(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、生体分子固定後もその活性が保たれ、物理吸着性が低い、さらに特殊な試薬を用いる等の複雑な操作をすることなく、ＳＨ基をもつ分子を強固に固定でき、固定分子と反応した後は安定で、安価で、安全性が高く、さらに機械的に強く、親水性も高いマレイミジル基含有ポリマーおよびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  スチレンとｔ−ブチルメタクリレートの共重合比が１０：９０〜７０：３０のポリマーであって、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式１で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマー、同材料により構成されるポリマー粒子、同材料に磁性粉が分散されてなる磁性ポリマー粒子、それらの製造方法、及び、アフィニティ分子固定材料。    【化１】2006089641.tif 000007【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチレンとｔ−ブチルメタクリレートの共重合比が１０：９０〜７０：３０のポリマーであって、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式１で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマー。
【化１】
2006089641.tif 000006
【請求項２】
請求項１に記載のポリマーを含有する粒子。
【請求項３】
磁性材料が分散されてなる磁性材料含有粒子であることを特徴とする請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合比が１０：９０〜７０：３０の共重合体に、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入した後、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドと脱水反応させる請求項１に記載のポリマーの製造方法。
【請求項５】
スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合比が１０：９０〜７０：３０の共重合体粒子に、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入した後、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドと脱水反応させる請求項２に記載の粒子の製造方法。
【請求項６】
１０：９０〜７０：３０のモル比のスチレン及びｔ−ブチルメタクリレートに、磁性材料を分散した後、該スチレンと該ｔ−ブチルメタクリレートとを共重合させて、磁性材料含有の共重合体粒子を製造することを特徴とする請求項５に記載の粒子の製造方法。
【請求項７】
前記共重合体粒子を膨潤させた後、磁性材料を分散して、磁性材料含有の共重合体粒子を製造することを特徴とする請求項５に記載の粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリマー、又は請求項２若しくは請求項３に記載の粒子を用いるアフィニティ分子固定材料。
【請求項９】
請求項１に記載のポリマーにペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であってＳＨ基を含む分子を結合させた化合物を用いる請求項８に記載のアフィニティ分子固定材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー担体、免疫沈降担体、タンパク質収集用ビーズ、細胞収集用ビーズ、フローサイトメトリー担体、診断薬、医薬品担体、プロテインチップ、ＤＮＡチップ、バイオリアクター、バイオセンサー、バイオフィルター等の用途に好適に使用可能なポリマー、その製造方法、及びアフィニティ分子固定材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド等生体分子の活性を保持したまま粒子や平板に固定し、そのアフィニティー性を利用して生体分子の収集や検出に使う試みが増えている。例えばアフィニティークロマトグラフィー、細胞収集用磁気ビーズ、フローサイトメトリー用診断ビーズ、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどがある。中でも抗体を担体に固定して抗原を検出したり、抗原を固定して抗体を精製したりする場合には、固定するタンパク質を還元し、中に含まれるＣｙｓのＳＨ基で固定する方法や、生体分子にＳＨ基を有する低分子を結合させてからそのＳＨ基で固定する方法が良く用いられる。
これに関して一般的に用いられている方法の１つとして、担体の硫黄原子に、固定する分子に含まれるＣｙｓの硫黄をＳ−Ｓで共有結合させる方法がある（例えば、非特許文献１参照。）。例えばアマシャムバイオサイエンス社のチオールセパロース担体は、アガロース粒子にグルタチオンを付加し、そのＣｙｓの硫黄に２、２’−ジピリジルジスルフィドをＳ−Ｓ結合させたものである。これに還元されたＳＨ基を持つタンパク質を混合すると、２、２’−ジピリジルジスルフィド分子がタンパク質を置き換わり、担体上にタンパク質がＳ−Ｓ結合で固定される。ところがＳ−Ｓ結合は他にＳＨ基があると容易に置き換わってしまうために、用途が限られてしまう。またアガロース粒子の場合種類によってはタンパク質が物理吸着してしまうので、非特異的吸着を避けるためにブロッキング操作など必要となる。
