(57)【要約】【課題】ポリマー、具体的には核酸の検出のための物質を提供し、特異的結合における核酸配列の検出に使用される標識シグナルを増強するための方法および化合物を提供し、高感度かつ高分解能で、特異的かつ迅速に検出される核酸配列を可能にする方法および化合物を提供すること。【解決手段】核酸標的を検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を含む核酸標的を、プローブの核酸配列を含む核酸プローブにハイブリダイズする工程であって、ここで、その標的が結合リガンドを含む、工程；ｂ）ハイブリダイズされた標的を、結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させ、レセプターと結合リガンドとを複合体化させる工程；ｃ）そのレセプターを、複数の結合リガンドを含む増幅試薬と接触させ、その増幅試薬を、レセプターと複合体化させる工程；およびｄ）複合体化した増幅試薬の存在を検出する工程、を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸標的を検出するための方法であって、以下の工程；
ａ）標的核酸配列を含む核酸標的を、プローブの核酸配列を含む核酸プローブにハイブリダイズする工程であって、ここで、該標的が結合リガンドを含む、工程；
ｂ）ハイブリダイズされた該標的を、該結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させ、該レセプターと該結合リガンドとを複合体化させる工程；
ｃ）該レセプターを、複数の該結合リガンドを含む増幅試薬と接触させ、該増幅試薬を、該レセプターと複合体化させる工程；および
ｄ）複合体化した該増幅試薬の存在を検出する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／１０２、５７７号（１９９８年９月３０日出願）に対する優先権を主張し、その開示は本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には特異的結合のアッセイ、具体的には核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける検出可能なシグナルを増強するための方法および化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸ハイブリダイゼーションは、一般的には生化学的研究および診断アッセイにおいて使用される。一般的には、一本鎖の分析物核酸は、標識された核酸プローブにハイブリダイズされ、そして得られた核酸二重鎖が検出される。放射活性標識および非放射活性標識が使用されてきた。検出されるシグナルを増強するための方法もまた、開発されてきた。例えば、第一のオリゴヌクレオチドユニット、および第二のオリゴヌクレオチドユニットを含む分枝を含有する大型の櫛形分枝ポリヌクレオチドが、核酸検出アッセイにおけるシグナル増幅のために開発されてきた。この適用において、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの米国特許第５，７１０，２６４号に記載のように、分枝ポリヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドユニットを介して一本鎖の分析物核酸とハイブリダイズし、次いで標識されたオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドユニットを介して分枝ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。
【０００４】
一本鎖ＤＮＡ鎖の連続したハイブリダイゼーションによって構築されるデンドリマーが、開発されてきた。一本鎖対同士のハイブリダイゼーションは、二本鎖の中心および４本の一本鎖の「腕」を有するモノマーを生成する。モノマーは、連続したハイブリダイゼーション工程において指数関数的に増殖し得、末端の一本鎖の腕を含む巨大分子を生成する。このデンドリマーは、数百から数百万塩基のサイズの範囲であり得る。標的とハイブリダイズされない腕は、共有結合的に標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る。これらのデンドリマーは、Ｐｏｌｙｐｒｏｂｅ、Ｂａｌａ、Ｃｙｎｗｙｄ、ＰＡより市販されている。核酸をアッセイするためのデンドリマーは、米国特許第５，１７５，２７０号、同第５，４８７，９７３号、および同第５，４８４，９０４号に記載され、これらの開示は本明細書中で援用される。
【０００５】
アビジン−ビオチン系は、種々の検出アッセイでの使用について開発されてきた。ビオチン系における核酸の検出および標識化についての方法は、例えば、「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，７０〜９９頁；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」，Ｇ．Ｈｏｗａｒｄ編．，ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，１９９３，１１〜２７頁および１３７〜１５０頁に記載される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸配列の検出についての方法は、バックグラウンドのノイズ、時間および要求される労力、特異性の欠落および感度の欠落を含む欠点に悩まされてきた。本発明は、ポリマー、具体的には核酸の検出のための物質を提供することを目的とする。本発明は、特異的結合における核酸配列の検出に使用される標識シグナルを増強するための方法および化合物の提供を目的とする。本発明は、高感度かつ高分解能で、特異的かつ迅速に検出される核酸配列を可能にする方法および化合物を提供することをさらなる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、核酸標的を検出するための方法を提供する。この方法は、ａ）標的核酸配列を含む核酸標的を、プローブの核酸配列を含む核酸プローブにハイブリダイズする工程であって、該標的が結合リガンドを含む、工程；ｂ）ハイブリダイズされた該標的を、該結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させ、該レセプターと該結合リガンドとを複合体化させる工程；ｃ）該レセプターを、複数の該結合リガンドを含む増幅試薬と接触させ、該増幅試薬を、該レセプターと複合体化させる工程；およびｄ）複合体化した該増幅試薬の存在を検出する工程、を包含する。
【０００８】
１つの好ましい実施態様では、上記増幅試薬は抗体を含む。
【０００９】
別の好ましい実施態様では、上記増幅試薬はＤＮＡマトリックスを含む。
【００１０】
より好ましい実施態様では、上記ＤＮＡマトリックスは、部分的に二本鎖であるＤＮＡ分子、および部分的に一本鎖であるＤＮＡ分子のサブユニットを含む。
【００１１】
本発明のより好ましい局面では、核酸標的を検出するための上記方法において、上記ＤＮＡマトリックスが以下：第一の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの複数の分子であって、該ポリヌクレオチドは、第一の分子末端、第二の分子末端、および該第一の末端と該第二の末端との中間にある二本鎖の胴部分を有し、ここで該第一の末端および該第二の末端のそれぞれが、ポリヌクレオチドの一本鎖からなる第一の腕および第二の腕の少なくとも１つを含み、そして該一本鎖は、核酸におけるヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズし得、そして該第一の末端および該第二の末端それぞれの該第一の腕および該第二の腕は互いにハイブリダイズし得ない、分子；第二の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの複数の分子であって、各ポリヌクレオチドは、第一の分子末端、第二の分子末端、ならびに該第一の末端および該第二の末端の中間にある二本鎖の胴部分を含み、該第一および第二の末端は、各々、核酸におけるヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズし得る一本鎖のポリヌクレオチドからなる第一の腕および第二の腕の少なくとも１つを有し、ここで、該第一の末端および該第二の末端のそれぞれの該第一の腕および該第二の腕は互いにハイブリダイズし得ない、分子；を含み、ここで、該第一のポリヌクレオチドおよび該第二のポリヌクレオチドの複数の分子が、１つ以上のそれらの腕のアニーリングを介して共に結合し、マトリックスを形成し、そして該マトリックスの外側表面に位置する複数の該第一および第二のポリヌクレオチド分子の腕が、核酸に付着した結合リガンドを有する核酸とハイブリダイズする、方法を提供する。
【００１２】
１つの好ましい実施態様では、少なくとも１つの上記レセプターおよび上記増幅試薬は、検出可能な標識を含有し；そして、工程ｄ）は、該標識を検出する工程を包含する。
【００１３】
さらに好ましい実施態様では、上記方法は、上記工程ｄ）に先行して、少なくとも１つの上記レセプターおよび上記増幅試薬を検出可能な標識で標識する工程をさらに包含し；そして工程ｄ）は、該標識を検出する工程を包含する。
【００１４】
別のさらに好ましい実施態様では、上記方法は、工程ｃ）の後および工程ｄ）の前に、複数の上記結合リガンドを含む上記増幅試薬を標識されたレセプター分子と接触させて、それにより複数の該標識されたレセプター分子を該増幅試薬と複合体化させる工程をさらに包含し；そして工程ｄ）は、該増幅試薬と複合体化された該標識されたレセプター分子を検出する工程を包含する。
【００１５】
さらにより好ましい実施態様では、上記標識は、蛍光標識、金標識および酵素標識からなる群から選択される。
【００１６】
なおさらにより好ましい実施態様では、上記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびクマリンからなる群から選択される。
【００１７】
本発明のさらなる局面では、核酸標的を検出するための上記方法において、上記結合リガンドがビオチンを含み、そして上記レセプターがアビジンまたはストレプトアビジンを含む、方法を提供する。
【００１８】
１つの好ましい実施態様では、上記増幅試薬は、上記レセプターと特異的に結合し得る抗体を含有する。
【００１９】
さらに好ましい実施態様では、上記結合リガンドはビオチンを含み、上記レセプターはアビジンまたはストレプトアビジンを含み、そしてビオチンは上記抗体と共有結合される。
【００２０】
本発明はさらに、核酸標的を検出するための上記方法において、上記レセプターがストレプトアビジンを含み、そして上記抗体が、該抗体と共有結合される複数のビオチン分子を含む抗ストレプトアビジン抗体である方法を提供し、ここで該方法は、工程ｃ）の後および工程ｄ）の前に、該抗体を標識されたストレプトアビジンと接触させ、それにより複数の該標識されたストレプトアビジン分子を該抗体と複合体化させる工程をさらに包含し得；そして工程ｄ）は、該抗体と複合体化された該標識されたストレプトアビジン分子を検出する工程を包含する、方法を提供する。
【００２１】
１つの好ましい実施態様では、上記増幅試薬は一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡマトリックスを含有し；そして、ビオチンが、複数のビオチン化核酸の該ＤＮＡマトリックスの一本鎖へのハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡマトリックスに結合する。
【００２２】
本発明の別の局面は、核酸標的を検出するための上記方法における工程ｃ）の後および工程ｄ）の前に、上記ＤＮＡマトリックスを標識されたストレプトアビジンと接触させ、それにより複数の標識されたストレプトアビジン分子を該ＤＮＡマトリックスと複合体化させる工程を包含し；そしてここで、工程ｄ）は、該ＤＮＡマトリックスと複合体化された該標識されたストレプトアビジン分子を検出する工程を包含する、方法に関する。
【００２３】
１つの好ましい実施態様では、上記標識が、蛍光標識、金標識および酵素標識からなる群から選択される。
【００２４】
より好ましい実施態様では、上記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびクマリンからなる群から選択される。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、上記核酸プローブが表面上に固定化される。
【００２６】
なおより好ましい実施態様では、上記表面はラングミュア−ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム、ケイ素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、ガリウムリン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２７】
本発明のさらに別の局面は、核酸標的を検出するための上記方法における、上記工程（ａ）において、上記ハイブリダイゼーションがスルホン酸塩緩衝液を含むハイブリダイゼーション溶液中で行われる方法に関する。
【００２８】
