(57)【要約】【課題】  物質間の相互作用が進行する反応溶液（電解質溶液）に電気力学的作用を用いるときに、該反応溶液でのジュール熱の発生を抑制し、反応温度を制御する。【解決手段】  電界質溶液中で進行する物質間の相互作用を検出するための反応場Ｘ内に、電位の基準となる参照電極ＲＥと、検出用物質が固定された作用電極ＷＥと、参照電極と作用電極の間の電圧印加によって発生する前記電解質溶液中のイオン電流を流入させる対極ＣＥと、を少なくとも備える物質間相互作用検出部、ならびにこのような反応場Ｘの構成を用いる物質間相互作用検出方法を提供する。【選択図】  図６
2006284205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電界質溶液中で進行する物質間の相互作用を検出するための反応場内に、
電位の基準となる参照電極と、
検出用物質が固定された作用電極と、
参照電極と作用電極の間の電圧印加によって発生する前記電解質溶液中のイオン電流を流入させる対極と、
を少なくとも備える物質間相互作用検出部。
【請求項２】
前記作用電極と前記対極との間の距離が、電界質溶液の温度変化が前記相互作用の進行を妨げない程度に収まるように設定されたことを特徴とする請求項１記載の物質間相互作用検出部。
【請求項３】
前記作用電極と前記対極との間の抵抗Ｒが次の数式１の条件を満たすように、前記作用電極と前記対極との間の距離が設定されたことを特徴とする請求項１記載の物質間相互作用検出部。
【数１】
2006284205.tif 000010
【請求項４】
前記物質間の相互作用は、生体高分子間の相互作用であることを特徴とする請求項１記載の物質間相互作用検出部。
【請求項５】
前記生体高分子間の相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項４記載の物質間相互作用検出部。
【請求項６】
請求項１記載の物質間相互作用検出部が一つ以上設けられたことを特徴とするセンサーチップ。
【請求項７】
物質間の相互作用が進行する電解質溶液中に、電位の基準となる参照電極と、検出用物質が固定された作用電極と、前記作用電極と離間する位置に設けられた対極と、を設けておき、
前記参照電極と前記作用電極の間への電圧印加で発生する前記電解質溶液中のイオン電流を前記対極に流入させることによって、該電解質溶液でのジュール熱の発生を抑制し、反応温度を制御すること特徴とする物質間相互作用の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を検出精度を向上させるための技術に関する。より詳しくは、反応溶液において電気力学的作用を用いる場合において、該反応溶液でのジュール熱の発生を抑制して、反応温度を正確に制御できる技術及び該技術を用いた物質間相互作用検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用されるようになり、さらには、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、テーラーメイド医療、進化の研究、法医学その他の分野において、幅広い応用が期待されている。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、固層基板上に固定された検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、対象物の存在量を定量化する。
【０００４】
ＤＮＡチップを例に挙げると、分析対象の遺伝子配列の一部をもつ一本鎖ＤＮＡ断片を予め固定しておき、試料中に、そのＤＮＡ断片と相補的な配列をもつ遺伝子が存在すると、両者は特異的に結合し（即ちハイブリダイゼーション）、二本鎖ＤＮＡを形成する。この二本鎖ＤＮＡを蛍光標識法などで検出することで、その遺伝子が試料溶液中で発現しているかどうかを判定する。異なる遺伝子配列の一本鎖ＤＮＡ断片を多数固定しておくことにより、一つの試料に対して、複数の遺伝子の発現解析を効率的に行い、あるいは、一つの遺伝子の発現解析に冗長性をもたせて解析の精度を上げることが可能である。
【０００５】
しかしながら、上記のようなセンサーチップは、生体高分子間の自然な相互作用に依拠しており、その反応速度は、拡散による輸送過程と相互作用の反応速度定数で決められるため、その反応精度は、相互作用の平衡定数で決められてしまう。したがって、試料中に、真の対象分子だけでなく、検出用物質に対して真の対象分子と同程度の親和性をもつノイズ分子が存在する場合、このノイズ分子もある程度検出用物質と結合してしまうので、センサーチップの解析精度が低下する。
【０００６】
