(57)【要約】【課題】アレイ作製条件や基板のロットなどの変動要因による影響をほとんど回避され、再現性に非常に優れた精度や信頼性の高いプロファイリングデータを得る手法を得る。【解決手段】複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によりキレート化合物を用いてプロテインキナーゼ活性を解析する方法であって、該アレイ上に予めリン酸化されたペプチドが１種以上固定化されてなり、かつアレイ上のリン酸化反応後における固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と該予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度の比の値を算出して対比することを特徴とするプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によりプロテインキナーゼ活性を解析する方法であって、リン酸化の検出に際してはリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させる方法であり、かつ該アレイ上に予めリン酸化されたペプチドが１種以上固定化されてなり、かつアレイ上のリン酸化反応後における固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と該予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度の比の値を算出して対比することを特徴とするプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項２】
予めリン酸化された同じペプチドが、２箇所以上に固定化されたアレイを用いることを特徴とする請求項１に記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項３】
リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項４】
レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項５】
レセプターにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項６】
リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項７】
キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項８】
キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項９】
キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【化１】
2006223187.tif 000006
【請求項１０】
ペプチドがチオール基を介して固定化されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項１１】
固定化されるペプチドの種類が２４種以上であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項１２】
固定化されるペプチドの種類が４８種以上であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【請求項１３】
固定化されるペプチドの種類が９６種以上であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による解析手法により、プロテインキナーゼ活性を網羅的に解析する方法に関する。より詳細には、内部標準として予めリン酸化された基質内部標準として用いてシグナル比を算出することにより、ある程度定量的なプロテインキナーゼ活性に関するプロファイリングを実現するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
こうしたバイオチップを用いた解析技術は、プロテオミクスにおける解析手段・ツールとして広く用いられている。例えば、蛋白質の翻訳後修飾、特に蛋白質のリン酸化に関するネットワークの解析は、細胞において営まれる生命現象を理解する上で重要である。そのためには、リン酸化修飾による活性調節、機能調節を含めて網羅的に詳細に解析する手段が求められている。近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、増殖因子やサイトカインにより活性化した細胞表面の受容体からどのように核へシグナルが伝達されるかはもとより、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生死などを制御する様々なシグナル伝達経路の実態が明らかになってきた。これらのシグナル伝達経路は独立して機能しているのではなく、互いにクロストークしあうことによってシステムとして機能している。そして、癌をはじめ色々な疾病の原因がこれらのシグナル伝達経路の異常として説明されるようになってきた。
【０００４】
上述したシグナル伝達経路においては、様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析して、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待される。しかしながら、これまでには簡便で効率よく種々のプロテインキナーゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術は、未だ十分なレベルのものが確立されていないのが現状である。ましてや、アレイ上におけるリン酸化におけるプロファイリング結果を定量的な観点から考察できるような技術なに関しては、ほとんど実現されていないのが現状である。
【０００５】
既に報告されている関連技術としては、例えばペプチドアレイを用いてチロシンキナーゼの一種であるｃＳｒｃキナーゼの活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ｐ６０チロシンキナーゼやプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡとも示す。）などに関して、おのおのの基質ペプチドをガラススライドに固定化したアレイを用いて、蛍光標識された抗体を用いたリン酸化反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献２及び３参照）や、あるいは放射性物質（［γ３２Ｐ］ＡＴＰ）を用いたアレイ上でのキナーゼ反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献４，５及び６参照）がある。しかしながら、いずれの先行技術においても種々のプロテインキナーゼの動態を同時に効率的にプロファイリングための方法としては、十分な技術が開示されているものではない。また上記いずれの方法においても、蛍光性物質や放射性物質を用いる必要があり、解析に手間を要する点や、取り扱いの困難性、特殊な技術や施設の必要性などの点で大きな問題がある。
【０００６】
また、上述したようなリン酸化に関するプロファイリングに際しては、その目的に応じて定性的なレベルのみならず定量的な視点からも評価する必要性が生ずる場合もある。しかしながら、アレイ化した場合の個々の基質がそれぞれどの程度のリン酸化を受けているのかを同時に定量化することは非常に困難な技術であり、これまで報告されている技術においてはほとんど実現されていない。
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２０巻、第２７０〜２７４頁（２００２年発行）
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第１２巻、第２０８５〜２０８８頁（２００２年発行）
【非特許文献３】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第１２巻、第２０７９〜２０８３頁（２００２年発行）
【非特許文献４】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第１３巻、第３１５〜３２０頁（２００２年発行）
【非特許文献５】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２７７巻、第２７８３９〜２７８４９頁（２００２年発行）
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８９巻、第１７６０〜１７６３頁（２０００年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、アレイ上において得られたリン酸化によるシグナル強度から、簡単な演算処理を行うことによりその反応効率を定量化して、プロファイリング結果の解析データを明瞭化するための有用な手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
