(57)【要約】【課題】細胞機能を効果的に再現性よく制御することができるリガンド構築物、及び該構築物を固定化してなる細胞培養用基材を提供すること。【解決手段】細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物、並びに前記リガンド構築物を固定化してなる細胞培養用基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物。
【請求項２】
細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物であって、核酸スペーサーが複数の核酸からなる場合、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子がそれぞれ同一又は異なる核酸鎖に結合してなるものである、リガンド構築物。
【請求項３】
核酸スペーサーの長さが１〜３００ｎｍである請求項１又は２記載のリガンド構築物。
【請求項４】
核酸スペーサーがデオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸又はそれらの誘導体である請求項１〜３いずれか記載のリガンド構築物。
【請求項５】
核酸スペーサーがデオキシリボ核酸又はその誘導体である請求項１〜３いずれか記載のリガンド構築物。
【請求項６】
リガンド分子を、デオキシリボ核酸又はその誘導体の５’末端及び／又は３’末端に結合してなる請求項５記載のリガンド構築物
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載のリガンド構築物を固定化してなる細胞培養用基材。
【請求項８】
リガンド構築物を基材１ｃｍ2当り０．１〜１６６×１０3ｆｍｏｌ固定化してなる請求項７記載の細胞培養用基材。
【請求項９】
請求項１〜６いずれかに記載のリガンド構築物の存在下に培養して得られた細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６いずれかに記載のリガンド構築物の存在下に細胞を培養する工程を含む、細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死といった細胞機能を制御し得る細胞培養用材料、詳しくは、細胞受容体に結合し得るリガンド分子のナノメートルオーダーでの精緻な配列を可能にしたリガンド構築物、及び該構築物を固定化した細胞培養用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を用いて様々な物質を評価する試みや細胞を医療に応用する試みが盛んに行われている。細胞を用いて様々な物質を評価する試みとしては、例えば、薬物の薬効・薬理・毒性に関する試験を効率的に行うシステム、動物実験を代替する細胞を利用した評価システム、細胞を用いた各種センサー、細胞の増幅方法や分化の仕組みを探索するシステム等の開発が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また、細胞を医療に応用する試みとして、例えば、体外で培養した細胞を移植して治療すること、スキャホールド（細胞の足場となる生分解性の材料）を細胞と共に体内に埋め込み欠損部を再生させること等の細胞（再生）医療、バイオ人工臓器、患者個人の細胞を体外で評価することにより個々に最適な医療を提供するための診断方法等の開発が挙げられる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
物質の評価、医療等の用途に細胞を利用する場合、細胞本来の性質を再現させるために、生体外、すなわち、人工的な基材の上で、細胞の機能、例えば、接着、増殖、分化、未分化、細胞死等を精緻に制御する技術が必要となる。本来の性質を失った細胞の使用は、例えば、薬物の作用の誤った解釈、移植した細胞の生体に対する不適合等を招く場合があるという欠点がある。そのため、人工基材を種々改変する試みが活発になされている。その際に、細胞、特に、細胞表面受容体が認識できる細胞接着性の機能性分子が重要な機能を担うことになる。
【０００５】
リガンド分子として生体内から抽出した細胞外マトリクスであるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を用いて人工基材を被覆し、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究が古くから行われている（例えば、非特許文献２、３参照）。また、リガンド分子として、ホルモンや増殖因子を用いて人工基材を被覆する方法を利用することによっても、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究がなされている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
しかし、抽出した細胞外マトリクスによって細胞の機能を制御する方法では、生体内から精製できる細胞外マトリクスの種類が実質的に限られること、微量で、抽出が困難な細胞外マトリクスを用いることが実質的にできないこと、純度、不純物等の影響により再現性の高い結果を得ることが困難であること等の欠点がある。そのため、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再構成することは困難であるのが現状である。
【０００７】
そこで、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等細胞外マトリクスに含有され、かつ細胞表面受容体が認識できる合成ペプチド分子（例えば、ＲＧＤ、ＲＥＤＶ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ等のアミノ酸配列）をリガンド分子として用い、密度及び種類を種々変更して人工基材上に被覆して細胞機能を制御する試みもなされている（例えば、非特許文献５、６）。しかし、単純な合成ペプチド分子でただ単に人工基材を被覆するだけでは、十分な細胞機能の制御は困難であった。
【０００８】
上述したような方法と組み合わされる形で、微細加工された基材表面に細胞を相互作用させて細胞の機能を制御する試みもなされている。例えば、インクジェットリソグラフィー法（例えば、特許文献１，２参照）、光リソグラフィー法（例えば、特許文献３，４及び非特許文献７参照）、マイクロコンタクトプリンティング法（例えば、特許文献５，６、非特許文献８参照）等の手法を用い、リガンド分子を配列させて細胞機能を制御する試みがなされている。これらの微細加工による方法では細胞自体の配置等を制御することが主たる目的である。従って、人工基材を被覆しているリガンド分子は抽出された細胞外マトリクスや合成ペプチド分子であって、当然ながら細胞の機能を十分に制御できているとは言えなかった。
【０００９】
その一方で、例えば、ディルーロ（ＤＡ．Ｄｉ  Ｌｕｌｌｏ）らは、約３００ｎｍの長さを有するＩ型コラーゲン分子鎖上に、種々の細胞表面受容体に結合するリガンド部位がナノメートルオーダーで配列して存在することを報告している（非特許文献９）。この概念に従えば、上述したようなリガンド分子の結合密度や種類を単純に変化させて人工基材上に固定化する方法や、マイクロメートルオーダーの微細加工をそれに組み合わせる方法等のような従来の細胞機能の制御方法では、十分な細胞機能を導き出すことは困難であると考えられる。
【００１０】
近年、ナノ構造を制御した表面によって細胞機能を制御する試みも実施され始めている。カーチス（ＡＳＧ．Ｃｕｒｔｉｓ）らのグループは高分子間の相分離による表面ナノトポグラフィーの制御に成功し、ナノ構造と細胞機能の相関性について検討を進めている（例えば、特許文献７、非特許文献１０参照）。しかし、この技術では、単に基材表面の凹凸構造をナノスケールで制御しているに過ぎず、種々のリガンド類をナノスケールで配列させることは困難である。
【００１１】
エレクトロスピニング法等により調製したナノファイバーに細胞を接触させ、機能制御する試みも最近報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。しかし、前記非特許文献１１に記載の方法においても、単に基材表面の凹凸構造をナノスケールで制御しているに過ぎず、任意のリガンド分子をナノスケールで配列させることは実質的には困難であるのが現状である。
【００１２】
ナノメートルスケールで任意の物質を任意の位置に付与する方法として、原子間力顕微鏡の探針にタンパク質等の溶液を付け基板にナノメータースケールの描画をする技術、ディップペンナノリソグラフィーが提案されている（例えば、非特許文献１２及び１３参照）。しかし、前記技術でもライン幅及びドット径は３０から５０ｎｍであり、コラーゲン分子に観察されるようなナノスケールでのリガンド分子の配列を再現して調製することは微細性の観点から困難である。さらに言えば、このディップペンナノリソグラフィーでは細胞の培養に適した広い範囲への描画は困難であり、今のところ実用は困難である。
【００１３】
以上の微細加工技術では限界のあるリガンド分子のナノスケールでの配列を実現できる方法として、ナノメーターの長さを有する高分子スペーサーによりリガンド分子を連結する技術（スペーサー法）が報告されている。ダイ（Ｗ．Ｄａｉ）らは、フィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体のリガンド分子であるＲＧＤ分子又はラミニン中のリガンド分子であるＹＩＧＳＲ分子どうしを平均分子量約３５００のポリエチレングリコール鎖を介して２分子結合させた細胞凝集剤を報告している（例えば、非特許文献１４参照）。
【００１４】
また、川崎らは、フィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体のリガンド分子であるＲＧＤと、そのシナジー配列であるＰＨＳＲＮを、平均分子量約２５００〜約３４００のポリエチレングリコール鎖を介して結合させたヘテロリガンド分子を合成している。この分子をディッシュ上に固定し、細胞の伸展具合を観察している（非特許文献１５及び１６参照）。同様にフィブロネクチン中のリガンド分子であるＲＧＤとＥＩＬＤＶやラミニン中のリガンド分子であるＰＤＳＧＲとＹＩＧＳＲを結合させた分子を合成し、ガン転移抑制試験に用いている（例えば、非特許文献１７及び１８参照）。
【００１５】
スペーサー法は、確かにこれまでのナノ相分離、ナノファイバー、ディップペンナノリソグラフィー等の微細加工法によるリガンド分子のナノ配列と比較すると、様々なリガンド分子を任意にナノ配列化できる、細胞の培養に適した広い範囲への描画が可能等の利点がある。しかし、川崎らのように分子量分布のあるポリエチレングリコール等をスペーサーとして利用した場合には、スペーサーが複数成分（混合物）となって、実質的にリガンド間の距離にも分布ができ、ナノ配列が曖昧となる。また、ポリエチレングリコール鎖は水溶液中でランダムコイル状態となってリガンド分子の間隔を設計して制御することは困難である。従って、単一成分であるコラーゲン等を模倣したリガンド分子のナノ配列を調製することが困難となる。これは細胞に対して特異的なシグナルを与えることが実質的にできないことを意味する。
【特許文献１】特開２００２−３５５０２５号公報
【特許文献２】特開２００２−３５５０２６号公報
【特許文献３】特開平７−３０８１８６号公報
【特許文献４】特開平１１−１５１０８６号公報
【特許文献５】特表２００２−３５５０３１号公報
【特許文献６】特表２００２−５０９００１号公報
【特許文献７】特表２００２−５０５９０７号公報
【非特許文献１】石川智久、堀江透  編集、創薬サイエンスのすすめ−ポストゲノム時代のパラダイムシフト、共立出版（２００２）
【非特許文献２】ＰＰ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献３】小出輝、林利彦  編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）
【非特許文献４】Ｙ．Ｉｔｏ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３３３（１９９９）
【非特許文献５】Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５（２００３）
【非特許文献６】Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３（２００３）
【非特許文献７】ＡＳ．Ｂｌａｗａｓ，ＷＭ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９，５９５−６０９（１９９８）
【非特許文献８】ＲＳ．Ｋａｎｅ，Ｓ．Ｔａｋａｙａｍａ，Ｅ．Ｏｓｔｕｎｉ，ＤＥ．Ｉｎｇｂｅｒ，ＧＭ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３６３−２３７６（１９９９）
【非特許文献９】ＧＡ．Ｄｉ  Ｌｕｌｌｏ，Ｓｍ．Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｋｏｒｋｋｏ，Ｌ．Ａｌａｋｏｋｋｏ，ＪＤ．Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（６），４２２３−４２３１（２００２）
【非特許文献１０】ＭＪ．Ｄａｌｂｙ，Ｄ．Ｇｉａｎｎａｒａｓ，ＭＯ．Ｒｉｅｈｌｅ，Ｎ．Ｇａｄｅｇａａｒｄ，Ｓ．Ａｆｆｒｏｓｓｍａｎ，ＡＳＧ．Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，７７−８３（２００４）
【非特許文献１１】ＸＭ．Ｍｏ，ＣＹ．Ｘｕ，Ｍ．Ｋｏｔａｋｉ，Ｓ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，１８８３−１８９０（２００４）
【非特許文献１２】Ｋ−Ｂ．Ｌｅｅ，Ｓ−Ｊ．Ｐａｒｋ，ＣＡ．Ｍｉｒｋｉｎ，ＪＣ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５，１７０２−１７０５（２００２）
【非特許文献１３】ＤＬ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｈｏｎｇ，Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ−Ｇｏｌｏｍｂ，ＣＡ．Ｍｉｒｋｉｎ，ＤＬ．Ｋａｐｌａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９８（２４），１３６６０−１３６６４（２００１）
【非特許文献１４】Ｗ．Ｄａｉ，Ｊ．Ｂｅｌｔ，ＷＭ．Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７９７−８０１（１９９４）
【非特許文献１５】Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）
【非特許文献１６】Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）
【非特許文献１７】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｎｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｙ．Ｋａｎｅｄａ，ｙ．Ｍｕ，ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＫＷ．Ｌｅｍ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，５９５−５９８（１９９７）