この問題を解決するためのアプローチが幾つか提案されている。例えば、電気力学的効果を用いる技術がある。以下に、本発明との関連において、一般的な技術水準と位置付けられる先行技術を掲げると、まず、特許文献１には、生物試料からのｍＲＮＡ転写物を増幅してアンプリコンを得て、このアンプリコンを支持体の所定位置に結合（固定）されたプローブに対して電気的にハイブリダイゼーションさせる技術が開示されている。
【０００７】
また、特許文献２には、生体高分子間相互作用（この場合、DNA間のハイブリダイゼーション反応）が平衡に達した後、あやまってリガンドとハイブリダイゼーションしてしまった真の対象分子以外の分子を除去するために、輸送過程改善のための電圧とは逆の極性をもつ直流電圧を印加する方法が提案されている。
【０００８】
さらに、特許文献３には、高周波交流電圧等を印加することで、ヌクレオチド鎖に分極を誘起して、不均一電場中で泳動させる（誘電泳動）ことにより、ハイブリダイゼーション効率を改善する方法などが提案されている。
【特許文献１】特表２００４−５２４８２３号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特表２００２−５４１８２３号公報。
【特許文献３】特開２００４−１３５５１２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、センサーチップの固相表面の領域において、生体高分子間の相互作用を安定的に進行させるためには、一般に一定濃度以上の塩（例えば、NaClやMgCl2）を含む電解質溶液中でなければならない。この電解質溶液を反応溶液とする場合、その中に浸漬された電極（参照電極と作用電極）間に電圧を印加すると、電解質溶液中のイオン（例えばNa＋、Mg2＋、Cl-）が電界によって泳動し、溶液中にイオン電流が流れる。電流が流れるとジュール熱が発生するので、反応場内の溶液温度が上昇してしまうという技術的課題がある。
【００１０】
生体高分子間の相互作用は、１℃以下の温度変化にも大きな影響を受けるので、センサーチップの反応領域内を一定温度に保持することは極めて重要な技術的要素である。ジュール熱の発生を抑制するために電導度の低い反応溶液を用いる方法も考えられるが、反応溶液は、生化学的な観点から適切に選択されるべきものであり、第一に、対象とする生体高分子が安定的に存在でき、その活性を損なわない環境を与えるものでなくてはならない。
【００１１】
そこで、本発明は、物質間の相互作用に適した反応溶液（電解質溶液）を選択し、該反応溶液において電気力学的作用を用いるときに、該反応溶液でのジュール熱の発生を抑制して、反応温度を正確に制御できる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、まず、電界質溶液中で進行する物質間の相互作用を検出するための反応場内に、（１）電位の基準となる参照電極（「照合電極」とも言う）と、（２）検出用物質が固定された作用電極（「動作電極」とも言う）と、（３）参照電極と作用電極の間の電圧印加によって発生する前記電解質溶液中のイオン電流を流入させる対極と、を少なくとも備える物質間相互作用検出部を提供し、並びにこの物質間相互作用検出部が一つ以上設けられているセンサーチップを提供する。
【００１３】
参照電極と作用電極は、両電極間に電圧を印加することにより、反応場に電気泳動や誘電泳動などの電気力学的作用を及ぼす役割を果たす。なお、本発明では、電気力学的作用の具体的内容は限定されない。
【００１４】
前記対極は、参照電極と作用電極の間へ電圧印加で発生する電解質溶液中のイオン電流を受け入れることによって、参照電極と作用電極との間のイオン電流の流れを阻止し、電解質溶液でのジュール熱の発生の抑制させる役割を果たす。
【００１５】
本発明では、前記作用電極と前記対極との間の距離は、電界質溶液の温度変化が前記相互作用の進行を妨げない程度に収まるように設定する。印加電圧（Ｖ）が一定である場合、ジュール熱はｑ＝Ｖ２／Ｒ（Ｒ：抵抗）の式で示されるため、抵抗Ｒが大きいほどジュール熱ｑは小さくなるから、反応場における設計上許容される範囲で、作用電極と対極との間の距離は長ければ長いほどよい。
【００１６】
より具体的には、前記相互作用の種類や内容に照らして許容され得る温度変化を想定し、採用する電解質溶液の電導度、電極面積、反応時間などを勘案して、作用電極と前記対極との間の距離を決定することができる。例えば、前記作用電極と前記対極との間の抵抗Ｒが、既述した「数式１」（請求項３参照）の条件を満たすように、作用電極と前記対極との間の距離を設定することができる。
【００１７】
あるいは、現実の反応場の条件に適合する温度変化の境界条件を熱シミュレーション等して、発生するジュール熱量に対する温度変化率を算定し、作用電極と前記対極との間の距離を決定することができる。
