(57)【要約】【課題】  正常型プリオンから異常型プリオンへの変化に必要と推測されるオクタリピートを含む正常型プリオン蛋白質(PrPc)のN末端23-89はグリシンに富み、安定な３次構造を構成しているとは考えられず、N末端23-89の部分のみを薬剤のターゲットとすることは困難である。プリオン病の診断、予防および治療に使用しうる、プリオン蛋白質に特異的に結合する分子を選択する際には、全長プリオン蛋白質を標的とする必要がある。【解決手段】  プリオン蛋白質を識別可能な核酸分子の同定および分離のための方法、ならびにこの方法により得られる核酸分子を記載する。さらに、プリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子を含む医薬組成物および診断用組成物、ならびに係る分子を用いる診断方法が記載される。【選択図】  図２
2006042645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオン蛋白質を識別可能な核酸分子の同定および／または分離するための方法であって、 
(i) プリオン蛋白質を、複数種の核酸分子と混合し；
(ii) 当該プリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；
(iii) 所望により、その分離された核酸分子を増幅後、工程 (i) および(ii) を反復し；
(iv) 分離された核酸分子の、プリオン蛋白質に対する結合特異性を決定する；
工程を含む方法。
【請求項２】
核酸分子がRNA分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プリオン蛋白質と特異的に結合するRNAアプタマー。
【請求項４】
以下の配列番号１または２に示される塩基配列を有する、30塩基長のランダム領域（NはA、C、GまたはU）をもつ複数種のRNA分子より、請求項１に記載の方法を使用して得られる、請求項３記載のRNAアプタマー。
5’-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号1)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号2)
【請求項５】
塩基配列5’-HGGH-3’ （HはA、CまたはU）を一分子中に４箇所以上含む、請求項３または４記載のRNAアプタマー。
【請求項６】
配列番号1および2で示される配列を有するRNA分子のランダム領域中に塩基配列5’-GGWGG-3’（WはAまたはU）を１箇所以上含む、請求項３〜５のいずれか１項記載のRNAアプタマー。
【請求項７】
下記の塩基配列
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
からなる群から選択される何れかの塩基配列からなることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項記載のRNAアプタマー。
【請求項８】
塩基配列中の１以上の塩基の2’-位の水酸基がヌクレアーゼ耐性基で置換された、請求項３〜７のいずれか１項記載のRNAアプタマー。
【請求項９】
塩基配列中の１以上の塩基Cおよび／またはUの2’-位の水酸基がフルオロ基で置換された、請求項３〜８のいずれか１項記載のRNAアプタマー。
【請求項１０】
5’-末端に機能性化合物が付加された、請求項３〜９のいずれか１項記載のRNAアプタマー。
【請求項１１】
機能性化合物がビオチンである、請求項１０記載のRNAアプタマー。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか１項記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の診断用組成物。
【請求項１３】
請求項３〜１１のいずれか１項記載のRNAアプタマーをサンプルと接触させることを含む、プリオン病の診断方法。
【請求項１４】
請求項３〜１１のいずれか１項記載のRNAアプタマーを用いてプリオン蛋白質を濃縮することを含む、プリオン病診断のための前処理方法。
【請求項１５】
請求項３〜１１のいずれか１項記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の治療及び／または予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオン蛋白質を標的とする核酸分子であって、特にマウスプリオン蛋白質を標的とするRNA分子に関する。本発明はさらに、該核酸分子を含むプリオン病の診断、予防または治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオンと呼ばれる蛋白質性感染性粒子は、羊のスクレイピー、ウシ海綿状脳症(BSE)、ミンクの伝達性ミンク脳症(TME)、ならびに人間の場合のクールー病、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)および致死的家族性不眠症(FFI) のような伝達性海綿状脳症(TSE) の原因物質であると考えられている(非特許文献１)。アミロイド様桿状体に付随するプリオン(非特許文献２−３) またはスクレイピーに付随する原線維（SAF）（非特許文献４）の主たる成分は、Ｎ末端切除された、プリオン蛋白質PrPSc（非特許文献５）の極めてプロテアーゼ耐性な種であるプリオン蛋白質PrP27-30であることが判明し(非特許文献６)、これはプリオン調製物中の小伸長物であることも見出されている(非特許文献２)。N末端の67アミノ酸を欠くPrP27-30は、プロテイナーゼＫ消化により(非特許文献３及び７)、またはリソソームプロテアーゼ消化により(非特許文献８)、PrPScから生成する。プリオン調製物中のPrPScおよびPrP27-30の分布は、プロテアーゼの存在または不在に応じて異なる。
【０００３】
解剖学的所見としては、正常型プリオン蛋白質(PrPc) は脳で高い発現が見られ、精巣、胎盤、心臓、肺で中程度の発現、脾臓、腎臓でわずかに検出される（非特許文献９）ことから、PrPcは脳において特に重要な役割を担っていると考えられるが、他の組織においてもなんらかの役割を果たしていると考えられる。
【０００４】
現在に至るまで、プリオン調製物中に特定の核酸は検出されておらず(非特許文献１０)、この事は、プリオン自体が感染性であり、核酸の不在下で複製できることを示唆している(非特許文献１)。蛋白質単独仮説(非特許文献１)によれば、外因性PrPSc／PrP27-30は、遍在する細胞イソ型PrPcのN末端をPrPSc／PrP27-30に変換することができると考えられている。このプロセスにはシャペロンが関与していると思われる(非特許文献１１)。PrPSc／PrP27-30は単量体として(非特許文献１)、またはPrPSc／PrP27-30オリゴマーから成る核形成体もしくは結晶の種として（非特許文献１２）現れ得る。
【０００５】
PrPcはその二次構造の点でのみPrP27-30と相違する：PrPcのαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ42%および3%である(非特許文献１３)。対照的に、PrP27-30のαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ21%および54%である(非特許文献１３)。これらの結果は、PrPcのPrPSc／PrP27-30への変換が、恐らくはプリオン蛋白質の二次構造の極端な変化を相伴うという事を示している。PrPcを発現しないノックアウトマウスを使用する一連の実験は、細胞プリオン蛋白質が幾つかの細胞プロセスで重要な役割を果たしていることを示唆してはいるが (非特許文献１４−１６)、PrPcの正確な生理学的役割は依然として推測の域を出ない。しかしながら、PrPcは伝達性海綿状脳症の進行に必要であることが判明している(非特許文献１７及び１８)。
