(57)【要約】      （修正有）【課題】血液凝固異常を伴う疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段の提供。【解決手段】血液凝固第Ｘ因子遺伝子の、８３１３Ｃおよび１９８１９Ａ（いずれも、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＦ５０３５１０記載の該遺伝子のゲノム塩基配列における位置と変異後の塩基で表示）で表される１塩基変異の検出を特徴とする、血液凝固異常（血液凝固時間の短縮または延長）を引き起こす遺伝子変異の検出方法；該１塩基変異の検出方法；該検出方法を利用した疾患罹患危険率検査方法、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性を予測する方法、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、並びに血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法；および該変異を有する遺伝子、前記方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の下記の群から選ばれる１塩基変異を検出することを特徴とする、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法：
（１）第８３１３位の塩基がシトシンである；
（２）第１９８１９位の塩基がアデニンである；
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項２】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の１塩基変異が、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異であり、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異が、血液凝固時間の短縮を引き起こす遺伝子変異である請求項１に記載の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項３】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の１塩基変異が、第１９８１９位の塩基がアデニンである１塩基変異であり、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異が、血液凝固時間の延長を引き起こす遺伝子変異である請求項１に記載の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項４】
下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物を制限酵素処理する工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＤＮＡ断片のサイズを比較する工程。
【請求項５】
下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドを用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項６】
下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第１９８１９位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物を制限酵素処理する工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＤＮＡ断片のサイズを比較する工程。
【請求項７】
下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第１９８１９位の塩基がアデニンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドを用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項８】
請求項４から７のいずれか１項に記載の１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする請求項１に記載の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法。
【請求項９】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項１０】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的核酸プローブ（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項１１】
血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。
【請求項１２】
配列表の配列番号３から配列番号１２のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１、２、３および８のいずれか１項に記載の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法。
【請求項１４】
血液凝固異常が向血栓性の血液凝固異常である請求項１３に記載の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法。
【請求項１５】
向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患が冠動脈疾患、深部静脈血栓症、または脳梗塞である請求項１３に記載の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法。
【請求項１６】
血液凝固異常が出血傾向を伴う血液凝固異常である請求項１３に記載の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法。
【請求項１７】
請求項１、２、３および８のいずれか１項に記載の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性を予測する方法。
【請求項１８】
請求項１、２、３および８のいずれか１項に記載の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤を選択する方法。
【請求項１９】
請求項１、２、３および８のいずれか１項に記載の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに請求項１１および１２に記載のポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つを含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子の１塩基変異の解析による、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法に関する。また、前記検出方法を利用する血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法に関する。さらに、前記検出方法を利用する血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性を予測する方法に関する。また、前記検出方法を利用する血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤を選択する方法に関する。さらに、前記検出方法を利用する血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法に関する。また、前記１塩基変異を有する遺伝子、並びに前記方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固第Ｘ因子（以下、単に第Ｘ因子と称する）は、血液凝固過程に係る一連のプロテアーゼの１つである。生体内の血液凝固は、２つの経路により担われている。第１の経路は、内因系と呼ばれ、第ＸＩＩ因子と異物面の接触による活性化に始まり、トロンビンを形成する。第２の経路は、外因系と呼ばれ、組織液中の組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ）と第ＶＩＩ因子による第Ｘ因子の活性化に始まり、速やかにトロンビンを形成する。内因系および外因系の両経路において、トロンビンは第Ｘ因子によるプロトロンビンの限定分解により形成される。すなわち、第Ｘ因子は、内因系および外因系の合流点に位置し、血液凝固の中心的役割を果たしている。トロンビンはフィブリノゲンを限定分解してフィブリンを生成する。フィブリンは生理的条件化で重合してフィブリンポリマーを形成する。トロンビンはさらにカルシウムイオン（以下、Ｃａ２＋と称する）の共存下に第ＸＩＩＩ因子を活性化して第ＸＩＩＩａ因子とする。第ＸＩＩＩａ因子はフィブリン分子に結合してフィブリン分子の架橋を行い安定化フィブリンを形成する。このようにしてフィブリンクロットが形成されることにより血液凝固が完了する。
【０００３】
第Ｘ因子は、肝臓で合成される血漿ビタミンＫ依存性のセリンプロテアーゼ前駆体であり、血液凝固因子活性化反応の過程で、前段階の活性化凝固因子によりペプチド鎖のアルギニンまたはリジンのＣ末端側が切断されて、活性化第Ｘ因子（第Ｘａ因子）に転換される。具体的には、第Ｘ因子は内因系に係る酵素（第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、リン脂質およびＣａ２＋）または外因系に係る酵素（第ＶＩＩａ因子、組織因子、リン脂質およびＣａ２＋）により活性化され、活性化第Ｘ因子となる。生成した第Ｘａ因子は、第Ｖａ因子、リン脂質およびＣａ２＋と共にプロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロンビンを活性化する。また、第Ｘａ因子は第ＶＩＩ因子を活性化させて正のフィードバックを行う。一方、第Ｘａ因子はアンチトロンビンＩＩＩや外因系凝固阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＴＦＰＩ）により阻害される。ＴＦＰＩの強い抗血栓性作用が、動物実験あるいは培養細胞を用いた実験で報告されている。
【０００４】
第Ｘ因子を阻害することにより効率的に血液凝固を阻害できることから、近年、第Ｘ因子の特異的合成阻害剤の開発が行われ、抗血栓薬として注目されている。
【０００５】
一方、第Ｘ因子の先天性欠乏症が知られている。第Ｘ因子の先天性欠乏症において、第Ｘ因子遺伝子のヘテロ接合体では無症状が多いが、ホモ接合体あるいは複合へテロ接合体では出血傾向を示す。
