(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、コラーゲンの産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療剤の提供を課題とし、特にDMP1の新規な用途を見出すことにある。【解決手段】本発明者は、上記課題解決のため、DMP1を特異的に骨組織で発現させる手段を確立し、その機能の検討から、DMP1の産生がI型コラーゲン遺伝子の発現を抑制するものであることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、DMP1の新規な用途として、コラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤および／または阻害方法、コラーゲンの産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療剤、予防および／または治療方法を提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DMP1を有効量含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤。
【請求項２】
DMP1遺伝子担持ベクターを含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤。
【請求項３】
コラーゲンがI型コラーゲンである請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
DMP1を有効量含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法。
【請求項５】
DMP1の存在が充填によるものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
DMP1遺伝子担持ベクターを用いることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
コラーゲンがI型コラーゲンである請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３に記載の阻害剤を用いることを特徴とする、コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項９】
コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患が線維症である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜３に記載の阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜３に記載の阻害剤を用いることを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜３に記載の阻害剤を有効量含んでなるコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１３】
コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患が線維症である請求項１１または１２に記載の予防剤および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、結合組織の適切な形成に不可欠なものである。それゆえ、コラーゲンの過剰もしくは過小生産、または（誤ってプロセシングされたコラーゲンを含めて）異常なコラーゲンの生産は多くの結合組織疾病および障害の原因となる。現在、２０種類程度のコラーゲンが同定されており、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型の線維状コラーゲンを含めたこれらのコラーゲンは、アミノおよびカルボキシ末端のペプチド延長部を含有するプロコラーゲン前駆物質として合成される。「プロ領域」と呼ばれるこうしたペプチド延長部はそれぞれＮ−およびＣ−プロペプチドと称される。典型的には、細胞からのプロコラーゲン三重らせん前駆分子の分泌の際にプロ領域が切断されて成熟三重らせんコラーゲン分子を生成する。切断されると、「成熟」コラーゲン分子は、例えば高度に構造化されたコラーゲン線維へと会合する能力を有する（非特許文献１〜５）。
【０００３】
コラーゲンの不適切な生産または制御されない生産と関連した重大な疾病が数多く存在する。こうした疾病には、例えば、心内膜硬化症、特発性間質線維症、間質性肺線維症、動脈の中膜外膜に起こる線維症（perimuscular  fibrosis）、シンマーズ線維症、中心周囲線維症（pericentral  fibrosis）、肝炎、皮膚線維腫、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変、急性肺線維症、突発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、腎線維症／糸球体腎炎、腎線維症／糖尿病性腎症、強皮症／全身、強皮症／局所、ケロイド、過形成瘢痕、重症の関節癒着／関節炎、骨髄線維症、角膜瘢痕形成、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー（デュシェーヌジストロフィー）、心臓線維症、筋線維症／網膜剥離、食道狭窄症、ペーロニー病などの病的線維症または瘢痕形成が含まれる。