(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＲＮＡｉ法等に使用できる細胞を短期間で効率よく製造できる細胞へのＤＮＡ導入方法を提供する。【解決手段】  特定の配列を有する塩基配列で示されるｌｏｘ６６配列又は特定の配列を有する塩基配列で示されるｌｏｘ７１配列と、特定の配列を有する塩基配列で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、ｌｏｘ６６配列又はｌｏｘ７１配列のうちアクセプトベクターが有していないいずれかの配列と、ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘ６６配列又はｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターに、Ｃｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列又は配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞。
【請求項２】
配列番号４で示されるｌｏｘ７１／６６配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列と、挿入ＤＮＡとが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞であって、挿入ＤＮＡがｌｏｘ７１／６６配列とｌｏｘＰ配列との間に安定に挿入された細胞。
【請求項３】
ｌｏｘ７１／６６配列とｌｏｘＰ配列との間に、マーカー遺伝子と、前記マーカー遺伝子発現のためのプロモータと、前記マーカー遺伝子の転写終結シグナルとを有する請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記ｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【請求項５】
配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記ｌｏｘ６６配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【請求項６】
３’側変異ｌｏｘＰ配列又は５’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞。
【請求項７】
３’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、５’側変異ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記５’側変異ｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【請求項８】
５’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、３’側変異ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記３’側変異ｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の塩基配列を安定に有する細胞、及び前記細胞に組み換え酵素を作用させて所望のＤＮＡを安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムプロジェクトにより様々な生物種のゲノム配列が解明され、生命現象を司る遺伝子の種類や数が推定されてきているが、その機能については未知なものが多い。ヒトにおいては、疾患原因遺伝子の同定を目的とし、ゲノム情報をもとに遺伝子領域の特定や遺伝子からのタンパク質発現量を網羅的に解析する技術（トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析等）が開発されている。しかし、個々の遺伝子の機能については解明が進んでおらず、ゲノム配列情報からの疾患メカニズムの推定には限界があるのが現状である。
【０００３】
従来、ほ乳類において個々の遺伝子機能を解析する方法には、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）又は培養細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、目的遺伝子を消失させ（ノックアウト）あるいは導入して（ノックイン）その影響を調べる方法がある。
【０００４】
ノックアウト法は、標的とする遺伝子に変異を導入してその遺伝子を消失させる方法である。
【０００５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏノックアウト法では、ヒトにゲノム配列が近く成熟期間が短いマウスが多用されているが、標的とする遺伝子に変異を導入してノックアウトしたマウス個体の作製には最低でも１系統につき約１年を要する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系では、ノックアウトしたマウス生体から分取した細胞を使用するので、ノックアウトした細胞を得るのに要する期間はｉｎ  ｖｉｖｏの系と同様約１年である。
【０００６】
ノックアウト法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれの系においても個体や細胞の作製に時間がかかるため、最近注目されているのが標的遺伝子を消失させずに遺伝子の発現を抑制する方法（ノックダウン法）である。
【０００７】
