(57)【要約】【課題】  相同組み換えなどの煩雑な操作を行うことなく簡便に、マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選別する方法を提供すること。【解決手段】  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
【請求項２】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を培養し、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
【請求項３】
ＥＳ細胞又は組織幹細胞が、哺乳類又は鳥類由来の細胞株である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列が、転写開始点から３ｋｂ上流の位置から転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列が連結されている、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発光酵素遺伝子である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、又はlacZ遺伝子である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
生殖細胞が生殖幹細胞である、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクター。
【請求項１０】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列が、転写開始点から３ｋｂ上流の位置から転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、請求項９に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列が連結されている、請求項９又は１０に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１２】
マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発光酵素遺伝子である、請求項９から１１の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１３】
マーカー遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、又はlacZ遺伝子である、請求項９から１２の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１から８の何れかに記載の方法のために使用する、請求項９から１３の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項９から１４の何れかに記載の組み換え発現ベクターを有する細胞。
【請求項１６】
ＥＳ細胞又は組織幹細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項９から１４の何れかに記載の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法。
【請求項１９】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の方法により得られる生殖細胞分化促進因子。
【請求項２１】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法。
【請求項２２】
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起されている細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクター、並びに当該組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物、又はＥＳ細胞若しくは組織幹細胞から生殖細胞を取得する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ショウジョウバエを用いた遺伝子解析により、Oskar, Vasa, Tudor, Nanosの遺伝子が生殖細胞の決定機構における中核的機能を持つことが明らかとなった（非特許文献１) 。これらの遺伝子はいずれも卵細胞形成において極顆粒に蓄積され、この母性決定因子を持つ割球が生殖細胞運命を決定される。Vasa遺伝子は、ATP依存性RNAヘリカーゼをコードし、その機能はmRNAからタンパク質への翻訳制御に関わると考えられている（非特許文献２)。また、その酵素機能を担う構造が進化的に強く保存されていることから、扁形動物（プラナリア）からヒトまで多くの多細胞動物種でVasaホモログ遺伝子が同定されている。マウスVasaホモログ遺伝子(Mvh)は、マウス遺伝子データバンクにおいて、遺伝子名, Ddx4 (gene ID:13206)として登録されている。全転写単位（エキソン）を含むMvh遺伝子座はマウス13番染色体上に約53kbの長さで位置し、転写方向上流の約9.5kbにある蛋白質遺伝子(RIKEN cDNA9130023D20)と、下流約3.2kbのTubulin-2偽遺伝子の間に位置する。これらの構造的特徴は、霊長類のVasaホモログ遺伝子でも共通する。
【０００３】
Mvh遺伝子発現は、胎児期の移動期始原生殖細胞から始まり、生殖腺始原生殖細胞を経て、減数分裂後の半数体生殖細胞まで、卵形成および精子形成のすべての生殖細胞系譜に検出される。その発現特異性は、脊椎動物、特にヒトを含む全ての哺乳動物種に共通である。このVasaホモログ遺伝子の発現は、これまでに特定された生殖細胞発現遺伝子の中においても、極めて厳格な生殖細胞特異性を示すものである(非特許文献３)。
【０００４】
特許文献１には、Vasa遺伝子またはそのホモログ遺伝子発現の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子を導入したES細胞株を、生殖細胞分化促進因子の存在下で培養し、マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選択することを特徴とする、生殖細胞の取得方法が記載されている。特許文献１の方法では、ＥＳ細胞にもともと内在するVasa遺伝子またはそのホモログ遺伝子の発現の制御下にマーカー遺伝子が置かれるように、マーカー遺伝子は、相同組換えによりES細胞株に導入されている。
【０００５】
また、非特許文献４には、メダカのVasa遺伝子プロモーターに緑色蛍光蛋白質（GFP）を連結したVasaベクターを導入することによって作成したトランスジェニックメダカが記載されている。非特許文献４では、雌雄の生殖細胞ができる前の細胞系譜が観察されており、これを培養するなどして生殖細胞を分離することは行われていない。また、Vasaベクターを導入したトランスジェニック哺乳動物の作成については未だ報告がない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−６５２６１号公報
【非特許文献１】Rongo, C., et al, Development, 121, 2737-2746, 1995
【非特許文献２】Liang, L., et al, Development, 120, 1201-1211, 1994
【非特許文献３】Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139-149, 2000
