(57)【要約】    【課題】  種々の測定を自動化するのに適する試薬キットとして使用される反応容器を提供する。    【解決手段】  一実施形態では、樹脂プレート４０にサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０が形成され、それぞれの上部が弾性フィルム４２で覆われ、さらにその上部は気密フィルム４３で覆われている。使用するときは気密フィルム４３をはがし、サンプル注入部４４に生体サンプルを注入し、ストッパ５８を外す。その後、反応液とタイピング試薬を混合してプローブ配置部３０に送り、ＳＮＰを検出する。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル又はサンプルと試薬との反応液を流す流路と、
この流路に接続され、試薬を収容して上部がキャップで覆われた少なくとも１つの液溜め部が平板状の基板に形成され、前記液溜め部の上方からの押圧、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引することにより前記流路へ移送されるようになっている反応容器本体と、
前記液溜め部の試薬の蒸発を抑えるためにその液溜め部を気密封止した取り外し可能な気密部材と、
を備えた反応容器。
【請求項２】
前記液溜め部の上方がキャップで覆われている請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
前記キャップは柔軟性をもつ素材により形成され弾性変形可能である請求項２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記素材はＰＤＭＳ又はシリコーンゴムである請求項３に記載の反応容器。
【請求項５】
前記キャップは弾性変形可能な上部部材とその周縁の枠体とからなり、前記枠体が前記液溜め部の周囲にはめ込まれたものである請求項２に記載の反応容器。
【請求項６】
前記上部部材はダイヤフラム構造である請求項５に記載の反応容器。
【請求項７】
前記キャップにはノズルが貫通可能でその貫通穴が復元可能な素材が用いられ、ノズルを介して前記キャップ内にエアーを吐出又は吸引することにより液を移送させるようにした請求項２に記載の反応容器。
【請求項８】
前記液溜め部の他にも流路で接続された液溜め部を備え、一対の液溜め部を交互に押圧することにより、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引することによりその一対の液溜め部間で液を混合させるものである請求項１から７のいずれかに記載の反応容器。
【請求項９】
前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、前記流路を介して接続された第１反応部を備え、
前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押圧することにより、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引することにより、液を移送させるようにした請求項１から８のいずれかに記載の反応容器。
【請求項１０】
前記液溜め部の試薬収容部の他に、サンプルが注入され又は収容したサンプル収容部をさらに備え、
前記流路はサンプル収容部と前記第１反応部の間及び前記試薬収容部と前記第１反応部の間を接続するとともに、各部間にはバルブ部を有する請求項９に記載の反応容器。
【請求項１１】
前記サンプル収容部のキャップはサンプル注入用に着脱可能に取りつけられるようになっている請求項１０に記載の反応容器。
【請求項１２】
希釈液を収容した希釈液収容部と空の空間からなる希釈部とをさらに備え、
この反応容器は前記希釈部で希釈された反応液が導かれる第２反応部をさらに備え、
前記流路は前記希釈液収容部及び希釈部も接続しているとともに、前記希釈部と第２反応部の間も接続しており、それら各部間にもバルブ部を有する請求項１０又は１１に記載の反応容器。
【請求項１３】
前記試薬収容部に収容された試薬は遺伝子増幅試薬であり、
前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であって、この反応容器が試薬キットを構成している請求項１０から１２のいずれかに記載の反応容器。
【請求項１４】
前記サンプル収容部に注入又は収容されるサンプルは生体サンプルであり、
前記試薬収容部に収容された試薬は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬であり、
前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、
前記基板内に形成され、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容し、上方がキャップで覆われているタイピング試薬収容部と、
前記基板内に形成され、上方がキャップで覆われている空の空間からなる混合部と、
前記混合部で混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持された、第２反応部としてのプローブ配置部と、をさらに備え、
前記流路は前記タイピング試薬収容部及び混合部も接続しているとともに、前記混合部と前記プローブ配置部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有し、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項１０又は１１に記載の反応容器。
【請求項１５】
前記増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなっている請求項１３又は１４に記載の反応容器。
【請求項１６】
前記液溜め部は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部であり、そのキャップが着脱可能に取り付けられており、前記タイピング試薬収容部には遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるようになっており、
第１反応部は前記タイピング試薬収容部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項９に記載の反応容器。
【請求項１７】
前記液タイピング試薬収容部として遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるサンプル収容部と、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部とを備え、両収容部は流路で接続されており、いずれかの収容部と第１反応部の間が流路で接続されており、
前記サンプル収容部のキャップが着脱可能に取り付けられており、
第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、
前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押すことにより若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引することで液を移送させることができ、
この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項９に記載の反応容器。
【請求項１８】
対象とする多型が一塩基多型である請求項１４から１７のいずれかに記載の反応容器。
【請求項１９】
前記サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプルである請求項１４から１８のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２０】
前記遺伝子増幅試薬はＰＣＲ反応試薬である請求項１４から１９のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２１】
前記タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である請求項１４から２０のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２２】
前記気密部材は試薬が収容された液溜め部のみを気密封止している請求項１から２１
のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２３】
気密封止された液溜め部はキャップが着脱可能であり、前記気密部材はキャップの内側に設けられていて、使用前に取り外されるものである請求項２２に記載の反応容器。
【請求項２４】
