(57)【要約】【課題】本発明は信頼性の高い定量測定を行うことができるＤＮＡ定量方法の提供を目的とする。【解決手段】被測定対象の１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡとを同時に増幅する増幅工程と、増幅された１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡにそれぞれ含まれ塩基配列が異なる１種類情の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を作製し、前記１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片の間で相互に識別可能となるように前記断片に標識物質を付加して標識化する標識化工程と、その標識化された１種類以上の１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を分離し、分離された１種類以上の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の各標準ＤＮＡの量に対する前記１種類以上の試料ＤＮＡの量の測定を行う測定工程とを有するように構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定対象の１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡとを混合して増幅する増幅工程と、
増幅された１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡにそれぞれ含まれ塩基配列が異なる１種類以上の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を作製し、前記１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片の間で相互に識別可能となるように前記断片に標識物質を付加して標識化する標識化工程と、
その標識化された１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を分離し、分離された１種類以上の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片に付加された前記標識物質に基づいて前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの量に対する前記１種類以上の試料ＤＮＡの量の測定を行う測定工程とを有するＤＮＡ定量方法。
【請求項２】
前記増幅工程、前記標識化工程または前記測定工程において、前記試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとを、所定の結合部位で担体に結合させ、前記測定工程における試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片の分離は、その担体を分離することによって行う請求項１に記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項３】
前記標識化工程は、前記１種類以上の試料ＤＮＡおよび１種類または複数種類の標準ＤＮＡを、相互に異なる塩基または塩基配列をもつ切断部位で切断することによって前記各試料ＤＮＡ断片および前記各標準ＤＮＡ断片を作製し、前記各切断部位に相補的な対をなす塩基または塩基配列を所定部位にもち、前記１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を相互に識別しうる標識物質を他の部位にもつ１種類以上の試料アダプターおよび１種類または複数種類の標準アダプターを多数作製し、前記試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片とライゲーションさせる請求項１または請求項２のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項４】
前記増幅工程において、前記１種類以上の各試料ＤＮＡは、配列上離れて位置する２箇所の既知の特定塩基配列を有し、前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡは、配列上離れて位置する２箇所の前記特定塩基配列と同一の特定塩基配列を有し、１の前記特定塩基配列と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および特異的結合物質対の一方を有するプライマーと、前記他の特定塩基配列と相補的な対をなす相補的特定塩基配列およびＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位を有するプライマーとを用いるものであり、前記標識化工程において、前記担体には、前記特異的結合物質対の他方を有しており、ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を加えることによって、前記各試料ＤＮＡと前記各標準ＤＮＡを前記切断部位で切断する請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項５】
前記担体は、多数の粒子である請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項６】
前記担体は、磁化されまたは磁化可能な磁気ビーズである請求項５に記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項７】
前記１種類以上の試料ＤＮＡと前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの長さは同一またはほぼ同一である請求項１ないし請求項６のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項８】
前記標識物質は、蛍光物質、燐光物質または化学発光物質等の発光物質、電磁波や光を吸収物質、これらの蛍光、発光物質、吸収物質を生成する反応を触媒する酵素、磁性体、またはこれらの蛍光、発光物質、磁性体、吸収物質もしくは酵素を固定化するために用いることができるビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、アビジンなどの物質など、短時間で２種類以上の物理量として判別測定を可能とする物質である請求項１ないし請求項７のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項９】
前記標識化工程は、前記各試料アダプターおよび各標準アダプターを等量加えることによってライゲーションさせる請求項１ないし請求項８のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項１０】
被測定対象の試料ＤＮＡであって、配列上離れて位置する２箇所の既知の特定塩基配列を有するものと、標準ＤＮＡであって、配列上離れて位置する２箇所の前記特定塩基配列と各々同一の特定塩基配列を有するものと、前記特定塩基配列の一方と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および特異的結合物質対の一方を有するプライマーと、前記特定塩基配列の他方と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および２箇所の前記特定塩基配列間にあって、前記試料ＤＮＡと標準ＤＮＡにおいて相互に異なる塩基または塩基配列に切断部位をもつＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法で増幅する増幅工程と、
前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を用いて前記切断部位で切断することによって、増幅された前記試料ＤＮＡ産物と前記標準ＤＮＡ産物にそれぞれ含まれ塩基配列が異なる試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片を作製し、前記各切断部位に相補的な対をなす塩基または塩基配列、および前記試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片を相互に識別しうる識別物質をもつ試料アダプターおよび標準アダプターを多数作製して、前記断片とライゲーションさせる標識化工程と、
