(57)【要約】      （修正有）【課題】  ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６に特異的であり、他のビフィドバクテリウム属細菌だけでなく、ビフィドバクテリウム  ロンガムの異なる菌株と交差反応を示さず、迅速かつ簡便にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出し得るＰＣＲプライマー、及びそれを用いた検出法を提供する。【解決手段】  特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの対からなるビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出するためのＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列をからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの対からなるビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出するためのＰＣＲプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＣＲプライマーを含むビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６検出用のキット。
【請求項３】
請求項１に記載のＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することを含む、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の検出に関する技術に関し、特にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６菌株をＰＣＲにより検出するためのプライマー、並びに、同プライマーを用いて同菌株を検出する方法及びキットに関する。本発明は微生物工業等の分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
健常な正常者においてはビフィズス菌が腸内細菌の５〜２０％存在している。ビフィズス菌は、乳酸と酢酸を２：３の割合で産生し、それらの酸によって大腸の蠕動運動を促進させ、大腸菌やウエルッシュ菌などの有害菌を抑制させ、さらに腐敗産物を抑制するなど便性を適正に保っているものと考えられている。これらのことから、乳製品に特定のビフィズス菌菌株を添加し発酵乳として飲用する、あるいは製剤化したビフィズス菌を投与することにより腸管機能の維持することが考案されている。ヒト由来のビフィズス菌をヒトに与えることはより生理的であり、特定の機能を有するヒト型のビフィズス菌を用いることが望まれている。ヒト型のビフィズス菌としては、例えばビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６（ＣＳＣＣ５５５０）株が知られている。同菌株は、健康なヒトの腸管から分離されたものであり、整腸作用に加えて種々の作用を有し、ヨーグルト等の食品に使用されている（非特許文献１）。
【０００３】
上記のようなビフィズス菌の利用の有効性を評価するためには、例えば、糞便中のビフィズス菌の存在量を算出し、さらに各々のビフィズス菌の菌種を測定することによって、臨床的な効果を判定することが必要である。それによって、摂取されたビフィズス菌の大腸への移行率や生残率を明らかにすることが可能となり、その保健効果が判定可能となる。したがって摂取されたビフィズス菌を確実に識別する技術が求められている。
【０００４】
従来、糞便中や環境中のビフィズス菌は、検体を嫌気培養してコロニーを分離した後、グラム染色や検鏡による菌型の観察などの形態学検査、あるいは、フルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性、酸素耐性、糖発酵性などの生化学検査により、同定が行われて来た。前記の検体の培養は、菌数測定や菌種の同定に通常用いられる標準的な方法で行われるが、必ずしも全ての糞便中のビフィズス菌を培養できるわけではなく、また嫌気装置を用いて培養を行う必要があり、培養時間が数日から１週間程度必要であるなど、手間がかかり複雑である。また、検体に含まれるビフィズス菌を嫌気的かつ低温で保存し、生菌のまま分析に供しなければならず、さらに、分析を行う者の習熟度が要求されること等、多くの問題があった。
【０００５】
一方、近年、微生物の同定法としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いて検出する分子生物学的手法を用いて行われるようになってきた。原核生物のｒＲＮＡ遺伝子は５Ｓ、１６Ｓ、２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子からなり、特に１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は原核生物に普遍的に存在し、属及び菌種間に共通な塩基配列があるため１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準株と比較して種を決定することができる。この方法は、被検菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を決定した後、これと近縁の菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を整列させ（アラインメント）、塩基配列の違いを解析することによって行われる。しかし、この方法では、比較対照として、土壌、汚泥、糞便や食品などに存在する菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列を決定し、多数配列間での系統的な解析を行う必要であり、多大な労力と時間を要する（非特許文献２）。
【０００６】
また、被検菌が、既に１６Ｓ  ｒＲＮＡの特異的配列が知られている比較対照の菌と同
一種であるか否かは、その配列を検出するためのプローブを用いて決定することができる。このような技術を応用した例として、ビフィドバクテリウム  ロンガムの１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的として検出するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体をプローブとする検出方法が開示されている（特許文献１）。しかし、この方法は、実施に長時間を要するという問題がある。
【０００７】
一方、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るＰＣＲプライマーを用いてビフィズス菌を解析する技術が開示されている（特許文献２及び非特許文献３）。しかし、これらの文献に開示されているＰＣＲプライマーはビフィドバクテリウム  ロンガムを同定するためのＰＣＲプライマーであり、ビフィドバクテリウム  ロンガムの中でも特定の菌株を検出するものではない。
【０００８】
また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の中間に位置するＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒの塩基配列は、種間で相違点が多いことから、ビフィズス菌の菌種間の比較に使用可能であることが報告されている（非特許文献４）。しかし、同属同種異株間の比較に関して応用可能かどうかについては詳細に検討されていない。
