(57)【要約】【課題】  細胞を伝導性透明電極上で培養し、細胞に均質に電気刺激を与え、かつ生きたままの状態での光学的観察が可能でハイスループット化が容易な装置の提供を目的としている。【解決手段】  本発明によれば、電気伝導性透明板上に生体細胞を培養し、電気伝導性透明板と上部電極の間に電圧を負荷することにより透明板上の生体細胞に均一に電気刺激を与え、その細胞が生きたまま光学的観察が可能な装置を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気伝導性透明板上に培養筋肉細胞を培養する事により、電気伝導性透明板と電極の間に電圧を加えることにより透明板上の培養筋肉細胞に電気刺激を与える事を特徴とした細胞培養法。
【請求項２】
前期の電気伝導性透明板はガラス面上にＺｎＯ膜を蒸着した物である事を特徴とする細胞培養法。
【請求項３】
前期の電気伝導性透明板上のＺｎＯ膜にパターン回路を作ることにより様々な電気刺激パターンを培養筋肉細胞に与える事を特徴とする細胞培養法。
【請求項４】
底部に光学的に透明な電極を設置してなる所定の容積を有する容器と前記容器の上方から被せて前記容器を密封し、かつ前記透明電極に対向して配設した対向電極を備え、前記容器と上下方向に対向して設置される蓋体とを備えたことを特徴とする請求項３記載の電気刺激用キュベット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、培養筋肉細胞を電気伝導性透明板上で培養する事により、培養筋肉細胞に均質に電気刺激を与える事を可能にする細胞培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】  筋肉細胞（骨格筋・心筋）は電気的に刺激する事が可能であり、細胞生物学分野における研究ではこれらの細胞の電気刺激に対する応答の解析などが頻繁に行われている。従来、細胞の電気刺激方法としては底面に接着している細胞に平行な電場を与える方法が一般的であり、このような形態の細胞電気刺激装置は例えば非特許文献１にあるようにいくつか販売されている。しかし、このような配置の場合、多くの培養・電気刺激条件のスクリーニングが難しい事や、電場が細胞に均質にかからないなどの欠点がある。【０００３】  培養筋肉細胞電気刺激方法における上記の問題を解決するため、特許文献１や特許文献２にあるような上下方向から細胞に電気刺激を与える方法が考案されている。しかし、これらの方法は下部電極が不透明なため細胞を光学的に観察するという細胞生物学上最重要な実験を不可能にしている。また、それぞれのチャンバーに対して配線する必要がある事から、電気刺激条件のスクリーニングに適しているとは言い難い。【０００４】
【特許文献１】特許公開２００３−２２５
【特許文献２】特許公開２００２−３３５９４５
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｃ−Ｐａｃｅ１００−Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐａｃｅｒ  ａｎｄ  Ｃ−Ｄｉｓｈ１００−Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；ＩｏｎＯｐｔｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｏｎｏｐｔｉｘ．ｃｏｍ／  ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  上記のように、従来の電極が平行に配置されている手法では薬剤や電気刺激条件のスクリーニングに適した方法で培養筋肉細胞に電気刺激を与える事は難しかった。また、上下方向に電極が配置されている方法では細胞が不透明な透過膜上に培養されているため、光学的観察が出来ないという欠点があった。【０００６】  本発明は、培養筋肉細胞を電気伝導性透明電極上で培養し、培養筋肉細胞に均質に電気刺激を与え、かつ光学的観察が可能でハイスループット化が容易な装置の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明によれば、電気伝導性透明板上に培養筋肉細胞を培養し、電気伝導性透明板と上部電極の間に電圧を負荷することにより透明板上の培養筋肉細胞に均一に電気刺激を与え、かつ細胞が生きたまま光学的観察が可能な装置を提供する。【０００８】  また、本発明の細胞電気刺激装置を使用することにより、薬剤や電気刺激条件などのスクリーニングを簡易に行う事が可能となる。