(57)【要約】【課題】  どのようなＥＳ細胞でも使用可能であり、ＥＳ細胞由来の動物が確実に得られ、得られた動物において選択マーカーの影響が残らない、トランスジェニック動物あるいはノックアウト動物の作成方法、ならびに該方法により得られるトランスジェニック動物あるいはノックアウト動物を提供する。【解決手段】  （ａ）（ｉ）適当なマーカーで標識したホスト胚、ならびに（ｉｉ）特定の遺伝子を導入した、あるいは特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞を用意し、（ｂ）該ホスト胚に該ＥＳ細胞を導入し、これを仮親に移植して雄性キメラ個体を得て、（ｃ）該キメラ個体中の該マーカーを発現していない生殖細胞を用いて受精させて子孫を得て、次いで，（ｄ）該特定の遺伝子を導入した、あるいは該特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞由来の動物を選別することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物の作成方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）選択マーカーで標識したホスト胚、ならびに（ｉｉ）特定の遺伝子を導入した、あるいは特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞を用意し、
（ｂ）該ホスト胚に該ＥＳ細胞を導入し、これを仮親に移植して雄性キメラ個体を得て、
（ｃ）該キメラ個体中の該選択マーカーを発現していない生殖細胞を用いて受精させて子孫を得て、次いで
（ｄ）該特定の遺伝子を導入した、あるいは該特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞由来の動物を選別すること
を含む方法。
【請求項２】
該生殖細胞が精子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該受精が顕微受精法により行われるものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
該精子が成熟期直前の動物の精子である請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られる、トランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物。
【請求項６】
該動物がマウスである請求項１〜４のいずれか１項記載に方法、あるいは請求項５記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物の新規作成方法ならびにそれにより得られる動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスジェニック動物は、遺伝子組み替え技術を用いて外部ＤＮＡをゲノムに導入することによって生産される動物であり、医学、薬学、生物学等の研究分野で幅広く利用されている。特定の遺伝子を発現させないようにしたノックアウト動物もトランシジェニック動物の範疇に含まれている。トランスジェニック動物あるいはノックアウト動物の一般的な作成方法は、例えば、特定の遺伝子を導入またはノックアウトしたＥＳ細胞を胚盤胞に注入してキメラ化し、これを仮親に戻してキメラ個体を得て、このキメラ個体の生殖細胞の中からＥＳ細胞由来の細胞を選別し、これを用いて子孫を得て、該特定の遺伝子が導入またはノックアウトされたＥＳ細胞由来の動物を選別するというものである。しかしながら、上記方法にはいくつかの問題点がある。その主な問題点は、キメラ個体の生殖細胞の中からＥＳ細胞由来の細胞を正確に選別することが困難であり、そのため、所望動物を得るために時間と労力を要し、かつ所望動物が得られる頻度も低いという点である。かかる問題点を解決するためにＥＳ細胞に選択マーカーを付すことが行われたが（非特許文献１参照）、この方法では、使用可能なＥＳ細胞が限定されること、ならびに、得られたトランスジェニック動物あるいはノックアウト動物中に該マーカーが残存し、後の実験に影響を及ぼす可能性があること等の問題がある。
【非特許文献１】水谷ら、２００４年国際分化学会ポスター（ポスター番号４４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の解決課題は、ＥＳ細胞を用いるトランスジェニック動物あるいはノックアウト動物の作成において、キメラ個体の生殖細胞の中からＥＳ細胞由来の細胞を効率的に選別することができ、どのようなＥＳ細胞でも使用可能であり、得られた動物において選択マーカーの影響が残らないような、トランスジェニック動物あるいはノックアウト動物を得る方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして驚くべきことに、ホスト動物の胚に選択マーカーを付して、これに選択マーカーを含まないＥＳ細胞を導入することによりキメラを作成し、そのキメラ個体中の該マーカーを発現していない生殖細胞由来の子孫を得ることにより、ＥＳ細胞由来の子孫を確実に得ることができ、上記課題も解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。このような本発明の方法では、数的に圧倒的に多いホスト胚由来の細胞を標識するので標識のシグナルが強くなりすぎて、比較的少数となるＥＳ細胞由来の細胞を識別できないのではないかと予想された。しかしながら予想に大きく反して、ＥＳ細胞由来の生殖細胞をホスト胚由来の生殖細胞から正確かつ容易に選別可能であることがわかった。