【００１８】
ここで、本発明における「物質間の相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く包含し、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応、低分子-高分子間の相互作用などの物質間の化学的結合あるいは解離などに適用できる。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００１９】
次に本発明は、物質間の相互作用が進行する電解質溶液中に、電位の基準となる参照電極と、検出用物質が固定された作用電極と、前記作用電極と離間する位置に設けられた対極と、を設けておき、前記参照電極と前記作用電極の間への電圧印加で発生する前記電解質溶液中のイオン電流を前記対極に流入させることによって、該電解質溶液でのジュール熱の発生を抑制し、反応温度を制御するように工夫した物質間相互作用の制御方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、物質間の相互作用に適した反応溶液（電解質溶液）を選択して、この反応溶液において何らかの目的で電気力学的作用を用いるときに、該反応溶液でのジュール熱の発生を抑制し、反応温度を正確に制御できる。また、参照電極に電流が流れず、また、流れたとしてもすぐに最初に電位に戻るので、参照電極の電位が安定し、不要な電気化学反応を起こさなくなる。これらにより、物質間の相互作用の検出精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２２】
まず、図１は、本発明に係る物質間相互作用検出部に好適に用いられる基本電気回路を示す図である。ここで、図１中の符号ＲＥ、ＷＥ、ＣＥは、それぞれ参照電極（Reference Electrode）、作用電極（Working Electrode）、対極を表している。
【００２３】
また、図１中の符号ＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３は、すべてオペアンプ（演算増幅器）を表している。これらのオペアンプＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３は、反転入力（-IN）と非反転入力（+IN）の二つの入力端子をそれぞれ持っており、非常に大きな増幅率Ａ０をもった差動増幅器である。二つの入力端子間の電圧差（ｅ-IN−ｅ＋IN）をＡ０倍に増幅して出力端子に出力する（次の数式２を参照）。
【００２４】
【数２】
2006284205.tif 000003
【００２５】
ここで、オペアンプＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３の働きは、その性質を理想化して、（ａ）Ａ０が無限大、（ｂ）入力インピーダンスが無限大、（ｃ）出力インピーダンスがゼロ、と考えると分かりやすい。図１の三つのオペアンプＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３は、それぞれ反転増幅型のコントロールアンプ、ボルテージフォロワ（信号ゲンインピーダンス変換回路）、およびカレントフォロワ（電流−電圧変換回路）という異なった役割を果たしている。いずれも、出力をマイナス記号のついた反転入力端子に戻す負帰還回路をもっている。この負帰還があると、オペアンプはプラス記号のついた非反転入力端子の電位と反転入力端子の電位が等しくなるように働く。
【００２６】
以下に三つのオペアンプＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３の働きを説明する。まず、最初にＯＡ１は、とりあえずＯＡ２の存在を無視して考える。対極ＣＥから参照電極ＲＥにいたる電気化学系に関係したインピーダンスをまとめてＺｆと表すと、オペアンプＯＡ１の関与する電気回路は図２のようになる。オペアンプの性質（上記（ｂ）の性質）から、図２中の点１〜オペアンプＯＡ１には電流が流れ込まないので、次の数式３、４の関係がある。
【００２７】
【数３】
2006284205.tif 000004
【００２８】
【数４】
2006284205.tif 000005
【００２９】
一方、上記数式２からｅ３＝−Ａ０ｅ１を導くことができるから、これらの数式を変形して、入力電圧に対する各点の電位を知ることができる。ここで、オペアンプの性質（上記（ａ）の性質）から、Ａ０→∞とすると、Ｒｆ＝ＲINならば、ｅ４／ｅIN＝−１となる。
【００３０】
つまり図１の点４には入力電圧の符号を逆転した電圧が正確に印加される。また、入力電圧の値によらず、点１の電位は回路のコモン電位に保たれる（即ち、仮想接地）。
