(57)【要約】      （修正有）【課題】  数cm程度の基板上でマイクロ流路内で数μLの全血から血漿を分離し、得られた血漿と基質緩衝液と混合して比色法により被検成分を測定する血液分析装置において、血漿と基質緩衝液の秤量と通常層流が支配するマイクロ流路内での混合の困難さと、注入された基質緩衝液の劣化と、多項目測定には基板の大面積化の課題に対して、特殊な混合を必要とせず、小面積の基板による安価・簡便な血液分析装置を提供する。【解決手段】石英板や高分子樹脂板などの絶縁材基板に作製した微細な流路を用い、遠心力を用いて微量（数μＬ以下）の血液を導入し分離を行い、血漿を秤量し、流路容積によって秤量されたドライケミストリー試薬流路に導入し、血漿との反応で生じた発色に同色の波長の光を導入し、減衰度を計測し、前記複数の溶液の混合を必要とせず、保存に良いドライケミストリー試薬の適用による分析装置の劣化が無く、装置の小型化が達成可能な血液分析装置及び血液分析方法の提供でより高精度、高信頼、安価な血液分析が可能となる。【選択図】図２
2006058093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液導入口とこれに連結された全血搬送案内流路並びに血球・血漿分離用流路、血漿案内流路とを有し、遠心により血液導入口から全血試料を導入し、血球・血漿分離行い、血漿を案内流路により搬送し、ドライケミストリー用試薬を収納した流路に導入し、血漿中の被検成分とドライケミストリー用試薬とを反応させ、特定の測定光を導入し、透過度の変化を受光器により測定する各手段を備えた積層基板により血漿中の被検成分する血液分析装置。
【請求項２】
血液導入口には略直線状に連結した採血針と採血した血液溜めが連結され、更に血液導入口は全血搬送案内流路を経て血球・血漿分離用流路と連結し、血球・血漿分離用流路から血液導入口を見て上方に第1の回転軸を中心として回転することにより全血を血液導入
口から血液案内流路を経て血球・血漿分離用流路に搬送し、血球分画と血漿分画に分離することを特徴とする請求項１の血液分析装置。
【請求項３】
全血搬送案内流路と血球・血漿用分離流路は、血液導入口を見て下方に設けられ、血球・血漿用分離流路は血液導入口を中心に略円弧に、且つ血液導入口に向かって複数の溝流路が設けられ、当該溝流路の血液導入口を見て下方側は一つの流路で連結され、第1の回
転軸を中心として回転することにより全血を、当該溝流路の下方側に血球分画を収容し、上方側に血漿分画を収容することを特徴とする請求項１または２の血液分析装置。
【請求項４】
血球・血漿分離流路は、概ねU字状流路で形成され、一端は全血導入口と連結した血液
搬送案内流路と連結し、U字状流路下端から前記血液導入口を見て基板の上方に設けられ
た第1の回転軸を中心として回転することにより全血を、U字状流路に導入し、U字状流路
下端の湾曲部には前記血球分画収容部が設けられ、その上部が血漿分画収容部とされていることを特徴とする請求項１または２の血液分析装置。
【請求項５】
請求項３に記載の血液分析装置にあって、複数の溝流路の他端の各々は血漿案内流路と血漿秤量用血漿溜めとキャピラリバルブと各ドライケミストリー用試薬導入流路がその順番で直列に接続され、複数の溝流路の下方側の外側に設けた第2の回転軸を中心に回転し
、遠心力により血漿分画収容部から血漿が、各血漿案内流路と各血漿案内流路と各血漿秤量用血漿溜めと各キャピラリバルブを経て各ドライケミストリー用試薬導入流路に導入することを特徴とする血液分析装置。
【請求項６】
請求項４の血液分析装置にあって、U字状流路の他端の流路に複数の分岐した血液搬送
案内流路が設けられ、当該各流路は血液溜めと秤量用血漿溜めとキャピラリバルブと当該血漿秤量用血漿溜めと血漿導入用流路がその順番で直列に接続され、血漿導入用流路の直下に血漿展開層が設けられ、当該血漿展開層の直下に垂直方向に一致して接合された血漿展開層と同面積の複数の孔を設けた領域を有する基板と当該孔基板の直下に設けられた血漿展開層と同面積のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路がこの順番で接合されたことにより形成された積層基板を、U字状流路と略直交方向で、当該流路から見て基板の
外側に位置する第2の回転軸を中心に回転させ、遠心力によりU字状流路内の血漿をドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に導入することを特徴とする血液分析装置。
【請求項７】
請求項５または６の血流分析装置の秤量用血漿溜めにあって、当該血漿溜めの側壁に廃棄血漿搬送案内流路とそれに連結した廃棄血漿溜めを設けたことを特徴とする５または６の血液分析装置。
【請求項８】
前記ドライケミストリー用試薬を収める流路へ当該試薬の注入口と排出口を設けたことを特徴とする請求項５または６の血液分析装置。
【請求項９】
前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、長手方向の流路の両端は45度の壁が設けられ、その全内部には金属が塗布され、45度の壁基板の下部または上部から垂直に45度の壁の近傍に光導入用と射出用ファイバーが導入されたことを特徴とする請求項６の血液分析装置。
【請求項１０】
前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、その内部に金属を塗布され、長手方向の流路の両端の壁には流路軸と一致した両方向から光導入用と射出用ファイバーが導入されたことを特徴とする請求項６の血液分析装置。
【請求項１１】
前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、血漿と反応してドライケミストリー試薬を含有したゲルが膨潤する容積を有することを特徴とする請求項６の血液分析装置。
【請求項１２】
前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、同一の容積を有することを特徴とする請求項６の血液分析装置。
