(57)【要約】  【課題】  エゾウコギ中に含まれるイソフラキシジン含有量を、共存成分によって妨害されることなく測定する方法の提供。  【解決手段】  エゾウコギ又はエゾウコギ抽出物に水及び酢酸エチルを混合し、その混合液から酢酸エチル層を分取し、液体クロマトグラフ法で測定を行うことを特徴とするエゾウコギ中のイソフラキシジンの定量方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エゾウコギ又はエゾウコギ抽出物に水及び酢酸エチルを混合し、その混合液から酢酸エチル層を分取し、液体クロマトグラフ法で測定することを特徴とするエゾウコギ中のイソフラキシジンの定量方法。
【請求項２】
エゾウコギ抽出物が、エゾウコギの親水性溶媒抽出物である請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
エゾウコギ抽出物が、エゾウコギの親水性溶媒抽出物から親水性溶媒を除去したエゾウコギ乾燥エキスである請求項１記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エゾウコギ中に含まれるイソフラキシジンを定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エゾウコギ（蝦夷五加：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ  Ｈａｒｍｓ）は、抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、抗ストレス作用、疲労回復作用、過酸化脂肪抑制作用、鎮静作用、血管拡張作用等を有する活性成分を含有するウコギ科の落葉潅木植物であって、北海道、ロシア、中国東北部等に分布する植物である。エゾウコギ及びその抽出物は、このように滋養強壮、疲労回復、抗アレルギー作用、抗腫瘍作用、血管拡張作用等の有効成分として各種医薬品、健康食品等に配合されている。
エゾウコギの活性成分は多種多様であって、リグナン類（エレウテロシドＥ）、クマリン類（イソフラキシジン、エレウテロシドＢ１）、フェノール類（エレウテロシドＢ）、タンニン類（クロロゲン酸）等が挙げられる。そのため、エゾウコギ又はその抽出エキス中の活性成分含有量は、例えばイソフラキシジンを指標にして測定されている。しかしながら、液体クロマトグラフ法で活性成分量を定量した場合、メインピーク以外にも共存する夾雑物による妨害ピークが発生し、分析が極めて困難で、エゾウコギ中の正確な活性成分量が得られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、エゾウコギ中に含まれるイソフラキシジンの含有量を、共存する夾雑物によって妨害されることなく定量する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、エゾウコギ中のイソフラキシジンを迅速に、高感度に、正確に検出できる方法を鋭意検討したところ、エゾウコギ又はその抽出物を水及び酢酸エチルで処理した後、その酢酸エチル層を液体クロマトグラフ法で測定すると、エゾウコギ中のイソフラキシジンが、共存する夾雑物による妨害を受けずに正確に精密に定量できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、エゾウコギ又はエゾウコギ抽出物に水及び酢酸エチルを混合し、その混合液から酢酸エチル層を分取し、液体クロマトグラフ法で測定することを特徴とするエゾウコギ中のイソフラキシジンの定量方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
共存する微量の夾雑物の影響を受けて妨害されることなく、エゾウコギ中のイソフラキシジンを迅速、高感度、正確に定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
エゾウコギは、その根、葉、茎等にイソフラキシジン等の活性成分を有する。本発明の定量方法の検体は、これらを粉砕又は粉末としたものを適用してもよいが、通常は、エゾウコギの根、葉、茎等の粉砕物又はその粉末化物の溶媒抽出物、特に該溶媒抽出物から溶媒を除去したエゾウコギ乾燥エキスを適用するのが、定量精度の点でよく好ましい。この前処理の溶媒抽出に使用する溶媒としては、親水性溶媒が好ましく、メタノール、エタノール等の炭素数１〜５の脂肪族アルコール、水又はそれらの混合物が挙げられる。特に水が好ましい。エゾウコギと抽出溶媒の質量比は、エゾウコギ：抽出溶媒が１：１〜１：３０であるのが好ましい。抽出前処理時間は、５〜６０分、更に１０〜５０分、特に２０〜４０分が好ましい。抽出前処理温度は、２０〜１００℃、更に４０〜１００℃、特に６０〜１００℃が好ましい。
【０００８】
更に、エゾウコギ溶媒抽出物から抽出溶媒を除去してエゾウコギ乾燥エキスを調製する場合、凍結乾燥、減圧蒸留等の通常の溶媒除去方法が使用される。したがって、検体に溶媒が混入している場合には、予めその溶媒を除去しておくのが好ましい。以下、検体がエゾウコギ乾燥エキスである場合を中心に記載する。
【０００９】
本発明の液体クロマトグラフ法でエゾウコギの活性成分であるイソフラキシジンを定量するに際し、検体は、水及び酢酸エチルと混合し処理することを要する。この場合、（１）先ず水と混合処理し、次いで酢酸エチルを加えて混合処理する方法、（２）先ず酢酸エチルと混合処理し、次いで水を加えて混合処理する方法、（３）水及び酢酸エチルを同時に加えて混合処理する方法の何れでもよい。混合処理としては、エゾウコギ乾燥エキス中のイソフラキシジンを水で処理抽出し、次いで酢酸エチル層に移行させる（１）の方法が好ましい。
【００１０】
検体であるエゾウコギ乾燥エキスと水との混合比率は、質量比でエゾウコギ乾燥エキス：水が１：１００〜１：１００００、更に１：５００〜１：５０００、特に１：１０００〜１：３０００であるのが好ましい。また、エゾウコギ乾燥エキスと酢酸エチルとの混合比率は、質量比でエゾウコギ乾燥エキス：酢酸エチルが１：１００〜１：１００００、更に１：５００〜１：５０００、特に１：１０００〜１：３０００であるのが好ましい。
