(57)【要約】【課題】  ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ，ＥＢＶ，ＨＣＭＶ）遺伝子を同時に特異的かつ高感度で検出することができるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセット，およびこれを用いるヘルペスウイルス遺伝子の検出方法を提供すること。【解決手段】  試料における２種類以上のヘルペスウイルスの存在または発現を検出するためのキットであって，少なくとも１つのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）検出用プライマーセット，少なくとも１つのエプステインバーウイルス（ＥＢＶ）検出用プライマーセット，および少なくとも１つのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）検出用プライマーセットからなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含むキットが開示される。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における２種類以上のヘルペスウイルスの存在または発現を検出するためのキットであって，以下のＡ−Ｃ：
（Ａ）  それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，および
それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ２，
からなる群より選択される少なくとも１つのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）検出用プライマーセット；
（Ｂ）  それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ１，
それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ２，および
それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ３，
からなる群より選択される少なくとも１つのエプステインバーウイルス（ＥＢＶ）検出用プライマーセット；
（Ｃ）  それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ１，
それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ２，および
それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ３，
からなる群より選択される少なくとも１つのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）検出用プライマーセット；
からなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含むキット。
【請求項２】
それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，
それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ１，および
それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ１，
を含む，請求項１記載のキット。
【請求項３】
それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，
それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ２，
それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ２，
それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ３，
それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ２，および
それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ３，
を含む，請求項１記載のキット。
【請求項４】
試料における２種類以上のヘルペスウイルスの存在または発現を検出する方法であって，前記試料から得られたＤＮＡまたは前記試料から得られたｍＲＮＡから逆転写により調製したｃＤＮＡをテンプレートとして，請求項１−３のいずれかに記載のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い，そして，増幅されたヘルペスウイルス遺伝子を検出することを含む方法。
【請求項５】
増幅されたヘルペスウイルス遺伝子の検出が，ＤＮＡアレイを用いて行われる，請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅されたヘルペスウイルス遺伝子の検出が，電気泳動を用いて行われる，請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ，ＥＢＶ，ＨＣＭＶ）遺伝子を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセット，およびこれを用いるヘルペスウイルス遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＳＨＶ）はカポジ肉腫の原因ウイルスである。免疫抑制剤を使用している患者がＫＳＨＶに感染すると，カポジ肉腫やリン腫瘍を発症することが知られているが，これまでのところ有効な薬物療法がない。したがって，このウイルスは，エイズ患者の日和見感染のみならず，免疫抑制剤を使用する臓器移植手術における感染が深刻な問題となりつつある。
【０００３】
エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）は，９５％の日本人がすでに感染しており，潜伏感染により発癌を引き起こしうる。また，ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）感染は脳症を引き起こしうるが，薬物耐性株の存在が医療現場において深刻な問題となっている。
【０００４】
現在，臨床現場においては，ヘルペスウイルス感染の診断法として，患者の血清を用いた抗体反応（ウエスタンブロット）や病理切片を抗ウイルス蛋白質抗体で染色する免疫組織染色法などの手法が用いられている。しかし，これらの手法は操作が複雑であり，解析に技術と経験を要するため，正確性を欠き，偽陽性を生じやすいという問題点があった。
【０００５】
また，ＰＣＲを用いるヘルペスウイルスの検出方法としては，各ウイルス遺伝子に特異的なプライマーを用いて目的とするヘルペスウイルス遺伝子のみを増幅させて検出する方法が報告されているが，それぞれのタイプのウイルスについて別々のチューブで増幅反応を行わなければならないため，操作が煩雑であり，少量の試料では実施が困難であった。Ｆｏｌｄｅｓ−Ｐａｐｐら（非特許文献１）は，ＤＮＡアレイを用いてＨＳＶ−１，ＨＳＶ−２，ＶＺＶ，（ＥＢＶ，ＣＭＶおよびＨＨＶ−６でを検出する方法を記載するが，ＫＳＨＶについては何も述べていない。
【０００６】
Ｐｏｚｏら（非特許文献４）は，マルチプレックスＰＣＲを用いてＥＢＶ，ＨＣＭＶ，ＨＨＶ６−Ａ，ＨＨＶ６−Ｂ，ＨＨＶ７，ＨＨＶ８／ＫＳＨＶの６種類のウイルスを検出する方法を記載するが，ＰＣＲを２回行ういわゆるネステッドＰＣＲを用いている。この方法は，感度が高いという利点を有するが，ＰＣＲを２回行うために時間と手間を要すること，および１回目のＰＣＲでウイルスＤＮＡの量にバイアスがかかる，すなわちウイルス量を定量的に検出することができないという欠点があった。
【非特許文献１】Foldes-Papp, et al., Mol. Diagn. (2004) 8, 1-9
【非特許文献２】Druce et al., J. Clin. Microbiol. (2002) 40, 1728-1732.