さらに、線維症性疾患は外科手術により誘発または発症されることがあり、こうした疾患としては、例えば、瘢痕修復／形成手術、緑内障、白内障線維症、角膜瘢痕形成、関節癒着、移植片対宿主病、腱手術、神経エントラップメント（nerveentrapment）、デュピュイトラン拘縮、OB/GYN癒着／線維症、骨盤癒着、硬膜外線維症（peridural  fibrosis）、再狭窄などがある。これらの疾病を治療するために有効な方法の一つは、コラーゲンの病的過剰生産を抑制することである。かくして、コラーゲンの生産を制御し、抑制し、かつ／または調節する分子の同定・単離が医学的見地から重要である。
【０００４】
骨、象牙質及びセメント質は、細胞外マトリックスにリン酸カルシウムが沈着し、石灰化したものである。該細胞外マトリックスは、主にコラーゲンであるが、非コラーゲン性マトリックスも含まれ、非コラーゲン性マトリックスの殆どは酸性リン酸化蛋白質である。該コラーゲンの線維はハイドロキシアパタイト結晶の沈着する足場として機能し、酸性リン酸化蛋白質は細胞外マトリックスの石灰化に関与すると信じられてきた。組換えDNA技術で同定された該酸性リン酸化蛋白質は、最初AG1と名づけられ（非特許文献６）、後にDMP1（Dentinmatrix protein 1）と変更された（非特許文献７）。DMP1のcDNAクローンは、ラットの歯のcDNAライブラリーから同定され、歯の象牙質に特異的であると考えられてきたが（非特許文献８）、後に、その発現は他の石灰化組織でも存在することが示された。
【０００５】
さらに、本発明者は、鳥類や哺乳類の骨組織では、その動物種に関係なく共通して、DMP1 遺伝子は骨マトリックスを分泌する骨芽細胞には発現せず、石灰化した骨マトリックスの中に存在する骨細胞に特異的に発現し、その蛋白は骨細胞周囲の骨マトリックスにのみ分布する事を発見した（非特許文献４）。DMP1の特徴的様相は、酸性アミノ酸含有量が非常に高いこと、また、組織中で高度にリン酸化されることから、組織中では高度に負に荷電する事である。さらに、本発明者により骨形成部位におけるマイナスイオン状態と骨の石灰化の速度との関係が見出され、DMP1の新規な用途として骨の石灰化促進因子についての特許出願が提出されている（特許文献１）。
【特許文献１】特願2003-059130
【非特許文献１】Annu. Rev. Biochem.1978; 47: 129-162
【非特許文献２】The Proteins. Academic Press, New York: 412-632
【非特許文献３】Extracellular Matrix Biochemistry. ElsevierScience Publishing Co.,New York 1984: 83-118
【非特許文献４】N. Engl.J. Med. 1984; 311: 376-383
【非特許文献５】Structure and Functionof Collagen Types.Academic Press Inc., Orlando, Florida 1987: 1-42
【非特許文献６】J. Biol Chem1993; 268:12624-12630
【非特許文献７】J. Histochem Cytochem1994; 42:1527-1531
【非特許文献８】J. Histochem Cytochem1994; 42:1527-1531
【非特許文献９】J. Bone Miner Res 2001; 16:2017-2026
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、コラーゲンの産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療剤の提供を課題とし、特にDMP1の新規な用途を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため、DMP1を特異的に骨組織で発現させる手段を確立し、その機能の検討から、DMP1の産生がコラーゲン遺伝子の発現を抑制し、ひいてはコラーゲンの産生を抑制するものであることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は以下よりなる。
１．DMP1を有効量含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤。
２．DMP1遺伝子担持ベクターを含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤。
３．コラーゲンがI型コラーゲンである前項１または２に記載の阻害剤。
４．DMP1を有効量含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法。
５．DMP1の存在が充填によるものである前項４に記載の方法。
６．DMP1遺伝子担持ベクターを用いることを特徴とする前項４または５に記載の方法。
