(57)【要約】【課題】本発明は、シリカ連続体カラム担体の高い分離性能を維持したまま、多様な分離モードを提供するカラムを作成する。【解決手段】本発明は、多孔性シリカ連続体に異なる表面修飾をした膜を交互に積み重ねてなる多孔性シリカ連続体カラムを提供する。また、表面修飾をしない無修飾の膜を交互に積み重ねても、未修飾の膜と修飾の膜を交互に積み重ねてもよい。多孔性シリカ連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより作製してなる。【選択図】      図７
2006223960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性シリカ連続体に異なる表面修飾をした膜を交互に積み重ねてなる多孔性シリカ連続体カラム。
【請求項２】
多孔性シリカ連続体が、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより作製してなる請求項１記載の多孔性シリカ連続体カラム。
【請求項３】
多孔性シリカ連続体が、ゾル-ゲル転移の後焼成してメソポアを減少させてなる請求項２記載の多孔性シリカ連続体カラム。
【請求項４】
表面修飾の膜が、オクタデシルジメチルクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン、3-メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリル酸3-スルホプロピルカリウム塩、3-アミノプロピルトリエトキシシランから選ばれてなる請求項１記載の多孔性シリカ連続体カラム。
【請求項５】
請求項1乃至４記載の多孔性連続体シリカカラムを用いてグリコヘモグロビンを分離することを特徴とする多孔性連続体カラムの使用法。
【請求項６】
メタクリル酸3‐スルホプロピルカリウム塩の修飾膜とオクタデシルジメチルクロロシランの修飾膜を交互に三層重ねてなる請求項５記載の多孔性連続体カラムの使用法。
【請求項７】
積層された多孔性シリカ連続体の膜に無修飾の多孔性連続体膜を含む請求項１記載の多孔性シリカ連続体カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマトグラフィー用カラム、特に多孔性シリカ連続体を用いたカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に代表される、カラム充填剤を用いた分離技術は、天然及び合成有機化合物、医薬品、生体成分などの精密分離定量、分取精製のための一般的な手法であり、広い分野で利用されている。ＨＰＬＣの分離モードの７０〜８０％は逆相液体クロマトグラフィーであり、主に疎水性の固定相と親水性の移動相との間で溶質が分配され、疎水性の差によって分離が達成される。近年生体由来成分など、イオン性、水溶性の高い試料の分離分析に関する要求が高まり、イオン交換型液体クロマトグラフィー、親水性相互作用型液体クロマトグラフィーについても利用例が増えている。
【０００３】
この逆相液体クロマトグラフイーの利点としては、1)対象とする化合物の範囲が広い、2)水を含む２-３種類の溶媒で非常に広い範囲を取り扱うことができる、3)クロマトグラフィーの結果に再現性が得られやすい、4)サンプルを高温に曝さずに済む、等が挙げられる。そして、逆相液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤としては、化学結合型シリカゲル充填剤と架橋有機ポリマー充填剤が汎用され、化学結合型シリカゲル充填剤はカラム効率が高いものの化学修飾法の種類が少なく、また酸、塩基条件下で不安定であるなどの特徴を有し、一方、架橋有機ポリマー充填剤はカラム効率がやや低いものの化学修飾法の種類が多く、酸、塩基に対して比較的安定であるという特徴を有する。
【０００４】
すなわち、架橋有機ポリマー充填剤には多くのミクロポア（１〜２nm以下の細孔）が存在し、この部分の大きさや形と適合する溶質が入り込むため遅い拡散を生じ、カラム効率が低くなる。化学修飾については、表面の多様な化学修飾が可能であり、また化学的（酸性、塩基性条件下）にも高い安定性を示す。
【０００５】
それに対して、化学結合型シリカゲル充填剤においてはシリカゲル粒子が持つメソポア（２-５０nmの細孔）内での溶質の拡散が容易であることから高いカラム性能が得られる。しかし、化学的修飾を行う場合、シラノール基と反応する官能基に制限を伴うため、化学修飾法が制限されること、残存するシラノール基や金属不純物による二次的な保持効果が起こること、高いｐＨ（＞８）でのシリカゲルの溶解、または低いｐＨ（＜２）でケイ素-酸素結合の切断が起こること等の問題が挙げられる。
