(57)【要約】      （修正有）【課題】プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸断片を用いたレジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の検出・同定方法を提供する。【解決手段】レジオネラ菌のｇｙｒＢ遺伝子の特定の領域を増幅することのできる、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとして用いて、レジオネラ菌の検出・同定を行うことを特徴とするレジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の検出・同定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列1s、2s、3s若しくは5s及び配列1as、2as、3as若しくは4asで表されるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いることにより、Legionella pneumophilaの検出を行うことを特徴とするLegionella pneumophilaの検出方法。
(配列1s ）：5'-TTG CAT CAT ATG GTT TTT GA-3'
(配列1as）：3'-AAC GTA GTA TAC CAA AAA CT-5'
(配列2s ）：5'-TCA GTA AAA GTC CCT GAT CC-3'
(配列2as)：3'-AGT CAT TTT CAG GGA CTA GG-5'
(配列3s ）：5'-AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC-3'
(配列3as）：3'-TCG ATT TTC TAA TGC ACT TAA CAG-5'
(配列4as）：3'-GAA TTT ATT TTT ATT TTG TGG TC-5'
(配列5s ）：5'-GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT-3'
【請求項２】
以下の配列1s、2s、3s若しくは5s及び配列1as、2as、3as若しくは4asで表されるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いることにより、Legionella pneumophilaの同定を行うことを特徴とするLegionella pneumophilaの同定方法。
(配列1s ）：5'-TTG CAT CAT ATG GTT TTT GA-3'
(配列1as）：3'-AAC GTA GTA TAC CAA AAA CT-5'
(配列2s ）：5'-TCA GTA AAA GTC CCT GAT CC-3'
(配列2as)：3'-AGT CAT TTT CAG GGA CTA GG-5'
(配列3s ）：5'-AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC-3'
(配列3as）：3'-TCG ATT TTC TAA TGC ACT TAA CAG-5'
(配列4as）：3'-GAA TTT ATT TTT ATT TTG TGG TC-5'
(配列5s ）：5'-GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT-3'
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸断片を用いたレジオネラ菌（Legionella pneumophila）の検出・同定方法に関する。この発明はレジオネラ菌の検出、同定を必要とする各種産業分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ菌の検出あるいは同定を従来の技術を以って行おうとすると、隔離施設での培養を行う必要があった。培養された細菌は、DNA-DNA交雑実験、レジオネラ菌に対する抗体（16種類）を用いた検査等によって判別されてきた。このようにレジオネラ菌の検出や同定には多大な手間と時間を要していた。
【０００３】
微生物の分類同定の手段として、16S rRNAの塩基配列を用いる方法が近年使われるようになった。しかしながら、この方法は近縁な生物種を見分ける（属内の種を特定する）には適さない。近縁な生物種を見分ける方法としてgyrB遺伝子による解析が開発されているが（特許文献１）、レジオネラ菌及びその菌縁種のgyrB遺伝子の配列については公表されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開平11-169175号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、迅速、簡易かつ特異的に、しかも高い精度でレジオネラ菌を検出、同定できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、これまで蓄積してきた多くの細菌のgyrB遺伝子配列及び翻訳されたアミノ酸配列を比較検討することにより、レジオネラ菌及びその近縁種のgyrB遺伝子を効率良く増幅できるPCRプライマーを設計し、このプライマーを用いてレジオネラ菌及び近縁種のgyrB遺伝子配列を多数決定した。次に、本発明者は、得られたgyrB遺伝子配列を参考にして、レジオネラ菌のgyrB遺伝子を特異的に増幅できるPCRプライマーを設計した。以上のような過程を経て、本発明は完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の性質を有するオリゴヌクレオチドをPCRプライマー又はプローブとして用いることにより、レジオネラ菌の検出・同定を行うことを特徴とするレジオネラ菌の検出・同定方法である。
