(57)【要約】【課題】フィブリン組成物に使用するフィブリン物質およびフィブリンモノマーベースのシーラントの活性化剤としてトロンビンを使用する必要を回避した方法の提供。【解決手段】本発明は、実質的に純粋なフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、他のＮ末端伸長を有するフィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリン−アナログを提供する。本発明はまた、フィブリン鎖またはフィブリン鎖変異体をコードするヌクレオチド配列、およびフィブリン鎖、フィブリン鎖変異体、フィブリンモノマー、フィブリン前駆体またはフィブリノーゲン−アナログを発現する細胞をも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固可能な組換えフィブリン前駆体を製造するための細胞であって、当該細胞は、以下の：
（ｉ）細胞プロセッシング後、フィブリンα鎖、又は第１のＮ末端伸長をもつフィブリンα鎖をコードし、かつ、発現するヌクレオチド配列、
（ii）細胞プロセッシング後、フィブリンβ鎖、又は第２のＮ末端伸長をもつフィブリンβ鎖をコードし、かつ、発現するヌクレオチド配列、及び
（iii）フィブリンγ鎖をコードし、かつ、発現するヌクレオチドにより形質転換され、
ここで、（ｉ）又は（ii）の配列の内の少なくとも１は、（ｉ）トロンビンがフィブリンα鎖を解放することを許容するために作用するトロンビン認識配列を欠き、かつ、（ii）Ａ又はＢ−フィブリノペプチドが阻害するような方法で、上記伸長したフィブリン鎖を取り込むフィブリノーゲン・アナログ分子のフィブリン重合を阻害する、Ｎ末端伸長をもつフィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖をコードし、かつ、発現し、
ここで、上記配列（ｉ）〜（iii）の各々は、上記コードされたフィブリン鎖の発現を調節するプロモーターに作用可能な状態で連結され、そして上記細胞は、上記ヌクレオチド配列（ｉ）〜（iii）から、トロンビン認識配列を欠くＮ末端伸長をもつフィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖を含む、組換えフィブリン前駆体を産生する、前記細胞。
【請求項２】
トロンビン認識配列を欠く、Ｎ末端伸長をもつフィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖をコードし、かつ、発現するヌクレオチド配列は、上記フィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖からＮ末端伸長を解放するためのタンパク質分解性開裂認識部位をコードし、かつ、発現し、それによりフィブリンを作製する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
血液凝固可能な組換えフィブリン前駆体の製造方法であって、当該方法は：
（ｉ）請求項１に記載の細胞を培養し；そして
（ii）上記血液凝固可能な組換えフィブリン前駆体を回収する、
を含む前記方法。
【請求項４】
前記（ii）に記載のヌクレオチド配列は、細胞プロセッシング後に、トロンビン認識配列を欠くＮ末端伸長をコードし、かつ、発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記（ｉ）に記載のヌクレオチド配列は、細胞プロセッシング後に、トロンビン認識配列を欠くＮ末端伸長をコードし、かつ、発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列によりコードされ、かつ、発現されるフィブリン鎖は、ヒト・フィブリン鎖である、請求項１，４又は５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
フィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖である組換えフィブリン鎖を含む単離フィブリン−アナログであって、当該フィブリン鎖は、（ｉ）伸長フィブリン鎖がトロンビンによりフィブリン鎖に交換されることを許容するトロンビン認識配列を欠き、かつ、（ii）Ａ又はＢフィブリノペプチドが阻害するような方法で、上記コードされた伸長フィブリン鎖を取り込むフィブリノーゲン・アナログ分子のフィブリン重合を阻害する、Ｎ末端伸長を有する、前記単離フィブリン−アナログ。
【請求項８】
前記伸長された組換えフィブリン鎖は、フィブリン鎖へのタンパク質変換に感受性でない、請求項７に記載の単離フィブリノーゲン−アナログ。
【請求項９】
前記伸長された組換えフィブリン鎖は、タンパク質分解により開裂されてフィブリンを産生する、請求項７に記載の単離フィブリノーゲン−アナログ。
【請求項１０】
前記伸長組換えフィブリンは、ヒト・フィブリンα鎖を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の単離フィブリノーゲン−アナログ。
【請求項１１】
前記伸長組換えフィブリンは、ヒト・フィブリンβ鎖を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の単離フィブリノーゲン−アナログ。
【請求項１２】
組換えフィブリン・モノマーを含む組成物であって、当該組成物は、フィブリノーゲン、及び以下のセットの内の１つ又は両者の分子を本質的に含有しない、前記組成物：
（ｉ）（ａ）フィブリノーゲンＡα鎖、（ｂ）Ａ−フィブリノペプチドが阻害するような方法で、伸長α鎖を取り込むフィブリノーゲン・アナログ分子のフィブリン重合を阻害するＮ末端伸長をもつフィブリンα鎖、（ｃ）フィブリノペプチドＡ、及び（ｄ）上記フィブリノーゲン・アナログから開裂された上記Ｎ末端伸長に対応するペプチド、並びに
（ii）（ａ）フィブリノーゲンＢβ鎖、（ｂ）Ｂ−フィブリノペプチドが阻害するような方法で、伸長β鎖を取り込むフィブリノーゲン・アナログのフィブリン重合を阻害するＮ末端伸長をもつフィブリンβ鎖、（ｃ）フィブリノペプチドＢ、及び（ｄ）上記フィブリノーゲン・アナログから開裂された上記Ｎ末端伸長に対応するペプチド。
【請求項１３】
前記組成物が、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンＡα鎖、フィブリノペプチドＡ、前記フィブリノーゲン・アナログ、及び前記ペプチドを本質的に含有しない、請求項１２に記載の組換えフィブリン・モノマー組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンＢβ鎖、フィブリノペプチドＢ、前記フィブリノーゲン・アナログ、及び前記ペプチドを本質的に含有しない、請求項１３に記載の組換えフィブリン・モノマー組成物。
【請求項１５】
前記フィブリン関連ポリペプチド及び前記フィブリノペプチドが、ヒト・フィブリン関連ポリペプチド及びフィブリノポリペプチドである、請求項１３又は１４に記載の組換えフィブリン・モノマー又はフィブリン・ホモログ組成物。
【請求項１６】
フィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン・アナログの製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）（ｉ）単離フィブリンα鎖組成物、又はＮ末端伸長をもつ単離フィブリンα鎖を含む第１成分、（ii）単離フィブリンβ鎖組成物、又はＮ末端伸長をもつ単離フィブリンβ鎖を含む第２成分、及び（iii）単離γ鎖組成物を含む第３成分、の混合物を得、ここで、上記伸長は、Ａ又はＢフィブリノペプチドが阻害するような方法で、Ｎ末端伸長をもつフィブリン鎖を取り込むフィブリノーゲン分子のフィブリン重合を阻害する；及び
（ｂ）上記混合物を、折り畳みを広げる量の変性剤及び還元剤に晒し、そして当該変性剤及び還元剤の濃度を低下させることにより鎖組成物（ｉ），（ii）、及び（iii）を含むフィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン−アナログを形成させる；
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記形成が、前記混合物を、折り畳みを広げる量の変性剤及び還元剤に晒し、そして当該変性剤及び還元剤の濃度を低下させることを含む、請求項１６に記載のフィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン−アナログの製造方法。
【請求項１８】
前記変性剤の濃度が、約０．５Ｍ〜約飽和の範囲にあり、かつ、前記還元剤の濃度が、約０．０５mM〜約１００mMの範囲にある、請求項１６に記載のフィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリン−アナログの製造方法。
【請求項１９】
前記鎖組成物のいずれかの異種対のモル比が、約１．５：１以下である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のフィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン−アナログの製造方法。
【請求項２０】
前記鎖組成物が、略等モル量である、請求項１９に記載のフィブリン・モノマー、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン−アナログの製造方法。
【請求項２１】
組成物（ｉ）又は（ii）の内の少なくとも１つが、ステップ（ｂ）がフィブリン・モノマーを形成するように、フィブリンα鎖又はフィブリンβ鎖から本質的に成る、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のフィブリン・モノマーの製造方法。
【請求項２２】
フィブリン・モノマーの製造方法であって、当該方法は、以下のステップ：
（ａ）（ｉ）フィブリン・アルファ−鎖をコードする配列を含む発現ベクター、
（ii）フィブリン・ベータ−鎖をコードする配列を含む発現ベクター、及び
（iii）ガンマ−鎖をコードする配列を含む発現ベクター、
を含む細胞を培養するステップ、ここで、上記コーディング配列の各々は、当該配列の発現を調節するプロモーターに作用可能な状態で連結され、
ここで、上記細胞は、低下されたpHで培養され、それによりα鎖、β鎖、及びγ鎖が産生され、そして当該細胞内で会合して、当該細胞内で、フィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマー又はデスＢＢフィブリン・モノマーを形成する；及び
（ｂ）上記フィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマー、又はデスＢＢフィブリン・モノマーを回収するステップ；
を含む前記方法。
【請求項２３】
約５．０未満のpHで前記細胞を培養することを含む、請求項２２に記載のフィブリン・モノマーの製造方法。
【請求項２４】
前記コードされたフィブリン鎖が、ヒト・フィブリン鎖であり、そして前記回収されたフィブリンが、ヒト・フィブリンである、請求項２２又は２３に記載のフィブリン・モノマーの製造方法。
【請求項２５】
前記形成されたフィブリン・モノマーは、前記培養中に分泌され、そして当該培地から回収される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のフィブリン・モノマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリン組成物に使用するフィブリン物質および活性化試薬としてトロンビンを使用する必要を回避した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定義
本明細書において使用する以下に列挙した語句は、指摘した意味を有する。特に断らない限り、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」の語句は、ペプチド結合によって結合した２またはそれ以上のアミノ酸を同じ意味にて使用する。
α鎖  ＝  α鎖はフィブリンの３成分ポリペプチド鎖のうちの一つである。Ｎ末端フィブリノペプチドＡの配列が欠失されているのを除けば、α鎖のアミノ酸配列は一般にフィブリノーゲンのＡα鎖のものと同じである。α鎖はまた、フィブリンα鎖とも称する。
Ａα鎖  ＝  Ｎ末端Ａフィブリノペプチドが結合したα鎖。Ａα鎖はまたフィブリノーゲンＡα鎖とも称する。
アミノ酸の番号付けおよび順序  ＝  フィブリン鎖に関するアミノ酸の番号付けはすべて、プロセシングされていない遺伝子産物の最初のメチオニンから開始するヒトの配列に関するものである。非ヒト配列に関しては、本明細書に示す配列範囲は相同配列をさす。たとえば、ヒトγ鎖については、プロセシングされたポリペプチドの最初のアミノ酸は、プロセシングされていない遺伝子産物のＮ末端メチオニンから数えて残基２７である。本願の目的上、アミノ酸は、一方が他方よりＮ末端に近い場合にそのアミノ酸を他方のアミノ酸の「前」に並べてある。
【０００３】
β鎖  ＝  β鎖はフィブリンの３成分ポリペプチド鎖のうちの一つである。Ｎ末端フィブリノペプチドＢの配列が欠失されているのを除けば、β鎖のアミノ酸配列は一般にフィブリノーゲンのＢβ鎖のものと同じである。β鎖はまた、フィブリンβ鎖とも称する。
Ｂβ鎖  ＝  Ｎ末端Ｂフィブリノペプチドが結合したβ鎖。Ｂβ鎖はまたフィブリノーゲンＢβ鎖とも称する。
鎖  ＝  フィブリン、フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログの成分ポリペプチド。
コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）領域  ＝  Ｄ−ドメインを中央のＥ−ドメインと連結しているフィブリン、フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログの領域は、らせん領域の「コイルドコイル」から構成され、各らせん領域はα鎖、β鎖およびγ鎖またはｖγ鎖のうちの一つから形成されている。これらのらせん領域は一緒になってコイルドコイル領域を構成する。
【０００４】
γ鎖のＣ末端部分の保存された２つのＣｙｓ残基  ＝  一般に天然のすべてのγ鎖配列のＣ末端部分中に認められるＣｙｓ残基。ヒト配列では、これらは残基３５２および３６５である。
構築物  ＝  組換えＤＮＡ技術を使用して産生されたヌクレオチド配列。
架橋フィブリンポリマー  ＝  第ＸIII因子によって形成された架橋などの、重合したフィブリン関連タンパク質間に共有結合架橋が形成されたフィブリンポリマー。
ｄｅｓＢＢフィブリン  ＝  Ｂフィブリノペプチドを欠くがＡフィブリノペプチドは保持しているフィブリン。
ｄｅｓＢＢフィブリンモノマー  ＝  ｄｅｓＢＢフィブリンで形成されたフィブリンポリマーと対比した、個々のｄｅｓＢＢフィブリン単位。
伸長したα鎖または伸長したβ鎖  ＝  Ｎ末端伸長を有するα鎖またはＮ末端伸長を有するβ鎖。
【０００５】
フィブリン  ＝  重合して血餅を形成しうるフィブリノーゲンの多くの誘導体（たとえば、フィブリンＩ、フィブリンIIまたはｄｅｓＢＢフィブリン）のうちの一つ。これら誘導体は、フィブリノーゲンからＡフィブリノペプチドまたはＢフィブリノペプチドを開裂することによって創製される。
フィブリンＩ  ＝  Ａフィブリノペプチドを欠くが、Ｂフィブリノペプチドは保持しているフィブリン。フィブリンＩは重合して血餅を形成できる。
フィブリンＩモノマー  ＝  フィブリンＩは重合可能であるため、「フィブリンＩモノマー」は個々のフィブリンＩ単位を同定するために使用する。
フィブリンII  ＝  ＡフィブリノペプチドおよびＢフィブリノペプチドを欠くフィブリン。フィブリンIIは重合して血餅を形成できる。
フィブリンIIモノマー  ＝  フィブリンIIは重合可能であるため、「フィブリンIIモノマー」は個々のフィブリンII単位を同定するために使用する。
【０００６】
フィブリン鎖  ＝  フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログを構成する鎖であり、α鎖、β鎖、γ鎖またはｖγ鎖のような修飾したγ鎖を含む。
フィブリン鎖前駆体  ＝  開裂してフィブリン鎖を生成することができるＮ末端リーダーペプチドを含むフィブリン鎖の前駆体。フィブリン鎖前駆体は特定のタイプのＮ末端伸長を有するフィブリン鎖である。
Ｎ末端伸長を有するフィブリン鎖  ＝  Ｎ末端側でペプチド結合を介してアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質と結合したフィブリン鎖。
トロンビン認識配列を欠くＮ末端伸長を有するフィブリン鎖  ＝  α鎖、β鎖、γ鎖または修飾したγ鎖を生成するトロンビン開裂を受けない、α鎖、β鎖、γ鎖または修飾したγ鎖へのＮ末端伸長。
【０００７】
タンパク質加水分解プロセシングに適合していないＮ末端伸長を有するフィブリン鎖  ＝  α鎖、β鎖、γ鎖または修飾したγ鎖を生成するタンパク質加水分解開裂を受けない、α鎖、β鎖、γ鎖または修飾したγ鎖へのＮ末端伸長。
フィブリン−ホモログ  ＝  このものは、γ鎖が修飾したγ鎖で置換されている点でフィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーまたはｄｅｓＢＢフィブリンモノマーと異なる。
フィブリン−ホモログ前駆体  ＝  １またはそれ以上のフィブリン鎖前駆体および修飾したγ鎖かまたは修飾したγ鎖前駆体のいずれかを含むフィブリノーゲン様分子。フィブリン−ホモログ前駆体は、その構成鎖上に１またはそれ以上のリーダーペプチドを含む。リーダーペプチドは、フィブリン−ホモログ前駆体からインビボまたはインビトロでタンパク質加水分解的にプロセシングされてフィブリン−ホモログを生成しうる。
フィブリンまたはフィブリノーゲン関連タンパク質  ＝  ２つのα鎖相同ポリペプチド、２つのβ鎖相同ポリペプチドおよび２つのγ鎖またはｖγ鎖相同ポリペプチドを含む、フィブリンまたはフィブリノーゲンに関連するタンパク質。
フィブリンポリマー  ＝  共有結合または非共有結合により会合してフィブリン関連タンパク質のポリマーを形成したフィブリン関連タンパク質の組成物。
【０００８】
フィブリン前駆体  ＝  １またはそれ以上のフィブリン鎖前駆体を含むフィブリンの前駆体。フィブリン前駆体は、その構成鎖上に１またはそれ以上のリーダーペプチドを含む。リーダーペプチドは、フィブリン前駆体からインビボまたはインビトロでプロセシングされてフィブリンを生成しうる。
フィブリンシーラント（ｓｅａｌａｎｔ）  ＝  血液凝固の最終段階を模倣した作用を有することによってフィブリン血餅を生成する生物学的接着剤。フィブリンシーラントは、出血を制御し、または２つの組織を互いに接着させるために手術において有用である。
フィブリノーゲン  ＝  血餅を形成する基礎単位を提供するように機能する、動物の循環系に認められるタンパク質。フィブリノーゲンは、２つのＡα鎖、２つのＢβ鎖および２つのγ鎖を含む。フィブリノーゲンがフィブリンモノマーにプロセシングされると、フィブリンモノマーは重合して血餅を形成することができる。
【０００９】
フィブリノーゲン−アナログ  ＝  α鎖またはβ鎖への少なくとも一つのＮ末端伸長（該伸長は、それぞれ、ＡフィブリノペプチドまたはＢフィブリノペプチドと異なる）を有する点でフィブリンと異なる分子。成分α鎖またはβ鎖のすべてがＮ末端伸長を有する場合には、フィブリノーゲン−アナログは一般に自己重合できない。
フィブリノーゲン鎖  ＝  フィブリノーゲン鎖はＡα鎖またはＢβ鎖である。
フィブリノーゲン半分子（ｈａｌｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）  ＝  フィブリノーゲン半分子は、Ａα鎖、Ｂβ鎖およびγ鎖を有するフィブリノーゲンの前駆体である。２つのフィブリノーゲン半分子はフィブリノーゲンを形成することができる。
γ鎖  ＝  γ鎖はフィブリンまたはフィブリノーゲンの３成分ポリペプチド鎖のうちの一つである。γ鎖はまたフィブリンγ鎖とも称する。
遺伝子融合  ＝  異種遺伝子のコード配列に機能的に連結したプロモーターからなる遺伝子構築物であって、該プロモーターは該コード配列の転写を制御するもの。
【００１０】
遺伝子工学  ＝  組換えＤＮＡ方法により作られたヌクレオチド配列の導入および維持により宿主細胞の遺伝子を変えること。遺伝子工学には、宿主細胞において自律複製が可能または可能でない組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）または組み込まれていない（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列の形質転換、形質導入またはトランスフェクション、並びに遺伝子が変えられた細胞を有する１またはそれ以上の組織を有するトランスジェニック多細胞生物体を製造する方法が含まれるが、これらに限られるものではない。
異種リーダーペプチド  ＝  該リーダーペプチドが結合したタンパク質とは異なるタンパク質に由来するリーダーペプチド。
相同ポリペプチド  ＝  α鎖、β鎖またはγ鎖の配列の有意部分、たとえば、これら鎖の一つの少なくともおよそ半分の配列と高いホモロジーを有するポリペプチド。
【００１１】
