(57)【要約】【課題】  吸着防止剤をコーティングすることなしに、抗体を基体表面の任意の位置に固定化し、検体中の複数種の標的蛋白質又はペプチドを同時に捕捉し、かつ非特異吸着に由来するノイズの少ない、高感度でハイスループットな蛋白質又はペプチドの検出方法を提供すること。【解決手段】基体表面に抗体を固定し、抗体との相互作用により検体中の蛋白質又はペプチドを特異的に捕捉して蛋白質又はペプチドを検出する方法であって、（ａ）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、（ｂ）該ポリマー上に抗体を固定化する工程、（ｃ）検体中の蛋白質又はペプチドを標識化する工程、（ｄ）工程（ｃ）で得られた検体と、ホスホリルコリン基を有するポリマーとを同一系中に共存させる工程、（ｅ）工程（ｂ）で得られた基体に工程（ｄ）で得られた検体を接触させる工程、を含む蛋白質又はペプチドの検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体表面に抗体を固定し、該抗体との相互作用により検体中の蛋白質又はペプチドを特異的に捕捉して該蛋白質又は該ペプチドを検出する方法であって、
（ａ）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、
（ｂ）該ポリマー上に抗体を固定化する工程、
（ｃ）検体中の蛋白質又はペプチドを標識化する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた検体と、ホスホリルコリン基を有するポリマーとを同一系中に共存させる工程、
（ｅ）工程（ｂ）で得られた基体に工程（ｄ）で得られた検体を接触させる工程、
を含むことを特徴とする蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項２】
前記検体が血清又は血漿である請求項１記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項３】
検体中の蛋白質又はペプチドの標識化方法が蛍光標識法、酵素標識法、及びビオチン標識法から選択された少なくとも１種の方法である請求項１又は２記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項４】
蛍光標識法で用いる物質がＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ
（fluorescein isothiocyanate）、及びローダミンから選択された少なくとも１種である請求項３記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項５】
酵素標識法で用いる物質がペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼから選択された少なくとも１種である請求項３記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項６】
前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１〜５いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項７】
前記ポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体である請求項１〜６いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項８】
前記抗体が基体表面にスポット状に固定化されている請求項１〜７いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項９】
複数種の抗体のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項８記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項１０】
基体の形状がスライドグラス状である請求項１〜９いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項１１】
基体が微細流路を有しており、微細流路内に抗体が固定化されていることを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項１２】
基体の材質がプラスチックである請求項１〜１１いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【請求項１３】
プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である請求項１２記載の蛋白質又はペプチドの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的に蛋白質又はペプチドを捕捉する物質を用いて、標識化された蛋白質又はペプチドを捕捉する検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして、ＤＮＡチップが開発され、実用化されつつある。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関してはプロテインチップが提唱され、近年研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板）表面に固定化したものを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
蛋白質等の検体の検出および定量において一般的に用いられている方法にサンドイッチ法がある。この方法は、固相に抗体（一次抗体）を結合させ、不溶化した抗体に標的となる蛋白をトラップさせ、次いで標的蛋白の別のエピトープを認識して結合する標識抗体（二次抗体）を反応させて、この標識物を測定することで蛋白を定量的に測定する方法である（例えば非特許文献１参照）。しかしこの方法では、例えばプロテインチップのように、一度に大量種の蛋白を検出しようとした場合、各々の標的蛋白に対して互いに競合しない複数種の抗体が必要となるため、条件の最適化は解決すべき多くの問題を含んでいる。
【０００６】
また、蛋白質を捕捉する分子（以下、捕捉分子と略す）を基板上に固定化した後、例えばサンドイッチ法のように該表面上で他の蛋白質（抗原抗体反応の場合、抗原に相当）と反応させ、更に、標識された蛋白質を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、捕捉分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質、すなわち、抗原や標識された蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献２参照）。特に、本発明者らが行った実験では、臨床診断等で用いられる血清や血漿においては、夾雑蛋白の非特異吸着が多くノイズが高く出てしまい、Ｓ／Ｎ比が低くなる傾向にあった。
