(57)【要約】【課題】  ペプチドチップを用いる測定系において、特異的結合シグナルを増幅しながら生体分子の非特異的吸着を抑制することにある。特に表面プラズモン測定に用いた際に、信頼性の高いデータを得ることのできるペプチドチップを得る。【解決手段】基板上にペプチドを固定化する方法であって、固定化するペプチドを有機溶媒に溶解して用いることを特徴とするペプチドの固定化方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にペプチドを固定化する方法であって、反応性部分を有するチップ上に、該反応性部分と反応し得る官能基を有するペプチドの有機溶媒溶液を適用して反応させ、共有結合によりペプチドを固定化することを特徴とするペプチドの固定化方法。
【請求項２】
有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、γ−ブチロラクトンよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチドの固定化方法。
【請求項３】
前記反応性部分と反応するペプチドの官能基がチオール基であることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドの固定化方法。
【請求項４】
前記反応性部分がマレイミド基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項５】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項６】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項７】
２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項８】
固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項９】
チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【請求項１０】
チップ上に固定化されるペプチドがリン酸化を検出するためのものであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドチップの作製におけるペプチドの固定化方法に関する。より詳細には、ペプチドの固定化に際して、有機溶媒にペプチドを溶解させることによりその固定化効率を高め、その結果として目的とする相互作用に関する結合シグナルを増大させることを実現するペプチドの固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
こうしたペプチドアレイにおいては、ペプチドを基板上に固定化する技術が重要になる。バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、このような水溶液を用いて固定化反応を行うと、水分の蒸発等の影響を完全に除去することは極めて困難であるため、固定化効率にも影響を及ぼす可能性もある。そのため有機溶媒の溶解液を用いる方法も考えられるが、アミノ酸シーケンシングの際のメンブレンへの固定（特許文献１）やヒドロゲルを担体とする場合（特許文献２）の事例が報告されてはいるものの、一般的なペプチドアレイ、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられるアレイの調製に際しては検討された事例もないのが実情である。
【０００５】
本発明は、ペプチドを変性させることなくチップ上への固定化効率を著しく高めることができるペプチドの固定化手段を提供するものである。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【特許文献１】特表平８−５０９４６１号公報
【特許文献２】特表２００２−５４３３９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制して、なおかつ標的ペプチドに対するリン酸化シグナルを増大させるためのバイオチップにおけるペプチドの固定化技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
１．基板上にペプチドを固定化する方法であって、反応性部分を有するチップ上に、該反応性部分と反応し得る官能基を有するペプチドの有機溶媒溶液を適用して反応させ、共有結合によりペプチドを固定化することを特徴とするペプチドの固定化方法。
２．有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、γ−ブチロラクトンよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする１のペプチドの固定化方法。
３．前記反応性部分と反応するペプチドの官能基がチオール基であることを特徴とする１又は２のペプチドの固定化方法。
４．前記反応性部分がマレイミド基であることを特徴とする１〜３のいずれかのペプチドの固定化方法。
５．チップの基板が透明基板であることを特徴とする１〜４のいずれかのペプチドの固定化方法。
６．チップ表面が金であることを特徴とする１〜５のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
７．２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする１〜６のいずれかのペプチドの固定化方法。
８．固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であることを特徴とする１〜７のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
９．チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする１〜８のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
１０．チップ上に固定化されたペプチドのリン酸化を検出することを特徴とする１〜９のいずれかに記載のペプチドの固定化方法。
【発明の効果】
【０００８】
ペプチドの固定化のための溶媒として有機溶媒を用いることにより、固定化されたペプチドのリン酸化シグナルを向上させた精度のよいペプチドチップを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法により得られるペプチドアレイは、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことが可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。ＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能である点でより好ましい。
【００１０】
本発明において得られるペプチドアレイは、固定化されたペプチドのリン酸化を検出する場合において特に有用である。ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰを本発明のアレイ上に適用して行うことができる。最適なリン酸化反応条件はプロテインキナーゼの種類に応じて変動するが、例えば、バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０分〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ2+，Ｃａ2+リン脂質などのリン酸化を補助する物質を共存させるのがよい。リン酸化の検出に際しては、直接リンの取り込みを確認してもよいし、あるいはリン酸化アミノ酸を認識する抗体や、リン酸基に対して特異的な結合性を有する物質などを作用させることにより検出してもよい。
【００１１】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できる。