【０００６】
また、第Ｘ因子遺伝子の１塩基変異が多数報告されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列において、アミノ酸変異を伴わない１塩基変異がエキソン中およびイントロン中に見出されたことが公開されており表１がその例である（非特許文献１〜５）。また、アミノ酸変異を伴う変異も報告されている（表２、非特許文献１６〜２４）。その他、第Ｘ因子遺伝子の多型に係る発明が特許出願されている（特許文献１）。しかしながら、これら１塩基変異と血液凝固または血液凝固異常との明確な関連については報告されていない。
【０００７】
【表１】
2006081418.tif 000002
【０００８】
以下の表２に要約する第Ｘ因子の１塩基変異に伴う機能変化は、出血若しくは出血傾向という表現型より見出された一例報告のみであり、遺伝子多型データベース（ｄｂＳＮＰ）に登録されているものはない。
【０００９】
【表２】
2006081418.tif 000003
表２中、変異アミノ酸位置は、第Ｘ因子遺伝子産物のアミノ酸配列中で該因子が成熟蛋白質になるときに限定分解を受ける部位（第４０番目のアルギニン（Ｒ）と第４１番目のアラニン（Ａｌａ）の間）のＣ末端側のアミノ酸（第４１番目のアラニン（Ａｌａ））を１とし、Ｎ末端側のアミノ酸（第４０番目のアルギニン（Ｒ））を−１としたときの位置で表示した。また、変異体名の項の「−」は、名称がつけられていないことを示す。
【００１０】
生体内では血管が損傷した場合、血管の機能、血小板機能、凝固・線溶系等の密接な相互作用のもとに生理的な止血機構が働く。止血機構の異常は各種の出血性疾患や血栓性疾患等の原因になる。例えば、活性酸素による血管内皮細胞の障害と剥離、血流の変化（低下）および血液凝固能の亢進等により血栓性疾患が引き起こされる。
【００１１】
血栓性疾患は、血栓による血管の狭窄あるいは閉塞に起因する疾患であり、血栓症と塞栓症とに分類できる。血栓症は、血栓がその形成箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状であり、塞栓症は血栓がその形成箇所から剥がれて血流により移動し、他の箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状をいう。向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患として冠動脈疾患、深部静脈血栓症、または脳梗塞があげられる。
【００１２】
冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＡＤと略称する）は、冠状動脈の閉塞による疾患として知られている。ＣＡＤは虚血性心疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、心筋への血液供給が著しく減少するため、心筋梗塞、狭心症あるいは不整脈等の症状が引き起こされる。
【００１３】
脳動脈の閉塞による疾患としては脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）が挙げられる。脳卒中は、虚血性脳血管障害と出血性脳血管障害の総称である。出血性脳血管障害には脳内出血やくも膜下出血等が含まれる。虚血性脳血管障害には脳梗塞や一過性脳虚血発作等が含まれる。脳梗塞は、脳卒中のなかに占める割合が高い。脳梗塞はその原因により２つ、すなわち脳血栓によるものと脳塞栓によるものとに大別される。脳血栓は脳の血管が動脈硬化等の変化により狭窄し、血流が悪くなって血栓を形成することに起因する。脳塞栓は心臓内や頚動脈において形成された血栓が血流により脳血管に運ばれた結果、脳血管の閉塞を起こすことに起因する。脳梗塞は心原性と非心原性に分類されるが、いずれも抗凝固薬が有効であることが示されている。
【００１４】
末梢動脈の閉塞により疾患として末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＰＡＤと略称する）が知られている。ＰＡＤは、ほとんどの患者ではアテローム性動脈硬化が基礎にあり、ＣＡＤおよび心原性を除く脳梗塞と病態生理学的には極めて近いと考えられている。急性の虚血は近位の動脈硬化性プラークの破裂、先在するアテローム動脈硬化による急性血栓症、心臓、大動脈または他の大型の脈管から飛来した塞栓、動脈瘤解離が原因である。慢性の虚血はアテローム性プラークが徐々に拡大することにより起こるとされている。
【００１５】
静脈血栓症は全身の表在性や深部のどの静脈にも起こり得るが、下腿静脈、大腿静脈、骨盤内深在静脈などの深部静脈血栓症（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、以下ＤＶＴと略称する）は頻度も多く、致命的となり得る肺塞栓を生じる可能性があり臨床的に重要である。ＤＶＴでは、血管内皮細胞の傷害によりコラーゲンが露出し、組織トロンボブラスチンが放出され、ここにうっ血を伴うと血液凝固が亢進して血栓が形成すると考えられている。実際、抗凝固薬（ヘパリンやワーファリン等）は血栓の形成や拡大を妨げることから、本病態には血液凝固系の亢進が極めて大きな役割を果たすことは明らかである。
【００１６】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ００／３４５１５号パンフレット。
【非特許文献１】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、１塩基多型（ＳＮＰ）公開データベース、ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ３２１１７７２、［平成１６年８月２０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ＞
【非特許文献２】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、１塩基多型（ＳＮＰ）公開データベース、ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ５９６２、［平成１６年８月２０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ＞
【非特許文献３】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、１塩基多型（ＳＮＰ）公開データベース、ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ３２１１７３６、［平成１６年８月２０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ＞
【非特許文献４】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、１塩基多型（ＳＮＰ）公開データベース、ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ３２１１７３７、［平成１６年８月２０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ＞
【非特許文献５】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、１塩基多型（ＳＮＰ）公開データベース、ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ２２５１１０２、［平成１６年８月２０日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ＞
【非特許文献６】Ｗａｔｚｋｅ  Ｈ．Ｈ．  ｅｔ．ａｌ．、「ザ  ジャーナル  オブ  クリニカルインベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９１年、第８８巻、ｐ．１６８５−１６８９。
【非特許文献７】Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ａ．Ｅ．  ｅｔ．ａｌ．、「ザ  ジャーナル  オブ    バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９６年、第２７１巻、ｐ．２８６０１−２８６０６。
【非特許文献８】Ｗａｔｚｋｅ  Ｈ．Ｈ．  ｅｔ．ａｌ．、「ザ  ジャーナル  オブ    バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」１９９０年、第２６５巻、ｐ．１１９８２−１１９８９。
【非特許文献９】Ｋｉｍ  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ．ａｌ．、「ヒューマン  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９５年、第９５巻、ｐ．２１２−２１４。
【非特許文献１０】Ｐｉｎｏｔｔｉ  Ｍ．  ｅｔ．ａｌ．、「トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、２００２年、第８８巻、ｐ．２３６−２４１。
【非特許文献１１】Ｎｏｂａｕｅｒ−Ｈｕｈｍａｎｎ  Ｉ．Ｍ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブラッド  コアギュレーション  アンド  フィブリノリシス（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）」、１９９８年、第９巻、ｐ．１４３−１５２。
【非特許文献１２】Ｚａｍａ  Ｔ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１０６巻、ｐ．８０９−８１１。
【非特許文献１３】Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ  Ｇ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９５年、第９０巻、ｐ．９１０−９１５。
【非特許文献１４】Ｗａｔｚｋｅ  Ｈ．Ｈ．  ｅｔ．ａｌ．、「トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、１９９３年、第６９巻、ｐ．７５２。
【非特許文献１５】Ｗａｌｌｍａｒｋ  Ａ．  ｅｔ．ａｌ．、「トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、１９９１年、第６５巻、ｐ．１２６３。
【非特許文献１６】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｅ．  ｅｔ．ａｌ．、「インターナショナル  ジャーナル  オブ  ヘマトロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第７３巻、ｐ．３９０−３９２。