【非特許文献１８】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｍｕ，Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＴＪ．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，４８５−４８９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、１つの側面では、種々の人工マトリクスを容易に調製できること、細胞機能を人工的に制御すること、ナノ構造を持つ人工的な環境と細胞とを相互作用させること、リガンド分子間の距離が実質的に均一であること、細胞機能を効果的に再現性よく制御すること、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えること等の少なくとも１つを達成する、リガンド構築物を提供することに関する。また、本発明は、他の側面では、細胞機能を人工的に制御すること、細胞機能を効果的に再現性よく制御すること、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えること等の少なくとも１つを達成する、細胞培養用基材を提供することに関する。さらに、本発明は、別の側面では、細胞機能が効果的に再現性よく制御された細胞を容易に、高い再現性で、かつ安定的に調製すること、生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルが再現性よく与えられた細胞を容易に、高い再現性で、かつ安定的に調製すること等の少なくとも１つを達成する、細胞の調製方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
すなわち、本発明は、
〔１〕  細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物、
〔２〕  細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結してなるリガンド構築物であって、核酸スペーサーが複数の核酸からなる場合、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子がそれぞれ同一又は異なる核酸に結合してなるものである、リガンド構築物、
〔３〕  核酸スペーサーの長さが１〜３００ｎｍである前記〔１〕又は〔２〕記載のリガンド構築物、
〔４〕  核酸スペーサーがデオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸又はそれらの誘導体である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載のリガンド構築物、
〔５〕  核酸スペーサーがデオキシリボ核酸又はその誘導体である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載のリガンド構築物、
〔６〕  リガンド分子を、デオキシリボ核酸又はその誘導体の５´末端及び／又は３´末端に結合してなる前記〔５〕記載のリガンド構築物、
〔７〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のリガンド構築物を固定化してなる細胞培養用基材、
〔８〕  リガンド構築物を基材１ｃｍ2当り０．１〜１６６×１０3ｆｍｏｌ固定化してなる前記〔７〕記載の細胞培養用基材、
〔９〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のリガンド構築物の存在下に培養して得られた細胞、並びに
〔１０〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のリガンド構築物の存在下に細胞を培養する工程を有する細胞の調製方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリガンド構築物によれば、リガンド分子間の距離が実質的に均一に設定され得、また、従来技術と比較して、リガンド分子の種類と配列を変更することでこれまでには得られなかった種々の人工マトリクスを容易に調製できるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のリガンド構築物によれば、細胞機能を効果的に再現性よく人工的に制御することができ、ナノ構造を持つ人工的な環境と細胞とを相互作用させることができ、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えることができるという優れた効果を奏する。従って、本発明のリガンド構築物を用いれば、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再現性よく調製することができる。本発明の細胞培養用基材によれば、細胞機能を効果的に再現性よく人工的に制御することができ、細胞に対して生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルを再現性よく与えることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の細胞の調製方法によれば、細胞機能が効果的に再現性よく制御され、生体内の細胞外マトリクスと同等の特異的なシグナルが再現性よく与えられた細胞を容易に、高い再現性で、かつ安定的に調製することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、リガンド分子を、核酸スペーサーで連結させることにより、リガンド分子の間隔をナノメートルオーダーで任意の距離に実質的に均一に規定することができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００２０】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の１文字表記又は３文字表記により表される場合がある。かかる表記とアミノ酸との対応関係を以下に示す。Ａ又はＡｌａ：アラニン残基；Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基；Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基；Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基；Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基；Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基；Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基；Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基；Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基；Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基；Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基；Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基；Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基；Ｖ又はＶａｌ：バリン残基；Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基；Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基；Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
【００２１】
接着、増殖等の細胞機能の制御には、細胞表面の受容体が認識するリガンド分子が重要な機能を担う。かかる機能を発揮するためには、好ましくは、リガンド分子は、制御する細胞機能に応じて、ナノメートルオーダーで少なくとも２つの分子を正確に配列させることが望ましい。
【００２２】
本発明においては、核酸（その誘導体も含む）が用いられているため、従来、制御する細胞機能に応じて、ナノメートルオーダーで少なくとも２つの分子を正確に配列させることが困難であったにもかかわらず、核酸を利用した全く新しい方法で目的に応じてリガンド分子を適正に配列させることができるという優れた効果を発揮する。従って、本発明のリガンド構築物の存在下に細胞を培養することで、細胞機能を効果的に再現性よく制御することができる。
【００２３】
本発明のリガンド構築物は、細胞表面受容体に結合し得る、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子を、核酸スペーサーを介して連結したものである。
【００２４】
本発明のリガンド構築物において、リガンド分子の種類、数、リガンド分子間の距離等は、所望の細胞制御に関わる細胞表面受容体に応じて選択される。
【００２５】
なお、前記核酸スペーサーが複数の核酸からなる場合、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子はそれぞれ、同一又は異なる核酸に結合されていればよい。例えば、核酸スペーサーが２本鎖を形成する核酸からなるものであり、２つのリガンド分子が核酸の５’末端又は３’末端にそれぞれ結合する場合、該核酸スペーサーには、２つの５’末端及び３’末端が存在する。この場合、同一核酸の当該両末端にリガンド分子が結合するとリガンド分子は、同一の核酸に結合することになり、いずれか一方の核酸の５’末端にいずれか一方のリガンド分子が結合し、他方の核酸の５’末端に他方のリガンド分子が結合すると、リガンド分子は異なる核酸に結合することになる（例えば、図１参照）。
【００２６】
細胞表面受容体とリガンド分子との組み合わせ等については、例えば、小出輝ら編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）；林正男著、実験医学バイオサイエンス  新細胞接着分子の世界、羊土社（２００１）；関口清俊、鈴木信太郎、日本化学会編、多細胞体の構築と細胞接着システム、シリーズ・バイオサイエンス新世紀第８巻、共立出版（２００１）；左邉壽孝、月田承一朗編、実験医学増刊、細胞接着研究の最前線−シグナル伝達から癌転移への関与まで−、羊土社（１９９６）等を参照すればよい。
【００２７】
なお、本発明のリガンド構築物は、リガンド分子がナノメートルオーダーで配列するものであることから、その構造を「ナノ構造」という場合がある。
【００２８】
細胞表面受容体は、細胞の形質膜上に存在する受容体であって、リガンド分子との結合により細胞の機能に影響を与える受容体であれば特に限定はない。当該受容体としては、例えば、細胞外マトリクスの受容体、細胞間接着の受容体（「細胞間接着分子」ともいう）、ホルモン受容体、サイトカイン（増殖因子）受容体等が挙げられる。前記細胞間接着の受容体としては、例えば、ＮＣＡＭ、カドヘリン、セレクチン等が挙げられる。前記細胞表面受容体は、制御対象となる細胞機能に応じて最適なものを選択すればよい。
【００２９】
本発明において、「細胞表面受容体に結合するリガンド分子」とは、細胞表面受容体に対して結合活性を有する合成又は天然の分子であって、細胞の機能、例えば接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死に対して影響を与える分子のことを指す。本発明の本質は、細胞表面受容体に結合するリガンド分子の種類やナノ配列を種々に変化させ、対象とするそれぞれの細胞に対して最も適した外的な環境を与える方法を提供するものであり、リガンド分子そのものについて特に限定はない。
【００３０】
リガンド分子は、前記リガンド分子としては、例えば、本発明の目的を妨げないものであれば、細胞表面受容体と共に、特に限定されるものではないが、例えば、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体に結合する分子、サイトカイン（増殖因子）、ホルモン、抗体、糖類等が挙げられる。
【００３１】
細胞外マトリクスとしては、例えば、小出輝、林利彦  編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）等に記載されているものが挙げられる。前記細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（プロコラーゲンも含む）、エラスチン、フィブロイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、アグリン、アンカリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブリノーゲン、プロテオグリカン等が挙げられる。プロテオグリカンとして、例えばアグリカン、アグリン、パールカン、デュリン、フィブロモジュリン、ブレビカン等が挙げられる。以上のような細胞外マトリクスに由来する一部分の構造、すなわち生体内の細胞マトリクスのフラグメントや合成ペプチドを前記リガンド分子として用いてもよい。また、本発明においては、前記リガンド分子として、細胞外マトリクスに由来するもの以外の物質を用いてもよい。かかる物質としては、単純に細胞表面受容体に結合するアゴニストとして人工的に設計して合成された物質等が挙げられる。前記細胞外マトリクスは、何れもが以下に述べるように化学的に誘導体化されていてもよい。
【００３２】
「細胞外マトリクスタンパク質の一部分の構造であるフラグメント」とは、細胞外マトリクスの一部分を化学的又は酵素的に切断し精製後に得られるフラグメントであり、かつある特定の細胞表面受容体が結合可能な精製フラグメントのことを指す。前記フラグメントとしては、例えば、ＣＮＢｒ処理されて得られるＩ型コラーゲンの精製フラグメント（例えば、WD. Staatz, JJ. Walsh, T. Pexton, SA. Santoro, J. Biol. Chem., 265(9), 4778-4781(1990)に記載されているようなフラグメント）や、ＣＮＢｒやさらに必要に応じてトリプシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のプロテアーゼで処理をしたＩＶ型コラーゲンの精製フラグメント（例えば、JA. Eble, R. Golbik, K. Mann, K. Kuhn, EMBO J., 12(12), 4795-4802(1993)に記載されている方法により得られる三重らせん構造を有するフラグメント、さらにはEC. Tsilibary, AS. Charonis, J. Cell. Biol., 103(6), 2467-2473(1986)に記載されているような方法により得られるＮＣ１ドメイン等が含まれる）、フィブロネクチンをトリプシン又はペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる細胞接着性のフラグメント（例えば、SK. Akiyama, E. Hasegawa, T. Hasegawa, KM. Yamada, J. Biol. Chem., 260(24), 13256-13260(1985)参照）等が挙げられる。その他の細胞外マトリクスにも同様のことが言え、当然ながら以上に例示したフラグメントのみに限定されるわけではない。
【００３３】
