(57)【要約】      （修正有）【課題】複数種類の遺伝子が混在する中で特定種類の遺伝子を増幅することなくその分子数カウントして高精度な定量を行うこと、及び定量下限濃度を低減して定量をより高感度化すること。【解決手段】3’末端に位置する第1の領域と、5’末端に位置第2の領域と、検出用プローブに対応する第3の領域を含むポリヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1の領域の3’末端と前記第2の領域の5’末端をライゲーションして、環状化ポリヌクレオチドを得る工程と、前記環状化ポリヌクレオチドを鋳型として、プライマーの伸長反応を行う工程と、前記伸長反応産物の一本鎖部分に繰返し現れる前記第3の領域に相補な配列に、前記第3の領域と同一の配列を含む検出用プローブをハイブリダイズさせる工程と、前記伸長反応産物にハイブリダイズした検出用プローブの量を光学的に定量することにより、前記標的核酸を定量する。【選択図】図１
2006333739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3’末端に位置して標的核酸に相補な配列を有する第1の領域と、5’末端に位置して前記標的核酸に相補な配列を有する第2の領域と、検出用プローブに対応する第3の領域を含むポリヌクレオチドを前記標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1の領域の3’末端と前記第2の領域の5’末端とをライゲーションして、環状化ポリヌクレオチドを得る工程と、
前記環状化ポリヌクレオチドを鋳型として、その一部に相補な配列を有するプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて前記プライマーからの伸長反応を行う工程と、
前記伸長反応産物の一本鎖部分に繰返し現れる前記第3の領域に相補な配列に、前記第3の領域と同一の配列を含む検出用プローブをハイブリダイズさせる工程と、
前記伸長反応産物にハイブリダイズした検出用プローブの量を光学的に検出して、前記標的核酸を定量する工程とを含む核酸分析方法。
【請求項２】
前記検出用プローブが一方の末端が蛍光体で、他方の末端が消光体で標識されたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出用プローブが蛍光体で標識されたものであって、遊離の検出用プローブは、当該検出用プローブに特異的にハイブリダイズし、かつ消光体で標識された消光用プローブによって消光されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記消光用プローブは前記検出用プローブに対して、長さが1〜5塩基短いものであるか、あるいは1又は2塩基のミスマッチを有するものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記伸長反応の産物に検出用プローブをハイブリダイズさせた後で、前記消光用プローブを遊離の検出用プローブにハイブリダイズさせることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記消光用プローブは、前記検出用プローブよりも過剰に加えられることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド上において前記第3の領域と重複しない任意の第4の領域に対し、前記第4の領域と同一の配列を含むオリゴマーを用意し、前記オリゴマーを前記伸長反応産物にハイブリダイズさせた後で、前記検出用プローブを前記産物にハイブリダイズさせることを特徴とする請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴマー、前記検出用プローブ、及び前記消光用プローブの3'末端は伸長反応が起きないように修飾されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて2種以上の標的核酸を同時に分析する方法であって、
前記標的核酸に対し、3’末端に位置して標的核酸に相補な配列を有する第1の領域と、5’末端に位置して前記標的核酸に相補な配列を有する第2の領域と、検出用プローブに対応する第3の領域を含むポリヌクレオチドを各々ハイブリダイズさせる工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1の領域の3’末端と前記第2の領域の5’末端とをライゲーションして、環状化ポリヌクレオチドを得る工程と、
前記環状化ポリヌクレオチドを鋳型として、その一部に相補な配列を有するプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて前記プライマーからの伸長反応を行う工程と、
前記伸長反応産物の一本鎖部分に繰返し現れる前記第3の領域に相補な配列に、前記第3の領域と同一の配列を含む検出用プローブをハイブリダイズさせる工程と、
前記伸長反応産物にハイブリダイズした検出用プローブの量を光学的に検出して、前記2種以上の標的核酸を定量する工程を含む核酸分析方法。
【請求項１０】
以下の(1)〜(4)を含む、核酸分析用キット：
(1)3’末端に位置して標的核酸に相補な配列を有する第1の領域と、5’末端に位置して前記標的核酸に相補な配列を有する第2の領域と、任意の第3の領域とを含む60〜200塩基長のポリヌクレオチド
(2)ライゲース
(3)鎖置換型DNAポリメラーゼ
(4)前記第3の領域と同一の配列を含み、一方の末端が蛍光体で、他方の末端が消光体で標識された15〜30塩基長の検出用プローブ。
【請求項１１】
前記(4)の検出用プローブに代えて、前記第3の領域と同一の配列を含み、その末端が蛍光体で標識された15〜30塩基長の検出用プローブと前記検出用プローブに特異的にハイブリダイズし、かつ消光体で標識された15〜30塩基長の消光用プローブを含む、請求項１０に記載の核酸分析用キット。
【請求項１２】
前記消光用プローブは前記検出用プローブに対して、長さが1〜5塩基短いものであるか、あるいは1又は2塩基のミスマッチを有するものであることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の核酸分析用キット。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド上において、前記第3の領域と重複しない第4の領域に対し、これと同一の配列を含む15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は単分子計測による核酸分析法とそのためのキットに関する。より詳細には、標的遺伝子（標的核酸）の分子数に応じてRCR産物を生成させ、生成したRCR産物に蛍光プローブを特異的に結合させて、光学的に検出することにより分子数をカウントする核酸分析方法とそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定遺伝子の発現量を高感度・高精度、かつ広範なダイナミックレンジで分析することは、遺伝子の機能解析、疾病の研究や診断において極めて重要な役割を果たす。例えば感染症診断では、感染拡大の回避や効果的な治療のため、初期段階で感染ウイルス遺伝子を定量する必要がある。また製薬分野では、創薬ターゲットを同定したり、新薬の薬効を評価するため、疾病特異的に変動する遺伝子の発現量を定量する必要がある。
【０００３】
遺伝子発現量を調べる方法としては、リアルタイムPCR法（非特許文献1）が知られている。リアルタイムPCR法は、標準試料と検体中に存在する標的遺伝子をそれぞれ別の反応容器でPCR増幅し、それらの増幅効率を比較して間接的に標的遺伝子を定量する方法である。しかし、標的遺伝子の配列や試料中に含まれる夾雑遺伝子の配列によっては増幅阻害などの影響を受けるため、増幅効率は実験毎にばらつきが生じ、定量の精度が低下することがある。
