(57)【要約】【課題】  ヒト有機カチオントランスポーターhOCT2により代謝される薬物の投与前にhOCT2/SLC22A2に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量の薬剤を投与することで、該薬剤による副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法を提供する。【解決手段】  有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が一塩基多型である請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセット。
【請求項４】
前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセット。
【請求項５】
有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１乃至４いずれか記載のプライマーセット。
【請求項６】
配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含む、請求項１乃至５いずれか記載のプライマーセット。
【請求項７】
有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目の塩基を決定するように設計されたプライマー。
【請求項８】
前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、一塩基多型である請求項７記載のプライマー。
【請求項９】
前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異しているものである請求項８記載のプライマー。
【請求項１０】
前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異しているものである請求項８記載のプライマー。
【請求項１１】
前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項７乃至１０いずれか記載のプライマー。
【請求項１２】
配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマー。
【請求項１３】
配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマー。
【請求項１４】
配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマー。
【請求項１５】
配列表の配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマー。
【請求項１６】
有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項１７】
請求項１乃至１６いずれか記載のプライマーセット又はプローブを含む、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する該トランスポーターの輸送活性検査薬。
【請求項１８】
前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物が、β−遮断薬メトプロロール、β−遮断薬プロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１７記載の検査薬。
【請求項１９】
有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に、又は第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異していることを確認する工程を含む、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する該トランスポーターの輸送活性の検査方法。
【請求項２０】
前記有機カチオントランスポーター遺伝子の一塩基多型が、有機カチオントランスポーターの第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１９記載の検査方法。
【請求項２１】
以下の(ａ)〜(ｃ)の工程を含む、請求項１９又は２０記載の検査方法。
（ａ）被検者から調製されたＤＮＡ試料より有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、（ｂ）単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する工程。
【請求項２２】
前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物が、β−遮断薬メトプロロール、β−遮断薬プロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１９乃至２１いずれか記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセット及びプローブ、並びに該トランスポーターの輸送活性検査薬及びその検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物は期待される薬効とともに常に副作用を引き起こす危険性を秘めているので、疾患の種類および症状等の他、個々の患者の薬物に対する反応性に応じて投与されるのが好ましい。
このような副作用は生体内でこれら薬物の尿中への排泄に重要な役割を果たす薬物トランスポーターにより影響を受けると考えられている。
トランスポーターとは薬物分子の細胞膜透過に関与する分子のことをいうが、薬物の薬効と安全性を知る為には特定の薬物がどのトランスポーター分子種により輸送されるのか、またいずれかの分子種の活性を阻害若しくは誘導しないか等について正確に知ることが重要である。
【０００３】
投与された薬物は、腸管、肝臓、腎臓等の多くの臓器に発現している薬物トランスポーターにより、その体内分布が調節されている。
このようなトランスポーターには、抗がん剤の耐性にも関与が報告されているＰ−糖蛋白質やアニオン性薬物の輸送に関わる有機アニオントランスポーター、カチオン性薬物の輸送に関わる有機カチオントランスポーター等が知られている。
尚、有機カチオントランスポーター（以下、ＯＣＴ）にはＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２などが含まれる。
【０００４】
ヒト有機カチオントランスポーター（以下、ｈＯＣＴ）はカチオン性薬物を膜電位及び薬物濃度（電気化学ポテンシャル）依存的に輸送する機能を有しており、一般の条件下では細胞内の膜電位が負であることから、種々のカチオン性医薬品・化学物質の血中から細胞内への輸送を担っていると考えられている。
例えば、ｈＯＣＴ２は腎臓において近位尿細管の上皮細胞の血管側に発現しており（非特許文献１）、血管から腎臓へのカチオン性薬物の取り込みに重要な役割を果たしている。
【０００５】
ｈＯＣＴ２による輸送が報告されている医薬品としては、β−遮断薬メトプロロール及びプロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチン等があり、ｈＯＣＴ２はこれら医薬品の尿中への排泄に重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
前記薬物等はそれぞれの疾患に対し有効な薬物ではあるが、それによる副作用も多く報告されている。
【０００６】
その為、β−遮断薬メトプロロール及びプロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチン等の薬物による副作用の程度を把握する為にはｈＯＣＴ２の輸送活性について正確に知ることが重要となる。
