(57)【要約】【課題】疎水性有機溶媒を用いることなく製造することができ、しかも微細孔の孔径制御が容易なスキャホールドシート及びその製造方法を提供する。【解決手段】エオシン化ゼラチン等の可視光架橋物質と、ハイドロゲンドナーとを含む水溶液を面状に展延し、微細孔形成用非透過部を有したマスクを介して可視光を照射することにより露光部を光架橋・不溶化してシート状とする。次いで、水に浸漬して未露光部を溶解除去することにより微細孔を形成してスキャホールドシートとする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート厚み方向に多数の微細孔が貫通しているスキャホールドシートを製造する方法において、
下記（Ａ）の化合物と、
ハイドロゲンドナーと、
を含む水溶液を面状に展延し、
微細孔の形成予定部が光の非透過部となっており、その他の部分は透光性となっているマスクを介して可視光を照射することにより、光が照射された部分を光架橋・不溶化してシートとし、
その後、該非透過部により遮光されて光が照射されなかった部分を水で溶解除去して前記微細孔を形成することを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
（Ａ）キサンテン系色素で修飾した、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ケラタン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、エラスチン、ヘパラン硫酸、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、オステオネクチン、エンタクチン、ガゼイン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシドール、ポリグリシドールの側鎖エステル化体、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体、ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種。
【請求項２】
請求項１において、面状に展延する水溶液の厚みは１００μｍ〜５ｍｍであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記水溶液を展延後に乾燥し、その後、前記可視光を照射することを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、ハイドロゲンドナーがチオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、キサンテン系色素がエオシンであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、（Ａ）がゼラチンであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項７】
請求項６において、ゼラチンが１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項８】
請求項７において、ゼラチンが１分子中に２個〜６個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、微細孔の孔径が０．１〜１０００μｍであることを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記水溶液に生理活性物質を含有させておくことを特徴とするスキャホールドシートの製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかの製造方法により製造されたスキャホールドシート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート厚み方向に多数の微細孔が貫通しているスキャホールドシート（シート状のスキャホールド材）の製造方法と、この方法により製造されたスキャホールドシートに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞の機能や分化応答性がマトリックスによって制御されていることが明らかになり、組織工学、再生医療においては細胞の増殖だけでなく分化などの応答性を制御する研究が盛んに行われている。特に、多種多様に発見されている幹細胞の分化抑制、分化誘導は重要であり、スキャホールド材はサブカルチャーの段階から分化応答性などを制御できる機能が要求されるようになってきている。
平板状のスキャホールド材の場合には、材料表面の物理的性質を制御してこれら機能発現を目指す技術と化学的性質を制御する技術などが検討されている。
【０００３】
細胞接着性の表面の化学的性質を制御する技術の例としては、アシアロ糖タンパク仲介型接着であるＰＶＬＡのような非インテグリン型接着での培養技術や、ＬＩＦ（Leukemia  Inhibitory  Factor）の固定皿などＥＳ細胞を未分化の状態でサブカルチャーする技術がある。
【０００４】
シート厚み方向に多数の微細孔が貫通しているスキャホールド材の製造方法として、高湿度条件下でプラスチック溶液をガラスシャーレ上に滴下した後、溶媒を蒸発させることにより蜂の巣（ハニカム）状に微細孔が配列されたフィルムを製造する方法が下記非特許文献１に記載されている。同文献によると、溶媒の蒸発とともに溶液表面へ結露した水滴が鋳型になって微細孔が形成されること；この水滴は経時的に成長すること；孔径制御には溶液の蒸発時間が最も効果的な制御因子であること；が記載されている。
