(57)【要約】【課題】被検材料中の有芽胞細菌を迅速に精度よく計量することを目的とする。【解決手段】被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、その栄養型細胞を微多孔膜支持体４でろ過し、微多孔膜支持体４の栄養型細胞が捕集されている側に、生死細胞または生細胞の蛍光させる化合物、試薬をろ過し、励起光で照射し有芽胞細菌を撮像６した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段５で認識させることにより、有芽胞細菌を計量１１できる。【選択図】図２
2006174751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させることにより、有芽胞細菌を計量する有芽胞細菌計量方法。
【請求項２】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、その栄養型細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段で、その栄養型細胞を認識させ計量することを特徴とした請求項１記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項３】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を発育的環境に放置することを特徴とした請求項１または２記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項４】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を２℃〜２５℃で放置することを特徴とした請求項１乃至３記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項５】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる工程として、被検材料を２℃〜２５℃で６時間〜２０時間放置することを特徴とした請求項１乃至４記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項６】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を温度２℃〜２５℃、湿度７０％〜８５％の環境に放置することを特徴とした請求項１乃至５記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項７】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にヒートショックを与えることを特徴とした請求項１乃至６記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項８】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料に発芽誘引物質、若しくはそれに相当する物質を与えることを特徴とした請求項１または２記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項９】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にグルコース、若しくはそれに相当する物質を与えることを特徴とした請求項１、２または８記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項１０】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にアラニン、若しくはそれに相当する物質を与えることを特徴とした請求項１、２、８または９記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項１１】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を液体培地で培養することを特徴とした請求項１または２記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項１２】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を液体培地で２時間培養することを特徴とした請求項１、２または１１記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項１３】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料のみを選択的に発育させ発芽させる液体培地で２時間培養することを特徴とした請求項１、２、１１または１２記載の有芽胞細菌計量方法。
【請求項１４】
被検材料である有芽胞細菌に抗菌剤を添加し栄養型細胞に変化させ、有芽胞細菌の発育を確認することで抗菌作用の評価が可能な請求項１乃至１４記載の有芽胞細菌計量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、励起光を照射し撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段で認識させることを特徴とし、有芽胞細菌を精度良く迅速に計量できる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の有芽胞細菌の検査方法は微生物検査方法と同じで被検材料中の菌数を計量するのに、例えば被検材料が液体の場合は寒天平板培地に直接塗抹し、また、被検材料が液体で無い場合は微生物を洗い出した液を寒天平板培地に塗抹して１個の菌が１個のコロニーを形成することを利用して、寒天平板培地上で微生物を培養し、寒天平板培地上に発現したコロニーを肉眼で観察しながら被検材料中の微生物数を計量する寒天平板法が用いられている。
【０００３】
また、メンブレンフィルターを使用して、微生物を計量する方法として、（例えば、特許文献１および特許文献２参照）に記載されているよう方法があり、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰ）分解酵素を含む溶液をメンブレンフィルターに施した後、乾燥処理をしたメンブレンフィルターに被検材料中の微生物をろ過捕集し、必要であれば所要時間培養した後、ＡＴＰを抽出するための液体抽出試薬と発光試薬であるルシフェリン・ルシフェラーゼを霧状に噴霧することにより、ルシフェリンとルシフェラーゼがＡＴＰと反応して、１分子のルシフェリンの酸化によって１フォトンの発光をし、その発光を高感度ＣＣＤカメラで撮り込み微生物を計量している。
