(57)【要約】      （修正有）【課題】高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統を開発すること。【解決手段】  イソフラボン集積遺伝子と密接に連鎖するＤＮＡマーカーを提供する。これらの配列は、特定の配列を含み、ダイズ染色体中でのこれらの配列の存在は、高イソフラボン蓄積量の指標となり得る。これらのＤＮＡマーカーを用いて、高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統を選択するための方法およびそれに使用するキットもまた提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ１連鎖群の９４．９〜９８．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１００．３〜１０３．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の５５．８〜７３．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの位置にある核酸配列、およびＧ連鎖群の１３３．１〜１４１．１ｃＭの位置にある核酸配列からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、ダイズにおけるイソフラボン産生レベルを判定するためのＤＮＡマーカー。
【請求項２】
Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ２連鎖群の４８．８４〜６７．８６ｃＭの位置にある核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項３】
配列番号１で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、請求項２に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項４】
配列番号２で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項５】
配列番号３で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項６】
所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズをスクリーニングする方法であって：
（ａ）ダイズからＤＮＡを抽出する工程；および
（ｂ）請求項１〜５に記載のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
（ｂ）請求項２および請求項５に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出する工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｃ）ダイズ種皮の色が白色のものを選択する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８に記載の方法により得られた、高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統。
【請求項１０】
イソフラボン蓄積量が、タマホマレ品種のイソフラボン蓄積量と比較して少なくとも１．４倍増加している、請求項９に記載のダイズ系統。
【請求項１１】
高イソフラボン蓄積量を有するダイズを作製する方法であって：
（ａ）Ｐｅｋｉｎｇ種とタマホマレ種をかけ合わせて組換え系統を作製する工程；
（ａ）該組換え系統からＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）請求項１〜５に記載のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出する工程；および
（ｃ）選択された系統を栽培する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
（ｂ）請求項２および請求項５に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）ダイズ種皮の色が白色のものを選択する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３に記載の方法により得られた、高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統。
【請求項１５】
イソフラボン蓄積量が、タマホマレ品種のイソフラボン蓄積量と比較して少なくとも１．４倍増加している、請求項１４に記載のダイズ系統。
【請求項１６】
ダイズであって、ここで、該ダイズ染色体において、タマホマレ品種由来のＩ遺伝子座を有し、かつ、種子中のイソフラボン蓄積量が６ｍｇ／ｇより高い、ダイズ。
【請求項１７】
前記ダイズ染色体中において、タマホマレ品種由来のＩ遺伝子座およびＰｅｋｉｎｇ品種由来のＳａｔｔ６６９遺伝子座を有し、かつ、種子中のイソフラボン蓄積量が７ｍｇ／ｇより高い、請求項１６に記載のダイズ。
【請求項１８】
所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズをスクリーニングするためのキットであって：
（ａ）請求項１〜５に記載のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出し得る核酸分子；ならびに
（ｂ）指示書、
を含む、キット。
【請求項１９】
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出し得る核酸分子、および請求項５に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出し得る核酸分子を含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＤＮＡマーカーおよびその利用に関する。より詳細には、本発明は、ダイズにおけるイソフラボン産生レベルを判定するためのＤＮＡマーカー、これらのＤＮＡマーカーを用いて高イソフラボン蓄積量を有するダイズをスクリーニングする方法、およびそれによって得られる高イソフラボンダイズに関する。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボンは、豆科の植物に含まれるフラボノイド配糖体の一つであり、その生理活性については、一般にエストロジェン作用、抗酸化作用、抗菌作用が知られている。
【０００３】
また、日本人の乳癌及び前立腺癌の死亡率が欧米人に比べてかなり低いことは周知の事実であるが、疫学的調査により、日本人女性のダイゼインの尿中排出量が、ボストンやヘルシンキの女性の約１０倍であること、及び、日本人男性の血中イソフラボン濃度が、フィンランド人男性の約４０倍と非常に高いことが確認され、従って、日本人がイソフラボンを高摂取するために、乳癌や前立腺癌による死亡率が低値に抑えられているとの報告がなされている（非特許文献１、２）。
【０００４】
このように日本人の尿中及び血中のイソフラボン濃度が高いことは、日本人が伝統的にダイズ食品を多く食していることに起因していると考えられている。
