(57)【要約】      （修正有）【課題】  金属表面での非特異吸着の抑制およびプローブ分子の固定化を向上させた両末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコールを用いた表面処理の提供。【解決手段】  両末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコールにより金属表面を処理することにより、生体分子の非特異的な吸着を抑制し、さらに鎖長の異なるポリエチレングリコールを用いて、表面のポリエチレングリコールの密度を制御することにより、両末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコールの片末端の片末端のみを固定し、もう片末端を生体分子などのプローブ分子を表面に固定化するために利用する事の出来る、高機能金属表面の提供。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属や半導体、酸化物、高分子などの機材表面（以下該表面という）に、片末端に該表面に固定可能な官能基を有する高分子によって適度な密度の高分子ブラシを構築せしめ、さらにその該表面に該表面に固定可能な官能基を両末端に有する高分子を固定することにより構築した高密度高分子ブラシ表面
【請求項２】
担持させる高分子が水溶性高分子であり、タンパク質等の生体成分の非特異吸着を抑制する請求項１の高密度高分子ブラシ表面
【請求項３】
先に担持させる高分子が数平均分子量２００〜３０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１，２に記載の表面
【請求項４】
先に担持させる高分子が数平均分子量２００〜３０，０００のメルカプト基を片末端に有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１−３に記載の表面
【請求項５】
後に担持させる高分子が数平均分子量２００〜３０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１−４に記載の表面
【請求項６】
後に担持させる高分子が数平均分子量２００〜３０，０００の量末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１−５に記載の表面
【請求項７】
該表面が金、銀、銅、アルミニウム、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種類の金属で作製された金属微粒子、および金属薄膜を含む金属表面における請求項１〜６のいずれかに記載の表面。
【請求項８】
タンパク質もしくは抗体がメルカプト基、およびジスルフィド基を介して、金属表面の一部に化学的に固定化されている、請求項１〜７のいずれかに記載の表面。
【請求項９】
金属表面に固定化されるタンパク質等の生理活性分子がマレイミド基、メルカプト基等の官能基によって修飾されている、請求項１〜８のいずれかに記載の表面。
【請求項１０】
金属表面に固定化されたタンパク質もしくは抗体が、特異的な相互作用を利用した検出を可能とする請求項１〜９のいずれかに記載の表面。
【請求項１１】
請求項１−１０に記載の表面を構築する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生体成分の非特異吸着を抑制し、効率的に抗体や核酸等の生体成分を固定できる表面およびその処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  生体分子の特異的な相互作用の検出を行うセンサーとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を応用したバイオセンサーの使用が検討されてきた。ＳＰＲセンサーは、プリズムの底面に金や銀等の金属薄膜を形成し、金属薄膜の裏面からレーザーなどの光を、入射角度を変えながら入射して、その反射光を測定し、金属表面プラズモンと共鳴して吸収される、特定入射角度の光を指標として、当該金属表面で起きている、タンパク質の相互作用等の反応を検出することが可能なバイオセンサーであり、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率の変化に対して鋭敏であることが知られている（非特許文献１参照）。【０００３】  ＳＰＲセンサーチップの高感度化の観点から、センサーチップ表面における表面処理は、非特異吸着を抑制する技術と特異的な吸着を行うプローブ分子の固定化の技術が求められる。このような表面を持つための表面処理として、アルキルチオールなどのアルキル鎖の疎水性相互作用による自己組織化単分子層（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（ＳＡＭ））を利用する方法（非特許文献２参照）やチップ表面にＳＡＭを固定化し、その上に側鎖にカルボキシル基を導入したデキストランを固定化する方法などが提案されている（非特許文献３参照）。しかし、デキストラン層が厚さ（約１００ｎｍ）を持つために、被検体がデキストラン層中に分配される等により、熱力学的および動力学的パラメーターに悪影響を及ぼす場合がある。