(57)【要約】【課題】本発明の課題は、光照射により酵素が失活し、これに因って組成物の性能が低下するという不具合に対して、光照射量を制限することで酵素の失活を防ぐ事、酵素及び／または酵素を構成成分とする組成物の性能を保持し、安定的に長期間保存することである。【解決手段】酵素および／または酵素を構成成分とする組成物に対する光照射量を低減させる事を特徴とする酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の安定化方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素および／または酵素を構成成分とする組成物に対する光照射量を低減させる事を特徴とする酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の安定化方法。
【請求項２】
酵素および／または酵素を構成成分とする組成物を充填し安定に保存するための、光透過率を制限した容器。
【請求項３】
光透過率を制限した容器に充填する事を特徴とする安定化された酵素および／または酵素を構成成分とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素の安定的な保存方法および安定性に優れた酵素および酵素を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物は、その基質特異性や簡便性により様々な用途に応用されている。一例を挙げると、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などである。これらの組成物に適用する酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体とのコンジュゲート化等を受けることもある。
【０００３】
しかし、上記のような酵素を含む組成物を長期間使用可能な状態にするためには、言うまでもなく酵素活性を安定的に保持する事が重要である。例えば、試薬組成物中の酵素活性が時間経過により低下する時、試薬の有効期限と酵素の活性低下速度に合わせて予め過剰量の活性を添加する方策があるが、多くの場合このような手段では問題の根本的な解決にはならない。試薬保存中に酵素蛋白が失活変性した場合、試薬中に変性蛋白が析出し測定値に影響を与え、分析機器の送液ライン内部に付着するなど分析トラブルの原因になる。
【０００４】
このため、組成物中に界面活性剤や補酵素、塩類、防腐剤などの物質を安定化剤として添加して組成物中の酵素活性を長期間安定的に保持する事が重要とされ、多くの先行文献が存在する。しかし、この様な物質を添加して酵素の安定化を保持しようとする手法は、逆に塩類の析出、防腐剤や界面活性剤による濁質の生成、共存する色素などの化学物質との意図しない反応などの問題を発生させる事がある。
【０００５】
一方、酵素を含む組成物はその保管条件によって、同一組成物でも安定性が大きく異なる場合がある。従来このような差は温度や湿度が原因であると考えられていたが、容器の材質や滅菌方法によっても組成物中酵素の安定性が左右されることが判っている。
例えば、組成物中の酵素がボトルの材質に吸着する事は、特に酵素が脂質関連物質を基質とする酵素である場合、経験的に良く知られた現象である。容器の滅菌方法が及ぼす酵素の安定性への影響に関してはエチレンオキサイドガス滅菌による酵素失活の例がある（たとえば、特許文献１を参照。）。
【特許文献１】特願２００２−５７７１５
【０００６】
このように、充填するための容器が、酵素を含む組成物の安定性に及ぼす影響が大きいにも関らず、従来、充填容器に対する注意が充分払われていなかった。
【０００７】
過去、色素や補酵素に関しては光が品質に影響を与えること、特に蛍光色素や発光色素、およびこれらを結合してなる蛍光基質や発光基質は光により分解や共重合などの好ましくない反応を起こし、品質の低下や性能の劣化を招くことが知られている（たとえば、非特許文献１を参照。）。このような不具合を防止するため、色素、特に蛍光色素や発光色素及びこれらと結合してなる化合物、また、コバラミン等の補酵素を含有してなる組成物を遮光し安定性を向上させる先行技術が存在する。
【非特許文献１】日本化学会編  化学総説  Ｎｏ．２６，（１９８０）
【０００８】
当然、光反応は合成化合物だけに起こるものではない。天然物質の光反応は、紫外線によるＤＮＡの損傷や葉緑素による光合成の明反応で良く研究され、高校レベルの生物や化学の教科書にも記載されている。また、更に詳細な研究により血色素モデル化合物として合成されたポルフィリンの２価鉄錯体についても光により励起されるという報告がある（たとえば、非特許文献２を参照。）。
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５，３０５２（１９８２）
【０００９】
しかし、通常のポルフィリン化合物は定常光の照射によっても、極めて安定である事も報告されている（たとえば、非特許文献３を参照。）。
定常光の下、ポルフィリンの光励起エネルギーを利用して、クロロフィルを含む葉緑体は光エネルギーを効率良く反応エネルギーに変換する。このようにポルフィリン金属錯体の光励起に関する報告が、これを含む蛋白質の変性を直接示していないことは明かである。
