(57)【要約】【課題】高感度かつ高精度に、被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定できる方法の提供。【解決手段】（１）精製度９０％以上の該ABCトランスポーター及びステロールを膜構成成分として含むプロテオリポソームを調製する工程；（２）工程（１）で得られたプロテオリポソームとATPとを該被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ反応させる工程；及び（３）工程（２）における該被検物質の存在下での反応で加水分解されたATP量が該被検物質の非存在下での反応で加水分解されたATP量と比べて実質的に変化した場合に該被検物質をABCトランスポーターの基質であると判定する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法であって、下記工程：
（１）精製度９０％以上の該ABCトランスポーター及びステロールを膜構成成分として含むプロテオリポソームを調製する工程；
（２）工程（１）で得られたプロテオリポソームとATPとを該被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ反応させる工程；及び
（３）工程（２）における該被検物質の存在下での反応で加水分解されたATP量が該被検物質の非存在下での反応で加水分解されたATP量と比べて実質的に変化した場合に該被検物質をABCトランスポーターの基質であると判定する工程
を含む方法。
【請求項２】
基質が輸送基質又は輸送阻害基質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロテオリポソームにおけるステロールの含有量がプロテオリポソームの総重量（該ABCトランスポーターの重量を除く）に対して１５重量％以上かつ３０重量％以下である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステロールがコレステロールである請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プロテオリポソームがさらに膜構成成分としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンからなる群から選択される1以上の成分を含む請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロテオリポソームがさらに膜構成成分としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンを含む請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの重量比が４：４：２である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ABCトランスポーターがMDR1である請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（３）において、加水分解されたATP量の測定を工程（２）における反応で生じたADP量の測定によって行う請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ADP量の測定において、二酸化チタンカラムによる高速液体クロマトグラフィーを用いる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
精製度９０％以上のABCトランスポーター及びプロテオリポソームの総重量（該ABCトランスポーターの重量を除く）に対して１５重量％以上かつ３０重量％以下のステロールを含むプロテオリポソーム。
【請求項１２】
被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定するためのキットであって、請求項１１に記載のプロテオリポソーム及びATPを含むキット。
【請求項１３】
ABCトランスポーターのATP加水分解活性の測定法であって、下記工程：
（１）精製度９０％以上の該ABCトランスポーター及びステロールを膜構成成分として含むプロテオリポソームを調製する工程；
（２）工程（１）で得られたプロテオリポソームとATPとを反応させる工程；及び
（３）工程（２）における反応で加水分解されたATP量を測定する工程
を含む方法。
【請求項１４】
