(57)【要約】      （修正有）【課題】完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうち全長として配列が新規なｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案すること。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質；（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）特定のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且キナーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのＤＮＡ；
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、および該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められている。既に約１００の原核微生物、下等真核生物の出芽酵母、多細胞性真核生物である線虫で、その全ゲノム配列が決定された。３０億塩基対といわれるヒトのゲノムについてはすでにその塩基配列のドラフトが発表されており、また完全配列も明らかにされようとしている。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
【０００３】
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、全ての遺伝子の機能を明らかにできるわけではない。例えば酵母では、ゲノム配列から推定された約６，０００の遺伝子の約半数しか、その機能を推定できなかった。一方、ヒトには約１０万種類のタンパク質が存在するといわれる。そこで、ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量の新しい遺伝子の機能を、迅速かつ効率的に解明していくための「ハイスループット遺伝子機能解析システム」の確立が、強く望まれている。
【０００４】
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエクソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡでは、タンパク質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのｃＤＮＡの研究では、これまでに数百万のＥＳＴ（Expressed Sequence Tags）データが公共データベースに公開されており、それらはヒトの全遺伝子の８０%以上をカバーしているものと推定されている。
【０００５】
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエクソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトＥＳＴ情報の多くはｃＤＮＡの３’末端側近傍に集中しているため、特にｍＲＮＡの５’末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。また、これらのヒトｃＤＮＡの中でコードされているタンパク質の配列が予測されているｍＲＮＡは約７，０００種類程度であり、更にそのうち全長ｃＤＮＡクローンとして取得されているものはわずか５，５００種類程度に過ぎないのが現状である。ＥＳＴとして登録されているものを含めても、全長クローンとしてこれまでに取得されているヒトｃＤＮＡは、ヒト全遺伝子のわずかに１０％〜１５％程度であると推定されている。
【０００６】
完全長ｃＤＮＡを取得できれば、その５’末端配列からゲノム配列上でのｍＲＮＡ転写開始点が推定できる上、その配列の中に含まれるｍＲＮＡの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。また、翻訳開始点であるａｔｇを５’側に含むことから、正しいフレームでタンパク質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝子発現系を適用することで、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を大量に生産したり、タンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。このように、完全長ｃＤＮＡの解析からはゲノム配列解析を相補する重要な情報が得られる。また、発現可能な全長ｃＤＮＡクローンは、その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、その重要性はきわめて高い。
【０００７】
また、同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、それをコードするｍＲＮＡが転写される際、ゲノム中一部のエクソンが挿入・欠失して結合する異性体（以下、これを「スプライシングバリアントｍＲＮＡ」と称することがある）がある。実際、これらのｍＲＮＡが翻訳されて生成される、複数種の類似のタンパク質（以下、これらを「スプライシングバリアント」と称することがある）が生体内において確認されている。スプライシングバリアントは、組織特異的、発生段階特異的、あるいは疾患特異的に発現し、それぞれ異なる機能を有していると考えられている。
【０００８】
例えば、チロシンキナーゼであるＪＡＫ３遺伝子は、Ｓ型、Ｂ型、Ｍ型の3種類のスプライシングバリアントが存在し、Ｓ型は造血細胞で発現しているのに対し、Ｂ型とＭ型は造血細胞と上皮細胞で発現している。Ｓ型とＭ型が抗体によって共沈し、同じ細胞で発現していることから、複数のスプライシングバリアントが共に機能し、細胞内におけるサイトカインのシグナル伝達反応の複雑性をより高めていると推測されている （例えば、非特許文献１を参照）。
【０００９】
このようなスプライシングバリアントのｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡも、従来のｃＤＮＡライブラリーやＥＳＴからは取得されにくく、転写開始点を含む完全長ｃＤＮＡライブラリーにより取得される可能性の高いクローンである（例えば、特許文献１を参照）。
【００１０】
特に、プロテインキナーゼは、基質であるタンパク質びセリン、スレオニンあるいはチロシン残基をリン酸化する酵素であり、極めて多くのファミリーが知られている。また、一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系を調節することにより、種々の生命現象の制御に関わっていることが知られており、疾患との関係が解明されている遺伝子が多い（例えば、非特許文献２を参照）。しかし、ヒトの遺伝子の約３〜４％はプロテインキナーゼの遺伝子であると言われ、ヒトの体内には約千種もの異なるプロテインキナーゼが存在すると推定されており、まだ多くのプロテインキナーゼ遺伝子がクローニングされないままに残されている。したがって、ヒトにおいて分離が進んでいないスプライシングバリアントを含む新規なプロテインキナーゼの全長ｃＤＮＡを提供する意義は大きい。また、プロテインキナーゼは、治療のための標的分子として、またタンパク質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡの全長を明らかにすることには大きな意義がある。
【００１１】
【特許文献１】
ＷＯ９８／２２５０７号公報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１およびＮＯ．２）
【非特許文献１】
Lai K. S. et al., J. Biol. Chem., 270: 25028-25036 (1995)
【非特許文献２】
Hunter, T., Cell, 50: 823-829 (1987)
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規なｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オリゴキャップ法 （Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174(1994); Suzuki, Y. et al., Gene, 200: 149-156 (1997)）を用いて取得されたスプライシングバリアントを含む配列が新規なｃＤＮＡについて、該ｃＤＮＡクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にキナーゼ活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がプロテインキナーゼであると同定した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１４】
すなわち本発明によれば、以下の１〜１５に記載の発明が提供される。
１．以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
２．前項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
３．前項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
４．以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのＤＮＡ；
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
５．前項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
６．前項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは前項５に記載の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
７．前項６に記載の細胞により産生される、前項１に記載の組換えタンパク質。
８．前項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
９．前項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
１０．抗体がモノクローナル抗体である前項９に記載の抗体。
１１．モノクローナル抗体が前項１または７に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする前項１０に記載の抗体。
１２．前項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
１３．前項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
１４．前項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報および／または前項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
１５．前項１に記載のタンパク質および／または前項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得および塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個（ここで、数個とは、例えば５個以下、好ましく３個以下、より好ましくは２個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードし得るものであればいかなるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
【００１６】
具体的には、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号３９〜２１５９、配列番号２の塩基番号３６〜１４５４、配列番号３の塩基番号４０１〜１９６０、配列番号４の塩基番号４２〜１７３３、配列番号５の塩基番号３７１〜３８７４、配列番号６の塩基番号８１〜２７２０、配列番号７の塩基番号１７４４〜２６８５、配列番号８の塩基番号２５４〜２５５４、配列番号９の塩基番号３２〜３８９８、配列番号１０の塩基番号１４６〜３４０６、配列番号１１の塩基番号５５〜１２８７、配列番号１２の塩基番号４０７〜１６９０に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’および／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であればいかなる方法により取得したものでもよいが、具体的には例えば下述の方法により取得することができる。まず、ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてオリゴキャップ法（Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174 (1994)）によりｃＤＮＡを取得する。具体的には、取得したｍＲＮＡについて酸性ピロフォスファターゼにより５’キャップをはずし、その後露出した５’末端のリン酸基を標的に、合成オリゴヌクレオチドをＲＮＡライゲースを用いて連結する。ここで、キャップ構造を５’末端に有していないＲＮＡ分子について、上記オリゴヌクレオチドが結合しないように、予め５’末端に存在するリン酸基を、５’キャップは外さないが５’端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファターゼ等を用いて外しておくことは有効である。このＲＮＡ分子を鋳型として、３’側のプライマーとしてオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、ＲＮＡ鎖を分解除去する。
【００１８】
さらに取得された１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記合成オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを５’プライマーとし、３’末端に特異的なプライマー（オリゴｄＴ等）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ここで、５’プライマーおよび３’プライマーは、上記合成オリゴヌクレオチドおよび逆転写プライマーの全長に対して相補的なものではなく、３’側に３〜１０ｂずらした配列を用いることが好ましい。プライマーの鎖長としては、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３０塩基が挙げられるが、増幅するｃＤＮＡの鎖長が長い場合には２５〜３５塩基の長さとすることが好ましく、また、Long and Accurate PCR（ＬＡ ＰＣＲ：林健志、実験医学別冊・ＰＣＲの最新技術、羊土社；Cheng, S. et al., Nature 369: 684-685 (1994)）を用いることが好ましい。
【００１９】
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、取得されたｃＤＮＡクローンを細胞に導入して該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現できるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。具体的には例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ００９８６４）等が好ましく、また大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ZAP Express（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００２０】
かくして取得されるｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、取得されたｃＤＮＡの５’末端あるいは３’末端の塩基配列を解析し、これをＮＣＢＩ（National Center of Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で運用しているＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ｄｂＥＳＴ等のデータベースをＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410(1990)）を用いて検索し、その全長について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供することとした。
【００２１】
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜１２に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号３９〜２１５９、配列番号２の塩基番号３６〜１４５４、配列番号３の塩基番号４０１〜１９６０、配列番号４の塩基番号４２〜１７３３、配列番号５の塩基番号３７１〜３８７４、配列番号６の塩基番号８１〜２７２０、配列番号７の塩基番号１７４４〜２６８５、配列番号８の塩基番号２５４〜２５５４、配列番号９の塩基番号３２〜３８９８、配列番号１０の塩基番号１４６〜３４０６、配列番号１１の塩基番号５５〜１２８７、配列番号１２の塩基番号４０７〜１６９０に示される配列を有するものが挙げられる。
【００２２】
