血清総ＩｇＥ濃度に関連する領域は３つの遺伝子に及ぶが、本発明者らの分析から、これがＡＮＧＥ遺伝子内の多型に起因し得ることが示唆される（図１、表１及び表２）。ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥ由来のドメインは、既知のＢ細胞転写因子と相同性を有する。１つの遺伝子ＡＮＧＥのみが、免疫細胞及び組織における発現が異なり、この遺伝子座においてアトピーの原因となっている可能性が高い。
【０２２７】
本発明者らは、さらに、５’領域に対するＡＮＧＥ及びＣＬＬＤ８、すべてのエキソン、及びイントロンの非反復領域の配列を決定した。１つの保存コード（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）バリアントがＣＬＬＤ８に見出されたが、ＩｇＥとわずかな関連性しか示さなかった（ｐ＜０．０１）。１つの非保存的な（Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）バリアントがＡＮＧＥ（ＡＮＧＥ１ｘ３Ｃ１４８Ｔ）に見出された。非保存コード（Ｖａｌ−Ａｌａ）バリアントがＣＬＬＤ７（ＣＬＤ７０３）に見出された。
【０２２８】
ＬＤのＡ島内のＳＮＰは、不平衡が大きかった。遺伝子の制御領域は１００Ｋｂに及ぶことがあり４９、本発明者らは、血清ＩｇＥ濃度に対する影響が異なる少なくとも２つのハプロタイプを認めた。本発明者らの結果は、複雑な形質を生じる遺伝子座が、異なる機能的結果となるいくつかの多型を含んでいることを示している。
【実験例３】
【０２２９】
配列解析
ＢＬＡＳＴＮを用いた系統的な比較・拡張ツールであるコンティグウォークを用いて、重複未完成ＢＡＣからＤＮＡ配列を集めてより大きなコンティグを形成した(S.J.Broxholme、未発表)。Genebridge4 Radiation Hybridハ゜ネル及びRadiation HybridマッピングソフトウエアRHMAPPER(Stein,L.、Kruglyak,L.、Slonim,D.、Lander,E.(1995)http://www.genome.wi.mit.edu/ftp/pub/software/rhmapper)における臨海領域(critical region)からのＳＴＳマーカーのベクタースコアを用いて、目的領域のフレームワーク地図を作製した。次いで、ＲＨＭＡＰＰＥＲを用いて、このフレームワーク内に位置し得るＲＨＤＢ中のマーカーを見出した(Rodriguez-Tome,P.及びLijnzaad,P Nucleic Acids Res 29、165〜6(2001))。
【０２３０】
フレームワーク内に位置する各ＲＨＤＢエントリーについて、その注記から受託番号を見つけ、次のステージのためにＥＳＴを選択した。TIGR Assembler(Sutton G.G.、White O.、Adams,M.D.及びKerlavage,A.R.(1995)Genome Science & Technology、1、9〜19)を用いて、非重複性の配列セットを作製した。
【０２３１】
hprep(G.Micklem、未発表）を改変して用いてゲノム配列を解析した；RepeatMasker(Smit,A.F.A.及びGreen,P. http://repeatmasker.genome.washington.edu)を用いて、RepBase(Jurka,J. Trends Genet 16、418〜20(2000))中の反復領域をスクリーニングした；ヒト、げっ歯類、ＥＳＴ、ＳＴＳ及び他のＤＮＡデータベースに適合させるために、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＴＲＥＭＢＬ及びＴＲＥＭＢＬＮＥＷペプチドデータベース、ｃｐｇ(Larsen,F.、Gundersen,G.、Lopez,R.及びPrydz,H. Genomics 13、1095〜107(1992))を用いたＣＰＧ島、転写因子領域及びプロモータースキャン(Prestridge,D.S J Mol Biol 249、923〜32(1995))を用いた推定プロモーター領域、並びにGRAIL(Xu,Y.、Mural,R.J.及びUberbacher,E.C. Comput Appl Biosci 10、613〜23(1994))、GENSCAN(Burge,C.及びKarlin,S.,J Mol Biol 268、78〜94(1997))、geneparser(Snyder,E.E.及びStormo,G.D. Nucleic Acids Res 21、607〜13(1993))及びMZEF(Zhang,M.Q. Proc Natl Acad Sci U S A 94、565〜8(1997))を用いたエキソンの予測を使用した。ACeDB(http://www.acedb.org/)を用いてアノテーションを照合した。
【０２３２】
BLASTN(Altschul,S.F.等 Nucleic Acids Res 25、3389〜402(1997))を用いてＥＭＢＬ  ＤＮＡデータベースに対して既知の遺伝子を同定した。機能が未知である転写物の相同体について、ペプチドデータベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＴＲＥＭＢＬ及びＴＲＥＭＢＬＮＥＷをＢＬＡＳＴＸ（Altschul等、同上）を用いて検索した。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul等、同上）及びＳＭＡＲＴ(Schultz,J.、Copley,R.R.、Doerks,T.、Ponting,C.P.及びBork,P Nucleic Acids Res 28、231〜4(2000))を用いて、残りの転写物の役割を推定した。
【０２３３】
ＩＭＡＧＥクローン配列及び伸長
領域をマッピングしたＩＭＡＧＥクローンをResearch Geneticsから入手し、３７７  ＤＮＡシーケンサーでＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてその配列を決定した。反応物には、Ｂｉｇｄｙｅ２μｌ、Ｈａｌｆ  Ｂｉｇｄｙｅ２μｌ、プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プラスミドＤＮＡ（４００ｎｇ）１〜４μｌ及びｄｓＨ２０  １  ４〜１μｌが含まれていた。ＭＪサーマルサイクラー中で配列反応を実施した。１）９５℃１分、２）９５℃１５秒、３）５０℃１０秒、４）６０℃４分、５）ステップ２〜４を２４サイクル繰り返し（合計２５サイクル）、６）１５℃保持。各ＩＭＡＧＥクローンに対するコンセンサス配列をＧＣＧプログラムによって整列させた。
【０２３４】
ＩＭＡＧＥクローン配列の５’及び３’ｃＤＮＡ末端を伸長させるために、ＣＬＯＮＴＥＣＨからＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡ  ＲＡＣＥライブラリを入手した。各コンセンサス配列に対し各方向に２つの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を設計した。２つのＧＳＰプライマー間で約１５０〜２００ｂｐの重複配列があった。２５〜２８ｂｐ、５０〜７０％ＧＣ及びＴｍ６５℃であるようにＧＳＰプライマーを設計した。タッチダウンＰＣＲをＲＡＣＥ末端に用いた。１）９４℃３０秒、２）９４℃５秒、６８〜７２℃４分を２５〜３０サイクル。
【０２３５】
ＲＡＣＥ  ＰＣＲからの異なるバンドをゲルから切断し精製した。InvitrogenのZERO Blunt（商標）PCR Cloningキットを用いてこれらのバンドをクローン化した。Big Dye Terminatorを用いて挿入断片の配列を決定し、ＧＣＧによりコンセンサス配列に組み込んだ。
【０２３６】
ノーザンブロット分析
Human Multiple Tissue Northern(MTN(商標))Blots及びHuman Immune System MTNブロットをCLONTECHから入手した。Ｈｕｍａｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔは、心臓、脳（全体）、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及びすい臓からのＲＮＡを含んでいた。Human Immune System MTNは、ひ臓、リンパ節、胸腺、末梢血白血球、骨髄及び胎児の肝臓を含んでいた。ｃＤＮＡ結腸又は組織ｃＤＮＡ溶液から作製したプローブを用いてＢｌｏｔｓをハイブリッド化した。プローブの平均サイズは、５００〜１０００ｂｐであった。遺伝子ｉｌ５４０１６の場合、プローブは、エキソン１からエキソン１０までの１１８０ｂｐであった。このプローブを、ランダムプライマー法により、［３２Ｐ］ｄＡＴＰで放射能標識した。すべてのプローブを、ハイブリダイゼーション溶液（１０％硫酸デキストラン；４ｘＳＳＣ；５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２；１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；１０Ｘデンハート液；５０ｍｇ／ｍｌ超音波処理ニシンＤＮＡ；１％ＳＤＳ）中４２℃で終夜ハイブリッド化した。
【０２３７】
ＭＴＣパネルのＰＣＲスクリーニング
CLONTECHのHuman Multiple Tissue cDNA Panels及びHuman Immune System Multiple Tissues cDNA Panelsを発現解析に使用した。Human Multiple Tissues cDNAパネルは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及びすい臓からのｃＤＮＡを含んでいた。Human Immune System Multiple Tissuesは、ひ臓、リンパ節、胸腺、扁桃、白血球、髄及び胎児の肝臓からのｃＤＮＡを含んでいた。５つのＢＡＣゲノム配列にわたるすべてのｃＤＮＡコンセンサス配列において、ＭＴＣパネルを調べた。１）脱イオンＨ２Ｏ  ３６μｌ、２）ＰＣＲ緩衝液５μｌ、３）ａｄｖａｎＴａｑ  Ｐｌｕｓ  １μｌ、４）８ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、及び５）５ｐｍｏｌフォワードプライマー及びリバースプライマー４μｌを含む５０μｌ中でＰＣＲを実施した。１）９４℃３０秒、２）９４℃３０秒、６８℃２分を２２〜３８サイクル、３）６８℃５分でＰＣＲを実施した。特定の標的の存在量を観察するため、２２、２６、３０、３４及び３８サイクル目に毎回全量５μｌの試料を反応物から採取した。