ノックダウンの代表的な方法としては、発現するｍＲＮＡの機能を特異的に阻害するＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）法がある。ＲＮＡｉ法においては、生体又は培養細胞のゲノムに標的遺伝子から発現するｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｉＲＮＡ  （ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ；スモールインターフェレンスＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈｅａｐｉｎ  ＲＮＡ；ショートヘアピンＲＮＡ）を発現するＤＮＡを導入する方法、もしくはオリゴ合成したｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを一過的に細胞内に導入する方法などがある。ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ切断酵素の一種であるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）で切断された後、ｓｉＲＮＡ／タンパク質複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ））に取り込まれる。ｓｉＲＮＡと相補的な配列を有するｍＲＮＡは、そのＲＩＳＣ複合体によって認識され、ＲＩＳＣに含まれるタンパク質によって切断されてその機能を消失する。
【０００８】
ＲＮＡｉ法においてｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡは細胞本来の機能を阻害しないゲノム上の領域であれば挿入が可能であるので、ノックアウト法に比較して挿入可能な範囲が広い。また、ＤＮＡの２本鎖のいずれか一方にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを挿入すればよく、２本鎖の両方に存在する標的遺伝子に変異を導入する必要があるノックアウト法に比較して、遺伝子発現が抑制されたマウス個体や培養細胞を作製する期間が飛躍的に短縮できる。ＲＮＡｉ法において、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス個体を作製する期間は約半年、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞を作成する期間は約３ヶ月である。
【０００９】
特許文献１には、ｌｏｘＰ配列及び変異ｌｏｘ配列を有するベクターを所定の遺伝子に導入した細胞及びノックアウトマウスが記載されている。この文献によれば、組み換え酵素（Ｃｒｅ酵素）を利用したｌｏｘ／Ｃｒｅシステムにより細胞に導入したベクター内のｌｏｘ部位に任意の遺伝子を挿入できるとある。
【００１０】
この文献に記載の細胞やノックアウトマウスは、所定の遺伝子がｌｏｘＰ及び変異ｌｏｘ配列を含むベクターで破壊されたものであるので、他の遺伝子の機能を調べる際にはその遺伝子を消滅させることが必要になり、ノックアウトマウス自体の作製期間を短縮するものではない。組み換え酵素により細胞に任意のＤＮＡを挿入するとしても内在性遺伝子の破壊により細胞本来の機能の一部が既に失われているので、挿入したＤＮＡによる細胞への影響を正確に判定することができず、ＲＮＡｉ法を適用することはできない。
【特許文献１】特開２００２−３６９６８９号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＲＮＡｉ法において、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現させる配列を有するＤＮＡを細胞のゲノムへ挿入する際には、通常電気刺激やウイルス感染による方法が多く用いられる。これらの方法によるＤＮＡの挿入は、挿入位置や挿入されるＤＮＡの数をコントロールすることができず、ＤＮＡはゲノム上へランダムに挿入される。上述したように、ＲＮＡｉ法は、ゲノムから発現するｍＲＮＡの機能を阻害することにより細胞の喪失した機能を調べて内在性遺伝子の機能を決定する方法であるので、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡは細胞本来の機能を妨げない位置に導入することが要求される。従って、ＲＮＡｉ法を行うに際しては、ＤＮＡの挿入を行う度に挿入位置をゲノム解析により特定して細胞の機能を妨げない位置に導入された細胞を選定する必要があり、多大な手間と時間を要している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、所定の配列を有するアクセプトベクターを予め細胞のゲノム上の内在性遺伝子を傷つけない領域に安定に挿入しておき、このアクセプトベクターと、所望のＤＮＡが挿入してあるドナーベクターとを組み換え酵素を用いて組み換えることにより、所望のＤＮＡをゲノムの所定位置に安定に挿入した細胞が容易に得られることを見出した。更に、挿入するＤＮＡを適宜選択することにより得られた細胞が目的遺伝子のノックインやＲＮＡｉ法などを用いた目的遺伝子のノックダウンに使用できることを確認し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１４】
〔１〕  配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列又は配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞。
【００１５】
〔２〕  配列番号４で示されるｌｏｘ７１／６６配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列と、挿入ＤＮＡとが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞であって、挿入ＤＮＡがｌｏｘ７１／６６配列とｌｏｘＰ配列との間に安定に挿入された細胞。
【００１６】
〔３〕  ｌｏｘ７１／６６配列とｌｏｘＰ配列との間に、マーカー遺伝子と、前記マーカー遺伝子発現のためのプロモータと、前記マーカー遺伝子の転写終結シグナルとを有する〔２〕に記載の細胞。
【００１７】
〔４〕  配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記ｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【００１８】
〔５〕  配列番号２で示されるｌｏｘ７１配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、配列番号１で示されるｌｏｘ６６配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記ｌｏｘ６６配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【００１９】
