(57)【要約】【課題】Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンを過剰発現する悪性腫瘍を同定するための方法および組成物を提供する。【解決手段】本発明は、腫瘍を有する哺乳類の生物的流体中にＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子によりコードされた外部ドメイン糖タンパク質（ｇｐ７５）又はその部分が検出されることに基づく。哺乳動物の生物学的液体中のＣ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメイン、糖たんぱく質ｇｐ７５の検出およびｇｐ７５レベルの定量を行うことにより悪性腫瘍の診断および予防を行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質（ｇｐ７５）の外部ドメインまたは前記ｇｐ７５の１又はそれ以上の領域をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ配列が前記ＤＮＡ分子中の発現コントロール配列に機能的に結合している組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
血清学的に活性な、すなわち抗原性および／または免疫原性を有する１又はそれ以上の部分を含む前記ｇｐ７５の該１又はそれ以上の部分をコードする請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した原核性または真核性の単細胞宿主。
【請求項４】
真核性生物である請求の範囲３記載の単細胞宿主。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡ分子が第１および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む組換えクローニングベヒクルであり、前記ＤＮＡ配列が該第１および第２の制限部位の間に挿入されている請求の範囲３記載の単細胞宿主。
【請求項６】
大腸菌、シュードモナス、バチルス、イースト、他の菌類、および培養した動物、昆虫および植物細胞からなる群から選ぼれる請求の範囲３記載の単細胞宿主。
【請求項７】
イーストおよび培養した哺乳類細胞からなる群から選ばれる請求の範囲４記載の単細胞宿主。
【請求項８】
培養したモンキー細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からなる群から選ばれた哺乳類細胞である請求の範囲７記載の単細胞宿主。
【請求項９】
モンキー細胞が細胞系列ＣＯＳ７に由来し、またＣＨＯ細胞が細胞系列ＣＨＯ−（ｄｘｂ１１）に由来する請求の範囲８記載の単細胞宿主。
【請求項１０】
プラスミドｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃである請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１】
ｇｐ７５のアミノ酸配列の少なくとも１部を有するたんぱく質またはポリペプチドの原核または真核性宿主細胞における発現を助ける目的で使用する精製・単離されたＤＮＡ分子で、前記ＤＮＡが以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれるＤＮＡ分子。
（ａ）ｇｐ７５またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列にハイプリダイズするＤＮＡ分子またはそのフラグメント、および
（ｃ）遺伝子コードの縮退がなければ（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ分子、
【請求項１２】
宿主が真核性生物である請求の範囲１１記載の精製単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１３】
組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。
【請求項１４】
グリコシル化された請求の範囲１３記載の組換えたんぱく質およびポリペプチド。
【請求項１５】
血清学的に活性な、すなわち免疫原性および、または抗原性を有する請求の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。
【請求項１６】
実質的に純粋なｇｐ７５たんぱく質およびその全てのポリペプチド部分。
【請求項１７】
請求の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチドに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体。
【請求項１８】
請求の範囲１７記載の抗体を投与することによる哺乳動物の悪性腫瘍の治療方法。
【請求項１９】
以下の工程を含むｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドの産生方法。
ａ）単細胞宿主を請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換すること、
ｂ）該単細胞宿主を培養し、該ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドを発現させること、及び
ｃ）該ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドを抽出および単離すること。
【請求項２０】
哺乳動物の体液をｇｐ７５の存在について試験する方法であって、ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体を含む組成物を哺乳動物の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のたんぱく質への該抗体の結合を測定することを含む方法。
【請求項２１】
哺乳動物の体液が血清、精液、血漿、胸滲出物、尿唾液および脊髄液からなる群から選ばれるヒトの体液である請求の範囲２０記載の方法。
【請求項２２】
ヒトの体液が血清、血漿および精液からなる群から選ばれる請求の範囲２１記載の方法。
【請求項２３】
ヒトの体液が血清または血漿である請求の範囲２２記載の方法。
【請求項２４】
ヒトの体液中のｇｐ７５を検出するために免疫検定法を用いるＣ−ｅｒｂＢ−２増幅に関連する悪性疾患の診断方法。
【請求項２５】
悪性疾患が分泌機能を有する器官の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法。
【請求項２６】
悪性疾患が上皮起源の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法。
【請求項２７】
悪性疾患が唾液腺、胸腺、胸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、胃腸、尿道および肝臓からなる群から選ばれる組織の腫瘍に関するものである請求の範囲２４記載の方法。
【請求項２８】
組織が胸部、卵巣および前立腺からなる群から選ばれる請求の範囲２７記載の方法。
【請求項２９】
悪性疾患が胸部アデノカルシノーマおよび、または卵巣アデノカルシノーマである請求の範囲２４記載の方法。
【請求項３０】
１つの抗体はヒトのがん細胞系列上の本来のｇｐ７５外部ドメインに対するものであり、かつ別の抗体はＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞系列上の本来のｇｐ７５外部ドメインに対するものを用いるサンドイッチ検定法を使用することを含む請求の範囲２０記載の方法。
【請求項３１】
アビジン／ピオチン法を用いて増巾し得ないか、もしくは増巾し得るサンドイッチ検定法、イライザ検定法またはこれらと等価な検定法の使用を含む請求の範囲２０記載の方法。
【請求項３２】
請求の範囲１７記載の抗体を使用する哺乳動物体液中のｇｐ７５の存在を測定する方法。
【請求項３３】
ヒトの体液サンプル中の抗原がｇｐ７５を認識する抗体への結合に関してラベル化したｇｐ７５たんぱく質またはそのポリペプチドと競合する請求の範囲２０記載の方法。
【請求項３４】
サンドイッチ法をｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体を用いて行う請求の範囲３３記載の方法。
【請求項３５】
ヒトの体液中のｇｐ７５を検定するテストキットで、以下のａ）及びｂ）を含むキット。
ａ）ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドに対する抗体、および／またはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞全体に対する抗体、および
ｂ）検出手段
【請求項３６】
ヒトの体液中のｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドを検定するテストキットで、以下のａ）及びｂ）を含むキット。
ａ）ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドおよび、またはｇｐ７５たんぱく質、および、またはポリペプチドに対する抗イディオタイプ抗体、および
ｂ）検出手段
【請求項３７】
生理学的に許容可能で無毒のべヒクル中に分散した１つ以上の実質的に純粋なｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドの免疫原的量、すなわちＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅に関する悪性疾患に対してヒトを免疫化するのに有効な量を含むワクチン。
【請求項３８】
生理学的に許容可能で無毒なべヒクル中に分散した表面にｇｐ７５を発現する細胞膜の免疫原的量；すなわちＣ−ｅｒｂＢ−２の増巾に関する悪性疾患に対してヒトを免疫化するのに有効な量を含むワクチン。
【請求項３９】
細胞膜がＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰生産するようトランスホームした細胞またはヒトのがん細胞系列に由来する請求の範囲３８記載のワクチン。
【請求項４０】
細胞膜が内部ドメインを切除した形のＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現するようトランスホームした組換え宿主に由来する請求の範囲３９記載のワクチン。
【請求項４１】
ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドとそれに結合するヒトには免疫原性を示さずかつヒト体液中の抗体とは一般に反応しないたんぱく質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合たんぱく質またはポリペプチド。
【請求項４２】
ｇｐ７５をコードするＤＮＡ配列を含む精製、単離したＤＮＡ分子。
【請求項４３】
合成により調製したｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。
【請求項４４】
悪性疾患のスクリーニング悪性疾患の診断、悪性疾患患者の病状のモニターあるいは悪性疾患の経過の予知を行なう方法で、ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチド、ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体、およびこれらの検出レベルに相関するＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンドのレベルの検定および定量、および長期生存の可能性または再発の時期に関する患者の分類を含む方法。
【請求項４５】
ｇｐ７５たんぱく質／ポリペプチド、それらに対する抗体および、またはヒト体液におけるＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンドの存在を転移の指標とする腫瘍切除手術後に行なう請求の範囲４４記載の方法。
【請求項４６】
生理学的に許容可能で無毒なべヒクル中に分散した治療効果量のｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドの投与を含むＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅に関連する悪性疾患の治療方法。
【請求項４７】
請求の範囲４６記載の方法で、さらにｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドの投与と合せて治療効果量の化学療法試薬の投与を含む方法。
【請求項４８】
化学療法試薬がアルキル化試薬である請求の範囲４７記載の方法。
【請求項４９】
化学療法試薬がシスプラチン、カルボプラチン、およびメファランからなる群から選ばれる請求の範囲４７記載の方法。
【請求項５０】
生理学的に許容可能で無毒のべヒクル中に分散したｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する治療効果量の抗イディオタイプ抗体の投与を含むＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅に関する悪性疾患の治療方法。
【請求項５１】
ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドをｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体で置き換える請求の範囲３３記載の方法。
【請求項５２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約７５キロダルトンの分子量を有するＣ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質のエクトドメインである実質的に純粋な糖たんぱく質またはその一部分。
【請求項５３】
組換えＤＮＡ分子法で生産される請求の範囲５２記載の糖たんぱく質。
【請求項５４】
請求の範囲５２記載の糖たんぱく質で、さらにグリコシル化され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約９０キロダルトンの分子量を有する糖たんぱく質。
【請求項５５】
ヒトの体液中約７５キロダルトンの分子量を有するＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメイン糖たんぱく質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の存在を検出する診断方法で、以下のａ）及びｂ）を含む方法。
ａ）該体液を該糖たんぱく質に特異性を有する抗体と接触させること、および
ｂ）該抗体に結合した糖たんぱく質の量を検出すること、ここで、正常細胞の結合レベルを越えた結合レベルの増加はＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメインを過剰発現する腫瘍細胞の存在を示すものである。
【請求項５６】
抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲５５記載の方法。
【請求項５７】
診断法がサンドイッチ検定法、競争検定法、粒子検定法、放射能測定検定法、酵素結合免疫吸着検定法、放射能免疫沈殿検定法または螢光検定法の様式をとる請求の範囲５５記載の方法。
【請求項５８】
体液が血清、血漿、精液、胸部滲出液、唾液、尿または脊髄液である請求の範囲５５記載の方法。
【請求項５９】
がん細胞を有する疑いのあるヒト宿主の治療方法で、約７５キロダルトンのＣ−ｅｒｂＢ−２エクトドメイン糖たんぱく質に対する治療効果量の抗体を投与することを含む方法。
【請求項６０】
ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項６１】
ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中のＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンドの検出ならびに定量方法、
【請求項６２】
ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中のｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体の検出ならびに定量方法。
【請求項６３】
ｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチドを用いたＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンドの精製方法。
