(57)【要約】【課題】  従来の遺伝子解析の検体管理方法は容器の内外に標識をつける方法であり、容器から取り出したり、容器を交換した場合、検体管理にエラーが生じる可能性があった。【解決手段】  解析対象となるＤＮＡ（検体由来のＤＮＡ）２と塩基配列が解析対象の情報の標識となっているＤＮＡ（標識ＤＮＡ）３を同一のベクター１の別のサイトに組み込んで管理する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
管理対象となるＤＮＡ（検体由来のＤＮＡ）、及び塩基配列が該管理対象となるＤＮＡの管理情報となるＤＮＡ（標識ＤＮＡ）を、複数のクローニングサイトを有する同一のベクターの別々のサイトに組み込んで管理することを特徴とするＤＮＡの管理方法。
【請求項２】
請求項１の遺伝子解析の管理方法において、１個のベクターに組み込まれる管理対象となるＤＮＡが１個であることを特徴とするＤＮＡの管理方法。
【請求項３】
請求項１の遺伝子解析の管理方法において、１個のベクターに組み込まれる管理対象となるＤＮＡが複数であることを特徴とするＤＮＡの管理方法。
【請求項４】
塩基配列が管理対象の管理情報となっているＤＮＡ（標識ＤＮＡ）を、複数のクローニングサイトを有するベクターの１個のサイトに組み込んであることを特徴とする管理情報付きベクター。
【請求項５】
管理対象となるＤＮＡ（検体由来のＤＮＡ）、及び塩基配列が該管理対象のＤＮＡの標識となっているＤＮＡ（標識ＤＮＡ）を、複数のクローニングサイトを有する同一のベクターの別々のサイトに組み込んだことを特徴とする標識付きＤＮＡ。
【請求項６】
複数のＤＮＡ情報からなる遺伝子ライブラリーであって、各ＤＮＡが、管理対象となるＤＮＡ（検体由来のＤＮＡ）及び塩基配列が該管理対象となるＤＮＡの管理情報・管理標識となるＤＮＡ（標識ＤＮＡ）を、複数のクローニングサイトを有する同一のベクターの別々のサイトに組み込んだことを特徴とする遺伝子ライブラリー。
【請求項７】
遺伝子の保存方法であって、遺伝子中の検査対象となるＤＮＡ（検体由来のＤＮＡ）及び塩基配列が該検査対象となるＤＮＡの管理情報・管理標識となるＤＮＡ（標識ＤＮＡ）を、複数のクローニングサイトを有する同一のベクターの別々のサイトに組み込むことにより、該検査対象となるＤＮＡに標識を付与するとともに、該検査対象となるＤＮＡの解析時に同時に該標識となっているＤＮＡを読取ることを特徴とする遺伝子の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ解析すなわち、遺伝子解析に関する技術であり、とくに解析対象の検体のトレーサビリティ確保を必要とする遺伝子解析に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解析完了などに代表されるように遺伝子解析技術の発展は著しく、さらにすでに各種の診断・検査など医療分野への応用も行われている。
【０００３】
以下、ヒトの遺伝子解析で最も盛んに行われている一塩基多型解析を例として従来の技術を説明する。
【０００４】
ヒトの一塩基多型解析では、通常、血液や対象臓器からゲノムＤＮＡを抽出し、解析対象となる領域をＰＣＲ法で増幅して検体とする。そして、そのＤＮＡを化学発光法、質量分析、塩基配列解析を原理とする方法で解析する。この際の検体の管理は検体を入れた容器に記名したり、バーコードを添付したり、あるいはＩＣタグと呼ばれる電子認証チップを容器に添付したり、容器内に入れたりして行われる。
【０００５】
この遺伝子研究向けバーコードの適用例としては、三井情報開発株式会社が開発したＳＣＴＳ２１という名称の方法（http://bio.mki.co.jp/whatsnew/20031009.html）やアプライドバイオシステムズジャパン社が開発したバーコード利用法（http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product）がある。前者は、この方法は「ヒト由来試料と研究成果のトレーサビリティを実現するシステムとして検体提供者、研究者の双方にメリットを見込めるシステムとなっている」としている。また、後者は、「多サンプル測定や多数ユーザーが１台の機器を利用する場合、実際のサンプルとサンプル情報を管理することは、正確かつスムーズに実験を進める上でとても重要です」とし、この方法でこの課題が解決できると記載しており、実際のイメージ図を示している。
【０００６】
なお、遺伝子解析としてはマイクロサテライトを利用した多型解析やＤＮＡチップを用いた解析など多くの種類があるが、検体の管理方法は上記と同じ方法である。
【０００７】
上記した従来の技術では検体自体に標識がついているのではないため、検体を移した際には管理にエラーが起こる可能性がある。とくに、検体がＳＮＰ解析など特定のＤＮＡ領域をＰＣＲして調整した場合、大部分が共通の塩基配列となり、検体の由来の情報を検体由来の部分から特定することはできない。更に、これまでの遺伝子解析は研究開発や臨床研究など限られた人数の検体については適用できたが、今後、遺伝子解析が一般化した場合、検体数は著しく増加し、かつ、保管する期間も長くなり、従来の技術では検体のトレーサビリティの確保は困難となる。
