(57)【要約】【課題】  作物の生長に役立つ植物生長促進力を持ち、化学肥料の部分的な代替機能を有する特定のシュードモナス属菌株を提供する。また、前記特定のシュードモナス属菌株及びこの菌株から生産される２次代謝産物を有効成分として含有する微生物製剤を提供する。【解決手段】  作物の栽培時、化学肥料の代わりに、植物根の表面と内部に定着して植物の生長を促進させる配列番号１のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株、及びこの菌株並びにこの菌株から生産される２次代謝産物を含有する環境親和的微生物製剤に関し、前記環境親和的微生物製剤は化学肥料の節減、作物生産性の安定化、水質及び土壌環境の保全、及び土壌生態系の健全性を増進させることができる。【選択図】        図２ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のｒＤＮＡ塩基配列を有するシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株。
【請求項２】
請求項１に記載のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を有効成分として含有する微生物製剤。
【請求項３】
前記微生物製剤は、化学肥料代替用有機肥料であることを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
【請求項４】
前記微生物製剤は、植物生長促進用であることを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
【請求項５】
前記微生物製剤は、病原菌生長抑制用であることを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
【請求項６】
前記微生物製剤は、シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）の２次代謝産物を有効成分としてさらに含有することを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
【請求項７】
請求項２乃至６のいずれか１項に記載の微生物製剤を土壌または植物に処理する土壌管理及び植物の栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、作物の栽培時、化学肥料の代わりに、植物根の表面と内部に定着して植物の生長を促進させる配列番号１のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株に関する。なお、このシュードモナス属RRj228（Pseudomonas sp. RRj228）については、2003年6月11日付けで「寄託番号KACC 91052」の下に韓国農村振興庁農業生命工学研究院に付設の韓国農用微生物保存センター（KACC）に寄託されたが、2005年5月27日付けで『寄託番号KCTC 10812BP』の下に韓国の国際寄託機関であるＫＲＩＢＢ（Korean Research Institute of Biosceience and Biotechnology）のＫＣＴＣ（Korean Culture for Type Cultures）に再寄託されたので、以下の記載においては、「寄託番号KACC 91052」に代えて『寄託番号KCTC 10812BP』を用いる。
【０００２】
また、本発明は、前記シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株及びこの菌株から生産される２次代謝産物を含有する環境親和的微生物製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
農業において、肥料は、作物の収量を決定づける重要な農業資材であるが、過度に多く使用する場合、河川水の富栄養化、地下水の水質汚染、土壌養分の不均衡、作物生育の不良要因として作用して、収量減少と共に農産物の品質低下を招く。それで、既存の化学肥料を部分的に代替できる植物生長促進機能を発揮しつつ、農作物を丈夫に育てる土壌微生物の適切な活用は、持続農業の発展と農業環境の保全のために必ず必要である。
【０００４】
土壌微生物のうち、宿主植物と完全な共生関係を有することなく植物の生長を促進させる微生物は、1980年KloepperなどによりＰＧＰＲ（Plant growth-promoting rhizobacteria）と命名され、これには、空中窒素を固定するAzospirrilum属菌（Okon, 1985）、Pseudomonas属菌（Kloepper et al., 1980）、Bacillus属菌（Backman et al., 1994）などが代表的な微生物に含まれる。いわゆるＰＧＰＲ菌株と呼ばれる植物生長促進微生物は、空中窒素の固定（Boddy and Dobereiner, 1995）、植物生長促進ホルモンの生産、植物の養分吸収促進（Hallmann et al., 1997）、植物の病発生抑制（Pleban et al., 1995）などの色々な機能によって植物の生長を助けると知られている。
【０００５】
Wardなど（1992）は、土壌に棲息する微生物のうち、分類及び同定されたものは、全体種の５%以下であると述べており、Torisvikなど（1990）は、土壌には人為的に培養されない細菌が多いと述べた。したがって、既に発見された有用微生物より機能性に優れた他の菌株がいくらでも存在するはずであり、これについての研究が続いて進行されてきている。
