(57)【要約】【課題】ニューログリカンＣ遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物、その動物の疾患モデルとしての用途及びその動物の生産に有用な胚性幹細胞を提供すること。【解決手段】ニューログリカンＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物（この動物は、ニューログリカンＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にニューログリカンＣの発現を抑制する変異を有していることが好ましい。また当該「遺伝子の一部」はイントロンであることが好ましく、当該イントロンはイントロン２であることが好ましい。この非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物であることが好ましい。）、非ヒト動物からなる神経症モデル動物（特に鬱病のモデル動物）、及びニューログリカンＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物の胚性幹細胞。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューログリカンＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物。
【請求項２】
ニューログリカンＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にニューログリカンＣの発現を抑制する変異を有していることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
「遺伝子の一部」が、イントロンであることを特徴とする、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
イントロンが、イントロン２であることを特徴とする、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物が、齧歯類に分類される動物であることを特徴とする、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
齧歯類として分類される動物が、マウスであることを特徴とする、請求項６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物からなる、神経症モデル動物。
【請求項９】
神経症が、鬱病であることを特徴とする、請求項８に記載の神経症モデル動物。
【請求項１０】
ニューログリカンＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物の胚性幹細胞。
【請求項１１】
ニューログリカンＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にニューログリカンＣの発現を抑制する変異を有していることを特徴とする、請求項１０に記載の胚性幹細胞。
【請求項１２】
「遺伝子の一部」が、イントロンであることを特徴とする、請求項１１に記載の胚性幹細胞。
【請求項１３】
イントロンが、イントロン２であることを特徴とする、請求項１２に記載の胚性幹細胞。
【請求項１４】
非ヒト動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の胚性幹細胞。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物が、齧歯類に分類される動物であることを特徴とする、請求項１４に記載の胚性幹細胞。
【請求項１６】
齧歯類に分類される動物が、マウスであることを特徴とする、請求項１５に記載の胚性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューログリカンＣ遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物及びその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＥＳ細胞：胚性幹細胞
ＨＥ染色：ヘマトキシリン−エオシン染色
ＮＧＣ：ニューログリカンＣ（neuroglycan C）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＮＧＣは、脳に特異的なＣＳプロテオグリカンである。既にラット、ヒト及びマウスにおいてそのクローニングがなされており、また、その遺伝子構造についても解析されている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
【非特許文献１】ワタナベ、Ｅ．（Watanabe, E.）ら，１９９５年，The Journal of Biological Chemistry，第２７０巻, p.２６８７６−２６８８２
【非特許文献２】ヤスダ、Ｙ．（Yasuda, Y.）ら，１９９８年，Neuroscience Research，第３２巻，ｐ３１３−３２２
