(57)【要約】【課題】細胞内への核酸導入効率が高く、かつ細胞毒性が低い上に、簡便、安価に調製が可能な核酸複合体、及びそれを用いた安全でかつトランスフェクション効率の高い細胞内への核酸導入方法を提供する。【解決手段】ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体と、核酸とからなる核酸複合体及び該核酸複合体を細胞に投与することを特徴とする細胞内への核酸導入方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンを、高分子量化して得られた誘導体（以下、「高分子量化誘導体」という）と、核酸とからなる核酸複合体。
2006304644.tif 000004
【請求項２】
高分子量化誘導体の分子量が５，０００〜１００，０００である請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンの脱水縮合により得られた請求項１または２に記載の核酸複合体。
【請求項４】
高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンの放射線照射により得られた請求項１または２に記載の核酸複合体。
【請求項５】
高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンと架橋剤との反応により得られた請求項１または２に記載の核酸複合体。
【請求項６】
式（１）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンが、微生物発酵により製造された請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項７】
核酸がプラスミドＤＮＡである請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸複合体を細胞に投与することを特徴とする細胞内への核酸導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体と核酸とからなる核酸複合体及び該核酸複合体を細胞に投与することを特徴とする細胞内への核酸導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞中に遺伝子のような核酸を導入する方法は、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストランに代表されるようなポリマー法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の化学・物理的手段を用いる導入方法（非ウイルス法）と、アデノウイルスやレトロウイルス等のウイルスベクターを利用する生物学的方法（ウイルス法）とに大別され、いずれも広く利用されている。
【０００３】
しかし、ウイルスの感染力を利用する生物学的方法は遺伝子導入・発現効率が高い利点がある反面、免疫原性や病原性再発の可能性や細胞のガン化等ウイルス自体の安全性に関して問題点が指摘されており、実際に事故も発生している（例えば、非特許文献１、及び２参照）。
【０００４】
一方、非ウイルス法にはウイルス法に比較すると安全面でのリスクが少ないことや、核酸導入操作の簡便性、導入剤の大量安価な調製が可能等の利点から、大きな期待が寄せられているが、ウイルスベクターと比較した場合の導入発現効率の低さが大きな改良課題となっている。非ウイルス法の効率を向上させるためには、細胞選択性、細胞膜の透過性、ヌクレアーゼに対する耐性、核内移行性、核酸のリリース性等いくつかの問題点を克服する必要がある。また、ウイルス法と同様に、生体や細胞に対する毒性を低減すること等安全性の確保も重要な課題である。
【０００５】
化学的手段の1つであるリポソーム法は、リポソーム膜の脂質が生体膜と同じ脂質によって構成されることが多く、細胞膜や細胞内器官と相互作用しやすく、かつ抗原性が低いという利点がある。しかしながら、リポソームによる遺伝子導入は、遺伝子の発現効率が低く細胞毒性が高い等の問題により実用に供しにくいという欠点がある（例えば、非特許文献３、及び４参照）。
【０００６】
リポソーム法と並び代表的な化学的手段としてポリマー法が挙げられる。ポリマー法は化学的修飾により種々の機能化が可能である非ウイルス法として注目を浴びている。カチオン系のポリマーであるポリエチレンイミンは、ポリマー系の中ではＤＮＡをコンパクションする能力に優れ、高い導入効率が得られるが、細胞毒性が非常に強いという欠点を有している。そのため細胞毒性等の安全面に対する問題を解決するためには、生分解性や生体適合性を付与する必要があり、生分解性や生体適合性を本来有する天然由来のカチオンポリマーを用いる手法も検討されている。多糖類ではα−グルカン系のデキストランやβ−１，４−グルコサミン系のキトサン誘導体が研究されているが、ＤＥＡＥ−デキストラン等は細胞毒性が非常に強い問題点を有しており、キトサンの場合もＤＮＡ複合体作成条件が限定されており、十分な遺伝子の発現効率を得るために必要なＤＮＡ量が多くなる等の問題点を有している（例えば、非特許文献５、及び６、及び特許文献１参照）。
【０００７】
また、カチオン性ポリペプチド類も遺伝子導入剤として検討されており、特にα−ポリ−Ｌ−リジンはＤＮＡをコンパクションする能力を持ち多くの研究が繰り広げられている。しかし、α−ポリ−Ｌ−リジンは遺伝子導入活性が充分ではなく、またＤＮＡ複合体の凝集性が高く、細胞毒性も高いことが知られている（例えば、非特許文献７参照）。