【０２３８】
ANGE(NY-REN-34)の場合、CLONETECH Human Blood Fractions MTCパネルも上述のように試験した。
【０２３９】
選択的ＰＣＲ、産物のゲル分離、ZERO Blunt（商標）PCR Cloningキットを用いたクローニング、及びBig Dye Terminatorシークエンシングにより、ＡＮＧＥのスプライスバリアントのエキソン及びイントロン構造を系統的に調べた。
【０２４０】
結果
次いで、本発明者らは、関連領域内の遺伝子を調べた。この領域の未完成ＢＡＣ配列を集め、アノテーションをつけた。ＥＳＴデータベースを調べ、ｃＤＮＡ選択実験から、発現した配列を体系的に同定した(G.Anderson.DPhil Thesis、Oxford University 2001)。これらのソースからの部分配列をｃＤＮＡコンティグに統合し、３’及び５’ＲＡＣＥによってさらに伸長した。ノーザンブロッティングを実施して転写物の大きさを決定し、遺伝子の組織発現を調べた。
【０２４１】
ゲノム配列の１Ｍｂ領域から６つの完全長ｃＤＮＡを最終的に同定した（表３）。５つの他の配列をＥＳＴデータベース中に見出したが、それらはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はスプライス構造を持たず、ゲノムきょう雑物（ｉ２７４１１７、ｉ４６５３６、ｉ５１３８２２、ｉｌ４３３１７及びｉ４４７２６２）である可能性が高かった。最近、染色体１３ｑ１４ＢＣＬＬ遺伝子座セルの物理的マッピングによって、本発明者らが見出した遺伝子のうち３つが同定され、ＣＬＬＤ６（ｉ２３５０４００）、ＣＬＬＤ７（ｉ４４５９３）及びＣＬＬＤ８（ｉ６２６５４８）（Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｈ．等  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１、２８７０〜７（２００１））と命名された。これらの遺伝子は白血病を誘発する新規な遺伝子候補と考えられる。これらの遺伝子のドメイン含量に関する本発明者らの分析結果は、ＣＬＬＤ７がクロマチン再構築による細胞サイクル調節に関与している可能性があり、ＳＥＴドメインを含むＣＬＬＤ８がメチル化によって媒介される転写抑制に関連している可能性があるというＭａｂｕｃｈｉ等の評価と一致している。本発明者らは、微小管結合に関与している可能性があるＣＬＬＤ６においてＳＰＲＹドメインを認めた。ＣＬＬＤ６は、ＬｎＩｇＥ又はＳＴＩに関連する領域の範囲外にあると考えられる。
【０２４２】
イメージクローンｉｌ５４０１６に対応する遺伝子は、腎細胞癌に罹った４人の患者に由来するｃＤＮＡの血清学的解析によって同定されたＮＹ−ＲＥＮ−３４抗原をコードすることがすでに認められている（Ｓｃａｎｌａｎ，Ｍ．Ｊ．等  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３、４５６〜６４（１９９９））。この遺伝子の転写物は、乳癌および扁桃においても常に見出された。この遺伝子は、２つのＰＨＤドメインを含み、その１つは完全であり、もう一方はそのＮ末端（５’）側にあり、その２つの亜鉛配位残基（ほとんどがＣｙｓ）の１つが欠失している。これら２つのＰＨＤドメインは、ショウジョウバエ／ヒトトリソラックス及びヒトＡＬＬ−１中のＰＨＤドメイン対に極めて類似しており、クロマチンによって媒介される転写調節にＮＹ−ＲＥＮ−３４抗原の遺伝子が関与していることが示唆される(Aasland,R.、Gibson,T.J.及びStewart,A.F. Trends Biochem Sci 20、56〜9(1995))。
【０２４３】
イメージクローンｉｌ８９５７９９は、Ｄ８−Ｄ７ステロールイソメラーゼとして働くＥｍｏｐａｍｉｌ結合関連タンパク質である。イメージクローンｉ６２６７８９は、カリオフェリンアルファ３であり、核輸送システムに関与している可能性があることを示唆する相同性を有する(Takeda,S.等 Cytogenet Cell Genet 76、87〜93(1997))。
【０２４４】
クロマチン構造は、ＩｇＥの生成に影響を及ぼす遺伝子の転写調節に重要であり(Lavender,P.、Cousins,D.、Smith,P.及びLee,T Presentation at the National Athma Campaign International Congress、June 1999、Clin Exp Allergy 30、1697〜708(2000))、SETドメイン及びＰＨＤドメインを含むタンパク質（ＣＬＬＤ８及びＮＹ−ＲＥＮ−３４）は、アトピープロセスに影響を及ぼす第１候補である。
【０２４５】
転写配列をＳＮＰ／ＬＤマップ上にマッピングし直すことによって、３つの遺伝子がＬｎＩｇＥ及びＳＴＩに関連するピーク下に含まれることが判明した（図１）。これらの遺伝子は、ＮＹ−ＲＥＮ−３４、ＣＬＬＤ７及びＤ８−Ｄ７ステロールイソメラーゼであった。
【０２４６】
組織発現に基づいてこれらの遺伝子をさらに検討した。ＣＬＬＤ８及びＣＬＬＤ７及びカリオフェリンのノーザンブロットから、先に記載したように、単一サイズの転写物が広範に発現することがわかった。しかし、ＮＹ−ＲＥＮ−３４は、スプライシングが異なり、より高分子量のバンドが免疫組織に存在した（図２）。
【０２４７】
そこで、この遺伝子をさらに詳細に調べた。この遺伝子は１０エキソンからなり、オルターナティブなエキソン１がＷ組織中に見られた（図３）。これらのエキソンのうち１つのみにプロモーターが存在した（図３）。本発明者らは、複数のｃＤＮＡ（ＭＴＣ）パネルからプロモーター関連エキソンを含むＰＣＲ産物のみを同定することができた。このパネル由来のｃＤＮＡのさらなるエキソン特異的ＰＣＲ増幅によって、いくつかの予期せぬバンド（図４）が組織中に見られた。オルターナティブなエキソンがエキソン２の内外で見られ、それはすべての組織にほぼ同じ濃度で存在した（図４ａ）。本発明者らは、エキソン４〜６を増幅したときに、さらに別のバンドを認めた。これらのバンドは、高度に組織特異的であり、肺及び末梢血白血球中に存在した（ＰＢＬ）（図４ｂ）。ＰＢＬ画分を調べることによって、スプライスバリアントが不活性なＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞中に存在するが、活性細胞中には存在しないことが判明した。スプライスバリアントバンドの配列を決定することによって、エキソン５と６の間に別のエキソンが存在することが明らかになった。これはプリマチュア終止コドンになった。エキソン７〜８の増幅によって、さらに、白血球に特異的なスプライスバリアントが見られた（図４ｃ）。
【０２４８】
したがって、この証拠から、ＮＹ−ＲＥＮ−３４の遺伝子がこの遺伝子座においてアトピーの原因になることが示された。この遺伝子は、ＬｎＩｇＥ及びＳＴＩに関連するピーク位置にあり、その配列相同性から、この遺伝子が調節因子として働き、ＩｇＥ及びアレルギー応答の調節に関与することが知られている特定の組織において示差的にスプライスされることが示唆される。したがって、本発明者らは、ＮＹ−ＲＥＮ−３４遺伝子をＡＮＧＥ（新アトピー遺伝子（ａｔｏｐｙ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ））と命名した。
【０２４９】
細胞−細胞相互作用、炎症細胞の補充、炎症の化学伝達物質の放出、及びエフェクター機能を含めた疾患表現型に対するこれらの遺伝子の寄与を評価するために測定可能である多数の細胞タイプ及び表現型の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）がある。本発明者らは、細胞ベースのアッセイに対するモデル系としてＢ細胞系を主に用い、Ｂ細胞機能の主要な読み出しとしてＩｇＥプロモーター活性を用いた。
【実験例４】
【０２５０】
ＣＬＬＤ８がＡＮＧＥの近傍（約４Ｋｂ）にあり、ＡＮＧＥがプロモーターのない選択的な第１のエキソンを有し、ＡＮＧＥのノーザンブロットにおいて高分子量バンドが認められたことは興味深い。ＣＬＬＤ８−ＡＮＧＥが単一の遺伝子産物を形成し得るかどうかを確認するために、胎盤のｃＤＮＡ中のＣＬＬＤ８エキソンとＡＮＧＥエキソンのＰＣＲを実施した。あるバンドが認められ、ドメイン構造ＣｐＧＢＤ−ＰｒｅＳＥＴ−ＳＥＴ−ＰｏｓｔＳＥＴ−ＰＨＤ−ＰＨＤを含む遺伝子の存在が示唆された。ＩＬ−５プロモーターＲＥＩＩ領域結合タンパク質においても類似のドメイン構造が認められた（Garlisi,C.G.等 Am J Respir Cell Mol Biol 24、90〜98(2001)）。
【０２５１】
１３ｑ１４に関連する突然変異は、この遺伝子座にマップされた遺伝子のいずれにおいても確認されなかった。しかし、ＣＬＬＤ８／ＡＮＧＥが選択的スプライシングによって単一の転写物を形成することが認められた（図９）ことから、この遺伝子がアトピーを引き起こしている可能性が示唆される。
【実験例５】
【０２５２】
哺乳動物細胞のエレクトロポレーション
以下は、ＩｇＥルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて用いられるエレクトロポレーションによるＢ細胞のトランスフェクションのためのプロトコルである。ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＬａｃＺをトランスフェクションした後にβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することによって、これらのエレクトロポレーション条件をＢ細胞に対して最適化した。最適化実験に用いた諸条件を結果の項に示す。
【０２５３】
トランスフェクション前に、１０％ＦＣＳを添加した新鮮なＲＰＭＩ中でヒトバーキットリンパ腫細胞系ＤＧ−７５（ＤＳＭＺ）を２４時間培養した。この細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収し、冷ＲＰＭＩで１回洗浄した。５×１０６個の細胞を冷ＲＰＭＩ４００μｌに再懸濁し、データを規格化してトランスフェクション効率の差を説明するために、ｐＧＬ２レポーターベクター１０μｇ、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ発現ベクター１０μｇ及びｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｇを含む０．４ｃｍ間隔のエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて室温で１０００μＦ、２５０Ｖでパルスをかけた。トランスフェクション直後に、６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳを含む暖かいＲＰＭＩ１ｍｌに移した細胞に、１０％ＦＣＳを含む暖かいＲＰＭＩ６００μｌを添加した。この細胞を、ヒト組換えＩＬ−４（Ｓｉｇｍａ）の存在下又は非存在下、３７℃で最高２４時間培養した。
