(57)【要約】【課題】  パーキンソン病の病発病可能性の評価方法、パーキンソン病の遺伝子診断方法並びに治療方法を提供すること。【解決手段】  アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型、或いは該遺伝子多型により構成されるハプロタイプに基づいて、パーキンソン病発病可能性を評価することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型、或いは該遺伝子多型により構成されるハプロタイプに基づいて、パーキンソン病発病可能性を評価することを特徴とするパーキンソン病発病可能性の評価方法。
【請求項２】
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型を、該遺伝子多型により構成されるハプロタイプを含むオリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイにより特定することでパーキンソン病の発病可能性を診断することを特徴とするパーキンソン病の遺伝子診断方法。
【請求項３】
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型、或いは該遺伝子多型により構成されるハプロタイプにより発現される症状を、前記遺伝子多型を改善あるいは前記遺伝子多型の影響を及ぼしている部分を改善することを特徴とするパーキンソン病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
パーキンソン病とアルファー−シヌクレイン遺伝子との関係については、これまであるという報告と無いという報告があり、結論は出されていない。一部の遺伝子多型に注目して数種類の民族について解析されている。アルファー−シヌクレイン遺伝子に限らず遺伝子多型については健常人等のDNAサンプルを用いて解析され明らかにされてきている。しかし、そのようなプロジェクトは特にパーキンソン病を意識したものではなく、遺伝子多型部位とパーキンソン病とを関連づける解析ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
パーキンソン病は、神経変性疾患であり６０歳以上の人口の1-2%が罹患すると言われ、根治は出来ない。そのため、パーキンソン病の病発病可能性の評価方法、パーキンソン病の遺伝子診断方法並びにパーキンソン病の治療方法が切望されている。パーキンソン病患者死後脳では、レビー小体といわれる色素沈着が見られる。このレビー小体の構成成分としてアルファー−シヌクレインなどが知られている。発明者はアルファー−シヌクレイイン遺伝子を詳細に解析し、日本人のパーキンソン病患者と健常人の遺伝子を比較し、疾患関連遺伝子多型が存在するか検討し、パーキンソン病とアルファー−シヌクレイイン遺伝子との関連性を明らかにすることで、上記のような課題を解決しようとしている。
【０００３】
本発明は、このような問題点に着目してなされたもので、パーキンソン病の病発病可能性の評価方法、パーキンソン病の遺伝子診断方法並びにパーキンソン病の治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するために、本発明の請求項１に記載のパーキンソン病発病可能性の評価方法は、
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型、或いは該遺伝子多型により構成されるハプロタイプに基づいて、パーキンソン病発病可能性を評価することを特徴としている。
この特徴によれば、被験者のアルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型を特定することで、該被験者がパーキンソン病を発病する可能性を客観的に評価することができる。
【０００５】
本発明の請求項２に記載のパーキンソン病の遺伝子診断方法は、
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型を、該遺伝子多型により構成されるハプロタイプを含むオリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイにより特定することでパーキンソン病の発病可能性を診断することを特徴としている。
この特徴によれば、被験者のアルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型を、該遺伝子多型により構成されるハプロタイプを含むオリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイにより特定することで、迅速かつ簡便に、該被験者がパーキンソン病を発病する可能性を客観的に診断することができる。
【０００６】
本発明の請求項３に記載のパーキンソン病の治療方法は、
アルファー−シヌクレイン遺伝子の１１カ所の一塩基多型部位と１カ所の多塩基多型部位における型式による遺伝子多型、或いは該遺伝子多型により構成されるハプロタイプにより発現される症状を、前記遺伝子多型を改善することに基づいて改善することを特徴としている。
この特徴によれば、アルファー−シヌクレイン遺伝子の遺伝子多型を改善することで、従来においては根治は出来なかったパーキンソン病の進行を抑止、或いは根治することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
パーキンソン病（PD）は神経変性疾患であり、脳の黒質におけるドーパミン神経の変性を特徴とする。生き残っている細胞はレビー小体（LB）といわれる細胞質の封入体を含んでいる。LBの主要な構成成分はアルファ−シヌクレインである。アルファ−シヌクレインは神経終末にあるものの、その機能は十分には分かっていない。
