(57)【要約】【課題】  ５'末端が無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを容易に固定化でき、ＤＮＡ分子の固定化量が高く、ＤＮＡ分子の結合強度が高いＤＮＡの固定化方法を提供すること。【解決手段】  ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化することを特徴とするＤＮＡの固定化方法であり、好ましくは、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡが、前記カルボン酸誘導基の部位と共有結合して、当該基板の表面に固定化されるＤＮＡの固定化方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化することを特徴とするＤＮＡの固定化方法。
【請求項２】
短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡが、前記カルボン酸誘導基の部位と共有結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項３】
前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項４】
基板表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項５】
固定化されるＤＮＡの塩基数が５〜１００個である請求項１〜４いずれか記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項６】
基板が、プラスチック材料であることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載のＤＮＡの固定化方法によって、ＤＮＡが固定化されたマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴＤＮＡ鎖を所定のプラスチック基板表面に固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、細胞や生体組織試料に由来する多数の遺伝子産物であるｍＲＮＡの測定には、選択的な核酸のハイブリダイゼーション法と多数の核酸固定化技術を組み合わせたＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップと呼ばれる同時に多数の遺伝子発現量を測定方法が存在する。多様な生物の全遺伝子機能や一遺伝子変異多型（ＳＮＰ）などを効率的に解析するためのＤＮＡマイクロアレイに関した技術開発が進んでおり、従来は、スライドガラスなどの基板表面に固定化した遺伝子の一部分と標的遺伝子断片の間でのハイブリダイゼーションによる検査・分析が利用されている。ＤＮＡチップとは、スライドガラス等の平板担体に多数のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ分子を整列させたマイクロアレイである。マイクロアレイ基板を用いる遺伝子解析技術は、創薬研究、疾病の診断法やその予防法の開発、環境問題対策（水質汚染、微生物、環境ホルモン等）の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって決定できるという発見に始まった。ＤＮＡチップ、マイクロアレイの作製技術が開発され、（多数の）遺伝子発現を対象としてその変異や多型などを短時間で効率よく調べることが可能となった。ＤＮＡチップは、種々の遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡの断片（プローブともいう）を、チップの固体表面に整列させて固定化し、固定した多数のプローブをマトリックスに形成した素子である。通常、1枚のＤＮＡチップ上には、数千から数万のオリゴヌクレオチド個体が固定化されていた。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いる方法では、逆転写酵素反応を用いて、生体試料としてのｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成し、断片化した後に各断片に蛍光標識をつけて標識化ＤＮＡ断片とする。これらの標識化ＤＮＡ断片をＤＮＡチップに接触させ、固定化させてあるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションさせる。標識化ＤＮＡ断片は配列が相補的なオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片と二本鎖を形成・保持され、過剰量の標識化ＤＮＡ断片は、洗浄操作で除去される。その後、蛍光測定によって保持された標識化ＤＮＡ断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の種類を調べる。この方法は配列既知の遺伝子の発現をモニターするのに適している。ｃＤＮＡの代わりに、ゲノムＤＮＡ断片のポリメラーゼ複製連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲと略す）を用いて増幅・蛍光標識化して、同様にプローブとの遺伝子相同性を調べることもできる。
【０００５】
ＤＮＡ固定化マイクロアレイは、スライドガラス或いはシリコン基板表面等にポリ−L−リジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法により製造されている。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する製造方法も知られている。マイクロアレイの作製法は、既に種々のものが公知である（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
【０００６】
一般的なＤＮＡチップ作成方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを有機合成により事前に準備し、そのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片をスライドガラスなどの基板表面に微量滴下し、その位置に共有結合等によって固定化する。例えば、基板表面にアミノ基と反応する官能基のイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、オリゴヌクレオチドの５'末端をアミノ基にしておけば、任意の位置にオリゴヌクレオチドを共有結合によって容易に固定化することができる。
【０００７】
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリ−L−リジン等の高分子を塗布して長鎖ＤＮＡを固定する方法並びにイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、５'末端アミノ化したオリゴヌクレオチドを固定化する方法では、核酸（長鎖ＤＮＡ又は短鎖オリゴヌクレオチド）の固定化状態が不安定であり、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーション工程中やその後の洗浄工程において、核酸が剥がれ落ちやすい。結果として検出感度が下がることがあり、又、再現性が得られない等の欠点がある。更に、この方法では、比較的長い核酸は固定できるが、１００ｍｅｒ以下の５’末端無修飾またはリン酸修飾した短いオリゴヌクレオチドになると、効率よく固定化できないという欠点がある。一方、半導体技術を用いたＤＮＡ固定化マイクロアレイに於いては、固相合成できるオリゴヌクレオチドの塩基鎖長は２０数塩基であるという技術的課題に加えて、極めて特殊な機械と試薬を必要で製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
【０００８】
以上の問題に鑑み、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドを容易に固定化できるＤＮＡの固定化方法が切望されている。
【特許文献１】国際公開WO95／11995号
【非特許文献１】Lockhart, D. J. et.al, Nat. Biotech. 14：1675-1680（1996）、
