(57)【要約】  【課題】  蛍光測定装置を用いて液体試料中の蛍光物質を測定する場合に、蛍光検出の検出感度を低下させず、またＳ／Ｎ比の経時的不安定化を簡易に防止できる方法を提供する。  【解決手段】  測定容器中の液体試料の上方から励起光を入射し、該励起光により発生する蛍光を検出する蛍光測定装置を用いて蛍光測定する場合において、試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防止する手段を講じることを特徴とする蛍光測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定容器中の液体試料の上方から励起光を入射し、該励起光により発生する蛍光を検出する蛍光測定装置を用いて蛍光測定する場合において、試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防止する手段を講じることを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項２】
凹面曲率半径を小さくする手段が、試料の温度を一旦上昇させ、曲率半径が小さくなった後に当該温度を低下させるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
凹面曲率半径を小さくする手段が、溶液に界面活性剤を添加するものである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料からの蛍光を安定して検出測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生化学分野におけるアッセイにおいて、蛍光試薬を反応させて生じた蛍光を測定して定量分析や定性分析を行う蛍光分析が知られている。一般に、斯かる蛍光分析においては、測定容器に注入された蛍光物質含有溶液に対して、励起ランプあるいはレーザー光等の励起光を照射し、照射した励起光の波長とは異なる波長の発光が観察される現象を利用して、測定対象物中の目的成分を検出する蛍光測定装置が用いられる。
【０００３】
この測定においては非常に微弱な光を検出する必要があることから、励起光による容器からの反射光を抑えるよう黒い容器に測定対象試料が入れられることが多く、通常上方から励起光を照射し、上方から蛍光検出される。この励起光による反射光の影響は、蛍光測定の検出感度、Ｓ／Ｎ比（SignalとNoiseの比率）を下げる原因となっている。これに対しては、例えば、一般的な蛍光物質が励起光に対する蛍光発光の時間差が生じることを利用して、チョッパーによって検出部の光路の時間的遮断が図られている（特許文献１参照）。
【０００４】
また蛍光測定は、通行券やテレフォンカードなどの各種プリペイドカードに設けた蛍光物質によって形成されたバーコードや文字を検出する場合にも行なわれているが、この場合にも励起光の反射の影響を受け、蛍光が発生していないにも関わらずそれを蛍光と誤認する虞があった。この問題に対しては、例えば、励起光と位相の異なる成分のみを取り出すことで反射光の影響を除去する方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの措置を講じた蛍光測定装置は高価になるばかりではなく、問題の応急的な対策でしかない。また、測定対象試料の注入からの時間経過にしたがってＳ／Ｎ比が経時的に変化してしまうこともあった。従って、生化学分野における蛍光測定・分析においては、データの経時的誤差を無くすため、濃度既知のコントロール試料についても反応や分離の処理を同時に行い、これに対する未知試料の濃度を比較・分析していた。
【特許文献１】特開２００３−２０７４５３号公報
【特許文献２】特開平７−３０２３００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、蛍光測定装置を用いて液体試料中の蛍光物質を測定する場合に、蛍光検出の検出感度を低下させず、またＳ／Ｎ比の経時的不安定化を簡易に防止できる方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、測定容器中の液体試料の上方から励起光を入射して蛍光測定を行う場合の検出感度の低下やＳ／Ｎ比の経時的不安定化によるデータのばらつきは、溶液の液面の形状に起因する光の反射が原因であることを解明し、容器中の試料液面の形状を外部から制御することで安定に蛍光測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