ABCトランスポーターのATP加水分解活性の測定のためのキットであって、請求項１１に記載のプロテオリポソーム及びATPを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はABCトランスポーター基質の判定法に関する。より詳しくは、本発明は、ABCトランスポーターの加水分解活性を測定することによって被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ABCトランスポーターは、分子内にATP結合部位（ATP−binding cassette）を持つ膜糖蛋白質であり、ATP加水分解のエネルギーによって構造を変化させ、細胞内から細胞外へ脂溶性の化合物を輸送する。この輸送機能は細胞を有毒な化合物から保護するというABCトランスポーターの重要な生理機能であるが、MDR1等のABCトランスポーターが認識する化合物には各種抗癌剤やその他の薬剤も含まれるため、ABCトランスポーターは投与薬剤の体外への排出、及び該排出による癌細胞の薬剤耐性等の様々な医療上の障壁の原因となっている。そのため、薬剤がABCトランスポーターの基質となりうるか否かまたはMDR1による物質の輸送の阻害効果を示すか否かの検討は、該薬剤によるインビボでの治療効果を予測するためにも重要である。
【０００３】
薬剤等がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法としては、例えば、該薬剤を投与された検体のABCトランスポーター発現量をフローサイトメトリー法、免疫組織化学法、ウェスタンブロット法等によって測定する方法が採られてきた。しかし、これらの方法は、感度が不十分なうえ、定量性もなく、また煩雑な実験を必要とするため適当ではなかった。
【０００４】
近年、ヒト又はラットの組換えABCトランスポーター蛋白質を発現させた昆虫細胞の細胞膜画分を用いてATP加水分解活性を測定することにより、特定の薬剤が該ABCトランスポーターによって輸送される薬剤であるかどうかの判定を行う方法が報告され（非特許文献１：J. Biol. Chem. 267, 4854, 1992）、現在、上記膜画分を含むキットが市販されている。しかし、該キットは感度の面で十分といえるものではない。
【０００５】
ABCトランスポーターは生体内において12回膜貫通構造又は17回膜貫通構造等を有し、その基質結合部位はリン脂質二重膜中にあると考えられている。そのため、ABCトランスポーターの基質輸送機能には脂質二重膜中での三次構造の再現が重要であると考えられる。このような観点から、ATP加水分解活性を指標とする方法としては、上記の細胞膜画分を用いる方法とは別に、単離したMDR１の人工脂質膜中での再構成物を用いる方法も報告されている。
【０００６】
例えば、非特許文献２（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8472, 1992）においては、12.5％のコレステロールを含むリン酸脂質混合物を用いてMDR1を含むプロテオリポソームを調製し、該プロテオリポソームを用いてATP加水分解活性を測定する方法が開示されている。しかし、該方法における再構成物中のMDR１は25−30％（銀染色結果から定量）と低い精製度であるため、非特許文献２は、特定のABCトランスポーターの基質輸送性を確実に判定できる方法を教示したものではない。また、該文献はプロテオリポソーム中のコレステロールがABCトランスポーターのATP加水分解活性に与える影響についてもなんらの教示も示唆もしていない。
【０００７】
さらに、より精製度の高いMDR１を含むプロテオリポソームを用いたATP加水分解活性の測定法も報告されているが（非特許文献３：Anal. Biochem. 326, 262, 2004）、該方法において、プロテオリポソームはコレステロールを含まない脂質から構成されており、また、該報告はMDR1を再構成させるプロテオリポソームの脂質組成等についての検討をしたものではない。
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 267, 4854, 1992
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8472, 1992
【非特許文献３】Anal. Biochem. 326, 262, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、高感度かつ高精度に、被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定できる方法を提供することである。具体的には、本発明の課題は、精製ABCトランスポーターを用いて該トランスポーターのATP加水分解活性を測定することにより上記判定を行う方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、MDR1の再構成のための脂質組成について検討を行った結果、精製度の高いMDR1を用いる場合にはコレステロールを含むプロテオリポソームとして再構成することにより、基質によるMDR1のATP加水分解活性の促進効果が増し、その結果、極めて高い測定感度を達成できることを発見し、この知見を基に本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法であって、下記工程：