【０００６】
スクレイピーに感染したシリアゴールデンハムスター由来のmRNAの翻訳は、NH2末端の22アミノ酸シグナルペプチドおよびカルボキシ末端の23アミノ酸シグナル配列を含む254アミノ酸蛋白質を導いた（非特許文献５及び１９）。成熟蛋白質PrPcおよびスクレイピーのイソ型PrPScは23ないし231のアミノ酸を含んでいる。PrPScのみが、142のアミノ酸から成るプロテイナーゼK耐性イソ型PrP27-30（アミノ酸90-231）へとプロセシングされ得る(非特許文献３)。
【０００７】
この性質を使用して、プリオン蛋白質に関連する疾病の診断検定が設計されているが、その場合、全PrPcを減成するためプローブをプロテイナーゼＫで処理し、次いでプリオン蛋白質に対する抗体と反応させる(非特許文献２０)。しかし、この検定は、PrPcのプロテイナーゼＫ消化が不完全であり、故に偽陽性結果が導かれるという事実により、感受性が障害され得るという不利な面がある。さらに、プロテイナーゼＫ消化という余分な工程は時間を消費する。
【０００８】
これまでに判明しているPrPcの生体内での機能としては、二価の銅イオンと結合すること（非特許文献２１）、およびこれによりスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性を有すること(非特許文献２２)、造血系細胞分化により発現制御を受けていること(非特許文献２３及び２４)、精細管の精子細胞に発現するPrPcのホモログであるDpl蛋白質と相互作用し、精子形成に関与していること(非特許文献２５)、およびシグナル伝達系に関与していること(非特許文献２６)などが挙げられる。特に、PrPcのN末端側にあるオクタリピート領域は、SOD活性に必須であること(非特許文献２２)および、オクタリピート領域を欠損したPrPcを過剰発現させたノックアウトマウスを作成すると行動異常を起こし、神経細胞の脱落が見られる(非特許文献２６)ことから、PrPcのN末端側もまた重要であると考えられる。また、PrPcのN末端を欠損したマウスはプリオン病を発症しない(非特許文献２７)ことから、PrPcのN末端はPrPscへの構造変化に関与していると考えられる。
【０００９】
【非特許文献１】プルシナー（Prusiner）ら, 「サイエンス（Science）」 （米国） 1982年, 216巻, p.136-144
【非特許文献２】プルシナー（Prusiner）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1983年, 35巻, p.349-358
【非特許文献３】プルシナー（Prusiner）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1984年, 38巻, p.127-134
【非特許文献４】ホープ（Hope）ら, 「ザ  エンボ  ジャーナル（The EMBO Journal）」 （英国） 1986年, 10巻, p.2591-2597
【非特許文献５】エシュ（Oesch）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1985年, 40巻, p.735-746
【非特許文献６】プルシナー（Prusiner）ら, 「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」 （米国） 1981年, 78巻, p.6675-6679
【非特許文献７】スタール（Stahl）ら, 「バイオケミストリー（Biochemistry）」 （米国） 1993年, 32巻, p.1991-2002
【非特許文献８】コーフィー（Caughey）ら, 「ジャーナル  オブ  ビロロジー（Journal of virology）」 （米国） 1991年, 65巻, p.6597-6603
【非特許文献９】サエキ（Saeki）ら, 「バイラス  ジーンズ（Virus Genes）」, （米国） 1996年, 12巻, p.15-20
【非特許文献１０】ケリングス（Kellings）ら, 「ザ  ジャーナル  オブ  ゼネラル  ビロロジー（The Journal of general virology）」 （英国） 1992年, 73巻, p.1025-1029
【非特許文献１１】エデンホーファー（Edenhofer）ら, 「ジャーナル  オブ  ビロロジー（Journal of virology）」 （米国） 1996年, 70巻, p.4724-4728
【非特許文献１２】ランスベリー（Lansbury）ら, 「ケミストリー  アンド  バイオロジー（Chemistry & Biology）」 （英国） 1995年, 2巻, p.1-5
【非特許文献１３】パン（Pan）ら, 「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」 （米国） 1993年, 90巻, p.10962-10966
【非特許文献１４】コリンゲ（Collinge）ら, 「ネイチャー（Nature）」 （英国） 1994年, 370巻, p.295-297
【非特許文献１５】サカグチ（Sakaguchi）ら, 「ネイチャー（Nature）」 （英国） 1996年, 380巻, p.528-531
【非特許文献１６】トブラー（Tobler）ら, 「ネイチャー（Nature）」 （英国） 1996年, 380巻, p.639-642
【非特許文献１７】ブエラー（Bueler）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1993年, 73巻, p.1339-1347
【非特許文献１８】ブランドナー（Brandner）ら, 「ネイチャー（Nature）」 （英国） 1996年, 379巻, p.339-343
【非特許文献１９】バスラー（Basler）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1986年, 46巻, p.417-428
【非特許文献２０】グロスカップ（Groschup）ら, 「アーカイブズ  オブ  ビロロジー（Archives of virology）」 （オーストリア） 1994年, 136巻, p.423-431
【非特許文献２１】ブラウン（Brown）ら, 「ネイチャー（Nature）」 （英国） 1997年, 390巻, p.684-687
【非特許文献２２】ブラウン（Brown）ら, 「ザ  バイオケミカル  ジャーナル（The Biochemical journal）」 （英国） 1999年, 344巻, p.1-5
【非特許文献２３】リウ（Liu）ら, 「ジャーナル  オブ  イミュノロジー（Journal of immunology）」 （米国） 2001年, 166巻, p.3733-3742
【非特許文献２４】クボサキ（Kubosaki）ら, 「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Biochemical and biophysical research communications）」 （米国） 2001年, 282巻, p.103-107
