(57)【要約】【課題】遺伝子組換えや、遺伝子解析などの遺伝子工学の分野で有用な新規II型制限酵素を提供する。【解決手段】二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式：【化１】2006042642.tif 000008（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシンを示す）で表される塩基配列を特異的に認識し、かつこれを矢印で示した位置で特異的に切断する能力を有することを特徴とする制限酵素 。【選択図】図７
2006042642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式：
【化１】
2006042642.tif 000007
（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシンを示す）で表される塩基配列を特異的に認識し、かつこれを矢印で示した位置で特異的に切断する能力を有することを特徴とする制限酵素 。
【請求項２】
該制限酵素が下記理化学的性質を有することを特徴とする請求項１に記載の制限酵素。
（ａ）  至適温度：約７５〜９０℃
【請求項３】
該制限酵素が下記理化学的性質を有することを特徴とする請求項１に記載の制限酵素。
（ｂ）  至適ｐＨ：ｐＨ４〜８
【請求項４】
該制限酵素のアミノ酸配列が、配列番号１に示される配列であることを特徴とする請求項１に記載の制限酵素。
【請求項５】
請求項１に記載の制限酵素と制限メチラーゼを生産する菌株を培養し、培養物より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。
【請求項６】
前記菌株がPyrococcus属に属する細菌の菌株であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の制限酵素を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中の特定の４塩基配列を特異的に認識、切断するII型制限酵素、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
制限酵素（制限エンドエンドヌクレアーゼ）とはある特定のＤＮＡ塩基配列を特異的に認識し、切断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、現在まで様々タイプの酵素が見出されている。制限酵素はI型とII型のクラスに分類できる。クラスI型酵素は特定塩基配列を認識するが切断個所に特異性が無いため、遺伝子組換えなどへの応用は、特定の認識配列および切断個所を有するタイプII型酵素が広く使われている。現在までに、３００以上のII型制限酵素が見出され、それらの多くは遺伝子組換え技術や、遺伝病などの解明等の解析に必須な酵素として、使用されている。しかし、これらのII型制限酵素が認識できないＤＮＡ塩基配列の組合せがまだ存在する。さらに、認識配列は同じでも異なる切断部位を生じさせる可能性のある酵素はまだまだ存在する可能性がある。異なる切断部位を生じさせる酵素は、様々な面で利用される可能性を秘めており、その酵素の発見には大変重要な意味があると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、遺伝子組換えや、遺伝子解析などの遺伝子工学の分野で有用な新規II型制限酵素を提供することにある。また、それらを含有する試薬・キットおよび、製造方法等を供給することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
制限酵素のスクリーニングは通常、ホモロジーの乏しい制限酵素遺伝子ではなく、必ずその隣に存在することの知られている制限メチラーゼ遺伝子を指標として行う。制限メチラーゼの配列は、制限酵素遺伝子に比べるとその配列の保存性は高いことが知られている。制限メチラーゼの作用としては、制限酵素が認識する配列と同一の配列を認識し、自分自身のＤＮＡ配列の一部をメチル化することにより、自ら産生した制限酵素の切断からＤＮＡを守ることである。
【０００５】
本発明者らは、始原菌Pyrococcus abyssiのＰＡＢ２２４６遺伝子がコードするタンパク質が制限メチラーゼにホモロジーがあることに着目し（Ｇｅｎｅ，２５９ ,１０９−１２１（２０００））、その隣に存在するＰＡＢ０１０５が制限酵素である可能性が高いと推定した。Pyrococcus abyssiは既に全遺伝子配列が解読されており、ＯＲＦと思われる配列にはすべてＰＡＢナンバーが付けられている。ただ、それらタンパク質の機能のアノテーションがついているわけではなく、当然ＰＡＢ０１０５に関しても機能アノテーションはついていない。
【０００６】
また制限酵素遺伝子は変異により活性を失っている場合が多い。そこで活性を失った制限酵素遺伝子と活性を保持した制限酵素遺伝子を見分ける指標としてGC含量とコドン使用に注目した。GC含量とコドン使用のゲノムとの違いが大きいほど、活性を保った制限酵素遺伝子である可能性が高い。またホモロジーではなく二次構造予測による機能予測からも制限酵素遺伝子を予測した。ＰＡＢ０１０５は前者のタイプに分類される。本発明者らは、ＰＡＢ０１０５に由来するタンパク質をＰａｂＩと命名した。