【００１２】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ペプチドがプロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることを目的とする場合、１種類のペプチドは１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。プロテインキナーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテインキナーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで全てのプロテインキナーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテインキナーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテインキナーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１３】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω1 と周波数ω2）が媒質中で混合され、ω1＋ω2、あるいはω1−ω2の光が発生する現象である。特にω1として可視光を用い、ω2として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１４】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲは蛍光物質、放射性物質などによるラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１５】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００１６】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１７】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１８】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００１９】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ2に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２０】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２１】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２２】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２３】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【００２４】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２５】
ペプチドの長さは、有機溶媒に溶解可能である限り特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のものが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産されたペプチドを用いてもよい。また基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させたものを用いるのも有用である。
本発明において、ペプチドアレイの基板上には、ペプチドの官能基と反応してペプチドを固定化可能な反応性部分を有する。該反応性部分としては、金のようなチオール基と結合できる金属であってもよいが、好ましくは反応性の高い有機官能基が好ましい。好ましい反応性部分としては、マレイミド基、アビジン、ビオチン等が挙げられ、好ましくはマレイミド基が挙げられる。
【００２６】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のキナーゼを含有する溶液を作用させ、さらにキレート化合物を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテインキナーゼの基質となるペプチドとは、該プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドをいうものである。
【００２７】
上記ペプチドの金属薄膜（特に金薄膜）への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすい官能基（例えばチオール基）を介して適当な官能基（例えばアミノ基）を予め導入し、その後で基質ペプチドを該官能基（例えばアミノ基）と直接に、或いは適当なヘテロ二官能型の架橋剤を介して固定化処理するのがより好ましい。例えばチオール基を介して金属薄膜表面に官能基（例えばアミノ基）を導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。
【００２８】
その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００２９】
固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで、ペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。
【００３０】
ここで、官能基がペプチドに存在している場合とは、具体的には例えば固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在する状態のものをいう。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００３１】
また、官能基がペプチドに付加されている場合とは、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものをいう。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
本発明においては、ペプチドの固定化に際して、有機溶媒にペプチドを溶解させた溶液を基板上にて反応させることを特徴としている。有機溶媒の種類は特に限定されないが、ペプチド自体の変性などの影響を及ぼさず、水に近い性質のものが好ましい。具体的には、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、γ−ブチロラクトンなどが例示され、特にＤＭＳＯが好ましい。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明は、特に反応性部分としてのマレイミド基（ＭＡＬ）に対して、ペプチドに由来するチオール基をカップリングさせる際により有用な方法である。その際には、ＮＨＳ基もしくは硫酸スクシンイミド基とＭＡＬ基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いるのが好ましい。ヘテロ二官能型架橋剤としては、ポリエチレングリコールのような親水性高分子を介してＮＨＳ基もしくは硫酸スクシンイミド基とＭＡＬ基を有する構造のものであってもよいし、低分子量の架橋剤であってもよい。低分子量の架橋剤としては、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）などが挙げられる。特にＳＭＣＣは水に対する溶解性は低いため、本発明においては適用されやすい。
【００３３】
上述したようなヘテロ二官能型架橋剤をチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、もう一方の端に有するスクシンイミド基あるいは硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
【００３４】
上述したような低分子量化合物を適用することにより、特に高分子量の物質を架橋剤として用いる場合と比べて、ペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるためリン酸化シグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる。
【００３５】
ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の固定化方法は非常に効果的である。