しかしながら、ｈＯＣＴ２の輸送活性は個々の患者に応じてそれぞれ異なることが知られている。
【０００７】
個々の患者におけるｈＯＣＴ２の輸送活性については、最近の遺伝子解析の進歩に伴い、個々の患者の遺伝的要因により支配されていることが知られている。
例えば、ｈＯＣＴ２遺伝子の多型によりｈＯＣＴ２の輸送活性が弱められたり増強されたりすることなどが報告されている（非特許文献５）。
このことから前記薬物投与前にｈＯＣＴ２の輸送活性に関連するｈＯＣＴ２遺伝子の多型を調べ、個々の患者のｈＯＣＴ２輸送活性に応じた量の薬物を投与することで、β−遮断薬メトプロロール等の薬物による副作用を避けることができると考えられる。
【０００８】
その為、上記薬物投与前にｈＯＣＴ２遺伝子の多型を検出し、個々の患者に応じた量の上記薬物を投与し、上記薬物による副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法の開発が強く望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】Motohashi H. et al., J. Am. Soc. Nephrol.,13:866-874 (2002)
【非特許文献２】Dudley A.J. et al., Br. J. Pharmacol., 131:71-79 (2000)
【非特許文献３】Koepsell H., et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 150:36-90 (2003)
【非特許文献４】Ishiguro N., et al., Drug Metab. Dispos., In press (2005)
【非特許文献５】Leabman M.K. et al., Pharmacogenetics, 12:395-405 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的はｈＯＣＴ２により輸送される薬物の投与前にｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量を投与することにより、該薬物による副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、請求項１は、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセットに関する。
請求項２は、前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が一塩基多型である請求項１記載のプライマーセットに関する。
請求項３は、前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセットに関する。
請求項４は、前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセットに関する。
請求項５は、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１乃至４いずれか記載のプライマーセットに関する。
請求項６は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含む、請求項１乃至５いずれか記載のプライマーセットに関する。
請求項７は、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目の塩基を決定するように設計されたプライマーに関する。
請求項８は、前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、一塩基多型である請求項７記載のプライマーに関する。
請求項９は、前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異しているものである請求項８記載のプライマーに関する。
請求項１０は、前記一塩基多型について、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異しているものである請求項８記載のプライマーに関する。
請求項１１は、前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項７乃至１０いずれか記載のプライマーに関する。
請求項１２は、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマーに関する。
請求項１３は、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマーに関する。
請求項１４は、配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマーに関する。
請求項１５は、配列表の配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項７乃至１１いずれか記載のプライマーに関する。
請求項１６は、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブに関する。
請求項１７は、請求項１乃至１６いずれか記載のプライマーセット又はプローブを含む、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する該トランスポーターの輸送活性検査薬に関する。
請求項１８は、前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物が、β−遮断薬メトプロロール、β−遮断薬プロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１７記載の検査薬に関する。
請求項１９は、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に、又は第７００番目の塩基シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異していることを確認する工程を含む、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する該トランスポーターの輸送活性の検査方法に関する。
請求項２０は、前記有機カチオントランスポーター遺伝子の一塩基多型が、有機カチオントランスポーターの第１９９番目又は第２３４番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１９記載の検査方法に関する。
請求項２１は、以下の(ａ)〜(ｃ)の工程を含む、請求項１９又は２０記載の検査方法。
（ａ）被検者から調製されたＤＮＡ試料より有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、（ｂ）単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する工程に関する。
請求項２２は、前記有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物が、β−遮断薬メトプロロール、β−遮断薬プロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１９乃至２１いずれか記載の検査方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法により、有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の輸送活性の大幅な低下を引き起こす遺伝子多型を検出できる。