【０００６】
一般に、逆相型シリカゲル充填剤以外の充填剤は、カラムを成形する際の充填条件を最適化するのが容易ではなく、逆相型とフッ素含有型、イオン交換型など、分離モードの異なる充填剤を段階的に、あるいは完全に混合して充填することで高性能のカラムを得ることは困難である。
【０００７】
三次元的に網目状構造のシリカ骨格を有するシリカ連続体カラムは、粒子充填型のカラムとはカラム形成過程が根本的に異なり、充填作業を必要としない。その高い透過度のため送液圧力が低く、粒子充填型カラムを用いては運転不可能な超高速条件下での分離を可能にした。またその細いシリカ骨格に起因する分離性能の改善は著しく、総合的に粒子充填型に比べて一桁高い分離性能を提供することができる（特許文献１）。
シリカ連続体カラムはカラム体積あたりのシリカ骨格量が10〜20％程度にとどまり、必然的に識別置換基の導入量が少なくなる。逆相型カラムと比較すると、サンプルの保持係数は粒子充填型の三分の一程度しか得られないことが特徴であり、サンプルの保持量が小さいことが欠点でもあった。
さらに、相互作用が混合により打ち消し合い、望む複数の分離モードを同時に加算的に発現させることは困難である。
【０００８】
【特許文献１】特開平６−２６５５３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ポストゲノム時代の研究ニーズの一つに、タンパク質、ペプチド、脂質、糖、代謝物など、生体由来の非常に複雑な多成分試料の網羅的分離分析の必要性が多くなっていることが挙げられる。しかしながら、イオン交換型、親水性相互作用型、サイズ排除型の分離機能を持つ粒子充填型カラムの分離性能は逆相型のそれに比べて明らかに低く、理論段数１万を達成することができないものが多いため、複雑成分の網羅的分離分析には性能が不足している。
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的はシリカ連続体カラム担体の高い分離性能を維持したまま、多様な分離モードを提供するカラムを作成することである。従来型のシリカ連続体カラムより大きいサンプル保持容量を達成するとともに、シリカ担体表面がサンプルと接触しないようなカラムの作成も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために本発明者らが鋭意検討を行ったところ、多孔性シリカ連続体を膜状にして、表面修飾の異なる膜を交互に積み重ねることにより、シリカ担体表面とサンプルとの接触を極力抑えること、保持容量を増大することで多種類の分離モードの提供を可能としたことにより本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、多孔性シリカ連続体に異なる表面修飾をした膜を交互に積み重ねてなる多孔性シリカ連続体カラムを提供する。なお、本発明において“膜”という用語は、ディスクもしくはプレートをも含む概念である。また、表面修飾をしない無修飾の膜を交互に積み重ねても、未修飾の膜と修飾の膜を交互に積み重ねてもよい。
多孔性シリカ連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより作製してなる。
また、多孔性シリカ連続体は、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜50nmのメソポアが存在する。ただし、メソポアは、ゾル-ゲル転移の後焼成して減少させてもよい。
本発明の多孔性連続体シリカカラムを用いれば、例えば、グリコヘモグロビンの高速分離に最適である。この場合、メタクリル酸3‐スルホプロピルカリウム塩の修飾膜とオクタデシルジメチルクロロシランの修飾膜を交互に二層から五層、好ましくは三層重ねて用いるのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における多孔性シリカ連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【００１２】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【００１３】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１４】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１５】
相分離・ゲル化にあたっては、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜２４時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１６】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１７】
