(57)【要約】【課題】  微生物を非常に高い効率で単離し得る微生物単離装置および微生物の単離方法を提供すること。【解決手段】  本発明の微生物単離装置は、所定の微生物を含む微生物供給液を含有する微生物供給部と；微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；微生物供給部から延び、微生物供給液が通る少なくもと１つの微生物供給流路と；接触液供給部から延び、接触液が通る接触液供給流路と；微生物供給流路と接触液供給流路とが合流して形成され、微生物供給液と接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備える。生成される微粒子は、微粒子内に所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む。【選択図】    図１
2006121998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが所定の微生物を含む微生物供給液を含有する、少なくとも１つの微生物供給部と；
該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；
該少なくとも１つの微生物供給部からそれぞれ延び、該微生物供給液が通る少なくもと１つの微生物供給流路と；
該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；
該少なくもと１つの微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、
該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む
微生物単離装置。
【請求項２】
所定の微生物を含む微生物供給液を含有する、１つの微生物供給部と；
該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；
該微生物供給部から延び、該微生物供給液が通る微生物供給流路と；
該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；
該微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、
該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む、請求項１に記載の微生物単離装置。
【請求項３】
第１の微生物を含む第１の微生物供給液を含有する、第１の微生物供給部と；
第２の微生物を含む第２の微生物供給液を含有する、第２の微生物供給部と；
該第１および第２の微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；
該第１の微生物供給部から延び、該第１の微生物供給液が通る第１の微生物供給流路と；
該第２の微生物供給部から延び、該第２の微生物供給液が通る第２の微生物供給流路と；
該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；
該第１および第２の微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該第１および第２の微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、
該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む、請求項１に記載の微生物単離装置。
【請求項４】
前記生成される微粒子が、該微粒子内に微生物をそれぞれ実質的に１個だけ含む、請求項１から３のいずれかに記載の微生物単離装置。
【請求項５】
前記接触液供給流路が、前記微生物供給流路の断面積よりも大きい断面積を有する、請求項１から４のいずれかに記載の微生物単離装置。
【請求項６】
所定の微生物を含む微生物供給液を調製する工程と；
該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を調製する工程と；
該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する工程とを含み、
該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む、微生物の単離方法。
【請求項７】
前記生成される微粒子の体積が、０．５〜５００ピコリットルである、請求項６に記載の微生物の単離方法。
【請求項８】
