(57)【要約】【課題】  １次元側のカラムから溶出された成分を効率良く２次元側のカラムに導くことのできる多次元液体クロマトグラフを提供する。【解決手段】  試料注入手段から電解質溶液を注入する注入タイミングは、洗浄工程への切り替え時期を基準として、第１分離カラムから試料成分を溶出してトラップカラムへ移送するに十分な分析所要時間の分だけ前に設定する。【効果】  試料成分がトラップカラムに保持されている時間を最短化することが出来、それによってトラップカラム保持中に起こる試料成分の流出を最小限に止めることが可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶出液を送液する第１の送液手段と、当該第１の送液手段から送液された溶出液に測定対象試料及び電解質溶液を注入する試料注入手段と、当該試料注入手段の下流に設けられ、測定対象試料を保持する第１の分離カラムと、当該第１の分離カラムにより溶出された試料成分を保持する第１及び第２のトラップカラムと、当該トラップカラムに対して溶出液を送液する第２の送液手段と、前記トラップカラムから溶出された試料を分離する第２の分離カラムと、前記第１の分離カラム、前記第１及び第２のトラップカラム、前記第２の分離カラムが接続される切り替えバルブと、前記複数の当該分離カラムから溶出された液を検出する検知器とを備えた多次元液体クロマトグラフであって、
前記切り替えバルブは、
前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第１のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第１の状態、
前記第１の送液ポンプ−前記第１のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第２の状態、
前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第２のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第３の状態、
前記第１の送液ポンプ−前記第２のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第４の状態、
の上記４つの状態を第１の状態から第４の状態の順に切り替え可能であり、
前記第１の状態及び第３の状態において、前記試料注入手段は電解質溶液を注入する工程を有し、当該電解質溶液の注入タイミングは、前記第２の状態及び第４の状態への切り替え時期を基準として、前記第１分離カラムから試料成分を溶出してトラップカラムへ移送するに十分な分析所要時間の分だけ前に設定することを特徴とする多次元液体クロマトグラフ。
【請求項２】
請求項１において、
前記第２の状態において、前記第１のトラップカラムは、前記第１の送液ポンプから溶出液が送液され、前記第１のトラップカラム内に滞留する電解質溶液の洗浄が行われ、
前記第４の状態において、前記第２のトラップカラムは、前記第１の送液ポンプから溶出液が送液され、前記第２のトラップカラム内に滞留する電解質溶液の洗浄が行われることを特徴とする多次元液体クロマトグラフ。
【請求項３】
請求項２において、
前記第２及び第４の状態で、前記第１及び第２のトラップカラムに前記第１の送液ポンプから送液される溶出液の流れは、前記第１及び第３の状態で、前記第１及び第２のトラップカラムに前記第１の送液ポンプから送液される溶出液の流れと反対方向であることを特徴とする多次元液体クロマトグラフ。
【請求項４】
請求項１において、
上記第２の状態及び第４の状態である時間は、３分以内であることを特徴とする多次元液体クロマトグラフ。
【請求項５】
請求項１において、
前記分析所要時間は、２０分以内であることを特徴とする多次元液体クロマトグラフ。
【請求項６】
溶出液を送液する第１の送液手段と、当該第１の送液手段から送液された溶出液に測定対象試料及び電解質溶液を注入する試料注入手段と、当該試料注入手段の下流に設けられ、測定対象試料を保持する第１の分離カラムと、当該第１の分離カラムにより溶出された試料成分を保持する第１及び第２のトラップカラムと、当該トラップカラムに対して溶出液を送液する第２の送液手段と、前記トラップカラムから溶出された試料を分離する第２の分離カラムと、前記第１の分離カラム、前記第１及び第２のトラップカラム、前記第２の分離カラムが接続される切り替えバルブと、前記複数の当該分離カラムから溶出された液を検出する検知器とを備えた多次元液体クロマトグラフを用いた分析方法であって、