〔６〕  ３’側変異ｌｏｘＰ配列又は５’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターが、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞。
【００２０】
〔７〕  ３’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、５’側変異ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記５’側変異ｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【００２１】
〔８〕  ５’側変異ｌｏｘＰ配列と、配列番号３で示されるｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターがゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域に安定に挿入された細胞と、３’側変異ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列と、前記３’側変異ｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間に挿入された挿入ＤＮＡとを有するドナーベクターにＣｒｅ酵素を作用させて、ドナーベクターの挿入ＤＮＡを前記細胞に安定に導入する細胞へのＤＮＡ導入方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明においては、ゲノム上の内在性遺伝子を破壊しない領域に予め導入してあるアクセプトベクターに目的とするＤＮＡを導入するので、クローンを作製する度に煩雑なゲノム解析を行ってＤＮＡが所望の位置に導入された細胞を選定する必要がない。このため、短期間で効率よく目的のＤＮＡを安定に導入した細胞を得ることができる。細胞へのＤＮＡの導入は、ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列に変異を導入したｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１配列とを組み合わせて利用するので、導入後の脱落率が低く、効率よく目的のＤＮＡを導入した形質転換体を得ることができる。
【００２３】
本発明のＤＮＡ導入方法により得られる細胞は、導入するＤＮＡを目的に応じて選択することにより、目的遺伝子のノックイン、ＲＮＡｉ法等の目的遺伝子のノックダウン等に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図１を参照して本発明のＤＮＡ導入方法を説明する。
【００２５】
ＤＮＡを導入する細胞（親株）１には、予め配列３（ｌｏｘ７１配列）と、配列５（ｌｏｘＰ配列）とを有するアクセプトベクター７が安定に挿入してある。
【００２６】
ｌｏｘＰは大腸菌Ｐ1ファージ由来の配列で、図２に示すように、５’末端から３’末端へむかって順に、センス側反復配列、スペーサ、アンチセンス側反復配列の３つの領域で構成されることが知られている。ｌｏｘＰの配列は、５’末端から３’末端方向の配列と、３’末端から５’末端方向の配列が、互いに相補的になっている。
【００２７】
ｌｏｘ７１は配列番号３で示される塩基配列で、ｌｏｘＰ配列のセンス側反復配列に変異を導入した配列である。
【００２８】
細胞１におけるアクセプトベクター７の挿入位置は、ゲノム上のタンパク質発現に関与しない領域、即ちエキソンとイントロンを含まない領域とする。ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域としては、非翻訳領域、遺伝子間ＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００２９】
アクセプトベクター７には、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＰの他に、マーカー遺伝子２７や、マーカー遺伝子発現のためのプロモータ２５、マーカー遺伝子の転写終結シグナル２９等の他の配列が挿入されていてもよい。マーカー遺伝子としては公知のものを使用できるが、例えばゼオシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００３０】
上記アクセプトベクターを有する細胞１（親株）は、例えば以下の方法により製造することができる。
【００３１】
まず、ｌｏｘ７１配列と、ｌｏｘＰ配列とを有するアクセプトベクターを含むＤＮＡ断片を、制限酵素等を用いた公知の方法により作製する。次に、このＤＮＡ断片を電気刺激により哺乳類培養細胞（ＨｅＬａ細胞）のゲノムへ導入する。アクセプトベクターにマーカー遺伝子が導入してある場合には、導入してあるマーカー遺伝子に応じて薬剤を添加した培地で細胞を培養し、マーカー遺伝子がゲノムに導入された細胞が形成するコロニーを選択する。得られた細胞についてサザンブロット法、ＰＣＲ法等によるゲノム解析を行い、ゲノム上のエキソンとイントロンを含まない領域にアクセプトベクターが１コピー導入されたクローンを選定し、細胞１（親株）とする。
【００３２】
一方、ドナーベクター９は、図１中１１で示されるｌｏｘ６６と、１３で示されるｌｏｘＰ配列とを有している。ｌｏｘ６６は配列番号１で示される塩基配列で、ｌｏｘＰのアンチセンス側反復配列に変異を導入した配列である。ドナーベクターのｌｏｘ６６とｌｏｘＰとの間には細胞１に挿入する所望の配列を有するＤＮＡ（以下、挿入ＤＮＡと称す）１５が導入してある。
【００３３】
ドナーベクター９に導入されたｌｏｘ６６配列とｌｏｘＰ配列との間には、挿入ＤＮＡ１５のほかに、マーカー遺伝子３３、マーカー遺伝子発現のためのプロモータ３１、マーカー遺伝子の転写終結シグナル３５、挿入ＤＮＡ発現のためのプロモータ等を有していてもよい。マーカー遺伝子としては、細胞１に導入してあるマーカー遺伝子２７、２８と異なる公知のものが使用できる。
【００３４】
ドナーベクター９は例えば以下のようにして調製することができる。
【００３５】
まず、ｌｏｘ６６とｌｏｘＰとの間に挿入ＤＮＡ１５が導入されたＤＮＡ断片を、制限酵素等を用いた公知の方法により作製する。次いで、プラスミド、ファージ等の公知のベクターとＤＮＡ断片とを同じ制限酵素で処理し、それぞれの粘着末端同士をＤＮＡリガーゼでつなぎ合わせることにより調製する。
