(57)【要約】【課題】長期間の生体培養観察が可能な生体培養チャンバ構造体であり、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体を提供する。【解決手段】透明なガラス質材料から成る天板（Ａ）と光透過性有機樹脂材料から成る下部基板（Ｂ）と前記天板（Ａ）の上面に載置され、かつ、前記下部基板（Ｂ）に取り外し可能に固定されるとともに前記天板（Ａ）を解放する孔を有する支持板（Ｃ）を有し、前記天板（Ａ）と前記下部基板（Ｂ）との間にＯーリング（Ｄ）が存在し、該Ｏーリング（Ｄ）の内部に位置する空間が生体培養チャンバ（Ｅ）である構造体であって、生体を培養するための流体を送り込むための通路（Ｆ）が前記下部基板（Ｂ）を貫通して前記生体培養チャンバ（Ｅ）に結合してなることを特徴とする、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明なガラス質材料から成る天板（Ａ）と光透過性有機樹脂材料から成る下部基板（Ｂ）と前記天板（Ａ）の上面に載置され、かつ、前記下部基板（Ｂ）に取り外し可能に固定されるとともに前記天板（Ａ）を解放する孔を有する支持板（Ｃ）を有し、前記天板（Ａ）と前記下部基板（Ｂ）との間にＯーリング（Ｄ）が存在し、該Ｏーリング（Ｄ）の内部に位置する空間が生体培養チャンバ（Ｅ）である構造体であって、生体を培養するための流体を送り込むための通路（Ｆ）が前記下部基板（Ｂ）を貫通して前記生体培養チャンバ（Ｅ）に結合してなることを特徴とする、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体。
【請求項２】
下部基板（Ｂ）がアクリル樹脂を素材とするものである請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
Ｏーリング（Ｄ）が有機ケイ素樹脂を材質とする弾性体である請求項１に記載の構造体。
【請求項４】
流体が生体の培養液である請求項１に記載の構造体。
【請求項５】
支持板（Ｃ）が塩化ビニル樹脂を素材とするものである請求項１に記載の構造体。
【請求項６】
さらに、下部基板（Ｂ）が培養内室面に温度センサ（Ｇ）を有する請求項１に記載の構造体。
【請求項７】
さらに、下部基板（Ｂ）が下部及び／又は周囲に温度制御の可能な熱媒体を流すウォーターバス（Ｈ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体培養チャンバ構造体に関し、詳しくは、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きたままの細胞、組織、器官、微生物等（以下、「生体」という。）を長時間にわたり顕微鏡観察するための生体培養チャンバとしては、数多くの構造体が提案されている。
例えば、特許文献１では、液体又は気体を環流する通路を有する生体培養チャンバ構造体が提案されている。また、特許文献２では、培養液を貯留し、かつ、培養液上部の空間において炭酸ガスの交換が可能な孔を有する生体培養チャンバ構造体が提案されている。また、特許文献３では、細胞培養ペトリ皿を収納し適切な温度と湿度を保つことができる生体培養チャンバ構造体が提案されている。
【０００３】
しかし、これらの生体培養チャンバ構造体は、生体培養チャンバが密閉構造ではなく、かつ、培養液を還流する機能を備えないものについては、培養液であるバッファ液（緩衝液）において乾燥による塩分濃度の上昇が原因となり、生体培養期間の限度が１〜２日の短期間であるという欠点があった。
【０００４】
また、これらの生体培養チャンバ構造体はいずれも倒立型顕微鏡に適用されるべく設計されたものであり、このものを、正立型顕微鏡に適用した場合は、生体培養チャンバ内に存在あるいは発生する気泡の除去が極めて難しい等の問題点があり、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用する生体培養チャンバ構造体としては実質的に使用できないものであった。