多孔性シリカ連続体は、メソポアを有しても焼成して消失させてもよい。焼成温度は、例えば600℃から1200℃、好ましくは、950℃から1050℃である。特に950℃焼成から1050℃焼成にかけてその比表面積，メソポア細孔径，細孔容積はそれぞれ大きく減少し，その分機械的強度が大きくなる。
【００１８】
表面修飾の膜は、例えば疎水性の修飾剤、スペーサーを介してイオン交換基を導入することにより作製する。疎水性の修飾剤は、例えば、オクタデシルジメチルクロロシランをはじめとするアルキルジメチルクロロシラン、アルキルメチルジクロロシラン、アルキルトリクロロシランを用いることができ、スペーサーとしては、例えば、メタクリロイルプロピルトリメトキシシラン（トリエトキシ可）などを用いることができ、イオン交換基としては、メタクリル酸3-スルホプロピルカリウム塩、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、（メタ）アクリル酸、4-(2-）ビニルピリジン、4-ビニルフェニルスルホン酸などを用いることができる。
これらの修飾は、多孔性シリカ連続体に反応溶液をシラノールの１当量から10当量、好ましくは５当量を加え、温度50℃〜120℃、好ましくは60℃〜110℃で反応させる。例えば、ODS（オクタデシルジメチルクロロシラン）、ピリジンを多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基量の５当量分加え、24時間トルエン還流条件で反応させた。カチオン交換膜（MASK膜）の調製 では，多孔性シリカ連続体膜にトルエン溶媒中でスペーサーとなるMOP（３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン），2,6-ルチジンを多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基の5当量ずつ加え，24時間トルエン環流条件下で反応させた後，トルエン，メタノールで洗浄した。多孔性シリカ連続体膜表面にスペーサーであるMOPが修飾された後，MASK（メタクリル酸３−スルホプロピル）をシリカ膜表面に存在するシラノール基の5当量，開始剤にBPOを用いて24時間メタノール環流条件下で反応させた後，水，メタノールで洗浄した。 
アニオン交換膜の調製では、多孔性シリカ連続体膜にAPS（３−アミノプロピルトリエトキシシラン），ピリジンを多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基の5当量ずつ加え，24時間トルエン環流条件下で反応させた後，トルエン，エタノールで洗浄した。
表面修飾膜は、ブロック体でも積層体でもいずれでもよい。
分離試料に応じて、修飾膜の種類を選択することができる。例えば、グリコヘモグロビンを分離するときは、イオン交換基を有する表面修飾膜と逆相系の修飾膜を交互に複数層、好ましくは３層以上積層させる。これ以外にも例えば、タンパク質、アミノ酸等を分離するときは、異なるイオン交換基修飾膜を複数枚積層させる。
【実施例】
【００１９】
多孔性シリカモノリスの調製
分子量10,000 のポリエチレングリコール（PEG） 4.2 g に0.01 N 酢酸水溶液50 ml を加え攪拌し溶解させた。完全に溶解した後に氷冷し，テトラメトキシシラン24 ml を加え攪拌を継続した。角型容器に溶液を移しテフロンリングを入れ，密封して40℃恒温槽（水浴）に1 日間放置した。得られたシリカバルクをエタノール/水=1/1（v/v）の水溶液に浸漬し1 日放置した。このバルクを0.5 M 尿素水溶液に浸漬させ，テフロン製の分解ビンを用いて加熱処理した後，
40℃オーブンに移し2 日間放置し，続いて60℃オーブンに移し1 日間放置し，電気炉を用いて焼成して，多孔性シリカモノリスを調製した。
多孔性シリカ連続体膜の調製
多孔性シリカモノリスを直径12 mm，厚さ3.0 mm の円筒状（膜状）に加工し，これに熱収縮チューブ（PTFE）を巻き成形することにより多孔性シリカ連続体膜を調製した。
【００２０】
多孔性シリカ連続体膜へのオクタデシルジメチルクロロシラン（ODS），ヘキサメチルジシラザン（HMDS）の修飾
多孔性シリカ連続体膜をエタノール，トルエンで共沸し反応系から水を排除した後，トルエン溶媒中でオクタデシルジメチルクロロシラン（ODS）を多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基の5 当量分加え，24 時間リフラックスさせた後，トルエン，テトラヒドロフラン，エタノール/水=1/1（v/v），エタノールの順で洗浄し，減圧乾燥した。ODS 化した多孔性シリカ連続体膜にヘキサメチルジシラザン（HMDS）の20%トルエン溶液を17 時間リフラックスさせ，トルエン，テトラヒドロフラン，エタノールの順で洗浄した。