【０２５４】
ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／ＭａｘＬａｃＺをトランスフェクトした細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
エレクトロポレーションから２４時間後に、細胞溶解物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することによって、Ｂ細胞のトランスフェクションをモニターした。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に再懸濁した。室温で１５分間インキュベートした後、この溶解物を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清を、等体積の２Ｘ  β−ガラクトシダーゼアッセイ緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭβ−メルカプトエタノール、１．３３ｍｇ／ｍｌ  ＯＮＰＧ）に添加した。この反応物を、室温又は３７℃で黄色になるまでインキュベートした。１Ｍ  ＮａＣＯ３  １ｍｌを添加し、すぐに４２０ｎｍの吸光度を読んだ。
【０２５５】
ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／ＭａｘＬａｃＺトランスフェクト細胞のＸ−ｇａｌ染色
遠心分離によりトランスフェクト細胞を回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ希釈３．７％ホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、この細胞を、Ｘ−ｇａｌ溶液（０．２％Ｘ−ｇａｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６３Ｈ２Ｏ、５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）中、３７℃で２〜１６時間インキュベートした。
【０２５６】
二重ルシフェラーゼ（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）アッセイ
トランスフェクト細胞懸濁液８００μｌを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した。細胞沈殿物を受動溶解緩衝液５０μｌに再懸濁し、回転ホイール上で室温で２０分間インキュベートした。この溶解物を１４，０００ｒｐｍで短時間遠心分離し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の指示に従って上清２０μｌにおける二重ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２５７】
ＷＳＴ−１増殖アッセイ
Ｕ２０Ｓ細胞を、ウェル当たり３×１０３個の細胞数で９６ウェルプレートに播き、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中、３７℃で２４時間培養した。ａ項に記載したように、ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８、ＲＥＮ３４又はＡＮＧＥを発現するｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ３００ｎｇ、及びＯｐｔｉｍｅｍ２０μ１に混合したＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬０．２μｌを用いて、トランスフェクションを３回実施した。この細胞を２４、４８又は７２時間培養した後、ウェル当たり１０μｌのＷＳＴ−１細胞増殖試薬を添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、４５０／６９０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２５８】
ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイ
ＳＵＶ３９Ｈ１（８２−４１２）−ＧＳＴタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｇを、ＭＡＢ（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ、Ｒｅａ等  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６、５９３〜５９９、２０００に記載のメチル化活性緩衝液。ただしＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０を使用）及び水中のビオチン化Ｈ３ペプチド（Ｕｐｓｔａｔｅ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＣＯ２Ｈ末端上のビオチン標識を含むヒストンＨ３の始めの２１アミノ酸）５μｇに添加して最終体積を１００μｌとし、放射性基質として１４Ｃ  ｓ−アデノシルメチオニン６００ｎＣｉ（２２０００Ｂｑ）を添加して、反応を開始した。これを３０℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄したストレプトアビジンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）３０〜５０μｌを、静かに撹拌しながら室温で３０分間添加して、すべてのビオチン化Ｈ３ペプチドを結合させた。少なくとも１０体積のＰＢＳでビーズを洗浄し、低速（約５０００ｒｐｍ）で回転させ、アガロースビーズを除去しないように注意しながら上清を除去して水性廃液とすることによって、結合していない反応成分を除去した。次いで、このビーズをＰＢＳ１００μｌに再懸濁し、シンチレーション流体３ｍｌに添加して、ｌ４Ｃ標識メチル化Ｈ３ペプチドを数えた。
【０２５９】
Screening Methods for Modulators of Methyltransferase Activityが国際公開第01/94621号に開示されている。この特許のスクリーニング方法は、ネズミＳＵＶ３９Ｈ２メチルトランスフェラーゼのモジュレーターに関係する。
【０２６０】
（国際公開第01/94621号の）Suv39h2 Mtase活性モジュレーターのスクリーニング
すべてのステップは自動化されており、試験した様々な化合物の位置は、後で参照するためにコンピュータに登録されている。活性調節用の試験化合物を、２組の３８４ウェルプレートに等分する。次いで、ＭＡＢ緩衝液中の組換えＧＳＴタグ付きヒトＳＵＶ３９Ｈ２  ２０〜２００ｎｍｏｌを反応物に添加する。次いで、ユーロピウムで標識した分枝ペプチド（［ＴＡＲＫＳＴ］４−Ｋ２−Ｋ−ｃｙｓ）２０ｎｍｏｌを添加し、その後Ｓ−アデノシルメチオニン１００ｎｍｏｌを添加した。この反応物を室温で４０分間放置し、次いでα−ｍｅｔｈＨ３−Ｋ９抗体をコートした第２のプレート上に移す。次いで、この反応物を室温で４０分間放置して、抗体をメチル化基質に結合させる。メチル化基質を捕捉後、結合していない非メチル化基質を５０ｍＭトリスｐＨ８．５で洗い流す。次いで、ユーロピウム標識を、ｐＨ４．５の促進溶液５０μｌ中で２５分間ペプチドから切断する。次いで、キレート化ユーロピウム分子を３６０ｎｍで励起し、次いで、放射された蛍光の６２０ｎｍにおけるレベルを、ＰｏｌａｒＳｔａｒプレートリーダーを用いて時間分解蛍光により計算する。この結果はその後自動的にグラフ化される。
【０２６１】
蛍光レベルは、ＭＴａｓｅ活性レベルと直接関係している。ＭＴａｓｅ活性に対する様々な化合物の効果は、化合物を添加していない又は酵素を添加していない対照の反応と比較して、グラフ上で明白に見ることができる。スクリーニング方法の原理は以下のとおりである。すなわち、
ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及び発色標識した未変性ペプチド基質（例えば、分枝ペプチド［ＴＡＲＫＳＴ］４−Ｋ２−Ｋ−ｃｙｓ）とともにＳｕｖ３９ｈ２をインキュベートする。この基質は、メチル化された後、マイクロタイタープレート上に固定されたＬｙｓ９メチル特異的抗体に対するエピトープになる。次いで、結合ペプチド量を発色標識からの蛍光レベルによって定量化することができる。
【０２６２】
ｂ）モジュレーター（例えば、阻害剤、Ｉ）の存在下で、ＭＴａｓｅによるメチル基の移動が影響を受け（減少し）、これにより蛍光レベルによって定量される固定抗体に捕捉された基質の量が影響を受ける。阻害効果を有する化合物は蛍光シグナルの減少をもたらすが、阻害効果を有する化合物は蛍光シグナルの減少をもたらすが、促進効果を有する化合物は蛍光シグナルを増加させる。
【０２６３】
クロモドメインのない短縮されたＳＵＶ３９Ｈ１（８２−４１２）を、Ｊｕｒｋａｔ  ｃＤＮＡライブラリからのＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化した。短縮したタンパク質のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を放射アッセイによって確認した。
【０２６４】
細菌発現プラスミドへのｃＤＮＡのクローニング
遺伝子ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥのすべてが、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローン（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ）から正常に増幅され、適切なベクターｐＥＴ２８ａ、ｐＧＥｘ４Ｔ及びｐＧＥｘ６Ｐにクローン化された。
【０２６５】
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現
ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥ  １の完全長ｃＤＮＡを、Ｂ細胞における過剰発現の研究に使用するためにｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。トランスフェクションから２４時間後に全細胞溶解物を調製し、抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによって発現したタンパク質を検出した。ウェスタンブロットにおいて検出されたバンドは、組換えタンパク質に対してほぼ予想されたサイズ、すなわち、ＣＬＬＤ７、５８ｋＤａ；ＣＬＬＤ８、８２ｋＤａ；ＲＥＮ３４、２２ｋＤａ；ＡＮＧＥ、３７ｋＤａで泳動した（図１１）。これは、ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ構築物が機能的に働き、目的遺伝子を発現することを示している。ＡＮＧＥを検出するためのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｅｐｉｔｏｐｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する抗体、並びにＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥに対する特異的抗体を用いて、トランスフェクトＣｏｓ−７細胞溶解物をプローブして、これらの結果を確認した。
【０２６６】
ＩｇＥレポーターアッセイ
ヒト生殖細胞系ＩｇＥプロモーターを、ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ−２  Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のフォワード及びリバースの両方向にクローン化した。ルシフェラーゼ遺伝子がＳＶ４０プロモーターの制御下にあるｐＧＬ−２  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ルシフェラーゼ活性の正の対照として用いた。トランスフェクション効率の差のためにデータを規格化する場合、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に同時トランスフェクトした。
【０２６７】
ＩｇＥプロモーター活性に対するＣＬＬＤ７の過剰発現の効果を測定した。ＩｇＥレポーター構築物＋／−ｐｃＤＮＡ４−ＣＬＬＤ７を細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ＩｇＥプロモーター活性をホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ活性の比として表した。
【０２６８】
ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイ
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）は、主に核において機能するが細胞質区画においてもある役割を有し得るクロマチン改変酵素である。したがって、ＨＭＴアッセイに使用するために、核及び細胞質抽出物をトランスフェクトＣｏｓ７細胞から精製した。（アッセイにおいて正の対照として使用する）ヒトＳＵＶ３９Ｈ１は、ヒストンＨ３のリジン９を特異的にメチル化するリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼである。Ｈ３のメチル化は、ＨＰ１タンパク質を補充してヘテロクロマチンを形成し、したがって、遺伝子制御／遺伝子サイレンシングに関与し得ることが示された（Ｒｅａ等）。
【０２６９】
ｐｃＤＮＡ  ＣＬＬＤ８をトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞からの核抽出物のＨＭＴ活性を試験した。実験では、トランスフェクトされたＣｏｓ細胞によって、トランスフェクトしていない対照よりもＨＭＴ活性が増加することが示された（図１２参照）。
【実験例６】
【０２７０】
遺伝子の機能を変えるＳＮＰを同定することは、疾患に関連することが知られているゲノム領域にＳＮＰがあるときには重要である。この実施例では、プロモーター又はエンハンサーなどの推定遺伝子調節領域におけるＳＮＰを機能的に有効にする一手法を記述する。これらのゲノム領域の正常機能が変わることによって、タンパク質レベルに影響を及ぼす可能性がある遺伝子の転写レベルが影響を受け、その結果、疾患状態に陥る。タンパク質が、ＳＮＰを含むＤＮＡや含まないＤＮＡに結合し得ることが、エレクトロモビリティーシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって実証された。野生型及び突然変異ＤＮＡと比較したときのシフトパターン又は強度の変化は、転写因子の結合性が異なることを示している。この異なる効果によって、遺伝子の発現パターンが異なる可能性がある。
【０２７１】
試験されたＳＮＰ
ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥ遺伝子プロモーターの予測領域内にあるＤＢ及びＣｅｌｅｒａ  ＳＮＰデータベースを使用したコンピュータ解析によって、４つのＳＮＰが同定された。ＳＮＰ、オリゴヌクレオチドプローブ及び転写因子結合部位候補を表７に示す。
【０２７２】
オリゴの標識
ＤＮＡ標的を、ＳＮＰを含む相補オリゴ又はＳＮＰを含まない相補オリゴの３’ビオチン末端標識によって産生し、次いで、ともにインキュベートし、アニーリングして二本鎖標的ＤＮＡを形成した。
【０２７３】
ＥＭＳＡ
表に示すように、二本鎖オリゴプローブ及び核抽出物の最適化を実施した。室温でインキュベーションした後、試料を５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、バイオダインを充填したメンブレン上でエレクトロブロッティングし、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ化学発光ＥＭＳＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて製造者の指示に記載されたとおりにビオチン標識オリゴの位置を特定し、フィルム又はＣＣＤカメラに暴露して視覚化した。
【０２７４】
結果
ＮＲ１オリゴ、ｈｃｖ９８７３８９６、図１３ａ
その結果、ＮＲ１の野生型及び突然変異オリゴに結合しているタンパク質に違いがあることが示された。突然変異オリゴとのＤＮＡ−タンパク質複合体の移動距離が増加した。これは、おそらく、突然変異オリゴに対する親和性が減少したためであり、タンパク質が解離し、核抽出物からの異なるタンパク質がＤＮＡに結合することが可能である。
【０２７５】
ＮＲ２オリゴ、ｃｌｌｄ７ｘ１ａ２９５ｔ、図１３ｂ
野生型と突然変異の両方のオリゴに対してタンパク質−ＤＮＡ複合体が形成されるが、両者にいかなる差異も見られなかった。
【０２７６】
ＮＲ３オリゴ、ｃｌｌｄ７ｐｒｏｍ１ａ３５１ｇ、図１３ｃ
タンパク質がＮＲ３野生型オリゴと結合した形跡はあったが、突然変異オリゴとの結合は検出されなかった。
【０２７７】
ＮＲ４オリゴ、ｃｌｌｄ８ｘ１ａ３８４ｇ、図１３ｄ
タンパク質に対して、野生型と突然変異の両方のオリゴによる極めて強い親和性があった。野生型オリゴと突然変異オリゴの親和性にいかなる差異も見られなかった。
【実験例６ａ】
【０２７８】
ＣＬＬＤ７、ＣＬＬＤ８及びＡＮＧＥタンパク質が細胞に局在することを確認するために、本発明者らは、細胞にトランスフェクトされると組換えタンパク質を発現し得る哺乳動物の発現構築物を作製した。目的タンパク質とインフレームで融合したエピトープタグに特異的な抗体を用いることによって、細胞内のタンパク質の視覚化が可能になる。
【０２７９】
発現クローニング
完全長ＥＳＴクローンを用いたＰＣＲによって、ＣＬＬＤ７（１５９０ｂｐ）、ＣＬＬＤ８（２１５７ｂｐ）及びＡＮＧＥ（９９３ｂｐ）のオープンリーディングフレームを作製し、そのＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ−Ｈｉｓ．Ｍａｘ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
【０２８０】
ｏｒｆのフレーム及び完全性を、挿入断片の二本鎖配列決定により確認した。プラスミド発現構築物をバルクで増殖させ、ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションができるように精製した。
【０２８１】
トランスフェクション及び分析
次いで、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、各精製プラスミドクローンをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション前に、ＣＯＳ−７細胞を、２４ウェルプレートにおいてウェル当たり０．５×１０５にてカバーガラス上で終夜培養した。次いで、カバーガラスを固定し、Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、抗マウスＣｙ３抗体を用いて検出した。免疫蛍光顕微鏡法（図１４ａ、ｂ、ｃ）によりイメージを得た。
【参考文献】
【０２８２】
1. Jarvis, D. & Burney, P. ABC of allergies. The epidemiology of allergic disease [published erratum appears in BMJ 1998 Apr 4;316(7137):1078]. British Medical Journal 316, 607-10 (1998).
2. Eiberg, H., Lind, P., Mohr, J. & Nielsen, L. S. Linkage relationship between the human immunoglobulin E polymorphism and marker systems. Cytogenetics. And Cell Genetics 40, 622 (1985).
3. Daniels, S. E. et al. A genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma. Nature 383, 247-50 (1996).
4. Anderson, G. G., Leaves N.I, Bhattacharyya S., Zhang Y., Walshe V., Broxholme J., Abecasis G., Levy E., Zimmer M., Cox R., Cookson W.O.C.M. Positive association to IgE levels and a physical map of the 13q14 atopy locus. Eur J Hum Genet (in press) (2002).
5. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature 402, B5-11 (1999).
6. O'Connor, G. T. & Weiss, S. T. Clinical and symptom measures. Am J Respir Crit Care Med 149, S21-8 (1994).
7. Duffy, D. L., Martin, N. G., Battistutta, D., Hopper, J. L. & Mathews, J. D. Genetics of asthma and hay fever in Australian twins. Am Rev Respir Dis 142, 1351-8 (1990).
8. Gerrard, J., Rao, D. & Morton, N. A genetic study of immunoglobulin E. Am J Hum Genet 30, 46-58 (1978).
9. Palmer, L. J. et al. Independent inheritance of serum immunoglobulin E concentrations and airway responsiveness. Am J Respir Crit Care Med 161, 1836-43 (2000).
10. Risch, N. J. & Zhang, H. Mapping quantitative trait loci with extreme discordant sib pairs: sampling considerations. Am J Hum Genet 58, 836-43 (1996).
11. Cookson, W. & Palmer, L. Investigating the asthma phenotype. Clin Exp Allergy 28 Suppl 1, 88-9; discussion 108-10 (1998).
12. Dizier, M. H. et al. Detection of a recessive major gene for high IgE levels acting independently of specific response to allergens. Genet Epidemiol 12, 93-105 (1995).
13. Kimura, K. et al. Linkage and association of atopic asthma to markers on chromosome 13 in the Japanese population. Hum Mol Genet 8, 1487-90 (1999).
14. Ober, C. et al. Genome-wide search for asthma susceptibility loci in a founder population. The Collaborative Study on the Genetics of Asthma. Hum Mol Genet 7, 1393-8 (1998).
15. Hizawa, N. et al. Genetic regulation of Dermatophagoides pteronyssinus-specific IgE responsiveness: a genome-wide multipoint linkage analysis in families recruited through 2 asthmatic sibs. Collaborative Study on the Genetics of Asthma (CSGA). J Allergy Clin Immunol 102, 436-42 (1998).
16. Beyer K, W. U., Freidhoff L, Nickel R, Bjoerksten B, Huang S, Barnes KC, Beaty T, Marsh DG. Evidence for linkage of chromosome 5q31-q33 and 13q12-q14 markers to atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 101, 152 (1998).
17. Bhattacharyya, S., Leaves, N. I., Wiltshire, S., Cox, R. & Cookson, W. O. A high-density genetic map of the chromosome 13q14 atopy locus. Genomics 70, 286-91 (2000).
18. Abecasis, G. R. et al. Extent and Distribution of Linkage Disequilibrium in Three Genomic Regions. Am J Hum Genet 68, 191-7 (2001).
19. Abecasis, G. R., Cookson, W. O. & Cardon, L. R. The power to detect linkage disequilibrium with quantitative traits in selected samples. Am J Hum Genet 68, 1463-74 (2001).
20. Oscier, D. G. Cytogenetic and molecular abnormalities in chronic lymphocytic leukaemia. Blood Rev 8, 88-97. (1994).
21. Kalachikov, S. et al. Cloning and gene mapping of the chromosome 13q14 region deleted in chronic lymphocytic leukaemia. Genomics 42, 369-77 (1997).
22. Mabuchi, H. et al. Cloning and characterisation of CLLD6, CLLD7, and CLLD8, novel candidate genes for leukemogenesis at chromosome 13q14, a region commonly deleted in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Cancer Res 61, 2870-7. (2001).
23. Bentley, D. R. et al. The physical maps for sequencing human chromosomes 1, 6, 9, 10, 13, 20 and X. Nature 409, 942-3. (2001).
24. McPherson, J. D. et al. A physical map of the human genome. Nature 409, 934-41. (2001).
25. Osoegawa, K. et al. A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome. Genome Res 11, 483-96 (2001).
26. Lander, E. S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921 (2001).
27. Abecasis, G. R., Cherny, S. S., Cookson, W. O. & Cardon, L. R. Merlin--rapid analysis of dense genetic maps using sparse gene flow trees. Nat Genet 30, 97-101 (2002).
28. Abecasis, G. R. & Cookson, W. O. GOLD--graphical overview of linkage disequilibrium. Bioinformatics 16, 182-3 (2000).
29. Abecasis, G. R., Cardon, L. R. & Cookson, W. O. A general test of association for quantitative traits in nuclear families. Am J Hum Genet 66, 279-92 (2000).
30. Cox, H. E. et al. Association of atopic dermatitis to the beta subunit of the high affinity immunoglobulin E receptor [see comments]. Br J Dermatol 138, 182-7 (1998).
31. Monks, S. A., Kaplan, N. L. & Weir, B. S. A comparative study of sibship tests of linkage and/or association. Am J Hum Genet 63, 1507-16. (1998).
32. Takeda, S. et al. Isolation and mapping of karyopherin alpha 3 (KPNA3), a human gene that is highly homologous to genes encoding Xenopus importin, yeast SRP1 and human RCH1. Cytogenet Cell Genet 76, 87-93 (1997).
33. Ohki, I., Shimotake, N., Fujita, N., Nakao, M. & Shirakawa, M. Solution structure of the methyl-CpG-binding domain of the methylation-dependent transcriptional repressor MBD1. Embo J 18, 6653-61 (1999).
34. Wakefield, R. I. et al. The solution structure of the domain from MeCP2 that binds to methylated DNA. J Mol Biol 291, 1055-65 (1999).
35. Rea, S. et al. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406, 593-9 (2000).
36. Jenuwein, T. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases. Trends Cell Biol 11, 266-73 (2001).
37. Nakayama, J., Rice, J. C., Strahl, B. D., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292, 110-3 (2001).
38. Scanlan, M. J. et al. Antigens recognised by autologous antibody in patients with renal-cell carcinoma. Int J Cancer 83, 456-64 (1999).
39. Aasland, R., Gibson, T. J. & Stewart, A. F. The PHD finger: implications for chromatin-mediated transcriptional regulation. Trends Biochem Sci 20, 56-9 (1995).
40. Angioni, A. et al. Interstitial insertion of AF10 into the ALL1 gene in a case of infant acute lymphoblastic leukaemia. Cancer Genet Cytogenet 107, 107-10 (1998).
41. Linder, B. et al. Biochemical analyses of the AF10 protein: the extended LAP/PHD-finger mediates oligomerisation. J Mol Biol 299, 369-78 (2000).
42. Fair, K. et al. Protein interactions of the MLL PHD fingers modulate MLL target gene regulation in human cells. Mol Cell Biol 21, 3589-97 (2001).
43. Miyake, T., Hu, Y. F., Yu, D. S. & Li, R. A functional comparison of BRCA1 C-terminal domains in transcription activation and chromatin remodelling. J Biol Chem 275, 40169-73 (2000).
44. Nemergut, M. E., Mizzen, C. A., Stukenberg, T., Allis, C. D. & Macara, I. G. Chromatin docking and exchange activity enhancement of RCC1 by histones H2A and H2B. Science 292, 1540-3 (2001).
45. Lavender, P., Cousins, D., Smith, P. & Lee, T. Presentation at the National Asthma Campaign International Congress, June 1999. Controlling the inflammatory response through transcriptional mechanisms. Clin Exp Allergy 30, 1697-708 (2000).
46. Garlisi, C. G. et al. A unique mRNA initiated within a middle intron of WHSC1/MMSET encodes a DNA binding protein that suppresses human IL-5 transcription. Am J Respir Cell Mol Biol 24, 90-8 (2001).
47. Chesi, M. et al. The t(4;14) translocation in myeloma dysregulates both FGFR3 and a novel gene, MMSET, resulting in IgH/MMSET hybrid transcripts. Blood 92, 3025-34 (1998).
48. Walker, W., Girardet, C. & Habener, J. Alternative exon splicing controls a translational switch from activator to repressor isoforms of transcription factor CREB during spermatogenesis. J Biol Chem 271, 20145-50 (1996).
49. Flint, J. et al. Comparative genome analysis delimits a chromosomal domain and identifies key regulatory elements in the alpha globin cluster. Hum Mol Genet 10, 371-82. (2001).
50. Terwilliger, J. D. & Weiss, K. M. Linkage disequilibrium mapping of complex disease: fantasy or reality? Curr Opin Biotechnol 9, 578-94. (1998).
51. Hill, M. R. et al. Fc epsilon RI-beta polymorphism and risk of atopy in a general population sample. BMJ 311, 776-9 (1995).
52. Jurka, J. Repbase update: a database and an electronic journal of repetitive elements. Trends Genet 16, 418-20 (2000).
53. Larsen, F., Gundersen, G., Lopez, R. & Prydz, H. CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics 13, 1095-107 (1992).
54. Prestridge, D. S. Predicting Pol II promoter sequences using transcription factor binding sites. J Mol Biol 249, 923-32 (1995).
