(57)【要約】【課題】  既に食経験があり、血圧降下作用を有し、かつ例えば機能性食品などに利用可能な安全性の高いＡＣＥ阻害剤を提供すること。【解決手段】  本発明は、シイタケおよびフサハリタケよりなる群から選択されるキノコの水抽出物をタンパク質分解酵素で処理することによって得られる、アンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供する。好適な実施態様では、上記タンパク質分解酵素は、ペプシンおよびデナプシンよりなる群から選択される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シイタケおよびフサハリタケよりなる群から選択されるキノコの水抽出物をタンパク質分解酵素で処理することによって得られる、アンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
前記タンパク質分解酵素が、ペプシンおよびデナプシンよりなる群から選択される、請求項１に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害剤を含む、高血圧の予防または治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤に関する。より詳細には、キノコ抽出物をタンパク質分解酵素処理して得られる、アンギオテンシン変換酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における代表的な生活習慣病の１つである高血圧症は、心筋梗塞や、脳梗塞、脳閉塞のような脳血管疾患などの重篤な疾病原因となり得る。このため、高血圧症は早期の改善が必要であり、軽症の段階から高血圧症の発症を予防することが望ましく、以前からその原因の究明ならびに有効な対策の研究がなされてきた。高血圧症の発症には、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系と呼ばれる昇圧酵素系ならびにカリクレイン−キニン−プロスタグランジン系と呼ばれる降圧酵素系が重要な役割を果たしていることが知られている。これらの酵素系においては、アンジオテンシンＩ変換酵素（Angiotensin Converting Enzyme、以下「ＡＣＥ」と称する）が、アンジオテンシンＩを強力な昇圧ペプチドであるアンジオテンシンIIに変換するとともに、降圧ペプチドであるブラジキニンを不活性化する作用を示すため、血圧上昇に関与する。したがって、ＡＣＥの活性を阻害することは、血圧上昇を抑制する作用と密接に相関している。ＡＣＥ活性阻害作用を有する降圧薬としては、例えば、カプトプリルが市販されている。
【０００３】
上記の知見に基づき、これまでに、ＡＣＥ阻害活性を有する多くの天然物が探索されてきた。例えば、イワシ筋肉のペプシン分解物（特許文献１）、カツオのサーモライシン分解物（特許文献２）、ゴマのタンパク分解酵素分解物（特許文献３）、ワカメの酵素分解物（特許文献４）などが報告されている。
【０００４】
食用キノコ由来のタンパク質についても検討されており、マイタケやエノキタケから抽出されたタンパク質が、血圧上昇および血清脂質上昇に対して優れた効果を有することが報告されている（特許文献５）。また、ハタケシメジ、マイタケ、およびシイタケの水抽出物が、ＡＣＥ阻害活性を有することも報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
シイタケ（Lentinula edodes）は、日本および中国においては代表的な食用キノコであり、日本では約３００年前から人工栽培が行われてきた。古くから、シイタケには種々の病気や症状に効果があると言われており、例えば、コレステロール低下作用（非特許文献２）、血圧降下作用（特許文献６）、脂肪合成促進作用（特許文献７）、肝障害防御作用（特許文献８）、ＩｇＡ産生促進作用（特許文献９）などが報告されている。さらに、自己消化処理したシイタケが、ＡＣＥ阻害活性を有することも報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ＡＣＥ阻害剤を食品の形態で工業的に大量に提供するためには、ＡＣＥ阻害剤としての生理学的作用および安全性を備えているだけでなく、製造や流通にかかるコスト、消費者の官能性・嗜好も十分に加味する必要がある。しかし、これらの必要性を十分に満足するものは、これまでには見出されていない。また、従来、降圧剤として市場に供されてきたカプトプリルのような医薬品は、優れた薬効を有する反面、副作用を有するなどの安全性に問題がある場合がある。そのため、このような医薬品を日常の食生活の中で用いて、高血圧症を予防および改善することは困難であった。
【特許文献１】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献２】特開平４−１４４６９６号公報
【特許文献３】特開平７−０６９９２２号公報
【特許文献４】特開２００３−１５３号公報
【特許文献５】特開平８−２９１０７８号公報
【特許文献６】特開昭５８−２６８２０号公報
【特許文献７】特開平１１−１９９４９９号公報
【特許文献８】特開２０００−１５９６８３号公報
