(57)【要約】【課題】体液量調節にとって重要な尿細管糸球体フィードバック機構における糸球体濾過量調節を制御する因子を産生放出する当該システム異常の基礎研究及び高血圧、心不全等の病態を改善する治療薬の開発において有用な不死化細胞株の提供。【解決手段】ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むベクターをＳＶ４０ＬＴ抗原遺伝子を導入した形質転換動物から得た腎臓細胞に導入して不死化腎マクラデンサ細胞を単離する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むベクターを腎臓培養細胞中に導入し、レポーター遺伝子が発現した細胞を採取することを特徴とする腎マクラデンサ（緻密班）細胞の単離方法。
【請求項２】
レポーター遺伝子がＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質変異体）遺伝子を含む請求項１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
【請求項３】
ｎＮＯＳプロモーターがエクソン１ｃの上流部分を含むｎＮＯＳプロモーター領域の全部または一部を含む請求項１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
【請求項４】
ｎＮＯＳプロモーターが配列番号１記載の塩基配列を含む請求項１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
【請求項５】
ＳＶ４０ＬＴ抗原遺伝子を導入した形質転換動物から得た腎臓細胞に請求項１〜４のいずれかの方法を適用し、不死化腎マクラデンサ細胞を単離することを特徴とする不死化腎マクラデンサ細胞株の樹立方法。
【請求項６】
ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むマーカー遺伝子を被検動物に導入することを特徴とする、腎マクラデンサ細胞特異的にレポーター遺伝子を発現する形質転換動物の作製方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法により樹立された不死化腎マクラデンサ細胞株。
【請求項８】
不死化腎マクラデンサ細胞株Ｍｏｕｓｅ ＮＥ−ＭＤ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年２月１０日付で寄託された受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３３）。
【請求項９】
請求項６に記載の方法により作製された形質転換動物。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により作製された形質転換動物にｎＮＯＳプロモーター活性化薬を投与してレポーター遺伝子が作る蛍光タンパク質を発現させ、生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
【請求項１１】
ｎＮＯＳプロモーター活性化薬がフロセミドである請求項１０に記載の生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子がＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質変異体）遺伝子を含む請求項１０に記載の生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかの方法により得られた腎マクラデンサ細胞を使用することを特徴とする高血圧症用医薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎マクラデンサ細胞の単離・識別方法、不死化腎マクラデンサ細胞の樹立方法及びその細胞株並びに形質転換動物に関する。さらに詳しくは、腎マクラデンサ細胞を腎臓組織から単離する方法、この方法を利用して不死化腎マクラデンサ細胞を樹立する方法、これにより得られるマクラデンサ細胞機能を永続的に保持する細胞株、並びに、前記の腎マクラデンサ細胞の単離方法と同一の原理により腎マクラデンサ細胞を生体内で識別する方法、及び腎マクラデンサ細胞の生体内での識別を可能にした形質転換動物に関する。本発明の各方法及び樹立した細胞株は、マクラデンサ細胞機能障害や高血圧心不全などの診断や治療法の開発、あるいは医薬品の有効性や安全性に関するスクリーニング等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞は、適切な培養条件が人為的に講じられれば、生体外においても分裂増殖を繰り返し、一定期間の培養が可能である。しかし、培養細胞が永続的に分裂増殖を繰り返し、本来の機能を保持し続けることは理論上不可能である。
