(57)【要約】【課題】  新規なDNA結合性物質を迅速に同定し、また、公知のDNA結合性物質におけるDNA結合能を迅速に評価する。【解決課題】  ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程と、上記チップを洗浄する工程と、上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程とを備える。【選択図】  図４
2006177714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、
検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程と、
上記チップを洗浄する工程と、
上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程とを備える、DNA結合性物質の同定方法。
【請求項２】
上記チップを洗浄する工程は、上記基板に固定化されたDNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする請求項１記載のDNA結合性物質の同定方法。
【請求項３】
上記基板上に固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする請求項１記載のDNA結合性物質の同定方法。
【請求項４】
ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、
検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程と、
上記チップを洗浄する工程と、
上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程とを備える、検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【請求項５】
上記チップを洗浄する工程は、上記基板に固定化されたDNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする請求項４記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【請求項６】
上記基板上に固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする請求項４記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAを固定化したチップを用いたDNA結合性物質の同定方法及び検査対象物質のDNA結合能検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、基板上に化学合成DNA、PCR増幅産物、生物クローン等を固定化して作成したDNAチップが知られている。DNAチップは、例えば、対象となる生物から抽出したmRNAを測定するために利用されている。すなわち、抽出したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、蛍光試薬等を用いて当該cDNAを標識し、基板上に固定化されたDNAとcDNAとをハイブリダイズさせ、DNAチップ上の蛍光を測定することでmRNAの検出及び定量していた。
【０００３】
CGH（Comparative Genome Hybridzation）チップとはCGH解析に使用されるDNAチップであるが、スポットされているDNAがゲノム由来のDNAであることに特徴がある。既存のDNAチップがmRNAの測定であったの対して、CGHチップはゲノム量、つまりはゲノムDNAの各部分における欠損等を測定するために利用されている。
【０００４】
既存のDNAチップ及びCGHチップいずれにおいても、化学的にはDNAを測定するためのツールであった。
【０００５】
一方、遺伝子の発現やゲノムの複製等には、所定の塩基配列を認識してDNAに結合するDNA結合タンパク質が関与していることが知られている。例えば、癌細胞と正常細胞においては、DNA結合タンパク質の一種である転写因子が相違することが知られている。よって、転写因子等のDNA結合性タンパク質の相違を検出することで、癌細胞を検出できたり、癌の診断を行うことができる。また、DNA結合タンパク質に限らずDNAに結合する物質（DNA結合性物質）を新たに同定することによって、細胞の癌化メカニズムを解明したり、薬剤の開発に寄与する事が可能となる。
【０００６】
ところが、DNA結合性物質を効率よく検出する手法は、十分に開発されておらず新たな手法が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２８４５５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、新規なDNA結合性物質を同定できたり、また、公知のDNA結合性物質におけるDNA結合能を評価することができるDNA結合性物質の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
(1)  ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程と、