従って、細胞内への核酸の導入に関しては、容易かつ安価に調製ができ、かつ細胞毒性が低く、核酸の導入効率が優れた核酸導入剤、導入方法の開発が大いに期待されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１５７２７０
【非特許文献１】Marshall, E., et al., Science, 286, 2244（1999）
【非特許文献２】Hacein-Bey-Abina, S., Von Kalle, C., Schmidt, M., McCormack, M. P., Wulffraat, N., Leboulch, P., Lim, A., Osborne, C. S., Pawliuk, R., Morillon, E., Sorensen, R., Forster, A., Fraser, P., Cohen, J. I., de Saint Basile, G., Alexander, I., Wintergerst, U., Frebourg, T., Aurias, A., Stoppa-Lyonnet, D., Romana, S., Radford-Weiss, I., Gross, F., Valensi, F., Delabesse, E., Macintyre, E., Sigaux, F., Soulier, J., Leiva, L. E., Wissler, M., Prinz, C., Rabbitts, T. H., Le Deist, F., Fischer, A., Cavazzana-Calvo, M., Science, 302, 415（2003）
【非特許文献３】Chassin, D., Andrieu, M., Cohen, W., Culmann-Penciolelli, B., Ostankovitch, M., Hanau, D., Guillet, J.G.., Eur. J. Immunol., 29, 196（1999）
【非特許文献４】Van Tendeloo, V. F., Snoeck, H.W., Lardon, F., Vanham, G.L., Nijs, G., Lenjou, M., Hendriks, L., Van Broeckhoven, C., Moulijn, A., Rodrigus, I., Verdonk, P., Van Bockstaele, D.R., Berneman, Z.N., Gene Ther., 5, 700（1998）
【非特許文献５】MacLaughlin, F. C., Mumper, R. J., Wang, J. M., Tagliaferri, J. M., J. Controlled Rel., 56, 259（1998）
【非特許文献６】Ishii, T., Okahata, Y., Sato, T., Biochim. Biophys. Acta, 1514, 51（2001）
【非特許文献７】Brown, M.D., Schaelein, A., Brownlie, A., Jack, V., Wang, W., Tetley, L., Gray, A.I., Uchegbu, I.F., Bioconjug. Chem., 11, 880（2000）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、例えば、細胞内への核酸導入効率が高く、かつ細胞毒性が低い上に、簡便、安価に調製が可能な核酸複合体、及びそれを用いた安全でかつトランスフェクション効率の高い細胞内への核酸導入方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した。その結果、天然由来で生体適合性や生分解生に優れたカチオンポリマーであるε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体が核酸と静電気的に強い複合体を形成すること、及びこの高分子量化誘導体と核酸とからなる核酸複合体の遺伝子導入効率が従来のポリマー系の核酸複合体に比べて格段に高く、かつ細胞毒性が低いことを見出し、その知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明は下記によって構成される
（１）下記式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンを、高分子量化して得られた誘導体（高分子量化誘導体）と、核酸とからなる核酸複合体。
2006304644.tif 000002
（２）高分子量化誘導体の分子量が５，０００〜１００，０００である前記（１）項に記載の核酸複合体。
（３）高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンの脱水縮合により得られた前記（１）または（２）項に記載の核酸複合体。
（４）高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンの放射線照射により得られた前記（１）または（２）項に記載の核酸複合体。
（５）高分子量化誘導体が、式（Ｉ）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンと架橋剤との反応により得られた前記（１）または（２）項に記載の核酸複合体。
（６）式（１）で表されるε−ポリ−Ｌ−リジンが、微生物発酵により製造された前記（１）〜（５）項のいずれか１項に記載の核酸複合体。