７．コラーゲンがI型コラーゲンである前項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．前項１〜３に記載の阻害剤を用いることを特徴とする、コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防方法および／または治療方法。
９．コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患が線維症である前項８に記載の方法。
１０．前項１〜３に記載の阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物。
１１．前項１〜３に記載の阻害剤を用いることを特徴とするコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
１２．前項１〜３に記載の阻害剤を有効量含んでなるコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
１３．コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患が線維症である前項１１または１２に記載の予防剤および／または治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明において、DMP1を骨組織で特異的に発現させることによりコラーゲン遺伝子の発現が抑制されることを見出した。したがって、DMP1によるコラーゲン産生阻害が可能となり、ひいてはコラーゲンの産生の増加に起因する疾患、より具体的には線維症などの予防および／または治療が可能である。このように本発明はコラーゲンの産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療のために非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１１】
DMP1は、アミノ酸数400〜550個の細胞外マトリックス蛋白質である酸性蛋白質である。そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、豊澤等により開示されている（JMol Evol 1999;48:160-166, Gene 1999; 234: 307- 314, JMol Evol 2000; 50:31-38など）。DMP1遺伝子は公知の遺伝子であり、ヒトを含む10種の動物からDMP1の配列が報告されている。アミノ酸配列の比較から、全ての種のDMP1は16-21個のアミノ酸を含む疎水性リーダー配列で始まることが知られている。細胞接着性のペプチドRGDモチーフはDMP1分子特異的ではないが、多くの他の酸性リン酸化蛋白質、例えばオステオポンチン、骨シアロ蛋白質、及び象牙質シアロリン酸化蛋白質に存在することが確認されている。Arg-Gly-Asp配列は厳格に哺乳動物のDMP1配列で保存され、その重要な生物学的機能を有することが考えられる。また、DMP1は酸性を示すアミノ酸を非常に多く含有し、また、Serを含む多数のモチーフ配列がリン酸化を受ける事から、組織中で高度にマイナスにチャージしていると判断される。このことから、DMP1はカルシウムイオンと強固な結合能を有し、細胞外マトリックスの石灰化に必要であると考えられる。
【００１２】
本発明の一の特徴はDMP1を骨組織で特異的に発現させることによりコラーゲン遺伝子の発現が抑制されることを見出したことである。本発明者は、DMP1遺伝子を骨組織で選択的に発現させ、その蛋白質を骨基質に蓄積させた。実施例の結果を示す図１から、DMP1の産生量の増加させたトランスジェニックマウスにおいては頭蓋骨の厚さが減少し、長管骨の海綿骨量が減少し、骨幹端部の皮質骨の厚さが減少している。さらに図４から、該トランスジェニックマウスにおいてI型コラーゲン遺伝子の発現レベルが低下している。I型コラーゲンはこれらの結合組織を構成する主要蛋白質であることから、DMP1によりI型コラーゲン遺伝子の転写が制御され、I型コラーゲン遺伝子産物の産生が阻害されることにより、これらの結合組織形成が阻害されていると考えられる。
【００１３】
上記知見により達成した本発明の実施の一態様は、DMP1を有効量含むことを特徴とするコラーゲン遺伝子の産物産生阻害剤および阻害方法である。コラーゲンとして、I型コラーゲンが好適に挙げられる。DMP1は、既に遺伝子工学的に産生できることが確認されており、既知の汎用される大腸菌宿主プロモーター系を使った系で大量生産した組み換えDMP1の使用が可能である。特に、糖鎖構造などの翻訳後修飾は必要でなく、大腸菌が生産するDMP1で十分である。本発明において、DMP1は、DMP1のコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害機能を維持した、特に哺乳類で確認された保存配列を維持したアミノ酸の１個から数個の置換・欠失・付加または挿入等の配列変異、及びDMP1のアミノ酸配列を部分的に模した数十個のアミノ酸からなる合成ポリペプチドをも対象とする。置換・欠失・付加または挿入などの変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（Ulmer,K. M. Science1983, 219: 666-671）を利用できる。また、DMP1は生分解性合成樹脂等との混合物であってもよい。
