(57)【要約】      （修正有）【課題】プローブ核酸鎖と標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを優勢に進め、ハイブリダイゼーション検出の精度を高める方法を提供する。【解決手段】基板上などに形成された反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖と、が混在する系において、核酸鎖と相互作用する物質、例えば、インターカレーターなどを前記反応領域中へ添加することで、プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させて、ハイブリダイゼーション検出の向上を図る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系において、
核酸鎖と相互作用する物質を前記反応領域中へ添加することによって、プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるバイオアッセイ方法。
【請求項２】
核酸鎖と相互作用する前記物質により、前記ハイブリダイゼーションの反応平衡定数と前記ミスハイブリダイゼーションの反応平衡定数との差を大きくすることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項３】
核酸鎖と相互作用する前記物質は、インターカレーターであることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項４】
前記プローブ核酸鎖の一末端が固相表面に固定されていることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項５】
前記固相表面は、基板表面であることを特徴とする請求項４記載のバイオアッセイ方法。
【請求項６】
反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系において、
プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるためのインターカレーターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出の精度向上に係わる技術に関する。より詳しくは、プローブ核酸鎖と標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを、ミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させることができるバイオアッセイ技術に関する。
技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
探針又は検出子としての役割を担うプローブ核酸鎖が存在する反応領域中へ、このプローブ核酸鎖との間での相補鎖形成の有無を調べることが目的とされる標的核酸鎖を添加してハイブリダイゼーションを進行させ、これを光学的あるいは電気的な手法などにより検出するアッセイ系が、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）などで実施されている。
【０００３】
例えば、一般のＤＮＡチップでは、基板上に固定配列されたプローブ核酸鎖に対して、予め蛍光色素を修飾（ラベル）しておいた標的核酸鎖をハイブリダイゼーションさせ、その相互作用の結果を蛍光量（蛍光シグナル）として捉えて検出する。
【０００４】
また、近年、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域へプローブ核酸鎖や標的核酸鎖以外の物質を添加し、ハイブリダイゼーション検出などに用いる技術も提案されている。一例を挙げると、二本鎖核酸鎖の相補鎖に特異的に結合したときに、蛍光を発したり、蛍光を増幅したりするセ性質を持つ「インターカレーター」と呼ばれる物質を反応領域へ添加し、その蛍光強度を捕捉することによってハイブリダイゼーションを検出する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この検出技術では、蛍光標識された標的核酸鎖を調製する必要が無いなどの利点がある。
【０００５】
このインターカレーターは、核酸鎖（ヌクレオチド鎖）と相互作用する物質であり、特許文献２〜７には、核酸鎖の相補鎖を検出するときに使用できるインターカレーターが具体的に開示されている。
【０００６】
また、このインターカレーターについては、ハイブリダイゼーションを検出する場合における蛍光や電気的な情報供給源以外の用途も知られている。例えば、特許文献８には、インターカレーターと蛍光強度の関係からＤＮＡの長さやコピー数を求める技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−２９９３９５号公報。
【特許文献２】特開平０９−０４０６６１号公報。
【特許文献３】特開２００１−１６５８９４号公報。
【特許文献４】特開２００１−２２６３７６号公報。
【特許文献５】特開２００１−２８９８４８号公報。
【特許文献６】特開２００２−３２７１３０号公報。
【特許文献７】特開２００４−０２４１１４号公報。
