(57)【要約】【課題】  本発明は、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する酵素をコードする遺伝子の塩基配列を提供し、更に、当該配列を利用して、ＰＣＥに汚染された土壌や地下水などを浄化するための方法を提供するものである。【解決手段】  本発明の遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列等からなる。本発明に係るＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌の検出方法は、当該遺伝子を利用するものであり、また、本発明のＰＣＥ汚染土壌等の浄化方法は、当該検出方法の結果に応じて土壌等を処理するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つテトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」という）をトリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」という）まで脱塩素化するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜２２１７からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜２２１７からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
上記ストリンジェントな条件が、室温において、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄を行なうものである請求項１または２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子を有し、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する能力を有する細菌。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）  請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の全部または一部に相補的な配列を有するＤＮＡ
（ｂ）  請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子の全部または一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号３〜１６から選択される１または２以上のＤＮＡ。
【請求項８】
ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌の検出方法であって、
ＰＣＥに汚染された汚染土壌または汚染水由来の被検試料からＤＮＡサンプルを得、当該ＤＮＡサンプル中に請求項１または２記載の遺伝子が含まれるか否か判断することを特徴とする方法。
【請求項９】
上記遺伝子の存在を定量的に測定する請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
定量的な測定によって、上記細菌の数を算出する請求項９記載の検出方法。
【請求項１１】
上記判断を行なう手段がＰＣＲである請求項８〜１０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
上記ＤＮＡサンプルを１０倍段階希釈し、各希釈液についてＰＣＲを行なうことによって、上記細菌数を算出する請求項１０記載の検出方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載の細菌検出方法の結果によって、上記細菌が検出された場合に、上記汚染土壌または汚染水を上記細菌が増殖できる条件にすることを特徴とするＰＣＥ汚染土壌または汚染水の浄化方法。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれかに記載の細菌検出方法の結果によって、上記細菌が検出されなかった場合に、上記細菌を上記汚染土壌または汚染水に添加し、当該細菌が増殖できる条件にすることを特徴とするＰＣＥ汚染土壌または汚染水の浄化方法。
【請求項１５】
ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する上記細菌として、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を使用する請求項１３または１４に記載の浄化方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の浄化方法において、上記細菌として、ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）を使用する方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の浄化方法の実施中または実施後において、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する上記細菌の存在を測定することを特徴とする環境影響評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」という）をトリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」という）まで脱塩素化するタンパク質（酵素）をコードする遺伝子、それを用いた特定細菌の検出方法、および当該検出方法の結果に応じたＰＣＥ汚染土壌または汚染水の浄化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機塩素系溶剤であるＰＣＥは、その優れた溶解能や揮発性、不燃性といった特性によって、ドライクリーニングやフロンガスの製造原料、金属部品の脱脂洗浄用途、繊維の精錬加工等に使用されてきた。その一方で、ＰＣＥには動物実験により発ガン性が確認されており、また、中枢神経や肝臓・腎臓に障害を与えることなども報告されている。
