(57)【要約】【課題】  健常者の組織から取得した正常細胞に代えて、正常細胞に対して行ったのと同等のスクリーニング結果を得る。【解決手段】  体液から分離した幹細胞を、所定の培養条件下で培養して分化させた生体組織細胞を含み、化合物を複数収容可能な基板を作成するステップＳＴＥＰ１と、該基板内に化合物を投入して、基板内の生体組織細胞と相互作用するように接触させるステップＳＴＥＰ２と、基板内において生体組織細胞と相互作用させられた化合物の活性を検出するステップＳＴＥＰ３とを含む創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法を提供する。【選択図】    図１
2006081432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液から分離した幹細胞を、所定の培養条件下で培養して分化させた生体組織細胞を含み、化合物を複数収容可能な基板を作成するステップと、
該基板内に化合物を投入して、基板内の生体組織細胞と相互作用するように接触させるステップと、
基板内において生体組織細胞と相互作用させられた化合物の活性を検出するステップとを含む創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法。
【請求項２】
人体から採取した体液を、自動培養装置に投入し、自動培養装置から得られた生体組織細胞を用いて前記基板を作成する請求項１に記載の創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法。
【請求項３】
体液から分離した幹細胞を、所定の培養条件下で培養して分化させた生体組織細胞を含み、化合物を複数収容可能な基板を作成するステップと、
該基板内に化合物を投入して、基板内の生体組織細胞と相互作用するように接触させるステップと、
基板内において生体組織細胞と相互作用させられた化合物の活性を検出するステップとを含む創薬スクリーニング方法。
【請求項４】
人体から採取した体液を、自動培養装置に投入し、自動培養装置から得られた生体組織細胞を用いて前記基板を作成する請求項３に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項５】
前記生体組織細胞が骨芽細胞である請求項１または請求項２に記載の生体組織細胞の使用方法。
【請求項６】
前記生体組織細胞が骨芽細胞である請求項３または請求項４に記載の創薬スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法および創薬スクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、化合物をいわゆるランダムスクリーニングすることにより新しい薬効を見いだす方法があり、このランダムスクリーニングを極めて効率的に実施するために、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ：High Through-put Screening）技術が採用されている（例えば、特許文献１参照）。ＨＴＳは、高度にシステム化した方法で短期間に多数（例えば、数万〜数１０万種類）の化合物を生化学的に評価して、新規なリード化合物を迅速に発見することができるという利点を有している。
【０００３】
ここで、リード化合物とは、本格的に合成展開して化合物の最適化を実施する元となる化合物であり、スクリーニングによって目的の薬効に対して確かに活性があると認められたヒット化合物の中から、非特異的な活性、物性、毒性や合成展開性等様々な観点で選ばれた化合物である。独創的な新薬を生み出すための創薬スクリーニングにおいては、リード化合物を発見できる可能性は極めて低く、このような場合に短期間に多数の化合物を評価できるＨＴＳの果たす役割は大きい。
【０００４】
創薬スクリーニングにおいては、第１段階のスクリーニングとして、セルベースドアッセイ系が実施される。セルベースドアッセイ系は、細胞と複数の化合物とを相互作用させることにより活性を示す化合物を発見するステージである。しかしながら、上述したように、ＨＴＳにおいては、多数の化合物について活性の評価を行うため、セルベースドアッセイ系において、これらの化合物と相互作用させる細胞としても非常に多くの細胞が必要とされる。
従来、細胞として株化された細胞であるセルラインが使用されていた。
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５０３２４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、セルラインは正常細胞とは異なるため、セルベースドアッセイ系においてセルラインを使用すると、スクリーニングにより得られる結果が正常細胞の場合と異なる可能性が高く、正確なスクリーニングを行うことができないという問題がある。
本来であれば、セルベースドアッセイ系において使用される細胞は、健常者の組織から取得した正常細胞であることが望ましいが、健常者から多量の細胞を取得することは困難である。特に、骨芽細胞等の生体組織細胞は、健常者の組織内に存在する量も非常に少なく、その取得は極めて困難である。
