(57)【要約】【課題】  関節リウマチの新たな検査方法を提供すること。【解決手段】  ヒトＢ  ａｎｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ（以下「ＢＴＬＡ」という）遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定することを特徴とする関節リウマチの検査方法とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢ  ａｎｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ（以下「ＢＴＬＡ」という）遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定することを特徴とする関節リウマチの検査方法。
【請求項２】
検体として遺伝子含有体液又は組織由来の遺伝子を用いることを特徴とする請求項１記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項３】
前記５９０番塩基の一塩基多型が、Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ又はＣ／Ｃのいずれかであることを同定することを特徴とする請求項１又は２記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項４】
ヒトＢＴＬＡ遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定できる塩基長を有するポリヌクレオチドからなるプライマー。
【請求項５】
前記塩基長は少なくとも１２塩基以上であることを特徴とする請求項４記載のプライマー。
【請求項６】
前記５９０番塩基の一塩基多型が、Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ又はＣ／Ｃのいずれかであることを同定することを特徴とする請求項４又は５記載のプライマー。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項記載のプライマーを含有することを特徴とする関節リウマチ検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの検査方法及び診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチの病因については、過去の疫学的観察からその背景に遺伝素因が存在することが明らかにされている。しかしこの遺伝的素因は単一遺伝子では説明できず、複数の遺伝子が関与するものと考えられていた。すなわち関節リウマチは、遺伝的素因を背景にして、性ホルモンの関与やウイルス感染等の環境からの発症因子がかかったときに発症する、いわゆる多因子病である。
【０００３】
関節リウマチは臨床的には全身性エリテマトーデスやシェーグレン症候群等と共に膠原病と総称され、免疫学的には自己抗体等の免疫異常の存在から自己免疫疾患に分類される。関節リウマチは関節の慢性の疼痛やこわばり、腫脹が出現するのみならず、発病後に適切な治療がなされないと罹患関節の変形や機能障害を来たし、患者のＱｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅは著しく低下する。現在、関節リウマチは全世界で多数の患者を悩ませているが、その早期の診断及び治療は極めて困難である。
【０００４】
特に我が国では、関節リウマチは膠原病の中で最も高頻度で全人口の１％に見られ、その診断法及び治療法の確立が望まれている。従来、診断にはアメリカリウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ＡＣＲ）の関節リウマチの分類基準（１９８７年版）が利用されている。この分類基準によって関節リウマチと分類した症例が専門家から見て実際に関節リウマチだった率（感度）は９１−９４％と評価されているが、この分類基準による感度はどの時点で診断できたかを特定せずに算出されており、早期のリウマチではＡＣＲ基準の診断感度は５０％前後と見られ、十分満足できるものではない。
【０００５】
