(57)【要約】【課題】  新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供するものである。【解決手段】  核酸増幅方法は、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、第１配列に相補的な第１のプライマーと、第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、第１増幅二本鎖核酸を、所定配列付一本鎖核酸に分離する第３工程と、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列に相補的な第３のプライマーと、第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第４工程と、第２増幅二本鎖核酸を合成する第５工程とを備える。さらに、第４工程が、第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われることを特徴とする。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し前記標的核酸の前記第１配列に相補的な第１のプライマーと、前記標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、
前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、
前記第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第３工程と、
前記所定配列付一本鎖核酸に対して、前記所定配列付一本鎖核酸の前記所定配列に相補的な第３のプライマーと、前記所定配列付一本鎖核酸の前記第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第４工程と、
前記第３のプライマー又は前記第４のプライマーが結合した前記所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第５工程とを備える核酸増幅方法において、
前記第４工程が、前記第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われることを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
前記第１工程から前記第３工程を少なくとも１回反復することを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記第５工程後に、前記第２増幅標的二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第６工程を備え、
前記第４工程から前記第５工程を少なくとも１回反復することを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記第１の配列が、ウイルス由来の核酸配列であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列であることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記ウイルス由来の核酸配列が、Ｇａｇ配列であることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記第２の配列が、Ａｌｕである請求項１乃至６いずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記第５工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われる請求項１乃至７のいずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記第４工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部とを有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる請求項１乃至７のいずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブを添加して行われる請求項１乃至７のいずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記競合核酸が、ＴａｑＭａｎプローブである請求項１乃至７のいずれか記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項１１のいずれか記載の核酸増幅方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法に関し、特に、核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＰＣＲ（polymerase  chain  reaction）法などの核酸増幅方法によって、ＨＩＶ（Human  immunodeficiency  virus）などのウイルス量が定量されてきている。例えば、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、ＰＣＲでの増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングして解析するReal  Time  PCR法などによって、ＲＮＡをウイルスゲノムとし、ＲＮＡをＤＮＡに転写する逆転写酵素を持つＲＮＡウイルスの一種であるレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ（Human  immunodeficiency  virus）など）のウイルス量が定量されている。
【０００３】
また、宿主細胞内でウイルスのＲＮＡがある程度存在している場合には、宿主細胞内のウイルスＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ウイルス量の定量が行われている。
【０００４】
しかし、近年、薬物治療によって一時的にＲＮＡを合成しないＨＩＶの存在が確認された。この一時的にＲＮＡを合成しないＨＩＶは、薬物に耐性があることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。このため、例えば、診断、治療方針の選定、研究などのために、このようなＨＩＶのウイルス量を定量する必要性が高まってきている。
【０００５】
例えば、ＨＩＶなどの宿主細胞内にインテグレートしたウイルスＤＮＡを定量するために、一方のプローブとしてウイルスのＬＴＲに結合可能な核酸配列を用いた、ＰＣＲ法が開発された。
【０００６】
しかし、宿主細胞内において、ウイルスによって逆転写されたＤＮＡと、宿主細胞の染色体にインテグレートされたＤＮＡとを、区別して核酸を増幅することは、非常に困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このため、ウイルスによって逆転写されたがインテグレートされていないＤＮＡと、宿主細胞の染色体にインテグレートされたＤＮＡを区別するため、一方のプライマーとしてウイルスのＬＴＲに結合可能な核酸配列を用い、他方のプライマーとして宿主細胞の染色体中に大量（一細胞あたり約１００万個）にコードされているＡｌｕ配列に結合可能な核酸配列を用いる、Nested  PCR法が開発された。
【０００８】
しかし、この核酸増幅方法であっても、第２段階のＰＣＲでＬＴＲに対するプライマーを使用しているために、インテグレートしていないウイルスのＤＮＡが検出されてしまう（非特許文献３）。このため、この核酸増幅方法による増幅産物を診断や治療方針の選定、研究などに用いるのは困難である。
【０００９】
さらに、検出精度を上昇するための方法の一つとして、所定配列のタグ配列を有するプライマーを用いたNested  PCR法が開発された（非特許文献３）。この方法は、一方のプライマーとしてタグ配列を有するプライマーを用いて、第一段階のＰＣＲを行う。このため、第一段階のＰＣＲ産物には、タグ配列を有するプライマーの配列が導入される。第二段階のＰＣＲ時に、タグ付のプライマーに含まれている所定配列に対して相補的なプライマーを使用することによって、第一段階のＰＣＲ産物に特異的に核酸増幅が行われ得る。
【非特許文献１】Chun,  T.-W.,  D.  Finzi,  J.  Margolick,  K.  Chadwich,  D.  Schwartz,  and  R.  F.  Siliciano.  1995.  Fate  of  HIV-1-infected  T  cells  in  vivo:  rates  of  transition  to  stable  latency.  Nat.  Med.  1:1284-1290.
