(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なバチルス属細菌の植物病害防除機能を新たに見出し、該細菌を利用する植物病害防除技術を提供する。【解決手段】１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が、特定な塩基配列である新規バチルス属細菌を提供する。また、このバチルス属細菌を用いる植物病害防除剤、植物病害防除用培土、並びに植物病害防除方法を提供し、トマトなどのうどんこ病、灰色かび病、疫病、イネ苗立枯細菌病などを含む植物病害を有効に防除する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が配列番号１に示す塩基配列であるバチルス属細菌。
【請求項２】
１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が配列番号１に示す塩基配列であるバチルス属細菌を用いる植物病害防除剤。
【請求項３】
１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が配列番号１に示す塩基配列であるバチルス属細菌を用いる植物病害防除用培土。
【請求項４】
バチルス属細菌を用いて植物病害を防除する方法であって、
前記バチルス属細菌は、１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が配列番号１に示す塩基配列であるバチルス属細菌である植物病害防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病害の防除に係わる技術に関する。より詳しくは、特定のバチルス属細菌を利用する植物病害防除技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化学合成農薬を用いた植物病害防除に比べて、環境負荷が少なく、人畜に対する安全性が高いなどの理由から、「生物農薬（Biological agrochemicals）」とも称される生物的防除技術を、積極的に利用する動きが活発になっている。
【０００３】
この生物的防除技術には、植物に各種の病害を引き起こす害虫や微生物の天敵となる生物（昆虫、線虫、細菌その他の微生物など）を利用する技術、生物が生産する物質（例えば、抗生物質）やフェロモンなどの生理活性物質を利用する技術などが含まれる。
【０００４】
害虫防除に広く利用されているバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis、略称Ｂt）は、上記生物農薬の代表例である。このＢｔ細菌を培養して産生させた結晶性の殺虫性タンパク質（デルタエンドトキシン）は、鱗翅目の害虫（例えば、野菜害虫のコナガなど）の防除、即ち殺虫剤として、既に実用化されている。
【０００５】
また、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)は、植物に病害をもたらすある種の病原菌と拮抗するので、ナスやトマトの灰色かび病の防除剤として、日本では、既に農薬登録されている。
【０００６】
加えて、バチルス属の細菌を利用する植物病害防除に係わる先行技術の具体例を幾つか掲げると、まず、特許文献１には、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属に属する細菌の培養物から胞子を乾燥重量で５０重量％以上含むように調製された胞子画分を含有する農園芸植物の病害防除技術が開示されている。
【０００７】
特許文献２には、フィトフトラ属に属する微生物に起因する植物の疫病を防除するために、同微生物に拮抗作用を有するバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）などのバチルス属細菌の菌体又は培養物、さらには、同細菌が産生する有機酸又はその塩を有効成分とする疫病防除剤が開示されている。
【０００８】
特許文献３には、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）の菌体又は培養物を含む植物病害防除剤が開示されている。
【０００９】
また、特許文献４、特許文献５には、バチルス・ズブチリスの特定株を有効成分として用いる植物病害防除剤が開示されている。
【００１０】
【特許文献１】特開平８−１７５９１９号公報。
【特許文献２】特開２００１−２０６８１１号公報。
【特許文献３】特開２００３−２７７２１０号公報。
【特許文献４】特開平６−１３３７６３号公報。
【特許文献５】特開平５−０５１３０５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