前記微生物供給液がゲル化材料を含む、請求項６または７に記載の微生物の単離方法。
【請求項９】
前記微生物供給液中における前記所定の微生物の濃度が、２×１０６〜２×１０９個／ｍｌである、請求項６から８のいずれかに記載の微生物の単離方法。
【請求項１０】
前記接触液がゲル化開始成分を含む、請求項６から９のいずれかに記載の微生物の単離方法。
【請求項１１】
前記所定の微生物が、真正細菌、古細菌、酵母および遺伝子組換え体からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６から１０のいずれかに記載の微生物の単離方法。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれかに記載の方法で得られる、微生物含有微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物単離装置、微生物の単離方法および該方法で得られた微生物含有微粒子に関する。より詳細には、本発明は、自然界に存在する微生物、特に生存するが培養困難な微生物を単離し得る微生物単離装置；多種類の微生物を個別に評価するために微生物を単離し得る微生物単離装置；および、微生物の単離方法；ならびに、そのような微生物を任意の個数、望ましくは実質的に１個だけ含有する微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、自然界から微生物を分離し培養する方法として、平板培養法が広く知られている。平板培養法は、多種多様の微生物が混在する試料を平板培地（プレート）に播き、一定時間培養後プレート上に形成されたコロニーを単離することにより、微生物の単一コロニーまたは単一細胞を分離する方法である。平板培養法によれば、通常、単離した微生物（コロニー）の中から目的にかなった微生物が検索される。この平板培養法をベースとして様々な方法が開発され、それにより産業上有用な微生物が数多く分離され利用されている。
【０００３】
１９７０年代後半になって、蛍光顕微鏡を用いる分離源中の全菌数計数法が確立された。このことにより、多種多様な微生物を計数する技術が開発されている。一方、自然界の分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色法で検出する技術が開発されている。これらの技術開発によって、上記の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきている。すなわち、自然界には、通常の栄養培地で培養可能な微生物群と、生物活性を示すが培養困難な微生物群とが存在することが明らかになっている。このような生物活性を示すが培養困難な微生物群は、ＶＢＮＣ状微生物（生きているが培養が困難な微生物）として知られるようになってきている。
【０００４】
上記のようなＶＢＮＣ状微生物の中には、未知の微生物種（新種の微生物）の存在が想定され得る。さらに、深海などの極端な環境、またはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海洋生物等の生物体内あるいは活性汚泥等の人工的環境中にも、未知の微生物種の存在が想定され得る。
【０００５】
加えて、ＶＢＮＣ状微生物は生きている細胞であるから、その中にはＤＮＡ遺伝子が存在している。したがって、ＶＢＮＣ状微生物のＤＮＡ遺伝子の中には、未だ知られていない機能を有する未知の遺伝子が存在すると想定され得る。このような未知の遺伝子は、食品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等において有用となり得る可能性がある。
【０００６】
しかし、上記のように、ＶＢＮＣ状微生物は、平板培養法では培養できないので、このような微生物（場合によっては、その遺伝子）を単離することができない。
【０００７】
このような問題を解決するために、通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源からＶＢＮＣ状微生物のみを分離する方法として、ゲルマイクロドロップ法と称する方法が提案されている（特許文献１参照）。この方法は、微生物を含む試料液を孔径約１５μｍの多孔質膜を通過させ、Ｗ／Ｏエマルジョン化して直径約４０μｍのゲル微粒子（ゲルマイクロドロップ）を形成する。このゲルマイクロドロップ集団を増殖環境下におく（特許文献１によれば、通常の微生物はゲル内で増殖しゲルは複数の細胞を含む一方で、ＶＢＮＣ状微生物は増殖しないのでゲル内の細胞は１個のままであるとしている）。最後に、フローサイトメトリー法により、１個の微生物細胞を有するゲル微粒子（ＶＢＮＣ化微生物）をセルソーターにより識別して分離する。このようにして、ＶＢＮＣ状微生物が分離され得るとされている。