【０００５】
さらにイソフラボンは、カルシウム欠乏下の卵巣摘出ラットにおける骨密度低下を抑制することが確認され、骨粗鬆症を予防する化合物としても大いに注目されている（特許文献１）。
【０００６】
上記のようにイソフラボンは多くの有用な作用を持ち、これを食することが健康維持、増進において重要な役割を果たすものと考えられる。
【非特許文献１】Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５４，１０９３（１９９１）
【非特許文献２】Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４２，１２０９（１９９３）
【特許文献１】特願平７−３６５９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ダイズイソフラボンの蓄積量には大きな品種間変異があることから、複数の主働遺伝子が関与していると考えられている。しかし、イソフラボン集積に関与する遺伝子の実体はほとんど解明されておらず、現行の高イソフラボンダイズ育種においては、全個体あるいは全系統についてイソフラボン蓄積量を測定しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、高イソフラボン蓄積量を有するダイズについて検討した結果、Ｐｅｋｉｎｇ品種とタマホマレ品種をかけ合わせるにより、高イソフラボン蓄積ダイズが得られることを見出した。今日まで、高イソフラボン蓄積量を有するダイズを得る目的で、このような組み合わせを採用することは知られていない。さらに、これらの染色体において、イソフラボン産生レベルに関与する部分を同定するため、イソフラボン蓄積量についてＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ  Ｌｏｃｉ）解析を行った結果、本発明のＤＮＡマーカー部分を同定するに至った。本発明のＤＮＡマーカーを用いれば、より効率的に所望の産生レベルを有する品種を同定・開発することができるようになる。
【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。
１．Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ１連鎖群の９４．９〜９８．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１００．３〜１０３．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の５５．８〜７３．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの位置にある核酸配列、およびＧ連鎖群の１３３．１〜１４１．１ｃＭの位置にある核酸配列からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、ダイズにおけるイソフラボン産生レベルを判定するためのＤＮＡマーカー。
２．Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ２連鎖群の４８．８４〜６７．８６ｃＭの位置にある核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、項目１のＤＮＡマーカー。
３．配列番号１で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、項目２のＤＮＡマーカー。
４．配列番号２で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、項目１のＤＮＡマーカー。
５．配列番号３で示される核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む、項目１のＤＮＡマーカー。
６．所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズをスクリーニングする方法であって：
（ａ）ダイズからＤＮＡを抽出する工程；および
（ｂ）項目１〜５のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出する工程、
を包含する、方法。
７．（ｂ）項目２および５のＤＮＡマーカーの存在を検出する工程を包含する、項目６の方法。
８．（ｃ）ダイズ種皮の色が白色のものを選択する工程をさらに包含する、項目７の方法。
９．項目６〜８に記載の方法により得られた、高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統。
１０．イソフラボン蓄積量が、タマホマレ品種のイソフラボン蓄積量と比較して少なくとも１．４倍増加している、項目９のダイズ系統。
１１．高イソフラボン蓄積量を有するダイズを作製する方法であって：
（ａ）Ｐｅｋｉｎｇ種とタマホマレ種をかけ合わせて組換え系統を作製する工程；
（ａ）該組換え系統からＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）項目１〜５のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出する工程；および
（ｃ）選択された系統を栽培する工程、
を包含する、方法。
１２．（ｂ）項目２および５に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出する工程を包含する、項目１１の方法。
１３．（ｃ）ダイズ種皮の色が白色のものを選択する工程をさらに包含する、項目１２の方法。
１４．項目１１〜１３の方法により得られた、高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統。
１５．イソフラボン蓄積量が、タマホマレ品種のイソフラボン蓄積量と比較して少なくとも１．４倍増加している、項目１４のダイズ系統。
１６．ダイズであって、ここで、該ダイズ染色体において、タマホマレ品種由来のＩ遺伝子座を有し、かつ、種子中のイソフラボン蓄積量が６ｍｇ／ｇより高い、ダイズ。
１７．前記ダイズ染色体中において、タマホマレ品種由来のＩ遺伝子座およびＰｅｋｉｎｇ品種由来のＳａｔｔ６６９遺伝子座を有し、かつ、種子中のイソフラボン蓄積量が７ｍｇ／ｇより高い、項目１６のダイズ。
１８．所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズをスクリーニングするためのキットであって：
（ａ）項目１〜５のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出し得る核酸分子；ならびに
（ｂ）指示書、
を含む、キット。
１９．（ａ）項目２のＤＮＡマーカーの存在を検出し得る核酸分子、および項目５に記載のＤＮＡマーカーの存在を検出し得る核酸分子を含む、項目１８のキット。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態およびより詳細な説明は、以下の節に示されている。
【発明の効果】
【００１１】