【００３６】
細胞１への挿入ＤＮＡ１５の導入は、細胞１とドナーベクター９に組み換え酵素４１を作用させてアクセプトベクター７と、細胞１へ導入したドナーベクター９との間でＤＮＡを組み換えることにより行う。
【００３７】
組み換え酵素としては、Ｃｒｅ酵素を使用する。Ｃｒｅ酵素は、ｌｏｘＰのスペーサ配列を切断し、粘着末端同士を結合して組み換えを行う酵素である。ｌｏｘＰの塩基対にＣｒｅ酵素を作用させたときの切断位置を図２に示す。
【００３８】
Ｃｒｅ酵素をアクセプトベクター７とドナーベクター９に作用させるに際しては、Ｃｒｅ酵素発現ベクターを公知の方法により細胞１へ導入する方法やＣｒｅ酵素を添加した培地で細胞１を培養する方法等が採用できる。
【００３９】
Ｃｒｅ酵素は、塩基対を形成するｌｏｘＰの２本鎖の一方又は両方を、センス側又はアンチセンス側のいずれかに変異が導入された変異ｌｏｘ配列に置き換えた場合であっても、スペーサ配列の切断、結合を行う（但し、２本鎖の両方に変異ｌｏｘを使用する場合であって、変異の導入位置がセンス側同士又はアンチセンス側同士の組み合わせである場合を除く）。従って、ｌｏｘＰとｌｏｘ７１、ｌｏｘＰとｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６の間でも、ｌｏｘＰ同士の場合と同様に配列の組み換えが行われる。
【００４０】
アクセプトベクター７とドナーベクター９にＣｒｅ酵素を作用させると、アクセプトベクターのｌｏｘ７１とドナーベクターのｌｏｘ６６、アクセプトベクターのｌｏｘＰとドナーベクターのｌｏｘＰの間でＣｒｅ酵素による組み換えがおこる。その結果、ドナーベクター９のｌｏｘ６６とｌｏｘＰの間の配列１９がゲノムに安定に組み込まれた細胞（子株）１７を得る。
【００４１】
この組み換えにより、細胞１７のドナーベクターに由来する配列１９の両端には、図１中、２１で示されるｌｏｘ７１／６６配列と、２３で示されるｌｏｘＰ配列とが形成される。ｌｏｘ７１／６６配列は、スペーサ配列の両端に、それぞれｌｏｘ７１のセンス側反復配列と、ｌｏｘ６６のアンチセンス側反復配列を有する配列を示す。ｌｏｘ７１／６６の塩基配列は、配列番号４に示す配列である。
【００４２】
ｌｏｘＰのセンス側反復配列とアンチセンス側反復配列の両方に変異が導入されたｌｏｘ７１／６６配列にはＣｒｅ酵素はほとんど作用しない。そのため、細胞１７からの配列１９の脱落はごく僅かで、ゲノム上に挿入ＤＮＡ１５が安定に導入された細胞１７を高い収率で得ることができる。本発明において「安定に」とは、細胞分裂の過程でゲノム上から所定の塩基配列が脱落せず半永久的に保持される状態をいう。
【００４３】
本発明においては、挿入ＤＮＡ１５の配列を目的に応じて適宜選択することにより、得られる細胞に様々な機能を付与でき、その結果様々な用途に使用することができる。
【００４４】
例えば、挿入ＤＮＡに標的遺伝子から発現するｍＲＮＡを阻害するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現させるような配列を有するＤＮＡを選択した場合には、得られた細胞はＲＮＡｉ法に使用できる。挿入ＤＮＡにレポーター遺伝子やレポーター遺伝子の応答配列を組み込んだ場合には、得られた細胞はレポーターアッセイに使用することができる。
【００４５】
なお、図１においては、アクセプトベクターの配列３にｌｏｘ７１、ドナーベクターの配列１１にｌｏｘ６６を使用する場合について示したが、配列３にｌｏｘ６６、配列１１にｌｏｘ７１を使用する場合についても同様に挿入ＤＮＡ１５を細胞１に導入することができる。
【００４６】
更に、アクセプトベクターの配列３とドナーベクターの配列１１には、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６に代えて、ｌｏｘＰのセンス側反復配列が一部変異した５’側変異ｌｏｘＰと、ｌｏｘＰのアンチセンス側反復配列が一部変異した３’側変異ｌｏｘＰとを組み合わて使用することが可能である。５’側変異ｌｏｘＰはｌｏｘＰのセンス側反復配列の２〜７塩基が、３’側変異ｌｏｘＰはｌｏｘＰのアンチセンス側反復配列の２〜７塩基が他の塩基で置換された配列である。但し、５’側変異ｌｏｘＰのスペーサ配列から５’末端へ向かう塩基配列と、３’側変異ｌｏｘＰのスペーサ配列から３’末端へ向かう塩基配列が同じ配列となる組み合わせは、配列１９が脱落する割合が高くなるので、異なる組み合わせを選択することが好ましい。
【００４７】
５’側変異ｌｏｘＰと３’側変異ｌｏｘＰの一例を以下に示す。以下の配列中、小文字で示した塩基は、ｌｏｘＰ配列と異なる塩基である。
【００４８】
〔５’側変異ｌｏｘＰ〕
(a) 5'-AatgCaTgcTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3'（配列番号24）
(b) 5'-taccgggCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3'（配列番号25）
(c) 5'-tagcgTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3'（配列番号26）
(d) 5'-taccgggCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3'（配列番号27）
〔３’側変異ｌｏｘＰ〕
(a) 5'-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATAgGtAccgAg-3'（配列番号28）
(b) 5'-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGcccggta-3'（配列番号29）
(c) 5'-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGcAcggta-3'（配列番号30）
(d) 5'-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATAgGtAccgta-3'（配列番号31）
(e) 5'-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGtAccggg-3'（配列番号32）
【実施例】
【００４９】
製造例１（アクセプトベクターの作製）
（１）lox71断片の増幅
