(57)【要約】【課題】好酸球性炎症を抑制し、しかもアレルギー性反応の治療、予防もしくは診断に使用可能な高アフィニティーＩＬ４アンタゴニストならびにその使用を提供する。【解決手段】２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・インターロイキン−４（ＩＬ４）に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、およびヒトまたはヒト化枠組み構造領域からなるヒト・ＩＬ４に対する結合特異性を有する融合蛋白。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・インターロイキン−４（ＩＬ４）に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、およびヒトまたはヒト化枠組み構造領域からなるヒト・ＩＬ４に対する結合特異性を有する融合蛋白。
【請求項２】
第２の融合パートナーに作動可能に結合した請求項１記載の融合蛋白。
【請求項３】
該非ヒト・中和モノクローナル抗体がハイブリドーマ３４２６Ａ１１Ｃ１Ｂ９により産生されるものである請求項１記載の融合蛋白。
【請求項４】
該第２の融合パートナーが、免疫グロブリン不変重鎖または免疫グロブリン不変軽鎖の全部もしくは一部、あるいは免疫グロブリン不変重鎖および免疫グロブリン不変軽鎖の両方の全部もしくは一部からなる請求項２記載の融合蛋白。
【請求項５】
該ヒトまたはヒト化枠組み構造領域配列が、配列番号：１２のアミノ酸２１〜５０、５６〜７１、８８〜１１９、および１３１〜１４１で示される重鎖配列である請求項１記載の融合蛋白。
【請求項６】
該ヒトまたはヒト化枠組み構造領域配列が、配列番号：１４のアミノ酸２０〜４２、５８〜７２、８０〜１１１、および１２１〜１３１で示される軽鎖配列である請求項１記載の融合蛋白。
【請求項７】
重鎖に関する相補性決定領域のアミノ酸配列が：
2006333870.tif 000007
である請求項１記載の融合蛋白。
【請求項８】
軽鎖に関する相補性決定領域のアミノ酸配列が：
2006333870.tif 000008
である請求項１記載の融合蛋白。
【請求項９】
軽鎖に関する相補性決定領域のアミノ酸配列が：
2006333870.tif 000009
である請求項１記載の融合蛋白。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、
2006333870.tif 000010
からなる群より選択される免疫グロブリン重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、
2006333870.tif 000011
からなる群より選択される免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項１２】
配列が、
2006333870.tif 000012
からなる群より選択される、免疫グロブリン重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子。
【請求項１３】
配列が、
2006333870.tif 000013
からなる群より選択される、免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子。
【請求項１４】
約２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられ、重鎖および軽鎖の枠組み構造領域が少なくとも１種の選択ヒト・抗体由来であり、各鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列が約２ｘ
１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられるヒト・ＩＬ４に特異的な非ヒト・中和モノクローナル抗体由来である、重鎖および軽鎖からなるヒト化抗体。
【請求項１５】
所望により該抗体が、非蛋白キャリヤー分子、ポリスチレン、およびプラスチックビーズからなる群より選択されるエフェクター剤に結合されていてもよい請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
約２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられ、重鎖および軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列が約２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられるヒト・ＩＬ４に特異的な非ヒト・中和モノクローナル抗体由来である、重鎖および軽鎖からなるキメラ抗体。
【請求項１７】
請求項１の融合蛋白および医薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１８】
有効量の請求項１の融合蛋白を含む、ヒトにおけるアレルギーおよび過剰なＩｇＥ産生に関連した他の症状を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
（ａ）請求項１の融合蛋白をコードしている核酸；
（ｂ）（ａ）に対して相補的な核酸；および
（ｃ）（ｉ）６５℃における４ＸＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次いで、６５℃で１時間０．１ＸＳＳＣでの洗浄、または（ｉｉ）５０％ホルムアミド、４２℃において４ＸＳＳＣである緊縮条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイゼーションしうる１８個またはそれ以上のヌクレオチドの核酸
からなる群より選択され、所望により配列が制限部位を含んでいてもよい単離核酸。
【請求項２０】
融合蛋白をコードしている配列が図５の配列番号：１３の核酸配列からなる請求項１９記載の単離核酸。
【請求項２１】
融合蛋白をコードしている配列が図４の配列番号：１１の核酸配列からなる請求項１９記載の単離核酸。
【請求項２２】
（ａ）ヒト・インターロイキン−４に特異的な中和的なネズミ・モノクローナル抗体から得られ、約２ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードしている核酸；
（ｂ）（ａ）に対して相補的な核酸；および
（ｃ）（ｉ）６５℃における４ＸＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次いで、６５℃で１時間０．１ＸＳＳＣでの洗浄、または（ｉｉ）５０％ホルムアミド、４２℃において４ＸＳＳＣである緊縮条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイゼーションしうる１８個またはそれ以上のヌクレオチドの核酸
からなる群より選択される単離核酸。
【請求項２３】
配列が、
2006333870.tif 000014
からなる重鎖相補性決定領域をコードしている配列の群から選択される、請求項２２記載の単離核酸。
【請求項２４】
配列が、
2006333870.tif 000015
からなる軽鎖相補性決定領域をコードしている配列の群から選択される、請求項２２記載の単離核酸。
【請求項２５】
請求項１９の核酸を含む組み換え型プラスミド。
【請求項２６】
請求項２２の核酸を含む組み換え型プラスミド。
【請求項２７】
請求項２５の組み換え型プラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２６の組み換え型プラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２９】
ヒト・インターロイキン−４に特異的なヒト化抗体の製造方法であって、細胞において該ヒト化抗体の発現を指令しうる選択調節配列の支配下にある請求項２５の組み換え型プラスミドでトランスフェクションされた細胞系を培養することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的には、本発明は、融合蛋白の分野に関し、ＩＬ４および過剰のＩｇＥ産生により伝達される症状の治療および診断に有用な蛋白に関し、より詳細には、キメラおよびヒト化ＩＬ４抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性アレルギー疾患は、季節的な鼻炎および結膜炎のごとき比較的軽症のものから、アトピー性皮膚炎およびアトピー性喘息のごときより重症のもの、さらにアナフィラキシーショックのごとき生命を脅かすものまでを包含する。これらの症状を関連づけるものは、アレルゲンに対する身体の免疫応答であり、その応答は、一般的に素因のある個体における免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の産生（アトピー）を包含する。長い間、ＩｇＥ産生の阻害は、脱感作ワクチンを用いるアレルギー性疾患の特異的免疫療法の最終目的であった。しかしながら、近年、ワクチン療法の安全性および効果に疑問がもたれているが、ＩｇＥレベルの低下に対する要望は小さくならない。
【０００３】
インターロイキン４（ＩＬ４）はリンパ系の蛋白メディエーターである。アトピー性の個体由来のリンパ球に関する研究は、刺激に応答してＩＬ４を分泌する能力のある正常数以上のＴリンパ球の存在、および刺激後に分泌された大量のＩＬ４の存在を明らかにした。
【０００４】
抗ＩＬ４抗体はＩｇＥを阻害するが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａを阻害せず［非特許文献１参照］、ＩＬ５を分泌するＴ細胞の産生を阻害する［非特許文献２参照］ことが見いだされた。さらに、最近のデータは、組織におけるＩＬ４が好酸球の蓄積に影響しうるということを示唆している。例えば、非特許文献３、非特許文献４参照。
【非特許文献１】フィンケルマン（Finkelman）ら,アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Ann.Rev.Immunol.）,第８巻：３０３頁（１９９０年）
【非特許文献２】マッギ（Maggi）ら,ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immunol.）,第１４８巻：２１４２頁（１９９２年）
【非特許文献３】テッパー（Tepper）ら,セル（Cell）,第６２巻：４５７頁（１９９０年）
【非特許文献４】テッパーら,セル,第５７巻：５０３頁（１９８９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＬ５分泌細胞の増殖を抑制すること、および好酸球が組織に蓄積しうる付着機構を阻害することの両方により、好酸球性炎症を抑制し、しかもアレルギー性反応の治療、予防もしくは診断に使用可能な高アフィニティーＩＬ４アンタゴニストに対する必要性が当該分野において存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様において、本発明は、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、および第１の融合パートナーからなる、ヒト・インターロイキン−４に対する結合アフィニティーを有する融合蛋白を提供し、第１の融合パートナーにおいては、第１の融合パートナーの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも１つ、好ましくはすべてが非ヒト・モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来のＣＤＲｓにより置換されている。非ヒト・中和モノクローナル抗体を、詳細な説明の欄においてより十分に説明される３Ｂ９および６Ａ１からなる群より選択してもよい。好ましくは、融合蛋白は、さらに免疫グロブリンの不変鎖の全部または一部からなる第２の融合蛋白に作動可能に結合される。
【０００７】
関連する態様において、本発明は、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来のＣＤＲｓ、およびかかるＣＤＲｓをコードする核酸分子を提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来の少なくとも１つ、好ましくは６つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有するヒト化抗体を提供する。
【０００９】
さらにもう１つの態様において、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられる、ヒト・重鎖ならびに軽鎖の不変領域および非ヒト・中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来の重鎖ならびに軽鎖の可変領域を含むキメラ抗体が提供される。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、１種（もしくはそれ以上）の上記融合蛋白またはＭＡｂｓ（例えば、ヒト化、キメラ等）および医薬上許容される担体からなる医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、ヒトに有効量の本発明医薬上許容される組成物を投与することによる、ヒトにおけるアレルギー性症状の治療および／または予防方法を提供する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対する解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）由来の融合蛋白、ＭＡｂｓ（例えば、ヒト化、キメラ等）、そのＣＤＲｓ、そのＦａｂまたはＦ(ａｂ)２もしくはそれらのアナログの組み換え法による製造方法、およびかかる製造に有用な成分を提供する。これらの成分は、それらをコードする単離核酸配列、宿主細胞中で発現を指令しうる選択調節配列の調節下にある当該核酸配列を含むプラスミド、および当該プラスミドで形質転換された宿主細胞（好ましくは、哺乳動物のもの）を包含する。本発明製造方法は、抗体、好ましくはヒト化抗体が該細胞中で発現されるような条件下で、形質転換された本発明宿主細胞系を培養し、次いで、細胞から発現された生成物を単離することを包含する。
【００１３】
