(57)【要約】      （修正有）【課題】修飾された低分子干渉ＲＮＡの提供。【解決手段】標的細胞、好ましくは肝細胞において、RNA干渉を仲介する二本鎖RNA分子を提供する。また、ウイルス、より具体的にはC型肝炎ウイルスHCVを不活性化する、ヌクレアーゼ分解に耐性であるように修飾された二本鎖RNA分子を提供する。また、哺乳動物細胞においてウイルスを不活性化するためにこれらの修飾RNA分子を用いる方法、およびヒトダイサーを用いて修飾された低分子干渉RNA（ｓｉＲＮＡ）を作製する方法を提供する。【選択図】図６
2006320327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを不活性化するための有効量で修飾siRNAを患者に投与する段階を含む、患者においてウイルスを不活性化する方法。
【請求項２】
修飾siRNAが2'修飾siRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
修飾がsiRNAの少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位に存在する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
修飾が、フルオロ-、メチル-、メトキシエチル-、およびプロピル-修飾からなる群より選択される、請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】
フルオロ-修飾が、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
siRNAのピリミジンが修飾され、かつ該ピリミジンがシトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体、またはそれらの組み合わせである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
siRNAの両方の鎖が少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ウイルスが、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがC型肝炎ウイルスである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
siRNAが以下の段階により調製される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法：
(a)低分子干渉RNA(siRNA)を設計するためにHCVゲノムにおいて標的ヌクレオチド配列を同定する段階；および
(b)少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むように修飾されたsiRNAを作製する段階。
【請求項１１】
siRNAが以下の段階により調製される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法：
(a)低分子干渉RNA(siRNA)を設計するためにウイルスゲノムにおいて標的ヌクレオチド配列を同定する段階；および
(b)少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むように修飾されたsiRNAを作製する段階。
【請求項１２】
標的ヌクレオチド配列が、5'-非翻訳領域(5'-UTR)、3'-非翻訳領域(3'-UTR)、コア、およびNS3ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
siRNAが、siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
siRNAがリボヌクレアーゼに耐性であり、かつウイルス複製を阻害する能力を保持する、修飾リボヌクレオチドを含むsiRNA。
【請求項１５】
修飾siRNAが2'修飾siRNAである、請求項14記載のsiRNA。
【請求項１６】
修飾がsiRNAの少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位に存在する、請求項15記載のsiRNA。
【請求項１７】
修飾が、フルオロ-、メチル-、メトキシエチル-、およびプロピル-修飾からなる群より選択される、請求項14〜16のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項１８】
フルオロ-修飾が、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾である、請求項17記載のsiRNA。
【請求項１９】
siRNAのピリミジンが修飾され、かつ該ピリミジンがシトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体、またはそれらの組み合わせである、請求項14〜18のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項２０】
siRNAの両方の鎖が修飾ヌクレオチドを含む、請求項14〜19のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項２１】
siRNAがウイルスゲノムにおける標的ヌクレオチド配列と相互作用する、請求項14〜20のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項２２】
ウイルスが、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項21記載のsiRNA。
【請求項２３】
ウイルスがC型肝炎ウイルス(HCV)である、請求項22記載のsiRNA。
【請求項２４】
以下の段階を含む、ウイルスにおける核酸配列を標的にする修飾siRNAを作製する方法：
(a)標的因子のゲノムに及ぶ少なくとも1つの鎖において少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含む修飾二本鎖RNA(dsRNA)断片を調製する段階；および
(b)該修飾dsRNA断片を組換えヒトダイサー(Dicer)で切断し、1つより多い修飾siRNAを生じる段階。
【請求項２５】
以下の段階をさらに含む、請求項24記載の方法：
(c)修飾siRNAを単離する段階。
【請求項２６】
標的因子がウイルスである、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
ウイルスが、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ウイルスを不活性化するための有効量で約10〜約30リボヌクレオチドからなる修飾siRNAを患者へ投与する段階を含む、患者においてウイルスを不活性化する方法。
【請求項２９】
修飾siRNAが約19〜約23リボヌクレオチドからなる、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
修飾siRNAが2'修飾siRNAである、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
修飾がsiRNAの少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位に存在する、請求項28〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
修飾が、フルオロ-、メチル-、メトキシエチル-、およびプロピル-修飾からなる群より選択される、請求項28〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
フルオロ-修飾が、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
siRNAのピリミジンが修飾され、かつ該ピリミジンがシトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体、またはそれらの組み合わせである、請求項28〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
siRNAの両方の鎖が修飾ヌクレオチドを含む、請求項28〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスが、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される、請求項28〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスがC型肝炎ウイルス(HCV)である、請求項28〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
siRNAが以下の段階により調製される、請求項28〜37のいずれか一項記載の方法：
(a)低分子干渉RNA(siRNA)を設計するためにHCVゲノムにおいて標的ヌクレオチド配列を同定する段階；および
(b)少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むように修飾されたsiRNAを作製する段階。
【請求項３９】
siRNAが以下の段階により調製される、請求項28〜37のいずれか一項記載の方法：
(a)低分子干渉RNA(siRNA)を設計するためにウイルスゲノムにおいて標的ヌクレオチド配列を同定する段階；および
(b)少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むように修飾されたsiRNAを作製する段階。
【請求項４０】
標的ヌクレオチド配列がHCV複製に必要な保存ヌクレオチド配列を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
保存ヌクレオチド配列が、5'-非翻訳領域(5'-UTR)、3'-非翻訳領域(3'-UTR)、コア、およびNS3ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
siRNAが、siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4である、請求項28〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
C型肝炎ウイルス(HCV)の複製を阻害する約10ヌクレオチドから約30ヌクレオチドまでの二本鎖RNA分子。
【請求項４４】
siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項43記載の二本鎖RNA分子。
【請求項４５】
請求項43または44記載の二本鎖RNA分子を肝細胞へ投与する段階を含む、肝細胞においてHCVに対して標的化RNA干渉を誘導する方法であって、該二本鎖RNA分子のヌクレオチド配列がHCVヌクレオチド配列に対応する方法。
【請求項４６】
請求項43または44記載のRNAポリヌクレオチド分子をC型肝炎ウイルス(HCV)に感染した細胞へ投与する段階を含む、HCVの複製を阻害する方法。
【請求項４７】
請求項43または44記載のRNA分子をコードするDNAセグメントを含むベクター。
【請求項４８】
二本鎖RNA分子のセンス鎖が第一プロモーターに機能的に連結され、かつ二本鎖RNA分子のアンチセンス鎖が第二プロモーターに機能的に連結される、請求項47記載のベクター。
【請求項４９】
第一および第二プロモーターがU6およびH1からなる群より選択される、請求項48記載のベクター。
【請求項５０】
第一および第二プロモーターが同一である、請求項48または49記載のベクター。
【請求項５１】
RNA分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖が単一のプロモーターの制御下にある、請求項47記載のベクター。
【請求項５２】
単一のプロモーターがU6およびH1からなる群より選択される、請求項51記載のベクター。
【請求項５３】
請求項47〜52のいずれか一項記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