【０００３】
この様に、使用量が多い一方で毒性の高いＰＣＥには、化学的に安定であり環境中で分解され難いという欠点もある。そこで、これまでにも吸引吸着法など様々な処理方法が検討されてきたが、近年では、より穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れている微生物による処理（バイオレメディエーション）が注目されており、開発が行なわれている。
【０００４】
このバイオレメディエーションでは、処理すべきＰＣＥ汚染土壌等の微生物分布をできる限り乱さないという観点から、被処理土壌等に元来存在する脱塩素化微生物によりＰＣＥを処理させるという考え方がある。しかしながら、被処理土壌等における脱塩素化微生物の有無によって、その処理結果は当然に異なる。そこで、特許文献１に記載の技術では、脱塩素化微生物の塩素化エチレン分解遺伝子にハイブリダイズする核酸を利用して、被処理土壌等中における脱塩素化微生物の存在を検出している。
【０００５】
しかし、特許文献１で具体的に開示されている核酸は、ｔｃｅＡおよびｔｃｅＡに相補的な核酸（ＫＷＩ−Ｄｈａｌｏ  １〜４６）であるが、ｔｃｅＡは非特許文献１の通り、ＴＣＥやジクロロエチレン、ビニルクロライドをエチレンまで脱塩素化する酵素をコードする遺伝子である。従って、特許文献１では、その処理対象について「塩素化エチレン」と概念的な記載がされており、その例としてＰＣＥも挙げられているものの、実際には、ＰＣＥを脱塩素化する手段は具体的に開示されていない。
【０００６】
また、特許文献２には、同様の脱塩素化微生物の検出方法と、当該方法に用いる核酸が開示されている。しかし、この核酸によればＴＣＥと共にＰＣＥを分解できる微生物を検出できるものの、脱塩素化の結果、メタンの他にｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレンやビニルクロライドも得られる。これらは、ＰＣＥやＴＣＥよりもかえって毒性が高いため、処理の結果、土壌汚染を更に進めてしまうことにもなりかねない。
【０００７】
斯かる事情は特許文献３に記載の技術でも同様であり、当該文献に開示されている酵素はＰＣＥをＴＣＥまで分解するとされているが（特許文献３の請求項１）、実際にはＴＣＥから更にｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレンまで分解してしまう（特許文献３の段落［００１９］）。
【特許文献１】特開２００２−３４５４７３号公報（特許請求の範囲、段落［００２５］〜［００２６］、実施例２）
【特許文献２】国際公開第００／６３４４３号パンフレット（クレーム、第１９頁１５〜１７行）
【特許文献３】特開２００２−１７３５８号公報（特許請求の範囲、段落［００１９］）
【非特許文献１】Ｊｏｎ  Ｋ．Ｍａｇｎｕｓｏｎら他３名，「Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ由来のトリクロロエチレンリダクティブデハロゲナーゼ：ｔｃｅＡの塩基配列と基質範囲の同定（Trichloroethene  Reductive  Dehalogenase  from  Dehalococcoides  ethenogenes：Sequence  of  tceA  and  Substrate Range  Characterization）」，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１２，ｐｐ５１４１−５１４７（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、塩素化炭化水素に汚染された土壌や地下水などを処理するために、脱塩素化微生物の存在の有無を判断する方法は従来でも知られており、また、脱塩素化微生物や脱塩素化酵素の遺伝子の中にはその塩基配列が公知のものもある。しかし、ＰＣＥを分解するに当たっては、いったん比較的毒性の低いＴＣＥまで脱塩素化してから、好気性細菌により無毒化することが好ましく、毒性の高いｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレンやビニルクロライドの発生は極力避けるべきである。また、ＰＣＥを比較的毒性の低いＴＣＥまで特異的に脱塩素化する酵素をコードする遺伝子は知られていなかったため、その塩基配列情報を利用することはできなかった。
【０００９】