検出された遺伝子多型をもとに前記ｈＯＣＴ２の輸送活性を判定した上で、ｈＯＣＴ２により腎臓から尿中へと排泄される薬物について個々の患者に応じた量を投与することにより、該薬物の副作用の発現を抑制することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らはβ−遮断薬やインフルエンザ・パーキンソン病治療薬アマンタジン等の医薬品の腎臓における排泄に関与する有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２における遺伝子多型を検出することを目的とし、日本人のβ−遮断薬・抗不整脈薬投与患者２０４人由来ゲノムＤＮＡにつき、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子のエクソン領域を中心にシーケンシング解析し、アミノ酸置換を引き起こす新規遺伝子多型を二種発見した。
即ち、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子（Genbank登録番号NM_003058.2）上の第５９６番目の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に（以下、「５９６Ｃ＞Ｔ」と略記する場合がある）、第７００番目の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に（以下、「７００Ｃ＞Ｔ」と略記する場合がある）変異した新規遺伝子多型である。なお、塩基番号は、翻訳開始コドンＡＴＧのＡを第１番目の塩基として示した（NM_003058.2では１７１番目の塩基）。
アリル頻度は前者が０．００７、後者が０．００２であった。
また、ハプロタイプ解析の結果、後者はアミノ酸置換を伴わない遺伝子多型、即ち、第３９０番目の塩基がグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に変異したもの（以下、「３９０Ｇ＞Ｔ（Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ）」と略記する場合がある）と連鎖していた。
【００１４】
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子は、ｈＯＣＴ１／ＳＬＣ２２Ａ１及びｈＯＣＴ３／ＳＬＣ２２Ａ３と共に、染色体６ｑ２６−２７に位置し（Verhaagh S. et al., Genomics, 55: 209-218 (1999)）、１１個のエクソンから構成される遺伝子である。
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２は５５５アミノ酸より成り、１２回膜貫通型の蛋白質である（Gorboulev V. et al., DNA Cell Biol. 16:871-881 (1997)）。
本分子種の主発現部位は腎臓であり、その他に視床や海馬等の脳や胎盤で発現が確認されている（非特許文献１及びBusch A.E. et al., Mol. Pharmacol. 54, 342-352, 1998）。
腎臓においてｈＯＣＴ２は近位尿細管の上皮細胞の血管側に発現しており、血管から腎臓へのカチオン性薬物の取り込みに重要な役割を果たしている。
ｈＯＣＴ２による輸送が報告されている医薬品としては、β−遮断薬メトプロロール及びプロプラノロール、抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチン等があり、ｈＯＣＴ２はこれら医薬品の尿中への排泄に重要な役割を果たしていると考えられている。
また内在性基質としてはコリン、ドパミン、プロスタグランジンＥ２及びＦ２α等が報告されている。
尚、ｈＯＣＴ２の機能測定にはモデル基質としてテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）や１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）が良く用いられている。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には人口中１％以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。
しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。
本発明における多型の種類としては例えば一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
更に多型部位の数についても特に制限はなく、１個以上の多型を有していてもよい。
【００１６】
以下、β−遮断薬をもとに本発明を説明するが、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物はβ−遮断薬に限定されるものではない。
更には、上述した抗消化性潰瘍薬シメチジン、パーキンソン病・インフルエンザ治療薬アマンタジン、パーキンソン病治療薬プラミペキソール、筋弛緩薬メマンチン等に限定されるものでもない。
【００１７】
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目の塩基ＣがＴに変異することにより、第１９９番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔｈｒ）からイソロイシン（Ｉｌｅ）に変異したｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２が発見された（以下、「５９６Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅ））と略記する場合がある）。
この変異の結果、β−遮断薬の生体からの排泄がｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現し易いと考えられる。
従って、β−遮断薬投与前にｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の変異、即ち、該一塩基多型（ＳＮＰ）について検査することによりｈＯＣＴ２輸送活性の判定を行い、個々の患者のｈＯＣＴ２輸送活性に応じた量のβ−遮断薬を投与することが可能となる。
その結果、個々の患者に応じてβ−遮断薬の投与量を調節することにより副作用を避けることができる。
【００１８】
もう一つは、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第７００番目の塩基ＣがＴに変異することにより第２３４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）に変異したｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２が発見された（以下、「７００Ｃ＞Ｔ (Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ)」と略記する場合がある）。
この変異の結果、β−遮断薬の生体からの排泄がｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現し易いと考えられる。
従って、β−遮断薬投与前にｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の変異、即ち、該一塩基多型について検査することによりｈＯＣＴ２輸送活性の判定を行い、個々の患者のｈＯＣＴ２輸送活性に応じた量のβ−遮断薬を投与することが可能となる。
その結果、個々の患者に応じてβ−遮断薬の投与量を調節することにより副作用を避けることができる。
【００１９】