さらにもう１つの態様において、本発明は、生物学的液体を、本発明融合蛋白、ＭＡｂｓ（例えば、ヒト化、キメラ等）およびＦａｂｓと接触させ、次いで、該融合蛋白、ＭＡｂまたはＦａｂとヒト・インターロイキン４との間の結合の生起をアッセイすることからなる、ヒトにおける過剰な免疫グロブリンＥ産生に関連するアレルギーおよび他の症状の診断方法である。
【００１４】
もう１つの関連した態様において、（ａ）ヒト・インターロイキン４に対するモノクローナル抗体の分泌により特徴づけられるハイブリドーマ細胞系を調製し；次いで、（ｂ）アルデヒド結合ヒト・インターロイキン４またはビオチン化ヒト・インターロイキン４を用いて該ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングすることからなる、ヒト・インターロイキン４に対して高力価を有するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法が提供される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞系をビオチン化ヒト・インターロイキン４を用いてスクリーニングする。
【００１５】
さらに、アルデヒド結合ヒト・インターロイキン４またはビオチン化ヒト・ＩＬ４を用いてハイブリドーマ生成物のライブラリーをスクリーニングすることにより得られる、ＩＬ４に高アフィニティーを有する中和ＭＡｂ、そのＦａｂフラグメントもしくはＦ(ａｂ)２フラグメントが提供される。
【００１６】
もう１つの態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン−４に特異的で、約２Ｘ１０−１０Ｍと同等またはそれ以下の解離定数により特徴づけられる結合アフィニティーを有する齧歯類の中和モノクローナル抗体を提供する。かかるモノクローナル抗体の例は、ネズミ・ＭＡｂである３Ｂ９、およびラットＭＡｂである６Ａ１ならびに同じ同定特性（すなわち、ヒト・ＩＬ４に特異的で、約２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数を有し、３Ｂ９または６Ａ１と同じエピトープに結合する）を有する他のＭＡｂｓである。本発明のもう１つの態様はハイブリドーマ３４２６Ａ１１Ｃ１Ｂ９である。
【００１７】
本発明の他の態様および利点を、以下の本発明の好ましい具体例の詳細な説明においてさらに説明する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＩＬ４および過剰のＩｇＥ産生により伝達される症状の治療および診断に有用な蛋白、より詳細には、キメラおよびヒト化ＩＬ４抗体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、種々の抗体、そのフラグメント、およびヒト・ＩＬ４結合特異性、中和活性ならびにネズミ・ＭＡｂ３Ｂ９もしくはラット・ＭＡｂ６Ａ１において例示されるようなヒト・ＩＬ４に対する高親和性により特徴づけられる融合蛋白、とりわけ、ヒト化抗体を提供する。これらの生成物は、ＩＬ４により伝達されるアレルギー反応およびＩｇＥにより伝達されるアレルギー反応を治療する治療用ならびに医薬組成物において有用である。さらにこれらの生成物は、ヒトにおいて循環している内在性ＩＬ４レベルを測定（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による）することによる、ＩＬ４により伝達される症状の診断においても有用である。
【００２０】
Ｉ. 定義
「融合蛋白」は、選択宿主細胞における発現により得られる、融合分子によりコードされる蛋白をいう。かかる融合蛋白は人工抗体、例えば、キメラもしくはヒト化抗体、または免疫グロブリン不変領域の全部もしくは一部を欠く抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂもしくはＦ(ａｂ)２等である。
【００２１】
「融合分子」は、ヒト・可変部枠組み構造からなる第１の融合パートナー中に挿入された非ヒト・免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードする核酸配列をいう。所望により、第１の融合パートナーが第２の融合パートナーに作動可能に結合されていてもよい。
【００２２】
「第１の融合パートナー」は、無処理の（天然の）ＣＤＲｓがドナー抗体のＣＤＲｓにより置換されたヒト・枠組み構造もしくはヒト・免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト・可変領域は免疫グロブリン重鎖、軽鎖（もしくは両方）、そのアナログもしくは機能的フラグメントであってよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域中に位置するかかるＣＤＲｓもしくはＣＤＲ領域は、当該分野において知られた方法により決定されうる。例えば、カバト（Kabat）ら,「シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第４版,ＵＳデパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシズ,ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス（U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health）（１９８７年）には、ＣＤＲｓの位置に関する規則が開示されている。さらに、ＣＤＲ領域／構造を同定するのに有用なコンピュータープログラムが知られている。
【００２３】
用語「高力価」は、２Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満のヒト・ＩＬ４に対するＫｄにより特徴づけられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
【００２４】
「ヒト・ＩＬ４に対する結合特異性」は、ヒト・ＩＬ４に対する高力価（もしくはアフィニティー）を意味し、ウシまたはネズミのＩＬ４に対するものはいわない。
【００２５】
「第２の融合パートナー」は、第１の融合パートナーがフレームを合わせて、あるいはさらなる慣用的なリンカー配列により結合（すなわち、作動可能に結合）している蛋白もしくはペプチドをコードしているもう１つのヌクレオチド配列をいう。好ましくは、それは免疫グロブリンである。第２の融合パートナーは、同じものに対する全不変領域（すなわち、同種−第１および第２の融合蛋白は同じ源に由来する）またはさらなる対象抗体（すなわち、異種）をコードしている核酸配列を含んでいてもよい。それは免疫グロブリン重鎖または軽鎖（あるいは単一ポリペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第２の融合パートナーは、特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限定されない。さらに、第２の融合パートナーは、ＦａｂもしくはＦ(ａｂ)２において見いだされるような免疫グロブリン不変領域の一部（すなわち、適当なヒト・不変領域または枠組み構造領域の別々の部分）からなっていてもよい。かかる第２の融合パートナーは、宿主細胞の外表面に露出した必須の膜蛋白をコードする配列、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーの一部、または分析もしくは診断における検出のための蛋白、例えば、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードしている配列からなっていてもよい。
【００２６】
用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、またはＦ(ａｂ)２は、それらの標準的な意味において用いられる（例えば、ハーロウ（Harlow）ら,アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies A Laboratory Manual）,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）,（１９８８年）参照）。
【００２７】
本明細書の用語「人工抗体」は、選択アクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部が、選択エピトープに対して特異性を有する１種もしくはそれ以上のドナー抗体由来の類似部分により置換されている融合蛋白のタイプ、すなわち合成抗体（例えば、キメラもしくはヒト化抗体）をいう。例えば、かかる分子は、未修飾軽鎖（もしくはキメラな軽鎖）に結合したヒト化重鎖（また、その逆も可）により特徴づけられる抗体を包含してもよい。人工抗体は、ドナー抗体の結合特異性を保持するようにアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み構造領域をコードしている核酸配列の変更によっても特徴づけられる。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲｓ（好ましくは、全部）を本明細書記載のドナー抗体由来のＣＤＲｓと置き換えたものからなっていてもよい。
【００２８】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖不変領域に結合したドナー抗体由来の天然の可変領域（軽鎖および重鎖）を含む人工抗体のタイプをいう。
【００２９】
「ヒト化抗体」は、非ヒト・ドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲｓを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が１種（またはそれ以上）のヒト・免疫グロブリン由来である人工抗体のタイプをいう。さらに、結合アフェニティーを保存するように枠組み構造支持残基を変更してもよい（例えば、クイーン（Queen）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,第８６巻：１００２９〜１００３２頁（１９８９年）、ホジソン（Hodgson）ら,Bio/Technology,第９巻：４２１頁（１９９１年）参照）。
【００３０】
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、ＣＤＲｓ、またはその他の機能的フラグメントもしくはアナログの核酸配列を第１の融合パートナーに与え、その結果、融合分子および得られるドナー抗体の抗原特異性ならびに中和活性を伴った発現融合蛋白を提供する抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたは組み換え型）をいう。本発明における使用に適する１のドナー抗体は、非ヒト・中和モノクローナル抗体（すなわち、ネズミの）３Ｂ９と命名された抗体である。抗体３Ｂ９は、高力価、ヒト・ＩＬ４特異性（すなわち、ウシまたはネズミのＩＬ４を認識しない）、配列番号：１ならびに２の可変軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列、および適当なネズミ・ＩｇＧ不変領域上の配列番号：３ならびに４の可変重鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列を有するイソタイプＩｇＧ１に対する中和抗体であると定義される。
【００３１】
用語「アクセプター抗体」は、その重鎖ならびに／もしくは軽鎖枠組み構造領域、および／またはその重鎖ならびに／もしくは軽鎖不変領域をコードしている核酸配列の全部（またはいかなる部分であってもよいが、好ましくは全部）を第２の融合パートナーに与える、ドナー抗体とは異種の抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたは組み換え型）をいう。好ましくは、ヒト・抗体がアクセプター抗体である。「ＣＤＲｓ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域として定義される。例えば、カバト（Kabat）ら,「シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第４版,ＵＳデパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシズ,ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス（U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health）（１９８７年）参照。免疫グロブリンの可変部分には３種の重鎖および軽鎖ＣＤＲｓ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、本明細書の用語「ＣＤＲｓ」は、３種すべての重鎖ＣＤＲｓ、または３種すべての軽鎖ＣＤＲｓ（あるいは、適当な場合には、すべての重鎖およびすべての軽鎖のの両方のＣＤＲｓ）をいう。
【００３２】
ＣＤＲｓは、抗原またはエピトープに対する抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明で対象とするＣＤＲｓは、ドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列由来であり、天然のＣＤＲｓのアナログを包含する。また、該アナログは、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有あるいは保持している。
【００３３】
「抗原結合特異性および／または中和能を共有」は、例えば、ＭＡｂ３Ｂ９があるレベルの抗原アフィニティーにより特徴づけられ、適当な構造上の環境において３Ｂ９の核酸配列によりコードされるＣＤＲがより低いまたはより高いアフェニティーを有しうるとしても、それにもかかわらず３Ｂ９のＣＤＲｓはかかる環境において３Ｂ９と同じエピトープを認識するであろうと考えられるということを意味する。３Ｂ９のＣＤＲｓの重鎖の例は、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６を包含し、３Ｂ９の軽鎖ＣＤＲｓの例は、配列番号：１６、配列番号：１８および配列番号：２０を包含する。
【００３４】