【０００７】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、健常者の組織から取得した正常細胞に代えて、正常細胞に対して行ったのと同等のスクリーニング結果を得ることができる創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法および創薬スクリーニング方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、体液から分離した幹細胞を、所定の培養条件下で培養して分化させた生体組織細胞を含み、化合物を複数収容可能な基板を作成するステップと、該基板内に化合物を投入して、基板内の生体組織細胞と相互作用するように接触させるステップと、基板内において生体組織細胞と相互作用させられた化合物の活性を検出するステップとを含む創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法および創薬スクリーニング方法を提供する。
【０００９】
この発明によれば、体液から分離した幹細胞から培養して分化させた生体組織細胞を用いてセルベースドアッセイ系の基板を作成するので、スクリーニングに必要な多量の基板を作成できる。また、健常者の組織から取得した正常細胞と同等の生物学的特性を有する生体組織細胞により、健常者の正常細胞に対して行ったのと同様のスクリーニング結果を得ることができる。
【００１０】
上記発明においては、人体から採取した体液を、自動培養装置に投入し、自動培養装置から得られた生体組織細胞を用いて前記基板を作成することとしてもよい。
自動培養装置に、幹細胞を投入して、生体組織細胞を自動的に得ることができるので、さらに高速で、スループットの高い創薬スクリーニングを実施することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、人体内に微量に存在する生体組織細胞を直接採取するのではなく、体液、例えば、骨髄液に含まれる幹細胞を培養、分化させて得られた生体組織細胞を用いて基板を作成するので、創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における十分な量の基板を作成でき、しかも、健常者の組織から直接採取した生体組織細胞に対するスクリーニング結果と同等のスクリーニング結果を得ることができる。したがって、候補化合物の薬効を正確に評価することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の一実施形態に係る創薬スクリーニングのセルベースドアッセイ系における生体組織細胞の使用方法および創薬スクリーニング方法について、図１〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る創薬スクリーニング方法は、セルベースドアッセイ系におけるスクリーニング方法であって、図１に示されるように、基板作成ステップＳＴＥＰ１と、反応ステップＳＴＥＰ２と、検出ステップＳＴＥＰ３とを備えている。
【００１３】
基板作成ステップＳＴＥＰ１は、体液、例えば骨髄液から分離した幹細胞、例えば間葉系幹細胞を、所定の培養条件下で培養して分化させた生体組織細胞、例えば骨芽細胞を、例えば、マイクロプレートの各ウェルに滴下することにより基板を作成するようになっている。
反応ステップＳＴＥＰ２は、マザープレートに配置した多数種の化合物溶液を希釈して作成したドータープレートから化合物の希釈溶液を前記基板に添加し、マイクロプレートの各ウェル内に配置されている骨芽細胞と相互作用させるようになっている。
検出ステップＳＴＥＰ３は、各ウェル内においてそれぞれ骨芽細胞と相互作用させられた化合物が、骨芽細胞に対して活性を示したか否かを判定するようになっている。
【００１４】
前記基板作成ステップＳＴＥＰ１においてはマイクロプレートの各ウェルに滴下される骨芽細胞は、自動培養装置１により製造される。すなわち、図２に示されるように、人体から採取した骨髄液と培地とを自動培養装置１に供給し、骨芽細胞（生体組織細胞）を出力として得る。なお、自動培養装置１から骨芽細胞が各ウェルに滴下されたマイクロプレート５０を出力してもよい。
【００１５】
以下、自動培養装置１について説明する。
自動培養装置１は、図３に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ２を介して相互に連絡する第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２とを備えている。
第１空間Ｓ１の両側空間Ｓ１１，Ｓ１３には、培養容器３を収容する培養室４が２個ずつ計４個配置され、中央空間Ｓ１２には、培養容器３を移動するための搬送ロボット（搬送機構）５が備えられている。中央空間Ｓ１２の上部には、中央空間Ｓ１２内の空気を浄化するために清浄な下降空気流を送る空気清浄部６が設けられている。
４個の培養室４は、それぞれ中央空間Ｓ１２に向けて扉４ａを配置することにより、横に並んだ２個ずつが相互に扉４ａを対向させて、間隔をあけて配置されている。
【００１６】
前記各培養室４は、図４および図５に示されるように、一側面に開口部４ｂを有し、該開口部４ｂを開閉可能な扉４ａを備えている。開口部４ｂに向かって左右の側壁には、対応する高さ位置に複数のレール状のトレイ保持部材４ｃが設けられており、左右対となる各トレイ保持部材４ｃに掛け渡すようにして、トレイ７を上下方向に複数段収容できるようになっている。各培養室４内は、所定の培養条件、例えば、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ２濃度５％等に維持されている。なお、トレイ保持部材４ｃはレール状に限定されず、トレイ７を出し入れ可能に支持することができれば任意の形態でよい。
