(57)【要約】【課題】Ｄダイマーに対する反応特異性が比較的低いモノクローナル抗体を用いても、実際のＤダイマーの量をより正確に測定することができるＤダイマー測定用キットを提供することを課題とする。【解決手段】フィブリンの分解産物であるＤダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を含む液状試薬と、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体またはそれを含む溶液とを組み合わせてなるＤダイマー測定用キットにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンの分解産物であるＤダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を含む液状試薬と、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体またはそれを含む溶液とを組み合わせてなるＤダイマー測定用キット。
【請求項２】
前記担体が、赤血球またはラテックス粒子である請求項１に記載のＤダイマー測定用キット。
【請求項３】
前記Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が、前記液状試薬に溶解されてなる請求項１または２に記載のＤダイマー測定用キット。
【請求項４】
緩衝液が、ウシ血清アルブミンを含む請求項３に記載のＤダイマー測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリンの分解産物であるＤダイマーの測定に用いられるＤダイマー測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、特に血液凝固線溶検査の分野において、Ｄダイマーを測定することが知られている。Ｄダイマーは血液凝固分子マーカーの１つであり、これを測定することは、凝固・線溶系を亢進する各種血栓症やＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）の診断、病態把握、治療効果判定などの指標を得るために重要である。
Ｄダイマーとは、血液中のフィブリノゲンがトロンビンなどの働きにより凝固して形成されるポリマーである安定化フィブリンが、プラスミンのような酵素により分解されて得られるフィブリン分解産物のうちの高分子画分のことであり、ＤＤ／Ｅ画分およびこれを基本単位とするＤＤ／Ｅ画分の多量体の総称である。ＤＤ／Ｅ画分の多量体は、ＤＸＤ／ＹＹ画分（ＤＤ／Ｅ画分の３量体）、ＹＸＹ／ＤＸＸＤ画分（ＤＤ／Ｅ画分の５量体）、ＤＸＸＤ／ＹＸＸＹ画分（ＤＤ／Ｅ画分の７量体）などを含む。
【０００３】
また、プラスミンのような酵素は、血液中に存在するフィブリノゲンも分解することができ、ＤＤ／Ｅ画分の構成要素であるＤ画分、Ｅ画分、Ｘ画分、Ｙ画分のようなフィブリノゲン分解産物をも生成する。
よって、血栓症患者の血液中にはフィブリンが分解されて生じるＤダイマーと、フィブリノゲンが分解されて生じるフィブリノゲン分解産物とが混在することになる。
【０００４】
Ｄダイマーの測定方法としては、Ｄダイマーを認識するモノクローナル抗体を、ラテックス粒子、プラスチックプレートなどの固相に固定してＤダイマーと結合させる抗原抗体反応に基づく方法、すなわちラテックス凝集法やＥＬＩＳＡなどが知られている（特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、抗原抗体反応に基づく方法において、現在用いられている固相に結合させるモノクローナル抗体は、Ｄダイマーに反応性を有すると共に、Ｄダイマーと類似の構造を有するＸ画分および／またはＹ画分に対する反応性も有する場合がある。このようなモノクローナル抗体を用いると、固相に結合したモノクローナル抗体が測定時にＤダイマー以外の画分にも結合し、実際のＤダイマーの量より低い値が検出されるという問題があった。
【特許文献１】特開昭６３−７９９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、Ｄダイマーに対する反応特異性が比較的低いモノクローナル抗体を用いても、実際のＤダイマーの量をより正確に測定することができるＤダイマー測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を予め検体と混合しておくと、次いで反応させる、固相に結合したモノクローナル抗体と検体中のＤダイマーとの特異的反応性が向上し、Ｄダイマーの量を正しく測定できることを見出して本発明を完成した。このことは、Ｘ画分やＹ画分が、モノクローナル抗体との結合部位を１つしか持っていないのに対して、Ｄダイマーは複数の結合部位をもっていることに起因すると推測される。
【０００８】
よって本発明は、フィブリンの分解産物であるＤダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を含む液状試薬と、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体またはそれを含む溶液とを組み合わせてなるＤダイマー測定用キットである。
【０００９】
上記の液状試薬に含まれるＤダイマー反応性を有するモノクローナル抗体は、溶解されてなるものでもよいし、不溶性の担体に結合されてなるものでもよいが、好ましくは溶解されてなるものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、Ｄダイマーに対する反応性を有するモノクローナル抗体を固定化したものを用い、実際のＤダイマーの量を正しく測定できる、Ｄダイマー測定用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のＤダイマー測定用キットにおいて、液状試薬に含まれるＤダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体は、Ｄダイマーに反応性を有するものであれば特に限定されないが、なかでも受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８７として寄託されたハイブリドーマ（平成１６年２月１７日に独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）が産生するモノクローナル抗体が好ましい。