下記成分をPCRチューブへ入れて混合した。
・pDNR-1r (Clontech社製)                                        1 ml
・5'Xho-lox71 (5'-TAGCTCgagAAAGATCCtaccgTTCGTATAGC-3':配列番号5)[10 mM]
1 ml
・3'Xho-lox71 (5'-cgcCTCgagTCACTAAATAATAG-3':配列番号6) [10 mM] 1 ml
・dNTP [2 mM]                                                  10 ml
・Mg2+[10 mM]                                                   6 ml
・10×buffer (付属品)                                          10 ml
・ddH2O                                                        69 ml
・KOD plus (TOYOBO社製；酵素)                                   2 ml
100 ml
PCRチューブに蓋をした後、pDNR-1rを鋳型として、PCRにより両端にXhoIサイトを付加してあるlox71断片の増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、53℃-30秒、68℃-30秒を30サイクルとした。
【００５０】
（２）loxP断片の増幅
下記成分をPCRチューブへ入れて混合した。
・pDNR-1r (Clontech社製)                                         1 ml
・5'Xba-loxP (5'-GCTTCtagAGCTCCTGAAAGATCC-3':配列番号7)[10 mM]   1 ml
・3'Xba-loxP (5'-TcCtCTAgATAATAGTGAACGGC-3':配列番号8) [10 mM]   1 ml
・dNTP [2 mM]                                                   10 ml
・Mg2+[10 mM]                                                     6 ml
・10×buffer (付属品)                                           10 ml
・ddH2O                                                          69 ml
・KOD plus (TOYOBO社製；酵素)                                    2 ml
100 ml
PCRチューブに蓋をした後、pDNR-1rを鋳型として、PCRにより両端にXbaIサイトを付加してあるloxP断片の増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、53℃-30秒、68℃-30秒を30サイクルとした。
【００５１】
（３）アクセプトベクターの作製
(1)で得られたPCR産物(約110bp)をPCR Purification Kit（QIAGEN社製)により精製した後、XhoIで消化した。XhoI消化したPCR精製産物(約110bp)とXhoI消化したpCMVZeo (Invitrogen社製)とをリガーゼでつなぎ合わせ、p71CMVZeoを作製した。
【００５２】
次いで、(2)で得られたPCR産物(約110bp)をPCR Purification Kit（QIAGEN社製)により精製した後、XbaIで消化した。XbaI消化したPCR精製産物(約110bp)とXbaI消化したp71CMVZeoとをリガーゼでつなぎ合わせ、p71CMVZeoP(約3.8Kbp)を作製し、アクセプトベクターとした。得られたアクセプトベクター(p71CMVZeoP)の構成図を図３に示す。
【００５３】
なお、アクセプトベクターに挿入されたlox71配列とloxP配列はシーケンサー(ベックマン社製)によって配列と挿入の向きが正しいことを確認した。
【００５４】
製造例２（細胞（親株）の作製）
（１）HeLa細胞へのアクセプトベクターの挿入
実施例１で作製したアクセプトベクター(p71CMVZeoP)20mgをPvuIIで消化し、直鎖状にした。直鎖状アクセプトベクターをTE buffer 50mlに溶解させ、さらに氷冷PBS(-)を50 ml加え、100 mlとした。
【００５５】
培養したHeLa細胞をトリプシン消化により、接着したデイッシュ上から回収し、氷冷PBS(-)0.7mlに懸濁した。この時、細胞数を計測したところ、約1.0×107個であった。
【００５６】
Gene Pluser Cuvette (サイズ；0.4cm electrode; BioRad社製)へ細胞懸濁液と直鎖状アクセプトベクター溶解液を移し、Gene Pluser (BioRad社製)にセットし、800V、3mFの条件で電気刺激を与えた。
【００５７】
この混合液を細胞培養用の10cmデイッシュに移し、400mg/mlゼオシンを含むDMEM培地で10日〜14日間培養した。
【００５８】
出現したコロニーを実態顕微鏡下でピックアップし、48ウエル細胞培養プレートへ移した(クローン化)。面積比で約12倍になるまで、通常のDMEM培地で細胞培養を続けた後、細胞をトリプシンによって剥がし、セルバンカーに溶解させ、-80℃で保存した。
【００５９】
（２）細胞株の選別
a)  (1)で得られた細胞を殖やし、ゲノム抽出(QIAGEN社)した。
【００６０】
b)  genomic PCRによってアクセプトベクターが挿入されたことを確認するため、以下の操作を行った。
【００６１】
下記成分をPCRチューブへ入れて混合した。
・それぞれのクローンのgenomic DNA                                 1 ml
・Zeo-S2 (5'-GAGGAGCAGGACTGA-3':配列番号9)[10 mM]                0.2ml
・CMVZeo-MCS-A1 (5'-GTGCTGCAAGGCGATTAAG-3':配列番号10) [10 mM]   0.2ml
