(57)【要約】【課題】  悪性腫瘍細胞におけるガンキリンの発現を効率よく抑制し、悪性腫瘍の増殖を十分に抑制し、その治療および／または予防に資する。【解決手段】  ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクター、ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを細胞内で産生するベクター、ならびにこれらのベクターを含む、悪性腫瘍の治療および／または予防のための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクター。
【請求項２】
該アンチセンスＲＮＡが配列番号：１に示される配列に対応する配列を有するもの、あるいはその変異体である請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを細胞内で産生するベクター。
【請求項４】
該ｓｉＲＮＡが配列番号：２または３に示される配列に対応する配列を有するもの、あるいはその変異体である請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
レトロウイルスベクターである請求項３または４に記載のベクター。
【請求項６】
増殖を抑制すべき悪性腫瘍細胞が肝癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、骨肉腫細胞および白血病細胞からなる群より選択されるものである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のベクターを含む、悪性腫瘍の治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項８】
該悪性腫瘍が肝癌、胃癌、肺癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌、骨肉腫および白血病細胞からなる群より選択されるものである請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍の増殖抑制物質、それを用いた悪性腫瘍の治療および／または予防などに関する。詳細には、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡおよびガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、これらを導入したベクター、かかるベクターを悪性腫瘍細胞に導入することによる悪性腫瘍の治療および／または予防などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンキリン遺伝子は肝癌において見出された癌遺伝子である（非特許文献１参照）。悪性腫瘍細胞、特に肝細胞癌組織においてガンキリン遺伝子の発現が常に亢進することが見出されている。ガンキリン蛋白（以下、「ガンキリン」と称する）は癌抑制蛋白Ｒｂ、Ｃｄｋ４、プロテアソームのサブユニットＳ６ＡＴアーゼ、ＭＡＧＥ−Ａ４などと結合して細胞内で複合体を形成する。この結果、Ｒｂのリン酸化と分解を促進し、癌抑制蛋白ｐ１６、ｐ１８の機能を阻害する。さらに、ガンキリンはＲｂだけでなく癌抑制蛋白ｐ５３の分解も促進することも見出されている。このようなガンキリンの作用により、悪性腫瘍の増殖が促進されるものと考えられている。
【０００３】
そこで、悪性腫瘍細胞におけるガンキリン遺伝子の発現を抑制し、ガンキリン量を低下あるいは消失させることが、悪性腫瘍の治療および予防につながると期待される。しかしながら、ガンキリンｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に添加しても、十分な増殖抑制効果は得られておらず（特許文献１参照）、結局のところ、ガンキリンの作用を抑制し、悪性腫瘍細胞の増殖を有効に抑制できたという報告はない。
【特許文献１】ＷＯ９９／１８２０１号公報
【非特許文献１】Higashitsuji et al., Nature Med., 6, 96-99, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、悪性腫瘍細胞におけるガンキリンの発現を効率よく抑制し、悪性腫瘍の増殖を十分に抑制し、その治療および／または予防に資することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡあるいはガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを導入したベクターを悪性腫瘍細胞に導入すると、効果的に悪性腫瘍細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、悪性腫瘍細胞の増殖を効率よく抑制するガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡあるいはガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、これらを導入したベクター、該ベクターを含む悪性腫瘍の治療および／または予防用の医薬組成物などが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
したがって、本発明は、
（１）ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクター；
（２）該アンチセンスＲＮＡが配列番号：１に示される配列に対応する配列を有するもの、あるいはその変異体である（１）に記載のベクター；
（３）ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを細胞内で産生するベクター；
（４）該ｓｉＲＮＡが配列番号：２または３に示される配列に対応する配列を有するもの、あるいはその変異体である（３）に記載のベクター；
（５）レトロウイルスベクターである（３）または（４）に記載のベクター；