【０００４】
定量精度がばらつく原因は増幅過程にあるため、高精度な定量を行うには、増幅操作の不要な単分子計測を用いることが有効である。単分子計測とは、検体溶液中の標的遺伝子を蛍光体で標識してレーザ照射により可視化し、蛍光標識された標的遺伝子を1個ずつ識別しながら直接計測する方法である。標的遺伝子を増幅せずに計測体積中の分子数をカウントすることで、高精度な定量が可能となる。蛍光標識された標的遺伝子を識別する方法としては、エバネッセント照射法（非特許文献２）や、共焦点照射法（特許文献1）を利用した方法が知られている。
【０００５】
エバネッセント照射法は、理想条件下では1分子に1つの蛍光体を標識しただけでも単分子計測可能なレーザ照射法である。この方法では、セル表面から厚さ50 nm程度の近傍のみを照射するため、視野50 μm×50 μmの画像を毎秒1回取得すると、10分間の計測体積は7.5×10-11 Lである。単分子計測では、原理的に計測体積中に1分子あれば計測できるため、定量下限濃度は10-14mol/Lとなる。また、共焦点照射法では、同様に計算すると10分間の計測体積は1.0×10-14 Lとなり、定量下限濃度は10-9mol/Lとなる。これに対してリアルタイムPCR法では、増幅操作2時間のうちに10 μLの検体を測定するが、検体中に10分子あれば増幅できるため、定量下限濃度は10-18mol/Lとなる。つまり、エバネッセント照射法や共焦点照射法では計測体積が小さいことが原因で、リアルタイムPCRと比べて定量下限濃度が4桁あるいは8桁高くなる。従って、単分子計測を用いて高精度な遺伝子定量を実現するためには、計測体積を増大して定量下限濃度をリアルタイムPCRと同等にする必要がある。
【０００６】
単分子計測の計測体積を増大することができる照射法として、シート状レーザビームの横入射法が報告されている(非特許文献３)。この方法では、レーザの厚さが20 μmの時、視野50 μm×50 μmの画像を毎秒1回取得し10分間計測することで、エバネッセント照射法の約400倍に相当する3.0×10-8Lを計測することができる。更に視野を250 μm×250 μmに拡大することで計測体積を増大し、リアルタイムPCRと同等の定量下限濃度まで定量することも可能となる。しかし一方で、レーザ強度密度の低下や、計測体積の厚さ方向の増大による背景光の強度上昇が原因で、エバネッセント照射法に比べて単分子計測の感度が低下する問題がある。従って横入射法の単分子計測を行うには、標的遺伝子の1分子に対して特異的にかつ複数の蛍光体を標識し、検出可能にすることが必要である。また、この報告では、蛍光体としてYOYOを用いているが、YOYOはDNAに対して5塩基に1個の割合で非特異的に結合する蛍光体であるため、標的遺伝子特異的な標識は不可能である。そのため、特異性を持たせるためには、モレキュラービーコンや蛍光プローブなどを標的遺伝子にハイブリダイズさせて特異的に標識する必要がある。
【０００７】
さらに、高精度な定量を行うためには、標的遺伝子に結合した蛍光体のみが蛍光を発し、フリーの蛍光体は蛍光を発しないことが望ましい。
【０００８】
1分子に複数の同じ蛍光体を標識する方法としては、RCR（Rolling circle replication）法が知られている（特許文献２）。この方法で得られるRCR産物には、プローブ結合サイトが繰返し存在するため、RCR産物1分子は複数の蛍光体で標識される。RCR反応では、標的遺伝子に対してRCR産物が1：1で生成するため、RCR産物に対して単分子計測による分子のカウントを行うことで、標的遺伝子を定量することが可能となる。RCR法の応用例として、例えばLizardiらは、SNPs検出を固相RCR反応により行い、野生型と変異型由来のRCR産物をそれぞれ異なる蛍光体の蛍光プローブで標識し、洗浄操作を行った後に単分子計測を行い、その存在比を分子のカウンティングによって計測することで、相対的な定量を行っている（非特許文献４）。また、Blabらは、RCR産物を蛍光プローブで標識し、大過剰のフリーの蛍光プローブが存在する溶液中でホモジニアスな単分子計測を行っている（非特許文献５）が、パドロックプローブに対して過剰のターゲットを混合しているため、ターゲットの定量を行うことはできない。
【０００９】
【特許文献１】特表  2002-528714号公報
【特許文献２】米国特許  第5,854,033号公報
【非特許文献１】Klein et al., Electrophoresis, 1999, 20, 291-299
【非特許文献２】Funatsu et al., Nature., 1995, 374, 555-559
【非特許文献３】Anazawa et al., Anal. Chem, 2002, 74, 5033-5038
【非特許文献４】Lizardi et al., Nature Genetics, 1998, 19, 225-232
【非特許文献５】Blab et al., Anal. Chem, 2004, 76, 495-498
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のとおり、従来の方法では高精度かつ高感度な遺伝子定量（核酸定量）を実現することができなかった。本発明の課題は、こうした従来技術の問題点を解決し、複数種類の遺伝子が混在する中で特定種類の遺伝子を増幅することなくその分子数カウントして高精度な定量を行うこと、及び定量下限濃度を低減して定量をより高感度化することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
1つの蛍光体で標識された対象分子を計測する従来の単分子計測は、計測体積が小さく定量下限濃度が高くなるため、実際の定量には使用できなかった。この問題を解決するため、横入射法による単分子計測を用いて計測体積を増大させると、レーザ密度の低下やバックグラウンドの上昇などにより、対象分子を1つの蛍光体で標識しただけでは検出ができなくなる。つまり、対象分子1分子に対して複数個の蛍光体を標識し、対象分子1分子あたりの蛍光強度を増大する必要がある。そこで、本発明ではRCR法を用いて1分子に複数の同じ蛍光体を標識することで、横入射法による単分子計測に適応可能な蛍光強度を得ることを可能とした。
【００１２】
すなわち、本発明は、3’末端に位置して標的核酸に相補な配列を有する第1の領域と、5’末端に位置して前記標的核酸に相補な配列を有する第2の領域と、検出用プローブに対応する第3の領域を含むポリヌクレオチドを前記標的核酸にハイブリダイズさせる工程と、前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1の領域の3’末端と前記第2の領域の5’末端とをライゲーションして、環状化ポリヌクレオチドを得る工程と、前記環状化ポリヌクレオチドを鋳型として、その一部に相補な配列を有するプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて前記プライマーからの伸長反応を行う工程と、前記伸長反応産物の一本鎖部分に繰返し現れる前記第3の領域に相補な配列に、前記第3の領域と同一の配列を含む検出用プローブをハイブリダイズさせる工程と、前記産物にハイブリダイズした検出用プローブの量を光学的に定量する工程とを含む、核酸定量方法を提供する。
【００１３】
後述するように、前記検出用プローブには通常のモレキュラービーコンを用いてもよいし、蛍光プローブをこれに対応する消光プローブとともに用いてもよい。さらに、前記ポリヌクレオチド上の任意の領域（前記第3の領域とは重複しない第4の領域）と同一の配列を含むオリゴマーを、前記伸長反応産物の高次構造解消用に利用してもよい。
【００１４】
