(57)【要約】【課題】  薬物依存症の脆弱性を遺伝子を解析することで予測する方法を提供すること。【解決手段】  アデノシンA2A受容体(ADORA2A)遺伝子の遺伝子多型を解析し、この解析に基づいて薬物依存症に対する脆弱性を予測する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンA2A受容体(ADORA2A)遺伝子の遺伝子多型を解析し、該解析に基づいて薬物依存症に対する脆弱性を予測することを特徴とする薬物依存症に対する脆弱性の予測方法。
【請求項２】
前記遺伝子多型が、少なくともExon2+751(1038C/T)多型であることを特徴とする請求項１に記載の薬物依存症に対する脆弱性の予測方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型が、Exon2+751(1038C/T)多型と連鎖不平衡にある一塩基変異多型（SNP）であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬物依存症に対する脆弱性の予測方法。
【請求項４】
前記薬物依存症が、メタンフェタミン(MAP)に対する薬物依存症であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の薬物依存症に対する脆弱性の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物依存症に対する脆弱性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシンA2A受容体(ADORA2A)遺伝子と疾患の関連解析ではパニック障害が唯一報告されている。ADORA2A遺伝子の遺伝子多型部位は既知であるものの、薬物依存症との関係については、明らかにされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
メタンフェタミンなどの覚醒剤は薬物依存を引き起こす。その弊害は個人にとどまらず、個人の社会適応性を低下させ、社会的コストを増大させる。そのため、薬物依存症の患者を立ち直らせる治療薬、治療法が望まれている。アデノシン受容体は情動などの高次神経機能に関与すると言われているドーパミンの受容体と相互作用することが知られ、薬物依存症と何らかの関わりが考えられた。そこで発明者はADORA2A遺伝子を詳細に解析し、日本人の薬物依存症患者と健常人の遺伝子を比較し、疾患関連遺伝子多型が存在するか検討し、それら関連性を明らかにしようと意図した。そして、診断、治療薬の開発に結びつけることを意図した。
【０００４】
本発明は、薬物依存症の脆弱性を遺伝子を解析することで予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
アデノシン受容体がドーパミン神経伝達に関与することから、アデノシン神経伝達がメタンフェタミン(MAP)依存に関わっていることが考えられる。そこで我々は、アデノシンA2A受容体(ADORA2A)遺伝子多型がMAP依存に関わっていると考えた。この仮説を検証するため、我々は16名のMAP依存患者についてADORA2A遺伝子のエキソン、イントロン部分について変異を解析した。そして６カ所の変異を見いだした。即ち４カ所は新規であり、２カ所は報告されたものであった。これら遺伝子多型部位とMAP依存の相関解析を患者群171例、コントロール群229例を用いて解析した。MAP依存とExon2+751のアレル頻度（P=0.0057）とジェノタイプ頻度(P=0.018)で相関を見いだした。Exon2+751はエキソン上の非翻訳領域にあるExon2+1360と連鎖不平衡にあった。MAPサンプルを臨床的に小分類したところ、幻覚妄想の期間が一ヶ月以下のもの、自然再燃のないもの或いはMAPだけの使用者について、Exon2+751について、統計的に有意差が認められた。男女別に見た場合、有意差は女性サンプルで確認された。これらの結果は、ADORA2A遺伝子変異がMAP依存における症状を重くしないことに働く脆弱性因子であることを示唆する。また、女性におけるMAP依存に関連する可能性も示唆された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
アデノシンA2A受容体遺伝子多型とメタンフェタミン依存の相関解析を行い、これを本発明の実施例として以下に説明する。
【実施例】
【０００７】
メタンフェタミン(MAP)は精神興奮作用を持ち、強い依存性薬物である。MAPはモノアミンの神経伝達を変化させる。中でもドーパミン(DA)は最も直接的に報酬効果に関わっている。MAPを急性投与するとDAはトランスポーター依存に逆輸送され、またMAPはシナプス小胞のプロトンの濃度勾配を変化させシナプス小胞より細胞内にDAを放出させ、細胞外のDA濃度は上昇する。MAPを反復投与すると逆耐性が起こるがこれはヒトにおける精神症状や依存と同じような神経系の可塑的変化が起こったためと考えられる。MAPを齧歯類やヒト以外の霊長類に繰り返し投与すると線条体のDA濃度の減少や様々な脳領域での代謝産物の減少が見られる。DA神経終末の変性、DA取り込みやチロシン水酸化酵素活性の減少も報告されている。これらの変化は薬剤投与後数日以内に起こり、その後数ヶ月、数年間は持続する。
