(57)【要約】【課題】検出可能な部分を含有する複素環式誘導体の提供。【解決手段】以下の構造：2006258818.tif 000057の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、核酸標識化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化３】
2006258818.tif 000047
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして
Ｍは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項２】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４】
2006258818.tif 000048
ここで、
Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、
Ｍは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ9であり、ここでＲ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項６】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項７】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項８】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項９】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが２である、核酸標識化合物。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが２である、核酸標識化合物。
【請求項１２】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項１３】
請求項３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＨであり；ＺはＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項１４】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化５】
2006258818.tif 000049
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして
Ｍは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項１５】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化６】
2006258818.tif 000050
ここで、
Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、
Ｍは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ9であり、ここでＲ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは１である、核酸標識化合物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは１である、核酸標識化合物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項２１】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項２２】
請求項１６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項２３】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４４】
2006258818.tif 000051
ここで、
Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項２４】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４５】
2006258818.tif 000052
ここで、
Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、アミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして
Ｍは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ9であり、ここでＲ9はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または、ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは１である、核酸標識化合物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは１である、核酸標識化合物。
【請求項２８】
請求項２５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＨまたはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項２９】
請求項２５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑはビオチンであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項３０】
請求項２５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項３１】
請求項２５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、ＡはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍが１である、核酸標識化合物。
【請求項３２】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４６】
2006258818.tif 000053
ここで、
Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9、またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、
Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項３３】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４７】
2006258818.tif 000054
ここで、
Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9、またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、
Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項３４】
請求項３２または３３に記載の核酸標識化合物であって、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である、核酸標識化合物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項３６】
請求項３４に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項３７】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４８】
2006258818.tif 000055
ここで、
Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9、またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項３８】
以下の構造の核酸標識化合物であって：
【化４９】
2006258818.tif 000056
ここで、
Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ9、ＳＲ9、またはＮＨＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；そして、
Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ9であり、ここで、Ｒ9は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ10であり、ここで、Ｒ10は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である、
核酸標識化合物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項４１】
請求項３９に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
【請求項４２】
請求項２、１６、２５、３４、または３９に記載の核酸標識化合物を核酸と結合させることによって生成される、核酸誘導体。
【請求項４３】
ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合される請求項４２に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
【請求項４４】
前記プローブがガラスチップに結合されている、請求項４３に記載のハイブリダイゼーション産物。
【請求項４５】
標識された核酸を合成する方法であって、該方法が、請求項２、１６、２５、３４、または３９に記載の核酸標識化合物を核酸と結合させる工程を包含する、方法。
【請求項４６】
核酸を検出する方法であって、該方法が、請求項４２に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府委託研究により行われる発明の権利書）
本発明は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ
ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより与えられた７０ＮＡＮＢ５Ｈ１０３１と契約を結び、政府の支援により行われた。
【０００２】
（技術分野）
本発明は核酸標識化合物に関する。より詳細には、本発明は、検出可能な部分を含有する複素環式誘導体を提供する。本発明はまた、このような複素環式誘導体の作製方法を提供する。本発明はさらに、この複素環式誘導体を核酸に結合させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
病気の個体および健常な個体における遺伝子発現は、しばしば異なり、そして特徴付け可能である。このような場合において、遺伝子発現をモニターする能力は、医師に強力な診断ツールを提供する。この形態の診断は、腫瘍学の領域において特に重要であり、ここで癌遺伝子の過剰発現、または腫瘍サプレッサ遺伝子の過小発現が腫瘍形成を引き起こすと考えられる。Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１，４６，３〜８を参照のこと。
【０００４】
遺伝子発現は、例えば、標的遺伝子の転写産物である核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することによって、間接的にモニターされ得る。核酸は、検出可能部分で化学的または生化学的に標識化され、公知の配列の局在的核酸プローブとハイブリダイズし得る。プローブ位置で標識化された核酸の検出は、標的遺伝子が発現したことを示す。国際出願公開ＷＯ９７／２７３１７、ＷＯ９２／１０５８８およびＷＯ９７／１０３６５を参照のこと。
【０００５】
核酸の標識化は典型的に、検出可能基（ラベル）を内部または末端位に共有結合することによって行われる。科学者は、酵素学的にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに取り込まれる、多数の検出可能ヌクレオチドアナログを報告した。例えば、Ｌａｎｇｅｒらは、共有結合ビオチン部分を含有するｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログを開示した。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８１，７８，６６３３〜６６３７。以下に示されるこれらのアナログは、ピリミジン環のＣ−５位に結合されたアリルアミンリンカーアームを有する。ｄＵＴＰおよびＵＴＰアナログ（ここで、ＲはＨまたはＯＨである）は、ポリヌクレオチドに取り込まれた。
【０００６】
【化７】
2006258818.tif 000002
【０００７】
Ｐｅｔｒｉｅらは、ｄＡＴＰアナログである、３−［５−［（Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロイル）アミノ］ペンチル］−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン−５’−トリホスフェートを開示した。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９１，２，４４１〜４４６。以下に示されるアナログは、３位を、ビオチン部分に結合されるリンカーアームで修飾される。Ｐｅｔｒｉｅらは、Ｒがビオチンである化合物は、ニックトランスレーションによってＤＮＡに取り込まれることを報告した。
【０００８】
【化８】
2006258818.tif 000003
【０００９】
Ｐｒｏｂｅｒらは、各々がスクシニルフルオレセイン色素を含む、４つのジデオキシヌクレオチドのセットを開示した。Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７，２３８，３３６〜３４１。これらのジデオキシヌクレオチド（これらのうちの１つが以下に示される）は、プライマーのテンプレート定方向伸長（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によってオリゴヌクレオチドに酵素学的に取り込まれる。これらの化合物は、ゲル移動に基づくＤＮＡ配列決定法を提供する。
【００１０】
【化９】
2006258818.tif 000004
【００１１】
Ｈｅｒｒｌｅｉｎらは、４つのＤＮＡ塩基の修飾されたヌクレオシド三リン酸を開示した。Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９４，７７，５８６〜５９６。これらの化合物（これらのうちの１つが以下に示される）は、放射性部分または蛍光性部分を含有する３’−アミノ基を含む。Ｈｅｒｒｌｅｉｎらはさらに、ＤＮＡ鎖ターミネーターとしてのヌクレオシドアナログの使用を記載した。
【００１２】
【化１０】
2006258818.tif 000005
【００１３】
Ｃｅｃｈらは、３’−アミノ官能化ヌクレオシド三リン酸を開示した。Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６，６１，Ｓ２９７〜Ｓ３００。これらの化合物（これらのうちの１つが以下に示される）は、アミノリンカーを通して３’位に結合されたフルオレセインを含有する。Ｃｅｃｈらは、記載された官能化ヌクレオシドはＤＮＡ配列決定のためのターミネーターとして有用であることを提案した。
【００１４】
【化１１】
2006258818.tif 000006
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によって以下が提供される。
（１）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００１６】
【化１】
2006258818.tif 000007
【００１７】
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミドアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（２）請求項１に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
