(57)【要約】【課題】  バックグラウンドノイズを低減し、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規技術を提供すること。【解決手段】  プローブ分子Ｘとターゲット分子Ｙとの間の特異的又は相補的な相互作用を、蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する際に用いられる検出部であって、前記相互作用の場を提供する反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに臨む検出表面Ｄと、を少なくとも備え、前記検出表面Ｄが、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された相互作用検出部１、該検出部１を用いる基板、装置、方法を提供する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を、蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する際に用いられる検出部であって、前記相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨む検出表面と、を少なくとも備え、前記検出表面が、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された相互作用検出部。
【請求項２】
前記検出表面には、前記プローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項３】
前記相互作用は、前記反応領域の液相で進行することを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項４】
前記表面は、金、銀、酸化銀のいずれかから選択される金属から形成されていることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項５】
前記蛍光物質は、前記ターゲット分子に標識された蛍光色素であることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項６】
前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項７】
前記蛍光物質は、二本鎖核酸に結合する蛍光インターカレーターであることを特徴とする請求項６記載の相互作用検出部。
【請求項８】
前記反応領域を挟むように形成された少なくとも一対の対向電極を備えており、前記検出表面が該対向電極の一方の電極として機能することを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項９】
前記対向電極によって前記反応領域に交流電界を印加することを特徴とする請求項８記載の相互作用検出部。
【請求項１０】
前記検出表面は、凹凸形状を有することを特徴とする請求項８記載の相互作用検出部。
【請求項１１】
請求項１記載の相互作用検出部が基板上に設けられたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
【請求項１２】
請求項１記載の相互作用検出部の前記反応領域に向けて蛍光励起光を照射する光照射手段と、
励起された蛍光を受光して検出する蛍光検出手段と、
検出された蛍光シグナルに基づいて前記相互作用の状態を解析する手段と、
を少なくとも備える相互作用検出装置。
【請求項１３】
請求項８記載の相互作用検出部の前記反応領域に向けて蛍光励起光を照射する光照射手段と、
励起された蛍光を受光して検出する蛍光検出手段と、
検出された蛍光シグナルに基づいて前記相互作用の状態を解析する手段と、
前記対向電極に通電して、前記反応領域に電界を印加する電界印加手段と、
を少なくとも備える相互作用検出装置。
【請求項１４】
プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する方法において、
前記相互作用を、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された検出表面に臨む反応領域で進行させ、該検出表面に非特異的に吸着した蛍光物質から発せられる蛍光を、前記表面プラズモンの作用により消光することを特徴とするノイズ蛍光低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を蛍光検出する際のＳ／Ｎを向上するための新規技術に関する。より詳しくは、基板表面に非特異的に吸着した蛍光物質から発せられる蛍光を消光してバックグラウンドノイズを低減することにより、高精度の相互作用検出を達成するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、前記ハイブリダイゼーションの検出は、一般には、どのプローブが試料中のヌクレオチド鎖と二本鎖を形成したかを示す蛍光シグナルを発する基板上の位置を光学的に検出する。前記蛍光シグナルは、通常、資料中のヌクレオチド鎖に標識された蛍光物質を励起することにより得られる。近年では、二本鎖核酸の塩基対部分に特異的に吸着する蛍光発色性のインターカレーターが提案されている。
【０００５】
ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの検出の精度は、いまだ改善の余地が多い。改善のためのアプローチは、いくつかあるが、中でも前記蛍光シグナルのＳ／Ｎ比の向上が重要である。即ち、検出される蛍光シグナルから、本質的にハイブリダイゼーションとは無関係のノイズ（バックグラウンド蛍光）をどれだけ排除できるかということが、ハイブリダイゼーション検出の精度の向上に直結する。この点、ハイブリダイゼーション以外の分子間相互作用を蛍光検出する技術においても共通である。
