(57)【要約】  【課題】  試料液が流動可能な流路を備えた測定ユニットを用いた測定装置において、測定精度を向上させる。  【解決手段】  流路中に１つの検出領域Ａに対して複数の参照領域Ｒを設け、複数の参照領域Ｒにおける測定値を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として用い、検出領域Ａにおける測定値をリファレンス法により校正する。【選択図】          図８
2006258636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平滑な一面に薄膜層が形成された誘電体ブロックと、試料液を注入する注入口から該試料液を排出する排出口に至る、前記薄膜層に沿って試料液を流動可能とする流路とを用い、
前記流路内の、前記薄膜層の所定領域と前記誘電体ブロックとの界面に該界面で全反射する角度で光ビームを入射させ、該界面で全反射した光ビームの強度を検出し、
該光検出手段の検出結果に基づいて、前記薄膜層上の測定対象物の屈折率情報を求める測定方法において、
前記流路内の、前記薄膜層の前記所定領域の近傍に設けられた２以上の参照領域と前記誘電体ブロックとの参照用界面にそれぞれ参照用の光ビームを入射させ、該参照用界面で全反射した光ビームの強度を検出し、
前記２以上の領域の参照用界面についての検出結果を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として前記光検出手段の検出結果を校正し、前記屈折率情報を求めるものであることを特徴とする測定方法。
【請求項２】
平滑な一面に薄膜層が形成された誘電体ブロックと、
試料液を注入する注入口から該試料液を排出する排出口に至る、前記薄膜層に沿って試料液を流動可能とする流路と、
前記流路内の、前記薄膜層の所定領域と前記誘電体ブロックとの界面に該界面で全反射する角度で光ビームを入射させ、前記該界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて、前記薄膜層上の測定対象物の屈折率情報を求める屈折率情報取得手段とを備えた測定装置において、
前記流路内の、前記薄膜層の前記所定領域の近傍に設けられた２以上の参照領域と前記誘電体ブロックとの参照用界面にそれぞれ参照用の光ビームを入射させ、該参照用界面で全反射した光ビームの強度を検出する参照用光検出手段を備え、
前記屈折率情報取得手段が、前記参照用検出手段による前記２以上の領域の参照用界面についての検出結果を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として前記光検出手段の検出結果を校正し、前記屈折率情報を求めるものであることを特徴とする測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料等の測定対象物に接した薄膜層と誘電体ブロックとの界面で光ビームを全反射させてエバネッセント波を発生させ、それにより全反射した光ビームのプロファイルに表れる変化を測定して試料の分析を行う測定方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている。金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。表面プラズモンセンサーは、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料の特性を分析するものであり、種々のタイプのセンサーが提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサーによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサーによって検出することができる。
【０００５】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００６】
この光強度の低下が生じる全反射角以上の特定入射角θＳＰ（以後全反射減衰角θＳＰと記載）より表面プラズモンの波数が解ると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【数１】
2006258636.tif 000003
【０００７】
試料の誘電率εｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料の屈折率等が分かるので、結局、全反射減衰角θＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００８】
また、エバネッセント波を利用した類似のセンサーとして、漏洩モードセンサーも知られている（例えば非特許文献１参照）。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００９】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰角θＳＰを知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１０】
