(57)【要約】      （修正有）【課題】システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法を提供する。【解決手段】Aeropyrum pernix由来システイン合成酵素の基質特異性決定ドメイン領域の特定の指定された位置にアルギニンまたはリジン残基を有しないシステイン合成酵素において、特定の位置にアルギニンまたはリジン残基を導入することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホセリンに対する基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶であって、単位格子定数がa=b=78.87Å, c=275.91Åである、上記結晶。
【請求項２】
配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しないシステイン合成酵素において、該２９７位および／または２９８位にアルギニンまたはリジン残基を導入することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法。
【請求項３】
配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素において、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐに対応する以下の位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法：
(1) 配列番号１の２９５位、２９６位及び２９９位に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種；
(2) 配列番号１の１５３位（Ｓｅｒ）、２０２位（Ｓｅｒ）、２０３位（Ｔｈｒ）、２２５位（Ｐｈｅ）及び２６２位（Ｔｈｒ）に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種。
【請求項４】
ホスホセリンを、配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素（但し、配列番号１に記載のＯＰＳＳ．Ａｐ由来のシステイン合成酵素を除く）及びＳＨ基含有化合物と反応させることを特徴とする、システインまたはその誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記システイン合成酵素が、以下の(i)〜(viii)のいずれかに記載のシステイン合成酵素
である請求項４に記載のシステインの製造方法：
(i)配列番号２に記載のスルフォロバス  トコダイイ  アセチルセリンスルフヒドリル化
酵素（OASS.St）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置以外の改変体；
(ii) 配列番号３に記載のサーモプラズマ  ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒド
リル化酵素（OASS.Tv）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位に対応する位置
以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iii) 配列番号４に記載のパイロコッカス  フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.Pf）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９
８位に対応する位置以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iv) 配列番号５に記載のサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS-A.Sty）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２
９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(v) 配列番号６に記載のホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.sp）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vi) 配列番号７に記載のサーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵
素（OASS.Tm）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／ま
たは２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vii) 配列番号８に記載のヒト由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.human）において、
少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(viii) 配列番号９に記載の酵母由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.Sc）において、少
なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法に関する。また、本発明はシステイン合成酵素の結晶に関する。さらに本発明は、システインまたはその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超好熱性古細菌アエロパイラム ペルニックスに見出されたシステイン合成酵素は、３
８９残基のアミノ酸からなり、ゲノム解析結果（非特許文献１）からは、O-アセチルセリンとスルフィドからシステインと酢酸を合成する反応を触媒するアセチルセリンスルフヒドリル化酵素(OASS)（反応式１）とアサインされていた。
【０００３】
しかし、その機能解析の結果、本酵素はアセチルセリンスルフヒドリル化反応だけでなく、ホスホセリンスルフヒドリル化反応(OPSS)（反応式２）も行える新酵素であることが分かった（非特許文献２）。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
ホスホセリンはアセチルセリンと比較して耐熱性が高いため、超好熱性微生物がOPSS活性を持つことは納得できる。
【０００６】
システインおよびその誘導体を酵素を用いて合成する場合、基質の安定性および価格面から、O-アセチルセリンよりもホスホセリンの使用が好まれる。