【特許文献８】特開平１１−１６４７００号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、プローブ核酸鎖と標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを検出技術において、当該ハイブリダイゼーションが進行する反応領域へプローブ核酸鎖や標的核酸鎖以外の物質を添加することによって、ハイブリダイゼーション検出の精度を向上する方法を提供すること、並びにインターカレーターの新規用途を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系において、核酸鎖と相互作用する物質を前記反応領域中へ添加することによって、プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるバイオアッセイ方法を提供する。
【０００９】
例えば、核酸鎖と相互作用する前記物質により、前記正規ハイブリダイゼーションの反応平衡定数（例えば、ｋ１とする）と前記ミスハイブリダイゼーションの反応平衡定数（例えば、ｋ２とする）との差を大きくすることによって、正規ハイブリダイゼーションをミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるようにする。
【００１０】
プローブ核酸鎖を符号Ｐ１、正規標的核酸鎖をＴ１、誤標的核酸鎖をＴ２とすれば、次の数式１で示される反応平衡定数Ｋ１と次の数式２で示される反応平衡定数Ｋ２との間において、ｋ１＞ｋ２の関係がより助長されるようにする。[Ｐ１Ｔ１]や[Ｐ１Ｔ２]は、反応生成物である二本鎖核酸鎖を意味している。反応速度の考え方によれば、正規ハイブリダイゼーションの反応速度ｖ１＝ｋ１[Ｐ１][Ｔ１]がミスハイブリダイゼーションの反応速度ｖ２＝ｋ２[Ｐ１][Ｔ１]よりも大きくなるようにする。
【００１１】
【数１】
2006304707.tif 000002
【００１２】
【数２】
2006304707.tif 000003
【００１３】
本発明で採用する、核酸鎖と相互作用する前記物質は、本発明の目的を達成できればよく、狭く限定されないが、例えば、核酸鎖と相互作用する性質を有する有機物質、化合物、インターカレーターなどを採用できる。また、本発明において、前記プローブ核酸鎖は、反応領域において遊離状態で存在する形態、あるいはその一末端が基板やビーズなどの固相表面に固定されている形態のいずれも採用できる。
【００１４】
また、本発明では、従来、ハイブリダイゼーション検出のための蛍光供給源として用いられることが一般的であったインターカレーターの新規用途を提案する。
【００１５】
即ち、反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系において、プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるために使用する。
【００１６】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１７】
「プローブ核酸鎖」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸鎖分子であって、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域中に遊離状態で存在したり、基板やビーズなどの固相表面にその一端が固定されて存在したりする。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００１８】
「標的核酸鎖」とは、前記プローブ核酸鎖との間で相補的な塩基対を形成するか否かを調べることを目的に、サンプルとして準備された核酸鎖分子である。正規標的核酸鎖とは、プローブ核酸鎖との間で形成される相補鎖にミスマッチがないものを意味し、誤標的核酸鎖は、前記相補鎖にミスマッチが発生し得るものを意味する。
【００１９】
「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２０】
「ハイブリダイゼーション」は、ヌクレオチド鎖間の二本鎖形成反応を意味し、特に「正規ハイブリダイゼーション」は、相補鎖部分にミスマッチがない状態で進行したハイブリダイゼーションを意味し、ミスハイブリダイゼーションは、相補鎖部分にミスマッチが発生した状態で進行したハイブリダイゼーションを意味する。
【００２１】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸鎖の相補鎖に特異的に結合する物質であって、例えば、ハイブリダイゼーション検出に用いられる蛍光性のインターカレーターを包含するが、本発明で採用可能なインターカレーターは、蛍光発光性の有無を問わない。縮合複素環やピロール-イミダゾール等を基本骨格とするもの、ノガラマイシンのような縫込み型のもの、市販のものではSYBR Green I（登録商標）やPico Greenなどを例示できる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系において、プローブ核酸鎖と前記正規標的核酸鎖との間の正規ハイブリダイゼーションを、プローブ核酸鎖と前記誤標的核酸鎖との間のミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させることができる。
【実施例１】
【００２３】
完全相補鎖を形成する二本鎖核酸鎖とミスマッチ塩基対を有して二本鎖を形成しているオリゴヌクレオドを用いて、二本鎖の安定性を比較検証する基礎実験を行った。