「細胞外マトリクスに由来する一部分の構造である合成ペプチド」とは、細胞外マトリクスに含まれ、ある特定の細胞表面受容体が結合できる最小のアミノ酸配列を含有する化学的に合成されたオリゴペプチド全般のことを指す。特にフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン及びトロンボスポンジン等に共通して含まれ、細胞表面受容体が結合する最小のアミノ酸配列として、アミノ酸が３個結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列がよく知られている。このＲＧＤを含む合成ペプチド全般について、本発明におけるナノ構造を有するリガンド構築物に含まれるリガンド分子として用いることができ、特に限定されるものではない。
【００３４】
以上のようなＲＧＤ配列を含む直鎖状の合成ペプチドであって、本発明のリガンド分子として用いることのできるさらに具体的なペプチド配列としては、特に限定されないが、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＶ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＦ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＹＰＣ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号：１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ（配列番号：２）、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号：３）、ＧＧＧＰＨＳＲＮＧＧＧＧＧＧＲＧＤＧ（配列番号：４）等が挙げられる。
【００３５】
また、ＲＧＤ配列を含むペプチドを環状にすることで、細胞表面受容体への結合活性を制御することもできる。環状ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＰｅｎ＊ＧＲＧＤＳＰＣ＊Ａ、ＧＡＣ＊ＲＧＤＣ＊ＬＧＡ、ＡＣ＊ＲＧＤＧＷＣ＊Ｇ、シクロ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ）、シクロ（ＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＲＧＤｆＫ）、シクロ（ＲＧＤＥｖ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＬ）、シクロ（ＡＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＶ）等が挙げられる。なお、前記「Ｐｅｎ」は、ペニシラミンを示し、「＊」は、分子内でジスルフィド結合をしたシステイン残基を示す。また、ペプチド配列を示すアミノ酸一文字表記に含まれる小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。
【００３６】
以上のペプチドは、生体内の細胞外マトリクスの多くに共通して含まれる機能モチーフであるＲＧＤ配列を中心に種々改変し、探索されたものである。ＲＧＤ配列以外にも種々の細胞外マトリクスに由来する最小のアミノ酸配列が利用でき、リガンド分子として用いる合成ペプチドに含有させることができる。前記リガンド分子としては、必要に応じて最適な合成ペプチドが選ばれ、特に限定されないが、フィブロネクチン由来の最小アミノ酸配列として、例えば、ＮＧＲ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ等の配列を含む合成ペプチド等が挙げられる。
【００３７】
また、細胞外マトリクスの１つであるラミニン由来のアミノ酸配列として、例えば、ＬＲＧＤＮ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＣＤＰＧＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＹＦＱＲＹＬＩ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＡ（配列番号：５）等の配列を含む合成ペプチドが挙げられる。また、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、ラミニンに関して、例えば、野水基義、蛋白質  核酸  酵素、第４５巻、１５号、２４７５−２４８２（２０００）等に記載されているような細胞接着活性のあるペプチド配列、例えば、α１鎖に由来するＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号：６）やα１鎖Ｇドメインに由来するＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号：７）等を含む合成ペプチド等が挙げられる。
【００３８】
同様に、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、細胞外マトリクスの１つであるＩ型コラーゲン由来のアミノ酸配列においては、例えば、ＤＧＥＡ、ＫＤＧＥＡ及びＧＰＡＧＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧ（配列番号：８）、ＧＥＲ、ＧＦＯＧＥＲ等を含む合成ペプチドが挙げられる。また、本発明においては、CD. Reyes, AJ. Garcia, J. Biomed. Mater. Res., 65A, 511-523(2003)に記載されているように、これらのアミノ酸配列を含むペプチドが幾つか会合したような構造体をリガンド分子として用いてもよい。さらに、前記リガンド分子としては、特に限定されないが、エラスチン由来のペプチド配列においては、例えば、ＶＡＰＧ、ＶＧＶＡＰＧ及びＶＡＶＡＰＧ等が挙げられ、トロンボスポンジン由来のペプチド配列においては、例えば、ＶＴＸＧを含む合成ペプチドが挙げられる。本発明においては、前記リガンド分子は、これらに限定されるものではない。
【００３９】
細胞外マトリクスに由来するものでなくとも、単純に細胞表面受容体に結合するアゴニストとして人工的に設計して合成された物質も本発明におけるリガンド分子として用いることができる。なお、かかるリガンド分子は、結果的に、細胞外マトリクスに由来する一部分の構造モチーフを含む場合と、含まない場合がある。かかるリガンド分子としては、例えば、α５β１インテグリンに対するリガンド分子として、Ｃ＊ＲＲＥＴＡＷＡＣ＊（＊はジスルフィド結合したシステイン残基を表す）等が挙げられ、α６β１インテグリンに対しては、ＶＳＷＦＳＲＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号：９）等が挙げられ、αＭβ２インテグリンに対してはＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号：１０）等が挙げられる。さらに、GA. Sulyok, C. Gibson, SL. Goodman, G. Holzemann, M. Wiesner, H. Kessler, J. Med. Chem., 44(12), 1938-1950(2001)等に記載されているようなペプチドではない細胞表面受容体に結合する物質（アゴニスト）も本発明のリガンド分子として利用可能である。
【００４０】
また、細胞表面受容体のうち、例えば、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４等は、プロテオグリカンを含有することから、本発明においては、該プロテオグリカンに対して結合するペプチド配列をリガンド分子として用いることもできる。
【００４１】
プロテオグリカンに対して結合するアミノ酸配列としては、例えば、ＢＢＸＢ、ＸＢＢＸＢＸさらにはＸＢＢＢＸＸＢＸ（Ｘは疎水性アミノ酸、Ｂは塩基性アミノ酸）等のコンセンサス配列が挙げられる。かかるアミノ酸配列としては、特に限定されないが、具体的には、例えば、ＫＲＳＲ、ＦＨＲＲＩＫＡ（骨シアロタンパク質に由来）、ＰＲＲＡＲＶ（フィブロネクチンに由来）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ等や、より長いペプチド配列として、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号：１１）（フィブロネクチンに由来）、ＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲ（配列番号：１２）（ビトロネクチンに由来）、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号：１３）（ラミニンに由来）、等が挙げられる。
【００４２】
以上の例示以外にも、例えば、U. Hersel, C. Dahmen, H. Kessler, Biomaterials, 24, 4385-4415(2003)、JA. Hubbell, Bio/Technology, 13, 565-576(1995)、H. Shin, S. Jo, AG. Mikos, Biomaterials, 24, 4353-4364(2003)及びE. Koivunen, W. Arap, D. Rajotte, J. Lahdenranta, R. Pasqualini, J. Nuclear Med., 40(5), 883-888(1999)等やそれらの引用文献に記載されているような直鎖状又は環状の合成ペプチドを本発明におけるリガンド分子として利用することができる。また、本発明においてリガンド分子として利用されえる全てのペプチド配列には、目的に応じて付加的なペプチド配列がそのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合していてもよい。合成ペプチドには、目的に応じて非天然型アミノ酸、化学的な修飾基、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸のどちらか一方又はその両方等が含まれていてもよい。
【００４３】
ホルモンとしては、特に限定されないが、例えば、インスリンやアドレナリン等が挙げられる。サイトカインとしては、特に限定されないが、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。以上のホルモンやサイトカインについても本発明におけるリガンド分子として利用できるが、もちろんこれら例示に限定されるわけではない。
【００４４】
ホルモンやサイトカインについても、それらの分子中に含まれ、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成されたアゴニストを用いてもよい。その例として、例えば骨形成因子（ＢＭＰ）においては、ＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩ（配列番号：１４）を用いると、ＢＭＰ−２と同様の性質を持たせることが可能である（例えば、Ｙ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｍ．  Ｔａｎｉｈａｒａ，  Ｋ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ａ．  Ｓａｉｔｏｕ，  Ｗ．  Ｓｕｆａｎ，  Ｙ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  ５０，  ４０５−４０９（２０００）参照）。また、同様にエリスロポエチンにおいてはＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（Ｘは数種のアミノ酸で置換可能な位置を示している（ＮＣ．Ｗｒｉｎｇｔｏｎ，ＦＸ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｃｈａｎｇ，ＡＫ．Ｋａｓｈｙａｐ，ＦＰ．Ｂａｒｂｏｎｅ，ＬＳ．Ｍｕｌｃａｈｙ，ＤＬ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＷ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＬＫ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，ＷＪ．Ｄｏｗｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，４５８−４６３（１９９６）参照）が挙げられる。但し、これに限ったものではなく、本発明のリガンド分子としては何れもが使用できる。
【００４５】
抗体としては、細胞表面受容体に対する抗体、特に好ましくはモノクローナル抗体を本発明のナノ構造を有するリガンド構築物におけるリガンド分子として用いることができる。様々な受容体に結合する抗体が利用でき限定されるわけではないが、例えば各種の抗インテグリン抗体、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４／ＣＳＰＧ等の細胞表面プロテオグリカンに対する抗体、抗カドヘリン抗体、抗セレクチン抗体等が挙げられる。抗体をリガンド分子として用いる場合には、抗体そのものを用いてもよいし、ペプシンやパパイン等のプロテアーゼ処理によって得られるフラグメント等を利用してもよい。
【００４６】
細胞間接着分子のうち、ＮＣＡＭ、カドヘリン等は、細胞外でホモフィリック結合することが多く、それぞれの細胞膜外成分は細胞間接着の受容体に結合する分子である。したがって、前記細胞間接着の受容体に結合する分子は、前記リガンド分子として用いることができる。また、前記リガンド分子としては、セレクチンに対するリガンド分子のうち、合成ペプチドとしてＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）等が例示される。これも当然ながら以上の例示に限定されるわけではない。これらの細胞表面受容体に対するリガンド分子を用いる意義は、細胞−細胞間相互作用を本発明のリガンド構築物によって模倣する際に有効であることである。
【００４７】
前記リガンド分子として、糖鎖も利用することができる。前記糖鎖としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のプロテオグリカンに含まれるグリコサミノグリカン類等が挙げられる。さらに、本発明においては、例えば、ガラクトース、ラクトース又は重合して接着性基質を形成することができる重合性ラクトースモノマー等、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖類を、リガンド分子として利用することができる。また、例えば、セレクチンに対しては、シアル酸とフコースを含むオリゴ糖であるシアリルルイスエックス（例えば、Ａ．  Ｖａｒｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９１，  ７３９０−７３９７（１９９４）参照）をリガンドとして用いることができる。
【００４８】
前記したように、前記リガンド分子は、天然のリガンド分子に由来するもの以外の物質であっても、単純に細胞表面受容体に結合するアゴニストとして人工的に設計して合成された物質であれば、本発明における「リガンド分子」として用いることができる。