また、上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のリガンドに結合するアナライトを見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にリガンドを固定し、該リガンド上に種々のアナライトを含有するバッファー（液体試料）を供給し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θＳＰを測定している。バッファー中のアナライトが、リガンドと結合するものであれば、この結合によりリガンドの屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θＳＰを測定し、全反射減衰角θＳＰに変化が生じているか否か測定することにより、アナライトとリガンドの結合が行われているか否か、すなわちアナライトがリガンドと結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このようなアナライトとリガンドとの組み合わせとしては、例えば抗原と抗体あるいは抗体と抗体が挙げられ、そのようなものに関する具体的な測定としては、一例として、リガンドをウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とし、アナライトであるヒトＩｇＧ抗体との結合の有無検出とその定量分析を行う測定が挙げられる。
【００１１】
なお、バッファー中のアナライトとリガンドの結合状態を測定するためには、必ずしも全反射減衰角θＳＰの角度そのものを検出する必要はない。例えば最初にアナライトを含まないバッファーを用いて基準となるベースラインを測定した後、リガンド上にアナライトが含まれたバッファーを供給した際の全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。
【００１２】
上記のような表面プラズモンセンサー等の測定装置においては、バッファーによるバルク効果や、リガンドおよびバッファーの温度変化や、光源変動等の外乱による測定結果の誤差をなくすため、リファレンス法と呼ばれる方法を用いて測定精度を向上させる方法が用いられている。
【００１３】
このリファレンス法は、例えば、リガンドとアナライトの結合状態について測定を行う場合に、薄膜層上にリガンドを固定した検出系、および薄膜層上にリガンドを固定していない参照系の２つの系を用意し、例えば、検出系での測定結果から参照系の測定結果を引く等、参照系の測定結果に基づいて検出系の測定結果を校正することによって、上記のような外乱の影響を除外することができるものである。
【００１４】
また、上記のような表面プラズモンセンサー等の測定装置においては、リガンドが固定された薄膜層上に流路機構を用いてバッファーを連続的に供給して測定を行うものが知られている。この形態のセンサーを用いれば、リガンドとアナライトとの結合状態を測定する際に、常に新しいバッファーが薄膜層上に供給されるため、バッファー中の被検体の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。
【００１５】
このような流路機構を備えた測定装置において、流路中に１つの検出系に対して１つの参照系を備えて既述のリファレンス法による校正を行って測定値を得る方法がBIACORE社により提案されている（非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平6−167443号公報
【特許文献２】特開2000−065731号公報
【非特許文献１】「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）
【非特許文献２】Biacore Symposium Japan 2002 Workshop 2 "Introduction of Biacore S51"
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、この流路機構を備えた測定装置において、流路内に参照系と検出系とを１つずつ設けてリファレンス法による校正を行う場合、流路サイズ（幅、高さ、断面積など）や流路内壁の表面粗さ等により、参照系と検出系との間で、流速、温度、濃度などの各種パラメータに位置ムラが生じるために測定誤差が生じることが本発明者の研究により明らかになった。具体的には、流速は流路入口側で早く、出口側で遅い、また、濃度は入口側で高く出口側で低い、さらに温度は流路全体に亘ってムラがあることなどが明らかになった。
【００１７】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、測定誤差を抑制し精度良く測定を行うことができる測定装置および測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の測定方法は、平滑な一面に薄膜層が形成された誘電体ブロックと、試料液を注入する注入口から該試料液を排出する排出口に至る、前記薄膜層に沿って試料液を流動可能とする流路とを用い、
前記流路内の、前記薄膜層の所定領域と前記誘電体ブロックとの界面に該界面で全反射する角度で光ビームを入射させ、該界面で全反射した光ビームの強度を検出し、
該光検出手段の検出結果に基づいて、前記薄膜層上の測定対象物の屈折率情報を求める測定方法において、
前記流路内の、前記薄膜層の前記所定領域の近傍に設けられた２以上の参照領域と前記誘電体ブロックとの参照用界面にそれぞれ参照用の光ビームを入射させ、該参照用界面で全反射した光ビームの強度を検出し、
前記２以上の領域の参照用界面についての検出結果を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として前記光検出手段の検出結果を校正し、前記屈折率情報を求めるものであることを特徴とするものである。
