(57)【要約】      （修正有）【課題】  本発明は、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法及びシステムを提供する。【解決手段】  蛍光物質を発現するトランスジェニック動物を得ること、及び走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて上記トランスジェニック動物の生体内部の組織を可視化することを含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法、及び、蛍光物質を発現するトランスジェニック動物、及び走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングするシステム。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
蛍光物質を発現するトランスジェニック動物を得ること、及び
走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて上記トランスジェニック動物の生体内部の組織を可視化すること
を含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法。
【請求項２】
上記トランスジェニック動物が、ヒトを除く哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記生体内部の組織が、血管及び／又は血液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記蛍光物質が、蛍光タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記生体反応が、血小板凝集反応である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
蛍光物質を発現するトランスジェニック動物、及び
走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡
を含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングするシステム。
【請求項７】
上記トランスジェニック動物が、ヒトを除く哺乳類である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
上記生体内部の組織が、血管及び／又は血液である、請求項６又は７に記載のシステム。
【請求項９】
上記蛍光物質が、蛍光タンパク質である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
上記生体反応が、血小板凝集反応である、請求項６〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来は、生体内部の組織を可視化し、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法は知られていなかった。
【０００３】
例えば、生体内の血液凝集能をリアルタイムでモニタリングするためには、血液を対外に取り出し、血小板を分離し、これに血小板凝集試薬を加えインビトロで観察する必要があり、血小板同士だけの凝集しやすさから血小板凝集能を判定しなければならなかった。したがって、インビトロでは、血管壁の性状、血流や他の血球成分の血小板凝集能に対する影響を検討することができない。
【０００４】
しかしながら、血管内における血小板凝集能とは、単に血小板同士自体の凝集し易さでなく血液中の様々な要因、血中の脂質濃度や糖濃度などの液性因子や血管壁の性状、血流の速度によって血小板が刺激を受けることによって決定される。すなわち、生体内の血小板凝集能や易血栓性を検討するためには、生体内血管をin situでリアルタイムに評価できることが極めて重要である。
【０００５】
血栓症における血栓の成長及び血栓の形成について血小板内カルシウム濃度の観点から検討する方法が報告されている。この方法は、血小板を体外に取り出してカルシウム感受性色素で標識し、別のラビットの血管に戻し、この標識された血小板を可視化し、個々の血小板の活性パターンに関してカルシウム濃度変化を指標にして、インビボでリアルタイムに観察するものである。この方法では、生体から血小板を取り出すという操作が必要であるという欠点を有する（非特許文献１）。
【０００６】
また、マウスの動脈での血栓形成時における血小板、組織因子、繊維素に対する抗体を蛍光標識し、これを血管に注射し、可視化し、これらの血管内成分をインビボでリアルタイムに観察する方法も知られている。同時に血栓形成を、ＣＣＤカメラと共焦点顕微鏡を用いて、リアルタイムに観察し、血栓をデジタル分析する方法が報告されている。しかし、この方法では、血液成分を取り出してはいないが、血管壁の性状や血小板以外の血球成分可視化できないのでこれらの因子の血栓形成に対する影響を検討することができないという欠点を有する（非特許文献２、３）。
【０００７】
上記のように、先行文献に記載されている方法は、マウス等のインビボでの血管中で生じる種々の現象を、蛍光タンパク質発現動物を用いて可視化し、血管壁、血流及び血球を含めた血液成分の機能を損なうことなくリアルタイムで観察し、デジタルデータ化して、その解析を行い得るものではなく、満足することができないものであった。
したがって、これらのニーズを満足させることができる方法の開発が待たれていた。
【非特許文献１】Miriam A. van Gestel et al., Real-time detection of activation patterns in individual platelets during thromboembolism in vivo: Differences between thrombus growth and emboulus formation., J Vascular Research, 39, 534-543, 2002.
【非特許文献２】Shahrokh Falati et al., Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse., Nature Medicine, 8, 1175-1180, 2002.
