(57)【要約】【課題】  本発明は巨大なＤＮＡを特定の位置で、しかも効率よく切断し、さらに切断断片を外来ＤＮＡと結合し、目的とする組換えＤＮＡを調製する方法の提供をその目的とする。【解決手段】  本発明によるＤＮＡの操作方法は、標的となる２本鎖ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、その一方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび、他方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断し、さらに、生成したＤＮＡ断片と外来ＤＮＡとを酵素を用いて結合する方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的となる２本鎖ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、その一方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび、他方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断し、さらに、生成したＤＮＡ断片と外来ＤＮＡとを酵素を用いて結合する方法。
【請求項２】
該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂが互いに相補的な部分を持ち、さらに、それぞれの５‘側および／または３’側に互いに相補的ではない部分を持つ請求項１記載の方法。
【請求項３】
セリウム（ＩＶ）錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミンーＮ−ポリカルボン酸の錯体であることを特徴とする、請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】
該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの５‘末端および／または３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とする請求項１〜４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【産業上の分野】
【０００１】  本発明は、人工的に作出された化学構造においてＤＮＡを特異的に切断し、さらにこれを他のＤＮＡ断片と結合して目的とする組換えＤＮＡを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＤＮＡ鎖を任意の位置で切断し、これに外来ＤＮＡを結合する方法は、医学、分子生物学等、遺伝子を取り扱う諸分野において大きな役割を果たすことが期待されている。現在は、ＤＮＡを切断するのに制限酵素が広く使用されているが、制限酵素は塩基配列の特異性が低く、巨大なＤＮＡを特定の位置で選択的に切断することができない。また天然酵素を使用しないＤＮＡ切断法としては、これまでにも、ＤＮＡを金属イオンや金属イオン錯体で切断する試みがなされてきた。しかし、たとえばセリウム（ＩＶ）イオンがＤＮＡ切断能を持つことは知られているものの、塩基配列特異性はほとんどない。すなわち、巨大なＤＮＡを特定の位置で切断する方法はいまだ開発されておらず、必然的に大きなＤＮＡを自在に操作する技術は知られていない。
【本発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明は巨大なＤＮＡを特定の位置で、しかも効率よく切断し、さらにこれを外来ＤＮＡと結合し、目的とする組換えＤＮＡを調製する方法の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明の課題は、
（１）標的となる２本鎖ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、その一方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび、他方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断し、さらに、生成したＤＮＡ断片と外来ＤＮＡとを酵素を用いて結合する方法。
（２）該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂが互いに相補的な部分を持ち、さらに、それぞれの５‘側および／または３’側に互いに相補的ではない部分を持つ請求項１記載の方法。
（３）セリウム（ＩＶ）錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミンーＮ−ポリカルボン酸の錯体であることを特徴とする、請求項１〜２記載の方法。
（４）該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする、請求項１〜３記載の方法。
（５）該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの５‘末端および／または３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とする請求項１〜４記載の方法によって達成された。（１）および（２）項における核酸複合体の構造を図１および図２に示す。
【０００５】図１
【０００６】図２
【発明の詳細な説明】
【０００７】  本発明による第一の態様によれば、標的となる２本鎖ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、その一方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび、他方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断し、さらに、生成したＤＮＡ断片を外来ＤＮＡと酵素を用いて結合することを特徴とする方法が提供される。
【０００８】  ここに相補鎖ＡおよびＢとは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ，ＲＮＡ、およびその誘導体であり、好ましくはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ここで、ＰＮＡは、アミド結合を主鎖に、核酸塩基を側鎖に持つ高分子であり、例えば、「生命化学のニューセントラルドグマ」（化学同人、平成１４年発行）の第６６ページに記載されているものを利用することができる。また、チミジンの代わりに２−チオウラシルを、またアデニンの代わりに２，６−ジアミノプリンを有するＰＮＡ誘導体であるｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＰＮＡ（以下ｐｃＰＮＡと略す）も利用できる。
【０００９】  相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂの５‘末端および／または３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体を導入してＤＮＡ切断効率を高めることもできる。
【００１０】  セリウム（ＩＶ）イオンは、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、硫酸セリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、硫酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、過塩素酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物など、Ｃｅ（ＩＶ）イオンを含む水溶液であれば、いずれの形態で反応系に導入してもよいが、好ましくは硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）である。ＤＮＡ切断能を有するセリウム錯体は、例えばセリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸を水中で接触することにより得られる。ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸としては、「金属キレート、Ｉ−ＩＶ」（南江堂、昭和４２年発行）に記載するものを利用することができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸、１，３−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，４−ジアミノブタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００１１】  核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることにより、標的ＤＮＡは切断される。得られた断片は、必要によりポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、またはＨＰＬＣにより精製できる。また、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＰＮＡは慣用方法により分離してもよい。
【００１２】  生成したＤＮＡ断片を外来断片と結合するには、例えば酵素リガーゼを使用することができる。
【発明の具体的な説明】
【００１３】以下に本発明の好ましい使用形態を示す。
