(57)【要約】【課題】本発明は、ＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する新規な脱グリコシル化抗体に関する。【解決手段】ＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する新規な脱グリコシル化抗体は、治療、特に免疫抑制へ利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する脱グリコシル化抗体。
【請求項２】
ヒトＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する、請求項１に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項３】
少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：
【化１】
2006089501.tif 000027
またはその保存的に修飾された派生体より選択される、請求項２に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項４】
少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：
【化２】
2006089501.tif 000028
またはその保存的に修飾された派生体より選択される重鎖を有し、および／または、少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：
【化３】
2006089501.tif 000029
またはその保存的に修飾された派生体より選択される軽鎖を有する、請求項２に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項５】
次のアミノ酸配列：
【化４】
2006089501.tif 000030
またはその保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを有する重鎖、及び、次のアミノ酸配列：
【化５】
2006089501.tif 000031
またはその保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを有する軽鎖を有し、かつ、重鎖ＣＤＲがリーダーから定常部の方向へ、（ａ），（ｂ），（ｃ）の順に配列されており、かつ、軽鎖ＣＤＲがリーダーから定常部の方向へ、（ｄ），（ｅ），（ｆ）の順に配列されている、請求項２に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項６】
可変部フレームワーク領域が、ラット若しくはマウスのもの、または、ラット若しくはマウスに由来するものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項７】
ＣＤＲが可変フレームワーク領域とは起源が異なるものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項８】
可変部フレームワーク領域が、ヒトのもの、または、ヒトに由来するものである、請求項７に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項９】
重鎖可変部フレ−ムワ−ク領域が、リ−ダ−から定常部の方向へ、次のアミノ酸配列：
【化６】
2006089501.tif 000032
［ＣＤＲは、少なくとも１つが（ａ），（ｂ）、（ｃ）、またはその保存的に修飾された派生体から選択されるＣＤＲが存在することを示す。］
より成る、請求項８に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１０】
軽鎖可変部フレ−ムワ−ク領域が、リ−ダ−から定常部の方向へ、次のアミノ酸配列：
【化７】
2006089501.tif 000033
［ＣＤＲは、少なくとも１つが（ｄ），（ｅ）、（ｆ）、またはその保存的に修飾された派生体から選択されるＣＤＲが存在することを示す。］
より成る、請求項８または９に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１１】
重鎖可変部が次のアミノ酸配列：
【化８】
2006089501.tif 000034
より成る請求項９に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１２】
軽鎖可変部が次のアミノ酸配列：
【化９】
2006089501.tif 000035
より成る請求項８または１１に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１３】
定常部が、ラット若しくはマウスのもの、または、ラット若しくはマウスに由来するものである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１４】
ＣＤＲが定常領域とは異なる起源を持つ、請求項１から１２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１５】
定常部が、ヒトのもの、または、ヒトに由来のものである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１６】
定常領域がＩｇＧのアイソタイプである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１７】
定常領域がＩｇＧ１のアイソタイプである、請求項１６に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１８】
各定常領域重鎖の２９７番目アスパラギン残基が他のアミノ酸残基と置換された、請求項１５、１６または１７に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項１９】
アスパラギンがアラニン残基と置換された請求項１８に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項２０】
片方のアームのみがＣＤ３抗原に対する親和性を有する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項２１】
単価抗体である請求項２０に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項２２】
半分が、完全な重鎖と軽鎖から成り、残りの半分が、類似しているが、軽鎖への結合部位を欠いている不完全な重鎖から成る、請求項２１に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項２３】
生理的に許容される希釈剤若しくは担体を含む薬剤組成物の形をした、請求項１から２２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
【請求項２４】
治療に用いるための請求項１から２２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体
【請求項２５】
免疫抑制のための薬剤を製造するために、請求項１から２２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体を使用する方法。
【請求項２６】
薬剤が移植を受けた者の治療に用いるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から２２のいずれか１項に記載の、リガンド、抗体、或いはそれらの断片を、治療に効果的な量患者に投与することより成る、癌患者または免疫抑制を必要とする患者を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新しい抗体、特にＣＤ３抗原複合体に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、すなわち免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結ばれた２つの重鎖と、Ｙ字型になるようにジスルフィド結合で各々の重鎖に結合している２つの軽鎖とから成る。抗体の２つの“腕（アーム）“は、抗原との結合に関与し、ポリペプチド構造が変化する領域を含む。これらの“腕“はＦａｂ’断片（断片−抗原−結合）、または２つのＦａｂ’の腕がジスルフィド結合で結ばれていることを表すためにＦ（ａｂ）２  と呼ばれている。抗体の“尾部“つまり中心軸には、ペプチドの固定された、すなわち不変の配列が見られ、Ｆｃ断片（断片−結晶）といわれている。モノクローナル抗体は初め、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））により発見された。この様なモノクローナル抗体は診断薬として、あるいは治療用として広く使われている。
