(57)【要約】【課題】  遺伝子の断片化を行うことなく、大腸菌内での相同組換えを利用してライブラリーサイズの大きなハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーを効率よく作製する手段を提供する。【解決手段】  ハイブリッドポリヌクレオチドの元となるポリヌクレオチドを、直鎖状のベクターに一方の末端だけを連結させ、これによって得られる直鎖状分子を大腸菌内での相同組換えによって環状化させることにより、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法。【選択図】  図１
2006042737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（７）の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法（下記の制限酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいて、制限酵素ＡとＢ、ＡとＤ、ＢとＣ、ＣとＤは異なる制限酵素であり、ＡとＣ、ＢとＤは同一又は異なる制限酵素である。）、
（１）5'末端が制限酵素Ａによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｂによる切断末端であり、5'末端又は3'末端のいずれかが脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
（２）第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持ち、5'末端が制限酵素Ｃによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｄによる切断末端であり、第一のポリヌクレオチドとは反対側の末端が脱リン酸化されている第二のポリヌクレオチドを作製する工程、
（３）第一のポリヌクレオチドの3'末端が脱リン酸化されている場合には、任意のベクターを制限酵素Ａ及び制限酵素Ｄで処理し、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｄによる切断末端を持つ直鎖状ベクターを作製し、第一のポリヌクレオチドの5'末端が脱リン酸化されている場合には、任意のベクターを制限酵素Ｂ及び制限酵素Ｃで処理し、制限酵素Ｂ及び制限酵素Ｃによる切断末端を持つ直鎖状ベクターを作製する工程、
（４）直鎖状ベクターの両末端を脱リン酸化する工程
（５）脱リン酸化したベクターと、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを混合し、それぞれ対応する制限酵素切断末端を介して連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
（６）直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程、
（７）選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程。
【請求項２】
工程（７）におけるハイブリッドポリヌクレオチドを第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、請求項１記載の（１）〜（７）の工程を２回以上繰り返すことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
【請求項３】
以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法（下記の制限酵素Ｅ、Ｈ、Ｂ、Ｐは、それぞれ異なる制限酵素である。）、
（１）5'末端が制限酵素Ｅによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｈによる切断末端であり、(a)5'末端及び3'末端の両方が脱リン酸化されているか、(b)5'末端のみが脱リン酸化されているか、又は(c)3'末端のみが脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
（２）(a)第一のポリヌクレオチドの5'末端及び3'末端の両方が脱リン酸化されている場合には、第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持つ第二のポリヌクレオチドを3'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｈによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｐによる切断末端であり、制限酵素Ｐによる切断末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクター、又は第二のポリヌクレオチドを5'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｂによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｅによる切断末端であり、制限酵素Ｂによる切断末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(b)第一のポリヌクレオチドの5'末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを3'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｈによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｐによる切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(c)第一のポリヌクレオチドの3'末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを5'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｂによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｅによる切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製する工程、
（３）直鎖状ベクターと、第一のポリヌクレオチドを混合し、それぞれ対応する制限酵素切断末端を介して連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
（４）直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程、
（５）選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程。
【請求項４】
工程（５）におけるハイブリッドポリヌクレオチドを第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、請求項３記載の（１）〜（５）の工程を２回以上繰り返すことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物内で、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法に関する。既存のタンパク質を人工的に改良し、機能の向上したタンパク質を獲得しようとする試みが数多くなされている。本発明は、そうしたタンパク質工学の分野に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
