(57)【要約】【課題】  タンパク質などのパターニングすべき目的物質をマイクロパターン化した基板を提供すること。【解決手段】  パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板。
【請求項２】
パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う、請求項１に記載の基板。
【請求項３】
目的物質が、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸である、請求項１又は２に記載の基板。
【請求項４】
親和性物質がアビジン類である、請求項３に記載の基板。
【請求項５】
ドース量φが１×１０12≦φ＜１×１０16個／ｃｍ2 となる範囲でイオン注入を行う、請求項１から４の何れかに記載の基板。
【請求項６】
イオン種が、He+、Ne+、Ar+ 又はKr+である、請求項１から５の何れかに記載の基板。
【請求項７】
パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされている基板の製造方法。
【請求項８】
パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
目的物質が、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
親和性物質がアビジン類である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ドース量φが１×１０12≦φ＜１×１０16個／ｃｍ2 となる範囲でイオン注入を行う、請求項７から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
イオン種が、He+、Ne+、Ar+ 又はKr+である、請求項７から１１の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パターン化したマイクロチップ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等、各種の核酸プローブ分子を利用した解析は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。従来、ＤＮＡチップを用いた解析システムでは、構造が既知のＤＮＡを定着したＤＮＡチップを用い、該ＤＮＡチップ上に未知のＤＮＡを滴下して既知のＤＮＡと反応（ハイブリダイゼーション）させ、未反応のＤＮＡを洗浄し、ＤＮＡ同士が結合したものと、結合しないものとを選別し、その反応を発色等により解析していた。
【０００３】
これらのＤＮＡチップは、すでに構造が解析されているＤＮＡを、スポッターと呼ばれる塗布装置を用いて平面状のガラスやシリコンの基板上などに、数千〜数万ポイント塗布することによって高密度にＤＮＡ分子を定着させたものである。また、この反応（ハイブリダイゼーション）でＤＮＡチップに用いるＤＮＡ分子と検査用のＤＮＡとが結合するか否かを解析することにより、試料中に目的のＤＮＡが存在するかを調べることができる。例えば疾患等によりＤＮＡの一部が損傷している場合、ＤＮＡ間の相補性が損なわれることを検知することが可能である。
【０００４】
既知のＤＮＡを定着させたＤＮＡチップは、現在極めて高価である。ＤＮＡチップの製造方法としては、幾つかの手法が知られている。例えば、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（特許文献１及び２）、並びに予め合成したＤＮＡまたはｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給して結合する方法（特許文献３〜５、及び非特許文献１）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。一般的には、上記の何れかの方法によって核酸チップは作製されるが、作製された核酸チップを前記用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性や再現性を保証するためには、各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、プローブに利用する核酸の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、定量性や再現性の確保の見地から重要である。
【０００５】
また、アビジンをパターニングする以下のような方法（非特許文献２）が提案されている。まず、酸化膜を有するシリコン基板上に3-メルカプトプロピル−トリメトキシシランを用いメルカプト基を基板表面に形成する。その後、フォトアクティブなビオチンである1-[4-アジド-アリシラアミド]-6-[ビオチンチンアミド]-ヘキサンを、2μg/mlとなるように無水メタノールで調整し、前記メルカプト基を有する基板上に塗布する。次に所望のパターンを有するフォトマスクを介してUV光（365nm、5min）で露光することにより、フォトアクティブなビオチンと基板表面のメルカプト基が共有結合することになる。次いで、ジメチルスルホキシドで15分間リンスし、さらにH2Oで簡単にリンスすることにより、ビオチンのパターンが完成する。パターン化されたビオチンにアビジンを結合させることにより、アビジンのパターンも得ることができる。しかしながら、この方法は、UV光による露光工程があるため、露光して無水メタノールで洗浄するまで周囲からの光による暴露がないような環境に基板を保管する手間が必要になる。即ち、本発明と比較すると従来技術の方法は、現像する必要があるため工程数が多くなり、周囲からの光による影響を遮断する環境設備が必要となるという問題点がある。