「機能的フラグメント」は、それが由来する抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持する部分的な重鎖または軽鎖の可変部配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端において少しのアミノ酸が欠失したもの）である。
【００３５】
「アナログ」は、少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列であって、少数（すなわち１０個未満）のアミノ酸の該修飾は化学修飾であってもよく、また、置換もしくは転位であってもよい。該修飾があっても配列は未修飾配列の生物学的特性、例えば、抗原特異性および高力価もしくはアフィニティーを保持する。例えば、沈黙の変異を置換により構築してＣＤＲ領域の中もしくは周囲にエンドヌクレアーゼ制限部位を作ることができる。
【００３６】
アナログが対立遺伝子の変異として生じてもよい。「対立遺伝子の変異または修飾」は、本発明アミノ酸またはペプチド配列をコードしている核酸配列における変異である。かかる変異または修飾は遺伝コードの縮重によるものであってもよく、また、意識的に操作された結果所望の特性を有するものであってもよい。例えば、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号：１６）は、無処理のネズミおよびヒト化３Ｂ９抗体と同じである。しかしながら、このＣＤＲ配列は配列番号：１５および配列番号：５３の両方によりコードされる。同様に、ＣＤＲ（配列番号：２２）は、配列番号：２１および配列番号：５４の両方によりコードされる。ＣＤＲ（配列番号：２４）は、配列番号：２３および配列番号：５５の両方によりコードされる。さらにＣＤＲ（配列番号：２６）は、配列番号：２５および配列番号：５６の両方によりコードされる。
【００３７】
用語「エフェクター剤」は、融合蛋白および／または天然もしくは合成のドナー抗体の軽鎖ないしは重鎖、またはドナー抗体の他のフラグメントが慣用的手段により結合されていてもよい非蛋白性キャリヤー分子をいう。かかる非蛋白性キャリヤーは、診断分野において使用される慣用的キャリヤー、例えば、ポリスチレンまたは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ「ファルマシア（Pharmacia）］システムに用いられる多糖類、あるいは医学分野で使用され、ヒトおよび動物への投与に関して安全である他のプラスチックビーズを包含しうる。他のエフェクター剤は、重金属原子または放射性同位元素をキレートするための大員環を包含してもよい。ポリエチレングリコールのごときかかるエフェクター剤は融合蛋白の半減期を延長するのにも有用でありうる。
【００３８】
II. 高アフィニーＩＬ４モノクローナル抗体
抗体の構築において使用するために、本発明の非ヒト種（例えば、ウシ、ヒツジ、霊長類、齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）のフラグメントおよび融合蛋白を用いて、無処理のヒト・ＩＬ４またはそれ由来のペプチドエピトープに関する提示に基づいて所望の免疫グロブリンを得てもよい。慣用的なハイブリドーマ法を用いて、ＩＬ４に対する非ヒト・ＭＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞系を提供する。次いで、９６ウェルプレートに結合したＩＬ４を用いて、あるいは別法として実施例２に詳述するスクリーニングアッセイに使用するビオチン化ＩＬ４を用いてかかるハイブリドーマをスクリーニングする。よって、本発明の１の特徴は、アッセイ系がＩＬ４の変性を回避するものである、ヒト・ＩＬ４に対するＭＡｂを検出方法である。かかる方法において、ヒト・ＩＬ４に対して高力価（または高アフィニティー）のＭＡｂを検出することができることが見いだされた。
【００３９】
一例として、ネズミ・ドナー由来の高力価中和ＭＡｂの生産を、まず開示する。キメラまたはヒト化抗体を得ることに使用する望ましいネズミ（ドナー）抗体であるＭＡｂ  ３Ｂ９を、実施例１において詳細に説明する。３Ｂ９  ＭＡｂは、ヒト・ＩＬ４に対する抗原結合特異性（ＩＬ４に対して２.０Ｘ１０−１０Ｍ未満（約１.８Ｘ１０−１０Ｍ）のＫｄ）により特徴づけられる。この３Ｂ９のＦａｂフラグメントのＩＬ４に対するＫｄは約３Ｘ１０−１０Ｍ未満である。この抗体のエピトープを直鎖状ペプチドＩＬ４とともにマッピングすることができなかったので、該エピトープは隣接していないエピトープに結合すると考えられる。結合のパターンは、Ｂ−Ｃループ（残基６０〜６９）→Ｃヘリックス（残基７０〜９３）領域における結合部位を示唆する。これらの領域は、クック（Cook）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,第２１８巻：６７５〜６７８頁（１９９１年）、ワルター（Walter）ら,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,第２６７巻：２０３７１〜２０３７６頁（１９９２年）、ウロダバー（Wlodaver）ら,ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.,第３０９巻：５９〜６４頁（１９９２年）、レッドフィールド（Redfield）ら,バイオケミストリー（Biochem.）,第３０巻：１１０２９〜１１０３５頁（１９９１年）、スミス（Smith）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,第２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）、ガレット（Garrett）ら,（１９９２年）、およびパワーズ（Powers）ら,バイオケミストリー,第３１巻：４３３４〜４３４６頁（１９９２年）ならびにサイエンス（Science）,第２５６巻：１６７３〜１６７７頁（１９９２年）（参照により本明細書に取り入れる）において提供されるマップ中に示されている。
【００４０】
もう１つの望ましいドナー抗体はラット・ＭＡｂ  ６Ａ１である。このＭＡｂの製造は下記実施例７に記載されている。このＭＡｂは、イソタイプＩｇＧ２であること、および２.０Ｘ１０−１０Ｍ未満（約１.６Ｘ１０−１０Ｍ）のヒト・ＩＬ４に対する解離定数を有することにより特徴づけられる。３Ｂ９に関するのと同じように、この６Ａ１の標的エピトープは直鎖状ペプチドＩＬ４に関してはマッピングされず、それゆえ、該エピトープは隣接しておらず、３次元的であると考えられる。ＩＬ４変異蛋白への結合パターンおよびその生物学的活性は、ヒト・ＩＬ４のＤヘリックス領域（アミノ酸残基１０９〜１２７）での結合を示し、アミノ酸残基＃１２４におけるチロシン付近での結合の可能性が最も高い。
【００４１】
本発明は、３Ｂ９  ＭＡｂ、６Ａ１  ＭＡｂ、またはその超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されない。ヒト・ＩＬ４に対する２.０Ｘ１０−１０Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる他の適当な高力価ＩＬ４抗体のいずれかおよび対応する抗−ＩＬ４  ＣＤＲｓを、それらに代えて使用できる。以下の説明においてドナー抗体が３Ｂ９または６Ａ１と確認される場合はいつでも、記載の説明および簡単のためだけにこの表記を行う。
【００４２】
III. 抗体フラグメント
さらに本発明は、ヒト・ＩＬ４に指向されたＭＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ)２フラグメントの使用も包含する。これらのフラグメントは、インビボにおいてＩＬ４およびＩｇＥにより伝達される症状に対して防御的な薬剤、あるいはインビトロにおいてＩＬ４診断試薬の一部として有用である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体と重鎖のアミノ末端部分を含む。Ｆ(ａｂ)２フラグメントは、ジスルフィド結合により結合された２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ＭＡｂｓ  ３Ｂ９、６Ａ１および他の類似の高アフィニティーＩＬ４結合抗体は、慣用的方法、例えば、適当な蛋白分解酵素であるパパインおよび／またはペプシンでのＭＡｂの開裂、あるいは組み換え法により得ることのできるＦａｂフラグメントおよびＦ(ａｂ)２フラグメントの源を提供する。これらのＦａｂフラグメントおよびＦ(ａｂ)２フラグメントは、それ自体、治療、予防または診断薬として有用であり、さらに、本明細書記載の組み換え型またはヒト化抗体の形成に有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして役立つ。
【００４３】
IV. 対象とする抗−ＩＬ４のアミノ酸およびヌクレオチド配列
ＭＡｂ  ３Ｂ９または上記他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる種々の融合蛋白（人工抗体を含む）を設計し得ることにおいて有用な、融合蛋白可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、枠組み構造配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、ならびにそのアナログのごとき配列、およびそれらをコードしている核酸配列を与える。
【００４４】
よって、本発明は、一例として、ＩＬ４ネズミ抗体３Ｂ９由来の可変軽鎖および可変重鎖の配列、ならびにそれ由来の配列を提供する。３Ｂ９の重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸残基２０ないし１４０により特徴づけられる。図２において、そのＣＤＲ領域は下線が付されており、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：２６に示されている。３Ｂ９の軽鎖クローン可変領域を、図１［配列番号：２］のアミノ酸残基２１ないし１３２により特徴づけられる。そのＣＤＲ領域は、アミノ酸残基４４〜５８［配列番号：１６］、７４〜８０［配列番号：１８］および１１３〜１２１［配列番号：２０］由来である。
【００４５】
キメラな重鎖可変領域およびシグナルのヌクレオチドならびにアミノ酸配列を提供する。これらの配列は、シグナル配列を除いて３Ｂ９重鎖と同じである。キメラな重鎖シグナル配列を配列番号：５および６に示す。図３において、ＣＤＲ領域は下線により示され、無処理のネズミ・ＣＤＲｓ［配列番号：２１〜２６］とアミノ酸配列が同じである。キメラな軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、未修飾３Ｂ９配列（配列番号：２のアミノ酸残基２１〜１３２）と同じであり、天然のマウス・シグナル配列（配列番号：２のアミノ酸残基１〜２０）を利用したものである。
【００４６】
ヒト化重鎖可変領域およびシグナルの配列を図４［配列番号：１１および１２］に示す。そのシグナル配列を配列番号：５および６にも示す。当業者に知られた他の適当なシグナル配列により、本明細書に例示したシグナル配列を置換してもよい。この構築物のＣＤＲアミノ酸配列は無処理のネズミおよびキメラ重鎖のＣＤＲｓと同じであり、配列番号：２２（配列番号：５４によりコードされる）、配列番号：２４（配列番号：５５によりコードされる）、および配列番号：５６（配列番号：２６によりコードされる）に示される。
【００４７】
代表的な（合成された）ヒト化軽鎖可変部配列を図５［配列番号：１３および１４］に示す。シグナル配列は、配列番号：８のアミノ酸残基１から１９に及ぶ。このＣＤＲ配列は下線で示され、配列番号：２０のただ１つのアミノ酸によって、無処理のネズミ・ＣＤＲのＣＤＲとは異なる。よって、ヒト化軽鎖のＣＤＲｓは、配列番号：５３および１６、配列番号：１７および１８、そして配列番号：２７および２８によって提供される。この相違を、実施例３において詳述する。
【００４８】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードしている本発明核酸配列もしくはそのフラグメントは未修飾形態で使用され、あるいは合成されて所望修飾、例えば制限部位を導入される。ＭＡｂ  ３Ｂ９または他の望ましい高力価ＩＬ４抗体由来の単離された天然または合成の核酸配列は、所望により、所望抗体枠組み構造領域をコードしているような適当な核酸配列中への挿入もしくは結合、変異したＣＤＲｓとの結合、または選択された第２の融合パートナーをコードしている核酸配列との融合を容易にするための制限部位を有していてもよい。
【００４９】
遺伝コードの縮重を考慮して、ドナー抗体の抗原特異性を共有している種々の重鎖ならびに軽鎖のアミノ酸配列、および本発明ＣＤＲ配列、ならびにその機能的フラグメントもしくはアナログ種々の暗号配列を構築することができる。第２の融合パートナーに作動可能に結合された場合、可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードしている本発明の単離核酸配列もしくはそのフラグメントは、本発明の融合蛋白、キメラもしくはヒト化抗体、または他の人工抗体の製造に使用されうる。
【００５０】
これらの配列は、ＣＤＲｓまたは枠組み構造領域をコードしている核酸配列中における特異的変化の突然変異による導入、および得られた修飾もしくは融合核酸配列の発現用プラスミドへの導入にも有用である。例えば、枠組み構造およびＣＤＲをコードする領域のヌクレオチド配列における沈黙の置換を用いて、突然変異されたＣＤＲ（および／または枠組み構造）領域の挿入を容易ににする制限酵素部位の作成が行われた。これらのＣＤＲ領域は、本発明ヒト化抗体の構築に用いられた。
【００５１】
本明細書記載の融合蛋白および抗体の一部をコードしている単離核酸配列以外に、無処理の配列に相補的な核酸配列のごとき他のかかる核酸配列を用いてもよい。有用なＤＮＡ配列は、緊縮条件下［ティー・マニアテイス（T.Maniatis）ら,モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Molecular Cloning(A laboratory Manual）,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年）,３８７〜３８９頁参照］で当該ＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列を包含する。１のかかる緊縮ハイブリダイゼーションの例は、６５℃における４ＸＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次いで、６５℃で１時間０.１ＸＳＳＣでの洗浄である。これとは別に、代表的な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４２℃において４ＸＳＳＣである。好ましくは、これらのハイブリダイズするＤＮＡ配列は少なくとも約１８ヌクレオチドの長さ、すなわち、ほぼＣＤＲのサイズである。
