(57)【要約】【課題】顎骨骨幹異形性症ＧＤＤは、骨脆弱性、易骨折性、長管骨の硬化、下顎骨のセメント骨病変等をもたらす骨系統疾患であり、その原因遺伝子のクローニングと作用機能の解明は、ＧＤＤの診断・治療・予防、骨再生、硬組織再建、硬組織代替材料の開発等に係る臨床医学、更に、骨分化、骨形成等の基礎研究において重要な課題である。【解決手段】ＧＤＤの原因遺伝子ＧＤＤ１のＤＮＡ完全長塩基配列、該配列のＤＮＡ及びその断片、上記遺伝子がコードするアミノ酸配列、該配列のタンパク質とその断片、上記ＤＮＡに相補的なＲＮＡ、これ等のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を用いる骨疾患遺伝子検査薬、ＧＤＤ・骨欠損症・骨吸収性疾患の診断剤、遺伝子診断マーカーである２つのミスセンス変異Ｃ３５６Ｒ及びＣ３５６Ｇ、骨疾患治療薬、骨疾患遺伝子治療薬等々。【選択図】図１
2006121961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の遺伝子ＤＮＡ完全長塩基配列、その断片である部分塩基配列、及びこれ等の塩基配列の少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列からなる配列群から選ばれる少なくとも１種の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列に相補的なＲＮＡ塩基配列を有するＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ又は請求項２記載のＲＮＡを反応試薬として反応を呈する量、含有する骨疾患遺伝子検査薬。
【請求項４】
骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である請求項３記載の骨疾患遺伝子検査薬。
【請求項５】
請求項１記載の完全長塩基配列に基づき設計されるプライマー。
【請求項６】
請求項１記載の完全長塩基配列に基づき設計されるプローブ。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡが生体内で発現されるよう設計構築された骨疾患遺伝子治療剤。
【請求項８】
骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である請求項７記載の骨疾患遺伝子治療薬。
【請求項９】
配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列、その断片である部分アミノ酸配列、及びこれ等のアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなる配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１０】
次に記載の配列番号のアミノ酸配列を有する請求項９記載のタンパク質：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載のタンパク質を有効成分として薬効を奏する量、含有することを特徴とする骨疾患治療剤。
【請求項１２】
骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である請求項１１記載の骨疾患治療薬。
【請求項１３】
請求項９又は１０記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、顎骨骨幹異形成症（ｇｎａｔｈｏｄｉａｐｈｓｅａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ；以下「ＧＤＤ」と略記する）の原因遺伝子あるいは責任遺伝子であるＧＤＤ１（以下「ＧＤＤ１遺伝子」という）、及びその用途としての、ＧＤＤを含む骨疾患、骨形成、骨組織再生、硬組織再建等に係る基礎研究用試薬、診断、臨床検査、診断剤、臨床検査薬、遺伝子診断剤、治療薬、遺伝子治療剤等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＤは、赤坂等により、新規な全身性骨疾患の家系とその遺伝性顎骨骨幹硬化症として、１９６９年に世界で初めて報告された（非特許文献１）。この報告によれば、ＧＤＤの臨床症状は、繰り返す骨折、骨折の正常治癒、下顎骨と上顎骨の線維性結合組織との置換、程度が多様な種々の骨化、顎への感染傾向、散発する化膿性骨髄炎、稀に見られる顔面の変形等である。この疾患は、更に、１９８５年にＬｅｖｉｎ等により異常骨病変を伴う骨異形成症として（非特許文献２）、また、２００１年にＲｉｍｉｎｕｃｃｉ等により顎骨骨幹異形成症（ＧＤＤ）として（非特許文献３）、それぞれ報告された。尚、ＧＤＤとその原因遺伝子あるいは責任遺伝子に係る発明（特許文献）は未だ知られていない。
【非特許文献１】日本生化学会誌、第４３巻、３８１−３９４頁、１９６９年。
【非特許文献２】Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１巻、２５７−２６９頁、１９８５年。