【非特許文献４】Tanaka, M. Et al, PNAS, Vol.98, No.5, p2544-2549, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、相同組み換えなどの煩雑な操作を行うことなく簡便に、マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選別する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成し、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選別できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
【００１０】
（２）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を培養し、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
（３）  ＥＳ細胞又は組織幹細胞が、哺乳類又は鳥類由来の細胞株である、（２）に記載の方法。
【００１１】
（４）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列が、転写開始点から３ｋｂ上流の位置から転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）  該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列が連結されている、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
【００１２】
（６）  マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発光酵素遺伝子である、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（７）  マーカー遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、又はlacZ遺伝子である、（１）から（６）の何れかに記載の方法。
（８）  生殖細胞が生殖幹細胞である、（１）から（７）の何れかに記載の方法。
【００１３】
（９）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクター。
（１０）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列が、転写開始点から３ｋｂ上流の位置から転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、（９）に記載の組み換え発現ベクター。
（１１）  該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列が連結されている、（９）又は（１０）に記載の組み換え発現ベクター。
【００１４】
（１２）  マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発光酵素遺伝子である、（９）から（１１）の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
（１３）  マーカー遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、又はlacZ遺伝子である、（９）から（１２）の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
（１４）  （１）から（８）の何れかに記載の方法のために使用する、（９）から（１３）の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
【００１５】
（１５）  （９）から（１４）の何れかに記載の組み換え発現ベクターを有する細胞。
（１６）  ＥＳ細胞又は組織幹細胞である、（１５）に記載の細胞。
（１７）  （９）から（１４）の何れかに記載の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【００１６】
（１８）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法。
（１９）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法。
（２０）  （１８）又は（１９）に記載の方法により得られる生殖細胞分化促進因子。
【００１７】
（２１）   哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法。
（２２）  哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起されている細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、未分化幹細胞には発現せず、分化した生殖細胞に特異的に発現するVasaホモログ遺伝子の発現を高感度に検出することができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物並びに培養細胞系が確立された。本発明の発現ベクターは、トランスジェニック非ヒト動物から始原生殖細胞や生殖幹細胞の選択的取得及びそれらに由来する培養細胞株を樹立するうえで、またES細胞系の根幹となる生殖細胞への分化能を検定するうえで、優れた実験系を提供する。また、本発明によれば、生殖細胞系譜への寄与能力が低下しているES細胞クローンからも生殖細胞及びその産仔を得ることが可能となる。また、本発明においては、遺伝子の相同組み換えによる導入といった複雑な操作を必要とせずに、比較的簡便に実施が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施方法および実施態様について詳細に説明する。
（１）本発明の組み換え発現ベクター
ES細胞から始原生殖細胞への分化を識別するには、ES細胞には発現せず、分化した生殖細胞に特異的に発現する形質を指標にする必要がある。生殖細胞特異的遺伝子であるVasaホモログ遺伝子は、生殖巣内に定住した後期始原生殖細胞に特異的であり、それ以前の未分化初期胚細胞やES細胞には発現が認められないことから、本発明では、哺乳動物由来のVasaホモログ遺伝子発現を生殖細胞の分化指標として用いることとした。但し、ES細胞の浮遊培養で形成される胚様体では、生体内と同様に三胚葉を含む様々な細胞種の分化が起こり、生殖細胞の出現頻度は極めて少ないと考えられる。そのため、従来の分子遺伝学的検出法や免疫組織学的染色法では正確な識別ができない。本発明では、この問題を克服する手段として、Vasaホモログ遺伝子発現をGFP（発光クラゲの緑色蛍光蛋白質）およびlacZ（バクテリア由来のガラクトシダーゼ酵素；発色基質によって青色呈色或いは発光基質によって蛍光発色が可能となる）遺伝子などのマーカー遺伝子の発現に置き換える遺伝子改変操作を施し、Vasaホモログ遺伝子の発現の制御下に置かれるように上記マーカー遺伝子を挿入した組み換え発現ベクターを構築した。
【００２０】
Vasaホモログ遺伝子の発現制御域を用いた外来遺伝子の発現ベクターの利用は、生殖細胞系譜を介した遺伝子機能解析および組織工学的応用に優れた特性を持つ。本発明で用いるマーカー遺伝子とは、その発現を容易に検出または測定できる遺伝子である限り、その種類は特に限定されず、例えば、GFP（緑色蛍光蛋白質）、RFP（赤色蛍光蛋白質）、BFP（青色蛍光蛋白質）、YFP（黄色蛍光蛋白質）等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子、lacZなどの化学発光酵素遺伝子、又はネオマイシン等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができ、これらに各種の変異を付加した人為的合成遺伝子を使用してもよい。
【００２１】