【０００８】
PDの発症に遺伝的、環境的要因が絡んでいるという知見が蓄積されてきた。家系研究で、エクソン内の翻訳領域内に、エクソン４のG209A(Ala53Thr)多型、エクソン３のG88C（Ala30Pro）が同定された。Ala53Thr多型はイタリア／ギリシャ家系でPDとの関連が指摘された。Ala30Pro太平はドイツ人の家系で見いだされた。しかしこれらの多型は頻度が低く家族性PDの主たる原因ではなかった。多くのPDは弧発的に起こるため、これらの多型について弧発例でも調べられたが関連性は認められなかった。
【０００９】
弧発例における多くの研究では二塩基繰り返しであるNACP-Rep1多型に注目されていた。この多型はプロモーター領域近傍に位置し10kbp上流にある。この多型については相反する結果が報告されている。相関があるという結果は少なくとも２報報告されている。しかし、他の論文では相関が見られないと報告されている。日本人の集団では、Izumiらが弧発PD群と健常群を比較し相関を認めていない。NACP-Rep1は近接する４カ所の二塩基繰り返しで構成され、いずれもが多型であると近年報告された。これがNACP-Rep1多型をそのサイズで解析した場合、違いが見られなかったことの原因と考えられる。
【００１０】
プロモーター領域の機能解析については培養細胞を用いて行われた。Chiba-FalekらはNACP-Rep1も含め多くの領域が転写に影響を与えることを見いだした。この結果は5’領域の多型は転写に影響を与えることを示唆する。これらのことから、我々はプロモーター領域の多型を検索することにした。アルファ−シヌクレイン遺伝子の5’領域からイントロン４までの領域について弧発ＰＤについて変化が見られるか検討した。本研究では日本人弧発ＰＤ例について変異が見られるか検討した。
【００１１】
材料と方法並びに対象としては、本研究は岡山大学他協力病院の倫理委員会の承認を得て行った。全ての被験者から書面でDNAサンプルを本研究に用いる同意を得た。185人の患者、191人の健常人のサンプルを用いた。患者は西日本の中部に属する県の５病院に神経病部門に来院した弧発ＰＤである。弧発PDの診断は、DMS-IVの基準にのっとり感情病の専門家によって行われた。
【００１２】
同意を得た後、患者185名（男６８名、女１１７名）と健常者１９１名（男６７名、女１２４名）からDNAサンプルを得るため採血を行った。患者群と健常群は日本人で、地域的、性別も一致している。患者群の平均発症年齢は６２歳（28-83歳）であり、健常群の平均採取年齢は69歳であった。ゲノムDNAは末梢血からフェノール／クロロフォルム法で抽出した。
【００１３】
アルファ−シヌクレイン遺伝子変異の検出は、まず最初にPD患者群15名のサンプルを用いてアルファ−シヌクレイン遺伝子の多型を検索した（NCBIデータベース登録番号AF163864）。DNAサンプルはPCRにより増幅し、PCR産物はABI3100遺伝子解析装置によりBigDye terminator法により両側からシークエンスした。全サンプルの見いだした遺伝子多型部位の確認はPCR産物のシークエンスあるいはPCR産物の制限酵素による消化（PCR-RFLP）によって行った。
【００１４】
統計解析として、各部位のデータはジェノタイプ頻度についてカイ平方検定によりHardy-Weinberg平衡によりサンプルの偏りを評価した。患者、健常群のアレル頻度、ジェノタイプ頻度の比較はカイ平方検定により比較した。T10A7多型のアレル頻度はhttp://anthropologie.unige.ch/arlequinから入手したArlequinプログラムで比較した。
【００１５】
結果として、まず最初に、日本人の多型情報が無かったため、プロモーター領域とイントロン４について日本人15人のPDサンプルを用いて再シークエンスを行った。1.6kbpのプロモーター領域には８多型部位を見いだした。３カ所(-672, -164, -116)は欧米人で報告されている。部位の番号はNCBIデータベース登録番号AF163864を元にした。部位の番号はFarrerらの参考にしたU46896とは少し異なり、たとえばAF163864の-672はU46896の-668である。４カ所はNCBI db-SNPデータベースに登録されていた。イントロン4の２カ所のSNPも登録されていた。最終的に185患者群サンプルと191健常群サンプルを解析した。各SNPについて疾患との関連性を検討した。プロモーターの8SNPとイントロン4の2SNPはHardy-Weinberg平衡を満たしサンプルの偏りは無かった。
【００１６】
プロモーター領域の-1364, -1283, -672, -164, -116およびイントロン４のIVS4+66はアレル頻度、ジェノタイプ頻度ともに患者群とコントロール群の比較で有意差(P<0.05)が認められた。-1369はアレル頻度のみ有意差が認められた。-672と-116多型を組み合わせると(C/C, G/G), (C/T, G/C), (T/T, C/C)ジェノタイプのみ患者群と健常群で認められたことからアレルとして(C, G)あるいは(T, C)のコンビネーションが考えられた。この結果は、ドイツ人で見られた組み換えが日本人では見られないことを示唆する。また、これらの結果は解析した領域よりもむしろプロモーター領域とイントロン４領域の間に重要な部位があることを示唆している。
【００１７】