【請求項６４】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２発現細飽の表面上にある完全ｇｐ７５に対する抗体とは交叉反応しない請求の範囲１７記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学工学及び免疫化学の分野におけるものである。特に、本発明は適当な宿主生物に発現された組換えＤＮＡ分子ならびにそのＤＮＡ分子から得られた新規な蛋白質及びポリペプチドに関するものであって、かかる蛋白質及びポリペプチドは組換え的に、合成的に又は、生物学的に生産された蛋白質及びポリペプチドをフラグメント化して生産することができるものである。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ここで指定した糖蛋白質７５（ｇｐ７５）であるＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジ−ンの外部ドメインから得られる蛋白質及びポリペプチドをコード化するＤＮＡによって特徴付けられる。これら血清学的に活性で、免疫原性及び／又は抗原性を有する蛋白質及びポリペプチドは、癌患者の体液中にあるｇｐ７５を免疫学的に検出するための試薬として有用であり、これらは診断医が患者の状態及び予後に関して重要な判断をすることを可能にするものであり、さらにこれらの蛋白質及びポリペプチドは、抗体の産生及び親和力による精製に用いる試薬として有用である。本発明の中心的な意義は、哺乳動物の体液中のｇｐ７５を検出するよう設定した診断アッセイにある。発現され、または合成的に若しくは生物学的に生産された本発明の蛋白質及びポリペプチドは、腫瘍形成活性に対する癌患者及び二次的な腫瘍形成攻撃に対する回復癌患者の免疫学的応答の増強を図るためのワクチンとして、さらに有用である。さらに、前記ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドは、Ｃ−ｅｒｂＢ−２発現細胞の腫瘍形成活性を抑制する治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞の悪性腫瘍に関する機序は、これまでも、また現在も熾烈な研究主題である。最も有望な領域の一つは、オンコジーンがいかにして発現し、また発現を停止するかということを解明することである。オンコジーンの多数が、癌の発生において重要な役割を演じていることが明らかにされている。オンコジーンによってコード化されている蛋白質が異常に作用し、正常細胞の癌細胞への転換において何らかの役割を演じているようである。まず最初に、オンコジーンがレトロウイルス中に検出され、続いてそのウイルスのオンコジーン細胞同等物が見出された。まず、急速なガン発生に応答し易いレトロウイルス遺伝子が１９７０年代初めにロウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に同定された。このウイルスは、ニワトリに癌を発生させるものであって、その遺伝子はｓａｒｃｏｍａ（肉腫）にちなんでｓｒｃと命名された。１９７５年には、ウイルスのｓｒｃ遺伝子（ｖ−ｓｒｃ）が、すべてのニワトリ細胞中にほぼ正確なコピーを有することが見出された。ｖ−ｓｒｃの該細胞同等物は、ｃ−ｓｒｃである。
【０００３】
オンコジーンのスコア（ｓｃｏｒｅ）は、以前よリレトロウイルスから分離されており、この分離の対象となったウイルスは、ニワトリ、他の鳥類、ラット、マウス、猫又は猿に、癌、肉腫、白血病又はリンパ種を起こさせるものである。それぞれの場合において、オンコジーンは宿主動物の正常遺伝子と密接に関係しており、かつ正常蛋白質に類似のオンコジーン蛋白質をコードすることが見出された。
【０００４】
また、オンコジーンは、人組織及び動物組織にも発見された。多種の腫瘍細胞のＤＮＡ中の遺伝子は、正常な培養細胞中にトランスフェクションにより導入された場合、それらを癌細胞に転換する。このようなオンコジーンは、プロト−オンコジーンの事実上のコピーでもある。プロト−オンコジーンをオンコジーンに転換する具体的な機序がいかなるものであろうとも、オンコジーンは、そのオンコジーンがコード化する蛋自質によって効果を発揮する。オンコジーンを誘導するプロト−オンコジーンの生成物は、細胞の成長及び分化の調節及び初期発生において重大な役割を有するように思われる。形質転換蛋白質は、細胞に関し根本的な効果を有する。というのは、それらは、基本的細胞プロセスを妨害するからである。
【０００５】
アミノ酸へのリン酸分子の付加反応（リン酸化）を触媒する場合の酵素活性は、蛋白質機能の制御に重要であることが知られている。蛋白質をリン酸化する酵素は、蛋白質キナーゼ（ギリシア語Ｋｉｎｅｉｎ“転位すること”に由来する。）と呼ばれている。公知の全オンコジーンのほぼ１／３は、チロシン残基に特異的な蛋白質キナーゼをコード化している。
【０００６】
表皮成長因子（ＥＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を、分裂していない細胞の培養に加えた場合、細胞が分裂するよう刺激する。ＢＧＦ及びＰＤＧＦは、細胞の原形質膜に理め込まれている特異的な蛋白質レセプターに結合することによって、そのシグナルを伝達する。ＥＧＦに対するレセプター蛋白質を分離した際に、ＥＧＦ分子がそのレセプターと結合した時に刺激されるチロシンキナーゼ活性に関連していることが見出された。次いで、ＰＤＧＦレセプターも同じ酵素機能があることが示された。
【０００７】
チロシンキナーゼ活性を有するヒトプロト−オンコジーンは、３つの研究グループによって確認された：センバ（Ｓｅｍｂａ）らのグループ、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８２：６４９７（１９８４）（遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ−２を示している）、Ｃｏｕｓｓｅｎｓらのグループ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１１３２（１９８５）（遺伝子ＨＥＲ２を示している）、Ｋｉｎｇらのグループ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）（遺伝子ＭＡＣ１１７を示している）である。関連するラットの遺伝子（ｎｅｕで示される）について、シェクター（Ｓｃｈｅｃｔｅｒ）らにより報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：９７６（１９８５）。遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現の増幅した翻訳が、腫瘍細胞及びセルラインにおいて観察されている。〔例えば、フクシゲ（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ）ら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，６：９５５（１９８６）（遺伝子の増幅及び発現（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ｍＲＮＡ）がＭＫＮ−７胃セルラインで観察されたことを記載）、コーセンス（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）らの前記論文（遺伝子の転写（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が、肝芽細胞腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、２種の神経芽細胞腫及びウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）癌から得られたセルラインで観察されたことを記載）、センバ（Ｓｅｍｂａ）らの前記論文（遺伝子が人唾液腺癌で増幅されたことを記載）、キング（Ｋｉｎｇ）らの論文（増幅が乳ガンセルラインで観察されたことを記載）、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｌａｎｃｅｔ，Ｉ：７５６（１９８６）（遺伝子の増幅が胸部、腎臓及び胃の腺癌において観察されたことを記載）及びタル（Ｔａｌ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．， ４８：１５１７（１９８８）（遺伝子の散発性の増幅が各種組織の腺癌において見出されたことを記載）を参照のこと。〕
【０００８】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプターは、ＥＧＦレセプターと密接に関連しているとはいえ、相違もしている。ＥＧＦレセプターのように、Ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質は、細胞外ドメイン、２つの富システイン反復クラスター（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を含む膜内外ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有するが、Ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパクは１８５，０００ダルトン（１８５ｋｄ）の分子量を有するのに対して、ＥＧＦレセプターは約１７０ｋの分子量を有する〔シェクター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：５１３（１９８４）〕。フンター（Ｈｕｎｔｅｒ）は、Ｓｃｉ．Ａｍ．，２５１：７０〜７７（１９８４）で、Ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質（ｇｐｌ８５）はＥＧＦレセプターのチロシンキナーゼ作用をまねるが、統制されていない方法においてであると仮定している。
【０００９】
チロシンキナーゼは、そのｃ−ｓｒｃ遺伝子の産生物がプロトタイプである機能グループと、細胞表面レセプターとして機能する機能グループの２つの機能グループに分けることができる。細胞成長因子またはそれらのレセプターと関連したものとして、少なくとも１２の哺乳動物のチロシンキナーゼが同定されている。これらオンコジーンのうち３つは、成長因子〔血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を伴うｃ−ｓｉｓ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を伴うｈｓｔ及びｉｎｔ２〕と強い相同性を共有している。その他のものは、配位子が同定されている成長因子レセプター〔表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターを伴うＣ−ｅｒｂＢ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）レセプターを伴うｆｍｓ〕と強い相同性を共有している。残りの７つ、即ち、ｅｐｈ，Ｃ−ｅｒｂＢ−２，ｃ−ｋｉｔ，ｍｅｔ，ｒｅｔ，ｃ−ｒｏｓ及びｔｒｋは、配位子を伴うレセプターであるかも知れないが、現時点ではその配位子は同定されていない。
【００１０】
今日、細胞のあるものは、それら細胞表面レセプターにおける変化によって腫瘍を形成するようになるという証拠が明らかにされてきている。これらの変化は、遺伝子の再配列、点突然変異またはＤＮＡ，ＲＮＡまたはタンパクレベルでの遺伝子増幅からなるということがいえる〔ドレビン（Ｄｒｅｂｉｎ）ら、ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：３８７（１９８８）；バーグマン（Ｂａｒｇｍａｎｎ）ら、Ｃｅｌ１，４５：６４９（１９８６）；デル（Ｄｅｒ），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３３：６４１（１９８７）〕。上記で引用したレセプターは、正常細胞の表面に存在し、一定のオンコジーンの過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、腫瘍形成活性と関連することが示されてきたとはいえ、そのようなことは、Ｃ−ｅｒｂＢ−２の場合においてである。
【００１１】
今日、細胞を悪性化する能力を有するＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンが、非常に高いレベルである腫瘍中に存在しているということが認められている〔ザウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７：６１２３（１９８７）；バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ４８：１２３８（１９８８）；クラウス（Ｋｒａｕｓ）ら，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６（３）：６０５（１９８７）；及びスラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７（１９８７）〕。Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンの発現及び細胞の外膜におけるその所在は、ガンと密接に関連していると思われ〔クラウス（Ｋｒａｕｓ）らの上記文献、スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）らの上記文献、ドレビン（Ｄｒｅｂｉｎ）ら、Ｃｅｌｌ，４１：６９５（１９８５）；及びジ・フィオレ（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１７８（１９８７）〕、事実、それは、少なくともある場合においては、ガン発育の主要な事象であるかも知れない〔ミュラー（Ｍｕｌｌａｒ）ら、Ｃｅｌｌ，５４：１０５（１９８８）〕。正常細胞表面上のＣ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の過剰発現は、それら正常細胞を変化させるかまたはそうでなければ腫瘍細胞として振舞うように思われる〔ドレビン（Ｄｒｅｂｉｎ）らの上記文献、ジ・フィオレＤｉ  Ｆｉｏｒｅ）らの上記文献、及びフジャック（Ｈｕｄｚａｉｋ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４；７１５９（１９８７）〕。
【００１２】
更に、Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンが高いレベルで発現する患者は、非常に乏しい臨床的予後しか有しないということが示されている〔スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７（１９８７）〕。Ｃ−ｅｒｂＢ−２の過剰発現と乏しい予後のこの関係は診断評価及び予後評価の両方の情報を提供することができる〔クラウス（Ｋｒａｕｓ）ら，ＴｈｅＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：６０５（１９８７）；及びスラモン（Ｓｌａｍｏｎ）らの上記文献〕。患者に要求される臨床治療の範囲の決定は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンまたは蛋白質の過剰発現を測定できる能力に基づいて行なうことができる。
【００１３】
組織の薄片の評価または組織病理学によって腫瘍組織中に発現されたＣ−ｅｒｂＢ−２を検出するのに、抗体が使用され得る。有用な予後の指標が得られうるということが、方法論によって実証された〔ビヨバー（Ｖｉｊｖｅｒ）ら、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０１９（１９８７）；ドウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：６１２３（１９８７）；バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４８：１２３８（１９８８）；クラウス（Ｋｒａｕｓ）ら、上記文献（１９８７）；及びスラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、上記文献〕。しかしながら、組織がすぐに手に入らないか、またはそれが望ましいものでないか、または、腫瘍から組織を取り出すことができない場合が多い。従って、便利でかつ患者に傷を与えない迅速で正確な診断上の検査方法が、医療技術において必要とされている。本出願で特許請求されている発明は、哺乳動物におけるＣ−ｅｒｂＢ−２の過剰発現を検出する、組織を傷つけることのない診断測定方法を提供することによって、前記要求に応えるものである。
【００１４】
スミス（Ｓｍｉｔｈ）らは、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１７０４（１９８７）で、過剰の可溶性膜レセプター（ＣＤ４抗原）がＨＩＶ−１の感染力を遮断することを報告している。