【非特許文献１７】Ｒｅｄｄｙ  Ｓ．Ｖ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９８９年、第７４巻、ｐ．１４８６−１４９０。
【非特許文献１８】Ｍｉｌｌａｒ  Ｄ．Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．、「ヒューマン  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２０００年、第１０６巻、ｐ．２４９−２５７。
【非特許文献１９】Ｍｅｓｓｉｅｒ  Ｔ．Ｌ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブラッド  コアギュレーション  アンド  フィブリノリシス（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）」、１９９６年、第７巻、ｐ．５−１４。
【非特許文献２０】Ｍｉｙａｔａ  Ｔ．  ｅｔ．ａｌ．、「トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、１９９８年、第７９巻、ｐ．４８６−４９０。
【非特許文献２１】Ｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｏ  Ｖ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９８８年、第６９巻、ｐ．３８７−３９１。
【非特許文献２２】Ｊａｍｅｓ  Ｈ．Ｌ．  ｅｔ．ａｌ．、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９１年、第７７巻、ｐ．３１７−３２３。
【非特許文献２３】Ｄｅａｍ  Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．、「トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、２００１年、第８５巻、ｐ．２６５−２６９。
【非特許文献２４】Ｄｅａｍ  Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．、「ジャーナル  オブ  トロンボーシス  アンド  ヘモスタシス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」、２００３年、第１巻、ｐ．６０３−６０５。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、血液凝固異常を引き起こす１塩基変異を第Ｘ因子遺伝子において見出し、さらに血液凝固異常を伴う疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列において新規な１塩基変異を見出した。具体的には、該１塩基変異は、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列における第８３１３番目のアデニン（Ａ）のシトシン（Ｃ）への１塩基変異である（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）。さらに、この１塩基変異により第Ｘ因子の血液凝固に対する活性が増加し、血液凝固時間が短縮されることを明らかにした。また、既に報告されている第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列における１塩基変異である第１９８１９番目のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への１塩基変異により、第Ｘ因子の発現が低減され、その結果、血液凝固時間が延長されることを明らかにした。そして、これら１塩基変異を、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法に利用すること、並びに血液凝固異常を伴う疾患の早期診断および罹患危険率判定のための検査方法に利用することにより本発明を完成した。
【００１９】
すなわち、本発明は、
１．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の下記の群から選ばれる１塩基変異を検出することを特徴とする、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法：
（１）第８３１３位の塩基がシトシンである；
（２）第１９８１９位の塩基がアデニンである；
（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
２．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の１塩基変異が、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異であり、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異が、血液凝固時間の短縮を引き起こす遺伝子変異である前記１．の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
３．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の１塩基変異が、第１９８１９位の塩基がアデニンである１塩基変異であり、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異が、血液凝固時間の延長を引き起こす遺伝子変異である前記１．の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
４．下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物を制限酵素処理する工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＤＮＡ断片のサイズを比較する工程、
５．下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドを用いてシークエンス法により決定する工程、
６．下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第１９８１９位の塩基がシトシンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物を制限酵素処理する工程、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られたＤＮＡ断片のサイズを比較する工程、
７．下記工程を含むことを特徴とする、血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子内の第１９８１９位の塩基がアデニンである１塩基変異の検出方法（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）：
（ｉ）配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドを用いてシークエンス法により決定する工程、
８．前記４から７のいずれかの１塩基変異の検出方法を用いることを特徴とする前記１．の血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法、
９．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド（ここで、塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
１０．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を検出可能な対立遺伝子特異的核酸プローブ（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
１１．血液凝固第Ｘ因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ）遺伝子のゲノム塩基配列において、第８３１３位の塩基がシトシンである１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表わされる遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする８個ないし５０個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ここで、各塩基の位置はＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）における位置として定義する）、
１２．配列表の配列番号３から配列番号１２のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
１３．前記１、２、３および８のいずれかの血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法、
１４．血液凝固異常が向血栓性の血液凝固異常である前記１３．の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法、
１５．向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患が冠動脈疾患、深部静脈血栓症、または脳梗塞である前記１３．の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法、
１６．血液凝固異常が出血傾向を伴う血液凝固異常である前記１３．の血液凝固異常を伴う疾患罹患危険率の検査方法、
１７．前記１、２、３および８のいずれかの血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性を予測する方法、
１８．前記１、２、３および８のいずれかの血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤を選択する方法、
１９．前記１、２、３および８のいずれかの血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を用いることを特徴とする、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤の用量を決定する方法、
