(57)【要約】【課題】LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子の提供。【解決手段】配列番号24のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその“二重Ｑ”変異体；配列番号25のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその“二重Ｑ”変異体；及びｆ）上記（ｃ）もしくは（ｅ）の核酸分子又はそれらのフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子、から成る群から選択された、LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ）配列番号24のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその“二重Ｑ”変異体；
ｅ）配列番号25のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその“二重Ｑ”変異体；及び
ｆ）上記（ｃ）もしくは（ｅ）の核酸分子又はそれらのフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子；
から成る群から選択された、LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
cDNA、ゲノムDNA 又は合成DNA である請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターにより安定して形質転換された又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞。
【請求項５】
LSIRF ポリペプチドの特異的DNA 結合活性を有する単離されたポリペプチド又はそのフラグメント。
【請求項６】
外因性核酸分子配列の原核又は真核宿主細胞発現の生成物である請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のDNA によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項８】
LSIRF 発現を可能にする条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る、LSIRF ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項９】
請求項１に記載のDNA によりコードされるポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
LSIRF ポリペプチドの調製方法であって；
ａ）LSIRF 遺伝子を含んで成るベクターを宿主細胞中に挿入し；そして
ｂ）前記LSIRF ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１２】
配列番号24である単離された核酸分子、又はその“二重Ｑ”変異体。
【請求項１３】
配列番号25のアミノ酸配列を有する請求項５に記載のポリペプチド、又はその“二重Ｑ”変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA 結合活性を有する新規ポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。これまで“ IRF−３”ポリペプチドと称されて来たポリペプチドは現在、“LSIRF ”ポリペプチド（リンパ球特異的インターフェロン調節因子）と称されており、そしてインターフェロン調節因子として知られているポリペプチドの種類の新規メンバーである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の調節は、いくつかの異なったレベルで起こるが、しかし遺伝子特異的転写因子の活性化はこの過程にとって最とも基礎的なものであると思われる。転写因子の１つの種類、すなわちインターフェロン調節因子(IRF) は、４種のメンバー、すなわち IRF−１， IRF−２，ISGF３γ及びICSBP から成る。すべての４種のIRFは、反復されたトリプトファンモチーフを含有する、強く保存されたＮ−末端DNA 結合ドメインにより特徴づけられる（Veals など., Mol. Cell. Biol., 12 : 3315-3324 [1992]）。
【０００３】
インターフェロン調節因子−１(IRF−１）及び−２(IRF−２）は、ヒトインターフェロン−β(IFN−β）遺伝子の転写調節の研究により初め同定された（Miyamotoなど., Cell, 54 : 903-913 [1988]及びHaradaなど., Cell, 58 : 729-739 [1989]）。cDNA発現研究は、 IRF−１がIFN 遺伝子及び IFN−誘導性遺伝子の転写活性化因子として機能し、そして IRF−２は IRF−１の効果を抑制することを示している（Fujitaなど., Nature, 337, 270-272 [1989]及びHaradaなど., Cell, 63 : 303-312 [1990]）。
【０００４】
最近の分析は、 IRF−１が、腫瘍抑制遺伝子としても作用し、そして IRF−２が可能性ある腫瘍遺伝子として作用することを示している（Haradaなど., Science, 259 : 971-974 [1993]）。IRF−１発現はタンプ−Ｉ（α／β）IFN 及びタイプII（γ）IFN により誘発され（Miyamotoなど., Cell, 54 : 903-913 [1988] ; Kannoなど., Mol. Cell. Biol., 13: 3951-3963 [1993]）、他方 IRF−２は構成的に発現され、且つタイプ−Ｉ IFNにより誘発される（Haradaなど., Cell, 58 : 729-739 [1989]）。
【０００５】
インターフェロンにより刺激される遺伝子因子−３γ（ISGF３γ）は、タイプ−Ｉ IFNにより潜在サイトゾル形から活性化されたISGF３αサブユニットに会合する IFN−γ−誘導性タンパク質である（Levyなど., EMBO J., 9 : 1105-1111 [1990] ; Levy など., New Biologist, 2 : 383-392 [1990]）。会合に基づいて、この複合体は、核にトランスロケートし、そしてISRE(IFNにより刺激される応答要素；Veals など., Mol. Cell. Biol., 12 : 3315-3324 [1992]）として知られる IFN−誘導性遺伝子のプロモーター領域に見出される特定のDNA 配列と結合することが示されている。
【０００６】
最近、91／84KDa 及び113KDaのISGF３αサブユニットがクローン化されており（Schindler など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 7836-7839[1992] ; Fu など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 7840-7843 [1992]）、そして転写−１（Stat−１）及び−２（Stat−２）のシグナルトランスジューサー及び活性化因子として、それぞれ命名されており、それらはタイプ−Ｉ IFN/IFN−レセプター関与に続いてのJAK キナーゼリン酸化の標的物である（Shuai など., Science, 261 : 1744-1746 [1993]；Darnell など., Science, 261 : 1415-1421 [1994]）。
【０００７】
インターフェロンコンセンサス配列結合タンパク質(ICSBP) はまた、ネズミMHC クラスＩ，Ｈ−２ＬＤ  遺伝子のプロモーターのISREモチーフ(ICSとも称する）を認識するタンパク質として初め単離された IFN−γ−誘導性タンパク質でもある（Driggersなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3743-3747 [1990]）。しかしながら、 IRF−１， IRF−２及びISGF３γとは異なって、ICSBP は、マクロファージ及びリンパ球系細胞において独占的に誘導されるので、発現の組織制限されたパターンを示す（Driggersなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3743-3747 [1990]）。
【０００８】
最近の研究は、ICSBP がIFN 遺伝子及び IFN−誘導性遺伝子の誘導に対する IRF−１の効果をアンタゴナイズすることにおいて IRF−２に類似する役割を有することを示唆している（Weisz など., J. Biol. Chem., 267 ; 25589-25596 [1992] ; Nelsonなど., Mol. Cell. Biol., 13 :588-599 [1993]）。インターフェロン−誘導性遺伝子のISREは、 IRF−Ｅ、すなわち IRF−１及び−２により認識されるDNA 配列とオーバーラップする（Tanakaなど., Mol. Cell. Biol. 13 : 4531-4538 [1993] ）。つい最近、ISGF３γは、 IFN−β遺伝子の IRF−Ｅを結合することが示された（Kawakamiなど., FEBS Letters, 358 : 225-229 [1995] ）。
【０００９】
インターフェロン遺伝子及び他の遺伝子の発現を調節することにおけるIRF の重要性の観点から、他のIRF 、特に組織特異的IRF を同定する必要性が当業界において存在する。
従って、IRF 遺伝子の種類の新規メンバーを同定することが、本発明の目的である。
他の目的は、当業者に容易に明らかになるであろう。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、リンパ球特異的インターフェロン調節因子をコードする新規核酸分子を提供する。“ IRF−３”分子としてこれまで言及されて来た分子は現在、“LSIRF ”分子として言及されるが、しかしながら、この用語は、用語“LSIRF ”分子と交換可能的に使用され得る。
【００１１】
１つの観点において、本発明は、
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｃ）配列番号24のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその“Double Q”変異体；
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ｅ）配列番号25のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸又はその“二重Ｑ”変異体；及び
ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）もしくは（ｅ）の核酸分子、又はそれらのフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子；
から成る群から選択された、LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、宿主細胞におけるそれらの核酸分子の発現の生成物であるポリペプチドを供給する。
さらにまた、本発明は、LSIRF ポリペプチドを特異的に結合する抗体を供給する。任意には、前記抗体はモノクローナル抗体である。
もう１つの観点において、本発明は、LSIRF ポリペプチドの特異的DNA 結合活性を有する単離されたポリペプチド又はそのフラグメントを供給する。
【００１３】
もう１つの観点において、本発明は、LSIRF ポリペプチドをコードするDNA 分子を含んで成るベクターを供給する。