【０００３】
各重鎖の一方の末端には、可変部があり、複数の定常部がそれに続く。各軽鎖の一方の末端には可変部が、他方の末端には定常部がある。軽鎖の可変部は重鎖の可変部と並んでおり、また定常部は重鎖の最初の定常部（ＣＨ１）と並んでいる。軽鎖および重鎖の定常部は抗体の抗原に対する結合に直接は関与しない。軽鎖の定常部と重鎖のＣＨ１ドメインは各Ｆａｂ’断片の５０％を占める。
【０００４】
軽鎖と重鎖の各対から成る可変部は抗原との結合部位を形成する。軽鎖と重鎖の可変部は同一の一般構造を有し、各ドメインは４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存されていて、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８７））。４つのフレームワーク領域はたいてい、βシート構造を形成し、ＣＤＲはループ上の連結部を形成する。ＣＤＲがβシート構造の一部を形成する場合もある。ＣＤＲ同士はフレームワーク領域によって非常に接近しており、他のドメインのＣＤＲと共に抗原結合サイトの形成に寄与している。
【０００５】
ヒトＣＤ３抗原は少なくとも４つの不変ポリペプチド鎖から成り、各ポリペプチド鎖はＴ細胞の表面上のＴ細胞受容体と非共有結合で結合する。そして、現在一般的にＣＤ３抗原複合体と呼ばれている。その複合体はＴ細胞受容体による抗原認識に応答したＴ細胞活性化に関与することが示唆されている。
【０００６】
すべてのＣＤ３モノクローナル抗体はＩＬ−１（インターロイキン１）やＩＬ−２（インターロイキン２）のような二次増殖刺激剤に対するＴ細胞の感受性を高めるために使用される。さらに、ＣＤ３モノクローナル抗体の中には、それ自身がＴ細胞に対して増殖促進活性を有するものもある。この性質はアイソタイプ依存性で、ＣＤ３抗原のＦｃ部と補助細胞の表面にあるＦｃ受容体との相互作用に起因する。
【０００７】
齧歯類のＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の抗原に対する反応を抑制、促進、再促進することにより免疫反応に影響を与えるために利用される。従って、それらはヒトの免疫抑制剤として治療に用いることができる可能性がかなり高い。例えば、腎臓、肝臓、心臓の他家移植後の拒否反応に対する治療のために使用できる。しかし、それらの価値は２つの主要な要因に左右される。１つは、抗体の異物的な性質により引き起こされる抗グロブリン反応である。２つは、患者に抗体を初めて投与した際に起こる“一次反応“症候群である。症状としては、熱、悪寒から肺炎にまで渡る苦痛を伴い、稀に死を招くこともあるが、これは、ＣＤ３抗体によって誘導されたＴ細胞活性化に伴って循環サイトカインのレベルが上昇することに起因する。この現象はＴ細胞表面のＣＤ３抗原と補助細胞とのＦｃ受容体を通したクロスリンクを必要とする。このような増殖はＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）２  断片を用いても起こらない。
【０００８】
最初の問題は、抗体の可変部の遺伝子を再編成、あるいは”人体と適応”させ、そしてそれらを関連したヒトの定常部遺伝子と共に発現させることによって対処することができる。これにより、抗グロブリン反応が起こり得ないくらいの低レベルまで、モノクローナル抗体の非ヒト部分の割合が下げることができる。ＣＤ３抗原複合体に対する結合性を持つこのような再編成された抗体については英国特許出願第９１２１１２６．８号（ＧＢ２２４９３１０Ａとして公開された）およびその対応出願（欧州特許出願第９１９１７１６９．４、日本特許出願第５１６１１７／９１号および米国特許出願第０７／８６２５４３号）に記載されている。
【０００９】
しかし、これら抗体が治療に使用されても、一次反応の問題は残ったままである。ある場合には抗体の脱グリコシル化により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体のＦｃ受容体に対する結合力が低下したと記載されている。しかし、この現象がすべての抗体で、特にｉｎ ｖｉｖｏでも起こるのかを予想することはできず、また脱グリコシル化によって、他の好ましくない効果を引き起こす新規なＦｃ結合特性を含む新規な予想できない性質が抗体に与えられる可能性もある。またＦｃ結合性とは関連のない好ましくない特徴を抗体に与えてしまう可能性もある。
【００１０】
さらに極めて重要なことは、脱グリコシル化によって、一次反応へ寄与するような好ましくない特徴と共に、Ｆｃ結合性の好ましい特徴まで失ってしまわないことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、本発明ではＩｇＧサブクラスの脱グリコシル化ＣＤ３抗体の産生が可能であることを見いだした。この抗体は驚くべきことに、Ｆｃへの結合能力をある程度残しており、その抗原結合特異性および免疫抑制活性を保持したまま、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＴ細胞の分化を誘導せず、そしてｉｎ ｖｉｖｏでサイトカイン放出のレベルを下げることができる。
【００１２】
従って、本発明は、ＣＤ３抗原複合体への結合親和力を有する脱グリコシル化ＩｇＧ抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
脱グリコシル化という用語は通常の意味で用いられ、発明された抗体はグリコシル化されていないことを示す。本発明は、ヒト以外のＣＤ３抗原複合体、例えば様々な他の哺乳類ＣＤ３抗原への結合親和性を有する抗体に適用して家畜病治療に用いることもできるが、発明の主な価値は、脱グリコシル化抗体が、ヒトに対して適用できるように、ヒトＣＤ３抗原複合体と親和性を持つことであり、次の記載では特にその内容に注目している。
【００１４】
ＣＤ３抗原についてのさらなる論議は、第一回国際ワークショップや、ヒト白血球分化抗原会議の報告にも見られ、ＣＤ３抗原に対するグリコシル化された様々な抗体についての記述も、このシリーズのワークショップおよび会議（特に第３回、第４回）の報告（オックスフォード社出版）にも見られる。そのような抗体の具体的な例としては、Ｖａｎ  Ｌｌｅｒ  ら、Ｅｕｒｏ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８７，１７，１５９９−１６０４、Ａｌｅｇｒｅら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４０，１１８４、およびＳｍｉｔｈら，ｉｂｉｄ，１９８６，１６，４７８，の中に記載されたものも含まれ、Ｓｍｉｔｈの文献は、ＩｇＧ１抗体ＵＣＨＴ１およびその派生体に関している。しかし、本発明の、脱グリコシル抗体の基本的特徴として特に興味深いのは、抗体ＯＫＴ３とＹＴＨ１２．５．１４．２に含まれるＣＤＲである。抗体ＯＫＴ３はＣｈａｔｅｎａｕｄら．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ，１９９１，５１，３３４およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｐａｐｅｒ，１９８５，３１３，３３９、さらに、欧州特許出願第００１８７９５号と米国特許出願第４，３６１，５３９号中に記載されている。抗体ＹＴＨ１２．５．１４．２（今後ＹＴＨ１２．５とする）については、Ｃｌａｒｋ  ら．，Ｅｕｒｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８９，１９，３８１−３８８に述べられており、そして、再構成されたＹＴＨ１２．５抗体は、英国特許出願第９１２１１２６．８号とその対応出願の主題となっており、この出願にはこの抗体に存在するＣＤＲについて詳細に記載されている。
【００１５】