【０００７】
さらに今回我々は、タンパク質のスクリーニングの方法として、無細胞タンパク質合成方を選択した。無細胞タンパク質合成法とは、生細胞の代わりに、種々の細胞系の破砕物を準備し、基質やエネルギー源等を必要に応じて添加することで、細胞の成育とは無関係にタンパク質を合成・発現させる技術である。そのため、大量に発現させることにより、宿主に毒性を与えてしまうようなタンパク質なども含めほぼあらゆる種類のタンパク質を合成することが可能で、その応用範囲はきわめて広い。制限酵素の菌体での発現は、通常、制限酵素と制限メチラーゼの両方をうまく菌体内で発現させる必要があり、非常に煩雑であることが知られている。そのような酵素でも、無細胞タンパク質合成法を用いれば簡単に発現させることができ、非常に有用である。
【０００８】
現在無細胞タンパク合成系として知られているものは、大腸菌の細胞破砕物、哺乳類の網状赤血球の抽出物、およびコムギなどの植物種子のエキストラクト等である。これらを用いることで、無細胞系においてタンパクの合成が可能である。
【０００９】
また特に近年、高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質抽出液を用いる方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(2),559-564(2000)）が注目を集めている。この方法は、コムギ胚芽抽出液中に含まれるとタンパク質合成を阻害する成分であるトリチンをはじめとするリボトキシンの含量を減らすことにより、タンパク質合成能を高めた方法である。真核生物由来のタンパク質合成方法としては、従来ウサギ網状赤血球を用いる方法が主に使用されてきたが、収量が低い、夾雑タンパク質が多い等の理由から、合成されたタンパク質の機能を解析するには、あまり向かない方法であると思われている。コムギ胚芽を用いる方法は、休眠期の胚芽を原料として抽出液を調製していることから、夾雑タンパク質も少なく、合成したタンパク質の機能を解析する場合有利であり、ヒトをはじめとする真核生物由来のタンパク質の解析に広く使われ始めている。
【００１０】
さらに、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系は、大腸菌の無細胞系に比べヌクレアーゼ等のレベルが低いことも知られており、無細胞合成液を直接酵素反応に使用できることが数多くの酵素で確かめられている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(2),559-564(2000)）。
【００１１】
更に、始原菌のタンパク質はどちらかというと原核生物と比べると真核生物に近いということも知られており、コムギ胚芽を用いる無細胞タンパク質合成法は向いていると考えられた。
【００１２】
今回の検討では、主にこの高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて検討を進めることで、効率良く、制限酵素であることの同定、認識配列・切断個所の解明に至ることができた。
【００１３】
本発明者らは、これらの課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式：
【００１４】
【化１】
2006042642.tif 000003
【００１５】
（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシンを示す）で表される塩基配列を特異的に認識し、かつこれを矢印で示した位置で特異的に切断する能力を有することを特徴とする制限酵素 。
（２） 該制限酵素 が下記理化学的性質を有することを特徴とする（１）に記載の制限酵素。
（ａ）  至適温度：約７５〜９０℃
（３） 該制限酵素 が下記理化学的性質を有することを特徴とする（１）に記載の制限酵素。
（ｂ）  至適ｐＨ：ｐＨ４〜８
（４）該制限酵素のアミノ酸配列が、配列番号１に示される配列であることを特徴とする（１）に記載の制限酵素。
（５）（１）に記載の制限酵素を生産する菌株を培養し、培養物より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。
（６）前記菌株がPyrococcus属に属する細菌の菌株であることを特徴とする（５）に記載の方法。
（７）（１）に記載の制限酵素を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。
（８）無細胞タンパク質合成法を用いる、新規制限酵素のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、異なる切断部位を生じさせる新規な制限酵素が提供された。
【００１７】