（３）請求項２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨであり、ここでｍは１である、
核酸標識化合物。
（４）請求項２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（５）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００１８】
【化２】
2006258818.tif 000008
【００１９】
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（６）請求項５に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
（７）請求項６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（８）請求項６に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（９）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００２０】
【化３】
2006258818.tif 000009
【００２１】
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（１０）請求項９に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
（１１）請求項１０に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは１である、核酸標識化合物。
（１２）請求項１０に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは１である、核酸標識化合物。
（１３）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００２２】
【化４】
2006258818.tif 000010
【００２３】
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（１４）請求項１３に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または、ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である、核酸標識化合物。
（１５）請求項１４に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは１である、核酸標識化合物。
（１６）請求項１４に記載の核酸化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは１である、核酸標識化合物。
（１７）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００２４】
【化５】
2006258818.tif 000011
【００２５】
ここで、Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（１８）請求項１７に記載の核酸標識化合物であって、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である、核酸標識化合物。
（１９）請求項１８に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（２０）請求項１８に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（２１）以下の構造の核酸標識化合物であって：
【００２６】
【化６】
2006258818.tif 000012
【００２７】
ここで、Ａは、Ｈまたは該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
（２２）請求項２１に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である、
核酸標識化合物。
（２３）請求項２２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（２４）請求項２２に記載の核酸標識化合物であって、ここで、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である、核酸標識化合物。
（２５）請求項２に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（２６）請求項６に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（２７）請求項１０に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（２８）請求項１４に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（２９）請求項１８に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（３０）請求項２２に記載の核酸標識化合物と核酸を結合させることによって生成される、核酸誘導体。
（３１）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項２５に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（３２）請求項３１に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（３３）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項２６に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（３４）請求項３３に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（３５）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項２７に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（３６）請求項３５に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（３７）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項２８に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（３８）請求項３７に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（３９）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項２９に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（４０）請求項３９に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（４１）ハイブリダイゼーション産物であって、ここで、該ハイブリダイゼーション産物が、相補的なプローブに結合された請求項３０に記載の核酸誘導体を含む、ハイブリダイゼーション産物。
（４２）請求項４１に記載のハイブリダイゼーション産物であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、ハイブリダイゼーション産物。
（４３）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項２に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４４）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項６に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４５）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項１０に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４６）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項１４に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４７）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項１８に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４８）標識された核酸を合成する方法であって、該方法は、請求項２２に記載の核酸標識化合物を核酸に結合させる工程を包含する、方法。
（４９）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項２５に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（５０）請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（５１）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項２６に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（５２）請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（５３）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項２７に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（５４）請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（５５）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項２８に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（５６）請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（５７）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項２９に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（５８）請求項５７に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（５９）核酸を検出する方法であって、該方法は、請求項３０に記載の核酸誘導体をプローブと共にインキュベートする工程を包含する、方法。
（６０）請求項５９に記載の方法であって、ここで、前記プローブがガラスチップに結合されている、方法。
（発明の開示）
効率的に核酸に取り込まれ、容易に検出可能な組成物を提供する、新規の核酸標識化合物の開発は、遺伝子分析技術に役立った。これは、例えば、遺伝子発現のモニタリング、ならびに突然変異および多型現象の検出およびスクリーニングにおいて、役立つ。このような化合物は、核酸への酵素学的取り込みに適切でなければならない。さらに、標識化合物が結合される核酸は、プローブ（例えば、相補的核酸）に結合するその能力を保持しなければならない。
【００２８】
本発明は、核酸に酵素学的に取り込まれ得る、核酸標識化合物を提供する。これらの化合物が結合される核酸は、相補的核酸配列に結合するそれらの能力を維持する。
【００２９】
本発明の核酸標識化合物は、以下の構造を有する：
Ａ−Ｏ−ＣＨ2−Ｔ−Ｈc−Ｌ−（Ｍ）m−Ｑ
ここで、Ａは、水素、または核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｔは、テンプレート部分であり；Ｈcは、複素環式基であり；Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約５の範囲の整数である。
【００３０】
一実施態様において、核酸標識化合物は以下の構造を有する：
【００３１】
【化１２】
2006258818.tif 000013
【００３２】
ここで、Ａは、Ｈ、または核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミドアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。
【００３３】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。
【００３４】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨであり、ここでｍは１である。
【００３５】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である。
【００３６】
一実施態様において、核酸標識化合物は以下の構造を有する：
【００３７】
【化１３】
2006258818.tif 000014
【００３８】
ここで、Ａは、Ｈ、または核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。
【００３９】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−またはＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。
【００４０】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である。
【００４１】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である。
【００４２】
一実施態様において、核酸標識化合物は以下の構造を有する：
【００４３】
【化１４】
2006258818.tif 000015
【００４４】
ここで、Ａは、Ｈ、または核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。
【００４５】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。
【００４６】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは１である。
【００４７】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは１である。
【００４８】
一実施態様において、核酸標識化合物は以下の構造を有する：
【００４９】
【化１５】
2006258818.tif 000016
【００５０】
ここで、Ａは、Ｈ、または核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、アミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。
【００５１】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−またはＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。
【００５２】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは１である。
【００５３】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは１である。
【００５４】
１つの実施態様において、核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００５５】
【化１６】
2006258818.tif 000017
【００５６】
ここで、Ａは、Ｈまたは核酸標識化合物が核酸に結合することを可能にする官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３までの範囲の整数である。
【００５７】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００５８】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である。