【００１４】
DMP1を例えば、標的部位に充填するためには、既知組成物との配合による汎用手段によってペースト状に調製されていることが好ましい。例えば、ポリ乳酸誘導体等との配合組成物が利用可能である。DMP1遺伝子を担持するベクターは、標的組織への特異的遺伝子導入手段により、本発明のコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害機能を発揮することができる。自己増殖ベクターに遺伝子を担持する手段によっても本発明の目的は達成可能である。つまり、DMP1遺伝子を担持したベクターも本発明の実施態様に含めることができる。
【００１５】
遺伝子の導入手段は、望ましくはインテグレーションさせる方法、例えばリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等によるのが好ましい。しかし一過性に発現させるリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法、アテロコラーゲン法等の方法であってもよい。用いるベクターは特に限定されず、公知のプラスミド、ファージ、コスミド、BAC、YAC、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入DNA断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。具体的には、ZAPExpress（ストラタジーン社製）、pSVK3（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、pEGFP-C1（クロンテック社製）、アテロコラーゲン等が挙げられる。プロモーターは、本発明の実施例では、マウスのpro-α1(I)collagenプロモーターを使ったが、その他オステオカルシンプロモーター等でもよい。このプロモーターは、骨形成細胞が特異的に分泌する蛋白質のプロモーターであることから、DMP1を骨組織で特異的に発現させるために有力な手段を提供するものである。
【００１６】
ベクターへのDMP1ポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチド又はこれを含むDNA断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターとDMP1との間にコザック配列（Kozak, M., Gene, 234, 187, (1999)）を挿入したり、DMP1の下流にタグとなるポリペプチドをコードするDNAを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、FLAGタグ（BioTechniques, 7, 580, (1989)）等が挙げられる。プロモーターを連結したDMP1ポリヌクレオチドを標的細胞の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（A.A.Vertes et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,57,2036(1993)）、あるいはトランスポゾンや挿入配列（A. A. Vertes et al.,Molecular Microbiol., 11,739(1994)）等を用いて発現させることができる。かくして調製されたDMP1は、コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の阻害を所望する標的部位に直接充填することができる。また、DMP1遺伝子を担持するベクターを、直接注入、遺伝子銃、注射などによって投与することができる。
【００１７】
本発明のまた別の実施の一態様はコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生の増加に起因する疾患の予防剤および／または治療剤、予防方法および／または治療方法に関する。当該疾患の予防剤および／または治療剤は上記阻害剤を含んでいる。当該疾患の予防方法および／または治療方法は上記阻害方法を使用することにより達成できる。
【００１８】
コラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生の増加に起因する疾患として具体的には線維症が挙げられ、より具体的には、これらに限定されないが、心内膜硬化症、特発性間質線維症、間質性肺線維症、動脈の中膜外膜に起こる線維症（perimuscular  fibrosis）、シンマーズ線維症、中心周囲線維症（pericentral  fibrosis）、肝炎、皮膚線維腫、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変、急性肺線維症、突発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、腎線維症／糸球体腎炎、腎線維症／糖尿病性腎症、強皮症／全身、強皮症／局所、ケロイド、過形成瘢痕、重症の関節癒着／関節炎、骨髄線維症、角膜瘢痕形成、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー（デュシェーヌジストロフィー）、心臓線維症、筋線維症／網膜剥離、食道狭窄症、ペーロニー病などの病的線維症または瘢痕形成が含まれる。さらに、線維症性疾患は外科手術により誘発または発症されることがあり、こうした疾患としては、例えば、瘢痕修復／形成手術、緑内障、白内障線維症、角膜瘢痕形成、関節癒着、移植片対宿主病、腱手術、神経エントラップメント（nerve  entrapment）、デュピュイトラン拘縮、OB/GYN癒着／線維症、骨盤癒着、硬膜外線維症（peridural  fibrosis）、再狭窄が挙げられる。