具体的には、本発明ではある既知体積中の標的遺伝子に対して過剰のパドロックプローブを作用させて標的遺伝子に対応した環状化パドロックプローブを生成させる。この環状化パドロックプローブにプライマーをハイブリダイズさせてRCR反応を行い、生成したRCR産物を特異的に蛍光標識する。分子の損失を防ぎ定量精度を保つため、BF分離は行わずにホモジニアス系で単分子計測を行い、蛍光標識されたRCR産物1分子を識別しながら分子数のカウンティングを行う。計測は横入射法を用いて10分間での計測体積を3.0×10-8L程度以上とし、10-18 mol/L程度の定量下限濃度を達成する。RCR産物は標的遺伝子に対応して生成されるため、RCR産物の分子数が分かれば標的遺伝子の分子数も分かり、標的遺伝子の定量が可能となる。これにより、複数種類の遺伝子が混在する中で特定の遺伝子を増幅することなく分子数カウントして高精度定量を行うことが可能となる。
【００１５】
本発明の方法では、標的遺伝子（標的核酸）を認識するパドロックプローブは、5'末端で標的遺伝子の塩基配列を認識する第１の塩基配列部分と、3'末端で標的遺伝子の塩基配列を認識する第2の塩基配列部分とプライマーがハイブリダイズする部分のほかに、モレキュラービーコンと同じ配列である第3の塩基配列部分を有する。標的遺伝子が存在すると、パドロックプローブは、当該標的遺伝子の配列を認識して標的遺伝子にハイブリダイズし、その後ライゲーション反応によって環状化されて環状化パドロックプローブとなる。この環状化パドロックプローブにプライマーがハイブリダイズして伸長することによりRCR反応が進行する。RCR産物は環状パドロックプローブを鋳型として、プライマーからの伸長鎖が、プローブ上を回転するように、既に合成された鎖を剥がしながら連続的に伸長することで生成する1本鎖核酸である（図１参照）。このため、RCR産物には第3の塩基配列に相補な塩基配列が繰り返し含まれる。よって、第3の塩基配列と同一の塩基配列を有するモレキュラービーコン（5'末端が蛍光体で標識されている）をRCR産物にハイブリダイズさせることにより、RCR産物は複数個の蛍光体で標識されることになる。
【００１６】
上記パドロックプローブは標的遺伝子を認識する配列部分以外は任意に設計でき、パドロックプローブに含まれる第3の塩基配列、つまりモレキュラービーコンと同じの塩基配列は標的遺伝子の配列に依存することなく任意に設計することができる。また、プライマーの配列も標的遺伝子の配列に依存することなく任意に設計することができる。パドロックプローブ中でプライマーがハイブリダイズする配列と第3の塩基配列は連続していても良いし、それぞれの部分の間に連結部があっても良い。以上の構成と機能から、パドロックプローブの好適な長さは60〜200塩基長程度となる。
【００１７】
RCR産物を標識するプローブとして、第3の塩基配列を持つモレキュラービーコンの代わりに、第3の塩基配列を持つ蛍光プローブと、第3の塩基配列の一部に相補な塩基配列を持つ消光プローブを用いてもよい。蛍光プローブの3'末端には蛍光体が標識されているため、RCR産物と蛍光プローブがハイブリダイズすることによりRCR産物は複数個の蛍光プローブで標識されることになる。RCR産物の標識後、蛍光プローブの一部と相補な塩基配列、つまり第3の塩基配列の一部と相補な塩基配列を有する消光プローブを、RCR産物にハイブリダイズしていない蛍光プローブにハイブリダイズさせる。消光プローブの5'末端には消光体が標識されているため、消光プローブとハイブリダイズした蛍光プローブの3'末端に位置する蛍光体には消光体が近接して蛍光が消光される。その結果、RCR産物にハイブリダイズしていない蛍光プローブ由来の蛍光は消光され、RCR産物にハイブリダイズした蛍光プローブのみ発光させることで、バックグラウンドを抑えたホモジニアスな単分子計測が可能となり、標的遺伝子の定量が可能となる。
【００１８】
上記方法では、第3の塩基配列の一部に相補な塩基配列を持つ消光プローブは、反応液中に存在する過剰の蛍光プローブを消光するために添加されるが、消光プローブの配列は第3の塩基配列と完全に相補な塩基配列ではなく、一部にミスマッチ塩基対を導入しておいてもよい。ミスマッチ塩基対を含む蛍光プローブと消光プローブとのハイブリダイゼーションの熱安定性は、ミスマッチ塩基対を含まない蛍光プローブに比べて低くなる。従って消光プローブは、RCR産物とハイブリダイズした蛍光プローブとは結合せず、反応液中に存在している過剰のフリーの蛍光プローブとだけハイブリダイズして、RCR産物の標識に関与していない蛍光プローブ由来の蛍光を優先的に消光することになる。こうしたミスマッチは、消光プローブ内に1若しくは2塩基導入しうる。
【００１９】
同様の効果は、消光プローブの塩基配列を1乃至5塩基短くして、ハイブリダイゼーションの熱安定性に差をつけて、消光プローブがRCR産物とハイブリダイズしている蛍光プローブを剥がさないようにしてもよい。
【００２０】
遊離の蛍光プローブを確実に消光するために、消光プローブは蛍光プローブとPCR産物とのハイブリダイゼーションが開始した後に加えられることが好ましく、また蛍光プローブよりも過剰に、例えばモル比で蛍光プローブの２倍以上加えられることが好ましい。
【００２１】
第3の塩基配列を持つ蛍光プローブや、モレキュラービーコンは3'末端を蛍光体あるいは消光体で標識されているため、若しくはリン酸化、ダイデオキシ化することにより、ハイブリダイズ後に伸長することがないようにする。また第3の塩基配列の一部に相補な塩基配列を持つ消光プローブの3'末端も、第3の塩基配列を持つ蛍光プローブとハイブリダイズした後に伸長することがないように、3'末端を消光体で標識するか、リン酸化あるいはダイデオキシ化しておく。
【００２２】
本発明の方法で生成するRCR産物は1本鎖核酸であるため、分子内で水素結合を形成することにより高次構造を形成する可能性がある。そこで、パドロックプローブに含まれる第4の塩基配列と同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを高次構造解消オリゴマーとして用いてもよい。高次構造解消オリゴマー存在下では、RCR産物と高次構造解消オリゴマーがハイブリダイズするため、RCR産物の高次構造が解消される。
【００２３】
第4の塩基配列と同じ配列を有する高次構造解消オリゴマーは、RCR産物にハイブリダイズするように設計されているが、ハイブリダイズ後に伸長しないように3'末端をリン酸化あるいはダイデオキシ化しておく。これにより、本発明で用いられる蛍光プローブ、消光プローブ、高次構造解消オリゴマーはいずれも伸長することがなく、そのためRCR産物生成を阻害することはない。
【００２４】
また、本発明で用いられる、モレキュラービーコン、蛍光プローブ、消光プローブ、高次構造解消オリゴマーはいずれも15塩基長〜30塩基長程度が好ましい。
【００２５】
複数遺伝子同時解析において、各遺伝子に対応した複数のモレキュラービーコン（あるいは、蛍光プローブと消光プローブ）を用いる場合、モレキュラービーコン間（あるいは、蛍光プローブ間と消光プローブ間）のクロスハイブリダイゼーションを防止するためモジュールシャッフリング配列（特開2000-106900）を採用してもよい。また、各遺伝子に対応した複数のプライマーや、複数の高次構造解消オリゴマーを用いる場合も、同様の理由からモジュールシャッフリング配列にすることができる。
【００２６】
本発明は、上記単分子計測のための蛍光強度測定用プローブキットも提供する。本発明のキットは標的遺伝子を認識するパドロックプローブ、パドロックプローブ中に含まれる第3の塩基配列と同じ配列をもつモレキュラービーコン、RCR産物を生成するためのプライマー、を必須の要素として構成される。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、RCR反応を用いることで1分子に複数の蛍光体を標識することができ、横入射法によりレーザの照射体積を拡大し計測体積を大きく保った状態において、十分な感度で単分子計測することが出来る。これにより単分子計測による標的遺伝子の定量が可能となり、従来のリアルタイムPCRと同等の定量下限濃度で標的遺伝子を高精度に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