【００５２】
Ｖ. 融合分子および融合蛋白
融合分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体のごとき人工抗体を含む融合蛋白をコードしうる。望ましい融合分子は、ＩＬ４抗体、好ましくは、第１の融合パートナー（ヒト・枠組み構造またはヒト・免疫グロブリン可変領域）中に挿入された本発明により提供される高アフィニティー抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードしているＣＤＲ配列を含む。
【００５３】
好ましくは、第１の融合パートナーは、第２の融合パートナーに作動可能に結合される。第２の融合パートナーは上記にごとく定義され、さらに対象とする第２の抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含んでいてもよい。さらに第２の融合パートナーは、軽鎖または重鎖不変領域がフレーム中で、あるいはリンカー配列により融合される別の免疫グロブリンをコードしている配列を含んでいてもよい。ＩＬ４の機能的フラグメントまたはアナログに指向された人工抗体を設計して当該抗体の結合の増大を誘導してもよい。
【００５４】
第２の融合パートナーは、非蛋白性キャリヤー分子をはじめとする上記定義のエフェクター剤に結合していてもよく、それに第２の融合パートナーが慣用的手段により作動可能に結合していてもよい。
【００５５】
第２の融合パートナー、例えば抗体配列と、エフェクター剤との間の融合または結合は、いかなる適当な手段、例えば慣用的な共有結合もしくはイオン結合、蛋白融合、またはヘテロ−二機能架橋、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒド等によって行われてもよい。かかる方法は当該分野において知られており、慣用的な化学および生化学の教科書によく記載されている。
【００５６】
さらに、第２の融合パートナーとエフェクター剤との間に所望量のスペースを単に提供するだけの慣用的なリンカー配列を融合分子中に構築してもよい。かかるリンカーの設計は当業者によく知られている。
【００５７】
さらに、本発明分子に対するシグナル配列を修飾して発現を増大させてもよい。一例として、図２［配列番号：４］に示すキメラな可変部重鎖（ＶＨ）と同じであるネズミ・重鎖配列のアミノ酸配列を有する望ましい融合蛋白は、元のシグナルペプチドを別のシグナル配列（アミノ酸残基１〜２０）［配列番号：６］で置換されたものである。
【００５８】
代表的な融合蛋白は、ＭＡｂ  ３Ｂ９の抗原特異性を有する可変部重鎖および／または軽鎖ペプチドまたは蛋白の配列、例えば、ＶＨ［配列番号：９および１０のアミノ酸残基２１〜１４１］およびＶＬ鎖［配列番号：１および２のアミノ酸残基２１〜１３２］を含んでいる。さらに別の本発明の望ましい融合蛋白は、ネズミ・抗体分子３Ｂ９の重鎖および／または軽鎖の可変領域の少なくとも１個、好ましくは全部のＣＤＲｓを含んでおり、残りの配列はヒト起源であるかあるいはその機能的フラグメントもしくはアナログであることにより特徴づけられる。例えば、配列番号：１１ならびに１２、および配列番号：１３ならびに１４（図４および５）のヒト化ＶＨおよびＶＬ領域参照。
【００５９】
さらなる具体例において、本発明の人工抗体にさらなる作因が結合していてもよい。例えば、組み換え型ＤＮＡ法を用いて、完全な抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ３ドメインが酵素もしくは他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターもしくは受容体分子）により置換されている本発明の人工抗体を製造してもよい。
【００６０】
さらに所望により第２の融合パートナーが、ネズミ・３Ｂ９の抗原特異性を有するＣＤＲ含有配列に対応しない非免疫グロブリンペプチド、蛋白もしくはそのフラグメントに作動可能に結合していてもよい。生じる蛋白は、抗ＩＬ４抗原特異性および発現された場合に非免疫グロブリンの特性の両方を示す可能性がある。その融合パートナーの特徴は、例えば、別の結合ドメインもしくは受容体ドメインのごとき機能的特性、または融合パートナーがそれ自体治療蛋白である場合には治療特性、あるいはさらなる抗原特性であってもよい。
【００６１】
本発明の別の所望蛋白は、全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、またはＦａｂもしくはＦ(ａｂ)２フラグメントのごときそれらの別個のフラグメント、重鎖ダイマー、またはＦｖもしくは１本鎖抗体（ＳＣＡ）のごとき何らかの最小組み換え型フラグメント、あるいは、例えばＭＡｂ  ３Ｂ９もしくは６Ａ１のような選択ドナーＭＡｂと同じ特異性を有する他のいずれかの分子からなっていてもよい。かかる蛋白を融合蛋白の形態で使用してもよく、あるいはその融合していない形態で使用してもよい。
【００６２】
第２の融合パートナーが別の抗体、例えば、いずれかのイソタイプもしくはクラスの免疫グロブリン枠組み構造または不変領域由来である場合はいつでも、人工抗体が得られる。人工抗体は、１の起源（例えば、アクセプター抗体）由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）不変領域および可変枠組み構造領域、およびドナー抗体抗体（例えば本明細書記載の抗ＩＬ４抗体）由来の１個もしくはそれ以上（好ましくは全部）のＣＤＲｓからなっていてよい。さらに、ドナー抗体の抗原結合特異性を保持するように、アクセプターＭＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み構造領域あるいはドナーＣＤＲの核酸またはアミノ酸レベルでの変更、例えば欠失、置換もしくは付加を行ってもよい。
【００６３】
ＩＬ４  ＭＡｂ（所望により上記のごとく修飾されていてもよい）の可変重鎖および／または軽鎖の一方（もしくは両方）、あるいは下記において同定される重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲｓ（実施例３参照）の１つもしくはそれ以上を用いるために、かかる人工抗体を設計する。本発明の人工抗体は中和的、すなわち、望ましくはＩＬ４蛋白の受容体への結合をブロックするものである。例えば、ＭＡｂ  ３Ｂ９由来の人工抗体は、上記のごとく、Ｂ−Ｃループ→Ｃヘリックス領域にあると考えられる特異的なヒト・ＩＬ４の３次元蛋白エピトープに対して指向される。
【００６４】
かかる人工抗体は、選択ヒト・免疫グロブリンもしくはサブタイプの枠組み構造領域を含んでいるヒト化抗体、あるいはＩＬ４抗体の機能的フラグメントに融合しているヒト・重鎖および軽鎖不変領域を含んでいるキメラ抗体を包含する。適当なヒト（もしくは他の動物）のアクセプター抗体は、ドナー抗体の核酸またはアミノ酸配列に対する相同性により、慣用的なデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴＲデータベース、ロス・アラモス（Los Alamos）データベース、およびスイス・プロテイン（Swiss Protein）データベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体の枠組み構造領域に対する相同性により（あるいはアミノ酸に基づいて）特徴づけられるヒト・抗体は、ドナーＣＤＲｓの挿入のための重鎖不変領域および／または重鎖可変枠組み構造領域を提供することに適している可能性がある。適当な枠組み構造領域を同様の方法で選択してもよい。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体由来であることを必要としないことに留意すべきである。
【００６５】
望ましくは、異種枠組み構造および不変領域は、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのごときヒト・免疫グロブリンクラスならびにイソタイプから選択される。しかしながら、アクセプター抗体はヒト・免疫グロブリン蛋白配列のみからなることを要しない。例えば、ヒト・免疫グロブリン鎖の一部をコードしているＤＮＡ配列がポリペプチドエフェクターもしくはレポーター分子のごとき非免疫グロブリンのアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列と融合している遺伝子を構築してもよい。
【００６６】
特に望ましいヒト化抗体の一例は、選択ヒト・抗体配列の枠組み構造に挿入された３Ｂ９のＣＤＲｓを含む。ヒト・抗体を中和のためには、ＩＬ４抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域由来の１個、２個もしくは３つのＣＤＲｓを選択ヒト・抗体配列の枠組み構造領域中に挿入し、後者の抗体の元のＣＤＲｓを置換する。
【００６７】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト・重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、１個もしくはそれ以上のＣＤＲの置換により加工されたものである。６個すべてのＣＤＲｓ、または６個未満のＣＤＲｓの種々の組み合わせを使用することが可能である。好ましくは、６個すべてのＣＤＲｓが置換されている。軽鎖としてヒト・アクセプター抗体由来の未修飾軽鎖を用いて、ヒト・重鎖においてのみＣＤＲｓを置換することが可能である。さらに別法として、慣用的な抗体のデータベースに基づいて、適合する軽鎖を別のヒト・抗体から選択してもよい。人工抗体の残りの部分は、いかなる適当なアクセプターヒト・免疫グロブリン由来であってもよい。
【００６８】
よって、人工的なヒト化抗体は、好ましくは、天然のヒト・抗体もしくはそのフラグメントの構造を有し、効果的な治療用途、例えば、ＩＬ４により伝達されるヒトの炎症性疾患の治療または診断用途に必要とされる特性の組み合わせを有する。
【００６９】
別の例として、人工抗体は、３Ｂ９の可変軽鎖領域の３個のＣＤＲｓ［配列番号：１６、１８および２８］および３Ｂ９の可変重鎖領域の３個のＣＤＲｓ［配列番号：２２、２４および２６］を含んでいてもよい。得られるヒト化抗体は、ＭＡｂ  ３Ｂ９の抗原結合特異性および高アフィニティーにより特徴づけられる。
【００７０】
必ずしもドナー抗体の特異性および高アフィニティーに影響することなく、可変ドメインのアミノ酸の変化により人工抗体をさらに修飾できる（すなわち、アナログ）ことが当業者に理解されよう。例えば、軽鎖アミノ酸残基が位置１２０においてアルギニン［配列番号：１３および１４］またはスレオニン［配列番号：５７および５８］となっているヒト化モノクローナル抗体が構築された。可変ドメイン枠組み構造もしくはＣＤＲｓあるいはその両方のいずれかにおいて重鎖および軽鎖のアミノ酸を他のアミノ酸により置換しうると考えられる。
【００７１】
さらに、不変領域を変更して本発明分子の特定の特性を増減させてもよい。例えば、ダイマー化、Ｆｃ受容体への結合、または結合して補体を活性化する能力である（例えば、アンガル（Angal）ら,モレキュラー・イミュノロジー（Mol.Immunol.）,第３０巻：１０５〜１０８頁（１９９３年）、ズー（Xu）ら,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,第２６９巻：３４６９〜３４７４頁（１９９４年）、ウィンター（Winter）ら,ＥＰ３０７,４３４−Ｂ参照）。
【００７２】
キメラ抗体である融合蛋白は、両鎖に関するヒト・免疫グロブリン不変領域と結合している枠組み構造領域を含んだ非ヒト・ドナー抗体の重鎖および軽鎖可変領域の全体を提供することにより、上記ヒト化抗体とは異なる。本発明のヒト化抗体に対するさらなる非ヒト・配列を有するキメラ抗体は、ヒトにおける有意な応答を誘導しうる。
【００７３】
かかる抗体は、下記のようなＩＬ４により伝達されるアレルギー性疾患の予防および治療に有用である。
【００７４】
VI. 融合蛋白および人工抗体の製造
好ましくは、種々の軽鎖および／または重鎖配列およびＭＡｂ  ３Ｂ９または他の適当なドナーＭＡｂｓ（例えば６Ａ１）のＣＤＲｓ［配列番号：１６、１８、２０、２２、２４および２６］、ならびにそれらがコードしている核酸配列を、以下の方法による本発明の融合蛋白および人工抗体、好ましくはヒト化抗体の構築に使用する。同じまたは類似の方法を用いて本発明の他の具体例を得てもよい。
【００７５】
ハイブリドーマを産生する選択ドナーＭＡｂ、例えば、ネズミ・抗体３Ｂ９を慣用的にクローン化し、当業者に知られた方法、例えば、サムブルック（Sambrook）ら,モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）,第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprong HarborLaboratory）（１９８９年）により、その重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡを得る。ドナーＭＡｂの結合特異性ならびにヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来の部分を保有するために必要な少なくともＣＤＲｓおよびアクセプターＭＡｂの軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み構造領域の一部を含む３Ｂ９の可変重鎖および軽鎖領域を、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得る。既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することにより、当該ＣＤＲｓを同定する。
【００７６】