ダイズイソフラボン産生レベルを判定できるＤＮＡマーカーを同定し、より効率的な高イソフラボンダイズの開発を可能にした。従来のスクリーニング法では交雑後代を何世代にも渡って大規模に展開した後に形質を調査する必要があったのに対し、本発明のＤＮＡマーカーによるスクリーニング法を用いれば、世代の非常に早い段階で非常に小さな植物体からスクリーニングを行うことができるため、時間、スペース、労力の飛躍的な縮小が可能であり、近代的な育種において非常に有用なツールであることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１３】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１４】
「ダイズ」（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．）は、直立性のマメ科の一年生植物である。世界中で広く栽培されており糧草として、また種子を収穫して食用として利用される。
【００１５】
「Ｐｅｋｉｎｇ品種」は、ダイズシストセンチュウに対して高度抵抗性を有する品種として米国農務省および日本の農林水産省での耐性育種の育成にしばしば利用されてきた品種である。もともとは米国が北京周辺で収集した品種だと考えられる。日本の一般ダイズ品種に比較して種皮が黒く種子が小さい特徴を有する。種子はジーンバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）より購入可能である。
【００１６】
「タマホマレ品種」は、昭和５５年に長野県中信農業試験場においてＬｅｅと東山７号との交雑により育成された日本を代表する品種である。種子はジーンバンクより購入可能である。
【００１７】
「イソフラボン」は、３−フェニルクロモン骨格を有する化合物を総称して言う。天然では、イソフラボンは、この骨格の一部に種々の官能基やグルコース等が結合したイソフラボン誘導体として存在する。特にダイズには種々のイソフラボン誘導体が含まれる。ダイズに含まれるイソフラボン誘導体としては、３−フェニルクロモンにグルコース１残基がβ結合した化合物が挙げられ、その代表例としてダイジン、ゲニスチンおよび、これらのアグリコン（β結合したグルコース残基がはずれたもの）としてダイゼイン、ゲニステインがある。
【００１８】
「イソフラボン蓄積量」は、Ｋｕｄｏらの方法に準拠して測定された量をいう（Ｓ．  Ｋｕｄｏｕ，Ｙ．Ｆｌｅｕｒｙ，Ｄ．Ｗｅｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，２２２７−２２３３（１９９１））。その測定方法を簡単に述べると、約５ｇのダイズ種子の種皮をむき、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１８００ｒｐｍ、１５ｓ×４回で粉砕した。得られたダイズ粉末の約２ｇを５０ｍｌチューブに入れ、７０％エタノールを２５ｍｌ分注し、３０ｍｉｎ振盪した後に冷却遠心機を用いて４℃、３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離して上澄みを得た。イソフラボンを抽出する際に加熱を行うと、室温での抽出に比べてマロニル配糖体が脱アシル化され、配糖体が増加する事が報告されている（Ｓ．Ｋｕｄｏｕ，Ｙ．Ｆｌｅｕｒｙ，Ｄ．Ｗｅｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，２２２７−２２３３（１９９１））。そのため、本発明においてはマルチビーズショッカーを用いた粉砕で１ｍｉｎを４回に分け、遠心分離に冷却遠心機を用いてマロニル配糖体が脱アシル化されるのを防いだ。上記の抽出作業を３回行い、最終的にメスフラスコで１００ｍｌにメスアップして０．４５μｍのフィルターで濾過した後に濾液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；島津製作所）で分析した。分析条件は、カラムにＯＤＳカラムを用い、１５％のアセトニトリル溶液（水：アセトニトリル：酢酸＝８５：１５：０．１）と３５％のアセトニトリル溶液（水：アセトニトリル：酢酸＝６５：３５：０．１）を移動相に用いて５０分間に１５％→３５％アセトニトリル濃度となる直線濃度グラジエントを行った。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃で、サンプル１０μｌを２５４ｎｍのＵＶで検出した。以上の条件下で分析して得られたクロマトグラムからあらかじめ濃度のわかっているダイズイン標準品を用いて各種ダイズイソフラボン濃度を定量した。定量の際には各種ダイズイソフラボンのダイズイン換算濃度に各種の定量係数を乗じることにより（表１）、各種ダイズイソフラボンの濃度を各々算出した。イソフラボン抽出のために量り取って残ったダイズ粉末は乾熱滅菌機を用いて９０℃、２４ｈで乾燥させた後に重量を量って含水率を計算し、乾物重あたりのイソフラボン含量を求めた。
【００１９】
【表１】
2006081511.tif 000002
【００２０】
（計算式）
ダイズイソフラボン［Ｘ］の濃度（ＣＸ）［ｍｇ／ｌ］
＝ＣＤ×ＡＸ／ＡＤ×ＦＸ
ＣＤ：ダイズイン標準液の濃度［ｍｇ／ｌ］
ＡＤ：ダイズイン標準液のピーク面積
ＡＸ：ダイズイソフラボン［Ｘ］のピーク面積
ＦＸ：ダイズイソフラボン［Ｘ］の定量係数
「イソフラボン蓄積量が高い」、または「高イソフラボン蓄積量」は、現在、食用ダイズ品種の中では高イソフラボン蓄積量を有する既存のタマホマレ品種よりも、イソフラボン蓄積量が高いことを意味する。後述のように、ダイズ種子中のイソフラボン蓄積量は、登熟期間中の気温によって変化するので、比較を行う場合は、同一条件下で行う必要がある。
【００２１】
「ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ  Ｌｏｃｉ）解析」は、形質およびＤＮＡマーカーに関して分離している集団を用いることにより、特定の形質を左右する染色体部分を明らかにする手法を総称していう。ＱＴＬ解析についての総論は、鵜飼保雄「量的形質の遺伝解析」、ｐｐ３５４、医学出版、東京、および鵜飼保雄「ゲノムレベルの遺伝解析」、ｐｐ３４９、東京大学出版、東京などに記載されており、その具体的な手順は、以下のＱＴＬ解析の節に詳述されている。ＱＴＬ解析を行うための多くのソフトフェアが公開されている。代表的なソフトウェアとしては、ＭＡＰＬ（鵜飼，１９８９）、ＭＡＰＭＡＫＥＲ（Ｌａｎｄｅｒ，１９８７）などが挙げられる。
【００２２】
「連鎖」は、複数の独立した遺伝子（非対立遺伝子）が，同一の染色体またはＤＮＡ分子上に連なって座位するために，それぞれランダムに子（Ｆ１）に遺伝すると期待される値よりも高い割合で組になって遺伝する現象をいう。「連鎖群」は、互いに連鎖する複数の遺伝子のグループをいう。ダイズにおいては、現在、２０本の連鎖群が知られている。
【００２３】