【００１９】
本発明の測定装置は、平滑な一面に薄膜層が形成された誘電体ブロックと、
試料液を注入する注入口から該試料液を排出する排出口に至る、前記薄膜層に沿って試料液を流動可能とする流路と、
前記流路内の、前記薄膜層の所定領域と前記誘電体ブロックとの界面に該界面で全反射する角度で光ビームを入射させ、前記該界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて、前記薄膜層上の測定対象物の屈折率情報を求める屈折率情報取得手段とを備えた測定装置において、
前記流路内の、前記薄膜層の前記所定領域の近傍に設けられた２以上の参照領域と前記誘電体ブロックとの参照用界面にそれぞれ参照用の光ビームを入射させ、該参照用界面で全反射した光ビームの強度を検出する参照用光検出手段を備え、
前記屈折率情報取得手段が、前記参照用検出手段による前記２以上の領域の参照用界面についての検出結果を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として前記光検出手段の検出結果を校正し、前記屈折率情報を求めるものであることを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の測定方法および測定装置においては、参照領域を、前記所定領域の前記流路の上流と下流および／または左右などに配置することができる。
【００２１】
本発明の測定装置は、薄膜層を、金属膜からなるものとし、前述の表面プラズモン共鳴による効果を利用して測定を行う、所謂表面プラズモンセンサーとして構成されたものとすることができる。また、薄膜層を、誘電体ブロックの前記一面に形成されたクラッド層とクラッド層上に形成された光導波層からなるものとし、光導波層における導波モードの励起による効果を利用して測定を行う、所謂漏洩モードセンサーとして構成されたものとすることができる。
【００２２】
また、薄膜層上の状態の測定方法は、誘電体ブロックと薄膜層との界面に対して種々の入射角度で入射させた光ビームの該界面での反射光を検出して、全反射減衰角もしくはその角度変化を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよいし、また、D.V.Noort,K.johansen,C.-F.Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の測定方法および測定装置によれば、１つの所定領域に対して該所定領域の近傍に設けられた２以上の参照領域を設定し、該２以上の参照領域の検出結果を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として校正に用いるので、参照領域が１箇所のみであった従来と比較して、参照領域と所定領域との濃度差などによる誤差を軽減し、より精度良く測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。本発明の第１の実施の形態の測定装置は、測定ユニットの複数の測定部に光ビームを並列的に入射させることにより複数の試料の分析を同時に行うことが可能な表面プラズモンセンサーであり、図１は本実施の形態の表面プラズモンセンサーの概略構成を示す平面図、図２はこの表面プラズモンセンサーの測定系の平面図、図３はこの表面プラズモンセンサーの測定系の側面図、図４〜図７は測定ユニットの詳細を説明するための図、図８は図２中のVIII−VIII線断面図である。
【００２５】
この表面プラズモンセンサー１は、図１に示すように、測定ユニット10に設けられた複数の測定部毎に光ビームを並列的に入射させることにより複数の試料の分析を同時に行うことが可能な表面プラズモンセンサーであり、同様の構成の複数の表面プラズモン測定系１Ａ、１Ｂ…により構成されている。各測定系の構成について、個別の要素を表す符号であるＡ、Ｂ…の符号は省略して説明する。
【００２６】
図２、図３および図８に示すように、各測定系は、１本の光ビーム13を発生させる半導体レーザ等からなる光源14（以下、レーザ光源14という）と、上記光ビーム13を測定ユニット10に通し、流路60（測定部63）の下の誘電体ブロック50と金属膜55との３箇所の界面40、41および42に対して、種々の入射角が得られるように並列的に入射させる光学系15と、上記界面40、41および42で全反射した光ビーム13を各々平行光化する３つのコリメーターレンズ16と、この平行光化された光ビーム13を各々検出する３つのフォトダイオードアレイ17と、３つのフォトダイオードアレイ17に接続された差動アンプアレイ18と、ドライバ19と、コンピュータシステム等からなる信号処理部20と、この信号処理部20に接続された表示部21とを備えている。なお、信号処理部20は、後述する補正動作の際に使用される補正手段を内蔵するものである。
【００２７】
まず、測定ユニット10について説明する。図４は測定ユニット10の斜視図、図５は上記測定ユニットの分解斜視図、図６は上記測定ユニットの上面図、図７は図６中のVII−VII線断面図である。
【００２８】
測定ユニット10は、光ビームに対して透明であり、平滑な上面50ａに薄膜層としての金属膜55が形成された誘電体ブロック50と、この誘電体ブロック50の金属膜55上に密接される流路部材（試料供給機構）51と、誘電体ブロック50と係合して、流路部材51を誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持する保持部材52とから構成される。