次いで、マウス／ヒト・キメラ抗体を調製し、結合活性をアッセイする。かかるキメラ抗体は、両鎖に関するヒト・Ｉｇ不変領域に結合した非ヒト・ドナー抗体のＶＨおよびＶＬ領域の全体を含んでいる。
【００７７】
ヒト・抗体由来の重鎖可変領域同種の枠組み構造領域を、コンピューターデータベース、例えばＫＡＢＡＴＲを用いて同定し、３Ｂ９に対して相同性を有するヒト・抗体をアクセプター抗体として選択した。ヒト・抗体枠組み構造内に３Ｂ９のＣＤＲｓを含んでいる合成重鎖可変領域の配列を、制限部位を有するように枠組み構造領域中の最適なヌクレオチド置換を用いて設計した。次いで、この設計された配列を、ヌクレオチドを重複させることにより合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、次いで、エラーを修正する。
【００７８】
同様の方法で、適当な軽鎖可変枠組み構造領域を設計した。
【００７９】
ヒト化抗体をキメラ抗体から誘導してもよく、あるいは好ましくは、重鎖および軽鎖由来のドナーＭＡｂのＣＤＲｓを適当に選択重鎖および軽鎖枠組み構造内に挿入することにより合成的に作成してもよい。別法として、標準的な突然変異法を用いて本発明のヒト化抗体を製造する。かくして得られたヒト化抗体は、ヒト・枠組み構造領域およびドナーＭＡｂのＣＤＲｓを含んでいる。引き続いて枠組み構造残基の加工を行ってもよい。得られたヒト化抗体は、組み換え型宿主細胞、例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞中で発現されうる。この方法のさらなる詳細を実施例４に示す。他の適当なＩＬ４特異的中和高力価非ヒト・抗体についてこの方法を用いて他のヒト化抗体を調製してもよい。
【００８０】
宿主細胞中での複製ならびに発現、および／または宿主細胞からの分泌能のある慣用的な調節配列に作動可能に結合した融合蛋白に対するこれらのコーディング配列を配置することにより、慣用的な発現ベクターまたは組み換え型プラスミドを製造する。調節配列は、他の知られた抗体から誘導されうるプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーターおよびシグナル配列を包含する。同様に、相補的抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを製造する。好ましくは、この第２の発現ベクターは、コーディング配列および選択可能なマーカーが、ポリペプチド鎖が可能なかぎり機能的に発現されるように関連していること以外は、第１の発現ベクターと同じである。
【００８１】
選択宿主細胞を、慣用的方法により、第１のベクターおよび第２のベクターの双方を用いる慣用的方法により同時トランスフェクションするかまたは単一ベクターにより単にトランスフェクションして、組み換え型もしくは合成の軽鎖および重鎖からなる本発明のトランスフェクションされた宿主細胞を作り出す。次いで、トランスフェクションされた細胞を慣用的方法により培養して本発明の人工抗体を得る。組み換え型重鎖および／または軽鎖の双方の結合物を含むヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのごとき適当なアッセイにより培養物からヒト化抗体をスクリーニングする。同様の慣用的方法を用いて本発明の他の融合蛋白および分子を構築してもよい。
【００８２】
本発明方法および組成物の構築に用いられるクローニングおよびサブクローニング工程用の適当なベクターは当業者により選択されうる。例えば、慣用的なｐＵＣシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される１のベクターはｐＵＣ１９であり、アマシャム（Amersham）社（英国バッキンガムシャー（Backinghamshire））またはファルマシア（Pharmacia）社（スゥエーデンのウプサラ（Uppsala））のごとき供給元から市販されている。さらに、容易に複製する能力を有するすべてのベクターは、クローニング部位およびマーカー遺伝子が豊富であり、取り扱いが簡単で、クローニングに使用されうる。よって、クローニングベクターの選択は、本発明における限定因子ではない。
【００８３】
同様に、本発明の人工抗体の発現に使用されるベクターが、当業者により、いかなる慣用的なベクターから選択されてもよい。さらにベクターは、免疫グロブリン領域のＤＮＡコーディング配列に作動可能に結合しており選択細胞中の異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令しうるＣＭＶプロモーターのごとき選択調節配列を含んでいる。これらのベクターは、人工抗体または融合分子をコードしている上記ＤＮＡ配列を含んでいる。また、ベクターが、取り扱いを容易にするための所望制限部位の挿入により修飾された選択免疫グロブリン配列を含んでいてもよい。
【００８４】
さらに発現ベクターを、異種ＤＮＡ配列の増幅発現に適するマーカー遺伝子、例えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）またはネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）により特徴づけてもよい。他の好ましいベクター配列は、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のごときポリＡシグナル配列およびベータたグロブリンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）を包含する。本発明に有用な発現ベクターを、当業者によく知られた方法により合成することができる。
【００８５】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等を、天然ソースから得てもよく、あるいは選択宿主における組み換え型ＤＮＡ産物の発現および／または分泌の指令に用いる既知方法により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現に関して多くのタイプが当該分野において知られている他の適当な発現ベクターをこの目的にために選択してもよい。
【００８６】
さらに本発明は、本発明の人工抗体または融合分子のコーディング配列を含んでいる組み換え型プラスミドでトランスフェクションされた細胞系を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の取り扱いに有用な宿主細胞宿主細胞もまた慣用的なものである。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（E.coli）の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製および本発明融合蛋白の構築における他の工程に使用する。
【００８７】
本発明の人工抗体または融合蛋白の発現に適する宿主細胞または細胞系は、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば３Ｔ３）および特に骨髄細胞のごとき真核細胞、最も好ましくはＣＨＯ細胞または骨髄細胞のごとき哺乳動物細胞である。よって、ヒト・細胞を用いて、分子がヒトのグリコシレーションパターンを有するように修飾されるようにしてもよい。別法として、他の真核細胞細胞系を用いてもよい。適当な哺乳動物細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産ならびに精製の方法は当該分野において知られている。上記サムブルック（Sambrook）らの文献参照。
【００８８】
細菌細胞は、本発明の組み換え型ＭＡｂｓの発現に適していることがわかる。しかしながら、細菌細胞で発現された蛋白の変性しやすさまたは不当に折り畳まれやすさのため、細菌細胞で生産されたすべての組み換え型ＭＡｂを抗原結合能の保持についてスクリーニングしなくてはならないであろう。細菌細胞により発現された分子が適切な折り畳み形態で生産されるならば、当該細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現に使用される種々のイー・コリ株はバイオテクノロジーの分野においてよく知られた宿主細胞である。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、他の枯草菌等の種々の株も本発明に使用できる。
【００８９】
所望であれば、当業者に知られた酵母細胞株ならびに例えば、ドロソフィラ（Drosophila）よびレピドプテラ（Lepidoptera）のような昆虫細胞、そしてウイルス発現系も宿主細胞として使用できる。ミラー（Miller）ら,ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering）,第８巻：２７７〜２９８頁、プレナム・プレス（Plenum Press）（１９８６年）およびそこに引用された文献参照。
【００９０】
本発明ベクターを構築しうる一般的方法、本発明宿主細胞を製造するために必要なトランスフェクション法、およびかかる細胞から本発明融合蛋白または人工抗体を生産するのに必要な培養方法は、すべて慣用的方法である。同様に、本発明融合蛋白または人工抗体を、生産後、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等をはじめとする当該分野において標準的な方法により細胞培養物から精製することができる。かかる方法は当業者の能力範囲内であり、本発明を限定するものではない。
【００９１】
ヒト化抗体の発現のさらに別の方法には、米国特許第４,８７３,３１６号記載のごときトランスジェニック動物における発現を用いてもよい。この方法は、トランスジェニックに動物中に取り込まれた場合メスの乳中に所望組み換え型蛋白を産生せしめる動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
【００９２】
所望方法により発現されたならば、人工抗体を、適当なアッセイを用いてインビトロにおいて試験する。現在慣用的となっているＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて人工抗体のＩＬ４エピトープへの定性的および定量的結合を評価する。さらに、他のインビトロでのアッセイ、例えば、通常のクリアランス機構にもかかわらず体内における人工抗体の維持を評価するために、引き続き行われるヒトの臨床研究の前にＢＩＡｃｏｒｅ［ファルマシア］を用いて中和効率を確認してもよい。
【００９３】
３Ｂ９から調製されたヒト化抗体に関して説明した方法を行った後、当業者は、本明細書記載の他のドナーＩＬ４抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築してもよい。人工抗体のレシピエントにより「自己」であると認識されうる可変領域枠組み構造を用いて人工抗体を製造することができる。可変領域枠組み構造に対する少しの修飾を行って、レシピエントに対する免疫原性の認められる程度の増加を伴わずに抗原結合を大いに増大させることができる。かかる人工抗体は、ＩＬ４により伝達される症状に関してヒトを有効に治療することができる。かかる抗体はかかる症状の診断にも有用である。
【００９４】
VII. 治療的／予防的使用
本発明は、有効量の１種もしくはそれ以上の本明細書記載の人工抗体または融合蛋白またはそのフラグメントを投与することを特徴とするアレルギー性疾患にかかっているヒトの治療方法にも関する。
【００９５】
本発明分子の使用により誘導される治療的応答は、ＩＬ４への結合、次いで、ＩｇＥ放出のブロッキングにより得られる。よって、本発明分子は、治療的使用に適した調製物および処方中にある場合には、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、およびアナフィラキシーのショックのごときアレルギー性応答にかかっているヒトにとり非常に望ましい。
【００９６】
本発明の融合蛋白、抗体、人工抗体またはそれらのフラグメントを他の抗体、特に、本発明の人工抗体が指向される症状の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応するヒト・ＭＡｂｓと組み合わせて使用してもよい。同様に、本発明抗体が指向される選択動物における症状の原因となるエピトープと反応するＭＡｂｓを、獣医用組成物に使用してもよい。
【００９７】
本発明治療薬は、約２日ないし約３週間あるいは必要な期間のアレルギー症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、季節性の鼻炎等の治療の場合には、より長い治療が望ましい。本発明治療薬は、先行技術のＩＬ４により伝達される疾患の治療に関する現用されている輸液プロトコールよりもかなり有利である。用量および治療期間は、ヒトの循環系における本発明分子の相対的存在時間に関連しており、治療すべき症状および患者の一般的健康状態に応じて当業者により調節されうる。
【００９８】
本発明治療薬の投与方法は、薬剤を宿主に送達するいかなる適当な経路であってもよい。本発明の融合蛋白、抗体、人工抗体およびそれらのフラグメント、ならびに本発明医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈または鼻腔内投与に特に有用である。
【００９９】
本発明治療薬を、医薬上許容される担体中の有効量の本発明の人工的な（例えば、ヒト化）抗体を活性成分として含有する医薬組成物として製造してもよい。本発明の予防薬において、好ましくは生理学的ｐＨに緩衝化された、人工抗体を含有する水性懸濁液または溶液は、容易に注射できる形態であるのが好ましい。非経口投与用組成物は、通常は、医薬上許容される担体中、好ましくは水性担体中に溶解された本発明の人工抗体の溶液またはそのカクテルからなる。種々の水性担体、例えば、０.４％セイライン、０.３％グリシン等を用いてもよい。これらの溶液は滅菌され、一般的には微粒子物質を含まない。慣用的なよく知られた滅菌法（例えば、濾過）によりこれらの溶液を滅菌してもよい。組成物は、ｐＨ調節剤、緩衝剤等のごとき適当な生理学的条件に必要とされる医薬上許容される補助的物質を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明抗体の濃度を広範囲に変更できる。すなわち、約０.５％重量未満、通常には約１重量％もしくは少なくとも約１重量％から１５ないし２０重量％までであり、主として液体の体積、粘度等により、そして選択された特定の投与方法により選択される。
