(57)【要約】【課題】  有害物質の存在で蛍光タンパク質を発現する微生物を用い、この微生物を膜状に固定化した微生物膜の蛍光強度から有害物質を迅速かつ簡便に検出でき、さらには有害物質の種類そのものを識別できるようにした有害物質の検出装置及び検出方法を提供する。【解決手段】  有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物１を、微孔性膜２と光透過性膜３との間に薄膜状に固定化した微生物膜６と、該微生物膜６に試料５を接触させるために該微生物膜６を設置する試料容器７と、該微生物膜６に励起光を照射するための励起光照射部と、蛍光測定部とを備え、該微生物膜６の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにした。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物を、微孔性膜と光透過性膜との間に薄膜状に固定化した微生物膜と、該微生物膜に試料を接触させるために該微生物膜を設置する試料容器と、該微生物膜に励起光を照射するための励起光照射部と、蛍光測定部とを備え、該微生物膜の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにしたことを特徴とする有害物質の検出装置。
【請求項２】
上記微孔性膜を、微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料が透過できる微孔性膜とし、上記光透過性膜を、微生物からの蛍光を透過できる光透過性膜としたことを特徴とする請求項１に記載の有害物質の検出装置。
【請求項３】
上記光透過性膜を上記試料容器の外側に向けて設置し、上記光透過性膜側から上記微生物膜に励起光を照射し、微生物膜の蛍光を測定するようにしたことを特徴とする請求項１又は２に記載の有害物質の検出装置。
【請求項４】
二以上の互いに異なる有害物質を検出するために、それぞれの有害物質に対応する二以上の微生物膜を上記試料容器に設置したことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の有害物質の検出装置。
【請求項５】
有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物を、微孔性膜と光透過性膜との間に薄膜状に固定化することによって微生物膜を構成し、該微生物膜に試料を接触させ、該微生物膜の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにしたことを特徴とする有害物質の検出方法。
【請求項６】
上記微孔性膜を、微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料が透過できる微孔性膜とし、上記光透過性膜を、微生物からの蛍光を透過できる光透過性膜とし、上記微生物膜の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにしたことを特徴とする請求項５に記載の有害物質の検出方法。
【請求項７】
上記微生物膜の上記微孔性膜を試料容器内の試料に接触させ、上記光透過性膜を上記試料容器の外側に向けて設置し、上記光透過性膜側から上記微生物膜に励起光を照射し、微生物膜の蛍光を測定するようにしたことを特徴とする請求項５又は６に記載の有害物質の検出方法。
【請求項８】
それぞれの有害物質に対応する二以上の微生物膜を上記試料容器に設置し、二以上の互いに異なる有害物質を検出することを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の有害物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等を対象として、水中の有害物質をモニタリングすることを目的とした有害物質の検出装置及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には６〜１０万種もの人為的に合成された化学物質に加え、トリハロメタン等の消毒副生成物、ダイオキシン等の燃焼副生成物といった非意図的生成物質、又は環境中での変化体等、数多くの化学物質が存在している。そのため、河川や湖沼等の環境水中には多様な化学物質が混入している。その濃度は、ごく微量であると考えられるものの、例えば、このような環境水を水道原水とする浄水場では、人体への健康影響の観点からより高度に水質を連続して監視することが求められている。
【０００３】