この問題を解決するために、高い増殖能を維持しながら本来の形質を保持する不死化細胞株の樹立方法が開発された（特許文献１：特許掲載公報第２９８８７５３号）。この方法は、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ（ＬＴ）抗原遺伝子を、哺乳動物（例えば、マウス）の受精卵に導入し、この動物の正常な出産によって得られる遺伝子導入動物の各種臓器由来の細胞を採取し、これを継代培養して各種不死化細胞株を樹立するものである。上記発明を適用した動物からの不死化肝細胞株や不死化腎尿細管細胞株などの樹立は可能になったが、上記発明を用いても、臓器における特殊な細胞については依然、不死化細胞株を得ることが極めて困難であるか不可能であった。
【０００３】
例えば、腎マクラデンサ（緻密班：ｍａｃｕｌａ ｄｅｎｓａ）細胞は、遠位尿細管濾液中の塩濃度を感知し、糸球体濾液量の調節指令を行なう。このため、腎マクラデンサ細胞の不死化細胞株の樹立は、電解質組成等の調節維持機能の研究及び係る機能が関与する疾病の診断、治療、並びにそのための医薬の開発に有用であると期待される。しかし、腎マクラデンサ細胞は、輸入細動脈と輸出細動脈の間に挟まれ、しかも構成細胞数が少ないためその単離は困難である。仮に該当部位を単離してｉｎ ｖｉｔｒｏの系に持ち込んでも腎マクラデンサ細胞のみの単離を有効に行なうことは困難であった。
【０００４】
Ｙａｎｇら（非特許文献１：Ｙａｎｇ Ｔ．ｅｔ．ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７５：３７９２２−３７９２９，２０００）は、上記の問題を解決するために、腎集合管に発現する糖鎖を認識するｌｅｃｔｉｎ  Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）と、腎集合管とマクラデンサ細胞に発現する糖鎖を認識するｌｅｃｔｉｎ Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ ａｆｆｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＰＡ）を利用した。即ち、ＦＩＴＣ標識ＤＢＡとｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識ＨＰＡをＳＶ４０ＬＴ遺伝子組換(Ｔｇ)マウス由来の腎尿細管細胞に結合させ、ＦＩＴＣ−ＤＢＡでは標識されずｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ＨＰＡで標識される細胞群を蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）により回収・濃縮することによりマクラデンサ細胞を単離し、これを“ＭＭＤＤ１細胞株”と命名した。
【０００５】
しかし、Ｙａｎｇらの方法では、使用する抗体の特異性やＦＡＣＳによる細胞選別の不完全性を否定できない。つまり、細胞表面のタンパク質を抗原として認識する実験手法では、理論上完全な（他の細胞が混入しない）マクラデンサ細胞を得ることは不可能である。さらに、Ｙａｎｇらの方法は、マクラデンサ細胞を得るためＦＡＣＳを用いて細胞の回収・濃縮を行っており、ＦＡＣＳ処理に伴う細胞へのダメージ、それによる細胞特性の変化を否定できない。
【０００６】
また、尿細管糸球体フィードバック（ＴＧＦ）システムが関与する糸球体濾過量制御の解明は、特殊な解剖学的位置関係が保存された状態で行なう必要がある。ＴＧＦシグナル伝達は、傍糸球体装置が保存された状態でのみ発揮されるからである。従って、マクラデンサ細胞及びＴＧＦシステムの研究には、不死化マクラデンサ細胞株の樹立とともに、生体内でマクラデンサ細胞を識別して傍糸球体装置の構造を維持した状態での機能解析が不可欠である。
【０００７】
【特許文献１】特許掲載公報第２９８８７５３号
【非特許文献１】Ｙａｎｇ Ｔ． ｅｔ．ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３７９２２−３７９２９，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、不死化した腎マクラデンサ細胞株の樹立方法及びその細胞株、並びに腎マクラデンサ細胞の生体内での識別を可能にする方法、及びそのような識別が可能な形質転換動物の提供を目的する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の問題を解決するため鋭意検討し、腎マクラデンサ細胞株にのみ発現するマーカーについて探索した。その結果、ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターを利用すれば腎マクラデンサ細胞を腎臓組織から単離・識別する有効なマーカーが得られることを見出した。また、この方法をＳＶ４０ラージＴ（ＬＴ）抗原Ｔｇマウスに適用することにより不死化した腎マクラデンサ細胞株の樹立方法を確立するとともに、通常の動物についても、マーカー遺伝子で形質転換することにより生体内で腎マクラデンサ細胞に蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現させてその識別を実現することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の腎マクラデンサ細胞の単離・識別方法、不死化腎マクラデンサ細胞の樹立方法及びその細胞株並びに形質転換動物を提供する。