【非特許文献３】Markoulatos et al., J. Clin. Microbiol. (2001) 39, 4426-4432.
【非特許文献４】Pozo et al.,  J. Virol. Methods. (1999) 79, 9-19.
【０００７】
したがって，ＫＳＨＶ，ＥＢＶおよびＨＣＭＶの遺伝子を同時に検出できる簡便な方法が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は，ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ，ＥＢＶ，ＨＣＭＶ）遺伝子を同時に特異的かつ高感度で検出することができるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセット，およびこれを用いるヘルペスウイルス遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は，試料における２種類以上のヘルペスウイルスの存在または発現を検出するためのキットであって，以下のＡ−Ｃ：
（Ａ）  それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，および
それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ２，
からなる群より選択される少なくとも１つのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）検出用プライマーセット；
（Ｂ）  それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ１，
それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ２，および
それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ３，
からなる群より選択される少なくとも１つのエプステインバーウイルス（ＥＢＶ）検出用プライマーセット；
（Ｃ）  それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ１，
それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ２，および
それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ３，
からなる群より選択される少なくとも１つのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）検出用プライマーセット；
からなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含むキットを提供する。
【００１０】
標的ウイルスと本発明にしたがうプライマーの配列を表１に示す。本発明のキットは，試料におけるＫＳＨＶ，ＥＢＶおよびＣＭＶの２種類または３種類を同時に簡便に検出するのに有用である。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
なお，ここでいう「からなる」とは，本発明のキットに含まれるプライマーが，本発明の作用効果を奏する程度に，配列番号により特定される配列を有していれば足りることを意味し，付加的な配列が一切含まれないことまでを意味するものではない。当業者であれば，プライマーとして所望の作用効果を奏するためには，すなわち標的を特異的に増幅しうるためには，その５’側および３’側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。
【００１３】
好ましくは，本発明のキットは，それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ１，およびそれぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ１を含む。
【００１４】
また好ましくは，本発明のキットは，それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ１，それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＫＳＨＶ２，それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ２，それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＥＢＶ３，それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ２，およびそれぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットＣＭＶ３を含む。