55. Xu, Y., Mural, R. J. & Uberbacher, E. C. Constructing gene models from accurately predicted exons: an application of dynamic programming. Comput Appl Biosci 10, 613-23 (1994).
56. Burge, C. & Karlin, S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol Biol 268, 78-94 (1997).
57. Snyder, E. E. & Stormo, G. D. Identification of coding regions in genomic DNA sequences: an application of dynamic programming and neural networks. Nucleic Acids Res 21, 607-13 (1993).
58. Zhang, M. Q. Identification of protein coding regions in the human genome by quadratic discriminant analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 565-8. (1997).
59. Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-402 (1997).
60. Schultz, J., Copley, R. R., Doerks, T., Ponting, C. P. & Bork, P. SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Res 28, 231-4 (2000)。
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
【図１】図１は、アトピー遺伝子座の連鎖不均衡マップを示している。
【０２８４】
ａ）アトピー遺伝子座の連鎖不均衡マップ
マーカー間の色でコードされた対応のある不均衡統計値（Ｄ’）をＧＯＬＤプロット２８したものが示されている。遺伝子座は、図の左下から右上へと広がっている。赤と黄色は、強いＬＤの領域を表している。ＬＤは、概ね、４つの領域に分割される。下のスケールバーは、２００Ｋｂの距離を表している。
【０２８５】
ｂ）ＡＮＧＥ（ＮＹ−ＲＥＮ−３４）遺伝子複合体周囲のＬＤの詳細
ＩｇＥレベルへの関連が、図の上に示されている。遺伝子は、転写の方向を向いた黒の矢印として示されている。下のスケールバーは、１００Ｋｂの距離を表している。
【図２】図２は、染色体１３ｑ１４上に存在するＳＮＰ間の連鎖不均衡の程度を示している。
【図３ａ】図３ａは、遺伝子ＡＮＧＥの模式的構造を示している。
【図３ｂ】図３ｂは、ＡＮＧＥプロモーターと代替的エキソンの構造の詳細。
【図３ｃ】図３ｃは、選択的エキソンＩとエキソンＩＩＩの間での増幅による転写物の堆積。
【図３ｃ−１】図３ｃは、選択的エキソンＩとエキソンＩＩＩの間での増幅による転写物の堆積。
【図３ｃ−２】図３ｃは、選択的エキソンＩとエキソンＩＩＩの間での増幅による転写物の堆積。
【図３ｃ−３】図３ｃは、選択的エキソンＩとエキソンＩＩＩの間での増幅による転写物の堆積。
【図３ｃ−４】図３ｃは、選択的エキソンＩとエキソンＩＩＩの間での増幅による転写物の堆積。
【図３ｄ】図３ｄは、代替的エキソン１から免疫組織へのＡＮＧＥの転写を示している。
【図４】図４は、ＡＮＧＥにおけるスプライス変異を示している。
【０２８６】
ａ）複数の組織ｃＤＮＡ群におけるエキソン１−３のＰＣＲ増幅。エキソン２が存在しないことを示す小さめのバンドの存在が、全ての組織で観察される。
【０２８７】
ｂ）多数の組織ｃＤＮＡ群におけるエキソン４−６のＰＣＲ増幅
さらなるエキソン（ＶａとＶｂ）が保持されていることを示すバンドがさらに存在することが、肺及び免疫組織中で観察される。バンドは、非活性化リンパ球由来のｃＤＮＡ中に存在し、活性化リンパ球中には存在しない。
【０２８８】
ｃ）複数の組織ｃＤＮＡ群におけるエキソン７−８のＰＣＲ増幅
エキソン７の保持を示すバンドがさらに存在することが、肺、肝臓、腎臓、及び膵臓、及び免疫組織中に観察される。バンドは、休止しているＴ細胞とＢ細胞由来のｃＤＮＡ中に最も高度に発現されている。
【図５−１】図５は、ヌクレオチド313649-346509としてANGE 1遺伝子(NY-REN-34)のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド249727-309803としてCLLD8のヌクレオチド配列を、BAC bA103J18.03548のヌクレオチト゛349634-410846としてCLLDの配列を示している。
【図５−２】図５−１に同じ。
【図５−３】図５−１に同じ。
【図５−４】図５−１に同じ。
【図５−５】図５−１に同じ。
【図５−６】図５−１に同じ。
【図５−７】図５−１に同じ。
【図５−８】図５−１に同じ。
【図５−９】図５−１に同じ。
【図５−１０】図５−１に同じ。
【図５−１１】図５−１に同じ。
【図５−１２】図５−１に同じ。
【図５−１３】図５−１に同じ。
【図５−１４】図５−１に同じ。
【図５−１５】図５−１に同じ。
【図５−１６】図５−１に同じ。
【図５−１７】図５−１に同じ。
【図５−１８】図５−１に同じ。
【図５−１９】図５−１に同じ。
【図５−２０】図５−１に同じ。
【図５−２１】図５−１に同じ。
【図５−２２】図５−１に同じ。
【図５−２３】図５−１に同じ。
【図５−２４】図５−１に同じ。
【図５−２５】図５−１に同じ。
【図５−２６】図５−１に同じ。
【図５−２７】図５−１に同じ。
【図５−２８】図５−１に同じ。
【図５−２９】図５−１に同じ。
【図５−３０】図５−１に同じ。
【図５−３１】図５−１に同じ。
【図５−３２】図５−１に同じ。
【図５−３３】図５−１に同じ。
【図５−３４】図５−１に同じ。
【図５−３５】図５−１に同じ。
【図５−３６】図５−１に同じ。
【図５−３７】図５−１に同じ。
【図５−３８】図５−１に同じ。
【図５−３９】図５−１に同じ。
【図５−４０】図５−１に同じ。
【図５−４１】図５−１に同じ。
【図５−４２】図５−１に同じ。
【図５−４３】図５−１に同じ。
【図５−４４】図５−１に同じ。
【図５−４５】図５−１に同じ。
【図５−４６】図５−１に同じ。
【図５−４７】図５−１に同じ。
【図５−４８】図５−１に同じ。
【図５−４９】図５−１に同じ。
【図５−５０】図５−１に同じ。
【図５−５１】図５−１に同じ。
【図５−５２】図５−１に同じ。
【図５−５３】図５−１に同じ。
【図５−５４】図５−１に同じ。
【図５−５５】図５−１に同じ。
【図５−５６】図５−１に同じ。
【図５−５７】図５−１に同じ。
【図５−５８】図５−１に同じ。
【図５−５９】図５−１に同じ。
【図５−６０】図５−１に同じ。
【図５−６１】図５−１に同じ。
【図５−６２】図５−１に同じ。
【図５−６３】図５−１に同じ。
【図５−６４】図５−１に同じ。
【図５−６５】図５−１に同じ。
【図５−６６】図５−１に同じ。
【図５−６７】図５−１に同じ。
【図５−６８】図５−１に同じ。
【図５−６９】図５−１に同じ。
【図５−７０】図５−１に同じ。
【図５−７１】図５−１に同じ。
【図５−７２】図５−１に同じ。
【図５−７３】図５−１に同じ。
【図５−７４】図５−１に同じ。
【図５−７５】図５−１に同じ。
【図５−７６】図５−１に同じ。
【図５−７７】図５−１に同じ。
【図５−７８】図５−１に同じ。
【図５−７９】図５−１に同じ。
【図５−８０】図５−１に同じ。
【図５−８１】図５−１に同じ。
【図５−８２】図５−１に同じ。
【図５−８３】図５−１に同じ。
【図５−８４】図５−１に同じ。
【図５−８５】図５−１に同じ。
【図５−８６】図５−１に同じ。
【図５−８７】図５−１に同じ。
【図５−８８】図５−１に同じ。
【図５−８９】図５−１に同じ。
【図５−９０】図５−１に同じ。
【図５−９１】図５−１に同じ。
【図５−９２】図５−１に同じ。
【図５−９３】図５−１に同じ。
【図５−９４】図５−１に同じ。
【図５−９５】図５−１に同じ。
【図５−９６】図５−１に同じ。
【図５−９７】図５−１に同じ。
【図５−９８】図５−１に同じ。
【図５−９９】図５−１に同じ。
【図５−１００】図５−１に同じ。
【図５−１０１】図５−１に同じ。
【図５−１０２】図５−１に同じ。
【図５−１０３】図５−１に同じ。
【図５−１０４】図５−１に同じ。
【図５−１０５】図５−１に同じ。
【図５−１０６】図５−１に同じ。
【図５−１０７】図５−１に同じ。
【図５−１０８】図５−１に同じ。
【図５−１０９】図５−１に同じ。
【図５−１１０】図５−１に同じ。
【図５−１１１】図５−１に同じ。
【図５−１１２】図５−１に同じ。
【図５−１１３】図５−１に同じ。
【図５−１１４】図５−１に同じ。
【図５−１１５】図５−１に同じ。
【図５−１１６】図５−１に同じ。
【図５−１１７】図５−１に同じ。
【図５−１１８】図５−１に同じ。
【図５−１１９】図５−１に同じ。
【図５−１２０】図５−１に同じ。
【図５−１２１】図５−１に同じ。
【図５−１２２】図５−１に同じ。
【図５−１２３】図５−１に同じ。
【図５−１２４】図５−１に同じ。
【図５−１２５】図５−１に同じ。
【図５−１２６】図５−１に同じ。
【図５−１２７】図５−１に同じ。
【図５−１２８】図５−１に同じ。
【図５−１２９】図５−１に同じ。
【図５−１３０】図５−１に同じ。
【図５−１３１】図５−１に同じ。
【図５−１３２】図５−１に同じ。
【図５−１３３】図５−１に同じ。
【図５−１３４】図５−１に同じ。
【図５−１３５】図５−１に同じ。
【図５−１３６】図５−１に同じ。
【図５−１３７】図５−１に同じ。
【図５−１３８】図５−１に同じ。
【図５−１３９】図５−１に同じ。
【図５−１４０】図５−１に同じ。
【図５−１４１】図５−１に同じ。
【図５−１４２】図５−１に同じ。
【図５ａ（ｉ）】図５ａ（ｉ）は、ＡＮＧＥ遺伝子について、エキソン配列を示している。
【図５ａ（ｉｉ）】図５ａ（ｉｉ）は、ＡＮＧＥ遺伝子について、タンパク質配列を示している。
【図５ｂ（ｉ）】図５ｂ（ｉ）は、ＮＹ−ＲＥＮ−３４遺伝子について、ｍＲＮＡ配列を示している。
【図５ｂ（ｉｉ）】図５ｂ（ｉｉ）は、ＮＹ−ＲＥＮ−３４遺伝子について、タンパク質配列を示している。
【図５ｂ（ｉｉｉ）】図５ｂ（ｉｉｉ）は、ＮＹ−ＲＥＮ−３４遺伝子について、選択的タンパク質配列を示している。
【図５ｃ（ｉ）−１】図５ｃ（ｉ）ＣＬＬＤ７遺伝子について、エキソン配列を示している。
【図５ｃ（ｉ）−２】図５ｃ（ｉ）ＣＬＬＤ７遺伝子について、エキソン配列を示している。
【図５ｃ（ｉｉ）】図５ｃ（ｉｉ）ＣＬＬＤ７遺伝子について、タンパク質配列を示している。
【図５ｄ（ｉ）−１】図５ｄ（ｉ）は、ＣＬＬＤ８遺伝子について、エキソン構造と核酸配列を示している。
【図５ｄ（ｉ）−２】図５ｄ（ｉ）は、ＣＬＬＤ８遺伝子について、エキソン構造と核酸配列を示している。
【図５ｄ（ｉｉ）】図５ｄ（ｉｉ）は、ＣＬＬＤ８遺伝子について、タンパク質配列を示している。
【図６】図６は、ＢＡＣ  ｂＡ１０１ｄ１１．０１１１６のヌクレオチド配列を示している。
【図７−１】図７は、BAC bA236m15.00303のヌクレオチド配列を示している。
【図７−２】図７−１に同じ。
【図７−３】図７−１に同じ。
【図７−４】図７−１に同じ。
【図７−５】図７−１に同じ。
【図７−６】図７−１に同じ。
【図７−７】図７−１に同じ。
【図７−８】図７−１に同じ。
【図７−９】図７−１に同じ。
【図７−１０】図７−１に同じ。
【図７−１１】図７−１に同じ。
【図７−１２】図７−１に同じ。
【図７−１３】図７−１に同じ。
【図７−１４】図７−１に同じ。
【図７−１５】図７−１に同じ。
【図７−１６】図７−１に同じ。
【図７−１７】図７−１に同じ。
【図７−１８】図７−１に同じ。
【図７−１９】図７−１に同じ。
【図７−２０】図７−１に同じ。
【図７−２１】図７−１に同じ。
【図７−２２】図７−１に同じ。
【図７−２３】図７−１に同じ。
【図７−２４】図７−１に同じ。
【図７−２５】図７−１に同じ。
【図７−２６】図７−１に同じ。
【図７−２７】図７−１に同じ。
【図７−２８】図７−１に同じ。
【図７−２９】図７−１に同じ。
【図７−３０】図７−１に同じ。
【図７−３１】図７−１に同じ。
【図７−３２】図７−１に同じ。
【図７−３３】図７−１に同じ。
【図７−３４】図７−１に同じ。
【図７−３５】図７−１に同じ。
【図７−３６】図７−１に同じ。
【図７−３７】図７−１に同じ。
【図７−３８】図７−１に同じ。
【図７−３９】図７−１に同じ。
【図７−４０】図７−１に同じ。
【図７−４１】図７−１に同じ。
【図７−４２】図７−１に同じ。
【図７−４３】図７−１に同じ。
【図７−４４】図７−１に同じ。
【図７−４５】図７−１に同じ。
【図７−４６】図７−１に同じ。
【図７−４７】図７−１に同じ。
【図７−４８】図７−１に同じ。
【図７−４９】図７−１に同じ。
【図７−５０】図７−１に同じ。
【図７−５１】図７−１に同じ。
【図７−５２】図７−１に同じ。
【図７−５３】図７−１に同じ。
【図７−５４】図７−１に同じ。
【図７−５５】図７−１に同じ。
【図７−５６】図７−１に同じ。
【図７−５７】図７−１に同じ。
【図７−５８】図７−１に同じ。
【図７−５９】図７−１に同じ。
【図７−６０】図７−１に同じ。
【図７−６１】図７−１に同じ。
【図７−６２】図７−１に同じ。
【図７−６３】図７−１に同じ。
【図７−６４】図７−１に同じ。
【図７−６５】図７−１に同じ。
【図７−６６】図７−１に同じ。
【図７−６７】図７−１に同じ。
【図７−６８】図７−１に同じ。
【図７−６９】図７−１に同じ。
【図７−７０】図７−１に同じ。
【図７−７１】図７−１に同じ。
【図７−７２】図７−１に同じ。
【図７−７３】図７−１に同じ。
【図７−７４】図７−１に同じ。
【図７−７５】図７−１に同じ。
【図７−７６】図７−１に同じ。
【図７−７７】図７−１に同じ。
【図７−７８】図７−１に同じ。
【図７−７９】図７−１に同じ。
【図７−８０】図７−１に同じ。
【図７−８１】図７−１に同じ。
【図７−８２】図７−１に同じ。
【図７−８３】図７−１に同じ。
【図７−８４】図７−１に同じ。
【図７−８５】図７−１に同じ。
【図７−８６】図７−１に同じ。
【図７−８７】図７−１に同じ。
【図７−８８】図７−１に同じ。