２０．前記１０．の対立遺伝子特異的核酸プローブ並びに前記１１および１２．のポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つを含む試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出が可能になる。具体的には、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列における第８３１３番目の塩基に相当する塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異を検出することにより、血液凝固時間の短縮、すなわち向血栓性の傾向を引き起こす遺伝子変異を検出することができる。また、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列における第１９８１９番目の塩基に相当する塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異を検出することにより、血液凝固時間の延長、すなわち出血傾向を引き起こす遺伝子変異を検出することができる。
【００２１】
さらに、本発明に係る遺伝子変異の検出方法を用いて、血液凝固異常を伴う疾患の早期診断および罹患危険率判定を実施できる。本発明に係る遺伝子変異の検出方法により血液凝固時間の短縮を引き起こす遺伝子変異が検出された場合、向血栓性の傾向があり、血液凝固の亢進を伴う疾患、例えば血栓性疾患の罹患危険率が高いと判定できる。このような判定により、抗凝固薬の積極的服用や、抗凝固薬の用量を増加するといった調節を行うことができる。また、発症する前に該疾患の危険因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正を行なうことができる。本発明に係る遺伝子変異の検出方法により血液凝固時間の延長を引き起こす遺伝子変異が検出された場合、出血傾向の危険性があり、出血性疾患、例えば頭蓋内出血、消化管出血および網膜出血等の罹患危険率が高いと判定できる。このような判定により、抗凝固薬の用量を低減するといった調節を行うことができる。
【００２２】
このように本発明は、血液凝固異常を引き起こす危険性の検出、血栓性疾患や出血性疾患の診断、当該疾患の防止および治療のための検査、および抗凝固薬や止血薬の薬剤用量の調節のための検査等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異を、血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法として利用することにより達成したものである。さらに、本発明においては、該検出方法を用いることを特徴とする、血液凝固異常を伴う疾患の罹患危険率の検査方法を提供することができる。血液凝固異常を伴う疾患としては、血栓性疾患や出血性疾患を挙げることができる。血栓性疾患として具体的にはＣＡＤ、Ｓｔｒｏｋｅ、ＤＶＴおよびＰＡＤ等が例示できる。出血性疾患として具体的には頭蓋内出血、消化管出血および網膜出血等が例示できる。
【００２４】
本発明においては、第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異を判断する基準の配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０に記載された第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）を用いた。この基準の配列を参照配列と呼称することもある。１塩基変異が存在する塩基の位置は、この参照配列における塩基の位置として定義する。
【００２５】
血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異として、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第８３１３番目の塩基に相当する塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異が挙げられる。この１塩基変異により第Ｘ因子の血液凝固に対する活性が増加し、血液凝固時間が短縮された。すなわち、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第８３１３番目の塩基に相当する塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異は、血液凝固時間の短縮を引き起こす遺伝子変異である。この１塩基変異は今までに報告されておらず、初めて見出した新規な１塩基変異である。以下、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第８３１３番目の塩基に相当する塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異を８３１３Ｃと称することがある。
【００２６】
８３１３Ｃは、第Ｘ因子遺伝子のエキソン２に存在する。この１塩基変異により、第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第３９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に変異する。アミノ酸変異を伴う１塩基変異は蛋白質の構造変化を生じることがある。その結果、アミノ酸変異を伴う１塩基変異を有する第Ｘ因子は正常な第Ｘ因子と比較してその機能が変化することが予想される。第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第３９番目のアミノ酸は、第Ｘ因子が成熟蛋白質になるときに限定分解を受ける部位（第４０番目のアルギニン（Ｒ）と第４１番目のアラニン（Ａｌａ）の間）からＮ末端側に２個目のアミノ酸である。したがって、第Ｘ因子の生成過程および付近に存在する翻訳後修飾の程度が変化し、第Ｘ因子の血液凝固に対する活性に変化が生じた可能性があると考えられる。８３１３Ｃが、第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第３９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）のプロリン（Ｐｒｏ）への変異を伴うことから、この１塩基変異をＴｈｒ−２Ｐｒｏと称することがある。
【００２７】
血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異としてまた、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第１９８１９番目のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への１塩基変異が挙げられる。この１塩基変異により、第Ｘ因子の発現が低減され、その結果、血液凝固時間が延長した。すなわち、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第１９８１９番目の塩基に相当する塩基のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への１塩基変異は、第Ｘ因子の発現の低下およびその結果、血液凝固時間の延長を引き起こす遺伝子変異である。この１塩基変異により、例えば遺伝子転写産物の安定性の低下、転写活性の低下およびスプライシング異常等の異常が起き、その結果、第Ｘ因子の発現が低減された可能性があると考える。この１塩基変異は既に報告されているが、該１塩基変異が血液凝固異常に関連することは知られていない。以下、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第１９８１９番目の塩基に相当する塩基のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への１塩基変異を１９８１９Ａと称することがある。
【００２８】
１９８１９Ａは、第Ｘ因子遺伝子のエキソン５に存在する。この１塩基変異により、第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第１５２番目のアラニン（Ａｌａ）がトレオニン（Ｔｈｒ）に変異する。第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第１５２番目のアミノ酸は、第Ｘ因子が成熟蛋白質になるときに限定分解を受ける部位（第４０番目のアルギニン（Ｒ）と第４１番目のアラニン（Ａｌａ）の間）からＣ末端側に１１２個目のアミノ酸である。すなわち、当該アミノ酸は、第Ｘ因子成熟蛋白質において、Ｎ末端から第１１２番目のアミノ酸である。１９８１９Ａが、第Ｘ因子が成熟蛋白質なるときに限定分解を受ける部位からＣ末端側に１１２個目のアラニン（Ａｌａ）のトレオニン（Ｔｈｒ）への変異を伴うことから、この１塩基変異をＡｌａ１１２Ｔｈｒと称することがある。
【００２９】
第Ｘ因子遺伝子の１塩基変異は、表１および表２に例示するように、今までに多数報告されている。しかし、表１に例示する第Ｘ因子の１塩基変異はアミノ酸変異を伴わない１塩基変異であり（非特許文献１〜５）、これら１塩基変異と血液凝固または血液凝固異常との明確な関連については報告されていない。また、表２に要約する第Ｘ因子の１塩基変異に伴う機能変化は、出血若しくは出血傾向という表現型より見出された一例報告のみであり（非特許文献６〜２４）、遺伝子多型データベース（ｄｂＳＮＰ）に登録されているものはない。
【００３０】
本発明に係る１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏはアリル頻度も０．７％〜１．０％とＳＮＰｓに近く、その位置が成熟蛋白質になるための切断部位のきわめて近傍であることからプロセッシングに影響する可能性が考えられ、これに加えて−２をアルギニン（Ａｒｇ）に置換することで凝固活性に重要なＧｌａ修飾（特定アミノ酸部位の翻訳後修飾の１つであり、グルタミン酸残基のγ−カルボキシグルタミン酸への変換）が増強することが文献的に報告されている（「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第３７巻、ｐ．５０２９−５０３８；および「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第３９巻、ｐ．１４３２２−１４３２９）。またＡｌａ１１２Ｔｈｒのデータベース上のアリル頻度は３．５％（ｒｓ３２１１７７２）であることより、一例報告と比較してはるかに多くの個人がこの変異の影響を受けると考えられ、表２に列挙した変異群より臨床上はるかに重要と考えられる。
【００３１】
本発明に係る１塩基変異は、第Ｘ因子遺伝子の転写・翻訳やその遺伝子産物の活性の変化に重要な影響を与える。したがって、該１塩基変異は、第Ｘ因子遺伝子産物の異常に起因する疾患、例えば血液凝固異常を伴う疾患と深く関連すると考えている。
【００３２】