かくして取得されたｃＤＮＡの全長として新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索（homology search）や、ＨＭＭＥＲ（隠れMarkovモデルによる配列解析手法；Eddy, S. R., Bioinformatics 14: 755-763(1998)）の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（profile search:http://pfam.wustl.edu）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００２３】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されている配列の触媒ドメイン部分と本発明のＤＮＡのこれに対応する部分との一致度（identity）がE-value（問い合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値）として１０-4以下のものか、あるいは３０％以上のものを示す。
【００２４】
例えば、上位にヒットした触媒ドメイン配列の多くがキナーゼとしての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、すなわち、キナーゼ活性を持つであろうという予測が成り立つ。
【００２５】
ＨＭＭＰＦＡＭでは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、解析対象である塩基配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析である。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない機能でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し機能予測ができる。このように、それがコードするタンパク質がキナーゼ活性を有すると予測されるｃＤＮＡは、後述する生化学的実験によりそのキナーゼ活性を確認することができる。
【００２６】
上記でｃＤＮＡの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、配列番号１〜１２のいずれかに示す塩基配列を有するものが挙げられる。また、これらの塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号１３〜２４のいずれかに示すものが挙げられる。
【００２７】
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは上記の配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１もしくは数個（ここで、言う数個とは、例えば１５個以下、好ましく９個以下、より好ましくは６個以下を意味する）の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号１３〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００２８】
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００２９】
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明のタンパク質の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を決定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号１３〜２４のいずれかに記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するものも含まれる。
【００３０】
本発明のタンパク質の取得方法としては、（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクターもしくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
【００３１】
また、そのＮ末端またはＣ末端に適当なタグが融合するように設計されたベクターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。タグとして具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇなどが挙げられる。
【００３２】
上記形質転換体が産生するタンパク質には、タンパク質合成時に重原子などで置換・修飾したアミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。また、タンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。例えば、Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化などの末端修飾、糖鎖付加、脂質付加、アシル化、メチル化、スルホン化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化などであるが、必ずしもこれらに限定されない。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ZAP Express（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が挙げられ、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ００９８６４）等が好ましい。
【００３５】
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。昆虫細胞の場合には、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
【００３６】
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
【００３７】
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック（J. Mol. Biol., 53: 154 (1970)）、リン酸カルシウム法（Science, 221: 551 (1983)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Science, 215: 166 (1982)）、インビトロパッケージング法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 581 (1975)）、ウィルスベクター法（Cell, 37: 1053 (1984)）、および電気パルス法（Chu. et al., Nuc. Acids Res., 15: 1331 (1987)）等が挙げられる。
【００３８】
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（J. Biol. Chem., 263: 7406 (1988)）とその宿主であるＳｆ−９（J. Biol. Chem., 263: 7406 (1988)）等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（J. Viol., 26: 291 (1978)）やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)）等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１：アメリカン  タイプ  カルチャー
コレクション保存細胞）が用いられる。
【００３９】
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Vertes, A. A. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 57: 2036 (1993)）、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Vertes, A. A. et al., Molecular Microbiol., 11: 739 (1994)）等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
【００４０】
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。
【００４１】
かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B.D.& Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞タンパク質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、E. coli S30 extract system（Promega社製）とRTS500 Rapid Translation System（Roche社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System（Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM（TOYOBO社製）等が挙げられる。
【００４２】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００４３】
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、キナーゼ活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
【００４４】
（３）本発明のタンパク質が有する活性の確認
本発明のタンパク質は、これを上記（２）に記載のとおり組換えタンパク質として作製し、これを解析することにより（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記（４）に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
【００４５】
本発明のタンパク質が、キナーゼ活性を有することは、それ自体既知の常法を用いて確認することができる。具体的な方法の例として、基質を該組換えタンパク質に接触させ、該組換えタンパク質のキナーゼ活性により基質がリン酸化される際に消費されるＡＴＰ量、生成物の量を測定する方法等を以下に説明する。
【００４６】
反応液としては、基質のリン酸化部位がセリン／スレオニンである、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、マグネシウムイオン、例えば５〜１００ｍＭの塩化マグネシウムあるいは酢酸マグネシウム、および還元剤として１〜１００ｍＭの２−メルカプトエタノール或いは１〜１０ｍＭのジチオスレイトールを含む、リン酸イオンの存在しない、中性から弱塩基性緩衝液、例えば５０ｍＭのトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用い、また、基質のリン酸化部位がチロシンであるチロシン特異的プロテインキナーゼの活性を測定する場合は、塩化マンガン、塩化亜鉛、ＮａＶＯ3、ジチオスレイトールを含むトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いることができる。
【００４７】
この反応液に、ＡＴＰおよびそれぞれに適した基質を加えた後、精製した本発明のタンパク質を添加し、室温〜３７℃で２４時間程度反応後、該タンパク質が有するキナーゼ反応により消費したＡＴＰ量、或いは該タンパク質により行われるキナーゼ反応による生成物を測定する。ここで、受容体型キナーゼと予想されるタンパク質のキナーゼ活性を測定する場合には、該タンパク質の細胞内部分、あるいはキナーゼ活性中心部分のみを組換えタンパク質として発現させて上記の反応に用いることが好ましい。
【００４８】
キナーゼ反応に関して、セリン／スレオニンプロテインキナーゼである環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼの場合、各キナーゼに対応する環状ヌクレオチドを反応液中に添加することが必要である。例えば、Ａ−キナーゼの場合は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を、Ｇ−キナーゼの場合は環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を添加し、基質としてヒストンを用いる。
【００４９】
リン脂質依存性プロテインキナーゼの場合は、リン脂質を反応液中に添加する。例えば、Ｃ−キナーゼの場合、ホスファチジルセリンを添加し、基質としてヒストンを用いる。カルシウム依存性プロテインキナーゼの場合には、カルモジュリンを反応液に添加し、基質としてミオシンＬ鎖を用いる。ここには、ミオシンＬ鎖キナーゼ、カルモジュリンキナーゼが含まれる。チロシン特異的プロテインキナーゼの場合は、基質としてチューブリン、ヒストン、カゼイン、ミオシンＬ鎖、ガストリン、アンギオテンシン、チロシン−グルタミン酸（１：４）重合物等を用いる。
【００５０】
キナーゼ活性測定において、基質へのリン酸基の転移に先立ち、キナーゼによるＡＴＰのＡＤＰへの加水分解反応が起こる。ここで加水分解されたＡＴＰ量を測定することで、キナーゼ活性を定義づけることも可能である。この場合、基質非存在下で行った反応液中のＡＴＰ量を測定し、消費ＡＴＰ量をキナーゼ活性とする。
【００５１】
キナーゼ反応により消費したＡＴＰ量を測定する場合、上記キナーゼ反応液にルシフェリン、ルシフェラーゼを加え、一定時間反応後、添加したルシフェリン特有の蛍光波長で蛍光強度を測定し、残存ＡＴＰによる蛍光量とする。プロテインキナーゼおよび基質非存在下で測定した、反応液中に存在する全ＡＴＰ蛍光強度から上記蛍光強度を差し引いた値を、キナーゼ活性により消費したＡＴＰ量とし、酵素のキナーゼ活性とする。
【００５２】
キナーゼ反応による生成物を測定する場合は、反応液に添加するＡＴＰとして放射性同位元素である32ＰをＡＴＰのγ位に含んだ［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いる。キナーゼ反応終了後、反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、泳動後のゲルをＸ線フィルムによりオートラジオグラフィーを行い32Ｐの取り込まれたタンパク質バンドを検出する。また、反応液に１０％トリクロロ酢酸、或いは終濃度９０％となるようにエタノールまたはアセトンを加え、タンパク質を沈殿させる。その後遠心或いはフィルター濾過により上清を除き、さらに同溶液で数回洗浄した後乾燥し、液体シンチレーションカウンターで32Ｐ量を測定する。放射性同位元素を用いない方法としては、キナーゼ反応終了後の反応液を、クロマトグラフィーにより分離し、リン酸化された基質の溶出位置の変化および変化量で活性を測定することも可能である。この場合、クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用いることができる。また、基質のリン酸化による質量変化を質量分析装置で測定することにより、活性測定することも可能である。この場合、前述のクロマトグラフィー分離と併用することで、測定精度がさらに上昇する。
【００５３】
このようなキナーゼ活性の解析系は、本発明のキナーゼ活性を有するタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。
【００５４】
（４）本発明のタンパク質の機能解析
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規タンパク質であって、かつキナーゼ活性を有する本発明のタンパク質は、上記（３）で確認されたキナーゼ活性以外の機能を解析することによりその新規の利用法が提供される（このキナーゼ活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある）。特に、本発明のタンパク質には、公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
【００５５】
具体的な機能の解析方法としては、例えば、（i）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ii）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（iii）適当な細胞へ導入し、導入細胞の表現型の変化を解析する方法、（iv）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
【００５６】
（i）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、in situハイブリダイゼーション法（In situ hybridization: Application to Developmental Biology & Medicine., Ed. by Harris, N. and Wilkinson, D. G., Cambridge University Press (1990)）、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法などが挙げられる。ここで、解析の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Wong, Y., Neuroscience Let., 320:  141-145 (2002)）等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合にも、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００５７】
（ii）の方法においては、本発明のタンパク質と既知のタンパク質との相互作用の有無を調べて、本発明のタンパク質の機能を解析することができる。相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
