(57)【要約】      （修正有）【課題】  耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶構造を解明し、作用を調節する分子の設計方法を提供する。【解決手段】  パイロコッカス・ホリコシから得た、以下の性質を有する耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶：空間群I4122に属し、a=143.84Å、b=143.84Å、c=304.13Å、α=90.0°、β=90.0°、γ=90.0°の単位格子定数を有し、補酵素（ＮＡＤ／ＮＡＤＰ）を持つ。アミノ酸の一部置換・欠失・付加した誘導体を含む。【選択図】  図３
2006223166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を有する耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶：
空間群I4122に属し、a=143.84Å、b=143.84Å、c=304.13Å、α=90.0°、β=90.0°、γ=90.0°の単位格子定数を有する。
【請求項２】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来のものである、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、以下の(a)又は(b)のポリペプチドである請求項１又は２に記載の結晶。
(a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１〜１００個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項４】
補酵素NAD及び／又はNADPを含むものである請求項１〜３のいずれかに記載の結晶。
【請求項５】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、野生型酵素の構成メチオニンの全部又は一部がセレノメチオニンに置換された誘導体型酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶に関する。また、本発明は、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの作用を調節する分子の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「古細菌」と分類される生物群の中には、９０℃以上の極めて高い温度条件のような極限条件下で生育するものが多く存在する。このような菌は好熱性古細菌と呼ばれるが、有用な耐熱性酵素を生産することから、多くの種がゲノム解析のターゲットとなっている。
【０００３】
中でも、超好熱性古細菌パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）は、
ゲノム情報が公開されている古細菌の中では最も生育温度が高い嫌気性微生物である。本発明者等はパイロコッカス・ホリコシをターゲットとすることにより、古細菌としては初めてスレオニンデヒドロゲナーゼに関与するタンパク質の存在を見出し、その活性を確認した（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
このスレオニンデヒドロゲナーゼは、NAD又はNADPの存在下で、ヒドロキシアミノ酸
（セリン、スレオニン）、アルコール、又は糖アルコールを脱水素する酵素であり、これらの物質の定量反応に利用できる。従って、各種アルコールおよびスレオニン等のアミノ酸定量、および、バイオセンサーへの応用が可能になる。さらに耐熱性のスレオニンデヒドロゲナーゼを用いることができれば、高温下で効率よく定量反応を行えるとともに、夾雑酵素の影響を抑えた温度下で正確に定量できる。
【０００５】
この耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶構造が解明されて、その耐熱性や酵素反応メカニズムに寄与する構造的知見が得られれば、より高い耐熱性又はより高い酵素活性を有するスレオニンデヒドロゲナーゼの作製、通常のスレオニンデヒドロゲナーゼへの耐熱性の付与、本酵素機能を調節する分子の設計などに役立てることができる。
【特許文献１】特開2000-060572号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶構造を解明することを課題とする。また、本発明は、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの作用を調節する分子の設計方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、超好熱性古細菌パイロコッカス・ホリコシOT3株（理化学研究所における登録番号：JCM9974）から単離された耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶化に成功し、その結晶構造の解析を行い、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、下記の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶、及び耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの作用を調節する分子の設計方法を提供する。
【０００８】
項１．  以下の性質を有する耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶：
空間群I4122に属し、a=143.84Å、b=143.84Å、c=304.13Å、α=90.0°、β=90.0°、γ=90.0°の単位格子定数を有する。
【０００９】
項２．  耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来のものである、項１に記載の結晶。
【００１０】
項３．  耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、以下の(a)又は(b)のポリペプチドである項１又は２に記載の結晶。
(a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１〜１００個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
項４．  補酵素NAD及び／又はNADPを含むものである項１〜３のいずれかに記載の結
晶。
【００１１】
項５．  耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼが、野生型酵素の構成メチオニンの全部又は一部がセレノメチオニンに置換された誘導体型酵素である項１〜４のいずれかに記載の結晶。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶構造が初めて解明された。これにより、この酵素の作用を調節することができる分子、例えば耐熱性を向上させる分子、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を向上させる分子、基質特異性を変化させる分子などの設計を行うことができるようになった。
