(57)【要約】【課題】KLF7の発現またはその活性を評価することによる、糖尿病の治療または予防薬の効率的なスクリーニング方法、前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に行い得るスクリーニング用キットを提供すること。【解決手段】被検物質の存在下に、KLF7の発現または活性を評価することを特徴とする、糖尿病の治療または予防薬のスクリーニング方法、ならびに（１）KLF7、（２）KLF7をコードする核酸、（３）KLF7をコードする核酸が導入された細胞、および（４）KLF7に対する抗体またはその断片からなる群より選択される少なくとも１種を含有してなる、該スクリーニング方法に用いるためのキット、【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の存在下に、KLF7の発現または活性を評価することを特徴とする、糖尿病の治療または予防薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
（Ｉ）KLF7をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ＩＩ）被検物質の存在下、工程（Ｉ）で得られた細胞においてKLF7の発現量または活性を測定する工程、および
（ＩＩＩ）被検物質の非存在下で測定した発現量または活性と比較し、それにより、発現の抑制または活性の阻害をもたらす被検物質を糖尿病の治療または予防薬の候補物質として選択する工程、
を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
KLF7の活性が、KLF7により発現が影響を受ける遺伝子の発現量により測定される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がインスリン遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、レプチン遺伝子、アディポネクチン遺伝子およびIL-6遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
糖尿病がII型糖尿病である請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
（１）KLF7、
（２）KLF7をコードする核酸、
（３）KLF7をコードする核酸が導入された細胞、および
（４）KLF7に対する抗体またはその断片
からなる群より選択される少なくとも１種を含有してなる、請求項１〜５いずれか記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【請求項７】
請求項１〜５いずれか記載の方法により得られる物質を有効成分として含有してなる糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項８】
KLF7遺伝子の第２イントロンの塩基配列における変異を検出することを特徴とする、糖尿病の発症に寄与する核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療または予防薬のスクリーニング方法、糖尿病に対する医薬組成物、糖尿病の診断薬および診断方法ならびに糖尿病の診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、多飲、多尿、体重減少などの症状、慢性の高血糖を主な特徴とし、一般的に、網膜症、腎症、末梢神経障害などの合併症を伴う疾患である。糖尿病は、病因により、一次性糖尿病（インスリン依存性糖尿病（I型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（II型糖尿病））、二次性糖尿病（膵臓性糖尿病、膵外性／内分泌性糖尿病、薬剤誘発性糖尿病）などに分類されている。さらに、糖尿病は、心筋梗塞、脳梗塞などの動脈硬化性疾患の危険因子となることが知られている。
【０００３】
従来、糖尿病の治療方法として、例えば、食事療法、運動療法などによる生活改善をはじめ、インスリン注射、インスリン分泌調節因子またはインスリン感受性調節因子などの糖代謝に関連する因子の制御、α−グルコシダーゼなどの糖吸収に関連する因子の機能の制御などを標的とする治療方法が行われていた。
【０００４】
一方、マウスKLF7（Kruppel-like transcription factor 7）は、神経発生に重要な役割を果たすことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、前記KLF7は、末梢神経系におけるTrkA（神経成長因子（NGF）に対するレセプター）遺伝子発現を調節し得ることも報告されている。（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Laub, F.ら、Dev, Biol. 2001 May 15;233(2):305-18
【非特許文献２】Lei L.ら、Development. 2001 Apr:128(7)1147-58
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の糖尿病の治療方法を適用しても、所望の効果が得られない症例もある。
【０００６】
ヒトKLF7は、そのアミノ酸配列から転写因子であると推測されるが、その詳細な機能については明らかになっていない。さらに、KLF7が糖尿病の発症にどのように関連しているかについては未だ不明である。
【０００７】
従って、本発明は、KLF7の発現またはその活性を評価することによる、糖尿病の治療または予防薬の効率的なスクリーニング方法、前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に行い得るスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、前記スクリーニング方法により得られる、糖尿病の治療または予防薬として好適に使用される物質、糖尿病の治療または予防に好適な前記物質を有効成分とする医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、糖尿病患者から得られた被検試料から、糖尿病の発症に寄与する核酸を、容易に検出する検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕被検物質の存在下に、KLF7の発現または活性を評価することを特徴とする、糖尿病の治療または予防薬のスクリーニング方法、
〔２〕（１）KLF7、
（２）KLF7をコードする核酸、
（３）KLF7をコードする核酸が導入された細胞、および
（４）KLF7に対する抗体またはその断片
からなる群より選択される少なくとも１種を含有してなる、前記〔１〕記載のスクリーニング方法に用いるためのキット、
〔３〕前記〔１〕記載の方法により得られる物質を有効成分として含有してなる糖尿病を治療するための医薬組成物、ならびに
〔４〕KLF7遺伝子の第２イントロンの塩基配列における変異を検出することを特徴とする、糖尿病の発症に寄与する核酸の検出方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の糖尿病の治療または予防薬のスクリーニング方法によれば、糖尿病患者において、糖尿病を治療し得、かつKLF7に基づく糖尿病に対して作用し得る物質を、簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖尿病に対する医薬組成物によれば、糖尿病患者において、糖尿病を治療または該糖尿病の発症を予防することができ、KLF7に基づく糖尿病に対して症状を軽減または発症を予防することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の糖尿病の発症に寄与する核酸の検出方法によれば、糖尿病患者から得られた被検試料から容易に検出することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法は、被検物質の存在下に、KLF7遺伝子の発現またはKLF7の活性を評価することを１つの大きな特徴とする。
【００１３】
従来の糖尿病関連遺伝子は、インスリン発現、インスリン分泌またはインスリン応答性などに関与する個々の因子をコードする遺伝子であったが、KLF7はその全てに関与する転写因子であることより、全ての糖尿病患者に使用可能な薬物をスクリーニングできるという効果が奏される。
【００１４】
すなわち、糖尿病の発症との関連が認められるKLF7の発現またはその活性に対する被検物質による影響を調べることにより、糖尿病に対する治療または予防薬として有効な物質のスクリーニングを効率的に行うものである。KLF7の発現またはその活性に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における該発現を対照として調べるのが好適である。
【００１５】
また、本発明のスクリーニング方法は、糖尿病に対する治療または予防薬の候補物質の薬理評価に用いることができる。
【００１６】