【００３１】
次に、オペアンプＯＡ２であるが、これは参照電極ＲＥに電流を流さないために設けられている。オペアンプの性質（上記（ｂ）の性質）から、点４に流れ込む電流は極めて小さく、参照電極ＲＥに内部抵抗があっても、それによる電圧降下は無視できる。一方、以下の数式５であり、かつｅ５＝ｅ６であることから、以下の数式６を導くことができる。
【００３２】
【数５】
2006284205.tif 000006
【００３３】
【数６】
2006284205.tif 000007
【００３４】
つまり、点４の電圧をそのまま点６に出力することができる。即ち、参照電極ＲＥには電流が流れないために、参照電極の劣化を気にする必要もなくなる。
【００３５】
最後にオペアンプＯＡ３の動作を説明する。図１中の点７は、前述の点１と同様に仮想接地されているので、作用電極ＷＥは常にコモン電位に保たれている。入力電圧がＥとすると、この場合、参照電極ＲＥの電位は−Ｅであり、作用電極ＷＥはコモン電位であるから、参照電極ＲＥから見た作用電極ＷＥの電位はＥとなる。
【００３６】
ここで、点７は仮想接地なので、作用電極ＷＥから流れ込む電流はそのままＲ１を通って点９に流れるので、点９の電圧ｉＲを測ることにより電流の大きさを知ることができる。この電気回路の優れている点は、電流測定が作用電極の電位に影響を与えないことである。もし、作用電極ＷＥとコモン電位との間に抵抗を入れてその両端の電位差を検出しようとすると、それが作用電極ＷＥの電位の誤差となってしまう。
【００３７】
以上から、図１に示したような基本電気回路を用いると、参照電極ＲＥに電流を流すことなく、作用電極ＷＥに電圧を印加し、該作用電極ＷＥで物質間の相互作用を進行させることができる。したがって、対極ＣＥを設置する構成によって、作用電極ＷＥと参照電極ＲＥとの間の反応領域にわたって、大きなイオン電流を流すことなく、作用電極ＷＥに電圧を印加することができる。
【００３８】
続いて、上記したような三電極系を採用した場合の電位分布について、図３に基づいて説明する。
【００３９】
陽極と陰極との間に電圧を印加すると、その瞬間は直線的な電位勾配が発生する。しかし、電解質溶液中のイオンが移動することによって、溶液内部の電場を打ち消す（ちょうど金属が帯電すると、表面に電荷が再配列して、内部の電位差をゼロにするのと同様の現象）。したがって、印加した電圧は、図３に示されたように、電極と溶液との境界にかかることになる。
【００４０】
この境界の界面を一般に「電気二重層」と呼ぶ。電気二重層は大変薄く、０．１Ｍ希硫酸なら１ｎｍ程度である。そのような距離に印加電圧がかかるので、１ｃｍあたり百万から一千万Ｖもの巨大電場が形成される。このような巨大電場が作用電極ＷＥの表面に固定された検出用物質、および該表面近傍に存在する標的物質に作用することになる。
【００４１】
図３では、両方の電極で電気化学反応が起こるかのように描いているが、基本電気回路の上記説明で述べたとおり、作用電極ＷＥと対をなす参照電極ＲＥでは電気化学反応は起こらず、図３に示すような電位勾配が形成されるのみである。作用電極での電気化学反応の電流は、別の場所に設けられた対極ＣＥへと流れる。
【００４２】
以下、図４〜９を参照して、本発明に係る物質間相互作用検出部の基本的な電極配置構成の実施形態例について説明する。
【００４３】
まず、初めに、本発明が提案する三電極構造の物質間相互作用検出部において、考えられ得る様々な電極配置構成を類型化して図４に示す。本発明の範囲には、少なくともこの図４に示された電極配置構成の全てが含まれる。
【００４４】
センサーチップの固相表面に形成される反応場は、その形状に関わらず、一般的には、底面Ａ、上面Ｂ、側面Ｃの３つの面、あるいはこれらに類した面構成をもつであろう。参照電極ＲＥ、作用電極ＷＥ、および対極ＣＥをそれぞれこれら三つの面のどこに配置するかによって、図４に提示されたような合計９通りの組み合わせが考えられる。なお、上面Ｂと底面Ａの区別は本質的ではないので、図４では、作用電極ＷＥを底面Ａに固定して組み合わせを示している。
【００４５】
以上の説明では、物質間の相互作用が作用電極ＷＥ上で進行することを前提としてきた。しかし、本発明では、これに加えて、物質間の相互作用を進行させるために用いる電極として、センサーチップの基板表面を用いる構成も提案する。
【００４６】
この提案では、図４に示す計９通りの組み合わせに加え、前記基板表面を参照電極とするか作用電極ＷＥとするかの選択が加わるため、合計１８通りの電極構成が考えられることになる。
【００４７】
参照電極ＲＥを基板表面とする利点は、既述したように、参照電極ＲＥには電流が流れない構成であるので、電極反応によって物質間の相互作用が阻害、あるいは妨害される心配がないということである。
【００４８】
