(57)【要約】【課題】数カ所の遺伝子多型、特にはチトクローム２Ｄ６、２Ｃ１９等の数カ所の遺伝子多型を明確にかつ再現性よく検出することができる方法及びそのための試薬を提供する。【解決手段】  野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方と核酸特異標識を用いて増幅を行うことにより、遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび／または３‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて増幅を行うことにより、チトクローム２Ｃ１９遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とするチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
変異箇所以外に少なくとも１箇所のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１に記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項４】
増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項６】
核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
【請求項７】
３‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび３‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方を用いて増幅を行うことにより、チトクローム２Ｃ１９遺伝子多型を検出するための試薬において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出できるよう調整されたことを特徴とするチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項７記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
【請求項９】
増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項７または８記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
【請求項１０】
核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する２種類以上の遺伝子多型の同時検出方法に関し、特に試料中に存在する２種類以上のチトクローム２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６と略することがある）遺伝子多型の同時検出方法に関する。
また、特に試料中に存在する２種類以上のチトクローム２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）と略することがある）遺伝子多型の同時検出方法に関する。
さらには、チトクローム２Ｄ６およびチトクローム２Ｃ１９の遺伝子多型の同時検出法に関する。
また、さらには２種類以上のＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２と略することがある）の遺伝子多型の同時検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、遺伝子多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（非特許文献１、非特許文献２参照）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間を必要でする。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００４】
特にヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６の多型は抗鬱剤や高血圧症の治療薬などの薬物代謝に関わり、薬物の副作用を抑えて効果的な投与を行う際に意義が高い。
また、ヒトチトクロームＰ４５０２Ｃ１９の多型はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉの除菌治療との関連が知られているなど、臨床的にも意義が高い。
ＮＡＴ２の多型は主に結核の治療薬であるイソニアジドの代謝に関連すると言われており、この点で臨床的な意義が高い。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献１、特許文献２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうち、一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００７】
【非特許文献１】GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁
【非特許文献２】Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻(1989)、第５５１〜５５４頁
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
【０００９】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び変異型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。特に薬物代謝酵素遺伝子とりわけチトクロームの遺伝子多型、その中においても多数の多型箇所を有するチトクローム２Ｄ６の遺伝子多型を検出するためには数カ所の変異箇所を調べることが必要である。このため、上記方法においては数多くの工程を数カ所に対して個々に行わねばならず、検出作業には多大な労力が必要であり、未だチトクローム２Ｄ６の遺伝子多型の複数の変異箇所を同時に測定すると言った簡便、短時間に検出する方法は提案されていなかった。
【００１０】
また、同様に、その中においても多数の多型箇所を有するチトクローム２Ｃ１９の遺伝子多型を検出するためにも数カ所の変異箇所を調べることが必要である。このため、上記方法においては数多くの工程を数カ所に対して個々に行わねばならず、検出作業には多大な労力が必要であり、未だチトクローム２Ｃ１９の遺伝子多型の複数の変異箇所を同時に測定する場合、特殊な専用装置を使用することなく簡便、短時間に検出する方法は提案されていなかった。
【００１１】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、数カ所の遺伝子多型、特にはチトクローム２Ｄ６の数カ所の遺伝子多型、チトクローム２Ｃ１９の数カ所の遺伝子多型、ＮＡＴ２の数カ所の遺伝子多型を明確にかつ再現性よく検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、野生型検出用オリゴヌクレオチド及びまたは１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、増幅された該オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．３‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび／または３‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて増幅を行うことにより、チトクローム２Ｃ１９遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とするチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
２．変異箇所以外に少なくとも１箇所のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする１のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
３．オリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする１または２のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
４．増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする１〜３のいずれかのチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