１つの好ましい実施態様では、上記工程（ａ）において、上記ハイブリダイゼーションが、スルホン酸塩緩衝液を含むハイブリダイゼーション溶液中で行われる。
【００２９】
本発明のさらに別の局面は、核酸標的を検出する方法に関し、この方法は、以下の工程：ａ）表面を含む基板を提供する工程であって、該表面は少なくとも１００個の核酸プローブを含み、各核酸プローブは、約０．１ｃｍ2より狭い面積に含まれ、そして各核酸プローブは、該表面上の規定された配列および位置を有する工程；ｂ）該表面を標的核酸配列を含む核酸標的と接触させ、該核酸標的を、該標的核酸配列とハイブリダイズし得るプローブ核酸配列を含む少なくとも１つの選択された核酸プローブとハイブリダイズさせる工程であって、そしてここで該標的は結合リガンドを含む、工程；ｃ）該ハイブリダイズされた標的を、該結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させ、該レセプターを該結合リガンドと複合体化させる工程；ｄ）該レセプターを複数の該結合リガンドを含む増幅試薬と接触させ、該増幅試薬を該レセプターを複合体化させる、工程；ならびにｅ）複合体化された該増幅試薬の存在を検出する工程、を包含する。
【００３０】
１つの好ましい実施態様では、上記工程ｂ）において、上記表面がスルホン酸塩緩衝液を含むハイブリダイゼーション溶液中で上記核酸標的と接触する。
【００３１】
より好ましい実施態様では、上記スルホン酸塩緩衝液は、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）である。
【００３２】
別のより好ましい実施態様では、上記増幅試薬が、ＤＮＡマトリックスを含み、上記結合リガンドは、ビオチンを含み、そして上記レセプターはストレプトアビジンを含む。
【００３３】
さらに別のより好ましい実施態様では、上記結合リガンドは、ビオチンを含み、上記レセプターは、ストレプトアビジンを含み、そして上記増幅試薬は、抗ストレプトアビジン抗体を含む。
【００３４】
本発明のさらに別の局面は、複合体に関し、この複合体は、結合リガンドを含む核酸；該結合リガンドと結合し得る多数の結合部位を含むレセプター；および複数の該結合リガンドを含む増幅試薬を含む。
【００３５】
１つの実施態様では、上記結合リガンドは、ビオチンを含み、そして上記レセプターはストレプトアビジンまたはビオチンを含む。
【００３６】
別の実施態様では、上記増幅試薬はＤＮＡマトリックスを含む。
【００３７】
より好ましい実施態様では、上記増幅試薬は抗ストレプトアビジン抗体を含む。
【００３８】
本発明のさらに別の局面は、核酸プローブを固定した表面を含む基板に関し、ここで該核酸プローブは、標的核酸配列を含む核酸標的とハイブリダイズするプローブ核酸配列を含み；該標的は結合リガンドを含み、そして該標的における該結合リガンドは、該結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと複合体化し、そして該レセプターは、複数の該結合リガンドを含む増幅試薬と複合体化する。
【００３９】
１つの好ましい実施態様では、上記結合リガンドは、ビオチンを含み、そして上記レセプターはストレプトアビジンまたはアビジンを含む。
【００４０】
より好ましい実施態様では、上記増幅試薬はＤＮＡマトリックスを含む。
【００４１】
さらにより好ましい実施態様では、上記増幅試薬は、抗ストレプトアビジン抗体を含む。
【００４２】
特異的結合のアッセイを使用する標的分子を検出するための方法および化合物が提供される。標的分子の検出におけるシグナル増幅に有用である方法および組成物が提供される。
【００４３】
１つの実施態様では、核酸標的を検出するための方法が提供され、ここでこの方法は標的核酸配列を含む核酸標的をプローブの核酸配列を含む核酸プローブとハイブリダイズする工程を含み、ここで、標的は結合リガンドを含む。ハイブリダイズされた標的を、結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させ、レセプターを結合リガンドと複合体化し、そしてレセプターを複数の結合リガンドを含む増幅試薬と接触させ、増幅試薬をレセプターと複合体化する。次に複合体化された増幅試薬の存在は、例えば、少なくとも１つのレセプターおよび増幅試薬上での検出可能な標識の存在を検出することにより検出される。
【００４４】
必要に応じて、ハイブリダイズされた標的と複合体化されたレセプターと増幅試薬とを複合体化した後、複数の結合リガンドを含む増幅試薬は、標識されたレセプター分子と接触され、それにより複数の標識されたレセプター分子は増幅試薬と複合体化し、そして増幅試薬と複合体化した標識されたレセプター分子が検出される。これは検出可能なシグナルが増強されそしてより容易に検出されることを可能にする。
【００４５】
使用され得る標識としては、蛍光標識、金標識、および酵素標識が挙げられる。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィン、またはクマリンが挙げられる。１つの好ましい実施態様では、結合リガンドはビオチンであり、そしてレセプターはアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００４６】
増幅試薬は、ポリマー（例えば、ポリ（アミノ酸）、またはポリヌクレオチド）を含み得る。１つの実施態様では、増幅試薬は抗体（例えば、レセプターと特異的に結合し得る抗レセプター抗体）であり得る。
【００４７】
別の実施態様では、増幅分子はＤＮＡマトリックスであり得る。ＤＮＡマトリックスは部分的に二本鎖のＤＮＡ分子および部分的に一本鎖のＤＮＡ分子のサブユニットを含み得る。１つの実施態様では、ＤＮＡマトリックス分子は、第一の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの複数の分子を含み、このポリヌクレオチドは、第一の分子末端、第二の分子末端および第一の末端および第二の末端の中間である二本鎖胴部分を有し、ここで、第一末端および第二末端は、一本鎖のポリヌクレオチドからなる少なくとも１つの第一の腕および第二の腕をそれぞれ含み、そしてここで一本鎖は核酸のヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズ可能であり、そして上記の第一の末端および第二の末端のそれぞれの第一の腕および第二の腕は、互いにハイブリダイズし得ない。このＤＮＡマトリックスは、複数の第二の部分的に二本鎖のポリヌクレオチド分子をさらに含み、それぞれのポリヌクレオチドは、第一の分子末端、第二の分子末端、および第一の末端および第二の末端の中間である二本鎖胴部分を有し、第一の末端および第二の末端は、核酸のヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズする一本鎖のポリヌクレオチドからなる少なくとも１つの第一の腕および第二の腕をそれぞれ有し、ここで、これら第一の末端および第二の末端それぞれの第一の腕および第二の腕は互いにハイブリダイズし得ない。ＤＮＡマトリックスでは、複数の第一のポリヌクレオチド分子および第二のポリヌクレオチド分子が１つ以上のそれらの腕のアニーリングを介して共に結合してマトリックスを形成し、ここで、マトリックスの外部表面上に位置する複数の第一のポリヌクレオチド分子および第二のポリヌクレオチド分子は、核酸に結合する結合リガンドを有する核酸とハイブリダイズする。
【００４８】
１つの実施態様では、結合リガンドはビオチンであり、レセプターはアビジンまたはストレプトアビジンである。例えば、増幅試薬が抗体である実施態様では、ビオチンは抗体と共有結合され得る。例えば、抗体は抗体と共有結合する複数のビオチン分子を含む抗ストレプトアビジン抗体であり得る。アッセイでは、抗体と、ビオチン化した標的核酸と結合したストレプトアビジンレセプターの複合体化の後、抗体は標識されたストレプトアビジンと接触され得、それによって複数の標識されたストレプトアビジン分子は抗体と複合体化し、次いで、抗体と複合体化した標識されたストレプトアビジン分子は検出され得、このようにしてアッセイでのシグナル増幅を提供する。
【００４９】
増幅試薬が一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡマトリックスである実施態様では、ビオチンからなる結合リガンドは、複数のビオチン化された核酸のＤＮＡマトリックスの一本鎖とのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡマトリックスと結合され得る。この実施態様では、ハイブリダイズされた標的と複合体化したレセプターと、ＤＮＡマトリックスとの複合体形成後、ビオチン化されたＤＮＡマトリックスは、標識されたストレプトアビジンと接触され、それによって複数の標識されたストレプトアビジン分子とＤＮＡマトリックス上のビオチンが複合体化し、そしてＤＮＡマトリックスと複合体化した標識されたストレプトアビジン分子が検出され、このようにして検出シグナルを増強する。
【００５０】
１つの好ましい実施態様では、核酸プローブは表面上に固定化される。この表面は、例えば、ラングミュア−ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム、シリコン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウム砒素、ガリウムリン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およそれらの組合せであり得る。
【００５１】
１つの実施態様では、標的核酸配列を含む核酸標的と、プローブ核酸配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションが、スルホン酸塩緩衝液を含むハイブリダイゼーション溶液中で実施される。
【００５２】
さらなる実施態様では、核酸標的を検出するための方法が提供され、ここでこの方法は以下の工程を含む。少なくとも１００個の核酸プローブを、それぞれ約０．１ｃｍ2より狭い面積に含む表面を提供する工程（それぞれの核酸プローブは表面上の規定された配列および位置を有する）、そして標的核酸配列を含む核酸標的と表面を接触させ、核酸標的と、標的核酸配列をハイブリダイズし得るプローブの核酸配列を含む少なくとも１つの選択された核酸プローブとのハイブリダイズを可能にする、工程（ここで、標的は結合リガンドを含む）。例えば、プローブは好ましくは共有結合により表面上に固定化される。この方法はさらに以下の工程を含む。ハイブリダイズされた標的を結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触させてレセプターと結合リガンドとを複合体化させる工程；レセプターと複数の結合リガンドを含む増幅試薬を接触させて増幅試薬とレセプターとを複合体化させる工程；および複合体化された増幅試薬の存在を検出する工程。１つの実施態様では、増幅試薬は、抗体またはＤＮＡマトリックスを含み、結合リガンドはビオチンを含み、そしてレセプターは、ストレプトアビジンを含む。１つの実施態様では、プローブを含む表面は、スルホン酸塩緩衝液（例えば、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」））を含むハイブリダイゼーション溶液中で核酸標的と接触される。
【００５３】
結合リガンドを含有する核酸；レセプター；および複数の結合リガンドを含む増幅試薬を含む複合体もまた提供される。１つの実施態様では、結合リガンドはビオチンであり、そしてレセプターはストレプトアビジンまたはアビジンである。
【００５４】
別の実施態様では、標的核酸配列を含む核酸標的とハイブリダイズした、プローブ核酸配列を含む核酸プローブを固定化した表面を包含する基板が提供され、ここで、この標的は結合リガンドを含み、そして標的上の結合リガンドは、結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターとを複合体化させ、そしてこのレセプターは、複数の結合リガンドを含む増幅試薬と複合体化する。
【発明の効果】
【００５５】
本発明により、ポリマー、具体的には核酸の検出のための物質、特異的結合における核酸配列の検出に使用される標識シグナルを増強するための方法および化合物、ならびに高感度かつ高分解能で、特異的かつ迅速に検出される核酸配列を可能にする方法および化合物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
特異的な結合のアッセイを使用して標的分子を検出するための方法および化合物が提供される。特に、核酸標的を検出するための方法が提供される。
【００５７】
１つの実施態様において、この方法は、標的核酸配列を含む核酸標的をプローブ核酸配列を含む核酸プローブにハイブリダイズする工程を包含し、ここで、この標的は結合リガンドを含む。ハイブリダイズした標的は、結合リガンドに結合し得る複数の部位を含むレセプターと接触して、結合リガンドにレセプターを複合体化させ、そしてレセプターは、複数の結合リガンドを含む増幅試薬と接触し、レセプターと増幅試薬を複合体化する。次いで、複合体化された増幅試薬の存在を、例えば、レセプターまたは増幅試薬上で、例えば、蛍光標識のような検出可能な標識の存在を検出することによって検出する。必要に応じて、ハイブリダイズした標的に複合体化したレセプターに増幅試薬を複合体化した後、複数の結合リガンドを含む増幅試薬は、標識されたレセプター分子と接触し、それにより、複数の標識されたレセプター分子を増幅試薬と複合体化させ、そして増幅試薬と複合体化した標識されたレセプター分子が検出される。これにより、検出可能なシグナルが増幅され、そしてより容易に検出される。１つの実施態様において、増幅試薬は抗体またはＤＮＡマトリックスであり、結合リガンドはビオチンであり、そしてレセプターはストレプトアビジンである。