そこでエキソン１、イントロン１、エキソン２、イントロン２の一部合わせて2.2kbpにわたって再シークエンスを行った。11SNPと１PNP（多塩基多型）を15PDサンプルから見いだした。これらの多型部位の位置については図１にまとめ、マイナーのアレル頻度と有意差については図２にまとめた。Exon1+145以外の全ての多型部位はNCBI db-SNPデータベースに登録されていた。IVS1+273, IVS1+608, IVS1+719, IVS1+804, IVS1+819, IVS1+841については中でも強い有意差（p<0.005）を認めた。マイナーアレル頻度は健常群では11-12%、PD患者群では5-6%であった。IVS1+801の患者群以外ではHardy-Weinberg平衡が成立していた。中でもIVS1+719は患者群と健常群の比較でもっとも強い有意差を示した（ジェノタイプ p=0.0002, アレルP<0.0001）。T10A7PNP（IVS1+155）もまた、アレル頻度比較で強い有意差を示した。T10A8， T11A6、T12A5アレルがPD患者群で高かった。ジェノタイプサンプルについてHardy-Weinberg平衡を調べたところ、健常群では有意差が見られなかったものの、患者群では見られたことも疾患との関連性を示唆した。
【００１８】
考察として、アルファ−シヌクレイン遺伝子の多型変化がPDの病因に関連するのではないかとの仮説の下に、日本人のPD患者群と健常群を用いて多型関連解析を行った。
【００１９】
アルファ−シヌクレイン遺伝子のプロモーター領域1.6kbpとエキソン１、イントロン１、エキソン２、一部のイントロン２およびイントロン４の合わせて3.8kbpについて解析し、11SNPと1PNPを見いだした。有意差はIVS1+719が最大であり、T10A7PNP（IVS1+155）も強い有意差を示した。これらの結果はイントロン１の重要性を強く示唆している。
【００２０】
エキソン1’非翻訳領域の5’側にあるT10A7多型はフィンランド人を対象に研究され、PD患者群で有意差は無かったと報告された。結果の相違はサンプルの大きさによるものと我々は考えている。PDサンプルにおけるT10A8とT11A6アレルの増加はいずれの研究でも認められる。
【００２１】
NACP-Rep1以外のプロモーター領域とイントロン領域の解析は何報か報告されている。欧米人で-116多型について研究され、有意差の無いことが報告されている。-672についても有意差が見られないと報告されている。これらの報告は我々の結果と異なるが、これはNACP-Rep1と同様、重要な多型部位はここではなく、他にあることを示唆している。イントロン4の多型についてもコンセンサスは得られていない。欧米人ではIVS4+78で有意差が見られているが、IVS4+66で我々は有意差を見いだしている。NACP-Rep1とIVS4+78insAの組み合わせについて中国人で調べられ、有意差が報告された。イントロン５の３塩基CAAの繰り返し多型はアイルランド人弧発例で調べられ有意差は報告されなかった。我々の詳細な解析によると調べた領域で有意差が認められるが、全てのSNPが有意差を示すわけではなく、中には有意差を示さない部位も存在している。このことから、これまで報告されていた弧発例のG209AやG88Cも含め、これまでの解析された部位について再考する必要がある。
【００２２】
エキソンのSNPは最初家族研究で報告された。A209GとG88Cは家族や弧発例で精力的に調べられ、これらの部位はまれであることが分かった。Vaughanらは全ての７エキソンについて欧米人の家族を調べ、G209A以外では変異を見いだしていない。これらの結果は蛋白質レベルではなく、あるとすれば調節領域あるいはイントロン領域の変異が重要であることを示唆していると思われる。
【００２３】
プロモーター領域とエキソン領域について機能解析されている。アルファ−シヌクレインプロモーター領域は10kbp全体にわたって遺伝子発現に関与していることが示唆された。-672と-116多型も転写調節に影響を与えている。G209A変異は遺伝子発現を減少させ、haploinsufficiencyが考えられている。これらの機能解析はある意味では遺伝子発現の調節機構を明らかにするために必要であり、調節部位を明らかにするために重要である。しかし、これで見つかった部位が多型を伴うことを保証するものではない。あくまでも見つかったSNPの転写調節などの機能変化を解析することが重要である。もっとも連鎖不平衡にある別の部位のSNPが重要である可能性も残る。
【００２４】
IVS1+719とT10A7のいずれの部位が最も重要であるかは構成するアレルの数が異なるため分からない。少なくともIVS1+719の近傍のイントロン１がPDに重要であると考えられる。この部位は日本人のMAP依存患者について検討したところ有意差は認められていないことから、この部位のPD特異性が見られていると考えられる。この部位の役割は分かっていないが、T10A7はイントロン１あるいはエクソン1’にあり、IVS1+719がイントロン１にあることから、スプライシングに関与している可能性がある。
【００２５】
我々の結果は、日本人の弧発例ＰＤの病因にアルファ−シヌクレインが関与していることを支持する結果である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アルファ−シヌクレイン遺伝子における多型部位の位置を示す図である。
【図２】マイナーのアレル頻度と有意差について示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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