【００１５】
別の観点においては，試料における２種類以上のヘルペスウイルスの存在または発現を検出する方法を提供する。この方法は，前記試料から得られたＤＮＡまたは前記試料から得られたｍＲＮＡから逆転写により調製したｃＤＮＡをテンプレートとして，上述の本発明のキットのいずれかを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い，そして，増幅されたヘルペスウイルス遺伝子を検出することを含む。
【００１６】
本発明の方法においては，好ましくは，増幅されたヘルペスウイルス遺伝子の検出は，ＤＮＡアレイまたは電気泳動を用いて行われる。
【００１７】
本発明のキットを用いてヘルペスウイルスを検出するためには，例えば，患者の血液サンプルから全ＤＮＡを調製し，検査標的となる複数のウイルスに対応するプライマーをミックスしてＰＣＲを行う。ＤＮＡアレイを用いてハイブリダイゼーションによりＰＣＲ産物を検出する。あるいは，キャピラリー電気泳動後，専用の読み取り解析機器により高感度でＰＣＲ産物を検出する。本発明の方法にしたがって，少量の血液サンプルから一回の解析でＫＳＨＶ，ＥＢＶ，ＣＭＶ感染を同時に診断することが可能となり，臓器移植手術時における免疫抑制剤投薬前に，またＨＩＶ潜伏感染患者のエイズ発症前に，日和見感染症の予測が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは，例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製  Ｍｏｄｅｌ  ３９４）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは，当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれを用いて合成してもよい。
【００１９】
本発明のプライマーセットを用いて試料におけるヘルペスウイルス遺伝子の存在を検出するためには，試料からＤＮＡを抽出し，これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い，ヘルペスウイルス遺伝子を増幅させる。試料としては，ヘルペスウイルスに感染していると疑われる被験者から得られた血液試料，組織試料，生検，スメア等を用いることができる。
【００２０】
試料からＤＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，フェノール・クロロホルムによる抽出を用いることができる。あるいは市販のＤＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００２１】
さらに，本発明のプライマーセットは，ヘルペスウイルス遺伝子の潜伏，溶解感染期に発現する遺伝子を標的としているため，試料中のヘルペスウイルス遺伝子の発現を検出することにより，ウイルスの潜伏感染や再活性化を診断するために用いることができる。ヘルペスウイルス遺伝子の発現を検出するためには，試料からＲＮＡを抽出して鋳型ｃＤＮＡを調製し，これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い，試料中で発現されているヘルペスウイルス遺伝子を増幅させる。
【００２２】
試料からＲＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，グアニジン−イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出を用いることができる。あるいは市販のＲＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００２３】
ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法も当該技術分野においてよく知られている。プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い，ｄＮＴＰｓの存在下で，逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することができる。逆転写酵素としては，例えば，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いることができる。
【００２４】