【００５８】
別の実施態様において、表面に固定化された異なる核酸プローブのアレイは、それぞれ、表面上で規定された配列および部位を有し、本明細書に開示されるアッセイにおいて使用され得、そのようにして、サンプル中の多数の核酸の結合のスクリーニングおよび検出を可能にする。
【００５９】
核酸標的およびプローブが、実施例によって本明細書に詳細に議論されるが、本明細書に開示される方法および化合物は、ポリペプチドを含む他の分子の結合を検出するために使用され得る。
【００６０】
（増幅試薬）
増幅試薬は、レセプターに結合し得る結合リガンドを含む任意の化学物質であり得る。好ましくは、増幅分子は、レセプターに結合し得る複数の結合リガンドを含む。そのリガンドは、例えば、非共有特異的結合相互作用を介してレセプターに結合可能であり得る。増幅試薬は、例えば、ポリ（アミノ酸）またはポリ（エステル）のようなポリマーを含み得る。
【００６１】
１つの実施態様において、増幅試薬は、抗体を含み得る。本明細書で使用される用語「抗体」とは、イムノグロブリン分子、または特定の抗原に特異的に結合する能力を有するイムノグロブリン分子のフラグメントをいう。抗体は、アッセイで使用されるレセプターに特異的な抗レセプター抗体であり得る。このように、抗体は、抗原としてのレセプターに特異的に結合可能であり得る。抗体およびその製造方法は、免疫学の分野において周知である。抗体は、例えば、ハイブリドーマ細胞株によって、ポリクローナル抗体応答を誘発する免疫化によって、または抗体をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換されている組換え宿主細胞によって産生され得る。抗体は、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のイムノグロブリン分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｃｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆｄ、ＶHおよびＶLを含む活性フラグメントを含むがこれらには限定されない。抗体は、一本鎖抗体、キメラ抗体、変異体、融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含むイムノグロブリン分子の任意の他の改変された構造を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
抗体フラグメントおよび他の改変した形態を含む抗体の調製は、例えば、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」において、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９６；「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」第２版、Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」Ｅ．Ｐ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９６；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，において記載され、それらの開示は、本明細書において援用される。広範な種々の抗体がまた市販される。
【００６３】
増幅試薬は、好ましくは、複数の結合リガンドを含む。好ましくは、結合リガンドは、増幅試薬と共有結合する。例えば、１つの実施態様において、結合リガンドは、ビオチンを含み、レセプターは、アビジンまたはストレプトアビジンであり、そして増幅試薬は、抗ストレプトアビジン抗体である。この実施態様において、例えば、複数のビオチン分子（例えば、約３〜１０ビオチン分子）が、抗体と共有結合する。
【００６４】
１つの実施態様において、増幅試薬は、ポリヌクレオチドマトリックスである。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合体形態をいい、それは、プリン塩基とピリミジン塩基、または、他の天然の、化学的または生化学的に改変した、非天然の、あるいは誘導体化したヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸塩の基（ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて代表的に見出し得るように）、または改変または置換した糖またはリン酸塩の基を含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような改変ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
【００６５】
１つの実施態様において、増幅試薬は、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）マトリックスである。本明細書に使用される句「ＤＮＡマトリックス」とは、１つ以上のデオキシリボ核酸を含むＤＮＡの複合体をいう。ＤＮＡは、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的または生化学的に改変された、非天然の、あるいは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。１つの実施態様において、ＤＮＡマトリックスは、部分的に二本鎖および部分的に一本鎖のＤＮＡ分子のサブユニットを含むデンドリマーである。デンドリマーＤＮＡマトリックスは、二本鎖の腰部、および分子末端に一本鎖の自由な腕を含む特定の構造のポリヌクレオチドの連続的な層を含み、その腕を隣接する分子の腕にハイブリダイズすることによって形成される。例示的なデンドリマーＤＮＡマトリックスは、Ｐｏｌｙｐｒｏｂｅ，Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ，ＰＡ，より市販されており、そして米国特許第５，１７５，２７０号および第５，４８７，９７３において詳細に記載されており、その開示は、本明細書中に援用される。
【００６６】
例えば、デンドリマーＤＮＡマトリックスを形成するために、ヌクレオチド鎖分子のセットが、例えば、Ｍｏｄｅｌ  １５００  ＳＹＳＴＥＣ合成機のようなＤＮＡ合成機または「遺伝子機器」で合成することによって提供される。分子は、公知の方法による大規模産生のための、特定の改変されたＥ．ｃｏｌｉベクター中にクローン化され得る。分子をハイブリダイズし、ＤＮＡマトリックスを形成する。
【００６７】
デンドリマーＤＮＡマトリックスは、ＤＮＡ層を含む。最も外側のＤＮＡマトリックス層は、あらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズし得る表面に一本鎖配列を有する。それぞれの層は、マトリックスモノマーの特定のクラスを構成する。マトリックスモノマーの配列の連続的付加により、３次元ＤＮＡマトリックスを生じる。
【００６８】
ＤＮＡデンドリマーのアセンブリの１つの実施態様を、図１〜図３および米国特許第５，１７５，２７０号の記載を参照することによって提供する。例えば、マトリックスモノマーは、米国特許第５，１７５，２７０号の図２に示すように、中央に２重鎖の「腰」、および４つの一本鎖の「腕」を有するＤＮＡダイマーである。マトリックスモノマーおよびその成分（すなわち、腰および腕）は、任意の長さであり得る。例えば、それぞれの腰は、約２５〜約２５００ヌクレオチドの範囲であり得る。一本鎖の腕は、代表的には、長さが、約１２と約１０００ヌクレオチドとの間の範囲であり得、そして好ましくは、約２０と１００ヌクレオチドとの間であり得る。
【００６９】
米国特許第５，１７５，２７０号の図１は、マトリックスモノマーを形成するようにアセンブリし得る７つの一本鎖ＤＮＡオリゴマーを図解する。示されたそれぞれのオリゴマーにおいて、実線は（＋）鎖を表し、一方、破線は相補鎖の配列を表す。それぞれの文字を記載した（ａ〜ｅ）セグメントは、異なるオリゴマーにおいて独特の配列を示す。米国特許第５，１７５，２７０号の図２は、米国特許第５，１７５，２７０号の図１において１〜７に番号付けされた一本鎖ＤＮＡオリゴマー鎖のハイブリダイゼーションによってアセンブリされたマトリックスモノマーＡ、Ｂ’、Ｂ’’、Ｃ’およびＣ’’を示す。このように各マトリックスモノマーは、二本鎖（腰）領域、および一本鎖領域（腕）を含むダイマーである。マトリックスモノマーＡ、Ｂ’、Ｂ’’、Ｃ’およびＣ’’の連続的な付加は、米国特許第５，１７５，２７０号の図３に記載した３次元のＤＮＡマトリックスを生じ、そこで３次元マトリックスは、コアおよび表面層を有する。マトリックスモノマーのさらなる付加は、所望の数の層を含むようにＤＮＡマトリックスの増殖を可能にするために実行し得る。このように、１つの実施態様において、ＤＮＡマトリックスは、米国特許第５，１７５，２７０号に詳細に記載しているように、当該分野で利用できるハイブリダイゼーション反応条件を使用して、上記のようにマトリックスモノマーの連続的なハイブリダイゼーションによってアセンブリされる。
【００７０】
最も外側の殻（ｓｈｅｌｌ）すなわち表面層は、選択された配列を有する末端オリゴヌクレオチドの腕を有する。このようにＤＮＡマトリックスは、マトリックスの腕の配列の逆の相補物であるオリゴヌクレオチドに結合したリガンドまたはレセプターまたは標識に、都合よくハイブリダイズし得る。
【００７１】
従って、１つの実施態様において、米国特許第５，１７５，２７０号（その開示は、本明細書に援用する）に記載するように、ＤＮＡマトリックスは、第一の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの複数の分子を含み、ここでこのポリヌクレオチドは第一の分子末端、第二の分子末端および第一および第二の末端の中間の二本鎖胴部分を有し、ここで第一末端および第二末端はそれぞれ、ポリヌクレオチドの一本鎖を含む第一の腕および第二の腕の少なくとも１つを含み、そしてここで一本鎖は、核酸のヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズし得、そして上記の第一末端および第二末端のそれぞれの第一の腕および第二の腕は、互いにハイブリダイズし得ない。ＤＮＡマトリックスはさらに第二の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの複数の分子を含み、それぞれのポリヌクレオチドは、第一の分子末端、第二の分子末端ならびに第一の末端および第二の末端の中間の二本鎖胴部分を含み、第一末端および第二末端はそれぞれ、核酸のヌクレオチドのあらかじめ決定された核酸配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチドの一本鎖からなる第一の腕および第二の腕の少なくとも１つを有し、ここで上記の第一および第二末端のそれぞれの第一の腕および第二の腕は、互いにハイブリダイズし得ない。第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドの複数の分子を、その１つ以上の腕をアニーリングすることによって、互いに結合して、マトリックスを形成し、そしてマトリックスの外側の表面に位置する複数の第一および第二のポリヌクレオチド分子の少なくとも１つのアニーリングしていない腕は、核酸配列と自由にハイブリダイズする。
【００７２】
有利なことに、アニーリングしていない腕は、核酸のヌクレオチドの特異的核酸配列とハイブリダイズし得る。従って、リガンド、レセプター、および標識のような他の部分に付着したデンドリマーの腕の特定の配列に相補的な配列を有する核酸は、当該分野で利用できるハイブリダイゼーション条件を使用して自由な腕とハイブリダイズし得、１つの好ましい実施態様において、ソラレンのような市販の試薬を使用して不可逆的に架橋し得る。１つの実施態様において、デンドリマーの腕の特定の配列に相補的な配列を有する核酸は、結合リガンドに共有結合し、次いで、これらの複数の核酸はＤＮＡマトリックスとハイブリダイズし、複数の結合リガンドを含むＤＮＡマトリックス増幅試薬を提供する。
【００７３】
（抗体を使用しての増幅）
１つの実施態様においてプローブ配列を含む核酸プローブに対する標的配列を含む核酸標的のハイブリダイゼーションを検出するための方法を提供する。核酸プローブを、好ましくは基板の表面に固定化する。１つの実施態様において、結合リガンドを、好ましくは共有結合によって核酸標的に複合体化する。
【００７４】
アッセイにおいて、例えば、固定化した核酸プローブを、連続的に、結合リガンドを含む核酸標的と接触させ、結合リガンドと結合し得る複数の部位を含むレセプターと接触させ、そして抗体に好ましくは共有結合する複数の結合リガンドを含む抗レセプター抗体と接触させる。核酸プローブの標的に対するハイブリダイゼーションが生じた場合、次いで、複合体が、標的、レセプターおよび抗体の結合リガンドから形成される。得られる複合物は、例えば、レセプターまたは抗体上に検出可能な標識を提供しそして検出することによって、または複合体化抗体と接触させることによって、検出され得、そして抗体における結合リガンド分子と結合できるレセプターの標識された検出可能分子を検出する。従って、標識の検出は、核酸標的およびプローブのハイブリダイゼーションの陽性指標を提供する。