【図７−８９】図７−１に同じ。
【図７−９０】図７−１に同じ。
【図７−９１】図７−１に同じ。
【図７−９２】図７−１に同じ。
【図７−９３】図７−１に同じ。
【図７−９４】図７−１に同じ。
【図７−９５】図７−１に同じ。
【図７−９６】図７−１に同じ。
【図７−９７】図７−１に同じ。
【図７−９８】図７−１に同じ。
【図７−９９】図７−１に同じ。
【図７−１００】図７−１に同じ。
【図７−１０１】図７−１に同じ。
【図７−１０２】図７−１に同じ。
【図７−１０３】図７−１に同じ。
【図７−１０４】図７−１に同じ。
【図７−１０５】図７−１に同じ。
【図７−１０６】図７−１に同じ。
【図７−１０７】図７−１に同じ。
【図７−１０８】図７−１に同じ。
【図７−１０９】図７−１に同じ。
【図７−１１０】図７−１に同じ。
【図７−１１１】図７−１に同じ。
【図７−１１２】図７−１に同じ。
【図７−１１３】図７−１に同じ。
【図７−１１４】図７−１に同じ。
【図７−１１５】図７−１に同じ。
【図７−１１６】図７−１に同じ。
【図７−１１７】図７−１に同じ。
【図７−１１８】図７−１に同じ。
【図７−１１９】図７−１に同じ。
【図７−１２０】図７−１に同じ。
【図７−１２１】図７−１に同じ。
【図７−１２２】図７−１に同じ。
【図７−１２３】図７−１に同じ。
【図７−１２４】図７−１に同じ。
【図７−１２５】図７−１に同じ。
【図７−１２６】図７−１に同じ。
【図７−１２７】図７−１に同じ。
【図７−１２８】図７−１に同じ。
【図７−１２９】図７−１に同じ。
【図７−１３０】図７−１に同じ。
【図７−１３１】図７−１に同じ。
【図８】図８は、概ね実物どおりに描かれたＣＬＬＤ８、ＡＮＧＥ、及び関連タンパク質のドメイン構造を示している。
【０２８９】
タンパク質は、本文中に記載されている。ＣＬＬＤ８のＳＥＴドメインとＥＳＥＴは、大きな交差が存在するために、二股に分岐している。ＷＨＳＣ１／ＭＭＳＥＴ遺伝子４６の中間イントロン内から始まるｍＲＮＡから生じるＩＬ−５プロモーターＲＥＩＩ領域結合タンパク質が示されている。
【０２９０】
ドメインの符号：ＡＴ、ＡＴ−フックＤＮＡ結合モチーフ；Ｂ、ブロモドメイン；Ｃ（黒地に白）、ＳＥＴドメインに隣接するシステインに富む領域；Ｃ、ＦＹＲＣドメイン；Ｃ５ＨＣＨ、ジンクフィンガードメイン；ＣｐＧ、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン；ＣＸＸＣ、ＣＸＸＣ型ジンクフィンガー；ＨＭＧ、高移動グループドメイン；Ｎ、ＦＹＲＮドメイン；Ｐ、２つ（青い長方形）と１つ（黄色の長方形）のＺｎ２＋配位基を有するＰＨＤドメイン；ＰＷ、ＰＷＷＰドメイン；ＳＥＴ、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９、ゼストのエンハンサー、トリソラックスメチルトランスフェラーゼドメイン；Ｔ、ｔｕｄｏｒドメイン。
【図９】図９は、ＣＬＬＤ８／ＡＮＧＥ遺伝子複合体の同時発現を示している。
【図１０】図１０は、ＡＮＧＥ（ＮＹ−ＲＥＮ−３４）及びＣＬＬＤ８に対する遺伝子のノーザンブロットを示している。大きなバンドの存在とＰＢＭＣ中での差異的スプライシングが明らかである。
【０２９１】
図は、同一ノーザンブロットの選択的プロービングを示している。ＡＮＧＥについて予測される約１．６Ｋｂの転写サイズが全ての組織中に見られる。３．０Ｋｂのバンドが、リンパ節と胸腺に顕著であり、免疫組織中には、６．０と８．０Ｋｂの間に、これより大きな多型性の分子量のバンドが見られる。ＣＬＬＤ８では、予想された４．０Ｋｂのバンドが全ての組織に見られる。これより大きな分子量のバンドもさらに見ることができるが、それらの分布はＡＮＧＥの場合と一致していない。
【図１１】ｐｃＤＮＡ４発現ベクターを一過性トランスフェクトした後のＣｏｓ−７細胞溶離液のウェスタンブロット。
【０２９２】
１μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／ＭａｘＬａｃＺのみ（レーン１）、又は１μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／ＭａｘＬａｃＺと６μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ−ＣＬＬＤ７（レーン２）、６μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ−ＣＬＬＤ８（レーン３）、６μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ−ＲＥＮ３４（レーン４）、及び６μｇのｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ−ＡＮＧＥ（レーン５）を３×１０５の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後に細胞を採集し、細胞全体の溶離液を１０％のポリアクリルアミドゲル上に展開した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、抗ポリヒスチジン抗体でプローブした。
【図１２】ｐｃＤＮＡ  ＣＬＬＤ８をトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞から得た核抽出物を用いたＨＭＴ放射能アッセイ。
【０２９３】
トランスフェクションの２４又は４８時間後に細胞を採集し、核抽出物のＨＭＴ活性を調べた。対照抽出物は、Ｆｕｇｅｎｅのみで処理した。全てのＣｏｓ７抽出物は、１１μｇ総タンパク質に相当する。陽性対照＝細菌のＳＵＶ３９Ｈ１（８２−４１２）１０μｇ；陰性対照＝タンパク質なし。
【図１３−１】図１３は、機能を有する可能性があるＳＮＰを含有するそれぞれのＤＮＡプローブを用いて得られた結果の例を示している。
【図１３−２】図１３は、機能を有する可能性があるＳＮＰを含有するそれぞれのＤＮＡプローブを用いて得られた結果の例を示している。
【図１４】図１４は、このような免疫分布実験の結果を示している。ＣＬＬＤ７（ａ）とＡＮＧＥ（ｂ）は、細胞質に点状に分布しているのに対して、ＣＬＬＤ８（ｃ）は、ＣＯＳ−７細胞の核に限局しているようである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｃ−１】
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【図３ｃ−２】
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【図３ｃ−３】
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【図３ｃ−４】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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【図５−２９】
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【図５−３０】
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【図５−３１】
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【図５−３２】
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【図５−３３】
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【図５−３４】
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【図５−３５】
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【図５−３６】
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【図５−３７】
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【図５−３８】
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【図５−３９】
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【図５−４０】
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【図５−４１】
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【図５−４２】
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【図５−４３】
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【図５−４４】
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【図５−４５】
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【図５−４６】
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【図５−４７】
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【図５−４８】
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【図５−４９】
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【図５−５０】
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【図５−５１】
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【図５−５２】
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【図５−５３】
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【図５−５４】
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【図５−５５】
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【図５−５６】
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【図５−５７】
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【図５−５８】
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【図５−５９】
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【図５−６０】
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【図５−６１】
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【図５−６２】
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【図５−６３】
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【図５−６４】
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【図５−６５】
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【図５−６６】
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【図５−６７】
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【図５−６８】
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【図５−６９】
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【図５−７０】
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【図５−７１】
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【図５−７２】
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【図５−７３】
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【図５−７４】
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【図５−７５】
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【図５−７６】
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【図５−７７】
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【図５−７８】
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【図５−７９】
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【図５−８０】
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【図５−８１】
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【図５−８２】
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【図５−８３】
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【図５−８４】