さらにもう１つの観点において、本発明は、LSIRF ポリペプチドをコードするDNA 分子を含んで成るベクターにより安定して形質転換され、又はトランスフェクトされた宿主細胞を供給する。
【００１４】
さらにもう１つの観点において、本発明は、単離されたLSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントを供給し；前記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
さらなる観点において、本発明は、外因性LSIRF 核酸配列の原核又は真核宿主細胞発現生成物であるLSIRF ポリペプチドを供給する。
さらに、本発明は、LSIRF 発現を可能にする条件下で原核又は真核宿主細胞を培養することを含んで成る、LSIRF ポリペプチドを生成するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な記載
用語“ IRF−３”及び“LSIRF ”は、本明細書において、交換可能に使用され、そして同じ核酸及びアミノ酸配列を言及し；LSIRFの“単一Ｑ”及び“二重Ｑ”形はこの定義内に包含される（例５を参照のこと）。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語“生物学的活性”とは、ISRE（インターフェロン結合性応答要素）型DNA フラグメント、たとえばネズミMHCI ISRE 、ヒトISG54 及び／又はISRE変異体、たとえばISREｍ１又はISREｍ４（それらの配列は表１に示されている）を結合する、いづれかの源に由来する完全な長さのポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。生物学的活性ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、完全な長さのLSIRF ポリペプチド、たとえば図２及び25に示されるLSIRF ポリペプチドに対して生ぜしめられ、そしてそのポリペプチドと反応する抗体との免疫学的交差反応性を有するそれらのポリペプチド又はフラグメントも包含する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語“安定して形質転換された又はトランスフェクトされた”とは、宿主細胞ゲノムDNA 又は独立した分子（たとえば染色体外的に）として、宿主細胞中に挿入され、そして宿主細胞に存在し、そしてそれが宿主細胞の連続的世代を通して代々伝えられるように親宿主細胞において維持され、そして複製される核酸分子を意味する。
【００１８】
用語“合成DNA ”とは、全体的に又は部分的に化学合成法により生成された核酸分子を言及する。
用語“ベクター”とは、細菌、酵母、無脊椎動物及び／又は哺乳類宿主細胞と機能することができるプラスミド又はウィルスDNA システムの形での核酸分子増幅、複製及び／又は発現ビークルを意味する。ベクターは、宿主細胞ゲノムDNA と独立して存続することができ、又はゲノムDNA と完全に又は部分的に統合することができる。ベクターは、それが適合できるいづれかの宿主細胞において機能的であるためのすべての必要な要素を含むであろう。そのような要素は、下記に示されている。
【００１９】
本発明の１つの観点は、LSIRF ポリペプチドを調製するための方法を提供する。典型的には、前記ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする核酸分子を得、この核酸分子を適切な発現ベクター中に挿入し、前記ベクターを適合する宿主細胞中に挿入し、前記宿主細胞においてLSIRF ポリペプチドを発現し、そして前記LSIRF ポリペプチドを精製することによって調製されるであろう。
【００２０】
１．LSIRF ポリペプチドをコードするDNA の調製
LSIRF をコードする核酸分子は、種々の手段、たとえば化学合成、cDNAもしくはゲノムライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリーのスクリーニング、及び／又はcDNAのPCR 増幅（但し、これらだけには限定されない）により容易に得られる。そのようなDNAを単離するのに有用な方法及び他のものは、Sambrookなど. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]）により、Ausubelなど., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994] ）により、及びBerger and Kimmel (Method in Enzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987] ）により示されている。LSIRF をコードする好ましい核酸配列は、哺乳類の配列である。LSIRF をコードする最とも好ましい核酸配列は、ヒト、ラット及びマウスのものである。
【００２１】
LSIRF 核酸分子の化学合成は、Engelsなど. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716-734 [1989]）により示される、当業界においてよく知られている方法を用いて達成され得る。それらの方法は、中でも、核酸合成のホスホトリエステル法、ホスホラミジト法及びＨ−ホスホネート法を包含する。典型的には、完全な長さのLSIRF ポリペプチドをコードする核酸分子は、長さ数百の塩基対（bp）又はヌクレオチドであろう。長さ約 100個以上のヌクレオチドの核酸は、長さ約 100個までのヌクレオチドであるいくつかのフラグメントとして合成され得る。次に、それらのフラグメントが下記のようにして一緒に連結され、LSIRF ポリペプチドをコードする完全な長さの核酸が形成される。好ましい方法は、標準的ホスホラミジト化学を用いてのポリマー支持合成法である。
【００２２】
あるいは、LSIRF ポリペプチドをコードする核酸は、適切なcDNAライブラリー（すなわち、ポリペプチドを発現すると思われる１もしくは複数の組織源から調製されたライブラリー）又はゲノムライブラリー（ゲノムDNA 全体から調製されたライブラリー）をスクリーニングすることによって得られる。cDNAライブラリーの源は、典型的には、適切な量でLSIRF を発現すると思われるいづれかの種からの組織（たとえばリンパ系組織）である。ゲノムライブラリーの源は、LSIRF 又はLSIRF 相同体をコードする遺伝子を有すると思われるいづれかの哺乳類又は他の種からのいづれかの組織である。
【００２３】
ライブラリーは、そのライブラリーに存在するLSIRF のcDNA又はLSIRF 相同体cDNAと選択的にハイブリダイズするであろう１又は複数の核酸プローブ（クローン化されるべきLSIRF 又はLSIRF 相同体cDNA又は遺伝子に対して許容できるレベルの相同性を有する、オリゴヌクレオチド、cDNA又はゲノムDNA フラグメント）を用いて、LSIRFcDNA／遺伝子の存在についてスクリーンされ得る。典型的には、そのようなライブラリースクリーニングのために使用されるプローブは通常、ライブラリーが調製された種と同じか又はそれに類似する種からのLSIRF DNA 配列の小領域をコードする。他方、プローブは、下記で論ぜられるようにして変性され得る。
【００２４】
ライブラリースクリーニングは、典型的には、プローブ又はプライマーと有意なレベルの相同性を有するそれらのクローンの非特異的結合を妨げるが、しかしその結合を可能にする緊縮条件下でライブラリーにおけるクローンにオリゴヌクレオチドプローブ又はcDNAをアニーリングすることによって達成される。典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄緊縮条件は、cDNA又はオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、ヌクレオチドの数）に、及びプローブが変性されるかどうかに依存する。クローンを得ることの確率（すなわち、cDNA又はゲノムライブラリーがスクリーンされるかどうか；それがcDNAライブラリーである場合；興味あるcDNAが高レベルで存在する確率）はまた、ハイブリダイゼーション溶液を企画することにおいても考慮される。
【００２５】
DNA フラグメント（たとえばcDNA）がプローブとして使用される場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel など., eds.,前記に示されるような条件である。ハイブリダイゼーションの後、ライブラリーを含むブロットは、いくつかの要因、たとえばプローブサイズ、クローンへのプローブの予測される相同性、スクリーニングされるライブラリーの型、スクリーニングされるクローンの数、及び同様のものに依存して、適切な緊縮下で洗浄される。緊縮性洗浄溶液（通常、イオン強度が低く、そして比較的高い温度で使用される）の例は、次の通りである。１つのそのような緊縮洗浄液は、55〜65℃での 0.015ＭのNaCl， 0.005Ｍのクエン酸ナトリウム及び 0.1％のSDS である。もう１つのそのような緊縮緩衝液は、約40〜50℃での１mMのNa２  EDTA，40mMのNaHPO４ (pH7.2)及び１％のSDS である。他の１つの緊縮洗浄液は、約50〜65℃での 0.2×SSC及び 0.1％ SDSである。
【００２６】
cDNA又はゲノムライブラリーをスクリーンするためにオリゴヌクレオチドプローブが使用される場合、次のような緊縮洗浄条件についての２種の手段が使用され得る。第１の手段は、プローブの長さに依存して、約35〜62℃の温度での６×SSC 及び0.05％ピロリン酸ナトリウムを使用する。たとえば、14塩基のプローブは35〜40℃で、17塩基のプローブは45〜50℃で、20塩基のプローブは52〜57℃で、そして23塩基のプローブは57〜63℃で洗浄される。その温度は、バックグラウンド非特異的結合が高く出現する場合、高められ得る。第２の段階は、洗浄のためにテトラメチルアンモニウムクロリド（TMAC）を用いる。１つのそのような緊縮洗浄溶液は、３ＭのTMAC, 50mMのトリス−HCl, pH8.0、及び 0.2％のSDS である。この溶液を用いての洗浄温度は、プローブの長さの関数である。たとえば、17塩基のプローブは約45〜50℃で洗浄される。
【００２７】
SIRF ポリペプチドをコードする核酸を得るためのもう１つの適切な方法は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR) である。この方法においては、poly（Ａ）＋RNA 又は全RNA が、LSIRF を発現する組織（たとえばリンパ系組織）から抽出される。次に、逆転写酵素を用いてRNA からcDNAが調製される。次に、LSIRF cDNAの２つの別々の領域に対して典型的に相補的な２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）が、ポリメラーゼ、たとえばFaq ポリメラーゼと共にcDNAに付加され、そして前記ポリメラーゼがそれらの２つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
【００２８】
LSIRF ポリペプチドをコードする核酸を調製するための選択された方法がオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを必要とする場合（たとえばPCR, cDNA 又はゲノムライブラリースクリーニング）、プローブ又はプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリースクリーニング又はPCR 増幅の間に生じるであろう非特異的結合の量を最少にするために適切な長さのもの及び有意に明白なものであるべきである。プローブ又はプライマーの実際の配列は通常、他の生物からの同じか又は類似する遺伝子からの保存された又は相同性の高い配列又は領域に基づいている。