請求項47〜52のいずれか一項記載のベクターで細胞をトランスフェクションする段階を含む、C型肝炎ウイルス(HCV)を保有する細胞においてHCVの複製を阻害する方法。
【請求項５５】
C型肝炎の治療を必要とする被検体においてC型肝炎を治療する方法であって、請求項43または44記載のRNA分子を含む組成物を該被検体に投与する段階を含む、方法。
【請求項５６】
C型肝炎の治療を必要とする被検体においてC型肝炎を治療する方法であって、請求項47〜52のいずれか一項記載のベクターを該被検体に投与する段階を含む、方法。
【請求項５７】
標的因子またはウイルスに対してRNA干渉を仲介し、かつ少なくとも1つの受容体結合リガンドに連結されている、約10ヌクレオチド長から約30ヌクレオチド長までの二本鎖RNA分子を含む修飾siRNA分子。
【請求項５８】
受容体結合リガンドがsiRNA分子の5'末端または3'末端に付着する、請求項57記載の修飾siRNA分子。
【請求項５９】
受容体結合リガンドがsiRNA分子の複数の末端に付着する、請求項57または58の修飾siRNA分子。
【請求項６０】
受容体結合リガンドが、コレステロール、HBV表面抗原、低密度リポタンパク質、HIV-1表面抗原、インフルエンザウイルス表面抗原、RSV表面抗原、HPV表面抗原、およびポリオウイルス表面抗原からなる群より選択される、請求項57〜59のいずれか一項記載の修飾siRNA分子。
【請求項６１】
受容体結合リガンドがコレステロールである、請求項57〜60のいずれか一項記載の修飾siRNA分子。
【請求項６２】
少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位において修飾をさらに含む、請求項57〜61のいずれか一項記載の修飾siRNA分子であって、少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位における修飾が該siRNAを分解に対して耐性にする、修飾siRNA分子。
【請求項６３】
少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位における修飾が、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾である、請求項62記載の修飾siRNA分子。
【請求項６４】
請求項57〜63のいずれか一項記載のsiRNAの有効量を患者に投与する段階を含む、患者において標的化RNA干渉を誘導する方法。
【請求項６５】
請求項61記載のsiRNAの有効量を患者に投与する段階を含む、患者において標的化RNA干渉を誘導する方法。
【請求項６６】
請求項63記載のsiRNAの有効量を患者に投与する段階を含む、患者において標的化RNA干渉を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出の分野に関し、およびRNAサイレンシングまたはRNA干渉(RNAi)の現象に関する。RNAサイレンシングは、生物体において非コードRNA分子が特定の遺伝子抑制を仲介する現象を構成する。天然において、その現象は、トランスポゾン、導入遺伝子およびウイルス遺伝子のような外来の侵入する核酸から生物体のゲノムを保護する。
【背景技術】
【０００２】
細胞への二本鎖RNA(dsRNA)の導入は、その時、dsRNAに対応する内因性mRNAを分解し、RNAサイレンシングを引き起こす。RNAサイレンシング経路は、リボヌクレアーゼを相同性mRNA標的へ向ける低分子干渉RNA(siRNA)へのdsRNAの変換を含む(Baulcombeら、2001)。ダイサー(Dicer)と呼ばれる酵素は、dsRNAを20〜25ヌクレオチド長であるsiRNAへプロセシングする。その後、siRNAは、集合して、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られているエンドリボヌクレアーゼ含有複合体を構築する。実質的に、siRNAは、RISCを相補RNA分子へ導き、RISCは標的mRNAを切断かつ破壊する。少量のdsRNAは、RNAサイレンシングの増幅成分により多量の標的mRNAをサイレンシングすることができる(Fireら、Nature、391:806-811 (1998))。
【０００３】
dsRNAがRNAiを通して効率的な遺伝子サイレンシングを生じるという最初の証拠は、線虫カエノルハブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)についての研究から出てきた(Fireら、Nature、391:806-811 (1998)および米国特許第6,506,559号)。ショウジョウバエであるキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)におけるその後の研究では、RNAiが多段階機構であることが実証された(Elbashirら、Genes Dev.、15(2):188-200 (2001))。
【０００４】
dsRNAは哺乳動物細胞において遺伝子特異的干渉を仲介することができるが(Wianny, F.およびZernicka-Goetz, M.、Nature Cell Biol. 2:70-75 (2000)；Svoboda, P.ら、Development 17:4147-4156 (2000))、翻訳因子eIF2aを不活性化し、タンパク質合成の全般的抑制を引き起こし、しばしばアポトーシスを引き起こすdsRNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)の誘発により、哺乳動物体細胞におけるRNAiの使用は、しばしば制限される(Gil, J.およびEsteban, M.、Apoptosis 5:107-114 (2000))。
【０００５】
最近、標的にされたRNAまたはDNA配列に対応する、長さが約21塩基対または22塩基対のsiRNAが、哺乳動物細胞において標的にされた配列の発現を乱すことが示された(Elbashir, S.M.ら、Nature 411:494-498 (2001))。しかしながら、哺乳動物細胞のゲノムのすべてのRNA配列またはDNA配列がsiRNAに対して感受性が高いことは、明らかではない。あらゆる哺乳動物細胞型がsiRNAを用いる遺伝子特異的抑制を実現するための必須の機構を所有していることも不確実である。さらに、siRNAは、少なくとも2つの理由：(a)siRNAが投与された細胞に見られる抑制効果の一過性の性質、および(b)それらの使用の前のsiRNAの化学的合成についての必要性で、有用性が限られる(Tuschl, T.、Nature Biotech.、20:446-448 (2002))。また、siRNAはインビボで不安定であるため、それらの長期的有効性が制限される。
【０００６】
これらの難題に取り組む発明は、核酸活性のレベルにおいてヒト疾患を治療するためのRNAiの有用性を向上させるものと思われる。特に、そのような発明は、RNAiを、HCVでの感染のようなウイルス感染についてのより実際的な治療にさせるものと思われる。そのようなウイルス感染についての現行の治療は非常に限られており、不十分な応答速度をもつ傾向がある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、標的細胞においてRNA干渉を仲介する二本鎖RNA(dsRNA)を提供する。特に、感染した細胞においてウイルスの複製を阻害する低分子干渉RNA(siRNA)を提供する。本発明の好ましいdsRNA分子は、C型肝炎ウイルス(HCV)核酸に対応し、肝細胞においてHCVの複製を阻害する。
【０００８】
もう一つの局面において、ヌクレアーゼ分解に対抗して保護されるが、哺乳動物細胞においてウイルス複製を阻害することができる、siRNAを含む修飾されたdsRNA分子を提供する。
【０００９】
本発明はまた、dsRNAまたはsiRNA分子を投与することにより、感染した細胞においてウイルス複製を阻害する方法を提供する。修飾されたdsRNAおよびsiRNA分子は、それらがヌクレアーゼ耐性であり、ウイルスにおけるRNA配列を標的にすることによりウイルス複製を阻害することができる生物学的活性をなお保持しているため、これらの方法に特に有用である。
【００１０】
本発明はさらに、ウイルスRNA配列またはDNA配列を標的にする修飾siRNAを作製する方法を提供する。本方法は、少なくとも1つの鎖において少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含むdsRNA断片を調製し、かつdsRNA断片をダイサー酵素で切断し、結果として、1つより多い修飾siRNAを生じることを含む。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるものと思われる。説明および特定の実施例は好ましい態様を示すが、本発明の範囲内の様々な改変が詳細な説明から当業者に明らかになるように、限定的とみなされるべきではない。さらに、実施例は、本発明の原理を実証するが、すべての有用な適用を具体的に例証しているものとは期待されえない。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、約10〜約30ヌクレオチド長であり、かつ標的細胞においてRNA干渉を仲介するdsRNA分子を提供する。好ましくは、本発明の分子は、ヌクレアーゼ分解に対して増加した安定性を与えるが、標的核酸に結合する能力を保持するように化学修飾される。
【００１３】
本明細書に用いられる場合、「RNA干渉」(RNAi)は、タンパク質合成の全般的抑制なしに、siRNAにより仲介される、遺伝子発現(タンパク質合成)の配列特異的または遺伝子特異的抑制を指す。本発明は、特定の理論または作用様式に限定されないが、RNAiは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によりメッセンジャーRNA(mRNA)を分解し、転写されたmRNAの翻訳を阻止することを含んでよい。または、遺伝子の転写をそらすゲノムDNAのメチル化を含みうる。RNAiにより引き起こされる遺伝子発現の抑制は、一過性であってよく、または、それはより安定で、永久であってもよい。
【００１４】
「遺伝子抑制」、「標的化抑制」、「配列特異的抑制」、「標的化RNAi」および「配列特異的RNAi」は、本明細書で互換的に用いられる。さらに、本明細書に用いられる場合、配列特異的抑制は、siRNAを含む細胞(実験細胞)において、および同一のsiRNAを含まない細胞(対照細胞)において、抑制について標的にされたタンパク質のレベルを別々にアッセイし、その後、その2つの値を比較することにより決定される。実験および対照の細胞は、同じ源および同じ動物由来であるべきである。また、遺伝子抑制のレベルまたは量を測定するにおいて用いられる対照および実験細胞は、たとえ同一でないとしても、類似した条件下でアッセイされるべきである。
【００１５】
RNAは、それぞれがリン酸基および窒素を含む塩基(典型的には、アデニン、グアニン、シトシンまたはウラシル)に結合した糖リボースを含む、リボヌクレオチドのポリマーである。RNAは、同類であるDNAのように、相補水素結合を形成することができる。それゆえに、RNAは、二本鎖(dsRNA)、一本鎖(ssRNA)または一本鎖オーバーハングを有する二本鎖でありうる。RNAの共通の型は、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)およびスモールヘアピンRNA(shRNA)を含み、それぞれが生物学的細胞において特定の役割を果たしている。本明細書に用いられる場合、用語「RNA」は、これらのすべてを含む。
【００１６】
「低分子干渉RNA」(siRNA)は、タンパク質発現に特異的に干渉するそれらの能力に因んで名付けられた約10ヌクレオチド長から約30ヌクレオチド長までの二本鎖RNA分子を指す。好ましくは、siRNA分子は、12〜28ヌクレオチド長、より好ましくは15〜25ヌクレオチド長、さらにより好ましくは19〜23ヌクレオチド長、および最も好ましくは21〜23ヌクレオチド長である。それゆえに、好ましいsiRNA分子は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29ヌクレオチド長である。