インビトロ  ＝  その一部または全体が完全な細胞の使用を含まないプロセスをいう。たとえば、フィブリンのインビトロ産生は、遺伝子操作した細胞により産生されたフィブリン鎖のインビトロアセンブリーを含みうる。それはまた、細胞により産生されたフィブリン鎖前駆体のインビトロプロセシングおよびその結果得られるフィブリン鎖のフィブリンへのインビトロアセンブリー、またはフィブリン鎖前駆体のフィブリン前駆体へのインビトロアセンブリーおよびフィブリン前駆体のフィブリンへのインビトロプロセシングをも含む。
インビボ  ＝  そのすべてが完全な細胞の使用を含むプロセスをいう。たとえば、遺伝子操作した細胞中でのフィブリンのインビボ産生は、フィブリン鎖前駆体をコードする発現構築物からの完全で機能性のフィブリンの細胞発現、プロセシングおよびアセンブリーを含む。
リーダーペプチド  ＝  ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端にあるポリペプチド。リーダーペプチドは、単一のアミノ酸から数個のアミノ酸長のペプチドおよびタンパク質全体にいたるまで、いかなるサイズのものであってもよい。本明細書においてはリーダーペプチドはすべての場合に「プロ」機能を有する。すなわち、リーダーペプチドは、たとえばタンパク質加水分解プロセシングにより、それが結合したポリペプチドまたはタンパク質から特異的かつ完全に除去されうる。幾つかの場合においては、リーダーペプチドはさらに、それが結合したタンパク質の細胞区画化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞外輸送を指令するという点で「プレ」機能を有する。幾つかの場合においては、リーダーペプチドは、細胞区画化または細胞外輸送に付随する膜移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）段階の間にプロセシングされうる。
【００１２】
修飾したγ鎖  ＝  フィブリン−ホモログ中に導入されたときに該ホモログが自己重合する能力は欠くがフィブリノーゲンと非共有結合を形成する能力は有するように、すべてのｖγ鎖および化学的に修飾されたγ鎖を包含する。
天然のフィブリン  ＝  動物に由来するフィブリン。
非共有結合  ＝  水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水相互作用、静電相互作用などを含む、タンパク質が安定な会合を形成する相互作用。非共有結合の存在は共有結合（すなわち、架橋）の可能性を排除するものではない。
非共有結合したフィブリンポリマー  ＝  会合したフィブリン関連タンパク質が非共有結合により会合しているフィブリンポリマー。
ＰＣＲ  ＝  ポリメラーゼ連鎖反応
組換えフィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログ  ＝  フィブリン鎖およびフィブリン鎖前駆体をコードする発現構築物を有する遺伝子操作した細胞により産生されたフィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログ。
【００１３】
ＲＮＡ  ＝  リボ核酸。
自己重合  ＝  第一のタンパク質分子が第二のタンパク質分子に共有結合または非共有結合により結合した同じタンパク質分子の集団。
安定な非共有結合  ＝  血餅を形成するに十分に安定なフィブリン関連タンパク質間での結合。
実質的に純粋  ＝  化合物が少なくとも５０重量％の問題の物質を含む純度の程度。
【００１４】
適当な細胞  ＝  本発明の目的のための「適当な細胞」は、特許請求されたヌクレオチド配列によってコードされた選択されたＮ末端伸長をタンパク質加水分解除去によりプロセシングしうる細胞である。
折り畳みを解除する量の変性剤  ＝  タンパク質の折り畳みを実質的に解除するに十分な組成物の量であり、一般に２．５Ｍ尿素と実質的に等価なポリペプチドの折り畳み解除活性を有する変性剤の量である。
ｖγ鎖または変異体γ鎖  ＝  フィブリン−ホモログ中に導入されたときに該ホモログが自己重合する能力は欠くがフィブリノーゲンと非共有結合を形成する能力は有するように、コイルドコイル形成領域に続くＣ末端領域中に１またはそれ以上の変異および／または欠失を含む変異体γ鎖。
【００１５】
フィブリンおよび血餅
哺乳動物の止血、すなわち血液損失の防止の一つの機構は、血餅の形成である。ヒトにおける血餅形成は複雑なカスケード反応により起こり、その最終段階はトロンビン、カルシウムイオンおよび活性化第ＸIII因子による最終的に架橋されたフィブリンIIポリマーへのフィブリノーゲンの変換であり、該フィブリンIIポリマーは不溶性フィブリンIIポリマーとしても知られる不溶性のフィブリン血餅である。
【００１６】
フィブリノーゲンは血液の血漿タンパク質の約２〜４ｇ／ｌを占め、（Ａα）2，（Ｂβ）2およびγ2で示されるジスルフィド結合した３対のポリペプチド鎖からなる複合タンパク質である。「Ａ」および「Ｂ」は、それぞれフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢとして知られる２つの小さなアミノ末端ペプチドを示す。フィブリノーゲンのこれら６つのポリペプチド鎖は、直線配置で少なくとも３つの球状ドメイン、２つの末端「Ｄ−ドメイン」および中央の「Ｅ−ドメイン」に折り畳まれている。Ｅ−ドメインは、フィブリノーゲン分子中のポリペプチド鎖の６つのすべてのＮ末端残基を含んでいると考えられている。各Ｄ−ドメインは、一つのＡα鎖、一つのＢβ鎖、および一つのγ鎖からのＣ末端配列を含む。
不溶性フィブリン血餅（すなわち、架橋されたフィブリンIIポリマー）の形成は、トロンビンによってフィブリンＩモノマーに変換されたフィブリノーゲンで開始されると考えられている。この変換は、フィブリノーゲンの２つの各Ａα鎖から１６アミノ酸のフィブリノペプチドＡ（Ｇ1−Ｒ16）がトロンビンに媒体されて開裂し、アミノ酸配列Ｇ17−Ｐ−Ｒ−Ｖ20−の新たなＮ末端を有する２つの各α鎖を生成することを含む。フィブリンＩモノマーは、該変換されたフィブリンモノマーのＥ−ドメイン（いまや接近可能な非共有結合部位を有する）と異なるフィブリンＩまたはフィブリンIIモノマーのＤ−ドメインとの間の分子間相互作用（すなわち、非共有結合）により、他のフィブリンＩまたはフィブリンIIモノマーと自発的に重合しうると思われる。フィブリンモノマーの各Ｄ−ドメインは、フィブリンＩまたはフィブリンIIモノマーのＥ−ドメインと安定に相互作用しうる重合部位を有する。
【００１７】
一つのフィブリンＩモノマーの２つのＥ−ドメイン重合部位と２つの相補的なＤ−ドメイン重合部位（それぞれ、２つの異なるフィブリンＩモノマーからのもの）との接触は、半分互い違いに重複して分子接触した、直線状のフィブリンフィブリン（すなわち、ポリマー）を形成すると思われる。このようにして生成したフィブリンＩポリマーは、しばしば可溶性のフィブリンＩポリマーと呼ばれる。なぜなら、このフィブリンＩポリマーは適当な化学的手段で処理することによって脱重合させ、フィブリンＩモノマーに再度変換することができるからである。
【００１８】
フィブリン血餅の形成における次の段階は、フィブリンＩモノマーのフィブリンIIモノマーへの変換を含む。この段階は、フィブリンＩの２つの各Ｂβ鎖からフィブリノペプチドＢをトロンビンを介して開裂することを含む。１４アミノ酸のフィブリノペプチドＢの除去により、それぞれＧ−Ｈ−Ｒ−のＮ末端配列を有するβ鎖が得られる。フィブリンIIモノマーはフィブリンＩモノマーと同様に、一つのフィブリンIIモノマーのＥ−ドメイン中の分子間相互作用部位（いまや開裂反応により接近可能になっている）と他のフィブリンIIまたはフィブリンＩモノマーのＤ−ドメインとの間の分子間相互作用により、他のフィブリンIIまたはフィブリンＩモノマーと自発的に重合しうる。フィブリンＩポリマーと同様、フィブリンIIポリマーもまた、しばしば可溶性のフィブリンIIポリマーと呼ばれる。なぜなら、このフィブリンIIポリマーは適当な化学的手段で処理することによって脱重合させ、フィブリンIIモノマーに再度変換することができるからである。Ｅ−ドメイン中のβ鎖Ｎ末端配列の暴露はフィブリン血餅形成にとって不可欠である。というのは、それが、フィブリンIIポリマー中の隣接するフィブリンIIモノマーの活性化第ＸIII因子を介した共有結合架橋を容易にするからである。活性化第ＸIII因子はフィブリンポリマー中のフィブリンＩモノマーをも架橋することができるが、この反応はフィブリンＩ上のフィブリノペプチドＢの存在のために効率が悪い。架橋されたフィブリンIIポリマーはしばしば不溶性のフィブリンIIポリマーと呼ばれる。なぜなら、それは脱重合することができず、フィブリンIIモノマーに再度変換することができないからである。
【００１９】
フィブリノーゲンから架橋されたフィブリンＩポリマーおよび架橋されたフィブリンIIポリマーへの変換の模式図を図８に示す。
トロンビンおよび第ＸIII因子に加えて、カルシウムイオンがフィブリン血餅形成において重要であり、多くの重要な役割を有していると考えられている。カルシウムイオンはプロトロンビンのトロンビンへの活性化に必要であり、トロンビンは第ＸIII因子を活性化するので、カルシウムイオンは第ＸIII因子の活性化に間接的に必要であると思われる。さらに、活性な第ＸIII因子は、カルシウムイオンの不在下ではフィブリンポリマーを架橋することができないカルシウム依存性の酵素であると考えられている。カルシウムイオンはまたポリマー性のフィブリンに直接結合し、該フィブリンポリマー鎖の不透明度（ｏｐａｃｉｔｙ）および機械的特性を変化させる。血液凝固の機構およびフィブリン血餅の成分の概略については、ジャクソン（C.M. Jackson）, 1980, Ann. Rev. Biochem., 49: 765〜811、およびフリー（B. Furie）およびフリー（B.C. Furie）, 1988, Cell, 53: 505〜518を参照。
【００２０】
フィブリンシーラント
フィブリンシーラントは、フィブリンポリマーを形成する血液凝固の段階に作用を模倣させた生物学的な接着剤である。シーラントは、フィブリンポリマーが不溶性のフィブリンポリマーに変換されるように設計することができる。一つのタイプのフィブリンシーラントはフィブリノーゲンを使用し、２つの成分からなる。一つの成分は濃縮したヒトフィブリノーゲン、ウシアプロチニンおよび第ＸIII因子を含む。第二の成分はウシトロンビンおよび塩化カルシウムを含む。このタイプのシーラントの適用は一般に二連式の注射器を用いて行い、そうすることによってフィブリン血餅形式の所望部位へ両成分を同時に送達することが可能となる。標的部位で２つの成分を混合すると、上記反応系列によりフィブリン血餅が形成される。
【００２１】
このタイプのフィブリンシーラントのフィブリノーゲン成分は、典型的にプールしたヒト血漿から調製する。フィブリノーゲンは、種々の試薬、たとえばポリ（エチレングリコール）、ジエチルエーテル、エタノール、硫酸アンモニアまたはグリシンを用いた凍結沈降（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）または沈降によりヒト血漿から濃縮することができる。このタイプのフィブリンシーラントの概略については、ブレナン（M. Brennan）, 1991, Blood Reviews, 5: 240〜244；ギッブル（J.W. Gibble）およびネス（P.M. Ness）, 1990, Transfusion, 30: 741〜747；マトラス（H. Matras）, 1985, J. Oral Maxillofac Surg., 43: 605〜611およびラーナー（Lerner）およびビヌール（N. Binur）, 1990, J. of Surgical Research, 48: 165〜181を参照。
【００２２】
第二の新しいタイプのフィブリンシーラントは、主としてフィブリンＩモノマーおよび／またはフィブリンIIモノマーからなる組成物を使用する。ヨーロッパ特許出願第０５９２２４２号（１９９４年４月公開）を参照。これらタイプのシーラントでは、シーラントの適用前にトロンビンなどのタンパク質加水分解酵素を用いてフィブリノーゲンからフィブリンＩモノマーおよび／またはフィブリンIIモノマーおよび／またはｄｅｓＢＢフィブリンモノマーを調製する。これらフィブリンモノマーは適当な緩衝液を用いて可溶性の形態に保持される。有用な緩衝液としては、低いpHおよび／またはカオトロープ剤を有するもの、好ましくは低いカルシウムレベルを有するかまたはカルシウムを含まないものが挙げられる。このような溶液中のフィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーまたはｄｅｓＢＢフィブリンモノマーは、該溶液を第二の溶液と混合して、フィブリンモノマーが自発的に重合してフィブリン血餅を形成することを可能にする条件を有する混合物を生成することによってフィブリンポリマーに変換することができる。
【００２３】
フィブリンＩ、フィブリンIIおよびｄｅｓＢＢフィブリンモノマーベースのシーラントは、フィブリノーゲンベースのシーラントに比べ幾つかの利点を有する。特に、フィブリンモノマーベースのシーラントはウシまたはヒトトロンビンを含まない。そのようなシーラントの使用は、フィブリンモノマーを自己由来で（すなわち、患者自身から）調製した場合に、受容者に外来タンパク質を導入することがなく、それによって免疫学的な反応から生じる合併症および血液経由の感染のリスクを回避することができる。フィブリンモノマーベースのシーラントは都合よく調製することができる。可溶性のフィブリンポリマーは弱酸性溶液を用いて溶解することができ、得られたフィブリンモノマーは微細な粉末に凍結乾燥することができる。そのような粉末は弱酸中にて容易に再溶解でき、アルカリ緩衝液を加えることにより再重合を起こすことができる。別のやり方として、粉末化したフィブリンモノマーをカオトロープ溶液、たとえば尿素中に非常に高濃度（＞１５０mg／ml）にて溶解し、水を加えることにより再重合を起こさせることができる。
【００２４】
フィブリンモノマーベースのシーラントの他の利点は、該シーラントは一般に自己由来の成分を使用するので、該シーラントの使用によって肝炎（Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ型肝炎を含む）や後天性免疫不全ウイルス（ＡＩＤＳ）などの血液経由の感染因子に晒されるリスクが低いことである。シルバースタイン（L.E. Silberstein）ら、1988, Transfusion, 28: 319〜321；ライタカリ（K. Laitakari）およびルオトネン（J. Luotonen）, 1989, Laryngoscope, 99: 974〜976およびドレスデール（A. Dresdale）ら、1985, The Annals of Thoracic Surgery, 40: 385〜387を参照。そのような因子によって引き起こされる疾患は、従来のフィブリノーゲンベースのシーラントによって伝播されうる。なぜなら、そのフィブリノーゲン成分は典型的にプールしたヒト血漿から調製したものだからである。さらに、フィブリンベースのシーラントの使用はまた、フィブリノーゲンベースのシーラントのウシトロンビン成分に付随するリスクをも回避することができる。ウシトロンビン調製物は、感染因子ウシ海綿様脳症（ＢＳＥ）並びに哺乳動物の他のウイルス性病原体を含みうる。また、ウシトロンビンは強力な抗原であり、ヒトにおいて有害な免疫学的反応を引き起こしうる。フィブリノーゲンベースのシーラントに付随するこれらタイプの合併症の詳細については、テイラー（D.M. Taylor）, 1991, J. of Hospital Infection, 18（補遺Ａ）：141〜146およびプルシナー（S.B. Prusiner）ら、1991, Cornell Vet.81: 85〜96を参照。
【００２５】
従って、ウイルス感染および／またはアレルギー作用のないフィブリンシーラントの調製物に対する必要性が存在する。フィブリンモノマーベースのシーラント中での自己由来フィブリンの使用は溶液であるが、その適用は残念ながら、十分な量の自己由来フィブリンモノマーを回収および調製するものとして、前以て計画することが可能な状況に限られる。しかしながら、前以て計画することが不可能な場合、すなわち緊急の場合や限られた量の自己由来血漿しか取っておけない場合（すなわち、新生児）、安全で便利なフィブリンシーラントの調製に使用できる感染のおそれのないフィブリンモノマーに対する必要性がなお存在する。
【００２６】
組換えフィブリノーゲンおよびフィブリン
遺伝子工学は、フィブリノーゲンおよびフィブリンモノマーを比較的高収率かつ実質的に純粋な形態で、しかも肝炎やＨＩＶなどの病原性ウイルスの存在なしに製造する方法を提供する。フィブリノーゲンおよびフィブリン鎖の異種発現はまた、天然に存在するフィブリン変異体を模倣しうる変異の構築、およびこれら稀な遺伝子欠損を有する患者の助けを借りることなくこれらタンパク質の単離および研究を可能とする。
【００２７】
フィブリノーゲンの３つの異なる各ポリペプチド鎖（Ａα，Ｂβおよびγ）は、別々の遺伝子によりコードされている。これら各鎖のｃＤＮＡは調製されており（チャング（Chung）ら、1983, Ann N.Y. Acad. Sci., 408: 449〜456；リクセン（Rixen）ら、1983, Biochemistry, 22: 3237〜3244；チャングら、1983, Biochemistry, 22: 3244〜3250；チャングら、1983, Biochemistry, 22: 3250〜3256）、原核生物において発現されている。さらに、各ヒトフィブリノーゲン鎖は、別々に（ファング（Huang）ら、1993, J. Biol. Chem., 268: 8919〜8926；ロイ（Roy）ら、1992, J. Biol. Chem., 267: 23151〜23158；ロイら、1991, J. Biol. Chem., 266: 4758〜4763）、または組み合わせて（ハートウィッグ（Hartwig）およびダニシェフスキー（Danishefsky）, 1991, J. Biol. Chem., 266: 6578〜6585；ハートウィッグら、上掲；ロイら、1991, J. Biol. Chem., 266: 4758〜4763）、発現プラスミド中に導入され、真核細胞中にトランスフェクションされている。
【００２８】
組換えヒトフィブリノーゲンを発現させるのに用いるプラスミドの大部分は、チャング博士（ワシントン大学、シアトル）によって構築されたものであり、ｃＤＮＡクローン（リクセンら、1983, Biochemistry, 22: 3237〜3244；チャングら、1983, Biochemistry, 22: 3244〜3250；チャングら、1983, Biochemistry, 22: 3250〜3256）に基づいている。組換えフィブリノーゲン鎖の発現は、最初、大腸菌で達成された（ボルヤード（Bolyard）およびロード（Lord）, 1988, Gene, 66: 183；ボルヤードおよびロード、1989, Blood, 73: 1202〜1206；ロードおよびファウルクス（Fowlkes）、1989, Blood, 73: 166〜171）。個々に発現された鎖はフィブリノーゲンと抗原類似性を示し、天然のフィブリノーゲンに認められるものと類似のトロンビン開裂可能部位を示した（ボルヤードおよびロード、1989, Blood, 73: 1202〜1206；ロードおよびファウルクス、1989, Blood, 73: 166〜171）。フィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢの放出もまた観察された（ボルヤードおよびロード、1989, Blood, 73: 1202〜1206；ロードおよびファウルクス、1989, 73: 166〜171）。
【００２９】
種々のフィブリノーゲン鎖をコードする適当な発現プラスミドを含む真核細胞は、コードされたフィブリノーゲン鎖を合成すること、および細胞内での二量体鎖分子、たとえば、Ａα2，Ｂβ2またはγ2二量体の生成という結果となることが示された（ロイら、1990, J. Biol. Chem., 265: 6389〜6393；ツァング（Zhang）およびレッドマン（Redman）, 1992, J. Biol. Chem., 267: 21727〜21732）。さらに、３つのすべてのヒトフィブリノーゲン鎖をコードする遺伝子を含む適当なプラスミドを同じ細胞中に移すと、３つのすべての鎖が発現されるだけでなく、ポリペプチド鎖が対で会合し完全なフィブリノーゲンが周囲媒体中に分泌される（ロイら、1991, J. Biol. Chem., 266: 4758〜4763；ハートウィッグおよびダニシェフスキー、1991, J. Biol. Chem., 266: 6578〜6585）。天然のフィブリノーゲンと同様に、分泌された組換えフィブリノーゲンは３対の非同一ポリペプチド鎖からなり、フィブリンポリマーを形成するうえで機能性である。
【００３０】