本発明の制限酵素は、遺伝子組換えや、遺伝子解析などの遺伝子工学の分野で有用であり、それらを含有する試薬・キットなどが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の制限酵素は、以下の二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式（化１）
【００１９】
【化２】
2006042642.tif 000004
【００２０】
（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシンを示す。）
を認識し、かつ矢印で示された結合を切断することを特徴としている。
【００２１】
この認識配列は、Ｃｓｐ６ＩとＲｓａＩと同一であるが、切断個所は異なる。更に詳細な検索によると、該酵素の同一の切断個所で二本鎖ＤＮＡを切断するII型制限酵素は存在しない。
【００２２】
更に本発明の制限酵素は、下記理化学的性質を有することを特徴とする。
（ａ）  至適温度：約７５〜９０℃
（ｂ）  至適ｐＨ：ｐＨ約４〜８
至適温度としては、好ましくは７５〜９０℃、更にこのましくは８０〜８５℃である。至適ｐＨとしては、好ましくはｐＨ４〜８、さらに好ましくは６〜７である。
【００２３】
なお、至適温度及び至適ｐＨは、ほぼその温度またはｐＨ範囲で活性が高いことを意味している。
【００２４】
本発明の酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものが好ましいが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上、更に好ましくは９０％以上のホモロジーを有し、かつ、制限酵素活性を有するものは本発明の制限酵素に包含される。配列番号１のアミノ酸配列において、機能に関係ない配列の除去や、変異を有しても当然よい。
【００２５】
また、本発明は、該制限酵素がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来であることを特徴とする。更に、好ましくは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ由来である。
【００２６】
更に、本発明は、本制限酵素の生産方法にも関する。すなわち、その方法とは、制限酵素を生産する菌株を培養し、培養物より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法である。その場合、制限メチラーゼと推察されるＰＡＢ２２４６(Accession AJ248283)を同時に発現させることが好ましいといえる。
【００２７】
「制限酵素を生産する菌株」とは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのような天然の菌株であってもよく、配列番号１に示される遺伝子配列を発現可能に組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体が好ましく例示できる。宿主としては、細菌、真菌等の菌が好ましく例示される。
【００２８】
菌の種類として特に制限されないが、好ましくは大腸菌、シュードモナス属細菌が用いられ、更に好ましくは大腸菌が用いられる。大腸菌としては、Ｋ−１２株由来もしくはＣ株由来菌などを好適に用いることができる。
【００２９】
さらに本発明は、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法である。無細胞タンパク質合成方法としては、特に限定されないが、好ましくは、大腸菌ライゼート、動物細胞ライゼート、もしくは植物由来ライゼートを用いる。最も好ましくはコムギ胚芽ライゼートが用いられる。最も好ましくは、高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質抽出液を用いる方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(2),559-564(2000)）が用いられる。
【００３０】
さらに、無細胞タンパク質合成法は「重層法」（FEBS Letter 514, 102-105(2000)）を併用することで、高収率でタンパク質を得ることができる。また、スピリン等によって開発された「透析法」（Science 242(4882),1162-1164（1988））を応用することによって、更に高収量なタンパク質合成が可能である（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(2),559-564(2000)）。すなわち、タンパク質合成に必要な、ＡＴＰ、ＧＴＰやアミノ酸などを連続的に供給することにより、タンパク質合成量を向上させる方法である。また、これらの方法は、反応によって生じた副精製物の濃度を下げる効果もある。
【００３１】
実際に、本発明の制限酵素を使用する際には、精製された酵素を用いる方が好ましいといえる。精製方法としては、特に限定されないが、菌で生産された場合は、菌体を破砕した後、塩析、カラムクロマトグラフィーなどの方法で精製を行う。また、無細胞タンパク質合成で生産した場合も、塩析、カラムクロマトグラフィーなどの方法が有効である。