１．ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むベクターを腎臓培養細胞中に導入し、レポーター遺伝子が発現した細胞を採取することを特徴とする腎マクラデンサ（緻密班）細胞の単離方法。
２．レポーター遺伝子がＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質変異体）遺伝子を含む前記１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
３．ｎＮＯＳプロモーターがエクソン１ｃの上流部分を含むｎＮＯＳプロモーター領域の全部または一部を含む前記１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
４．ｎＮＯＳプロモーターが配列番号１記載の塩基配列を含む前記１記載の腎マクラデンサ細胞の単離方法。
５．ＳＶ４０ＬＴ抗原遺伝子を導入した形質転換動物から得た腎臓細胞に前記１〜４のいずれかの方法を適用し、不死化腎マクラデンサ細胞を単離することを特徴とする不死化腎マクラデンサ細胞株の樹立方法。
６．ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むマーカー遺伝子を被検動物に導入することを特徴とする、腎マクラデンサ細胞特異的にレポーター遺伝子を発現する形質転換動物の作製方法。
７．前記５に記載の方法により樹立された不死化腎マクラデンサ細胞株。
８．不死化腎マクラデンサ細胞株Ｍｏｕｓｅ ＮＥ−ＭＤ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年２月１０日付で寄託された受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３３）。
９．前記６に記載の方法により作製された形質転換動物。
１０．前記９に記載の方法により作製された形質転換動物にｎＮＯＳプロモーター活性化薬を投与してレポーター遺伝子を発現させ、生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
１１．ｎＮＯＳプロモーター活性化薬がフロセミドである前記１０に記載の生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
１２．レポーター遺伝子がＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質変異体）遺伝子を含む前記１０に記載の生体内において腎マクラデンサ細胞を特異的に識別する方法。
１３．前記１〜５のいずれかの方法により得られた腎マクラデンサ細胞を使用することを特徴とする高血圧症用医薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、腎マクラデンサ細胞の不死化細胞が得られ、生体内においてマクラデンサ細胞の識別が可能となる。このため、体液量調節にとって重要な尿細管糸球体フィードバック機構における糸球体濾過量調節を制御する因子を産生放出する当該システム異常の基礎研究及び高血圧、心不全等の病態を改善する治療薬の開発において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、腎臓においてはマクラデンサ細胞にのみ特異的に発現しているｎＮＯＳ（神経型一酸化窒素合成酵素：ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）のプロモーター領域下流に、レポーター遺伝子を挿入することにより（図１）、これらをマーカーとしてマクラデンサ細胞を単離・識別する。
ヒトｎＮＯＳのエクソン１はａ〜ｉまで９種類存在し、それぞれが様々な臓器で発現し、プロモーター領域もそれぞれ異なっていると考えられている（Ｗａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１２１５０−１２１５５，１９９９）。本発明では、このうち腎臓での発現が確認されているエクソン１ｃのプロモーター領域を使用することができる。プロモーター解析により発現が確認されている最短の部分（Ｓａｕｒ Ｄ.ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２５７９８−２５８１４，２００２）（配列番号１）を含んでいればよい。
【００１３】
ｎＮＯＳプロモーターは、上述した塩基配列情報により化学合成によって、またはｎＮＯＳ遺伝子の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーを用いた増幅反応によって得ることができる。例えば、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、２７９Ｓプライマー（５’−ｃａｇ ａｃｇ ｃｔｇ ｃｃａ ｃｔｇ ｃｔｇ−３’）（配列番号２）と４９ＡＳプライマー（５’−ｇｔｃ ａｃｃ ｃｃｃ ｔｃｔ ｃａｇ ａｃａ ｇｔｇ−３’）（配列番号３）を用いてＰＣＲにより増幅してｎＮＯＳプロモーターを得ることが可能である（図２）。
【００１４】
