(57)【要約】      （修正有）【課題】１０種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの標的配列を特異的に増幅できるプライマーセット及び前記バクテリアの各標的配列に対して特異的で、かつ他種の核酸と交差反応を起こさないプローブオリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定配列の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、別の特定配列の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用プライマーセット及び、該１０種のバクテリアの各種に特異的なプローブオリゴヌクレオチドである。【選択図】図１
2006174837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１中の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２中の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用プライマーセット。
【請求項２】
配列番号３及び４中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の百日咳菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号５及び６中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号７及び８中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号９及び１０中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１１及び１２の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１３及び１４の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１５及び１６の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１７及び１８の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の緑膿菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１９及び２０の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、及び配列番号２１及び２２の配列中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐの一つ以上の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌からなる群から選択された一つ以上のバクテリアの標的核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、請求項１に記載のプライマーセットをプライマーとしてＰＣＲを行うステップを含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法。
【請求項４】
請求項２に記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法。
【請求項５】
バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、請求項１に記載のプライマーセットをプライマーとしてＰＣＲを行うステップと、
請求項２に記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、得られたＰＣＲ産物を検出するステップと、
を含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法。
【請求項６】
前記プローブオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイの基板に固定化されていることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載のプローブオリゴヌクレオチドが固定化された基板を使用することを特徴とするマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器疾患と関連した１０種のバクテリア種の標的配列を共通に増幅できるプライマーセット及び該１０種のバクテリアのうち各バクテリアの標的配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたオリゴヌクレオチドプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、呼吸器疾患と関連するウイルスを検出するためのプローブが知られている。例えば、特許文献１には、約１４〜１８ｂｐのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドから構成されるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対するハイブリダイゼーション分析プローブが開示されている。特許文献２には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の特定の遺伝子（例、ｅｎｔＥ）と選択的にハイブリダイゼーションができるオリゴヌクレオチドが開示されている。また、特許文献３には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ肺炎菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）のそれぞれに特異的なプライマーまたはプローブが開示されている。
【特許文献１】米国特許第５，８３０，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２５，７１８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，００１，５６４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前記従来技術によっても、呼吸器疾患に関連するとされる百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌という１０種のバクテリアに共通な標的配列を増幅できるプライマー、または前記バクテリア種の各標的配列に対する特異的なプローブは、開示されていない。
【０００４】
従って、本発明の第一の目的は、前記１０種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの標的配列を増幅できるプライマーセットを提供することである。
【０００５】
また、本発明の第二の目的は、前記１０種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの各標的配列に対して特異的で、かつ他種の核酸と交差反応を起こさないプローブオリゴヌクレオチドを提供することである。
【０００６】
さらに、第三の目的は、前記１０種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの存在を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明は、配列番号１中の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２中の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎クラミドフィラ菌（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用プライマーセットを提供する。
【０００８】