前記気密部材はこの反応容器全体を覆って気密封止している請求項１から２１のいずれかに記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器と、それを用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための遺伝子多型検出方法及びそのための自動解析装置や自動遺伝子解析装置、並びにその遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なう方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。
【０００３】
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。
【０００４】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
【特許文献１】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３６６号公報
【特許文献３】特開２００２−３００８９４号公報
【非特許文献１】Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、遺伝子多型検出に限らないが、種々の測定を自動化するのに適する試薬キットとして使用できる反応容器を提供し、特に試料注入の効率化、又は試薬の揮発防止を行なうことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の反応容器は、サンプル又はサンプルと試薬との反応液を流す流路と、この流路に接続され、試薬を収容した少なくとも１つの液溜め部とが平板上の基板に形成され、前記液溜め部の試薬は液溜め部の容積変化、加圧又は減圧により前記流路へ移送されるようになっている反応容器本体と、前記液溜め部の試薬の蒸発を抑えるために気密封止した取り外し可能な気密部材とを備えたものである。
【０００７】
前記液溜め部の上方はキャップで覆うことができる。
キャップは柔軟性をもつ素材により形成され弾性変形可能であることが好ましく、素材としてはＰＤＭＳやシリコーンゴムなどがある。
【０００８】
キャップは弾性変形可能な上部部材とその周縁の枠体とからなり、前記枠体が前記液溜め部の周囲にはめ込まれたものとすることができる。
前記上部部材はダイヤフラム構造であることが好ましい。
【０００９】
前記キャップにはノズルが貫通可能でその貫通穴が復元可能な素材が用いられ、ノズルを介して前記キャップ内にエアーを吐出又は吸引することにより液を移送させるようにすることができる。
この反応容器は、前記液溜め部を複数備え、ノズルをそれぞれのキャップに交互に貫通させてエアーの吐出又は吸引により液を移送させることにより混合させることができる。
【００１０】
流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備えていることが好ましく、バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、液溜め部を押さえることで液を移送させることができる。
【００１１】
前記液溜め部の他にも流路で接続された液溜め部を備え、一対の液溜め部を交互に押圧することにより、若しくはノズルを介してエアーの吐出又は吸引することにより、その一対の液溜め部間を混合させることができる。
【００１２】
本発明の反応容器の一形態は、サンプルと試薬を混ぜて反応させる反応容器であって、平板状の基板内に形成され、上方からの押圧により弾性変形し容積が可変である、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引する貫通穴を有すキャップで覆われているサンプル収容部、及び試薬を収容する試薬収容部と、前記サンプル収容部と前記第１反応部の間及び前記試薬収容部と前記第１反応部の間を接続するとともに、各部間には上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有する流路と、を備えている。
【００１３】
サンプルは予め収容しておくこともできるが、通常はこの反応容器を試薬キットとして使用し、その都度サンプルをサンプル収容部に注入して測定を行なう。そのために、サンプル収容部のキャップは、着脱可能に取りつけられるようになっていることが好ましい。試薬収容部のキャップは開閉可能に取り付けなくてもよい。
【００１４】
サンプルと試薬を混ぜて反応させた後、希釈して第２の反応部に導いてさらに反応を行なわせる用途もある。そのような用途に対処するために、この反応容器は、前記基板内に形成され、希釈液を収容し、上方からの押圧により弾性変形し容積が可変、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引する貫通穴を有しているキャップで覆われている希釈液収容部、及び弾性変形し容積が可変、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引する貫通穴を有しているキャップで覆われている、空の空間からなる希釈部と、前記希釈部で希釈された反応液が導かれる第２反応部と、をさらに備え、前記流路は前記希釈液収容部及びに希釈部も接続しているとともに、前記希釈部と第２反応部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有するものとすることができる。
【００１５】
この反応容器を使用する反応の１つとして遺伝子増幅がある。そのような用途に適する本発明の反応容器は、試薬収容部に収容された試薬が遺伝子増幅試薬であり、第１反応部が遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、この反応容器がその遺伝子増幅反応の試薬キットを構成する。
【００１６】
この反応容器を用いる目的の主なものに遺伝子多型検出がある。そのような目的に適した反応容器の一例は、前記サンプル収容部に注入又は収容されるサンプルは生体サンプルであり、前記試薬収容部に収容された試薬は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬であり、前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、前記基板内に形成され、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容し、上方からの押圧により弾性変形し容積が可変、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引する貫通穴を有しているキャップで覆われているタイピング試薬収容部と、前記基板内に形成され、上方からの押圧により弾性変形し容積が可変、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引する貫通穴を有しているキャップで覆われ、空の空間からなる混合部と、前記混合部で混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持された、第２反応部としてのプローブ配置部と、をさらに備え、前記流路は前記タイピング試薬収容部及び混合部も接続しているとともに、前記混合部と前記プローブ配置部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有し、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。
【００１７】
増幅反応部は温度を変化させるサイクルを繰り返すことから基板の熱伝導性が高い方が好ましい。そのために、増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなっていることが好ましい。
【００１８】
遺伝子多型検出の目的に適した反応容器の他の例は、前記液溜め部が複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部であって、そのキャップが着脱可能に取りつけられており、タイピング試薬収容部には遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるようになっており、第１反応部は前記タイピング試薬収容部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。
【００１９】
