(57)【要約】【課題】  分離流路数を増大させた場合にもサンプル注入を迅速かつ簡便に行なうことができるようにする。【解決手段】  電気泳動プレート１０は、基板内部に複数本の分離流路１２が設けられ、それらの分離流路１２はそれぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることにより流路に沿って試料が電気泳動分離される。それらの分離流路１２は互いに交差することなく基板表面に沿って配列され、分離流路１２は両端側において基板表面に開口をもち、カソード端側の開口は長穴形状のサンプル導入口１４となって行列状に配置され、その配置のピッチ配列はこのサンプル導入口１４に注入されるサンプルが収容されるサンプルプレート２のウェル４のピッチ配列と等しく設定されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板内部に複数本の分離流路が設けられ、それらの分離流路はそれぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることにより流路に沿って試料が電気泳動分離されるものであり、かつそれらの分離流路は互いに交差することなく基板表面に沿って配列されている電気泳動プレートにおいて、
前記分離流路は両端側において基板表面に開口をもち、一端側の開口はサンプル導入口となって行列状に配置され、その配置のピッチはこのサンプル導入口に注入されるサンプルが収容されるサンプルプレートのウェルのピッチと等しく設定されていることを特徴とする電気泳動プレート。
【請求項２】
前記サンプル導入口の形状は流路長方向に延びた長穴形状である請求項１に記載の電気泳動プレート。
【請求項３】
前記他端側の開口は分離流路長方向にほぼ直交する方向の直線状の領域に沿って配置されており、前記分離流路のうち、サンプル導入口が分離流路配置に近い方に配置されているほぼ半分の数の分離流路の他端側が、折り返されてそれぞれの開口につながることによって分離流路間の流路長の差異を減少させている請求項１又は２に記載の電気泳動プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学、分子生物学、臨床などの分野において、例えばＤＮＡシーケンシングなど、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを高速かつ高分解能に分析する電気泳動分離に用いる電気泳動プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。その代表的なものとしてキャピラリー電気泳動装置があるが、煩雑であった。その欠点を補って分析の高速化、装置の小型化を目的とした基板内部に流路をもつ電気泳動部材が、いわゆるマイクロ流体デバイスである。
【０００３】
これまでのマイクロ流体デバイスを用いた電気泳動方法は、分離流路の他にそれに交差する試料導入流路を備えたクロスインジェクターデザインの流路を基本としている（特許文献１〜４参照。）。
しかし、クロスインジェクション法では、流路構成により分離流路に導入される試料に限界があり、多様なサンプル（例えば、濃度差の大きい成分を含むサンプル）に対応できない。
そこで、印加電圧及び印加時間により注入サンプル量が制御可能な分離流路のみの電気泳動プレートが用いられている。その電気泳動プレートは、基板内部に複数本の分離流路が設けられ、それらの分離流路はそれぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることにより流路に沿って試料が電気泳動分離されるものである。それらの分離流路は基板表面に沿って互いに交差することなく、かつ一端側から他端側に向って収束するように配列されているものであり、カソード端での集積を避けるようにしている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１３１２７９号公報
【特許文献２】特開２００２−１３１２８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３１０９９０号公報
【特許文献４】特開２００３−１６６９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前処理プロセスで、サンプルプレートとして通常使用される９６穴又は３８４穴のＭＴＰ（マイクロタイタープレート）から、放射型流路構造であるＭＥＭＳ(Micro Electro Mechanical Systems)電気泳動プレートにサンプル注入を行なう場合、分離流路のピッチ配列がサンプルプレートのウェルのピッチと対応していないために、サンプル１つずつの注入が必要となり、短時間でのサンプル注入が困難になる場合がある。
【０００６】