【００２４】
実験方法。0.1M Phosphate Buffer pH7.2(NaCl 200mM)中に２種（以下の「表１」に記載した組み合わせ）のオリゴヌクレオチド混合した。表１のＳ１とＳ２を混合したサンプル（Ｓ１/Ｓ２）は、オリゴの濃度が0.5、1.0, 1.5, 2.0, 2.5μMとなるように５種、調整した。それ以外は、オリゴの濃度が0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0μMとなるように5種ずつ調整した。次に、アニーリング（条件：95℃、5分→急冷）し、インターカレーターである市販のSYBR Green Iをサンプルに混合した。SYBR Green Iの混合量は、オリゴ濃度が1.0μMのサンプルについてはSYBR Green Iの希釈率が10000倍となるように混合し、それ以外についてはオリゴ濃度1.0μMのときを基準として、オリゴ濃度とSYBR Green Iの希釈率が比例するように添加した。
【００２５】
本実験で用いた合成オリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）は、次の「表１」の通りであり、本実験の結果については、後掲の表２〜６に示す。なお、「表１」において、例えば、Ｓ１/Ｓ２は１０mer（10塩基）の完全相補鎖、Ｍ１/Ｍ２は２０mer（20塩基）の完全相補鎖である。Ｍ１/Ｍ３は、一つのA-Cミスマッチを、Ｍ１/Ｍ４は一つのG-Gミスマッチを、Ｍ１/Ｍ５は二つのA-Cミスマッチと一つのG-Gミスマッチの計３個のミスマッチを持っている二本鎖であることを示している。なお、表１中に下線で特定された塩基は、ミスマッチ塩基を示している。
【００２６】
【表１】
2006304707.tif 000004
【００２７】
【表２】
2006304707.tif 000005
【００２８】
【表３】
2006304707.tif 000006
【００２９】
【表４】
2006304707.tif 000007
【００３０】
【表５】
2006304707.tif 000008
【００３１】
【表６】
2006304707.tif 000009
【００３２】
上掲した表２〜６では、緩衝液中に対するインターカレーター（SYBR Green I）の添加量を0.3、0.5、1.0、1.5、2.0μＭと５段階に変化させたときに、計５種類の二本鎖のサンプル種別ごとのＴｍ値を測定した結果を示している。
【００３３】
このＴｍ値の測定結果からもわかるように、二本鎖核酸鎖の安定性は、ミスマッチ塩基の数が少ないほど高く、順番に、Ｍ１/Ｍ２＞Ｍ１/Ｍ３（Ｍ１/Ｍ４）＞Ｍ１＞Ｍ５であった。
【実施例２】
【００３４】
次に、インターカレーターが存在する場合と無い場合において、サンプルである各種二本鎖Ｓ１/Ｓ２、Ｍ１/Ｍ２、Ｍ１/Ｍ３、Ｍ１/Ｍ４、Ｍ１/Ｍ５のＴｍ曲線と該Ｔｍ曲線の変極点（inflection point）での傾きの変化を調べる実験を行った。なお、UV Melting測定は、BECKMAN U-8000 Spectrophotometerを用いて実施した。測定波長（Scanning wave length）は260nm,測定速度（scanning rate）は1℃/minである。Ｔｍ値の解析は、公知の2-point average法により行った。
【００３５】
図１から図５は、Ｓ１/Ｓ２、Ｍ１/Ｍ２、Ｍ１/Ｍ３、Ｍ１/Ｍ４、Ｍ１/Ｍ５の各Ｔｍ曲線（２６０ｎｍ紫外吸収で測定したＴｍ曲線）を、それぞれインターカレーターがある場合（点線曲線）と無い場合（実線曲線）で比較した図である。
【００３６】
また、次の「表７」は、図１から５にそれぞれ示されている、Ｓ１/Ｓ２、Ｍ１/Ｍ２、Ｍ１/Ｍ３、Ｍ１/Ｍ４、Ｍ/Ｍ５のＴｍ曲線を基に、変極点におけるタンジェント線（tangent line）の傾き、並びにインターカレーターがある場合（点線曲線）と無い場合（実線曲線）傾きの変化率をまとめた表である。
【００３７】
【表７】
2006304707.tif 000010
【００３８】
前掲の表７からわかるように、Ｍ１/Ｍ２では変化率が１．０６であり、インターカレーター（SYBR Green I）の有無によりその傾きは、ほぼ変化しないことがわかった。また、Ｍ１/Ｍ３における変化率は１６．２７、Ｍ１/Ｍ４での変化率は１２.３５、Ｍ１/Ｍ５においては３２．８５であり、ミスマッチ塩基が多くなるほど、即ち、二本鎖核酸鎖が不安定であればあるほど、インターカレーター（SYBR Green I）の添加により、その傾きがより緩やかに変化することがわかった。
【００３９】
インターカレーター（SYBR Green I）をハイブリダイゼーションアッセイの過程で添加することによって、ミスマッチ塩基が存在して二本鎖核酸鎖が不安定であればあるほど、そのハイブリダイゼーションの反応速度を緩やかにすることが可能であることがわかった。
【００４０】
即ち、インターカレーターの添加によって、完全相補鎖を形成する正規ハイブリダイゼーションに対して、ミスハイブリダイゼーションの反応速度を遅くできることがわかった。このことから、正規ハイブリダイゼーションをミスハイブリダイゼーションよりも優勢に進行させるのに、インターカレーターを使用できることがわかった。
【００４１】
また、Ｍ１/Ｍ２は２０merの鎖長の完全相補鎖であるのに対し、Ｓ１/Ｓ２は１０merの鎖長の完全相補鎖であり、その二本鎖の安定性は、Ｍ１/Ｍ２＞Ｓ１/Ｓ２である。傾きの変化率は、Ｍ１/Ｍ２で１．０６であるのに対し、Ｓ１/Ｓ２では２５．８と非常にその値は異なっている。
