(57)【要約】【課題】  疎水性の低分子化合物（分子量1000以下）の非特異吸着を抑制することができるバイオセンサー及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で表面が修飾されている基板から成るバイオセンサー。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で表面が修飾されている基板から成るバイオセンサー。
【請求項２】
上記化合物が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、請求項１に記載のバイオセンサー。
一般式（Ｉ）
【化１】
2006234730.tif 000011
（式中：R1〜R3は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基である。また、２個以上のR1〜R3は互いに結合して環を形成してもよい。X1及びY1は各々独立に環を形成する置換基を表す。L1及びL2は各々独立に、置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。M-は負荷電を持つ基もしくは陰イオンを示し、X1、Y1に連結していてもよい。ｎは0〜3の整数を表す。）
【請求項３】
上記化合物が、下記一般式（II）で表される化合物である、請求項１に記載のバイオセンサー。
一般式（II）
【化２】
2006234730.tif 000012
（式中、R4及びR5は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基である。また、R4及びR5は互いに結合して環を形成してもよい。X2及びY2は各々独立に環を形成する置換基を表す。L3は置換もしくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。Nは0〜3の整数を表す。）
【請求項４】
基板が金属表面又は金属膜である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
金属表面又は金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる、請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で基板の表面を修飾することを含む、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
【請求項９】
生理活性物質が共有結合により結合している、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項１１】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１２】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。
【０００７】
この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、特許文献３には、非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供することを目的として、疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサーが記載されている。しかしながら、薬剤スクリーニングにおいて、界面活性剤のようなミセルを形成する化合物は、流路なども汚染し、センサー表面などに非特異的に吸着し、正確な測定ができないことが多かった。これらの化合物、特に疎水性の低分子化合物（分子量1000以下）の非特異吸着を抑制し、正確な測定を可能とするシステムが求められている。しかしながら、疎水性の低分子化合物（分子量1000以下）の非特異吸着を十分に抑制することができるバイオセンサーについては現在までのところ報告がない。
【０００８】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】特開２００４−２７１５１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち本発明は、疎水性の低分子化合物（分子量1000以下）の非特異吸着を抑制することができるバイオセンサー及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で基板の表面を修飾することによって、疎水性の低分子化合物の非特異吸着を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で表面が修飾されている基板から成るバイオセンサーが提供される。
【００１２】
好ましく、上記化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
一般式（Ｉ）
【００１３】
【化１】
2006234730.tif 000002
【００１４】
（式中：R1〜R3は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基である。また、２個以上のR1〜R3は互いに結合して環を形成してもよい。X1及びY1は各々独立に環を形成する置換基を表す。L1及びL2は各々独立に、置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。M-は負荷電を持つ基もしくは陰イオンを示し、X1、Y1に連結していてもよい。ｎは0〜3の整数を表す。）
【００１５】
好ましくは、上記化合物は、下記一般式（II）で表される化合物である。
一般式（II）
【００１６】
【化２】
2006234730.tif 000003
【００１７】
（式中、R4及びR5は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基である。また、R4及びR5は互いに結合して環を形成してもよい。X2及びY2は各々独立に環を形成する置換基を表す。L3は置換もしくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。Nは0〜3の整数を表す。）
【００１８】
好ましくは、基板は金属表面又は金属膜である。
好ましくは、金属表面又は金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１９】
本発明の別の側面によれば、溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で基板の表面を修飾することを含む、本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により結合している、本発明のバイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、疎水性の低分子化合物（分子量1000以下）の非特異吸着を抑制することができるバイオセンサー及びその製造方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で表面が修飾されている基板から成ることを特徴とする。