【特許文献１】特開平８−３３６３８２号公報
【特許文献２】米国特許６７２７０８９号公報
【特許文献３】米国特許４３０１２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、上記問題点を解消するために研究した結果、本発明に到達した。即ち、本発明の目的は、長期間の生体培養観察が可能な生体培養チャンバ構造体であり、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、「透明なガラス質材料から成る天板（Ａ）と光透過性有機樹脂材料から成る下部基板（Ｂ）と前記天板（Ａ）の上面に載置され、かつ、前記下部基板（Ｂ）に取り外し可能に固定されるとともに前記天板（Ａ）を解放する孔を有する支持板（Ｃ）を有し、前記天板（Ａ）と前記下部基板（Ｂ）との間にＯーリング（Ｄ）が存在し、該Ｏーリング（Ｄ）の内部に位置する空間が生体培養チャンバ（Ｅ）である構造体であって、生体を培養するための流体を送り込むための通路（Ｆ）が前記下部基板（Ｂ）を貫通して前記生体培養チャンバ（Ｅ）に結合してなることを特徴とする、正立型顕微鏡にて生体を観察する際に使用される生体培養チャンバ構造体。」により、達成される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の生体培養チャンバ構造体は、生体培養チャンバ構造体を組み立てる際に発生する気泡あるいは液体の還流時に発生する気泡の除去が容易であり、また、汎用の正立型顕微鏡に簡単に取り付けることが可能である等の利点を有する。また、本発明の生体培養チャンバ構造体は、生体培養チャンバが培養液の還流機能を備える密閉型であることにより、培養液において乾燥による塩分濃度の上昇を避けられる利点を有する。このため、本発明の生体培養チャンバ構造体は、長期間の生体培養に適し、培養対象が増殖をする細胞であれば、細胞の増殖による観察限界の３〜４日までの培養が可能であり、また、神経細胞に例示される増殖のない細胞が培養対象であれば、一週間程度の培養が可能である。また、本発明の生体培養チャンバ構造体は、培養液の還流通路に、ろ過滅菌フィルタを追加することにより、生体を無菌状態にて培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面に従い説明する。
【０００９】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態の生体培養チャンバ構造体の平面図および断面図である。図１に示されるように、本発明の生体培養チャンバ構造体１は、下部基板２の上面にＯーリング３が載置され、このＯーリング３の上に天板４が載置されている。この天板４の上には、天板４を解放する孔５ａを有する支持板５が載置され、この支持板５は、ビス止めにより下部基板２に固定されている。また、生体培養チャンバ６は、下部基板２と天板４に挟まれるＯーリング３の空間部に形成される。また、通路７と通路８は下部基板２の内部を貫通し生体培養チャンバ６につながっている。通路７は、外部から生体培養チャンバへ培養液を送り込む管である。通路８は、生体培養チャンバから外部へ培養液を送り出す管である。
【００１０】
下部基板２は光透過性有機樹脂材料からなり、例えば、透明なアクリル樹脂からなる。下部基板２の底部形状は、正立型顕微鏡ステージに載置が可能な形状であり、さらに特定の正立型顕微鏡のステージに勘合可能な形状であり、生体培養チャンバ構造体１のステージへの固定を容易かつ確実に行うことができる。また、生体培養チャンバ構造体１の正立型顕微鏡のステージへの固定は、磁石の磁力やゴムの張力を用いることもできる。
【００１１】
Ｏーリング３は、生体の活動維持に無害であり、かつ、生体培養チャンバを気密に保つことができる材料からなる。かかる材料としては、例えばシリコーンゴムが例示される。また、Ｏーリング３は、生体の活動維持に無害な材料からなる接着剤を用いて下部基板２に接着して固定されることが好ましい。かかる接着剤としてはシリコーン系接着剤が例示される。
【００１２】
