(57)【要約】【課題】    ｐ５３の不活性化の分子メカニズムを解明し、そして、そのメカニズムから導き出されたアポトーシスを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。【選択図】  図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、
を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、Ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、
を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス抑制剤。
【請求項６】
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤。
【請求項７】
配列番号１３に示すアミノ酸配列において、７８７〜１６３４番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ｐ５３結合活性を有するタンパク質からなるアポトーシス抑制剤。
【請求項８】
配列番号１３に示すアミノ酸配列において、７８７〜１６３４番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ｐ５３結合活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシスを促進又は抑制する化合物をスクリーニングする方法、アポトーシス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＫＩＡＡ０１７０は１９９６年にＫＧ−１（ヒト未成熟骨髄性細胞株）由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された遺伝子であるが、その機能については不明であった（非特許文献１）。また、ＫＩＡＡ０１７０のＣ末端にリン酸化タンパク質の結合ドメインであるＢＲＣＴドメインが保存されていることから、ＤＮＡ修復に関与することが推測されていたが、未だその機能については明らかにされていない（非特許文献２、３）。本発明者らは２０００年に、ＫＩＡＡ０１７０は様々な哺乳動物細胞の核内に局在し、ＤＮＡ結合活性を有し、抗アポトーシス機能を有する核内転写因子である事を報告した（非特許文献４）。そして、本発明者らはＫＩＡＡ０１７０をＮＦＢＤ１（ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ＢＲＣＴ  ｄｏｍａｉｎ  １）と名づけた。
【０００３】
ＮＦＢＤ１はＮ末端及びＣ末端に、それぞれフォークヘッド・ホモロジー関連ドメイン（ＦＨＡドメイン）及びリン酸化タンパク質結合ドメイン（ＢＲＣＴドメイン）を有している。また、最近、ＮＦＢＤ１はＤＮＡ損傷、特にＤＮＡ二本鎖切断の際に、毛細血管拡張性運動失調原因遺伝子ＡＴＭによりリン酸化され、ＤＮＡ修復複合体であるＭＲＮ  ｃｏｍｐｌｅｘ等をＤＮＡ損傷部にリクルートする事が報告されている（非特許文献５）。また、Ｘｕらは、ＮＦＢＤ１がｐ５３と複合体を形成する事を報告したが（非特許文献６）、その機能的意義については不明であった。
【０００４】
また、ｐ５３の機能異常は発癌だけでなく、神経変性疾患でも重要な役割を果たしていることが報告された（非特許文献７）。
【０００５】
【非特許文献１】Takahiro N. et al., Prediction of the coding sequence of unidentifiedhuman genes. v. the coding sequence of 40 new genes (KIAA0161-KIAA0200) deducedby analysis of cDNA clones from human cell line KG-1. DNA Research 3: 17-24(1996).
【非特許文献２】Peer B. et al., A superfamily of conserved domains in DNAdamage-responsive cell cycle checkpoint proteins. The FASEB Journal 11: 68-76(1997).
【非特許文献３】Isabelle C. et al., From BRCA1 to RAP1: a widespread BRCT module associatedwith DNA repair. FEBS Letters 400: 25-30 (1997).
【非特許文献４】Toshinori O. et al., NFBD1/KIAA0170 is a novel nuclear transcriptionaltransactivator with BRCT domain. DNA and Cell Biology 19: 475-485 (2000).
【非特許文献５】Xingzhi X. et al., NFBD1/KIAA0170 is a chromatin-associated protein involvedin DNA damage signaling pathways. J. Biol. Chem. 278: 8795-8803 (2003).
【非特許文献６】Xingzhi X. et al., NFBD1/MDC1 regulated ionizing radiation-inducedfocus formation by DNA checkpoint signaling and repair factors. The FASEBJournal 17: 1842-1848 (2003).