【０００８】
しかし、この方法は、ゲル微粒子の生成に多孔質膜（いわゆる軽石状の孔構造を有する膜）を用いているので、得られる微粒子の粒径が非常に不均一である。さらに、孔の平均径が約１５μｍと大きく、結果として得られる微粒子の平均径も直径約４０μｍと大きい。その結果、１つの微粒子内に含まれる微生物（細胞）の数が不均一となり、分離の効率がきわめて不十分である。
【特許文献１】特開２０００−１９７４７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、ＶＢＮＣ状微生物および／または既知の微生物を非常に高い効率で単離し得る微生物単離装置および微生物の単離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、所定の微生物を含む原料液体を流す微小流路にパルス状の圧力をかけ、当該原料液体を脈動させて微小流路の合流部に供給し、該合流部で瞬間的に物理的過程および／または化学的過程を起こさせて微粒子を生成することにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の微生物単離装置は、それぞれが所定の微生物を含む微生物供給液を含有する、少なくとも１つの微生物供給部と；該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；該少なくとも１つの微生物供給部からそれぞれ延び、該微生物供給液が通る少なくもと１つの微生物供給流路と；該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；該少なくもと１つの微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む。
【００１２】
好ましい実施形態においては、上記装置は、所定の微生物を含む微生物供給液を含有する、１つの微生物供給部と；該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；該微生物供給部から延び、該微生物供給液が通る微生物供給流路と；該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；該微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む。
【００１３】
別の好ましい実施形態においては、上記装置は、第１の微生物を含む第１の微生物供給液を含有する、第１の微生物供給部と；第２の微生物を含む第２の微生物供給液を含有する、第２の微生物供給部と；該第１および第２の微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を含有する、接触液供給部と；  該第１の微生物供給部から延び、該第１の微生物供給液が通る第１の微生物供給流路と；該第２の微生物供給部から延び、該第２の微生物供給液が通る第２の微生物供給流路と；該接触液供給部から延び、該接触液が通る接触液供給流路と；該第１および第２の微生物供給流路と該接触液供給流路とが合流して形成され、該第１および第２の微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する、微粒子生成部とを備え、該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む。
【００１４】
好ましい実施形態においては、上記生成される微粒子は、該微粒子内に微生物をそれぞれ実質的に１個だけ含む。
【００１５】
好ましい実施形態においては、上記接触液供給流路は、上記微生物供給流路の断面積よりも大きい断面積を有する。
【００１６】
本発明の別の局面によれば、微生物の単離方法が提供される。この方法は、所定の微生物を含む微生物供給液を調製する工程と；該微生物供給液と接触して微粒子を生成する接触液を調製する工程と；該微生物供給液と該接触液とを接触させて微粒子を生成する工程とを含み、該生成される微粒子が、該微粒子内に該所定の微生物をそれぞれ所定の数だけ含む。
【００１７】
好ましい実施形態においては、上記生成される微粒子の体積は、０．５〜５００ピコリットルである。
【００１８】
好ましい実施形態においては、上記微生物供給液はゲル化材料を含む。
【００１９】
好ましい実施形態においては、上記微生物供給液中における上記所定の微生物の濃度は、２×１０６〜２×１０９個／ｍｌである。