本発明は、電気泳動プレートにおいて、分離流路数を増大させた場合にもサンプル注入を迅速かつ簡便に行なうことができる電気泳動プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、基板内部に複数本の分離流路が設けられ、それらの分離流路はそれぞれが１本の流路からなり、両端間に電圧が印加されることにより流路に沿って試料が電気泳動分離されるものであり、かつそれらの分離流路は互いに交差することなく基板表面に沿って配列されている電気泳動プレートにおいて、分離流路は両端側において基板表面に開口をもち、一端側の開口はサンプル導入口となって行列状に配置され、その配置のピッチはこのサンプル導入口に注入されるサンプルが収容されるサンプルプレートのウェルのピッチと等しく設定されている電気泳動プレートである。
【０００８】
行列状に配置されるサンプル導入口は、隣接する導入口間の導通によるコンタミを防ぐため、分離流路ごとに独立させる必要がある。しかし流路数に応じたサンプル導入口を樹脂又はガラスに接着して形成する場合、基板への接着不良は許されず、また電気泳動プレートが高価なものとなってしまう。
したがって、本発明ではガラス基板そのものに開口を形成し、それをサンプル導入口（リザーバ）として使用する。
【０００９】
もし、開口を例えば３８４穴（例えば１６ｘ２４の配列）とした場合は、４．５ｍｍの開口間に最大１５本の流路を刻む必要がある。
しかし流路幅が１００μｍ程度の場合、ガラス接合に必要な幅を考慮すると流路間隔は３００μｍ以上を必要とするため、１５本の分離流路で４．３ｍｍ（３００μｍ×１４本＋１００μｍ）の幅が必要となる。これに開口と流路端面の間に必要な幅を考慮すると、開口用の幅は２００μｍ以下になってしまう。サンプルの分注、さらにはインジェクションのための電極（０．５ｍｍ）の挿入等を考えると開口の幅は１．５ｍｍ以上必要である。
【００１０】
さらに、サンプルインジェクションの際、電極先端と流路端面のゲルとの接触は、サンプルのインジェクションを完全に阻害するため、開口と流路端面の間の分離流路は１ｍｍ以上離した距離を保つ必要がある。
ガラス基板にサンプル導入口を接着して形成する場合は、流路に対して直交方向に流路端面と電極先端の距離を確保できるが、ガラス基板に開口を形成してサンプル導入口とする場合は、流路方向に距離をかせぐ必要があり、流路方向に２ｍｍ以上の幅がある開口をガラス基板に形成する必要がある。ここでは説明のために具体的な数値を示したが、本発明はもちろんこれらの数値に限定されるものではない。
そこで、本発明の好ましい形態では、導入口の形状を流路長方向に延びた長穴形状にする。
【００１１】
流路端の開口をサンプルプレートのウェルと同じピッチ配列で行列状に配置した場合、流路の他端を一直線上に揃えると、開口の位置によって流路長に差異が発生する。しかし、流路長の不揃いを解消するために他端位置をずらすと、泳動毎のゲル置換の際、ゲル注入口としてアノード端を使用するのが困難になる。ゲル注入は流路の他端側をひとまとめにして行なうからである。流路長の差異が大きい場合、電圧印加の際に長い流路ほど電界強度が低くなり、サンプルの移動度は低くなってしまう。また、それによって流路間の泳動時間の差が大きくなってしまう。
マルチ電気泳動の特徴の一つは分析のハイスループットであるため、泳動時間の長いチャンネルが存在することは問題となる。さらに、流路が短く電界強度が高い流路は、電気泳動速度が速いために、充分な分離性能が得られないという問題が生じる。
【００１２】
そこで、本発明の他の好ましい形態では、分離流路の他端側の開口は、分離流路長方向にほぼ直交する方向の直線状の領域に沿って配置されており、分離流路のうち、サンプル導入口が分離流路配置に近い方に配置されているほぼ半分の数の分離流路の他端側が、折り返されてそれぞれの開口につながることによって分離流路間の流路長の差異を減少させているものとする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の電気泳動プレートにおいて、ガラス基板そのものに開口を形成することで、複数穴を開けた別部材によるサンプル導入口の作成と接着作業を必要としなくなり、また、開口の配置のピッチがサンプルプレートのウェルのピッチと等しいことにより、サンプルプレートからサンプル導入口へのサンプル移送及び注入を、迅速かつ簡便に行なうことができる。
サンプル導入口の形状を流路長方向に延びた長穴形状にすれば、流路長に直交する方向に隣接する開口とは接することがなくなり、多くの開口を配置することができる。
【００１４】
サンプル導入口から繋がる分離流路の他端部のうち、ほぼ半分の数を折り返してそれぞれの開口につなげるようにすれば、分離流路間の流路長の差異を減少させることができる。このように、サンプル移送と注入の簡便さを実現しながら流路長の格差を抑えた場合には、流路間の泳動が安定し、同じ分離性能と同じ泳動時間をもつ複数流路の集積が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明をＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System：微小電気的・機械的システム）キャピラリープレートを電気泳動部材として用いた実施例を詳細に説明する。