上述の出願に記載されているＣＤＲを１つ若しくは複数含んでいる脱グリコシル抗体は特に興味深い。従って、本発明の抗体は下記のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのＣＤＲをもつことが好ましい。
（ａ）
【００１６】
【化１０】
2006089501.tif 000002
【００１７】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．１），
（ｂ）
【００１８】
【化１１】
2006089501.tif 000003
【００１９】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．２），
（ｃ）
【００２０】
【化１２】
2006089501.tif 000004
【００２１】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．３），
（ｄ）
【００２２】
【化１３】
2006089501.tif 000005
【００２３】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．４），
（ｅ）
【００２４】
【化１４】
2006089501.tif 000006
【００２５】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．５），
（ｆ）
【００２６】
【化１５】
2006089501.tif 000007
【００２７】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．６），
およびこれらの保存的に修飾された派生体である。
“保存的に修飾された派生体“とは当該技術分野においてよく知られており、抗体−抗原の親和力に本質的に影響を与えることのない変化を有する派生体を意味する。
【００２８】
ＣＤＲは、重鎖可変部のフレームワーク領域中（（ａ），（ｂ），（ｃ）の場合）および軽鎖可変部のフレームワーク領域中（（ｄ），（ｅ），（ｆ）の場合）に位置している。抗体はさらに定常部も含んでいる。
【００２９】
好ましい態様では、脱グリコシル抗体は、上述アミノ酸配列（ａ），（ｂ），（ｃ）に相当する、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する３つのＣＤＲ，および／あるいは、アミノ酸配列（ｄ），（ｅ），（ｆ）に相当する、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する３つのＣＤＲを有するが，最も重要なのは重鎖ＣＤＲ（ａ），（ｂ），（ｃ）である。
【００３０】
従って、ＣＤ３抗原に対する結合親和性を有する好ましい脱グリコシル抗体は、少なくとも１つ、特に３つのＣＤＲがアミノ酸配列：
（ａ）
【００３１】
【化１６】
2006089501.tif 000008
【００３２】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．１），
（ｂ）
【００３３】
【化１７】
2006089501.tif 000009
【００３４】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．２），
（ｃ）
【００３５】
【化１８】
2006089501.tif 000010
【００３６】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．３），
および、これらの保存的に修飾された派生体から選択された重鎖、および／または、少なくとも１つ、特に３つのＣＤＲがアミノ酸配列：
（ｄ）
【００３７】
【化１９】
2006089501.tif 000011
【００３８】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．４），
（ｅ）
【００３９】
【化２０】
2006089501.tif 000012
【００４０】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．５），
（ｆ）
【００４１】
【化２１】
2006089501.tif 000013
【００４２】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．６），
およびこれらの保存的に修飾された派生体から選択される軽鎖を有する。
本発明の脱グリコシル抗体は、前述のような好ましいＣＤＲを含んでいる場合、都合のいいことに、特異的な重鎖ＣＤＲを１つ以上と特異的な軽鎖ＣＤＲを１つ以上を両方とも有している。ＣＤＲ（ａ），（ｂ），（ｃ）は重鎖中で次のように配列される。リーダー配列から定常部（Ｎ末端からＣ末端へ）の方向へ、フレームワーク領域１／（ａ）／フレームワーク領域２／（ｂ）／フレームワーク領域３／（ｃ）／フレームワーク領域４。また、ＣＤＲ（ｄ），（ｅ），（ｆ）は軽鎖中で次のように配列される。リーダー配列から定常部（Ｎ末端からＣ末端へ）の方向へ、フレームワーク領域１／（ｄ）／フレームワーク領域２／（ｅ）／フレームワーク領域３／（ｆ）／フレームワーク領域４。そこで３つの配列が全て存在する場合には、重鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ａ），（ｂ），（ｃ）と並び、軽鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ｄ），（ｅ），（ｆ）と並ぶのが好ましい。
【００４３】
しかし、本発明の脱グリコシル抗体が、前述のような配列とはまったく異なるＣＤＲを含んだり、あるいは全く異なることはないとしても、重鎖や特に軽鎖が、各々（ａ），（ｂ），（ｃ）という配列のＣＤＲ、（ｄ），（ｅ），（ｆ）という配列のＣＤＲのうち、たった１つまたは２つしか持たない可能性もあり得ることを認識しておく必要がある。しかし、本発明の脱グリコシル抗体に上述の６つのＣＤＲ全てが存在することが必要とされているわけではないが、大半の好ましい抗体中には通常存在するであろう。従って、特に好ましい脱グリコシル抗体は、アミノ酸配列（ａ），（ｂ），（ｃ）若しくはこれらの保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを持つ重鎖、及び、アミノ酸配列（ｄ），（ｅ），（ｆ）若しくはこれらの保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを持つ軽鎖を有し、そして、重鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ａ），（ｂ），（ｃ）と並び、軽鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ｄ），（ｅ），（ｆ）と並ぶ。
【００４４】
ＣＤＲは可変フレームワーク領域、および／または、定常部とは異なった起源を持っていてもよい。そして、ＣＤＲは通常、ラット若しくはマウス由来であるので、本発明がラットやマウス由来のそのような領域を持った抗体を包含しても、ヒトでの抗グロブリン反応が起こらないという利点がある。
【００４５】
さらに通常は、ＣＤＲは、例えばヒトのキメラ抗体の一部の様に可変フレームワーク領域と同じ起源であって、定常フレームワーク領域とは起源が異なるか、または、より一般には、可変フレームワーク領域とも起源が異なる。
【００４６】
上述の望ましいＣＤＲはラットＣＤ３抗体より得られる。従って、可変部フレームワーク領域は様々な形態を取り得るが、齧歯類（例えばラットやマウス）のもの、または齧歯類由来のものが都合がよく、ヒトのものまたはヒト由来のものであるのがより望ましい。１つの可能性として、抗体の定常部はヒトのものまたはヒト由来のもののままで、可変部フレームワーク領域はＹＴＨ１２．５ハイブリドーマのものに相当するものを持たせることもできる。しかし、本発明の抗体は、好ましくは可変部フレームワーク領域も、さらに後述するように定常部フレームワーク領域もヒト由来のものに近付けた方が良い。
【００４７】
従って、本発明はさらに、ヒトＣＤ３抗原に結合親和性を有し、且つ、可変部フレームワーク領域、および／または、定常部フレームワーク領域がヒトのものまたはヒト由来のものである脱グリコシル抗体を含む。
【００４８】