【００４９】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物に含まれるリガンド分子としては、例えば、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体に結合する分子、増殖因子（成長因子）、ホルモン、抗体、糖類等から、それぞれの細胞毎に最適なものが二つ以上選ばれる。なお、本発明の１つの目的、すなわち、リガンド分子の配列をナノメートルオーダーで制御し、それぞれの細胞に最適な環境を再現性よく提供する観点から、リガンド分子として天然由来のリガンド分子そのものを利用するよりは、それらのフラグメント、合成ペプチド分子、糖類及び人工的に合成されたアゴニスト等やこれらの複合体を利用すること好ましい。なお、特に限定するものではないが、利用性及び細胞機能制御への有効性が高いことから、リガンド分子がペプチドからなる場合、その鎖長としては、通常、アミノ酸３〜１５０残基程度であるのが好ましく、一方、糖鎖からなる場合、単糖１〜１００残基程度であるのが好ましい。
【００５０】
本発明のリガンド構築物において、前記リガンド分子は、後述の核酸スペーサーに共有結合又は非共有結合によって連結される。前記連結は、リガンド分子及び核酸スペーサーに互いに官能基を導入し、それを利用して行うのが好適である。以下、リガンド分子に導入する官能基を「核酸スペーサー結合用官能基」といい、核酸スペーサーに導入する官能基を「リガンド分子結合用官能基」という。核酸スペーサーとリガンド分子とを連結するための反応は、以下で説明するように種々のものが選択可能である。また、核酸スペーサー結合用官能基は、特に限定されるものではない。さらに、リガンド分子結合用官能基も特に限定されるものではなく、使用する核酸スペーサー結合用官能基に応じて適切なものを選択すればよい。
【００５１】
本発明の要素は、以上のように説明されるリガンド分子を二つ以上用いて、これらの分子が核酸スペーサーを介して連結されている構造のリガンド構築物を調製し、細胞と接触させることによって細胞の機能制御を行うことにある。スペーサーは、隣り合うリガンド分子どうしの中間部分に配置され、隣り合うリガンド分子の間隔をあけて一つの分子として結合できるものを指し、核酸を基本とする材料で構成されるのが本発明の一つの構成要件である。
【００５２】
本発明のリガンド構築物は、少なくとも２つの同一又は異なるリガンド分子と核酸スペーサーとが連結され、細胞の機能制御に対し適正なリガンド分子の配列を有するものであるが、１つのリガンド構築物におけるリガンド分子間の間隔（連結位置）や、リガンド分子の数等は、制御対象である細胞、細胞機能に応じて決定すればよい。
【００５３】
リガンド分子間の間隔はスペーサー長、すなわちスペーサー分子が伸長した状態での長さで規定される。スペーサー長、すなわち隣り合うリガンド分子間の距離は、それぞれのリガンド分子やそれぞれの細胞によって最適な距離を選択すればよいが、好ましくは１〜３００ｎｍの範囲であり、より好ましくは５〜１００ｎｍの範囲である。
【００５４】
本発明において核酸スペーサーとしては、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸又はそれらの誘導体が使用できる。なお、以下、それらの核酸等をまとめて核酸という場合がある。
【００５５】
デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略称することがある）及びリボ核酸（以下、ＲＮＡと略称することがある）は、それぞれデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドがモノマー単位となって、３´→５´ホスホジエステル結合したポリマーである。「ペプチド核酸（以下、ＰＮＡともいう）」とは、例えば、PE. Nielsen, M. Egholm, RH. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497-1500(1991)に記載されているようにＤＮＡやＲＮＡ類似の構造をもつ非天然の化合物をいう。前記ＰＮＡは、より具体的には、ヌクレオチドがリン酸ジエステルで結合した構造ではなく２−アミノエチル−グリシンをモノマー単位として含むペプチド結合により骨格を形成しているものを指す。本発明のスペーサーとして、以上のような基本骨格を有するポリマーを用いることで、リガンド分子の間隔を任意の距離に規定し、かつスペーサー部分の分子量が単一である細胞機能制御に適したナノ構造を有するリガンド構築物が提供できる。核酸スペーサーは先行技術のスペーサーと比較して、段階的・選択的にヌクレオチド等のモノマー単位を縮合させることができるため、長さの揃ったスペーサーが合成できる、分岐構造等複雑な高次構造を調製することができる、生化学的な伸長反応を応用することができるため長さが揃っていながらも１００ｎｍを超えるようなスペーサーを合成できる等の利点がある。核酸スペーサーはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡの混合物からなるものでもよい。
【００５６】
本発明において核酸スペーサーとして使用する、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸の誘導体としては、以下のようなものを挙げることができる。
【００５７】
細胞との接触条件において本発明の分子自体の安定性を増加させること、本発明の分子をエンザイムイムノアッセイ又は蛍光ラベル等によって定量分析すること、微粒子によりラベル化して電子顕微鏡等により観察すること等を可能とするため、以上の核酸スペーサーは化学的修飾を施されていてもよい。「化学的修飾」とは、リン酸部位、リボース部位又は２−アミノエチル−グリシン部位（ＰＮＡの場合）等の核酸の主鎖を化学的に改変したり、又は核酸塩基部位等に化学修飾を施すことをいう。核酸の主鎖を化学的に改変する例としては、構造的に不安定なデオキシリボ核酸やリボ核酸のリン酸部分をチオール化する等してヌクレアーゼに対する耐性を向上させたホスホロチオエート等の化学的修飾体（ＰＮＡに関してはこの誘導体は含まれないが、ＰＮＡ自体の分解耐性はもともと高いことが知られている）、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体及びアレクサ等の発色団（以上に加えて、例えば、栗原靖之、武内恒成、松田洋一編「ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール−蛍光の原理と実際：遺伝子解析からバイオイメージングまで」別冊実験医学、羊土社（１９９９）等に記載されている発色団が例示できる）、ビオチン、ブロモデオキシウリジンやジゴキシゲニン等の抗原部位等を導入した化学的修飾体が含まれる（導入法等は、例えば、高橋豊三著「ＤＮＡプローブ−技術と応用―」シーエムシー（１９８８）や高橋豊三著「ＤＮＡプローブＩＩ−新技術と新展開−」シーエムシー（１９９０）等に記載されているものを例示できる）。また、以下に述べるように核酸スペーサーの原料となる１本鎖の核酸を合成する段階で以上の化学的修飾が施されてもよい。前記化学的修飾は、それぞれ最適な製法で調製され、上述した目的に応じて選択できるため、以上の例示に限定されるものではない。
【００５８】
核酸スペーサーは、以上のようにＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらの誘導体からなるものであって、一旦、リガンド構築物が形成された際には、その構造として１本鎖の状態でもよいし、少なくとも一部分が二重らせん、三重らせんとなった状態やそれらの組み合わせ、さらに、K. Matsuura, T. Yamashita, Y. Igami, N. Kimizuka, Chem. Commun., 376(2003)、NC. Seeman, Trends in Biotechnology, 17, 437-443(1999)、CM. Niemeyer, Current Opinion in Chemical Biology, 4, 609-618(2000)、JH. Gu, LT. Cai, S. Tanaka, Y. Otsuka, H. Tabata, T. Kawai, J. Appl. Phys., 92, 2816(2002)等に記載されているような３本以上に分岐したものでもよい。さらにこれらの構造単位が組み合わさって、さらに大きな一次元的、二次元的又は三次元的な構造体を形成してもよい。
【００５９】
以上に例示したように、リガンド構築物における核酸スペーサーがどのように複雑なスペーサー構造を有するにしても、スペーサー原料としては、１本鎖の核酸を用いることが好ましい。１本鎖の核酸は鎖長１５０塩基、より実用的には鎖長１００塩基程度まで化学的に合成することが可能（ほとんどがホスホアミダイト法による固相合成法を採用している）である。例えば、この化学合成の段階で位置特異的にリガンド分子を導入するためのリガンド分子結合用官能基を導入しておけば、後は当該官能基に対し核酸スペーサー結合用官能基を結合してリガンド分子を連結すれば、容易にリガンド分子を所定の間隔をもってナノメートルオーダーで適正に配列させることができる。リガンド分子結合用官能基と、リガンド分子の核酸スペーサー結合用官能基とは、互いに共有結合又は非共有結合を形成させて結合させればよい。
【００６０】
核酸スペーサーへのリガンド分子の導入反応（すなわち核酸スペーサーに含まれるリガンド分子結合用官能基とリガンド分子に含まれる核酸スペーサー結合用官能基の組み合わせ）としては、反応中において、核酸スペーサーや機能性分子が安定に維持され、意図された部位同士で特異的に導入反応を行なえるものであれば、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。
【００６１】
共有結合による導入反応としては、アミド結合形成反応、マイケル付加反応、チオエーテル形成反応、ディールスアルダー環化付加反応、シッフベース形成反応、チアゾリジン環形成反応等が挙げられる。
【００６２】
前記アミド結合形成反応としては、例えば、カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基とを縮合させる方法、アミノ基と予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステルとを反応させる方法；チオエステル基とアミノ基とチオール基が残留したシステインとを反応させてアミド結合を形成させる方法等が挙げられる。
【００６３】
前記マイケル付加反応としては、例えば、マレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等のα，β−不飽和カルボニル基とチオール基とを反応させる方法等が挙げられる。
【００６４】
前記チオエーテル形成反応としては、例えば、ハロアセチル基等のハロゲン化アルキル基やエポキシ基、アジリジン基等とチオールとの反応等が挙げられる。
前記ディールスアルダー環化付加反応としては、例えば、シクロペンタジエン等の共役ジエン類とキノン等のオレフィン類とを反応させる方法等が挙げられる。
【００６５】
前記シッフベース形成反応としては、例えば、グリオキシル酸等のアルデヒド基とオキシアミノ基等のアミノ基を反応させる方法等が挙げられる。なお、前記シッフベース形成反応において、形成されるシッフベース基は、適切な還元剤で還元されていてもよい。
【００６６】
前記チアゾリジン環形成反応としては、例えば、アミノ基及びチオール基が残留したシステインとアルデヒド基を反応させる方法等が挙げられる。
【００６７】
非共有結合による導入反応としては、錯体形成反応（例えば、トリニトリロ酢酸−ニッケル錯体とオリゴヒスチジンの三元錯体形成を利用したＨｉｓ−Ｔａｇ形成反応、金−チオール結合反応等）、生物学的な認識反応（例えば、糖鎖−レクチン反応、アビジン−ビオチン反応、抗原−抗体反応等）等が挙げられる。
【００６８】
導入反応は、リガンド分子結合用官能基と核酸スペーサー結合用官能基との組み合わせを上記の反応様式で互いに結合し得るものとしておくことで行うことができる。そのような組み合わせは、上記を参照すれば適宜選択することができる。なお、以上の導入反応は、光、熱、振動、時間、脱保護等別の因子によって開始されるものであってもよい。
【００６９】
核酸スペーサー結合用官能基として、リガンド分子にもともと含有される反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を用いてもよく、リガンド分子に核酸スペーサー結合用官能基を意図的に導入して用いてもよい。リガンド分子に核酸スペーサー結合用官能基を導入する方法としては、核酸スペーサー用官能基を含有し、かつリガンド分子に結合する官能基を同一分子中に含有する二官能性試薬を使って、リガンド分子を化学修飾する方法が挙げられる。ペプチドを含むリガンド分子を化学修飾する一つの方法は、リガンド分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用して二官能性試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、リガンド分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えば、ＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由に導入することが可能である。糖類を含むリガンド分子に関しても同様のことがいえ、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用いることができる。
【００７０】
１本鎖の核酸、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらの誘導体の位置特異的にリガンド分子結合用官能基を導入する方法として、例えば、高分子学会／バイオ・高分子研究会編「高分子化学と核酸の機能デザイン」、バイオ・高分子研究法６、学会出版センター（１９９６）やＹ．Ｉｔｏ，Ｅ．Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８，１５５−１６６（２００４）及び該文献に記載された参考文献等に記載された方法等が利用できる。例示すると、リン酸部位やリボース又はデオキシリボース等を含む主鎖（ペプチド核酸においては２−アミノエチル−グリシン主鎖）や核酸塩基等の部分にリガンド分子結合用官能基を導入した化学的修飾体、５´末端や３´末端へリガンド分子結合用官能基を導入した化学的修飾体（ペプチド核酸においてはＮ末端及び／又はＣ末端に官能基を導入した化学的修飾体）が含まれる。以上のようにリガンド分子結合用官能基の核酸スペーサーにおける位置が特定できれば、以上の例示に限定されるものではない。
【００７１】
核酸スペーサーとリガンド分子結合用官能基及び／又はリガンド分子と核酸スペーサー結合用官能基との間にはリンカーが含有されていてもよい。リンカーの目的は、核酸スペーサーとリガンド分子の間の距離を僅かに隔離しておくことであって、核酸スペーサーとリガンド分子間の反応において立体障害等を低減させて導入反応を迅速に進行させる機能や、本発明のナノ構造を有するリガンド構築物を細胞と接触させた場合に細胞表面受容体とリガンド分子との結合反応を阻害しない機能等を発揮させるためである。通常、０．１〜５ｎｍ程度までの長さであれば、特に素材等は制限されるものではなく、例えば、アルキル鎖、ペプチド鎖、オキシエチレン鎖、オキシプロピレン鎖等やそれらが混合された構造であってもよい。但し、リンカーとしては以上の構造に限定されるわけではなく、目的により最適なものが選ばれる。リンカーは、例えば、リガンド分子結合用官能基、核酸スペーサー結合用官能基の一部として核酸スペーサー及び／又はリガンド分子に導入しておけばよい。
【００７２】
