(57)【要約】【課題】本発明は、グリコヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の検出のための、及びそれに関連した、組成物及びアッセイ法を提供する。【解決手段】特に、グリコヘモグロビンの存在及びレベルを、血液試料又はあらゆるこのような類似好適試料において検出することができる。本発明の組成物は、亜鉛結合ドメインを示すタンパク質、特にヘモグロビン、例えばグリコヘモグロビンの、結合の向上に使用される亜鉛被覆物を有する微粒子に関する。【選択図】図１
2006058295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のグリコヘモグロビンのレベルを測定するアッセイ法であって、
ヘモグロビンを含有する試料を準備するステップと、
高親和性亜鉛結合部位を露出させる配座変化によって、ヘモグロビンを変性するステップと、
支持体に結合した亜鉛分子を使用して、ヘモグロビン分子を捕捉するステップと、
結合亜鉛分子に結合したグリコヘモグロビンの量を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
変性を界面活性剤によって行なう、請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】
界面活性剤が、コール酸塩、Ｎ−オクチル−グルコシド、Ｎ−オクチル−チオグルコシド、トリトンＸ、ツィタージェント３−１４及び胆汁酸塩からなる群から選択される１つ以上の界面活性剤である、請求項１又は２に記載のアッセイ法。
【請求項４】
結合亜鉛分子によるヘモグロビンの捕捉を、変性界面活性剤の存在下に行なうことができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項５】
亜鉛分子を微粒子に結合させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項６】
微粒子が、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズからなる群から選択されるビーズである、請求項５に記載のアッセイ法。
【請求項７】
微粒子に適用される亜鉛被覆物が塩化亜鉛である、請求項５又は６に記載のアッセイ法。
【請求項８】
微粒子がデキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５に記載のアッセイ法。
【請求項９】
キレート剤が、支持体への亜鉛分子の結合を促進する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１０】
キレート剤が亜鉛結合キレート剤である、請求項９に記載のアッセイ法。
【請求項１１】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ、ＤＭＰＳ、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、アミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類又はこれらの化合物と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載のアッセイ法。
【請求項１２】
ヘモグロビン含有試料が、全血液、赤血球、溶血血液又は血液抽出物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１３】
ヘモグロビン含有試料が、変性の前に溶解される全血液細胞である、請求項１２に記載のアッセイ法。
【請求項１４】
ヘモグロビンの変性も生じさせる界面活性剤を使用して、赤血球を溶解する、請求項１２に記載のアッセイ法。
【請求項１５】
熱を使用して、赤血球を溶解する、請求項１２に記載のアッセイ法。
【請求項１６】
試料中のグリコヘモグロビンのレベルを測定するアッセイ法であって、
血液試料を準備するステップと、
試料からヘモグロビンを抽出し、存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップと、
亜鉛分子で被覆した微粒子にヘモグロビンを曝露して、ヘモグロビン及びグリコヘモグロビンを微粒子に結合させるステップと、
微粒子に結合したＨｂＡ１ｃの量を測定するステップと、
を含むアッセイ法。
【請求項１７】
試料の溶血によって細胞結合ヘモグロビンを遊離させ、試料からヘモグロビンを抽出する、請求項１６に記載のアッセイ法。
【請求項１８】
処理工程の間のヘモグロビンの部分変性を、界面活性剤によって行なう、請求項１６に記載のアッセイ法。
【請求項１９】
界面活性剤が、コール酸塩、Ｎ−オクチル−グルコシド、Ｎ−オクチル−チオグルコシド、トリトンＸ、ツィタージェント３−１４及び胆汁酸塩からなる群から選択される１つ以上の界面活性剤である、請求項１８に記載のアッセイ法。
【請求項２０】
ヘモグロビンを亜鉛被覆粒子に曝露するステップをｐＨ７付近で行なう、請求項１６に記載のアッセイ法。
【請求項２１】
ＨｂＡ１ｃに選択的に結合し、それを標識し、それを検出可能にするシグナル発生分子に、ＨｂＡ１ｃを接触させることによって、存在するＨｂＡ１ｃの量の測定を行なう、請求項１６に記載のアッセイ法。
【請求項２２】
ＨｂＡ１ｃグリコへモグロビンレベルの評価による、糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断及びモニタリングのためのアッセイ法であって、
血液試料を準備するステップと、
試料を溶血して、細胞結合ヘモグロビンを遊離させ、ヘモグロビンを部分的に変性させるステップと、
亜鉛で被覆した微粒子上にグリコヘモグロビンを捕捉するステップと、
微粒子上の捕捉グリコヘモグロビンを、グリコヘモグロビンに結合できるシグナル発生分子に曝露するステップと、
グリコヘモグロビンに結合していないシグナル発生分子を除去するステップと、
試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージレベルを求めるために、結合したシグナル発生分子の量を定量化するステップと、
を含むアッセイ法。
【請求項２３】
適切な支持体上に微粒子を捕捉するステップと、
微粒子を洗浄して、非結合物質を除去するステップと、
ＨｂＡ１ｃに特異的なモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体に標識が結合してあるシグナル発生分子によって、ＨｂＡ１ｃを標識するステップと、
試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージを求めるステップと、
によって、試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージレベルを求める、請求項２２に
記載のアッセイ法。
【請求項２４】
生物学的試料からヘモグロビンを分離する方法であって、
生物学的試料を準備するステップと、
亜鉛で被覆された微粒子上にヘモグロビンを捕捉するステップと、
亜鉛被覆微粒子から微粒子結合ヘモグロビンを溶離するステップと、
を含む方法。
【請求項２５】
捕捉するステップの前に、試料を溶血し、試料に存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的試料が血液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
試料に存在するグリコヘモグロビンの存在を定量化するアッセイに使用することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
亜鉛結合部位を有する少なくとも１つの標的タンパク質の選択的結合についてのアッセイであって、
試料を準備するステップと、
亜鉛被覆微粒子に試料を曝露するステップと、
亜鉛被覆微粒子上に標的タンパク質を捕捉するステップと、
微粒子を分離するステップと、
微粒子に結合した標的タンパク質の存在を検出するステップと、
