(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ−チロシン生成活性が向上したチロシンフェノール・リアーゼを提供すること。【解決手段】特定なる配列のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸を含む少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、Ｌ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、及び当該タンパク質をコードする遺伝子、更に、当該遺伝子によって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸を含む少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がセリン、システイン、アラニン又はグリシンである、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列における２６番目、３３番目、５４番目、６６番目、８２番目、８５番目、９３番目、９４番目、１６８番目、２０６番目、２１３番目、２２６番目、２３４番目、２６６番目、２７７番目、３３０番目、３３１番目、３５４番目、３７２番目、３７８番目、３８９番目、３９０番目、３９１番目、３９５番目、３９６番目、３９７番目、４２０番目、４４５番目及び４５５番目のアミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸に更に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質。
【請求項５】
配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がセリン、システイン、アラニンまたはグリシン、２６番目のアミノ酸がアルギニン、３３番目のアミノ酸がフェニルアラニン、５４番目のアミノ酸がスレオニン、６６番目のアミノ酸がメチオニン、８２番目のアミノ酸がアルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン、８５番目のアミノ酸がグルタミンまたはアルギニン、９３番目がロイシン、９４番目がイソロイシン、１６８番目のアミノ酸がグルタミン酸またはスレオニン、２０６番目のアミノ酸がセリン、２１３番目のアミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニン、２２６番目のアミノ酸がアルギニン、２３４番目のアミノ酸がアスパラギン酸、２６６番目のアミノ酸がロイシン、２７７番目のアミノ酸がセリン、３３０番目のアミノ酸がリジン、３３１番目のアミノ酸がアラニン、３５４番目のアミノ酸がグルタミン酸、３７２番目のアミノ酸がイソロイシン、３７８番目のアミノ酸がグリシン、３８９番目のアミノ酸がアスパラギン、３９０番目のアミノ酸がアスパラギン、３９１番目のアミノ酸がバリン、３９５番目のアミノ酸がヒスチジン、３９６番目のアミノ酸がロイシン、３９７番目のアミノ酸がアルギニン、４２０番目のアミノ酸がバリン、４４５番目のアミノ酸がアスパラギン及び４５５番目のアミノ酸がロイシンであるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を有する組換えＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えＤＮＡによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培地で培養するＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型チロシンフェノール・リアーゼ、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡにより形質転換された細胞株、および該細胞株を用いた変異型チロシンフェノール・リアーゼの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシンフェノール・リアーゼはＬ−チロシンやＬ−ドーパの製造に使用されている産業上重要な酵素である。
【０００３】
既に、種々のバクテリアがチロシンフェノール・リアーゼ活性を有することが知られている。このようなバクテリアとして、エルビニア・へルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＭＴ−１０５０９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８５）株、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＭＴ−１０４１９株が代表的なものとして挙げられる。これらのバクテリアからチロシンフェノール・リアーゼ活性に関与するＤＮＡ断片が単離され、その遺伝子により形質転換されたエシェリヒア・コリ菌株がＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力（以下、「L-チロシン生成活性」と略記することもある。）を有することが知られている（特許文献１、非特許文献１を参照。）。
【０００４】
しかし、前記の酵素はL-チロシン生成活性が低いため、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパなどのＬ−チロシン誘導体の製造に必要な酵素量が多くなるという問題があった。
【０００５】
一方、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）株のチロシンフェノール・リアーゼの７１番目、３８１番目、１２４番目および４４８番目のアミノ酸を他のアミノ酸に変換した変異型チロシンフェノール・リアーゼが報告されている（非特許文献２を参照）。しかし、この変異型チロシンフェノール・リアーゼはチロシンを生成する活性が激減しており、工業的に用いるには問題がある。
【特許文献１】特開平４−２１８３８０号公報
【非特許文献１】Ｉｗａｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．１４７−１５１