天板４は透明なガラス質材料であり、例えば、ソーダ石灰ガラス、珪酸ガラス、カリ石灰ガラス、鉛ガラス、アルカリガラスが例示される。一般には、顕微鏡用カバーグラスが使用される。
【００１３】
支持板５は、支持板５の下面に接する天板４を傷つけず、かつ、容易に変形しない硬度を有する材料からなり、例えば、塩化ビニル樹脂を素材とする材料である。また、支持板５の上面は、支持板５を下部基板２に固定するビスの頭部が突出しない堀を設けた形状である。
【００１４】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００１５】
図２は、本発明の第２の実施の形態の生体培養チャンバ構造体の平面図および断面図である。図２に示されるように、本発明の生体培養チャンバ構造体１は下部基板２の上面にＯーリング３が載置され、このＯーリング３の上に天板４が載置されている。この天板４の上には、天板４を解放する孔５ａを有する支持板５が載置され、この支持板５は、ビス止めにより下部基板２に固定されている。また、生体培養チャンバ６は、下部基板２と天板４に挟まれるＯーリング３の空間部に形成される。また、下部基板２の内部には、外部から生体培養チャンバへ培養液を送り込む管である通路７と、生体培養チャンバから外部へ培養液を送り出す管である通路８が形成されている。通路７は、下部基板２の内部を貫通して下部基板２の側面と下部基板２の底面をつなぐ管と、下部基板２の内部を貫通して下部基板２の底面と生体培養チャンバをつなぐ管の２つの管からなる。一方、通路８は、下部基板２の内部を貫通して下部基板２の側面と生体培養チャンバ６をつなぐ管からなる。通路７の両管には、両管それぞれにおける下部基板２の底面の開口に、ステンレススチールチューブ９がそれぞれ刺し込まれている。両ステンレススチールチューブ９には、１本のシリコーンゴムチューブ１０の両端が、両ステンレススチールチューブ９を結合する形に刺し込まれている。なお、図示はしないがシリコーンゴムチューブ１０は２回転のとぐろを巻き、ステンレススチールチューブ９に刺し込まれている。また、生体培養チャンバ６の内面には、下部基板２上に温度センサ１１が設けられている。また、下部基板２の下部には、生体培養チャンバ６に充填される培養液を所定の温度に制御するウォータバス１２が設けられている。ウォーターバス１２は、勘合により下部基板２の下部に固定される。なお、ウォーターバス１２と下部基板２の間には、ウォーターバス１２の気密性を高めるためのＯーリング１３が挟まれている。
【００１６】
下部基板２は光透過性有機樹脂材料からなり、例えば、透明なアクリル樹脂からなる。下部基板２の底部形状は、ウォータバス１２に勘合が可能な形状であり、例えば、底部外周に、ウォータバス１２の上部内周に設けるネジ溝と勘合が可能なネジ溝を備える形状である。
【００１７】
Ｏーリング３、天板４としては、上記実施態様１で例示したものと同様なものが例示される。
【００１８】
支持板５は、支持板５の下面に接する天板４を傷つけず、かつ、容易に変形しない硬度を有する材料からなり、例えば、塩化ビニル樹脂を素材とする材料である。支持板５の厚みは、カバーグラス４の外気による温度変化を軽減するため、孔５ａの空間を十分に確保するための厚みが適宜選択され、例えば、６ｍｍ〜１０ｍｍの厚みが選択される。また、支持板５の上面は、支持板５を下部基板２に固定するビスの頭部が突出しない堀を設けた形状である。
【００１９】
ウォーターバス１２は、内部に所定の温度の熱媒体を流す空間を有する。空間の側面の対角する位置には、開口１２ａと開口１２ｂが設けられる。開口１２ａは、空間の外部から内部に所定の温度の熱媒体を送り込む開口であり、開口１２ｂは、送り込まれた熱媒体を空間の内部から外部に送り出す開口である。空間の内部に送り込まれる熱媒体は、たとえば３７℃の温水である。熱媒体は、シリコーンゴムチューブ１０を介し、シリコーンゴムチューブ１０内に流れる培養液に伝熱をする。熱媒体から培養液への伝熱において、シリコーンゴムチューブ１０がウォーターバス１２内にて２回転のとぐろを巻く配置は、伝熱を確実に行うのに有利な配置である。