【００２１】
多孔性シリカ連続体膜への3‐メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（MOP），メタクリル酸3‐スルホプロピルカリウム塩（MASK）の修飾
多孔性シリカ連続体膜にトルエン溶媒中でスペーサーとなる3‐メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（MOP），2，6‐ルチジンを多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基の5 当量ずつ加え，24 時間リフラックスさせた後，メタノールで洗浄した。
多孔性シリカ連続体膜表面にスペーサーであるMOP が修飾された後，メタクリル酸3‐スルホプロピルカリウム塩をシリカ膜表面に存在するシラノール基の5 当量，開始剤に過酸化ベンゾイル（BPO）を用いてメタノール溶媒中で24時間リフラックスさせた後，水，メタノールで洗浄した。
【００２２】
多孔性シリカ連続体膜への3‐アミノプロピルトリエトキシシラン（APS）の修飾
多孔性シリカ連続体膜にトルエン溶媒中で3‐アミノプロピルトリエトキシシラン（APS），ピリジンを多孔性シリカ連続体膜表面に存在するシラノール基の5 当量ずつ加え，24 時間リフラックスした後，トルエン，エタノールで洗浄した。
【００２３】
多孔性シリカ連続体膜の特性
1)BET法による細孔観察
表面積測定装置（ジェミニ2375 [V 5.0]）を使用して，BET比表面積（m2/g），メソポア細孔径（nm），細孔容積（cm3/g）の測定を行った。
焼成温度の変化によるBET比表面積（m2/g），メソポア細孔径（nm），細孔容積（cm3/g）の測定を行った。焼成温度を600℃から1050℃に上昇させることで，その比表面積，細孔容積が減少する傾向がみられた。特に950℃焼成から1050℃焼成にかけてその比表面積，メソポア細孔径，細孔容積はそれぞれ大きく減少し，その分機械的強度が大きくなっていることが確認できた。これは，1000℃付近にシリカの溶融点が存在することにより，この温度付近での焼成はシリカモノリス骨格の極端な収縮を生じさせ，比表面積，メソポア細孔径，細孔容積の大幅な減少をもたらしたと思われる。
膜カラムが手締め式のカラムであるという性質上，ある程度分離媒体である多孔性シリカ連続体膜に機械的な負荷がかかることから，以後の実験では機械的強度の最も大きかった1050℃焼成の多孔性シリカ連続体膜を使用することにした。
【００２４】
HPLC測定による細孔特性の解析
気孔率の算出
カラム内に多孔性シリカ連続体膜が挿入されている時とされていない時とで，それぞれのt0（保持を持たない溶質の溶出時間）を測定し，その際の流速から多孔性シリカ連続体膜内の空隙量を算出した。この値と多孔性シリカ連続体膜の見掛け上の全体積とから，多孔性シリカ連続体膜の空隙率（気孔率）を算出した（気孔率p = 0.651）。
【００２５】
HbA1c分析
1)MASK膜，MASK & ODS膜によるHbA1c分析の比較
膜カラムに流れ方向の上流側から順に以下のように多孔性シリカ連続体膜を挿入する際に略称を付けた。今後必要のある場合はこの法則に従って記述するものとする。
ODS 膜単独の場合⇒“O”
MASK 膜単独の場合⇒“M”
MASK 膜→ODS 膜の順の場合⇒“MO”
MASK 膜→ODS 膜→MASK 膜→ODS 膜→MASK 膜→ODS 膜の順の場合
⇒“MOMOMO”
MASK 膜→MASK 膜→MASK 膜→ODS 膜→ODS 膜→ODS 膜の順の場合
⇒“MMMOOO”
HPLC によるHbA1c の測定では，イオン交換クロマトグラフィーの原理によってHb 成分をHbA0，HbA1a+b，HbA1c 分画に分離し，逆相分配クロマトグラフィーの原理によってHbA1c 分画中のHbF，L-HbA1c，St-HbA1c を分離するということが知られている。
HbA1c の分離に必要とされている「カチオン交換性相互作用」と「疎水性相互作用」の二つに関して，これら二つの作用がどの程度ずつ分離に寄与しているのか検討を行った。
Hb 試料の溶出に対する基準カラムとして，市販のカチオン交換カラムであるSP-NPR（TSK-gel）を用いて評価を行った（図１）。
まずカチオン交換性相互作用の寄与を確かめるべく，“M”と“MO”を使用してHPLC による分析を試みた（図２）。
【００２６】
HPLC 条件