【０００６】
特許文献１は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減するために、消光剤を用いる技術が開示されている。特許文献２には、プローブＤＮＡがループ構造を形成してその解放末端側が基板側にあるようにすることによって、バックグラウンドノイズを低減しようとする技術が開示されている。特許文献３には、コロナ放電処理を利用して担体表面の親水性を制御し、該担体表面への埃の付着を抑制することによって、蛍光分析に際してのバックグランドノイズを低くする技術が開示されている。
【０００７】
このように、蛍光分析に際してバックグラウンドノイズを低減するためのアプローチとして、他の薬剤を用いる方法（特許文献１）、プローブＤＮＡの構造を工夫する方法（特許文献２）、担体（基板）表面に対する処理を施す方法（特許文献３）などが知られている。さらには、バックグラウンドノイズの原因となる物質を、検出領域から洗浄除去した後に、蛍光検出を行う技術も広く採用されている。
【０００８】
また、特許文献４は、基板表面にコーティングされた金薄膜に自己組織化単分子膜を吸着させ、この自己組織化単分子膜にプローブＤＮＡを固定した上で、ハイブリダイゼーションを進行させる技術が開示されている。検出には、前記金薄膜の表面プラズモン共鳴を利用する。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特開２００３−３２９６７６号公報。
【特許文献３】特開２００３−０２８８６７号公報。
【特許文献４】特開２００２−５１７７４号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を蛍光検出する技術に関して、バックグラウンドノイズを低減し、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、まず、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を、蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する際に用いられる検出部であって、前記相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨む検出表面と、を少なくとも備え、前記検出表面が、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された相互作用検出部、該検出部を基板上に備えるバイオアッセイ用基板、並びに該検出部を検出対象部位とする相互作用検出装置を提供する。前記表面を構成する金属又は合金に利用される金属は、表面プラズモンを励起する金属であれば特に限定されないが、例えば、特に、金、銀、酸化銀などから選択することができる。
【００１１】
上記構成の相互作用検出部は、反応領域に臨む検出表面に対して非特異的に吸着した蛍光物質から発せられるバックグラウンドノイズとなる蛍光（以下「ノイズ蛍光」と称する。）を、該表面を構成する金属の表面プラズモン共鳴によるダイポールの相互作用によりエネルギー移動して、消光するという機能を有する。
【００１２】
ノイズ蛍光の発生源と想定される物質は、相互作用に寄与しなかったターゲット分子に標識されている蛍光色素やハイブリダイゼーション（相互作用の一例）により生成した二本鎖核酸に結合する蛍光インターカレーターなどである。これらの蛍光物質が反応領域に臨む検出表面に非特異的に吸着した場合、反応領域に入射される蛍光励起光によって励起されてしまうため、検出時のノイズ蛍光が発生する。本発明は、このノイズ蛍光を消光することを目的とする。
【００１３】
本発明では、反応領域に臨む検出表面に前記プローブ分子を固定し、この固定化されたプローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を、該反応領域に貯留又は保持された液相中で進行させるように工夫する。
【００１４】
液相中で相互作用を進行させる構成を採用すると、該相互作用により生成した物質（以下「生成物質」という。）が検出表面に横臥するように付着してしまうのを防止できる。この結果、生成物質（例えば、二本鎖核酸）から発せられる正規蛍光（相互作用検出に有用な蛍光）に対する表面プラズモンの影響を排除し、正規蛍光を消光してしまうのを有効に防止することができる。
【００１５】
本発明では、反応領域を挟むように、少なくとも一対の対向電極を設けるようにしてもよく、この場合、金属や合金で形成された前記検出表面を、該対向電極の一方の電極として機能させるようにしてもよい。
【００１６】
この対向電極に対して通電し、反応領域に交流電界などの電界を印加すれば、誘電泳動などの電気力学的効果により、生成物質を伸張等させることが可能となる。このため、該生成物質の検出表面に対する付着をより有効に防止し、正規蛍光の消光をさらに確実に防止することができる。なお、前記検出表面に凹凸形状を形成することによって、凸部エッジ部分などに電界を集中させて不均一電界を形成できるので、前記誘電泳動の効果を確実に得ることができる。
【００１７】
ここで、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、上記構成の相互作用検出部が基板上に形成又は配設されたものであり、例えば、検出対象の相互作用がハイブリダイゼーションである場合は、ＤＮＡチップ（又はＤＮＡマイクロアレイ）として利用でき、検出対象の相互作用にタンパク質が関与する場合は、プロテインチップとして利用できる。
【００１８】