（６）増殖を抑制すべき悪性腫瘍細胞が肝癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、骨肉腫細胞および白血病細胞からなる群より選択されるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載のベクター；
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のベクターを含む、悪性腫瘍の治療および／または予防のための医薬組成物；
（８）該悪性腫瘍が肝癌、胃癌、肺癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌、骨肉腫および白血病細胞からなる群より選択されるものである（７）に記載の医薬組成物
を提供するものである。
【０００８】
本発明は、第１の態様において、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクターを提供する。本発明の、この態様のベクターによりガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡが細胞内に産生されてガンキリンの発現が抑制され、その結果、細胞内のｐ５３の分解が抑制されてその量が増加することにより悪性腫瘍細胞の増殖が抑制される。悪性腫瘍細胞としては、ガンキリンを発現している細胞であればいずれの細胞であってもよく、なかでも、ガンキリンを高発現している細胞、例えば、肝癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、子宮癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、腎癌細胞、骨肉腫細胞、白血病細胞などが好ましい悪性腫瘍細胞である。したがって、本発明のガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクターを用いて、悪性腫瘍、とりわけ、肝癌、胃癌、肺癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌、骨肉腫、白血病などを治療および／または予防することができる。特に肝臓癌ではすべての例でガンキリンの発現が亢進しており（Higashitsuji et al., Nature Med., 6, 96-99, 2000）、特に好ましい対象である。「細胞内で産生」とは、悪性腫瘍細胞内において本発明のベクターから所望のガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡが生成されることを意味する。
【０００９】
ガンキリンｍＲＮＡはいずれの哺乳動物のものであってもよく、対象とする動物種に応じてその起源を選択することができる。例えば、ヒトの悪性腫瘍細胞の増殖を抑制して、その予防および治療を行う場合には、ヒト由来のものが好ましい。
【００１０】
ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡの取得および発現は、種々の公知方法を用いて行うことができる。一般的には、ガンキリンｃＤＮＡの蛋白コード領域を反対向きに組み込んだベクターを適切な細胞中で発現させることができる。例えば、ヒトガンキリンｃＤＮＡの蛋白コード領域に関しては、Genebank accession number D83197のヌクレオチド配列を参照することができる。
【００１１】
本発明の第１の態様のベクターにより産生される、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡは、ガンキリンの発現を抑制するものであればいずれの配列を有するものであってもよいが、ヒトの悪性腫瘍細胞に対して用いられるものとしては、ヒトガンキリンｃＤＮＡの蛋白コード領域（Genebank accession number D83197のヌクレオチド９９−７７９）（配列番号：１）のヌクレオチド配列の全長またはその一部分に対応する配列を有するアンチセンスＲＮＡが好ましいものとして例示される。配列番号：１のヌクレオチド配列の全長に対応する配列を有するアンチセンスＲＮＡが特に好ましい。なお、本明細書において「対応する配列」とは、あるヌクレオチド配列に対して各塩基が相補的な対合関係にあるヌクレオチド配列をいう。
【００１２】
また、本発明の第１の態様における、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡは、配列番号：１のヌクレオチド配列の全長またはその一部分に対応する配列を有するアンチセンスＲＮＡと同等の機能を有する変異体であってもよい。すなわち、かかる変異アンチセンスＲＮＡは、（ｉ）配列番号：１に示すＤＮＡ配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する配列またはその一部分；（ｉｉ）ストリンジントな条件下（例えば、６５℃、０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ）で配列番号：１に示すＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションしうる配列またはその一部分、に対応する配列を有するものであってもよい。なお、本明細書において、「ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ」という場合には、特に限定しない限り、上で説明したすべてのアンチセンスＲＮＡを包含するものとする。
【００１３】
さらに、本発明におけるガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡは修飾されたものであってもよく、例えば、ホスホロチオエート修飾体、ホスホロアミデート修飾体、低級アルキルホスホネート修飾体であってもよい。
【００１４】