【特許文献１】特開平１１−１３７２９３号公報
【特許文献２】特開平６−２３７７９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような従来の有芽胞細菌の検査方法では、一般的な微生物検査方法と同じく寒天平板培地にサンプルを塗抹もしくは混釈するので、被検材料の検査量１ｍｌ程度が限界であり、有芽胞細菌が少なく多量ろ過の検査が必要な被検材料の検査は不可能であり、検査の結果が得られるまでに２４時間〜５２時間の培養時間が必要となり、生鮮食品などの製造あるいは製品出荷の段階で検査結果待ちを要し、時間的経済的に大きなデメリットとなっており、場合によっては検査結果が判る前に出荷せざるをえないという課題があり、被検材料中の有芽胞細菌数を計量するのに要する時間を短時間にすることが要求されている。
【０００５】
また、従来の有芽胞細菌試験は公定法に準拠しており、寒天平板培地を使用している。検査期間が２４時間〜５２時間であるため、製品在庫期間の長期化の要因となり有芽胞細菌の検査時間の短縮が要求されている。また、抗菌剤の評価は、阻止円の発育の有無で評価しており、揮発性の抗菌剤等は、抗菌性能を正確に把握することが困難という課題があり、抗菌剤の性能を正確に計量することが要求されている。
【０００６】
また、メンブレンフィルターを使用して、所要時間の培養後または培養無しで有芽胞細菌を計量する方法は、培養をする場合は有芽胞細菌を捕集したメンブレンフィルターを平板寒天培地に置いて培養する時に、メンブレンフィルターと平板寒天培地の間にエアーが入るなど、メンブレンフィルターと培地が完全に密着していないと培地の栄養分がメンブレンフィルターに捕集した有芽胞細菌まで行き渡りにくく、メンブレンフィルターに捕集した有芽胞細菌の培養性が悪くなり、同じサンプルを培養してもメンブレンフィルターごとに有芽胞細菌の増殖性が一定にならずにコロニーの大きさがばらつくという課題があり、有芽胞細菌の培養性を高めることが要求されている。
【０００７】
また、培養無しの場合は、被検材料中に有芽胞細菌と同じように発光する蛍光異物等が含まれる被検材料の検査においては、有芽胞細菌と同じように発光する蛍光異物等と微生物の蛍光との明確な差が得られず、正確な有芽胞細菌数の計量ができないという課題があり、正確な有芽胞細菌数を計量することが要求されている。
【０００８】
本発明は、このような従来の課題を解決するもので被検材料中の有芽胞細菌数を微多孔膜支持体を用いることで多量なろ過を可能とし、また、被検材料を計量するのに従来に比べ短時間で有芽胞細菌を計量することができ、また、有芽胞細菌である被検材料中を栄養型細胞に変化させる工程を踏まえることにより、正確な有芽胞細菌を計量することができ、また、有芽胞細菌を光学的に撮像し形状を画像解析手段で認識させることにより元々のサンプルに存在する有芽胞細菌数を計量することのできる有芽胞細菌計量方法を提供することを目的としている。
【０００９】
また、抗菌剤の性能を正確に計測できる有芽胞細菌計量方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の有芽胞細菌計量方法は上記目的を達成するために、有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させることによるものである。
【００１１】
これにより有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、細胞の染色を促進し迅速に計量できる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００１２】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、その栄養型細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段で認識させたものである。
【００１３】
これにより有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ染色させることで、染色液で染色した形状、または染色した面積および染色による蛍光輝度を認識させることができ、さらに、微多孔膜支持体に被検材料を多量にろ過できるため、多量な被検材料中の微量な有芽胞細菌を正確に計量できる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００１４】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を発育的環境に放置したものである。
【００１５】
これにより有芽胞細菌を効率良く栄養型細胞にすることができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００１６】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を２℃〜２５℃で放置したものである。
【００１７】
これにより有芽胞細菌を精度良く栄養型細胞にすることができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００１８】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を２℃〜２５℃で６時間〜２０時間放置したものである。
【００１９】
これにより有芽胞細菌を精度良く効率的に栄養型細胞にすることができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００２０】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を温度２℃〜２５℃、湿度７０％〜８５％の環境に放置したものである。
【００２１】
これにより、有芽胞細菌を損傷無く栄養型細胞にすることができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００２２】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にヒートショックを与えるものである。
【００２３】