【非特許文献３】A. Celi et al., Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thrombosis and Haemositasis, 1, 60-68, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体内部の組織を可視化し、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法及びシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、蛍光物質を発現するトランスジェニック動物を得、そして走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて上記トランスジェニック動物の生体内部の組織を可視化することによって、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングすることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明は、下記のとおりである。
１．蛍光物質を発現するトランスジェニック動物を得ること、及び走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて上記トランスジェニック動物の生体内部の組織を可視化することを含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法。
２．上記トランスジェニック動物が、ヒトを除く哺乳類である、上記１に記載の方法。
３．上記生体内部の組織が、血管及び／又は血液である、上記１又は２に記載の方法。
４．上記蛍光物質が、蛍光タンパク質である、上記１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．上記生体反応が、血小板凝集反応である、上記１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．蛍光物質を発現するトランスジェニック動物、及び走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングするシステム。
７．上記トランスジェニック動物が、ヒトを除く哺乳類である、上記６に記載のシステム。
８．上記生体内部の組織が、血管及び／又は血液である、上記６又は７に記載のシステム。
９．上記蛍光物質が、蛍光タンパク質である、上記６〜８のいずれか１に記載のシステム。
１０．上記生体反応が、血小板凝集反応である、上記６〜９のいずれか１に記載のシステム。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、医薬品を投与されたマウス等の動物について、生体内において生じる種々の現象、たとえば、血管中の血管壁の炎症、血管内の血小板の凝集化、血栓の形成などを、リアルタイムで観察し、解析し、定量化する新しい方法を提供するとともに、新薬などの薬効を確認するためのスクリーニングに供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、蛍光物質を発現するトランスジェニック動物を得ること及び走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて上記トランスジェニック動物の生体内部の組織を可視化することを含む、生体反応をin situで非侵襲的及びリアルタイムにモニタリングする方法に関する。
【００１３】
本発明において、生体反応とは、侵襲に対して生体が恒常性を保つための防御反応をいう。例えば、血管壁を含む血管内事象、血管を含めた臓器の再生及び炎症過程を挙げることができ、好ましくは、血管中の血管壁の透過性、炎症、血管内の血小板の凝集、血栓の形成である。
【００１４】
本発明において、in situとは、「生体内の本来の場所での」という意味で用いられる。インビボ（in vivo）も生体内であるが、インビボが試験管などで培養された細胞内での実験を指すことがあるのに対し、in situはその細胞が由来する生物個体内の本来あるべき場所における実験であることを意味する点で相違する。
【００１５】
本発明において、侵襲とは、生体の内部環境の恒常性を乱す可能性がある外部からの刺激であり、非侵襲的とは、このような外部からの刺激を排除する意である。たとえば、血管内の血栓形成に関して侵襲とは、血中の脂質濃度や糖濃度などの液性因子や血管壁の性状、血流の速度のような血管内における血小板凝集能を乱す外部からの刺激である。
【００１６】
本発明において、リアルタイムとは、生体内部の組織における生体反応を把握し得る程度に即時に可視化を行うことである。たとえば、血管内の血流中の血球の動きを捉えるためには、最大流速を考慮して少なくとも２００フレーム／秒の速度が要求される。それに対して、血栓形成は、血小板の傷害血管内皮下組織への血小板の粘着により開始されることから１フレーム／秒程度で粘着血小板凝集塊（血小板血栓）の形態変化は観察可能である。ただし、血小板血栓の形態的、機能的変化を詳細に検討するためには、少なくとも３０フレーム／秒程度で血栓全体をスキャンして血栓の３次元像を取得する必要がある。
【００１７】
本発明において、蛍光物質とは、特定波長の光（励起光）を吸収し、それにより励起された状態（励起状態）から元の状態（基底状態）に戻る際に光（蛍光）としてエネルギーを放出する特性をもつ物質であり、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および強化緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescence Protein：ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）およびＥＹＦＰ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）およびＥＣＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびＥＢＦＰを挙げることができる。