上記チップを洗浄する工程と、上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程とを備える、DNA結合性物質の同定方法。
【００１０】
(2)  上記チップを洗浄する工程は、上記基板に固定化されたDNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする(1)記載のDNA結合性物質の同定方法。
【００１１】
(3)  上記基板上に固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする(1)記載のDNA結合性物質の同定方法。
【００１２】
(4)  ゲノム配列を断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップに、プローブをハイブリダイズさせる工程と、検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程と、
上記チップを洗浄する工程と、上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程とを備える、検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【００１３】
(5)  上記チップを洗浄する工程は、上記基板に固定化されたDNA断片と上記プローブとのハイブリダイズを、上記検査対象物質が結合した領域では解離させず、上記検査対象物質が結合していない領域で解離させる条件で実施することを特徴とする(4)記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【００１４】
(6)  上記基板上に固定化されたDNA断片の鎖長は100〜1000merであり、上記プローブの鎖長は４〜20merであることを特徴とする(4)記載の検査対象物質のDNA結合能検定方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、DNA結合性物質の新規な同定方法を提供することができる。本発明に係るDNA結合性物質の同定方法によれば、基板上にゲノム配列を断片化したDNA断片を固定してなるチップを使用するため、未知のDNA結合物質を迅速に同定することが可能となる。
【００１６】
また、本発明により、検査対象物質のDNA結合能を検定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るDNA結合性物質の同定方法は、図１に示すように、ゲノムを断片化したDNA断片を基板上に固定してなるチップにプローブをハイブリダイズさせる工程１（図１中“Ｓ１”と表記する。以下同様。）と、検査対象物質を含む溶液を上記チップに接触させる工程２と、上記チップを洗浄する工程３と、上記プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出する工程４とを備える。
【００１８】
本DNA結合性物質の同定方法において、使用可能なチップの一例としては、図２に示すように、基板１と、基板１の一主面に固定化されたDNA断片２とを備える。DNA断片２は、ゲノムの領域毎に１つのスポットとして固定化される。すなわち、DNAチップにおける１のスポットは、ゲノムの所定の領域に由来するDNA断片２が固定化されている。例えば、第１染色体におけるp32領域〜p36領域までのDNA断片（図３参照）をそれぞれ異なる位置に固定化することで、DNAチップ上のスポット位置と第１染色体におけるp32領域〜p36領域とを対応付けることができる。
【００１９】
DNA断片２の鎖長は、100〜1000merであることが好ましい。DNA断片２が100mer未満である場合には基板１に対して固定化することが困難であり、また、DNA断片２が1000merを超える場合にはプローブが結合した位置の検出精度が低下する虞がある。従って、DNA断片２の鎖長を100〜1000merとすることによって、優れた検出精度でDNA結合性物質を同定することができる。
【００２０】
DNA断片２としては、化学的に合成したものでも、ＰＣＲ等の生化学的増幅したものでも特に問わない。基板１の材料及び形状は特に限定されず、公知のDNAチップに用いられる材料及び形状が適用される。基板１の材料としては、例えば、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレンから選ばれる。
【００２１】
なお、図２及び３を用いて説明した、ゲノム由来のDNA断片を基板上に固定化したDNAチップは、CGHチップと呼ばれる。すなわち、本DNA結合性物質の同定方法においてはCGHチップを使用することが望ましい。CGHチップとしては、例えば、アズワン株式会社製の“BACチップ（MAC ArrayTM）”を使用することができる。
【００２２】
本DNA結合性物質の同定方法において、使用可能なプローブは、４〜２０merであることが好ましい。プローブが４mer未満である場合には、DNA結合タンパク質等のDNA結合性物質が当該プローブを認識することができず、結合しない虞がある。また、プローブが２０merを超える場合には、DNA結合性物質の認識配列を繰り返し含むことがあり、好ましくない。したがって、プローブを４〜２０merとすることで、DNA結合タンパク質等のDNA結合性物質の当該プローブに対する結合能を確実に評価することができる。
【００２３】