微粒子から標的タンパク質を任意に精製するステップと、
を含むアッセイ方法。
【請求項２９】
試料が生物学的試料である、請求項２８に記載のアッセイ法。
【請求項３０】
亜鉛結合ドメインを有する標的タンパク質の選択的結合における、亜鉛被覆微粒子の使用。
【請求項３１】
請求項１〜３０に記載のいずれか一項のアッセイ法の実施用のキットであって、請求項１に記載の微粒子並びにアッセイ法の実施のための使用説明書及びプロトコールを一緒に含むキット。
【請求項３２】
亜鉛結合ドメインを有するタンパク質を標的とした結合に使用される亜鉛被覆微粒子の使用。
【請求項３３】
診断アッセイ法において、ヘモグロビンを捕捉するために用いる亜鉛被覆微粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グリコヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）検出のためのアッセイ法の改良及び該アッセイ法に関連した改良を提供する。本発明は、特に、亜鉛結合ドメインを表示するタンパク質、特にヘモグロビン、例えばグリコヘモグロビン、の結合の向上に使用される亜鉛被覆物を有する微粒子を提供する。
【０００２】
発明の背景
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、赤血球に存在するタンパク質であり、酸素運搬の役割を担っている。ヘモグロビンは、いくつかの突然変異体で存在し、最も一般的な形態は、ヘモグロビンＡであり、これは血中に見出される総ヘモグロビンの約９０％を占める。
【０００３】
Ａ１ｃはヘモグロビンＡの特殊サブタイプである。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンの糖化形態であり、これは、ヘモグロビン（Ａｏ）ベータ鎖のＮ−末端バリン基の非酵素的糖化によって形成される。非糖尿病個体において、総ヘモグロビンの約９０％が、非糖化形態（ヘモグロビンＡｏ）で存在する。体液中に溶解状態で存在するタンパク質は、連続的に糖化過程に付される。グルコースがヘモグロビンＡにゆっくり結合して、Ａ１ｃ糖化サブタイプを形成する。ＨｂＡ１ｃの形成は、約３．０％〜６．５％のヘモグロビンがＡ１ｃサブタイプである際に定常状態に達する。大部分の糖尿病個体は、非糖尿病の人より高い血中グルコース濃度を有する。この結果として、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃレベルはより高くなり、I型（若年性）及びII型（成人発症）糖尿病患者は、約６％〜約１５％のＨｂＡ１ｃレベルを有することとなる。
【０００４】
糖尿病は、不十分な血糖調節に関連した疾患である。糖尿病関連合併症は、血中グルコース濃度の長期モニタリング及び厳格な管理によって減少し得る。血中グルコース濃度が明らかに高い患者において、ＨｂＡ１ｃレベルも高くなりうる。
【０００５】
個人のＨｂＡ１ｃレベルの定量は、現在の血中グルコース平均濃度の指標としての役割を果たすことができ、この指標は、次に、組織の糖化損傷の可能性レベル、それと共に、この状態が長期間維持された場合の関連糖尿病合併症の可能性を示すことができる。
【０００６】
ＨｂＡ１ｃ検査は、個人の血糖管理の優れた指標として十分に確定している。ＨｂＡ１ｃ検査（ヘモグロビンＡ１ｃ検査、グリコヘモグロビンＡ１ｃ検査、グリコヘモグロビンＡ１ｃ検査又はＡ１ｃ検査としても知られている）は、２〜３ヶ月間にわたる平均血中グルコース濃度を明らかにする検査室ベースのアッセイである。この検査は、ヘモグロビンに結合したグルコース分子の数を測定する。赤血球は、約９０〜１２０日の標準寿命後に再利用されるので、現在の血液試料中の結合グルコースの測定によって、２〜３ヶ月前の平均血糖レベルを求めることができる。
【０００７】
より長い期間のグルコースレベルをモニタリングするためのＨｂＡ１ｃ検査の使用は、血液、血漿又は尿中のグルコース濃度を個人が測定することによって直接行なう連続した日々の血中グルコース濃度のモニタリングを補足する役割をする。
【０００８】
現在、ＨｂＡ１ｃレベルのモニタリングは、状態が適切に管理されているか否かを評価するために糖尿病をモニタリングする最も優れた方法の１つである（１９８３〜１９９３年にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓによって行なわれたＤＣＣＴ臨
床試験）。特に、この検査によって、医師は、糖尿病患者が最適血糖管理を行なうことを確実にすることができ、さらに、医師による検査と検査の間のグルコースレベルを糖尿病患者が適切に管理することも確実にすることができる。
【０００９】
全てのII型糖尿病患者は、ＨｂＡ１ｃ検査を少なくとも年に２回受けることが推奨される。得られた血中グルコース濃度が高すぎる場合、より頻繁な間隔での再検査が薦められる。この検査は、ヨーロッパ及び米国だけで毎年約４０００万件行なわれている。
【００１０】
ＨｂＡ１ｃレベルの定期的な判定は、患者自身が自分の状態を管理し得るようにし、その結果、糖尿病患者における重篤な眼、腎臓及び神経疾患を遅らせるか又は予防し得る。個人の全体的な健康において、これに関連した向上も得られる。
【００１１】
ＨｂＡ１ｃレベルの測定に使用される現在の方法は、イオン交換又は親和性樹脂上でのカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含する。しかし、これらの方法はいずれも多くの欠点を有し、例えば、正確でないか又は容易に標準化できず、高コストであり、そして／又は複雑な手順を含むために、ＨｂＡ１ｃを測定する方法として理想的でない。
【００１２】
従って、ＨｂＡ１ｃレベルの正確な検出のための、迅速な、信頼性できる、使用の容易な方法が必要とされている。
【００１３】
発明の概要
本発明者らは、亜鉛で被覆した微粒子が、亜鉛結合ドメインを有する標的タンパク質、特にヘモグロビン及びグリコヘモグロビンのような誘導体の結合を促進することを意外にも見出した。従って、これらの微粒子は、グリコヘモグロビンの検出法、さらには、少なくとも１つの亜鉛結合部位を示すタンパク質又は他の分子の分離法に使用することができる。
【００１４】
本発明の第１の態様によれば、試料中のグリコヘモグロビンのレベルを測定するアッセイ法であって、
ヘモグロビンを含有する試料を準備するステップと、
試料からヘモグロビンを抽出し、存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップと、
亜鉛分子で被覆した微粒子にヘモグロビンを曝露して、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を微粒子に結合させるステップと、
試料中のＨｂＡ１ｃの量を測定するステップと、
を含むアッセイ法を提供する。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、試料は、血液、特に、ヒト凝固阻止全血である。他の実施形態において、試料は、赤血球ペレット、溶血血液、又は血液抽出物、例えば血清であってもよい。さらに他の実施形態において、試料を、濾紙で採集し、乾燥し、次に、再溶解させてもよい。
【００１６】
本発明の１つの実施形態において、細胞結合ヘモグロビンを遊離するために試料を溶血させることによってヘモグロビンを得る。この工程は、血液試料が全血液又は赤血球である場合に特に望ましい。血液試料は、当業者によく知られている方法、例えば、サポニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又は四級アンモニウム塩のような溶血剤の添加によって溶血させることができる。
【００１７】