前記標識化された試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片を分離し、分離された試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片の有する標識物質に基づいて前記標準ＤＮＡの量に対する前記試料ＤＮＡの量を測定する測定工程とを有するＤＮＡ定量方法。
【請求項１１】
前記標識化された試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片の分離は、増幅工程の後に、増幅された前記試料ＤＮＡ産物および前記標準ＤＮＡ産物を、標識化工程において、切断されて得られた前記試料ＤＮＡ断片および前記標準ＤＮＡ断片を、または標識化工程の後、標識化された該試料ＤＮＡ断片および該標準ＤＮＡ断片を、前記特異的結合物質対の他方を有する多数の粒子に結合させて、結合した該粒子を分離することによって行う請求項１０に記載のＤＮＡ定量方法。
【請求項１２】
前記増幅工程における前記プライマー対による増幅は、外側の第１のプライマー対を用いて増幅した後に、そのＰＣＲ産物を鋳型にして、前記第１のプライマー位置より、両側とも内側にある２箇所の前記特定塩基配列に対して第２のプライマーを設定して前記１種類以上の試料ＤＮＡと前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの増幅を行う請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載のＤＮＡ定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、微量ＤＮＡの定量的な解析を行う場合にＰＣＲ法が利用されている。近年、簡便で高速な定量法として、リアルタイムＰＣＲを用いた定量法が頻用されている（特許文献1）。しかし、この方法では、ＰＣＲを行いながら蛍光を測定するための特別な装置を必要とする。また、増幅産物が検出可能となるＰＣＲでのサイクル数（立ち上がり）によって試料ＤＮＡ量を推定することから、実験を行う際の条件を厳密に設定する必要があり、例えば、試料ＤＮＡの純度が異なる試料間では、ＰＣＲの各サイクルでの増幅度が異なり、この結果、非常に大きな誤差を生じることになる。これ以外のＤＮＡの定量方法としては、限界希釈法（非特許文献１）や競合的ＰＣＲ法（非特許文献文献２〜４）が開発されている。
【０００３】
限界希釈法は、ＰＣＲ反応容器当たりＤＮＡが1分子になるまで希釈し、その時の希釈度からＤＮＡの分子数の絶対数を計測する方法であり、絶対定量が可能であるという利点があるが、ＤＮＡの1分子を鋳型とするＰＣＲは、非特異的なＰＣＲ産物の生成を避けることが極めて困難であり、難易度が高いことから、ほとんど利用されていない。簡便的に行われている希釈法では、単にＰＣＲでの増幅ができなくなるまで希釈することによって行われているが、この方法では、1分子のＤＮＡの存在・非存在を判別しているわけではなく、結果がＤＮＡの純度や反応条件に大きく影響され、ＤＮＡ量の大まかな目安を算出する方法に過ぎない（非特許文献１）。
【０００４】
一方、正確な定量には競合的ＰＣＲ法が最も広く用いられている。従来の競合的ＰＣＲ法は、被測定対象となるＤＮＡと同一の塩基配列を両端に有するサイズや制限酵素分解パターンの異なる既知の量の競合ＤＮＡを用いて、同一のプライマーで増幅することによって定量解析を行うものである。その際，加える競合ＤＮＡの量を段階的に変化させて解析し、被測定対象のＤＮＡと、競合ＤＮＡのＰＣＲ産物量が等しくなる競合ＤＮＡ量を決定することによって被測定対象のＤＮＡ量を推定するもので、電気泳動法を利用して解析を行うものである。
【０００５】
この従来の競合的ＰＣＲ法では、放射性同位元素や蛍光物質等の標識物質を用いなくても実行可能であるため、ＤＮＡの定量的解析の実用に広く供されている（非特許文献２〜４）。
【０００６】
しかし、従来の競合的ＰＣＲ法は、前記被測定対象のＤＮＡと競合ＤＮＡのサイズや制限酵素分解パターンを異ならせることによって識別する方法であるが、サイズ等が異なるＤＮＡを同時にＰＣＲ法で増幅する場合、その増幅産物量は必ずしも増幅前の遺伝子量と相関しないことが定量的解析上の問題点となっていた。それは、わずかな増幅効率の差が増幅産物量に大きく影響するからである。また、増幅産物の蓄積による増幅効率の低下も問題となっていた。さらに、被測定対象ＤＮＡと競合ＤＮＡの同時増幅における相互作用があるという問題点をも有していた。また、従来の競合的ＰＣＲ法によって定量解析を行うには、電気泳動法を用いなければならず、作業に手間がかかるという問題点をも有していた。
【０００７】
また、電気泳動を用いずに競合的ＰＣＲの測定を行う簡便な方法として、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの間に２０から１００塩基の異なる領域を付加しておき、それぞれに特異的な標識オリゴヌクレオチドをプローブとすることにより、検出する方法があった（非特許文献５）。この方法は電気泳動を用いない点で簡便であるが、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの間で、高い特異性を持ったハイブリダイゼーションを行うための違いを導入しておく必要があり、この例で示されたように、実用的には２０塩基程度以上の長さあるいは配列が異なるＤＮＡ断片を用いる必要があることから、前述の増幅配列の違いによる増幅率の違いを最小にすることはできない。試料ＤＮＡと標準ＤＮＡの１塩基だけの違いによるハイブリダイゼーションも不可能ではないが、厳密なプローブと実験条件の設定が必要であり、高い特異性で判別可能であるかどうかの検証に時間と手間を要するばかりか、実験条件の微妙な違いによって結果が左右されるなど、信頼性が低いという問題点を有していた。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２１０１９９号公報
【非特許文献１】Quantitation oftargets for ＰＣＲ by use of limitingdilution. Biotechniques. 1992 Sep; 13(3): 444-9.
【非特許文献２】Becker-Andre,M. & Hahlbrock, K.: Absolute m RNA quantification using the polymerasechain reaction (ＰＣＲ). A novelapproach by a ＰＣＲ aidedtranscript titration assay (PAATY). Nucleic Acids Res., 17: 9437-9446, 1989
【非特許文献３】Gilliland, G.,Perrin, S., Blanchard,K.&amp;Bunn. H. F. : Analysis of cytokine m RNA and ＤＮＡ : Detection and Quantitation bycompetitive polymerase chain reaction. Proc. Natl. Axad. Sci. USA, 87:2725-2729, 1990
【非特許文献４】Siebert, P. D.& Larrick, J. W. : Competitive ＰＣＲ. Nature, 359: 557-558, 1992
【非特許文献５】H.Sobek,M.Greif,Hockett, R.、「ＰＣＲ標識と分析のアプリケーション」、RocheMolecular Biochemicals 「ＰＣＲアプリケーションマニュアル」第２版（1999）
【０００９】
なお、特許文献１は、多重化リアルタイム定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲによる定量を基本とし、複数の蛍光色素を用いることにより、2種以上のＤＮＡを同時に定量する方法）に関するものであり、その名称は、「高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ＰＣＲ」である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明が解決しようとする問題点は、前記被測定対象のＤＮＡの量を測定する場合に、被測定対象のＤＮＡと、競合ＤＮＡのサイズまたは制限酵素分解パターンを異ならせることによって識別することであり、それによる両者のＤＮＡにＰＣＲ法を適用した場合の増幅率が相違し、また電気泳動法を用いなければならない点である。
【００１１】
そこで、本発明の第１の目的は、被測定対象の試料ＤＮＡと、競合ＤＮＡに相当する標準ＤＮＡとの識別を行うにあたって、これらのＤＮＡのサイズや制限酵素分解パターンの相違に依拠しない識別を行うことにより正確な定量を実現することができるＤＮＡ定量方法を提供することである。