【００５９】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である。
【００６０】
１つの実施態様において、核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００６１】
【化１７】
2006258818.tif 000018
【００６２】
ここで、Ａは、Ｈまたは核酸標識化合物が核酸に結合することを可能にする官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、官能基化されたアルキル、アルケニルアルキル、またはアルキニルアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３までの範囲の整数である。
【００６３】
別の実施態様において、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００６４】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、ビオチンであり；そしてｍは０である。
【００６５】
別の実施態様において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−であり；Ｑは、５−カルボキシフルオレセインであり；そしてｍは０である。
【００６６】
本発明はまた、核酸標識化合物と核酸および相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含むハイブリダイゼーション産物とを結合させることによって生成される核酸誘導体を提供する。
【００６７】
１つの実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００６８】
【化１８】
2006258818.tif 000019
【００６９】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００７０】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００７１】
別の実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００７２】
【化１９】
2006258818.tif 000020
【００７３】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００７４】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００７５】
別の実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００７６】
【化２０】
2006258818.tif 000021
【００７７】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００７８】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００７９】
別の実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００８０】
【化２１】
2006258818.tif 000022
【００８１】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００８２】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００８３】
別の実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００８４】
【化２２】
2006258818.tif 000023
【００８５】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００８６】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００８７】
別の実施態様において、結合に使用される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００８８】
【化２３】
2006258818.tif 000024
【００８９】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００９０】
この核酸誘導体から形成されるハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合された核酸誘導体を含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００９１】
本発明はまた、核酸標識化合物を核酸に結合することによって核酸誘導体を合成する方法を提供する。さらに、これは、プローブと共に核酸誘導体をインキュベーションする工程を含む、核酸を検出する方法を提供する。
【００９２】
１つの実施態様において、核酸に結合される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００９３】
【化２４】
2006258818.tif 000025
【００９４】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００９５】
この核酸誘導体を使用する核酸検出方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【００９６】
１つの実施態様において、核酸に結合される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【００９７】
【化２５】
2006258818.tif 000026
【００９８】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【００９９】
この核酸誘導体を使用する核酸検出方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【０１００】
１つの実施態様において、核酸に結合される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１０１】
【化２６】
2006258818.tif 000027
【０１０２】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【０１０３】
この核酸誘導体を使用する核酸検出方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【０１０４】
１つの実施態様において、核酸に結合される核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１０５】
【化２７】
2006258818.tif 000028
【０１０６】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｘは、Ｏであり；Ｙは、ＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０までの範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【０１０７】
この核酸誘導体を使用する核酸検出方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１つの実施態様において、プローブは、ガラスチップに結合される。
【０１０８】
１実施態様において、核酸に結合した核酸標識化合物は以下の構造を有し：
【０１０９】
【化２８】
2006258818.tif 000029
【０１１０】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑはビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは１または０である。
【０１１１】
核酸誘導体を使用する核酸検出の方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１実施態様において、プローブはガラスチップに結合される。
【０１１２】
１実施態様において、核酸に結合した核酸標識化合物は、以下の構造を有し：
【０１１３】
【化２９】
2006258818.tif 000030
【０１１４】
ここで、Ａは、ＨまたはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ1であり、ここで、Ｒ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり、ここでＲ1はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑはビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；そしてＭは−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは１または０である。
【０１１５】
核酸誘導体を使用する核酸検出の方法は、プローブと誘導体のインキュベーションを含む。１実施態様において、プローブはガラスチップに結合される。
【０１１６】
（発明を実施するための最良モード）
（定義）
「アルキル」は、炭素および水素のみを含む直鎖、分枝または環式の化学基をいう。アルキル基には、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチルおよび２−メチルブチルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は１個以上の置換基（例えば、ハロゲン、アルコキシ、アミノ）で置換されないかまたは置換される。
【０１１７】
「アリール」は、一価の不飽和芳香族炭素環式基をいう。アリール基には、フェニル、ナフチル、アントリルおよびビフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、１個以上の置換基（例えば、ハロゲン、アルコキシ、アミノ）で置換されないかまたは置換される。
【０１１８】
「アミドアルキル」は、構造−Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4−を有する化学基をいい、ここで、Ｒ3は水素、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ4はアルキルまたはアリールである。好ましくは、アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここで、ｎは約２〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、ここでＲ6は水素、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）−であり、ここでｎは約２〜約６の範囲の整数である。最も好ましくは、アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4Ｎ（Ｈ）−である。
【０１１９】
「アルキニルアルキル」は、構造−Ｃ≡Ｃ−Ｒ4−を有する化学基をいい、ここでＲ4はアルキルまたはアリールである。好ましくは、アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここでｎは１〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、ここでＲ6は水素、アルキルまたはアリールである。さらに好ましくは、アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）−であり、ここで、ｎは１〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2Ｎ（Ｈ）−である。
【０１２０】
「アルケニルアルキル」は、構造−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ4−を有する化学基をいい、ここでＲ4はアルキルまたはアリールである。好ましくは、アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここでｎは１〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、ここでＲ6は水素、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）−であり、ここでｎは１〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2Ｎ（Ｈ）−である。
【０１２１】
「官能基化されたアルキル」は、構造−（ＣＨ2）nＲ7−の化学基をいい、ここでｎは、１〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ7はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、官能基化されたアルキル基の構造は、−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−であり、ここでｎは、１〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、官能基化されたアルキル基の構造は、−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１２２】
「アルコキシ」は、構造−Ｏ（ＣＨ2）nＲ8−の化学基をいい、ここで、ｎは２〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ8はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、アルコキシ基の構造は、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−であり、ここで、ｎは２〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、アルコキシ基の構造は、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１２３】
「チオ」は、構造−Ｓ（ＣＨ2）nＲ8−の化学基をいい、ここでｎは２〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ8はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、チオ基の構造は、−Ｓ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−であり、ｎは、２〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、チオ基の構造は、−ＳＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１２４】
「アミノアルキル」は、アルキル基に結合したアミノ基を有する化学基をいう。好ましくは、アミノアルキルの構造は、−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは約２〜約１０の範囲の整数である。より好ましくは、アミノアルキルの構造は−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは約２〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、このアミノアルキル基の構造は、−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−である。
【０１２５】
「核酸」は、２個以上のヌクレオチドを含むポリマーをいい、一本鎖、二本鎖および三本鎖のポリマーが挙げられる。「ヌクレオチド」は、天然に存在するおよび天然に存在しない両方の化合物をいい、複素環式塩基、糖、および結合基、好ましくはリン酸エステルを含む。例えば、構造基が、２’−Ｏ位におけるメチルまたはアリル基、あるいは２’−Ｏ基と置換するフルオロ基のような、ヌクレオチドのリボシルまたはデオキシリボシル単位に加えられ得る。核酸のホスホジエステルのような結合基は、例えば、メチルホスホネートまたはＯ−メチルホスホネートで置換され得るか、または改変され得る。塩基および糖はまた、当該分野で公知であるように、改変され得る。本開示の目的のための「核酸」はまた、天然または改変された核酸塩基がポリアミド骨格に結合される「ペプチド核酸」を含む。