これにより有芽胞細菌の発芽速度を上げることにより迅速な計測ができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００２４】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料に発芽誘引物質、若しくはそれに相当する物質を与えるものである。
【００２５】
これにより有芽胞細菌の発芽速度の向上および有芽胞細菌自体に損傷を与えない有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００２６】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にグルコース、若しくはそれに相当する物質を与えるものである。
【００２７】
これにより有芽胞細菌の発芽速度の向上および効率の良い発芽を促すことのできる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００２８】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にアラニン、若しくはそれに相当する物質を与えるものである。
【００２９】
これにより有芽胞細菌の芽胞の耐久性を低下させることを可能とし、計測が容易な有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００３０】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を液体培地で培養するものである。
【００３１】
これにより有芽胞細菌を自然な状態で栄養型細胞に変化させ、計測が容易な有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００３２】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、液体培地で２時間培養するものである。
【００３３】
これにより有芽胞細菌を自然な状態で栄養型細胞に変化させ、且つ、定量的に栄養型細胞に変化させることができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００３４】
また、本発明は被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料のみを選択的に発育させ発芽させる液体培地で２時間培養するものとする。
【００３５】
これにより有芽胞細菌のみを選択的に発芽させることのできる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【００３６】
また、本発明は有芽胞細菌に抗菌剤を添加し栄養型細胞に変化させ、有芽胞細菌の発育を確認できるものとする。
【００３７】
これにより正確な抗菌作用の評価ができる有芽胞細菌計量方法が得られる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば微多孔膜支持体を用いて有芽胞細菌の多量ろ過を可能とし、迅速に計量できる効果のある有芽胞細菌計量方法を提供できる。
【００３９】
また、有芽胞細菌に対する抗菌剤の正確な抗菌作用評価ができる有芽胞細菌計量方法が提供できる。
【００４０】
また、食材に含まれる有芽胞細菌を計測することで、食中毒を未然に防ぐことができる有芽胞細菌計量方法が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の請求項１記載の発明は、有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させることにより、有芽胞細菌を計量できるというものであり、有芽胞細菌を計量するという作用を有する。
【００４２】
また、本発明の請求項２記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、その栄養型細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像処理で認識させるというものであり、多量の被検材料中の微量な有芽胞細菌を計量できるという作用を有する。また、現在主流となっている寒天培養法では有芽胞細菌の検査時間に２４時間〜５２時間を要しており、また、現状では有芽胞細菌の寒天培養法で形成した集落を目視で確認しているが、本発明では短時間の前処理で有芽胞細菌を画像解析手段で認識するため、検査時間を短時間にすることが可能で、且つ、有芽胞細菌検査期間は製品を在庫として保管しなければならず、検査費用について金銭的にも安価と成りうる作用を有する。
【００４３】
また、本発明の請求項３記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を発育的環境に放置するというものであり、有芽胞細菌を効率良く栄養型細胞にする作用を有する。
【００４４】
また、本発明の請求項４記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を２℃〜２５℃で放置するものであり、有芽胞細菌を精度良く栄養型細胞にする作用を有する。
【００４５】
また、本発明の請求項５記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を２℃〜２５℃で６時間〜２０時間放置するものであり、有芽胞細菌を精度良く効率的に栄養型細胞にする作用を有する。
【００４６】
また、本発明の請求項６記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、温度２℃〜２５℃、湿度７０％〜８５％の環境に放置するものであり、有芽胞細菌を損傷無く栄養型細胞にする作用を有する。
【００４７】
また、本発明の請求項７記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にヒートショックを与えるものであり、有芽胞細菌の発芽速度を上げ、迅速な計測ができるという作用を有する。
【００４８】
また、本発明の請求項８記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料に発芽誘引物質、若しくはそれに相当する物質を与えるものであり、有芽胞細菌の発芽速度の向上および有芽胞細菌自体に障害を与えない作用を有する。
【００４９】
また、本発明の請求項９記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にグルコース、若しくはそれに相当する物質を与えるものであり、有芽胞細菌の発芽速度の向上および効率の良い発芽を促すことのできる作用を有する。