【請求項１３】
前記ドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、アンモニアガス発生用ドライケミストリー試薬流路の基板と多数の孔を設けた基板とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、この順番で垂直方向に一致して積層され、アンモニアガス発生用ドライケミストリー試薬流路と多数の孔を設け領域とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、同面積を有し、更に他の項目の検出用流路がアンモニア発生用流路と同一基板内に設けたことを特徴とする請求項６の血液分析装置。
【請求項１４】
ドライケミストリー試薬を用いた比色法センサーと電気化学センサーが積層基板から構成された血液分析装置に設けられたことを特徴とする請求項１の血液分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質を含む試料が導入された石英板や高分子樹脂板などの絶縁材基板に作製した超小型の溝流路によって構成された血液分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の健康診断や疾病状態の診断は、患者から数ｃｃの多量の血液を採取し、その分析に大規模な自動血液分析装置で得た測定値より行われてきた。通常、このような自動分析装置は、病院などの医療機関に設置されており、規模が大きく、また、その操作は専門の資格を有するものに限られるものであった。
【０００３】
しかし、近年、極度に進歩した半導体装置作製に用いられる微細加工技術を応用し、たかだか数mmから数cm四方の基板上に種々のセンサなどの分析装置を配置して、そこに被験者の血液などの体液を導き、被験者の健康状態を瞬時に把握することができる新しいデバイスの開発とその実用化の気運が高まってきている。このような安価なデバイスの出現により、来たるべき高齢化社会において高齢者の日々の健康管理を在宅で可能にすることなどで増加の一途を辿る健康保険給付金の圧縮を図れる。また救急医療の現場においては被験者の感染症(肝炎、後天性免疫不全症など)の有無などを、本デバイスを用いて迅速に判断できれば適切な対応ができるなど、種々の社会的な効果が期待されるために非常に注目されつつある技術分野である。このように従来の自動分析装置に代わって、血液分析を各家庭で自らの手で実施することを目指した小型簡便な血液分析方法ならびに血液分析装置が開発されている (例えば、特許文献１参照) 。
【０００４】
特許文献１に記載されたマイクロモジュール化された血液分析装置では、高分子基板上に微細な溝流路が設けられ、その一端には針が取り付けられており、他端からポンプにより針から血液を溝に導入し、U字状流路に導入後、遠心分離で血球と血漿の分離後、当該
血漿を電気化学センサに当該ポンプによって導き、血漿中に被検物質の濃度を測定する。その結果、血液中のｐＨ値、酸素、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、グルコース、乳酸などの各濃度が測定される。
【０００５】
しかし、電気化学センサーでは肝機能測定用の被検物質であるγ-GTP、GOT、GPTの各酵素の活性度や総コレステロールや中性脂肪などの濃度の測定は容易ではなく、γ-GTP、GOT、GPTの各酵素の活性度は、特許文献２では比色法を用いて測定を可能にしている。従って、大規模な自動血液検査装置では、ナトリウムやカリウムなどのイオンは電気化学的に測定するが、他の項目は比色法が主流である。
【特許文献１】特開２００１−２５８８６８号公報
【特許文献２】特願２００３−３４６４３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
自動血液検査装置では、大量の血液を採取し、大量の血漿と多量の基質緩衝液との混合を試験管内で行い、その反応を吸光度によって測定されるが、本方法を微量の血液を導入した微細な流路からなる数cm2の高分子などからなる基板を用いて実現するには、特許文
献２と特許文献３で述べられているように、まず血漿と多量の基質緩衝液の均一な混合に特殊な流路が必要になる。
【特許文献２】ではチップの二つの中心を用いた遠心力による攪拌、
【特許文献３】では混合室を多段もうけるが、前者では二つの遠心力中心に変える機構の複雑さ、後者では、均一な混合を達成するには混合室の段数を増加する必要があり、血液検査チップを実現するには、混合器を配置するための面積が増大する。また、血漿または血清と基質緩衝液の混合比は、被検体物質によって大きくことなるが、一般に１：１０〜４０と広範囲にわたり、その比率を保持するためには、血漿と基質緩衝液の厳密な秤量が極めて重要であり、これをマイクロ流路で実行するためには、血漿と基質緩衝液の蓄蔵用マイクロ流路の精密加工が求められる。また、高分子材料からなる流路基板内に基質緩衝液を長期間保管すると、高分子材料を透過する酸素によって変質し、その保管は極めて難しい。一方、基質緩衝液を保管せず、外部から秤量した液を蓄蔵用マイクロ流路に吐出すれば良いが、測定装置に基質緩衝液容器を備え、吐出用管を蓄蔵用マイクロ流路に正確な位置合わせしなければならず、測定装置の複雑化、大型化が避けられず、在宅用としては実用的でない。
【０００７】
一方、小型化された血液分析装置として、ドライケミストリー法を用いたレフトロン(独国、ベーリンガー・マンハイム)、ビトロス(米国、ジョンソン&ジョンソン)、富士ド
ライケム(富士写真フイルム)、スポットケム(京都第一科学)からシステムが市販されている。構造は富士ドライケムの例を取ると、図１に示すような構造の試薬スライド透明支持体(プラスチックフィルム)(101)上に分析反応に必要な試薬を含有した試薬層(102)がコーティングされている。この試薬層には反応に必要な試薬が調製済みにし、ゲル中に乾燥した状態で保持されている。更にこの上に反射測光を可能にする反射層(103)と検体を均一