【００１２】
第２の目的は、用いる試料の精製度に影響されずに定量を行うことができるＤＮＡ定量方法を提供することである。
【００１３】
第３の目的は、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を利用して高感度化、広特異性化が可能となるＤＮＡ定量方法を提供することである。
【００１４】
第４の目的は、電気泳動法を使用する必要がなく容易であり、また、効率的かつ迅速に処理を行うことができるＤＮＡ定量方法を提供することである。
【００１５】
第５の目的は、処理の開始から終了まで一貫した自動化を可能とするＤＮＡ定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の発明は、被測定対象の１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡとを混合して増幅する増幅工程と、増幅された前記１種類以上の試料ＤＮＡと前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡ内にそれぞれ含まれ塩基配列が異なる１種類以上の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を作製し、その１種類以上の試料ＤＮＡ断片と１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片の間で相互に識別可能となるように前記断片に標識物質を付加して標識化する標識化工程と、その標識化された１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を分離し、分離された試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片に付加された前記標識物質に基づいて前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの量に対する前記１種類以上の試料ＤＮＡの量の測定を行う測定工程とを有するＤＮＡ定量方法である。
【００１７】
ここで、「試料ＤＮＡ」および「標準ＤＮＡ」の量は、両方とも未知であっても、試料ＤＮＡのみが未知であっても良い。両方とも未知の場合には、その両者の間の割合のみが測定されることになる。標準ＤＮＡの量が既知である場合には、試料ＤＮＡの絶対量を測定することができる。また、試料ＤＮＡ、標準ＤＮＡは、天然に得られたもの、ＰＣＲ法で増幅された産物、人工的に合成されたもの、または切断等の加工がされたものであっても良い。増幅前に標準ＤＮＡの量を測定するには、例えば、増幅前に、増幅されるべき標準ＤＮＡを精製して光学的濃度を測定することによって行う。さらに、前記試料ＤＮＡまたは標準ＤＮＡを得るために、別個独立に異なるＤＮＡ検体を鋳型としてＰＣＲ法で増幅し、さらに増幅した産物を鋳型としてＰＣＲ法で増幅して試料ＤＮＡまたは標準ＤＮＡを得るものであっても良い。この場合には、試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡをそれぞれ変異部位を有するＤＮＡを用いることによって、同一の長さおよび変異部位を除いて同一の塩基配列をもつＤＮＡであるので、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡの増幅の際の増幅率を同一にすることができる。したがって、信頼性の高い定量を行うことができる。
【００１８】
なお、試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡの塩基配列は、その一部が既知であれば良い。「増幅」は、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)法によって行われる。「塩基配列が異なる」とは、少なくとも１の塩基が異なれば足りる。「１種類以上の試料ＤＮＡ」であるので、１の塩基が異なる場合には、例えば、３種類の試料ＤＮＡと、１種類の標準ＤＮＡを用いることができる。２の塩基が異なる場合には、例えば、１５種類の試料ＤＮＡと１種類の標準ＤＮＡを用いることができる。「標識物質」は、塩基物質またはそれを配列した物質以外の標識を可能とする化学物質を含むものであって、例えば、発光物質、蛋白質等の物質を含むものである。
【００１９】
「測定」は、標識化に用いられた標識化物質の量、または、これらが発光物質である場合には、発光強度によって測定される。「量」は、質量または個数等で表すことができる。
「ＤＮＡ」は、ＤＮＡ，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ、およびｃＤＮＡ等の遺伝物質を含む。
「増幅」の程度は、容易な検出を可能にし、統計的誤差を無視することができる程度の多数、例えば、１０５〜１０１０程度以上に相当する量にまで行う。
【００２０】
第２の発明は、前記増幅工程、前記標識化工程または前記測定工程において、前記試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとを、所定の結合部位で担体に結合させ、前記測定工程における試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡの分離は、その担体を分離することによって行うＤＮＡ定量方法である。
【００２１】
「所定の結合部位」は、ＤＮＡ断片の５’末端の上流側に結合部位を設ける。結合部位としては、特異的結合物質対としては、例えば、抗原および抗体、ビオチンおよびアビジン、ストレプトアビジン等を用いる。
【００２２】
「担体」は、必ずしも粒子の場合に限られることなく、例えば、容器の内壁面もしくは内底面ピペットチップやノズルの内壁面や、プレートの表面のようなものであっても良い。
担体への固定は、前記標識化工程または前記測定工程において行うのが好ましい。標識化工程で担体への固定を行う場合には、固定化は試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片の作製の前後または標識化の前後を問わない。
【００２３】
第３の発明は、前記標識化工程は、前記１種類以上の試料ＤＮＡおよび１種類または複数種類の標準ＤＮＡを、相互に異なる塩基または塩基配列をもつ切断部位で切断することによって前記各試料ＤＮＡ断片および前記各標準ＤＮＡ断片を作製し、前記各切断部位に相補的な対をなす塩基または塩基配列を所定部位にもち、前記１種類以上の試料ＤＮＡ断片および１種類または複数種類の標準ＤＮＡ断片を相互に識別しうる標識物質を他の部位にもつ１種類以上の試料アダプターおよび１種類または複数種類の標準アダプターを多数作製し、前記試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片とライゲーションさせるＤＮＡ定量方法である。
【００２４】
ここで、「試料アダプター」および「標準アダプター」は、標識化を行うために前記試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片に前記切断部位において連結可能な物質であって、前記標識物質を有するものである。
【００２５】
第４の発明は、前記増幅工程において、前記１種類以上の各試料ＤＮＡは、配列上離れて位置する２箇所の既知の特定塩基配列を有し、前記１種類または複数種類の各標準ＤＮＡは、配列上離れて位置する２箇所の前記特定塩基配列と同一の特定塩基配列を有し、１の前記特定塩基配列と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および特異的結合物質対の一方を有するプライマーと、前記他の特定塩基配列と相補的な対をなす相補的特定塩基配列およびＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位を有するプライマーとを用いるものであり、前記標識化工程において、前記担体には、前記特異的結合物質対の他方を有しており、ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を加えることによって、前記試料ＤＮＡと前記標準ＤＮＡを前記切断部位で切断するＤＮＡ定量方法である。
【００２６】
ここで、２箇所の各特定塩基配列は少なくとも１の塩基をもつ必要があり、したがって、前記試料ＤＮＡの塩基配列のうち少なくとも２個の塩基は既知でなければならないことになる。
【００２７】