【００２９】
任意には、プローブ又はプライマーは、完全に又は部分的に変性することができ、すなわちプローブ／プライマーの混合物を含むことができ、ここですべては同じアミノ酸配列をコードするが、しかしそのようにするためには異なったコドンを用いている。変性プローブを調製するためのもう１つの手段は、種により変化するそれらのコドン位置のいくつか又はすべてにイノシンを配置することである。オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、上記のようなDNA の化学合成法により調製され得る。
【００３０】
LSIRF 変異体配列は、本発明の本発明の範囲内に考慮される。本発明において使用されるような変異体配列は、野生型アミノ酸配列に比較してアミノ酸配列変異をもたらす；野生型配列に比較しての１又は複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。多くの場合、天然に存在するLSIRF アミノ酸変異体は、天然の対立遺伝子変動の存在により存在することができる。そのような天然に存在する変異体もまた、本発明の範囲内でもある。合成変異体配列の調製は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、Wells など. (Gene, 34 : 315 [1985]）及びSambrookなど.,前記に記載されている。
【００３１】
２．LSIRF ポリペプチドの５’側フランキング配列の調製
いづれかの種からのLSIRF ５’フランキング配列（また、本明細書においては、“プロモーター”としても言及される）は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用される場合、プロモーターとは、LSIRF 遺伝子の５’側フランキング配列を意味する。その５’側フランキング配列は、種々の転写因子結合部位を有し、そしてまた、ほぼ−30位置でのTATAボックス及びそのTATAボックスの上流のCCAAT ボックスも有することができる。
【００３２】
そのような５’側フランキング配列は、単独で又は他の因子、たとえばエンハンサー要素、リプレッサー及び同様のもの（それらのいづれか又はすべては、ひじょうに遠位に位置することができる）と組合して、LSIRF 遺伝子の転写をインビボで天然において調節するものとして特徴づけられる。好ましい５’側フランキング配列は、哺乳類LSIRF ５’側フランキング配列である。ヒトLSIRF ５’側フランキング配列が最とも好ましい。
【００３３】
本発明の５’側フランキング配列は、LSIRF 遺伝子の５’部分に好ましくはハイブリダイズするcDNA又はゲノムLSIRF フランキングによりゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってそのライブラリーから得られる。そのようなフラグメントは、LSIRF のためのコード配列の開始点のすぐ５’側に一般的に位置する、LSIRF ５’側フランキング配列のいくつか又はすべてを含むライブラリー中のクローンにハイブリダイズすることができる。同定されたクローンがプロモーターの一部のみを含む場合、そのクローン自体又はそのフラグメントは、追加の５’側フランキング配列を得るために続いてのゲノムライブラリースクリーニングのために使用され得る。フラグメントによるスクリーニング（ハイブリダイゼーション及び洗浄を包含する）は、LSIRF 遺伝子及び／又はcDNAをクローニングするために上記のようにして達成され得る。
【００３４】
３．LSIRF 発現のためのベクターの調製
クローニングの後、LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントをコードするcDNA又は遺伝子を単離し、それを典型的には、増幅及び／又は発現ベクター中に挿入し、前記遺伝子のコピー数を高め、そして／又は適切な宿主細胞において前記ポリペプチドを発現せしめる。ベクターはしばしば、市販のベクターであるが、但し“注文製造された”ベクターも同様に使用され得る。ベクターは、使用される特定の宿主細胞において機能するよう選択される（すなわち、ベクターは、LSIRF 遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞の機構と適合することができる）。
【００３５】
LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントは、原核、酵母、昆虫（バキュロウィルス系）及び／又は真核宿主細胞において増幅され／発現され得る。宿主細胞の選択は、LSIRF ポリペプチド又はそのフラグメントがグリコシル化され得るかどうかに少なくとも一部依存するであろう。そのような場合、酵母、昆虫又は哺乳類宿主細胞が好ましく；酵母細胞はポリペプチドをグリコシル化するであろうし、そして昆虫及び哺乳類細胞は、それがLSIRF ポリペプチドに対して天然において生ぜしめるように、ポリペプチドをグリコシル化し、そして／又はリン酸化することができる（すなわち、“生来”のグリコシル化及び／又はリン酸化）。
【００３６】
典型的には、宿主細胞のいづれかに使用されるベクターは、５’側フランキング配列及び他の調節要素、たとえばエンハンサー、複製起点の要素、転写終結要素、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択可能マーカー要素を含むであろう。任意には、ベクターは、“標識”配列、すなわちポリHis(たとえばヘキサHis)又は他の小さな免疫原性配列をコードするLSIRF コード配列の５’又は３’端で位置するオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。この標識は、タンパク質と共に発現され、そして宿主細胞からのLSIRF ポリペプチドの精製のための親和性標識として作用することができる。任意には、標識は、続いて、種々の手段、たとえば選択されたペプチダーゼを用いて、精製されたLSIRF ポリペプチドから除去され得る。
【００３７】
Ａ．５’側フランキング配列要素
５’側フランキング配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／又は株からの）、異種（すなわち、宿主細胞種又は株以外の種からの）、ハイブリッド（すなわち、１つよりも多くの源からのｐ５’フランキング配列の組合せ）、合成、又は生来のLSIRF ５’側フランキング配列であり得る。５’側フランキング配列の源は、単細胞原核又は真核生物、いづれかの脊椎もしくは無脊椎動物、又はいづれかの植物であり得るが、但し、その５’側フランキング配列は、宿主細胞機構において機能的であり、そしてそれにより活性化され得る。
【００３８】
本発明のベクターにおいて有用な５’側フランキング配列は、当業界においてよく知られているいくつかの方法のいづれかにより得られる。典型的には、LSIRF ５’側フランキング配列以外の本発明において有用な５’側フランキング配列は、マッピングにより及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によりすでに同定されており、そして従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離され得る。多くの場合、５’側フランキング配列の完全なヌクレアーゼ配列は知られることができる。従って、５’側フランキング配列は、核酸合成又はクローニングについての上記方法を用いて合成され得る。
５’側フランキング配列のすべて又は単に一部が知られている場合、それは、PCR を用いて、及び／又は同じか又は他の種からの適切なオリゴヌクレオチド及び／又は５’側フランキング配列フラグメントによりゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００３９】
５’側フランキング配列が知られていない場合、ある５’側フランキング配列を含むDNA のフラグメントが、コード配列又はさらにもう１つの遺伝子を含むより大きなDNA 断片から単離され得る。単離は、適切なDNA フラグメントを単離するために１又は複数の注意して選択された酵素を用いての制限エンドヌクレアーゼ消化により達成され得る。消化の後、その消化されたフラグメントは、アガロースゲル精製、QiagenＲカラム、又は当業界において知られている他の方法により単離され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に明らかであろう。
【００４０】
Ｂ．複製起点要素
この成分は典型的には、市販の原核発現ベクターの一部であり、そして宿主細胞においてベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、多くの場合、LSIRF ポリペプチドの最適な発現のために重要である。選択されるベクターが複製部位の起点を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクター中に連結され得る。
【００４１】
Ｃ．転写終結要素
この要素は典型的には、LSIRF ポリペプチドコード配列の端の３’側に位置し、そしてLSIRF ポリペプチドの転写を終結するよう作用することができる。通常、原核細胞における転写終結要素は、Ｇ−Ｃに富むフラグメント、続いてポリＴ配列を有する。その要素はライブラリーから容易にクローン化され、又はベクターの一部として市販されているが、それはまた、核酸合成のための方法、たとえば上記方法を用いて容易に合成され得る。
【００４２】
Ｄ．選択マーカー要素
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存及び増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の要素、たとえば原核宿主細胞のためのアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を付与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補足し、又は（ｃ）複雑な培地から入手できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択可能マーカーは、耐カナマイシン性遺伝子、耐アンピシリン性遺伝子及び耐テトラサイクリン性遺伝子である。
【００４３】
Ｅ．リボソーム結合部位要素
通常、 Shine−Dalgarno配列（原核生物）又はKozak 配列（真核生物）と呼ばれるこの要素は、mRNAの翻訳開始のために必要である。この要素は典型的には、プロモーターの３’側及び合成されるべきポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。その Shine−Dalgarno配列は種々であるが、しかし典型的には、ポリプリン（すなわち高いＡ−Ｇ含有率を有する）である。多くの Shine−Dalgarno配列は同定されており、それらの個々は上記に示される方法を用いて容易に合成され得る。
【００４４】
上記に示される要素のすべて、及び本発明において有用な他の要素は、当業者に良く知られており、そしてたとえば、Sambrookなど. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]）及びBergerなど., eds. (Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987]）に記載されている。
【００４５】
Ｆ．シグナル配列要素