【００２０】
好ましい実施形態においては、上記接触液がゲル化開始成分を含む。
【００２１】
好ましい実施形態においては、上記所定の微生物は、真正細菌、古細菌、酵母および遺伝子組換え体からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２２】
本発明のさらに別の局面によれば、微生物含有微粒子が提供される。この微生物含有微粒子は、上記の方法で得られる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、微小な領域で微小量の微生物供給液を、当該微生物供給液と接触して微粒子を生成し得る接触液と接触させることにより、きわめて小さなサイズの微粒子を生成することができる。微生物供給液の濃度を調整することにより、上記微小量の供給液中に実質的に１個の微生物を含有させることができる。したがって、生成される微粒子中に実質的に１個の微生物を含有させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。
【００２５】
Ａ．微生物単離装置
図１は、本発明の好ましい実施形態による微生物単離装置の全体的な構成を説明する概略斜視図である。簡単のため、図示例では単一の微生物供給部を有する場合について説明するが、本発明が２つ以上の微生物供給部を有する場合に適用され得ることはいうまでもない（２つ以上の微生物供給部を有する場合については、特徴的な部分のみを簡単に後述する）。図１の微生物単離装置１００は、基板１０上に形成された微生物供給部１ａと、接触液供給部１ｂと、微生物供給部１ａから延びる微生物供給流路２ａと、接触液供給部１ｂから延びる接触液供給流路２ｂと、微生物供給流路２ａと接触液供給流路２ｂとが合流して形成された微粒子生成部５とを備える。微生物供給部１ａに含有された微生物供給液が微生物供給流路２ａを通って微粒子生成部５に供給される。同様に、接触液供給部１ｂに含有された接触液が接触液供給流路２ｂを通って微粒子生成部５に供給される。微粒子生成部５において、微生物供給液と接触液との間に物理的過程および／または化学的過程を生じさせることにより、微粒子が生成される。物理的過程の代表例は相分離であり、化学的過程の代表例は化学反応（例えば、酸化、還元、塩の生成）である。なお、この装置における液体供給機構は、特開２００３−２２０３２２号公報に記載の液体混合機構を応用したものであり、当該公報の開示は本明細書に参考として援用される。
【００２６】
このような装置１００の外形寸法は、代表的には、約２５ｍｍ×３０ｍｍ×０．５ｍｍである。好ましくは、接触液供給流路２ｂは、微生物供給流路２ａの断面積より大きい断面積を有する。このような構成を採用することにより、微生物供給液の１回ごとの供給量を非常に小さくすることができるので、結果として、微生物（細胞）を１個のみ含有する微粒子を生成できる確率が顕著に大きくなる。具体的には、微生物供給流路２ａの幅は代表的には５０〜２００μｍであり、深さは代表的には３０〜１２０μｍである。接触液供給流路２ｂの幅は代表的には１００〜５００μｍであり、深さは代表的には５０〜５００μｍである。微粒子生成部５は、実質的には接触液供給流路２ｂから連続的に延びており、その幅は代表的には１００〜５００μｍであり、深さは代表的には５０〜５００μｍである。微生物供給流路２ａに対する接触液供給流路２ｂの断面積の比２ｂ／２ａは、好ましくは２〜５０である。好ましくは、微生物供給流路２ａの幅は、接触液供給流路２ｂと合流する直前の部分において、狭くなっていることが望ましい。合流直前の微生物供給流路２ａの幅は、代表的には１０〜５０μｍである。微生物供給流路２ａはテーパー状に狭くなってもよく、段階的に狭くなってもよい。このような微小な領域で微小量の微生物供給液を接触液と接触させて微粒子を生成することが本発明の特徴の１つである。微小量の微生物供給液を接触させることにより、従来は困難であったきわめて微小なサイズの粒子の製造が可能となる。その結果、微粒子に取り込まれる微生物（細胞）の数を非常に小さくする（代表的には、実質的に１個だけ取り込む）ことが可能となる。本発明においては、基板１０は特に制限されず、任意の適切な基板が採用され得る。代表的には、シリコンウェハーが用いられる。基板１０上の流路等の形成は、任意の適切な微細加工技術（例えば、フォトリソグラフィー）によって行われる。
【００２７】