【００１７】
1つの鎖の長さが、siRNA分子の長さを表す。例えば、21リボヌクレオチド長(21-mer)と記載されるsiRNAは、19個の連続した塩基対形成として共にアニールする2つの逆のRNA鎖を含みうる。各鎖における2つの残りのリボヌクレオチドは、「オーバーハング」を形成する。siRNAが異なる長さの2つの鎖を含む場合、鎖のより長い方がsiRNAの長さを表す。例えば、21ヌクレオチド長である1つの鎖および20ヌクレオチド長である第二の鎖を含むdsRNAは、21-merを構成する。
【００１８】
オーバーハングを含むsiRNAが望ましい。オーバーハングは、鎖の5'または3'末端にありうる。好ましくは、それはRNA鎖の3'末端にある。オーバーハングの長さは変わりうるが、好ましくは、約1〜約5塩基であり、より好ましくは約2ヌクレオチド長である。好ましくは、本発明のsiRNAは、約2〜4塩基の3'オーバーハングを含む。より好ましくは、3'オーバーハングは2ヌクレオチド長である。さらにより好ましくは、3'オーバーハングを含む2リボヌクレオチドは、ウリジン(U)である。
【００１９】
本発明のsiRNAは、標的リボヌクレオチド配列と相互作用するように設計され、それらが標的配列に結合するのに十分に標的配列を相補することを意味する。好ましくは、標的リボヌクレオチド配列は、疾患発生因子または病原体由来である。より好ましくは、標的リボヌクレオチド配列は、RNAウイルスまたはDNAウイルスのウイルスゲノムにある。さらにより好ましくは、ウイルスは、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される。
【００２０】
C型肝炎ウイルス(HCV)は、非常に好ましいウイルス標的である。図1および図2は、いくつかのHCV特異的siRNA分子についての核酸配列を開示している。示されているそれらの中で、siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2およびsiRNA5B4は、特に良好な活性を示したので、非常に好ましい。これらの非常に好ましいsiRNAと少なくとも80%、90%または95%同一のsiRNAもまた、本発明の一部を構成する。
【００２１】
もう一つの好ましいウイルス標的は、コロナウイルスであり、ヒトにおいて上気道炎に関連しており、最近では、SARS(重症急性呼吸器症候群)と結びつけられた。コロナウイルスは、最も大きな既知のRNAウイルスゲノムである32キロ塩基長を有し、それのゲノムは正鎖RNAから構成される(図5参照)。各コロナウイルスmRNAは、約200ヌクレオチド長のゲノムRNAの5'-UTRと同一である60〜80ヌクレオチドの5'末端リーダー配列を有する(図6参照)。これらの配列は、高度に保存されており、それゆえ、siRNAの対する標的配列の優れた供給源を提供する。Fundamental Virology、第3版、18章、p.541-560(Fields、KnipeおよびHowley編)、Lippincott-Raven (1995)を参照されたい。一つの態様において、全リーダー配列(ヌクレオチド1位〜72位)が標的にされる。もう一つの態様において、リーダー配列の1つまたは複数のセクションが標的にされる。好ましい態様において、リーダー配列のヌクレオチド64位〜72位（TAAACGAAC）が標的にされる。コロナウイルスを標的にするsiRNAは修飾されてもよい、または修飾されなくてもよい。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、標的因子またはウイルス由来のリボヌクレオチド配列と少なくとも80%同一のリボヌクレオチド配列を含むsiRNA分子を提供する。好ましくは、siRNA分子は、標的因子またはウイルスのリボヌクレオチド配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。標的は、全ウイルスゲノム、一次転写産物、オープンリーディングフレームまたはこれらの任意の部分であってよい。最も好ましくは、siRNAは、標的因子またはウイルスのヌクレオチド配列と100%同一であるを考えられる。しかし、標的に対して挿入、欠失または単一点突然変異をもつsiRNA分子もまた効果的でありうる。siRNA設計を援助するツールは、公共において容易に利用可能である。例えば、コンピューターに基づくsiRNA設計道具は、www.dharmacon.comでインターネットにおいて利用可能である。
【００２３】
例として、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%「同一の」ヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドの配列が、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドあたり5つの点突然変異まで、または20ヌクレオチドあたり1つの点突然変異までを含みうる。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの5%までが欠失してもよく、もしくは別のヌクレオチドと置換されてもよく、または参照配列における全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチドの数が参照配列へ挿入されてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位で、またはそれらの末端位の間の任意の場所で、参照配列におけるヌクレオチド中に個々にかまたは参照配列内に1つもしくは複数の連続した群かのいずれかで散在して、起こってもよい。
【００２４】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が標的因子またはウイルスのリボヌクレオチド配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるかどうかを、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン8  Unix用、Genetics Computer Group、マディソン、WI)のような公知のコンピュータープログラムを用いて通常的に決定することができる。Bestfitは、2つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出すためにSmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))を用いる。特定の配列が、本発明による参照配列と、例えば、95%同一であるかどうかを決定するためにBestfitまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照リボヌクレオチド配列の完全長に対して計算され、かつ参照配列におけるリボヌクレオチドの総数の5%までの相同性におけるギャップが許されるように、設定される。
【００２５】
本発明はまた、ヌクレアーゼ分解に対する増加した安定性を与えるが、細胞に存在しうる標的核酸に結合する能力を保持するように化学修飾されたsiRNAを含む。標的RNAがウイルス特異的である場合、修飾siRNAは、ウイルス特異的なRNAまたはDNAに結合し、それによりウイルスを不活性化することができる。
【００２６】
本発明の修飾siRNAは、修飾リボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ分解のような酵素的分解に耐性であるが、特定のウイルス標的RNAまたはDNA配列を含む細胞においてウイルス複製を阻害する能力をなお保持する。siRNAは、修飾siRNAが標的配列に結合し、かつ酵素的分解に耐性である限り、分子の任意の位置において修飾されうる。siRNAにおける修飾は、ヌクレオチド塩基、すなわち、プリンもしくはピリミジン、リボースまたはリン酸においてでありうる。好ましくは、修飾は、siRNAにおける少なくとも1つのリボースの2'位で起こる。
【００２７】
より具体的には、siRNAは、少なくとも1つのピリミジン、少なくとも1つのプリンまたはそれらの組み合わせにおいて修飾される。しかしながら、一般的に、siRNAの、すべてのピリミジン(シトシンまたはウラシル)もしくはすべてのプリン(アデノシンまたはグアニン)、またはすべてのピリミジンおよびすべてのプリンの組み合わせが修飾される。より好ましくは、ピリミジンが修飾され、かつこれらのピリミジンが、シトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体、またはそれらの組み合わせである。siRNAのどちらか1つのまたは両方の鎖におけるリボヌクレオチドが修飾されてもよい。
【００２８】
RNAに見出されるピリミジン塩基を含むリボヌクレオチド(シチジンおよびウリジン)は、塩基、リボースもしくはリン酸のRNA分解または崩壊を阻害する任意の分子を付加することにより化学修飾されうる。前に言及されているように、リボースの2'位が修飾にとって好ましい部位である。2'修飾siRNAは、アンチセンスまたはリボザイムのような非修飾siRNAまたは一本鎖RNAに対して、より長い血清半減期をもち、分解に耐性がある。2'-修飾ピリミジンリボヌクレオチドは、当技術分野において公知の多数の異なる方法により形成されうる。
【００２９】
好ましい化学修飾は、ハロゲン化物化学基由来の分子のsiRNAのリボヌクレオチドへの付加である。ハロゲン化物内で、フッ素が好ましい分子である。フルオロ-のほかにも、メチル-、メトキシエチル-およびプロピル-のような他の化学部分が修飾として付加されてもよい。しかし、最も好ましい修飾は、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾のようなフルオロ-修飾である。
【００３０】
このように、本発明の好ましい態様において、siRNAは、ピリミジンリボヌクレオチドの2'炭素へのフッ素分子の付加により修飾される。siRNAは、完全にまたは部分的にフッ化されうる。例えば、シトシンリボヌクレオチドのみがフッ化されてもよい。または、ウラシルリボヌクレオチドのみがフッ化されうる。好ましい態様において、ウラシルおよびシトシンの両方がフッ化される。siRNAのセンスかまたはアンチセンスかのいずれかの1つの鎖のみが、フッ化されてもよい。siRNAの部分的な2'フッ化でさえも、ヌクレオチド鎖分解性分解からの保護を与える。重要なことには、2'フッ化siRNAは、細胞に対して毒性ではなく、フッ化化学的性質が通常、生きている生物体に対して毒性であることを考えれば、予想外の結果である。
【００３１】
さらに、本発明の修飾siRNAは、ウイルスRNAポリメラーゼを阻害する化学修飾を含んでもよい。例えば、siRNAは、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼを阻害する1つまたは複数のヌクレオシドを含んでもよい。そのようなヌクレオシドおよび他の化学修飾の例は、国際公開公報第02/057425号、第02/057287号、第02/18404号、第02/100415号、第02/32920号、第01/90121号、米国特許第6,063,628号および米国公開出願番号第2002/0019363号にある。
【００３２】
siRNAを、化学合成、T7ポリメラーゼ転写、またはダイサー酵素での2つの前の方法の1つにより調製される長い二本鎖RNA(dsRNA)を処理することによるような多数の方法において調製することができる。ダイサー酵素は、サイズが約500塩基対〜約1000塩基対であるdsRNAから、長さが約21塩基対から約23塩基対までのdsRNAの混合集団を生成する。意外にも、ダイサーは、2'フルオロ-修飾dsRNAのようなdsRNAの修飾された鎖を効果的に切断することができる。この方法の開発の前では、ダイサーは修飾siRNAを切断することができないであろうとあらかじめ考えられた。siRNAを調製するダイサー方法を、Gene Therapy Systems(San Diego、CA)から入手可能なダイサーsiRNA作製キット(Dicer siRNA Generation Kit)を用いて行うことができる。