【非特許文献２５】ロシ（Rossi）ら, 「ザ  エンボ  ジャーナル（The EMBO Journal）」 （英国） 2001年, 20巻, p.694-702
【非特許文献２６】シュメルリング（Shmerling）ら, 「セル（Cell）」 （米国） 1998年, 93巻, p.203-214
【非特許文献２７】ワイスマン（Weissmann）ら, 「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（The Journal of biological chemistry）」 （米国） 1999年, 274巻, p.3-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
正常型プリオンから異常型プリオンへの変化に必要と推測されるオクタリピートを含むPrPcのN末端23-89はグリシンに富むゆえに、安定な３次構造を構成しているとは考えられないため、PrPcのN末端23-89の部分のみを薬剤のターゲットとすることは困難だと考えられる。
【００１１】
従って、プリオン病の診断、予防および治療に使用しうる、プリオン蛋白質に特異的に結合する分子を選択する際には、PrP27-30およびそれに関連したプリオン蛋白質のアミノ酸90番目以降の断片、またはN末端側23-89ではなく、全長プリオン蛋白質を標的とする必要がある。
【００１２】
本発明者らは、マウスプリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子、特に全長マウス正常型プリオン蛋白質を標的とするRNAアプタマーを作製することができないかと考え、これを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述した目的を達成するため、鋭意研究を行った結果、全長マウス正常型プリオン蛋白質に対するRNAアプタマーを見い出し、本発明を関するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）を包含する。
（１）  プリオン蛋白質を識別可能な核酸分子の同定および／または分離するための方法であって、 
(i) プリオン蛋白質を、複数種の核酸分子と混合し；
(ii) 当該プリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；
(iii) 所望により、その分離された核酸分子を増幅後、工程 (i) および(ii) を反復し；
(iv) 分離された核酸分子の、プリオン蛋白質に対する結合特異性を決定する；
工程を含む方法。
【００１５】
（２）  上記核酸分子がRNA分子である、上記（１）記載の方法。
（３）  プリオン蛋白質と特異的に結合するRNAアプタマー。
（４）  以下の配列番号１または２に示される塩基配列を有する、30塩基長のランダム領域（NはA、C、GまたはU）をもつ複数種のRNA分子より、上記（１）に記載の方法を使用して得られる、上記（３）記載のRNAアプタマー。
5’-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号1)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号2)
【００１６】
（５）  塩基配列5’-HGGH-3’ （HはA、CまたはU）を一分子中に４箇所以上含む、上記（３）または（４）記載のRNAアプタマー。
（６）  配列番号1および2で示される配列を有するRNA分子のランダム領域中に塩基配列5’-GGWGG-3’（WはAまたはU）を１箇所以上含む、上記（３）〜（５）のいずれか記載のRNAアプタマー。
【００１７】
（７）  下記の塩基配列
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
からなる群から選択される何れかの塩基配列からなることを特徴とする、上記（３）〜（６）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（８）  塩基配列中の１以上の塩基の2’-位の水酸基がヌクレアーゼ耐性基で置換された、上記（３）〜（７）のいずれか記載のRNAアプタマー。
【００１８】
（９）  塩基配列中の１以上の塩基Cおよび／またはUの2’-位の水酸基がフルオロ基で置換された、上記（３）〜（８）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（１０）  5’-末端に機能性化合物が付加された、上記（３）〜（９）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（１１）  機能性化合物がビオチンである、上記（１０）記載のRNAアプタマー。
【００１９】
（１２）  上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の診断用組成物。
（１３）  上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーをサンプルと接触させることを含む、プリオン病の診断方法。
（１４）  上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを用いてプリオン蛋白質を濃縮することを含む、プリオン病診断のための前処理方法。
（１５）  上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の治療及び／または予防のための医薬組成物。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に関わるRNAアプタマーは、プリオン蛋白質に特異的に結合する新規の機能性核酸分子である。すなわち、本発明に関わるRNAアプタマーは、プリオン病の診断方法への応用や、プリオン病の発症予防やプリオン病発症後の治療に使用可能であり、診断成績、治療成績の向上が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を、図面を用いて詳細に説明する。先ず、本明細書で説明する用語の定義は以下の通りである。
【００２２】
「アプタマー」とは、アミノ酸のような小分子から、タンパク質及びウイルスのような高分子に至る種々の分子に対して特異的に認識して結合することができる核酸分子を意味し、特に本発明ではプリオン蛋白質に直接結合することが可能な機能性RNA分子をいう。アプタマーは、インビトロ選択法によって得ることができる。
【００２３】
「インビトロ選択法」とは、ランダム化された核酸分子の大きな集団から、定められた標的分子と結合する核酸分子(RNA、修飾されたRNA、ssDNAまたはdsDNA)を選択し、増幅するサイクルを繰り返すことによって、より標的分子と高い親和性で結合する核酸分子 を選別する方法である(Tuerkら, Science.; 249 (4968):505-10, 1990；Famulokら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31、979-988, 1992)。すなわち、最初はごく僅かしかないそのような分子もPCR法で増幅され、結合の弱い分子はサイクルをくり返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残る。
【００２４】