【０００８】
又、下記特許文献１には、試料由来のＤＮＡに、識別子として用いるＤＮＡを結合させることが開示されている。しかし、この方法は、両者の直接的結合であるため、識別子として用いるＤＮＡを結合させる際に試料由来のＤＮＡを損傷させる恐れがあった。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５７７６７３７号明細書（ＷＯ０２／３８８０４号公報）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、検体のトレーサビリティの確保を容易とする標識付与手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、検体由来のＤＮＡと標識となるＤＮＡを同一のプラスミドなどのベクターに組み込むことにより、検体自体に標識をつけることにより従来の技術の問題点を解決して検体のトレーサビリティを確保する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、検体を容器から取り出したり、容器を交換しても検体の由来が塩基配列確認により確定でき、遺伝子解析のトレーサビリティが大幅に改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１は本発明で作製した検体管理用プラスミドの構造の概念図で、複数のクローニングサイトを有するベクターＤＮＡ１にあるサイトに解析対象ＤＮＡ２を組み込み、別のクローニングサイトに標識用ＤＮＡ３が組み込まれている。この構造のため、塩基配列決定を行えば、長期間の保存後や容器交換後も検体の由来が確認できる。
【００１４】
解析対象ＤＮＡはゲノムなどのＤＮＡからのＰＣＲなどの遺伝子工学手法により取得する。標識用ＤＮＡの塩基配列は管理する目的により様々な形式をとり、表記する内容は検体採取場所や検体採取機関の名称、検体採取時期、検体提供者名、薬剤服用や治療行為の有無などで、とくに制限ない。
標識用ＤＮＡは合成やＰＣＲにより作製でき、とくに製法に制限はない。
【００１５】
塩基配列で標識とする方法も多くあり、例えば、２値・２ビットでは００、０１，１０，１１の表記をＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔで表現したり、ＡＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧＡ、ＡＧＧＧＡなどのようにＡ−Ａの間のＧの数で１，２，３を標識したり、ＡＧ，ＡＧＡＧ、ＡＧＡＧＡＧのように特定の塩基の組み合わせとその繰り返し数を標識とすることなどが可能である。すなわち、遺伝子解析の検体数が増加しても問題となることはない。また、特定ＤＮＡの領域を規則的にずらしてＰＣＲすれば、標識となるＤＮＡが調製できる。なお、２値・２ビット表記利用方式、Ａ−Ａの間のＧの数利用方式は記載が一般的に理解しやすいので公的な場合など広い範囲で使用するのみ好適であり、特定の塩基の組み合わせとその繰り返し数方式や特定ＤＮＡのＰＣＲ利用方式は関係者しか内容を把握できない暗号的な使用に好適である。
【００１６】
以下、本発明の実施例を説明する。
【実施例１】
【００１７】
標識用ＤＮＡで表記する内容を検体採取期日の２００４０２２６と２００４０２２７とし、数字の０、１，２，３，４，５，６，７，８，９をＡＡ，ＡＧ，ＡＣ，ＡＴ，ＧＡ，ＧＧ，ＧＣ，ＧＴ，ＣＡ，ＣＧと表記するとして方式を採用して標識用ＤＮＡの一方となる一本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、標識用ＤＮＡの一方となる一本鎖ＤＮＡ塩基配列は２００４０２２６採取検体ではＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣとなり、２００４０２２７採取検体はＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＴとなる。また、これらと相補配列である一本鎖ＤＮＡも合成し、それらの２本鎖とし、標識用ＤＮＡとした。
【００１８】
次に複数のクローニングサイトを有するプラスミドＤＮＡであるｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトに２００４０２２６採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだクローンと２００４０２２７採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだ２種のクローンを調製した。
【００１９】
そして、２００４０２２６採取検体のゲノムからＰＣＲにて調製したＰＣＲ産物を２００４０２２６採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだクローンのＳｍａＩサイトに組み込んだ。また、２００４０２２７採取検体のゲノムからＰＣＲにて調製したＰＣＲ産物を２００４０２２７採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだクローンのＳｍａＩサイトに組み込んだ。
