(57)【要約】【課題】遺伝子を効率的に導入する。【解決手段】マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）と遺伝子を含むリポソーム型のトランスフェクション試薬を細胞に適用し、細胞増殖を行いながら遺伝子を細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）と遺伝子を含むリポソーム型のトランスフェクション試薬を細胞に適用し、細胞増殖を行いながら遺伝子を細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記トランスフェクション試薬を細胞播種とほぼ同時に細胞に適用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
トランスフェクション試薬を細胞に適用後、トランスフェクション試薬の除去のための培地交換を行わないでトランスフェクションを行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い遺伝子発現率を示す遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、遺伝子導入効率の向上を目的に、リポソームの構成成分の検討が行われており、主成分である中性のリン脂質以外に、正電荷を持つ脂質化合物、例えばコレステロール誘導体などを少量添加する試みも行われている（非特許文献１）。特に正電荷を有するリポソームは、遺伝子との複合体を形成する上で必要であるが、カチオン性のリポソームベクターは一般に細胞毒性が高く、未だ満足する効果は得られていない。
【０００３】
先に、本発明者らの一人は、MELを含有したリポソーム（MELリポソーム）が細胞に対して高い遺伝子導入作用を有していることを見出している（特許文献１、非特許文献２）。このとき用いたリポソームは、バンガム法で調製しており、ＤＮＡとリポソーム複合体の粒子径が大きくなり、動物に注射することが困難であったが、その後エタノール注入法で粒子サイズが小さいリポソームを調製することで、in  ｖｉｖｏ投与で有効なMELリポソームを見出している（特許文献２）。
【０００４】
一方、ある種のウィルスは宿主細胞の膜表面に結合し、細胞膜と融合することによりヌクレオカプシドを細胞質内に送り込む。一般に、リポソームの場合は細胞との融合は起こりにくく、エンドサイトーシスにより取り込まれ、ライソゾームによる分解を免れた遺伝子の一部が核に取り込まれ発現すると言われている。膜融合の場合はリソゾームによる分解を受けることなく細胞内に送達される。従って、ウィルスのように膜融合能が高いリポソームが高い発現効率を示すことが期待される。ＭＥＬリポソームは膜融合性を持っていることが知られているが（非特許文献３）、in  vitro遺伝子導入効率としては未だ満足のいく結果は得られていない。
【０００５】
そこで、これらの点を改善するためにMELを添加したリポソームの遺伝子導入方法を検討し、優れた方法を発明するに至った。
【特許文献１】特開２００３−４０７６７
【特許文献２】特願２００４−９３５２４
【非特許文献１】中西ら、蛋白質・核酸・酵素、44 (11), 1590-1596 (1999)
【非特許文献２】北本大、フレグランスジャーナル、5, 29-38 (2002)
【非特許文献３】Y. Inoh, D. Kitamoto, N. Hirashima, and M. Nakanishi, BiosurfactantMEL-A drastically increase gene transfection via membrane fusionｃ, J.Contr. Release., 94 (2), 423-431 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子発現効率に優れたリポソームを用いる遺伝子導入方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の遺伝子導入方法を提供するものである
１．  マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）と遺伝子を含むリポソーム型のトランスフェクション試薬を細胞に適用し、細胞増殖を行いながら遺伝子を細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
２．  前記トランスフェクション試薬を細胞播種とほぼ同時に細胞に適用することを特徴とする請求項１記載の方法。
３．  トランスフェクション試薬を細胞に適用後、トランスフェクション試薬の除去のための培地交換を行わないでトランスフェクションを行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一般に、細胞毒性が高いリポソームを遺伝子導入剤として使用する際は、細胞播種時に遺伝子導入剤を使用するトランスフェクションでは細胞の増殖が阻害されるため、前培養して細胞を増やし、接着細胞の場合コンフルエントに近い状態にしておく必要がある。しかも、リポソーム添加一定時間後に培地を交換してリポソームを除去しておく操作が欠かせない。しかし、本発明で使用するMELリポソームのように細胞毒性が低いものでは、前培養の必要がなく培地交換も必要でない。さらに、増殖速度の遅い細胞にでも、十分に接触時間を保てるために遺伝子の導入を有利に行うことができる。
