(57)【要約】      （修正有）【課題】神経分野の薬理試験、毒性試験に用いられるミクログリアを、信頼性高く安定した状態で得られる調製方法の提供。【解決手段】混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアを、疎水性培養表面を持つ培養容器中で、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はグリア細胞培養上清、あるいはこれらの混合物と、血清とを添加した培養液を用いて培養し、酵素処理後、培養表面からミクログリアを剥がしとることを特徴とするミクログリアの調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアを、疎水性培養表面を持つ培養容器中で、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）又は顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、あるいはこれらの混合物である細胞増殖因子と、血清とを添加した培養液を用いて培養し、酵素処理後、培養表面からミクログリアを剥がしとることを特徴とするミクログリアの調製方法。
【請求項２】
混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアを、疎水性培養表面を持つ培養容器中で、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はグリア細胞培養上清、あるいはこれらの混合物と、血清とを添加した培養液を用いて培養し、酵素処理後、培養表面からミクログリアを剥がしとることを特徴とするミクログリアの調製方法。
【請求項３】
疎水性培養表面がポリエチレンテレフタレート、フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタアクリレート、ポリカルボネート及び環状ポリオレフィンから選ばれる少なくとも1種の材料からなるものである請求項１又は２記載の細胞調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経組織において恒常性維持や免疫機能を担うミクログリアの調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ミクログリアは神経組織に存在し、特に中枢神経系に於いては、主要な恒常性維持や生体防御機能を担う細胞である。この機能が過剰に、また適切性を欠いて働くことにより、アルツハイマー病を始めとする中枢性神経変性疾患を悪化させることが知られている。多くの神経変性疾患に関与していることが示されており、神経系疾患の病因解明、その治療薬の開発などに於いて重要な細胞となっている。
中枢神経に存在するミクログリアは、障害を受けた際に活性化し、障害部位に顕著な存在を認めるが、通常は脳内に広く分散し存在する。細胞数がアストロサイトや神経細胞に比べ少ないため、生体外に中枢組織を取り出し、これを分散しても充分な数を確保できない。そこで試験に使う細胞数を確保するために生体外で培養する方法が用いられる。一般的に混合グリア細胞培養系と呼ばれる方法で培養することにより、アストロサイトを主とするグリア細胞の培養表面に数を増したミクログリアが認められてくる。
【０００３】
大脳などの神経組織を分散し、血清添加培養液を用いて接着性の細胞培養容器で培養する。これにより、まず培養容面にアストロサイトを主とするグリア細胞が増殖し単層状になる。この後にミクログリアの増殖が容易に認められる状態になるが、これを採取し、培養することによりミクログリアの培養試験系を作ることが出来る。この細胞採取時には培養容器を振とうする方法が、よく用いられる。これは単層アストロサイト培養細胞上に接着しているミクログリアを遊離させるため物理的刺激を加えるもので、より多くの細胞を採取することが出来る。一般的に用いられる方法となっているが、細胞へのダメージ、ミクログリア以外の混入比の上昇などがあり、必ずしも好適な方法と言い得るものではない。
【０００４】
初回採取後も継続して培養すれば繰り返し、増殖したミクログリアを採取することが出来る。しかし、この方法では、一度に採取される細胞数は多いとは言えず、試験に用いる量を確保するためには、広い培養面積、すなわち大きな培養基材、ないしは多くの培養容器を必要とする。つまり、これらの方法は試験に用いるミクログリアを調製する方法として有利なものではない。
【０００５】
ミクログリア増殖活性があると報告されているものには、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、トロンビンなどが報告されている。これらを培養液に添加して培養することにより、その効果は確認される。しかし満足できる効果が常に得られるわけではない。
【０００６】
すなわち、これらを採取し試験用細胞を調製しようとしても、充分な細胞数が確保できない、細胞の安定培養性が失われている、機能が充分維持されていない、などの現象に直面する。このように単に混合グリア細胞培養系から採取し、培養するだけでは充分有効なミクログリアの調製方法とはなりえない。
【０００７】
【非特許文献１】Brain Research、324巻、379-383ページ、(1984年)