また、シリコーンゴムチューブ１０を生体培養チャンバ６近くに配置することは、培養液を加熱する期間を短くし、培養液の熱的変化を抑えるのに有利である。培養液の温度は、生体培養チャンバ６の内面に設けられた温度センサ１１により検出することができる。また、ウォータバス１２の材料は、送り込まれる熱媒体により変質及び変形しない光透過性有機樹脂であり、たとえば、透明のポリ塩化ビニル樹脂である。ウォーターバス１２の上部は、下部基板２と勘合が可能な形状であり、例えば、上部内周に、下部基板２の底部外周に設けるネジ溝と勘合が可能なネジ溝を備える形状である。また、ウォータバス１２の底部形状は、正立型顕微鏡ステージに載置が可能な形状であり、さらに特定の正立型顕微鏡のステージに勘合可能な形状とすれば、生体培養チャンバ構造体１のステージへの固定を容易かつ確実に行うことができる。また、生体培養チャンバ構造体１のステージへの固定は、磁石の磁力やゴムの張力を用いることができる。
【００２０】
以下本発明を実施例にて説明する。
【実施例１】
【００２１】
図３に示されるような生体培養チャンバ構造体１を組み立てた。即ち、図３に示されるように、下部基板２（直径５２ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱形状の透明なアクリル樹脂）の上面にＯーリング３（直径２０ｍｍ、断面径２ｍｍ、シリコ−ンゴム）を置き、その上に、生細胞を付着させた天板４（松浪硝子株式会社製、商品名角カバーグラス  ２２ｍｍ×２２ｍｍ  Ｎｏ．３）を細胞の付着面を下にして置いた。なお、生細胞としては、１ｍｌの５−ＡＬＡを加えた肺癌細胞と、アポトーシスを引き起こしたラットの肝臓培養細胞を使用した。該Ｏーリング３は、シリコーン系接着剤１４（信越化学工業株式会社製、商品名一液型ＲＴＶゴム  脱酢酸タイプ  ＫＥ４２Ｔ）により下部基板２に接着した。なお、シリコーン系接着剤１４は、下部基板２のアクリル樹脂との接着力が強固ではないため、生体培養チャンバ構造体１の洗浄時に、Ｏーリング３を下部基板２から容易に取り外すことができる。この天板４の上には、天板４を解放する孔５ａ（直径１６ｍｍ）を有する支持板５（直径５２ｍｍ、厚さ１ｍｍの円板形状、透明なポリ塩化ビニール樹脂）を置いた。この支持板５は、ビス止めにより下部基板２に固定した。ここで、生体培養チャンバ６は、下部基板２と天板４に挟まれるＯーリング３の空間部である。また、培養液を外部から生体培養チャンバへ送り込む管である通路７と、培養液を生体培養チャンバから外部へ送り出す管である通路８を、下部基板２の内部を貫通し生体培養チャンバ６に結合した。通路７と通路８は、直径１．２ｍｍの円形断面孔であり、下部基板の上面から垂直に５ｍｍ延長する孔と、下部基板２の側面から垂直に２０ｍｍ延長する孔が結合して成る。
【００２２】
また、通路７の下部基板２の側面の孔には、ステンレススチールチューブ１５（外形１．２ｍｍ、内径０．８ｍｍ）を差し込み、通路８の下部基板２の側面の孔には、ステンレススチールチューブ１６（外形１．２ｍｍ、内径０．８ｍｍ）を差し込み、これにより、通路７および通路８をチャンバの外方向に延長した。
【００２３】
また、ステンレススチールチューブ１５の端は、シリコーンゴムチューブ１７（外径３ｍｍ、内径１ｍｍ）を接続し、ろ過滅菌フィルタ（ミリポアコーポレーション、商品名０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  ＳＬＧＶ０２５ＬＳ）を接続した。ろ過滅菌フィルタの先には、シリコーンゴムチューブ（外径３ｍｍ、内径１ｍｍ）を接続し、ろ過滅菌フィルタに接続したシリコーンゴムチューブの先には、液体流体から気泡を除去する気泡除去装置を接続した。気泡除去装置の構造は、上部に開口を一つ有する小瓶に蓋をし、蓋に入口と出口の２本の管を通過させ、小瓶内に溜まる液体の液面下に入口の管の開口を配置し、小瓶内に溜まる液体の液面に接しない上部に出口の管の開口を配置した構造である。ろ過滅菌フィルタに接続したシリコーンゴムチューブの先には、気泡除去装置の出口の管を接続した。