(57)【要約】【課題】  ラビリンチュラ類に外来遺伝子を導入して形質転換することを可能にするベクターを提供すること。【解決手段】  （１）ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、（２）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び（３）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含む、ラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクター。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、（２）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び（３）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含む、ラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクター。
【請求項２】
ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列が、ラビリンチュラ類の18SrRNAの遺伝子配列である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列が、配列番号１に記載のSchizochytrium sp CB15-5の18SrRNAの塩基配列である、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である、請求項１から３の何れかに記載のベクター。
【請求項５】
選択マーカーがゼオシン(ブレオマイシン)耐性遺伝子である請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
プロモーター及びターミネーターがラビリンチュラ類由来である、請求項１から５の何れかに記載のベクター。
【請求項７】
ラビリンチュラ類がSchizochytrium sp CB15-5である、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
プロモーターが、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーターである、請求項１から７の何れかに記載のベクター。
【請求項９】
プロモーターの塩基配列が配列番号２から４の何れかである、請求項１から８の何れかに記載のベクター。
【請求項１０】
ターミネーターが、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのターミネーターである、請求項１から９の何れかに記載のベクター。
【請求項１１】
ターミネーターの塩基配列が配列番号５から７の何れかである、請求項１から１０の何れかに記載のベクター。
【請求項１２】
プラスミドpUC18をバックボーンとする、請求項１から１１の何れかに記載のベクター。
【請求項１３】
プラスミドprGPZTをバックボーンとする、請求項１から１１の何れかに記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れかに記載のベクターのクローニング部位に導入遺伝子を挿入されている、組み換えベクター。
【請求項１５】
導入遺伝子が、脂肪酸合成酵素遺伝子である、請求項１４に記載の組み換えベクター。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の組み換えベクターで形質転換されたラビリンチュラ類細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換されたラビリンチュラ類細胞を用いて脂質又は脂肪酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター及び当該ベクターで形質転換されたラビリンチュラ類細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラビリンチュラ類は、海洋に広く分布する真核単細胞微生物であり、不等べん毛を持つストラメノパイル(クロミスタ界, 不等毛類) に分類されている。この生物は、機能性食品成分として知られるドコサヘキサエン酸（DHA）などのC22の高度不飽和脂肪酸(PUFA)を蓄積する油糧微生物であることから、Single cell oilの供給者として注目を浴びている。Single cell oilsとは微生物が作る脂質である。微生物が生成する脂質には、油糧植物や動物油脂には含まれていない特殊なものや、異なる組成を示すものがあり、新しい脂質資源として、医薬品、機能性食品、飼料などへの用途が期待されている。微生物油脂の特徴としては、上記のように動植物とは異なる特殊なものであること以外に、増殖が速いため生産性が高いこと、特定の油脂生産に適する菌株の育種が容易なことなどが挙げられる。油糧微生物には、γ−リノレン酸(C18:3) 生産菌としてMucor及びMortierella糸状菌や、アラキドン酸(C20:4) 生産菌としてMortierella糸状菌などがおり、すでにγ−リノレン酸においては工業化が行われている。DHAなどのC22の脂肪酸の種々の高い生理機能の発見による需要の拡大、また同微生物の一種はPUFAに加えて同様に高い生理機能を示すアスタキサンチンなどのカロテノイドを生産するという既存の生物資源にはない特徴を備えていることから、ラビリンチュラ類を用いたそれら機能性脂質の生産系ならびに微生物飼料としての有効利用システムの開発が望まれる。しかし、培養条件の至適化や分子育種など、生産系の開発に重要なポイントとなるPUFAやカロテノイドの産生機構はまだ未解明である。特にラビリンチュラ類微生物におけるDHAの合成経路は解明されていない。
【０００３】
特許文献１及び２並びに非特許文献１では、ドコサヘキサエン酸を始めとする高度不飽和脂肪酸あるいはカロチノイドを体内に蓄積することが知られている微生物が鋭意探索され、多数の微生物群の中から高生産性のラビリンチュラ類が見出されている。しかしながら、これらのラビリンチュラ類においても、高度不飽和脂肪酸あるいはカロチノイドの生産性は未だ十分なものとは言えなかった。
【０００４】
【特許文献１】特許  第２７６４５７２号公報
【特許文献２】特開２００３−１８９８４６号公報
【非特許文献１】遺伝子の分子生物学、第19章  p595−620、ワトソン等、トッパン
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ラビリンチュラ類の形質転換系が開発されれば、遺伝子破壊を可能にし、ラビリンチュラ類のDHA の合成経路を解明することができ、このような問題を解決するとともに、カロテノイドの生合成機構の解明にもつながり、この微生物での分子育種も可能にし、多種機能性脂質の生産系の開発につながる。また、このような微生物からDHA やカロテノイドの生合成にかかわる遺伝子が取り出されれば、それを他の微生物や植物などに導入することにより、新たなDHA やカロテノイド供給源を提供することが可能となる。同じストラメのパイルには、渇藻、珪藻、卵菌などが属しており、これらにおいてはすでに数種の微生物において形質転換系が開発されているが、ラビリンチュラ類の形質転換系は全く開発されていない。そこで、本発明では、PUFA やカロテノイドなどの脂質生合成機構の解明とその制御による高生産系の構築及び新規機能性脂質分子の設計開発を可能とするようなラビリンチュラ類の形質転換系を提供することを目的とした。即ち、本発明は、ラビリンチュラ類に外来遺伝子を導入して形質転換することを可能にするベクターを提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記ベクターを用いて形質転換したラビリンチュラ類細胞を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、ラビリンチュラ類の有用物質の生産能力を向上させるために外来遺伝子を導入して形質転換することを可能とするベクターの構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、（１）ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、（２）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び（３）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含む、ラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクターが提供される。
【０００８】
好ましくは、ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列は、ラビリンチュラ類の18SrRNAの遺伝子配列である。
好ましくは、ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列は、配列番号１に記載のSchizochytrium sp CB15-5の18SrRNAの塩基配列である。
【０００９】
好ましくは、選択マーカーは薬剤耐性遺伝子である。
好ましくは、選択マーカーはゼオシン(ブレオマイシン)耐性遺伝子である。
【００１０】
好ましくは、プロモーター及びターミネーターはラビリンチュラ類由来である。
好ましくは、ラビリンチュラ類はSchizochytrium sp CB15-5である。
好ましくは、プロモーターは、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーターである。
好ましくは、プロモーターの塩基配列は配列番号２から４の何れかである。
【００１１】
好ましくは、ターミネーターは、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのターミネーターである。
好ましくは、ターミネーターの塩基配列は配列番号５から７の何れかである。
好ましくは、本発明のベクターはプラスミドpUC18をバックボーンとするものであるか、プラスミドprGPZTをバックボーンとするものである。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のベクターのクローニング部位に導入遺伝子を挿入されている、組み換えベクターが提供される。
好ましくは、導入遺伝子は、脂肪酸合成酵素遺伝子である。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターで形質転換されたラビリンチュラ類細胞が提供される。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の形質転換されたラビリンチュラ類細胞を用いて脂質又は脂肪酸を製造する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のベクターを用いることによりラビリンチュラ類に外来遺伝子を導入して、形質転換することが初めて可能になった。本発明のベクターを用いることにより、ラビリンチュラ類における脂質又はカロチノイドの生産効率を向上させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によるラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクターは、（１）ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、（２）上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び（３）上流にプロモーターを有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明で用いるラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列は、ラビリンチュラ類細胞に導入された際に、ラビリンチュラ類の染色体DNAとの間で相同組み換えを起こすことを可能にするものであり、これにより、ベクター内に含まれる導入遺伝子がラビリンチュラ類の染色体DNAの中に組み込まれることになる。このようなラビリンチュラ類の染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列の具体例としては、ラビリンチュラ類の18SrRNAの遺伝子配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号１に記載のSchizochytrium sp CB15-5の18SrRNAの塩基配列が挙げられる。18SrRNAの遺伝子配列は、Schizochytrium sp CB15-5のゲノムDNAと好適なプライマーを用いてPCR法等により取得することができる。
【００１７】
本発明で用いる上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子としては、本発明のベクターを有する形質転換体を選別することができる適当な表現型を示す遺伝子を使用することができ、例えば、薬剤耐性遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ゼオシン(ブレオマイシン)耐性遺伝子などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。選択マーカー遺伝子の上流及び下流にはそれぞれプロモーター配列及びターミネーター配列が連結している。本発明で用いるプロモーター配列及びターミネーター配列としては、宿主であるラビリンチュラ類で機能する配列が好ましく、ラビリンチュラ類由来のプロモーター配列及びターミネーター配列を使用することが好ましい。プロモーター及びターミネーターの具体例としては、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーター配列及びターミネーター配列を挙げることができる。
【００１８】