【００１２】
上記のモノクローナル抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどのいずれに由来するものであってもよいが、マウスが特に好ましい。また、抗体はＩｇＧ、ＩｇＭなどのいずれであってもよい。
【００１３】
上記のモノクローナル抗体は、公知の方法により得ることができる。すなわち、抗原としてのＤダイマーとアジュバントとを任意に混合して動物を免疫にし、該動物から血清を得て、該血清からモノクローナル抗体を精製する方法が挙げられる。該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、上記のようにして免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することにより得ることができる。
【００１４】
具体的には、以下の方法により、本発明に用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。
（抗原の取得）
抗原として用いるＤダイマーは、プラスミンのようなフィブリンを分解し得る酵素をフィブリンに作用させて得ることができる。該Ｄダイマーは、ＤＤ／Ｅ画分より大きい分子量の画分を含むものが好ましい。このようなものとしては、ＤＤ／Ｅ画分の２〜５量体が挙げられる。また、Ｄダイマーのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的手法により得られるものを抗原として用いてもよい。
原料となるフィブリンは、市販のものを用いてもよいし、フィブリノゲンにトロンビン、ＸＩＩＩ因子およびカルシウム塩を作用させて得られるものを用いてもよい。
【００１５】
（免疫方法）
上記のようにして得られる抗原を、アジュバントと任意に混合し、適当な緩衝液に溶解または懸濁して得られる抗原液で、動物を免疫することができる。該抗原液中の抗原の濃度は、５０〜５００μｇ／ｍＬ程度が好ましい。抗原の免疫原性が低い場合は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアータンパク質を任意に抗原と結合させてもよい。
【００１６】
アジュバントとしては、公知のアジュバントを用いることができ、例えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Bordetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）およびこれらの組み合わせが挙げられる。初回免疫時にＦＣＡを用い、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを用いる組み合わせが特に好ましい。
【００１７】
免疫にする動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどのいずれであってもよく、好ましくはマウス、より好ましくはBALB/cマウスである。
免疫法は、使用する抗原の種類やアジュバントの有無により適宜選択することができる。例えば、マウスを用いる場合、アジュバント混合抗原液0.05〜1 mL (抗原10〜200μg)を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することにより、抗原液にアジュバントを用いずに免疫を行ってもよい。追加免疫の約５〜１０日後に血液を採取して抗体価を測定する。抗体価は、後記の抗体価アッセイのような公知の方法に従って測定できる。最終免疫から約３〜５日後に、免疫された動物から脾臓を摘出し、脾細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。
【００１８】
（モノクローナル抗体の作製）
モノクローナル抗体は、従来公知の方法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)に記載の方法に従って作製することができる。
用いる骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒトなどいずれに由来するものであってもよく、例えば、マウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が挙げられる。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生するものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14などを用いるのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来のものが好ましい。
【００１９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。ＰＥＧを用いる場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量1,000〜6,000）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞とを１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄し、ＰＥＧ含有溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート上に播種して培養する。
【００２０】
上記のようにして融合させた細胞を選択培地上で培養して、ハイブリドーマの選択を行うことができる。選択培地としては、融合細胞のみが増殖し得る培地であればよく、通常、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が用いられる。ハイブリドーマの選択は、通常、細胞融合の１〜７日後に培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換し、さらに２〜３日毎に同様にして培地交換を繰り返しながら培養し、培養終了後、顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウェルを選択することにより行うことができる。