【非特許文献２】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１６４７，ｐｐ．１６７−１７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記の状況に鑑み、前記のチロシンフェノール・リアーゼに比べてL-チロシン生成活性が向上したタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記の課題を解決するため検討した結果、前記特許文献１に記載されているチロシンフェノール・リアーゼの変異体を種々構築し、該変異体のＬ−チロシンの生成能を評価した結果、該チロシンフェノール・リアーゼにおける特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによってＬ−チロシン生成活性が向上した、チロシンフェノール・リアーゼ活性を有するタンパク質が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸を含む少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、
（２）配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列における２６番目、３３番目、５４番目、６６番目、８２番目、８５番目、９３番目、９４番目、１６８番目、２０６番目、２１３番目、２２６番目、２３４番
目、２６６番目、２７７番目、３３０番目、３３１番目、３５４番目、３７２番目、３７８番目、３８９番目、３９０番目、３９１番目、３９５番目、３９６番目、３９７番目、４２０番目、４４５番目及び４５５番目のアミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸に更に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がセリン、システイン、アラニンまたはグリシン、２６番目のアミノ酸がアルギニン、３３番目のアミノ酸がフェニルアラニン、５４番目のアミノ酸がスレオニン、６６番目のアミノ酸がメチオニン、８２番目のアミノ酸がアルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン、８５番目のアミノ酸がグルタミンまたはアルギニン、９３番目がロイシン、９４番目がイソロイシン、１６８番目のアミノ酸がグルタミン酸またはスレオニン、２０６番目のアミノ酸がセリン、２１３番目のアミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニン、２２６番目のアミノ酸がアルギニン、２３４番目のアミノ酸がアスパラギン酸、２６６番目のアミノ酸がロイシン、２７７番目のアミノ酸がセリン、３３０番目のアミノ酸がリジン、３３１番目のアミノ酸がアラニン、３５４番目のアミノ酸がグルタミン酸、３７２番目のアミノ酸がイソロイシン、３７８番目のアミノ酸がグリシン、３８９番目のアミノ酸がアスパラギン、３９０番目のアミノ酸がアスパラギン、３９１番目のアミノ酸がバリン、３９５番目のアミノ酸がヒスチジン、３９６番目のアミノ酸がロイシン、３９７番目のアミノ酸がアルギニン、４２０番目のアミノ酸がバリン、４４５番目のアミノ酸がアスパラギン及び４５５番目のアミノ酸がロイシンであるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、
（５）前記（１）〜前記（４）のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子、（６）前記（５）に記載の遺伝子を有する組換えＤＮＡ、
（７）前記（６）に記載の組換えＤＮＡによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体、
（８）前記（７）に記載の形質転換体を培地で培養するＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質の生産方法、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来公知のチロシンフェノール・リアーゼよりもＬ−チロシン生成活性が向上したタンパク質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸を含む少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質としては、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるチロシンフェノール・リアーゼに比べてL-チロシン生成活性が向上したタンパク質であれば特に制限されない。
【００１１】
このようなタンパク質としては、例えば、配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質、配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列における２６番目、３３番目、５４番目、６６番目、８２番目、８５番目、９３番目、９４番目、１６８番目、２０６番目、２１３番目、２２６番目、２３４番目、２６６番目、２７７番目、３３０番目、３３１番目、３５４番目、３７２番目、３７８番目、３８９番目、３９０番目、３９１番目、３９５番目、３９６番目、３９７番目、４２０番目、４４５番目及び４５５番目のアミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸に更に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００１２】
配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質として、配列番号１記載又は配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がセリン、システイン、アラニン又はグリシンであるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質は、配列番号１又は配列番号２記載のアミノ酸配列からなるそれぞれのチロシンフェノール・リアーゼに比べてＬ−チロシン生成活性が高いので好ましい。配列番号２記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がアラニン又はグリシンであるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるチロシンフェノール・リアーゼに比べてＬ−チロシン生成活性が高いので好ましい。