【０００６】
また、植物の生長を助ける色々な植物生長促進微生物の作物接種効果は、稲で１９〜６０%（Baldani, 2000）増収されたことをはじめとして、トマト（Kloepper and Schroth, 1981）、豆（Polonenko et al., 1987; Dashti et al., 1998）、小麦（Freitas and Germida, 1990）、砂糖大根（Suslow and Schrith, 1982）などでも確認され、これらの植物生長促進微生物の実用化についての研究が進行されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者らは、土壌に棲息する土壌微生物について研究していたところ、稲根の表面と内部に定着する特性がある植物根圏細菌シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を最初に分離・同定するようになり、この菌株が農作物の生長を促進させて、従来の化学肥料を代替できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、作物の生長に役立つ植物生長促進力を持ち、化学肥料の部分的な代替機能を有するシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の目的は、前記シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株及びこの菌株から生産される２次代謝産物を有効成分として含有する微生物製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、植物根の表面と内部に定着して植物の生長を促進させる配列番号１のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株に関する。
【００１１】
本発明によるシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、本発明者により最初に発見された土壌細菌であって、自然条件で作物根の表面と内部に定着して植物生長促進物質を分泌し、植物病原性カビや細菌に対する拮抗力を有していて、各種植物病原菌の生長抑制力を持つ。
【００１２】
本発明によるシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、ロッド形状を有するグラム（gram）陰性の細菌であり、２８±２℃条件のＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地でよく成長する中温菌である。
【００１３】
本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を使用することによって得られる効果は、次の通りである。
【００１４】
（１）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、植物の養分供給力及び植物生長促進力に優れているので、通常の方法で微生物製剤を製作し、農作物接種剤として使用する場合、化学肥料を少なく与えても収穫量を増やすことができる。
【００１５】
（２）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、化学肥料代替資源であって、稲、唐辛子、キュウリなどの農作物に適用できるので、適用範囲が広い。
【００１６】
（３）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、土壌内における植物病原性微生物の生長を抑制する特性があり、作物に接種する場合、病原菌から作物の安全な生育を助ける。
【００１７】
（４）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、作物の根組織の内部に定着する特性があるので、作物接種効果発現の安定性が高い。
【００１８】
（５）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、培養物から２次代謝産物を通常の方法で分離、精製することによって、植物生長促進または植物病原菌生長抑制物質を純粋分離して、化学肥料代替効果以上の付加価値を創出することができる。
【００１９】
（６）本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、農業で環境汚染の可能性が全くない微生物資源であるから、農作物の栽培に使用する場合、水質及び土壌環境の保全と土壌生態系の健全性増進効果を期待することができる。
【００２０】
また、本発明は、前記シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株及びこの菌株から生産される２次代謝産物を含有する環境親和的微生物製剤に関する。
【００２１】
本発明による微生物製剤は、通常の方法で植物生長促進用または病原菌生長抑制用製剤で剤型化することができ、その剤型は特に限定されるものではなく、好ましくは、化学肥料を代替するための植物生長促進有機肥料で剤型化することができる。
【００２２】