【００１３】
また、この知見により、この酵素自体の機能を改良することができるようになった。例えば、より高い耐熱性を有する酵素、より高いスレオニンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、基質特異性が変化した酵素などの設計を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶
１．耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ
スレオニンデヒドロゲナーゼは、NAD又は／及びNADPを補酵素として用い、スレオニン
を酸化してL-2-アミノ-3-ケトブタノエートに変換する活性を有する酵素である。また、
酵素活性には亜鉛イオン（Zn２+）を必要とする。
【００１５】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼは、100℃で0.5時間熱処理した場合に50％以上の活性が残存するものであり、好ましくは100℃で0.5時間熱処理した場合に60％以上の活性が残存するものである。
【００１６】
本明細書において、スレオニンデヒドロゲナーゼの活性は次の方法で測定される。即ち、基質である5mMのL-スレオニン、0.2mM NAD(P)、25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中に、活性測定対象のスレオニンデヒドロゲナーゼ2 - 1000 ngを添加し、NAD(P)Hの濃度の指標である340nmにおける吸光度の減少速度を5 分間測定することにより耐熱性スレ
オニンデヒドロゲナーゼの活性を測定する。
【００１７】
本発明において、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼとして、具体的には、
(a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１〜１００個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
が挙げられる。
【００１８】
(a)の配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、後述する実施例で得たパ
イロコッカス・ホリコシJCM9974株の産生する耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼである
。(b)の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において１〜
５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものが好ましい。配列番号１において１００個程度までのアミノ酸の欠失、付加、又は置換であれば、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性及び結晶構造はほぼ維持される。
【００１９】
この耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの由来は特に限定されないが、例えばパイロコッカス属やアエロパイラム属のような超好熱性古細菌に由来するスレオニンデヒドロゲナーゼが挙げられ、中でもパイロコッカス・ホリコシ由来のものが好ましく挙げられる。
２．耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの調製
本発明において、結晶構造の解析に使用される耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼは、例えば上記例示した超好熱性古細菌から公知のタンパク質精製法に従って得ることができる。また、遺伝子工学的手法を用いて、これらの超好熱性古細菌からスレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を取得し、これを大腸菌等の適当な宿主に形質転換させ発現させて、大量に取得することもできる。例えばパイロコッカス・ホリコシの耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを用いたPCRや、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて
設計したプローブを用いたゲノムDNAライブラリーのスクリーニングにより取得できる。
【００２０】
また、本発明の結晶における耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼは、タンパク質中のメチオニンがセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン誘導体（以後、「セレン誘導体」ともいう）であってもよい。セレンを付加することにより立体構造の決定を容易に行える。耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼのメチオニンをセレノメチオニンに置換しても結晶構造は変化しない。メチオニンのセレノメチオニンへの置換は、後述する実施例に示すように、メチオニンに代えてセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより得られる。
【００２１】
単離された耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼを結晶化すると、通常、補酵素であるNAD又はNADPを包含した状態の結晶が得られる。また、後述するように耐熱性スレオニンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を大腸菌などの宿主に導入して耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼを生産させる場合も、得られる耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼを結晶化すると、NAD
又はNADPを包含した状態の結晶が得られる。
３．結晶化
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶化は、例えば、ハンギングドロップ蒸気拡散法、シッティングドロップ法、透析法、シーディング法等の公知の手法により実施することができる。好ましくは、ハンギングドロップ蒸気拡散法である。
【００２２】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶化に使用する緩衝液の種類、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ濃度、ｐＨ、沈殿剤の種類、温度等の条件としては、具体的には、下記条件が例示される。
・緩衝液：HEPES緩衝液、好ましくはナトリウムHEPES緩衝液
・緩衝液の濃度１０〜２００mM
・耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ濃度：5〜15mg/ml、好ましくは5〜10mg/mL
・pH：4〜8、好ましくは6〜7.5
・沈殿剤：ＰＥＧ−400
・  沈殿剤の濃度：30〜60(v/v)％
・  NaCl 濃度100-300 mM
・温度：4〜25℃、好ましくは4〜15℃
このような条件下で、Ｘ線構造解析によって立体構造を解明し得る品位の結晶を得ることができる。
４．結晶の構造解析
得られた耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶をＸ線結晶構造解析に供することにより、結晶学的パラメーターを特定することができる。本発明の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶は、空間群I4122に属し、a=b= 143.84Å、c=304.13Å、α=β=γ=90.0
°の単位格子定数を有するものである。
（ＩＩ）耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの作用を調節する分子の設計方法
本発明の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの酵素機能を調節する分子の設計方法は、上述した本発明の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶構造の特徴を利用して、この酵素の作用に影響を与える分子を設計する方法である。このような分子として、例えば、酵素活性を促進する分子、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる分子、基質特異性を変換（例えばスレオニンから種々のアルコールへの変換）する分子、既存のスレオニンデヒドロゲナーゼに対して耐熱性を付与する分子などが挙げられる。
【００２３】
結晶状態の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼに対して影響を及ぼすと考えられる分子は、工業的に利用される溶液状態の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼに対して同様の影響を及ぼすことが予測される。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの調製
＜耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの調製＞
パイロコッカス・ホリコシからの耐熱性スレオニン・デヒドロゲナーゼの単離は、特許文献１に記載の方法により行った。
【００２４】
即ち、13.5ｇのNaCl、４ｇのNa2SO4、0.7ｇのKCl、0.2ｇのNaHCO3、0.1ｇのKBr、30
ｍｇのH3BO3、10ｇのMgCl2・６H2O、1.5gのCaCl2，25ｍｇのSrCl2、1.0mLのレザスリン溶液（0.2ｇ/L）、1.0ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Lの水に溶かし、この溶
液のｐHを6.8に調整し炭酸ガスで飽和して嫌気性とした後、パイロコッカス・ホリコシJCM9974を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sに
よるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で２〜４日培養し、その後、5，000rpm、10分間の遠心分離により集菌した。
【００２５】
菌体を10ｍM Tris（ｐH7.5）−１ｍM EDTA溶液で2回洗浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入した。このブロックを1％N-ラウロイルザルコシン−１mg/mLプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAがAgaroseブロック中に分離調製された。
【００２６】
上記のようにして得られた染色体DNAから目的の遺伝子をクローニングした。デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の構造遺伝子領域の前後に制限酵素部位NdeI及びBamHIを導入するために
、構造遺伝子中のNdeI切断配列に変異を導入したプライマー:5'-TTTTGAATTCGTGCATATGTCAGAAAAGATGGTA-3'（配列番号２）(ここで、前の一重下線はEcoRIを、後の一重下線はNdeI
を示す。)と、プライマー：3'-TACGAATTTACTATGGAAATGATTCCTAGGGGGCCATGGTTTT-5' （配
列番号３）(ここで、前の一重下線はBamHIを、後の一重下線はKpnIを示す。)；並びに、
プライマー：5'-TCTTGCAACCAGTATATGTGGAACTGATCTTCATAT-3'（配列番号４）（ここで、一重下線は変異部位を示す。すなわち、構造遺伝子配列中の484位のCがTに置換されている
。）と、プライマー：3'-ATTCCAAGAACGTTGGTCATATACACCTTGACTAGA-5'（配列番号５）を合成し、PCR法でその遺伝子の前後に目的の制限酵素部位を導入した。PCR反応後、制限酵素NdeIとBamHIで37℃、2時間処理して完全に分解し、構造遺伝子を精製した。
【００２７】
プラスミドｐET-11a（Novagen社製）を予め制限酵素NdeIとBamHIで切断し精製した後、T4リガーゼを用いて上記の構造遺伝子と16℃、2時間反応させ、連結した。連結したDNAの
一部をE.coli−XL2-BlueMRF'のコンピテント細胞（Novagen社製）に導入し、形質転換体
のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法（Qiagen社製のPlasmid Maxi Kit使用）で精製した。この発現プラスミドを大腸菌株E.coli BL21(DE3)（Novagen社製）に移入したものは、「大腸菌 TDH」の識別名で平成10年8月7日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し受託番号FERM P-16931が与えられている。
【００２８】
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼを発現するプラスミドを保持した大腸菌Rosetta(DE3)をLB培地で37℃で培養し、OD=0.6となったところでIPTGを1 mMとなるように添加し、25℃で約15時間さらに振とうした。
【００２９】
上記により得られた大腸菌の菌体を超音波破砕して、遠心分離により水溶性画分（上清）を得た。85℃で30分間の熱処理の後、遠心分離により熱に不安定なタンパク質を除き、上清を得た。2.5（ｗ/ｖ）％ストレプトマイシン硫酸塩を添加して、遠心分離により核酸を除き、上清を得た。それに56ｇ/Ｌの比率で硫安を徐々に加え遠心分離により得た沈
殿を緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 8.0）に溶解し、さらに同緩衝液に対して透析した。それを、Hi-TrapQ (Amersham Biotech)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより分