【０００７】
このため通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定化した後に抗原および二次抗体の非特異吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。また、一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまう場合があり、二次抗体と反応できないという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ生理活性物質の非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００８】
一方、すべての蛋白質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【非特許文献１】「酵素免疫測定法」、石川榮治、河合忠、宮井潔編、医学書院、1987年、p.44-45
【非特許文献２】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、抗体を基体表面の任意の位置に固定化し、検体中の複数種の標的蛋白質又はペプチドを同時に捕捉するとともに、夾雑蛋白の非特異吸着を低減させ、高感度でハイスループットな蛋白質又はペプチドの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明は、
（１）基体表面に抗体を固定し、該抗体との相互作用により検体中の蛋白質又はペプチドを特異的に捕捉して該蛋白質又は該ペプチドを検出する方法であって、
（ａ）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、
（ｂ）該ポリマー上に抗体を固定化する工程、
（ｃ）検体中の蛋白質又はペプチドを標識化する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた検体と、ホスホリルコリン基を有するポリマーとを同一系中に共存させる工程、
（ｅ）工程（ｂ）で得られた基体に工程（ｄ）で得られた検体を接触させる工程、
を含むことを特徴とする蛋白質又はペプチドの検出方法、
（２）前記検体が血清又は血漿である（１）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（３）検体中の蛋白質又はペプチドの標識化方法が蛍光標識法、酵素標識法、及びビオチン標識法から選択された少なくとも１種の方法である（１）又は（２）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（４）蛍光標識法で用いる物質がＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、及びローダミンから選択された少なくとも１種である（３）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（５）酵素標識法で用いる物質がペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼから選択された少なくとも１種である（３）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（６）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）〜（５）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（７）前記ポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体である（１）〜（６）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（８）前記抗体が基体表面にスポット状に固定化されている（１）〜（７）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（９）複数種の抗体のスポットが基体表面の同一区画中に存在している（８）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（１０）基体の形状がスライドグラス状である（１）〜（９）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（１１）基体が微細流路を有しており、微細流路内に抗体が固定化されていることを特徴とする（１）〜（１０）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（１２）基体の材質がプラスチックである（１）〜（１１）いずれか記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
（１３）プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である（１２）記載の蛋白質又はペプチドの検出方法、
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の蛋白質又はペプチドの検出方法によれば、吸着防止剤をコーティングすることなしに、抗体を基体表面の任意の位置に固定化し、検体中の複数種の標的蛋白質又はペプチドを同時に捕捉するとともに、夾雑蛋白の非特異吸着を低減させ、高感度でハイスループットな蛋白質又はペプチドの検出ができる。特に血清や血漿のような夾雑蛋白の非特異吸着が多い検体の場合に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に使用する基体は、基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーがコートされていることを特徴とする。ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)４など）。
【００１３】
本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００１４】
また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との二元共重合体が好ましい。
【００１５】
基板表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基板表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。
本発明においては、基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを含む溶液を塗布することが好ましい。
【００１６】
（基体の素材）