トランスジーン（trans gene）が分泌される予定である本発明のそれらの態様のためには、シグナル配列は、それが合成されるトランスジーンによりコードされるポリペプチドを細胞外に出すために、ときおり存在する。典型的には、シグナル配列は、コード領域の５’端近くでの又は５’端でのトランスジーンのコード領域に位置する。多くのシグナル配列は同定されており、そしてトランスジェニック組織において機能するそれらのいづれかがトランスジーンと共に使用され得る。従って、シグナル配列はトランスジーンに対して同種性であり、又は異種性であり得、そしてトランスジェニック哺乳類に対して同種性であり、又は異種性であり得る。さらに、シグナル配列は、上記に示される方法を用いて化学的に合成され得る。しかしながら、本発明の目的のためには、好ましいシグナル配列は、トランスジーンにより天然に存在する配列である（すなわち、トランスジーンに対して同種である）。
【００４６】
Ｇ．イントロン要素
多くの場合、トランスジーンの転写は、ベクター上の１又は複数のイントロンの存在により高められる。イントロンは、トランスジーン配列内に、特にトランスジーンが完全な長さのゲノムDNA 配列又はそのフラグメントである場合、天然に存在することができる。イントロンがDNA 配列内に天然に存在しない場合（ほとんどのcDNAに関して）、イントロンは他の源から得られる。イントロンは、トランスジーン及び／又はトランスジェニック哺乳類に対して同種性であり又は異種性であり得る。プロモーター及びトランスジーンに対するイントロンの位置は、イントロンは効果的に転写されるべきであるので、重要である。
【００４７】
トランスジーンがcDNA配列である場合、イントロンについての好ましい位置は、転写開始部位の３’側及びポリＡ転写終結配列の５’側に存在する。好ましくは、cDNAトランスジーンのためには、イントロンは、それがトランスジーンを中断しないように、トランスジーン配列の片側又は他側（すなわち、５’側又は３’側）に位置するであろう。いづれかの源、たとえばいづれかのウィルス、原核及び真核（植物又は動物）生物からのいづれかのイントロンが、本発明を実施するために使用され得るが、但し、それは、それが挿入される宿主細胞と適合性であるべきである。合成イントロンもまた、本発明に包含される。任意には、１よりも多くのイントロンが、ベクターに使用され得る。
【００４８】
Ｈ．ベクターの構成
１又は複数の上記要素が使用されるベクターにすでに存在しない場合、それらは個々に得られ、そしてベクター中に連結される。個々の要素を得るために使用される方法は当業界において良く知られており、そして上記に示される方法（すなわち、DNA の合成、ライブラリースクリーニング、及び同様のもの）に適合できる。
【００４９】
本発明を実施するために使用される最終ベクターは典型的には、出発ベクター、たとえば市販のベクターから構成される。このベクターは、完結されたベクターに含まれるべき要素のいくつかを含んでも又は含まなくても良い。所望する要素のどれも出発ベクターに存在しない場合、個々の要素は、連結されるべき要素の端及びベクターの端が連結のために適合するように適切な制限エンドヌクレアーゼによりベクターを切断することによって、ベクター中に個々に連結され得る。多くの場合、満足すべき連結を得るためには、一緒に連結されるべき端を“ブラント化”することが必要である。ブラント化は、すべての４種のヌクレオチドの存在下でクレノウDNA ポリメラーゼ又はＴ４ DNAポリメラーゼを用いて“付着端”をまず、フィルインすることによって達成される。この方法は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、Sambrookなど.,前記に記載されている。
【００５０】
あるいは、ベクター中に挿入されるべき複数の要素は、まず、一緒に連結され（それらは、お互い隣接して配置され）、そして次に、ベクター中に連結される。
ベクターを構成するための１つの他の方法は、１つの反応混合物中で種々の要素のすべての連結を同時に行なう。ここで、多くのナンセンス又は非機能的ベクターが要素の不適切な連結又は挿入により生成されるであろうが、しかしながら、機能的ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定され、そして選択され得る。
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫及び哺乳類宿主細胞と適合できるものである。そのようなベクターは、中でも、 pCRII（Invitrogen Company, San Diego, CA)， pBSII（Stratagene Company, La Jolla, CA) 及びpETL (Blue BacII；Invitrogen）を包含する。
【００５１】
ベクターが構成され、そしてLSIRF 核酸がそのベクターの適切な部位中に挿入された後、その完結されたベクターは、増幅及び／又はLSIRF ポリペプチド発現のために適切な宿主細胞中に挿入され得る。典型的に使用される宿主細胞は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：原核細胞、たとえばグラム陰性又はグラム陽性細胞、すなわちＥ．コリ(E. coli) 、バシラス（Bacillus) 、ストレプトミセス（Streptomyces) 、サッカロミセス(Saccharomyces) 、サルモネラ（Salmonella) 及び同様のもののいづれかの株；真核細胞、たとえばCHO (Chineseハムスター卵巣）細胞、ヒト腎臓293 細胞、 COS−７細胞；昆虫細胞、たとえばSf４，Sf５，Sf９及びSf21、及びHigh５（すべては、Invitrogen Company, San Diego, CA からである）；及び種々の酵母細胞、たとえばサッカロミセス(Saccharomyces) 及びピチア（Pichia) 。
【００５２】
選択された宿主細胞中へのベクターの挿入（また、“形質転換”又は“トランスフェクション”とも称される）は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はDEAE−デキストラン法のような方法を用いて達成され得る。選択された方法は、一部、使用される宿主細胞のタイプの関数であろう。それらの方法及び他の適切な方法は、当業者に良く知られており、そしてたとえば、Sambrookなど.,前記に示されている。
【００５３】
ベクターを含有する宿主細胞（すなわち、形質転換され又はトランスフェクトされている）が、当業者に良く知られている標準培地を用いて培養される。培地は通常、細胞の増殖及び生存のために必要なすべての栄養物を含むであろう。Ｅ．コリ細胞を培養するための適切な培地は、たとえばLuria Broth (LB)及び／又はTerrific Broth (TB) である。真核細胞を培養するための適切な培地は、RPMI1640, MEM, DMEM であり、それらのすべては培養される特定の細胞系により必要とされる場合、血清及び／又は成長因子により補充され得る。昆虫培養のための適切な培地は、必要な場合、イーストレート、ラクタルブミン加水分解物、及び／又はウシ胎児血清により補充されたGrace's 培地である。
【００５４】
典型的には、形質転換された細胞のみの選択的増殖のために有用な抗生物質又は他の化合物が補充物として培地に添加され得る。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素により検出されるであろう。たとえば、選択可能マーカー要素が耐カナマイシン性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンであろう。
【００５５】
４．発現の評価
宿主細胞に生成されるLSIRF ポリペプチドの量は、当業界において知られている標準の方法を用いて評価され得る。そのような方法は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ウェスターンブロット分析、 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、HPLC分離、免疫沈殿、及び／又は活性アッセイ、たとえばDNA 結合ゲルシフトアッセイ。
【００５６】
５．LSIRF ポリペプチドの精製
LSIRF ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるよう企画されている場合、そのポリペプチドの大部分は、細胞培養培地に見出されるであろう。しかしながら、LSIRF ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、それは細胞質（真核、グラム陽性細菌及び昆虫宿主細胞に関して）、及びペリプラズム（グラム陰性細菌宿主細胞に関して）に存在するであろう。
細胞内LSIRF に関しては、宿主細胞はまず、緩衝溶液中に細胞質含有物を開放するために機械的に又は浸透圧的に粉砕される。次に、LSIRF ポリペプチドがこの溶液から単離される。
【００５７】
溶液からのLSIRF ポリペプチドの精製は、種々の技法を用いて達成され得る。ポリペプチドが標識、たとえばヘキサヒスチジン(LSIRF／ヘキサHis)又は他の小さなペプチドをそのいづれかのカルボキシル又はアミノ端で含むように合成される場合、それは親和性カラムを通して溶液を通すことによって一段階工程で実質的に精製され、ここで前記カラムマトリックスは標識又はポリペプチド（すなわち、LSIRF を特異的に認識するモノクローナル抗体）に対する高い親和性を有する。たとえば、ポリヒスチジンはニッケルに対して高い親和性及び特異性を伴って結合し、従ってニッケルの親和性カラム（たとえば、Qiagenニッケルカラム）は、 LSIRF／ポリHis の精製のために使用され得る（たとえば、Ausubel など., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10. 11. 8, John Wiley & Sons, New York [1993]を参照のこと）。
【００５８】
LSIRF ポリペプチドが標識を有さず、そして抗体が利用できない場合、精製のための他の良く知られた方法が用いられ得る。そのような方法は次のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない：イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、HPLC、ゲル溶離と組合しての活性ゲル電気泳動、及び分離用等電点電気泳動（“Isoprime”機械／技法、Hoefer Scientific)。多くの場合、複数のそれらの技法が、高い純度を達成するためには組合され得る。精製のための好ましい方法は、分離用等電点電気泳動と組合してのポリヒスチジン標識及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する。
【００５９】
LSIRF ポリペプチドが細菌のペリプラズム空間又は真核細胞の細胞質に主として見出されることが予測される場合、ペリプラズム又は細胞質、たとえば封入体（細菌）（処理されたポリペプチドがそのような複合体を形成する場合）の含有物は、当業者に知られているいづれかの標準的技法を用いて宿主細胞から抽出され得る。たとえば、宿主細胞は、ペリプラズムの含有物を開放するために、Frenchプレス、均質化及び／又は音波処理により溶解され得る。次に、その均質物が遠心分離され得る。
【００６０】
LSIRF ポリペプチドがペリプラズムにおいて封入体を形成している場合、その封入体はしばしば、内部及び／又は外部細胞膜に結合し、そして従って、遠心分離の後、ペレット材料に主に見出されるであろう。次に、そのペレット材料がカオトロピック剤、たとえばグアニジン又はウレアにより処理され、封入体が開放され、分解され、そして溶解される。次に、現在、その溶解形で存在するLSIRFポリペプチドが、ゲル電気泳動、免疫沈澱又は同様の方法を用いて分析され得る。LSIRF ポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、標準の方法、たとえば下記に及びMarstan など. (Meth. Enz., 182 : 264-275 [1990] ）に示される方法を用いて達成され得る。
