(57)【要約】【課題】  本発明は、改変狂犬病ウイルスを用いて、神経回路に選択的に外来遺伝子を神経細胞に導入するためのウイルスベクター、及びその製造方法を提供する【解決手段】狂犬病ウイルスベクターのゲノムに二種以上の改変を適用する。まず、ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子を組換え、次に、ウイルスベクターのゲノム内に於いて外来遺伝子の位置をゲノム先端から最初の遺伝子または二番目の遺伝子となるように組換えを行う。更に、外来遺伝子挿入部位に複数の遺伝子を挿入できるように組換えを行うことにより作製されたウイルスベクターは、神経回路を利用して特定のニューロンに選択的に遺伝子を十分量導入できる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
狂犬病ウイルスベクターのゲノムにおいて、ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子の組換えと、ウイルスベクターのゲノム内に於いて外来遺伝子の位置がゲノム先端付近となるような組換えと、外来遺伝子挿入部位に複数の遺伝子を挿入できるような組換えを行ったことを特徴とする外来遺伝子導入ベクター。
【請求項２】
前記ゲノム先端付近は、ゲノム先端から最初の遺伝子または二番目の遺伝子の位置であることを特徴とする請求項１記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項３】
前記ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子を組換えは、ワクチン株を母体としたウイルスベクターのGタンパク質をCVS株のものに置き換えたことを特徴とする請求項１記載の外来遺伝子導入ベクター。  
【請求項４】
狂犬病ウイルスベクターにおいて、まず、ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子を組換え、次に、ウイルスベクターのゲノム内に於いて外来遺伝子の位置をゲノム先端付近となるように組換えを行い、更に、外来遺伝子挿入部位に複数の遺伝子を挿入できるように組換えを行うことを特徴とする外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項５】
前記ゲノム先端付近は、ゲノム先端から最初の遺伝子または二番目の遺伝子の位置であることを特徴とする請求項４記載の外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項６】
前記ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子を組換えは、ワクチン株を母体としたウイルスベクターのGタンパク質をCVS株のものに置き換えたことを特徴とする請求項４記載の外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項７】
前記外来遺伝子挿入部位は、N遺伝子とP遺伝子の間に作製したことを特徴とする請求項４記載の外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項８】
前記外来遺伝子挿入部位は、N遺伝子の前に作製したことを特徴とする請求項４記載の外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項９】
前記外来遺伝子挿入部位は、二つ以上の遺伝子を挿入することが可能なよう外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製したことを特徴とする請求項４記載の外来遺伝子導入ベクターの製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターを用い、外来遺伝子を神経回路上で同一の役割を果たす特定のニューロン集団にのみ高効率に発現させることを特徴とする外来遺伝子発現手法。
【請求項１１】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターを用い、ニューロン集団に神経投射を送っているニューロン集団にも外来遺伝子の発現を可能とし、ある機能を担う特定の神経回路に選択的に外来遺伝子を導入することを特徴とする外来遺伝子発現手法。
【請求項１２】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターにマーカー遺伝子を挿入することで、経シナプス性神経回路トレーサーとして用いることを特徴とする経シナプス性神経回路トレーサー手法。
【請求項１３】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターに細胞内生理的環境モニター遺伝子を挿入することで、特定の神経細胞集団の活動のみをモニターする細胞内生理的環境モニター手法。
【請求項１４】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターに機能遺伝子を挿入し、特定の神経細胞集団の活動をモジュレートすることを特徴とする神経細胞集団活動モジュレート手法。
【請求項１５】
請求項１記載の外来遺伝子導入ベクターを用い、神経細胞集団の機能不全が原因で起こる神経疾患に対し、その細胞集団にのみに対応する対処遺伝子を導入することで、疾患の治癒を行うことを特徴とする遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変狂犬病ウイルスを用いて、神経回路に選択的に外来遺伝子を神経細胞に導入するためのウイルスベクター、及びその製造方法に関する。更にそのようなベクターの利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
狂犬病ウイルスはその神経選択性シナプスを介した逆行性感染伝播の特徴から、有用な神経回路トレーサーとして用いられてきている。同ウイルスのこれらの特徴は同時にニューロン特異的な経シナプス性発現ベクターとしての可能性を示唆するものである。しかし、これまで、このようなベクターを作製する技術は開示されてはいない。この原因として、ワクチン株から作製された従来の狂犬病ウイルスベクターが、上記のような感染形態の特徴を示さないことや、従来の狂犬病ウイルスベクターは外来遺伝子の発現量が低く、一般的な外来遺伝子発現ベクターとして用いるには不十分であることなど、複数の要件が挙げられる。従って、神経回路選択的な外来遺伝子導入ベクターを作製するためには、これらの問題を同時に解決することが必要であった。しかしながら、このような試みはこれまで行われていない。
【０００３】
例えば、非特許文献１には狂犬病ウイルスベクターを利用してサイトクロームc遺伝子を脳内に発現させているが、これは単純に脳内で発現させたというだけであり、神経回路を利用して特定のニューロンに選択的に遺伝子を導入することに成功はしていない。
【０００４】
また、サイトクロームcの検出にも成功できておらず、ごく微少量の外来遺伝子しか発現できていないことが分かる。ベクターの感染形態に関しては非特許文献２に、ウイルスの神経選択性の恒常及びウイルスの初期感染が軸索末端からのみ起こるようなベクターの報告があるが、このベクターを用いて十分量の外来遺伝子を発現させることは確認されていない上、神経回路に沿った感染伝播についても記載がない。
【０００５】
ウイルスの発現量に関しては非特許文献３にウイルスゲノム内の外来遺伝子導入部位を変えることにより発現量が増加したとの報告があるが、やはり神経回路を利用して特定のニューロンに選択的に遺伝子を導入することに成功はしていない。    
【非特許文献１】Pulmanausahakul R. et al., J. Virol.75, 10800-10807 (2001).