【００３２】
さらに、本発明の方法は、該制限酵素が好熱細菌由来であることから、菌の破砕液や、無細胞タンパク質合成液などを加熱することにより、夾雑タンパク質を変性させて除去することにより、簡便かつ効果的な精製が可能である。加熱温度として、好ましくは６０〜１００℃、さらに好ましくは８０〜９５℃、最も好ましくは９０〜９５℃で処理する。また、加熱時間は、好ましくは、５〜６０分間、さらに好ましくは１０〜２０分間、最も好ましくは１０〜１５分間が処理する。その後、変性したタンパク質を、遠心分離やフィルター分離で除去し、タンパク質溶液として、次に精製工程へ進む。
【００３３】
具体的な本発明の酵素の反応は、好ましくはｐＨ４〜８、更に好ましくは５〜７．５、最も好ましくは、６〜７で行う。バッファーとしては、特に限定されないがグッドバッファーが好適に用いられる。その中でもトリスバッファーが最も好適に用いられる。反応時に含まれる塩としては、特に限定されないが、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムが好適に用いられる。更に好ましくは、塩化ナトリウムが用いられる。塩の濃度としては、好ましくは０〜２５０ｍＭ、更に好ましくは１〜１００ｍＭが用いられる。反応液中のマグネシウム濃度は、好ましくは１〜２０ｍＭ、更に好ましくは５〜１５ｍＭが用いられる。反応液中に含まれる還元剤としては、２−メルカプトエタノールもしくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）が好ましく用いられる。更にこのましくは２−メルカプトエタノールが用いられ、その濃度は特に限定されないが、好ましくは０．１〜５ｍＭ、更にこのましくは０．５〜２ｍＭで用いられる。
【００３４】
反応温度としては、特に限定されないが、７５〜９５℃が好ましく用いられ、さらに好ましくは８０〜９０℃が更に好ましく用いられる。
【００３５】
本発明の実施の一態様としては、遺伝子組換え用、および／または遺伝子解析用制限酵素試薬またはキットである。
【００３６】
本発明のさらに具体的な実施の一態様としては、酵素溶液および（至適になるようにバッファー成分、塩成分、マグネシウム成分、還元剤成分を含んで成る）反応用緩衝液から構成される、遺伝子組換え用、および／または遺伝子解析用制限酵素試薬またはキットである。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明の実施例をあげることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
実施例１：ＰＡＢ０１０５のクローニング
まず、Ｐ．ａｂｙｓｓｉのゲノムＤＮＡを鋳型として目的の制限酵素遺伝子候補のＯＲＦ（ＰＡＢ０１０５）をＰＣＲで増幅し、無細胞タンパク質合成用のベクターｐＥＵ３−ＮＩＩへクローニングした。具体的には、配列番号２および３に記載のプライマーを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡製）にて増幅を実施した（配列番号２のプライマーは制限酵素ＢａｍＨＩのサイトを含む）。増幅は、取扱い説明書に記載の一般的な方法に従って実施した。ＰＣＲ産物はＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  Ｋｉｔ（東洋紡製）にて精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩにて消化した。その消化物をもう一度ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  Ｋｉｔにて精製した後、同様にＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩにて消化したｐＥＵ３−ＮＩＩベクターと混合し、ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡製）を至適量添加し、１６℃にて１時間インキュベートし、コンピテントセルＪＭ１０９（東洋紡製）を形質転換した。翌日コロニーから得られた菌体を培養し、得られたプラスミドをシーケンスし、正しくインサートが挿入されていることを確認した後、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてプラスミドを精製した。また、混入したリボヌクレアーゼを除去する目的でさらにフェノール／クロロホルム抽出したプラスミドを、次の転写へ用いた。このプラスミドをｐＥＵ−ＰａｂＩと名づけた。
実施例２：無細胞タンパク質合成系によるＰＡＢ０１０５（ＰａｂＩ）の発現
まず、実施例１で調製したｐＥＵ−ＰａｂＩを鋳型として翻訳用のｍＲＮＡを合成した。具体的には、ｐＥＵ−ＰａｂＩ  ５μｇに１０×反応バッファー ５μｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）、２５ｍＭ  ＮＴＰｓ（アマシャムバイオサイエンス製）５μｌ、 ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）１ μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製）３μl、さらに滅菌水を加え５０μlになるようにして、３７℃にて４時間反応させた。