、測定容器中の液体試料の上方から励起光を入射し、該励起光により発生する蛍光を検出する蛍光測定装置を用いて蛍光測定する場合において、試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防止する手段を講じることを特徴とする蛍光測定方法に係るものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、時間経過による測定対象試料の検出変化が少ない安定的な蛍光検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の蛍光測定方法は、測定容器中の液体試料の上方から励起光を入射し、該励起光により発生する蛍光を検出する蛍光測定装置を用いて蛍光測定する場合において、試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防ぐ手段を講じるものである。
試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防ぐことにより、液面の形状（メニスカス）が補正され、励起光による強い反射光が検出部に入り込んでくることが抑えられる。
【００１１】
本発明の蛍光測定方法において用いられる蛍光測定装置は、液体試料を測定できるものであれば特に制限されるものではなく、一般に、蛍光物質や蛍光試薬を反応させて生じた蛍光化合物の溶液に、その上方から紫外線等の励起光をあてて分子軌道電子を励起し、該電子が励起状態から基準状態へ遷移するときに発する蛍光を測定して、定量分析や定性分析を行う蛍光分析装置であればよい。例えば、図１の概略構成図に示すような蛍光装置を用いればよい。
【００１２】
測定容器は、特に限定されるものではないが、例えばマイクロプレート、マイクロチューブなどのＳＢＳ規格化されている容器が用いられ、素材はポリスチレンやポリプロピレンなどの樹脂製のものを始め、いずれのものでもよい。また、微細加工技術によって作られるＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）を材料とするマイクロチャンバや、熱伝導の良いシリコンやアルミを材料とするマイクロウェルであってもよい。
【００１３】
試料液面の凹面曲率半径をより小さくするか又は凹面曲率半径の経時変化を防ぐ手段としては、例えば、１）試料の温度を一旦上昇させ、曲率半径が小さくなった後に当該温度を低下させること、２）溶液に界面活性剤を添加すること等が挙げられる。
ここで、試料液面の凹面曲率半径の経時変化とは、微妙な力関係で釣合っている測定容器内壁と溶液の接触点における表面張力のバランスが時間経過に伴って変化することを意味する（場合によって測定容器中の試料液面は凸面形状になっていることもある）。これを防ぐことによりＳ／Ｎ比の経時的不安定化を防止でき、これによるデータのばらつきを抑えることが出来る。
【００１４】
１）試料の温度調整
試料液面の凹面曲率半径は、測定容器内壁と溶液の接触点における接触角に依存して決定されるが、一般的にこの接触角は容器内壁材料が不変の場合には溶液の表面張力に依存する。従って溶液の表面張力を低下させれば、容器内壁と溶液との接触角が小さくなり、試料液面の凹面曲率半径も小さくなる。溶液が水を主成分とする場合、水の表面張力は水銀に続いて大きいことから測定容器に導入した時点では、液面は凸面形状、又は平坦形状になっているが、溶液温度を上昇させると凹面曲率半径は小さくなる。溶液を上昇させる温度は、沸点に近いほど短時間で凹面曲率半径が小さくなるが、７０℃〜１００℃に１０秒〜１０分、好ましくは９０℃〜１００℃に１分〜５分である。
【００１５】
一般的に蛍光物質は温度感受性が高く、より低温の方が高い感度で測定が可能であることから温度を下降させて計測することが好ましい。溶液を下降させる温度範囲は、測定時に毎回同一温度に保つことが出来ればよく、０℃〜４０℃、好ましくは４℃〜２５℃である。ここで温度低下に伴って溶液の表面張力は上昇してしまうが、測定容器内壁と液面との接触角には履歴効果（前進接触角と後退接触角には履歴性を持つこと）があることから、凹面曲率半径が熱処理前の状態まで大きくなることはない。また、この接触角が変化することによる凹面曲率半径の経時変化も生じない。
【００１６】