また、「ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素」は、切断部位と認識部位とが離れている場合に適用する制限酵素であって、好ましくは、切断部位と認識部位とが、ＰＣＲプライマーに影響を及ぼさない程度に離れているものである。さらに好ましくは、３塩基以上離れている場合で、理想的には、１０から２０塩基程度はなれているのが良い。なお、切断部位は、各ＤＮＡごとに必ずしも１の場合に限られることなく、複数の切断部位を持つようにしても良い。
【００２８】
用いられる「ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素」としては、例えば、Acu I, BceA I, Bpm I, BpuE I, BseR I, Bsg I, Eci I, Fau I, Mme I, Sap I, Ear I, Bbs I, Bbv I, BfuA I, Bsa I, BsmA I, BsmB I, BsmF I, BspM I, Fok I, SfaN I, Hga Iなどがある。
【００２９】
したがって、例えば、前記プライマー対の一方は、前記特定塩基配列と相補的な対をなす相補的特定塩基配列をその３’末端側に有し、その５’末端の上流側に特異的結合物質対の一方を有するものである。また、該プライマー対の他方は、前記他の特定塩基配列と相補的な対をなす相補的塩基配列を、その３’末端側に有し、その５’末端の上流側に前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位が挿入されているものである。
【００３０】
さらに、前記２箇所の前記特定塩基配列によって挟まれた試料ＤＮＡと標準ＤＮＡの長さおよび塩基配列は同一またはほぼ同一であることが好ましい。これによって、各ＤＮＡの増幅率を同一またはほぼ同一に保つことができる。
【００３１】
第５の発明は、前記担体は、多数の粒子であるＤＮＡ定量方法である。
【００３２】
第６の発明は、前記担体は、磁化されまたは磁化可能な磁気ビーズであるＤＮＡ定量方法である。
【００３３】
第７の発明は、前記１種類以上の試料ＤＮＡと前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの長さは同一またはほぼ同一であるＤＮＡ定量方法である。なお、塩基配列についても同一またはほぼ同一であることが好ましい。
【００３４】
第８の発明は、前記標識物質は、蛍光物質、燐光物質または化学発光物質等の発光物質、電磁波や光を吸収物質、これらの蛍光、発光物質、吸収物質を生成する反応を触媒する酵素、磁性体、またはこれらの蛍光、発光物質、磁性体、吸収物質もしくは酵素を固定化するために用いることができるビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、アビジンなどの物質など、短時間で２種類以上の物理量として判別測定を可能とする物質であるＤＮＡ定量方法である。
【００３５】
第９の発明は、前記標識化工程は、前記各試料アダプターおよび各標準アダプターを等量加えることによってライゲーションさせるＤＮＡ定量方法である。
【００３６】
第１０の発明は、被測定対象の試料ＤＮＡであって、配列上離れて位置する２箇所の既知の特定塩基配列を有するものと、標準ＤＮＡであって、配列上離れて位置する２箇所の前記特定塩基配列と各々同一の特定塩基配列を有するものと、前記特定塩基配列の一方と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および特異的結合物質対の一方を有するプライマーと、前記特定塩基配列の他方と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および２箇所の前記特定塩基配列間にあって、前記試料ＤＮＡと標準ＤＮＡにおいて相互に異なる塩基または塩基配列に切断部位をもつＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法で増幅する増幅工程と、
前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を用いて前記切断部位で切断することによって、増幅された前記試料ＤＮＡ産物と前記標準ＤＮＡ産物にそれぞれ含まれ塩基配列が異なる試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片を作製し、前記各切断部位に相補的な対をなす塩基または塩基配列、および前記試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片を相互に識別しうる識別物質をもつ試料アダプターおよび標準アダプターを多数作製して、前記断片とライゲーションさせる標識化工程と、
前記標識化された試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片を分離し、分離された試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片の有する標識物質に基づいて前記標準ＤＮＡの量に対する前記試料ＤＮＡの量を測定する測定工程とを有するＤＮＡ定量である。
【００３７】
第１１の発明は、前記標識化された試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片の分離は、増幅工程の後に、増幅された前記試料ＤＮＡ産物および前記標準ＤＮＡ産物を、標識化工程において、切断されて得られた前記試料ＤＮＡ断片および前記標準ＤＮＡ断片を、または標識化工程の後、標識化された該試料ＤＮＡ断片および該標準ＤＮＡ断片を、前記特異的結合物質対の他方を有する多数の粒子に結合させて、結合した該粒子を分離することによって行うＤＮＡ定量方法である。
【００３８】
第１２の発明は、前記増幅工程における前記プライマー対による増幅は、外側の第１のプライマー対を用いて増幅した後に、そのＰＣＲ産物を鋳型にして、前記第１のプライマー位置より、両側とも内側にある２箇所の前記特定塩基配列に対して第２のプライマーを設定して前記１種類以上の試料ＤＮＡと前記１種類または複数種類の標準ＤＮＡの増幅を行うＤＮＡ定量方法である。
【発明の効果】
【００３９】
第１の発明によれば、１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡとの識別をそのサイズや制限酵素分解パターンの相違に依拠していないので、各試料ＤＮＡと各標準ＤＮＡとを、その初期の量比を保ったまま増幅することができる。また、標識化は、増幅後に行うようにしているので、標識物質が増幅率に悪影響を与えることなく、信頼性の高い定量を行うことができるという利点がある。
【００４０】
また、本発明によれば、１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡの塩基配列の全てが既知であることを要求していないので、未知の塩基配列をもつ試料ＤＮＡに適用して、多様な処理を行うことができるという利点がある。
【００４１】
さらに、初期状態において微量な試料ＤＮＡしか手に入らなくても、測定可能な量にまで増幅するので、微量な試料ＤＮＡに対してもその量を測定することができるという利点がある。
【００４２】
本発明にあっては、１種類以上の試料ＤＮＡと１種類または複数種類の標準ＤＮＡを多数増幅して標識化するために、容易な検出を可能にし、統計的誤差を無視することができ、正確な定量を行うことができるという利点がある。
【００４３】
本発明にあっては、電気泳動を利用する必要がない点で処理が容易であるという利点がある。
【００４４】
本発明によれば、相互に識別可能となるように発光による標識物質によって標識化することができる。したがって。標識物質量または標識化の程度または強度を測定することによって、初期の試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの量比を容易に測定することができるという利点がある。
【００４５】
また、本発明によれば、ＰＣＲによる増幅を飽和するまで行っても問題がなく、各試料ごとのＰＣＲの各増幅サイクルにおける増幅度を厳密に制御し一致させる必要もないので、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を適用して、外側のプライマーと内側のプライマーを用いて２段階以上の増幅を行うことができる。２段階目のＰＣＲは、１段階目のＰＣＲ産物のごく微量を用いるか、１段階目のＰＣＲ産物を希釈して一部を用いることによって簡便に達成されるが、プライマーシフトＰＣＲ法ともいわれる外側のプライマーを使ったＰＣＲの後、ＤＮＡを精製してプライマーを除くことによって行うこともできる。これによって極微量な試料ＤＮＡより、高い特異性で精密な測定を行うことができるという利点がある。