一方、気泡除去装置の入口の管には、シリコーンゴムチューブ（外径３ｍｍ、内径１ｍｍ）を接続し、培養液（ＰＨ７．２のヘーペス緩衝液）の貯留槽に接続した。なお、本実施例において実施はしなかったが、貯留槽に接続されるシリコーンゴムチューブを分岐させて、培養液の貯留槽のほかに薬剤液の貯留槽を接続することができる。この時、培養液の貯留槽側のシリコーンゴムチューブと薬剤液の貯留槽側のシリコーンゴムチューブのそれぞれにコックを設けてコックの開閉を交互に行えば、培養液の貯留槽と薬剤液の貯留槽の通路の切換が可能となる。還流する液体の培養液から薬剤液への連続的な切換が可能となることにより、生体の培養の観察から生体の薬物反応の観察への連続した移行が可能となる。
【００２４】
また、ステンレススチールチューブ１６の端は、シリコーンゴムチューブ１８（外径３ｍｍ、内径１ｍｍ）を接続し、点滴用のコックを介し、液体環流ポンプ（東京理化器械株式会社製、マイクロチューブポンプＭＰ−３）を接続した。液体還流ポンプは、培養液を吸引する形で動作し、すなわち、培養チャンバにおいては、通路８からの吸引力により、天板４が生体培養チャンバ内に引きつけられる形となる。このため、生体培養チャンバから外部への培養液の漏れを防ぐことができる。また、本実施例において実施はしなかったが、液体還流ポンプにタイマを付属すれば、タイマにより液体還流ポンプの電源をオンオフさせることができ、液体還流ポンプを、例えば３時間ごとに２分間といった形で自動的に作動させることができる。
【００２５】
また、下部基板２の底部形状を、正立型レーザ顕微鏡（ライカマイクロシステムズ株式会社、商品名ＬＥＩＣＡ  ＴＣＳ  ＮＴ）のステージに勘合できる形状（直径３５．８ｍｍ、高さ５ｍｍの円柱形状）とした。また、生体培養チャンバ構造体は、顕微鏡ステージに底部を勘合した後、顕微鏡ステージ付属の磁石と、ステンレススチールチューブにつなげた輪ゴムにより、顕微鏡ステージに固定した。
【００２６】
また、生体培養チャンバ６を環流する培養液から気泡を除去する際は、生体培養チャンバ構造体１を一度、顕微鏡ステージから取り外し、液体環流ポンプを作動させつつ、生体培養チャンバ構造体１を適宜傾けた。
【００２７】
本実施例により撮影された、１ｍｌの５−ＡＬＡを加えた肺癌細胞の画像を図４に示す。また、本実施例により撮影された、薬物を添加してアポトーシスを引き起こしたラットの肝臓培養細胞の画像を図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の第１の実施の形態の培養チャンバの平面図および断面図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の培養チャンバの平面図および断面図。
【図３】本発明の１実施例の培養チャンバの平面図および断面図。
【図４】本実施例により撮影された、１ｍｌの５−ＡＬＡを加えた肺癌細胞の画像。
【図５】本実施例により撮影された、薬物を添加してアポトーシスを引き起こしたラットの肝臓培養細胞の画像。
【符号の説明】
【００２９】
１…生体培養チャンバ構造体
２…下部基板
３…Ｏーリング
４…天板
５…支持板
５ａ…天板４を解放する孔
６…生体培養チャンバ
７…培養液を外部から生体培養チャンバへ送り込む通路
８…培養液を生体培養チャンバから外部へ送り出す通路
９…ステンレススチールチューブ
１０…シリコーンゴムチューブ
１１…温度センサ
１２…ウォータバス
１２ａ…ウォータバスの内部空間に熱媒体を送り込む開口
１２ｂ…ウォータバスの内部空間から外部に熱媒体を送り出す開口
１３…Ｏーリング
１４…シリコーン系接着剤
１５…ステンレススチールチューブ
１６…ステンレススチールチューブ
１７…シリコーンゴムチューブ
１８…シリコーンゴムチューブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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