(57)【要約】【課題】原料に加熱殺菌を施さずに培地として用いることで従来問題となっていた原料培地中の有効成分分解や発酵阻害物質生成を回避すると同時に発酵の高度な集中管理と殺菌設備を不要とする乳酸液の製造法などにおいて，従来よりも高い生産性でしかも光学純度高くL-乳酸を生産するＬ−乳酸生産菌とそれを使用したＬ−乳酸液製造方法の開発。【解決手段】新規に分離，同定された耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7を好熱性Ｌ乳酸生産菌とし、これを用い，糖質とその他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料を，50〜60℃，ｐH5.8〜6.5において殺菌することなく直接培養基として発酵するＬ−乳酸液製造方法である。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
16S リボゾーマルRNA遺伝子の部分配列が
GCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCT
である耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7からなることを特徴とするL-乳酸生産菌。
【請求項２】
耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7を用い，糖質とその他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料を，50〜60℃，ｐH5.8〜6.5において殺菌することなく直接培養基として発酵することを特徴とするL-乳酸液製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規に分離され，高い生産性によって未利用有機廃棄物からのＬ−乳酸発酵生産に利用しうる耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7と同定されたL-乳酸生産菌とこれを用いてＬ−乳酸液を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は種々の食品添加物や工業用原料として重要な物質である。特に乳酸を化学的に重合することで得られる高分子ポリ乳酸はバイオマス由来プラスチック素材として近年大きく注目されている。３炭素化合物である乳酸の２位の炭素はメチル基、水酸基、カルボキシル基と結合する不斉炭素であり、その立体配座からＤ−乳酸およびＬ−乳酸の２種類の光学異性体（鏡像異性体）が存在する。世界的には現在、全生産量の90％が発酵法により、残り10％が化学的合成法により生産されている。
【０００３】
発酵法による乳酸生産では、グルコースや可溶性デンプンなどの炭素源と共にアミノ酸、ビタミン、無機質などを含む生産用培地を調製し、１２０℃以上の加熱・加圧と、密閉系による無菌的操作と培養が可能な装置を用い、１２０℃、２気圧で２０分間保つことで殺菌を施した後、乳酸生産菌を無菌的に植菌し、主に３０〜３７℃で発酵が行なわれていた。
【０００４】
発酵菌として使用される微生物には、Ｌ−乳酸を主に生成する多くのラクトバチルス属の常温細菌（Lactobacillus rhamnosus，Lactococcus lactisなど）や、カビの一種Rhizopus oryzaeなどが用いられる事が総説にまとめられている（非特許文献１、非特許文献２）。また、Bacillus属の細菌を用いることによるＬ−乳酸の生産方法に関してBacillus coagulansJCM2257,Bacillus cereusJCM2152,Bacillus subtilisJCM1465,及び昆虫毒素などを生産するBacillus thuringiensis,Bacillus larvae,Bacillus lentimorbus,Bacillus popilliae,Bacillus shphaericusなどの微生物に関して特許が取得されている（特許文献１）。これとは別に、Bacillus coagulansを用いて膜分離を行いながら50℃にて連続的に乳酸を生産する方法が特許化されている（特許文献２）。これらの方法により光学純度[（Ｌ−乳酸 - Ｄ−乳酸）/（Ｌ−乳酸 ＋ Ｄ−乳酸）×100(％)]が約90〜98％の乳酸が生産されていた。
【０００５】
１９９０年頃より再生可能なバイオマス原料から得られ、生分解性を有するプラスチックとしてポリ乳酸が注目され、その生産量は年々増加している。ポリ乳酸はＬ−またはＤ−乳酸あるいはそれらの混合物を脱水重合して得られるが、原料の光学活性が高い乳酸と光学活性が低い乳酸で、前者からは結晶性が高く堅いプラスチックが、後者からは結晶性が低く解けやすいポリ乳酸が得られる。例えば堅さが要求されるエンジニアリングプラスチックなどではポリＬ−乳酸が主に用いられている。即ち光学純度の異なる乳酸はポリ乳酸プラスチックに求められる物性に応じた原料として使い分けられる。