【００１９】
上記コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。本発明に係る医薬組成物は、通常は１種または２種以上の医薬用担体を用いて製造することが好ましい。医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製することもできる。
【００２０】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて用量を変更することができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００２１】
本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。投与形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリンなどの包接体、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００２２】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ＰＥＧなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００２３】
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、またはγ型）を適宜選択すればよい。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例で説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであって、その技術的範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１
microfocus X線写真によるDMP1遺伝子導入マウスの骨格の評価
【００２６】
ラットDMP1遺伝子の翻訳領域の開始コドンからストップコドンまでをpro-α1(I) collagenプロモーター（文献: J CellBiol.1995; 129:1421-1432）で骨組織に選択的に発現させるようpNASSβ(CLONTECHLab., Inc.)に制限酵素を使って組み込み、トランスジェニックマウス作製用のコンストラクトを構築した。このコンストラクトを使い、C57B/Lの受精卵に遺伝子導入し、DMP1トランスジェニックマウスを作製した。骨組織におけるDMP1の発現はノーザンブロッティングでその発現量を検討し、insituハイブリダイゼーションでその発現部位を再度確認し、DMP1を正常値の約5倍強制発現したものをDMP1トランスジェニックマウスとして用い、正常マウスと比較した。DMP1トランスジェニックマウスを麻酔薬にて屠殺後、軟組織を除去し、70%アルコール中に保存後、microfocusX線写真を撮影した。
【００２７】
その結果、図１Ａに示すように、生後3ヶ月のDMP1トランスジェニックマウス（Tg）は野生型に比べて、大きな異常はみられないが、やや小型であることがわかった。図１Ｂに示すように、生後2ヶ月のDMP1トランスジェニックマウス（Tg）の頭蓋骨は正常マウス（WT）に比べてX線透過性がやや強かった（図１Ｂ上）。頭頂骨の中心部を打ち抜いた骨片の強拡大した結果、DMP1トランスジェニックマウス（Tg）の頭頂骨は、正常マウス（WT）に比べてX線透過性が強いことがわかった（図１Ｂ下）。
【００２８】
また、図１Ｃ〜Ｅに示すように生後1ヶ月、3ヶ月および6ヶ月のDMP1トランスジェニックマウス（Tg）の大腿骨は全体的に正常マウス（WT）と比べてX線透過性が強かった。図１ＤおよびＥに示すように生後3ヶ月および6ケ月のDMP1トランスジェニックマウス（Tg）の大腿骨は正常マウス（WT）と比べて遠心側骨幹端部の海綿骨の減少が見られた。さらに図１Ｅに示すように生後6ヶ月のDMP1トランスジェニックマウス（Tg）の大腿骨は正常マウス（WT）と比べて短くなっていた。これらの結果から、DMP1トランスジェニックマウスにおいては正常マウスと比べて骨形成が阻害されており、特に大腿骨の海綿骨の形成が阻害されていることがわかった。
【００２９】
実施例２
pQCTによる大腿骨遠心側骨幹端部の評価
【００３０】
実施例１と同様の方法で調製したDMP1トランスジェニックマウスを麻酔薬にて屠殺後、軟組織を除去し、70%アルコール中に保存後、peripheralquantitative computed tomography (pQCT)により骨幹端部の海綿骨面積（mm2）、皮質骨の厚さ（mm）及び骨密度（mg/cm3）を測定した。横軸は、遠位側から0.5mm刻みでスライスし、スライス番号1−15のスライスについて各値を測定した。