この方法を使用して、HIV-1逆転写酵素(Tuerkら, 1992)、HIV-1インテグラーゼ(Allenら, Virology, 209, 327-336, 1995)、ヒトα-トロンビン(Kubikら, Nucleic Acids Res.22, 2619-2626, 1994)、ショウジョウバエの性致死蛋白質（Sakashitaら, Nucleic Acids. Res. 22, 4082-4086, 1994）およびC型肝炎ゲノム由来のプロテアーゼ(Fukudaら, Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000) を包含する様々な標的蛋白質を特異的に認識する核酸の分離が報告されている。
【００２５】
「正常型プリオン蛋白質(PrPc)」とは、供給源となった生物の如何に拘わらず、このプリオン蛋白質の細胞イソ型ならびにそのフラグメントおよび誘導体を含む。本明細書において、特に「mPrPc」と表記した場合は、マウス由来の組換えPrP23-231を表す。
【００２６】
「ヌクレアーゼ耐性修飾」とは、任意のRNA分子中の2’-位の水酸基を、化学合成または酵素反応によりフルオロ基、メトキシ基などの任意のヌクレアーゼ耐性基に置換することを言う。本発明において、ヌクレアーゼ耐性修飾とは、特にピリミジンヌクレオシドの2’-F修飾をいう。
【００２７】
「末端ビオチン化」とは、任意の核酸の5’-末端および／または3’-末端にビオチンを合成または酵素反応により付加することをいう。本発明では特に、5’-末端のビオチン化をいう。
【００２８】
マウスプリオン蛋白質に対するRNAアプタマーのインビトロ選択
本発明の基礎となるインビトロ選択法について説明する。本発明は、以下の工程：
(i) プリオン蛋白質を、複数種の核酸分子と混合し；
(ii) 当該プリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；
(iii) 所望により、その分離された核酸分子を増幅後、工程 (i) および(ii) を反復し；
(iv) 分離された核酸分子の、プリオン蛋白質に対する結合特異性を決定する；
を含む方法に関する。
【００２９】
本発明では、核酸分子として、一本鎖または二本鎖核酸分子、例えばRNA、修飾されたRNA、一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAを使用することが可能である。特に、本発明においては一本鎖RNAを表す。
【００３０】
好ましい態様において、上記の方法で用いられる核酸分子はRNAである。
【００３１】
プリオン蛋白質と特異的に結合する核酸分子が選択される元である出発物質を構成する複数種の核酸分子は、種々の配列を有する核酸分子の混合物のプールとすることが好ましい。このプールは核酸分子の任意の混合物であってよいが、好ましくはランダム化された分子のプールである。好ましくはこのプールの核酸分子は化学合成され、またはインビトロ転写により生成される。ここで複数種とは、1012〜1072（420〜4120）種類、好ましくは1018〜1036（430〜460）種類である。
【００３２】
RNA分子の場合、プリオン蛋白質のイソ型の一つと特異的に結合する分子についてスクリーニングされるRNAプールは、好ましくは菊池ら(J Biochem (Tokyo), 133(3), 263-270, 2003)および／または福田ら(Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000)において記載されるRNAプールである。このプールは、30の位置でランダム化された60および74ヌクレオチドのRNA分子から成り、対応するDNA配列の転写から生成される。これらのRNAプールは、およそ1 x 1018の異なる配列のRNA分子を含んでいる。本発明においては、上記方法を適宜改変することができ、例えばランダム化された配列は20〜60塩基長とすることができ、それに応じてプールを構成するRNA分子の種類は1012〜1036の範囲であり得る。
【００３３】
本発明に係る方法は、哺乳動物における種々のプリオン病、例えば羊のスクレイピー、子牛のウシ海綿状脳症(BSE)、ミンクの伝達性ミンク脳症(TME)、人間の場合のクールー病、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ラバ、シカおよびエルクの慢性消耗病(CWD)またはネコのネコ海綿状脳症(FSE)のような伝達性海綿状脳症に関係するプリオン蛋白質を識別できる核酸分子の同定および分離に使用することができる。伝達性海綿状脳症はまた、アラビアオリックス、グレータークーズー、エランド、アンコール、ムフロン、ピューマ、チータ、シミターホーンドオリックス、オセロットおよびトラ等でも知られている。従って、本発明の方法は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス等のげっ歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の種々の哺乳動物のプリオン蛋白質を標的として使用することができる。
【００３４】
核酸分子のプールをプリオン蛋白質と混合する工程、及びプリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択及び分離する工程は、種々の方法で実施することができる。
【００３５】
本発明の一つの好ましい態様では、プリオン蛋白質は溶液に含まれた状態である。この場合、プリオン蛋白質に結合している核酸分子は、例えばニトロセルロース膜を使用した分離検定を実施し、蛋白質／核酸複合体を回収することにより分離することができる。その後、この核酸分子を複合体から分離し、既知の方法によってさらに精製することができる。
【００３６】
もう一つの好ましい態様においては、プリオン蛋白質を、例えば磁気ビーズまたは樹脂のようなマトリックス上に固定化する。固定化は当業者に知られる手段によって達成することができる。例えば、蛋白質をマトリックスに共有結合させ、またはマトリックス上に存在する基と、この基を特異的に認識する蛋白質のドメインとの間の特異的相互作用によって蛋白質をマトリックスに結合させることができる。このようなドメインは、下に述べるような組換えDNA技術によってプリオン蛋白質に融合させることができる。
【００３７】
プリオン蛋白質が固定化されると、プリオン蛋白質に結合しない核酸分子は、適当な緩衝液による洗浄により、反応後に除去することができる。その後、プリオン蛋白質に結合しているこの核酸分子は、例えば7M尿素により、固定化された蛋白質から溶離し、さらに例えばフェノール抽出および沈澱化により精製することができる。
【００３８】
プリオン蛋白質が溶液状態である場合、プリオン蛋白質に結合している核酸分子は、例えばニトロセルロース膜を利用した検定を実施し、蛋白質−核酸複合体を分離することにより分離することができる。その後、この核酸分子を複合体から分離し、既知の方法によってさらに精製することができる。
【００３９】
上記核酸分子の選択及び分離の工程は、２種以上の方法で行うことが好ましい。それによって、特定の選択系に依存せずに標的分子と結合する核酸分子を選択することが可能である。
【００４０】
本発明によれば、例えばインビトロ転写、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応またはこれらの技術の組み合わせにより、工程(i)および(ii)により得られる核酸分子を増幅し、そして工程(i)および(ii)を反復することが可能である。この事により、使用されたプリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子のさらなる選択および増幅が導かれる。工程 (i) および(ii)の反復は、5〜20サイクルとすれば良く、好ましくは8〜15サイクルである。
【００４１】