【００２４】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２５】
本発明で用いる溶液吸収極大が450nm以上である化合物とは、溶解可能な溶媒（例えば水、メタノールやエタノールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジメチルホルムアミドやジアセチルホルムアミドなどのホルムアミド類、ジメチルスルホキシドなど）に溶解させたときの吸収が450nm以上である化合物を言う。溶液によって吸収極大が異なる場合があるが、その場合、最も長波化した溶媒での測定値を基準とする。本発明では、溶液吸収極大が450nm以上である化合物を使用できるが、好ましくは溶液吸収極大が450nm以上950nm以下である化合物を使用することができる。
【００２６】
本発明で用いる溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物の好ましい具体例としては、下記一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
一般式（Ｉ）
【００２７】
【化３】
2006234730.tif 000004
（式中：R1〜R3は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基である。また、２個以上のR1〜R3は互いに結合して環を形成してもよい。X1及びY1は各々独立に環を形成する置換基を表す。L1及びL2は各々独立に、置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。M-は負荷電を持つ基もしくは陰イオンを示し、X1、Y1に連結していてもよい。ｎは0〜3の整数を表す。）
【００２８】
本明細書において、R1〜R3は各々独立に水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。
【００２９】
本明細書における、「アルキル基」とは直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、ｎ−オクチル基、エイコシル基、２−エチルヘキシル基などの炭素数１から３０程度の直鎖又は分枝鎖のアルキル基；シクロヘキシル基、シクロペンチル基、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル基などの炭素数３から３０の置換または無置換のシクロアルキル基又はシクロアルキル基と直鎖若しくは分枝鎖アルキル基との組み合わせであるアルキル基；ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル基、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イル基などの炭素数５から３０のビシクロアルキル基；トリシクロアルキル基などを包含する。アルキル部分を有する置換基（例えばアルキルチオ基など）のアルキル部分も同様である。
【００３０】
また、置換基を有するアルキル基としては、例えば、２−クロロエチル、２−シアノエチルなどを挙げることができる。本明細書においてハロゲン原子という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい。
【００３１】
また、本明細書においてある官能基又は環構造について「置換基を有することもある（あるいは置換又は無置換と表現する場合もある）」という場合、その官能基又は環が１又は２以上の置換基を有する場合があることを意味しているが、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されないが、5員環、6員環を形成していることが好ましい。
【００３２】
本発明においてＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、例えば、置換又は無置換の炭素原子数１ないし１５、好ましくは炭素原子数１ないし１０、特に好ましくは炭素原子数１ないし５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素原子数６ないし３０、好ましくは炭素原子数６ないし２０、さらに好ましくは炭素原子数６ないし１５のアリール基（例えば、フェニル基、ｏ−カルボキシフェニル基など）、置換又は無置換の炭素原子数３ないし２０、好ましくは炭素原子数４ないし１５、さらに好ましくは炭素原子数６ないし１０の複素環基（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、炭素原子数１ないし２０、好ましくは１ないし１５、さらに好ましくは１ないし１０のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、炭素原子数０ないし２０、好ましくは炭素原子数２ないし１５、さらに好ましくは炭素原子数４ないし１５のアミノ基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ基、Ｎ−メチルピペラジノ基など）、炭素原子数１ないし１５、好ましくは炭素原子数１ないし１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６ないし２０、好ましくは炭素原子数６ないし１８、さらに好ましくは炭素原子数６ないし１５のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ｐ−メチルチオ基など）などが挙げられる。
【００３３】
アリール基とは、好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリール基（例えばフェニル、ｐ−トリル、ナフチル、ｍ−クロロフェニル、ｏ−ヘキサデカノイルアミノフェニル）、を表す。
【００３４】
R1〜R3の好ましい具体例としては、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基、フェニル基などが挙げられ、環を形成している場合には、主鎖も含めて5員環もしくは6員環を形成していることが好ましい。
【００３５】