本発明で言う哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子とは、哺乳動物（例えば、マウス、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット等）におけるVasa遺伝子を意味する。このようなVasaホモログ遺伝子は公知であり、例えば、マウス（Fujiwara, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12258-12262, 1994)、ヒト（Castrillon, D.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 9585-9590, 2000)、ラット（Komiya et al., Dev. Biol., 162, 354-363, 1994）等に記載されている。
【００２２】
以下、哺乳動物由来のVasaホモログ遺伝子がマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。
Mvh遺伝子の発現調節領域の特定は、以下の２つの方法で行った。
第一の方法は、第１エキソン上流のゲノムDNAを様々な長さで単離して、ホタルluciferase酵素蛋白質等をレポーター遺伝子としたプロモーター活性検定法である。本発明において、プロモーター活性とは、基本プロモーターが有する転写活性およびエンハンサーが有する転写促進活性を意味し、かかるプロモーター活性を有する発現調節配列を、「プロモーター配列」と称する。具体的には、GC-rich基本プロモーターを含む転写開始点上流部DNA配列を一定の長さに調製し、luciferaseを持つプロモーターベクターに連結し、生殖細胞培養株であるEG(Embryonic Germ)細胞にリポフェクション法で遺伝子導入した後、発現活性をluciferase酵素活性測定法で検出する手法である。その結果、図１に示すように、強い転写促進活性は、転写開始点から上流約3.0kbの範囲内に存在することが判明した。以下、特に断らない限り、「上流」とは「転写開始点から上流」を意味する。上流1.0kbに見られる弱い活性は基本プロモーターのそれを示すものと考えられ、これは図２に示すように1.0kbの活性化には細胞種による差違がないことやこの部分の欠失が転写活性の完全な喪失をもたらすこと（図１）からも支持される。一方、3.0kbの転写促進活性は細胞種特異性が見られるほか、EG細胞を生殖腺体細胞株（M15）と混合培養した際に発現増強が見られることは、内在性Vasa発現の挙動と一致する。従って、上流域の1.0 kbから3.0 kbの領域には少なくとも主要な生殖細胞特異的発現調節配列が含まれることが判明した。
【００２３】
さらに第二の方法として、上記の培養細胞系で検定されたVasa発現調節域は、外来遺伝子をマウス受精卵に顕微注入して得られるトランスジェニック(Tg)マウスによって検証された。例として、転写上流域3.0 kbにGFP遺伝子をレポーターとして連結した3.0-GFP遺伝子のトランスジェニックマウスでは、精巣内生殖細胞に特異的なGFP発現が検出される。そのGFP発現は蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を発する細胞として識別され、強陽性は減数分裂期に入った精母細胞から減数分裂後の精子細胞に観察される（図３）。この結果は、より広範囲の上流域8.0 kb, 5.0kbを用いた場合にも同様であった。
【００２４】
しかし、これら上流域のみを用いたトランスジェニックマウスでは、Mvhが持つ胎児期始原生殖細胞や卵母細胞などの雌性生殖細胞での発現は検出感度以下であり、上流域以外の領域にもその発現増強を担う制御配列の存在が示される。一つの可能性として、Mvh遺伝子の３'-非翻訳領域が生体内生殖細胞における長期的蛋白質発現を担う翻訳活性化制御を持つことが推定される。実際に、Mvh翻訳域の末尾にある翻訳停止コドンから下流2.3kbを3.0-GFP遺伝子の下流に連結した3.0-GFP-UTR遺伝子のトランスジェニックマウスでは、胎児期始原生殖細胞にも弱いながらGFP発現を可視化することができ、GFP抗体染色によっても有意な発現性を確認することができる（図４）。
【００２５】
以上の結果から、Mvh遺伝子の発現制御には転写上流域（約3.0kb）による特異的転写促進活性と、非翻訳領域を含む3'-下流域による翻訳活性化の少なくとも２つの制御エレメントが有効であることが判明した。
【００２６】
本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができるMvh遺伝子の転写開始点から約３ｋｂ上流の位置から転写開始点までの塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。また、本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができるMvh遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列の塩基配列を、配列表の配列番号２に示す。なお、本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができる哺乳動物由来のVasaホモログ遺伝子のプロモーター配列は、由来する哺乳動物種に限定されないが、発現ベクターを導入する動物または導入する細胞が由来する動物と同じ種のものを用いることが好ましい。また、分化した生殖細胞に特異的に発現するものであることが好ましい。
【００２７】
本発明の組み換え発現ベクターには、上記した要素の他にも、アンピシリン耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、及び複製起点など、通常の発現ベクターに使用される要素を適宜含めることができる。
【００２８】
（２）本発明の組み換え発現ベクターを導入した細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明によれば、上記（１）に記載した組み換え発現ベクターを導入して得られる細胞が提供される。本発明の組み換え発現ベクターを導入するための細胞としては、ＥＳ細胞、及び組織幹細胞などを挙げることができる。組織幹細胞としては、間葉系細胞、特に骨髄間葉系細胞等を使用することができる。また、ＥＳ細胞及び組織幹細胞などの細胞は、哺乳類又は鳥類由来の細胞などを使用することができ、好ましくは、哺乳類由来の細胞を使用することができ、特に好ましくは、マウス又はヒトに由来する細胞を使用することができる。本発明で用いることができるES細胞株の具体例としては、マウス129系統雄由来E14細胞株およびこれに由来するE14TG2a細胞株、ヒトES細胞株H9（Thomson et al., Science, 282, 1145-1147, 1998）等を挙げることができる。これらの細胞に本発明の組み換え発現ベクターを導入し、生殖細胞及び分化した細胞を分離することができる。
【００２９】
組み換え発現ベクターを細胞に導入する方法は、当業者に公知の方法を用いることができる。具体的には、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、又はリポフェクション法等を用いることができ、Lipofectamine 2000 (Invitrogen社)など市販のトランスフェクション試薬を用いて行うこともできる。
【００３０】
本発明によればさらに、本発明の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法は特に限定されないが、例えば、本発明の組み換え発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製することができる。具体的には、非ヒト哺乳動物の受精卵に本発明の組み換え発現ベクターを導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物から該組み換え発現ベクターが導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。
【００３１】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
【００３２】