また、本発明による微生物製剤を植物生長促進用製剤として乾燥粉末形態または液状肥料形態で製造する場合には、前記シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を乾燥粉末ｇ当たり、又は液状肥料１mL当たり１０5〜１０7匹含有することができる。
【００２３】
また、本発明による微生物製剤を病原菌生長抑制用製剤として乾燥粉末形態または液状形態で製造する場合には、前記シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を乾燥粉末ｇ当たり、または液状１mL当たり１０7匹以上含有することができ、前記植物生長促進用製剤で剤型化する時よりも菌株の含量を多く使用することが特徴である。
【００２４】
本発明によるシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を化学肥料代用で適宜活用する場合、化学肥料の節減、作物生産性の安定化、水質及び土壌環境の保全、土壌生態系の健全性増進を期待することができる。
【００２５】
シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、一般的な農耕地土壌に適した微生物製剤形態で製造して、化学肥料の代わりに、稲、唐辛子、キュウリなどの農作物に接種することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によるシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株は、土壌から直接分離された従来の菌株とは異なって、植物体（稲）の根から直接分離したので、稲、キュウリなどの作物根の内部に定着する特性がよく再現される。これにより、作物に接種されると、根の表面または内部で自体増殖が可能であり、作物が生きている限り、雨水または乾燥による密度減少が少ないため、接種効果が長く持続されることができる。
【００２７】
また、本発明による環境親和的微生物肥料組成物は、シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を使用することによって、作物を栽培する時に、化学肥料を部分的に代替できるので、水質、土壌などのような農業環境の健全性を増大させることでき、作物の生産性の向上に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、実施例により韓国とロシア土壌から分離した１７２菌株のうち、ロシアのサンクト・ぺテルブルク（St. Petersburg）から分離した植物生長促進力に優れた本発明のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株の分離、同定及び植物生長促進力について説明する。
【００２９】
但し、下記の実施例は、本発明を実施するために提示された一例に過ぎないもので、これらの実施例により本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］土壌微生物RRj228菌株の分離
植物根圏土壌微生物RRj228菌株の分離は、図１に示すように、無菌的に発芽させた種籾１粒を0.6%アガロース（Agarose）培地上に移し、稲根から１〜２cm距離に、菌株を分離すべき土壌試料０．５gを接種し、２８℃で４８時間恒温処理した後、根を磨いて懸濁液に作った後、ＬＣ培地｛バクトトリプトン(Bactotrypton)１０g、酵母抽出物(Yeast extract)５g、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ８g、1M Tris １mL、蒸留水１L、ｐＨ６．８｝に塗抹して、菌株を分離した。
【００３１】
［実施例２］土壌微生物RRj228 の同定
（イ）生理、生化学的特性
RRj228菌株の生理、生化学的特性は、下記表１（土壌微生物RRj228菌株の生理、生化学的特性）に示した。
【００３２】
前記RRj228菌株は、ロッド形状よりなり、サイズは、２．０〜３．０×０．５〜０．７μmであり、図２ａ及び図２ｂから分かるように、鞭毛を有している。ＰＤＢ培地では、２４時間培養すれば、集落色が赤黄色を呈した。グラム（Gram）陰性細菌であるRRj228菌株は、呼吸代謝をし、カタラーゼ（Catalase）とオキシダーゼ（Oxydase）活性を有する。そして、シュードモナス属RRj228菌株は、培地に添加された炭素源がアラビノース（Arabinose）、フラクトース（Fructose）、ガラクトース（Galactose）、グルコース（Glucose）、マンニトール（Mannitol）、スクロース（Sucrose）、キシロース（Xylose）である時は、生長過程で酸を生成し、炭素源がラクトース（Lactose）、デキストリン（Dextrine）、ラムノース（Ramnose）、ソルビトール（Sorbitol）、マルトース（Maltose）、ツシトール（Dulcitol）である時は、アルカリを生成した。また、RRj228菌株は、図３及び図４に示すように、植物根の表面に棲息しながら根組織の内部に入って定着する特性を有する。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
（ロ）塩基配列分析