【非特許文献３】アオノ、Ｓ．（Aono, S.）ら，２０００年，The Journal of Biological Chemistry，第２７５巻, p.３３７−３４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＮＧＣ遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物、その動物の疾患モデルとしての用途及びその動物の生産に有用なＥＳ細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＮＧＣ遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物及びその動物の生産に有用なＥＳ細胞を提供するに至り、さらに前記動物を神経症のモデル動物として利用しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、ＮＧＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物（以下、「本発明動物」という。）を提供する。
【０００７】
本発明動物は、ＮＧＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にＮＧＣの発現を抑制する変異を有していることが好ましい。また、当該「遺伝子の一部」はイントロンであることが好ましく、当該「イントロン」はイントロン２であることが好ましい。
【０００８】
また本発明動物は、非ヒト哺乳動物であることが好ましく、齧歯類に分類される動物であることは好ましく、マウスであることが好ましい。
【０００９】
また本発明は、本発明動物からなる、神経症モデル動物（以下、「本発明モデル動物」という。）を提供する。この「神経症」は、鬱病であることが好ましい。
【００１０】
さらに本発明は、ＮＧＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物の胚性幹細胞（以下、「本発明細胞」という。）を提供する。
【００１１】
本発明細胞は、ＮＧＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にＮＧＣの発現を抑制する変異を有していることが好ましい。また、当該「遺伝子の一部」はイントロンであることが好ましく、当該「イントロン」はイントロン２であることが好ましい。
【００１２】
また本発明細胞は、非ヒト哺乳動物の細胞であることが好ましく、齧歯類に分類される動物の細胞であることは好ましく、マウスの細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明動物は、本発明モデル動物として利用することができ極めて有用である。本発明モデル動物は、神経症に対する薬剤等の探索や有効性の評価等に利用することができ、極めて有用である。また本発明細胞は、本発明動物や本発明モデル動物の生産に用いることができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明動物、本発明細胞
本発明動物は、ＮＧＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物である。
【００１５】
ここにいう「遺伝子の発現が抑制されている」とは、遺伝子の発現が完全に抑制されている（遺伝子が発現していない）ものと、遺伝子は発現しているがその発現量が野生型の同種の動物に比して低減しているものの両方を含む趣旨であるが、後者が好ましい。
【００１６】
ＮＧＣをコードする遺伝子の発現を抑制する方法も特に限定されないが、ＮＧＣをコードする遺伝子の一部を欠失させるか、又は当該遺伝子の一部にＮＧＣの発現を抑制する変異を導入する方法が例示される。すなわち、本発明動物では、ＮＧＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にＮＧＣの発現を抑制する変異を有していることが好ましい。このような欠失や変異は、後述するような標的遺伝子組換え法や、部位特異的変異法等によって導入することができる。
【００１７】
また、ここにいう「遺伝子の一部」も特に限定されない。例えばマウス由来のＮＧＣをコードする遺伝子はエキソン「１」、「１'」、「２」、「３」、「４」、「５」及び「６」（J. Biol. Chem., 275, p337-342, 2000）と、これらのエキソンの間に存在するイントロンとから構成されているが、前記「遺伝子の一部」はイントロンであることが好ましい。この「イントロン」は、ＮＧＣをコードする遺伝子を構成している非翻訳領域である限りにおいて１つのイントロンであってもよく、複数のイントロンであってもよい。なかでもイントロン２（エキソン２と３の間に存在するイントロンを指す）であることが好ましい。
【００１８】
またここにいう「非ヒト動物」とは、ＮＧＣ遺伝子を保持する動物種であって、かつ、ヒト以外の動物を意味するものである。なかでも、非ヒト哺乳動物（ヒトを除く哺乳動物）であることが好ましい。このような動物としては、例えばマウス、ラット、サル、ウサギ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。そのなかでも、齧歯類に分類される哺乳動物であることがより好ましい。齧歯類に分類される哺乳動物としては、マウス、ラット等が例示される。なかでも、マウスであることが特に好ましい。
【００１９】
以下に、本発明動物を生産する方法の一例を示す。
【００２０】