核酸スペーサーを２本以上の核酸鎖で構成する場合、リガンド分子を核酸スペーサーに結合する工程として二つの方法が例示できる。すなわち、リガンド分子結合用官能基を有する１本鎖の核酸の段階でリガンド分子を、官能基を介して予め結合させる方法（以下、前変性法と呼ぶことがある）、リガンド分子結合用官能基が導入されて完成された核酸スペーサーに対してリガンド分子を後付する方法（以下、後変性法と呼ぶことがある）、がある。
【００７３】
リガンド分子の前変性法をより詳細に説明するならば、リガンド分子結合用官能基を含む１本鎖の核酸の段階でリガンド分子を予め結合させ、次いで、さらに１本鎖の核酸（この核酸はリガンド分子結合用官能基を含んでも含まなくてもよい）を1種類以上組み合わせてリガンド分子が位置特異的に導入された核酸スペーサーを完成させる方法である。
【００７４】
リガンド分子の後変性法はより詳細に説明するならば、リガンド分子結合用官能基を含む１本鎖の核酸に、さらに１本鎖の核酸（この核酸はリガンド結合用官能基を含んでも含まなくてもよい）を1種類以上組み合わせて核酸スペーサーを完成させる（この時点ではリガンド分子は導入されていない）。その後に、核酸スペーサー結合用官能基を有するリガンド分子を導入する方法である。以上の前変性法、後変性法は必要に応じてどちらも選択できるが、調製の容易さを考慮すると前変性法がより好適に用いられる。
【００７５】
以上のような構造的特長によって定義される本発明のナノ構造を有するリガンド構築物であるが、ヌクレオチド３０量体を超える長鎖スペーサーの合成し易さ等を考慮するとデオキシリボ核酸を核酸スペーサーとして利用するのが好ましい。特に、二重らせんのＤＮＡ鎖は、１０ヌクレオチドで３．４ｎｍの長さを有し、構造的にも明確であるため、特に、好ましくは、核酸スペーサーとして二重らせんのＤＮＡ鎖（以下、ｄｓＤＮＡともいう）を使用することが望ましい。
【００７６】
より具体的に本発明のナノ構造を有するリガンド構築物の構造について以下に説明する。ｄｓＤＮＡからなる核酸スペーサーの中でリガンド分子を導入する好ましい位置としては、５´末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）、及び３’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）等ｄｓＤＮＡスペーサーの末端部位や核酸塩基部位等ｄｓＤＮＡスペーサーの途中の任意の位置が挙げられる。二つのリガンド分子を含有する場合を記載すると、ｄｓＤＮＡ鎖の二つの５’末端にそれぞれリガンド分子が結合した分子、又は二つの３’末端にそれぞれリガンド分子が結合した分子、又はそれらの組み合わされた分子（例えば、５’末端と３’末端のそれぞれにリガンド分子が結合した分子等）が挙げられる。３つ以上のリガンド分子を導入する場合には空いている末端を利用することもできる。以上はあくまでも例示であってリガンドの導入位置としては特に限定されず、目的に応じて変更し得る。
【００７７】
前変性法によりリガンド分子を導入するため、核酸スペーサーの原料となる１本鎖ＤＮＡ（以下、ｓｓＤＮＡともいう）にリガンド分子結合用官能基をＤＮＡの化学合成の段階で導入する。リガンド分子結合用官能基としては、上述したように種々のものが選択でき限定されるものではないが、高い反応選択性を発揮させる観点から、例示されたもののうちチオール基またはアミノ基を導入するのが好ましい。
【００７８】
リガンド分子には、チオール基またはアミノ基と結合活性を有する核酸スペーサー結合用官能基を導入しておくことが好ましい。前記核酸スペーサー結合用官能基としては、特に限定されないが、例えば、チオール基とマイケル付加反応させるためのマレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等、チオール基とチオエーテル形成反応をさせるためのハロアセチル基、エポキシ基、アジリジン基等が挙げられる。この中でもリガンド分子への導入のし易さ、安定性の点からマレイミド基やハロアセチル基が好適な核酸スペーサー結合用官能基として例示できる。
【００７９】
リガンド分子として、合成ペプチド分子を使用する場合についてさらに詳細に記す。合成ペプチド分子を合成する際に、リジン残基等のアミノ基側鎖やＮ末端のアミノ基等に対して、カルボン酸や、酸クロライド、活性エステル基等を有する二官能性試薬であるマレイミド誘導体（例えば、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミドブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等）又はハロアセチル誘導体（例えば、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸無水物等）を作用させることで、容易にリガンド分子に対して核酸スペーサー結合用官能基を導入することができる。
【００８０】
以上のような、ｓｓＤＮＡ及びリガンド分子を用いることで、前変性法によりリガンド分子が導入されたｓｓＤＮＡ（以下、このようにリガンド分子が導入されたｓｓＤＮＡを単にコンジュゲートと略称する場合がある）を調製することができる。この反応条件や精製方法等については特に限定されるものはなく、公知の方法が利用できる。以上のようにして得られたリガンド分子が導入された１本鎖のＤＮＡを原料として、その他のｓｓＤＮＡ（このｓｓＤＮＡはリガンド分子を結合していなくてもよい）とのハイブリダイゼーションや必要に応じてｄｓＤＮＡ（このｄｓＤＮＡはリガンド分子を結合していなくてもよい）とのライゲーション等を行うことにより本発明のリガンド構築物が得られる。また、コンジュゲートをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることで本発明のリガンド構築物を調製することもできる。
【００８１】
以上に説明されたリガンド構築物は本発明の実施の一態様であり、以上に限定されるというわけではない。ｓｓＤＮＡにおけるリガンド分子結合用官能基の導入方法、部位及び官能基の種類、リガンド分子における核酸スペーサー結合用官能基の導入方法、部位及び種類は既に述べたように目的により選ばれることは明白である。また、以上の概念を用いれば既に述べたように核酸スペーサー構造は単純な二重らせんだけではなく、種々の複雑な構造、例えば分岐構造や三次元構造、二次元的、三次元的に多重に核酸スペーサーが連結した構造等を持たせた本発明のリガンド構築物を作製できることも明白であろう。
【００８２】
以上のように調製される本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は単独で用いてもよいし、二種類以上のものを混合して用いてもよい。それぞれの細胞によって最適なものが選択される。
【００８３】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は、機能を制御しようとする細胞の培養時に培地に含有させておけばよく、当該構築物は、特段、細胞培養用基材に固定化されている必要はないが、生分解性又は生分解性でない材料からなる基材に固定化されて使用されることもある。特に接着依存性の細胞の機能を制御する用途に使用する場合には基材に固定化された状態であることが好ましい。かかる細胞培養用基材もまた、本発明の一態様として提供される。ナノ構造を有するリガンド構築物が生分解性材料に固定化される場合は、例えば、生体内への移植に用いた後、移植された材料が残ることを考慮している。それ以外の場合には、特に、生分解性材料である必要はなく、目的に応じて選択できる。
【００８４】
ナノ構造を有するリガンド構築物が固定化される材料のうち、生分解性の材料としては、ポリエステル類（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、乳酸・グリコール酸及びポリエチレングリコールとの共重合体、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート等）、ポリオルトエステル類（例えば、ポリオール／ジケテンアセタール類付加物ポリマー類等）、ポリ無水物類（例えば、ポリ（無水セバシン酸）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキサン）、ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）メタン］及び以上のポリマーに含まれるモノマーどうしの共重合体等）、ポリアミノ酸類、ポリホスファゼン類、蛋白質（例えば、血清アルブミン、コラーゲン、絹フィブロイン、フィブロイン、アビジン、ストレプトアビジン等）、多糖類（例えば、アルギン酸、スターチ、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース等やこれらの誘導体）等が挙げられる。
【００８５】
ナノ構造を有するリガンド構築物が固定化される材料のうち、生分解性でない材料としては高分子材料や無機材料が用いられる。付加重合系高分子として、例えば、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール誘導体、エチレン・ビニルアルコール共重合体及びその誘導体、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。重縮合系高分子として、例えば、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル類、ナイロン−６，６等のポリアミド類、ポリイミド類、ポリウレタン類等がある。無機系材料としては、チタン／酸化チタン、金等の金属類、ヒロキシアパタイト、ガラス、シリコン等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、目的に応じて最適な材料が選ばれる。また、以上の材料は、種々の改質処理、例えば、プラズマ処理、イオン注入処理、ラビング処理、化学的な酸化処理、加水分解処理等が施されていてもよい。
【００８６】
以上の材料は表面にコーティングが施されていてもよい。コーティング層として、例えば、グラフト化高分子層、単分子膜層（例えば、ケーネ（ＲＳ．Ｋａｎｅ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３６３−２３７６（１９９９）等に記載されている自己組織化単分子膜等が利用できる）、ハイドロゲル層（例えば、長田及び梶原編、「ゲルハンドブック」エヌ・ティー・エヌ、１９９７年）等に記載されているようなハイドロゲルがコーティングされた層）、タンパク質層（例えば、ポリアミノ酸類やタンパク質等がコーティングされた層）、吸着ポリマー層（例えば、ポリリジン、プルロニック（ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのブロックポリマー）、ポリ（２−メトキシエチルアクリレート）、多糖類等の親水性ポリマーがコーティングされた層）等が挙げられる。
【００８７】
ナノ構造を有するリガンド構築物が固定化される材料は、例えば、編織布、不織布、綿状体、糸状体、中空糸、多孔体、球体、円筒体、フィルム、プレート及びこれらの複合構造（例えばマルチウェルプレート等が例示できる）になっていてもよく、それぞれの形状に含まれる糸、球、孔、円筒等の大きさはナノメートルサイズであってもよい。また、それぞれの材料に関して、公知の方法によってナノメートルサイズ以上の微細加工が施されていてもよく、例えば、Ｋ．Ｓａｔｏ，Ａ．Ｈｉｂａｒａ，Ｍ．Ｔｏｋｅｓｈｉ，Ｈ．Ｈｉｓａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋｉｔａｍｏｒｉ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９，１５−２２（２００３）にあるようなマイクロ流路が形成された回路や、非特許文献８等に記載されているようなマイクロメートルサイズの細胞接着領域と非接着領域が形成されたプレート等が挙げられる。本発明のリガンド構築物を先に例示した微細加工法、例えばインクジェットリソグラフィー法、光リソグラフィー法、マイクロコンタクトプリンティング法、ディップペンナノリソグラフィー法等の方法により、材料に対してマイクロメートルからナノメートルの大きさのドット状やライン状やこれらが組み合わされたパターンを描いて固定化してもよい。これらは必要に応じて選ばれる。
【００８８】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は以上のような材料若しくは該材料からなる基材に固定化されて使用されてもよい。固定化のための方法としては、共有結合又は非共有結合によるものが必要に応じて選択でき公知の方法が利用できるが、固定化の容易さから判断すると非共有結合による固定化が好適に用いられる。非共有結合による固定化には、例えば、材料表面へ単に物理吸着させる方法や、ポリリジン等のポリカチオン分子で表面を被覆した材料に対して、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる核酸スペーサーのリン酸部位の負電荷によって静電的相互作用により結合させる方法等が利用できる。
【００８９】
材料若しくは該材料からなる基材に固定化される際、本発明のリガンド構築物の表面密度は対象とする細胞に応じて自由に選択でき、特に限定されるわけではない。ただし、リガンド構築物の表面密度は、本発明のリガンド構築物に含まれる核酸スペーサーの長さよりも、以下の式によって規定されるリガンド構築物間の平均距離が短くならない範囲であることが好ましい。
平均距離＝１０００／（６．０２×表面密度）1/2
リガンド構築物間の平均距離の単位は、ナノメートル（ｎｍ）であり、リガンド分子の表面密度の単位は、１平方センチメートル当たりのフェムトモル（ｆｍｏｌ／ｃｍ2）である。以上の計算式によって、様々な核酸スペーサーの長さに応じて最大の表面密度はその都度選択できるが、既に記載した好ましい核酸スペーサーの長さの範囲から考えると、好ましいリガンド構築物の表面密度としては１６６ｐｍｏｌ／ｃｍ2（１６６×１０3ｆｍｏｌ／ｃｍ2）以下であり、より好ましくは６．６ｐｍｏｌ／ｃｍ2（６．６×１０3ｆｍｏｌ／ｃｍ2）以下である。表面密度の下限値は特に限定されないが、例えばＳＰ．Ｍａｓｓｉａ，ＪＡ．Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１４（５），１０８９−１１００（１９９１）等に記載されているように、細胞が接着できる最小の密度である０．１ｆｍｏｌ／ｃｍ2程度以上であることが好ましい。
【００９０】
本発明のリガンド構築物及びそれらを固定化した材料、基材は必要に応じて滅菌することができる。滅菌方法も特に限定されず用途に応じていずれも採用でき、例えばオートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、電子線滅菌、濾過滅菌等が挙げられる。以上を組み合わせた方法、例えば予め滅菌された材料、基材に対して濾過滅菌したリガンド構築物を無菌条件下で固定化し、本発明のリガンド構築物及びそれらを固定化した材料を調製すること等も可能であり、必要に応じて最適な滅菌方法が選択できる。
【００９１】
本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は溶液状態で、又は材料、基材に固定化された状態で細胞と相互作用させて培養することで目的を達成することができる。細胞の機能を発現させるためには、本発明のリガンド構築物に加えて培地が必要である。培地としては、用いる細胞の種類等に応じて変化するが、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地及びこれらの混合物（例えば、朝倉書店発行、日本組織培養学会編「組織培養の技術」第三版５８１頁）、並びにこれらの培地に血清成分（例えば、ウシ血清等）等を添加したものが挙げられる。細胞の培養は、少なくとも本発明のリガンド構築物の存在下に行えばよいが（例えば、これらの培地に本発明のリガンド構築物を溶液状態のまま添加したものを用いてもよい）、細胞機能の制御をより効果的に達成する観点からは、本発明の細胞培養用基材を用いて細胞を培養するのが好適である。従って、本発明は、別の一態様として、本発明のリガンド構築物の存在下に培養して得られた細胞、並びに本発明のリガンド構築物の存在下に細胞を培養する工程を有する細胞の調製方法を提供する。なお、細胞培養の具体的方法については、前記成書等を参照すればよい。