（７）核酸がプラスミドＤＮＡである前記（１）〜（６）項の何れか１項に記載の核酸複合体。
（８）前記（１）〜（７）項の何れか１項に記載の核酸複合体を細胞に投与することを特徴とする細胞内への核酸導入方法。
【発明の効果】
【００１２】
前記式（Ｉ）のε−ポリ−Ｌ−リジンは，これを高分子量化させることにより核酸と強く静電的に結合し複合体を形成する。この核酸複合体は、細胞毒性が低く、簡便安価に調製可能で、トランスフェクション効率が高く細胞内への核酸を導入すること等を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において使用される、前記式（Ｉ）のε−ポリ−Ｌ−リジンは、何れの方法によって得られたものであってもよく、リジンから化学合成により得られたものでもよいが、この化学合成品は非常に合成が難しく、また非常に高価でもある為、具体的には、特許第１２４５３６１号明細書に記載のストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを分離・採取することによって得られるε−ポリ−Ｌ−リジンを挙げることができる。
【００１４】
本発明におけるε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体（以下、「高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン」という）は、何れの方法によって得られたものであってもよく、例えば特許第３５０２８７９号明細書に記載の放射線の照射により得られたものや、特開２００３−１７１４６４号明細書に記載の架橋剤を用いて調製したものでも使用できる。また、トランスグルタミナーゼ等の酵素を用いて架橋剤との反応により高分子量化したものも使用できる。但し、放射線の照射は高価な機械設備が必要であり、調製にあたっては高度な作業管理を必要とし、また架橋剤による高分子量化はある程度長時間の反応工程と未反応物の除去等の煩雑な作業を要する。簡便、短時間で得られる高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンとしては、特開２００３−１７１４６３２号明細書に記載の、微生物発酵により得られるε−ポリ−Ｌ−リジンを不活性ガス雰囲気もしくは真空中において、１５０℃以上の温度で熱処理することによる脱水縮合反応により得られる高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを挙げることができる。
【００１５】
本発明において使用される高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンは、核酸の導入効率と細胞毒性の点から、分子量５，０００〜１００，０００が好ましく、１０，０００〜７０，０００がより好ましく、１０，０００〜５０，０００が更に好ましい。
【００１６】
本発明において、使用される高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの分子量の分画方法は何れの方法であっても良く、例としてゲル濾過クロマトグラフ法、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフ法、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法等を挙げることが出来る。
【００１７】
本発明に用いる核酸は、１本鎖、２本鎖にとらわれず比較的短い核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、すなわち、一般的には１キロベース（kb）以下、多くの場合５００ベース以下程度の核酸フラグメントを対象とすることもできる。また、目的のタンパクをコードする遺伝子のほか、当該タンパク発現に必要なプロモーターやターミネーターを含有する２本鎖の核酸構成体であるプラスミドＤＮＡのような一般的には１kb以上、多くの場合、３kb〜１０kb程度の大きさを有するものも適用可能である。
【００１８】
既述のように、本発明において、細胞に導入される核酸物質としては、プラスミドＤＮＡも使用可能であり、発現するタンパクをプロモーターの下流にコードするもので、その具体的な塩基配列については目的タンパクによって異なる。
【００１９】
また、プラスミドＤＮＡを導入される細胞も限定されるものではなく、疾患の治療用、クローン用等の目的に応じてあらゆる種類の培養・初代動物細胞を対象とすることができる。また、生体への投与においても有効である。生体への投与方法は非経口投与（静脈内投与）、エアロゾルの吸入、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射が可能である。
【００２０】
核酸複合体形成の条件は、特に限定されるものではないが、適当な溶媒中で高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンと核酸とを混合した後、例えば、３０分程度静置させるだけでよい。プラスミドＤＮＡに対する高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの混合比はＮ／Ｐ比１〜２５、好ましくは５〜１５である。ここで、Ｎ／Ｐ比は、高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンのプロトン化可能な窒素原子数／ＤＮＡのアニオン数により算出される値である。ε−ポリ−Ｌ−リジンの窒素原子は半数の窒素原子がプロトン化することで全てカチオンとなることが可能なのでカチオン数は全窒素原子数の半分で見積もることができる。アニオン数は、ＤＮＡを構成するヌクレオチド１残基が１つのアニオンとなる。ヌクレオチドの平均分子量は３２５と仮定することができ、使用ＤＮＡ量からアニオン数を算出できる。