本発明は、熱を使用して行なわれる溶血にも提供される。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、処理工程の間のヘモグロビンの部分変性を界面活性剤によって行なう。ヘモグロビンの好ましい変性度を得るために、最適化組合せの界面活性剤を配合し得る。本発明の１つの態様において、好ましい界面活性剤は、コール酸塩、Ｎ−オクチル−グルコシド、Ｎ−オクチル−チオグルコシド、トリトンＸ、ツィタージェント３−１４及び胆汁酸塩である。ヘモグロビンの変性の重要性は、これがヘモグロビン分子における配座変化を生じることである。この配座変化は、ヘモグロビン分子への亜鉛の高親和性結合を促進し、可能にする。高親和性結合の発生は、それが、アッセイ法の間に行ないうる１つ以上の任意洗浄工程の間に亜鉛及びヘモグロビンを会合状態に維持し得るので、本発明に関して特に好ましい。
【００１９】
ヘモグロビンの変性は、亜鉛分子への高親和性結合を可能にする結合部位を形成し、それと同時に、ヘモグロビンの存在を示すために抗体又は同様の結合要素が結合し得るエピトープを保持する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、試料に含有されているヘモグロビンを部分的に変性する前に、試料を先ず溶血させる。
【００２１】
１つの実施形態において、亜鉛被覆微粒子にヘモグロビンを曝露するステップを、ｐＨ７周辺、好ましくはｐＨ６〜８で行なう。
【００２２】
本発明はさらに、ラテックスビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズである微粒子を提供する。ラテックスビーズが好ましい。亜鉛分子の結合を促進するために、カルボキシル基をラテックスビーズの表面に与えてもよい。代替物として、シリカビーズを使用してもよい。しかし、シリカビーズは、一般に、ラテックスビーズより重く、従って、本発明のアッセイの実施にはあまり好ましくない。特にこれらのアッセイが自動化されている場合が該当する。微粒子がシリカである場合には、好ましくは直径が１０〜５０マイクロメートル、より好ましくは直径が２０〜３０マイクロメートルである。１つの実施形態において、シリカ粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
【００２３】
他の実施形態において、微粒子は、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。微粒子がデキストランである場合、デキストラン主鎖を形成するのが好ましい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させてもよく、該キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合状態にある際に、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【００２５】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。本発明は、キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ及びＤＭＰＳを包含する。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【００２６】
１つの実施形態において、亜鉛被覆物は、微粒子を活性化する作用をする。典型的に、塩化亜鉛を使用して、微粒子を被覆する。または、あらゆる適切な亜鉛塩又は亜鉛の元素形態を使用して、微粒子の表面に結合させてもよい。
【００２７】
他の実施形態において、微粒子は、予め荷電された亜鉛粒子によって活性化されたキレートビーズである。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、本発明に係る微粒子への結合後、ＨｂＡ１ｃに選択的に結合させることによって標識し検出可能としたシグナル発生分子に、ＨｂＡ１ｃを接触させることによって、存在するＨｂＡ１ｃの量の測定が行なわれる。適切なシグナル発生分子は、特に、グリコヘモグロビンに選択的に結合できるが、非糖化ヘモグロビンには結合できない直接標識物、酵素標識物又は放射性標識物であってもよい。このシグナル発生分子は、特異的結合パートナー、例えば、抗体、好ましくはモノクローナル抗体によってＨｂＡ１ｃに結合し得るが、ボロン酸のようなあまり好ましくない他の結合剤も使用し得る。本発明はさらに、抗体に結合されるシグナル発生分子も提供する。
【００２９】
抗体を検出可能に標識する１つの方法は、それを酵素に結合させることである。次に、この酵素は、後にその基質に曝露された際に、基質との反応を触媒し、それによって、例えば分光測光法又は蛍光定量法（ＥＬＩＳＡ系）によって検出できる化学成分を生じる。
【００３０】
検出可能な標識として使用し得る酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼである。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ系の感度増加のために、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体と反応するビオチン化抗体を使用して、前記の方法を改変し得る。ビオチン化を検出する他の方法も使用し得る。このような方法は、当業者に明らかであり、ストレプトアビジンを含む検出系、並びにペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ検出系を含む系を包含する。
【００３２】
抗原の量は、放射性同位元素で抗体を標識することによっても測定できる。次に、放射性同位元素の存在を、ガンマカウンター又はシンチレーションカウンターの使用のような方法によって測定する。特に有用な同位体は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９ｗｅ、７５Ｓｅ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ及びＹである。
【００３３】
抗原の測定は、蛍光化合物で抗体を標識することによっても行なうことができる。蛍光標識した分子を適切な波長の光に曝露した際に、色素の蛍光によってその存在を検出することができる。最も重要な蛍光標識化合物の例は、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンである。
【００３４】
蛍光発光金属原子、例えば、Ｅｕ（ユーロピウム）及び他のランタニドも使用し得る。これらは、金属キレート基、例えばＤＴＰＡ又はＥＤＴＡによって、所望の分子に結合させることができる。
【００３５】
抗体を検出可能に標識する他の方法は、それを化学発光化合物にカップリングさせることによって行なわれる。次に、化学発光標識免疫グロブリンの存在を、化学反応の間に生じる発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリ
ジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【００３６】
同様に、生物発光化合物も標識として使用し得る。生物発光は化学発光の特殊型であり、これは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系に見られる。生物発光分子の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識するのに重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【００３７】
ＨＲＰ及びアルカリホスファターゼ用に化学発光基質を使用することもできる。
【００３８】
結合ヘモグロビンの測定は、レゾルシノールのような樹脂中で紫外線吸収剤を使用して定量化し得る。
【００３９】
シグナル発生分子と相互作用する試料中のグリコヘモグロビンの最大比率を確実にするために、過剰のシグナル発生分子を使用することが好都合である。
【００４０】
１つの実施形態において、試料中の全てのグリコヘモグロビンがシグナル発生分子によって結合されるので、非糖化ヘモグロビンから識別可能かつ検出可能である。