前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第１のトラップカラムの流路、及び、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路を形成する第１のステップと、
前記第１の送液ポンプ−前記第１のトラップカラムの流路、及び、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路を形成する第２のステップと、
前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第２のトラップカラムの流路、及び、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路を形成する第３のステップと、
前記第１の送液ポンプ−前記第２のトラップカラムの流路、及び、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路を形成する第４のステップとを有し、
前記第１のステップ及び第３のステップにおいて、前記試料注入手段は電解質溶液を注入する工程を有し、当該電解質溶液の注入は、前記第２の状態及び第４の状態への切り替え時期を基準として、前記第１分離カラムから試料成分を溶出してトラップカラムへ移送するに十分な分析保持時間の分だけ前に行われることを特徴とする多次元液体クロマトグラフを用いた分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の分離カラムを有する多次元液体クロマトグラフ分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内に発現する多様な蛋白質全体の挙動を網羅的に解析するプロテオミクスの分野において、質量分析装置が主要な分析手段となっている。生体由来の試料を質量分析装置にかける前操作として、試料中に含まれる多種類の蛋白質を分離する必要があるが、その手段の一つとして、多次元液体クロマトグラフが用いられている。
【０００３】
多次元液体クロマトグラフでは、分離の原理が異なる複数のカラムを直列に接続して用いることにより、生体試料中に含まれる多種多様な成分を分離する。多次元クロマトグラフでは、通例、第一のカラムによる分離に要求される溶出液と、第二のカラムによる分離に要求される溶出液が異なる。プロテオミクス分野においては、第一の分離カラムとして陽イオン交換カラムなど、溶出液に塩などを含む電解質溶液を用いる分離カラムを用いられることが多い。このような溶液は、質量分析装置による測定に悪影響を及ぼすため、電解質溶液が質量分析装置に導入されないように、第一の分離カラムから溶出された試料を、一旦適切な貯留用カラムに貯留した後、流路切換バルブを切り替え、電解質溶液以外の質量分析装置に導入可能な溶液を、貯留カラムから第２の分離カラムに供給して、分析した試料を質量分析装置に供給する分析方法が取られている。
【０００４】
非特許文献１には、１次元側の第１の分離カラム（SCX column）より分離された試料成分を貯留する二つの貯留カラム(enrichment column) と、二つの貯留カラムの接続を切り替える流路切替バルブ(Micro 10-port valve) を備えた装置構成例が示されている。この装置においては、試料を注入して第１の分離カラムに特定の試料を捕捉し、第１の分離カラムから捕捉した試料成分を溶出するために、濃度を変えながら、定期的に塩（Salt）を第１の分離カラムに注入する。塩の注入に応じて溶出された試料成分は、二つの貯留カラムに交互に貯留される。貯留カラムに貯留された試料成分は、流路切替バルブを介して２次元側の第２の分離カラム(C18 RP column) に接続されたほうの貯留カラムに保持された試料成分をNanoflowポンプで押し出して第２の分離カラムを通過させて分析する。
【０００５】
即ち、非特許文献１の装置においては、片方の貯留カラムを第１の分離カラムに接続し、第１の分離カラムより溶出された試料成分を保持し、その間に他方の貯留カラムは第２の分離カラムとNanoflowポンプに接続し、第２の分離カラムで分析を行うことで、第１の分離カラムからの塩を注入することによる試料成分の溶出を停止せずに定期的に行うことのできる装置を実現している。