【非特許文献２】Chun,  T.  W.,  L.  Stuyver,  S.  B.  Mizell,  L.  A.  Ehler,  J.  M.  Mican,  M.  Baseler,  A.  L.  Lloyd,  M.  A.  Nowak,  and  A.  S.  Fauci.  1997.  Presence  of  an  inducible  HIV-1  latent  reservoir  during  highly  active  antiretroviral  therapy.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  94:13193-13197.
【非特許文献３】Brussel  A,  Sonigo  P.  2003  Analysis  of  early  human  immunodeficiency  virus  type  1  DNA  synthesis  by  use  of  a  new  sensitive  assay  for  quantifying  integrated  provirus.  J  Virol.  77(18):10119-24.
【００１０】
しかし、上記の核酸増幅方法であっても、第一段階のＰＣＲの残留物であるタグ配列を有するプライマーなどが第二段階のＰＣＲ時に意図せぬ反応し、不要な核酸配列が対数的に増幅され得る。このため、上記の核酸増幅方法による増幅産物を用いても、不要な核酸配列が大量に増幅され得るため、正確なウイルス量の定量は困難である。このため、不要な核酸配列が増幅されず、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法の提供が望まれている。
【００１１】
本発明は、上述したような課題に鑑みてなされたものである。その目的は、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以上のような目的を達成するために、本発明は、以下のようなものを提供する。
【００１３】
（１）  第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し前記標的核酸の前記第１配列に相補的な第１のプライマーと、前記標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、前記第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第３工程と、前記所定配列付一本鎖核酸に対して、前記所定配列付一本鎖核酸の前記所定配列に相補的な第３のプライマーと、前記所定配列付一本鎖核酸の前記第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第４工程と、前記第３のプライマー又は前記第４のプライマーが結合した前記所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第５工程とを備える核酸増幅方法において、前記第４工程が、前記第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われることを特徴とする核酸増幅方法。
【００１４】
（１）に記載の発明によれば、第１工程において、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する。第２工程において、第１のプライマー又は第２のプライマーが、結合した標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する。第３工程において、第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列一本鎖核酸に分離する。第４工程において、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する。さらに、第４工程において、添加された第１の配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸が、第１の配列に対して結合するため、第３工程までに未反応の第１のプライマーが第１の配列に結合することを阻害する。第５工程において、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する。このように、第４工程において添加された競合核酸が、第１工程から第３工程までにおいて未反応の第１のプライマーの結合を阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００１５】
（２）  （１）に記載の核酸増幅方法であって、前記第１工程から前記第３工程を少なくとも１回反復することを特徴とする核酸増幅方法。
【００１６】
（２）の発明によれば、（１）の発明の効果に加えて、第１工程から第３工程を少なくとも１回反復することによって、第１のプライマーと第２のプライマーが使用され、所定配列付一本鎖核酸がさらに増幅される。このため、反応によって、第１のプライマーが使用され、未反応の第１のプライマーが減少するとともに、第４工程以降の増幅の対象である所定配列付一本鎖核酸が増幅され、第３のプライマーや第４のプライマーがより効率よく標的となる核酸配列を増幅することができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００１７】
（３）  （１）又は（２）に記載の核酸増幅方法であって、前記第５工程後に、前記第２増幅標的二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第６工程を備え、前記第４工程から前記第５工程を少なくとも１回反復することを特徴とする核酸増幅方法。
【００１８】