受精卵細胞段階における本発明の組み換え発現ベクターの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行うことができる。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の組み換え発現ベクターが存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の組み換え発現ベクターが存在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の組み換え発現ベクターを有する。
【００３３】
本発明のトランスジェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認した後、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を有するように繁殖継代することができる。
【００３４】
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。本発明の組み換え発現ベクターをマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記発現ベクターを有する仔マウスを選択することにより、本発明のトランスジェニックマウスを作製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。
【００３５】
本発明の組み換え発現ベクターを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、導入した組み換え発現ベクターをプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３６】
（３）生殖細胞の取得方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする生殖細胞の取得方法、並びに上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を培養し、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする生殖細胞の取得方法が提供される。
【００３７】
取得される生殖細胞としては、生殖幹細胞が好ましい。ここで言う生殖幹細胞は、精子幹細胞、又は卵子幹細胞の何れでもよい。
【００３８】
上記したMvh遺伝子上流域3.0kbを制御プロモーター配列として、外来遺伝子を発現する場合、その発現を精子形成細胞の減数分裂期以降にのみ限定することが可能である。この特異性は精子形成過程に特異的な遺伝子産物の機能解析やその外来蛋白質の細胞内挙動を追跡することに利用することができる。一つの具体例として、Vasa-GFP融合タンパク質の細胞内局在性の場合を挙げる。抗体染色法によって、MVH蛋白質はマウス精子形成過程で細胞質内において均等分散状の局在から、減数分裂期には顆粒構造化し、精子細胞では核膜に隣接する１個の巨大顆粒構造（Chromatoid Body : CB）に局在する変化を示すことが判明している(Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139-149, 2000)。CB構造は、蛋白質とRNA成分の複合体であり、精子形成における翻訳制御装置としての役割が推定される細胞内器官である。生殖細胞特異的なVasa-GFP融合タンパク質の発現は、このCB構造の非固定条件下の観察を可能にする。3.0 kb上流域による発現は、内在性Mvh遺伝子発現に比べて約１/5程度と低く、精子形成やその稔性への影響など生理的機能阻害は生まれない。図５に示すように、外来遺伝子によるMVH-GFPは、内在性MVH蛋白質の挙動と一致して、精母細胞下では細胞質内顆粒、精子細胞内ではCB構造への局在を示した。この特性は、CB構造の継時的挙動をリアルタイムで計測することを可能にするほか、その形成や機能に関わる因子を非固定試料から精製するための新規の手段を提供する。同様の方法によって、精子形成に関わる蛋白質因子についても適用され、可視的標識化と共役因子の同定に用いることができる。
【００３９】
また、 内在性Mvh遺伝子の発現特異性を忠実に再現する外来ベクター構築法の一つとして、Mvh（或いは各種動物のVasaホモログ遺伝子）ゲノム遺伝子全長を含む長大DNAをBACベクターなど（Cosmid, P1ファージ）にクローン化したものを用いて、そのベクター内で外来発現遺伝子をMvh遺伝子内に組み込む形態を用いることができる。この場合、全長Mvh遺伝子とは、少なくとも転写開始点の上流約3.0kb から翻訳終止点下流約3.0kbまでの約60kbを含む配列であり、組み込む形態は翻訳開始点の下流に翻訳コドンフレームを合わせた形で外来遺伝子cDNAを挿入する、もしくはリボソーム結合配列(ires)を外来遺伝子上流に付加した遺伝子を挿入或いは置換することが有効である。一つの具体例として、Mvh遺伝子を内包する約150kbゲノムDNAを持つBACクローンにRFP遺伝子を組み込んだレポーター遺伝子の実施例を挙げる。図６Ａに示すように、RFP遺伝子cDNAが第2エキソンの翻訳開始点に合わせて挿入されたBac-Vas-RFPベクターは、リポフェクション法などによる培養細胞への遺伝子導入或いはDNA顕微注入法によるトランスジェニックマウス作成に用いられる。ES細胞を宿主細胞とした遺伝子導入では、内包する薬剤耐性（この場合にはNeo 耐性遺伝子によるG418耐性による選別）によってBac-Vas-RFP組み換え体ES細胞を選別することができる。ES細胞からの培養下において、始原生殖細胞、精子形成細胞、および卵子までの細胞種が分化することは、近年の研究において明らかにされている (Toyooka, Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 11457-11462, 2003; Hubner, K. et al, Science, 300, 1251-1256 2003; Geijsen, N. et al., Nature, 427, 147-154, 2004)。従って、本発明の組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞は、培養下の分化誘導によってMvh発現陽性の生殖細胞をRFP赤色蛍光細胞として識別することができ、セルソーター操作によって、培養条件下から各発生段階に分化した生殖細胞のみを精製することが可能である（図６Ｂ）。また、Bac-Vas-RFPベクターを組み込んだトランスジェニックマウス系統（BR-15）では、その精巣および卵巣内の生殖細胞、即ち精原細胞から精子までの精子形成細胞と卵原細胞から成熟卵子までの卵形成細胞がRFP発現による赤色蛍光細胞として識別される（図６Ｃ）。その顕著なレポーター発現は、上流3.0kbプロモーター配列を用いた場合よりも早期から検出され、内在性Mvh発現と一致して、雌雄の胎児期生殖腺内の始原生殖細胞から検出することが可能である（図６Ｄ）。
【００４０】
また、成体精巣には、その周期的精子形成を担う精子幹細胞が存在し、未分化生殖細胞である始原生殖細胞や精原細胞とも異なる特性を持つことが知られている。また、近年その培養法が確立され、生体精巣への移植によって培養精子幹細胞に由来する精子や産仔を得ることが可能であるなど、生殖工学技術の上で優れた新素材となることが注目される (Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003)。上記のBac-Vas-RFPは、この精子幹細胞をも可視化識別することができる。これは、マウス成体精巣細胞を精子幹細胞の培養条件で培養した場合、増殖した精子幹細胞クローンが特異的にRFP陽性細胞として識別されることによって確認された（図７Ａ）。一方、最近、成体卵巣にも卵子形成の幹細胞となる卵子幹細胞の存在が報告された。この細胞種は、卵巣全体を取り囲む基底膜内もしくはその外側に位置するMvh発現陽性細胞として識別される(Johnson, J. et al, Nature, 428, 145-150, 2004)。卵巣内の卵母細胞が大きな細胞質を持つ球状形態であるのに対して、この卵子幹細胞は組織断面像において扁平な形態を持つ。Bac-Vas-RFPマウス卵巣の組織試料において、卵母細胞と同様に基底膜外の卵子幹細胞もRFP陽性細胞として観察される（図７Ｂ）。さらに、図７Ｃに示すように、分散した卵巣細胞を培養下においた場合、減数分裂期にある全ての卵母細胞は増殖しないにも拘わらず、RFP陽性で増殖性を持つ細胞や扁平形態のまま維持される細胞が観察されることもBac-Vas-RFPベクターによる細胞標識化が卵子幹細胞の識別や精製を可能にすることを示す。