（１）精製度９０％以上の該ABCトランスポーター及びステロールを膜構成成分として含むプロテオリポソームを調製する工程；
（２）工程（１）で得られたプロテオリポソームとATPとを該被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ反応させる工程；及び
（３）工程（２）における該被検物質の存在下での反応で加水分解されたATP量が該被検物質の非存在下での反応で加水分解されたATP量と比べて実質的に変化した場合に該被検物質をABCトランスポーターの基質であると判定する工程
を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、基質が輸送基質又は輸送阻害基質である上記方法；プロテオリポソームにおけるステロールの含有量がプロテオリポソームの総重量（該ABCトランスポーターの重量を除く）に対して１５重量％以上かつ３０重量％以下である上記いずれかの方法；ステロールがコレステロールである上記いずれかの方法；プロテオリポソームがさらに膜構成成分としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンからなる群から選択される1以上の成分を含む上記いずれかの方法；プロテオリポソームがさらに膜構成成分としてホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンを含む上記いずれかの方法；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの重量比が４：４：２である該方法；及び、ABCトランスポーターがMDR1である上記いずれかの方法が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、工程（３）において、加水分解されたATP量の測定を工程（２）における反応で生じたADP量の測定によって行う上記いずれかの方法、及びADP量の測定において、二酸化チタンカラムによる高速液体クロマトグラフィーを用いる該方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の観点からは、精製度９０％以上のABCトランスポーター及びプロテオリポソームの総重量（該ABCトランスポーターの重量を除く）に対して１５重量％以上かつ３０重量％以下のステロールを含むプロテオリポソーム、及び被検物質がABCトランスポーターの基質であるか否かを判定するためのキットであって、上記のプロテオリポソーム及びATPを含むキットが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の観点からは、ABCトランスポーターのATP加水分解活性の測定法であって、下記工程：（１）精製度９０％以上の該ABCトランスポーター及びステロールを膜構成成分として含むプロテオリポソームを調製する工程；
（２）工程（１）で得られたプロテオリポソームとATPとを反応させる工程；及び
（３）工程（２）における反応で加水分解されたATP量を測定する工程
を含む方法、ならびにABCトランスポーターのATP加水分解活性の測定のためのキットであって、上記のプロテオリポソーム及びATPを含むキットが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ABCトランスポーターの基質であるか否かを高感度かつ高精度に判定できる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法は、精製度９０％以上のABCトランスポーター及びコレステロールを含むプロテオリポソームを用いることを特徴としている。該精製度は９５％以上であることがより好ましい。ABCトランスポーターの精製度（９０％以上）は、当業者に周知の何れの蛋白質定量法で確認してもよいが、電気泳動した蛋白質の銀染色の定量によって確認することが好ましい。このとき、電気泳動はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）が好ましい。また、電気泳動した蛋白質の銀染色の定量法は当業者に周知であるが、銀染色には、例えばPierce社製銀染色試薬（SilverSNAP Stain Kit II）あるいはWAKO社(銀染色IIキット）を用いることができ、定量には染色像をScion image(Scion Corporation.)などの画像解析ソフトにより解析する方法などを用いることができる。
【００１７】