RRj228菌株の塩基配列分析は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析法を用いて行ったが、まず、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域を核酸増幅法（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）で増幅させ、ｐＧＥＭＴ−Ｔベクトル（vector）に挿入した後、自動塩基配列分析機ABI3100（Applied Biosystem, USA）を用いて塩基配列を分析した。これに使われたプライマーは、配列番号２のｆＤ１（５′−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｇｇｃｔｃａｇ−３′）及び配列番号３のｒＰ２（５′−ａｃｇｇｃｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３′）であり、プライマーの両末端部位の塩基配列を分析するために、ｐＵＣ／Ｍ１３の正方向プライマ （forward primer：５′−ｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃ−３′）（配列番号４）及び逆方向プライマー（reverse primer：５′−ｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇ−３′）（配列番号５）を利用し、内部の塩基配列分析のために、４つのプライマーを利用した。
【００３５】
それぞれの塩基配列は、Escherichia coli １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（GenBank No. J01695）の順序によって３１１〜３３０部位の塩基配列である１６ＳＰ−１（５′−ｇｃｃａｃａｃｔｇｇａａｃｔｇａｇａｃａｃ−３′）、６８４〜７０３部位の塩基配列である１６ＳＰ−２（５′−ｔｇｔａｇｃｇｇｔｇａａａｔｇｃｇｔｇ−３′）、９４４〜９６３部位の塩基配列である１６ＳＰ−３（５′−ｇｇａｇｃａｔｇｔｇｔｔａｔｔｃｇ−３′）及び１２２８〜１２４７部位の塩基配列である１６ＳＰ−４（５′−ｃｔａｃａｃａｃｇｔｇｃｔａｃａａｔｇｇ−３′）を利用した。
【００３６】
RRj228菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は配列番号１に記載し、GenBankライブラリーの塩基配列と相同性を調べた結果、Pseudomonas chlorororaphis、P. Corrugata、P. tolaasiiなど多数のPseudomonas種と９９%以上の塩基配列相同性を示したので、暫定的にシュードモナス属（Pseudomonas Sp.）に分類した。
【００３７】
したがって、本発明者らは、RRj228菌株を“シュードモナス属RRj228菌株”と命名し、2003年6月11日付で韓国農村振興庁農業生命工学研究院に付設の韓国農用微生物保存センター（KACC）に寄託し、受託番号KACC 91052を付与された。また、このシュードモナス属RRj228（Pseudomonas sp. RRj228）については、2005年5月27日付けで国際寄託機関であるＫＲＩＢＢ（Korean Research Institute of Biosceience and Biotechnology）のＫＣＴＣ（Korean Culture for Type Cultures）に再寄託され、寄託番号KCTC 10812BPを付与された。
【００３８】
［試験例１］シュードモナス属RRj228菌株の植物生長促進効果検定
シュードモナス属RRj228菌株の植物生長促進効果検定試験は、とうもろこし幼苗を対象にして実施した。とうもろこし幼苗接種試験は、とうもろこし根の終端３ｍｍ部位を試験菌株の培養物懸濁液に１．５時間浸漬して接種処理し、対照区の幼苗は、滅菌した微生物培養液に浸漬した。次に、とうもろこし幼苗をプラスチックボックス内の湿っぽいろ過紙に載置し、根の伸張開始点（starting line）にある根終端をろ過紙で覆った後、２８℃で２４時間恒温処理して、新しく伸張した根の長さを１０回繰り返して測定し、このようなRRj228菌株のとうもろこし生長促進力を検定した結果を下記表２（シュードモナス属RRj228菌株のとうもろこし生長促進力程度）に示した。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
前記表２から明らかなように、本発明によるシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株の植物生長促進力は、とうもろこし根を菌株培養液に１．５時間沈積する方法で接種した時、根伸張が培養原液（4.5×109cfu/mL）の５０倍希釈接種時、２６%減少したが、１００倍希釈接種の場合、１３．０%増加したことから、接種濃度が低い条件で効果が高いことが分かる。
【００４１】
［試験例２］シュードモナス属RRj228菌株の土壌病拮抗力検定
シュードモナス属RRj228菌株の土壌病拮抗力検定は、ＰＤＡに病原性カビ及び細菌を各々接種した後、シャーレに移して、培地を固めた後、半径４mm大きさのウェル（well）を作り、ここに液体の馬鈴薯培地で２８℃条件で５日間培養したシュードモナス属RRj228菌株を１００μLずつ接種して、２８℃条件で５日間保管した後、根圏細菌の病原菌生長阻止範囲を測定し、その結果を表３｛土壌微生物RRj228菌株の植物病原性カビ及び細菌に対する生長抑制力程度（菌株接種５日後の病原菌の生長阻止範囲）｝に示した。植物病原菌の接種は、カビの場合、１×１０6conidia/mL ５mLと細菌性病原菌１×１０8cfu/mL ５mLを各々４５℃のＰＤＡ培地２５０mLに混合し、攪拌した後、シャーレ当たり２５mLずつ３回繰り返して分株して接種した。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