【特許文献９】特開２００３−１５５２４９号公報
【非特許文献１】卯川ら、「日本食品科学工学会誌」、２００１年、第４８巻、第１号、５８−６３頁
【非特許文献２】カネダら、「ジャーナル・オブ・ヌトリション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、１９６６年、第９０巻、３７１−３７６頁
【非特許文献３】渡辺ら、「日本食品科学工学会誌」、２００２年、第４９巻、第１０号、６６２−６６９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、既に食経験があり、血圧降下作用を有し、かつ例えば機能性食品などに利用可能な安全性の高いＡＣＥ阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かかる課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、キノコ水抽出物をタンパク質分解酵素で分解して得られた分解物が、優れた血圧降下作用、特にアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、シイタケおよびフサハリタケよりなる群から選択されるキノコの水抽出物をタンパク質分解酵素で処理することによって得られる、アンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供する。
【００１０】
好適な実施態様では、上記タンパク質分解酵素は、ペプシンおよびデナプシンよりなる群から選択される。
【００１１】
本発明はまた、上記アンギオテンシン変換酵素阻害剤を含む、高血圧の予防または治療薬を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、優れた血圧降下作用、特にアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する。高血圧予防、改善、または治療に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、キノコの子実体または菌糸体からの水抽出物を、タンパク質分解酵素で処理することによって得られる。
【００１４】
原料となるキノコとしては、シイタケ、レイシ、アガリクス、フサハリタケなどが挙げられる。本発明においては、シイタケおよびフサハリタケが好ましい。シイタケ（Lentinula edodes）は、主としてコナラ、クヌギ、クリ、シイ、シデ類などのブナ科およびカバノキ科の枯れ木を腐朽する担子菌ハラタケ目に属する菌である。日本および中国においては代表的な食用キノコであり、上述のように、種々の生理作用を有することが知られている。フサハリタケ（Creolophus cirrhatus）は、担子菌類ヒダナシタケ目サンゴハリタケ科に属するキノコである。ヨーロッパ、北アメリカなどに広く分布するが、日本では発生の報告が数例しかない珍しいキノコであり、その生理作用についてはほとんど知られていない。
【００１５】
キノコの子実体は、日常食用としている形態であり、菌類が子孫を残すために胞子を生じる生殖体である。一方、キノコの菌糸体は、キノコの栄養体である菌糸細胞が、地中や原木中で長い時間をかけて形成したものである。
【００１６】
本発明においてキノコの水抽出物とは、キノコの子実体の水抽出物およびキノコの菌糸体の水抽出物をいう。ここでいう水抽出物は、水のみでなく、水酸化ナトリウム水溶液、ＰＢＳ（−）のようなバッファーで抽出して得られた抽出物も含まれる。キノコの子実体の水抽出物は、子実体をそのまままたは乾燥後、切断、摩砕、粉砕などを行って表面積を増大させて、水（例えば、精製水、イオン交換水など）や水酸化ナトリウム水溶液、ＰＢＳ（−）のようなバッファーで抽出して得られる抽出物をいう。また、キノコの菌糸体の水抽出物は、キノコの菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体を含む固体培地を粉砕した後、水で抽出して得られる抽出物をいう。切断、摩砕、粉砕などは、当業者が通常用いる手段（例えば、ミキサーなど）によって行われ得る。キノコの子実体からは、例えば、以下のような方法で水抽出物を得るが、この方法に限定されない。
【００１７】
具体的には、子実体を乾燥後、ミキサーで粉砕し、粉砕物１〜５００ｇに対して水１〜１０Ｌを加えて懸濁させ、１〜３０℃、好ましくは４〜１０℃で１〜４８時間、より好ましくは攪拌しながら１〜２４時間抽出する。抽出後、不溶物を濾去して濾液を得、得られた濾液を凍結乾燥する。得られた乾燥物を水に溶解し、氷で冷やしながら冷アセトンを加え、析出する沈殿を集め、凍結乾燥することによって、キノコの子実体の水抽出物を得る。この水抽出物は、キノコ粗タンパクともいう。
【００１８】
あるいは、子実体を乾燥後、ミキサーで粉砕し、粉砕物１〜５００ｇに対して０．０１〜０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１〜１０Ｌを加えて懸濁させ、１〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃で３０分間〜２４時間、より好ましくは攪拌しながら１〜２４時間抽出する。抽出後、不溶物を濾去して濾液を得る。得られた濾液を１Ｎ塩酸によりｐＨを４．０〜４．５に調製して、得られた沈殿を遠心分離（８，０００×ｇ、１５分間）により、回収し、凍結乾燥し、キノコの子実体の水抽出物を得る。この水抽出物は、キノコ粗タンパクともいう。