本発明の方法において精製度９０％以上のABCトランスポーターを用いることにより該ABCトランスポーター由来のATP分解活性を高感度かつ高精度に測定することが可能であり、これにより、検体である薬剤等が該ABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する際に、信頼性の高い結果を得ることが可能である。なお、本明細書において「ABCトランスポーターの基質であるか否かの判定」等というときは、該ABCトランスポーターの輸送基質であるか否かの判定及び、該ABCトランスポーターによる物質の輸送の阻害基質であるか否かの判定等を含む意味である。
本発明の方法においてプロテオリポソームを用いることによって、ABCトランスポーターのインビボでの基質輸送性を再現できるとともに、コレステロールを含むプロテオリポソームを用いることによって後述するようにATP加水分解活性が促進され、被検物質のスクリーニングの迅速化が可能である。
【００１８】
ABCトランスポーターとしては例えば、P糖蛋白質（MDRファミリー）及びMRPファミリーに属する蛋白質等が挙げられる。本発明方法に用いられるABCトランスポーターとしてはMDR１が好ましい。
ABCトランスポーターの調製方法は特に限定されないが、一般的にはABCトランスポーターをコードする遺伝子を培養細胞系で発現させることによって調製することができる。遺伝子はヒトを含む哺乳動物由来の遺伝子を用いることが好ましく、ヒト由来の遺伝子を用いることが好ましい。例えば、ヒトMDR1の遺伝子としてはBiochem. Biophys. Res. Commun. 162, 224, 1989に報告されている塩基配列に基くcDNAを用いることができる。遺伝子は発現ABCトランスポーターの基質輸送性に影響のない限り野生型ABCトランスポーター遺伝子塩基配列の一部に欠失、置換及び／又は付加等があってもよい。また、ABCトランスポーターをコードする遺伝子にはいずれか又は両方の末端に、後述の精製などに必要なタグ等を付してもよい。
【００１９】
培養細胞系は昆虫細胞系を用いることが好ましく、特にSF9（S. frugiperda）細胞が好ましい。SF9細胞を用いたABCトランスポーターの発現については、Biochemistry 29, 2295, 1990を参照することができる。ABCトランスポーターの精製は、糖蛋白質の精製法として当業者に周知のいずれの精製法を用いてもよく、例えば、発現の際、ABCトランスポーターにポリヒスチジンタグを付すことによってニッケル-トリニトリロ酢酸アガロースレジン（Ni-NTA）を用いて精製することができる。ABCトランスポーター発現細胞からのABCトランスポーターの具体的な精製法は、Anal. Biochem. 326, 262, 2004の記載を参照することができる。
【００２０】
プロテオリポソームにおけるコレステロールの比率は、蛋白質以外のプロテオリポソームの構成成分の総重量に対して、例えば５重量％〜４０重量％であればよく、好ましくは５重量％〜３０重量％であり、より好ましくは１５重量％〜３０重量％であり、さらに好ましくは約２０重量％である。ステロールの種類は特に限定されないが、例えばコレステロール又はスティグマステロール（stigmasterol）を用いることができ、コレステロールを用いることが好ましい。また、2種以上のステロールの組み合わせを用いてもよい。
【００２１】
本発明に用いられるプロテオリポソームを構成する脂質（ステロール以外）としては例えば、ホスファチジルコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。リン脂質としてはホスファチジルコリン（以下PCという）、ホスファチジルエタノールアミン（以下PEという）、及びホスファチジルセリン（以下PSという）からなる群から選ばれる1以上を用いることが好ましく、PC、PE、及びPSの混合物を用いることがさらに好ましい。該混合物において重量比（PC：PE：PS）は、例えば、１〜５：１〜５：１〜５の範囲であればよく、約４：４：２が好ましい。
また、必要に応じて、プロテオリポソームは、トコフェロール等の抗酸化剤、ガングリオシド等の荷電物質を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明に用いられるプロテオリポソームの製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。製造方法としては、例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え、機械的振盪を加えて形成する方法、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法（FEBS Lett.，99, 210, 1979）、界面活性剤除去法、逆相蒸発法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194,1978)、などが挙げられる。これらのうちで、本発明に用いられるプロテオリポソームの製造方法としては超音波処理法が好ましい。本発明に用いられるプロテオリポソームの形態も特に限定されず、マルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）、スモールユニラメラリポソーム（ＳＵＶ）、ラージユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）の何れの形態でもよいが、ＳＵＶが好ましい。