そこで、本発明が解決すべき課題は、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する酵素をコードする遺伝子の塩基配列を提供し、更に、当該配列を利用して、ＰＣＥに汚染された土壌や地下水などを安全に浄化するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、独自に見出したＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌であって、ＰＣＥをＴＣＥまで特異的に脱塩素化できるＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）の遺伝子配列を解析したところ、脱塩素化酵素をコードする全く新規な脱塩素化遺伝子を見出して本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる。（ａ）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
また、本発明のもう一つの遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜２２１７からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜２２１７からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１３】
上記ストリンジェントな条件としては、例えば、室温において、２×ＳＳＣ（塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムの混合水溶液）および０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）に相当する塩濃度で洗浄を行なうものを挙げることができる。
【００１４】
本発明に係る細菌は、上記遺伝子を有し、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する能力を有するものである。
【００１５】
また、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）である。（ａ）配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである。（ａ）上記本発明遺伝子の全部または一部に相補的な配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記本発明遺伝子の全部または一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。また、当該ＤＮＡで好適には、配列番号３〜１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  ｔｏ  １６）から選択される１または２以上のＤＮＡである。斯かるＤＮＡは、以下の検出方法で使用できるものとして有用である。
【００１７】
本発明に係る細菌の検出方法は、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌の検出方法であって、ＰＣＥに汚染された汚染土壌または汚染水由来の被検試料からＤＮＡサンプルを得、当該ＤＮＡサンプル中に上記本発明遺伝子が含まれるか否か判断することを特徴とする。
【００１８】
上記検出方法においては、上記本発明遺伝子の存在を定量的に測定し、また、定量的な測定によって、上記細菌の数を算出するものが好ましい。定性的ではなく定量的な測定を行なうことによって、ＰＣＥに汚染された土壌等を浄化するに当たって、より効率的な処理が可能になるからである。
【００１９】
また、上記検出方法において判断を行なう手段としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が便利である。更に、上記ＤＮＡサンプルを１０倍段階希釈し、各希釈液についてＰＣＲを行なうことによって上記細菌数を算出すれば、より正確な細菌数を効率的に求めることができる。
【００２０】
本発明に係るＰＣＥ汚染土壌または汚染水の浄化方法は、上記細菌検出方法の結果によって、上記細菌が検出された場合に、上記汚染土壌または汚染水を上記細菌が増殖できる条件にすることを特徴とする。また、上記細菌が検出されなかった場合には、上記細菌を汚染土壌または汚染水に添加し、当該細菌が増殖できる条件にする。
【００２１】
上記浄化方法においては、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌としてＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を使用することが好ましく、更に、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の中でもＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）を用いることが好ましい。斯かる細菌は、本発明に用いることができるものとして特に優れているからである。
【００２２】