図１（Ａ）はサンプルプレートの模式図、（Ｂ）は電気泳動部材におけるキャピラリー流路の平面図、（Ｃ）は電気泳動部材のカソード端における斜視図、（Ｄ）は電気泳動部材のカソード端における断面図を示している。図２（Ａ）はカソード端を拡大した平面図で、（Ｂ）はそれを拡大したリザーバを示した図である。図３はアノード端を拡大した平面図である。
【００１６】
電気泳動プレート１０は厚さ約０．７ｍｍの一対の板材１０ａ，１０ｂが接合されて基板となったものであり、一端がカソード端、他端がアノード端である。一方の板材１０ａの接合面側にはキャピラリー流路からなる分離流路１２が複数本、例えば３８４本形成されており、互いに交差しないように配列されている。他方の板材１０ｂには各分離流路１２の両端の位置に貫通穴１３，１４が設けられている。
各分離流路１２のカソード端は基板表面に開口したそれぞれのサンプル導入口である小容量リザーバ１４に接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４を含む大きさの大容量リザーバ１６がリザーバの壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２のアノード端は、基板表面に形成された共通のリザーバに接続されるように開口している。
【００１７】
基板を構成する板材１０ａ，１０ｂの材質としては、石英ガラスやホウ珪酸系ガラス、樹脂などを用いることができ、泳動分離された成分を光学的に検出する場合には透明な材質を選択する。光以外の検出手段を使用する場合は、板材１０ａ，１０ｂの材質は透明なものに限定されるものではない。
【００１８】
板材１０ａへの分離流路１２の形成はリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング又はドライエッチング）により形成することができる。
分離流路１２の幅は１００ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは５０〜９０μｍであり、深さは１００ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは２０〜４０μｍである。
【００１９】
小容量リザーバ１４は板材１０ｂに貫通穴として形成され、そのサイズは直径が１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜２ｍｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料を注入するのに適した大きさに設定されている。板材１０ｂへの貫通穴はサンドブラストやレーザドリルなどの方法により形成することができる。
【００２０】
サンプルプレート２のウェル４は３８４穴（１６ｘ２４配列）あるが、カソード端の小容量リザーバ１４は、図１，２に示すようにこれを１９２穴ずつ（８ｘ２４配列）に分割し流路に直交する方向に展開（８ｘ４８配列）する。Ｘ，Ｙ方向の開口のピッチは４．５ｍｍであり、導入口はＸ方向に２．５ｍｍ、Ｙ方向には１．５ｍｍの大きさである。
【００２１】
Ｘ方向の導入口の数を１６個から８個に減らすことで、分離流路数も１５本から７本に減らすことができ、分離流路に必要な幅は１．９ｍｍ（３００μｍ×６＋１００μｍ）となり、ウェル形成用の幅を確保することができる。
そのため、リザーバと流路端面の間に必要な幅１ｍｍを考慮してもＸ方向には２．５ｍｍ、Ｙ方向に１．５ｍｍの大きさの開口が配置できる。
カソード端での開口のＸ方向の配置等によって生じる、１６本の分離流路の場合での最大流路長と最小流路長の差は６７．５ｍｍであったが、このように８本の分離流路の場合での流路差は３１．５ｍｍになり約半減することができる。
【００２２】
分離流路１２において、サンプル導入口が分離流路配置に近い方に配置されている半分の分離流路のアノード端側をＵ型に折り返して他端側開口につながるように配置したものを図３に示す。
アノード端では３８４本の流路は蛍光検出器の走査のために収束しており、その端面は４本ずつ束ねて末端が向かいあうように配置され、ゲル充填および電気的導通のためのアクセスホール１３と繋がっている。
【００２３】
実施例における分離流路１２の平均長は４４０ｍｍであり、最大流路長は４５２．４ｍｍ、最小流路長は４３０．８ｍｍであった。この場合の流路長の差は２１．６ｍｍで、平均流路長に対する割合は４．９％であった。
【００２４】
次に図１の電気泳動プレートにおける試料注入動作を説明する。
（１）電気泳動プレート１０を５０℃の恒温状態に保つ。
（２）カソード側の大容量リザーバ１６に純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を満たし、アノード側からシリンジで加圧して全ての分離流路１２にゲルを充填する。