同じ機能を持ちアミノ酸配列が似ているタンパク質同士はタンパク質ファミリーを形成する。同じタンパク質ファミリーに属する２種類以上のタンパク質の間でハイブリッドを作ることで、既存のタンパク質にはない機能を持たせる試みがなされている。例えば熱安定性を向上させることや、基質特異性を変化させることである。
【０００３】
既存のタンパク質のアミノ酸配列の一部を他の配列と置換し、タンパク質を改良する試みは古くから行われている。その中でも共通の祖先分子に由来した、同じタンパク質ファミリーに属する２種類以上のタンパク質の間でハイブリッドを作製する方法が近年開発されている。Sexual PCRやファミリーシャフリングと呼ばれるこの方法は、目的のタンパク質をコードする複数の遺伝子（親遺伝子）を断片化し、PCRを利用して遺伝子断片を再結合することで、複数の親遺伝子がランダムに混ぜあわされた多数のハイブリッド遺伝子を作製することができる（特許文献１）。また、遺伝子の断片化を制限酵素で行うことで、ハイブリッド遺伝子の形成効率を上昇させることも可能である（特許文献２）。
【０００４】
一方、大腸菌などの微生物内における相同組換えを利用したハイブリッド遺伝子の作製も行うことができる。例えば、大腸菌におけるRecAタンパク質による相同組換えを利用したハイブリッド遺伝子の作製例が数多く報告されている。この方法は、ベクター上に相同な２種類の遺伝子を同じ向きにクローン化したプラスミドを用いる。遺伝子間を制限酵素で切断し、直鎖状にした分子を大腸菌に導入し、RecAを利用した遺伝子間での相同組換えによって環状になったものを選択することで、ハイブリッド遺伝子を得る方法である。この方法では比較的相同性の低い遺伝子間からもハイブリッド遺伝子を作製することができる。
【特許文献１】特表平10-50561号公報
【特許文献２】特開2000-245473号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の in vitro、in vivoのハイブリッド遺伝子作製法はいずれも有効な方法であるが、問題点がある。in vitroでのファミリーシャフリング法には、何らかの方法でDNAを断片化しなければならないという煩雑な工程が存在する。また、試験管内で、PCRを利用した断片の再結合を行うため、遺伝子の全長にわたり比較的高い相同性（制限酵素による断片化であっても80%以上）が要求される。一方in vivoでの相同組換えを用いる方法の問題点は、一度の反応で一回の相同組換えしか起こらず、得られるハイブリッド遺伝子の種類がファミリーシャフリング法に比べて少ないことにある。二回目、三回目の相同組換えにより、ハイブリッド遺伝子の種類を増やすことは可能であるが、そのためには、その都度遺伝子のクローン化を行う必要があり非常に煩雑である。
【０００６】
本発明の目的は、それぞれの方法の利点を生かしつつ、問題点を克服するための手段を提供することにある。特に、相同性の低い遺伝子間でもハイブリッド遺伝子を作製することのできる微生物細胞内でのin vivo相同組換えを用いた方法を元に、より多くのハイブリッド遺伝子を簡便に作製するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ベンゼン環のメタ開裂を行う酸素添加酵素は数多くの生物種から見いだされ、スーパーファミリーを作る。その中の2,3-ジヒドロキシビフェニル 1,2-ジオキシゲナーゼをコードする２種類の遺伝子bphCを選んだ。それぞれKF704株とKF712株から単離された遺伝子である。いずれの遺伝子も既にクローン化され、塩基配列も公開されている。本発明者は同じメタ開裂酸素添加酵素スーパーファミリーに属する２種類の遺伝子、トルエン、キシレンの分解酵素遺伝子群を運ぶTOL プラスミドpWW0上のxylE遺伝子、ナフタレンの分解酵素遺伝子群を持つNAH7プラスミド上のnahH遺伝子、を用いて大腸菌内における相同組換えを行い、１回組換えによってハイブリッドを作製することに成功している。しかしながら、２回目の組換えを起こしたハイブリッドポリヌクレオチドを作製することは非常に煩雑であった。そこで、２種類のbphC遺伝子を用いて、より複雑なハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法を検討した。
【０００８】
従来の微生物内での相同組換え法は、２種類の相同な遺伝子をダンデムにクローン化した後、これを制限酵素で切断して直鎖状DNAとし、次いで、この直鎖状DNAを大腸菌内での相同組換えによって環状化することによって行われてきた。本発明者は、この従来の方法における直鎖状DNA作製工程に着目し、遺伝子断片を含む環状ベクターを制限酵素で切断するのではなく、予め直鎖状のベクターを作製し、これに遺伝子断片の一方の末端だけを連結することによって直鎖状DNAを作製する方法を見出した。この方法は、従来の相同組換え法のように相同組換えする度に遺伝子のクローン化をする必要がなく、また、一度の反応で複数の組み合わせのハイブリッド遺伝子を作製できるという利点を持つ。
【０００９】
本発明は以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を提供する。
〔１〕以下の（１）〜（７）の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法（下記の制限酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいて、制限酵素ＡとＢ、ＡとＤ、ＢとＣ、ＣとＤは異なる制限酵素であり、ＡとＣ、ＢとＤは同一又は異なる制限酵素である。）、
（１）5'末端が制限酵素Ａによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｂによる切断末端であり、5'末端又は3'末端のいずれかが脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
（２）第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持ち、5'末端が制限酵素Ｃによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｄによる切断末端であり、第一のポリヌクレオチドとは反対側の末端が脱リン酸化されている第二のポリヌクレオチドを作製する工程、
（３）第一のポリヌクレオチドの3'末端が脱リン酸化されている場合には、任意のベクターを制限酵素Ａ及び制限酵素Ｄで処理し、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｄによる切断末端を持つ直鎖状ベクターを作製し、第一のポリヌクレオチドの5'末端が脱リン酸化されている場合には、任意のベクターを制限酵素Ｂ及び制限酵素Ｃで処理し、制限酵素Ｂ及び制限酵素Ｃによる切断末端を持つ直鎖状ベクターを作製する工程、
（４）直鎖状ベクターの両末端を脱リン酸化する工程
（５）脱リン酸化したベクターと、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを混合し、それぞれ対応する制限酵素切断末端を介して連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
（６）直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程、
（７）選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程。