また、下水処理場、廃棄物最終処分場、化学薬品を使用する工場からは、化学物質を含む排水について、オゾン処理や生物処理、活性炭処理等を行った後、河川に放流している。このため、このような処理プロセスが適切に稼動し、水中の有害物質が除去されているかを監視し、各処理プロセスの評価結果を処理プロセスにフィードバックし、さらには処理施設の改善等の措置を講じる必要がある。そのためには、処理水中の有害物質を迅速かつ簡便に検出し、さらにはどのような有害物質かを識別する必要がある。
【０００４】
これまで、細菌等の微生物を用いた有害物質の評価試験では微生物の増殖阻害を指標とする寒天平板法、液体培養法、又は生理活性阻害を指標とする方法等が行われている。
また、発ガン物質の短期識別法として微生物を用いたAmesテストやumuテスト等のテストが数多く報告されている。これらの方法はDNAの損傷性を色素の発色反応で検出する方法である。
【０００５】
しかし、上述の方法は微生物をあらかじめ培養し、試験に必要な量を増殖させる必要があり結果を得るまでに長時間必要である。また、培養液の分注や希釈、色素の発色反応で検出する試験においては発色試薬の分注や色素の抽出等の操作が煩雑であり、多量の試料を処理することが困難である等、簡便さという点で問題があった。
このような問題に対し、微生物の運動阻害を指標とし、より簡便・迅速に有害物質の検出を行うようにした提案もなされている（特許文献１）。しかし、この提案においても、実際のところ上記した従来の問題点は解消されていなかった。
【特許文献１】特開２００１−１６１３９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述の問題点に鑑み、有害物質の存在で蛍光タンパク質を発現する微生物を用い、この微生物を膜状に固定化した微生物膜の蛍光強度から有害物質を迅速かつ簡便に検出でき、さらには有害物質の種類そのものを識別できるようにした有害物質の検出装置及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明に係る有害物質の検出装置は、有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物を、微孔性膜と光透過性膜との間に薄膜状に固定化した微生物膜と、該微生物膜に試料を接触させるために該微生物膜を設置する試料容器と、該微生物膜に励起光を照射するための励起光照射部と、蛍光測定部とを備え、該微生物膜の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにしたことを特徴とする。上記微孔性膜は、微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料が透過できる微孔性膜とし、上記光透過性膜は、微生物からの蛍光を透過できる光透過性膜とすることが好適である。上記微孔性膜は、試料、栄養成分、酸素等を透過できるポアサイズを備え、一般的には、親水性であることが好ましい。試料は、一般的には試料液として供給され、最も一般的には試料水として提供される。上記微孔性膜は、微生物からの蛍光を透過できるように、透明、又は透明に近く、蛍光の透過に支障のない材質で構成する。
【０００８】
本発明に係る有害物質の検出装置では、好適な実施の形態で、上記光透過性膜を上記試料容器の外側に向けて設置し、上記光透過性膜側から上記微生物膜に励起光を照射し、微生物膜の蛍光を測定するようにすることができる。一般的には、上記微孔性膜を上方に向けて試料容器の底部に設置し、上記光透過性膜を下方に向け、励起光の照射を受けることができるようにする。
【０００９】
さらに、別の好適な実施の形態において、本発明に係る有害物質の検出装置は、二以上の互いに異なる有害物質を検出するために、それぞれの有害物質に対応する二以上の微生物膜を上記試料容器に設置することとしている。
【００１０】
本発明は、別の側面において、有害物質の検出方法であり、該検出方法は、有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物を、微孔性膜と光透過性膜との間に薄膜状に固定化することによって微生物膜を構成し、該微生物膜に試料を接触させ、該微生物膜の蛍光強度を測定することによって有害物質を検出するようにしたことを特徴とする。上記微孔性膜は、微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料が透過できる微孔性膜とし、上記光透過性膜は、微生物からの蛍光を透過できる光透過性膜とすることが好適である。上記微孔性膜は、試料、栄養成分、酸素等を透過できるポアサイズを備え、一般的には、親水性であることが好ましい。試料は、一般的には試料液として供給され、最も一般的には試料水として提供される。上記微孔性膜は、微生物からの蛍光を透過できるように、透明、又は透明に近く、蛍光の透過に支障のない材質で構成する。
【００１１】