【０００６】
一方、アセトニトリルを出発原料とする化学合成法では光学純度０%のＬ乳酸とＤ乳酸の混合物即ちラセミ乳酸が得られている。また、前述の総説にはＤ−，Ｌ−乳酸を生成するLactobacillus helveticus,Lactobacillus aminovorusによるラセミ乳酸の発酵生産の例も報告されている。ラセミ乳酸やそのエステルなどは食品添加物として用いられるが、このような用途では光学純度の高低はその効能と無関係である。
【０００７】
前記発酵法による乳酸液の製造においては、これまで均質に溶解可能な成分を適量混合溶解した後，高圧蒸気殺菌した培地で行われていた。しかしながら、乳酸菌やカビの増殖に必要な糖質、アミノ酸、ビタミンなどは高温処理に対して不安定で分解しやすく、それらが共存するとさらに分解反応が促進される。また、廃液の着色の原因となる褐変物質や発酵を阻害するフルフラールなどの望ましくない物質がこの殺菌工程で生じる。
従来のように、糖質、タンパク分解物、アミノ酸、ビタミンなど培養の各原料が純度高く精製されている場合にはそれぞれを個別に高圧蒸気滅菌した後混和する、あるいは熱を加えない濾過滅菌によって除菌する方法をとることで前述のような望ましくない分解を避けることができるが、その場合には前もって原料を精製する必要があり、また殺菌操作が煩雑で必要な設備も増加する。さらに、生ゴミや農産バイオマスなどのように必要な成分がその中に混在する原料を直接の発酵基質とする場合にはこのような個別の殺菌は不可能である。加えて、半固形あるいは懸濁物の形態をしているバイオマスでは上記のような濾過滅菌は適用できない。
【０００８】
これに対し、製造のための経済性を改善する試みとして、設備費や殺菌エネルギーを必要としない生ゴミの開放系発酵についても検討されている。粉砕した半固形生ゴミのpＨを間欠的に中和しながら保温すること（ｐＨ振幅変動制御）によって、特に乳酸生産微生物を植菌しない場合でも乳酸が高収率で高選択的(＞９５％・全有機酸)に蓄積する事が申請者らにより見いだされている（非特許文献３）。
【０００９】
これに関連して、糖質を高く含有すると共にその他の栄養成分を同時に含有する等、内容物が複雑で、雑菌、自然乳酸菌が多数生存している生ゴミや農産バイオマスを原料として、設備、エネルギーコストがかからず、かつ高圧蒸気滅菌などによる栄養成分の分解や発酵阻害物質の生成が回避できる非殺菌開放系で、Ｄ−，Ｌ−乳酸（Lactobacillus plantarum）生産菌あるいはＬ−乳酸（Bacillus coagulans）生産菌の選択的増殖を制御することで、廉価でかつ用途に応じた光学純度の乳酸を高収率で生産する方法が申請者らにより現在公開されている（特許文献３）。しかしながら，本法においてB.coagulansを用いた場合の５０℃における生産性は0.9g/l・hと低かった。
【００１０】
【非特許文献１】J.H.Litchfield著「Microbiological production of lactic acid」Advances in Applied Microbiology 42巻45-95頁１９９６年
【非特許文献２】K.Hofvendahl,B.H-Hagerdal著「Factors affecting thefermentativelacticacidproductionfromrenewableresources」EnzymeandMicrobialTechnology２６巻８７−１０７頁２０００年26:87-107(2000).
【非特許文献３】K.Sakai,M.Yoshihiro,H.Yamazumi,Y.Tau,M.Mori,M.Moriguchi,Y.Shirai著「SelectiveProliferationofLacticAcidBacteriaAndAccumulationofLacticAcidduringOpenFermentationofKitchenRefusewithIntermittentpHAdjustment.」FoodScienceandTechnologyResearch６巻１４０−１４５頁２０００年
【特許文献１】H.Ohara,M.Yahata,USPatent5801025１９９６年MethodforproducingL-lacticacidwithhighopticalpurityusingbacillusstrains(JP7-280660,JP-280661)
【特許文献２】VanNispen,JoannesG.M.,Jonker,Ronald,USPatent5002881１９８９年Processforthefermentativepreparationoforganicacids.