次に、作用電極ＷＥと対極ＣＥとの距離を決定する基準について考察する。反応溶液の重量をｍ、熱容量をＣｐ、単位時間に発生するジュール熱をｑとする。このとき、温度の変化率は次の「数式７」で与えられる。
【００４９】
【数７】
2006284205.tif 000008
【００５０】
しかし、実際には、反応場を構成する面を通しての熱の流出により温度変化は小さくなるため、上式は上限を示すものとなる。ここで、ジュール熱ｑは、 Ｖ２／Ｒで与えられる（以下の「数式８」を参照）。
【００５１】
【数８】
2006284205.tif 000009
【００５２】
従って、前記した「数式８」から導くと、作用電極ＷＥと対極ＣＥの間の抵抗Ｒは、既述した「数式１」（請求項３参照）の条件を満たしていることが望ましい。即ち、この「数式１」の条件を満たすように、作用電極ＷＥと対極ＣＥの間の距離を設定するのが好適である。
【００５３】
ここで、ΔＴは、許容される温度誤差である。抵抗Ｒは、反応溶液でる電解質溶液の電導度、電極面積、および電極間距離によって決定され、該反応溶液の電導度以外は自由度があるので、上記数式７の条件を満たすように電極を設計すればよい。
【００５４】
ただし、この数式８の条件は発生した熱量がすべて反応場内に蓄積されることを仮定しており、条件として厳しすぎる場合もある。そのような場合は、より現実に適合した境界条件を仮定した熱シミュレーション等により、発生する熱量に対する温度変化率を算出するべきである。
【００５５】
図５は、本発明に係る物質間相互作用検出部の第１実施形態を上方から視た平面図である。この図５に示す第一実施形態は、参照電極ＲＥ、作用電極ＷＥ、対極ＣＥの計三つの電極が、全て同一平面上に形成されている形態の一例であって、図４の類型Ｎｏ．１に対応する実施形態である。
【００５６】
なお、図５に示した構成のように、反応場Ｘが一つで、その内部に多数の電極が並んでいる構成だけでなく、図６に示す第２実施形態のように、反応場Ｘが多数配列され、各々の反応場Ｘの内部に三電極が形成されている構成も考えられ、このような構成は、センサーチップで利用されるだろう。なお、この図６中の円形線Ｌは、ウエル状をなす反応場Ｘが複数形成されている場合の該反応場Ｘの境界を示している。なお、この図６に示された実施形態も、図４の類型Ｎｏ．１に対応する実施形態である。
【００５７】
ここで、参照電極ＲＥ、作用電極ＷＥ、対極ＣＥを構成する各電極の材質や製造方法には非常に多くのバリエーションがあり得る。もっとも簡単な方法は、ガラスやシリコンの基板上に金属膜（例えば、白金、金）、もしくは透明電極材料（例えば、ＩＴＯ）を成膜し、フォトリソグラフィー法で電極パターンを定義し、エッチング処理により電極パターンを形成する方法である。あるいは、電極パターン形成後に、感光性ポリイミド樹脂等の高分子膜を塗布し、再度フォトリソグラフィー法により、電極パターンに対応した反応場を形成することができる。
【００５８】
作用電極ＷＥと参照電極ＲＥとの間の距離は、リソグラフィーなどの方法によって精度設定することができ、小さい印加電圧でも大きな実効電場を発生させることができる。作用電極ＷＥと参照電極ＲＥとの距離が反応場Ｘの高さに相当する場合、ポリイミド等の高分子膜の塗布厚さを調整することで、上記数式１、若しくはそれに準じる基準を満たす距離に設定することができる。
【００５９】
図７に示す第３実施形態は、作用電極ＷＥと参照電極ＲＥが反応場Ｘの底面Ａに形成されているが、対極ＣＥが反応場Ｘの上面Ｂに形成されている例である。この例は、図４の類型Ｎｏ．２に対応する実施形態に相当する。
【００６０】
続く図８に示す第４実施形態は、作用電極ＷＥと参照電極ＲＥが、図５や図６の実施形態と同様に反応場Ｘの底面Ａにあるが、対極ＣＥが反応場Ｘの側面Ｃにある露出された状態で形成された例である。この例は、図４の類型Ｎｏ．３に対応する実施形態に相当する。
【００６１】
なお、反応場Ｘの側面Ｃを形成する部分は、上記ポリイミド樹脂等の単一の材料から形成してもよいが、前記部分を、絶縁膜、金属膜、絶縁膜のように積層し、反応場Ｘの部分のみエッチングで除去すれば、側面Ｃに対極ＣＥが露出した構造（図８参照）を製造することができる。
【００６２】
図９に示す第５実施形態は、作用電極ＷＥと対極ＣＥが底面Ａに、参照電極ＲＥが上Ｃに形成される場合であって、図４に示す類型Ｎｏ.４に相当する実施形態である。この形態では、これは上面Ｃの参照電極ＲＥが形成された基板Ｙを、反応場Ｘを閉塞する蓋としてももちいることができる。
【００６３】
このような実施形態では、有効な電場強度を得るために、上面Ｂと底面Ａの間の距離を小さく保つ必要がある。その距離に対して、作用電極ＷＥと対極ＣＥの距離を十分大きく設定することで、発生するジュール熱を抑制することができる。
【００６４】