本発明の第１の態様のベクターとしては、プラスミドＤＮＡやウイルス起源のものなど、種々のものが挙げられるが、とりわけ、ｐＭｋｉｔｎｅｏベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）などが好ましい。ヒトをはじめとする哺乳動物の悪性腫瘍の治療あるいは予防を行うために、本発明の第１の態様のベクターを患部に導入あるいはデリバリーする。本発明のベクターを直接患部に注入してもよく、血管内注入、例えば、カテーテルにより選択的に注入してもよい。細胞内への到達効率を上げるために、カプセルやリポソームあるいはポリマーコートなどのデリバリー手段に封入して患部に到達させてもよい。また、本発明のベクターを悪性腫瘍細胞に導入する場合、腫瘍に直接投与してもよく、あるいは薬剤（例えば、トランスフェクション用試薬など）を用いて細胞に導入してもよく、また遺伝子銃の手法により細胞に導入してもよい。また、本発明のガンキリンｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡをそのまま（naked）患部に導入してもよいが、上述のごとく細胞内で当該アンチセンスＲＮＡを産生するベクターの形で、あるいはリポソーム等のデリバリーシステムと組み合わせて細胞に導入することが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明の第１の態様のベクターを腫瘍に適用する際に、化学療法、免疫療法、放射線療法などとの併用療法も考えられる。
【００１６】
本発明は、第２の態様において、ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを細胞内で産生するベクターを提供する。本発明の、この態様のベクターによりガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡが細胞内で産生されてガンキリンの発現が抑制され、その結果、細胞内のｐ５３の分解が抑制されてその量が増加することにより悪性腫瘍細胞の増殖が抑制される。なお、本発明の第２の態様における悪性腫瘍細胞、ガンキリンｍＲＮＡ、患部へのベクターの導入あるいはデリバリー、他の療法との併用に関しては上述と同様である。「細胞内で産生」なる表現に関しても上述のとおりである。
【００１７】
本発明の第２の態様のベクターにより産生される、ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、ガンキリンの発現を抑制するものであればいずれのｓｉＲＮＡであってもよい。ガンキリンｃＤＮＡの蛋白コード領域配列を参照して種々の配列のＳｉＲＮＡを設計することができる。対象とする動物種に応じた配列のｓｉＲＮＡが好ましい。ヒトの悪性腫瘍細胞の増殖を抑制して、その予防および治療を行う場合には、ヒト配列に対応したものが好ましい。例えば、Genebank accession number D83197のヌクレオチド配列を参照することにより、ヒト悪性腫瘍細胞用のｓｉＲＮＡを設計することができる。本発明の第２の態様のベクターにより産生される好ましいｓｉＲＮＡは、ガンキリンの発現を抑制するものであればいずれの配列を有するものであってもよいが、ヒトの悪性腫瘍細胞に対して用いられるものとしては、配列番号：２または３に示すヌクレオチド配列（それぞれ、Genebank accession number D83197のヌクレオチド２０５−２２３および４５６−４７４）（それぞれ、配列番号：２および配列番号：３）に対応する配列を有するｓｉＲＮＡが好ましいものとして例示される。
【００１８】
また、本発明の第２の態様における、ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、配列番号：２および配列番号：３に対応する配列を有するｓｉＲＮＡと同等の機能を有する変異体であってもよい。すなわち、かかる変異ｓｉＲＮＡは、配列番号：２または配列番号：３に示すＤＮＡ配列に対して、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する配列；（ｉｉ）ストリンジントな条件下（例えば、６５℃、０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ）で配列番号：２または配列番号：３に示すＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションしうる配列、に対応する配列を有するものであってもよい。ｓｉＲＮＡの長さは１９〜２５ヌクレオチドが好ましい。なお、本明細書において、「ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ」という場合には、特に限定しない限り、上で説明したすべてのｓｉＲＮＡを包含するものとする。
【００１９】
さらに、本発明におけるガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは修飾されたものであってもよく、例えば、ホスホロチオエート修飾体、ホスホロアミデート修飾体、低級アルキルホスホネート修飾体であってもよい。
【００２０】
本発明に用いるｓｉＲＮＡは化学合成することもでき、これを上述のごとく当該ｓｉＲＮＡを細胞内で産生するベクターの形として、あるいはそのまま（nakid）患部に導入してもよい。好ましくは、ベクターの形で、あるいはリポソーム等のデリバリーシステムと組み合わせて細胞に導入することが好ましい。
【００２１】
本発明の第２の態様のベクターは、プラスミドＤＮＡやウイルスなど、種々のものが挙げられるが、２本鎖ＲＮＡを産生しうるベクターである。詳細には、かかるベクターシステムは、Ｕ６やＨ１などのポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いるものであり、その産生するＲＮＡの構造により、タンデム型とヘアピン型に分けられる（Wadhwa R, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2004 Aug;6(4):367-72）が、いずれの型を用いてもよい。このようなベクターとしては、ｐＳｕｐｅｒベクター、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒベクター（いずれもOligoEngine社）、pSilencer（Ambion社）などがある。また、ウイルスベクターは遺伝子導入効率の面から好ましいものである。本発明において好ましいウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが例示される。これらの本発明の第２の態様のベクターを用いて、悪性腫瘍、とりわけ、肝癌、胃癌、肺癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌、骨肉腫、白血病などを治療および／または予防することができることは上述と同様である。