【０００６】
【非特許文献１】E. Nagele他，「Journal of Biomolecular Techniques」，Volume 15,2004,pp.134-143
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に示されるような従来技術では、第１の分離カラムにおける試料分離の開始時間（塩の注入開始時間）と、第２の分離カラムにおける試料分離の開始時間（Nanoflowポンプ送液開始時間）は、ほぼ同時に設定されている。すなわち、第１の分離カラムと第２の分離カラムは、ほぼ同じ時間帯で分析ステップを切り替えていくものであるが、第２の分離カラムで分析される試料は、一つ前の分析ステップで第１の分離カラムで分離され、貯留カラムに蓄えられていた試料である。よって、第１の分離カラムから分離されて他の１つの貯留カラムに貯留された成分は、次の分析ステップまで、その貯留カラムに保持されていなければならない。
【０００８】
第２の分離カラムでの分離所要時間は、通常１〜２時間程度であるため、貯留カラムに保持された試料成分は、ほぼ１〜２時間程度の間、貯留カラムに保持されている必要がある。しかし、生体試料中に含まれる蛋白質由来の成分の中には、貯留カラム内の充填剤との相互作用が低いものも含まれており、そのような成分は貯留カラムにおける保持時間が長くなるに従って流出していく。プロテオミクスにおいては、試料中に含まれる微量な蛋白質の同定が重要な課題であるため、分析途中における試料成分の脱落は極力避けなければならない。
【０００９】
本発明の目的は、１次元側のカラムから溶出された成分を効率良く２次元側のカラムに導くことのできる多次元液体クロマトグラフを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、溶出液を送液する第１の送液手段と、当該第１の送液手段から送液された溶出液に測定対象試料及び電解質溶液を注入する試料注入手段と、当該試料注入手段の下流に設けられ、測定対象試料を保持する第１の分離カラムと、当該第１の分離カラムにより溶出された試料成分を保持する第１及び第２のトラップカラムと、当該トラップカラムに対して溶出液を送液する第２の送液手段と、前記トラップカラムから溶出された試料を分離する第２の分離カラムと、前記第１の分離カラム、前記第１及び第２のトラップカラム、前記第２の分離カラムが接続される切り替えバルブと、前記複数の当該分離カラムから溶出された液を検出する検知器とを備えた多次元液体クロマトグラフであって、前記切り替えバルブは、前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第１のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第１の状態、前記第１の送液ポンプ−前記第１のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第２のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第２の状態、前記第１の送液ポンプ−前記第１の分離カラム−前記第２のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第３の状態、前記第１の送液ポンプ−前記第２のトラップカラムの流路、前記第２の送液手段−前記第１のトラップカラム−前記第２の分離カラムの流路が形成される第４の状態、の上記４つの状態を第１の状態から第４の状態の順に切り替え可能であり、前記第１の状態及び第３の状態において、前記試料注入手段は電解質溶液を注入する工程を有し、当該電解質溶液の注入タイミングは、前記第２の状態及び第４の状態への切り替え時期を基準として、前記第１分離カラムから試料成分を溶出してトラップカラムへ移送するに十分な分析所要時間の分だけ前に設定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、試料成分がトラップカラムに保持されている時間を最短化することが出来、それによってトラップカラム保持中に起こる試料成分の流出を最小限に止めることが可能である。
【００１２】