【非特許文献１】北海道大学２１世紀ＣＯＥプログラム「バイオとナノを融合する新生命科学拠点：ＢＢ市民キャンパス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｔａｃａｎ.ｊｐ／ｃｏｅ／０８／）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のスキャホールド材の製造方法では、フィルムは疎水性有機溶媒に溶解するポリマーでしか作成することができず、疎水性有機溶媒がフィルム中に残存するおそれがある。また、微細孔の孔径制御が容易ではない。
【０００６】
本発明は、疎水性有機溶媒を用いることなく製造することができ、しかも微細孔の孔径制御が容易なスキャホールドシート及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明（請求項１）のスキャホールドシートの製造方法は、シート厚み方向に多数の微細孔が貫通しているスキャホールドシートを製造する方法において、下記（Ａ）の化合物と、ハイドロゲンドナーと、を含む水溶液を面状に展延し、微細孔の形成予定部が光の非透過部となっており、その他の部分は透光性となっているマスクを介して可視光を照射することにより、光が照射された部分を光架橋・不溶化してシートとし、その後、該非透過部により遮光されて光が照射されなかった部分を水で溶解除去して前記微細孔を形成することを特徴とするものである。
（Ａ）キサンテン系色素で修飾した、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ケラタン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、エラスチン、ヘパラン硫酸、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、オステオネクチン、エンタクチン、ガゼイン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシドール、ポリグリシドールの側鎖エステル化体、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体、ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種。
【０００８】
請求項２のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１において、面状に展延する水溶液の厚みは１００μｍ〜５ｍｍであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項３のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１又は２において、前記水溶液を展延後に乾燥し、その後、前記可視光を照射することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項４のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、ハイドロゲンドナーがチオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項５のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、キサンテン系色素がエオシンであることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項６のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、（Ａ）がゼラチンであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項７のスキャホールドシートの製造方法は、請求項６において、ゼラチンが１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項８のスキャホールドシートの製造方法は、請求項７において、ゼラチンが１分子中に２個〜６個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項９のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、微細孔の孔径が０．１〜１０００μｍであることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項１０のスキャホールドシートの製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記水溶液に生理活性物質を含有させておくことを特徴とするものである。
【００１７】
請求項１１のスキャホールドシートは、請求項１ないし１０のいずれかの製造方法により製造されたものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスキャホールドシート及びその製造方法にあっては、キサンテン系色素で修飾された、生分解性の水溶性高分子化合物を、マスクを介してハイドロゲンドナーの存在下で可視光照射することにより、光を照射した部分（露光部）を架橋不溶化してシート状とする。微細孔形成予定部には光が照射されず、架橋しないので、シートの未露光部分を水で溶解除去することにより、微細孔が形成される。
【００１９】
本発明では、このように高分子化合物の水溶液を展延して光架橋し、水で未露光部分を溶解除去するようにしており、作成に有機溶媒を一切使用しない。従って、ゲル中に有機溶媒は残留しない。