もしこの方法の工程(i)ないし(iii)を数サイクル実施するならば、１またはそれ以上のサイクルに固定化された蛋白質を、そして１またはそれ以上のサイクルに溶液の蛋白質を使用することが可能である。溶液状態の蛋白質が使用されるサイクルは、固定化された蛋白質が結合しているマトリックスに結合している核酸分子の除去を可能にする。
【００４２】
この方法に用いられるプリオン蛋白質は、任意の既知のプリオン蛋白質イソ型または係る蛋白質のフラグメントもしくは誘導体であってよい。
【００４３】
好ましい態様において、プリオン蛋白質は、組み換えプリオン蛋白質である。特に好ましい態様においては、組み換えマウスプリオン蛋白質が使用される。さらなる好ましい態様において、この方法で用いられるプリオン蛋白質は、細胞イソ型ＰrＰcである。
【００４４】
本発明に係る方法の最終工程では、分離された核酸分子を、プリオン蛋白質に対する結合特異性について試験する。
【００４５】
したがって、本発明に係る方法は、プリオン蛋白質のイソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体の一方と特異的に結合する核酸分子の同定および分離を可能にし、それにより異なるイソ型の識別を可能にする。
【００４６】
本発明の方法を実施して、mPrPcを識別できるRNA分子を４種類分離することができた。
【００４７】
従って、本発明はまた、本発明に係る方法により取得可能な核酸分子、即ち、プリオン蛋白質に結合する一本鎖RNA、一本鎖DNAまたは二本鎖DNA分子に関するものである。これらは、細胞イソ型PrPc、即ちプロセシングされた型PrPc23-231、またはこれらの蛋白質の誘導体に、特異的に結合する核酸分子を包含する。
【００４８】
マウスプリオン蛋白質に対する結合活性を持つRNAアプタマー配列
本発明に係るRNAアプタマーは、配列番号１または２の、ランダム配列を有するRNA分子より、インビトロ選択法により選択される。選択されるRNA分子は、塩基配列5’-HGGH-3’ （HはA、CまたはU）を一分子中に４箇所以上含む。かかる配列を有することにより、アプタマーが分子構造学的に安定なG４量体(Lin Y.ら, Nucleic Acids Res. 22, 5229-34, 1994.等)を形成し、mPrPcに結合しうる高次構造を形成するのに必須と推測される。
【００４９】
好ましい態様において、RNAアプタマーは、上記と同様の理由により、ランダム領域に5’-GGWGG-3’（WはAまたはU）の配列を含んでいる。
【００５０】
さらにより好ましくは、当該RNAアプタマーは、以下の配列である。
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA -3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
【００５１】
本発明の方法または類似の方法によって核酸分子の選択を行う場合、元となる核酸分子のプールを構成する核酸分子と同じ塩基長の核酸分子が得られる場合もあるが、選択の過程で１〜５塩基程度短いものが好適な結合特異性を有するものとして得られる場合もある。従って、本発明のRNAアプタマーは、その塩基長が元となる核酸分子と同じ塩基長を有するものに限定されない。尚、上記配列番号３及び４のRNAアプタマーは57塩基長、配列番号５及び配列番号６のRNAアプタマーは74塩基長である。
【００５２】
マウスプリオン蛋白質に対する結合活性を持つRNAアプタマーの化学修飾
本発明に係る核酸分子は、それらの安定性を増し、そして／またはそれらの生化学的および／または生物物理学的性質を改変するため、１またはそれ以上の位置でさらに修飾しても良い。
【００５３】
好ましい態様において、RNAアプタマー分子中の2’-位の水酸基を、化学合成または酵素反応によりフルオロ基、アミノ基、メトキシ基などの任意のヌクレアーゼ耐性基に置換することができる。
【００５４】
より好ましい態様において、該核酸分子はピリミジンヌクレオチドの2’-水酸基の１ないしそれ以上の箇所において、フルオロ基に置換することができる。
【００５５】
好ましい態様において本発明に係る核酸分子は、それらを生化学的な検定に供するため、そして／またはそれらの生化学的および／または生物物理学的性質を改変するため、核酸分子の末端の一方または両端の位置をフルオロセイン、ローダミンなどの蛍光物質、ビオチン、マルトースなどのタグ分子等の当分野において通常用いられる機能性化合物で修飾することができる。
【００５６】
より好ましい態様において、該核酸分子は5’-末端に適切なリンカーを介してビオチン化することができる。
【００５７】
マウスプリオン蛋白質に対するRNAアプタマーの結合活性
本発明に係るRNAアプタマーは、プリオン蛋白質に対して結合活性を示す。例えば、評価対象のRNA分子がプリオン蛋白質に対して結合活性を示すか否かについては、プリオン蛋白質に対する結合活性を測定することによって検討することができる。
【００５８】
結合活性を測定する際には、結合対象となるプリオン蛋白質を含む反応液に、評価対象のRNA分子を添加し、当該RNA分子と結合対象との結合を検出する。RNA分子と結合対象との結合は、RNA分子を標識化する場合には放射線検出器や蛍光検出器で、RNA分子を標識化しない場合には水晶振動子や表面プラズモン共鳴検出装置等によって検出することができる。
【００５９】
診断用組成物および医薬組成物
本発明に係るプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーは、プリオン病を診断、予防または治療するために用いることができる。
【００６０】
プリオン病を診断するためには、係る組成物は、診断目的のために一般的に用いられる添加物を含有してよい。本発明に係る核酸分子および診断用組成物は、伝達性海綿状脳症の診断のための方法で使用することができる。係る方法は、例えば、身体から取得したプローブ（サンプル）を、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類と接触させ（例えば共にインキュベートし）、その後、該核酸分子とプリオン蛋白質のイソ型PrPcおよびPrPScとの相互作用を測定することを含む。
【００６１】
伝達性海綿状脳症に罹患中は、イソ型PrPScの量が増加し、細胞イソ型PrPcの総量は減少するため、原則として二つのイソ型の一方または他方と結合する核酸分子を診断に使用することが可能である。すなわち、正常な状態（対照）と比較して、イソ型PrPScの量の増加、あるいは細胞イソ型PrPcの量の減少が検出されれば、伝達性海綿状脳症に罹患している可能性が高いと診断することができる。
【００６２】
一方で、プローブ中のプリオン蛋白質の少なくとも一つのイソ型の量を定量するため、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類を使用することが可能である。
【００６３】
他方では、プローブ中のイソ型の絶対量および／または相対量を測定するため、PrPcイソ型に特異的に結合する核酸分子をPrPScイソ型に特異的に結合する核酸分子と組み合わせて使用することが可能である。
【００６４】
好ましい態様において、プローブは様々な臓器、好ましくは組織から、例えば脳、扁桃、回腸、皮質、硬膜、プルキニエ細胞、リンパ節、神経細胞、脾臓、筋肉細胞、胎盤、膵臓、眼球、脊髄またはパイエル板から、例えば薄い切片の形で取得することができる。別法としてプローブは、体液、好ましくは血液、脳脊髄液、乳または精液から取得することができる。
【００６５】