また、電解質溶液が検知器に導かれる可能性を低減し、高感度に分析を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態を添付図面を参照して説明する。図１は本発明の実施形態である多次元液体クロマトグラフの概略構成図である。
【００１４】
図１において、切り替えバルブ１は、ポンプ２からの送液を、試料注入装置３から第１分離カラム４を経由する流路と、十方バルブ５を介してトラップカラム６あるいはトラップカラム７を経由して、廃液ボトル８に送る流路とを切り替える。トラップカラム６，７には、逆相カラムが用いられる。ポンプ２は、溶出液Ａを、切り替えバルブ１が接続する流路を介して、一定流量で試料注入装置３に送液を行う。試料注入装置３には、測定試料の入った容器の他に、電解質濃度が低いものから段階的に高くなるように濃度を調整した複数の電解質溶液（塩など）の入った容器が収納される。この試料注入装置３に収納される複数の電解質溶液の電解質濃度，数，注入量は測定試料の分析条件によって随時変更される。試料注入装置３はポンプ２からの溶出液と共に試料を流路に注入した後、後述する図２の分析プログラム１２に基づき、電解質溶液を所定のタイミングで流路に注入する。試料注入装置３により注入された試料成分は、第１分離カラム４に送られ、一度カラム内に保持された後、後から注入される電解質溶液の作用により、第１分離カラム４との相互作用の小さい順に溶出される。
【００１５】
第１分離カラム４により溶出された各成分は、切り替えバルブ１と十方バルブ５で構成される流路に送られ、トラップカラム６あるいは７で貯留される。何れのトラップカラムに送られるかは、切り替えバルブ１によって制御される。切り替えバルブ１には、ポンプ９と第２分離カラム１０が接続され、ポンプ９は溶出液Ｊ及び溶出液Ｋをその組成比を変化させながら、後述する図２の分析プログラム１４に基づいて、何れかのトラップカラムに送液する。何れのトラップカラムに送液されるかは、切り替えバルブ１によって制御される。ポンプ９からの送液を受けたトラップカラム内の試料は、第２分離カラム１０に溶出し、分離が開始され、その後、検知器１１によって検出される。
【００１６】
図２は本発明の分析プログラムの模式図である。１２は第１分離カラム４の分析プログラム、１４は第２分離カラム１０の分析プログラム、１３は第１分離カラム４に接続されているトラップカラムを表す。
【００１７】
分析プログラム１２において、１５は試料注入装置３により試料を注入するタイミングである。また、１６，１９，２０は、電解質溶液を試料注入装置３により注入するタイミングであり、それぞれ分析所要時間１７の間、電解質溶液が注入される。分析プログラム１２の高さ方向は、電解質溶液の電解質濃度を示しており、電解質濃度の低い溶液から高い溶液の順にステップ毎に注入する。また、分析所要時間１７の後には、洗浄時間１８が設けられ、トラップカラムの洗浄を行う。
【００１８】
分析プログラム１４において、２１，２２，２３は、ポンプ９による溶出液Ｋ，Ｊを用いたグラジエントプログラムの分析開始時間である。
【００１９】
図２に示された、電解質溶液を試料注入装置３により注入するタイミング、すなわち第１分離カラム４での分析開始時間１６は、次のステップの第２分離カラム１０での分析開始時間２１から、第１分離カラムにおける分析所要時間１７と、後述するトラップカラム６あるいはトラップカラム７に保持された電解質溶液の成分を溶出液Ａによる洗浄時間
１８との合計の時間だけ前に設定される。
【００２０】
第１分離カラム４での分析所要時間１７とは、本実施形態の場合、試料注入装置３から電解質溶液が流路に注入されてから第１分離カラム４での試料成分の溶出が行われるのに充分な時間を指し、電解質溶液の注入量とポンプ２の送液速度から求めることが出来る。
【００２１】
図３は、切り替えバルブ１と十方バルブ５の流路を示す概略構成図である。切り替えバルブ１と十方バルブ５により、流路は図３の（ｉ）（ii）(iii) （iv）に示す４通りに切り替えられる。
【００２２】
切り替えバルブ１及び十方バルブ５が図３の（ｉ）に示す流路の状態である場合は、試料注入装置３から試料が注入され、第１分離カラム４において、目的の試料成分の保持が行われる。その後、分析所要時間１７において、試料注入装置３から電解質溶液が第１分離カラム４に対して注入される。電解質溶液が第１分離カラム４に導入されることにより、第１分離カラム４で保持されていた試料成分が溶出され、その後トラップカラム６に保持される。保持されない溶出液の大半はトラップカラム６から廃液ボトル８に送られる。また、トラップカラム７は、図１に示すポンプ９と第２分離カラム１０及び検知器１１に流路を介して接続されている。