【００２１】
このようにして得られたハイブリドーマが所望の抗体を産生しているか否かは、そのハイブリドーマの培養上清を採取して、抗体価アッセイを行うことにより確認することができる。抗体価アッセイは、公知の方法により行うことができる。例えば固相に固定化した抗原タンパク質に段階希釈した培養上清を添加し、さらに蛍光物質、酵素または放射性同位体（ＲＩ）で標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させることにより、抗体を検出することができる。
【００２２】
上記の抗体価アッセイにより所望の抗体を産生していることが確認されたハイブリドーマは、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などにより、単一クローンを分離することができる。例えば、限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウェル程度となるように培地で段階希釈して培養することにより、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを単離することができる。
【００２３】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、モノクローナル抗体の必要量やハイブリドーマの性状により、適宜選択することができる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが挙げられる。マウスの腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマの場合には、細胞培養の培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。この場合は、抗体産生量が低いが、免疫グロブリンや他の夾雑物の混入が少なく、精製が容易である。
【００２４】
ハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から抗体を取得する場合、例えば予めプリスタン（２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン）のような免疫抑制作用を有する物質を投与したBALB/cマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約１０6個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマを移植する場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスなどを用いるのが好ましい。
【００２５】
細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養の他に、高密度培養法またはスピナーフラスコ培養法などによりハイブリドーマを培養して、抗体を含有する培養上清を得ることができる。培地に血清を添加すると、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれることとなり、抗体の精製が煩雑になることが多いので、培地への血清の添加量は可能な限り少なくするのが好ましい。さらに好ましいのは、ハイブリドーマを常法により無血清培地に馴化させ、無血清培地で培養することである。これにより、抗体精製が容易になる。
【００２６】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知の方法により行うことができ、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いる塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などに基づく方法が挙げられる。
【００２７】
目的のモノクローナル抗体がマウスＩｇＧである場合、プロテインＡ結合担体または抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法を用いて抗体を精製することができる。
【００２８】
本発明のＤダイマー測定用キットを構成する液状試薬は、緩衝液に、上記のようにして得られるモノクローナル抗体を懸濁または溶解してなる。緩衝液中のモノクローナル抗体の濃度は、１〜１００μｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは５〜５０μｇ／ｍＬである。
【００２９】
緩衝液としては、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９に緩衝作用を有するものが好ましく、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン−塩酸、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどの各種緩衝液が挙げられる。なかでも、ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸）が特に好ましい。
【００３０】
上記の液状試薬は、タンパク質安定化剤（例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)など）、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、フェニルメタンスルホニルフルオリドなど）、ｐＨ調整剤、増感剤（例えばポリビニルピロリドン、ポリアニオン、ポリエチレングリコール、多糖類など）、無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウムなど）などの添加剤を含み得る。
【００３１】
本発明のＤダイマー測定用キットは、もう一方の構成要素として、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体またはそれを含む溶液を含む。該モノクローナル抗体は、上記の液状試薬に含まれるモノクローナル抗体と同じであることが好ましい。
【００３２】