【００２１】
一定の細胞数に対する、本発明の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンと核酸との複合体を添加する量は限定されるものではなく、細胞の種類、核酸の種類、細胞に導入したい核酸の量等によって、当業者が適宜選択することができる。また、静置時間についても限定されるものではなく、本発明の化合物、核酸の種類等に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、０．５〜５時間、好ましくは２〜５時間が例示される。また、本発明で形成される高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン／アニオン性プラスミドＤＮＡの複合体は、主として静電的な凝集作用によるものであり、水媒体中で錯体形成が可能である。
より具体的なトランスフェクション剤としての調製法、キャラクタリゼーション及びｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における投与の方法と評価に関しては、以下の実施例において詳細に例示する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明の特徴を更に具体的に示すため、本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）
高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの調製 
ε−ポリ−Ｌ−リジン(ε−ＰＬＬ、数平均分子量４，０００、チッソ（株）製)１００ｍｇをガラスマイクロチューブに入れ、ガラスチューブオーブン（柴田科学（株）製、Shibata GTO-350-RD）を用い、真空中１８５℃で４０分間脱水縮合を行った。以後、この４０分間脱水縮合しものをε−ＰＬＬ４０と表記する。
【００２４】
高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの分子量分画 
ε−ＰＬＬ４０（５０ｍｇ）を超純水（milliQ、MILLIPORE社製）１０ｍｌに溶解し限外濾過フィルター[Centriplus YM-50(MILLIPORE社製)]を使用し、分子量５０，０００以上を分画した。以降、分子量５０，０００以上の画分をε−ＰＬＬ４０Ｈと表記する。上記で得られた濾液を用いて、更に限外濾過フィルター[Centricon Plus-20(MILLIPORE社製)]を使用し、分子量１０，０００以上の成分を分画した。以降、分子量１０，０００〜５０，０００の画分をε−ＰＬＬ４０Ｌと表記する。得られた分子量５０，０００以上の画分（ε−ＰＬＬ４０Ｈ）、１０，０００〜５０，０００の画分（ε−ＰＬＬ４０Ｌ）をそれぞれ、サンプルチューブに入れ、液体窒素を用いて凍結させた後、凍結乾燥し、白色粉末として各々１２ｍｇのε−ＰＬＬ４０Ｌ，及び１０ｍｇのε−ＰＬＬ４０Ｈを得た。元素分析値（重量％）及びそのＮ重量％から算出した、プロトン化可能窒素数を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2006304644.tif 000003
【００２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量評価 
アクリルアミド濃度１５ｗ／ｖ％の分離ゲルを用い電気泳動を行った。泳動サンプル３μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）に超純水（milliQ） ２μｌと２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｗ／ｖ％２−メルカプトエタノール、４ｗ／ｖ％ＳＤＳ、及び１０ｗ／ｖ％スクロースを含む０．１２５Ｍ（ｍｏｌ／ｌ）トリスバッファー）を５μｌ加え調製したサンプル溶液を９５℃で３分間ボイルした。１００Ｖ、３０ｍＡで約２時間泳動後、ゲルを一晩クーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。その後、ゲルを約１２時間脱色し、写真を撮影した結果を図１に示す。
熱処理により分子量１０，０００以下の成分はほとんど見られなくなった。また、分子量分画によりε−ＰＬＬ４０Ｈには分子量５０，０００以下の成分はほとんど含有されていないことがわかる。一方、ε−ＰＬＬ４０Ｌは分子量５０，０００以下の成分が主成分であることがわかる。
【００２７】
（実施例２）
プラスミドＤＮＡ複合体の調製 
実施例１で得られた分子量分画を行った高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを用いて、あらかじめプロトン化可能窒素原子濃度が７．７ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように１０ｗ／ｖ％ＰＢＳ溶液を調製した（溶解させる際、必要に応じて加熱・超音波処理を行った）。１条件あたり０．２μｇ／μｌのｐＧＬ３−Control（ＣＯＳ−１へのルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ：配列番号１）溶液５μｌと所定量の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン溶液を１０ｗ／ｖ％ＰＢＳ溶液中（５０μｌ）で混合し、ＤＮＡ複合体形成を行った。