前記ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の一塩基多型を利用するｈＯＣＴ２輸送活性異常の判定に用いられる本発明に係るプライマーセット、プローブ、及びそれらを含むｈＯＣＴ２輸送活性の検査薬、並びにｈＯＣＴ２輸送活性の検査方法について、以下、詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
【００２０】
ｈＯＣＴ２輸送活性の判定において、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目又は第７００番目の塩基における多型を決定し、その塩基の種類に基づきｈＯＣＴ２輸送活性の判定を行う。
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目の塩基がシトシン（Ｃ）である場合には問題ないが、前記塩基がチミン（Ｔ）に変異している場合にはアミノ酸変異をもたらすものとなり、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第１９９番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔｈｒ）からイソロイシン（Ｉｌe）に変異したｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２が発現する。
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第７００番目の塩基がシトシン（Ｃ）である場合には問題ないが、前記塩基がチミン（Ｔ）に変異している場合にはアミノ酸変異をもたらすものとなり、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の第２３４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）に変異したｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２が発現する。
その結果、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の輸送活性が低いと判断することができる。
【００２１】
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目又は第７００番目の塩基を決定する方法としては、被検者から調製されたＤＮＡ試料よりｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する）により、第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の部分断片を増幅する工程を経た後、単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、例えば、その部分断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列を直接決定するダイレクトシークエンス法による工程を経ることにより行うことができる。
【００２２】
前記方法においては最初に被検者からＤＮＡ試料を調製する。
ＤＮＡ試料は例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡあるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００２３】
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡさらにはｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むＤＮＡを単離する。
第５９６番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を構成する１１個のエクソンの内、エクソン３に存在する（図１）。
第７００番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を構成する１１個のエクソンの内、エクソン４に存在する（図１）。
【００２４】
第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅する際に使用するプライマーは、第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の部分断片を増幅可能なプライマーである限り、特に限定されるものではなく、当業者であればｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
このようなプライマー、即ち、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセットとしては、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含むプライマーセットをあげることができる。
これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施すると、第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の部分断片を得られる。
【００２５】
第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の部分断片の塩基配列を決定する。
単離した遺伝子断片の塩基配列の決定は、マクサムギルバート法やサンガー法など、当業者に公知の方法で行うことができる。
塩基配列を決定するにあたり使用するプライマーとしては、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目の塩基を決定するように設計されたものであれば、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
ＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンス法においては、ＰＣＲに用いたプライマーと同じ塩基配列を有するプライマーを用いることができる。
【００２６】
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目の塩基を決定するには、例えば配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマー、若しくは、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して実施することができる。
ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第７００番目の塩基を決定するには、例えば配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマー、若しくは、配列表の配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して実施することができる。
【００２７】
決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する。
本法における対照とは、正常な（野生型）ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の配列を言う。
一般に健常人のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の配列と比較することを意味するが、GenBankに野生型として登録されているｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の配列（NM_003058.2）と比較してもよい。