【００５８】
（iii）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のものも同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はキナーゼ活性を有するものであることがわかっているので、キナーゼが関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
【００５９】
（iv）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
【００６０】
（５）オリゴヌクレオチドの調製および該オリゴヌクレオチドを用いる機能解析上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１〜１２のいずれかで表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントＤＮＡが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
【００６１】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
【００６２】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Elbashir, S., et al., Nature, 411: 494-498 (2001)）に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
【００６３】
このＲＮＡインターフェアランス法において標的となる遺伝子（以下これを「標的遺伝子」と称することがある）は、本発明のＤＮＡであれば、いかなるものであってもよい。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい２０ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。
【００６４】
また、解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、２本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を２本鎖ポリヌクレオチド配列とすることにより、該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡの塩基配列と比較して、解析対象タンパク質をコードするＤＮＡに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害することができる。
【００６５】
ヌクレオチドの鎖長は２０ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよいが、２０〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Mareus, P. I., et al., Interferon, 5: 115-180 (1983)）、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（dsRNA-responsive protein kinase: Bass, B. L., Nature, 411: 428-429 (2001)）を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に2’-5’oligoadenylate synthetase（Bass, B. L., Nature, 411: 428-429(2001)）を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には２０〜３０ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’または３’末端が一部突出したものも含む。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補正を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００６６】
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００６７】
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであればいかなるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業または工業において使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００６８】
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００６９】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００７０】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
【００７１】
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明のＤＮＡの導入体内での発現抑制により、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００７２】
（６）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばEpitope Adviser（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列（ジャンクション部分）等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのＮ末またはＣ末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
【００７３】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００７４】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００７５】
免疫後、適宜試験的に採血を行ってオクタローニー法、固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００７６】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Milstein, et al., Nature, 256: 495 (1975)）ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
【００７７】
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Zimmermann, U. et al.,  Naturwissenschaften, 68: 577 (1981)）によっても行うことができる。
【００７８】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ2、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００７９】
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したSevere combined immune deficiency（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Mosier, D. E., et al., Nature, 335: 256-259 (1988); Duchosal, M. A., et al., Nature, 355: 258-262 (1992)）。
【００８０】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一過性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００８１】
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するキナーゼ活性等を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触させ、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
【００８２】
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００８３】
（７）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
【００８４】
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であればいかなるものであってもよい。例えば、まずはじめに本発明のタンパク質とスクリーニングに供する物質（以下、これを「被検物質」と称することがある）とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
【００８５】
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であればいかなるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記（６）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ結合し、公知のまたは他のバリアントには結合しない物質についてその影響を解析するか、または公知のあるいは他のバリアントにおいても同様に結合するか否かを同定し、結合した場合にはその影響の相違を解析することによって、対象タンパク質に対する該物質の影響を解析することができる。また、該物質の個体内での分布を検討することにより、対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することができる。
【００８６】
具体的な解析方法としては、例えば、キナーゼ活性を調節する物質を解析する場合には、（２）に記載したＤＮＡ導入体に基質となるタンパク質も同様の方法で導入する。この導入体について選択された物質の存在下／または非存在下で基質となるタンパク質のリン酸化をそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。具体的には、上記（３）に記載の方法等を用いて行うことができる。基質となるタンパク質のリン酸化が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質はキナーゼ活性化物質として機能する可能性があり、また低下、または阻害された場合には物質はキナーゼ阻害物質として機能する可能性があると同定できる。
【００８７】
ここで、医薬活性成分の取得を目的として調節物質をスクリーニングするために用いる本発明のＤＮＡ、あるいは組換えタンパク質を用いる場合は、上記したヒトのホモログを用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、さらに生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。なお、本発明のタンパク質の機能調節物質の評価は、上記した方法に限定されるものではない。
【００８８】
本発明のタンパク質が有するキナーゼ活性としては、例えば、癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール３リン酸を生成する機能、脳皮質発達、神経細胞等遊走を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、脂肪酸やステロールの合成に関連する機能、細胞死に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、インシュリンシグナル伝達等である。そこで、本スクリーニング方法により同定できる化合物は、制癌剤、心疾患治療剤、不妊治療剤、再生組織誘導剤、アルツハイマー病治療剤、神経変性疾患治療剤、糖尿病治療剤として用いられ得るものである。
【００８９】
また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、副腎、子宮、精巣、脳（全脳、尾状核、扁桃核、視床、小脳）等の組織または器官由来のＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされており、取得された本発明のタンパク質は、上記組織または器官等において特有の機能を有している可能性があるので、本発明のタンパク質の機能調節物質は該組織または器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得るものである。
【００９０】
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９１】
（８）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
【００９２】
被検物質としては、（７）に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
【００９３】
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９４】
（９）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００９５】
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
【００９６】
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
【００９７】
（１０）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１〜１２のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。ここで、対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、ＤＮＡアレイには、対象タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、他のバリアントＤＮＡと異なる配列を選択することが好ましい。
【００９８】
また、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ―Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【０１００】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、取得された各ｃＤＮＡクローンについて以下の実験を行った結果は、実施例５に纏めて記載した。
【０１０１】
実施例１  オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト各組織より全ＲＮＡとして抽出された市販の各ｍＲＮＡ（クロンテック社製：副腎（＃６４０１６−１）、子宮（＃６４０２９−１）、精巣（＃６４０２７−１）、小脳（＃６４０３５−１）、全脳（＃６４０２０−１））から、およびヒト各組織よりポリ（Ａ）+ＲＮＡとして抽出・精製された市販の各ｍＲＮＡ（クロンテック社製：尾状核（＃６５７５−１）、扁桃核（＃６５７４−１）、視床（＃６５８２−１））に全脳の全ＲＮＡらポリ（Ａ）+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースで除くことにより調製したポリ（Ａ）-ＲＮＡをそれぞれ混ぜたＲＮＡから、オリゴキャップ法（Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174 (1994)）によりｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。
【０１０２】
まず、上記ＲＮＡをＢＡＰ（Bacterial Alkaline Phosphatase）およびＴＡＰ（Tobacco Acid Pyrophosphatase）で処理した後に、オリゴキャップリンカー（配列番号２５）をＲＮＡライゲースを用いて連結した。このＲＮＡ鎖を鋳型としてオリゴｄＴプライマー（配列番号２６）用いた逆転写反応により第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてＲＮＡ鎖を分解除去した（鈴木ら、タンパク質  核酸  酵素、41: 603-607 (1996)；Suzuki, Y. et al., Gene, 200: 149-156 (1997)）。次いで、５’のＰＣＲプライマー（配列番号２７）と３’のＰＣＲプライマー（配列番号２８）を用いＰＣＲ（polymerase chain reaction）により２本鎖ｃＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡ鎖をＳｆｉＩにより切断した。
【０１０３】
次いで、発現用ベクターであるｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに上記で取得したＳｆｉＩ切断断片をクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。上記で用いたｐＭＥ１８ＳＦＬ３ベクターは、クローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０  ｓｍａｌｌ  ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリ（Ａ）付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物であるタンパク質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