1.  パドロックプローブ、モレキュラービーコンの設計
図1は本発明によるRCR産物の蛍光標識を模式的に示した図である。1は標的遺伝子であり、2は標的遺伝子を認識するパドロックプローブである。パドロックプローブ2は、標的遺伝子に5'末端でハイブリダイズする配列部分3、3'末端でハイブリダイズする配列部分4と、検出時に用いるモレキュラービーコン11中の配列と同一の配列からなる配列部分5と、プライマー13がハイブリダイズする配列部分7を含む。配列部分3と配列部分4はそれぞれパドロックプローブの5'末端と3'末端に位置するように設計され、ハイブリダイズした標的遺伝子上でライゲーションすることによりプローブを環状化する。
【００２９】
前記配列部分3、4、5、7はプローブ上連続していても良いし、それぞれの間に連結部があってもよい。配列部分3及び配列部分4の長さは、特に限定されないが、それぞれ好ましくは15〜30塩基長程度である。配列部分5の長さも特に限定されないが、好ましくは15〜30塩基長程度である。配列部分7の長さも特に限定されないが、好ましくは15〜30塩基長程度である。配列部分3及び配列部分4は標的遺伝子に応じて配列を設計しなおす必要があるが、配列部分5、7は標的遺伝子の配列によらず、任意に設計でき、全ての標的遺伝子に共通に使用することができる。なお、以上の構成と機能から、パドロックプローブの好適な長さは60〜200塩基長程度となる。
【００３０】
モレキュラービーコン11はパドロックプローブ2の配列部分5と同じ配列を持ち、5'末端に蛍光体16を、3'末端に消光体36を有するように設計する。プライマー13は、パドロックプローブ2の配列部分7と相補な配列を有するように設計する。
【００３１】
２．  パドロックプローブの環状化
前記パドロックプローブは、標的遺伝子上の特定配列を認識してハイブリダイズした後、前記配列部分3と配列部分4のライゲーションを行うことで環状化される。標的遺伝子は、当該分野で公知の方法に従いRNAからcDNAへ変換しておく。検出したい標的遺伝子がDNAの場合はそのまま用いることができる。図1に示すように所定の反応液中の標的遺伝子1に対して、設計したパドロックプローブ2を接触させ、ライゲースを加えて35〜45℃で30〜60分程度インキュベートすることでパドロックプローブは環状化され、環状化パロドックプローブ15となる。
【００３２】
環状化パドロックプローブ15は、標的遺伝子を認識する配列部分3及び配列部分4で、標的遺伝子1とハイブリダイズし、検出時に用いるモレキュラービーコン11中の配列と同一の配列からなる配列部分5と、プライマー13がハイブリダイズする配列部分7をそれぞれ含んでいる。
【００３３】
３．  RCR反応と標識
次に、前項で作成された環状化パドロックプローブ15に対して、RCR産物を生成するためのプライマー13と、RCR産物を検出するためのモレキュラービーコン11を加え、所定の反応液中で鎖置換型DNAポリメラーゼと基質を加えてRCR反応を行う。鎖置換型DNAポリメラーゼによって、プライマー13の3'末端は環状化パドロックプローブ15を鋳型として、この鋳型プローブ上を回転するように、既に合成された鎖を剥がしながら連続的に伸長してRCR産物21を生成する。反応の進行に伴い、RCR産物21には、配列部分5に相補な配列部分25が繰り返し合成され、含まれるようになる。モレキュラービーコン11は、配列部分25にハイブリダイズする。
【００３４】
モレキュラービーコン11は、図1中にFで示す蛍光体16とQで示す消光体36で標識されている。蛍光体16と消光体36は、モレキュラービーコン11のそれぞれ5'末端と3'末端のどちらに標識されていてもよい。なお用いられる蛍光体としては、例えば、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシフェールイエロー（Lucifer yellow）、ローダミン、BODIPY、テトラメチルローダミン、Cy3、Cy5、Cy7、イオシン、テキサスレッド、ROX、FAM、及びVIC等が挙げられる。消光体としては、BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABMI、メチルレッド、4−（4’−ジメチルアミノフェニルアザ）−安息香酸（DABCYL）等が挙げられる。なお、消光体もそれ自体は一種の蛍光体である。すなわち、蛍光体のうちあるものは、他の蛍光体に接触するとその蛍光を吸収して消光する機能を有する。よって、前記した蛍光体及び消光体の中から、一方（蛍光体）が発した蛍光を他方（消光体）が吸収する適切な組み合わせを選び、蛍光体及び消光体として使用する。
【００３５】
RCR産物を検出するための標識は、図2に示すように、配列部分5を持つ蛍光プローブ14を用いて行っても良い。蛍光プローブ14は、RCR産物に繰返し含まれる配列部分25とハイブリダイズする。RCR産物21に蛍光プローブ14がハイブリダイズした後、消光プローブ31を反応溶液中に加える。消光プローブ31は蛍光プローブ14の配列部分5に相補な配列部分の一部、つまり配列部分25の一部の配列部分35を含んでいる。また、消光プローブ31は図中にQで示す消光体36で標識されている。消光体としては、前述のモレキュラービーコンで用いることのできるものを、消光体として使用できる。
【００３６】
ここで、消光プローブ31は、蛍光プローブ14とRCR産物21のハイブリダイゼーションを阻害しないように、Tm値が3〜15℃、好ましくは5℃程度低くなるように設計する。Tm値を低く設計するために、図3(a)や図3(b)に示すように消光プローブ31の長さを蛍光プローブ14よりも1〜5塩基短くしたり、図3(c)や図3(d)に示すように消光プローブ31を構成する配列部分35を、蛍光プローブ14を構成する配列部分5と完全に相補な配列でなく、一部にミスマッチ塩基38を1乃至2塩基導入して両プローブ間にミスマッチ塩基対を形成するように設計しても良い。
【００３７】
図3(a)や図3(c)のように蛍光プローブ14の5'末端に蛍光体16が標識されている場合には、消光プローブ31の3'末端に消光体36を標識して、蛍光プローブ14と消光プローブ31がハイブリダイズした場合に、蛍光体16と消光体36が近接して蛍光エネルギートランスファーにより蛍光体16の蛍光が消光されるようにする。一方、図3(b)や図3(d)のように、蛍光プローブの3'末端に蛍光体16が標識されている場合には、消光プローブ31の5'末端に消光体36を標識して、蛍光プローブ11と消光プローブ31がハイブリダイズした場合に、蛍光体16と消光体36が近接して蛍光エネルギートランスファーにより蛍光体16の蛍光が消光されるようにする。
【００３８】
図3(a)や図3(c)のように、蛍光体16が蛍光プローブ14の5'末端に標識されている場合には、蛍光プローブ14はDNAポリメラーゼによって伸長しないように、その3'末端はリン酸化又はダイデオキシ化といった末端修飾37がなされている。一方、図3(b)や図3(d)のように蛍光体16が、蛍光プローブ14の3'末端に標識されている場合には、前述のような末端修飾を施さなくても、蛍光プローブ14はDNAポリメラーゼによって伸長することはない。
【００３９】
同様に、図3(b)や図3(d)のように、消光体36が消光プローブ31の5'末端に標識されている場合には、消光プローブ31はDNAポリメラーゼによって伸長しないように、その3'末端にはリン酸化又はダイデオキシ化といった末端修飾37が必要となる。一方、図3(a)や図3(c)のように消光体36が、消光プローブ31の3'末端に標識されている場合には、末端修飾を施さなくて、消光プローブ31はDNAポリメラーゼによって伸長しない。