本発明に用いられるKLF7は、神経発生または末梢神経系におけるTrkA遺伝子発現の調節に関与していることが知られている因子であり、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１７】
本発明は、II型糖尿病患者において、KLF7遺伝子の第２イントロンにおいて、驚くべきことに、35092番目がAとなる遺伝子型が高い頻度で見られ、KLF7の異常発現により、糖尿病の悪化または憎悪に関連する症状が現れるという本発明者らの知見に基づく。すなわち、本発明は、神経系に作用することが知られていたKLF7が、予想外にも糖尿病に関連するという本発明者らの知見に基づく。
【００１８】
本発明に用いられるKLF7遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。
【００１９】
Human Adipocyte Marathon-Ready cDNA（CLONTECH社製）を鋳型としヒトKLF7特異的プライマーを用いてPCRをおこなうことによりヒトKLF7 cDNAのクローニングを行う。ヒトKLF7特異的プライマーはセンス鎖5'-TGAGCCAGACAGACTGACAA-3'（配列番号：３）、アンチセンス鎖5'-CCTTTAGACACTAGCCGATG-3'（配列番号：４）を用い、PCRはKOD-PLUS（TOYOBO社製）を使用し、95℃で2分を1サイクル、94℃で15秒、55℃で30秒、68℃で2分を30サイクル行う。その後、Ex Taq（タカラバイオ社製）を少量添加し、72℃で2分間反応させる。得られたPCR産物を0.8％アガロースゲルで電気泳動し目的のDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1 vectorへ組み込む。得られたプラスミドpCR2.1-KLF7のヒトKLF7領域の塩基配列をM13-Forwardプライマー：5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'（配列番号：５）およびM13-Reverseプライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'（配列番号：６）を用いたシークエンスをおこなうことにより確認する。シークエンス反応はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用い、電気泳動および解析はApplied Biosystems 3700 DNA Analyzerを用いて行う。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法に用いられる「被検物質」としては、例えば、生物の細胞抽出物、該生物の無細胞抽出物、該生物の細胞培養上清などの試料中に含まれた物質、生物学的に産生された物質、化学的に合成された化合物などが挙げられる。
【００２１】
被検物質としては、より具体的には、化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、各種タンパク質、核酸、核酸アナログ、抗体、抗体断片などが挙げられる。なお、前記化合物には、コンビナトリアルケミストリーにより得られたコンビナトリアルライブラリーの化合物も含まれる。また、前記抗体および抗体断片には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fabフラグメントなどが含まれる。前記核酸および核酸アナログには、アンチセンス核酸、リボザイム、PNAなどが含まれる。
【００２２】
ここで、前記生物としては、例えば、植物、動物、微生物などが挙げられる。
【００２３】
前記「KLF7の活性」としては、「KLF7を発現させることにより引き起こされる事象」が挙げられる。
【００２４】
前記事象としては、具体的には、種々の遺伝子発現の調節、インスリンの分泌の抑制、脂肪細胞への分化の抑制などが挙げられる。遺伝子発現の調節としては、例えば、インスリン遺伝子発現の抑制、ヘキソキナーゼ遺伝子発現の抑制、レプチン遺伝子発現の抑制、アディポネクチン遺伝子発現の抑制、IL-6遺伝子発現の亢進などが挙げられる。本発明のスクリーニング方法においては、かかる事象をKLF7の活性の指標として評価することにより、より簡便に、KLF7に対する被検物質の活性を評価することができるという優れた効果を奏する。従って、KLF7の活性が各遺伝子発現の調節を指標として評価される場合、該遺伝子がKLF7により発現が影響を受けるように動作可能に連結されていることが好ましい。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、KLF7遺伝子を発現させることにより引き起こされる事象を、被検物質の存在下に評価する。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法は、より具体的には、（Ｉ）KLF7をコードする核酸を細胞に導入する工程、
（ＩＩ）被検物質の存在下、工程（Ｉ）で得られた細胞においてKLF7の発現量または活性を測定する工程、および
（ＩＩＩ）被検物質の非存在下で測定した発現量または活性と比較し、それにより、発現の抑制または活性の阻害をもたらす被検物質を糖尿病の治療または予防薬の候補物質として選択する工程、
を含む。
【００２７】
KLF7をコードする遺伝子を含む核酸としては、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸などが挙げられる。
【００２８】
なお、本発明においては、コードされるポリペプチドが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、野生型KLF7ともいう）と同等の生物学的活性を呈するものであれば、前記KLF7をコードする核酸は、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸のバリアントであってもよい。
【００２９】
野生型KLF7と同等の生物学的活性とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。従って、上記活性が同等（例えば、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３０】
前記野生型KLF7をコードする核酸のバリアントとしては、例えば、
１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基、具体的には、1個もしくは複数個、好ましくは、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
２）野生型KLF7をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る核酸、
３）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対し、Lipman-pearson法（Science, 227, p1435(1985)）により、最適な状態にアラインメントされ、算出された値であり、少なくとも50％、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上である塩基配列からなる核酸
などが挙げられる。
【００３１】
前記１）の核酸は、天然由来のバリアントであってもよく、人為的な変異を有する変異体であってもよい。人為的な変異を有する変異体は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版などの記載に準じ、部位特異的変異導入法などにより作製され得る。
【００３２】
本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（1×SSCの組成：0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）と0.5％SDSと5×デンハルトと100μg/ml変性サケ精子DNAと50％ホルムアミドとを含む溶液中、50℃、よりストリンジェントには、60℃で12時間インキュベーションし、低イオン強度、例えば、0.5×SSC、よりストリンジェントには、0.1×SSCなどの条件および／またはより高温、50℃以上、よりストリンジェントには、55℃、さらにストリンジェントには、60℃、より一層ストリンジェントには、65℃などの条件下での洗浄を行う条件が挙げられる。
【００３３】
なお、前記工程（Ｉ）において、前記KLF7をコードする核酸を細胞に導入する際、該核酸を適切なベクターに連結し、得られた組換えベクターを慣用の遺伝子導入法により、細胞に導入してもよい。また、前記工程（Ｉ）においては、前記核酸を、いわゆるnaked-DNAとして用いてもよく、リポソーム、金粒子、ウイルス抽出物などの慣用の担体に担持させ、得られた産物（以下、核酸導入用担体ともいう）を用いてもよい。
【００３４】