【０１２６】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションによって、標的核酸を検出するために使用され得る核酸をいう。好ましくは、プローブは、プローブの全長に沿って標的核酸に対して相補的であるが、プローブと標的との間の１個以上の塩基ミスマッチの存在下でハイブリダイゼーションが起こり得る。
【０１２７】
（核酸標識化合物）
本発明の核酸標識化合物は、以下の構造を有し：
【０１２８】
【化３０】
2006258818.tif 000031
【０１２９】
ここで、Ａは、核酸への核酸標識化合物の結合を可能にする水素または官能基であり；Ｔはテンプレート部分であり；Ｈcは複素環式環であり；Ｌはリンカー部分であり；Ｑは検出可能部分であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは０〜約５の範囲の整数である。
【０１３０】
基Ａは、核酸への核酸標識化合物の結合を可能にする水素または官能基のいずれかである。このような基の限定しない例には以下が挙げられる：モノホスフェート；ジホスフェート；トリホスフェート（Ｈ4Ｏ9Ｐ）；ホスホルアミダイト（（Ｒ2Ｎ）（Ｒ’Ｏ）Ｐ）であり、ここでＲは直鎖、分枝または環式アルキルであり、Ｒ’は２−シアノエチルのような保護基であり；およびＨ−ホスホネート（ＨＰ（Ｏ）Ｏ−ＨＮＲ3）であり、ここでＲは直鎖、分枝または環式アルキルである。
【０１３１】
テンプレート部分（Ｔ）は、ある位置でメチレン基（ＣＨ2）に共有結合され、そして別の位置で複素環式基（Ｈc）に共有結合される。テンプレート部分の限定されない組は図１に示され、ここで置換基は以下のように規定される：Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；ＹはＨ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；ＺはＨ、Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；ＷはＯ、ＳまたはＣＨ2であり；ＤはＯまたはＳであり；そしてＧはＯ、ＮＨまたはＣＨ2である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立し、Ｈ、アルキル、またはアリールである。
【０１３２】
複素環式基（Ｈc）は、炭素およびヘテロ原子の両方を含む環式部分である。本発明により意図される複素環式基の限定されない例は図２に示される：４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；１，３−ジアゾール（イミダゾール）；１，２，４−トリアジン−３−オン；１，２，４−トリアジン−３，５−ジオン；および５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オン。
【０１３３】
核酸標識化合物のリンカー部分（Ｌ）は、１つの末端位置にて複素環（Ｈc）に共有結合される。それは、別の末端位置にて検出可能部分（Ｑ）に、直接にまたは結合基（Ｍ）を介して結合される。それは、核酸への挿入に対して立体的にかつ電子的に適した構造を有する。リンカー部分の限定されない例には、アミドアルキル基、アルキニルアルキル基、アルケニルアルキル基、官能基化したアルキル基、アルコキシ基、チオ基およびアミノアルキル基が挙げられる。
【０１３４】
アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4−であり、ここで、Ｒ3は水素、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ4はアルキルまたはアリールである。このアミドアルキル基の構造は、好ましくは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここでｎは約２〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、そしてここでＲ6は、水素、アルキルまたはアリールである。さらに好ましくは、アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）−であり、ここでｎは約２〜約６の範囲の整数である。最も好ましくは、アミドアルキル基の構造は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4Ｎ（Ｈ）−である。
【０１３５】
アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ4−であり、ここで、Ｒ4は、アルキルまたはアリールである。アルキニルアルキル基の構造は、好ましくは、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここで、ｎは１〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、ここでＲ6は水素、アルキルまたはアリールである。さらに好ましくは、アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）−であり、ここでｎは、１〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アルキニルアルキル基の構造は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2Ｎ（Ｈ）−である。
【０１３６】
アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ4−であり、ここでＲ4はアルキルまたはアリールである。アルケニルアルキル基の構造は、好ましくは、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＲ5−であり、ここで、ｎは１〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ5はＯ、ＮＲ6またはＣ（Ｏ）であり、ここでＲ6は水素、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここでｎは、１〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アルケニルアルキル基の構造は、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＮＨ−である。
【０１３７】
官能基化したアルキル基の構造は、−（ＣＨ2）nＲ7−であり、ここでｎは、１〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ7はＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＣ（Ｏ）である。官能基化したアルキル基の構造は、好ましくは、−（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−であり、ここで、ｎは、１〜約４の範囲の整数である。より詳細には、官能基化したアルキル基は、−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１３８】
アルコキシ基の構造は、−Ｏ（ＣＨ2）nＲ8−であり、ここで、ｎは２〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ8はＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＣ（Ｏ）である。アルコキシ基の構造は、好ましくは、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−であり、ここで、ｎは２〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、アルコキシ基の構造は−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１３９】
チオ基は、構造−Ｓ（ＣＨ2）nＲ8−（ここで、ｎは、２〜約１０の範囲である整数であり、そしてＲ8は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＣ（Ｏ）である）である。このチオ基は、好ましくは、構造−Ｓ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−（ここで、ｎは、２〜約４の範囲である整数である）である。より好ましくは、このチオ基は、構造−ＳＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−である。
【０１４０】
アミノアルキル基は、アルキル基に連結するアミノ基を含む。好ましくは、アミノアルキル基は、構造−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−（ここで、ｎは、約２〜約１０の範囲である整数である）である。このアミノアルキル基は、さらに好ましくは、構造−ＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−（ここで、ｎは、約２〜約４の範囲である整数である）である。最も好ましくは、このアミノアルキル基は、構造−ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ−である。
【０１４１】
検出可能部分（Ｑ）は、シグナルを提供する化学基である。このシグナルは、任意の適切な手段により検出され、これらには、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段が挙げられる。特定の場合において、シグナルは、２以上の手段によって検出可能である。
【０１４２】
検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかのシグナルを提供する。標識基が、自発的にシグナルを放射するか、または適切な刺激を導入してシグナルを発生する場合に、直接的シグナルが生じる。放射標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐ）および磁性粒子（たとえば、ＤｙｎａｂｅａｄｓTM）は、直接的かつ自発的にシグナルを提供する基の非制限例である。刺激の存在下でシグナルを直接的に提供する標識基には、次の非制限例が挙げられる：コロイド金（４０〜８０ｎｍ直径）（これは、高い効率で緑色光を散乱する）；蛍光標識（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド（ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）（これらは、光を吸収し、そして実質的に光を放射する）；化学ルミネセンスまたはバイオルミネセンス標識（例えば、ルミノール、ロフィン、アクリジン塩およびルシフェリン）（これらは、化学的反応または生物学的反応の結果として電気的に励起され、そして実質的に光を放射する）；スピン標識（例えば、バナジウム、銅、鉄、マンガン、およびニトロオキシド遊離ラジカル）（これらは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光器によって測定される）；色素（例えば、キノリン色素、トリアリールメタン色素およびアクリジン色素）（これらは、特定の波長の光を吸収する）；ならびに着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズ。米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１号を参照のこと。
【０１４３】
検出可能部分は、自発的にシグナルを放射するか、または適切な刺激を導入してシグナルを発生する第二化合物と相互作用する場合に直接的シグナルを生じる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジンと結合体を形成することでシグナルを生じ、これは、次いで検出される。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓを参照のこと。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．編；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；第２４巻。ホースラディシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素（ＥＬＩＳＡアッセイにおけるような標識−抗体−抗体の抗体に結合される）はまた、間接的シグナルを生じる。
【０１４４】
好ましい検出可能部分は、蛍光基である。蛍光基は、高いシグナル対ノイズ比を典型的に生じ、これにより検出手順において増加した分解能および感度を提供する。好ましくは、蛍光基は、約３００ｎｍより上、より好ましくは約３５０ｎｍより上および最も好ましくは、約４００ｎｍより上の波長で光を吸収する。蛍光基によって放射される光の波長は、好ましくは、約３１０ｎｍより上、より好ましくは約３６０ｎｍより上および最も好ましくは、約４１０ｎｍより上の波長で光を吸収する。
【０１４５】
蛍光検出可能部分は、種々の構造クラスから選択され、これらには、以下の非制限的な例が挙げられる：１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’−ジアミノスチルベン、ピレン、四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール（ｓｔｅｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン（ｃｈｒｏｍｅｎ）、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチラート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビン、キサンテン色素（例えば、フルオレセインおよびローダミン色素）；シアニン色素；４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン色素、ならびに蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質）。
【０１４６】
多数の蛍光化合物は、本発明に組み込むのに適している。このような化合物の非制限例には、以下が挙げられる：ダンシルクロリド；フルオレセイン（例えば、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル−２−アミノ−６−スルホナトナフタレン；４−アセタミド−４−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホナート；Ｎ−フェニル，Ｎ−メチル２−アミノナフタレン−６−スルホナート；臭化エチジウム；ステブリン（ｓｔｅｂｒｉｎｅ）；アウロミン（ａｕｒｏｍｉｎｅ）−０，２−（９’−アントロリル）パルミタート；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ−Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ｃｙｃａｎｉｎｅ）；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４−（３’−ピレニル）ブトリエート（ｂｕｔｒｙａｔｅ）；ｄ−３−アミノデスオキシ−エキレニン；１２−（９’−アントロイル）ステアラート；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’−（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンズオキサゾール；ｐ−ビス［２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）］ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェンジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）−１，１０−デカンジイルジヨージド；ヘレブリゲニン（ｈｅｌｌｉｂｒｉｅｎｉｎ）のスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−［ｐ−（２−ベンズイミダゾールイル）フェニル］マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル）マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レザズリン（ｒｅｓａｚａｒｉｎ）；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジゾール；メロシアニン５４０；レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）；ローズベンガルならびに２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン。好ましくは、蛍光検出可能部分は、フルオレセインまたはローダミン色素である。