可溶性のＣＤ４の分泌型は、その膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを欠いている多種のＣＤ４をコードするベクターとの哺乳動物細胞の形質移入（トランスフェクション）によって産生される。この産生した可溶性ＣＤ４は、ＨＩＶ−１の膜糖タンパク（ｇｐ１２０）を完全なＣＤ４に匹敵する親和力と特異性で結びつけていると報告されている。
【００１５】
ウェバーとギル（Ｗｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌ）は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：２９４（１９８４）で、培養したヒト表皮腫Ａ４３１細胞が、彼らがＥＧＦレセプターの細胞表面ドメインと関連していると決定した可溶性１０５ｋｄ蛋白質を生産することを報告した。彼らはさらに、可溶性１０５ｋｄ蛋白質は摸結合完全レセプターからは得られないが、単独でその細胞によって生産されることを決定した。
ヒアリング等（Ｈｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）は、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７（１）：３７９（１９８６）で、精製されたマウス黒色腫−特異性抗原によるマウスの免疫化は、同系の宿主に、マウス黒色腫の二次的な接種に対する耐性を与えることを証明した。
【００１６】
ベルナルド等（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）は、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：６８５４（１９８７）で、外部ドメイン、膜内外アンカードメイン及び“ｎｅｕ”オンコ遺伝子といわれるヒトＣ−ｅｒｂＢ−２ガン遺伝子と同等の約５０のアミノ酸のラット細胞内ドメインを発現する遺伝子組換えワクシニアウイルスは、マウスを免疫するために使用した時に、ｎｅｕ発現腫瘍細胞の二次的な接種に対して防御をもたらすことを証明している。ラットのｎｅｕ蛋白質の外側のドメイン（外部ドメイン）が、担ガンマウス（ＮＦＳ株）における高度に免疫原性な決定因子であることが、そこでは注目される。
【００１７】
アロンソン等（Ａｒｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の“Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｂｕｔ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ”〈米国特許出願第６−８３６，４１４号；１９８６年３月５日出願）と題されたＮＴＩＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）出願では、遺伝子の族をコード化するチロシンキナーゼの１種であり、ヒト乳ガンにおいて増輻される、ｖ−ｅｒｂＢ関連ヒト遺伝子のクローニング、単離および部分的特性表示を記載している。前記の遺伝子はＣ−ｅｒｂＢ−２であると決定された。この出願はその目的として、前記の遺伝子によってコードされた蛋白質生産物に向けられる抗体と、腫瘍の検出のための前記の抗体を含む診断用キット；その遺伝子によってコードされた生産物；異種ベクターシステムにおいてその蛋白質を発現することが可能なｃＤＮＡクローン；その遺伝子を発現することのできる形質転換細胞または微生物；および前記の遺伝子または蛋白質を検出することのできる核酸プローブおよび／または抗体試薬キットを提供することを記載している。前記の出願はさらに、毒物と接合した遺伝子生産物に特異的な抗体の治療的用途を示唆し、もし配位子がｖ−ｅｒｂＢ関連遺伝子に存在するならば、それをターゲット物質として使うことができることを示唆している。
【００１８】
クライン等（Ｃｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、米国特許第４，６９９，８７７号（１９８４年１１月２０日出願）で、オンコジーンの発現生産物を目的として、生理的試料が分析されることを特徴とする、腫瘍の存在を検出するための方法と組成物を記載している。
ジ・フィオレ（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）はＳｃｉｅｎｃｅ，２３７：１７８（１９８７）で広範囲にわたる多様なヒト腫瘍が、増幅されたあるいは過剰発現された（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）ｅｒｂＢ−２遺伝子を含むことを指摘している。ｅｒｂＢ−２蛋白質による形質転換に配位子−レセプターの相互作用は必要ないことを確立するためにジ・フィオレ等は、ＮＨ2−末端の６２１個のアミノ酸（外部ドメインから）をコードする配列を除いた構造物を作った。彼らの発見は、ＮＨ2−末端の切断が何であっても、ｅｒｂＢ−２蛋白質の形質転換活性を増加することを示唆した（１８０頁に記載がある）。
【００１９】
アバウト−ピラック等（Ａｂｏｕｔ−Ｐｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．）は、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０（２０）：１６０５（１９８８）でＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が試験管内でヒトの口の類表皮腫細胞のクローン形成を減少させることを報告している。抗−ＥＧＦレセプター抗体をシスプラチンと共に添加した時、これらの物質の抗腫瘍効果は生体内で相乗性を示した。
ベルガー等（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：１２３８（１９８８）で、原発性ヒト乳ガンからの５１個のＤＮＡ試料のうち１３個（２６％）がＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の多コピーを含むことを報告し、Ｃ−ｅｒｂＢ−２蛋白質の発現と乳ガンの予後に使われるパラメーター（結節の状態と核のグレード）の間に統計的に顕著な相関関係があることを観察した。ベルガー等は、最近の研究が、検査された原発性乳ガンの３３％までに、Ｃ−ｅｒｂＢ−２が増幅されており〔Ｋｉｎｇ等、上記文献；Ｓｌａｍｏｎ等、上記文献；ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ等、ｓｕｐｒａ；そしてＶｅｎｔｅｒ等、Ｌａｎｃｅｔ２：６９（１９８７）〕そして、ヒト乳ガンセルラインの２５％までに、Ｃ−ｅｒｂＢ−２が増幅されていることを〔Ｋｒａｕｓ等，上記文献〕示していることを指摘した。
【００２０】
スラモン等（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）は上記文献（１９８７）で、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の増幅が、腋窩リンパ節のガンの存在と、乳ガン患者のエストロジェンレセプターの状態と乳ガン患者中の原発性腫瘍の大きさとに相関関係を持つことを示した。その研究で、調査された１８９の原発性ヒト乳ガンうち３０％に、Ｃ−ｅｒｂＢ−２が２倍から２０倍以上、増幅されていることが見出された。スラモン等は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の増幅は、乳ガン患者において、生存期間と再発までの時間の両方にとって顕著な予測指標となることを結論づけた。患者の腫瘍からのＤＮＡ中に該遺伝子の多数のコピーを有する患者は、生存期間が短いだけではなく、再発までの時間が短いため、より不幸な結末となった。
【００２１】
スラモンら（Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ  ７／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，ｐ．３７１）（コールドスプリングハーバーラボ．１９８９）は、ヒト乳癌腫瘍から産生される数種のｃＤＮＡクローンの配列決定により、ラットｎｅｕ遺伝子と異なり，膜内外ドメインにおける変異は遺伝子産物の変化に不可欠なものではないことが示されたと報告した。その代わり、上記のデータは正常産物の過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を含む変化と一致している。
【００２２】
ドレビンら（Ｄｒｅｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：６９５（１９８５））は、ｎｅｕ  ｇｐ１８５に対するモノクローン抗体はｎｅｕ−形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を非形質転換表現型に復帰させることが、足場非依存性増殖により明らかになったことを報告した。ドレビンら（Ｄｒｅｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：３８７（１９８８））は、ｇｐ１８５の細胞表面外部ドメインと反応するモノクローン抗体は試験管内及び生体内で直接に腫瘍増殖を禁止すると述べている。
マスコら（Ｍａｓｕｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０：１０（１９８９））は、ヒトＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子一形質移入ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対してモノクローン産生したネズミ１ｇＭについて、胃癌、結腸癌及び肝臓癌細胞セルラインを含む上皮腫瘍セルラインの一部と反応するが、いかなる非上皮セルラインとも反応しないと記載している。
【００２３】
ヤーデンとワインベルクは（Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８６：３１７９（１９８９））は、モデル系としてｎｅｕオンコジーンを用いて、成長因子レセプターを想起させる構造を有するオンコジーンコード膜内外チロシンキナーゼに対する仮想的配位子の検出へのいくつかの実験的アプローチを開発した。そこには、ｒｅｓオンコ遺伝子による形質転換された線維芽細胞が分泌したｎｅｕ−コードオンコ蛋白質の配位子の候補が示唆されている。
【００２４】
以下の論文は、オンコジーンの一般的記載、治療薬としてのモクローン抗体の使用、及びＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンについての情報を提供する。デール（Ｄｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３（５）；６４１（１９８７））；ビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：３０５（１９８７））；ヘンリック及びウェスターマーク（Ｈｅｎｒｉｋ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｃｅｌｌ．３７：９（１９８４））；デュースベルク（Ｄｕｅｓｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：６６９（１９８５））；シベリー（ＳｈｉｖｅＩｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，７（１）：１１２（１９８４））；ファンデビジャー（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｌｖｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ２：１７５（１９８８））；及びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２５１：７０（１９８４））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
方法及び組成物はＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する悪性腫瘍を同定するために提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本出願により特許請求されている発明は、腫瘍荷（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）を運搬する哺乳類の生物的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）中におけるＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子によりコードされた外部ドメイン糖タンパク質（ｇｐ７５）又はその部分の検出に基づく。該発明は、哺乳類の生物的流体中のｇｐ７５を検出及び定量し、それにより腫瘍を検出しその増殖を定量する特殊な治療検出法を提供し、また腫瘍性疾患の治療及び予後に価値のある情報を提供する。宿主の体液中のｇｐ７５の上昇した値、即ち、正常バックグラウンドバインデング値以上の値は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２の過剰発現を示す。（典型的なバックグラウンドバインデング値は、一連の正常ヒト血清に対して１．６８％と図１０には示されている。）
【００２７】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２増殖と関係する他の癌の中で乳癌又は卵巣腺癌のような腫瘍性疾患の愚者の生存は、患者の生物的流体をｇｐ７５又はその部分の存在について検査することにより決定できる。
さらに、本発明は患者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体を検出及び定量する検査法を提供する。患者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリペプチドの値を測定する本発明の検査法の結果と特に相関する上記検査法の結果は、診断し、患者の状態をモニターして治療方針を決定し、そして予後を作成する際に重要な情報を提供する。
【００２８】
さらにまた、本発明は、患者の体液中のｇｐ７５に対する仮想の配位子の値を検出及び定量する検査法を提供する。同様に、本明細書で提供されるような、患者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリペプチド及びその抗体の値を検出及び定量する方法の結果と特に相関する上記の情報は、治療及び予後に重要であり、患者の状態をモニターする際及び治療方針を決定する際に有用である。
【００２９】
上記の背景技術において示したように、Ｃ−ｅｒｂＢ−２の増幅は、長期間の生存の可能性の減少及び疾患の再発時期の早期化と相関していることがわかっている。本発明の検査法は手術の前後において有用である。上記のＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅を示す患者は、疾患のかなりの初期の段階であっても、生存の可能性を増加させるためにより厳密に治療する方がよいであろう。さらに、腫瘍を取り除く手術後における患者の生物的流体中にｇｐ７５が存在することは、例えば、系統的な化学療法又は放射線療法の介入をすぐに必要とする転移を示すものである。
本発明は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）腫瘍の検出についての非侵入性診断検定及び予診検定に関する．上記の要求を満たすものである。
【００３０】
さらに、本発明はＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーン（以後、ｇｐ７５遺伝子という）の外部ドメインＤＮＡ配列又はそのフラグメントによりコードされる新規な蛋白質及びポリペプチドに関するものであり、かつｇｐ７５遺伝子又はそのフラグメントを好適な発現べクターに遺伝子組換えすること、このような発現ベクターで宿主を形質転換すること、及び組換え、合成又は他の生物学的手段によりｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドを生産することに関する。このような組換ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドはグリコシル化又は非グリコシル化のいずれをも行うことができるが、グリコシル化するのが好ましい。又、ここに記載の方法により実質的に純品となるまで精製することができる。本発明は、さらに合成又は生物学的に製造したｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドに関する。
【００３１】