前記ベクターとしては、安定発現細胞株を樹立する観点から、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子を含有しているベクターが望ましく、例えば、pcDNA3.1、pCDM8、pREP、pUC19、pTrxFus（商品名、Invitrogen社製）、pET-3、pET-11、pBluescriptII SK（+）、pBluescriptII SK（-）、pCMV-Script（STRATAGENE社製）、pCl-neo（プロメガ社製）、pAxCAwr、pUC118、pSTV28（タカラバイオ社製）などが挙げられる。
【００３５】
前記遺伝子導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology,3(2),133-140(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平2-227075号公報）、リポフェクション法（Proceedings of the National Academy of Sciences USA,84,7413(1987)；Vilology,52,456(1973)）、DEAEデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法などが挙げられる。
【００３６】
ウイルスを使用した方法を使用する場合、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどを用いることが好ましい。
【００３７】
前記細胞としては、哺乳動物細胞が好ましく、例えば、HIT-T15（ハムスターβ細胞、大日本製薬社製）、HPA（ヒト脂肪細胞、Zen-Bio,Inc.社製）、L6（ラット骨格筋細胞、ATCC：CRL-1458）、3T3-L1（マウス線維芽細胞、ATCC：CL-173）、ヒト由来株細胞のHEK293（ヒト胎児腎細胞、ATCC：CRL-1573）、HeLa（子宮頚部癌細胞、ATCC：CCL-2）HBT5637（白血病細胞、特開昭63-299）、BALL-1（白血病細胞）およびHCT-15（大腸癌細胞）、ヒト腎糸球体上皮細胞、マウス由来株細胞のSp2/0-Ag14（マウス骨髄種細胞、ATCC：CRL-1581）およびNSO（マウス骨髄種細胞）、マウス腎糸球体上皮細胞、サル由来株細胞のCOS-1（アフリカミドリザル腎細胞（SV40形質転換細胞）、ATCC：CRL-1650）およびCOS-7（アフリカミドリザル腎細胞（SV40形質転換細胞）、ATCC：CRL-1651）、ハムスター由来株細胞のCHO-K1（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ATCC：CCL-61）およびBHK-21（C-13）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ATCC：CCL-10）、ラット由来株細胞のPC12（副腎褐色細胞腫、ATCC：CRL-1721）およびYB2/0（ラット骨髄種細胞、ATCC：CRL-1662）、ラット腎糸球体上皮細胞などが挙げられる。なかでも、治療薬スクリーニングのする観点から、好ましくは、ヒト由来細胞が望ましい。
【００３８】
ついで、工程（ＩＩ）において、被検物質の存在下に、KLF7を発現する細胞におけるKLF7の発現量または活性を測定する。
【００３９】
工程（ＩＩ）において、KLF7の発現量または活性は、例えば、
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞からtotal RNAを抽出し、得られたtotal RNAを鋳型とし、KLF7、インスリン、ヘキソキナーゼ、レプチン、アディポネクチンおよびIL-6（本明細書において、評価対象という場合がある）に応じたプライマー（対）を用いてRT-PCRを行う方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞からtotal RNAを抽出し、得られたtotal RNAを鋳型としてcDNAを合成し、評価対象に応じたプライマーおよびプローブを用いてリアルタイム定量PCRを行う方法；
−評価対照のプロモーター領域にレポーター遺伝子を連結したものを細胞に導入し、被検物質を含有した培地で培養して得られた細胞を用いてレポーターアッセイを行う方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞からtotal RNAを抽出し、評価対象に応じたプローブを用いて、ノーザンブロット解析を行う方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞から無細胞抽出液を調製し、得られた無細胞抽出液と評価対象に対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行う方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた培養上清と評価対象に対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行う方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞または細胞上清における評価対象の量を定量することのできるアッセイキットを用いる方法；
−被検物質を含有した培地で細胞を培養し、得られた細胞における脂肪細胞への分化を評価することのできるアッセイに供する方法；
などにより、測定され得る。なかでも、スクリーニングを迅速かつ多量に行う観点から、迅速かつ多量に処理可能な方法が望ましく、好ましくは、イムノアッセイおよびレポーターアッセイが望ましい。
【００４０】
前記培地としては、哺乳動物由来細胞の培養に適した培地であればよく、例えば、MEM培地（Science, 130, 432（1959））、DMEM培地（Virology, 8, 396（1959））、RPMI1640培地（The Journal of the American Medical Association, 199, 519（1967））などにウシ胎仔血清（FCS）を適量添加したものなどが挙げられる。
【００４１】
培養は、例えば、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行うことができる。培養温度、培養時間および培養液のpHは、各種宿主に適した範囲に設定される。例えば、培養は、通常、15〜40℃、5時間〜7日間、pH3.0〜9.0、5％ CO2存在下などの条件で行われ得る。pHの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行い得る。また、所望により抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４２】
本発明において用いられるプライマーは、例えば、Tm値など、公知配列、核酸の二次構造の形成などを考慮し、プライマーのデザインを支援する慣用のソフトウェアなどにより作製され得る。プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、15〜40ヌクレオチド長であり、好ましくは、17〜30ヌクレオチド長であることが望ましい。
【００４３】
用いられ得るプライマー対としては、例えば、KLF7遺伝子について、配列番号：３０に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：３１に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対；インスリン遺伝子について、配列番号：７に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対；ヘキソキナーゼ遺伝子について、配列番号：９に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：１０に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対；アディポネクチン遺伝子について、配列番号：１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：１２に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対；IL-6遺伝子について、配列番号：１３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：１４に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対；レプチン遺伝子について、配列番号：１５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：１６に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対などが挙げられる。
【００４４】