本発明に係る１塩基変異による第Ｘ因子遺伝子産物の異常として、例えば第Ｘ因子の発現の変化（低下、消失または増加）が挙げられる。第Ｘ因子の発現の変化は、該１塩基変異を有する第Ｘ因子ｃＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、該発現ベクターを用いて適当な細胞にトランスフェクションして第Ｘ因子を発現させ、該１塩基変異を有さない第Ｘ因子ｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクションしたときと第Ｘ因子の発現量を比較することにより、検出することができる。該１塩基変異を有する第Ｘ因子ｃＤＮＡを含む発現ベクターの作製、発現ベクターのトランスフェクション、および発現誘導は、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）を用いて実施できる。具体的には、該１塩基変異による第Ｘ因子遺伝子の発現の変化は、後述する実施例２を参照して検出することができる。
【００３３】
本発明に係る１塩基変異による第Ｘ因子遺伝子産物の異常としてまた、例えば第Ｘ因子の凝固活性の変化（増加、低下または消失）が挙げられる。第Ｘ因子の凝固活性の変化は、第Ｘ因子の凝固活性を反映する血液凝固を測定できる方法により検出することができる。このような測定方法として、例えば、プロトロンビン時間（ＰＴ）の測定や活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定等、好ましくはＰＴの測定が挙げられる。具体的には、後述する実施例３を参照して第Ｘ因子の凝固活性の変化を測定することができる。
【００３４】
ここで、血液凝固異常とは、正常な血液凝固反応と比較したときの、血液凝固に要する時間の短縮または延長を意味する。血液凝固に要する時間を、以下、単に血液凝固時間と称する。血液凝固異常とは、好ましくは、第Ｘ因子遺伝子産物の異常に起因する血液凝固時間の短縮または延長を意味する。さらに好ましくは、本発明に係る第Ｘ因子遺伝子の１塩基変異により生じる第Ｘ因子遺伝子産物の異常に起因する血液凝固時間の短縮または延長を意味する。
【００３５】
血液凝固時間の短縮または延長は、正常な血液における血液凝固時間との比較により検出することができる。血液凝固時間の測定は、公知の血液凝固時間測定法により測定することができる。好ましくは、第Ｘ因子の凝固活性を反映する血液凝固を測定できる方法を用いる。このような測定方法として、例えば、ＰＴの測定やＡＰＴＴの測定等、好ましくはＰＴの測定が挙げられる。具体的には、後述する実施例３を参照して血液凝固時間を測定することができる。
【００３６】
本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、上記知見に基づいて達成したものであり、ヒトの第Ｘ因子遺伝子内の１塩基変異が存在する位置における塩基を決定し、その塩基の種類を正常遺伝子のものと比較することにより、血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異を検出することを特徴とする。
【００３７】
塩基の決定は、ヒト第Ｘ因子遺伝子の塩基配列の次の位置に相当する塩基について行なう：好ましくは第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）における第８８１３位および第１９８１９位である。塩基の決定はこれら位置の１つまたは２つについて行なう。
【００３８】
塩基の決定方法は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により、所望の位置の塩基を含む第Ｘ因子遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。本発明に係る１塩基変異の解析はこれら方法に限らず、自体公知の方法を適用して実施できる。１塩基変異の解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）が知られている。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法としては、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等が例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ  ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）およびタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００３９】
被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは組織等から調製した核酸試料を用いる。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれも使用できる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ｃＤＮＡまたはＲＮＡを用いて１塩基変異を検出する場合は、ゲノム塩基配列において１塩基変異が存在する位置に対応する、ｃＤＮＡまたはＲＮＡにおける位置の塩基の決定を行なう。
【００４０】
本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、具体的には以下のように実施できる。８８１３Ｃの検出は、例えば、第Ｘ因子遺伝子のゲノムＤＮＡについて、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物を制限酵素処理した後に、得られたＤＮＡ断片のサイズを比較することにより実施できる。制限酵素処理に用いる制限酵素としてＡｖａＩＩが例示できる。また、８８１３Ｃの検出は、例えば、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ついで得られた増幅産物の配列を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定することにより実施できる。同様に、１９８１９Ａの検出は、ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素処理した後に、得られたＤＮＡ断片のサイズを比較することにより実施できる。また、１９８１９Ａの検出は、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ついで得られた増幅産物の配列を、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定することにより実施できる。
【００４１】
８８１３Ｃおよび１９８１９Ａはまた、対立遺伝子特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により検出することもできる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ塩基配列の差に基づく差異を有する２個以上の遺伝子をいう。
【００４２】
核酸プローブとしては、第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列において８８１３Ｃ、または１９８１９Ａで表される１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、被検試料中において１塩基変異を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件が例示できる。
【００４３】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、８８１３Ｃまたは１９８１９Ａで表される１塩基変異を有する第Ｘ因子遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異を有する塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異を示す位置の塩基を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブと対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであれば用いることができる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【００４４】
本発明に係る血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血液凝固異常を伴う疾患の罹患危険率の検査方法を実施することができる。また、本遺伝子変異の検出方法を用いて、血液凝固異常を伴う疾患の早期診断を実施できる。
【００４５】
第Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異は、血液凝固時間の短縮を引き起こす遺伝子変異である。さらに、この１塩基変異の頻度が、健常人と比較してＣＡＤ患者で高いことを明らかにした（実施例１の表３を参照）。したがって、Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異は、向血栓性の血液凝固異常に関連すると考える。
【００４６】
このように、第Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異の検出方法を用いることにより、向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患の罹患危険率の検査を実施できる。向血栓性の血液凝固異常として、好ましくはＣＡＤ、Ｓｔｒｏｋｅ、ＤＶＴおよびＰＡＤ等を、より好ましくはＣＡＤを例示できる。
【００４７】
第Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異は、第Ｘ因子の発現の低下およびその結果、血液凝固時間の延長を引き起こす遺伝子変異である。したがって、Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異は、出血傾向の血液凝固異常に関連すると考える。
【００４８】
このように、Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異の検出方法を用いることにより、出血傾向の血液凝固異常を伴う疾患の罹患危険率の検査を実施できる。出血傾向の血液凝固異常として、例えば頭蓋内出血、消化管出血および網膜出血等を例示できる。
【００４９】