「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位である。交叉価をパーセントにした値に等しい。「センチモルガン（ｃＭ）」は、１Ｍの１００分の１の値を意味する。ダイズ染色体において、１ｃＭは、約４００ｋｂに相当する。本発明においては、モルガン（Ｍ）またはセンチモルガン（ｃＭ）で表す地図距離は、図１および図２に示す本発明者らの組換え自殖系統を用いて算出した値である。各々のダイズにおける実際の染色体上の実際の位置は、図１および図２に示される対応する既知ＤＮＡマーカー座およびＣｒｅｇａｎ  Ｐ．Ｂ．，Ｊａｒｖｉｋ，Ｔ．，Ｂｕｓｈ，Ａ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｌａｒｋ，Ｋ．Ｇ．，Ｋａｈｌｅｒ，Ａ．，Ｋａｙａ，Ｎ．，ＶａｎＴｏａｉ，Ｔ．，Ｌｏｈｎｅｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．，＆  Ｓｐｅｃｈｔ，Ｊ．Ｅ．（１９９９）．Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３９，１４６４−１４９０に記載される連鎖地図を参照することにより特定できる。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００２５】
本明細書において「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００２６】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。
【００２７】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００２８】
本明細書では、塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００２９】
本明細書中では、ヌクレオチドは、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。その文字コードは以下のとおりである。
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００３０】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本発明でポリヌクレオチドが使用される場合、所望の目的（例えば、イソフラボン産生レベルの判定）が達成される限り、このようなフラグメントもまた、全長のものと同様に使用され得ることが理解される。
【００３１】
本明細書において、ポリヌクレオチドの長さは、上述のように核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００３２】
本明細書において「改変体」とは、もとのポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、ポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリヌクレオチドに対して、ヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、イソフラボン産生レベルの判定など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００３４】
本明細書において「マーカー」とは、特定の生物について目印となる物質をいう。物質がＤＮＡであるときは、ＤＮＡマーカーという。
【００３５】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００３６】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００３７】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子などが挙げられるがそれに限定されない。
【００３８】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プローブとして用いる場合は、識別対象となる種に特異的な配列は不変であるか、類似の配列と識別可能な程度の相同性を有していることが好ましい。
【００３９】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４１】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、酵素、プライマー、分子量標準など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、酵素、ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、慎重反応を止めるヌクレオチドなど（およびその三リン酸）、プライマー、標準など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、試薬成分、緩衝液、塩濃縮液、使用するための補助手段、使用方法を記載した指示書などが含まれる。
【００４２】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。本発明のキットは、核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む。このような試薬には、緩衝液、必要なイオン濃縮液、塩濃縮液、ｐＨ調整剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４３】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の核酸分子を使用することができる。
【００４４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００４５】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００４６】
（発明を実施するための好ましい形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００４７】
１つの局面において、本発明は、イソフラボン産生レベルを判定できるＤＮＡマーカーを提供する。１つの実施形態において、本発明のＤＮＡマーカーは、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ１連鎖群の９４．９〜９８．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１００．３〜１０３．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の５５．８〜７３．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの位置にある核酸配列、およびＧ連鎖群の１３３．１〜１４１．１ｃＭの位置にある核酸配列からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも８塩基を含む。好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡマーカーは、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ１連鎖群の９４．９〜９８．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの位置にある核酸配列、Ａ２連鎖群の１００．３〜１０３．８ｃＭの位置にある核酸配列、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の５５．８〜７３．４ｃＭの位置にある核酸配列、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの位置にある核酸配列、およびＧ連鎖群の１３３．１〜１４１．１ｃＭの位置にある核酸配列からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基、またはそれ以上を含む。