上記したプロモーター配列及びターミネーター配列は、本明細書の配列表の配列番号２〜１０に記載の塩基配列の情報に基づいて設計したプライマー配列と、ラビリンチュラ類細胞（例えば、Schizochytrium sp CB15-5など）のゲノムDNAとを用いてPCRを行うことにより取得することができる。
【００１９】
本発明のベクターは、上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を有している。ここで言うクローニング部位とは、目的遺伝子を挿入するための制限酵素部位である。ここで用いるプロモーター配列及びターミネーター配列としては、目的遺伝子を発現できるものであれば特には限定されず、上記したようなアクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーター配列及びターミネーター配列を使用してもよいし、使用する目的遺伝子自体のプロモーター配列及びターミネーター配列を使用してもよい。
【００２０】
本発明のベクターは、例えば、プラスミドpUC18又はプラスミドprGPZTをバックボーンとすることができる。これらのプラスミドは、通常、複製起点（E.coli oriなど）及び抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子など）を有している。
本発明では、線状化ベクターを使用することが好ましい。なお、導入するベクターを組換えたい部位で切断して線状化した場合はその部位で相同組換えが起こるが、組換え部位を限定しなければ環状ベクターでも形質転換は可能である。従って、目的によっては環状ベクターも利用可能である。
【００２１】
本発明のベクターは、そのクローニング部位に導入遺伝子を挿入して使用することができる。導入遺伝子の種類は特に限定されず、作製する形質転換体の用途など、その目的に応じて選択することができる。導入遺伝子としては、例えば、脂肪酸合成酵素遺伝子などを使用することができる。
【００２２】
上記のようにしてクローニング部位に導入遺伝子を挿入した本発明の組み換え発現ベクターは、ラビリンチュラ類細胞に導入することができる。なお、ラビリンチュラ類細胞の形質転換は本発明のベクターを用いることによって初めて達成可能になったものである。
【００２３】
本発明のベクターを導入するラビリンチュラ類細胞の種類は特に限定されないが、例えば、シゾキトリウム属又はスラウストキトリウム属の細胞などを使用することができる。シゾキトリウム属の細胞の具体例としては、Schizochytrium aggregatum ATCC 28209、Schizochytrium limacinum NIBH SR21、及び本願明細書の実施例で使用したSchizochytrium sp CB15-5などを挙げることができる。また、スラウストキトリウム属の細胞の具体例としては、Thraustochytrium aureum ATCC 34304、Thraustochytrium striatum ATCC 24473、Thraustochytrium属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））（特開２００５−１０２６８０号公報に記載）などを挙げることができる。
【００２４】
また、Thraustochytrium属ＬＦＦ１株（特開２００５−１０２６８０号公報）は、例えば、次のようなスクリーニング法に従って選択することもできる。先ず、採取した海水を０.４μmの滅菌フィルターを用いて濾過および集菌し、このフィルターを９０％天然海水、グルコース、酵母エキス、ペプトンよりなる寒天培地上に張り付け、２０〜３０℃で培養する。この寒天平板培地のフィルター上に形成したコロニーを、上記と同じ組成の寒天培地上で培養し、得られた菌体をスパーテルで採取し、常法に従って菌体から脂肪酸を直接メチルエステル化し、その組成をガスクロマトグラフィーで分析し、ドコサヘキサエン酸を産生している菌株を選択する。さらに、菌体内に油脂を乾燥菌体あたり１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上の量で蓄積し、そして／または油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有する菌株を選択することができる。
【００２５】
Schizochytrium sp CB15-5は、Thraustochytrium属ＬＦＦ１株ととほぼ同等の性質を有するので、同様の取扱が可能である。
【００２６】
本発明のベクターによるラビリンチュラ類の形質転換は、エレクトロポレーション、遺伝子銃、細胞膜の薬剤処理、リン酸カルシウムトランスフェクション、又はＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション等により行うことができるが、好ましくは、エレクトロポレーションにより行うことができる。
【００２７】
また、形質転換の効率の面から言うと、定常期に達した培養液から採取したラビリンチュラ類細胞に、導入遺伝子を含む本発明の組み換えベクターを導入することが好ましい。例えば、本明細書の実施例では２日程度で定常期に達する株を用いており、この場合には、３〜４日間培養したラビリンチュラ類細胞に、導入遺伝子を含む本発明の組み換えベクターを導入することが好ましい。
【００２８】
形質転換体の選別は、本発明のベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の発現を指標として行うことができる。例えば、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、その薬剤を含有する培地中で培養することにより、当該選択マーカーを有する形質転換体のみを選別して取得することができる。
【００２９】
形質転換体を培養する培地としては、公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプンなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０〜３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、炭素源濃度の異なる２種類の培地を用いて培養を行うことができ、例えば、炭素源濃度が４％以上７％以下の培地で培養した後、炭素源濃度が１３％以上２０％以下の培地で引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、油脂の生産量を増大させることができる場合がある。
【００３０】
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素を使用することができる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【００３１】
また、ドコサヘキサエン酸の産生を促進することを意図する場合には、ドコサヘキサエン酸の前駆体を培地に添加することができる。前駆体としては、テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカンなどの炭化水素、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸などの脂肪酸、またはその塩(例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩)、脂肪酸エステル、または脂肪酸を構成成分として含む油脂(例えば、オリーブ油、大豆油、綿実油、ヤシ油)などを挙げることができるが、これらに限られるものではない。
【００３２】
上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０〜９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
【００３３】
菌の培養温度は一般的には１０〜４５℃であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養温度は、目的油脂組成を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは一般的には３．５〜９．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なる。
培養期間は、例えば３〜７日間とすることができ、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で培養を行なうことができる。
【００３４】
このようにして、培養物中に所望の脂質や脂肪酸を高濃度に蓄積した菌体を得ることができる。培養物から培養液と菌体とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができ、特に遠心分離法が好適である。
【００３５】
上記の培養物から分離した菌体を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、所望の脂質や脂肪酸を得ることができる。
【００３６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、モデル宿主として、高増殖かつ高脂質蓄積性のSchizochytrium sp.CB15-5 を用いた。また、導入遺伝子の安定保持のため、相同組換えによる遺伝子導入を行うこととし、まず確実に働くpromoter と選択マーカー遺伝子を持つ導入プラスミドを作製し、導入法の検討を行うことにした(図１) 。
【００３８】
（Ａ）材料及び方法
（１）使用菌株
Schizochytrium 属CB15-5 株
【００３９】
（２）菌体培養
GPY medium (pH 7.4)
3.0％ D-Glucose
1.5％ Polypepton
0.5％ Yeast Extract
50.0％ Sea water
【００４０】
GPYS medium (pH 7.4)
3.0％ D-Glucose
0.6％ Polypepton
0.2％ Yeast Extract
50.0％ Sea water
50 mM sucrose
【００４１】
振盪培養槽Bio-Shaker BR-300 CF (TAITEC)
温度 : 28 ℃
振盪速度: 170 min-1
前培養時間：1日
本培養液時間：1〜4日
培養温度：28 ℃
【００４２】
（３）CB15-5 株のゼオシンに対する感受性試験
前培養まで行った菌体を1000 倍希釈し、ゼオシンの濃度が0〜50μg/ml となるGPY プレート培地に100μl まき、72時間, 28 ℃に遮光してインキュベートし、コロニー数とコロニーの大きさを測定した。
【００４３】
（４）ラビリンチュラ類からのgenome DNA 抽出
１日の本培養後の菌体5 ml を15 ml のファルコンチューブに入れ遠心分離で集菌し、冷PBSで洗浄したあとTNE buffer ( 10 mM Tris-HCl / pH 7.5 + 0.1 M NaCl + 0.1 mM EDTA ) 5ml を加え、voltex で懸濁した。次に10％ SDS (フィルター滅菌済み) を50μl, 20 mg / mlのProteinaseK を25μl 加え、手でおだやかに転倒攪拌した。これを60 ℃の恒温器にいれ２時間放置した。次にフェノールを等量加え(フェノールは8-ヒドロキシキノリンを加え、1 M Tris-HCl でpH 8.0 に平衡化したもの) 、おだやかに20分転倒攪拌した後、3000 rpmで15分遠心分離した。上清を先端を切ったチップで新しいファルコンに入れ、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：1) を等量加え、おだやかに20分転倒攪拌した後、3000 rpm で15分遠心分離した。上清を1.5 ml 容のマイクロチューブに小分けし、それぞれに等量の冷イソプロパノ-ルを加えておだやかに転倒攪拌した後、15000 rpm で15分遠心分離した。上清を捨て、70％冷却エタノールを500μl 加え、15000rpm で5分遠心分離した。上清を捨て、DNA をスピードバックで5分乾燥させた後、TE buffer (10 mM Tris-HCl / pH 7.5 + 1 mM EDTA ) を200μl 加えてDNA を溶かし、さらにRNase (1 mg / ml ) 溶液を2.5μl 加えて、これを37 ℃で1時間反応させた。すべてのチューブの溶液を1 本のチューブにまとめ、これに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：1) を加えておだやかに5 min 転倒攪拌した後、15000 rpm で5 分遠心分離した。この操作を2 回繰り返した。上清を1.5 ml のマイクロチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム40μl (1/10 容) と等量の冷エタノール1 ml を加えておだやかに転倒攪拌した後、15000 rpm で10分遠心分離した。上清を捨て、70％冷却エタノールを700μl 加え、15000 rpm で5分遠心分離した。上清を捨て、DNA をスピードバックで5分乾燥させた後、TE buffer を200μl 加えてDNA を溶かし-20℃で保存した。
【００４４】
（５）PCR 法による18S rRNA 遺伝子の単離
ＰＣＲ条件
プライマー18S1,18S12 各0.5μM
genomic DNA 500 ng
10×Ex taq buffer 5 μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq (5 units/μl) 0.25 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0μl
【００４５】
サーマルサイクラー
95 ℃ 5 分の後、（95 ℃ 30 秒、55 ℃ 30 秒、72 ℃ 1 分）を35サイクル
【００４６】
（６）PCR 産物の精製
PCR精製キット< Marligen Rapid PCR Purification System (Marligen) > を用いて精製した。
【００４７】
（７）クローニング
ライゲーション
Vector 5 ng
インサートDNA 5 ng〜50 ng
2 × Rapid ligation buffer 5.0μl
T4DNA Ligase (3 unit/μl) 1.0μl
滅菌水q.s.