レポーター遺伝子としては、種々の遺伝子を用いることができるが、細胞を生きたまま識別できる点から蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を用いることが好ましい。ＧＦＰ遺伝子としては種々のもの（ＥＧＦＰ，ＥＹＦＰ，ＥＣＦＰ，ＥＢＦＰ）が利用可能であるが、好ましくはＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質変異体）遺伝子を利用できる。
ｎＮＯＳ（神経型ＮＯ合成酵素）プロモーターとレポーター遺伝子を含むベクターの構築は、慣用の手順により行なうことができる。
【００１５】
本発明による不死化腎マクラデンサ細胞株の樹立は、不死化に適した遺伝形質を有する細胞に前記マーカー遺伝子を導入し、継代培養し、前記マーカー遺伝子が発現する細胞を単離することにより行なう。不死化に適した細胞は特に限定されず現在知られていない細胞でも実施可能であるが、例えば、ＳＶ４０ ＬＴ形質転換動物から単離した細胞を用いることができる。ＳＶ４０ ＬＴ抗原は細胞の増殖を促進する機能を有し、ＳＶ４０ ＬＴ抗原遺伝子を導入した形質転換動物（ＳＶ４０ ＬＴ形質転換動物）由来の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて高い増殖能を示し、細胞の不死化が容易に起こる（Ｈｏｓｏｙａｍａｄａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，７０：２８４−２９２，１９９６）。また、ＳＶ４０ ＬＴ抗原遺伝子には温度感受性変異が含まれているため、３３℃においてのみ高い増殖能が発揮される。
【００１６】
本発明ではＳＶ４０ＬＴ抗原遺伝子を導入した形質転換動物から得た腎遠位尿細管細胞に前記単離方法を適用し、不死化腎マクラデンサ細胞を単離する。このような形質転換動物としてはマウスが好ましい（但し、このＴｇマウスは生後１２週〜１６週令で神経疾患を発症し死亡するため自然交配は不能で、体外受精によって子孫維持がなされている）。
本発明者らは以下の実施例に示すようにこのような不死化細胞株を樹立し、２００５年２月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（不死化腎マクラデンサ細胞株Ｍｏｕｓｅ ＮＥ−ＭＤ；受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３３）。この細胞株は、薬品開発（例えば、高血圧症用医薬（高血圧症の治療・診断・予防その他関連する医薬をいう）の開発）における効果判定及びスクリーニング等において有用であると期待される。
【実施例】
【００１７】
実施例１：発現ベクターｐＮＥによる腎マクラデンサ細胞の単離
（１−１）発現ベクターｐＮＥの構築
ヒトｎＮＯＳプロモーターを組み込んだ発現ベクターｐＮＥを以下の手順で構築した。
初めにヒトｎＮＯＳプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ３０８５４５）を単離するために、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０−１）を鋳型とし、２７９Ｓプライマー（５’−ｃａｇ ａｃｇ ｃｔｇ ｃｃａ ｃｔｇ ｃｔｇ−３’）（配列番号２）と４９ＡＳプライマー（５’−ｇｔｃ ａｃｃ ｃｃｃ ｔｃｔ ｃａｇ ａｃａ ｇｔｇ−３’）（配列番号３）を用いて常法に基づきＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物を精製後、ＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）にＰＣＲ産物を挿入し、断片をシークエンシングにより決定し、増幅された断片がｎＮＯＳプロモーターに相当することを確認した。
【００１８】
次に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに組込まれたｎＮＯＳプロモーター配列を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、３４７ｂｐの断片を切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ断片の末端を平滑化した。一方、ｐＣＥ−２９（図１ａ）を制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断し、ＣＡＧプロモーター部分を除いた４，０００ｂｐの断片を切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化を施した。これら２つの断片をＤＮＡリガーゼにより連結させ、ｐＮＥ（図１ｂ）を得た。ｐＮＥを基に、ＮＥ部分を制限酵素ＳａｌＩとＳａｃＩで消化し、これをネオマイシン発現ユニット（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーターより支配）を持つｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃａｔ．Ｎｏ．６０８６−１）のＳａｌＩ、ＳａｃＩ部位に挿入し、ｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１（図１ｃ）を得た。なお、ｐＥＧＦＰ−１はＥＧＦＰ ｃＤＮＡを有するが、その上流にはプロモーターが存在しないので、そのベクターからのＥＧＦＰの発現はないと考えられる。