【０１４７】
別の好ましい検出可能部分は、コロイド金である。このコロイド金粒子は、典型的に、直径４０ｎｍ〜８０ｎｍである。このコロイド金は、種々の方法で標識化合物に結合され得る。１実施態様において、核酸標識化合物のリンカー部分は、チオール基（−ＳＨ）で終結し、そしてチオール基は、配位結合を介して直接的にコロイド金に結合する。Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６、３８２、６０７〜６０９を参照のこと。別の実施態様において、例えば、抗ビオチンのコロイド金結合体とビオチン化標識化合物との相互作用を介して間接的に結合される。金標識化合物の検出は、銀エンハンスメント法（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
ｍｅｔｈｏｄ）の使用を介して増強され得る。Ｄａｎｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈ  １９９３、１６、２０１−２０７を参照のこと。
【０１４８】
結合基（Ｍ）mは、リンカー基（Ｌ）を検出可能部分（Ｑ）に共有結合するのに役に立ち得る。任意の適切な構造は、標識化合物の機能と相互作用しない構造である。Ｍ基の非制限例には、以下が挙げられる：−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯ（Ｏ）−、−ＣＯ（ＮＨ）−、および−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−；ここで、ｍは、０〜約５、好ましくは０〜約３の範囲の整数である。
【０１４９】
１実施態様において、本発明の核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１５０】
【化３１】
2006258818.tif 000032
【０１５１】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；Ｚは、Ｈ，Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；Ｈcは、複素環式基であり；Ａは、Ｈ、または核酸標識を核酸に結合させる官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立しており、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１５２】
１実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、イミダゾールであり、そしてこの核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１５３】
【化３２】
2006258818.tif 000033
【０１５４】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；Ｚは、Ｈ，Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；Ａは、Ｈ、または核酸標識を核酸に結合させる官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立しており、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１５５】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、イミダゾールであり、そして連結部分は、アミノアルキルである：
【０１５６】
【化３３】
2006258818.tif 000034
【０１５７】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ3は、水素またはアルキルであり；Ｒ4は、−（ＣＨ2）nＮＨ−であり、ここで、ｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；そしてＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ−、ここでｍは、１または０である。より好ましくは、ＹおよびＺは水素であり；Ｒ3は水素であり；Ｒ4は、−（ＣＨ2）4ＮＨ−であり；Ａは、Ｈ4Ｏ9Ｐ3−であり；そしてＱは、ビオチンであり、ここで、Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、かつｍが１であり、あるいは、５−または６−カルボキシフルオレセインであり、かつｍが０である。
【０１５８】
別の実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、Ｃ３置換４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンであり、そして核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１５９】
【化３４】
2006258818.tif 000035
【０１６０】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；Ｚは、Ｈ，Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；Ａは、Ｈ、または核酸標識を核酸に結合させる官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立しており、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１６１】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、Ｃ３置換４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンであり、そして結合基は、アルキニルアルキルである：
【０１６２】
【化３５】
2006258818.tif 000036
【０１６３】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；ｎは、１〜約１０の範囲の整数であり；Ｒ5は、ＯまたはＮＨであり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。より好ましくは、ＹおよびＺは、ＯＨであり；ｎは１であり；Ｒ5は、ＮＨであり；Ａは、Ｈ4Ｏ9Ｐ3−であり；そしてＱは、ビオチンあるいは５−または６−カルボキシフルオレセインであり、ここでｍは１である。
【０１６４】
別の実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、Ｃ４置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンであり、そして核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１６５】
【化３６】
2006258818.tif 000037
【０１６６】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；Ｚは、Ｈ，Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；Ａは、Ｈ、または核酸標識を核酸に結合させる官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立しており、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１６７】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、Ｎ４置換４−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンであり、そして結合基は、アミノアルキルである：
【０１６８】
【化３７】
2006258818.tif 000038
【０１６９】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；ｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。より好ましくは、ＹおよびＺは、水素であり；ｎは４であり；Ａは、Ｈ4Ｏ9Ｐ3−であり；そしてＱは、ビオチンあるいは５−または６−カルボキシフルオレセインであり、ここでｍは０である。
【０１７０】
別の実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、１，２，４−トリアジン−３−オンであり、そして核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１７１】
【化３８】
2006258818.tif 000039
【０１７２】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1またはＮＨＲ1であり；Ｚは、Ｈ，Ｎ3、ＦまたはＯＲ1であり；Ａは、Ｈ、または核酸標識を核酸に結合させる官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立しており、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１７３】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、１，２，４−トリアジン−３−オンであり、そして結合基は、アミノアルキルである：
【０１７４】
【化３９】
2006258818.tif 000040
【０１７５】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；ｎは、約２〜約１０の範囲の整数であり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここでｍは、１または０である。より好ましくは、ＹおよびＺは、水素であり；ｎは４であり；Ａは、Ｈ4Ｏ9Ｐ3−であり；そしてＱは、ビオチンあるいは５−または６−カルボキシフルオレセインであり、ここでＭは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、そしてｍは１である。
【０１７６】
別の実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンであり、そして核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１７７】
【化４０】
2006258818.tif 000041
【０１７８】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能な部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1、またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、またはＯＲ1；Ａは、Ｈまたは核酸標識の核酸への付着を可能にする官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立であり、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１７９】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンであり、そして結合基は、アルケニルアルキルである：
【０１８０】
【化４１】
2006258818.tif 000042
【０１８１】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｒ5は、ＮＲ6であり、ここで、Ｒ6は、水素、アルキルまたはアリールであり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【０１８２】
別の実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オンであり、そして核酸標識化合物は、以下の構造である：
【０１８３】
【化４２】
2006258818.tif 000043
【０１８４】
ここで、Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは、検出可能な部分であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ1、またはＣＨＲ2であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、ＯＲ1、ＳＲ1、またはＮＨＲ1；Ｚは、Ｈ、Ｎ3、Ｆ、またはＯＲ1；Ａは、Ｈまたは核酸標識の核酸への付着を可能にする官能基であり；そしてＭは、結合基であり、ここで、ｍは、０〜約３の範囲の整数である。置換基Ｒ1およびＲ2は、互いに独立であり、そしてＨ、アルキルまたはアリールである。
【０１８５】
好ましい実施態様において、複素環式基（Ｈc）は、５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オンであり、そして結合基は、アルケニルアルキルである：
【０１８６】
【化４３】
2006258818.tif 000044
【０１８７】
ここで、Ｙは、水素またはヒドロキシルであり；Ｚは、水素またはヒドロキシルであり；ｎは、約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｒ5は、ＮＲ6であり、ここで、Ｒ6は、水素、アルキルまたはアリールであり；Ａは、水素またはＨ4Ｏ9Ｐ3−であり；Ｑは、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；Ｍは、−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5ＮＨ−であり、ここで、ｍは、１または０である。
【０１８８】
（核酸標識化合物の合成）
図３は、核酸標識化合物８ａおよび８ｂへの合成経路を示し、ここで、複素環式基（Ｈc）は、イミダゾールであり、そしてリンカー部分（Ｌ）は、アミドアルキルである。シリル保護イミダゾール（２）をペントフラノース（１）に添加し、カルボエトキシイミダゾールジデオキシリボシド異性体（３ａ〜３ｄ）の混合物を得た。この異性体を分離して、精製された３ｃを得た。３ｃのカルボエトキシ基を、ジアミンを用いて、アミノカルボキシアミド（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（４）に転換した。４の末端アミンを保護し、トリフルオロアセチル化生成物５を得た。５のシリル保護基を除去し、第１級アルコール６を得た。化合物６を５’−トリホスフェートに転換し、７を得た。７のトリフルオロアセチル保護基を除去し、そして脱保護されたアミンを、ビオチン−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−ＮＨＳまたは５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳと反応させ、それぞれ核酸標識化合物８ａおよび８ｂを得た。
【０１８９】
図４は、Ｃ３−標識４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンβ−Ｄ−リボフラノシドトリホスフェートへの合成経路を示す。保護されたプロパルギルアミンリンカーを、パラジウム触媒下で、ヌクレオシド（９）に添加して、カップリングされた生成物（１０）を得た。アルキレン置換ヌクレオシド（１０）の第１級アルコールをホスホリル化し、５’−トリホスフェート１１を得た。トリホスフェート１１の保護アミンを、次いで、脱保護し、そして生じた第１級アミンを、反応性ビオチンまたはフルオレセイン誘導体で処理し、それぞれ核酸標識化合物１２ａおよび１２ｂを得た。