【００６１】
LSIRF ポリペプチド封入体が宿主細胞の細胞周辺に有意な程度形成されない場合、LSIRF ポリペプチドは、細胞均質物の遠心分離の後、その上清液に主に見出され、そしてLSIRF ポリペプチドは、下記に示されるような方法を用いて、その上清液から単離され得る。  LSIRF ポリペプチドを部分的に又は完全に単離することが好ましい情況においては、精製は、当業界において良く知られている標準方法を用いて達成され得る。そのような方法は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：電気泳動、続く電気溶離による分離、種々のタイプのクロマトグラフィー（イムノアフィニティー、分子篩い、及び／又はイオン交換）、及び／又は高圧液体クロマトグラフィー。多くの場合、完全な精製のためには、１つ以上のそれらの方法を用いることが好ましい。
【００６２】
用語“物質”とは、本明細書において使用される場合、LSIRF 遺伝子の転写、LSIRF mRNAの翻訳、又はLSIRF ポリペプチドの活性のいづれかを阻害することにおいて有用な化合物を意味する。
【００６３】
用語“治療的に効果的な”とは、所望する生理学的応答を得るために、すなわち抗原刺激又は自己免疫応答に応答してリンパ球の活性化を抑制し、又は抗原の刺激に対する免疫応答を刺激するためにリンパ球の数を高めるために必要とされる物質の量を意味する。
用語“抗原刺激”とは、哺乳類において天然において見出され（内因性）、そして免疫応答のいくつかの点を誘発し、又は外因性源からであり、そして免疫応答のいくつかの点を誘発する化合物を意味する。
本発明の方法を実施するために有用な組成物は、当業者に良く知られている標準の方法に従って調製され得る。
【００６４】
治療用抗−LSIRF 抗体
本発明の実施において有用なポリクローナル又はモノクローナル治療用抗−LSIRF 抗体は、次の方法を用いて、実験用動物において又は組換えDNA 技法により調製され得る。標的アミノ酸配列を含むLSIRF 分子又はそのフラグメントに対するポリクローナル抗体は一般的に、アジュバント、たとえばフロイント  アジュバント（完全又は不完全）と共にLSIRF 分の複数回の皮下（sc）又は腹腔内（ip）注射により動物において生ぜしめられる。
【００６５】
免疫原性を増強するためには、LSIRF 分子又はその標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホールクンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又は大豆トリプシンインヒビターに、二官能価又は誘導体化剤、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通しての接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を通して）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、SOCl2  又はR1N＝Ｃ＝NR（ここでＲ及びＲ1は異なったアルキル基である）を用いて最初に接合することが有用である。他方では、LSIRF−免疫原接合体は、融合タンパク質として組換え的に生成され得る。
【００６６】
動物は、約１mg又は約１μｇの接合体（それぞれ、ウサギ又はマウスのための）と約３体積のフロイント完全アジュバントとを組合し、そして複数の部位でその溶液を皮下注射することによって、免疫原性LSIRF 接合体又は誘導体（たとえば、標的アミノ酸配列を含むフラグメント）に対して免疫化される。約７〜14日後、動物を放血し、そして血清を抗−LSIRF 力価についてアッセイする。動物は、力価が安定状態に達するまで、くり返して抗原により追加免疫化される。好ましくは、動物は、初期免疫化のために使用されるのと同じであるが、しかし異なったタンパク質に及び／又は異なった架橋剤を通して接合されているLSIRF 分子又はそのフラグメントにより追加免疫化される。さらに、凝集剤、たとえばミョウバンが、免疫応答を高めるために注射に使用される。
【００６７】
モノクローナル抗体は、免疫化された動物から脾臓細胞を回収し、そして従来の態様で、たとえば骨髄腫細胞との融合により前記細胞を免疫化することによって調製され得る。次に、クローンが、所望する抗体を発現するクローンについてスクリーンされる。モノクローナル抗体は好ましくは、他のLSIRF ポリペプチド又はLSIRF ポリペプチドイソフォームと交差しない。
組換えDNA 法、たとえばフォージミド表示法を用いての抗体の調製は、たとえばPharmacia (Uppsala, Sweden) から入手できるRecombinant Phagemid Antibody System、又はSurf ZAPＴＭファージ表示システム（Stratagene Inc., La Jolla, CA)として、市販のキットを用いて達成され得る。
【００６８】
好ましくは、ヒトへの投与のための抗体は、実験用動物、たとえばマウスにおいても調製されるが、“ヒト化され”ているか又はキメラ性であり、すなわちヒト患者が抗体に対する免疫応答を進行せしめないように、ヒト免疫系と適合できるように製造される。さらにより好ましくは、たとえば、Lonberg など. (Nature Genetics,7 : 13-21 [1994]）に記載されるような方法を用いて現在調製され得るヒト抗体は、患者への治療投与のために好ましい。
上記方法のいづれかを用いて製造された抗体は、核中に抗体を輸送するために細胞膜及び核膜を侵入することができる化合物に、たとえば核標的化シグナル、たとえばLSIRF のリン酸化された形上に見出されるシグナルを用いて接合され得る。
【００６９】
治療用組成物及び投与
本発明を実施するために有用な組成物、たとえばLSIRF 抗体の治療用配合物は、所望する程度の純度を有する選択された組成物と、生理学的に許容できる任意のキャリヤー、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th 版、A. R. Gonnaro, ed., Mack Publishing Company [1990]）とを混合することによって、凍結乾燥されたケーク又は水溶液の形で貯蔵のために調製され得る。
【００７０】
許容できるキャリヤー、賦形剤又は安定剤は、受容者に対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、そして緩衝液、たとえばリン酸、クエン酸又は他の有機酸緩衝液；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、たとえばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート化剤、たとえばEDTA；糖アルコール、たとえばマンニトール又はソルビトール；塩形成性カウンターイオン、たとえばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、たとえばツイーン、プルロニック又はポリエチレングリコール(PEG) を含む。
【００７１】
インビボ投与のために使用される組成物は無菌であるべきである。これは、凍結乾燥及び再構成の前又はそれらの後、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。非経口投与のための組成物は、通常、凍結乾燥された形又は溶液において貯蔵されるであろう。
【００７２】
治療用組成物は一般的に、無菌の入口を有する容器、たとえば皮下注射針により突き刺すことができるストッパーを有する静脈注射溶液バッグ又はバイアル中に配置される。
組成物の投与路は、既知の方法に従って、たとえば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は外傷内路による、又は持効性システム又は移植装置による経口、注射又は注入である。所望には、組成物は、注入、巨丸注射、又は移植装置により連続的に投与され得る。
【００７３】
持効性調製物の適切な例は、形状化された物品、たとえばフィルム又はマイクロカプセルの形での半透性ポリマーマトリックスを包含する。持効性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（アメリカ特許第 3,773,919号、ヨーロッパ特許第58,481号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートの子ポリマー（Sidmanなど., Biopolymers, 22 : 547-556 [1983] ）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langerなど., J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167-277 [1981]及びLanger, Chem. Tech., 12 : 98-105 [1982] ）、エチレンビニルアセテート（Langerなど.,前記）、又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ヨーロッパ特許第 133,988号）を包含する。
【００７４】
持効性組成物はまた、当業界において知られているいくつかの方法のいづれかにより調製され得るリポソームを包含する（デンマーク特許第 3,218,121号；Epsteinなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688-3692 [1985] ; Hwangなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4030-4034 [1980]；ヨーロッパ特許第52,322号；ヨーロッパ特許第36,676号；ヨーロッパ特許第88,046号；ヨーロッパ特許第 143,949号）。
【００７５】
治療的に使用される組成物の有効量は、たとえば治療用目的物、投与の経路、及び患者の状態に依存するであろう。従って、最適な治療効果を得るために必要とされる場合、セラピストが投与量を滴定し、そして投与の経路を改良することが必要であろう。典型的に毎日の投与量は、上記要因に依存して、約１μｇ／kg〜100 mg／kg又はそれ以上の範囲である。典型的には、臨床医は、投与量が所望する効果を達成するまで、組成物を投与するであろう。この治療の進行は、評価するよう企画された従来のアッセイにより容易にモニターされる。
【００７６】
本発明のLSIRF 核酸分子、５’側フランキング配列、ポリペプチド及び抗体は、当業者に明らかである種々の用途を有するであろう。
LSIRF ポリペプチドは、リンパ球活性化を調節するために使用される治療用化合物のための標的物として使用されるであろう。LSIRF 遺伝子の発現(LSIRF転写又は翻訳を低めることにより）又はLSIRF ポリペプチドの活性のいづれかを遮断することによって、一定の環境刺激に応答するリンパ球活性化を抑制することが可能である。LSIRF 遺伝子の発現のレベルを高めることによって(LSIRF５’側フランキング配列のアップ−レギュレートにより）、リンパ球活性化及び増殖を刺激することが可能であり、それにより、特定の抗原に対する免疫応答を高める。
【００７７】
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり、そしていづれかの哺乳類からのLSIRF に対して生ぜしめられ得る。それらの抗体は、一定の組織又は生物学的サンプルにおけるLSIRF ポリペプチドの存在及び／又は量を評価するために使用され得る。さらに、それらは、このポリペプチドの活性部位に結合することによりLSIRF の活性を遮断するために使用され得る。従って、抗体自体は、LSIRF のレベルを低めるための治療用化合物として使用され得る。