脳をプローブとして使用する場合、診断は殆どの場合死後に実施する。例外的に脳生検を生きている生物に実施することができる。脳は、伝達性海綿状脳症に罹患し得る任意の生物、例えば羊、子牛、マウス、ネコ、ハムスター、ラバ、シカ、エルクもしくは人間、またはTSEに罹患し得る上記のようなその他の生物に源を発することができる。脳は、PrP0/0(ノックアウト)、PrPsc（感染した）およびPrPc（野生型）または未知のPrP状態である生物を供給源とすることができる。血液、乳、脳脊髄液、精液または上に述べたその他の臓器由来の組織をプローブとして使用する場合は、生きている個体に対する診断が可能である。
【００６６】
また、プリオン病を診断するための有効な前処理操作として、本発明のRNAアプタマーは、例えばプリオン濃縮カラムの担体として用いることができる。濃縮操作は低濃度の異常プリオン蛋白の検出を可能にするため、プリオン病の生前診断が可能になる。例えば、RNAアプタマーを共有結合または適切なリガンドを介してビーズに固定したカラムを作製する。大容量の血清や血液等の液性生体材料、およびそれらを用いて作られた製剤等をカラムに通し、結合したPrPScを小容量の溶出液で溶出することにより、PrPScの高度濃縮液を作製する。作成した濃縮液は通常の抗体法等で検出し、PrPSc混入の有無を判断することが可能である。
【００６７】
プリオン病を予防又は治療するには、プリオン病を発症した被験者の組織または細胞（例えば脳など）に、上述したプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーを導入することによって、PrPcに結合し、PrPScの増殖を阻止することができる。プリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーの導入は、例えば、導入対象のプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーをリポソームに封入し細胞内に取り込む方法（“lipidic vector systems for gene transfer”(1997) R.J lee 及び L. Huang Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 14: 173-206; 中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  vol.44, No. 11, 1590-1596 (1999)）、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。
【００６８】
なお、RNAアプタマーを有効成分として含む医薬組成物は、必要により医薬上許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）、賦形剤等の通常用いられる成分を適宜含むことができる。本発明の医薬組成物は、プリオン病の予防または治療に使用することができる。被験者への投与量、投与方法、投与頻度は、被験者の年令、体重、性別、疾病の状態、重篤度、生体の応答性によって適宜変化させうるし、また、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり投与が継続される。
【００６９】
本発明はさらに、本発明に係る核酸分子を含む医薬組成物に関するものである。係る組成物は所望により製薬上許容し得る担体を含むことができる。
【００７０】
これらの組成物は、例えば上に列挙されたような伝達性海綿状脳症等のプリオン病の治療に有用であり得る。例えば、PrPcに特異的に結合する核酸分子を適用することにより、イソ型PrPcからプリオン関連イソ型PrPScへの変換を抑制することが可能となり得る。
【００７１】
さらに、本発明に係る核酸分子を使用して、プリオン蛋白質イソ型の特異的結合に必要な三次元構造を同定することができる。この情報の助けにより、プリオン蛋白質イソ型と特異的に結合できる他の化合物を分離または合成することができる。したがって、本発明はさらに、本発明に係る核酸分子の三次元構造から導かれる情報に基づき無機または有機化合物、好ましくは糖類、アミノ酸、蛋白質または炭水化物より成る群から選ばれる、核酸分子以外の化合物を同定する方法を提供する。
【００７２】
さらに、本発明に係る核酸分子を使用して、PrPSc結合分子の同定が可能である。例えば、TSE感染脳など、PrPScを含む生体材料を上記のRNAアプタマーを用いたプリオン濃縮カラムで濃縮し、生体内でPrPScと結合している蛋白質等の生体内分子の同定および得られたPrPSc結合性生体内分子によるPrPSc生成の影響等を明らかにすることが可能である。
【００７３】
PrPSc結合性生体内分子の検出は、例えば、洗浄操作を行った後、RNAアプタマーを特異的に消化する酵素等を作用させ、ビーズとの結合を切断後、遊離したPrPSc-PrPSc結合性生体内分子複合体を電気泳動等で検出し、質量分析計等で同定することにより行うことができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００７５】
[実施例１]
マウスプリオン蛋白質と特異的に結合するRNA分子のインビトロ選択
マウス由来の組換えPrP23-231 (mPrPc)(プリオニクス)およびRNAプールを用いて、各々のプールについて下記の表に示す条件でインビトロ選択法（図１に模式的に示した）を実施した。
【００７６】
本発明で用いたRNAプールは、記載のように（Kikuchiら, J Biochem (Tokyo), 133(3), 263-270, 2003；Fukudaら, Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000）２種のDNAプール（N30K:79塩基長、N30V:93塩基長、いずれも転写プロモーターの存在のため、転写されるRNAプールの塩基長より19塩基長い）からインビトロ転写によって作製した。簡潔に述べると、得られるRNAプールは、30塩基のランダム化された配列、すなわち塩基の順列430＝1.03 x1018分子、を含む。その結果、およそ1.03 x1018の異なる配列と1.03 x1018の複雑度を有するプールが生成したが、これは一つのプールのコピーに相当する(即ち、各々一つ一つのRNA分子がプール内で一重に表される)。
【００７７】
詳細には、RNAプールの技術的特徴は以下の5'領域の固定配列と3'領域の固定配列の間にランダム化された30ヌクレオチドの配列（塩基順列430＝1.03 x1018通り）を有するものである。
【００７８】
5'領域のヌクレオチド配列：
N30K: 5’-AGTAATCGACTCACTATAGGTAGATACGATGGA-3’(配列番号7)
N30V: 5’-AGTAATCGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-3’ (配列番号8)
【００７９】
3'領域のヌクレオチド配列： 
N30K: 5’-CATGACGCGCAGCCA-3’(配列番号9)
N30V: 5’-CCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3’ (配列番号10)
【００８０】
１プールの複雑度が430（＝1.03 x1018分子＝１プールコピー）であり、各々のRNA分子がプール内で一重に表される2種類のRNAプールの配列は以下のように示される。
N30K（60ヌクレオチド）
5’-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号1)