また、本発明に係る相互作用検出装置は、上記構成を備える相互作用検出部の前記反応領域に向けて蛍光励起光を照射する光照射手段と、励起された蛍光を受光して検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光シグナルに基づいて前記相互作用の状態を解析する相互作用解析手段と、を少なくとも備える。相互作用検出部に対向電極が設けられている構成では、光照射手段、蛍光検出手段、相互作用解析手段に加えて、該対向電極に通電して、前記反応領域に電界を印加する電界印加手段を少なくとも備える。
【００１９】
上記した相互作用検出部、バイオアッセイ用基板、相互作用検出装置は、いずれも、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する方法に利用されるものである。
【００２０】
本発明は、前記方法において、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された検出表面に臨む反応領域で進行させて、該検出表面に非特異的に吸着した蛍光物質から発せられる蛍光を、前記表面プラズモンにより消光するノイズ蛍光低減方法を提供する。
【００２１】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００２２】
「プローブ分子」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する分子である。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００２３】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２４】
「相互作用」とは、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応などの物質間の化学的結合あるいは解離を広く含む。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２５】
「検出表面」は、物資間の相互作用情報を得るために利用される表面であって、反応領域と固体の臨界表面層を意味する。例えば、基板表面や合成樹脂ビーズなどの粒子表面などを挙げることができる。
【００２６】
「表面プラズモン」は、金属や合金の表面に局在する電子密度波であって、電磁波と相互作用して共鳴（表面プラズモン共鳴）状態を形成する。
【００２７】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供できる領域であり、一例を挙げるなら、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場である。
【００２８】
「ノイズ蛍光」は、蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光を意味する。
【００２９】
「蛍光インターカレーター」は、二本鎖核酸に挿入結合等する蛍光性物質であり、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを挙げることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する技術において、前記相互作用が進行する反応領域に臨む表面で発生するノイズ蛍光を消失させることができるため、前記相互作用を、良好なＳ／Ｎに基づいて、定量検出することができる。また、ハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させた後に、ノイズ蛍光の発生原因となる物質を除去するための水溶液洗浄作業を省略することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３２】
まず、図１は、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する技術の一例に係わる概念を説明するための図、図２は、同技術の別の例に係わる概念を説明するための図である。なお、これらの技術は、本発明に直接関与する技術である。
【００３３】
まず、図１、図２には、プローブ分子の代表例の一つである一本鎖のプローブ核酸Ｘと、該プローブ核酸Ｘにハイブリダイゼーションしたターゲット核酸Ｙと、が示されている。なお、ハイブリダイゼーションは、本発明において検出対象とする相互作用の一例にすぎない。
【００３４】
図１、図２の双方において、一本鎖のプローブ核酸Ｘ（例えば、オリゴＤＮＡ）は、その末端部位が検出表面Ｄに対して、カップリング反応等の化学結合により固定されている。
【００３５】
検出表面Ｄには、例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたプローブ分子末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ分子等をジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００３６】
ここで、検出表面Ｄは、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された薄膜層、あるいは前記金属又は合金の微粒子を散在させた層である。この検出表面Ｄは、例えば、３０ｎｍの厚みに形成することができる。また、この検出表面Ｄに利用される金属の例としては、金、銀、酸化銀などを挙げることができる。
【００３７】
この検出表面Ｄは、例えば、所定波長の光を透過するケイ素、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂などで形成された基板層１１の上に積層されており、また、この検出表面Ｄは、プローブ分子Ｘとターゲット分子Ｙの相互作用が進行する場となる反応領域Ｒに、臨んでいる（面している）。
【００３８】