本発明動物は、標的遺伝子組換え法（ジーンターゲッティング法；例えば、実験医学別冊「ジーンターゲッティングの最新技術」（八木健 編集、２０００年、羊土社）、「ジーンターゲティング」（野田哲生 監訳、メディカル・サイエンス・インターナショナル社）、実験医学別冊「新訂  遺伝子工学ハンドブック  改訂第３版」（１９９９年、羊土社）、Science 244:1288-1292, 1989等参照）を利用して生産することができる。
【００２１】
具体的には、まず、ＮＧＣ遺伝子のエキソン（exon）を中心としてイントロン部分を含むゲノム断片を挿入したターゲティングベクターを調製する。かかるターゲッティングベクターは、常法（例えば、Science 244:1288-1292, 1989等）に従って作製することができ、以下のようなジーンターゲッティングの方法等に応じて適宜選択することができる；
・ＮＧＣ遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエキソンやイントロン部分に他のＤＮＡ断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンやイントロンの機能を破壊する方法（この場合、ＤＮＡ断片の組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択されうる）、
・loxP-Creシステム（Sauer及びHenderson、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(14) p5166, 1988）やfrt-Flpシステム等を用いてＮＧＣ遺伝子の全部又は一部を切り出して当該遺伝子を欠失させる方法、
・タンパク質のコード領域内へ終止コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にする方法、
・転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させる塩基配列（例えば、poly A付加シグナル等）を挿入して、完全なメッセンジャーＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築した塩基配列を有するＤＮＡ鎖を、相同的組換えによって対象とする非ヒト動物のＮＧＣ遺伝子座に組み込ませる方法。
【００２２】
このような方法のなかでも、loxP-Creシステムを用いることが好ましい。また、ターゲッティングベクターを調製する際には、目的とする相同組換えが起こった場合に発現して選別することができる陽性マーカーと、目的とする相同組換えが起こらなかって場合に発現して選別することができる陰性マーカーとを保持させることが好ましい。このような陽性マーカーや陰性マーカーは、当業者が適宜選択することができる。なかでも、陽性マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子を、陰性マーカーとしてはジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を用いることが好ましい。
【００２３】
次に、調製したターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する。これによって、本発明細胞が生産される。本発明細胞は、ＮＧＣをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、非ヒト動物のＥＳ細胞である。
【００２４】
本発明細胞は、前記の説明と同様に、ＮＧＣをコードする遺伝子の一部が欠失しているか又は当該遺伝子の一部にＮＧＣの発現を抑制する変異を有しているものが好ましく、かかる「遺伝子の一部」がイントロンであるものが好ましい。この「イントロン」はイントロン２であることが好ましい。
【００２５】
ターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法も、公知の手法の中から当業者が適宜選択することができ、特に限定されない。例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の方法が例示される。なかでもエレクトロポレーション法を用いることが好ましい。
【００２６】
ターゲッティングベクターを導入するＥＳ細胞は、どのような非ヒト動物を本発明動物とするかに応じて適宜選択することができる。例えば、マウスを本発明動物としたい場合には、マウスのＥＳ細胞にターゲッティングベクターを導入すればよい。したがってＥＳ細胞の由来は、本発明動物と同様に非ヒト哺乳動物であることが好ましく、齧歯類に分類される動物であることがより好ましく、マウスであることが特に好ましい。
【００２７】
例えば、マウス、ラット、サル、ウサギのＥＳ細胞は、それぞれ、Nature 292:154-156, 1981、Dev. Biol. 163(1):288-292, 1994、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995、Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996等に開示されているもの等を使用することができる。
【００２８】
ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロッティング法やＰＣＲ等で解析することによって、染色体上に存在する野生型のＮＧＣ遺伝子と導入した変異遺伝子断片との間で正しく相同遺伝子組換えが起こっているか否か確認することができる。これにより、染色体上のＮＧＣ遺伝子に変異が導入された細胞を選択することができる。
【００２９】
このようにして得られる本発明細胞を野生型動物の胚盤胞に注入し、つづいてこのキメラ胚を仮親の子宮に移植する。出生した動物を里親につけて飼育させた後、ＮＧＣ変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物を選別する。選別は、ゲノムＤＮＡを抽出してこれをサザンブロッティング法やＰＣＲ等で分析することによって行うことができる。
【００３０】
ＮＧＣ変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物と野生型動物との交配によって得られる子孫からさらにゲノムＤＮＡを抽出して、これをサザンブロッティング法やＰＣＲ等で分析することによって、変異遺伝子が導入されたヘテロ接合体を同定することができる。さらにヘテロ接合体同士の交配によって、ＮＧＣ変異遺伝子ついてホモ接合体となった個体動物を得ることができる。生産されたＮＧＣ変異遺伝子を保有するヘテロ接合体やホモ接合体は、生殖細胞や体細胞のすべてに安定的にＮＧＣ遺伝子変異が保持されており、交配等によって、効率良くその変異を子孫動物に伝達することができる。
＜２＞本発明モデル動物
本発明モデル動物は、本発明動物からなる神経症モデル動物である。
【００３１】
本発明動物は後述の実施例からも明らかな通り周囲に無関心で行動性が乏しい性質を有していることから、これを神経症のモデル動物として応用したものである。特に、このような消極的な行動は鬱病の症状に類似していることから、本発明モデル動物は鬱病のモデルマウスであることが好ましい。
【００３２】
本発明モデル動物の生産方法は、前記の本発明動物と同様である。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜１＞ターゲティングベクターの作製 
野生型マウスのＮＧＣ遺伝子の一部（Ｗ）、これにターゲッティングベクターが導入された状態（ＴＶ）、及び変異が起こった状態（Ｍ）の模式図を図１に示す。また、lox Pの塩基配列（配列番号１）、ＰＣＲプライマーとして用いた部分（PCR Primer）（配列番号２及び３）及びサザンブロッティングのプローブとして用いた部分（Southern probe）（配列番号４）の位置関係も併せて示す。このように、本実施例で用いたサザンブロッティングのプローブは、野生型マウスのＮＧＣ遺伝子のイントロン２の一部をベースに作製したものである。
【００３４】
ポジティブ選別を行うためにネオ耐性遺伝子（Neor）を、ネガティブ選別を行うためにジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子（DT）を用いた。ＮＧＣ遺伝子のエキソン１の上流約6.4 kbの部位からイントロン２に存在するBgl IIサイトまでを、DTカセット（pMCDT-A; インビトロジェン（Invitrogen）社製）に挿入した。poly A選別を行うために、イントロン２のBamH Iサイトに、 Neorカセットである pKJ2（インビトロジェン（Invitrogen）社）のEcoR I-BamH I 部位、及び、ＮＧＣ遺伝子のエキソン２の3'側の約400 bp（図１において「Ｄ」と表示）を挿入した。コンディショナル変異マウスを作製するために Cre-lox Pシステムを用い、lox P配列をイントロン１に存在するSma Iサイト及びNeorの両端に挿入した。ターゲティングベクターのサイズは15.7kbであった。
＜２＞変異マウスの作製
ターゲティングベクターをSac Iサイトで切断し、エレクトロポレーション法によって129マウス（マウスのストレイン名である）由来のＥＳ細胞（D3株）に導入した。PCRで相同組換え体をスクリーニングし、サザンブロッテイング法で相同組換えが起こっていることを確認した。PCR用のプライマーの位置、サザンブロッテイング用のプローブの位置は図１に示した。ゲノム遺伝子をEcoR Iで切断した場合には、サザンブロッティングにおいて、野生型は5kb、相同組換え型は4kbの位置にバンドが現れる。
【００３５】
宿主胚としてC57BL/6マウスの胚を用いた。キメラマウスをC57BL/6マウスと交配し、ヘテロマウスを得た。ヘテロマウス同士を交配しホモマウスを得、その後兄妹交配を行っている。
＜３＞変異マウス（５代目）の解析
（１）遺伝子の解析
２ヶ月令の野生型マウス（C57BL/6）と変異マウスについて、サザンブロッティングを行った。結果を図２に示す。図２中の「Wild」は野生型マウスを、「Mutant」は変異マウスをそれぞれ示す。野生型では5kb、変異マウスでは4kbの位置にバンドが観察された。
（２）ＮＧＣの発現量の解析
２カ月令の野生型及び変異マウスの海馬、脳幹、大脳及び小脳におけるＮＧＣの発現量をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。各組織からプロテオグリカンを抽出し、コンドロイチナーゼＡＢＣで処理した後、ＮＧＣをラットＮＧＣのコンドロイチン硫酸結合ドメインに対するポリクローナル抗体を用いて検出した。結果を図３に示す。図３中の「Hippocampus」は海馬を、「Brain stem」は脳幹を、「Cerebrum」は大脳を、「Cerebellum」は小脳をそれぞれ示す。また、「Ｃ」は野生型のマウスを、「Ｋ」は変異マウスをそれぞれ示す。また「−」はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理を行わなかったものを、「＋」はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理を行ったことを示す。