新規なバチルス属細菌の植物病害防除機能を新たに見出し、これにより、前記バチルス属細菌を用いた植物病害防除剤、植物病害防除用培土、並びに植物病害防除方法を提供することを、本発明の主な技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１６ＳリボゾームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）が配列番号１に示す塩基配列であるバチルス属細菌の植物病害防除に係わる作用機能を新規に見出したことに基づいて、（１）前記バチルス属細菌、（２）同バチルス属細菌を用いる植物病害防除剤、（３）同バチルス属細菌を用いる植物病害防除用培土、（４）同バチルス属細菌を用いる植物病害防除方法、を提供する。
【００１３】
本発明に係る新規バチルス属細菌は、植物病害防除技術において有用である。また、本発明に係る植物病害防除剤は、前記バチルス属細菌を用いることが特徴であって、その薬剤としての形態や状態は、適宜決定でき、あるいはその使用方法についても、例えば、散布、混合、塗布、浸漬などの方法を広く含み、狭く解釈されない。本発明に係る植物病害防除用培土は、上記バチルス属細菌を用いることが特徴であって、例えば、植物を生育させるための土壌へ適当量を供給する方法などによって用いられる。本発明に係る植物病害防除方法は、上記バチルス属細菌を用いることが特徴であって、当該方法は、植物の生育過程や生育環境に対して、植物病害防除の機能を発揮するように使用される。
【００１４】
本発明において「バチルス属細菌を用いる」とは、防除目的の植物病害との関係において、病害の原因微生物と生活環境において拮抗する当該細菌自体の直接的病害防除作用を用いることだけにとどまらず、植物の病害抵抗性を誘導して病害防除を行うことなどを広く含む。
【００１５】
ここで、本発明に係るバチルス属細菌は、上記のとおり、１６Ｓのサブユニットに相当するｒＤＮＡの塩基配列によって分類特定されるバチルス属に属する細菌であり、Bacillus sp.K-2、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１０２３２の細菌である。
【００１６】
本発明に係るバチルス属細菌は、配列番号１に示された１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と完全同一の塩基配列を有するものにだけ狭く限定されることなく、当該塩基配列の一部塩基が、欠失、置換、付加又は挿入等されていても、植物病害防除作用において同バチルス属細菌と同様の形質を備えるものも含む。
【００１７】
なお、現在、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づいた細菌の系統分類方法は、１６ＳｒＤＮＡが、種の違いを示す適当な差異を持ち、過去の進化(変異)の過程を類推するのに十分量の情報があり、取り扱いが容易であるなどの理由から、細菌の系統分類技術の有力な技術となっている。
【００１８】
本発明に係わる「植物病害」とは、上記バチルス属細菌が病害防除に役立ち得る病害を広く包含するのであって、狭く解釈されない。代表例として、うどんこ病、灰色かび病、疫病、イネ苗立枯細菌病などを挙げることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るバチルス属細菌を植物の生育環境の中に用いることによって植物病害を有効に防除することができる。本発明に係る植物病害防除用培土は、植物の生育にとって有害な土壌病害菌の生育を抑制し、植物に対する土壌病害の起こりにくい土壌を提供することができる。
【実施例１】
【００２０】
植物病害防除剤（フロアブル剤）の調製。
【００２１】
本発明に係るバチルス属細菌は、自然の土壌から微生物を分離し、植物病害に対する活性を検定した結果、植物病害活性を有することが確認されたものであり、１６Ｓのサブユニットに相当するリボゾームＤＮＡ（以下、１６ＳｒＤＮＡ）が、添付する配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するバチルス属細菌である。
【００２２】
なお、前記ｒＤＮＡの塩基配列情報を得るための手法及び操作は次の通りである。まず、各検体をNutrient Agar(Oxoid,Ebgland,UK)に植菌し、３０℃で２日間培養して、その後、この検体をＤＮＡ抽出のための供試検体とした。ゲノムの抽出には、PrepMan Method(Applied Biosystems,CA,USA.http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/home/index_g.jsp)を使用した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法により、１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列１５００〜１６００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された前記１６ＳｒＤＮＡをシーケンシングして、当該検体の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列情報(配列表・配列番号１を参照)を得た。