【００２２】
さらに、本発明の第２の態様のベクターを腫瘍に適用する際に、化学療法、免疫療法、放射線療法などとの併用療法も考えられる。
【００２３】
本発明は、第３の態様において、本発明の第１の態様のベクターあるいは第２の態様のベクターを含む、悪性腫瘍の治療および／または予防のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物の剤形および投与経路は様々である。剤形および投与経路は対象の悪性腫瘍の種類、部位、対象の年齢、性別、あるいはその他の身体的状態などに応じて選択することができる。本発明の医薬組成物の剤形としては、注射剤、輸液剤などの液体剤形、粉末、錠剤、顆粒などの固体剤形、パスタ、塗布剤、坐薬、点鼻剤など、あるいはカプセル処方、脂質封入処方（例えば、リポソーム処方）などがある。本発明の医薬組成物の投与経路も様々なものであり、例えば、患部に直接適用してもよく、注射や輸液のような血管内投与により患部に到達させてもよい。細胞内への到達効率を上げるために、カプセル処方やリポソーム処方あるいはポリマーコート処方を用いてもよい。好ましくは、該医薬組成物は投与経路に適した形態とされ、例えば、血管内投与の場合には輸液処方を用いることができる。本発明の医薬組成物の製造は、当該分野においてよく知られている方法を用いて行うことができる。本発明の医薬組成物は、ガンキリンを発現している悪性腫瘍、例えば、肝癌、胃癌、肺癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎癌、骨肉腫、白血病、特に肝臓癌の治療および／または予防に好適である。
【００２４】
さらに、本発明の医薬組成物を腫瘍に適用する際に、化学療法、免疫療法、放射線療法などとの併用療法も考えられる。
【００２５】
本発明は、別の態様において、本発明の第１の態様のベクターあるいは第２の態様のベクターを悪性腫瘍細胞に導入することを特徴とする、哺乳動物における悪性腫瘍の治療および／または予防方法を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに別の態様において、哺乳動物における悪性腫瘍の治療および／または予防のための、本発明の第１の態様のベクターあるいは第２の態様のベクターの使用も提供する。
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は説明のためだけのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２８】
ｐＭｋｉｔｎｅｏベクターのＳＲαプロモーターの下流にヒトガンキリンｃＤＮＡの蛋白コード領域（配列番号：１）を順方向あるいは逆方向に挿入して、ガンキリンのセンスＲＮＡ（コントロール）あるいはアンチセンスＲＮＡを発現させるプラスミドを作成した。Ｕ−２ ＯＳ細胞（骨肉腫由来）にリン酸カルシウム法でそれぞれのプラスミドＤＮＡを導入し、ＭＧ４１８で導入細胞のみを選択した結果、導入ガンキリン発現クローンは１００個以上取得されたのに対し、アンチセンスのＲＮＡを発現したクローンは１個も取得されず、細胞増殖が抑制されたことが示された。
【実施例２】
【００２９】
ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを細胞内で発現することのできる２種のベクターを作成した。ヒトガンキリンｃＤＮＡ配列の一部１９ｍｅｒ（Genebank accession number D83197のヌクレオチド４５６−４７４：GAGATCGCTGTCATGTTAC）（配列番号：２）がステムループ構造を作るような５７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を作成し、ヒトＨ１プロモーターの支配下にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターに組み込んで、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１を得た。
【００３０】
ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１の１９ｍｅｒ部分をヒトガンキリンｃＤＮＡ配列の一部１９ｍｅｒ（Genebank accession number D83197のヌクレオチド２０５−２２３：CTGACCAGGACAGCAGAAC）（配列番号：３）としてステムループ構造を作るようにした５７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を組み込んで、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２を得た。
【００３１】
ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１の１９ｍｅｒ部分を３カ所変異させ、GAGATTTCTGTCTTGTTAC（配列番号：４）としてステムループ構造を作るようにした５７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を組み込んで、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｍｕｔを得た。このベクターをコントロールとして使用した。
【００３２】