【非特許文献２】Schena M．et.al, Proc．Natl．Acad．Sci．93：10614-10619（1996）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾されたＤＮＡの固定化量が高く、それらＤＮＡと基板表面間の結合強度が著しく向上し、更に、熱安定性の高いＤＮＡの固定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した結果、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板と５’末端無修飾またはリン酸修飾されたＤＮＡの塩基部位に存在するアミノ基の間で共有結合させ固定化する方法を見出した。即ちＤＮＡの塩基部分(アデニン、グアニン、シトシン)のアミノ基NH2と基板表面の電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基との間でアミド結合を作成させることによってＤＮＡを基板に固定化させた短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドは、強固にＤＮＡを保持す能力を持ちかつ、ハイブリ効率も高いＤＮＡマイクロアレイ用基板の作製が可能であることをあることを見出した。
【００１１】
この方法により、安価な無修飾合成オリヌクレオチドを使用した非常に経済的なＤＮＡマイクロアレイ作成が可能となり、遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイ基板が提供されることを見出して本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＤＮＡの固定化方法によれば、安定した経済的なＤＮＡマイクロアレイ作製が可能となる。遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１４】
本発明においてＤＮＡの固定化を行う方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを化学合成する時に、その５'末端側に無修飾（ＯＨ）またはリン酸基を有する分子を共有結合させておく。
【００１５】
本発明に使用される基板の表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１６】
このホスホリルコリン基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれる電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基は短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡが化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡは、前記このコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００１７】
ホスホリルコリン基を含む第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１８】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における検体溶液中の核酸の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１９】
電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００２０】
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００２１】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２２】
【化１】
2006234712.tif 000002
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００２３】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２４】
【化２】
2006234712.tif 000003
【００２５】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２６】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２７】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化３】
2006234712.tif 000004
【００２８】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２９】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００３０】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３１】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３２】
第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３３】
また、本実施形態の基板のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３４】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３５】
【化４】
2006234712.tif 000005
【００３６】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３７】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、検体溶液中の核酸の非特異吸着を抑制する性質と、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制しつつ、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
【００３８】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３９】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００４０】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４１】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００４２】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４３】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４４】
このような第二の高分子物質は、検体溶液中の核酸の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４５】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４６】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４７】
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４８】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００４９】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００５０】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５１】
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５２】
次に、基板の表面へのＤＮＡの固定化方法について、一例として、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位が活性エステル基の場合について説明する。
【００５３】
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基と短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面で短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化し、続いて（ｉｉ）短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することによって、短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５４】
この短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００５５】