【００９２】
本明細書における「細胞機能」とは、例えば、接着、増殖、分化、未分化、生存及び／又は細胞死等目的に見合った細胞の状態を奏する細胞の能力をいう。本発明のナノ構造を有するリガンド構築物は、細胞を用いて様々な物質を評価する機器において、その心臓部となる細胞の機能を制御する材料として利用することができる。また、細胞（再生）医療におけるスキャホールド部品等として利用できる。従って、以上のような多岐に渡る用途に依存して使用される細胞及び要求される機能も変わるため、特に細胞、制御対象の機能は目的に応じて決定すればよく特に限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はそれらにより何ら限定されない。以下の実施例等において使用した測定方法又は評価方法をまとめて示す。
【００９４】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分析は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ（東ソー株式会社製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、５重量％〜１０重量％のアセトニトリルによる２０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％  トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」ともいう）を含有した５重量％  アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％  ＴＦＡを含有した３０重量％  アセトニトリル水溶液とを用いた。
【００９５】
（逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＰＲＥＰ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速１０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、１０重量％〜２０重量％のアセトニトリルによる８分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％  トリフルオロ酢酸を含有した１０重量％  アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％  ＴＦＡを含有した２０重量％  アセトニトリル水溶液とを用いた。
【００９６】
（マススペクトルの測定）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計〔商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ社製）〕により、マトリクスとして、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を用いて、マススペクトルを測定した。
【００９７】
（逆相ＨＰＬＣによる機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡ（コンジュゲート）の分析）
逆相ＨＰＬＣによるコンジュゲートの分析は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＯｌｉｇｏＤＮＡ  ＲＰ（東ソー株式会社製）を用いた。流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２６０ｎｍに設定した。コンジュゲートは、５％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で５分間溶出し、その後、５重量％〜３０重量％のアセトニトリルによる５０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、５重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液と、３０重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液とを用いた。
【００９８】
（ｓｓＤＮＡの濃度測定）
ｓｓＤＮＡ溶液  ２５μＬを、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）  ９７５μＬに添加して希釈した。得られた希釈物について、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液のみでベース補正した分光光度計で、２６０ｎｍの吸光度を測定した。このとき測定される吸光度に４０を乗じた値をｓｓＤＮＡ溶液のＯＤ値とした。本実施例で用いられるｓｓＤＮＡのＯＤあたりの重量（μｇ）は、それぞれ計算されたＯＤ値から算出できる。ｓｓＤＮＡの分子量を用いることで、前記ＯＤ値を、モル濃度に換算できる。
【００９９】
（ＤＮＡスペーサーを有する機能性高分子複合体の濃度測定）
以下の実施例で示されるリガンド構築物の濃度は、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ピアース社製）を用いて決定した。濃度既知のλＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。記載した測定値は、全て３回測定の平均値である。
【０１００】
（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
細胞の機能を制御する性能は、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力を比較することにより評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０重量％  ウシ胎仔由来血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ（ギブコ社製、α−ＭＥＭは、Ａｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの略称である）培地で培養した。その後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を９０％コンフルエント状態時にトリプシン処理により回収した。１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（シグマ社製）と５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（シグマ社製）と１０重量％  ＦＢＳ（シグマ社製）とを添加したα−ＭＥＭに、１９０００個／ｍＬとなるように、前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を再分散させた。その後、リガンド構築物を以下に示す方法により固定化した１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬとなるように前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種した。この時の細胞密度は、５０００個／ｃｍ2であった。３７℃、５容積％  ＣＯ2を含む湿潤空気中で前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。３日毎に培地の交換を行なった。１１日後にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。前記ＡＬＰ活性をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化度合の指標として、リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能を評価した。
【０１０１】
培養後の細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳ  ０．５ｍＬに再分散した。得られた分散液を用い、細胞数を、ビルケルチルク氏血球計算盤で計数した。その後、分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性の測定を行なった。ＡＬＰ活性測定は、基質溶液〔商品名：ＦＡＳＴ  ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＴＡＢＬＥＴ  ＳＥＴＳ（シグマ社製）を溶解して使用した〕を用いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）法により行なった。ここで、基質であるｐＮＰＰが、ＡＬＰによりｐ−ニトロフェノールとなり黄色を呈することを利用し、一定時間に生じるｐ−ニトロフェノール量で酵素活性値を示した。ｐ−ニトロフェノールの生成量は、ｐ−ニトロフェノールをＰＢＳに溶解させたものを検量線の作成に使用した。また、細胞膜の溶解には、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（シグマ社製）を用いた。９６ウェルプレートに、細胞液又は検量線溶液  １００μＬと、０．３％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００  ５０μＬと、基質溶液  １００μＬとを入れ、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションして反応を行なった。得られた反応産物に、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液  ５０μＬを添加し、酵素反応を停止させた。その後、得られた産物について、マイクロプレートリーダー（デカン社製ジェニオス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。１個の細胞あたりのＡＬＰ活性（細胞１個あたりのｐ−ニトロフェノールの生成速度（ｆｍｏｌ／分／細胞））を算出した。
【０１０２】
以下の実施例では本発明における最も単純な実施態様の１つを例示する。すなわちリガンド分子としては二つ（ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来するリガンド分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来するリガンド分子））、その二つのリガンド分子間を繋ぐ核酸スペーサーの構造としては相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡ、二つのリガンド分子の導入位置としてはｄｓＤＮＡに二箇所存在する５´末端とした。本発明において好適な長さとして記載した範囲の核酸スペーサーが調製できることを示すため、ＤＮＡスペーサーの長さは１０，２０，４０，８０，１６０ｎｍ（ＤＮＡとしてはそれぞれ３０，６０，１２０，２４０，４８０量体）とした。以上の概念に従って設計されたリガンド構築物の構造（模式図）を以下に示す。ＤＮＡスペーサーの長さが１０，２０，４０，８０，１６０ｎｍのリガンド構築物を、それぞれＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳ，ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳ，ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ，ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ，ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳと呼ぶ。
【０１０３】
【化１】
2006042811.tif 000002
【０１０４】
以下の実施例で示される全てのリガンド構築物は、前変性法を使用して調製されるため、まず、ｓｓＤＮＡにリガンド分子を結合したコンジュゲートが合成される。以下の実施例では、リガンド分子に含有される核酸スペーサー結合用官能基としてマレイミド基を選び、ＫＤＧＥＡ及びＧＲＧＤＳペプチド分子のＮ末端にマレイミド基が導入されたもの（それぞれマレイミド化ＫＤＧＥＡ、マレイミド化ＧＲＧＤＳと呼ぶ）を使用した。また、ｓｓＤＮＡにはリガンド分子結合用官能基としてチオール基が５’末端に導入されているものを用いた。より具体的に構造を説明すると、５’末端のリン酸基に対して６−メルカプト−１−ヘキサノールのＯＨ部位が結合した状態となっている合成ｓｓＤＮＡである。合成された直後では５´末端のチオール部位は、チオール基を有する保護基とジスルフィド結合により保護されている。前記保護基を脱保護してチオール基を形成させ、マレイミド化ＫＤＧＥＡ又はマレイミド化ＧＲＧＤＳを導入してｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成する。
【０１０５】
実施例１
スペーサーとして１０ｎｍ（３０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳの調製法について説明する。合成プロセスの概略は図１の通りである。
【０１０６】
（マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成）