に展開させる展開層(104)が積層された4層構造になっている。このフイルムの上面に10μL前後の血漿や血清の検体(105)が展開層に滴下されると、検体は展開層の毛管現象により横方向へ放射状に均一展開し、その後に反射層に浸透する。反射層及びゲルと混合された試薬層は血液成分を吸収し、単位面積あたりに一定量の検体を吸収して保持される。試薬層に吸収された検体と含有された試薬が反応し、検体成分に対応した発色を呈する。この呈色強度を支持体側から、発色に対応した特定の入射光(104)を照射し、反射光(105)の強度を測定することで、検体中の成分濃度を算出している。ここで、(106)はスリット、(107)はプラスチック製マウントである。
【０００８】
ドライケミストリー法では、乾燥状態または外観上乾燥した状態で保存された試薬が測定時に液状の試料に出会うとはじめて試薬に含まれるマトリックスにおいて化学反応が進行する検査法であり、予め試薬を調製しておくと、前述した比色法法の血漿または血清と基質緩衝液との厳密な秤量と混合が必要で無くなる大きな利点がある。
【０００９】
そこで、本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、石英板や高分子樹脂板などの絶縁材基板に作製した超小型の溝流路に微量（数μＬ以下）の血液を導入して遠心分離を行い、当該血漿から被険を電気化学センサ用の流路とドライケミストリー用試薬を収納した流路に導入され、ドライケミストリー反応用流路にあっては血漿との反応によって生じる特定の発色の波長と同じ光を導入し、受光することからなる基板構造を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願第1発明は、上記の課題を解決するために、基板に種々の機能を有するマイクロ
流路を形成し、遠心力を用いて、血液導入口から全血試料を血球・血漿分離用流路に導入し基板内で血漿分画を得て、血漿を案内流路により搬送し、ドライケミストリー用試薬を収納した流路に導入して血漿中の被検成分とドライケミストリー用試薬とを反応させ、特定の測定光を導入し、透過度の変化を受光器により測定することにより血漿中の被検成分する血液分析装置を提供する。
【００１１】
本願第2発明は、本願第1発明において、採血針と全血溜め用の管が連結された採血アセンブリを本血液分析装置の基板に設けられた全血導入口に挿入し、採血アセンブリの軸方向の基板の外側に設けた第1の回転軸を中心として回転することにより、全血を血液導入
口から血液案内流路を経て血球・血漿分離用流路に搬送し、更に遠心力を用いて血球分画と血漿分画に分離する装置を提供する。これによって、ポンプによる吸引や外部からの圧力、及びその案内口と管などを必要としないため装置の設計が容易になり、装置の小型化が図れる。
【００１２】
本願第３発明は、本願第１発明と本願第２発明において、複数の溝からなる流路による血球・血漿用分離流路の構造を提供する。まず、全血導入口は全血搬送案内流路と連結し、全血搬送案内流路は、血液導入口を中心に略円弧に、且つ血液導入口の方向に設けられた複数の溝流路が形成された溝群の血液導入口を見て下方側が連結された一本の溝と連結し、第1の回転軸を中心として回転することにより全血を全血搬送案内流路を経て溝流路に導入し、そのまま回転すると溝流路の下方側に血球分画が収容され、上方側に血漿分画が収容される装置を提供する。
当該溝流路は、特開２００１−２５８８６８号公報に述べられ、ここでは上方側に上清された血漿中に電気化学バイオセンサーを設けておくことにより直接に被検成分を測定できる特徴がある。本発明を本願に適用すると、概ね秤量された血漿を後続の測定用流路に分配することができる。
【００１３】
本願第４発明は、本願第１発明と本願第２発明において、血球・血漿分離流路は、概ねU字状流路、即ちU字が外側にわずかに開いて形成されている流路によって血漿を得る装置を提供している。U字状流路の一端は全血導入口と連結した血液搬送案内流路と連結し、U字状流路下端から前記血液導入口を見て基板の上方に設けられた第1の回転軸を中心とし
て回転することにより全血をU字状流路に導入され、そのまま遠心を続けると、U字状流路下端の湾曲部に血球分画が収容され、その上部には血漿分画が収容される装置を提供している。本願も
【特許文献２】特願２００３−３４６４３６に基本が提示されているが、上清の血漿をドライケミストリー法のセンサーに導くことにより本方法の新たな応用を本願では述べている。
【００１４】
本願第５発明は、本願第１発明と本願第３発明を基に、ドライケミストリー法による被検成分の測定する装置を提供している。即ち、本願第３発明に記載の複数の溝流路の他端の各々は血漿案内流路と血漿秤量用血漿溜めとキャピラリバルブと各ドライケミストリー用試薬導入流路がその順番で直列に接続されている。本願第３発明に記載の第2の回転軸
を中心に回転し、遠心力により血漿分画収容部から血漿が、各血漿案内流路を経て、一旦各血漿秤量用血漿溜めに導入される。更に遠心力を増すと秤量された血漿が各キャピラリバルブを経て各ドライケミストリー用試薬導入流路に導入させ、更に秤量されたドライケミストリー用試薬が導入された流路の片側から血漿が遠心力で導入される。ドライケミストリー用試薬は、血漿内に一定の濃度の被検成と、試薬導入流路の長手方向に反応が進む。一連の血漿の搬送はポンプや空気圧を用いずに行われ、装置の動作の簡便さと小型化が達成される。
【００１５】
本願第６発明は、本願第１発明と本願第４発明を基に、U字状流路の他端の流路に複数
の分岐した血液搬送案内流路が設けられ、当該各流路は血液溜めと秤量用血漿溜めとキャピラリバルブと血漿導入用流路がその順番で直列に同一基板上で接続され、更に、血漿導入用流路の直下に血漿展開層が設けられ、その直下に垂直方向に一致して接合された複数の孔を設けた領域を有する基板と当該孔基板の直下に設けられたドライケミストリー試薬注入比色測定用流路がこの順番で接合されたことによって積層基板が形成された装置を提供している。血漿展開層と複数の孔を設けた領域とドライケミストリー試薬注入比色測定用流路の各面積は等しい。そして、U字状流路と略直交方向で、当該流路から見て基板の