【００２３】
本発明に用いられるプロテオリポソームにおいて、ABCトランスポーター及びステロールは上記脂質により構成される膜の構成成分として存在していればよい。膜の構成成分として存在することによって、ABCトランスポーターはインビボでの活性な三次構造をとることができる。ステロールは、脂質膜中に存在していてもよく、ABCトランスポーターに保持されていてもよい。
【００２４】
いかなる特定の理論に拘泥するものではないが、ステロールは基質とABCトランスポーターとのアフィニティを増加させることによって、及び／又は基質によって誘導されるABCトランスポーターによるATPの加水分解を促進させることによって、ABCトランスポーターによるATP加水分解活性を増加させていると考えられる。ABCトランスポーターによるATP加水分解反応をミカエリス・メンテンの式に従って解析すると基質とABCトランスポーターとのアフィニティの増加はKm値の減少、反応の促進はVmax値の増加になって現れるため、後述の実施例においてはKm値及びVmax値を用いてATPの加水分解反応を解析している。
【００２５】
本発明のABCトランスポーターのATP加水分解活性の測定法は、上述のプロテオリポソームとATPとを反応させる工程；及び該反応で加水分解されたATP量を測定する工程を含む方法である。また本発明のABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法は、プロテオリポソームとATPとを被検物質存在下及び非存在下でそれぞれ反応させ、該被検物質存在下の反応で加水分解されたATP量と該被検物質の非存在下の反応で加水分解されたATP量を比較することによって、該被検物質の添加による上記のプロテオリポソームに含まれるABCトランスポーターのATP分解活性の変化を測定し、これにより、該被検物質が該ABCトランスポーターの基質であるか否かを判定する方法である。具体的には被検物質存在下の反応で加水分解されたATP量が該被検物質非存在下の反応で加水分解されたATP量よりも実質的に多い場合に該被検物質をABCトランスポーターの輸送基質であると判定することができ、被検物質存在下の反応で加水分解されたATP量が該被検物質非存在下の反応で加水分解されたATP量よりも実質的に少ない場合に該被検物質をABCトランスポーターの阻害基質であると判定することができる。
【００２６】
加水分解されたATP量の測定はどのような方法で行ってもよく、例えば、ルシフェラーゼアッセイ、Pi-Mo方法（Anal. Biochem. 168, 1, 1988）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた方法（Anal. Biochem. 212, 1, 2001）などを行えばよい。ATP分解活性の測定は、特に、上記反応により生じたADPを二酸化チタンカラム（Anal. Sci. 6, 911, 1990）を用いたHPLCで定量することにより行うことが好ましい。この方法についてはAnal. Biochem. 326, 262, 2004を参照することができる。加水分解されたATP量の比較の際は、用いたATP量の測定方法が記載された文献や当業者の常識から、実質的に変化しているか否かを判断することができる。
【００２７】
本発明の方法の被検物質は、特に限定されないが、分子量３００〜１０００程度の脂溶性の化合物が好ましい。被検物質としては通常1種の化合物を用いることができるが、2種以上の化合物を用いることにより、2種以上の化合物の組み合わせの該ABCトランスポーターの基質としての特性を判定することも可能である。本発明の方法を用いて、体内吸収性の高い薬剤、中枢移行性の高い薬剤、又は耐性を持ちやすい薬剤などのスクリーニングが可能である。さらに本発明方法によって薬物相互作用を予見することが可能となり副作用を減少させることができる。
【実施例】
【００２８】
ABCトランスポーターとしてMDR1を用いた以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、以下の記載においてステロールの濃度はプロテオリポソームの総重量（MDR1の重量を除く）に対する重量％である。
【００２９】
（例１）ヒトMDR１をコードする組み換えバキュロウィルスの作製