本発明は、次の例により一層容易に理解され得る。それらの例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７８】
例１：マウスLSIRF cDNAのクローニング
２種のPCR(ポリメラーゼ鎖反応）部分的変性プライマーを、Ｃ57Ｂ１／６マウスの脾臓組織から得られた全RNA から調製されたcDNAのPCR 増幅のために使用した。プライマーは下記のものであった：
ATCCTGGAACACGC（配列番号５）
GCACACGAACTGCCTTCCA （配列番号６）
【００７９】
プライマーNo. ５は、ヌクレオチド２と３（ＴとＣ）の間、ヌクレオチド４と５（ＣとＴ）の間、及びヌクレオチド９と10（ＡとＣ）の間に位置する３個のイノシン塩基を含んだ。プライマーNo. ６は、ヌクレオチド５と６（ＡとＣ）の間、ヌクレオチド７と８（ＧとＡ）の間、ヌクレオチド９と10（ＡとＣ）の間、及びヌクレオチド11と12（ＴとＧ）の間に位置する４個のイノシン塩基を含んだ。
【００８０】
PCR を、 200μＭのdNTP，２ＵのTaq ポリメラーゼ、及び 100pMの個々のプライマーを含むPCR 緩衝液（10mMのトリス−HCl, pH8.3, 1.5mM のMgCl2、及び50mMのKCl)50μｌにおいて、プログラムできる熱サイクラー（Perkin−Elmer Cetus, Norwalk, CT) に基づいて行なった。30サイクルのPCR を、次の温度型式下で行なった：94℃で60秒；37℃で60秒；及び72℃で60秒。続いて、PCR 生成物を、TA−Cloning System (Invitrogen Corp., San Diego, CA)を用いてpCRIIプラスミド中に直接的に挿入した。PCR 生成物挿入体を含むプラスミドを用いて、コンピテントＥ．コリ株 INV−αＦ’(Invitrogen Corp.)を、増幅のために形質転換した。
【００８１】
それらの宿主細胞からのプラスミドDNA を、標準のアルカリ溶解法（Sambrookなど.,前記）を用いて調製し、そして次に、そのプラスミドDNA を、約 1.5％のアガロースゲルを通して電気泳動した。そのDNA の一部を、Hybond−Ｎ膜紙（Amersham, Oakville, Ontario, Canada)上にブロットし、そして製造業者のプロトコール（Amersham) を用いて、ネズミ IRF−１及び IRF−２のランダムに感作された、３２ＰラベルされたDNA フラグメントとハイブリダイズした。 IRF−１又は IRF−２フラグメントのいづれともハイブリダイズしなかったクローンからのプラスミドDNA を、US Bioscience Sequonase キット（US Bioscience, Cleveland, Ohio) を用いて配列決定した。
【００８２】
１つのクローン、“ spl５”は、Genbank における調査から決定される場合、新規のヌクレオチド配列を含んだ。このクローンを、ランダムプライミングを用いて３２Ｐによりラベルし（Amersham法）、そして次に、それを用いて、マウスIL−４誘発された脾臓cDNAライブラリーをスクリーンした（Clonetech, Dalo Alto, CA) 。ハイブリダイゼーションの後、cDNAライブラリークローンを含むフィルターを、まず１×SSC 及び 0.1％ SDSにより約65℃で約30分間、及び次に、 0.2×SSC 及び 0.1％ SDSにより約65℃で約30分間、洗浄した。ATG 開始コドンを欠いている２種のLSIRF cDNAクローンを得た。
【００８３】
３種のクローンの１つ、すなわち“Ｃ13”を用いて、同じライブラリーを再スクリーンし、５’配列をまた欠いている、約５kbのクローン“Ｃ16”を得た。次に、クローンＣ16を用いて、λZAPII マウス脾臓cDNAライブラリー（Stratagene, La Jolla, CA) をスクリーニングし、そして推定上のATG 開始コドンを有するいくつかの部分的クローンを得た。全コードのLSIRF 領域を含む完全なcDNA配列を、５’延長されたプライマーによりPCR を用いて人工的なクローンを創造することによって得た。このクローンをベクター pBSII中に挿入し、プラスミドPV−１を生成し、そしてLSIRF の配列を確かめた。
【００８４】
予測されるアミノ酸配列を、部分的cDNAクローンの個々のために得、そしてクローンのいくつかは、アミノ酸位置164 で特別のグルタミンを有した。約 1.4kbである、PV−１の十分な長さのcDNA配列は、図１に示されている。PV−１ cDNA は、アミノ酸位置164 で特別なグルタミンを含む。LSIRF cDNA配列に基づく、LSIRF のための予測される十分な長さのアミノ酸配列は、図２に示されている。
【００８５】
例２：マウスLSIRF のゲノムクローニング
LSIRF cDNAのＣ16クローンの約 630bp部分を、次のプライマーを用いてPCR 増幅した：
CAGCCCGGGGTACTTGCCGCTGTC（配列番号７）
AGACCTTATGCTTGGCTCAATGGG（配列番号８）
PCR 条件は、94℃で１分、及び72℃で30秒であった。
【００８６】
得られたPCR フラグメントを、１％アガロースゲル電気泳動により続いてSpin−Ｘカラム（Costar Corp., Cambridge, MA)に通すことにより精製した。次に、このフラグメントを、ランダムプライマー技法（Amersham) を用いて32Ｐによりラベルし、そして続いて、それを用いて、 129／Ｊマウスの腎臓組織から調製されたゲノムライブラリーをスクリーンした。いくつかのクローンを、 0.1×SSC及び 0.1％ SDSにより65℃で洗浄することによって得た。それらのクローンの２種（サイズ12及び15kb）を、配列決定のためにベクター pBSII（Stratagene, La Jolla, CA）中にサブクローン化した。
【００８７】
それらのクローンは、約２kbの５’側フランキング配列の同定を可能にするオーバーラップ配列を含んだ。ネズミLSIRF 遺伝子のエキソン及びイントロンを含むゲノム配列は、図４に示されており、そして配列の不明確性による配列における不整合は、Ａ又はＧのために“Ｒ”、Ｇ又はＣのために“Ｓ”、Ａ又はＣのために“Ｍ”、及びＴ又はＧのために“Ｋ”として示される。それらの不明瞭性は次の通りである：
【００８８】
ヌクレオチド748, 4159, 7413 及び10357 でのＭ；
ヌクレオチド5277, 5310, 10564 及び11713 でのＲ；
ヌクレオチド4513，5885及び9812でのＫ；並びに
ヌクレオチド6425でのＳ。
【００８９】
すべての不明瞭性はイントロンに存在し、従って、LSIRF のコード領域を含んで成るエキソンの実際のヌクレオチド配列には影響を及ぼさない。
LSIRF のヌクレオチド（cDNA及びゲノム）配列及び推定されるアミノ酸配列を、GenBank 及びSwiss Protデータバンクにおけるすべての配列と比較し、そして同一の配列は見出されなかった。しかしながら、LSIRF のアミノ末端配列は、IRF ファミリーの他のメンバとの相同性を有した。最高の相同性は、アミノ末端でLSIRF と約83％の相同性（１つのアミノ酸ギャップを可能にする）を共有するポリペプチドICSBP(インターフェロンコンセンサス配列結合タンパク質）に対してであった。
【００９０】
例３：マウスLSIRF 発現
十分な長さのLSIRF cDNA配列を、EcoRＩ制限消化によりプラスミドPV−１から切り出した。LSIRF 遺伝子を、電気泳動の後、 0.7％アガロースゲルから単離し、クレノウDNA フラグメントを用いてブラント末端化し、そしてプラスミドpETL（Blue BacII，InvitrogenCompany) の NheＩ部位に連結し、プラスミドpETL−LSIRF を生成した。プラスミドを、標準の培養法及び条件を用いてＥ．コリ細胞株DH５−α（アンピシリンの存在下で増殖された）において増幅した。
【００９１】
適切な配向（EcoRＩ，HindIII 又は PvuII消化による制限エンドヌクレアーゼマッピングにより決定される場合）でLSIRF 遺伝子を含む精製されたプラスミドを、線状化されたバキュロウィルスゲノムDNA (Invitrogen Corp., San Diego, CA USA) と共に、Sf９昆虫細胞（American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USAから入手できる）中に同時トランスフェクトし、そして細胞を、イーストレート、ラクタルブミン加水分解物及び10％ウシ胎児血清により補充されたGrace 培地において、約28℃で約48時間インキュベートした。
【００９２】
インキュベーションの後、細胞を収穫し、そして組換えウィルスを単離するために、Bluo−gal (Gibco−BRL, Grand Island, NY, USA) の存在下でプラークアッセイを行なった（Richardson, ed., Meth. Mol. Biol., vol 39 : Baculovirus Expression Protocols,Humana Press, Totowa, NJ [1995] ）。青色の組換えプラークを、５〜７日間の培養の後に選択し、そしてプラークを、Sf９細胞を含む24ウェルのマイクロタイタープレートにおいて増幅した。
【００９３】
組換えウィルスのさらなる増幅を、約108pfu／mlの力価が得られるまで、組織培養フラスコにおける大規模細胞培養により行なった。LSIRFの発現を、約１ pfu／細胞の感染の多重性でSf９細胞を感染せしめ、そして感染後０，24，48，72、及び96時間で細胞を収穫することによって確かめた。次に、細胞溶解物を、 SDS−PAGEサンプル緩衝液(100mMのDTT, 80mM のトリス−HCl, pH6.8, 10％のグリセロール、0.0012％のブロモフェノールブルー）における溶解により調製し、そしてウェスターンブロット分析により分析した。
【００９４】
Sf９細胞及びマウス末梢リンパ球の両者からのタンパク質抽出物を、LSIRF ポリペプチドの存在について分析した。リンパ球を、細かなメッシュスクリーンにリンパ節組織を通すことによってマウスから摘出されたリンパ節から調製した。リンパ球を、10％ウシ胎児血清により補充されているIscove培地に保持した。Sf９及びリンパ球細胞からのタンパク質抽出物を、Sf９細胞についての製造業者のプロトコール（Pharmingen, San Diego, CA)又はSambrookなど.,（Molewlar Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]）に示されるリンパ球細胞のための方法を用いて調製した。
【００９５】
タンパク質を、８％ポリアクリルアミド／ 0.1％ SDSゲル上で分解し、そしてゲルを、標準の方法を用いて、 Immobilon−Ｐ膜（Millipore Company)に移した。まず、そのブロットを、ブロッキング緩衝液（１×PBS 中、４％脱脂乳及び0.05％ Tween−20）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、LSIRF カルボキシ末端ペプチドに対して生ぜしめられたLSIRF ウサギポリクローナル抗血清を、約１：2000（１部のPBS に対して１部のブロッキング緩衝液の溶液において）の希釈度で、ブロットに添加した。抗体を生成するためにウサギ中に注射されるLSIRF ペプチドは次の通りである：GYELPHEVTTPDYHR （配列番号９）。LSIRF 抗体と共に約１時間インキュベートした後、ブロットを洗浄し、そしてLSIRF 抗体を、約１：5000の希釈度で、ヤギ抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ−接合された抗体により検出した。
【００９６】
その結果は、約51KDのバンド(LSIRFの予測される分子量）が抗−CD３抗体及び組換えSf９細胞により刺激された両末梢Ｔ細胞に関する抗LSIRF 抗体により認識されたことを示唆する。