〔２〕工程（７）におけるハイブリッドポリヌクレオチドを第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、〔１〕記載の（１）〜（７）の工程を２回以上繰り返すことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
〔３〕以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法（下記の制限酵素Ｅ、Ｈ、Ｂ、Ｐは、それぞれ異なる制限酵素である。）、
（１）5'末端が制限酵素Ｅによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｈによる切断末端であり、(a)5'末端及び3'末端の両方が脱リン酸化されているか、(b)5'末端のみが脱リン酸化されているか、又は(c)3'末端のみが脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
（２）(a)第一のポリヌクレオチドの5'末端及び3'末端の両方が脱リン酸化されている場合には、第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持つ第二のポリヌクレオチドを3'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｈによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｐによる切断末端であり、制限酵素Ｐによる切断末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクター、又は第二のポリヌクレオチドを5'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｂによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｅによる切断末端であり、制限酵素Ｂによる切断末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(b)第一のポリヌクレオチドの5'末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを3'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｈによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｐによる切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(c)第一のポリヌクレオチドの3'末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを5'末端側に含み、5'末端が制限酵素Ｂによる切断末端で3'末端が制限酵素Ｅによる切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製する工程、
（３）直鎖状ベクターと、第一のポリヌクレオチドを混合し、それぞれ対応する制限酵素切断末端を介して連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
（４）直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程、
（５）選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程。
〔４〕工程（５）におけるハイブリッドポリヌクレオチドを第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、〔３〕記載の（１）〜（５）の工程を２回以上繰り返すことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
【００１１】
なお、以下、上記〔１〕及び〔２〕の方法を「本発明の第一の方法」といい、上記〔３〕及び〔４〕の方法を「本発明の第二の方法」という。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、遺伝子の断片化を行うことなく、大腸菌内での相同組換えを利用してライブラリーサイズの大きなハイブリッド遺伝子ライブラリーを効率よく作製することができるようになる。本発明は、耐熱性に優れた酵素や基質特異性の変化した酵素など既存のタンパク質に比べて高機能を持ったり、また全く新しい機能を持ったタンパク質の創出に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の方法に使用する第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、それぞれ１種類だけであってもよく、また、２種類以上であってもよい。
【００１５】
本発明の方法に使用する任意のベクターは特に限定されないが、通常、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を含むものを使用する。
【００１６】
本発明の方法に使用する相同組換え能を持つ微生物は特に限定されないが、通常、recA遺伝子を持つ大腸菌株を使用し、recBCsbcA変異株の大腸菌を使用するのが特に好ましい。
【００１７】
本発明の第一の方法に使用する制限酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、それぞれ異なる制限酵素であることが好ましいが、ＡとＣ、ＢとＤは同じ制限酵素であってもよい。また、本発明の第二の方法に使用する制限酵素Ｅ、Ｈ、Ｂ、Ｐは、それぞれ異なる制限酵素である。なお、本発明の方法における各工程を２回以上繰り返す場合、使用する制限酵素は通常１回目に使用したものと同一のものを使うが、異なる制限酵素を使ってもよい。
【００１８】
本発明の第一の方法の概要を図１を用いて説明する。第一のポリヌクレオチドと、それに相同な部分配列を持つ第二のポリヌクレオチドをベクターのmultiple cloning siteにクローン化したものを例に本発明を説明するが、本発明は相同性のある遺伝子断片すべてに適用できる。
【００１９】
第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ｂで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ａで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離す。同様に、第二のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ｃで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｄで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離す（図１Ａ−１左側）。また、第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ａで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｂで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離す。同様に、第二のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ｄで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｃで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離す（図１Ａ−１右側）。