図１の例では、ターゲット核酸Ｙの一端に蛍光色素ｆ（例えば、市販のＣｙ３など）が標識（ラベル）されており、この蛍光色素ｆに対して蛍光励起光Ｐを照射することにより、蛍光を励起する。この蛍光Ｆを図示しない光学系で受光、検出し、蛍光強度を解析することによって、一本鎖核酸プローブＸとターゲット核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーションを測定する。
【００３９】
一方の図２で示された例では、ターゲット核酸Ｙには蛍光色素ｆが標識されていない。この例では、二本鎖核酸の相補結合部位に特異的に結合する蛍光インターカレーターＩを用いて、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００４０】
即ち、ハイブリダイゼーションの生成物である二本鎖核酸に結合した蛍光インターカレーターＩに蛍光励起光Ｐを照射し、これにより励起された蛍光Ｆを、図示しない光学系で受光、検出し、蛍光強度を測定することによって、一本鎖核酸プローブＸとターゲット核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーションを測定する。
【００４１】
本発明に係る相互作用検出部１は、上記した例のように、プローブ分子Ｘとターゲット分子Ｙとの間の特異的又は相補的な相互作用を、蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する技術に好適に利用される。
【００４２】
しかし、この目的で利用される相互作用検出部では、反応領域Ｒに臨む検出表面Ｄに対して、ハイブリダイゼーションに関与しなかった（出来なかった）ターゲット核酸Ｙａ（図１参照）、あるいは余剰の蛍光インターカレーターＩａ（図２参照）が、非特異的に吸着するという問題が起こる。
【００４３】
検出表面Ｄに対して非特異的に吸着したターゲット核酸Ｙａや蛍光インターカレーターＩａは、蛍光励起光Ｐの照射によって励起されてしまうため、ハイブリダイゼーション検出の際のバックグラウンドノイズとなり、検出精度を低下させる原因となる。
【００４４】
この問題を解決するため、本発明に係る相互作用検出部１は、相互作用の場を提供する反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに臨む検出表面Ｄと、を少なくとも備えた構成において、前記検出表面Ｄを、上記したように、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成する。一例を挙げると、検出表面Ｄは、金薄膜を電気鍍金やＰＶＤ等の公知の方法で成膜することにより形成できる。
【００４５】
このような構成の検出表面Ｄは、これらの蛍光物質（ｆ又はＩ）から発せられるバックグラウンドノイズとなる蛍光（以下「ノイズ蛍光」と称する。）を、該検出表面Ｄを構成する金属の表面プラズモン共鳴によるダイポールの相互作用によりエネルギー移動して、消光するという機能を発揮する。
【００４６】
図３は、本発明に係る相互作用検出部１の最も基本的な実施形態の一例を示す要部断面図である。
【００４７】
図３に示された相互作用検出部１（以下、単に「検出部１」と称する。）では、基板層１１に積層された検出表面Ｄの更に上層に、反応領域形成層１２が積層されている。前記基板層１１は、光透過性を有するので、基板層１１の下方側（裏面側）からの蛍光励起光Ｐの照射によって、反応領域Ｒ内の蛍光検出作業等を実施できる。なお、基板層１１の光透過性は、蛍光励起光Ｐと励起された蛍光Ｆを少なくとも透過する性質を意味し、さらには、反応領域の位置を検出するための光や焦点を合せるための光を透過する性質までを有するものを含む。
【００４８】
なお、基板層１１の下方側（裏面側）からの光照射によって反応領域Ｒ内の蛍光検出作業を実施する構成を採用すると、検出部１が形成された基板の周辺に、必要な装置群の配置設計を行う場合、該基板の上方側には、試料溶液などの滴下又は注入に係わる装置を配置し、基板の下方側には、検出（読み取り）用の光学的装置群をまとめて配置することができるという利点がある。
【００４９】
次に、反応領域形成層１２は、例えば、ＳｉＯ２や感光性ポリイミド樹脂層などの合成樹脂などから形成する。この反応領域形成層１２を感光性ポリイミド樹脂で形成する場合、公知の光ディスクマスタリング技術によって、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供する役割を果たす反応領域Ｒ、例えば、ウエル状の反応領域Ｒ（図３参照）を容易に形成することができる。
【００５０】
反応領域形成層１２の上層には、符号１３で示す蓋材層を設けることによって、反応領域Ｒ内の媒質の乾燥、蛍光反射層、送液路形成などに役立てる。この蓋材層１３には、後述するように、対向電極を構成する一方の電極層（導体層）や絶縁層などを形成してもよい。
【００５１】
このような検出部１を、所定形状の基板上に多数配列しておくことによって、物質間の相互作用を網羅的に検出できるバイオアッセイ用基板を提供することができる。図４には、本発明に係るバイオアッセイ用基板の好適な一実施形態の外観が示されている。なお、本発明に係るバイオアッセイ用基板の形状は、図４に示されたものに狭く限定されない。
【００５２】
図４に示されたバイオアッセイ用基板１００は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様に円盤状の形態をなし、該基板１００上に、多数の検出部１が放射状列をなすように形成されている。なお、図４中の符号１０１は、基板１００を支持したり、回転させたりするためのチャッキング部材、あるいは検出部１に電界を印加するために利用される通電部材が挿着される孔である。
【００５３】
以下、図５〜図１２を参照して、本発明に係る検出部１の実施形態や該検出部１の機能を検証した実施例について、詳しく説明する。なお、以下の実施形態及び実施例では、反応領域Ｒに対して滴下等されて貯留又は保持される媒質が、水溶液溶媒である例を代表例として説明する。