次に，このようにして調製したＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとして，本発明のプライマーセットの混合物をプライマーとして用いて，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ポリメラーゼとしては例えばＥｘ  Ｔａｑ（登録商標）（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を用いることができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，９４℃で１５分間の変性，次に９４℃で３０秒間，６０℃で１．５分間，７２℃で１分間を３５サイクル，次に７２℃で３分間の伸長により実施することができる。また，ＰＣＲ産物の検出を容易にするために，ラベリングしたヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うことができる。このようなラベリング物質としては，当該技術分野においてよく知られる放射性同位体，蛍光物質，化学発光物質，ビオチン等を用いることができる。
【００２５】
増幅産物の検出は，ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーションまたは電気泳動により行うことができる。
【００２６】
検出用のＤＮＡアレイは，検出すべきヘルペスウイルス遺伝子の配列とハイブリダイズしうる配列を有するＤＮＡ断片が固定化されている支持体である。支持体としては，限定されないが，ナイロン膜，ニトロセルロース膜，ガラス，シリコンチップなどを用いることができる。ＤＮＡ断片の固定化は，ＤＮＡ断片の水溶液を支持体上に自動化機械または手動により滴下し，乾燥させることにより行う。さらに，ＵＶクロスリンク法によりＤＮＡ断片を支持体上に定着させてもよい。
【００２７】
検出用アレイに固定化するＤＮＡ断片は，それぞれ対応するタイプのヘルペスウイルス遺伝子とのみハイブリダイズし，他のタイプのヘルペスウイルス遺伝子とはハイブリダイズしないよう選択する。最も好ましくは，本発明において用いる検出用アレイは，検出に用いるプライマーセットを用いてウイルスＤＮＡをＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片である。ハイブリダイゼーションおよび検出は，当該技術分野においてよく知られる方法により容易に行うことができる。
【００２８】
ＰＣＲ増幅産物を電気泳動により検出する場合には，検出すべきウイルスのタイプによって増幅産物の長さが異なるようにプライマーセットを設計し，増幅産物をゲル電気泳動，キャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動法により分離する。得られたＰＣＲ増幅産物の長さに基づいて，試料中に存在するウイルスのタイプを判定することができる。
【００２９】
また，１つの標的ウイルスに対して２種類またはそれ以上の遺伝子を増幅させることができる。検出にＤＮＡアレイを用いる場合には，それぞれの増幅された遺伝子に対応するＤＮＡ断片をアレイに固定化させておく。検出に電気泳動を用いる場合には，それぞれの遺伝子について長さの異なるＰＣＲ増幅産物が得られるように，プライマーを設計する。このことにより，擬陽性を判定することが容易になり，ウイルス検出をより確実に行うことができる。
【００３０】
本発明のキットは，２または３種類のヘルペスウイルスに対応するプライマーセットを混合して用いてマルチプレックスＰＣＲを行ったときに，各ヘルペスウイルス遺伝子を特異的に増幅させることができるという特徴を有する。したがって，１つの試験管内で２−３種類のヘルペスウイルスについて同時にその存在または非存在を調べることができるため，タイプ特異的プライマーを用いて別々の試験管内でＰＣＲを行う従来技術の方法と比較して，アッセイが簡単であり，アッセイに要する時間，費用および試料が少なくてよいという利点を有する。
【００３１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
プライマーの設計
ヘルペスウイルスの遺伝子配列は公共データベースから入手した（ＫＳＨＶについてはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３６０１２０およびＡＦ１４８８０５，ＥＢＶについてはＶ０１５５５，ＡＪ３１５７７２およびＭ１２５５３，ＨＣＭＶについてはＡＹ３１５１９７，Ｍ２１２９５，ＡＹ４４２２８６）。
【００３３】