基体の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基体の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等を指す。
【００１７】
（基体の形状）
本発明に使用する基体の形状は特に限定しないが、スライドガラス状等の平板、マイクロビーズ状等が挙げられる。更に基体が表面に微細流路を有しており、微細流路内に生理活性物質を固定化することも好ましい。
【００１８】
（抗体の固定化）
本発明において、抗体を基体上に固定化する際には、抗体を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。
抗体を溶解または分散した液体のｐＨは８〜１０であることが好ましく、ｐＨ９．０〜９．９がより好ましい。固定化後は、固定化されなかった生理活性物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ましい。
又、抗体が基体表面にスポット状に固定化されていることが好ましく、更には複数種の抗体のスポットが基体表面の同一区画中に存在していることが好ましい。
【００１９】
（検体の標識化）
本発明において、検体となる蛋白質又はペプチドを標識化する方法としては、例えば蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等が挙げられ、いずれの方法も利用できる。
蛍光標識法の場合、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ローダミン等の物質を使用する。
酵素標識法の場合、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の物質を使用する。
【００２０】
（検体とホスホリルコリン基を有するポリマーとの同一系中での共存）
本発明において、検体と共存させるホスホリルコリン基を有するポリマーの形態は、粉末、懸濁液状態、溶液状態のいずれでもよく、好ましくは水、緩衝液などの溶解液が挙げられる。
本発明において、ホスホリルコリン基を有するポリマーと同一系中で共存する検体は特に限定されるものではないが、血清等、夾雑蛋白が多数含まれているものが特に本発明の効果を得ることができる。
検体とホスホリルコリン基を有するポリマーとを同一系中で共存させるとは、例えば溶液状態の検体溶液に前記液状のホスホリルコリン基を有するポリマーを添加等して同一液中に共存させることなどにより実施できる。
本発明において、同一系中での共存の工程で用いるホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
また、上記工程で使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との二元共重合体が好ましい。
なお、上記工程で使用するホスホリルコリン基およびポリマーは、前述の基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程で用いたものと同一でも良いし、異なっていても良い。
【００２１】
（蛋白質及びペプチドの検出）
抗体が固定化された基体に、ホスホリルコリン基を有するポリマーが共存し、標識化された検体を含む液体を接触させることによって、基体への夾雑蛋白の非特異吸着を抑えながら、検体中の蛋白質又はペプチドが捕捉される。
本発明において、検出する蛋白質又はペプチドを溶解または分散した液体のｐＨは６．０〜７．６であることが好ましい。ｐＨが６．０を下回ると、酸により検出する蛋白質及びペプチドが変性する恐れがあり好ましくない。また、ｐＨが７．６を超えた場合は検出する蛋白質及びペプチドが変性する恐れがあり好ましくない。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。
次に、自動スポッターを用いて、３．３μｍｏｌ／Ｌの濃度で、ｐＨが９．５に調整された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａ抗体溶液を該基板にスポットし、２４時間静置して固定化させた。固定化後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。
続いて、抗原である血清蛋白の全混合物をＮＨＳ−Ｃｙ３によりＣｙ３標識した。
その後、上記Ｃｙ３標識溶液に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の５重量％水溶液を標識溶液に対して５分の１量加え、よく混合した。これを基板に接触させて基板上で抗原抗体反応を起こさせ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。
【００２３】
（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。
次に、自動スポッターを用いて、３．３μｍｏｌ／Ｌの濃度で、ｐＨが９．５に調整された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａ抗体溶液を該基板にスポットし、２４時間静置して固定化させた。固定化後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。
続いて、抗原である血清蛋白の全混合物をＮＨＳ−Ｃｙ３によりＣｙ３標識した。
その後、上記Ｃｙ３標識物を基板に接触させて基板上で抗原抗体反応を起こさせ、各スポットおよびスポット部以外の部分（バックグラウンド）について蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。
【００２４】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製バイオチップスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６５％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、解像度１０μｍであった。
実施例は、スポットシグナル強度は比較例とほぼ同じ値であったが、スポット部以外の蛍光強度（バックグラウンド）が比較例に比べて低く、Ｓ／Ｎ比は実施例の方が高い結果となった。すなわち、高感度な蛋白質及びペプチドの検出ができたと言える。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
本発明の蛋白質又はペプチドの検出方法によれば、吸着防止剤をコーティングすることなしに、抗体を基体表面の任意の位置に固定化し、検体中の複数種の標的蛋白質又はペプチドを同時に捕捉するとともに、検体（特に血清や血漿のような夾雑蛋白の非特異吸着が多いもの）と、ホスホリルコリン基を有するポリマーとを同一系中に共存させることにより、気体表面のホスホリルコリン基を有するポリマーとの相乗効果で夾雑蛋白の非特異吸着を低減させ、高感度でハイスループットな蛋白質又はペプチドの検出ができるので、マイクロフルイディクスを含む各種バイオチップの検出方法に適用できる。