【０００８】
（１）以下の(a)から(e)のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含む
(a) Leu-His-His-Met-Val-Phe-Glu
(b) Ser-Val-Glu-Lys-Val-Pro-Asp-Pro
(c) Leu-Ala-Lys-Arg-Leu-Arg-Glu-Leu-Ser
(d) Phe-His-Tyr-Glu-Gly-Gly-Ile
(e) Asp-Gly-Tyr-Gln-Glu-Thr-Ile-Phe
【０００９】
（２）プライマー又はプローブとしての実質的な機能を有する
より具体的には、本発明は以下の特徴を有する。
以下の配列1s、2s、3s若しくは5s及び配列1as、2as、3as若しくは4asで表されるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いることにより、Legionella pneumophilaの検出を行うことを特徴とするLegionella pneumophilaの検出方法。
(配列1s ）：5'-TTG CAT CAT ATG GTT TTT GA-3'
(配列1as）：3'-AAC GTA GTA TAC CAA AAA CT-5'
(配列2s ）：5'-TCA GTA AAA GTC CCT GAT CC-3'
(配列2as)：3'-AGT CAT TTT CAG GGA CTA GG-5'
(配列3s ）：5'-AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC-3'
(配列3as）：3'-TCG ATT TTC TAA TGC ACT TAA CAG-5'
(配列4as）：3'-GAA TTT ATT TTT ATT TTG TGG TC-5'
(配列5s ）：5'-GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT-3'
【００１０】
以下の配列1s、2s、3s若しくは5s及び配列1as、2as、3as若しくは4asで表されるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いることにより、Legionella pneumophilaの同定を行うことを特徴とするLegionella pneumophilaの同定方法。
(配列1s ）：5'-TTG CAT CAT ATG GTT TTT GA-3'
(配列1as）：3'-AAC GTA GTA TAC CAA AAA CT-5'
(配列2s ）：5'-TCA GTA AAA GTC CCT GAT CC-3'
(配列2as)：3'-AGT CAT TTT CAG GGA CTA GG-5'
(配列3s ）：5'-AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC-3'
(配列3as）：3'-TCG ATT TTC TAA TGC ACT TAA CAG-5'
(配列4as）：3'-GAA TTT ATT TTT ATT TTG TGG TC-5'
(配列5s ）：5'-GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT-3'
【発明の効果】
【００１１】
本発明の検出方法によれば、レジオネラ菌に汚染された環境から、レジオネラ菌を高精度、特異的かつ迅速に検出することが出来る。したがって、24時間風呂、クーリングタワー、温泉等で、レジオネラ症を引き起こす細菌による汚染があるか否かを迅速に把握できる。また、これらの環境でレジオネラ菌及びその菌縁種の菌の消長を追跡するといった応用も可能になる。さらに、これらの特異的な配列をプローブとしたDNAチップの開発も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の同定・検出方法は、レジオネラ菌のgyrB遺伝子の特定の領域を増幅することのできるPCRプライマー、又は特定の領域とハイブリダイズすることのできるプローブを用いてレジオネラ菌の検出・同定を行うことを特徴とするものである。より具体的には、以下の性質を有するオリゴヌクレオチドをPCRプライマー又はプローブとして用いることにより、レジオネラ菌の検出・同定を行うことを特徴とするものである。
【００１４】
（１）以下の(a)から(e)のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含む
(a) Leu-His-His-Met-Val-Phe-Glu（配列番号５）
(b) Ser-Val-Glu-Lys-Val-Pro-Asp-Pro（配列番号６）
(c) Leu-Ala-Lys-Arg-Leu-Arg-Glu-Leu-Ser（配列番号７）
(d) Phe-His-Tyr-Glu-Gly-Gly-Ile（配列番号８）
(e) Asp-Gly-Tyr-Gln-Glu-Thr-Ile-Phe（配列番号９）
【００１５】
（２）プライマー又はプローブとしての実質的な機能を有する
上記の性質を有するオリグヌクレオチドの具体例としては、例えば、以下の配列1s〜5s、又は配列1as〜5asを例示することができる。
(配列1s）：5'-TTG CAT CAT ATG GTT TTT GA-3'（配列(a)に対応、配列番号１０）