【００１３】
配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列における２６番目、３３番目、５４番目、６６番目、８２番目、８５番目、９３番目、９４番目、１６８番目、２０６番目、２１３番目、２２６番目、２３４番目、２６６番目、２７７番目、３３０番目、３３１番目、３５４番目、３７２番目、３７８番目、３８９番目、３９０番目、３９１番目、３９５番目、３９６番目、３９７番目、４２０番目、４４５番目及び４５５番目のアミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸に更に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質として、配列番号１記載のアミノ酸配列中の４０６番目のアミノ酸がグリシン、２６番目のアミノ酸がアルギニン、３３番目のアミノ酸がフェニルアラニン、５４番目のアミノ酸がスレオニン、６６番目のアミノ酸がメチオニン、８２番目のアミノ酸がアルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン、８５番目のアミノ酸がグルタミンまたはアルギニン、９３番目のアミノ酸がロイシン、９４番目のアミノ酸がイソロイシン、１６８番目のアミノ酸がグルタミン酸またはスレオニン、２０６番目のアミノ酸がセリン、２１３番目のアミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニン、２２６番目のアミノ酸がアルギニン、２３４番目のアミノ酸がアスパラギン酸、２６６番目のアミノ酸がロイシン、２７７番目のアミノ酸がセリン、３３０番目のアミノ酸がリジン、３３１番目のアミノ酸がアラニン、３５４番目のアミノ酸がグルタミン酸、３７２番目のアミノ酸がイソロイシン、３７８番目のアミノ酸がグリシン、３８９番目のアミノ酸がアスパラギン、３９０番目のアミノ酸がアスパラギン、３９１番目のアミノ酸がバリン、３９５番目のアミノ酸がヒスチジン、３９６番目のアミノ酸がロイシン、３９７番目のアミノ酸がアルギニン、４２０番目のアミノ酸がバリン、４４５番目のアミノ酸がアスパラギン及び４５５番目のアミノ酸がロイシンであるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるチロシンフェノール・リアーゼに比べＬ−チロシン生成活性が高いので好ましい。
【００１４】
前記のＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質の調製方法は特に制限されないが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用する方法が一般的である。
【００１５】
すなわち、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子中の変異を導入する位置のアミノ酸に対応するコドンを他のアミノ酸に対応するコドンに変換し、次いで、コドンが変換された遺伝子を適宜選択したベクターに組み込んだ組換えＤＮＡを作成し、この組換えＤＮＡを適宜選択した宿主細胞に形質転換させて形質転換体を作成する。そして、この形質転換体に目的とするＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質を生産させ、このＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質を回収する。
【００１６】
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子はそれぞれ、特開平４−２１８３８０号公報又は非特許文献２（Ｉｗａｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．１４７−１５１）に記載された方法に従い取得することができる。
【００１７】
現在、特定の塩基配列に対して変異を導入するための材料は市販されており、該材料に添付された使用説明書に記載された方法に従って操作することにより、該塩基配列の特定の位置への特定の変異の導入は容易になった。
【００１８】
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子において、４０６番目のアミノ酸（スレオニン）に対応するコドンが他のアミノ酸のコドンへ変換された遺伝子は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型として、該他のアミノ酸のコドンを有するプライマーＤＮＡを用いたＰＣＲ（Polymerase chain reaction）を行うことにより得ることができる。
【００１９】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸（スレオニン）に対応するコドンがセリン、システイン、アラニン又はグリシンのコドンに変換された遺伝子はそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型として、配列番号３と４のプライマー、配列番号５と６のプライマー、配列番号７と８のプライマーまたは配列番号９と１０のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸（スレオニン）に対応するコドンがアラニン又はグリシンのコドンへ変換された遺伝子はそれぞれ、配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型として、配列番号１１と１２のプライマー、または配列番号１３と１４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。