【００３１】
生後3ヶ月および6ヶ月における骨幹端部の海綿骨面積を解析した結果、図２ＢおよびＣに示すように、骨端軟骨のごく近傍（スライス番号：2-4）では、海綿骨面積は正常マウスに比べてDMP1トランスジェニックマウスの方が有意に増加したが、骨幹端部の大部分（スライス番号：8-15）では、海綿骨面積はDMP1トランスジェニックマウスで有意に減少した。また、生後3ヶ月および6ヶ月における骨幹端部の皮質骨の厚さを解析した結果、図２ＤおよびＥに示すように骨端軟骨付近（スライス番号：1-4）では、皮質骨の厚さは正常マウスに比べてDMP1トランスジェニックマウスの方が有意に減少した。さらに、骨幹端部の皮質骨の骨密度を解析した結果、図２ＦおよびＧに示すように、生後3ヶ月の大腿骨骨幹端部では、皮質骨の骨密度は正常マウスに比べてDMP1トランスジェニックマウスの方が有意に増加したが、生後6ヶ月ではその変化が小さくなることがわかった。これらの結果から、DMP1トランスジェニックマウスは正常マウスと比べて海綿骨面積、皮質骨の厚さが減少することがわかった。
【００３２】
実施例３
大腿骨遠心側骨幹端部の病理組織学的評価
【００３３】
実施例１と同様の方法で調製したDMP1トランスジェニックマウスを麻酔薬にて麻酔後、4%パラホルムアルデヒドにより15分間灌流固定し、EDTAにて脱灰後、パラフィン包埋した。サンプルを5μｍに薄切後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、光学顕微鏡で大腿骨遠心側骨幹端部を観察した。
【００３４】
その結果、生後1ヶ月の大腿骨遠心側骨幹端部においては、図３ＡおよびＥに示すように、正常マウス（図３Ａ）とDMP1トランスジェニックマウス（図３Ｅ）の間の顕著な変化は観察されなかった。しかしながら、生後3ヶ月の大腿骨遠心側骨幹端部においては、図３Ｂ、Ｃ、ＦおよびＧに示すように側面及び正面像から、正常マウス（図３ＢおよびＣ）に比べてDMP1トランスジェニックマウス（図３ＦおよびＧ）の骨幹端部の海綿骨の明らかな減少が観察された（図３ＣおよびＧの強拡大挿入図参照）。また、生後6ヶ月の大腿骨遠心側骨幹端部においては、図３ＤおよびＨに示すように、正常マウス（図３Ｄ）に比べてDMP1トランスジェニックマウス（図３Ｈ）の骨幹端部の海綿骨が減少していたが、生後3ヶ月に比べ著しい減少ではなかった。これらの結果から、特に生後3ヵ月におけるDMP1トランスジェニックマウスの大腿骨遠心側骨幹端部においては、正常マウスと比べて海綿骨が減少していることがわかった。
【００３５】
実施例４
大腿骨のノーザンブロットとin situ ハイブリダイゼーションによる各骨基質遺伝子発現の評価
【００３６】
実験４．１  大腿骨における各骨基質遺伝子のノーザンブロット
実施例１と同様の方法で調製したトランスジェニックマウス（生後１ヶ月）の大腿骨から、グアニジン・塩化セシウム抽出法によりtotal RNAを抽出し、変性ゲル（1%アガロースゲル、1xMOPS、20%ホルムアルデヒド）で泳動後、Hybond-N+膜（Amersham社）にUVによるクロスリンク（150J）で固定した。次に、マルチラベリングキット（Amersham社）により32Pラベルした、I型コラーゲン遺伝子、オステオポンチン遺伝子、オステオカルシン遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子のプローブにて前記膜を42℃で一晩ハイブリダイズさせた後、洗浄し、X線フィルムに感光させた。
【００３７】
その結果、図４に示すように正常マウス（WT）に比べて、DMP1トランスジェニックマウス（Tg）のI型コラーゲン遺伝子の遺伝子発現レベルが有意に減少した。その他の各骨基質蛋白質の遺伝子発現に有意な差は見られなかった。
【００３８】
実験４．２  大腿骨における各骨基質遺伝子のin situハイブリダイゼーション
実施例１と同様の方法で調製したトランスジェニックマウス（生後１ヶ月）を麻酔薬にて麻酔後、4%パラホルムアルデヒドにより15分間灌流固定し、RNase  free の状態で、EDTAにて脱灰後、パラフィン包埋した。サンプルを5μｍに薄切後、DIGラベリングキット（RocheDiagnostics）を用いてDIGラベルした各骨基質蛋白質遺伝子のRNAプローブにて55℃で一晩ハイブリダイズさせた後、翌日洗浄し、NBT/BCIP溶液（RocheDiagnostics）にて発色させた。
【００３９】
実験４．１におけるノーザンブロットの結果と同様に、in situハイブリダイゼーションにおいても、図５に示すように、正常マウス（WT）に比べてDMP1トランスジェニックマウス（Tg）のI型コラーゲン遺伝子発現レベルが減少したが、発現分布に変化は観察なかった。また、オステオポンチンやオステオカルシン遺伝子発現レベルや発現分布に変化は観察されなかった。
【００４０】