フィブリノーゲンは天然では肝臓で合成され、巨核球細胞および形質転換された肝臓細胞は培養維持され、フィブリノーゲンの合成および分泌を継続する（オット（Otto）ら、1987, J. Cell. Biol., 105: 1067〜1072；ユー（Yu）ら、1987, Thromb. Res., 46: 281〜293；アルビング（Alving）ら、1982, Arch. Biochem. Biophys., 217: 19を参照）。そのような細胞株の一つはＨｅｐ  Ｇ２細胞である（ノウルズ（Knowles）博士およびアデン（Aden）博士、ウイスター・インスティチュート（Wister Institute）、フィラデルフィア）。この細胞株はＢβ鎖に対して過剰のＡα鎖およびγ鎖を合成し、その結果、生産能のないＡα鎖とγ鎖との二量体複合体（たとえば、Ａα2γ2）を形成する。Ｂβ鎖をコードする別の発現ベクターを導入すると三量体複合体（ＡαＢβγ）が形成され、このものは正しい折り畳みおよび鎖内ジスルフィド結合パターンに適合している（ロイら、1990, J. Biol. Chem., 265: 6389〜6393）。この折り畳みの機構は未だ不明であるが、補助的なタンパク質および酵素が関与しているかもしれない（ロイら、1992, J. Biol. Chem., 267: 23151〜23158）。これら研究は、Ｂβ  ｃＤＮＡの正しい転写のみならず過剰のＢβ鎖が完全なフィブリノーゲンのアセンブリーおよび分泌を促進することを示している。
【００３１】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞では、ＡαＢβγ三量体複合体は対で会合して完全なフィブリノーゲン分子を形成し、このものがグリコシル化され細胞から活性に分泌される（ファングら、1993, J. Biol. Chem., 268: 8919〜8926）。実際、正しくアセンブリーしたフィブリノーゲン分子のみが分泌される。それゆえ、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞はフィブリノーゲンのアセンブリーのための合成および分泌装置を有する。
【００３２】
その後の実験では、通常はフィブリノーゲンを合成しない真核細胞中にフィブリノーゲン鎖をコードするｃＤＮＡプラスミドを導入した。これら実験により機能性のフィブリノーゲンが首尾よく産生され、フィブリノーゲンのアセンブリーおよび分泌に必要な因子がＨｅｐ  Ｇ２のような肝臓由来の細胞に特有のものではないことが示された。組換えフィブリノーゲンをアセンブリーおよび分泌することができる真核細胞としては、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＣＯＳ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が知られている（ロイら、1991, J. Biol. Chem., 266: 4758〜4763；ハートウィッグおよびダニシェフスキー、1991, The Journal of Biol. Chem., 266: 6578〜6585；ファレル（Farrell）ら、1991, Biochemistry, 30: 9414〜9420）。
【００３３】
安定に形質転換された真核細胞により分泌された完全な機能性のフィブリノーゲンは、約１〜２μｇ／mlのフィブリノーゲンレベルの蓄積となる。基礎的な分泌レベルの何千倍ものレベルに発現レベルが達しうるように、ＣＨＯ細胞などのトランスフェクションされた細胞からの組換えタンパク質の産出を増大させる方法が知られている。
【００３４】
そのような首尾よくいった呈示にもかかわらず、ウイルスの混入や有害なアレルギー作用のない安全なフィブリンシーラントの製造に対する完全に満足のいく解決を組換えフィブリノーゲンは与えてはいない。フィブリンシーラントにおける組換えフィブリノーゲンの使用が動物産生トロンビンによるプロセシングを依然として必要とする限り、そのようなフィブリノーゲンベースのシーラントのトロンビン成分によるウイルス混入やアレルギー反応に対する有意の懸念が残っている。
【００３５】
酵母およびアスペルギルス中での異種タンパク質の発現
組換えＤＮＡ技術の出現以来、種々の原核および真核細胞系で異種ＤＮＡを発現させる努力がなされてきた。そのような２つの系は酵母および糸状菌アスペルギルスである。
【００３６】
酵母およびアスペルギルスなどの他の真菌は、組換えＤＮＡによりコードされたポリペプチドまたはタンパク質の産生系として細菌や他の真核細胞に比べて多くの利点を有する。酵母や他の真菌は大スケールでの発酵に広範に用いられてきており、それゆえ酵母および他の真菌の発酵技術はよく知られており、多くの酵母または他の真菌宿主および発現ベクターが開発されてきている。キングスマンら、1985, Biotechnology and Genet. Engineering Rev., 3: 337〜416（サッカロミセス酵母）；レイサー（Reiser）ら、1990, Adv. Biochem. Engineering and Biotechnol., 43: 75〜102；（サッカロミセス以外の酵母）；サンダース（Sanders）ら、1989, Trends. Biotechnol., 7: 283〜287、ジーンズ（Jeenes）ら、(1991) Biotechnol. Genet. Eng. Reve., 9: 327〜367、ファン・デア・ホンデル（van der Hondel）ら、（1991）モア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・ファンジャイ（More Gene Manipulations in Fungi）、ベネット（Bennett）およびレイシャー（Lasure）編、396〜428頁参照。加えて、酵母および他の真菌は、細菌や他の多くのタイプの真核細胞に比べて一層高密度に増殖することができ、連続的な発酵プロセスにも容易に適合する。酵母および他の真菌は真核生物であるので、高等生物と同じかまたは類似のコドンの選択を示すであろう。さらに、酵母および他の真菌は天然では広範囲の糖タンパク質を分泌するため、細胞外真核性糖タンパク質の産生に対してこれらの系を特に魅力的なものにしている。分泌は、酵母および他の真菌が異種リーダーペプチドを正しく認識およびプロセシングしうること、並びに分泌可能な融合タンパク質を構築するのに使用できる広範囲のクローニング同種リーダーペプチドが利用可能であることによる。クレン（Cullen）ら、1987, Bio/Technology, 5: 369〜376；ファン・ハーティングスベルト（van Hartingsveldt）ら、1991, Proceedings of the 6th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms（ストラスブルク）、107〜116；キングスマンら、上掲；レイサーら、上掲；ウォード（Ward）ら、1990, Bio/Technology, 8: 435〜440を参照。酵母および他の真菌はまた、Ｎ末端プロセシングやグリコシル化などのほとんどの翻訳後修飾を行う。キングスマンら、上掲；レイサーら、上掲；ファン・ブルント（Van Brunt）, 1988, Biotechnol. 4: 1057〜1062を参照。
【００３７】
多くの異種タンパク質が酵母サッカロミセス中で首尾よく発現および分泌されている。例としては、インターフェロン（ヒッツェマン（Hitzeman）およびロイング（Leung）、米国特許第４，７７５，６２２号（１９８８年１０月４日発行）；ヒッツェマンら、カナダ特許第１，２０５，０２６号（１９８６年５月２７日発行）；ヒッツェマンら、1981, Nature（ロンドン）293：717）；血小板由来成長因子（マレイ（Murray）ら、米国特許第４，８０１，５４２号（１９８９年１月３１日発行））；グルカゴン（ノリス（Norris）ら、米国特許第４，８２６，７６３号（１９８９年５月発行））が挙げられる。サッカロミセス以外の酵母中で産生される異種タンパク質についてはレイサーらの文献をも参照。
【００３８】
同時に、真菌中でも多くの異種タンパク質が首尾よく発現および分泌されている。例としては、ブタ膵臓プロホスホリパーゼＡ２（ロバーツ（Roberts）ら、1992, Gene 122: 155〜161）；ニワトリ卵白リゾチーム（ジーンズら、1993, FEBS Microbiol. 107: 267〜272）；ヒトラクトフェリン（ウォードら、1992, Gene 122: 219〜223）；ヒトリゾチーム（ツチヤ（Tsuchiya）ら、1992, Appl. Microl. Biotechnol. 38: 109〜114）；ヒトインターフェロン（グウィン（Gwynne）ら、1987, Biotechnol. 5: 713〜719）；ウシキモシン（クレンら、1987, Biotechnol. 5: 369〜376）；ヒト組織プラスモーゲンアクチベーター（アップシャル（Upshall）ら、1987, Biotechnol. 5: 1031〜1034）が挙げられる。ジーンズら、1991, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 9: 327〜367およびファン・デア・ホンデルら、1991、モア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・ファンジャイ、ベネットおよびレイシャー編、396〜428頁をも参照。
【発明の開示】
【００３９】
発明の要約
本発明は、一般に、組換えフィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログに関する。組換えフィブリン鎖はフィブリン鎖由来因子の製造およびフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログの製造に有用であり、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログはまた安全で便利な外科用接着剤およびシーラントの製造に有用である。本発明は、組換えフィブリン鎖、並びにフィブリンＩモノマー、ｄｅｓＢＢフィブリンモノマーおよびフィブリンIIモノマー、およびフィブリン様のポリマーを形成するのに前以て酵素的プロセシングを必要としない有用な誘導体の製造を提供する。
【００４０】
本発明は、一つの側面において、たとえば、（ａ）αフィブリン鎖、フィブリンβ鎖およびγフィブリン鎖、（ｂ）フィブリンα鎖、フィブリノーゲンＢβ鎖およびγフィブリン鎖、または（ｃ）フィブリノーゲンＡα鎖、フィブリンβ鎖およびフィブリンγ鎖を含む調製物から、フィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーおよびｄｅｓＢＢフィブリンモノマーを調製する方法に関する。一つの場合において、フィブリンモノマーは成分ポリペプチド鎖からインビトロで調製され、他の場合にはフィブリンモノマーは上記フィブリン鎖の（ａ）〜（ｃ）の組み合わせの一つの合成を指令するＤＮＡ構築物を含む生物中でインビボで調製される。他の側面において、本発明は、フィブリノーゲン半分子、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンＡα鎖、フィブリノーゲンＢβ鎖、フィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢのうちの少なくとも一つを本質的に含まないフィブリンＩ、ｄｅｓＢＢフィブリンおよびフィブリンIIモノマー組成物に関する。
【００４１】
さらに他の側面において、本発明は、γ鎖が、フィブリン−ホモログが自己重合はできないがフィブリノーゲンとともに重合しうるように変えられた変異体γ鎖である、Ａフィブリノペプチドおよび／またはＢフィブリノペプチドを欠くフィブリン−ホモログに関する。変異体γ鎖は、Ｄ−ドメイン中に位置する球状領域が隣接するフィブリンモノマーのＥドメインと安定な分子内非共有結合を形成（この相互作用はフィブリン重合の関与する）できないように該球状領域中で変えられているのが好ましい。さらに他の態様において、本発明は、フィブリン−ホモログを含む組成物をフィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマー、ｄｅｓＢＢフィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲンアナログ組成物などのフィブリン関連組成物と混合することによりフィブリンシーラントを形成する方法に関する。本発明はさらに、フィブリンリーダー配列かまたは他の輸送タンパク質由来のリーダー配列に由来する輸送リーダー配列を含む、Ｎ末端伸長をコードするヌクレオチド配列に関し、その際、該Ｎ末端伸長をコードする配列はα鎖またはβ鎖のヌクレオチド配列に結合している。本発明はまた、Ｄ−ドメインがＥドメインと相互作用するのに必要な構造を欠くγ鎖アナログに関する。
【００４２】
本発明の一つの側面は、フィブリン鎖およびフィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーおよびｄｅｓＢＢフィブリンモノマーを製造するための新規なフィブリン鎖前駆体および該前駆体をコードする核酸配列の使用に関する。
本発明のフィブリン鎖前駆体は、α鎖、β鎖、γ鎖またはｖγ鎖に融合した異種リーダーペプチドを含む。本発明は、４つの異なるクラスのフィブリン鎖前駆体：α鎖前駆体、β鎖前駆体、γ鎖前駆体および変異体フィブリンγ鎖（ｖγ鎖または変異体γ鎖）前駆体を提供する。本発明によれば、リーダーペプチドは、「遊離の」フィブリン鎖前駆体から、またはアセンブリーしてフィブリン前駆体を形成したフィブリン鎖前駆体から開裂して、それぞれフィブリン鎖またはフィブリンを生成しうる「プロ」配列として機能する。リーダーペプチドはさらに、該リーダーペプチドを含むフィブリン鎖前駆体またはフィブリン前駆体の細胞区画化および細胞外輸送を提供する「プレ」配列として機能しうる。上記Ｎ末端伸長もまた「プレ」配列として機能する。
【００４３】
本発明は、本発明の新規なフィブリン鎖をコードするヌクレオチド配列およびプロモーターに機能的に連結した該コード配列を含む発現構築物を提供する。本発明によれば、これら構築物の細胞による発現を用いて個々のフィブリン鎖を産生しうる。さらに、これら構築物の特定の組み合わせを同時に細胞発現させてフィブリンを産生させることができる。フィブリンモノマーを産生する組み合わせは、以下の発現構築物の各一つを有していてよい：１）α鎖構築物またはＡα鎖構築物：２）β鎖構築物（フィブリンIIの産生のため）またはＢβ鎖構築物（フィブリンＩの産生のため）；および３）γ鎖構築物またはｖγ鎖構築物（これらすべての構築物は、フィブリン鎖前駆体またはフィブリン鎖の他のＮ末端伸長をコードしていてよい）。
【００４４】
本発明の他の側面は、フィブリンと類似の構造および特性を有する新規なフィブリン−ホモログ、および該フィブリン−ホモログを産生させるためのフィブリン鎖前駆体および新規な変異体γ鎖前駆体をコードする核酸配列の使用に関する。本発明のフィブリン−ホモログはそれ自身と反応して均質ポリマーを形成することはできないが、適当な条件下でたとえばフィブリン−ホモログとフィブリンモノマーまたはフィブリノーゲンとを含む不均質ポリマーを形成しうる。
本発明の新規なフィブリン−ホモログは、以下のペアの各一つのペアを含んでいてよい：１）α鎖またはＡα鎖（ｄｅｓＢＢフィブリン−ホモログにおいて）；２）β鎖（フィブリンII−ホモログにおいて）またはＢβ鎖（フィブリンＩ−ホモログにおいて）；および３）変異体γ鎖。本発明の変異体γ鎖は、ｖγ鎖がフィブリン−ホモログ中にアセンブリーしたときにＤ−ドメイン中で球状構造を形成するγ鎖の領域中にＩまたはそれ以上の変異または欠失を含む。これら変異または欠失は、該ホモログのＤ−ドメインが他のフィブリンまたはフィブリン−ホモログモノマーのＥ−ドメインと非共有結合を形成する能力を減少または消失させる。しかしながら、そのような変異は、フィブリン−ホモログがそのＥ−ドメインによって他のフィブリンまたはフィブリノーゲンモノマーとの分子間非共有結合の形成に預かる能力に影響を及ぼすものではない。それゆえ、フィブリン−ホモログは、フィブリノーゲン、フィブリンモノマーまたは機能性のＤ−ドメインを有する他のタイプのフィブリン関連タンパク質と組み合わせることにより、外科用接着剤またはシーラントとして有用な不均質ポリマーを形成するのに用いることができる。
【００４５】
フィブリン鎖前駆体と同様に、本発明の新規な変異体γ鎖前駆体は、特別の態様においてプロまたはプレリーダーペプチドを含む。本発明は、ｖγ鎖前駆体がアセンブリーしてフィブリン−ホモログまたはフィブリン−ホモログ前駆体となる前または後に、該リーダーペプチドが翻訳後にプロセシングされてよいことを提供する。
【００４６】
本発明は、ｖγ鎖をコードするヌクレオチド配列およびプロモーターに機能的に連結した該コード配列を含む発現構築物を提供する。本発明によれば、ｖγ鎖、フィブリノーゲン鎖、およびフィブリン鎖前駆体をコードする構築物の特定の組み合わせの細胞内での同時発現を用いて所望のフィブリン−ホモログを産生することができる。構築物の有用な組み合わせとしては、以下の発現構築物の少なくとも各一つを有するものが挙げられる：１）α鎖またはＮ末端伸長を有するα鎖を形成するための構築物；２）β鎖またはＮ末端伸長を有するβ鎖を形成するための構築物；および３）ｖγ鎖またはＮ末端伸長を有するｖγ鎖を形成するための構築物。
【００４７】
本発明の他の側面は、組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログを製造するための新規手段に関する。とりわけ、本発明は、フィブリン前駆体またはフィブリン鎖前駆体を発現する細胞培養系、フィブリン鎖前駆体の組換え遺伝子を発現してフィブリン鎖を産生する細胞培養系、およびフィブリンおよびフィブリン−ホモログを発現、プロセシングおよびアセンブリーする細胞培養系を提供する。本発明はまた、フィブリン鎖前駆体をインビトロプロセシングしてフィブリン鎖を形成する方法およびフィブリン鎖をインビトロアセンブリーしてフィブリンおよびフィブリン−ホモログを形成する方法をも提供する。
【００４８】
本発明の方法により製造したフィブリン鎖は、血管形成、血小板凝集などを制御するフィブリン由来因子の製造のための実質的に純粋な出発材料の入手源として用いることができる。本発明の方法により製造したフィブリンおよびフィブリン−ホモログは、フィブリン−モノマーベースの外科用シーラントの成分として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログに関する。組換えフィブリン鎖は、フィブリン由来調節因子の有用な入手源である。組換えフィブリンおよびフィブリン−ホモログは、安全で便利なフィブリンシーラントの機能性成分として有用である。本発明は、フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体およびＮ−末端伸長を有するフィブリン鎖をコードする発現構築物で宿主細胞を遺伝子操作した後の、実質的に純粋なフィブリン鎖、フィブリン、フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲン−アナログおよびその前駆体の製造を提供する。
【００５０】
本発明の組換えフィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログは、とりわけコイルドコイル領域およびＥ−ドメインにおいてフィブリノーゲンのトロンビンプロセシングによって産生された天然のフィブリンと同一ではないにしても同様の二次および三次構造を有する。天然のフィブリンモノマーと同様に、本発明の組換えフィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログは、それぞれ、鎖内および鎖間ジスルフィド結合により共有結合した３対の非同一ポリペプチドからなる。組換えフィブリンを形成する非同一ポリペプチドは、フィブリンのα鎖、β鎖およびγ鎖またはその前駆体である。組換えフィブリン−ホモログを形成する非同一ポリペプチドは、フィブリンのα鎖、β鎖およびｖγ鎖などの修飾γ鎖またはその前駆体である。特別の場合において、フィブリノーゲンＢβ鎖はβ鎖と置換してたとえばフィブリンＩおよびフィブリンＩ−ホモログを形成してよく、またはＡα鎖はα鎖と置換してたとえばｄｅｓＢβフィブリン−ホモログを形成してよい。加えて、α鎖またはβ鎖は、それぞれのＡまたはＢフィブリノペプチドとは異なるＮ末端伸長を有していてよい。これらＮ末端が伸長した鎖は、ＡおよびＢフィブリノペプチドが機能するように、重合を阻止または抑制する配列を有する分子を形成するのに用いることができる。これら分子はフィブリノーゲン−アナログである。幾つかの態様において、これら伸長体は開裂してフィブリノーゲン−アナログからフィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーまたはｄｅｓＢＢフィブリンモノマーを生成しうる（この場合には、フィブリノーゲン−アナログはフィブリン前駆体である）。本発明の組換えフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、さらにタンパク質プロセシングすることなく、また適当な条件下で、外科用シーラントの機能性成分として使用しうる均質または不均質のフィブリンまたはフィブリン様ポリマーを形成しうる。
【００５１】