【００２３】
電解質溶液注入時間１６から分析所要時間１７が経過した後、切り替えバルブ１の流路は、図３の（ii）に示す状態に切り替えられる。このとき、トラップカラム６には、図３の（ｉ）の状態とは逆方向から溶出液Ａが送液され、トラップカラム６内に滞留していた電解質溶液の成分がトラップカラム６より溶出され、廃液ボトル８に送られる（トラップカラムは、逆送カラムを用いているため、試料成分は吸着するが電解質溶液は吸着しないため、内部で滞留しているのみである。このため、溶出液Ａを流すことにより、試料成分はトラップカラム内に保持したまま、電解質溶液のみを洗い流すことができる）。これにより、トラップカラムに滞留する電解質溶液を効率的に洗浄することができる。電解質溶液としては、塩を用いることが多いが、塩が検知器１１に送液されると汚染の原因となる。特に、検知器１１が質量分析装置の場合、塩がイオン源の汚染原因となる。また、電解質溶液は試料よりもイオン化効率が高いため、試料のイオン化効率を落としてしまう原因にもなる。したがって、電解質溶液の洗浄時間１８を設けることにより、検知器１１の汚染防止と、目的とする試料の検出の高感度化を図ることが可能となる。
【００２４】
洗浄時間１８が経過した後、切り替えバルブ１と十方バルブ５は図３の(iii) に示す状態に切り替えられる。このときトラップカラム６は、ポンプ９と第２分離カラム１０及び検知器１１に流路を介して接続される。ポンプ９は、溶出液Ｊ及び溶出液Ｋをその組成比を変化させながら、トラップカラム６に送液する。これにより、トラップカラム６に保持された試料成分は、トラップカラム６から試料成分の吸着が離れて溶出され、第２分離カラム１０に送られ、第２分離カラム１０との相互作用の小さい順に分離されて溶出される。溶出された成分は質量分析装置である検知器１１に送られ、質量分析装置によって成分の質量数情報が得られる。
【００２５】
この図３の(iii) に示す状態においては、トラップカラム７は第１分離カラム４に接続されると共に、廃液ボトル８に廃液を供給する流路に接続され、溶出液Ａによって平衡化される。その後、次のステップの分析開始時間２２から、第１分離カラム４での分析所要時間１７と、トラップカラム７に保持された電解質成分が充分に溶出するための洗浄時間１８とを合計した時間だけ前のタイミング１９で、試料注入装置３から前記の電解質溶液よりも電解質濃度の高い電解質溶液が流路に注入される。この電解質溶液の作用によって第１分離カラム４から溶出された試料成分はトラップカラム７に送られてそこで保持される。この時、保持されない溶出液の大半はトラップカラム７から廃液ボトル８に送られる。
【００２６】
第１分離カラム４での分析所要時間１７が経過した後、切り替えバルブ１は図３の(iv)に示す状態に切り替えられる。このとき、トラップカラム７には図３の(iii) の状態とは逆方向から溶出液Ａが送液され、トラップカラム７に保持されていた電解質成分がトラップカラム７より溶出され、廃液ボトル８に送られる。
【００２７】
第１分離カラム４での分析所要時間１７が経過した後、切り替えバルブ１と十方バルブ５は図３の（ｉ）に示す状態に切り替えられ、トラップカラム７はポンプ９と第２分離カラム１０及び検知器１１に流路を介して接続され、トラップカラム６に保持された試料成分の第２分離カラム１０による分離が開始される。また、トラップカラム６においては、新たな試料成分の保持が行われる。
【００２８】
このように、切り替えバルブ１と十方バルブ５は測定中、図３の（ｉ）→(ii)→(iii) →（iv）→（ｉ）・・・というように接続状態を順次切り替えていく。なお、ポンプ２，９，切り替えバルブ１，十方バルブ５の動作は動作制御部（図示せず）により、図２に模式的に示した分析プログラムに従って制御される。
（分析例）
図１に示した装置を用いて行った分析例をここで示す。
【００２９】
第１分離カラム４として陽イオン交換カラム（グレイス・ヴァイダック社製４００VHP８.３０５ （内径３００μｍ，長さ５０mm，粒子径５μｍ，細孔径９００Å））を、第２分離カラム１０として逆相カラム（ニューオブジェクティブ社製ピコフリット（内径７５μｍ，長さ５０mm，プロテオペップIIＣ１８，粒子径５μｍ））を、トラップカラム６および７として逆相型トラップカラム（エスジーイー社製プロテコルトラップカラム（内径３００μｍ，長さ５mm，粒子径５μｍ，細孔径３００Å））を使用した。
