(57)【要約】【課題】単核細胞を多機能型Ｐ幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に変換する方法を提供する。【解決手段】Ｐ幹細胞が更に目標細胞に転化し、例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等で、このようなＰ幹細胞を損傷組織の部位に注入すると、Ｐ幹細胞が組織細胞に転化して、修復作用が得られ、また、目標細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入しも、修復作用が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単核細胞に蛋白質キナーゼＣ条件剤を添加して培養することにより形成される、
ことを特徴とするＰ幹細胞。
【請求項２】
蛋白質キナーゼＣ条件剤がＢｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１やＧｏ６９７６或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項１に記載のＰ幹細胞。
【請求項３】
蛋白質キナーゼＣ条件剤がＧＭ−ＣＳＦやＳＤＦ或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項１に記載のＰ幹細胞。
【請求項４】
蛋白質キナーゼＣ条件剤がコラーゲンやフィブロネクチン或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項１に記載のＰ幹細胞。
【請求項５】
活性化単核細胞の蛋白質キナーゼＣのbIIにより、単核細胞をＰ幹細胞に変換する、
ことを特徴とするＰ幹細胞の形成方法。
【請求項６】
活性化単核細胞の蛋白質キナーゼＣのbIIは、蛋白質キナーゼＣ条件剤として、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１やＧｏ６９７６或いはその組合わせるものを使用することを特徴とする請求項５に記載のＰ幹細胞の形成方法。
【請求項７】
蛋白質キナーゼＣ条件剤がＧＭ−ＣＳＦやＳＤＦ或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項５に記載のＰ幹細胞の形成方法。
【請求項８】
蛋白質キナーゼＣ条件剤がコラーゲンやフィブロネクチン或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項５に記載のＰ幹細胞の形成方法。
【請求項９】
Ｐ幹細胞に転化酵素を添加し、培養基において、培養されることにより形成される、
ことを特徴とする目標細胞。
【請求項１０】
骨細胞であり、培養基が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、転化酵素がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅやb−グリセロリン酸、アスコルビン酸或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１１】
軟骨細胞であり、培養基が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、転化酵素がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅやトランスフォーミング成長因子−b１或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１２】
神経細胞であり、培養基がa−最低基礎培養基で、転化酵素がメルカプトエタノールやレチノイン酸、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補助剤、Ｂ２７補助剤或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１３】
心筋細胞であり、培養基がＩＭＤＭで、転化酵素が５−アザシチジンであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１４】
腎臓細胞であり、培養基がＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍで、転化酵素が白血病抑制因子であることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１５】
肺臓細胞であり、培養基がＤＭＥＭで、転化酵素がインシュリンや繊維芽細胞成長因子或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１６】
肝臟細胞であり、培養基が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、転化酵素が肝細胞増殖因子や繊維芽細胞成長因子或いはその組合わせるものであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１７】
骨格筋細胞であり、培養基がＤＭＥＭで、転化酵素が５−アザシチジンであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１８】
脂肪細胞であり、培養基がＤＭＥＭで、転化酵素がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅとｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、インシュリン及びｍｅｔｈｙｌ−ｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｉｎｅであることを特徴とする請求項９に記載の目標細胞。
【請求項１９】
Ｐ幹細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、損傷組織細胞を修復する、
ことを特徴とする組織修復の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種類の目標細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、損傷組織細胞を修復する、
ことを特徴とする組織修復の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有性細胞を多機能型Ｐ幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に変換する方法に関し、このようなＰ幹細胞が更に目標細胞に転化し、例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等で、このようなＰ幹細胞を損傷組織の部位に注入すると、Ｐ幹細胞が、組織細胞に転化して、修復作用が得られ、また、目標細胞を損傷組織細胞の部位に注入しても、修復作用が得られるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨髄幹細胞（ｎａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）と臍帯血幹細胞（ｃｏｒｅ  ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、主な、幹細胞を取得する２種類のソースである。このような幹細胞の取得量は、極めて少なく、また、異種に対して排他性を有するため、今において、臨床上の細胞治療の素材としてよく利用されている。その中、ＣＤ３４＋（ＣＤ３４陽性）の造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣ）が、一番応用され、それは、ヒトＣＤ３４抗体により分離された幹細胞である。しかしながら、ＣＤ３４＋の造血幹細胞は、一般の成人体内において、総数量が少なく、骨髄において、約１００，０００個の血液細胞から、１個のＣＤ３４＋造血幹細胞が収集され、取得できる幹細胞の数量が極めて少なく、また、異種に対して排他性を有するため、臨床上の応用は、大きく制限され、相対的に、成功率が低くなる。そのため、現在において、幹細胞（ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）を研究する者は、体外の細胞培養により、ＣＤ３４＋幹細胞を大量に増殖できる方法と経路を捜しているが、このような幹細胞も、異種に対して排他性を有する。上記の要因により、骨髄幹細胞の臨床応用上において、制限される欠点がある。
【０００３】