本発明において用いられるプローブは、前記プライマーと同様に、例えば、Tm値など、公知配列、核酸の二次構造の形成などを考慮し、慣用のソフトウェアなどにより作製され得る。前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、連続した15ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、18ヌクレオチド長以上であることが望ましい。前記プローブとしては、検出対象のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列のうち、データベースの公知配列に存在しない塩基配列からなる核酸またはそのアンチセンス鎖、該塩基配列中の連続した15ヌクレオチド長以上の塩基配列を有する核酸またはそのアンチセンス鎖などが挙げられる。
【００４５】
本発明において用いられるレポーター遺伝子としては、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。レポーターアッセイの具体例を以下に説明する。インスリン遺伝子のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結させたベクターを構築し、これをHIT-T15細胞に導入する。この細胞にKLF7アデノウイルスを感染させることによりKLF7を過剰発現させると共に被検物質を培地中に添加する。KLF7過剰発現により抑制されるルシフェラーゼ活性が、未感染のHIT-T15細胞で認められるルシフェラーゼ活性にまで回復する被検物質を選択する。
【００４６】
本発明に用いられる抗体は、例えば、1992年、John Weily & Sons, Inc発行、John E. Coligan編、Current Protocols in Immunologyに記載の方法により、検出対象のポリペプチドを用いて、ウサギやマウスなどを免疫することにより、容易に作製され得る。本発明に用いられる抗体は、検出対象のポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体を精製後、ペプチダーゼなどにより処理することにより得られた抗体の断片であってもよい。さらに、本発明に用いられる抗体は、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fabフラグメント、単鎖抗体などや公知技術により修飾された抗体などであってもよい。なお、本発明に用いられる抗体の特異性は、例えば、検出対象のポリペプチドおよび他のポリペプチドを用い、オクタロニー法により、検出対象のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、他のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さないことを指標として評価され得る。
【００４７】
本発明に用いられるアッセイキットとしては、評価対象を測定することのできるキットであれば限定されず、例えば、インスリン測定キット（森永生化学研究所社製）、レビスインスリン測定用ELISAキット（シバヤギ社製）などが挙げられる。
【００４８】
本発明に用いられる脂肪細胞への分化を評価することのできるアッセイとしては、当該分野で公知のアッセイが挙げられる。例えば、以下の工程：
コラーゲンコート6穴プレート（IWAKI社製）に細胞をまき、コンフルエントになるまで培養する工程；
細胞の分化誘導をおこない、分化誘導後各日数経過した細胞をPBSで３回洗浄後1mlの10％ホルマリン含有PBSで固定する工程；
4℃で1hr以上放置した後10％ホルマリン含有PBSを取り除き風乾する工程；  1mlのオイルレッドO液（0.5％オイルレッドOイソプロパノール液：蒸留水=6：4（w/w））を各ウェルに添加し室温で15分間放置後、蒸留水で3回洗浄をおこなう工程；ならびに
写真撮影した後、各ウェルに100μlのイソプロパノールを添加することによりオイルレッドOを溶出し吸光度測定（OD540）をおこない脂肪蓄積量を測定する工程
を有するオイルレッドOアッセイなどが挙げられる。
【００４９】
続いて、工程（ＩＩＩ）において、被検物質の非存在下で測定した発現量または活性と比較して、それにより、発現の抑制または活性の阻害をもたらす被検物質を糖尿病治療または予防薬の候補物質として選択する。
【００５０】
なお、「被検物質の非存在下で測定した」とは、工程（ＩＩ）において、被検物質の非存在下に工程（Ｉ）で得られた細胞においてKLF7を発現させて測定したことをいい、被検物質の存在下におけるKLF7の発現の抑制または活性の阻害を把握するための基準となる。具体的には、かかる場合の細胞、または該細胞の抽出液などを対照として用いる。
【００５１】
KLF7の発現または活性を測定した結果、対照と比較してKLF7の発現の抑制または活性の阻害が認められた場合、該被検物質が糖尿病治療または予防薬の候補物質であると判定され、該被検物質が候補物質として選択される。
【００５２】
選択された候補物質は、細胞レベルにおいてKLF7の発現を抑制する、または細胞レベルにおいてKLF7の活性を阻害するという特徴的な性質を有するものと考えられ、KLF7の発現を特異的に抑制することができる、またはKLF7の活性を特異的に阻害することができるという優れた効果を奏する。
【００５３】
また、本発明は、糖尿病の治療または予防薬のスクリーニングに用いられるKLF7、該KLF7をコードする核酸、該核酸が導入された細胞、KLF7の抗体などを含むスクリーニング用キットを提供する。
【００５４】
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
−  KLF7を含有してなるキット、
−  KLF7をコードする核酸を含有してなるキット、
−  KLF7をコードする核酸が導入された細胞を含有してなるキット、
−  KLF7に対する抗体またはその断片を含有してなるキット、
などが挙げられる。
【００５５】
また、各キットには、所望により、本発明のスクリーニング方法に好適に使用され得る前記プローブおよび／またはプライマー対を含有させてもよい。さらには、所望により検出用試薬、緩衝液、標準物質、本発明のスクリーニング方法を実施するための説明書などを含有させてもよい。
【００５６】
本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に、高処理量で行うことができるという優れた効果が奏される。
【００５７】
KLF7が、予想外にも、糖尿病と関連するという本発明者らの知見により、KLF7の発現を抑制または活性を阻害する物質により、糖尿病の治療または予防に用いるための医薬組成物が提供される。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、本発明の医薬組成物は、糖尿病に対し、KLF7の発現の抑制または活性の阻害を介して治療または予防効果を奏する。
【００５９】
本発明の医薬組成物中における前記物質の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができ、治療上有効量であればよい。含有量は当該物質の種類によっても異なるので一概にはいえないが、当該物質が低分子化合物または高分子化合物の場合、例えば、0.0001〜1000mg、好ましくは、0.001〜100mg、当該物質がポリペプチドまたはその誘導体の場合、例えば、0.0001〜1000mg、好ましくは、0.001〜100mg、当該物質が核酸またはその誘導体の場合、例えば、0.0001〜1000mg、好ましくは、0.001〜100mgであることが望ましい。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、前記物質を安定に保持し得る種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容され得る助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などが挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重などに応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与などが挙げられる。
【００６２】
また、本発明の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重などに応じて、適宜選択される。投与方法としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物または高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、0.0001〜1000mg/kg体重、好ましくは0.001〜100mg/kg体重、ポリペプチドまたはその誘導体である場合、例えば、0.0001〜1000mg/kg体重、好ましくは、0.001〜100mg/kg体重、核酸またはその誘導体である場合、例えば、0.0001〜1000mg/kg体重、好ましくは、0.001〜100mg/kg体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、1〜3回投与することなどが挙げられる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の薬理評価は、例えば、血中インスリン値、血糖値、血中IL-6、血中Cペプチド、尿Cペプチドなどを指標として行われ得る。