各ヘルペスウイルス遺伝子の配列に基づいて，ウイルス感染初期に発現される遺伝子が増幅され，かつ増幅産物の長さが３００−６００ｂｐの範囲内であるように，プライマーの候補を設計した。次に，他の種類のヘルペスウイルスと有意なホモロジーを有する配列，ヒトゲノム配列中に多数コピー存在する配列，および分子内に二次構造を形成しうる配列を排除した。このようにして選択された数十種類のプライマーの組み合わせについて，ヒトゲノム遺伝子および各ウイルスＤＮＡを混合した試料で実際にＰＣＲ反応を行い，増幅の効率および非特異的増幅を示すかどうかを確認した。その結果，最も好ましいプライマーセットとして，上記表１に示される数組のプライマーセットを選定した。
【実施例２】
【００３４】
マルチプレックスＰＣＲおよびＤＮＡマクロアレイを用いるヘルペスウイルスの検出
（１）  ウイルスＤＮＡの抽出
ＫＳＨＶおよびＥＢＶについては，ウイルスゲノムＤＮＡを調製するために，２ｘ１０5個のＫＳＨＶ+Ｂ細胞（ＢＣ２）またはＥＢＶ＋Ｂ細胞（Ｒａｊｉ）を培養し，市販のＤＮＡ抽出キット（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）により抽出した。ＨＣＭＶについては，１ｘ１０6個のヒト線維芽細胞ＨＥＬを１０ｃｍプレートに播種した。細胞をＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ  ｓｔｒａｉｎ）でＭＯＩ＝１０で感染させた。７日後，細胞を回収し，市販のＤＮＡ抽出キット（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）により抽出した。
【００３５】
（２）  ｃＤＮＡマクロアレイの調製
表２に示される３種類のウイルスゲノムＤＮＡクローン，２種類の外部対照対照クローンおよび２種類の内部対照クローンからのＤＮＡを７箇所にスポットしたナイロンマイクロアレイを作製した。すべてのクローンは表２に示されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。なお，外部対照（Ｅ１，Ｅ２）遺伝子はＢｕｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａからクローニングした。
【００３６】
【表２】
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ＬＡＮＡ，潜在的核抗原；ＥＢＥＲ，ＥＢＶによりコードされるＲＮＡ；ＩＥ，前初期遺蛋白質遺伝子；ＡＬＡＳ１，アミノレブリン酸シンターゼ；ＧＡＰＤＨ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
／Ｆ，フォワードプライマーの配列；／Ｒ，リバースプライマーの配列
【００３７】
次に増幅産物をＱＩＡＱＵＩＣＫ  ８  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し，１００μｌの蒸留水に再懸濁し，１０％（ｖ／ｖ）キシレンシアノールを加えた。精製した０．２μｌ（４ｎｇ）のＤＮＡを手動によりナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にスポットし，次にＧＳＧＥＮＥＬＩＮＫＥＲ  ＵＶ  ＣＨＡＭＢＥＲ（ＢＩＯＲＡＤ）中でＤＮＡを膜に架橋させた。
【００３８】
（３）  マルチプレックスＰＣＲによるラベル標的の調製
外部標準特異的プライマーおよび全ウイルスのプライマーをミックスしたマルチプレックスＰＣＲラベリングを行った。ＰＣＲは，１×ＰＣＲバッファ，１ユニットのＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．），２ｍＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭのビオチニル化ｄＵＴＰおよび１ｐｍｏｌの特異的プライマー対を含む各２５μｌの反応混合物中で行い，抽出したサンプルＤＮＡまたは１０4コピーの各プラスミドをＰＣＲ反応溶液と混合した。特異的プライマー対は上記の表２に示される。
【００３９】
テンプレートとしては，各ウイルスゲノムプラスミドまたは外部標準プラスミド（外部標準２）をそれぞれ１０3コピーで用いた。また，ハイブリダイゼーション効率のコントロールとして，別にビオチン化ＰＣＲを行った外部標準プラスミドを用いた（外部標準１）。外部標準クローンは，複数のクローンについて，予備的に，ヒトゲノム，各ウイルスゲノムクローンと非特異的に増幅，検出されないことを調べ，非特異的な検出が確認されなかったクローンを選抜した。
【００４０】
ＰＣＲは，９５℃で５分間，次に，９５℃で３０秒間，５５℃で３０秒間，７２℃で３０秒間の３０サイクルの増幅，および７２℃で５分間の伸長工程からなる反応サイクルで行った。ＰＣＲ産物は，エタノール沈殿し，乾燥し，ＤＤＷに溶解して，ラベル標的として用いた。
【００４１】
（４）  ｃＤＮＡマクロアレイハイブリダイゼーション