ヒトの可変部フレームワーク領域の配列のあるものは、望ましいＣＤＲ配列を繋ぎ合わせるのに好ましい。なぜなら、そのような配列中においてはＣＤＲの３次元構造がより保持され、且つ、抗体が抗原に対して高い結合親和性を維持するであろうからである。そのような可変部フレームワーク領域における望ましい特徴は、主要なアミノ酸が存在していることであり、それらのアミノ酸はＣＤ３抗原に対する抗体の親和性と特異性を確実にするため、ＣＤＲル−プ構造、すなわち、軽鎖にとって望ましいλ型の構造を維持する。
【００４９】
上述のＣＤＲとの結合に特に適するヒト可変フレームワーク領域は、英国特許出願第９１２１１２６．８号で既に同定されている。重鎖可変（Ｖ）領域フレームワークは、ヒトＶＨIII型遺伝子ＶＨ２６．Ｄ．Ｊ．によりコードされており、Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系１８／２（Ｇｅｎｂａｎｋ  コード：Ｈｕｍｉｎｇｈａｔ，Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ  ら．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３９，２４９６−２５０１）に由来する。軽鎖可変領域フレームワークは、ヒトＶＬ  λ型VI遺伝子ＳＵＴ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  コード；ＬＶ６ＣｓＨｕｍ，Ｓｏｌｏｍｏｎら．，Ｉｎ  Ｇｌｅｎｎｅｒら（Ｅｄｓ）、Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎ．Ｙ．，１９８６，ｐ．４４９）にコードされている。
【００５０】
従って、ラットＣＤ３抗体の重鎖の１つ、或いはそれ以上の好ましいＣＤＲは好ましくはヒトの可変部領域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダー配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。ＣＤＲは、前述のような（ａ），（ｂ），（ｃ）、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選択可能なＣＤＲを示す。
【００５１】
【化２２】
2006089501.tif 000014
【００５２】
（配列Ｎｏ．７／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．８／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．９／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．１０）
３つの望ましいＣＤＲをすべて含む脱グリコシル抗体においては、重鎖可変部は下記の配列：
【００５３】
【化２３】
2006089501.tif 000015
【００５４】
（配列Ｎｏ．１１）
より成る。
同様にラットＣＤ３抗体の軽鎖の１つ、或いはそれ以上の好ましいＣＤＲは好ましくはヒトの可変部領域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダー配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。ＣＤＲは、前述のような（ｄ），（ｅ），（ｆ）、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選択可能なＣＤＲを示す。
【００５５】
【化２４】
2006089501.tif 000016
【００５６】
（配列Ｎｏ．１２／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．１３／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．１４／ＣＤＲ／配列Ｎｏ．１５）
３つの望ましいＣＤＲをすべて含む脱グリコシル抗体においては、軽鎖可変部は下記の配列：
【００５７】
【化２５】
2006089501.tif 000017
【００５８】
（配列Ｎｏ．１６）
より成る。
可変部は、例えば上述のように１つ若しくは複数の好ましいＣＤＲを含むが、好ましくはヒト抗体由来の可変フレームワーク領域を有する人体に適応した形で、適切な定常部に結合している。
【００５９】
重鎖と軽鎖の定常部は、任意の異なるタイプの抗体（ＩｇＧ抗体であることを条件とする）に基づくことができる。しかし、それらは、ラットやマウスのものまたはそれらに由来のものでもよいが、ヒトのものまたはヒト由来のもののほうが望ましい。軽鎖の定常部はλ型のものが好ましく、重鎖の定常部はＩｇＧアイソタイプ、特に脱グリコシル化に適切に影響を与えるように修飾を受けたＩｇＧ１が望ましい。ＩｇＧアイソタイプのヒト定常部は全て、２９７番目のアスパラギンがグリコシル化されていることが知られており、該アスパラギンは、次のようなＮグリコシル化モチーフ：アスパラギン２９７  −Ｘ２９８  −セリン２９９  若しくはスレオニン２９９（Ｘはプロリン以外のどんな残基でもよい）：の一部を構成している。よって、本発明の抗体は、このような定常部中の２９７番目のアスパラギンをグリコシル化されない他のアミノ酸と置換することにより、脱グリコシル化される。アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基を利用できるが、アラニンが最も望ましい。
【００６０】
別法として、Ｎグリコシル化モチーフの他の残基のうち１つを変えることによって、２９７番目のアスパラギンのグリコシル化を防ぐことができる。例えば２９８番目の残基をプロリンと置換する、或いは、２９９番目の残基をセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸と置換することが考えられる。この部位特異的突然変異誘発を行うにあたっての方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば部位特異的突然変異誘発キット（例えばアマシャム社から市販されているもの）を利用して行うことができる。この方法については後にさらに例示する。
【００６１】
ＣＤＲの１つのアミノ酸を同様の性質を有する他のアミノ酸と置換させても、例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基と置換させた場合でも、置換を起こされたペプチドやタンパク質の性質や構造を実質的には変化させないであろうことは当該技術分野においてよく知られている。従って、本発明の脱グリコシル化抗体には、その内部においてＣＤＲの結合親和性や結合特異性を実質的に変化させることのない置換を起こさせた特定のアミノ酸配列を持つ望ましいＣＤＲを有する抗体も含まれる。また、活性を保持したまま、ＣＤＲのアミノ酸配列中に欠失を起こさせたり、Ｎ末端やＣ末端の一方、あるいは両方に配列を延長させたりすることも可能である。
【００６２】
本発明の好ましい脱グリコシル化抗体は、１０５／モル若しくはそれ以上、例えば１０１２／モルもの抗原に対する親和定数を有するものである。異なる親和力を持つリガンドは、異なった利用に適している。よって、例えば親和力が１０６、１０７  、１０８／モルやそれ以上で最適な場合もあるかもしれない。しかし、親和力１０６  〜１０８／モルの抗体が最適である場合が多い。
【００６３】
都合良くは、本抗体は他の抗原と強い結合親和力示すことがない。抗体の結合親和力および抗体特異性は後述の実施例の欄で記述されているような分析法（エフェクター細胞再標的分析法）、またはＥＬＩＳＡや他の免疫分析法で測定することができる。
【００６４】
本発明の抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を持つＹ字型の脱グリコシル化ＩｇＧ  ＣＤ３抗体であり得、従って、ＣＤ３抗原に対する親和力を持つ各抗原結合部位が２箇所あり得る。または、本発明は一方のアームのみがＣＤ３抗原に対する親和力を持つ抗体にも適用できる。そのような抗体は様々な形を取り得る。従って、抗体のもう片方のアームはＣＤ３以外の抗原に対する結合親和力をもち、このような抗体は、例えば米国特許第４，４７４，８９３号及び欧州特許出願第８７９０７１２３．１号と第８７９０７１２４．９号に記載されているように、２種の抗原に特異的な抗体（二価抗体）である。また、１つのアームのみが結合親和力を示す抗体もあり、そのような抗体は、”単価”（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）と言われる。