Ｘ1、Ｙ1はＮとともに環構造を形成する非金属原子群を表す。Ｘ1又はＹ1とＮで形成される環としては、チアゾール核｛例えばチアゾール、4-メチルチアゾール、4-フェニルチアゾール、4,5-ジメチルチアゾール、4,5-ジ- フェニルチアゾールなど｝、ベンゾチアゾール核｛例えばベンゾチアゾール、5-クロルベンゾチアゾール、6-クロルベンゾチアゾール、5-メチルベンゾチアゾール、6-メチルベンゾチアゾール、5-ブロモベンゾチアゾール、6-ブロモベンゾチアゾール、5-ヨードベンゾチアゾール、6-ヨードベンゾチアゾール、5-フェニルベンゾチアゾール、5-メトキシベンゾチアゾール、6-メトキシベンゾチアゾール、5-エトキシベンゾチアゾール、5-エトキシカルボニルベンゾチアゾール、5-ヒドロキシベンゾチアゾール、5-カルボキシベンゾチアゾール、5-フルオロベンゾチアゾール、5-ジメチルアミノベンゾチアゾール、5-アセチルアミノベンゾチアゾール、5-トリフロロメチルベンゾチアゾール、5,6-ジメチルベンゾチアゾール、5-ヒドロキシ-6- メチルベンゾチアゾール、5-エトキシ-6- メチルベンゾチアゾール、テトラヒドロベンゾチアゾールなど｝、ナフトチアゾール核｛例えばナフト〔2,1-ｄ〕チアゾール、ナフト〔1,2-ｄ〕チアゾール、ナフト〔2,3-ｄ〕チアゾール、5-メトキシナフト〔1,2-ｄ〕チアゾール、7-エトキシナフト〔2,1-ｄ〕チアゾール、8-メトキシナフト〔2,1-ｄ〕チアゾール、5-メトキシナフト〔2,3-ｄ〕チアゾールなど｝、セレナゾール核｛例えば4-メチルセレナゾール、4-フェニルセレナゾールなど｝、ベンゾセレナゾール核｛例えばベンゾセレナゾール、5-クロルベンゾセレナゾール、5-フェニルベンゾセレナゾール、5-メトキシベンゾセレナゾール、5-メチルベンゾセレナゾール、5-ヒドロキシベンゾセレナゾールなど｝、ナフトセレナゾール類｛例えばナフト〔2,1-ｄ〕セレナゾール、ナフト〔1,2-ｄ〕セレナゾールなど｝、オキサゾール核｛例えばオキサゾール、4-メチルオキサゾール、5-メチルオキサゾール、4,5-ジメチルオキサゾールなど｝、ベンズオキサゾール核｛例えばベンズオキサゾール、5-フルオロベンズオキサゾール、5-クロロベンズオキサゾール、5-ブロモベンズオキサゾール、5-トリフルオロメチルベンズオキサゾール、5-メチルベンズオキサゾール、5-メチル-6- フェニルベンズオキサゾール、5,6-ジメチルベンズオキサゾール、5-メトキシベンズオキサゾール、5,6-ジメトキシベンズオキサゾール、5-フェニルベンズオキサゾール、5-カルボキシベンズオキサゾール、5-メトキシカルボニルベンズオキサゾール、5-アセチルベンズオキサゾール、5-ヒドロキシベンズオキサゾールなど｝、ナフトオキサゾール核｛例えばナフト〔2,1-ｄ〕オキサゾール、ナフト〔1,2-ｄ〕オキサゾール、ナフト〔2,3-ｄ〕オキサゾールなど｝、2-キノリン核、イミダゾール核、ベンズイミダゾール核、3,3 '- ジアルキルインドレニン核、2-ピリジン核、チアゾリン核などが挙げられる。
【００３６】
L1及びL2の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、i-プロピル基、n-ブチル基、i-ブチル基、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ベンジル基、フェニル基などを用いることができる。
【００３７】
M-の具体例としては、陰イオンの場合、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、p-トルエンスルホン酸イオン、過酸化塩素イオンなど、X、Yに連結している場合には、スルホン酸基、スルフィン酸基、硫酸エステル基、リン酸基、カルボキシル基、チオカルボキシル基などを用いることができる。
【００３８】
本発明で用いる溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物の別の好ましい具体例としては、下記一般式（II）で表される化合物が挙げられる。
一般式（II）
【００３９】
【化４】
2006234730.tif 000005
【００４０】
（式中、R4及びR5は各々独立に、水素原子、又は置換若しくは無置換のアルキル基である。また、R4及びR5は互いに結合して環を形成してもよい。X2及びY2は各々独立に環を形成する置換基を表す。L3は置換もしくは無置換のアルキル基若しくはアリール基を表す。Nは0〜3の整数を表す。）
【００４１】
R4及びR5の定義は、上記したR1〜R3の定義と同様である。
X2の具体例としては、上記したX1及びY1と同様なものが用いられる。
【００４２】
Y2は、好ましくは、酸性核を形成するために必要な原子群を表し、いかなる一般のメロシアニン色素の酸性核の形もとることができる。ここで言う酸性核とは、例えば、ジェイムス(James) 編「ザ・セオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス」(The Theory of the Photographic Process)第４版、マクミラン出版社、1977年、198 頁により定義される。好ましい形において、共鳴に関与する置換基としては、例えば、カルボニル基、シアノ基、スルホニル基、スルフェニル基である。具体的には、米国特許第3,567,719 号、第3,575,869 号、第3,804,634 号、第3,837,862 号、第4,002,480 号、第4,925,777 号、特開平3-167546号などに記載されているものが挙げられる。具体的には、2-チオヒダントイン、2-オキサゾリン-5- オン、ローダニン核などが用いられる。
L3は上記したL1及びL2と同様なものが用いられる。
【００４３】
本発明で用いる溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物（例えば、上記一般式（Ｉ）又は（II）で表される化合物）は、エフ・エム・ハーマー（F.M.Hamer）著「ヘテロサイクリック・コンパウンズ- シアニン・ダイズ・アンド・リレイテッド・コンパウンズ(Heterocyclic Compounds-Cyanine Dyesand Related Compounds)（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ John Wiley &Sons社- ニューヨーク、ロンドン、1964年刊）. 、デー・エム・スターマー（D.M.Stu rmer） 著, 「ヘテロサイクリック・コンパウンズ--スペシャル・トピックス・イン・ヘテロサイクリック・ケミストリー --(Heterocyclic Compounds---Specialtopics in heterocyclic chemistry ---) 」第18章, 第14節, 第482 〜515 頁, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（John Wiley & Sons ）社, ニューヨーク、ロンドン, （1977年刊）.,「ロッズ・ケミストリー・オブ・カーボン・コンパウンズ(Rodd'S Chemistry of Carbon Compounds)」,(2nd.Ed.vol. IV, partB,1977年刊),第15章, 第369 〜422 頁;(2nd.Ed.vol. IV,partB,1985 年刊),第15章, 第267 〜296 頁, エルスバイヤー・サイエンス・パブリック・カンパニー・インク(Elsevier Science Publishing Company Inc.)社刊, ニューヨーク. などに記載の方法に基づいて合成することができる。