【０００６】
一方、基材上にコーティングされた生体高分子材料に対してイオンビームを照射することにより細胞粘着性が制御され、照射部位が細胞非粘着面とされていることを特徴とする細胞粘着性制御材料が報告されている（特許文献６）。ここでは、生体高分子材料としてゼラチン、コラーゲン等を使用し、イオンビームとしては、加速エネルギー５０〜１５０ｋｅＶ、照射量１×１０15個／cm2 以上で照射することが記載されている。また、イオン種等の条件を選定することで、照射部位が癌細胞非粘着面、正常細胞粘着面とされた選択的粘着性表面が形成されることが記載されている。また、細胞外マトリックスをコートした培養基質にイオンビーム照射を行うことによって細胞接着を制御する技術も報告されている（非特許文献３及び４）
【０００７】
【特許文献１】特表平４−５０５７６３号公報
【特許文献２】米国特許第５４０５７８３公報等
【特許文献３】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献４】米国特許第５６０１９８０公報
【特許文献５】特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献６】特開平７−１０８０６０号公報
【非特許文献１】Science Vol.270,467,1995
【非特許文献２】Chandran R.Sabanayagam,Cassandra L.Smith, Charles R.Cantor, “Oligonucleotide immobilization on micropatterned Streptabidin surfaces", Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, No.8
【非特許文献３】細胞外マトリックスをコートした培養基質へのイオンビーム照射による細胞接着制御、鈴木嘉昭ほか、人工臓器，23 (3), (1994) pp 700-707
【非特許文献４】Cell Adhesion Control by Ion Implantation into Extracellular Matrix, Y. Suzuki, 他、Nucl. Instr. and Meth., B91, (1994) pp 588-592
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質などのパターニングすべき目的物質をマイクロパターン化した基板を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、定量性や再現性に優れ、任意の目的物質を任意にパターン化して、微細構造の表面を形成している基板を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基板表面に物理的あるいは化学的に吸着されたタンパク質などの目的物質に高エネルギー荷電粒子（イオンビーム）を照射することにより上記目的物質を消失させ、残存する面（イオンビームを照射しなかった面）の機能を利用して任意の物質をパターン化した表面を作成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされている基板の製造方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う。
好ましくは、目的物質は、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸である。
好ましくは、親和性物質はアビジン類である。
好ましくは、ドース量φが１×１０12≦φ＜１×１０16個／ｃｍ2 となる範囲でイオン注入を行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、任意のタンパク機能あるいは官能基集団を任意にパターン化して、微細構造表面の形成が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板、並びにパターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされている基板の製造方法に関するものである。
【００１５】
表面・表層加工技術は新しい優れた機能や複合機能を持つ表面表層を形成する手法として発達してきた。この技術には母材の性質を変化させずに母材表層のみを改変する方法と表面上に新しい層を形成する方法とがある。本発明で用いるイオン注入法（イオンビーム照射技術）は前者にあたり、添加効果を目的にした例ではすでにシリコンへの不純物添加法として確立された技術である。
【００１６】
イオン注入法とは、添加を目的とする粒子を高真空（例えば、10-4 Pa）中でイオン化し、数十 kV から数 MV に加速して固体基板に添加する方法である。これによって作られるイオンビームは質量分離されるため、イオンの純度が極めてよく、また加速エネルギー、照射量など制御性が高く、再現性、均一性がよい加工が可能である。また照射材料の構造変化に対するイオンビーム照射効果が解析しやすい利点を有する。
【００１７】