【００４１】
上記したような哺乳類Vasaホモログ遺伝子の発現調節域を用いた本発明の組み換え発現ベクターの特性は、これを用いたトランスジェニック動物個体の生体組織から生殖細胞を特定することが可能であり、特に生殖幹細胞を特異的に選別培養する操作において有効であり、外来遺伝子発現によって蛍光標識化、薬剤選択性、或いは新たな生理機能因子などの外来形質の付加を実現することができる。また、同様の特異性は培養細胞系においても利用することができ、マウスに限らず、ヒトなど他の動物種において、ES細胞、組織幹細胞など各種の生体組織に由来する培養細胞に遺伝子導入することによって、培養下に生殖細胞系譜へ分化誘導或いは分化転換した細胞の分取、特に生殖幹細胞に分化した細胞の分離培養から生殖幹細胞の純粋培養を樹立することに優れた特性を発揮するものである。
【００４２】
（４）生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法、並びに上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法が提供される。上記スクリーニング方法により得られる生殖細胞分化促進因子も本発明の範囲内である。
【００４３】
被験物質の種類は特には限定されないが、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成化合物（低分子有機化合物、高分子有機化合物など）、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングの被験物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、最終的にマーカー遺伝子の発現を誘起する物質を単離することも可能である。
【００４４】
（６）生殖細胞への毒性試験方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法、並びに上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したＥＳ細胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起されている細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試験方法が提供される。
【００４５】
生殖細胞への毒性を有する物質（被験物質）の種類は特には限定されないが、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成化合物（低分子有機化合物、高分子有機化合物など）、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。被験物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、最終的にマーカー遺伝子の発現を誘起する物質を単離することも可能である。より具体的には、内分泌撹乱物質（環境ホルモン）などを生殖細胞への毒性を有する物質として本発明の毒性試験方法で評価することができる。
【００４６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：Mvh遺伝子の転写制御領域の検定
Mvhゲノム遺伝子領域は、129マウスゲノムライブラリー（EMBL3:Clontech社）より同遺伝子第１エキソンを含むクローンを単離し、そのインサートDNAの制限酵素地図に基づいて調製した。上流域5.0 kb, 3.0 kb, 1.0 kbとは第１エキソン内のSmaI部位から、それぞれ約5.0 kb上流に位置するKpnI部位、約3.0 kb上流に位置するPstII部位、約1.0 kb上流に位置するEcoRV部位までを含む断片であり、これらをBasic-Lucベクター(pGL3-basic; Promega社)のクローニング部位に対して5'-3'方向を合わせて挿入し、5.0Luc, 3.0Luc, 1.0Lucの検定ベクターを作成した。8.0 Lucは、1.0Lucベクターをもとにゲノム第１エキソン直前に存在する約7.8 kbのNotIゲノム断片を挿入置換したベクターとして作成した。3.0Δlucは、3.0LucベクターからXbaI/SacI断片（上流-400〜-900に対応）を欠失したベクターである（図１を参照）。
【００４８】
遺伝子導入の宿主細胞とするEG細胞は受精後8.5日目マウス胚の始原生殖細胞から樹立された培養細胞であり、10％FCS（ウシ胎児血清）、bFGF(100ng/ml), LIF(1万単位/ml)を含むDMEM培地で生育させる。検定試料は12穴プレートに約百万細胞/穴の密度で培養した細胞を1試料とした。1検体2μgを用いる遺伝子導入にはLipofectamine 2000 (Invitrogen社)を用い、導入法はその使用マニュアルに従った。導入効率を標準化する内在的コントロールとして、CMV-Renilla (ウミシイタケ)Lucベクター（pRL-CMV: Promega社）を用い、各検定導入当たり100：1の割合で同時導入した。導入後１日目に細胞試料を回収し、Dual Luciferase Assay System (Promega社)を用いて、酵素活性を測定した。図１は、内在的コントロールCMV-Renilla Lucに対する、活性相対比をグラフに示したものである。
【００４９】
有意な発現促進活性を示した3.0Lucベクターについて、各種のマウス細胞株を宿主とした検定の結果を図２に示す。用いられた細胞株は、上記のEG細胞（Matsui, Y. et al., Cell, 70, 841-847, 1992）とM15（10.5日目胚マウス胎児生殖腺支持細胞株）(Larsson, S.H. et al., Cell, 81, 391-401, 1995), P19（胚性腫瘍細胞株）(McBurney, M.W. & Rogers, B.J., Dev. Biol., 89, 503-508, 1982), STO（繊維芽細胞株）(Martin, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634-7639, 1981), ES（CCE;胚性幹細胞株）(Robertson, E. et al., Nature, 323, 445-449, 1986)である。
【００５０】
測定方法は図１と同様に行った。その結果、3.0Lucベクターは生殖細胞に由来するEG細胞に特異的な発現促進活性を持つことが示された。図２で示すように、ES細胞でも若干の発現は見られるが、顕著な発現はEG細胞に見られる。つまり、ES細胞での発現はない、もしくは極めて低いことを確認している。これは、ES細胞への導入が無効であることを示すのではなく、ES細胞に導入した後、生殖分化すれば活性化する特性を裏付ける結果である。また、内在的Mvh遺伝子の発現は、生殖細胞が生殖腺に定着した後に顕著に亢進し、それはEG細胞を生殖腺支持細胞株と混合培養することによっても観察される。この促進効果が3.0Lucベクターでも再現されるか否かの検討を行った。比較として1.0Lucベクターを用いて、EG細胞単独とM15細胞との混合（1：1）培養を宿主として、上記と同様の検定を行った結果は、3.0Lucにおいて顕著な促進効果が見られることを示した。以上の結果は上流域1.0〜3.0の領域にMvh発現特異性を担う要因配列があることを示している。
【００５１】
実施例２：3.0-GFPトランスジェニック(Tg)マウスの作成と性状解析