【００５４】
検出部１に設けられ、一本鎖のプローブ核酸Ｘが検出表面Ｄに固定された状態にある反応領域Ｒに対して、ターゲット核酸Ｙを含有する水溶液溶媒Ｍを供給する。水溶液溶媒Ｍの供給は、公知のインクジェットノズルＮ、あるいはメカニカルスポット等の滴下手段を用いて実施することができる（以下、同様）。図５に示された例では、一本鎖のターゲット核酸Ｙの末端に、例えば、Ｃｙ３などの蛍光色素ｆが予め標識してある。
【００５５】
この反応領域Ｒ内で、所定の温度、ｐＨ等の条件でハイブリダイゼーションを進行させた後、例えば、２×ＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ溶液中で浸透しながら５分間×２回洗浄、４０℃に温めた０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で浸透しながら５分間×２回洗浄、０．２×ＳＳＣ溶液中でリンスの順で基板を洗浄する。
【００５６】
この洗浄作業により、余剰なターゲット核酸Ｙを検出表面Ｄ上から除去し、ハイブリダイゼーションしたターゲット核酸Ｙを検出表面Ｄ上に残すようにする。この場合、検出表面Ｄ上に残ったターゲット核酸Ｙに標識されているＣｙ３などの蛍光色素ｆの蛍光強度を検出測定することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５７】
ただし、ハイブリダイゼーション後に洗浄を実施して、余剰なターゲット核酸Ｙを除去する固定を行ったとしても、検出表面Ｄ上には、図５に示すように、非特異的に吸着したターゲット核酸Ｙａが残留する場合がある。検出表面Ｄに非特異的に吸着したターゲット核酸Ｙａは、蛍光色素ｆが標識されているので、この蛍光色素ｆからの発光分がバックグラウンドノイズとなり、検出信号のＳ／Ｎを悪化させる。
【００５８】
しかしながら、本実施形態では、プローブ核酸Ｘが固定されている検出表面Ｄが、蛍光消光効果を持つ金薄膜により形成されているので、検出表面Ｄに非特異的に吸着したターゲット核酸Ｙａに標識された蛍光色素ｆからの発光を消光することができる。金は、表面プラズモンを励起する金属であることから、表面に吸着した蛍光色素は、表面プラズモン共鳴によるダイポールの相互作用で蛍光しないものにエネルギー移動し消光される。
【００５９】
なお、蛍光強度を測定する際は、検出表面Ｄが乾燥した状態であると、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸Ｗが検出表面Ｄに横臥したような状態となり易く、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲット核酸Ｙに標識されている蛍光色素Ｆも検出表面Ｄに付着することが予想される。この場合、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲット核酸Ｙの有用な正規蛍光も消光されてしまう。
【００６０】
従って、蛍光強度を測定する際において、検出表面Ｄの上方領域が、水溶液溶媒Ｍ（例えば、バッファー溶液）で満たされていることが望ましい。つまり、図５に示すように、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸Ｗが溶媒Ｍ中で立ち上がって浮遊している状態とすることにより、蛍光色素ｆを検出表面Ｄから離れた位置に存在させて、検出すべき正規蛍光の消光を防ぐようにする。
【００６１】
次に説明する実施例は、１５ｍｅｒ同士の核酸（ＤＮＡ）間でハイブリダイゼーションを実施し、上記した手順に従った洗浄作業後に、検出表面Ｄが乾燥した状態（Ｄｒｙ）とバッファー溶液で満たされている場合（Ｗｅｔ）のそれぞれの状態において、ターゲットＤＮＡに標識された蛍光色素Ｃｙ３からの蛍光発光強度を、実際に測定し、比較している。
【００６２】
その結果を、図６の図面代用グラフに示す。なお、本実施例では、前記洗浄作業を経ているので、検出表面Ｄ上には、一本鎖ターゲットＤＮＡには殆ど存在しないと考えられる。
【００６３】
この図６を見ればわかるように、検出表面Ｄが乾燥した状態では、明らかに蛍光色素Ｃｙ３の消光が起こり、蛍光強度が顕著に低下していることがわかる。この結果から、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲットＤＮＡに標識された蛍光色素Ｃｙ３は、乾燥した検出表面Ｄの条件では、該検出表面Ｄの消光効果を受けてしまうことが明らかである。これは、前記ターゲットＤＮＡの蛍光色素が検出表面Ｄに付着しているか、極めて近接した位置に存在することを示している。
【００６４】
一方、検出表面Ｄ上をバッファー溶液で満たした場合では、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲットＤＮＡに標識された蛍光色素Ｃｙ３は、検出表面Ｄの消光効果を受け難く、検出に有用な正規蛍光の強度を低下させないことがわかる。
【００６５】
これは、検出表面Ｄ上が溶液で満たされていると、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸Ｗが溶媒Ｍ中で立ち上がって浮遊している状態となり、蛍光色素ｆが検出表面から離れるので、消光されなくなることを示している。
【００６６】
この実施例の結果から、金で形成された検出表面Ｄは、該検出表面Ｄに付着等した蛍光色素の消光効果を発揮するため、バックグラウンドノイズを減らすことに役立てることができること、また、二本鎖を形成したターゲット核酸Ｙの蛍光色素ｆから発せられる正規蛍光の強度を低下させないためには、検出表面Ｄ上を水溶液溶媒で満たす条件が好適であること、を検証できた。
【００６７】