また、プローブの塩基配列は、特に限定されず、いかなる塩基配列であっても良い。例えば、ランダム合成によって合成されたプローブを使用することができる。また、プローブの塩基配列としては、４種類の塩基全ての組合せの塩基配列を設計してもよい。さらに、プローブとしては、既知のDNA結合性タンパク質が認識して結合する既知の配列の一部又は全部を含む塩基配列であってもよい。
【００２４】
また、プローブは、標識物質が結合していることが好ましい。標識物質としては、蛍光標識物質、磁気標識物質及び放射性同位元素標識物質等を挙げることができるが、これらに限定されず如何なる標識物質であっても良い。好ましくは、蛍光標識物質としてCy5またはCy3を結合したプローブを使用することができる。
【００２５】
工程１において、DNAチップにプローブをハイブリダイズさせるには、例えば、２５℃の４ｘＳＳＣ溶液にて5分間の条件とすることができる。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、これに限定されない。工程１によって、DNAチップにおけるDNA断片とプローブとからなる２本鎖を形成することができる（図４参照）。
【００２６】
工程２において、DNAチップに接触させる溶液とは、検査対象物質を含む溶液である。検査対象物質としては、DNAに結合することが知られている既知のDNA結合性物質であっても良いし、DNAに対する結合能が未知である物質であっても良い。ここで、物質とは、タンパク質、有機化合物、無機化合物、高分子化合物、低分子化合物のいずれに属する物質であっても良い。検査対象物質としては、タンパク質であることが好ましい。
【００２７】
また、検査対象物質を含む溶液は、精製した検査対象物質を含む溶液であっても良いし、クルード状態のタンパク質混合物を含む溶液であっても良く、特に限定されない。精製した検査対象物質を含む溶液を使用する場合、タンパク質濃度は1nM〜1mMが好ましい。
検査対象物質にDNA結合性物質が含まれている場合には、工程２によって、工程１で形成された２本鎖に当該DNA結合性物質が結合した複合体が形成されることとなる（図４参照）。
【００２８】
工程３において、洗浄液によってDNAチップを洗浄する。詳細には、洗浄液で洗浄することによって、DNAチップ上においてハイブリダイズしたDNA断片とプローブとを、検査対象物質が結合した領域では解離させず、検査対象物質が結合していない領域で解離させることができる。すなわち、工程３によって、工程２で形成された２本鎖とDNA結合性物質との複合体は維持されるが、複合体が形成されていない２本鎖領域ではプローブが解離することとなる。その結果、検査対象物質が結合した領域ではDNA断片とプローブとのハイブリダイズが維持されることとなる（図４参照）。
工程３で使用可能な洗浄液としては、例えば、純水等を挙げることができる。
【００２９】
工程４において、DNAチップから発せられる標識物質を検出する際には、標識物質の種類に応じた検出装置を使用する。検出装置によれば、プローブ及び/又は上記検査対象物質に結合した標識物質を検出することができる。工程４では、工程３で洗浄した後のDNAチップに対して標識物質を検出することによって、検査対象物質の結合の有無および検査対象物質の結合位置を測定することができる。
【００３０】
具体的に、プローブに蛍光標識物質Cy5を結合した場合、日立ソフトウェアエンジニアリング（株）社製の蛍光スキャナー（商品名；CRBIOIIe）を使用して、DNA断片にハイブリダイズするとともに検査対象物質が結合したプローブを検出することができる。工程４においては、蛍光スキャナー以外にも標識物質の種類に応じて以下のような検出装置を使用することができる。例えば、UVゲル蛍光意メージャー、落射式蛍光顕微鏡、レーザー方共焦点顕微鏡を適宜使用することができる。
【００３１】
工程４において、標識物質のシグナルが検出できた部分を、検査対象物質の結合する領域であることが判明する。基板に固定化されたDNA断片は、ゲノムの所定の領域に由来するDNA断片が固定化されているため、シグナルを検出することによって検査対象物質がゲノムのどの領域に結合するのかを判定することができる。これにより、新規なDNA結合性物質を迅速に同定することができる。
【００３２】
一方、検査対象物質として既知のDNA結合性物質を使用した場合、当該既知のDNA結合性物質が結合する新規な領域を同定することができる。また、工程４で検出するシグナルの強度及びシグナル検出位置に基づいて、既知のDNA結合性物質おけるDNA結合能を検定することも可能となる。例えば、既知のDNA結合タンパク質に変異を導入してなる変異型DNA結合タンパク質を、検査対象物質とすることで、変異型DNA結合タンパク質のDNA結合能を迅速に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法のフローチャート
【図２】DNA結合性物質の同定方法に使用するDNAチップを模式的に示す側面図である。
【図３】DNAチップに固定するDNA断片の一例を第１番染色体を模式的に示す図である。
【図４】本発明を適用したDNA結合性物質の同定方法の各工程を説明するための図である。
【符号の説明】
【００３４】
１…基板
２…DNA断片
【図１】
2006177714.tif 000003
【図２】
2006177714.tif 000004
【図３】
2006177714.tif 000005
【図４】
2006177714.tif 000006