【非特許文献７】澤明、ｐ５３神経変性疾患ハンチントン病を１つのモデルとして、実験医学  Ｖｏｌ１９．  Ｎｏ．９，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、ＮＦＢＤ１と、ｐ５３によって仲介されるアポトーシスとの間のあり得る関係の機能的な重要性については、いまだに確立されていない。ｐ５３のアポトーシス誘導活性をそのメカニズムを含めて明らかにし、それを増強又は抑制する化合物を見出すことは、癌又は神経変性疾患の治療薬及び予防薬の開発につながる。
【０００７】
従って、本発明は、ｐ５３の不活性化の分子メカニズムを解明することを目的の一つとした。そして、そのメカニズムから導き出されたアポトーシスを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アドリアマイシンによってＤＮＡ損傷を起こした際、ｐ５３はリン酸化されることによって安定化し、その下流遺伝子の発現が誘導されるのに対して、ＮＦＢＤ１はｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでの発現が減少することを見出した。一方、ＮＦＢＤ１を過剰発現させると、ｐ５３のリン酸化が阻害され、その下流遺伝子の発現誘導も阻害されることを見出した。また、ＮＦＢＤ１に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、内在性ＮＦＢＤ１のノックアウトによってアドリアマイシン依存性のアポトーシスが亢進することを見出した。また、ｐ５３とＮＦＢＤ１とは、それぞれｐ５３の転写活性化ドメインを含むアミノ末端、及びＮＦＢＤ１のＢＲＣＴドメインとＦＨＡドメインを介して複合体を形成しており、ＮＦＢＤ１のプロリン・セリン・スレオニンリッチドメイン（ＰＳＴドメイン）は複合体形成に関与していないことを見出した。また、量を変化させたＮＦＢＤ１及び／又はｐ５３を細胞に発現させることによって、ＮＦＢＤ１はｐ５３の転写活性能を抑制することを見出した。さらに、免疫染色によって、アドリアマイシンによるＤＮＡ損傷に伴って、ｐ５３の発現誘導が認められる細胞ではＮＦＢＤ１が消失し、一方、ＮＦＢＤ１が修復の場と考えられるｎｕｃｌｅａｒ  ｆｏｃｉに集積している細胞では、ｐ５３の発現が誘導されることを見出した。以上の知見等から、ＮＦＢＤ１がｐ５３と結合することによって、ｐ５３のリン酸化に伴う安定化を阻害し、ｐ５３が誘導するアポトーシスを阻害するという分子メカニズムを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、従って、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス促進剤や抗癌剤として応用することが可能である。
【００１０】
本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を得ることが可能であり、また、かかる化合物は、アポトーシス促進剤や抗癌剤として応用することが可能である。
【００１１】
本発明は、また、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを阻害する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、従って、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬及び予防薬として応用することが可能である。
【００１２】
本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬及び予防薬として応用することが可能である。
【００１３】
本発明は、また、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス阻害剤及び配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス阻害剤を提供する。配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＮＦＢＤ１タンパク質であり、それをコードする核酸配列は、例えば配列番号１４に示すＮＦＢＤ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列である。上述したように、本発明者らは、ＮＦＢＤ１はｐ５３と直接相互作用することによりｐ５３の安定化を阻害し、ｐ５３が誘導するアポトーシスを阻害するという分子メカニズムを明らかにした。即ち、ｐ５３が仲介するアポトーシスにおいて、ＮＦＢＤ１は、アポトーシス阻害的な役割を演じている。従って、ＮＦＢＤ１タンパク質やそれをコードする核酸は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬及び予防薬として応用することが可能である。
【００１４】
本発明は、また、配列番号１３に示すアミノ酸配列において、７８７〜１６３４番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ｐ５３結合活性を有するタンパク質からなるアポトーシス抑制剤を提供する。配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＮＦＢＤ１タンパク質である。上述したように、本発明者らは、ｐ５３とＮＦＢＤ１とは複合体を形成しており、ＮＦＢＤ１のＰＳＴドメイン（７８７〜１６３４）は複合体形成に関与していないことを明らかにした。即ち、ＮＦＢＤ１タンパク質のＰＳＴドメインにおいて、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたとしても、ｐ５３とＮＦＢＤ１とが複合体を形成することが可能である。従って、ＮＦＢＤ１たんぱく質のＰＳＴドメインにおいて１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬及び予防薬として応用することが可能である。
【００１５】
本発明は、また、配列番号１３に示すアミノ酸配列において、７８７〜１６３４番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ｐ５３結合活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤を提供する。配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＮＦＢＤ１タンパク質であり、それをコードする核酸配列は、例えば配列番号１４に示すＮＦＢＤ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列である。上述したように、本発明者らは、ｐ５３とＮＦＢＤ１とは複合体を形成しており、ＮＦＢＤ１のＰＳＴドメイン（７８７〜１６３４）は複合体形成に関与していないことを明らかにした。即ち、ＮＦＢＤ１タンパク質のＰＳＴドメインにおいて、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたとしても、ｐ５３とＮＦＢＤ１とが複合体を形成することが可能である。従って、ＮＦＢＤ１たんぱく質のＰＳＴドメインにおいて１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする核酸からなるタンパク質は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬及び予防薬として応用することが可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物及び抗アポトーシス性化合物を得ることが可能である。このような化合物を見出すことで、癌又は神経変性疾患の治療・予防に有効な薬を開発することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１８】
（アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法は、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える。本スクリーニング方法はｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物が得られる。
【００１９】
具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要を以下に説明する。
【００２０】
まず、酵母ツーハイブリッド法を説明する。酵母Ｇａｌ４は、Ｎ末端側のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＣ末端側の転写活性化ドメイン（ＡＤ）とからなる転写制御因子である。両ドメインは基本的には自律的に機能し、ＤＢＤは単独でＤＮＡに結合できるが転写の活性化は起こせない。ＡＤはその反対である。この性質を応用して開発されたのが酵母ツーハイブリッド法である。つまり、Ｇａｌ４のＤＢＤに目的のタンパク質Ｐを融合したタンパク質（ベイト）と、Ｇａｌ４のＡＤに別のタンパク質Ｑを融合したタンパク質（プレイ）を酵母細胞に導入した場合、ＰとＱとが核内で相互作用すれば、酵母細胞内で転写制御複合体が再構成され、Ｇａｌ４結合部位依存的に転写が活性化されることになる。この活性をレポーター遺伝子を用いて検出することにより、タンパク質Ｐ及びＱの間の相互作用が容易に評価できる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３などを利用することができる。また、酵母Ｇａｌ４以外にも、ＳＲＦやＬｅｘＡを用いた系も利用することが可能である。
【００２１】
酵母ツーハイブリッド法において、タンパク質Ｐとしてｐ５３を、タンパク質ＱとしてＮＦＢＤ１を用いた系（又はその逆の系でも構わない）によれば、本発明のスクリーニング方法を行うことが可能である。即ち、ベイトとしてｐ５３又はＮＦＢＤ１の一方を、プレイとしてＮＦＢＤ１又はｐ５３の他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養した酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも低下している場合、被検化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。
【００２２】
次に、ＰＣＡ法について説明する。ＰＣＡ法では、一つの機能タンパク質Ａ（酵素、転写因子など）を二つの断片Ａ１及びＡ２に分割し、それぞれを目的タンパク質Ｐ及びＱと融合し、融合タンパク質Ａ１−Ｐ及びＡ２−Ｑを作製する。目的タンパク質Ｐ及びＱが結合すると、機能タンパク質Ａの機能が回復し、その活性を検出することで、Ｐ及びＱの相互作用を判定する、という原理に基づいている。機能タンパク質としては、例えばβ−ラクタマーゼを利用することができる。以下では、β−ラクタマーゼを利用したＰＣＡ法について説明する。
【００２３】
β−ラクタマーゼは細菌由来のβ−ラクタム環切断酵素である。Ｎ末端側のα１９７断片（２５〜１９７残基）とＣ末端側のω１９８断片（１９８〜２８８残基）に分割し、それぞれを目的タンパク質との融合タンパク質として発現すると、その両者が結合する場合にのみβ−ラクタマーゼタンパク質の立体構造が回復し、活性を示す。β−ラクタマーゼ活性は細胞透過性の蛍光プローブＣＣＦ２／ＡＭ（ＣＣＦ２アセトキシメチルエステル）により検出される。ＣＣＦ２／ＡＭは、セファロスポリン分子の両末端に２種類の異なる蛍光物質クマリン及びフルオレセインが結合した構造をしており、前者をドナー、後者をアクセプターとする分子内ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を呈する。即ち、クマリンを４０９ｎｍの光で励起すると、フルオレセイン由来の５２０ｎｍの蛍光を発することになる。しかし、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼ活性による分解を受けると、両者が解離し、ＦＲＥＴは観察されなくなるため、４０９ｎｍの光の励起によってクマリン本来の４４７ｎｍの蛍光を発するようになる。４４７ｎｍの蛍光を測定することにより、β−ラクタマーゼの活性、即ち、目的タンパク質の相互作用の強さを測定することが可能となる。
【００２４】
従って、ＰＣＡ法を利用して本発明のスクリーニング方法を行うには、以下の方法によればよい。機能タンパク質の二つの断片Ａ１又はＡ２にｐ５３又はＮＦＢＤ１を融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも低下している場合、被検化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。
【００２５】
また、本発明のアポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、を備える。本スクリーニング方法はｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物が得られる。
【００２６】
具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法を以下に説明する。
【００２７】
まず、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を調製する。ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞としては、両者を発現している細胞、どちらか一方を発現している細胞に他方をトランスフェクションさせて両者を発現させた細胞、又は、いずれも発現していない細胞に両者をコトランスフェクションさせた細胞のいずれを用いてもよい。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。培養時間は、ｐ５３とＮＦＢＤ１とが相互作用する時間であればよく、用いる細胞の種類によって異なるが、例えば、ｐ５３及びＮＦＢＤ１をコトランスフェクトした場合、１２〜４８時間程度である。
【００２８】
次に、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用を測定する。相互作用の測定には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。調製した細胞可溶化物にｐ５３及びＮＦＢＤ１のいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。そして、得られた沈殿物（ｐ５３及びＮＦＢＤ１の複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、ｐ５３及びＮＦＢＤ１の複合体を検出、定量することにより、ｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用を測定できる。