またＳＨ基をもつタンパク質を固定化するもう一つの方法として、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｓｙｌａｔｅ）等の二官能性試薬を用いてことがある（例えば、非特許文献２参照。）。これは担体側のＮＨ基に二官能性試薬のスルフォサクシイミド基側とを反応させて付加することにより、二官能性試薬のもう片側のマレイミジル基が担体表面に現れる。マレイミジル基はＳＨ基と常温で容易に反応し、その後安定して保持される。しかしこの方法で用いるＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ等の二官能性試薬は安価でないこと、担体と二官能性試薬の反応、それとタンパク質の反応、と操作が２段階必要である。
【非特許文献１】アフィニティークロマトグラフィーハンドブック（アマシャムバイオサイエンス（株）），ｐ８１
【非特許文献２】Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．刊），ｐ４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明の課題は、生体分子固定後もその活性が保たれ、物理吸着性が低く、さらに特殊な試薬を用いる等の複雑な操作をすることなくＳＨ基をもつ分子を強固に固定でき、固定分子と反応した後は安定で、かつ安価で安全性が高いポリマー、その製造方法、及びアフィニティ分子固定材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題に対して、本発明者らは、ポリマーに直接マレイミジル基を結合させることを試みてきた。これによるとＳＨ基をもつ分子はマレイミジル基に直接結合するため、強固で、操作が単純で、比較的安価に固定化を行うことが出来る。
しかしマレイミジル基直結法においては、担体材料によって固定化された分子の活性が失われてアフィニティー特性が発揮されない場合が多い。また他の分子が物理吸着して非特異的吸着が起こりやすく、ブロッキング操作が必要になることが多い。ましてやアフィニティー特性と低物理吸着性を同時に実現することは困難であった。
そこで、マレイミジル基直結法の利点を活かしつつ、生体分子固定後の活性が維持され、かつ物理吸着性が低いマレイミジル基含有ポリマーおよびその製造方法について鋭意研究を重ねた。その結果、下記に示す発明に至った。
【０００５】
＜１＞  スチレンとｔ−ブチルメタクリレートの共重合比が１０：９０〜７０：３０のポリマーであって、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式１で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマー。
【化１】
2006089641.tif 000002
【０００６】
＜２＞  前記＜１＞に記載のポリマーを含有する粒子。
【０００７】
＜３＞  磁性材料が分散されてなる磁性材料含有粒子であることを特徴とする前記＜２＞に記載の粒子。
【０００８】
＜４＞  スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合比が１０：９０〜７０：３０の共重合体に、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入した後、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドと脱水反応させる前記＜１＞に記載のポリマーの製造方法。
【０００９】
＜５＞  スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合比が１０：９０〜７０：３０の共重合体粒子に、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入した後、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドと脱水反応させる前記＜２＞に記載の粒子の製造方法。
【００１０】
＜６＞  １０：９０〜７０：３０のモル比のスチレン及びｔ−ブチルメタクリレートに、磁性材料を分散した後、該スチレンと該ｔ−ブチルメタクリレートとを共重合させて、磁性材料含有の共重合体粒子を製造することを特徴とする前記＜５＞に記載の粒子の製造方法。
【００１１】
＜７＞  前記共重合体粒子を膨潤させた後、磁性材料を分散して、磁性材料含有の共重合体粒子を製造することを特徴とする前記＜５＞に記載の粒子の製造方法。
【００１２】
＜８＞  前記＜１＞に記載のポリマー、又は前記＜２＞若しくは＜３＞に記載の粒子を用いるアフィニティ分子固定材料。
【００１３】
＜９＞  前記＜１＞に記載のポリマーにペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であってＳＨ基を含む分子を結合させた化合物を用いる請求項８に記載のアフィニティ分子固定材料。
【００１４】
特に本発明のポリマーの製造方法はスチレンとｔ−ブチルメタクリレート共重合ポリマーにｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入して得られた水酸基含有ポリマーに、さらにＮ−ヒドロキシメチルマレイミドを反応させることを特徴とする。