【０１９０】
図５は、ピラゾロピリミジンヌクレオチドへの合成経路を示す。クロロピラゾロピリミジン（１３）を、ペントフラノース１に添加し、アノマーの混合物として付加体１４を得た。ジアミンを化合物１４に添加し、第１級アミン（１５）の混合物を得た。第１級アミン（１５）を保護し、そしてクロマトグラフィーによって分離し、純粋なβ−アノマー１６を得た。１６のシリル基を除去し、そして生じた第１級アルコールをホスホリル化し、トリホスフェート１７を得た。１７のトリフルオロアセチル基を除去し、そして脱保護されたアミンを、反応性ビオチンまたはカルボキシフルオレセイン誘導体で処理して、それぞれ核酸標識化合物１８ａ〜１８ｄを得た。
【０１９１】
図６は、Ｎ４−標識１，２，４−トリアジン−３−オンβ−Ｄ−リボフラノシドトリホスフェートへの反応経路を示す。１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンリボヌクレオシド１９を、トリアゾールおよび三塩化リンで処理して、トリアゾールヌクレオシド２０に転換した。ジアミンを２０へ添加して、アミノアルキルヌクレオシド２１を得た。２１の第１級アミンを保護し、トリフルオロアセトアミド２２を得た。２２の第１級アルコールをホスホリル化し、そして保護アミンを脱保護し、そして、反応性ビオチンまたはカルボキシフルオレセイン誘導体と反応させて、それぞれ核酸標識化合物２３ａおよび２３ｂを得た。
【０１９２】
図７は、Ｃ５−標識１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンリボシドホスフェートへの反応経路を示す。アルデヒド２４をイリド２５と反応させ、フタルイミド保護アリルアミン２６を得る。化合物２６をペントフラノシド２７とカップリングし、ヌクレオシド２８を得る。２８のフタルイミド基をヒドラジンで処理して除去し、第１級アミン２９を得る。アミン２９を、アミド３０として保護する。アミド３０をホスホリル化し、脱保護し、そして、ビオチンまたはカルボキシフルオレセインの反応性誘導体で処理して、それぞれ核酸標識化合物３１ａおよび３１ｂを得る。
【０１９３】
図８は、Ｃ５−標識５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オンリボシドトリホスフェートへの反応経路を示す。化合物２８を、塩素化剤およびアンモニアで処理して、アミノ−１，３，６−トリアジン化合物３２に転換する。３２のフタルイミド基を、ヒドラジンで処理して除去し、そして得られる第１級アミンを保護して、３３を得る。化合物３３をホスホリル化し、脱保護し、そしてビオチンまたはカルボキシフルオレセインの反応性誘導体で処理して、それぞれ核酸標識化合物３４ａおよび３４ｂを得る。
【０１９４】
（核酸標識）
核酸は、生体サンプルから単離され得るか、または、当業者に公知の方法に従って、例えば、固体支持体上または溶液中で、合成され得る。本明細書中で使用されるように、標識化プロセスにおいて使用される核酸の長さまたは起源において、制限は存在しない。核酸の例示的な単離および精製方法は、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎに記述される（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，編；第１巻；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎ．Ｙ．，１９９３）。単離の好ましい方法は、酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−フェノール−クロロホルム抽出に続いて、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ）ｎ磁気ビードの使用に関係する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９；第１〜３巻；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎ．Ｙ．，１９８７）。
【０１９５】
特定の場合において、核酸は増幅を通して、量が増加する。適切な増幅法は、以下の例を含むが、それらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ，らＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９８９，４，５６０；Ｌａｎｄｇｒｅｎ，らＳｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２４１，１０７７；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ，らＧｅｎｅ  １９９０，８９、１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８９，８６，１１７３）；および自己持続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９０，８７，１８７４）。
【０１９６】
核酸標識化合物は、種々の方法を使用して、核酸内に組み込まれ得る。例えば、それは、起源の核酸サンプル（例えば、ＭＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）または増幅生成物へ直接付着させ得る。標識化合物を核酸に付着する方法は、ニック転位、３−末端−標識、連結反応、インビトロ転写（ＩＶＴ）またはランダムプライミングを含むが、これだけに限定されない。核酸がＲＮＡである場合、標識化リボリゴヌクレオチドが、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼのようなＲＮＡリガーゼを使用して連結される（Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ；ＵｈｌｅｎｂｅｃｋおよびＧｒｅｅｎｓｐｏｔ，編；第１５巻，Ｂ，ｐｐ．３１−５８；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ｐｐ．５．６６−５．６９）。末端転位酵素は、例えば、核酸が１本鎖ＤＮＡである場合、デオキシ−、ジデオキシ−、またはリボヌクレオシド（ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰまたはＮＴＰ）を付加するために使用される。
【０１９７】
標識化合物はまた、核酸の内部位置で組み込まれ得る。例えば、標識化合物の存在下でのＰＣＲは、内部に標識された増幅生成物を提供する。例えば、Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９４，２２，３２２６−３２３２を参照。同様に、標識化合物の存在下におけるＩＶＴは、内部に標識化された核酸を提供し得る。
【０１９８】
（プローブハイブリダイゼーション）
標識化合物が付着する核酸は、核酸プローブとのハイブリダイゼーション後、検出され得る。あるいは、プローブは、使用者によって好まれる実験スキームに依存して、標識され得る。プローブは核酸であるか、または改変された核酸であり、これは、固体支持体に付着されるか、または溶液中に存在するかのいずれである。それは、それがハイブリダイズする標識された核酸に対し、構造において相補的である。固体支持体は、任意の適切な材料であり、これはポリスチレンベースビーズおよびガラスチップを含む。好ましい実施態様において、プローブまたは標的核酸は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）製品（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のようなガラスチップに付着される。国際出願公開第ＷＯ９７／１０３６５号、同第ＷＯ９７／２９２１２号、同第ＷＯ９７／２７３１７号、同第ＷＯ９５／１１９９５号、同第ＷＯ９０／１５０７０号、および米国特許第５，７４４，３０５号、同第５，４４５，９３４号を参照。これらは、これによって参考として援用される。
【０１９９】
プローブハイブリダイゼーションは、たいてい核酸の検出における工程であるので、核酸標識化合物は、このプロセスに、実質的に干渉しない構造であるべきである。従って、標識化合物の立体的および電子的性質は、付着された核酸の相補的構造への結合と両立できる。
【実施例】
【０２００】
以下の実施例は、例示のために示されるのであり、本発明を限定するためではない。
【０２０１】
（一般的な実験の詳細）
試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から、入手可能な最高の純度で購入した。列挙する全ての溶媒は、無水物であった。中間体は、1Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析により特徴付けた。
【０２０２】
（実施例１）
フルオレセインおよびビオチンにより標識した、１−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロペンタフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミドヌクレオチドの合成
１−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−２，３−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−ペンタフラノース１（９．４ｇ、３４．２ｍｍｏｌｅ）（Ｄｕｅｌｈｏｌｍ，Ｋ．；Ｐｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９２，１を参照のこと）および１−トリメチルシリル−４−カルボエトキシイミダゾール２（６．３ｇ；３４．２ｍｍｏｌｅ）（Ｐｏｃｈｅｔ，Ｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，５，１６７９を参照のこと）を、１００ｍｌの乾燥ＤＣＭ中Ａｒ下で合わせ、そしてトリメチルシリルトリフレート触媒（６．２ｍｌ；３４．２ｍｍｏｌｅ）を０℃で添加した。この溶液を室温で５時間撹拌し、そして次いで、１００ｍｌのＮａＨＣＯ3飽和水溶液で３回、ＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、ＮａＳＯ4で乾燥して、エバポレートし、４種類のカルボエトキシイミダゾールジデオキシリボシド異性体（３ａ〜ｄ）（これらは、Ｎ１およびＮ３の両方のアルキル化生成物のαおよびβアノマーに対応する）の粗製混合物を１４ｇ得た。これらの異性体生成物を精製し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で分離して、全収率は５２％であった。β−Ｎ１異性体（２．２ｇ；１８％収率）を、1Ｈ−ＮＭＲの化学シフトおよびＮＯＥデータにより同定した（Ｐｏｃｈｅｔ，Ｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，５，１６７９を参照のこと）。精製した３ｃ（０．５ｇ；１．４ｍｍｏｌｅ）を、２０倍過剰の１，４−ジアミノブタン（３．０ｍｌ、３０ｍｍｏｌｅ）と共に、１４５℃付近で４時間加熱し、次いで、得られた混合物を、５０ｍｌのＥｔＯＡｃで希釈し、水で３回、ブラインで１回洗浄し、ＮａＳＯ4で乾燥して、エバポレートし、イミダゾール−４−（４−アミノブチル）カルボキサミドジデオキシリボシド４を、無色のオイルとして、５００ｍｇ（９５％）得た。トルエンと共蒸発させた後に、４（３９３ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌｅ）を、トリフルオロアセチルイミダゾール（９４μＬ；０．８３ｍｍｏｌｅ）と５ｍｌ乾燥ＴＨＦ中で０℃で合わせ、そして１０分間撹拌した。溶媒をエバポレートし、そして油性の残渣を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液で２回、ＮａＣｌ飽和水溶液で１回抽出し、ＮａＳＯ4で乾燥し、そしてエバポレートして、４７５ｍｇ（９９％）のＮ−ＴＦＡ保護されたヌクレオシド５を、無色のオイルとして得た。ＴＢＤＭＳ基を、２０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の過剰のトリエチルアミントリヒドロフルオリド（２．３ｍｌ；１４．４ｍｍｏｌｅ）を添加し、一晩撹拌することによって、除去した。ＴＨＦを真空下でエバポレートし、残渣を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、そしてこの溶液をＮａＨＣＯ3飽和水溶液とブラインの１：１の混合物で注意深く洗浄して中性とし、次いでＮａＳＯ4で乾燥し、そしてエバポレートして、３４０ｍｇ（９６％）の５を淡黄色オイルとして得た。ＮＭＲおよびＭＳのデータは、帰属した構造と一致した。
【０２０３】
ヌクレオシド６を、他の箇所（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、ＰＣＴ
０  ２５２  ６８３  Ａ２を参照のこと）に報告された手順に従って、５’−トリホスフェートに転換し、脱保護し、ビオチン−ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ−ＮＨＳまたは５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳと反応させ、そして精製して、標識されたヌクレオチド８ａ、ｂを得た（ＨＰＬＣ、31Ｐ−ＮＭＲから、９５％より高い純度）。
【０２０４】
（実施例２）
Ｃ３−標識４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンβ−Ｄ−リボフラノシドトリホスフェートの合成
３−ヨード−４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンリボフラノシド（ｒｉｂｏｆｕｒａｎｓｉｄｅ）（９）の合成を、Ｈ．Ｂ．Ｃｏｔｔａｍら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３４２４に記載のように実施した。適切なデオキシフラノシド前駆体を使用して、２’−デオキシおよび２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの両方を、類似の手順を使用して調製した。例えば、Ｕ．ＮｅｉｄｂａｌｌａおよびＨ．Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ  １９７４、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３９：３６５４；Ｋ．Ｌ．ＤｕｅｈｏｍおよびＥ．Ｂ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  １９９２、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９２：１を参照のこと。あるいは、これらは、確立された手順に従って、リボフラノシド９を脱酸素することにより、調製される。Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓら、１９８３  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：４０５９；およびＣ．Ｋ．Ｃｈｕら、１９８９  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：２２１７を参照のこと。
【０２０５】