【００２９】
誘電体ブロック50は、例えば透明樹脂等からなるものであり、長手方向に直交する断面が上底よりも下底の方が短い台形状の本体を有し、この本体の長手方向の両端部に上面（もしくは下面）方向から見たときの幅が本体よりも薄く形成された保持部50ｂが形成されたもので、後述の測定装置の光源から出射された光ビームを誘電体ブロック50と金属膜55との界面に入射させるとともに、この界面で全反射した光ビームを測定装置の光検出手段に向けて出射させるプリズム部が一体的に形成されたものである。本体の長手方向の両側面には後述の保持部材52に形成された係合孔52ｃに係合させるための係合凸部50ｃと側面が垂直に形成された垂直凸部50ｄとが両側面で各々互いに対向するように形成されており、底面には長手方向に平行に延びる摺動溝50ｅが形成されている。
【００３０】
流路部材51は、入口61から測定部63に至る供給路62、および測定部63から出口65に至る排出路64から構成される流路60が、流路部材51の長手方向に渡って複数形成されており、この複数の流路60は直線状に配置されている。
【００３１】
図７に示すように、流路部材51の下部部分には、供給路62の出口と排出路64の入口が開口され、また流路部材51の下面に位置する金属膜55の表面と接する領域に、この供給路62の出口と排出路64の入口を囲むシール部51ａが形成されており、このシール部51ａの内側が測定部63となる。このため、流路部材51を誘電体ブロック50の金属膜55上に密接させた場合に、このシール部51ａ内の測定部63が流路として機能するようになる。なお、シール部51ａは、流路部材51の上部部分と一体形成されたものであってもよいし、上部部分とは異なる素材により形成され、後付されたものであってもよく、例えばＯリング等を流路部材51の下部部分に取り付けたものであってもよい。
【００３２】
本発明の測定ユニットを使用する表面プラズモンセンサー等の測定装置では、蛋白質を含む液体試料が使用されることが想定されるが、流路60内で液体試料中の蛋白質が固着してしまうと測定を正確に行うことが困難となってしまうため、流路部材51の材料としては蛋白質に対する非特異吸着性を有しないことが好ましく、具体的にはシリコン、ポリプロピレン等を用いるとよい。また、流路部材51をこのような弾性材料からなるものとすることにより、流路部材51を金属膜55上に確実に密接させることができるため、接触面からの液体試料の液漏れを防止することができる。
【００３３】
保持部材52は、ポリプロピレン等の弾性材料からなり、長手方向と直交する方向の断面が略冂字形状をしており、保持部材52の上板（保持板部）の流路部材51の入口61および出口65と対向する位置には流路部材51に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔52ａが形成されており、保持部材52の上面の各ピペット挿入孔52ａの中間、および両端のピペット挿入孔52ａのさらに外側には位置決め用のボス52ｂが形成されている。
【００３４】
また、この保持部材52の上面には、蒸発防止部材54が両面テープ（接着部材）53により貼付されている。図５に示すように、両面テープ53のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはピペット挿入用の孔53ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔53ｂが形成されており、同様に、蒸発防止部材54のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはスリット54ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔54ｂが形成されており、ボス52ｂに両面テープ53の孔53ｂおよび蒸発防止部材54の孔54ｂを挿通した状態で、蒸発防止部材54を保持部材52の上面に貼付することにより、蒸発防止部材54のスリット54ａと流路部材51の入口61および出口65とが対向するように構成される。この蒸発防止部材54は、スリット54ａからピペットを挿入できるように弾性を有する材料である必要があり、具体的にはシリコンまたはポリプロピレン等を用いるとよい。なお、上記の保持部材52と蒸発防止部材54とは一体的に形成してもよく、これに加えてさらに流路部材51も一体的に形成してもよい。
【００３５】
さらに、保持部材52の長手方向側板には、誘電体ブロック50に形成された係合凸部50ｃに係合させるための係合孔52ｃが形成されており、この係合孔52ｃを係合凸部50ｃに係合させて保持部材52と誘電体ブロック50とを係合させた状態で、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持され、流路部材51が誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持されるように構成されている。
【００３６】
図７に示すように、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持された状態では、流路部材51の入口61および出口65は、蒸発防止部材54のスリット54ａにより外気から遮断され、流路60内に注入された液体試料の蒸発を防止するように構成されている。