（１）標的となる２本鎖ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、その一方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび、他方の鎖と相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断し、さらに、生成したＤＮＡ断片と外来ＤＮＡとを酵素を用いて結合する方法。
（２）該セリウム（ＩＶ）が、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）該セリウム錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体であることを特徴とする（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂが互いに相補的な部分を持ち、さらに、それぞれの５‘側または３’側に互いに相補的ではない部分を持つ（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）標的ＤＮＡの一方の鎖の中で相補鎖Ａがハイブリダイズする領域、ならびに標的ＤＮＡの他方の鎖の中で相補鎖Ｂがハイブリダイズする領域の大きさは典型的には３〜２５塩基対、好ましくは７〜１５塩基対である。相補鎖Ａと相補鎖Ｂとが同じ長さである必要はない。
（６）相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂがそれぞれの５‘側または３’側に持つ互いに相補的ではない部分の大きさは、典型的には０〜１０塩基対、好ましくは１〜７塩基対である。ここで、相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂがそれぞれの５‘側または３’側に持つ互いに相補的ではない部分は、相補鎖Ａと相補鎖Ｂの一方が他方よりも短いためにワトソン・クリック型の塩基対が作れなくても、また対応する塩基が相補的塩基対をつくることができないものであってもかまわない。
（７）相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂの塩基配列には特別な制限はない。
（８）相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂの５‘末端および／または３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入された（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１４】  以下のようにＤＮＡ操作試験を実施したが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【実施例】  市販試薬（アプライドバイオシステムズ社）および別途合成したモノマーを用い、固相ペプチド合成法により、ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）を合成した。【００１５】  ＤＮＡ切断反応
プラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）で切断し、これをＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ７）に溶解し、濃度４ｎＭの溶液を調製した。ここに、２本のｐｃＰＮＡ水溶液をそれぞれ終濃度１００ｎＭとなるように加え、３７℃で３時間インキュベーションして核酸複合体を合成した。ここに、ＮａＣｌ水溶液を終濃度１００ｍＭとなるように加えた後に、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体水溶液を終濃度２０μＭとなるよう加え、３７℃で６４時間反応させた。反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、ＧｅｌＳｔａｒ（キャンブレックス社）を用いた染色によりＤＮＡ断片を検出した。【００１６】結果
実験に用いたｐｃＰＮＡ配列および基質ＤＮＡの切断部位近傍の配列は図３に示す通りであった。【００１７】図３【００１８】ＤＮＡ切断試験
図３に示すｐｃＰＮＡを準備し、【００１５】に記載された条件に従ってｐＢＲ３２２を切断した。結果は図４に示される通りであった。【００１９】図４【００２０】  レーン１：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体不在のもとでのＰＮＡ（１）＋ＰＮＡ（２）、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体のみで処理したもの、レーン３：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体とＰＮＡ（１）＋ＰＮＡ（２）で処理したもの。
ｐｃＰＮＡとＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体をもちいた場合には、２本の切断生成物が観察された（レーン３）。切断生成物の長さはそれぞれ約１８００塩基対と約２５００塩基対であり、これはｐｃＰＮＡが結合した部位が選択的に切断されたときに生成するＤＮＡの長さと一致するものであった。（Ｍのレーンは、タカラバイオ社より購入した１０００塩基対のラダーである）。
この切断のバンドを富士フィルム社製イメージングアナライザーＦｕｊｉｘＦＬＡ−３０００Ｇにて読み取りを行ない、解析ソフトでバンドの濃さを計算した。その結果、ターゲット部位での切断効率は、約３０％であった。
ｐｃＰＮＡのみを用いた場合（レーン１）やＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体のみを用いた場合（レーン２）では位置選択的な切断は起こらなかった。
以上のように、ｐｃＰＮＡとＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体を併用することで二本鎖ＤＮＡが位置選択的に切断された。【００２１】組み換えＤＮＡの調製方法
生成した２本の断片のうち約２５００塩基の大きさを持つ断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した。これに対し、この切断断片の突出末端と２本鎖を形成する突出末端を持つ外来ＤＮＡの溶液を終濃度１００ｎＭとなるように加え、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ結合反応を行ない組み換えＤＮＡを調製した。ＰＣＲにより組み換えＤＮＡを増幅しｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）およびＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡績社）を用いてクローニングし、ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社製）で配列を決定した。【００２２】結果
実験に用いた外来ＤＮＡの配列は図５に示す通りであった。但し、図中右に示したＤＮＡ配列はＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体を用いたｐＢＲ３２２の位置選択的切断反応で生成した断片の末端部の配列である。【００２３】図５【００２４】組み換えＤＮＡの調製試験
図５に示した外来ＤＮＡを準備し、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体による位置選択的切断断片と結合させた。得られた組み換えＤＮＡの配列分析の結果は図６に示される通りであった。【００２５】図６【００２６】  図６に示されたように、組み換えＤＮＡの配列は、ｐＢＲ３２２由来の切断断片と外来ＤＮＡとが結合したものの配列と完全に一致しており、組み換えＤＮＡが誤りなく調整されたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ、相補鎖Ａ、および相補鎖Ｂから形成される核酸複合体を示す。太い黒線がＰＮＡである。
【図２】相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂが、３‘端側に互いに相補的ではない部分を持つ場合に形成される核酸複合体を示す。太い黒線がＰＮＡである。
【図３】実施例で使用したｐｃＰＮＡ（ＰＮＡ（１）およびＰＮＡ（２））ならびに反応基質ＤＮＡの切断部位近傍の配列。ＤＮＡ配列中に下線で示した部位がＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体により選択的に切断される部位である。なお、ｐｃＰＮＡ配列中の「Ｕ」および「Ｄ」は塩基部位に２−チオウラシルおよび２，６−ジアミノプリンを有している。
【図４】ＤＮＡ切断試験の結果を示す。レーン１：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体不在のもとでのＰＮＡ（１）＋ＰＮＡ（２）、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体のみでの切断、レーン３：Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ錯体とＰＮＡ（１）＋ＰＮＡ（２）による切断。
【図５】実施例で使用した外来ＤＮＡの配列と、ＤＮＡ切断試験で得られた断片の末端部位の配列。
【図６】実施例で調製した組み換えＤＮＡの塩基配列の分析結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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