マルチプレックスＰＣＲラベリングおよびハイブリダイゼーションの特異性を検証した。１００℃で５分間変性したＰＣＲ増幅産物をプレハイブリダイゼーションしたマクロアレイ膜に加え，６８℃で１０時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後，膜を２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより６８℃にて各５分間，３回洗浄し，次に，０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより６８℃にて各５分間，３回洗浄した。得られた膜から，Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−Ｓｔａｒ検出キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造元の指針にしたがって核酸を検出した。検出は，化学発光画像分析により行い，Ｆｌｕｏｒ−ＳＭＡＸ２マルチイメージングシステム（ＢＩＯＲＡＤ）により画像を記録した。
【００４２】
結果を図１に示す。図中，ＫＳＨＶ（Ａ）；ＥＢＶ（Ｂ）；ＣＭＶ（Ｃ）；カラムＥ１およびＥ２：外部対照；カラム１：ＫＳＨＶ；カラム２：ＥＢＶ；カラム３：ＣＭＶ；カラムＩ１およびＩ２：内部対照；矢印はウイルスシグナルを示す。ウイルスのプラスミドが存在するときのみ，対応するスポットに特異的なシグナルが検出されることが確認された。なお，内部標準のプライマーは加えていないので，シグナルは検出されない。
【００４３】
（５）  各ウイルスの検出感度
次に，検出感度の解析を行った。ウイルス特異的プライマー，外部標準，内部標準のプライマーを全て等量になるように混合し，プライマーミックスを調製した。プラスミドにクローン化したウイルスゲノムクローン，外部標準クローン，内部標準クローンのプラスミドを全て等量になるように混ぜ合わせた。クローニングしたウイルスＤＮＡの１０倍希釈列（１０3〜１０0コピー／反応チューブ）を混合し，マルチプレックスＰＣＲラベリングのテンプレートとして用いた。これらのプライマーミックス，テンプレートミックスを用いて，マルチプレックスＰＣＲラベリングを行い，各ウイルスの検出感度を解析した。
【００４４】
結果を図２に示す。図中，１０3（Ａ），１０2（Ｂ），１０1（Ｃ），１０0（Ｄ）コピー／反応チューブ；各カラムは図１に示されるものと同じである。その結果，ＥＢＶが１０2と感度が低いが，ＫＳＨＶとＣＭＶに関しては１０0コピーまで検出可能であった。
【００４５】
（６）  ウイルス感染細胞からのウイルスの検出
次に，ウイルス感染細胞より全ＤＮＡを調製し，アレイの解析を行った。ウイルス感染細胞としては，ＢＣ２（ＫＳＨＶ，ＥＢＶダブルポジティブ），ＢＣ３（ＫＳＨＶポジティブ），Ｒａｊｉ（ＥＢＶポジティブ），Ａｋａｔａ（ＥＢＶポジティブ）およびＨＥＬ＃１，＃２（ＣＭＶポジティブ）を用いた。約１ｘ１０6個の細胞より，ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｓｉｇｍａ）を用いてＤＮＡを調製した。外部標準のプラスミドは１０2コピーを用いた。ウイルス特異的プライマー，外部標準，内部標準のプライマーを全て等量になるように混合したプライマーミックスを用いて，上述と同様にＰＣＲおよびマクロアレイハイブリダイゼーションを行った。
【００４６】
結果を図３に示す。図中，ＫＳＨＶ，ＥＢＶダブルポジティブＢＣ２（Ａ），ＫＳＨＶポジティブＢＣ３（Ｂ），ＥＢＶポジティブＲａｊｉ（Ｃ），ＥＢＶポジティブＡｋａｔａ（Ｄ），ＣＭＶポジティブＨＥＬ＃１，＃２（Ｅ，Ｆ）；各カラムは図１に示されるものと同じである；矢印はウイルスシグナルを示す。図から明らかなように，いずれのウイルスについても，本発明のマルチプレックスＰＣＲおよびマクロアレイを用いてウイルスを特異的に検出することが可能であった。
【実施例３】
【００４７】
マルチプレックスＰＣＲおよび電気泳動を用いるヘルペスウイルスの検出
（１）  マルチプレックスＰＣＲ
各ウイルスからクローン化したプラスミドをテンプレートとし，対応するプライマーをミックスしてマルチプレックスＰＣＲを行った。マルチプレックスＰＣＲ用の標的遺伝子および用いたプライマーセットの配列を表３に示す。なお，ＡＬＡＳ１（アミノレブリン酸デルタシンターゼ１）をヒトゲノム内部対照として，Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｕｔａに由来する未知ＤＮＡフラグメントを外部対照として増幅した。各プライマーを用いる特異的増幅は予め確認した。
【００４８】
【表３】