【０００９】
また、染色体ＤＮＡの多型性を用いて菌株を同定する方法がある。例えば、制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを切断し、その切断ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離後、染色を行い泳動パターンにより菌株の違いを比較するＰＦＧＥ法が行われている（非特許文献５）。また、１０塩基長程度のＰＣＲプライマーを用いＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｕｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）によってＰＣＲを行い、アガロース電気泳動によって分離後、染色を行い泳動パターンを比較することが行われている（非特許文献６）
【００１０】
しかし、ＰＦＧＥ法は精査を行うのには好適であるが、複雑な工程が必要であり、実施するのに数日が必要であるなどルティーンワークには不向きである。一方、ＲＡＰＤ法は迅速に検出が可能であるが、短いＰＣＲプライマーを使用して低温でアニーリングを行うため、再現性が劣る、あるいは使用する機器によって結果が異なることが知られている。
【特許文献１】特開平６−１９７７６３号公報
【特許文献２】特開平１１−１２３０９３号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  Ｖｏｌ．１６  ｐ５３−５８  （１９９７）
【非特許文献２】Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３２  ｐ１５５−２１６  （１９８５）
【非特許文献３】Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２５  ｐ．５３６（２００２）
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４６  ｐ．１０２−１１１  （１９９６）
【非特許文献５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２９  ｐ１１−２９（１９９６）
【非特許文献６】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４３，  ｐ１８５−１９３  （１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６に特異的であり、他のビフィドバクテリウム属細菌だけでなく、ビフィドバクテリウム  ロンガムの異なる菌株と交差反応を示さず、迅速かつ簡便にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出し得るＰＣＲプライマー、及びそれを用いた検出法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前期課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を特異的に検出し得るＰＣＲプライマーを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの対からなるビフィドバクテリウム ロンガムＢＢ５３６を検出
するためのＰＣＲプライマー。
（２）前記ＰＣＲプライマーを含むビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６検出用のキット。
（３）前記ＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することを含む、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を、簡便、迅速に、かつ同種のビフィドバクテリウム  ロンガムと交差反応を示すことなく、検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＰＣＲプライマーは、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６に特異的な塩基配列を有する染色体ＤＮＡ領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，  ５，１８５  （１９８９））により増幅し得る２種のオリゴヌクレオチドの対からなる。
【００１６】
尚、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６は、オーストラリアの菌株寄託機関ＣＳＩＲＯ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＳＩＲＯ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓｃｉｅｎｃｅ（オーストラリア、３１９０、ビクトリア州、ハイエット、グラハムロード（Ｇｒａｈａｍ  Ｒｏａｄ，  Ｈｉｇｈｅｔｔ．  Ｖｉｃ．  ３１９０，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ））にＣＳＣＣ５５５０として寄託されている菌株と同一の菌株である。また、同株は、米国の菌株寄託機関Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国、２０１１０、ヴァージニア州、マナサス、ユニバーシティ  ブルバード１０８０１（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））に、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の受託番号で寄託されている。
【００１７】
本発明のプライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えばＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
【００１８】
本発明のＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲ反応が起こると、
ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の染色体ＤＮＡ内の、各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。したがって、本発明のＰＣＲプライマーを用いて増幅産物が得られれば、被検菌はビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６であると同定されるか、又は、被検菌にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６が含まれていると判定される。また、ＰＣＲを定量的に行うことにより、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の存在量を測定することもできる。また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。被検菌にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６が含まれていれば、通常は４３４ｂｐの増幅産物が得られる。尚、本発明において、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の検出とは、試料中にビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６が存在するか否かを検出すること、及び、被検菌が単一種である場合には、同被検菌がビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６であるか否かを同定すること、さらには、試料中のビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の存在量を測定することを含む。