本発明に係る有害物質の検出方法では、好適な実施の形態で、上記微生物膜の上記微孔性膜を試料容器内の試料に接触させ、上記光透過性膜を上記試料容器の外側に向けて設置し、上記光透過性膜側から上記微生物膜に励起光を照射し、微生物膜の蛍光を測定するようにすることができる。一般的には、上記微孔性膜を上方に向けて試料容器の底部に設置し、上記光透過性膜を下方に向け、励起光の照射を受けることができるようにする。
【００１２】
さらに、別の好適な実施の形態において、本発明に係る有害物質の検出方法は、それぞれの有害物質に対応する二以上の微生物膜を上記試料容器に設置し、二以上の互いに異なる有害物質を検出することとしている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、有害物質を迅速かつ簡便に検出でき、さらには有害物質の種類そのものを識別できるようにした有害物質の検出装置及び検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、添付した図面を参照して、本発明に係る有害物質の検出装置及び検出方法の一実施の形態を説明する。
まず、本発明に係る有害物質の検出装置に用いられる微生物膜について説明する。図１に、係る微生物膜について、その一実施の形態を示す。
図示のように、本実施の形態に係る微生物膜６は、微生物１を微孔性膜２と光透過性膜３との間に挟み込み、膜状に固定化している。微孔性膜２と光透過性膜３との間には両面テープ４を介在させている。図1の左は、微孔性膜２を外した状態を示している。また、図１の右は、微孔性膜２を貼り合わせた状態を示している。
【００１５】
微生物１は、有害物質の存在下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物である。
このような微生物１は、有害物質の存在によって機能する制御遺伝子と、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を連結したプラスミドＤＮＡを宿主微生物に導入し、形質転換を行う遺伝子組換え操作により作製できる。
ここで、有害物質の存在によって機能する制御遺伝子としては、遺伝子損傷性物質によるＤＮＡ損傷の修復に関与するｕｍｕＤＣ遺伝子を例示することができる。もっとも、本発明で用いることができる制御遺伝子は、これに限定されるものではなく、様々な有害物質ごとに機能する制御遺伝子を利用することができる。ｕｍｕＤＣ遺伝子は、遺伝子損傷性物質によって微生物のＤＮＡが損傷を受けるとＳＯＳ応答により損傷したＤＮＡを修復するために機能する遺伝子である。このｕｍｕＤＣ遺伝子の下流に蛍光タンパク質を発現する遺伝子を連結すれば、ＳＯＳ応答とともに蛍光タンパク質が合成される。
上記有害物質としては、遺伝子損傷性物質、内分泌攪乱物質、重金属等を挙げることができる。
上記遺伝子損傷性物質としては、例えば、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、ベンゾ（ａ）ピレン、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミドを挙げることができる。
上記内分泌攪乱物質としては、例えば、１７β−エストラジオール、ビスフェノールＡ、ノニルフェノールを挙げることができる。
上記重金属としては、例えば、水銀、カドニウム、６価クロム、ヒ素挙げることができる。
【００１６】
本発明における蛍光タンパク質には一般的に緑色蛍光を発するＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られており、ＧＦＰは４８８ｎｍ付近の波長の励起光を照射すると５０７ｎｍ付近の蛍光を発する。ＧＦＰをコードする発現ベクターはインビトロジェン社やクロンテック社等から市販されている。また、発現される蛍光タンパク質を改良した発現ベクターも市販されており、緑色蛍光タンパク質のほかに、赤色蛍光タンパク質（励起光５５８ｎｍ付近、蛍光５８３ｎｍ付近）や黄色蛍光タンパク質（励起光５１３ｎｍ付近、蛍光５２７ｎｍ付近）、青色蛍光タンパク質（励起光４３３ｎｍ付近、蛍光４７５ｎｍ付近）も使用できる。これらの発現ベクターに前述の制御遺伝子を連結し微生物に導入すれば、有害物質を暴露するとその有害物質に対する応答とともに蛍光タンパク質が発現される。
【００１７】
蛍光タンパク質を発現する宿主微生物としては、大腸菌（Esherichia coli）やチフス菌（Salmonella typhimurium）等のサルモネラ属細菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等を挙げることができる。これらの宿主微生物に制御遺伝子と蛍光タンパク質を連結したプラスミドベクターを導入することで、本発明に用いる蛍光タンパク質を発現する微生物１を作製できる。
【００１８】