【非特許文献２】Koyama M. et al., Neurosci. Res. Abst.,S200. (2003)
【非特許文献３】McGettigan JP. et al., J. Virol.77:10889-99 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の技術では上記のように実現できなかった、神経回路を利用して特定のニューロンに選択的に遺伝子を十分量導入できるベクターを提供することを目的としている。又、そのようなベクターを用いて、脳における情報処理を解明したり、神経細胞疾患を遺伝子的に治癒したりすることに利用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく本発明者らは、狂犬病ウイルスベクターのゲノムに二種以上の改変を適用した。まず、ウイルスのスパイクタンパクをコードする遺伝子を組換えた。
【０００８】
次に、ウイルスベクターのゲノム内に於いて外来遺伝子の位置をゲノム先端から最初の遺伝子または二番目の遺伝子となるように組換えを行った。更に、外来遺伝子挿入部位に複数の遺伝子を挿入できるように組換えを行った。
【０００９】
これらの組換えにより作製されたウイルスベクターを外来遺伝子発現能・初期感染の特異性・感染伝播の特異性の点において、神経細胞初代培養への感染実験或いはラット脳内への微小量注入実験により検証した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、外来遺伝子を、神経回路上で同一の役割を果たす特定のいニューロン集団にのみ高効率に発現させることが可能となる。更に、このニューロン集団に神経投射を送っているニューロン集団にも外来遺伝子の発現を可能とし、脳内である機能を担う特定の神経回路に選択的に外来遺伝子を導入することが可能となる。
【００１１】
本発明によって作製されるベクターにマーカー遺伝子を挿入することで、経シナプス性神経回路トレーサーとして用いることが出来る。又、本発明によって作製されるベクターに細胞内生理的環境モニター遺伝子を挿入することで、特定の神経細胞集団の活動のみをモニターすることが可能となる。
【００１２】
同様に、ベクターに機能遺伝子を挿入すれば、特定の神経細胞集団の活動をモジュレートすることが出来る。更にその応用として、ある神経細胞集団の機能不全が原因で起こる神経疾患に対し、その細胞集団にのみ対処遺伝子を導入することで、疾患の治癒を行うような遺伝子治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００１４】
非分節RNAウイルスに属する狂犬病ウイルスには様々な株が存在する。そのうち現在ウイルスベクターとして利用されているのは、ワクチン株と呼ばれる弱毒株であり、本発明で実施形態の一つとして利用したHEP-Fulry株もこれに当てはまる。
【００１５】
一方、ウイルストレーサーとして利用されており、シナプスを介した逆行性感染伝播等の感染形態の特徴が知られているのは、CVS株に代表される固定株である。
【００１６】
狂犬病ウイルスは、それぞれN・P・M・G・Lと呼ばれる５つのタンパク質から構成されているが、このうち感染性に関与するのはGタンパク質と言われている。狂犬病ウイルスGタンパク質はスパイクプロテインとも呼ばれるエンヴェロープタンパクであり、感染の際に標的細胞のリセプターと結合する感染に必須なタンパクであることが知られている。狂犬病ウイルスのエンヴェロープタンパクはGタンパクのみであり、このことからもGタンパク質がウイルスの感染伝播に大きな役割を果たしていることが推察される。
【００１７】
森本らは2001年に、ワクチン株のエンヴェロープタンパク質をCVS株のものに置き換えた組換えウイルス（ベクターでは無い）を作製し、その病原性を解析したところ、組換えウイルスは組換え前に比べ著しく病原性が増加したという結果を得た。この病原性の増加はシナプスを介した感染伝播の能力が備わったことに由来すると考えられる。
【００１８】
そこで、本発明では、まずワクチン株を母体としたウイルスベクターのGタンパク質をCVS株のものに置き換え、シナプスを介した感染伝播の能力を持つウイルスベクターを作製する。具体的には、図１に示すように、ベクターのゲノムをコードするcDNA内のGタンパ
ク質をコードする領域をCVS株のものに置き換える。この組換えにより、シナプスを介した感染伝播の能力を持つ狂犬病ウイルスベクターの作製が可能になる。
【００１９】
さて、従来から、狂犬病ウイルスのベクターはその外来遺伝子挿入領域として、ゲノム上の偽遺伝子部位を利用していた。この理由は、この領域は元々メッセンジャーRNA（mRNA）は転写されるものの、タンパク質へ翻訳されない塩基配列が配置しており、この領域に外来遺伝子を挿入してもウイルスの性状に変化が現れないことが知られていたためである。