実施例１で作成した3.0LucベクターのLuciferase遺伝子部分を欠失した断片とpEGFP-promoterベクター（Clontech社）から単離したEGFP遺伝子のEcoRI-SalI断片を連結することによって3.0-GFPベクターを作成した。3.0-GFPベクターの構造を図８に示す。このDNAをベクター内のScaI部位で切断、線状化した10ng/μlのDNA溶液をマウス（B6C3F1）受精卵の前核内に顕微注入することによって、3.0-GFPベクターを組み込んだTgマウス3系統を樹立した。
【００５２】
具体的には、発現ベクターDNAを顕微注入した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、当該仮親マウスから遺伝子組み換え体マウスを分娩されることにより作成することができる。産仔マウスが組み換え体であることは、当該マウスの尾部先端を切断し、その組織から抽出したゲノムDNAをEcoRI制限酵素処理した後、アガロース電気泳動で展開、GFP断片を32Ｐラベルしたプローブを用いてサザンブロット解析することによって判別した。得られた組み換え体マウス産仔は、それぞれ個別の交配繁殖を行うことによって、異なる染色体部位に発現ベクターを組み込んだマウス系統として樹立された。
【００５３】
上記のようにして作製した3.0-GFPベクターを組み込んだTgマウス3系統は、全く同じ結果を示した。得られたTgマウスの成体精巣は、蛍光実体顕微鏡下において臓器レベルでもGFP由来の緑色蛍光を示す。図３にそのTgマウス精巣の組織切片像を示した。精巣は４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、凍結切片とし、組織を可視化する核染色にはTO-PRO3 iodide溶液（Molecular Pbobes社）が使用された。その結果、GFP蛍光は精細管内の精子形成細胞の精母細胞から精子細胞の細胞層に検出された。同様の検出は、胎児期生殖腺や卵巣についても行ったが、この3.0-GFP Tgでは、その発現は検出されなかった。したがって、Mvh 上流プロモーター域は、生体内では減数分裂期以降の雄性生殖細胞に発現することが判明した。
【００５４】
実施例３：3.0-GFP-UTR Tgマウスの作成と性状解析
上流3.0 kbでは、胎児期や卵巣内の発現が再現されなかった結果から、翻訳領域下流にある非翻訳転写領域(3'-UTR)の翻訳制御活性の存在が示唆された。このため、実施例２の3.0-GFPの下流にMvh遺伝子の3'-UTRを連結した3.0-GFP-UTR Tgマウスの作成を行った。用いた3'-UTR断片は、Mvhゲノムクローン(マウス細胞の全ゲノムDNAも可能)を鋳型にしたPCR法によって単離した。ここで用いたプライマーは、5'-GATTAAAGCAAACGAACATA-3'（配列番号３）と5'-CCCACTGCACATAGGACTTAT-3'（配列番号４）であり、得られる2.3kb産物は翻訳の停止コドンから非翻訳転写領域の約600bを完全に含む。PCR反応は、Ex-taqもしくはLA-taq（タカラ酒造社）を用い、94℃１分、58℃ 2分、72℃3分のサイクルを27-30回反復する反応を用いた。このPCR反応条件は、特記しない限り全ての実施例においても共通に用いられるため、以降の実施例では表記は省略する。PCR産物は、pGEM-T Easyベクター（Promega社）にサブクローンした上で、そのクローニング部位両端にあるNotI部位を利用して切り出し、3.0-GFPベクターのGFP下流にあるNotI部位に方向を合わせて挿入したものを3.0-GFP-UTRベクターとした。Tgマウスの作成は実施例２と同様である。
【００５５】
得られた3.0-GFP-UTR Tgマウスについて、その成体精巣、胎児期精巣の生体でのGFP蛍光観察と組織切片観察を図４に示した。胎児期のGFP蛍光発現は成体精巣に比して微弱であるが、有意な発現が見られた。その組織切片では抗GFP抗体(1/500希釈；Clontech社)とOregon Green-抗rabbit IgG（1/500希釈；Molecular Probes社）の組合せで蛍光抗体法による検出が可能であった。これらの結果によって、Mvh遺伝子の発現特異性を用いる場合、上流3.0 kbと下流域最長2.3 kbの組合せが有効であることが結論される。
【００５６】
実施例４：3.0-VASA-GFP Tgマウスの作成と可視化蛋白分子の挙動解析
上記の実施例２の結果より、Mvh 3.0 kbは下流に連結する遺伝子を精巣内精子形成細胞に特異的発現をもたらす活性を示した。その特異性を利用して、可視化標識した蛋白分子の挙動を解析する事例として、3.0-VASA-GFP Tgマウスを作成した。これは、Mvh 3.0 kbの下流にVASA-GFPの融合cDNAを連結し、VASA蛋白質の細胞内分布の変動をGFP蛍光によって可視化することを図ったものである。ベクターの構築は、3.0-GFPベクターの改変を基本とした。先ず、Mvh全長cDNAを含むplasmidクローン（もしくは精巣mRNAから調製したcDNAを用いることも可）を鋳型として、Mvh 全長翻訳領域の5'端にBamHI部位、3'端にKpnI部位を持つcDNAをPCR反応によって作成する。用いたプライマーは、5'-BamHI-GAAGCTATCATGGGAGATGAA-3'（配列番号５）と5'-KpnI-GGCCCATGATTCGTCATCAA-3'（配列番号６）である。同様に、GFP cDNAについても5'端にKpnI部位、3'端にSalI部位を持つcDNAをPCR反応によって作成する。用いたプライマーは、5'-KpnI-ACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'（配列番号７）と5'-SalII-CTACTCAGACAA TGCGATGC -3'（配列番号８）である。2つのPCR断片は、pGEM-T Easy plasmidにサブクローンした後、このMvh plasmidをKpnI/SalIで開環した中に、もう一方のGFP plasmidからKpnI/SalI切断した断片を連結する。これによって、MvhとGFPはKpnI部位の2つのコドンを挟んで連結され、一つの融合cDNAを構成する。このMvh-GFP cDNAをBamHI/SalI切断で切り出した断片を3.0-GFPベクターからBglII/SalI切断でGFP cDNAを切り出した開環ベクター内に挿入して、3.0-VASA-GFPベクターを構築した。
【００５７】
Tgマウスの作成及びその精巣組織の蛍光像観察の方法は、上記の実施例と同じである。図５に示すように、このTgマウス精巣ではVASA-GFP融合蛋白質の発現が精母細胞と精子細胞に確認され、その特徴的な細胞内の局在性としてChromatoid Bodyの可視化とその生細胞での動態の観察が可能であった。
【００５８】
実施例５：BAC-Vasa-RFP遺伝子を用いた生殖細胞の可視化
BACベクターを用いたTg遺伝子の作成は、基本的にLee らによって開発された方法に準じて行った(Lee E-C et al. Genomics 73, 56-65, 2001)。マウスゲノムBACライブラリー(Clontech社)より、Mvh遺伝子座を含む約140 kbのマウスゲノムDNAをインサートとするBACクローン大腸菌を単離した。このBACクローン内で相同組み換えを起こすDNA断片はPfu polymerase (Promega社)を用いたPCRによって作成する。RFP遺伝子の挿入を図る場合、予めpUC-loxP-Neo-loxPにRFP cDNA (Clontech社)断片をサブクローンしたplasmid DNAを鋳型として用いる。用いる5'及び3'プライマーは、5'-50mer[相同配列A]-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3'（配列番号９）と5'-50mer[相同配列B]-GTTTTCCCAGTCACGACGTT -3'（配列番号１０）であり、相同配列AはMvh 第２エキソンにあるMvhの翻訳開始点ATGまでの50塩基配列、相同配列Bはそれ以降の50塩基の相補鎖配列である。得られたPCR産物を組み換えcompetent化処理したBACクローン大腸菌と混合して導入し、クロラムフェニコール/カナマイシンプレート状に培養して、薬剤耐性の大腸菌から相同組み換え体BACを含むクローンを単離した。BAC DNAはNucleobond-axカラム (Macherey-Nagel社)で調製し、Tgマウス作成、及びES細胞への導入に用いられた(図６Ａ)。