イオンビームによる表層の改質方法は大きく２つに分かれる。１つはイオンを添加することによるドーピング効果であり、他方はイオンが通過することにより生じる結合の切断などの照射損傷効果である。目的物質（例えば、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸など）にイオンビームを照射すると、目的物質の一次構造あるいは高次構造は破壊され、目的物質はその機能を消失する。また目的物質中の官能基にイオンビームが照射されることにより、官能基が破壊され、反応性を消失する場合もある。
【００１８】
イオン注入法におけるイオンビームは直進性を有する。この性質を利用して金属などのパターン化したマスクを試料表面に装着した後にイオンビームを照射すると、作成したパターンに従った照射面を形成が可能となる。パターンの形状は線状、円状など任意であり、それらの大きさはサブミクロンでも数mmでも任意に選択できる。本発明では、この特色を利用して、照射部分の目的物質の機能を消失させることによってパターン化機能化表面を形成することができる（図１）。
【００１９】
一方、DNAマイクロチップ及びマイクロアレイを作製するためには、プローブDNAを基板上に固定することが必要である。プローブDNAを基板上に固定するためには、例えばチオール（SH）基が末端に修飾されたプローブDNAをAu表面あるいはシランカップリング反応によりSH基が形成された基板表面にチオール結合により固定する方法、あるいは、アミノ基が修飾されたプローブDNAをシランカップリング反応等によりカルボキシル基が形成された基板表面にペプチド結合により固定する方法、基板上に形成されたゲルあるいは高分子層にプローブDNAを取り込み固定する方法など、様々な方法がある。中でも、基板表面にアビジンを均一に固定することで、末端がビオチン化されたプローブDNAを用いて固定する方法は、アビジンが4量体構造を持つことでビオチン化されたプローブDNAの固定位置が定まることから、プローブ固定密度を制御しやすいという利点を持つ。
【００２０】
本発明で用いる、パターニングすべき目的物質としては、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸などが挙げられる。
【００２１】
親和性物質としては、アビジン類などが挙げられる。ここで言うアビジン類としては、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンと安定な複合体を形成することができるこれらの改変化合物などが挙げられる。
【００２２】
タンパク質又はペプチドの種類も特に限定されず、生理活性を有する任意のタンパク質又はその断片ペプチドでもよいし、抗原、レセプター、抗体又は抗体フラグメント、核酸認識タンパク質などでもよい。核酸認識タンパク質としては、転写因子などの２本鎖ＤＮＡ認識物質などが挙げられる。
【００２３】
核酸の種類も特に限定されないが、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びペプチド核酸などを挙げることができる。核酸は、天然由来の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの断片）でもよいし、化学合成した核酸でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え核酸でもよい。例えば、遺伝子の発現を調べる場合には、ＤＮＡとしてｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、又はＥＳＴ等を使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を分析する場合には、既知の塩基配列に基づいて変異や多型に対応する各種のオリゴヌクレオチドを化学合成して使用することができる。
【００２４】
本発明では上記した目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板を用いる。基板としては、目的物質を固定できるものであれば特に限定されず、表面が平滑な基板でもよいし、表面に凹凸を有する基板でもよい。基板の材質も特に限定されないが、例えば、シリコン、多孔質シリコン、ガラス、多孔質ガラス、セラミックス、多孔質セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリスチレン、又はポリメチルメタクリレートなどを挙げることができる。基板が多孔質である場合の多孔質物質の細孔の大きさは、１〜１０００ｎｍ程度であることが好ましい。基板は、表面に被覆層を有していてもよく、例えば、熱酸化膜を有するシリコン基板、又は有機質被覆層で被覆されたガラス基板などを使用することもできる。
【００２５】
本発明では、目的物質が吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う。具体的には、例えば、パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことができる。
【００２６】
注入するイオン種としてはＨ+ ，Ｈｅ+ ，Ｃ+ ，Ｎ+ ，Ｎｅ+ ，Ｎａ+ ，Ｎ+ ，Ｏ+ ，Ｎ2+，Ｏ2+，Ａｒ+，Ｋｒ+ 等が例示されるが、目的物質の構造及び／又は機能を消失できるものであれば、これらに限定されるものではない。イオン種は特に好ましくは、Ｈｅ+、Ｎｅ+、Ａｒ+  又はＫｒ+である。
【００２７】
イオン注入の際のドース量φは１×１０12≦φ＜１×１０16個／ｃｍ2 となる範囲であることが好ましい。ドース量φが1×1012 個/ cm2より低いと目的物質の構造の破壊が生じず、改善効果が小さくなり好ましくない。