【００７５】
１つの実施態様において、リガンドおよびレセプターは、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジンである。この実施態様において、プローブヌクレオチド配列を含む固定化した核酸プローブを有する標的ヌクレオチド配列を含む核酸標的のハイブリダイゼーションを決定する方法を提供する。１つのビオチン化核酸標的を提供する。この方法は、固定化核酸プローブを、例えば、連続的にビオチン化核酸標的；ストレプトアビジン；複数のビオチンを含むビオチン化抗ストレプトアビジン抗体；および標識したストレプトアビジン分子とを接触させる工程を包含する。ストレプトアビジンは、蛍光標識のような検出可能な標識によって標識される。この実施態様において、プローブに核酸標的をハイブリダイズすることによる結合は、高度の感受性で検出し得る。プローブおよび標的のハイブリダイゼーションの際に、標的は、ストレプトアビジンが複合体化し得る１つのビオチン部分のみを含む。ビオチン化標的を有するストレプトアビジンの複合体化の際に、ビオチン分子の数が、大きく増幅される。抗体上のビオチンに標識されたストレプトアビジンを複合体化させる際に、検出し得る標識の数が、大いに増幅され、そのようにして大いにアッセイの感度を増強する。
【００７６】
このアッセイを、摸式的に図１に示す。図１、スキーム１は、共有結合したビオチン分子を含む核酸標的３０とハイブリダイズした固相基板１０の表面に固定化した核酸プローブ２０を図示する。標的３０のビオチン分子を、必要に応じて検出可能な標識で標識したストレプトアビジン分子と複合体化する。図１のスキーム２に示すように標識されたストレプトアビジン４０は、複数のビオチン分子を含むビオチン化された抗ストレプトアビジン抗体５０と複合体化する。従って、抗体は、抗体結合相互作用およびビオチン−ストレプトアビジン相互作用のいずれかまたは両方によって、固定化したビオチン化ストレプトアビジンと相互作用し、そして複合体化し得る。図１のスキーム３に示すように、標識されたストレプトアビジン分子４０は、固定化した抗体５０と複合体化し、そして検出およびシグナル増幅のための多数の標識を提供する。従って、抗体は、多数の標識されたストレプトアビジン分子が複合体化および検出されるようにする架橋を提供する。標識の検出可能なシグナルを増強する架橋およびシグナル増幅のさらなる工程がまた、本発明の範囲内に含められ得る。
【００７７】
１つの実施態様において、使用し得る検出可能なストレプトアビジンは、ストレプトアビジン  フィコエリトリンであり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）より市販されている。ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から入手可能である。
【００７８】
当該分野で開発された核酸ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，第１５２巻，「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，１９８７；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：１１９４（１９８３）に記載されるように使用され得る。
【００７９】
使用され得る核酸ハイブリダイゼーション緩衝液は、例えば、ｐＨが約６〜８のリン酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝液を含む。１つの実施態様において、標準生理食塩水リン酸エチレンジアミンテトラ酢酸（「ＳＳＰＥ」）緩衝液を使用する。例示的なリン酸緩衝液は、ｐＨが約６．８の０．０６Ｍ  Ｈ2ＰＯ4／ＨＰＯ4、１Ｍ  Ｎａ+，０．００６Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）を含み、本明細書中で「６×ＳＳＰＥ−Ｔ」という。１つの好ましい実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、スルホン酸塩ハイブリダイゼーション緩衝液、例えば、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）を含む緩衝液が使用される。例えば、ハイブリダイゼーション緩衝溶液は、例えば、約６〜７のｐＨで、約０．０１Ｍ〜約２Ｍ  ＭＥＳまたはそれより多く（例えば、約０．２５Ｍ  ＭＥＳ）を含み得る。１つの実施態様において、ＭＥＳ緩衝液は、約５．５〜６．７のｐＨ（例えば、６．７）で０．２５Ｍ  ＭＥＳ、１Ｍ  Ｎａ+、および０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む。ハイブリダイゼーションは、例えば、約２５℃〜７０℃（例えば、約４５℃）で行ない得る。必要に応じて、その緩衝液を、使用前に、例えば、２μｍフィルターを通して濾過し得る。
【００８０】
（ＤＮＡマトリックスを使用しての増幅）
１つの実施態様において、プローブ配列を含む核酸プローブへの、標的配列を含む核酸標的のハイブリダイゼーションによって、結合を検出するための方法を提供する。核酸プローブを、好ましくは、表面に固定化する。この実施態様において、結合リガンドを、好ましくは共有結合によって、核酸標的に複合体化する。次いで、固定化核酸プローブを、例えば、連続的に、結合リガンドを含む核酸標的；結合リガンドに結合し得る複数の部位を含むレセプター；および複数の結合リガンドを含むＤＮＡマトリックスと接触させる。標的に対する核酸プローブのハイブリダイゼーションが生じた場合、次いで複合体が、標的の結合リガンド、レセプター、およびＤＮＡマトリックスから形成される。得られる複合体は、例えば、ＤＮＡマトリックス上で検出可能な標識を提供しそして検出することによって、または複合体化ＤＮＡマトリックスと接触させ、ＤＮＡマトリックス上の結合リガンド分子に結合し得るレセプターの標識された検出可能分子を検出することによって検出され得る。従って、標識の検出は、核酸標的およびプローブのハイブリダイゼーションの陽性指標を提供する。
【００８１】
１つの実施態様において、リガンドおよびレセプターは、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジンである。この実施態様において、プローブヌクレオチド配列を含む固定化した核酸プローブを有する標的ヌクレオチド配列を含む核酸標的のハイブリダイゼーションを決定する方法を提供する。１つのビオチン化核酸標的を提供する。この方法は、固定化核酸プローブを、好ましくは連続的に：ビオチン化核酸標的；ストレプトアビジン；複数のビオチンを含むビオチン化ＤＮＡマトリックス；および標識されたストレプトアビジン分子とを接触させる工程を包含する。ストレプトアビジンを、蛍光標識のような検出可能な標識で標識する。この実施態様において、プローブに対する核酸標的のハイブリダイゼーションによる結合を、高感度で検出し得る。プローブおよび標的のハイブリダイゼーション後、標的は、ストレプトアビジンが複合体化し得る１つのビオチン部分のみを含む。ストレプトアビジンは、ビオチン化標的と複合体化する。ビオチン化ＤＮＡマトリックスは、複合体化ストレプトアビジンと複合体化する。従って、ビオチン分子の数は、大いに増幅される。ＤＮＡマトリックス上のビオチンに標識されたストレプトアビジンが複合体化する際に、検出可能な標識の数が、大いに増幅される、従ってアッセイの感度が増強される。
【００８２】
当該分野で開発された核酸ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条件は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，１９８９；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１５２巻「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．，１９８７；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：１１９４（１９８３）に記載されるように使用され得る。
【００８３】
使用され得る核酸ハイブリダイゼーション緩衝液は、例えば、ｐＨが約６〜８のリン酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝液を含む。１つの実施態様において、標準生理食塩水リン酸エチレンジアミンテトラ酢酸（「ＳＳＰＥ」）緩衝液を使用する。例示的なリン酸緩衝液は、本明細書で「６×ＳＳＰＥ−Ｔ」という、ｐＨ約６．８の０．０６Ｍ  Ｈ2ＰＯ4／ＨＰＯ4，１Ｍ  Ｎａ+，０．００６Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸），０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）を含む。１つの好ましい実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、スルホン酸塩ハイブリダイゼーション緩衝液を、例えば、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）を含む緩衝液に使用する。例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液は、例えば、ｐＨが約６〜７の、約０．０１Ｍから約２ＭのＭＥＳまたはそれよりも多く（例えば約０．２５Ｍ  ＭＥＳ）を含み得る。１つの実施態様において、ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨが約６．７の０．２５Ｍ  ＭＥＳ、１Ｍ  Ｎａ+、および０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む。例えば、ハイブリダイゼーションは、約２５〜７０℃（例えば、約４５℃）で行われ得る。必要に応じて、その緩衝液は、使用前に、例えば、２μｍフィルターを通して濾過し得る。
【００８４】
１つの実施態様において、生物学的チップのような固体表面に固定化した核酸プローブへの核酸標的のハイブリダイゼーションについてのアッセイにおいて、ハイブリダイゼーションを、約４５℃で１６時間で行なう。続いて、以下を行なう：１×  ＳＴ−Ｔ（１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，０．０１％  ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ８．０）で手動で３回洗浄し；（６×  ＳＳＰＥ−Ｔ，２２℃，１０×２（１０サイクル排水し、各サイクルで２回排出および補充する））を使用してＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）での洗浄を行い；０．１×ＳＴ−Ｔ（ｐＨ８．０）で２０分５０℃で洗浄を行い；実施例に記載されたようにフィコエリトリン（「ＰＥ」）染色溶液で１５分間４０℃で染色し；１×ＳＴ−Ｔ（ｐＨ８．０）で３回手動で洗浄し；フルーイディクスステーション洗浄液Ａ（６×ＳＳＰＥ−Ｔ、２２℃、１０×２）での洗浄を行なう。スキャンを、自動共焦点蛍光スキャナー、ＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）２５００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して行う。引き続いて、４０℃で、ＳＴ−Ｔ中で約１０μｌＢＳＡを含むデンドリマー溶液を、２０分間アプライする。その後、以下を行なう：１×ＳＴ−Ｔで３回手動で洗浄；Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎでの洗浄（６×ＳＳＰＥ−Ｔ、２２℃、１０×２）；５．０×ＰＥ染色溶液での４０℃で１５分間の染色；１×ＳＴ−Ｔ（ｐＨ８．０）使用する手動での３回の洗浄；およびＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎでの洗浄（６×ＳＳＰＥ−Ｔ、２２℃、１０×２）。
【００８５】
（リガンドレセプター対）
本明細書中で、用語「リガンドレセプター対」とは、相互に認識および結合が可能な化学的部分である、リガンドおよびレセプターをいう。リガンドおよびレセプターは、相互に認識および結合して複合体を形成することが可能な任意の部分であり得る。さらに、リガンドおよびレセプターは、第３の中間物質の結合を介して、相互作用し得る。代表的には、リガンドレセプター対を構成するリガンドおよびレセプターは、相互に特異的非共有結合的相互作用をする結合分子である。リガンドおよびレセプターは、天然に存在し得、または人工的に生成され得、そして必要に応じて他の種と凝集し得る。
【００８６】