【００４４】
本発明で使用される化合物は、金属表面で凝集体が形成されることが好ましく、特にいわゆるＪ凝集体を形成し易いものが好ましい。
【００４５】
本発明において溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物を使用する場合、化合物は単独の化合物を使用してもよいし、複数の化合物を組合せて使用してもよい。特に、複数で複合体を作る組合せを使用することも好ましい。
【００４６】
本発明で用いることができる溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
【化５】
2006234730.tif 000006
【００４８】
【化６】
2006234730.tif 000007
【００４９】
上記した溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物の使用量は特に限定されないが、例えば、0.01mM〜100mMの濃度、好ましくは0.1mM〜10mMの濃度になるように希釈した溶液中に基板を所定の時間浸漬することにより、上記化合物で基板の表面を修飾することができる。
【００５０】
溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物で修飾された表面に生理活性物質（リガンド）を結合する方法は、例えば、一般式（I）もしくは一般式（II）の化合物の置換基として、カルボン酸、アミノ基、水酸基などリガンドと直接結合可能な基を導入してもよいし、リガンドを固定するための別の化合物を併用してもよい。また、カルボキシメチルデキストランのようなヒドロゲルを前記の方法で結合させて、そこに生理活性物質（リガンド）を固定してもよい。
【００５１】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００５２】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００５３】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００５４】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５５】
本発明において、生理活性物質は、前記の通り、中間層を介して結合させることができる。中間層としては、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物から成る層、又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００５６】
疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００５７】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００５８】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００５９】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００６０】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００６１】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００６２】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００６３】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００６４】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００６５】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００６６】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００６７】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００６８】
本発明で用いるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００６９】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００７０】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００７１】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００７２】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００７３】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００７４】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００７５】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００７６】
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００７７】
本発明で用いる基板はさらに、一般式（A）で表される化合物を基板に結合するためのリンカーを有していてもよい。
本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ20―Ｌ20―Ｙ20      （４）
（式中、Ｘ20は、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を示し、Ｌ20は２価の連結基を示し、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を示す。）
【００７８】
式（４）において、Ｘ20は疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。
【００７９】
また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。
【００８０】
式（４）において、Ｌ20は２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸ20と別の分子のＹ20が結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。