【００３０】
また、ポンプ２によって送液される溶出液Ａには水／アセトニトリル／ギ酸＝９８／２／０.１(ｖ／ｖ) 混合溶液、試料注入装置３により注入される溶出液Ｂには溶出液Ａ＋
１Ｍギ酸アンモニウム、ポンプ９で送液する溶出液Ｊには溶出液Ａと同じ組成の溶液、溶出液Ｋには水／アセトニトリル／ギ酸＝２／９８／０.１(ｖ／ｖ) 混合溶液を用いた。溶出液Ｂの注入量は９０μＬ、ポンプ２の流速は１０μＬ／min 、ポンプ９の流速は２００ｎＬ／min とし、ポンプ９で行われるグラジエントプログラムを溶出液Ｋ５％−６５％
（第２分離カラム１０の分析開始０分−６０分）,１００％（６０.１分−８０分），５％（８０.１分−１００分）と設定した。
【００３１】
図４は、トラップカラムに保持された電解質成分の洗浄時間１８を０分，３分，５分，７分，１０分と設定した時の試料成分の回収率を、０分設定時の回収量を１００％として求めた結果をまとめたグラフである。サンプルはアンジオテンシンＩ，ブラジキニン，リシルブラジキニン各１００fmol／μＬを含むペプチド混合溶液を用いた。このとき、３分以内では９０％以上の成分を回収できているが、５分以上では徐々に回収率が低下していくことが示されたため、洗浄効果と試料成分の回収率のバランスを考慮し、本実施例におけるトラップカラムに保持された電解質成分の洗浄時間１８を３分と設定した。
【００３２】
図５は前記の条件において、第１分離カラム４での分析所要時間１７を１０分，２０分，３０分，４０分，５０分，９０分とした時の、前記の各ペプチドの回収率を１０分設定時の回収量を１００％として求めた結果をまとめたグラフである。これからわかるように、第１分離カラム４の分析所要時間１７が２０分以内であれば各ペプチド成分とも９０％以上の回収率であるが、ブラジキニン，リシルブラジキニンのようなトラップカラムとの相互作用が小さいペプチド成分は時間とともに回収率が低下し、９０分では回収率３０％程度まで低下する。すなわち、第１分離カラム４から分離された試料成分がトラップカラムに保持されている時間が短いほど回収率は向上する。
【００３３】
本発明により、第１分離カラム４の分析開始時間を、次の分析ステップの分析開始時間から、第１分離カラム４での分析所要時間１７とトラップカラム６およびトラップカラム７に保持された電解質成分の洗浄時間１８の合計分だけ前にすることで、第１分離カラム４の分析開始時間と次の分析ステップの第２分離カラムでの分析開始時間の間の時間を最短化することが可能となり、本発明に係る多次元液体クロマトグラフ分析装置の測定を高感度化することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の多次元液体クロマトグラフ分析装置の概略構成図である。
【図２】本発明の分析プログラムの模式図である。
【図３】本発明における切り替えバルブと十方バルブによる流路切り替えを説明する図である。
【図４】洗浄時間を変更した場合の試料成分の回収率を示すグラフである。
【図５】分析所要時間を変更した場合の試料成分の回収率を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３５】
１…切り替えバルブ、２，９…ポンプ、３…試料注入装置、４…第１分離カラム、５…十方バルブ、６，７…トラップカラム、８…廃液ボトル、１０…第２分離カラム、１１…質量分析装置。
【図１】
2006284188.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月15日(2005.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
第１分離カラム４により溶出された各成分は、切り替えバルブ１と十方バルブ５で構成
される流路に送られ、トラップカラム６あるいは７で貯留される。何れのトラップカラム
に送られるかは、十方バルブ５によって制御される。切り替えバルブ１には、ポンプ９と第２分離カラム１０が接続され、ポンプ９は溶出液Ｊ及び溶出液Ｋをその組成比を変化させながら、後述する図２の分析プログラム１４に基づいて、何れかのトラップカラムに送液する。何れのトラップカラムに送液されるかは、十方バルブ５によって制御される。ポンプ９からの送液を受けたトラップカラム内の試料は、第２分離カラム１０に溶出し、分離が開始され、その後、検知器１１によって検出される。