【特許文献３】酒井謙二，江崎豊，白井義人，特願2003-306871（２００３年）乳酸液の製造方法
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明の解決しようとする課題は，原料に加熱殺菌を施さずに培地として用いることで従来問題となっていた原料培地中の有効成分分解や発酵阻害物質生成を回避すると同時に発酵の高度な集中管理と殺菌設備を不要とする乳酸液の製造法などにおいて，従来よりも高い生産性でしかも光学純度高くL-乳酸を生産する乳酸生産菌とそれを使用したＬ−乳酸液製造方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであり，それは次の(1)と(2)のとうりである。
(1).16SリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列が
GCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCT
である耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7すなわち本発明者が新規に分離，同定した好熱性Ｌ−乳酸生産菌BacilluslicheniformisTY7からなることを特徴とするＬ−乳酸生産菌。
(2).耐熱性微生物BacilluslicheniformisTY7を用い，糖質とその他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料を，50〜60℃，ｐH5.8〜6.5において殺菌することなく直接培養基として発酵することを特徴とするＬ−乳酸液製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の乳酸生産菌と乳酸液製造方法は、食品生ゴミや農産物あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの、糖質と共に多くの栄養成分を高く含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さない無殺菌の状態で，新規に分離された前記Ｌ−乳酸生産菌BacilluslicheniformisTY7を一定量植菌し、所定のｐＨを保ちながら50〜60℃の温度で加温することでＬ-乳酸の光学純度が96％の発酵液を従来より高い生産性（2.5g/l/h）で得ることができるものである。
これにより従来４-5日であった発酵期間が２日程度と短縮され，設備の小型化や使用エネルギーの低減によりさらに環境負荷が低減された工程となり，バイオマス廃棄物の処理コストを省略することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明を実施するための最良の形態は、生ゴミや農産廃棄物の破砕懸濁物、あるいはその搾汁液さらにはこれをアミラーゼなどで糖化処理した糖化液などの糖質と共に他の栄養成分を含有するバイオマス原料を、高圧蒸気滅菌などの殺菌を施さずに培養基として用い、この培養基に新規に分離されたＬ−乳酸生産菌BacilluslicheniformisTY7をを105〜107となるように植菌し、アルカリ剤を連続的に添加してｐＨをｐH5.8〜6.5に、好ましくはｐＨ６.０に調整しながら５０〜６５℃、好ましくは５０℃に保つことで生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、かつ９％以上の高い光学純度のＬ-乳酸液を製造する方法である。
【００１５】
即ち本発明は、上記の手段により無殺菌の該バイオマス原料から生成有機酸当たりの乳酸割合が高く、かつ９０%以上の高い光学純度のＬ−乳酸液が効率よく生産できる効果を得る。
【００１６】
これらの手段と効果は、図１〜図３に示す新規Ｌ乳酸生産菌TY-7の同定と培養実験により得た新知見によってもたらされたものである。
TY-7は長さ２．１-３．８マイクロメーター，幅０．６〜０．８マイクロメーターのグラム陽性桿菌であり，内生胞子を形成した。また，カタラーゼ活性及びV-Pテストは陽性であった。以上はBacillus属に属する細菌の性質とよく一致した。
表１には本菌が利用して酸を生成可能な糖質の種類を示す。日本ビオメリューの提供するAPI50CHB陽性率表における比較から，本分離菌が99.9％の同定確率でBacilluslicheniformisであることがわかった。また，バイオマス中の重要な糖質類として，グリセロール，ガラクトース，グルコース，フルクトース，セロビオース，マルトース，スクロース，トレハロース，ラフィノース，スターチ，グリコーゲンなどを利用することが分かった。
【００１７】
【表１】
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表２には本分離菌の16SリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列（１２０３ｂｐ）の分析結果を示した。これにより本分離菌の16SリボゾーマルRNA遺伝子の部分配列はBacilluslicheniformisstr.B-6-4Jと100%相同であることが分かったのである。