【００３７】
入射光学系15は、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビーム13を平行光化するコリメーターレンズ15ａと、該平行光化された光ビーム13を分割するハーフミラー15ｃおよび15ｄと、ハーフミラー15ｃにより反射されハーフミラー15ｄを透過した光ビームを測定ユニット10方向に反射させるミラー15eと、ハーフミラー15ｃを透過した光ビーム13、ハーフミラー15ｄにより反射された光ビーム13およびミラー15ｄにより反射された光ビーム13を上記界面40、41および42上で各々収束させる３つの集光レンズ15ｂとから構成されている。
【００３８】
光ビーム13は、上述のように集光されるので、界面40、41および42に対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面40、41および42で全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。なお、上記光学系15は、光ビーム13を界面40、41および42にデフォーカス状態で入射させるように構成されてもよい。そのようにすれば、表面プラズモン共鳴の状態検出の誤差が平均化されて、測定精度が高められる。
【００３９】
なお光ビーム13は、界面40、41および42に対してｐ偏光で入射させる。そのようにするためには、予めレーザ光源14をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板で光ビーム13の偏光の向きを制御してもよい。
【００４０】
図８に示すように、本実施の形態において、測定ユニット10の各流路60の測定部63には３箇所の界面40、41および42に対して光ビーム13が並列的に入射されるが、このうち流路上流側および下流側に位置する界面40および42上の金属膜55上は何も固定していない参照領域Ｒとし、両界面に挟まれた界面41上の金属膜55上はリガンド73を固定した検出領域（所定領域）Ａとし、後述のリファレンス法による測定結果の校正を行うことができるようにしている。
【００４１】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサー１による試料分析について説明する。測定に先立ち、恒温室２からチップ保持部11上の測定位置へ向けて測定ユニット10が移動される。チップ保持部11には誘電体ブロック50に形成された摺動溝50ｅと係合するレール11ａが形成されており、測定ユニット10を移動させる際に高い位置精度を確保することができるようになっている。さらに、測定ユニット10がチップ保持部11上に載置された後、誘電体ブロック50に形成された垂直凸部50ｄが不図示の固定機構により挟持されてチップ保持部11上の測定位置に固定される。その後、図８に示すように流路部材51の入口61に液体試料供給用ピペットチップ70を挿入し、出口65に液体試料吸入用ピペットチップ71を挿入し、液体試料供給用ピペットチップ70から液体試料としてアナライトを含有するバッファー72を流路60の測定部63に供給した後、測定を開始する。
【００４２】
図３に示す通り、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビーム13は、光学系15の作用により、測定部63の下の誘電体ブロック50と金属膜55との界面40、41および42上で収束する。この際、光ビーム13は、界面40、41および42に対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面40、41および42で全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００４３】
界面40および41で全反射した後、２つのコリメーターレンズ16によって各々平行光化された２本の光ビーム13は、２つのフォトダイオードアレイ17により各々検出される。本例におけるフォトダイオードアレイ17は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が１列に並設されてなり、図３の図示面内において、平行光化された光ビーム13の進行方向に対してフォトダイオード並設方向がほぼ直角となる向きに配設されている。したがって、上記界面40、41および42において種々の反射角で全反射した光ビーム13の各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が受光することになる。
【００４４】
図９は、この表面プラズモンセンサーの電気的構成を示すブロック図である。図示の通り上記ドライバ19は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力をサンプルホールドするサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……、これらのサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……の各出力が入力されるマルチプレクサ23、このマルチプレクサ23の出力をデジタル化して信号処理部20に入力するＡ／Ｄ変換器24、マルチプレクサ23とサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……とを駆動する駆動回路25、および信号処理部20からの指示に基づいて駆動回路25の動作を制御するコントローラ26から構成されている。なお、差動アンプアレイ18、ドライバ19、信号処理部20は、３つのフォトダイオードアレイ17からの入力に対して、同様の処理を並列的に行うように構成されている。