遺伝子多型検出の目的に適した反応容器のさらに他の例は、前記液溜め部が遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるサンプル収容部と、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部とを備えたものであり、両収容部は流路で接続されており、いずれかの収容部と第１反応部の間が流路で接続されており、前記サンプル収容部のキャップが着脱可能に取りつけられており、第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押さえることで、若しくはノズルを介してエアーを吐出又は吸引することで液を移送させることができ、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。
【００２０】
前記気密部材は試薬が収容された液溜め部のみを気密封止することが好ましい。
気密封止された液溜め部はキャップが着脱可能であり、前記気密部材はキャップの内側に設けられていて、使用前に取り外すことができる。
前記気密部材はこの反応容器全体を覆って気密封止することができる。
【００２１】
図１は本発明の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。生体サンプル２は例えば１μＬを採取し、それにＰＣＲ反応試薬４を１０μＬ程度添加する。ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのバッファ液、４種類のデオキシリボヌクレオチド、その他必要な試薬が添加されており、サンプル２と混合したときにｐＨが８.５−９.５になるように調製されている。
【００２２】
生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行わせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルはゲノム抽出操作を施したものであってもよいが、ここではゲノム抽出操作を施していないものを使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。
【００２３】
ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。
【００２４】
次に、インベーダ試薬６が添加された反応液をタイピング反応部のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。プローブ配置部８の各部位には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。
【００２５】
インベーダ法については、特許文献３の段落［００３２］から［００３４］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものが用意されており、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
【００２６】
本発明で用いる増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものであり、かつ核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる。そのため、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。
【００２７】
ＰＣＲ反応試薬は、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び熱安定性合成酵素を含む。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。
【００２８】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
【００２９】
合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００３０】
タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の反応容器は、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで覆われて容積が可変になっている液溜め部を備えているので、送液動作が容易になり、その反応容器を用いて反応を自動的に検出する装置の送液機構が簡単になる。
反応容器において、上方がノズルが貫通可能でその貫通穴の復元可能な素材のキャップで覆われている液溜め部を備え、そのキャップに貫通するノズルからエアーを吐出又は吸引することで、送液の効率がよくなり、その反応容器を用いて反応を自動的に検出する装置の送液機構が簡単になる。
【００３２】
試薬が収容された液溜め部を気密部材により気密封止することで、試薬の蒸発を防ぐことができる。
気密部材が反応容器全体を取り外し可能に気密封止することにより、反応容器を使用する直前に気密部材を開封して使用することができる。
流路に上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備えれば、送液動作の制御が容易になる。
この反応容器を用いた遺伝子多型検出方法によれば、複数の多型部位が増幅されたＤＮＡサンプルについて、又は生体サンプルについてはそれから目的とする複数の多型部位を同時に増幅させた後に、それらの多型部位を同時にタイピングするので、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
第1の実施例を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す反応容器を用いて説明する。（Ａ）は平面図、（Ｂ）は斜視図、（Ｃ）は断面図である。
この反応容器はＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入し、インベーダ反応によりＳＮＰを検出するものであり、蛍光測定を行なうことのできる基板１０上に薄層フィルム１２が接合され、液溜め部１４と、流路を介してそれにつながるチャンバ１６が基板１０に形成されたものである。液溜め部１４、流路及びチャンバ１６は上部が薄層フィルム１２で覆われている。基板１０は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。
基板１０は、使用前は封入された試薬などの溶液が蒸発しないように取り外し可能な気密部材４３で覆われており、気密部材として、例えばアルミニムと樹脂を積層したフィルム４３（以下、気密フィルムという）を用いることができる。基板１０は全体が気密フィルム４３で覆われてもよいし、溶液の収容部を有する表面だけを覆ってもよいし、溶液を収容した部分のキャップを着脱可能にしてそのキャップの内側に設けて溶液収容部上を覆ってもよい。
気密フィルム４３は分析前に反応容器から除去する。
【００３４】
液溜め部１４は上方がノズル６７が貫通可能でその貫通穴の復元可能な封止部材１５を備えたキャップ１８ａで覆われている。液溜め部１４はタイピング試薬が収容されたタイピング試薬収容部となっている。キャップ１８ａは着脱可能で、例えば薄層フィルム１２と一体形成して基板１０に粘着剤により固着し、サンプル注入時にはキャップ１８ａの部分を基板１０から剥がし、サンプル注入後に再び基板１０に固着できるものとする。また、キャップ１８ａのみが取り外せる嵌め込みタイプやねじ込みタイプのものとして着脱可能にすることもできる。他の実施例においても、キャップを着脱可能とするにはこのような構成とすることができる。封止部材１５は例えばシリコーンゴム又はＰＤＭＳである。
【００３５】
試料注入時は、キャップ１８を外してタイピング試薬収容部１４にＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入する。送液時は、キャップ１８ａの封止部材１５にノズル６７が貫通し、エアーを吐出又は吸引することによって、収容部１４に封入された反応液を流路に送り又は吸引し、流路から反応液を上記空間に引き込む。上記ノズル６７を収容部１４から引き抜くと、その貫通穴は復元可能な封止部材１５の弾性によって閉じる。
【００３６】
タイピング試薬収容部１４と流路は、流路の一部が塞がれていて、タイピング試薬収容部１４の内部の圧力がある圧力以上になると、その塞がれている部分が開き、タイピング試薬が流路の方へ流出するようになっている。流路の一部を塞ぐ方法は、例えば接着による方法、熱溶着による方法などを採用することができる。そのようにして閉塞された流路を開くための圧力は、例えば１５〜２．０ｋｇ／ｃｍ2である。
【００３７】
チャンバ１６は広い面積の凹部に複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部となっている。チャンバ１６において、符号１６ａで示されるドットはそれぞれ個別のプローブ配置部を示している。チャンバ１６の端部でタイピング試薬収容部１４の反対側には空気抜きのための穴２０が空けられている。