５．オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする１〜４のいずれかのチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
６．核酸特異標識により検出することを特徴とする１〜５のいずれかのチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出方法。
７．３‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび３‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方を用いて増幅を行うことにより、チトクローム２Ｃ１９遺伝子多型を検出するための試薬において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出できるよう調整されたことを特徴とするチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
８．オリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする７のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
９．増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする７または８のチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
１０．核酸特異標識により検出することを特徴とする７〜９のいずれかのチトクローム２Ｃ１９遺伝子多型の検出試薬。
【発明の効果】
【００１４】
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。
【００１６】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。例えば、このような遺伝子多型が数カ所生じることにより薬物代謝酵素の代謝活性が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を数カ所有しているか否かを検査し、被験者の有する遺伝子のタイプを検出する方法である。
【００１７】
本発明において、野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。
【００１８】
本発明において、野生型検出用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、変異型検出用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
本発明を達成するには、検出のための重要な要素であるオリゴヌクレオチドの遺伝子多型部位近辺が、野生型検出用オリゴヌクレオチドの場合は変異型配列と、変異型検出用オリゴヌクレオチドの場合は野生型配列と２本鎖を形成することなく明確に解離しするような、野生型検出用および変異型検出用オリゴヌクレオチドを選択することが好ましい。このように明確に解離させることにより、伸長反応やハイブリダイズの有無などといった相補的なオリゴヌクレオチドと相補的でないオリゴヌクレオチドとの差異が生じる条件の範囲が広くなり、本発明を達成するのに好適である。
【００２０】
このようなオリゴヌクレオチドの例としては、変異箇所以外に少なくとも１箇所のミスマッチを有する野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドであることも好ましい。変異箇所以外のミスマッチ部位としては、変異箇所から５塩基以内が好ましく、さらに好ましくは４塩基以内、特に好ましくは３塩基以内である。最も好ましくは２塩基以内である。
【００２１】
従来では変異箇所のみで差を出していたために２本鎖の形成の有無が明確でない場合があったが、オリゴヌクレオチドとしてこのような構成を採ることで変異箇所と他のミスマッチ部の２箇所で２本鎖形成を妨げることになり、複数箇所の変異部位を同一の条件で検出することが容易に出来るようになる。
【００２２】
このようなオリゴヌクレオチドの例としては、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドを増幅のフォワード側プライマーとして用いる場合、好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応し、かつ野生型及び変異型両方に相補的でない塩基を３’末端から３〜７番目の少なくとも１箇所、（特に好ましくは３番目）に有するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３’  末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
【００２４】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、下限は好ましくは１０，より好ましくは１３、さらに好ましくは１６塩基であり、上限は好ましくは５０、より好ましくは３５塩基、さらに好ましくは３０塩基である。上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在することが好ましい。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
【００２５】
なお、上記にはフォワード側プライマーに用い、伸長反応開始点の３’末端部を明確に解離させる例を示したが、リバース側プライマーとして用いる場合も同様に明確に解離させたりすることもできる。さらには、前述の思想を基に、相補的でないプライマー自身をハイブリダイズさせにくくしたりすることも可能である。
【００２６】
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００２７】
該伸長反応は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、例えば、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００２８】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research  第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J. Clin. Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。
【００２９】
ＬＣＲ法は、標的核酸に２種類のオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とリガーゼを作用させ標的核酸上で２種類のオリゴヌクレオチドを結合させる反応を繰り返すことによって標的核酸を増幅させる方法である。
ＳＤＡは、その配列に制限酵素サイトを有する鋳型と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用い、伸長反応と制限酵素処理を繰り返すことによって核酸を増幅させる方法である。
ＲＣＡは、環状の標的核酸に対し相補的なオリゴヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼを作用させることによって、新たに生成したオリゴヌクレオチドが、鋳型から離されながら、連続的に標的核酸を増幅させる方法である。
【００３０】
ｉｎｖａｄｅｒ法は、ＤＮＡターゲットフラグメントに対して相補的配列を持つインベーダーオリゴと５’のフラップ構造を持ち、ＳＮＰを検出するための相補的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲットＤＮＡに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダイズさせる。この時、インベーダーオリゴとプローブは１塩基がオーバーラップする構造（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持つ。この部分にＣｌｅａｖａｓｅが作用し、ＳＮＰ部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（ＳＮＰなし）の場合にはシグナルプローブの５’フリップが切断される。切断された５’フリップはＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅ  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｂｅ）にハイブリダイズします。ＦＲＥＴ  プローブ上には蛍光色素とクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が近接しており、蛍光が抑制されているが、５’フリップＤＮＡが結合することによりＣｌｅａｖａｓｅによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出可能である。