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（なお、前記「Ｆｍｏｃ」は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌの略称である）が予め導入された樹脂（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）から、マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成を開始した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０重量％  ピペリジン（アプライドバイオシステムズ社製）／ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦともいう）溶液を用いて行なった。また、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応は、前記レジン中のアミノ酸量に対して１０当量のＦｍｏｃ−ａａ（ａａは、適切に保護されたアミノ酸を示す）と、縮合試薬として１０当量のＨＢＴＵ〔株式会社島津製作所製；ＨＢＴＵは、２−（１−Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略称である）、１０当量のＨＯＢｔ〔株式会社ペプチド研究所製，ＨＯＢｔは１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅの略称である〕及び２０当量のＤＩＥＡ（アプライドバイオシステムズ社製；ＤＩＥＡは、Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅの略称である）をＤＭＦに溶解して得られた溶液を、アミノ酸配列に対応して逐次的に前記レジンに添加することにより樹脂上で行なった。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０重量％  ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護した。得られた産物に、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ〔同仁化学株式会社製、ＧＭＢＳは、Ｎ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である〕と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させ、その後、得られた産物に、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、該樹脂を、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。洗浄後の樹脂を減圧乾燥した。樹脂からのマレイミド基含有ペプチドの切断には、９０容積％  ＴＦＡ（株式会社ペプチド研究所製）／５容積％  チオアニソール（アルドリッチ社製）／３容積％  Ｈ2Ｏ／２容積％  アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液を、樹脂に添加し、得られた混合物を、２時間室温で攪拌した。その後、樹脂を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られたペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは、分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間１０．４分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６８４．６０［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＫＤＧＥＡを得た。
【０１０７】
（マレイミド化ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入されたレジン（株式会社島津製作所製；商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、前記マレイミド化ＫＤＧＥＡの場合と同様の方法で合成した。得られた粗ペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間８．６分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６５６．６１［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＧＲＧＤＳを得た。
【０１０８】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡは、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂの２種類である（図１参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ａ（シグマジェノシス社製）を１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるように、ＴＥバッファー（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた溶液  ０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍ  ジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）  ０．２ｍＬを混合し、その後、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。溶離液〔０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）〕で平衡化した商品名：ＮＡＰ−５カラム（ファルマシアバイオテク社製）により精製して、チオール基が脱保護されたＨＳ−ＳＰ１０Ａを得た。得られた産物について、２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ１０Ａの濃度を決定した。同様にＰＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂも脱保護してＨＳ−ＳＰ１０Ｂを得た。得られたＨＳ−ＳＰ１０Ｂの濃度を、同様に決定した。
【０１０９】
【表１】
2006042811.tif 000003
【０１１０】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ１０Ａへのマレイミド化ＫＤＧＥＡの結合形成により、以下のように、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０Ａ（図１を参照）を調製した。
【０１１１】
ＨＳ−ＳＰ１０Ａ溶液（濃度１７．０ｎｍｏｌ／ｍＬ）  ０．８ｍＬと、ＨＳ−ＳＰ１０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液  ０．８ｍＬとを混合し、４℃で２４時間反応させた。得られた反応溶液を凍結乾燥させた。得られた産物を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ０．５ｍＬに溶解させた。得られた溶液を、溶離液で平衡化したＮＡＰ−５（商品名）を用いたゲル濾過に供して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０Ａを精製した。なお、前記溶離液として、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。得られた産物について、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＳ−ＳＰ１０Ａ（表１）のデータを利用して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０Ａの濃度を決定した。同様に、マレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ１０ＢのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂを得た。得られたＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂの濃度を同様に決定した。
【０１１２】
【表２】
2006042811.tif 000004
【０１１３】
また、全てのコンジュゲートが、ＨＰＬＣによりシングルピークであることが確認できた。
【０１１４】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂを等量混合した。得られた混合物を、９４℃で３０秒間、次いで、５５℃で３０秒間インキュベーションして、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１０Ｂとをアニーリングさせ、二重らせん化（ハイブリダイゼーション）した３０量体のＤＮＡをスペーサーとして有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳを得た。また、前記ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳを、定法に従ったポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、核酸スペーサー部分の検出を行なった。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡが３０量体であることが確認できた。
【０１１５】
実施例２
スペーサーとして２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを、以下のように調製した。合成プロセスの概略は、図２の通りである。
【０１１６】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡはＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの２種類である（図２参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂ（シグマジェノシス社製）を実施例１と同様にジチオスレイトールにより脱保護した。得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａ及びＨＳ−ＳＰ２０Ｂの濃度を表３に示す。
【０１１７】
【表３】
2006042811.tif 000005
【０１１８】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａ及びＨＳ−ＳＰ２０Ｂに対して、それぞれマレイミド化ＫＤＧＥＡ及びマレイミド化ＧＲＧＤＳを、実施例１と同様の方法により導入した。ゲル濾過によりＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂを精製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、表３のデータを利用して濃度を計算した。結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
2006042811.tif 000006
【０１２０】
また、全てのコンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることが確認できた。
【０１２１】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ、ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂ及びＳＰ２０Ｃ（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの各３２量体のＤＮＡ部位にそれぞれ相補的に結合する２８量体の５’末端がリン酸化されたｓｓＤＮＡ）等を表５のように混合した。得られた混合物を、９４℃で３０秒間、次いで、５５℃で３０秒間インキュベーションして、アニーリングさせた。得られた溶液  ９０μＬと、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ株式会社製）の酵素溶液  ９０μＬとを混合した。得られた混合物を用い、１６℃で６０分間ライゲーション反応を行なった。得られた産物を、スピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを得た。
【０１２２】
得られた産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡが６０量体であることが確認できた。これにより、ｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。また、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって、前記産物の濃度を定量した。その結果、４８．０μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると１．３ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。
【０１２３】
【表５】
2006042811.tif 000007
【０１２４】
実施例３〜５
スペーサーとして４０ｎｍ（１２０量体）、８０ｎｍ（２４０量体）及び１６０ｎｍ（４８０量体）のｄｓＤＮＡを有するそれぞれＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの調製法について説明する。ここでも実施例１及び２と同様にコンジュゲートをまず調製するが、図３にはそれぞれのリガンド構築物の作製に用いられるコンジュゲートの構造を示した。
【０１２５】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡはＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂの二種類である（図３の塩基配列で表記した部分参照。左がＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ、右がＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂである。他の原料も同様に示す。）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂを実施例１と同様にジチオスレイトールにより脱保護した。得られたＨＳ−ＳＰ４０Ａ及びＨＳ−ＳＰ４０Ｂの濃度を表６に示す。同様にＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの場合についても表６に示す。
【０１２６】
【表６】
2006042811.tif 000008
【０１２７】
（コンジュゲートの調製）
上述の脱保護ｓｓＤＮＡに対してそれぞれマレイミド化ＫＤＧＥＡ及びマレイミド化ＧＲＧＤＳを実施例１と同様の方法により導入、精製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、表６のデータを利用して濃度を計算した（表７を参照）。全てのコンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることを確認した。
【０１２８】
【表７】
2006042811.tif 000009
【０１２９】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳについても実施例１及び２と同様に、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ４０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂとを調製した。得られた産物を、ＰＣＲ用プライマー対として用い、大腸菌１６ｓ  ｒＲＮＡを鋳型核酸として用い、以下のように、１２０量体のＤＮＡスペーサーを調製した。
【０１３０】
前記プライマー対（各５０ｐｍｏｌ）と、商品名：Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）  ２５μＬ、大腸菌懸濁液  ５μＬに蒸留水を添加して、全量５０μＬの反応溶液を得た。なお、前記大腸菌懸濁液は、寒天培地上に生育させた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ３９７２）の１コロニーを、蒸留水  １００μＬに溶解させることにより調製した懸濁液である。得られた反応溶液を用い、９４℃で０．５分と、５５℃で０．５分と、７２℃で１分とを１サイクルとする２４サイクルの反応を行なった。得られた反応産物を、スピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）に供して、精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳを得た。得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ついで、可視化させ、検出した。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳは、１２０量体のｄｓＤＮＡを含むことが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量した結果を表８に示す。