【００３８】
この反応容器では、タイピング試薬収容部１４のキャップ１８ａを外して、外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液がピペットなどにより注入される。その後キャップ１８ａが再び覆せられ、この反応容器が検出装置に装着され、サンプル反応液とタイピング試薬が混合する。
【００３９】
検出装置においてキャップ１８ａを貫通してノズル６７によりエアーが吐出されることにより、タイピング試薬収容部１４にエアーが送り込まれ、希釈液中のサンプル反応液とタイピング試薬との反応液がチャンバ１６に導かれ、プローブ配置部１６ａのプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
チャンバ１６の寸法は、例えば幅が２．５ｍｍ、長さが５〜２５ｍｍ、深さが１００μｍ、内容積が１５〜５０μＬである。
【００４０】
第２の実施例を図２（Ａ），（Ｂ），及び（Ｄ）に示す反応容器を用いて説明する。（Ｄ）は断面図である。
この反応容器はタイピング試薬収容部１４のキャップ構造を除いて第1の実施例と同じであり、基板１０上に薄層フィルム１２が接合され、タイピング試薬収容部１４とチャンバ１６が形成されたものである。
【００４１】
第１の実施例と異なるのは、タイピング試薬収容部１４は上方からの押圧により弾性変形可能なキャップ１８ｂで覆われて容積が可変になっているところである。キャップ１８ｂは弾性変形可能なダイヤフラム１７と周縁の枠体１９とからなっており、枠体１９がタイピング試薬収容部１４の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取り付けられる。このキャップはスクリューキャップでもよい。
サンプル注入時は、キャップ１８を取り外しＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液をタイピング試薬収容部１４に注入する。
キャップ１８ｂの内側はダイヤフラム構造になっているので、上から押すとダイヤフラム面が下がり、封入されている液は流路に押し出される。
【００４２】
検出装置においてキャップ１８ｂのダイヤフラム１７が上方から押圧されることにより、タイピング試薬収容部１４の容積が減少し、タイピング試薬収容部１４のサンプル反応液とタイピング試薬との反応液がチャンバ１６に導かれ、プローブ配置部１６ａのプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
【００４３】
図３は反応容器の第３の実施例を示したものである。基板２２の内部にタイピング試薬収容部１４、混合部２８、及びプローブ配置部３０がこの順に配置され、それぞれの間が流路で接続されている。この場合も、タイピング試薬収容部１４と流路は、流路の一部が塞がれていて、タイピング試薬収容部１４の内部の圧力がある圧力以上になると、その塞がれている部分が開き、タイピング試薬が流路の方へ流出するようになっている。流路の一部を塞ぐ方法は、例えば接着による方法、熱溶着による方法などを採用することができる。そのようにして閉塞された流路を開くための圧力は、例えば１５〜２．０ｋｇ／ｃｍ2である。基板２２は図２の実施例と同様に、樹脂プレートとその上を覆う弾性フィルムとからなっている。混合部２８は効率よく攪拌できるように、蛇行流路にしたり、流路の広い部分と狭い部分を繰り返すなどの構成が好ましい。プローブ配置部３０は、特に限定されるものではないが、１又は複数個のプローブが固定された複数個の凹部が流路に沿って直列に配列されたものが４列設けられており、プローブ配置部３０の端部には空気抜きのための穴３２が開けられている。プローブ配置部３０はＤＮＡとプローブとの反応に必要な温度に制御される。タイピング試薬収容部１４と混合部２８の間の流路にはＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入するためのサンプル注入口２６が設けられ、注入時以外は栓で閉じることができるようになっている。
【００４４】
使用前はこの反応容器はタイピング試薬の蒸発を防ぐために気密フィルム４３で封止されている。気密フィルム４３は反応容器全体を覆っていてもよく、図２の実施例のようにタイピング試薬収容部１４の部分のみを覆っていてもよい。図３の反応容器では使用前に気密フィルム４３が除かれ、サンプル注入口２６からサンプル反応液が注入されて、そのサンプル注入口２６が塞がれた後、この反応容器が検出装置に装着される。装着装置ではタイピング試薬収容部１４が押されて、若しくは上方からノズルが貫通しそのノズルを介してエアーが送られて、タイピング試薬とサンプル反応液が混合部２８へ送られて混合される。その後、プローブ配置部３０へ送られ、所定のプローブでＳＮＰが蛍光により検出される。
タイピング試薬収容部１４を押すことで、若しくはノズル６７を介してエアーを吐出又は吸引することでタイピング試薬とＰＣＲ反応液を混合する作業は、装置外で手作業で行なってもよい。
【００４５】
反応容器の第４の実施例を図４（Ａ）〜（Ｄ）を用いて説明する。（Ａ）及び（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は平面図、（Ｄ）はＰＣＲ反応部の断面図である。（Ａ），（Ｃ）及び（Ｄ）で１つの形態を表わし、（Ｂ），（Ｃ）及び（Ｄ）で他の形態を表わす。
（Ｃ）に示されるように、樹脂プレート４０には、サンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０が４つの凹部として形成され、それぞれにノズルが貫通可能でその貫通穴の復元が可能な封止部材１５を備えたキャップが被せられている。プローブ配置部３０は図３のものと同じであり、またプローブ配置部３０の他端部にはエアー抜きのための穴３２が開けられている。樹脂プレート４２は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。
【００４６】
サンプル注入部４４と混合部５０の間の流路と、ＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８の間の流路との間を結んで、さらに流路５４が形成されている。流路５４はＰＣＲ反応部となる部分である。
【００４７】
混合部５０とプローブ配置部３０の間も流路で結ばれている。サンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０はそれぞれ貫通穴の復元可能な素材のキャップ１８ａで覆われている。サンプル注入部４４のキャップは着脱可能であり、サンプルを注入する際にキャップが開けられる。
【００４８】
ＰＣＲ反応部５４は熱伝導率をよくするためにその樹脂プレートの下面側が図４（Ｄ）に示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．２〜０．３ｍｍである。
【００４９】
使用前は、封入された溶液が蒸発しないように取り外し可能な気密部材４３によって封止されており、気密部材４３として、例えば気密フィルムを用いることができる。気密フィルム４３は分析前に反応容器から除かれる。
（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す反応容器では、気密フィルム４３はＰＣＲ反応収容部４６とタイピング試薬収容部４８の復元可能な封止部材１５を備えたキャップ１８ａの内側に設けられ、それらのキャップ１８ａも着脱可能にされており、使用時にキャップ１８ａを取り外してフィルム４３を剥がし、再びキャップ１８ａを被せる。
【００５０】
（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す反応容器では、気密フィルム４３は反応容器の表面全体を覆っている。しかし、ＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８の表面だけを覆っていてもよい。使用時にフィルム４３を剥がす。
また、図２、図３に示されているように、気密フィルムで反応容器全体を覆って封止してもよい。
【００５１】
サンプル注入部４４は使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。ＰＣＲ反応試薬収容部４６にはＰＣＲ反応試薬が１０〜２０μＬ収容されている。タイピング試薬収容部４８にはタイピング試薬が４０μＬ程度収容されている。また、使用前の状態ではＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８及びＰＣＲ反応部５４の間がストッパ５８で抑えられて試薬の移動が阻止されている。流路は上部が弾性フィルム４２で覆われているので、上方から押すことにより流路のその部分を閉塞することができる。