Total 10.0μl
↓
16℃で一晩
【００４８】
トランスフォーメーション
ライゲーションを行ったDNA 溶液10μl にコンピテントセル100μl を加え、5分氷冷後37 ℃,3分インキュベート(heat shock) し、直ちに氷上に戻し5分おいた。この菌体懸濁液をあらかじめIPTG (100 mM) 40μl, X-gal (20 mg/ml) 40μl をスプレッドしておいたLB 培地(50μg/ml ampicillin) にまき、37 ℃, 12時間培養した。
【００４９】
（８）プラスミド抽出
プラスミド抽出キット< Marligen Rapid Plasmid System (Marligen) > のprotocol に従って行った。
【００５０】
（９）シークエンス反応プロトコール
<DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit ( Amersham Biosciences ) > 及び
AutoSeq G-50 ( Amersham Biosciences ) のprotocol に従って行った。シークエンス解析は、< ABI PRISMR310 Genetic Analyzer ( Biosystem ) > により、操作ガイドに従って行った。
【００５１】
増幅及びシークエンスに使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列 (5'-3')
18S-1 CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA （配列番号１１）
18S-2 CATTCAAGTTTCTGCCCTATC  （配列番号１２）
18S-3 CAGGCTCCCTCTCCGGAATC  （配列番号１３）
18S-4 GCAGCCGCGGTAATTCCAGC  （配列番号１４）
18S-5 ACTACGAGCTTTTTAACTGG  （配列番号１５）
18S-6 GTCAGAGGTGAAATTCTTGG  （配列番号１６）
18S-7 TCCTTGGTAAATGCTTTCGC  （配列番号１７）
18S-8 GGATTGACAGATTGAGAGCT  （配列番号１８）
18S-9 AACTAAGAACGGCCATGCACC  （配列番号１９）
18S-10 AGGTCTGTGATGCCCTTAGA  （配列番号２０）
18S-11 CGTTTACTAGGAATTCCTCG  （配列番号２１）
18S-12 CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT  （配列番号２２）
【００５２】
（１０）系統学的解析
系統樹は、neighbor-joinig (NJ) 法 (Saitou and Nei 1987)とmaximun-likelihood (ML)
法(Felsenstein 1981) を用いて作成した。NJ 分析はPAUP version 4.0d64 (Swofford 1998) を用いて行った。距離は、Felsenstein's (1984) (F84) model を用いたML method により見積もった。
【００５３】
（１１）18S rRNA 遺伝子のInverse PCR
遺伝子配列上にない酵素を選択し、その酵素でgenome を完全消化した。次にそのサンプルにLigase を加えて反応させ、self ligation genome を作製した。self ligation genome を鋳型に、遺伝子特異的の逆向きprimer を用いてPCR を行った。
【００５４】
選択した制限酵素：Nhe I
ＰＣＲ条件
プライマー18SF3,18SR3 各0.5 μM
self ligation genomic DNA 100 ng
10×La PCR buffer 5 μl
dNTP 0.4mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００５５】
サーマルサイクラー
94 ℃ 2分の後、（94 ℃ 20秒、68 ℃ 分、72 ℃ 10分）を２５サイクル
【００５６】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
18SF TACACTGATGGGTTCATCGG  （配列番号２３）
18SR CCCGTTATAGTCACCGTAGT  （配列番号２４）
【００５７】
（１２）ゲル抽出
ゲル抽出キット< Marligen Rapid Gel Extraction System (Marligen) > を用いて精製した。
【００５８】
（１３）ラビリンチュラ類からのtotal RNA 抽出
1日の本培養後の菌体(1〜5 g)を集菌し、適量の液体窒素、Trisol (GIBCO) 5 ml を加え石英砂により粉状になるまで破砕した。そこへ60 ℃に保温しておいた5 ml のTrisol を加えvortex で30秒攪拌し、15分, 60 ℃でインキュベートした。その後遠心分離(14,000 rpm, 15分, 4 ℃) し、その上清を1.5 ml マイクロチューブに1 mlずつ分注し、各チューブに200μl ずつクロロホルムを加え、5分室温でインキュベートした後、vortex でエマルジョンになるまで激しく攪拌した。その後、遠心分離(14,000 rpm, 15分, 4 ℃) し、2 層に分かれた上層部分を別のマイクロチューブにとり、それに500μl のイソプロパノールを加え10分、室温で静置し、遠心分離(14,000 rpm, 10分, 4 ℃) した。上清を除き、残存した沈殿に300μl の氷冷した4 M LiCl を加え、ピペッティングにより溶解し、遠心分離（6,500 rpm,10分, RT）した。上清を除き沈殿物に200μl の0.5％ SDS-TE buffer と200μl のクロロホルムを加えvoltex で攪拌した後、遠心分離(6,500 rpm, 5分, RT) した。上層の水層部分を別のマイクロチューブにとり1/10 量の3 M 酢酸ナトリウムと2.5 倍量のエタノールを加え5 min 静置した後、遠心分離(14,000 rpm, 10分, 4 ℃) した。上清を除き沈殿したRNA に75％エタノールでリンスし、風乾後DEPC 処理水に溶解しtotal RNA サンプルとした。
【００５９】
（１４）cDNA の合成
3' RACE システム<3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endsz ( Invitrogen ) >のprotocol に従って行った。
【００６０】
（１５）PCR 法によるactin, elongation factor 1α, gapdh の各遺伝子の単離
ＰＣＲ条件
プライマーactin (a2, a6)、ef1α (ef2, ef5)、gapdh (g1, g4) 各々0.5 μM
cDNA 50 ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００６１】
サーマルサイクラー
94 ℃ 2分で後、（94 ℃ 20秒、64 ℃ 5分、72 ℃ 10 分）を３０サイクル
【００６２】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
a2 GCTCCTCGCGCTGTGTTCCC  （配列番号２５）
a6 GAAGCACTTGCGGTGGACAAT  （配列番号２６）
ef2 ACCACCACTGGTCACCTGAT  （配列番号２７）
ef5 ACGTTGAAGCCCACGTTGTC  （配列番号２８）
gap1 GGTATCAACGGCTTTGGCCGCA  （配列番号２９）
gap4 ACCTTGCCCACAGCCTTGGC  （配列番号３０）
【００６３】
（１６）3'RASE actin,elongation factor 1α,gapdh の各遺伝子
3' RACE システム< 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endsz ( Invitrogen )> のprotocol に従って行った。
GSP1-プライマー  actin ( a1 ), ef1α ( ef2 ), gapdh ( gap2 )
GSP2-プライマー  actin ( AF ), ef1α( EF ), gapdh ( GF )
【００６４】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
a1 GACAACGGTTCCGGTATGTGC  （配列番号３１）
AF GGTTATCATGGTCGGCATGG  （配列番号３２）
ef2 ACCACCACTGGTCACCTGAT  （配列番号３３）
EF CTCAAGGCCGAGCGTGAGCG  （配列番号３４）
gap2 AACGGCTTTGGCCGCATCGGTCG  （配列番号３５）
GF GCCTCCTGCACCACTAACTG  （配列番号３６）
【００６５】
（１７）5'RASE actin,elongation factor 1α,gapdh の各遺伝子
5' RACE、バージョン2.0 システム< 5' RACE System, Version 2.0 ( Invitrogen ) > のprotocol に従って行った。
GSP1-プライマー actin ( a8 ), ef1α ( ef7 ), gapdh ( gap4 )
GSP2-プライマー actin ( AR ), ef1α ( e9 ), gapdh ( GR )
GSP3-プライマー actin ( a11 ), ef1α ( ER ), gapdh ( g8 )
【００６６】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
a8 AGCGAGGCGCATCTCCTCGT  （配列番号３７）
AR ACGCGGAGCTCGTTGTAGAA  （配列番号３８）
a11 GGTCACGATACCGTGCTCAA  （配列番号３９）
ef7 GTACTCAGTGAAGGACTCAACG  （配列番号４０）
e9 CGTAGCCAGCGCGGATCTCA  （配列番号４１）
ER GGCAACATCGGCCTGGGAGG  （配列番号４２）
gap4 ACCTTGCCCACAGCCTTGGC  （配列番号４３）
GR CCAGCACGCCAGTCCTTTCC  （配列番号４４）
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT  （配列番号４５）
【００６７】
（１８）real time PCR 法を用いたactin,ef1α,gapdh の各遺伝子の発現の確認
（ｉ）標準曲線用standard sample の調製
PCR法により各遺伝子の特異的primerを用いて増幅させた断片をゲル抽出し、吸光度計を用いて濃度を測定し、1μg/mlのstandard sampleを作製した。各sampleにおいて1×10-3〜10-6μg/mlまでの希釈系列を作製し実験に用いた。
【００６８】
ＰＣＲ条件
プライマー actin ( a7, a8 )、ef1α ( e8, e9 ) 、gapdh ( g7, g8 )  各0.5μM
cDNA 100 ng
10×Ex taq buffer 5μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq(5 units/μl) 0.25μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００６９】
サーマルサイクラー
94 ℃ 2分の後、（94 ℃ 30秒、57 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒）を３０サイクル
【００７０】
（ｉｉ）cDNA sample の調製
4.5μg のtotal RNA からsuper scriptIIによりcDNA ( 0.2μg/ml )を合成し、そのsample をCO とした。ゲノムのコンタミを考慮して、同じ操作で、super scriptIIの代わりに滅菌水を使用したsample をCX とした。各sample を10 倍希釈して実験に用いた。
【００７１】
（iii）real time PCR
（Light-Cycler-FastStart DNA マスターSYBR Green I < Roche > ) のprotocol に従い、standard sample 及びcDNA sample をreal time PCR を行った。
【００７２】
ＰＣＲ条件
プライマー actin (a7, a8)、ef1α (e8, e9) 、gapdh (g7, g8)各々0.5μM
CO, CX, 各standard sample 2μl
MgCl2 Stock Sol. 1.6μl
LD-DNA Master Sybr Green 2μl 
滅菌水q.s.