疾患の罹患危険率は、試料中の第Ｘ因子遺伝子の塩基配列を、参照配列と比較することにより判定できる。参照配列として、好ましくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０３５１０に記載されたヒト第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列（配列番号１）を用いることができる。あるいは、健常人または第Ｘ因子遺伝子の異常がない疾患の患者由来の核酸試料に含まれる第Ｘ因子遺伝子の塩基配列を用いることがより好ましい。具体的には、被検試料中の第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列第８８１３位および／または第１９８１９位に相当する位置の塩基を決定し、当該位置における塩基の種類を参照配列と比較する。その結果、参照配列ではアデニン（Ａ）である第８８１３位の塩基が異なる塩基、例えばシトシン（Ｃ）であると認められたとき、および／または参照配列ではグアニン（Ｇ）である第１９８１９位の塩基が異なる塩基、例えばアデニン（Ａ）であると認められたときには、血液凝固異常を伴う疾患罹患率が高いと判定することができる。これらの変異は対立遺伝子の双方で検出されてもよく、一方のみで検出されてもよい。
【００５０】
本発明に係る血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性の予測方法を実施することができる。例えば、第Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異が検出された場合、向血栓性の血液凝固異常を生じる可能性があることから、血栓性疾患の予防および／または治療剤に対する反応性は、該１塩基変異が検出されない場合と比較して、低いと予測できる。一方、第Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異が検出された場合、出血性疾患の予防および／または治療剤に対する反応性は、該１塩基変異が検出されない場合と比較して、高いと予測できる。また、例えば、第Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異が検出された場合、出血傾向の血液凝固異常を生じる可能性があることから、出血傾向の血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤に対する反応性は、該１塩基変異が検出されない場合と比較して、低いと予測できる。一方、血栓性疾患の予防および／または治療剤に対する反応性は、該１塩基変異が検出されない場合と比較して、高いと予測できる。
【００５１】
本発明に係る血液凝固異常を引き起こす可能性を有する遺伝子変異の検出方法を用いることにより、さらに、血液凝固異常を伴う疾患の予防および／または治療剤の選択方法、および該予防および／または治療剤の用量を決定する方法を実施できる。例えば向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患において第Ｘ因子遺伝子の第８８１３位の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への１塩基変異が検出された場合、該疾患の予防および／または治療剤として、抗Ｘａ薬を選択することができる。また、抗Ｘａ薬の用量の調節が可能になる。一方、例えば、出血傾向の血液凝固異常を伴う疾患において第Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への１塩基変異が検出された場合、第Ｘ因子の服用を選択することができる。また、第Ｘ因子の用量の調節が可能になる。
【００５２】
本発明は、第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列第８８１３位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有する第Ｘ因子遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、上記対立遺伝子特異的なプローブやプライマーも提供できる。例えば、８８１３Ｃを検出するためのプライマーとして、配列番号３および４に記載の各塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせ、並びに配列番号５および６に記載の各塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。さらに、１９８１９Ａを検出するためのプライマーとして、配列番号７および８に記載の各塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。また、第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列第８８１３位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有する第Ｘ因子遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを作製するためのプライマーとして、配列番号９および１０に記載の各塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。さらに、第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列第１９８１９位がアデニン（Ａ）である１塩基変異を有する第Ｘ因子遺伝子の塩基配列または該塩基配列に相補的塩基配列を有するポリヌクレオチドを作製するためのプライマーとして、配列番号１１および１２に記載の各塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。本発明において、ポリヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドからなるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチドからなるポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）が含まれる。リボヌクレオチドは修飾されたリボヌクレオチドであってもよい。
【００５３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体的な塩基配列に関わる情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得することができる。具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。その他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。また、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）や５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等を利用することもできる。このような方法で得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定（以下、シークエンシングと称することもある）は、常法、例えばジデオキシ法（「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシークエンスキット等を用いて実施できる。
【００５４】
より具体的には、第Ｘ因子遺伝子のゲノム塩基配列第８８１３位がシトシン（Ｃ）である１塩基変異を有する第Ｘ因子ｃＤＮＡの塩基配列を有するポリヌクレオチドは、後述する実施例２を参照して作製できる。
【００５５】
プローブやプライマーは、８８１３Ｃまたは１９８１９Ａで表される１塩基変異を有する第Ｘ因子遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製することができる。
【００５６】
上記ポリヌクレオチド、上記プロ−ブおよび上記プライマーは、いずれも試薬として使用できる。また、これらの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、１塩基変異検出用の標識物質、緩衝液、並びに塩等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬および試薬キットは、本発明に係る検出方法および検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
また、実施例に記載した実験は、試料提供者である患者のインフォームドコンセントを得て行なった。
【実施例１】
【００５８】
（第Ｘ因子遺伝子の塩基配列解析およびタイピング）
第Ｘ因子遺伝子のエキソン２およびエキソン５について、それぞれの塩基配列における変異の検出をゲノムＤＮＡ試料を用いて行なった。ゲノムＤＮＡ試料は冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者から供与された。変異の検出は、試料中のゲノムＤＮＡから第Ｘ因子遺伝子のエキソン２およびエキソン５を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列を決定した後、決定された塩基配列と第Ｘ因子遺伝子の参照配列とを比較することにより実施した。第Ｘ因子遺伝子の参照配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０として登録されている血液凝固の異常を伴うゲノムＤＮＡ（配列番号１）を使用した。塩基配列の決定は、ダイターミネータ法により行った。
【００５９】
また、ＣＡＤ患者および健常人由来のゲノムＤＮＡ試料を用いて、第Ｘ因子遺伝子のタイピングを行った。ＣＡＤ患者由来のゲノムＤＮＡ試料については、第Ｘ因子遺伝子エキソン２のタイピングを制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法またはシークエンス法により行った。健常人由来のゲノムＤＮＡ試料については、第Ｘ因子遺伝子エキソン２のタイピングをＲＦＬＰ解析法により行った。また、第Ｘ因子遺伝子エキソン５のタイピングはシークエンス法により行った。
【００６０】
ダイターミネータ法によるシークエンシングは次のように行った。まず、第Ｘ因子遺伝子エキソン２およびエキソン５の増幅をＰＣＲにより行なった。ＰＣＲ用プライマーは、該遺伝子ゲノム塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０）のエキソン２およびエキソン５それぞれの上流および下流の塩基配列に基づいて設計し作製した。使用したＰＣＲ用プライマーの配列を以下に示す。
【００６１】
エキソン２を増幅するためのＰＣＲプライマー
フォワードプライマー（領域：８１８７−８２０７）
５´−ＣＡＴＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＴＡＧ−３´（配列番号５）
リバースプライマー（領域：８５３８−８５５７）
５´−ＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＧＣＡＣ−３´（配列番号６）
【００６２】
エキソン５を増幅するためのＰＣＲプライマー
フォワードプライマー（領域：１９６５５−１９９７５）