N30V（74ヌクレオチド）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号２）
【００８１】
5’領域のヌクレオチド配列中5'側19塩基（5’-AGTAATACGACTCACTATA-3’、配列番号１１）は、転写されていないため、DNAプールにのみ属する。
【００８２】
なお、以下の操作は20 mＭ Tris-HCl (pH 7.5)、100 mＭ NaClを含有する結合緩衝液中で、下記表１及び２に示す反応条件下、mPrPcの存在下で反応させた(図１)。表１はN30Kプールからの選択条件、表２はN30Vプールからの選択条件を示し、表中、G1〜G10はそれぞれの選択サイクルを示し、「RNA」は用いた選択対象のRNA分子の濃度、「mPrP」はマウスプリオン蛋白質の濃度、「tRNA」は競合RNA分子の濃度をそれぞれ示す。また、N30Kからの選択（表１）においては、更に選択圧を高めるために、６サイクル目からN30Vプールから10サイクルの選択を経たRNAプールを共存させた。尚、当業者には容易に理解されるように、N30Kプールから選択されたRNA分子とN30Vプールから選択されたRNA分子は、末端の配列を異なるように設計しているため、容易に分離可能である。反応はすべてのサイクルにおいて室温静置で行った。
【００８３】
【表１】
2006042645.tif 000003
【００８４】
【表２】
2006042645.tif 000004
【００８５】
ニトロセルロース膜を用いたインビトロ選択法
福田らの方法(Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000)に従い行った。
表１及び２に示す組成でmPrPcとRNAプールおよび必要に応じて競合分子（tRNA）を反応溶液中にて反応させた後、HAポップ-トップキット（ミリポア）上に固定した0.45μm孔径ニトロセルロース膜（ミリポア）で濾過した。このとき、膜上にはmPrPcおよびmPrPc-RNA複合体が残る。膜を回収後、7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
【００８６】
磁気ビーズに固定化したプリオン蛋白質を用いたインビトロ選択法
N30Kプールを用いた9サイクル目のインビトロ選択操作において、ダイナビーズM-450(ダイナル)上に固定したmPrPcを標的分子として用いた。mPrPcの磁気ビーズへの固定は、付属のマニュアルに従って行った。反応溶液を加えた後、磁気分離を行い、回収した磁気ビーズを7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
【００８７】
プレートを用いたインビトロ選択法
N30Vプールを用いた7サイクル目のインビトロ選択操作において、ゼノバインドプレート（ゼノポア）上に固定したmPrPcを標的分子として用いた。mPrPcのゼノバインドプレートへの固定は、付属のマニュアルに従って行った。反応溶液を加えた後、磁気分離を行い、回収した磁気ビーズを7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
【００８８】
[実施例２]
逆転写反応
リバートエイドM-MuLV逆転写酵素キット（MBIファーメンタス）に従い逆転写反応を行った。具体的には、実施例１にて抽出されたRNAの全量に、逆転写反応溶液と以下に示される各々の3’-プライマー 50 pmolを加えた後、94℃で2分間反応後、室温に15分静置させた。反応後、0.25 mM dNTPs、逆転写酵素100ユニットを加えて42℃で１時間反応させた。
【００８９】
3’-末端プライマーのヌクレオチド配列： 
N30K：5’-TGGCTGCGCGTCATG-3’ (配列番号12)
N30V: 5’-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3’ (配列番号13)
【００９０】
[実施例３]
ポリメラーゼ連鎖反応
GeneTaq PCRキット（ニッポンジーン）に従い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。具体的には、実施例２で精製したサンプルの全量に、PCR反応溶液と配列番号７、８、１２及び１３の5’-及び3’-プライマーを各々50 pmol、0.2 mM dNTPsおよびGeneTaqポリメラーゼ１ユニットを加えた後、94℃、1分間−55℃、１分15秒−72℃、1分15秒のサイクルを任意の回数行った。反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅の確認をエチジウムブロマイド染色で行った。産物の増幅の確認後、エタノール沈澱を行い、凍結乾燥したサンプルを30 mM NaCl中に溶かした。
【００９１】
[実施例４]
転写反応
アンプリスクライブT7転写キット（エピセントレ）に従い転写反応を行った。具体的には、実施例３で増幅されたｃDNAの50% を、転写反応溶液と7.5 mM ATP、7.5 mM GTP、7.5 mM CTP、7.5 mM UTP、10 mM DTT、T7 RNA ポリメラーゼ２ユニットを加えて、37℃で2時間反応させた。反応後、DNアーゼ0.5ユニットを加え、15分反応させた。RNA断片は、既知の方法に従って回収した(Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)。
【００９２】
[実施例５]
ニトロセルロース結合検定
α-32P標識（Sambrookら, Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989）されたRNA 10 nMを、結合緩衝液中でプリオン蛋白質0ないし150nＭの存在下、プリオン蛋白質100 nM の存在下においてはtRNA（NEB）0ないし150 nＭの存在下で、10分間室温で反応した。反応混合物をHA ポップ-トップ 装置上に固定したニトロセルロース膜で濾過した後、反応緩衝液１mＬで洗浄し、BAS2500（富士フィルム）により測定した。
【００９３】
10サイクルの選択の後、N30KプールにおいてはmPrPcに結合した選択されたRNAの約70%が、N30VプールにおいてはmPrPcに結合した選択されたRNAの50%が、ニトロセルロース膜上に固定化された。
【００９４】
RNA結合の比率は以下のように決定した：反応溶液中に加えた放射能ラベルしたRNA分子の総放射能活性を100%と定めた。 2回の洗浄工程の後に保持されている放射能がRNA結合のパーセンテージを表す。
【００９５】
[実施例６]
配列解析
10サイクルの増幅および選択の後に同定されたRNA分子の配列を決定するため、これらのRNA分子をcDNAに逆転写し、PCR（Sambrookら, Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989）により増幅した。得られたcDNAをpGEM-T EASY(プロメガ)中にサブクローニングし、cDNAクローンの配列をSangerらの方法（1977）に従って決定した。同定された4種類のRNA分子（RNAアプタマー60-3、60-2、74-9及び74-25）の配列を配列番号3〜6に示す。
【００９６】
60-3（N30Kプール由来）
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号3)
60-2（N30Kプール由来）
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