【００４６】
本発明によると、相互に識別可能な標識物質を多種類用意さえすれば、１種類以上の試料ＤＮＡについて、１種類または複数種類の標準ＤＮＡに基づいてその量を並行して測ることができるので、迅速で、効率が高いという利点がある。
【００４７】
第２の発明によれば、前記試料ＤＮＡと前記標準ＤＮＡとを担体に結合させることによって、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとを容易かつ確実に分離して測定することができるので、高い精度が得られるという利点がある。
【００４８】
第３の発明によれば、切断部位で切断させることによって、標識化しやすい部位を利用することができるので、種々のＤＮＡに対して適用することができて汎用性が高いという利点がある。増幅後に制限酵素を加えて切断するようにしているので、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡの各増幅率に悪影響を与えることがなく、信頼性の高い処理を行うことができる。
【００４９】
第４の発明によれば、前記試料ＤＮＡとして、少なくとも２個の塩基が既知であれば適用することができるので、未知の塩基配列をもつＤＮＡに対しても量の測定を行うことができ汎用性が高いという利点がある。また、ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を利用することができるので、増幅率に影響を与えることなく、種々の切断部位に適用することができ汎用性が高い。
【００５０】
第５の発明によれば、担体として粒子を用いることによって、単位体積当りより大きな表面積を利用することができるので、反応を促進し、迅速かつ効率的な処理を行うことができるという利点がある。
【００５１】
第６の発明によれば、粒子として磁気ビーズを用いることによって、分離処理等について、自動化、効率化または迅速化することができるという利点がある。
【００５２】
第７の発明によれば、前記試料ＤＮＡと前記標準ＤＮＡ等の長さ、好ましくはその塩基配列をも同一またはほぼ同一とすることによって、増幅する場合の各ＤＮＡの増幅率を同一またはほぼ同一とすることができるので、より正確な定量を行うことができるという利点がある。
【００５３】
第８の発明は、蛍光物質、燐光物質または化学発光等の発光物質、電磁波や光を吸収物質、これらの蛍光、発光物質、吸収物質を生成する反応を触媒する酵素、磁性体、またはこれらの蛍光、発光物質、磁性体、吸収物質もしくは酵素を固定化するために用いることができるビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、アビジンなどの物質など、短時間で２種類以上の物理量として判別測定を可能とする物質を用いることによって、その発光強度比に基づいてその量比を測定することができるので、測定が容易かつ正確であるという利点がある。
【００５４】
第９の発明は、前記試料アダプターおよび標準アダプターを等量加えることによって、各試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片に対するその遭遇率がその量比だけの相違になるので、より正確な測定を行うことができるという利点がある。
【００５５】
第１０の発明によれば、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの識別をそのサイズや制限酵素分解パターンの相違に依拠していないので、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとを、その初期の量比を保ったまま増幅することができる。また、標識化は，増幅後に行うようにしているので、標識物質が増幅率に悪影響を与えることなく、信頼性の高い定量を行うことができるという利点がある。
【００５６】
また、本発明によれば、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡの塩基配列の全てが既知であることを要求していないので、未知の塩基配列をもつ試料ＤＮＡに適用して、多様な処理を行うことができるという利点がある。
【００５７】
さらに、初期状態において微量な試料ＤＮＡしか手に入らなくても、測定可能な量にまで増幅するので、微量な試料ＤＮＡに対してもその量を測定することができるという利点がある。
【００５８】
本発明にあっては、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡを多数増幅して標識化するために、統計的誤差を無視することができるので、正確な定量を行うことができるという利点がある。
【００５９】
本発明にあっては、電気泳動を利用する必要がない点で処理が容易であるという利点がある。
【００６０】
本発明によれば、相互に識別可能となるように発光による標識物質によって標識化することができる。したがって。標識物質量または標識化の程度または強度を測定することによって、初期の試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの量比を容易に測定することができるという利点がある。
【００６１】
また、本発明によれば、ＰＣＲによる増幅を飽和するまで行っても問題がなく、各試料ごとのＰＣＲの各増幅サイクルにおける増幅度を厳密に制御し一致させる必要もないので、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を適用して、外側のプライマーと内側のプライマーを用いて２段階以上のＰＣＲを適用することができる。２段階目のＰＣＲは、１段階目のＰＣＲ産物のごく微量を用いるか、１段階目のＰＣＲ産物を希釈して一部を用いることによって簡便に達成されるが、プライマーシフトＰＣＲ法ともいわれる外側のプライマーを使ったＰＣＲの後、ＤＮＡを精製してプライマーを除くことによって行うこともできる。これによって極微量な試料ＤＮＡより、高い特異性で精密な測定を行うことができる。
【００６２】
第１１の発明によれば、その処理に応じて選択された種々の段階で粒子を用いて分離を行うことを可能にして、迅速で効率的な処理を行うことができる。
【００６３】
第１２の発明によれば、１組の外側にある第１のプライマー対で増幅した最初のＰＣＲ産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー位置より、内側にプライマー位置のある第２のプライマーを用いて増幅を行うことによって、用いるべき第２のプライマーに類似の配列の存在を避けることができて、信頼性の高い増幅を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
図１に基づいて、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ定量方法について説明する。
本実施の形態にあっては、次の増幅工程（ステップＳ１およびステップＳ２）と、標識化工程（ステップＳ３〜ステップＳ５）、と、測定工程（ステップＳ６）とからなる。
【００６５】
ステップＳ１において、被測定対象の未知の量をもつ試料ＤＮＡ１１と既知の量をもつ標準ＤＮＡ１２を混合する。
【００６６】
ここで、試料ＤＮＡ１１は、塩基配列上離れて位置する２箇所の既知の特定塩基配列（図示せず）を有するものであり、標準ＤＮＡ１２は、塩基配列上離れて位置する２箇所の前記特定塩基配列（図示せず）と同一の塩基配列を有するものである。さらに前記混合溶液には、プライマー対１３，１４が混合される。そのプライマー対１３，１４は、前記特定塩基配列の一方と相補的な対をなす相補的特定塩基配列および特異的結合物質対の一方であるビオチン１５を有するプライマー１３と、前記特定塩基配列の他方と相補的対をなす相補的特定塩基配列および２箇所の前記特定塩基配列間にあって、前記試料ＤＮＡ１１と標準ＤＮＡ１２において相互に異なる塩基１６および塩基１７に切断部位を持つＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位１８を有するプライマー１４である。
【００６７】
図１では、前記試料ＤＮＡ１１の塩基１６は「Ｇ」であり、前記標準ＤＮＡ１２の塩基１７は「Ａ」である。前記プライマー１３においては、前記ビオチン１５は、５’末端の上流側に設けられ、３’末端側に、前記試料ＤＮＡ１１および標準ＤＮＡ１２において、既知の特定塩基配列と相補的な対をなす塩基配列を有しており、前記プライマー１４においては、５’末端の上流側にＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位１８を有している。その他前記混合溶液には、増幅に必要なその他の試薬が入れられる。