【００６４】
さらに、本発明によれば、II型糖尿病を発症した患者において、KLF7遺伝子の第２イントロンにおいて、驚くべく、35092番目がAである遺伝子型が高い頻度で見られるという本発明者らの知見に基づき、II型糖尿病疾患感受性の診断方法が提供される。かかる診断方法も本発明に含まれる。
【００６５】
本発明の診断方法は、KLF7遺伝子の第２イントロンにおける多型を検出することを１つの大きな特徴とする。
【００６６】
本発明の診断方法においては、具体的には、配列番号：１７の塩基配列における多型、すなわち、変異を検出する。
【００６７】
また、本発明の診断方法は、KLF7遺伝子の第２イントロンにおける多型、すなわち、変異を指標とするため、被験個体におけるII型糖尿病疾患感受性を高い信頼度で診断することができ、被験個体におけるII型糖尿病疾患感受性を容易に、迅速に診断することができるという優れた効果を奏する。
【００６８】
前記多型、すなわち、変異とは、少なくとも１塩基の多型を意味し、例えば、少なくとも１塩基の置換、欠失、付加または挿入を有することを意味する。
【００６９】
なお、本明細書において、「少なくとも１塩基」とは、１塩基〜数百塩基、好ましくは、１個もしくは複数個、好ましくは、１個もしくは数個を意味する。
【００７０】
前記多型は、核酸多型解析手段などを行うことにより検出され得る。
【００７１】
具体的には、前記多型は、例えば、（Ｉ）KLF7遺伝子の第２イントロン、または（ＩＩ）KLF7遺伝子の第２イントロンの塩基配列を有する核酸（センス核酸）もしくはそのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る核酸からなる群より選ばれた核酸を用いて、ダイレクトシーケンス法、タックマン法、Allele specific oligonucleotide hybridization(ASO)法、SSCP法、DGGE法、MALDI-TOF/MS法による解析、clevageを用いた解析などを行うこと、あるいは
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の核酸を増幅し得るプライマー対を用いて、PCRなどを行うこと
などにより検出され得る。
【００７２】
なお、前記（ＩＩ）の核酸は、少なくとも数ヌクレオチド長、好ましくは、数ヌクレオチド長〜数十ヌクレオチド長であることが望ましい。具体的には、前記（ＩＩ）の核酸は、少なくとも12ヌクレオチド長、好ましくは、18ヌクレオチド長以上である。
【００７３】
前記（ＩＩＩ）のプライマー対は、例えば、Tm値など、公知配列、核酸の二次構造の形成などを考慮し、プライマーのデザインを支援する慣用のソフトウェアなどにより作製され得る。プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、15〜40ヌクレオチド長であり、好ましくは、17〜30ヌクレオチド長であることが望ましい。
【００７４】
前記多型の検出に用い得る核酸およびプライマー対としては、例えば、
KLF7第２イントロン＋35092がAであるポリヌクレオチド（配列番号：１８）：
5'-AAAACCCAAAAGACAGTGGTATACTATGTTAGGAAATCTAGTCTTTCAGGAATGAGTTAAACAGCCCTTTCCCAAGCCTGACCAGCAGGCAGCACAGGCTGGTTGGGTGTAATCCCTTTTG-3'；
KLF7第２イントロン＋35092の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：１９）：
5'-TTTCCTTTCTGCCTGGACTG-3'；
KLF7遺伝子第２イントロン＋35092の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：２０）：
5'-CTCCTCCCTAGCCCATCAAC-3'；
KLF7遺伝子第２イントロン＋35092の塩基がCであるものを検出するためのプローブ（配列番号：２１）：
5'-ATGACGTGGCAGACCCAGCCCTTTCCCAAGCCTG-3'；
KLF7遺伝子第２イントロン＋35092の塩基がAであるものを検出するためのプローブ（配列番号：２２）：
5'-CGCGCCGAGGACAGCCCTTTCCCAAGCCTG-3'；
KLF7遺伝子第２イントロン＋35092の塩基がCであるかAであるかを検出するためのインベーダープローブ（配列番号：２３）：
5'-GTCTTTCAGGAATGAGTTAAN-3'；
などが挙げられる。
【００７５】
前記被験個体としては、哺乳動物、具体的には、ヒト、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌなどが挙げられる。
【００７６】
本発明の診断方法に用いられる試料としては、前記被験個体から得られた生物学的試料、例えば、だ液、皮膚、末梢血、摘出された臓器、各種組織、毛髪、体液などが挙げられる。
【００７７】
本発明の診断方法においては、前記多型が検出された場合、被検個体が、糖尿病を発症していること、あるいは将来の発症が予想されることの指標となる。
【００７８】
また、本発明により、被検核酸試料中における糖尿病の発症に寄与する核酸の検出方法が提供される。
【００７９】
本発明の検出方法によれば、前記多型を検出しているため、被検核酸試料から、糖尿病の発症に寄与する核酸を、容易に迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。
【００８０】
本発明の検出方法に用いられる被検核酸試料は、慣用の方法で、個体の細胞または組織より調製され得る。
【００８１】
本発明の検出方法は、例えば、輸血用血液、採血された血液の検査などに適用され得る。
【００８２】
本発明の検出方法は、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有した検出キットにより、より容易かつ迅速に行うことができる。かかる検出キットも本発明に含まれる。
【００８３】
本発明の検出用キットは、前記（Ｉ）の核酸、前記（ＩＩ）の核酸および前記（ＩＩＩ）のプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するものである。
【００８４】
本発明のキットは、前記核酸、プライマー対などを含有するため、II型糖尿病疾患感受性を容易かつ迅速に診断することができ、糖尿病および糖尿病の疑いのある患者から得られた被検試料から、糖尿病の発症に寄与する核酸を、容易かつ迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の検出キットは、本発明の診断方法および本発明の検出方法に有用である。
【実施例】
【００８５】
本発明を、下記実施例などにより説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養などには、特に断りのない限り、Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Second Edition（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、Current Protocols in  Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）などに記載された方法を用いた。
【００８６】
参考例１
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学または川崎医科大学に定期的に来診するII型糖尿病患者、ならびに日本の幾つかの医療施設を介して募集した564人の対照患者を対象として実験を行った。
【００８７】
前記II型糖尿病患者および対照患者の末梢血液を採血し、得られた末梢血液7mlを3000回転で10分間遠心分離して、血漿を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で20分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、3000回転で5分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロテイナーゼKを添加し、37℃4時間以上インキュベートした。得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層（水層）に、イソプロパノールを添加して、DNAの沈殿を生じさせた。ついで、遠心分離（12000回転、10分）を行ない、DNAを回収し、1ml 70％エタノールを添加し、得られたDNAのペレットをTE緩衝液（組成：10mM Tris-HCl、1mM EDTA（pH8.0））に溶解し、DNA試料を得た。
【００８８】
