(57)【要約】【課題】少ない生菌数でも検出可能であって、検出時間の短縮を図ることができる生菌検出方法および生菌検出用寒天培地を提供する。【解決手段】容器３に収容され、血液または赤血球などの、二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合した寒天培地２に試料を加える。その後、寒天培地２の露出面２ａに気密可能な透明ジェルを塗布して密着させ、空気遮断層４を形成し、空気遮断層４の上に透明プレート５を載せる。生菌の培養条件で保ち、試料中の生菌が排出する二酸化炭素による寒天培地２の色の変化に基づいて生菌を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の生菌を検出する生菌検出方法であって、
二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合した寒天培地に試料を加えた後、前記寒天培地の露出面に空気遮断層を密着させて前記生菌の培養条件で保ち、前記生菌が排出する二酸化炭素による前記寒天培地の色の変化に基づいて生菌を検出することを、
特徴とする生菌検出方法。
【請求項２】
前記試薬は血液または赤血球から成ることを、特徴とする請求項１記載の生菌検出方法。
【請求項３】
前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に載せられた透明プレートから成ることを、特徴とする請求項１または２記載の生菌検出方法。
【請求項４】
前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に塗布された気密可能な透明ジェルから成り、前記空気遮断層の上に透明プレートが載せられていることを、特徴とする請求項１または２記載の生菌検出方法。
【請求項５】
前記空気遮断層は赤色フィルムから成ることを、特徴とする請求項２記載の生菌検出方法。
【請求項６】
二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合した寒天培地であって、容器に収容され、露出面に空気遮断層が密着していることを、特徴とする生菌検出用寒天培地。
【請求項７】
前記試薬は血液または赤血球から成ることを、特徴とする請求項６記載の生菌検出用寒天培地。
【請求項８】
前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に載せられた透明プレートから成ることを、特徴とする請求項６または７記載の生菌検出用寒天培地。
【請求項９】
前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に塗布された気密可能な透明ジェルから成り、前記空気遮断層の上に透明プレートが載せられていることを、特徴とする請求項６または７記載の生菌検出用寒天培地。
【請求項１０】
前記空気遮断層は赤色フィルムから成ることを、特徴とする請求項６記載の生菌検出用寒天培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の生菌を検出する生菌検出方法および生菌検出用寒天培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の生菌検出方法として、液体培地に試料を加えて培養し、生菌が排出する二酸化炭素を検出する方法や、寒天培地に試料を加えて培養し、コロニーが形成されるのを検出する方法がある。二酸化炭素を検出して生菌を検出する方法として、容器内に液体培地と二酸化炭素の呈色指示薬とを、液体培地を遮断する二酸化炭素透過膜で隔てて収容し、液体培地に検査対象試料を入れた後、容器を密閉して指示薬の呈色反応により生菌を検出するものがある（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１７８５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１記載の生菌検出方法は、短時間で生菌を検出可能にする画期的な方法であるが、生菌が排出する二酸化炭素が容器内に拡散するため、二酸化炭素の呈色指示薬の反応が遅れ、検出時間が長くなるという課題があった。また、生菌数が極度に少ない場合、生菌が排出する二酸化炭素の量が少ないため、検出が難しいという課題もあった。
【０００５】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、少ない生菌数でも検出可能であって、検出時間の短縮を図ることができる生菌検出方法および生菌検出用寒天培地を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明に係る生菌検出方法は、試料中の生菌を検出する生菌検出方法であって、二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合した寒天培地に試料を加えた後、前記寒天培地の露出面に空気遮断層を密着させて前記生菌の培養条件で保ち、前記生菌が排出する二酸化炭素による前記寒天培地の色の変化に基づいて生菌を検出することを、特徴とする。
【０００７】
本発明に係る生菌検出用寒天培地は、二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合した寒天培地であって、容器に収容され、露出面に空気遮断層が密着していることを、特徴とする。