【０１０４】
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端または３’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction KitまたはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit:PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００：PE Biosystems社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。
【０１０５】
実施例２  オリゴキャップ法で作製したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’末端の全長性の評価
実施例１で作製したヒトｃＤＮＡライブラリーの５’末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡの配列と比較し、５’末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’末端が伸びている場合、または５’末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
【０１０６】
次に、ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬによるクローンの評価を行った。ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬは、公共データベース中のＥＳＴの５’末端配列や３’末端配列との比較によって全長ｃＤＮＡの可能性の高いクローンを選択するために、ヘリックス研究所の西川・太田らにより開発された方法である。実施例１で解析したｃＤＮＡクローンの５’末端や３’末端配列をＥＳＴデータベースに登録されている塩基配列と比較し、取得されたｃＤＮＡクローンの配列よりも、５’側または３’側へ伸長しているＥＳＴが存在する場合には、そのクローンは「全長ではない可能性が高い」と判断した。公共データベース中のＥＳＴ配列より５’末端が伸長している場合、あるいは５’末端が短いクローンでも、その差が５０塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全長とした。
【０１０７】
実施例３  ｃＤＮＡクローンの塩基配列、アミノ酸配列の解析
実施例２で解析したｃＤＮＡクローンの全塩基配列について、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol.,  215: 403-410 (1990)）による相同性検索（homology search）や、ＨＭＭＥＲ（隠れMarkovモデルによる配列解析手法；Eddy, S. R., Bioinformatics, 14: 755-763 (1998)）の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（profile search:http://pfam.wustl.edu）を行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
【０１０８】
実施例４  キナーゼ活性の測定
（１）タンパク質の調製
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンについて、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質がキナーゼ活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
【０１０９】
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンのＯＲＦ断片を、５’側のプライマーとして各クローンに特異的な下記プライマー、３’側のプライマーとして下記の共通プライマーを使用したＰＣＲ法によって取得した。
【０１１０】
５’側のプライマー
（ａ）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０５３６６７：ATGGTGTTTCCAAACTATCATATTTATCCTC（配列番号２９）
（ｂ）ｃ−ｂｒｃａｎ２０１８２４０：ATGGCCTTCATGGAGAAGCC（配列番号３０）
（ｃ）ｃ−ｂｒａｃｅ３０３８６８７：ATGTCGTCGTCCTTCTTCAAC（配列番号３１）
（ｄ）ｃ−ｂｒａｃｅ３０５０７６４：ATGGAGCCCATGTATCAAGATCG（配列番号３２）
（ｅ）ｃ−ｂｒａｍｙ３０１８３５７：ATGAGCCCTGAGGGCC（配列番号３３）
（ｆ）ｃ−ｂｒａｗｈ３０２２８６６：ATGAGCAGCAATGATATTCAGTACC（配列番号３４）
（ｇ）ｃ−ｂｒａｗｈ３０４３８２７：ATGCTCGAGGCCCGG（配列番号３５）
（ｈ）ｃ−ｂｒｔｈａ２０３４８７４：ATGGCGGCTCCGAGC（配列番号３６）
（ｉ）ｃ−ｔｅｓｔｉ４０５２１９７：ATGTTCACCTTGGGATACCATGG（配列番号３７）
３’側の共通プライマー
GGAGAAAGGCGGACAGGTAT（配列番号３８）
【０１１１】
これを、ＳＰ６プロモーターを含む翻訳制御領域−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子−PreScission Protease（アマシャムファルマシアバイオテク社製）切断サイト−ＤＮＡクローニングサイト（ＳｍａＩ， ＳｆｉＩ）−ポリ（Ａ）シグナル配列を有するベクター（ｐＥＵ−ＳＳ４）のクローニングサイトに挿入した。
【０１１２】
上記で調製されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column（Amersham Pharmacia Biotech社製）によって精製した。
【０１１３】
透析法によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の方法は既報（Endo, Y. et al., J. Biotech., 25: 221-230 (1992)）の方法に従った。反応溶液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液を含み、上記Ericksonらの方法に準じた以下の成分組成である。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、８０ｍＭ酢酸カリウム、１．６ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ-アミノ酸(各 ０．２４ｍＭ)、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２６ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ribonuclease inhibitor（ＲＮａｓｉｎTM）に、上述したｍＲＮＡ (１ｍｇ／ｍｌ反応容量) を添加して用いた。上記反応溶液をフロータ・ライザー（Spectra/Float-A-Lyzer（Biotech RC）、分画分子量：１０ｋＤａ、 容量：１ｍｌ）に入れ、反応液の４０倍容量の透析外液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２．５ｍＭジチオスレイトール、２０ 種類のＬ−アミノ酸（各 ０．３ｍＭ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸）に対しての透析系で、反応は２６℃で、４８時間行った。
【０１１４】
反応終了後、透析内液を１６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分離した。この上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したアフィニティ樹脂であるグルタチオンセファロース・４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）を充填したアフィニティカラムに室温で添加し、目的タンパク質を吸着した。ここで、上記カラムには、取得した遠心上清の１／２量のアフィニティ樹脂を用いた。
【０１１５】
さらに、上記で用いたアフィニティ樹脂の１０倍容量の同緩衝液にてカラムを洗浄した後、２ｕｎｉｔｓ／μｌ濃度のPreScission protease（アマシャムバイオサイエンス社製）の同緩衝液による２５倍希釈液を、アフィニティ樹脂と等容量添加し、４℃で４０時間切断反応を行った後、上記緩衝液にて目的タンパク質を溶出した。
【０１１６】
（２）目的タンパク質のＡＴＰ消費量を指標とするキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、終濃度１〜１０ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加後、１μＭのＡＴＰと室温で２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ・ルシフェリンキット（和光純薬工業社製）１００μｌを加え、室温で２４時間反応した後、５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。目的タンパク質を添加していない反応系をコントロールとして、同様に５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。このコントロールの値と目的タンパク質を添加した系の値の差を目的タンパク質が消費したＡＴＰ量として、目的タンパク質１ｍｏｌあたりが２４時間に消費するＡＴＰ量（ｍｏｌ）を目的タンパク質のキナーゼ活性として同定した。
【０１１７】
（３）目的タンパク質によるポリペプチドのリン酸化を指標としたキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２：Promega社、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ：Sigma社、Syntide2：BACHEM FEINCHEMIKALIEN AG）０．２μｇとともに、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１〜１０ｍＭジチオスレイトール、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１μＭ  ＡＴＰと室温で２時間インキュベートした。反応終了後、反応液を、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したBakerbond C18（J. T. Baker社製：０．４６×２５ｃｍ）カラムに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、２０〜８０％のアセトニトリルの６０分間の直線濃度勾配により流速１ｍｌ／分でペプチドを分離した。ペプチドの溶出は、２１５ｎｍの吸光度により測定した。コントロールとして目的タンパク質を添加しない反応液についても同様に分離し２１５ｎｍの吸光度を測定した（図２１）。ここで、目的タンパク質を添加することによってピークの減少および溶出位置の変動が検出されるポリペプチドについては、目的タンパク質の有するキナーゼ活性の基質となると判断することができる。
【０１１８】
実施例５  各ｃＤＮＡクローンの解析結果
（１）ｃ−ａｄｒｇｌ２００１５５４（配列番号１、１３）
ｃ−ａｄｒｇｌ２００１５５４（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１に示すように、２１６８塩基から成り、そのうち塩基番号３９番から２１５９番までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、７０６アミノ酸残基から成る (配列番号１３)。配列番号１３のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース (ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、（i）データベース登録記号ＡＸ０４０９９８およびＷＯ００／６５０４０号公報に記載されているアミノ酸配列がヒットしていた。その内容として、ＡＸ０４０９９８およびＷＯ００／６５０４０号公報に記載されているアミノ酸配列は６２６アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１７〜６１６番が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２５〜６６１番と、E-value（問い合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値）：３×１０-82かつ６５５アミノ酸残基にわたり３２％の一致度（identity）をもつことが認められた。また（ii）データベース登録記号Ｐ５０５２８、Serine/threonine-protein kinase plol（Fission yeast）がヒットしていた。その内容として、Ｐ５０５２８は６８３アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号４７〜６７４番が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号４５〜６９５番と、E-value：６×１０-75かつ６７０アミノ酸残基にわたり３２％の一致度をもつことが認められた。さらに（iii）データベース登録記号、Ｑ９Ｒ０１１、Cytokine-inducible Serine/threonine-protein kinase（ラット）がヒットしていた。その内容として、Ｑ９Ｒ０１１は６１５アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３１〜５５８番が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３９〜６４５番と、E-value：７×１０-71かつ６１３アミノ酸残基にわたり３０％の一致度をもつことが認められた。これらの結果より配列番号１３に示したアミノ酸配列からなるタンパク質は新規のセリン／スレオニンプロテインキナーゼであることが推測された。上記（ii）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Genes Dev., 9: 1059-1073 (1995)）からＧ１、Ｇ２期の細胞における隔壁の形成に関わることが、さらに上記（iii）のタンパク質は、データベース中の文献情報（EMBO J., 18: 5528-5539 (1999)）からシナプス形成を調節するシグナル伝達に関わることがそれぞれ明らかとなった。いずれも細胞周期への関与を示すものであり、後者では神経機能への関わりもあると考えられる。
【０１１９】
また、配列番号１３のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号１３のアミノ酸番号３９〜２９７番に示されるアミノ酸配列にプロテインキナーゼドメインの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。タンパク質の機能の類似性によりドメイン構造やファミリーを分類したアミノ酸パターンのデータベースであり、機能的に重要な部位を検索可能なＰＲＯＳＩＴＥ（Nucleic Acid Res., 30: 235-8 (2002)）によれば、このプロテインキナーゼドメインのうち、アミノ酸番号４５〜６９番はATP region（ＡＴＰ結合部位）、アミノ酸番号１５８〜１７１番はST region（基質のセリン／スレオニンをリン酸化する部位）であり、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの機能的に重要な部位を保持しているため、キナーゼ活性を有すると考えられる。またＨＭＭＰＦＡＭによる検索では、アミノ酸番号５１１〜５８５番に示されるアミノ酸配列にPOLO box duplicated regionの特徴を示す配列（ＰｆａｍにＰＯＬＯ＿ｂｏｘとしてエントリーされるアミノ酸配列）も見出された。ＰＯＬＯ  ｂｏｘは細胞周期、特にＭ期やサイトカインのはたらきに関わるセリン／スレオニンプロテインキナーゼのサブグループであることが知られている。更にタンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるＰＳＯＲＴＩＩ(Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999))による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率はそれぞれ細胞質は４３．５％、核は２６．１％、ミトコンドリアは１７．４％、液胞は４．３％、原形質膜４．３％、ペルオキシゾーム４．３％であることがわかった。よって本タンパク質は細胞質に存在する確率が最も高いことがわかった。
【０１２０】
一方、ゲノム情報を得るため、ヒトｃＤＮＡをヒトゲノム配列へ写像するソフトウエアｓｉｍ４(Genome Res., 8: 976-74 (1998))を用い、本ＤＮＡのゲノムへの写像を試みたが、ヒト染色体のいずれにも写像されなかった。これは本ＤＮＡがヒトゲノムのドラフト配列中には存在せず、存在の予測もできないことを意味する。しかし我々は検討を重ねることにより、今回初めて本ＤＮＡをクローニングすることに成功した。以上より本タンパク質は細胞周期や神経機能などに関わる機能を有する新規セリン／スレオニンプロテインキナーゼであることが推測された。また本ＤＮＡは、副腎よりクローニングされており、本タンパク質は該組織・細胞特有の発生、分化、また機能や疾患に関連する可能性が推測された。