【００３３】
本発明は、具体的には、(a)少なくとも1つの鎖において少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含む修飾された二本鎖RNA(dsRNA)断片を調製する段階、および(b)組換えヒトダイサーで修飾dsRNA断片を切断し、結果として1つより多い修飾siRNAを生じる段階を含む、ウイルスにおける核酸配列を標的にする修飾siRNAを作製する方法を含む。方法は、(c)修飾siRNAを単離する段階をさらに含みうる。
【００３４】
siRNAを作製する方法において、dsRNA断片は、化学合成により、またはインビトロ翻訳において調製されうる。一つの態様において、修飾siRNAは、修飾がそのsiRNAの少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位にある2'修飾siRNAである。修飾は、フルオロ-、メチル-、メトキシエチル-およびプロピル-修飾からなる群より選択される。好ましくは、フルオロ-修飾は、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾である。siRNAのピリミジン、プリンまたはそれらの組み合わせが修飾される。より好ましくは、シトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体またはそれらの組み合わせのようなピリミジンが修飾される。siRNAの1つまたは両方の鎖が、1つまたは複数の修飾リボヌクレオチドを含みうる。
【００３５】
本発明は、dsRNAを、標的にされた因子またはウイルスを不活性化するための有効量で患者へ投与することにより、患者における標的因子またはウイルスを不活性化する方法をさらに提供する。好ましくは、dsRNAは上記のように修飾される。細胞における標的化DNAセグメントに対するRNA干渉を、細胞へ二本鎖RNA分子を投与することにより達成することができ、二本鎖RNA分子のリボヌクレオチド配列は、標的にされるDNAセグメントのリボヌクレオチド配列に対応している。好ましくは、標的化RNAiを誘導するために用いられるdsRNAは、siRNAである。
【００３６】
本明細書に用いられる場合の「標的化DNAセグメント」は、抑制が望まれる、イントロンまたはエキソンを含む、標的化タンパク質についてのmRNAを全部または一部、コードするDNA配列を意味するのに用いられる。DNAセグメントはまた、標的化タンパク質の発現を正常には制御するDNA配列を意味してもよく、限定されるものではないが、標的化タンパク質のプロモーターを含む。なおさらに、DNAセグメントは、細胞のゲノムの一部である場合もあるし、ない場合もあり、またはそれは、プラスミドDNAのような染色体外である場合がある。
【００３７】
本発明は、具体的には、siRNA、好ましくは修飾siRNAを、ウイルスを不活性化するための有効量で患者へ投与することにより、患者におけるウイルスを不活性化する方法に関する。siRNAは、好ましくは、長さが約10〜約30リボヌクレオチド、より好ましくは12〜28リボヌクレオチド、より好ましくは15〜25リボヌクレオチド、さらにより好ましくは19〜23リボヌクレオチドおよび最も好ましくは21〜23リボヌクレオチドである。
【００３８】
また、ウイルスを不活性化する方法は、好ましくは、siRNAの少なくとも1つのリボヌクレオチドの2'位で修飾されているsiRNAを利用する。siRNAは、フルオロ-、メチル-、メトキシエチル-およびプロピル-からなる群より選択される化学基で修飾されてもよい。フルオロ-修飾が最も好ましく、2'-フルオロ-修飾または2',2'-フルオロ-修飾のいずれかが方法において有用である。修飾は、siRNAのピリミジン、プリンまたはそれらの組み合わせにおいてありうる。より好ましくは、シトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体またはそれらの組み合わせのようなピリミジンが修飾される。一つの態様において、siRNAの1つの鎖は、少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含むが、もう一つの態様において、siRNAの両方の鎖が少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含む。
【００３９】
治療方法に有用なsiRNAはまた、siRNAへの、少なくとも1つであるが、好ましくは1つより多い、受容体結合リガンドの付着により修飾されうる。そのようなリガンドは、肝臓、胃腸管、気道、頸または皮膚のような患者の全身、器官、組織または細胞における標的ウイルスへsiRNAの送達を引き起こすために有用である。
【００４０】
好ましい態様において、受容体結合リガンドは、siRNA分子の5'末端または3'末端のいずれかに付着される。受容体結合リガンドは、5'末端および3'末端の任意の組み合わせを含む、1つまたは複数のsiRNA末端に付着されうる。このように、受容体結合リガンドがsiRNA分子の末端のみに付着している場合、1つと4つの間ならどこでも、そのようなリガンドが付着されうる。
【００４１】
特に全身、器官、組織または細胞におけるウイルスへsiRNAを標的化するための適切なリガンドの選択は、当技術分野の通常の技術内にあるとみなされる。例えば、siRNAを肝実質細胞に標的化するために、コレステロールが、siRNA分子の5'末端および3'末端の任意の組み合わせを含む、1つまたは複数の末端に付着されうる。結果として生じるコレステロール-siRNAは、肝臓における肝実質細胞へ送達され、それにより、この標的にされた位置へsiRNAを送達するための手段を提供する。siRNAを肝臓に標的化するために有用な他のリガンドは、HBV表面抗原および低密度リポタンパク質(LDL)を含む。
【００４２】
もう一つの例として、ヒト免疫不全症ウイルス1型(HIV-1)を標的にするsiRNA分子は、標的核酸が位置しているTリンパ球へ送達されうる(Song, E.ら、J. of Virology、77(13):7174-7181 (2003))。この送達は、siRNA分子の3'末端または5'末端に、T細胞に位置しているCD4表面タンパク質に結合することができるHIV-1表面抗原を付着させることにより達成されうる(Kilby, M.ら、New England J. of Medicine、348(22):2228-2238 (2003))。
【００４３】
同様に、インフルエンザAウイルスを標的にするsiRNA分子は、標的核酸が位置している気道の上皮細胞へ送達されうる(Ge, Q.ら、Proc. Natl. Acad. of Sciences、100(5):2718-2723 (2002))。この送達は、siRNA分子の3'末端または5'末端に、上皮細胞の表面上に位置しているシアル酸残基に結合することができるインフルエンザウイルス表面抗原を付着させることにより達成されうる(Ohuchi, M.ら、J. of Virology、76(24):12405-12413 (2002)；Glick, G.ら、J. of Biol. Chem.、266(35):23660-23669 (1991))。
【００４４】
また、呼吸器合胞体ウイルス(respiratory syncitial virus)(RSV)を標的にするsiRNA分子を、標的核酸が位置している気道の上皮細胞へ送達することができる(Bitko, V.ら、BMC Microbiology、1:34 (2001))。この送達は、siRNA分子の3'末端または5'末端に、RSV表面抗原を付着させることにより達成されうる(Malhotra, R.ら、Microbes and Infection、5:123-133 (2003))。
【００４５】
さらにもう一つの例として、ヒトパピローマウイルス(HPV)を標的にするsiRNA分子は、標的核酸が位置している基底上皮細胞へ送達されうる(Hall, A.ら、J. of Virology、77(10):6066-6069 (2003))。この送達は、siRNA分子の3'末端または5'末端に、基底上皮細胞の表面上に位置しているヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合することができるHPV表面抗原を付着させることにより達成されうる(Bousarghin L.ら、J. of Virology、77(6):3846-3850 (2002))。
【００４６】
さらに、ポリオウイルス(PV)を標的にするsiRNA分子は、標的核酸が位置している神経系の細胞へ送達されうる(Gitlin, L.ら、Nature、418:430-434 (2002))。この送達は、siRNA分子の3'末端または5'末端に、ニューロンの表面上に位置しているCD155受容体に結合することができるPV表面抗原を付着させることにより達成されうる(He, Y.ら、Proc. Natl. Acad. of Science、97(1):79-84 (2000))。
【００４７】
言及されているように、治療の方法は、疾患を引き起こす因子または病原体、より具体的には、RNAウイルスまたはDNAウイルスのいずれかでありうるウイルスを標的にすることを意図される。好ましいウイルスは、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される。より好ましくは、標的ウイルスは、C型肝炎ウイルスまたはコロナウイルスである。
【００４８】
一つの局面において、本方法は、(a)低分子干渉RNA(siRNA)を設計するためにウイルスゲノムにおいて標的リボヌクレオチド配列を同定する段階、および(b)少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含むように修飾されたsiRNAを作製する段階により調製されたsiRNAを利用する。好ましくは、siRNAは、ウイルスにおける標的リボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列に対応する第一鎖リボヌクレオチド配列、および標的リボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を含む第二鎖を有する二本鎖RNA分子を含む。第一および第二鎖は、二本鎖RNA分子を形成するように互いにハイブリダイズする別々の相補鎖であるべきである。しかも、鎖の1つまたは両方は、少なくとも1つの修飾リボヌクレオチドを含むべきである。
【００４９】
本発明の好ましい態様において、siRNAは、C型肝炎ウイルスゲノムにおけるリボヌクレオチド配列を標的にする。標的リボヌクレオチド配列は、HCV複製に必要な保存リボヌクレオチド配列を含み、保存リボヌクレオチド配列は、5'-非翻訳領域(5'-UTR)、3'-非翻訳領域(3'-UTR)、コア、およびNS3ヘリカーゼからなる群より選択される。非常に好ましいsiRNA分子は、siRNA5、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2、またはsiRNA5B4の配列と少なくとも80%同一の配列を含む。siRNAは、修飾されなくてもよく、または上記のように修飾されてもよい。
【００５０】
HCVが陽性である細胞においてHCVの複製を阻害する方法は、細胞に対して毒性ではない、または処理された細胞においてアポトーシスを引き起こさないべきである。好ましくは、HCV複製の阻害は、正常な増殖、分裂または代謝が影響を及ぼされないために、細胞においてHCV複製のみに作用するように特異的に形成される。HCVが複製することを示された細胞は、限定されるものではないが、肝細胞、B細胞リンパ球およびT細胞リンパ球を含む。好ましくは、HCVの複製を阻害する方法は、肝細胞において行われる。
【００５１】