上記微孔性膜２としては、親水性を有し、微生物１を固定化後には、該微生物１が漏出しないようなポアサイズを有する物が好適である。ポアサイズは、好適には、０．２〜１．０μｍである。また、試料、栄養成分、酸素等が透過できるような親水性の材料であることが望ましい。なお、試料は、一般的には試料液、最も一般的には試料水として供給される。
【００１９】
微孔性膜２を構成する好適な材料としては、ニトロセルロース、親水性ポリ塩化ビニリデンクロライド、ポリカーボネート等を挙げることができる。強度、保持することのできる菌体量の観点からは、ニトロセルロースが最も好適である。
【００２０】
一般に、例えば細菌を微生物１として用いる場合、細菌の捕捉に用いられる膜材料のポアサイズは、０．２μｍ、０．４５μｍ、１．０μｍのものが用いられる。ここで、後述するように、微生物膜６を作製する際には、細菌の培養液を吸引ろ過する。ポアサイズは、細菌を用いる場合、０．４５μｍが最適である。少なくともこのポアサイズであれば、目詰まりを起こしにくく、菌体を多く固定することができる。
【００２１】
次いで、光透過性膜３としては、ガラス、石英等の無機材料、透明軟質塩化ビニル、ポリカーボネート等の有機材料を使用することができる。製膜時、又は試料容器への装着時に、割れにくい性質を持つという点からは、有機材料が好適である。さらに、光透過性膜３は、光透過性材料を打抜きポンチ等を用い所定のサイズで円形に切断する必要がある。そのため、材質は軟質のものが適しており、このような観点から、光透過性膜３としては、透明軟質塩化ビニルが最も好適なものの一つである。
【００２２】
本実施の形態では、前述したように、微生物１を微孔性膜２と光透過性膜３との間に挟み込み、膜状に固定化している。膜状に微生物１を固定するためには、高分子ゲル化剤を用いることが好適である。このような高分子ゲル化剤としては、アルギン酸ナトリウム、多糖類のカラギーナン、寒天、タンパク質のコラーゲン、ゼラチン等が使用でき、又高分子材料の光硬化樹脂、ポリアクリルアミド等も使用することができる。
【００２３】
上記のうち、アルギン酸ナトリウムは、塩化カルシウム溶液を添加するのみでゲル化し、ゲル化材料として好適である。アルギン酸ナトリウムを用いる場合、１％溶液の粘度が５００〜６００ｃＰで分子量約１０万のものであれば、酸素、栄養分の透過性を良好に保ちつつ、菌体を良好に保持することができる。
【００２４】
次に、微生物膜の作製方法について、その一実施の形態を、図２について説明する。 
まず、図２（ａ）に示すように、両面テープ４の片面に微孔性膜２をあらかじめ接着し、微孔性膜２側から吸引しながら、微生物1として例えば細菌の培養液を滴下し、培養液中の細菌を微孔性膜２上に保持する。
【００２５】
続いて、 図２（ｂ）に示すように、細菌の流動を防ぐため、高分子ゲル化剤としてのアルギン酸ナトリウム溶液２１を滴下する。
【００２６】
続いて、 図２（ｃ）に示すように、両面テープ４の反対側に光透過性膜３を張り合わせる。そして、アルギン酸ナトリウムをゲル化するため、微生物膜６を塩化カルシウム溶液に浸漬する。
なお、両面テープ４としては、ポリイミドといった材質のものを用いることができ、例えば、日東電工社製の両面接着テープを用いることができる。
【００２７】
次に、上記のような微生物膜６を用いた有害物質の検出装置について、その一実施の形態を、図３を参照して説明する。
本実施の形態に係る有害物質の検出装置は、主たる構成要素として、微生物膜６、試料容器７、励起光照射部、蛍光測定部、及び演算部１７を備える。
試料容器７は、試料（試料水）５を注入するための円筒状の容器であり、底部に微生物膜６が装着されている。微生物膜６は、微孔性膜２を上方に向けて試料容器７に接着することによって装着されているが、試料容器７と微生物膜６とで容器を形成し、試料が漏れない構造であれば、固定方法は問わない。
【００２８】
上記励起光照射部は、対物レンズ８、励起側フィルター９、集光レンズ１０、励起用光源１１、及びダイクロミックミラー１２を主たる構成要素としている。対物レンズ８及び集光レンズ１０は、通常の光学レンズである。励起用光源１１は、一般的には水銀ランプであり、主波長として２５４ｎｍ、３１３ｎｍ、４０５ｎｍ、４３６ｎｍなどが効率良く放射される。励起側フィルター９は、蛍光物質の励起に必要な光を励起光源から抽出するためのフィルターである。また、ダイクロミックミラー１２は、励起光を反射して集光レンズ１０に向けると共に蛍光を透過するためのミラーである。
【００２９】
上記蛍光測定部は、対物レンズ８、蛍光側フィルター１３、結像レンズ１４、撮像素子１５を主たる構成要素としている。蛍光側フィルター１３は、微生物膜の蛍光タンパク質による蛍光のみを透過するためのフィルターである。結像レンズ１４は、通常の光学レンズである。撮像素子１５は、例えば、ＣＣＤカメラ等の光学センサーで構成されている。