（３）の発明によれば、（１）又は（２）の発明の効果に加えて、第４工程から第６工程を少なくとも１回反復することによって、第２増幅標的二本鎖核酸がさらに増幅される。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００１９】
（４）  （１）乃至（３）いずれかに記載の核酸増幅方法において、前記第１の配列が、ウイルス由来の核酸配列であることを特徴とする核酸増幅方法。
【００２０】
（４）に記載の発明によれば、例えば、ＨＩＶなどのウイルス由来の核酸配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（１）乃至（３）いずれかの発明の効果に加えて、例えば、宿主細胞にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされた場合に、ウイルス由来の核酸配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００２１】
（５）  （４）に記載の核酸増幅方法において、前記ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列であることを特徴とする核酸増幅方法。
【００２２】
（５）に記載の発明によれば、例えば、ＨＩＶに含まれているＬＴＲ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（４）の発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、ＬＴＲ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００２３】
（６）  （４）に記載の核酸増幅方法において、前記ウイルス由来の核酸配列が、Ｇａｇ配列である核酸増幅方法。
【００２４】
（６）に記載の発明によれば、例えば、ＨＩＶに含まれているＧａｇ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（４）の発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ｇａｇ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００２５】
（７）  （１）乃至（６）いずれかに記載の核酸増幅方法において、前記第２の配列が、Ａｌｕ配列である核酸増幅方法。
【００２６】
（７）に記載の発明によれば、例えば、ヒトやサルなどの宿主細胞に数多く含まれているＡｌｕ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（１）乃至（６）いずれかの発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ａｌｕ配列に第２のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００２７】
（８）  （１）乃至（７）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第５工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われる核酸増幅方法。
【００２８】
（８）の発明によれば、（１）乃至（７）のいずれかの発明の効果に加えて、第５工程において、核酸が伸張する際に、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬であるインターカレーター性蛍光物質を添加して行われる。インターカレーター性蛍光物質は、合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発光する。この蛍光強度の検出により、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００２９】
（９）  （１）乃至（７）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第４工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部と蛍光部及びクエンチャー部の間にあるＲＮＡ部を有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる核酸増幅方法。
【００３０】
（９）の発明によれば、（１）乃至（７）のいずれかの発明の効果に加えて、第４工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部を有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる。第４工程において、所定配列付一本鎖核酸に標識核酸が結合する。第５工程において、核酸が伸張する際に、ＲＮａｓｅＨが、標識核酸のＲＮＡ部を分解することによって、標識核酸の蛍光部とクエンチャー部が分離する。例えば、励起光の照射を受けることによって、分離した蛍光部が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００３１】
（１０）  （１）乃至（７）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブを添加して行われる核酸増幅方法。
【００３２】
（１０）の発明によれば、（１）乃至（７）のいずれかの発明の効果に加えて、第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われる。第４工程において、所定列付の一本鎖核酸にＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が特異的に結合する。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第５工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００３３】