【０００５】
すなわち、本発明は：
（１）トランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物の作成方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）選択マーカーで標識したホスト胚、ならびに（ｉｉ）特定の遺伝子を導入した、あるいは特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞を用意し、
（ｂ）該ホスト胚に該ＥＳ細胞を導入し、これを仮親に移植して雄性キメラ個体を得て、
（ｃ）該キメラ個体中の該選択マーカーを発現していない生殖細胞を用いて受精させて子孫を得て、次いで
（ｄ）該特定の遺伝子を導入した、あるいは該特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞由来の動物を選別すること
を含む方法、
（２）該生殖細胞が精子である（１）記載の方法、
（３）該受精が顕微受精法により行われるものである（２）記載の方法、
（４）該精子が成熟期直前の動物の精子である（３）記載の方法、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られる、トランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物、
（６）該動物がマウスである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、あるいは（５）に記載の動物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
キメラ個体の生殖細胞の中からＥＳ細胞由来の細胞を効率的に選別することができ、どのようなＥＳ細胞でも使用可能であり、ＥＳ細胞由来の動物が確実に得られ、得られた動物において選択マーカーの影響が残らない、トランスジェニック動物あるいはノックアウト動物の作成方法、ならびに該方法により得られるトランスジェニック動物あるいはノックアウト動物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上述のごとく、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物の作成方法に関するものである。本発明の方法が適用される動物はヒトを除くいずれの動物であってもよいが、好ましくは哺乳動物である。好適な哺乳動物の例としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ならびにアカゲザル、チンパンジーなどの霊長類が挙げられるが、これらの動物に限られない。現在、トランスジェニック動物やノックアウト動物に関して研究が最も進んでいる実験動物としてはマウスが挙げられ、マウスは本発明の方法を適用するに最も好ましい動物の一例である。
【０００８】
本発明の方法を、手順を追って説明する。
適当な選択マーカーで標識したホスト胚を用意する。ホスト胚は、選択マーカーを導入され、これを発現するようになった動物から得ることができる。選択マーカーとしては、動物に対する安全性が高く、ＥＳ細胞を導入した胚から生じるキメラ個体の体内に移行可能であり、後の工程においてキメラ個体中のＥＳ細胞由来の生殖細胞とＥＳ細胞由来でない生殖細胞とを識別することを可能にするマーカーであればいずれのマーカーであってもよい。選択マーカーとして緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白（ＲＦＰ）、黄色蛍光蛋白（ＹＦＰ）などの可視的手段により識別可能な選択マーカーを用いることが簡便性および作業効率等の点で好ましい。
【０００９】
このように、ホスト胚に選択マーカーを付しておくと、後の工程において、ホスト胚に付した選択マーカーを含まない生殖細胞を選択することにより、ＥＳ細胞由来の生殖細胞を選択することができる。このことは、実験に使用する際にホスト胚のマーカーの影響を受けないという利点を生じる。
【００１０】
本発明に用いる「ホスト胚」とは、後述のＥＳ細胞が由来する動物と同種の動物に由来する胚をいう。ＥＳ細胞とホストが由来する動物は、同種の動物であればよく、系統は異なっていてもあるいは同じであってもよい。特に、本発明において、ホスト胚として胚盤胞を用いることが好ましい。また、本発明において、ホスト胚として８細胞期胚を用いることもできる。
【００１１】
特定の遺伝子を導入した、あるいは特定の遺伝子をノックアウト（すなわち、特定の遺伝子を破壊または消失）したＥＳ細胞を用意する。ここに、ＥＳ細胞とは、胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＥＳ細胞はすべての組織に分化可能である。ＥＳ細胞は、例えば、胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊をほぐすことにより得ることができる。また、マウスのＥＳ細胞系のいくつかは市販されている（例えば、Ｅ１４細胞など）。特定の遺伝子を導入した、あるいは特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞の作成は、当該分野において公知の一般的方法を用いて行うことができる。例えば、マイクロインジェンクションによる遺伝子導入方法、ウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法、エレクトロポレーションによる遺伝子導入法などの遺伝子導入方法により、特定の遺伝子をＥＳ細胞に導入することができる。また、当該分野において公知の方法、例えば、相同性組み換えにより、ＥＳ細胞のゲノム中の遺伝子を破壊または修飾することができる。