次に、図７には、ハイブリダイゼーション検出に蛍光インターカレーターＩを利用した場合の実施形態を具体的に示している。この実施形態では、図５に示された実施形態と同様に、金薄膜からなる検出表面Ｄ上にプローブ核酸（ＤＮＡ）Ｘが固定されている状態で、ターゲット核酸（ＤＮＡ）Ｙを含有する溶液を供給し、所定条件でハイブリダイゼーションを進行させる。
【００６８】
この図７に示された実施形態では、ターゲット核酸（ＤＮＡ）Ｙは、例えばＣｙ３のような蛍光色素による標識がなされていない。代わりに、ハイブリダイゼーションに続く洗浄作業後の工程で、二本鎖核酸Ｗの相補塩基対部分に対して特異的に結合する蛍光インターカレーターＩ（例えば、市販のSYBR GreenＩ）が反応領域Ｒへ供給されている。
【００６９】
そして、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸Ｗに結合した蛍光インターカレーターＩの蛍光発光強度を測定することによって、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００７０】
この蛍光インターカレーターＩは、二本鎖核酸Ｗに取り込まれることによって蛍光を発する特性を持つ。しかし、検出表面Ｄに非特異的に吸着した場合にも幾分かの蛍光を発し、バックグランドノイズを増やす要因となる。従って、本発明では、検出表面Ｄを金薄膜などで形成することによって、その表面プラズモンに由来する消光効果により、前記バックグランドノイズを減らすようにする。このような蛍光インターカレーターＩを用いた実施形態においても、検出対象の正規蛍光を消光させないために、検出表面Ｄ上は、水溶液溶媒で満たすことが望ましい。
【００７１】
なお、蛍光インターカレーターＩは、二本鎖核酸Ｗに特異的に取り込まれて発光する特性を利用するので、前記したようなハイブリダイゼーション後の洗浄作業を省略することも可能である。特に、検出表面Ｄの消光効果を利用すれば、前記洗浄作業を省略しても、満足できるＳ／Ｎを得ることができる。
【００７２】
次に、図８は、本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、消光効果を発揮する検出表面Ｄを有することに加え、反応領域Ｒを挟むように配設された対向電極Ｅ１−Ｅ２を用いることが特徴である。
【００７３】
対向電極Ｅ１−Ｅ２の一方（例えば、Ｅ１）は、基板１３上に積層された金薄膜からなる検出表面Ｄを利用し、他方の電極（例えば、Ｅ２）は、例えば、光透過性のＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）で形成する。このような構成では、ＩＴＯ電極Ｅ２側から反応領域Ｒへ蛍光励起光Ｐを照射することができる（図８参照）。この場合、ＩＴＯ電極Ｅ２を設ける上方基板１４は、蛍光励起光Ｐや蛍光Ｆなどを透過するガラスや合成樹脂で形成する必要がある。
【００７４】
なお、ＩＴＯ電極Ｅ２の反応領域Ｒに望む表面Ｅ２ａは、その表面上でのイオン溶液による電気化学的な反応を防止するために、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などのような絶縁膜１５で覆う構成が望ましい。
【００７５】
ここで、対向電極Ｅ１−Ｅ２間は、図８に示されたスイッチＳをオン/オフすることで、電源Ｖにより電圧を印加することができる。既述した実施形態と同様に、電極Ｅ１であり、かつ検出表面Ｄでもある金薄膜表面には、プローブ核酸Ｘが固定された状態とし、この状態でターゲット核酸Ｙを含有する溶液を反応領域Ｒへ供給し、ハイブリダイゼーションを進行させる。
【００７６】
そのとき、図８に示されたスイッチＳをオンにし、電源Ｖによって対向電極Ｅ１−Ｅ２間に、例えば高周波電界を印加する。このときの電界の条件としては、例えば、約１×１０６Ｖ／ｍ、１ＭＨｚサイン波を選択できる。
【００７７】
この電界の作用、特に核酸分子などの場合では誘電泳動の作用によって、ハイブリダイゼーションにより生成した二本鎖核酸Ｗは、電界方向に沿って伸張する。この場合、予めターゲット核酸Ｙの末端に修飾された蛍光色素ｆは、図８に示すように、伸張された二本鎖核酸Ｗの一端に位置することになる。
【００７８】
なお、「誘電泳動」とは、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００７９】
例えば、核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、不均一電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)）。
【００８０】
この電界の作用によって、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲット核酸Ｙの蛍光色素ｆは、消光効果を発揮する検出表面Ｄから離れているため、該検出表面Ｄの影響を受けることなく、蛍光を発光することが可能となる。
【００８１】
一方、検出表面Ｄ、即ち電極Ｅ１上に非特異的に吸着したターゲット核酸Ｙａの蛍光色素ｆは、検出表面Ｄの消光効果により発光しなくなる。本発明では、この状態で蛍光発光強度を測定することにより、ハイブリダイゼーション検出を行う。
【００８２】
既述したように、検出表面Ｄ上を水溶液溶媒で満たすことによって、二本鎖核酸Ｗを溶液中に浮遊させて、蛍光色素ｆを検出表面Ｄから離なすことによって、検出対象の正規蛍光の消光を防ぐことができる。
【００８３】
しかし、二本鎖核酸Ｗの他端（固定されている側の逆側の末端）は、溶液中をブラウン運動等によって動くことができる状態であるため、場合によっては、検出表面Ｄに蛍光色素ｆが接近して、これを消光してしまう可能性も否定できない。
【００８４】
しかしながら、対向電極Ｅ１−Ｅ２を用いる本実施形態（図８参照）では、二本鎖核酸Ｗを、誘電泳動などの電気力学的効果によって強制的に伸張させておくことが可能となる。このため、二本鎖核酸Ｗを構成するターゲット核酸Ｙの蛍光色素Ｙを、消光効果を発揮する検出表面Ｄから強制的に離すことが可能となる。この結果、よりＳ／Ｎの高いハイブリダイズ信号が得られる。