【００２０】
狂犬病ウイルスのゲノム内での各遺伝子内の位置は、株間で同一であり、この並びが遺伝子の発現レベルを決めることが知られている。
【００２１】
狂犬病ウイルスは図２に示すようにゲノムの先端（Leader部位）からN・P・M・G・Lの順で遺伝子が並んでおり、偽遺伝子部位はG遺伝子とL遺伝子の間に位置する。各タンパク質の発現量は図２に示されているようにゲノム先端に近い遺伝子の方が多くなっている。
【００２２】
従来までの狂犬病ウイルスベクターの外来遺伝子の発現量が不十分であるのは、この偽遺伝子部位の位置、即ち外来遺伝子挿入部位の位置がゲノム先端から遠すぎることに由来すると考えられる。従って、外来遺伝子挿入部位をゲノム先端に作製することで外来遺伝子の発現量を増やすことが出来る。McGettiganらは実際に、外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製することにより若干の外来遺伝子発現の増加を報告している。
【００２３】
この外来遺伝子挿入部位の操作は、G遺伝子組み換えを行った狂犬病ウイルスベクターにも原理的に応用可能であると考えられる。ただし、McGettiganらの組換えでは、著しい遺伝子発現の増加は見られない上、ゲノムの不安定さを招きウイルスの回収や増加に影響をきたすことが確認されている。
【００２４】
実際に、下記実施例において、McGettiganらと同様の遺伝子組み換えを行ったウイルスベクターにもっとも汎用されると考えられる遺伝子であるGFPを挿入したところ、インビボの脳においては十分な（検出に足る）GFPの蛍光は観察されなかった。又、特定の神経細胞集団にのみ選択的に遺伝子を導入するためにはウイルス液が広範囲に広がることは避けなくてはならず、注入ウイルス液量は最小限に留めたい。
【００２５】
そのため、高力価のウイルス液が必要となるが、この時、外来遺伝子挿入部位の操作によるウイルスの回収や増加効率の現象が問題となる。そこで本発明においては、先述のG遺伝子組み換えを行い感染の特異性を得る狂犬病ウイルスベクターのcDNAに図３に示すように、以下の改変を適用したベクターをそれぞれ作製する。
１、外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製しより遺伝子発現を増強する。
２、外来遺伝子挿入部位をN遺伝子の前に作製しより高い遺伝子発現を得る。
３、二つ以上の遺伝子を挿入することが可能な外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製しより高い遺伝子発現を得る。
【００２６】
更に、これらの組換えの回収には井上らが2003年に発表した狂犬病ウイルスcDNA発現法を改変して用いるが、改変ウイルスにおいてN遺伝子及びP遺伝子の発現量が減少するために、この方法では組換えウイルスの回収効率の非常に低くウイルスが全く得られない問題と、ウイルスの増殖能が低下してしまう問題を解決するため、狂犬病ウイルスNタンパク質及びPタンパク質を同時に恒常発現する神経芽腫細胞株を樹立し、この細胞でウイルスの回収及び増殖を行うことで、高濃度（高力価）のウイルスを得る。
【００２７】
上記までの改変とウイルス回収・増殖操作を全て行うことにより、初めて神経回路に選
択的な感染（つまり軸索末端からの初期感染とシナプスを介した逆行性の感染伝播）と高い外来遺伝子発現能力を併せ持つ、実用的な神経回路選択的外来遺伝子発現ベクターを作製することができる。
【００２８】
このベクターにマーカー遺伝子・細胞内生理的環境モニター遺伝子・細胞内機能遺伝子等を挿入し、脳情報処理の解明や神経疾患の治癒に用いる。
【００２９】
本発明とその効果をより詳細に説明するため、以下に実施例を示す。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例において本発明をより詳細に説明するが、如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
ワクチン株を母体としたウイルスベクターとして、r3.0-HEP株を用いた。この株は井上らが2003年に発表した、日本のヒト用ワクチン株であるHEP-Flury株から作製された組換えウイルスベクターである。このr3.0-HEP株のcDNAのG遺伝子を図１のようにRT-PCR法によりクローニングしたCVS株のG遺伝子のcDNAと置き換えた。この組換えによって起こる感染性の変化を確認するため、図４に示す井上らが2003年に発表した狂犬病ウイルスcDNA発現法を用いて組換えcDNAからウイルスを回収した。
【００３２】