本発明により、「肝細胞」は、任意の動物源由来でありうる。さらに、肝細胞は、細胞培養において、または組織の部分、または一部もしくは全部の器官でありうる。肝細胞という用語は、正常な、異常なまたは病気にかかった肝臓細胞を構成する任意の細胞を含むものとする。肝細胞の例は、限定されるものではないが、クッパー細胞、肝実質細胞、および肝細胞癌を含む細胞を含む。「肝細胞」は、血管を裏打ちしている内皮細胞のような肝臓内の別々の構造を作り上げている細胞を含まないものとする。肝細胞を含む組織または器官は、被検体内にありうる、または生検を実施されうるもしくは動物から取り出されうる。さらに、組織は、組織が切除と本発明の方法との間にどんな保存段階もなく、被検体から最近取り出されるようにすることで「新鮮」でありうる。本発明の方法の適用の前に、組織はまた、限定されるものではないが、凍結、急速凍結、パラフィン包埋および組織固定を含むそのような標準的組織調製技術により保存されている場合がある。さらに、組織はまた、別の宿主動物の上もしくは中の異種移植片または同種移植片でありうる。本明細書に用いられる場合、動物および被検体という用語は、互換的に用いられる。
【００５２】
本発明により、「C型肝炎ウイルス」または「HCV」は、発明の日付における当技術分野でのそれの通常の意味をとる。C型肝炎ウイルスは、フラビビリダエ(Flaviviridae)ファミリーのRNAウイルスである。本明細書に用いられる場合の例として、HCVは、限定されるものではないが、遺伝子型1〜11(最も広く知られたジェノタイピング系を用いる)を含み、これらの遺伝子型は亜類型へと分類され、いくつかは、限定されるものではないが、1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、4b、4c、4d、4e、5a、6a、7a、7b、8a、8b、9a、10aおよび11aを含む。さらに、個体からの単離物は、密接に関連しているが不均一なウイルスゲノムの集団からなり、疑似種（quasispecies）と呼ばれることがある。
【００５３】
ペスチウイルスは、本発明のさらにもう一つの標的である。本明細書に用いられる場合、「ペスチウイルス」は、本発明日における当技術分野での通常の意味をとる。ペスチウイルスは、ファミリーのフラビビリダエに属する。ペスチウイルスは、オーストラリアのウシ個体群中に広まっている。ウシの群の約70%が活発にペスチウイルスに感染していると考えられている。感受性のある動物の感染は、様々な疾患を引き起こしうる（いくつかは、群へのウイルスの最初の伝播後かなりになるまで明らかにならない）。ペスチウイルスは、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)およびボーダー病ウイルス(BDV)またはヘアリー-シェーカー(hairy-shaker)病ウイルスを含むウイルスの属である。
【００５４】
siRNAは、静脈注射、皮下注射、経口送達、リポソーム送達または鼻腔内送達により患者へ投与されうる。siRNAは、その後、患者の標的全身、器官、組織または細胞型に蓄積しうる。
【００５５】
本発明はまた、ウイルス特異的siRNAの発現を指示するベクターでウイルスを宿す細胞をトランスフェクションすることを含む、哺乳動物細胞においてウイルスの複製を阻害する方法を提供する。一つの態様において、本発明は、HCV特異的siRNAの発現を指示するベクターでHCV陽性細胞をトランスフェクションすることを含む、HCVが陽性である細胞においてC型肝炎ウイルス(HCV)の複製を阻害する方法を提供する。細胞は、細胞におけるマーカーがsiRNAにより阻害されたかどうかを測定することで評価されうる。
【００５６】
このように、本発明はまた、記載されたsiRNAをコードする核酸セグメントを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００５７】
本発明のベクターは、組換え技術によりsiRNAを作製するために用いられうる。このように、例えば、siRNAをコードするDNAセグメントは、任意のDNA配列を発現させるための様々な発現ベクターのいずれか一つに含まれうる。そのようなベクターは、染色体の、非染色体のおよび合成のDNA配列、例えば、SV40誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドならびにファージDNA、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のようなウイルスDNAの組み合わせに由来するベクターを含む。しかしながら、任意の他のベクターを、それが所望の宿主において複製可能かつ生存可能である限り用いることができる。
【００５８】
適切なDNAセグメントを、様々な方法によりベクターへ挿入することができる。一般的に、DNA配列は、当技術分野において公知の方法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位へ挿入される。そのような方法などは、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５９】
発現ベクターにおけるDNAセグメントは、siRNA合成を指示する適切な発現制御配列(プロモーター)に機能的に連結される。適する真核生物のプロモーターは、CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のもののようなレトロウイルスLTRのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを含む。好ましくは、本発明のプロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターのIII型クラス由来である。より好ましくは、プロモーターは、U6およびH1プロモーターからなる群より選択される。U6およびH1プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターのIII型クラスの両方のメンバーである。本発明のプロモーターはまた、発現が「オン」または「オフ」に変更可能ということで、誘導性でありうる。例えば、U6プロモーターを用いるテトラサイクリン制御可能系は、siRNAの産生を制御するために用いられうる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む場合もあり、含まない場合もある。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含みうる。
【００６０】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、真核生物細胞培養についてのジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性、またはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性のような形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を与える1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含む。
【００６１】
一般的に、組換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞の形質転換を容認する選択マーカー、例えば大腸菌(E. coli)のアンピシリン耐性遺伝子およびS. セレビシエ(S. cerevisiae)TRP1遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、特に、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のような解糖の酵素、A因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来でありうる。異種性構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外培地への翻訳されたタンパク質の分泌を方向づけることができるリーダー配列と、適切な相において構築される。任意で、異種性配列は、望ましい特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【００６２】
一つの態様において、本発明は、RNAポリヌクレオチドのセンス鎖をコードするDNAセグメントが第一プロモーターに機能的に連結されており、かつRNAポリヌクレオチド分子のアンチセンス(反対)鎖をコードするDNAセグメントが第二プロモーターに機能的に連結されているベクターを提供する。換言すれば、RNAポリヌクレオチドの各鎖は、独立して発現される。さらに、各鎖の発現を操作するプロモーターは同一であってもよく、またはそれぞれが他方のプロモーターと異なってもよい。
【００６３】
もう一つの態様において、本発明のベクターは、対向するプロモーターを含んでもよい。例えば、ベクターは、RNAポリヌクレオチドのセンス鎖をコードするDNAセグメントの両側に、かつ対向する配向で配置される2つのU6プロモーターを含んでもよく、2つの対向するプロモーター間に配置される転写ターミネーターを含むまたは含まない。U6の対向するプロモーター構築物は、Wang, Zら、J. Biol. Chem. 275:40174-40179 (2000)に記載されるようなT7の対向するプロモーター構築物に類似する。Miyagishi, M.およびTaira, K.、Nature Biotech. 20:497-500 (2002)を参照されたい。
【００６４】
もう一つの態様において、RNAポリヌクレオチドの両方の鎖をコードするDNAセグメントは、単一のプロモーターの制御下にある。一つの態様において、各鎖をコードするDNAセグメントは、「ループ」領域を2つのDNAセグメント間に散在させて、ベクター上に並べられ、DNAセグメントおよびループ領域の転写が1つのRNA転写産物を産生する。単一の転写産物は、次に、それ自身にアニールし、RNAiを誘導することができる「ヘアピン」RNA構造を形成する。ヘアピン構造の「ループ」は、好ましくは、約4ヌクレオチド長から約6ヌクレオチド長までである。より好ましくは、ループは4ヌクレオチド長である。
【００６５】
本明細書に記載されているような適切なDNA配列、および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換して、宿主がsiRNAを発現させるのを可能にするために用いられうる。原核生物および真核生物の宿主についての使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)により記載されており、その開示は、参照として本明細書に組み入れられている。
【００６６】
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターでありうる本発明のベクターで遺伝子操作(形質導入または形質転換またはトランスフェクション)される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化すること、形質転換体を選択することに適しているように改変された通常の栄養培地で培養されうる。温度、pHなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に用いられたものであり、当業者に明らかであると思われる。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、もしくは酵母細胞のような下等真核生物細胞でありうる、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞でありうる。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は肝細胞である。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション法、または電気穿孔法により実施されてもよい(Davis, L.ら、Basic Methods in Molecular Biology (1986))。
【００６８】
本明細書に用いられる場合、患者という用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。より好ましくは、患者は、非ヒトおよびヒトを含む霊長類でありうる。被検体および患者という用語は、本明細書に互換的に用いられる。
【００６９】