【００４１】
本発明のこの態様による方法に関して、試料に接触した際に、グリコヘモグロビンに結合していないシグナル発生分子のフラクションを、試料から分離することが重要である。
【００４２】
本発明の第２の態様は、ＨｂＡ１ｃグリコヘモグロビンレベルの評価による糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断及びモニタリングのためのアッセイ法であって、その方法は、
モグロビンを含有する個体から得た試料を準備するステップと、
試料を溶血させて、細胞結合ヘモグロビンを遊離し、ヘモグロビンを部分的に変性させるステップと、
亜鉛で被覆した微粒子上に、グリコヘモグロビンを捕捉するステップと、
試料に存在するグリコヘモグロビンに結合し得るシグナル発生分子に、試料を曝露するステップと、
グリコヘモグロビンに結合していないシグナル発生分子を除去するステップと、
結合したシグナル発生分子の量を定量化して、試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージレベルを求めるステップと、
を含むアッセイ法を提供する。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、血液試料は、ヒト抗凝固全血である。他の実施形態において、血液試料は、赤血球ペレット、溶血血液又は血液抽出物であってもよい。本発明はさらに、濾紙に採集し、乾燥し、次に再溶解させた血液試料も提供する。
【００４４】
１つの実施形態において、細胞結合ヘモグロビンを遊離する試料の溶血を、当業者によく知られた任意の方法、例えば、サポニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又は四級アンモニウム塩のような溶血剤の添加によって行なう。
【００４５】
さらに本発明は、熱を使用して行なう溶血も提供する。
【００４６】
他の実施形態において、処理工程の間のヘモグロビンの部分変性を、界面活性剤を使用して行なう。好ましい界面活性剤の例は、コール酸塩、Ｎ−オクチル−グルコシド、Ｎ−オクチル−チオグルコシド、トリトンＸ、ツィタージェント３−１４及び胆汁酸塩である。
【００４７】
好ましい実施形態において、ヘモグロビンの部分変性が生じる前に、試料を先ず溶血さ
せる。代替の実施形態において、試料の溶血と共にヘモグロビンの部分変性が生じる。
【００４８】
１つの実施形態において、亜鉛被覆微粒子上にヘモグロピンを捕捉するステップを、ｐＨ７周辺、好ましくはｐＨ６〜８で行なう。
【００４９】
１つの実施形態において、該方法は、遠心分離によって細胞残渣を除去するステップをさらに含み、このステップは、血液試料の溶血後すぐに行なわれる。
【００５０】
本発明はさらに、ラテックスビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズである微粒子を提供する。ラテックスビーズが好ましい。亜鉛分子の結合を促進するために、カルボキシル基をラテックスビーズの表面に与えてもよい。代替物として、シリカビーズを使用してもよい。しかし、シリカビーズは、一般に、ラテックスビーズより重く、従って、本発明のアッセイの実施にはあまり好ましくない。特にこれらのアッセイが自動化されている場合が該当する。微粒子がシリカである場合には、好ましくは直径が１０〜５０マイクロメートル、より好ましくは直径が２０〜３０マイクロメートルである。１つの実施形態において、シリカ粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
【００５１】
他の実施形態において、微粒子はデキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。微粒子がデキストランである場合、デキストラン主鎖を形成するのが好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させてよく、キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合状態にある際に、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【００５３】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。本発明は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ及びＤＭＰＳをキレート剤とする。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類、又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【００５４】
１つの実施形態において、亜鉛被覆物は、微粒子を活性化する作用をする。典型的に、塩化亜鉛を使用して、微粒子を被覆する。あるいは、あらゆる適切な亜鉛塩又は亜鉛の元素形態を使用して、微粒子の表面に結合させてもよい。
【００５５】
他の実施形態において、微粒子は、予め荷電された亜鉛粒子によって活性化されたキレートビーズである。
【００５６】
グリコヘモグロビンの分析は、ヘモグロビン源、例えば溶血した赤血球において行なうことができる。測定は、競合アッセイ型又は免疫測定アッセイ型のような免疫測定法によって行なうことができる。後者の型の例は、ラジオイムノメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）及び酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。競合アッセイにおいて、抗原（即ち、グリコヘモグロビン）を、検出可能な標識で標識化する。抗原を含有する試料を、グリコヘモグロビン特異抗体及び標識抗原と共にインキュベーションし、免疫複合体の形成、分離及び検出後に、試料中のグリコヘモグロビンの量を測定する。
【００５７】
好ましい実施形態において、試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージレベルを、
適切な支持体上に微粒子を捕捉するステップと、
微粒子を洗浄して、非結合物質を除去するステップと、
ＨｂＡ１ｃに特異的なモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体に標識が結合してあるシグナル発生分子によって、ＨｂＡ１ｃを標識するステップと、
試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージを求めるステップと、
によって、求める。
【００５８】
１つの実施形態において、支持体は、ガラス繊維マトリックスである。
【００５９】
他の実施形態において、ＨｂＡ１ｃに特異的なモノクローナル抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体である。抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体は、ＨｂＡ１ｃのＮ末端の８個のアミノ酸を含有する単糖に特異的なエピトープを有する。
【００６０】
他の実施形態において、抗体に結合される酵素は、アルカリホスファターゼである。
【００６１】
他の実施形態において、モノクローナル抗体を、酵素で標識する。好ましい実施形態において、酵素はアルカリホスファターゼであり、該アルカリホスファターゼは、基質に存在するリン酸基の除去を触媒する。抗体に結合した酵素は、信号を生じるために結合微粒子に導入された基質の成分と反応する役割をし、該信号を測定して、試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージを求めることができる。
【００６２】