上記ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドの用途の１つはワクチンである。さらに、ｇｐ７５エピトープを免疫系に効率的に与えるワクチンは、ｇｐ７５又はｇｐ１８５を過剰発現する強化細胞膜を含むことができる。このような細胞膜は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現させるために形質転換した組換宿主、好ましくはトランケート内部ドメインを有する形にＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現するものから誘導、又は人癌細胞系から誘導することができる。さらに、本発明により提供される抗イディオタイプ抗体は、ワクチンとして有効である。
【００３２】
ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドの別の用途は、腫瘍活性を弱める治療剤であり、このものを単独で又は化学療法剤と組合せて使用することができる。
ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドのさらに別の用途は、親和性結合研究においてＣ−ｅｒｂＢ−２に対する推定上のリガンド（配位子）を検出することである。仮に哺乳動物の生物学的流体中に該リガンドが検出されると、次にこれを本発明のｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドを用いて精製できるかも知れない。例えば、ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドは、遺伝子工学によって生産されたリガンドを精製する方法において使用できるかも知れない。
【００３３】
さらに、本発明は、ｇｐ７５蛋白質又はポリペプチドをコードするだけでなく、人に対して免疫原性を有さずかつ人の体液中の抗体に典型的には反応しない蛋白質／ポリペプチドのアミノ酸配列をもコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。このようなＤＮＡ配列の例は、ベータガラクトシダーゼのアルファペプチドコード領域である。さらに、本出願では、実質的に純粋で、かつ天然生成物を含まない組換え融合蛋白質／ポリペプチドをクレームする。
【００３４】
さらに、本発明は、ｇｐ７５遺伝子又はそのフラグメントを含む精製、単離ＤＮＡ分子に関する。さらに本発明は、ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドに対する抗体の診断及び治療上の使用に関する。さらに本発明は、ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドに対するような抗体に対する非イディオタイプ抗体に関する。
さらに本発明は、組換により、合成により又は他の生物学的方法により製造した本発明のｇｐ７５蛋自質及びポリペプチド及び／又はこれに対する抗体を用いたｇｐ７５用診断検定に関する。
【００３５】
本発明は、また、本発明の検定を具体化したテストキットを提供するものであり、該テストキットは、抗体ｇｐ７５蛋白質／ポリペプチド及び／又はＣ−ｅｒｂＢ−２の無傷（ｉｎｔａｃｔ）外部ドメインに対する抗体を含む（ここで無傷とは、ｇｐ７５が細胞表面で発現することを意味する。）。これらの検定は固相検定とすることができるが、これに限定されるものではなく、液相形態でも行うことができ、エリサ法に基づく粒状検定や、例えばアビジン／ビオチン法を用いた増幅した又は非増幅の放射又は螢光検定とすることもできる。
【００３６】
本発明はさらに、本発明の診断検定におけるｇｐ７５蛋白質／ポリペプチドを置換することができるｇｐ７５蛋白質／ポリペプチド認識モノクローナル抗体に対する抗イディオタイプを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
図１は、ＣＨＯ細胞から発現した組換Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメイン蛋白質（ｇｐ７５）のイムノアフィニティークロマトグラムを示す。濃縮ＣＨＯ上清を０．５×５．０ｃｍのイムノアフィニティーカラムに流速０．２μｌ／分で流した。次に、カラム溶離液の２８０ｎｍ（Ａ２８０ｎｍ）における吸収がベースラインに到達するまでカラムにＰＢＳを０．５μｌ／分の速度で流してカラムを洗浄した。特異結合物質が図中の矢印で示した、流速０．２μｌ／分、ｐＨ２．５の１００ｍＭグリシン−ＨＣ１の段階的グラジエントで溶離した。
【００３８】
図２Ａは、図１に示した組換的に生産したＣ−ｅｒｂＢ−２  ｇｐ７５のイムノアフィニティーカラムフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。各フラクションのサンプルをラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプルバッファー中で調製し、１０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。ゲルをコーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーＲ−２５０で染色した。
図２Ｂは、ウェスタンブロットである。図２Ａで使用したゲルと同じゲルを使用し、分離したタンパク質は電気泳動により０．２２μｍのニトロセルロース膜に移した。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換フラグメントｇｐ１８５に対して生起させたウサギポリクローナル抗体（抗体９２Ａ）を使用して膜をプローブ分析した。ヤギ抗ウサギ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合体及びインドファン基質（Ｖｉｏ−ｍｅｄｉｃｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を使用して特異的に結合した抗体を可視化した。各レーンには以下のように負荷した。レーン１：濃縮ＣＨＯ上清；レーン２：予備染色分子量標準（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ＞；及びレーン３から７：免疫アフィニティカラムフラクション１から５（図２Ａに示したのと同様）。
【００３９】
図３は、クローニングベクターｐＦＲＳＶの部分制限地図である。このベクターは、ＳＶ４０初期領域プロモーターによって駆動される転写ユニット及び複製開始点（ｏｒｉｇｉｎ）、並びにＳＶ４０大Ｔ抗原挟持配列（５´ｍＲＮＡスプライシング＞及び初期領域ポリアデニル化部位を有している。第２の転写カセットは、突然変移体ＤＨＦＲ遺伝子、即ちメトレキセート（ＭＴＸ）耐性をコードする優勢選択マーカーを含んでいる。最初のＳＶ４０ｏｒｉ／プロモーターから下流に位置する唯一のＥｃｏＲＩ部位に、前記２．２ｋｂ  ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃフラグメントをサブクローン化してｐＦＲＳＶ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃを生成した。
【００４０】
図４は、以下のように各レーンに負荷したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１及び９：Ｓｔｄ；レーン２から６：抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２  ＴＡｂ  ２５２に結合するために、ＮＩＨ３Ｔ３  ｃ−ｅｒｂＢ−２形質移入体により発現されたｃ−ｅｒｂＢ−２の可溶フラグメントをｇｐ７５と競合させる；レーン２から６：ＮＩＨ３Ｔ３−ｃ−ｅｒｂＢ−２からの細胞溶解物を増加量で１０μｇの抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２  ＴＡｂ  ２５２と共に７時間インキュベートし、その後ｇｐ７５発現ＣＨＯ細胞から回収したｉｎ  ｖｉｔｒｏラベル化上清の４００μｌのインキュベートを１０時間行った；レーン７：アイソトープ適合非特異的コントロールのマウスミエローマｍＡｂ、（ＩｇＧ１）により免疫沈降させたｉｎ  ｖｉｔｒｏラベル化ｇｐ７５  ＣＨＯクローンからの溶解物；レーン８：ＴＡｂ  ２５２により免疫沈降させたＣＨＯ−ｇｐ７５からの溶解物。
【００４１】
図５は、組織培養上清からのｇｐ７５の放射活性免疫沈降を示す。レーン１及び１２：分子量マーカー；レーン３から６：１２倍に濃縮され９．２ウサギポリクローナルにより沈降されたＳＫＢＲ３細胞からの上清−レーン３；レーン４：Ａ−２９ネズミ抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２ハイブリドーマペアレント；レーン５：ＴＡｂ  ２５２ネズミ抗−ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル；レーン６：Ａｍｅｒｓｈａｍネズミ抗−ＥＧＦレセプターモノクローナル；レーン７から１０：６倍に濃縮されたｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子により形質転換された３Ｔ３細胞からの上清；培地は沈降可能シグナルを可視化するのに充分なまでには濃縮しなかった。
【００４２】
図６は、ｃ−ｅｒｂＢ−２陽性及び陰性細胞系からの上清の放射活性免疫沈降を示す。レーン１及び１２：分子量マーカー；レーン２及び４：１２倍に濃縮されＴＡｂ  ２５２により沈降されたＭＤＡ４３５からの上清；レーン３及び５：Ａｍｅｒｓｈａｍ抗−ＥＧＦレセプター抗体で沈降された同じ上清；レーン６及び７；ＴＡｂ  ２５２及び抗−ＥＧＦレセプター抗体でそれぞれ沈降されたＭＤＡ４６８培養からの１２倍に濃縮された上清；レーン８及び９：無関係；レーン１０及び１１：１２倍に濃縮されＴＡｂ  ２５２及び抗−ＥＧＦレセプター抗体で沈降された形質移入３Ｔ３細胞からのコントロール上清。
【００４３】
図７は、ＴＡｂ  ２５９を捕獲抗体として、ＴＡｂ  ２５６を放射活性標識第２抗体として使用したサンドウィッチＩＲＭＡアッセイにおける、部分的に精製したｇｐ１８５及びｇｐ７５タンパク質の標準曲線を示す。このアッセイにより、形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分的に精製した全ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質並びに形質移入ＣＨＯ細胞の上清から精製された外部ドメインタンパク質の両方を検出することができる。このアッセイは、部分精製ｇｐ７５を標準として使用した場合、約１００倍感度が向上する。
【００４４】
図８は、ＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチＩＲＭＡアッセイで試験した場合における、ｃ−ｅｒｂＢ−２形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するヌードマウス血清中に出現した抗原の検出を示す。血清はすべて１：５（容量／容量）の希釈で試験し、このアッセイにおける血清の前（プレ）腫瘍プールのバックグラウンド結合は１．７％である。このアッセイにおいてｇｐ７５蛋白質を使用した標準曲線は、図７のものと同等のものである。マウス中、シグナルは５００から１０００ｍｍ3の範囲の腫傷サイズで検出することができ、腫瘍が３０００から１０，０００ｍｍ3に達するまで増加し続ける。
【００４５】
図９は、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子により形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するマウスから得られＴＡｂ  ２５２又はＰＢＳ又はｌｇＧ１により処理されＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチ１ＲＭＡで試験されたヌードマウス血清の分析を示す。血清は、１月の実験期間の間を通じて種々の採血日から得、１；５の希釈において試験した。マウスは、その血清を試験した時点において、ＴＡｂ  ２５２、ｃ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメインと反応性を有するＭＡｂ、ＩｇＧ１又はＰＢＳによる２から８回の処理（１００−５００μｇ／処理）を受けていた。アッセイにおいて６種の前腫瘍血清を試験し、平均結合を調べた。アッセイにおけるバックグラウンドカットオフ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）は、前腫瘍血清の平均+２標準偏差分この平均より上、即ち２．２％と決定した。ＰＢＳ処理マウスは、１００１から３０００ｍｍ3の腫瘍容量において有意にバックグラウンドを上回る抗原を発生し（ｎ＝７）、一方、ＴＡｂ  ２５２処理マウスは同じ腫瘍容量において極くわずかの検出可能抗原しか発生しなかった（ｎ＝５）。より大きな腫瘍容量においても、ＴＡｂ処理マウスからの血清における発生抗原の検出可能性は（ｎ＝９）、ＰＢＳ処理マウスからの血清と比較して（ｎ＝８）、やはり抑制されている。
【００４６】
図１０は１：５の希釈度（容量／容量）において、ＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチＩＲＭＡにおける、正常な志願者からの１２人の血清に対する試験結果を示す。これらの血清を使用し、１．６８％のバックグラウンドバインディングレベル（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）が決定される（平均+２の標準偏差）。
【００４７】
図１１は１：５の希釈度において、ＴＡＢ  ２５９／２５６ＩＲＭＡ検定における、２０人の乳癌患者からの連続的な出血に対する試験結果を示す。一連の試料が疾患および治療の経過を通じて採取された。１−４の患者に対しては、腫瘍の外科手術による切除の１日前の、最初の診断時に試料〔ａ〕が採取された。５−１０の患者の試料〔ａ〕は腫瘍の外科手術による切除の数日後に採取され、１１−２０の患者の試料〔ａ〕は最初の、またはつぎの再発時に採取された。残余の試料〔ｂ−ｆ〕（各患者に対し４または５）は治療期間中いろいろな間隔で採取され、疾患または治療に対する応答の特別な状態には相応しない。この検定に対するバックグラウンドカットオフ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）は１．６８％であった。
【００４８】
図１２はＴＡｂ  ２５９／２５６ＩＲＭＡ検定における、乳癌患者からの３人の血清をｇｐ７５標準および正常な人の血清と比較した滴定曲線を示す。血清はすべて１：５の希釈度において試験され、検定中のバックグラウンドカットオフは１．６％である。患者１９ａに対しては、初期の腫瘍が切除されて約１−１／２年後に患考１９に転移があらわれた時に血清の試料がとり出された。患者１９はこの試料が採取されて１−１／２年後に死亡した。初期の腫瘍が診断された７ヶ月後に肝臓および骨髄への転移についての最初の減退があった時に患者７から７ｅの血清試料がとり出された。患者７は、この最後の試料がとり出された６日後に死亡した。患者４ｆの試料は、初期の腫瘍が診断された２年後に肝臓および結節への転移についての最初の減退があった時にとり出された。患者４はこの〔ｆ〕試料がとり出された６ヶ月後に死亡した。
【００４９】
図１３はＣ−ｅｒｂＢ−２遣伝子で形質移入（トランスフェクション）されるＮＩＨ３Ｔ３細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合に拮抗するいろいろな細胞溶解液の能力が試験された拮抗検定結果を示す。ＳＫＯＶ３、ＢＴ４７４およびＮＩＨ３Ｔ３ｔラインはすべてｇｐ１８５蛋白質を過剰に表現し、これらのラインからの溶解物は増加する蛋白質濃度と拮抗する。対照のＮＩＨ３Ｔ３溶解物は拮抗することがない。
【００５０】
図１４はＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のｇｐ７５部分でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞系からの上澄液がＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合と拮抗する拮抗検定に対する結果を示す。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞からの上澄液は拮抗することがない。
【００５１】
図１５はＣ−ｅｒｂＢ−２でトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導された動物が持つ腫瘍からのヌードマウスの血清はＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合と拮抗し得ることを表わす試験結果を示す。１１００ｍｍ3よりも大きなサイズの腫瘍を持ったマウス２−４は拮抗することができるが、マウス１の血清および血清のプレ腫瘍プールはこの検定において拮抗しない。