【００４８】
本発明のＤＮＡマーカーには、従来から知られているＤＮＡマーカー（以下、既知マーカーと称する）が含まれる。特に、それらの既知ＤＮＡマーカーの中でも、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．のＡ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの位置にある核酸配列中のＩ、ＡＷ１３２４０２（配列番号１）、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの位置にある核酸配列中のＳａｔｔ１３９（配列番号２）、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの位置にある核酸配列中のＳａｔｔ６６９（配列番号３）は、本発明のＤＮＡマーカーとして特に有用であることが実証された。これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能であり、図２に示されるようなＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで登録されている。本発明のＤＮＡマーカーに含まれるその他の既知ＤＮＡマーカーは、図１および図２に示されており、これらの既知ＤＮＡマーカーを用いることもまた有用である。しかし、本発明のＤＮＡマーカーは、図１および図２に示される既知ＤＮＡマーカーに限定されず、本発明により特定された上記染色体部分に基づき、当業者に周知の技術を使用して同定することができる。
【００４９】
例えば、そのような本発明のＤＮＡマーカー部分は、（１）ダイズの染色体断片を多数クローニングしたライブラリーを構築し、（２）ライブラリーのクローン群の中から本発明の高イソフラボンＤＮＡマーカー部分を有するクローンを探し出し、（３）クローンの配列情報から反復配列や遺伝子介在配列など変異の生じ易い塩基配列を特定し、（４）イソフラボン蓄積量を高くする染色体部分を持つ系統と、低くする染色体部分を持つ系統との間で、（３）の塩基配列に差異があるものを選択し、（５）ＱＴＬ解析を行ってイソフラボン蓄積への寄与率が高いものを選択する、ことにより同定することができる。あるいは、本発明のＤＮＡマーカー部分は、（１）ダイズＤＮＡ情報のデータベース（例えば、Ｓｏｙｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｙｂａｓｅ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／）、ＤＤＧＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ−ｊ．ｈｔｍｌ）など）から本発明の高イソフラボンＤＮＡマーカー部分の配列情報を入手し、（２）（１）の塩基配列を基にして、イソフラボン蓄積量を高くする染色体部分を持つ系統と、低くする染色体部分を持つ系統との間に差異があるものを探し、（３）ＱＴＬ解析を行って、イソフラボン蓄積と強く関係するものを選択する、ことによっても同定できる。
【００５０】
本発明のＤＮＡマーカー部分は、本発明者らの組換え自殖系統を用いて算出した地図距離を用いて表している（図１および図２）。その地図距離により特定される染色体部分は、別のダイズ系統の遺伝子地図上では異なる地図距離により表される場合がある。しかし、図１および図２に示される既知ＤＮＡマーカー座の位置関係は、品種間で保存されている（Ｂｒｅｇａｎ  Ｐ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．前出）ので、異なる品種における、本発明のＤＮＡマーカー部分に対応する部分は、既知ＤＮＡマーカー座を参照することで、特定することができる。例えば、Ａ１連鎖群の９４．９ｃＭ〜９８．８ｃＭの部分は、Ｓａｔｔ２５８とＳａｔ＿２７１とにより挟まれる部分としても表すことができる。
【００５１】
別の局面において、本発明は、本発明のＤＮＡマーカーを用いて、所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズをスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、ダイズからＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡにおいて本発明のＤＮＡマーカーを検出し、高イソフラボン蓄積量に関与する染色体部分を有すると判定されたダイズを選択する工程を包含する。本発明のＤＮＡマーカーの判定は、種々の方法によって実施できる。例えば、本発明のＤＮＡマーカーは、核酸増幅技術を用いて検出できる。例えば、本発明のＤＮＡマーカーとして、図１および図２に示される既知ＤＮＡマーカーを用いる場合、図２に示される対応するプライマー対を用いて核酸を増幅し（例えば、ＰＣＲにより）、その増幅産物の多型を調査することでマーカーの有無を検出することができる。図２には、ひとつのＤＮＡマーカーに対して一対のプライマー対が記載されているが、それ以外のプライマーを用いても本発明のＤＮＡマーカーを検出できることは明らかである。当業者は、当該分野で周知の技術を用いて、本発明のＤＮＡマーカーを検出し得るプライマーを作製することができる。
【００５２】
別の局面において、本発明は、所望のイソフラボン産生レベルを有するダイズを作製する方法を提供する。本発明においては、Ｐｅｋｉｎｇ品種とタマホマレ品種とが、イソフラボン蓄積量を増加させる染色体部分を有していることを初めて見出した。さらに、これらの品種をかけ合わせることで、従来より高濃度のイソフラボンを含有するダイズ系統を作製することに成功した。例えば、Ｐｅｋｉｎｇ×タマホマレ系統において、ダイズ種子中に平均７ｍｇ／ｇを超えるイソフラボンを蓄積する系統を作製した。これは、従来、イソフラボン蓄積量が高いとされていた品種「ふくいぶき」のイソフラボン蓄積量を超える値である。１つの実施形態において、本発明の方法は、Ｐｅｋｉｎｇ品種とタマホマレ品種をかけ合わせて組み換えダイズ系統を作製する工程、該組み換え系統から染色体ＤＮＡを抽出する工程、該染色体ＤＮＡにおいて本発明のＤＮＡマーカーを検出する工程、および高イソフラボン蓄積量を有すると判定された系統を選択し、栽培する工程を包含する。ダイズＤＮＡ中に本発明のＤＮＡマーカーが存在するか否かを決定する方法は、上記の通りである。この実施形態においては、Ｐｅｋｉｎｇ種とタマホマレ種をかけ合わせて組み換えダイズ系統を作製する例を示したが、本発明は、両品種の組み合わせに限定されるものではなく、本発明のＤＮＡマーカーが存在し得るいかなる組み合わせも含むことが理解されるべきである。従って、Ｐｅｋｉｎｇ種とタマホマレ種の組み合わせ以外からも、本発明のＤＮＡマーカーの存在が確認され得る系統が存在し、それらもまた、上記のような高イソフラボン蓄積量を有し得ること、およびそのようなダイズ系統もまた、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。本発明はまた、上記方法によって作製された高イソフラボン蓄積量を有するダイズを提供する。