離した。目的の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を示す画分をSuperdex-200 (Amersham Biotech)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離し、最終精製標品とした
。
＜耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼセレノメチオニン誘導体の調製＞
セレノメチオニン誘導体の作製方法は文献（Sylvie Doublie (1997) Methods in Enzymology 276, 523-530）を参照した。詳述すれば、耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼを発現するプラスミドを保持した大腸菌Rosetta(DE3)をM9培地（メチオニンは含まない。）で37℃で培養した。OD=0.3となったところで0.1 mg/ml リジン, 0.1 mg/ml フェニルアラニン, 0.1 mg/ml スレオニン, 0.05 mg/ml イソロイシン, 0.05 mg/ロイシン, 0.05 mg/ml バリン, 0.06 mg/ml セレノメチオニンを添加した。これらの濃度はいずれも終濃度であ
る。さらに、OD=0.6となったところで（1 mM IPTG）を添加し、25℃でさらに約15時間振
とうした。
上記により得られた大腸菌の菌体を超音波破砕して、遠心分離により水溶性画分（上清）を得た。85℃で30分間の熱処理の後、遠心分離により熱に不安定なタンパク質を除き、上清を得た。2.5（ｗ/ｖ）％ストレプトマイシン硫酸塩を添加して、遠心分離により核酸を除き、上清を得た。それに560ｇ/Ｌの比率で硫安を徐々に加え遠心分離により得た沈殿を緩衝液（50 mM Tris-HCl、 5mM-DTT、pH 8.0）に溶解し、さらに同緩衝液に対して透析した。それを、Hi-TrapQ (Amersham Biotech)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに
より分離した。耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を示す画分をSuperdex-200 (Amersham Biotech)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離し、最終精製標品とした
。
【００３０】
このようにして、目的の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼのセレノメチオニン誘導体の精製標品が得られた。
２．結晶化
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶化
＜結晶化条件１＞
タンパク質濃度5〜15mg/mlの水溶液を調製した。また、0.2M塩化ナトリウム、0.1M HEPES、及び40(v/v)％PEG400のリザーバー（水溶液）を調製した。タンパク質水溶液とリ
ザーバーとを1.5マイクロリットルずつ等量混合してドロップを作り、ハンギングドロッ
プ蒸気拡散法により4℃で結晶化した。結晶化条件を以下にまとめる。
・緩衝液：0.1M  HEPES
・タンパク質濃度：１０mg/ml
・pH:７．５
・沈殿剤：PEG-400
・  沈殿剤濃度：40 (v/v)％
・  NaCl 濃度100-300 mM
・温度：4℃
このようにして、  0.2  ×  0.1  ×  0.1  mmのサイズの耐熱性スレオニンデヒド
ロゲナーゼの結晶を得た。得られた結晶の写真を図１に示す。
耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼのセレン誘導体の結晶化
上記の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶化と同条件でセレン誘導体を結晶化させた。このようにして、0.2  ×  0.1  ×  0.1mmのサイズの耐熱性スレオニンデヒドロ
ゲナーゼのセレン誘導体の結晶を得た。得られた結晶の写真を図２に示す。
３．結晶構造解析
上記のようにして得られた耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼ、及びそのセレン誘導体について、リガクのX線発生装置FR-E により発生させたX線（1.54A）および R-AXIS VII
のイメージンブプレートを使用して解析データを収集した。少なくとも分解能2.05Åの回析データが得られた。
【００３１】
結晶化条件１で得られた耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶及びそのセレン誘導体の結晶をそれぞれ100Ｋで測定したところ、いずれも空間群  I4122に属し、a=b= 143.84Å、c=304.13Å、α=β=γ=90.0°の単位格子定数を有することが明らかとなった。
【００３２】
精密化の結果を表１にまとめて示す。
【００３３】
【表１】
2006223166.tif 000003
かっこ内の値は最後のシェルの値である。 
†Rmerge =ΣhklΣi｜Ii(hkl)-〈I(hkl)〉｜/ΣhklΣiIi(hkl)；ここで、 Ii(hkl) は、
対称に関連した反射率を含む反射hklのith強度測定値であり、I(hkl)〉はそれらの平均値である。
４．立体構造
X線解析から推測される本酵素の立体構造を図３に示す。本酵素は２量体構造を示し、２
回回転軸を有する対称性を有する。また、矢印の部分が２ケ所の活性部位である。活性中心は、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニンから数えて97, 100, 103, および111番
目の４残基のシステインのSHに配位する亜鉛である。経験則上、この亜鉛から半径１０Å以内にあるアミノ酸残基を変えることにより、基質特異性を変えることが可能になる。例えば、本結晶構造では、スレオニンに対する基質特異性が高いが、他の種々のアルコールに対する基質特異性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】パイロコッカスホリコシ由来の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの結晶の光学顕微鏡写真である。
【図２】パイロコッカスホリコシ由来の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼのセレン誘導体の結晶の光学顕微鏡写真である。
【図３】X線構造解析から推測されるパイロコッカス・ホリコシ由来の耐熱性スレオニンデヒドロゲナーゼの立体構造である。
【図１】
2006223166.tif 000004
【図２】
2006223166.tif 000005
【図３】
2006223166.tif 000006
【配列表】
2006223166000001.app