【００５２】
図１６はＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。〔カウスセンス等、上記（Ｃｏｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ）〕。ｇｐ７５外部ドメインは約アミノ酸ナンバー２２（セリン：ｓｅｒ−２２）から約アミノ酸ナンバー６５３（セリン；ｓｅｒ−６５３）までを含む（このアミノ酸はそれらの上に黒わくで印がつけられている）。
【００５３】
本発明の多くの面を強調する概念は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２で過剰発現された細胞がＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメイン（ｇｐ７５）を宿主の哺乳動物の体液中に放つということの発見である。実施例１、４、５および６はこの発見に導く証拠を略述する。可溶性のＣ−ｅｒｂＢ−２誘導体（ｇｐ７５）は安定して変形されｇｐ７５で表現された細胞の上澄液中に見出された。この蛋白質は約７５Ｋの分子量を有することおよびＮＩＨ３Ｔ３ｔ（Ｃ−ｅｒｂＢ−２で表現された細胞）中に存在する蛋白質と拮抗することがわかった。（実施例１）実施例４、５および７はＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメインに特有な親和性結合を有する発生した抗原の検出を、それぞれＣ−ｅｒｂＢ−２トランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３ｔ）によって誘導されたヌードマウスの持つ腫瘍の血清において、および人の腫瘍培養上澄液において、および乳癌患者からの人の血清において、詳しく述べている。この発見は人および他の哺乳動物における腫瘍疾患の診断および治療のための新規な方法および組成物の開発への道を開いた。
【００５４】
アッセイ
哺乳類、好ましくはヒトの体液中の三つの異なる実体を検出し、定量するためのアッセイが、ここに提供される。この場合、これらの実体は、以下のとおりである。ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチド；ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体；及びＣ−ｅｒｂＢ−２に対する推定配位子（リガンド）。夫々のアッセイは患者の症状に関する重要に情報を与え、且つ新生物性疾患に関して哺乳類をスクリーニングし、新生物性疾患を診断し、その疾患の進行を監視するのに個別に有益であり、且つその疾患の進行を予測し、そして適切な治療プロトコルを決定することに有益である。しかしながら、これらのアッセイの一つ以上からの結果、好ましくは三つの全てに関する試験結果の相関関係は、患者の症状に関する最良のプロフィールを与える。
【００５５】
例えば、患者は大きな腫瘍を示すことがあるが、患者のｇｐ７５の量は比較的少ないことがある。読み取りの低さはｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の患者による発生のためによるものであり得るが、腫瘍の小さいことのためではない。
データを相関させる方法の別の例は、ｇｐ７５に対する推定リガンドの関係に関して患者の状態の広範な所見を与える。患者は多量の循環ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを示すことがあるが、患者が推定リガンドを生産していない場合には、新生物性疾患を有していない。リガンドがない場合、Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞表面レセプターはそれにより非制御増殖を開始するように刺激され得ない。こうして、リガンド対ｇｐ７５の比は、プロトオンコジーンがオンコジーンに活性化される機構であるリガンド／レセプター複合体のモデルのもとに有意である。
【００５６】
哺乳類体液中のｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに関するアッセイ
哺乳類、好ましくはヒトの体液中のｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを検出し、その中のこのようなｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの量を定量するための非観血的診断アッセイが提供される。ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドという用語は、この状況下で体液中の標的抗原として使用される。何となれば、放出された（ｓｈｅｄ）ｇｐ７５タンパク質は患者の体液中で種々のフラグメントに分解されることがあり、これらのフラグメントがタンパク質（５０個より多いアミノ酸を有する）及びポリペプチド（５０個より少ないアミノ酸）を構成するからである。
このようなアッセイは、新生物性疾患の状態を監視する貴重な手段を与える。予測を改良することに加えて、症状の知識は、担当医師が個々の患者に最適の治療を選ぶことを可能にする。例えば、再発の高い可能性がある患者は、全身の化学療法及び／または放射線療法を通常伴なって激しく治療し得る。再発の可能性が少ない場合には、それ程積極的ではない治療が選択し得る。更に積極的な治療養生によりひき起こされる重度の患者の窮迫のために、このような積極的な治療を要するこれらの愚者を高い確度でもって見分けることが望ましい。
【００５７】
本発明は、充実性腫瘍及び造血性癌の両方を含む多種の新生物性疾患をスクリーニングするのに有益である。新生物性疾患の例は、腺癌及びメラノーマの如き癌；神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫の如き中胚葉腫瘍；アソステオサルコーマ（ａｓｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｓ）、ユーイングサルコーマ、及び種々の白血病の如きサルコーマ；及びリンパ腫を含む。胸、卵巣、特に結腸及び胃を含む胃腸管、肝臓、甲状腺、前立腺、脳、膵臓、尿管（膀胱を含む）、及び唾液腺の腫瘍が、特に関係がある。前立腺、卵巣及び胸の腫瘍が、更に特別な関係がある。更に詳しくは、胸及び卵巣の腺癌が広く研究され、Ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現することを確かめられた。
本発明の方法によりｇｐ７５を分析するのに特に関係がある体液は、血清、精液、胸部浸出液、唾液、尿、シトゾル、血漿及び髄液を含む。血清が本発明の方法によリスクリーニングするのに好ましい体液である。
【００５８】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーン（ｇｐ７５）の外部領域（外部ドメイン）の構造を知るため、このタンパク質を特異的に認識する幾つかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が生成し得る。ｇｐ７５はＣ−ｅｒｂＢ−２増幅に関連する腫瘍の表面から特異的且つ特別に放出され、しかも哺乳類の生体液中に自由に存在するので、そのタンパク質の量を検出し定量することが可能である。Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンの外部領域への特別につくられたモノクローナル抗体の結合を定量化し得る現行の抗体検出技術を利用して、癌患者の体液中の外部領域の量を測定することができる。このようなアッセイは腫瘍を検出し、それらの増殖を定量化し、ヒトの疾患の診断及び予後を助けるのに使用し得る。そのアッセイは、哺乳類の体液中のｇｐ７５を検出し定量化するために適当にラベルし得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を伴なう。
【００５９】
本発明の主題は、宿主中の正常な細胞または宿主から新たに取り出された細胞の群中の悪性細胞の存在の可能性を評価するための方法及び組成物を提供する。好ましい方法は、第一段階として、精製量のＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンの外部領域を得、それを免疫原として使用してマウスまたはその他の適当な宿主中でモノクローナル抗体を生成することを伴なう。モノクローナル抗体はｇｐ７５のエピトープと特異的に反応すべきである。また、膜表面でＣ−ｅｒｂＢ−２を発現する全無傷細胞が抗原源として使用し得る。外部領域の異なるエピトープを認識するために多数のモノクローナル抗体を生成することが可能であり、これらのモノクローナル抗体は単独で使用でき、またはカクテルとして組合せて使用してアッセイの特異性及び感度を増大することができる。免疫原として全外部領域を使用することの他に、このタンパク質のフラグメント、または組換えＤＮＡ手段により生成されたタンパク質が、また、特異的なモノクローナル抗体を生成するのに使用し得る。また、外部領域配列内の種々の配列に相当するポリペプチドが免疫原の源として使用し得る。全ての場合、生成された抗体は、それらが腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方の表面に存在する他のタンパク質との極めて制限された交差反応性を有するような特異性を有する。それらは、例えば、多くの正常細胞の表面に存在するＥＧＦレセプターと反応しない。診断アッセイそのものは、典型的には、ヒト宿主からの少量の体液、好ましくは血清を得ることを伴なう。次いで、血清中のＣ−ｅｒｂＢ−２外部領域の存在が、幾つかの良く特定された抗体診断アッセイを用いて定量化し得る。これらはウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＲＩＡアッセイ（放射性免疫測定法）、または二重抗体サンドイッチアッセイであってもよく、これらは全て診断業界で普通に使用される。全ての場合、結果の解釈は、抗体または抗体の組合せがＣ−ｅｒｂＢ−２に無関係である血清中に存在するその他のタンパク質及びタンパク質フラグメントと交差反応しないという仮定に基く。これらの方法は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２外部領域の存在が背景に上記されたように腫瘍の存在と強い相関関係を有するという事実に基く。これらのアッセイは腫瘍の存在を検出し、腫瘍の持続される増殖を検出し、癌転移の存在を検出し、また外科手術、癌の化学療法また放射線療法後の全腫瘍組織の不在または除去を確かめるのに使用し得る。更に、それは癌化学療法及び腫瘍再発を監視するのに使用し得る。
【００６０】
実施例３は、本発明の好ましい診断方法−二重サンドイッチ免疫ラジオメトリック測定法（ＩＲＭＡ）のフォーマットを説明する。体液中のｇｐ７５の検出のための多くのその他のフォーマットが勿論利用でき、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ＥＬＩＳＡ試験の一つの型の代表は、マイクロタイタプレートがｇｐタンパク質／ポリペプチドの抗体またはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現、好ましくは過剰発現する全細胞（即ち、無傷ｇｐ７５）の抗体で塗布され、これに患者の血清の試料が添加されるフォーマットである。抗原を抗体に結合させるインキュベーションの期間の後に、プレートが洗浄され、酵素に結合される別の組の抗ｇｐ７５抗体が添加され、インキュベートされて反応を行ない、次いでプレートが再度洗浄される。その後、酵素基質がマイクロタイタプレートに添加され、酵素が基質上で作用するのに充分な期間にわたってインキュベートされ、最終調製物の吸光度が測定ざれる。吸光度の大きな変化は陽性結果を示す。
【００６１】
また、ｇｐ７５タンパク質及び／またはポリペプチドの抗体が患者の体液中のｇｐ７５の存在を検出し定量化するのに使用し得ることが、診断アッセイの当業者に明らかである。一つのこのような実施態様に於いて、競合イムノアッセイが使用され、その場合、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドがラベルされ、体液が添加され、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに特異的な抗体へのラベルしたｇｐ７５の結合を競合する。このようなアッセイはｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを検出するのに使用し得る。
【００６２】
別の実施態様に於いて、イムノメトリックアッセイが使用でき、この場合、ｇｐ７５タンパク質またはポリペプチドのラベルした抗体が使用される。このようなアッセイに於いて、抗原結合された抗体と複合体形成するラベルした抗体の量は体液中のｇｐ７５の量に直接比例する。本発明のアッセイに使用するためのモノクローナル抗体は、当業界で公知の方法、特にＮａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）に記載されているコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方法により得ることができる。
【００６３】
このような診断方法は、哺乳類、好ましくはヒトの体液中のｇｐ７５に関して測定するたあの試験キットで具体化でき、その場合、このような試験キットはｇｐ７５タンパク質及び／またはボリペプチドのポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体、及び／またはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現する全細胞（即ち、無傷ｇｐ７５）の抗体を含むことができる。更に、このような診断試験キットは、サンドイッチフォーマットに関して別の組のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体を含むことができ、その場合、前記の第二組の抗体が適当にラベルされる。
【００６４】
好適な特異性を有する抗体が一旦調製された時、多種の免疫測定法が特定の抗体−抗原複合体の形成を測定するのに利用できる。多数の競合タンパク質結合アッセイ及び非競合タンパク質結合アッセイが科学文献及び特許文献に記載されており、多数のこのようなアッセイが商業的に利用できる。血清抗原を検出するのに適したイムノアッセイの例は、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３、８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；及び同第４，０９８，８７６号明細書に記載されたアッセイを含む。
【００６５】
アッセイに使用される抗体は、ラベルされてもよく、またラベルされなくてもよい。ラベルされていない抗体は凝集に使用でき、種々のラベルを用いてラベルされた抗体は多種のアッセイに使用し得る。
或種の技術では、抗体ではなく抗原またはそのフラグメントをラベルし、抗体に関してラベルした抗原と試料中の抗原との間の競合を有することが有益である。この状況下で、ラベルした抗原またはラベルしたフラグメントと最高の感度及び精度を与える量の抗体との組合せを有するキットを提供することが普通である。
【００６６】
その他の状況下で、固体担体を有することが望ましく、この場合、抗原または抗体が結合される。ポリエピトープ抗原が、担体に結合された抗体とアッセイ媒体中のラベルした抗体との間のブリッジとして利用できる。また、制限量の抗体に関して、ラベルした抗原と試料中の抗原との聞の競合を有することができる。
好適な検出手段は、放射性核種、酵素、螢光物質、化学発光物質、酵素基質またはコファクター、酵素インヒビター、粒子、色素等の使用を含む。このようなラベルした試薬は、放射性免疫測定法、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、螢光イムノアッセイ、等の如き種々の公知のアッセイに使用し得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，７９１，９３２号；第３，８１７，８３７号；．及び同第４，２３３，４０２号明細書を参照のこと。
【００６７】
ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体に関する分析
上記の如く、患者の体液中のｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の量は、新生物性疾患についてスクリーニングし、その疾患の進行を監視し、予測すること及び治療のコースを決めることに重要なパラメータである。このような抗体を検出するのに代表的なアッセイは競合アッセイであり、その場合、ラベルしたｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドがｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体と組合せて患者血清中の抗体により沈殿される。当業者は、上記のフォーマットのいずれかを適用してｇｐ７５の抗体の定量化のために抗ｇｐ７５抗体を検出し得る。