【００２９】
測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用よりも弱い場合（タンパク質複合体の形成量が少ない場合）に、当該化合物を陽性と判定する。即ち、当該化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。
【００３０】
（アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法は、ｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程を備える。本スクリーニング方法はｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物が得られる。
【００３１】
具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要は先に説明した通りである。
【００３２】
酵母ツーハイブリッド法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。ベイトとしてｐ５３又はＮＦＢＤ１の一方を、プレイとしてＮＦＢＤ１又はｐ５３の他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養したそれぞれの酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。
【００３３】
ＰＣＡ法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。機能タンパク質の二つの断片Ａ１又はＡ２にｐ５３又はＮＦＢＤ１を融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養したそれぞれの細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。
【００３４】
本発明のアポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３及びＮＦＢＤ１を発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３及びＮＦＢＤ１との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、を備える。本スクリーニング方法はｐ５３とＮＦＢＤ１とが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物が得られる。
【００３５】
具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法は、化合物を判定する工程を除いて先に説明したのと同様である。即ち、ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用よりも強い場合（タンパク質複合体の形成量が多い場合）に、当該化合物を陽性と判定する。即ち、当該化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。
【００３６】
（アポトーシス抑制剤）
本発明のアポトーシス抑制剤は、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる。配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はＮＦＢＤ１タンパク質を表す。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、ＮＦＢＤ１はｐ５３と直接相互作用することによりｐ５３の安定を阻害し、ｐ５３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。従って、本アポトーシス抑制剤を細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に本アポトーシス促進剤を接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。即ち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ５３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。
【００３７】
本発明のアポトーシス抑制剤及び配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる。本発明者らは、ＮＦＢＤ１はｐ５３と直接相互作用することによりｐ５３の安定を阻害し、ｐ５３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。従って、本アポトーシス抑制剤を適切なベクターに組み込み、当該ベクターを細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は癌組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に前記ベクターを接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。即ち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ５３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。
【００３８】
本発明のアポトーシス抑制剤及び配列番号１３に示すアミノ酸配列において、７８７〜１６４３番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ｐ５３結合活性を有するたんぱく質からなる。本発明者らは、ＮＦＢＤ１はｐ５３と直接相互作用し複合体を形成することによりｐ５３の安定を阻害し、ｐ５３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。また、ＮＦＢＤ１のＰＳＴドメイン（７８７〜１６４３）は複合体形成に関与していないことを明らかにした。従って、本アポトーシス抑制剤を細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に本アポトーシス促進剤を接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。即ち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ５３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（細胞培養及びトランスフェクション）
アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ７細胞及びヒト子宮頸癌由来Ｈｅｌａ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；インビトロジェン）及びペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９及びＨ１２９９細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び抗生剤混合物（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。培養物は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下、３７℃で維持した。
【００４１】
ＦｕＧＥＮＥ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いて、製造業者の説明書に従い、直径６センチの組織培養皿において、所定の組合せの発現プラスミドをＣＯＳ７細胞及びＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。Ａ５４９細胞及びＨ１２９９細胞は、リポフェクション法を用い、製造業者の説明書に従い、６ウェル又は１２ウェルの組織培養皿において、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）でトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）をブランクプラスミドとして用い、一過的なトランスフェクションで導入されるＤＮＡ量のバランスをとった。
（ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ）
【００４２】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、製造業者のプロトコールに従って、アドリアマイシン（ＡＤＲ；最終濃度：６００ｎＭ）に曝したＡ５４９細胞又は所定の発現プラスミドでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞から全ＲＮＡを抽出した。逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン）及びランダムプライマーを用いて、ファースストランドｃＤＮＡを調製した。４２℃で１時間インキュベーションすることで行った。
【００４３】
用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のとおりである。
ｐ２１ＷＡＦ１：
（フォワード、配列番号１）  5’-ATGAAATTCACCCCCTTTCC-3’
（リバース、配列番号２）  5’-CCCTAGGCTGTGCTCACTTC-3’
ｐ５３：
（フォワード、配列番号３）  5’-GTCCAGATGAAGCTCCCAGA-3’
（リバース、配列番号４）  5’-CAAGGCCTCATTCAGCTCTC-3’
ＮＦＢＤ１：
（フォワード、配列番号５）  5’-AGCAACCCCAGTTGTCATTC-3’
（リバース、配列番号６）  5’-AGCGCTGCTGAGACTTCTTC-3’
ＢＡＸ：
（フォワード、配列番号７）  5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3’
（リバース、配列番号８）  5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’
ＰＵＭＡ：
（フォワード、配列番号９）  5’-CTGTGAATCCTGTGCTCTGC-3’
（リバース、配列番号１０）  5’-TCCTCCCTCTTCCGAGATTT-3’
【００４４】
（ＮＦＢＤ１及びｐ５３とＮＦＢＤ１の部分欠失ミュータントの発現プラスミドの構築）
ＮＦＢＤ１及びＧＦＰ−ＮＦＢＤ１の哺乳類発現プラスミドの作成はＯｚａｋｉら，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９：  ４７５−４８５の記載に従って行った。ｐｃＤＮＡ３−ｐ５３、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｐ５３、及びｐ５３（１−３５９）、ｐ５３（１−２９２）、ｐ５３（１−１０１）とｐ５３（１０２−３９３）を含むｐ５３の部分欠失ミュータントの作製はＡｎｄｏら，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９：  ５５４９−２５５６１の記述に従って行った。ＦＨＡ（２−１４０）及びＢＲＣＴ（１８８３−２０８８）はＰＣＲで増幅し、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を用い、製造業者の説明書に従って、それぞれｐｃＤＮＡ３―ＦＬＡＧの制限酵素サイトＥｃｏｒ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの間に導入し、ｐｃＤＮＡ３―ＦＬＡＧ―ＦＨＡ（２−１４０）及びｐｃＤＮＡ３―ＦＬＡＧ―ＢＲＣＴ（１８８３−２０８８）を得た。ＰＳＴ（７９１−１６９５）はＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３―ＦＬＡＧの制限酵素サイトＥｃｏｒ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉの間に導入し、ｐｃＤＮＡ３―ＦＬＡＧ―ＰＳＴ（７９１−１６９５）を得た。
【００４５】
（ＮＦＢＤ１に対する低分子干渉ＲＮＡの発現プラスミドの構築）
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ベクターはＡ．Ｋ．Ｍｕｎｉｒａｊａｎ博士（千葉がんセンター研究所）より分譲された。ＮＦＢＤ１に対するｓｉＲＮＡ二本鎖を得るために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＮＦＢＤ１：
（配列番号１１）5’-CCCCAGCUCGAGCCUUCCACUUCUUCAAGAGAGAAGUGGAAGGCUCGAGCUUUUUUGGAAAC-3’
（配列番号１２）5’-UCGAGUUUCCAAAAAAGCUCGAGCCUUCCACUUCUCUCUUGAAGAAGUGGAAGGCUCGAGCUGGGGAGCU-3’
【００４６】
合成されたオリゴヌクレオチドはそれぞれ制限酵素ＭｌｕＩ及びＳｃａＩによって切断し、ｓｉＲＮＡベクターの同じサイトに導入し、ｓｉＲＮＡ−ＮＦＢＤ１を得た。
【００４７】
（抗体）
抗ＮＦＢＤ１ポリクローナル抗体は、Ｌｏｕら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４２１：  ９５７−９６１の記載通り、ＮＦＢＤ１のＮ末端領域（アミノ残基１−１５０）を含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパクに対して調製した。イムノブロットのため以下の抗体を用いた：抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１；オンコジーンリサーチプロダクツ）、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２；シグマ）、抗Ｂａｘモノクローナル抗体（６Ａ７；ｅバイオサイエンス）、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（１Ｅ４；ＭＢＬ）、抗ｐ２１ＷＡＦ１ポリクローナル抗体（Ｈ−１６４；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗アクチンポリクローナル抗体（２０−３３；シグマ）、抗リン酸ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）ポリクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー）、及び抗ＰＵＭＡポリクローナル抗体（アブカム）。