Total 20.0μl
【００７３】
CO=cDNA (0.02 μg/ml )
S10-3=standard (1×10-3 μg/ml)
S10-4= standard (1×10-4 μg/ml)
S10-5= standard (1×10-5 μg/ml)
S10-6= standard (1×10-6 μg/ml)
【００７４】
サーマルサイクラー
95 ℃ 10 分(変性)
↓
95 ℃ 10 s (PCR)
65 ( actin ), 60 ( ef1 ), 63 ( gapdh ) ℃ 5秒
72 ℃ 10 秒
87 ( actin ), 84 ( ef1 ), 88 ( gapdh ) ℃ 1秒（33 サイクル）
↓
95 ℃ 0秒 (融解)
70 (actin) , 65 (ef1) ,68 (gapdh) ℃ 15 秒
95 ℃ 0 秒
【００７５】
増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
a7 GGCCGTGACCTCACTGACTA (アクチンのreal time PCR)（配列番号４６）
a8 AGCGAGGCGCATCTCCTCGT (アクチンのreal time PCR)（配列番号４７）
e8 TTGGCTTCAACGTCAAGAAC (ef1αのreal time PCR) （配列番号４８）
e9 CGTAGCCAGCGCGGATCTCA (ef1αのreal time PCR）（配列番号４９）
g7 GACGCCTCGTGTTCCGCACG (gapdhのreal time PCR)（配列番号５０）
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT (gapdhのreal time PCR) （配列番号５１）
【００７６】
（１９）Inverse PCR 法を用いたactin, ef1α, gapdh の各遺伝子のプロモーター及びターミネーターの獲得
遺伝子配列上にない酵素を選択し、その酵素でgenome を完全消化した。次にそのサンプルにLigase を加えて反応させ、self ligation genome を作製した。self ligation genome を鋳型に、遺伝子特異的の逆向きprimer を用いてPCR を行った。
選択した制限酵素：actin (Kpn I, Nhe I, EcoR I) , ef1α(Hind III, Nhe I, EcoR I) , gapdh(Kpn I, Hind III, Nhe I)
【００７７】
ＰＣＲ条件
プライマー actin (a9, AR)、ef1α (e10, ER)、gapdh (g9, g8)  各々 0.5μM
酵素はLa Taq を使用し、上記の18S rRNA gene のprotocol と同じ条件で行った。
【００７８】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
a9 ATCTCCAAGCAGGAGTACGA (Inverse PCR of actin) （配列番号５２）
AR ACGCGGAGCTCGTTGTAGAA (Inverse PCR of actin) （配列番号５３）
e10 GGTGTCATCAAGGAGGTTGA (Inverse PCR of ef1α) （配列番号５４）
ER GGCAACATCGGCCTGGGAGG (Inverse PCR of ef1α) （配列番号５５）
g9 CTCATCAGCTGGTACGATAA (Inverse PCR of gapdh) （配列番号５６）
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT (Inverse PCR of gapdh) （配列番号５７）
a12 TGAACTTCGTCGTCAGCCAT (sequencing of actin) （配列番号５８）
a13 TCCACCGCAAGTGCTTCTAA (sequencing of actin) （配列番号５９）
ae14 TGTGCGTCTAGTCCAACCTT (sequencing of actin) （配列番号６０）
ak14 TTGGAAGACGCTCCTAGTAG (sequencing of actin) （配列番号６１）
ak15 GACTTCAACTATGTCCAGGC (sequencing of actin) （配列番号６２）
ak16 GTAGTCAGAGGTACTGAGTT (sequencing of actin) （配列番号６３）
ak17-2 CATGTGGTTATGTAGAACGGCA (sequencing of actin) （配列番号６４）
ak18 AGTATCTCGTGAAAGCGGGA (sequencing of actin) （配列番号６５）
e12 TGCTCCTTCGTCTTGCCCAT (sequencing of ef1α) （配列番号６６）
e13 TATGAAGCTAGGATGTGCGT (sequencing of ef1α) （配列番号６７）
e14 CACCTACCTTGGCTCCTCGT (sequencing of ef1α) （配列番号６８）
e15 CGATATCGCAACTGTGTCGA (sequencing of ef1α) （配列番号６９）
en16 GAAAACGTTGGAGAGCCTGA (sequencing of ef1α) （配列番号７０）
e17 ACAGTGACGGTATCTCTGCT (sequencing of ef1α) （配列番号７１）
en18 ACCGTAACGGCCATAAGAAG (sequencing of ef1α) （配列番号７２）
g12 ATAGGTGCGTCGGCAGACAT (sequencing of gapdh) （配列番号７３）
g13 TAAGCACTGAAGAAGCGAGT (sequencing of gapdh) （配列番号７４）
g14 CGTACCAGTCGGAACCTCTG (sequencing of gapdh) （配列番号７５）
g15 CTTAGGGCTCATCGTCAACA (sequencing of gapdh) （配列番号７６）
gh16 ACAGCACGCCTTACTTACCT (sequencing of gapdh) （配列番号７７）
g17 CCTTCAATCCTAAACACCATGC (sequencing of gapdh) （配列番号７８）
gh18 TGAGGAGAACTGCAAGCACC (sequencing of gapdh) （配列番号７９）
【００７９】
（２０）導入プラスミドの構築
（ｉ）insert の作製
各断片をPCR により増幅し、ゲル抽出して濃度を測定した。各遺伝子のターミネーターはSal I とSph I で消化し、PCR 精製キットで精製した。18S rRNA gene は、一度pUC18 にサブクローニングし、次に精製したプラスミドをKpn I で消化し、ゲル抽出した。
【００８０】
プロモーター、ターミネーター及び18S rRNA遺伝子のＰＣＲ条件
プライマー
actin プロモーター (pAF, zAR)
ef1α プロモーター (pEF, zER)
gapdh プロモーター (pGF, zGR)
actin ターミネーター (salAF, sphAR)
ef1α ターミネーター (salEF, sphER)
gapdh ターミネーター (salGF, sphGR)
18srRNA遺伝子(kpn18rF, kpn18rR)    各々50 pmol
genomic DNA 100 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００８１】
ブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子のＰＣＲ条件
プライマー
actin (aZF, pZR)
ef1α (eZF, pZR)
gapdh (gZF,p ZR) 各々50 pmoll
pPhaT1 20 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００８２】
プロモーター及び18S rRNA遺伝子のサーマルサイクラー
（98 ℃ 15 秒、63 ℃ (プロモーター)又は65 ℃ (18S rRNA) 2秒、74 ℃ 30秒）を２５サイクル
【００８３】
ターミネーター及びブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子のサーマルサイクラー
（98 ℃ 15秒、68 ℃ 30秒）を２５サイクル
【００８４】
増幅及びシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
pAF TCGAGCTCGGTACCCCTTCATACTCTCGCATTTCC（配列番号８０）
zAR TTGGCCATTTTGCTAGTTGGGTGCTTGTTCTT（配列番号８１）
pEF TCGAGCTCGGTACCCTCATGCTCCTTTCCCGCCAA（配列番号８２）
zER TTGGCCATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTTCGA（配列番号８３）
pGF TCGAGCTCGGTACCCTTGATCTTGTGAGGGCTCCA（配列番号８４）
zGR TTGGCCATTTTGCTTGGTGTTTATGTGTGCGC（配列番号８５）
aZF CTAGCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT（配列番号８６）
eZF CAAACAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT（配列番号８７）
gZF CAAGCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT（配列番号８８）
pZR CTCTAGAGGATCCCCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA（配列番号８９）
salAF AGAGTCGACATTGGAGTGATGGAATGCCC（配列番号９０）
sphAR CTTGCATGCTGTTGAAAGAGCTGAGGCCA（配列番号９１）
salEF AGAGTCGACGTGGTTTGACCTCTTATACT（配列番号９２）
sphER CTTGCATGCGTTTCCCAACTCACGTTGTG（配列番号９３）
salGF AGAGTCGACATGTACCCAATACCACACCG（配列番号９４）
sphGR CTTGCATGCCTTGAAGCACTAGAAGAGCA（配列番号９５）
kpn18rF CGGGGTACCCCAGTAGTCATATGCTCGTC（配列番号９６）
kpn18rR CGGGGTACCCCTTGTTACGACTTCACCTT（配列番号９７）
【００８５】
（ii）作製の流れ
（ａ） pUC18 はSma Iで消化し、ゲル抽出したのち濃度を測定した。(BD In-FisionTM
Dry-Down PCR Cloning Kit <BD Biosciences> ) のprotocolに従い、各遺伝子プロモーターとブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子をFausion EnzymeをもちいてpUC18 のSma I部位に導入した。次に、シークエンスによりブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子に変異がないことを確かめた。
【００８６】
（ｂ）（ａ）でできた各遺伝子プロモーターとブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子をもつプラスミド(pAPZ (4568 bp) , pEPZ (4547 bp) , pGPZ (4418 bp) ) を、Sal I とSph I で消化し、ゲル抽出し、Ligase をもちいて、プロモーターに対応するターミネーターを導入した。
【００８７】
（ｃ）（ｂ）でできた各遺伝子プロモーターとブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子とターミネーターを持つプラスミドpAPZT (5562 bp) , pEPZT (5545 bp) , pGPZT (5396 bp) ) を、Kpn I で消化し、ゲル抽出し、Ligase をもちいて18S rRNA gene を導入し、３種類の導入プラスミドprAPZT (5562 bp) <actinプロモーター> , prEPZT (5545 bp) <ef1α プロモーター>, prGPZT(5396 bp) <gapdhプロモーター> とした（図１５）。
【００８８】
（２１）elctroporation 法による遺伝子導入
（i）プラスミドの調製
高速プラスミド大量(midi) 精製システム<PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega) > のprotocolに従ってプラスミドを大量抽出し、吸光度計で濃度を測定した。線状プラスミドサンプルは、Sac llを用いて消化した。10μgのサンプルをEthachinmate (NIPPON GENE) を用いて濃縮し10μlの滅菌水に溶解した。
【００８９】
（ii）細胞の調製(5μm 以下)
本培養液をfilter (5μm <MILLIPORE> ) に通し、遠心(12,000 g, 5 min, 4 ℃) し上清を捨て、BSS buffer (10 mM KCl, 10 mM NaCl, 3 mM CaCl2) を加え、遠心(12,000 g, 5 分,4 ℃) し上清を捨てた。次に50 mM sucroseを加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てる操作を2 回行った。血球計数盤を用いて細胞数を測定し、最後に4×107/ 80μlになるよう50 mM sucroseに懸濁した。
【００９０】
（iii）細胞の調製
本培養液を1.5 ml マイクロチューブに入れ遠心（12,000 g, 5分,4 ℃）し上清を捨て、BSS buffer を加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てた。次に50 mM sucrose を加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てる操作を2 回行った。最後に全量100 μl になるよう50 mM sucrose を加えて、vortex し懸濁した。
【００９１】
（iv）形質転換