また、複数の遺伝子の導入を同時にまたは一定の間隔をおいて２回以上行う場合や、数の少ない細胞に遺伝子導入を行う場合には、細胞毒性が低い本発明の方法は特に有利である。また、本発明のトランスフェクション試薬は、接着系細胞においては細胞が浮遊している状態の細胞と容器に接着後の細胞のいずれであっても遺伝子導入を行うことができる。
本発明では、増殖している培養細胞（例えばＳ期、Ｇ２期、Ｍ期の細胞））に対しトランスフェクション試薬を適用して遺伝子導入を行う点に特徴を有するが、コンフルエントに近いか、コンフルエントに達した培養細胞（例えばＧ０期の細胞）に対してトランスフェクション試薬を適用することができる。
【０００９】
例えば、培養される細胞を培養容器に播種し、通常１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内、さらに好ましくは１時間以内、特に好ましくは細胞播種と同時或いはほぼ同時にトランスフェクション試薬を適用することができる。トランスフェクション試薬は、培養容器の培養液中に予め添加しておき、そこに細胞を播種してもよい。培養される細胞を播種したときからトランスフェクション試薬を適用（培養液への添加）するまでの時間間隔が短いほうが、より効率的に遺伝子を培養細胞内に導入し、高効率で遺伝子を発現させることが可能になる。
【００１０】
本発明で使用するトランスフェクション試薬は、毒性が低いため、細胞に適用後試薬を取り除く必要はなく、通常の培養と同様に培地交換のみで（即ちトランスフェクション試薬の除去のための培地交換を行わないで）培養することで、トランスフェクション試薬（ＭＥＬリポソーム遺伝子複合体）と細胞との接触時間を延長させ、遺伝子導入の効率をさらに高めることができる。
【００１１】
本発明においては、遺伝子としてＤＮＡあるいはＲＮＡあるいはその他の核酸分子を用いることができる。ＤＮＡあるいはＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、また線状、環状等であってもよく、さらに１種類以上のＤＮＡあるいはＲＮＡを同時に用いることもできる。
【００１２】
遺伝子が導入される細胞としては、真核細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、酵母）、原核細胞（バクテリア、真菌など）のいずれでもよいが、好ましくは真核細胞の培養細胞であり、特に、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳類の培養細胞が好ましく使用される。
【００１３】
本発明で使用されるＭＥＬリポソームおよび導入される遺伝子を含むトランスフェクション試薬は、そのまま水、生理食塩液などの適当な媒体に懸濁させるか、又は凍結乾燥若しくはスプレードライによって粉末化したものを水、生理食塩液等で再懸濁させて培養細胞に適用することができる。
【００１４】
本発明において、「細胞増殖を行いながら遺伝子を細胞に導入する」とは、培養細胞だけでなく、動物（特にヒトを含む哺乳動物）中にin vivoでトランスフェクション試薬を投与する場合を含む。in vivoでトランスフェクション試薬を投与するには、例えばヒトを含む哺乳動物に、遺伝子を含む本発明のトランスフェクション試薬を静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内などの注射する方法や、エアゾール剤、舌下錠、点鼻剤、点眼剤などにより、粘膜（口腔、鼻、咽頭ないし気管）に投与する方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明のリポソームベクターを含む遺伝子導入剤は、遺伝子導入用のキットを利用してもよい。キットは、リポソーム、懸濁用媒体、導入用遺伝子及び容器を含む。好ましくは、リポソームは、リポソーム懸濁液又は粉末、懸濁用媒体は、水又はバッファー溶液を用いることができる。
【００１６】
本発明のリポソームは、リン脂質とＭＥＬを含むが、好ましくはカチオン性脂質、特にカチオン性コレステロールをさらに含む。
【００１７】
リン脂質としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の他、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、或いはこれらを定法により水素添加したもの（例えば水素添加大豆レシチン等）等が挙げられる。
【００１８】
カチオン性脂質としては、例えば３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール（以下「ＤＣ−コレステロール」と記す。）、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート等が挙げられる。中でも、ＤＣ−コレステロールが細胞毒性の低い点から好ましい。
【００１９】
リン脂質とコレステロール誘導体を用いる場合、本発明のＭＥＬリポソームの調製は、好ましくは中性脂質ＤＯＰＥ、カチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＭＥＬを用いて調製することができる。中性脂質とカチオン性脂質のモル比は、通常モル比で１０：１〜１０：２０、好ましくは、５：１〜１：１。ＭＥＬは中性脂質とカチオン性脂質の混合物に対し、通常モル比で１０００：１〜０：１であり、好ましくは、５０：１〜１：１、さらに好ましくは５：１の混合物とするのがよい。ＤＣ−Ｃｈｏｌは、相対的に毒性が低いカチオン性脂質である３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロールである。