回収されたGタンパク質組換え狂犬病ウイルスr3.0-CVSG株の性状を検証するため、まずNAとBHK・BSRにおける力価の比を求めた。この値はウイルスの病原性と良く相関することが知られており、ウイルス学において神経親和性の指標となる。その結果、図５に示すように、野生株(HEP-Flury)と組換え前のベクター(r3.0-HEP)ではその値がそれぞれ48、103であったのに対し、r3.0-CVSG株では1057と十倍以上の値を取っており、その値は野生型CVS株(wCVS)の値とほぼ同じであった。この結果より、r3.0-CVSG株はその感染においてはCVS株と近い性状を持っていることが確認された。
【００３３】
この実験結果を受けて、実際のニューロンにおける感染動態を調べるため、まず初代神経培養細胞にウイルスを感染させた。ウイルスのニューロンに対する感染特異性を調べたところ、図６に示されるとおりr3.0-CVSG株は野生型CVS株(wCVS)と同様に、ほぼ100%ニューロンのみに感染するということが示された。従って、CVS株の高いニューロン特異的感染能を有していると言える。
【００３４】
上記の結果で、小山らの2003年の報告と同様に、Gタンパク組換え狂犬病ウイルスに感染の特性性の変化が見られたので、次にこの組換えウイルスのcDNAに、図３に示されるように、外来遺伝子挿入部位を作製する改変を３種類行った。
【００３５】
外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製たものをr5.0-CVSG、外来遺伝子挿入部位をN遺伝子の前に作製したものをr4.0-CVSG、二つ以上の遺伝子を挿入することが可能な外来遺伝子挿入部位をN遺伝子とP遺伝子の間に作製したものをr6.0-CVSGと名づけた。
【００３６】
本実施例では、挿入する外来遺伝子として、最も汎用的に遺伝子発現のマーカー遺伝子として用いられているGFPとβ-galという遺伝子を挿入した。GFPは自ら基質無しに蛍光を発する蛍光タンパク質であり、β-galはX-gal基質と反応し青色の反応産物を生成する発色タンパク質である。これらの改変cDNAからウイルスベクターを回収し増幅させるために、神経芽腫細胞株NA細胞から、狂犬病ウイルスNタンパク質及びPタンパク質を同時に恒常発現するNA-NP株を樹立し、この細胞でウイルスの回収及び増殖を行った。
【００３７】
これらのウイルス株は従来の方法では全く回収することが出来なかったが（３回の独立した試行でも回収に失敗した）、NA-NP株を用いることで、回収に成功することが出来た。さらに、ウイルス増殖においてもNA-NP株を用いることで、著しいウイルス増殖効率の増加が見られ、例えば図７に示されるように、普通のNA細胞では殆ど増殖が見られないr4.0-CVSGにおいても良好な増殖を行うことが出来た。
【００３８】
これらの回収した改変ウイルスベクターの評価を以下のように行った。
【００３９】
まず、改変ウイルスベクターを初代神経培養細胞に感染させ、外来遺伝子の発現を見た。図８にGFP発現ウイルスベクターを感染させ、感染二日後にその蛍光を、ウイルスのNタンパク質の抗体染色と共に見た写真を示す。
【００４０】
ここに示されているように、全てのサンプルでウイルスの感染が確認できるが、r3.0-CVSGでは殆どGFPの蛍光は観察されず、その蛍光はr5.0-CVSG、r4.0-CVSGの順で強くなる。
【００４１】
ウイルス感染細胞のうち蛍光が一定強度以上の細胞をカウントしてその比を取ったものが図９である。この解析の結果、r4.0-CVSGはその他の株に比べ非常に強い発現を示し、r5.0-CVSGもr4.0-CVSGには及ばないものの、r3.0-CVSGと比べると発現が増強していることが明らかとなった。
【００４２】
酵素であるためにGFPより検出感度の高いβ-gal発現ウイルスでは、図１０のように、r3.0-CVSGでもラベルが見られるが、r5.0ではその発現はより強く、樹状突起末端までもが可視化あれることが分かる。
【００４３】
次にラット海馬領域にこれらのウイルスベクターを微小量注入し、その発現効率と感染様式を調べた。図１１に見られるように、全てのウイルスにおいて、注入部位に直接投射を行っている領域（図１１の場合は注入部位である海馬歯状回分子層に投射を行っている嗅内皮質や中隔核などの領域になる、代表として嗅内皮質を示す）にウイルスの存在が確認された。このことは同ウイルスベクターが軸索末端から初期感染を行うことを示している。生存期間をより長くすると、これら一次投射領域に直接投射を送るいわば二次投射領域（図１１ではその代表例として梨状皮質錐体細胞が示されている）にウイルスが検出され、これら改変狂犬病ウイルスベクターのシナプスを介した逆行性感染伝播が示された。