【００２０】
また、マスクに、目的とする微細孔の孔径及び配列パターンに従った光非透過部を形成しておくことにより、目的とする孔径及び配列パターンにて微細孔を形成することができる。
【００２１】
作成されたスキャホールドシートを構成するゲルには柔軟性があり、全面に穿孔された微細孔の効果により、播種された細胞は単層ではなく３次元的なすなわち生体内と近似の環境で細胞を培養することが可能となる。
【００２２】
なお、上記の水溶性高分子の水溶液に生理活性物質を含有させてもよい。この生理活性物質は、ゲルシートよりなるスキャホールドシートから徐々に放出される。
【００２３】
このゲル状シートは、可視光で架橋して作成されるため、この生理活性物質が光に弱いものであっても、その活性が損なわれないし、シートの基材からの分解物による細胞への悪影響も少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２５】
本発明では、可視光の照射によりラジカルを発生してゲル化する物質として、前記（Ａ）の物質を用いる。
【００２６】
この（Ａ）の化合物におけるキサンテン系色素としてはエオシンが好適であり、上記（Ａ）の物質としてはエオシン化ゼラチンが好適である。このエオシン化ゼラチンについては後に記述する。
【００２７】
ゼラチンをキサンテン系色素で修飾する場合、ゼラチン１分子に対するキサンテン系色素分子の導入数は１０個以下が好ましく、特に２〜６個であることが好ましい。この導入数が１０よりも多いと、ゼラチンが水へ難溶となり、最終的にはスキャホールドシートが硬くなる。
【００２８】
本発明では、ラジカルのカウンターであるプロトン供与体として、ハイドロゲンドナーを用いる。このハイドロゲンドナーとしては、チオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール、１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物などが好適であり、特に１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物が好適である。
【００２９】
シート作成用の水溶液に生理活性物質を含有させてもよい。
【００３０】
生理活性物質としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヒルジン、アルガトロバン、フォルマコリン、バピプロスト、プロスタモリン、プロスタキリン同族体、デキストラン、ローフェプローアルグクロロメチルケトン、デイピリダモール、グリコプロテインの血小板膜レセプタ抗体、組換え型ヒルジン、トロンビン抑制剤、脈管ペプチン、脈管テンシン転換酵素抑制剤、ステロイド、繊維芽細胞成長因子アンタゴニスト、フィッシュオイル、オメガ３ー脂肪酸、ヒスタミン、アンタゴニスト、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクテース抑制剤、セラミン、セロトニン阻止抗体、チオプロテイース抑制剤、トリマゾールピリデイミン、インターフェロン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子α、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因子結合蛋白、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、アンジオポイエチン、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、形質転換増殖因子β、潜在型形質転換増殖因子β、アクチビン、骨形質タンパク、繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子β、二倍体繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子、シュワノーマ由来増殖因子、アンフィレグリン、ベーターセルリン、エピグレリン、リンホトキシン、エリスロエポイエチン、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−1β、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１７、インターフェロン、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗生物質、抗がん剤、拮抗剤、免疫抑制剤、レセプター遮断剤、抗パーキンソン病薬、ビタミン薬、フラボノイド、抗不整脈剤、インスリン、カルシトニン、放射性物質、還元グルタチオン、ニトログリセリン、プロスタグランジン、ポリフェノール、エリスロポイエチン、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを導入したベクターよりなる群から選択される少なくとも１種が例示される。
【００３１】
（Ａ）の物質の水溶液中の濃度は０．１〜５０重量％程度が好ましい。
【００３２】
水溶液中における場合の上記（Ａ）、ハイドロゲンドナー及び生理活性物質の割合は、（Ａ）に対してハイドロゲンドナーが０．０１〜１５０重量部、生理活性物質が１５０重量部以下例えば０．０１〜１５０重量部であることが好ましい。
【００３３】
この水溶液を好ましくは厚み１００μｍ〜５ｍｍ程度となるように面状に展延し、マスクを介して可視光を照射することにより露光部分を光架橋し不溶化してシート状とする。その後、未露光部分を水で溶解除去して微細孔を形成し、スキャホールドシートとする。