【００２０】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシン、２６番目のアミノ酸がアルギニン、３３番目のアミノ酸がフェニルアラニン、５４番目のアミノ酸がスレオニン、６６番目のアミノ酸がメチオニン、８２番目のアミノ酸がアルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン、８５番目のアミノ酸がグルタミンまたはアルギニン、９３番目のアミノ酸がロイシン、９４番目のアミノ酸がイソロイシン、１６８番目のアミノ酸がグルタミン酸またはスレオニン、２０６番目のアミノ酸がセリン、２１３番目のアミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニン、２２６番目のアミノ酸がアルギニン、２３４番目のアミノ酸がアスパラギン酸、２６６番目のアミノ酸がロイシン、２７７番目のアミノ酸がセリン、３３０番目のアミノ酸がリジン、３３１番目のアミノ酸がアラニン、３５４番目のアミノ酸がグルタミン酸、３７２番目のアミノ酸がイソロイシン、３７８番目のアミノ酸がグリシン、３８９番目のアミノ酸がアスパラギン、３９０番目のアミノ酸がアスパラギン、３９１番目のアミノ酸がバリン、３９５番目のアミノ酸がヒスチジン、３９６番目のアミノ酸がロイシン、３９７番目のアミノ酸がアルギニン、４２０番目のアミノ酸がバリン、４４５番目のアミノ酸がアスパラギン及び４５５番目のアミノ酸がロイシンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型とし、配列番号１５と１６のプライマー、配列番号１７と１８のプライマー、配列番号１９と２０のプライマー、配列番号２１と２２のプライマー、配列番号２３と２４のプライマー、配列番号２５と２６のプライマー、配列番号２７と２８のプライマー、配列番号２９と３０のプライマー、配列番号３１と３２のプライマー、配列番号３３と３４のプライマー、配列番号３５と３６のプライマー、配列番号３７と３８のプライマー、配列番号３９と４０のプライマー、配列番号４１と４２のプライマー、配列番号４３と４４のプライマー、配列番号４５と４６のプライマー、配列番号４７と４８のプライマー、配列番号４９と５０のプライマー、配列番号５１と５２のプライマー、配列番号５３と５４のプライマー、配列番号５５と５６のプライマー、配列番号５７と５８のプライマー、配列番号５９と６０のプライマー、配列番号６１と６２のプライマー、配列番号６３と６４のプライマー、配列番号６５と６６のプライマー、配列番号６７と６８のプライマー、または配列番号６９と７０のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。
【００２１】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシン、かつ２６番目がアルギニンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型とし、配列番号１５と１６のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシン、かつ３３番目がフェニルアラニン、５４番目がスレオニンであるような、配列番号１のアミノ酸配列中に離れて存在するアミノ酸の変異が組み合わされたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を鋳型として、配列番号５９と６０のプライマーを用いて配列番号１のアミノ酸配列をコード
する遺伝子の４０６番目のアミノ酸がグリシン、かつ３３番目がフェニルアラニンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を得た後、さらにその遺伝子を鋳型として配列番号６１と６２のプライマーを用いることにより対応する遺伝子を得ることができる。これと同様の操作を配列番号の異なるプライマーを用いて繰り返すことにより、さらに多くのアミノ酸変異が組み合わされたアミノ酸配列をコードする遺伝子を得ることもできる。
【００２２】
前記の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクターに組込むことにより組換えＤＮＡを作成する。
【００２３】
Ｌ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主細胞内でＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えＤＮＡの複製起点とＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が機能し、かつ、宿主細胞内で該組換えＤＮＡが複製可能でかつＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が可能なものであれば特に制限はない。例えば、宿主細胞としてエシェリヒア・コリ等の細菌類を用いる場合には、該細菌内で自己複製できるプラスミドを挙げることができる。このようなベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２などが挙げられる。
【００２４】
前記のベクターに前記のＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を組込むことにより、Ｌ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する組換えＤＮＡを得ることができる。ベクターにＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を組込む方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。
【００２５】
宿主細胞としては特に制限されないが、例えば、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５αなどが好ましいものとして挙げられる。
【００２６】
前記のＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクターに組込んだ組換えＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては特に制限はなく、例えば、前記の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている一般的な方法を利用することができる。
【００２７】