【００４０】
RCR産物21は1本鎖DNAであるため、分子内で高次構造を形成し、蛍光標識効率を低減させるおそれがある。こうした高次構造化は、図4に示す高次構造解消オリゴマー12を用いて解消することができる。図4に示すように、パドロックプローブ2には、あらかじめ高次構造解消オリゴマー12と同一の配列からなる配列部分6が含まれるように設計する。配列部分6の長さは特に限定されないが、好ましくは15〜30塩基長程度である。これにより、パドロックプローブを鋳型として生成するPCR産物中には、高次構造解消オリゴマー12に相補な配列26が繰り返し含まれることになる。
【００４１】
図4に示すように、高次構造解消オリゴマー12は、RCR産物21中に繰り返し含まれる前記配列部分26にハイブリダイズし、RCR産物21内に複数の2本鎖構造を形成する。その結果、RCR産物21は分子内結合による高次構造形成が不可能となり、蛍光プローブ14は配列部分25に効率よくハイブリダイズする。なお、高次構造解消オリゴマー12の3'末端は予めリン酸化又はダイデオキシ化して、DNAポリメラーゼによって伸長しないようにしておく。高次構造解消オリゴマー12は、図1のようにモレキュラービーコン11でRCR産物を標識する際にも同様に用いることができる。
【００４２】
４．  計測
RCR産物の計測は図5に示すような装置を用いて行う。レーザ光源41から発振したレーザビーム51は、2つのシリンドリカルレンズ42によりシート状に形成されたレーザビーム52となり、角型キャピラリ43を横方向から照射する。角型キャピラリ43中の蛍光標識サンプル61はシート状に形成されたレーザビーム52によって励起され、蛍光を発する。蛍光は、角型キャピラリ43の上面に設置された対物レンズ44とフィルタ45を通り、CCDカメラ46により画像として取得される。取得された画像はPC47に転送されて記録され、データとして解析される。角型キャピラリの内径は50 μm×50 μm、シート状レーザビームの幅は50μm、シート状レーザビームの厚さは20 μmであるため、CCDカメラで毎秒1回画像を取得すると、計測体積は5×10-11 L/secとなる。取得した画像中の分子数をカウントし、ある一定の計測体積中の分子数から、試料中の標的遺伝子の濃度を求めることができる。
【００４３】
５．  複数標的遺伝子の同時解析
次に、2種類以上の標的遺伝子を同時に解析する方法について説明する。複数の標的遺伝子を同時に解析する場合には、複数のパドロックプローブとモレキュラービーコン（又は蛍光プローブと消光プローブ）を設計する必要がある。
【００４４】
図6(a)は、複数標的遺伝子を同時解析する場合に用いるパドロックプローブの構造を模式的に示したものである。図には2種の標的遺伝子を同時解析する場合のパドロックプローブ71、81を図示した。パドロックプローブ中の標的遺伝子を5'末端で認識する配列部分72、82、標的遺伝子を3'末端で認識する配列部分73、83、蛍光プローブと同一の配列部分74、84、をそれぞれ異なる配列を有するように設計する。高次構造解消オリゴマーと同一の配列部分75と、プライマーがハイブリダイズする配列部分76は同じでも良いし、異なっていてもよい。
【００４５】
図6(b)は、複数標的遺伝子を同時解析する場合に用いる蛍光プローブの構造を模式的に示したものである。蛍光プローブ91、101はそれぞれパドロックプローブに含まれる配列部分74、84と同一配列からなるため、標的遺伝子ごとに異なる。蛍光プローブ91、101には、図中F1とF2で示される互いに異なる蛍光体92、102が標識されている。
【００４６】
図6(c)は、複数標的遺伝子を同時解析する場合に用いる消光プローブの構造を模式的に示したものである。消光プローブ111、121もパドロックプローブに含まれる配列部分74、84とそれぞれ相補な配列からなるため、標的遺伝子ごとに異なる。消光プローブ111、121には、図中F1とF2で示される蛍光体92、102をそれぞれ消光する作用のある消光体112、122が標識されている。蛍光体92、102を1種類の消光体で消光できる場合には、消光体は1種類でよいが、蛍光体によって消光体の消光効率は異なるため、蛍光体F1、F2に最適な消光体が異なる場合には、消光体Q1、Q2は異なる種類の消光体であっても良い。
【００４７】
複数標的遺伝子を同時解析する場合に用いる高次構造解消オリゴマーとプライマーは同じでも良いし、異なっていても良い。解析手順は図1に示す手順と同じであり、以下の工程からなる。複数種類の標的遺伝子に対して複数のパロドックプローブを加えて環状化し、プライマーを添加してRCR反応を行うことにより複数種類のRCR産物を同じ容器内で生成させる。その後、複数種類の高次構造解消オリゴマーでRCR産物の高次構造形成を防ぎつつ、複数種類の蛍光プローブでそれぞれRCR産物を標識し、複数種類の消光プローブでそれぞれ過剰の蛍光プローブを消光させる。これらの工程を行い、図7に示す複数の蛍光波長を識別して検出できる装置を用いて計測を行う。
【００４８】
図7に複数の蛍光波長を識別して検出する装置の検出部の構成を示す。蛍光標識サンプル61からの蛍光は、キャピラリ131の上面に設置された対物レンズ44とフィルタ45を通り、ビームスプリッタ132により二つに分けられ、片方の蛍光は波長分散されずにレンズ133で結像されてCCDカメラ46で画像（非波長分散像）として取得され、もう片方の蛍光はプリズム134により波長分散されてから別のレンズ133で結像されて、別のCCDカメラ46で画像（波長分散像）として取得される。これらの非波長分散像と波長分散像の位置関係、及び波長分散像の蛍光強度分布より、発光蛍光の蛍光スペクトルを取得することで蛍光体の識別を行う。それぞれの蛍光体で標識された分子数をカウントすることで2種類以上の標的遺伝子を同時に定量する。
【００４９】
複数遺伝子同時解析において、各遺伝子に対応した複数のモレキュラービーコン（あるいは、蛍光プローブと消光プローブ）を用いる場合、モレキュラービーコン間（あるいは、蛍光プローブ間と消光プローブ間）のクロスハイブリダイゼーションを防止するためモジュールシャッフリング配列（特開2000-106900）を採用してもよい。また、各遺伝子に対応した複数のプライマーや、複数の高次構造解消オリゴマーを用いる場合も、同様の理由からモジュールシャッフリング配列にすることができる。
【００５０】
モジュールシャッフリング配列とは、両末端の塩基が同一である3乃至4塩基長の複数のモジュール配列同士の順序を入れ替えて構成された複数の配列を意味する。モジュールシャッフリング配列を有するオリゴヌクレオチド（あるいはポリヌクレオチド）同士は、同じ反応特性でそれぞれの標的遺伝子にハイブリダイズする。例えば、遺伝子A及びBに対応する２つのプローブAとプローブBの配列が、それぞれ3塩基乃至4塩基のモジュール配列から構成されるものとする。プローブAとプローブBを構成するモジュール配列の数は、特に限定されないが、一般的には5〜8程度である。前記各モジュール配列の両末端の塩基は同じ塩基種で構成される。またプローブAの配列は、プローブBの配列と同じ両末端の塩基を有するモジュール配列同士の順番を入れ替えて構成される。両末端の塩基種が同じモジュール配列同士の順番を入れ替えているため、モジュール配列同士の連結部分の塩基配列はプローブAとプローブBで同じである。また、プローブ配列を構成するモジュールはプローブAとプローブBで同じである。これにより、プローブAとプローブBの熱力学的性質は等価になり、それぞれのTm値はnearest neighbor法で計算すると同一の値となる。すなわち、プローブAとプローブBは全体の配列は異なるが、実質的に同じTm値を有し、同一反応チューブで、同時に反応させても、それぞれの相補的な配列に対して同じ反応特性でハイブリダイズすることが可能となる。よって、これらのプローブを定量分析に用いる場合のクロスハイブリダイゼーションを防止して、より厳密な分析が可能となる。以上は、2種類のプローブの設計について説明したが、3種以上の場合も同様にして設計することができる。