【０１２１】
（２）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０５３６６７（配列番号２、１４）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０５３６６７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号２に示すように、２１３５塩基から成り、そのうち塩基番号３６番から１４５４番までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、４７２アミノ酸残基から成る (配列番号１４)。配列番号１４のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース (ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、（i）データベース登録記号ＡＹ０６１１８３、ＬＤ１４９０１ｐ (fluit fly)がヒットしていた。その内容として、ＡＹ０６１１８３は７９０アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３２５〜７８８番が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号７〜４６８番と、E-value：５×１０-135かつ４７１アミノ酸残基にわたり５２％の一致度をもつことが認められた。また（ii）データベース登録記号Ｐ３６１０２、PAB-dependent poly(A)-specific ribonuclease subunit PAN3（Yeast）がヒットしていた。その内容として、Ｐ３６１０２は６７９アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号２３１〜６７７番が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号６〜４６４番と、E-value：１×１０-47かつ４８２アミノ酸残基にわたり２６％の一致度をもつことが認められた。さらに（iii）データベース登録記号ＡＢ０６２４５０、ＮＥＫ７（Human）がヒットしていた。その内容として、ＡＢ０６２４５０は３０２アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号３５〜１８２番が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号７８〜２４６番と、E-value：４×１０-7でかつ１７３アミノ酸残基にわたり２４％の一致度をもつことが認められた。これらの結果より配列番号１４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質はセリン／スレオニンプロテインキナーゼであることが推測された。上記（ii）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Mol. Cell. Biol., 16: 5744-5753 (1996)）から生体内でｍＲＮＡのポリＡを短化する機能に関わることが、さらに上記（iii）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Genomics, 68: 187-196 (2000)）から有糸分裂の調節に関わることがそれぞれ明らかとなった。いずれも細胞周期への関与を示すものである。
【０１２２】
また、配列番号１４のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号１４のアミノ酸番号８７〜３３４に示されるアミノ酸配列にプロテインキナーゼドメインの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。更にタンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるＰＳＯＲＴＩＩ(Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999))よる解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率はそれぞれ細胞質は４３．５％、核は３０．４％、ミトコンドリアは１７．４％、ゴルジ体は４．３％、小胞体は４．３％であることがわかった。よって本タンパク質は細胞質に存在する確率が最も高いことがわかった。これらのことから本タンパク質は細胞周期に関わる機能を有する新規セリン／スレオニンプロテインキナーゼであることが推定された。
【０１２３】
本タンパク質を実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）に記載の方法でＡＴＰ消費活性（２４ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が認められたことから本タンパク質がキナーゼであることが示された。
【０１２４】
また本ＤＮＡの発現組織を検討するため、本ＤＮＡをクエリーとしてｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3 (1993)）に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、E-value≦１０-50でヒットしたヒトＥＳＴが存在する組織を抽出したところ、正常な乳腺・免疫系・腸、癌化した子宮・精巣であった。更に本ＤＮＡは精巣由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。本蛋白質はこれらの組織や細胞に特有の機能や疾患、例えば乳癌、悪性リンパ腫、白血病、大腸癌、子宮癌、精巣癌などの癌や、炎症性疾患、免疫系疾患、アレルギー疾患、不妊などに関連する可能性が推測でき、これらの疾患の診断薬や治療薬のターゲットとしての有用性が見込まれる。
【０１２５】
（３）ｃ−ｕｔｅｒｕ２００８０１９（配列番号３、１５）
ｃ−ｕｔｅｒｕ２００８０１９（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号３に示すように、３１６５塩基からなり、そのうち塩基番号４０１番から１９６０番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５１９アミノ酸残基からなる（配列番号１５）。配列番号１５のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中の、データベース登録記号ＢＣ０１０６４０、serine/threonine kinase 3（Ｓｔｅ２０、yeast homolog）（Human）がE-value：０．０、かつ４８３アミノ酸残基にわたり１００％の一致度でヒットした。ＢＣ０１０６４０は４９１アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号９〜４９１番が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号３７〜５１９番と一致した。両者の配列の違いは、本タンパク質のＮ末端３６残基とＢＣ０１０６４０のＮ末端８残基である（図１）。
【０１２６】
図１に示すように、配列番号１５のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号５５〜３０６番に示されるアミノ酸配列にプロテインキナーゼドメインの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。タンパク質の機能の類似性によりドメイン構造やファミリーを分類したアミノ酸パターンのデータベースであり、機能的に重要な部位を検索可能なＰＲＯＳＩＴＥ（Nucleic Acids Res., 30: 235-8. (2002)）によれば、このプロテインキナーゼドメインのうち、アミノ酸番号６１〜８５番はATP region（ＡＴＰの結合部位）である。
【０１２７】
本ＤＮＡとＢＣ０１０６４０ｃＤＮＡとのエクソン使用状況を比較するためにｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）を用いてゲノム配列へのアライメントを行った（図２）。その結果、本ＤＮＡはヒト第８番染色体上の１３個のエクソンにマッピングされ、ＢＣ０１０６４０はその第４〜１３エクソンを共有するが、別の第３’エクソンをもつ。本ＤＮＡとＢＣ０１０６４０は翻訳開始点を含むエクソンを異にするために、両タンパク質のＮ末アミノ酸配列に違いを生じていることが判明した。この違いが酵素活性や、他のタンパク質との結合・相互作用、発現組織に差異をもたらす可能性が考えられる。以上から、本タンパク質はＢＣ０１０６４０、serine/threonine kinase 3（Ｓｔｅ２０、 yeast homolog）（Human）のスプライシングバリアントである。
【０１２８】
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムＰＳＯＲＴＩＩ（Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999)）による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在確率は、核６９．６％、細胞質１７．４％、ペルオキシソーム１３．０％であることがわかった。ＢＣ０１０６４０は、出芽酵母Ｓｔｅ２０のホモログであるヒトＳｔｅ２０様キナーゼ（ＭＳＴ）のメンバーであるが、ＭＳＴはカスパーゼの基質であり、アポトーシス感受性を増加させること（J. Biol. Chem., 276:  19276-19285 (2001)）が知られている。以上から、本タンパク質はアポトーシスに関わるＳｔｅ２０様のセリン／スレオニンプロテインキナーゼと考えられる。
【０１２９】
真核生物ゲノムのアノテーション情報データベースＥｎｓｅｍｂｌ中のDisease Browser（http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/diseaseview）によると、写像された本ＤＮＡの第８番染色体上の位置（ｑ２２．２）を含むｑ２２−ｑ２３にコーエン症候群、ｑ２２．２にクリッペル‐フェイル症候群（喉頭部の奇形を伴う）の原因遺伝子座が存在することがわかり、本ＤＮＡがこれらの疾患の原因遺伝子である可能性や、スプライシングバリアントを含む本ＤＮＡの変異がこれらの疾患の診断薬に応用できる可能性が推測された。本ＤＮＡの発現組織を検討するため、本ＤＮＡをクエリーとしてｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3 (1993)）に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、E-value≦１０-50でヒットしたヒトＥＳＴが５個以上ある組織を抽出したところ、正常な骨髄・腎臓・前立腺・胎盤・全脳、癌化した子宮という結果を得た。また、本ＤＮＡは子宮由来ライブラリーからクローニングされた。本タンパク質はこれらの組織や細胞に特有の機能や疾患、例えば子宮癌・前立腺癌・脳腫瘍・骨髄腫・白血病・悪性リンパ腫などの癌、アルツハイマー病・パーキンソン病・ハンチントン舞踏病などの神経変性疾患、うつ病・精神分裂病などの中枢疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、糸球体腎炎・ネフローゼ症候群・腎不全などの腎疾患、ゴーシェ病などの骨髄疾患、等の疾患の診断薬や治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１３０】
（４）ｃ−ｂｒｃａｎ２０１８２４０（配列番号４、１６）
ｃ−ｂｒｃａｎ２０１８２４０（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号４に示すように、２８１７塩基からなり、そのうち塩基番号４２番から１７３３番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５６３アミノ酸残基からなる（配列番号１６）。配列番号１６のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中のデータベース登録記号ＡＸ４０５７３７（unnamed ORF）およびＷＯ０２／２２６６０号公報に記載されているアミノ酸配列が、E-value＝０．０、かつ５１４アミノ酸残基にわたり９５％の一致度でヒットした。ＢＬＡＳＴ検索のアライメントから本タンパク質は、ＡＸ４０５７３７のアミノ酸番号３５〜５１番の１７残基、４８９番の１残基に該当するアミノ酸を欠失しており、ＡＸ４０５７３７のアミノ酸番号５１０番、５１１番、５１２番、５１３番に該当するアミノ酸にそれぞれグリシン／アラニン、イソロイシン／アラニン、セリン／ロイシン、アラニン／グリシンの置換が存在することがわかった（図３）。また本ＤＮＡは、ＡＸ４０５７３７の塩基番号２０９〜２５９番の５１塩基、塩基番号１５６９〜１５７１番の３塩基に該当する塩基を欠失し、ＡＸ４０５７３７の塩基番号１６３４／１６３５番に該当する位置に３４塩基が挿入されている。この挿入によってフレームがシフトし、本タンパク質のＣ末端の６７残基、ＡＸ４０５７３７のＣ末端の６４残基に違いが生じている。
【０１３１】
配列番号１６のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号１３２〜３７９番に示されるアミノ酸配列にプロテインキナーゼドメインの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。また配列番号１６のアミノ酸番号６〜１０５番に示されるアミノ酸配列にＰＸドメインの特徴を示す配列（ＰｆａｍにＰＸとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。ＰＸドメインはphosphoinositide結合ドメインであり、細胞内シグナル伝達に関与することが知られている。本タンパク質はＡＸ４０５７３７と比較してＰＸドメインの一部を欠失しているため、ＡＸ４０５７３７とは異なる相互作用を有することが考えられる。
【０１３２】
ｃＤＮＡ配列をゲノム配列へ写像するソフトウエアｓｉｍ４（Genome Res., 8:  967-74 (1998)）を用い、本ＤＮＡとＡＸ４０５７３７のｃＤＮＡ配列をゲノム配列にマッピングしたところ、データベース登録記号ＡＣ１３５５０７、ヒト第３番染色体のクローンＲＰ１１−８０２０２３上に、本ＤＮＡは１８個のエクソンに、ＡＸ４０５７３７は１９個のエクソンにアラインされた（図４）。本ＤＮＡの第２から第１６エクソンに該当するエクソンはＡＸ４０５７３７にも存在するが、本ＤＮＡは第１エクソンと第２エクソンの間にエクソンを１つ欠失している。また本ＤＮＡの第１７エクソンはＡＸ４０５７３７では欠失しているが、この領域は３４塩基からなるためフレームがシフトし、両者のＣ末端のアミノ酸配列に違いが生じている。
【０１３３】
実施例４（１）に記載の無細胞タンパク質合成系で発現させた本タンパク質を機能評価したところ、実施例４（２）に示した方法で本タンパク質のＡＴＰ消費活性（７３ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が検出できた。さらに、実施例４（３）に記すように合成ペプチドを基質としたリン酸基転移活性を逆相ＨＰＬＣで分析した結果（図２２。矢印は変化した溶出位置を示す。）、Syntide2のリン酸化活性（２０１．１ｕｎｉｔ／ｄａｙ）を確認し、本タンパク質はキナーゼであることが明確となった。以上から、配列番号４の本ＤＮＡはＡＸ４０５７３７およびＷＯ０２／２２６６０号公報に記載されている塩基配列のスプライシングバリアントであり、キナーゼをコードしていることがわかった。両者はＮ末部Ｃ末部のアミノ酸配列が異なることから、他のタンパク質との結合や相互作用、発現組織などが異なる可能性がある。
【０１３４】
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるＰＳＯＲＴＩＩ（Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999)）による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は、核７８．３％、細胞質８．７％、ミトコンドリア８．７％であり、核への局在確率が高いため、本タンパク質は細胞の増殖や分化、細胞周期、転写因子の制御などに関わる可能性がある。
【０１３５】
真核生物ゲノムのアノテーション情報データベースＥｎｓｅｍｂｌ中のDisease Browser（http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/diseaseview）によると、本ＤＮＡが写像された第３番染色体上の位置（ｐ１４．３）を含むｐ２１−ｐ１４に常染色体劣性難聴の原因遺伝子座が存在することがわかり、本ＤＮＡがこれらの疾患の原因遺伝子である可能性や、スプライシングバリアントを含む本ＤＮＡの変異が該疾患の診断薬に応用できる可能性が予想された。本ＤＮＡの発現組織を検討するため、本ＤＮＡをクエリーとしてｄｂＥＳＴ（Nature Genetics,  4: 332-3 (1993)）に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、E-value≦１０-50でヒットしたヒトＥＳＴが５個以上ある組織を抽出したところ、正常な免疫系・リンパ系・骨格筋・脳、癌化した免疫系・精巣という結果を得た。また本ＤＮＡは脳の尾状核由来ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。本タンパク質はこれらの組織や細胞に特有の機能や疾患、例えばリンパ腫・白血病・脳腫瘍・精巣癌などの癌や、筋ジストロフィー・ミオパチー・テタニー・重症筋無力症などの骨格筋疾患、免疫系疾患、不妊症、常染色体劣性難聴などに関連する可能性が推測でき、これらの疾患の診断薬や治療薬のターゲットとしての有用性が見込まれる。