前記DNA試料を用いて、インベーダー法により遺伝子型の判定を行った。解析するSNPは、JSNPデータベース（IMS-JST SNPsデータベース：http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から無作為に選択した。各SNP遺伝子座の遺伝子型を、Multiplex PCRと組み合わせたインベーダー法（例えば、Ohnishi Y.ら、J.Human.Genet., 46, 471-477, 2001などを参照のこと）により解析した。
【００８９】
より詳細な遺伝子多型の検索をダイレクトシーケンス法にて行った。KLF7を含むゲノム配列に関連するGenBankの情報（アクセッション番号：NM003709およびBC012919）を基にデザインしたPCRプライマーを用いて、標的部位を増幅した。また、PCRプライマーのデザインに際して、Bedellら、Bioinformatics, 16, 1040-1041, 2000に記載されたように、商品名：REPEATMASKERプログラム（ワシントン大学より供給、ウェブページアドレス：http://repeaTmasker.genome.washington.eduにて利用可能）により、検索対象から反復エレメントを排除した。
【００９０】
Multiplex PCRにおける反応条件は、反応溶液（組成：16.6mM （NH4）2SO4、67mM Tris（pH8.8）、6.7mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、6.7μM EDTA、1.5mM dNTP、10xTaqミックス（2.5U/μl Taq DNAポリメラーゼ、31.25U/μl Taq Antibody）、0または10％ DMSO、各0.25μMプライマー）、95℃、5分の反応後、95℃で15秒と60℃で45秒と72℃で3分とを1サイクルとする40サイクルの反応を行った。
【００９１】
増幅された産物をdH2Oで、1：11に希釈し、384プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾させ、プレート上の各ウェルに、3μlインベーダー反応液（組成：10×緩衝液、10×FRETプローブ、10×clevase、アレルプローブ）を添加した。その後、63℃で20分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、蛍光（520nm、546nm）を測定した。
【００９２】
糖尿病症例の188人の患者および対照群の564人の患者のそれぞれに対し、83,540個のSNP座について遺伝子タイピングを行った。ついで、2×3または2×2分割表を用いた統計学的データを評価することにより、糖尿病症例の患者と対照群個体との間の遺伝子型または対立遺伝子頻度に有意な差異を示したSNPを選択した。
【００９３】
なお、相関解析、ハプロタイプ頻度およびHardy-Weinberg平衡の統計解析ならびに連鎖不平衡係数（D'）の算出は、Devlin B.らGenomics, 29, 311-322, 1995およびNielsen DM.らAm.J.Hum.Genet.,63, 1531-1540, 1998のように行った。
【００９４】
スクリーニングにおいて、糖尿病患者と対照患者との間で0.01未満のP値を示した2,015個のSNP座を、さらに多数の患者について、解析した。
【００９５】
【表１】
2006081414.tif 000002
【００９６】
その結果、表１に示されるように、第2染色体短腕32のKLF7遺伝子の第2イントロンにおける１つのSNP座の遺伝子型の分布が、II型糖尿病との強い関連性を示した（A対C：χ2=16.3、P=0.000053、オッズ比=1.51、95％CI  1.23〜1.85）。
【００９７】
また、図１に示されるように、KLF7遺伝子におけるランドマークSNP周辺の領域の連鎖不平衡マッピングにより、ランドマーク部位の約20kb上流および60kb下流において、この領域における連鎖不平衡が広がっていることが示された。
【００９８】
したがって、II型糖尿病の罹病性に重要な領域は、おそらく、この80kbの高連鎖不平衡ブロック内に存在すると考えられる。また、この連鎖不平衡ブロック内に、KLF7の他に遺伝子がないため、KLF7自体が、糖尿病の罹病性に関する候補であると考えられる。
【００９９】
参考例２
KLF7遺伝子の発現による影響を調べるため、種々の細胞にKLF7遺伝子を導入し、各細胞の挙動を確認した。
【０１００】
１．ヒトKLF7 cDNAのクローニング
Human Adipocyte Marathon-Ready cDNA（CLONTECH社製）を鋳型としヒトKLF7遺伝子特異的プライマーを用いてPCRをおこなうことによりヒトKLF7 cDNAのクローニングを行った。ヒトKLF7遺伝子特異的プライマーはセンス鎖5'-TGAGCCAGACAGACTGACAA-3'（配列番号：３）、アンチセンス鎖5'-CCTTTAGACACTAGCCGATG-3'（配列番号：４）を用い、PCRはKOD-PLUS（TOYOBO社製）を使用し、95℃で2分を1サイクル、94℃で15秒、55℃で30秒、68℃で2分を30サイクル行った。その後、Ex Taq（タカラバイオ社製）を少量添加し、72℃で2分間反応させた。得られたPCR産物を0.8％アガロースゲルで電気泳動し目的のDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1 vectorへ組み込んだ。得られたプラスミドpCR2.1-KLF7のヒトKLF7領域の塩基配列をM13- Forwardプライマー：5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'（配列番号：５）およびM13-Reverseプライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'（配列番号：６）を用いたシークエンスをおこなうことにより確認した。シークエンス反応はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用い、電気泳動および解析はApplied Biosystems 3700 DNA Analyzerを用いて行った。得られたヒトKLF7 cDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。
【０１０１】
２．アデノウイルスの作製
各細胞にKLF7遺伝子を導入するためのヒトKLF7アデノウイルスを、Adenovirus Expression Vector Kit（TaKaRa社製）を使用して作製した。コスミドベクターpAxCAwtに、１．でクローニングしたヒトKLF7 cDNAを組み込み、プロトコールに従いヒトKLF7アデノウイルスを作製した。
【０１０２】
３．細胞培養
HPAをZen-Bio, Inc.、HIT-T15を大日本製薬、3T3-L1およびL6をAmerican Type Culture Collectionから購入した。HPAをDMEM：HAM F-10=1：1（10％ FBS、50U/mlペニシリンG、50μg/mlストレプトマイシン）、HIT-T15をRPMI1640（10％ FBS、50U/mlペニシリンG、50μg/mlストレプトマイシン）、3T3-L1およびL6をDMEM（10％ FBS、50U/mlペニシリンG、50μg/mlストレプトマイシン）で37℃、5％ CO2環境下で培養した。
【０１０３】
４．HPAにおけるmRNA発現量の確認
分化誘導後13日目のHPAにLacZまたはKLF7アデノウイルスを終夜感染させ、5日後に各細胞からRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotal RNAを調製した。得られたtotal RNAをSuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社製）を用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてKLF7特異的プライマー、レプチン特異的プライマー、アディポネクチン特異的プライマーおよびIL-6特異的プライマー（それぞれ、配列番号：３０および３１、配列番号：１５および１６、配列番号：１１および１２、ならびに配列番号１３および１４）を用いて定量PCRをおこなうことにより各遺伝子mRNA発現量の検討をおこなった。定量結果の補正にはβ-アクチンを用いた。KLF7に対するPCRは、95℃で2分を1サイクル、95℃で30秒、68℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル、レプチン、アディポネクチン、IL-6およびβ-アクチンに対するPCRは、95℃で2分を1サイクル、95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を40サイクルで、Mx3000P Multiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE社製）を用いて反応および解析をおこなった。その結果を図２に示す。なお、β-アクチンについては、配列番号：２４に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：２５に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対を使用した。