【００１７】
各トレイ７には、複数個、例えば、１０個の培養容器３を並べて載置できるようになっている。各培養容器３は、図６に示されるように、容器本体３ａと、該容器本体３ａの上面に設けられた蓋体３ｂとからなり、容器本体３ａの左右の側面には、後述する第２空間内のハンドにより引っかけられる突起３ｃが設けられている。
【００１８】
各培養室４の下方には、図３に示されるように、未使用の培養容器３をトレイ７に搭載した状態で複数収容するストッカ８が配置されている。ストッカ８は、前記培養室４の扉とは反対側の第１空間Ｓ１の外部に向かう側面に開閉可能なドアを有している。該ドアは、ストッカ８の一側面全体を開放する大きさに形成されている。
【００１９】
前記搬送ロボット５は、４個の培養室４の間隔位置のほぼ中央に配置されている。該搬送ロボット５は、水平回転可能な第１アーム５ａと、該第１アーム５ａの先端に鉛直軸回りに回転可能に連結された第２アーム５ｂと、該第２アーム５ｂの先端に鉛直軸回りに回転可能に取り付けられ、それ自身は駆動部、伝導機構などの培養室内の環境を劣化させる機構を持たないハンド５ｃと、これら第１アーム５ａ、第２アーム５ｂおよびハンド５ｃを昇降可能な昇降機構５ｄとを備えている。これにより、搬送ロボット５は、４個の培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記シャッタ２を跨いで第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２との間に配置されたコンベア９上にトレイ７を引き渡すことができる水平方向の動作範囲を有している。
【００２０】
前記コンベア９は、搬送ロボット５のハンド５ｃの幅寸法より大きな間隔をあけて左右に配置された２本の無端ベルト９ａを備え、これら無端ベルト９ａに掛け渡してトレイ７を載置できるようになっている。また、搬送ロボット５は、培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記ストッカ８内の少なくとも最上段のトレイ７にアクセスできる垂直方向の動作範囲を有している。
なお、ベルト９ａは無端ベルトに限られない。
【００２１】
前記ハンド５ｃは、トレイ７を載置可能に水平方向に伸びる平坦な形状に形成されており、培養室４に収容されているトレイ７間の隙間に挿入可能な厚さ寸法に形成されている。そして、ハンド５ｃは、トレイ７間の隙間に挿入された状態から上昇させられることにより、２本の腕によってトレイ７を下方から押し上げてトレイ保持部材４ｃから取り上げるとともに、トレイ７を安定して保持できるようになっている。
【００２２】
前記第２空間Ｓ２には、培養処理装置３０が構成されている。この培養処理装置３０は、シャッタ２が開かれた状態で第１空間Ｓ１からコンベア９によって搬送されてきたトレイ７上の培養容器３に対し細胞を供給し、あるいは、培地を供給、回収する給排ロボット１０と、培養容器３内の培地から細胞を分離する遠心分離機（処理装置）１１と、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット１２を備えた水平回転および昇降移動可能な４台の分注ロボット１３と、これら給排ロボット１０および分注ロボット１３の電動ピペット１２先端に取り付ける使い捨て可能なチップ１４を複数収容していて給排ロボット１０および分注ロボット１３の動作範囲内に提供可能な３台のチップ供給装置（処理装置）１５と、使用済みのチップ１４を廃棄回収するチップ回収部３１と、血清や試薬等の種々の液体を複数の容器に貯留する試薬等供給装置（処理装置）１６と、培養容器３内における細胞の様子を観察可能な顕微鏡（処理装置）１７と、各試薬および培地交換等により廃棄される廃液をそれぞれ貯留する複数の貯留タンク１８と、前記コンベア９と各ロボット１０，１３との間で培養容器３を受け渡し可能とするように培養容器３を移動させる水平移動機構（処理装置）１９と、該水平移動機構１９のスライダ２０に取り付けられ、受け取った培養容器３を載置する載置台２１とを備えている。
なお、第２空間Ｓ２にも、該第２空間Ｓ２内の空気を浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機３２が設けられている。
【００２３】
前記第２空間Ｓ２に構成された培養処理装置３０は、その高さ方向の中間位置に配され第２空間Ｓ２内を上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに上下に区画する第１の区画壁３３と、該第１の区画壁３３により形成された下部空間Ｓ２２内をさらに上下に区画する第２の区隔壁（下部区画壁）３４とにより、上下方向に並ぶ３つの空間Ｓ２１，Ｓ２２１，Ｓ２２２に区画されている。第１の区画壁３３は、前記コンベア９の高さに配置され、その上方の上部空間Ｓ２１内に、載置台２１、給排ロボット１０、分注ロボット１３のアーム１３ａ、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以上の機構部等を配置している。これらの装置は、培養容器３の移動に必要な装置、および培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な装置だからである。なお、試薬等供給装置１６の上面も第１の区画壁３３の上面に露出しているが、これはチップ１４の挿入口１６ｃを上部空間Ｓ２１に開口させるためである。