【００４５】
上記フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の各出力は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……に入力される。この際、互いに隣接する２つのフォトダイオードの出力が、共通の差動アンプに入力される。したがって各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が出力する光検出信号を、それらの並設方向に関して微分したものと考えることができる。
【００４６】
各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、それぞれサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……により所定のタイミングでサンプルホールドされ、マルチプレクサ23に入力される。マルチプレクサ23は、サンプルホールドされた各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力を、所定の順序に従ってＡ／Ｄ変換器24に入力する。Ａ／Ｄ変換器24はこれらの出力をデジタル化して信号処理部20に入力する。
【００４７】
図１０は、界面41で全反射した光ビーム13の入射角θ毎の光強度と、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力との関係を説明するものである（界面40および42についても同様である）。ここで、光ビーム13の界面41への入射角θと上記光強度Ｉとの関係は、同図（１）のグラフに示すようなものであるとする。
【００４８】
界面41にある特定の入射角θＳＰで入射した光は、金属膜55とバッファー72との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθＳＰが全反射減衰角であり、この角度θＳＰにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。この反射光強度Ｉの低下は、図３にＤで示すように、反射光中の暗線として観察される。
【００４９】
また図１０の（２）は、フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向を示しており、先に説明した通り、これらのフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置は上記入射角θと一義的に対応している。
【００５０】
そしてフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置、つまりは入射角θと、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力Ｉ´（反射光強度Ｉの微分値）との関係は、同図（３）に示すようなものとなる。
【００５１】
信号処理部20は、Ａ／Ｄ変換器24から入力された微分値Ｉ´の値に基づいて、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の中から、全反射減衰角θＳＰに対応する微分値Ｉ´＝０に最も近い出力が得られているもの（図１０の例では差動アンプ18ｄとなる）を選択し、それが出力する微分値Ｉ´に所定の補正処理を施してから、その値を表示部21に表示させる。なお、場合によっては微分値Ｉ´＝０を出力している差動アンプが存在することもあり、そのときは当然その差動アンプが選択される。
【００５２】
以後、所定時間が経過する毎に上記のように選択された差動アンプのいずれかが出力する微分値Ｉ´が、所定の補正処理を受けてから表示部21に表示される。この微分値Ｉ´は、測定ユニットの金属膜55に接している物質の誘電率つまりは屈折率が変化し、全反射減衰角θＳＰが変化して、図１０（１）に示す曲線が左右方向に移動する形で変化すると、それに応じて上下する。したがって、この微分値Ｉ´を時間の経過とともに測定し続けることにより、金属膜55に接しているバッファー72（またはリガンド73）の屈折率変化を調べることができる。
【００５３】
特に本実施形態では検出領域において、バッファー72に含まれるアナライトがリガンド73と結合する特定物質であれば、リガンド73とアナライトとの結合状態に応じてリガンド73の屈折率が変化するので、上記微分値Ｉ´を測定し続けることにより、アナライトがリガンド73と結合する特定物質であるか否かを検出することができる。
【００５４】
本実施の形態においては、１つの検出領域Ａに対してその流路上流および下流にそれぞれ参照領域Ｒが設けられており、３つの領域についての測定を同時に行い、信号処理部20の補正手段において、２つの参照領域Ｒにおける測定値を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値とし、検出領域の測定値を補正する。例えば、内挿の例として、２つの参照領域Ｒにおける測定値の平均値をリファレンス値とする場合を例に挙げる。所定時刻において、２つの参照領域の測定値がそれぞれＳr1およびＳr2であったとき、その平均値をリファレンス値Ｓr＝（Ｓr1＋Ｓr2）/２とし、検出領域の測定値Ｓoからリファレンス値を差し引くことによりバッファー等による誤差を差し引き校正された測定値Ｓ＝So―Sｒを得る。なお、校正の方法は単純に差を求める方法に限定されるものではなく、例えばS0とＳrとの間に感度の相違等による重み付けの違いがある場合は、それぞれの感度による重み付けをＧ0、Ｇrとして、Ｓ＝Ｇ0×Ｓ0−Ｇr×Ｓrを得るようにしてもよい。