(配列1as）：3'-AAC GTA GTA TAC CAA AAA CT-5'（配列(a)に対応、配列番号１１）
(配列2s）：5'-TCA GTA AAA GTC CCT GAT CC-3'（配列(b)に対応、配列番号１２）
(配列2as)：3'-AGT CAT TTT CAG GGA CTA GG-5'（配列(b)に対応、配列番号１３）
(配列3s）：5'-AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC-3'（配列(c)に対応、配列番号１４）
(配列3as）：3'-TCG ATT TTC TAA TGC ACT TAA CAG-5'（配列(c)に対応、配列番号１５）
(配列4s）：5'-CTT AAA TAA AAA TAA AAC ACC AG-3'（配列(d)に対応、配列番号１６）
(配列4as）：3'-GAA TTT ATT TTT ATT TTG TGG TC-5'（配列(d)に対応、配列番号１７）
(配列5s）：5'-GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT-3'（配列(e)に対応、配列番号１８）
(配列5as）：3'-CTA CCG ATA GTT CTT TG(GA) TAT AA-5'（配列(e)に対応、配列番号１９）
【００１６】
「プライマー又はプローブとしての実質的な機能を有する」とは、特異的なアニール又はハイブリダイズが可能な程度の長さを有するという意味であり、検出・同定の対象とするDNAとアニール又はハイブリダイズする配列を有しているが、その長さが短いため非特異的なアニーリング又はハイブリダイゼーションを頻繁に起こし、特異的な検出・同定に使用できないオリゴヌクレオチドを排除する趣旨である。
【００１７】
本発明において「検出」とは、単にサンプル中に特定の微生物が存在するかどうかを判定することのみならず、特定の微生物がサンプル中にどのくらい存在するのかを判定すること（定量的検出）をも含む意である。特定の微生物を定量的に検出する方法としては、競合PCR法を例示することができる。本発明において「同定」とは、サンプル中に存在する微生物の分類学的な位置を定めることをいう。
【００１８】
検出・同定の対象とするDNAの調製、プライマーの作製及びそれを用いたPCR、プローブの調製及びそれを用いたハイブリダイゼーションは、常法に従って行うことができ、特別な方法を用いる必要はない。
【００１９】
なお、PCRプライマーとするオリゴヌクレオチドは、両者が上記性質を有するものである必要なく、一方だけがその性質を有すれば十分である。
【実施例】
【００２０】
〔実施例１〕  レジオネラ菌２株の塩基配列の決定
1982年長崎県の土壌から分離したGIFU10070株及び1983年東京の患者より分離したGIFU10074株の２種類のレジオネラ菌からDNAを抽出した。DNAの抽出は、以下の丁寧法及び簡便法の２種類の方法を用いた。
丁寧法：フェノール、クロロホルム法を用いてDNAを抽出
簡便法：滅菌水に菌体を懸濁し、煮沸によりDNAを抽出
抽出したDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅された断片の塩基配列を決定した。
【００２１】
PCRは、DNAポリメラーゼとしてアンプリタックゴールド（パーキンエルマー社製）を使用し、以下のプライマーを50〜100pM/mlの濃度になるように添加して行った。
Foward側プライマー ：5'-TTGCATCATATGGTTTTTGA-3'（配列1s）に対応
Reverse側プライマー：5'-GGATCAGGGACTTTTACTGA-3'（配列2as）に対応
増幅条件は、変性95℃1分、アニール50℃1分、伸長反応72℃1分、40サイクルとした。増幅産物はアガロースゲル電気泳動により単離し、キアゲンゲル抽出キット（キアゲン社製）により回収した。精製された増幅断片を直接シークエンス反応に用いた。シークエンス反応には、PCRに用いたものと同一のプライマーを用いた。
【００２２】
GIFU10070株から得られたDNAの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、IFU10074株から得られたDNAの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００２３】
〔実施例２〕  レジオネラ菌を特異的に検出できるプローブ及びプライマーの設計
レジオネラ菌を特異的に検出できるプローブ及びプライマーを設計するために、26株のレジオネラ菌と4株のレジオネラ菌以外のレジオネラ属に属する細菌（Legionella hackeliae、Legionella jamestowniensi、Legionella cherrii、Legionella rubliluens)のgyrB遺伝子の塩基配列を決定した。
【００２４】
レジオネラ菌のgyrB遺伝子の塩基配列の決定は、実施例１と同様の方法で行った。レジオネラ菌以外のレジオネラ属に属する細菌のgyrB遺伝子の塩基配列の決定は、以下の方法で行った。
【００２５】
各菌株から実施例１と同様の方法でDNAの抽出を行った後、以下のプライマーを用い、増幅条件を変性95℃1分、アニール52℃1分、伸長反応72℃1分、計40サイクルとしてPCRを行った。
【００２６】
Foward側プライマー：
5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC AYG SNG GNG GNA ART TYR A-3'（配列番号２０）