１９９０年から、臍帯血も、幹細胞研究者の視線を来す。それは、臍帯血に、骨髄より豊富のＣＤ３４＋幹細胞を有するためであり、また、骨髄のＣＤ３４＋幹細胞に比較して、臍帯血のＣＤ３４＋幹細胞が、より良い転化能力を持つ。そのため、近年、世界の国々において、将来の医学研究や臨床応用のソースとして、婦人生産後の臍帯血を保存するための臍帯血バンクを、陸続と設立する。しかしながら、骨髄より、臍帯血に、幹細胞が比較的に多いが、血液細胞に対する比例が、依然として低いため、体外培養により、十分の数量を取得して細胞医療用途に利用することが必要である。また、臍帯血の特別の冷凍保存に、普通の人が負担できない膨大なコストが必要とし、また、長期に保存過程において、細胞が、任意の温度変化により、死亡するから、不安定性が向上される。臍帯血幹細胞による治療の時、また、免疫学上の組織和合性（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）の問題を顧慮しなければならなく、即ち、排他性の問題を顧慮しなければならなく、そうでなければ、病者の体内免疫系により臍帯血幹細胞を排他して、治療の成功率が低減され、最悪の場合、治療が失敗する。組織和合性の一対組合せ実験に必要とするコストは、一般として、臍帯血幹細胞を保存するコストより高いから、組織和合性が同じ幹細胞を捜すことが、更に困難になる。
【０００４】
骨髄と臍帯血幹細胞は、医学と臨床応用において、下の問題点がある。（１）幹細胞は、骨髄と臍帯血の幹細胞の数量が多くないため、体外培養により、数量を増加する必要があるが、幹細胞の体外の自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）により良い培養環境や方法がない。（２）臍帯血バンクが、臍帯血を永久に保存できると断言するが、解凍後の幹細胞の生存率と再凍細胞の生存率が安定的ではなく、また、前記の説明した要因により、不安定的である。（３）骨髄幹細胞を取得するため、病者が骨髄穿刺による痛みを忍耐しなければならなく、また、過程においての麻酔によるリスクがある。（４）臍帯血幹細胞で治療する時、免疫学上の組織和合性の問題を顧慮して、病者の体内免疫系により排他作用を防止する必要がある。（５）１人にとって、臍帯血幹細胞の採集が、一生に１回のチャンスしかない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的の１は、少なくとも一つの単核細胞と少なくとも一つの蛋白質キナーゼＣ条件剤により、直接に単核細胞から変換される多機能型Ｐ幹細胞を提供する。
【０００６】
本発明目的の２は、Ｐ幹細胞と少なくとも一つの転化酵素により、当該Ｐ幹細胞から転化される例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等である目標細胞を提供する。
【０００７】
本発明目的の３は、Ｐ幹細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、当該Ｐ幹細胞が組織細胞に転化し、修復作用が得られるＰ幹細胞修復剤を提供する。
【０００８】
本発明目的の４は、少なくとも一つの目標細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、修復作用が得られる目標細胞修復剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、例えば、血液中の単核細胞である単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｔｅｄ）を完全に多機能型Ｐ幹細胞に変換する。単核細胞は、数量が少なくとも血液中の白血球細胞の１／１０である、例えば、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）であり、一般の正常人の周辺白血球細胞濃度が、１ミリリットルに約５，０００乃至１０，０００個であり、これで試算すると、単核細胞濃度が、周辺血液中において、少なくとも、１ミリリットルに約５００乃至１，０００個である。また、１００ミリリットルの周辺血液であれば、単核細胞の数量が、５０，０００乃至１００、０００個になる。本発明によれば、この５０，０００乃至１００、０００個の単核細胞を完全に多機能型Ｐ幹細胞に変換することができる。また、血液の採集量を制御するだけで、Ｐ幹細胞の取得量を制御できる。本発明の進歩性の１は、血液中の単核細胞を多機能型Ｐ幹細胞に変換し、これによる数量が、骨髄や臍帯血の幹細胞の千倍か万倍になり、場合によれば、もっと多くなり、骨髄や臍帯血の幹細胞は、それに比較できないものであり、本発明進歩性の２は、排他作用が完全になく、自体の細胞を自体に注入するため、排他作用を顧慮する必要が無く、例えば、骨髄や臍帯血の幹細胞については、免疫学上の組織和合性の排他作用を顧慮しなければならない。また、本発明において、単核細胞は、単一球状細胞核を有する細胞を指す。
【００１０】
本発明による最大の進歩性は、何時でも実験を繰り返すことができ、成功率が、ほぼ百パーセントであり、また、血液の取得が簡単で、例えば採血により、何時でも利用でき、そのため、冷凍保存の問題がない。臍帯血幹細胞の採集のように、一生に１回しかできず、また、骨髄幹細胞の採集のように、病者が骨髄穿刺による痛みを忍耐しなければならなく、また、過程においての麻酔によるリスクがあり、そして、長時間の冷凍保存が必要し、応用上のコストが高いだけでなく、幅広く適用することが因難である問題は、解決される。
【００１１】
本発明は、例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等の目標細胞に転化できるＰ幹細胞に関する。上記より、Ｐ幹細胞が、骨髄や臍帯血幹細胞と同じように原始細胞の最も重要な転化機能を有することが証明された。当該目標細胞は、損傷組織細胞に対して修復機能を持ち、例えば、軟骨細胞を損傷関節の軟骨の部位に接種することにより、損傷軟骨の修復や再建ができる。また、例えば、神経細胞を損傷神経の部位に接種することにより、直接に神経の修復に有利である。本発明に係わるＰ幹細胞は、生物の任意の細胞に転化でき、また、生物の任意の損傷組織細胞の修復に適用でき、例えば、肝組織細胞や脳組織細胞、神経細胞、軟骨組織細胞、脂肪細胞、眼球組織細胞、聴覚組織細胞、膵臓組織細胞、心臓組織細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、骨組織細胞、胆嚢組織細胞、血管組織細胞、腎臓組織細胞、骨髄組織細胞、肺臓組織細胞、毛嚢組織細胞、腸胃組織細胞、消化器系組織細胞或いは生殖器系組織細胞等であり、また、本発明は、自体細胞を注入するため、排他性や他の副作用がない。
【００１２】
本発明は、直接にＰ幹細胞を損傷組織細胞の部位に接種することにより、直接に損傷組織細胞を修復や再建できる組織細胞修復剤を提供する。例えば、Ａ病者のＰ幹細胞をＡ病者の損傷心筋の組織細胞の部位に接種することにより、Ｐ幹細胞が直接に心筋細胞に転化し、直接に修復や再建の目的を達成でき、骨髄や臍帯血幹細胞の治療史上において、既に成功の事例があり、例えば、幹細胞を骨髄に注入することにより、白血病を治療でき、病者の造血機能が正常に戻り、また、例えば、心筋梗塞の病者であれば、幹細胞を直接に損傷心筋の部位に注入し、心筋の機能が回復や改善でき、以上の事例は、ニュースや新聞雑誌或いはネットワークにより報道されている。肝機能不全や腎機能不全についても、同じの効果が得られる。Ｐ幹細胞により、生物の任意の損傷組織細胞を修復や再建できる。例えば、肝組織細胞や脳組織細胞、眼球組織細胞、聴覚組織細胞、膵臓組織細胞、心臓組織細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、骨組織細胞、胆嚢組織細胞、神経細胞、軟骨組織細胞、血管組織細胞、脂肪細胞、腎臓組織細胞、骨髄組織細胞、肺臓組織細胞、毛嚢組織細胞、腸胃組織細胞、消化器系組織細胞及び生殖器系組織細胞等であり、本発明は、自体細胞を注入するため、排他性や副作用がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施例１
Ｐ幹細胞の調製
ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）抗凝固剤を含有する無菌真空採血管や無菌採血注射器により、２０ｍｌの血液を採集する。蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＦＩＴＣ）を利用して、採集した血液中の例えば単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）である単核細胞を分離し、また、流動細胞計測器（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により単核細胞を単独に分離して無菌試験管に収集し、そして、分離された単核細胞を、１０％のＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ  ＵＳＡ）を含有する培養基の中に注入する。
【００１４】
実施例１の具体例１
例えばＧｏ６９７６である蛋白質キナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ）抑制条件剤を、培養液の中においての濃度が０.１−１０mＭになるように、細胞培養液に添加し、３０分の作用後、培養液の中においての濃度が５−１５mＭになるように、例えばｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１である蛋白質キナーゼＣ活性化条件剤を添加する。そして、３７℃の５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１５−２１日に細胞を培養する。培養基において、単核細胞が直接にＰ幹細胞に転化し、その転化率が、約百パーセントである。