本発明の環境影響評価方法は、上記浄化方法の実施中または実施後において、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌の存在を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子は、ＰＣＥを比較的毒性の弱いＴＣＥまで特異的に脱塩素化できる酵素をコードするものである。従って、この塩基配列情報を利用すれば、ＰＣＥに汚染された土壌や地下水などにおいてＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化できる細菌の有無を判断することができ、更に、得られた情報を汚染土壌等の浄化のために用いることができる。よって、本発明は、ＰＣＥに汚染された土壌等を効率的に浄化できるものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の遺伝子は、ＰＣＥをＴＣＥまで特異的に脱塩素化できるＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌であるＫＢＣ−１株のＤＮＡ塩基配列情報から、ＰＣＥ脱塩素化酵素をコードしているものと推定される塩基配列として見出され、この推定の正しさが実験により確認された新規なものである。従って、本発明の遺伝子によりコードされたタンパク質は、ＰＣＥをＴＣＥまで特異的に脱塩素化する反応を触媒するものであり、また、本発明遺伝子を有する細菌は同様の能力を有する。
【００２５】
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子である。（ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２若しくは塩基番号５０１〜２２１７からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５０１〜１８９２若しくは塩基番号５０１〜２２１７からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
塩基番号１９０６〜２２１７からなる遺伝子は、必ずしもその機能は明らかでないが、既知のデハロゲナーゼ遺伝子の上流または下流に共通して存在する。従って、この遺伝子にコードされているタンパク質は、デハロゲナーゼと結合して或いは結合しないまま、協同的にＰＣＥを脱塩素化する作用を発揮すると考えられる。例えば、塩基番号１９０６〜２２１７の塩基配列に対応するペプチドには疎水性アミノ酸が連続する部分があることから、デハロゲナーゼを細胞膜表面に存在せしめるためのアンカーである可能性がある。
【００２７】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、室温において２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄を行なうものを挙げることができ、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズ」するとは、斯かる条件で洗浄してもなおハイブリダイズしていることを意味するものとする。この条件を相同性で表すと、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件ということができる。
【００２８】
本発明のタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化するタンパク質。ここで、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加」とは、公知の変異タンパク質調製方法による欠失等であって、タンパク質の主要機能を失わせないものをいう。また、ここでの「置換」は、極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸などの分類において、同様のカテゴリーに属するアミノ酸による置換であることが好ましい。但し、活性中心など、そのタンパク質の機能発現のために極めて重要な部位においては、これら変異を起こさないことが好ましい。或いは、天然に存在するタンパク質であって、同様の変異を起こしたものを単離精製したものであってもよい。
【００２９】
本発明のタンパク質は、本発明遺伝子の配列から導き出されたものである。また、本発明遺伝子がＰＣＥをＴＣＥまで特異的に脱塩素化するタンパク質（酵素）をコードすることは、後述する実施例により確認されている。従って、本発明タンパク質は、ＰＣＥをＴＣＥまで特異的に脱塩素化するものと考えられる。
【００３０】
本発明の遺伝子の情報は、ＰＣＥに汚染された土壌等の浄化に利用することができる。具体的には、先ず、ＰＣＥに汚染された汚染土壌または汚染水由来の被検試料からＤＮＡサンプルを得、当該ＤＮＡサンプル中に本発明遺伝子が含まれるか否か判断することによって、ＰＣＥを脱塩素化してＴＣＥとする能力を有する細菌の有無を判断する。
【００３１】
このＤＮＡサンプルの取得は、メーカーより様々なＤＮＡサンプルの調製キットが市販されているので、適宜選択して用いればよい。そして本発明では、得られたＤＮＡサンプル中に本発明遺伝子が含まれているか否かは、本発明遺伝子とハイブリダイスできるＤＮＡを用いることにより判断できる。
【００３２】
ここで用いられるＤＮＡとしては、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを挙げることができる。（ａ）本発明遺伝子の全部または一部に相補的な配列を有するＤＮＡ、（ｂ）本発明遺伝子の全部または一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。好ましくは、１０〜３０塩基程度（より好ましくは、１５塩基以上、２５塩基以下）のものを使用し、具体的には配列番号３〜１６から選択される１または２以上のＤＮＡを用いることができる。ここでの「ストリンジェントな条件」は、前述したものと同様の条件とすることができる。
【００３３】
判断のための手段としては、公知のＤＮＡ検出手段を用いることができる。例えば、ＤＮＡサンプルを電気泳動により分離した上で、放射性同位元素や蛍光発色基等により標識した上記ＤＮＡを作用させ、これとハイブリダイズするものがあるか否かによって、本発明遺伝子の有無を判断することができる。