【０００８】
これまでに得られた知見によると、アデノシンはドーパミンの神経伝達に関与している。ドーパミン機能に対し、アデノシン受容体作動薬は阻害し、アデノシン受容体阻害薬は促進する。アデノシンA2A受容体(ADORA2A)は線条体や側坐核、嗅球といったDA神経が投射している部分に限局されている。アデノシン神経伝達がアンフェタミンの機能を修飾することについては、アデノシンA2A受容体を欠損したマウスでアンフェタミン投与によっても行動量が増加しないという結果から明らかになった。アンフェタミンやコカインによる行動量の増加はアデノシンA2A受容体欠損マウスで減少した。毎日アンフェタミンを一週間投与すると運動量は野生型マウスに比べ上昇した。しかし運動量の逆耐性現象は見られなかった。
【０００９】
従って、ADORA2A遺伝子多型がMAP依存の個体差に関係していることは考えられる。ヒトのADORA2A遺伝子は染色体22q11.2に存在する。ADORA2A遺伝子多型と疾患との相関についての最初の報告は、Deckertらの統合失調症の報告である。彼らは、405C/T, 1083C/T, 1018G/Aの３つの多型を見いだしたが、相関は見いだせなかった。アデノシン作動薬であるカフェインはパニック症状を引き起こすことが知られている。彼らはさらにSSCA法を用いて432C/T、1083C/T多型を見いだした。パニック障害と1083C/T多型との相関をドイツ人サンプルを用いて解析し相関を見いだした。Yamadaらは405C/T, 432C/T, 1018C/T, 1083C/T多型について日本人のパニック障害について解析した。405C/T, 432C/T, 1018C/T多型はまれであり、1083C/T多型はパニック障害と相関しないことを報告した。いずれの報告でも405C/T, 1018G/A多型はまれであった。Alseneらは、1083C/T多型（彼らは1976C/Tと呼んでいる）と2592C/Tins多型は連鎖不平衡にあることを見いだした。彼らは1976T/Tと2592Tins/Tinsのジェノタイプ頻度は、カフェイン摂取による不安の増大が他の多型グループよりも大きいことを報告した。従って彼らは、パニック障害と相関する1976C/T多型はカフェイン急性投与による不安作用とも相関すると結論づけている。ADORA2A遺伝子多型とパニック障害の相関はさらに家系でも解析された。Hamiltonらは、1083C/T多型を含む５SNPについて相関を見いだした。1083C/T多型と本態性高血圧症との相関は日本人のサンプルで解析され相関は見られなかった。
【００１０】
ADORA2A遺伝子多型と薬物依存の相関については解析されていない。本研究では、我々は翻訳領域を含むエキソンの全てとエキソン−イントロン境界部分について日本人のサンプルについて遺伝子多型の検索を行い、ADORA2A遺伝子の報告されている多型および新たに見いだした多型について日本人のMAP依存患者との相関を解析した。
【００１１】
本実施例の材料と方法について説明すると、本研究は、JGIDAの各施設において倫理委員会の承認を得て実施し、全ての被験者についてDNAサンプルを本研究に用いることについて書面による同意をえた。
【００１２】
171患者群サンプルと229健常群サンプルを用いた。患者群（男性138名、女性33名、37.5±12.0才）はMAP依存でありICD-10DCRを満たす精神疾患(F15.2及びF15.5)を持っており、入院および外来患者である。患者群は統合失調症や精神疾患、その他の身体的精神疾患の診断があれば除外した。コントロール群（男性119名、女性110名、41.2±12.3才）は過去や家族歴に薬物依存や精神疾患のない健常人とし、大半は医療関係者であった。全てのサンプルは日本人であり、生まれと居住は九州北部、瀬戸内、中京、東海、関東地域と日本のうちでも限られた地域とした。
【００１３】
症状別に検討する場合、４つの指標について、２−３のサブグループに分けて行った（図５参照）。(A)初回MAP摂取から発症するまでの期間：３年未満、あるいは３年以上、(B)幻覚妄想の期間：短期（１ヶ月以内）、長期（１ヶ月以上）、(C)自然再燃：あり、なし、(D)多剤依存：MAPのみ、MAPと合法薬剤、MAPと非合法薬剤。
【００１４】
被験者から同意を得たのち、DNA抽出のために血液を採取した。ゲノムDNAはフェノール／クロロフォルム法により末梢血から得た。
【００１５】
ADORA2A遺伝子多型部位の同定について説明すると、まず最初に、MAPサンプル１６名分を用いて、ADORA2A遺伝子（NCBI登録配列 AP000355およびNT_011520）内の遺伝子多型を検索した。エキソン1,2およびエキソン−イントロン境界部分をPCR法により増幅し、PCR産物はBigDye ターミネータ法により両側からシークエンスした。エキソン１の増幅には1F-4Rを用い、エキソン２には、5F-8Rをそれぞれ用いた。PCR産物のシークエンスは、エキソン１では、1F, 1R, 2F, 2R, 3F, 3R, 4F, 4R、エキソン２では5F, 5R, 6F, 6R, 7F, 7R, 8F, 8Rを用いた(図１参照)。