【００５１】
６．キット
上記の通り、標的遺伝子の配列を認識するパドロックプローブを用いて、標的遺伝子の有無に対応してパドロックプローブを環状化させ、環状化したパドロックプローブにプライマーをハイブリダイズさせてRCR反応を行い、生成したRCR産物をモレキュラービーコンで標識し、これを単分子計測することでRCR産物の分子数をカウントして、標的遺伝子を定量することが可能となる。別の標的遺伝子を検出する場合には、パドロックプローブの標的遺伝子を認識する配列だけを変更すれば良い。プライマー、モレキュラービーコンは標的遺伝子の塩基配列とは無関係であるため、標的遺伝子によらずユニバーサルに使用できるものとすることができる。
【００５２】
すなわち、本発明はこれらユニバーサルに利用できるプライマー、プローブを含む核酸定量用キットを提供する。キットは、１種類の標的遺伝子解析用のものであってもよいし、複数種類の標的遺伝子解析用のものであってもよい。キットの必須構成要素である、パドロックプローブ、プライマー、モレキュラービーコンの特徴や構造は上記のとおりである。
【００５３】
本発明のキットは、必須構成要素である前記パドロックプローブ、プライマー、モレキュラービーコンのほか、遺伝子定量解析に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。そのようなものとしては、例えば、酵素（鎖置換型DNAポリメラーゼ）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、核酸基質、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を挙げることができる。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
【００５４】
また本発明のキットは、モレキュラービーコンの代わりに蛍光プローブと消光プローブが含まれていてもよい。また本発明のキットには、高次構造解消オリゴマーが含まれていてもよい。
【００５５】
キットはまた、本発明の前述した本発明の単分子計測による遺伝子定量を適切に実施するための表示を含む。そのような表示は、説明書としてキットに添付されるほか、パッケージの表面に記載されていても、シールの形態でパッケージ表面に貼付されていてもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
〔実施例1〕モデル標的遺伝子を用いた定量
本発明の方法を用いて、実際に高精度な定量が可能であることを確認した実施例を示す。
（1）試験方法
標的遺伝子のモデルとしてC型肝炎ウイルスの配列の一部を有するターゲットオリゴを用いて試験を行った。濃度をそれぞれ10-16 M、10-15M、10-14 M、10-13 Mに調製した既知濃度のターゲットオリゴに対して、パドロックプローブを作用させてライゲーション反応を行った。ライゲースとしてNEB社のLigaseを用いた。10 μlの反応用緩衝液を含む溶液中に、それぞれの濃度のターゲットオリゴ（配列番号1）と、HCV用パドロックプローブ（配列番号2）10 fmolを加えて、37℃で30分保温してライゲーション反応を行い、ライゲースを失活させて反応を止めた。次に、鎖置換型DNAポリメラーゼとしてNEB社のBst DNAポリメラーゼを用い、プライマー（配列番号3）、モレキュラービーコン（配列番号4）を用いて、RCR反応を行った。15 μlの反応用緩衝液と基質dNTPを含む溶液中に、先に合成した環状化パドロックプローブと、450 fmolのプライマー、5'末端をFAM、3'末端をBHQ1で標識された450 fmolのHCV検出用モレキュラービーコンを加えて65℃で90分間保温してRCR反応を行った。得られたサンプルを図5に示す計測装置を用いて測定し、標的とするターゲットオリゴの定量を行った。
ターゲットオリゴ：5'-GTA CCA CAA G GCC TTT CGC GAC CCA ACA CTA CTC GGC TAG CAG TCT CGC GGG GGC A-3'（配列番号1）
HCV用パドロックプローブ：5'-TGT TGG GTC GCG AAA GGC CCC TTCT CAC TGTT CTC TCAT AGAA GTG ATGA GGG AACA GAG CAC TCAT CTC TTCT CCC TGTT AGA CTG CTA GCC GAG TAG-3'（配列番号2）
プライマー：5'-CTC TGTT CCC TCAT CAC TTCT-3'（配列番号3）
HCV検出用モレキュラービーコン：5'-(FAM)-CGA CGT CCC TTCT CAC TGTT CTC TCAT CAG TCG-(BHQ1)-3'（配列番号4）
【００５８】
（2）結果
図8に、単分子計測によるRCR産物の分子カウント数と、濃度と計測体積（6.5×10-8 L）から計算したターゲットオリゴの計算分子数を示す。10-17M〜10-14 Mの濃度範囲において、単分子計測によるRCR産物の分子かウント数と、ターゲットオリゴの計算分子数が一致した結果となった。以上より、RCR反応を用いた横入射法による単分子計測を行うことで、ターゲットオリゴの高精度定量が可能となった。
【００５９】
〔実施例2〕C型肝炎ウイルスの定量検査
本発明の方法を用いて、未知濃度のC型肝炎ウイルスの定量を行った実施例を示す。
（1）試験方法
試料として、血液1 mLから抽出したtotal RNAをC型肝炎ウイルス(HCV)用の逆転写プライマー(配列番号5)を用いて逆転写して得られたcDNAを用いた。逆転写反応は、下記の逆転写用プライマー 2 pmolと血液から抽出したRNAとスーパースクリプトIIリバーストランスクリプターゼ（インビトロジェン社）を反応緩衝液に加え、42℃で50分間保温することで行った。その後、反応液中に残存するRNAを分解するために、リボヌクレアーゼHを反応液に加えて37℃で20分間保温した。
HCV用逆転写プライマー：5'-TGC TCA TGG TGC ACG GTC TA-3'（配列番号5）
【００６０】
次にライゲーション反応を行った。ライゲースとしてはNEB社のLigaseを用いた。10 μlの反応用緩衝液を含む溶液中に、先に合成した第一鎖cDNAと、実施例1で用いた（配列番号2）で示されるHCV用パドロックプローブ10 fmolを加え、37℃で30分保温してライゲーション反応を行い、その後、ライゲースを失活させた。さらに、鎖置換型DNAポリメラーゼとしてNEB社のBst DNAポリメラーゼを用い、実施例１で用いたプライマー（配列番号3）、実施例1で用いたHCV検出用モレキュラービーコン（配列番号4）を用いて、RCR反応を行った。15 μlの反応用緩衝液と基質dNTPを含む溶液中に、先に合成した環状化パドロックプローブと、450 fmolのプライマー、5'末端をFAM、3'末端をBHQ1で標識された450 fmolのHCV検出用モレキュラービーコンを加え、65℃で90分間保温してRCR反応を行った。反応後、得られたサンプルを図5に示す計測装置を用いて測定し、標的とするHCV遺伝子の定量を行った。
【００６１】
（2）結果
実施例1と同様に反応後の溶液を6.5×10-7 Lを計測した結果、図9に示すように分子数は356分子であった。これより抽出前の血液1mL中には、HCVウイルスが5340個存在していたことが分かった。
【００６２】
〔実施例3〕  蛍光プローブを用いたB型肝炎ウイルスの定量検査
本発明の方法において、図2に示すような蛍光プローブと消光プローブを用いて、B型肝炎ウイルス定量を行った実施例を示す。消光プローブは、蛍光プローブの配列と1塩基のミスマッチ塩基対を形成するように設計し、このミスマッチにより蛍光標識効率が向上することを確認した。
（1）試験方法