・dNTP [2.5 mM]                                                 1.6 ml
・10×buffer (付属品)                                             2 ml
・ddH2O                                                           15ml
・EX Taq (TAKARA社製；酵素)                                      0.1ml
20 ml
PCRチューブに蓋をした後、PCRによりゲノムの増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、55℃-30秒、72℃-30秒を30サイクルとした。PCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、約300bpの位置のバンドの有無を確認した。
【００６２】
c)  genomic PCRによってアクセプトベクターが挿入されたことを確認するため、以下の操作を行った。
【００６３】
下記成分をPCRチューブへ入れて混合した。
・それぞれのクローンのgenomic DNA                                 1 ml
・Ori-S1 (5'-CTACACCGAACTGAGATAC-3':配列番号11)[10 mM]           0.2ml
・lox71-zeo (5'-CCGCATAACTTCGTATAATG-3':配列番号12) [10 mM]      0.2ml
・dNTP [2.5 mM]                                                 1.6 ml
・10×buffer (付属品)                                             2 ml
・ddH2O                                                           15ml
・EX Taq (TAKARA社製；酵素)                                      0.1ml
20 ml
PCRチューブに蓋をした後、PCRによりゲノムの増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、55℃-30秒、72℃-30秒を30サイクルとした。PCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、約400bpの位置のバンドの有無を確認した。
【００６４】
d)  サザンブロットによってアクセプトベクターが挿入されたことを確認するため、以下の操作を行った。
【００６５】
genomicDNAをEcoRIとBglIIで消化し、サザンブロッテイングした。NcoIプローブで検出し、約1.5Kbの位置のバンドの有無を確認した。
【００６６】
e)  サザンブロットによってアクセプトベクターが挿入されたことを確認するため、以下の操作を行った。
【００６７】
genomicDNAをBglIIで消化し、サザンブロッテイングした。HinfIプローブで検出し、単一のバンドが出るかどうかを確認した。
【００６８】
f)  当りクローンについて、以下の手順によりアクセプトベクター挿入部位近傍のゲノム配列をクローニングした。
【００６９】
b)、c)で行ったPCR解析とd)、e)で行ったサザンブロットで結果が確認されたクローン（No.55）のgenomicDNAをBglIIで消化した。リガーゼでセルフライゲーションさせ、大腸菌stbl4へ形質転換した。30℃で1時間培養した後、アンピシリンを含むプレートに播き、30℃で培養した。出現したコロニーを培養し、シーケンサー(ベックマン社製)によってアクセプトベクター挿入部位の5’上流側の配列を読んだ。その結果、得られたゲノム配列をデータベース上で検索し、ヒト9番染色体上の一部の配列であることを確認した。
【００７０】
次に、アクセプトベクター挿入部位を挟んで、3'側下流のゲノム側に4種類のプライマー(5'-gtcttgttctgtagcccaagc-3'(配列番号13)、5'-cagcttgttgagagaacttgc-3'(配列番号14)、5'-catctgtctggagcctcaactttc-3'(配列番号15)、5'-gactcctcccacagtcaccactg-3'(配列番号16))を設定し、PCR反応を行った。
・genomic DNA(クローンNo.55)                                      1 ml
・Zeo-S2 (5'-GAGGAGCAGGACTGA-3':配列番号17)[10 mM]               0.2ml
・ゲノム側プライマー各種 [10 mM]                                 0.2ml
・dNTP [2.5 mM]                                                 1.6 ml
・10×buffer (付属品)                                             2 ml
・ddH2O                                                           15ml
・Platinum Taq (Invitrogen社製；酵素)                            0.1ml
20 ml
上記成分を混合し、PCRチューブへ入れて蓋をした後、PCRによりゲノムの増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、55℃-30秒、72℃-30秒を30サイクルとした。
【００７１】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドを切り出してGel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した後、シーケンサー(ベックマン社製)によってアクセプトベクター挿入部位の3'下流側の配列を読んだ。その結果、得られたゲノム配列をデータベース上で検索し、ヒト9番染色体上の一部の配列であることを確認した。ゲノム上へのアクセプトベクターの挿入マップを図４に示す。