【０００８】
本発明に係る生菌検出方法および生菌検出用寒天培地では、寒天培地が二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬を混合しているため、寒天培地に試料を加えて培養すると、試料中の生菌が排出する二酸化炭素に対し試薬が反応して変色する。このため、寒天培地の色の変化を検出することにより、生菌を検出することができる。
【０００９】
寒天培地の露出面に空気遮断層が密着しているため、試薬は、寒天培地に加えられた生菌が排出する二酸化炭素だけに反応して、寒天培地の色を変化させる。このため、空気遮断層がない場合に比べ、検出時間の短縮を図ることができる。寒天培地の変色による生菌検出の誤差が小さく、検出精度の向上を図ることができる。また、微量の二酸化炭素でも試薬が変色するため、少ない生菌数でも検出可能で、培養時間を短くして検出時間の短縮を図ることもできる。また、試薬が外気中の二酸化炭素に触れるのを防ぐことができるので、検出精度の向上を図ることができる。
【００１０】
本発明に係る生菌検出方法で、前記試薬は血液または赤血球から成ることが好ましい。また、本発明に係る生菌検出用寒天培地で、前記試薬は血液または赤血球から成ることが好ましい。この場合、寒天培地に試料を加えて培養すると、試料中の生菌が排出する二酸化炭素に対し血液または赤血球が反応して赤色から黒色に変色する。赤血球は、血液から分離したものを利用することができる。前記試薬は、ヘモグロビンまたはミオグロビンを利用して二酸化炭素に対し変色するものであってもよい。
【００１１】
本発明に係る生菌検出方法で、例えば、前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に載せられた透明プレートから成る。また、本発明に係る生菌検出用寒天培地で、例えば、前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に載せられた透明プレートから成る。この場合、透明プレートにより、生菌の二酸化炭素の拡散と外気の影響を防ぐことができる。
【００１２】
本発明に係る生菌検出方法で、前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に塗布された気密可能な透明ジェルから成り、前記空気遮断層の上に透明プレートが載せられていることが好ましい。また、本発明に係る生菌検出用寒天培地で、前記空気遮断層は前記寒天培地の表面に塗布された気密可能な透明ジェルから成り、前記空気遮断層の上に透明プレートが載せられていることが好ましい。この場合、空気遮断層を寒天培地の露出面に隙間なく設けるのが容易なため、寒天培地の表面に透明プレートだけを載せる場合に比べ、生菌の二酸化炭素の拡散と外気の影響をより確実に防ぐことができる。気密可能な透明ジェルは、例えばオプティカルゲルやグリースから成る。
【００１３】
また、本発明に係る生菌検出方法で、前記空気遮断層は赤色フィルムから成っていてもよい。本発明に係る生菌検出用寒天培地で、前記空気遮断層は赤色フィルムから成っていてもよい。この場合、試薬として血液または赤血球を用いると、赤色フィルムにより、二酸化炭素による変色前の赤色と変色後の黒色とのコントラストを強くすることができる。また、赤色フィルムが紫外線を遮断するため、紫外線で生菌が死滅して検出結果に影響を与えるのを防ぐことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、少ない生菌数でも検出可能であって、検出時間の短縮を図ることができる生菌検出方法および生菌検出用寒天培地を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態について説明する。
図１は、本発明の実施の形態の生菌検出用寒天培地を示している。
図１に示すように、本発明の実施の形態の生菌検出用寒天培地１は、寒天培地２と容器３と空気遮断層４と透明プレート５とを有している。
【００１６】
寒天培地２は、二酸化炭素と反応して色変化を呈する試薬として血液または赤血球が一定量混合されている。血液が混合された寒天培地２は、一例では、粉状乾燥寒天（日水製薬社製、商品名「標準寒天培地」）２３．５ｇを水１リットルに溶解させ、ブタの血液１５０ミリリットルを加えて混合して製造される。血液の混合量は、寒天培地に対し１０体積％乃至２０体積％が好ましい。
【００１７】
容器３は、シャーレから成り、内部に寒天培地２を収容している。
空気遮断層４は、気密可能な透明ジェルから成り、容器３に収容された寒天培地２の表面の露出面２ａ全体に塗布して形成されている。空気遮断層４の塗布される厚さは、特に限定されるものではないが、一例では、約１乃至２ミリである。空気遮断層４は、寒天培地２の露出面２ａに密着している。空気遮断層４は、一例では、オプティカルゲル（販売元：カーギル−ザッハ・ラボラトリイズ・インク、商品名「オプティカルゲルnＤ１．４６」）から成っている。
透明プレート５は、透明プラスチック板またはガラス板から成り、容器３の内部で空気遮断層４の上に載せられている。
【００１８】
本発明の実施の形態の生菌検出方法は、本発明の実施の形態の生菌検出用寒天培地１を使用し、例えば、以下に示す生菌検出装置（図示せず）により実施される。