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、第１６巻、１７１０−１７１８頁、２００１年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＧＤＤは前述した通り、骨脆弱性、易骨折性、長管骨の硬化、下顎骨のセメント骨病変等をもたらす骨系統疾患であり、その原因遺伝子のクローニングと作用機能の解明は、ＧＤＤの診断・治療・予防、骨再生、硬組織再建、硬組織代替材料の開発等に係る臨床医学だけではなく、骨分化、骨形成等の基礎研究においても重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この発明によれば、上記の課題を解決するための手段として、ＧＤＤ原因遺伝子クローン、該遺伝子ＤＮＡ完全長塩基配列と該配列のＤＮＡ、それがコードする完全長アミノ酸配列と該配列のタンパク質、ＧＤＤ患者に特異的なミスセンス変異、これ等の用途等がそれぞれ提供される。
先ず、この発明への理解を高めるため、本発明者らの深い学識経験に基づく卓抜した着想と集中した不断の勤勉による本願発明完成に至る経緯の概要を以下に示す：
【０００５】
本発明者らは、前述の赤坂等が報告の日本人ＧＤＤ家系に関し、連鎖解析を行うことにより、ＧＤＤ疾患原因遺伝子が第１１染色体の短腕１４．３から１５．１の範囲の、Ｄ１１Ｓ１３０８とＤ１１ｓ９８０の２つのマイクロサテライトマーカーで挟まれた、８．７センチモルガン(組換距離)の領域に疾患原因遺伝子が存在することを明らかにした（図１）。尚、連鎖解析とは、疾患原因遺伝子と下記マーカーが連鎖して子孫に伝わる現象を利用したものであり、家系内の罹患者と健常対照者とを対象としてヒトゲノム全体に存在する約４００個種類のマイクロサテライトマーカーの内、どのマーカーが疾患原因遺伝子の近傍に存在するかを解析することにより疾患原因遺伝子の座位を決定する方法である。
遺伝子解析によれば、上記の８．７センチモルガン領域には、８つの既知の遺伝子（ＮＡＶ２、ＨＪＡＴＬＰ２、ＰＲＭＴ２、ＳＬＣ６Ａ５、ＮＥＬＬ１、ＳＬＣ１７Ａ６、ＦＡＮＣＦ、ＧＡＳ２）が存在した。しかし、いずれのエキソン、あるいはエキソン・イントロン境界領域にも変異を認めなかった（図１）。
そのため、発明者らは、この領域内にメッセンジャーＲＮＡとして発現しているが、遺伝子としては未だその機能が同定されていないＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）の１つとして、約６．７ｋｂのメッセンジャーＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＬ８３３２７１に注目し、種々検討を重ねた。その結果、該ｃＤＮＡは、３’ポリアデニル化のシグナルを有するため、遺伝子として発現している可能性が示唆され、また、９１３個のアミノ酸からなるポリペプチドの読み枠を含む２，７４２塩基の配列を有するので、１０７．２０ｋＤの蛋白をコードしている遺伝子だと考えられた。更に、５’上流には、これ以外の配列が存在しないことをＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）の方法で確認することにより、このｃＤＮＡ塩基配列は、完全長配列であると思量された。
以上の知見に基づき、上記ｃＤＮＡ塩基配列は、約９０ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ塩基配列と対応し、２２エキソンからなる新規な遺伝子であると判断された。発明者らは、この新規な遺伝子をＧＤＤ１と命名した（図１）。
【０００６】
更に、本発明者らは、次の（１）〜（３）を確認した：（１）上述の領域内に、９１３個のアミノ酸から構成される新規遺伝子、ＧＤＤ１が存在すること；（２）日本人ＧＤＤ家系のみにならず、アフリカ系アメリカ人ＧＤＤ家系において罹患者特異的にＧＤＤ１の３５６番目のアミノ酸のミスセンス変異を認めること;及び（３）ＧＤＤ１の３５６番目のアミノ酸は、ヒト、マウス、ゼブラフィシュ、ショウジョウバエ、蚊において種を越えて保存されており、生物学的に重要な役割を果たすと考えられること。また、（４）ＧＤＤ１蛋白は、小胞体に局在し、細胞内のカルシウム濃度の恒常性維持に関わることを予測した。更に、（５）ＧＤＤを発症の異なる２家系において、ＧＤＤ１で高度に保存された上記システイン（Ｃ）が罹患者特異的にアルギニン（Ｒ）又はグリシン（Ｇ）に変異（Ｃ→Ｒ及びＣ→Ｇ）することを明らかにすることにより、新規なＧＤＤ１遺伝子がＧＤＤ疾患の原因遺伝子であることを証明した。
【０００７】
以上の経緯に基づき、本発明によれば、次の（１）〜（１３）に記載の技術がそれぞれ提供される：
（１）配列番号１に記載のＧＤＤ１遺伝子ＤＮＡ完全長塩基配列、その断片である部分塩基配列、及びこれ等の塩基配列の少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列からなる塩基配列群から選ばれる少なくとも１種の塩基配列を有するＤＮＡないしはポリヌクレオチド。