【００５３】
本発明はまた、イソフラボン産生レベルが低いダイズを作製する方法も提供する。本発明の方法は、ダイズ染色体において、本発明のＤＮＡマーカーを検出し、高イソフラボン蓄積量に関与する染色体部分を含まないダイズを選択する工程を包含する。本発明のＤＮＡマーカーの非存在は、イソフラボン産生レベルが抑制されていることの指標となる。
【００５４】
別の局面において、本発明は、高イソフラボン蓄積量を有するダイズをスクリーニングするためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明のＤＮＡマーカーのうちの少なくとも１つを検出し得る核酸分子、および指示書を含む。このような核酸分子は、例えば、上記のような、本発明のＤＮＡマーカーの一部を増幅することができるプライマーとして利用できる核酸分子である。そのような核酸分子の詳細については、上記を参照されたい。
【００５５】
（ＱＴＬ解析）
この節では、本発明において使用されるＱＴＬ解析について説明する。
【００５６】
一般に、植物の特性の中で、収量や含有量など品種によって多いものから少ないものまで連続的な変異が観察される特性を量的形質と呼び、品種によってモチとウルチなどのように容易に２群に分けることが可能な形質を質的形質と呼んで互いに区別する。イソフラボン含有量が質的形質ならば、イソフラボンの多い品種と少ない品種との交配後代において多い系統と少ない系統とに容易に分類でき、イソフラボン含量の多少と連動する染色体領域を容易に確認することができる。しかし、実際にはイソフラボン含量は量的形質であり、その変異には多数の遺伝子が関与しているため雑種集団のイソフラボン含量は連続分布をする。したがって、イソフラボン含量の増加に寄与している染色体領域を特定するためには統計的解析を行う必要がある。この手法の総称がＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔ  Ｌｏｃｉ：量的形質遺伝子座）解析である。ＱＴＬ解析では、特性に関して分離が認められる雑種集団（Ｆ２集団や組換え自殖系統）について遺伝子地図が完成している必要があるため、ＱＴＬ解析には広い範囲の品種の組み合わせにおいて遺伝子地図作製に用いることができる分子マーカーを利用するのが一般的である。遺伝子地図作製に用いた分子マーカーは同時に雑種集団において染色体の各部分がどちらの両親に由来するものかを判定する道具となる。ＱＴＬ解析を分散分析に基づいて行う場合には（Ｗｅｌｌｅｒｒ  Ｊ．Ｌ．，Ｍ．Ｓｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｂｒｏｄｙ  １９８８  Ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓ  ｏｆ  ｔａｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ×  Ｌ．  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１８：３２９−３３９．）、染色体の特定部位に関する分子マーカーの遺伝子型に基づいて雑種集団を２もしくは３群（両親型もしくは両親型とヘテロ型）に分類する。このとき、観察される特性値の群間分散が郡内分散より有意に増加していれば、当該染色体部位の近傍に特性値に関与するＱＴＬがある可能性が高いと判定する。ただし、この手法ではＱＴＬ近傍マーカーからＱＴＬまでの距離を推定できないので、マーカーから遠くて効果の大きい因子とマーカーに近くて効果の小さい因子の区別ができない。この点を補う別法が区間マッピング法である（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓ．  ＆  Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  １９８６  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＦＬＰ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｏｎ  Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：４９−６２）。この手法では特性値に関与する遺伝因子（Ｑとする）が近傍の染色体のマーカーＡおよびマーカーＢの間に存在し、ＡおよびＢとの連鎖価をｒ１およびｒ２であると仮定する。このとき、ＡおよびＢの遺伝子型別に算出したＱの遺伝子型（Ｑ１Ｑ１、Ｑ１Ｑ２、Ｑ２Ｑ２）の確率頻度と推定遺伝子型値（ｚ１、ｚ２、ｚ３）より、Ｑの部分に相加効果ｕ、優性効果ｄの遺伝因子が存在する場合の対数尤度（ｌｏｇ１０Ｌ）を算出する。さらに、Ｑの部分に遺伝効果が全くない場合（ｕ＝０、ｄ＝０）の対数尤度（ｌｏｇ１０Ｌ０）を算出してＬＯＤスコア＝ｌｏｇ１０Ｌ  −ｌｏｇ１０Ｌ０を求める。ＱＴＬ解析ではＱの位置を連鎖群の端から少しずつ移動させながら各点でのＬＯＤスコアを算出する。ＬＯＤスコアの値が閾値（一般的には２．５〜３）を超える部分にＱが存在する可能性があると判断し、ＬＯＤ値の最大値の位置をＱすなわちＱＴＬが存在する位置であると推定する。
【００５７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、これらの実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【００５８】
以下に、本発明の実施例を記載する。しかし、これらの実施例は、本発明の一実施形態を例示するものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１：大阪、京都、長野において栽培したダイズ種子中のイソフラボン蓄積量のＱＴＬ解析）
品種Ｐｅｋｉｎｇ（母本）×タマホマレ（父本）の組み換え自殖Ｆ８系統（以下ＰＴ８と略）を作製してこれを栽培し、得られた種子中のイソフラボン蓄積量とその関与遺伝子をＱＴＬ解析により調査した。ダイズ種子中のイソフラボン蓄積量は様々な環境の影響を受けて変化し、中でも登熟期間中の気温が蓄積量を大きく左右することが知られている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。従って、ＰＴ８系統を登熟期間中の気温が異なる大阪、京都、長野で栽培した。
【００６０】
（方法）
ダイズの組換え系統の作製は、Ｈａｌｄａｎｅ  Ｊ．Ｂ．Ｓ．＆  Ｃ．Ｈ．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ（１９３１）Ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎｋａｇｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：３５７−３７４に記載される方法に従って、実施した。簡単に言うと、純系である両親品種を交雑して得られたＦ１個体を自殖してＦ２個体を育成した。この後、各Ｆ２個体を自殖して得られた種子より１粒を取って次世代Ｆ３個体を育成した。同様にして、各世代の個体から自殖種子を１粒ずつ採種して次世代を育成することを繰り返した。１１〜１３世代の自殖を繰り返すことで遺伝子座の９割がどちらかの親型に固定した。