抗体に結合している酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質は好ましくは４−メチルウンベリフェリルホスフェートであり、アルカリホスファターゼ標識結合体が、基質からのリン酸基の除去を触媒し、蛍光生成物４−メチルウンベリフェリルホスフェートを生成する。このような実施形態においては、生じた蛍光の量を試料に存在するＨｂＡ１ｃのパーセンテージに直接関連づけることが好ましく、これは標準反応曲線によって求められる。
【００６３】
都合のよいことに、生じた蛍光の量は、ＭＥＩＡ光学アセンブリによって測定される。このような実施形態において、蛍光値は、ＨＰＬＣ又は他の何らかの適切な測定器によって求めた既知のパーセンテージのＨｂＡ１ｃを含有する試料の４４８ｎｍにおける蛍光をプロットすることによって得た標準曲線によって、総ヘモグロビンにおけるＨｂＡ１ｃのパーセンテージに変換される。
【００６４】
アッセイ
本発明は、ＨｂＡ１ｃグリコヘモグロビンレベルを求めるアッセイシステム及びスクリーニング法を提供する。本明細書において使用される「アッセイシステム」は、１つ以上の特定の事象を検出しそして／又は測定するアッセイを、実施し、その結果を分析するのに必要な全ての要素を包含する。
【００６５】
特異的結合活性を有するタンパク質の活性を検出するために、種々のアッセイを使用することができる。例示的アッセイは、蛍光偏光、及びレーザー走査法を使用して、蛍光的に標識したタンパク質、ペプチド又は他の分子の結合を測定する（Ｌｙｎｃｈ，  Ｂ．Ａ．ら、１９９９、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７５：６２−７３；Ｌｉ  ＨＹ，  ２００１，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８０：２９３−３０３；Ｚｕｃｋ  Ｐら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，  ９６：１１１２２−１１１２７）。
【００６６】
他の例において、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して、結合活性を検出し、該アッセイは、ストレプトアビジン被覆ＳＰＡビーズに捕捉したビオチン化ペプチドプローブ及び放射標識パートナー分子を使用する。該アッセイは、ＳＰＡビーズ内に固
定されたシンチラントによってペプチドプローブに結合した放射標識タンパク質を特異的に検出する（Ｓｏｎａｔｏｒｅ  ＬＭら、１９９６，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４０：２８９−２９７）。
【００６７】
好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイは、高処理量又は超高処理量であり、従って、自動化された対費用効果の高いスクリーニング法を提供する。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、アッセイを自動化することができ、第１の好ましい実施形態において、１時間に４０〜６０試験を行なうことを可能にし得る。第２の好ましい実施形態において、自動化は、１時間に１００〜１６０試験を行うことを可能にし得る。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、自動分析器を使用してスクリーニングを行なう。好ましくは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの自動ＡｘＳＹＭ（商標）システムを使用する。自動試料分析及び処理に使用される方法は、Ａｂｂｏｔｔ  ＩＭｘ（商標）及び微粒子酵素免疫測定法を包含する。
【００７０】
本発明の方法は、試料、例えば血液試料からの、ヘモグロビンの精製法に及ぶ。ヘモグロビンは糖化している必要はない。
【００７１】
本発明のさらに他の態様において、生物学的試料からヘモグロビンを分離する方法であって、
患者からの生物学的試料を準備するステップと、
塩化亜鉛で予め被覆した微粒子上にヘモグロビンを捕捉するステップと、
亜鉛被覆微粒子から結合ヘモグロビンを溶離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００７２】
１つの実施形態において、該方法は、捕捉するステップの前に、試料を溶血させ、試料に存在するヘモグロビンを部分的に変性させることをさらに含む。
【００７３】
１つの実施形態において、生物学的試料は血液試料である。
【００７４】
１つの実施形態において、この方法によって得られるヘモグロビンは、ヘモグロビン、その誘導体及び類似体、特にヘモグロビンの糖化形態、例えば糖化サブタイプＨｂＡ１ｃを分離する。
【００７５】
本発明のさらに他の態様において、亜鉛結合部位を有する少なくとも１つの標的タンパク質の選択的結合についてのアッセイ法であって、
試料を準備するステップと、
試料を、本発明の亜鉛被覆微粒子に曝露するステップと、
標的タンパク質を、亜鉛被覆微粒子上に捕捉するステップと、
微粒子を分離するステップと、
微粒子に結合した標的タンパク質の存在を検出するステップと、
場合により、微粒子から標的タンパク質を精製するステップと、
を含む方法を提供する。
【００７６】
１つの実施形態において、試料は生物学的試料である。
【００７７】
本発明のさらに他の態様において、亜鉛結合ドメインを有する標的タンパク質の選択的結合における、亜鉛被覆微粒子の使用を提供する。
【００７８】
好ましい標的タンパク質は、ヘモグロビン及びそれに関連した糖化形態、類似体及び誘導体、メタロプロテアーゼ、メタロペプチダーゼ、酵素、アルカリホスファターゼ、メタロチオネイン（ＭＴｓ）、及び亜鉛結合ドメインを示すか又は規定する転写因子を包含する。
【００７９】
本発明はさらに、ラテックスビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズである微粒子を提供する。ラテックスビーズが好ましい。亜鉛分子の結合を促進するために、カルボキシル基をラテックスビーズの表面に与えてもよい。代替物として、シリカビーズを使用してもよい。しかし、シリカビーズは、一般に、ラテックスビーズより重く、従って、本発明のアッセイの実施にはあまり好ましくない。特にこれらのアッセイが自動化されている場合が該当する。微粒子がシリカである場合には、好ましくは直径が１０〜５０マイクロメートル、より好ましくは直径が２０〜３０マイクロメートルである。１つの実施形態において、シリカ粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
【００８０】
他の実施形態において、微粒子は、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。微粒子がデキストランである場合、デキストラン主鎖を形成するのが好ましい。
【００８１】
好ましい実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させてよく、キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合状態にある際に、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【００８２】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。典型的に、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ及びＤＭＰＳである。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類、又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【００８３】
微粒子がデキストランである場合、キレート剤はＥＤＴＡであるのが好ましい。
【００８４】
本発明のさらに他の態様において、本発明のアッセイ法のいずれか１つを行なうためのキットを提供し、該キットは、本発明の微粒子、ならびにアッセイ法の実施についての使用説明書及びプロトコールを含む。