【００４８】
（ウェスタンブロット）
Ａ５４９細胞に所定の発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培養物にアドリアマイシンを終濃度が６００ｎＭになるように加えた。所定の処理時間が経過後、細胞を溶解バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、プロテアーゼインヒビターミックス（シグマ）を含む）に懸濁させ、１０秒間超音波処理を行った。１５０００ｒｐｍで１０分間、遠心を行い、上清を回収し、ブラッドフォード法（バイオラッド）を用い、製造業者の説明書に従い、タンパク濃度を測定した。等量の細胞全体の可溶化物（タンパク量：５０μｇ）をＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８）、２％のβ−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルーを含む）中で煮沸して変性させ、還元条件下の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア）に室温下にて１時間で転写した。膜を５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で室温にて１時間、ブロックした。その後、所定の一次抗体を含むＴＢＳ−Ｔで１時間反応させ、さらに西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス又は抗ウサギ二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ）を用いて、室温にて１時間反応させた。膜をＴＢＳ−Ｔで充分に洗浄して、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を製造業者の説明書に従って用いることにより、免疫反応性のタンパク質は最終的に可視化された。
【００４９】
（免疫沈降及びプルダウンアッセイ）
免疫沈降：細胞を３０μＬのグルタチオン−セファロース懸濁液（ファルマシア）で前処理し、正常マウス血清（ＮＭＳ）又は抗ＧＦＰモノクローナル抗体（１Ｅ４；ＭＢＬ）と４℃にて３０分間免疫沈降させた。免疫沈降物を、抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１；オンコジーンリサーチプロダクツ）を用いてイムノブロットで分析を行った。
【００５０】
プルダウンアッセイ：[３５Ｓ]メチオニン標識したＦＬＡＧ−ＦＨＡ、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＴ及びＦＬＡＧ−ＰＳＴは転写／翻訳カップルシステム（プロメガ）によって調製して、ＣＯＳ７細胞から調製した細胞全体の可溶化物と４℃にて２時間反応させた。[３５Ｓ]メチオニン標識タンパクを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００５１】
（ルシフェラーゼ・レポーターアッセイ）
ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞を５×１０４細胞／ウェルの密度で１２ウェル組織培養皿に播き、以下のもので細胞を一過的にトランスフェクトした：１００ｎｇのｐ５３応答配列を保有するルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘ）、１０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ、及び２５ｎｇのｐ５３発現プラスミドと量を変化させたｐｃＤＮＡ３−ＮＦＢＤ１と一緒に又は無しに。ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）を用いて、トランスフェクションあたりのトータルのＤＮＡ量は一定（５１０ｎｇ）に保った。トランスフェクションから４８時間後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ）に再懸濁させた。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）を用いて、説明書に従い、ホタル及びウミシイタケの両ルシフェラーゼ活性を測定した。蛍光強度はＴＤ−２０ルミノメーター（ターナーデザイン）を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼのシグナルを、ウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに基づいて規格化した。少なくとも３回のトランスフェクションを行って得られた結果を、平均値±標準偏差で表した。
【００５２】
（細胞生存アッセイ）
生存率は、改良３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて評価した。１００μＬの完全培地を添加してある９６ウェル組織培養皿に、Ａ５４９細胞を５×１０３／ウェルの密度で播き、付着させた。次の日、アドリアマイシンを含む新鮮な培地に交換し、さらに２４時間又は４８時間培養した。ＭＴＴアッセイは、１０μＬのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、培養物を３７℃で３時間インキュベーションして行った。マイクロプレートリーダー（モデル４５０；バイオラッド）を用いて、各ウェルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５３】
（アポトーシスアッセイ）
一定量の緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）発現プラスミドを、ＮＦＢＤ１発現プラスミド又はｓｉＲＮＡ−ＮＦＢＤ１発現プラスミドの存在下又は非存在下、Ａ５４９細胞にトランスフェックションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をアドリアマイシンで処理した。アドリアマイシン処理から２４時間後、トランスフェクトした細胞を緑色蛍光の存在によって識別して、核濃縮及びフラグメンテーションを確認するため細胞核を４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；シグマ）によって染色した。フラグメンテーションを呈するＧＦＰ陽性細胞をスコア化して、全ＧＦＰ陽性細胞に占めるパーセンテージとして表した。
【００５４】
（間接免疫蛍光法）