（１１）  （１）乃至（７）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記競合核酸が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）であることを特徴とする核酸増幅方法。
【００３４】
（１１）の発明によれば、（１）乃至（７）のいずれかの発明の効果に加えて、競合核酸がＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）である。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が、第１の配列に対して第１のプローブ（登録商標）と競合的に結合する。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第５工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００３５】
（１２）  （１）乃至（１１）のいずれか記載の核酸増幅方法を行うためのキット。
【００３６】
（１２）の発明によれば、（１）乃至（１１）のいずれかの核酸増幅方法を行うためのキットによって、（１）乃至（１１）のいずれかの核酸増幅方法を行うことができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を行うことができるキットを提供することが可能である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、第４工程において添加された競合核酸が、第１工程から第３工程までにおいて未反応の第１のプライマーの結合を阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に、本発明に好適な実施形態について説明する。
【００３９】
図１は、従来のAlu−LTR  PCR法を説明する概念図である。図１に示すように、ウイルス由来の核酸がインテグレートされた宿主細胞の核酸配列には、複数のAlu配列と、ウイルス由来のLTR（long  terminal  repeat）配列とが含まれている。Alu配列と相補的なプライマー及びLTR配列に相補的なプライマーを用いて第１段階のPCRを１２サイクル行う。次に、第１段階のPCRにより増幅された増幅産物を一部取出し、それを鋳型にし、所望の配列に対するプライマーを用いて、第２段階のPCRを行う（所謂Nested  PCR法）。
【００４０】
しかし、従来の方法においては、第２段階のPCRにおいて、第１段階のプライマーによって、ウイルス由来核酸配列がインテグレートされていない核酸配列も増幅され得るため、感度が低くなるという課題があった。
【００４１】
なお、ここで、Alu配列とは、ヒトやサルなどのゲノム中に散在する小型の反復配列であり、ヒトゲノムのマーカーとして、また遺伝子クローニングでの人DNA断片のプローブとしても利用される。LTR配列とは、レトロウイルスゲノムDNAの両端末で重複している長い末端反復配列の略であり、U３、R、U５の配列からなる。この配列がウイルスDNAの染色体へのランダムな部位への組込みに関与すると考えられている。
【００４２】
図２は、改良したNested  PCR法を説明する概念図である。図２に示すように、Alu配列と相補的なプライマー及びLTR配列の少なくとも一部または近傍に相補的なプライマーを用いて第１段階のPCRを１２サイクル行う。このとき、LTR配列の少なくとも一部または近傍に相補的なプライマーは、Tag配列を有している。次に、第１段階のPCRにより増幅された増幅産物を一部取出し、それを鋳型にし、LTR配列内のU５配列に対するプライマーとタグ配列に対して相補的なプライマーを用いて、第２段階のPCRを行う。
【００４３】
この方法は、理論的には、第１段階のPCRで増幅された核酸がTag配列を含む。このため、第２段階のPCRにおいて、Tag配列に対するプライマーを用いることによって、ウイルス由来の核酸がインテグレートした核酸配列を特異的に増幅することが可能となり得る。
【００４４】
しかしながら、この方法であっても、第１段階のPCRにおいて、未反応のTag配列付のプライマーが、第２段階のPCRで反応し得るため、意図しない核酸増幅を起こし得る。
【００４５】
図３は、本発明に係る核酸増幅法を説明する概念図である。図３の左側に示される方法１（Method  １）は、図２で説明した従来のPCR法である。図３の右側に示される方法２（Method  ２）は、本発明に係る核酸増幅法である。
【００４６】
図３に示すように、方法１では、第１段階のPCR時にAlu配列とLTR配列を有する核酸が増幅される。しかしながら、第２段階のPCRにおいて、第１段階のPCRで未反応のであった、Alu配列を有さないがLTR配列を有する核酸が存在し得る。この核酸に対して、U５に対するプライマーと、LTR配列の少なくとも一部または近傍に相補的なプライマーとが結合し得る。これらのプライマーが結合した核酸も第２段階のPCR時に増幅され得る。このため、意図しない核酸増幅が行われる可能性がある。
【００４７】
方法２では、Gag配列（第１の配列）に相補的な第１のプライマーとAlu配列（第２の配列）と相補的な第２のプライマーを用いて第１段階のPCRを１２サイクル行う。このとき、Gag配列に相補的な第１のプライマーは、Tag配列（所定の配列）を有している。次に、第１段階のPCRにより増幅された増幅産物を一部取出し、それを鋳型にし、LTR配列内のU５配列（第３の配列）に対する第３のプライマーとタグ配列に対して相補的な第４のプライマーを用いて、第２段階のPCRを行う。さらに、方法２では、Gag配列に対して競合的に結合する核酸を加えて行われる。