たとえば、ポルフィリンを補欠分子とする酵素蛋白を精製によって単離し、これに光、特に本発明で取り扱われる定常光を照射する事によって活性が低下するような報告は為されていない。
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１７３（１９８３）
【００１０】
食品分野でも食品陳列中の光照射の影響が報告されている。光による劣化を回避し品質を保持するため包装材料を遮光フィルムにする事は、特に酸化され易い不飽和油成分を含むスナック菓子では当然のことである。食品以外の分野では、色素の安定化のため退色防止剤を添加するなどの報告もある（たとえば、非特許文献４を参照。）。
【非特許文献４】日本写真学会秋季大会，１０２（１９９７）
【００１１】
上記先行技術に関する文献に記載されている食品や色素を含む組成物が酵素を含む場合もあるが、安定化すべきは不飽和油、色素またはビタミン類などであり、酵素蛋白自体を光の照射の影響から保護し安定性を向上させる目的ではない。
他方、酵素の安定化という観点では過去様々な報告が為されている。例えばグリセロ三リン酸オキシダーゼにフラビン色素やＥＤＴＡを添加して安定化させる事、仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼに低濃度の亜鉛イオンを添加して安定化する事等が上げられる。
これらから分るように、今まで酵素及び酵素を含む組成物中に、安定化作用を持つ何かを添加する、または阻害原因となる何かを除去することにのみ主眼が置かれていた。
試薬組成中の酵素が光の影響を受け、酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の性能低下を招くこと、更に、光照射の影響を回避する事で酵素の失活を防止し、酵素を含む組成物の性能を長期間安定的に保持する事は従来報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、光照射により酵素が失活し、これに因って組成物の性能が低下するという不具合に対して、光照射量を制限することで酵素の失活を防ぐ事、酵素及び／または酵素を構成成分とする組成物の性能を保持し、安定的に長期間保存することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の安定性が、これら組成物に対する光照射量によって大きく変動する事を見出した。このため、光照射量と酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の安定性を調査検討し発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
（１）酵素および／または酵素を構成成分とする組成物に対する光照射量を低減させる事を特徴とする酵素および／または酵素を構成成分とする組成物の安定化方法。
（２）酵素および／または酵素を構成成分とする組成物を充填し安定に保存するための、光透過率を制限した容器。
（３）光透過率を制限した容器に充填する事を特徴とする安定化された酵素および／または酵素を構成成分とする組成物。
【発明の効果】
【００１５】
光透過量を制限することで、特に、光透過量を制限できる容器を用いることで、酵素の失活を防ぎ、酵素または酵素を構成成分とする組成物の性能を保持し、安定的に長期間保存することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明で言う光は、定常光である。つまりレーザー光などと異なり一般環境下で通常に照射される波長と照度の範囲の光であり、太陽光および室内照明に用いる蛍光灯や白熱灯の光である。
このため、太陽光に含まれ物質の変性や劣化、分解に関することが知られている紫外線だけでなく、一般的に物質への影響が少ないとされる可視光線から近赤外線の波長を範囲に含む。
その照射量および光透過率は、例えば市販の照度計を用いて照度を測定することにより求めることができる。
【００１８】
本発明でいう光照射量の低減は、安定化対象の組成物と光源の間に遮蔽物をおくことにより達成される。その形状は、密閉系としての容器であっても良いし、開放系として板状やシート状のものであっても良い。
本発明で言う容器は、内部に酵素及び／または酵素を構成成分とする組成物を充填するのに適した性能を有するものならば、その材質や形状を問わない。
具体的には、硬質および軟質ガラス製、陶磁器製、アルミやチタン、ステンレスなどの金属製、塩化ビニール、ポリエチレンテレフタレート、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、フッ素樹脂、ユリア樹脂、ナイロン、ポリカーボネート、ＡＳ樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリウレタン、フェノール樹脂、メラミン樹脂などの樹脂製、及びこれらの材質を組み合わせた容器が上げられる。
【００１９】
本発明に言う光透過率の制限された容器とは、容器全面から内部に透過する光の総量を低下させる処置の施された容器であって、容器本体の透明、不透明、着色の有無を問わない。
古くから、褐色瓶、黒色瓶のように容器の製造段階で材料に色素を添加したものが遮光容器として販売されている。また、樹脂製の容器でも同様に褐色色素を添加したものが販売されている。容器が樹脂と樹脂または樹脂と金属とのラミネート材から作られる場合でも、光透過率を制限出来る。本発明の実施にあたり、この様な容器を選択し使用することが可能である。