【００１６】
Exon1+179およびexon1+219の遺伝型の決定には、3F-4RプライマーでPCR産物の増幅を行い、3Fおよび3Rでシークエンスした。IVS1+64は、4F-4RプライマーでPCR産物の増幅を行い、BcnIで制限酵素消化を行った(PCR-RFLP)。Exon2+751およびIVS2+28は5F-8RによるPCR後、6F, 6R、あるいは8F, 8Rによりそれぞれシークエンスした。
【００１７】
統計解析を行うことで、各遺伝子多型部位は、アレル頻度、ジェノタイプ頻度を求め、また、カイ平方検定によりHardy-Weinberg平衡を調べた。統計解析の有意水準はα=0.05とした。コントロール群―患者群の比較はカイ平方検定によってアレル頻度とジェノタイプ頻度を比較した(図３参照)。
【００１８】
ADORA2A遺伝子多型解析の結果について説明すると、ADORA2A遺伝子多型を同定するため、我々は日本人のMAP患者16名分のゲノムDNAについてエキソン、エキソン−イントロン境界部分について解析した。6カ所のSNP（一塩基変異多型）を同定し、うち２カ所Exon+751(1083C/T)とExon2+1360は報告されていた。405C/T, 432C/T, 1018C/T多型は検出出来なかった。このことはYamadaらによる日本人のサンプルの結果と一致した。Exon1+179、Exon1+219はエキソン１の5’側の非翻訳領域にあった。IVS1+64はイントロン１にあった。Exon2+751はエキソン２の翻訳領域にあった。このSNPはアミノ酸変異を伴わない。Exon2+1360はエキソン２の3’側非翻訳領域にあった。IVS2+28はイントロン２にあった。Exon2+751とExon2+1360の二つのSNPはMAP16サンプルを解析し、SNPのジェノタイプパターンが一致しているという意味で、連鎖不平衡にあった。この連鎖不平衡は欧米人でも報告されている。我々はExon2+751をこれらSNPの代表として選んだ。Exon1+179, Exon1+219, IVS1+64, Exon2+751と IVS2+28をさらに解析することにした(図２参照)。
【００１９】
ADORA2A遺伝子多型とMAP依存の相関解析について説明すると、ADORA2A遺伝子多型とMAP依存の相関を解析するため、我々は代表的な5SNPについて、171例のMAP患者群と229例のコントロール群を比較した。コントロール群のSNPのジェノタイプ頻度はHardy-Weinberg平衡にあり、コントロール群ではサンプルにバイアスはなかった。MAP患者群では、Exon1+179, Exon1 +219, Exon2 +751および IVS2 +28ではHardy-Weinberg平衡にあったが、IVS1+64だけはHardy-Weinberg平衡になかった。このことはMAP依存に何らかの関係があることを示唆する。しかし、IVS1+64はアレル頻度、ジェノタイプ頻度とも相関は認められなかった。Exon2+751ではジェノタイプ頻度（P=0.018）、アレル頻度（P=0.0057）ともに患者−コントロール群の比較で違いが認められた。さらに男女別に解析したところ、ジェノタイプ頻度(P=0.0078)、アレル頻度(P=0.0143)ともに女性サンプルで有意差が認められた(図４参照)。
【００２０】
我々はさらにExon2+751多型について臨床パラメーター（発症までの期間、幻覚妄想の期間、自然再燃、多剤乱用）との相関を検討した。幻覚妄想の期間の短い群(P=0.0356)、自然再燃のない群（P=0.046）、MAPのみの依存群(P=0.0099)で相関が認められた。最後の群のみBonferroni修正を行っても有意であった。
【００２１】
本実施例に関して考察した結果について説明すると、我々はADORA2A遺伝子多型とMAP依存の相関を解析した。我々はExon2+751(1083C/T)とExon2+1360多型を再認し、エキソンとイントロンに新たに４SNPを見いだした。Exon2+751多型とMAP依存の相関を見いだした。この相関は女性サンプルでも認められた。また、幻覚妄想の期間の短い群、自然再燃のない群、MAPのみの依存群で相関が認められた。
【００２２】