【００３４】
展延は、水溶液を成形型上又は成形型内に流し込んだり流し出したりするようにして行われてもよく、刷毛やヘラなどによって成形型に塗布して行ってもよい。成形型の成形面は平面であってもよく、曲面であってもよい。スリット状の開口を有したノズルから幕（カーテン）状に流し出すようにしてシート状に展延してもよい。
【００３５】
この展延の後、乾燥を行ってもよい。成形面が曲面の場合は、乾燥を行う方が望ましい。成形面の少なくとも一部が曲面である成形型を用いると、臓器の曲面におおむね合致するように湾曲したシートを成形することができる。このように少なくとも一部が湾曲したシートは、臓器の形状に成形して細胞生着させて培養したものを移植する臓器再生や、事故などで欠損した組織（腕や耳など）の欠損部位の形状で細胞を培養して移植する再生医療への応用が期待できる。
【００３６】
上記の微細孔の孔径は０．１〜１０００μｍ特に１〜１００μｍとりわけ１０〜７０μｍ程度が好適である。
【００３７】
微細孔の孔の形は、真円、楕円形、三角形又は四角形以上の多角形、星形など任意である。異なる孔径状の微細孔が混在していてもよい。
【００３８】
隣接する直近の微細孔間の平均距離は０．５〜５００μｍ、特に５〜５０μｍ程度が好適である。
【００３９】
この微細孔の孔径や微細孔の配置密度は、マスクに設ける非透過部の大きさ及び配置により任意に制御することができる。
【００４０】
マスクとしては、透明なＰＭＭＡ等の樹脂フィルムに非透過部を銀ペースト等のスクリーン印刷や、アルミ等の金属の蒸着等により形成したものが好適である。
【００４１】
次に、本発明において用いるのに好適なエオシン化ゼラチンについて説明する。
【００４２】
ここでゼラチンは、分子量５千〜１０万、アミノ基約１０〜１００個／１分子程度の通常のゼラチンで良い。
【００４３】
エオシン化ゼラチンは、下記反応に従ってゼラチンの側鎖にエオシンを導入することにより調製される。
【００４４】
【化１】
2006333727.tif 000002
【００４５】
ゼラチン分子へのエオシンの導入数は、例えば、エオシン化ゼラチンの水溶液の吸光度をエオシンの最大吸収波長５２２ｎｍにおいて測定し、エオシンのモル吸光係数（ε＝９４７５５）を基に算出可能であり、ゼラチン１分子に対して１〜１０個、特に２〜５個程度が好ましい。このエオシン等の感光基を有する化合物の導入数が少ないとゲル化率が低下し、また必要以上に多くてもゼラチン固有の柔軟性が損なわれる可能性があると共に、水へ難溶性となってしまう。
【００４６】
このエオシン化ゼラチンは、粘稠性の液体状である。これを例えば濃度１〜１０重量％の水溶液とした場合には、３００〜３０，０００ｌｘ程度の可視光、特に生体に対する用途にあっては、３００〜１５，０００ｌｘ程度の比較的低照度で、生体に対して影響の低い可視光を０．１〜３０分程度照射してゲル状に硬化させることができる。
【実施例】
【００４７】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００４８】
実施例１
［エオシン化ゼラチンの合成］
ゼラチン（分子量９５，０００、アミノ基量約３７個／分子）に、水溶性カルボジイミドであるＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）の存在下、下記反応でゼラチンの側鎖のアミノ基にエオシンを結合させることにより、ゼラチン１分子当たりエオシン約５個を導入してエオシン化ゼラチンを合成した。
【００４９】
【化２】
2006333727.tif 000003
【００５０】
［キサンテン系色素で修飾した高分子及びハイドロゲンドナーを含む溶液の調製］
合成したエオシン化ゼラチンを終濃度１０重量％、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミンを終濃度１．２重量％となるように溶解混合し、キサンテン系色素で修飾した高分子化合物及びハイドロゲンドナーを含む水溶液とした。
【００５１】
［マスクの作成］
厚さ３０μｍのＰＭＭＡ製フィルムに銀粉末含有感光性ペーストをスクリーン印刷して露光することにより、直径１０μｍの真円形の非透過部が枡目状に配列されたマスクを製造した。隣接する直近の非透過部同士の距離は１０μｍである。
【００５２】
［スキャホールドシートの作成］
放射線滅菌済みのシャーレへ厚み２００μｍとなるように、上記溶液を流し込むことにより展延した。その上に、空気を巻き込まないように上記マスクを重ね、トクソーパワーライト（トクヤマ製、ハロゲンランプ、波長４００ｎｍ〜５２０ｎｍ）にて照射強度２００ｍＷ／ｃｍ２となるように可視光を２０分間照射して露光部を不溶化させてシートとした。その後、シートを４０℃の水中に２００Ｈｒ浸漬し、未露光部を溶解除去して微細孔を形成した。これにより、赤色の弾力のある厚さ２００μｍの柔軟なスキャホールドシートが得られた。
【００５３】
［スキャホールドシートの評価］
上記スキャホールドシートへ生食を含浸させ、高圧蒸気滅菌した。ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＳＣ及びＡＢ抗生物質配合）でリンスした後に株化平滑筋細胞を播種し、培地を加えて培養した。
【００５４】
細胞は、モノレイヤーでなく、２００μｍ厚みのスキャホールドシートの孔の内部へも浸潤しており、孔１個に細胞は１個〜数個生着していたが、コンフェルトではなかった。培養７日目にミオシン重鎖ＳＭ１、カルポニンをノーザンブロット法及びウエスタンブロット法で確認した。形質マーカー量は少なく、分化させないで培養することができた。