【００５２】
この反応容器はＳＮＰ検出用の試薬キットとして用意され、サンプル注入部４４のキャップ１８ａを外して核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入する。使用にあたってストッパ５８を外し、流路の適当な箇所を閉じ、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６に交互にノズル６７を介してエアーを吐出又は吸引することによってサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合し、その混合液をＰＣＲ反応部５４に保持させる。ＰＣＲ反応部５４で所定の温度サイクルによりＰＣＲ反応を行なわせる。その後、流路の適当な箇所を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０にノズル６７を介してエアーを吐出又は吸引することによって、ＰＣＲ反応終了後の反応液とタイピング試薬を混合し、その後混合液を混合部５０に保持させる。
その後、混合部５０の反応液をプローブ配置部３０に送り、対応するプローブで蛍光を検出することによりＳＮＰを検出する。
【００５３】
反応容器の第５の実施例を図５（Ａ）〜（Ｄ）を用いて説明する。（Ａ）及び（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は平面図、（Ｄ）はＰＣＲ反応部の断面図である。（Ａ），（Ｃ）及び（Ｄ）で１つの形態を表し、（Ｂ），（Ｃ）及び（Ｄ）で他の形態を表す。
（Ｃ）に示されるように、樹脂プレート４０には図４に示す第４の実施例と同じように、サンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０が形成されている。
【００５４】
第４の実施例と異なるのは、サンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０のキャップ１８ｂの構造である。それらのキャップ１８ｂは図２（Ｄ）に示されたものと同じであり、ダイヤフラム構造となっている。サンプル注入部４４のキャップ１８ｂは着脱可能であり、サンプルを注入する際に枠体１９を外すことによってキャップ１８ｂが開けられる。
【００５５】
使用前は封入された溶液が蒸発しないように取り外し可能な気密部材４３によって封止されており、気密部材として、例えば気密フィルムを用いることができ、気密フィルム４３は分析前に反応容器から除かれる。
（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す反応容器では、気密フィルム４３はＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８のダイヤフラム構造のキャップ１８ｂの内側に設けられ、それらのキャップ１８ｂも着脱可能にされており、使用時にキャップ１８ｂを取り外してフィルム４３を剥がし、再びキャップ１８ｂを被せる。
【００５６】
（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す反応容器では、気密フィルム４３は反応容器の表面全体を覆っている。しかし反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８の表面だけを覆っていてもよい。使用時にフィルム４３を剥がす。
また、図２、図３に示されるように、気密フィルムで反応容器全体を覆って封止してもよい。
【００５７】
この反応容器もＳＮＰ検出用の試薬キットとして用意され、サンプル注入部４４のキャップ１８ｂを外して核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入する。使用にあたってストッパ５８を外し、流路の適当な箇所を閉じ、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６を交互に押すことによってサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合し、その混合液をＰＣＲ反応部５４に保持させる。ＰＣＲ反応部５４で所定の温度サイクルによりＰＣＲ反応を行なわせる。その後、流路の適当な箇所を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０を交互に押すことによって、ＰＣＲ反応終了後の反応液とタイピング試薬を混合し、その後混合液を混合部５０に保持させる。
その後、混合部５０の反応液をプローブ配置部３０に送り、対応するプローブで蛍光を検出することによりＳＮＰを検出する。
【００５８】
以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ヒト新鮮血液１μＬに対して、ＰＣＲ反応試薬２４μＬを用いて、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ  ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
【００５９】
タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。
【００６０】
図６は図４又は５の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型遺伝子多型検出装置の一例を示したものである。装置内に上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されて検査試薬キット装着部を構成しており、図５の反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に下側ヒートブロック６０上に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。
【００６１】
下側のヒートブロック６０はＰＣＲ反応部５４の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅部と、プローブ配置部３０の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部とを備えている。増幅部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応部の温度は、例えば６３℃に設定されている。
【００６２】
またヒータブロック６０の下部には蛍光検出を行なう検出器６４が配置されており、検出器６４は図の矢印Ｘ方向に移動してプローブ配置部３０からの蛍光を検出する。ヒータブロック６０には蛍光検出のために開口が設けられている。検査試薬キット装着部によるプローブ配置部３０のＹ方向への移動と、検出器６４のＸ方向移動により各プローブでの蛍光検出を行なう。
【００６３】
反応容器の各部を押して容積を変化させたり、各部にノズルを介してエアーを送ったり、流路上の一部を押して閉じるために、送液装置として送液アーム６６が設けられている。送液アーム６６は下方向に押すアクチュエータ６８と、エアーを吐出もしくは吸引するノズル６７を備えている。ここではアクチュエータ６８とノズル６７をともに備えているが、反応容器によってはどちらか一方のみでもよい場合がある。その場合には一方を省くことができる。ヒートブロック６２にはその下に配置された反応容器４１の流路上の所定の箇所を押すためのピンチバルブ軸と、エアー抜きの穴３２を閉じるためのシールバルブ軸が埋め込まれている。また、ノズル６７がサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０にエアーを吐出又は吸引することができるように、又は、アクチュエータ６８がサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０を押すことができるように、また、ピンチバルブ軸が所定の個所を押すことができるように、ヒートブロック６２には該当する位置に開口が設けられている。アクチュエータ６８でそれらのピンチバルブ軸、並びにサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０を押し、又はアクチュエータ６８でそれらのピンチバルブ軸を押し、ノズル６７でサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０にエアーを吐出もしくは吸引することにより送液動作を行なう。
【００６４】
図７は上側ヒートブロック６０に埋め込まれたピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅとシールバルブ軸７０ｆの位置を示したものである。（Ｂ）に示されるように、ピンチバルブ軸は流路上で５箇所の位置７０ａ〜７０ｅに配置されており、シールバルブ軸はエアー抜きの穴３２の位置に配置されている。