【００８１】
式（４）において、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。
【００８２】
以下に式（４）の化合物の具体例を示すが、本発明で使用できる式（４）の化合物はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
【化７】
2006234730.tif 000008
【００８４】
本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００８５】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００８６】
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００８７】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００８８】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００８９】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００９０】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００９１】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００９２】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００９３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００９４】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００９５】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００９６】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９７】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００９８】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００９９】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１００】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１０１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１０２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１０３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１０４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１０５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１０６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１０７】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１０８】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１
以下の方法で、本発明のセンサチップを作成した。
（１）プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズム（図１）の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
【０１１０】
（１−１）金製膜
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エッチング、逆スパッタとも呼ばれる）する。プラズマ照射後の光学ブロックの光反射面の表面粗さがRa≦30nmであった。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。Auの粒子サイズは、20nm程度である。得られた試料をチップＡと呼ぶ。
【０１１１】
（２）表面処理
チップＡの金薄膜上に以下の方法で表面処理を行った。
（２−１）溶液の調製
溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物として表１に記載の化合物を、表１に記載の溶媒で1mMの濃度になるように希釈し、超音波処理を60分間した後、0.45μm径のフィルターでろ過をして使用した。
【０１１２】
（２−２）処理
上記で作製した溶液15mlを試験管に入れ、その中にチップAを25℃にて16時間浸漬させた。
処理後、化合物溶液と同じ溶媒で5回洗浄した後、純水にて5回洗浄を行った。
【０１１３】
実施例２
上記処理を施したチップについて以下の方法で非特異吸着の評価を行った。吸着量測定は図２に示すSPR装置のリーダー部分を用いた。測定には、図１の部品４１のタフセレン製の流路を用いた。
（１）準備
（１-１）測定溶液の調製：下記化合物（A）をDMSO：HBS-N＝5：95の混合溶液（以下N-DMSOと略す）に100μMになるように溶解した。この溶液をテスト液と呼ぶ。
HBS-N成分（ＨＥＰＥＳ       0.01mol/l（ｐＨ7.4）；      ＮａＣｌ  0.15mol/l）
【０１１４】
【化８】
2006234730.tif 000009
【０１１５】
（２）測定
流路をN-DMSOで満たし、基準点を測定する。このときの値を0とした。
テスト液にて流路を置換し、流れを止めて５分間放置し、５分後に再度N-DMSOにて流路を置換した。置換後、１分間放置した後、変化量を測定した。
結果を表１に示す。
【０１１６】
【表１】
2006234730.tif 000010
【０１１７】
表１の結果から、溶液吸収極大が450nm以上であり、かつ金属に吸着できる化合物を用いることにより、疎水性化合物の非特異吸着を抑制したセンサー表面を得ることができることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、実施例で使用したプラスチックプリズムを示す。
【図２】図２は、本発明の測定を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【図１】
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【図２】
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