【００１９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、キノコの水抽出物をタンパク分解酵素で処理することにより調製することができる。タンパク分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、デナプシンなどの各種タンパク質分解酵素を使用することができる。安全性を考慮すれば、市販の食品用タンパク分解酵素、例えば、商品名デナチウムＡＰ、ビオプラーゼＡＬ−１５ＦＧ、デナプシン１０Ｐ（いずれもナガセケムテックス株式会社製造）などが好ましく、デナプシンがより好ましい。
【００２０】
タンパク分解酵素の反応条件については、基本的には、使用するタンパク質分解酵素の至適反応温度および至適ｐＨを考慮して設定される。酵素の添加量は、酵素の比活性によって異なるが、通常粗タンパク（キノコ水抽出物）に対して０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜１０質量％、さらに好ましくは０．１〜５質量％である。ペプシンを用いる場合は、０．１〜１質量％がより好ましい。デナプシンを用いる場合は、０．５〜５質量％が好ましく、０．８〜３質量％がより好ましい。反応時間は、酵素添加量、反応温度などによって変わるが、通常、１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、さらに好ましくは１〜１８時間である。
【００２１】
上記酵素処理で得られた溶液を、そのままの形態で本発明のＡＣＥ阻害剤として用いることができるが、より好ましくは、上記酵素処理溶液をタンパク変性処理（例えば、熱処理）してタンパク質分解酵素を失活させる。必要に応じて、単独で、あるいはデンプン、デキストリンなどの賦形剤や他の食品添加物とともに、スプレードライ、凍結乾燥などによって乾燥粉末化する。また、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。
【００２２】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、食品として提供され得る。食品中に含まれる割合は、特に限定されず、当該食品の使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。通常、食品１００質量部あたり０．１〜９９質量部の範囲である。
【００２３】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、高血圧の予防または治療薬としても用いることができる。投与経路は、経口投与が最も好ましいが、静脈内投与、皮下投与であってもよい。経口投与に適する製剤として、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの製剤中には、薬学的に受容可能な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、コーティング剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の高血圧の予防または治療薬の投与量は、患者の年齢および体重、改善すべき症状、投与経路などによって異なるが、主治医の判断によって適宜決定され得る。本発明の高血圧の予防または治療薬に含まれるキノコの水抽出物は、食品として使用されてきたものであるため、その投与量を厳格に規定する必要はないが、通常、キノコの水抽出物の乾燥粉末換算で１日あたり１０ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１ｇである。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）シイタケ水抽出物の調製（１）
乾燥シイタケ菌興１１５号（日本きのこセンターで栽培）の子実体５０ｇをミキサーで粉砕した後、イオン交換水５００ｍＬを加え、４〜１０℃で２日間静置して抽出した。抽出後、不溶物を濾去し、濾液３５０ｍＬを得た。得られた濾液を凍結乾燥して、抽出物１３．２ｇを得た。得られた抽出物を約５０ｍＬのイオン交換水に溶解し、氷で冷やしながら冷アセトン９００ｍＬを加えた。析出した沈殿を集め、凍結乾燥して、シイタケ水抽出物５．８ｇを得た。
【００２６】
（実施例２）シイタケ水抽出物の調製（２）
乾燥シイタケ菌興１１５号（日本きのこセンターで栽培）の子実体５ｇをミキサーで粉砕した後、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ中に置き、５０℃２時間静置して抽出した。次に、残渣をろ去後、１Ｎ塩酸によりｐＨを４．３に調製して、得られた沈殿を遠心分離（８，０００×ｇ、１５分間）により、回収し、凍結乾燥し、シイタケ水抽出物０．６ｇを得た。
【００２７】
（実施例３）シイタケデナプシン分解物の調製