【００８５】
好都合にも、キットは、商業的に入手可能な、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳ）によって供給されているＡｘＳＹＭ自動アッセイシステムを使用する方法を実施するための使用説明書を提供する。
【００８６】
本発明の他の態様において、亜鉛分子で被覆した微粒子を提供する。
【００８７】
１つの実施形態において、微粒子は、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズである。亜鉛は、微粒子の表面に直接結合させるか、又は真空蒸着によって表面に付着させることができる。
【００８８】
微粒子がシリカである場合、それは、好ましくは１０〜５０マイクロメートル、より好ましくは２０〜３０マイクロメートルの直径を有する。１つの実施形態において、シリカ
粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
【００８９】
他の実施形態において、微粒子は、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００９０】
他の実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させ、該キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【００９１】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。例えば、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ又はＤＭＰＳであってもよい。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類、又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【００９２】
微粒子がデキストランである場合、キレート剤は好ましくはＥＤＴＡである。
【００９３】
他の実施形態において、亜鉛被覆物は、微粒子を活性化する作用をする。典型的に、塩化亜鉛を使用して微粒子を被覆するが、あらゆる適切な可溶性亜鉛塩又は亜鉛の元素形態を使用して微粒子の表面を被覆してもよい。理論に縛られるものではないが、微粒子は、結合亜鉛分子によって完全には被覆されないと予測される。しかし、利用可能な表面積に対して高レベルの亜鉛結合分子が存在すると考えられる。
【００９４】
特定の実施形態において、微粒子は、予め荷電された磁性亜鉛粒子によって活性化されたキレートビーズである。
【００９５】
本発明のさらに他の態様によれば、亜鉛結合部位を有するタンパク質の標的結合に使用される化合物を提供し、該化合物は、亜鉛分子で被覆された微粒子を含む。
【００９６】
１つの実施形態において、微粒子は、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズである。
【００９７】
微粒子がシリカである場合、それは、好ましくは１０〜５０マイクロメートル、より好ましくは２０〜３０マイクロメートルの直径を有する。１つの実施形態において、シリカ粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
【００９８】
他の実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させ、該キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合状態にある際に、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【００９９】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。典型的に、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ又はＤＭＰＳである。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類、又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【０１００】
他の実施形態において、標的タンパク質は、ヘモグロビン及びそれに関連した糖化形態並びにその類似体及び誘導体、メタロプロテアーゼ、メタロペプチダーゼ、酵素、アルカリホスファターゼ、メタロチオネイン（ＭＴｓ）、及び亜鉛結合ドメインを示すか又は規定する転写因子を包含する。
【０１０１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、亜鉛被覆微粒子を、亜鉛結合タンパク質の捕捉及び検出に使用することができる。
【０１０２】
本発明のこの態様の第２の好ましい実施形態において、亜鉛被覆微粒子を、亜鉛結合ドメインを示す標的タンパク質の精製に使用し得る。
【０１０３】
本発明の他の態様によれば、グリコヘモグロビンの結合の向上に使用される化合物を提供し、該化合物は、亜鉛で被覆された微粒子を含む。
【０１０４】
１つの実施形態において、微粒子は、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズであってもよい。
【０１０５】
好ましい実施形態において、キレート剤をビーズの表面に結合させ、該キレート剤は亜鉛分子がそれに結合するのを可能にする。好都合にも、キレート剤は、結合状態にある際に、結合亜鉛分子を微粒子の表面から離す役割をする。
【０１０６】
キレート剤は、いかなる適切な亜鉛結合キレート剤であってもよい。典型的に、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩（ＤＴＰＡ）、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩（ＣＤＴＡ）、エデト酸カルシウムナトリウム、ＤＭＳＡ又はＤＭＰＳである。他のキレート剤は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びアミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）エチレンアミン類、又は列挙した物質と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤を包含する。
【０１０７】
１つの実施形態において、亜鉛被覆物は、微粒子を活性化する作用をする。典型的に、塩化亜鉛を使用して、微粒子を被覆する。あるいは、あらゆる適切な亜鉛塩又は亜鉛の元素形態を使用して、微粒子の表面に結合させてもよい。
【０１０８】
１つの実施形態において、微粒子は、予め荷電された亜鉛粒子によって活性化されたキレートビーズである。
【０１０９】
好都合にも、本発明者らは、本発明によって提供される亜鉛結合微粒子が、該化合物によって付与される有利な界面活性特性によって、ヘモグロビン、その関連誘導体及び糖化形態の結合において、向上した特性を有することを見出した。理論に縛られるものではないが、該化合物によって示される向上した界面活性特性は、向上した洗浄条件を与え、迅速かつ効率的な細胞膜破裂を生じさせ、次に、ヘモグロビンが効率的に結合することによって、ヘモグロビンが膜結合状態から、より効率的に抽出されることを可能にすると考えられる。
【０１１０】
状況が許す限り、本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、他の各態様と同様である。
【０１１１】
特に指定しなければ、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の当業者に共通に理解される意味を有する。
【０１１２】