【０１００】
よって、筋肉内注射用の本発明医薬組成物を、１ｍＬの滅菌済み緩衝水および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇないし約３０ｍｇ、あるいはより好ましくは、約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の人工抗体を含有するように調製することができる。同様に、静脈輸液用本発明医薬組成物を、約２５０ｍｌまでの滅菌済みリンゲル溶液および約１ｍｇないし３０ｍｇ、好ましくは、５ｍｇないし約２５０ｍｇの本発明の人工抗体を含有するように調製することができる。非経口的投与組成物の実際の製造方法はよく知られているかまたは当業者に明らかであり、より詳細には、例えば、レミントンズ・ファーマシューテイカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）,第１５版,マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）,イーストン（Easton）,ペンシルベニア（Pennsylvania）に記載されている。
【０１０１】
本発明治療薬を、医薬調製物とした場合には、単位剤型として提供するのが好ましい。適切な治療的に有効な用量を、当業者は容易に決定することができる。ヒトまたは他の動物における炎症性疾患を有効に治療するためには、体重７０ｋｇあたり約０.１ｍｇないし約２０ｍｇの本発明蛋白または抗体を１回分の用量として非経口的に、好ましくは、筋肉内投与すべきである。必要であれば、かかる投与を、炎症性応答のある間、医師により適当であると選択された適当時間間隔をおいて繰り返してもよい。
【０１０２】
さらに本発明は、本発明ＩＬ４融合蛋白の、本発明融合蛋白のＩＬ４受容体結合能に適合する抗腫瘍壊死因子活性または他の医薬活性成分のごとき抗ＩＬ４活性により特徴づけられる他の抗体または融合蛋白との同時投与または連続投与を包含する。かかる他の抗体は市販されているかまたは本明細書記載の方法と同様の方法で設計することができる。
【０１０３】
本発明の融合蛋白および人工抗体を、ＩＬ４により伝達される疾患の決定またはかかる疾患の治療の進行の追跡のごとき診断法に用いてもよい。診断試薬として、これらの融合蛋白を慣用的に標識して、血清、血漿もしくは他の適当な組織におけるＩＬ４レベルの測定のためのＥＬＩＳＡおよび他のアッセイのフォーマットに使用してもよい。融合蛋白が使用されるアッセイの性質は慣用的なものであり、本発明を限定するものでない。
【０１０４】
本明細書記載の抗体、人工抗体またはそれらのフラグメントを、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体中で復元することができる。この方法は、慣用的な免疫グロブリンに関して有効であることが示されており、当該分野で知られた凍結乾燥および復元方法を用いることができる。
【０１０５】
以下の実施例は、代表的な人工的抗体の構築および適当なベクターならびに適当な宿主細胞中でのその発現をはじめとする本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。すべてのアミノ酸は慣用的な３文字コードまたは１文字コードにより表される。特にことわらない限り、すべての必要な制限酵素、プラスミド、および他の試薬ならびに材料を市販ソースから得た。すべての一般的なクローニングのライゲーションおよび他の組み換えＤＮＡ法を、上で引用した、ティー・マニアティス（T.Maniatis）らの文献またはサムブルックら編の同じ出版社によるその第２版（１９８９年）（「サムブルックら」）と同様に行った。
【実施例１】
【０１０６】
実施例１−ＭＡｂ  ３Ｂ９の製造
Ａ.  免疫方法
４匹のマウス（Ｂａｌｂ／ｃとＣ５７ＢＬ／６のＦ１雑種）を、フロイント（Freund）の完全アジュバント中の５０μｇの組み換え型イー・コリヒトＩＬ４で皮下免疫し、４週間後にフロイントの不完全アジュバント中の５０μｇのＩＬ４で腹腔内追加免疫した。ＩＬ４に対する良好な血清抗体力価に基づいて、１匹のマウスには、８週目に２００μｇのＩＬ４（セイライン中腹腔内免疫）を、その２日後１００μｇのＩＬ４（セイライン中腹腔内免疫）を、さらにその２日後に５０μｇのＩＬ４（セイライン中腹腔内免疫）をさらに免疫した。最後の免疫から２日後に、脾臓切除を行った。
【０１０７】
Ｂ.  融合方法およびスクリーニング系
マウスの脾臓細胞を用いてハイブリドーマを調製し（標準的方法、例えばコーラー（Kohler）ら,ネイチャー（Nature）,第２５６巻：４９５頁（１９７５年）による）、ＩＬ４結合に関して市販ＢＩＡｃｏｒｅシステムおよび下記ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、２５０個より多い細胞をＩＬ４に対する抗体の分泌に関してスクリーニングした。５個のウェルが陽性の応答を示した。マウスからの１クローンのみ、すなわち３Ｂ９が強く陽性であった。３Ｂ９由来のすべての２次クローンは陽性であった。
【実施例２】
【０１０８】
実施例２−ＥＬＩＳＡアッセイおよびアフィニティー定数
Ａ. ＥＬＩＳＡ
以下のごとく行われるスクリーニングアッセイを設計して無処理のヒト・ＩＬ４に対するアフィニティーを測定した。実験１に関して、アルデヒド活性化９６−ウェルプレートを、ｐＨ８.５の０.１Ｍホウ酸緩衝液１００μｌ／ウェル中１μｇ／ｍＬのＩＬ４で被覆し、室温で一晩インキュベーションした。ヒト・ＩＬ４はプレートに共有結合した。ＩＬ４溶液を吸引し、非特異的結合（ＮＳＢ）部位をＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.０２％  ＮａＮ３,ｐＨ７.４）中のウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）で、３７℃において６０分間ブロックした。この工程および以下の各工程に従って、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.０５％  ツイン２０、０.０２％  ＮａＮ３,ｐＨ７.４）で４回洗浄した。この後、５０μｌのハイブリドーマ培地（または精製３Ｂ９もしくはＦａｂフラグメント）および５０μｌのアッセイ緩衝液（ＴＢＳ緩衝液中０.５％ウシ・ガンマグロブリン）を添加し、プレートを３７℃で６０分間インキュベーションした。ウェルあたり１００μｌのアッセイ緩衝液中のビオチン化抗マウス抗体を添加し、上記のごとくインキュベーションした。ウェルあたり１００μｌのアルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジンを添加し、インキュベーション（３７℃で３０分間）した。１００μｌ／ウェルのＰＮＰ基質を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。４０５ｎｍの光学密度を読み取った。
【０１０９】
実験２に関しては、ストレプトアビジン被覆プレート（１００μｌ／ウェル,リン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩インキュベーションし、以下のようにアッセイした。ストレプトアビジン溶液を吸引し、ＮＳＢ部位をＴＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡでブロックした（３７℃で６０分）。この工程の後、以下の各工程を行った。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。５０μｌのビオチン化ＩＬ４を５０μｌのアッセイ緩衝液とともに添加し、３７℃で３０分インキュベーションした。次いで、５０μｌの精製３Ｂ９  ＩｇＧまたはＦａｂフラグメント（もしくはハイブリドーマ培地）および５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、３７℃で６０分インキュベーションした。１００μｌの抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ抱合物を添加し、３７℃で６０分インキュベーションした。１００μｌのＰＮＰ基質を添加し、３７℃で３０分インキュベーションした。上記のごとく光学密度を読んだ。
【０１１０】
Ｂ. ＩＬ４に対する３Ｂ９のアフィニティーの計算
上記実験の結果を用いて、ベティ（Beatty）ら,ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Methods）,第１００巻：１７３〜１７９頁
（１９８７年）に記載のごとく３Ｂ９に対するＫｄを計算して以下のようにまとめた。
【数１】
2006333870.tif 000002
Ａｂ*＝１５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト・ＩＬ４の場合に結合したＡｂ濃度
Ａｂ＝３００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒト・ＩＬ４の場合に結合したＡｂ濃度
解離定数Ｋｄを以下の関係式から計算した。
【数２】
2006333870.tif 000003
実験１：ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（１００ｎｇ／ウェル）上でのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｋｄ＝２.２Ｘ１０−１０Ｍ（３Ｂ９  Ｆａｂ）
実験２：ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（１００ｎｇ／ウェル）上でのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｋｄ＝１.４Ｘ１０−１０Ｍ（３Ｂ９  ＩｇＧ）
【０１１１】
Ｃ. 特異性
ＭＡｂ  ３Ｂ９はヒト・ＩＬ４を認識するが、ウシ・またはネズミのＩＬ４を認識しない。これを調べる１の方法は以下のごとし。抗マウスＩｇＧで被覆した９６ウェルプレートを用い、次いで、ウシ・血清アルブミンでブロックし、これに５０μｌの３Ｂ９（１００ｎｇ／ｍｌ）、２５μｌの非ヒト・ＩＬ４および２５μｌのビオチン−ＩＬ４を添加し、３７℃で６０分インキュベーションし、次いで、洗浄し、ストレプトアビジン抱合アルカリ性ホスファターゼおよびＰＮＰを添加した。
同様に、ＭＡｂ  ６Ａ１はウシまたはネズミのＩＬ４を認識しないことが見出された。
【実施例３】
【０１１２】
実施例３−ヒト化抗体
ヒト・抗体枠組み構造内にネズミのＣＤＲｓを含むように１のヒト化抗体を設計した。以下の操作を行うことにより、このＩＬ４特異的マウス・抗体３Ｂ９のヒト化バージョンを調製した。
【０１１３】
Ａ. ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社のキットを用いて、３Ｂ９ハイブリドーマ細胞系［実施例１］から抽出したｍＲＮＡ由来の３Ｂ９重鎖および軽鎖からｃＤＮＡクローンを作成した。マウス・ヒンジ領域またはカッパ不変領域にいずれかに特異的なプライマーを第１鎖の合成に使用した。
カッパ鎖プライマーは［配列番号：２９］：
5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'
である。
ガンマ重鎖プライマーは［配列番号：３０］
5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3'
である。
２本鎖ｃＤＮＡをプラスミドｐＧＥＭ７ｆ＋中に直接組み込み、次いで、イー・コリＤＨ５−α［ベセスダ・リサーチ・ラブズ（Bethesda Research Labs.）］中に形質転換した。
【０１１４】
Ｂ. ＤＮＡ配列決定
上記Ａからの８つの重鎖および１つの軽鎖に関するネズミｃＤＮＡクローンの配列決定を行った。これらのクローンの可変領域の配列決定の結果を配列番号：１、２、３および４に示す。各クローンは、マウス・重鎖可変領域または軽鎖可変領域、およびネズミ・シグナル配列の間で保存的であることが知られているアミノ酸を含んでいた。ＣＤＲアミノ酸配列を以下に示す。
【０１１５】
重鎖に関するＣＤＲ領域は、配列番号：２２、２４および２６（配列番号：４のアミノ酸５０〜５６、７１〜８６および１１９〜１２９）である。図２参照。これらの配列は、配列番号：２１、配列番号：１３および配列番号：２５によりそれぞれコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は、配列番号：１６、１８および２０（配列番号：２のアミノ酸４５〜５８、７４〜８０および１１３〜１２１）である。図１参照。これらの配列は、配列番号：１５、１７および１９によりそれぞれコードされている。
【０１１６】
Ｃ. ヒト・枠組み構造の選択
３Ｂ９のクローニングの後、ＫＡＢＡＴＲおよびＳＷＩＳＳデータベースを用いて可変領域のアミノ酸配列（配列番号：２のアミノ酸２１〜１３２および配列番号：４のアミノ酸２０〜１４０）を、ヒト・免疫グロブリン配列のデータベースと比較し、配列の相同性においてネズミの親配列と最もよくマッチすると考えられる重鎖および軽鎖双方に関するヒト・枠組み構造を同定した。これらの配列相同性に関する探求以外にも、Ｆａｂドメインの構造モデルから得られる位置のデータベースに対して重鎖および軽鎖を評価して、ＣＤＲ型に影響する可能性のあるアミノ酸置換が原因の存在しうる矛盾を評価した。本ケースに関しては、構造の探求においては明らかな矛盾は検出されなかった。それゆえ、アミノ酸配列の相同性の探求から推定されるＤＮＡコーディングを使用した。
【０１１７】
ヒト・骨髄腫免疫グロブリン（ＣＯＲ）から得られた抗体の重鎖枠組み構造領域を使用した［イー・エム・プレス（E.M.Press）およびエヌ・エム・ホッグ（N.M.Hogg）,バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.J.）,第１１７巻：６４１〜６６０頁（１９７０年）］。この配列は、アミノ酸レベルにおいて、３Ｂ９可変鎖領域に対して約７７％の相同性（６９.４％が同一）があることが示わかった。
【０１１８】
適当な軽鎖可変枠組み構造領域に関しては、エイチ・ジー・クロベック（H.G.Klobeck）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）,第１３巻：６５１５〜６５２９頁（１９８５年）において同定されているヒト・抗体の軽鎖可変枠組み構造配列を用いた。そのヒト・抗体の配列は、アミノ酸レベルにおいて、３Ｂ９可変軽鎖領域に対して約８０.２％の相同性（７２.０％が同一）があることがわかった。