脱リン酸化部位は星印で示している。ベクターは酵素Ａ、Ｄ（左側）もしくはＣ、Ｂ（右側）で切断し、脱リン酸化したものを用意する。第一のポリヌクレオチド／Ａ／Ｂ＊、第二のポリヌクレオチド／Ｃ＊／Ｄとベクター／Ａ＊／Ｄ＊を混ぜ合わせ、ライゲーションするとＢ＊、Ｃ＊の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる（図１Ａ−２左側）。同様に第一のポリヌクレオチド／Ａ＊／Ｂ、第二のポリヌクレオチド／Ｃ／Ｄ＊とベクター／Ｃ＊／Ｂ＊を混ぜ合わせ、ライゲーションするとＡ＊、Ｄ＊の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる（図１Ａ−２右側）。同じプラスミドの組み合わせから順番が逆の直鎖状分子ができる。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。２種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーとする。図１の左側に記載された方法で得られたライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー１１、図１の右側に記載された方法で得られたハイブリッドライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー２１とする。ポリヌクレオチドライブラリー１１は5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図１Ａ−３左側）。またポリヌクレオチドライブラリー２１は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図１Ａ−３右側）。
【００２０】
一回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、二回目の組換えを行う。方法は一回目の組換えと同じである（図１Ｂ−１〜Ｂ−３）。ポリヌクレオチドライブラリー１１とポリヌクレオチドライブラリー２１を制限酵素ＡとＢ、およびＣとＤでそれぞれ切断し、ポリヌクレオチド断片を得る。ポリヌクレオチドライブラリー１１／Ａ／Ｂ＊、ポリヌクレオチドライブラリー２１／Ｃ＊／Ｄとベクター／Ａ＊／Ｄ＊を混ぜ合わせライゲーションするとＢ＊、Ｃ＊の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる（図１Ｂ−２左側）。同様にポリヌクレオチドライブラリー１１／Ａ＊／Ｂ、ポリヌクレオチドライブラリー２１／Ｃ／Ｄ＊とベクター／Ｃ＊／Ｂ＊を混ぜ合わせライゲーションするとＡ＊、Ｄ＊の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる（図１Ｂ−２右側）。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、適当な抗生物質を含んだ培地に塗布する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーとする。図１の左側に記載された方法で得られたライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー１２、図１の左側に記載された方法で得られたハイブリッドライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー２２とする。ポリヌクレオチドライブラリー１２は5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、中央部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図１Ｂ−３左側）。またポリヌクレオチドライブラリー２２は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、中央部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドである（図１Ｂ−３右側）。
【００２１】
二回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、三回目の組換え、三回組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、四回目の組換え、と順次組換えを行うことができる。方法は一回目の組換えと同じである。これにより非常に大きいサイズのハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーを作り出すことが可能である。
【００２２】
本発明の第二の方法の概要を図２を用いて説明する。第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素ＥとＨで切断し、さらに両末端のリン酸基を脱リン酸化する。第一のポリヌクレオチドと相同な配列をもつ第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを制限酵素Ｐで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｈで処理する（図２Ａ−１左側）。同様に第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを制限酵素Ｂで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｅで処理する（図２Ａ−１右側）。脱リン酸化部位は星印で示している。第一のポリヌクレオチド/Ｅ*/Ｈ*と第二のポリヌクレオチドを含むベクター/Ｐ*/Ｈを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｈによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図２Ａ−２左側）。同様に第一のポリヌクレオチド/Ｅ*/Ｈ*と第二のポリヌクレオチドを含むプラスミド/Ｂ*/Ｅを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｅによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図２Ａ−２右側）。同じプラスミドの組み合わせから順番が逆の直鎖状分子ができる。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。２種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーとする。図２の左側に記載された方法で得られたライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー３１、図２の右側に記載された方法で得られたハイブリッドライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー４１とする。ポリヌクレオチドライブラリー３１は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図２Ａ−３左側）。またポリヌクレオチドライブラリー４１は5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第二の持つポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図２Ａ−３右側）。
【００２３】