以上のことから本分離菌TY-7はBacilluslicheniformisと命名されるべきであることが示された。
【００１８】
【表２】
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図１のグラフには、各pHに調整したMRS培地（１Ｌ中にグルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス８ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、酵母エキス４ｇ、リン酸２カリウム２ｇ、クエン酸三アンモニウム２ｇ、硫酸マグネシウム０.２ｇ、硫酸マンガン０.０５ｇ、ソルビタンモノオレエート１ｍｌを含む）を用いて新規Ｌ乳酸生産菌（BacilluslicheniformisTY-7）を静置培養した際の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、本菌の最適ｐＨが６．0であり、生育可能ｐＨ範囲が５．０〜6．０付近であることが判明したのである。
図２のグラフには、pH６.２に調整したMRS培地中で，温度勾配培養装置を用いて各種温度で新規Ｌ−乳酸生産菌（BacilluslicheniformisTY-7）を静置培養した際の、その培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示す。
これにより、本菌の生育上限温度が、６０℃前後であることが判明したのである。
図３のグラフには、非殺菌実生ゴミ糖化液を５０℃でpHを一定に保ってＬ−乳酸生産菌（BacilluslicheniformisTY-7）を植菌した場合の発酵時間と生成した有機酸、全乳酸、Ｄ及びＬ乳酸量との関係を示すものである。これにより約４３g/lの可溶性糖質（内グルコース３０g/lを含む）と共に不溶性の基質を含む原料から、およそ４２g/lのＬ乳酸が９７%以上の光学純度で生成し、この際、最大生産性は２．５g/l/hであり，Ｄ−乳酸及び酢酸の生成がほとんど見られないことが判明した。
【実施例１】
【００１９】
非殺菌生ごみの開放系乳酸発酵は、糖質その他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料として、商業施設から回収した生ゴミに２０％（V/W）の水とグルコアミラーゼ（最終濃度0.03％）を加えて５０℃にて８時間回転撹拌した後、100ｍｍ２メッシュの篩にて得られた濾液（：実生ごみ糖化液）を用い、全容2L小型多目的培養装置、pH計測器及び6打点式記録計（ABLE製）で行った。
前述のMRS液体培地5mlに、新規L乳酸生産菌（BacilluslicheniformisTY-7）を24hr、50℃で静置培養し、洗菌、集菌した菌液100μlを標準生ごみ30mlに添加し、50℃で、24hr静置培養した。その30mlを、全容2L小型多目的培養装置に殺菌を施さずに加えた1.5Lの前記実生ごみ糖化液に入れ、10%NH3でpH6.0の一定制御のもと、６０ｒｐｍで回転撹拌しながら５０℃に保った。
その結果、有機酸当たりの乳酸比率が100％と高く、かつ97％の高い光学純度の乳酸液を得ることができた。
【００２０】
表３には従来用いられていたBacilluscoagulansと新規分離菌BacilluslichemiformisTY-7の標準生ゴミ糖化液の発酵結果を比較した。その結果対グルコース収率，対糖収率，光学純度，L-乳酸選択性，などはBacilluscoagulansとほぼ同等であるのに対し，最大生産性は２．８倍に達することがわかったのである。
【００２１】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００２２】
これにより生ゴミや農産物など常温の腐敗性微生物が生息するにもかかわらず、乳酸発酵のための糖質や微生物の増殖に必要な栄養物が混在して高圧蒸気滅菌などによる分解が避けられないバイオマスから、低設備費、低エネルギーで望まれる光学純度を示す乳酸を高収率且つ高生産性で得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明におけるBacilluslicheniformisTY-7の、培養時の初発ｐＨと生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図２】本発明におけるBacilluslicheniformisTY-7の、培養時の温度と生育度（６１０ｎｍにおける濁度）の関係を示すグラフ。
【図３】本発明における非殺菌実生ゴミ糖化液を５０℃でpHを一定に保ってBacilluslicheniformisTY-7を植菌した場合の発酵時間と生成した有機酸、全乳酸、Ｄ及びＬ乳酸量との関係を示すグラフ。
【符号の説明】
【００２４】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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