これらの結果から、DMP1トランスジェニックマウスにおいては、I型コラーゲン遺伝子の遺伝子発現レベルが減少していることがわかった。このことから、DMP1によりI型コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生が抑制されることにより、上記の解析で観察されたDMP1トランスジェニックマウスにおける強い頭蓋骨のX線透過性、海綿骨における骨面積の低下、皮質骨の厚さの減少等の現象が生じていると推測された。また、I型コラーゲン遺伝子以外の骨基質蛋白質遺伝子（オステオポンチン遺伝子、オステオカルシン）遺伝子の発現の減少が観察されなかった。このことから、DMP1トランスジェニックマウスにおける造骨細胞の数は正常マウスに比べ減少していないと考えられる。したがって、DMP1トランスジェニックマウスにおいて造骨細胞の減少による造骨作用の低下により上記の現象が生じているという可能性は否定された。
【００４１】
実施例５
破骨細胞による骨吸収レベルの評価
【００４２】
実験５．１  デオキシ・ピリジノリン値の測定
実施例１と同様の方法で調製したトランスジェニックマウス（生後2ヶ月および3ヶ月）および正常マウスの採尿を３日間行い、デオキシ・ピリジノリン値を測定した（（株）三菱ビー・シー・エルに受託）。
【００４３】
その結果、図６に示すように、生後2ヶ月および3ヶ月の両方において、骨吸収が有意に減少していることがわかった。
【００４４】
実験５．２  破骨細胞数の測定
実施例１と同様の方法で調製したトランスジェニックマウス（生後2ヶ月および3ヶ月）および正常マウスの大腿骨を非脱灰で樹脂包埋し、サンプルを15μｍに薄切後、トルイジンブルー染色し、破骨細胞の数を測定した。
【００４５】
その結果、図７に示すように、生後2ヶ月と3ヶ月の正常マウスとDMP1トランスジェニックマウスにおいて、大腿骨遠位の骨幹端部の海綿骨部の破骨細胞の数に有意な差は見られなかった。この結果から、DMP1トランスジェニックマウスにおいて破骨細胞の増加による破骨作用の促進により、強い頭蓋骨のX線透過性、海綿骨における骨面積の低下、皮質骨の厚さの減少等が生じているという可能性は否定された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
上記のように、本発明において提供するDMP1によるコラーゲン遺伝子の遺伝子産物産生阻害剤および／または阻害方法により、コラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患、具体的には線維症の予防および／または治療が可能になる。このように本発明はコラーゲン遺伝子の遺伝子産物の産生の増加に起因する疾患の予防および／または治療のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】microfocus X線写真により骨格を解析した結果を示す。（実施例１）WTは正常マウス、TgはDMP1トランスジェニックマウスを示す。Aは全身骨格、Bは頭蓋骨、Cは生後1ヶ月の大腿骨、Dは生後3ヵ月の大腿骨、Eは生後6ヶ月の大腿骨における結果を示す。
【図２】大腿骨遠心側骨幹端部においてpＱＣＴを行った結果を示す。（実施例２）●はDMP1トランスジェニックマウス、○は正常マウスにおける結果を示し、データの有意性の検定は、ANOVAで行った。対照群との危険率p<0.005の場合は★、危険率p<0.001の場合は★★で示す。また、バーは標準誤差を示す。AはpＱＣＴのスキャン番号に相当する大腿骨の部位、B、D、Fは生後3ヵ月の大腿骨、C、E、Gは生後6ヶ月の大腿骨における結果を示す。また、B、Cは骨幹端部の海綿骨面積、D、Eは骨幹端部の皮質骨の厚さ、F、Gは骨幹端部の皮質骨の骨密度を示す。
【図３】大腿骨遠心側骨幹端部の組織切片を用いてヘマトキシリン・エオジン染色を行った結果を示す。（実施例３）A〜Dは正常マウス、E〜HはDMP1トランスジェニックマウスにおける結果を示す。A、B、D、E、F、G、Hは側面像、C、Gは正面像を示し、C、Gの挿入図は骨幹端部を拡大したものである。A、Eは生後1ヶ月、B、C、F、Gは生後3ヵ月、D、Hは生後6ヶ月における結果を示す。
【図４】ノーザンブロットにより大腿骨における各骨基質遺伝子発現を解析した結果を示す。（実施例４）Type IはI型コラーゲン遺伝子、OPNはオステオポンチン遺伝子、OCはオステオカルシン遺伝子、ALPはアルカリホスファターゼ遺伝子、GAPDHはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を解析した結果示す。
【図５】in situハイブリダイゼーションにより大腿骨における各骨基質遺伝子発現を解析した結果を示す。（実施例４）a、dはI型コラーゲン遺伝子、b、eはオステオポンチン遺伝子、c、fはオステオカルシン遺伝子の発現を解析した結果を示す。
【図６】破骨細胞による骨吸収レベルを解析した結果を示す。（実施例５）白棒は正常マウス、黒棒はDMP1トランスジェニックマウスにおける結果を示す。データの有意性の検定は、ANOVAで行った。対照群との危険率p<0.001の場合は★★で示す。また、バーは標準誤差を示す。
【図７】破骨細胞の数を測定した結果を示す。（実施例５）白棒は正常マウス、黒棒はDMP1トランスジェニックマウスにおける結果を示す。データの有意性の検定は、ANOVAで行ったが、各群とも対照群と有意差は認められなかった。また、バーは標準誤差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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