【００６５】
単価抗体（或いは、抗体断片）は様々の方法で調製することができる。ＧｌｅｎｎｉｅとＳｔｅｖｅｎｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２９５，７１２−７１３，（１９８２））は、酵素を用いた切断によって単価抗体を調製する方法を記載している。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎらは、酵素処理で生産されたＦａｂ’とＦｃ断片を化学的に架橋させて単価抗体を調製する第二の方法を記載している。（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３，２１９−２３０（１９８９））。これらの方法では、得られた単価抗体は片方のＦａｂ’アームを欠いている。第三の単価抗体調製法は、欧州特許出願第１３１４２４号に記載されている。この方法では、抗体のＹ字型は保持されるが、２つのＦａｂ’部のうち一方だけが抗原に結合する。この方法は、不適切な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマに導入するもので、その軽鎖は抗体の重鎖と結合して混合生成物が生成されるが、該混合生成物の１つとして単価抗体が得られる。
【００６６】
しかし、さらに好ましくは本発明の単価脱グリコシル化抗体は下記の方法で調製される。この方法では適切な発現系、例えば、後述するような細胞系に、重鎖と軽鎖をコードする遺伝子、および重鎖の可変部領域および第一定常部領域を欠いた欠損重鎖をコードする遺伝子（すなわちこれらの各部のエキソンを欠く遺伝子）を導入する。この結果、該細胞系の生成物として次のものが混在したものが得られる。
（ａ）完全に２価抗体である抗体；
（ｂ）２つの欠損重鎖（つまりＦｃ断片）のみから成る抗体断片；および
（ｃ）欠損重鎖と通常の重鎖に結合した軽鎖からなる、ＣＤ３抗原に対して単価な抗体断片。
上記（ｃ）の抗体断片は、Ｆａｂ’アームを１つだけ持つため、単価である。この方法によってこのような断片の形で単価抗体を生成することは、多くの理由から好ましい。すなわち、得られた抗体断片は、細胞系で生成された抗体混合物から精製することが容易である。なぜなら、例えば、分子量に基づいて簡単に分離できるからである。欧州特許出願第１３１４２４号の方法では生成された単価抗体は大きさや外見が２価抗体と似た性質を示すので、このような分離は不可能である。
【００６７】
また、新しい方法による単価抗体断片の生成では、より容易に調節可能な条件を用いるので、複雑な反応生成物の分離を要する酵素処理／化学的結合法ほど偶発的な方法ではない。さらなる利点は、使用する細胞系は単価抗体断片を生成し続けるため、酵素処理／化学的結合法のように合成操作を継続して行う必要がない点である。
【００６８】
本発明における脱グリコシル化抗体は自然界には存在せず、一般的にこの抗体は多数の方法で人工的に作ることができる。しかし、抗体に存在する重鎖と軽鎖の定常部と可変部の適切な遺伝子構築物を別々に得て、適した発現系に挿入するのが最も都合がよい。
【００６９】
望みの構造をしたリガンドの可変部をコードする遺伝子を生成し、部位特異的突然変異誘発を受けた抗体の定常部をコードする遺伝子と共有結合させる。これらの定常部遺伝子は、ハイブリドーマｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡより得られ、脱グリコシル化された定常部を生成するために（部位特異的な）突然変異誘発を受けている。可変部をコードする遺伝子は、本明細書中のＣＤＲの同定に使用された遺伝子合成技術により作ることもできる。ＤＮＡの適切なクローニングベクターとしては様々なタイプのものを使用できる。
【００７０】
機能するＣＤ３リガンドを生産するための、細胞系の培養におけるこれらの遺伝子の発現は、適切な原核細胞、または、真核細胞系、特にミエローマ細胞系のような不死化哺乳類細胞［例えば、ＹＢ２／３．０１／Ａｇ２０（いかＹ０と呼ぶ）ラットミエローマ細胞や、チャイニーズハムスター卵巣細胞（植物細胞の使用も興味深い）］を様々な抗体領域を含む発現ベクターを用いて形質転換し、形質転換した細胞系を培養して望みの抗体を生産させることによって、最も都合よく得ることができる。本発明のリガンドを製造するために使用されるこのような一般的技術は、遺伝子工学の非常に重要な分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓらによる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ“（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９（第２版））などの刊行物に記載されている。これらの技術については、本明細書中の実施例においてさらに詳述する。
【００７１】
従って、本発明は、抗体の発現に影響を与えるために、抗体を発現できる細胞を培養する工程からなるＣＤ３抗原に対する結合親和力を有する脱グリコシル化ＩｇＧ抗体の調製方法を含む。本発明は、本発明の脱グリコシル化抗体を発現可能な細胞系も含む。
【００７２】
そのような細胞系の中で望ましいのは、前述の望ましいＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含むものである。前述のＣＤＲ（ａ）〜（ｆ）をコードする塩基配列のグループは、以下にそれぞれ（ａ）〜（ｆ）で示されている。しかし、遺伝子コードの縮重により、コードされるＣＤＲのアミノ酸配列は変えることなく塩基配列のみが異なっている変異体も得られることは認識されるであろう。
（ａ）
【００７３】
【化２６】
2006089501.tif 000018
【００７４】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．１７），
（ｂ）
【００７５】
【化２７】
2006089501.tif 000019
【００７６】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．１８），
（ｃ）
【００７７】
【化２８】
2006089501.tif 000020
【００７８】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．１９），
（ｄ）
【００７９】
【化２９】
2006089501.tif 000021
【００８０】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．２０），
（ｅ）
【００８１】
【化３０】
2006089501.tif 000022
【００８２】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．２１），
（ｆ）
【００８３】
【化３１】
2006089501.tif 000023
【００８４】
（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２），
そのような細胞系は特に、次のような配列からなる長いＤＮＡ配列を有する：
（１）ヒト重鎖の可変フレームワーク領域および（ａ），（ｂ），（ｃ）のうちの１つまたは複数を発現するＤＮＡ；
（２）ヒト軽鎖の可変フレームワーク領域および（ｄ），（ｅ），（ｆ）のうちの１つまたは複数を発現するＤＮＡ。
【００８５】
その様なＤＮＡ配列の具体例としては、下記に示したような：
（１）前述のヒトＶＨIII型遺伝子ＶＨ２６．Ｄ．Ｊ．にコードされる重鎖フレームワーク領域中に配列された（ａ），（ｂ），（ｃ）をコードしている配列；および
（２）ヒトＶＬ  λ型遺伝子ＳＵＴにコードされる軽鎖フレームワーク領域中に配列された（ｄ），（ｅ），（ｆ）をコードしている配列；
がある。ＣＤＲ配列（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ），（ｅ），（ｆ）には下線が引いてある。
（１）（配列ＩＤ  Ｎｏ．２３）
【００８６】
【化３２】
2006089501.tif 000024
【００８７】
（２）（配列ＩＤ  Ｎｏ．２４）
【００８８】
【化３３】
2006089501.tif 000025
【００８９】
もちろん、細胞系は重鎖と軽鎖の定常部を発現するＤＮＡ配列をも含んでいる。