この装置１００は、微生物供給流路２ａおよび接触液供給流路２ｂにそれぞれ圧力発生機構３ａ、３ｂを有する。圧力発生機構としては、任意の適切な装置が採用され得、代表的には、マイクロポンプ（好ましくは、ディフューザー型マイクロポンプ）である。図２は、ディフューザー型マイクロポンプの流路方向の概略断面図である。マイクロポンプ３ａは、ポンプ室３１に対向する振動板３２に、セラミック圧電材料であるＰＺＴ〔Ｐｂ（Ｚｒ，Ｔｉ）Ｏ３〕３３が貼り付けられてなる。ＰＺＴ３３は、駆動部３４により駆動電圧が印加されるとポンプ室３１側に湾曲し、ポンプ室３１の容積が変動し、圧力が発生する。パルス状の駆動電圧を印加することにより、駆動電圧に対応したパルス状の圧力が発生する。圧力が発生すると、前後のディフューザー３５、３６の流路インピーダンスの差により原料液体が送液される。マイクロポンプ３ｂには一定の駆動電圧が印加され、当該駆動電圧に対応した一定圧力が発生し、その結果、一定量の接触液が連続的に供給され得る。接触液供給流路２ｂに一定量の接触液を連続的に流す手段としては、マイクロポンプ３ｂの代わりに、接触液供給部１ｂにシリンジポンプなどを接続してもよい。
【００２８】
上記圧力のパルス形状は、目的に応じて適宜設定され得る。代表的には、当該パルス形状は、流路ごとに独立して設定され得る。具体的には、図３（ａ）に示すように、微生物供給流路２ａには所定のパルス状圧力がかけられる。その結果、微生物供給液が間欠的に微粒子生成部に供給される。接触液供給流路２ｂについては、上記のようにおよび図３（ａ）に示すように、一定の圧力がかけられる。その結果、一定量の接触液が連続的に微粒子生成部に供給される。接触液供給流路２ｂに目的に応じて任意の適切なパルス状の圧力をかけて、接触液を微粒子生成部に間欠的に供給してもよいことは言うまでもない。
【００２９】
特に好ましくは、上記圧力のパルス形状は、微生物供給液を微粒子生成部に供給する場合に対応する大きな圧力部分（液滴形成パルス）と該微生物供給液を該微粒子生成部に供給しない場合に対応する小さな圧力部分（逆流防止パルス）とを有する。すなわち、図３（ｂ）に示すように、微生物供給液を微粒子生成部に供給しないときに小さな圧力（逆流防止パルス）を発生させる。このような小さな圧力を発生させることにより、微粒子生成部５から微生物供給流路２ａへの逆流が防止できる。当該小さな圧力は、使用する微生物供給液の種類等に応じて適宜設定され得る。例えば、大きな圧力部分の圧力ＰＬと小さな圧力部分の圧力ＰＳとの比ＰＬ／ＰＳは、１／２〜１／１００の範囲である。大きな圧力部分（液滴形成パルス）を発生させる印加電圧は、代表的には５〜４０Ｖであり、小さな圧力部分（逆流防止パルス）を発生させる印加電圧は、代表的には１〜１０Ｖである。本発明によれば、後述のように微生物供給液の供給の切り替え周期を非常に短くできるが、切り替え周期を短くすると逆流が起きやすく、微粒子生成の精度に非常に悪影響を与える。したがって、このような逆流防止手段を実現できたことは極微小なサイズの粒子の製造にとってきわめて重要であり、本発明の大きな成果の１つである。もちろん、図３に示すような形状以外に、目的に応じて任意の適切な形状のパルスを発生させることにより、微粒子生成部における微生物供給液の供給量および供給間隔を変更することが可能となる。
【００３０】
図３（ａ）を参照して説明すると、上記パルスにおける液滴形成パルスＳの周波数は、好ましくは１〜５０ｋＨｚ、さらに好ましくは８〜１３ｋＨｚである。パルスの切り替え周期は、好ましくは１０Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、さらに好ましくは１００Ｈｚ〜５ｋＨｚである。このようなきわめて短い切り替え周期を達成できること（結果として、きわめて小さい供給量で微生物供給液を微粒子生成部に送ることができること）が、本発明の特徴の１つである。駆動素子が非常に短いので共振周波数を格段に大きくすることができるからである。微粒子供給液をきわめて短い切り替え周期で（きわめて小さい供給量で）微粒子生成部に供給することにより、接触空間または反応空間のスケールが非常に小さくなる。その結果、非常に小さく、かつ非常にシャープな粒度分布を有する微粒子を製造することができる。その結果、微粒子内に微生物を所定の数だけ含ませる統計的な精度が格段に高くなる。しかも、微粒子供給液と接触液との接触機会をきわめて増大させることができるので、生産性がきわめて大きい。加えて、装置スケール（反応スケール）がきわめて小さいので、きわめて小さな消費電力で微粒子を製造することができる。
【００３１】