スチレンは疎水性が強く、ｔ−ブチルメタクリレートは比較的親水性である。スチレンとｔ−ブチルメタクリレートの共重合比率を１０：９０以下にすると親水性が強まりすぎて、固定化した生体分子にカップリングすべき分子が粒子の近くに留まり難く、結果として活性が低下する。一方、共重合比率が７０：３０を超えると疎水性が強まりすぎて物理吸着しやすくなり、分子の固定化を阻害したり、非特異的吸着の原因となる。疎水性と親水性の均整のとれる比率が、１０：９０から７０：３０であると考える。すなわち、このような比率とすることで、生体分子の物理吸着が起こりにくく、かつ一般式（１）で示されるマレイミジル基部に生体分子を固定化しても活性を保つことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に因れば、生体分子を固定化しても活性を保つことができるポリマー又は粒子を提供することができ、該ポリマー又は粒子を製造する方法の提供も行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のポリマーは、スチレンとｔ−ブチルメタクリレート共重合ポリマーを骨格とし、一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で一部置換されていることを特徴とする。
また、本発明のポリマーの製造方法は、スチレンとｔ−ブチルメタクリレート共重合ポリマーにｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入して得られた水酸基含有ポリマーに、さらにＮ−ヒドロキシメチルマレイミドを反応させることを特徴とする。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合体＞
本発明にかかるポリマーは、スチレンとｔ−ブチルメタアクリレートの共重合体（以下、「共重合体」と称する場合有り。）を骨格とする。スチレンとｔ−ブチルメタアクリレートのモル比は特に限定されるものではないが、固定化した分子の活性と物理吸着の低減を両立するために、１０：９０〜７０：３０が好ましい。
【００１８】
当該共重合体は必要に応じて架橋されるが、重合時に架橋させても、重合した後に架橋させてもよい。架橋の方法は特に限定されるものではないが、架橋剤の添加、電磁波の照射、電子線の照射、粒子線の照射などがある。架橋剤の種類は特に限定されるものではないがジビニルベンゼン、尿素樹脂、メラミン樹脂等がある。
【００１９】
＜マレイミジル基を含む官能基＞
本発明のポリマーは、下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基を含有する。
【化２】
2006089641.tif 000003
一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基は、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールとＮ−ヒドロキシメチルマレイミドとの反応により得ることができる。ｐ−キシレン−α，α’−ジオールの水酸基とＮ−ヒドロキシメチルマレイミドの水酸基とが反応し、脱水することで、一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基が得られる。
【００２０】
＜本発明のポリマー＞
本発明のポリマーは、一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基が、前記共重合体の少なくとも一部と置換したものである。その結合は、共重合体のメタクリル酸エステルのｔ−ブチル基と、一般式（１）のｐ−キシレン−α，α’−ジオールの水酸基とが、エステル交換触媒で直接エステル交換反応することにより行われる。エステル交換は、一部分で行われていても、全部が交換されていてもよいが、好ましくは、ｔ−ブチルメタクリレートが一部残存している場合である。ｔ−ブチル基が一部残存することにより、ポリマーの疎水性の度合いに影響を与え、ポリマー全体として生体分子の物理吸着を阻害しつつ活性の維持を可能とする。
【００２１】
本発明のポリマーに含まれる一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基の量は特に限定されるものではないが、０．００１ｍｍｏｌ／ｇ以上含有することが好ましく、単位質量当たりの反応量をできるだけ多くするという観点から、０．０１ｍｍｏｌ／ｇ以上が更に好ましく、特に、０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上が好ましい。０．００１ｍｍｏｌ／ｇ以上とすることにより、アフィニティー担体としてＳＨ基含有物質を固定化することができ、０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上とすることにより固定化の能力が特に充足される。
【００２２】
本発明のポリマーは用途に応じて様々な形態をとり、それは限定されるものではないが、ブロック状、平板状、膜状、粒子状等がある。一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基は、様々な形状のポリマーにおいて、表面に有しても、内部に有してもよく、又は、表面及びその内部の両方に有しても良い。
【００２３】
＜アフィニティ分子固定用ポリマー＞
本発明のポリマーは、アフィニティ分子固定用として好適に用いることができる。本発明のポリマーにアフィニティ分子を固定化する方法としては、本発明のポリマーに導入したマレイミジル基とアフィニティ分子のメルカプト基との反応が好適に用いられ、ＳＨ基を含むあらゆる分子を共有結合することができる。特にアフィニティー担体として利用する場合にはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体分子を１種類または２種類以上結合させる。。アフィニティ分子がペプチドである場合、ペプチド連鎖中のシステイン残基のメルカプト基を利用して本発明のポリマーに固定化することができ、アフィニティ分子が抗体である場合は、抗体をペプシンで消化し、抗体の可変部位のみに精製して、アフィニティ分子に生成するメルカプト基を用いて本発明のポリマーに固定化することができる。また、ジスルフィド結合しているペプチドや抗体をアミノエタンチオールなどのチオール化合物で還元断片化し、生成したメルカプト基を用いて本発明のポリマーに固定化することができる。