【００３４】
また、上記ＤＮＡのうち適切なもの２本を選択し、これらをフォワードプライマーとリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行なうことによって、これらとハイブリダイズする本発明遺伝子の全部または一部がサンプル中に存在すればそれを特異的に増幅できるので、本発明遺伝子の有無を判断できる。ＰＣＲの実施方法は一般的なものであればよく、また、その後に電気泳動によりＤＮＡを分離して増幅されたものがあるか否かを確認する。或いは、リアルタイムＰＣＲ法を用いれば、電気泳動を行なう必要がないため解析時間を大幅に短縮することができる。
【００３５】
また、上記ＤＮＡサンプルを、例えば１００〜１０８に１０倍段階希釈してＰＣＲを行なった上でアガロースゲル電気泳動し、増幅の有無を判定することによって、本発明遺伝子ＤＮＡの存在を定量的に測定でき、ひいてはＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化できる能力を有する細菌の数を算出できる。即ち、血球計算版やフローサイトメーター等により目的遺伝子を有する細胞の数を計測した培養液を、オートクレーブ滅菌した土壌へ一定量（一定菌数）添加することによって、細菌数が明らかとなっている土壌サンプルを得る。この土壌サンプルから、被検試料よりＤＮＡサンプルを得た手段と同様の手段によってＤＮＡサンプルを得、この細菌数が明らかとなっているＤＮＡサンプルについてＰＣＲを行なって増幅の有無を観察する。ＰＣＲでは、もとのＤＮＡ量が少な過ぎると増幅されない。従って、この結果から、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅される場合と増幅されない場合の細菌数が明らかとなるので、段階希釈した試料から得られたＰＣＲ結果と照らし合わせることによって、試料中に含まれる細菌数を知ることができる。
【００３６】
本発明に係る細菌検出方法の結果によって、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌が検出された場合には、浄化処理すべき汚染土壌または汚染水を当該細菌が増殖できる条件とすることによって、ＰＣＥをＴＣＥへ脱塩素化することができる。ここでの「増殖できる条件」は、本発明遺伝子を有する細菌、例えばＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌であるＫＢＣ−１株が増殖できる条件とする。即ち、ＫＢＣ−１株の至適条件は、ｐＨ  ７．５で３４℃であるので、好適にはｐＨ  ７．０〜９．０の１０〜４２℃とする。また、ＫＢＣ−１株は嫌気性菌であるので、好ましくは嫌気条件とするが、微好気条件でもよい。更に、必要に応じて脱塩素微生物の生育に必要な炭素源や窒素源、ビタミン等の栄養源も添加する。ＫＢＣ−１株の他にＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化できる細菌が存在すれば、その細菌の増殖条件に合わせてもよい。
【００３７】
本発明に係る細菌検出方法の結果によって、ＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化できる細菌が検出されなかった場合には、斯かる能力を有する細菌（好適にはＫＢＣ−１株）を被処理土壌等に添加して、その細菌の増殖条件とすることにより処理する。この様に、本発明に係る細菌の検出方法を実施した後にＰＣＥ汚染土壌等の処理を行なえば、より効率的な浄化が可能となる。また、当該細菌が検出された場合であってもその細菌数がＰＣＴを分解処理するに十分でなければ、当該細菌を添加してもよい。
【００３８】
処理すべき土壌や地下水においては、たとえＰＣＥで汚染されたものではあっても、元来の微生物分布をできる限り乱さないことが望ましい。そこで、本発明の浄化方法において、特にＰＣＥをＴＣＥへ脱塩素化できる細菌を添加した場合には、浄化方法の実施中または実施後において、当該細菌の存在を測定することにより環境への影響を評価すべきである。
【００３９】
以下に、実施例を示すことによって本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１  遺伝子配列の解析
（１）  液体培地の調製
先ず、嫌気性培養のための液体培地を、以下に示す通り調製した。即ち、表１の成分を水に溶解し、１Ｎ  ＫＯＨ水溶液でｐＨを７．２に調整し、更に水を添加して５００ｍＬにメスアップしたものを２０％ＣＯ2−８０％Ｎ2ガスで液相パージした後、オートクレーブ滅菌した。
【００４１】
【表１】
2006042815.tif 000002
【００４２】
表１中、微量元素溶液は、表２に示す組成を有する。因みに、成分中ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏは溶解し難かったため、先ず塩酸に溶解させた後に蒸留水を加え、更に他の成分を加えて均一溶液とした。
【００４３】
【表２】
2006042815.tif 000003
【００４４】
また、表１中のビタミン溶液は、表３に示す組成の均一溶液を２００ｍＬにメスアップした後、フィルター滅菌したものを用いた。
【００４５】
【表３】
2006042815.tif 000004
【００４６】
次に、別途表４に示す溶液を調製して滅菌後、嫌気的に混合した。更に、適当量の飽和ＰＣＥ溶液（１５０ｐｐｍ）と滅菌した嫌気水を加えて約１Ｌとし、最終ＰＣＥ濃度が５０ｐｐｍである液体培地を得た。