リガンドおよび／またはレセプターの例としては、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ステロイドのようなホルモン、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素および他の触媒ポリペプチド、酵素基質、補因子、低分子有機薬物を含む薬物、アヘン剤、アヘン剤レセプター、レクチン、糖、ポリサッカライドを含むサッカライド、タンパク質、ならびにモノクローナル抗体および合成抗体フラグメントを含む抗体、細胞、細胞膜および細胞膜レセプターを含む細胞膜の部分、ならびにオルガネラが挙げられるが、これらに限定されない。リガンドレセプター対の例としては、抗体−抗原；レクチン−炭水化物；ペプチド−細胞膜レセプター；プロテインＡ−抗体；ハプテン−抗ハプテン；ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン；酵素−補因子および酵素−基質が挙げられる。
【００８７】
好ましくは、リガンドレセプター対としては、複数の（例えば、２、３、４以上）のリガンド分子と結合し得るレセプターを含む。１つの好ましい実施態様において、リガンドレセプター対は、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンである。ビタミンであるビオチンは、卵白から単離される指標タンパク質であるアビジン、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ細菌より単離されるストレプトアビジンの結合により検出される。アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンについて約Ｋ＝１０15ｍｏｌ-1の結合定数を有する４つの高親和性結合部位を有する。Ｋｅｓｓｌｅｒ，「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２（この開示は本明細書中において援用する），  ２７〜３４頁中のＯｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。
【００８８】
本明細書中に開示するアッセイ方法で使用される増幅試薬は、当該分野において利用可能なリガンドレセプター結合対の種々のメンバーのいずれかに結合し得る。１つの好ましい実施態様における、標的核酸にハイブリダイズし得る固定化プローブ核酸を用いる核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、標的核酸は、リガンドレセプター結合対のメンバーを構成する結合リガンドに結合する。さらに、増幅試薬は、複数の結合リガンドを含む。好ましくは、リガンドレセプター対のレセプターは、２つ以上のリガンド分子と結合し得る。例えば、リガンドはビオチンであり得、そしてレセプターはアビジンまたはストレプトアビジン（それぞれは、ビオチン４分子と結合し得る）であり得る。プローブヌクレオチドに対する標的核酸のハイブリダイゼーションは、レセプターに対する標的核酸のリガンドの結合の検出、および増幅試薬上の結合リガンドに対するレセプターの結合の検出により、検出される。増幅試薬は、例えば、増幅試薬上に標識を提供することにより、または増幅試薬を、標識されたレセプターの複数の分子と複合体化することにより、検出される。
【００８９】
結合分子と核酸を結合するための当該分野で利用可能な方法は、リガンドまたはレセプターを、核酸標識または増幅試薬と、結合するために用いられ得る。１つの実施態様において、共有結合した結合分子を有する核酸は、ＤＮＡ合成機および標準的なホスホロアミダイト試薬を用いて、合成され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの直接標識のためのビオチンホスホロアミダイトが、使用され得る。ビオチンホスホロアミダイトは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡより市販されている。
【００９０】
１つの実施態様において、結合リガンドがビオチンである場合、ビオチン化ＤＮＡ標的は、ニックトランスレーションおよびランダムプライマーエクステンションを用い調製し得、一方、ビオチン化ＲＮＡ標的は、ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により合成し得る。ビオチン化デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオシド三リン酸は、ビオチン化ＤＮＡおよびビオチン化ＲＮＡの酵素的調製のために使用された。例示的方法は、ＲａｓｈｔｃｈｉａｎおよびＭａｃｋｅｙ、「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、７０〜８４頁中のＬａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓに詳細に開示されている。ビオチン分子の濃度は、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８４：５７７〜５８３（１９９０）；およびＣｉｍｏｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：１１５１〜１１９３（１９８５）（これら各々の開示は本明細書中で援用される）に記載のように、ソラレンビオチン試薬の使用により増加し得る。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、ビオチン化標的核酸のＨＰＬＣ精製により減少し得る。
【００９１】
ビオチンのような結合リガンドは、例えば、ビオチンのような結合リガンドが共有結合するデンドリマーの腕の特定の配列と相補的配列を有する核酸を提供し、次にＤＮＡマトリックスの腕に対して複数の核酸をハイブリダイスさせ、それにより複数の結合リガンドを含むＤＮＡマトリックス増幅試薬を生成することにより、デンドリマーＤＮＡマトリックスに取り込まれ得る。
【００９２】
ビオチンのような結合リガンドは、当該分野で利用可能な方法を用いて、抗体のようなポリ（アミノ酸）を含むポリマーのような増幅分子と結合し得る。例示的方法は、ＢａｙｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ、「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９１〜１００頁中のＬａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓおよびそこで引用される参考文献において詳細に開示され、これらの開示は本明細書中で参考として援用される。さらに、ビオチン化抗ストレプトアビジン分子のようなビオチン化抗体は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）より市販されている。
【００９３】
（標識）
種々の標識は、本明細書中で開示されるアッセイ方法において使用され得る。標識は、増幅試薬、レセプターおよび／または結合リガンド上で提供され得る。標識の例としては、蛍光標識、化学発光標識、および金のような無機的標識、ならびに酵素的標識が挙げられる。
【００９４】
例えば、色素検出、化学発光検出および蛍光検出により検出可能な標識が使用され得る。使用され得る標識としては、マーカー酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）、βガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含み、これらは、色素基質を用いて検出される。例えば、ＡＰは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸またはニトロブルーテトラゾリウム塩を用いて検出され得る。
【００９５】
他の標識としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、およびレゾルフィンのような蛍光タグならびにそれらの誘導体、ならびにヒドロキシクマリンのようなクマリンが挙げられる。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動は、Ｃａｒｄｕｌｌｏ、「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、４１４〜４２３頁中のＮｏｎｒａｄｉａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒに記載のように測定され得、この開示は本明細書中に援用される。必要に応じて、金コロイド粒子またはフェリチンのような無機標識が使用され得る。標識としての金コロイド粒子の使用は、例えば、Ｖａｎ  ｄｅ  ＰｌａｓおよびＬｅｕｎｉｓｓｅｎ、「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、１１６〜１２６頁中のＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｍａｌｌ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓにおいて記載され、この開示は本明細書中に援用される。
【００９６】
１つの好ましい実施態様における、核酸標的を検出するアッセイにおいて、固定化プローブまたはプローブアレイを用い、結合リガンドがビオチンであり、そしてレセプターがアビジンまたはストレプトアビジンであり、そして増幅試薬が抗体またはＤＮＡマトリックスである。１つ以上の標識は、アビジンまたはストレプトアビジンおよび／または増幅試薬と結合され得る。
【００９７】
蛍光タグを用いたストレプトアビジンまたはアビジンの標識のための試薬は、市販されている。例えば、試薬、５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＦＬＵＯＳ）、７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−酢酸−Ｎ’−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＭＣＡ、活性化）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮより入手可能である。蛍光標識を用いるタンパク質の蛍光標識方法、および蛍光標識の検出方法は、Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｇ．Ｈｏｗａｒｄ編、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、１９９３、３９〜６９頁中のＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓに記載され、この開示は本明細書中に援用される。さらに、種々の市販の標識されたストレプトアビジンおよびアビジン分子が存在する。例として、ストレプトアビジン−金、ストレプトアビジン−蛍光色素、ストレプトアビジン−ＡＭＣＡ、ストレプトアビジン−フルオレセイン、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＴＰＥ）、ストレプトアビジン−スルホローダミン１０１、アビジン−ＦＩＴＣおよびアビジン−Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（登録商標）が挙げられ、これらは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮより市販されている。
【００９８】
（アッセイ）
本明細書中に開示される方法および組成物は、標的配列を含む核酸標的とプローブ配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションについてのアッセイのために種々の適用において使用され得る。１つの実施態様において、異なる標的配列を含む１つ以上の標的核酸は、異なる配列を含む核酸プローブの高密度アレイとのハイブリダイゼーションについてスクリーニングされ得る。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、２つの核酸間の結合性会合（例えば、塩基対水素結合および塩基の積み重ねを介する非共有結合的相互作用）をいう。２つの一本鎖核酸がハイブリダイズする能力は、それらの相補性の程度ならびにハイブリダイゼーション反応条件のストリンジェンシーのような要素に依存する。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「ストリンジェンシー」とは、核酸がハイブリダイズする程度に影響するハイブリダイゼーションの反応条件をいう。ストリンジェントな条件は、核酸２重鎖がミスマッチの程度に基づき区別され得るよう、選択され得る。高いストリンジェンシーは、ミスマッチ塩基を含有する２重鎖の形成のより低い可能性と相関する。従って、ストリンジェンシーがより高いと、ミスマッチ２重鎖を形成しうる２つの一本鎖核酸が一本鎖にとどまる確率がより大きくなる。逆に、ストリンジェンシーがより低いと、ミスマッチ２重鎖を形成する確率が増加する。１つ以上のミスマッチを含有する２重鎖に比べ、完全にマッチする２重鎖の選択を可能とする（またはより高いミスマッチの程度を有する２重鎖と比べて、特定のミスマッチ２重鎖の選択を可能とする）適切なストリンジェンシーは、一般に経験的に決定される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを調節する手段は、当業者にとって周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９８７、１９８８、１９８９、１９９０、１９９１、１９９２、１９９３、１９９４、１９９５、１９９６および定期的なアップデート；ならびにＨａｍｅｓら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．、１９８５を参照のこと。一般的に、ストリンジェンシーを増加する条件（すなわち、よりしっかりとマッチした２重鎖の形成のための選択）は、高温度、低イオン強度および溶媒の存在または不存在を含み；より低いストリンジェンシーは、より低温度、より高イオン強度、およびより低濃度またはより高濃度の溶媒（例えば、ホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのより低い濃度）によりもたらされる。ハイブリダイゼーション反応の持続時間および反応物（すなわち、一本鎖核酸）の濃度はまた、ストリンジェンシーに影響し得、短い反応時間および低い反応物濃度によりより高いストリンジェンシーをもたらす。