【００３８】
反応後、副生成物の白濁を除く目的で１２，０００ｒ．ｐ．ｍ．×２分間（４℃）遠心し、その上清をゲルろ過カラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス製）を用いて、ＰＲＯＴＥＩＯＳ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ添付のバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ  ｍｉｘ）へとバッファー交換した。合成されたｍＲＮＡの濃度は、フォトメーターを用いて測定した紫外吸収より以下の式を用いて計算した。
【００３９】
【数１】
2006042642.tif 000005
【００４０】
次に、調製したｍＲＮＡを用いて、ＰＲＯＴＥＩＯＳ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡製）にて、無細胞タンパク質合成を実施した。具体的には、上述のｍＲＮＡ溶液 （０．４μｇ／μｌ） 16.75 μｌに、滅菌水 ０．９μｌ、 Ｂｕｆｆｅｒ＃２（キット添付）１μｌ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ：キット添付） ０．８５μｌ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）０．５μｌ、Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ μｌを加え、反応溶液とした。次に、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（コースター製）に、まず、キット添付のＢｕｆｆｅｒ  ｍｉｘ１２５μｌを添加し、その下に層を形成させるように反応溶液を静かに添加した。詳細はキット取扱い説明書に従って行った。反応は、２６℃、１６時間実施した。
実施例３：ＰａｂＩの精製
実施例２で調製したＰａｂＩは、続いて加熱処理を行うことにより粗精製を行った。具体的には、実施例２で得られた無細胞反応液を１２，０００ｒ．ｐ．ｍ．×１５分間（４℃）遠心して、不溶化したタンパク質や夾雑物を除去し、上清を９０℃・１０分間インキュベートした。この加熱した反応液をさらに、１２，０００ｒ．ｐ．ｍ．×１５分間（４℃）遠心することで、加熱により変性した夾雑タンパク質を分離し、その上清を酵素液とした。
【００４１】
次に、場合に応じて、得られた酵素液を透析と限外ろ過により、任意なバッファーへ置換した用いた。具体的には、透析は３００μｌの加熱処理酵素液に対して、ｌＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴに対して行い、さらに限外ろ過により液量が２／３になるまで行った。透析には、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ製）、限外ろ過には、ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１０（ミリポア製）を用いた。精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析パターン（ＣＢＢ染色）を図１に示した。
実施例５：制限酵素活性の検出
λＤＮＡ （ＴａＫａＲａ製）０．３μｇ、Ｐａｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）１μｌ、滅菌水７μｌ、酵素溶液（場合に応じて加熱処理していないものも用いた）１μｌを加え、１０μｌとし、６５℃で１時間反応させた。反応後、これを１％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色してＤＮＡの切断パターンから、活性の有無および強弱を判定した。
実施例６：至適反応温度、至適反応ｐＨの測定
実施例３で調製したＰａｂＩを用いて、まず、至適反応温度の検討を実施した。具体的には、ｐＵＣ１９ベクター（東洋紡製）０．２μｇを鋳型として、実施例４に示した反応組成中で、様々な温度条件下、１時間反応させ、アガロースゲル電気泳動法により活性を比較した。その結果を図２に示した。ｐＵＣ１９は完全に切断を受けるとｂ、ｃ、ｄのバンドを生じる（ａは未消化物）。図から、７５℃〜９０℃においてｂ、ｃ、ｄのバンドが強く見られることから、ＰａｂＩの反応は、７５〜９０℃において至適であることが確認された。
【００４２】
次に、様々なｐＨのバッファー（実施例４で示した成分のバッファーのみを変更）を用いてｐＵＣ１９の切断を行った。その結果、図３に示すように、ｐＨ４〜８の間でほぼ同じ活性を示すことが分かった。ｐＨ２．５におけるＤＮＡの低分子化は、酸による加水分解の結果を示すものであり、酵素としては安定であるが、基質の安定性という意味で至適でない可能性もあると思われる。ｐＨ８．９でのパターンは、塩基性条件下でのＤＮＡの変性に起因している可能性もある。