調整した細胞80μl とプラスミド10μl を混合して、冷却していたキュベット(2 mm gap <BM 機器> )にいれ、5分(氷上) インキュベートした。次に、キュベットをelectropolation装置(ECM600 <BTX> ) にセットし、200 V, 500 V, 1500 V, 2500 V (50μF,13Ω) の各条件でパルスを1 回かけた。次に、1 ml のGPYS liquid medium を加え、エッペンに移し、28 ℃の湯浴で１時間インキュベートした。その後、遠心（12,000 g, 5分, RT）し、全量100 μlになるよう上清をすてvortex し、100μg/ml のゼオシン含有GPYS培地にまいて、28 ℃で2日間培養した。
【００９２】
（２２）形質転換体のゼオシンに対する感受性試験
前培養まで行った菌体を20 cells/μl に希釈し、ゼオシンの濃度が0-6000μg/mlとなるGPY プレート培地に1μl スポットし、60時間、28℃で遮光してインキュベートした。
【００９３】
（２３）PCR 法を用いた導入遺伝子の確認
ＰＣＲ条件
プライマー  各々0.5 μM
genomic DNA 500 ng
10×Ex taq buffer 5 μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq (5 units/μl) 0.25 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００９４】
サーマルサイクラー
94 ℃ 2分の後、（94 ℃ 30秒、68 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒）を３０サイクル
【００９５】
増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
ZEOF TACCGGTTCAACTGGTCACGGC（配列番号９８）
ZEOR TCAGTCCTGCTCCTCTTCCA（配列番号９９）
【００９６】
（２４）PCR 法を用いた相同組換えの確認
ＰＣＲ条件
プライマー18srDT, ZEOR 各々各0.5μM
genomic DNA 500 ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【００９７】
サーマルサイクラー
94 ℃ 2分の後、（94℃ 20秒、64℃ 5分、72℃ 10分）を３０サイクル
【００９８】
増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
18srDT CGCAGGTTCACCTACGGAAA（配列番号１００）
ZEOR TCAGTCCTGCTCCTCTTCCA（配列番号１０１）
【００９９】
（２５）発現プラスミドの作製
（i）インサートの作製
各断片をPCR により増幅し、ゲル抽出して濃度を測定した。
【０１００】
ラットelongase 2遺伝子のＰＣＲ条件
プライマー epELOF、etELOR 各50 pmoll
pYES2 20 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【０１０１】
ラットelongase 2遺伝子のサーマルサイクラー
98 ℃ 15秒、68 ℃ 30秒を25サイクル
【０１０２】
プロモーター及びターミネーターのＰＣＲ条件
プライマー
ef1αプロモーター <elongase> (psac I EPF, eloEPR)
ef1αプロモーター <elongaseなし> (psac I EPF, etEPR)
ef1αターミネーター <elongese> (eloETF, psac I ETR)
ef1αターミネーター<elongaseなし> (epETF , psac I ETR) 各々0.5μM
genomic DNA 500ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
【０１０３】
プロモーター及びターミネターのサーマルサイクラー
94 ℃ 2分の後、（94 ℃ 30秒、60 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒）を25サイクル
【０１０４】
増幅およびシークエンスのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー
プライマー配列(5'-3')
psac I EPF ATGATTACGAATTCGAATGACTGGCTTCAAGTTTG（配列番号１０２）
eloEPR GACATGTTCATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTT（配列番号１０３）
epELOF CAAACAAAATGAACATGTCAGTGTTGACTTTA（配列番号１０４）
etELOR CAAACCACCTACTCGGCCTTCGTCGCTTTCTT（配列番号１０５）
eloETF CCGAGTAGGTGGTTTGACCTCTTATACTTGATCGA（配列番号１０６）
psac I ETR GATTGACAGATTGAGCTCTCAAACATACAAAAGAATT（配列番号１０７）
etEPR ACCACTTACATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTT（配列番号１０８）
epETF ACAAAATGTAAGTGGTTTGACCTCTTATACTTGAT（配列番号１０９）
【０１０５】
（ii）作製の流れ
gapdhプロモーター、ブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子、ターミネーター、18S rRNA遺伝子を導入したprGPZT (5396 bp) をSac I で消化し、ゲル抽出し濃度を測定した。(BD In-FisionTM Dry-Down PCR Cloning Kit <BD Biosciences> ) のprotocol に従い、ef1 プロモーター<elongase> とラットelongase 2遺伝子とef1ターミネーター<elongase>をFausion EnzymeをもちいてprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPELOT (7999 bp) とした。次に、シークエンスによりラットelongase2遺伝子に変異がないことを確かめた。negative controlとして同様にef1プロモーター<elongaseなし> とef1ターミネーター<elongaseなし> をprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPT (7210 bp) とした（図２０）。
【０１０６】
（Ｂ）結果
（１）CB15-5 株の薬剤感受性試験
選択マーカーを決めるため、DNA 構造破壊物質であるゼオシンに対する薬剤感受性を調べた結果、10〜30μg/ml のゼオシンを含む培地においてコロニー数及びコロニーサイズに関して濃度依存的に減少傾向が見られた(図２）。そこで、選択マーカーとしては、ゼオシンの類似物質であるブレオマイシンに対して耐性を与える遺伝子を用いることにした。
【０１０７】
（２）PCR法による18S rRNA遺伝子の単離
相同組換え遺伝子としては、染色体上に多コピーで存在すると考えられる18Ｓ rRNA 遺伝子を用いることにし、同類株との相同性にもとづいてＰＣＲで単離し、さらにその上流と下流をinverse PCR で単離した(配列番号１） 。それを、他のラビリンチュラ類の18S rRNA 遺伝子と比較するため分子系統樹を作製した結果、ドコサヘキサエン酸の高生産株であるSchizochytrium 属limacinum や、カロテノイド生産株であるSchizochytrium 属KH105 株などと高い相同性を有することがわかった(図３）。
【０１０８】
（３）PCR 法によるアクチン、elongation factor 1α (ef1α)、グリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh) の各遺伝子の単離
ブレオマイシン耐性遺伝子の発現を制御するプロモーター及びターミネーター遺伝子は、恒常的発現が予想されるアクチン、ef1α、gapdh の各遺伝子のものを用いることにした。そこで、まずラビリンチュラにおいて配列情報のないアクチン, ef1α, gapdh の各遺伝子の部分断片を他種生物との相同性にもとづいてCB15-5 株cDNA からＰＣＲ法を用いて取得し、さらに5'RACE及び3'RACE 法により全長を取得した。アクチン遺伝子の塩基配列を配列番号８（コード領域は塩基番号１５０４〜２６３４）に示し、ef1α遺伝子の塩基配列を配列番号９（コード領域は塩基番号１４８７〜２７９１）に示し、gapdh遺伝子の塩基配列を配列番号１０（コード領域は塩基番号１３５８〜２３７７）に示す。それらにコードされるアミノ酸配列について近縁微生物との各々の相同性を調べた結果、高い相同性が得られたとともに、CB15-5の配列の中に各タンパクで保存された領域が存在したので、目的遺伝子が得られたと判断した(図４〜６）。
【０１０９】
（４）Real time PCR法によるアクチン,ef1α,gapdhの各遺伝子の発現の確認
各遺伝子特異的プライマーを用いてCB15-5 株cDNA を用いてSYBER Green によるReal time PCR を行った。得られた各遺伝子の蛍光値データを(Light-Cycler Software Ver.3.5 <Roche> ) のFit Point 法を用いて解析し、standard による標準曲線を作成し、サンプル濃度を算出した(図７〜９) 。そこから得られたサンプル濃度10 × (CO-CX) を各PCR 産物の分子量を用いて、モル濃度を算出した結果、発現量はアクチンが最も多く、次にef1α、gapdh の順であることがわかった(図１０）。アクチンとef1α は少なくとも、gapdh より発現量が多いことがわかりプロモーターとして使用できることが示唆された。また、gapdh も絶対量はわからないが発現は確認できたので、同様にプロモーターを取得することにした。
【０１１０】
（５）Inverse PCR 法によるアクチン,ef1α,gapdhの各遺伝子のプロモーター及びターミネーターの獲得
獲得法としては各遺伝子配列上に認識配列をもたない制限酵素で完全消化したのちself ligation させたgenome DNA を鋳型に、各遺伝子の配列に対応するプライマーを用いて、inverse PCR をおこない得られた断片を配列決定することにした(図１１）。各遺伝子の遺伝子上にない酵素（Kpn I , Nhe I , EcoR I < actin >, Hind III, Nhe I, EcoR I<ef1α>, Kpn I, Hind III, Nhe I <gapdh> ）を３個づつ選択した。それらの各制限酵素で完全消化したのちself ligation させたgenome DNA を鋳型に、上記遺伝子の配列に対応するプライマーを用いて、inverse PCR をおこなった結果、2〜9 Kb のバンドが得られた(図１２）。
【０１１１】
各遺伝子において２つの違う酵素で消化したサンプルのバンド（Kpn I < actin > 4 Kb, EcoR I < actin > 2 Kb, Hind III <ef1α> 5Kb, Nhe I <ef1α> 5 Kb, Hind III <gapdh> 6 Kb, Nhe I <gapdh> 3 Kb）を切り出し、T-vector に組み込んだ。獲得できたプロモーター及びターミネーターの長さを知るために、各々のサンプルの制限酵素地図を作成した(図１３）。その後シークエンス解析をによりそれぞれ0.5〜1.5 Kb のプロモーター及びターミネーター領域の配列情報を得た。アクチン遺伝子、ef1α遺伝子、及びgapdh遺伝子のプロモーター配列を配列番号２〜４に示し、アクチン遺伝子、ef1α遺伝子、及びgapdh遺伝子のターミネーター配列を配列番号５〜７に示す。
【０１１２】
各遺伝子サンプルの配列を比較した結果、ef1α及びgapdh においてはプロモーター及びターミネーター領域共に相同であったが、アクチンにおいては開始コドンから約120 bp のプロモーター領域のみ相同で(図１４）、120 bp 以降のプロモーター及びターミネーターは非相同であった。そこでアクチンにおいては1.5 Kb のプロモーター及び1 Kb のターミネーターが獲得できたKpn I < actin > 4 Kb サンプルの配列を使用することにした。
【０１１３】
（６）Electropolation によるプラスミドの導入
まずef1αのプロモーターを持つ導入プラスミド(図１５) をsacllで線状プラスミドとし、本培養液(3日) を調整し、5μm以下のラビリンチュラ細胞(50 mM sucrose懸濁液<3×107cell/80μl> ) に、200 V, 500 V, 1500 V, 2500 V (50μF, 13Ω) の各条件下でelectropolationにより導入し、100μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。その結果、200 V, 500Vにおいてゼオシン耐性を示すコロニーが得られた。また、500 Vにおいて最も多くのコロニーが得られ、1500 V, 2500 Vでは得られなかった(表１）。そこで、以後の実験は、500 Vで行うことにした。
【０１１４】
【表１】
2006304685.tif 000002
【０１１５】
次に、本培養液(3日)を調整し、5μm以下及び正常のラビリンチュラ細胞(50 mMsucrose 懸濁液) に、ef1αのプロモーターを持つLinerにした導入プラスミドを500 V ,50μF,13Ωの条件下でelectropolationにより導入し、100 μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。サイズを固定しない細胞を用いて導入した結果、同様にゼオシン耐性を示すコロニーが得られたので、以後の実験はサイズを固定せずに行うことにした(表２）。
【０１１６】
【表２】
2006304685.tif 000003
【０１１７】
次に、本培養液(4日)を調整し、正常のラビリンチュラ細胞(50 mM sucrose 懸濁液) に、各遺伝子のプロモーターを持つLinerにした導入プラスミドを500 V, 50 μF,13 Ωの条件下でelectropolationにより導入し、100 μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。決定した条件で3 種類全てのプラスミドを用いて導入した結果、全てのプラスミドを導入したサンプルでゼオシン耐性株が得られた(表３）。
【０１１８】
【表３】
2006304685.tif 000004
【０１１９】
次に、導入する細胞の培養日数による形質転換効率を比較した結果、3 日目から4 日目の細胞が形質転換に適していることが分かった（図１６）。
【０１２０】