試料として、血液から抽出したDNAを用いて、前述のHBV用パドロックプローブ（配列番号6）の標的遺伝子へのハイブリダイズ及びライゲーション反応を行った。ライゲースとしてはNEB社のLigaseを用いた。10 μlの反応用緩衝液を含む溶液中に、抽出したDNAと、HBV用パドロックプローブ（配列番号6）10 fmolを加え、37℃で30分保温してライゲーション反応を行い、その後、ライゲースを失活させた。さらに、鎖置換型DNAポリメラーゼとしてNEB社のBst DNAポリメラーゼを用い、実施例１で用いたプライマー（配列番号3）、HBV検出用蛍光プローブ（配列番号7）を用いてRCR反応を行った。15 μlの反応用緩衝液と基質dNTPを含む溶液中に、先に合成した環状化パドロックプローブと、450 fmolのプライマー、5'末端をROXで標識された450 fmolのHBV検出用蛍光プローブを加えて65℃で90分間保温してRCR反応を行った。反応後、600 fmolのHBV用消光プローブを加えて、過剰のHBV検出用蛍光プローブを消光した。また、HBV用消光プローブとして、HBV検出用蛍光プローブにハイブリダイズする3種類のHBV用消光プローブ（それぞれ配列番号8、配列番号9、配列番号10）を用いて、その特性を比較した。なお、配列番号8で示す消光プローブは蛍光プローブと塩基長が同じであり蛍光プローブと完全にハイブリダイズするもの、配列番号9で示す消光プローブは、蛍光プローブと塩基長が同じであり蛍光プローブとハイブリダイズする際に1塩基のミスマッチ塩基対を形成するもの、配列番号10で示す消光プローブは、蛍光プローブよりも3塩基塩基長が短いものである。得られたサンプルを図5に示す計測装置を用いて測定し、B型肝炎ウイルスの定量を行った。
HBV用パドロックプローブ：5'-AC YTG TAT TCC CAT CCC A CCC TTCT CTC TCAT CAC TGTT AGAA GTG ATGA GGG AACA GAG CAC TCAT CTC TTCT CCC TGTT AG AAG GAG AGG AAA YTG C-3'（配列番号6）
HBV検出用蛍光プローブ：5’-(ROX)-CCC TTCT CTC TCAT CAC TGTT-3’（配列番号7）
HBV用消光プローブ：5’-AACA GTG ATGA GAG AGAA GGG-(BHQ2)-3’（配列番号8）
HBV用消光プローブ：5’-AACA GTG ATGA GCG AGAA GGG-(BHQ2)-3’（配列番号9）
HBV用消光プローブ：5’-A GTG ATGA GAG AGAA GGG-(BHQ2)-3’（配列番号10）
【００６３】
（2）結果
図10にROXで蛍光標識したRCR産物を、さまざまな消光プローブを用いて計測した画像を示す。画像は、視野50 μm×50 μmをCCDカメラで露光時間10 msecで撮影して取得したものである。図10(a)は、蛍光プローブとハイブリダイズする際にミスマッチ塩基対が形成されるように設計された消光プローブを用いて計測した画像、図10(b)は、蛍光プローブとミスマッチ塩基対を形成せずに完全にハイブリダイズするように設計された消光プローブを用いて計測した画像、図10(c)は、消光プローブの塩基長が蛍光プローブよりも短くなるように設計した消光プローブを用いて計測した画像、図10(d)は、消光プローブを加えずに計測した画像である。消光プローブを加えない場合には、反応液中に過剰に存在する蛍光プローブ由来の蛍光のため、バックグラウンドが高く、図10(d)のように蛍光標識サンプルを識別できない画像164となった。
【００６４】
一方、塩基長が蛍光プローブと同じであり、ミスマッチ塩基対を形成しないように設計された消光プローブを用いた場合には、蛍光プローブと消光プローブのハイブリダイゼーションの熱安定性は、RCR産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーションの熱安定性と同じになる。このため、RCR産物にハイブリダイズした蛍光プローブの一部が消光プローブとハイブリダイズして、蛍光プローブによる標識の効率が低くなり、図10(b)のように被標識物の蛍光強度が小さい画像162となった。
【００６５】
さらに、塩基長が蛍光プローブと同じであり、ミスマッチ塩基対を形成するように設計された消光プローブを用いた場合（図10(a)の場合）は、塩基長を蛍光プローブよりも短く設計した消光プローブを用いた場合（図10(c)の場合）と同様に、蛍光プローブと消光プローブのハイブリダイゼーションの熱安定性は、RCR産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーションの熱安定性よりも低くなる。このため、RCR産物にハイブリダイズした蛍光プローブが消光プローブとハイブリダイズすることはない。よって、RCR産物を効率的に蛍光プローブで標識でき、十分強い蛍光強度をもった画像161及び163が得られた。
【００６６】
ミスマッチを導入した消光プローブを用いた方法において、実施例1と同様に反応後の溶液6.5×10-7 Lを計測した結果、分子数は平均2493分子であった。これより抽出前の血液1mL中に含まれるB型肝炎ウイルス量を算出し、37395個と定量することできた。
【００６７】
〔実施例4〕  蛍光プローブと高次構造解消オリゴマーを用いたC型肝炎ウイルスの定量検査
本発明の方法を用いて、図4に示すように高次構造解消オリゴマーを用いることによって蛍光標識効率の効果が向上することを確認した実施例を示す。
（1）試験方法
実施例2と同様に、逆転写反応、パドロックプローブのハイブリダイゼーションとライゲーション反応を行った。さらに、鎖置換型DNAポリメラーゼとしてNEB社のBst DNAポリメラーゼを用い、実施例1で用いたプライマー（配列番号3）と、蛍光プローブ（配列番号11）、高次構造解消オリゴマー（配列番号12）を用いて、RCR反応を行った。15 μlの反応用緩衝液と基質dNTPを含む溶液中に、先に合成した環状化パドロックプローブと、450 fmolのプライマー、5'末端をFAMで標識された450 fmolのHCV検出用蛍光プローブ、450 fmolの高次構造解消オリゴマーを加えて65℃で90分間保温してRCR反応を行った。反応後、600 fmolのHCV用消光プローブ（配列番号13）を加えて、過剰のHCV検出用蛍光プローブを消光した。得られたサンプルを図5に示す計測装置を用いて測定し、標的とするC型肝炎ウイルスの定量を行った。
HCV検出用蛍光プローブ:5'-(FAM)- CCC TTCT CAC TGTT CTC TCAT-3'（配列番号11）
高次構造解消オリゴマー：5’- CAC TCAT CTC TTCT CCC TGTT-3’（配列番号12）
HCV用消光プローブ：5’-A GAG AACA GTG AGAA GGG-(BHQ1)-3’（配列番号13）
【００６８】
（2）結果
図11にFAMで蛍光標識したRCR産物を計測した画像を示す。画像は、視野50 μm×50 μmをCCDカメラで露光時間10 msecで撮影して取得したものである。図11(a)は、高次構造解消オリゴマーを加えて反応を行った試料を撮影したもの、図11(b)は、高次構造解消オリゴマーを加えずに反応を行った試料を撮影したもの、図11(c)は、消光プローブを加えずに計測した試料を撮影したものである。消光プローブを加えない場合には、反応液中に過剰に存在する蛍光プローブ由来の蛍光のため、バックグラウンドが高く、図11(c)のように蛍光標識サンプルを識別できない画像143となった。高次構造解消オリゴマーを加えない場合には、蛍光プローブによる標識の効率が低く、図11(b)のように被標識物の蛍光強度が小さい画像142となった。一方、高次構造解消オリゴマーを加えると図11(a)のように効率的に蛍光プローブで標識できるため、蛍光強度が十分強い感度で単分子計測できる画像141が得られた。以上より、高次構造解消オリゴマーによる標識効率改善の効果が確認できた。