さらに詳しくは、本発明の一つの態様は、フィブリン鎖を形成するための新規なフィブリン鎖前駆体および該前駆体をコードするヌクレオチド配列の使用に関する。新規なフィブリン鎖前駆体には、α鎖、β鎖、γ鎖またはｖγ鎖のＮ末端に融合した異種リーダーペプチドが含まれる。リーダーペプチドは、フィブリン鎖前駆体またはフィブリン鎖前駆体を含むフィブリン前駆体またはフィブリン−ホモログ前駆体から完全かつ特異的にプロセシングされうるプロ配列として機能しうる。好ましい態様において、リーダーペプチドはまた、該リーダーペプチドを含むフィブリン鎖前駆体またはフィブリンおよびフィブリン−ホモログの前駆体の細胞の区画化または細胞外輸送を指令する「プレ」配列としても機能しうる。本発明によって提供されるヌクレオチド配列は新規なフィブリン鎖前駆体をコードする。本発明はまた、フィブリン鎖前駆体をコードする配列と該コード配列の宿主細胞中での発現を制御するプロモーターとが機能的に連結した発現構築物をも提供する。
【００５２】
本発明の他の側面は、フィブリンと同様の構造および特性を有するフィブリン−ホモログ、およびフィブリン−ホモログを製造するための新規な変異体γ鎖またはその前駆体および該鎖および前駆体をコードする核酸配列の使用に関する。本発明の変異体γ鎖は、突然変異γ鎖であり、これをフィブリン分子中に取り込めば（それによってフィブリン−ホモログ分子が生成される）該ホモログが自己重合する能力をなくさせるが、該ホモログがフィブリノーゲンと非共有結合することは可能にするものである。該ホモログの２つのＤ−ドメインは、他のフィブリン分子またはフィブリン−ホモログ分子のＥ−ドメインと安定な分子間非共有結合を形成する能力を欠くのが好ましい。本発明のフィブリン−ホモログが活性化Ｅ−ドメイン（すなわち、ＡまたはＢフィブリノペプチドが除去されたＥ−ドメイン）を有していたとしても、該ホモログがＤ−ドメイン機能を欠くことによって該ホモログが均質ポリマーを形成するのが妨げられる。しかしながら、そのようなホモログも、機能性のＤ−ドメインを有するフィブリン、フィブリノーゲンまたはフィブリン−ホモログと組み合わされた場合には、外科用シーラントとして有用な不均質ポリマーを形成しうる。本発明の新規な変異体γ鎖は、コイルドコイル形成配列のＣ末端側の配列中にＩまたはそれ以上の変異、置換および／または欠失を有する。他の態様において、変異体γ鎖は、Ｃ末端側の保存された一対のＣｙｓ残基のおよそ第一のものからＣ末端までの配列中に１またはそれ以上の変異、置換および／または欠失を有する。さらに他の態様において、変異体γ鎖は、Ｃ末端側の遠位で分子内ジスルフィド結合を形成するシスチン残基の１またはそれ以上の変異、置換および／または欠失を有する。本発明の他の変異体γ鎖は、該変異体γ鎖がＥ−ドメインとの安定な非共有結合を形成できなくなるようにγ鎖の球状ドメインの構造を破壊したり、球状ドメインからの配列を欠失した他の変異を有する。
【００５３】
本発明のさらに他の側面は、（１）修飾γ鎖（変異体γ鎖であってよい）を含むフィブリン−ホモログおよび（２）フィブリノーゲン、フィブリノーゲン−アナログまたはフィブリンモノマー組成を含むフィブリン関連混合ポリマー（該フィブリン−ホモログは第二の組成のフィブリン関連タンパク質に非共有結合している）に関する。第二の組成のフィブリン関連タンパク質は自己重合できないのが好ましい。本発明はまた、混合ポリマーを形成しうるこれら２つの組成を別々に含む外科用シーラントを形成するためのキットをも提供する。
【００５４】
本発明の他の側面は、組換えフィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログを製造する手段に関する。とりわけ、本発明は、本発明のヌクレオチド配列および構築物で遺伝子操作し、フィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖、フィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログを正しく発現、プロセシングおよびアセンブリーさせる宿主細胞系を提供する。本発明のポリペプチドおよびタンパク質分子を発現させるのに有用な宿主細胞としては、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵胞（ＣＨＯ）細胞、肝臓由来Ｈｅｐ細胞などの哺乳動物細胞；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のものなどの真菌細胞；並びに細菌、昆虫および植物細胞が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００５５】
幾つかの態様において、組換えフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリン−アナログの１またはそれ以上の構成鎖の合成は誘導性である。他の態様において、フィブリン鎖、フィブリンまたはフィブリン−ホモログの前駆体上のリーダーペプチドのプロセシングは誘導性である。好ましい態様において、宿主細胞は組換えフィブリン鎖、フィブリン、フィブリン−ホモログまたはその前駆体を合成し、輸送する。特に好ましい態様において、宿主細胞は、輸送された組換えフィブリンまたはフィブリン−ホモログの重合を抑制する、約３．０〜約５．０の間のpHを有する培地などの低pH培地中で組換えフィブリン、フィブリン−ホモログまたはその前駆体を合成し、輸送する。そのような培地は約４．０〜約４．８のpHを有するのが好ましい。適当な生物の例としては、アスペルギルス・フラビウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、およびアスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）が挙げられる。本発明はまた、フィブリン鎖前駆体のフィブリン鎖へのインビトロプロセシングおよびフィブリン鎖のフィブリンおよびフィブリン−ホモログへのインビトロアセンブリーによるフィブリンおよびフィブリン−ホモログの製造を提供する。
【００５６】
好ましくは、本発明のタンパク質または核酸は巨大分子に関して少なくとも約６０％の純度、より好ましくは８０％の純度、さらに一層好ましくは９５％の純度を有する。
【００５７】
開示を明快にするため、および限定を意図するものではなく、本発明の詳細な説明は以下の細項目に分けられる。
１．フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンおよびフィブリン−ホモログ；
２．フィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖をコードするヌクレオチド配列；
３．変異体γ鎖をコードするヌクレオチド配列；
４．フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体およびフィブリノーゲン鎖の発現；
５．発現された遺伝子産物の同定および精製；
６．フィブリン鎖に対する抗体；
７．フィブリン、フィブリンホモログ、およびその前駆体のインビトロアセンブリー；
８．組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログの用途；
９．実施例
【００５８】
１．フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンおよびフィブリンホモログ
フィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログは、それぞれ、鎖内および鎖間ジスルフィド結合により共有結合した３対の非同一ポリペプチドからなる複合タンパク質である。３つの異なるタイプのフィブリンモノマー（フィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマーおよびｄｅｓＢＢフィブリンモノマー）が可能である。フィブリンＩモノマーでは、３対の非同一ポリペプチドは、１）α鎖；２）フィブリノーゲンＢβ鎖；および３）γ鎖である。フィブリンIIモノマーでは、３対の非同一ポリペプチドは、１）α鎖；２）β鎖；および３）γ鎖である。ｄｅｓＢＢフィブリンモノマーでは、３対の非同一ポリペプチドは、１）フィブリノーゲンＡα鎖；２）β鎖；および３）γ鎖である。
【００５９】
上記３つの異なるタイプのフィブリンモノマーに対応して、フィブリンＩ−ホモログ、フィブリンII−ホモログおよびｄｅｓＢＢフィブリン−ホモログを含む異なるタイプのフィブリン−ホモログが可能である。これら３つのタイプのフィブリン−ホモログのポリペプチド組成は、各タイプにおいてγ鎖が修飾γ鎖で置換されている他は上記３つの異なるフィブリンモノマーのものと同一である。たとえば、フィブリンＩ−ホモログは、以下の３対の非同一ポリペプチドであってよい：１）フィブリンα鎖、２）フィブリノーゲンＢβ鎖、および３）ｖγ鎖。
本発明のフィブリン鎖は、フィブリン血餅を形成しうるフィブリンからのフィブリン鎖であればいかなるものであってもよい。同様に、本発明のフィブリノーゲン鎖は、トロンビンによってプロセシングされてフィブリン鎖を形成しうるフィブリノーゲン鎖であればいかなるものであってもよい。好ましい鎖は、ヒトフィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖からのものである。ヒトフィブリノーゲン鎖のヌクレオチド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列については、リクソン（Rixon）らの1983, Biochemistry, 22: 3237〜3244；チャング（Chung）らの1983, Biochemistry, 22: 3244〜3250；チャングらの1983, Biochemistry, 22: 3250〜3256を参照。
【００６０】
変異体γフィブリン（ｖγフィブリン）鎖とは、そのアミノ酸配列中に１またはそれ以上の変異または欠失を有するγ−フィブリン鎖である。変異は、フィブリン−ホモログが自己重合できないように、ｖγ−フィブリン鎖で形成されるフィブリン−ホモログ間の非共有結合の形成を妨害するものであればいかなるものであってもよい。フィブリン−ホモログはフィブリノーゲンや他のフィブリン関連タンパク質と非共有結合を形成できるのが好ましい。変異または欠失は、ｖγ−フィブリン鎖で形成されるフィブリンのＤ−ドメイン→Ｅ−ドメインフィブリン間非共有結合機能を妨害するのが好ましい。好ましい変異または欠失は、Ｄ−ドメインのフィブリン間非共有結合機能に影響を及ぼすものである。特に好ましいのは、γ鎖のＮ末端−遠位鎖内ジスルフィド結合を妨害する変異である。最も好ましいのは、ジスルフィド結合を形成するシスチン残基、すなわちヒトγ鎖におけるＣｙｓ３５２またはＣｙｓ３６５または他のγ鎖における等価物の変異である。これら変異には、いずれかのシスチン残基を除去するミスセンスまたはインフレームの欠失が含まれる。
【００６１】
天然に存在しないγ鎖をコードする核酸を構築するには、天然の配列を出発点として用い、特定のニーズに沿うように修飾してよい。たとえば、配列を変異させて有用な制限部位を導入してよい。マニアチス（Maniatis）らのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（コールドスプリングハーバープレス、１９８９）を参照。かかる制限部位は、「カセット」、すなわち制限酵素およびライゲーション反応を用いて容易に置換できる核酸配列の領域を生成するのに用いることができる。カセットは、変異したγ鎖アミノ酸配列をコードする合成配列を置換するのに用いることができる。別のやり方として、γ鎖をコードする配列は、実質的にまたは完全に合成されたものであってよい。たとえば、ゴッデル（Goeddel）らのProc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106〜110, 1979を参照。組換え発現の目的のためには、かかる核酸が発現される生物におけるコドンの使用の選択を、合成フィブリン鎖をコードする核酸を設計するに際して有利に考慮する。
【００６２】
所定の活性を保持する組換えタンパク質を製造するための欠失または変異法はよく知られている。それゆえ、本発明のフィブリン−ホモログは、フィブリノーゲンと重合する能力を有するフィブリンのアナログを包含する。これらアナログは、フィブリン分子のコイルドコイル領域を形成するγ鎖の配列をすべて保持しているのが好ましい。好ましくは、γ鎖は、約２７２のＣ末端アミノ酸残基以外、より好ましくは約１５０のＣ末端アミノ酸残基以外、さらに好ましくは約１００のＣ末端アミノ酸残基以外、さらに一層好ましくは約８３のＣ末端アミノ酸残基以外は天然のγ鎖と実質的に同一であろう。
【００６３】
好ましくは、保持されるべき天然配列の量は、欠失したまたは変異したγ鎖を含むフィブリン−ホモログにおいて、フィブリノーゲンと非共有結合を形成する天然のフィブリンの能力の実質的にすべてを保存するに十分なものであろう。好ましくは、保持された天然配列は、フィブリン−ホモログにおいてフィブリノーゲンとともに血餅を形成する能力を保存するに十分なものであろう。これら基準を満足させて除去または変異させうる配列の正確な境界は、当該技術分野でよく知られた遺伝子発現法を用いて決定することができる。たとえば、これら基準を満足させるための推定の最小配列をコードする核酸を下記方法を用いて発現およびフィブリン−ホモログに折り畳ませ、得られたフィブリン−ホモログがフィブリノーゲンと相互反応する能力を試験することができる。
【００６４】
当業者であれば、上記欠失したγ鎖を含む本明細書に記載するフィブリン鎖はすべて、本明細書に記載する機能または各フィブリン鎖に付随する他の機能を実質的に妨害することなく、ある程度変異させることができることを認識するであろう。好ましくは、かかる鎖は天然のフィブリン鎖に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、さらに一層好ましくは少なくとも約９９％のホモロジーを有するであろう。
【００６５】
変異および欠失法は、フィブリン鎖を発現する本発明の核酸配列のすべてに適用することができる。上記で記載したように、保存的な変異が好ましい。かかる保存的な変異には、下記群のうちの一つの群内で一つのアミノ酸を他のものと置き換える変異が含まれる。
１．小さな脂肪族で非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，ＰｒｏおよびＧｌｙ；
２．極性で負に荷電した残基およびそのアミド；
３．極性で正に荷電した残基；
４．大きな脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＶａｌおよびＣｙｓ；
５．芳香族残基。
【００６６】
保存的置換の好ましい例示は以下の通りである。
【表１】
2006223316.tif 000002
【００６７】
これら置換タイプの選択は、シュルツ（Schultz）ら（プリンシプルズ・オブ・プロテイン・ストラクチャー（Principles of Protein Structure）、スプリンガー−フェアラーク、１９７８）によって開発された異なる種の相同タンパク質間でのアミノ酸置換の頻度の分析、チョウ（Chou）およびファスマン（Fasman）（Biochemistry 13, 211, 1974およびAdv. Enzymol. 47, 45〜149, 1978）によって開発された構造形成能（structure-forming potentials）の分析、およびアイゼンベルク（Eisenberg）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140〜144, 1984）、カイト（Kyte）＆ドゥーリットル（Doolittle）（J. Molec. Biol. 157, 105〜132, 1981）およびゴールドマン（Goldman）ら（Ann. Rev. Biophys. Chem. 15, 321〜353, 1986）によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づく。
【００６８】
本発明のフィブリン鎖前駆体は、フィブリン鎖のＮ末端に異種リーダーペプチドが融合してなる。リーダーペプチドは複数の別個の配列を含んでいてよく、複数の機能を有していてよい。リーダーペプチドの機能は、正しいＮ末端配列を有するフィブリン鎖を放出するために、リーダーペプチドとフィブリン鎖との間の融合ジャンクションにてフィブリン鎖前駆体の特異的なタンパク質加水分解開裂を可能とすることである。本発明はまた、それぞれＡおよびＢフィブリノペプチドとは異なるＮ末端ポリペプチド伸長を有するフィブリンα鎖およびβ鎖を包含する。これら伸長された鎖はトロンビン認識配列を欠いていてよく、α鎖またはβ鎖を生成するのに適した他のプロテアーゼ認識配列を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００６９】
細胞発現を用いてフィブリン鎖前駆体を産生させる場合は、リーダーペプチドは、発現宿主中でフィブリン鎖前駆体からのリーダー配列の特異的タンパク質加水分解開裂を可能とすることが知られているいかなるリーダー配列をも包含する（下記参照）。リーダーペプチドはさらに、該ペプチドを含む前駆体タンパク質を細胞内区画または好ましくは細胞外へターゲティングする「プレ」機能をコードする配列を有していてよい。細胞発現を用いてＮ末端伸長を有するフィブリン鎖を産生させる場合は、伸長ポリペプチドは発現プロセスの間に部分的または完全な開裂を受けるものであってよい。さらに伸長ポリペプチドは、発現されたタンパク質をターゲティングすべく機能してよい。
【００７０】
従って、フィブリン鎖前駆体のリーダーペプチドまたはＮ末端伸長は、いかなるタンパク質のプレプロ配列をも含んでいてよい。好ましい態様において、プレプロ配列は、フィブリンまたはフィブリン−ホモログを発現するのに用いた宿主細胞または生物にとって、または該プレプロペプチドが正しく認識される宿主細胞または生物に進化上密接に関連した細胞または生物にとって内生のタンパク質からのものである。例示としてであって限定を意図するものではなく、フィブリン鎖前駆体のリーダーペプチドの構築に使用できるプレプロ配列を有するタンパク質は下記の通りである。サッカロミセス中で発現するには、下記タンパク質のいずれの前駆体からのプレプロ（シグナル）配列も使用できる。酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）（パールマン（Perlman）およびハルボーセン（Halvorsen）, 1983, J. Molec. Biol., 67: 391〜409）；およびα−因子（Ｍｆα）（ジュリウス（Julius）ら、1984, Cell, 36: 309〜318；ブレイク（Brake）ら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642〜4646；キングスマン（Kingsman）ら、1985, Biotech. and Genet. Engineering Rev., 3: 377〜416をも参照）。アスペルギルス中で発現させるには、下記タンパク質のいずれの前駆体からのプレプロ（シグナル）配列も使用できる。ニワトリリゾチームシグナル配列（ツチヤ（Tsuchiya）ら、1992, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38: 109〜114）；およびグルコアミラーゼ（ｇｌｎＡ）シグナル配列（ジーンズ（Jeenes）ら、1993, FEMS Microbiol Lett., 107: 267〜272；ウォード（Ward）ら、1990, Biotechnol., 8: 435〜440）。
【００７１】
さらに、プレプロペプチドの開裂認識部位が知られている場合には、開裂認識部位のペプチド配列を用いてリーダーペプチドのカルボキシル末端を形成することができる。開裂可能なリーダーペプチドを構築するのに用いられてきた特異的な開裂認識部位の例としては、トロンビン開裂認識部位（チャング（J.Y. Chang）, 1985, Eur. J. Biochem., 151-217-224）、第Ｘａ因子開裂認識開裂部位（ナガイ（Nagai）およびソーゲンセン（Thorgensen）, 1984, Nature, 309: 810〜812）、およびＫＥＸ２開裂部位（ジュリウスら、上掲）が挙げられる。開裂可能なリーダーペプチドの形成におけるトロンビンおよび第Ｘａ因子開裂認識部位の使用の例としてはスミス（Smith）およびジョンソン（Johnson）、1988, Gene, 67: 31〜40を、ＫＥＸ２部位の使用の例としてはキングスマンの上掲を参照のこと。好ましい認識部位は、ヒト病原体、とりわけウイルス性病原体の担体または保有者である動物に由来しないプロテアーゼに対するものである。
【００７２】