また、最近の研究により、ヒトＢ  ａｎｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ（以下「ＢＴＬＡ」という）はリンパ球上に発現する抑制性レセプターであり、ＢＴＬＡ刺激によりＴ細胞の増殖やサイトカイン産生が抑制されること、ＢＴＬＡ欠損マウスでは活性化刺激に対しリンパ球の過剰反応や実験的自己免疫モデルの増悪が見られることから、生体内において免疫応答を負に制御しホメオスターシス（免疫寛容）を維持する機能を果たしていると考えられている（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｎ．  Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ｖｏｌ．４，  ｐ．６７０−６７９  （２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
確かに、上記非特許文献１に記載の報告によると、ＢＴＬＡの機能欠陥や低下により免疫応答が活性化しやすくなり免疫寛容の破綻すなわち自己免疫疾患の発症をきたす可能性を考えることができる。しかしながら、上記非特許文献１にはＢＴＬＡ遺伝子の一塩基多型と関節リウマチとの関係に関してまで報告されておらず、関節リウマチの新たな検査方法まで考慮したものでもない。
【０００８】
そこで本発明は、上記課題を鑑み関節リウマチの新たな検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、自己免疫疾患発症の候補遺伝子としてヒトＢＴＬＡ遺伝子の一塩基多型に着目し、種々検討したところ、ヒトＢＴＬＡ遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型（以下、「ＳＮＰ５９０」という）が、自己免疫疾患の中でも関節リウマチの発症、発症時の血中ＣＲＰ，  ＭＭＰ−３およびＲＦ値と高い相関性を有し、当該ＳＮＰ５９０を同定すれば関節リウマチ、特に早期関節リウマチの診断および疾患重症度の予測に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ヒトＢＴＬＡ遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定することを特徴とする関節リウマチの検査方法を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、ヒトＢＴＬＡ遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定できる塩基長を有するポリヌクレオチドからなるプライマーを提供するものである。また本発明は、このプライマーを含有することを特徴とする関節リウマチ診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、日本人に多い関節リウマチ及びその発症リスクを的確に検査することができる。また、若年重症型関節リウマチの発症リスクも的確に診断できることから、その治療手段の選択も容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１４】
（関節リウマチの検査方法）
本発明の実施の一形態として関節リウマチの検査方法があり、ヒトＢＴＬＡ遺伝子の５９０番塩基の一塩基多型を同定することを特徴の一つとする。ヒトＢＴＬＡ遺伝子は、白人由来の細胞より本発明者（渡邊紀彦）らにより既にクローニングされており（上記非特許文献１参照）、その塩基配列も知られている（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ_１８１７８０）。
【００１５】
検査対象者の検体から採取したＢＴＬＡ遺伝子ＤＮＡを用いてＳＮＰスクリーニングを行うと、翻訳領域内に１０個のＳＮＰを同定することができ（図１参照）、特にＳＮＰ５９０（ヒトＢＴＬＡ遺伝子の翻訳領域の第５９０番塩基をいう。以下同じ）においては、Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、又はＣ／Ｃの遺伝子型が存在することが分かった。そして、その中でもＡ／Ｃ又はＣ／Ｃの遺伝子型保持者は、Ａ／Ａ型遺伝子保持者に比べて有意に関節リウマチ発症リスクが高く、また発症年齢も若く、しかも発症時の血中ＣＲＰ、ＭＭＰ−３およびＲＦ値が高いため、このＳＮＰ５９０を同定することにより、関節リウマチの検査を行うことができ、炎症反応の強い、すなわち機能障害発症リスクの高い関節リウマチであるか否かも検査できる。この詳細については後述の実施例にて明らかとなる。
【００１６】
なお、ヒトＢＴＬＡ伝令ＲＮＡには一部のエクソンを欠失するオルタネイティブスプライシングフォームが存在することが知られているが、本明細書でいうＳＮＰ５９０はこれまで知られているすべてのエクソンを含むヒトＢＴＬＡ伝令ＲＮＡの翻訳領域（８７０塩基長）の最初の塩基（Ａ）より数えて５９０番目の塩基に見られる単塩基多型を指す。配列番号１にＳＮＰ５９０Ａ型の１〜８７０番の塩基配列を、配列番号２にＳＮＰ５９０Ｃ型の１〜８７０番の塩基配列を示す。後述のようにＢＴＬＡにはＳＮＰ８００（Ｔ−Ｃ）も存在し、配列番号１および２には８００Ｔのものを挙げたが８００Ｃでももちろんかまわない。