実施例６：認識部位の予測
ｐＵＣ１９  ０．４μｇ（１μｌ）にＰａｂＩ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）１μｌ、加熱精製したＰａｂＩ  １μｌ、滅菌水  ７μｌを加え８５℃、０．５〜１２時間反応した。その後、反応物をアガロース電気泳動し、移動度から反応の最終産物であるDNA断片のおおまかな大きさを計算した。
【００４３】
最終産物の大きさの計算値をもとにＲＥＢＡＳＥのツールＲＥＢｐｒｅｄｉｃｔｏｒで同じ配列を認識する制限酵素 （Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）があるか調べた。方法はＲＥＢｐｒｅｄｉｃｔｏｒのＷｅｂ上の説明文に従い、あらゆる制限酵素でｐＵＣ１９を消化した場合にできるDNA断片の大きさを計算させた後ＰａｂＩの場合に近いパターンを示す酵素を検索した。
【００４４】
まずＰａｂＩでｐＵＣ１９を消化したときの最終消化産物を決めるために、ｐＵＣ１９をＰａｂＩで長時間消化し消化産物の経時変化を調べた。最終消化産物の大きさを移動度から計算するとの大まかに１８７５ｂｐ、７００ｂｐ、２１１ｂｐと推定された。
【００４５】
この値をもとに制限酵素データベースＲＥＢＡＳＥの制限酵素の認識配列を予測するツールＲＥＢｐｒｅｄｉｃｔｏｒで同様の切断パターンを示す制限酵素を検索したところ、ＲｓａＩ（ＧＴＡＣを認識）の切断パターンが最も似ていた。
【００４６】
そこで次に、ｐＵＣ１９（東洋紡製）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ製）、およびφＸ１７４（ＴａＫａＲａ製）それぞれ０．２μｇに加熱精製したＰａｂＩ  １μｌ、または、ＲｓａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）１μｌ、ＰａｂＩ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）１μｌを加え、全体で１０μｌになるよう滅菌水を添加し、ＰａｂＩは８５℃、ＲｓａＩは３７℃で４時間反応させた（ＰａｂＩの反応には反応液の上にミネラルオイルを重層した）。反応後のサンプルを１％アガロースゲルで電気泳動した結果を、図４に示す。結果、すべてほとんど同じ切断パターンを示していることが分かる。つまりＰａｂＩはＲｓａＩと同じＧＴＡＣという配列を認識するＲｓａＩのＩｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒであることが分かった。
実施例７：切断部位の決定
切断部位の決定は石野の方法に手を加えて行った（図４）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.  ２７，  ４１６７−４１７４（１９９９）。
【００４７】
まず、ｐＵＣ１９の一本鎖DNAを得るためにアルカリ変性を行った。６ｐｍｏｌ のｐＵＣ１９を０．２Ｎ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡに加え、液の全体積を１２０μｌ とし、３７℃で５分間静置したのちエタノール沈殿後６０μｌ の滅菌水に溶解した。
【００４８】
シーケンス反応とＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔによる伸長反応には配列番号４、５ に示したオリゴヌクレオチドをＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）にて末端ラベル化したものを用いた。具体的には、１０ｐｍｏｌ のオリゴヌクレオチドに、酵素添付Ｂｕｆｆｅｒ １μｌ、 γ-33Ｐ−ＡＴＰ（アマシャム
バイオサイエンス製）５μｌ、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）１μｌ、滅菌水２μｌを加え３７℃、３０分間反応させ、９０℃、２分間ＤＮＡを変性させた。
【００４９】
制限酵素反応の基質となるｄｓＤＮＡはＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ製）で合成した。上述の一本鎖ｐＵＣ１９  ２０μｌ（２  ｐｍｏｌ）にラベルされたオリゴヌクレオチドを２  ｐｍｏｌ 加え滅菌水を加え全体の容量を３５μｌ として９５℃で３分間加熱した後、ただちに氷上に移し５分間静置した。これに８μｌ のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ：それぞれ１ｍＭ）とＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ添付Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２μｌ（４Ｕ）を加え３７℃で３時間反応させた。続いてＭｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャムバイオサイエンス製）を用いたゲル濾過により、未反応のヌクレオチドを除去し、さらにフェノール/クロロホルム処理で除タンパクしエタノール沈殿後２０μｌ の滅菌水に溶解した。