【００７２】
製造例３（ドナーベクター(p66CMVBsdP)の作製）
（１） lox66断片の増幅
下記成分をPCRチューブに入れて混合した。
・pDNR-1r (Clontech社製)                                          1 ml
・5'Xho-lox66[10mM]  (5'-TAGCTCgaGAAAGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAc
ggtaGCG-3':配列番号18)                                            1 ml
・3'Xho-lox71 (5'-cgcCTCgagTCACTAAATAATAG-3':配列番号19) [10 mM]  1 ml
・dNTP [2 mM]                                                    10 ml
・Mg2+[10 mM]                                                     6 ml
・10×buffer (付属品)                                            10 ml
・ddH2O                                                          69 ml
・KOD plus (TOYOBO社製；酵素)                                     2 ml
100 ml
PCRチューブに蓋をした後、pDNR-1rを鋳型として、PCRにより両端にXhoIサイトを付加してあるlox66断片の増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、53℃-30秒、68℃-30秒を30サイクルとした。
【００７３】
（２）ベクターへのlox66断片の導入
(1)で得られたPCR産物(約110bp)をPCR Purification Kit(QIAGEN社)により精製した後、XhoIで消化した。更に、pCMVBsd (Invitrogen社)についてもXhoIで消化した。XhoI消化したPCR精製産物(約110bp)とpCMVBsdをリガーゼでつなぎ合わせ、p66CMVBsdを作製した。
【００７４】
（３）loxP断片の増幅
下記成分をPCRチューブに入れて混合した。
・pDNR-1r (Clontech社)                                            1 ml
・5'Nar-loxP (5'-TTAGgcgCCTTAGCTCCTGAA-3':配列番号20)[10 mM]      1 ml
・3'Nar-loxP (5'-CATggCgCcAAATAATAGTGAACG-3':配列番号21) [10 mM]  1 ml
・dNTP [2 mM]                                                    10 ml
・Mg2+[10 mM]                                                      6 ml
・10×buffer (付属品)                                            10 ml
・ddH2O                                                           69 ml
・KOD plus (TOYOBO社製；酵素)                                     2 ml
100 ml
PCRチューブに蓋をした後、pDNR-1rを鋳型として、PCRにより両端にNarIサイトを付加してあるloxP断片の増幅を行った。PCR条件は、95℃-30秒、53℃-30秒、68℃-30秒を30サイクルとした。
【００７５】
（４）ベクターへのloxP断片の導入
(1)で得られたPCR産物(約110bp)をPCR Purification Kit(QIAGEN社)により精製し、XhoIで消化した。更に、pCMVBsd (Invitrogen社)についてもXhoIで消化した。XhoI消化したPCR精製産物(約110bp)とpCMVBsdをリガーゼでつなぎ合わせ、p66CMVBsdを作製した。
【００７６】
(3)で得られたPCR産物(約110bp)をPCR Purification Kit(QIAGEN社)により精製し、NarI消化した。更に、(2)で得たp66CMVBsdをNarIで消化した。XbaI消化したPCR精製産物(約110bp)とp66CMVBsdをリガーゼでつなぎ合わせ、p66CMVBsdP(約3.8Kbp)を作製し、これをドナーベクターとした。得られたドナーベクターの構成図を図５に示す。
【００７７】
なお、ドナーベクターに挿入されたlox66配列とloxP配列はシーケンサー(ベックマン社)によって配列と挿入の向きが正しいことを確認した。
【００７８】
製造例４（ドナーベクター (p66BsdP/Green)の作製）
製造例３で作製したp66CMVBsdPの3581bpのNarIサイトを部位特異的変異法により、G→Aに置換し、p66CMVBsdP mutを得た。更に、p66CMVBsdP mutをNarIで消化し、Klenow酵素でブラント(平滑末端)化した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドを切り出してGel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。
【００７９】
pZsGreen1(Clontech社)をBspLUll Iで消化後、Klenow酵素+dNTPによりブラント化し、リン酸化した後、更ににSspIで消化した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンド(CMV-ZsGreen-pAフラグメント;約1.6Kb)を切り出し、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。
【００８０】
ニックの入ったp66CMVBsdP mutと約1.6KbのCMV-ZsGreen-pAフラグメントをリガーゼでつなぎ合わせ、ドナーベクターp66BsdP/Greenを作製した。得られたp66BsdP/Greenの構成図を図６に示す。