トロンビン切断部位、10個のヒスチジンコドン及び終結コドン３’末端に挿入したヒトMDR１cDNAを転換ベクターｐVL1392（ファーミンジェン：Pharmingen）にサブクローンした。SF9細胞をｐVL1392及びバキュロゴールド  DNA（ファーミンジェン）とコトランスフェクションすることによってMDR1をコードする組み換えバキュロウィルスを得た。得られたバキュロウィルスを製造元のプロトコールに従って精製増幅した。
【００３０】
（例２）MDR１の発現とミクロソームの調製
Sf9細胞はIPL41とSf900IIを７：３で混合した培地で培養した。細胞凝集と微生物汚染との防止のためにプルロニックF68とゲンタマイシンをそれぞれ最終濃度が0.1％及び10μg/mlになるように加えた。Sf9細胞は感染多重度５で上記のバキュロウィルスに感染させた。48時間培養後、細胞を収穫し、氷冷リン酸緩衝液で洗浄した。細胞ペレットは-80℃で保管した。凍結Sf9細胞は10倍容量の超音波緩衝液（20 mM  Tris- Cl、pH 7.5 10容量％グリセロール、1 mM EDTA）に再懸濁させた。これ以降の処理はすべて４℃の温度条件下（氷上）で行われた。細胞をウルトラソニックプロセッサXL（ミソニックス：Misonix）で３０秒処理して２分間氷上に置くことを１０回繰り返した。懸濁液を650ｇで１０分間遠心分離した。壊れていない細胞はもう一度上記のように超音波処理してから遠心分離し、細胞ペレットは廃棄した。ホモジェネートを2000gで30分間遠心分離し、核を除いた。さらに上清を40,000ｇで60分間遠心分離した。ミクロソームを含むペレットを、プロテアーゼインヒビター（100μg/ml p-アミジノフェニルメチルスルホニルフルオライド、10μg/mlロイペプチン、2μg/ml  アプロチニン）を含む氷冷緩衝液A（50 mM Tris-Cl、pH 8.0、50 mM NaCl、30容量％グリセロール、15 mM イミダゾール、1 mM 2-メルカプトエタノール）に再懸濁させた。ミクロソームは-80℃で保管した。
【００３１】
（例３）ヒトMDR１の精製
ミクロソームは氷上で解凍し、氷冷緩衝液A(プロテアーゼインヒビターを含む)に4mg蛋白質／mlになるように希釈した。同量の0.8％重量／容量n-ドデシル-β‐D‐マルトシド（DDM）の氷冷緩衝液A(プロテアーゼインヒビターを含む)の溶液を上記溶液に加えた。得られた懸濁液を倒置させることにより混合し、氷上に10分間置いた。不溶性蛋白質は遠心分離（60,000 g、30分）により除いた。この上清にNi-NTAレジン（キアジェン：Qiagen）を可溶化蛋白質100 mgに対して0.5 mlの割合で加えた。このスラリーを４℃で18時間常時回転させながらインキュベーションを行った。レジンは10ベッド量の0.1％DDMを含む緩衝液Aで３回洗浄し、その後0.1％DDM及び40 mMイミダゾールを含む緩衝液A（５容量）で洗浄した。MDR１は0.1％DDM及び300 mMイミダゾールを含む緩衝液A（５容量）で溶出させた。蛋白質濃度はBradford法（バイオラッド）で概算し、その結果約300 mgの全膜蛋白質から１〜３mgの精製蛋白質が得られたことがわかった。精製蛋白質におけるMDR１の精製度を、1 mm厚の８％ポリアクリルアミドゲルSDS-PAGEした精製蛋白質の銀染色（図１）の結果からScion imageにより解析した結果、９５％以上であった。なお、図１中、レーン１は膜蛋白質、レーン２は膜表在性蛋白質、レーン３は膜貫通蛋白質、レーン４はDDM可溶性画分、レーン５はNi-NTA非吸着画分、及びレーン６は精製蛋白質の電気泳動の銀染色結果を示す。
【００３２】
（例４）プロテオリポソームの調製
PC：PE：PS及びステロールは所定の比率でクロロホルムに溶解し、高真空下に2.5時間置いてクロロホルムを除いた。得られた脂質フィルムを40 mM Tris-Cl溶液(pH 7.4, 0.1 mM EGTA)に10 mg/ml で溶解し、懸濁液が透明になるまで超音波槽（Bioruptor CD-200 TM, COSMO BIO）で超音波処理した。処理後、脂質は24時間氷上に保管し、凍結-解凍を2サイクル行った。最後に脂質を再度超音波処理（30秒ずつ５サイクル、各サイクルの間に２分間氷上に置いた）した。これらの脂質ストックは1週間以内に使用した。精製MDR1及び脂質ストックを１：１０の比率で40 mM Tris-Cl溶液(pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 2 mM ジチオトレイトール)中で混合し、２３℃で20分間インキュベートした。超音波槽にて４℃で30秒間超音波処理してプロテオリポソームを得た。
【００３３】
（例５）MDR１のATP加水分解活性の測定