【０００４】  そこで発明者らは以前より、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子の片末端を機材表面に固定し、高分子ブラシ層を構築することによりタンパク質等の非特異吸着を効率的に抑制する表面が構築されることを示してきた。【０００５】  しかしながら両末端に同じ官能基を有するＰＥＧを利用して高分子ブラシを構築した場合、両方の末端が表面に結合してループを形成するなどによって非特異吸着が必ずしも抑制できない欠点があった。【０００６】  たとえば両末端にメルカプト基を有するＰＥＧの片末端だけを機材に固定できれば、反対末端のメルカプト基をタンパク質の固定に利用できる等の利点があるが、上述のように未だ精密な密生層は構築されていないのが現状である。【０００７】  高分子ブラシの自由末端に理想的に官能基を導入せしめるために、発明者らは両末端に異なる官能基を定量的に有するヘテロ２官能生ＰＥＧの合成法を確立し、これを用いた表面構築を行ってきた。（特許文献１参照）。この表面処理方法においてはポリエチレングリコールが片末端のみ固定化されるため、金属表面上にブラシ状に固定化される。ブラシ状に固定化されたポリエチレングリコール鎖は高い運動性を示し、タンパク質などの生体分子の表面に対する非特異的な吸着を抑制することを見出してきた。
【非特許文献１】Ａ．Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ，，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｎｃｔ．Ｂｉｏｌ，５（１９９５）６９９−７０５
【非特許文献２】Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１５（１９９３）１０７１４−１０７２１
【非特許文献３】Ｌ．Ｓｔｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１０（１９９５）８１３−８２２
【特許文献１】特開平７−３１６２８５号公報
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  両末端に異なる官能基を有するヘテロ２官能性高分子による高分子ブラシの構築では精密な非特異吸着抑制表面を有する表面ができるものの、ヘテロ２官能性高分子が必修である。両末端に同じ官能基を有する高分子の合成はヘテロ２官能性高分子に比べて合成が容易であるため、両末端に同一官能基を有する高分子を利用した高分子ブラシ作成法が必要であり、本発明はかようなニーズに応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意検討を重ねた結果、片末端に表面に結合する反応性基を有する高分子を用い、あらかじめ該表面に適度な高分子ブラシを構築させた後、両末端に表面に結合しうる官能基を有する高分子を担持させることで、ループ形成を抑制し、高密度な高分子ブラシ表面を形成できるだけでなく、両末端反応性高分子の一方の末端に生体分子等を結合させることによって高性能なバイオセンシング表面を構築することに成功した。
このような両末端に反応性基を有する高分子による該表面への表面処理は、本発明者らの知る限り文献未戴のものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明による表面処理は、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーにおける金属薄膜表面に用いるのが好適であるが、これに限定されるものではなく、リガンドとレセプターの組、例えば、抗原若しくはハプテンと抗体、糖とレクチン、基質と酵素、ホルモンとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖、等の組における結合対の形成により、表面に生ずる何らかの変化を検出することが可能なセンサーや粒子であれば、いかなる範疇においても用いることができる。【００１１】  このように本発明は、該表面に、被検対象物を接触させて、被検対象物中の被検物質を、この表面上にブラシ状に起立している高分子の末端の官能基と結合させ、この結合を検出する、センサーチップやナノ粒子表面としての使用方法を提供する発明であり、本使用方法の好適な態様として、表面プラズモン共鳴を利用して、表面上における生体分子の相互作用を検出可能な機器による検出が挙げられる。【００１２】  本発明において利用される高分子に特に限定は無いが、生体環境下で利用されるバイオセンサーやナノ粒子のためにはポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子が好ましく、ポリエチレングリコールがもっとも良い。用いる高分子の分子量に限定はないが、２００〜１００，０００程度、より好ましくは１，０００〜３０，０００程度、１，５００〜２０，０００程度がもっとも好ましい。