【００２８】
このような比較の結果、被検者のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子、第５９６番目の塩基配列が対照と異なっていた場合、即ち、対照のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子、第５９６番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるのに対し、被検者のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子、第５９６番目の塩基がチミン（Ｔ）である場合、当該一塩基多型（ＳＮＰ）により、被検者はβ−遮断薬等のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する輸送活性が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
即ち、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目の塩基ＣがＴに変異することにより、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の１９９番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔｈｒ）からイソロイシン（Ｉｌe）へと変異し、β−遮断薬等の生体からの排泄が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
同様にｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第７００番目の塩基ＣがＴに変異することにより、第２３４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）へと変異し、β−遮断薬等の生体からの排泄が、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
【００２９】
上述の一塩基多型により、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性が減少しているかどうかを調べる手段としては、以下のような工程を含む方法を例示することができる。
（１）多型を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を発現する発現ベクターを構築する、
（２）該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入する、
（３）該宿主細胞をｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２が発現される条件下で培養する、
（４）多型を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の発現レベルは、野生型のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を導入した場合の結果と比較することにより明らかとなるが、その方法としては、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び免疫蛍光法等により決定することができる。
（５）また多型を含むｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を導入した（３）の細胞を用いてテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）や１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ+）を基質として輸送活性を調べ、野生型のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を導入した場合の結果と比較することにより、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性を決定することができる。
（４）および（５）の結果、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２輸送活性が低下していれば、被検者はβ−遮断薬等のｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２により輸送される薬物に対する輸送活性が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと判定される。
【００３０】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下の方法によっても行うことができる。
被検者からＤＮＡ試料を調製した後、該試料を制限酵素により切断する。
ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００３１】
他の一つの態様においては、被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを制限酵素により切断し、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の長さを対照と比較する。
【００３２】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。
変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することにより、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
或いは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明に係るプローブ、例えばｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。
用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。
この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００３３】
さらに別の方法においては、被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させた後、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。
分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３４】
該方法としては、例えばＰＣＲ-ＳＳＣＰ(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法が挙げられる。
この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。
その原理は次の通りである。
二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。
この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。
一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。
従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００３５】