外側に位置する第2の回転軸を中心に回転させると、遠心力によりU字状流路内の血漿をドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に導入される。
【００１６】
血漿展開流路からの血漿はその下部にある孔を通してドライケミストリー用試薬用流路に導入されるが、その導入に用いる遠心力は孔と直角方向にある。しかし、血漿溜め用流路の遠心力が印加される方向の端が壁となり、また血漿溜め用流路に血漿が満たされているため、遠心力によって圧力を受けた血漿が下部の孔へ導入されることになる。このように遠心力を用いるだけで血漿をドライケミストリー用試薬用流路に導入できる。
本願第７発明は、本願第５発明と本願第６発明の秤量用血漿溜めの上流側の壁に過剰血漿収容溜めを設けた装置を提供する。決った量の血漿を血漿溜めに遠心力で導入する際、過剰な血漿が導入されると、側壁に設けた廃棄血漿搬送案内流路を経て外部の廃棄血漿溜めに廃棄され、秤量用血漿溜めへの正確な血漿量を提供する。
【００１７】
本願第８発明は、本願第５発明と本願第６発明に記載のドライケミストリー用試薬の決った量を流路に収めるために流路へ試薬を注入し、過剰な試薬は排出するため、ドライケミストリー用試薬流路に注入口と排出口を設けたこと装置を提供する。
ドライケミストリー試薬はゲル状で調製され、本願によって一定量のゲルをマイクロ流路に導入することが容易になる。
【００１８】
本願第９発明は、本願第６発明に記載のドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、長手方向の流路の両端は45度の壁が設けられ、その内部には金属などが塗布され、45度の壁で光が反射するよう基板の下部または上部から垂直に光導入用と射出用ファイバーが導入されたことを特徴とする装置を提供する。
【００１９】
ドライケミストリー用試薬は、導入血漿中の被検成分やアンモニアと反応して発色や着色するが、その度合いを調べる比色測定用流路において、特定の波長を基板の下部または上部から導入し、流路内を内壁による光吸収などによる減衰が無く伝播させ、発色や着色などの化学反応のみによる導入光の減衰度を検出器により測定し、且つ外部からの迷光の侵入することを防止するため、流路内部には金属などの光漏洩や侵入を防止する材料が塗布され、更に長手方向の流路の両端は45度の壁が設けられ、その付近に光導入用と射出用ファイバーが導入されるため、45度の壁で光が反射して光導入と受光が高効率で行える。
【００２０】
本願第１０発明は、本願第６発明に記載のドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、本願第９発明と当該測定用流路の内部を金属など光遮蔽材で覆う点は同じであるが、長手方向の流路の両端は流路軸と一致した両方向に光導入用と射出用ファイバーが導入された装置を提供する。
【００２１】
本願第１１発明は、本願第６発明に記載のドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、秤量された一定の血漿がドライケミストリー試薬を含有したゲルが反応して膨潤する際、その膨潤量を予め測定し置き、当該流路をその膨潤した容積で設計・製作された装置を提供する。
【００２２】
本願第１２発明は、本願第６発明に記載のドライケミストリー試薬比色測定用流路にあっては、秤量された一定の血漿がドライケミストリー試薬を含有したゲルが反応して膨潤しても、一定の流路容積で設計・製作された装置を提供する。
【００２３】
ゲルは通常2倍から5倍程度に膨潤するが、本願第１１発明では、膨潤した全量に特定光を導入してその減衰度を測定でき、S/N比の大きい測定値が得られるが、逆に減衰度が大
き過ぎて測定が困難になる場合もあり、流路が基板に占める面積が大きくなり基板面積が拡大する。一方、本願第１２発明では、大きく膨潤した試薬に対しては、導入試薬が本願第８発明により排出されるため、測定光の減衰度が小さく、S/N比の低い測定になるが、
使用者の被検成分の濃度を予め知っておくことや測定可能なドライケミストリー試薬を調
製しておくことにより、一定容積の流路でも多項目の被検成分濃度の測定が可能になる。現実の基板では両発明を併用する。
【００２４】
本願第１３発明は、本願第６発明に記載のドライケミストリー試薬比色測定用流路にあって、アンモニアガス発生用ドライケミストリー試薬流路の基板と多数の孔を設けた基板とアンモニアガス検出用発生用発色材導入比色測定用流路は、この順番で垂直方向に一致して積層され、更に他の項目の検出用流路とアンモニア発生用流路が同一基板内に設けた装置を提供する。尿酸やクレアチニンや尿素窒素の測定では、直接測定することは難しく、各酵素と反応した後にアンモニアガスが発生するが、アンモニアガス発生用流路から発生したアンモニアガスは均一にアンモニアガスと反応して発色する試薬が導入された流路に導入されねばならないが、本発明はそれを可能にする。
【００２５】
本願第１４発明は、本願第１発明に記載のドライケミストリー試薬を用いた血漿からの被検成分の測定法に加え、従来の電気化学センサーによる被検成分の測定法が同一積層基板に構成された血液分析装置を提供する。
【００２６】
一般の診断では、Na+、K+、Ca++、pHなどの測定は必須であるが、これらをドライケミ
ストリー試薬で測定することは困難であり、多項目を同時に採取した血液から同時に被検成分を測定することにより診断の正確さが増す。
【発明の効果】
【００２７】
以上のように、本発明の血液分析装置は、全血の基板への導入、血球・血漿分離、血漿の秤量、及びドライケミストリー試薬への展開の一連の動作をポンプを一切使わずに遠心力で行い、ドライケミストリー試薬が導入された流路の長手方向の光の減衰を測定することから、極微量血液の血漿中から多項目の被検成分を測定可能とすることが可能な安価・簡便な多項目の血液分析装置を実現できる。
【００２８】