図５〜９には、図４の類型Ｎｏ．１〜４に相当する実施形態を示したが、残りの類型Ｎｏ．５〜９に相当する実施形態は、特に図示していない。また、当然のことながら、いずれの実施形態においても、参照電極ＲＥ，作用電極ＷＥ、対極ＣＥは、図１に示したような電気回路に接続されているが、図５〜９では、接続のための配線パターンは特に図示していない。
【００６５】
いずれにしても、本発明に係る物質間相互作用検出部では、電気力学的作用を利用するセンサーチップの温度制御を簡単に行うことができ、反応場Ｘの設計や製造も容易である。また、従来よりも高い電圧を印加することが可能になり、電気的作用をより有効に利用することができるようになる。所望の電圧を正確に印加することが可能になる。また、参照電極ＲＥの寿命が長くなる。
【実施例】
【００６６】
本発明に係る物質間相互作用検出部の基本構成の効果を検証する実験を、テスト用センサーチップを用いて実施した。
【００６７】
その構造を図１０に示す。まず、ベース基板は厚さ0.7 mmのガラス基板で、その上に成膜されたＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）が作用電極（ＷＥ）として働く。このＩＴＯ膜上に保護膜（絶縁膜）として二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をスパッタリングにより積層した。その間にあるクロム（Ｃｒ）の膜は、蛍光顕微鏡観察用の遮光膜であり、該センサーチップの性能には影響を与えず、本発明の効果とは関係がない。
【００６８】
フォトレジストにより円筒状（ウエル状）の反応場が二つ並設されている。一方は電気的作用の効果を見るための反応場として用意し、もう一方の反応場は、対照のための反応場として用意した。これら二つの反応場は、同一基板上に搭載されているため、ほぼ同じ熱履歴を受けるが、中心部で物理的に絶縁されているため、電気的には完全に絶縁されている。
【００６９】
図１０に示した基板に、まず、イオン化蒸着法によりダイヤモンドライクカーボンを約10 nm成膜した。タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガスとなるベンゼンやメタンをイオン化し、バイアス電圧によって基板上に成膜する。次に反応容器に塩素を導入し、高圧水銀灯の光を約30分照射した。続いて、塩素ガスを排気した後、アンモニアガスを容器に導入して、高圧水銀灯の光を約30分照射した。これにより表面にアミノ基-NH2が導入される。この基板を、1-メチル-2-ピロリドンに140mMの無水コハク酸、0.1Mの放散ナトリウム（pH 8）を添加した溶液に浸漬した。これにより表面にカルボニル基-COOHが導入される。この-COOHを以下のように活性エステル化する。0.1 Mのリン酸バッファーに0.1 MのN-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩と20 mMのN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した溶液を作製した。これに30分浸漬した。このようにして処理された基板表面に１本鎖オリゴＤＮＡの断片を固定した。このオリゴＤＮＡ断片の配列は、5末端から3末端方向に、CGAAGCGCTTATTCCAGAGCCCGACATGAA（30mer）である。５’末端がＮＨ２で終端された上記配列をもつ合成オリゴを、エスペックオリゴサービス社から購入し、濃度１００μＭになるように純水に溶解した。その溶液１０μＬに、溶解液（東京鋼鈑株式会社製・Solution 6）を９０μＬ加え、濃度１０μＭのＤＮＡ溶液を調整した。
【００７０】
次に、日本レーザー電子社製の自動スポッティング装置STAMPMAN（登録商標）で、図１０の各反応場の中心部にスポッティングした。スポッティングしたチップは、ガラスシャーレ上に並べ、オーブン中で８０℃、１時間加熱した。この過程でオリゴＤＮＡ断片の上記ＮＨ２末端と表面の活性化エステルとが反応し、オリゴＤＮＡ断片の５’末端が基板表面に固定された。
【００７１】
この基板をオーブンから取り出し、５００ｍｌビーカーに洗浄液（2x SSC/0.2%SDS）を１５０ｍＬ入れ、基板を浸漬し、１００ｒｐｍで浸透しながら１５分間洗浄した。次に、予め準備しておいた９０℃の不活化溶液（2x SSC）に５分浸漬し、ＮＨ２末端と反応しなかった余分の活性化エステルを不活性化した。その後、流純水中で軽くリンスし、乾燥窒素ガスでブローした。完成した基板は窒素ガスボックス中で保管した。
【００７２】