【００４７】
【表４】
2006042815.tif 000005
【００４８】
（２）  ファージライブラリーの作製
上記液体培地１００ｍＬを１２５ｍＬ容のガラスバイアルビンへ嫌気的に注入した。ここへ、ＫＢＣ−１株の菌液を終濃度が０．１％となる様に添加し、テフロン（登録商標）コートされたブチルゴム栓を介してアルミシールで密閉し、３０℃で３日間静置培養した。培養後の細胞を、４０００×Ｇ、４℃で８分間遠心分離した。次いで、ＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを用いてＫＢＣ−１株の染色体ＤＮＡを分離した。
【００４９】
得られた染色体ＤＮＡを、制限酵素であるＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。部分消化することにより生じたＤＮＡ断片をエタノール沈殿により精製・濃縮し、ＴＯＹＯＢＯ製のλＥＭＢＬ３／ＢａｍＨ  Ｉ  Ｖｅｃｔｏｒキットを用いて、λファージＤＮＡのＬｅｆｔ  ａｒｍとＲｉｇｈｔ  ａｒｍとの間にライゲーションした。ライゲーション後のファージＤＮＡは、ＴＯＹＯＢＯ製のＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  Ｇｏｌｄキットを用いてパッケージングし、ファージライブラリーとした。
【００５０】
（３）  塩基配列情報の解析
上記ファージライブラリー中、５クローンについてファージＤＮＡを調製し、挿入されたＤＮＡ断片のシークエンシングを行ない、１０〜１５ｋｂの５種類の塩基配列（合計：約７０ｋｂ）を決定した。読み取ったＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列解析ソフトであるＧｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ  ｖｅｒ．６を用いて解析した。その結果、配列番号１中塩基番号５０１〜１８９２からなる塩基配列が、以下の特徴を有することを見出した。
（ｉ）  対応するアミノ酸配列のＣ末端付近に、４Ｆｅ−４Ｓクラスタを２箇所持つというデハロゲナーゼの特徴に対応する配列が存在している。
（ｉｉ）  その分子量が、既知のデハロゲナーゼ遺伝子とほぼ同じである。
（ｉｉｉ）  既知デハロゲナーゼに共通して存在するシグナルペプチドに対応する配列を有する。
（ｉｖ）  その下流に、既知デハロゲナーゼに共通して存在する膜アンカープロテインに対応する配列が存在する。
【００５１】
以上の特徴より、配列番号１中塩基番号５０１〜１８９２からなる塩基配列は、デハロゲナーゼをコードしていると推定した。
【００５２】
実施例２  ノーザン解析
上記実施例１の推定遺伝子領域（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、以下、「ＯＲＦ」という）がデハロゲナーゼをコードしていることを、実施例２と３の実験により確認した。
【００５３】
上記実施例１（１）の液体培地５００ｍＬにＫＢＣ−１株の菌液を添加し、３０℃で２日間静置培養した。ＯＤ６００が０．１付近に達した時点で終濃度５０ｐｐｍになる様にＰＣＥを添加し、更に３０℃で３時間静置培養した。その後、４０００×Ｇ、４℃で８分間遠心分離し、細胞を回収した。次いで、ナカライテスク社のセパゾールＲＮＡを用いて、全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡ１０μｇを変性アガロース電気泳動にかけ、分離した。これをメンブラン（アマシャムバイオサイエンス社製、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）へブロッティングし、固定化した。
【００５４】
プローブのラベリング、ハイブリダイゼーションおよび検出は、アマシャムバイオサイエンス社製のＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒを用いた。詳しくは、上記実施例１のＯＲＦのＮ末端部分に相補的な以下に示す２つのプライマー（配列番号３と４）を用いて、ＫＢＣ−１株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ増幅を行なった。
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＴＴＧＧ、  ５’−ＴＴＡＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧ
増幅されたＤＮＡ断片を、アマシャム社製のカラム（Ｓ−４００  ＨＲ）を用いて精製した。ＤＮＡの濃度測定後、マニュアルに従ってプローブのラベリングを行なった。標識プローブとのハイブリダイゼーションは、指定されたバッファーを用いて５５℃で２０時間行なった。その後、表５の組成のバッファーを用いて、５５℃で１０分ずつ２回洗浄した。
【００５５】
【表５】
2006042815.tif 000006
【００５６】
更に、表６のバッファーを用いて、室温で５分ずつ２回洗浄した。
【００５７】
【表６】
2006042815.tif 000007
【００５８】
そして、所定量のＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液を添加後、室温にて３０分程度静置し、Ｘ線フィルムを用いて検出した。
【００５９】