使用する水と酢酸エチルの容量比は、水：酢酸エチルが５：１〜１：５、更に２：１〜１：２が好ましく、特に１：１であるのが好ましい。
【００１１】
エゾウコギ乾燥エキスと水・酢酸エチルとの混合処理は、その混合物を撹拌、振盪、超音波等で処理する方法で行われる。混合処理時間は、５〜１２０分、更に１０〜９０分、特に２０〜６０分が好ましい。混合処理温度は、５〜６０℃、更に１５〜４０℃、特に２０〜３０℃が好ましい。
【００１２】
次いで、混合処理処理液は、遠心分離等で固形物を分離する処理を行った後、上層の酢酸エチル層を分取する。酢酸エチル層の酢酸エチルを留去した後、水を加え、その上澄を液体クロマトグラフ法の検体に供する。加える水の量は、０．２〜２０ｍＬ、特に１〜１０ｍＬが好ましい。
【００１３】
このようにして前処理されたエゾウコギ乾燥エキスは、常法に従って液体クロマトグラフ法、特に好ましくは高速液体クロマトグラフ法にて、その活性成分であるイソフラキシジン含有量が定量される。
好ましい条件としては、検出器は、紫外可視分光検出器又は多波長検出器が好ましく、その測定波長は、３４０〜３５０ｎｍが好ましい。また、紫外吸収スペクトルの測定波長範囲は１９０〜４００ｎｍが好ましい。カラムは、内径約３〜５ｍｍで、長さ約５〜２５ｃｍのステンレス管に平均粒子径３〜７μｍの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充てんしたものが好ましく、カラム温度は、２５〜６０℃付近の一定温度が好ましく、更に３０〜５０℃付近の一定温度が好ましく、特に３５〜４５℃が好ましい。
移動相は、リン酸、酢酸、アセトニトリル、メタノール、水又はその混液が用いられ、特にリン酸、アセトニトリルと水の混液が好ましい。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例により本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００１５】
実施例１
エゾウコギ（蝦夷五加：北海道東部産）３００ｍｇを裁断し、粗切したしたものを水３ｍLを加えて、９５℃で３０分間抽出し、ステンレス製金網（１５０メッシュ）でろ過する。ろ液を減圧濃縮し、濃縮液を噴霧乾燥し、乾燥物を混合篩過して得たエゾウコギ乾燥エキス１２ｍｇに、水２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、５分間超音波処理した。次いでそれに酢酸エチル２０ｍＬを加えて、１０分間振り混ぜた後、遠心分離し、上澄層を分離した。該上澄層１０ｍＬから酢酸エチルを減圧留去して残留物を得た。残留物に、水２ｍＬを加えて溶解した後、５分間超音波処理をした。該溶解液を遠心分離し、上澄液を液体クロマトグラフ法での測定検体溶液とした。
【００１６】
比較例１
実施例１で使用したエゾウコギ乾燥エキス１２ｍｇに、水２０ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、５分間超音波処理し、次いで遠心分離を行った。その上澄層を分離し、水を減圧留去して残留物を得た。残留物に水２ｍＬを加えて溶解した後、５分間超音波処理をした。該溶解液を遠心分離し、上澄液を液体クロマトグラフ法での測定検体溶液とした。
【００１７】
比較例２
比較例１の水２０ｍＬに代えて、酢酸エチル２０ｍＬを用いて同様にして液体クロマトグラフ法での測定検体溶液を作成した。
【００１８】
標準溶液の作成
イソフラキシジン標準品２ｍｇを酢酸エチルに加えて溶解し１００ｍＬとした。この溶液１ｍＬをとり、酢酸エチルを加えて２０ｍＬとした。この溶液１０ｍＬから酢酸エチルを減圧留去した後、その残留物に水２ｍＬを加えて溶解しした後、５分間超音波処理し、上澄液を標準溶液とした。
【００１９】
測定検体溶液及び標準溶液のそれぞれ５０μＬを、次の条件で液体クロマトグラフ法で測定を行った。
【００２０】
測定条件
検出器：多波長検出器（クロマトグラム測定波長；３４５ｎｍ、吸収スペクトル測定波長範囲；１９０〜３７０ｎｍ）。
カラム：内径約３ｍｍ、長さ約７．５ｃｍのステンレス管に平均粒子径３μｍの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填したもの。
カラム温度：約４０℃付近の一定温度。
移動相：リン酸緩衝液（１→１０００）／アセトニトリル（８５：１５）。
流量：イソフラキシジンの保持時間が約９分になるように調整した。
なお、標準溶液５０μＬについて、上記条件で操作したときの、イソフラキシジンのピークの理論段数及びシンメトリー係数は、それぞれ３０００段以上、２．０以下であった。
【００２１】
測定検体溶液から得られた液体クロマトグラムのピークの一つは、標準溶液から得られたイソフラキシジンのピークと保持時間（約９分）が一致した（図１）。液体クロマトグラムで保持時間の一致したそれぞれのピークの紫外吸収スペクトルを測定した結果、両者はスペクトル波長３３９〜３４３ｎｍ付近に吸収の極大を認めた（図４）。本発明の測定方法は、共存する夾雑物の影響を受けず、高精度でエゾウコギ乾燥エキス中のイソフラキシジンを検出することができた。これに対して、比較例１及び２で調製した測定検体溶液の液体クロマトグラフ法での測定では、夾雑物の妨害ピークがあって、共存する夾雑物の影響を受けた（図２、３）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図２】比較例１の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図３】比較例２の液体クロマトグラフ法での測定結果を示す図である。
【図４】紫外吸収スペクトル測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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