【０１３６】
（５）ｃ−ｂｒａｃｅ３００３９２０（配列番号５、１７）
ｃ−ｂｒａｃｅ３００３９２０（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号５に示すように、５３４２塩基からなり、そのうち塩基番号３７１番から３８７４番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、１１６７アミノ酸残基からなる（配列番号１７）。配列番号１７のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中のデータベース登録記号ＡＸ２６２５１６（unnamed ORF）およびＷＯ０１／７３０５０号公報に記載されているアミノ酸配列が、E-value：０．０、かつ１１６０アミノ酸残基にわたり９９％の一致度でヒットした。このＢＬＡＳＴ検索のアライメントから本タンパク質は、ＡＸ２６２５１６のアミノ酸番号３０９番、４５６番、５５７番に該当するアミノ酸にそれぞれスレオニン／イソロイシン、スレオニン／アラニン、リジン／アスパラギンの置換が存在し、また本タンパク質のＮ末端３残基とＡＸ２６２５１６のＮ末端７２残基が異なり、本タンパク質のＣ末端４残基とＡＸ２６２５１６のＣ末端１２残基が異なることがわかった（図５）。また本ＤＮＡは、ＡＸ２６２５１６の塩基番号３８６〜５３３番の１４８塩基に該当する塩基を欠失している。
【０１３７】
配列番号１７のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号１〜２１２番に示されるアミノ酸配列にプロテインキナーゼドメインの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。タンパク質の機能の類似性によりドメイン構造やファミリーを分類したアミノ酸パターンのデータベースであり、機能的に重要な部位を検索可能なＰＲＯＳＩＴＥ（Nucleic Acids Res., 30: 235-8 (2002)）によれば、ＡＸ２６２５１６のプロテインキナーゼドメインのうち、アミノ酸番号２７〜５１はATP region（ＡＴＰ結合部位）であった。この領域はＡＸ２６２５１６の第３’エクソンに該当し、本ＤＮＡでは欠失している。
【０１３８】
ｃＤＮＡ配列をゲノム配列へ写像するソフトウエアｓｉｍ４（Genome Res., 8:  967-74 (1998)）を用い、本ＤＮＡおよびＡＸ２６２５１６のｃＤＮＡ配列をゲノム配列にマッピングしたところ、本ＤＮＡ、ＡＸ２６２５１６はともにヒト第１５番染色体上に１５個のエクソンがアラインされた（図６）。本ＤＮＡは、第３と第４エクソンの間にＡＸ２６２５１６が有するエクソン部を１個欠失しており、ＡＸ２６２５１６は本ＤＮＡの第１エクソンに該当するエクソンをもたない。本ＤＮＡは第３エクソンの３’末端寄りから翻訳領域が開始しているが、ＡＸ２６２５１６は本ＤＮＡの第３エクソンの中央付近から開始しており、両者のＮ末部の読み枠が異なる。ＡＸ２６２５１６は第３エクソン相当部の直後に本ＤＮＡには存在しない１４８塩基からなる挿入を有するため、フレームシフトを生じ、第４エクソン相当部分以降の翻訳フレームは両者で一致する。また、ＡＸ２６２５１６の翻訳終止コドンの直ぐ上流に位置する塩基番号４００６番と４００７番の間に該当する本ＤＮＡの位置（塩基番号３８５５）に１塩基（シトシン）が挿入されたためにフレームシフトが生じた結果、本タンパク質のＣ末部４アミノ酸残基と、ＡＸ２６２５１６タンパク質のＣ末部１２アミノ酸残基が異なっている。ゲノム配列中には本挿入は見られないが、ＥＳＴ配列中には本挿入のあるクローンと、無いクローンの両方が登録されていることから、この違いは個体差と思われる。以上から、本タンパク質はＡＸ２６２５１６およびＷＯ０１／７３０５０号公報に記載されているアミノ酸配列のバリアントであり、プロテインキナーゼであるか、またはプロテインキナーゼの内在性の阻害物質であることが推定された。
【０１３９】
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるＰＳＯＲＴＩＩ（Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999)）による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は、核９１．３％、細胞質４．３％、ペルオキシソーム４．３％であり、ＡＸ２６２５１６の細胞内での局在確率は、核６９．６％、細胞質１７．４％、細胞骨格４．３％、ミトコンドリア４．３％、ペルオキシソーム４．３％であった。本タンパク質はＡＸ２６２５１６と比較して核への分布の確率が増加することから、本タンパク質は核内で細胞増殖・分化、細胞周期、転写因子のリン酸化制御などに関与することが考えられるが、ＡＸ２６２５１６とは異なる機能を有することが予測される。
【０１４０】
真核生物ゲノムのアノテーション情報データベースＥｎｓｅｍｂｌ中のDisease Browser（http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/diseaseview）により、本ＤＮＡが写像された第１５番染色体上の位置（ｑ１５．２）を包含するｑ１５．１−ｑ２１．１に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ５）、ｑ１５．１−ｑ１５．３に先天性赤血球異形成貧血の原因遺伝子座が存在することがわかり、これらの疾患の原因遺伝子である可能性や、スプライシングバリアントを含む本ＤＮＡの変異がこれらの疾患の診断薬に応用できる可能性が予想された。本ＤＮＡの発現組織を検討するため、本ＤＮＡをクエリーとしてｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3  (1993)）に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、E-value≦１０-50でヒットしたヒトＥＳＴが５個以上ある組織を抽出したところ、正常な免疫系・リンパ系組織、癌化した肺という結果を得た。また本ＤＮＡは小脳よりクローニングされた。よって本タンパク質はこれらの組織や細胞に特有の機能や疾患、たとえばリンパ腫・白血病・骨髄腫・肺癌・脳腫瘍などの癌や、脊髄小脳変性症、炎症性疾患、アレルギー疾患、自己免疫疾患、筋萎縮性側索硬化症、先天性赤血球異形成貧血などに関わる可能性が推測でき、これらの疾患の診断薬や治療薬のターゲットとしての有用性が見込まれる。
【０１４１】
（６）ｃ−ｂｒａｃｅ３０３８６８７（配列番号６、１８）
ｃ−ｂｒａｃｅ３０３８６８７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号６に示すように、４９３８塩基から成り、そのうち塩基番号８１番から２７２０番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）で８７９アミノ酸残基（配列番号１８）のタンパク質をコードすると推測される。配列番号１８のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）および特許データベースＧＥＮＥＳＥＱ（アミノ酸配列）中の、ＷＯ９８／２２５０７号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されているHuman receptor tyrosine kinase LMR1_hがヒットした。Human LMR1_hは１３８３アミノ酸からなる受容体型チロシンプロテインキナーゼであり、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１０〜９０５番が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜８６０番と、E-value：０で８９７アミノ酸残基にわたり９４％の一致度をもつことが認められた。
【０１４２】
ＷＯ９８／２２５０７号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２として記載されているヒトＬＭＲ１＿ｈの遺伝子（ＧＥＮＥＳＥＱデータベース塩基配列登録記号ＡＡＶ３２４４９）は５２６７塩基からなりその塩基番号５１５〜４１３８番のオープンリーディングフレームが１２０７アミノ酸のタンパク質（ＬＭＲ１＿ｈ）をコードしうる。しかし該公報に記載されているアミノ酸配列（ＧＥＮＥＳＥＱデータベースアミノ酸配列登録記号ＡＡＷ４８８４２）では、ラットの上流配列１７６アミノ酸を連結したタンパク質配列を仮想合成し１３８３アミノ酸からなるタンパク質を開示している（これをＬＭＲ１＿ｒ＋ｈとよぶ）（図７）。これはヒト配列とラット配列の比較から、ヒト配列がＮ末端に達していないとの推測に立っており、完全長のヒトＬＭＲタンパク質はまだ報告されていない。一方、ＷＯ９８／２２５０７号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１として記載されているラットＬＭＲ１＿ｒ遺伝子（ＡＡＶ３２４４８）は２５７２塩基からなり最大のオープンリーディングフレームをとると塩基番号１３〜２５７１番で終止コドンがなく、この部分のアミノ酸残基数は８５３である。しかし公報にはこの塩基配列の塩基番号１３〜２５５６番に由来する８４８アミノ酸からなるタンパク質（ＬＭＲ１＿ｒ）を記載している（ＡＡＷ４８８４１）。ラットのＬＭＲ１＿ｒ（ＡＡＷ４８８４１）はＣ末端が短いが、これは終止コドンが不明のためで不完全長であることを示している。以上のように既報のＬＭＲタンパク質は、ヒトＬＭＲ１＿ｈはＮ末端が不完全で、ラットＬＭＲ１＿ｒはＣ末端が不完全であり、ＬＭＲ１＿ｒ＋ｈでその全長を推測しているに過ぎない。
【０１４３】
配列番号１８のアミノ酸配列はＬＭＲ１＿ｒ＋ｈのアミノ酸配列と比較して以下の点が異なる。
（ａ）本タンパク質にはＬＭＲ１＿ｒ＋ｈのＮ末端９アミノ酸を欠くが、この領域の配列の差異はヒトとラットの種差を反映したと考えられる。なお、後述のゲノムマッピングから、本ｃＤＮＡの翻訳開始近傍の配列はヒトゲノム配列と一致している。
（ｂ）本タンパク質のアミノ酸番号４６７番、４６８番の間にＬＭＲ１＿ｒ＋ｈのアミノ酸番号４７７〜５１１番に相当する３６アミノ酸の欠失がある。これはエクソン内スプライシングの結果である。
（ｃ）本タンパク質のアミノ酸番号８６０番以降（ＬＭＲ１＿ｒ＋ｈのアミノ酸番号９０６番以降）の配列が異なる。
ＬＭＲ１は細胞外ドメインをほとんど持たない膜受容体型チロシンキナーゼである。本タンパク質を膜貫通領域予測ソフトウエアＴＭｐｒｅｄ（Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 166 (1993)）で解析すると、アミノ酸番号３２〜５３番にＬＡＶＶＡＶＳＦＳＧ  ＬＦＡＶＩＶＬＭＬＡ  ＣＬからなる膜貫通領域がヒットした。また、ＨＭＭＰＦＡＭ検索を行うと、本タンパク質のアミノ酸番号１２５〜３９５番にE-value＝３．３×１０-47でプロテインキナーゼドメインがヒットした。本タンパク質とＬＭＲ１＿ｈは、細胞内プロテインキナーゼドメインよりもＣ末端側に違いが存在することから、本タンパク質はＬＭＲ１＿ｈと異なるシグナル伝達に関与する可能性が有る。
【０１４４】
本ＤＮＡ配列のゲノム上の位置をＮＲＮＥＥ塩基配列データベース（ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＤＤＢＪから作成されたＥＳＴを除く重複のない塩基配列データベース）で検索すると、ヒト第１７番染色体に由来するRPCI-13 Human Female BAC（データベース登録記号ＡＣ１２９９１９）などにマップされた。そこでゲノム配列であるＡＣ１２９９１９の配列上で、ｓｉｍ４（Genome Res., 8:  967-74 (1998)）を用いて、本ＤＮＡと、ＬＭＲ１＿ｈをコードするＤＮＡ（ＷＯ９８／２２５０７号公報）とを比較した（図８）。その結果、本ＤＮＡはエクソン１６個からなり、ＬＭＲ１＿ｈは本ＤＮＡの第１１、第１２、第１３エクソンを含む長いエクソンをもっていた。すなわち、本ＤＮＡは第１１と第１２エクソンの間のスプライシング（塩基番号１４８１／１４８２番）により１０８塩基３６アミノ酸の欠失を、第１２と第１３エクソンの間の２６３塩基のスプライシング（塩基番号２６６０／２６６１番）により８８アミノ酸の欠失とフレームシフトを生じ、スプライシング後の第１３エクソン（塩基番号２６６１〜３４４４番）で１９アミノ酸を付加して翻訳を終了する。一方、ＬＭＲ１＿ｈは翻訳が継続しＣ末端の長いタンパク質を生じる。また、ＬＭＲ１＿ｈの５’端は本ＤＮＡよりも１００塩基分短いため、本ＤＮＡのＡＴＧ翻訳開始コドンを有さず、ＬＭＲ１＿ｈ自身でオープンリーディングフレームを予測すると、下流の第５エクソンから翻訳開始することになる（図８）。以上から、ヒトＬＭＲ１＿ｈはＮ末端の不完全クローンであるが、本タンパク質はこのバリアントであり完全長であると考えられる。
【０１４５】
本タンパク質を実施例４（１）の小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて発現させたところ、実施例４（２）によってＡＴＰ消費活性が認められ、実施例４（３）ではSyntide2を基質としてリン酸基転移によるＨＰＬＣのバンドシフトが認められたことからキナーゼであることが証明された（図２３）。
【０１４６】
本ＤＮＡの特徴である第１１、第１２、第１３エクソンをプローブにしてｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3 (1993)）に対して検索すると、成人のメラノーマ由来ＡＬ１２０８４７が本ＤＮＡ配列の塩基番号１０８４〜１４８２番（第１０、第１１、第１２エクソンに相当）にヒットした。また、視床下部由来ＡＢＩ６００７１１が本ＤＮＡの１１３０〜１８０５番（第１０、第１１、第１２エクソンに相当）にヒットした。このことは第１１、第１２エクソンの間をスプライスアウトする分子がメラノーマや視床下部に存在することを示している。ＷＯ９８／２２５０７号公報によるとＬＭＲ１は神経細胞に発現が限局されている。本ＤＮＡは小脳由来ｃＤＮＡライブラリーから単離され細胞内ドメインに異なる配列をもつ完全長ＬＭＲ１である。このことから本タンパク質は脳腫瘍・神経芽腫・黒色腫などの癌、アルツハイマー病・パーキンソン病・脊髄小脳変性症などの神経変性疾患、うつ病・不安症・精神分裂病などの中枢疾患、糖尿病などの内分泌疾患、炎症などに関与する可能性があり、これらの疾患の診断薬や治療薬のターゲットしての利用が考えられる。
【０１４７】
（７）ｃ−ｂｒａｃｅ３０５０７６４（配列番号７、１９）
ｃ−ｂｒａｃｅ３０５０７６４（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号７に示すように、３３４６塩基からなり、そのうち塩基番号１７４４番から２６８５番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、３１３アミノ酸残基からなる（配列番号１９）。配列番号１９のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中の、データベース登録記号Ｑ１５１３に登録されているcell division kinase10/PISSLRE（ｃｄｋ１０、Human）がE-value ＝５×１０ -179 で３０６アミノ酸にわたり９９％の一致度でヒットした（図９）。ｃｄｋ１０タンパク質は３６０アミノ酸残基からなりアミノ酸番号３９〜３２３番にプロテインキナーゼドメインをもつcyclin dependent kinaseである。そのアミノ酸番号８０〜８６番に増殖抑制因子が結合するＰＩＳＳＬＲＥ配列がある。ｃｄｋ１０のアミノ酸配列番号５５〜３６０番が本タンパク質のアミノ酸番号８〜３１３番に一致するため、本タンパク質はｃｄｋ１０とＮ末端が異なるバリアントと考えられた。
【０１４８】
配列番号１９のアミノ酸配列に対してＨＭＭＰＦＡＭ検索を行うとアミノ酸番号８〜２７６番にプロテインキナーゼドメインが見出された。これはｃｄｋ１０のプロテインキナーゼドメイン（アミノ酸番号３９〜３２３番）と比較するとＮ末端側が短い。
【０１４９】
ｃｄｋ１０をコードするゲノム配列が既知（ＡＪ０１０３４１）であるので、そのＣＤＳ部分と本ＤＮＡをヒト第１６番染色体由来の配列ＡＣ１０３８８８の上でｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）を用いて比較しエクソンの違いを調べた（図１０）。その結果、本ＤＮＡはエクソン１２個からなり、ｃｄｋ１０のＣＤＳはその第２〜１２エクソンを共有し、第１と第２エクソンの間に別のエクソン２個（第１'と第１媒エクソン）をもっていた。本ＤＮＡの翻訳開始は第１エクソンにあり、ｃｄｋ１０は第１'エクソンから翻訳開始する。このように両タンパク質のＮ末アミノ酸配列の違いはそれをコードするエクソンが異なることによる。本ＤＮＡはｃｄｋ１０のスプライシングバリアントである。
【０１５０】
本タンパク質を実施例４（１）の小麦胚芽無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）の方法でＡＴＰ消費活性があること（３９ｕｎｉｔ／ｄａｙ）、実施例４（３）の方法でsyntide2を基質としてリン酸基転移によるＨＰＬＣのバンドシフトが認められた（図２４）（１５９ｕｎｉｔ／ｄａｙ）ことから本タンパク質はキナーゼであることが示された。本タンパク質とｃｄｋ１０はプロテインキナーゼドメインのＮ末端部に違いがあることから基質特異性や活性が異なる可能性がある。
【０１５１】