Ａ５４９細胞をカバーガラスの上に蒔き、一晩培養した後、アドリアマイシン（終濃度が１μＭ）で処理するか、または処理しないままとした。アドリアマイシン処理から２４時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、さらに４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で室温にて２０分固定した。ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００のＰＢＳ溶液で室温にて５分間透過処理し、さらに３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。カバーガラスを、抗ＮＢＳ１モノクローナル抗体（１Ｄ７；ＧｅｎｅＴｅｘ，  Ｉｎｃ．）、抗Ｍｒｅｌ１（１２Ｄ７；ＧｅｎｅＴｅｘ，  Ｉｎｃ．）モノクローナル抗体、抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１）、抗ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）モノクローナル抗体（１６Ｇ８；セルシグナリング）、又は抗ＮＦＢＤ−１ポリクローナル抗体を用いて、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで結合していない一次抗体を洗浄除去した後、カバーガラスを、ローダミン標識抗マウス二次抗体、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ウサギ二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ）を用いて、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、細胞核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。最後にカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、ａｎｔｉｆａｄｅ溶液でマウントし、共焦点レーザ走査型顕微鏡（オリンパス）を用いて分析した。
【００５５】
（実施例１）  Ａ５４９細胞におけるアドリアマイシンを介したアポトーシス誘導過程中のＰ５３とＮＦＢＤ１との関係
ＤＮＡ損傷により誘導されるアポトーシスにおいて、ＮＦＢＤ１の潜在的な機能を規定するため、野生型ｐ５３を持つ肺非小細胞癌由来の細胞株であるＡ５４９細胞を、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるＤＮＡ２本鎖切断を惹起するアドリアマイシン（ＡＤＲ）で処理して、ＮＦＢＤ１及びｐ５３等のタンパク質及びｍＲＮＡの発現レベルを調べた。アドリアマイシン処理から４８時間後、細胞生存アッセイ（ＭＴＴ）により調べたところ、Ａ５４９細胞はアドリアマイシンの用量依存的にアポトーシスを起こしていた（図１）。さらに、６００ｎｍアドリアマイシンで処理したＡ５４９細胞についてイムノブロット分析を行ったところ、アドリアマイシン依存性のアポトーシス誘導過程において、ＮＦＢＤ１はｍＲＮＡ（図２）及び蛋白レベル（図３）で発現の低下を認めた。その一方、ｐ５３はＳｅｒ−１５のリン酸化に伴う安定化が認められ、その標的遺伝子群であるｐ２１ＷＡＦ１やＢａｘ等の発現誘導も観察された（図２及び図３）。特に、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＮＦＢＤ１のｍＲＮＡの発現はアドリアマイシン処理で顕著に低下し、２４時間後にその発現はほとんど認められなくなった（図２）。これに対して、ｐ５３及びＳｅｒ−１５のリン酸化ｐ５３（Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ−１５））のｍＲＮＡの発現レベルは、アドリアマイシン処理によって、２４時間をピークに顕著な増加が認められた（図２）。また、ｐ２１ＷＡＦ１及びＢａｘのｍＲＮＡの発現レベルもアドリアマイシン処理時間依存的に増加した（図２）。その一方、アドリアマイシン処理により、ＮＦＢＤ１のタンパク質レベルの発現が顕著に低下し、アドリアマイシン曝露から２４時間後にその発現はほとんど認められなくなった（図３）。それに対して、ｐ５３のタンパク質レベルはほとんど変化せず、ｐ２１ＷＡＦ１及びＰＵＭＡのタンパク質レベルはアドリアマイシン処理時間依存的に発現が顕著に誘導された（図３）。
【００５６】
以上の結果をあわせると、ＤＮＡ損傷で誘導されるｐ５３の蓄積はＮＦＢＤ１の発現量と逆相関していること、及び、ＤＮＡ損傷が介するアポトーシス経路の間にそれらの機能的な相互作用が存在する可能性があることが示唆された。
【００５７】
（実施例２）アドリアマイシンによるアポトーシス誘導における過剰発現するＮＦＢＤ１の機能
アドリアマイシンによるアポトーシス誘導におけるＮＦＢＤ１の調節機能を規定するため、Ａ５４９細胞にＮＦＢＤ１発現プラスミドをトランスフェクトして過剰発現させ、アドリアマイシン対する感受性を測定した。その結果、コントロール（エンプティベクター）に比べて、ＮＦＢＤ１過剰発現のＡ５４９細胞にはアドリアマイシン対する感受性の顕著な低下を認められた（図４）。また、イムノブロット分析を行ったところ、ｐ５３はＳｅｒ−１５のリン酸化阻害に伴う発現レベルの低下が認められた（図５）。さらに、ｐ５３標的遺伝子群であるｐ２１ＷＡＦ１及びＰＵＭＡのタンパク質レベルの発現誘導の阻害も認められた(図５)。以上よりＮＦＢＤ１はｐ５３のリン酸化阻害により、そのアポトーシス機能を阻害している可能性が示唆される。
【００５８】
（実施例３）アドリアマイシンによるアポトーシスにおけるＮＦＢＤ１の機能
内在性ＮＦＢＤ１の機能を規定するため、ＮＦＢＤ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（以下ｓｉＲＮＡ−ＮＦＢＤ１）を作製し、イムノブロットによって確認した（図６）。ＮＦＢＤ１又はｓｉＲＮＡ−ＮＦＢＤ１の存在下又は非存在下ＧＦＰによって一過性にトランスフェクトしたＡ５４９細胞を用いて、アポトーシスアッセイを行った。その結果、ＧＦＰ陽性の細胞はトランスフェクト細胞であり、ＤＡＰＩ陽性の細胞はアポトーシスを起こした細胞である（図７Ａ）。ＤＡＰＩ及びＧＦＰともに陽性の細胞を、ＧＦＰ陽性細胞に占める比率としてスコアした（図７Ｂ）。図７Ｂに示しているように、ＮＦＢＤ１トランスフェクトされた場合、ＮＦＢＤ１トランスフェクトされない場合に比べて、アドリアマイシン処理によって生じたアポトーシス細胞数は減少した。また、ＮＦＢＤ１及びｓｉＲＮＡ−ＮＦＢＤ１の共トランスフェクト細胞において、アドリアマイシン処理によって生じたアポトーシス細胞数は顕著に増加した。即ち、内在性ＮＦＢＤ１のノックアウトによってアドリアマイシン依存性のアポトーシスの亢進が認められた。以上の結果から、ＮＦＢＤ１はアドリアマイシンによるアポトーシスを抑制することが判明した。
【００５９】
（実施例４）  ｐ５３とＮＦＢＤ１との相互作用
哺乳動物の培養細胞において、ＮＦＢＤ１がｐ５３と相互作用するかどうかを調べるため、ＧＦＰ−ＮＦＢＤ１によってトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から細胞全体の可溶化物を調製し、その可溶化物を正常マウス血清（ＮＭＳ）又は抗ＧＦＰ抗体と免疫沈降させ、それぞれ、抗ｐ５３抗体を使ったイムノブロットで分析した。図８に示したように、外因的に発現させたＧＦＰ−ＮＦＢＤ１は、ＣＯＳ７細胞中で安定な融合タンパクを形成し（上段）、ｐ５３はＧＦＰ−ＮＦＢＤ１と免疫共沈降した（下段）。これは、ｐ５３とＮＦＢＤ１と複合体を形成していることを示している。