【０００９】  また、本発明は、底部に光学的に透明な電極を設置してなる所定の容積を有する容器と前記容器の上方から被せて前記容器を密封し、かつ前記透明電極に対向して配設した対向電極を備え、前記容器と上下方向に対向して設置される蓋体とを備えたことを特徴とする電気刺激用キュベットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】  以上説明したように本発明によれば、電気伝導性透明板上に培養した培養筋肉細胞に電気刺激を与え、かつ、同時にその細胞を光学的に観察する事が可能となる。培養筋肉細胞研究の分野では細胞の電気刺激依存的な応答を調べる事が重要であり、その際に光学的観察は主要な手段の一つである。また、電極は上下方向に配置されているため、薬剤や電気刺激条件のスクリーニングに適している。さらに、電気伝導性透明板はガラス面に光学的に透明な電気伝導性物質を蒸着したものであるため、ガラス面上に回路を構成する事により同一のガラス面上で部位に応じて同時に様々な条件の電気刺激を与える事を可能にする。また、培養筋肉細胞に電気刺激を与えることによって細胞に擬似的運動効果を与えることができるため、細胞内のエネルギー代謝に対する薬剤の影響を調べる事も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
【実施例】
【００１２】  図１は本発明の実施の形態による培養筋肉細胞電気刺激装置の概略構成を示す図、図２はその外観斜視図である。図１を参照すると、ウエル型培養皿（４）の下部に電気伝導性透明板（１）が電気伝導面が上向きになるように設置されており、この電気伝導性透明板上に培養筋肉細胞（３）を培養する。上部電極（５）は培地（２）に接するように蓋体（６）に設置され、下部に設置された電気伝導性透明板（１）間に通電する事によって培養筋肉細胞（３）に電気刺激を与える。【００１３】  本実施例では低栄養培地で筋肉様組織へと分化誘導されるＣ２Ｃ１２筋芽細胞を用いた。この細胞は分化誘導後に電位依存性チャンネルを発現し、電気刺激によって収縮運動が起きる事から本発明による刺激が最適な細胞である。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＺｎＯでコートしたガラス基板上にてダルベッコ改変イーゲル培地＋１０％牛胎児血清において培養した（図３）。３日間上記条件で培養後、ダルベッコ改変イーゲル培地＋２％ウシ血清に置換し、１週間培養することによって分化したＣ２Ｃ１２筋管細胞を得た（図４）。細胞どうしが融合し、チューブ上の構造を示していることから分化していることがわかる。【００１４】  ＺｎＯでコートしたガラス基板上にて培養した分化誘導後のＣ２Ｃ１２細胞に本発明による装置によって電気刺激を与えた。Ｃ２Ｃ１２細胞は筋肉様組織に分化する細胞なため、電気刺激によって収縮を誘導する事ができる。電気刺激発生装置としてＩｏｎＯｐｔｉｘ社のＣ−Ｐａｃｅを用い、電圧５Ｖ、周期１Ｈｚ、パルス幅２４ｍｓで電気刺激を与えたところ、細胞の収縮が観察された（図５）。位相差像の特定部位の明るさの変化を調べたところ、１Ｈｚで周期的に変化している事から細胞が与えられた電気刺激に反応して収縮している事がわかる（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００１５】  本発明に係わる筋肉細胞電気刺激装置は、筋肉細胞における分子生物学、細胞生物学、遺伝子工学、再生医療など様々な分野に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施の形態による電気刺激装置の概略構成である。
【図２】本発明の実施の形態による電気刺激装置の外観斜視図である。
【図３】ＺｎＯコートされたガラス基板上で培養された分化誘導前のＣ２Ｃ１２細胞。
【図４】ＺｎＯコートされたガラス基板上で培養された分化誘導後のＣ２Ｃ１２細胞。
【図５】ＺｎＯコートされたガラス基板上で培養された分化誘導後のＣ２Ｃ１２細胞に本発明による方法で電気刺激を与えた。右図は左図の白い四角で囲まれた部分の拡大図。右上は電気刺激前。右下は電気刺激後。電気刺激によって細胞が収縮し、縞模様が動いている事がわかる（矢印参照）。
【図６】周期的電気刺激（電圧５Ｖ、周期１Ｈｚ、パルス幅２４ｍｓ）に応答する細胞。左図の白い四角で囲まれた部分の明るさの経時変化を調べた（右図）。細胞が動く事によって明るさが電気刺激に応答して変化している事がわかる。
【符号の説明】
【００１７】１        電気伝導性透明板
２        培地
３        培養筋肉細胞
４        ウエル型培養皿
５        上部電極
６        蓋体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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