５´−ＴＧＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧ−３´（配列番号７）
リバースプライマー（領域：１９９７０−１９９９０）
５´−ＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＧ−３´（配列番号８）
【００６３】
ＰＣＲは具体的には、ゲノムＤＮＡサンプル２μｌを使用し、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて１０μｌの反応系で下記の条件にて行なった。
【００６４】
ＰＣＲ条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ６４℃      ３０秒間
４）  ７２℃        １分間
２）から４）の工程は３５サイクル行なった。
５）  ７２℃        ３分間
６）    ４℃で冷却
【００６５】
エキソン５については、上記ＰＣＲで十分な増幅が認められなかったため、ゲノムＤＮＡサンプル５μｌを使用し、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて１０μｌの反応系で下記の条件にてＰＣＲを行なった。
【００６６】
ＰＣＲ条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ６４℃      ３０秒間
４）  ７２℃        １分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃        ３分間
６）    ４℃で冷却
【００６７】
ＰＣＲ増幅産物をＥｘｏＳＡＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製後にシークエンシングを行った。
【００６８】
精製ＰＣＲ産物を鋳型としてダイターミネータ法によるシークエンシングを次のように行った。シークエンス反応は、シークエンスプライマーおよびＭｅｇａＢＡＣＥ  ＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、その後、反応産物をＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製）により精製した。シークエンスプライマーとして、上記ＰＣＲプライマーと同じプライマーを使用した。シークエンサーは、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【００６９】
得られた配列データを波形データ（ｓｃｆファイル）として表し、該データを用いて、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／ＰｏｌｙＰｈｒｅｄソフトウエアを使用して各塩基の精度の算出並びにアセンブルおよび多型塩基の検出を行った。参照配列としてＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバーＡＦ５０３５１０として登録されている第Ｘ因子遺伝子の塩基配列（配列番号１）および塩基位置を使用した。ＰｏｌｙＰｈｒｅｄは、Ｐｈｒｅｄにより処理された波形ファイルをＰｈｒａｐによりアセンブルし、そのアセンブルデータからヘテロまたはホモ多型、ヘテロ欠失・挿入多型を検出するソフトウエアである。多型検出条件は、両端低クオリティー領域のクオリティーカット値（ｑ値）を３０から２５に下げた以外はＰｏｌｙＰｈｒｅｄのデフォルト値を用いた。ＰｏｌｙＰｈｒｅｄが検出した多型塩基は目視確認し、明らかに多型波形でないものは除いた。また、ＰｏｌｙＰｈｒｅｄでは多型として検出できないホモ多型およびホモ欠失・挿入多型については、マニュアル作業により参照配列と異なる塩基を見出し、波形の目視確認を行った後に、多型と同定した。上記選択した多型のうち、フォワードおよびリバース両データが存在する部分については、両データの変異が一致する多型のみを検出した。また、フォワードまたはリバースの一方のデータしか存在しない部分ではすべての多型を検出した。
【００７０】
ＲＦＬＰ解析法によるタイピングは、次のように行った。まず、第Ｘ因子遺伝子のエキソン２の増幅をＰＣＲにより行なった。ＰＣＲ用プライマーは、第Ｘ因子遺伝子の塩基配列（配列番号１）に基づいて制限酵素部位ＡｖａＩＩを挟むように設計し合成により作製した。使用したＰＣＲ用プライマーの塩基配列、ＰＣＲ反応液およびＰＣＲ条件を以下に示す。
【００７１】
ＰＣＲプライマー
フォワードプライマー
５´−ＡＣＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＴＴＡＧ−３´（配列番号３）
リバースプライマー
５´−ＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＴＣ−３´（配列番号４）
【００７２】
ＰＣＲ反応液
クエン酸加全血                    ０．５  μＬ
５×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ−Ａ        ５      μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍＭ）        ２      μＬ
ＰＣＲフォワードプライマー        １．２５μＬ
ＰＣＲリバースプライマー          １．２５μＬ
ｒＴａｑ                          ０．２５μＬ
蒸留水                          １５．２５μＬ
───────────────────────
総量                          ２５．５  μＬ
【００７３】
ＰＣＲ条件
１）  ８０℃      １５    分間
２）  ９４℃        ４．５分間
３）  ９４℃      ３０    秒
４）  ６３℃        １    分間
５）  ７２℃        １    分間
３）から５）の工程は４０サイクル行なった。
６）  ７２℃        ７分間
７）    ４℃で冷却
【００７４】
ＰＣＲ産物は、下記反応液中で３０℃にて４時間以上インキュベーションすることにより制限酵素処理してＡｖａＩＩ部位で切断し、次いで電気泳動で展開してＤＮＡ断片の検出を行った。
【００７５】
反応液
１０×ＶｐａＫ１１ＢＩバッファー    １    μＬ
ＶｐａＫ１１ＢＩ                    ０．２μＬ
ＰＣＲ産物                          １．５μＬ
蒸留水                              ７．３μＬ
───────────────────────
総量                            １０    μＬ
【００７６】
第Ｘ因子遺伝子の塩基配列解析およびタイピングの結果、第Ｘ因子遺伝子のエキソン２においてアミノ酸変異を伴う１塩基変異が検出された。
【００７７】
エキソン２における１塩基変異は、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）においてその第８３１３番目のアデニン（Ａ）がシトシン（Ｃ）に変異していた。この１塩基変異により、第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第３９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に変異する。第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第３９番目のアミノ酸は、第Ｘ因子が活性化されて限定分解を受ける部位からＮ末端側に２つめのアミノ酸である。以下、この変異を、Ｔｈｒ−２Ｐｒｏと称することがある。この１塩基変異は今までに報告されておらず、初めて見出した新規な１塩基変異である。
【００７８】
エキソン５における１塩基変異は、第Ｘ因子遺伝子ゲノム塩基配列（配列番号１）においてその第１９８１９番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していた。この１塩基変異により、第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号２）中第１５２番目のアラニン（Ａｌａ）がトレオニン（Ｔｈｒ）に変異する。以下、この変異を、Ａｌａ１１２Ｔｈｒと称することがある。この１塩基変異は既に報告されている。
【００７９】
エキソン２で検出された上記１塩基変異の、健常人およびＣＡＤ患者における頻度を検討した。その結果、エキソン２における１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏの頻度が、健常人と比較してＣＡＤ患者で高いことが判明した（表３）。
【００８０】
【表３】
2006081418.tif 000004
【実施例２】
【００８１】
（第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異の第Ｘ因子発現への影響）
実施例１で検出された第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異が、第Ｘ因子発現に及ぼす影響について検討した。
まず、野生型および１塩基変異型第Ｘ因子発現ベクターを作製した。野生型第Ｘ因子発現ベクターは、野生型第Ｘ因子ｃＤＮＡをｐＣＭＶベクターに組込むことにより作製した。１塩基変異型第Ｘ因子発現ベクターは、１塩基変異Ｔｈｒ−２ＰｒｏおよびＡｌａ１１２ＴｈｒをそれぞれプライマーセットＡおよびＢを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で導入することにより作製した。
【００８２】
プライマーセットＡ（Ｔｈｒ−２Ｐｒｏ用）
５´−ＧＧＡＡＴＴＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＡＧ−３´（配列番号９）
５´−ＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＡＡＴＴＣＣ−３´（配列番号１０）
【００８３】
プライマーセットＢ（Ａｌａ１１２Ｔｈｒ用）
５´−ＧＧＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣ−３´（配列番号１１）
５´−ＧＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＧＴＡＣＡＣＣ−３´（配列番号１２）
【００８４】