【００６０】
また、ＮＦＢＤ１との結合に関与するｐ５３の領域を同定するため、ｐ５３の欠失変異体をいくつか作製し、インビトロのプルダウンアッセイにおいてＮＦＢＤ１への結合能を調べた。転写活性化ドメイン（ＴＡドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤドメイン）及びオリゴマー化ドメイン（ＯＤドメイン）を含むｐ５３の機能的ドメインに基づいて、変異体ｐ５３（１−３５９）、ｐ５３（１−２９２）、ｐ５３（１−１０１）及びｐ５３（１０２−３９３）を設計した（図９）。ｐ５３（１−１０１）は、ＮＦＢＤ１に結合した（図１０Ａ）が、ｐ５３（１０２−３９３）はＮＦＢＤ１には結合しなかった（図１０Ｂ）。他のｐ５３変異体も全てＮＦＢＤ１に結合したことが認められた（データは示さず）。以上の結果より、アミノ末端を欠くｐ５３の変異体はＮＦＢＤ１に対する結合活性を失っていることから、ＮＦＢＤ１と複合体を形成するには、ｐ５３の転写活性化ドメインを含むアミノ末端が重要であると考えられる。
【００６１】
さらに、ｐ５３との結合に関与するＮＦＢＤ１の領域を同定するため、ＮＦＢＤ１の欠失変異体をいくつか作製し、インビトロのプルダウンアッセイにおいてｐ５３への結合能を調べた。ＦＨＡドメイン（２−１４１）、ＰＳＴドメイン（７８７−１６３４）及びＢＲＣＴドメイン（１８９０−２０８９）を含むＮＦＢＤ１の機能的ドメインに基づいて、これらの変異体を作製した（図１１）。ＦＬＡＧ−ＦＨＡ及びＦＬＡＧ−ＢＲＣＴはＧＳＴ−ｐ５３に結合したが、ＦＬＡＧ−ＰＳＴはＧＳＴ−ｐ５３には結合しなかった（図１２）。以上のことから、ＮＦＢＤ１はそのＢＲＣＴドメイン及びＦＨＡドメインを介してｐ５３と結合していることが示唆された。
【００６２】
（実施例５）ＮＦＢＤ1のｐ５３の転写活性に対する効果
ＮＦＢＤ１のｐ５３の活性に対する効果を検討するため、ｐ５３の下流遺伝子である、ｐ２１、ＭＤＭ２、ＢＡＸのプロモーターを用いたルシフェラーゼ・レポーターアッセイを行った。ｐ５３が欠損したＨ１２９９細胞に、ｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘプロモーターのコントロール下のルシフェラーゼレポーター発現プラスミド、ｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ、及びｐ５３発現プラスミドを、量を変化させたＮＦＢＤ1の発現プラスミドと一緒に又は無しにトランスフェクトした。図１３に示したように、エンプティプラスミドの対照に比べて、異所的に発現したｐ５３は、ｐ５３応答性レポーターの転写を活性化した。また、ＮＦＢＤ１単独では、ルシフェラーゼ活性にはほとんど影響を与えなかった。ＮＦＢＤ１をｐ５３と共発現させたときは、ｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘの活性がＮＦＢＤ１用量依存的に顕著に減少したことが認められた。以上のことから、ＮＦＢＤ１はｐ５３に転写活性化能を抑制していることが示唆された。
【００６３】
（実施例６）アドリアマイシンによるＤＮＡ損傷に伴うｐ５３及びＮＦＢＤ１の細胞内局在
アドリアマイシン処理に伴うｐ５３及びＮＦＢＤ１の細胞内局在を間接免疫蛍光法で検討した。図１４に示したように、アドリアマイシン処理しない時、ｐ５３もＮＦＢＤ１も核内に局在している（図１４上段）。１μＭのアドリアマイシンで処理して２４時間後、ｐ５３の発現誘導が認められる細胞ではＮＦＢＤ１が消失していた（図１４下段）。一方、ＮＦＢＤ１が修復の場と考えられるｎｕｃｌｅａｒ  ｆｏｃｉに集積している細胞では、ｐ５３の発現誘導は認められなかった（図１４下段）。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９細胞を異なる用量のアドリアマイシンに曝したときの細胞生存率を表すグラフである。
【図２】アドリアマイシン処理したＡ５４９細胞のアポトーシス誘導過程でのｍＲＮＡレベルを表す図である。
【図３】アドリアマイシン処理したＡ５４９細胞のアポトーシス誘導過程での蛋白レベルを表すグラフである。
【図４】ＮＦＢＤ１発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＡ５４９細胞をアドリアマイシン処理したときの細胞生存率を表すグラフである。
【図５】ＮＦＢＤ１発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＡ５４９細胞をアドリアマイシン処理したときのアポトーシス誘導過程での蛋白レベルを表す図である。
【図６】イムノブロットによって内在性ＮＦＢＤ１に対する特異的なｓｉＲＮＡがＮＦＢＤ１の発現を阻害したことを表す図である。
【図７】Ａ５４９細胞にＧＦＰ−ＮＦＢＤ１発現プラスミドを一過的にトランスフェクションしたとき、ＮＦＢＤ１−ＲＮＡｉによるアポトーシスの亢進をアポトーシス細胞の確認（図７Ａ），及び全トランスフェクション細胞中のアポトーシス細胞の占める割合（図７Ｂ）で表す図である。
【図８】ＣＯＳ７細胞にＧＦＰ−ＮＦＢＤ１発現プラスミドを一過的にトランスフェクションしたとき、細胞全体の可溶化物を抗ＮＦＢＤ１抗体及び抗ｐ５３抗体でイムノブロットした結果（上図）、及び正常マウス血清又は抗ＮＦＢＤ１抗体で免疫沈降したものを抗ｐ５３抗体でイムノブロットした結果（下図）を表す図である。
【図９】ｐ５３欠失変異体の構築及びそれらの変異体とＮＦＢＤ１との結合能を表す図である。
【図１０】図１０ＡはＮＦＢＤ１及びｐ５３（１−１０１）でＣＯＳ７細胞をトランスフェクションしたとき、細胞全体の可溶化物を抗ＮＦＢＤ１抗体及び抗ｐ５３抗体でイムノブロットした結果（図１０Ａ左図）、及び正常マウス血清又は抗ＮＦＢＤ１抗体で免疫沈降したものを抗ｐ５３抗体でイムノブロットした結果（図１０Ａ右図）を表す図であり、図１０Ｂは、ＮＦＢＤ１及びで又はｐ５３（１０２−３９３）でＣＯＳ７細胞をトランスフェクションしたときの結果を表す図である。
【図１１】ＮＦＢＤ１欠失変異体の構築を表す図である。
【図１２】ＦＨＡドメイン、ＰＳＴドメイン及びＢＲＣＴドメインの発現プラスミドによって、一過的にトランスフェクションしたとき、インビトロプルダウンアッセイの結果を表す図である。
【図１３】Ｈ１２９９細胞に、ｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘプロモーターのコントロール下のルシフェラーゼレポーター発現プラスミド、ｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ、及びｐ５３発現プラスミドを、量を変化させたＮＦＢＤ1の発現プラスミドと一緒に又は無しにトランスフェクトしたとき、それぞれのフォールディング活性を表すグラフである。
【図１４】アドリアマイシンによるＤＮＡ損傷に伴うＮＦＢＤ１及びｐ５３の細胞内局在を表す図である。
【図１５】ＤＮＡ損傷に伴うＰ５３とＮＦＢＤ１の相互作用の模式図を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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