（３）分離流路１２から小容量リザーバ１４に流出したゲルは、大容量リザーバ１６の純水中に拡散するので、リザーバ１４，１６内の水及びゲルを吸引ノズルによって吸引し、リザーバ１４，１６内を洗浄する。
【００２５】
（４）リザーバ１４，１６内の洗浄後、カソード側リザーバ１６とアノード側リザーバにバッファ溶液を満たし、両リザーバ間に電圧を印加してプレセパレーションを行ない、ゲル中の夾雑物イオンをアノード電極又はカソード電極に移動させる。印加電圧は、例えば１２５Ｖ／ｃｍで、印加時間は５分間である。
（５）カソード側リザーバ１６のバッファ溶液を吸引し、リザーバ１６内を洗浄した後、リザーバ１６内を純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で満たす。
（６）その後、純水で満たされたリザーバ１６の各小容量リザーバ１４にサンプルプレート２のウェル４から試料を移送して注入する。サンプルプレート２のウェル４は３８４穴（１６ｘ２４配列）あるので、初めに半分の１９２穴（８ｘ２４配列）から移送し、その後もう半分の１９２穴（８ｘ２４配列）から移送する。
【００２６】
（７）各小容量リザーバ１４にカソード電極を挿入し、アノード電極との間に電圧を印加して流路１２への試料注入を行なう。試料注入のための印加電圧は、例えば５０Ｖ／ｃｍで、印加時間は４０秒間である。
（８）リザーバ１６の純水とともに小容量リザーバ１４内の残った試料も吸引して洗浄した後、リザーバ１４，１６内をバッファ溶液で満たす。
【００２７】
（９）リザーバ１６にカソード電極を挿入し、アノード電極との間に泳動電圧を印加して試料の電気泳動分離と信号検出を行なう。泳動分離のための印加電圧は、７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、例えば１２５Ｖ／ｃｍである。
アノード電極はリザーバにそれぞれ予め設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。また、試料注入側ではリザーバ１４ごとに電極を設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。
【００２８】
実施例での泳動パターンの一例を図４に示す。検出部で泳動分離されたＤＮＡサンプルに励起光を照射し、その蛍光を検出したものであり、横軸は励起光で走査したときの走査番号を表し、時間に対応している。縦軸は蛍光強度である。
【００２９】
図４は順に並んだ８本の流路における蛍光の結果であり、（Ａ）から（Ｈ）の順に流路配置に近い方から順に並んでいる。すなわち、図２（Ａ）では一組の８本の流路について図の左側から（Ａ）〜（Ｈ）としている。（Ａ）〜（Ｄ）はアノード側で折り返されている。横軸の２００００前後にあるピークに注目すると、（Ａ）から（Ｄ）にかけて長時間側に移動していき、（Ｄ）から（Ｅ）にかけて一たん短時間側に移動した後、再び（Ｅ）から（Ｈ）にかけて長時間側に移動している。
８本の流路のうち、（Ａ）〜（Ｄ）の４本の流路を折り返すことによって、図４に示すように（Ａ）と（Ｈ）におけるピークの位置の差異は減少した。
【００３０】
本発明は前述の実施例のみに限定されず、流路幅が５０μｍ程度確保でき、リザーバ用の幅がＸ方向に２ｍｍ、Ｙ方向に１．５ｍｍ程度確保できれば実施可能である。そのためカソード端の導入口は長穴形状に限らず、円形であってもよい。
また、ウェルの数も３８４個に限らずそれ以下でもよく、例えば９６個であってもよい。また、３８４個以上でもよく、例えば１０００個程度形成してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
生化学、分子生物学、臨床などの分野において、例えばＤＮＡシーケンシングなど、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを高速かつ高分解能に分析する電気泳動分離に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（Ａ）はサンプルプレートの平面図、（Ｂ）は電気泳動部材におけるキャピラリー流路の平面図、（Ｃ）は電気泳動部材のカソード端における斜視図、（Ｄ）は電気泳動部材のカソード端における断面図を示している。
【図２】（Ａ）はカソード端を拡大した平面図であり、（Ｂ）はそれをさらに拡大したリザーバを示した平面図である。
【図３】アノード端を拡大した平面図である。
【図４】泳動パターンの一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３３】
２      サンプルプレート
４      ウェル
８      リザーバの壁
１０      電気泳動プレート
１０ａ，１０ｂ      板材
１２      分離流路
１４      小容量リザーバ（開口）
１６      大容量リザーバ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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