【００１８】
本発明において、トランスジェニック動物とは、遺伝子組み替え技術を用いて外部ＤＮＡをゲノムに導入することによって生産された動物をいう。外部ＤＮＡのゲノムへの導入は、マイクロインジェクションやレトロウイルスベクター等の従来公知の方法を用いて行うことができる。また、種々のＧＦＰ発現トランスジェニック動物が市販されている。たとえば、大阪大学で作られ体毛、赤血球以外の全組織にＧＦＰを発現させたgreen mouse FM131が日本ＳＣＬ社より、そして血管内皮細胞特異的にＧＦＰを発現させたマウス（FVB/N-TgN(TIE2GFP)287Sato）がThe Jackson Laboratoryより購入可能である。
【００１９】
本発明に用いることができる走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡には、例えば、フルフレーム高速共焦点スキャナ（横河電機、ＣＳＵ２１、ＣＳＵ２２）を装備した蛍光顕微鏡を挙げることができる。
【００２０】
本願発明で可視化とは、本来は視覚で認識することができない流れや運動を視覚を通じて認識することができるようにすることをいう。
【００２１】
走査型共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いてデータを可視化するためには、従来公知の任意の技術を用いることができるが、たとえば、下記：
光学顕微鏡
共焦点スキャナ
蛍光波長分離装置
カメラ、たとえばＣＣＤカメラ
レーザセット、たとえばＡｒＫｒレーザセット又はＡｒレーザセット
画像入力ボード
画像取得ソフト
画像処理ソフト
画像処理装置、たとえば、市販のパーソナルコンピュータ
３次元画像取り込み装置（ピエゾアクチュエータ、波形発生器、信号制御機、信号制御ソフトからなる）
からなるシステムを用いることができる。
【実施例１】
【００２２】
血小板活性化機構のリアルタイム解析
血管内血栓形成過程は、血管内皮細胞の障害部位における障害内皮あるいは内皮下組織への血小板の粘着により開始される。粘着血小板は、形態変化とともに細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の上昇がトリガーとなりフィブリノーゲンを分子糊として血小板凝集塊を形成する（血小板血栓）。この血小板凝集塊を足場として、血液凝固反応が惹起され、フィブリノーゲンはフィブリンとなり、血小板血栓は、より強固な凝固血栓にいたる。凝固反応の開始には、血小板内［Ｃａ２＋］ｉの持続的上昇によるホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞内膜から外膜への暴露が必須である。そこで、インビボ血流環境下における血栓形成過程を検討するために、マウス腸間膜静脈を用いて、細胞外膜へのＰＳの暴露を血小板活性化の指標としてリアルタイム解析を行った。
【００２３】
マウス腸間膜静脈においてレーザー照射により血管内皮細胞を傷害し、ＧＦＰ標識血小板とＰＳの特異的な結合タンパク質であるａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８標識ａｎｎｅｘｉｎＶ（ＡＮＸＶ）とを用いて血小板凝集及び血液凝固開始シグナルとしてＰＳを可視化し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いてそれぞれの蛍光強度の変化をモニタリングした。
【００２４】
実験材料：ＧＦＰトランスジェニックマウス(体毛、赤血球以外の全組織に発現。大阪大学にて作製されたC57BL/6TgN（act-EGFP）Obsc14-Y01-FM131)（以下ＧＦＰマウスという。）を日本ＳＬＣ社より購入し、実験に用いた。
【００２５】
使用機器:
１．光学顕微鏡：ニコン正立顕微鏡
２．共焦点スキャナ：横河電機ＣＳＵ２１フルフレーム高速共焦点スキャナ
３．カメラ：ＣＣＤカメラ(浜松ホトニクスＥＢ−ＣＣＤ)
蛍光波長分離装置 Ｗ−ｖｉｅｗ（浜松ホトニクス）
４．レーザセット：
共焦点スキャナ観察用レーザー（Melles Griot社）  ２０mW ＡｒＫｒレーザー  ４８８／５６８nm、
血管内皮細胞傷害用レーザー 150 mW（Melles Griot社）  Ａｒレーザ５１４ nm、
フィルターセッティング：ダイクロイックミラー  ５５０nm、エミッションフィルタ：ＧＦＰ用バンドパスフィルター  ５３５／２５nm、ａｌｅｘａ５６８用ロングパスフィルタ５９０nm
５．画像入力ボード
６．画像処理ソフト
画像取得ソフト：ＩＰＬａｂ３．６及びＩＰｌａｂＲＴ３Ｄ
画像処理ソフト：３次元再構築アプリケーション  ＶｏｘＢｌａｓｔ  ３．０
７．パーソナルコンピュータ：Windows（登録商標） Pentium（登録商標） 4 RAM 2GB HDD 160GB
８．３次元画像取り込み装置：ピエゾアクチュエータ(P-720.10, PI-PLYTEC社)、波形発生器（７０６１２２−Ｍ、横河電機）、ＧＰ−ＩＢボード(National Instrument製)、信号制御機(ＲＳＣ３１,横河電機)、信号制御ソフト（ＲＳＣ３２,横河電機）
【００２６】
実験方法