【００５５】
このように、１つの参照領域からの測定値をリファレンス値として用い校正していた従来の測定装置と比較して、本実施の形態の測定装置は２つの参照領域からの測定値を元に内挿もしくは外挿して得られる値をリファレンス値として用い校正するため、測定位置に依存する種々のパラメータ（流速、濃度および温度など）による誤差を緩和することができ、測定精度をより向上させることができる。
【００５６】
なお、本実施の形態において金属膜55上の参照領域には何も固定していないが、参照領域はバッファー72中のアナライトと結合しない機能を有している方が好ましい。そのような態様とするためには、例えばアルキルチオール、アミノアルコールまたはアミノエーテル等を金属膜55上に固定すればよい。
【００５７】
さらに、測定装置については、複数の表面プラズモン測定系により測定ユニットに設けられた全ての流路に対して同時に測定を行う態様に限定されるものではなく、一つの表面プラズモン測定系のみを備え、測定ユニットの位置を測定系に対して相対的に移動させることによって測定ユニットに設けられた複数の流路の測定を順次行う態様としてもよい。
【００５８】
次に、図１１および図１２を参照して本発明の第２の実施の形態について説明する。なおこの図１１および図１２において、図３および図８中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。この第２の実施の形態の測定ユニットは漏洩モードセンサーに対応したものであり、測定系は第１の実施の形態の表面プラズモンセンサーと同じ構成である。
【００５９】
この測定ユニット10´の誘電体ブロック50の一面（図中の上面）には薄膜層としてのクラッド層56および光導波層57が順に積層されている。誘電体ブロック50は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層56は、誘電体ブロック50よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層57は、クラッド層56よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層56の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層57の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００６０】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源14から出射した光ビーム13を誘電体ブロック50を通してクラッド層56に対して全反射角以上の入射角で入射させると、光ビーム13が誘電体ブロック50とクラッド層56との界面40、41および42で全反射するが、クラッド層56を透過して光導波層57に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層57を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層57に取り込まれるので、上記界面40、41および42で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００６１】
光導波層57における導波光の波数は、該光導波層57の上のバッファー72もしくはリガンド73の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、バッファー72もしくはリガンド73の屈折率を知ることができる。また、差動アンプアレイ18の各差動アンプが出力する微分値Ｉ´に基づいてリガンド73とバッファー72の中の被検体との結合状態の変化の様子を調べることができる。
【００６２】
本実施形態においても第１の実施形態の測定装置と同様に、測定ユニット10’の各流路60の測定部63には３箇所の界面40、41および42に対して光ビーム13が並列的に入射されるが、このうち流路上流側および下流側に位置する界面40および42上の光導波層57上は何も固定していない参照領域Ｒとし、両界面に挟まれた界面41上の光導波層57上はリガンド73を固定した検出領域（所定領域）Ａとしリファレンス法による測定結果の校正を行うものとしている。そして、信号処理手段20において、検出領域Ａの測定値を２つの参照領域Ｒの測定値を元に内挿もしくは外挿して得られる値（例えば平均値）で校正するので、測定位置に依存する種々のパラメータ（流速、濃度および温度など）による誤差を緩和することができ、測定精度をより向上させることができる。
【００６３】
なお、上記実施形態においては流路の上流、下流に検出領域を挟むようにして２つの参照領域を設けたものを挙げたが、参照領域は検出領域を挟むようにして２以上設けてあれば数および配置は特に限定されるものではない。流路中の検出領域と参照領域の別の配置例を図１３〜図１６に示す。図１３〜図１６は、測定ユニットの流路の測定部63における検出領域Ａおよび参照領域Ｒの配置を模式的に示すものである。図中矢印は液体試料の流れの向きを示す。