【００９７】
例４：マウスLSIRF 発現分析
Ａ．組織ブロット
LSIRF 転写体の組織特異性を評価するために、完全なRNA を、マウス脳、肺、胸腺、骨髄、脾臓、肝臓、腸、膵臓、唾液腺、精巣、心臓及び平滑筋組織から、Wangm など. (EMBO J., 10 : 2437-2450 [1991] ）により記載される方法を用いて調製した。RNA を、標準の方法を用いて、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動し、そして次に、Sambrookなど.,前記に記載されるようにしてニトロセルロース紙に移した。次に、ブロットを、LSIRF の全コード領域（PV−１からの挿入体）を含むランダム−感作された、32Ｐ−ラベルされた 1.4kbのcDNAによりハイブリダイズせしめ、そして続いて、Stewart など. (Meth. Mol. Cell Biol., 1 : 73-76[1989]）により記載されるようにして、 0.2×SSC 及び 0.1％ SDSにおいて約50℃で洗浄した。
【００９８】
図５に示されるような結果は、約 5.5kbのLSIRF 転写体が大規模に脾臓及び骨髄組織に、同じサイズの弱い転写体が胸腺及び肺組織に存在することを示唆する。驚くべきことには、さらなるバンドは観察されなかった。さらに、図６は、リンパ節組織もまた、LSIRF転写体を含むことを示す。
【００９９】
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USAから入手できる、CTLL−２，D10.G4.1, HT−２，EL−４及びBW5147を包含する種々のＴ細胞系を、ノザンブロット分析を用いてLSIRF 発現について評価した。RNA を、Chomczynski など. (Anal. Biochem., 162 : 156-159 [1987] ）の方法を用いて、それらの細胞系から抽出した。細胞系を、10％ウシ胎児血清及び２mMのＬ−グルタミンにより補充されたIscove培地において、37℃及び５％ CO2下で維持した。最初の３種の細胞系は、末梢Ｔ細胞系統であると思われ、そして最後の２種は、未熟Ｔ細胞系統であると思われる。HT−２及びCTLL−２細胞の培養物を、50Ｕ／mlのIL−２（Genzyme Inc., Cambridge, MA)及び50μＭの２−メルカプトエタノールにより補充し；D10.G4.1の培養物を、50Ｕ／mlのIL−１（Genzyme Inc., Cambridge, MA)、50Ｕ／mlのIL−２及び50mMの２−メルカプトエタノールにより補充した。
【０１００】
ノザンブロットを、完全なRNA から調製し、Hybond  Ｎ紙に移し、そしてStewart など.,前記の方法を用いて、上記のようにして、1.4kbのランダム感作されたcDNAによりプローブした。
その結果は、LSIRF 転写体が末梢Ｔ細胞系にのみ見えることを示し、これは、LSIRF が成熟Ｔ細胞に選択的に発現されることを示唆する。プレ−Ｂ細胞系CB17.51 ，Ｂ細胞系WEHI231 (American Type Culture Collection)及びプラスマ細胞腫細胞系J558（American Type Culture Collection) におけるmRNA転写体の類似する分析は、すべての細胞系においてその転写体の存在を示し、そしてJ558は最強のシグナルを有した。
【０１０１】
脾臓又はリンパ節から得られた一次リンパ球におけるLSIRF の誘発を、培養された細胞に種々の刺激剤を添加し、そしてLSIRF mRNAレベルを評価することによって評価した。リンパ節細胞のために使用される刺激剤は、1000Ｕ／mlのネズミインターフェロン−β(IFN−β；Lee Biomolecular Research, San Diego, CA)、 100Ｕ／mlのネズミインターフェロン−γ(IFN−γ；Genzyme Inc., Cambridge, MA)、又は10ng／mlのネズミ腫瘍壊死因子（TNF ; Genzyme Inc.) であった。脾臓細胞を、20μｇ／mlの抗−IgM 抗体、10μｇ／mlのリポ多糖（LPS ；細菌性内毒素）、10ng／mlのPMA(ホルボールミリステートアセテート；Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、１mg／mlのシクロスポリンＡ（CsA ; Sandoz Campany, Basel, Switzerland), 10μｇ／mlのコンカナバリンＡ（ConA ; Sigma) 、又は１又は10μｇ／mlのシクロヘキシミド（CHX ; Sigma)により処理した。すべての細胞を、37℃で６時間、処理した。
【０１０２】
その結果は図６，７及び８に示される。すべての図において、β−アクチンが、分析される全RNA の量のインビケーターとして示される。
図６は、抗−CD３抗体がLSIRF 転写を誘発したことを示す。しかしながら、最とも驚くべきことには、インターフェロンはLSIRF 転写体を誘発しなかった。これは、他の既知のIRF の両者の転写体はインターフェロンにより誘発されるので、他の既知のIRF との強力な対比である。
【０１０３】
図７は、シクロヘキシミド、すなわちタンパク質合成インヒビターがLSIRF 転写を誘発することを示す。この結果は、シクロヘキシミドが IRF−１又は IRF−２遺伝子の転写を誘発しないので、予測されなかった。
図８は、抗−IgM 及びPMA がLSIRF 転写を誘発することを示す。抗−IgM によるそのような誘発は、LSIRF がＢ細胞及びＴ細胞に発現されるので、驚くべきである。
【０１０４】
Ｂ．ゲルシフトアッセイ
電気泳動移動度シフトアッセイを、LSIRF ポリペプチドがDNA 結合タンパク質であるかどうかを評価するために行なった。対照Sf９細胞（野生型バキュロウィルスのみによりトランスフェクトされた）及びLSIRF 発現Sf９（LSIRF cDNAを含むバキュロウィルスによりトランスフェクトされた）細胞からの核抽出物を次のようにして調製した。Sf９細胞をペレット化し、そして次に、PBS により２度洗浄した。最終洗浄の後、その細胞を、 10７個の細胞当たり 0.5mlの“Ｈ−緩衝液”（低張緩衝液）（Ｈ−緩衝液は、25mMの Hepes−NaOH, pH8.0, 10mM のKCl ，５mMのMgCl２, 0.5mMのEDTA、及び 0.5mMのDTT から成る）に再懸濁し、そして約30分間、氷上でインキュベートし、この間、細胞は低張緩衝液により膨張された。
【０１０５】
次に、細胞を、ダウンスホモジナイザーにおけるタイプＢ乳棒での15回のストロークにより破壊した。核を、約10分間、10Ｋrpm での遠心分離機により約４℃でペレット化することにより、細胞残髄から単離した。主要部の核を含むペレットを、107個の細胞当たり 0.5mlのＮ−緩衝液（Ｎ−緩衝液は、25mMの Hepes−NaOH, pH8.0, 400mMのKCl，５mMのMgCl2, 0.5mMのEDTA，10％のグリセロール及び 0.5mMのDTT から成る）に再懸濁し、そして氷上で約20分間インキュベートすることにより抽出した。次に、その懸濁液を、遠心分離機により15Ｋrpm で約15分間、４℃で遠心分離した。
【０１０６】
主要部のLSIRF ポリペプチドを含む上清液を、Gentricon 10マイクロコンセントレーター（Amicon Corporation）を用いて過剰の塩を除去するために緩衝液交換した。濃縮のための希釈緩衝液は、Ｅ−緩衝液（25mMの Hepes−NaOH, pH8.0, 50mM のKCl ，５mMのMgCl2, 0.5mMのEDTA，15％のグリセロール、及び 0.5mMのDTT)であった。Ｈ−緩衝液、Ｎ−緩衝液及びＥ−緩衝液のすべては、次のプロテアーゼインヒビターを含んだ： 0.5mMのPMSF， 0.5μｇ／mlのロイペクチン及び 0.5μｇ／mlのアプロチニン。
【０１０７】
フラグメントのLSIRF 結合による特定のDNA フラグメントの電気泳動移動度を評価するために、抽出物を32Ｐ−ラベルされた二本鎖DNA プローブと共にインキュベートした。このプローブのセンス鎖の配列、すなわち野生型ネズミMHC IRSE結合配列は下記に示される：
TGCAGAAGTGAAACTGAGG （配列番号10）
【０１０８】
結合反応のために、約25×103cpm（プローブ約１×10-11モルに相当する）を、結合反応緩衝液（12mMの Hepes−KOH, pH7.9, 30mMのKCl ，60μＭのEGTA, 0.3mM のDTT, 2.5％の Ficoll, 0.6μｇの poly (olI−dC) 〔Pharmacia から得られた〕、及び0.05％のNP−40）において調製した。核抽出物を、LSIRF 含有反応のために約14μｇの全タンパク質／ml及び対照反応のために約22μｇ／mlの最終濃度に、約 0.1mg／mlのBSA(ウシ血清アルブミン）を含むＥ−緩衝液において約８倍に希釈することにより調製した。結合反応は、約6.24μｌのプローブ溶液に約１μｌの核抽出物を添加することにより開始され、ここで多くの場合、前記プローブ溶液はまた、ラベルされていない“競争体”DNA フラグメントも含んでいた。
【０１０９】
それらのフラグメントの個々の配列は、下記表１に示される。競争体フラグメントを、約 750倍のモル過剰（ラベルされたフラグメントに比較して）で添加した。核抽出物／プローブ溶液を、約23℃で約、20分間インキュベートし、そして次に、サンプル適用の前、約 250ボルトで約２時間、予備運転された９％ポリアクリルアミドゲル（0.25×TBA により調製された）に適用した。ゲルを約 300ボルトで約２時間、運転し、結合されていないDNA プローブからタンパク質−DNA複合体を分離した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてフィルムに暴露し、タンパク質結合によるDNA プローブ移動シフトを評価した。
【０１１０】
【表１】
2006223311.tif 000002
【０１１１】
表１において、“ｍ”は、マウス配列を示し、そして“ｈ”はヒト配列を示す。
結果は図９に示される。それから明らかなように、野生型MHC ISRE配列は、LSIRF タンパク質を結合する。さらに、２種のISRE DNAフラグメント変異体、すなわちｍ１及びｍ４は、２種の他のDNA フラグメント、すなわちIgλＢ及びISG54 と同じように結合のために十分に競争する。
【０１１２】
例５：ヒトLSIRF クローニング
LSIRF をコードするヒトcDNAを同定するために、ヒトリンパ球cDNAライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA ; カタログ番号HL1031ａ）を、マウスPV−１クローンを用いてスクリーンした。スクリーニング条件は、Church緩衝液（Church and Gilbert, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81 : 1991-1995 [1984] ）において65℃で一晩であった。フィルターをそれぞれ２×SSC 及び 0.1％ SDSにより約30分間、２度洗浄した。スクリーンされた約百万のプラークのうち、２つの陽性クローンを同定し、単離し、そしてそのDNA を標準の技法を用いて精製した。クローンを、pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA)のEcoRＩ部位中にサブクローン化した。
【０１１３】
約２kbよりも長い、Ｈ14と称する、それらのクローンのうち最長のクローンを配列決定した。その配列は、このクローンが、TNF(腫瘍壊死因子）受容体ｐ55（約 400個の塩基対）、及びマウスLSIRF 配列のエキソン３−９に高い相同性を有する約１kbの配列のハイブリッドであったことを示した。さらに、このクローンは、保存された終止コドン、スプライスドナー配列及びイントロン９の約 600個の塩基対を有した。従って、この1019個の塩基対配列はヒトLSIRF 配列の一部を表わすことが結論づけられた。この1019個の塩基対配列を、次のプライマーを用いてPCR により増幅した：