【００１９】
被検菌は、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６が存在し得る試料に含まれる細菌であれば特に制限されず、例えば、糞便、食品、又は土壌等の環境中に含まれる細菌が挙げられる。好ましくは、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６又は同菌株以外のビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム  ロンガムである。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。
【００２０】
前記鋳型には、被検菌の染色体ＤＮＡを用いる。染色体ＤＮＡの調製は、ＰＣＲの鋳型となり得るこれらの核酸を取得することができるものであれば特に制限されず、通常、細菌の染色体ＤＮＡの抽出又は単離に用いられる方法を採用することできる。
【００２１】
前記核酸の抽出に用いる菌体は、例えば、前記糞便、食品、又は土壌等から得た被検菌を、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養を行うことによって、取得することができる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から菌体を抽出してもよい。
【００２２】
得られた菌体から目的の核酸を抽出するには、例えば、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ）や、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔなどの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３  ｐ２０８−２１８  （１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１  ｐ５２７９−５２８０  （１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）等にも記載されている。
【００２３】
本発明においては、ＰＣＲ反応は、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる通常のＰＣＲと同様にして行うことができる。典型的には、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を、変性、アニーリング及び伸長反応を各々適した温度に保温し、これを２０〜３５サイクル繰り返す。
【００２４】
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応に用いることができるものであれば特に制限されず、例えば、市販のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ（タカラバイオ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）などのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼや、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）やＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）等のＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらの酵素と緩衝液からなるキットも使用することができる。
【００２５】
ＰＣＲ反応の条件は、使用する酵素や装置等に応じて、適宜設定すればよい。具体的には例えば、９４℃  １０分間加温後、変性９４℃  ３０秒、アニーリング５０〜６５℃  ３０秒、及び伸長反応７２℃  ３０秒からなる反応を３０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０2〜１０8コピーの染色体ＤＮＡに対し、プライマー０．２〜２μｍｏｌ程度が好ましい。
【００２６】
ＰＣＲ反応により得られる増幅産物の有無又はその量もしくはその大きさは、通常の核酸の検出又は定量法によって、決定するができる。例えば、アガロース電気泳動やキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うと、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく、増幅産物を検出することができる。さらにはＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無又は量を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
【００２７】
本発明のＰＣＲプライマーは、それのみで、又は、他の要素と併せて、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６検出用のキットとすることができる。前記の他の要素としては、核酸の抽出、ＰＣＲ反応、及び増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種又は２種以上が挙げられる。また、前記キットは、陽性コントロールとして、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の染色体ＤＮＡの配列の一部を有し、本発明のＰＣＲプライマーにより増幅され得るＤＮＡ断片、及び／又は、陰性コントロールとして、本発明のＰＣＲプライマーに対応するが、１塩基又は数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明のＰＣＲプライマーは、前記したように、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６の検出に用いることができる。また、本発明のＰＣＲプライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６菌体又は同菌体を含む飲食品等を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されない。
【００３０】
＜１＞プライマーの合成
配列番号１〜４に示すオリゴヌクレオチド（各々順にプライマー１〜４という）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３４００  ＤＮＡ合成機を用いてフォスフォアミダイト法によって合成した。
【００３１】