尚、この明細書でいうポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドからなるヌクレオ
チド化合物の総称として用いられている。
また、上記の完全長塩基配列の非コード領域（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）は、プロモーターやオペレーター等の調節遺伝子を含むため、遺伝子操作によるＧＤＤ１やその他の遺伝子の発現、遺伝子の機能や調節の解明等に有用である。
そして、コード領域（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）の塩基は、コドンの縮重に基づき、随意に、例えばコドン使用頻度に合致させ、同義語的置換が可能である。
（２）上記（１）のＤＮＡ塩基配列に相補的なＲＮＡ塩基配列を有するＲＮＡないしはポリヌクレオチド。
かかるＲＮＡとその塩基配列は、例えば、骨分化の研究用試薬等としてのアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の設計や合成等に用いることができる。
（３）前記（１）のＤＮＡ又は上記（２）のＲＮＡを反応試薬として反応を呈する量、含有する骨疾患遺伝子検査薬。
ここでいう遺伝子検査薬とは、医科歯科領域の臨床検査用の遺伝子診断剤、創薬及び基礎研究用の遺伝子機能の解析用試薬等を意味する。
また、ＧＤＤの遺伝子診断用のマーカーとしては、最良の形態の欄で後述される２つのミスセンス変異、Ｃ３５６Ｒ及びＣ３６５Ｇを用いることができる。
尚、この明細書でいうポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド化合物の総称として用いられている。
【０００８】
（４）骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である上記（３）の骨疾患遺伝子検査薬。
この明細書でいう骨疾患の具体例としては、ＧＤＤ以外に、歯槽骨欠損症、骨粗鬆症等を上げることができる。
（５）前記（１）の完全長塩基配列に基づき設計されるプライマー。
ＰＣＲ用のプライマーとして、例えば、実施例１と２で後述されるように、
５’−ＴＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧ−３’  及び
５’−ＴＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣ−３’  からなる１対；
５’−ＴＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧ−３’  及び
５’−ＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣ−３’  からなる１組
等を上げることができる。
（６）前記（１）の完全長塩基配列に基づき設計されるプローブ。
この発明に係るプローブは、サザンブロット法、ノーザンブロット法、遺伝子発現のマーカー等に用いることができる。
【０００９】
（７）前記（１）のＤＮＡが生体内で発現するよう設計構築された骨疾患遺伝子治療剤。
例えば、ＧＤＤ１遺伝子のコード領域ＤＮＡやその断片ＤＮＡ等は、これ等をウイルスベクターや真核細胞ベクター等に挿入連係することにより作成される発現ベクターとして用いることができる。
（８）骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である上記（７）の骨疾患遺伝子治療薬。骨疾患に関しては前述（４）の通りである。
（９）配列番号２に記載のＧＤＤ１遺伝子がコードする完全長アミノ酸配列、その断片である部分アミノ酸配列、及びこれ等のアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１０）次に記載の配列番号のアミノ酸配列を有する上記（９）のタンパク質、このタンパク質は、ＧＤＤ１遺伝子がコードする完全長アミノ酸配列のタンパク質の断片であり、ＧＤＤ１機能の活性ドメインである：  
配列番号３（第３１２〜３３２番アミノ酸）、配列番号４（第３８１〜４０１番）、
配列番号５（第４６３〜４８３番）、        配列番号６（第５１２〜５３２番）、
配列番号７（第５５８〜５７８番）、        配列番号８（第６８０〜７００番）、
配列番号９（第７３３〜７５３番）、及び    配列番号１０（第８３３〜８５３番）。
尚、上記（アミノ酸番号）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン（Ｍ）残基を第１番アミノ酸として、これよりＣ末端方向、左から右方向にアミノ酸残基を数えた序数で示されている。
【００１０】
（１１）上記（９）又は（１０）のタンパク質を有効成分として薬効を奏する量、含有することを特徴とする骨疾患治療剤。