【００２４】
また、第１の区画壁３３には、載置台２１を上部空間Ｓ２１において移動させるために、載置台２１を下部空間Ｓ２１内の水平移動機構１９に連結するための長孔３５、第１の区画壁３３の下方の空間Ｓ２２１に配置されたチップ供給装置１５からチップ１４を取り出すための貫通孔３６、使用済みのチップ１４を廃棄するための廃棄口３７が貫通形成されている。さらに、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口３８が設けられている（斜線部）。
【００２５】
第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間の空間Ｓ２２１には、図７に示されるように、分注ロボット１３の本体部分、チップ供給装置１５、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以下の部分、水平移動機構１９および、チップ回収部３１の廃棄口３７と廃棄容器３９とを接続するダクト４０が備えられている。前記ダクト４０は、図９に示されるように、例えば、その上端にフランジ部４０ａを備える構造とされ、第１の区画壁３３の下部に設けたフック４４に引っかけることで、第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間に着脱可能に設ければよい。第２の区画壁３４の側壁３０ａ，３０ｂ近傍には、該側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口４３が設けられている（斜線部）。
【００２６】
さらに、第２の区画壁３４の下方の空間Ｓ２２２には、図８に示されるように、遠心分離機１１、貯留タンク１８、廃棄容器３９、および排気ファン４１が配置されている。排気ファン４１の出口にはＨＥＰＡフィルタのようなフィルタ４２が設けられ、排気される空気を清浄にするようになっている。貯留タンク１８は、図示しない配管によって前記給排ロボット１０に接続されており、一方の貯留タンク１８に貯留している培地構成液を給排ロボット１０に供給する一方、他方の貯留タンク１８には、培養容器３内から吸引された使用済みの廃培地を配管を通して廃棄するようになっている。
【００２７】
前記給排ロボット１０は、水平多関節型ロボットであって、例えば、図４に示す例では、蓋体３ｂが開かれた培養容器３の上部開口から培地を供給あるいは吸引する電動ピペット１０ａおよび前記遠心分離機１１により分離された細胞を吸引して培養容器３内に注入する電動ピペット１０ｂを備えたヘッド１０ｃと、水平旋回可能な２つのアーム１０ｄ，１０ｅと、アーム１０ｅの先端に設けられヘッド１０ｃを昇降させる昇降機構１０ｆとを備えている。符号１０ｇは、貯留タンク１８から培地を導き、あるいは、他の貯留タンク１８内へ培地を廃液として排出するダクトである。
【００２８】
給排ロボット１０は、電動ピペット１０ｂ先端にチップ供給装置１５から供給されたチップ１４を装着して、遠心分離機１１により分離された細胞を吸引し、載置台２１上に搭載された培養容器３内に上部開口から供給するようになっている。また、電動ピペット１０ａ先端にチップ供給装置１５から供給された他のチップ１４を装着して、載置台２１上に搭載された培養容器３内に培地を供給し、あるいは、培養容器３内から培地あるいは細胞入りの培地を吸引するようになっている。一旦使用された使用済みのチップ１４は、チップ回収部３１において取り外され回収されるようになっている。したがって、給排ロボット１０は、載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および遠心分離機１１からの細胞供給装置（図示略）等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
【００２９】
前記遠心分離機１１は、給排ロボット１０から供給された細胞入り培地を低速回転させることにより培地内に浮遊していた比重の重い細胞を培地から分離して沈下させるようになっている。
【００３０】
前記分注ロボット１３は、それぞれ、先端にチップ１４を着脱可能に取り付ける電動ピペット１２を備えた水平回転可能なアーム１３ａと、該アーム１３ａを昇降させる昇降機構１３ｂとを備えている。分注ロボット１３は、水平移動機構１９によって搬送されて来た培養容器３内へ、培地や種々の試薬を供給するようになっている。したがって、分注ロボット１３は、水平移動機構１９上の載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および試薬等供給装置１６等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
【００３１】