【００２８】
（比較例１）
実施例２の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを、ε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ、数平均分子量４，０００、チッソ（株）製）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５，０００、アルドリッチ社製）、及びα−ポリリジン（α−ＰＬＬ、分子量５，０００〜１５，０００、和光純薬工業（株）製）に変えた以外は実施例２と同様にしてプラスミドＤＮＡ複合体を調製した。
【００２９】
ＤＮＡ複合体形成のゲル電気泳動法による確認 
プラスミドＤＮＡは負に帯電したリン酸基が正電荷方向に電気泳動する。さらにゲルマトリックスの網目の隙間を泳動するためプラスミドＤＮＡがポリカチオン性修飾ポリマーと複合体を形成することにより分子量が大きくなるほど移動度は減少する。そこで、実施例２、及び比較例１に記載の方法で高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン、及びε−ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、α−ポリリジンをプラスミドＤＮＡ量一定のもと添加し、アミノ基カチオン量／リン酸アニオン量（Ｎ／Ｐ）を変化させ、複合体を形成させた後、１ｗ／ｖ％アガロースゲル用いて１００Ｖで４０分間電気泳動させ、エチジウムブロマイドで染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。
【００３０】
図２に結果を示した。アガロースゲル電気泳動の結果によると、どのサンプルも添加量の増大に伴って、プラスミドＤＮＡの移動度は減少しており、複合体の形成が確認された。実施例２の高分子量ε−ポリ−Ｌ−リジンは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と比較するとよわいものの、比較例１のε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ）、及びα−ポリリジンと比較して明らかにプラスミドＤＮＡに対する親和性が増大していることがわかる。
【００３１】
（実施例３）
トランスフェクション操作及び発現タンパクの定量 
実施例１にて得られた高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを用いて、ＣＯＳ−１（アフリカ緑ザル腎細胞）へのルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡであるｐＧＬ3-Controlの導入、発現評価を行った。
【００３２】
あらかじめプロトン化可能な窒素原子濃度が７．７ｍＭとなるように高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの１０ｗ／ｖ％ＰＢＳ溶液を調製した（溶解させる際、必要に応じて加熱・超音波処理を行った）。１穴あたり０．２μｇ／μｌのｐＧＬ３-Control溶液５μｌと所定量の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの１０ｗ／ｖ％ＰＢＳ溶液を１０％ｗ／ｖＰＢＳ溶液中（５０μｌ）で混合し、ＤＮＡ複合体形成をおこなった。
【００３３】
２４穴マイクロプレートにＣＯＳ−１を３〜４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一晩ＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０ｗ／ｖ％含む）を用い３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２で培養した細胞の培地をアスピレーターで取り除き、新たに１穴当り２００μｌずつ通常の濃度より１．２５倍濃い培地を加えた。先のＤＮＡ複合体溶液（５０μｌ）を加え、３７℃で３時間細胞を培養し、複合体の細胞への導入をおこなった。アスピレーターで培地を取り除いて、新たに培地を１穴当り１ｍｌずつ加え３７℃で４８時間培養した。
【００３４】
培養した細胞中に含まれるルシフェラーゼの発現量は下記文献を参照し、Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega社製)を用いそのプロトコールに従い化学発光量を定量し、トランスフェクション活性とした。その際、ルミノプレートリーダー（ThermoLab Systems社製, Fluoro Acent FL）を用いた。
文献：Wood, K.V. (1991) In: Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status, Stanley, P. and Kricka, L., eds., John Wiley and Sons, Chichester, NY, 11.
