(57)【要約】【課題】非凍結乾燥の生菌全細胞において共生の(probiotic)酵母をマイクロカプセルの形態で調製する方法を開示する。【解決手段】ａ）酵母細胞をその培養液から遠心分離または精密ろ過するステップと、  ｂ）酵母細胞を水で洗浄し、滅菌水で再懸濁するステップと、  ｃ）場合により、ｂ）で得られた懸濁液に、ベントナイト、カオリン、シリカ、ミクロセルロース、レシチンナトリウム塩、および／または天然もしくは水素化(hydrogenated)植物油または動物油を添加するステップと、  ｄ）ｃ）で得られた混合物を、含水量が０．５と５％の間になるまで２０℃と４０℃の間の温度で低圧で乾燥するステップと、  ｅ）賦形剤をこの乾燥物質に添加し、この混合物を直接圧縮成形するステップと、  ｆ）ｅ）で得られた錠剤を粒状化するステップと、  ｇ）ｆ）で得られた顆粒を溶融ワックスで被覆するステップと  を含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非凍結乾燥の生菌全細胞において共生の(probiotic)酵母をマイクロカプセルの形態で調製する方法であって、
ａ）酵母細胞をその培養液から遠心分離または精密ろ過するステップと、
ｂ）酵母細胞を水で洗浄し、滅菌水で再懸濁するステップと、
ｃ）場合により、ｂ）で得られた懸濁液に、ベントナイト、カオリン、シリカ、ミクロセルロース、レシチンナトリウム塩、および／または天然もしくは水素化(hydrogenated)植物油または動物油を添加するステップと、
ｄ）ｃ）で得られた混合物を、含水量が０．５と５％の間になるまで２０℃と４０℃の間の温度で低圧で乾燥するステップと、
ｅ）賦形剤を前記乾燥物質に添加し、前記混合物を直接圧縮成形するステップと、
ｆ）ｅ）で得られた錠剤を粒状化するステップと、
ｇ）ｆ）で得られた顆粒を溶融ワックスで被覆するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ｂ）段階の細胞を滅菌水中に懸濁させて、３〜６×１０10ＣＦＵ／ｇ乾燥重に相当する、乾燥重２０と３０ｇ／ｌの間の細胞濃度にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母がサッカロミセス属である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母がサッカロミセスセレビシエである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｃ）段階の乾燥ステップを２５℃と３５℃の間で行う、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ベントナイトをｃ）段階で添加する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記圧縮成形賦形剤を、マンニトール、ラクトース、サッカロース、マルトース、微結晶性セルロース、シリカ、ベントナイト、カオリン、レシチンナトリウム塩およびベヘン酸グリセロールから選択する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記錠剤が直径１５〜３０ｍｍ、好ましくは２０〜２５ｍｍであって、平均硬度２０〜４０Ｋｐ、好ましくは２５〜３０Ｋｐである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記錠剤を、メッシュ径１００〜３０００ミクロン、好ましくは４００〜１５００ミクロンのスクリーン付の振動造粒機で粒状化する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記錠剤から得られる顆粒を、スクリューミキサーにより溶融ワックスで被覆し、５００〜１６００ミクロンのマイクロカプセルを作製する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワックスが２５℃と６５℃の間の融点、４〜１２のＨＬＢ（親水性親油性バランス）を有し、好ましくは３０℃と５０℃の間の融点、５と１０の間のＨＬＢを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワックスを、水素化(hydrogenated)油、モノ−、ジ−およびトリグリセリド、植物性の飽和脂肪酸Ｃ８〜Ｃ１８の半合成グリセリド、植物性のモノステアレート、ポリエチレングリコールのモノ−およびジエステル、ならびに水素化(hydrogenated)パーム油から選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１１に記載の方法から得られる酵母マイクロカプセル。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロカプセルを含む共生の(probiotic)製剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非凍結乾燥の生菌全細胞における酵母の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
小袋(sachet)および／またはカプセルに入れた凍結乾燥酵母を下痢の治療に利用することはよく認められており（Ｂｉｏｃｏｄｅｘが出願したＵＳ４６４３８９７および５６６５３５２、ならびにＳ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｌ．が出願したＵＳ５６３９４９６）、同様に、低温殺菌および乾燥させ、散剤、カプセル、丸剤または錠剤の形態でセレンおよび／またはゲルマニウムおよび／またはクロムおよび／または化学療法薬と共に共生の(probiotic)製剤に供することがよく知られている（Ｖｉｖａ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ社が出願したＵＳ６１４０１０７、６１５９４６６、６１９７２９５および６３６８６４３）。