【００３６】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好まし。チオール基を有する化合物は特に限定されるものではなく、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体のように高分子であってもよいし、低分子量のものであってもよい。
【００３７】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ＴＥＧ−ＳＨの合成）
図１に合成反応のスキームを示した。ジクロロメタン中にテトラエチレングリコールモノメチルエーテル（東京化成製）１当量、ピリジン２当量を溶解し、これに塩化チオニル４当量を徐々に滴下しながら添加した。その後、この系を室温で一晩攪拌した。次に、水、０．１ｍＭ 塩酸、水、０．１ｍＭ   ＮａＨＣＯ3で洗い（塩酸とＮａＨＣＯ3は各３回）、ジクロロメタンを減圧で蒸発除去してＴＥＧ−Ｃｌを得た。元素分析により生成物の確認を行った。元素分析についてはヤナコＣＮＨコーダーＭＴ５型（柳本製作所製）を用いて差動熱伝導法により行い、結果は表１に示す通りであった。また合成収率は６６％であった。
【００３９】
【表１】
2006058183.tif 000003
【００４０】
得られたＴＥＧ−Ｃｌ１当量をＤＭＦに溶解し、チオ尿素２当量を加え、２時間還流加熱した（窒素ガス存在下、約１００℃）。その後、ＮａＯＨ３当量を添加し、さらに２時間加熱還流した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタンを減圧で蒸発除去し、シリカゲル（関東化学製シリカゲル６０；粒径６３−２００ｍｍ，７０−２３０ｍｅｓｈ  ＡＳＴＭ）を充填したカラムで精製した（展開溶媒：クロロホルム）。生成物（ＴＥＧ−ＳＨ）の確認は元素分析及びチオール定量試薬による方法で行った。元素分析の結果は表２に示す通りであった。また合成収率は６０％であった。
【００４１】
【表２】
2006058183.tif 000004
【００４２】
チオール定量に関しては、図２にその原理を示した通りであるが（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．１５０９（１９８７）を参照）、ＤＴＮＢ（５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）；同仁化学製）は、ＳＨ基が存在するとＳＨ基の量に相当する量のＳ−Ｓ結合が切れて５−Ｍｅｒｃａｐｔｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄを生じ、このチオールの吸光度(λmax＝４１２ｎｍ)からＳＨ基を定量することができるものである。ＴＥＧ−ＳＨを添加することにより、５−Ｍｅｒｃａｐｔｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ由来の４１２ｎｍにおける吸光度の上昇が起こりチオール基の存在を確認できた。ＤＴＮＢ６０μＭ、ＴＥＧ−ＳＨ３０μＭ（終濃度）の条件で、添加３分後、３０分後の吸光度を測定した（溶媒ＰＢＳ）。４１２ｎｍの吸光度から定量すると３２．１μＭであった。
（ペプチド固定化）
上記のようにして得られたＴＥＧ−ＳＨを１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。修飾されたチオール基は特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＴＥＧ−ＳＨ溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＴＥＧ−ＳＨを結合させた。
【００４３】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が１６個有し（４個×４個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００４４】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００４５】
上記のようにして得られた表面に、図３に示したように、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチドＢ、ｃＳｒｃキナーゼ基質のネガティブコントロールペプチドＡ（チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換）、ｃＳｒｃキナーゼ基質のポジティブコントロールペプチドＣ（チロシン残基がリン酸化）となるアミノ酸配列からなるペプチドを、いずれもＤＭＳＯで溶解して、０．１μｌずつマニュアルでスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記ＴＥＧ−ＳＨを１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡリン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで１０００倍希釈した溶液を用いて作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
（観察の結果と考察）
ＳＰＲシグナル変化をグラフ化したセンサグラムの結果を図４に示した。センサグラムはスポットごとにおけるシグナルの平均値をプロットしている。Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄについては、基質ペプチドのスポット部分以外の任意に選択した箇所を測定ポイントとして得たシグナルの平均値をプロットしている。また、ＳＰＲイメージングを行った結果も図４に示した。これはＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、ストレプトアビジン（以下、ＳＡと示すこともある。）反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。ポジティブコントロールペプチドＣに対しては非常に強い抗体結合シグナルの上昇を確認されている。ｃＳｒｃキナーゼ基質ペプチドＢ、ネガティブコントロールペプチドＡ、ブランク及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいてはシグナルの上昇は軽微である。したがって、この方法により特異的にリン酸化基質と抗体との結合を確認することができている。
［比較例１］
上記ペプチドをＤＭＳＯの代わりに水に溶解させてスポッティングさせる点を除き、全て実施例１と同様にして検討した。結果を図５に示した。この場合は、ポジティブコントロールペプチドＣのみならず、ｃＳｒｃキナーゼ基質ペプチドＢ、ネガティブコントロールペプチドＡ、ブランク及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄいずれにおいても非特異的のシグナル上昇が見られている。これは固定化反応時において水の蒸発が進むことによりペプチドの固定化効率が低下することにより、特にポジティブコントロール以外のスポットでは未反応マレイミドに対するブロッキング効果も十分に奏することができなかったことに起因するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の方法により、ペプチドチップにおける結合シグナルを増幅させることができつつ、非特異的吸着に関しては抑制することができ、より正確な測定が可能となる。また処理方法も非常に容易であり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＴＥＧ−ＳＨの合成スキームを示す図である。
【図２】チオール定量の原理を示す図である。
【図３】実施例１及び比較例１で用いたアレイにおけるペプチドの固定化パターンを示す図である。
【図４】実施例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【図５】比較例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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