【０１０４】
HPAにおける各種遺伝子発現への影響
この結果、ウイルス感染により、KLF7は約196倍の発現亢進が認められ、このKLF7過剰発現に伴い、アディポネクチンおよびレプチンはそれぞれ54％および78％の発現抑制、IL-6は17倍の発現亢進が確認された。
【０１０５】
５．HIT-T15におけるインスリンmRNA発現量の確認
6穴プレート（CORNING社製）にHIT-T15を5×105/wellまきこみ2日間培養後、0、1、3、10および30MOIでKLF7アデノウイルスを1時間感染させた。感染2日後に細胞をPBSで洗浄後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotal RNAを精製した。このtotalRNAからSuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社製）を用いてcDNAを合成し、得られたcDNAを鋳型としKLF7特異的プライマー（配列番号：３０および３１）およびインスリン特異的プライマー（配列番号：７および８）を用いて定量PCRをおこなうことにより、各遺伝子mRNA発現量を測定した。定量結果の補正にはmGAPDHを用いた。PCRは、95℃で2分を1サイクル、95℃で30秒、68℃で30秒、72℃で30秒を40サイクル、mGAPDHに対するPCRは、95℃で2分を1サイクル、95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を40サイクルで、Mx3000P Multiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE社製）を用いて反応および解析をおこなった。その結果を図３に示す。なお、mGAPDHについては、配列番号：２６に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：２７に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対を使用した。
【０１０６】
HIT-T15におけるmRNA発現への影響
この結果、感染MOI数の増加にともないKLF7の著しい発現亢進が認められた（図３のＡ）。また、このKLF7の発現亢進にともないインスリン発現量の減少が確認され、30MOIのKLF7アデノウイルス感染時には約74%のインスリン発現量の減少が認められた（図３のＢ）。
【０１０７】
６．HIT-T15におけるインスリン分泌量の確認
24穴プレート（CORNING社製）にHIT-T15を1×105/wellでまきこみ2日間培養後、10MOIのLacZアデノウイルスまたはKLF7アデノウイルスを1時間感染させた。感染2日後にHepes-Krebs buffer（119mM NaCl、4.75mM KCl、5mM NaHCO3、2.54mM CaCl2、1.2mM MgSO4、20mM Hepes pH7.4）/0.2％BSAで3回洗浄後、1mlのHepes-Krebs buffer/0.2％BSAを添加しCO2インキュベーターで37℃、2時間培養した。その後、0mM、2.7mM、10mMまたは16.7mMグルコース濃度のHepes-Krebs buffer/0.2％BSAを500μl添加しCO2インキュベーターで37℃、1時間培養後培養液を回収した。得られた培養液中に分泌されたインスリン量をインスリン測定キット（森永生化学研究所社製）を用いて測定した。また、各ウェルの細胞をRIPA bufferで溶解後Bio-Rad Dc Protein Assay Kit（Bio-Rad社製）を用いてタンパク質量測定をおこない、タンパク質量で補正をおこなった。その結果を図４に示す。
【０１０８】
HIT-T15におけるインスリン分泌への影響
この結果、HIT-T15およびHIT-T15/LacZではグルコース濃度の増加にともないインスリン分泌亢進が認められ、16.7mMグルコース刺激時には非刺激時の約2.6倍のインスリン分泌が確認されたが、HIT-T15/KLF7ではグルコース刺激によるインスリン分泌が著しく抑制された。
【０１０９】
７．L6におけるヘキソキナーゼmRNA発現量の確認
6穴プレート（CORNING社製）にL6を5×105/wellまきこみ2日間培養後、0、1、3、10、30および100MOIでKLF7アデノウイルスを終夜感染させた。感染2日後に細胞をPBSで洗浄後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotalRNAを調製し、得られたtotalRNAよりSuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社製）を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としKLF7特異的プライマー（配列番号：３０および３１）およびヘキソキナーゼ特異的プライマー（配列番号９および１０）を用いて定量PCRをおこなうことにより各遺伝子mRNA発現量の検討をおこなった。定量結果の補正にはrGAPDHを用いた。PCRは95℃で2分を1サイクル、95℃で30秒、68℃で30秒、72℃で30秒を40サイクルとし、Mx3000P Multiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE社製）を用いて反応および解析をおこなった。その結果を図５に示す。なお、rGAPDHについては、配列番号：２８に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：２９に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対を使用した。
【０１１０】
L6におけるヘキソキナーゼmRNA発現への影響
この結果、MOI数の増加にともないKLF7の発現亢進が認められた（図５のＡ）。また、このKLF7の発現亢進にともないヘキソキナーゼ発現量の減少が確認され、100MOIのKLF7アデノウイルス感染時には約47％のヘキソキナーゼ発現量の減少が認められた（図５のＢ）。
【０１１１】
８．脂肪細胞分化への影響
以下のようなオイルレッドOアッセイを使用して脂肪細胞への分化を確認した。
コラーゲンコート6穴プレート（IWAKI社製）に3T3-L1またはHPAを1×105/wellまきこみコンフルエントになるまで培養後、100MOIのLacZアデノウイルスまたはKLF7アデノウイルスを終夜感染させた。感染2日後に3T3-L1はDMEM（10％FBS、50U/mlペニシリンG、50μg/mlストレプトマイシン、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、1μMデキサメタゾン、1μMインスリン）に、HPAはDMEM：HAM F-10=1：1（10％FBS、50U/mlペニシリンG、50μg/mlストレプトマイシン、0.2mMインドメタシン、2μMインスリン、1μMデキサメタゾン、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン）で培養することにより分化誘導をおこない、その後各日数経過した細胞をPBSで3回洗浄後1mlの10％ホルマリン含有PBSで固定した。4℃で1時間以上放置した後10％ホルマリン含有PBSを取り除き風乾させた。1mlのオイルレッドO液（0.5％オイルレッドOイソプロパノール液：蒸留水=6：4）を添加し室温で15分間放置後、蒸留水で3回洗浄をおこなった。写真撮影した後、各ウェルに100μlのイソプロパノールを添加することによりオイルレッドOを溶出し吸光度測定（OD540）をおこなうことにより脂肪蓄積量を判定した。
【０１１２】
13日目のHPAおよびHPA/LacZでは脂肪滴の蓄積が観察された（それぞれ図６Ａのａおよびｂ）が、HPA/KLF7では脂肪滴の蓄積がほとんど観察されなかった（図６Ａのｃ）。なお、図６Ａのｄは染色時の全体像を示したものである。
【０１１３】
また、イソプロパノールを用いてオイルレッドOを抽出しその吸光度を測定することにより脂肪滴量を数値化したところ、KLF7過剰発現により著しい脂肪滴蓄積量の減少が認められた（図６Ｂ）。このことからKLF7過剰発現によりHPAの脂肪細胞への分化が抑制されることが示唆された。
【０１１４】
3T3-L1においては、図７Ａに示すように、未処理（ウイルスによる感染を行わなかった）3T3-L1（3T3-L1/-）およびLacZアデノウイルス感染3T3-L1（3T3-L1/LacZ）では分化誘導後3日目で脂肪滴の蓄積が観察され始め、大部分の細胞で日数の経過と共に脂肪滴の蓄積量の増大が確認された（それぞれ図７Ａのａおよびｂ）。一方、KLF7アデノウイルス感染3T3-L1（3T3-L1/KLF7）では分化誘導後10日目においても脂肪滴の蓄積がほとんど観察されなかった（図７Ａのｃ）。なお、図７Ａのｄは染色時の全体像を示したものである。
【０１１５】