【００６５】
ピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅ及びシールバルブ軸の一例は、図８（Ａ）に示されるノック機構部の先端にピン７２を備えたものである。ピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅのノック機構部は、カム筒７４、ノック棒７６及び回転子７８を備えたカーン式ノック式機構と同等のものである。カム筒７４にはカム溝８０が設けられ、カム溝８０はノック棒７６とかみ合っている。８２はバルブ軸リフィールで、回転子７８の先端側にはめ込まれ、バネ８４により上方向に付勢されている。ピン７２はバルブ軸リフィール８２の先端にバネ８６により先端方向に付勢されて取り付けられている。
シールバルブ軸は、図８（Ｂ）に示されるように、ピンチバルブ軸のピン７２の先端にエアー抜きの穴３２を塞ぐためのシール部８８を設けたものである。
【００６６】
図９は検出器６４を詳細に示したものである。検出器６４は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器４１のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ，ＲＯＸ，ＶＩＣ，ＴＡＭＲＡ，Redmond Redなどを使用することができる。
【００６７】
次に、図４に示される反応容器の実施例の動作について説明する。
図４に示される状態は未使用の状態の試薬キットを示したものである。
（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップが開けられて、ピペット４５によりンプルが注入され（図１０参照。）、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて図６の検出装置に装着される。
【００６８】
（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
検出装置では図１１に示されるようにアクチュエータ６８がピンチバルブ軸７０ｂ，７０ｄを押し、その部分の流路を閉じる。ピンチバルブ軸は押されて先端が前進した状態又は後退した状態になると、アクチュエータ６８による押圧を解除しても、次に押圧されるまではその状態を維持する。そして、図１１と図１２に示されるように、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６に交互にノズル６７を介してエアーを吐出又は吸引することによって、ＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。
【００６９】
（ＰＣＲ反応）
図１３に示されるようにピンチバルブ軸７０ａ，７０ｂ，７０ｃ及び７０ｄにより流路を４箇所で閉じ、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液を閉じ込める。その状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。サンプルはゲノム抽出操作を施していないものであるが、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。
【００７０】
（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図１４〜図１６に示されるように、ピンチバルブ軸７０ａ、７０ｃ及び７０ｅにより流路のその部分を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０に交互にノズル６７を介してエアーを吐出又は吸引することによって、タイピング試薬がＰＣＲ反応部５４を通過するようにし、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
【００７１】
（プローブ配置部への送液）
図１７に示されるようにピンチバルブ軸７０ｂにより流路のその部分を閉じ、混合部５０にノズルを介してエアーを送ることによって混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
【００７２】
（インベーダ反応）
図１８に示されるように、ピンチバルブ軸７０ｅにより流路のその部分を閉じ、シールバルブ軸７０ｆによりエアー抜き用の穴３２を閉じて、プローブ配置部３０に反応液を溜めた状態でインベーダ反応を起こさせる。インベーダ反応は温度が例えば６３℃に設定されて行なわれる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器６４で励起光を照射し蛍光を検出する。
【００７３】
図１９はこの反応容器を使用する検出装置の他の例を表わしたものであり、送液アーム１１０に反応容器上の所定の部分にエアーを吐出又は吸引する２つのノズル１１２ａ、１１２ｂと、流路の所定の位置に対応して設けられた７個のピンチバルブ軸１１６ａ，１１６ｂ，１１６ｃ，１１６ｄ，１１６ｅ，１１６ｆ，１１６ｇを備えた例である。図６の検出装置では、流路を押さえるピンチバルブ軸は検査試薬キット装着部を構成する上側ヒートブロック６２に埋め込まれていたが、この実施例では上側ヒートブロック６２には該当する位置に穴をあけておき、ピンチバルブ軸は送液アーム１１０に設けてピンチバルブ軸用のアクチュエータにより押圧して作動させる。
【００７４】
（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップが開けられて、サンプルが注入され、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて検出装置に装着される（図１９参照。）。
【００７５】
（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
この工程では、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６をＰＣＲ反応部５４を介して導通させ、タイピング試薬収容部４８との間、及び混合部５０との間を閉じるようにピンチバルブ軸で流路を押した状態でサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合させる。そのために、図２０に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｂ，１１６ｄによりそれらの下の流路を閉じた状態でノズル１１２ａによりＰＣＲ反応試薬収容部４６にエアーを送る動作と、図２１に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｄ，１１６ｆによりそれらの下の流路を閉じた状態でノズル１１２ａによりサンプル注入部４４にエアーを送る動作とを交互に繰り返す。これによってＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。
【００７６】
（ＰＣＲ反応）
図２２に示されるように流路の閉塞を解除し、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液が存在している状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。
【００７７】
（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図２３に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８にノズル１１２ａでエアーを吐出又は吸引する動作と、図２４に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｃ、１１６ｄ及び１１６ｅによりそれらの下の流路を閉じ、混合部５０にノズル１１２ａでエアーを吐出又は吸引する動作とを繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図２５に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８にノズル１１２ａを介してエアーを送り、混合液を混合部５０に移動させる。
【００７８】
（プローブ配置部への送液）
図２６に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｇによりその下の流路を閉じ、混合部５０にノズル１１２ｂを介してエアーを吐出して混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