【００６８】
ステップＳ２において、ＰＣＲ法で増幅が行われる。これによって、増幅前の初期の量比（図上  ２：１）を維持した状態で、試料ＤＮＡ産物１９と標準ＤＮＡ２０とが得られることになる。
【００６９】
図１に示すように、前記試料ＤＮＡ産物１９と前記標準ＤＮＡ産物２０は、ＰＣＲ法の増幅によって、それぞれ、前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素の認識部位１８をもち、切断部位としては異なる塩基１６および塩基１７を有し、その一端に特異的結合物質対の一方であるビオチン１５を有する。前記試料ＤＮＡ産物１９と前記標準ＤＮＡ産物２０とが得られる。
【００７０】
ステップＳ３において、前記試料ＤＮＡ産物１９と前記標準ＤＮＡ産物２０とを混合した溶液中に、前記特異的結合物質の他方、例えば、アビジン２１で被覆された多数の磁気ビーズ２２を添加して、前記ビオチン１５との間で特異的反応を起こさせることによって各磁気ビーズ２２ごとに、多数の前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０をその磁気ビーズ２２に結合させる。その際、その「多数」の程度が統計的誤差を無視できる程度の多数である場合には、多数の磁気ビーズ２２が全体として担持する試料ＤＮＡ産物１９と標準ＤＮＡ産物２０との量比が、初期の前記試料ＤＮＡ１１と前記標準ＤＮＡ１２との量比を維持された状態となるように、各磁気ビーズ２２に分散して保持されることになる。
【００７１】
ステップＳ４において、前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素を、前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０の混合溶液に添加して、前記切断部位である、前記塩基１６「Ｇ」および塩基１７「Ａ」において切断させて、一端で前記磁気ビーズ２２と結合し、それぞれ異なる塩基配列、この例では、「ＧＧ」および「ＡＧ」を各々、他端にもつ、試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４とを得る。この段階でも、前記試料ＤＮＡ１１と標準ＤＮＡ１２の量比は、相変わらず前記試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４との間で維持されている。
【００７２】
ステップＳ５において、別途作製された多数の試料アダプター２５と標準アダプター２６とを、前記試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４の混合溶液と混合し、前記試料アダプター２５を前記試料ＤＮＡ断片２３と、前記標準アダプター２６を前記標準ＤＮＡ断片２４とをライゲーションによって結合させる。ここで、試料アダプター２５は、前記試料ＤＮＡ断片２３の前記他端に有する塩基配列「ＧＧ」と相補的な対をなす塩基配列「ＣＣ」を有するとともに、試料ＤＮＡ断片２３であることを表示する識別物質としての蛍光物質２７、例えば、Ｃｙ５を有するものである。また、前記標準アダプター２６は、前記標準ＤＮＡ断片２４の前記他端に有する塩基配列「ＡＧ」と相補的な対をなす塩基配列「ＴＣ」を有するとともに、標準ＤＮＡ断片２４であることを表示する識別物質としての蛍光物質２８、例えば、Ｃｙ３やＴｅｘａｓ
Ｒｅｄを有するものである。
【００７３】
ステップＳ６において、標識化された前記試料ＤＮＡ断片２３および標識化された前記標準ＤＮＡ断片２４であって、前記磁気ビーズ２２に結合したものについて、例えば、容器の外部から磁場を及ぼすことによって容器の壁部または底部に吸着させることによって、または、分注装置のピペットチップやノズル等の流路または管路に外部から磁場を及ぼした状態で、溶液を吸引吐出する際に、その流路や管路の内壁に、前記磁気ビーズ２２を吸着させることによって溶液から分離して、夾雑物を除去し、各磁気ビーズ２２に分散して担持されている標識物質から得られる、全磁気ビーズ２２の集合としての発光強度の割合、すなわち、その発光の強度比を測定することによって、初期の前記標準ＤＮＡ１２の量に対する前記試料ＤＮＡ１１の量を測定することができる。
【００７４】
図２には、各磁気ビーズ２２に担持されている標識物質の状態を模式的に示すものであり、各磁気ビーズ２２に注目する限りは、種々の標識物質の比で担持されているが、これらの磁気ビーズ２２全体としての発光強度を測定することによって、正確な初期の試料ＤＮＡ１１の量を、標準ＤＮＡ１２の量との比較によって得ることができる。図２によれば、試料ＤＮＡの量に応じてほぼ直線状に変化する発光強度が得られている。
【００７５】
以下に、この実施の形態に示したＤＮＡ定量方法の処理の手順の詳細について、ヒトゲノム中に存在するＣｙｔｒｏｃｈｒｏｍｅ
Ｐ４５０ (ＣＹＰ)遺伝子領域を用いて、ＤＮＡを定量した例を示す。ただし、本発明の実施の形態に係る測定の正確さを示すために、試料ＤＮＡの量は未知ではなく、既知の複数の量について測定し、標識物質である蛍光物質の発光強度と前記量比との相関性について検証可能なものとした。
【実施例１】
【００７６】
実施例１は、前記試料ＤＮＡ１１として、ＤＮＡ検体であるヒトゲノムＤＮＡそのものを用い、標準ＤＮＡ１２として、前記変異部位を塩基「Ｇ」から「Ａ」に変異したＤＮＡ（標準ＤＮＡ１２）を用いて、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法によって増幅することによって、ヒトゲノムＤＮＡそのものの量を前記標準ＤＮＡの量に基づいて求めるものである。
ステップＳ１において、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡを混合して増幅するために前記試料ＤＮＡ１１と前記標準ＤＮＡ１２とを準備する。
試料ＤＮＡ１１は、ＤＮＡ検体である未知の量のヒトゲノムＤＮＡそのものであって、その変異部位は塩基「Ｇ」を有するものである。
【００７７】
前記標準ＤＮＡ１２としては、前記変異部位が塩基「Ａ」を有するＤＮＡ検体であるヒトゲノムＤＮＡの所定断片を、ＰＣＲ法で増幅したものである。この標準ＤＮＡ１２は、配列番号1のプライマー E4anおよび配列番号２のプライマーE5bnを用いてＰＣＲ法で増幅した配列番号8で表されるCYP2C19領域ＤＮＡ断片である。その配列番号8の1479番目の変異部位の塩基は、塩基「A」であって、前記試料ＤＮＡ１１の変異部位は、塩基「Ｇ」である。ここで、標準ＤＮＡのＰＣＲ産物を作製するためのＰＣＲの反応液の組成および反応温度の条件は以下の通りである（表１）。
【００７８】
【表１】
2006081416.tif 000003
【００７９】
このようにして得られた前記標準ＤＮＡ１２を下記の方法に従って精製し、かつ260 nmの光の吸収を測定することによってその濃度を求めた。
【００８０】
＜ＰＣＲ産物の精製＞
ここでは、各容器にＰＣＲ産物50μlずつ分注した場合の量を示す。
ステップＳ１．１で、各容器にTE（トリス  ＥＤＴＡ）バッファを200μlずつ加える。
ステップＳ１．２で、各容器にPEG（ポリ・エチレン・グリコール）を150μl加える。
ステップＳ１．３で、4℃で2時間から一昼夜かけてインキュベーションを行う。
ステップＳ１．４で、15000 rpmの回転速度で、4℃で15分間遠心分離を行う。
ステップＳ１．５で、上清を捨てる。
ステップＳ１．６で、70% エタノールを800μl加える。
ステップＳ１．７で、15000 rpmの回転速度で、4℃で5分間遠心分離を行う
ステップＳ１．８で、上清を捨てる。
ステップＳ１．９で、減圧下で乾燥する。
ステップＳ１．１０で、TEバッファで溶解する。
【００８１】
＜260 nm吸収による濃度測定＞
光学的濃度測定機（例えば、Jasco V-550（商品名））にてOD（光学的濃度）値を測定し濃度を算出しておく。
【００８２】
ステップＳ２で、前記試料ＤＮＡ１１と、標準ＤＮＡ１２とを混合して、同時にＰＣＲ法で増幅が行われることになる。この実験に用いた内部標準ＤＮＡ断片とヒトゲノムＤＮＡの各混合量は下記の通りである（表２）。
【００８３】
【表２】
2006081416.tif 000004
【００８４】