【０１３１】
以上の方法と同様にして、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳについて、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ８０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ８０ＢをＰＣＲ用プライマー対として用い、リガンド構築物を調製した。また、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳについて、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１６０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１６０Ｂをプライマー対として用い、リガンド構築物を調製した。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの分子量を、前記と同様に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。その結果、分子量マーカーとの相対移動度の比較により、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳは、それぞれのｄｓＤＮＡ部が、２４０量体及び４８０量体であることが確認できた。これにより、それぞれのｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量した結果を表８に示す。
【０１３２】
【表８】
2006042811.tif 000010
【０１３３】
実施例６
（ポリ−Ｌ−リジン表面の調製）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）塩酸塩（ペプチド研究所製、平均分子量８０００以上）を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。なお、これ以降の操作は、安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行なった。得られた溶液を０．２μｍ内径のフィルターを通して濾過滅菌し、ＰＢＳでさらに１０倍に希釈して、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液を得た。得られたＰＬＬ溶液を、ヌンク社製のデルタ処理１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、ついで、プレートを密封した。前記プレートを３７℃で２時間インキュベーションすることにより、該プレートにＰＬＬを吸着させた。その後、前記プレートからＰＬＬ溶液を吸引してウェル内から除去した。さらに、前記プレートに、１ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳを添加して３分間放置し、アスピレーションする洗浄操作を３回行ない、ＰＬＬ表面を調製した。
【０１３４】
（ポリイオンコンプレックス形成によるポリ−Ｌ−リジン表面へのナノ構造を有するリガンド分子の固定化）
以下、全ての操作は、安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行った。実施例１〜５で得られたリガンド構築物、すなわち、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳを目標密度となるように、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。得られた希釈物を、０．２μｍ内径のフィルターで濾過滅菌した。滅菌後の産物を、ＰＬＬ表面を形成させた１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。ここで、前記産物  ０．５ｍＬ中にリガンド構築物をそれぞれ０．４５ｐｍｏｌ含むように調整した。１２ウェルプレートの場合、１ウェルに液体  ０．５ｍＬを添加すると、液体が覆う面積は、約４．５ｃｍ2となる。したがって、この場合のリガンド構築物が全てＰＬＬ表面に結合したときの密度は、１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2と判断される。その後、４℃において１２時間以上吸着させた。吸着後のリガンド構築物溶液を回収した。ついで、得られた機能性高分子複合体溶液について、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによりｄｓＤＮＡ濃度を測定し、添加した機能性高分子複合体がどの程度ＰＬＬ表面に固定化されているかを確認した。その結果を表９に示す。
【０１３５】
【表９】
2006042811.tif 000011
【０１３６】
これによりリガンド構築物がＰＬＬ表面に固定化されたことが分かった。
【０１３７】
実施例７
（リガンド構築物が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例６で作製したリガンド構築物を固定化したＰＬＬ表面が持つ、細胞の機能を制御する性能を評価した。前記と同様に、リガンド構築物がマウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力（ＡＬＰ活性）を比較することにより行った。
【０１３８】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して１１日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表１０に示す。
【０１３９】
【表１０】
2006042811.tif 000012
【０１４０】
その結果、今回の細胞、リガンド分子及びスペーサー長の組み合わせにおいて、実施例１〜５のリガンド構築物は、いずれもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＬＰ活性を増幅させ得たが、中でもスペーサーの長さが２０ｎｍのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳによってより特異的に増幅されることが分かった。
【０１４１】
比較例１
（リガンド分子を１つ有するリガンド構築物の調製）
実施例２においてＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを調製する際、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａの代わりに脱保護されていないＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａを用いることにより、ＧＲＧＤＳのみが２０ｎｍのＤＮＡスペーサーに結合したＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを調製した。
【０１４２】
また、ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの代わりに脱保護されていないＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂを用いてＫＤＧＥＡのみが２０ｎｍのＤＮＡスペーサーに結合したＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０−ＫＤＧＥＡを調製した。実施例６と同様にＰＬＬ表面に、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのみ（表面密度は約１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2）、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０−ＫＤＧＥＡのみ（表面密度は約１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2）を固定化した表面を調製して、実施例７と同様に細胞の機能評価を行った。その結果を表１１に示す。
【０１４３】
【表１１】
2006042811.tif 000013
【０１４４】
その結果、リガンド分子を１つ有するリガンド構築物では特異的なＡＬＰ活性の上昇は実質的に観測されず、比較例１のリガンド構築物による細胞機能の制御は不充分であると思われる。
【０１４５】
比較例２
（ポリエチレングリコールスペーサーを有するリガンド構築物の調製）
リガンド分子としてＫＤＧＥＡ分子とＧＲＧＤＳ分子とを含有し、かつ平均分子量が３０００のポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称することがある）をスペーサーとするリガンド構築物を合成した。Ｆｍｏｃ基により保護されたアミノ基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル基をもう１つの末端に持つＦｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＥＫＴＡＲ社製，分子量３４００）をＰＥＧスペーサー結合部位として用いた以外は、ヤマモト（Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）及びスズキ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ）らＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）に記載された方法を適用し、ＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを合成した。
【０１４６】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有するリガンド構築物のディッシュ表面への固定化）
９ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを純水に溶解させた。得られた溶液を、１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製、デルタ処理）のウェルに、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加した。前記プレートを、そのままクリーンベンチ内で放置し、溶液を風乾した。前記プレートのウェルに、３重量％  ウシ血清アルブミン／ＤＭＥＭ（ギブコ社製、ＤＭＥＭはＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍの略称である）を１ウェルあたり２ｍＬ添加して室温１時間静置した。その後、溶液を吸引した。０．１重量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ溶液を、前記プレートの１ウェルあたり２ｍＬ入れてアスピレーションする一連の洗浄操作を３回行なって、リガンド構築物を固定化した表面を調製した。
【０１４７】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有するリガンド構築物を固定化した表面による細胞機能制御）
以上のように調製した１２ウェルプレートを用いて実施例７と全く同じ条件で、かつ同時に細胞機能の評価を行った。その結果、１１日間培養を続けるとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がプレート底面から剥がれてしまった。また、１細胞あたりのＡＬＰ活性は、２８ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌであり、きわめて低かった。かかる結果は、比較例２で得られたプレートの表面では細胞機能の制御ができなかったことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明により、細胞機能を効果的に再現性よく制御することができるリガンド構築物、及び該構築物を固定化した細胞培養用基材が提供される。本発明は、例えば、薬物の薬効、薬理、毒性に関する試験の効率化による医薬品の開発支援、動物試験代替法、細胞を用いたバイオセンサー、研究用又は移植用の機能細胞の供給、細胞の機能発現の仕組みを探索する研究、細胞（再生）医療、患者の細胞を用いた診断、医薬品等有用物質の製造等の分野に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、スペーサーとして１０ｎｍ（３０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１０−ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。
【０１５０】
【図２】図２は、スペーサーとして２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。
【０１５１】
【図３】図３は、スペーサーとして４０ｎｍ（１２０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、８０ｎｍ（２４０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及び１６０ｎｍ（４８０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳそれぞれの構造と、それらのリガンド構築物の調製に用いたコンジュゲートの構造を示す概略図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号：１は、リガンドの配列を示す。
【０１５３】
配列番号：２は、リガンドの配列を示す。
【０１５４】
配列番号：３は、リガンドの配列を示す。
【０１５５】
配列番号：４は、リガンドの配列を示す。
【０１５６】
配列番号：５は、リガンドの配列を示す。
【０１５７】
配列番号：６は、リガンドの配列を示す。
【０１５８】
配列番号：７は、リガンドの配列を示す。
【０１５９】
配列番号：８は、リガンドの配列を示す。
【０１６０】
配列番号：９は、リガンドの配列を示す。
【０１６１】
配列番号：１０は、リガンドの配列を示す。
【０１６２】
配列番号：１１は、リガンドの配列を示す。
【０１６３】
配列番号：１２は、リガンドの配列を示す。
【０１６４】
配列番号：１３は、リガンドの配列を示す。
【０１６５】
配列番号：１４は、リガンドの配列を示す。
【０１６６】
配列番号：１５は、リガンドの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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