本発明により構想される治療は、先在するウイルス感染をもつ被検体に、または感染に罹りやすい被検体に、用いられうる。さらに、本発明の方法は、患者にウイルス感染に対する感受性を与えることに関与する細胞性もしくは生理的異常について修正するもしくは代償するために、および/または患者においてウイルス感染の症状を緩和するために、または患者における予防的処置として、用いられうる。
【００７０】
ウイルス感染をもつ患者を治療する方法は、被検体への組成物の投与を含む。本明細書に用いられる場合、組成物は、純粋な化合物、剤もしくは物質、または2つもしくはそれ以上の化合物、剤もしくは物質の混合物を意味してもよい。本明細書に用いられる場合、剤、物質または化合物という用語は、薬物のような、タンパク質、核酸、糖、脂質、ポリマーまたは低分子を意味するものとする。
【００７１】
本発明の一つの態様において、被検体へ投与される組成物は、薬学的組成物である。さらに、薬学的組成物は、経口で、鼻に、非経口で、全身内的に、腹膜内に、局所的に(滴剤または経皮的パッチによるような)、頬に、または口もしくは鼻のスプレーとして投与されうる。コロナウイルスまたはメタニューモウイルスのような上気道疾患を引き起こすウイルスの鼻腔内送達は、特に有利な送達様式である。本明細書に用いられる場合、用語「非経口の」とは、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内の注射ならびに注入を含む投与様式を指す。本発明により企図されるような薬学的組成物はまた、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【００７２】
「薬学的に許容される担体」は、限定されるものではないが、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、リポソームのような任意の型の封入材料または製剤補助剤を含む。
【００７３】
非経口注射のための本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される滅菌した水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、加えて、使用直前に滅菌した注射可能な溶液または分散液への再構成のための滅菌した粉末を含みうる。適する水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒または媒体の例は、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような)、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの適する混合物、植物油(オリーブ油のような)、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルを含む。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持されることができる。
【００７４】
本発明の組成物はまた、限定されるものではないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助剤を含みうる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含により保証されうる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を含むことも望ましいことがある。注射可能な医薬品形態の長時間吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる剤の包含により成し遂げられうる。
【００７５】
いくつかの場合、薬物の作用を長くするために、皮下または筋肉内注射からの吸収を遅らせることが望ましい。これは、弱い水溶性をもつ結晶質または非晶質の材料の流動性懸濁液の使用により達成されうる。その後、薬物の吸収の速度は、次には、結晶サイズおよび結晶形に依存しうるそれの溶解の速度に依存する。または、非経口投与された薬物形態の遅延性吸収は、油媒体に薬物を溶解または懸濁することにより達成される。
【００７６】
注射可能なデポー型は、ポリラクチド-ポリグリコリドのような生分解性ポリマーにおいて薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度は制御されうる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)を含む。デポー注射可能製剤はまた、身体組織と適合性があるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を閉じ込めることにより調製される。
【００７７】
注射可能製剤は、例えば、細菌保留フィルターを通しての濾過により、または使用直前に滅菌水もしくは他の滅菌注射可能媒質に溶解または分散されうる滅菌固体組成物の形をとる滅菌剤を組み込むことにより、滅菌されうる。
【００７８】
経口投与のための固体剤形は、限定されるものではないが、カプセル、錠剤、ピル、粉末および顆粒を含む。そのような固体剤形において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムのような少なくとも1つの部材薬学的に許容される賦形剤もしくは担体ならびに/または(a)澱粉、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトールおよび珪酸のような充填剤もしくは増量剤、(b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ポリビニルピロリドン、ショ糖およびアラビアゴムのような結合剤、(c)グリセロールなどの湿潤剤、(d)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定の珪酸塩および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、(e)パラフィンのような溶液遅延剤、(f)第四アンモニウム化合物のような吸収促進剤、(g)例えば、アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートのような湿潤剤、(h)カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤、ならびに(i)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物のような潤滑剤と混合される。カプセル、錠剤およびピルの場合、剤形はまた、緩衝剤を含みうる。
【００７９】
類似した型の固体組成物はまた、乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いる軟および硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いられうる。
【００８０】
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティング剤および薬学的製剤分野において周知の他のコーティング剤のようなコーティング剤ならびに殻で調製されうる。それらは、任意で乳白剤を含みうる、およびそれらが活性成分のみを、または優先的に腸管の特定の部分において、任意で遅延型様式において、放出する組成物でありうる。用いられうる包埋組成物の例は、重合物質および蝋を含む。
【００８１】
活性化合物はまた、マイクロカプセルの形を、適切な場合には1つまたは複数の上記の賦活剤と共にとってもよい。
【００８２】
経口投与のための液体剤形は、限定されるものではないが、薬学的に許容される乳濁液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、剤を可溶化する、例えば水または他の溶媒のような当技術分野において一般に用いられる不活性希釈剤、ならびにエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物のような乳化剤を含みうる。
【００８３】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、フレーバー剤ならびに芳香剤のような補助剤を含みうる。
【００８４】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびスルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含みうる。
【００８５】
または、組成物は加圧され、かつ窒素または液化ガス噴射剤のような圧縮ガスを含みうる。液化噴射剤媒体および実際には全組成物は、好ましくは、活性成分が少しの実質的程度でもそれらに溶解しないようなことが好ましい。加圧組成物はまた、界面活性剤を含みうる。界面活性剤は、液体もしくは固体の非イオン性界面活性剤でありうる、または固体陰イオン界面活性剤でありうる。固体陰イオン界面活性剤をナトリウム塩の形で用いることが望ましい。
【００８６】
本発明の組成物はまた、リポソームの形をとって投与されうる。当技術分野において知られているように、リポソームは、一般的に、リン脂質または他の脂質物質から引き出される。リポソームは、水性媒体に分散している単または多層状水和液体結晶により形成される。リポソームを形成することができる、任意の非毒性の、生理学的に許容されかつ代謝可能な脂質が用いられうる。リポソーム型における本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤などを含みうる。好ましい脂質は、天然および合成の両方の、リン脂質ならびにホスファチジルコリン(レシチン)である。リポソームを形成する方法は、当技術分野において知られている(例えば、Prescott編、Meth. Cell Biol. 14:33および次ページ参照(1976)を参照されたい)。
【００８７】
当業者は、本発明の剤の有効量を経験的に決定してもよく、かつ純粋な形で、またはそのような形を、薬学的に許容される塩、エステルもしくはプロドラッグの形で存在しているところにおいて、用いることができる。本発明の組成物の「治療的に有効な」量は、治療されることになっている疾患、傷害もしくは障害の有害な状態または症状の予防または改善により決定されうる。剤は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた薬学的組成物として、ウイルス感染の治療を必要としている被検体に投与されうる。ヒト患者に投与される場合、本発明の剤または組成物の全一日使用量が健全な医学的判断の範囲内において病院所属医師により決定されることは、理解されているものと思われる。任意の特定の患者に特異的な治療的有効用量レベルは、様々な因子：達成されるべき細胞性または生理的応答の型および程度；用いられる特定の剤または組成物の活性；用いられる特定の剤または組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事；剤の投与時間、投与経路および排出速度；治療の継続期間；特定の剤と組み合わせてまたは同時に用いられる薬物；ならびに医学分野において周知の同様な因子に依存するものである。例えば、所望の治療的効果を達成するのに必要とされるものより低いレベルでの剤の用量から開始すること、および所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分、当技術分野の技術内である。
【００８８】
投薬はまた、当技術分野において是認されかつ日常的な技術により決定されるが、血液においてあらかじめ決定された剤の濃度を与えるように患者特異的様式において計画されてもよい。このように、患者投薬は、HPLCにより測定されるが、50 ng/mlから1000 ng/mlまでのオーダーにおいて規則的な継続している血液レベルを達成するように調整されうる。
【００８９】
本明細書に記載される方法および適用に対する他の適する改変ならびに適応が、本発明またはそれらの任意の態様の範囲から逸脱することなくなされうることは、当関連業者にとって容易に明らかであると思われる。
【００９０】
実施例