CTGGACATCTCAGACCCGTACAAAGTG （配列番号19）
CTTGACATTTTTCATTCTTGAATAGAG （配列番号20）
【０１１４】
増幅条件は、94℃で30秒、65℃で30秒及び72℃で約90秒であった。約 500ngのＨ14鋳型を、Taq ポリメラーゼの存在下で用い、そして約15サイクルのPCR を実施した。得られるPCR 生成物を、TAクローニングキットベクター PCRII（Invitrogen, San Diego, CA)中に直接的に連結し、そして配列決定し、適切なフラグメントが増幅されたことを確かめた。次に、“FISH”と称する、この1019個の塩基対のcDNAフラグメントを用いて、ヒト白血球５’−延長cDNAライブラリー（Clontech；カタログ番号HL1169ｘ）をスクリーンした。
【０１１５】
そのスクリーニング条件は次の通りであった：Church緩衝液において約65℃で一晩、続いて、２×SSC 及び 0.1％ SDSにおいて約30分間にわたって２度のすすぎ、及び次に、 0.2×SSC 及び 0.1％ SDSにおいて約30分間にわたって２度のすすぎ、約 500,000のうちの１つのプラークを同定し、そしてそのDNA を精製し、そして配列決定した。HIRF４λDR２と称するこのクローンは、イントロン２及び十分な長さのエキソン３（エキソン３の一部のみがＨ14クローンには見出された）、並びにエキソン５，７，８及びイントロン８を含んだ。エキソン４及び６はたぶんスプライスされているか又は欠失していた。
【０１１６】
LSIRF コード配列の残りを得るために、２つのアプローチが用いられた。第１においては、ベクターλ fix２（Stratagene, La Jolla, CA) におけるヒト胎盤ゲノムライブラリーを、プローブとしてFISH cDNA を用いてスクリーンした。スクリーニング条件は、Church緩衝液において約65℃で一晩、続いて、２×SSC 及び 0.1％ SDSにおいて約30分間にわたっての２度のすすぎ、及び次に、 0.2×SSC 及び 0.1％ SDSにおいて約30分間にわたっての２度のすすぎであった。
【０１１７】
10個のファージクローンを単離し、そしてそのDNA を、HG−１と称する１つのクローンから精製した。このDNA を制限エンドヌクレアーゼBamHＩ， SacＩ、及び XbaＩにより消化し、そしてフラグメントをクローニングベクターpMOB（Strathmannなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 1247-1250 [1991]）中にサブクローン化した。個々のフラグメントの配列を得、そしてマウスLSIRF 配列と比較した。ヒトLSIRF のプロモーター、エキソンＩ及びエキソンIIを、マウス配列に対する相同性に基づいてこのクローンにおいて同定した。
【０１１８】
使用される第２のアプローチは、 Clontech MarathonＲキットを用い、そして製造業者のプロトコールに従ってのRACE反応であった。高いLSIRF 発現を有することが前のノザンブロット分析により示されている、OCILY8（Blood, 69 : 1307-1314 [1987]）と称するＢ−細胞リンパ腫系を用いた。得られるRACE生成物が配列決定され、そしてエキソンＩ及びII（上記のようにして得られた）のゲノム配列に適合することが見出された。
【０１１９】
読み取り枠を生成するために、FISH cDNA を、ベクター PCRIIのEcoRＩ部位から切り出し、そしてPGEX4T3 (Promega, Madison, WI)のEcoRＩ部位中に連結し、ベクター pGEX4T3−FISHを形成した。読み取り枠の５’端を、FISHクローンへの融合を可能にする形で得るために、ヒト脾臓MarathonＲ（Clontech, カタログNo. 7412−１）からのcDNAを、増幅のために次の２つのプライマーと共に使用した：
TGCCCTCAGCTCCGAGTCCAG （配列番号21）
AACCATTTTCACAAGCTG（配列番号22）
【０１２０】
増幅は次の条件下でPCR を用いて達成された：94℃で30秒、64℃で30秒、及び68℃で１分間。30回のサイクルが、Expond High Fidelity Polymerose (Boehringer Manheim)を用いて行なわれた。この方法を用いて、LSIRF のＮ−末端の配列を増幅し、約 600個の塩基対の予測されるDNA フラグメントサイズを付与した。
約 600個の塩基対フラグメントを、配列番号22（上記に示される）及び下記に示されるような配列番号23を用いて、PCR により増幅した：
GGATCCGGATCCATGAACTGGAGGGCGGCGGCCGAGGC（配列番号23）
PCR の15回のサイクルが次のようにして行なわれた：生来のPFUポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA) を用いて、94℃で30秒、64℃で30秒、及び72℃で90秒。
【０１２１】
FISH挿入体を含むPGEX4T3 ベクター(pGEX4T3−FISH）を、BamHＩ及び SacIIの両者により消化し、それにより、FISH挿入体の５’部分を除去した。上記からの約 600個の塩基対PCR 生成物を同じ酵素により消化し、そして pGEX4T3−FISHベクター中に連結し、十分な長さの読み取り枠構造体 pGEX4T3  LSIRF BamHＩ／EcoRＩを形成し、このコード領域は図10に示されている。予測されるアミノ酸配列は、図11に示されている。このクローンを、製造業者のプロトコールに従って、GST 融合タンパク質(Pharmacia) の生成により評価した。その融合タンパク質の予測されるサイズは、約79KDであり、この約27KDはGST タンパク質であり、そして約52KDがLSIRF タンパク質である。前記融合タンパク質は、クーマシーブルー染色により決定される場合、約79KDの予測されるサイズに８％ SDS−PAGE上を移動した。
【０１２２】
ヒトLSIRF のノザンブロット分析は、この遺伝子が脾臓組織及び末梢血液組織において主に発現され、そして低レベルで、結腸及び腸に見出されることを示した。さらに、Clontech（カタログNo. 7757−１）から得られる複数癌細胞系ノザンブロットを用いる場合、前記遺伝子の弱い発現がヒトＢ細胞Burkitt リンパ腫系Rajaに見出され、そして強い発現がヒト黒色腫系G361癌細胞に観察された。
【０１２３】
部分的hLSIRF配列を含むいくつかのクローンのDNA 配列決定に基づけば、hLSIRF配列の２種の形が存在すると思われる。１つの形、すなわち“単一Ｑ”形は、アミノ酸位置164 でアミノ酸Ｑ(Gln) をコードする、塩基 490−492 で“CAG ”コドンを含む。LSIRF DNAの第２の形、すなわち“二重Ｑ”形は、“単一Ｑ”形の塩基492 と493 との間に追加の“CAG ”コドンを含み、“単一Ｑ”形のアミノ酸163 と164 との間に追加のアミノ酸Ｑ(Gln）をもたらす。この１つの差異の他に、前記２種の形のアミノ酸及び核酸配列は同一である。
【０１２４】
ベクターpGEX4T3 におけるヒトLSIRF(hLSIRF) をコードする十分な長さの“単一Ｑ”DNA 配列は、1996年３月27日、受託番号98016としてATCCに寄託された。さらに、hLSIRFタンパク質の“二重Ｑ”形をコードする十分な長さのヒトLSIRF 配列は、1996年３月27日、受託番号98017 としてATCCに寄託された。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、完全な長さのマウスLSIRF cDNA核酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、完全な長さのマウスLSIRF ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、完全な長さのマウスLSIRF ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、マウスLSIRF 遺伝子の５’フランキング配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスLSIRF 遺伝子の５’フランキング配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図４Ｈ】図４Ｈは、マウスLSIRF ゲノムDNA 配列を示す。
【図５】図５は、マウスの種々の組織からのDNA のノザンブロットを示す。前記ブロットは、LSIRF 転写体を同定するために、放射性ラベルされたLSIRF プローブによりプローブされた。前記転写体のサイズを示すDNA 塩基対マーカーは、左側に示されている。リボソームRNA を示すアガロースゲルの写真もまた示されている。
【０１２６】
【図６】図６は、示されるように、刺激体（stimulator）を伴わないで（−）又は刺激体により処理されたマウスリンパ球からのRNA のノザンブロットを示す。前記ブロットは、LSIRF 転写を誘発するそれらの刺激体を同定するために、放射性ラベルされたLSIRF プローブによりプローブされた。放射性ラベルされたβアクチンプローブによりプローブされた同じブロットがまた、示されている。
【図７】図７に示されるように、刺激体を伴わないで（−）又は１又は複数の刺激体により処理され、そして次に、放射性ラベルされたLSIRF プローブによりプローブされたマウス脾臓細胞のノザンブロットを示す。放射性ラベルされたβ−アクチンプローブによりプローブされた同じノザンブロットもまた示されている。
【０１２７】
【図８】図８は、示されるように、刺激体を伴わないで（−）又は刺激体により処理され、そして次に、放射性ラベルされたLSIRF プローブによりプローブされたマウス脾臓細胞のノザンブロットを示す。放射性ラベルされたβ−アクチンプローブによりプローブされた同じノザンブロットもまた示される。
【図９】図９は、マウスMHC ISKEのLSIRF 結合のゲルシフト結合アッセイを示す。対照のバキュロウィルス感染されたSF９昆虫細胞（レーン２）又はLSIRF 遺伝子を含む、バキュロウィルスにより感染されたSF９細胞（レーン３〜12）からの核抽出物を、放射性ラベルされたマウスMHC ISREプローブ及び示される競争体DNA フラグメント（前記競争体フラグメントの配列は表１に示されている）の両者と共にインキュベートした。レーン１及び13は、放射性ラベルされたMHCISREプローブのみを含む。
【０１２８】
【図１０】図10は、“単一Ｑ”形でのヒトLSIRF のコード領域の完全な長さのヌクレオチド配列を示す（配列番号24）。“二重Ｑ”形は、アミノ酸163 のコドンとアミノ酸164 のコドンとの間に挿入されたアミノ酸Ｑ(Glu) をコードする追加のコドンを有する。
【図１１Ａ】図11Ａは、図10のヌクレオチド配列から翻訳されるような、ヒトLSIRF のアミノ酸配列の推定上の“単一Ｑ”形を示す（配列番号25）。“二重Ｑ”形は、アミノ酸163 とアミノ酸164 との間に挿入された追加のアミノ酸Ｑ(Glu) を有する。
【図１１Ｂ】図11Ｂは、図10のヌクレオチド配列から翻訳されるような、ヒトLSIRF のアミノ酸配列の推定上の“単一Ｑ”形を示す（配列番号25）。“二重Ｑ”形は、アミノ酸163 とアミノ酸164 との間に挿入された追加のアミノ酸Ｑ(Glu) を有する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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