【００４８】
より具体的に方法２を説明すると、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、タグ配列などの所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、この標的核酸の第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程が行われる。次に、第１のプライマー又は第２のプライマーが結合した標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程が行われる。次に、第１増幅二本鎖核酸を、第３配列及び所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第３工程が行われる。次に、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第４工程が行われる。さらに、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第５工程が行われる。さらに、第４工程が、第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われる。
【００４９】
これによって、第１工程において、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する。第２工程において、第１のプライマー又は第２のプライマーが結合した標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する。第３工程において、第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する。第４工程において、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する。さらに、第４工程において、添加された第１の配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸が、第１の配列に対して結合するため、第３工程までに未反応の第１のプライマーが第１の配列に結合することを阻害する。第５工程において、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する。このように、第４工程において添加された競合核酸が、第１工程から第３工程までにおいて未反応の第１のプライマーの結合を阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。ここで競合的に結合するとは、第１配列を有する標的となる核酸に対して結合する部位を持つ第１のプライマーと、第１のプライマーが第１配列と結合する部位と少なくとも一部が重複して結合する部位を持つ非伸張性の競合核酸とが、競合して標的となる核酸の第１配列に結合することを言う。つまり、競合核酸が、標的となる核酸の第１の配列に結合すると第１のプライマーが結合できなくなる。また、競合核酸は、第１のプライマーよりも標的となる核酸に結合しやすいものならば、いかなるものでもよく、例えば、TaqManプローブ（登録商標）やＥＮＡ（登録商標）であっても良い。
【００５０】
さらに、方法２は、第１工程から第３工程を少なくとも１回反復し、より好ましくは１２回以上反復しても良い。これによって、第１工程から第３工程を少なくとも１回反復することによって、第１のプライマーと第２のプライマーが使用され、所定配列一本鎖核酸がさらに増幅される。このため、反応によって、第１のプライマーが使用され、未反応の第１のプライマーが減少するとともに、第４工程以降の増幅の対象である所定配列付一本鎖核酸が増幅され、第３のプライマーや第４のプライマーがより効率よく標的となる核酸配列を増幅することができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、第１工程から第３工程の反復回数は、本実施例において、１回、３回、１２回と例示されているが、本発明は、これに限定されない。第４の工程以降において、核酸を増幅するために十分な核酸を増幅するために必要ないかなる回数であっても良い。
【００５１】
さらに、方法２は、第５工程後に、増幅標的二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第６工程を備え、第４工程から第６工程を少なくとも１回反復し、より好ましくは１２回以上反復しても良い。第４工程から第６工程を少なくとも１回反復することによって、第２増幅標的二本鎖核酸がさらに増幅される。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００５２】
さらに、方法２は、第１の配列が、ウイルス由来の核酸配列であっても良い。この場合、例えば、ＨＩＶやなどのレトロウイルス由来の核酸配列を標的にして、プライマーを設計しても良い。このため、例えば、宿主細胞にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされた場合に、ウイルス由来の核酸配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。なお、本発明のレトロウイルスの例としては、哺乳類B型レトロウイルスグループ（Mammalian  type  B  retroviruses）、哺乳類C型レトロウイルスグループ（Mammalian  type  C  retroviruses）、鳥類C型レトロウイルスグループ(Avian  type  C  retroviruses)、鳥類D型レトロウイルスグループ(Avian  type  D  retroviruses)、ウシ白血病ウイルス‐ヒトリンパ球向性ウイルス（BLV-HTLV  retroviruses）、HIVなどのレンチウイルス族（Lentivirus）、スプマウイルス族（Spumavirus）が含まれる。