【００６１】
各栽培地で得られたＰＴ８種子中のイソフラボン蓄積量は、定義の節に記載されるように、ＨＰＬＣにより測定した。
【００６２】
ＱＴＬ解析については、定義の節およびＱＴＬ解析の節に記載されている通りである。
【００６３】
（結果）
ＱＴＬ解析により、３府県で栽培したＰＴ８系統においてイソフラボン蓄積量の増加に関与する可能性が高い（ＬＯＤ２．５以上）と判断されたＱＴＬを、図１および図２に図示した。本実験により、Ａ１連鎖群の９４．９〜９８．８ｃＭの染色体部分の親型がＰｅｋｉｎｇ品種であること、Ａ２連鎖群の１７．９〜７０．０ｃＭの染色体部分の親型がタマホマレ品種であること、Ａ２連鎖群の１００．３〜１０３．８ｃＭの染色体部分の親型がタマホマレ品種であること、Ｃ１連鎖群の６３．４〜７１．４ｃＭの染色体部分の親型がタマホマレ品種であること、Ｄ２連鎖群の５５．８〜７３．４ｃＭの染色体部分の親型がＰｅｋｉｎｇ品種であること、Ｄ２連鎖群の８３．９〜８９．３ｃＭの染色体部分の親型がＰｅｋｉｎｇ品種であること、およびＧ連鎖群の１３３．１〜１４１．１ｃＭの染色体部分の親型がＰｅｋｉｎｇ品種であることが、高いイソフラボン蓄積量に関与していることが明らかになった（図１および図２を参照のこと）。これらの染色体部分に該当する既知ＤＮＡマーカー（図１および２を参照のこと）について検討したところ、特に、京都ではＩ、Ｓａｔｔ１３９、大阪ではＡＷ１３２４０２、Ｓａｔｔ１３９、長野ではＩ、Ｓａｔｔ６６９が寄与率の高いピークを示した。
【００６４】
【表２】
2006081511.tif 000003
【００６５】
（実施例２：検出されたマーカーと実際のイソフラボン蓄積量との関係）
長野で寄与率の高かったＩ、Ｓａｔｔ６６９において遺伝子型の組み合わせごとにイソフラボン蓄積量の頻度分布をまとめた。
【００６６】
（方法）
イソフラボン蓄積量については、実施例１と同様の方法により測定した。
【００６７】
ＩおよびＳａｔｔ６６９の遺伝子型の特定は、以下の手順で行った。
【００６８】
（ダイズＤＮＡの抽出（ＣＴＡＢ法））
まず、ダイズ植物体から核ＤＮＡを以下の手順で抽出した。
１．サンプル（若葉）を３ｇ強、ＳＤＳを０．３ｇ、ＰＶＰを０．３ｇ、５０ｍｌチューブに入れる
２．メタルコーンを入れ、液体窒素で凍結させる
３．マルチビーズショッカー（安井器械）で１４００ｒｐｍ、１５ｓ×２回で粉砕
４．ＣＴＡＢを６５℃のウォーターバスで加温（１×、２×両方とも）
５．ＣＴＡＢ２×を３ｍｌ、１×を適量入れ、内容物を撹拌して１×で最終的に２０ｍｌに定量する
６．チューブを６５℃のウォーターバスに入れ、１時間加温（３０分ごとにチューブを攪拌する）
７．プロテアーゼＫを５００μｌ入れる（プロテアーゼＫ４ｍｇ／ＣＴＡＢ（１×）１０ｍｌ）
８．室温で３０分放置
９．ＣＩＡで４０ｍｌに定量
１０．６０ｒｐｍで３０ｍｉｎ振盪
１１．チューブ１本あたり１ｍｌのＴＥバッファと１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ１０μｌを混合したものを５８℃のウォーターバスで１時間加温
１２．３０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離
１３．上澄みを５０ｍｌチューブに１０ｍｌ分注
１４．イソプロパノールを１０ｍｌ入れ、軽く混合する
１５．軽く遠心
１６．上澄みを捨てる
１７．７０％エタノール１０ｍｌ以上で洗う（２回程度）
１８．７０％エタノールを捨てて、９９％エタノールで洗う
１９．９９％エタノールを捨てて、乾燥させる
２０．各チューブに１ｍｌのＴＥバッファ＋Ｒｎａｓｅ（１１．で作成）を入れ、５８℃で１時間放置
２１．４２℃で放置し、ＤＮＡを溶かす
２２．１．５ｍｌのチューブに移す（移す前にピペッティングして完全にＤＮＡを溶かす）
２３．冷蔵庫に入れて保存
（核酸増幅）
公開されているデータベースからＳａｔｔ６６９などのＳＳＲマーカーを増幅するために用いるプライマー配列を入手した。配列をもとにオリゴＤＮＡ合成受託サービスを手がける民間企業より合成プライマーを購入した。
【００６９】
次に、所定のプライマー対を用いて、抽出した核ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを市販のＰＣＲ反応装置（アプライドバイオシステム社  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００など）を用いて以下の条件で増幅反応を行った。
【００７０】
（ＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）の反応組成）
ｔＤＮＡ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−３０ｎｇ
Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｕｐｐｅｒ）−−−−−−−−−−−−０．２μＭ
Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｌｏｗｅｒ）−−−−−−−−−−−−０．２μＭ
Ｔａｑ  ポリメラーゼ−−−−−−−−−−−−−−−−０．２５Ｕ
１０×反応バッファ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１μｌ
滅菌蒸留水で１０μｌに調整する。
【００７１】
（ＰＣＲの反応条件）
１：９５℃  ５分間
２：９２℃  １分間
３：４７℃  １分間
４：６８℃  １分間
５：２へ戻る  ３２回
６：６８℃  ３分間
（増幅産物の特定）
増幅されたＤＮＡ断片を１２％のポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色した後、トランスイルミネーター上で増幅断片の長さを確認した。増幅断片長の長さから（表３を参照のこと）、調査個体のＤＮＡ断片が両親のどちらに由来するものであるかを判定した。高いイソフラボン蓄積量を示す個体を選ぶ場合は、イソフラボン含量を増加させるＱＴＬをもつ親と同じＤＮＡ断片を示す個体を選抜した。
【００７２】
【表３】
2006081511.tif 000004
【００７３】
また、Ｉの遺伝子型は、Ｐｅｋｉｎｇ種に由来する場合、得られる種皮が黒色になり、タマホマレ種に由来する場合は、白色になることが知られている（Ｐａｌｍｅｒ，Ｒ．Ｇ．＆  Ｔ．Ｃ．Ｋｉｌｅｎ  １９８７  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｉｎ  Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｃｏｘ（Ｅｄ．）Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅｓ．２ｎｄ  ｅｄ．Ａｇｒｏｎ．Ｍｏｎｏｇｒ．１６．ＡＳＡ，ＣＳＳＡ，ａｎｄ  ＳＳＳＡ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．ｐｐ１３５−２０９）。従って、本発明においては、Ｉについての遺伝子型の判別は、得られる種子の色により行った。
【００７４】
（結果）