【００１９】
（１−２）不死化腎遠位尿細管（ＤＴ）初代培養細胞の作製
以下に示す操作により、ＳＶ４０ＬＴ抗原遺伝子を導入した遺伝子組換マウス（ＳＶ４０−ＬＴ Ｔｇマウス）から腎遠位尿細管（ＤＴ）由来不死化細胞系の確立とマクラデンサ細胞の樹立を行なった。
本実験においては、８週令に達したＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（第一製薬（株）から譲渡）の腎臓から実体顕微鏡下で無菌的に腎遠位尿細管（ＤＴ）を単離し、複数のＤＴ細胞株（ＤＴ１−１２）を樹立した。この中から増殖性に優れていたＤＴ細胞株（ＤＴ７）を実験に用いた。
【００２０】
（１−３）腎皮質尿細管の初代培養細胞へのｐＮＥの遺伝子導入
尿細管初代培養細胞にｐＣＥ−２９、ｐＮＥをそれぞれ遺伝子導入し、それら遺伝子発現効率を調べた。ｐＣＥ−２９（図１ａ）はどの細胞にも働くＣＡＧプロモーターを保有しているので、遺伝子導入がなされた細胞では、すべてＥＧＦＰを発現するものと考えられる。実際、ＥＧＦＰ由来の蛍光が確認された細胞は、全細胞数の約８０％であった（図３ａ）。ｐＮＥはｎＮＯＳプロモーターを保有しているので、遺伝子導入がなされた細胞の中でもＭＤ細胞でのみＥＧＦＰが発現するものと考えられる。ＭＤ細胞は生体内でもごく少数の細胞群であるため、尿細管初代培養細胞に含まれるＭＤ細胞もごく少数と思われる。実際、ＥＧＦＰ由来の蛍光が確認された細胞は、全細胞の＜１％であった（ｎ＝３）（図３ｂ）。
【００２１】
（１−４）ＤＴ７細胞へのｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１遺伝子導入とＮＥ−ＭＤ細胞の選別
ｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１を制限酵素ＳａｌＩで処理し、直鎖状にした。この遺伝子（２μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと複合体を作らせ、これをＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス腎臓より単離したＤＴ７細胞株に遺伝子導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。２４時間後、ネオマイシン誘導体であるＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ：Ｗａｋｏ；Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５−０４８９３）を含むＲＩＴＣ８０−７培養液と交換し、１０日間培養した。その後、Ｇ４１８存在下で増殖した細胞塊を蛍光顕微鏡下で観察し、ＥＧＦＰ蛍光を示した細胞クローンを滅菌したプラスチックチップで無菌的に拾い上げ、３５ｍｍ径プラスチック培養皿に移し、個々に培養した。約７日後、ＥＧＦＰ陽性細胞を同様の方法で拾い上げ、新しい３５ｍｍ径プラスチック培養皿に移し培養を継続した。この操作をさらに１〜３回繰り返し、最終的にＥＧＦＰ陽性細胞のみから成る細胞株を取得した（図５）。このＥＧＦＰ陽性細胞は、ｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１を自らの染色体に組込んでいると考えられ、かつｎＮＯＳプロモーターが働くマクラデンサ（ＭＤ）細胞由来の細胞と考えられる。従って、このＥＧＦＰ陽性細胞をｐＮＥが導入されたＭＤ細胞由来の細胞とし、”ＮＥ−ＭＤ細胞”と命名した（２００５年２月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２３３））。
【００２２】
（１−５）ウエスタンブロット法による検定
ＮＥ−ＭＤ細胞がＭＤ細胞の特性を備えているかどうかを確認するため、ＭＤ細胞およびＤＴ７細胞に反応する各種抗体（抗ｎＮＯＳ抗体、抗ＣＯＸ−２抗体及び抗ＲＯＭＫ抗体）を用いてウエスタンブロットによる解析を行った。抗ｎＮＯＳ抗体及び抗ＣＯＸ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−７９５１）はＭＤ細胞と強く反応し、抗ＲＯＭＫ抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰＣ−００１）はＤＴ７細胞とＭＤ細胞の相方に反応する（Ｙａｎｇ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００）。細胞はＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−２８８４）を含んだＴＢＳ（１３６ｍＭＮａＣｌ，２．