図４は、微生物供給流路２ａと接触液供給流路２ｂの合流部（微粒子生成部５の最上流部）における微粒子形成過程のメカニズムを説明する模式図である。上記圧力のパルス形状に応じて、微生物供給液の塊（層）４１が接触液の流れ４２に供給される。微生物供給液の溶媒（分散媒）と接触液とを適切に選択することにより、微生物供給液の塊（層）４１は接触液の流れ４２と接触した瞬間にゲル状微粒子４３を形成する（なお、微生物供給液および接触液の詳細は、後述のＢ項で説明する）。ゲル状微粒子４３は接触液の流れに乗って下流へと移動する。例えば、微生物供給液における微生物の濃度を１×１０８〜２×１０９個／ｍｌに設定し、１パルスごとの微生物供給液の供給量を０．５〜１０ピコリットルに設定すると、微生物供給液１パルスあたり実質的に１個の微生物が含まれることとなる。本明細書において、「実質的に１個の微生物が含まれる」とは、微生物が同種の他の微生物および／または他種の微生物の影響を実質的に受けないで増殖・成長し得るような個数で１パルスの供給液中または生成微粒子中に存在することを意味する。当該１パルス分の供給液が接触液と接触することにより、約１０〜２７μｍの平均粒径を有するゲル状微粒子が得られる。微生物供給液と接触液の液−液界面は微生物供給液の濃度分布および接触度合いがきわめて均一であるので、非常にシャープな粒度分布を有する微粒子が得られる。得られる微粒子のＣＶ値（粒度分布の指標であり、標準偏差／平均粒径×１００（％）で表される）は、代表的には２％〜２０％、好ましくは５％〜１５％である。非常にシャープな粒度分布を有する微粒子を形成することにより、微粒子１個に実質的に１個の微生物が存在する統計的な確率が格段に大きくなる。
【００３２】
好ましくは、微粒子生成部５に温度制御部（図示せず）が設けられる。温度制御部は、任意の適切な温度制御手段で構成される。代表的な温度制御手段は、流路基板１０の裏側に薄膜抵抗体であるＴａＳｉＯ２やＴａ２Ｎが形成されてなる。また、流路基板にＳｉを使用する場合には、不純物ドープＳｉ抵抗体を使用することもできる。温度制御の仕方は、目的に応じて適宜設定され得る。例えば、微粒子生成部５の全体を一定温度に制御してもよく、上流から下流に向かって正（または負）の温度勾配を形成してもよく、微粒子生成部５の任意の部分のみを高温（または低温）に制御してもよい。このようにして、微粒子生成過程を精密かつ良好にコントロールすることができる。
【００３３】
好ましくは、微粒子生成部５の下流に微粒子捕集部６が設けられている。微粒子捕集部６は、微粒子のサイズおよび／または物理的特性を利用して微粒子を捕集（回集）する。微粒子のサイズを利用する手段としては、流路に予め加工しておいたフィルター手段（例えば、孔、柱）、遠心分離機構などが挙げられる。微粒子の物理的特性を利用する手段としては、誘電率または電荷などを利用する手段が挙げられる。具体的には、流路に予め加工しておいた電極パターン、撥水・親水パターンなどを利用して、誘電泳動、電気泳動などによって捕集する。
【００３４】
図５は、本発明の別の実施形態による微生物単離装置の流路形状を説明する概略平面図である。この実施形態は、２つの微生物供給流路２ａおよび２ｃが形成されている場合である。図５のような流路を用いる場合には、第１の微生物供給部１ａに微生物αを含有する第１の微生物供給液を入れ、第２の微生物供給部１ｃに微生物βを含有する第２の微生物供給液を入れることにより、微生物αと微生物βを実質的に１個ずつ含む微粒子を形成することができる。図６は、このような実施形態における微生物供給流路と接触液供給流路の合流部での微粒子形成過程のメカニズムを説明する模式図である。圧力発生機構に印加された圧力のパルス形状に応じて、第１の微生物供給液の塊（層）６１が微生物供給流路２ａに供給される。第１の微生物供給液の濃度および１パルスあたりの供給量を調整することにより、塊（層）６１中には実質的に１個の微生物αが含有される。同様に、第２の微生物供給液の塊（層）６４が微生物供給流路２ｃに供給される。第２の微生物供給液の濃度および１パルスあたりの供給量を調整することにより、塊（層）６４中には実質的に１個の微生物βが含有される。微生物供給流路２ａと２ｃの合流点で、塊（層）６１と塊（層）６４とが合流し、塊（層）６５を形成する。パルスのタイミングを調整することにより、塊（層）６１と塊（層）６４とが適切に合流するようにすることができる。塊（層）６５は、接触液の流れ６２と接触した瞬間にゲル状微粒子６３を形成する。ゲル状微粒子６３は接触液の流れに乗って下流へと移動する。例えば、第１の微生物供給液における微生物αの濃度を１×１０８〜２×１０９個／ｍｌに設定し、１パルスごとの微生物供給液の供給量を０．５〜１０ピコリットルに設定すると、塊（層）６１の１個あたりに実質的に１個の微生物αが含まれることとなる。同様にして、塊（層）６４の１個あたりに実質的に１個の微生物βを含めることができる。