【００５０】
また、本発明の請求項１０記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料にアラニン、若しくはそれに相当する物質を与えるものであり、有芽胞細菌の芽胞の耐久性を低下させることを可能とし、計測が容易になる作用を有する。
【００５１】
また、本発明の請求項１１記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料を液体培地で培養するものであり、有芽胞細菌を自然な状態で栄養型細胞に変化させ、計測を容易にする作用を有する。
【００５２】
また、本発明の請求項１２記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、液体培地で２時間培養するものであり、有芽胞細菌を自然な状態で栄養型細胞に変化させ、且つ、定量的に栄養型細胞に変化させる作用を有する。
【００５３】
また、本発明の請求項１３記載の発明は、被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法として、被検材料のみを選択的に発育させ発芽させる液体培地で２時間培養するものであり、有芽胞細菌のみを選択的に発芽させる作用を有する。
【００５４】
また、本発明の請求項１４記載の発明は、有芽胞細菌に抗菌剤を添加し栄養型細胞に変化させ、有芽胞細菌の発育を確認できるものであり、有芽胞細菌に対する抗菌作用の評価ができるという作用を有する。
【００５５】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００５６】
（実施の形態）
被検材料の有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる方法、例えば有芽胞細菌を発芽させる培地、好ましくはソイビーン・カゼイン・ダイジェスト液体培地で２時間、有芽胞細菌の発芽に適した温度で好ましくは２℃〜２５℃で発芽培養する。なお、被検材料である有芽胞細菌を発芽させるために液体培地の使用を記したが、発芽させるために発育的環境に放置してもよい。また、被検材料である有芽胞細菌にヒートショック、例えば常温で保管していた被検材料を８０℃の環境に放置、それをまた常温に戻すようなことを繰り返しすることだが、好ましくは８０℃で１０分間の環境を与えることで、有芽胞細菌を効率的、定量的に発芽させてもよい。また、発芽誘引物質、好ましくはグルコースまたはアラニンを使用し、有芽胞細菌の芽胞の耐久性を低下させることにより発芽速度をあげてもよい。そして、図１に示すように微多孔膜１と押さえリング２とベース３からなる微多孔膜支持体４（松下エコシステムズ製ろ過チップ）に被検材料をろ過し、有芽胞細菌が捕集されている側に生死細胞もしくは生細胞を蛍光させる化合物、試薬（例えばＳＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒｅｎｇｅ、ＳＹＴＯ９）をろ過して、励起光を照射する光源（例えば励起波長３５０ｎｍ〜６７０ｎｍのものであり、細胞を蛍光させる化合物、試薬に適している波長のもの）と、励起光によって蛍光した光を受光する蛍光受光レンズ（例えば受光波長４３０ｎｍ〜６９０ｎｍのものであり、細胞を蛍光させる化合物、試薬に適している波長のもの）を有する微生物計測装置（図示せず）で有芽胞細菌を撮像する。そして、画像解析手段５を図２に示すが、図２に示すように撮像６をした画像を輝度測定７により発光点の輝度を測定し、基準の輝度値を境に２値化８をして基準値以上の輝度値がある発光点を輝点化し、形状判断９で輝点化された形状の面積を認識してその発光が有芽胞細菌か否かを判断し、有芽胞細菌と判断した輝点をカウント１０し計量１１する。これにより画像解析手段５を使用して有芽胞細菌以外の被検材料中の夾雑物を誤って計量しないようになり、微多孔膜１に捕集された有芽胞細菌を多量に精度よく計量することが可能となる。
【００５７】
また、被検材料に抗菌剤、例えば銀、酸化亜鉛等を添加した後、被検材料である有芽胞細菌を前記の方法で有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させる。そして、図１に示すように微多孔膜１と押さえリング２とベース３からなる微多孔膜支持体４（松下エコシステムズ製ろ過チップ）に被検材料をろ過し、有芽胞細菌が捕集されている側に生死細胞もしくは生細胞を蛍光させる化合物、試薬（例えばＳＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒｅｎｇｅ、ＳＹＴＯ９）をろ過して、励起光を照射する光源（例えば励起波長３５０ｎｍ〜６７０ｎｍのものであり、細胞を蛍光させる化合物、試薬に適している波長のもの）と、励起光によって蛍光した光を受光する蛍光受光レンズ（例えば受光波長４３０ｎｍ〜６９０ｎｍのものであり、細胞を蛍光させる化合物、試薬に適している波長のもの）を有する微生物計測装置（図示せず）で有芽胞細菌を撮像する。そして、画像解析手段５を図２に示すが、図２に示すように撮像６をした画像を輝度測定７により発光点の輝度を測定し、基準の輝度値を境に２値化８をして基準値以上の輝度値がある発光点を輝点化し、形状判断９で輝点化された形状の面積を認識してその発光が有芽胞細菌か否かを判断し、有芽胞細菌と判断した輝点をカウント１０し計量１１する。これにより有芽胞細菌の生菌数を確認することで正確な抗菌作用の評価が可能となる。
【００５８】
上記構成において、被検材料中における有芽胞細菌の生死菌数計測を行う有芽胞細菌計量方法を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
被検材料である有芽胞細菌を栄養型細胞に変化させ、存在する有芽胞細菌数を従来よりも短時間で多量に計量することができ、食品分野、医薬品分野、化成品分野における有芽胞細菌の出荷検査、および抗菌剤の抗菌作用の評価において適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施の形態の微多孔膜支持体を示す全体断面図
【図２】本発明の実施の形態の撮像から計量までの模式図
【符号の説明】
【００６１】
１  微多孔膜
２  押さえリング
３  ベース
４  微多孔膜支持体
５  画像解析手段
６  撮像
７  輝度測定
８  ２値化
９  形状判断
１０  カウント
１１  計量
【図１】
2006174751.tif 000003
【図２】
2006174751.tif 000004