前記チップ供給装置１５は、上方に開口した容器１５ａ内に、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２への取付口を上向きにして複数のチップ１４を配列状態に収容しており、給排ロボット１０や分注ロボット１３が、新たなチップ１４を必要とするときに、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を上方から挿入するだけで、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の先端にチップ１４を取り付けるように構成されている。容器１５ａは、給排ロボット１０や分注ロボット１３による電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の移動方向に対して交差する方向に往復移動させられるように移動機構１５ｂに取り付けられている。また、分注ロボット１３にチップ１４を供給するチップ供給装置１５には、移動機構１５ｂによる移
動方向とは直交する方向に容器１５ａを移動させる他の移動機構１５ｃが備えられている。これにより、容器１５ａ内の全てのチップ１４に対して電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２がアクセスすることができるようになっている。
【００３２】
前記チップ回収部３１は、廃棄容器３９の入口に、チップ１４を把持する把持装置（図示略）を備えていて、給排ロボット１０や分注ロボット１３において使用されたチップ１４が把持装置に挿入されると、これを把持するようになっている。そして、この状態で給排ロボット１０や分注ロボット１３が電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を移動させることにより、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２先端から使用済みチップ１４が取り外され、廃棄容器３９内にダクト４０を介して回収されるようになっている。廃棄容器３９は、空間Ｓ２２２内に着脱可能に配置されており、必要に応じて交換可能となっている。
前記ダクト４０および廃棄容器３９の交換時には、培養処理装置３０の側壁３０ａ，３０ｂに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置３０の外部からアクセスすることとすればよい。
【００３３】
前記試薬等供給装置１６は、例えば、図７に示されるように、円筒状のケーシング内部に、水平回転可能なテーブル１６ａを収容し、該テーブル１６ａ上に、扇型の底面形状を有する筒状の試薬等容器１６ｂを周方向に複数配列して搭載している。ケーシング内部は一定の温度に保冷されている。各試薬等容器１６ｂには、種々の試薬等が貯留されている。例えば、細胞を培養するために必要な培地を構成するＭＥＭ(Minimal Essential
Mediu
m：最小必須培地)、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）、ＦＢＳ（Fetal Bo
vine
Serum：ウシ胎児血清）やヒト血清のような血清、培養容器３内の細胞を剥離させるトリプシンのような蛋白質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。
【００３４】
試薬等供給装置１６のケーシングの上面には、分注ロボット１３が電動ピペット１２先端のチップ１４を挿入する挿入口１６ｃが設けられている。この挿入口１６ｃは、前記分注ロボット１３の動作範囲内に配置されている。また、各試薬等容器１６ｂは、その上面に、前記挿入口１６ｃに一致する位置に配置される開口部（図示略）を備えている。これにより、テーブル１６ａを回転させて試薬等容器１６ｂの開口部をケーシングの挿入口１６ｃの鉛直下方に配置することで、分注ロボット１３が、電動ピペット１２先端のチップ１４を上方から試薬等容器１６ｂ内へ挿入して、内部に貯留されている試薬等を吸引することができるようになっている。試薬等供給装置１６を２台設けているのは、検体に共通のトリプシンのような薬液と、検体に固有の血清のような液体とを分離して取り扱うようにしているためである。
【００３５】
前記顕微鏡１７は、培養工程の途中、あるいは、培地交換の際に、培養容器３内の細胞の様子や増殖の程度を観察したり、細胞数を計数したりする場合等に使用されるようになっている。顕微鏡１７のＸＹステージ１７ａや作動距離調整、倍率の変更等は全て遠隔操作により行うことができるように構成されている。第２空間Ｓ２の外方に向けて接眼レンズを配置しておくことにより、自動培養装置１の外部から培養容器３内の細胞の状態を観察できるようにしてもよい。
【００３６】
前記貯留タンク１８は、例えば、全ての検体に共通して使用できるＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等を貯留しておき、必要に応じて試薬等供給装置１６内の試薬等容器１６ｂ内に供給するようになっている。また、貯留タンク１８には、廃液タンクとして、
培地交換の際に排出される廃培地等を貯留するものもある。
【００３７】
前記水平移動機構１９は、直線移動機構により水平方向に移動可能なスライダ２０を備えている。スライダ２０上には前記載置台２１が搭載されており、載置台２１に搭載された培養容器３を、コンベア９から分注ロボット１３の動作範囲まで移動させることができるようになっている。
【００３８】
前記載置台２１は、コンベア９上のトレイ７内から移載された培養容器３を搭載して保持する保持機構（図示略）を備える。また、該培養容器３に振動を付与する加振装置（図示略）を備えていてもよい。加振装置は、例えば、培養容器３を所定の角度範囲で往復揺動させる装置の他、超音波振動を加える装置や、水平方向の振動を加える装置を採用してもよい。