またメルカプト基を含まないアフィニティー分子については、工業的にＳＨを含む誘導体とすることで結合させても良い。
マレイミジル基とメルカプト基との反応は速やかで、かつ得られた結合は化学的安定性が高い。本発明のポリマーへのアフィニティ分子の固定化は本発明のポリマーとアフィニティ分子とを純水中もしくはバッファ中で混合攪拌すれば良い。
【００２４】
ここで定義されるアフィニティ分子は、ターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品、天然物の限定はされないが、抗体やレセプターなどを好ましく用いることができる。
ペプチドを用いるのであればグルタチオンの様な融合タンパク質精製に有用なものが使用できる。
抗体を用いるのであれば、たとえば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗黄色ブドウ球菌毒素抗体などを用いることができ、目的によってその他のものも含めて種々選定することができる。
【００２５】
また、レセプターを使用するのであれば、例えばＣＣＲ３，ＣＣＲ４等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等を用いることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明のアフィニティ分子固定用ポリマーは水不溶性であることが好ましい。アフィニティ分子固定用ポリマーの形態は特に限定しないが、液体処理カラムとして用いる場合には、粒子、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編地、織物等が用いられるが、表面積が大きくかつ細胞を流した場合にも詰まることなく、流路抵抗の低いことを考慮すると、粒子、繊維、編地、織物、中空糸、多孔質膜が好ましく用いられる。特に操作性の点で粒子が好ましい。さらには、プレート上あるいはフィルム上にスポットとしてアフィニティ分子固定化担体が形成されていても良い。この場合、粒子状のアフィニティ分子固定化担体がプレート上あるいはフィルム上に固着されていても良いし、プレート上あるいはフィルム上にアフィニティ分子固定化部位が直接形成されていても良い。
【００２７】
粒子の場合、その粒径は種々の用途に応じて選択可能であるが、一般的にその平均直径が１０ｎｍ〜１ｍｍであり、中でも、１００ｎｍ〜１００μｍであること好ましく、特に１００ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００２８】
本発明において、ポリマーを粒子状とするためには公知の方法が利用でき、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等が好適に用いられる。さらに、膜乳化法として知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。
【００２９】
本発明におけるアフィニティ分子固定用ポリマーは、特殊な反応性官能基を有さないので添加剤や溶媒との反応、残存による粒子物性への悪影響が全くないか、きわめて少ないという利点がある。また本発明におけるリガンド固定化用担体は熱および溶剤に対する安定性が高いので、ソックスレー抽出などの精製処理を長時間行うことで不純物を低減化でき、純度を上げることができる。
【００３０】
さらに本発明におけるアフィニティ分子固定用ポリマーは着色を目的に、公知の染料、顔料、カーボンブラック、磁性粉などを添加することも可能である。マイクロカプセルにすることも可能で、多孔質粒子とすることも可能である。
【００３１】
＜ポリマー粒子＞
本発明のポリマー粒子は、免疫沈降担体、タンパク質収集用ビーズ、細胞収集用ビーズ、フローサイトメトリー担体、診断薬、医薬品担体等多くの用途に利用できる。粒子の大きさは特に限定されるものではなく、種々の用途に応じて選択可能であるが、一般的にその平均直径が１０ｎｍ〜１ｍｍであり、中でも、１００ｎｍ〜１００μｍであること好ましい。１００ｎｍ〜１００μｍの範囲とすれば、固定化分子やそれにアフィニティーカップリングする分子に比べて充分な大きさ、質量を確保できるので、担体としての性質を保つことができる。
ポリマー粒子の形状は特に限定されるものではないが、球形、楕円形、多角形、不定形、針状形、多孔質形等あらゆる形のものを１種類もしくは２種類以上組み合わせて用いることができる。
【００３２】
また、該ポリマー粒子には、上記ポリマーのほか、親水性又は疎水性の度合いを変更させない程度に、かつ活性を低下させない範囲で、適宜添加剤を含有させることも可能である。例えば、着色を目的に、公知の染料、顔料、カーボンブラックなどを添加することも可能である。下記の磁性材料を含有させる態様も、好ましい態様の一つである。
【００３３】
＜ポリマー磁性粒子＞
ポリマー粒子に磁性材料を含有させることにより、外部磁場により容易に収集等の操作することが可能である。これは分子固定化粒子を溶液に分散してアフィニティーカップリングさせた後、カップリングした分子を収集するときに有用である。