【０１１９】
ネズミ・３Ｂ９のＣＤＲｓ［配列番号：１５〜２６］およびヒト・抗体の配列が与えられたので、合成重鎖を作成し、ＰＣＲを行ってフィル・インし、ＤＮＡを増幅した。以下の重複オリゴヌクレオチドによりこれらの配列を合成し、ＰＣＲにより増幅した。配列番号：３１〜３７は５個の重複オリゴヌクレオチドおよび２個のＰＣＲプライマーを提供する。オリゴ１［配列番号：３１］は塩基５〜１２１にまたがることがわかる。オリゴ２［配列番号：３２］は塩基１２２〜２４１にまたがることがわかり、オリゴ３［配列番号：３３］は塩基２４２〜３６１にまたがることがわかる。２個のボトム鎖プライマー（配列番号：３４および配列番号：３５）は塩基１３４〜１１０および塩基２５３〜２３０にまたがる。ＰＣＲにより挿入されたマッピングされた配列におけるエラーをすべて修正した。５'プライマーヌクレオチド１〜２５（配列番号：３６）および３'プライマーヌクレオチド３６１〜３４１（配列番号：３７）を用いて再度ＰＣＲを行った。
【０１２０】
合成可変領域を、ＩｇＧ１ヒト・不変領域を伴ったキメラな重鎖構築物由来の合成シグナル配列（配列番号：５および６）とともに、発現ベクターｐＣＤ中に連結した。合成ＶＨおよびシグナル配列ならびにアミノ酸配列を図４に示す［配列番号：１１および１２］。ＣＤＲｓのアミノ酸配列［配列番号：２２、２４および２６］はネズミ・３Ｂ９のＣＤＲｓと同一である。しかしながら、これらのＣＤＲｓに対するコーディング配列［配列番号：５４、５５および５６］はネズミ・３Ｂ９のコーディング配列［配列番号：２１、２３および２５］とは異なる。得られた発現ベクターＩＬ４ｈｚｈｃ１−１−Ｐｃｄを図９に示す。
【０１２１】
もともと存在する軽鎖枠組み構造のＣＤＲ遺伝子領域を制限消化して除去し、以下の合成されたＩＬ４ＣＤＲ遺伝子により置換した。
【０１２２】
ＣＤＲ１に関しては：
配列番号：３８：
5'CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG3'
配列番号：３９：
CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAG
配列番号：４０：
TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCC
配列番号：４１
GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCAACACTTTGGGAGGCCTC
【０１２３】
ＣＤＲ２に関しては：
配列番号：４４
GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGGTAC
配列番号：４５
CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCTGCCC
【０１２４】
ＣＤＲ３に関しては：
配列番号：４２
ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGAGGGAC
配列番号：４３
CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACAGTAGT
【０１２５】
合成ＶＬおよびシグナル配列のヌクレオチドならびにアミノ酸配列を図５に示す［配列番号：１３および１４］。はじめの２個のＣＤＲのアミノ酸配列［配列番号：１６および１８］はネズミの３Ｂ９  ＣＤＲｓと同一である。しかしながら、はじめのＣＤＲ［配列番号：５３］に対するコーディング配列はネズミ・３Ｂ９のコーディング配列［配列番号：１５とは異なる。さらに、最後のＣＤＲにおいて、３Ｂ９アミノ酸配列の２個のヒト化構築物を構築した。１つは配列番号：２８であり、無処理のネズミ・３Ｂ９配列［配列番号：２０］とはただ１つのアミノ酸が異なる。配列番号：２８は配列番号：２７によりコードされている。合成可変軽鎖領域を、シグナル配列［配列番号：７および８］とともに発現ベクター中に連結した。得られた発現ベクターの１つであるＩＬ４ｈｚｌｃ１−０−Ｐｃｎを図１０に示す。
これらの合成可変軽鎖および／または重鎖配列をヒト化抗体の構築に用いた。
【実施例４】
【０１２６】
実施例４−ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞におけるヒト化ＭＡｂの発現
ＶＨに関してはｐＵＣ１８サブクローンを作成してヒト・抗体からもともと得られたシグナル配列（配列番号：５）を付加した。ＶＬに関してはｐＵＣ１８サブクローンを作成してシグナク配列（配列番号：７）を付加した。
【０１２７】
ＩｇＧ１イソタイプ由来のヒト化重鎖は、アミノ酸レベルにおいて、３Ｂ９由来のネズミ・重鎖と８９.３％の相同性（８４.３％が同一）を示す。この合成ＶＨは、配列番号：１１および１２のアミノ酸２０〜１４１において提供される。  ヒト化軽鎖であるヒト・カッパ鎖は、アミノ酸レベルにおいて、３Ｂ９と９２.０％の相同性（８６.６％が同一）を示す。３Ｂ９のＤＲｓを含んでいるこの合成ＶＬ［配列番号：１３および１４のアミノ酸２１〜１３１］を設計し、合成重鎖について上で説明したように合成した。
【０１２８】
慣用的方法［マニアティスら,上で引用］により、ヒト化重鎖または軽鎖いずれかの可変領域に結合したそれぞれのシグナルを含むＤＮＡフラグメントを、下記実施例５で製造される、キメラなＣＭＶプロモーターおよびヒト・重鎖またはヒト・軽鎖不変領域を含むｐＵＣ１９をベースにした哺乳動物細胞発現プラスミド中に挿入して、プラスミドＩＬ４ｈｚｈｃ１−１Ｐｃｄ（重鎖）［図９］およびＩＬ４ｈｚｌｃ１−０−Ｐｃｎ（軽鎖）［図１０］を得た。ＨＺＨＣおよびＨＺＬＣプラスミドをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションし、３日および５日後にヒト化抗体の存在についてすぐ上で説明したＥＬＩＳＡにより上清をアッセイした。別のヒト化抗体を構築したがＩｇＧ４イソタイプを用いなかった。
【０１２９】
上記実施例は、代表的な人工抗体の調製を説明するものである。慣用的手段により得られた他の抗ＩＬ４抗体（例えば、６Ａ１−実施例７）を用いて、同様の方法により他の人工抗体を得た。
【実施例５】
【０１３０】
実施例５−キメラ抗体の構築
Ａ. 元のマウス・Ｍａｂ  ３Ｂ９からネズミ・可変重鎖領域をＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥII制限フラグメントとして単離することによりキメラな重鎖を構築した。小型のＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、合成してネズミ・可変領域とヒト・ＩｇＧ１不変領域を結合した（ＢｓｔＥII−ＡｐａＩ）：
５’プライマー：配列番号：５０：
GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC
３’プライマー：配列番号：５１：
CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG
【０１３１】
これら２個のフラグメントを、すでにヒト・ＩｇＧ１不変領域をコードしているプラスミドｐＣＤ（図７参照）（ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで消化）中に連結した。このクローンは発現しなかった。それゆえ、野生型５'ＵＴＲおよびシグナル配列を欠失させ、配列番号：５および６で置き換えた。
【０１３２】
都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位がシグナル配列の３'末端において使用できなかったので、ＰＣＲによりＢｓｔＥII部位を導入した（すなわち沈黙の変異）。以下のＰＣＲプライマーを用いた：
配列番号：４８：５'プライマー：
5'CAGGTTACCCTGAAAGAGTC3'
配列番号：４９：３'プライマー：
5'GAAGTAGTCCTTGACCAG3'
【０１３３】
次いで、ＢｓｔＥII−ＰｓｔＩ制限フラグメントをこのプラスミドから単離した。次いで、新たなシグナル配列および５'ＵＴＲを消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥII末端を有するように合成した。
配列番号：４６：５'プライマー：
AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG
配列番号：４７：３'プライマー：
GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAGAGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG
【０１３４】
ｐＧＥＭ７２ｆ（＋）［プロメガ（Promega）社製］中に組み込まれた元のネズミ・３Ｂ９軽鎖にＰＣＲ法を適用することにより、キメラな軽鎖を構築した。使用プライマーは、５'末端（ＥｃｏＲＩ）においては市販されているｐＵＣ１８ユニバーサルリバースプライマー、およびマウス・可変領域をヒト・不変領域に融合させるために用いられるＮａｒＩ部位を導入する３'プライマー
5'CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3'
［配列番号：５２］
であった。次いで、この可変領域を、すでにヒト・カッパ領域を含んでいる発現ベクターｐＣＤＮ（ＥｃｏＲＩ  ＮａｒＩ）（図８）中に連結した。
【０１３５】
３日後および５日後に培養上清を集め、以下に説明するＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＥＬＩＳＡプレートを、ヒト・抗体のＦｃフラグメントに特異的な０.１μｇのヤギ・抗体で被覆した。培養上清を添加して１時間おいた。ヒト・ＩｇＧ抗体全体に特異的なセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ・抗体を添加した。次いで、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（メリーランド州ゲイサースバーグ（Gaithersburg）のキルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.）社製）を添加して１時間おいた。キメラ抗体の発現を検出した。２回目のＥＬＩＳＡにおいて、キメラ抗体を含有するＣＯＳ細胞上清が特異的に組み換え型ヒト・ＩＬ４蛋白に結合した。この結果により、ＩＬ４に特異的な抗体をコードしている遺伝子がクローン化されたことが確認された。
【０１３６】
Ｂ. このキメラ重鎖からヒト化重鎖を得ることもできる。ヒト・枠組み構造中にネズミ・ＣＤＲｓを挿入することによりヒト化重鎖を設計した。選択されたヒト・枠組み構造は上記のようなものであり、ネズミ・３Ｂ９のＶＨに基づくＳｗｉｓｓ蛋白データ中の最も相同的な蛋白配列である（配列番号：４のアミノ酸２０〜１４０）。このヒト化重鎖配列（ＥｃｏＲＩ  ＡｐａＩ）を合成し、ＰＣＲを行って上記のごとくフィル・インし、ＤＮＡを増幅した。この合成可変領域を、キメラな重鎖構築物由来の合成シグナル配列（配列番号：５および６）ならびにＩｇＧ１ヒト・不変領域と一緒に発現ベクターｐＣＤ（ＥｃｏＲＩ  ＡｐａＩ）中に連結した。
【０１３７】
同様に、ヒト化軽鎖を重鎖について説明したようにしてキメラな軽鎖から誘導することができる。この遺伝子（ＥｃｏＲＶ  ＮａｒＩ）も合成した。ヒト化ＶＬを、シグナル配列（ＥｃｏＲＩ  ＥｃｏＲＶ）とともに、ＥｃｏＲＩ  ＥｃｏＲＶで消化された発現ベクターｐＣＮ中に連結した。該発現ベクターはヒト・カッパ不変領域を提供した。
【実施例６】
【０１３８】
実施例６−精製および熱力学−ヒト化ＭＡｂ
ＣＨＯにより発現されたキメラかつヒト化された３Ｂ９の精製を、慣用的な蛋白Ａ（またはＧ）アフィニティークロマトグラフィー、次いで、イオン交換および分子ふるいクロマトグラフィーにより行うことができる。他のＭＡｂｓ（例えば、呼吸器合胞体ウイルスおよびマラリア・サーカムスポロゾイト抗原）の９５％より高い純度での精製に同様のプロセスがうまく用いられている。
【０１３９】
ヒト化ＭＡｂ３Ｂ９およびネズミ・３Ｂ９（実施例１）に対するＩＬ４の結合のアフィニテイーおよび詳細な熱力学を、滴定微小熱量測定（titration microcalorimetry）により調べた。この方法は、固有の反応熱によって結合反応を測定するものである（例えば、ワイスマン（Wiseman）ら,アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）,第１７９巻：１３１〜１３７頁（１９８９年）参照）。両方のＭＡｂｓのアフィニティーは強固すぎて室温では直接測定できないことがわかった。よって、以下の熱力学的アプローチを採用した：i）アフィニティーが十分弱く直接測定可能である６０℃においてアフィニティーを測定した；およびii）結合エンタルピーの温度依存性を３０〜６０℃で測定した。これらのデータを合わせて、ギッブス−ヘルムホルツの等式を用いて広範囲の温度におけるアフィニティーの計算が可能となる。
【０１４０】
ヒト化およびネズミの３Ｂ９抗体のＩＬ４結合の熱力学のまとめを表１に示す。自由エネルギー、エンタルピーおよび２つのＭＡｂｓの熱容量の変化に基づくと、結合の熱力学は区別できないものである。
【表１】
2006333870.tif 000004
【実施例７】
【０１４１】
実施例７−ラット・ＭＡｂの製造および特徴付け
高アフィニティー結合に関して選択されたＭＡｂ  ６Ａ１は、実施例１においてマウスに関して説明したのと同じ免疫プロトコールを用いて免疫されたラットから誘導されたものであった。６Ａ１は、ヒト・ＩＬ４で免疫されたラットから調製したハイブリドーマ（特別には、ハイブリドーマ３４２６Ａ１１Ｃ１Ｂ９）から選択された。
【０１４２】
ベティ（Beatty）ら,ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（J.Immunol.Methods）,第１００巻：１７３〜１７９頁（１９８７年）記載のように６Ａ１のＫｄを計算すると２ｘ１０−１０Ｍであった。
【０１４３】