自動培養装置１の各種装置には、図示しない制御装置が接続されている。制御装置は、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、動作履歴等を記録保存するようになっている。
【００３９】
このように構成された培養処理装置３０および自動培養装置１の作用について、以下に説明する。
自動培養装置１を用いて、骨髄間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液を遠心分離容器（図示略）に入れた状態で遠心分離機１１に投入する。この工程は、作業者が行ってもよく、また、給排ロボット１０に行わせてもよい。これにより、遠心分離機１１の作動により、骨髄液中から比重の重い骨髄細胞が集められる。
【００４０】
集められた骨髄細胞は、給排ロボット１０により、培養容器３に投入される。このとき、コンベア９の作動により、トレイ７に載せた１０個の空の培養容器３が、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２に差し出されている。トレイ７上の培養容器３の内の２個の培養容器３が、図示しない移載装置の作動により、載置台２１上に載置される。そして、図示しない蓋体開閉装置の作動により、載置台２１上の培養容器３の蓋体３ｂが開けられる。
【００４１】
チップ供給装置１５が移動機構１５ｂを作動させることにより、未使用のチップ１４を給排ロボット１０の動作範囲内に配すると、給排ロボット１０は、昇降機構１０ｆを作動させることにより、ヘッド１０ｃを下降させて、第１の区画壁３３下方のチップ供給装置１５から未使用のチップ１４を受け取り、電動ピペット１０ａの先端に取り付ける。
この状態で、給排ロボット１０を作動させて、電動ピペット１０ａ先端のチップ１４を遠心分離機１１内に集められた骨髄細胞懸濁液に接触させる。そして、電動ピペット１０ａを作動させることにより、チップ１４内に骨髄細胞を吸引する。吸引された骨髄細胞は給排ロボット１０を作動させることにより、載置台２１上の培養容器３内に上部開口から投入される。
【００４２】
骨髄細胞を培養容器３内に投入し終わると、給排ロボット１０は、第１の区画壁３３に形成された廃棄口３７にチップ１４を挿入して取り外し、チップ回収部３１に回収させる。廃棄口３７において取り外されたチップ１４は、ダクト４０を介して、最下位の空間Ｓ２２２に配置されている廃棄容器内に投入される。
【００４３】
この状態で、給排ロボット１０は、昇降機構１０ｆを作動させることにより、ヘッド１０ｃを下降させて、第１の区画壁３３下方のチップ供給装置１５から未使用のチップ１４を受け取り、電動ピペット１０ｂの先端に取り付ける。この状態で、給排ロボット１０を作動させて、電動ピペット１０ｂ先端のチップ１４を介して、貯留タンク１８に貯留されているＤＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）を培養容器３内に供給する。
【００４４】
次に、骨髄細胞が投入された培養容器３は、水平移動機構１９を作動させることにより、載置台２１ごと水平移動させられ、各分注ロボット１３の動作範囲内に配置される。分注ロボット１３は、チップ供給装置１５から受け取った未使用のチップ１４を先端に取り付けた電動ピペット１２を作動させることにより、試薬等供給装置１６の試薬等容器１６ｂ内からＤＭＥＭや血清、あるいは各種試薬を適量吸引した後に、培養容器３の上方まで搬送して培養容器３内に注入する。血清や各試薬の吸引は、各試薬等の吸引毎にチップ供給装置１５から未使用のチップ１４に交換して行われる。これにより、培養容器３内においては、適正な培地内に骨髄細胞が混合された状態で存在することになる。なお、培地内において骨髄細胞を均一に分布させるために、載置台２１を作動させて、培養容器３ごと加振することにしてもよい。
【００４５】
そして、全ての処理を終えた培養容器３は水平移動機構１９の作動により、コンベア９の近傍まで移動させられ、そこで、再度、蓋体開閉装置および移載装置の作動により、蓋体３ｂにより上部開口を閉じられた状態で、トレイ７に戻される。
トレイ７上の全ての培養容器３に対して所定の処理が行われた後に、コンベア９を作動させることにより、トレイ７に載せられた培養容器３が第２空間Ｓ２から第１空間Ｓ１の中央空間Ｓ１２内に挿入される。
【００４６】
この状態で、搬送ロボット５を作動させることにより、ハンド５ｃによってトレイ７を持ち上げる。そして、トレイ７を収容する培養室４の前まで搬送したところで、当該培養室４の扉４ａを開き、搬送ロボット５によって、空いているトレイ保持部材４ｃ上にトレイ７を挿入する。そして、再度、扉４ａを閉じることにより、培養室４内の培養条件を一定に保持して細胞の培養が行われることになる。なお、骨髄細胞投入や、ＤＭＥＭ、血清、各種試薬の投入や吸引の順序は適宜変更してもよいのは言うまでもない。
【００４７】
また、培地交換や容器交換の際にも、上記と同様にして、培養室４外に配置されている搬送ロボット５の作動により、培養室４内の培養容器３がトレイ７ごと取り出され、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２へ受け渡される。第２空間Ｓ２では、培養容器３内にトリプシンが注入されて、培養容器３内の細胞が剥離させられた状態で、給排ロボット１０の作動によって遠心分離機１１内に投入され、間葉系幹細胞等の必要なもののみが集められる。その他の処理工程は上記と同様である。