モノクローナル抗体を固定化する担体としては、有機高分子化合物、無機化合物、赤血球などが挙げられる。有機高分子化合物としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、セルロース、ラテックス、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、シリカ、アルミナなどが挙げられる。なかでも、ラテックスおよび赤血球が特に好ましい。
上記の担体の形状は特に限定されず、粒子状、平面状などいずれの形状でもよい。粒子状である場合、粒子の平均粒径は測定機器などに応じて適宜選択することができるが、通常、０．０５〜０．５μｍが適当である。
【００３３】
モノクローナル抗体を担体に固定化する方法としては、物理的吸着法および化学的結合法のいずれであってもよいが、担持操作が簡便であるので物理的吸着法がより好ましい。
【００３４】
上記の担体が赤血球またはラテックス粒子である場合、Ｄダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体は、適当な緩衝液に懸濁されてなるのが好ましい。緩衝液としては、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９に緩衝作用を有するものが好ましく、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン−塩酸、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどの各種緩衝液が挙げられる。なかでも、ＭＯＰＳＯが特に好ましい。
【００３５】
上記の緩衝液は、さらにタンパク質安定化剤（例えばＢＳＡなど）、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、フェニルメタンスルホニルフルオリドなど）、ｐＨ調整剤、無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウムなど）などの添加剤を含み得る。
【００３６】
本発明のＤダイマー測定用キットは、上記の液状試薬と、モノクローナル抗体が固定化された担体を含む溶液とからなる形態が好ましい。該溶液は、モノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子が緩衝液に懸濁された形態であるのが、特に好ましい。
【００３７】
液状試薬と、モノクローナル抗体が固定化されたラテックス粒子を緩衝液に懸濁してなる溶液とを組み合わせてなる本発明のＤダイマー測定用キットを用いるＤダイマー測定方法について、以下に具体的に説明する。
【００３８】
まず、液状試薬と検体とを反応セル中で混合してインキュベートする。検体としては血清、血漿、尿などが挙げられる。インキュベートする時間は１〜１０分間程度でよい。液状試薬と検体とを混合する際の容量比は、５：１〜５０：１程度が適当である。
【００３９】
液状試薬と検体との混合物に、モノクローナル抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液を添加する。該溶液中のラテックス粒子の濃度は、０．５〜１０ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．７５〜５ｇ／Ｌである。また、該混合物と溶液とを混合する際の容量比は、１：０．０５〜１：１．５程度が適当である。
【００４０】
該溶液を添加して混合した後、１分間当たりの吸光度変化量を測定して、既知の濃度のＤダイマー標準物質を用いて得られる検量線から、検体中のＤダイマーの量を算出することができる。
【００４１】
本発明のＤダイマー測定用キットを用いれば、検体中にＤダイマーの構造類似成分、例えばＸ画分やＹ画分が存在しても、液状試薬中のモノクローナル抗体がこれらの画分と前もって結合するので、続いて添加される固定化モノクローナル抗体とこれらの画分との反応性は抑制されると考えられる。これは、Ｘ画分やＹ画分はモノクローナル抗体との反応部位が１つしかないのに対して、Ｄダイマーにはモノクローナル抗体との反応部位が複数あることによるものと考えられる。よって、測定しようとするＤダイマーがより高い特異性で固定化モノクローナル抗体と反応することができ、より正確にＤダイマーの濃度を測定することが可能になる。
【実施例】
【００４２】
以下に、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
（１）Ｄダイマー溶液の調製
フィブリノゲン（シグマ社製）100 mg (5.3 mg/mL)に、塩化カルシウム、ヒトトロンビンおよびXIII因子(ERL社製)をそれぞれ最終濃度25 mM、2U/mLおよび1.25μg/mLとなるように加え、３７℃で１８時間反応させて、フィブリノゲンをフィブリンに変換させた。12,000×gで２０分間遠心分離し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。フィブリンを1 mm3以下に切断し、50 mM Tris緩衝液(pH 7.4) 2.5 mLに浮遊させ、プラスミン（シグマ社製）25μL (1 U/mL)を添加した。攪拌しながら３７℃で３時間反応させた後、アプロチニンを最終濃度1,000 U/mLとなるように添加して分解反応を停止した。12,000×gで２０分間遠心分離し、その上清を50 mM Tris緩衝液(pH 7.4)で平衡化したLysine-Sepharose 4B (容積3 mL)に充填し、クロマトグラフィーを行った。非還元下でのSDS-PAGEにより、ＤＤ／Ｅ画分の３量体以上のものを含む画分をＤダイマー溶液とした。
【００４３】
（２）モノクローナル抗体の反応特異性の検討
独立行政法人産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８７として寄託されたハイブリドーマDD-M1653株が産生するモノクローナル抗体（以下、DD-M1653抗体という）の反応特異性を、以下に記載のウェスタンブロット法により検討した。
ウェスタンブロット法