上記結果から明らかなように、本発明によるRRj228菌株は、植物病原性カビであるフィトフトラ・カプシシ（Phytophtora capsici）とピシウム（Pythium）、植物病原性細菌であるエルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）とシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringiae）などに対して強い生長抑制効果を示した。
【００４４】
［試験例３］シュードモナス属RRj228菌株の根着生競合力
試験菌株の植物根着生競合力は、対照菌株であるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ＷＣＳ３６５と試験菌株を稲（金烏稲）と大根（Saxa nova）の根に同時に接種した時、根に着生された全体菌株の中でRRj228菌株が占める割合で示し、その結果を表４（土壌微生物シュードモナス属RRj228 のシュードモナス・フルオレセンスWCS365菌株対比根着生競合力）に示した。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
［試験例４］シュードモナス属RRj228菌株の農作物接種効果検定
本発明の植物生長促進土壌微生物シュードモナス属RRj228菌株（KCTC 10812BP）を通常の方法で培養した培養液を、稲、唐辛子、キュウリ、トマトに接種し、その結果を下記表５（土壌微生物RRj228菌株の農作物接種効果）に示した。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
上記表５から、シュードモナス属RRj228菌株（KCTC 10812BP）は、稲の収量を３３．２%、唐辛子の収量を８．５%、キュウリの生長を２１．４%、及びトマトの生長を１１７．５%向上させることが分かり、これにより、本発明によるシュードモナス属RRj228菌株が化学肥料を相当量代替できる微生物肥料資源として使われることができることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株を分離するために培養したプレートを示す図である。
【００５０】
【図２ａ】シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株の電子顕微鏡写真である。
【００５１】
【図２ｂ】シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株の電子顕微鏡写真である。
【００５２】
【図３】シュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株が植物根の内部に定着した写真である。
【００５３】
【図４】シュードモナス属RRj228（KACC 91052）菌株の寄託証である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月30日(2005.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、作物の栽培時、化学肥料の代わりに、植物根の表面と内部に定着して植物の生長を促進させる配列番号１のシュードモナス属RRj228（KCTC 10812BP）菌株に関する。なお、このシュードモナス属RRj228（Pseudomonas sp. RRj228）については、2003年6月11日付けで「寄託番号KACC 91052」の下に韓国農村振興庁農業生命工学研究院に付設の韓国農用微生物保存センター（KACC）に寄託されたが、2005年5月27日付けで『寄託番号KCTC 10812BP』の下に韓国の国際寄託機関であるＫＲＩＢＢ（Korean Research Institute of Biosceience and Biotechnology）のＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures）に再寄託されたので、以下の記載においては、「寄託番号KACC 91052」に代えて『寄託番号KCTC 10812BP』を用いる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
したがって、本発明者らは、RRj228菌株を“シュードモナス属RRj228菌株”と命名し、2003年6月11日付で韓国農村振興庁農業生命工学研究院に付設の韓国農用微生物保存センター（KACC）に寄託し、受託番号KACC 91052を付与された。また、このシュードモナス属RRj228（Pseudomonas sp. RRj228）については、2005年5月27日付けで国際寄託機関であるＫＲＩＢＢ（Korean Research Institute of Biosceience and Biotechnology）のＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures）に再寄託され、寄託番号KCTC 10812BPを付与された。