ポリマー粒子に含有する磁性材料としては、磁性をもつあらゆる物質が使用可能であり限定されるものではないが、一般的には金属、合金、金属酸化物を単体でもしくは２種類以上を混合して用いる。金属ではＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｇｄ、等を用いる。合金ではＮｉ−Ｆｅ系、Ｎｉ−Ｍｎ系、Ｎｉ−Ｍｏ−Ｃｕ系、Ｆｅ−Ａｌ系、Ｆｅ−Ｃｏ系、Ｆｅ−Ｓｉ−Ａｌ系、Ｓｉ−Ｆｅ系、Ｃｏ−Ｎｉ系、Ｃｏ−Ｐｔ系、Ｃｏ−Ｓｍ系、Ｍｎ−Ｓｂ系、Ｃｕ−Ｍｎ−Ａｌ系、Ｃｏ−Ｆｅ−Ｖ系等が使用できる。なかでもＦｅＮｉ3、Ｎｉ3Ｍｎ、ＣｏＰｔ，Ｃｕ2ＭｎＡｌ、７０Ｆｅ−３０Ｃｏ、ＦｅＣｏ，ＳｍＣｏ5，ＭｎＳｂ等を用いることができる。金属酸化物ではＦｅ3Ｏ4、Ｆｅ2Ｏ3、ＢａＦｅ12Ｏ19、ＮｉＦｅ2Ｏ4，Ｙ3Ｆｅ5Ｏ12、ＣｏＦｅ2Ｏ4、Ｔｉ3Ｏ5、ＶＯ、Ｖ2Ｏ5、ＭｎＯ、Ｍｎ3Ｏ4、Ｍｎ2Ｏ3、ＭｎＯ2、ＣｏＯ、Ｃｏ2Ｏ3、ＮｉＯ等の他、ＭＯＦｅ2Ｏ3で一般的に表されるフェライト（Ｍは単一または複数の元素で、合計して化学量論比が１となる配合。Ｍの組成は特に限定するものではないが、Ｍｇ−Ｆｅ系，Ｍｎ−Ｚｎ系、Ｍｎ−Ｍｇ系、Ｍｎ−Ｍｇ−Ａｌ系、Ｎｉ、Ｎｉ−Ｃｕ系、Ｎｉ−Ｚｎ系、Ｎｉ−Ｃｕ−Ｃｏ−Ｆｅ系、Ｃｕ−Ｚｎ系、Ｃｕ−Ｚｎ−Ｍｇ系等）等が使用できる。以上は代表的な化学量論比を示したにすぎず、実際に使用する磁性体はこれらの比に拘束されるものではない。これらを単体でもしくは２種類以上混合して使用することができる。
【００３４】
磁性材料は、ポリマー粒子の内部に塊として包含されても、分散して含有されてもよいが、分散して含有されることが好ましい。また、磁性材料はポリマー粒子の内部に含有させても、その表面に含有させても、あるいは内部及び表面に含有させてもよいが、疎水性などの物理的な性質や、活性の劣化への影響が少ないという点から、粒子内部に分散されることが好ましい。
【００３５】
磁性材料は、磁性粉の形状として添加されることが好ましく、磁性粉の大きさはポリマー粒子自体の直径を超えない範囲のあらゆる大きさのものを、均一もしくは取り混ぜて使用することができる。具体的には１ｎｍから数ｍｍで、なかでも１０ｎｍ〜１００μｍがよく使用される。形状は球形、楕円形、多角形、不定形、針状形、多孔質形等あらゆる形のものを１種類もしくは２種類以上組み合わせて用いることができる。
これらの磁性粉はそのままでも、もしくは原料モノマーとの親和性を良くするために表面処理して用いることもできる。表面処理法には既知のあらゆる手段が使用でき限定するものではない。一般的にはカップリング剤や様々なコート剤の添加処理を行う。カップリング剤にはＳｉ，Ｔｉ，Ｚｒ，Ａｌ等の有機金属化合物を用いることができる。添加量は金属１００重量部に対して０．０００１〜１０重量部が使用できるが、０．０１〜５重量部が好ましい。
【００３６】
磁性材料はポリマー粒子合成時に適量添加して同時に造粒される。磁性ポリマー１００重量部中に占める磁性材料の割合は０．１〜９０重量部で、１〜６０重量部が好ましい。
磁性材料は粒子ポリマーと反応するわけではないので、粒子表面のポリマーとしての化学特性が保持され、その後の化学反応が問題なく行える。
【００３７】
さらにポリマーの着色を目的に、公知の染料、顔料、カーボンブラックなどを添加することも可能である。
このように、本発明のマレイミジル基を含む官能基を含有したポリマーは、生体分子あるいは生体分子類似の合成分子中のＳＨ基との間に選択的で安定な結合を形成し、固体化分子の活性を失わず、ポリマー表面への物理吸着もないので、アフィニティー担体として広く利用できる。
【００３８】
＜ポリマーの製造方法＞
（スチレン、ｔ−ブチルメタクリレート共重合の製造方法）
スチレンモノマー及びｔ−ブチルメタクリレートモノマーをモル比１０：９０から７０：３０の範囲で混合してラジカル重合を行う。
このときに必要に応じてジビニルベンゼン等の架橋剤を添加することにより、重合と同時に架橋を行うことも可能である。
重合には公知の方法が利用でき、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等が好適に用いられる。さらに、膜乳化法として知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。必要に応じて、当業者には周知の重合開始触媒を用いることができる。具体的には、ジアシルパーオキサイド、ケトンパーオキサイドおよびアルキルハイドロパーオキサイドのような有機過酸化物；過酸化水素およびオゾンのような無機過酸化物；およびアゾビスバレロニトリル（ＡＩＢＮ；和光純薬社よりＶ−６０として入手可能）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）（和光純薬社よりＶ−５９として入手可能）および２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（和光純薬社よりＶ−６５として入手可能）のような油溶性アゾ系有機化合物；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二酸塩（和光純薬社よりＶ−５０として入手可能）、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬社よりＶＡ−０８６として入手可能）および２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二酸塩（和光純薬社よりＶＡ−０４４として入手可能）のような水溶性アゾ系有機化合物が挙げられる。重合開始剤を用いる場合は、それらは重合が良好に開始されるのに充分な量で用いられる。このような量は当業者に周知である。一般には、０．１〜５．０質量％の量で用いることが好ましい。
【００３９】
得られた共重合体はメタノール等の溶媒に希釈分散させ、濾別し、更に水洗及び／又は溶剤洗浄の後、噴霧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段によって粉体として単離することができる。
上記で重合された共重合体を熱融解したり、溶剤に溶解することにより所望の形に成型後、冷却したり、溶剤を除去することにより固化することができる。溶解や融解時にメラミン樹脂や尿素樹脂を添加することにより硬化させることができる。