結果を図３に示す。図３に示されるように、Ｉ×Ｓａｔｔ６６９の遺伝子型がＡＢからＢＡに移行するにつれて集団が高イソフラボン側へ遷移する様子が観察された。また、イソフラボン蓄積量毎の各遺伝子型の頻度を調べると、図４に示されるように、ＢＡは最もイソフラボン蓄積量が高い傾向を示した。この結果は、ＱＴＬ解析で検出されたＩおよびＳａｔｔ６６９が、実際のイソフラボン蓄積量に関与していることを実証している。今回のＱＴＬ解析において検出されたその他のマーカーについても同様に、イソフラボン蓄積量と関与しているものと考えられる。
【００７５】
この実施例から、Ｐｅｋｉｎｇ×タマホマレの組換え系統において、ＢＡ遺伝子型のダイズのイソフラボン蓄積量が最も高かった。
【００７６】
また、ＢＡ型ダイズのイソフラボン蓄積量は、平均７．２６ｍｇ／ｇであった。従来は、６ｍｇ／ｇ程度で高イソフラボン蓄積量であるとされており、本発明によって、従来の蓄積量をはるかに凌ぐ高イソフラボンダイズ系統を開発することが可能であることが実証された。純系のタマホマレ品種の平均イソフラボン蓄積量は、約４〜５ｍｇ／ｇである。本発明により、純系のタマホマレ品種と比較して、種子中のイソフラボン蓄積量が、少なくとも１．４倍以上増加したダイズを作製することができた。
【００７７】
（実施例３：栽培温度の寄与率への影響）
ＱＴＬ解析において各栽培地でピークの集中するＩ、ＡＷ１３２４０２（図１および表２を参照のこと）における寄与率を比較すると、共通して非常に高い寄与率が確認された。
【００７８】
【表４】
2006081511.tif 000005
【００７９】
各栽培地で共通するピークは、環境の影響を受けずにイソフラボン蓄積に関与していると考えられたため、Ａ２連鎖群におけるＩ〜ＡＷ１３２４０２の領域は特に、イソフラボン生合成の遺伝的メカニズムにおいて重要な役割を果たし得ることが実証された。また、栽培地が異なっても高イソフラボン蓄積量を示す系統が確認されたことから（図５）、高温下においても安定して高イソフラボン蓄積量を示す品種育成が可能であることが実証された。
【００８０】
（実施例４：高イソフラボン蓄積量を有するダイズ系統の作製）
実施例１に記載される方法を用いて、Ｐｅｋｉｎｇ品種×タマホマレ品種の組み換え自殖系統を作製し、栽培する。得られた各個体から若葉をサンプリングし、上記手順に従ってＤＮＡを抽出する。得られたＤＮＡ抽出物をテンプレートとし、上記手順に従って核酸増幅を行い、Ｉがタマホマレ品種に由来し、かつＳａｔｔ６６９がＰｅｋｉｎｇ品種に由来する個体を同定する。得られた個体は、イソフラボン蓄積量が高いダイズである。これらを低温環境下で栽培することで、より高イソフラボン蓄積量を有するダイズを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
高イソフラボン品種の開発効率が容易になれば、さまざまなダイズ加工食品、豆腐、納豆、豆乳、あるいは煮豆、それぞれに特化した品種をすべて高イソフラボン品種に置き換えることが容易になる。イソフラボン摂取量の向上は国民の食生活の改善に繋がると期待される。また、本発明によれば、遺伝子組換えを行わずに高イソフラボン品種を開発することが可能である。日本のように、遺伝子組換え食品に対する消費者の抵抗感が依然として強く残っている地域においては、本発明の産業的価値は、特に高い。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１−１】図１−１は、長野・大阪・京都で栽培したＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量についてのＱＴＬ解析により、イソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分を図示した図である。図中、右側の、大阪等と書かれた線を付された部分がイソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分である。そのうち、特に寄与率の高い部分に三角印を付している。図には、既知ＤＮＡマーカー部位およびその位置（ｃＭ）も示されている。
【図１−２】図１−２は、長野・大阪・京都で栽培したＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量についてのＱＴＬ解析により、イソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分を図示した図である。図中の各部の説明は、図１−１の説明を参照のこと。
【図１−３】図１−３は、長野・大阪・京都で栽培したＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量についてのＱＴＬ解析により、イソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分を図示した図である。図中の各部の説明は、図１−１の説明を参照のこと。
【図１−４】図１−４は、長野・大阪・京都で栽培したＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量についてのＱＴＬ解析により、イソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分を図示した図である。図中の各部の説明は、図１−１の説明を参照のこと。
【図１−５】図１−５は、長野・大阪・京都で栽培したＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量についてのＱＴＬ解析により、イソフラボン蓄積に関与すると判断された染色体部分を図示した図である。図中の各部の説明は、図１−１の説明を参照のこと。
【図２−１】図２−１は、ＱＴＬ解析により同定された本発明のＤＮＡマーカー領域に含まれる既知マーカーおよびそれらの既知マーカーを検出するためのプライマー対を示す。
【図２−２】図２−２は、ＱＴＬ解析により同定された本発明のＤＮＡマーカー領域に含まれる既知マーカーおよびそれらの既知マーカーを検出するためのプライマー対を示す。図２−２は、図２−１の続きである。
【図３】図３は、Ｉ×Ｓａｔｔ６６９の各々の遺伝子型についてのイソフラボン蓄積量の傾向を示す。
【図４】図４は、長野で栽培したＰＴ８系統におけるＢＡ遺伝子型の頻度分布を示す。ＢＡ遺伝子型を有するダイズは、高イソフラボン蓄積量を有する傾向が高いことが示されている。矢印は、Ｐｅｋｉｎｇ：６．９５ｍｇ／ｇ、タマホマレ：４．８５ｍｇ／ｇ、全体平均：５．８６ｍｇ／ｇを示す。
【図５】図５は、大阪および長野におけるＰＴ８系統のイソフラボン蓄積量の相関図である。破線は、既存の高イソフラボン品種「ふくいぶき」のイソフラボン含量を示している。
【図１−１】
2006081511.tif 000006
【図１−２】
2006081511.tif 000007
【図１−３】
2006081511.tif 000008
【図１−４】
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【図１−５】
2006081511.tif 000010
【図２−１】
2006081511.tif 000011
【図２−２】
2006081511.tif 000012
【図４】
2006081511.tif 000013
【図５】
2006081511.tif 000014
【図３】
2006081511.tif 000015
【配列表】
2006081511000001.app