プライマー１およびプライマー２は、本発明のプライマーである。プライマー３及びプライマー４は、特開平１１−１２３０９３号公報に、ＢｉＬＯＮｇ及びＢｉＬＯＮ−１として記載されたビフィドバクテリウム  ロンガムの特異検出プライマーである。便宜的に、プライマー１及びプライマー３をフォワードプライマー、プライマー２及びプライマー
４をリバースプライマーと呼ぶ。
【００３２】
前記プライマー１およびプライマー２は、ＳＴＳ−ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｇｅｄ−ｓｉｔｅ  ＰＣＲ）法により作製した。すなわち、ＲＡＰＤプライマーを用いて２２株のビフィドバクテリウム  ロンガムの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６株に特異的なバンドを生成する３種のＲＡＰＤプライマーから１種を選択した。このバンドからＤＮＡを抽出し、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を決定した。この塩基配列に基づいて、ＳＴＳ−ＰＣＲプライマーとしてプライマー１およびプライマー２を設定した。尚、これらのプライマーで増幅されるＤＮＡ断片がどの遺伝子に由来するかは不明である。
【００３３】
＜２＞被検菌の染色体DNAの調製
ＧＡＭ寒天培地（市販品（日水製薬）に３％（Ｗ／Ｗ）グルコースを添加した。）上で生育させたビフィズス菌のコロニーを白金耳を用いて採取し、１．０ｍｌの滅菌水を入れたチューブに分散させた。これを１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。得られた菌体沈殿物に、２００μｌのインスタジーンマトリックス（日本バイオラッド社）を加え、５６℃で１５〜３０分間加熱した。１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、沸騰水中で８分間加熱した。再度１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を得た。この上清液の２６０ｎｍの波長における吸光度を分光光度計で測定し、ＤＮＡ濃度を測定後、滅菌水で希釈して、１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液とした。
【００３４】
前記ビフィズス菌は、以下のとおりである。
ビフィドバクテリウム  インファンティス（B. infantis）ATCC15697株
ビフィドバクテリウム  ブレーベ（B. breve）ATCC15700株
ビフィドバクテリウム  ビフィダム（B. bifidum）JCM1255株
ビフィドバクテリウム  ロンガム（B. longum）JCM1217株
ビフィドバクテリウム  ロンガム（B. longum）CSCC5550(BB536)株
ビフィドバクテリウム  シュードカテヌラータム（B. pseudocatenulatum）JCM1200株
ビフィドバクテリウム  アドレスセンティス（B.adolescentis）JCM1275株
ビフィドバクテリウム  デンティウム（B. dentium）JCM1195株
ビフィドバクテリウム  ガリカム（B. gallicum）JCM8224株
ビフィドバクテリウム  アングラータム（B. angulatum）JCM7096株
【００３５】
＜３＞ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６（ＣＳＣＣ５５５０）株の検出
（１）ＰＣＲ反応
下記組成のＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＲ（宝酒造社）を用いて、プライマー１及びプライマー２、又は、プライマー３及びプライマー４を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃  １０分間加温後、変性９４℃  ３０秒、アニーリング５５℃  ３０秒、及び伸長反応７２℃  ３０秒の条件で３０サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱。
【００３６】
（PCR反応液組成）
フォワードプライマー溶液（10μM）                  5  μl
リバースプライマー溶液  （10μM）                  5  μl
滅菌水                                            53.5μl
GeneAmp 10×PCR  BufferII                         10  μl
（Applied Biosystems）
25mM MgSO4                                         6  μl
AmpliTaq Gold DNA polymerase（5ユニット/μl）      0.5μl
（Applied Biosystems）
GeneAmp dNTP MIX（各2mMのdATP、dTTP、dGTP、dCTP） 10  μl
（Applied Biosystems）
DNA溶液                                           10  μl
【００３７】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせは、以下のとおりであった。
【００３８】
【表１】
2006081429.tif 000002
【００３９】
（２）ＰＣＲ反応産物の検出
ＰＣＲ反応液１μｌに４μｌの色素液を加え、０．５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いて作製した２％（ｗ／ｗ）のＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ社）ゲルで電気泳動を行った。０．５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒで２０，０００倍に希釈したＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）染色液でゲルを染色後、デンシトグラムＡＥ−６９２０Ｖ−ＦＸ（アトー社）を用いて３００ｎｍの波長で蛍光を観察した。増幅産物は、ＤＮＡマーカーを指標として検出した。その結果を、表２及び表３に示す。表中、「＋」は増幅産物が検出されたことを、「−」は増幅産物が検出されなかったことを示す。
【００４０】
【表２】
2006081429.tif 000003
【００４１】
表２に示したように、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＣＭ１２１７株とビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６株の両株で増幅産物が得られ、ビフィドバクテリウム  
ロンガムＢＢ５３６を特異的に検出できなかった。
【００４２】
【表３】
2006081429.tif 000004
【００４３】
表３に示したように、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６株で増幅産物（４３４ｂｐ）が得られ、ビフィドバクテリウム  ロンガムＪＣＭ１２１７を含む他のビフィドバクテリウムでは特異的に検出できなかった。
【００４４】
以上のとおり、本願発明のプライマーは、ビフィドバクテリウム  ロンガムＢＢ５３６株を高い特異性で検出することが可能である。
【配列表】
2006081429000001.app