保護されたプロパルギルアミンリンカーを、有機パラジウムに媒介される４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンリボシドの３位への置換を経て、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオシド（９）に付加した（Ｈｏｂｂｓ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：３３６）により記載される手順を使用した）。ヨウ化銅（３８ｍｇ；０．２ｍｍｏｌｅ）、トリエチルアミン（５６０μＬ；４．０ｍｍｏｌｅ）、Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミノプロピン（７００μＬ；６．０ｍｍｏｌｅ）および３−ヨード−４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  −Ｄ−リボフラノシド（９）（Ｈ．Ｂ．Ｃｏｔｔａｍら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３４２４）（７８６ｍｇ；２．０ｍｍｏｌｅ）を、５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中アルゴン下で合わせた。この撹拌混合物に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２３２ｍｇ；０．２ｍｍｏｌｅ）を添加した。この溶液は、１０分以内に均一になり、そして暗所でさらに４時間撹拌し、この時点で、この反応物を２０ｍＬのＭｅＯＨ−ＤＣＭ（１：１）で希釈し、３．３ｇのＤｏｗｅｘ  ＡＧ−１アニオン交換樹脂（重炭酸塩形態）を添加して、撹拌をさらに１５分間続けた。この樹脂を濾過により除去して、ＭｅＯＨ−ＤＣＭ（１：１）で洗浄し、そしてあわせた濾液をエバポレートして乾固させた。残渣を４ｍＬの熱ＭｅＯＨに溶解し、次いで１５ｍＬのＤＣＭを添加して、この混合物を昇温状態に保って均一な溶液を維持し、同時にこの溶液を、１：９  ＭｅＯＨ−ＤＣＭ中に充填したシリカゲルのカラム（５ｃｍ×２５ｃｍ）に装填した。この生成物（Ｒf約０．４、６：３：１：１  ＤＣＭ−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−ＨＯＡｃ）を、１０〜１５〜２０％  ＭｅＯＨ−ＤＣＭの段階的な勾配で溶出した。得られた淡黄色の固体を、２．５ｍｌの氷冷アセトニトリルで３回、次いでエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥して、６３０ｍｇ（７５％）の４−アミノ−３−（Ｎ−トリフルオロアセチル−３−アミノプロピニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンβ−Ｄ−リボフラノシド（１０）を得た。この生成物の同定を、1Ｈ−ｎｍｒ、質量分析および元素分析により、確認した。
【０２０６】
このヌクレオシドを、他の箇所（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、ＰＣＴ  ０  ２５２  ６８３  Ａ２）に報告された手順に従って、５’−トリホスフェート（１１）に転換し、脱保護し、オキシスクシニミジル−（Ｎ−ビオチノイル−６−アミノ）ヘキサノエート、またはオキシスクシニミジル−（Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボキシル）−６−アミノ）ヘキサノエートと反応させ、そして精製して、ビオチン−およびフルオレセイン−標識ヌクレオチド（１２ａ、１２ｂ）を、９５％より高い純度で得た。
【０２０７】
（実施例３）
フルオレセイン−およびビオチン−Ｎ６−ジデオキシ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチドの合成
１−Ｏ−アセチル−５−Ｏ（ｔ−ブチルジメチルシリル）−２，３−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−ペントフラノース（１）および１−トリメチルシリル−４−クロロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（１３）を、文献の手順に従って合成した。Ｄｕｅｌｈｏｌｍ，Ｋ．Ｌ．；Ｐｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９２、１〜２２；およびＲｏｂｉｎｓ，Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ａｍｅｒ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１９９５、７８、７８４〜７９０。４０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２．３ｇ（８．３ｍｍｏｌ）の１および１．９ｇ（８．３ｍｍｏｌ、１当量）の１３に、０℃、アルゴン下で、１．５ｍＬ（８．３ｍｍｏｌ、１当量）のトリメチルシリルトリフレートを、５分間かけてゆっくりと添加した。３０分後、４．２ｍｌ（４１．５ｍｍｏｌ、５当量）の１，２−ジアミノブタンを手早く添加し、そしてこの反応系を室温で１時間撹拌した。溶媒をエバポレートし；残渣を５０ｍｌの酢酸エチルに溶解して、５０ｍｌのＮａＨＣＯ3の飽和水溶液で洗浄し、そしてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過して、溶媒をエバポレートし、４．２ｇの黄色泡状物を得た。この泡状物を、１００ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、そして１００ｍｌのヘキサンを添加して、生成物をオイルとして沈殿させた。この溶媒をデカントし、そしてこのオイルを高真空下で乾燥させて、３．４ｇの１５を淡黄色泡状物として得た。ＨＰＬＣ、ＵＶおよびＭＳのデータは、α−およびβ−アノマーの２：１混合物に一致した。
【０２０８】
１４０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の、異性体の粗製混合物（３．４ｇ、８．１ｍｍｏｌ、約５０％純粋）に、０℃、アルゴン下で、１．０ｍｌの１−トリフルオロアセチルイミダゾール（８．９ｍｍｏｌ、１．１当量）をゆっくりと添加した。この反応系を、ＲＰ−ＨＰＬＣで追跡した。さらなる５％のアシル化剤を添加して、出発物質をＴＦＡ−保護されたアノマーの混合物に完全に転換させた。Ｂｅｒｇｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．；ＭｃＭａｉｎｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  １９９８、５３、３１０８〜３１１１。この反応系を室温まで昇温させ、次いで溶媒をエバポレートして約２５ｍｌ容量とし、そして１００ｍｌの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、２５ｍｌの１％ＮａＨＣＯ3水溶液で２回、ブラインで１回抽出し、次いでＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そしてエバポレートして、３．４ｇの黄色泡状物を得た。この粗製物質を、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン中のシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、１６の１．３ｇのα−アノマーおよび０．７ｇのβ−アノマーを得た（全収率５０％）。１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＳのデータは、帰属した構造および立体化学に一致した。
【０２０９】
５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１．３ｇ（２．５ｍｍｏｌ）の１６（α−アノマー）に、アルゴン下で、１ｍｌ（１３．６ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンおよび６．１ｍｌ（３７．５ｍｍｏｌ、１５当量）のトリエチルアミントリヒドロフルオリドを添加した。１６時間の撹拌の後に、この溶媒をエバポレートし、そして残渣のトリエチルアミントリヒドロフルオリドを、高真空下で除去した。Ｐｉｒｒｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ら；Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９４、４、１３４５〜１３４６。その残渣を１００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、そして１００ｍｌのＮａＨＣＯ3の飽和水溶液で４回、ブラインで１回、注意深く洗浄し、次いでＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そしてエバポレートして、８５０ｍｇ（９５％）の白色泡状物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶおよびＭＳのデータは、脱シリル化したヌクレオシドの帰属した構造に一致し、これを、さらに精製することなく次の工程に使用した。
【０２１０】
このヌクレオシドを、Ｅｃｋｓｔｅｉｎリン酸化手順（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．Ｌ．；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９、５４、６３１〜６３５）を使用して、トリホスフェートに転換し、続いてＲｅｓｏｕｒｃｅＱアニオン交換カラム（緩衝液Ａは、２０ｍＭ  Ｔｒｉ  ｐＨ８、２０％ＣＨ3ＣＮであり、そして緩衝液Ｂは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０％ＣＨ３ＣＮである）におけるＨＰＬＣで精製した。31Ｐ−ＮＭＲ、ＵＶおよびＭＳのデータは、このトリホスフェートの構造に一致した。このトリフルオロアセチル保護基を、過剰のＮＨ4ＯＨで、５５℃で１時間処理することによって除去し、続いてエバポレートして乾固させた。質量分析データは、アミノブチルヌクレオチド１７に一致した。さらに精製することなく、このヌクレオチドを、他の箇所（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、ＰＣＴ  ０  ２５２  ６８３
Ａ２）に記載のように、ビオチン−ＮＨＳエステルまたは５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳのいずれかで処理し、それぞれの標識ヌクレオチド１８ａ〜１８ｄを形成し、これらを記載のように（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、ＰＣＴ  ０  ２５２  ６８３  Ａ２）、ＨＰＬＣによって精製した（１８ａの場合には、緩衝液が２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６であったことを例外とする）。31Ｐ−ＮＭＲおよびＵＶのデータは、この標識アナログの構造に一致した。
【０２１１】
（実施例４）
（Ｎ４−標識１，２，４−トリアジン−３−オンβ−Ｄ−リボフラノシド三リン酸）
３０ｍＬ乾燥ＡＣＮ中の１，２，４−トリアゾール（６．７ｇ；９７ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＰＯＣｌ3（２．１ｍＬ；２２ｍｍｏｌ）を攪拌しながらアルゴン下で徐々に添加した。３０分後、この溶液を０℃まで冷却し、そして１０ｍＬＡＣＮ中のトリエチルアミン（２１ｍＬ；１５０ｍｍｏｌ）および２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−６−アザウリジン（１９、４．１４ｇ；１１ｍｍｏｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販））の溶液を添加した。さらに１時間室温で攪拌した後、得られた活性化ヌクレオシドの溶液を、２０ｍＬ  ＭｅＯＨ中、１，４−ジアミノブタン（４６ｇ；５２４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ滴下して移した。この溶媒を真空下で除去し、そして残渣を水に溶解し、酢酸で中和し、そして再度エバポレートして乾固した。この粗残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（９５：５  ＭｅＯＨ−ＮＨ4ＯＨ）、続いて分取逆層ＨＰＬＣによって精製し、１５０ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ；３％）のアミノブチルヌクレオシド（２１）を得た。これを、０℃で２時間、３ｍＬのＡＣＮ中の１−トリフルオロアセチルイミダゾール（３００ｕＬ；１．８ｍｍｏｌ）との反応によって、直接、ＴＦＡ保護ヌクレオシド（２２）へ転換し、この溶媒をエバポレートし、そしてフラッシュクロマトグラフィー（１：９  ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製した。収量１７５ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ；９３％）この生成物の同定を、1Ｈ−ｎｍｒおよび質量分析によって確認した。
【０２１２】
このヌクレオシドを、５’−三リン酸へ転換し、脱保護し、オキシスクシンイミジル−（Ｎ−ビオチノイル−６−アミノ）ヘキサノエート、またはオキシスクシンイミジル−（Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボキシ）−６−アミノ）ヘキサノエートと反応させ、そして他に報告される手順（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８，ＰＣＴ  ０  ２５２  ６８３  Ａ２．）に従って精製し、ビオチン−およびフルオレセイン−標識ヌクレオチド（２３ａ、２３ｂ）を＞９５％の純度で得た。
【０２１３】
（実施例５）
（ビオチンおよびフルオレセインＣ５−標識１，２，４，−トリアジン−３，５−ジオンリボシド三リン酸の合成）
５−ホルミル−６−アザウラシル（２４）を、文献手順に従って調製した。Ｓｃｏｐｅｓ，Ｄ．Ｉ．Ｃ．１９８６，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．，２９，８０９−８１６、およびそこで引用される参考文献を参照のこと。化合物２４を、２５のホスホニウムイリド（これは、２５を触媒量のｔ−ブトキシドで処理することによって形成される）と反応させ、フタルイミドイル保護アリルアミン２６を得る。Ｓｃｏｐｅｓら、１９８６、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．，２９，８０９−８１６の手順に従って、２６とβ−Ｄ−ペントフラノシド２７（Ａｌｄｒｉｃｈから市販）とを反応させて、保護アリルアミン２６をリボシル化し、β−アノマー２８を得る。β−リボヌクレオシド２８を、ＴＨＦ中の無水ヒドラジンで脱保護し、アリルアミン２９を得る。ＴＨＦ中での一級アミン２９とトリフルオロアセチルイジダゾールとの反応によって、保護アミン３０を得る。
【０２１４】
ヌクレオシド３０を、５’−三リン酸へ転換し、脱保護し、オキシスクシンイミジル−（Ｎ−ビオチオニル−６−アミノ）ヘキサノエートまたはオキシスクシンイミジル−（Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボキシ）−６−アミノ）ヘキサノエートと反応させ、そしてＰｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８，ＰＣＴ  ０
２５２  ６８３  Ａ２）で報告される手順に従って精製し、それぞれビオチン−ならびにフルオレセイン−標識ヌクレオチド３１ａおよび３１ｂを得る。
【０２１５】
（実施例６）
（ビオチンおよびフルオレセインＣ５−標識５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オンリボシド三リン酸の合成）
上述のβ−リボヌクレオシド２８を、ＳＯＣｌ2またはＰＯＣｌ3で処理し、そして引き続いてアンモニアと反応させ、４−アミノ−１，３，６−トリアジンヌクレオシド３２を得る。３２のフタルイミド基を、ヒドラジンとの反応で除去し、そして得られる一級アミンを保護し、ヌクレオシド３３を得る。ヌクレオシド３３を、５’−三リン酸へ転換し、脱保護し、オキシスクシンイミジル−（Ｎ−ビオチノイル−６−アミノ）ヘキサノエート、またはオキシスクシンイミジル−（Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボキシ）−６−アミノ）ヘキサノエートと反応させ、そして他に報告される手順（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８，ＰＣＴ  ０  ２５２  ６８３  Ａ２）に従って精製し、それぞれビオチン−およびフルオレセイン−標識ヌクレオチド３４ａ，３４ｂを得る。
【０２１６】
（実施例７）
（修飾ヌクレオチドの酵素による組み込みのＨＰＬＣ分析に関する手順）
（反応条件）