【０１０１】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当該分野において十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、適用に依存して変動し、そして以下の参照を含む公知の一般的な結合方法によって選択される：Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１５２巻、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．、１９８７；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：１１９４（１９８３）、これらの各々は本明細書において参考として援用する。
【０１０２】
使用され得る核酸ハイブリダイゼーション緩衝液としては、リン酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝液（例えば、ｐＨがおよそ６〜８）が挙げられる。１つの実施態様において、標準的な生理食塩リン酸エチレンジアミン四酢酸（「ＳＳＰＥ」）緩衝液が用いられる。例示的リン酸緩衝液は以下を含む：０．０６Ｍ  Ｈ2ＰＯ4／ＨＰＯ4、１Ｍ  Ｎａ+、０．００６Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、ｐＨは約６．８、これを本明細書で「６×ＳＳＰＥ−Ｔ」という。
【０１０３】
１つの実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行う方法を提供し、ここでハイブリダイゼーション溶液は、スルホン酸塩緩衝液を含有する。スルホン酸塩ハイブリダイゼーション緩衝液としては、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）および３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）が挙げられる。１つの実施態様において、スルホン酸塩緩衝液を用いたハイブリダイゼーションアッセイは、固体表面（例えば、シリコン表面またはガラス表面）に固定化された核酸プローブを用いて行い得る。固体表面は、例えば、核酸プローブの固定化に先立って、シランコートされ得る。スルホン酸塩緩衝液を含む液体中でのハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、約２５〜７０℃の温度で、例えば、少なくとも約３５℃、または４５℃以上で、そして例えば、約１０分間から５時間以上の時間にわたり、例えば、約１６時間以上の時間にわたり、行われ得る。スルホン酸塩緩衝液は、例えば、遺伝子発現ハイブリダイゼーションアッセイおよび多型性ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、使用され得る。
【０１０４】
例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液は、約０．０１Ｍ〜約２Ｍ以上のＭＥＳ（例えば、約０．２５Ｍ  ＭＥＳ、例えば、ｐＨは約６〜７）を含有し得る。１つの実施態様において、ＭＥＳ緩衝液は、以下を含む：０．２５Ｍ  ＭＥＳ、１Ｍ  Ｎａ+、および０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ約５．５〜６．７（例えば、６．７）。ハイブリダイゼーションは、例えば、約２５〜７０℃、例えば、約４５℃で行われ得る。必要に応じて、緩衝液は使用前に、例えば、２μｍフィルターを通して濾過され得る。核酸ハイブリダイゼーション緩衝液は、さらにＴｗｅｅｎ−２０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のような界面活性物質、ならびに消泡剤のような添加物を含有し得る。
【０１０５】
核酸のようなポリマーを固体基板上に固定化したアレイを用いるスクリーニング方法は、例えば、米国特許第５、５１０、２７０号に開示され、この開示は本明細書において参考として援用される。この方法において、多様な核酸のアレイは基板上に形成される。固体基板上における核酸のようなポリマーのアレイの製造、および異なるアッセイにおける使用方法は、米国特許第５、６７７、１９５号、同５、６２４、７１１号、同５、５９９、６９５号、同５、４５１、６８３号、同５、４２４、１８６号、同５、４１２、０８７号、同５、３８４、２６１号、同５、２５２、７４３号、および同５、１４３、８５４号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１００９２号、同ＷＯ９３／０９６６８号、同ＷＯ９７／１０３６５号、ならびに米国特許出願第０８／３８８、３２１号（１９９５年２月１４日出願）に記載され、これらの全ての開示は、本明細書において援用される。高密度ＤＮＡアレイを用いる遺伝情報の入手は、Ｃｈｅｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０〜６１４（１９９６）にさらに記載され、この開示は本明細書において参考として援用される。写真平板技術と製造技術の組み合わせは、各プローブ配列が、支持体上の非常に小さな部位を占めることを可能にする。この部位は、数マイクロ程度または低分子程度の小ささですらあり得る。このようなプローブアレイは、Ｖｅｒｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＶＬＳＩＰＳ（登録商標））のような公知の型であり得る。米国特許第５、６３１、７３４号の開示は、本明細書において援用される。
【０１０６】
ポリヌクレオチドのアレイが結合した表面を有する基板を、本明細書において「生物学的チップ」という。基板は、例えば、シリコンまたはガラスであり得、そして顕微鏡スライドまたはカバーガラスの厚さを有し得る。例えば、米国特許第５、５４５、５３１号（この開示は本明細書において援用される）に記載のように、アッセイが光学的検出を含む場合、光透過性の基板は有用である。他の基板としては、ラングミュア−ブロジェット膜、ゲルマニウム、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、ガリウムリン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０７】
核酸アレイが表面に固定化される実施態様において、核酸配列の数は、異なる適用のために選択され得、そして例えば、約１００以上、または例えばいくつかの実施態様において、１０5または１０8を超え得る。１つの実施態様において、表面は、それぞれが好ましくは異なる配列を有する少なくとも１００のプローブ核酸を含み、各プローブは約０．１ｃｍ2未満、または例えば約１μｍ2〜１０、０００μｍ2間の面積に含まれ、そして各プローブ核酸は、表面上で規定された配列と位置を有する。１つの実施態様において、少なくとも１、０００の異なる核酸は表面上に提供され、ここで各核酸は、米国特許第５、５１０、２７０号に記載のように約１０-3ｃｍ2未満の面積内に含まれる。
【０１０８】
遺伝子発現をモニターするために用いられる核酸アレイは、ＰＣＴ  第ＷＯ９７／１０３６５号に記載され、この開示は本明細書において援用される。１つの実施態様において、核酸プローブのアレイは表面上に固定化され、ここでアレイは１００を超える異なる核酸を含み、そしてここで異なる各核酸は、表面上の予め決められた区域に位置決めされ、そして異なるオリゴヌクレオチドの密度は、１ｃｍ2あたり約６０を超える異なるオリゴヌクレオチドである。
【０１０９】
使用され得る表面上に固定化された核酸アレイはまた、本明細書において援用する開示である米国特許第５、７４４、３０５号に詳述される。そこで開示されるように、基板上で、異なる配列を有する核酸は、それぞれ表面上の予め規定された区域に固定化される。例えば、１０、５０、６０、１００、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、または１０8の異なるモノマー配列は、基板上に提供され得る。特定の配列の核酸は、基板上の予め規定された領域内（例えば、約１ｃｍ2〜１０-10ｃｍ2の表面積を有する）に提供される。いくつかの実施態様において、領域は、約１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、または１０-10ｃｍ2未満の面積を有する。例えば、１つの実施態様において、少なくとも第１の表面を有する平面および非多孔性の支持体、ならびに密度が約４００を超える異なる核酸／ｃｍ2である第１の表面に結合する複数の異なる核酸が提供され、ここで異なる各核酸は、予め規定された異なる領域において固形支持体の表面に結合し、異なる決定し得る配列を有し、そして例えば少なくとも４ヌクレオチド長である。核酸は、例えば、約４〜２０ヌクレオチド長であり得る。異なる核酸の数は、例えば、１０００以上であり得る。
【０１１０】
１つの実施態様において、低いガラス蛍光バックグラウンドを有する石英ガラス基板は、使用され得る。シリカ基板は、約５０μｍ〜２０μｍのフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）から発するシグナルの減衰を全くまたはほとんど生じない、低い露光プリントギャップ（ｐｒｉｎｔ  ｇａｐ）を可能にし、そして５０μｍ未満（例えば、２μｍ）のフィーチャーサイズについては、シグナルおよび区別を含む改善された性能を生じる。固体基板に結合した物質のアレイの合成および使用における、固相化学、写真平板、およびデータ収集方法の記載は、米国特許第５、７４４、３０５号に記載され、この開示は本明細書において援用される。
【０１１１】
既知の化学配列のポリヌクレオチドが基板上の既知の位置において合成され、核酸のハイブリダイゼーションが検出され、ここで蛍光標識が検出される実施態様において、検出は、光を基板上の比較的小さくかつ正確に既知の位置に向けることにより行われ得る。例えば、基板は、結合が起こる位置の同定のための顕微鏡検出装置中に配置される。顕微鏡検出装置は、基板に光を向ける単色光源または多色光源、基板からの蛍光を検出する手段、ならびに蛍光の位置を決定する手段を含む。いくつかの実施態様における、基板上の蛍光を検出する手段は、光子計数管を含み得る。蛍光の位置を決定する手段は、基板についてのｘ／ｙ変換表を含み得る。基板の変換およびデータの収集は、本明細書において援用する開示である米国特許第５、５１０、２７０号に記載のように、適切なプログラムされたデジタルコンピュータにより記録および処理される。
【０１１２】
多数の生物学的チップアッセイを同時にプロセスするデバイスは、本明細書において援用する開示である米国特許第５、５４５、５３１号に記載のように、使用され得る。固体支持体上のサンプル上で標識されたマーカーを検出し、ここで標識された物質は励起波長と異なる波長で照射光を放射し、この照射光はコレクションオプティクス（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃｓ）により収集されそしてサンプルの画像を画く検出器上に像を画く、という方法および系は、本明細書において援用する開示である米国特許第５、５７８、８３２号において開示される。これらの方法は、高い感度を可能にし、そして得られる画像を高速に分解する。蛍光標識された物質を検出する方法および装置は、さらに本明細書において援用する開示である米国特許第５、６３１、７３４号および同５、３２４、６３３号において記載される。
【０１１３】
（適用）
本明細書中に記載されるアッセイ方法および組成物を、生物医学的な研究および遺伝子研究ならびに臨床的診断を含む適用範囲において使用し得る。核酸のようなポリマーのアレイを、標的（例えば、結合親和性の決定のためのスクリーニング研究および診断アッセイにおける、例えば、相補的なヌクレオチド）に対する特異的な結合についてスクリーニングし得る。１つの実施態様において、ポリヌクレオチドの配列決定を、米国特許第５，５４７，８３９号（この開示は、本明細書中に援用される）に開示されるように行い得る。核酸アレイを、米国特許出願第０８／１４３，３１２号（この開示は本明細書中に援用される）に開示されるように、嚢胞性線維症、糖尿病、および獲得性疾患（例えば、ガン）のような遺伝子疾患の検出を含む多くの他の適用において使用し得る。遺伝子変異を、ハイブリダーゼーションによる配列決定によって検出し得る。１つの実施態様において、遺伝子マーカーを、米国特許第５，７１０，０００号（この開示は本明細書中に援用される）に開示されるようにＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列決定およびマッピングし得る。