また、イソプロパノールを用いてオイルレッドOを抽出しその吸光度を測定することにより各経過日数での脂肪滴量を数値化したところ、KLF7過剰発現により著しい脂肪滴蓄積量の減少が認められた（図７Ｂ）。このことからKLF7過剰発現により3T3-L1の脂肪細胞への分化が抑制されることが示唆された。
【０１１６】
実施例１
Adenovirus Expression Vector Kit（TaKaRa社製）を使用して、コスミドベクターpAxCAwtに、ヒトKLF7 cDNAを組み込み、プロトコールに従いヒトKLF7アデノウイルスを作製する。このKLF7アデノウイルスを3T3-L1細胞に感染させることにより、得られた形質転換細胞を、化合物ライブラリーの化合物を含有したDMEM培地において、5％CO2、37℃で4〜24時間培養する。また、対照として、前記化合物ライブラリーの化合物を含まないDMEM培地において、同様に培養する。培養後の細胞から、total RNAを抽出する。ついで、total RNAを鋳型とし、前記参考例２と同様に、KLF7、インスリン、ヘキソキナーゼ、レプチン、アディポネクチン、IL-6、β-アクチン、rGAPDHおよびmGAPDHのそれぞれに対するプライマーを用いて、定量的RT-PCRを行う。β-アクチン、rGAPDHおよびmGAPDHの結果により、数値を正規化し、化合物存在下および非存在下におけるKLF7、インスリン、ヘキソキナーゼ、レプチン、アディポネクチンおよびIL-6それぞれの発現量を評価する。
【０１１７】
HIT-T15細胞、L6細胞またはHPA細胞の形質転換細胞におけるKLF7遺伝子、インスリン遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、レプチン遺伝子、アディポネクチン遺伝子およびIL-6遺伝子の発現量を、非形質転換細胞における発現量と比較して、化合物の存在により、形質転換細胞におけるKLF7遺伝子およびIL-6遺伝子の発現量の亢進が阻害され、インスリン遺伝子、レプチン遺伝子、アディポネクチン遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子の発現量の抑制が阻害されることを指標として、糖尿病の治療または予防薬の候補物質をスクリーニングする。
【０１１８】
実施例２
被験個体の末梢血より、慣用の核酸抽出法で核酸含有試料を調製する。KLF7遺伝子の第２イントロンの領域の核酸を基に作製されたSNP検出用マイクロアレイに、前記核酸含有試料を供して、ハイブリダイズさせ、生じるDNAハイブリッドの一方のDNA鎖について、４種の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼとを用いて、プライマー伸長させる。SNPが、存在する部分の塩基に取り込まれた蛍光を指標として検出されることに基づき、核酸含有試料が、糖尿病の発症に寄与する核酸を含むことが示され、被験個体が、糖尿病を発症しているか、あるいは、将来発症する可能性があると判断される。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のスクリーニング方法は、糖尿病の治療または予防の手段の開発に有用である。また、本発明の診断方法は、糖尿病に対する治療計画または予防処置を立てるに際して有用である。さらに、本発明の検出キットは、糖尿病の診断などに用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、KLF7遺伝子周辺における連鎖不平衡マッピングを示す。
【図２】図２は、HPAにおいてKLF7遺伝子を過剰発現させた際の、レプチン、アディポネクチンおよびIL-6発現への影響を示す図である。
【図３】図３は、HIT-T15においてKLF7遺伝子を過剰発現させた際の、インスリン遺伝子発現への影響を示す図である。
【図４】図４は、HIT-T15においてKLF7遺伝子を過剰発現させた際の、インスリン分泌量への影響を示す図である。
【図５】図５は、L6においてKLF7遺伝子を過剰発現させた際の、ヘキソキナーゼ遺伝子発現への影響を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、分化誘導13日目のHPAのオイルレッドOアッセイ後の顕微鏡写真（×100）である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、分化誘導13日目のHPAのオイルレッドOアッセイを数値化した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、3T3-L1のオイルレッドOアッセイ後の顕微鏡写真（×100）である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、3T3-L1のオイルレッドOアッセイを数値化した図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号：３は、ヒトKLF7 cDNAのクローニング用センスプライマーの配列を示す。
配列番号：４は、ヒトKLF7 cDNAのクローニング用アンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：５は、M13-Forwardプライマーの配列を示す。
配列番号：６は、M13-Reverseプライマーの配列を示す。
配列番号：７は、インスリン遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：８は、インスリン遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：９は、ヘキソキナーゼ遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１０は、ヘキソキナーゼ遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１１は、アディポネクチン遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１２は、アディポネクチン遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１３は、IL-6遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１４は、IL-6遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１５は、レプチン遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１６は、レプチン遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：１９は、KLF7第２イントロン＋35092の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：２０は、KLF7第２イントロン＋35092の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーの配列を示す。
配列番号：２１は、KLF7第２イントロン＋35092の塩基がCであるものを検出するためのプローブの配列を示す。
配列番号：２２は、KLF7第２イントロン＋35092の塩基がAであるものを検出するためのプローブの配列を示す。
配列番号：２３は、KLF7第２イントロン＋35092の塩基がCであるかAであるかを検出するためのインベーダープローブの配列を示す。ｎは任意の塩基である。
配列番号：２４は、β-アクチン遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：２５は、β-アクチン遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：２６は、mGAPDH遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：２７は、mGAPDH遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：２８は、rGAPDH遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：２９は、rGAPDH遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：３０は、KLF7遺伝子に対するセンスプライマーの配列を示す。
配列番号：３１は、KLF7遺伝子に対するアンチセンスプライマーの配列を示す。
【図１】
2006081414.tif 000003
【図２】
2006081414.tif 000004
【図３】
2006081414.tif 000005
【図４】
2006081414.tif 000006
【図５】
2006081414.tif 000007
【図６Ｂ】
2006081414.tif 000008
【図７Ｂ】
2006081414.tif 000009
【図６Ａ】
2006081414.tif 000010
【図７Ａ】
2006081414.tif 000011
【配列表】
2006081414000001.app