その結果、微生物αと微生物βを実質的に１個ずつ含有する塊（層）６５が形成され、最終的には、微生物αと微生物βを実質的に１個ずつ含有するゲル状微粒子６３が生成され得る。この場合の塊（層）６５の体積は１．０〜２０ピコリットルとなり、得られる微粒子の平均粒径は約１２〜３４μｍとなる。微生物供給液の濃度および１パルスごとの供給量を制御することにより、ゲル上微粒子に含有される微生物の数を目的に応じて適宜設定できる。例えば、（α１個、β２個）、（α２個、β１個）、（α２個、β２個）、（α３個、β２個）、（α２個、β３個）のような任意の組み合わせが採用され得る。なお、目的に応じて３つ以上の微生物供給部を有する実施形態が採用され得ることは言うまでもない。また、２つ以上の微生物供給流路の合流形態も、目的に応じて任意の適切な形態が採用され得る。
【００３５】
Ｂ．微生物の単離方法
次に、本発明の微生物の単離方法の好ましい一例を説明する。簡単のため、１種の微生物を単離する場合についてのみ説明する。
【００３６】
最初に、所定の微生物を含む微生物供給液を調製する。微生物供給液は、微生物を所定の液体に分散させることにより調製される。液体には、必要に応じて、分散剤（例えば、界面活性剤）等が添加され得る。このプロセスは、従来と同様の手順に従って行われる。一例は以下の通りである。分離源（例えば、土壌）を採取する。土壌１ｇ中に、１０５〜１０９個の微生物が存在すると言われている。この微生物濃度が、微生物供給液の濃度や１パルスあたりの供給量を決定する基礎となる。採取した土壌を水に懸濁し、不純物を物理的手段（代表的には、フィルター）で除去する。次いで、不純物を除去した懸濁液を、目的に応じた適切な液体を用いて、所定の濃度まで多段階で希釈して微生物供給液を調製する。微生物を分散させる液体の具体例としては、アルギン酸が挙げられる。アルギン酸を用いる場合には、微生物供給液中の微生物濃度は、好ましくは２×１０６〜２×１０９個／ｍｌに設定され得る。この場合の微生物供給液の粘度は、代表的には１〜３ｃｐｓである。好ましくは、微生物供給液は、ゲル化材料を含有する。本明細書において、ゲル化材料とは、外部からの物理的および／または化学的な刺激により、自身がゲルを形成し得る材料をいう。ゲル化材料の具体例としては、アルギン酸、カラギーナン、ペクチン、セルロース、シアノアクリレート、多糖アミノ酸カーバメート誘導体、ポリビニルアルコール、ケイ酸ナトリウム、アルキル基含有シリカマトリックスなどが挙げられる。
【００３７】
次に、接触液を調製する。接触液としは、上記微生物供給液と接触して微粒子（代表的には、ゲル状微粒子）を生成し得る任意の適切な液体が採用され得る。代表的には、接触液は、ゲル化開始成分を含む。本明細書において、ゲル化開始成分とは、物理的および／または化学的刺激により上記ゲル化材料のゲル化を引き起こす物質をいう。ゲル化開始成分の具体例としては、塩化カルシウム水溶液が挙げられる。塩化カルシウム水溶液を用いる場合、その粘度は代表的には１〜３ｃｐｓである。
【００３８】
次に、図１に示すような装置を用いる。微生物供給部１ａに微生物供給液を入れ、接触液供給部１ｂに接触液を入れる。微生物供給流路２ａにはマイクロポンプで所定の電圧（１０ＫＨｚ、１０Ｖ）を印加し、パルス状の圧力（液滴形成パルス）を発生させる。このような圧力を発生させることにより、１パルスごとの微生物供給液の供給量を０．５〜１０ピコリットルに設定することができる。このようにして、１パルスごとの微生物供給液中に実質的に１個の微生物を含有させることができる。一方、接触液供給流路２ｂには、例えば５０ｎｌ／ｓの流量で整流を発生させ、一定量で連続的に接触液を流す。
【００３９】
次に、微生物供給流路２ａと接触液供給流路２ｂの合流部において、微生物供給液と接触液とを接触させる。そうすると、図４に示したようなメカニズムでゲル状微粒子を生成する。上記のように、１パルスごとの微生物供給液中には実質的に１個の微生物が含まれているので、得られる微粒子中にも実質的に１個の微生物が含まれるようになる。微生物供給液の濃度および１パルスあたりの供給量を制御することにより、任意の適切な数の微生物を微粒子中に含ませることができる。
【００４０】
このようにして得られた微粒子を回収し、所定の環境で増殖および／または成長させる。このようにすることにより、ＶＢＮＣ状微生物を単離できる可能性が飛躍的に増大し得る。また、既知の微生物に関しても、他の微生物の影響を排除することにより、培養効率を格段に高めることができる。
【００４１】