【０１１４】
他の適用には、米国特許出願第０８／７９７，８１２号（１９９７年２月７日出願）および米国特許出願第０８／６２９，０３１号（１９９６年４月８日出願）（これらの開示は、本明細書中に援用される）に記載されるように、チップベース遺伝子型決定、種同定、および表現型の特徴づけが含まれる。
【０１１５】
遺伝子発現は、細胞（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）（この開示は本明細書中に援用される）に記載されるような、酵母などの微生物）における高密度の核酸アレイを並行使用して、多数のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによってモニターされ得る。全ＲＮＡの核酸アレイへのハイブリダイゼーションによって画像化される細菌の転写は、Ｓａｉｚｉｅｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４５−４８（１９９８）（この開示は本明細書中に援用される）に記載されるように行われ得る。
【０１１６】
固相化学、感光性保護基、および写真平板を使用して、米国特許第５，５２７，６８１号（この開示は、本明細書中に援用される）に記載されるように、基材上の大きなアレイのポリヌクレオチドの光指向型部分的アドレシング可能並行化学合成（ｌｉｇｈｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を作製する実施態様において、アレイを形成するためにコンピューターツールを使用し得る。例えば、コンピューターシステムを使用して、基材上の核酸または他のポリマープローブを選択し得、そして米国特許第５，５７１，６３９号（この開示は本明細書中に援用される）に記載されるようなアレイのレイアウトを設計し得る。
【０１１７】
別の実施態様において、材料：固定化プローブ核酸、増幅試薬、および標識されたレセプターをパッケージされた組み合わせで含む増幅された核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行うためのキットが提供される。これらの試薬は、例えば、キットにおいて、別々の容器中にある。キットはまた、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール、ならびにアッセイを行うための説明書を含み得る。
【０１１８】
本明細書中に言及される全ての刊行物は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１１９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに理解される。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
核のハイブリダイゼーションアッセイを、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（「ＳＡＰＥ」）およびビオチン化抗ストレプトアビジン抗体増幅検出法を使用して行った。
【０１２１】
以下の材料を使用した。溶液を分子生物学的特級水（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で作製した。
【０１２２】
１２×ＭＥＳストック緩衝液
０．３３Ｍ  ＭＥＳ遊離酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
０．８９Ｍ  Ｎａ−ＭＥＳ塩（Ｓｉｇｍａ）
０．２μｍフィルターを通してろ過した
ｐＨ６．５〜６．８。
【０１２３】
２×ＭＥＳハイブリダイゼーション（「Ｈｙｂ」）緩衝液
２×ＭＥＳストック緩衝液
１．７７Ｍ  ＮａＣｌ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
０．０４Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）
０．２μｍのフィルターを通してろ過した
ｐＨ６．５〜６．８。
【０１２４】
０．１×ＭＥＳストリンジェント緩衝液
１×ＭＥＳストック緩衝液
０．０３Ｍ  ＮａＣｌ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）
０．２μｍのフィルターを通してろ過した
ｐＨ６．５〜６．８。
【０１２５】
６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液
６×ＳＳＰＥ（０．０６Ｍ  Ｈ2ＰＯ4／ＨＰ０4、１Ｍ  Ｎａ+、０．００６Ｍ  ＥＤＴＡ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）
０．００５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）消泡剤Ｏ−３０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
０．２μｍフィルターを通してろ過し、ろ過後、消泡剤を添加する
ｐＨ約７．６。
【０１２６】
２×染色緩衝液
２×ＭＥＳストック緩衝液
ｌ．８５Ｍ  ＮａＣｌ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
０．ｌ０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）
０．０１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）消泡剤Ｏ−３０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
０．２μｍを通してろ過し、ろ過後、消泡剤を添加する。
【０１２７】
ＳＡＰＥ染色溶液
１×染色緩衝液
２．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（アセチル化）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
１０．０μｇ／ｍｌ  ＳＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）
染色容量＝５００．０μＬ。
【０１２８】
ビオチン化抗ストレプトアビジン染色溶液
１×染色緩衝液
２．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（アセチル化）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
０．１ｍｇ／ｍｌ正常ヤギｌｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）    ３．０μｇ／ｍｌビオチン化ヤギポリクローナル抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）
染色容量＝５００．０μＬ。
【０１２９】
チップ前処理溶液
１×ＭＥＳストック緩衝液
０．８９Ｍ  ＮａＣ１（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ（ＳｉｇｍａＳｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【０１３０】
５×フラグメント化緩衝液
２００ｍＭ  ＴＲＩＳアセテート  ｐＨ８．１
５００ｍＭ  酢酸カリウム
ｌ５０ｍＭ  酢酸マグネシウム。
【０１３１】
サンプル調製（２００μｌ）
１×ＭＥＳ  Ｈｙｂ緩衝液
０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（アセチル化）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
０．１ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
５０ｐＭ  ビオチン化コントロールオリゴマー
１０μｇ  フラグメント化ｃＲＮＡサンプル
スパイクコントロール（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）−以下のプラスミドのインビトロ転写物（ＩＶＴ）：ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＢ；ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＣ；ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＤ；ｐｇｌｋｓ−Ｃｒｅ；ｐｇｌｂｓ−ｌｙｓ；ｐｇｌｂｓ−ｐｈｅ；ｐｇｌｂｓ−ｔｈｒ；ｐｇｌｂｓ−ｔｒｐ；ｐｇｌｂｓ−ｄａｐ（これらは、９５℃での３５分間のフラグメント化緩衝液中での加熱によってフラグメント化される）。
【０１３２】
（アッセイプロトコル）
フラグメント化されたｃＲＮＡサンプルを以下のように調製した。プラスミドライブラリーのＰＣＲ増幅、次いで、ビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰの存在下でインビトロ転写を行い、ビオチン化ｃＲＮＡを形成させ、次いでこれを９５℃での３５分間の加熱によって１×フラグメント化緩衝液中でフラグメント化した。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９６；およびＬｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）に記載の一般的な技術を参照のこと。
【０１３３】
２００μＬのチップ前処理溶液を、生物学的チップ（その上に固定化された、公知の配列のプローブ核酸のアレイを有する）に適用した。チップをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ３２０  Ｏｖｅｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のロウティッシェリ（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）上に配置し、そして４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた。
【０１３４】
サンプルを９９℃で５分間加熱し、次いで４５℃の水浴中に配置するか、または５分間熱ブロックした。チップ前処理溶液をカートリッジから除去し、そして４５℃で２００μＬのサンプルを添加した。チップをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ３２０  Ｏｖｅｎのロウティッシェリ上に配置し、そして４５℃、６０ｒｐｍで１６時間ハイブリダイズした。
【０１３５】
サンプルをチップから除去し、そして６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で置換した。チップを、以下のようなＥｕｋＧＥ−ＷＳ２フルーイディクススクリプトを使用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）における自動化洗浄／染色プロトコルに供した。
【０１３６】
チップを、２５℃でフルーイディクススクリプト上で、６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で１０サイクル（各サイクル当たり２回混合）洗浄した。これに続いて、別の洗浄を、５０℃、４サイクル（各サイクル当たり１５回混合）で、０．１×ＭＥＳストリンジェントな緩衝液で行った。
【０１３７】
次いで、チップを、フルーイディクスステーション上で、上記のＳＡＰＥ染色溶液で１０分間、２５℃で染色した。染色後、２５℃、１０サイクル（各サイクル当たり４回混合）で、６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で洗浄した。
【０１３８】
ＨＰ  Ｇ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、第１のスキャンを行った。２×マルチイメージスキャンを、５７０ｎｍで、３μｍ画素サイズを使用して行った。蛍光の検出強度のダイナミックレンジは、５００〜５０００カウント（任意の単位）であった。結果を図２ａに示す。ここで、バックグラウンドは７０７カウントであり、そしてバックグラウンドの標準偏差は１２．６であった。
【０１３９】
チップをフルーイディクスステーションに戻し、そして１０分間２５℃で、ビオチン化抗ストレプトアビジン染色溶液で染色し、続いて６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液でのパージ（２回）、および２５℃でＳＡＰＥ染色溶液での第３の１０分染色を行った。
【０１４０】