【００２０】
そしてさらに、これらの２種類のプラスミドについてｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトの塩基配列解析用のユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡシーケンサで標識用ＤＮＡの塩基塩基配列を確認し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトの塩基配列解析用のユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡシーケンサで解析対象ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００２１】
上記の２種類のプラスミドは標識を内部に持っており、長期間の保管や容器を変えても、その由来は特定できる。
【実施例２】
【００２２】
標識用ＤＮＡで表記する内容を検体採取場所のＨＩＴＡＣＨＩ（日立）とＴＯＫＹＯとし、現在一般に使用されている電子計算機の８ビット表記を採用し、それぞれ２ビットの００、０１，１０，１１をＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔで表記する方法で標識用ＤＮＡの一方となる一本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、標識用ＤＮＡの一方となる一本鎖ＤＮＡ塩基配列はＨＩＴＡＣＨＩ採取検体ではＧＡＣＡＧＡＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧとなり、ＴＯＫＹＯ採取検体はＧＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴとなる。また、これらと相補配列である一本鎖ＤＮＡも合成し、それらの２本鎖とし、標識用ＤＮＡとした。
【００２３】
次に複数のクローニングサイトを有するプラスミドＤＮＡであるｐＥＴ−２８−ｃ(+)ＶｅｃｔｏｒのＸｈｏ１サイトにＨＩＴＡＣＨＩ採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだプラスミドとＴＯＫＹＯ採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだ２種のプラスミドを調製した。
【００２４】
そして、ＨＩＴＡＣＨＩ採取検体のゲノムからＰＣＲにて調製したＰＣＲ産物をＨＩＴＡＣＨＩ採取検体標識用ＤＮＡを組み込んだプラスミドのＢａｍＨ１サイトに組み込んだ。また、ＴＯＫＹＯ採取検体のゲノムからＰＣＲにて調製したＰＣＲ産物をＴＯＫＹＯ採取検体標識用ＤＮＡを組み込んプラスミドのＢａｍＨ１サイトに組み込みんだ。
【００２５】
そしてさらに、これらの２種類のプラスミドについてｐＥＴ−２８−ｃ（＋）ＶｅｃｔｏｒのＸｈｏ1サイトの塩基配列解析用のユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡシーケンサで標識用ＤＮＡの塩基塩基配列を確認し、ｐＥＴ−２８−ｃ（＋)ＶｅｃｔｏｒのＢａｍＨ1サイトの塩基配列解析用のユニバーサルプライマーを用いてＤＮＡシーケンサで解析対象ＤＮＡの塩基塩基配列を確認した。
【００２６】
上記の２種類のプラスミドは標識を内部に持っており、長期間の保管や容器を変えても、その由来は特定できる。
【００２７】
なお、上記ではゲノムからＰＣＲする部分を特定して記載していないが、それは塩基配列が個人の遺伝情報に関わるためであり、このＰＣＲ操作で遺伝子サンプルを得られることは公知となっているためである。
【００２８】
また、上記の実施例２，３ではプラスミドとクローニングサイトの具体名を記載したが他のプラスミドやクローニングサイトを利用しても本発明の効果は得られ、プラスミド以外にもラムダファージやＢＡＣ、ＰＡＣなどのベクターでも本発明の効果は得られる。
【００２９】
またさらに、上記の例では解析対象となるＤＮＡは１種類であったが、解析対象となるＤＮＡが複数であっても本発明の技術は適用でき、かつ、例えば同一の検体提供者から採取したＤＮＡを一括して管理できるなど、有効性はさらに高くなる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、検体を容器から取り出したり、容器を交換しても検体の由来が塩基配列確認により確定でき、遺伝子解析のトレーサビリティが大幅に改善される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の検体管理用プラスミドの構造の概念図。
【符号の説明】
【００３２】
１…複数のクローニングサイトを有するベクターＤＮＡ、２…検体由来のＤＮＡ、３…標識となるＤＮＡ（標識用ＤＮＡ）
【図１】
2006081475.tif 000003
【配列表】
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