【００７９】
（インベーダ反応）
図２７に示されるように流路の閉塞を解除し、プローブ配置部３０に反応液を存在させた状態でインベーダ反応を起こさせる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器６４で励起光を照射し蛍光を検出する。この例では、空気抜きのための穴３２を閉じていない。その場合、反応液の蒸発によりインベーダ反応に影響が出ないようにするために、一例として蒸発をしてもインベーダ反応に影響が出ないだけの反応液量を穴３２に存在させておくのが好ましい。
【００８０】
次に、図５に示される反応容器の実施例の動作について説明する。この場合、図６の検出装置にはノズル６７は不要である。
図５に示される状態は未使用の状態の試薬キットを示したものである。
（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップが開けられて、ピペット４５によりサンプルが注入され（図１０参照。）、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて図６の検出装置に装着される。
【００８１】
（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
検出装置では図１１に示されるようにアクチュエータ６８がピンチバルブ軸７０ｂ，７０ｄを押し、その部分の流路を閉じる。ピンチバルブ軸は押されて先端が前進した状態又は後退した状態になると、アクチュエータ６８による押圧を解除しても、次に押圧されるまではその状態を維持する。図１１と図１２に示されるように、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６を上から交互にアクチュエータ６８で押すことによって、ＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。
【００８２】
（ＰＣＲ反応）
図１３に示されるようにピンチバルブ軸７０ａ，７０ｂ，７０ｃ及び７０ｄにより流路を４箇所で閉じ、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液を閉じ込める。その状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。
【００８３】
（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図１４〜図１６に示されるように、ピンチバルブ軸７０ａ、７０ｃ及び７０ｅにより流路のその部分を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０をアクチュエータ６８で交互に押すことによってタイピング試薬がＰＣＲ反応部５４を通過するようにし、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
【００８４】
（プローブ配置部への送液）
図１７に示されるようにピンチバルブ軸７０ｂにより流路のその部分を閉じ、混合部５０をアクチュエータ６８で押すことによって混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
【００８５】
（インベーダ反応）
図１８に示されるように、ピンチバルブ軸７０ｅにより流路のその部分を閉じ、シールバルブ軸７０ｆによりエアー抜き用の穴３２を閉じて、プローブ配置部３０に反応液を溜めた状態でインベーダ反応を起こさせる。
【００８６】
図１９の検出装置を使用することもできる。この場合、その検出装置は、送液アーム１１０に反応容器上の所定の部分を押圧する２つのアクチュエータ１１４ａ，１１４ｂと、流路の所定の位置に対応して設けられた７個のピンチバルブ軸１１６ａ，１１６ｂ，１１６ｃ，１１６ｄ，１１６ｅ，１１６ｆ，１１６ｇを備える。図６の検出装置では、流路を押さえるピンチバルブ軸は検査試薬キット装着部を構成する上側ヒートブロック６２に埋め込まれていたが、この実施例では上側ヒートブロック６２には該当する位置に穴をあけておき、ピンチバルブ軸は送液アーム１１０に設けてアクチュエータ１１４ａ、１１４ｂとは異なるピンチバルブ軸１１６ａ〜１１６ｄ用のアクチュエータにより押圧することで作動させる。
次にこの検出装置を用いた図６の実施例の反応容器の動作を説明する。
【００８７】
（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップが開けられて、サンプルが注入され、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて検出装置に装着される（図１９参照。）。
【００８８】
（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
この工程では、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６をＰＣＲ反応部５４を介して導通させ、タイピング試薬収容部４８との間、及び混合部５０との間を閉じるようにピンチバルブ軸で流路を押した状態でサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合させる。そのために、図２０に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｂ，１１６ｄによりそれらの下の流路を閉じた状態でアクチュエータ１１４ａによりＰＣＲ反応試薬収容部４６を押す動作と、図２１に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｄ，１１６ｆによりそれらの下の流路を閉じた状態でアクチュエータ１１４ａによりサンプル注入部４４を押す動作とを交互に繰り返す。これによってＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。
【００８９】
（ＰＣＲ反応）
図２２に示されるように流路の閉塞を解除し、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液が存在している状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。
【００９０】
（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図２３に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８をアクチュエータ１１４ａで押す動作と、図２４に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｃ、１１６ｄ及び１１６ｅによりそれらの下の流路を閉じ、混合部５０をアクチュエータ１１４ａで押す動作とを繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図２５に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８をアクチュエータ１１４ａで押して混合液を混合部５０に移動させる。
【００９１】
（プローブ配置部への送液）
図２６に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｇによりその下の流路を閉じ、混合部５０をアクチュエータ１１４ｂで押して混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
【００９２】
（インベーダ反応）
図２７に示されるように流路の閉塞を解除し、プローブ配置部３０に反応液を存在させた状態でインベーダ反応を起こさせる。
【００９３】
図２８は反応容器の第７の実施例を示したものである。この反応容器では、サンプルとして外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を使用する。この反応容器は、液溜め部としてサンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８が設けられ、プローブ配置部３０が設けられている。タイピング試薬収容部４８及びプローブ配置部３０は上記の実施例のものと同じである。この実施例でも、使用前はタイピング試薬の蒸発を防ぐために、反応容器全体を気密フィルムで封止しておくが、少なくともタイピング試薬収容部４８の部分は封止しておき、使用時にその気密フィルムを取り除く。
【００９４】