ＰＣＲ産物の複製、サイクルシークエンスには、MicroSeqFull 16SDNA Bacterial Sequencing Kit(Applied Biosystems,CA,USA.)を使用した。サーマルサイクラーには、GeneAMP PCR System 9600(Applied Biosystems,CA,USA.)、ＤＮＡシーケンサーには、ABI PRISM 3100DNA Sequencer(Applied Biosystems,CA,USA.)を使用し、得られた塩基配列断片の結合には、AutoAssembler2.1（Applied Biosystems,CA,USA.）を使用した。ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの基本的操作は、Applied Biosystems社のプロトコール（P/N4308132Rev.A）に従った。
【００２３】
このようにして、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が特定されて、帰属分類群が推定されたバチルス属細菌を、ＫＡＢＢ培地（大豆粉１０ｇ、シュークロース１０ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸水素ニナトリウム１ｇ、デンプン１ｇ、水１０００ｍｌ、ｐＨ７）で３０℃、４日間振盪培養して芽胞を形成させ、これを遠心により集菌した。その後、１．０×１０１１cells／ｍｌ以上の芽胞濃度となるように水に懸濁し、目的のフロアブル剤を得た。このフロアブル剤を後述の実施例３〜５で使用した。
【００２４】
なお、本実施例で使用したバチルス属細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば１丁目市東１番地１中央第６）に平成１７年２月１０日付けで、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１０２３２として寄託されているものである。
【００２５】
本発明に係るバチルス属細菌の近縁種として考えられるものとして、Bacillus mojavensis、Bacillus atrophaeus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformisなどを例示できる。
【実施例２】
【００２６】
植物病害防除用培土の作製。
【００２７】
本発明に係るバチルス属細菌を含む培養土を調製するため、まず、セル苗用土（セル培土２００タイプ：呉羽化学製）の３リットルをオートクレーブ滅菌した。この滅菌済みセル苗用土に、ポテトデキストロース寒天培地で培養した本発明に係るバチルス属細菌を、一白金耳接種した。接種後、２８℃で培養し、セル用土内の菌濃度が、１×１０７cells／ｍｌ以上となるまで増殖させて、目的の植物病害防除用培土を得た。この植物病害防除用培土を後述の実施例６で使用した。
【実施例３】
【００２８】
「トマトうどんこ病」に対する活性検証試験。
【００２９】
セルトレーに穂木として品種桃太郎エイト、台木としてベスパを播種し、２５日間栽培した。これらを接木し、３寸ポットに鉢上げして３０日間栽培し、生育ステージが７．５〜８葉期の苗を得た。この苗を社内温室に定植し、３ヶ月間の栽培で、生育ステージが第４果房開花期に達したとき、実施例１で作製したフロアブル剤を、２５００倍に稀釈し、上記トマトの茎葉部に均一に散布した。
【００３０】
なお、本実施例に対する比較例として、市販微生物農薬ボトキラー水和剤（登録商標、出光興産社製）の１０００倍稀釈液を用いて、上記同様のトマトの茎葉部に均一に散布した。また、薬剤散布しない「対照区」も準備した。
【００３１】
本実施例に係わる試験区の大きさは、８株植え／２．４ｍ２／区であり、各処理３反復とした。散布時の液量は、３５０Ｌ／１０アールの割合として。散布は、１週間毎に計５回行い、自然発病したトマトうどんこ病に対する活性を達観で調査した。調査時の無処理区の発病面積率は１２％であった。結果を次の「表１」に示す。
【００３２】
【表１】
2006304684.tif 000002
【００３３】
防除値は、次の式に基づいて算定した（他の実施例でも同様）。
【００３４】
【数１】
2006304684.tif 000003
【００３５】