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ｖＦＬＩＰ：ウイルスＦＬＩＣＥ阻害蛋白質；ＬＡＮＡ：潜在的核抗原；ＥＢＮＡ１：エプステインバーウイルス核抗原１，ＬＭＰ１：潜在的膜蛋白質１；ＩＥ：前初期蛋白質遺伝子；ＡＬＡＳ１：アミノレブリン酸シンターゼ
／Ｆ，フォワードプライマーの配列；／Ｒ，リバースプライマーの配列
【００４９】
テンプレートプラスミドを１０8〜１０0コピー数まで段階希釈し，検出可能な感度を求めた。各ウイルスについてターゲットとなる２クローンは，交差反応を起こさないことを予備実験で確認し複数のクローンから選抜した。内部対照についてはデータベース上でシングルコピーであることを確認したＡＬＡＳ１（アミノレブリン酸シンターゼ）を用い，内部対照のコピー数もウイルスクローンと同様のコピー数となるよう調整した。
【００５０】
ＰＣＲは，マスターミックス（マルチプレックスＰＣＲＫｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ），３．１２５ｐｍｏｌの各特異的プライマー対を含む各２５μｌの反応混合物中で行い，抽出したサンプルＤＮＡまたは１０4コピーの各プラスミドをＰＣＲ反応溶液と混合した。ＰＣＲは，９４℃で１５分間の変性，次に９４℃で３０秒間，６０℃で１．５分間，７２℃で１分間の３５サイクルの増幅，および７２℃で３分間の伸長工程からなる反応サイクルで行った。
【００５１】
（２）  ＰＣＲ産物の検出および電気泳動分析
得られたＰＣＲ産物は，２１００バイオアナライザおよびＤＮＡ  ５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分離し，分析した。２１００バイオアナライザを用いて高解像度および高感度の分析を行った。ゲルの疑似画像はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理し，分析した。最後に，ＰＣＲ産物のサイズによりウイルスの種類を識別した。
【００５２】
その結果，各検出感度は，ＫＳＨＶが１０0コピー，ＥＢＶ・ＣＭＶが１０1コピーであった（図４）。矢印はヒトゲノム内部対照を示す。
【００５３】
（３）  ウイルス感染細胞からのウイルスの検出
次に，ウイルス感染培養細胞から抽出・精製したゲノムＤＮＡをテンプレートとし，対応するプライマーと外部・内部標準プライマーをミックスしてマルチプレックスＰＣＲを行った。外部標準としては，Ｂ．ｄｉｍｉｕｔａゲノム由来クローンを導入したプラスミドを１０4コピーに調整して用いた。テンプレートに用いた細胞株は，ＢＣ２（ＫＳＨＶ，ＥＢＶダブルポジティブ），ＢＣ３（ＫＳＨＶポジティブ），Ｒａｊｉ（ＥＢＶポジティブ），Ａｋａｔａ（ＥＢＶポジティブ），ＨＥＬ＃１，＃２（ＣＭＶポジティブ）およびＳｉＨａ（ネガティブ対照）である。ＰＣＲおよび増幅産物の電気泳動は上述と同じ条件で行った。
【００５４】
結果を図５に示す。図中，ＫＳＨＶ，ＥＢＶダブルポジティブＢＣ２（レーン１），ＫＳＨＶ−ポジティブＢＣ３（レーン２），ＥＢＶ−ポジティブＲａｊｉ（レーン３），ＥＢＶ−ポジティブＡｋａｔａ（レーン４），ＣＭＶ−ポジティブＨＥＬ＃１，＃２（レーン５，６）およびＳｉＨａ（ネガティブ対照）（レーン７）；矢印は外部対照（上）およびヒトゲノム内部対照（下）を示す。
【００５５】
図から明らかなように，ウイルス感染細胞から目的のウイルスゲノム由来のバンドが特異的に検出された。また，２種類のウイルスの同時感染も検出しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法にしたがって，少量の血液サンプルから一回の解析でＫＳＨＶ，ＥＢＶ，ＣＭＶ感染を同時に診断することが可能となり，臓器移植手術時における免疫抑制剤投薬前に，またＨＩＶ潜伏感染患者のエイズ発症前に，日和見感染症の予測が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は，マルチプレックスＰＣＲおよびマクロアレイを用いるウイルスＤＮＡの検出を示す。
【図２】図２は，マルチプレックスＰＣＲおよびマクロアレイを用いるウイルスＤＮＡの検出感度を示す。
【図３】図３は，マルチプレックスＰＣＲおよびマクロアレイを用いるウイルス感染細胞株における各ウイルスＤＮＡの検出を示す。
【図４】図４は，マルチプレックスＰＣＲおよび電気泳動を用いるウイルス遺伝子の検出感度を示す。
【図５】図５は，マルチプレックスＰＣＲおよび電気泳動を用いるウイルス感染細胞株における各ウイルスＤＮＡの検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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