実施例は、修飾siRNAを含むsiRNAが哺乳動物細胞においてウイルス複製を効果的に阻害することができることを実証している。さらに、実施例は、本発明のsiRNAがヒト肝臓細胞においてHCV RNA分解を促進することを示し、かつ肝実質細胞が修飾siRNA誘導サイレンシングの必要な機能的成分を所有することを確立している。実施例はまた、siRNA技術が宿主細胞においてHCV複製を阻害する治療として用いられうることを実証している。本発明者らは、以下の実施例を提出することにより、主張された本発明の範囲を限定するつもりはない。
【００９１】
実施例1
HCVゲノムに方向づけられたsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を与えるかどうかを試験するために、最近開発された、ヒト肝腫瘍細胞株であるHuh-7におけるHCV細胞培養系を用いた。細胞株の一つである5-2は自己複製サブゲノムHCV RNAを含む(Bartenschlager、J. Virol、2001)。サブゲノムのレプリコンは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をもち、HCV RNA複製の測定としてレポーター機能アッセイ法を可能にする(図5)。ゲノムへ導入された細胞培養適応性突然変異(Bart)のために、これらの5-2細胞は、5 x 104ウイルス粒子/細胞までのレベルにおいてHCV RNAを複製する。
【００９２】
T7転写を用いて、HCVゲノムの5'-UTRの異なる領域に対するいくつかの21-bp siRNA二重鎖を作製した(図5)。簡単に言えば、センス方向かまたはアンチセンス方向かのいずれかに配向されることになっているT7プロモーターおよびHCVの5'UTRを含む2つのオリゴ二本鎖DNA分子を作製した。各オリゴDNAは、その後、インビトロで転写されて、(+)および(-)RNAを生じ、その後、デオキシリボヌクレアーゼIで処理され、DNA鋳型が除去された。2つのRNA鎖を37℃で一晩、アニールしてdsRNAを生じるようにさせた。未反応のssRNA種を除去するためにリボヌクレアーゼT1でdsRNAを処理した後、dsRNAをトランスフェクションのために精製した。
【００９３】
GL2およびGL3を含む、それぞれ、ショウジョウバエおよびウミシイタケルシフェラーゼに対して方向づけられるいくつかの他のsiRNA二重鎖を設計した。標準的トランスフェクション技術を用いて、siRNAを5-2細胞へトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を、HCV複製へのsiRNAの効果を決定するために測定した。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後48時間目に測定した。siRNAがトランスフェクションされている細胞においては、用量反応性様式で85%までのルシフェラーゼ活性の低下があった(図6)。ルシフェラーゼ活性の阻害は、関連性のないsiRNA(SIN)でトランスフェクションされた細胞には見られなかった。SINの配列は、シンドビスウイルス転写プロモーターから取られた(図1)。
【００９４】
実施例2
siRNA5応答の配列特異性は、追加のsiRNA二重鎖、GL2およびGL3を用いてさらに試験された。図1は、GL2およびGL3が互いに3ヌクレオチドだけ異なることを示している。ルシフェラーゼ活性は、siRNA5またはGL2でトランスフェクションされた細胞において90%低下したが、GL3でトランスフェクションされた細胞では有意な低下が見られなかった(図7)。ルシフェラーゼアッセイ法は、Promega Corp.(マディソン、WI)から入手可能なルシフェラーゼアッセイ系を用いて、製造会社の使用説明書に従って行われた。
【００９５】
実施例3
siRNA5はトランスフェクションされた細胞への毒性があるかどうかも試験した。毒性はATP分解酵素アッセイ法を用いて測定された。図8は、図6に見られるHCV複製におけるsiRNA5誘導性低下が、配列特異的ではないRNAiに起因する細胞毒性によるのではないことを示している。ATP分解酵素レベルは、Promega(マディソン、WI)からのATP分解酵素アッセイキットを用いて製造会社の使用説明書に従ってアッセイされた。
【００９６】
実施例4
完全長HCVレプリコンは、Li, H、Science 296:1319-1321 (2002)に記述されているように、RNAiに順応して抑制する能力をもち、それに従ってsiRNAの存在にもかかわらず複製する可能性がある。Huh-7細胞において完全長HCV RNAの複製へのsiRNA5の効果を測定するために、選択可能完全長HCVレプリコンを含む21-5細胞株由来の細胞をsiRNA5で処理した。HCV RNAのレベルは、TaqMan(商標)(F. Hoffman La-Roche、スイス)を用いる定量的PCRにより測定された。図9に見られる結果は、RNA複製が非常に高い適合したHCV突然変異体の設定においてさえも、siRNA定方向サイレンシングが定常状態のウイルスRNA産生を低下させたことを示している。サブゲノムおよび完全長の両方のHCVレプリコンからの結果は、HCVタンパク質のいずれもRNA干渉を抑制することができないことを示唆している。
【００９７】
実施例5
siRNA5はトランスフェクションされた細胞への毒性があるかどうかも試験した。具体的には、解糖に必須の酵素であるGAPDHをコードするmRNAを、siRNA5、またはGAPDH配列に対して特異的なsiRNAでトランスフェクションされたHuh 5-2細胞において測定した。図10は、siRNA5がGAPDHのRNAレベルに影響を及ぼさなかったことを実証している。GAPDHは、TaqMan(商標)RNAキット(F. Hoffman La-Roche、スイス)を用いて製造会社の使用説明書に従って測定された。
【００９８】
実施例6
感染した肝臓において複製するHCVの能力を阻害することについてのsiRNA5の有効性を試験するために、HCV感染ヒト肝臓の部分を、当業者に周知の方法に従って、トランスジェニックの重症複合免疫不全(SCID)マウス上へ異種移植する。
【００９９】
簡単に言えば、いったんHCV感染肝臓がマウス肝臓に取って代わった場合、リポソームのカプセルに入れられたsiRNA5または対照リポソームを、尾静脈または別の利用しやすい静脈を通してマウスへ静脈注射により投与する。マウスは、1日に1回、3〜10日間投薬される。
【０１００】
投薬計画の終わりに、マウスを屠殺し、血液を収集し、肝臓を取り出す。一部を液体窒素を用いて凍結する、一部をパラフィン包埋のために固定する、および一部をスライド上への切片化のために固定するために、肝臓を部分に分割する。
【０１０１】
適切な割当を用い、HCV RNAを、肝臓細胞においてHCV RNAのレベルを測定するために本明細書で前に利用されたTaqMan(商標)RNAアッセイキットを用いて定量する。さらに、抗HCV抗体力価を血清ALTレベルと共に、収集された血液試料において測定することができる。
【０１０２】
実施例7
健康な肝臓を感染させるHCVの能力を阻害するについてのsiRNA5の有効性を試験するために、正常なヒト肝臓の部分を、当業者に周知の方法に従って、トランスジェニックの重症複合免疫不全(SCID)マウス上へ異種移植する。
【０１０３】
簡単に言えば、いったん健康な肝臓がマウスの肝臓に取って代わった場合、リポソームのカプセルに入れられたsiRNA5または対照リポソームを、静脈または別の利用しやすい静脈を通してマウスへ静脈注射により投与する。マウスは、1日に1回、3〜10日間投薬される。事前投薬計画後、活性HCVをその後、静脈内にまたは肝臓注射により、マウスへ注射する。
【０１０４】
マウスがHCVに感染した後約6時間目、12時間目、18時間目、24時間目において、および約5日目まで定期的に、マウスを殺し、血液を収集し、肝臓を取り出す。一部を液体窒素を用いて凍結する、一部をパラフィン包埋のために固定する、および一部をスライド上への切片化のために固定するために、肝臓を部分に分割する。
【０１０５】
適切な割当を用い、HCV RNAを、肝臓細胞においてHCV RNAのレベルを測定するために本明細書で前に利用されたTaqMan(商標)RNAアッセイキットを用いて定量する。さらに、抗HCV抗体力価を血清ALTレベルと共に、収集された血液試料において測定することができる。
【０１０６】
実施例8
修飾siRNAは、化学合成により調製されうる。一つの態様において、siRNA二重鎖（例えばGL2）内の各CおよびUは、2'-F-Uおよび2'-F-Cに置換されうる。2'-F-Uおよび2'-F-Cを含む3'末端オーバーハングを有するsiRNAを作製するために、ユニバーサルサポートが用いられうる。サポート由来のオリゴを選択的に切断することにより、従事者は、オーバーハングの残基が修飾ヌクレオチドを含むことを保証することができる。または、3'末端オーバーハングを含むヌクレオチドは、非修飾dTdTでありうる。
【０１０７】
2'-F RNAオリゴヌクレオチドは、標準1 μモル ベータ-シアノエチルホスホラミダイトRNA化学プロトコールを用いてApplied Biosystems 8909または8905 DNA/RNA合成機で合成されうる。RNAホスホラミダイト単量体およびPac-A、2'-F-Ac-C、iPr-Pac-G、2'-F-UおよびU-RNA CPGのカラムは、Glen Research(スターリング、VA)から入手されうる。(それぞれ、カタログ番号10-3000-05、10-3415-02、10-3021-05、10-3430-02および20-3430-41Eを参照。)Glen Researchの硫化試薬(Sulfurizing Reagent)(カタログ番号40-40360-10)は、3'CPGとその後の塩基との間に単一のホスホロチオエートバックボーンを得るための酸化剤として用いられうる。その共役を得るために、標準RNA 1 μモルプロトコールの酸化段階を、標準チオエート1 μモルプロトコールと取り替えることができる。コレステリル-TEGホスホラミダイト(Glen Research、カタログ番号10-1975-90)およびコレステリル-TEG CPG(Glen Research、カタログ番号20-2975-41E)が、1つもしくは複数のオリゴリボヌクレオチドの5'または3'末端上に組み込まれうる。合成後、2'-F RNAのものは、切断され、1:1 水酸化アンモニウム/メチルアミンで脱保護され、シリル基は、標準プロトコールを用いてトリエチルアミントリヒドロフルオリドで除去される。例えば、http://www.glenres.com/productfiles/technical/tb_rnadeprotection.pdfを参照されたい。オリゴリボヌクレオチドは、その後、滅菌水を用いてSephadex G25カラム(Pharmacia NAP 25、カタログ番号17-08252-02)上で脱塩され、標準ゲル電気泳動プロトコールを用いて精製される。修飾siRNAはまた、Dharmacon(ラフィエット、CO)のような業者から入手できうる。
【０１０８】
または、修飾siRNAは、Epicentre Technologies(マディソン、WI)から購入されるDurascribe(商標)T7転写キットを用いる転写により調製されうる。
【０１０９】
これらの方法により作製された修飾siRNA(dsRNA)は、ホスホジエステル結合オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス分子のような修飾一本鎖RNAを作製するための標準的方法は、修飾一本鎖RNAが一緒にアニールされて二本鎖RNAを形成することができるため、修飾siRNAを作製するのに有用である。そのような標準方法は、限定されるものではないが、Chiangら, J. Biol. Chem. 266, 18162-18171 (1991); Bakerら, J Biol. Chem. 272, 11994-12000 (1997); Kawasakiら, J. Med. Chem. 36, 831-841 (1993); Moniaら, J. Biol. Chem. 268, 14514-14522 (1993)に記載されるものを含む。
【０１１０】
実施例9