前記他の課題を解決するために、本発明は、配列番号３及び４中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の百日咳菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号５及び６中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号７及び８中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号９及び１０中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号１１及び１２中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号１３及び１４中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号１５及び１６中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号１７及び１８中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の緑膿菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号１９及び２０中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、及び配列番号２１及び２２中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐの一つ以上の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌からなる群から選択された一つ以上のバクテリアの標的核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、前記記載のプライマーセットをプライマーとしてＰＣＲを行うステップを含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
【００１０】
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
【００１１】
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、前記記載のプライマーセットをプライマーとしてＰＣＲを行うステップと、前記記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、得られたＰＣＲ産物を検出するステップとを含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
【００１２】
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブが、マイクロアレイの基板に固定化されている前記バクテリアの存在を検出する方法を提供するものである。
【００１３】
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブが固定化された基板を使用することを特徴とするマイクロアレイを提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプライマーセットによれば、１つのプライマーセットを利用して百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌の１０種の呼吸器疾患関連バクテリア種の標的配列を増幅できる。
【００１５】
また、本発明のプローブによれば、前記１０種の呼吸器疾患関連バクテリア種の核酸配列と交差反応性がなく、かつ特異的に特定種を検出できる。
【００１６】
また、本発明の方法によれば、前記１０種の呼吸器疾患関連バクテリアからなる群から一つ以上のバクテリアを効率的に検出できる。さらに、本発明のマイクロアレイは、前記１０種の呼吸器疾患関連バクテリアのいずれか一つ以上のバクテリアの検出に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、配列番号１中の１０個以上の連続塩基の断片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２中の１０個以上の連続塩基の切片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用のプライマーセットを提供する。
【００１８】
本発明のプライマーセットは、前記１０種のバクテリアから由来する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の標的配列、すなわち３２７〜５２９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを増幅するのに使われうる。前記プライマーセットは、前記１０種のバクテリア由来の標的配列を共通して増幅できるために、各バクテリア種に対して別々のプライマーセットを使用せずに標的配列を増幅できる。
【００１９】
プライマーセットを作製するために用いられた各種の菌株数は、下記表１の通りである。
【００２０】
【表１】
2006174837.tif 000003
【００２１】
前記バクテリア種の１１９菌株から１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を比較し、その結果から４個のプライマー候補を選別した（表２参照）。
【００２２】
【表２】
2006174837.tif 000004
【００２３】
前記表２に表した候補プライマーセットのうち、配列番号１及び２を含むプライマーセットが１０種のバクテリア由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を最も効率的に増幅できると判別された。
【００２４】
また、本発明は、配列番号３及び４中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の百日咳菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号５及び６中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号７及び８中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号９及び１０中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１１及び１２中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１３及び１４中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１５及び１６中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１７及び１８中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の緑膿菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号１９及び２０中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、及び配列番号２１及び２２中の１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌からなる群から選択された一つ以上のバクテリアの標的核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、前記１０種のバクテリアのうち、特定の種を特異的に検出するためのプローブとして使われうる。
【００２５】
すなわち、配列番号３及び４；配列番号５及び６；配列番号７及び８；配列番号９及び１０；配列番号１１及び１２；配列番号１３及び１４；配列番号１５及び１６；配列番号１７及び１８；配列番号１９及び２０；配列番号２１及び２２はそれぞれ、百日咳菌；肺炎クラミドフィラ菌；インフルエンザ菌；クレブシエラ肺炎菌；レジオネラ肺炎菌；モラクセラ・カタラーリス；マイコプラズマ肺炎菌；緑膿菌；黄色ブドウ球菌；肺炎レンサ球菌から由来した核酸に特異的なオリゴヌクレオチドである。本発明では、このオリゴヌクレオチドを、前記１０種のバクテリアのうち、特定の種を特異的に検出するためのプローブとして（例えば、配列番号３及び４に基づくオリゴヌクレオチドを百日咳菌を検出するためのプローブとして）使用することができる。
【００２６】
本発明において、「プローブ」とは、ハイブリダイゼーションプローブを意味し、核酸の相補性鎖に配列特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを意味する。本発明において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記１０種のバクテリアから特定の種を特異的に検出するために使われるいかなる方法でも使われうる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが固定化されている固体基板を利用して特定の種を検出する方法に使うことができる。