一回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、二回目の組換えを行う。方法は一回目の組換えと同じである（図２Ｂ−１〜Ｂ−３）。ポリヌクレオチドライブラリー４１を制限酵素ＥとＨで切断し、さらに両末端のリン酸基を脱リン酸化する。ポリヌクレオチドライブラリー３１を制限酵素Ｐで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｈで処理する（図２Ｂ−１左側）。同様に、ポリヌクレオチドライブラリー３１を、制限酵素Ｂで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Ｅで処理する（図２Ｂ−１右側）。ポリヌクレオチドライブラリー４１/Ｅ*/Ｈ*とポリヌクレオチドライブラリー３１/Ｐ*/Ｈを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｈによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図２Ｂ−２左側）。同様にポリヌクレオチドライブラリー４１/Ｅ*/Ｈ*とポリヌクレオチドライブラリー３１/Ｂ*/Ｅを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｅによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図２Ｂ−２右側）。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。２種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーとする。図２の左側に記載された方法で得られたライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー３２、図２の右側に記載された方法で得られたハイブリッドライブラリーをポリヌクレオチドライブラリー４２とする。ポリヌクレオチドライブラリー３２は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、中央部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドである（図２Ｂ−３左側）。ポリヌクレオチドライブラリー４２は5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、中央部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる（図２Ｂ−３右側）。
【００２４】
二回組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、三回目の組換え、三回組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、四回目の組換え、と順次組換えを行うことができる。方法は一回目の組換えと同じである。これにより非常に大きいサイズのハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーを作り出すことが可能である。
【００２５】
以上述べた本発明の第二の方法の一部を変更した方法によっても本発明の第二の方法と同様のハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーを作製できる。以下、本発明の第二の方法の一部を変更した方法について説明する。
【００２６】
第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ｅで切断し切断部位を脱リン酸化した後、制限酵素Ｈでさらに切断する。第一のポリヌクレオチドと相同な配列をもつ第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを制限酵素ＰとＨで処理した後切断部位を脱リン酸化する（図３Ａ−１左側）。同様に第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Ｈで切断し切断部位を脱リン酸化した後、制限酵素Ｅでさらに切断する。第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを制限酵素ＢとＥで処理した後切断部位を脱リン酸化する（図３Ａ−１右側）。脱リン酸化部位は星印で示している。第一のポリヌクレオチド/Ｅ*/Ｈと第二のポリヌクレオチドを含むベクター/Ｐ*/Ｈ*を混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｈによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図３Ａ−２左側）。同様に第一のポリヌクレオチド/Ｅ/Ｈ*と第二のポリヌクレオチドを含むプラスミド/Ｂ*/Ｅ*を混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Ｅによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる（図３Ａ−２右側）。同じプラスミドの組み合わせから順番が逆の直鎖状分子ができる。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。２種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーとする。
【００２７】
２回目以降の組換えも上記と同様に行い、本発明の第二の方法と同様のハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーが得られる。
【００２８】
以上のようにして作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーの中から、メタ開裂酸素添加酵素の阻害剤である、３−クロロカテコールに対して耐性を獲得したハイブリッド酵素や、また耐熱性に優れたハイブリッド酵素をコードする遺伝子のスクリーニンなど、目的に応じたハイブリッド遺伝子の選択を行うことで、機能の向上したタンパク質を作り出すことができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３０】
〔実施例１〕
同じメタ開裂酸素添加酵素タンパク質ファミリーに属する相同な２種類の遺伝子bphCKF704及びbphCKF712をベクターpUC18のmultiple cloning siteのBamHI及びPstI部位にそれぞれクローン化し、p704、p712とした。遺伝子をクローン化したプラスミドp704をHindIIIで切断し、精製後shrimp alkaline phosphatase (SAP)で脱リン酸化した。さらにBamHIによる切断でbphCKF704を得た。同様にp712をEcoRIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにPstIで切断しbphCKF712を得た。ベクターpUC18をBamHIとPstIで切断し、SAPで脱リン酸化したものを用意した。これと上記のbphCKF704ならびにbphCKF712を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質のひとつであるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5’末端部分がbphCKF704由来、3’末端部分がbphCKF712由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp4121とした。
【００３１】