【非特許文献２】The Journal of Pharmaceutical and ExperimentalTherapeutics、304巻、1-7ページ、(2003年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、神経分野の薬理試験、毒性試験に用いられるミクログリアを安定した培養と信頼性の高い試験が可能な形で得ることが出来る細胞調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち本発明は、
（１）混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアを、疎水性培養表面を持つ培養容器中で、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）又は顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、あるいはこれらの混合物である細胞増殖因子と、血清とを添加した培養液を用いて培養し、酵素処理後、培養容器表面からミクログリアを剥がしとることを特徴とするミクログリアの調製方法、
（２）混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアを、疎水性培養表面を持つ培養容器中で、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はグリア細胞培養上清、あるいはこれらの混合物と、血清とを添加した培養液を用いて培養し、酵素処理後、培養表面からミクログリアを剥がしとることを特徴とするミクログリアの調製方法、
（３）疎水性培養表面がポリエチレンテレフタレート、フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタアクリレート、ポリカルボネート及び環状ポリオレフィンから選ばれる少なくとも１種の材料からなるものである（１）又は（２）記載の細胞調製方法、
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明を用いることにより安定したミクログリアの量を確保することができる。これにより、細胞数の確保が障害となり本細胞による評価実験が行なえなかった試験研究者も、充分な細胞数を得ることができ、神経系疾患の病因解明やその治療薬開発の加速化が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者は、ミクログリアを生体外に取り出した後の分化・増殖、安定性、回収法の検討を行った。ミクログリアを分離した条件で、単に増殖因子添加した通常の培養方法では採取後の細胞数、状態などに問題を認めた。しかし採取した細胞をさらに、疎水性表面を持つ培養容器で培養し酵素処理した後、物理的に回収する方法をとることにより、大きな効果を認めた。ここに着目し、さらに種々の培養方法の検討を行った結果、本発明に至ったものである。
【００１２】
本発明において、混合グリア細胞培養系を形成するには、ラット、マウスなどの脳、ないしは末梢神経組織を用いる。より好ましくは、胎児ないしは新生児の脳を用いる。ヒト由来とすることも可能である。これを細切、トリプシンなどにより結合組織を切断し細胞を分離する。これを血清添加培養液で培養することにより、アストロサイトを主要な細胞とする混合グリア細胞培養系が形成される。
使用する血清は、培養する細胞の由来動物と同じとすることが好ましいが、必ずしも限定を受けるものでは無い。この状態で培養を継続すると、ミクログリアが顕微鏡観察下で容易に認めることが出来る状態で出現してくる。この期間は使用する組織の量、由来が胎児、新生児、成熟動物などにより異なる。使用する培養液は血清添加培養液が適するが、さらにミクログリア増殖作用を持つＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどの増殖誘導因子を添加してもよい。
【００１３】
増殖してきたミクログリアは浮遊している状態のものと接着しているものが認められる。後者は培養器を軽く振とうすることにより浮遊状態へ変わり、より多くの細胞を採取することが出来る。より長い時間の振とうを行うことにより、得られる細胞数は増す。しかし細胞に与えるダメージが大きくなる、他の細胞の混入比率が高くなる等必ずしも好適な方法ではない。なお、この混合グリア細胞培養系の培養を継続すればミクログリアの採取は複数回可能である。
【００１４】
混合グリア細胞培養系を形成する培養容器は特に制限されるものではないが、多くのミクログリアを得ようとする場合には培養面積の大きなものを用いる必要がある。また、振とう操作を行い、より多くの細胞を得ようとする場合は容器を密閉状態にする必要がある。長い期間の培養と、培養液交換時の汚染の防止にも留意が必要である。これらの点から容易に密閉状態に出来る培養フラスコなどが好適である。培養表面は通常の接着性細胞を培養するための表面状態であればよい。より接着性を増すため、コラーゲン、ポリリジンなど細胞刺激の無い細胞接着性因子、ポリマーなどをコーティングすることも好ましい。なお、培養基材として限定を受けるものではなく、ミクロキャリアーやファイバー状のものなど各種の培養基材が使用できる。
【００１５】
混合グリア細胞培養系から採取したミクログリアは疎水性表面を持つ培養容器でさらに培養する。これにより、より多くのミクログリアを安定して得ることが出来るようになる。複数回採取したミクログリアを、それぞれこの培養器に移しさらに培養を継続する。通常の表面親水化培養容器ではミクログリアの安定した接着が継続せず良好な培養は期待できない。表面が疎水性を示すポリエチレンテレフタレート、フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカルボネート、環状ポリオレフィンなどからなる培養容器ないしは培養基材が好適である。これらの疎水性材料を容器表面にコートしたものも適する。すなわち基材がガラス、セラミックス、金属などでも表面にこれら材料の表層を形成すれば用いることが出来る。また、形状もミクロキャリアー、ホローファイバーなど特に限定されるものではない。