Column：Membrane column（“M”or“MO”）
Flow rate：0.4 ml/min
Detection：415 nm
Temperature：25℃
Eluent：
（A）；20 mM MES，20 mM HEPES，0.01% NaN3（pH5.20）
（B）；20 mM MES，20 mM HEPES，400 mM NaCl，0.01% NaN3 (pH7.00)
Injection volume：3 μl
Gradient table：
Time (min) 0 10 16 17 35 36 38 39 50
B (%)     18 19 23 26 28 80 80 18 Stop run
【００２７】
この結果から，“M”でもHbA1c をある程度分離できることが確認できた。
しかし図２ からもわかるように，注入回数が増すにつれてHbA1c ピークが後ろに溶出してくるHbA0 ピークに吸収されていく現象がみられた。また，HbA1c に対して，“M”の分離能よりも明らかに“MO”の分離能の方が優れており，この比較ではODS 膜の必要性が大きいことが伺えた。
エージングに関しては，“M”では1〜2 回程度で済むが，“MO”にでは10 回程度の試料注入が必要であり，HbA1c 分析の一つの問題点であるエージングに関しては“M”の方が有利であることがわかった。これより，エージングはODS膜による疎水性相互作用が関連していることが示唆された。
【００２８】
2)ODS膜，MASK & ODS膜によるHbA1c分析の比較
次に疎水性交互作用の寄与を確かめるべく，“O”と“MO”を使用してHPLCによる分析を試みた。分析条件は[００２６]と同じである。
この実験の結果（図３）から，“O”ではHbA1c を全く分離できないことが確認できた。
“M”と比較した際に，明らかにその分離性能には差が有り，他分画からのHbA1c 分離にはカチオン交換性相互作用が大きく寄与していることが裏付けられた。しかし“MO”で測定しても，HbA1c ピークは一本のピークであり，L-HbA1c とSt-HbA1c の分離傾向は全く見られなかった。
エージングに関して，“O”と“MO”の比較から，エージングの回数はMASK膜を挿入することでほぼ変化しないことがわかった。しかし，この実験結果から“O”による評価を行った際に，エージング終了後，ピークが二つに分離するという現象が起こった。その原因について，エージングの段階でODS 膜に吸着した血中タンパク質がヘモグロビン試料と相互作用したことが可能性として考えられる。
また“MO”による評価でも，HbA1c のピークはエージングが終了した後に前方にシフトする傾向が見られている。これもまた，ODS 膜に吸着した血中タンパク質による相互作用を示唆している可能性がある。
今回はエージングの定義を溶出ピーク面積の変動がなくなった時点までとしたが，ピークの変動（移動）がなくなるまでをコンディショニングと考えると、コンディショニングにはエージングともう一つの作用が寄与しているように思われる。このもう一つの作用については定かではないが，今回の実験により，血中タンパク質の吸着により生じている現象ではないかと考えられた。このことに関してはさらなる検討が必要である。
他に観察された現象として，評価を一旦（数時間）中断し，送液を再開するという操作を行うことによって，中断直前と再開直後ではピーク形状に著しい変化が見られた。この変化は，再開直後の全体のピーク形状が中断直前のものから数回注入する前のピーク形状と似たものとなるという現象であった。これもまた血中タンパク質の吸着による作用であることが伺える。
これらの推察は，評価後にODS 膜のみが赤く着色しており，血中タンパク質，特にその色からHb タンパク質の吸着が予想出来ることに起因している。
これらのことから，血中タンパク質の中で少なくともHb タンパク質が疎水性部分（主にODS 膜）に吸着していることが推察でき，この吸着が生じることによってヘモグロビン試料とODS 膜が疎水性相互作用以外に弱い吸着を起こしている可能性が示唆された。
【００２９】
3)長さの異なるODS膜（“O1”と“O2”）を使用した“MO1”と“MO2”の比較
これまでの結果からODS膜がエージングに関与していることはほぼ間違いないと思われる。そこで，ODS膜の全長（厚み）が3.5 mm（“O1”）のものと7.7mm（“O2”）のものを使用して，ODS膜による疎水性相互作用がエージングにどの程度寄与しているのかを“MO1”と“MO2”を評価することで確認した（図４）。評価に用いたHPLC条件は[００２６]と同じである。