ＴｄＴ
３ｕＭｄ  Ｔ１６テンプレート
１５（３０）ｕＭ  ＮＴＰ
４０Ｕ  ＴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１Ｘ緩衝液、ｐＨ７．５（Ｐｒｏｍｅｇａ）
手順：１時間３７℃で、次いで１０分７０℃でインキュベートし、続いて５０ｕＬの容量のＥＤＴＡ（２ｍＭ  最終濃度）を添加する。
【０２１７】
（ＨＰＬＣ分析）
（物質および試薬）
４．６ｍｍＸ２５０ｍｍ  Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ  ＰＡ−１００イオン交換カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）
緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＮａＯＨ（または２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、色素標識されていないヌクレオチド三リン酸のＴｄＴ組み込みの場合）
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ（または２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ
ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、色素標識されていないヌクレオチド三リン酸のＴｄＴ組み込みの場合）
（一般的手順）
この反応物を５０ｕＬの緩衝液Ａで希釈する。５０ｕＬのこのサンプルをＨＰＬＣカラムへ注入し、そして５〜１００％の緩衝液Ｂの勾配を使用して３０分にわたり１ｍＬ／分の流速で分画する。この色素の２６０ｎｍでの吸光度のピークおよび吸光度の極大（この色素のフルオレセイン発光極大）を同時に検出する。
【０２１８】
この組み込み効率は、標識されたオリゴヌクレオチドの割合として表される。この数値は、標識されたオリゴヌクレオチドの２６０ｎｍで測定した吸光度ピーク面積を、標識されていないオリゴヌクレオチドおよび標識されたオリゴヌクレオチドの合計ピーク面積で除算することによって、決定した。（フルオレセイン標識されたｄＴ１６の保持時間は、２〜３分のオーダーにおいてであり、標識されていないｄＴ１６よりも長い）。この種のアッセイにおける誤差は、約１０％である。４種の核酸標識化合物についてのパーセンテージ標識効率は、以下の表１において示される。
【０２１９】
【表１】
2006258818.tif 000045
【０２２０】
（実施例８）
（標識されたイミダゾールカルボキサミド（「ＩＴＰ」）および４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（「ＡＰＰＴＰ」）ヌクレオチドのハイブリダイゼーション研究）
標識されたイミダゾールカルボキサミドおよび４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチドの性能を、標準ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プロダクトプロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用してｐ５３アッセイにおいて評価し、これは、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ｐ５３アッセイのパッケージ挿入物中に詳細に記載される。この実験において使用されるサンプルＤＮＡは、プラスミド「ｐ５３ｍｕｔ２４８」であった。この標識されたヌクレオチドアナログを、通常の標識試薬（フルオレセイン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰまたはビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ（ここで、Ｍ＝アミノカプロイル）、ＮＥＮから、それぞれパート番号ＮＥＬ−５０３およびＮＥＬ−５０８）で置き換えた。標識反応を、このアッセイプロトコルにおいて指定される標準量（２５Ｕ）のＴｄＴ酵素および１００Ｕの酵素の両方を使用して、実施した。標識化後、フルオレセイン標識標的を、この配列にハイブリダイズし、そして直接スキャンした。ビオチン標識標的を使用する実験において、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）チップを、ハイブリダイゼーション工程後において、スキャンの前に、記載される手順（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０７７−１０８２（１９９８））に従ってフィコエリトリン−ストレプトアビジン接合体（ＰＥ−ＳＡ）で染色した。
【０２２１】
図９は、このチップの「Ｕｎｉｔ−２」部分でコールされる１３００塩基について観察されたハイブリダイゼーション蛍光強度の比較を示す。下方のプロットにおいて、フルオレセイン−ｄｄＩＴＰ（８ｂ）標識標的についての強度を、標準フルオレセイン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ標識標的（コントロール）についての強度に対してプロットする（両方ともＴｄＴが２５Ｕで）。観察される約０．７５の傾きは、８ｂの標識効率が、これらの条件下でのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎｄ−ｄｄＡＴＰの標識効率の約７５％であったことを示す。上方のプロットにおいて、同一の比較が、１００ＵのＴｄＴが８ｂ標識反応において使用されたことを除いてなされた。約１．１の傾きは、標準Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ／２５Ｕコントロールの反応よりもわずかに良好かまたは等しいことを示す。
【０２２２】
図１０は、このチップの「Ｕｎｉｔ−２」部分でコールされる１３００塩基に対して観察されたハイブリダイゼーション蛍光強度の比較を示す。ビオチン−（Ｍ）2−ｄｄＡＰＰＴＰ（１８ｃ、Ｍ＝アミノカプロイルリンカー；図１０においてビオチン−Ｎ４−ｄｄＡＰＰＴＰとして表す）標識標的（ＰＥ−ＳＡ染色後）についての強度を、標準ビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ標識標的（コントロール）についての強度に対してプロットする（両方ともＴｄＴが２５Ｕで）。約０．３の観察された傾きは、ビオチン−（Ｍ）2−ｄｄＡＰＰＴＰ（１８ｃ）での標識効率が、これらの条件下で、ビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰの標識効率の約３０％であったことを示す。
【０２２３】
図１１は、チップの「Ｕｎｉｔ−２」でコールされる１３００塩基に対して観察されるハイブリダイゼーション蛍光強度の比較を示す。下方のプロットにおいて、ビオチン−Ｍ−ｄｄＩＴＰ（８ａ、Ｍ＝アミノカプロイル；図１１においてＢｉｏ−ｄｄＩＴＰとして表す）標識標的についての強度が、標準ビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ標識コントロール標的についての強度に対してプロットされる（両方ともＴｄＴが２５Ｕで）。約０．４の観察された傾きは、８ａでの標識効率が、これらの条件下で、ビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰの標識効率の約４０％であったことを示す。上方のプロットにおいて、同一の比較が、８ａ標識反応において１００ＵのＴｄＴが使用されることを除いて、実施される。約１．１の傾きは、標準ビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ／２５Ｕコントロール反応よりもわずかに良いかまたは等しい標識化を示す。
【０２２４】
図１２は、ＴｄＴが２５Ｕおよび１００Ｕの両方でのフルオレセイン−ｄｄＩＴＰ標識標的、ならびに標準フルオレセイン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ／２５Ｕ  ＴｄＴ標識「コントロール」標的を使用して得られた、両方の鎖についての全ての再塩基配列決定（塩基−コーリング（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ））精度の比較を示す。図１３は、ビオチン−Ｍ−ｄｄＩＰ（８ａ；図１３においてビオチン−ｄｄＩＴＰとして表す）およびビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ「コントロール」で標識した標的についての同様の比較を示す。続いてＰＥ−ＳＡ染色。図１４は、ビオチン−（Ｍ）2−ｄｄＡＰＰＴＰ／１００Ｕ  ＴｄＴおよびビオチン−Ｍ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ／２５Ｕ  ＴｄＴを使用する、再塩基配列決定精度の比較を示す。これらのデータは、標識されたイミダゾールカルボキサミドおよび４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンジデオキシヌクレオチドアナログが、ハイブリダイゼーションベースアッセイにおけるＤＮＡ標識のために使用され得、そして標準標識−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ試薬と等価の性能を与えることを示す。
【０２２５】
（実施例９）
ビオチン標識したイミダゾールカルボキサミドおよび４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンのヌクレオチド（「ビオチン−Ｍ−ＩＴＰ」（８ａ）および「ビオチン−（Ｍ）2−ＡＰＰＴＰ」（１８ｃ））の性能を、シングルヌクレオチド多形遺伝子型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）チップアレイを使用して評価した。公開されたプロトコル（Ｄ．Ｇ．Ｗａｎｇら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０７７〜８２）を、これらの実験において、以下の改変を除いて使用した：１）標識反応を、公開されたプロトコルにおいて指定される標準量（１５Ｕ）のＴｄＴ酵素、または３倍（４５Ｕ）の酵素、の両方を使用して実施した；２）標識ヌクレオチドアナログを標準的な標識試薬（ビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ、ＮＥＮ：Ｐ／Ｎ  ＮＥＬ−５０８から）で置換；３）この標識されたヌクレオチドアナログを、公開プロトコルにおいて指定される標準濃度の２倍（２５ｕＭ）、または６倍（７５ｕＭ）のいずれかで使用した。標識後、ビオチン標識標的を、これらのアレイにハイブリダイズさせ、フィコエリトリン−ストレプトアビジン接合体（ＰＥ−ＳＡ）で染色し、そしてこのアレイを、公開された手順に従ってスキャンして分析した。
【０２２６】
このデータを以下の表２において示す。観察されたハイブリダイゼーションシグナルの平均強度（全アレイにわたって平均化した）によって示されるように、２５ｕＭのビオチン−Ｍ−ＩＴＰ（８ａ）での標識効率は、１２．５ｕＭのビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰと同じぐらい良好であり、そして７５ｕＭで８ａを使用することによってなおさらに高い強度が得られた（項目１〜３；７、８）。コントロールと比較して、このアナログは、等しいまたはより良好な性能を提供し、コレクトベースコール（ｃｏｒｒｅｃｔ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌ）比として表された。幾分低い平均シグナル強度が、このアナログの低い組み込み効率を反映して、ビオチン−（Ｍ）2−ＡＰＰＴＰ（１８ｃ）で観察されるが、等しいアッセイ性能が、幾分高い酵素およびヌクレオチド濃度を使用して、このアナログを用いてさらに達成され得た。
【０２２７】
【表２】
2006258818.tif 000046
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、限定しない組のテンプレート部分を示す。
【図２】図２は、以下の限定しない組の複素環式基を示す：４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１、３−ジアゾール（イミダゾール）、１，２，４−トリアジン−３−オン、１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンおよび５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オン。
【図３】図３は、フルオレセインおよびビオチンで標識した１−（２，３−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−ペンタフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミドヌクレオチドへの合成経路を示す。
【図４】図４は、Ｃ３−標識４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンβ−Ｄ−リボフラノシドトリホスフェートへの合成経路を示す。
【図５】図５は、フルオレセインおよびビオチンで標識したＮ６−ジデオキシ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチドへの合成経路を示す。
【図６】図６は、Ｎ４−標識１，２，４−トリアジン−３−オンβ−Ｄ−リボフラノシドトリホスフェートへの合成経路を示す。
【図７】図７は、ビオチンおよびフルオレセインＣ５標識１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンリボシドトリホスフェートへの合成経路を示す。
【図８】図８は、ビオチンおよびフルオレセインＣ５標識５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オンリボシドトリホスフェートへの合成経路を示す。
【図９】図９は、フルオレセインｄｄＩＴＰおよびフルオレセインｄｄＡＴＰを使用して観察したハイブリダイゼーション蛍光強度のグラフィカル比較を示す。
【図１０】図１０は、ビオチン−（Ｍ）2−ｄｄＡＰＴＰ（ここでＭ＝アミノカプロイル）およびビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを使用して観察したハイブリダイゼーション蛍光強度のグラフィカル比較を示す。
【図１１】図１１は、ビオチン−Ｍ−ｄｄＩＴＰ（ここでＭ＝アミノカプロイル）およびビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを使用して観察したハイブリダイゼーション蛍光強度のグラフィカル比較を示す。
【図１２】図１２は、フルオレセインｄｄＩＴＰおよびフルオレセインＮ６−ｄｄＡＴＰ標識標的を使用した全体の再配列塩基決定（塩基−コール）精度のグラフィカル比較を示す。
【図１３】図１３は、ビオチン−Ｍ−ｄｄＩＴＰ（ここでＭ＝アミノカプロイル）およびビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを使用した全体の再配列塩基決定精度のグラフィカル比較を示す。
【図１４】図１４は、ビオチン−（Ｍ）2−ｄｄＡＰＰＴＰ（ここで、Ｍ＝アミノカプロイル）およびビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを使用した再配列塩基決定精度のグラフィカル比較を示す。
【図１】
2006258818.tif 000058
【図２】
2006258818.tif 000059
【図３】
2006258818.tif 000060
【図４】
2006258818.tif 000061
【図５】
2006258818.tif 000062
【図６】
2006258818.tif 000063
【図７】
2006258818.tif 000064
【図８】
2006258818.tif 000065
【図９】
2006258818.tif 000066
【図１０】
2006258818.tif 000067
【図１１】
2006258818.tif 000068
【図１２】
2006258818.tif 000069
【図１３】
2006258818.tif 000070
【図１４】
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