【００１５】
実施例１の具体例２
そして、具体的の実施例１を説明し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と間質細胞由来因子（ＳＤＦ、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ）を細胞培養液に添加し、濃度を１００−１，０００Ｕ／ｍｌと１０−１００ｎＭに維持し、そして、細胞を３７℃、５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３−７日に培養する。培養基において、ＣＤ１４＋単核細胞が直接にＰ幹細胞に転化し、その転化率がほぼ百パーセントである。
【００１６】
実施例１の具体例３
培養皿に一層のコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）やフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）を固定し、１０％のＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ  ＵＳＡ）を含有する培養基を培養皿に添加する。また、分離された単核細胞を培養皿に注入する。そして、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で７−１４日に培養する。培養基において、ＣＤ１４＋単核細胞が直接にＰ幹細胞に転化する。
【００１７】
また、本実施例において、単核細胞を分離する方法は、ヒトＣＤ１４抗体を連結する磁性ビードにより分離し、磁性細胞選別器（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｏｒ）単核細胞を収集するのが、公知の方法である。本実施例において、単核細胞のソースは、血液検体に限らない。その結果は、図（１）のようである。Ｐ幹細胞を、無菌生理食塩水で、少なくとも３回清浄し、最後に、１０００回転の遠心速度で１０分により上清液を除去して、濃縮したＰ幹細胞を無菌注射器内に収集し、これにより、直接に損傷組織細胞の部位に注射して、修復することに供されることができる。本実施例において、蛋白質キナーゼＣ条件剤は、Ｇｏ６９７６やｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＤＦ、コラーゲン、フィブロネクチン或いるその組合わせる物だけでなく、蛋白質キナーゼＣの活性を抑制できる物質や活性化蛋白質キナーゼＣの物質或いは同じ効果を有するものとその組合わせる者であればよい。
【００１８】
実施例２
蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体でＰ幹細胞を測定し、流動細胞計測器（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による測定結果は、Ｐ幹細胞がＣＤ１４陽性反応（ＣＤ１４＋）を示す。０.５ｍｌのＰ幹細胞懸濁液を試験管に入れ込み、そして、１０μｌの蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＦＩＴＣ）を添加し、そして、４℃に３０分置いてから、遠心機で１０分（１０００回転）処理して、上清液を除去し、そして、生理食塩水で、３回清浄し、また、５ｍｌの生理食塩水を添加してＰ幹細胞と均一に混合し、そして、遠心機で１０分（１０００回転）処理して、上清液を除去し、清浄ステップを３回繰り返し、最後に清浄されたＰ幹細胞を直接に流動細胞計測器（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）により蛍光測定し、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＦＩＴＣとＰ幹細胞が結合すれば、蛍光陽性反応を示し、逆に、陰性反応を示し、本実施例２の測定結果は、陽性反応である。流動細胞計測器による測定する測定方法は、公知的である。
【００１９】
実施例３
Ｐ幹細胞を骨細胞培養基（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、当該骨培養基は、骨細胞転化酵素を含有する低ブドウ糖ＤＭＥＭ培養基（ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉａ）、Ｇｉｂｃｏ）で、例えば、１００ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと１０ｍＭのb−グリセロリン酸（b−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び１００mｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）等を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで１４日に培養すると、Ｐ幹細胞が直接に骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ、ＯＢ）に転化する。
【００２０】
実施例４
骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ、ＯＢ）の鑑定
Ａｌｉｚａｒｉｎ化学染色法と細胞内アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）は、それぞれ、一般の骨細胞の鑑定方法で、公知的である。図２（Ａ）は、Ａｌｉｚａｒｉｎ化学染色法により測定した細胞間のカルシウムイオンの堆積状態（赤い領域で、２００倍拡大である）。図２（Ｂ）は、細胞内アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）の測定結果である。Ｐ幹細胞（対比基準細胞として）と骨細胞を、それぞれ、等量細胞の懸濁液を作り、そして、細胞を粉砕してから、それぞれの比色管に１ｍｌの細胞懸濁液を添加し、そして、それぞれの比色管に更に０.３ｍｌのアルカリホスファターゼである比色剤ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、そして、１５分放置すると、直ちに、４０５ｎｍ（波長）で各比色管の吸光度を比色測定し、比色剤ｐＮＰＰとアルカリホスファターゼが作用すると、黄色い変化が発生し、アルカリホスファターゼの含量が多ければ、黄色いが濃くなる。図2Ｂは、測定結果であり、骨細胞内アルカリホスファターゼの活性／濃度が、Ｐ幹細胞の約６倍に高くなる。
【００２１】
実施例５
Ｐ幹細胞を軟骨細胞培養基（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、軟骨細胞培養基は、軟骨細胞転化酵素を含有するｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭで、例えば、１００ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング成長因子−b１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ１、ＴＧＦ−b１）を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで２１日に培養すると、Ｐ幹細胞が直接に軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に転化する。
【００２２】
実施例６
軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）の鑑定
図２Ｃは、顕微鏡で観察した結果であり、殆どの細胞が、典型的な軟骨細胞の形態である多角形（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）を有する。図２Ｄは、更に、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏの組織染色法で軟骨細胞の中の粘液質（Ｍｕｃｉｎ）（赤い部分）の生成を鑑定し、公知的である基本鑑定方法である。
【００２３】
実施例７
Ｐ幹細胞を神経細胞培養基（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、神経細胞培養基は、神経細胞転化酵素を含有するa−最低基礎培養基（a−ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ））で、例えば、５０mＭのメルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と１mＭのレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、０.５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１％のＮ２補助剤（１％のＮ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）及び２％のＢ２７補助剤（２％のＢ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで１４日に培養すると、Ｐ幹細胞が直接に神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ  Ｃｅｌｌ）に転化する。