次に、基板上に固定したオリゴＤＮＡ断片と完全に相補的な配列をもつ1本鎖DNA（同じくエスペックオリゴサービス社から購入）を、濃度１００μＭになるように純水に溶解し、さらに5x SSC/0.5%SDS中で濃度５０μＭになるように調整した。なお、このオリゴＤＮＡ断片の５’末端は、蛍光色素Cy3で蛍光標識されている。
【００７３】
この溶液を高精度ピペットで採取し、二つの反応場に滴下した。滴下量はそれぞれ１．５μＬである。その後、高ドープシリコンでできた上部電極（参照電極）を各反応部上に被せ、加熱ステージを有するハイブリダイゼーション装置（特注製造品）であり、上部電極をピンで押さえ、片方の反応場のWEとREとの間にのみ電圧を印加することができる装置である。
【００７４】
このハイブリダイゼーション装置を用いて、６５℃の温度条件で時間を変化させてハイブリダイゼーション反応を進行させた。反応後の基板（チップ）は、2x SSC/0.2%SDS中で、１００ｒｐｍで浸透しながら１５分間洗浄した。その後、乾燥窒素ガスでブローし、ハイブリダイゼーション反応量を蛍光顕微鏡（オリンパス社製DP70）で計測した。
【００７５】
図１１は、電圧印加を実施した反応場と、電圧印加を実施しなかった反応場におけるハイブリダイゼーション反応量の比較を示した図面代用グラフである。なお、この実験では、内径２ｍｍ、厚さ（高さ）５μｍの反応場を使用した。また、印加電圧は、１５Ｖｐｐ、５ＭＨｚの交流電圧である。
【００７６】
この図１１に示された結果から、ハイブリダイゼーション反応量が飽和するまでの時間はほぼ同一であるが、反応量が大きく異なっていることが理解できる。反応量の差異の原因は明確には解明されていないが、図１０に示したように、二つの反応場は同一基板上に形成されており、電圧印加の有無以外の実験条件は高い精度で同一であると考えられる。
【００７７】
さらに、後述するように、この条件下では、ＳｉＯ２保護層による電圧降下のため、印加電圧の一部分しか反応場内には印加されていない。これらのことを考え合わせると、反応量の差異はイオン電流によるジュール熱の効果に起因するものと推測される。
【００７８】
反応量自体が増加することは好ましい効果ではあるが、その反面、反応場内の温度が正確に制御されていないという点で、物質間の相互作用を定量するアッセイ系では深刻な問題である。そのため、発生したジュール熱を以下のように評価した。
【００７９】
図１２には、本実験を実施した系の等価電気回路を示す。作用電極ＷＥ上の保護膜（この場合はスパッタリングで成膜したＳｉＯ２膜）の静電容量Ｃ１が、反応場中の溶液の静電容量Ｃ２と抵抗Ｒが並列合成されたものと直列に接続されている。印加する高周波の周波数が低い場合、電圧は全て保護膜に印加され、溶液には印加されない。したがって、物質間の相互作用に及ぼす電気的な影響は期待できない。
【００８０】
周波数が高くなってある閾値を越え、Ｃ１が実質的に短絡された状態になると、溶液に電圧が印加されるようになる。すると反応場中の電解質溶液内にイオン泳動による電流が流れ、ジュール熱が発生する。
【００８１】
さらに周波数を上げると、イオンの移動が高周波電場に追随できなくなり、ジュール熱の発生は減少するが、その周波数帯（一般に１ＧＨｚ以上）になると、今度は水の誘電緩和が励起され、液温が上昇する。また、１ＧＨｚ以上の高周波を印加する電源系を構成するのは容易ではない。したがって、実用上利用可能な周波数領域をもちいた電気的なセンサーチップを作製する場合、イオン泳動による発熱の問題は避けて通ることができない。
【００８２】
また、本実験では、非常に小さい反応場の温度分布を計測することは容易ではないので、有限要素シミュレーションにより評価を実施した。
【００８３】
６５℃の温度条件で、ハイブリダイゼーションを実施する場合、反応場の底面である作用電極ＷＥは６５℃になっていることが、熱電対を作用電極ＷＥに貼り付けた計測から明らかになった。これは、ベース基板のガラスが比較的薄く、チップ全体がそれよりはるかに熱容量の大きな加熱ステージ上に搭載されていることを考えれば物理的に納得のできる計測結果と言える。
【００８４】
反応場の側面は、熱伝導度の極めて小さいレジスト材料（この場合ポリイミド）で形成されているので、水平方向への熱伝導は非常に小さい。したがって、反応場内で発生した熱は、上面の参照電極ＲＥを経由して、それに接続されているピンを通じて外部に流れて行く以外にない。上面での境界条件の設定の仕方によって計算結果は異なる。
【００８５】
そこで、ここでは、（１）上面からの熱の出入りがない場合（worst case）、（２）上面の温度も65℃に正確に制御できた場合（best case）、および（３）上面は室温の場合（realistic case=今回の実験条件に近いと思われる）の３つの境界条件を設定して計算を行った。
【００８６】
印加電圧１０Ｖ、周波数１００ＭＨｚの場合の温度分布を図１３に示す。この図１３は、反応場中心点を底面から上面まで行ったときの温度変化をプロットした図面代用グラフである。