明細書を通して、状況が許す限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（含む）又は「ｉｎｃｌｕｄｅ」（包含する）、若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のようなそれらの変化形、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」又は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の語は、記載されている完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）又は完全体の群の包含を意味し、いずれかの他の完全体又は完全体の群の除外を意味するのではないものと理解される。
【０１１３】
発明の詳細な説明
ここに、本発明について、下記の実施例を参照して説明するが、例示が目的であって本発明を限定するものと理解すべきではない。さらに、以下の図に関しても説明する：
【０１１４】
図１は、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びグリコヘモグロビンサブタイプＨｂＡ１ｃの捕捉並びに本発明の亜鉛被覆微粒子を例示する図であり、亜鉛は、ＥＤＴＡ仲介物によって微粒子に結合しており、そして
【０１１５】
図２は、本発明の微粒子に結合後の結合標的タンパク質の好ましい検出方法を示す図であって、この場合はグリコヘモグロビンサブタイプＨｂＡ１ｃである。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
「ＡｘＳＹＭ自動アッセイ条件」
０．５％ＴＸ−１００及び０．８ｍＭツィタージェント３−１４を補充した溶解緩衝液で、血液を手動で溶解する。
【０１１７】
ＭＥＩＡ＋５％ＢＳＡでタブ（ｔａｂ）を予備洗浄する。
溶解血液試料を、３０％ショ糖中で同容量の亜鉛被覆ＥＤＴＡシリカ微粒子と混合し、５分間インキュベートする。
タブに移し、ＭＥＩＡで洗浄する。
ブロッキング緩衝液１７に溶解した１μｇ／ｍｌのαＨｂＡ１ｃを添加し、５分間インキュベートする。
ＭＥＩＡで洗浄する。
ｐＨ７のＨＥＰＥＳで１：３０００に希釈したα−マウス−アルカリホスファターゼを添加する。
ＭＥＩＡで洗浄する。
ＭＵＰを添加し、読み取る。
【０１１８】
【表１】
2006058295.tif 000003
【０１１９】
アッセイは、ＨｂＡ１ｃの存在を検出し、５％と９％のＨｂＡ１ｃレベルを識別できる。
【０１２０】
（実施例２）
「ＩＭｘ自動アッセイ条件」
ＭＥＩＡ＋５％ＢＳＡでタブを予備洗浄する。
３０％ショ糖中で、０．１％亜鉛被覆ＥＤＴＡシリカ微粒子と試料を混合する（１：１）。
タブに入れ、ＭＥＩＡ（２×５０μｌ）で洗浄する。
ＨＥＰＥＳに溶解した１μｇ／ｍｌのαＨｂＡ１ｃを添加し、５分間インキュベートする。
ＭＥＩＡ（２×５０μｌ）で洗浄する。
α−マウス−アルカリホスファターゼ複合体（ＨＥＰＥＳで１：３０００に希釈）を添加し、５分間インキュベートする。
ＭＥＩＡ（２×５０μｌ）で洗浄する。
ＭＵＰを添加し、読み取る。
【０１２１】
【表２】
2006058295.tif 000004
【０１２２】
ＨｂＡ１ｃ濃度の増加と共に、より高いレート（ｒａｔｅｓ）が測定される。
【０１２３】
（実施例３）
「９６ウェル真空マニホールドアッセイ」
Ｚｎ微粒子を使用するＨｂの捕捉
シリカＥＤＴＡ及びポリスチレンＮＴＡ微粒子を、ＺｎＣｌ２で被覆し、次に、０．５％固形分で、Ｈｂ（０．５ｍｇ／ｍｌ）又は（０.２ｍｇ／ｍｌ）と共に１０分間インキュベートした。ＯＤ  ４０５ｎｍを使用して、非結合物質を測定することによって、結合を評価した。０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌについての読み取りは、４０５ｎｍでのＨｂ測定に関して、直線範囲内（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）である。
【０１２４】
【表３】
2006058295.tif 000005
【０１２５】
この試験では、１〜１．５μｍのシリカＥＤＴＡビーズが、最も高い結合能力を示し（０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｈｂで８５％以上、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｈｂで１００％）、ＮＴＡ及びＥＤＴＡ  ３μｍは、より低いＨｂ結合を示す（０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｈｂで６５％以上
、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｈｂで７５％）ことを示している。
【０１２６】
捕捉ＨｂＡ１ｃの検出
シリカＥＤＴＡ及びポリスチレンＮＴＡ微粒子を亜鉛で被覆し、０．５％固形分において、０、１、５及び１０％  ＨｂＡ１ｃを添加した０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｈｂと共にインキュベートした。粒子は、α−ＨｂＡ１ｃ抗体（１０μｇ／ｍｌ）及びα−マウス−アルカリホスファターゼ（１：３０００に希釈）で探索された。アルカリホスファターゼ基質と共にインキュベートした後、反応を停止し、ＯＤ  ５５０ｎｍを読み取った。
【０１２７】
【表４】
2006058295.tif 000006
【０１２８】
シリカＥＤＴＡ  １〜１．５μｍ微粒子は、最良の結果を生じ、１０％  ＨｂＡ１ｃの添加によって信号の増加を示した。
【０１２９】
（実施例４）
「種々のタイプの亜鉛被覆微粒子の使用」
シリカＥＤＴＡ微粒子
ＩＭｘ（実施例２に記載した方法）による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆し、４０％ショ糖に再懸濁した。
【０１３０】
【表５】
2006058295.tif 000007
【０１３１】
シリカ粒子は、ＨｂＡ１ｃに結合することができ、５％と９％のＨｂＡ１ｃを首尾よく識別する。
【０１３２】
ポリスチレンＥＤＴＡ微粒子
ＡｘＳＹＭ（実施例１に記載した方法）による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆し、３０％ショ糖に再懸濁した。αＨｂＡ１ｃ（２μｇ／ｍｌ）と５分間インキュベーションし、次に、α−マウス−アルカリホスファテーゼ（１：３０００）と２分間インキュベートした。
【０１３３】
【表６】
2006058295.tif 000008
【０１３４】
ポリスチレンＥＤＴＡ微粒子は、ＨｂＡ１ｃに結合することができ、５％と９％のＨｂＡ１ｃを首尾よく識別する。
【０１３５】
ポリスチレンＮＴＡ微粒子
真空マニホールド（実施例３に記載した方法）による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆した。
【０１３６】
【表７】
2006058295.tif 000009
【０１３７】
ポリスチレンＮＴＡ微粒子は、Ｈｂに結合することができるが、試料に１０％  ＨｂＡ１ｃを添加した後は、ＨｂＡ１ｃの極めて低い識別を示すか又はほとんど識別を示さない。
【０１３８】
磁性Ｚｎ微粒子
微粒子を、結合能力に関して、真空マニホールドによって分析した（実施例３に記載した方法）。
【０１３９】
【表８】
2006058295.tif 000010
【０１４０】
磁性Ｚｎ微粒子は、Ｈｂに首尾よく結合する。
【０１４１】
真空マニホールド（実施例３に記載した方法）による分析によって、結合ＨｂをＨｂＡ１ｃについて分析した。
【０１４２】
【表９】
2006058295.tif 000011
【０１４３】
磁性Ｚｎ微粒子は、結合ＨｂＡ１ｃを検出することができる。
【０１４４】
キレートセファロース
キレートセファロースを亜鉛で被覆し、溶解血液試料と共にインキュベーションし、結合能力について真空マニホールドによる分析を使用した（実施例３に記載した方法）。
【０１４５】
【表１０】
2006058295.tif 000012
【０１４６】