次に、本培養液(3日)を調整し、正常のラビリンチュラ細胞(50 mM sucrose 懸濁液) に、各遺伝子のプロモーターを持つLinerにした導入プラスミド及び環状のままのプラスミドを、500 V ,50 μF,13 Ωの条件下でelectropolationにより導入し、100 μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。環状プラスミドを導入した結果、線状プラスミドと同様に、ゼオシン耐性を示すコロニーが得られた(表４）。
【０１２１】
【表４】
2006304685.tif 000005
【０１２２】
次にKH105 株の培養液（１日〜４日目の培養液）を用いて、CB15−5 株同様に導入してみたが、耐性株は得られなかった。
【０１２３】
（７）transformant のゼオシンに対する感受性試験
得られたtransformant のゼオシンに対する感受性を調べた結果、野生型が20μg/mlで完全に生育不能になるのに対し、アクチンでは4000μg/ml, ef1α では6000μg/ml, gapdh では2000μg/ml まで生育可能であった(図１７）。
【０１２４】
（８）PCR 法による導入遺伝子の確認
ブレオマイシン耐性遺伝子が導入されたことを確認するため、得られたtransformant のgenomeDNA を鋳型として、ブレオマイシン耐性遺伝子特異的primer を用いたPCR を行った。その結果、コントロールプラスミドで得られたものと同じサイズのバンドが得られたことから遺伝子導入がされていることがわかった(図１８）。
【０１２５】
（９）PCR 法による相同組換えの確認
18SrRNA 遺伝子座において相同組換えが起こったことを確認するため、ゲノムDNA のみに存在する18SｒRNA 遺伝子下流に対応するプライマーと導入したブレオマイシン耐性遺伝子の特異的プライマーを用いたPCR を行った。その結果、transformant において予想される3600bp にバンドが得られたことから相同組換えによる染色体DNA への遺伝子導入がおこっていることが示された（図１９）。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、ゲノムと相同遺伝子を持つプラスミドとの相同組換えの模式図を示す。
【図２】図２は、Schizochytrium sp. CB15-5のゼオシン感受性を示す。
【図３】図３は、18S rRNA遺伝子の系統樹を示す。
【図４】図４は、推定アミノ酸配列（アクチン）の比較を示す。アクチン遺伝子にコードされるアミノ酸配列について近縁微生物との各々の相同性を調べた。Schizochytrium sp. CB15-5 AB200876(Labyrinthulida)Phytophthora brassicae AY244551-1 (Oomycetes)Fucus distichus U11697 (Phaeophyceae)Saccharomyces cerevisiae V01288-1 (Fungi)Actin proteinで保存された領域(54-64 Actins signiture, 105-117 Actins and actin-related proteins signature, 357-365 Actins signiture)
【図５】図５は、推定アミノ酸配列（ef1α）の比較を示す。ef1α遺伝子にコードされるアミノ酸配列について近縁微生物との各々の相同性を調べた。Schizochytrium sp. CB15-5 AB200877 ( Labyrinthulida )Saccharomyces cerevisiae X78993-28 (Fungi)Phytophathora infestans AJ249839-1 (Oomycetes)Blastocystis hominis D64080-1 (Blastocystis)Ef1a proteinで保存された領域(14-21 ATP/GTP-binding site motif A (P-loop) 61-76 GTPbinding elongation factors signature)
【図６】図６は、推定アミノ酸配列（gapdh）の比較を示す。Gapdh遺伝子にコードされるアミノ酸配列について近縁微生物との各々の相同性を調べた。Schizochytrium sp. CB15-5 AB200878 (Labyrinthulida )Phaeodactylum tricornutum AAF34325 (Bachillariophyta)Phytophathora palmivora AY292378-1 (Oomycetes)Saccharomyces cerevisiae V01300-1 (Fungi)Gapdh proteinで保存された領域(151-158Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenaseactive site)
【図７】図７は、real time PCR (アクチン)解析を示す。PCRサイクルにおける各サンプル蛍光値を示したreal time PCR のデータを(Light-Cycler Software Ver.3.5<Roche>)のFit Point 法を用いて解析し、蛍光値0.3615 におけるStandard sampleのサイクル数を縦軸にとり、濃度のlog値を横軸にとり標準曲線を作成し、それを用いてsampleのサイクル数からsample濃度を算出した。
【図８】図８は、real time PCR (ef1α)解析を示す。PCR サイクルにおける各サンプル蛍光値を示したreal time PCR のデータを(Light-Cycler Software Ver.3.5<Roche>)のFit Point 法を用いて解析し、蛍光値0.1235 におけるStandard sampleのサイクル数を縦軸にとり、濃度のlog値を横軸にとり標準曲線を作成し、それを用いてsampleのサイクル数からsample濃度を算出した。
【図９】図９は、real time PCR(gapdh)解析を示す。PCR サイクルにおける各サンプル蛍光値を示したreal time PCR のデータを(Light-Cycler Software Ver.3.5<Roche>)のFit Point 法を用いて解析し、蛍光値4.8276 におけるStandard sampleのサイクル数を縦軸にとり、濃度のlog値を横軸にとり標準曲線を作成し、それを用いてsampleのサイクル数からsample濃度を算出した。
【図１０】図１０は、クローニングしたイ電子の発現量を示す。得られた各遺伝子のサンプル濃度10×(CO-CX)を各PCR産物の分子量を用いて、発現量(M) を算出し、グラフで示した。発現量(M)=10 (CO-CX) / PCR product MW
【図１１】図１１は、プロモーター及びターミネーター遺伝子の単離を示す。
【図１２】図１２は、Inverse PCR産物を示す。各遺伝子配列上に認識配列を持たない種々の制限酵素で完全消化したのちself ligationさせたgenome DNAを鋳型に、各遺伝子の配列に対応するprimerを用いて、inverse PCR をおこない、そのPCR産物を電気泳動した。
【図１３】図１３は、inverse PCR 産物の構造を示す。Inverse PCRにより得られたバンドを切り出し、T-vectorに組み込んだ。獲得できたプロモーター及びターミネーターの長さを知るために、各々のサンプルの消化に用いた酵素の位置を調べた。
【図１４】図１４は、アクチンプロモーターの塩基配列の比較を示す。アクチンプロモーター(Kpn I)とアクチンプロモーター(EcoR I)の500 bpの相同性を調べた。Actin promoter (Kpn I) AB200876
【図１５】図１５は、形質転換ベクターの構築を示す。sacllを導入プラスミドにおいて唯一のサイトとして利用できるように設計し、各遺伝子のプロモーター、ターミネーターのセットとブレオマイシン耐性遺伝子、そして18ＳrRNA遺伝子をpUC18 にクローニングして、導入プラスミドとした。
【図１６】図１６は、形質転換効率に対する培養期間の影響を示す。ラビリンチュラ細胞(50 mM sucrose懸濁液)と線状化したプラスミドをキュベットに加え、500V、13Ω、50μFの条件下でエレクトロポレーションをおこない100 μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。
【図１７】図１７は、形質転換体のゼオシン耐性を示す。前培養まで行った菌体をゼオシンの濃度が0〜6000 mg/mlとなるGPYプレート培地に1μlスポットし、48時間、28℃で遮光してインキュベートした。
【図１８】図１８は、ブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子の検出を示す。得られた各形質転換体のゲノムを鋳型に、ブレオマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてPCRを行った。
【図１９】図１９は、18SｒRNA遺伝子座における導入遺伝子の検出を示す。18SrRNA遺伝子座において相同組換えが起こったことを確認するため、ゲノムDNAのみに存在する18SｒRNA遺伝子下流に対応するprimerと導入したブレオマイシン耐性遺伝子の特異的プライマーを用いたPCRを行った。
【図２０】図２０は、発現ベクターの構築を示す。ef1プロモーター(300bp) とラットelongase 2遺伝子とef1ターミネーター(300bp) をprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPELOT (7999bp) とした。negative controlとして同様にef1プロモーターとef1ターミネーターをprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPT (7210bp) とした。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.Ltd.,
<120> A vector capable of transforming labyrinthulida
<130> A51366A 
<160> 109
<210> 1
<211> 1787
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 1
aaacatagca attctggttg atcctgccag tagtcatatg ctcgtctcaa agattaagcc 60
atgcatgtgt aagtataagc gattgtactg tgagactgcg aacggctcat tatatcagta 120
ataatttctt cggtagtttc ttttatatgg atacctgcag taattctgga aataatacat 180
gctgtaagag ccctgtctgg ggctgcactt attagattga agccgatttt attggtgaat 240
catgataatt gagcagattg acttttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc 300
agttgtcgac ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc 360
tcgactccgg agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg 420
taaattaccc actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta 480
tgcgctttgc tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc 540
aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc 600
agttaaaaag ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg 660
attgattgtc tgtgttgcct tggccatctt tctcatgcta ttttggtatg agatctttca 720
ctgtaatcaa agcagagtgt tccaagcagg tcgtatgacc ggtatgttta ttatgggatg 780
ataagatagg acttgggtgc tattttgttg gtttgcacgc ctgagtaatg gttaatagga 840
acagttgggg gtattcgtat ttaggagcta gaggtgaaat tcttggattt ccgaaagacg 900
aactagagcg aaggcattta ccaagcatgt tttcattaat caagaacgaa agtctgggga 960
tcgaagatga ttagatacca tcgtagtcta gaccgtaaac gatgccgact tgcgattgtt 1020
gggtgcttta tacatgggcc tcagcagcag cacatgagaa atcaaagtct ttgggttccg 1080
gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag 1140
tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacataggta 1200
ggattgacag attgagagct ctttcatgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1260
gttggtggag tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat 1320
agtgcgtggt atggcaacat agtgcgtttt tacttcttag agggacatgt ccggtttacg 1380
ggcaggaagt tcgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440
gcgctacact gatgggttca tcgggtttta attctgtttt tatggaattg agtgcttggt 1500
cggaaggcct ggctaatcct tggaacgctc atcgtgctgg ggctagattt ttgcaattat 1560
taatctccaa cgaggaattc ctagtaaacg caagtcatca gcttgcattg aatacgtccc 1620
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgcacct accgattgaa cggtccgatg aaaccatggg 1680