尚、この明細書でいうタンパク質は、２個以上のアミノ酸からなるペプチド化合物の総称として用いられている。
（１２）骨疾患がＧＤＤ及び／又は骨欠損症及び／又は骨吸収性疾患である上記（１１）の骨疾患治療薬。骨疾患に関しては前述（４）の通りである。
（１３）前記（９）又は（１０）のタンパク質に対する抗体。
抗体としては、例えば、常法により作成できるモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を上げることができる。かかる抗体は診断剤、抗原抗体反応試薬、治療薬等に用いることができる。
【発明の効果】
【００１１】
この発明は、ＧＤＤの診断、治療、予防、硬組織再建、硬組織代替材料の開発等に係る臨床医学、歯科、再生医療、医薬品等の応用分野、更に、骨分化、骨形成等に係る基礎研究に多大に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
（１）ＧＤＤ疾患原因遺伝子の存在領域とＧＤＤ１との物理的位置関係：
図１を参照。尚、エキソンは塗りつぶしボックスで、非翻訳領域は灰色ボックスでそれぞれ示す。
（２）ＧＤＤ１の３５６番目の位置のシステイン（Ｃ）のミスセンス変異：
図２を参照。日本人ＧＤＤ家系ではコドン塩基が「Ｔ→Ｃ」に置換し、Ｃがアルギニン（Ｒ）「Ｃ→Ｒ」にミスセンス変異（Ｃ３５６Ｒ）［図１（ａ）］。アフリカ系アメリカ人ＧＤＤ家系ではコドン塩基が「Ｔ→Ｇ」に置換し、Ｃがグリシン（Ｇ）「Ｃ→Ｇ」にミスセンス変異（Ｃ３６５Ｇ）［図１（ｂ）］。
ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；  一本鎖高次構造多型）の方法により上記のミスセンス変異が罹患者特異的に認められたことを示す。解析症例は矢印で表記されている。
（３）ＧＤＤ１蛋白の疎水性プロット：図３（ａ）を参照。８つの疎水性を示す膜貫通部位が示されている。
【００１３】
（４）膜に対するＧＤＤ１蛋白の位置関係：
図３（ｂ）を参照。Ｎ−グリコシル化部位、種を越えて完全に保存された８つのシステイン、小胞体局在シグナル（灰色ボックス）、及び変異したシステインをそれぞれ示す。
（５）各種の生物のＧＤＤ１のアミノ酸配列：
図４を参照。ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、および蚊とのアミノ酸配列上の同一性は、７９％、５６％、４０％、および４１％である。細胞外ループに存在する８つのシステインは、これら全ての種で保存されている。予想される膜貫通部位をボックスで示す。種間のアミノ酸配列の比較として、同一（＊）、高度保存（：）、保存（・）で示す。
（６）ヒトとマウス組織におけるＧＤＤ１メッセンジャーＲＮＡの発現解析：
図５を参照。ヒトの多組織におけるメッセンジャーＲＮＡのノーザンブロット解析［図５（ａ）］。ｈＧＤＤ１の３２Ｐで標識した５８１ｂｐ（塩基対）のＧＤＤ１断片をプローブとして解析、さらに３２Ｐで標識したベータアクチンで解析した。
ヒト組織、健常人ヒト骨芽細胞、および健常人歯根膜細胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）のメッセンジャーＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による結果を示す［図５（ｂ）］。ＨＯＢ１−４は下顎骨から得た骨芽細胞、ＨＯＢ５は大腿骨から得た骨芽細胞、ｈＰＤＬは抜歯後の歯から得た歯根膜細胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）。これらの細胞は、１０％牛胎児血清、５０  μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むα−ミニマムエッセンシャル培地で培養した。全ＲＮＡは、３−４回継代培養した細胞から抽出した。ｈＧＤＤ１の３４８  ｂｐ断片を、エキソン９と１２に設定したプライマーでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃２分間加熱後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、および７２℃３０秒を３０から４０サイクルで行った。ｈＧＡＰＤＨ  （ｈｕｍａｎ  Ｇｌｙｃｅｒｏ−Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｃＤＮＡの４５２ｂｐの断片で解析したｈＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡを内部標準とした。
ｍＧＡＰＤＨで標準化したｍＧＤＤ１メッセンジャーＲＮＡの相対的発現量［図５（ｃ）］。ＡＢＩ社製の７９００ＨＴと呼ばれるＴａｑＭａｎシステムとサイバーグリーンマスターミックスを用いた、二段階時間経時的な（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。全ＲＮＡは、８週齢マウスから単離し、ランダムプライマーを用いて一次鎖ＤＮＡを作成した。スプライシングを受けたｍＧＤＤ１とｍＧＡＰＤＨを検出した。ゲノムＤＮＡから増幅された増幅産物を排除して検討した。ｍＧＤＤ１メッセンジャーＲＮＡのｍＧＡＰＤＨメッセンジャーＲＮＡに対する相対量として標準化して示した。