サンプル注入部１２０は外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を注入するために着脱可能なキャップで覆われており、そのキャップは上方が貫通穴の復元可能な材質で構成される。サンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８の間が流路１２２を介して接続されており、サンプル注入部１２０とプローブ配置部３０との間が流路１２２を介して接続されている。流路１２２，１２４も上記の実施例と同様に弾性フィルムにより覆われていて、上方から押圧することによりその部分を閉塞することができる。
【００９５】
この反応容器は、使用前の状態では流路１２２がストッパ１２６で押さえられてサンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８の間が閉塞されている。
この反応容器の動作を説明する。送液アームは上記のいずれの実施例のものも使用することができるが、ここでは、図６に示したものを使用するものとする。
【００９６】
（ＰＣＲ反応終了後のサンプル注入）
図２８に示されるように、流路１２４を閉じ、サンプル注入部１２０のキャップを開けて、ピペット４５により、外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を注入する。注入量は約１μＬとする。その後、サンプル注入部１２０のキャップを閉じる。
【００９７】
（タイピング反応液との混合）
次に、ストッパ１２６を外し、ピンチバルブ軸で流路１２４を閉じた状態で、図２９のようにタイピング試薬収容部４８にノズル６７を介してエアーを送る動作と、図３０のようにサンプル注入部１２０にノズル６７を介してエアーを送る動作を繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図３１に示されるようにタイピング試薬収容部４８にノズル６７を介してエアーを送って混合液をサンプル注入部１２０に移動させる。
このとき、ノズル６７の代わりにアクチュエータ６８を用いることもできる。つまり、図２９のようにアクチュエータ６８でタイピング試薬収容部４８を押す動作と、図３０のようにアクチュエータ６８でサンプル注入部１２０を押す動作を繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図３１に示されるようにタイピング試薬収容部４８をアクチュエータ６８で押して混合液をサンプル注入部１２０に移動させる。
【００９８】
（プローブ配置部への送液）
図３２に示されるように流路１２２をピンチバルブ軸で閉じ、サンプル注入部１２０にノズル６７でエアーを送るか、アクチュエータ６８でサンプル注入部１２０を押すことにより、サンプル注入部１２０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
（インベーダ反応）
【００９９】
図３３に示されるようにピンチバルブ軸７０ｅにより流路のその部分を閉じ、シールバルブ軸７０ｆによりエアー抜き用の穴３２を閉じて、プローブ配置部３０に反応液を存在させた状態でインベーダ反応を起こさせる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器で励起光を照射し蛍光を検出する。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の検出方法を概略的に示すフローチャート図である。
【図２】反応容器の第１，２の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は斜視図、（Ｃ）、（Ｄ）は断面図である。
【図３】反応容器の第３の実施例を示す平面図である。
【図４】反応容器の第４の実施例を示す図であり、（Ａ）及び（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は平面図、（Ｄ）はそのＰＣＲ反応部の断面図である。
【図５】反応容器の第５の実施例を示す図であり、（Ａ）及び（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は平面図、（Ｄ）はそのＰＣＲ反応部の断面図である。
【図６】図５の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型遺伝子多型検出装置の一実施例を示す概略斜視図である。
【図７】（Ａ）は同検出装置のピンチバルブ軸などの位置を示す斜視図、（Ｂ）はピンチバルブ軸などと反応容器との位置関係を示す平面図である。
【図８】（Ａ）はピンチバルブ軸を示す断面図、（Ｂ）はシールバルブ軸の先端部を示す断面図である。
【図９】同検出装置における検出器を示す概略構成図である。
【図１０】一実施例におけるサンプル注入動作を示す平面図である。
【図１１】同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。
【図１２】同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。
【図１３】同実施例におけるＰＣＲ反応動作を示す平面図である。
【図１４】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図１５】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図１６】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図１７】同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。
【図１８】同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。
【図１９】他の実施例におけるサンプル注入動作を示す平面図である。
【図２０】同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。
【図２１】同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。
【図２２】同実施例におけるＰＣＲ反応動作を示す平面図である。
【図２３】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図２４】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図２５】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図２６】同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。
【図２７】同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。
【図２８】さらに他の実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル注入動作を示す平面図である。
【図２９】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図３０】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図３１】同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。
【図３２】同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。
【図３３】同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。
【符号の説明】
【０１０２】
２      サンプル
４      ＰＣＲ反応液
６      インベーダ試薬
８      プローブ配置部
１４      希釈液収容部
１５      封止部材
１６      チャンバ
１７      ダイヤフラム
１６ａ，３０    プローブ配置部
１８ａ，１８ｂ    キャップ
２６      サンプル注入口
２８      混合部
４１      反応容器
４３      気密部材（気密フィルム）
４４，１２０      サンプル注入部
４６      ＰＣＲ反応試薬収容部
４８      タイピング試薬収容部
５０      混合部
５４      ＰＣＲ反応部
６０，６２      ヒートブロック
６４      検出器
６６，１１０      送液アーム
６７，１１２ａ，１１２ｂ    ノズル
６８，１１４ａ，１１４ｂ    アクチュエータ
７０ａ〜７０ｅ，１１６ａ〜１１６ｇ      ピンチバルブ軸
７０ｆ      シールバルブ軸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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