また、比較のために、ＰＣＥを添加しない培地で培養したＫＢＣ−１株から得た全ＲＮＡサンプルについても、同様の処理を行なった。結果を図１に示す。図１中、（ｉ）はＰＣＥを添加した培地で培養したＫＢＣ−１株の全ＲＮＡサンプルの結果であり、（ｉｉ）はＰＣＥを添加しなかった場合のサンプルの結果である。当該結果から明らかな様に、上記実施例１のＯＲＦの発現はＰＣＥの存在により誘導され、対応するｍＲＮＡ量が増加することが実証された。
【００６０】
実施例３  
含塩素化合物（ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の脱塩素活性を有する酵素は基質の添加により誘導される場合が多い。そこで、ＫＢＣ−１株のＰＣＥ脱塩素酵素がＰＣＥの添加により誘導されるか否かを実験により確認した。
【００６１】
（１）  粗酵素溶液の調製
上記実施例１（１）の液体培地にＫＢＣ−１株の菌液を添加した後、終濃度が５０ｐｐｍになる様にＰＣＥを添加し、３０℃で３日間静置培養した。その後、４０００×Ｇ、４℃で８分間遠心分離した。次いで、嫌気条件下で１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を加え、細胞を懸濁した。この懸濁液中の細胞に、バイオラプター（コスモバイオ社製）を用いて、４℃、２００Ｗで１０５秒間の超音波破砕処理を行なった。その後、４０００×Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を粗酵素液とした。また、比較のために、ＰＣＥを添加しないで同様の処理を行なった粗酵素液も得た。
【００６２】
（２）  酵素活性の測定
デハロゲナーゼのアッセイは、Ｎｅｕｍａｎの方法（Ｎｅｕｍａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，ｐｐ１６５１５−１６５１９（１９９６年））を用いた。詳しくは、２０ｍＬのアルミシール用試験管に、表７の組成を有する酵素アッセイ溶液を添加し、テフロン（登録商標）コートのブチルゴム栓とアルミシールで密栓した。
【００６３】
【表７】
2006042815.tif 000008
【００６４】
このアッセイ溶液に１００μＬの粗酵素溶液を添加して、反応を開始した。また、別途ネガティブコントロールとして、粗酵素溶液の代わりに１００ｍＭリン酸バッファーを１００μＬ添加したものを作成した。これらを３０℃で１〜２０時間インキュベートした。その後、エレクトロンキャプチャー検出器付ガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＥＣＤ）により生成したＴＣＥ量（ｎｍｏｌ）を測定した。また、粗酵素溶液に含まれる全タンパク質の定量は、バイオラッド社製のプロテインアッセイキットを用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法により行なった。結果を表８に示す。
【００６５】
【表８】
2006042815.tif 000009
【００６６】
当該結果の通り、ＰＣＥを添加してＫＢＣ−１株を培養した場合と添加しなかった場合とでは、全タンパク質に対する脱塩素化能は約６０倍も異なっていた。従って、ＫＢＣ−１株のデハロゲナーゼは、ＰＣＥの添加によって発現することが明らかとなった。
【００６７】
以上の結果より、配列番号１中塩基番号５０１〜１８９２からなる塩基配列がデハロゲナーゼをコードしているのではないかとの上記実施例１での推定は、当該ＯＲＦがＰＣＥの存在により発現すること（実施例２）、また、デハロゲナーゼの発現が同じくＰＣＥにより誘導されることから（実施例３）、正しいことが証明された。
【００６８】
実施例４  本発明細菌の検出
表９の通り、上記実施例１のＯＲＦの一部に相補的なプライマー（配列番号３〜６）と、ＰＣＥをｃｉｓ−ＤＣＥまで脱塩素化するデハロゲナーゼをコードする遺伝子に相補的なプライマーを調製した。
【００６９】
【表９】
2006042815.tif 000010
【００７０】
次に、下記微生物の培養液サンプルまたは土壌のサンプルから５００μＬをサンプリングした。培養液サンプルの場合はＱｂｉｏｇｅｎｅ社製のＦａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔを用いて、土壌サンプルの場合はＱｂｉｏｇｅｎｅ社製のＦａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌを用いて、メーカーの指示通りの方法でＤＮＡサンプルを調整した。
【００７１】
【表１０】
2006042815.tif 000011
【００７２】
得られたＤＮＡサンプルは、上記プライマーセットＡ〜Ｃを用いたＰＣＲに供した。ＰＣＲの反応液の組成は、以下の通りである。
【００７３】
【表１１】
2006042815.tif 000012
【００７４】
また、ＰＣＲ各工程の条件は、表１２の通りである。
【００７５】
【表１２】
2006042815.tif 000013
【００７６】
ＰＣＲ後の反応液５μＬを１．５％アガロースゲルにて電気泳動し、目的バンドの増幅を確認した。結果を図２（泳動ゲルの写真）と表１３に示す。
【００７７】
【表１３】
2006042815.tif 000014
【００７８】
当該結果の通り、実施例１のＯＲＦに相補的なプライマーセットＡとＢは、ＫＢＣ−１株のみならず、同じくＰＣＥをＴＣＥへ脱塩素化する微生物の遺伝子に特異的にハイブリダイズした。その一方で、ＰＣＥをｃｉｓ−ＤＣＥまで脱塩素化する微生物遺伝子にはハイブリダイズしないことが分かった。従って、実施例１のＯＲＦを指標にしたＤＮＡ検出方法は、ＰＣＥをＴＣＥに脱塩素化する微生物の検出に有用であることが実証された。