74-9（N30Vプール由来）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
74-25（N30Vプール由来）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCU CUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
【００９７】
[実施例７]
ヌクレアーゼ耐性修飾
デュラスクライブT7転写キット（エピセントレ）に従い転写反応を行った。具体的には、実施例３で増幅されたｃDNAの50%を、転写反応溶液と3.75 mM ATP、3.75 mM GTP、3.75 mM 2’-F CTP、3.75 mM 2’-F UTP、10 mM DTT、T7 RNA ポリメラーゼ２ユニットを加えて、37℃で8時間反応させた。反応後、DNアーゼ0.5ユニットを加え、15分反応させた。RNA断片は、既知の方法に従って回収した(Sangerら, Proc. Notl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)。
【００９８】
[実施例８]
結合定数測定
この目的のためにα-32P標識したRNAアプタマー（配列番号3〜6）10 nMを、0、0.5、1、5、10、50、100、500、1000 nMのmPrPcの存在下に、上記の検定条件の下で37℃で10分間反応した。反応混合物をHA ポップ-トップ 装置上に固定したニトロセルロース膜で濾過した後、反応緩衝液１mＬで洗浄した。
【００９９】
フィルターを乾燥し、２時間のオートラジオグラフィーに付した。シグナルの強度をBAS2500（富士フィルム）上で、燐の画像化により測定した。
【０１００】
平衡結合定数の算出のために、RNAおよび蛋白質間の二分子反応を想定した。
【０１０１】
平衡状態のRNA／蛋白質複合体の濃度［ｃ］は、膜上に残った放射能の量およびRNAの既知の比放射能から決定することができる。平衡結合定数（Ｋd）の算出には以下の式が使用された(Meisterernstら, Nucleic acids Res, 16, 4419-4435, 1988)：  
Ro＝Req＋[RP]eq；
Peq＝Po−[RP]eq；
R＝RNAアプタマー
P＝mPrPc；
【０１０２】
RNAアプタマーおよびmPrPcの複合体に対する以下の平衡結合定数(Ｋd)は、RNAアプタマー60-3および60-2について、それぞれＫd＝5.6 x 10 -9 Ｍ(60-3)、9.4 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図２）。
【０１０３】
何れも、bPrPc(ウシ組換えプリオン蛋白質；ロシュ)に対しては親和性が弱くなり、それぞれＫd＝72 x 10 -9 Ｍ(60-3)、120 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図２）。
【０１０４】
また、ピリミジン2’-F修飾したRNAアプタマー60-3および60-2について、Ｋd＝27.5 x 10 -9 Ｍ(60-3)、23.0 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図３）。
【０１０５】
[実施例９]
5’-末端ビオチン化反応
5’末端核酸ラベリングシステム（ベクター）に従い、5’-末端ビオチン化反応を行った。具体的には、実施例８で得られたRNA分子600 pmolを反応溶液中でアルカリフォスファターゼで37℃、30分反応させた。反応後、1.3 μgのATPγSの存在下でT4ポリヌクレオチドキナーゼで37℃、30分反応させた。反応後、ビオチンマレイミド380μg存在下で65℃、30分反応させた。反応後、定法によりエタノール沈澱操作を行い、回収した。回収した産物は、吸光度測定により濃度を測定した。
【０１０６】
[実施例１０]
ドットブロットアッセイ
RNAアプタマーに対するmPrPcの相互作用部位をマッピングするため、本発明者らは一連のGST融合組換えプリオン蛋白質（独立行政法人  動物衛生研究所  横山  隆氏より提供）を使用した。
【０１０７】
操作は基本的にParamjeetら(RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256)の方法に従って行った。GST融合組換えプリオン蛋白質をニトロセルロース膜に1μg滴下、乾燥後、１%BSAでブロッキングをした後、5’末端をビオチン化したRNAアプタマー60-3、74-9、または74-25で一定時間反応させた。反応後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）（ロシュ）を一定時間反応させ、ビオチンを介してRNAアプタマー／SA-AP複合体を形成させる。反応後、膜を洗浄し、発光基質CDP-Star（ロシュ）を湿潤させ、発光反応を行った。検出は、ポラロイドミニカメラ（アマシャム）で行った。
【０１０８】
GST融合組換え蛋白質23-231および89-231が、5’-ビオチン化したRNAアプタマー60-3と相互作用し(図４)、このことは、アプタマーによる認識のためには、マウスのプリオン蛋白質のアミノ末端残基aa23ないしaa155で十分であることを証明している。
【０１０９】
[実施例１１]
ノースウエスタンアッセイ
基本的にParamjeetら(RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256)の方法に従って行った。5週齢DDYマウス脳ホモジネートをSDS-PAGEで展開した後、ニトロセルロース膜に転写し、１％BSA-0.5 μg/μl Poly U(アマシャム)でブロッキングをした後、5’末端をビオチン化、または32P標識したRNAアプタマー60-3で一定時間反応させた。
【０１１０】
5’末端をビオチン化したRNAアプタマーの場合、反応後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）（ロシュ）を一定時間反応させ、ビオチンを介してRNAアプタマー／SA-AP複合体を形成させる。反応後、膜を洗浄し、発光基質CDP-Star（ロシュ）を湿潤させ、発光反応を行った。検出は、ポラロイドミニカメラ（アマシャム）で行った。
【０１１１】
5’末端を32P標識したRNAアプタマーの場合、反応後膜を洗浄し、BAS2500（富士フィルム）上で、燐の画像化により測定した。
【０１１２】
その結果、RNAアプタマー60-3は目的の位置（29KDa）付近に特異的なバンドが検出され（図５）、このバンドは抗体6H4（ロシュ）を用いた場合と同じ位置に検出された。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明で用いるインビトロ選択における工程を模式的に示す（RT＝逆転写反応；PCR＝ポリメラーゼ連鎖反応）。
【図２】mPrPcに対する、RNAアプタマー60-3および60-2の結合定数の測定結果を示す。
【図３】RNAアプタマー60-3および60-2中のすべてのピリミジンヌクレオチドを2’-フルオロ基修飾したRNAアプタマーの結合定数の測定結果を示す。
【図４】GST融合マウス部分プリオン蛋白質を使用した、RNAアプタマー60-3の結合部位の解析結果を示す。
【図５】正常マウス脳ホモジネートを使用した、RNAアプタマー60-3のノースウエスタン解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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