前掲する「表１」に示された結果からわかるように、実施例は、トマトうどんこ病に対する防除効果があり、ボトキラー水和剤散布区である比較例と比べて、防除価が高い。本発明に係るバチルス属細菌がその防除効果を示すうどんこ病は、トマトうどんこ病の他に、例えば、キュウリうどんこ病、メロンうどんこ病、ナスうどんこ病などを挙げることができる。
【実施例４】
【００３６】
「キュウリ灰色かび病」に対する活性検証試験。
【００３７】
上記実施例１で得たフロアブル剤を、１．７×１０９cells／ｍｌとなるように水で稀釈し、この希釈液を、ポットで栽培した０．２葉期のキュウリ茎葉部に散布した。散布液量は、８００Ｌ／ｈａの割合である。散布後、風乾し、灰色かび病菌の胞子懸濁液を含浸させたペーパーディスクをキュウリ一株５枚の葉の各々に一枚ずつ置床した。これを２０℃、高湿度の発病箱に入れ、３日後に達観により発病程度を調べた。また、薬剤散布しない「対照区」の発病面積率は、１００％であった。結果を次の「表２」に示す。
【００３８】
【表２】
2006304684.tif 000004
【００３９】
前掲の「表２」に示された結果からわかるように、フロアブル剤散布区である実施例では、キュウリ灰色かび病に対する高い防除効果を示した。
【実施例５】
【００４０】
「トマト灰色かび病」に対する活性検証試験。
【００４１】
上記実施例１で得たフロアブル剤を、１．６×１０９cells／ｍｌとなるように水で希釈し、ポットで第二段果房開花期まで栽培したトマトの茎葉部に対して、４０ｍｌ／ポットの割合で散布した。
【００４２】
散布後４日目に、灰色かび病菌胞子懸濁液（胞子濃度１．０×１０５cells／ｍｌ）をトマト茎葉部に噴霧接取した。噴霧接種の液量は、３３０ｍｌ／ｍ２の割合である。その後、高湿度の発病箱に３日間入れて発病させ、発病の程度を達観で調査した。無散布区の発病面積率は７６％であった。結果を次の「表３」に示す。
【００４３】
【表３】
2006304684.tif 000005
【００４４】
前掲した「表３」に示された結果からわかるように、フロアブル剤散布区である本実施例は、トマト灰色かび病に対する防除効果があった。本発明に係るバチルス属細菌がその防除効果を示す灰色かび病は、上記キュウリ（実施例４参照）、トマト（実施例５参照）の他に、例えば、ナス、ピーマン、イチゴ、ブドウなどに対する灰色かび病を挙げることができる。
【実施例６】
【００４５】
「イネ苗立枯細菌病」に対する活性検証試験。
【００４６】
実施例１で作製したフロアブル剤を、６．５×１０７cells／ｍｌとなるように水で稀釈し、この希釈液にイネ苗立枯細菌病に罹病したイネ種子（品種：日本晴）を２０℃、２４時間浸漬処理した。その後、２０℃で４日間浸種し、３２℃で２４時間催芽処理を行った。
【００４７】
このようにして得た種子を、市販の水稲用粒状培土（呉羽化学工業社製）を詰めた１０ｃｍ×１５ｃｍのプラスチックカップに播種し、覆土して、加温育苗器に入れて出芽させた（温度条件：３２℃、２日間）。育苗器から取り出した後、ガラス温室内で栽培し、播種２１日後に発病程度を達観で調査した。対照区（フロアブル剤未使用区）の発病苗率は、３０％であった。結果を次の「表４」に示す。
【００４８】
【表４】
2006304684.tif 000006
【００４９】
前掲の「表４」に示された結果からわかるように、フロアブル剤使用区である実施例では、イネ苗立枯細菌病に対する高い防除効果を示した。
【実施例７】
【００５０】
「トマト疫病」に対する活性検証試験。
【００５１】
セル苗用土（セル培土２００タイプ：呉羽化学製）と畑土を容量比１：１に混合し、これに疫病に罹病したトマトの茎葉部を混ぜ込み、発病土を調製した。この発病土に、実施例２で得た植物病害防除用培土を、容量比１０％の割合で混合し、２０℃で、１日間栽培上の管理下に置いた。
【００５２】
これにトマトの苗（品種：福寿、２．５葉期）を移植し、湿室で栽培管理するとともに、発病を促した。調査は移植５日後に達観で行った。無処理区の発病面積率は４６％であった。結果を次の「表５」に示す。
【００５３】
【表５】
2006304684.tif 000007
【００５４】
前掲した「表５」に示された結果からわかるように、フロアブル剤散布区である本実施例では、トマト疫病に対する防除効果があった。本発明に係るバチルス属細菌がその防除効果を示す疫病は、トマト疫病の他に、例えば、キュウリ疫病、スイカ疫病、ジャガイモ疫病、メロン疫病、カボチャ疫病などを挙げることができる。
【００５５】
以上の実施例の結果から明らかなように、本発明に係るバチルス属細菌は、植物病害防除効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、バチルス属細菌を用いる植物病害防除技術、いわゆる生物農薬として利用できる。例えば、植物病害防除剤、植物病害防除用培土、植物病害防除方法として利用できる。
【配列表】
2006304684000001.app