【非特許文献１】Kawarabayasi, Y. et al. Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1. DNA Res. 6, 83-101 (1999)
【非特許文献２】Mino, K. and Ishikawa, K. A novel O-phosphoserine sulfhydrylation reaction catalyzed by O-acetylserine sulfhydrylase from Aeropyrum pernixK1. FEBS Lett. 551, 133-138 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性をより高めることを目的とする。
【０００８】
また、本発明はシステイン合成酵素の結晶を提供することを目的とする
さらに本発明は、システインまたはその誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、システイン合成酵素の結晶、システイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法およびホスホセリンを基質としてシステインまたはその誘導体を製造する方法を提供するものである。
１．  ホスホセリンに対する基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶であって、単位格子定数がa=b=78.87Å, c=275.91Åである、上記結晶。
２．  配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しないシステイン合成酵素において、該２９７位および／または２９８位にアルギニンまたはリジン残基を導入することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法。
３．  配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素において、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐに対応する以下の位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換することを特徴とするシステイン合成酵素のホスホセリンに対する基質特異性を高める方法：
(1) 配列番号１の２９５位、２９６位及び２９９位に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種；
(2) 配列番号１の１５３位（Ｓｅｒ）、２０２位（Ｓｅｒ）、２０３位（Ｔｈｒ）、２２５位（Ｐｈｅ）及び２６２位（Ｔｈｒ）に対応するアミノ酸残基の群から選ばれる少なくとも１種。
４．  ホスホセリンを、配列番号１の２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有するシステイン合成酵素（但し、配列番号１に記載のＯＰＳＳ．Ａｐ由来のシステイン合成酵素を除く）及びＳＨ基含有化合物と反応させることを特徴とする、システインまたはその誘導体の製造方法。
５．  前記システイン合成酵素が、以下の(i)〜(viii)のいずれかに記載のシステイン合
成酵素である請求項４に記載のシステインの製造方法：
(i)配列番号２に記載のスルフォロバス  トコダイイ  アセチルセリンスルフヒドリル化
酵素（OASS.St）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置以外の改変体；
(ii) 配列番号３に記載のサーモプラズマ  ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒド
リル化酵素（OASS.Tv）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位に対応する位置
以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iii) 配列番号４に記載のパイロコッカス  フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.Pf）または、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９
８位に対応する位置以外がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体；
(iv) 配列番号５に記載のサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS-A.Sty）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２
９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(v) 配列番号６に記載のホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素（OASS.sp）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８
位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vi) 配列番号７に記載のサーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵
素（OASS.Tm）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／ま
たは２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(vii) 配列番号８に記載のヒト由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.human）において、
少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体；
(viii) 配列番号９に記載の酵母由来シスタチオニンβ合成酵素（CBS.Sc）において、少
なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換した改変体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、システイン合成酵素の基質特異性に関し、アセチルセリンよりも安価で耐熱性に優れたホスホセリンに対する基質特異性を高めることができ、システインまたはその誘導体をより効率よく製造することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ホスホセリンスルフヒドリル化酵素（OPSS）の遺伝子操作によるタンパク質工学的手法でホスホセリンに対する基質特異性をより高めるか、或いは、本来ホスホセリンに基質特異性がなくO-アセチルセリンと種々の求核試薬とからシステインおよびその誘導体を合成できるシステイン合成酵素（アセチルセリンスルフヒドリル化酵素; OASS）をホスホセリンスルフヒドリル化酵素（OPSS）に変換することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明によりホスホセリンに対して基質特異性を有するシステイン合成酵素の結晶構造が明らかにされたため、ホスホセリンの基質特異性をさらに高める等のタンパク質変異体の設計を適切に行うことができる。
さらに配列番号２〜４のＯＡＰＰは、配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置にアルギニンまたはリジン残基を有しているので、ホスホセリンを基質としてシステインを生産する能力を有していると推定される。従って、配列番号２〜４の該酵素あるいはその２９７位および２９８位に対応する以外の位置が置換、付加、欠失または挿入された改変体をホスホセリン及びＳＨ基含有化合物と反応させることで、システインまたはその誘導体を製造することができる。
さらに、配列番号５〜９のＯＡＰＰまたはＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）を含むシステイン合成酵素において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換し、必要に応じてさらに２９７位および２９８位に対応する以外の位置がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体は、ホスホセリンを基質としてシステインまたはその誘導体を生産する能力を有していると推定される。従って、配列番号５〜９のＯＡＰＰまたはＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）において、少なくとも配列番号１のＯＰＳＳ．Ａｐの２９７位および／または２９８位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジン残基に置換し、必要に応じてさらに２９７位および２９８位に対応する以外の位置がさらに置換、付加、欠失または挿入された改変体をホスホセリン及びＳＨ基含有化合物と反応させることで、システインまたはその誘導体を製造することができる。
ＳＨ基含有化合物としては、Ｒ−ＳＨ（Ｒは、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいアリール基を示し、これらの基の置換基としてはフッ素原子、カルボニル基、アルコキシ基、ニトロ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、複素環基、ＣＯＯＨ，アルコキシカルボニル基、アシル基、アルカノイル基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、アルカノイルアミノ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基、アルキル基などが挙げられ、置換基の数としては１〜３個が例示される）で表される化合物が挙げられる。アルキル基（アルコキシ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基等に含まれるアルキル基を含む）の炭素数としては、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好
ましくは１〜６個、特に１〜４個であり、直鎖又は分枝を有していてもよい。アリール基（アリールオキシ基、アラルキル基に含まれるアリール基を含む）の炭素数は５〜１８個好ましくは６〜１０個である。
<アエロパイラムペルニックスのホスホセリンスルフヒドリル化酵素のリン酸基の認識に
関与する部位の同定>
本酵素の結晶構造を、多波長異常分散法により、2.0Åの分解能で決定した。モノマー
は新規なα/βフォールドを含むN-末端側ドメインを含む。中間のドメインとC-末端側の
ドメインは、既存の酵素であるサルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素ならびにヒト由来シスタチオニンβ合成酵素と類似している。補酵素であるピリドキサールリン酸は127番目のリジンとシッフ塩基結合している（図２）。
【００１３】
決定した立体構造情報に基づいて、ホスホセリンを結合したモデルを構築して、活性部位を検証した結果、297番目のアルギニンと298番目アルギニン（特に297番目のアルギニ
ン）のは、ホスホセリンのリン酸基の近傍に配置すると予測された（図２）。そこで蛋白質工学的手法で297番目のアルギニンをアラニンに変えた変異型酵素を調製した。
【００１４】
この変異型酵素を用いて、ホスホセリンスルフヒドリル化反応およびアセチルセリンスルフヒドリル化反応との比較を行った。比活性を測定した結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
変異型酵素のアセチルセリンスルフヒドリル化反応の相対比活性は野性型酵素と比較して、74%であったのに対して、ホスホセリンスルフヒドリル化反応の相対比活性は0.5％以下であった。このことから、297番目のアルギニンはホスホセリンの負に荷電したリン酸
基の認識に関与する重要な残基の1つであり、この残基が、ホスホセリンスルフヒドリル
化活性に必要であることが示された。
【００１７】
図１にアミノ酸配列のアライメントを示す。図１における記号の意味を以下に示す：
OPSS.Ap: アエロパイラムペルニックス  ホスホセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.St: スルフォロバス  トコダイイ  アセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測さ
れている遺伝子産物
OASS.Tv: サーモプラズマ  ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予
測されている遺伝子産物
OASS.Pf:  パイロコッカス  フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物