具体的には、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の第５９６番目又は第７００番目の塩基を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。
増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。
ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。
ＰＣＲの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。
或いはＰＣＲ反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。
ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。
こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。
この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。
泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（20〜25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4〜30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。
電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。
移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。
標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００３６】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。
変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。
それをサザンブロット法や特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。
具体的には、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。
変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３７】
本発明に係るｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子上の第５９６番目又は第７００番目の塩基を同定し得るプライマー及びプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。
プローブは制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は適宜標識して用いることが好ましい。
標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、オリゴヌクレオチドの５'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００３９】
上記の検査薬においては有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４１】
（実施例１）ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子多型の検出
〔ＤＮＡ抽出〕
日本人のβ−遮断薬・抗不整脈薬投与患者２０４人より、文書による同意の上、末梢静脈血を採血し、含まれる白血球よりゲノムDNAを調製した。
尚、本研究は国立循環器病センターおよび国立医薬品食品衛生研究所の研究倫理審査委員会の承認のもとに行った。
得られたＤＮＡの濃度はＵＶ吸収により測定し、ＤＮＡ溶液はシーケンシング解析時まで4℃で保存した。
【００４２】
〔ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の配列解析〕
ゲノムコンティグ配列（Genbank登録番号NT_007422.12）に基づき、遺伝子増幅用およびシーケンシング用プライマーを設計した（表１）
【００４３】
【表１】
2006223221.tif 000003
【００４４】
２種類のプライマーセット（表１、1st PCR; 各0.2 μM）とZ-Taq酵素（1.25 units;Takara Bio.Inc.,Shiga,Japan）を用い、ゲノムＤＮＡ（100ng）についてｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の全長（エクソン1から9まで、及びエクソン10から11まで）を増幅した。
この際のＰＣＲの条件としては、98℃で5秒、55℃で5秒および72℃で190秒を、30サイクル行った。
各エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表１、2nd PCR; 各0.2 μM）を用いて、第一段ＰＣＲの産物であるＤＮＡ断片より、各エクソンを含むＤＮＡ断片をEx-Taq酵素（0.625 units; Takara Bio. Inc.）を用いて増幅した。
但し、エクソン3及び4は１つの断片として増幅した。
この際ＰＣＲの条件は、94℃で5分処理後、「94℃で30秒、60℃で1分および72℃で2分」を30サイクル行い、その後72℃で7分処理した。
その後、PCR Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH)を用いて精製したＰＣＲ産物を両鎖について、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、シーケンシング用プライマー（表１、シーケンシング、0.08 μM）にて直接配列決定した。
これはサイクルシーケンシング反応後、過剰な色素をDyeEx96 plate (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて除去した後、溶出液をABI Prism 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)により分析することにより行った。
見いだした遺伝子多型は、上記ゲノムＤＮＡからの増幅及びシーケンシング作業の繰り返し実験により、その存在を確認した。
【００４５】
上記ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子のシーケンシング解析により、アミノ酸置換を引き起こす新規遺伝子多型を二種見いだした。
即ち、５９６Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅ）及び７００Ｃ>Ｔ（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ）である（塩基番号は翻訳開始コドンであるＡＴＧのＡを１とした）。
図２に両多型のシーケンシング結果を示した（５９６Ｃ＞Ｔはセンス鎖、７００Ｃ＞Ｔはアンチセンス鎖を示した）。
アリル頻度は前者が０．００７、後者が０．００２であった。
また、ハプロタイプ解析の結果、後者はアミノ酸置換を伴わない遺伝子多型３９０Ｇ>Ｔ（Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ）と連鎖していた。
【００４６】
［実施例２］異型ｈＯＣＴ２トランスポーターの発現
（プラスミド構築）
完全長野生型ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２断片をpENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に組み込んだものを野生型とした。