【００２８】
ビーム電流密度は約3μA/cm2 を越えない範囲に設定することが望ましい。これはビーム電流密度が過大になるとターゲットである材料の温度が上がりすぎ、パターン化部以外の材料自体が劣化する上、ガス透過性が低下するおそれがある。
【００２９】
イオン加速エネルギーに関してはこの高低によりエネルギー伝達機構に差異が生じるものと考えられるが、実際的には数MeV以下の範囲で設定することができ、好ましくは2 MeV 以下である。
【００３０】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：試料の作成（アビジン固定工程）
50nm程度の熱酸化膜を有するシリコン基板にシランカップリング反応によりアミノ基を形成し、カルボキシル化、活性エステル化工程を経て、アビジンを共有結合により基板上に固定し、試料を作製した。具体的には、下記の通り試料を作製した。
【００３２】
5mm×10mmの酸化膜を有するシリコン基板の表面をプラズマアッシング（200W, 5min）でクリーニングした後、過酸化水素水に10分間浸すことで基板表面に-OH基を形成する。純水でリンスした後、オーブン（120℃, 5分）で乾燥させる。次に、2％3-aminopropyltriethoxysilaneの無水トルエン溶液に、前記基板を浸し、50℃で30min、揺動攪拌しながら基板表面に-NH2基を形成する。トルエンでリンス後、120℃1時間乾燥させ、-NH2基を定着させる。次に、10mg/mlの無水コハク酸と0.05M のジメチルアミノピリジンを溶解した無水ジメチルホルムアミドの中に前期基板を浸し、50℃で2時間反応を行うことによりカルボキシル基が形成される。ジメチルホルムアミドでリンスした後、1-ethyl-3-(3-dimethylamino)propylcarbodiimid Hydrochloride（塩酸1-エチル-3（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとN-hydroxysiccinimide（N-ヒドロキシコハク酸イミド）をそれぞれ100mg/ml溶解した水溶液に常温で30min浸すことにより、カルボキシル基を活性エステル化する。100mM HEPES Bufferでリンス後、その表面を0.1mg/mlのアビジンもしくはストレプトアビジン水溶液に常温で1時間浸すことによりアビジンが固定され、100mM HEPES Bufferでリンスし余剰なアビジンを除去することでアビジン固定基板が完成する。
【００３３】
実施例２：イオンビーム照射
イオン注入器RIKEN 200kV Low Current Implanter で、He+, Ne+, Ar+, 又はKr+イオンを加速電圧150keV、照射量を1x1013, 1x1014 , 1x1015 ions/cm2に設定し、イオンビーム照射を行った。イオンビーム電流は0.1μA/cm2以下で行った。パターン化はパターン化されたステンレスマスクを試料表面に装着してイオンビーム照射することで行った。金属部分に照射されたイオンビームは試料表面に到達できないためにパターン化される。
【００３４】
実施例３：イオンビーム照射アレイの評価１
一末端がビオチン化、他方の末端にCy3が修飾されたpoly-T 30merを含む溶液の濃度を1μMに調整し、試料（基板）に滴下、室温で30min放置した。その後、0.5％のTween（界面活性剤）を含むPhosphate Buffer Solution（PBS） を用いて5min間常温で揺動洗浄を行い、余剰なCy3修飾poly-Tを除去した。そして、以下の撮影条件により、蛍光顕微鏡でCy3の蛍光観察を行なった。
【００３５】
（撮影条件）
・露光時間：1500 ms
・閾値： Low 800, High 3000
【００３６】
図２および図３にイオンビーム照射したアビジン固定化試料のBiotin-Cy3ラベリング結果を示す。イオンビーム照射によってアビジンは破壊され、不活性となり、蛍光強度が低下することが観察された。これらの結果よりイオンビームにより新規なバイオチップ、マイクロアレイの形成が可能であることが実証された。
【００３７】
実施例４：イオンビーム照射アレイの評価２
また、イオンビームが照射されたアビジン固定基板に、実施例３と同じ操作により一末端がビオチン化されたpoly-T 30merを固定した後、一末端にCy3が標識されたpoly-A 30merを含む1μMの溶液を用いて、55℃で3時間、揺動させながらハイブリダイゼーションを行った。0.5％のTween（界面活性剤）を含むPhosphate Buffer Solution（PBS） を用いて5min間常温で揺動洗浄を行い、余剰なpoly-Aを除去した。その結果、プローブ固定時と同様のパターンが得られることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明によるパターン化機能化表面の形成の概要を示す。
【図２】図２は、イオンビーム照射したアビジン固定化試料をBiotin-Cy3でラベリングした結果（He+, 又はNe+）を示す。
【図３】図３は、イオンビーム照射したアビジン固定化試料をBiotin-Cy3でラベリングした結果（Ar+, 又はKr+）を示す。
【図１】
2006170630.tif 000002
【図２】
2006170630.tif 000003
【図３】
2006170630.tif 000004