atgtttctgt ttggattcat ttttggacag aggcagaact cgggtgaatc ttattgttta 1740
gaggaaggtg aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcggaa               1787
<210> 2
<211> 1503
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 2
cttcatactc tcgcatttcc taatttattt gagcacgagc caacacaagc tccctcgtaa 60
gagaaggtag taggtacttt agcagtgagc atctgggtag aggtatctgc cttctaatat 120
cacctacctc aaggtccgtg ccacgcgcga gggaactctg aagaagacta gaagtgcact 180
actactccac gagggaatcc cgctttcacg agatactcaa cttggactat caacgacata 240
cattctcagc cagtaggcac ccagcactct gtagtagctg tacctaatgg aagactagat 300
gctctgacac tcaacttacc tacttctgtt tctgcggtgt ggaatatcgc agttattaac 360
taaaaacagg ataaaaatga gaatactatg taagtttaat ttattattag tagcaatcat 420
atctcatata tggaatcttt ttctaaagat aaagcaaaaa caaacattat tttggaaata 480
aaaagagttg ttaatcaaag cgtaagacgt cctatacagc tgcctgtatg atgggacatt 540
aggtataaat tggtcctaag aaggttcacc caagtcattg gccattcaag ttgagtaaag 600
ctaagtgatt caagttgttt tgaccttgag ttttttaccg caagttaaaa gatctcaact 660
cagtacctct gactacctcg tgagagtggc cattggcttt tgatatttac ttgtgtaaga 720
agagttcctc ccgacggcag gtgggcagta gtacctacca ataggagaag cgctgcgtgc 780
tattcctgaa gtacacacca cgtaggtgag tgagttttat tattcttttt attttaaaca 840
tagtgtgtat gaagcttact atagttagtt aattttagaa ataccatacc ataatatatc 900
atctttatat agtcgggata caacagaaaa gggcaatgaa aatcgacttt gggcgggcga 960
gtgaaggcga gagtccgcag ctgctctggc cttcgggtcg tgtccgcact cacattggta 1020
gtctgtagac atgatttgga ccttctgtag gcagagagta cctactagga gcgtcttcca 1080
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gatagaggta tctctcacaa acactgtaaa tagttttgtg agtaaataca cacacgagca 1260
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aggaacctac gactaagaag gttatcataa atggatgtaa tcagaggagg taacactgta 1380
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aaa                                                               1503
<210> 3
<211> 1486
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 3
tcatgctcct ttcccgccaa aaagaaagaa gaggaaagca ccccgaagaa aagaaagaaa 60
tcacccaaac accctcctcc ttcctcgtcc acagacagct cagaataatg aaagctatct 120
ttccatcgct cttgacctaa ctctctttct gctcctgtaa attcatccaa caaatgttta 180
gtctcagaaa cccttctgcc tcatactact acttactacc ttccttactt gaaagcaggc 240
aggctcacgg ccagcttggc agataggata gttctcatat ctattgctga tcgttcccgt 300
ttctttctca aagcaaagtc ttttctcttc aattcctttt ctttttcttt tcttttcagg 360
ctctccaacg ttttcaggag tagtacattt tctacttagt aattagaaag cttagtactt 420
tttgcttttc tggattctga agacttggaa atagaaagaa attaaaaatc tttttcttct 480
ttctttcagc ctttgctgga ctccctcgca cgcctccttc ttccccagcc atccatcagc 540
ggcactccac ccgcgcttca acgctcgctc gagtgcgtgc ttatttgcct tcaacgcggc 600
gcggcggtta atatagtccc agcactcctt aaggggggca tcgcagggat taccttttta 660
aaacctgtca cagaattaca tcttccctcg catcaaagtg ttcccggccg cgtctcacat 720
ctaagtttta taacctacac cccttgtggg gtaggggcga attctatgta cacagcacct 780
cagaacttgc gcgcgttccg tgacaaatga ggggtgtggc ggcgcattcg gccgcatcgc 840
cacattcaga tatctaacat accccccctt cgcgatgagt ggcaggcgag gcgattcggc 900
tcgcgagagg cgaggtgccc acagcagacc agtaacgagg agccaaggta ggtgaccacc 960
gacgactacg accacgacca cgaccacagc cacggcggct gcagccacgg gacgcctcgc 1020
atggcagcgc atcagcacca gcaacgacag ctgcgaggag cgcagggccg atctggacgc 1080
gccggagccg cacgaccaat gccgacgcaa cgctgattct tctggattcc ctctttacat 1140
gcatatatgt gtagaggtgc ggatgaaatg ccctgcgaat aaatgactgg cttcaagttt 1200
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tgtgcttacc tcaccagcac attcttgcaa cgccatacga agcacgcgaa atcttgtggc 1320
tcagagagga aggcattcgt ggtacgggaa cgtggggaac gctatcaatt tagaattgaa 1380
aatgagtgaa ccagacaact aactgtgact tgaactgttg ctccacgcat caaaaccaaa 1440
cctttaacag aagtagacca gttcgaagct actagcacca aacaaa                1486
<210> 4
<211> 1357
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 4
ttgatcttgt gagggctcca ctggaatttt ccgacacaag aaagtgccag tggacaaagg 60
gggaagtggg cctcgaaata gcggtatggt tatgtgaggg atacggggcg gagttccggc 120
gttccctcag gccttcctct ctgcgcctca ggcaagtttc taagaaaagt gcttttggat 180
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gctgtgcggg agcgcccccg gccagtcagt gttggagctt gggatgagtt gcatctgcgc 360
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tgtcttctag gatgcgcgct tttgatgtgc tgaagattcc gagcaccgtg tgctatgccg 600
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ttaggaaaag aaagatactc gtgacgttga aacgtcctgt tctttttctt ttctaagtat 720
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<213> Schizochytrium
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attggagtga tggaatgccc tctccgtgtg gtgtatccga ttgacaaatc ttaaactcct 60
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cttgccgtac atggcggatc ctggcaatca ttttacttgt acagacccaa gactttgtga 2820
gtcagtaaat agtaaagaaa tgcagaataa tcattagata attgcaaaac cctgatcttc 2880
aaaatgttat atcacaagta cctaccaaga catttgtatc ttctttttgt cttatgcatt 2940
tttatttccc ttagcgcaat taaaaatatt aaataactga cgactctttt cttaaggatt 3000
cgcggtttgc tagttgcact attgaaaaga gcacggtatt aatttcatag ttttactttg 3060
ttggcaatct cagcaaacat gggttttaat tttaaaatta aataatactt gtgttagact 3120
caaaagatac ctatacaacc cttagggctc atcgtcaaca tttgcaaatt aaaacgattc 3180
agctcctttg gtacggtcat gtctgtttct gatgcactga aaaaccttgg acgaacgaca 3240
catcttattt tcattaggac atctaaaaaa cgttgtaaag agtatacaat aagcataaaa 3300
aaggagaaga gaaaaaagaa agacatacat ggttctgctc ttctagtgct tcaag      3355
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 11
ccaacctggt tgatcctgcc agta  24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 12
cattcaagtt tctgccctat c     21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 13
caggctccct ctccggaatc      20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 14
gcagccgcgg taattccagc      20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 15
actacgagct ttttaactgg      20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 16
gtcagaggtg aaattcttgg      20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 17
tccttggtaa atgctttcgc      20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 18
ggattgacag attgagagct       20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 19
aactaagaac ggccatgcac c     21
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 20
aggtctgtga tgcccttaga      20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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cgtttactag gaattcctcg      20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 22
ccttgttacg acttcacctt cctct   25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 23
tacactgatg ggttcatcgg         20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 24
cccgttatag tcaccgtagt         20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 25
gctcctcgcg ctgtgttccc         20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 26