【００５９】
ES細胞（E14）野生株への導入はLipofectamin 2000を用い、その組み換え体クローンはG418薬剤耐性で選別された。胚様体の形成には、10% FCSを含むDMEM培地にES細胞（百万細胞/ml）を移し、浮遊培養用プレート（Nunc社）を用いた。この中でES細胞は細胞凝集塊を形成し、培養下の三胚葉分化を行う。BAC-Vasa-RFP組み換え体の場合、約３日以降にRFP赤色蛍光陽性の細胞が明瞭に観察され、培養下に分化する生殖細胞の識別された（図６Ｂ）。また、BAC-Vasa-RFP Tgマウスでは、その精巣、卵巣及び胎児生殖腺内の始原生殖細胞も明瞭なRFP赤色蛍光細胞として検出された（図６Ｃ）。このうち、卵巣内卵細胞の可視化は、このTgにおいて初めて可能になった成果であり、その理由の一つはレポーターとしたRFP蛋白の長寿命が挙げられる。また、この顕著なレポーター発現は、上流3.0kbプロモーターを用いた場合よりも早期から検出され、内在性Mvh発現と一致して、雌雄の胎児期生殖腺内の始原生殖細胞から検出することが可能である（図６Ｄ）。
【００６０】
実施例６：BAC-Vasa-RFPを用いた生殖幹細胞の識別と培養
実施例５で作製したTgマウス用いることによって、これまで可視化が困難、あるいは不可能であった幹細胞の同定が可能であることが判明した。このマウス系統では、図７に示すように卵巣の基底膜上或いはその組織外に位置するMvh陽性の細胞を生体組織の状態で赤色蛍光細胞として識別することができる。この利点は組織から初代培養を行う過程で、この推定卵子幹細胞を見失うことなく、その形態や生育状態を追跡することを可能にする。例として、BAC-Vasa-RFPマウスの生後10日目仔マウス卵巣の培養を示す。生体より摘出した卵巣を0.25%トリプシン溶液（Gibco社）で5分間の短時間分散処理を行うことにより、卵巣内の柔軟な組織部分を遊離細胞として回収する。これらを10％のFCSを含むDMEM培地に懸濁し、ゼラチンコートした培養プレートで１晩培養する。その後、培地は精子幹細胞用に開発されたSTEM培地(Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003)に置換を繰り返して、長期培養を行う。この過程で巨大な細胞塊である卵胞や大きな球形細胞である卵母細胞は浮遊状態にあるため、培養液交換で除去される。約１週間目にはプレート底面に付着した細胞層の中にRFP赤色蛍光、即ちMvh陽性の生殖細胞が散在することが観察された(図７Ｃ)。その中の一部は、細胞分裂によって生じたコロニー形態を示すものと単一細胞で紡錘形の形態を持つものに分類される。これらは、その大きさ、形態や分裂能力から明らかに卵母細胞とは異なる細胞種であり、生体組織に見られた卵子幹細胞に由来すると考えられる。この細胞種を培養下に同定できることは、蛍光に基づく細胞選別からクローン細胞株の樹立の可能性を示すものである。一方、既にその培養株化が可能となった精子幹細胞についても、BAC-Vasa-RFPマウスの精巣由来細胞を用いた培養によって、赤色蛍光を持つ精子幹細胞の識別と細胞株化が可能であることが判明した(図７Ｂ)。精子幹細胞培養に用いた方法は、Kanatsu-shinoharaら（Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003）によって報告された方法に準じた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、Mvh遺伝子の各種プロモーター断片を用いてルシフェラーゼアッセイによりプロモーター活性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、3.0Lucベクターを用いて各種のマウス細胞株を宿主としてルシフェラーゼアッセイによりプロモーター活性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、3.0-GFPトランスジェニックマウスの精巣の組織切片像を示す。
【図４】図４は、3.0-GFP-UTRトランスジェニックマウスの成体精巣及び胎児期精巣の生体でのGFP蛍光観察と組織切片観察を示す。
【図５】図５は、3.0-VASA-GFPトランスジェニックマウスの精巣のGFP蛍光観察と組織切片観察を示す。
【図６】図６は、BAC-Vasa-RFP遺伝子を用いて生殖細胞を可視化した結果を示す。
【図７】図７は、BAC-Vasa-RFPを用いた生殖幹細胞の識別と培養の結果を示す。
【図８】図８は、3.0-GFPベクターの構造を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
SEQUENCE LISTING
<110> Mitsubishi chemical corporation
<110> RIKEN
<120> An expression vector comprising a promoter sequence of Vasa homologue gene derived from mammal and use thereof
<130> A51458A
<160> 10
<210> 1
<211> 2789
<212> DNA
<213> mouse
<400> 1
tctgcagtaa actgaatctc cagttttcac gttatgtaga tccatctcca tgaatctggc 60
ctggccttgt gaatttctgg taactgatta gttgaaagtt gcaaatataa ttgtttaact 120
tcttatgcta gaattcaaga agccttgcaa ctattaccct ggtcctttgg agcgatgtcc 180
ctgacaagtg tgtccagttg aaatgcagca tccttacaga gtctgactga gattgtccaa 240
caaccttcag agcctaagtc agcctcttgg aaactattca attgttctgg ccatcccagc 300
cactagatgc cagagtagag aagtcacctt ggatgttaaa caaactggta ttggaggttg 360
gggataaact cagtagtaca gagcttgcct ggcacgctca agtacctagg ttcaaactct 420
ggcaatgcca aaaaagaaaa aagttgatag caaactctca gatgattcaa gttctaatta 480
gcatttgaat ggaattgtat gagatggtct cctgagccct ctcaatccct gagagagaat 540
tttttttgta agtcaatata ttatgcaata gtttgttata tagttgtact ggctaatttg 600
ggtcaagctg gagttatcac agaaaaagga gcttcagttg gggaaatgcc tccatgagat 660
ccaactgtaa ggcattttct caattagtga tcaaggggga aaggcccctt gtgggtagga 720
ccatctctgg gctggtagtc ttggttctat aagagagcag gctgagcaag ccaggtgagg 780
caagccagta aggaacatcc ctcccatggc ctctgcatca gctcctgctc ctgacctgct 840
tgagttccag tcctgacttc ctttggtgat gaacagcaat gtggaaagtg taagctgaat 900
aaaccctttc ctccccaatt tgctcagtgg tcatgatgtt ttgtcctgga atagaaacct 960