生菌検出装置は、培養装置と画像取得装置と画像処理手段と表示手段とを有している。
【００１９】
培養装置は、インキュベータから成り、容器３を一定温度で培養可能になっている。
画像取得装置は、高分解能でコントラスト比の高いスキャナーやＣＣＤカメラ等から成り、培養装置で培養している容器３の内部の寒天培地２を撮影可能になっている。画像取得装置は、一定時間間隔で撮影するよう設定可能である。画像取得装置は、寒天培地２の変色を確実に検出できるよう、ミクロンレベルの分解能を有している。
【００２０】
画像処理手段は、コンピュータから成り、画像取得装置で撮影された画像を取得し、各撮影時間毎の寒天培地２の色や色の濃淡の変化を検出可能に構成されている。
表示手段は、モニタから成り、画像処理手段により寒天培地２の色や色の濃淡の変化が検出された領域の面積等を時間の関数として数値とグラフとで表示可能になっている。また、表示手段は、画像取得装置で撮影された画像も表示可能になっている。
【００２１】
本発明の実施の形態の生菌検出方法は、混釈法または塗抹法で試料中の生菌を検出するために用いられる。まず、容器３の内部に収容され、試薬を混合した寒天培地２に試料を加える。その後、寒天培地２の露出面２ａに気密可能な透明ジェルを塗布して密着させ、空気遮断層４を形成し、空気遮断層４の上に透明プレート５を載せる。このように、気密可能な透明ジェルを使用すれば、空気遮断層４を寒天培地２の露出面２ａに隙間なく設けるのが容易なため、寒天培地２の表面に透明プレート５だけを載せる場合に比べ、生菌の二酸化炭素の拡散と外気の影響をより確実に防ぐことができる。
【００２２】
インキュベータに容器３をセットし、インキュベータにより容器３を生菌の培養条件で保ち、培養を行う。その間、画像取得装置により一定時間間隔で容器３の内部の寒天培地２を撮影する。このとき、寒天培地２が試薬として血液を混合しているため、試料中の生菌が排出する二酸化炭素に対し血液が反応して赤色から黒色に変色する。その色の変化を、画像処理装置により画像取得装置の撮影画像に基づいて検出し、その結果を表示手段により表示する。こうして、本発明の実施の形態の生菌検出方法によれば、寒天培地２の色の変化を検出することにより、生菌を検出することができる。
【００２３】
本発明の実施の形態の生菌検出方法および生菌検出用寒天培地１では、寒天培地２の露出面２ａに空気遮断層４が密着しているため、試薬は、寒天培地２に加えられた生菌が排出する二酸化炭素だけに反応して、寒天培地２の色を変化させる。このため、空気遮断層４がない場合に比べ、検出時間の短縮を図ることができる。寒天培地２の変色による生菌検出の誤差が小さく、検出精度の向上を図ることができる。また、微量の二酸化炭素でも試薬が変色するため、少ない生菌数でも検出可能で、培養時間を短くして検出時間の短縮を図ることもできる。一例では、試料１０ミリリットル中１個の微量な生菌を確実に検出することができる。また、試薬が外気中の二酸化炭素に触れるのを防ぐことができるので、検出精度の向上を図ることができる。
【００２４】
本発明の実施の形態の生菌検出方法および生菌検出用寒天培地１は、表示手段により画像取得装置で撮影された画像も表示可能であるため、検出結果を目視で確認することもできる。血液中の生菌の検出はもとより、試薬の血液を滅菌して用いることにより、一般試料中の生菌の検出も可能である。
【００２５】
本発明の実施の形態の生菌検出方法および生菌検出用寒天培地１では、透明プレート５と容器３の内壁面との隙間から外気が混入するのをより確実に防ぐために、容器３の内部に二酸化炭素吸収剤が設けられていてもよい。また、容器３は、試料を注入する穴を有する密閉容器から成っていてもよい。この場合、穴は、容器３の蓋または側面に設けられる。穴を有する容器は、混釈法に用いて、寒天培地２と外気との接触を防ぐことができる。また、空気遮断層４が気密可能な透明ジェルから成るとき、空気遮断層４をあらかじめ透明プレート５に塗布しておいてもよい。この場合、その透明プレート５を寒天培地２の表面に載せることにより、空気遮断層４を設けることができる。
【００２６】
本発明の実施の形態の生菌検出方法および生菌検出用寒天培地１で、画像取得装置は、容器３に光線を照射する光源と、その投影を受けるよう配置されたイメージセンサーとから成っていてもよい。この場合、寒天培地２の変色を確実に検出することができ、その検出時間とそのときの変色面積とを正確に測定することができる。このため、生菌が少ないとき、変色面積の数から生菌の数を正確に把握することができる。また、生菌が多いときには、血液が二酸化炭素の量に応じてこれを吸着して変色するため、複数の生菌が隣接する血液は、早く黒色に変色する。このため、生菌が多ければ多いほど早く検出することができる。生菌が少ないときの検出面積と検出時間とを基準にすれば、生菌が多いときの検出面積と検出時間とを計測することにより、正確な生菌の数を把握することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施の形態の生菌検出用寒天培地の側面図である。
【符号の説明】
【００２８】
１    生菌検出用寒天培地
２    寒天培地
３    容器
４    空気遮断層
５    透明プレート
【図１】
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