【００４２】
これは二本鎖核酸鎖の鎖長を変化させることにより、インターカレーターによるハイブリダイゼーション反応の平衡定数の変化率を制御できることを示している。
【実施例３】
【００４３】
次に、プローブ核酸鎖が基板表面に固定された反応系での検証実験を行った。
【００４４】
実験方法。株式会社イニシアム製のＱＣＭ（水晶発振子）装置（ＱＣＭ２０００）を用いて、同社推奨の方法により、ＱＣＭチップ上にアビジンを固定し、これに５’末端がビオチン修飾されたプローブ核酸鎖をアビジンービオチン結合により固定した。
【００４５】
実験区１では、１５ｍｅｒのプローブ核酸鎖を固定する過程（ａ）、固定したプローブ核酸鎖に１５ｍｅｒの標的核酸鎖をハイブリダイゼーションさせたとき（ｂ）、ハイブリダイゼーション後にインターカレーター（SYBR Green I）を添加してインターカレートさせたとき（ｃ）について、それぞれＱＣＭ測定を行った。
【００４６】
実験区２では、標的核酸鎖の濃度が反応系中で１０ｎＭとなるように、また、SYBR Green Iの希釈率が10000倍となるように、予めエッペンチューブ中で混合したものを、ＱＣＭ反応系へ添加した。即ち、標的核酸鎖とインターカレーターを同時添加した。
【００４７】
実験区３では、標的核酸鎖の濃度が１００ｎＭとなるように、また、SYBR Green Iの希釈率が10000倍となるように、予めエッペンチューブ中で混合したものを、ＱＣＭ反応系へ添加した。即ち、標的核酸鎖とインターカレーターを同時添加した。
【００４８】
なお、本実験の実験区２、３で用いたプローブ核酸鎖（合成オリゴＤＮＡ）と標的核酸鎖（合成オリゴＤＮＡ）を以下の「表８」に、測定結果を「表９」に示す。
【００４９】
【表８】
2006304707.tif 000011
【００５０】
【表９】
2006304707.tif 000012
【００５１】
図６から図８は、実験区１から３のＱＣＭ曲線（横軸は時間（分））をそれぞれ示している。まず、図６を見ると、約６０分で、プローブ核酸鎖の固定やハイブリダイゼーションが飽和しており、ハイブリダイゼーション後に添加したインターカレーターは、添加直後にインターカレートが即座に飽和していることを確認した。
【００５２】
実験区２と実験区３では、反応領域への標的核酸鎖の添加濃度を変化させた。実験区２は、標的核酸鎖の添加濃度が１０μＭ、実験１は標的核酸鎖の添加濃度が１００μＭである。なお、それぞれインターカレーターを標的核酸鎖と同に添加している。
【００５３】
実験区２と実験区３では、ハイブリダイゼーションにかかる時間が変化した（実験区３の方が実験区２よりもハイブリダイゼーションが速い）。実験区２（標的核酸鎖濃度：１０ｎＭ）では、約６時間後でも依然としてハイブリダイゼーションが飽和していないが、実験区３（標的核酸鎖濃度：１００ｎＭ）では、約５０分後にはハイブリダイゼーションが飽和に達した。
【００５４】
即ち、標的核酸鎖とインターカレーター（SYBR Green I）の濃度比を変化させることによって、ハイブリダイゼーション反応の平衡定数を変化させ、ハイブリダイゼーションの速度を制御できることを検証できた。本測定は、基板上にプローブ核酸鎖を固定して行ったものであり、本実施例により、基板上での本発明の有効性を証明できた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術に利用できる。特に、反応領域中に存在するプローブ核酸鎖との間で完全相補鎖を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する正規標的核酸鎖と、前記プローブ核酸鎖との間でミスマッチ塩基対を形成し得る塩基配列又は塩基配列部分を有する誤標的核酸鎖とが混在する系におけるハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。ＤＮＡチップなどの基板上に設けられた反応領域でのハイブリダイゼーション検出技術に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２の結果を示す図面代用グラフ（Ｓ１/Ｓ２のＴｍ曲線、実線はインターカレーターあり、点線はインターカレーターなし）。
【図２】実施例２の結果を示す図面代用グラフ（Ｍ１/Ｍ２のＴｍ曲線、実線はインターカレーターあり、点線はインターカレーターなし）。）。
【図３】実施例２の結果を示す図面代用グラフ（Ｍ１/Ｍ３のＴｍ曲線、実線はインターカレーターあり、点線はインターカレーターなし）。
【図４】実施例２の結果を示す図面代用グラフ（Ｍ１/Ｍ４のＴｍ曲線、実線はインターカレーターあり、点線はインターカレーターなし）。
【図５】実施例２の結果を示す図面代用グラフ（Ｍ１/Ｍ５のＴｍ曲線、実線はインターカレーターあり、点線はインターカレーターなし）。
【図６】実施例３の結果を示す図面代用グラフ（実験区１のＱＣＭ曲線）。
【図７】実施例３の結果を示す図面代用グラフ（実験区２のＱＣＭ曲線）。
【図８】実施例３の結果を示す図面代用グラフ（実験区３のＱＣＭ曲線）。
【図１】
2006304707.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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