１．複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によりプロテインキナーゼ活性を解析する方法であって、リン酸化の検出に際してはリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させる方法であり、かつ該アレイ上に予めリン酸化されたペプチドが１種以上固定化されてなり、かつアレイ上のリン酸化反応後における固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と該予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度の比の値を算出して対比することを特徴とするプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
２．予めリン酸化された同じペプチドが、２箇所以上に固定化されたアレイを用いることを特徴とする１のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
３．リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする１又は２のプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
４．レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする１〜３のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
５．レセプターにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００であることを特徴とする１〜４のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
６．リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする１〜５のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
７．キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする１〜６のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
８．キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることを特徴とする１〜７のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
９．キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いることを特徴とする１〜８のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【化１】
2006223187.tif 000002
１０．ペプチドがチオール基を介して固定化されていることを特徴とする１〜９のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
１１．固定化されるペプチドの種類が２４種以上であることを特徴とする１〜１０のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
１２．固定化されるペプチドの種類が４８種以上であることを特徴とする１〜１１のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
１３．固定化されるペプチドの種類が９６種以上であることを特徴とする１〜１２のいずれかのプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明におけるプロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法は、アレイ上のリン酸化反応後における固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と該予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度の比の値を算出して対比する
ことにより、特にアレイの作製ロットや測定回数によって、ＳＰＲシグナル強度の絶対値がばらつくことから定量性がやや見劣るという問題を解決することができ、明瞭でかつ効果的なプロファイリング解析に関する結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明におけるペプチドの基板上への固定化方法は特に限定されるものではないが、例えばチオール基を介してペプチドを固定化する方法が挙げられる。ここで用いられるペプチドとは一般的に用いられる意味のものが例示されるが、高分子量の蛋白質であってもよい。アミノ酸残基が２個以上ペプチド結合により連結されたものであって、プロテインキナーゼの基質として機能しうる性質を有するものをいう。その基質配列部位のアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。
【００１２】
ここで、基板に固定化される部位においては、具体的には例えば固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在する状態のものをいう。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。また、別な態様として、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものも挙げられる。この場合に該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１３】
上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物があらかじめ挿入されていることが好ましい。親水性化合物の分子量は特に限定されないが、１００〜１０００程度が好ましく、４００〜１０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が２〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる配列が例示される。
【００１４】
上述したようなチオール基を介してペプチドを固定化するに際しては、予め基板表面にアミノ基を導入させて、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いてマレイミド表面を形成させて反応させる方法が推奨される。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。こうしたヘテロ二官能型架橋剤としては、種々市販されているものもあり、特に限定されるものではないが、例えばＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくはＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）などを挙げることができる。またこれらの化合物と完全に同一構造のものでなくても、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物も適用することが可能である。ＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。また、その他にも、ＰＥＧのような高分子の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するものも用いることができる。
【００１５】
ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、上述のような固定化方法は非常に効果的である。
【００１６】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧの誘導体が好適に用いられる。
【００１７】
ＳＰＲにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００１８】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００１９】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００２０】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２１】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２２】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２３】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２４】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２５】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２６】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２７】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。