アンモニアガスの測定には、アンモニアガス発生層と展開層とアンモニアガスと反応して発色層が積層分離構造になっているため、アンモニアガスの高感度測定を可能にした血液分析を実現できる。その結果、アンモニアガス測定を含むドライケミストリー比色法センサーに加え電気化学センサーを併用できるので通常の血液検査項目のほとんどを測定可能になり、ベッドサイドのみならず無痛針の使用により在宅での診断が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
第１実施態様
図２〜図６は血液検査装置を構成する各積層基板示し、図２は最上層基板(201)、図３
は第2層基板(202)、図４は第3層基板(203)、図５は第4層基板(204)、図６は最下層基板(205)である。各基板は厚さが0.5mmのポリカーボネート製であり、流路や孔は射出成型で形成する。勿論、リソグラフィによって作製したSU-8などのパターンをPET（ポリエチレンテレフタレート）板などの高分子基板にモールドすることによっても作製され、製法に特徴があるものではない。図２〜図６の各積層基板に設けられた孔(206)は、(207)の円柱が孔(206)へ挿入されることによって、最下層基板(205)の上に第４層基板(204)、第4層基板(204)の上に第3層基板(203)、第3層基板(203)の上に第2層基板(202)、そして第2層基板(202)の上に最上層基板(201)が接続され、各基板は接着剤などにより接着される。その結果、各基板に設けられた流路の位置が決められ、各基板間の溶液の流れが可能になる。次に第２層基板(202)について説明する。(208)は外径100μm、内径50μmのステインレス管であり、先端は10度で三面研磨が行われた無痛針を示す。内壁を超平滑化に研磨してあるため、静脈に刺すと、血圧により自動的に採血できる。また(209)は外径250μmのステインレス管であり、(208)と接着されている。(210)は外径1.8mm、内径1mmのガラス管であり、(209)と接着され、無痛針(208)から採取された血液は、ガラス管(210)に溜められる。(211)は基板(202)に加工された血液搬送案内流路であり、第２層基板(202)の第１の回転軸(212)を中心として遠心力を印加すると、複数の血液溜め溝(213)に導入される。更に遠心を続けると、第１の回転軸(212)を見て外側に血球が、内側に血漿が分離される。次に、第2の回転軸(214)を中心に遠心力を印加すると、上清の血漿が血液搬送案内溝(215)を経て秤量用血漿溜め(216)に導入される。その際、導入を可能とするため空気導入孔(217)とその案内溝(218)を設けてある。空気導入孔(217)は、最上層基板(201)の空気導入孔(219)と直結している。秤量用血漿溜め(216)を満たした後の過剰な血漿は過剰血漿案内流路(220)を経て過剰血漿廃棄溜め(221)に捨てられる。更に、第2の回転軸(214)を中心として1000G以上の遠心力を印加すると(216)に秤量用溜めてあった血漿はキャピラリバルブ(222)を介して、基板(202)に設けられた複数の流路に導入される。
【００３０】
前述のキャピラリバルブに関しては、Nam-Trung Nguyen とSteven T. Wereleyの著作による「Fundamentals and Applications of Microfludics」(発行所:Artech House (Boston・London) 2002)の315ページに述べられている。簡単に説明すると、細管(キャピラリ)に溶液が存在する時、細管の軸方向の一端の延長上に回転軸があり、細管の他端に溶液が表面張力で溜まっているとすると、その回転軸を中心に回転すると、小さい遠心力ではこの溶液は細管の他端からは吐出しないが、遠心力を増していくと遂に表面張力を勝り、溶液が吐出する。従って、遠心力の大小がバルブの働きをするのでキャピラリバルブと呼ぶ。溶液が細管から吐出する最小の回転数fmは、溶液が回転軸から、回転軸側の細管半径R1と吐出側の半径R2の間に存在し、溶液が細管から吐出する時の溶液の細管に対する接触角をθ、表面張力をγ、細管の半径をR、溶液の密度をρとすると、以下の関係にある。
【００３１】
fm2 ＞γcosθ/R・ρ・π2・(R2-R1)(R2+R1)
25℃の水のγは72×10-3[N/m]であり、PETを基板として用いた場合、水との接触角θは80度となり、水のρは1×103[kg/m3]なので、これらの値を用いると、この式から、R2を5cm、キャピラリバルブの長さ、つまり(R2-R1)を0.5cm、その直径(2R)を100μm程度に形成すれば、fmが約1000回転/秒以上の時に血漿が秤量用血漿溜めからドライケミストリー試薬流路に流れ込む。この時の重力加速度は60G以上となる。
【００３２】
ドライケミストリーでは少なくとも2種類の反応系がある。その一つはクレアチニンや
尿素窒素の測定と、他一つはグルコース、γ-GTP、GOT、GPTや総コレステロールなどの測定である。前者の測定は、まずクレアチニンの場合は、クレアチニンデイアミラーゼ、尿素窒素の場合はウレアーゼの各酵素との反応でアンモニア(NH3)ガスが発生し、そのNH3ガスは各々ブロムクレゾールグリーンやブロムフェノールブルーと反応して発色させる2段
階の反応を用いる。一方、上記の他の被検物質は、それぞれの反応に応じての酵素と発色試薬を含有したゲルと一段階の反応で検出する。そこで、(223)はNH3の検出用流路を示し、(224)はNH3以外の検査項目用流路を示し、それぞれ上述のゲルが満たされている。
【００３３】
図7は、NH3以外の検査項目用流路を設けた積層基板の構造を示す。最上層基板(201)の
孔(225)と孔(226)は各々、当該ゲルの導入口と排出口であり、導入口の径は排出口の径より大きく、試薬を含有したゲルの導入はマイクロディスペンサーで行われる。導入口と排出口は、(223)と(224)の2つの異なる反応系の流路に注入し、内部を満たした後の余分な