ｃｄｋ１０タンパク質は細胞周期のＧ２からＭへの進展（progression）に関与し、過剰発現により生育が抑制されることが報告されている（Cancer Res., 55: 3992-3995 (1995)）。そのタンパク質は成人組織でユビキタスに発現しているが、特に最終分化を遂げた細胞で高いため、癌抑制因子ではないかと予想されたが、乳癌での変異は認められておらず（Genomics, 56: 90-97 (1999)）、その機能の詳細は不明である。しかし、本タンパク質はｃｄｋ１０と異なるＮ末端配列をもっており、異なる発現制御を受けている可能性があることから、細胞増殖、分化、発癌、癌抑制機能への関与、免疫・炎症、神経変性疾患などの診断薬や治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１５２】
（８）ｃ−ｂｒａｍｙ３０１８３５７（配列番号８、２０）
ｃ−ｂｒａｍｙ３０１８３５７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号８に示すように、３５７６塩基からなり、そのうち塩基番号２５４番から２５５４番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、７６６アミノ酸残基からなる（配列番号２０）。配列番号２０のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中のデータベース登録記号ＡＸ３２７９９３およびＷＯ０１／８１５８８号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２として記載されているunnamed ORFがE-value＝０で６６０アミノ酸にわたって９４％の一致度でヒットした。この配列は６７４アミノ酸からなり、そのアミノ酸番号３１〜６４６が本タンパク質のアミノ酸番号７７〜６９２番と一致した。本タンパク質はＡＸ３２７９９３とＮ末端、Ｃ末端を異にするバリアントと思われた（図１１）。
【０１５３】
配列番号２０のアミノ酸配列をＨＭＭＰＦＡＭによって検索を行うと、アミノ酸番号７７〜３１６番にプロテインキナーゼドメインが検出され、ＰＲＯＳＩＴＥ（Nucleic Acids Res., 30: 235-8 (2002)）検索によりアミノ酸番号１８３〜１９６番にセリン／スレオニンプロテインキナーゼに特有の配列が見出された。他方、ＡＸ３２７９９３をＨＭＭＰＦＡＭによってプロテインキナーゼドメインを検索すると、アミノ酸番号１９〜２７０番に存在することが予想された。すなわちプロテインキナーゼドメインは両者のＮ末端配列の異なる領域にかかっており、基質特異性や活性が異なることが推測される。
【０１５４】
本ＤＮＡをＮＲＮＥＥ塩基配列データベース（ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＤＤＢＪから作成されたＥＳＴを除く重複のない塩基配列データベース）に対して検索するとＡＣ１１６０２２に登録されるヒト第１１番染色体ゲノム配列に由来するクローンＣＴＤ−２５８３Ｌ２１がヒットした。そこで第１１番染色体上でｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）を用い本ＤＮＡとblast top hitであるＡＸ３２７９９３をアライメントしエクソン構造を比較した（図１２）。本ＤＮＡはエクソン２１個からなっていたが、ＡＸ３２７９９３は
（ａ）本ＤＮＡの第２〜２０エクソンを共有し、
（ｂ）本ＤＮＡの第１エクソンより５'側に別の第１'エクソンをもち
（ｃ）本ＤＮＡの第１８と第１９エクソンの間に別の第１８'エクソンを有し、
（ｄ）本ＤＮＡの第２１エクソンに相当する領域を欠く。
本ＤＮＡに由来するＯＲＦは第１〜２０エクソンに存在し、ＡＸ３２７９９３のＯＲＦは第１'、第２〜１８、第１８'エクソンに存在する。すなわち、両者のＮ末端の違いは異なるエクソンから翻訳開始することに起因し、Ｃ末端の違いは本ＤＮＡが第１８'エクソンをスキップして第１９エクソン以降下流まで翻訳が続くのに対し、ＡＸ３２７９９３では第１８'エクソンで翻訳が終了することによる。以上から、本ＤＮＡとＡＸ３２７９９３は同一遺伝子からのスプライシングバリアントであることが判明した。
【０１５５】
本タンパク質を実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）に記載の方法でＡＴＰ消費活性（６９ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が認められ、実施例４（３）に記載の方法でsyntide2を基質としてリン酸基の転移によるバンドシフトが認められた（図２５）（４３２ｕｎｉｔ／ｄａｙ）ことから本タンパク質がキナーゼであることが示された。
【０１５６】
本ＤＮＡは脳の扁桃から単離されたがその発現分布を調べるためヒトｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3 (1993)）に対して相同性検索を行うと、正常組織ではＥ＝１０-100以下に眼由来の３クローンと胎児脳由来の１クローンがヒットした。以上の事から本ＤＮＡおよび本タンパク質は脳の発生分化における機能、不安症、うつ病、精神分裂病、神経変性疾患、癌、炎症、糖尿病などの診断薬や治療薬、あるいは眼科領域（緑内障、白内障、網膜症など）の診断薬や治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１５７】
（９）ｃ−ｂｒａｗｈ３０２２８６６（配列番号９、２１）
ｃ−ｂｒａｗｈ３０２２８６６（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号９に示すように、４５４７塩基からなり、そのうち塩基番号３２番から３８９８番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、１２８８アミノ酸残基からなる（配列番号２１）。配列番号２１のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ヒト配列の中ではＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中および特許データベースＧＥＮＥＳＥＱ（アミノ酸配列）中に、ＷＯ０１／３８５０３号公報にＳＥＱＩＤ ＮＯ．５４として記載されているヒトプロテインキナーゼ（ＳＧＫ０４０、９０９アミノ酸）がE-value＝０、９４５アミノ酸にわたって８８％の一致度でヒットした。配列番号２１のアミノ酸配列とＳＧＫ０４０のアミノ酸配列を比較すると、本タンパク質のアミノ酸番号３１０〜４０７番、４０８〜５２１番、５７１〜６８３番、６８４〜１１９２番が、ＳＧＫ０４０のアミノ酸番号２０〜１１７番、１３０〜２４３番、２４４〜３５６番、４０１〜９０９番とそれぞれ一致する（図１３）。すなわち本タンパク質は
（ａ）ＳＧＫ０４０のアミノ酸番号１１８〜１２９番に相当する１２アミノ酸を欠失し、
（ｂ）ＳＧＫ０４０のアミノ酸番号２４３番と２４４番の間に４９アミノ酸の挿入をもち
（ｃ）ＳＧＫ０４０のアミノ酸番号３５７〜４００番の４４アミノ酸を欠失し、
（ｄ）Ｎ末端のアミノ酸配列３０９アミノ酸は異なっており、
（ｅ）Ｃ末端に関しては本タンパク質が９６アミノ酸長い。
【０１５８】
配列番号２１のアミノ酸配列をＨＭＭＰＦＡＭ検索した結果、アミノ酸番号６８４〜９２６番にプロテインキナーゼドメインが、アミノ酸番号６８４〜７０５番にATP binding regionが予想された。ＳＧＫ０４０にはプロテインキナーゼドメインの上流に隣接して４４アミノ酸の挿入がある。このことから本タンパク質はＳＧＫ０４０と基質特異性あるいは活性に違いがある可能性がある。また、本タンパク質のアミノ酸番号３６０〜３８８番にはロイシンが７アミノ酸ごとに５回繰り返されるロイシンジッパー構造があり、タンパク質相互作用あるいは本タンパク質が２量体を形成する可能性が有る。
【０１５９】
両ＤＮＡのエクソン構造を明らかにするためにｓｉｍ４（Genome Res., 8:  967-74 (1998)）による写像をおこなった（図１４）。その結果  本ＤＮＡの塩基番号１６〜４５４７がヒト第１２番染色体上にアラインされ２３個のエクソンからなることがわかった。一方ＳＧＫ０４０は塩基番号５２〜２７３０番がアラインされ、エクソン１８個からなっていた。ＳＧＫ０４０は
（ａ）本ＤＮＡの第７と第８エクソンの間に別の第７'エクソンをもち、
（ｂ）本ＤＮＡの第１０エクソンを欠失し
（ｃ）本ＤＮＡの第１２と第１３エクソンの間に別の第１２'エクソンをもち
（ｄ）本ＤＮＡの第２２エクソンに続いてゲノム上にストップコドンＴＡＡが出現し翻訳域が終了する。一方、本ＤＮＡでは第２３エクソンで翻訳が終了する。
（ｅ）両者の５'配列はこのゲノム配列の中では位置が確定できないが、本ＤＮＡの塩基番号１〜９５１番、ＳＧＫ０４０の塩基番号１〜５８番に共通配列がないことから両者は別のエクソンに由来すると推定される。
このゲノム構造からタンパク質の構造の違いを説明すると、以下のようになる。
（ａ）本ＤＮＡは第７'エクソンをスキップすることでアミノ酸１２個の欠失を，
（ｂ）第１０エクソンを有することでアミノ酸４９個の挿入を、
（ｃ）第１２'エクソンをスキップすることでアミノ酸４４個の欠失を、
（ｄ）第２３エクソンを持つことでＣ末端に９６アミノ酸長い配列をもつ。
（ｅ）また、相異なる５'エクソンを持つことでＮ末端アミノ酸配列が異なる。
以上から、本ＤＮＡとＳＧＫ０４０は同一遺伝子からのスプライシングバリアントであることが判明した。
【０１６０】
本タンパク質を、実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）によりＡＴＰ消費活性（２１７ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が認められ、実施例４（３）によりsyntide2を基質としてリン酸基転移によるＨＰＬＣでのバンドシフトが認められた（図２６）（４５８ｕｎｉｔ／ｄａｙ）ことからキナーゼであることが確認された。
【０１６１】
本ＤＮＡは脳に由来するが、ｄｂＥＳＴ（Nature Genetics, 4: 332-3 (1993)）に対するＢＬＡＳＴ検索では免疫系、皮膚、腎臓、脳、副腎などで全域にわたってヒットクローンが散見される。ＰＳＯＲＴＩＩ（Trends Biochem. Sci., 24: 34-6 (1999)）による細胞内局在予測によると、本タンパク質には核移行シグナル候補配列が５箇所あり、ＲＣＣ（regulator of chromosome condensation signature）であるＩＧＴＧＧＧＨＩＬＬＬがアミノ酸番号１２２５〜１２３５番に見出されることから、本タンパク質は核に存在し染色体の凝集への関与が予想される。したがって細胞分裂にかかわる疾患たとえば癌などの診断治療、また、その発現組織情報から免疫炎症（たとえば自己免疫疾患、腎炎など）、高血圧、神経変性疾患などの診断薬や治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１６２】
（１０）ｃ−ｂｒａｗｈ３０４３８２７（配列番号１０、２２）
ｃ−ｂｒａｗｈ３０４３８２７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１０に示すように、４２２２塩基からなり、そのうち塩基番号１４６番から３４０６番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、１０８６アミノ酸残基からなる（配列番号２２）。配列番号２２のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中の、データベース登録記号Ｌ１３７３８に登録されている１０３６アミノ酸のHomo sapiens activated p21cdc42Hs kinase（ＡＣＫ１）がE-value＝０、１０５３アミノ酸にわたり９５％の一致度でヒットした。本タンパク質は、
（ａ）アミノ酸番号６４〜５７７番がＡＣＫ１のアミノ酸番号１〜５１３番と一致、
（ｂ）アミノ酸番号５７８〜５９２番に１５アミノ酸の挿入を持ち、
（ｃ）アミノ酸番号５９３〜１０４２番がＡＣＫ１のアミノ酸番号５１４〜９６２番に相当し、
（ｄ）アミノ酸番号１０４２／１０４３番の間に３０アミノ酸の欠失をもち、
（ｅ）アミノ酸番号１０４３〜１０８６番がＡＣＫ１のアミノ酸番号９９３〜１０３６番と一致する（図１５）。
【０１６３】
すなわち本タンパク質は、
（ａ）ＡＣＫ１よりＮ末端が６３アミノ酸長く、
（ｂ）ＡＣＫ１のアミノ酸番号５１３と５１４の間に１５アミノ酸の挿入（本タンパク質のアミノ酸番号５７８〜５９２番）をもち、
（ｃ）アミノ酸番号１０４２番と１０４３番の間に３０アミノ酸の欠失（ＡＣＫ１のアミノ酸番号９６３〜９９２番）をもつバリアントである。
【０１６４】
スプライシングバリアントであることを塩基配列からあきらかにするために、本ＤＮＡとＡＣＫ１をコードするｃＤＮＡ（Ｌ１３７３８）のゲノム上での位置についてｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）で解析を行った（図１６）。その結果、本ＤＮＡの塩基番号３１１〜４２２２番はヒト第３番染色体に由来するゲノム配列ＡＣ１１２７７５上にアラインされ、この領域に関しては１４個のエクソンにより規定されていた。
（ａ）本ＤＮＡはＡＣＫ１にない第１１エクソンをもつことで１５アミノ酸の挿入をもつ。
（ｂ）ＡＣＫ１は本ＤＮＡの第１２と第１３エクソンの間に別の第１２' エクソンの挿入をもつ。これは本タンパク質にとって３０アミノ酸の欠失である。
（ｃ）両者とも５'末端がゲノムにアラインされないためＮ末端に相当する配列をコードするエクソンの使用状況が不明であるが、本ＤＮＡの塩基番号１〜３１０番、ＡＣＫ１の塩基番号１〜５９７番に共通部分がないことから両者は別のエクソンに規定されていると考えられる。本ＤＮＡのオープンリーディングフレームはアラインされていない上流のエクソンから開始しておりＡＣＫ１よりＮ末端が６３アミノ酸長い。また、ＡＣＫ１のｃＤＮＡ（Ｌ１３７３８）をマッピングすると第１２エクソンに３塩基欠失による１アミノ酸欠失、および近傍の２個所合計３塩基の欠失によるアミノ酸置換と１アミノ酸の欠失が存在するが、本ＤＮＡはゲノムを反映する配列となっていた（図１６）。
【０１６５】
ＡＣＫ１にはＮ末端からチロシンプロテインキナーゼドメイン、ＳＨ３ドメイン、cdc42 binding domain、clathrin binding domainがある。一方、配列番号２２のアミノ酸配列をＨＭＭＰＦＡＭ検索した結果、プロテインキナーゼドメインがアミノ酸番号１８０〜４５０番に、ＳＨ３ドメインがアミノ酸番号４５４〜５０９番に、また論文情報（Nature, 363: 365-367 (1993)）との比較からcdc42 binding regionがアミノ酸番号５０９〜５５２番に、Clathrin binding regionがアミノ酸番号６３９〜７２３番に見出された。
【０１６６】
本タンパク質を、実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）により２１７ｕｎｉｔｓ／ｄａｙのＡＴＰ消費活性が認められ、実施例４（３）によりsyntide2を基質としてリン酸基転移活性４５８．４ｕｎｉｔｓ／ｄａｙが認められた（図２７）ことから、本タンパク質はキナーゼであることが確認された。
【０１６７】
ＡＣＫ１はactivated p21cdc42Hs kinaseで、活性化型低分子Ｇタンパク質をリン酸化しその不活性化型への変換を阻害しＧタンパク質を活性化型に保つ。低分子量Ｇタンパク質（GTP binding protein p21）のRho familyにはＲＡＣＩ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２Ｈｓが知られている。これらの分子には活性型（ＧＴＰ結合型）と不活性型（ＧＤＰ結合型）が存在し、自身のＧＴＰａｓｅ活性により不活性型を生じる際ＧＡＰ（GTPase activationg protein）が関与し、不活性型から活性型への変換にはＧＥＦ（guanine nucleotide exchange factor）が関与する。ＡＣＫ１はこれらのうち活性型Ｃｄｃ４２Ｈｓと結合しそのＧＴＰａｓｅ活性を阻害するチロシンキナーゼであり、細胞骨格、細胞分化、細胞増殖などに関わる。また、ＡＣＫ１はＧＥＦであるＤｂｌをリン酸化し活性型低分子Ｇタンパク質（ｃｄｃ４２Ｈｓ）を蓄積し細胞骨格であるアクチン繊維を誘導する。ＡＣＫ１にはＣ末端の短いバリアントＡＣＫ２が知られておりＥＧＦ（epidermal growth factor）やブラジキニンによってリン酸化されることが報告されており、細胞外からのシグナルを受けて細胞骨格形成を調節する。
【０１６８】
さらにＡＣＫ１はクラスリン（clathrin）とも結合しclathrin-coated vehicleによるreceptor mediated endocytosisに関与することが報告されている。クラスリンは受容体がクラスターを形成するcoated vehicle, coated pitとよばれるオルガネラの裏打ちタンパク質で、受容体など高分子のエンドサイトーシスに関与する。受容体の細胞内へのエンドサイトーシスは、ＨＩＶ受容体としても機能するケモカイン受容体、アドレナリン受容体、インスリン受容体、ＬＤＬ受容体など多くの受容体で知られている。リガンドの結合した受容体のとりこみにより細胞外からのシグナル伝達の調節あるいは受容体のリサイクルが行われる。本タンパク質はcdc42 binding regionとclathrin binding regionの間に１５アミノ酸の挿入を持つタンパク質であり、ｃｄｃ４２やクラスリンなどとの結合や相互作用がＡＣＫ１と異なる可能性がある。以上より、本タンパク質は、癌、動脈硬化、糖尿病、ＨＩＶ、炎症、受容体の細胞内取りこみにかかわる疾患、神経伝達異常に関わる疾患、アルツハイマー病などの痴呆症、高血圧、緑内障などの診断薬・治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１６９】