MAPは日本では非合法依存性薬物の中で最も使用されている。MAPを摂取すると強い精神依存症状を現し、繰り返し使用するとしばしば精神症状を来たす。この症状は分裂型統合失調症と似ている。MAPによるドーパミントランスポーターからのドーパミンの放出は報酬や精神症状の誘導に最初に関わってくるものである。ドーパミン神経系による神経伝達は依存における神経回路の重要な部分である。このドーパミン受容体とアデノシン受容体との相互作用やアデノシン受容体の精神運動に及ぼす影響についてはよく研究されている。コカインやアンフェタミンのような精神興奮薬と比較し、アデノシン受容体作動薬は逆向きに、アデノシン受容体拮抗薬は増強側に働く。この線条体における拮抗的なアデノシン−ドーパミンの相互作用はアデノシンA1受容体とドーパミンD1受容体の複合体或いはアデノシンA2A受容体とドーパミンD2受容体複合体によるものを思われる。D2受容体やA2受容体は線条体、側坐核或いは嗅球に密に発現している。従ってADORA2Aがドーパミン神経系を修飾しているのは明らかであるが、MAP依存の病理的側面はまだ明らかになっていない。Exon2+751多型でMAP依存と相関が認められたことは、MAP依存を発症する際にADORA2Aがドーパミン神経系を修飾することを示唆する。
【００２３】
ADORA2A遺伝子の病理的側面を解析するために、MAP患者群のサンプルを臨床症状により分類し解析した。この臨床症状による分類の結果は注意が必要である。候補遺伝子に注目した相関解析のアプローチでは、多くの候補遺伝子がある場合、有意水準を0.05とした時に多数の擬陽性を生じる。Bonferroniによる補正を臨床症状によって分類した数で補正した場合、幻覚妄想の期間の短い群、自然再燃のない群では有意ではなくなる。ただ一つ、MAPのみの依存群で相関が認められた。Exon2+751多型は、他の依存性薬剤を使用していないMAPだけの使用で依存になるという脆弱性に関わっているものと思われる。Tアレルの増加が、カフェインに対して急性の不安作用を引き起こすことやパニック障害で多く見られることと、この研究ではむしろMAP依存で減少することは一見矛盾して見える。Tアレルは非合法依存性薬剤の使用における精神的なコントロールに関与しているのかもしれない。
【００２４】
Exon2+751Tのアレル頻度は日本人の結果でも様々である。即ち、78%、46%、そして本研究では56%である。この違いは注意が必要である。サンプルの層別化はしばしば患者−コントロール群比較実験では擬陽性をもたらす。我々はサンプルを限局された地域、限局された施設、病院で収集した。従って、コントロール群のアレル頻度が実験間でばらついていても、今回の研究の中に限ればバイアスはかかっていないと考えられる。違いは日本国内における地域の違いだと思われる。
【００２５】
女性で有意がみられたことについても議論が必要である。サンプルサイズはそれほど大きくはなく、より多くのサンプルを用いた追試が必要である。多くのMAP依存者は男性であり、女性は多くはない。男女数の違いは社会的な環境、性差による影響あるいは別の理由かもしれない。前臨床あるいは臨床試験で、卵巣ホルモン、特にエストロジェンは薬物依存に関わっていることが示唆されている。ADORA2A遺伝子はこれらに対して影響している、或いは影響されているのかもしれない。
【００２６】
Exon2+751多型はアミノ酸変異を伴わない。Exon2+1360はExon2+751と連鎖不平衡にある。この連鎖不平衡は欧米人でも報告された。このSNP或いはこれらと連鎖不平衡にある別のSNPがMAP依存の病理に関与しているのかもしれない。
【００２７】
まとめると、ADORA2A遺伝子は日本人のMAP依存の危険因子であり、MAP依存におけるアデノシン系とドーパミン系の相互作用について今後の研究価値があると思われる。
【００２８】
以上、本発明の実施例を説明してきたが、具体的な構成はこれら実施例に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における変更や追加があっても本発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
発明者は、ADORA2遺伝子の解析を行い、多くの遺伝子多型を見いだした。中でも一部の遺伝子多型は薬物依存症との関連を強く示し、本発明を完成するに至った。本発明により、ADORA2遺伝子の薬物依存症と関連する遺伝子多型が提供される。本遺伝子多型に注目し、治療薬の開発、診断法の開発を行うことが可能となる。
【００３０】
本発明の活用例として、アデノシンA2A受容体遺伝子を、薬物依存症の診断薬や薬物依存症の治療薬開発のための標的としての情報として用いることができる。例えば、ADORA2A遺伝子の遺伝子多型、ハプロタイプを含むオリゴヌクレオチドを用いたマイクロアレイによる遺伝子診断や、ADORA2A遺伝子の遺伝子多型、ハプロタイプにより変化する発現・機能を改善させる治療薬の開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】プライマー配列一覧。
【図２】日本人のADORA2A遺伝子の多型。
【図３】患者群とコントロール群におけるジェノタイプ頻度とアレル頻度。
【図４】患者群、コントロール群におけるExon2+751多型の性差。
【図５】Exon2+751の症状により分類した解析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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