また、点着後、基板表面に固定化されなかった短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５６】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後は短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００５７】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００５８】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５９】
本発明に使用する短鎖の５’末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡの鎖長は、ハイブリダイゼーションが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜５００００塩基、好ましくは６〜１００塩基である。
【００６０】
短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたＤＮＡを溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常ＤＮＡ溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばTE緩衝液（10mM Tris塩酸, pH8.0／1mM EDTA）等のTris緩衝液、食塩を含む水溶液、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）を挙げることができる。また、一般に市販されている溶媒、Spotting Solution等も挙げることができる。また、ＤＮＡ溶液の濃度も特に制限されないが、通常１ｍＭ〜１ｐＭ、好ましくは10mＭ〜1ｎＭの濃度である。
【００６１】
ＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットする方法としては、ピペットでＤＮＡ溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッター(アレイヤー)を用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、ＤＮＡ溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は10nl〜10mlである。ＤＮＡ溶液は、マイクロアレイ基板上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされるＤＮＡ溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体にＤＮＡが固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識したＤＮＡを固定化しておいてもよい。
【００６２】
本発明の好ましい形態においては、ＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットした後に、２８０nmの波長を含む紫外線を照射することで固定化率を上げることも出来る。また、前記ＤＮＡ溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記ＤＮＡ溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは７０〜１００℃である。
【００６３】
次に、マイクロアレイ基板、少なくとも基板のＤＮＡを固定した部位に、波長280nmの成分を含む紫外線を照射する。具体的には、波長280nmを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。照射量は、累積照射量として通常100mJ/cm2以上、好ましくは200mJ/cm2以上である。
【００６４】
上記のようにして、ＤＮＡをマイクロアレイ基板上に固定化することにより、ＤＮＡ固定化マイクロアレイが製造される。本発明の方法により得られるＤＮＡ固定化マイクロアレイは、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いることができる。本発明の方法によりマイクロアレイ基板に固定化されたＤＮＡは、通常のハイブリダイゼーションの条件下で担体から脱離しにくいため、紫外線照射を行わない場合に比べて検出感度が良好で、再現性も良い。ハイブリダイゼーション及びその検出は、通常の固相化ＤＮＡ(プローブ)を用いたハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。
【００６５】
本発明では、ＤＮＡを固定化するのに用いるマイクロアレイ基板として、安価な熱可塑性合成樹脂のプラスチックを用いているため、低コスト化が可能である。また、プラスチック素材は軽量で形成が容易なため、様々な形態のＤＮＡマイクロアレイの作製が容易となる。また、長期保存が可能であり、保存安定性に優れている。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００６７】
下記の実験にて、５’末端無修飾あるいは比較対象としてアミノ基修飾されたオリゴＤＮＡを、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面に固定化して、熱安定性、再利用性、ハイブリダイゼーション効果について比較検討した。
【００６８】
（実験例１）
（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板（寸法：76ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００６９】
（ＤＮＡの固定）
５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（１５〜５０塩基鎖）をＳＳＣバッファー中に溶解させ、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液はマイクロピペットを用い、前記のホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面上に、それぞれ0.2μlスポットした。スポット径は直径約0.5mmであった。この平板を乾燥機に入れ、８０℃で1時間加熱乾燥して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液中に５分間浸とうさせ活性エステル基を不活化することによりブロッキングを行った後、前記平板を沸騰水中に1分間浸とうして洗浄後、乾燥した。各スポットのオリゴＤＮＡ固定化量は、定法のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）とＣｙ３標識dUTPヌクレオチドを併用してプローブの３‘末端にＣｙ３標識を導入して検定した。表１に結果を示した。
【００７０】
【表１】
2006234712.tif 000006
【００７１】
オリゴＤＮＡプローブ塩基鎖長に依存した固定化率が観察される。無修飾オリゴの15mer並びに20merはアミノ基修飾オリゴに比べ、固定化率は低いが、25mer以上の塩基鎖長のオリゴプローブでは固定化率はほぼ同等である。
又、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板をブロッキング溶液で活性エステル基を不活性化した後では、オリゴＤＮＡは基板表面に全く固定化できなかった。
【００７２】
（実験例２）
(ハイブリダイゼーション)
実験例１の５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（１５〜５０塩基鎖）を固定化したホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板を、ハイブリダイゼーションチャンバーに着装し、5’末端がＣｙ5蛍光ラベル化された５０塩基鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するターゲット溶液(５００ｐＭ、２０ml)をチャンバー内に注入し、1000rpm振動下、45℃で２時間過熱した。結果を表２に示した。
【００７３】
【表２】
2006234712.tif 000007
【００７４】
完全に相補的なターゲットがハイブリダイゼーションした量は、プラスチック基板表面に固定されているオリゴＤＮＡの固定化量に依存しており、５’末端が無修飾またはアミノ基修飾オリゴ間の基板表面との結合様式の違いがあるにも係らず、ハイブリダイゼーション効果に差異は見出されない。