【００２８】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドが複数種固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のキナーゼを含有する溶液を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰを本発明のアレイ上に適用して行うことができる。最適なリン酸化反応条件はプロテインキナーゼの種類に応じて変動するが、例えば、バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。リン酸化反応は、アレイ上にプロテインキナーゼを含む、あるいは含むと推定される液をドロップしてインキュベーションして行ってもよいし、あるいはポンプのような送液手段を用いて、アレイをＳＰＲ装置にセットしながら行ってもよい。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋リン脂質などのリン酸化を補助する物質を共存させるのがよい。リン酸化の検出に際しては、直接リンの取り込みを確認してもよいし、あるいはリン酸化アミノ酸を認識する抗体や、リン酸基に対して特異的な結合性を有する物質などを作用させることにより検出してもよい。
【００２９】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できる。
【００３０】
本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を感度よくモニターするため、リガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させるものである。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が、亜鉛、鉄、コバルト、パラジウム、ジルコニウムのような金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３１】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３２】
【化２】
2006223187.tif 000003
【００３３】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ２Ｌ）は、市販の１，３−ビス[ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ２Ｌ−ＣＨ３ＣＯＯ−・２ＣｌＯ４−・Ｈ２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００３４】
本発明に用いられるリガンドとレセプターは、お互いを特異的に認識し結合できる関係にあるものが選択されるのがよい。リガンドとレセプターの例としては、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ステロイドホルモンとステロイドホルモンレセプター、核酸と転写因子、一本鎖核酸配列とその一本鎖核酸配列に相補的な配列を有する一本鎖核酸配列などがあげられる。なかでも、リガンドとしてビオチン、レセプターとしてアビジンもしくはストレプトアビジンを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明においては、上述のようなポリアミン亜鉛錯体が、例えばビオチンのようなリガンドにより修飾されたものを用いることを特徴とする。なお、リガンドとはビオチンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンや核酸などであってもよい。直鎖状のリンカー構造を介してビオチン修飾されていることが好ましい。そして、その分子量としては５００〜１０００の範囲であり、より好ましくは６００〜９００、更に好ましくは７００〜９００である。具体的には、式（ＩＩ）に示されるような構造のものが例示されるが、特に限定されるものではない。ビオチン修飾されたポリアミン亜鉛錯体の分子量が１０００を超えると、安定性も悪くなり、リン酸への結合効率の点からも好ましくない。
【００３６】
【化３】
2006223187.tif 000004
【００３７】
なお、本発明において作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。
【００３８】
本発明においては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させるだけでもリン酸化を検出することは可能な場合もあるが、特にビオチンが修飾されたものを用いることにより、その後更に、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンのようなレセプターを作用させることにより、その検出感度がより高まるという効果を期待することができる。なお、レセプターとは、アビジンもしくはストレプトアビジンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンレセプターや転写因子や核酸などであってもよい。ストレプトアビジンを作用させる方がより好ましい。作用させるアビジンもしくはストレプトアビジンの濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の場合と同様である。
【００３９】
更に好ましい態様として、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後に、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体いずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。アレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンの場合と同様である。
【００４０】
また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。
【００４１】
こうしたキレート性化合物の適用は、特に従来から用いられてきた抗体と比べると非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。
【００４２】
本発明において用いられるアレイ上には、できる限り多種類のアミノ酸配列からなる基質ペプチドが固定化されている方が好ましい。その数は特に限定されるものではないが、２４種以上が好ましく、より好ましくは４８種以上、更に好ましくは９６種以上である。勿論、数百から数千種以上であってもよい。
【００４３】
本発明のプロファイリング方法においては、該アレイ上に予めリン酸化されたペプチドが１種以上固定化されてなり、かつアレイ上のリン酸化反応後における固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と該予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度の比の値を算出して対比することを特徴とする。予めリン酸化されたペプチドは特に限定されるものではなく、１種であっても複数種であってもよい。また１箇所のみであっても、複数箇所であっても構わないが、好適には複数箇所にできるだけランダムな配置に固定化されている形が挙げられる。その場合、全てのリン酸化された基質におけるシグナル強度を平均した値を用いるのが好ましい。より好ましい態様としては、作用させるプロテインキナーゼによりある程度は確実にリン酸化を受けることが予め既知であるようなアミノ酸配列でリン酸化部位が予めリン酸化されたペプチドを用いることが考えられる。リン酸化部位は、セリン、スレオニンもしくはチロシン残基である。
【００４４】
リン酸化反応後のＳＰＲ解析を行った後、固定化された各種ペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度と上述した予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度との比を算出して、その値を比較する。市販されているソフトウェアなどを用いることにより、容易に演算処理を行うことが可能である。このように、予めリン酸化されたペプチドにおけるＳＰＲシグナル強度との比を用いることにより、アレイの作製ロットや測定の日間差などによるシグナル強度のばらつくという定量化に際した大きな問題点を解決することができる。このような計算処理を行ってプロファイリングすることにより、アレイ作製条件や基板のロットなどの変動要因による影響をほとんど受けることがなく、再現性に非常に優れた精度や信頼性の高いプロファイリングデータを得ることができるものである。その結果、リン酸化効率に関する定量的な観点での議論を可能とすることができる。また、基質間でのリン酸化率の対比が容易かつ明確になることから、例えば既知の基質と対比してより優れた基質のスクリーニング、選抜を行う場合においても有用な手法である。また、この理論に基づき、リン酸化に関するプロファイリングデータを整理、解析するためのソフトウェアの開発も可能である。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