ゲルを排出するためと、血漿がゲル中に遠心力で導入されると、ゲルの種類にもよるが、2〜5倍に膨潤するため、膨潤したゲルを外部に排出するための孔である。また、流路(224)の長手方向の両端には45度の傾斜壁(227)が形成されている。その内壁はアルミ膜がスパッタ蒸着され、第３層基板(203)、第４層基板(204)、最下層基板(205)に貫通孔(228)を設け、その中にファイバー(229)が挿入され、その端面が流路の45度の傾斜壁の下方に留める。アルミ膜(230)を流路(224)の内壁にスパッタ蒸着する方法は、まず最上層基板(201)と第２層基板(202)を接触させ、第２層基板(202)の裏面からアルミをスパッタ蒸着し、流路以外の部分のアルミ膜はCMP(化学的機械研磨)によって除去する。次に、第２層基板(202)から最上層基板(201)を除去して、第２層基板(202)と第３層基板(203)を接触させ、最上層基板(201)の上方からアルミをスパッタ蒸着し、流路以外の部分のアルミ膜はCMPによって除去する。なお、アルミの他、光が流路から外部に逃げず、流路内で効率よく反射する材料であるならば金属の他いかなる材料でも良い。ファイバー(229)には、(231)のハロゲンランプやタングステンランプから(232)のバンドパスフィルターを介して発色した波長の光を導入し、 (233)の受光器によってその減衰度を測定する。
【００３４】
図８は、アンモニアガス検出用の流路(223)を含む多層の流路構造を示す。第３層基板(203)には、アンモニアガスを通す役割の直径5μm〜50μm程度の多数の孔(234)が設けられている。この多数の孔を設けた領域の面積は第２層基板(202)に設けたアンモニアガス発生用試薬を収容された流路(223)と同じ面積を有する。この孔領域(234)はドライケミストリーの展開層の役目も果たす。図４にはその鳥瞰図を示す。当該孔の作成法は、大きい径の場合は、ステインレスや高分子製のメッシュや射出成型で形成可能だが、小さい径の場合はシリコン基板にディープエッチングで形成される。多数の孔(234)を通過したNH3ガスは、第４層基板(204)と最下層基板(205)に形成した図８で述べた流路に導入される。流路内壁へのアルミ膜のコーティング形成法は前述と同様である。流路(235)はアンモニアガスと反応して発色する試薬を含有したゲルが導入される。ここで、(236)は45度の傾斜壁、(237)アルミ膜、(238)ファイバー用貫通孔、(239)はファイバー、(240)と(241)はそれぞれアンモニアガス反応発色試薬含有ゲルの注入孔と排出孔である。ランプ、バンドパスフィルター、受光器などの光学部品の図示は省いた。
【００３５】
第２実施態様
図９〜図１２は、複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板示す。一般に、診断にとっては基本的に必要なpHやNa+、K+、Cl―、Ca++などイオンの濃度測定も必要であり、pHはアンペロメトリ、Na+とK+とCl―とCa++の各濃度はポテンシオメトリによる電気化学的方法によって測定される。従って、比色センサーと電気化学センサーの両方を一つの基板に集積化し、一度の採血で測定することが望ましい。この比色センサー群にはNH3検出用の比色センサーを構成が煩
雑になるので搭載しなかったが、NH3を検出する場合は、図2〜図６と同様にNH3ガスの発
生層が追加される。
【００３６】
図９は最上層(501)、図１０は第2層(502)、図１１は第3層(503)、図１２は最下層(504)であり４枚の基板からなる。図2〜図６と同様に図９〜図１２の各積層基板に設けられた孔(505)は、(506)の円柱が孔(505)へ挿入されることによって、最下層(504)の上に第３層(503)、第３層(503)の上に第2層(502)、そして第2層(502)の上に最上層(501)が接続され、各基板は接着剤などにより接着される。まず、第２層基板(502)では、図３と同様に、無痛針(507)からステインレス管(508)を経て  (509)のガラス管に接続され、ガラス管(509)に血液が採取される。採血は、開いた概ねU字管(510)に第１の回転軸(511)を中心に遠心力によって導入され、更に遠心を続けると、第１の回転軸(511)を見て外側に血球分画が、内側に血漿分画が分離され、血球分画は血球溜め(512)に溜められる。(513)は血球がU字管に戻ることを防ぐ柱である。次に、第2の回転軸(514)を中心に遠心力を印加すると、上清の血漿が一旦血漿溜め(515)に導入される。更に、回転を続けると、血漿搬送案内流路(516)を経て、更に60G以上の重力加速度の遠心力によってキャピラリバルブ(517)を通過して血漿秤量用血漿溜め(518)と血漿導入用流路(519)に導入される。その際、血漿秤量  用血漿溜め(518)の側壁に秤量後の余分な血漿を廃棄血漿搬送案内流路(520)を経て  廃棄血漿溜め(521)に廃棄される。血漿導入用流路(519)の直下には血漿展開層(522)が設けられ、一旦血漿を平板上に拡大した。ここで、(523)はドライケミストリー比色法のセンサー領域を示し、(524)は電気化学センサー法センサー領域を示す。電  気化学センサーは測定前に較正しなければならず、(525)は較正液の導入口、(526)  は較正液導入案内流路、(527)は較正後廃液案内流路、(528)は較正後廃液の廃液口を示す。
【００３７】
図１１に示すように、血漿展開層(522)の直下に、第３層(503)に図4と同様に直径5μm
〜50μm程度の多数の孔を設けた領域(529)を形成し、この領域の面積と位置は血漿展開層(522)と一致させる。ここで、(530)はドライケミストリー比色法のセンサー領域を示し、(531)は電気化学センサー法センサー領域を示す。
【００３８】
図１２に示すように、最下層(504)には、血漿展開層(522)の直下の同位置に、同面積のドライケミストリー試薬注入比色測定用流路(532)、(533)、(534)、(535)が接合される。これらの流路の内壁は、図7で述べた方法に準じてアルミなどの光を反射させる金属がコ
ートされている。(536)と(537)はそれぞれドライケミストリー試薬の注入口と排出口である。ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路(531)の長手方向の側壁の一端には測定