前記のようにして得られるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する組換えＤＮＡで形質転換させて得られる形質転換体は、炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源を含む適当な培地で培養することにより、該形質転換体にＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質を生産させることができる。Ｌ−チロシン生成活性を有するタンパク質が形質転換体内に蓄積される場合は、培養した形質転換体を遠心分離等の手段により回収し、回収した形質転換体を緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などにより細胞膜を破壊して、形質転換体内からＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質を回収する。
【００２８】
回収されるＬ−チロシン生成活性を有するタンパク質の分離精製は、例えば、塩析、透析、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の手段を適宜組み合わせて行うことができる。
【００２９】
Ｌ−チロシン生成活性の測定方法及び単位は、次のようにして測定され、かつ定義される。すなわち、ピリドキサールリン酸（以下、「ＰＬＰ」と略記する。）存在下、Ｌ−セリンとフェノールを基質として反応を行い、生成したＬ−チロシンを２８０ｎｍの波長にて逆相高速液体クロマトグラフィーでその量を測定する。このようにしてＬ−チロシンの量により検量線を作成し、１分間に１μモルのＬ−チロシンを生成させる酵素量を１ユニットと定義する。この測定法は特開平４−２１８３８０号公報に詳細に示されている。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
ない。
【実施例１】
【００３０】
配列番号１に記載のチロシンフェノール・リアーゼの部位特異的変異体の作成
特許文献１に開示されている組換えＤＮＡのｐＣＥ２６を鋳型として、ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社のＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて変異を導入した。以降単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。プライマーは合成したオリゴヌクレオチドを用いた。
【００３１】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、特許文献１に開示されているｐＣＥ２６により形質転換された大腸菌ＭＴ−１０５１９を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＣＥ２６の組換えＤＮＡを調製した。
【００３２】
ｐＣＥ２６の組換えＤＮＡを鋳型として配列番号３と４、５と６、７と８、９と１０のＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応液の組成を表１に示した。増幅条件を表２に示した。
上記ＰＣＲ増幅反応液に制限酵素ＤｐｎＩを４ｕｎｉｔ加え、３７℃にて１ｈｒ保温した。この反応液１μＬを大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡）１００μＬに加え、氷中で３０分間保持した。４２℃の恒温水槽に３０秒間浸した後、コンピテントセルに付属するＮＺＹ＋培地０．９ｍＬを加え３７℃で１時間振とうした。上記培養液をＬＢ寒天培地にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬとなるように加えた培地上に塗抹し、３７℃で２０時間保温しコロニーを形成させた。  
【００３３】
該コロニーより任意に選別した３クローンを各一白金耳ずつ植菌し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの組換えＤＮＡを調製した。ＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。
【００３４】
活性測定は特許文献１に開示されている方法を用いて行った。具体的には下記の操作を行った。目的とする変異が導入されたクローンを各一白金耳ずつ植菌し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。該培養液を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。菌体を洗浄後、０．１ｍＭのＰＬＰを含む１０ｍＭピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１０ｍｌに懸濁した。超音波処理により無細胞抽出液を調整し、この酵素液をＬ―セリン７０ｇ／Ｌ、フェノール１７ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム１７ｇ／Ｌを含みｐＨ８．５に調整した反応液９０ｍＬに加え、３７℃で１時間緩やかに振とうしながら反応した。生成したＬ−チロシン量を、Ｋｏｎｄｏらの方法（Ｋｏｎｄｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４８，ｐｐ１５９５−１６０１）により高速液体クロマトグラフィーで定量した。
【００３５】
各変異型チロシンフェノール・リアーゼのＬ−チロシン生成活性を表３に示した。なお、活性値は鋳型であるｐＣＥ２６の組換えＤＮＡで大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αを形質転換したクローンに対する相対値で示した。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
【表３】
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【実施例２】
【００３９】
配列番号２に記載のチロシンフェノール・リアーゼの部位特異的変異体の作成
非特許文献１で開示されているシトロバクター・フロインディ株由来のチロシンフェノール・リアーゼの塩基配列とアミノ酸配列を配列番号２に示した。非特許文献１で開示されている組換えＤＮＡ  ｐＡＦ３１８を鋳型とし、配列番号１１と１２、１３と１４のプライマーを用いてＰＣＲを実施して、実施例１と同様に部位特異的変異を導入した。シトロバクター・フロインディ株由来の各変異型チロシンフェノール・リアーゼの活性を表４に示した。なお、活性値は鋳型であるｐＡＦ３１８の組換えＤＮＡで大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αを形質転換したクローンに対する相対値で示した。