【００６８】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２の推定リガンドに関するアッセイ
Ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプターの推定リガンドの量を検出し定量化するためのアッセイが、新生物性疾患を診断しスクリーニングし、その疾患及び治療スケジュールの進行を監視し予測するのに同様に有益である。このようなアッセイは、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチド及びその抗体に関する上記のアッセイの一つと関連して、更に好ましくはこのようなアッセイの両方に関連して特に有益である。
ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを利用するＣ−ｅｒｂＢ−２リガンドに関するこのようなアッセイの代表的なフォーマットは、精製され、好ましくは実質的に純粋なｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドをプラスチック表面またはその他の固体担体にこのような表面へのそれ自体の結合により、または補足抗ｇｐ７５抗体により付着することを伴なう。未知の量のラベルされていないリガンドとのラベルしたリガンドの競合アッセイを利用して、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドへの結合に関するラベルされていないリガンドの濃度が通常の診断器具使用を利用して定量化し得る。
【００６９】
別のフォーマット、ラベリング、及び一般にその他の改良（これらはｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに関するアッセイについて上記されたように当業者の知識の範囲内にある）がＣ−ｅｒｂＢ−２の推定リガンドを検出し定量化するためのアッセイに同様に適用する。
【００７０】
ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の抗イディオタイプ抗体
ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の抗イディオタイプ抗体が更に本発明の範囲内にある。上記のアッセイの夫々の場合に、このような抗イディオタイプ抗体がｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。ワクチンの項目に更に記載されるように、このような抗イディオタイプ抗体は免疫原性薬剤として使用し得る。
【００７１】
抗ｇｐ７５抗体の抗イディオタイプ抗体は、方法の部、モノクローナルＣ−ｅｒｂＢ−２抗体の調製に実質的に上記されたように調製され、その場合、初期免疫化はＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞ではなく適当な抗ｇｐ７５抗体による。融合プロトコルは同様にしてそれに従って行なわれる。スクリーニング方法は、免疫化に使用されるもとの抗ｇｐ７５モノクローナルへの結合に関する一次スクリーン、及び競合アッセイ、例えば、ラジオメトリックアッセイを含む二次スクリーニングであり、その場合、適当なｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドは放射能ラベルしたもとの抗ｇｐ７５モノクローナルによる結合に関して融合中に生産された抗イディオタイプ抗体と競合する。
【００７２】
試験キット
上記のアッセイは試験キットの形態で具体化し得る。前記の試験キットはｇｐタンパク質／ポリペプチドの抗体及び無傷のｇｐ７５（即ち、Ｃ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞の表面上にある）の抗体を含み得る。前記の抗体はポリクローナル及び／またはモノクローナルであり得る。更に、前記の試験キットはｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを単独で、または上記の抗体と組合せて含み得る。上記のように、抗ｇｐ７５抗体の抗イディオタイプ抗体がこのような試験キット中で適当なｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。
【００７３】
例は推定リガンドに関して分析するためのキットであり、その場合、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドが表面に塗布され、またはその上に捕捉されるか、あるいは抗ｇｐ７５抗体の抗イディオタイプ抗体が表面上にそうして塗布される。また、このようなアッセイは上記のように競合アッセイとして処方し得る。勿論、このようなアッセイは固相アッセイに限定されないが、液相フォーマットであってもよく、また酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、粒子アッセイ、例えばアビジン／ビオチン技術を用いて増幅され、または増幅されないラジオメトリックアッセイまたはフルオルメトリックアッセイに基いてもよい。
【００７４】
ｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドの調製
本発明のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは種々の方法で調製し得る。ｇｐ７５タンパク質を調製するのに好ましい方法は組換え手段による。本発明の代表的な組換え法は実施例１に後記される。
本発明のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは、更に合成法または生物学的法により、即ち長いタンパク質及びポリペプチドを酵素及び／または化学的に切断することにより調製し得る。前記の合成法及び生物学的法は、項目、ｇｐ７５タンパク質及びそのポリペプチド部分の合成的及び生物学的生産（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｐ  ７５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）のもとに詳細に後記される。このような方法はｇｐ７５ポリペプチドを調製するのに好ましい。
【００７５】
ｇｐ７５配列またはそのフラグメントのクローニング
実施例１に従ってつくられたプラスミドｐＦＲＳＶ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃは、本発明に従って調製し得る多くの可能なＤＮＡ組換え分子の代表にすぎない。使用される制限エンドヌクレアーゼに応じて、ｃ−ｅｒｂＢ−２外部領域配列の全部または一部が本発明に従ってクローン化され、発現され、使用し得る。
本発明に有益な制限酵素は、生成されるＤＮＡフラグメントがｇｐ７５配列の部分を含むような方法でＤＮＡを切断する酵素を含んでもよい。好適な制限エンドヌクレアーゼは、本発明の範囲から逸脱しないで本明細書に記載された因子を考慮して当業者により選択し得る。
【００７６】
実施例１に使用された代表的なクローニングビヒクルはｐＳＶ７１８６である。しかしながら、多種の宿主−クローニングビヒクルの組合せがｇｐ７５ＤＮＡをクローン化するのに有効に使用し得る。例えば、有益なクローニングビヒクルは、ｐＢＲ３２２、その他のＥ．ｃｏｌｉプラスミド及びそれらの誘導体の如き種々の既知の細菌プラスミド及びＲＰ４の如き広範な宿主域プラスミド、ファージラムダの多数の誘導体、例えばＮＢ９８９の如きファージＤＮＡ及びファージＤＮＡ発現調節配列を使用するように修飾されたプラスミドのようにプラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクターの如き、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００７７】
有益な宿主は、真核生物または原核生物、好ましくは真核生物であってもよく、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＡＧ４５６、ＪＭ１０３、Ｎ４８３０、Ｘ１７７６、Ｘ２２８２、ＨＢ１０１及びＭＲＣ１及びシュードモナス株、枯草菌及びその他のかん菌の株、酵母及びその他の真菌類の如き細菌宿主、並びに培養中の動物細胞または植物細胞、昆虫細胞の如き動物宿主または植物宿主及びその他の宿主を含む。本発明の好ましい宿主は酵母細胞、培養中の哺乳類細胞、好ましくはサル細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。好ましいサル細胞は細胞系ＣＯＳ７からの細胞であり、好ましいＣＨＯ細胞は細胞系ＣＨＯ−（ｄｘｂ１１）からの細胞である。勿論、宿主の全てが等しく有効であるとは限らない。宿主−クローニングビヒクルの組合せの特別な選択は、本発明の範囲から逸脱しないで本明細書に記載された原理を考慮した後に当業者によりなし得る。
【００７８】
更に、夫々の特異的なベクター内で、種々の部位が単離された二本鎖ＤＮＡの挿入のために選択し得る。これらの部位は、通常、それらを切断する制限酵素またはエンドヌクレアーゼにより指示される。例えば、ｐＢＲ３２２では、ＰｓｔＩ部位はペニシリナーゼタンパク質のアミノ酸１８１及び１８２をコードするヌクレオチドトリプレット間のペリシリナーゼの遺伝子中に配置される。
【００７９】
選択されたＤＮＡフラグメントをクローニングビヒクルに挿入して組換えＤＮＡ分子を生成するのに選ばれる特別な部位は、種々の因子により決定される。これらは、発現されるタンパク質またはポリペプチドのサイズ及び構造、宿主細胞成分による細胞内酵素分解に対する所望のタンパク質またはポリペプチドの感受性及びそのタンパク質による汚染、開始コドン及び停止コドンの位置の如き発現特性、及び当業者により認識されるその他の因子を含む。これらの因子のいずれもが単独では特別なタンパク質またはポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制御しないが、むしろ選択部位はこれらの因子のバランスに影響し、全ての部位が所定のタンパク質に等しく有効であるとは限らない。
【００８０】
勿論、クローニングビヒクルの選択された制限部位で挿入されるヌクレオチド配列または遺伝子フラグメントは、所望のタンパク質の実際の構造遺伝子の部分ではないヌクレオチドを含んでもよく、あるいはその構造遺伝子のフラグメントのみを含んでもよいことが理解されるべきである。どのようなＤＮＡ配列が挿入されようとも、形質転換宿主はｇｐ７５のエピトープを示すタンパク質またはポリペプチドを生産することのみが必要とされる。
【００８１】
ハイブリッド遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子は、宿主（形質転換体）が構造遺伝子またはそのフラグメントを発現しハイブリッドＤＮＡがコードするタンパク質またはポリペプチドを生産することを可能にするように、宿主を形質転換するのに使用し得る。また、組換えＤＮＡ分子は、複製後の宿主がｇｐ７５ＤＮＡ及びそのフラグメントの源として別の組換えＤＮＡ分子を生産することを可能にするように、宿主を形質転換するのに使用し得る。これらの使用のいずれかに適した宿主の選択は、当業界により認識される幾つかの因子により制御される。これらは、例えば、選択されたベクターとの適合性、同時生産物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔ）の毒性、所望のタンパク質またはポリペプチドの回収の容易なこと、発現特性、生物学的安全性及びコストを含む。宿主の絶対的な選択は、これらの因子のいずれか単独から特別な組換えＤＮＡ分子またはタンパク質もしくはポリペプチドに関して、なし得ない。その代わり、これらの因子のバランスは、全ての宿主が特別な組換えＤＮＡ分子の発現に等しく有効であるとは限らないという認識により見つけることができる。
【００８２】
ｇｒタンパク質／ポリペプチドの発現
宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉの如き原核生物である場合、ＤＮＡ取込みの可能なコンピテント細胞は指数増殖後に回収され、続いて公知の操作により塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）法により処理された細胞から調製される。また、形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に行ない得る。
使用される宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム沈殿としてのＤＮＡの形質移入法、マイクロインジェクションの如き通常の機械的操作、赤血球宿主またはリボソーム中に被包されたプラスミドの挿入、リゾボスファチジルコリンの如き薬剤による細胞の処理またはウイルスベクターの使用等が使用し得る。
【００８３】
タンパク質またはポリペプチドの生産量は、二つの主要因子：その遺伝子または細胞内でそれを暗号化コード化するＤＮＡ配列のコピー数及びこれらの遺伝子及び配列のコピーが転写され翻訳される効率により支配される。転写及び翻訳（これらは一緒に発現を含む）の効率は、順に、通常所望の暗号配列の前方に配置されるヌクレオチド配列に依存する。
これらのヌクレオチド配列または発現調節配列は、特に、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して転写を開始する位置（プロモーター配列）及びリボソームがｍＲＮＡ（転写の生産物）を結合し、それと相互作用して翻訳を開始する位置を規定する。このような発現調節配列の全てが等しい効率で作用するとは限らない。こうして、所望のタンパク質に特別な暗号配列をそれらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、高レベルの発現を有利にするように既知の発現調節配列に代えてそれらを融合することが有利である。これが達成された場合、細胞内の遺伝子または配列のコピー数を増加し、それにより発現タンパク質の収率を更に改良するために、新たに処理されたＤＮＡフラグメントがマルチコピープラスミドまたはバクテリオファージ誘導体中に挿入し得る。
【００８４】
幾つかの発現調節配列が使用し得る。これらは、Ｅ．Ｃｏｌｉのラクトースオペロンのオペレータ、プロモーター及びリボソーム結合配列及び相互作用配列（シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の如き配列を含む）（“ｌａｃ系”）、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンシンセターゼ系の相当する配列（“ｔｒｐ系”）、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーターの融合（“ｔａｃ系”）、ファージ１の主要なオペレーター及びプロモーター領域（ＯLＰL及びＯRＰR）、及びファージλコートタンパクの調節領域を含む。これらの配列を含むＤＮＡフラグメントは、ｌａｃオペロンまたはｔｒｐオペロンを有する形質導入ファージから分離されたＤＮＡまたはファージλもしくはｆｄのＤＮＡから制限酵素による切断により切除される。次いで、これらのフラグメントは、必須の調節配列が暗号配列の開始コドンの極めて近くに、またはそのコドンと近位で接合し得るような分子の制限された集団を得るために、操作される。
【００８５】
次いで、融合生産物が適当な宿主の形質転換のためのクローニングビヒクル中に挿入され、抗原生産量が測定される。こうして、最も有効な発現を示す細胞が選択される。また、開始コドンに結合されるｌａｃ、ｔｒｐまたはλＰL調節系を有するクローニングビヒクルが使用されて、ｇｐ７５タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むフラグメントに融合されてもよく、その結果、その遺伝子または配列がクローニングビヒクルの開始コドンから正確に翻訳される。
【００８６】
ｇｐ７５タンパク質及びそのポリペプチドフラグメントの合成的及び生物学的生産
本発明のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは、組換え手段によるだけでなく、合成手段及びその他の生物学的手段によっても生成し得る。所望のポリペプチドまたはタンパク質を調製するためのその他の生物学的手段は、所望のアミノ酸配列を含む長いｇｐ７５ポリペプチドまたはタンパク質を選択的タンパク質加水分解にかけることである。例えば、長いポリペプチドまたはタンパク質は化学試薬または酵素により切断し得る。ポリペプチドまたはタンパク質の合成による生成は、当業界で公知の方法によリアミノ酸の所望の鎖を化学的に合成することを必要とする。