【００５３】
さらに、方法２は、ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列であっても良い。例えば、ＨＩＶに含まれているＬＴＲ配列やＧａｇ配列を標的にして、プライマーを設計する。このため、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、ウイルス由来の核酸配列の例として、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列記載されているが、本発明はこれに限定されず、例えば、Pol配列やenv配列など他の外皮タンパクをコードする遺伝子や、転写促進に働くtat配列、m-RNAの輸送を促進するrev配列など、プロウイルスに含まれる他の遺伝子配列であっても良い。
【００５４】
さらに、方法２は、第２の配列が、Ａｌｕ配列であっても良い。例えば、ヒトやサルなどの宿主細胞に数多く含まれているＡｌｕ配列を標的にして、プライマーを設計すると、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ａｌｕ配列に第２のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００５５】
さらに、方法２を使用して、核酸の量を定量する場合に、第５工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われても良い。つまり、第５工程において、核酸が伸張する際に、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬であるインターカレーター性蛍光物質を添加して行われる。インターカレーター性蛍光物質は、合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発光する。この蛍光強度の検出により、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。例えば、インターカレーター性蛍光物質として、タカラバイオ株式会社のインターカレーター（SYBR（R）  Green  I（登録商標））やアマシャム  バイオサイエンシズ会社のインターカレーター（Vistra  Green)などが知られている。
【００５６】
さらに、方法２を使用して、核酸の量を定量する場合に、第４工程が、蛍光物質（FAMなど）が結合している蛍光部とクエンチャー（TAMRA  など）が結合しているクエンチャー部とを有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われても良い。つまり、第４工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部を有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる。第４工程において、所定配列付一本鎖核酸に標識核酸が結合する。第５工程において、核酸が伸張する際に、ＲＮａｓｅＨが、標識核酸のＲＮＡ部を分解することによって、標識核酸の蛍光部とクエンチャー部が分離する。例えば、励起光の照射を受けることによって、分離した蛍光部が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、蛍光物質の一例としてＦＡＭを、クエンチャーの一例としてＴＡＭＲＡを記載したが、蛍光物質は、特定の波長によって発光する物質であればどのような物質でもよく。また、クエンチャーは、その蛍光物質からの発光を吸収し、他の波長に変更する物質であればどのような物質でも良い。このような目的で使われる核酸には、Taqmanプローブ、Molecular  Beaconプローブ、Hybridizationプローブ（Roche  Diagnostics）がある。
【００５７】
さらに、方法２を使用して、核酸の量を定量する場合に、第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われても良い。第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われる。第４工程において、所定列付の一本鎖核酸にＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が特異的に結合する。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第５工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。Taqman  プローブを用いたキットとしては、例えばTaqMan  Gene  Expression  AssaysやPre-Developed  TaqMan  Assay  Reagents  がある。
【００５８】
さらに、方法２を使用して、核酸の量を定量する場合に、競合核酸として、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を使用しても良い。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が、第１の配列に対して第１のプローブと競合的に結合する。第４工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第５工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００５９】
［実験例１］