【００８５】
図９は、対向電極Ｅ１−Ｅ２を備える検出部１において、ハイブリダイゼーションにより生成した二本鎖核酸Ｗに特異的に結合する蛍光インターカレーターＩを用いて、ハイブリダイゼーションを検出する例を示している。なお、電界印加の操作や作用効果は、図８に示した実施形態と同様であるので、説明を割愛する。
【００８６】
図８や図９で示す実施形態では、電界印加を利用することで、以下のような利点が得られる。まず、検出部１の反応領域Ｒ中に、ブラウン運動によりランダムに分散して存在しているターゲット核酸Ｙを、電界に沿った方向に伸張させ、直鎖状とすることができる。
【００８７】
さらに、電界の電気力学的作用によって、ターゲット核酸Ｙは、プローブ核酸Ｘが固定された検出表面Ｄ（電極Ｅ１）上へ電気泳動あるいは誘電泳動の効果によって集まり、ハイブリダイゼーション反応を効率よく進行させることもできる。
【００８８】
このように、電気泳動あるいは誘電泳動の効果を用いて、ターゲット核酸Ｙを短時間で検出表面Ｄ（電極Ｅ１）上へ移動させ、プローブ核酸Ｘ周辺領域におけるターゲット核酸Ｙの濃度を高めることにより、プローブ核酸Ｘとターゲット核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーション時間を短縮することができる。
【００８９】
さらには、核酸分子の電界による伸張効果により、立体障害によるハイブリダイゼーション反応の阻害およびミスハイブリダイゼーションを低減することが可能となる。
【００９０】
なお、電界による誘電泳動の効果をより効果的に得るために、図１０に示す変形形態のように、プローブ核酸Ｘを固定する側の電極Ｅ１（検出表面Ｄ）の表面積を、他方の電極Ｅ２の表面積よりもより狭小にして、電極Ｅ１（検出表面Ｄ）表面近傍に電界を集中させるように工夫してもよい。なお、図１０における符号ｅは、電界を模式的に示している。
【００９１】
ここで、プローブ核酸Ｘを固定する側の電極Ｅ１（検出表面Ｄ）に電界を集中させて、不均一電界を形成するための工夫として、図１１に示す変形形態のように、電極Ｅ１（検出表面Ｄ）に凹凸形状を形成してもよい。
【００９２】
この構成では、凸部Ｄａの角部、あるいは凹部Ｄｂの屈曲部などに、特に電界を集中させることができるので、電極Ｅ１（検出表面Ｄ）の近傍領域において、誘電泳動の作用や効果をより確実に利用できる。
【００９３】
図１２に示す別の変形形態では、一方の基板１６そのものを、ＳＵＳ（ステンレススチール）やＮｉなどの金属板、あるいは、ｎやｐが高ドープされた０．１Ωｃｍ程度以下のシリコン基板で作製し、電極Ｅ２として用いることも可能である。このように一方の基板１６を導電性の材料で作製することにより、高周波電源とのワイヤリングがどの部位でも可能となり、電極取り出し部の扱いが格段に容易になる。
【００９４】
このような構成では、他方の電極Ｅ１を、検出表面Ｄと別体で、ＩＴＯなどの透明電極で形成することによって、透明基板層１１の裏面側から蛍光励起光Ｐを照射することができる（図１２参照）。
【００９５】
また、本実施形態では、図１２に示されているように、金薄膜などからなる検出表面ＤをＩＴＯ電極Ｅ１に積層された絶縁膜１５上に形成することもできる。この場合では、透明基板層１１の裏面側から照射される蛍光励起光Ｐは、透明基板層１１、ＩＴＯ電極Ｅ１、絶縁膜１５、検出表面Ｄを順番に通過して、反応領域王Ｒへ入射されることになる。
【００９６】
よって、光透過率をできるだけ高くするために、検出表面Ｄを構成する金薄膜の厚みは、極力薄くしなければならない。例えば、金薄膜の厚みは、５〜１０ｎｍの厚みが好適である。この点、蛍光励起光Ｐなどを、検出表面Ｄを透過させる実施形態においては、すべて同様である。
【００９７】
なお、図１２に示す実施形態では、基板１６の表面１６１にも蛍光色素が吸着し、ノイズを増やす原因に成り得るため、該基板１６の表面１６１にも、表面プラズモンを励起する金属や合金によって薄膜を形成しておいてもよい。
【００９８】
以上の説明において、検出表面Ｄを形成する材料として、主に金を採り上げてきたが、本発明では、表面プラズモンを励起する金属あるいは合金であれば、適宜採用できる。また、局在プラズモンを励起する金属粒子からなる金属層あるいは合金層、もしくは、局在プラズモンを励起する突起を有する金属膜あるいは合金膜からなる金属あるいは合金でもよい。検出表面Ｄを形成する材料としては、金、銀、酸化銀等が、その代表例である。
【００９９】
蛍光色素についても、例示したＣｙ３やSYBR GreenＩに限定されない。また、上記説明した各実施形態における反応領域Ｒは、目的のアッセイに適切なサイズや形状を選択すればよい。さらに、図８〜図１２に示す実施形態においては、電界強度、周波数、サイン波や三角波などの波形について特に限定されず、これらは、分子種、核酸分子等の長さなどによって、目的に応じて選定すればよい。
【０１００】
以上説明した検出部１を利用する相互作用検出装置Ｕの構成について、図１３に基づいて、以下説明する。なお、この図１３に示された検出部１は、代表例としての扱いで図１２に相当する検出部を示しているが、本装置Ｕを適用できる検出部は、これに限定されない。
【０１０１】
本装置Ｕは、検出部１に設けられた反応領域Ｒに向けて、蛍光励起光Ｐを照射する光照射手段を備える。光照射手段は、例えば、符号Ｔで示されたレーザダイオードなどのレーザ出射装置を利用できる。なお、光照射手段は、蛍光励起光Ｐを出射する役割を担うもの以外に、検出部１の位置を検出ときに用いるトラッキングサーボ光を出射するものなどを、他に設けておいてもよい。
【０１０２】