【００７９】
実施例５  本発明遺伝子の検出
土壌サンプルとして、サンプルＡ（一般畑土）、サンプルＢ（油田土壌）、サンプルＣ（一般畑土）、サンプルＤ（腐葉土）を取得した。各土壌サンプルＡ〜Ｄ８ｇを２５ｍＬ容のバイアルビンに挿入し、さらに、表４に示す溶液の代わりに表１４に示す溶液を用いる以外は上記実施例１（１）と同様の条件で調製した液体培地５ｍＬを加えて密栓し、３０℃で８日間静置培養を行なった。なお、土壌サンプルや液体培地の添加は全て好気条件で行なったが、密封状態で培養したことから土壌サンプル中に含まれる好気性細菌の働きによりバイアルビン中は次第に嫌気条件になると考えられる。
【００８０】
【表１４】
2006042815.tif 000015
【００８１】
別途、上記実施例１のＯＲＦの一部に相補的な表１５のプライマー（配列番号３〜１６）を調製した。
【００８２】
【表１５】
2006042815.tif 000016
【００８３】
これらプライマーを組合せ、培養後の各土壌サンプルについて上記実施例４と同様の条件でＰＣＲを行ない、増幅を確認した。増幅が確認されたものを「○」、確認されなかったものを「×」として結果を表１６に示す。
【００８４】
【表１６】
2006042815.tif 000017
【００８５】
上記結果の通り、土壌サンプルＡには本発明遺伝子を有する細菌が存在していることが明らかとなった。土壌サンプルＢの結果では、増幅されていない場合がある。これは、本発明遺伝子と比較的高い相同性を有しながらも一部配列が異なる遺伝子を有する細菌が存在していることを示す。一方、土壌サンプルＣとＤには本発明遺伝子を有する細菌は存在しないことが分かる。
【００８６】
実施例６  ＰＣＥ分解実験
上記実施例５の実験において、各バイアルビンのヘッドスペースガスを培養開始直後と２日間ごとに抜き取り、気相中に放散されるＰＣＥとＴＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。結果を図３に示す。
【００８７】
当該結果の通り、土壌サンプルＡでは経時的にＰＣＥ濃度が低減されており、５日目以降ではほぼ全量が分解されている。それに対応して、ＴＣＥ濃度が上昇している。従って、上記実施例５の結果を合わせて考察すれば、本発明遺伝子を有する細菌（以下、「本発明細菌」という）の働きによりＰＣＥがＴＣＥへ特異的に分解されていると考えられる。なお、２日目まではそれ程ＰＣＥ濃度の低下が見られないのは、十分な嫌気条件に至っていないためである。また、ＰＣＥの減少に比してＴＣＥの増加が少ないが、図３の縦軸の単位はｐｐｍであり、ＴＣＥはＰＣＥよりも塩素数が１つ少なく分子量が小さいので、分解されたＰＣＥはほぼＴＣＥに変換されたものと考えられる。
【００８８】
土壌サンプルＢでは、同じくＰＣＥ濃度は経時的に低減されているものの、ＴＣＥ濃度はＰＣＥ濃度の低下に相当する程に上昇していない。上記実施例５の結果の通り、土壌サンプルＢには本発明細菌は少ないか存在せず、本発明遺伝子と類似する遺伝子を有する細菌が優勢であると考えられる。従って、ＰＣＥが分解されているにもかかわらずＴＣＥの生成量が少ないのは、検出されたＴＣＥは本発明遺伝子と類似する遺伝子を有する細菌の作用によりＰＣＥがｃｉｓ−ＤＣＥ等まで分解される途中の中間生成物であるか、僅かに存在する本発明細菌の働きによるものであると思われる。
【００８９】
一方、土壌サンプルＣとＤではＰＣＥ濃度はほとんど低下しておらず、ＴＣＥの生成も観察されない。これは、上記実施例５の結果の通り本発明細菌が存在していないことによると考えられる。
【００９０】
以上の結果の通り、本発明によればＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化する細菌を検出できることが実証された。また、上記結果から、本発明細菌が検出された土壌サンプルＡの場合には、本発明細菌の生育に適した条件とすることによりＰＣＥをＴＣＥへ特異的に分解できる。土壌サンプルＢの場合は本発明細菌を他の細菌よりも優勢にし、土壌サンプルＣとＤの場合には本発明細菌を添加して同様の条件とすることによって、同じくＰＣＥの特異的な分解が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＫＢＣ−１を培養するに当たり、ＰＣＥを添加した場合と添加しなかった場合において、本発明遺伝子の発現状態を示す結果である。本発明遺伝子はＰＣＥの添加により発現誘導されることが証明されている。
【図２】本発明遺伝子の塩基配列に相補的なＤＮＡをプライマーとして用いて、サンプルＤＮＡのＰＣＲを行なったアガロースゲル電気泳動結果である。当該結果より、本発明のＤＮＡは、サンプルを得た土壌等にＰＣＥをＴＣＥまで脱塩素化できる細菌が含まれるか否かを判断するのに有用であることが分かる。
【図３】実施例５と６において、ＰＣＥを添加した土壌サンプルから放散されるＰＣＥとＴＣＥの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した結果である。
【図３】
2006042815.tif 000018
【図１】
2006042815.tif 000019
【図２】
2006042815.tif 000020
【配列表】
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