画像解析によってＮＧＣの半定量を行った結果、全ての部位において、変異マウスにおけるＮＧＣの発現は激減しており、その量は野生型の10％以下であった。
（３）その他の神経系プロテオグリカンの発現量の解析
２カ月令の野生型及び変異マウスの大脳および海馬におけるニューロカンおよびホスファカンの発現量を、ウエスタンブロッティング法を用いて検討した。ニューロカンはモノクローナル抗体である1G2（生化学工業株式会社製）、ホスファカンはモノクローナル抗体である6B4（生化学工業株式会社製）を用いて検出した。結果を図４に示す。図４の左側の図（Ａ）はニューロカンの検出結果を、右側の図（Ｂ）はホスファカンの検出結果を示す。また図４中、「Cerebrum」は大脳を、「Hippocampus」は海馬をそれぞれ示す。また、「Ｃ」は野生型のマウスを、「Ｍ」は変異マウスをそれぞれ示す。また「−」はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理を行わなかったことを、「＋」はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理を行ったことを示す。
【００３６】
画像解析によってニューロカンおよびホスファカンの半定量を行った結果、変異マウスにおける両者の発現量は、野生型と比べて大差なかった。
（４）組織学的な解析
２カ月令の野生型及び変異マウス（オス）の大脳組織及び小脳組織のパラフィン切片（いずれも前額断）を作製し、これをＨＥ染色して光学顕微鏡で観察した。大脳組織の結果を図５に、小脳組織の結果を図６にそれぞれ示す。図５及び図６中、「Normal」は野生型のマウスを、「Mutant」は変異型のマウスをそれぞれ示す。その結果、大脳及び小脳ともに、両者間で大きな違いは認められなかった。
（５）行動学的な解析
マウスの行動を観察するため、オープンフィールドテストを行った。２カ月令の野生型、ヘテロ又は変異マウス（ホモ）（いずれもオス）を３０ｃｍ角の白い箱に３分間入れたときの行動をビデオ観察した。テストは続けて３日間行った。
【００３７】
３分間のうちに後ろ足で立った回数を図７に、静止していた時間を図８にそれぞれ示す。図７及び図８中、左から、第１日目、第２日目及び第３日目における結果をそれぞれ示す。また、各日目の結果において、左のカラムは正常型のマウスの結果を、中央のカラムはヘテロマウスの結果を、右側のカラムは変異マウス（ホモ）の結果をそれぞれ示す。また、各カラムに付されたバーは、標準誤差を示す。
【００３８】
その結果、後ろ足で立ち上がる行動は、野生型及びヘテロマウスに比して変異マウスでは激減していた。また、３分間で静止していた時間は、野生型及びヘテロマウスに比して変異マウスにおいて著しく増加していた。Creマウスと交配して Neoｒ遺伝子を除去した場合にはこの行動異常は認められなかった。したがって、この異常行動は、脳におけるＮＧＣの発現低下に起因すると考えられる。
【００３９】
このような、周囲に無関心で行動性が乏しい性質は、鬱病の症状に類似していることから、神経症のモデル動物として利用できることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明動物は、本発明モデル動物として利用することができる。本発明モデル動物は、神経症に対する薬剤等の探索や有効性の評価等に利用することができる。本発明細胞は、本発明動物や本発明モデル動物の生産等に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明動物の作出に用いたターゲティングベクターを示す図である。
【図２】野生型及び変異マウスのサザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３】野生型及び変異マウスにおけるＮＧＣの発現をウエスタンブロッティング法で調べた結果を示す図である。
【図４】野生型及び変異マウスの大脳（A）および海馬（B）におけるニューロカンおよびホスファカンの発現をウエスタンブロッティング法で調べた結果を示す図である。
【図５】野生型及び変異マウスにおける大脳組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の結果を示す図である。
【図６】野生型及び変異マウスにおける小脳組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の結果を示す図である。
【図７】野生型及び変異マウスのオープンフィールドテスト（３分間に後ろ足で立った回数）の結果を示す図である。
【図８】野生型及び変異マウスのオープンフィールドテスト（３分間で静止していた時間）の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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