【００４０】
（水酸基含有ポリマーの製造方法）
本発明に用いられる水酸基含有ポリマーは、スチレンとｔ−ブチルメタクリレートの共重合体を構成成分に有するポリマーに、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入して得られるポリマーである。
導入する方法としては、その目的によって適宜選択することができが、重合ポリマーのｔ−ブチル基と水酸基を２個有するｐ−キシレン−α，α’−ジオールとを適当なエステル交換触媒で直接エステル交換反応させることにより、水酸基含有ポリマーとすることができる。エステル交換をスムーズに進行させるため、ポリマーに含まれるｔ−ブチル基の総モル量に対し等モル以上のｐ−キシレン−α，α’−ジオールを反応させることが好ましいが、実際にはポリマー中の全てのｔ−ブチル基がエステル交換するわけではないので等量以下であってもかまわない。
【００４１】
本発明において、共重合体と、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールとの反応割合は、ｔ−ブチル基の導入量により異なるが、基本的には共重合体の重量で約１倍から２０倍量のｐ−キシレン−α，α’−ジオールを用いる。共重合体のｔ−ブチル基のモル数に対しては、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールのモル数は、０．１倍〜１００倍が好ましく、より好ましくは、１倍〜１０倍である。
必要に応じて用いられる上記非反応性溶媒中、１５０℃から２００℃の反応条件で、５〜２４時間程度加熱して反応させることにより、水酸基含有ポリマーを得ることができる。
【００４２】
本発明で添加する前記含金属エステル交換反応用触媒は、ポリエステル合成時に使用される、いわゆるエステル交換触媒が好適に利用できる。前記含金属エステル交換触媒としては、例えば、酢酸鉛、酢酸亜鉛、アセチルアセトネート亜鉛、酢酸カドニウム、酢酸マンガン、マンガンアセチルアセトネート、酢酸コバルト、コバルトアセチルアセトネート、酢酸ニッケル、ニッケルアセチルアセトネート、酢酸ジルコニウム、ジルコニウムアセチルアセトネート、ジルコニウムテトラ−ｎ−ブトキシド、酢酸チタン、テトラブトキシチタネート、テトライソプロポキシチタネート、チタニウムオキシアセチルアセトネート、酢酸鉄、アセチルアセトネート鉄、酢酸ニオブなどの遷移金属化合物、ジブチルスズオキシド、モノブチルヒドロキシスズオキサイド、ジブチルスズジラウレート、三酸化アンチモン、酸化ゲルマニウム、炭酸ビスマスオキシド、酢酸ビスマスオキシドなどの典型金属化合物があげられる。また、酢酸マグネシウム、酢酸リチウム、酢酸カルシウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム，炭酸セシウムなどのアルカリ金属化合物またはアルカリ土類金属化合物、さらに、酢酸ランタン、酢酸サマリウム、酢酸ユウロピウム、酢酸エルビウム、酢酸イッテルビウムなどの希土類化合物も用いることができる。
【００４３】
これらの触媒は、単独で用いても、２種以上組合せて用いてもよい。この中でも、チタニウムテトラアルコキシドが溶媒への溶解性、反応性の点でより好ましい。チタニウムテトラアルコキシドとしては、例えば、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−ブトキシチタン、テトライソブトキシチタン、テトラ−ｔ−ブトキシチタン、テトラ−第二−ブトキシチタン、テトラ−ｎ−アミルオキシチタン、トリイソアミルオキシイソプロポキシチタンなどが挙げられる。
ポリマーに対する触媒の添加量（含有量）は、粒子中のポリマー重量１００質量部に対して、通常０．０１〜５０質量部が用いられる。好ましくは０．１〜２０質量部、さらに好ましくは０．５〜１０質量部である。触媒を０．０１〜５０質量部の範囲とすることにより、水酸基が導入し易くなり、また、反応後の触媒の除去も有利に進行させることができる。
【００４４】
架橋ポリマーの架橋度が高い場合には、反応促進の目的でポリマーを膨潤させうる非反応性溶媒を助溶剤として添加することができる。例えば、キシレン、メシチレン、ジエチルベンゼン、シクロヘキシルベンゼン、ジメチルナフタレン、シメン、ジメトキシベンゼンなどの芳香族化合物、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーエル、フェネトール、ブチルフェニルエーテルなどのエーテル化合物、アセトフェノン、イソホロン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メチルシクロヘキサノンなどのケトン化合物、ジクロロベンゼン、クロロトルエン、ジクロロトルエンなどのハロゲン化合物があげられるが、前記目的を達成する非反応性溶媒であればいずれでも使用できる。この中でも、特に、キシレン、メシチレン、ジメトキシベンゼンなどの芳香族化合物が反応性の点で好ましい。
【００４５】
（マレイミジル基を含む官能基を含有するポリマーの製造方法）
本発明のマレイミジル基を含む官能基を含有するポリマー磁性粒子の製造方法は、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを導入して得られた水酸基含有ポリマーに、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドを反応させることを特徴とする。
前記水酸基含有ポリマーとＮ−ヒドロキシメチルマレイミドとの反応は、水１分子が外れて縮合した形態であり、従来公知の反応によって行うことができるが、中でも、エーテル化触媒の存在下で行うことが好ましい。