Reverse側プライマー：
5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCN GGR TCY TTY TCY TGR CA-3'（配列番号２１）
増幅産物を精製し、直接シークエンス反応に用いた。シークエンス反応は、上記プライマーのタグ部分の配列に対応する以下のプライマー：
5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'（配列番号２２）
5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'（配列番号２３）
を用いて行った。
【００２７】
得られた塩基配列を整列させた。これを図１〜図４に示す。なお、図中の略号の意味は下表に示すとおりである。
【００２８】
【表１】
2006320334.tif 000002
【００２９】
各菌株由来の配列を比較した結果、以下の（い）〜（は）のレジオネラ菌に特異的な配列を見出した（図中で下線を付した配列）。
（い）：AGC TAA AAG ATT ACG TGA ATT GTC （配列3sに対応）
（ろ）：CTT AAA TAA AAA TAA AAC ACC AG  （配列4sに対応）
（は）：GAT GGC TAT CAA GAA AC(CT) ATA TT （配列5sに対応）
【００３０】
〔実施例３〕  PCRによるレジオネラ菌の検出及び同定
実施例２において見出した配列をプライマーとして用いることにより、レジオネラ菌の特異的な検出が可能かどうかを、以下のサンプルを用いて検証した。
サンプル1：Legionella pneumophila GTC1287血清型7（レジオネラ菌）
サンプル2：レジオネラ属未同定株 GIFU11174
サンプル3：レジオネラ属未同定株 GIFU11500
サンプル4：Legionella pneumophila GIFU12174血清型2（レジオネラ菌）
サンプル5：Legionella feeleii ATCC35072
サンプル6：Legionella maceachernii ATCC33218
サンプル7：Legionella feeleii ATCC35849
サンプル8：Legionella micdadei ATCC33218
【００３１】
（１）サンプルDNAを用いたPCR増幅
実施例２に示された配列（ろ）及び（は）に対応するPCRプライマー（配列4sと配列5as）と上記サンプル１〜８より抽出されたDNAを用い、変性95℃１分、アニール55℃１分、伸長反応72℃30秒、計35サイクルの増幅条件でPCRを行った。
【００３２】
この結果、レジオネラ菌以外のレジオネラ属に属する細菌であるサンプル５〜８のDNAを用いたとき、PCR増幅は観察されなかった。一方、残りのサンプル、即ち、サンプル１〜４のDNAを用いたときは、約120bpの増幅産物が得られた。
【００３３】
（２）サンプル１〜４由来のgyrB遺伝子の塩基配列の決定
上記結果より、サンプル１〜４は、レジオネラ菌であると判定された。サンプル１及び４は、レジオネラ菌であり、予想された結果であった。一方、サンプル２及び３は、種の同定がなされていなかった細菌なので、それらが実際にレジオネラ菌であるか否かを再度確認するため、増幅断片の塩基配列を決定することとした。
【００３４】
サンプル１〜４より得られた約120bpの増幅産物を精製し、プライマー（は）を用いた直接シークエンス反応によって塩基配列を決定した。基準株の配列と得られた配列とを整列させた。これを図５に示す。なお、図中の略号の意味は、下表の通りである。
【００３５】
【表２】
2006320334.tif 000003
【００３６】
サンプル1(GTC1278)は得られた塩基配列がLegionella pneumophila ATCC35289血清型9の基準株(L9)と100％一致したので、これに近縁な株であると同定された。サンプル2(G11174) も得られた塩基配列がLegionella pneumophila ATCC35289血清型9の基準株(L9)と100％一致したので、これに近縁な株であると同定された。サンプル3(G12174) は得られた塩基配列がLegionella pneumophila ATCC43283血清型10の基準株(L10)と100％一致したので、これに近縁な株であると同定された。サンプル4(G11500) は得られた塩基配列がLegionella pneumophila subsp. fraseri ATCC33156血清型4の基準株(L4)と100％一致したので、これに近縁な株であると同定された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】レジオネラ属に属する細菌のgyrB遺伝子の塩基配列を示す図（１）。
【図２】レジオネラ属に属する細菌のgyrB遺伝子の塩基配列を示す図（２）。
【図３】レジオネラ属に属する細菌のgyrB遺伝子の塩基配列を示す図（３）。
【図４】レジオネラ属に属する細菌のgyrB遺伝子の塩基配列を示す図（４）。
【図５】サンプルとして用いた菌株及び基準株のgyrB遺伝子の塩基配列を示す図。
【図１】
2006320334.tif 000004
【図２】
2006320334.tif 000005
【図３】
2006320334.tif 000006
【図４】
2006320334.tif 000007
【図５】
2006320334.tif 000008
【配列表】
2006320334000001.app