本発明の、人体に適応させた脱グリコシル化抗体は治療用に用いることができる。特に、人体に適応し、且つヒトＣＤ３抗原に特異性を持つような脱グリコシル化抗体は、免疫抑制のために適用できるという価値がある。特に、免疫抑制が持続性ではなく一過性のものであることが望まれ、従って、Ｔ細胞を完全に破壊するのではなくＣＤ３抗原−ＴＣＲ複合体による抗体防御によって機能させないようにすることが強く望まれる移植拒絶反応の場合の免疫抑制のために有用である。さらに、脱グリコシル化Ｃ３抗体は、治療剤の有効性がエフェクタ−細胞のＦｃを介した死またはＦｃ受容体発現細胞の非特異的な死のそれぞれによって低下する可能性がある癌の治療において、特に（エフェクタ−細胞の再標的のための）２価抗体を作成したり、抗体−毒素結合体を生成したりするといったように、他の分野においても利用できる可能性を秘めている。
【００９０】
さらなる観点として、本発明は、癌患者、特に白血病患者を治療するための方法、または、例えば、移植拒絶反応が起こった場合に本発明の脱グリコシル化抗体を治療に有効な量だけ投与するといったような、免疫抑制のための方法を含む。
【００９１】
本発明の脱グリコシル化抗体は、生理学的に許容できる希釈剤または担体と共に患者に投与することによって処方することもできる。本発明の抗体を、無菌で発熱原を含まない希釈剤または担体と共に、注射によって投与するのが望ましい。処方の目安としては、抗体の適切な量を、例えば１０日間にわたって毎日約１〜１０ｍｇを投与するのが望ましい。しかし、最初の用量に対する反応が低下したら、個々の患者の必要に応じて、より多量の抗体、例えば毎日１００ｍｇずつの抗体を投与することも可能である。家畜の場合は、同様にｇ／ｋｇの単位で投与する。
【００９２】
［実施例］
本発明は、下記の実施例、および、以下に列記する実施例の解説図によって説明される。
【実施例１】
【００９３】
実施例１：ヒト可変フレームワーク領域に、ＹＴＨ１２．５ラット抗体由来のＣＤＲを含んだヒトＣＤ３抗原に特異的な脱グリコシル化抗体の調製
ヒトＣＤ３抗原に特異的なＹＴＨ１２．５ラット抗体のＶ領域遺伝子のクローニングと再編成は、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，２７１７及び英国特許出願第９１２１１２６．８号とその対応出願に記載されている。ＹＴＨ１２．５は、ＣＤ３抗原複合体に特異的なＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を分泌している、ラットハイブリドーマ細胞系である。
【００９４】
簡単には、Ｏｒｌａｎｄｉら．，１９８９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８６，３８３３  の複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる方法に基づいて行った。ＶＨ  遺伝子（重鎖可変部遺伝子）は、オリゴヌクレオチドプライマーＶＨ１ＦＯＲとＶＨ１ＢＡＣＫを用いて単離した。ＰＣＲ産物を、ベクター、Ｍ１３−ＶＨＰＣＲ１に挿入し、このベクターに６オリゴヌクレオチドプライマーを用いて部位特異的突然変異誘発を起こした。ＶＨ  遺伝子（軽鎖可変部遺伝子）は、公知のＶＬ  λ塩基配列に基づいてデザインされたプライマーを用いて単離した。遺伝子を、Ｍ１３−ＶＫＰＣＲに、ヒトλ軽鎖定常部遺伝子と共に、挿入した。このベクターにおいて、５オリゴヌクレオチドを用い、ＶＬ  フレームワーク領域の突然変異誘発を行っ
た。人体に適応させたＶＬ  遺伝子を発現ベクターｐＨβＡｐｒ−１に挿入した。
【００９５】
再編成されたＣＤ３ＶＨ３遺伝子が種々の異なる免疫グロブリンＨ鎖の定常部遺伝子と共に発現されるように、ベクター（ｐ３１６）を作成した。このベクターはｐＨβＡｐｒ−ｇｐｔベクター（Ｇｕｎｎｉｎｇら．，１９８７，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８５，７７１９−７７２３）に基づいている。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｔ）遺伝子およびＳＶ４０の発現シグナル（Ｐａｇｅ＆Ｓｙｄｅｎｈａｍ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４）をもつＤＮＡの１．６５Ｋｂ断片を、ｐＨβＡｐｒ−ｇｐｔのユニークなＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。次ぎに、再編成されたＣＤ３−ＶＨ遺伝子をコードする７００ｂｐのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を、ベクターのβアクチンプロモーターの下流で制御を受けているマルチクローニングサイトに挿入した。任意のＨ鎖定常部遺伝子を（ゲノムの配置と一致するように）ＣＤ３−ＶＨ遺伝子の下流のユニークなＢａｍＨＩ部位に挿入した。
【００９６】
脱グリコシル化ヒトＩｇＧ定常部は、後述するようにＴａｋａｈａｓｈｉら（１９８２，Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９）により記載されている、野性型Ｇｌｍ（１，１７）遺伝子に由来している。この遺伝子をベクター、Ｍ１３  ｔｇ１３１にクローン化し、このベクターの２９７番目のアミノ酸残基をアスパラギンからアラニンへ変えるため、部位特異的突然変異誘発（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣ）を行った。
【００９７】
アスパラギン２９７のオリゴ糖鎖は、正常なヒトＩｇＧ抗体（Ｋａｂａｔら．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）の全てに特徴的なものであり、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のそれぞれが、アスパラギン残基のアミド基に結合した１箇所枝分かれした炭水化物基を有する（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｗｅｋ，１９８４，Ｐｒｏｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，９５−１１２）。アスパラギンをアラニンに置換すると、抗体のグリコシル化が防止される。
【００９８】
２．３Ｋｂの脱グリコシル化ＩｇＧ定常部を、ＢａｍＨＩとＢｇｌIIの二重制限酵素処理でＭ１３から切り出してｐ３１６ベクターのＢａｍＨＩ部位へ挿入し、クロ−ンｐ３２３を作成した。
【００９９】
ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の準集密的（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞単層を、重鎖遺伝子を含むｐ３２３ベクターと、再編成されたヒトλ軽鎖（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，２７１７−２７２５）を含むｐ２７４ベクターとで同時にトランスフェクションした。トランスフェクションの前に、両プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで線状（ｌｉｎｅａｒ）にした。トランスフェクションはＤＯＴＭＡ試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，ドイツ）を用い、使用説明書に従って行った。
【０１００】
重鎖と軽鎖を含む形質転換体は、５％（ｖ／ｖ）透析ずみのウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含み、キサンチン／ヒポキサンチンを含まないＩＭＤＭで選択された。