大部分のヘモグロビンがキレートセファロースに結合した。
【０１４７】
（実施例５）
「種々の金属イオンの使用」
キレートセファロース
キレートセファロースを種々の金属イオンで被覆し、溶解血液試料と共にインキュベーションし、結合能力について、真空マニホールドによる分析を使用した（実施例３に記載した方法）。
【０１４８】
【表１１】
2006058295.tif 000013
【０１４９】
塩化亜鉛が、最多量のヘモグロビンに結合した。
【０１５０】
シリカＥＤＴＡ微粒子
シリカＥＤＴＡ微粒子を種々の金属イオンで被覆し、ＩＭｘ（実施例２に記載した方法）によって分析した。
【０１５１】
【表１２】
2006058295.tif 000014
【０１５２】
塩化亜鉛は、大部分のＨｂＡ１ｃに結合し、それはＩＭｘによって検出できた。
【０１５３】
（実施例６）
「ＲＢＣを溶解し、しかも亜鉛被覆微粒子へのＨｂＡ１ｃの結合及び検出を可能にする界面活性剤の使用」
試験１
０．５％ＴＸ１００及び０．８ｍＭツィタージェント３−１４を含有する緩衝液で血液試料を溶解し、ＡｘＳＹＭ（実施例１に記載した方法）によって分析した。
【０１５４】
【表１３】
2006058295.tif 000015
【０１５５】
試験２
０．５％ＴＸ１００及び８０ｍＭコール酸塩を含有する緩衝液で血液試料を溶解し、ＡｘＳＹＭ（実施例１に記載した方法）によって分析した。
【０１５６】
【表１４】
2006058295.tif 000016
【０１５７】
試験３
０．５％ＴＸ１００及び種々の界面活性剤を含有する緩衝液で血液試料（通常、５％ＨｂＡ１ｃ）を溶解し、ＩＭｘ（実施例２に記載した方法）によって分析した。ブロッキング緩衝液１７中において、αＨｂＡ１ｃ−アルカリホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ）でＨｂＡ１ｃを検出した。
【０１５８】
【表１５】
2006058295.tif 000017
【０１５９】
赤血球膜（ＲＢＣ）を溶解する種々の界面活性剤の使用は、その後の、亜鉛被覆ＥＤＴＡ微粒子へのＨｂＡ１ｃの結合及び検出に影響を与えない。
【０１６０】
（実施例７）
「種々の大きさのシリカ微粒子上でのＨｂＡ１ｃの捕捉、及び検出における抗ＨｂＡ１ｃ−アルカリホスファターゼ複合体の使用」
８０ｍＭコール酸塩を含有する溶解緩衝液で血液試料を溶解し、ＩＭｘ（実施例２に記載した方法の中の複合体を使用した唯１つのインキュベーションステップ）によって分析した。試料を、０．０５％固形分において、種々の大きさ（１．５、０．５及び０．３μｍ）のシリカ微粒子と共にインキュベートした。０．２％アジ化ナトリウム  、２％  ＰＥＧ  １０００及び１．２％  ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ複合希釈液を含むｐＨ７．０のＨｅｐｅｓ中で、ＨｂＡ１ｃは、αＨｂＡ１ｃ−アルカリホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ）によって検出された。
【０１６１】
【表１６】
2006058295.tif 000018
【０１６２】
（実施例８）
「ＡＸＳＹＭ自動アッセイを使用した自動グリコヘモグロビン定量化の実施のための、条件及び試薬の最適化」
本発明のアッセイを実施する条件の最適化の結果として、ＡＸＳＹＭ自動アッセイ機（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＵＳ）での自動分析を使った本発明の実施には、次のプロトコール及び緩衝剤が好ましいことが確認された。
【０１６３】
「アッセイ法の実施」
５μｌの全血液試料（ＥＤＴＡ、ＦＬＵＯＸ、クエン酸塩、ヘパリン）を、９５μｌのＲＢＣ溶解緩衝液（１／２０希釈）に添加した。溶解試料を、１００μｌの試料希釈液でさらに希釈した（最終試料希釈１／４０）。
【０１６４】
２０秒後、タブブロッカー（９５μｌ）を、マトリックスセルのＡＸＳＹＭタブに加えた。希釈溶解試料（９５μｌ）をタブに移し、１０秒後、タブを１００μｌのＡｘＳＹＭ（登録商標）溶液３で洗浄した。複合体（９０μｌ）をタブに添加し、３００秒間インキュベートした。次に、各パルスの間に１０秒間おいて、タブを２×１００μｌのＡｘＳＹＭ（登録商標）溶液３で洗浄し、１×５０μｌのＭＵＰをタブに加えた。
【０１６５】
次に、蛍光生成物を８回読み取り、各読み取りは５０６．８８ミリ秒を要し、各読み取りの間隔は０．６秒であった。ゲイン（ｇａｉｎ）は２０に設定した。最初の結果までの時間は１３．７であり、１時間に４６試験の処理能力であった。
【０１６６】
この実施例の方法に使用するのに好ましい緩衝液は以下のように配合される。
【０１６７】
（i）使用濃度複合体
ＤＡＫＯマウス抗Ｈｂ（Ａ、Ｃ、Ｓ）１ｃ及び抗ＨｂＡ１ｃを、一般的なマレイミド結合法を使用して、アルカリホスファターゼと自家結合させた。それらを評価し、抗Ｈｂ（Ａ、Ｃ、Ｓ）１ｃアルカリホスファターゼ複合体が最も優れた性能であった。その複合体を、複合体希釈液中で０．２５μｇ／ｍｌの濃度で使用する（緩衝液の組成は、０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、６％  Ｓｔａｂｉｌｇｕａｒｄ、２％  ポリエチレン１０００、０．５％  トリトンＸ１００、１％  ＳｔａｂｉｌｚｙｍｅＡＰ、０．０９％  アジ化ナトリウム、ｐＨ７である）。
【０１６８】
（ii）ＲＢＣ溶解緩衝液
最も優れた性能は、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５Ｍ  グリシン、０．０５Ｍ  塩化マグネシウム、０．４Ｍ  塩化ナトリウム、１％  トリトンＸ１００、０．８ｍＭ  ツィタージェント３−１４、０．０９％  アジ化ナトリウム、ｐＨ８を使用して得られた。
【０１６９】
（iii）タブブロッカー／試料希釈液
タブブロッカー及び試料希釈液を使用する場合、ＡｘＳＹＭ（登録商標）マトリックスセルの変化は最小限にされ、Ｈｂ結合は最適である。現在、２つの好ましい緩衝液は、緩衝液３（０．０５Ｍ  トリス、２０％  ショ糖、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％  魚皮ゼラチン、１０％  Ｓｔａｂｉｌｇｕａｒｄ、１ｍＭ  塩化亜鉛、０．０９％  アジ
化ナトリウム、ｐＨ８）、及び緩衝液７（０．０５Ｍ  トリス、２０％  ショ糖、２Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％  魚皮ゼラチン、１０％  Ｓｔａｂｉｌｇｕａｒｄ、５％  ポリエチレングリコール８０００、０．１％  カゼイン加水分解物、１ｍＭ  塩化亜鉛、０．０９％  アジ化ナトリウム、ｐＨ８）である。
【０１７０】
本明細書に記載されている全ての文献は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の前記実施形態についての種々の変更及び変形は、本発明の範囲を逸脱することなく、業者にとって明らかである。本発明を、特定の好ましい実施形態に関して説明したが、請求項に記載されている本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定すべきでないものと理解される。実際に、当業者にとって明らかな、本発明の前記実施法の種々の変更は、本発明に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ヘモグロビン（Ｈｂ）及びグリコヘモグロビンサブタイプＨｂＡ１ｃの捕捉並びに本発明の亜鉛被覆微粒子を例示する図であり、亜鉛はＥＤＴＡ仲介物によって微粒子に結合している。
【図２】本発明の微粒子に結合後の結合標的タンパク質の好ましい検出方法を示す図であり、この場合はグリコヘモグロビンサブタイプＨｂＡ１ｃである。
【図１】
2006058295.tif 000019
【図２】
2006058295.tif 000020
【外国語明細書】
2006058295000001.pdf