【００３１】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００３２】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型検出用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型検出用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
【００３３】
野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。
【００３４】
また、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチド及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を用いて反応を行い、どちらのオリゴヌクレオチドで反応が起こったかを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることもできる。
【００３５】
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００３６】
また、対象となる遺伝子多型部位は、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出できるものであれば特に限定されるものではない。しかしながら、チトクローム２Ｄ６、チトクローム２Ｃ１９の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましい。さらには、チトクローム２Ｄ６の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上を含む遺伝子多型の同時検出、チトクローム２Ｃ１９の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上を含む遺伝子多型の同時検出、チトクローム２Ｄ６の少なくとも１箇所およびチトクローム２Ｃ１９の少なくとも１箇所を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましい。
【００３７】
また、ＮＡＴ２の少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることも好ましく、ＮＡＴ２の少なくとも１箇所とチトクローム２Ｄ６およびチトクローム２Ｃ１９の中の少なくとも１箇所を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることも好ましい。
さらには上述の箇所に加えて、チトクローム２Ａ６の少なくとも１箇所の遺伝子多型の同時検出を行ってもよい。
【００３８】
中でも、チトクローム２Ｄ６の中では２Ｄ６＊２、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１０、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１、２Ｄ６＊３６少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましく、チトクローム２Ｃ１９の中では２Ｃ１９＊２、２Ｃ１９＊３の少なくともいずれかを含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましく、ＮＡＴ２の中ではＮＡＴ２＊５、ＮＡＴ２＊６、ＮＡＴ２＊７の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましい。
【００３９】
また、異なる遺伝子間を含む組み合わせとしては、チトクローム２Ｄ６＊２、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１０、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１、２Ｄ６＊３６、２Ｃ１９＊２、２Ｃ１９＊３、２Ａ６＊３、ＮＡＴ２＊５、ＮＡＴ２＊６、ＮＡＴ２＊７の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む遺伝子多型の同時検出に用いられることが好ましい。
【００４０】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法の例としては、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、核酸特異標識、特に２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
その他にも、電気泳動による方法、ハイブリダイゼーションによる方法等増幅反応の有無を検出できる方法であれば用いることができる。
【００４１】
核酸特異標識を用いる場合は、電気泳動等の後処理を行うこともなくフォワードプライマーのタイプにより伸長反応が起こったか否かによってのみ判断するため、標識したオリゴヌクレオチドを用いる必要がなく、コスト面で有利であるにもかかわらず、未だ同一条件で伸長反応を行うことは困難であると考えられていたが、例えば上述のプライマーを用いることで同一条件で伸長反応を行うことが可能となった。
【００４２】
上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。２本鎖核酸特異的結合物質としては、エチレンブロマイド、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、32Ｐ、35Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。フォワード側プライマーとして用いる場合は、好ましくは、５’  部位である。
【００４３】
野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を添加して、１つの反応槽で検出ができる。
【００４４】
本発明で増幅を行う際には、溶液としては、その増幅方法に合った反応液を用いる。この反応液は、公知のものを用いることができる。
【００４５】
例えば、ＰＣＲ法であれば、オリゴヌクレオチド及び試料以外では、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4等の各種塩類等が添加された溶液である。本発明の操作の簡便性、人為的ミスを少なくするためには、オリゴヌクレオチド以外の反応液は予め所定の濃度に調製されたものを用いることが好ましく、さらに、試料の濃度も同じにすることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を適宜変えることもできる。
【００４６】
反応液の調整の方法としては、具体的には、試料に対して、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方ともが増幅してしまう場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を下げることが好ましい。また、増幅すべきでない方の濃度のみ下げることも好ましい。
逆に、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方とも増幅が認められない場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を上げることが好ましい。また、増幅すべき方の濃度のみ上げることも好ましい。
なお、緩衝液、ｄＮＴＰの濃度は、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドや対象の変異箇所にかかわらず、同一であることが好ましい。
【００４７】
これらの反応液としては、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが０．５〜５０ｐｍｏｌ、×１０の緩衝液が０．５〜５０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで０．５〜５０μｌ、塩類が２５ｍＭ濃度液で０．１〜３０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが０．１〜３０ｎｇ程度であることが好ましい。
【００４８】
本発明では、少なくとも２箇所以上の異なった変異箇所を対象とした増幅反応を、温度および時間サイクルが同一の条件下で行う。