また、容器本体が透明で光透過性が高い場合でも、表面を顔料で着色したり、光透過率の低いフィルム材でカバーしたりコーティング剤で処理する、或いは二重構造、つまり本体容器を別の容器内に挿入することで内部への光透過率を低下させる事は可能である。
当然、この様な容器も本発明に使用することが可能である。
【００２０】
また、本発明で言う内部に酵素及び／または酵素を構成成分とする組成物は、その用途と使用目的によって適した形状を取るべきものであるから、粉末状、溶液状、ペースト状、スラリー状、ゲル状など、その形状は限定されない。酵素タンパクが糖類や標識化合物による修飾を受けていても良く、固層担体や水溶性高分子に固定化されていても良い。市場で要求される品質を満たすように設計され、酵素および共存する物質の特性によって保存に適した組成条件を設定するべきである。
【００２１】
酵素は純粋なタンパク質である必要がなく、粉末の場合、一般的な安定化剤や形状改善剤として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、ラフィノース、トレハロース、シクロデキストリン、プルラン、イヌリン、可溶性デンプンなどの糖類およびグルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール類、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン、グリシルグリシルグリシンなどのペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩などの無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸及び有機酸の塩、ゼラチン、カゼイン、ＢＳＡなどのタンパク質、更にコール酸類、脂肪酸の糖エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエーテルなどの界面活性剤を含むことが可能である。
【００２２】
酵素が液状である場合、酵素タンパクが完全に溶解している状態だけでなく、懸濁液のように液体の中に分散している場合も含む。液状酵素は水ではなく、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ，ＭＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液に溶解又は懸濁されていて良く、この様な液状酵素中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールやエチレングリコールなどのポリオール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良い。必要に応じて、ペニシリン系、セフェム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー・キノロン系等の抗生物質、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］，２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ，２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ，２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅなどの防腐剤を添加しても良い。
【００２３】
酵素を構成成分とする組成物は、その組成物の使用目的に応じてＮＡＤ＋やＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋，ＮＡＤＰＨ，ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，ＧＴＰ，ＧＭＰ，ＦＡＤやＦＭＮ、ビオチン、ナイアシン、コバラミン、ＰＱＱなどの補酵素類、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、リチウム、銅、鉄、マンガン等の金属塩、チオール化合物、セレン化合物、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、トリス塩等の塩類、アミノ酸及びアミノ酸塩、糖および配糖体、また必要により、フェノール系およびアニリン系の各種トリンダー試薬とカプラーである４−アミノアンチピリン，テトラゾリウム塩類とフエナジンメトサルフェートなどの電子キャリヤー、ロイコ系試薬などの色素類，および基質類を添加する事が可能である。
【００２４】
本発明において、安定化効果の評価方法は酵素の失活を見ることによって行なうことができる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
次の試薬を調整し、以下に示す光透過量の異なる容器にて保存し、室温（２５℃）、蛍光灯下にて５００Ｌｕｘ，２週間経過後の酵素活性を原料供給メーカーのカタログ記載の方法に従い測定した。アルミホイルにて遮光したものを比較対照とした時の相対値を表１に示す。
【００２７】
【表１】
2006081439.tif 000002
【００２８】
試薬
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