tgactaagac aatagttata ggtaacaaga agagagctgt gaactcgtca tgtagttaag 1020
tgtttgctag atttcctatt gcatagttcc tattttctct ttatatttgg aaaaaaattg 1080
tggtaacata ccttagacac ttattgttgt tctcctccct gacctgcact caatgaattc 1140
tcagccaaac tctagtgatg tcctccccat tcaaaagctt caaccttcta gtctttattt 1200
taaaaaatgt tattattaca tttatttatt ctgtggtgtg tgtgtgtgag agagaggatg 1260
ggagcaggtg tgtgtgtgtg tgtcggtgtg tttgttaaat cagaacatga gtgtgtgtgt 1320
aagacagaga cggggtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt cagtggataa 1380
gttgtagaag tcagttcttt ccttccctta ctcggacctc agggatcaaa ctcaagttct 1440
caggttgcca ggtacatgtc acctgtcttt gctttattat tatttagttc tggcttttga 1500
gcctaagtgt tatgttacat aggttgacct tgaattagct atgcactgag gtcctgatcc 1560
tcctgccttt atcttccaag taatggttac aggaatgggc cactggacct agcaagtgaa 1620
cctacctggt cactccaaaa atgcacagca aagaatatac gtttaaaaat aggttcattt 1680
taggaagttt gtccacattt taaatgacag ttctgttaaa gtatactgtg ttttgtcctt 1740
tgttaaatgt gacttttaaa agcaattcac cttaatagcc tgggcgacta cagtgctcac 1800
tgtataaatg ctagtgtgtt tttggtgctg aaacagaaag gtggctctag aaagctggag 1860
ttcctcatct ttaagttcca gactgagata tctacaactt cttcaaaaat ccagggaaag 1920
gaaagcgatg gaagtgaaaa taaaaacaag aacatgcttt acatatattt gattgtgatc 1980
cctttggcgg gtactaggaa aaccacggat ggaattttcc ttcttgaaag aggtgaggag 2040
caggcagaat gtgaacatct acttaatgag ctgaactggc cggtgccctc agaattgtaa 2100
acaggttcac cacaaatcca ggccttggca aacagaccaa gtcttcctct cttcggtttt 2160
ctttttacag actggctttc ttgacaactt caagatggag tctcatcctt gcccttttta 2220
tggagaggag aagcattgct tctagttggt tttagtagag gagtgaagtg catttctcag 2280
atacaaagag agcacttgag acgttcagac tcagaatggc caagcctggc actttgggag 2340
gtcaagagga ggctggaacg gctgggagag aaagcaatta gatgttccac ccctttggtt 2400
tttctccaga cagggtttct ctgtgtagcc ctgactgtcc tgaagtttgc tctgtagacc 2460
aggctggcct ccacccaggg atttgcctgc ctctgcctcc ccgagcccca gatttttatt 2520
tttatttatt tatatatcta ttttaacttt tgaatgaaca caatggaatt gatgagccct 2580
tggagagaga aacgggatgt cgtgcgtggc agccccgggg atcagctcac tcccacaggc 2640
ctcacaggcc atggagccaa gaggcctccc tgcctcggcc tcggcctcgg cctcaacaaa 2700
ggtggagaac gcgcaggccg tccgtccatg gggcgggaag tcgcgcgccg cggccgctga 2760
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tatatgtttt gcttatttct agtatattct tcagaaagtt aagacatgtt tcatgtccaa 300
gtgcttaagt cttagtatag tgtttatgat cctataaaac aagcaatagg atgtgatgtg 360
cttttgttta attattgggt ctaatttcta cttgatcctt taaaagaata gtgtatcagt 420
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cctcctcccc ctgcttctat gagggtgctc ccctacccac ccacccactc cttcctcccc 1080
accctggcat tcccctacat tggggcatcg agccttcaca ggaccaatgg cctttcctcc 1140
cactgacaag gctgttctct gctacatatg tgactagagc catgggtcaa tccatacgta 1200
atctttgatt ggtggtttag tccctgggat ctgggggtgg gggcaggtct ggttggctga 1260
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tcctccattg gggaccctgt ggttggctgt gagaattcac ctctgtattt gtgaggctct 1380
gacagagctt ctcaagagac agctatatca gggtcctgtc aacaaaatct tgctggcata 1440
tgcaatagtg tccgggtttg gtggttgttt atgggatgga tccccaggtg gggtagtttc 1500
tggatggtcc atccttccgt ctcagctccg aactttgtaa ctccttccat gggtattttg 1560
ttccccattc taagaaggaa cgaagaatct acactttggt cttccttctt gagtttcatg 1620
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gatatatcca tttgcccaag aatttcataa attcattatt tttaatagct gagtagtatt 1800
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ccaccagact gtcccaccag caatggagga gtgttcctct ttctccacat cctcaccagc 2040
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gttttcccag tcacgacgtt                  20
【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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