これまで知られているオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を検出する方法では、各変異箇所の周辺の塩基配列は全く同じではないため、異なった条件で増幅反応を行うことが必要である他、標的核酸部位を特異的に増幅させるために、増幅産物の塩基数は各変異箇所に応じて異なっていたため、複数の変異箇所を同じ温度及び時間サイクル条件では増幅が行えないと考えられていた。本発明では、各変異箇所に特異的なオリゴヌクレオチドを用いること、および反応液を適宜調整することによって従来の課題を克服し、本発明を完成するに至った。
【００４９】
増幅反応としては、最初の熱変形工程が８０〜１００℃で１〜１５分、繰り返しの熱変形工程が８０〜１００℃で２〜３００秒、アニーリンクが４０〜８０℃で２〜３００秒、伸長反応工程が６０〜８５℃で２〜３００秒程度行い、この繰り返しを２０〜５０回繰り返しすことが好ましい。
【００５０】
本発明の方法により、従来は変異箇所個々に変異型を調べ、そのデータを総合して遺伝子多型を判断・検出していたが、複数箇所の変異型を同時に調べることができるため、遺伝子多型の検出が短時間で済む上、条件設定の複雑さが解消されたため、単純な設定ミスなどの人的ミスを減らすことができる。
【００５１】
キット
本発明において、キットとしては、野生型検出用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む遺伝子多型検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００５２】
また、キットとしては、複数の変異箇所に対応するそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマーを一つのセットとしてパッケージされていることが好ましい。
キットとしては、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。
また、キットのオリゴヌクレオチドの種類以外は同じ組成、含有量であることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を前述のように適宜変えることもできる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５４】
オリゴヌクレオチドの合成
実施例における各オリゴヌクレオチドはパーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。
もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ  ＫＫ、アマシャムファルマシア  バイオテク（株）等）に依頼した。
【００５５】
試薬の調整
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応液ａ
オリゴヌクレオチド（フォワード側プライマー）    ５  ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチド（リバース側プライマー）      ５  ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                                    ２．５  μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                ２．５  μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2                             １．５  μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ                      １．３  Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液                                  １００  ｎｇ
【００５６】
増幅条件
９５℃・５分
９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃、３０秒（３５サイクル）
７２℃・２分。
【００５７】
２．  核酸特異的結合物質による検出
それぞれの増幅反応液３μｌを１００００倍に希釈されたＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）の溶液１００μｌに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約５分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
ＦＬ（試料の蛍光強度）＝ＦＬｓ  −  ＦＬｂ      （式１）
ＦＬｂ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  （試料が未添加）の蛍光強度
ＦＬｓ：各試料の蛍光強度
【００５８】
実施例１  ＣＹＰ２Ｄ６＊２、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子多型の同時検出
（１）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１００番目及び２８５０番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
【００５９】
オリゴ１及び２はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の２８５０番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ１は３’末端から２番目に野生型（Ｃ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ２は３’末端から２番目に変異型（Ｔ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ３がアンチセンス鎖であり、オリゴ１、２と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１、２、３は必要により標識して使用される。
【００６０】
オリゴ４及び５はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１００番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ４は３’末端から２番目に野生型（Ｃ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ５は３’末端から２番目に変異型（Ｔ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ６がアンチセンス鎖であり、オリゴ４、５と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ４、５、６は必要により標識して使用される。
【００６１】
また、本実施例でのオリゴ１、オリゴ２、オリゴ４、オリゴ５の各オリゴヌクレオチドは、この記載のオリゴヌクレオチドに限定されず、前述したように３’末端から１０〜５０塩基の長さであれば同様の結果が得られる。さらに、各オリゴヌクレオチドは３’末端から３番目に人為的ミスマッチを導入したが、前述のように、３〜７番目の範囲であっても良いし、さらにはこれ以外に数カ所（１〜５箇所程度でプライマーの全体長による（特に５’末端））のミスマッチが導入されていても良い。
さらに、オリゴ３およびオリゴ６は伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
【００６２】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６＊２、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりＣＹＰ２Ｄ６＊２、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄとも同じ条件で同時に行った。
【００６３】
反応液１−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ１およびオリゴ３
反応液１−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ２およびオリゴ３
反応液１−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ４およびオリゴ６
反応液１−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ５およびオリゴ６
【００６４】
【表１】
2006320338.tif 000002
【００６５】
【表２】
2006320338.tif 000003