腹腔内にネンブタールを投与してＧＦＰマウスを麻酔し、腹部を開腹し顕微鏡ステージ上に置き腸間膜を腹部より出して観察台にのせる。血小板の活性化指標としてａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８にて標識したＡＮＸＶを血中最終濃度１００ｎＭ〜２μＭがなるように尾静脈より前投与した。３７℃の生理食塩水を観察部位に灌流させながら１０〜４０倍対物水浸レンズを用いて腸間膜静脈に焦点を合わせた。血管壁近傍の血小板に焦点を合わせ、可視化血小板の蛍光強度が飽和しないようにレーザ出力を調節した後、血管内皮細胞を傷害用レーザーにてレーザーパワー７０〜９０  ｍＷ  ３〜５秒間照射して血栓を作製した。作製された血栓の大きさに応じて血栓の画像を１  μｍ  間隔で血管内腔より血管壁まで画像取得ソフトにてコンピューターに取り込み、画像再構築ソフトにて３次元化してデジタル解析を行う。なお、ＧＦＰ標識血小板（緑色）とａｌｅｘａ５６８標識ＡＮＸＶ（赤色）同時測定にはＷ−ＶＩＥＷを用いた。
【００２７】
血小板凝集の増大とともにＧＦＰの蛍光強度は増大したが、その後急速に減弱した。一方、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８の蛍光強度は、時間とともに増大した。インビトロに実験でもＣａイオノフォアで刺激されたＧＦＰ標識血小板の蛍光強度の急激な減少が認められたが、それと同様に、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８の蛍光強度は、経時的に増大した。
【００２８】
ＧＦＰマウスの腸間膜静脈を上記の方法にて観察すると、血管外部より血管平滑筋の輪状配列、ときおり血小板や白血球の粘着する様子が可視化された。
【００２９】
このように、本発明によって、従来の実験系では実現し得なかった、血管平滑筋も含めた血管壁の正常と両血球成分を詳細に可視化することができる実験系が確立された。
【００３０】
血小板や白血球は、その形態及び大きさよって、容易に鑑別することができた。また、最大流速を示す血流中央部の血小板や白血球個々の挙動の観察は３０フレーム／秒の撮像スピードでは正確に捉えられなかったが、２００フレーム／秒の撮像スピードでは血流中央部の血小板や白血球個々の挙動も容易かつ明瞭に観察することができた。３０フレーム／秒の撮像スピードであっても、遅い血流速度示す血管壁近傍において時折見られる両血球成分の血管内皮への粘着を観察することができた。血栓形成部位は血管壁近傍なので３０フレーム／秒の撮像スピードであれば十分であると考えられた。ただし、血栓全体の経時的形態変化を考慮して３次元画像を得るためには、３０フレーム／秒程度の撮像スピードにて各共焦点面の画像取得を行う必要があると考えられるが、血栓全体へのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識ＡＮＸＶの空間的広がりの評価を行う際には、各３次元画像は５−１０秒間隔程度の取り込み時間で十分と考えられる。
【００３１】
レーザー傷害により障害部への主に血小板まれに白血球の粘着が始まり、５秒後には明瞭な血小板凝集塊（血小板血栓）が形成された。この時、血管壁を構成する血管平滑筋の形態の変化は認められなかったことより、平滑筋層は傷害されていないことが推測された。血栓の大きさは血流に削られながらも次第に増大していき、約５〜１０分後における底面で、約５０μｍ×約５０μｍ、高さ、３０μｍの山型の血栓が維持された。血栓形成初期のＧＦＰ蛍光標識血小板の蛍光強度は血栓の増大と共に暫増し、大きさの変化が少なくなるにつれ次第にレーザー照射部分より外周を残すように中心部の蛍光強度の減弱が見られた。これは血栓形成過程において血小板の活性化とともに血小板膜の透過性が亢進しＧＦＰ蛍光が血小板より漏出したためと考えられた。経時的には血小板のＧＦＰ蛍光強度（緑色蛍光）の減少と逆にａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識ＰＳの蛍光強度（赤色蛍光）の増大が３次元的広がりを持って観察された。ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識ＡＮＸＶとの同時記録でのインビトロの実験でも、この現象が血小板を薬理学的に活性化させたときに見られることが確認された。
【００３２】
ＧＦＰ蛍光強度の減少は、血小板膜の透過性の亢進による血小板内からのＧＦＰ漏出と考えられた。血管内でのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識ＡＮＸＶを指標とした血小板凝集塊におけるＰＳの暴露は、凝集塊の深部・中心部を基点として空間的に広がっていき、表層ではＰＳの暴露が少なかったことにより、ＰＳの暴露には、血流の速さが深く関与していると考えられた。
【実施例２】
【００３３】
血管内皮細胞特異的にＧＦＰを発現させたマウスでは、腸間膜動静脈において血管内皮細胞は血流方向に沿って進展した紡錘型の個々の細胞として識別が可能であった。また肝臓や脾臓の表面血管の分布の可視化は可能であり、各臓器における血管の再生過程も定量化して検討することが可能であると考えられた。ＧＦＰマウス膵臓では核と細胞膜は細胞質より蛍光が強く個々の外分泌腺房細胞の可視化が可能であった。また、膵炎などにより腺房細胞が障害されたときや腺房構造の破綻も識別することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、医薬品を投与されたラット等について、生体内において生じる種々の現象、たとえば、１）血管中の血管壁の炎症、血管内の血小板の凝集化、血栓の形成などを、２）血管新生を指標とした臓器の再生過程を、３）膵炎の炎症過程をリアルタイムで観察し、解析し、定量化する新しい方法を提供するとともに、新薬などの薬効を確認するためのスクリーニングに供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】システム構成の概要図である。
【図１】
2006234596.tif 000003