【００４０】
【表４】
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【実施例３】
【００４１】
実施例１の変異体にさらに部位特異的が導入された変異体の作成
（１）クローン番号７の作製
クローン番号７は、鋳型とする組換えＤＮＡとＰＣＲ時に用いるプライマーを変更した以外は、実施例１（１）と同様の操作を行うことにより作製した。実施例１（２）で作製
した配列番号１に記載のアミノ酸配列の４０６番目のスレオニンがグリシンに置換された変異体（クローン番号４）の組換えＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１５と１６のプライマーを用いた。
【００４２】
（２）クローン番号８からクローン番号２８の作製
ＰＣＲ時に用いるプライマーを変更した以外は、実施例３（１）と同様にしてクローン番号８からクローン番号２８を作製した。
【００４３】
クローン番号８は配列番号１７と１８のプライマーを用いて作製した。クローン番号９は配列番号１９と２０のプライマーを用いて作製した。クローン番号１０は配列番号２１と２２のプライマーを用いて作製した。クローン番号１１は配列番号２３と２４のプライマーを用いて作製した。クローン番号１２は配列番号２５と２６のプライマーを用いて作製した。クローン番号１３は配列番号２７と２８のプライマーを用いて作製した。クローン番号１４は配列番号２９と３０のプライマーを用いて作製した。クローン番号１５は配列番号３１と３２を用いて作製した。クローン番号１６は配列番号３３と３４のプライマーを用いて作製した。クローン番号１７は配列番号３５と３６のプライマーを用いて作製した。クローン番号１８は配列番号３７と３８のプライマーを用いて作製した。クローン番号１９は配列番号３９と４０のプライマーを用いて作製した。クローン番号２０は配列番号４１と４２のプライマーを用いて作製した。クローン番号２１は配列番号４３と４４のプライマーを用いて作製した。クローン番号２２は配列番号４５と４６のプライマーを用いて作製した。クローン番号２３は配列番号４７と４８のプライマーを用いて作製した。クローン番号２４は配列番号４９と５０のプライマーを用いて作製した。クローン番号２５は配列番号５１と５２のプライマーを用いて作製した。クローン番号２６は配列番号５３と５４のプライマーを用いて作製した。クローン番号２７は配列番号５５と５６のプライマーを用いて作製した。クローン番号２８は配列番号５７と５８のプライマーを用いて作製した。
【００４４】
（３）クローン番号２９、３０、３１の作製
クローン番号２９からクローン番号３１は、離れた位置に存在する変異部位が組み合わされた変異体である。鋳型としては、実施例１（２）で作製した配列番号１に記載のアミノ酸配列の４０６番目のスレオニンがグリシンに置換された変異体（クローン番号４）の組換えＤＮＡを用いた。
【００４５】
クローン番号２９は２段階の変異を導入する操作を行うことにより作製した。まず、配列番号５９と６０のプライマーを用いて、対応した塩基配列を有するクローンを得た。さらに、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号６１と６２のプライマーを用い、クローン番号２９を作製した。クローン番号３０は、７段階の変異を導入する操作を行うことにより作製した。まず、配列番号１９と２０のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５と２６のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と２８のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５と５６のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７と５８のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号６３と６４のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。最後に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、再度配列番号６５と６６のプライマーを用い、クローン番号３０を作製した。クローン番号３１は、６段階の変異導入操作を行うことにより作製した。まず、配列番号１７と１８のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３と４４のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９と５０のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７と５８のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。次に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７と６８のプライマーを用い、対応した塩基配列を有するクローンを得た。最後に、前段で得られたクローンの組換えＤＮＡを鋳型とし、配列番号６９と７０のプライマーを用い、クローン番号３１を作製した。
【００４６】
（４）活性測定
活性測定は、実施例１（３）と同様に行った。ここで得られたクローンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるチロシンフェノール・リアーゼに比べ高いＬ−チロシン生成活性を示した。結果を表５、表６に示した。なお、活性値は実施例１で鋳型として用いたｐＣＥ２６の組換えＤＮＡで大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αを形質転換したクローンに対する相対値で示した。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のＬ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生成する能力を有するタンパク質は、Ｌ−セリンとフェノールからＬ−チロシンを生産効率よく製造するのに有用である。
【配列表】
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