この反応には酸性あるいは塩基性の公知のエーテル化触媒が好適に使用できる。例えば、塩基性の触媒としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等が使用でき、単独又は２種類以上混合して使用できる。酸性の触媒としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の無機酸やｐ−トルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸、酢酸等の有機酸が使用でき、これらは水和物の形態でもよい。また、ハイドロタルサイト類の固体触媒でも使用が可能である。
塩基性触媒や酸性触媒を使用する場合のその使用量は、対応する塩基又は酸として、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドに対して、０．０１〜４０質量％、好ましくは０．１〜１５質量％である。固体触媒の場合は、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドに対して、０．００１〜１００質量％、好ましくは０．１〜５０質量％である。前記触媒等は、反応液に均一に溶解した状態で使用しても不溶の状態で使用しても良いが、均一溶解状態では、使用量を少なくすることができる。一方、不溶の状態では、反応後に反応液から常法により容易に触媒を分離回収することができる。
【００４６】
前記水酸基含有ポリマーとＮ−ヒドロキシメチルマレイミドとの反応割合は、導入した水酸基の量によって異なるが、基本的には水酸基含有ポリマーの重量で約０．１〜１０倍量の前記Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドを用いことによりマレイミジル基含有ポリマーを得ることができる。水酸基含有ポリマーの水酸基のモル数に対して、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドのモル数は、０．１倍〜１００倍が好ましく、より好ましくは、１倍〜１０倍である。
【００４７】
また、この反応における反応温度、反応時間は、水酸基含有ポリマーのエステル部の組み合わせ、これら官能基の導入量等により異なり、適宜選択できる。一般的に、８０〜１８０℃の反応条件で、２〜２０時間加熱して反応させることにより、マレイミジル基含有ポリマーを得ることができる。
【００４８】
前記エーテル化反応の溶剤としては、反応を阻害しないものであればいずれの溶媒も使用できる。例えば、トルエン、キシレン、メシチレンが挙げられる。
前記水酸基導入ポリマーが粒子の場合、マレイミジル基導入量の再現性の面で、あらかじめ反応前に粒子を分級処理し、粒径をそろえてから反応させることが望ましい。こうして得られたマレイミジル基含有ポリマーは、メタノール等の溶媒に希釈分散させ、濾別し、更に水洗及び／又は溶剤洗浄の後、噴霧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段によって粉体として単離することができる。
また、本発明の製造方法は、大気下のみならず、加圧下においても、反応させることができるが、これらのその他の反応条件は、必要に応じて適用されるもので、特に限定されるものでははい。
【００４９】
前記操作により得られたマレイミジル基含有ポリマーにおけるマレイミジル基量は、マレイミジル基を過剰量の２−メルカプトエチルアミンと反応させ、反応後に残った２−メルカプトアミンの量を測定することにより、逆にポリマーのマレイミジル基を求めることができる。その具体例としては、例えば、（株）同仁化学研究所の総合カタログ（平成１４年３月２９日発行）第一部プロトコル集の８０ページに記載されている。
本発明の製造方法により、生体分子固定後もその活性が保たれ、物理吸着性が低い、さらに特殊な試薬を用いる等の複雑な操作をすることなく、ＳＨ基をもつ分子を強固に固定でき、固定分子と反応した後は安定で、安価で、安全性が高く、さらに機械的に強く、親水性も高い得られるマレイミジル基を含む官能基を含有したポリマーが得られる。
【００５０】
上記ポリマーの製造方法の他、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールとＮ−ヒドロキシメチルマレイミドとを反応させ、下記一般式（２）で表される化合物を得た後、スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合体に対して、エステル交換反応を行う方法も挙げられる。この場合のｐ−キシレン−α，α’−ジオールとＮ−ヒドロキシメチルマレイミドとの反応は、通常の脱水反応であり、上記同様、エーテル化触媒の存在下で行うことが好ましい。また、下記一般式（２）で表される化合物と、スチレンとｔ−ブチルメタクリレートとの共重合体とのエステル交換反応においても、上記の含金属エステル交換触媒を用いることができる。
【化３】
2006089641.tif 000004
【００５１】
＜ポリマー粒子の製造方法＞
本発明のポリマーの形状を粒子とするときは、上記における懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法、膜乳化法等により生成した共重合体の粒子を、洗浄、分級等を経て用いる。この場合、前記モノマーとともに、トルエン、オクタン、シクロヘキサノン、ジブチルフタレート、ラウリルアルコール等の非重合性の添加剤を入れ、重合後に抽出除去して粒子を多孔質とすることも可能である。
このようにして得られた共重合体の粒子に対して、ｐ−キシレン−α，α’−ジオールを適当なエステル交換触媒で直接エステル交換反応させ、Ｎ−ヒドロキシメチルマレイミドとの脱水反応を行うことで、本発明のポリマー粒子を得ることができる。
【００５２】
＜磁性ポリマー粒子の重合＞