【００６６】
実施例２  ＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６遺伝子多型の同時検出
（１）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１８４６番目及びＥｘｏｎ９  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎの多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ７及び８はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１８４６番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ７は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ８は３’末端から２番目に変異型（Ａ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ９がアンチセンス鎖であり、オリゴ７、８と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ７、８、９は必要により標識して使用される。
【００６７】
オリゴ１０及び１１はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＥｘｏｎ９  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎを検出するためのものである。
オリゴ１０は野生型（２Ｄ６  Ｅｘｏｎ９）のヌクレオチド配列を有し、オリゴ１１は変異型（２Ｄ７  Ｅｘｏｎ９）のヌクレオチド配列を有し、オリゴ１２がアンチセンス鎖であり、オリゴ１０、１１と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１０、１１、１２は必要により標識して使用される。
【００６８】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６遺伝子多型遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊３６遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄとも同じ条件で同時に行った。
【００６９】
反応液２−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ７およびオリゴ９
反応液２−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ８およびオリゴ９
反応液２−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ１０およびオリゴ１２
反応液２−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ１１およびオリゴ１２
【００７０】
【表３】
2006320338.tif 000004
【００７１】
【表４】
2006320338.tif 000005
【００７２】
実施例３  ＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４遺伝子多型の検出
（１）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１８４６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ１３は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ１４は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ１５がアンチセンス鎖であり、オリゴ１３、１４と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１３、１４、１５は必要により標識して使用される。
（２）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の１７５８番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ１６は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ１７は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ１５がアンチセンス鎖であり、オリゴ１６、１７と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１６、１７、１５は必要により標識して使用される。
（３）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄとも同じ条件で同時に行った。
【００７３】
反応液３−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ１３およびオリゴ１５
反応液３−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ１４およびオリゴ１５
反応液３−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ１６およびオリゴ１５
反応液３−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ１７およびオリゴ１５
【００７４】
【表５】
2006320338.tif 000006
【００７５】
実施例４  ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６８１番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ１８は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ａ）を有し、オリゴ１９は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ａ）を有し、オリゴ２０がアンチセンス鎖であり、オリゴ１８、１９と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１８、１９、２０は必要により標識して使用される。
【００７６】
（２）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６３６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴ２１は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（ｃ→ｔ）を有し、オリゴ２２は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（ｃ→ｔ）を有し、オリゴ２３がアンチセンス鎖であり、オリゴ２１、
２２と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ２１、２２、２３は必要により標識して使用される。
【００７７】
（３）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄとも同じ条件で同時に行った。
【００７８】
反応液４−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ１８およびオリゴ２０
反応液４−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ１９およびオリゴ２０
反応液４−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ２１およびオリゴ２３
反応液４−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ２１およびオリゴ２３
【００７９】
【表６】
2006320338.tif 000007
【００８０】
２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型の同時検出（その２）