OASS-A.Sty: サルモネラ菌由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.sp: ホウレンソウ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素
OASS.Tm: サーモトガマリティマ由来アセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されて
いる遺伝子産物
CBS.human: ヒト由来シスタチオニンβ合成酵素
CBS.Sc:  酵母由来シスタチオニンβ合成酵素
図１中において、▼は、アエロパイラムペルニックス  ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目のアルギニンに相当する位置を示す。
【００１８】
アエロパイラムペルニックス由来ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目のアル
ギニンに相当するアミノ酸は、超好熱性古細菌サーモプラズマ  ヴォルカニウムのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物において、アルギニンであり、超耐熱性古細菌スルフォロバス  トコダイイ、パイロコッカス  フリオサスのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物において、リジンである。リジンはアルギニンと同様に正の電荷を持つ塩基性アミノ酸である。上記の超好熱性古細菌のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と予測されている遺伝子産物は、いずれもホスホセリンスルフヒドリル化反応を触媒する可能性がある。すなわち、これら２９７番目と２９８番目周辺（２９５−３００番目）に相当する非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に変換することで、OPSSのホスホセリンに対する基質特異性をさらに高めることができる。また、構造から予想すると、図２で示したホスホセリンのリン酸残基から半径５オングストロームに存在するアミノ酸残基を改変することで、この変換が可能であることを示唆する。この残基には、１５３（Ser）,２０２（Ser）,２０３（Thr）,２２５（Phe）,２６２（Thr）が該当する。
【００１９】
一方、アエロパイラムペルニックス由来ホスホセリンスルフヒドリル化酵素の297番目
のアルギニンに相当するアミノ酸は、サルモネラ菌、ホウレンソウのアセチルセリンスルフヒドリル化酵素、サーモトガマリティマ由来のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素と推定されている遺伝子では、グリシンである。すなわち、サルモネラ菌、ホウレンソウ、サーモトガマリティマ由来等のアセチルセリンスルフヒドリル化酵素において上記グリシンおよび電荷がないアミノ酸を正電荷のアミノ酸、例えばリジンおよびアルギニンに変えることで、OASS活性にOPSS活性（ホスホセリンスルフヒドリル化反応）を付与できる。また、構造から予想すると、図２で示したホスホセリンのリン酸残基から半径５オングストロームに存在するアミノ酸残基を改変することで、この変換が可能であることを示唆する。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
実施例１
アエロパイラムペルニックス由来のホスホセリンスルフヒドリル化酵素遺伝子を、論文１（K. Mino and K. Ishikawa, Journal of  Bacteriology (2003) 185, pp2277-2284）
の方法で大腸菌の発現ベクター（pET ベクター）に組み込んだ。本ベクターで、大腸菌Rosetta(DE3)を形質転換する。得られた形質転換体を、論文２（S. Doublie Methods Enzymology 276, pp523-530）の方法で培養し、メチオニンがセレノメチオニンに変換した目的酵素（ホスホセリンスルフヒドリル化酵素）を調製した。得られた酵素は、論文１の方法で精製した（ただし、酸化防止の目的で、使用した全ての緩衝液には10mMジチオスレイトールを加えた）。精製した酵素（セレノメチオニン変換ホスホセリンスルフヒドリル化酵素）は、論文３（K. Mino, Y. Oda, M. Ataka and K. Ishikawa, Acta crystallography D(2003) 59, pp338-340）の方法を、少し改良した方法で結晶化した。酵素溶液は、緩衝
液（0.1mM ピリドキサールリン酸、 3mMメルカプトエタノールを含む50mM リン酸緩衝液
（pH7.5））に透析し、２０mg/mlになるまで限外ろ過膜で濃縮した。結晶化のための緩衝液（0.2 M Sodium acetate、3mM メルカプトエタノール、 21% PEG8000を含む0.1 M Sodium cacodylate 緩衝液（pH7.0））を調製した。結晶化は、CrystalClearStrip(Hampton Research) を使用してsitting-drop法で行った。本溶液と濃縮酵素溶液とを、0.0035mlづ
つ混合し、リザーバーに結晶化のための緩衝液 0.1ml を加え約２週間で結晶（0.5 mm程
度）が生じた。
【００２１】
得られた結晶は、SPring-8 のビームラインBL40B2において、３波長のX線を照射し、その結晶の反射データの収集を行った。振動角は1°で１８０フレームのデータを収集した
（表２）。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
分解能は2.2Åで、MAD法により本酵素の構造解析を行った。位相はSOLVEで決定し、TURBO-FRODO でモデルを構築した後、REFMAC で構造の精密化を行った。その結果、本酵素は２回軸で対称付けられる２量体構造を形成していた。その活性部位構造を図２に示す。
【００２４】
アセチルセリンおよびリン酸セリンに対する酵素活性は、論文１、４（K. Mino and K.
Ishikawa, FEBS Letters (2003) 551,pp133-138）の方法で測定した。２９７番目のアルギニン残基は、タンパク質工学的手法（site-directed mutagenesis）で、アラニン残基
に変換した。本変異体酵素は、論文１の手法で調製・精製した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】アエロパイラムペルニックスのホスホセリンスルフヒドリル化酵素の活性部位近傍の構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2006304673000001.app