また、本装置Ｕは、反応領域Ｒから戻ってくる、励起された蛍光Ｆを受光して検出する蛍光検出手段（例えば、光ディテクタ）Ｚと、蛍光検出手段Ｚで検出された蛍光シグナルに基づいて、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の状態を解析する手段（例えば、コンピュータ）Ｑと、を備えている。
【０１０３】
なお、図１３中に示された符号Ｌ１は、蛍光励起光Ｐを絞り込んだり、蛍光Ｆを平行光に変換したりするためのレンズ、符号Ｌ２は、蛍光Ｆを蛍光検出手段（例えば、光ディテクタ）Ｚに向けて絞り込むためのレンズを示している。基板裏面近傍に配置されるレンズＬ１は、図示しないアクチュエーターによって保持し、スライド移動可能とする。
【０１０４】
また、本装置Ｕは、検出部１に対向電極Ｅ１−Ｅ２が設けられている実施形態（図１３参照）では、上記各手段Ｔ、Ｚ、Ｑに加えて、前記対向電極Ｅ１−Ｅ２に通電して、前記反応領域に電界を印加する電界印加手段Ｇを備えている。なお、電界印加手段Ｇは、電源Ｇと、スイッチＳ、さらに対向電極Ｅ１−Ｅ２に導通する給電線などから構成されている。
【０１０５】
その他、基板に多数配設された検出部１の位置を検出するためのトラッキングサーボ機構（基板に形成されたアドレスピットを用いる）やフォーカシング機構を備え、また、図４に示すような円盤状のバイオアッセイ用基板１００を用いる場合は、該基板１００を保持し、さらにこれを回転させる手段を設ける。また、本装置Ｕに、プローブ分子Ｘやターゲット分子Ｙなどのサンプルを滴下等する手段（例えば、インクジェットプリンティング装置群）を一体化してもよい。
【０１０６】
以上の検出部１、基板１００、あるいは装置Ｕを用いることによって、プローブ分子Ｘとターゲット分子Ｙとの間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する方法において、前記相互作用を、表面プラズモンを励起する金属又は合金から形成された検出表面Ｄに臨む反応領域Ｒで進行させ、かつ、該検出表面Ｄに非特異的に吸着した蛍光物質ｆ（又は蛍光インタカレーターＩ）から発せられる蛍光を、前記表面プラズモンの作用により消光できるので、これにより、ノイズ蛍光低減をしながら、高精度の相互作用検出を実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、プローブ分子とターゲット分子との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する技術に利用できる。特に、前記技術において、ノイズ蛍光を、効率よく短時間で、消失させ、Ｓ／Ｎを向上させる技術として利用できる。また、従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程を行わなくてもよい相互作用検出技術、即ち、洗浄フリーの相互作用検出技術としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】プローブ分子（Ｘ）とターゲット分子（Ｙ）との間の特異的又は相補的な相互作用を蛍光物質からの蛍光シグナルに基づいて検出する技術の一例に係わる概念を説明するための図である。
【図２】同技術の別の例（蛍光インターカレーターを用いる例）に係わる概念を説明するための図である。
【図３】本発明に係る相互作用検出部（１）の最も基本的な実施形態の一例を示す要部断面図である。
【図４】本発明に係るバイオアッセイ用基板（１００）の好適な一実施形態の外観を示す図である。
【図５】ターゲット核酸（Ｙ）に蛍光色素（ｆ）を標識して行う場合の検出部１における検出表面（Ｄ）領域を拡大して示す図である。
【図６】実施例の結果を示す図面代用グラフである。
【図７】ハイブリダイゼーション検出に蛍光インターカーレーター（Ｉ）を利用する実施形態を示す図である。
【図８】本発明に係る検出部（１）の他の実施形態（対向電極を用いる実施形態）を示す図である。
【図９】対向電極（Ｅ１−Ｅ２）を備える検出部（１）で、ハイブリダイゼーションにより生成した二本鎖核酸（Ｗ）に特異的に結合する蛍光インターカレーター（Ｉ）を用いて、ハイブリダイゼーションを検出する実施形態を示す図である。
【図１０】対向電極の一方の表面積をより狭小にした実施形態を示す図である。
【図１１】電極（Ｅ１）として機能する検出表面（Ｄ）が凹凸形状を有するように形成された実施形態を説明するための図である。
【図１２】検出表面（Ｄ）が積層された基板層（１１）にＩＴＯ電極が形成された実施形態を示す図である。
【図１３】本発明に係る検出部１を利用する相互作用検出装置Ｕの構成を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１０９】
１  相互作用検出部
Ｄ  検出表面
Ｆ  蛍光
ｆ  蛍光色素
Ｉ  蛍光インターカレーター
Ｍ  水溶液溶媒
Ｐ  検出用の蛍光励起光
Ｒ  反応領域
Ｕ  相互作用検出装置
Ｗ  二本鎖核酸
Ｘ  プローブ分子（その一種であるプローブ核酸分子）
Ｙ  ターゲット分子（その一種であるターゲット核酸分子）
Ｙａ  検出表面に吸着したターゲット核酸分子
Ｚ  蛍光検出手段
【図１】
2006177725.tif 000003
【図２】
2006177725.tif 000004
【図３】
2006177725.tif 000005
【図４】
2006177725.tif 000006
【図５】
2006177725.tif 000007
【図６】
2006177725.tif 000008
【図７】
2006177725.tif 000009
【図８】
2006177725.tif 000010
【図９】
2006177725.tif 000011
【図１０】
2006177725.tif 000012
【図１１】
2006177725.tif 000013
【図１２】
2006177725.tif 000014
【図１３】
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