該表面に固定するための官能基としては特に限定はないが、メルカプト基、シラノール基、トリアルキルシリル基、アミノ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、活性エステル基、アルデヒド基、エステル基、カテコール基、酸無水物基などが一般的に利用できる。これらの官能基は先に該表面に固定する片末端反応性高分子および後から固定する両末端反応性高分子いずれの場合にも利用可能である。【００１３】  本発明における該表面の素材としては様々なものに利用可能であるが、金、銀、銅、アルミニウム、白金などの金属、シリカ、クレイ、ゼオライト、酸化チタン、酸化ジルコニウムのような無機物・酸化物、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳなどの半導体、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ポリカーボネートなどのプラスチック表面などに利用可能である。【００１４】  本発明における表面処理は、高分子を該表面上と結合させることによって、表面上にブラシ状に起立した表面を製造することができる。また金属表面と結合する高分子溶液の濃度を調節する事によって、表面の高分子の担持密度を制御する事ができる。【００１５】  また、本発明における表面処理は、鎖長の異なる高分子溶液を調製して、各々の表面上に固定化する事も可能である。例えば、片末端にメルカプト基を有する、鎖長の短いポリエチレングリコールを、上記の固定化工程を行う事によって、担持密度を制御した表面を製造し、後から両末端にメルカプト基を有する、鎖長の長いポリエチレングリコールを、再度、上記の固定化工程を行う事も可能である。
【発明の効果】
【００１６】  本発明で得られた金属表面は、タンパク質などの生体分子の非特異的な吸着を著しく抑制させることができる。また、片末端にメルカプト基を有する高分子ルのみを固定化した表面処理と比較すると、プローブ分子の導入のために、高分子末端の処理を必要とする事がなく、タンパク質などを、特異的に表面上に固定化する事ができ、プローブ分子を簡易かつ効率的に、表面上に固定化する事が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。【００１８】実施例１：両末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコールの製造【００１９】  Ａｒ下、室温のフラスコ中に溶媒としてＴＨＦ２０ｍｌを入れ、市販の両末端にヒドロキシル基を有するポリエチレングリコール（Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入、ＭＷ．４６００）１．０ｍｍｏｌを溶解し、さらにＮａＨ２０．０ｍｍｏｌとＴｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ９．０ｍｍｏｌを加えた。またＡｒ下、溶媒ＴＨＦ２０ｍｌにＭｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ７．０ｍｍｏｌを溶解させたフラスコ中に、シリンジを用いてＰＥＧ溶液を滴下し、水冷下１晩攪拌し反応させた。得られた生成物はｅｔｈｅｒ再沈を行い、沈殿物を回収後、クロロホルムと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ベンゼン凍結乾燥によって回収した。回収後、ＧＰＣ、１Ｈ−ＮＭＲ測定により、分子量測定および構造解析を行った。【００２０】  減圧乾燥したｐｏｔａｓｓｕｉｍ−Ｏ−ｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ０．８８ｍｍｏｌに溶媒としてＴＨＦ５０ｍｌ、ＤＭＦ３．６ｍｌを加え、この溶液を減圧乾燥したＭＳ−ＰＥＧ−ＭＳ０．２ｇに加え、室温で４時間反応させた。得られた生成物はｅｔｈｅｒ再沈を行い、沈殿物を回収後、クロロホルムと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ベンゼン凍結乾燥によって回収した。回収後、ＧＰＣ、１Ｈ−ＮＭＲ測定により、分子量測定および構造解析を行った。【００２１】  さらに、減圧乾燥したＤＴＣ−ＰＥＧ−ＤＴＣ０．１ｇにＡｒ下、室温、溶媒としてＴＨＦ１０ｍｌを加えた。ここにｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅを１．４Ｍ  ＴＨＦ溶液になるように加え、室温で３時間攪拌し反応させた。反応後、クロロホルムと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ベンゼン凍結乾燥によって回収した。回収後、ＧＰＣ、１Ｈ−ＮＭＲ測定により、分子量測定および構造解析を行った。【００２２】実施例２：センサーチップの製造【００２３】  まず、金表面のＳＰＲセンサーチップ（ＳＩＡキット：ＢＩＡＣＯＲＥ社、以下同様）のピラニア洗浄を行った。洗浄液として、特級濃硫酸：特級過酸化水素水＝３：１（容量比）とし、洗浄は、室温で１分間、洗浄液中にチップを浸漬することにより行った。次に、市販のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ（日本油脂（株）より購入、ＭＷ．２０００）を１．０Ｍ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ：７．４）に溶解し、このＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ溶液をＳＰＲ装置（ＢｉａＣｏｒｅ３０００：ＢＩＡＣＯＲＥ社、以下同様）にセットし、流速５μｌ／分で流して固定化した。その固定化量において、それぞれアングルシフト（角度変化量）で０．