【００５０】
次に、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ で合成された二本鎖ｐＵＣ１９をＲｓａＩ またはＰａｂＩで消化した。上述のラベルされた二本鎖ｐＵＣ１９を２μｌに０．５μｌ（５Ｕ）のＲｓａＩ、ＲｓａＩ添加付Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、滅菌水４２．５μｌ を加え３７℃で一時間反応させた。また、同様に２μｌ のラベルされた二本鎖ｐＵＣ１９に加熱処理、バッファー置換したＰａｂＩを２μｌ、ＰａｂＩ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）５μｌ、滅菌水  ４１μｌを添加し、８５℃で１時間反応した。酵素処理後それぞれのサンプルをＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  Ｋｉｔ（東洋紡製）で精製し９μｌ の滅菌水で溶出した。これに次に述べるＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔのＳｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを４．５μｌ加え、９５℃、３分間加熱した後、直ちに氷上で急冷した。
【００５１】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 反応はＢｃａＢＥＳＴ  Ｄｉｄｅｘｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用い、基本的には取扱い説明書に従って行った。ただし鋳型ＤＮＡとプライマーは上述のＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔによる伸長反応の鋳型に使用したものと同じものを使った。またＳｅｑｕｅｎｃｅ 反応の基質であるｄＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ 溶液はアマシャムバイオサイエンス社より購入したｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰを表１ に示す組成で調製したものを用いた。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
次に、ＰａｂＩによるＤＮＡの切断部位を決定した。具体的には、末端を33Pでラベルした基質を切断し、シーケンスラダーとともにポリアクリルアミドゲル電気泳動した（図６））。ＲｓａＩは認識配列ＧＴＡＣのうちＴとＡの間を切断し平滑末端を生成する。これに対しＰａｂＩはAとCの間を認識配列の対称な位置で切断し３’側に２塩基突出した末端を生じることが分かった。このことから、ＰａｂＩはＲｓａＩと同じ配列を認識するが異なる部位で二本鎖ＤＮＡを切断するため、ＲｓａＩのＮｅｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒであるといえる（図７）。この切断様式はＧＴＡを認識する制限酵素のなかで新規のものである（ＲＥＢＡＳＥ）。また３’ＴＡという突出末端は制限酵素では新規の突出末端であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】加熱精製されたＰａｂＩのＳＤＳ電気泳動パターン（ＣＢＢ染色）を示す図。１：タンパク質合成前の溶液、２：反応後、３：加熱処理後
【図２】ＰａｂＩの至適反応温度を示す図。ａはＰａｂＩでｐＵＣ１９を切断した時の未消化物、ｂ、ｃ、ｄはＰａｂＩでｐＵＣ１９を完全に消化したときに生じるバンドをそれぞれ示している。１：６０℃、２：７０℃、３：７５℃、４：８０℃、５：８５℃、６：９０℃、７：９５℃
【図３】ＰａｂＩの至適反応ｐＨを示す図。ａはＰａｂＩでｐＵＣ１９を切断した時の未消化物、ｂ、ｃ、ｄはＰａｂＩでｐＵＣ１９を完全に消化したときに生じるバンドをそれぞれ示している。１：ｐＨ２．５、２：ｐＨ４．３、３：ｐＨ４．９、４：ｐＨ５．６、５：ｐＨ６．３、６：ｐＨ６．７、７：ｐＨ７．３、８：ｐＨ７．８、９：ｐＨ８．９
【図４】ＰａｂＩで様々なＤＮＡを切断した場合の、アガロースゲル電気泳動パターンを示す図。１：ＲｓａＩ、２：ＰａｂＩ
【図５】制限酵素の切断配列を解析するための原理を示す図。
【図６】ＲｓａＩ、およびＰａｂＩの切断配列の解析結果を示す図。
【図７】ＲｓａＩ、およびＰａｂＩの切断配列を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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