【００８７】
所望のアミノ酸配列を含む長いポリペプチドまたはタンパク質の部分は、下記の操作のいずれかにより切除し得る。
（ａ）タンパク質加水分解酵素、特にその基質がアミノ酸の所望の配列の直ぐ隣りの部位でタンパク質またはポリペプチドの切断を特異的に生じるこれらの酵素によるタンパク質または長いポリペプチドの消化。
（ｂ）化学的手段によるタンパク質またはポリペプチドの切断。アミノ酸間の特別な結合は、特定の試薬との反応により切断し得る。その例は、下記のものを含む。メチオニンを伴なう結合は臭化シアンにより切断され；アスパラギニルグリシン結合はヒドロキシルアミンにより切断され；二つのシステイン残基間のジスルフィド結合は、例えばジチオスレイトールによる還元により切断される。
（ｃ）タンパク質加水分解変化と化学変化の組合せ。勿論、上記のように、合成ポリペプチドをコードするＤＮＡの小部分をクローン化して単細胞宿主によるペプチドの生産をもたらすことがまた可能であるべきである。
【００８８】
生物学的に、または合成的に生産されたタンパク質及び一旦生産されたポリペプチドは、ゲル濾過、イオン交換または高速液体クロマトグラフィー、またはその他の好適な手段により精製し得る。
ポリペプチドの化学合成は、下記の刊行物に記載されている。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５巻、２１４９〜２１５６頁（１９６３）；ケント（Ｋｅｎｔ）ら，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ”，２９ｆｆ．，アリタロ（Ａｌｉｔａｌｏ）ら編集、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９８５年）；ハウグ（Ｈａｕｇ），ＡＢＬ，４０〜４７頁（１９８７年、１月／２月）；アンドリューズ（Ａｎｄｒｅｗｓ），Ｎａｔｕｒｅ  ３１９巻、４２９〜４３０頁（１月３０日、１９８６年）；ケント，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ”，２１３〜２４２頁、ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）ら編集、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８０年）；ミッチル（ＭｉｔｃｈｅｌＤら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３巻、２８４５〜２８５２頁（１９７８年）；タム（Ｔａｍ）ら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ．，４０３３〜４０３６頁（１９７９年）；モジュゾフ（Ｍｏｊｓｏｖ）ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５巻、５５５〜５６０頁（１９８０年）；タムら、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８５１〜２８５４頁（１９８１年）；及びケントら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（タンパク質配列分析の方法に関する第４回国際シンポジウムの会報）”（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９８１年）。
【００８９】
上記の刊行物に記載された“メリフィールド固相操作”は、カルボキシル末端アミノ酸からアミノ末端アミノ酸までのＬ−アミノ酸の適当な配列をつくるのに使用し得る。樹脂のクロロメチル基、ベンズヒドリルアミン基、またはその他の反応基への化学結合により適当な樹脂に付着された適当なカルボキシル末端アミノ酸から出発して、アミノ酸が夫々に関して下記の操作を用いて一つずつ付加される。
【００９０】
（ａ）ペプチジル樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
（ｂ）その樹脂が塩化メチレン中の５％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（またはその他のヒンダード塩基）と室温で１０分間混合することにより中和される；
（ｃ）その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
（ｄ）生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量のアミノ酸が、それを半分のモル数のカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドと０℃で１０分間合わせることにより活性化されてアミノ酸の対称酸無水物を生成する。使用されるアミノ酸は、ベンジルエステル（アスパラギン酸及びグルタル酸）、ベンジルエーテル（セリン、スレオニン、システイン、チロシン）、ベンジルオキシカルボニル基（リシン）またはペプチド合成に普通使用されるその他の保護基で保護された側鎖を有するＮ−α−ブチルオキシカルボニル誘導体として最初に与えられるべきである；
（ｅ）活性化されたアミノ酸が室温で２時間にわたってペプチジル樹脂と反応させられて、成長するペプチド鎖の末端への新しいアミノ酸の付加を生じる；
（ｆ）その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
（ｇ）Ｎ−α−（ブチルオキシカルボニル）基が塩化メチレン中の３０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸と室温で３０分間反応させることにより直前に付加されたアミノ酸から除去される；
（ｈ）その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
（ｉ）必要とされるペプチド配列がつくられるまで工程ａ〜ｈが繰返される。次いで、１０％（ｖ／ｖ）のアニソールを含む無水のフッ化水素酸と反応させることにより、ペプチドが樹脂から除去され、同時に側鎖保護基が除去される。続いて、ペプチドはゲル濾過、イオン交換、または高速液体クロマトグラフィー、またはその他の適当な手段により精製し得る。
【００９１】
化学合成は固相樹脂を使用しないで行なうことができ、その場合、合成反応は完全に溶液中で行なわれる。反応、及び最終生成物は、特別なことがない限り実質的に同じである。
化学的ペプチド合成の技術は、自動ペプチド合成装置を使用すること、市販の保護されたアミノ酸を使用することを含む。このような合成装置は、例えば、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）（ＳａｎＲａｆａｅｌ，ＣＡ）型式９５００及び９６００、アプライド・バイオシステム・インコーポレーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｌｎｃ．）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）型式４３０、及びミリゲン（ＭｉｌｌｉＧｅｎ）（ミリポア社の一部門）型式９０５０を含む。更に、デュポンズ・ランプ（Ｄｕｐｏｎｔ’ｓ  Ｒａｍｐ）（高速自動化多重ペプチド合成）を使用して約２５までのポリペプチドを一度に手動で合成し得る。
【００９２】
本発明の合成ポリペプチドは、ｇｐ７５の一つ以上のエピトープを含むことが好ましい。エピトープ（これは約３〜約１１個のアミノ酸、更に通常約５〜約１１個のアミノ酸であり得る）を形成するアミノ酸配列をその両側面にある少なくとも三つのアミノ酸に結合することによりこのようなポリペプチドを合成することが可能である。両側面の三つのアミノ酸は天然のｇｐ７５配列中のものと同じアミノ酸であってもよく、またその他のアミノ酸であってもよい。
【００９３】
ｇｐ７５の抗体
本発明の組換体、合成もしくは天然のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは、診断アッセイだけでなく、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドのアフィニティ精製及び治療上の使用に関して用途を有する。背景に上記されたように、Ｃ−ｅｒｂＢ−２の抗体は、試験管内及び生体内で腫瘍増殖を抑制することが示された〔ドレビンらの上記の文献（１９８５年）を参照のこと〕。
【００９４】
ワクチン
本発明のｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドが腫瘍性疾患に対して防御免疫を誘発でき、かつ腫瘍形成活性に対する抑制効果をもつワクチンに配合し得ることは容易に理解されよう。ポリペプチドは単量体または多量体形状で、ｇｐ７５の１種以上のエピトープに対応する１種以上のアミノ酸を含むように、組換え手法であるいは生物学的に合成または調製することができる。次いで、これらのポリペプチドを、ｇｐ７５に対する防御免疫性を誘起することのできるワクチンに配合できる。かかるポリペプチドの抗原性を高める方法は多量体構造への組込み、免疫原性の高いタンパクキャリヤ、例えばキーホールリンプレットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはジフテリア毒素などへの結合、およびアジュバントまたは任意の他の免疫応答のエンハンサとの組合せでの投与などを包含する。
更に、ｇｐ７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体の抗イデオタイプ抗体もワクチンとして有用であり同様に処方し得ることも理解されよう。
【００９５】
単量体または多量体形状のいずれかのｇｐ７５のエピトープに対応するアミノ酸配列を、化学的合成手段により、あるいは遺伝的に修飾された微生物またはその培養物を包含する生物起源から精製することにより得ることができる。〔ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ），“シンセティックバクシンズ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）”，Ｓｃｉ．Ａｍ．，１９８３，２４８（２），ｐｐ．６６−７４参照〕。このポリペプチドは、例えば融合タンパクとして合成される場合における如く、アミノ酸配列中で他のタンパクのフラグメントを含む他のポリペプチドと結合するか、あるいは合成または天然起源の他の抗原性または非−抗原性のポリペプチドに結合することができる。
【００９６】
“ｇｐ７５のエピトープに対応する”なる用語は以下のような実際上の可能性を含むものと理解される。即ち、いくつかの例においては、天然にみられるタンパクおよびポリペプチドのアミノ酸配列の変動は抗原性であり得、かつ腫瘍性疾患に対する防御免疫および／または抗−腫瘍形成効果を与え得るという可能性を包含する。起こり得る配列変動はアミノ酸の置換、伸長、欠落、端部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ），挿入（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）およびこれらの組合せを含むが、これに制限されない。このような変更は、これらの変更を含むタンパクまたはポリペプチドが免疫原性であり、しかもこのようなポリペプチドまたはタンパクが誘発する抗体が十分に天然に産するｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドと交叉反応して、ワクチンとして投与された場合に防御免疫性および／または抗−腫瘍形成活性を与えるとすれば、本発明の意図する範囲内に含まれる。
このようなワクチン組成物は生理的に許容される媒体と組合せられ、該媒体としては免疫学的に許容される希釈剤および担体並びに一般的に使用されているアジュバント、例えばフロインド完全アジュバント、サポニン、ミョーバンなどが挙げられる。投与はｇｐ７５タンパクまたはポリペプチドの免疫学的に有効量、好ましくはレシピエントの体重１ｋｇ当たり免疫学的に活性なｇｐ７５タンパクおよび／またはポリペプチド０．０１〜１０．０μｇなる単位投薬量を与えるような量で行われる。全予防投薬量は抗原０．１〜約１００μｇの範囲内であり得る。
投与経路、抗原投与量、注入の回数および頻度は、当業者が最適化し得る範囲内の事項である。
【００９７】
ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドの治療での使用
本発明のｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドは、更に単独でもしくは化学療法薬と組合せて腫瘍性疾患の治療において使用できる。Ｃ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメインが、完全な（ｉｎｔａｃｔ）分子として、体液中に注入されたという事実はそれ自体治療上の役に立つ。細胞に付着しない過剰のｇｐ７５は、背景の項で既に述べたように〔スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、上記文献（１９８７）〕、ＣＤ４レセプタおよびＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープタンパクに類似する様式で、Ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する推定リガンドのオンコジーンの細胞表面レセプタへの結合と競合し、かつこれを妨害する可能性がある。ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドの治療上の効果を説明するためのもう一つの機序は、腫瘍形成を容易にするＣ−ｅｒｂＢ−２表現細胞間のレセプタ／レセプタ相互作用を阻害もしくは破壊することであり得る。
【００９８】
このような治療法は、患者にＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメイン物質、そのフラグメントあるいはその配列の一部に由来するペプチドを投与することを含む。ｇｐ７５タンパク／ポリペプチドの高い循環濃度は、上述の如く、腫瘍の成長を減衰もしくは排除することを期待できた。このｇｐ７５タンパク／ポリペプチドは生理的に許容される、非毒性の液状ビヒクルに分散させ、治療上有効な量で投与できる。投与経路および投与量は上記のワクチンの項で述べたのと同様である。
【００９９】
定義
用語“ｇｐ７５”とは、ここでは分子量約１８５キロダルトン（ｋｄ）の糖タンパク（ｇｐ１８５）即ちＣ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメインを構成する、分子量約７５ｋｄの糖タンパクを意味するものとする。用語“ｇｐ７５”は正確には図１６に示されたそのヌクレオチドおよびアミノ酸配列により定義され、ｇｐ７５外部ドメインは大体アミノ酸番号２２（セリン；Ｓｅｒ−２２）からほぼアミノ酸番号６５３（セリン；Ｓｅｒ−６５３）までの領域（図１６においてこれらアミノ酸はその上部の黒丸でマークされている〉を含み、これに対応するヌクレオチド配列をもつ。このアミノ酸配列はｇｐ７５のグリコシル化されていないバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）を表し、およその分子量６９ｋｄを有するものと思われる〔クッセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）等の上記文献〕。用語“ｇｐ７５”に含まれるものとしては、タンパク生成物の分子量に影響する種々の度合のグリコシル化をもつ酵母および高等真核生物による組換え技術により生成される糖タンパクであり、例えば少量のｇｐ９０は、以下の実施例１で示されるように、安定に形質転換されたｇｐ７５−表現ＣＨＯ細胞中で生成された。
【０１００】
“完全ｇｐ７５（ｉｎｔａｃｔ  ｇｐ７５）なる表現は細胞表面に発現されたｇｐ７５外部ドメインを意味するものとしてここでは定義する。従って、この完全ｇｐ７５は依然として膜内外領域を介して該細胞に付着している。
“ポリペプチド”とはペプチド結合によって共有結合的に結合したアミノ酸の鎖であり、かつここでは５０以下のアミノ酸を含むものと考える。“タンパク”とは、ここでは５０以上のアミノ酸を含むポリペプチドであると定義する。
“ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチド”なる表現は、ここでは、図１６に示したようなｇｐ７５外部ドメインＤＮＡ配列（ほぼ−Ｓｅｒ−２２乃至ほぼＳｅｒ−６５３をコードするヌクレオチド）により、あるいは該ｇｐ７５ＤＮＡ配列のフラグメントによってコードされるタンパクおよびポリペプチドを意味するものと定義する。“ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチド”なる表現は、該“ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチド”と実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学的活性を有するタンパクおよびポリペプチドを包含するものと解釈すべきである。