微細孔の空いていない，ノンポーラスな充填材を使用した場合にはほとんどエージング現象がみられないということが以前の研究からわかっており，ヘモグロビンは分子サイズが約6.4 x 5.5 x 5.0 nmの球状分子であることから，5.0nm付近の細孔が存在するとその細孔にHb分子がはまり込むことによって「エージング」現象が生じるという議論がなされているが，吸着現象の起こる正確な要因はまだ断定されていなかった。
今回行った実験では先に挿入したMASK膜と組み合わせるODS膜として，全長が3.5mm（“O1”）の膜と7.7mm（“O2”）の膜を使用しているが，二つの膜におけるエージング回数を比較すると，“O1”の約倍の厚さをもった“O2”を用いた“MO2”ではエージング回数も約倍になるという結果が得られた。
今回用いた多孔性シリカ連続体膜には，4.0 nm付近のメソポアと呼ばれる微細孔が微量に存在している。しかし，メソポア自体が微量であること，またその細孔径分布が4.0 nm付近に集中していることからも，細孔にHb分子全体がはまり込むことによってのみエージング現象が引き起こされるというようなことは考えにくい。このことから，Hb分子のある一部分だけが多孔性シリカ連続体膜の細孔にはまり込み，そこで疎水性相互作用を示す過程がエージングに寄与しているのではないかということが示唆された。
【００３０】
4)HbA1c分析の高速化
高流速条件によるHbA1c分析の高速化
“MO”によりある程度のHbA1c 分析が可能となったことから，最終的な目的であるHbA1c 分析の高速化を試みた。
第一のプロセスとして，前回まで使用していた分析条件と比較して，流速を9.99 ml/min（従来の25 倍），タイムプログラムをそれぞれ25 分の1 にすることで高速化をはかった。
【００３１】
HPLC 条件
Column：Membrane column（“MO”）
Flow rate：9.99 ml/min
Detection：415 nm
Temperature：25℃
Eluent：
（A）；20 mM MES，20 mM HEPES，0.01% NaN3（pH5.20）
（B）；20 mM MES，20 mM HEPES，400 mM NaCl，0.01% NaN3 (pH7.00)
Injection volume：3 μl
Gradient table：
Time (min) 0   0.40 0.64 0.68 1.40 1.44 1.52 1.56   2.00
B (%)     18    19   23   26   28   80   80   18   Stop run
【００３２】
この検討では，高速化を実現する為に単に高流速条件での分析を行っていた。
この方法では確かに高速分析が可能になり分析時間の短縮化が可能となるが、高流速状態で複雑なタイムプログラムのグラジエント分析を行うことにより装置に負担がかかり、得られるデータの再現性も低く，どのピークがHbA1c か同定できなかった。
【００３３】
HbA1c分析条件の最適化(1)
前記の測定では流速があまりに早かったために，装置系の安定性に欠け，再現性のあるデータが得られなかったことから，この状態を打開する為にグラジエント条件と移動相組成の改善を試みた。まず、装置が安定してグラジエントのミキシングが出来る範囲での流速として4.0 ml/min（従来の10 倍），タイムプログラムをそれぞれ10 分の1 にして測定を行った（図５）。
【００３４】
HPLC 条件
Column：Membrane column（“MO”）
Flow rate：4.00 ml/min
Detection：415 nm
Temperature：25℃
Eluent：
（A）；20 mM MES，20 mM HEPES，0.01% NaN3（pH5.20）
（B）；20 mM MES，20 mM HEPES，400 mM NaCl，0.01% NaN3 (pH7.00)
Samples：Normal level sample（ノーマルサンプル），High level St-HbA1c
sample（アブノーマルサンプル）
Injection volume：3 μl
Gradient table：
Time (min)   0  1.0 1.6 1.7 3.5 3.6 3.8 3.9  5.0
B (%)       18  19   23  26  28  80  80 18  Stop run
【００３５】
この方法で測定を行うと，装置が安定してグラジエントのミキシングを行えることから再現性のあるデータが得られた。また，従来までは60 分で1 検体という，非常に長時間の分析しか行えてなかったのが，今回の試みにより5.0 分で1検体というある程度の高速化が達成できた。
今回得られたクロマトグラムから，HbA1c の割合を算出した（表１）。