各成分の濃度が50μg/mLになるように1% (w/v) SDS溶液で調整したＤＤ／Ｅ画分、ＤＤ／Ｅ画分の3〜5量体、Ｘ画分、Ｙ画分、Ｄ画分、Ｅ画分およびフィブリノゲンの混合物を、0.1% (w/v) SDSを含む7.5% ポリアクリルアミドゲル上で60ボルトの定電圧で2.5時間展開させた。緩衝液には0.02% (w/v) SDS を含む 25 mM Tris-192 mM グリシン緩衝液（pH 7.5）を用いた。
【００４４】
このゲルに、PVDF (ポリビニリデンフルオライド)メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を密着させ、1 mA/cm2の電流を3時間流してメンブレンにタンパク質をトランスファーした。その後、メンブレンをブロッキング液（5％スキムミルク、1％ (w/v) BSA、0.1％ (w/v)アジ化ナトリウムを含むPBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4、8.1 mM Na2HPO4））に浸して30分間振とうした。ブロッキング液を捨て、0.05％ (w/v) Tween 20を含むPBS（洗浄液）を用いて5分間、3回洗浄した。メンブレンを、DD-M1653抗体100 μg/mLおよび0.05％ (w/v) Tween 20を含むPBSに浸して60分間振とうした。洗浄液で5分間、3回洗浄後、メンブレンを、２次抗体としてHRP （ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗マウス抗体（ダコサイトメトリー社製）100 μg/mLおよび0.05％ (w/v) Tween 20を含むPBSに浸して60分間振とうした。メンブレンを洗浄液で5分間、3回洗浄後、4−クロロ−1−ナフトールと過酸化水素を用いるHRP標識キット（Bio-Rad社製）を用いてタンパク質のバンドを視覚化することにより、モノクローナル抗体の反応特異性を検討した。
結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2006234676.tif 000002
【００４６】
表１において、＋は反応性が検出されたことを表し、−は反応性が検出されなかったことを表す。
【００４７】
（３）イムノグロブリンサブクラスの同定
DD-M1653抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを、Zymed社製MONOAbタイピングキットを用いて同定した。その結果、DD-M1653抗体はIgG 2aであった。
【００４８】
実施例１
Ｄダイマー測定用キットの製造
液状試薬の製造
ポリエチレングリコール、アジ化ナトリウムおよびBSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1)に、DD-M1653抗体を10μg/mLとなるように添加して、液状試薬を製造した。
【００４９】
DD-M1653抗体が固定化された担体の製造
10% (w/v)ポリスチレンラテックス懸濁液（積水化学株式会社製、粒径0.245μm）0.5 mLを、DD-M1653抗体を含むリン酸緩衝液(pH 7.5) 2.0 mL (抗体濃度0.625 mg/mL)に添加してボルテックスミキサーで混合した。この混合液を遠心分離し（25,000×g、20分間）、1% BSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1) 2.5 mLに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し（25,000×g、20分間）、ペレットを2% BSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1) 40 mLに懸濁して、DD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液を得た。
【００５０】
キットの製造
上記の液状試薬の入った容器と、DD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液の入った容器とを組み合わせて、本発明のＤダイマー測定用キットとした。
【００５１】
試験例１
検体14μLと、実施例１で得られた液状試薬84μLとを混合し、37℃で5分間反応させた。ここに、実施例１で得られたDD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液84μLを混合して、波長800 nmで1分間当たりの吸光度変化量を測定することにより、Ｄダイマー量を測定した。検体としては、上記の（１）で作製したＤダイマー溶液(25μg/mL)、上記の（１）で作製したＤダイマー溶液(25μg/mL)に、Ｘ画分（森永生化学研究所社製）を40μg/mLとなるように添加したもの、および上記の（１）で作製したＤダイマー溶液(25μg/mL)に、Ｘ画分（森永生化学研究所社製）を20μg/mLとなるように添加したものを用いた。
結果を表２に示す。
【００５２】
比較試験例1
試験例1と同じ検体14μLと、DD-M1653抗体を含まない試薬（ポリエチレングリコール、アジ化ナトリウムおよびBSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1)）84μLとを混合し、37℃で5分間反応させた。ここに、実施例１で得られたDD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液84μLを混合して、波長800 nmで1分間当たりの吸光度変化量を測定することにより、Ｄダイマー量を測定した。
結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2006234676.tif 000003
【００５４】
表2の結果から明らかなように、DD-M1653抗体を含む液状試薬を用いる、本発明のＤダイマー測定用キットを用いて得られた結果は、Ｘ画分の有無に関わらず、実際のＤダイマーの量にほぼ一致した。したがって、DD-M1653抗体を含まない試薬を用いる場合に比べて、より正確なＤダイマー量の測定が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、Ｘ画分のような低分子量画分を含む検体であっても、実際に含まれるＤダイマーの量をより正確に測定することができる。このことは、Ｄダイマーを測定する検査の信頼性を高める。