光の入射口(538)と他端には流路を伝播した後の射出口(539)が設けられ、各口にはファイバー(540)と(541)が接続され、測定光の入射と受光光への射出の役割を果たす。両ファイバーはドライケミストリー試薬注入比色測定用流路(532)〜(535)の長手方向の中心軸と一致して基板(504)に設けられる。試薬の発色による導入光の減衰度を光ダイオードなどに
よるフォトディテクターにより検出する。
【００３９】
血漿展開流路(522)からの血漿はその直下にある多数の孔が形成された領域(529)を通してドライケミストリー用試薬用流路(532)〜(535)と電気化学センサー領域(542)に導入
されるが、その導入に用いる遠心力は孔と直角方向にあり、垂直方向には遠心力が働かない。しかし、血漿溜め用流路の遠心力が印加される方向の端が壁となり、また血漿溜め用流路に血漿が満たされているため、遠心力によって圧力を受けた血漿が下部の孔へ導入されることになる。このように遠心力を用いるだけで血漿をドライケミストリー用試薬用流路(532)〜(535)と電気化学センサー領域(542)に導入できる。
【００４０】
(532)〜(535)の流路の長手方向の長さが異なって示されている理由を以下に述べる。試薬をゲルに分散させる際、試薬とゲルとを馴染ませるためには各試薬に適したゲルが必要であるが、各種のゲルが血漿と反応するとゲルの膨潤度が異なり、通常、ゲルは通常2倍
から約5倍程度に膨潤する。そこで、ドライケミストリー用試薬用流路(532)〜(535)は、
秤量され供給された血漿と最大限にゲルと反応させるため最適な長さで設計されなければならない。試薬を含有したゲルの注入口と排出口の(536)と(537)は、流路の容積を越えて膨潤したゲルを外部に排出する役目も果たしている。しかし、膨潤した全量に特定光を導入してその減衰度を測定でき、S/N比の大きい測定値が得られるが、逆に減衰度が大き過
ぎて測定が困難になる場合もあり、流路が基板に占める面積が大きくなり基板面積が拡大する。
【００４１】
一方、図３におけるNH3の検出用流路(223)とNH3以外の検査項目用流路(224)は同じ面積と体積で示した。大きく膨潤した試薬に対しては、導入試薬が排出孔から排出されるため、測定光の減衰度が小さく、S/N比の低い測定になるが、使用者の被検成分の濃度を予め知っておくことや測定可能なドライケミストリー試薬を調製しておくことにより、一定容積の流路でも多項目の被検成分濃度の測定が可能になる。現実の基板では両発明を併用する。
【００４２】
(542)は電気化学センサー領域である。(543)はAg／AgCl電極であり、その上にNa+やK+
イオン用のイオノフォアを含むセンサー膜が塗布されている。(544)はKCl飽和Ag／AgCl参照電極であり、これらの電極は銀カーボン配線(545)に設けられ、(546)は信号取り出し用の外部電極である。
【００４３】
図１３は電気化学センサー領域(542)の図１２に一点斜線で示した構造の断面を示す。
電気化学センサーは血漿導入前にまず較正される。その後、第２層(502)に設けられた血
漿搬送案内流路(516)を経て、更に60G以上の重力加速度の遠心力によってキャピラリバルブ(517)を通過して血漿秤量用血漿溜め(518)と血漿導入用流路(519)と血漿展開層(522)に導入され、多数の孔が形成された領域(529)を通して電気化学センサー領域(542)に導入される。ここで、(547)はイオノフォア膜、(548)はKCl飽和Ag／AgCl参照電極のKClが電解液に溶失するのを防止する膜である。
【００４４】
第１実施例
＜グルコース測定＞
図2〜図６を基にした血液分析装置を用いて、グルコース測定を行った例を示す。測定
原理は、試料に発色試薬を作用させると、試料中のグルコースは発色試薬中に含まれるムタロターゼの作用によりα型からβ型へすみやかに変換する。β-D-グルコースは、グル
コースオキシダーゼ(GOD)の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成し
た過酸化水素は、共存するペルオキシダーゼ(POD)の作用により、発色試薬中のフェノー
ルと4-アミノアンチピリンとを定量的に酸化縮合させ、赤色(505nm)の色素を生成させる
。この赤色の吸光度を測定することにより試料中のグルコース濃度を求める。
【００４５】
ドライケミストリー試薬として、(1)黒かびAspergilius niger由来のグルコースオキシダーゼを1.8U、(2)1,7-ジヒドロオキシナフタレンを0.03mg(0.188μmol)、(3)4-アミノアンチピリンを0.1mg(0.492μmol)、(4)ペルオキシダーゼを0.13U、(5)ムタロターゼ（ブタ腎臓由来）を0.065Uの粉末を混合し、燐酸緩衝液に溶解させる。次に、その溶解液をゼラチンに全てを含有させ、ゼラチンゲルを形成する。これをドライケミストリー試薬注入比色測定用流路に注入する。当該比色測定用流路は0.4mm×0.4mmの断面積で長さは1mmであ
った。その中に前述のゲルを注入し、更に0.2μLのブドウ糖標準液をグルコース濃度を0mg/dlから600mg/dlに変化させた。この流路に505nmの光を入射させて得られた吸光度を図14に示す。この結果より良好に検出されたことが分かる。
【００４６】
第２実施例
＜尿素窒素測定＞
図７〜図12を基にした血液分析装置を用いて、尿素窒素測定を行った例を示す。
【００４７】
尿素窒素(H2NCONH2)は水の存在下でウレアーゼの作用でNH3とCO2に分解され、このNH3
はブロムクレゾールグリーンと反応して青色(620nm)色素を生じる。尿素測定は以下のよ
うに測定された。デンプンーアクリルニトリルからなる吸水性ポリマー10mgに2mLのウレ