ハイブリドーマ３４２６Ａ１１Ｃ１Ｂ９は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、１９９３年１０月６日に、英国、ＳＰ４０ＪＧ、ウィルトシャー、サリスベリー、ポートン・ダウン（Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,United Kingdom）のヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、パブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービス・センター・フォー・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・リサーチ（European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC),Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology & Research）に、受託番号９３１００６２０の下、寄託された。
【実施例８】
【０１４４】
実施例８−ＭＡｂｓの生物学的活性：  ３Ｂ９（ヒト化）、３Ｂ９（ネズミ）および６Ａ１
下記方法を用いて以下のアッセイを行った。
【０１４５】
Ａ. 糖鎖付加された組み換え型ヒト・ＩＬ４に対する結合
上で同定した抗体を、イー・コリにおいて生産された非糖鎖付加組み換え型ヒト・ＩＬ４（ｒｈＩＬ４）に対して生起させた。無処理のヒト・ＩＬ４が糖鎖付加されているため、哺乳動物細胞系により分泌された物質に対する結合を確認することが重要であった。３Ｂ９は、糖鎖付加および非糖鎖付加ヒト・組み換え型ＩＬ４の両方に対して等しく十分に結合し、それゆえ、３Ｂ９は、天然のヒト・ＩＬ４上でマスクされていると考えられるエピトープには指向されない。
【０１４６】
Ｂ. 受容体へのＩＬ４結合に対する阻害
細胞１個あたり約６０００個の受容体を有するテナガザル細胞系ＭＬＡ［ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２０１］に結合する１２５Ｉ−ｒｈＩＬ４を用いてＩＬ４のその受容体への結合を阻害する３Ｂ９の能力を研究した。ＭＬＡ細胞を１２５Ｉ−ＩＬ４とともに３７℃で３０分インキュベーションした。油グラジエントによる遠心分離により細胞に結合した１２５Ｉ−ＩＬ４を分離した後放射活性の取り込みをガンマカウンターで調べた。１００倍モル過剰の非標識ＩＬ４の存在下においてインキュベーションすることにより非特異的結合を調べた［パーク（Park）ら,ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,第１６６巻：４７６〜４８８頁（１９８７年）］。ＩＬ４（添加）量が８３ｐＭである場合、このアッセイにおける非標識ＩＬ４に対するＩＣ５０値は２２ｐＭであった。インタクトなネズミ・（ＩｇＧ）３Ｂ９に対するＩＣ５０は６３ｐＭであり、Ｆａｂフラグメントに対しては９３ｐＭであった。別の濃度（２１８ｐＭ）におけるネズミ（ＩｇＧ）３Ｂ９のアッセイ量は１０９ｐＭであった。
【０１４７】
Ｃ. リンパ球増殖に対する阻害
スピッツ（Spits）ら,ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immunol.）,第１３９巻：１１４２〜１１４７頁（１９８７年）記載の方法を用いて、ヒト・末梢血リンパ球を、フィトヘマグルチニン、Ｔ細胞マイトジェンとともに３日間インキュベーションしてＩＬ４受容体をアップレギュレーションした。次いで、得られた幼若細胞をＩＬ４でさらに３日間刺激した。３Ｈチミジンの取り込みにより増殖を測定した。以下のように変更されたカラード（Callard）ら,リンホカインズ・アンド・インフェクションズ.ア・プラクティカル・アプローチ（Lymphokines and Infections. A Practical Approach）,第１９章,３４５頁のアッセイによりＢ細胞の増殖を測定した。精製されたヒト・扁桃Ｂ細胞をＩＬ４および固定化抗ＩｇＭで３日間刺激した。３Ｈチミジンの取り込みにより増殖を測定した。
【０１４８】
３Ｂ９（ネズミ）は、１３３ｐＭのＩＬ４で刺激されたヒト・末梢血Ｔリンパ球および１６７ｐＭのＩＬ４により刺激されたヒト・扁桃Ｂリンパ球による３Ｈチミジンの取り込みを阻害した。ＩＬ２により刺激されたＴリンパ球は影響を受けなかった。Ｔ細胞の増殖に対する阻害についてのＩＣ５０は３０ｐＭであり、Ｂ細胞の増殖に関しては１０３ｐＭであった。３Ｂ９（ネズミ）のＦａｂフラグメントに関する対応値は１０８および３９３ｐＭであった。
【０１４９】
Ｄ. ＣＤ２３誘導に対する阻害
ＣＤ２３はＩｇＥ（ＦｃＥＲII）に対する低アフィニティー受容体であり、ＩｇＥ産生の不可欠条件として、低濃度ＩＬ４により休止Ｂ細胞の膜上に誘導される。精製ヒト・扁桃Ｂ細胞をＩＬ４で２日間刺激する。ＣＤ２３受容体を発現している細胞のパーセンテージを、流動細胞計測法［デフランス（Defrance）ら,ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）第１６５巻：１４５９〜１４６７頁（１９８７年）］により決定する。３Ｂ９（ネズミ）は、８.３ｐＭのＩＬ４で刺激されたヒト・扁桃Ｂリンパ球上のＣＤ２３発現を阻害し、ＩＣ５０値は１３６ｐＭであった。
【０１５０】
Ｅ. ＩｇＥ分泌に対する阻害
ＩＬ４がＥＣ５０濃度で添加される他のアッセイ［ペア（Pere）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.）,第８５巻：６８８０〜６８８４頁（１９８８年）］とは異なり、この系における固有のばらつきを減少させるために、最大の分泌を与える濃度のＩＬ４の存在下でＩｇＥ分泌を調べた。Ｔ細胞の増殖を以下のように測定した。ヒト・末梢血リンパ球をＩＬ４とともに１０〜１８日、好ましくは１２日間インキュベーションする。培養上清中のＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡにより決定する。
【０１５１】
１.７ｎＭのＩＬ４の存在下において、ＩｇＥ分泌は３Ｂ９（ネズミ）および３Ｂ９のＦａｂフラグメントにより阻害され、ＩＣ５０値はそれぞれ１.９および５.０ｎＭであった。より低濃度のＩＬ４（６６７ｐＭ）を用いて実験を繰り返すと、ＩＣ５０値は３Ｂ９（ネズミ）に関して０.６５ｎＭに減少した。試験した濃度範囲においては、ＩＬ４に対する抗体（ＩｇＧ）のモル比は不変のまま
（１：１）とした。
【０１５２】
Ｆ. データ解釈のまとめ
バイオアッセイにおいて、機能の５０％を阻害するのに必要とされる種々の
ＭＡｂｓに対するＩＬ４のモル比を表２に示す。
【表２】
2006333870.tif 000005
【０１５３】
ＩｇＥ分泌を除くすべてのアッセイにおいて、ほぼＥＤ５０濃度でＩＬ４を添加した。５０％阻害に要するＩＬ４に対する抗体のモル比は、２種のリンパ球の増殖アッセイにおいてはヒト化３Ｂ９、ネズミ３Ｂ９、および６Ａ１に関して同様であったが、ＣＤ２３誘導アッセイにおいてはヒト化３Ｂ９に関して高かった。後者は、明らかに低い（〜５％）受容体占有率を要求する特に敏感なアッセイであり（クルセ（Kruse）ら,ＥＭＢＯ  Ｊ.,第１２巻：５１２１頁（１９９３年））、ネズミ・３Ｂ９について得られた結果から明らかなようにアッセイ間のばらつきがある。
【０１５４】
ラット・６Ａ１とネズミ・３Ｂ９の活性の比較により同様の機能的効果のプロフィールが示されたが、６Ａ１は放射標識されたＩＬ４のその受容体への結合を十分には阻害しなかったことが示された。受容体結合アッセイに使用した放射標識ＩＬ４は、近接可能なチロシン（残基１２４）においてヨウ素化されていると考えられる。非標識またはヨウ素化ＩＬ４のいずれかにより誘導されたＣＤ２３発現を阻害する６Ａ１の能力を比較した場合、阻害はヨウ素化されたリガンドに対してはあまり有効でないことがわかった。これらの結果は、６Ａ１がチロシン１２４の領域においてＩＬ４に結合するがチロシン１２４には特異的でないことを示す。
【０１５５】
よって、このデータによれば、６Ａ１は、３Ｂ９とは非常に異なるＩＬ４の領域に結合する、高アフィニティーを有する中和抗体である。
【実施例９】
【０１５６】
実施例９−薬物動態学
オスのスプラグ・ダウリー（Sprague Dawley）ラットにおいてヒト化３Ｂ９の薬物動態学を調べた。４匹の動物にヒト化３Ｂ９を静脈内に濃縮塊として
１ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、投与後５週間採血を行った。循環しているヒト・ＩｇＧのみならず組み換え型ヒト・ＩＬ４に対するその結合能をも確認するように設計されたＩＬ−４／抗ヒト・ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ヒト化３Ｂ９の血漿濃度を決定した。
【０１５７】
この研究の結果を表３にまとめる。
【表３】
2006333870.tif 000006
【０１５８】
データは、動物間のばらつきは比較的小さく、ヒト化３Ｂ９の血漿からの消失は２局面からなるように思われた。見かけの血漿クリアランスは低かった（０.５ｍＬ／ｈ／ｋｇ）。半減期は１１日と思われた。よって、ＣＨＯ細胞由来のヒト化３Ｂ９の薬物動態学的特性は、ラットにおける他のヒト化モノクローナル抗体と矛盾しない。ラットにおけるヒト化３Ｂ９の長い循環半減期は、ヒトに投与した場合に、ヒト化３Ｂ９は長時間にわたり有効である可能性があることも示唆する。
【０１５９】
本発明の多くの修飾および変法は、上記明細書に包含され、当業者に明らかである。例えば、上記の代表的な抗体以外のヒト・枠組み構造領域またはその修飾物をヒト化抗体の構築に使用してもよい。本発明の組成物および方法に対するかかる修飾および変更は、添付した請求の範囲内に包含されると確信する。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明は、ＩＬ４および過剰のＩｇＥ産生により伝達される症状の治療および診断に有用な蛋白、より詳細には、キメラおよびヒト化ＩＬ４抗体を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１［配列番号：１および２］は、ネズミ・ＩＬ４抗体３Ｂ９およびヒト／ネズミ・３Ｂ９キメラ抗体に関する軽鎖可変領域（アミノ酸２１〜１３２）ならびに無処理のシグナル配列（アミノ酸１〜２０）を示す。下線を付した部分はＣＤＲｓ［配列番号：１５および１６；配列番号：１７および１８；配列番号：１９および２０］を示す。
【図２】図２［配列番号：３および４］は、ネズミ・３Ｂ９に関する重鎖可変領域（アミノ酸２０〜１４０）、ならびに無処理のシグナル配列（アミノ酸１〜１９）を示す。下線を付した部分はＣＤＲｓ［配列番号：２１および２２；配列番号：２３および２４；配列番号：２５および２６］を示す。
【図３】図３［配列番号：９および１０］は、ヒト／ネズミ３Ｂ９キメラ抗体の重鎖可変領域（アミノ酸２１〜１４１）ならびにそのシグナル配列（アミノ酸１〜１９：配列番号：５および６）を示す。下線を付した部分は、３Ｂ９由来のＣＤＲｓ［配列番号：２１および２２；配列番号：２３および２４；配列番号：２５および２６］を示す。
【図４】図４［配列番号：１１および１２］は、ヒト化３Ｂ９抗体の重鎖可変領域（アミノ酸２０〜１４１）ならびにシグナル配列（アミノ酸１〜１９：配列番号：５および６）を示す。下線を付した部分は、３Ｂ９由来のＣＤＲｓ［配列番号：５４および２２；配列番号：５５および２４；配列番号：５６および２６］を示す。
【図５】図５［配列番号：１３および１４］は、ヒト化３Ｂ９抗体の軽鎖可変領域（アミノ酸２１〜１３１）およびシグナル配列（アミノ酸１〜２０：配列番号：７および８）を示す。下線を付した部分は、３Ｂ９由来のＣＤＲｓ［配列番号：５３および１６；配列番号：１７および１８；配列番号：２７および２８］を示す。
【図６】図６Ａ［配列番号：５および６］は、下記実施例４に用いる重鎖シグナル配列である。図６Ｂ［配列番号：７および８］は、下記実施例４に用いる軽鎖シグナル配列である。
【図７】図７は、哺乳動物細胞においてキメラなＩＬ４重鎖を発現するために使用されるプラスミドｐＩＬ４ｃｈｈｃ３−ｐｃｄの図解である。該プラスミドは、ベータラクタマーゼ遺伝子（ＢＥＴＡ  ＬＡＣ）、ＳＶ−４０複製開始点（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス・プロモーター配列（ＣＭＶ）、シグナル配列、配列番号：９および１０のキメラな可変部重鎖、ヒト・重鎖不変領域、ウシ・成長ホルモン由来のポリＡシグナル（ＢＧＨ）、ベータグロブリンのプロモーター（beta glopro）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、およびｐＵＣ１９バックグラウンド中のもう１つのＢＧＨ配列のポリＡシグナルを含む。
【図８】図８は、哺乳動物細胞において配列番号：１および２のキメラなＩＬ４軽鎖可変領域を発現するために使用されるプラスミドｐＩＬ４ｃｈｌｃ−ｐｃｄｎの図解である。該プラスミドは、キメラな重鎖可変領域ではなくキメラな軽鎖可変領域、ヒト・軽鎖不変領域およびＤＨＦＲに加えてネオマイシン遺伝子（Ｎｅｏ）を含むことにより、図７のプラスミドと異なる。
【図９】図９は、哺乳動物細胞において配列番号：１１および１２の合成ＩＬ４重鎖可変領域を発現するために用いられるプラスミドｐＩＬ４ｈｚｈｃ−１−ｐｃｄの図解である。該プラスミドは、キメラな重鎖の可変領域ではなくヒト化重鎖可変領域を含むことにより、図７のプラスミドと異なる。
【図１０】図１０は、哺乳動物細胞において配列番号：１３および１４のヒト化ＩＬ４軽鎖可変領域を発現するために使用されるプラスミドｐＩＬ４ｈｚｌｃ１−０−Ｐｃｎの図解である。該プラスミドは、キメラな軽鎖の可変領域ではなくヒト化軽鎖可変領域を含み、ＤＨＦＲ遺伝子をコードしないことにより、図７のプラスミドとは異なる。
【図１】
2006333870.tif 000016
【図２】
2006333870.tif 000017
【図３】
2006333870.tif 000018
【図４】
2006333870.tif 000019
【図５】
2006333870.tif 000020
【図６】
2006333870.tif 000021
【図７】
2006333870.tif 000022
【図８】
2006333870.tif 000023
【図９】
2006333870.tif 000024
【図１０】
2006333870.tif 000025
【配列表】
2006333870000001.app