この表から，ノーマルサンプルにおけるHbA1c の割合が7.5%，アブノーマルサンプルにおけるHbA1c の割合が12.2%であり，ノーマルサンプルに関しては正常成人のHbA1c 割合（表２）と比較すると“可”の範囲に分類されることとなり，少し高値を示しているようではあるが，ある程度合理性のある結果となった。
表１. HbA1c の割合
ノーマルサンプル    7.5%
アブノーマルサンプル12.2%
表２ 正常成人のHbA1c 割合（文献値）
コントロールの評価    優        良       可     不可 
HbA1c (%)       5.8 未満 5.8〜6.5 6.6〜7.9 8.0 以上
【００３６】
また図５から，HbA1c ピークに分離傾向（L-HbA1c とSt-HbA1c）がみられた。60 分で1 検体を扱っている際にはこの傾向は見られなかったことから，分析時間短縮の効果が分離能の向上にも寄与している可能性がある。
しかし、HbA1c 分析の最先端では1.5 分で1 検体という高速分析が行われており，今回の結果では本当の意味での“高速化“は達成されなかったと言える。
以上のことから，ここまでに示した二つの方法では，流速の限界が分析時間短縮の限界となってしまい，仮に再現性のあるデータが得られたとしても最短で2.0 分で1 検体ということになるので，これ以上の高速化を目指すことは不可能であることから，更に分析条件を改良する必要性があった。
【００３７】
HbA1c分析条件の最適化(2)
ここまでの測定で、流速を上昇させることである程度までの高速化は可能であるが一定以上の流速（5.0 ml/min 以上）でグラジエント分析を行うことは装置に対して負担が大きく再現性のあるデータが得られないことが確認されたことから、高流速条件下においても負担の少ないアイソクラティックモードによる測定が可能かどうか検討を行った。
これまでの条件で得られたクロマトグラムのHbA1c ピークの溶出時間とその際のグラジエント条件（移動相組成）から、溶離液A / 溶離液B = 72 / 28（v/v）となる新しい溶離液X と、溶離液A / 溶離液B = 20 / 80（v/v）となる新しい溶離液Y を調製し、この二つの溶離液を用いて分析を行った。この分析に際して，多孔性シリカ連続体膜は，内径12.0 mm，厚さ2.0 mm という通常よりも薄い膜を採用した。このサイズに加工することにより，最高で6 枚（全長12.0 mm）の多孔性シリカ連続体膜を挿入することが可能となり，重ねあわせの有用性などを示す為にも有利であると考え適用した。
まず“MMMOOO”を使用して，新しい分析条件によりHbA1c の分析を試みた（図６）。
【００３８】
HPLC 条件
Column：Membrane column（“MMMOOO”）
Flow rate：2.00 ml/min
Detection：415 nm
Temperature：25℃
Mobile phase：Eluent X；溶離液A / 溶離液B = 72 / 28（v/v）
Eluent Y；溶離液A / 溶離液B = 20 / 80（v/v）
Method：TO-08
Samples：Normal level sample（ノーマルサンプル），High level St-HbA1c
sample（アブノーマルサンプル）
Injection volume：3 μl
Gradient table：
Time（min） 0 0.30 0.31 0.70 0.71 1.00
Y（%）      0  0   100   100   0   Stop run
【００３９】
膜の重ねあわせによる分離性能の比較を行うために，“MMMOOO”を分析したものと同じ分析条件を用いて，“MOMOMO”におけるHbA1c の分析を試みた（図６）。
図６からも明らかなように，“MMMOOO”と“MOMOMO”ではその分離性能に大きさ差が見られた。挿入している分離媒体は，MASK膜が3 枚とODS膜が3 枚（全ての膜の厚みは2.0 mm）と容量としてはどちらも同じなのにも関わらず，その性能には大きな違いが認められたことから，重ねる順番が分離性能に大きく寄与していることが示唆された。
本発明では，非常に良い分離性能を示した“MOMOMO”を使用して流速およびグラジエント条件のタイムプログラムを限界まで変化させることで，現段階でのHbA1c 分析の最高速化を試みた（図７）。
HPLC conditions
Column：Membrane column（“MMMOOO”）
Flow rate：3.00 ml/min（TO-10），4.00 ml/min（TO-09）
Detection：415 nm
Temperature：25℃
Mobile phase：Eluent X；溶離液A / 溶離液B = 72 / 28（v/v）