Ｕ−２ ＯＳ細胞にＦｕｇｅｎｅ６（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いてｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１をおよびｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｍｕｔをトランスフェクションし、２日後および３日後に細胞数を計数した。その結果、ガンキリンの発現および細胞増殖が抑制され、コントロールを導入したものに比べて細胞数が導入３日後には半分以下であることがわかった（図１）。ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２を用いた場合にも同様の結果が得られた。
【００３３】
Ｕ−２ ＯＳ細胞にｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２あるいはｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｍｕｔをトランスフェクションして、２日後に細胞抽出液を作成し、ウエスタンブロッティング法にて、ｐ５３蛋白レベルを測定した（図２）。ゲルに流したタンパク量の比較のため、アクチンの量を測定した。ｐ５３蛋白はｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２のトランスフェクションにより増加していた。Ｕ−２ ＯＳ細胞にｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２あるいはｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｍｕｔをトランスフェクションして、２日後に細胞抽出液を作成し、そのカスパーゼ３活性を測定（ApoAlert Caspase-3 Fluorescent Assay Kit, BD Bioscience社を使用）した（図３）。カスパーゼ３活性はｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ２のトランスフェクションにより増加していた。このようにｐ５３蛋白量およびカスパーゼ３活性が増加していたことから、アポトーシスが誘導されたと考えられた。
【実施例３】
【００３４】
ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを化学合成した（Genebank accession number D83197のヌクレオチド４５６−４７４に対応）。このｓｉＲＮＡの構造を以下に示す：
【００３５】
5'-   GAGAUCGCUGUCAUGUUACTT-3'
3'- TTCUCUAGCGACAGUACAAUG  -5'
【００３６】
コントロールとして１９ｍｅｒをスクランブルしたものを合成した。SiPORT Amine Transfection Agent（Ambion）を用いて、上記ＳｉＲＮＡおよびコントロールをＡ５４９細胞（肺癌由来）に導入したところ、ガンキリンの発現および細胞増殖が抑制され、導入３日後の細胞数はコントロールの約５０％であった。
【実施例４】
【００３７】
遺伝子導入効率を上げるために、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１および緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）を発現するレトロウイルスを作成した。レトロウイルスベクターＳＦ／Ｌｙｔ（Tsuji T. et al., Hum. Gene Ther. 2000 Jan 20;11(2):271-84）中のＳＦＦＶレトロウイルスのゲノムにヒトリコンビナントＧＦＰを組み込み、その下流にｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１由来のガンキリンに対するｓｉＲＮＡを発現する配列を組み込んだ。コントロールとして、ＧＦＰのみを発現するレトロウイルスを同様に作成した。細胞への遺伝子導入は常法により行った。遺伝子導入された細胞は、４日後にコントロールでは５．５７倍に増加していたが、ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１を導入されたものは０．７８倍と減少しており、コントロールの約１／７であった。
【００３８】
これらの結果から、ガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを細胞内で産生するベクター、ガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡおよびこれらを細胞内で産生するベクターを用いてガンキリンの発現を抑制することにより、これまでアンチセンスオリゴヌクレオチドで得られたよりも強く悪性腫瘍細胞の増殖を抑制できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、悪性腫瘍の治療および／または予防用の医薬の製造、悪性腫瘍の研究、特に発癌遺伝子の機能解析などの分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ヒトガンキリンｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ発現ベクター（ｐＳｕｐｅｒ−ｇａｎｋｙｒｉｎ−ｗｔ１）の導入によるＵ−２ ＯＳ細胞の増殖抑制効果を示す図である。白棒はガンキリン発現細胞（コントロール）、黒棒はアンチセンスＲＮＡ発現ベクター導入細胞の結果を示す。
【図２】図２は、ヒトガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるＵ−２ ＯＳ細胞内のｐ５３量の変化を示すウエスタンブロットである。ゲルに流したタンパク量を比較するため、アクチンの量も測定した。
【図３】図３は、ヒトガンキリンｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入によるＵ−２ ＯＳ細胞内のカスパーゼ３活性の変化を示す図である。
【図１】
2006320216.tif 000002
【図２】
2006320216.tif 000003
【図３】
2006320216.tif 000004
【配列表】
2006320216000001.app