上記の方法で得られたＤＮＡ試料（試料ＤＮＡ１１および標準ＤＮＡ１２）を下記のプロトコールによりＰＣＲ法で増幅する（表３、表４）。したがって、実施例１では、ＰＣＲ法は、配列番号1〜4に記載された入れ子になったプライマーを用いて2回行ったことになる（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）。ここで、配列番号３のプライマー 19R5fは、その３’末端側に特定塩基配列と相補的な対をなす相補的塩基配列を有し、その５’末端の上流側にＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素である制限酵素BseRIの認識部位が挿入されている。また、配列番号４のプライマー 19BtF5eは、その３’末端側に特定塩基配列の他方と相補的な対をなす他方の相補的塩基配列を有し、その５’末端の上流側には、前記特異的結合物質対の一方であるビオチンを有するものである。
【００８５】
【表３】
2006081416.tif 000005
【００８６】
【表４】
2006081416.tif 000006
【００８７】
次に、ステップＳ３において、前記試料ＤＮＡ産物１９と前記標準ＤＮＡ産物２０とが混合した溶液中に、前記アビジン２１で被覆された多数の磁気ビーズ２２を添加して多数の前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０をその磁気ビーズ２２に結合させる。
反応に用いる前記磁気ビーズ２２は下記に従って調製した。
【００８８】
＜磁気ビーズの調製＞
GenoVision ビーズ（アビジンで被覆された磁気ビーズの商品名、粒径0.75μm、10 mg/ml、東洋紡） 65μlについて、 
ステップＳ３．１で、150μlの2×BW（バッファ）で2回洗浄し、
ステップＳ３．２で、325μlの2×BWに懸濁する（最終的には 2μg/μl、13回反応分）。
ＰＣＲによって調製したＤＮＡ試料（配列番号9）は、下記に従って磁気ビーズに固定化した（表５）。
【００８９】
【表５】
2006081416.tif 000007
【００９０】
ステップＳ３．３で、上記混合溶液を室温で、1０分間インキュベーションする。
ステップＳ３．４で、100μlの1×BW（商品名）で1回洗浄する。
ステップＳ３．５で、さらに100μlの1×TEで1回洗浄する。
ステップＳ３．６で、12.8μlの1×TEに懸濁する。
【００９１】
次に、ステップＳ４で、前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素である（BseRI、NEB）を用いて、前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０の混合液に添加して、前記塩基１６「Ｇ」および塩基１７「Ａ」において切断させて、一端で前記磁気ビーズ２２と結合し、それぞれ異なる塩基配列、「ＧＧ」および「ＡＧ」を他端にもつ試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４とを得る（表６）。
【００９２】
【表６】
2006081416.tif 000008
【００９３】
ステップＳ５において、別途作製された試料アダプター２５と標準アダプター２６とを、前記試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４に、前記切断部位において、ライゲーションによって結合させる。ここで、前記制限酵素で切断された磁気ビーズ固定化ＤＮＡは、下記に示すように、配列番号5と7あるいは配列番号6と7のオリゴヌクレオチドを用いて調製された蛍光標識された合成ＤＮＡ断片（アダプター）とリガーゼによる連結反応を行う。ここで、試料アダプター２５、すなわち、連結部位を除いて二本鎖のＣｙ5−ＧＧ ＡＤ、は、５’末端の上流側に、標識物質である蛍光物質Ｃｙ５が結合された一本鎖の配列番号５のＣｙ5−ＧＧと、連結部位を除いて、それと相補的な塩基配列をもつＤＮＡ断片である、配列番号７の一本鎖のＴｅｓｔ ｕｐとアニーリングさせて調製される(表７)。同様にして、標準アダプター２６、すなわち、連結部位を除いて二本鎖のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＡＧ ＡＤは、５’末端の上流側に、標識物質である蛍光物質Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄが結合され、３’末端側には、前記塩基配列「ＡＧ」を有する、一本鎖の配列番号6のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ａｇと、連結部位を除いて、それと相補的な塩基配列をもつＤＮＡ断片である、配列番号7の一本鎖の前記Ｔｅｓｔ ｕｐとアニーリングさせて調製される(表８)。
【００９４】
【表７】
2006081416.tif 000009
【００９５】
【表８】
2006081416.tif 000010
【００９６】
ステップＳ６で、前記磁気ビーズを分離し、十分に洗浄した後、蛍光マイクロプレートリーダーにより、磁気ビーズ上に固定化された2種類の蛍光物質からのそれぞれの蛍光強度、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄを測定した（表９、表１０）。
【００９７】
ステップＳ６．１で、94℃で2分間インキュベーションを行う。
ステップＳ６．２で、90分間かけて室温（または4℃）まで冷却させアニールする。
【００９８】
【表９】
2006081416.tif 000011
【００９９】
【表１０】
2006081416.tif 000012
【０１００】
ステップＳ６．３で、25℃で、30分間インキュベーションを行う。
ステップＳ６．４で、100μlの1×BWで1回洗浄する。
ステップＳ６．５で、この溶液を新しい容器に移し変えて100μlの1×BWで2回洗浄する。
ステップＳ６．６で、100μlの1×BWで懸濁させる。
ステップＳ６．７で、GEMINI SPECTRA
MAX（商品名）で蛍光測定を行う(50μg磁気ビーズ)。その際、コントロールとして1×BW 100μl およびGenoVisionビーズの混合溶液  (2μg/μl)100μlを用いている。
【実施例２】
【０１０１】
実施例２は、前記試料ＤＮＡ１１として、ＤＮＡ検体であるヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー配列番号1、2のプライマー E4anおよびプライマー E5bnを用いてＰＣＲで増幅した配列番号8で表されるCYP2C19 領域ＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ１１）を用い、標準ＤＮＡ１２として、配列番号８の1479番目の塩基（以下「変異部位」という）を塩基「G」から塩基「A」に変位させたＤＮＡ断片（標準ＤＮＡ１２）を用いて、前記CYP2C19 領域ＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ１１）の前記標準ＤＮＡ１２に対する量を測定する。
【０１０２】
実施例２においては、ステップＳ’１において、前記試料ＤＮＡ１１と標準ＤＮＡ１２を混合して増幅するために前記試料ＤＮＡ１１と前記標準ＤＮＡ１２とを準備する。
前記試料ＤＮＡ１１を準備するために、ＤＮＡ検体としてヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号1、2のプライマー E4anおよびプライマー E5bnを用いてＰＣＲで増幅した配列番号8で表されるCYP2C19領域ＤＮＡ断片（試料ＤＮＡ１１）、および配列番号8の1479番目の塩基（以下「変異部位」という）を塩基「G」から塩基「A」に変位したＤＮＡ断片（標準ＤＮＡ１２）を準備する。ここで、ＰＣＲの反応液の組成および反応温度の条件は以下の通りである（表１１、表１２）。
【０１０３】
【表１１】
2006081416.tif 000013
【０１０４】
【表１２】
2006081416.tif 000014
【０１０５】
次に、同様な方法で、変異部位「Ａ」をもち、別途独立に他のＤＮＡ検体から得られた標準ＤＮＡを下記の方法に従って精製し、かつ260 nmの光の吸収を測定することによってその濃度を求めた。
【０１０６】
＜ＰＣＲ産物の精製＞
なお、以下、各容器にＰＣＲ産物50μlずつ分注した場合の量を示す。
各容器にTE（トリス  ＥＤＴＡ）バッファを200μlずつ加える
ステップＳ’１．１において、各容器にPEG（ポリ・エチレン・グリコール）を150μl 加える。
ステップＳ’１．２において、各容器を4℃で2時間から一昼夜掛けてインキュベーションを行う。
ステップＳ’１．３において、15000 rpmの回転速度で、4℃で15分間遠心分離を行う。
ステップＳ’１．４において、上清を捨てる。
ステップＳ’１．５において、70% エタノールを800μl加える。
ステップＳ’１．６において、15000 rpmの回転速度で 、4℃で5分間遠心分離を行う。
ステップＳ’１．７で、上清を捨てる。
ステップＳ’１．８で、減圧下で乾燥する。