【００２４】
実施例８
神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ  Ｃｅｌｌ）の鑑定
神経細胞が専有する２種類の蛋白であるＧＡＤ（ｇｌｕｔａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とＮｅｓｔｉｎを測定し、公知的である基本鑑定方法である。蛍光を含有する抗ＧＡＤ抗体と蛍光を含有する抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体で、更に免疫蛍光細胞を染色し、ＧＡＤとＮｅｓｔｉｎとが、陽性蛍光反応である。図２Ｅと図２Ｆを参照する。
【００２５】
また、Ｐ幹細胞が、他の目標細胞に転化することができ、例えば、骨格筋細胞や心筋細胞、腎臓細胞、肺臓細胞或いは肝臟細胞等である。
【００２６】
例えば、Ｐ幹細胞を骨格筋細胞培養基（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、骨格筋細胞培養基は、骨格筋細胞転化酵素を含有するＤＭＥＭで、例えば、１０mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）をＣＯ２培養器に入れ込んで２４時間に培養して、また、細胞培養基を新鮮のＤＭＥＭに入れ替えてから、細胞を７乃至１１日に培養し、Ｐ幹細胞が直接に骨格筋細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ）に転化する。
【００２７】
例えば、Ｐ幹細胞を心筋細胞培養基（ｃａｒｄｉｏｍｙｃｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、心筋細胞培養基は、心筋細胞転化酵素を含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で、例えば、３mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２４時間に培養して、また、細胞培養基を新鮮のＩＭＤＭに入れ替えてから、細胞を５乃至７日に培養する。この時、３mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を含有するＩＭＤＭである心筋細胞培養基により細胞を２４時間に処理して、細胞を新鮮のＩＭＤＭで７乃至１４日に培養することにより、Ｐ幹細胞が直接に心筋細胞（ｃａｒｄｉｍｙｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌ）に転化する。
【００２８】
例えば、Ｐ幹細胞を第１型コラーゲンコーティング（coating）の培養皿に入れ込み、また、培養皿に、予めに腎臓細胞培養基が入れ込まれておられ、腎臓細胞転化培養基は、腎臓細胞転化酵素を含有するＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｉｍｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）培養基で、例えば、１０ｎｇ／ｍｌの白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））を、ＣＯ２培養器に入れ込んで３乃至４週間に培養し、また、３乃至５日に置きに、新鮮の１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを含有するＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍ培養基に入れ替えることにより、Ｐ幹細胞が直接に腎臓細胞（ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ）に転化する。
【００２９】
例えば、Ｐ幹細胞を肺臓細胞培養基に入れ込み、肺臓細胞培養基は、肺臓細胞転化酵素を含有するＤＭＥＭで、例えば、１０mg／ｍｌのインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）と１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１、ＦＧＦ−１）、２００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、５０ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−７（ＦＧＦ−７）、８００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−９（ＦＧＦ−９）、１，０００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び１，０００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１８（ＦＧＦ−１８）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２乃至３週間に培養し、また、３乃至５日に置きに肺臓細胞転化酵素を有する新鮮のＤＭＥＭに入れ替えることにより、Ｐ幹細胞が直接に肺臓細胞（ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ）に転化する。
【００３０】
例えば、Ｐ幹細胞を肝臟細胞培養基（Ｈｅｐａｔｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、肝臟細胞培養基は、肝臟細胞転化酵素を含有するｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ＤＭＥＭで、例えば、５０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）と１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２乃至３週間に培養し、また、３乃至５日に置きに新鮮の肺臓細胞転化酵素を含有するｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ＤＭＥＭに入れ替えることにより、Ｐ幹細胞が直接に肝臟細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に転化する。
【００３１】
例えば、Ｐ幹細胞を脂肪細胞分化培養基に入れ込み、脂肪細胞分化培養基は、１０％のウシ血清を含有し、そして、脂肪細胞転化酵素−１μＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと０.５ｍＭのｍｅｔｈｙｌ−ｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｉｎｅ、１０μｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎ及び１００ｍＭのｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭで、それをＣＯ２培養器に入れ込んで７２時間に培養し、そして、培養基を、１０％のウシ血清を含有し、そして、脂肪細胞転化酵素−１０μｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎを含有するＤＭＥＭに入れ替えて、そして、ＣＯ２培養器に入れ込んで６−１０日に培養することにより、Ｐ幹細胞が直接に脂肪細胞に転化する。
【００３２】
Ｐ幹細胞は、多機能性の転化能力を有するため、様々の目標細胞に転化でき、Ｐ幹細胞が存在した場合、異なる培養基や転化酵素を使用すれば、異なる目標細胞に転化でき、例えば、腎細胞培養基や心筋細胞培養基等である。例えば実施例３と５及び７のような転化された細胞である目標細胞は、少なくとも、無菌生理食塩水で３回清浄し、１０００回転の遠心速度で１０分に処理して、上清液を除去し、当該濃縮された目標細胞を無菌注射器内に収集してから、直接に自体の損傷組織細胞の部位に注射することにより、修復することができる。
【００３３】
実施例９
単核細胞の蛋白質キナーゼＣの鑑定
実施例１のような単核細胞を、Ｇｏ６９７６とＢｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１に入れ込んでから、０時間と０.２５時間、０.５時間、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間に、それぞれ、サンプリングして、培養基の単核細胞の蛋白質キナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ）の変化を測定する。図１は、０時間の時、単核細胞の蛋白質キナーゼＣの電気泳動の変化図で、結果として、単核細胞の細胞質に、aとbＩ、bII、g、i／l及びzである６種類のハイポタイプの蛋白質キナーゼＣが含有され、図３において、Ｍoが単核細胞の蛋白質で、ｐｃが蛋白質キナーゼＣである陽性対照組である。単核細胞を粉砕して、直接に粉砕した後の１μｌの溶液について、蛋白質電気泳動を３０分に分析し、それをＮＣ  ｐａｐｅｒに転写してから、ウシ血清によりＮＣ  ｐａｐｅｒのブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、また、抗蛋白質キナーゼＣの各ハイポタイプの抗体（冷光を結合済み）で、ＮＣ  ｐａｐｅｒ上に蛋白質キナーゼＣがあるかどうか測定し、例えば抗蛋白質キナーゼＣのa抗体に結合された冷光が、ＮＣ  ｐａｐｅｒ上に転写された蛋白質キナーゼＣのaに結合し、最後に、清水でＮＣ  ｐａｐｅｒを３回清浄して、フィルム露光により結果が手に入れられる。図３は、その結果である。