【００２７】
本発明の前記プローブオリゴヌクレオチドは、１０種の呼吸器疾患関連バクテリアのゲノムをテンプレートとし、配列番号１中の１０個以上の連続塩基の切片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２中の１０個以上の連続塩基の切片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットをプライマーとしたＰＣＲで増幅された核酸を特異的に検出することもできる。プローブオリゴヌクレオチドが結合する位置を表３に示す。
【００２８】
【表３】
2006174837.tif 000005
【００２９】
本発明のプライマーセット及びオリゴヌクレオチドプローブは、特定バクテリアの存在を検出する方法に使用することができる。この方法は、前記プライマーセットをプライマーとして、前記１０種のバクテリアのうち一つ以上を含む試料から分離された核酸をテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、また、前記各バクテリア種に特異的に結合できる前記プローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することにより、特定バクテリアの存在を検出するのに使われうる。さらに前記プライマーセットをプライマーとして、前記１０種のバクテリアのうち一つ以上を含む試料から分離された核酸をテンプレートとしてＰＣＲを行い、それから得られるＰＣＲ産物を前記各バクテリア種に特異的に結合できる前記プローブオリゴヌクレオチドを反応させることによって、前記ＰＣＲ産物検出することによっても、特定バクテリアの存在を検出することができる。
【００３０】
従って、本発明は、具体的にはバクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、本発明の配列番号１中の１０個以上の連続塩基の切片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２中の１０個以上の連続塩基の切片を有し、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとをプライマーとして使用してＰＣＲを行うステップと、得られたＰＣＲ産物を本発明の配列番号３〜２２の配列中のいずれかに存在する１０個以上の連続塩基の切片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して検出するステップとを含む、百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法をも提供する。
【００３１】
前記プローブオリゴヌクレオチドは、適切な検出可能なシグナルを発生させる標識物質で標識されていてもよい。
【００３２】
本発明の方法において、「ＰＣＲ」とは、重合酵素連鎖反応を意味し、重合酵素を利用して標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法である。かかるＰＣＲ法は、当業界で公知であり、商業的に利用可能なキットを利用することもできる。かかるＰＣＲ法には、一回に一つの標的だけを増幅する単一ＰＣＲと、一回に複数の標的を増幅する多重ＰＣＲとが含まれる。多重ＰＣＲでは、複数のプライマー対が利用される。
【００３３】
本発明の方法において、前記一つ以上のバクテリアの検出は、検出可能なシグナルを発生させる物質で前記ＰＣＲ産物を標識し、それを前記プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それから発生するシグナルを検出して行うことができる。前記検出可能なシグナルは、例えば、光学的シグナルまたは電気的シグナルであるが、これらの例に限定されるものではない。前記光学的シグナルとして、具体的には蛍光または燐光を発生させる物質が挙げられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ−５及びＣｙ−３などが挙げられる。また、前記ＰＣＲ産物は、ハイブリダイゼーション前またはその後に検出可能なシグナルを発生させる物質で標識されてもよいし、標識されなくてもよい。標識されていない場合の前記ＰＣＲ産物とプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果は、例えば、電気的シグナルを介して検出できるが、それらの例に限定されるものではない。
【００３４】
本発明はまた、本発明のプローブオリゴヌクレオチドまたはプローブオリゴヌクレオチドセットが固定化されている基板を用いたマイクロアレイを提供する。
【００３５】
本発明のマイクロアレイにおいて、「マイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度に固定化されているものであり、本発明においては、前記ポリヌクレオチドグループを、それぞれ一定の領域に固定化する。かかるマイクロアレイは、当業界で公知である。マイクロアレイについては、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号明細書及び同第５，７４４，３０５号明細書に開示されている。
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：９種の呼吸器疾患関連バクテリアに特異的なプローブが固定化されているマイクロアレイを利用した標的バクテリアの検出）
本実施例では、百日咳菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なそれぞれ２個のオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号３及び４、７及び８、９及び１０、１１及び１２、１３及び１４、１５及び１６、１７及び１８、１９及び２０、２１及び２２）がそれぞれ４個のスポット領域に固定化されているマイクロアレイを製造し、これを利用して試料中に標的バクテリア種が存在しているか否かを確認した。
【００３８】
本実施例で用いられるマイクロアレイは、アミン化合物で活性化された基板上に、前記種の特異的オリゴヌクレオチドを添加し、５０℃で３０分間反応させることによって固定化した。得られたマイクロアレイに、前記のような９種各バクテリア由来した核酸が含まれている試料を、前記バクテリアに特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているスポットに添加し、１６℃で１２時間ハイブリダイゼーション反応を行った。図１は、マイクロアレイから測定された５４０ｎｍでの蛍光強度によるハイブリダイゼーションの結果を表す写真である。図１に示すように、本発明の各オリゴヌクレオチドが各種に対する特異的なプローブとして使用することができるということが分かる。図１で、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩは、それぞれ百日咳菌、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に対して特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイからのハイブリダイゼーション結果を表す写真である（四角形内を参照）。
【００３９】
従来公知のプライマーの場合、１個のプライマーセットで１０種の呼吸器バクテリアを１回で検出できるということは確認されていないが、本発明のプライマーセットは、本発明の実施例で確認されたように、百日咳菌１１株数、肺炎クラミドフィラ菌１５株数、インフルエンザ菌２０株数、マイコプラズマ肺炎菌１０株数、クレブシエラ肺炎菌１９株数、レジオネラ肺炎菌９株数、モラクセラ・カタラーリス６株数、緑膿菌７株数、黄色ブトウ球菌１７株数及び肺炎レンサ球菌５株数、すなわち１０種のバクテリアの１１９株数で発見された標的配列を共通に増幅するのに使われうるという長所がある。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の１０種のバクテリアの標的配列を特異的に増幅できるプライマーセット及び該１０種のバクテリアのうち各種の標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、例えば呼吸器疾患と関連した１０種のバクテリア種関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マイクロアレイから測定された５４０ｎｍでの蛍光強度によるハイブリダイゼーション結果を表す写真である。
【図１】
2006174837.tif 000006
【配列表】
2006174837000001.app