野性型ヒトＩｇＧ−ＣＤ３重鎖ベクター、ｐ２７８の類似体の作成方法は、種々の文献に記載されている（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，２７１７−２７２５）。ヒトＩｇＧ２（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ３００，７０９−７１３）、ＩｇＧ３（Ｈｕｃｋら．，１９８６，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１４、１７７９−１７８９）、ＩｇＧ４（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ３００，７０９−７１３），イプシロン（ε）（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ，１９８２，ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  １，６５５−６６０）およびα−２（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ３００，７０９−７１３）の定常部遺伝子の非変異体を有するＨ鎖発現ベクターは、ｐ３１６ベクターから作成した（各々、ベクターｐ３１７，ｐ３１８，ｐ３２０，ｐ３２１，ｐ３２５）。軽鎖ベクターｐ２７４と結合したこれらベクターを、前述のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞へ導入することにより、各々γ１、γ２、γ３、γ４、εおよびα−２のアイソタイプに対するＣＤ３抗体を分泌する細胞系が作成された。ＣＤ３抗体を発現している細胞を用いて軟寒天中で２回クローニングを行い、その後回転式ボトル培養装置で大量培養を行った。各々の細胞系の約４リットルの組織培養上清から、免疫グロブリンを硫酸アンモニウム沈殿法によって採集し、ＰＢＳ中で透析を行い、次の方法で定量した。
【０１０１】
抗体の純度が高くないので、競合アッセイはＣＤ３抗原への結合能力をもつ抗体の濃度を、特異的に定量することで行われた。ヒトＴ細胞未分化細胞を、ＵＣＴＨ−１ラベルされたＦＩＴＣ、すなわち、キメラパネルとしてＣＤ３抗原の同じエピトープにして結合する抗体と共に、インキュベートした。使用するＦＩＴＣ試薬の濃度は、半飽和状態になるようあらかじめ定められた。ラベルされていないＹＴＨ１２．５（ＨＰＬＣ精製）について、既知の出発濃度から滴定を行い、Ｔ細胞とＵＣＴＨ−１を含んでいるウェルに加えた。未標識抗体は、抗原結合部位への競合体として機能する。これは、ＦＡＣＳ分析を用いて細胞を分析する際に、平均の蛍光量が減少することによって検出された。よって、未知の出発濃度からのキメラ抗体の滴定を行い、平均蛍光を抗体の希釈に対してプロットすることで、シグモイド型曲線が得られた。これらは、ＹＴＨ１２．５の標準カ−ブと直接比較可能である。
【実施例２】
【０１０２】
実施例２：増殖分析
ＣＤ３抗体が溶液中のＴ細胞の増殖を支持する能力は、抗体のＦｃ領域と補助細胞上のＦｃ受容体との相互作用に関係している。
【０１０３】
実施例１に示されたように調製された脱グリコシル化キメラＣＤ３抗体を、可変部構造は同一であるがＨ鎖定常部（実施例１参照）は異なる他の一群のキメラ抗体と、ヒト末梢血液リンパ球の増殖促進力について比較した。健康な提供者の血液から得られたリンパ球を、リンホパーク勾配で分離、洗浄し、熱失活させたヒトＡＢ血清を５％（ｖ／ｖ）含むＩＭＤＭに再懸濁し、ＣＤ３抗体の溶液をウェル中に含むプレ−トに５×１０４  〜１×１０５  細胞／ウェルになるよう播種した。培養３日後、細胞をトリチウムを含んだチミジンでパルスラベルし、６時間後に採集し、細胞の３  Ｈ取り込みレベルを、シンチレーションカウンターで測定した。滴定された抗体に対する増殖反応を４人の血液提供者について調べた。５人目の提供者については、増殖反応は１μｇについてのみ調べた。その結果は、図１〜８に示されている。
【０１０４】
試験を行った提供者については、“野性型“の抗体は全てＴ細胞増殖を引き起こした。だが、変異型の脱グリコシル化ＩｇＧ１アイソタイプは増殖促進作用を持たず、このことは炭水化物側鎖が重要な役割果たしていることを意味する。
【０１０５】
別の実験では、溶液中ＣＤ３モノクロ−ナル抗体のパネルがＴ細胞増殖を促進する能力が、様々な人種の１０人の提供者から得られたリンパ球を用いて調べられた。自然発生的アイソタイプはすべて、５％ヒトＡＢ血清存在下で増殖を引き起こしたが、抗体により起こされた反応の程度は、Ｔ細胞の提供者によって異なった。一般的に、γ１、εモノクローナル抗体は増殖促進活性が最も高く、最も低濃度で細胞分化を起こし、γ３とγ２はこれらよりも活性が低い。γ１モノクローナル抗体の脱グリコシル化誘導体は、テストされたどの提供者においてもＴ細胞増殖を誘導せず、コントロールとして用いた非活性化性のモノクローナル抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈと同様の反応を起こす、唯一のＣＤ３抗体であった。α２とεの調製品においてみられた増殖を起こす原因が内毒素の混入である可能性を除くため、過剰量の脱グリコシル化ＣＤ３  ｍＡｂを加えると増殖を抑制できることを確認したが、このことは活性化の過程にＣＤ３抗原が関与していることを意味する。
【０１０６】
脱グリコシル化γ１ＣＤ３モノクローナル抗体に見られるような増殖促進活性の完全な欠失は、ＥＣＲ活性レベル（後述の実施例５を参照）における順位を考慮すると驚くべきものである。この不活性化の原因は、おそらく、脱グリコシル化により増殖に必要な結合後の事象を誘導する能力を（例えば、モノクローナル抗体の２つ目の認識部位の破壊等によって）失ったことよりもむしろ、ＦｃＲに対する親和力が減少したことにある。このことは、ＩｇＧのない培地中でアッセイを行った場合、脱グリコシル化γ１  ｍＡｂはかなりの程度まで増殖を促進する、というような観察結果からも支持される。おそらく、Ｔ細胞と補助細胞との接触回数若しくは相互作用の強度には、増殖の開始前に越えていなければならない最小閾値があり、競合する免疫グロブリンが十分なレベルで存在する場合、脱グリコシル化γ１ｍＡｂによってはこの閾値を越えられないのであろう。
【実施例３】
【０１０７】
実施例３：混合リンパ球反応におけるキメラＣＤ３抗体の影響
実施例１の脱グリコシル化ＩｇＧ１Ａｇ抗体が、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞増殖を抑制する能力があるかを調べるための一連の実験を行った。２つの実験の結果を図９乃至図１２に示してある。
【０１０８】
末梢血管リンパ球を２人の提供者から単離した。刺激細胞をセシウム照射した。照射された刺激細胞を加える前に、反応細胞集団を滴定された抗体と共に３０分インキュベ−トした（図９、１０、１１）。反応細胞のコントロールウェルについても、各抗体条件の照射された反応細胞と共にインキュベートし、抗体の反応細胞に対する特異的な影響を調べた（図９、１０、１１）。
【０１０９】
５日間インキュベーションした後、ウェルをトリチウムを含んだチミジンでパルスラベルし、６時間後に採集した。
脱グリコシル化抗体は確かに混合リンパ球反応を抑制する；抗体が滴定（希釈）されていくに従い、抑制効果が低下し、増殖が促進される。´野性型´ＩｇＧ１は実際Ｔ細胞の分裂促進活性を有するので、この反応においては、ＭＣＲの抑制は全く観察されない。
【０１１０】
ネズミＣＤ８抗原に特異的な´不適切な´脱グリコシル化抗体をネガティブコントロールとして使用した。この抗体は、予想通り、ＭＣＲにおいて何の影響も及ぼさなかった。
【実施例４】
【０１１１】
実施例４：ＩｇＧ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果
実施例１の脱グリコシル化抗体（ＩｇＧ１Ａｇ）を含むヒトＣＤ３εサブユニットを遺伝子導入したマウスにおいて、キメラ抗ヒトＣＤ３抗体を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を行った。注射を一回行った後に、キメラＣＤ３抗体がＴＮＦ因子放出を引き起こす能力を比較した。
【０１１２】
この一連の実験で、注射前、関連したＣＤ３抗体の１０μｇ静脈注射後９０分、４時間、の各時間にマウスから血清を採集した。５匹のマウスを１グループとし、各々のグループから血清を集め、プ−ルした。血清中のＴＮＦレベルの分析が、Ｊｅａｎ−Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｂａｃｈ教授の研究室で行われた。そこでは、Ｌ９２９マウス繊維芽細胞での血清に対する、ＴＮＦ存在による細胞毒性の影響を測定するバオイオアッセイが用いられた。
【０１１３】
結果は、下の表に示されている。
【０１１４】
【表１】
2006089501.tif 000026
【０１１５】