【００８１】
製造例５（ドナーベクター(p66Bsd/TNFR RNAi)の作製）
TNFR (Tumor Necrosis Factor Receptor；Acc No., NM 001065.2)をターゲットにセンス鎖(5'-caccGGAGCTTACTTGTATGATGATgtgtgctgtccGTCATTGTACAAGTAGGTTCCttttt-3':配列番号22)とアンチセンス鎖(5'-gcataaaaaGGAACCTACTTGTACAATGACggacagcacacATCA-3':配列番号23)をデザインし、等量をアニーリングバッファー(annealing buffer：10 mM Tris-HCl, pH 7.5/ 1 mM EDTA/ 100mM NaCl)に溶解した。99℃で2分間反応させた後、2時間かけて4℃まで冷却した。BfuIで消化した後、pUC-hU6とリガーゼでつなぎ合わせ、pU6/TNFRを得た。
【００８２】
PU6/TNFRをEcoRI - HindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動し、pU6-TNFRshRNA-pTフラグメント(約1.4kb)を切り出した後、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。
【００８３】
p66CMVBsdPをEcoRI - HindIIIで消化し、pU6-TNFRshRNA-pTフラグメントとリガーゼでつなぎ合わせ、ドナーベクターp66BsdP/TNFR RNAiを作製した。得られたp66BsdP/TNFR RNAiの構成図を図７に示す。
【００８４】
実施例１
製造例２で作製した細胞（親株）500〜1000個を直径10cmの細胞培養用ディッシュに播種した。製造例４で作製した緑色蛍光タンパク質(GFP:Green Fluorescent Protein)発現ドナーベクター(p66BsdP/Green、環状)と、Cre酵素発現ベクター（環状、東京大学  齋藤泉教授より提供）をリポフェクションにより親株へ導入した。24時間後に10μg/mlブラストシジンを含む培地（ＤＭＥＭ）に交換し、１日置きに培地を交換しながら10日間培養した。培地に生じたコロニーを顕微鏡下で単離し、48wellプレートへ移し、直径6cmのディッシュにいっぱいになるまで10〜20日間培養した。その後、得られた細胞（子株）を蛍光顕微鏡下で観察し、緑色蛍光の有無について確認したところ、2/6クローン(33.3％)がGFP陽性細胞であった。GFP発現ドナーベクターが導入された細胞は、４週間経過後も緑色蛍光が確認できた。
【００８５】
実施例２
製造例２で作製した細胞（親株）500〜1000個を直径10cmの細胞培養用ディッシュに播種した。製造例５で作製した腫瘍壊死因子受容体Ｉ(TNFRI:Tumor necrosis Factor Receptor I)発現ドナーベクター(p66Bsd/TNFR RNAi、環状)と、Cre酵素発現ベクター（環状）をリポフェクションにより親株へ導入した。24時間後に10μg/mlブラストシジンを含む培地(DMEM)に交換し、１日おきに培地を交換しながら10日間培養した。培地に生じたコロニーから21クローンを顕微鏡下で単離して、48wellプレートへ移し、直径6cmのディッシュいっぱいになるまで10〜20日間培養した。培養した細胞からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した。18クローンについて定量的RT-PCRによりTNFRI mRNAの発現量を測定した。18クローンのうち、最もTNFRIの発現量が抑制されていたクローンをTNFRI RNAi安定細胞株とした。この安定細胞株を10代目まで培養を続けたところ（約２ヶ月）、10代目のTNFRI RNAi安定細胞株の遺伝子発現抑制効果は保持されていた。
【００８６】
試験例１
TNFRIのリガンドであるTNF-α刺激が、実施例２で製造したTNFRI RNAi細胞の生存に与える影響について調べるため、以下の試験を行った。
5000個/wellのTNFRI RNAi細胞を6wellに播種し、24時間経過した後0.24〜1,000ng/mlのTNF-αと１ug/mlのCHXとを共暴露した。暴露時間は、24時間とし、暴露後にMTT分析（同仁化学社製、Cell Counting Kit-8を使用）を行った。
TNFRI RNAi細胞(TNFRIの発現を抑制した安定細胞株)は、TNRFI発現株に比べて、TNF-α暴露後の生存率が高かった（24時間暴露時；Hela55（親株）約20％、TNFRI RNAi株；80％）。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明のＤＮＡ導入方法を示す説明図である。
【図２】ｌｏｘＰ配列と、ｌｏｘＰ配列のＣｒｅ酵素による切断位置を示す説明図である。
【図３】製造例１で作製したアクセプトベクターの構成図である。
【図４】製造例２で作製した細胞におけるアクセプトベクターの挿入位置を示す挿入マップである。
【図５】製造例３で作製したドナーベクターの構成図である。
【図６】製造例４で作製したドナーベクターの構成図である。
【図７】製造例５で作製したドナーベクターの構成図である。
【符号の説明】
【００８８】
１、１７    細胞
３、５、１１、１３、１９、２１、２３    配列
７    アクセプトベクター
９    ドナーベクター
１５    挿入ＤＮＡ
２５、３１    プロモータ
２７、２８、３３    マーカー遺伝子
２９、３５    転写終結シグナル
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
〔配列番号１〜４及び２４〜３２について〕
バクテリオファージP1由来の人工配列
【図１】
2006333742.tif 000003
【図２】
2006333742.tif 000004
【図３】
2006333742.tif 000005
【図４】
2006333742.tif 000006
【図５】
2006333742.tif 000007
【図６】
2006333742.tif 000008
【図７】
2006333742.tif 000009
【配列表】
2006333742000001.app