【００３４】
図４は、０時間と０.２５時間、０.５時間、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間に、単核細胞の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）と細胞膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）においての蛋白質キナーゼＣの電気泳動の変化図であり、任意のハイポタイプの蛋白質キナーゼＣが活性化された後、一部の細胞質が細胞膜に転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）し、また、同時に濃度の変化が見られる。ｍＰＫＣは、細胞膜の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定し、ｃＰＫＣは、細胞質の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定する。図４から分かるように、蛋白質キナーゼＣのbIIだけが活性化される。単核細胞の蛋白質キナーゼＣのbIIが活性化されれば、単核細胞をＰ幹細胞に変換することができる。単核細胞の蛋白質キナーゼＣのbIIが活性化された任意の物は、蛋白質キナーゼＣのbIIの活性化条件剤になり、当該蛋白質キナーゼＣのbIIの活性化条件剤は、単一の物質や複合の物質である。図３の実験方法により、粉砕された単核細胞を高速に遠心し、上清液について、細胞質の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定し、沈殿した細胞屑について、細胞膜の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】２００倍顕微鏡拡大の単球写真
【図１Ｂ】２００倍顕微鏡拡大のＰ幹細胞写真
【図２Ａ】骨細胞のＡｌｉｚａｒｉｎ染色結果の２００倍顕微鏡拡大写真
【図２Ｂ】骨細胞内のアルカリホスファターゼの測定値棒図
【図２Ｃ】４００倍顕微鏡拡大の多角形態の軟骨細胞写真
【図２Ｄ】４００倍顕微鏡拡大の染色後の軟骨細胞写真で、粘液質（Ｍｕｃｉｎ）が赤い。
【図２Ｅ】４００倍顕微鏡拡大の神経細胞写真で、ＧＡＤ蛋白が蛍光陽性反応である。
【図２Ｆ】４００倍顕微鏡拡大の神経細胞写真で、Ｎｅｓｔｉｎ蛋白が蛍光陽性反応である。
【図３】蛋白質キナーゼＣの電気泳動測定
【図４】２４時間の蛋白質キナーゼＣの電気泳動測定
【図１Ａ】
2006333866.tif 000002
【図１Ｂ】
2006333866.tif 000003
【図２Ａ】
2006333866.tif 000004
【図２Ｂ】
2006333866.tif 000005
【図２Ｃ】
2006333866.tif 000006
【図２Ｄ】
2006333866.tif 000007
【図２Ｅ】
2006333866.tif 000008
【図２Ｆ】
2006333866.tif 000009
【図３】
2006333866.tif 000010
【図４】
2006333866.tif 000011
【外国語明細書】
Background of the
invention
The invention relates to a method for the enriched induction of multipotent stem cells, named P-stem cells, from CD14+
peripheral monocytic cells. P-stem cells are capable
of differentiating into osteoblasts, chondrocytes, neuron cells, etc. Also disclosed relates to
a method for tissue repairing by in vivo implanting P-stem cells into damaged
tissues. 
Prior
art
Recently, stem cells used in clinical cell therapies were mainly
collected from bone marrow and core blood. However, the content of those stem
cells in whole blood cells is rare and allogenic
transplantation of which usually generates the host immune rejection. 
CD34+ hematopoitic
stem cells are isolated by CD34 antibody from bone marrow and extensively
applied for cell therapies in current clinic. However, the rare proportion of
CD34+ hematopoitic stem cells in whole
blood cells (〜 1/100,000) and the allogenic rejection
of transplantation lead to the limitation of their application in the clinic. Although
researches in this field were attempting to develop the method to efficiently
manipulate the proliferation of CD34+ hematopoitic
stem cells in the in vitro cultivation,
the allogenic rejection of transplantation is still
major issue and disadvantage of their application in the clinic.  
Since 1990, the isolation of stem cells from
core blood was become to be other way than bone marrow. The amount of stem
cells isolated from core blood is more than that of bone marrow. In addition,
the differentiating capacity of core blood-derived stem cells is greater than
bone marrow-derived stem cells. Therefore, Core Blood Bank was widely developed
on the earth to preserve core blood from newborns and offer the future stem
cell-related researches and clinical cell therapies. Although the amount of
stem cells isolated from core blood is more than that of bone marrow, the in vitro proliferation of core
blood-derived stem cells is still needed to obtain the sufficient amount for
clinical cell therapies. Furthermore, the particular preservation of core blood
in low temperature is very expensive, and blood cells intend to death when the
temperature of preservation is unstable. Besides, the histocompatibility
is another critical issue for the clinical cell therapy of core blood-derived
stem cells. This issue not only increases the cost of the therapy but also
decline the successful rate of transplantation. 