ステップＳ’１．９で、TEバッファで溶解する。
【０１０７】
＜260 nm吸収による濃度測定＞
次に、光学的濃度測定機（例えば、Jasco V-550（商品名））にてOD（光学的濃度）値を測定し濃度を算出しておく。
【０１０８】
ステップＳ’２で、前記試料ＤＮＡ１１と、標準ＤＮＡ１２とを混合して、同時にＰＣＲ法で増幅が行われることになる。この実験に用いた内部標準ＤＮＡ断片とヒトゲノムＤＮＡ産物の各混合量は以下の通りである（表１３）。ここでは、本発明によるＤＮＡの定量の正確差を実証するために、内部標準として濃度が既知の標準ＤＮＡ断片（変異部位がA）を用い、ヒトゲノムＤＮＡ産物（変異部位がG）のＤＮＡ量を測定した。
【０１０９】
【表１３】
2006081416.tif 000015
【０１１０】
上記の方法で得られたＤＮＡ試料（試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡ）を下記のプロトコールによりＰＣＲで増幅することになる（表１４）。実施例２では、ＰＣＲは、前記配列番号３、４に記載されたプライマー対によって１回行われることになる。
【０１１１】
【表１４】
2006081416.tif 000016
【０１１２】
次に、ステップＳ’３において、前記試料ＤＮＡ産物１９と前記標準ＤＮＡ産物２０とが混合した溶液中に、前記アビジン２１で被覆された多数の磁気ビーズ２２を添加して多数の前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０をその磁気ビーズ２２に結合させる。反応に用いる磁気ビーズ２２は上記実施例１において説明したような調製を行う。
【０１１３】
次に、ステップＳ’４で、前記ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素である（BseRI（NEB））を用いて、前記試料ＤＮＡ産物１９および標準ＤＮＡ産物２０の混合液に添加して、前記塩基１６「Ｇ」および塩基１７「Ａ」において、上記実施例１で説明した方法で切断させて、一端で前記磁気ビーズ２２と結合し、それぞれ異なる塩基配列、「ＧＧ」および「ＡＧ」で他端にもつ試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４とを得る。
【０１１４】
ステップＳ’５において、別途作製された試料アダプター２５と標準アダプタ２６とを、上記実施例１で説明したように、前記試料ＤＮＡ断片２３と標準ＤＮＡ断片２４にライゲーションによって結合させる。ここで、前記制限酵素で切断された磁気ビーズ固定化ＤＮＡは、上記実施例１で示したように、配列番号５と７あるいは配列番号６と７のオリゴヌクレオチドを用いて調製された蛍光標識された合成ＤＮＡ断片（アダプター）とリガーゼによる連結反応を行う。
【０１１５】
ステップＳ’６で、前記磁気ビーズを分離し、十分に洗浄した後、蛍光マイクロプレートリーダーにより、磁気ビーズ上に固定化された２種類の蛍光物質からのそれぞれの蛍光強度を測定した。
【０１１６】
これらの実施例１および実施例２の測定結果を図３、図４および図５に示した。これらの図は、本発明に係るＤＮＡ定量方法を用いて、予め設定した試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの量比と、その発光強度との相関性についての測定結果を示すものである。
【０１１７】
図５のグラフ中における―□―は、実施例１の測定結果、すなわち、試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡを予め所定の量比で混合した後、１ｓｔ ＰＣＲおよび２ｎｄ ＰＣＲの２回のＰＣＲ法を行うＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を適用したものであり、―●―は、実施例２の測定結果、すなわち、試料ＤＮＡ断片および標準ＤＮＡ断片のそれぞれの１ｓｔ ＰＣＲ産物を所定の量比で混合した後１回のＰＣＲ法を適用して、その所定の量比と、その発光強度との相関性についての測定結果を示すものである。実施例１においては、約４桁の範囲で極めて良い直線性、すなわち相関性が得られ、実施例２においても、同様に約３桁の範囲で極めて良い直線性、すなわち相関性が得られている。
【０１１８】
なお、標準ＤＮＡ断片として用いる一塩基が変異したＤＮＡは、既知のいずれの方法でも調製することができるが、変異を導入したＰＣＲプライマーを用いることによって最も簡便に作製することができる（ＰＣＲ Technology: Principles and Applications for ＤＮＡ Amplification, Edited by Henry A. Erlich,
Stockton Press, pp63-66 (1989)）。
【０１１９】
以上説明した実施の形態および各実施例は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態または別実施例を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、ヒトゲノムについてのＤＮＡに適用したが、その場合に限られず他の天然または人工的なＤＮＡまたは、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ等を用いることができる。
【０１２０】
また、担体として磁気ビーズを用いた場合のみについて説明したが、担体が容器の内壁や内底、ピペットチップの内壁、またはプレートもしくはチップの表面であっても良い。また、磁気ビーズとの結合は、試料ＤＮＡ産物と標準ＤＮＡ産物について行うようにしたが、この場合に限られることなく、切断あとに試料ＤＮＡ断片と標準ＤＮＡ断片について、行うか、または、標識化後に行うようにしても良い。さらに、識別物質として蛍光物質の一例を用いた場合のみについて説明したが、他の蛍光物質または燐光物質や化学発光物質であっても良い。また、ＰＣＲ法の適用を、１回または２回行う場合について説明したが、３回以上適用することもできる。これは、本発明では、試料ＤＮＡと標準ＤＮＡとの識別を、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ等のＰＣＲの増幅効率に依存する方法に依拠していないからである。
【０１２１】
さらに、以上の説明では、試料ＤＮＡおよび標準ＤＮＡについて各々１種類を用いた実施例のみを説明したが、各々２種類以上について、同時に増幅して、その量を測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、遺伝子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば、工業分野、食品、農産、水産加工等の農業分野、薬品分野、衛生、保健、疾病、遺伝等の医療分野、生化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に関係するものである。
本発明は、特に、感染症の検査、微生物の同定と定量、マッピング、塩基配列解析、発現解析等の種々のＤＮＡを扱う解析や検査の際のＤＮＡ定量方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明の実施の形態に係る流れ図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る測定結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例１に係る測定結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例２に係る測定結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例１および実施例２に係る測定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１２４】
１１  試料ＤＮＡ
１２  標準ＤＮＡ
１３、１４  プライマー対
１５    ビオチン
１６、１７    変異部位
１８    ＣＬＡＳＳIIＳ制限酵素認識部位
１９    試料ＤＮＡ産物
２０    標準ＤＮＡ産物
２２    磁気ビーズ
２３      試料ＤＮＡ断片
２４    標準ＤＮＡ断片
２５    試料アダプター
２６    標準アダプター
２７、２８    蛍光物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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