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【図５−８５】
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【図５−８６】
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【図５−８７】
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【図５−８８】
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【図５−８９】
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【図５−９０】
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【図５−９１】
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【図５−９２】
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【図５−９３】
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【図５−９４】
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【図５−９５】
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【図５−９６】
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【図５−９７】
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【図５−９８】
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【図５−９９】
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【図５−１００】
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【図５−１０１】
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【図５−１０２】
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【図５−１０３】
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【図５−１０４】
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【図５−１０５】
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【図５−１０６】
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【図５−１０７】
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【図５−１０８】
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【図５−１０９】
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【図５−１１０】
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【図５−１１１】
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【図５−１１２】
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【図５−１１３】
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【図５−１１４】
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【図５−１１５】
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【図５−１１６】
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【図５−１１７】
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【図５−１１８】
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【図５−１１９】
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【図５−１２０】
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【図５−１２１】
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【図５−１２２】
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【図５−１２３】
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【図５−１２４】
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【図５−１２５】
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【図５−１２６】
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【図５−１２７】
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【図５−１２８】
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【図５−１２９】
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【図５−１３０】
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【図５−１３１】
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【図５−１３２】
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【図５−１３３】
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【図５−１３４】
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【図５−１３５】
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【図５−１３６】
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【図５−１３７】
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【図５−１３８】
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【図５−１３９】
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【図５−１４０】
2006081547.tif 000190
【図５−１４１】
2006081547.tif 000191
【図５−１４２】
2006081547.tif 000192
【図５ａ（ｉ）】
2006081547.tif 000193
【図５ａ（ｉｉ）】
2006081547.tif 000194
【図５ｂ（ｉ）】
2006081547.tif 000195
【図５ｂ（ｉｉ）】
2006081547.tif 000196
【図５ｂ（ｉｉｉ）】
2006081547.tif 000197
【図５ｃ（ｉ）−１】
2006081547.tif 000198
【図５ｃ（ｉ）−２】
2006081547.tif 000199
【図５ｃ（ｉｉ）】
2006081547.tif 000200
【図５ｄ（ｉ）−１】
2006081547.tif 000201
【図５ｄ（ｉ）−２】
2006081547.tif 000202
【図５ｄ（ｉｉ）】
2006081547.tif 000203
【図６】
2006081547.tif 000204
【図７−１】
2006081547.tif 000205
【図７−２】
2006081547.tif 000206
【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
2006081547.tif 000209
【図７−６】
2006081547.tif 000210
【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【図７−５２】
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【図７−５３】
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【図７−５４】
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【図７−５５】
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【図７−５６】
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【図７−５７】
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【図７−５８】
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【図７−５９】
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【図７−６０】
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【図７−７０】
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【図７−９６】
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【図７−９８】
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【図７−９９】
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【図７−１００】
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【図７−１０９】
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【図７−１１０】
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【図７−１１１】
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【図７−１１２】
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【図７−１１３】
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【図７−１１４】
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【図７−１１５】
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【図７−１１６】
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【図７−１１７】
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【図７−１１８】
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【図７−１１９】
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【図７−１２０】
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【図７−１２１】
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【図７−１２２】
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【図７−１２３】
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【図７−１２４】
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【図７−１２５】
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【図７−１２６】
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【図７−１２７】
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【図７−１２８】
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【図７−１２９】
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【図７−１３０】
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【図７−１３１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【配列表】
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