Eluent Y；溶離液A / 溶離液B = 20 / 80（v/v）
Method：TO-09，TO-10
Samples：Normal level sample（ノーマルサンプル），High level St-HbA1c
sample（アブノーマルサンプル）
Injection volume：3 μl
Gradient table：
TO-10  Time（min） 0 0.20 0.21 0.46 0.47 0.66
Y（%）     0   0   100 100   0   Stop run
TO-09  Time（min） 0 0.15 0.16 0.35 0.36 0.50
Y（%）     0   0   100 100   0   Stop run
【００４０】
表３ 高速化した際の各流速におけるHbA1c の割合
2.0 ml/min 3.0 ml/min 4.0 ml/min
ノーマルサンプル    6.3%       6.0%       4.5%
アブノーマルサンプル10.3%     10.5%       8.3%
【００４１】
図７のクロマトグラムをみると，流速が3.0 ml/min までの分析ではHbA0からHbA1c の高速分離が可能となっており，St-HbA1c とL-HbA1c の分離傾向も確認できた。さらに表３から，HbA1c の割合に関して，流速が3.0 ml/minまでの測定ではかなり近接した値が得られており、1.8 分に1 検体と非常に高速なHbA1c 分析が可能となった。
流速が4.0 ml/min における分析では，HbA1c ピークの前に大きなピークが検出されている。この部分には，吸着に関与できなかったHbA1c の一部が含まれていることが考えられ，正確なHbA1c の値を知る上で支障をきたす可能性がある。実際に表３からも，4.0 ml/min の条件で分析した際のHbA1c の値が少し少なめに算出されていることから，今回の分析では3.0 ml/min までが限界であることが示唆された。
このような条件で分析することで，従来までは60 分に1 検体しか分析できなかったHbA1cの値が最高で1.8 分に1 検体も分析できることになり，膜カラムという特殊なカラムを使用してのHbA1c 分析の高速化が達成できたと言える。
これは現在市販されている全自動グリコヘモグロビン測定装置（アークレー株式会社製）の所要分析時間（1.5 分で1 検体）に匹敵するものがあり，今後の可能性が期待できるものであった。
【００４２】
・多孔性シリカ連続体膜の適用が可能である膜カラムを作製しHPLC システムに導入した結果，逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー両モードにおいてその性能を発揮することが確認された。
・ある一定以上の大きさはあるが，一般的なカラムとしての加工が困難な任意のポリマー(今回はジビニルベンゼン系ポリマーモノリス)を膜状に加工することでそのHPLC 特性を迅速且つ容易に評価できたことから，「任意のポリマーをカラムに加工可能である」という膜カラムの特性を確認できた。
・性質の同じ多孔性シリカ連続体膜（ODS 膜とODS 膜），性質の異なる多孔性シリカ連続体膜（ODS 膜とMASK 膜）双方において，重ね合わせによる加法的な性能の向上が確認されたことから，「分離媒体の重ねあわせによる性能の向上」という膜カラムの特性を確認できた。
・MASK 膜とODS 膜を重ねあわせることにより，HbA1c の分離が可能であることが確認できた。さらに，厚さを2.0 mm に加工したMASK 膜とODS 膜を交互に複数枚重ねあわせ，分析条件を改良することにより，HbA1c の高速分析（約100 秒で1 検体の分析）が可能となった。これは現在市販されている全自動グリコヘモグロビン測定装置の所要分析時間と同程度のものであり，かなりの高速化が達成されたと言える。また，St-HbA1c とL-HbA1cの分離もある程度達成できた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】SP-NPRによるHbAlc分析例
【図２】“M”および“MO”における溶出挙動の変化
【図３】“O”および“MO”における溶出挙動の変化
【図４】“MO1”および“MO2”における溶出挙動の変化
【図５】分析条件の最適化
【図６】分析条件の最適化（“MMMOOO"と“MOMOMO”)
【図７】HbAlc分析の最適条件
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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