【００６９】
高次構造解消オリゴマーを用いた方法において、実施例1と同様に反応後の溶液を6.5×10-7 Lを計測した結果、分子数は平均127分子であった。これより抽出前の血液1mLのC型肝炎ウイルスを1905個と定量できた。
【００７０】
〔実施例5〕  複数標的遺伝子の同時測定
本発明の方法を用いて複数の標的遺伝子を同時に解析した実施例を示す。なお標識には、2種類のモレキュラービーコンを用いた。
（１）試験方法
試料として異なる患者から採取した血液a、bを用いて、それぞれの血液から抽出したtotal RNAをHCV用の逆転写プライマーを行って得られたcDNAに、別途それぞれの血液から抽出したDNAを混合して用いた。逆転写反応は実施例2と同様の方法で行った。次いで、以下の2つのパドロックプローブを試料に混合してライゲーション反応を行った。パドロックプローブは実施例1で用いたHCV用パドロックプローブ（配列番号2）と、実施例3で用いたHBV用パドロックプローブ(配列番号6)で示すものを用いた。RCR反応は、実施例2と同様に行った。環状化したそれぞれのパドロックプローブに対して、共通にハイブリダイズしうるプライマー（配列番号3）を用い、それぞれのRCR産物に対して共通にハイブリダイズできる高次構造解消オリゴマー（配列番号12）を用いた。それぞれのRCR産物を標識するため、HCV由来の環状化パドロックプローブから生成されたRCR産物にハイブリダイズするHCV検出用モレキュラービーコン（配列番号4）を実施例1と同様に用い、HBV由来の環状化パドロックプローブから生成されたRCR産物にハイブリダイズする下記に示すHBV検出用モレキュラービーコン（配列番号14）を用いた。HBV検出用モレキュラービーコン（配列番号14）は、5’末端をROXで標識されている。得られたサンプルを図7に示す計測装置を用いて測定し、標的とするHCV及びHBV遺伝子の定量を行った。
HBV検出用モレキュラービーコン：5'-(ROX)- CGA CGT CCC TTCT CTC TCAT CAC TGTT ACG TCG -(BHQ2)-3'（配列番号14）
【００７１】
（2）結果
図12に示すように、血液aからはC型肝炎ウイルスが、血液bからはB型肝炎ウイルスが検出でき、それぞれの6.5×10-7L中の分子数は、532分子及び1301分子であった。従って、血液aの1 mL中にC型肝炎ウイルスが7980個、血液bの1 mL中にB型肝炎ウイルスが19515個存在していることが確認された。なお両サンプルとも、存在しないウイルスは図12にNCで記すネガティブコントロールと同レベルの検出であった。以上より、本発明の方法により、複数標的遺伝子を同時に単分子測定することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、高精度かつ定量下限濃度10-18 Mという高感度な定量が可能となる。本発明による、高精度かつ高感度な遺伝子定量法の実現は、信頼性の高い診断や治療効果の確認など、医療・創薬の分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号1−人工配列の説明：モデルターゲットオリゴ（HCVの一部の配列）
配列番号2−人工配列の説明：HCV用パドロックプローブ
配列番号3−人工配列の説明：RCR産物を生成するためのプライマー
配列番号4−人工配列の説明：HCV検出用モレキュラービーコン
配列番号5−人工配列の説明：HCV用逆転写プライマー
配列番号6−人工配列の説明：HBV用パドロックプローブ
配列番号7−人工配列の説明：HBV検出用蛍光プローブ
配列番号8−人工配列の説明：HBV用消光プローブ
配列番号9−人工配列の説明：HBV用消光プローブ
配列番号10−人工配列の説明：HBV用消光プローブ
配列番号11−人工配列の説明：HCV検出用蛍光プローブ
配列番号12−人工配列の説明：RCR産物の高次構造を解消するためのオリゴマー
配列番号13−人工配列の説明：HCV用消光プローブ
配列番号14−人工配列の説明：HBV検出用モレキュラービーコン
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図1は、モレキュラービーコンを用いてRCR産物を蛍光標識し、単分子計測を行いRCR産物の分子数をカウントして標的遺伝子の定量を行う手順を示した図である。
【図２】図2は、蛍光プローブRCR産物を蛍光標識し、消光プローブを用いて背景光を下げて単分子計測を行いRCR産物の分子数をカウントして標的遺伝子の定量を行う手順を示した図である。
【図３】図3は、蛍光プローブと消光プローブがハイブリダイズした際の二本鎖の関係を模式的に示した図である。
【図４】図4は、図2において高次構造解消オリゴマーを用いてRCR産物を蛍光標識する際の標識効率を向上させて、単分子計測を行いRCR産物の分子数をカウントして標的遺伝子の定量を行う手順を示した図である。
【図５】図5は、蛍光標識したRCR産物を検出する単分子計測装置の構成を模式的に示した図である。
【図６】図6は、複数標的遺伝子を同時解析する場合に用いるパドロックプローブの構造を模式的に示した図である。
【図７】図7は、複数の蛍光波長を識別して検出する装置の検出部の構成を模式的に示した図である。
【図８】図8は、様々な濃度のターゲットオリゴより生成したRCR産物に対して、単分子計測による分子数カウントを行った結果を示した図である。
【図９】図9は、C型肝炎ウイルスの定量結果を示したグラフである。
【図１０】図10は、ROXで蛍光標識したRCR産物をさまざまな消光プローブを用いて計測した画像である。
【図１１】図11は、FAMで蛍光標識したRCR産物を計測した画像である。
【図１２】図12は、2種類のウイルスを識別して定量した結果を示したグラフである。
【符号の説明】
【００７５】
1…標的遺伝子
2、71、81…パドロックプローブ
3、72、82…標的遺伝子に5’末端でハイブリダイズする配列部分
4、73、83…標的遺伝子に3’末端でハイブリダイズする配列部分
5、74、84…モレキュラービーコンの一部、又は蛍光プローブと同一の配列部分
6、75…高次構造解消オリゴマーと同一の配列部分
7、76…プライマーがハイブリダイズする配列部分
11…モレキュラービーコン
12…高次構造解消オリゴマー
13…プライマー
14、91、101…蛍光プローブ
15…環状化パドロックプローブ
16、92、102…蛍光体
21…RCR産物
25…配列部分5に相補な配列部分
26…配列部分6に相補な配列部分
31、111、121…消光プローブ
36、112、122…消光体
37…リン酸化又はダイデオキシ化などの末端修飾
41…レーザ光源
42…シリンドリカルレンズ
43…角型キャピラリ
44…対物レンズ
45…フィルタ
46…CCDカメラ
47…PC
51…レーザビーム
52…シート状レーザビーム
61…蛍光標識サンプル
131…キャピラリ
132…ビームスプリッタ
133…レンズ
134…プリズム
141…高次構造解消オリゴマーを加えた試料を計測した画像
142…高次構造解消オリゴマーを加えない試料を計測した画像
143、164…消光プローブを加えない試料を計測した画像
145、165…蛍光標識サンプルの蛍光強度の平均値を比較したグラフ
151…波長分散なしで取得した画像
152…波長分散してFAMに対応する蛍光を取得した画像
153…波長分散してROXに対応する蛍光を取得した画像
161…ミスマッチ消光プローブを用いて計測した画像
162…蛍光プローブと完全にハイブリダイズする消光プローブを用いて計測した画像
163…短い消光プローブを用いて計測した画像
164…コントロール画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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