Several issues are concerned in the clinical cell therapies using bone
marrow- and core blood-derived stem cells. 1) The proportion of bone marrow-
and core blood- derived stem cells in whole blood are rare. Their in vitro cultivation is needed to obtain
the sufficient amount for clinical cell therapies. However, the efficient
induction of their proliferation is still not reported. 2) The long-term
preservation of core blood at low temperature was promised to be safety by Core
Blood Bank. However, the cell viability after thawing is still needed to further
estimation. 3) The donor is susceptible to the pain and anesthetic risk during
the bone marrow puncture to collect stem cells. 4) Rejection: The immunity of
recipient might reject the transplanted stem cells, which leads to decline in
the efficiency of transplantation. 5) The core blood collection is once a life
for everyone. 
Summary of the invention
The inventor offers a method to prepare autologous stem cells and provide a feasibility of those
cells in clinical application. 
The first object of this invention is to
provide P-stem cells. The fundamental is that one of monocytic
cell population treated with at least one of protein kinase
C (PKC) modulator to directly differentiate the monocytic
cells towards multipotent P-stem cells. 
The second object of this invention is to
offer a target cells. The fundamental is that P-stem cells treated with at
least one of differentiation factors to induce their differentiation into
target cells, such as chondrocytes, osteoblast, neuron cells, etc. 
The third object of this invention is to
offer a P-stem cell-based repairing agent. The fundamental is that the P-stem
cell-based repairing agent transplants to the lesion where P-stem cells
differentiate to become the target cell which consequently repair the
lesion.  
The fourth object of this invention is to
offer a target cell-based repairing agent. The fundamental is to directly
transplant at least one of the target cells to repair the lesion.
The invention is to fully differentiate mononucleated
cells, such as peripheral monocytes, into multipotent P-stem cells. The proportion of monocytes, one of so-called mononucleated
cells, is about 10% of total leukocytes. In the physiological condition, one milliliter
of peripheral blood contains 5,000 to 10,000 leukocytes or 500 to 1,000 monocytes at least. Furthermore, the 100 ml of peripheral
bloods should contain 50,000 to 100,000 monocytes. The
employment of this invention can promptly induce the differentiation of those
50,000 to 100,000 monocytes to become P-stem cells.
The first advance of this invention is to differentiate
peripheral monocytes towards P-stem cells. The amount
of peripheral monocyte-derived P-stem cells is more
than (1,000 to 10,000 folds) bone marrow- and core blood-derived stem cells.
The second advance of this invention is that the autologous
transplantation of P-stem cells dose not concern the immune rejection.
The reproducibility of P-stem cell
differentiation from peripheral monocytes and the
convenience of peripheral blood collection from veins are great advance of this
invention. Unlike collecting stem cells from bone marrow, the donor must take a
risk in the process of bone marrow puncture. The collection of peripheral blood
collection can be repeatable, but core blood collection is once a life of man. The
particular preservation (-180℃ liquid nitrogen) of bone marrow- and core
blood-derived stem cells cause rise in the cost of therapy, which may, in turn,
elevate the difficulty in their clinical application. 
This invention regarding P-stem cells is
capable of differentiating into target cells, such as chondrocytes,
osteoblasts, neuron cells, etc, suggests that P-stem
cells, similar to bone marrow- and core blood-derived stem cells, is a multipotent progenitor cells. Those P-stem cell-derived
target cells are able to directly repair the damaged tissues. For example, the
transplantation of P-stem cell-derived chondrocytes
into damaged joints might promptly replenish the amount of chondrocytes
and repair the damaged joints. Furthermore, the transplantation of P-stem
cell-derived neuron cells into the lesions might also provide efficient repair
of damaged neurons. 
In this invention, P-stem cells are able to
differentiate towards many cell (tissue) types of human, such as hepatocytes, brain cells, neuron cells, chondrocytes,
adipocytes, ophthalmic tissue, acoustic tissue,
pancreatic tissue, cardiocytes, myocytes,
keratinocytes, osteoblasts,
bile tissue, vascular tissue, renal tissue, bone marrow tissue, pulmonary
tissue, follicular tissue, gastric-intestine tissue, digestion tissue,
reproductive tissue, ect. Moreover, the autologous transplantation of P-stem cell-derived cells
(tissues) into recipients does not induce an immune rejection. 
This invention also provides a method of
P-stem cell-derived cell (tissue)-dependent tissue repairing to directly repair
and reconstruct the damaged tissue. For example, the cardiac tissue damage of
Patient A can be repaired by the autologous transplantation
of Patient A’s P-stem cells into the
damaged tissue where P-stem cells can promptly differentiate into cardiocytes. The cardiac failure will be readily recovered
after the P-stem cell-derived cardiocytes replenishing
the lost of original cardiocytes. The ideal has been
previously carried out by transplanting bone marrow- or core blood-derived stem
cells into damaged cardiac tissue. In accord with previous reports in the
transplantation of bone marrow- or core blood-derived stem cells, transplanting
P-stem cells into bone marrow can improve the hematopoiesis
of leukemia and transplanting P-stem cells into cardiac tissue can treat myocardial
infarction. The ideal is also feasible to treat hepatic and renal failures. P-stem
cells can be used to recover any tissue damages of patients. These tissues
includes hepatocytes, brain cells, neuron cells, chondrocytes, adipocytes, ophthalmic
tissue, acoustic tissue, pancreatic tissue, cardiocytes,
myocytes, keratinocytes, osteoblasts, bile tissue, vascular tissue, renal tissue,
bone marrow tissue, pulmonary tissue, follicular tissue, gastric-intestine
tissue, digestion tissue, reproductive tissue, ect.
Detailed description of preferred embodiments
Preparation of
P-stem cells
Human peripheral blood (20 ml) is
collected in the tube or syringe containing heparin, an anticoagulant. The
mononuclear blood cells, such as monocytes are
isolated by Flow-Cytometry using fluorescein-conjugated
CD14 antibody and then cultured in RPMI-1640 containing 10% fetal bovine serum.