【００２０】
ＭＥＬとしては、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃの３種類が知られているが、特に好ましいものは、ＭＥＬ−Ａであり、下記式に対応させれば、マンノースの２位、３位に炭素数１〜１５のアルカノイル基を有し、Ｒ’、Ｒ”がアセチル基である化合物である。
【００２１】
【化１】
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［実施例］
【００２２】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【参考例１】
【００２３】
ＭＥＬリポソームの調製
ＭＥＬリポソームはバンガム法により調製した。すなわち、3β[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カラバモイル]コレステロール (DC-Chol) (シグマ社)：L- ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) (アバンチボーラーリピッド社)：マンノシルエリスッリトールリピッド(MEL)= ２/ ３/ １ (モル比)で各種成分を量りとり、クロロホルム適当量に溶解し、ロータリーエバポレーター(N-1000S. S-W型、東京理化機器株式会社)で留去し、引き続き真空下１時間乾燥した。そこへ、ＰＢＳ4mLを加え、これを水浴型超音波装置(W-220R、本多電子株式会社)を用い約５分間ソニケーションした後、さらにチップ型超音波装置で10分間ソニケーションし0.44μmのフィルターを通し、直ちに遺伝子との複合体を調製し、細胞に播種した。
ＭＥＬリポソームと遺伝子との複合体（リポプッレクス）の調製
リポプレックスの作製は電荷比DC-Chol (+) / DNA (-) =3/1で行った。まず、滅菌水に溶解したルシフェラーゼ遺伝子pCMV-luc (pGL3 enhanced Plasmid) (Promega社) 1μgに対し、10μLのMELリポソームを十分に混合し、室温で15分間インキュべートすることにより、複合体を調製した。
【実施例１】
【００２４】
細胞播種時にｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入方法
細胞数104個のCOS-1細胞を24wellの培養プレートに加え、直後に調製した複合体DNA 1μgを添加し、そのまま培地交換することなく４８時間炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培地はDMEM培地（FBS 10%）(GIBCO)を用いた。
【比較例１】
【００２５】
２４時間前培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入方法
細胞数104個のCOS-1細胞を24wellの培養プレートに加え、一晩培養後、調製した複合体DNA 1μgを添加し、４８時間炭酸ガスインキュベーター中で培養した。培地はDMEM培地（FBS 10%）(GIBCO)を用いた。
ルシフェラーゼ活性の測定
MELリポソームを用いた導入遺伝子の活性を評価するためピッカジーン(東洋インキ株式会社)を用いて ルシフェラーゼ活性を測定した。また、対照としてリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いた。
【００２６】
４８時間培養後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をケモルミノメーター(ルミネッセンスリーダー、BLR-201、アロカ社)を用いて測定した。なお、細胞溶解液をタンパク定量（DCプロテインアッセイ、Bio-Rad社）で得た結果をもとに、ルシフェラーゼ活性をKcount/mg-proteinに補正した。
【００２７】
結果を図１および図２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、細胞毒性の極めて低いＭＥＬリポソームを使用していることで、細胞に対する毒性もほとんどなく、培養細胞への遺伝子導入の効率をさらに高めることができる。
【００２９】
従って、本発明によれば、実用的な導入効率で遺伝子を培養細胞に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】COS-1細胞播種と同時にトランスフェクションを行ったときのMELリポソームの遺伝子発現効率
【図２】COS-1細胞播種と同時にトランスフェクションを行ったときの培養４８時間後のCOS-1細胞の顕微鏡写真  （A）DOPE/DC-Chol/MELリポソーム、（B）リポフェクトアミン
【図１】
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【図２】
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