磁性ポリマー粒子を得る方法は特に限定されるものではないが、共重合反応前に磁性材料をモノマー中に予め分散してから重合する方法がある。分散操作は公知の方法が利用でき、例えばボールミル、振動ミル、各種攪拌機、各種シェイカー、超音波装置などで行うことができる。
また磁性ポリマー粒子を得る他の方法として、重合して得られたポリマー粒子を水に膨潤させて、そこに磁性材料を添加し、その後アルカリ等で磁性材料を析出させることにより、磁性材料をポリマー粒子に定着させる方法を挙げることができる。
【００５３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
（スチレン：ｔ−ブチルメタクリレート＝１０：９０の粒子）
スチレンモノマー１０、ｔ−ブチルメタクリレート９０、ジビニルベンゼン１のモル比で、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（以上和光純薬工業（株）製）を加えて懸濁重合反応を行った。分級操作により平均粒径５０μｍの架橋ポリマー粒子選別し、イオン交換水及び溶剤で洗浄後単離乾燥した。
得られたポリマー粒子１０重量部にｐ−キシレン−α，α’−ジオール３０重量部、メシチレン溶媒７０重量部、チタンテトラブトキシド触媒０．３重量部（以上和光純薬（株）製）を混合して、１６０℃で３時間反応させた。得られた粒子をエタノールで３時間ソックスレー抽出装置で洗浄、さらに蒸留水で洗浄して水酸基導入ポリマー粒子を得た。
上記で得られた水酸基導入ポリマー１０重量部にＮ−ヒドロキシメチルマレイミド５部、トルエン３５０部を入れ６０−７０℃に加熱撹拌し、触媒のｐ−トルエンスルホン酸一水和物０．５部を入れ、温度を上げて６時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらに、エタノールで８時間ソックスレー抽出を行った。濾過した後、イオン交換水及び溶剤で再度洗浄後、単離乾燥した。
【実施例２】
【００５５】
（スチレン：ｔ−ブチルメタクリレート＝５０：５０の粒子）
スチレンモノマー５０、ｔ−ブチルメタクリレート５０、ジビニルベンゼン１のモル比で、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（以上和光純薬工業（株）製）を加えて懸濁重合反応を行った以外は実施例１と同様に作成した。
【実施例３】
【００５６】
（スチレン：ｔ−ブチルメタクリレート＝７０：３０の粒子）
スチレンモノマー７０、ｔ−ブチルメタクリレート３０、ジビニルベンゼン１のモル比で、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（以上和光純薬工業（株）製）を加えて懸濁重合反応を行った以外は実施例１と同様に作成した。
【００５７】
＜比較例１＞
（スチレン：ｔ−ブチルメタクリレート＝０：１００の粒子）
スチレンモノマー０、ｔ−ブチルメタクリレート１００、ジビニルベンゼン１のモル比で、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（以上和光純薬工業（株）製）を加えて懸濁重合反応を行った以外は実施例１と同様に作成した。
＜比較例２＞
（スチレン：ｔ−ブチルメタクリレート＝１００：０の粒子）
スチレンのベンゼン環ｐ位置にＣＨ2ＯＨが結合したＷａｎｇ  Ｒｅｓｉｎ粒子（ジビニルベンゼン１質量％、３８〜７５μｍ、和光純薬工業（株）製）を用いて、水酸基化、マレイミジル化を実施例１と同様に実施した。
このようにして得られたポリマー粒子のマレイミジル基量、及びアフィニティー特性を以下の様な方法で評価した。
【００５８】
＜マレイミジル基含有担体粒子中のマレイミジル基定量法＞
粒子を一定量ねじ口試験管にＷ（ｇ）秤量し、あらかじめ調製した２−メルカプトエチルアミン（東京化成社製）の反応液を、２−メルカプトエチルアミンが過剰量になるよう一定量加え、攪拌反応させた。
粒子を遠心分離したのち上澄み溶液の２−メルカプトアミンと４，４’−ジチオジピリジンと反応させ、３２４ｎｍの吸光度をからモル吸光係数ε＝１９８００を用いて上澄み溶液中の２−メルカプトエチルアミン量Ｂ（ｍｏｌ）を求めた。ブランクとして、サンプルを含まない系の２−メルカプトアミン量Ｃ（ｍｏｌ）も同様に測定し、下記の式に従ってマレイミジル基量Ｍ（ｍｍｏｌ／ｇ）を求めた。
Ｍ＝（Ｃ−Ｂ）／Ｗ×１０００
【００５９】
＜アフィニティー特性及び物理吸着特性の評価＞
マウスＩｇＧ（和光純薬工業（株）製，商品コード１３２−１３７２６）を一次抗体とし、この抗体を還元断片化し粒子に結合させた。ついで、抗マウスＩｇＧ，ウサギ，ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（和光純薬工業（株）製，商品コード０１７−１７６０１）を二次抗体として、アフィニティカップリングさせた後、二次抗体の分離操作を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて二次抗体の回収の有無を調べた。
一次抗体を還元断片化処理しないでそのまま、粒子と混合し、二次抗体をアフィニティカップリングさせた後、二次抗体の分離操作を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて二次抗体の回収の有無を調べた。
各ポリマー粒子の結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2006089641.tif 000005
【００６１】
表１の結果から、スチレン含有量が１０ｍｏｌ％を下回るとアフィニティー特性がなくなり、スチレン含有量が７０ｍｏｌ％を超えると物理吸着が増大することがわかった。アフィニティー特性が保たれ、しかも物理吸着がないのはスチレン：ｔ−ブチルメタクリレートのモル比が１０：９０から７０：３０であることも判明した。