Practice Example 1-1:
Protein kinase C (PKC) inhibitors, Go6976
for example, add to culture medium at a range of concentration 0.1 to 10 μM. Mononucleated cells are incubated with Go6976 for 30
minutes at 37℃. PKC activators, Bryostatin-1 for example, then add to the
culture at a range of concentration 1 to 100 nM. Cell
culture is performed at 37℃ with 5% CO2 for 15 to 21 days. Mononucleated cells will be fully differentiated into
P-stem cells.
Practice Example 1-2:
Mononucleated
cells are treated with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
(GM-CSF) (100 to 1,000 IU/ml) and stromal
cell-derived factor (SDF-1) (10 to 100 nM) for 3 to 7
days at 37℃ with 5% CO2. Mononucleated
cells will be fully differentiated into P-stem cells.
Practice Example 1-3:
Mononucleated
cells are seeded on collagen- or fibronectin-precoated
culture plate and cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine
serum for 7 to 14 days with 5% CO2. Mononucleated
cells will be fully differentiated into P-stem cells.
The magnetic particle-conjugated CD14 antibody is one of methods to
isolate mononucleated cells from peripheral blood
(See Figure 1). The mononucleated cells are not
limited in peripheral blood cells. For tissue repairing, P-stem cells can be resuspended in normal saline (0.85% NaCl)
and then transplanted into damaged tissues. In the above Practice Examples, PKC
modulator is not limited to be Go6976, Bryostatin-1, GM-CSF, SDF-1, collagen,
or fibronectin. Substances modulating PKC activity
are capable of inducing the generation of P-stem cells from their progenitor
cells.
Practice Example 2:
P-stem cells are identified as CD14 positive cells by Flow-Cytometry analysis with fluorescein-conjugated
CD14 antibody. Briefly, P-stem cell suspension (0.5 ml) is incubated with 10 μl of fluorescein-conjugated CD14 antibody for 30 minutes at 4℃.
After the incubation, P-stem cells are centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes,
washed with normal saline for 3 times, and then analyzed by Flow-Cytometry. 
Practice Example 3:
P-stem cells are cultured in osteogenic
medium [low-glucose DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium) containing osteogenic differentiating factor,
such as 100 nM
of dexamethasone, 10 mM of β-glycerophosphate, or 100 μg/ml of ascorbic acid.] for 14
days at 37℃ with 5% CO2. P-stem cells can fully differentiate into osteoblasts. 
Practice Example 4:
The identification of P-stem cell-derived osteoblasts
are usually performed by staining intracellular calcium deposition with alizarin
red and determining intracellular alkaline phosphatase
activity. Figure 2A shows intracellular calcium deposition of P-stem
cell-derived osteoblasts (red area, 200x magnification).
Figure 2B shows the intracellular alkaline phosphatase
activity of P-stem cell-derived osteoblasts. Briefly,
equal amount of P-stem cells and P-stem cell-derived osteoblasts
are lyzed in equal volume of lysis
buffer. Subsequently, 1-ml cell lysate of P-stem
cells or P-stem cell-derived osteoblasts is incubated
with 0.3 ml of alkaline phosphatase substrate, p-nitrophenyl phosphateis (pNPP), for 15 minutes. The yellow product generated by the
reaction of alkaline phosphatase and pNPP is read at 405 nm by spectrophotometer. As shown in
Figure 2B, the intracellular alkaline phosphatase
activity is 6-fold higher than that of P-stem cells (Figure 2B). 
Practice Example 5:
P-stem cells are cultured in chondrogenic
medium [low-glucose DMEM containing chondrogenic
differentiating factor, such as 100
nM of dexamethasone or 10 ng/ml of Transforming growth factor-beta1 (TGF-β1)] for 21
days at 37℃ with 5% CO2. P-stem cells can fully differentiate into chondrocytes. 
Practice Example 6:
Figure 2C shows the microscopic observation of chondrocytes.
The cultured chondrocytes exhibit a polygonal cell
type. Safranin O staining is usually used to stain
intracellular mucin of chondrocytes
(Figure 2D, red area).
Practice Example 7:
P-stem cells are cultured in neurogenic
medium [a-minimum essential medium (α-MEM)
containing neurogenic differentiating factor, such as
50 μM Mercaptoethanol, 1μM retinoic acid, 0.5 mM L-glutamine, 1% N2 supplement, and 2% B27 supplement]
for 14 days at 37℃ with 5% CO2. P-stem cells can fully differentiate
into neuron cells. 
Practice Example 8:
The immunostaining of glutaminic
acid decarboxylase (GAD) and nestin
is used to identify the generation of neuron cells. Figures 2E and 2F shows that
GAD and nestin are expressed in the cytoplasm of
P-stem cell-derived neuron cells. 
Besides, P-stem cells can differentiate into
skeletal myocyte, cardiomyocyte,
renal cell, pulmonary cell, hepatocyte, and adipocyte in the conditioned media. For example: 
1) culturing P-stem cells in skeletal myogenic medium (DMEM containing skeletal myogenic differentiating factor, 10 μM of 5-azacytidine)
for 7 to 11 days, P-stem cells can fully differentiate into skeletal myocytes; 
2) culturing P-stem cells in cardiomyogenic medium [Iscove's
Modified Dulbecco's Medium (IMDM) containing cardiomyogenic differentiating factor, 3 μM of 5-azacytidine)
for 7 to 14 days, P-stem cells can fully differentiate into cardiomyocytes;
3) culturing P-stem cells in type-1 collagen
pre-coated plate with renal cells induction medium [Embryo medium containing
renal cell differentiating factor, 10 ng/ml of
leukemia inhibitory factor (LIF)] for 21 to 28 days, P-stem cells can fully
differentiate into renal cells; 
4) culturing P-stem cells in pulmonary cell
induction medium [DMEM containing pulmonary cell differentiating factor, 10 μg/ml
of insulin, 100 ng/ml of Fibroblast Growth Factor-1
(FGF-1), 200 ng/ml of FGF-2, 50 ng/ml
of FGF-7, 800 ng/ml of FGF-9, 1,000 ng/ml of FGF-10, 1,000 ng/ml of
FGF-18] for 14 to 21 days, P-stem cells can fully differentiate into pulmonary
cells; 
5) culturing P-stem cells in hepatogenic medium [low glucose-DMEM containing hepatogenic differentiating factor, 50 ng/ml
of hepatocyte growth factor (HGF) and
100 ng/ml of FGF-4] for 14 to 21 days, P-stem cells
can fully differentiate into hepatocytes; 
6) culturing P-stem cells in adipogenic medium (DMEM containing 10% of fetal bovine
serum and adipogenic differentiating factor, 1 μM of dexamethasone, 0.5 mM of  methyl-isobutylxantine,
10 μg/ml of insulin, and 100 mM of indomethacin) for 72 hours and adipogenic
medium with 10 μg/ml of insulin for additional 6 to 10 days, P-stem cells can
fully differentiate into adipocytes. P-stem cells can
be differentiated into any cell types in suitable induction media. Then, P-stem
cell-derived target cells can repair the damaged tissue by directly
transplanting them into the lesion. 