【００１４】
（７）ＧＤＤ１蛋白のＣＯＳ−７細胞での発現：
図６を参照。野生型、および変異型ＧＤＤ１の発現をウェスタンブロットで確認した［図６（ａ）］。野生型ＧＤＤ１を発現するプラスミドｈＧＤＤ−１−Ｖ５、および変異型ＧＤＤ１（Ｃ３５６ＲまたはＣ３５６Ｇ、３５６位のシステインがアルギニンまたはグリシンに変異したことの意味）のｃＤＮＡに−Ｖ５エピトープを付けたプラスミドをトランスフェクト導入したＣＯＳ−７細胞からの全細胞溶解液をＳＤＳ−ポリアクリラミドゲル電気泳動にかけた。抗Ｖ５抗体［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）製］を用いてウェスタンブロットを行った。ＧＤＤ１に無関係なコントロール蛋白として、ｌａｃＺ−Ｖ５を発現するｐｃＤＮＡ６／ｌａｃＺ−Ｖ５プラスミドを用いた。
野生型ＧＤＤ１の細胞内局在［図６（ｂ）］。Ｖ５で標識したｈＧＤＤ１蛋白は明らかに、核（緑）周囲の網目状の分布パターンを示した。小胞体に存在するカルレティキュリンに対する抗体で染色した分布パターンと、野生型ＧＤＤ１の細胞内局在を示す分布パターンが完全に重複した。また、ｈＧＤＤ１は、小胞体に局在することが示された。
変異型ＧＤＤ１発現のＣＯＳ−７細胞の形態変化［図６（ｃ）］。変異型ＧＤＤ１を発現したＣＯＳ−７細胞は、球形の形態を示し、細胞接着が減弱した。
この発明につき、以下、実験例、参考例及び実施例を上げ、具体的に説明する。但し、本発明はこれ等の実験例及び実施例にだけ、限定されるわけではない。
（実験例１）
【００１５】
疾患原因となる遺伝子変異の同定：
ＧＤＤ１の全エキソンとエキソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した結果、第１１エキソンに存在する３５６番目のシステインをコードするコドンが、ＴＧＴからＣＧＴに変異した結果、システインがアルギニンに置換されることを、日本人ＧＤＤ家系内の１４名の全罹患者で確認し、家系内の健常対照者８名には一名にもこの変異を認めなかった。また、アフリカ系アメリカ人のＧＤＤ家系では３５６番目遺伝子のシステインをコードするコドンが、ＴＧＴからＧＧＴに変異した結果、システインがグリシンに、罹患者特異的に置換されることを認めた［図２（ａ）と（ｂ）］。一方、健常日本人４８８名または健常アフリカ系アメリカ人８０名の集団では、これらの変異を認めなかった。二つの異なるＧＤＤ家系が、罹患者特異的にＧＤＤ１遺伝子変異を認めたことから、ＧＤＤ１がＧＤＤの疾患原因遺伝子であることが確認された。
（実験例２）
【００１６】
ＧＤＤ１蛋白の構造、モチーフ、およびマウス遺伝子との相同性：
ＧＤＤ１蛋白に相同性を示す既知蛋白は存在しない。疎水性を示す膜貫通領域が８箇所あり、蛋白のＮ末端とＣ末端はいずれも細胞内に存在し、５つの蛋白のＮ−グリコシル化を起こす可能性のある部位が存在する。小胞体局在シグナル（アラニン−リジン−セリン−スレオニン）をＣ末端に有している［図３（ｂ）］。
マウスのＧＤＤ１のｃＤＮＡ配列とヒトＧＤＤ１のｃＤＮＡ配列は、アミノ酸レベルで７９％の同一性を示し、３４２、３５３、３５６、３６０、３６９、６０１、６０６、および８０４番目のアミノ酸としてコードされている８つのシステインは、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蚊で保存されており、細胞外の蛋白のループ構造に関与すると考えられる（図４）。
（実験例３）
【００１７】
遺伝子発現解析：
ヒトＧＤＤ１のｃＤＮＡの３’末端５８１ｂｐ（塩基対）の断片を標識プローブとして検討した、ヒトの多組織のノーザンブロットの結果、７．５ｋｂと４．５ｋｂの二つのシグナルを骨格筋、心筋、膵臓に認めた。メッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、メッセンジャーＲＮＡ量を定量するＲＴ−ＰＣＲ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、ヒトＧＤＤ１が脳、心筋、腎臓、肺、および骨格筋に、ＰＣＲの３０サイクルで、比較的強く検出した。ヒトから採取・培養した骨芽細胞、および歯根膜細胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）では、ＰＣＲの４０サイクルで、比較的弱く検出した。マウス組織を用いるＲＴ−ＰＣＲで、マウスＧＤＤ１遺伝子の発現は、頭蓋冠、大腿骨、下顎骨で強い発現が認められた［図５（ａ）〜（ｃ）］。
（実験例４）
【００１８】
ＧＤＤ１の人工発現と細胞内局在：