さらに、リーダーペプチドまたはＮ末端伸長は、フィブリン鎖前駆体の精製を容易にする特性を有する配列をも含んでいてよい。所望の特性は、リーダーペプチドを含むタンパク質を該ペプチドを含まないタンパク質から選択的に分離することを可能にする該ペプチドのあらゆる独特の物理的、化学的または生物学的特性に基づいていてよい。そのような「精製配列」の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のカルボキシル末端部分であり、このものはグルタチオンに対して高い親和性を有する。ＧＳＴ精製配列を含むリーダーペプチドを有する融合タンパク質は、グルタチオン−アフィニティーカラムを用いて細胞抽出物から都合よく精製することができる。融合タンパク質のアフィニティー精製におけるＧＳＴ精製配列の使用に関しては、スミスおよびジョンソンの上掲を参照。融合タンパク質精製において有用なリーダーペプチドを形成するのに使用できる他の精製配列としては、それに対する抗体の入手が容易なもの、たとえば、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質精製を容易にするのに使用できるペプチドの他の例としては、転写因子（ガブリエルソン（Gabrielson）およびヒュエット（Huet）, 1993 Methods in Enzymology 218: 508〜525）、ホスホチロシン含有タンパク質およびペプチド（フラッケルトン（Frackelton）ら、1991, Methods in Enzymology, 201: 79〜92）、およびセリンキナーゼ（ウッドゲット（J.R. Woodgett）, 1991, Methods in Enzymology, 200: 169〜178）が挙げられる。
【００７３】
リーダーペプチドまたはＮ末端伸長は、発現宿主中で上記特性の１または２以上を有するタンパク質またはポリペプチドに由来するものであってよい。別のやり方として、リーダーペプチドまたはＮ末端伸長は、幾つかの異なるペプチド配列の混成体であり、各ペプチド配列が発現宿主中で上記特性の１または２以上をフィブリン鎖前駆体に付与しうるものであってよい。混成体のリーダーペプチドでは、構成配列は各配列の全機能を保存するいかなる順序で整列されていてもよい。プロテアーゼ開裂認識部位を含む配列は混成体リーダーペプチドのＣ末端を形成するのが好ましい。
【００７４】
フィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖、フィブリン、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、化学的合成、細胞の遺伝子操作またはこれらの組み合わせにより製造できる。とりわけ、フィブリン鎖前駆体、伸長されたフィブリン鎖、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖は、市販のペプチド合成機などのような当該技術分野で知られた手順を用いて化学的に合成することができる。そのようなポリペプチド合成の標準技術は、メリフィールド（Merrifield）, 1963, J. Chem. Soc., 85: 2149〜2154およびフンカピラー（hukapillar）ら、1984, Nature (ロンドン), 310: 105〜111などの刊行物に記載されている。
【００７５】
好ましい態様において、フィブリン鎖前駆体、伸長されたフィブリン鎖、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖は、細胞および生物の遺伝子操作により産生される（下記参照）。
【００７６】
フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、（必要なら）フィブリン鎖前駆体をインビトロプロセシングし、ついでその構成鎖（すなわち、フィブリン鎖および／またはフィブリノーゲン鎖）を機能性のフィブリンおよびフィブリン−ホモログにインビトロアセンブリングすることにより製造できる（項目７を参照）。フィブリン、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログはまた、細胞および生物の遺伝子操作により産生したフィブリン鎖のインビトロアセンブリングによっても製造できる。さらに、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログはまた、遺伝子操作した細胞および生物を用いて完全にインビボでも製造できる（下記参照）。すなわち、遺伝子操作した細胞および生物を用いてフィブリン前駆体鎖を発現およびプロセシングさせ、ついで得られたフィブリン鎖をフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログにアセンブリングさせることができる。
【００７７】
２．フィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖をコードするヌクレオチド配列
本発明は、フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログの組換え産生に有用な発現構築物を産生するのに使用できるヌクレオチド配列を提供する。本発明により提供されるヌクレオチド配列の特性は、本発明のフィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログを産生するのに使用できる種々の宿主細胞および生物の遺伝子構造と同じくらい様々である。好ましい態様では、絶対に必要というわけではないが明らかに有利であると当業者が認めるであろう多くの特性を記載するであろう。これらには、ヌクレオチド配列および遺伝子構築物の単離、合成または構築、宿主細胞および生物中に導入すべき配列および構築物の操作、配列および構築物のある種の特性、および配列および構築物に付随するベクターのある種の特性が含まれる。
【００７８】
フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖およびフィブリン鎖前駆体をコードする発現構築物の適当な組み合わせを宿主細胞または生物中で発現させることにより製造できる。フィブリンＩモノマー、フィブリンIIモノマー、ｄｅｓＢＢフィブリンモノマー、フィブリンＩ−ホモログ、フィブリンII−ホモログおよびｄｅｓＢＢフィブリン−ホモログを生成するポリペプチド鎖の種々の組み合わせについては項目１を参照。α鎖およびβ鎖はＮ末端メチオニンを有しないので、その遺伝子発現による産生には、インビトロまたはインビボで開裂されて正しいＮ末端配列を生成しうるリーダーペプチドを有するα鎖前駆体およびβ鎖前駆体をコードする構築物を使用する必要がある。
【００７９】
フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、およびＮ末端伸長を有するフィブリン鎖をコードするヌクレオチド配列は、公知のいずれの方法によっても構築できる。構築は単一の方法でも可能であるし、方法の組み合わせでも可能である。所望のヌクレオチド配列の合成は、フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖の公知または導かれたアミノ酸配列、および前駆体鎖の場合にはフィブリン鎖とリーダーペプチドとの配列の組み合わせに基づいて行うことができる。すなわち、アミノ酸配列を、遺伝子コドンから、所望のポリペプチド配列から１またはそれ以上のヌクレオチド配列へ逆翻訳する（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）。そのような逆翻訳に使用できるフィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖およびリーダーペプチドのアミノ酸配列を含む文献については上記を参照。好ましい態様においては、逆翻訳したコード配列のコドンの使用は、コードしたポリペプチドを発現するのに使用した宿主細胞または生物の好ましいコドンの使用と一致するものである。
【００８０】
所望のヌクレオチド配列の合成は、当該技術分野で知られた標準化学法（たとえば、フンカピラーら、1984, Nature, 310: 105〜111を参照）により行うことができる。別のやり方として、ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成したオリゴヌクレオチドプライマー断片とともにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いて合成することができる。ＰＣＲ法については、たとえば、ゲルフィンド（Gelfind）、１９８９、ＰＣＲテクノロジー  プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ・フォア・ＤＮＡ・アンプリフィケーション（PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification）、エーリッヒ（H.A. Erlich）編、ストックトンプレス、ニューヨーク；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Currrent Protocols in Molecular Biobology）, 1988, Vol.2, Ch.15、オースベル（Ausubel）ら編、ジョンウイリー＆サンズ；およびホートン（Horton）ら、1989, Gene, 77: 61〜68を参照。
【００８１】
フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖前駆体、およびＮ末端伸長を有するフィブリン鎖をコードするヌクレオチド配列はまた、当該技術分野でよく知られた組換えＤＮＡ法を用いて構築することができる。たとえば、サンブルック（Sambrook）ら、１９８９、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨークに記載された技術を参照。組換えＤＮＡ法はまた、他の方法、たとえば化学的合成やＰＣＲにより産生されたヌクレオチド配列を維持し、操作し、および／または組換えるのに使用できる。
【００８２】
組換えＤＮＡ法を用いた所望のヌクレオチド配列の構築は、フィブリノーゲン鎖、フィブリン鎖およびリーダーペプチドの利用可能なクローニング配列を操作することにより行うことができる。そのようなクローニング配列は、たとえば制限消化およびライゲーションにより構築に直接使用できる。
【００８３】
別のやり方として、クローニング配列はまたヌクレオチドプローブを構築するのに使用でき、該プローブは、標準法を用いて適当なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから所望の鎖またはリーダーペプチドをコードするゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンを単離するのに使用できる。そのような方法としては、たとえば、バクテリオファージライブラリーについてはベントン（Benton）およびデービス（Davis）, 1977, Science, 196: 180、プラスミドライブラリーについてはグルンスタイン（Grunstein）およびホグネス（Hogness）, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961〜3965を参照。さらに、ヌクレオチド配列はまた、適当なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡから所望の鎖、リーダーペプチドまたはＮ末端伸長をコードする配列を増幅するのに使用できるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを構築するのに用いることができる。ＰＣＲは、たとえば、パーキン−エルマーシータスサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ  ＡｍｐTM）を使用して行うことができる。増幅する核酸はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む。ＰＣＲ反応に使用するため幾つかの異なる縮重プライマーを合成するのを選択することができる。また、ＰＣＲ反応をプライミングするのに使用するハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変え、フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質をコードする未知のヌクレオチド配列と単離した核酸ホモログとの間でヌクレオチド配列の類似性の程度を一層大きくまたは小さくすることができる。所望のクローニング配列のセグメントを首尾よく増幅した後、このセグメントを分子的にクローニングおよびシークエンシングし、完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのプローブとして利用することができる。それはまた、出発材料の核酸中に最初に増幅したセグメントに隣接して存在する配列を増幅するのに使用できる５′ＲＡＣＥ法に使用するＰＣＲプライマーを設計するのに用いることができる。５′ＲＡＣＥ法については、フローマン（Frohman）、「ラビッド・アンプリフィケーション・オブ・ｃＤＮＡ・フォア・ジェネレーション・オブ・フル−レンクス・ｃＤＮＡ（Rapid Amplification of cDNA for Generation of Full-Length cDNA）」、Methods in Enzymology, 218: 340〜356, 1993を参照。
【００８４】
いかなるヒト細胞（または他のフィブリン産生生物に由来する細胞）も、潜在的にフィブリン鎖またはフィブリノーゲン鎖をコードする配列のモレキュラークローニングのための核酸源になりうる。いかなる細胞または生物も、潜在的に、リーダーペプチドの成分の採取源となりうるタンパク質をコードする配列のクローニングのための核酸源となりうる。「リーダーペプチド成分」の好ましい採取源は、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体またはフィブリン−ホモログを発現させるのに使用した宿主細胞または生物である。ＤＮＡは、クローニングしたＤＮＡ（たとえば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製したゲノムＤＮＡまたはその断片のクローニングにより、当該技術分野で知られた標準法により得ることができる。（たとえば、サンブルックら、１９８９、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；グロバー（Glover, D.M.）（編）、１９８５、ＤＮＡ・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）、ＭＲＬプレス、オックスフォード、U.K. Vol.Ｉ，IIを参照）。ゲノムＤＮＡに由来するクローンはコード領域に加えてある種の調節ＤＮＡ領域およびイントロンＤＮＡ領域を含みうる：ｃＤＮＡに由来するクローンはイントロンを欠き、エクソン配列のみを含むであろう。採取源がいかなるものであれ、コード配列の増殖のため該配列を適当なベクター中に分子的にクローニングしなければならない。
【００８５】
ゲノムＤＮＡからのコード配列のモレキュラークローニングにおいて、ＤＮＡ断片が得られ、その幾つかは所望の配列をコードしているであろう。ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて特定の部位で開裂できる。別のやり方として、ＤＮＡを断片化するためにマンガンの存在下でＤＮアーゼを用いることができ、または、たとえば超音波処理によりＤＮＡを物理的に切断することができる。線状化したＤＮＡ断片は、ついでアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを含む（これらに限られるものではない）標準法によりサイズに従って分離することができる。
【００８６】
ＤＮＡ断片が得られたら、所望のコード配列を含む特定のＤＮＡ断片の同定を多くの仕方により行うことができる。たとえば、相当量のフィブリン鎖遺伝子またはその特定ＲＮＡの一部が入手可能で精製でき、または合成でき標識できる場合には、得られたＤＮＡ断片は標識プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる（ベントンおよびデービス、1977, Science, 196: 180；グルンスタインおよびホグネス、1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961）。プローブに対して実質的なホモロジーを有するＤＮＡ断片がハイブリダイズするであろう。適当な断片の同定はまた、制限酵素消化し、得られた断片のサイズを公知の制限地図（利用可能かまたは公知のヌクレオチド配列から導かれたもの）から期待されるサイズと比較することによっても可能である。さらなる選択は、遺伝子の特性に基づいて行うことができる。別のやり方として、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイにより検出できる。たとえば、ｃＤＮＡクローン、または適切なｍＲＮＡをハイブリダイズ選択できるＤＮＡクローンは、たとえば、フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質について知られている電気泳動移動度、等電点電気泳動における挙動、タンパク質加水分解消化地図、結合活性、または抗原特性と類似または同一の特性を有するタンパク質を産生するものとして選択できる。所望のタンパク質に対する抗体を使用することにより、ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）型の方法において推定フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質を合成するクローンへの標識抗体の結合によって同定することができる。
【００８７】
フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質をコードする配列はまた、核酸ハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡ選択した後にインビトロ翻訳させることによっても同定できる。この方法では、相補的なｍＲＮＡをハイブリダイゼーションによって単離するために断片を用いる。単離したｍＲＮＡの単離産物のインビトロ翻訳産物の免疫沈降分析は該ｍＲＮＡ、それゆえ所望の配列を含む相補的なＤＮＡ断片を同定できる。加えて、特定のｍＲＮＡは、フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質に対して特異的に向けられた固定化抗体への細胞から単離したポリソームの吸着によっても選択できる。フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖およびリーダーペプチド含有タンパク質をコードする放射性標識したｃＤＮＡは、（吸着したポリソームから）選択したｍＲＮＡを鋳型として用いて合成できる。放射性標識したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ついで、他のゲノムＤＮＡ断片からフィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖またはリーダーペプチド含有タンパク質をコードする断片を同定するためのプローブとして使用できる。
【００８８】
同定および単離したコード配列は、ついで適当なクローニングベクター中に挿入できる。当該技術分野で知られた多くのベクター−宿主系を使用できる。可能なベクターとしては、プラスミド、コスミド、または修飾したウイルスまたはバクテリオファージが挙げられ、これらに限られるものではないが、ベクター系は使用した宿主細胞と適合するものでなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダおよびＴ４ファージ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミドが挙げられるが、これらに限られるものではない。クローニングベクター中への挿入は、たとえば、相補的な粘着末端を有するクローニングベクター中に該ＤＮＡ断片をライゲートすることにより行うことができる。しかしながら、ＤＮＡを断片化するのに用いた相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合には、該ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾して、たとえば平滑末端ライゲーションを可能とすることができる。別のやり方として、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲートすることにより所望の部位を生成することができる；これらライゲートしたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成したオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。別の方法において、開裂したベクターおよびクローニングすべき配列はホモポリマーテーリングにより修飾できる。組換え分子は、該遺伝子配列の多数のコピーが得られるように、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞中に導入できる。
【００８９】
別の方法において、所望の配列は、適当なクローニングベクター中に挿入した後に「ショットガン」法において同定および単離できる。たとえばサイズ分画により所望のコード配列を富ませることは、クローニングベクター中に挿入する前に行うことができる。
【００９０】