上記実施例２で得られたシイタケ水抽出物０．２５ｇをイオン交換水１０ｍＬに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液でｐＨ３．０に調製した。調製した液に、基質（シイタケ水抽出物）に対して１質量％となるように２．５ｍｇのデナプシン１０Ｐを加え、４０℃にて１６時間振とうした。次いで、反応液を約９０℃にて１５分間加熱して、タンパク分解酵素を失活させた。この溶液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を凍結乾燥して、シイタケデナプシン分解物０．２２ｇを得た。
【００２８】
（実施例４）シイタケペプシン分解物の調製
上記実施例２で得られたシイタケ水抽出物０．２５ｇをイオン交換水１０ｍＬに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液でｐＨ１．２に調整した。調製した液に、基質（シイタケ水抽出物）に対して０．４重量％となるように１ｍｇのペプシンを加え、３７℃にて４時間振とうした。次いで、反応液を１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．８に調整した後、約９０℃にて１５分間加熱し、タンパク分解酵素を失活させた。この溶液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を凍結乾燥して、シイタケペプシン分解物０．２４ｇを得た。
【００２９】
（実施例５）フサハリタケ水抽出物の調製
乾燥フサハリタケ（日本きのこセンターで栽培）の子実体５０ｇをミキサーで粉砕した後、イオン交換水５００ｍＬを加え、４〜１０℃で２日間静置して抽出した。抽出後、不溶物を濾去し、濾液３５０ｍＬを得た。得られた濾液を凍結乾燥して、抽出物１３．２ｇを得た。得られた抽出物を約５０ｍＬのイオン交換水に溶解し、氷で冷やしながら冷アセトン９００ｍＬを加えた。析出した沈殿を集め、凍結乾燥して、フサハリタケ水抽出物１２．１ｇを得た。
【００３０】
（実施例６）フサハリタケデナプシン分解物の調製
上記実施例５で得られたフサハリタケ水抽出物１ｇをイオン交換水１０ｍＬに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液でｐＨ３．６に調製した。調製した液に、基質（フサハリタケ水抽出物）に対して１重量％となるように１０ｍｇのデナプシン１０Ｐを加え、４０℃にて１６時間振とうした。次いで、反応液を約９０℃にて１５分間加熱し、タンパク分解酵素を失活させた。この溶液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を凍結乾燥して、フサハリタケデナプシン分解物０．９８ｇを得た。
【００３１】
（実施例７）ＡＣＥ阻害活性評価
酵素は市販のＡＣＥ（Ｓｉｇｍａ社）を使用した。基質はヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンを用いた。４．８ｍＵ（１Ｕは１分間に１μｍｏｌのヒプリル酸を生成する酵素力価）のＡＣＥ、２ｍｍｏｌのヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン、表１に記載の濃度のキノコ水抽出物の各酵素分解物、および１２０ｍｍｏｌのＮａＣｌを、０．４ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）に添加し、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを０．１ｍＬ添加して反応を停止させた後、１ｍＬの酢酸エチルを加えて１５秒間激しく攪拌した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、酢酸エチル層０．５ｍＬを採取した。酢酸エチルを窒素ガスで除去した後、残渣を１ｍＬのイオン交換水に溶解し、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。阻害率は、次式によって算出した。
【００３２】
阻害率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／  Ａ  ｝×１００
Ａ：酵素分解物を加えない場合の吸光度
Ｂ：酵素分解物を加えた場合の吸光度
【００３３】
【表１】
2006016317.tif 000002
【００３４】
表１に示すように、シイタケ水抽出物およびフサハリタケ水抽出物にはごくわずかのＡＣＥ阻害効果が認められたが、タンパク質分解酵素で処理することによりＡＣＥ阻害活性が著しく上昇することがわかった。
【００３５】
（実施例８）シイタケ水抽出物に対するデナプシンの濃度の検討
上記実施例３において、用いたデナプシンの量を以下の表２に記載の量としたこと以外は、上記実施例３と同様にして、シイタケ水抽出物のデナプシン分解物を得た。０．８ｍｇ／ｍＬのこれらの分解物について、上記実施例７と同様にＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2006016317.tif 000003
【００３７】