【００４８】
そして、複数回の培地交換や容器交換を介した所定期間にわたる培養工程を行うことにより、間葉系幹細胞が十分な細胞数まで増殖させられることになる。十分な細胞数に達したか否かは、給排ロボット１０の作動により、間葉系幹細胞が底面に付着した培養容器３を顕微鏡１７まで搬送することにより、観察あるいは測定され、細胞の増殖の程度が判断される。なお、トレイ７上には、同一検体の培養容器３が載置されていてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。また、載置台２１上には同一検体の培養容器３が載置されてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。
【００４９】
このようにして、自動培養装置１により、患者から採取した骨髄液から十分な細胞数の間葉系幹細胞を自動的に培養することが可能となる。なお、十分な間葉系幹細胞が得られた後には、培養容器３内にデキサメタゾンのような分化誘導因子を投入して、再度培養工程を継続することにより、培養された間葉系幹細胞を分化させた骨芽細胞を得ることができる。なお、培養容器３内にリン酸カルシウムのような生体組織補填材を入れておいてもよい。
【００５０】
この自動培養装置１によれば、培養室４内に、培養容器３を取り出すための機構部が存在しない。すなわち、培養室４内には、トレイ７を載置した状態に支持するトレイ保持部材４ｃが設けられているのみであり、培養容器３を取り出すための機構部は全て培養室４外に配置された搬送ロボット５に集約されている。そして、搬送ロボット５は、トレイ７の出し入れ作業が行われた後には、培養室４の扉４ａの外側に完全に退避することができるようになっている。
【００５１】
したがって、扉４ａが閉じられた状態では、培養室４内に機構部が存在せず、機構部の作動によって発生するような塵埃の発生は全く存在しない。また、培養室４内は、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ２濃度５％等に維持されるが、機構部が存在しないために、このような環境下においても、腐食等の問題が生ずることがない。また、扉４ａが開かれた状態においても、培養室４内に挿入されるのは搬送ロボット５のハンド５ｃ先端のみであり、実質的に回転機構や摺動機構が培養室４内に入ることはない。したがって、培養室４内への塵埃の侵入が抑制され、培養室４内部の清浄度を高めることができる。
なお、培養室４はＣＯ２インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。
【００５２】
また、培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、培養処理装置３０の第２空間Ｓ２内が、第１の区画壁３３により上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに区画されている。さらに、上部空間Ｓ２１には清浄な下降気流を発生させる空気清浄機３２が設けられている。そして、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂ近傍に通気口３８が設けられている。第１の区画壁３３には、通気口３８の他に種々の装置を貫通させるための貫通孔３６，３７等が形成されているが、通気口３８の流通断面積を他の貫通孔３６，３７等の流通断面積より十分に大きく確保しておくことにより、気流を通気口３８に通過させることが可能となる。
【００５３】
したがって、上部空間Ｓ２１内を下降してきた清浄な気流は、第１の区画壁３３の近くで側壁３０ａ，３０ｂの方向に向かい、通気口３８を介して下部空間Ｓ２２へと流通させられる。その結果、上部空間Ｓ２１内に浮遊していた塵埃を下方に向かって押し流してきた気流が、上部空間Ｓ２１の側壁３０ａ，３０ｂ近傍の角部に滞留することがなく、スムーズに下部空間Ｓ２２へ流通させられることになる。
【００５４】
さらに、培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、蓋体３ｂを開かれた状態の培養容器３が移動させられる上部空間Ｓ２１には、培養容器３の移動に必要な載置台２１、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ、培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な給排ロボット１０、分注ロボット１３の電動ピペット１２、顕微鏡１７の光源部分等のみが配置され、その他の機構部は下部空間Ｓ２２に配置されている。したがって、上部空間Ｓ２１における塵埃の発生が最小限に抑えられ、培養容器３内への塵埃の混入の可能性が低減されることになる。
【００５５】
また、特に、塵埃を発生する可能性の高い装置、例えば、遠心分離機１１、廃棄容器３９、排気ファン４１等は、下部空間Ｓ２２の内、さらに第２の区画壁３４によって区画された最下位の空間Ｓ２２２内に配置されているので、そこで発生した塵埃が上部空間Ｓ２１に流入することはない。さらに、空間Ｓ２２２内の空気は排気ファン４１によって吸引され、ＨＥＰＡフィルタ４２によって塵埃を除去された後に培養処理装置３０の外部に放出される。したがって、上部空間Ｓ２１の清浄度は、極めて高い清浄度に維持されることになる。