野生型第Ｘ因子発現ベクターおよび各変異型第Ｘ因子発現ベクターを、それぞれ細胞にトランスフェクションし、第Ｘ因子を発現させた。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞にＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて各発現ベクターをそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭ中でビタミンＫ１（６μｇ／ｍｌ）存在下に培養を行った。培養は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で行った。４８時間後、細胞培養上清を回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ登録商標  ＹＭ−３０で濃縮し、測定まで−８０℃で保存した。
【００８５】
得られた細胞培養上清中に含まれる野生型第Ｘ因子または変異型第Ｘ因子を、ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ  Ｘ：Ａｇ（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ  ＳＴＡＧＯ社製）を用いてその使用説明書に従い、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）にて測定した。
【００８６】
検討は２回行い、その平均値を比較した。エキソン５における１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒを有する変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の変異型第Ｘ因子量は約２．５３ｎｇ／μＬであった（図１）。それに対して、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の第Ｘ因子量は約７．４０ｎｇ／μＬであった。一方、エキソン２における１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏを有する変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の変異型第Ｘ因子量は、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の第Ｘ因子量と差がなかった。
【００８７】
このように、エキソン５における１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒにより、第Ｘ因子の発現が１／３程度に低減されることが判明した（図１）。１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒが第Ｘ因子の発現を低減させることは、今までに報告されていない。一方、エキソン２における１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏは、第Ｘ因子の発現に影響しないことが判明した。
【実施例３】
【００８８】
（第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異の血液凝固への影響）
実施例２で作製した変異型第Ｘ因子発現ベクターまたは野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を用いて、第Ｘ因子遺伝子における１塩基変異の血液凝固への影響を検討した。血液凝固の測定は、プロトロンビン時間（ＰＴ）の測定により行った。
【００８９】
ＰＴの測定は、被検体にカルシウムイオンと組織トロンボプラスチンを添加して凝固時間を測定することにより、外因性凝固系に関与するファクター、例えばプロトロンビンや第Ｘ因子の凝固活性を検査する方法である。
【００９０】
具体的には、細胞培養上清を、オーレンベロナール緩衝液を用いて２０ｎｇ／μＬになるように希釈した。希釈した細胞培養上清５０μＬと第Ｘ因子欠乏血漿５０μＬを混和し、３７℃で３分間インキュベーション後、トロンボレルＳを１００μＬ加え、自動血液凝固測定装置ＣＡ５０（Ｓｙｓｍｅｘ社製）でプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。別途、生成した野生型第Ｘ因子を用い、同様にＰＴを測定して検量線を作成した。
【００９１】
検討は２回行い、その平均値を比較した。検討は、変異型と野生型の各第Ｘ因子発現ベクターをそれぞれトランスフェクションした細胞の培養上清中の第Ｘ因子の抗原量が同一になるように調整して行った。Ｔｈｒ−２Ｐｒｏ変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を用いたときのＰＴは、約１８．０秒であった。それに対して、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を用いたときのＰＴは約２４．１秒であった。実施例２で示したように、１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏは、第Ｘ因子の発現に影響しなかった。したがって、１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏによる上記血液凝固時間の短縮は、発現量の違いによるものではなく、第Ｘ因子活性の変化によるものである。検量線から、野生型第Ｘ因子を含む上記細胞培養上清のＰＴは、４０．９ｎｇの野生型第Ｘ因子によるＰＴに相当すること、またＴｈｒ−２Ｐｒｏ変異第Ｘ因子を含む上記細胞培養上清のＰＴは、８１．３ｎｇ〜１０４．４ｎｇの野生型第Ｘ因子によるＰＴに相当することが分かった。このことから、Ｔｈｒ−２Ｐｒｏ変異第Ｘ因子の血液凝固に対する活性は、野生型第Ｘ因子の活性と比較して約２倍〜２．５倍程度増加していることが明らかになった。１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏにより第Ｘ因子の活性が増強されることは今までに報告されていない。
【００９２】
一方、Ａｌａ１１２Ｔｈｒ変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を用いたときのＰＴは、約４５．７秒であった。それに対して、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を用いたときのＰＴは約３５．６秒であった。実施例２で示したように、１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒにより、第Ｘ因子の発現が約１／３程度に低減された。このことから、１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒによる血液凝固時間の延長は、発現量の減少によるものと考えた。そこで、Ａｌａ１１２Ｔｈｒ変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清と、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清の蛋白質濃度を揃えて検討を行ったところ、血液凝固時間の変化は認められなかった。エキソン５における１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒは、第Ｘ因子の血液凝固に対する活性に影響しないことが判明した。
【００９３】
このように、エキソン２における１塩基変異Ｔｈｒ−２Ｐｒｏにより第Ｘ因子の血液凝固に対する活性が増強され、その結果、血液凝固時間が短縮することが明らかになった。また、エキソン５における１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒにより、第Ｘ因子発現が低減し、その結果、血液凝固時間の延長が起きることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、血液凝固異常を引き起こす遺伝子変異の検出方法を提供できる。さらに、本検出方法を用いて、血液凝固異常を伴う疾患（例えば、血栓性疾患や出血性疾患）の早期診断および罹患危険率判定を実施することができる。本発明は、血液凝固異常の危険性の検出、血栓性疾患や出血性疾患の診断、当該疾患の防止および治療のための検査、および抗凝固薬の用量の調節のための検査に有用であり、医薬分野において多大に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】エキソン５における１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒにより、第Ｘ因子の発現が約１／３程度に低減されることを示す図である。１塩基変異Ａｌａ１１２Ｔｈｒを有する変異型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の変異型第Ｘ因子量は約２．５３ｎｇ／μＬであった。それに対して、野生型第Ｘ因子発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清中の第Ｘ因子量は約７．４０ｎｇ／μＬであった。（実施例２）
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号３：第Ｘ因子遺伝子のエキソン２を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号４：第Ｘ因子遺伝子のエキソン２を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号５：第Ｘ因子遺伝子のエキソン２を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号６：第Ｘ因子遺伝子のエキソン２を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号７：第Ｘ因子遺伝子のエキソン５を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号８：第Ｘ因子遺伝子のエキソン５を増幅するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号９：第Ｘ因子遺伝子の第８３１３位に１塩基変異を導入するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号１０：第Ｘ因子遺伝子の第８３１３位に１塩基変異を導入するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号１１：第Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位に１塩基変異を導入するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。
配列番号１２：第Ｘ因子遺伝子の第１９８１９位に１塩基変異を導入するためのプライマーとして使用するポリヌクレオチド。。
【図１】
2006081418.tif 000005
【配列表】
2006081418000001.app