【００３５】
（比較例２）
実施例３で用いた高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを、ε−ポリ−Ｌ−リジン（ε-ＰＬＬ、数平均分子量４，０００、チッソ（株）製）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５，０００、アルドリッチ社製）、及びα-ポリリジン（α-ＰＬＬ、分子量５，０００〜１５，０００、和光純薬工業（株）製）に変えた以外は実施例３と同様にしてトランスフェクション操作、及び発現タンパクの定量を行った。
【００３６】
結果を図３に示した。比較例２で用いたポリアミン系トランスフェクション剤であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と比較して、高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンの発現タンパク活性は高い。また、ε−ポリ−Ｌ−リジン（ε-ＰＬＬ）と比較した場合、その発現効率は２０倍以上の高い活性を示し、特に分子量１０，０００〜５０，０００の成分を分画したε−ＰＬＬ４０Ｌは優れたトランスフェクション活性を示しており、トランスフェクション剤として有効であることが確認できた。また、α-ポリリジンよりもはるかにトランスフェクション活性が優れていることは明白である。
【００３７】
細胞毒性評価 
実施例１にて得られた高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンを用いて、ＣＯＳ−１（アフリカ緑ザル腎細胞）に対する細胞毒性評価を行った。
【００３８】
９６穴マイクロプレートにＣＯＳ−１（アフリカ緑ザル腎細胞） ５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  を播種し、一晩ＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０ｗ／ｖ％含む）を用い３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２で培養した。細胞の培地をアスピレーターで取り除き、新たに１穴当り４０μｌずつ通常の濃度より１．２５倍濃い培地を加えた。それぞれの濃度の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン溶液（１０μｌ）を加え、３７℃で３時間細胞を培養した。３時間培養後、アスピレーターで培地を取り除いて、新たに培地を１穴当り１１０μｌずつ加え、３７℃、５５ｖ／ｖ％ＣＯ２インキュベーターで４６時間前培養した。培地を交換し、ＷＳＴアッセイ（下記文献参照）液(（株）同仁化学研究所製,Cell-counting Kit-8)を１０μｌずつ加え、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２インキュベーターで２時間培養し呈色反応を行った。プレートリーダー（ThermoLab Systems社製, MultiSkan Acent BIF）を用い、４５０ｎｍ（リファレンス ６５０ｎｍ）の吸光度を測定し細胞生存率を算出した。
文献：Ishiyama, M., Miyazono, Y., Sasamoto, K., Ohkura, Y., Ueno, K., Talanta, 44, 1299 (1997). 
【００３９】
結果を図４に示した。一般に、トランスフェクション活性と比例して細胞毒性は増大する。今回の高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンは高分子量化していないε−ポリ−Ｌ−リジン（ε-ＰＬＬ）と比較すると細胞毒性が高い結果となった。分子量の増加と共に細胞毒性は増大し、その特性は分子量５０，０００以上のε−ＰＬＬ４０Ｈでは顕著である。それに対して、ε−ＰＬＬ４０Ｈよりトランスフェクション活性が高いε−ＰＬＬ４０Ｌがε−ＰＬＬ４０Ｈと比較して細胞毒性が低いことは注目に値する。また、ε−ＰＬＬ４０Ｌの細胞毒性は実際のトランスフェクション条件下（１０ｍｇ／ｌ）ではではほとんど見られず、ε−ＰＬＬ４０Ｌの安全性の高さが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
プラスミドＤＮＡを用いる遺伝子治療用の非ウィルスベクターとして利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例１）
【図２】ＤＮＡ複合体形成のゲル電気泳動法による分子量の確認
【図３】高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジンのトランスフェクション活性
【図４】高分子量化ε−ポリ−Ｌ−リジン処理時の細胞生存率
【図１】
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【図２】
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【図３】
2006304644.tif 000007
【図４】
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【配列表】
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