例４で得られたプロテオリポソームにおいて再構成されたMDR1は種々の濃度の薬剤を含む20μlの40 mM Tris-Cl溶液(pH 7.5、0.1 mM EGTA、1 mM NaATP、1 mM MgCl2)中、３７℃で３０分間反応させた。反応は３％SDSと10 mMのバナジウム酸塩の添加によって終結させた。なお、実験データはミカエリス・メンテンの式、v＝Vmax[S]/(Km+[S])（ここでvは薬剤によって促進されたATPase活性であり、[S]は薬剤濃度である。）にコンピュター計算で当てはめて解析した。解析は最小二乗法（KaleidaGraph）を用いて行われ、Vmax値とKm値が抽出された。
【００３４】
（１）例４に記載の方法でPC：PE：PS＝４：４：２でステロールを含まないプロテオリポソームを調製し、薬剤としてベラパミル（図２中黒丸）、ローダミンB（白丸）、ジゴキシン（黒ひし形）、ローダミン１２３（白ひし形）、ビンブラスチン（黒三角）、コルヒチン（白三角）、及びタキソール（黒四角）を用いて、MDR1の輸送基質依存的なATP加水分解活性((ATP activity)を測定した。結果を図２に示す。MDR1のATP加水分解活性は強い基質依存性を示した。またATP加水分解活性は、高濃度の輸送基質存在下では逆に阻害が見られた。これらはMDR1のATP加水分解活性の特徴として報告されている結果と一致した。この結果から本方法で精製したMDR1は活性な三次構造を保持していることが確認された。
【００３５】
（２）例４に記載の方法で、0、 5、10、 20、 30、又は 40%のコレステロールを含みPC : PE : PS が4 : 4 : 2であるプロテオリポソームを調製し、輸送基質非存在下でのATP加水分解活性(basal活性)を測定した。結果を図３に示す。図３から分かるように MDR1のATP加水分解活性はリポソーム中に含まれるコレステロール濃度依存的に増加し、コレステロールがMDR1の輸送基質として認識され、薬剤等の基質とMDR1とのアフィニティに関わっていることを示唆している。
【００３６】
（３）例４に記載の方法で、0％(図４中、白ひし形又は白丸)又は 20%(図４中、黒ひし形又は黒丸)のコレステロールを含みPC : PE : PS が 4 : 4 : 2であるプロテオリポソームを調製し、ジゴキシン(図４中、ひし形)、タキソール(図４中、丸)によって誘導されるATP加水分解活性を比較検討した。結果を図４に示す。ジゴキシンによる誘導活性では、コレステロール添加によるKm値の顕著な減少が観測され、タキソールによる誘導活性ではコレステロール添加によるVmax値の増大が観測された。この結果から、コレステロールによってジゴキシンはMDR1とのアフィニティが増し、一方、タキソールによって誘導されるMDR1によるATPの加水分解はコレステロールの存在により増加することが分かった。
【００３７】
（４）コレステロールが与える影響をより詳細に解析するため、例４に記載の方法で、0、 5、10、 20、及び30％のコレステロールを含みPC : PE : PS が 4 : 4 : 2であるプロテオリポソームを調製し、種々の輸送基質によって誘導されるATP加水分解活性を測定して、Km, Vmax値を算出した。結果を表１に示す。コレステロールは、基質とMDR1とのアフィニティを増加させることによって及び／又は基質によって誘導されるMDR1によるATPの加水分解を促進させることによって、様々な基質によって誘導されるMDR1のATP加水分解活性を増加させていることが分かる。
【００３８】
【表１】
2006304726.tif 000002
【００３９】
（５）例４に記載の方法で、種々のステロールを20%含むプロテオリポソームを調製し、基質非存在下でのATP加水分解活性、及びタキソール添加時のATP加水分解活性の促進を比較した。さらに種々のステロール間でのKm値及びVmax値を比較した。結果を表２に示す。いずれのステロールも基質とMDR1とのアフィニティを増加させることによって及び／又は基質によって誘導されるMDR1によるATPの加水分解を促進させることによって、MDR1のATP加水分解活性を増加させていることが分かる。
【００４０】
【表２】
2006304726.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】MDR１の精製度を示すSDS-PAGEである。
【図２】精製MDR1の薬剤依存的ATP加水分解活性を示すグラフである。
【図３】精製MDR1及び種々の量のコレステロールを含むプロテオリポソームの輸送基質非存在下でのATP加水分解活性を示すグラフである。
【図４】精製MDR1を含むプロテオリポソームの輸送基質存在下でのATP加水分解活性に対するコレステロールの影響を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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