プラスミドp704をEcoRIで切断し、精製後SAPで脱リン酸化した。さらにPstIによる切断でbphCKF704を得た。同様に、p712をHindIIIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにBamHIで切断しbphCKF712を得た。ベクターpUC18をBamHIとPstIで切断し、SAPで脱リン酸化したものを用意した。これと上記のbphCKF704ならびにbphCKF712を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分がbphCKF712由来、3’末端部分がbphCKF704由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた（図４）。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp1241とした。
【００３２】
一回の組換えで作製したハイブリッド遺伝子ライブラリーに対して、二回目の組換えを行った。ハイブリッド遺伝子ライブラリーp4121をHindIIIで切断し、精製後、SAPで脱リン酸化した。さらにBamHIによる切断でbphC4121を得た。同様に、p1241をEcoRIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにPstIで切断しbphC1241を得た。ベクターpUC18をBamHIとPstIで切断し、SAPで脱リン酸化したものを用意し、上記のbphC4121ならびにbphC1241を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分と3'末端部分がbphCKF704由来、中央部分がbphCKF712由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp4122とした。
【００３３】
プラスミドp4121をEcoRIで切断し、精製後SAPで脱リン酸化した。さらにPstIによる切断でbphC4121を得た。同様に、p1241をHindIIIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにBamHIで切断しbphC1241を得た。ベクターpUC18をBamHIとPstIで切断し、SAPで脱リン酸化したものを用意した。これと上記のbphC4121ならびにbphC1241を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分及び3'末端部分がbphCKF712由来、中央部分がbphCKF704由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた（図４）。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp1242とした。
【００３４】
三回目の相同組換えも同様に行った結果、bphCKF712由来、bphCKF704由来、bphCKF712由来、bphCKF704由来 の配列が交互に並んだハイブリッド遺伝子が得られた（図４）。
【００３５】
〔実施例２〕
プラスミドp704をEcoRIとHindIIIで切断しSAPで脱リン酸化し、bphCKF704を得た。プラスミドp712をPstIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにHindIIIで切断した。これと上記のbphCKF704を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分がbphCKF712由来、3'末端部分がbphCKF704由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp1241とした。
【００３６】
プラスミドp712をBamHIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにEcoRIで切断した。これと上記のbphCKF704を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分がbphCKF704由来、3'末端部分がbphCKF712由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp4121とした。
【００３７】
ハイブリッド遺伝子ライブラリーp4121をEcoRIとHindIIIで切断しSAPで脱リン酸化し、bphC4121を得た。ハイブリッド遺伝子ライブラリーp1241をPstIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにHindIIIで切断した。これと上記のbphC4121を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分と3'末端部分がbphCKF712由来、中央部分がbphCKF704由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp1242とした。
【００３８】
ハイブリッド遺伝子ライブラリーp1241をBamHIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにEcoRIで切断した。これと上記のbphC4121を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、4.8 kbの大きさの断片をゲルから回収、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った後、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。アンピシリンを含んだ培地上で増殖したコロニーに酵素の基質であるカテコールを噴霧したところ、90%以上のコロニーが黄色を呈し、酵素活性を示した。また、活性のあるコロニーをランダムに選びそこからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、5'末端部分と3'末端部分がbphCKF704由来、中央部分がbphCKF712由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた。そこで、アンピシリンを含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp4122とした。
【００３９】
三回目の相同組換えを二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp4122と二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーp1242を用いて、一回目及び二回目の相同組換えと同様に行った結果、bphCKF712由来、bphCKF704由来、bphCKF712由来、bphCKF704由来の配列が交互に並んだハイブリッド遺伝子が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の第一の方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の第二の方法の概要を示す図である。
【図３】本発明の第二の方法の一部を変更した方法の概要を示す図である。
【図４】実施例１で得られたbphCKF704とbphCKF712のハイブリッド遺伝子の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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