カタラーゼ（東洋紡製、ＣＡＯ−５０９、牛肝臓由来）
５ｕ／ｍｌ  サルコシンオキシダーゼ（東洋紡製、ＳＡＯ−３３１、微生物由来）
１００ｕ／ｍｌ  クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製、ＣＲＨ−２１９、微生物由来）
２０ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（東洋紡製、ＰＥＯ−３０１、西洋わさび由来）
容器
褐色塩化ビニル製容器：以下塩ビと略す。
褐色ポリエチレンテレフタレート製容器：以下ＰＥＴ−茶と略す。
淡褐色ポリエチレンテレフタレート製容器：以下ＰＥＴ−淡と略す。
白色ポリプロピレン製容器：以下白色と略す。
なお、上記４種の容器の光透過率は、「日立Ｕ−３５００形自記分光光度計」に、「日立６０φ積分球付属装置（紫外可視近赤外域用）」を装着して測定した。分析条件は以下の通り。
測定条件：透過法（２４０ｎｍ〜１０００ｎｍ）、スキャンスピード：３００ｎｍ／ｍｉｎ、サンプリング間隔：自動。
光度計条件：スリット（可視）：固定２ｎｍ、ＰｂＳ感度：１、光源切換：自動切換  切換波長３４０ｎｍ、検知器切り替え：８５０ｎｍ。
例えば３００ｎｍにおける光透過率は塩ビ、ＰＥＴ−茶、ＰＥＴ−淡、白色の順にそれぞれ、０．００１３５、０．００１６３、０．００２６６、０．１９６３７であった。４００ｎｍにおける光透過率は塩ビ、ＰＥＴ−茶、ＰＥＴ−淡、白色の順にそれぞれ、０．００１９４、０．００２４５、０．０３２０５、０．３２９６６であった。
表１に示した通り光透過量の少ない、塩ビ＞ＰＥＴ−茶＞ＰＥＴ−淡＞白色の順に酵素活性の安定化効果を認めた。
【００２９】
（実施例２）
次の試薬を調整し、以下に示す光透過量の異なる容器にて保存し、９℃、蛍光灯下にて５００Ｌｕｘ，２週間経過後の酵素活性を原料供給メーカーのカタログ記載の方法に従い測定した。アルミ保存にて遮光したものを比較対照とした時の相対値を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2006081439.tif 000003
【００３１】
試薬
２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
８ｕ／ｍｌ  サルコシンオキシダーゼ（東洋紡製、ＳＡＯ−３４１、微生物由来）
３００ｕ／ｍｌ  クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製、ＣＮＨ−３１１、ナタ豆由来）
１０ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（東洋紡製、ＰＥＯ−３０１、西洋わさび由来）
容器
塩ビ、ＰＥＴ−淡
表２に示した通り光透過量の少ない、塩ビ＞ＰＥＴ−淡の順に酵素活性の安定化効果を認めた。
【００３２】
（実施例３）
次の試薬を調整し、以下に示す光透過量の異なる容器にて保存し、９℃、蛍光灯下にて５００Ｌｕｘ，２週間経過後の酵素活性を原料供給メーカーのカタログ記載の方法に従い測定した。アルミ保存にて遮光したものを比較対照とした時の相対値を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2006081439.tif 000004
【００３４】
試薬
５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５）
２ｕ／ｍｌ  ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡製、ＬＥＤ−２０１、Ｂａｃｉｌｌｅｓ  ｓｐ．由来）
１１５ｕ／ｍｌ  ウレアーゼ（東洋紡製、ＵＲＨ−２０１、ナタ豆由来）
容器
塩ビ、ＰＥＴ−淡、白色
表３に示した通り光透過量の少ない、塩ビ＞ＰＥＴ−淡＞白色の順に酵素活性の安定化効果を認めた。
【００３５】
（実施例４）
次の試薬を調整し、以下に示す光透過量の異なる容器にて保存し、９℃、蛍光灯下にて５００Ｌｕｘ，２週間経過後の酵素活性を原料供給メーカーのカタログ記載の方法に従い測定した。アルミ保存にて遮光したものを比較対照とした時の相対値を表４に示す。
【００３６】
【表４】
2006081439.tif 000005
【００３７】
試薬
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
１０ｕ／ｍｌ  グリセロールリン酸オキシダーゼ（東洋紡製、Ｇ３Ｏ−３１１、微生物由来）
４ｕ／ｍｌ  リポプロテインリパーゼ（東洋紡製、ＬＰＬ−３１４、微生物由来）
１０ｕ／ｍｌ  グリセロールキナーゼ（東洋紡製、ＧＹＫ−３１１、微生物由来）
５ｕ／ｍｌ  アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡製、ＡＳＯ−３１１、南瓜由来）
容器
ＰＥＴ−茶、ＰＥＴ−淡
表４に示した通り光透過量の少ない、ＰＥＴ−茶＞ＰＥＴ−淡の順に酵素活性の安定化効果を認めた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の酵素の安定化方法、および安定化のための容器、安定化された酵素を含む組成物は、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。