上記手段を実現するためには、測定容器の温度を調節するための温度調節機構を備えればよい。温度調節機構としては、測定容器の置かれた雰囲気を温風によって高温に調整することで測定容器の温度を上げ、また、高温になった空気を外に逃すことによって測定容器の温度を外気と同程度まで下げる機構があるが、好ましくは測定容器の外壁を直接ペルチェ素子等の温度調節部材によって素早く温度調節できる機構を備えるものが処理時間を短縮できることから都合が良い。
【００１７】
２）界面活性剤の添加
界面活性剤の添加により、溶液の表面張力を安定的に低下できることから、液面の凹面曲率半径を小さくさせ、かつその経時変化を防ぐことができる。
使用できる界面活性剤としては、非イオン性またはイオン性のいずれでもよいが、蛍光物質の蛍光特性に及ぼす影響が小さいことから、非イオン性の界面活性剤の方が好ましく、中でも溶液の表面張力低下能に優れる親水疎水比（ＨＬＢ）価が高いポリオキシエチレン付加型界面活性剤が特に好ましい。具体例としては、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）や、ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等が挙げられる。これらの界面活性剤を単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。
【００１８】
用いられる界面活性剤の添加量は、試料溶液中にその界面活性剤の臨界ミセル濃度の１〜１０００倍の濃度となるように、更には臨界ミセル濃度の５〜２０倍の濃度となるように用いるのが好ましい。
【００１９】
上記手段を実現するためには、測定容器中に界面活性剤を導入する手段を設ければよく、斯かる導入手段としては、界面活性剤の溶液を所定の測定容器の位置に所定量だけ分注するポンプ機構を備える。この分注ポンプ機構としては、プランジャーポンプ方式、ペリスタルポンプ方式、圧送・ピンチバルブ方式などの方式のいずれでもよいが、分注量を精密に制御できるプランジャーポンプ方式が好ましい。
【実施例】
【００２０】
実施例１
１．方法
ＰＢＳバッファ中で混合した０．１ｐｍｏｌ／１００μＬ濃度の蛍光色素Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、吸収極大波長：５５０ｎｍ）をマイクロプレート中に導入し、この溶液の蛍光強度をプレートリーダーにて計測した。コントロールとして、Ｃｙ３を含まないＰＢＳバッファ（ブランク）の計測も行なった。時間経過による変化を見るため、１０時間の計測を５分間おきに行なった。
【００２１】
２．結果
Ｃｙ３溶液およびブランクの蛍光強度は、時間経過によって共に増強をしていき、７時間を過ぎると減少して安定してくる結果となった（図２）。この結果から、液面の形状の変化による反射光が、蛍光検出に影響を与えていることが考察された。
【００２２】
実施例２
１．方法
次に、マイクロプレート中に、ＰＢＳバッファ中で混合した０．１ｐｍｏｌ／１００μＬ濃度のＣｙ３溶液に界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％の濃度になるように混ぜた溶液、および、測定前に９５℃，３分間の後に２５℃, ３分間の熱処理を行ったＰＢＳバッファ中で混合した０．１ｐｍｏｌ／１００μＬ濃度のＣｙ３溶液を、プレートリーダーにて５分間おきに１０時間計測した。コントロールとして、Ｃｙ３を含まないＰＢＳバッファ（ブランク）に対しても同様の計測も行なった。
【００２３】
２．結果
各時間におけるＣｙ３溶液とブランクとの蛍光強度差を図３に示す。何も処理を施さない溶液においては７時間経過まで大きく蛍光強度差は変化してしまうのに対し、界面活性剤を混合した溶液、および、予め熱処理を行った溶液は、測定開始時点からずっと安定した蛍光強度差が測定された。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】蛍光測定装置の概念図である。
【図２】Ｃｙ３溶液の蛍光強度の経時的変化を示す図である。
【図３】界面活性剤を添加したＣｙ３溶液、および、測定前に熱処理を行ったＣｙ３溶液の蛍光強度の経時的変化を示す図である。
【符号の説明】
【００２５】
１  測定容器保持部
２  光照射部
３  光検出部
４  制御部
５  指令部
６  データ表示部
２ａ  光源
２ｂ  集光レンズ
２ｃ  干渉フィルター
３ａ  ディテクター
３ｂ  集光レンズ
３ｃ  干渉フィルター
【図１】
2006258744.tif 000002
【図２】
2006258744.tif 000003
【図３】
2006258744.tif 000004