なお、本実施の形態に係る有害物質の検出装置は、上記励起光照射部及び上記蛍光測定部を制御するための演算部１７をさらに備える。なお、この演算部が、上記励起光照射部又は上記蛍光測定部の一部として構成されている形態も本発明に含まれる。
【００３０】
次に、図３の実施の形態に係る有害物質の検出装置を用いた有害物質の検出方法について説明する。
まず、試料容器７には、非測定状態では、培養液が注入され、微孔性膜２を透過して培養液中の栄養成分、酸素が、固定化された微生物膜６内の微生物１（細菌）に供給される。
有害物質を測定する際には、培養液を除去し、試料容器７に試料５を注入する。これによって、微生物膜６に試料５が接触する。試料５は、一般的に試料液（試料水）として注入される。試料５は、微孔性膜２を透過する。ここで、試料５に、例えば青酸等の有害物質が存在すると、ＳＯＳ反応が起こり、蛍光タンパク質が発現する。
【００３１】
このような蛍光タンパク質を励起するため、演算部１７の指示により、励起用光源１１から励起光が発せられ、該励起光は、集光レンズ１０によって平行光となる。平行光は、励起側フィルター９を経て、ダイクロミックミラー１２で反射され、対物レンズ８を介して微生物膜６に照射される。そして、励起した蛍光タンパク質からの蛍光は、蛍光は対物レンズ８で平行光となる。平行光は、ダイクロミックミラー１２を通過し、蛍光側フィルター１３、結像レンズ１４を介して撮像素子１５に捉えられる。
撮像素子１５によって捕らえられた蛍光に関する測定情報は、演算部１７に伝達される。
これにより微生物膜６からの蛍光を受けて、蛍光強度が測定でき、試料５中に混入している有害物質を検出できる。
【００３２】
さらに、図４は、本発明に係る有害物質の検出装置について他の実施の形態を示す。
制御遺伝子としては、遺伝子損傷性物質に応答する遺伝子、内分泌攪乱物質に応答する遺伝子、重金属に応答する遺伝子等のように、有害物質ごとに異なる遺伝子を、有害物質の存在によって機能する制御遺伝子として採用することができる。このような異なる遺伝子ごとに、下流に蛍光タンパク質を発現する遺伝子を連結すれば、有害物質ごとに応答を生じさせることができる。すなわち、相異なる有害物質に応じて蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え微生物を、このような相異なる有害物質に対応して複数種用いることもできる。
このように複数の有害物質を含有する試料について、複数の微生物膜を用い、それらの蛍光強度から試料中に含まれる複数の有害物質が同時に検出できる。
【００３３】
図４に、このような有害物質の検出装置の一実施の形態を示す。この有害物質の検出装置では、試料３０を注入する試料容器３１の底部に五の微生物膜３２〜３６を装着している。そして、励起光照射部及び蛍光測定部から成る測定ユニット３７が、試料容器３１の下で移動可能に設置されている。測定ユニット３７は、図３の検出装置と同様の構成を備え、演算部３８に制御されながら、各微生物膜３２〜３６の蛍光強度を測定する。測定操作については、図３の検出装置について説明したものと基本的に同様である。
この実施の形態に係る有害物質の検出装置を用いた検出方法によれば、試料３０中に五種のいずれの有害物質に関しても、それらの蛍光強度をほぼ同時に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る有害物質の検出装置に用いることができる微生物膜の一実施の形態を説明する斜視図である。
【図２】本発明に係る有害物質の検出装置に用いることができる微生物膜の作製方法を説明する概念図である。
【図３】本発明に係る有害物質の検出装置の一実施の形態を説明する概念図である。
【図４】本発明に係る有害物質の検出装置の他の実施の形態を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００３５】
１  微生物
２  微孔性膜
３  光透過性膜
４  両面テープ
５  試料
６  微生物膜
７  試料容器
８  対物レンズ
９  励起側フィルター
１０  集光レンズ
１１  励起光用光源
１２  ダイクロミックミラー
１３  蛍光側フィルター
１４  結像レンズ
１５  撮像素子
１６  蛍光フィルター
１７  演算部
３０  試料
３１  試料容器
３２、３３、３４、３５、３６  微生物膜
３７  測定ユニット
３８  演算部
【図１】
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【図２】
2006042655.tif 000004
【図３】
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【図４】
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