【００１２】
特定の遺伝子を導入あるいは特定の遺伝子をノックアウトしたＥＳ細胞を、ホスト胚に導入する。本発明の方法においては、すでにホスト胚に選択マーカーを付してあるので、ＥＳ細胞をマーカーで標識する必要がなく、本発明の方法はどのようなＥＳ細胞にも適用可能であるという利点を有する。マーカーをＥＳ細胞に付する必要はないが、作出した動物の実験上の特性に影響を及ぼさないようなマーカー（例えば、体毛および目の色）をＥＳ細胞に付しておくことは差し支えない。
【００１３】
かかる変異が導入されたＥＳ細胞のホスト胚への導入も、当該分野において公知の方法を用いて行うことができる。ＥＳ細胞を胚盤胞に導入するには、顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用い、ＥＳ細胞を胚盤胞の割腔内にマイクロインジェクションする方法が一般的である。好ましくは、圧電作動型マイクロインジェクション装置を用いて行う。また、ＥＳ細胞を８細胞期胚に導入するには、その透明帯内にＥＳ細胞を注入することが一般的である。
【００１４】
次に、ＥＳ細胞が導入され、キメラ化されたホスト胚を仮親に移植して、子供を産ませ、キメラ個体を得る。一般的には、ＥＳ細胞を導入した胚を、仮親の卵管内または子宮内に移植する。仮親は、ＥＳ細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統は異なっていてもあるいは同じであってもよい。常法により仮親を飼育し、キメラ個体を出産させる。キメラ個体の判別は体毛を指標として用い、まだらになっている個体を選別することにより行うのが一般的である。
【００１５】
次に、得られたキメラ個体からＥＳ細胞由来の生殖細胞を取得する。キメラ個体中の組織はＥＳ細胞由来の部分とホスト胚由来の部分からなっており、ＥＳ細胞由来の組織はホスト胚に含まれる選択マーカーを含まない。したがって、上述のごとく、ホスト胚のマーカーを含まない組織部位から生殖細胞を選別取得することにより、ＥＳ細胞由来の生殖細胞を得ることができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を取得する際の組織、取得手段・方法は様々であり、適宜、選択して行うことができる。一度に多くの生殖細胞が得られることから、雄性キメラ個体を用いることが好ましい。雄性生殖細胞としては精子、精細胞、円形精子細胞などがあり、通常には、成熟した精子を取得して受精に用いる。
【００１６】
生殖細胞は成熟したキメラ個体から取得するのが通常であるが、顕微受精法により受精させる場合には、成熟直前の雄性キメラ個体（例えば、生後約２０日の雄性マウス）から生殖細胞を得て受精させることもできる。このことにより、所望のトランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物を得るまでの時間が短縮される。
【００１７】
得られた生殖細胞を用いて受精を行い、子孫を得て、その中から所望のトランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物を選別する。受精は交雑法により行うことができるが、顕微受精法を用いることが好ましい。交雑による方法よりもはるかに高い受精率が得られ、交雑では困難な系統間でも受精が可能となる。また、顕微受精法を用いると、成熟直前の若い個体由来の生殖細胞を受精させることもできる。具体的には、顕微鏡下でマイクロピペットを使用して精子を卵に注入して受精させることにより行う。顕微受精法には、顕微操作には部分的透明帯開孔法、透明帯内精子注入法、細胞質内精子注入法があり、細胞質内精子注入法が一般的であるが、これらの方法を適宜選択することができる。顕微受精に用いる卵は成熟した卵母細胞が好ましい。卵母細胞は、精子を得た動物と同種の成熟雌性動物から得られるものが好ましい。成熟卵母細胞の取得方法は当該分野で知られた方法であってよく、例えば、排卵過度になったメスの動物から取得することができる。受精後、常法により、受精卵をメスの体内に戻した後、飼育して子供を産ませ、所望のトランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物を選別する。
【００１８】
上述のごとく、本発明の方法により作成されるトランスジェニック非ヒト動物あるいはノックアウト非ヒト動物は、ホスト胚に含まれる選択マーカーを発現しないので、以後の実験において該選択マーカーが影響を及ぼす心配がないという利点を有する。
【００１９】
次に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２０】
ＧＦＰ遺伝子を導入した胚盤胞着床後３．５日目（３．５ｄｐｃ）のＩＣＲマウス株（Shizuoka Laboratory Animal Center）の胞胚腔に、圧電作動型マイクロインジェクション装置（Prime Tech社製）を用いてＥＳ細胞を導入した。ＥＳ細胞としては、Ｅ１４細胞、ＥＢ３細胞およびＲｅｔ９細胞を使用した。Ｅ１４細胞は広く用いられているＥＳ細胞系である。ＥＢ３細胞およびＲｅｔ９細胞は理化学研究所の榎本博士から提供されたものである。Ｒｅｔ９細胞系においては、ＲＥＴ蛋白のＴｙｒ１０１５およびＴｙｒ１０６２がフェニルアラニンに変化している。使用したすべての細胞系は黒色色素を発現し、体毛および目の色を、それらに由来する子孫を示す指標とすることができる。