Practice Example 9:
The constitutively expressed PKC isoforms
in mononucleated cells are detected by Western Blot
analysis with each PKC isoform-specific antibodies.
Figure 3 shows that mononucleated cells
constitutively expressed PKC isoforms α, β1, β2, γ, ι/λ,
and ζ. In the Figure 1, Mo and pc represents mononucleated
cell and PKC positive cell lysate, respectively. To
examine the specific activation of PKC isoform(s) in
the differentiation of P-stem cells, mononucleated
cells are pre-treated with Go6976 (1 μM) for 30 minutes at 37℃ and then
incubated with Bryostatin-1 (10 nM) at designated
time intervals. As shown in Figure 4, only PKCβ2 is activated and translocates from cytosol to
plasma membrane in the differentiation process of P-stem cells. Therefore, any
substances stimulating the activation of PKCβ2 are capable of inducing the
differentiation of P-stem cells.
Brief description of the drawing
Figure 1A: The microscopic observation of monocytes (200x magnification).
Figure 1B: The microscopic observation of
P-stem cells (200x magnification).
Figure 2A: The microscopic observation of
Alizarin-stained osteoblasts (200x magnification).
Figure 2B: The alkaline phosphatase
activity of osteoblasts
Figure 2C: The microscopic observation of polygonal
chondrocytes (400x magnification). 
Figure 2D: The microscopic observation of Safranin O-stained osteoblasts (400x
magnification).
Figure 2E: The fluorescence microscopic
observation of GAD-immunostained neuron cells (400x
magnification).
Figure 2F: The fluorescence microscopic
observation of nestin-immunostained neuron cells (400x
magnification).
Figure 3: The determination of
constitutively expressed PKC isoforms in monocytes by Western Blotting.
Figure 4: The analysis of PKCβ2
translocation in Go6976/Bryostatin-treated monocytes.  
What is claimed is:
1.   
A P-stem cell is generated from
one of mononucleated cells treated with protein kinase C (PKC) modulators.
2.   
A P-stem cell as claimed in
claim 1, wherein the PKC modulator is Go6976, Bryostatin-1, or the combination
of both.
3.   
A P-stem cell as claimed in
claim 1, wherein the PKC modulator is GM-CSF, SDF or the combination of both.
4.   
A P-stem cell as claimed in
claim 1, wherein the PKC modulator is collagen, fibronectin,
or the combination of both. 
5.   
A method of P-stem cell
generation comprising the mononucleated cells
differentiate into P-stem cells via activating intracellular PKCβ2.
6.   
A method of P-stem cell generation
as claimed in claim 5, wherein the PKCβ2 activator is Go6976, Bryostatin-1, or
the combination of both.
7.   
A method of P-stem cell generation
as claimed in claim 5, wherein the PKCβ2 activator is GM-CSF, SDF or the combination
of both.
8.   
A method of P-stem cell
generation as claimed in claim 5, wherein the PKCβ2 activator is collagen, fibronectin, or the combination of both.
9.   
A target cell is differentiated
from P-stem cells treated with differentiating factors and cultured in the
induction media.
10. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is osteoblast; the osteogenic medium
is low glucose-DMEM; the osteogenic differentiating
factors include dexamethasone, β-glycerophosphate,
ascorbic acid or other supplements. 
11. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is chondrocyte; the chondrogenic
medium is low glucose-DMEM; the chondrogenic
differentiating factors include dexamethasone, TGF-β1,
or other supplements.
12. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is
neuron cell; the neurongenic medium is α-MEM; the neurongenic differentiating factors include mercaptoethanol, retinoic acid, L-glutamine, N2 supplement,
B27 supplement, or other supplements.
13. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is cardiomyocyte; the cardiomyogenic
medium is IMDM; the cardiomyogenic differentiating
factors include 5-azacytidine or other supplements.
14. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is
renal cell; the renal cell induction medium is Embryo medium; the renal cell
differentiating factors include type-1 collagen, LIF or other supplements.
15. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is pulmonary
cell; the pulmonary cell induction medium is DMEM; the pulmonary cell
differentiating factors include insulin, FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-9, FGF-10,
FGF-18, or other supplements.
16. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is hepatocyte; the hepatogenic
medium is low glucose-DMEM; the hepatogenic
differentiating factors include HGF, FGF-4, or other supplements.
17. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is
skeletal myocyte; the skeletal myogenic
medium is DMEM; the skeletal myogenic differentiating
factors include 5-azacytidine or other supplements.
18. A target cell as claimed in claim 9, wherein the target cell is adipocyte; the adipogenic medium
is DMEM containing 10% of fetal bovine serum; the adipogenic
differentiating factors include dexamethasone,
methyl-isobutylxantine, insulin, indomethacin,
or other supplements.
19. A method of tissue repairing, comprising the tissue repairing by
transplanting P-stem cells into the damaged tissues.
20. A method of tissue repairing, comprising the tissue repairing by
transplanting target cells into the damaged tissue.
Abstract of the disclosure
The invention relates to a method for the enriched induction of multipotent stem cells, named P-stem cells, from CD14+
peripheral monocytic cells. P-stem cells are capable
of differentiating into osteoblasts, chondrocytes, neuron cells, etc. Also disclosed relates to
a method for tissue repairing by in vivo implanting P-stem cells into damaged
tissues. 
2006333866.tif 000012
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