【００５６】
また、第２の区画壁３４にも、側壁３０ａ，３０ｂに沿って通気口４３が設けられているので、上部空間Ｓ２１から流入した塵埃を含む気流が、空間Ｓ２２１内に広がることなく、スムーズに空間Ｓ２２２に向けて流通させられることになる。
【００５７】
さらに、培地や細胞が付着した使用済みのチップ１４を収容した廃棄容器３９は、着脱可能であり、必要によりまたは定期的に交換することで、下部空間Ｓ２２の清浄度をも高い状態に回復することができる。さらに、廃棄容器３９への廃棄の際に使用済みのチップ１４を通過させるダクト４０も、必要によりまたは定期的に取り外して、交換あるいは清掃することで、清浄度の向上に寄与することができる。
【００５８】
さらに、自動培養装置１は、搬送ロボット５の設置されている中央空間Ｓ１２の上部に、空気清浄部６を備えているので、搬送ロボット５の存在する中央空間Ｓ１２内も常に清浄度が維持されている。したがって、培養室４の扉４ａが開かれたときにも、培養室４内に塵埃が流入することを最小限に抑えることが可能となる。
したがって、自動培養装置１によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができる。
【００５９】
なお、培養室４の形状や数、搬送ロボット５、給排ロボット１０および分注ロボット１３の形態や数、各種装置の形態や数等は、何ら限定されることなく、適用条件に合わせて任意に設定することができる。
また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
なお、自動培養装置１は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞を培養してもよい。
【００６０】
また、生体組織補填材を使用する場合は、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。
【００６１】
このようにして、自動培養装置１により得られた骨芽細胞を用いてセルベースドアッセイ系の基板を作成することにより、創薬スクリーニングに必要な量の基板を作成できる。したがって、健常者の組織から正常な骨芽細胞を採取してセルベースドアッセイ系の基板を作成する場合と比較すると、健常者から採取する体液の量を最小限に抑えて、遙かに多量の基板を作成することができる。
【００６２】
また、健常者の組織から直接取得した正常な骨芽細胞も用いてスクリーニングを行う場合と比較すると、正常な骨芽細胞と同等の生物学的特性を有する骨芽細胞を得ることができ、これを用いたセルベースドアッセイ系の創薬スクリーニングにおいては、健常者から直接取得した骨芽細胞に対して行ったのと同じスクリーニング結果を得ることができる。
【００６３】
したがって、反応ステップＳＴＥＰ２および検出ステップＳＴＥＰ３において、目的の薬効に対して確かに活性があると認められるヒット化合物を正確に検出することができるとともに、その中から、非特異的な活性、物性、毒性や合成展開性等様々な観点で選ばれるリード化合物を精度よく検出することができる。
【００６４】
なお、創薬スクリーニングに用いる生体組織細胞としては、骨芽細胞に限定されるものではなく、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、角膜細胞、血管内皮細胞等、他の任意の生体組織細胞でもよいことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】この発明の一実施形態に係る創薬スクリーニング方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の創薬スクリーニング方法における基板作成ステップにおいて、骨芽細胞を得るステップを説明する概略的なブロック図である。
【図３】図２の骨芽細胞を得るステップに使用される自動培養装置を示す斜視図である。
【図４】図３の自動培養装置の第１空間を概略的に示す縦断面図である。
【図５】図３の自動培養装置の第１空間を概略的に示す平面図である。
【図６】図３の自動培養装置において用いられる培養容器の一例を示す斜視図である。
【図７】図３の自動培養装置の培養処理装置の第１の区画壁を除去して第２の区画壁上の装置を示す斜視図である。
【図８】図３の自動培養装置の培養処理装置の第１および第２の区画壁を除去して最下位の空間内に設置された装置を示す斜視図である。
【図９】図３の自動培養装置の培養処理装置の廃棄容器に接続するダクトの取付構造例を示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００６６】
１  自動培養装置
ＳＴＥＰ１  基板作成ステップ
ＳＴＥＰ２  反応ステップ
ＳＴＥＰ３  検出ステップ
【図１】
2006081432.tif 000003
【図２】
2006081432.tif 000004
【図３】
2006081432.tif 000005
【図４】
2006081432.tif 000006
【図５】
2006081432.tif 000007
【図６】
2006081432.tif 000008
【図７】
2006081432.tif 000009
【図８】
2006081432.tif 000010
【図９】
2006081432.tif 000011