【００４７】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００４８】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００４９】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに室温で１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応して、ＭＡＬ基は未反応のまま残り表面に導入することができた。
【００５０】
上記のようにして得られた表面に、配列表に示された１７１種類のペプチドをスポットして固定化を行った。１７１種の基質の中には、既知のＰＫＡ基質（配列番号６９），ＰＫＣ基質（配列番号７０）及びｃＳｒｃキナーゼ基質２種（配列番号７１，７２）の４つの対照ペプチドを含んでいる。図１に示したように、２枚のアレイに分けて固定化を行った。Ｎｏ．１、Ｎｏ．２のアレイともに、図に示したような８箇所に、上記配列番号６９のＰＫＡ基質において予めセリンがリン酸化されたペプチドを内部標準として固定化している。また、いずれのペプチドに関しても、末端にシステイン残基が付加されており、システイン残基と基質配列の間にグリシン２残基のスペーサー配列が存在している。
【００５１】
上記ペプチドは全てリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌに溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒスポッター（東洋紡績製）を用いて、ペプチド溶液を１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００５２】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で３０分間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００５３】
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡによるリン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイを用いて、ＰＫＡによるｏｎ−ｃｈｉｐでリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で４時間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製；８０Ｕ／μｌ）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ４μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（ＩＩ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇＴＭＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所より購入）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇＴＭＢＴＬ−１０４は２５μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。作用は室温で１時間行った。
【００５４】
【化４】
2006223187.tif 000005
【００５５】
上記作用させたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒＴＭ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、上記と同じ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ランニングバッファーをプランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、ストレプトアビジン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製）を同緩衝液に溶解して１０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製して、送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行い、更に２μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン抗体溶液を同様に調整して作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
【００５６】
（観察の結果と考察）
ＳＰＲイメージングを行った結果を図２に示した。ＳＰＲ解析に際してＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアとしてＳｃｉｏｎ   Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ.製）を用いて引き算処理を行った結果である。内部標準である８箇所のリン酸化ＰＫＡ基質に対して、強い抗体結合シグナルの上昇を確認されている。また、対照である配列番号６９のＰＫＡ基質に関しては、２枚のアレイともにリン酸化シグナルを確認することができている。
【００５７】
また、各アレイにおける上述した８箇所のリン酸化されたＰＫＡ基質における抗体作用後のＳＰＲシグナルの上昇分を平均し、その平均値と、各々の固定化ペプチドにおけるＳＰＲシグナルの上昇分との比を算出した。その結果をグラフ化した結果を図３に示した。いくつかの基質において、従来からＰＫＡの基質として広く知られているＫｅｍｐｔｉｄｅ基質（配列番号６９）と対比しても、かなり強いシグナルを示していることが確認されており、これらは有用な基質であると考えられる。
【００５８】
［実施例２］
実施例１と同じアレイを用いて、ブロッキング処理までの工程を同様に行った後、ｏｎ−ｃｈｉｐでのＰＫＣβＩによるリン酸化を行った。反応は３０℃で１時間行った。反応液組成は、ＰＫＣβＩ（シグマ製）を実施例１の場合と同じバッファー組成に対して、更に０．１ｍＭ濃度の塩化カルシウム、８μｇ／ｍＬ濃度のホスファチジルセリン（シグマ製）、０．８μｇ／ｍＬ濃度のジアシルグリセロール（シグマ製）を添加した。リン酸化反応後のアレイを用いて、実施例１と同様の操作により亜鉛キレート化合物及びストレプトアビジン、ストレプトアビジン抗体反応によるＳＰＲイメージングを行った結果を図４に示した。更に同様のプロファイリング解析を行った結果を図５に示した。
【００５９】
図４、図５より、いくつかの基質において、かなり強いシグナルを示しているものが認められる。ＰＫＡによるリン酸化反応を施した場合と比べると、リン酸化のパターンは大きく相違していることが確認されている。特に本発明における解析を行った図３と図５とで対比するとその差異はより明瞭であることが分かる。また、この結果に関する再現性に関しても、非常に良好であることが確認できている。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の方法により、アレイ作製条件や基板のロットなどの変動要因による影響をほとんど回避され、定量的な観点からもリン酸化パターンに関して再現性に非常に優れた精度や信頼性の高いプロファイリングデータを得ることができるものである。この理論に基づいたリン酸化パターンを得ることにより、今後創薬のスクリーニングをはじめ様々な産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１及び実施例２において、作製したＳＰＲ用アレイにおける基質ペプチドの固定化位置を示す図である。
【図２】実施例１において、ＰＫＡによるｏｎ−ｃｈｉｐリン酸化反応に関するＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図３】実施例１において、ＰＫＡによるｏｎ−ｃｈｉｐリン酸化反応に関して、本願発明の方法によるプロファイリング解析処理を行った結果を示す図である。
【図４】実施例２において、ＰＫＣβＩによるｏｎ−ｃｈｉｐリン酸化反応に関するＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図５】実施例２において、ＰＫＣβＩによるｏｎ−ｃｈｉｐリン酸化反応に関して、本願発明の方法によるプロファイリング解析処理を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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