ＣＯＳ−７細胞に発現したヒトＧＤＤ１をウェスタンブロットで解析した結果、ＧＤＤ１蛋白は約１１０  ｋＤａ程度であった。小胞体に特異的に発現視しているカルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）の細胞内発現と、ＧＤＤ１の細胞内発現が、重複したので、ＧＤＤ１は、小胞体に発現することを明らかにした。また、変異型ＧＤＤ１の発現は、野生型ＧＤＤ１の発現の場合と異なり、ＣＯＳ−７細胞の形態を球形化し、細胞の培養皿への接着を減少させた［図６（ａ）〜（ｃ）］。
（参考例１）
【００１９】
機能予測：小胞体の膜に存在するＧＤＤ１蛋白の機能として、蛋白プロセシング、蛋白の折りたたみ、カルシウムの恒常性等に関わる可能性がある。ＧＤＤ１蛋白にはＡＴＰ結合部位は存在しないが、カルシウム等のイオン等の低分子量の物質の膜を介する輸送に関わる可能性が考えられる。
【実施例１】
【００２０】
２つのミスセンス変異の検出（１）：
ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法により検出した。プライマーとして、次の１対を用いた：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５´−ＴＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧ−３´、及び
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５´−ＴＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣ−３´。
上記プライマー対によるＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国）製］にて酵素処理した後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国）製］を用いて直接シーケンスを行った。
【実施例２】
【００２１】
２つのミスセンス変異の検出（２）：
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により検出した。６−ＦＡＭでラベルした次の１対のプライマーを
用いた：
５´−ＴＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧ−３´、及び
５´−ＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣ−３´
上記プライマーによるＰＣＲ産物をＡＢＩ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国）製）］にて電気泳動した。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、ＧＤＤを含む骨疾患、骨形成、骨組織再生、硬組織再建、骨分化の調節や機序解明、低分子物質の細胞膜輸送の研究、タンパク質のプロセッシングと折りたたみの研究、創薬等に利用できる。用途としては、基礎研究用試薬、臨床検査、診断剤、臨床検査薬、遺伝子診断剤、治療薬、遺伝子治療剤、骨補填材、骨組織再生促進材等々であり、医薬品、歯科材料、再生医療材、実験試薬等の分野の製造において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、ＧＤＤ疾患原因遺伝子の存在領域とＧＤＤ１との物理的位置関係を示す。エキソンは塗りつぶしボックスで、非翻訳領域は灰色ボックスでそれぞれ示す。
【図２】ＧＤＤ１の３５６番目の位置のシステイン（Ｃ）のミスセンス変異を示す。解析症例は矢印で表記されている。
【図３】ＧＤＤ１蛋白の疎水性プロット［図３（ａ）］、及び膜に対するＧＤＤ１蛋白の位置関係［図３（ｂ）］、小胞体局在シグナルは灰色ボックスで示されている。
【図４】各種の生物のＧＤＤ１のアミノ酸配列を示す。予想される膜貫通部位をボックスで示す。種間のアミノ酸配列の比較として、同一（＊）、高度保存（：）、保存（・）でそれぞれ示す。
【図５】ヒトとマウス組織におけるＧＤＤ１メッセンジャーＲＮＡの発現解析を示す。ヒトの多組織におけるメッセンジャーＲＮＡのノーザンブロット解析［図５（ａ）］、ヒト組織、健常人ヒト骨芽細胞、および健常人歯根膜細胞のメッセンジャーＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲ法による結果［図５（ｂ）］、及びｍＧＡＰＤＨで標準化したｍＧＤＤ１メッセンジャーＲＮＡの相対的発現量［図５（ｃ）］。
【図６】ＧＤＤ１蛋白のＣＯＳ−７細胞での発現を示す。野生型、および変異型ＧＤＤ１発現のウェスタンブロット画像［図６（ａ）］、野生型ＧＤＤ１の細胞内局在の顕微鏡画像［図６（ｂ）］、及び変異型ＧＤＤ１発現のＣＯＳ−７細胞の形態変化の顕微鏡画像［図６（ｃ）］。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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