【００１７】
また、本形態に係る関節リウマチの検査方法に用いる検体としては、遺伝子含有体液又は組織であればよいが、血液、汗、尿、スワブ（口腔内、鼻腔内、咽喉内等）、毛髪、糞便等が挙げられ、特に血液が好ましい。
【００１８】
ＳＮＰ５９０の同定法としては、直接シーケンス法、プライマーエクステンション法、ＰＣＲ法が挙げられる。ＰＣＲ法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ＲＣＡ法（ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が挙げられるが、このうち特にゲノムＤＮＡの当該ＳＮＰ周辺配列をＰＣＲ反応で増幅する直接シーケンス法が好ましい。
【００１９】
直接シーケンス法やＰＣＲ反応を用いるＳＮＰ５９０の同定に用いられるプライマーとしては、当該ＳＮＰ５９０の上／下流２キロベース以内のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡに結合し、当該ＳＮＰ５９０を含むポリヌクレオチドが増幅されるような塩基長を有することが望ましく、例えば１２塩基長以上、好ましくは１２〜３０塩基長のプライマーであればよいが、例えば下記の配列を有するプライマーセットが望ましい。
【００２０】
（ｅｘｏｎ４Ｓ）  ５’−ＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＧＡ−３’  （配列番号３）、
（ｅｘｏｎ４ＡＳ）    ５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴ−３’  （配列番号４）
【００２１】
（関節リウマチの検査薬）
本発明の他の実施の一形態として、上記のプライマーを含む関節リウマチの検査薬が含まれる。なお、より具体的な態様としては上記プライマーを含むＰＣＲ用の緩衝液などを含んだ検査薬が含まれる。本検査薬は、検査対象者から採取した検体に作用させることにより上記ＳＮＰ５９０の遺伝子型を同定し、関節リウマチの検査を行うことができる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
Ａ．方法（対象者）
アメリカリウマチ学会の関節リウマチ分類基準を満たす日本人関節リウマチ患者８１名および自己免疫疾患の発症を見ない正常者７１名からインフォームドコンセントを得て採血しＤＮＡを抽出した。疾患コントロールとしてアメリカリウマチ学会の全身性エリテマトーデス分類基準を満たす日本人全身性エリテマトーデス患者６４名、厚生省シェーグレン病調査研究班の診断基準（１９９９年版）を満たすシェーグレン症候群患者６０例よりも検体を採取した。
【００２４】
（ＳＮＰスクリーニング）
２０名（正常１０名、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群計１０名）の日本人由来のＤＮＡを利用しＰＣＲ産物の直接シーケンス法によりＢＴＬＡ遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）におけるＳＮＰのスクリーニングを行った。
【００２５】
（ＳＮＰタイピング）
同定したＳＮＰについて関節リウマチ８１名、全身性エリテマトーデス患者６４名、シェーグレン症候群患者６０名および正常者７１名を対象にＲＴ−ＰＣＲ法またはｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ法により当該ＳＮＰを含む遺伝子領域をＰＣＲ法で増幅後、直接シーケンス法によって遺伝子型を決定した。直接シーケンス法はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用い、ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）によって泳動・検出を行った。
【００２６】
（臨床的検討）
関節リウマチ患者についてＢＴＬＡの５９０ＳＮＰのＡアレル保持者とＣアレル保持者における臨床症状、検査所見（発症時ＣＲＰ、ＭＭＰ−３、ＲＦ値）を解析した。
【００２７】
（統計学的検討）
各ＳＮＰの遺伝子型あるいはアリル頻度についてχ２検定によって関節リウマチ群、全身性エリテマトーデス群、シェーグレン症候群群と正常群で差があるか検定を行った。
【００２８】
Ｂ．結果
（１）ＢＴＬＡ遺伝子新規ＳＮＰの同定:
得られた日本人由来のＢＴＬＡ遺伝子塩基配列をすでにインターネットデータベースに登録されているヒトＢＴＬＡの塩基配列（ＮＭ_１８１７８０）と比較する事により計１０個のＳＮＰを同定した（図１）。全てのＳＮＰについてＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡にあった。今回同定されたＳＮＰは、次のとおりである。ＳＮＰ３１３（Ａ−Ｇ）、ＳＮＰ４１２（Ｇ−Ａ）、ＳＮＰ４４２（Ｇ−Ａ）、ＳＮＰ５１３（Ｇ−Ｔ）、ＳＮＰ５９０（Ａ−Ｃ）、ＳＮＰ５９１（Ｔ−Ｃ）、ＳＮＰ６１５（Ｃ−Ｔ）、ＳＮＰ６６７（Ｇ−Ａ）、ＳＮＰ７２８（Ｇ−Ａ）、ＳＮＰ８００（Ｔ−Ｃ）。ＢＴＬＡ遺伝子におけるこれらの多型の存在部位を図１に示す。なお、このうちＳＮＰ５９０とＳＮＰ８００を除く８個のＳＮＰはすべての調査した日本人のＢＴＬＡ遺伝子配列に認められ、日本人に共通のＳＮＰと考えられた。またこれらの共通のＳＮＰと自己免疫疾患の発症との関連はなかった。
【００２９】
（２）ＢＴＬＡ遺伝子のＳＮＰ５９０およびＳＮＰ８００と関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群との相関結果を表１、表２に示す。
【００３０】
【表１】
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【表２】
2006304721.tif 000004
【００３１】
新規に同定した１０個のＳＮＰのうちＳＮＰ５９０（ｐ＝０．０４１）に関節リウマチとの有意な相関を認めた。ＳＮＰ５９０についてはＡ／Ｃ、Ｃ／Ｃ遺伝子型保持者はＡ／Ａ遺伝子型保持者に比してそれぞれ相対危険度で２．１９（９５％信頼区間１．１３−４．２４）（表１）、アレルごとの頻度でみるとＡ遺伝子型保持者はＣ遺伝子型保持者に比して２．２７（９５％信頼区間１．１４−４．５６）と関節リウマチ発症リスクの有意な上昇を認めた（表２）。
【００３２】
（３）ＢＴＬＡ遺伝子ＳＮＰと関節リウマチの症状との相関：
ＢＴＬＡは免疫抑制分子であることから関節リウマチの発症時の症状、検査データとＳＮＰとの関連を検討した。関節リウマチ発症リスクが上昇しているＳＮＰ５９０Ｃ遺伝子型保持者はＡ遺伝子型保持者に比して発症時のＣＲＰ、ＭＭＰ−３、ＲＦの指標が高値で発症年齢が若い傾向が見られた。（図２参照）。
【００３３】
以上よりＳＮＰ５９０はＢＴＬＡの機能変化を介して自己反応性を惹起し関節リウマチの発症リスクを上昇させていると考えられた。ＳＮＰ５９０は他のＳＮＰに比べ特異的なマーカーとして利用することができることが臨床的に確認され、他の自己免疫疾患における頻度を比較した結果、特に関節リウマチの発症を検査するマーカーとして利用することができることも確認された。
【００３４】
このＳＮＰ５９０は一般にコーディングＳＮＰと呼ばれるカテゴリーに属し、遺伝子産物の発現量よりは遺伝子産物の活性を変化させる可能性があり、薬の治療効果などの個人差の一部を説明できることから、治療法の選択や予後判定にも有用であると考えられる。
【００３５】
本発明は多数の日本人の遺伝子サンプルを使用した患者−対照関連解析により導きだされた。一方、欧米には複数の個人の遺伝子サンプルをソースにショットガンシークエンスを行い、ＳＮＰを収集したデータベース（米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰなど）が存在する。これらのデータベースはＳＮＰ情報を疾患との関与とは関係なく網羅的に収集しているが、当該ＳＮＰ５９０も収載されている。このことから日本人以外にもＳＮＰ５９０は存在し、他人種でもＳＮＰ５９０を利用した関節リウマチの診断または検査が有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、日本人に多い関節リウマチ及びその発症リスクや発症した際の重症化リスク・治療反応性を診断又は検査することができる。また、若年重症型関節リウマチの発症リスクが的確に診断できることから、その治療手段の選択も容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＢＴＬＡ遺伝子の１塩基多型の存在位置を示す図である。上の行（ｓａｍｐｌｅ）に発明者の発見した一塩基多型の含まれる配列を、下の行に最初に報告された遺伝子配列（ｏｒｉｇｉｎ）を示す。一塩基多型の部位を灰色の塗りつぶしと位置番号で示す。
【図２】ＳＮＰ５９０遺伝子型と関節リウマチの症状、検査値との関連を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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