特別の態様において、単離したフィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖、リーダーペプチドまたはＮ末端伸長をコードする配列または合成ＤＮＡ配列を導入した組換えＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換することにより、遺伝子の複数のコピーを生成することが可能となる。それゆえ、形質転換体を増殖させ、該形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要なら該単離した組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる。
【００９１】
フィブリン鎖、フィブリノーゲン鎖およびリーダーペプチド含有タンパク質をコードするクローニングおよび合成ヌクレオチド配列は、さらに、標準組換えＤＮＡ法を用いて所望の前駆体鎖をコードする配列を構築するために操作および使用できる。たとえば、所望のリーダーペプチドまたはＮ末端伸長が幾つかの異なるタンパク質からのペプチド配列を含む場合には（上記参照）、各ペプチドをコードするヌクレオチド配列を一緒に連続的なコード配列中にスプライスし、この混成コード配列を今度はフィブリン鎖コード配列の５′末端にスプライスすることができる。そのようなスプライシングには、各コード配列上に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位、インビトロ突然変異誘発またはＰＣＲ増幅により導入した人為的な制限部位またはクローニングした断片の末端にライゲートしたリンカーの制限エンドヌクレアーゼ部位の使用を含む、当該技術分野で知られた戦略を利用することができる。同様に、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ由来の配列は、フィブリン鎖前駆体またはフィブリノーゲン鎖構築物にとっては望ましくない調節配列、リーダーＲＮＡ配列、イントロンおよび／またはテーラーＲＮＡ配列を含みうるので、そのような外来配列は上記で記載したようなものを含む公知の組換えＤＮＡ法により除去することができる。
【００９２】
３．変異体γ鎖をコードするヌクレオチド配列
変異体γ鎖（ｖγ鎖）の製造および使用もまた想起することができ、本発明の範囲内に含まれる。項目１にも記載したように、フィブリンのＤ−ドメイン機能の欠失となるｖγ鎖としては、γ鎖のＮ末端遠位分子内にジスルフィド結合を破壊する変異を含む変異体が挙げられるが、これに限られるものではない。特に好ましい変異としては、ヒトγ鎖中のＣｙｓ３５２および／またはＣｙｓ３６５残基または他のγ鎖中の等価なＣｙｓのミスセンス変異、または同残基を除去するインフレームの欠失が挙げられるが、これらに限られるものではない。たとえば、有用なミスセンス変異としては、シスチン残基の一つまたは両方がアラニンまたはバリン残基となる変異が挙げられる。他の有用な変異としては、Ｃｙｓ３５２またはＣｙｓ３６５部位またはその近傍のｖγ鎖の二次および／または三次コンホメーションを変化させる変異が挙げられるが、これに限られるものではない。これら構造的な変化は、ｖγ鎖がフィブリンまたはフィブリノーゲン分子中に導入されたときに該Ｃｙｓ残基が分子内ジスルフィド結合を形成できないようにするようなものであってよい。
【００９３】
ｖγ鎖は、当該技術分野で知られた種々の方法により製造できる。該鎖の産生となる操作は、遺伝子レベルでもタンパク質レベルでも起こりうる。γ鎖は当該技術分野で知られた方法を用い、部位特異的突然変異誘導により遺伝子レベルで変化させることができる。採用しうる一つのアプローチは、塩基置換を有する変異体γ鎖を構築するための合成オリゴヌクレオチドの使用を含む。一つの態様において、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖の形態の野生型のγ鎖配列にアニールさせる（ゾラー（Zoller）およびスミス（Smith）, 1984, DNA 3: 479〜488）。得られた短いヘテロ二本鎖は、第二の鎖をＤＮＡポリメラーゼにより合成するためのプライマーとして機能しうる。５′末端には一本鎖のニックが生成されるが、これはＤＮＡリガーゼにより閉じられる。他の態様においては、それぞれ変異配列を含む２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成する。これら相補的なオリゴヌクレオチドがアニールした後に生成される二本鎖は、ＤＮＡリガーゼによって一層大きなＤＮＡ分子に結合させることができるが、両分子の末端が相補的な一本鎖「粘着」末端を有することを条件とする。採用できる他のアプローチは、ＤＮＡ分子中に小さな一本鎖ギャップを導入し、ついでミス修復ＤＮＡ合成、すなわちギャップ中での非相補的なヌクレオチドのミス導入を含む（ボットスタイン（Botstein）およびショートル（Shortle）, 1985, Science, 229: 1193）。ギャップにチオールヌクレオチドを導入すると非相補的なヌクレオチドの切り出しを最小にすることができる。別のやり方として、変異体γ鎖をコードする配列は、当該技術分野で知られた方法（たとえば、フレーラー（Froehler）, 1986, Nucl. Acids Res., 14: 5399〜5407およびカルザース（Caruthers）ら、1982, Genetic Engineering、セットロウ（J.K. Setlow）およびホレンダー（A. Hollaender）ら編、プレナムプレス、ニューヨーク、vol.4, 1〜17頁）を用いてＤＮＡを化学的に合成することにより調製できる。好ましい態様において、変異体γ鎖のセグメントをコードする断片を化学的に合成し、ついでこれら断片を一緒にライゲートする。得られた変異体γ鎖コード鎖は当該技術分野で知られた方法、たとえばＰＣＲ法を用いて増幅することができ、ついで項目２に記載したようにクローニングベクター中に挿入できる。特別の態様において、ＰＣＲ増幅をプライミングするのに使用したオリゴヌクレオチド中にミスマッチを導入することにより部位特異的突然変異を生成することができる（ジョーンズ（Jones）およびハワード（Howard）, 1990, Biotechniques, 8: 178〜180）。
【００９４】
欠失変異を生成するための多数の方法が当該技術分野で知られている。たとえば、サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバープレス、１９８９を参照。これらには、偶然の制限部位、エクソヌクレアーゼ消化戦略およびＰＣＲ法を用いた部分長配列の増幅を使用した方法が含まれるが、これらに限られるものではない。
【００９５】
４．フィブリン鎖、Ｎ末端伸長を有するフィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖の発現
本発明のフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、Ｎ末端伸長を有するフィブリン鎖またはフィブリノーゲン鎖をコードするヌクレオチド配列は、適当な発現ベクター、すなわち挿入したタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター中に挿入することができる。該タンパク質コード配列を発現させるために種々の宿主−ベクター系を利用できる。これらには、ウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスなど）を感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡベクターで形質転換したまたはウイルスでトランスフェクションした植物または植物細胞；酵母ベクターまたは真菌ベクターを含む酵母または真菌、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌などの微生物が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００９６】
ベクターの発現要素は、その強さおよび特異性が様々である。利用した宿主−ベクター系に依存して、多くの適当な転写および翻訳要素の一つを使用できる。本発明の特別の態様は、本発明のフィブリンおよびフィブリン−ホモログの各構成鎖のすべての発現を含む。本発明の別の態様は、完全かつ機能性のフィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの産生を可能とする、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、伸長したフィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖の特定の組み合わせの同時発現を含む。
【００９７】
ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入のための本明細書に記載する方法のいずれを用いても、適当な転写および／または翻訳調節シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築できる。これら方法には、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成法およびインビボ組換え法（遺伝子組換え）が含まれる。フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、Ｎ末端伸長を有するフィブリン鎖またはフィブリノーゲン鎖をコードするヌクレオチド配列の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主中でフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体およびフィブリノーゲン鎖が発現されるように第二のヌクレオチド配列によって調節されうる。たとえば、所望のタンパク質の発現は、当該技術分野で知られたプロモーターおよび／またはエンハンサー要素によって制御されうる。所望のフィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖の発現を制御しうるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（バーノイスト（Bernoist）およびシャンボン（Chambon）, 1981, Nature, 290: 304〜310）、ラウス肉腫ウイルスの３′ロングターミナルリピート（long terminal repeat）中に含まれるプロモーター（ヤマモト（Yamamoto）ら、1980, Cell, 22: 787〜797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ワグナー（Wagner）ら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1441〜1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（ブリンスター（Brinster）ら、1982, Nature, 296: 39〜42）、原核細胞発現ベクター、たとえば、β−ラクタマーゼプロモーター（ビラ−カマロフ（Villa-Kamaroff）ら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727〜3731）、ｔａｃプロモーター（ドゥボア（DeBoer）ら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21〜25）、ｔｒｐＥプロモーター；Scientific American, 1980, 242: 74〜94中の「組換え細菌からの有用なタンパク質（Useful proteins from recombinant bacteria）」をも参照；オパインシンテターゼプロモーター領域（ヘレラ−エストレラ（Herrera-Estrella）ら、Nature, 303: 209〜213）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（ガードナー（Gardner）ら、1981, Nucl. Acids Res., 9: 2871）を含有する植物発現ベクター、および光合成酵素のリブロース２リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（ヘレラ−エストレラら、1984, Nature, 310: 115〜120）；組織特異性を示しトランスジェニック動物において利用されてきた下記動物転写調節領域からのプロモーター：膵臓胞状細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（スウィフト（Swift）ら、1984, Cell, 38: 639〜646；オーニッツ（Ornitz）ら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50: 399〜409；マクドナルド（MacDonald）, 1987, Hepatology, 7: 425〜515）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（ハナハン（Hanahan）, 1985, Nature, 315: 115〜122）、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（グロスシェドル（Grosshedl）ら、1984, Cell, 38: 647〜658；アダムス（Adames）ら、1985, Nature, 318: 533〜538；アレキサンダー（Alexander）ら、1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436〜1444）、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性なマウス乳腫瘍ウイルス調節領域（レダー（Leder）ら、1986, Cell, 45: 4ss〜4s5）／肝臓において活性なアルブミン遺伝子調節領域（ピンカート（Pinkert）ら、1987, Genes and Devel., 1: 268〜276）、肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子調節領域（��ルムラウフ（Krumlauf）ら、1985, Mol. Cell. Biol., 5: 1639〜1648；ハマー（Hammer）ら、1987, Science, 235: 53〜58）；肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（ケルシー（Kelsey）ら、1987, Genes and Devel., 1: 161〜171）、脊髄細胞において活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（モグラム（Mogram）ら、1985, Nature, 315: 338〜340；コリアス（Kollias）ら、1986, Cell, 46: 89〜94）；脳中の寡突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（リードヘッド（Readhead）ら、1987, Cell, 48: 703〜712）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（サニ（Sani）ら、1985, Nature, 314: 283〜286）、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（メイソン（Mason）ら、1986, Science, 234: 1372〜1378）が挙げられ、これらに限られるものではない。
【００９８】
好ましい態様において、宿主系は酵母または糸状菌などの真菌である。異種タンパク質の発現のためのそのような系はよく開発されている。有用なサッカロミセス・セレビシエ発現ベクター（およびプロモーター）および宿主としては、キングスマンら、1985, Biotech. and Genet. Engineering Rev., 3: 377〜416；またはエムル（S.C. Emr）, 1990, Meth. Enzymology, 185: 231に記載されているものが挙げられる。有用な非サッカロミセス酵母発現ベクターおよび宿主としては、レイサー（Reiser）ら、1990, Adv. Biochem. Engineering Biotechn., 43: 75〜102に記載されているものが挙げられる。アスペルギルスベクターおよび宿主もまた本発明の好ましい発現系である。有用なアスペルギルスベクターおよび宿主としては、シュバレット（Chevalet）ら、1993, J. Biotechn., 27: 239〜246（アスペルギルス・フラビウス（Ａ．ｆｌａｖｉｕｓ）発現ベクターおよび宿主株）；ジーンズ（Jeenes）ら、1993, FEMS Microbiol. Lett., 107: 267〜272、バードス（Verdoes）ら、1993, Transgenic Res., 2: 84〜92、アーチャー（Archer）ら、1992, Biotechn. Leet., 14: 357〜369、ロバーツ（Roberts）ら、1992, Biotechn. Leet., 14: 897〜902、カーン（Khanh）ら、1992, Biotechn. Leet., 14: 1047〜1052、およびシャリフ（Sharif）ら、1992, Appl. Microbiol. Biotechn., 38: 115〜116（アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターおよび宿主）；ラチムンド（Lachmund）ら、1993, Current Microbiol., 26: 47〜51、およびウォード（Ward）ら、1992, Gene, 122: 219〜223（アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）発現ベクターおよび宿主）、ウォードら、上掲文献、およびツチヤ（Tsuchiya）ら、1992, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38: 109〜114（アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）発現ベクターおよび宿主）が挙げられるが、こられに限られるものではない。フィブリンおよびフィブリン−ホモログのインビボ産生および分泌に特に好ましい宿主は、pH４．０またはそれ以下で増殖しうる宿主細胞である。所望の培養が低pHであるのは、そのような宿主の酸性の代謝、すなわち、酸の生成、または培地への酸の人為的な添加によるものである。従って、有用な宿主は、サッカロミセス、アスペルギルス、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が挙げられ、これらに限られるものではない。
【００９９】
フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体およびフィブリノーゲン鎖挿入を含む発現ベクターは、３つの一般的なアプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および（ｃ）挿入された配列の発現によって同定できる。第一のアプローチでは、発現ベクター中に挿入したポリペプチドコード配列の存在は、挿入した配列に相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第二のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクター中への異種配列の挿入および該ベクターによる宿主の形質転換によって引き起こされた、ある種の「マーカー」遺伝子機能（たとえば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体の形成など）の存在または不存在に基づいて同定および選択することができる。たとえば、ベクターのマーカー遺伝子配列内にフィブリン鎖のコード配列が挿入されると、フィブリン鎖挿入を有する組換え体は該マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。第三のアプローチでは、組換え発現ベクターは宿主細胞によって発現された異種遺伝子産物をアッセイすることによって同定することができる。そのようなアッセイは、たとえば、インビトロアッセイ系における発現構築産物の物理的または機能的な特性、たとえば、フィブリンポリマーの形成（ハートウィッグ（Hartwig）およびダニシェフスキー（Danishefsky）, 1991, J. Biol. Chem., 266: 6578〜6585）、フィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体またはフィブリノーゲン鎖に対して向けられた抗体を用いたイムノアッセイに基づいていてよい。