最終洗浄を、６×ＳＳＰＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で、３０℃で１５サイクル（各サイクル当たり４回混合）行った。
【０１４１】
第２のスキャンを、ＨＰ  Ｇ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して上記のように行った。結果を図２ｂに示す。ここで、バックグラウンドは７３９．２カウントであり、そしてバックグラウンドの標準偏差は１４．２であった。結果は、抗体増幅の使用は、増幅なしで得られた結果と比較して、実質的に検出シグナルを増強したことを示した。
【０１４２】
（実施例２）
核のハイブリダイゼーションアッセイを、ストレプトアビジン−フィコエリトリンおよびビオチン化抗ストレプトアビジン抗体増幅を使用して行った。
【０１４３】
以下の材料を使用した。緩衝液を、分子生物学的特級水（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で作製した。
【０１４４】
６×ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液（ｐＨ７．６）
０．９Ｍ  ＮａＣｌ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
０．０６Ｍ  ＮａＨ2Ｐ０4（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
６ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１４５】
１×ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）
０．１Ｍ  ＭＥＳ（ＭＥＳ水和物およびＭＥＳ−ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（６．９７ｇ  ＭＥＳ水和物と１９．３９ｇ  ＭＥＳナトリウム塩／１００ｍＬ水とを合わせることによって作製した、１２×ＭＥＳのストック溶液から作製した）
ｌ．０Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ）。
【０１４６】
０．１×ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）
０．１Ｍ  ＭＥＳ（ＭＥＳ水和物およびＭＥＳ−ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ））
ｌ．０Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ）
０．０１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）。
【０１４７】
５×ＳＡＰＥ染色溶液
２μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）
１０μｌの５０ｍｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
１８８μｌの１×ＭＥＳ緩衝液。
【０１４８】
ビオチン化抗ＳＡ染色溶液
１μｇ／ｍｌビオチン化ヤギポリクローナル抗ストレプトアビジン抗体（「抗ＳＡ」）抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
１×ＭＥＳ緩衝液中。
【０１４９】
チップ前処理溶液
０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
０．５ｍｇ／ｍｌ  ＨＳ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
１×ＭＥＳ緩衝液中。
【０１５０】
サンプル（２００μｌ）
１０μｇのフラグメント化標識化（ビオチン化）ｃＲＮＡサンプル
０．１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳ（ニシン精子）ＤＮＡ（２μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＳ  ＤＮＡストック、Ｐｒｏｍｅｇａ）
０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（２μｌの５０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡストック）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
スパイクコントロール（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（以下のプラスミドのインビトロ転写物（ＩＶＴ）：ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＢ；ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＣ；ｐｇｌｋｓ−ＢｉｏＤ；ｐｇｌｋｓ−Ｃｒｅ；ｐｇｌｂｓ−ｌｙｓ；ｐｇｌｂｓ−ｐｈｅ；ｐｇｌｂｓ−ｔｈｒ；ｐｇｌｂｓ−ｔｒｐ；ｐｇｌｂｓ−ｄａｐ（これらは９５℃での３５分間の、実施例１に記載されるようなフラグメント化緩衝液中での加熱によって、フラグメント化される））
１×ＭＥＳ緩衝液。
【０１５１】
（アッセイプロトコル）
マウスＢ細胞ライブラリー由来のフラグメント化されたｃＲＮＡサンプルを、プラスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のＰＣＲ増幅、続いてビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰの存在下でインビトロ転写してビオチン化ｃＲＮＡを形成することによって調製し、次いで、これを、９５℃で３５分間加熱することによって、実施例１に記載されるように、１×フラグメント化緩衝液中でフラグメント化した。フラグメント化ｃＲＮＡサンプルをまた、ヒト脳細胞ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）から得た。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９６；およびＬｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）に記載される一般的な技術を参照のこと。
【０１５２】
生物学的チップ（その上に、マウスＢ細胞遺伝子配列を有する、固定された核酸を有する）へのマウスＢ細胞ｃＲＮＡのハイブリダイゼーション、および生物学的チップ（その上に、ヒト脳細胞遺伝子配列を有する、固定された核酸を有する）へのヒト脳細胞ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションを、種々のレベルの添加されたスパイクコントロールの存在下で行い、そして蛍光を検出シグナルの抗体増幅の前および後で測定した。生物学的チップは、２４ミクロンのフィーチャーのサイズを有した。
【０１５３】
各ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、２００μｌのチップ前処理溶液を生物学的チップに適用した。チップを、４０℃、６０ｒｐｍで、１５分間、ロウティッシェリ（Ｒｏｔａｍｉｘ，Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）上に配置した。チップを１×ＭＥＳ緩衝液でリンスした。
【０１５４】
サンプルを９９℃で５分間加熱し、次いでそれをチップ上に置く前に約１０分間未満の時間、４５℃の水浴中に配置した。４５℃の２００μｌのサンプルをチップに添加した。ロウティッシェリ上でのハイブリダイゼーションを、４５℃、６０ｒｐｍで、１６または４０時間行った。
【０１５５】
チップをフルーイディクスステーション（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で、２２℃での６×ＳＳＰＥ−Ｔで、１０×２（１０サイクル、各サイクル毎に２回の排出および充満）洗浄した。チップを０．１×ＭＥＳ緩衝液でリンスした。次いで２００μｌの０．１×ＭＥＳ緩衝液を適用して、４５℃、６０ｒｐｍで３０分間、ロウティッシェリ上でチップを洗浄した。チップを１×ＭＥＳ緩衝液でリンスした。
【０１５６】
チップを、４０℃、６０ｒｐｍで１５分間、５×ＳＡＰＥ染色溶液で染色した。これに続いて、フルーイディクスステーション上での６×ＳＳＰＥ−Ｔ洗浄を、２２℃で１０×２行った。
【０１５７】
第１のスキャンを、ＨＰ  Ｇ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して行った。２×マルチイメージスキャンを、５７０ｎｍで、３μｍの画素サイズを使用して行った。
【０１５８】
６×ＳＳＰＥ−Ｔ溶液をチップから除去し、そして２００μｌの１×ＭＥＳ緩衝液を使用してチップを洗浄した。チップを、２００μｌの抗ＳＡ（抗ストレプトアビジン）染色溶液で、４０℃、６０ｒｐｍで３０分間染色した。２００μｌの１×ＭＥＳ緩衝液を使用して、チップを手作業で洗浄した。これに続いて、フルーイディクスステーション上で、２２℃、１０×２で、６×ＳＳＰＥ−Ｔ洗浄を行った。次いで、１×ＭＥＳ緩衝液を使用してチップをリンスした。
【０１５９】
２００μｌの５×ＳＡＰＥ染色溶液を使用して、４０℃、６０ｒｐｍで１５分間、チップを染色した。チップを、１×ＭＥＳ緩衝液で手作業で洗浄した。これに続いて、フルーイディクスステーション上で、２２℃、１０×２で、６×ＳＳＰＥ−Ｔ洗浄を行った。第２のスキャンを行った。
【０１６０】
ヒト脳細胞ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションの結果を以下の表１に示す。表１は、それぞれ第１〜１３列で示される：１）スパイク濃度；２）ハイブリダイゼーション時間；３）抗体の使用または非使用；４）検出された遺伝子の数；５）検出された遺伝子のパーセント；６）全てのシグナルについて、マッチとミスマッチとの間の強度の平均差異；７）ポジティブシグナルについて、マッチとミスマッチとの間の強度の平均差異；８）バックグラウンド；９）標準偏差；１０）ノイズに対応するＱ値；１１）シグナル／ノイズ比に対応するＰ／Ｑ値；１２）検出されたスパイクの数；１３）偽ネガティブまたはポジティブのパーセント。
【０１６１】
【表１】
2006042831.tif 000002
【０１６２】
マウスＢ細胞ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションの結果を、以下の表２に示す。表２は、それぞれ第１〜１３列で示される：１）スパイクの濃度；２）ハイブリダイゼーション時間；３）抗体の使用または非使用；４）検出された遺伝子の数；５）検出された遺伝子のパーセント；６）全てのシグナルについて、マッチとミスマッチとの間の強度の平均差異；７）ポジティブシグナルについて、マッチとミスマッチとの間の強度の平均差異；８）バックグラウンド；９）標準偏差；１０）ノイズに対応するＱ値；１１）シグナル／ノイズ比に対応するＰ／Ｑ値；１２）検出されたスパイクの数；１３）偽ネガティブまたはポジティブのパーセント。
【０１６３】
【表２】
2006042831.tif 000003
【０１６４】
特異的結合アッセイを使用して試料中の標的分子を検出するために方法および化合物が提供される。具体的には、方法は試料中の核酸標的を検出するために提供される。１つの実施態様では、この方法は標的核酸配列を含む核酸標的を、プローブの核酸配列を含む核酸プローブへハイブリダイズする工程を包含し、ここで、標的は結合リガンドを含む。ハイブリダイズされた標的は、結合リガンドと結合し得る多数の部位を含むレセプターと接触され、レセプターは結合リガンドと複合体化し、そしてレセプターは複数の結合リガンドを含む増幅試薬と接触し、増幅試薬をレセプターと複合体化する。次いで複合体化された増幅試薬の存在は、例えば、レセプターまたは増幅試薬上での検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在を検出することにより検出される。必要に応じて、複数の結合リガンドを含む増幅試薬は、標識されたレセプター分子と接触され、それにより複数の標識されたレセプター分子は増幅試薬と複合体化し、そして増幅試薬と複合体化された標識されたレセプター分子が検出される。これは検出可能なシグナルが増強されそして増幅されることを可能にする。１つの実施態様では、結合リガンドはビオチンであり、レセプターはストレプトアビジンであり、そして増幅試薬は抗体またはＤＮＡマトリックスである。別の実施態様では、表面上に固定化された異なる核酸配列プローブ（それぞれ表面上での規定された配列および位置を有する）のアレイは、アッセイにおいて使用され得、そのようにして多数の核酸の結合のスクリーニングおよび検出を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】複数のビオチン分子と共有結合した抗ストレプトアビジンを抗体を含む増幅試薬を使用する核酸標的の検出を図示する模式図である。
【図２】パネルａおよびパネルｂは、増幅なし、または有りのそれぞれについての核酸のハイブリダイゼーションの蛍光検出の比較を示す画像である。
【図１】
2006042831.tif 000004
【図２】
2006042831.tif 000005