gaagcacttg cggtggacaa t       21
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 27
accaccactg gtcacctgat        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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acgttgaagc ccacgttgtc        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtatcaacg gctttggccg ca      22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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accttgccca cagccttggc        20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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gacaacggtt ccggtatgtg c       21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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ggttatcatg gtcggcatgg        20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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accaccactg gtcacctgat        20
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<212> DNA
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ctcaaggccg agcgtgagcg        20
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aacggctttg gccgcatcgg tcg     23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcctcctgca ccactaactg        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ggtcacgata ccgtgctcaa        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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gtactcagtg aaggactcaa cg      22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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accttgccca cagccttggc        20
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<213> Artificial Sequence
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ccagcacgcc agtcctttcc        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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ccatccttga tctcaatagt        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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agcgaggcgc atctcctcgt        20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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ttggcttcaa cgtcaagaac        20
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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cgtagccagc gcggatctca        20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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gacgcctcgt gttccgcacg        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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ccatccttga tctcaatagt        20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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acgcggagct cgttgtagaa        20
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<213> Artificial Sequence
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ggcaacatcg gcctgggagg        20
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ccatccttga tctcaatagt        20
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tccaccgcaa gtgcttctaa        20
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tgtgcgtcta gtccaacctt        20
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ttggaagacg ctcctagtag        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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gacttcaact atgtccaggc        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtagtcagag gtactgagtt        20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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catgtggtta tgtagaacgg ca     22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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tgctccttcg tcttgcccat        20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 82
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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ttggccattt tgtttggtgc tagtagcttc ga            32
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 86
ctagcaaaat ggccaagttg accagtgccg tt            32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 87
caaacaaaat ggccaagttg accagtgccg tt            32
<210> 88
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 88
caagcaaaat ggccaagttg accagtgccg tt            32
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 89
ctctagagga tcccctcagt cctgctcctc ggcca         35
<210> 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 91
cttgcatgct gttgaaagag ctgaggcca             29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 92
agagtcgacg tggtttgacc tcttatact             29
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 93
cttgcatgcg tttcccaact cacgttgtg             29
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 94
agagtcgaca tgtacccaat accacaccg             29
<210> 95
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 95
cttgcatgcc ttgaagcact agaagagca             29
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 96
cggggtaccc cagtagtcat atgctcgtc             29
<210> 97
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 97
cggggtaccc cttgttacga cttcacctt             29
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 98
taccggttca actggtcacg gc                    22
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 99
tcagtcctgc tcctcttcca                      20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 100
cgcaggttca cctacggaaa                      20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 101
tcagtcctgc tcctcttcca                      20
<210> 102
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 102
atgattacga attcgaatga ctggcttcaa gtttg       35
<210> 103
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 103
gacatgttca ttttgtttgg tgctagtagc tt          32（配列番号１０３）
<210> 104
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 104
caaacaaaat gaacatgtca gtgttgactt ta          32
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 105
caaaccacct actcggcctt cgtcgctttc tt          32
<210> 106
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 106
ccgagtaggt ggtttgacct cttatacttg atcga       35
<210> 107
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
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<400> 107
gattgacaga ttgagctctc aaacatacaa aagaatt     37
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 108
accacttaca ttttgtttgg tgctagtagc tt          32
<210> 109
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 109
acaaaatgta agtggtttga cctcttatac ttgat       35
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図１２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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