【００６４】
ここで、検出領域Ａは誘電体ブロック上の薄膜層上にリガンドが固定された領域であり、参照領域は薄膜層上に何も固定されていない領域である。
【００６５】
図１３に示すように、測定部63において検出領域Ａの左右に参照領域Ｒを設けてもよいし、図１４に示すように、検出領域Ａの上流、下流および左右の４箇所に参照領域Ｒを設けてもよい。さらに、図１５に示すように検出領域Ａを取り囲む８箇所に参照領域Ｒを設けてもよい。いずれの場合も検出領域Ａにおける測定値を、参照領域Ｒの測定値を元に内挿もしくは外挿して得られる値で校正することにより測定精度を向上させることができる。
【００６６】
また、図１６に示すように、流路が部分的に枝分かれして複数の枝路を有する場合、そのうちの１つの枝路を検出領域Ａとして用い、他の枝路を参照領域Ｒとして用いるようにしてもよい。
【００６７】
さらに、図１７に示すように、参照領域Ｒと検出領域Ａとを液の流れと垂直かつ直列に交互に配置するようにしてもよい。このように、参照領域Ｒと検出領域Ａとが液の流れと垂直かつ直列に配置されており、単純に流速／流量のみにより反応の違い（置換効率等）が生じると仮定できる場合は、流速の理論曲線（一般に、図中点線で示すような放物線）にてフィッティング（内挿もしくは外挿）を行い、その値をリファレンス値として用いるとより精度の高い測定値を得ることができる。参照領域Ｒ１とＲ２の測定値の平均値をＳ１に対するリファレンス値としてもよいが、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の値を用い、放物線でフィッティングしてリファレンス値を得た方がより精度を向上させることができる。
【００６８】
上記各例においては、参照領域Ｒが検出領域Ａの上流および下流もしくは左右に、検出領域Ａを挟むように設けられた例を挙げたが、図１８に示すように、検出領域Ａの近傍に参照領域Ｒが検出領域Ａを挟むことなく配置されていてもよい。この場合、参照領域Ｒの検出結果を元に外挿して得られる値をリファレンスとして用いればよい。
【００６９】
なお、図１３〜図１８に示す流路中の検出領域Ａと参照領域Ｒをそれぞれ同時に測定するに当たっては、検出領域および複数の参照領域の薄膜層と誘電体ブロックとの界面に対して同時に光ビームを入射し、該界面からの全反射光を検出できるように、既述の実施形態に示した測定系の光学系および検出系の構成および配置から適宜変更する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の第１の実施の形態による表面プラズモンセンサーの概略構成を示す平面図
【図２】上記表面プラズモンセンサーの測定系の平面図
【図３】上記表面プラズモンセンサーの測定系の側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーの測定ユニットの斜視図
【図５】上記測定ユニットの分解斜視図
【図６】上記測定ユニットの上面図
【図７】図６中のVII−VII線断面図
【図８】図２中のVIII−VIII線断面図
【図９】上記表面プラズモンセンサーの測定系の電気的構成を示すブロック図
【図１０】上記表面プラズモンセンサーの測定系における光ビーム入射角と検出光強度との関係、並びに光ビーム入射角と光強度検出信号の微分値との関係を示す概略図
【図１１】本発明の第２の実施の形態による漏洩モードセンサーの測定系の側面図
【図１２】漏洩モードセンサーの部分断面図
【図１３】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【図１４】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【図１５】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【図１６】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【図１７】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【図１８】流路中の検出領域と参照領域の配置例を示す図
【符号の説明】
【００７１】
10    測定ユニット
13    光ビーム
14    レーザ光源
15    光学系
16    コリメーターレンズ
17    フォトダイオードアレイ
17ａ、17ｂ、17ｃ……    フォトダイオード
18    差動アンプアレイ
18ａ、18ｂ、18ｃ……    差動アンプ
19    ドライバ
20    信号処理部
21    表示部
40、41、42    界面
50    誘電体ブロック
51    流路部材
52    保持部材
55    金属膜
63    測定部
60    流路
72    液体試料
Ａ    検出領域
Ｒ    参照領域
【図１】
2006258636.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006258636.tif 000008
【図６】
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【図７】
2006258636.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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