【００４４】
外来遺伝子の発現量について調べてみると、GFPを挿入したウイルスベクターの場合、図１２、図１３に示されるように、r3.0-CVSG又はr5.0-CVSGでは、ウイルスの感染は確認できるものの、GFPの発現が非常に低く、その蛍光を検出することが困難なのに対し、r4.0-CVSGやr6.0-CVSGでは非常に強い蛍光が観察された。
【００４５】
図１２は腹側のCA1、図１３は背側のCA3と、打ち込み部位に直接投射を持つ領域が示されているが、これらのウイルスベクターは上記のようにシナプスを介した逆行性感染伝播を行うので（図１１参照）、GFPの蛍光も図１４に示されているように、感染から日数を経るに至り逆行性に伝播していく。又、β-gal発現ウイルスでは図１５、図１６に示されるように、r5.0-CVSGで、打ち込み部位に投射を持つCA3領域（図１５）や外側中隔核（図１６）において、ゴルジ染色のように、突起末端までの非常に強いラベルが観察された。
【００４６】
これらの結果から、本発明の技術を用いることで、神経回路に選択的に外来遺伝子を効率的に導入するウイルスベクターの作製が可能となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本実施例で用いたGFPやβ-gal発現ウイルスはそのまま有用な神経回路トレーシングに利用することが出来る。マーカー遺伝子を複数種用いることが出来るために、従来は不可能であった、狂犬病ウイルスベクターを用いての多重トレーシングが可能となる。又、挿入遺伝子を細胞内環境モニタリング遺伝子や細胞内機能遺伝子とすることで、脳情報処理の解明や神経疾患の治癒に用いることが可能となることは、本実施例の結果から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の技術の一部をなすGタンパク質組換え狂犬病ウイルスベクター作製法の模式図である。
【図２】狂犬病ウイルスのゲノム上の遺伝子の並びと各タンパク質発現量との関係を示した模式図である。
【図３】本発明の技術の一部をなす、高い外来遺伝子発現能と感染の特異性を併せ持つ狂犬病ウイルスベクター作製法の模式図である。
【図４】本発明の実施例で利用する、組換え狂犬病ウイルスをcDNAから回収する方法の模式図である。
【図５】Gタンパク組換えウイルスの神経親和性（NA細胞とBSR細胞とでの力価の比）を示すグラフである。
【図６】Gタンパク組換えウイルスの神経細胞への感染の特異性を示す表である。
【図７】本発明の一環を成す、狂犬病ウイルスNタンパク質及びPタンパク質恒常発現細胞NA-NP株におけるr4.0-CVSG株の増殖能（力価）を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのGFP発現能の違いを神経細胞初代培養において示す図である。
【図９】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのGFP発現能の違いを神経細胞初代培養において示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのβ-gal発現能の違いを神経細胞初代培養において示す図である。
【図１１】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターの軸索からの初期感染とシナプスを介した逆行性伝播の特性を示す図である。
【図１２】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのGFP発現能の違いをインビボのラット脳（CA１領域）において示す図である。
【図１３】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのGFP発現能の違いをインビボのラット脳（CA3領域）において示す図である。
【図１４】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターの軸索からの初期感染とシナプスを介した逆行性伝播、及び高い外来遺伝子（GFP）の発現を示す図である。
【図１５】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのβ-gal発現能の違いをインビボのラット脳（CA3領域）において示す図である。
【図１６】本発明の実施例における、組換え狂犬病ウイルスベクターのβ-gal発現能の違いをインビボのラット脳（外側中隔核領域）において示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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