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６８１番目及び６３６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ２４及び２５はＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６８１番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ２４は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ａ）を有し、オリゴ２５は３’末端から２番目に変異型（Ａ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｇ→Ａ）を有し、オリゴ３がアンチセンス鎖であり、オリゴ２４、２５と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ２４、２５、２６は必要により標識して使用される。
【００８１】
オリゴ２７及び２８はＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６３６番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ２７は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ２８は３’末端から２番目に
変異型（Ａ）のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｃ→Ａ）を有し、オリゴ２９がアンチセンス鎖であり、オリゴ２７、２８と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ２７、２８、２９は必要により標識して使用される。
【００８２】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄとも同じ条件で同時に行った。
【００８３】
反応液５−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ２４およびオリゴ２６
反応液５−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ２５およびオリゴ２６
反応液５−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ２７およびオリゴ２９
反応液５−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ２８およびオリゴ２９
【００８４】
【表７】
2006320338.tif 000008
【００８５】
【表８】
2006320338.tif 000009
【００８６】
実施例６  ＮＡＴ２＊５、ＮＡＴ２＊６、ＮＡＴ２＊７遺伝子多型の検出
（１）ＮＡＴ２遺伝子の４８１番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ３０は３’末端から２番目に野生型（Ｃ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ａ→Ｃ）を有し、オリゴ３１は３’末端から２番目に変異型（Ｔ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ａ→Ｃ）を有し、オリゴ３２がセンス鎖であり、オリゴ３０、３１と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ３０、３１、３２は必要により標識して使用される。
【００８７】
（２）ＮＡＴ２遺伝子の５９０番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ３３は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｔ→Ａ）を有し、オリゴ３４は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｔ→Ａ）を有し、オリゴ３２がセンス鎖であり、オリゴ３３、３４と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ３３、３４は必要により標識して使用される。
【００８８】
（３）ＮＡＴ２遺伝子の８５７番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ３５は３’末端から２番目に野生型（Ｇ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｔ→Ｇ）を有し、オリゴ３６は３’末端から２番目に変異型（Ａ）に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチ（Ｔ→Ｇ）を有し、オリゴ３２がセンス鎖であり、オリゴ３５、３６と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ３５、３６は必要により標識して使用される。
【００８９】
（４）ＰＣＲ法によるＮＡＴ２＊５、ＮＡＴ２＊６、ＮＡＴ２＊７遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりＮＡＴ２＊５、ＮＡＴ２＊６、ＮＡＴ２＊７遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆとも同じ条件で同時に行った。
【００９０】
反応液６−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ３０およびオリゴ３２
反応液６−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ３１およびオリゴ３２
反応液６−ｃのオリゴヌクレオチド
オリゴ３３およびオリゴ３２
反応液６−ｄのオリゴヌクレオチド
オリゴ３４およびオリゴ３２
反応液６−ｅのオリゴヌクレオチド
オリゴ３５およびオリゴ３２
反応液６−ｆのオリゴヌクレオチド
オリゴ３６およびオリゴ３２
【００９１】
【表９】
2006320338.tif 000010
【００９２】
以上、何れの実施例でも明らかなように、複数箇所の多型部位を同一の条件で増幅でき、さらに明確にその差を区別することが出来た。
【００９３】
実施例７  ＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型の検出
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ３７はおよびオリゴ３９はＣＹＰ２ＤＡ６（野生型）に相補的なヌクレオチド配列を有し、オリゴ３８およびオリゴ４０はＣＹＰ２Ａ６＊３（変異型）に相補的なヌクレオチド配列を有する。オリゴ３７と３９、オリゴ３８と４０は組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ３７、３８、３９、４０は必要により標識して使用される。
【００９４】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型の解析
１．  ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加し前記条件によりＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型を解析した。反応は反応液ａ、ｂとも同じ条件で同時に行った。
【００９５】
反応液７−ａのオリゴヌクレオチド
オリゴ３７およびオリゴ３９
反応液７−ｂのオリゴヌクレオチド
オリゴ３８およびオリゴ４０
【００９６】
【表１０】
2006320338.tif 000011
【００９７】
ＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型の解析は他の実施例と同一の増幅の温度・時間条件で検出可能であることが判り、実施例で示した他の箇所と組み合わせて同時に増幅反応を行っても同時に検出できることが明らかになった。
【００９８】
上記実施例で示した通り、オリゴヌクレオチドを用いて複数箇所を同一温度、時間条件で同時に塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【００９９】
また、実施例では特定の組み合わせしか行っていないが、増幅の温度・時間条件は同じであり、これらの箇所の中で自由な組み合わせを行っても、同時に検出できることは明かである。
【０１００】
また、本実施例での各オリゴヌクレオチドは、この記載のオリゴヌクレオチドに限定されず、前述したように３’末端から１０〜５０塩基の長さであれば同様の結果が得られる。さらに、いくつかのオリゴヌクレオチドは３’末端から３番目に人為的ミスマッチを導入したが、前述のように、３〜７番目の範囲であっても良いし、さらにはこれ以外に数カ所（１〜５箇所程度でプライマーの全体長による（特に５’末端））のミスマッチが導入されていても良い。
さらに、リバース側は伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られたことからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【配列表】
2006320338000001.app