【００１６】
個々で用いる培養液には増殖因子を添加する必要がある。単に血清だけでは良好な培養は行なえず、更にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グリア細胞培養上清、あるいはこれらの混合物を添加することが好適である。顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）も効果的な場合がある。また血清添加条件が好適であり、好ましい増殖・維持培養が可能である。無血清の場合でも増殖因子、栄養因子などの配合により短期間の培養が可能である。
【００１７】
増殖したミクログリアを回収し試験用細胞とするには、まず酵素処理行う。酵素としては、トリプシン（0.1〜0.5％）、パパイン（5〜50U/mL）などが好適であり、EDTA−Ｎａ塩（エチレンジアミンテトラアセティックアシッド−ナトリウム塩、0.01〜0.1％）を加えるのもさらに効果的である。数分間処理した後、スクレーパー等でかきとって細胞を容器表面から剥がしとる。酵素を使用せずEDTA−Ｎａ塩などによる方法では充分な細胞を回収できない。単に物理的なピペッティングだけでは細胞が剥がし取れないし、酵素処理をせずにかきとる方法では細胞へのダメージが大きく良好な細胞を調製できない。ここで調製した細胞は別の培養容器に移し培養、後試験に用いることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例にもとづき説明する。
（ミクログリアの採取）
ラット新生児大脳を定法により切り出し細切、トリプシン0.25％液(ＳＩＧＭＡ製)中で15分間酵素処理した。トリプシンを除き、ＤＭＥ／Ｆ−１２液に牛胎児血清(10％量)を加えた培養液（いずれもインビトロジェン製）で分散、40μmのメッシュに通した後、遠心分離した。分離した細胞を、再度同じ培養液で分散した。150cm2の培養フラスコ（住友ベークライト製）あたり1胎児分とし、培養液30mlを加え、5％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。各フラスコは培養液を交換しながら、その後12日間培養。容器を軽く前後左右に動かし培養液を攪拌、浮遊したミクログリアを採取した。
【００１９】
（実施例１）
環状ポリオレフイン(ＪＳＲ製)フィルムを25cm2培養フラスコ（住友ベークライト製）内に固定し、上述の採取したミクログリアを、ＤＭＥ／Ｆ−１２液に牛胎児血清(10％量)を加えた培養液に更にＧＭ−ＣＳＦ(ＳＩＧＭＡ製)を10ng/mLの濃度になるように添加した培養液で5×105c/mLに調製したものを、5mL加え培養液を交換しながら5日間培養した。PBSでリンスし、トリプシン−ＥＤＴＡ液(ＳＩＧＭＡ製)で3分処理、セルスクレーパー（住友ベークライト製）で細胞をかきとった。回収細胞数/播種時細胞数の値を測定したところ、２．１であった。
【００２０】
（実施例２）
ポリスチレン製表面疎水性25cm2培養フラスコ（住友ベークライト製）を用いて、上述の採取したミクログリアを、ＤＭＥ／Ｆ−１２液に牛胎児血清(10％量)を加えた培養液に更にＭ−ＣＳＦ(ＳＩＧＭＡ製)を10ng/mLの濃度になるように添加した培養液で5×105c/mLに調製したものを、5mL加え７日間培養した。PBSでリンスし、パパイン液(15U/mL)（ＳＩＧＭＡ製）で3分処理し、セルスクレーパーで細胞をかきとった。回収細胞数/播種時細胞数の値を測定したところ、1.7であった。
【００２１】
（実施例３）
実施例２と同様の培養フラスコを用い、培養液はグリア細胞培養上清50％、10％血清添加ＤＭＥ／Ｆ−１２を50％に調製したものを用いた。グリア細胞培養上清はミクログリアを採取した混合グリア細胞培養系から、細胞採取と同時に採取したものを使用した。実施例２と同条件で採取したミクログリアを前記培養液で5×105c/mLに調製したものを、5mL加え７日間培養した。回収細胞数/播種時細胞数の値は、1.8であった。
【００２２】
（実施例４）
実施例２と同様の培養フラスコを用い、培養液はグリア細胞培養上清10％、10％血清添加ＤＭＥ／Ｆ−１２を90％からなる培養液に、更にＧＭ−ＣＳＦを5ng/mLに調製したものを用いた。実施例２と同条件で採取したミクログリアを前記培養液で5×105c/mLに調製したものを、5mL加え７日間培養した。回収細胞数/播種時細胞数の値は2.1であった。
【００２３】
（比較例１）
表面を親水処理したポリスチレン製25cm2培養フラスコ（住友ベークライト製）を使用して実施例１と同じ培養方法で、5日間培養し細胞を調製した。回収細胞数/播種時細胞数の値は0.9であった。
【００２４】
（比較例２）
ポリスチレン製疎水表面25cm2培養フラスコ（住友ベークライト製）を用いて、実施例１と同じ方法で培養した。PBSでリンス後、酵素液を使用せずに、ＥＤＴＡ−Ｎａ塩を主成分とする細胞分散液（ＳＩＧＭＡ製）で５分処理し、セルスクレーパーで細胞をかきとった。回収細胞数/播種時細胞数の値を測定したところ、1.1であった。
【００２５】
（比較例３）
実施例１と同じ方法で、培養液のみＤＭＥ／Ｆ−１２に10％牛胎児血清を加えたものを用いた。培養後の回収細胞数/播種時細胞数の値は0.4であった。