アーゼ溶液を含ませたゲル状のものを0.4mm×0.4mmの断面積で長さは1mmのNH3発生用流路に注入した。発色剤は、エタノール2mLにブロムクレゾールグリーン(BCG)3%(重量比)を溶いたものに、イソプロビルアルコール20mLとその5%重量比のPVB(ポリビニールブチラール)1.28mgを合わせて溶かし込んだものを調製し、発色用流路に注入した。多数の孔が形成された基板の厚さは1.2mmであった。図15は、10mgから50mgの尿素標準液を作製し、620nmの光を入射したときの吸光度を示す。この結果より良好に検出されたことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】従来のドライケミストリーを用いた診断チップの構造を示す図である。
【図２】血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最上層基板を模式的に例示した図である。
【図３】血液検査装置を構成する各積層基板のうち、全血導入、血球・血漿分離、血漿の搬送、血漿の秤量、キャピラリバルブ、ドライケミストリー試薬導入流路、及びアンモニアガス発生試薬導入流路などからなる第２層基板を模式的に例示した図である。
【図４】血液検査装置を構成する各積層基板のうち、アンモニアガス展開用の多数の孔などからなる第３層基板を模式的に例示した図である。
【図５】血液検査装置を構成する各積層基板のうち、アンモニアガス反応発色剤試薬導入流路などからなる第４層基板を模式的に例示した図である。
【図６】血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最下層基板を模式的に例示した図である。
【図７】アンモニアガス検出以外の検査項目用流路を設けた積層基板の構造を示す図である。
【図８】アンモニアガス検出用の流路(223)を含む多層の流路構造を示す図である。
【図９】複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最上層基板を模式的に例示した図である。
【図１０】複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、第２層基板を模式的に例示した図である。
【図１１】複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、第３層基板を模式的に例示した図である。
【図１２】複数の比色センサーと複数の電気化学センサーを一つの基板に集積化した血液検査装置を構成する各積層基板のうち、最下層基板を模式的に例示した図である。
【図１３】電気化学センサー領域の図12に一点斜線で示した構造の断面を示す図である。
【図１４】ブドウ糖標準液中のグルコース濃度に対する吸光度の関係を示す図である。
【図１５】尿素標準液の尿素濃度変化に対する吸光度の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００４９】
101試薬スライド透明支持体(プラスチックフィルム)
102分析反応に必要な試薬を含有した試薬層
103反射層
104展開層
105血漿や血清の検体
106スリット
107プラスチック製マウント
201最上層基板
202第2層基板
203第3層基板
204第4層基板
205最下層基板
206基板接続用孔
207基板接続用孔を貫通する円柱
208ステインレス管製針
209ステインレス管
210ガラス管
211血液搬送案内流路
212第１の回転軸
213複数の血液溜め溝
214第2の回転軸
215血液搬送案内溝
216秤量用血漿溜め
217空気導入孔
218案内溝
219空気導入孔
220過剰血漿案内流路
221過剰血漿廃棄溜め
222キャピラリバルブ
223アンモニアガスの検出用流路
224アンモニアガス以外の検査項目用流路
225ゲルの導入口
226ゲルの排出口
22745度の傾斜壁
228貫通孔
229ファイバー
230アルミ膜
231ハロゲンランプやタングステンランプ
232バンドパスフィルター
233受光器
234多数の孔
235アンモニアガス反応発色剤含有流路
23645度の傾斜壁
237アルミ膜
238ファイバー用貫通孔
239ファイバー
240注入孔
241排出孔
242ガラス管挿入孔
501最上層
502第2層
503第3層
504最下層
505基板接続用貫通孔
506貫通孔に挿入される円柱
507無痛針
508ステインレス管
509ガラス管
510概ねU字管
511第１の回転軸
512血球溜め
513血球逆流防止用柱
514第2の回転軸
515血漿溜め
516血漿搬送案内流路
517キャピラリバルブ
518血漿秤量用血漿溜め
519血漿導入用流路
520廃棄血漿搬送案内流路
521廃棄血漿溜め
522血漿展開層
523ドライケミストリー比色法のセンサー領域
524電気化学センサー法センサー領域
525較正液の導入口
526較正液導入案内流路
527較正後廃液案内流路
528廃液口
529多数の孔を設けた領域
530ドライケミストリー比色法のセンサー領域
531電気化学センサー法センサー領域
532ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路
533ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路
534ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路
535ドライケミストリー試薬注入比色測定用流路
536注入口
537排出口
538測定光の入射口
539射出口
540ファイバー
541ファイバー
542電気化学センサー領域
543Ag／AgCl電極
544KCl飽和Ag／AgCl参照電極
545銀カーボン配線
546信号取り出し用の外部電極
547イオノフォア膜
548KCl溶失防止膜
549  ガラス管挿入孔
【図１】
2006058093.tif 000003
【図２】
2006058093.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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