０，０．０２５，０．０５，０．１，０．２°となるように、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ溶液の濃度を調節して固定化した。さらに、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨを固定化したセンサーチップ表面に対して、上記の実施例１において合成した、ＳＨ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ．４６００）を１．０Ｍ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ：７．４）に溶解し、０．２ｍＭになるように調整した、ＳＨ−ＰＥＧ−ＳＨ溶液をＳＰＲ装置にセットし、流速５μｌ／分、３０分間流して固定化し、チップ表面上にメルカプト基が構築されたセンサーチップ表面を得た。【００２４】実施例３：センサーチップ表面へのマレイミド化タンパク質の固定化【００２５】  １００ｍＭ  ＰＢＳに溶解し、１０μＭに調製したＢＳＡ溶液に対して、クロスリンカーであるｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを同様に１００ｍＭ  ＰＢＳに溶解し、１ｍＭに調整したｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ水溶液をＢＳＡの８倍モル量加え、３７℃で３０分静置した後、カラム精製し１０μＭ  ＢＳＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ溶液を調製した。実施例２で作成したセンサーチップ表面に対して、調製したＢＳＡ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ溶液をＳＰＲ装置にセットし、流速１μｌ／分、３時間流して固定化し、そのＳＰＲのレスポンスの角度変化量を観察した。【００２６】  比較のために、実施例３と同様の条件で、作成したセンサーチップ表面に対して、１０μＭに調製したＢＳＡ溶液を、ＳＰＲ装置にセットし、ＢＳＡの吸着量をそのＳＰＲのレスポンスの角度変化量から計測し、センサーチップ表面の非特異吸着抑制能の評価も行った。【００２７】  以上の結果を図１に示した。作製したセンサーチップ表面はＢＳＡの非特異的な吸着に対して、高い抑制能が示された。また、チップ表面に構築されたメルカプト基と、マレイミドＢＳＡのマレイミド基が特異的に結合し、チップ表面にマレイミドＢＳＡが固定化された事が示された。さらに、マレイミドＢＳＡの固定化量が、表面のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ．２０００）の固定化量に依存している事から、チップ表面上のポリエチレングリコールの担持密度を制御する事によって、チップ表面上に構築されるメルカプト基の量が制御され、固定化されるマレイミドＢＳＡの固定化量を制御できる事が示された。【００２８】  実施例４：センサーチップ表面に固定化したタンパク質の活性評価【００２９】  実施例３により得られた、センサーチップ表面に固定化されたマレイミドＢＳＡに対して、１００ｍＭ  ＰＢＳに溶解し、１μＭに調整したＢＳＡ抗体溶液をＳＰＲ装置にセットし、流速５μｌ／分、３０分間流し、ＢＳＡ抗体の吸着量をそのＳＰＲのレスポンスの角度変化量を観察した。【００３０】  比較のために、実施例２で作成したセンサーチップ表面に対して、実施例４と同様の条件で、１μＭに調整したＢＳＡ抗体溶液を、ＳＰＲ装置にセットし、ＢＳＡ抗体の吸着量をそのＳＰＲのレスポンスの角度変化量から計測し、センサーチップ表面の非特異吸着抑制能の評価も行った。【００３１】  以上の結果を図２に示した。作製したセンサーチップ表面はＢＳＡ抗体の非特異的な吸着に対して、高い抑制能が示された。またＢＳＡ抗体の吸着量が、表面に固定化されたマレイミドＢＳＡの固定化量に依存している事から、表面に固定化されたマレイミドＢＳＡはＢＳＡ抗体に対して特異的に結合し、その生理活性を失う事なく、表面に固定化されている事が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は作製したセンサーチップ表面上における、マレイミドＢＳＡの固定化およびＢＳＡの吸着における、ＳＰＲのレスポンスの角度変化量の結果である。〔縦軸：マレイミドＢＳＡおよびＢＳＡの吸着による角度変化量（Δθ×１０４［°］）、横軸：作成した表面におけるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ．２０００）の固定化による角度変化量（Δθ×１０４［°］）〕
【図２】図２は作製したセンサーチップ表面に固定化されたマレイミドＢＳＡおよびセンサーチップ表面に対するＢＳＡ抗体の吸着における、ＳＰＲのレスポンスの角度変化量の結果である。〔縦軸：ＢＳＡ抗体の吸着による角度変化量（Δθ×１０４［°］）、横軸：作成した表面におけるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ．２０００）の固定化による角度変化量（Δθ×１０４［°］））
【図１】
2006177914.tif 000002
【図２】
2006177914.tif 000003