２種類のヒトＩｇＧ１の注射において、ＴＮＦレベルに有意な相違が観察される。脱グリコシル化型は、野性型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体よりも、ＴＮＦ放出が少なくとも８倍低い。
【０１１６】
実施例２−４の結果は、脱グリコシル化ＣＤ３抗体は溶液中のＴ細胞に対する増殖促進因子ではないことを示しており、このことは、抗体の補助細胞のＦｃ受容体と相互作用する能力が減少していることを示唆している。該抗体は、ＣＤ３抗体に特徴的な免疫抑制作用は保持している。ｉｎ ｖｉｖｏでは、脱グリコシル化抗体がヒトＣＤ３トランスジェニックマウスにおいて誘導する腫瘍破壊因子（ＴＮＦ）の放出量は、元のＩｇＧ抗体の場合と比較して著しく少なかった。従って、もしマウスで観察されたようにヒトでもＴＮＦ放出量の減少が起こるならば、この薬剤は免疫抑制のための´改良型´ＣＤ３抗体として使用できるかもしれない。
【実施例５】
【０１１７】
実施例５：Ｔ細胞傷殺力を有するＣＤ３抗体を検出するためのエフェクタ−細胞再標的分析（ＥＣＲ）
この実験は、文献（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら．，１９８８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，４４１９）の記載に従って行い、「活性化Ｔ細胞をＦｃγＲを産生している標的細胞にクロスリンクさせ、標的細胞の溶解を媒介する能力」がＣＤ３モノクローナル抗体にあるかを測定した。簡単に述べると、Ｆｃγ受容体Ｉ、IIおよびIIIを発現しているヒト単核細胞Ｕ９３７を５１Ｃｒクロム酸ナトリウム塩でラベルし、２×１０５  細胞／ｍｌになるように再懸濁した。これらの細胞を標的として用いた。ヒト末梢血液リンパ球を増殖促進ＣＤ３抗体によって活性化し続いてＩＬ−２を含む培地で培養することによって生産したヒトＴ細胞未分化細胞をエフェクタ−細胞として用いた。分析を行う前に、それらを洗浄し、２×１０５  細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。精製キメラ抗体の調製液１００μｌをマイクロタイタープレートのウェル中で３倍希釈とした。エフェクター細胞および標的細胞を５０μｌずつ各々のウェルに加え、その混合物を３７℃で４時間以上インキュベートした。この後１００μｌの上清を除去し、放出された５１Ｃｒを測定した。各抗体の希釈液について二回ずつ実験を行った。
【０１１８】
単核細胞系Ｕ９３７はヒトＦｃ受容体を発現し、Ｕ９３７とＴ細胞未分化細胞とをクロスリンクできるＣＤ３モノクローナル抗体存在下で、活性化ヒトＴ細胞未分化細胞によって溶解される。実施例１のヒトＩｇ１Ｇ１抗体は脱グリコシル化した場合でも、少ないレベルではあるが、まだＴ細胞をＵ９３７細胞にクロスリンクさせ、Ｔ細胞の細胞毒性を再向させることができることが、実験結果（図１３、１４）によって示された。既知の公表デ−タから考えて、脱グリコシル化γ１モノクローナル抗体に媒介された効果的な殺傷現象は予想外であり、この結果は驚くべき発見であった。
【０１１９】
炭水化物を除去することによって、このモノクローナル抗体は粘着性が特に増し、ＦｃγＲと相互作用せずにＵ９３７細胞と結合可能となったという可能性も考えられた。しかし、その後、脱グリコシル化γ１モノクローナル抗体がマウスＬ細胞標的（ヒトＦｃγＲＩを発現しているマウス細胞系）の破壊を媒介するか否かはトランスフェクトされたヒトＦｃγＲＩ遺伝子の発現に依存していることが示され（結果は示していない）、このモノクローナル抗体はＦｃγＲへの結合活性を有することが確認された。我々は、Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用を検出するのにＥＣＲ分析は特に感度の高い方法であると結論する。
【０１２０】
ＥＣＲの結果より、ＩｇＧキメラ抗体の結合力の強さはγ２＜γ３＜Ａｇγ１＜γ４＜γ１の順であることが示された。もし、抗体の増殖促進活性をＦｃ受容体結合力から推定できるとすれば、Ｔ細胞増殖分析において上述の結合力順位付けが示されることを期待するであろう。しかし、この仮定は正しくない。すなわち、Ｔ細胞増殖実験（実施例１−３）における活性の順は、Ａｇγ１＜γ２＜γ４＜γ３＜γ１であった。このことは、Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用の測定結果から抗体の増殖促進性を単純に予想することはできないことを示している。ＥＣＲアッセイではあまり活性を示さなかったが、一定して高い増殖促進活性を示したεキメラ抗体の挙動からも、この見解が支持される。これにより、（Ｕ９３７細胞の例で示されたように）抗体は補助細胞上のＦｃγ受容体以外の何かと結合することによってＴ細胞を活性化しうる可能性が出てきた。つまり、Ｆｃγ受容体へ結合することができないからといって、抗体が分裂促進活性を有しないとは限らないのである。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図２】図２は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図３】図３は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図４】図４は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図５】図５は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図６】図６は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図７】図７は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図８】図８は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロ−ルとして含まれている。
【図９】図９は、脱グリコシル化ＣＤ３抗体とグリコシル化ＣＤ３抗体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスＣＤ８抗原に特異的な脱グリコシル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。
【図１０】図１０は、脱グリコシル化ＣＤ３抗体とグリコシル化ＣＤ３抗体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスＣＤ８抗原に特異的な脱グリコシル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。
【図１１】図１１は、脱グリコシル化ＣＤ３抗体とグリコシル化ＣＤ３抗体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスＣＤ８抗原に特異的な脱グリコシル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。
【図１２】図１２は、脱グリコシル化ＣＤ３抗体とグリコシル化ＣＤ３抗体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスＣＤ８抗原に特異的な脱グリコシル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。
【図１３】図１３は、グリコシル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体と脱グリコシル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体の，エフェクター細胞再標的分析を比較した結果を示してある。ＣＤｗ５２抗体の結果が、ネガティブコントロールとして含まれている。
【図１４】図１４は、グリコシル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体と脱グリコシル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体の，エフェクター細胞再標的分析を比較した結果を示してある。ＣＤｗ５２抗体の結果が、ネガティブコントロールとして含まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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