HCVゲノムへ方向づけられたsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を与えるかどうかを試験するために、最近開発された、ヒト肝腫瘍細胞株であるHuh-7におけるHCV細胞培養系を用いた。細胞株の一つである5-2、は自己複製サブゲノムHCV RNAを含む(Bartenschlager、J. Virol、2001)。サブゲノムのレプリコンは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をもち、HCV RNA複製の測定としてレポーター機能アッセイ法を可能にする。ゲノムへ導入された細胞培養適応性突然変異のために、5-2細胞は、5 x 104ウイルス粒子/細胞までのレベルにおいてHCV RNAを複製する。
【０１１１】
T7転写を用いて、HCVゲノムの5'-UTRの異なる領域に対するいくつかの21-bp siRNA二重鎖を作製した。簡単に言えば、センス方向かまたはアンチセンス方向かのいずれかに配向されることになっているT7プロモーターおよびHCVの5'UTRを含む2つのオリゴ二本鎖DNA分子を作製した。各オリゴDNAは、その後、インビトロで転写されて、(+)および(-)RNAを生じ、その後、デオキシリボヌクレアーゼIで処理され、DNA鋳型が除去された。2つのRNA鎖を37℃で一晩、アニールしてdsRNAを生じるようにさせた。未反応のssRNA種を除去するためにリボヌクレアーゼT1でdsRNAを処理した後、dsRNAをトランスフェクションのために精製した。
【０１１２】
2つの典型的修飾siRNAは下に提供される。
2006320327.tif 000003
【０１１３】
ショウジョウバエのルシフェラーゼ遺伝子に対して方向づけられたsiRNA GL2内の各CおよびUを2'-F-Uおよび2'-F-Cに置換した。修飾siRNAを標準リポソームトランスフェクション技術を用いて5-2細胞へトランスフェクションした。具体的には、修飾siRNAを、0.5 μlのオリゴフェクタミン(Oligofectamine)(Invitrogen、カールスバッド、CA)を含む250 μl 細胞懸濁液において37℃で4時間、375 μl 血清含有培地において20時間、およびリポソーム-siRNA複合体を含まない新鮮な培地において37℃で24時間インキュベートした。修飾siRNAのHCV複製への効果を測定するために、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後48時間目に測定した。
【０１１４】
図11は、GL2が増加する濃度においてルシフェラーゼ活性を低下させたことを示している。ルシフェラーゼ活性は、2'-F-GL2でトランスフェクションされた細胞において90%低下したが、偽のトランスフェクションされた細胞においてまたは対照(2'-F-GFP = 緑色蛍光タンパク質)については、有意な低下が見られなかったことを示している。ルシフェラーゼアッセイ法は、Promega Corp.(マディソン、WI)から入手可能なルシフェラーゼアッセイ系を用いて、製造会社の使用説明書に従って行われた。
【０１１５】
siRNA Chol-GL2は、5'末端の1つにコレステリル基を含む。5-2細胞をリポソームの非存在下において様々な濃度のChol-GL2とインキュベートした。細胞をインキュベーション後48時間目に回収し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。図12は、Chol-GL2が用量依存性様式でルシフェラーゼ遺伝子活性を阻害したことを示している。InvAは、逆方向配列におけるchol-GL2を指す。
【０１１６】
実施例10
非修飾siRNA(siRNA)と比較した2'化学修飾されたsiRNAの安定性を試験するために、以下の実験を行った。4ナノグラムのsiRNAを、健康な供与者由来の80%ヒト血清の20 μL容量に添加する。この混合物を、1分間から10日間までわたる様々な時間の間、37℃でインキュベートする。結果は、図13のレーン2〜10に示される。同じ工程を2'フッ素修飾siRNA(2'-F siRNA)についても行い、結果は、図3のレーン12〜20および22〜25に示されている。インキュベーション工程が終了するとすぐに、混合物を氷上に置き、その後すぐに、32P-siRNA対照(図13のレーン1、11および21を参照)と共にPAGEにより分離する。データは、2'-修飾siRNAが、非修飾siRNAと比較して10日間の期間を通して安定であることを示している。
【０１１７】
実施例11
長いdsRNAから修飾siRNAの作製を実証するために、5マイクログラムの1000 bp長のフッ化dsRNA(図14、パネル(A))を37℃で15ユニットのヒトダイサーと一晩、インキュベートした。その結果生じたディセッドsiRNA（diced-siRNA）をセファデックス(Sephadex)G-25カラムを用いて精製し、20%PAGE上で電気泳動した(図14、パネル(B))。図4は、組換えヒトダイサーがフッ化dsRNAを2'F-siRNAへと効果的に変換することを示している。
【０１１８】
実施例12
HCVゲノムへ方向づけられたsiRNAがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を与えるかどうかをさらに試験するために、実施例1に記載されているアッセイ法を用いて、それぞれが図2に示されている、siRNAC1、siRNAC2、siRNA5B1、siRNA5B2およびsiRNA5B4を試験した。各siRNAを1 nM、10 nMおよび100 nMの濃度において試験した。図15に示されているように、siRNAのそれぞれは、用量依存性様式でルシフェラーゼ活性を有意に阻害した。siRNAC2は特別な有効性を示した。
【０１１９】
実施例13
実施例9に報告されている実験についての追跡として、コレステロール修飾が、フルオロ修飾ではなく、siRNA分子をHuh-7肝臓細胞へ方向づけたことを実証するためにアッセイを行った。Huh-7細胞を、様々な濃度の2種類のChol-GL2 siRNAとインキュベートした：一方は2'-フルオロ修飾をもち、他方はそのような修飾を欠く。その結果は、図16に示されているが、コレステロール修飾siRNA分子の肝臓細胞への送達がコレステロールによるものであり、他の修飾ではないことを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】HCVゲノム由来の5'UTRの配列および二次構造を示す。肝細胞においてHCVに対してRNAiを誘導するために特異的なsiRNAの配列も提供する。
【図２】肝細胞においてHCVに対してRNAiを誘導するのに有用な、いくつかのHCV特異的siRNAについての配列を提供する。各HCV特異的siRNAは、第一列に提供されている名称により同定される。
【図３】SARSコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図４】SARSコロナウイルスのオープンリーディングフレームの模式図である。
【図５】ヒト肝臓細胞においてsiRNAの効果を試験するために用いられる、肝腫瘍細胞株Huh 7に含まれるサブゲノムHCVレプリコンを示す。
【図６】異なる濃度のsiRNA5を投与された、サブゲノムHCVレプリコンを含むHuh-7細胞(5-2系)における標準化されたルシフェラーゼ活性の用量反応を示す。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション後1日目、2日目および3日目において測定されたが、siRNAの用量増加につれて低下した。ルシフェラーゼアッセイ法は、Promega Corp.(マディソン、WI)から入手可能なルシフェラーゼアッセイ系を用いて、製造会社の使用説明書に従って行われた。
【図７】Huh-7肝臓細胞においてHCV定方向RNAiを誘導するためのsiRNA5の配列特異性を示す。
【図８】siRNA5がHuh-7細胞に対して毒性がないことを実証する。ATP分解酵素レベルは、Promega Corp.(マディソン、WI)から入手可能なATP分解酵素アッセイキットを用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイされた。
【図９】RNAアッセイ法により測定した場合の、21-5細胞(完全長HCVを含むHuh-7細胞)におけるHCV複製へのsiRNA5の効果を示す。RNAレベルは、TaqMan(商標)RNAキット(F. Hoffman La-Roche、スイス)を用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイされた。値は標準化されている。
【図１０】siRNA5がHuh 5-2細胞の生存力に影響を及ぼさないことを実証する。具体的には、解糖に必須の酵素であるGAPDHをコードするmRNAが、siRNA5またはGAPDH特異的siRNAでトランスフェクションされたHuh 5-2細胞において測定された。グラフは、siRNA5がGAPDHのRNAレベルに影響を及ぼさなかったことを実証している。GAPDHは、TaqMan(商標)RNAキット(F. Hoffman La-Roche、スイス)を用いて製造会社の使用説明書に従って測定された。値は標準化されている。
【図１１】ショウジョウバエのルシフェラーゼ遺伝子を標的にする2'-フルオロ-siRNA(2'-F-GL2)の異なる濃度を投与された、サブゲノムHCVレプリコンを含むHuh 7細胞(5-2系)における標準化されたルシフェラーゼ活性の用量反応を示す。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション後2日目において測定されたが、siRNAの用量増加につれて低下した。ルシフェラーゼアッセイ法は、ホタルルシフェラーゼキット(Promega Corp.、マディソン、WI)を用いて、製造会社の使用説明書に従って行われた。
【図１２】リポソームの非存在下で、siRNA Chol-GL2を用いる5-2細胞におけるルシフェラーゼ活性の阻害を実証する。
【図１３】PAGEにより分離された5'-標識siRNA二重鎖のオートラジオグラフを示す。10日間までの間の、ヒト血清においてインキュベートされた2'-フルオロ-修飾siRNA(2'-F-GL2)の安定性を示す。siRNA二重鎖は、ヒト血清とのインキュベーションにかけられ、20%PAGEにより分析された。レーンの組成物は以下のとおりである：レーン1、11および21：32P-末端標識siRNA単独；レーン2〜10、12〜20および22〜25：ヒト血清とインキュベートされたsiRNA。それぞれ、レーン2および12、1分間；レーン3および13、5分間；レーン4および14、15分間；レーン5および15、30分間；レーン6および16、1時間；レーン7および17、2時間；レーン8および18、4時間；レーン9および19、8時間；レーン10および20、24時間；レーン22、24時間；レーン23、48時間；レーン24、120時間；レーン25、240時間インキュベーション。
【図１４】フッ化dsRNAを2'F-siRNAへと変換するための組換えヒトダイサーの使用を実証する。レーンの組成物は以下のとおりである：レーン1：サイズマーカー、λ/HindIII+φX174/HaeIII；レーン2：リボ/リボ  ホモ二重鎖RNA；レーン3：リボ/2'-F  ヘテロ二重鎖RNA；レーン4：2'-F/リボ  ヘテロ二重鎖RNA；レーン6：サイズマーカー、10 bp DNAラダー；レーン7：リボ/リボ  ホモ二重鎖siRNA；レーン8：リボ/2'-F  ヘテロ二重鎖siRNA；レーン9：2'-F/リボ  ヘテロ二重鎖siRNA；レーン10：2'-F/2'-F  ホモ二重鎖siRNA。
【図１５】HCV特異的siRNAに対する、サブゲノムHCVレプリコンを含むHuh-7細胞における標準化されたルシフェラーゼ活性の用量反応を示す。ルシフェラーゼ活性は、各siRNAの用量増加につれて低下した。
【図１６】コレステロールが、コレステロール修飾GL2 siRNAに対する、サブゲノムHCVレプリコンを含むHuh-7細胞(5-2系)における標準化されたルシフェラーゼ活性の用量反応を示すことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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