６ｍＭＫＣｌ，２４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で洗浄後回収、遠心分離により上清を除去した後、６％β−メルカプトエタノールの入った緩衝液を加えた。１００℃で５分間煮沸後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、１０％ポリアクリルアミドゲル（ＲＥＡＤＹＧＥＬＳ  Ｊ：ＢＩＯ−ＲＡＤ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１−Ｊ３７１）にて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｐ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２０２０Ｆ）に転写した。転写された膜は、１０％スキムミルク／ＴＢＳＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３０分間ブロッキングした後、一次抗体（ＴＢＳＴで抗ｎＮＯＳ抗体は１０，０００倍、抗ＣＯＸ−２抗体は５，０００倍、抗ＲＯＭＫ抗体５００倍に希釈）を添加し４℃で一晩反応させた。次いで、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ９３４）を添加し、室温で４５分間反応させ、ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１３２）で発色させた（図６）。
【００２３】
フロセミド（商品名ラシックス（登録商標））によるｎＮＯＳ発現誘導：マクラデンサ細胞のｎＮＯＳは生体内において正常な状態では低発現であるが、尿細管腔液の低塩濃度がＮＫＣＣ２を介して感知されると発現が上昇し、活性化することが知られている（Ｔｏｊｏ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２０００）。そのため、ＮＫＣＣ２阻害薬であるラシックスを培養液に添加し、ｎＮＯＳタンパクの発現誘導を試みた。
その結果、ラシックス添加前、添加後０．５、１、２、５時間目におけるｎＮＯＳタンパク量を比較したところ、ＤＴ７細胞においては発現上昇は見られなかったが、ＮＥ−ＭＤ細胞においては強い発現誘導が確認された（図７）。これらの実験結果は、本実験で樹立したＮＥ−ＭＤ細胞株が生体内におけるＭＤ細胞の特性を保持していることを意味し、この性質を利用してＭＤ細胞が識別可能であることを示した。
【００２４】
実施例２：遺伝子組換動物（Ｔｇマウス）の作製
実施例１において、本発明者らが構築したｐＮＥは不死化腎遠位尿細管細胞において有効に機能し、マクラデンサ細胞を株化することが可能である事を実証した。本実施例では、ｐＮＥを加工して動物受精卵に導入し、腎マクラデンサ細胞特異的にレポーター遺伝子を発現する遺伝子組換動物を作製した。
【００２５】
（２−１）Ｔｇマウスの作製
実施例１で構築した遺伝子発現ユニットのうちＴｇマウス作製に不要な部分を切り出し、純化したｐＮＥ（図１ｂ）をマウス受精卵に顕微注入することで遺伝子組換マウスを作製した。マウス受精卵は、採卵用のＢ６Ｃ３Ｆ１系統の雌にＰＭＳＧ（セロトロピン、帝国臓器）を５ユニット／１匹の用量で投与し、４８時間後にｈＣＧ（プベローゲン、三共）を５ユニット／１匹の用量で投与したあと、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雄と交配させることで得、ｈＣＧ投与後１８〜２２時間目の前核期の卵子を顕微注入操作に用いた。マイクロマニュピレータに装着したマイクロニードル（ガラス管を加工し作製）に約５ｍｇ／ｍｌに調製した遺伝子発現ユニットＤＮＡ液を充填し、卵子の前核内に約２ｐｌ注入した。約４００個の受精卵の核に遺伝子発現ユニットＤＮＡ液を注入し、一晩培養して分割した２細胞期の卵子を精管結紮雄と交配させることによって得た代理親マウス（系統：ＩＣＲ）７匹に移植した。その結果６４匹の産仔が得られた。
【００２６】
（２−２）ＰＣＲによるＴｇマウスの同定
出生したマウスの尾から、ゲノムＤＮＡを常法（Ｂｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３：２３０３−２３０８，１９７６）に従い、単離した。ＰＣＲ用プライマーとして、ｎＮＯＳプロモーター５’及び３’側に相当するＦｏｒｗａｒｄプライマー（５’−ｔｇｃ ｃａｃ ｔｇｃ ｔｇｃ ｔｇｃ ｃａｃ−３’）（配列番号４）とＲｅｖｅｒｓｅプライマー（５’−ｃｇａ ｃｔｇ ｇｇｇ ｔｔｔ ａａｔ ｔｇａ−３’）（配列番号５）を設計した。９４℃−１分間、５８℃−１分間、７２℃−１分間のＰＣＲサイクルを３０回行い、反応産物の全てを２％アガロースゲル電気泳動に用いた。目的のバンド（約２５０ｂｐ）の生成が確認されたサンプルをＴｇマウスとした。
【００２７】
実施例３：Ｔｇマウスによる生体内での腎マクラデンサ細胞の識別
次に、実施例２で得た上記遺伝子組換動物（Ｔｇマウス）を用いて生体内で腎マクラデンサ細胞を識別した。すなわち、Ｔｇマウスとして同定されたマウスに対し、導入した遺伝子が発現しているかどうかを組織学的に調べた。
【００２８】