【００８７】
この図１３を見ると、どのケースでも温度分布が生じてしまっていることが分かる。上記（２）のように、底面と上面を正確にハイブリダイゼーション温度に制御できたとしても、反応場内の温度分布は避けることができない。したがって、発生する熱量自体を抑制する本発明のような方法のみが正確な温度制御を可能にすると考えられる。
【００８８】
作用電極ＷＥと参照電極ＲＥとを近接させ、その間に強い電場を発生させると共に、イオン電流を対極ＣＥに流れ入れる構成である本発明の検証として、電気化学セルを用いて、２極からなる電極構成と３極からなる電極構成で、それぞれ電気化学測定を実施し、その間の温度変化を記録した。
【００８９】
図１４のように、デフロン製の電気化学セルの下面に、ガラス板上に金を５０ｎｍ蒸着した作用電極ＷＥを置き、Ｏリングで密着させた。通常用いる銀-塩化銀の参照電極ＲＥと白金からなる対極ＣＥをセルに差し込み、三つの電極をソーラトロン社製ポテンショスタットSI 1287に接続した。
【００９０】
２極式で用いる場合は、対極ＣＥとポテンショスタットとの接続を外した。溶液は1x PBSバッファー（Ambion社製10x PBSを超純水で10倍に希釈）を用い、セル中の溶液量は約５０μＬであった。溶液の温度変化は、キーエンス社製WAVE THERMOを用いて、Ｋ熱電対で測定した。参照電極ＲＥと作用電極ＷＥの距離は約１００μｍ、作用電極ＷＥと対極ＣＥの距離は約５ｍｍであった。
【００９１】
参照電極ＲＥに対して、-0.6から+1.0 Vまでを50mV/sの速度で走査して、１１回サイクリックボルタムメトリー測定を行った。そのときの温度変化を図１５に示す。残念ながら、図１０に示すようなセンサーチップと異なって溶液量が多かったことから、観測された温度変化は小さかったものの、有意な差異が認められた。溶液量が少なく、印加電圧も大きい現実の系では、両者の差異はさらにもっと大きくなると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、物質間の相互作用を進行させる反応場の設計に利用できる。より具体的には、物質間の相互作用を進行させる反応場において電気泳動や誘電泳動などの電気力学的作用を用いるときに、該反応場中に発生するジュール熱を抑制し、反応溶液の温度制御を容易に行うための技術として利用できる。ＤＮＡチップやプロテインチップその他のセンサーチップ、あるいはチップ上の反応場の設計技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明に係る物質間相互作用検出部に好適に用いられる基本電気回路を示す図である。
【図２】オペアンプＯＡ１の関与する電気回路を示す図である。
【図３】反応場に三電極構成を採用した場合の電位分布を示す図である。
【図４】反応場における三電極の典型的な配置構成の類型（計９通り）をまとめた図である。
【図５】本発明に係る物質間相互作用検出部の第１実施形態を示す図（平面図）である。
【図６】本発明に係る物質間相互作用検出部の第２実施形態（反応場が複数ある形態）を示す図（平面図と縦断面図）である。
【図７】本発明に係る物質間相互作用検出部の第３実施形態を示す図（平面図と縦断面図）である。
【図８】本発明に係る物質間相互作用検出部の第４実施形態を示す図（平面図と縦断面図）である。
【図９】本発明に係る物質間相互作用検出部の第５実施形態を示す図（平面図と縦断面図）である。
【図１０】実施例で使用したセンサーチップの構成及び構造を示す図である。
【図１１】電圧印加を実施した反応場と電圧印加を実施しなかった反応場におけるハイブリダイゼーション反応量の比較を示した図面代用グラフである。
【図１２】実施例で使用した等価電気回路の構成を示す図である。
【図１３】反応場のジュール熱による温度分布を、有限要素シミュレーションにより計算した結果を示す図面代用グラフ（反応場の上面からの熱の出入りがない場合：worse case）。
【図１４】反応場のジュール熱による温度分布を、有限要素シミュレーションにより計算した結果を示す図面代用グラフ（反応場の上面の温度も６５℃に正確に制御できた場合：best case）。
【図１５】反応場のジュール熱による温度分布を、有限要素シミュレーションにより計算した結果を示す図面代用グラフ（反応場の上面が室温の場合：realistic case）。
【符号の説明】
【００９４】
ＣＥ  対極
ＲＥ  参照電極
ＷＥ  作用電極
Ｘ  反応場
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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