（１１）ｃ−ｂｒｔｈａ２０３４８７４（配列番号１１、２３）
ｃ−ｂｒｔｈａ２０３４８７４（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１１に示すように、３８５７塩基からなり、そのうち塩基番号５５番から１２８７番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、４１０アミノ酸残基からなる（配列番号２３）。配列番号２３のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中の、データベース登録記号Ｐ４５９８５に登録されているDual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 4、MAP kinase kinase 4（ＭＡＰＫＫ４）、JNK activating kinase 1、c-JunN-terminal kinase kinase 1（ＪＮＫＫ）、SAPK/ERK kinase 1（ＳＥＫ１））がE-value＝０、４１０アミノ酸にわたり９７％の一致度でヒットした。ＭＡＰＫＫ４は全長３９９アミノ酸からなる。本タンパク質はＭＡＰＫＫ４のアミノ酸番号３９番と４０番の間に１１アミノ酸の挿入（本タンパク質のアミノ酸番号４０〜５０）をもつバリアントである（図１７）。
【０１７０】
配列番号２３のアミノ酸配列をＨＭＭＰＦＡＭ検索するとアミノ酸番号１１３〜３７８番にプロテインキナーゼドメインが、ＰＲＯＳＩＴＥ（Nucleic Acids Res., 30:  235-8 (2002))検索するとアミノ酸番号２３６〜２４９番にST region（セリン／スレオニンプロテインキナーゼの特徴配列）が、アミノ酸番号１１９〜１４３番にATP region（プロテインキナーゼのATP binding site）が検出された。
【０１７１】
本タンパク質の１１アミノ酸の挿入がスプライシングによるかを塩基配列上で比較した（図１８）。本ＤＮＡとＭＡＰＫＫ４をコードするＬ３６８７０ｃＤＮＡとをｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）を用いてゲノムにマッピングしたところ、本ＤＮＡはヒト第１７番染色体上にエクソン１２個をもつが、ＭＡＰＫＫ４はその第２エクソン（本ＤＮＡの塩基番号１７０〜２０３番、１１アミノ酸に相当）を欠失していた。このことは本ＤＮＡがエクソンを付加することにより本タンパク質がＭＡＰＫＫ４にない１１アミノ酸を新規に有することを示している。この特異的なエクソン部分とホモロジーを持つｃＤＮＡ（ＥＳＴを含む）の塩基配列を検索したが見出されなかった。このことはこのエクソンを有する分子種が稀であり、本ＤＮＡが新規分子であることを示している。
【０１７２】
本タンパク質を実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、実施例４（２）の方法でＡＴＰ消費活性（３３ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が検出され、実施例４（３）でsyntide2を基質としてリン酸基転移によるＨＰＬＣのバンドシフト（２３７．８ｕｎｉｔ／ｄａｙ）が認められた（図２８）ことから、本タンパク質はキナーゼであることが示された。
【０１７３】
ＭＡＰＫＫ４はセリン／スレオニンプロテインキナーゼに属するdual specificity protein kinaseである。増殖あるいはストレスなどの外界シグナルに反応してＭＡＰＫＫＫに相当するＭＡＰＫ３／ＭＥＫＫなどによってＭＡＰＫＫ４のセリン／スレオニンがリン酸化されて活性化し、ＭＡＰＫに相当するＪＮＫ１（ＭＡＰＫ８）、ＪＮＫ２（ＭＡＰＫ９）、ＪＮＫ３をｐ３８（ＭＡＰＫ１４）と同様に活性化する。さらにその下流の転写因子が活性化され、アポトーシスにかかわる遺伝子などが発現する。ＭＡＰＫＫ４ノックアウトマウスの解析からＴ細胞の分化や、生存シグナルや肝臓の器官形成に関与することが示されている。ＭＡＰＫＫ４は骨格筋で発現が多いがその他の組織でも発現が認められている。またＭＡＰＫＫ４は、受容体のinternalization（ＧＰＣＲの脱感作にかかわる）に関与するタンパク質であるβ−arrestin2と会合しそれに結合するＪＮＫ３をリン酸化する。これによりＧＰＣＲのシグナル伝達とＭＡＰＫシグナル伝達カスケードはクロストークする。本タンパク質は、免疫、肝臓、脳などのストレスに対するアポトーシス、細胞増殖、癌、ＧＰＣＲによるシグナル伝達異常、神経細胞の突起伸長、痴呆、肝再生、糖尿病、血圧調節、筋萎縮性側索硬化症、あるいは自己免疫疾患、アレルギーをはじめとする免疫炎症疾患などへの関与が推測され、これらの疾患の診断薬や治療薬のターゲットとしての利用が考えられる。
【０１７４】
（１２）ｃ−ｔｅｓｔｉ４０５２１９７（配列番号１２、２４）
ｃ−ｔｅｓｔｉ４０５２１９７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１２に示すように、３１０５塩基からなり、そのうち塩基番号４０７番から１６９０番までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、４２７アミノ酸残基からなる（配列番号２４）。本タンパク質についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中の、データベース登録記号Ｘ０７７６７に登録されているHuman cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit type alpha（ＰＫＡＣα）がE-value＝０、３３６アミノ酸にわたり９９％の一致度でヒットした。この配列は３５１アミノ酸からなり、そのアミノ酸番号１６〜３５１番が本タンパク質のアミノ酸番号９２〜４２７番に相当することから本タンパク質はＰＫＡ  ＣαのＮ末端バリアントであると考えられる（図１９）。他にＰＫＡＣαのアミノ酸番号３０９番アルギニン（ＡＧＧ）が本タンパク質では３８５番グリシン（ＧＧＧ）となっている。
【０１７５】
配列番号２４のアミノ酸配列をＨＭＭＰＦＡＭ検索した結果、アミノ酸番号１２０〜３７４番にプロテインキナーゼドメインが見出された。この領域はＰＫＡＣαと共通部分である。
【０１７６】
本ＤＮＡとＰＫＡＣαのｃＤＮＡのエクソン使用状況を比較するためｓｉｍ４（Genome Res., 8: 967-74 (1998)）を用いてゲノムへのアライメントを行った（図２０）。その結果、本ＤＮＡはエクソン１０個からなり、ＰＫＡＣαはその第２〜１０エクソンを共有するが、別の第１'エクソンがあった。両者は翻訳開始部位を含む最初のエクソンを異にすることにより、両タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の違いを生じている。本タンパク質はＰＫＡＣαのスプライシングバリアントである。
【０１７７】
本タンパク質を実施例４（１）の無細胞タンパク質合成系により発現させたところ、実施例４（１）でＡＴＰ消費活性があり、実施例４（２）でSyntide2およびＰＫＡ基質に対してリン酸基転移によるＨＰＬＣでのバンドシフトが認められた（図２９）ことからキナーゼ活性を有することが確認された。
【０１７８】
ＰＫＡはreguratory subunit（Ｒ）２個、catalytic subunit（Ｃ）２個からなるセリン／スレオニンプロイテンキナーゼで、テトラマー（Ｒ２Ｃ２）は不活性型として細胞質に存在するが、Gs-coupled Recepterからのシグナルが入るとadenylyl cyclaseが活性化しＡＴＰからｃＡＭＰを生じ、これがＰＫＡのReguratory subunit（Ｒ）に結合してcatalytic subunit（Ｃ）を遊離し活性化する。ＲとＣの相互作用にかかわるＣのアミノ酸はプロテインキナーゼドメイン内にある１９０番リジン、１９５番アルギニン、１９７番トリプトファン、２１４番リジンである（ＰＲＳ２ドメイン）。Ｒは細胞質にとどまるタンパク質でＣを細胞質にアンカーリングする。ＣはＲから離れると、別の領域（ＰＲＳ１ドメイン；１３４番アルギニン、２０４番グルタミン酸、２３６番チロシン）を介してＰＫＩ（protein kinase inhibitor）と相互作用し細胞質にアンカーされる。Ｒサブユニットについては細胞増殖に関与するＲＩタイプ（ＲＩα、ＲＩβ）、分化に関与するＲＩＩタイプ（ＲＩＩα、ＲＩＩβ）が知られており、ＣサブユニットについてはＣα、Ｃβ、Ｃγが知られている。文献情報によると、ＣがＲによって細胞質にアンカーされるのをＲＩαのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害するとＣαが核に移行することが報告されている（Oncogene, 20: 8019-24 (2001)）。また、インスリン分泌培養細胞ＴＣ６をグルコースあるいはＧＬＰ−１（glucagon-like polypeptide-1）で刺激するとＣαが核へ、Ｃβが細胞膜と核へ移行し、Ｃγは細胞内局在が変わらないことが報告されている（Biochem. J., 368: 397-404 (2002)）。このようにＰＫＡの活性本体であるcatalytic subunitの細胞内局在あるいは活性はさまざまな分子によって調節されている。
【０１７９】
ＰＫＡの基質としてはＧＰＫ（Glycogen phosphorylase kinase）、ＣＲＥＢ（cAMP responisible element binding protein）などが挙げられる。グリコーゲンはGlycogen phosphorylaseにより加水分解されるが、この酵素はＰＫＡによってリン酸化されて活性化され、グリコーゲンの分解が進む。また、ＣＲＥＢは２分子でcAMP responsible elementに結合しＰＫＡなどのプロテインキナーゼにより１３３番セリンがリン酸化されてソマトスタチン、ＳＦ−１（steroid genic factor-1）などの遺伝子を転写活性化する。PKA catalytic subunitαのノックアウトマウスの解析によると、新生仔は大部分致死であるが、生き残ったものは肝臓でのＩＧＦ１の発現や、腎臓由来の尿中タンパク質が低下し生育が著しく阻害され、オスでは精子の成熟ができないことが認められた。
【０１８０】
本タンパク質はそのアミノ酸番号１〜９１番が新規配列である。この領域に特有に結合するタンパク質によって、あるいは特有の発現調節をうけることにより、本来のPKA catalytic subunit αと異なる機能を有する可能性がある。また本ＤＮＡは精巣から単離され、また、PKA catalytic subunitαのノックアウトマウスの実験から本タンパク質は精子成熟、肝臓、腎臓タンパク質の発現調節にかかわると推定されること、グリコーゲン合成の調節、ＩＧＦの分泌不全などのかかわりから、たとえば肝癌・腎臓癌・精巣癌などの癌、肝炎、肝硬変、腎炎、糖尿病、炎症性疾患、不妊、ＧＰＣＲのシグナル伝達にかかわる疾患などの診断治療などのターゲットとしての利用が考えられる。
【０１８１】
【発明の効果】
本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡはキナーゼ活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて該活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発に有用である。
【０１８２】
【配列表】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
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【０２２０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＢＣ０１０６４０の構造を比較した図である。
【図２】図２は、配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＢＣ０１０６４０をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図３】図３は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＡＸ４０５７３７の構造を比較した図である。
【図４】図４は、配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＡＸ４０５７３７をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図５】図５は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＡＸ２６２５１６の構造を比較した図である。
【図６】図６は、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＡＸ２６２５１６をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図７】図７は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＡＡＶ３２４４９、ＡＡＷ４８８４１、ＡＡＷ４８８４２の構造を比較した図である。
【図８】図８は、配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＡＡＶ３２４４９をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図９】図９は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ｃｄｋ１０の構造を比較した図である。
【図１０】図１０は、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ｃｄｋ１０をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図１１】図１１は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＡＸ３２７９９３の構造を比較した図である。
【図１２】図１２は、配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＡＸ３２７９９３をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図１３】図１３は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＳＧＫ０４０の構造を比較した図である。
【図１４】図１４は、配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＳＧＫ０４０をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である（ａ）。さらに、エクソン構造から見た両タンパク質の構造を比較した図も示す（ｂ）。
【図１５】図１５は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＡＣＫ１の構造を比較した図である。
【図１６】図１６は、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＡＣＫ１をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図１７】図１７は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＭＡＰＫＫ４の構造を比較した図である。
【図１８】図１８は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＭＡＰＫＫ４をコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図１９】図１９は、配列番号２４のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造と既知タンパク質ＰＫＡＣαの構造を比較した図である。
【図２０】図２０は、配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡと既知タンパク質ＰＫＡＣαをコードするｃＤＮＡをそれぞれヒトゲノム配列にマッピングして解析したエクソン構造を比較した図である。
【図２１】図２１は、逆相ＨＰＬＣ上で測定した、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）のピークを示す。
【図２２】図２２は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２３】図２３は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２４】図２４は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２５】図２５は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２６】図２６は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２７】図２７は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２８】図２８は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図２９】図２９は、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ、Syntide2）に配列番号１２のアミノ酸配列を有するタンパク質を添加して反応させた後、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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