１０週齢に達したマウスの腹腔に、ラシックス（一般名フロセミド：１２μＭ）を２時間おきに３回投与し、約２０時間後に、マウスをネンブタールで麻酔し、心臓から４％ＰＦＡを灌流することによって全身の組織を固定した。臓器を摘出し、約３ｍｍ厚にスライスした後、４％ＰＦＡに入れ一晩４℃にて固定した。次に３０％ショ糖／ＰＢＳ（−）に入れ換え、室温で８時間振盪した。組織をＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ；ｃｏｄｅ．４５８３）中に包埋し、約−５０℃に冷やした２−メチルブタン（Ｗａｋｏ；ｃｏｄｅ．１６６−００６１５）中に投入し、凍結した。切片作製時は−２０℃に設定し、７μｍ厚に薄切し、スライドガラスに貼り付け風乾させた。
ＮＥ Ｔｇマウスの腎臓では、ｎＮＯＳプロモーターの制御を受けて、下流側のＥＧＦＰがＭＤ細胞特異的に発現している。その点を確認するため、ＮＥ Ｔｇマウス腎臓の凍結切片に対しｎＮＯＳ抗体を用いて免疫染色を施した後、ＥＧＦＰ蛍光を同時に観察した。
【００２９】
すなわち、凍結切片をＰＢＳ（−）で５分間×３回洗浄し、５％ＮＧＳを含むＰＢＳ（−）（以下５％ＮＧＳ／ＰＢＳ）で６０分間ブロッキングした。一次抗体である抗ｎＮＯＳ抗体（５％ＮＧＳ／ＰＢＳで１５，０００倍に希釈）を添加し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ（−）で５分間×３回洗浄後、Ａｌｅｘａ５６８標識二次抗体（５％ＮＧＳ／ＰＢＳで２００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）を添加し、室温で６０分間反応させた。ＰＢＳ（−）で５分間×３回洗浄後、退色防止封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  マウント溶液；ｃｏｄｅ．＃Ｈ−１０００）を滴下しカバーグラスをかけ、蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰ（図４左）およびＡｌｅｘａ５６８（図４右）の蛍光を観察した（図４）。
得られた結果は、組織学的に見て矛盾のないものであった。この結果、従来、困難であった生体内における腎マクラデンサ細胞が容易に識別され得ることが確認された。
【００３０】
実施例４：不死化腎マクラデンサ細胞株
本発明で株化された不死化腎マクラデンサ細胞（ＮＥ−ＭＤ細胞）は、高血圧、心不全、浮腫などを主訴とする循環系治療薬および一酸化窒素（ＮＯ）合成に必要な基質（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ：Ｌ−アルギニン）などのアミノ酸輸送の促進または阻害薬開発のためのモデル細胞として有効である。このことを検証するため、以下の実験を行なった。
【００３１】
実施例１で得たＮＥ−ＭＤ細胞にラシックス（１２μＭ）を添加し、２〜５時間培養を継続した後、細胞外液（標準溶液）にＬ−アルギニン（１ｍＭ）を加えると、溶液中のＮＯ産生量が増加した（ＩＳＯ−ＮＯ ＭＡＲＫ ＩＩ、ＷＰＩ製、Ｕ．Ｓ．Ａ．）。このＮＯ産生応答は、同時に添加した５０μＭ７−ニトロインダゾール（７−ＮＩ：神経型一酸化窒素合成酵素阻害薬）でほぼ完全に抑制された。光学異性体のＤ−アルギニン（１ｍＭ）ではこのような応答は見られなかった（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
以上詳しく説明した通り、本発明において作製したマウス不死化腎マクラデンサ細胞株（ＮＥ−ＭＤ細胞）は、循環系治療薬やアミノ酸輸送機能の促進または阻害薬関連の薬品開発に必要なスクリーニングおよび治療効果判定に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の方法で用いるプラスミドベクターの種類を示す模式図（ａ：ｐＣＥ−２９，ｂ：ｐＮＥ，ｃ：ｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１）。
【図２】本発明の方法で用いるｎＮＯＳプロモーターの位置を示す模式図。
【図３】ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス腎遠位尿細管初代培養細胞へのｐＣＥ−２９およびｐＮＥ遺伝子導入によるＥＧＦＰ陽性細胞を示す蛍光顕微鏡写真（ａ：ｐＣＥ−２９，ｂ：ｐＮＥ）。
【図４】ｐＮＥ遺伝子導入によるＥＧＦＰ陽性細胞とｎＮＯＳ免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真。
【図５】ＤＴ７細胞へのｐＮＥ−ＥＧＦＰ−１遺伝子導入によるＥＧＦＰ陽性細胞の濃縮を示す顕微鏡写真。上段：蛍光顕微鏡（ａ，ｃ，ｅ）、下段：位相差顕微鏡（ｂ，ｄ，ｆ）。
【図６】ウエスタンブロット法によるＮＥ−ＭＤ細胞の特性解析を示す図。
【図７】フロセミド（１２μＭ）添加後のｎＮＯＳ発現量変化（ウエスタンブロット法）を示す写真。
【図８】ＮＥ−ＭＤ細胞におけるＮＯ産生を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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