【０１００】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定および単離されたら、当該技術分野で知られた幾つかの方法を用いて該分子を増殖させることができる。適当な宿主系および増殖条件が確立されたら、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製することができる。すでに説明したように、使用できる発現ベクターとしては、わずかばかりの列を挙げるとすれば以下のベクターまたはその誘導体が挙げられるが、これらに限られるものではない：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（たとえば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【０１０１】
加えて、挿入した配列の発現を調節するか、または特定の所望の仕方で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロモーターからの発現はある種のインデューサーの存在下で促進されうる；それゆえ、遺伝子操作したフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体およびフィブリノーゲン鎖タンパク質の発現は制御することができる。さらに、異なる宿主細胞および生物は、タンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングおよび修飾（たとえば、開裂）のための特徴的で特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にすべく適当な細胞株または宿主系を選択することができる。異なるベクター／宿主系はタンパク質加水分解開裂などのプロセシング反応に種々の程度に影響を及ぼすので、そのような差異は産生された最終タンパク質産物を制御する機会を与える。
【０１０２】
特定の態様において、宿主細胞または生物は、Ｎ末端伸長またはリーダーペプチド上のターゲティング（「プレ」）および特異的な開裂（「プロ」）シグナル配列を認識することができる。そのような宿主は、単一のフィブリン鎖前駆体をコードする構築物を発現させるのに用いた場合に、成熟した（すなわち、タンパク質分解酵素によりプロセシングされた）フィブリン鎖または短くなったＮ末端伸長を有するフィブリン鎖を産生および分泌するであろう。同宿主を、必要な（ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ）フィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖（フィブリンまたはフィブリン−ホモログを構成する）をコードする構築物を発現させるのに用いた場合には、成熟したフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログを産生するであろう。この点で、アスペルギルス宿主は特に好ましい。なぜなら、アスペルギルス宿主は、細菌から哺乳動物由来のものにわたる異種源のターゲティングおよび開裂シグナルを正しく認識およびプロセシングするまで非常に適用範囲が広いからである。グウィン（Gwynne）ら、1987, Biotechnol., 5: 369〜376；アップシャル（Upshall）ら、1987, Biotechnol., 5: 1301〜1304；ウォード（Ward）ら、1992, Gene, 122: 219〜223；ツチヤ（Tsuchiya）ら、1992, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38: 109〜1134参照。
【０１０３】
他の態様において、宿主細胞または生物は、Ｎ末端伸長またはリーダーペプチド上のターゲティング（「プレ」）シグナル配列は認識できるが特異的な開裂（「プロ」）シグナル配列は認識できない。そのような宿主は、単一のフィブリン鎖前駆体またはＮ末端伸長を有するフィブリン鎖をコードする構築物を発現させるのに用いた場合に、フィブリン鎖前駆体またはＮ末端伸長を有するフィブリン鎖を分泌する。同宿主を、必要なフィブリン鎖前駆体、Ｎ末端伸長したフィブリン鎖、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖（フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログ、またはフィブリノーゲン−アナログを構成する）をコードする構築物を発現させるのに用いた場合には、フィブリンモノマーの前駆体、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの前駆体を分泌する。かくして産生されたフィブリン鎖前駆体、フィブリンモノマー前駆体またはフィブリン−ホモログ前駆体は、さらにインビトロでプロセシングして（すなわち、適当なプロセシングプロテアーゼで開裂して）対応する成熟したポリペプチドまたはタンパク質を産生することができる。たとえば、フィブリン鎖、フィブリンモノマーまたはフィブリン−ホモログ前駆体のリーダーペプチドが第Ｘａ因子認識部位を含む場合には、リーダーペプチドは第Ｘａ因子でインビトロ消化することにより開裂できる。スミスおよびジョンソンの上掲文献を参照。
【０１０４】
さらに他の態様において、宿主細胞または生物は、フィブリン鎖前駆体またはＮ末端伸長を有するフィブリン鎖のリーダーペプチド上のターゲティング（「プレ」）または特異的な開裂（「プロ」）シグナル配列を認識できない。そのような宿主は、フィブリン鎖前駆体またはＮ末端伸長を有するフィブリン鎖をコードする構築物を発現させるのに用いた場合に、フィブリン鎖前駆体または他の仕方で伸長したフィブリン鎖を産生または分泌するであろう。同宿主を、必要なフィブリン鎖前駆体、Ｎ末端伸長したフィブリン鎖、フィブリン鎖およびフィブリノーゲン鎖（フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログを構成する）をコードする構築物を発現させるのに用いた場合には、フィブリンの前駆体、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの前駆体を産生および分泌するであろう。かくして産生したフィブリン鎖前駆体、フィブリン前駆体またはフィブリン−ホモログ前駆体は、宿主細胞から回収し、さらにインビトロでプロセシングして（すなわち、適当なプロセシングプロテアーゼで開裂して）対応する成熟したポリペプチドまたはタンパク質を産生することができる。
【０１０５】
本発明はまた、適当な場合に、フィブリン鎖前駆体またはかかる前駆体を含むフィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログの分泌および／またはプロセシングを可能にする必要な分泌および／またはプロセシング機能を有する宿主細胞または生物を操作することをも提供する。たとえば、フィブリン鎖前駆体のリーダーペプチドが第Ｘａ因子またはトロンビン開裂認識部位を含む場合には、フィブリン鎖前駆体またはそのようなフィブリン鎖前駆体からアセンブリーしたフィブリンまたはフィブリン−ホモログの前駆体からのリーダーペプチドの適当な開裂が可能となるように、第Ｘａ因子またはトロンビンをコードする発現構築物で宿主細胞または生物を操作することができる。同様に、特定のターゲティング配列について輸送または膜機能が同定されている場合には、フィブリン鎖前駆体またはフィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの前駆体であるかにかかわらず、所望のターゲティングまたはリーダーペプチド含有タンパク質の分泌を可能とするため、遺伝子工学により、または可能なら伝統的な遺伝子操作により、該機能を分泌欠損宿主細胞または生物中に導入することができる。
【０１０６】
５．発現された遺伝子産物の同定および精製
特定のコード配列について発現構築物が同定されたら、所望の遺伝子産物の発現を分析し、タンパク質産物を精製することができる。発現された産物の分析は、沈降遠心分離；遺伝子産物に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡを含むイムノアッセイ（項目６を参照）；ＨＰＬＣ；ゲル電気泳動；フィブリンポリマーの生成（ハートウィッグおよびダニシェフスキー、上掲文献）；などを含む、該産物の物理的または機能的特性に基づくアッセイにより行うことができる。
【０１０７】
混入物からのフィブリン鎖前駆体、フィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの単離および精製は、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解、またはタンパク質の精製のための他の標準法を含む標準法により行うことができる。ＣＮ／セルロースクロマトグラフィーを用いた個々のフィブリン鎖を分離する手順についてはムラノ（Murano）ら、1971, FEBS Lett., 14: 37〜41を参照。リーダーペプチドまたはＮ末端伸長が「精製容易化（purification-facilitating）」部分または配列を含む場合には、フィブリン鎖前駆体、Ｎ末端伸長したフィブリン鎖、フィブリン前駆体、フィブリン−ホモログ前駆体またはフィブリノーゲン−アナログの精製は、対応するアフィニティー法（たとえば、ＧＳＴ由来のリーダーペプチドを含むタンパク質に対してはグルタチオニンカラム、特異的な抗体が存在するリーダーペプチドを含むタンパク質に対しては抗体カラムまたは免疫沈降など）を用いて行うことができる。さらに、個々のフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体または伸長したフィブリン鎖の精製は、個々のフィブリン鎖（すなわち、α鎖、β鎖、γ鎖またはｖγ鎖）に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いたイムノアフィニティー法を用いて行うことができる（項目６を参照）。
【０１０８】
フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログおよびそれらの前駆体の精製はまた、それらが非共有結合した「可溶性の」ポリマーを自発的に生成する能力に基づいても行うことができる。特別の態様において、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログの前駆体（すなわち、その構成鎖の１またはそれ以上の上に存在するリーダーペプチドまたはＮ末端伸長を有するもの）は、適当な「開裂部位特異的な」プロテアーゼ（たとえば、第Ｘａ因子またはトロンビン）によりインビトロでプロセシングすることができる。インビトロまたはインビボでプロセシングされたフィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログは、まず、重合を妨害する緩衝液（たとえば、pH≦４．０の緩衝液）中で前記の通常の生化学的手順のいずれかを用いて精製することができる。フィブリンモノマーまたは自己重合しうるフィブリノーゲン−アナログが産生される場合には、フィブリンモノマーまたはフィブリノーゲン−アナログをついで緩衝液を中性にすることにより重合させ、可溶性の混入物からフィブリンポリマーを分離できる適当なフィルターを用いた濾過により精製する。適当なフィルターとしては、ポレックス（Porex, Inc.）からの焼結ポリプロピレン２０ミクロン孔径フィルター、フルオロテクニクス（Fluorotechniques, Inc.）からのテフロン（登録商標）２０〜７０ミクロン孔径フィルター、またはコスター（Coster, Inc.）からのナイロン６６  ２２〜４６ミクロン孔径フィルターが挙げられる。産生したフィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログの機能的特性は、フィブリン、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログへのアセンブリーおよびフィブリンポリマーの生産を含む（これに限られるのではない）適当なアッセイを用いて評価できる。
【０１０９】
６．フィブリン鎖に対する抗体
公知の方法を用いて製造した実質的に純粋なフィブリン鎖調製物を免疫源として用い、各フィブリン鎖（すなわち、α鎖、β鎖、γ鎖またはｖγ鎖）およびその前駆体に対する特異的抗体を産生することができる。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーからのものであってよい。当該技術分野で知られた種々の手順を用いてフィブリン鎖に対するポリクローナル抗体を産生することができる。特別の態様において、各フィブリン鎖に対するウサギポリクローナル抗体を得ることができる。抗体を産生するには、組換えにより製造したフィブリン鎖、またはその合成体または断片で種々の宿主動物を免疫すればよい。有用な宿主としては、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限られるものではない。免疫学的応答を増大するため、宿主の種に依存して種々のアジュバントを用いることができ、フロイント（完全および不完全）のアジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル、界面活性物質、たとえば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（バシルカルメット−ゲリン（bacille Calmette-Guerin））やコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限られるものではない。
【０１１０】
フィブリン鎖またはフィブリン鎖前駆体に対して向けられたモノクローナル抗体を調製するには、培養中の継続細胞株により抗体分子を産生することのできるいかなる技術も用いることができる。たとえば、コーラー（Kohler）およびミルシュテイン（Milstein）により最初に開発されたハイブリドーマ法（1975, Nature, 256: 495〜497）、並びにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コズボレ（Kozbor）ら、1983, Immunology Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（コール（Cole）ら、1985、「モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アラン・アール・リス（Alan R. Liss. Inc.）, 77〜98頁）が挙げられる。
【０１１１】
該分子のイディオタイプ（結合ドメイン）を含む抗体断片は、公知の技術により生成できる。たとえば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ′）２フラグメント；Ｆ（ａｂ′）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成できるＦａｂフラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成できるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限られるものではない。
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当該技術分野で知られた技術、たとえばＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）、ウエスタンブロッティング、免疫拡散アッセイにより行うことができる。たとえば、α鎖を認識する抗体を選択するには、実質的に純粋なα鎖、フィブリンまたはフィブリノーゲン調製物に結合する生成物について生成ハイブリドーマをアッセイすることができる。
【０１１２】
上記抗体は、項目５に記載したようにフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログまたはフィブリノーゲン−アナログのイムノアッセイにおいて有用性を有する。これら抗体はまた、項目５に記載したようにフィブリン鎖、フィブリン鎖前駆体、フィブリンまたはフィブリン−ホモログのイムノアフィニティー精製のための試薬としての有用性をも有する。
【０１１３】
７．フィブリン、フィブリンホモログおよびその前駆体のインビトロアセンブリー
本発明の他の側面は、構成鎖からのフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログおよびその前駆体のインビトロアセンブリーを提供する。構成ポリペプチドからのタンパク質のアセンブリーに関する当該技術分野で知られたいかなる手順も用いることができる。アセンブリー手順は一般に、カオトロープ剤（変性剤）および還元剤の存在下でフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲン−アナログまたはその前駆体の３つの構成（たとえば、フィブリンＩモノマーについてはα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖；フィブリンＩホモログについてはα鎖、Ｂβ鎖、およびｖγ鎖；フィブリンＩ前駆体についてはγ鎖前駆体、Ｂβ鎖、およびα鎖；など）の等モル溶液を調製し、ついて変性剤および還元剤を透析により徐々に除去することを含む。適当な条件下、そのような手順により構成鎖は、機能性のフィブリン、フィブリン−ホモログまたは、フィブリンもしくはフィブリン−ホモログ前駆体の場合には、その後にプロセシングされて機能性のフィブリンまたはフィブリン−ホモログを生成しうる前駆体タンパク質にアセンブリーするであろう。構成鎖の他の比率も用いることができる。好ましい態様において、アセンブリープロセスに使用した鎖調製物の異種ペアは約１．５：１未満である。
【０１１４】
さらに詳しくは、アセンブリー手順には、カオトロープ剤および変性剤を含む初期アセンブリー（ＩＡ）溶液中に溶解した鎖調製物当たり約０．１mg／ml〜約６．０mg／mlの各構成フィブリン鎖のほぼ等モルの混合物をアセンブリー反応液として利用する。好ましい態様において、これら３つの鎖調製物（たとえば、フィブリンＩのアセンブリーには、α鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖調製物）のそれぞれをＩＡ溶液中に約２．０〜約４．０mg／mlにて溶解する。いかなる純度の鎖調製物をもアセンブリー手順に用いることができるが、実質的に純粋な鎖調製物（＞５０重量％純度）を用いるのが好ましく、高度に純粋な鎖調製物（＞８０重量％純度）を用いるのが一層好ましい。
【０１１５】
ＩＡ溶液は、１またはそれ以上の高濃度のカオトロープ剤（変性剤）を含む。適当なカオトロープ剤としては、尿素、臭化ナトリウム、塩酸グアニジン、ＫＣＮＳ、ヨウ化カリウムおよび臭化カリウムが挙げられる。いかなる変性剤をも用いることができるが、好ましい変性剤は約０．５Ｍ、好ましくは２．５Ｍもしくはそれ以上の濃度の尿素である。尿素の濃度は、より好ましくは約３．５Ｍまたはそれ以上、さらに一層好ましくは少なくとも約５．０Ｍまたはそれ以上である。他の変性剤の匹敵するタンパク質折り畳み解除濃度を尿素の代わりに用いることができる。ＩＡ溶液はさらに、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）またはβ−メルカプトエタノールなどの１またはそれ以上の還元剤をも含む。ＩＡ溶液中の還元剤の濃度は、約０．０５mM〜約１００mMの範囲であってよい。好ましい態様において、還元剤は約５〜約１０mMの濃度のＤＴＴである。ＩＡ溶液はさらに、トリス−ＨＣｌやトリス−酢酸などの緩衝液を含む。緩衝液の濃度は好ましくは約１０〜約５０mMであり、そのpH範囲は約６．５〜約８．５である。好ましい態様において、緩衝液は約１０mMおよび約pH７のトリス−ＨＣｌである。ＩＡ溶液はさらに、１またはそれ以上の２価カチオンキレート化剤を含む。キレート化剤の例としては、クエン酸、サッカリン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＥＤＴＡ）、エチレンジアミンジ［ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸］（ＥＤＤＨＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン、およびＮ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）およびそれらの塩が挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましいキレート化剤はＥＤＴＡまたはＥＧＴＡであり、その濃度は約０．１mM〜約５mMである。
【０１１６】
ＩＡ溶液中の構成鎖からのフィブリンモノマー、フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲン−アナログおよびその前駆体のアセンブリーは、変性剤および還元剤の除去によって開始される。この除去を行うために当該技術分野で知られたいかなる方法をも用いることができる。除去は、５またはそれ以上の等価工程から変性剤および還元剤を欠く最終緩衝溶液への段階的な透析により行うことができる（たとえば、５Ｍ尿素、１５mM  ＤＴＴ  ＩＡ溶液からの５等価工程透析は、４Ｍ尿素、０mM  ＤＴＴを含む溶液、３Ｍ尿素、０mM  ＤＴＴを含む溶液、２Ｍ尿素、０mM  ＤＴＴを含む溶液、１Ｍ尿素、０mM  ＤＴＴを含む溶液、および０mM尿素、０mM  ＤＴＴを含む溶液に対して順次透析することからなる）。幾つかの態様においては、連続的な勾配の透析系を用いることができる。