Quick Change Site-Directed Mutagenesis KitまたはQuick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、野生型ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２- pENTR/D-TOPOプラスミドを鋳型として、異型トランスポーターである５９６Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅ）及び７００Ｃ＞Ｔ（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ）の発現プラスミドを構築した。
後者については、ハプロタイプ解析の結果、連鎖が見られた３９０Ｇ＞Ｔ（Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ）との二重変異体（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ）も作成した。
野生型及び３種の置換体の全配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
次項におけるｃＲＮＡ合成のため、野生型及び３種の置換体のｃＤＮＡインサートをT7プロモーターを有するpcDNA3.2/V5-DESTベクター(Invitorgen)に組換えた。
【００４７】
〔ｃＲＮＡの合成及びマイクロインジェクション〕
ｃＲＮＡ合成は、以下の通り行った。即ち、ｈＯＣＴ２のｃＤＮＡインサートを含んだpcDNA3.2/V5-DESTよりmMESSAGE mMACHINE T7 Kit（Ambion. Inc., Austin, Tx）を用いてin vitro転写反応によりｃＲＮＡ合成を行なった。
輸送活性測定はトランスポーター活性の研究に良く用いられるアフリカツメガエル卵母細胞を使用した。
細胞をModified Birth Solution(ＭＢＳ)培地中、１８℃で培養した。
細胞をメッシュ上で固定し、ｃＲＮＡを５０ｎｇマイクロインジェクションした。
７２時間後、次項における輸送活性測定に供した。
【００４８】
［実施例３］ｈＯＣＴ２変異体の輸送活性測定
野生型ｈＯＣＴ２及びThr199Ile, Arg234Trp/Thr130Thr, Arg234Trp置換体の輸送活性を、有機カチオントランスポーターの典型的な基質であるテトラエチルアンモニウムおよび1-メチル-4-フェニルピリジニウムを用いて決定した。
（輸送活性の測定）
テトラエチルアンモニウム（図３）：野生型ｈＯＣＴ２及びＴｈｒ１９９Ｉｌｅ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ置換体cRNAを導入したアフリカツメガエル卵母細胞をMBS培地 (pH 7.4)中で、室温にて[14Ｃ]標識テトラエチルアンモニウム(3.3 μM)存在下、60分間インキュベートした。
反応終了後、卵母細胞を回収し、液体シンチレータを加えて溶解し、卵母細胞に取り込まれた放射活性を測定した。
同時に反応に用いた反応溶液中の放射活性濃度も測定し、その比（細胞/培地）を細胞内への取り込み量とした。
1-メチル-4-フェニルピリジニウム（図４）：野生型ｈＯＣＴ２及びＴｈｒ１９９Ｉｌｅ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ置換体ｃＲＮＡを導入したアフリカツメガエル卵母細胞をMBS培地 (pH 7.4)中で、室温にて[3Ｈ]標識1-メチル-4-フェニルピリジニウム(2.5 nM)を含む1 μM 1-メチル-4-フェニルピリジニウム存在下、30分間インキュベートした。
反応終了後、卵母細胞を回収し、液体シンチレータを加えて溶解し、卵母細胞に取り込まれた放射活性を測定した。同時に反応に用いた反応溶液中の放射活性濃度も測定し、その比（細胞/培地）を細胞内への取り込み量とした。
野生型ｈＯＣＴ２及びＴｈｒ１９９Ｉｌｅ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ置換体の輸送活性を比較した。
まずテトラエチルアンモニウムを基質として用いたところ、Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ, Ａｒｇ２３４Ｔｒｐのすべての置換体で野生型に比して95%以上の大幅な輸送活性の低下が認められた。
さらに1-メチル-4-フェニルピリジニウムの場合でも、Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅで約80%の、Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒ及びＡｒｇ２３４Ｔｒｐでは95%以上の、輸送活性の大幅な低下が認められた。
尚、７００Ｃ＞Ｔ（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ）単独でも、Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ／Ｔｈｒ１３０Ｔｈｒと同程度の輸送活性の低下が見られたことから、輸送活性の低下は７００Ｃ＞Ｔ（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ）に起因すると考えられた。
【００４９】
〔結果のまとめ〕
今回の結果は、新規に見いだされたｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の遺伝子多型、５９６Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ１９９Ｉｌｅ）、７００Ｃ＞Ｔ（Ａｒｇ２３４Ｔｒｐ）が活性の大幅な低下を引き起こすことを示したものである。
これらの遺伝子多型を有するヒトでは、ｈＯＣＴ２による排泄が遅いことが予想され、結果的に薬物の血中濃度上昇を招き、副作用発現を引き起こすと考えられる。
ｈＯＣＴ２により腎臓から尿中へと排泄される薬物の投与前に、これらの遺伝子多型を調べることにより、薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能である。
【００５０】
本発明により、ｈＯＣＴ２により排泄される薬物を医薬品として投与する場合に、薬物の投与量を調節し、その副作用を避ける方法が提供される。
即ち、ｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２の遺伝子多型により本トランスポーターの輸送活性が低下することによる薬物排泄異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子を提供することにより、ｈＯＣＴ２により排泄される薬物の投与による副作用発症を抑制するための検査方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明に係る一塩基多型の位置をｈＯＣＴ２／ＳＬＣ２２Ａ２遺伝子の構造全体から表した図である。
【図２】本発明に係る一塩基多型のシーケンシング結果を示した図である。
【図３】本発明の効果をテトラエチルアンモニウムを基質としたｈＯＣＴ２変異体の輸送活性により示した図である。
【図４】本発明の効果を１−メチル−４−フェニルピリジニウムを基質としたｈＯＣＴ２変異体の輸送活性により示した図である。
【図１】
2006223221.tif 000004
【図２】
2006223221.tif 000005
【図３】
2006223221.tif 000006
【図４】
2006223221.tif 000007
【配列表】
2006223221000001.app