方法１による核酸増殖の特異性を調べた。方法１の第１のPCRでは、ＰＣＲ用試薬としてABI社より販売されているAmpliTaq  Goldを使用した。０.６２５ユニットのAmpliTaq  Gold、２.５μlの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００mM  トリス−HCl（pH  ９.０）、５００mM  KCl、１５mM  MgCｌ２、２mM  dNTP）、各２.５μlのプライマー（フォワードプライマー  ３μM及びリバースプライマー３μM）、ゲノムDNA  １００ngを含む溶液を１μl、滅菌水を加えて２５μｌの溶液とした。
【００６０】
第１フォワードプライマー（以下、１stPCR/F）は、配列番号１のプライマーを使用した、第１リバースプライマー（以下、１stPCR/R）は、配列番号２の配列のプライマーを使用した。ＰＣＲ反応にはサーマルサイクラー（Gene  Amp  ９６００,  パーキンエルマー社）を用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１０分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１分間、アニーリング５８℃で１分間、伸長反応７２℃で５分間）を１２回行い、その後７２℃で５分間置いた。
【００６１】
第２のPCRは、PCR用試薬としてABgene社から販売されているABsolute  qPCR  Rox  mixを使用した。１２.５μlのqPCR  mix、各２.５μlのプライマー・プローブ（フォワードプライマー  ３μM、リバースプライマー３μM、及びプローブ２μM）、第１PCR反応液２.５μl、水を５μl加え、２７.５μlの溶液とした。プライマーとして、第２フォワードプライマー（以下、２ndPCR/F）は、配列番号３の配列のプライマーを使用した、第２リバースプライマー（以下、２ndPCR/R）は、配列番号４の配列のプライマーを使用した。また測定用のプローブとして、AluLTR  probe1（配列番号５）を使用した。
【００６２】
ＰＣＲ反応にはABI  ７７００  シークエンス  ディテクター  システムを用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１５分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１５秒間、アニーリング及び伸長反応６０℃で１分間）を４５回行った。
【００６３】
図４は、方法１による実験の結果を示す説明図である。図中のPrimer+/polymerase+は、プライマーとして上記の１stPCR/Fと１stPCR/Rとを使用し、ポリメラーゼを加えて第１のPCRを行い、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。図中のPrimer+/polymerase-は、プライマーとして上記の１stPCR/Fと１stPCR/Rとを使用し、ポリメラーゼを加えず第１のPCRを行い（上記の合成反応サイクルに応じた温度変化を１２サイクル行った）、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。図中のPrimer-/polymerase-は、プライマーも、ポリメラーゼも加えずに第１のPCRを行い（上記の合成反応サイクルに応じた温度変化を１２サイクル行った）、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。
【００６４】
図４に示されるように、Primer+/polymerase+は、２４サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えている。Primer+/polymerase-は、２７サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えている。Primer-/polymerase-は、４４サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えている。
【００６５】
Primer+/polymerase-は、第１のPCRでポリメラーゼが含まれていないため、第１のPCRでは、核酸の増幅が起こらないはずである。このため、理論的には、Primer-/polymerase-と同じような結果になるはずである。しかし、実際には、Primer+/polymerase-は、２７サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えている。Primer+/polymerase+の蛍光強度の値が０.４を超えたサイクル数とPrimer+/polymerase-の蛍光強度の値が０.４を超えたサイクル数とは、３サイクルしか異ならない。PCRは１回のサイクルで約２倍に核酸を増幅するため、標的となる核酸を増幅したPrimer+/polymerase+と、意図しない核酸を増幅したPrimer+/polymerase-との核酸の増幅量が近いため、方法１は、あまり特異性が高くない。
【００６６】
［実験例２］
図５は、方法２による実験の結果を示す説明図である。方法２は測定用のプローブとして、配列番号６のAluLTR  probe２を使用した以外は、方法１と同様のプロトコルで行った。
【００６７】
図５は、方法２の結果を示している。図中のPrimer+/polymerase+は、プライマーとして上記の１stPCR/Fと１stPCR/Rとを使用し、ポリメラーゼを加えて第１のPCRを行い、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。図中のPrimer+/polymerase-は、プライマーとして上記の１stPCR/Fと１stPCR/Rとを使用し、ポリメラーゼを加えず第１のPCRを行い（上記の合成反応サイクルに応じた温度変化を１２サイクル行った）、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。図中のPrimer-/polymerase-は、プライマーも、ポリメラーゼも加えずに第１のPCRを行い（上記の合成反応サイクルに応じた温度変化を１２サイクル行った）、その増幅産物に対して、第２のPCRを行ったものである。