【０１１７】
アセンブリー反応の各工程に用いる透析溶液は、還元剤が存在せず変性剤が減少している他はＩＡ溶液と組成が同じであるのが好ましい。特別の態様において、変性剤の温度を約１Ｍおよびそれ以下から減少させるのに用いる透析溶液は、アセンブリーしたフィブリンモノマーまたはフィブリン−ホモログ内でのジスルフィド結合の形成を容易にするために、さらにグルタチオン／酸化グルタチオン、またはＣｕＳＯ4を含んでいてよい。適用する場合には、グルタチオンおよび酸化グルタチオンの好ましい濃度はそれぞれ約１〜３mMおよび０．３〜０．５mMであり、ＣｕＳＯ4の好ましい濃度は約８０mMである。
【０１１８】
アセンブリー反応の温度は、約４℃〜約６５℃であるのが好ましい。この反応の好ましい温度は、約２０℃〜約５０℃、さらに好ましくは約２５℃である。
アセンブリー反応の透析の速度は、いかなる知られた手段を用いても制御できる。たとえば、アセンブリー反応容量に対する膜表面積の比を増大または減少させることにより、溶質の交換速度、従って溶質が平衡に達するのに要する時間を増大または減少させることができる。アセンブリープロセスの各透析工程は、約１５分〜約１８０分の平衡が得られる透析速度を用いるのが好ましい。特に好ましい速度は、約６０分以内に溶質の平衡を達成する。
【０１１９】
フィブリンモノマーおよび自己重合性のフィブリノーゲン−アナログについては、アセンブリーした分子は一般に透析が進行するにつれて重合するであろう。アセンブリーおよび重合したフィブリンまたはフィブリノーゲン−アナログの調製物は、フィブリンまたはフィブリン−ホモログポリマーからのモノマーの放出という結果になるいかなる溶液を用いても可溶化することができる。可溶化は、適当な酸性緩衝溶液で、該調製物を透析することにより、またはアセンブリー反応液から回収したフィブリンポリマー血餅を溶解することにより行うことができる。この酸性緩衝液は、約１〜約５、好ましくは約４のpHを有する。この酸性緩衝液の好ましい濃度は、約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、最も好ましくは約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである。適当な酸性緩衝液の例としては、酢酸、コハク酸、グルクロン酸、システイン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジピン酸およびそれらの塩が挙げられるが、これらに限られるものではなく、コハク酸、アスパラギン酸、アジピン酸および酢酸の塩が好ましく、酢酸ナトリウムが最も好ましい。
【０１２０】
フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログ調製物は、いかなる知られた物理的、化学的または生化学的方法を用いても混入物からさらに精製することができる。
【０１２１】
８．組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログのための用途
大量かつ高純度のフィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、本発明の方法を用いて得ることができる。得ることができるフィブリン鎖の例としては、α鎖、β鎖、γ鎖およびｖγ鎖が挙げられる。得ることができるフィブリンの例としては、フィブリンＩ、ｄｅｓＢＢフィブリンおよびフィブリンIIが挙げられる。得ることができるフィブリン−ホモログの例としては、フィブリンＩ−ホモログ、ｄｅｓＢＢフィブリン−ホモログおよびフィブリンII−ホモログが挙げられる。フィブリノーゲン−アナログの例は、Ａフィブリノペプチドのものとは異なるＮ末端伸長を有する２つのα鎖、２つのβ鎖および２つのγ鎖からなる分子である。フィブリン鎖、フィブリンモノマー、フィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン−アナログは、細胞性の物質を実施的に含んでおらず、ヒト血液由来の製品にしばしば認められる感染性のウイルス因子を完全に含んでいないのが好ましいであろう。フィブリンモノマーおよびフィブリン−ホモログは、フィブリン−モノマーシーラントの調製に用いることができる。たとえば、エドワードソン（Edwardson）らのヨーロッパ特許公開第０５９２２４２Ａ１（４／１３／９４）を参照。
【０１２２】
本発明はまた、自己重合することができない第一のフィブリン関連タンパク質を自己重合することができない第二のフィブリン関連タンパク質と反応させることによる、フィブリンポリマーシーラントの生成方法にも関する。第一のフィブリン関連タンパク質の例はフィブリン−ホモログ（２つの修飾γ鎖を含有する）である。第二のタンパク質の例は、フィブリノーゲンおよび自己重合できないフィブリノーゲン−アナログである。これら自己重合できないフィブリノーゲン−アナログは、一般に、そのα鎖およびβ鎖上にＮ末端伸長（全部で４つの伸長）を有するであろう。これら２成分フィブリン関連タンパク質組成物は、約２：１〜約１：２のモル比で反応させるのが好ましく、さらに好ましくは約１．５：１〜約１：１．５のモル比で反応させる。適当な緩衝液条件は、他のフィブリン−モノマーシーラントに用いたものと同じである。ＥＰ０５９２２４２Ａ１を参照。これら２組成物は、好ましくは約２０％ｗ／ｗ未満、一層好ましくは約１０％未満、さらに一層好ましくは約５％未満の自己重合するフィブリン関連タンパク質を含む。
【０１２３】
さらに、フィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログは、血管形成、血小板凝集、フィブリン重合、細胞増殖などを制御する機能を有するフィブリンの生物活性な断片を生成するのに用いることができる。
【０１２４】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２５】
９．実施例
９．１．発現構築物の構築
９．１．１．α鎖の構築
プライマーＰＣＲ１ＡおよびＰＣＲ２Ａ（図５）を用い、ヒトフィブリノーゲンＡα鎖ｃＤＮＡクローンから約５６０塩基対の断片を増幅させた。この断片をＨｉｄIIIおよびＸｂａＩで消化し、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで切断したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ＋プラスミド（ストラタジーン（Strategne））中にクローニングした。この断片（α鎖のＮ末端部分をコードする）の配列を調べ、このクローンをｐＢＳａｌｐｈａ１と称した。
【０１２６】
ｐＢＳａｌｐｈａ１をＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで消化し、図１に示す合成リーダー配列を挿入した。このクローンの配列を調べ、このクローンをｐＢＳａｌｐｈａ２と称した。
【０１２７】
Ａα鎖ｃＤＮＡクローンをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、α鎖のＣ末端部分をコードする挿入物を精製した。この断片を、同様に消化したｐＢＳａｌｐｈａ２中に挿入した。かくして生成したクローンｐＢＳａｌｐｈａ３は完全なα鎖をコードする。発現ベクター中にサブクローニングする前に、この構築物の完全な配列を調べた。この構築物をＫｐｎＩ／ＮｏｔＩで消化することにより除去し、発現ベクターｐＲＥＰ４（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に挿入した。
【０１２８】
９．１．２．β鎖の構築
プライマーＰＣＲ１ＢおよびＰＣＲ２Ｂ（図５）を用い、ヒトフィブリノーゲンＢβ鎖ｃＤＮＡクローンから約７５０塩基対の断片を増幅させた。この断片をＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化し、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ＋プラスミド中にクローニングした。この断片（β鎖のＮ末端部分をコードする）の配列を調べ、このクローンをｐＢＳｂｅｔａ１と称した。
ｐＢＳｂｅｔａ１をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、図２に示す合成リーダー配列を挿入した。このクローンの配列を調べ、このクローンをｐＢＳｂｅｔａ２と称した。
【０１２９】
Ｂβ鎖ｃＤＮＡクローンをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、β鎖のＣ末端部分をコードする挿入物を精製した。この断片を、同様に消化したｐＢＳｂｅｔａ２中に挿入した。かくして生成したクローンｐＢＳｂｅｔａ３は完全なβ鎖をコードする。発現ベクター中にサブクローニングする前に、この構築物の完全な配列を調べた。この構築物をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化することにより除去し、発現ベクターｐＲＥＰ８（インビトロジェン）中に挿入した。
【０１３０】
９．１．３．γ鎖の構築
プライマーＰＣＲ１ＧおよびＰＣＲ２Ｇ（図５）を用い、ヒトフィブリノーゲンγ鎖ｃＤＮＡクローンから約３１０塩基対の断片を増幅させた。この断片をＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断したγ鎖ｃＤＮＡクローンを含有するｍｐ１９ベクター中にクローニングした（該ベクターのＳｐｈＩ／ＥｃｏＲＩ消化により該ｃＤＮＡクローンの３′部分が除去され、この配列をｓｐｈＩ／ＥｃｏＲＩ断片で置換した）。このクローンの配列を調べ、ｍｐ１９−ｇａｍｍａ１と称した。
【０１３１】
ｍｐ１９−ｇａｍｍａ１から二本鎖ＲＦ−ＤＮＡを調製し、ＡｖｒIIおよびＥｃｏＲＩで消化した。図３に示す合成３′断片を挿入した。得られたクローンの配列を調べ、このクローンをｍｐ１９−ｇａｍｍａ２と称した。このクローンは、完全長のガンマ−鎖（γ鎖）挿入物を含んでいた。
【０１３２】
ｍｐ１９−ｇａｍｍａ２二本鎖ＲＦ−ＤＮＡからＳａｌＩおよびＮｏｔＩ断片として挿入物を単離し、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ切断したｐＲＥＰ９（インビトロジェン）中にライゲートしたが、その際、ライゲーション反応液中にＫｐｎＩ／ＳａｌＩアダプター（図４に示す）を含ませた。この挿入物の構造をシークエンシングにより確かめた。このクローンをｇａｍｍａ−ｐＲＥＰ９と称した。
【０１３３】
９．１．４．γ鎖の突然変異誘発
ここでは、γ鎖ｃＤＮＡのＣＹＳ３５２コドンおよびＣＹＳ３６５コドンをＡＬＡコドンで置換し、ｐＲＥＰ９中にクローニングした。
ｇａｍｍａ−ｐＲＥＰ９からＳｐｈＩ（挿入物中の１０５７位）およびＢａｍＨＩ（ＮｏｔＩ部位の３′側のベクターポリリンカー中に存在する部位）を用いて約４００塩基対の断片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１８中にクローニングした。このクローン（ｍｐ１８−ｇａｍｍａ１）の配列をシークエンシングにより確かめた。
【０１３４】
ｄｕｔ−ｍｉｎｕｓ，ｕｎｇ−ｍｉｎｕｓの大腸菌株ＲＺ１０３２の培養液に組換えｍｐ１８−ｇａｍｍａ１を感染させ、ウラシル置換した一本鎖ｍｐ１８−ｇａｍｍａ１  ＤＮＡを調製した。これを、プライマーＭＵＴ１Ｇ（６′−ＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡ−３′）およびＭＵＴ２Ｇ（５′−ＡＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧ−３′）を用いた部位特異的突然変異誘発の鋳型として用いた。両標的ＣＹＳのＡＬＡ変換を有するクローンを、プライマーＰＣＲＹ（５′−ＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣ−３′）およびＰＣＲＸ（５′−ＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣ−３′）および通常のシークエンシング（図７を参照）を用いた３′ミスマッチＰＣＲの組み合わせを用いて同定した。
【０１３５】
得られたクローン（ｍｐ１８−ｇａｍｍａ２）をＳｐｈＩ部位とＮｏｔＩ部位との間でシークエンシングした。このＳｐｈＩ／ＮｏｔＩ断片を、γ鎖のＮ末端部分をコードするｇａｍｍａ−ｐＲＥＰ９からのＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ断片とともにＫｐｎＩ
【０１３６】
９．１．６．アスペルギルス・ニガー発現ベクター
フィブリンアルファｃＤＮＡをＧＡＭ−融合ベクターｐＩＧＦのＸｂａＩ−ｍｉｎｕｓ誘導体を用いて２段階でクローニングした（図６）。最初に、ｐＩＧＦをＸｂａＩおよびＨｐａＩで切断し、合成ＸｂａＩ／ＨｐａＩリンカー：
【化１】
2006223316.tif 000003
をライゲーションにより挿入する（この結果、読み取り枠を変えることも停止コドンを導入することもなく、ＸｂａＩ部位は失われるがＨｐａＩ部位は保持される）ことにより該プラスミドのＸｂａＩ部位を除去する。
【０１３７】
成熟アルファ−フィブリンｃＤＮＡのおよそ最初の５７０塩基対（bp）をオリゴプライマーを用いたＰＣＲにより増幅して、ａｌｐｈａ−ｐＲＥＰ４からシグナル配列を除去およびアミノ末端のすぐ上流にインフレームにてＨｐａＩ部位およびＫＥＸ２エンドプロテアーゼプロセシング部位を導入し（導入した配列：ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＧＡＡ、このものはＨｐａＩ部位をコードし、その後にＫＥＸ２プロセシング部位を含むペプチドＬｙｓＡｒｇＧｌｙＰｒｏＡｒｇＶａｌＶａｌＧｌｕが続く）、６３４bpにてＸｂａＩ部位のすぐ下流にＨｐａＩ部位を導入した。このＰＣＲ断片をＨｐａＩで切断し、ゲル精製し、ＸｂａＩ−ｍｉｎｕｓｐＩＧＦ誘導体のＨｐａＩ部位中にクローニングした。ＧＡＭ（Ｇ４９８）−融合、ＫＥＸ２部位およびＸｂａＩ／ＨｐａＩ部位までのアルファ−フィブリン配列の存在を調べるため、挿入物を正しい方向で含むクローンをシークエンシングした。このクローンをｐＩＧＦ−ａｌｐｈａ５′と称した。
【０１３８】
合成ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ−ＮｏｔＩリンカーを用い、ａｌｐｈａ−ｐＲＥＰ４中のＮｏｔＩ部位にＸｂａＩ部位を導入した。得られた１３１０bpのＸｂａＩ断片（アルファ−フィブリンｃＤＮＡの残りを含有する）をゲル精製し、ＸｂａＩで切断した正しいｐＩＧＦ−ａｌｐｈａ５′クローン中にクローニングした。
【０１３９】
フィブリンベータｃＤＮＡも２段階手順を用いてクローニングしたが、ｐＩＧＦのＳｔｕＩ−ｍｉｎｕｓ誘導体を用いた。ｐＩＧＦを平滑末端切断剤（ＡＧＧＣＣＴ）であるＳｔｕＩで切断し、ｇｌａＡ５′フランキング領域の最も５′末端にある単一部位はターミナルトランスフェラーゼおよびジデオキシＡＴＰ／ＴＴＰの混合物用いて破壊されるであろう。
【０１４０】
９．２．フィブリノーゲンおよびフィブリンのインビトロアセンブリー
１mlの５Ｍ尿素、５mM  ＤＴＴ、１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、pH７．０当たり１０mgのフィブリノーゲンを変性および解離させた。上記「アセンブリー」反応液から尿素およびＤＴＴを段階的透析により除去し、各段階は４Ｍ，３Ｍ，２Ｍ，１Ｍおよび０Ｍ尿素を含有する１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、pH７．４透析緩衝液中、室温で１時間行った。最終調製物は、トロンビンを１０Ｕ／mlで添加したときに５mM  ＣａＣｌ2の存在下および不在下のいずれにおいても重合した。この血餅の形成はフィブリノーゲンが首尾よくアセンブリーしたことを示しており、フィブリノーゲンはトロンビンによりフィブリンに変換され、フィブリンは重合した。
【０１４１】
フィブリンのアセンブリーは以下のようにして行った。１０mgのフィブリノーゲンを１０Ｕ／mlのトロンビンで消化した。フィブリンを含有する反応液を、ついで５Ｍ尿素、５mM  ＤＴＴ、１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、pH７．４中で１０mg／mlのフィブリン濃度とした。変性し解離したフィブリンは、上記、すなわち４Ｍ，３Ｍ，２Ｍ，１Ｍおよび０Ｍ尿素を含む透析緩衝液に対する連続的な透析手順の後にアセンブリーした。１Ｍ尿素の段階では、透析チューブから取った試料は認識しうる血餅を含んでおり、フィブリンのアセンブリーが首尾よくいったことを示していた。０Ｍ尿素緩衝液に移した２０分後に透析チューブから取った試料は一層強い（一層白い）血餅を含み、１Ｍ尿素の段階におけるアセンブリー反応が不完全であったことを示していた。
【０１４２】
９．３．γ鎖の欠失分析
一つの欠失変異は、ｇａｍｍａ−ｐＲＥＰ９をＳｐｈＩで消化し、Ｍｅｔ３３６の後に停止コドンをコードするように設計した二本鎖ＳｐｈＩアダプターを挿入することにより作成する。他の欠失変異は、本質的に実施例９．１．２．に記載した方法に３つの変更を加えて構築する。第一に、３′ＰＣＲプライマーは、Ｍｅｔ３３６をコードするものとＣ末端をコードするものとの間のいずれかに基づいて設計する。第二に、増幅した配列中に３′断片を加えない。第三に、プライマーの５′末端はｍｐ１９ベクターおよびｐＲＥＰ９ベクター中にクローニングするための適当な制限部位配列を含む。
【０１４３】
９．４．Ｃｙｓ−修飾フィブリンおよびフィブリノーゲンを用いて作成した異種フィブリンシーラント
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス、pH７．０中に溶解した変異体γ鎖（Ｃｙｓ３５２−Ａｌａ３５２，Ｃｙｓ３６５−Ａｌａ３６５）を含むフィブリンII−ホモログ（１００μｇ／ml）を、種々の濃度（同緩衝液中に１０μｇ／ml〜１０００μｇ／ml）を含むフィブリノーゲンの等容量と混合し、３７℃でインキュベートする。重合を視覚観察により評価すると、異種フィブリンポリマーはフィブリノーゲン：フィブリンII−ホモログを１：０．５〜１：２．０のモル比で含有する溶液において明らかである。
【０１４４】
天然のヒトフィブリノーゲンを、Ｃｙｓ３５２および３６５を含む幾つかのＣｙｓ残基が穏やかな還元条件下で還元されたアルキル化されるように、プロシク（Procyk）ら、Biochemistry 31: 2273〜2278, 1992およびプロシクら、ヨーロッパ特許公開第４７２２０５Ａ１（実施例１および２を参照）に概略が記された手順を用いて修飾した。アルキル化したフィブリノーゲンをトロンビンで処理して活性化してフィブリノペプチドの大部分を除去し、フィブリンモノマーを生成した（プロシクらの上掲文献）。アルキル化したフィブリンモノマーは自己重合する能力を欠き、それゆえフィブリン−ホモログである。このアルキル化したフィブリン−ホモログを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス、pH７．０中に１００μｇ／mlにて溶解し、同緩衝液中のフィブリノーゲン溶液（１０μｇ／ml〜１０００μｇ／ml）の等容量と混合し、３７℃でインキュベートした。重合を視覚観察により評価すると、異種フィブリンポリマーはフィブリノーゲン：フィブリン−ホモログを１：０．５〜１：２．０のモル比で含有する溶液において明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１  α鎖前駆体構築物の構築に用いる合成リーダー配列（項目１参照）。
【図２】図２  β鎖前駆体構築物の構築に用いる合成リーダー配列（項目２参照）。
【図３】図３  γフィブリン鎖構築物の構築に用いる合成３′末端断片（項目３参照）。
【図４】図４  γフィブリン鎖構築物の構築に用いる合成ＫｐｎＩ／ＳａｌＩアダプター（項目３参照）。
【図５】図５  組換えフィブリン鎖の構築オリゴヌクレオチド（項目１参照）。
【図６】図６  ｐＩＧＦ融合ベクターの発現カセットの模式図（項目６参照）。
【図７Ａ】図７  ヒトγ鎖の部分ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。突然変異プライマーＭＵＴ１ＧおよびＭＵＴ２ＧおよびシークエンシングプライマーＰＣＲＹおよびＰＣＲＸの位置を示す（項目４参照）。
【図７Ｂ】ヒトγ鎖の部分ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。突然変異プライマーＭＵＴ１ＧおよびＭＵＴ２ＧおよびシークエンシングプライマーＰＣＲＹおよびＰＣＲＸの位置を示す（項目４参照）。
【図７Ｃ】ヒトγ鎖の部分ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。突然変異プライマーＭＵＴ１ＧおよびＭＵＴ２ＧおよびシークエンシングプライマーＰＣＲＹおよびＰＣＲＸの位置を示す（項目４参照）。
【図８】フィブリノーゲンから架橋フィブリンIIポリマーへの変換経路を示す模式図。
【図１】
2006223316.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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