表２からわかるように、上記実施例７よりも低濃度の分解物を用いたにもかかわらず、１．０％および５．０％のデナプシン分解物は非常に高いＡＣＥ阻害率を示した。また、ＡＣＥ阻害率が５０％を示すときの反応液１ｍＬ中の水抽出物濃度（ＩＣ５０）は、シイタケ水抽出物では３．９７ｍｇ／ｍＬ以上であり、１．０％デナプシン分解物では、２９５．０μｇ／ｍＬであった。このように、シイタケ水抽出物のデナプシン分解物は、シイタケ水抽出物の約１０倍以上もの非常に高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００３８】
（実施例９）シイタケ水抽出物に対するペプシンの濃度の検討
上記実施例４において、用いたペプシンの量を以下の表３に記載の量としたこと以外は、上記実施例４と同様にして、シイタケ水抽出物のペプシン分解物を得た。０．８ｍｇ／ｍＬのこれらの分解物について、上記実施例７と同様にＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
2006016317.tif 000004
【００４０】
表３からわかるように、ペプシンを用いた場合は、デナプシンよりも低い酵素濃度の０．１％で、比較的高いＡＣＥ阻害率を示したが、１％以上ではデナプシンよりも低いＡＣＥ阻害率を示した。
【００４１】
（実施例１０）低濃度でのフサハリタケデナプシン分解物の評価
上記実施例７において、用いたフサハリタケ水抽出物およびフサハリタケデナプシン分解物の量を０．８ｍｇ／ｍＬとしたこと以外は、上記実施例７と同様にＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】
2006016317.tif 000005
【００４３】
表４からわかるように、フサハリタケの１．０％デナプシン分解物は、低濃度でも非常に高いＡＣＥ阻害率を示した。
【００４４】
（実施例１０）食品の調製
実施例２で得たシイタケデナプシン分解物を用いて、以下の組成を有する食品を調製した。
【００４５】
成分                                  質量（ｇ）
シイタケデナプシン分解物                  ０．６
大豆サポニン                              ２．０
黒酢エキス                                ２．０
リンゴファイバー                          ２．０
レシチン                                  １．０
フラクトオリゴ糖                          ２．０
果糖                                      １．０
粉末酢                                    ０．１
シクロデキストリン                        １．０
蜂蜜                                      １．０
骨粉                                      １．０
デキストリン                              ４．９
【００４６】
各成分を流動造粒機中で混合した後、水を噴霧して造粒を行ない、入風温度８０℃で乾燥した。
【００４７】
（実施例１１）食品の調製
実施例６で得たフサハリタケデナプシン分解物を用いて、以下の組成を有する食品を調製した。
【００４８】
成分                                  質量（ｇ）
フサハリタケデナプシン分解物              ０．６
大豆サポニン                              ２．０
黒酢エキス                                ２．０
リンゴファイバー                          ２．０
レシチン                                  １．０
フラクトオリゴ糖                          ２．０
果糖                                      １．０
粉末酢                                    ０．１
シクロデキストリン                        １．０
蜂蜜                                      １．０
骨粉                                      １．０
デキストリン                              ４．９
【００４９】
各成分を流動造粒機中で混合した後、水を噴霧して造粒を行ない、入風温度８０℃で乾燥した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、優れた血圧降下作用、特にアンギオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する。したがって、高血圧予防、改善、または治療への利用に有用である。また、比較的安価な食用キノコに由来し、天然に存在する酵素で処理されるのみなので、安価に提供可能であり、副作用も少ないと考えられる。