【００２１】
ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠した雌性ＩＣＲマウス（２．５ｄｐｃ）の子宮に移植し、常法により出産させ、体毛を指標にして雄性キメラ個体を選別した。
【００２２】
ＥＳ細胞由来の精子を下記のようにして得た。得られた成体雄性キメラマウス（生後８週目）の精巣（図１ＡおよびＡ’）から輸精管を取り出し、顕微鏡観察した（図１ＢおよびＢ’）。輸精管は、蛍光を発するホスト胚由来の領域と、蛍光を発しないＥＳ細胞得由来の領域とのコロニーあるいはセグメントを形成していた（図１Ｂ’）。蛍光立体顕微鏡下で蛍光を発していない輸精管の領域を集め、小型のハサミを用いて細かく切り刻み、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ媒体中に懸濁し、精子懸濁液を得た。また、同様にして蛍光を発する領域からも精子懸濁液を得た。
【００２３】
成熟卵母細胞を、生後８〜１２週目の雌性ＩＣＲマウスから下記のようにして得た。５ＩＵの妊娠メス血清ゴナドトロピン（帝国臓器社製）を雌性ＩＣＲマウスに注射し、その４８時間後に５ＩＵのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（帝国臓器社製）を注射した。ヒト絨毛膜ゴナドトロピン注射１３〜１５時間後に、卵管の膨大部から成熟卵母細胞を得た。Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ媒体中０．１％ウシ精巣ヒアルロニダーゼで卵丘を処理することにより、卵母細胞を遊離させた。空気中５％ ＣＯ２雰囲気下において卵母細胞を３７℃の新鮮なＣＺＢ媒体ですすいだ後、ＥＳ細胞由来の精子との顕微授精を行った。
【００２４】
顕微授精は下記の手順で行った。約２μＬの精子懸濁液を、１２％ポリビニルピロリドンを含有する１滴のＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ媒体と混合した。圧電パルスを精子の首の部分に２〜３回与えることにより、精子の頭部と尾部を分離させた。得られた精子頭部を、顕微鏡下で卵母細胞の細胞質内にマイクロインジェクションした。受精した卵母細胞を、空気中５％ ＣＯ２雰囲気下、３７℃にてＣＺＢ媒体中でインキュベーションした。２細胞期胚を雌性ＩＣＲマウス（０．５ｄｐｃ）の卵管中に移植した。
【００２５】
常法に従い雌性ＩＣＲマウスを出産させ、子供を観察した。結果を表１に示す。
【表１】
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* すべての胚を、２細胞期において偽妊娠レシピエントに移植した。
Ｅ１４細胞、ＥＢ３細胞、Ｒｅｔ９細胞のいずれのＥＳ細胞を用いた場合にも、雄性キメラの輸精管の緑色蛍光を発しない領域から得た精子を受精させて得られた子孫はすべて目の色が黒色で、ＥＳ細胞由来の形質を有することがわかった。Ｒｅｔ９細胞を用いた場合の変異ＲＥＴ蛋白遺伝子導入率は４９％であった。輸精管の蛍光を発しない領域から得た精子に由来する子孫はすべて励起光下で蛍光を発しなかったが、輸精管の蛍光を発する領域から得た精子に由来する子孫はすべて励起光下で蛍光を発した（図１ＣおよびＣ’）。このように、得られたＥＳ細胞由来の動物は、ホスト胚の選択マーカーとして使用したＧＦＰを発現していなかった。このように、本発明の方法によれば、いずれのＥＳ細胞を用いた場合にも、確実にＥＳ細胞由来の子孫が得られることがわかった。
【００２６】
上述のキメラ個体取得方法に従って生後２０日目の若い雄性キメラマウスを得て、球形精子細胞を取り出して上記手順により顕微授精を行ったところ、同様に受精可能であり、本発明の方法に使用可能であることがわかった（データ示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、どのようなＥＳ細胞でも使用可能であり、ＥＳ細胞由来の動物が確実に得られ、得られた動物において選択マーカーの影響が残らない、トランスジェニック動物あるいはノックアウト動物の作成方法、ならびに該方法により得られるトランスジェニック動物あるいはノックアウト動物を提供するものであるため、病理学的研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の創製をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａは、成体雄性キメラ個体（生後８週目）から得られた精巣の写真である。図１Ａ’は同じ精巣を励起光下で観察したものである。蛍光が精巣全体に見られた。図１Ｂは、図１Ａに示す精巣から得られた輸精管の写真である。図１Ｂ’は同じ輸精管を励起光下で観察したものである。図１Ｃは、図１Ｂに示す輸精管の蛍光を発しない部分から得た精子に由来する子孫（左３匹）および蛍光を発する部分に由来する子孫（右３匹）の写真である。図１Ｃ’は同じ子孫を励起光下で観察したものである。
【図１】
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