本発明に用いられ得る既知の微生物の具体例としては、土壌や河川などの自然環境、生活空間環境、消化管内に存在する真性細菌、古細菌、酵母、遺伝子組換え体が挙げられる。真性細菌の具体例としては、Rhodococcus属、Norcardia属、Alcaligenes属、Lactococcus属、Acetobacter属、Pseudomonas属、Sphingomonas属、Corynebacterium属、Synechococcus属、Botryococcus属、Chlamydomonas属、Zymomonus属、Methanosarcina属、Methylosinus
属、Bachillus属、Gordonia属、Actinobacteria属、放線菌類が挙げられる。酵母の具体例としては、Candida属、Cryptococcus属が挙げられる。遺伝子組換え体の具体例としては、Escherichia
coli、Bachillus subtilisが挙げられる。これらを所定の数（代表的には、実質的に１個）含む微粒子は、各種バイオリアクターにきわめて好適に用いられ得る。このような微粒子によれば、粒子内での拡散が速いので、リアクターの生産効率が格段に向上し得るからである。より具体的には、Rhodococcus属は、例えば油分分解、ニトリル分解、シアノ基加水分解に好適に用いられる。Candida属は、例えば炭化水素の酸化、リパーゼ反応、光学異性化に好適に用いられる。Norcardia属は、例えばシアノ基加水分解に好適に用いられる。Alcaligenes属は、例えばレトロアルドール反応、ＰＨＢ生成に好適に用いられる。Lactococcus属は、例えばポリ乳酸の原料生成に好適に用いられる。Acetobacter属は、例えばセルロース生成に好適に用いられる。Escherichia
coliおよびBachillus subtilisは、例えば遺伝子組み換え菌株として好適に用いられる。Pseudomonas属およびSphingomonas属は、例えば汚染有機化合物の分解に好適に用いられる。Corynebacterium属は、例えば廃水処理、二酸化炭素の回収に好適に用いられる。Synechococcus属およびBotryococcus属は、例えば光合成（油分合成）に好適に用いられる。Chlamydomonas属は、例えば水素生成に好適に用いられる。Cryptococcus属は、例えばバイオディーゼル製造に好適に用いられる。Zymomonus属は、例えばエタノール生成に好適に用いられる。Methanosarcina属は、例えばメタン生成に好適に用いられる。Methylosinus属は、例えばメタノール生成、塩素化合物生成に好適に用いられる。
【００４２】
本発明において利用され得る微生物は上記に限定されず、目的に応じて任意の適切な微生物が採用され得る。本発明によって分離された微生物は、種々の物質（例えば、医薬品、診断薬、ファインケミカル、光学活性体、汎用樹脂、エタノール、メタン、油脂）の生産用途；ならびに、排水・下水・生ごみ処理、好気有機廃棄物処理・嫌気有機廃棄物処理による土壌処理などの環境保全・環境浄化・衛生管理に好適に利用され得る。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の微生物単離装置は、例えば、創薬の材料、食品・化成品などの材料、環境浄化・環境センシング材料などの有用微生物の探索や評価に好適に利用され得る。分離された微生物は、微生物リアクターに好適に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の好ましい実施形態による微生物単離装置の全体的な構成を説明する概略斜視図である。
【図２】本発明の好ましい実施形態による微生物単離装置に用いられるディフューザー型マイクロポンプの流路方向の概略断面図である。
【図３】（ａ）および（ｂ）は、流路にかけられるパルス状圧力のパルス形状を説明する模式図である。
【図４】流路の合流部における微粒子形成過程のメカニズムを説明する模式図である。
【図５】本発明の別の実施形態による微生物単離装置の流路形状を説明する概略平面図である。
【図６】図５の実施形態における流路の合流部での微粒子形成過程のメカニズムを説明する模式図である。
【符号の説明】
【００４５】
１００    微生物単離装置
１ａ  微生物供給部
１ｂ  接触液供給部
２ａ  微生物供給流路
２ｂ  接触液供給流路
５    微粒子生成部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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