【０００３】
凍結乾燥は、酵母細胞に対して、その完全性を変化させるショックを与える。
【０００４】
非常に低い温度（冷凍）および高真空は、細胞壁に損傷を与え、その結果、細胞の完全性に損傷を与え得る。またタンパク質および細胞酵素に損傷を与え、細胞の損傷および高い死滅率を招き得る。
【０００５】
さらに、凍結乾燥物の再水和により死滅率が上昇し、使用される液体および温度によっては、細胞がさらに損傷を与えられ、弱化し、胃腸通過時の死滅率が高まり、生存率が下がる。
【特許文献１】ＵＳ４６４３８９７明細書
【特許文献２】ＵＳ５６６５３５２明細書
【特許文献３】ＵＳ５６３９４９６明細書
【特許文献４】ＵＳ６１４０１０７明細書
【特許文献５】ＵＳ６１５９４６６明細書
【特許文献６】ＵＳ６１９７２９５明細書
【特許文献７】ＵＳ６３６８６４３明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述の凍結乾燥に伴う不利な点を排除し、凍結乾燥のショックを受けない完全な酵母細胞を得ることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による方法は、制御された温度および低真空における乾燥とその後のマイクロカプセル化を含み、調製液の含水量を経時的に変化させず、その結果、老化の進行、細胞劣化および汚染を遅らせ、胃酸に対する耐性がさらに増し、調製における経時的な安定性が増す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
既定の発酵技術により調製された酵母バイオマスを、遠心分離または精密ろ過で集め、予めろ過滅菌したわき水(spring water)で１回または２回洗浄し、滅菌水で再懸濁して、３〜６×１０10ＣＦＵ／ｇ乾燥重に相当する、乾燥重２０と３０ｇ／ｌの間の細胞濃度にした。こうして得られたクリームをそのまま乾燥することができ、または安定性を上昇させるために、ベントナイト、カオリン、シリカ、ミクロセルロースまたはレシチンナトリウム塩、ならびに／あるいは水素化(hydrogenated)ココナッツ油および／またはタラ肝油などの様々な油と混合することができる。
【０００９】
内部の水収支に影響を与えず、細胞が完全であり、かつ完全に生存能力を有する(viable)ままであるように、２０℃と４０℃の間、さらに正確には２５℃と３５℃の間の温度で、真空下で乾燥プロセスを行わなければならない。経時的な安定性を維持するために、この乾燥物質の含水量は、０．１と５％の間、さらに正確には１と３％の間でなければならない。乾燥バイオマスを細かく砕き、得られた粉末を、マンニトール、ラクトース、サッカロース、マルトース、微結晶性セルロース、シリカ、ベントナイト、カオリン、レシチンナトリウム塩、ベヘン酸グリセロールなどの薬剤で汎用される賦形剤と適切に混合する。
【００１０】
この混合物を打錠機（ＫＩＬＩＡＮ）で圧縮成形し、直径１５〜３０ｍｍ、またはさらに正確には２０〜２５ｍｍであって、平均硬度２０〜４０Ｋｐ、好ましくは２５〜３０Ｋｐの錠剤を作製する。その後、メッシュ径１００〜３０００ミクロン、好ましくは４００〜１５００ミクロンのスクリーン付の振動造粒機（ＶＩＡＮＩ）を用いて、この錠剤を粒状化する。
【００１１】
選び出した顆粒を、循環スクリューミキサー（ＳＡＧＡ）を用いて溶融ワックス（水素化(hydrogenated)植物性脂肪）で被覆し、常温で冷やし、平均３（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇ乾燥重を含む５００〜１６００ミクロンのマイクロカプセルを作製した。
【００１２】
顆粒をカプセル化するための本発明のワックスは、好ましくは２５℃と６５℃の間の融点、４〜１２のＨＬＢ（親水性親油性バランス）を有し、さらに正確には３０℃と５０℃の間の融点、５と１０の間のＨＬＢ（親水性親油性バランス）を有する。有利には、モノ−、ジ−およびトリグリセリド（例えば、ＢＩＯＧＡＰＲＥＳＳ  ＶＥＧＥＴＡＬ  ８Ｍ  ２９７  Ａ．ＴＯ  ＧＡＴＴＥＦＯＳＳE）、植物性の飽和脂肪酸のＣ８〜Ｃ１８鎖よりなる半合成グリセリド（例えば、ＳＵＰＰＯＣＩＲＥ  ＡＭ，ＣＭ，ＤＭ−ＧＡＴＴＥＦＯＳＳＥ’、ＯＳＩＳ  ６０／７０／８０  ＥＵＬＩ）、植物性のモノステアレート（例えばＧＥＬＥＯＬ：モノステアリン酸グリセロール４０〜５５  ＧＡＴＴＥＦＯＳＳＥ’）などの水素化(hydrogenated)油、脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの混合物、ポリエチレングリコールのモノ−およびジエステル（例えば、ＣＥＬＬＵＣＩＲＥ  ４４／１４およびＣＥＬＬＵＣＩＲＥ  ５０／１３  ＧＡＴＴＥＦＯＳＳＥ’）、水素化(hydrogenated)パーム油（例えば、水素化(hydrogenated)植物性脂肪スプレー５８〜６０  Ｉ．Ｇ．Ｏ．Ｒ．）として定義される化合物などの群の中から、前記ワックスを選択する。
【実施例】
【００１３】
実施例１
サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＢＶＰＧ６７６３を、２８℃の培養槽（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ、Ｔｅｃｈｆｏｒｓ、スイス）においてＰｉｍ  Ｖａｎ  Ｈｏｅｋの培地で好気培養する。約１８時間後、このバイオマス（乾燥重２０〜２２ｇ／ｌ）を遠心分離で集め、ろ過滅菌した水で２回洗浄し、滅菌水で再懸濁して４〜６×１０10ＣＦＵ／ｇ乾燥重に相当する、乾燥重の約２０％の濃度にする。ベントナイト５％ｗ／ｖをこのクリームに添加する。こうして得られたクリームは、約２５％ｗ／ｖの濃度であり、約３〜５×１０10ＣＦＵ／ｇ乾燥重を有するであろう。ベントナイトを添加したクリームを、５ｍｂａｒの真空下の３２℃（±２℃）で乾燥させ、細かい粉末に砕き、以下のマイクロカプセル化用の顆粒に添加する。
【００１４】
重量％
・  サッカロミセスセレビシエＤＢＶＰＧ６７６３粉末            １０
・  マンニトール                                              ５０
・  微結晶性セルロース                                        １０
・  コロイド状二酸化ケイ素                                      ２
・  ステアリン酸マグネシウム                                    ３
・  ベヘン酸グリセロール８８８                                  ５
・  水素化(hydrogenated)植物性脂肪（Ｂｉｏｇａｐｒｅｓｓ  Ｖｅｇｅｔａｌ  ８Ｍ２９７、ＧＡＴＴＥＦＯＳＳＥ）                                  ２０
この粉末を、水素化(hydrogenated)植物性脂肪を除いたすべての成分と適切に混合する。この混合物を用いて、２０〜２５ｍｍ径の錠剤を作製し、その後、振動造粒機で粒状化し、３００〜１５００ミクロンの顆粒を作製する。この顆粒を、循環スクリューミキサーを用いて溶融植物性脂肪で被覆し、常温で冷やし、３．０（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇを含む５００〜１６００ミクロンのマイクロカプセルを作製する。
【００１５】
実施例２
実施例１において、マイクロカプセル化用の処方が以下の組成である。
【００１６】
重量％
・  サッカロミセスセレビシエＤＢＶＰＧ６７６３粉末            １０
・  ラクトース                                                ４５
・  微結晶性セルロース                                        １５
・  エアフロートタルク（Ａｉｒｆｌｏａｔ  ｔａｌｃ）            ７
・  ステアリン酸マグネシウム                                    ３
・  水素化(hydrogenated)植物性脂肪                            ２０
このマイクロカプセルは、２．９（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００１７】
実施例３
実施例１において、酵母がサッカロミセスセレビシエＧＮ／２２２０−ＮＣＹＣ２９５８である。
このマイクロカプセルは、３．１（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００１８】
実施例４
実施例１において、酵母がＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ  ＧＮ／２２１９−ＮＣＹＣ２９５７である。
このマイクロカプセルは、２．６（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００１９】
実施例５
実施例１において、マンニトール濃度が４７％であり、ベントナイト３％を添加する。
このマイクロカプセルは、３．０（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００２０】
実施例６
実施例２において、ラクトース濃度が４３％であり、ベントナイト２％を添加する。
このマイクロカプセルは、２．９（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００２１】
実施例７
実施例１において、マンニトール濃度が４４％であり、第二リン酸カルシウム６％を添加する。
このマイクロカプセルは、３．１（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００２２】
実施例８
実施例２において、ラクトース濃度が３９％であり、第二リン酸カルシウム６％を添加する。
このマイクロカプセルは、３．０（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇの含有量を有する。
【００２３】
実施例９
実施例１に記載する方法に従い、水素化(hydrogenated)植物性脂肪を被覆する前に、サッカロミセスＤＢＶＰＧ６７６３の顆粒を、１０〜１５％のタラ肝油で湿らせる。３．２（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇを含むマイクロカプセルが得られる。
【００２４】
実施例１０
実施例１に記載する通りに乾燥し、粉砕した細胞全体をタラ肝油（５−１０５）で湿らせ、実施例１および２に記載するようにマイクロカプセル化する。３．１（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇを含むマイクロカプセルが得られる。
【００２５】
実施例１１
実施例１、２、５、６、７、８および９に記載される手順で、サッカロミセスセレビシエＤＢＶＰＧ６９０７クリームを得る。２．９〜３．４（±５％）×１０9ＣＦＵ／ｇを含むマイクロカプセルが得られる。