【００６８】
図５に示されるように、Primer+/polymerase+は、２６サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えた。Primer+/polymerase-は、４４サイクルで蛍光強度の値が０.４を超えた。Primer-/polymerase-は、４５サイクルでは蛍光強度の値が０.４を超えなかった。
【００６９】
この結果から示されるように、Primer+/polymerase+の蛍光強度の値が０.４を超えたサイクル数とPrimer+/polymerase-の蛍光強度の値が０.４を超えたサイクル数とが、約１８サイクル異なっており、意図しない核酸の増幅が抑制されていることが示された。このように、第２のPCRにおいて添加された競合核酸（AluLTR  probe２）が、第１のPCRにおいて未反応の第１のプライマー（１stPCR/R）の配列番号７の部分の標的核酸に対する結合を競合的に阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。
【００７０】
［実験例３］
方法２により、第１のPCRにおいて添加するDNAコピー数を変更して、方法２の定量製を調べた。第１のPCRのゲノムDNAを含む溶液１μl中のコピー数を段階希釈し、２４４０００コピー、２４４００コピー、２４４０コピー、２４４コピー、２４コピー、２．４コピー含む６種類の溶液に対して方法２を行った。
【００７１】
図６は、サイクル数と蛍光強度との関係を示す説明図である。図６に示されるように、コピー数と蛍光強度に関係性が見られた。図７は、サイクル数と最初のコピー数を対数グラフに示す説明図である。図７に示されるように、線形性が示され、本発明の方法が、核酸量の定量に使用できることが示された。
【００７２】
［実験例３］
本発明の方法を使用して、Jurkat細胞内のウイルス（HIV）由来の核酸量と、宿主細胞のDNAにインテグレートされたウイルス由来の核酸量とを調べた。
【００７３】
図８は、Jurkat細胞内のウイルス由来の核酸量の動態を示す説明図である。ウイルス由来の核酸量の測定方法は以下の通りである。ウイルス溶液として、１００ng  DNAを含む液１μlを用い、水の量を調節して全体量を２５μlに調整した。そして、PCR用試薬としてABgene社から販売されているABsolute  qPCR  Rox  mixを使用した。１２.５μlのqPCR  mix、各２.５μlのプライマー・プローブ（フォワードプライマー  ３μM、リバースプライマー３μM、及びプローブ２μM）、ウイルス溶液１μl、水を５μl加え、２５μlの溶液とした。プライマーとして、フォワードプライマー（以下、total/F）は、配列番号８の配列のプライマーを使用した、第２リバースプライマー（以下、total/R）は、配列番号９の配列のプライマーを使用した。また測定用のプローブとして、配列番号１０の配列のtotal/probeを使用した。
【００７４】
ＰＣＲ反応にはABI  ７７００  シークエンス  ディテクター  システムを用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１５分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１５秒間、アニーリング及び伸長反応６０℃で１分間）を４５回行った。
【００７５】
図８に示されるように、ウイルス感染後、５時間で１０００細胞あたりのコピー数が約８０００コピーとなった。時間が経過することによって、１０００細胞あたりのコピー数が約１０００コピーに減少した。HIVは、宿主細胞に感染後に核酸を増幅するが、宿主細胞のDNAにインテグレートされない核酸は、分解されていると考えられている。この結果より、インテグレートされた核酸は、１０００細胞あたりのコピー数が約１０００コピーであると分かった。
【００７６】
インテグレートされたウイルスの核酸量を、方法２で行った。図９は、Jurkat細胞内でインテグレートされたウイルス由来の核酸量の動態を示す説明図である。図９に示すように、ウイルス感染後、５時間で１０００細胞あたりのコピー数が約１５００コピーとなり、８時間で、１０００細胞あたりのコピー数が約１０００コピーとなった。
【００７７】
この結果は、図８の結果から導き出される結論と同じであり、方法２は、このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を利用した核酸定量法として使用できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】従来のAlu−LTR  PCR法を説明する概念図である。
【図２】改良したNested  PCR法を説明する概念図である。
【図３】本発明に係る核酸増幅法を説明する概念図である。
【図４】方法１による実験の結果を示す説明図である。
【図５】方法２による実験の結果を示す説明図である。
【図６】サイクル数と蛍光強度との関係を示す説明図である。
【図７】サイクル数と最初のコピー数を対数グラフに示す説明図である。
【図８】Jurkat細胞内のウイルス由来の核酸量の動態を示す説明図である。
【図９】Jurkat細胞内でインテグレートされたウイルス由来の核酸量の動態を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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