【０１０１】
遺伝子コードの縮重のために、即ち１種以上のコドンが１種のアミノ酸をコードする〔例えば、コドンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧは夫々アミノ酸のロイシン（Ｌ）をコードする〕ことから、一つのコドンが他のコドンで置換されている図１６のヌクレオチド配列の変更は、本発明によれば実質的に等価なタンパクまたはポリペプチドを生成するものと理解される。ｇｐ７５に対するヌクレオチド配列のこのようなすべての変更は、本発明の範囲内にはいる。
更に、図１６のｇｐ７５ＤＮＡ配列は天然に生ずるヌクレオチド配列の正確な構造のみを示していることを理解すべきである。僅かに修飾されたヌクレオチド配列が血清学的に類似の活性をもつ、免疫原性のおよび／または抗原性のタンパクおよびポリペプチドをコードすることが見出され、もしくはこれらをコードすべく当分野で公知の技術によって修飾し得ることが予想され、このようなヌクレオチド配列並びにタンパク／ポリペプチドは本発明の目的にとって等価であると考えられる。同等のコドンをもつＤＮＡは本発明の範囲内にあり、例えば該ｇｐ７５ＤＮＡ配列に相同もしくは実質的に相同なタンパク／ポリペプチドをコードする合成ＤＮＡ配列およびｇｐ７５タンパク／ポリペプチドをコードする配列とハイブリッド化されたＤＮＡ配列並びに遺伝子コードの縮重がなければ該ｇｐ７５配列にハイブリッド化されるであろうこれらの配列が含まれる。更に、ここでいうｇｐ７５配列に相補的なＤＮＡ配列も本発明の範囲内にある。ここで示したようなＤＮＡ配列の上記の如き修飾並びに変更は、ｇｐ７５配列またはそのタンパクと実質上同一である配列を与えるものと考えられる。
【０１０２】
典型的には、このような関連ヌクレオチド配列は、実質的に相同の定義にはいるものと実質的に同一である。
更に、ｇｐ７５のアミノ酸配列は遺伝子技術により修飾し得ることを理解するであろう。１種以上のアミノ酸を削除もしくは置換することができる。このようなアミノ酸の変更は、特にこの変更がポリペプチドのエピトープ外の領域におけるものである場合には、タンパクまたはポリペプチドの血清学的、抗原性および／または免疫原性活性に何等検知し得る変化を生じ得ない。生成するタンパクまたはポリペプチドは実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学的活性を有し、かつ本発明の範囲内にある。
好ましくは、該ｇｐ７５タンパク／ポリペプチドが化学療法薬と共に投与された場合には、該薬品はアルキル化剤である。この方法にとって好ましい化学療法薬はシスプラチン、カルボプラチンおよびメファラン（ｍｅｐｈａｌａｎ）である。
【０１０３】
略  語
本明細書では以下のような略語を使用する。
ＡＴＣＣ：アメリカンティッスカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
ＢＣＡ：ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＤＡＢ：ジアミノベンジン４塩酸塩
ＤＨＦＲ：ジヒドロフォレートリダクターゼ
ＤＭＥＭ：ドゥルベコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＧＦ：表皮増殖因子
ＥＧＦｒ：表皮増殖因子レセプタ
ＥＧＴＡ：エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素標識イムノソーベントアッセイ
ＦＡＣＳ：フルオレセント活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｃｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）
【０１０４】
ＦＢＳ：仔牛血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＨＡＴ：ハイポキサンチンアミノブテリンチミジン
ＨＢＳＳ：ハンクス液
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフ
ＨＲＰ：セイヨウワサビペルオキシダーゼ
ＩＲＭＡ：イムノラジオメトリックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓｅｙ）
【０１０５】
ＭＥＭ：最小必須培地
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾイル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド
ＭＴＸ：メトトレキセート
ＮＨＳ：Ｎーヒドロキシサクシンイミド
ＰＢＳ：リン酸緩衝塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド
ＰＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニルホスフェート
ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ
ＲＰＭＩ：ロスウェルパークメモリアルインスティチュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地
ＲＴ：室温
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＡＢ−ＭＡＢ：モノクローナル抗体
ＴＣＡ：トリクロロ酢酸
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＴＲＩＳ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンあるいはアミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
【０１０６】
セルライン
以下のセルラインを、以下に記載する実験で使用した。
ＳＫＢＲ３：ヒト乳癌セルライン。転移胸膜滲出液として得られ、ＡＴＣＣカタログＮｏ．ＨＴＢ３０として得た。
ＳＫＯＶ３：ヒト卵巣癌セルライン。転移腹水滲出液として得られ、ＡＴＣＣから得た。カタログＮｏ．ＨＴＢ７７。
ＭＣＦ７：ヒト胸腺癌セルライン（胸膜滲出液由来）。ＡＴＣＣから得た。カタログＮｏ．ＨＴＢ２２。
ＭＤＡ３６１：脳への転移腫瘍由来のヒト乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得た。カタログＮｏ．ＨＴＢ２７。
ＭＤＡ４３５：転移胸膜滲出液由来のヒト乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得られる。カタログＮｏ．ＨＴＢ１２９。
ＭＤＡ４６８：転移胸膜滲出液由来で増幅されたＥＧＦｒを含む乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得た。力タログＮｏ．ＨＴＢ１３２。
ＮＩＨ３Ｔ３：Ｓ．アーロンソン（Ａａｒｏｎｓｏｎ）（ＮＩＨ）から得た二十日ネズミ繊維芽細胞セルライン（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３７，ｐ．１７８）。
ＮＩＨ３Ｔ３ｔ：Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンと共に移入された二十日ネズミ繊維芽細胞セルライン。Ｓ．アーロンソン（ＮＩＨ）から入手した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３７，ｐ．１７８）。
ＨＢＬ１００：この比較的正常なヒトミルク由来の乳癌セルラインはＳＶ−４０で不死化されており、ＡＴＣＣから得た。カタログＮｏ．ＨＴＢＩ２４。
ＣＯＳ７：ＳＶ−４０形質転換アフリカ産グリーンモンキー細胞。ＡＴＣＣから入手した。カタログＮｏ．ＣＲＬ１６５１。
ＣＨＯ−（ｄｘｂｌ１）：チャイニーズハムスター卵巣細胞。ＵＣＳＦセルカルチャーファシリティ（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ)から入手。
【０１０７】
増殖培地
ここに記載する実験における、指定したセルラインの増殖のために以下の増殖培地を使用した。
ＳＫＢＲ３，ＭＤＡ４３５，ＤＡ４６８：これらの細胞は最小必須培地（ＭＥＭ）〔ギブコバイオロＭジカルズ社（Ｇｉｂｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．），Ｎ．Ｙ．〕、１０％の熱失活させた仔牛血清、０．２９μ・ｇ／μｌのＬ−グルタミン中で培養した。
ＳＫＯＶ３：細胞は、イスコブズ改良ダルベッコ培地（ｌｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、１０％熱失活仔牛血清、０．２９μｇ／μｌＬ−グルタミン中で培養した。
ＭＤＡ３６１：細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活仔牛血清、１μｇ／μｌ牛膵臓インシュリン、０．２９μｇ／μｌＬ−グルタミン中で培養した。
ＨＢＬ１００：細胞はマッコイ（ＭｃＣｏｙｓ）５Ａ培地、１０％熱失活仔牛血清、０．２９μｇ／μｌＬ−グルタミン中で培養した。
ＣＯＳ７：細胞は、１０％仔牛血清（ギブコ）、１００μＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／μｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に定常的に保持した。
ＣＨＯ−（ｄｘｂｌ１）：細胞は１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したα−ＭＥＭ中に維持した。
ＮＩＨ３Ｔ３：これら細胞はＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中に維持した。
ＮＩＨ３Ｔ３ｔ
ＭＧＦ７
【０１０８】
文  献
以下の文献は本明細書中で、著名または編者および年号で言及した参照文献である。
アウステル（Ａｕｓｕｔｅｌ）等（編）、カレントプロトコールズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２，（ウィリーインタサイエンス（Ｗｉｌｌｅｙｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），１９８８）。
・クッセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，ｐ．１１３８
・ジフィオレ（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ）等，ｉｂｉｄ，１９８７，２３７，ｐ．１７８
・グラハム＆ファンデルエブ（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）（編），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９７３，５２，Ｐ．４５６
・ホーラン−ハンド（Ｈｏｒａｎ−Ｈａｎｄ）等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８３，４３，ｐ．７２８
・ホルビッチ（Ｈｏｒｗｉｃｈ）等，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ１．，１９８５，１００，Ｐ．１５１５
・スー（Ｈｓｕ）等，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，１９８１，．２９，ｐ．５７７
・キング（Ｋｉｎｇ）等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２９，ｐ．９７４
・ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，ｐ．６８０
・マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等，モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：アラボラトリーマニュアル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），コールドスプリングハーバーラボラトリ，１９８２
・マッコングローグ（ＭｃＣｏｎｇｌｏｇｕｅ），哺乳類細胞用の遺伝子伝達ベクタ（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ），ｐｐ．７９−８４（ＣＳＨ出版、１９８７）
・スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）等，“ヒト乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトーオンコジーヌの研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）”，癌細胞７／ヒト癌の分子論的診断（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ７／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ），ｐｐ．３７１−３８４，（ＣＳＨ，ＮＹ，１９８９）
・トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）等，ＰＮＡＳ，１９７９，７６，ｐ．４３５０
・ゾラー＆スミス（Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４，ｐ．３２９
【０１０９】
方法
以下の方法を下記実施例において使用した。
タンパク分析
４％アクリルアミド濃縮用ゲルと、１０％解像ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｇｅｌ）（両者共に０．２％ＳＤＳを含む）を使用して、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）〔Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，ｐｐ．６８０−６８５；この論文を本発明の参考文献とする〕により記載されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパクを分析した。サンプルを５０μｌのサンプルバッファー〔６３ｍＭのトリス（ＴＲＩＳ），ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、５％の２−メルカプトエタノール、および２．３％のＳＤＳ〕中に適用し、２０ｍＡなる定電流条件で４時間電気泳動させた。タンパクの分子量は既知の分子量をもつ標準タンパクに対する各タンパクの易動度から評価した。タンパクの濃度はクーマシー青色色素−結合アッセイ（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），リッチモンドＣＡ）を利用して測定した。
【０１１０】
ウェスタンブロット
適当な抗体によって同定される抗原を特徴付けするために、トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９７９，７６，ｐｐ．４３５０−４３５４；この論文を本発明の参考文献とする）により記載されたようなウェスタンブロット法の改良法を利用したが、ここではタンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースフィルタに移され、かつ適当なモノクローナル抗体で同定された。ニトロセルロースフィルタに移した後、過剰なタンパク結合サイトを、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に該フィルタを浸漬することにより遮断した。１％のＢＳＡおよび１〜２×１０7カウント／分（ｃｐｍ）のヨウ素化抗体を含む３０μｌのＰＢＳ中で該シートを１時間インキュベートすることによりこの抗原を配置させた。次いで、このフィルタを洗浄し、乾燥し、かつオートラジオグラフィーに付した。（この手順により１００ピコグラム（ｐｇ）程度までのタンパクを検出することができる）。
【０１１１】
抗体の調製
ポリクローナル抗体：９２の調製
ニュージランド白兎を、Ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパクの８１％のＮ−末端に該当するＥ．コリ組換え抗原５０〜２００μｇで免疫した。初期免疫はフロインド完全抗原に１：１（ｖ／ｖ）の割合で乳化した該抗原からなっており、これは２箇所の皮下部分に注射された。後の追加免疫は不完全アジュバントに乳化した該抗原で２度に渡り２週間隔で行った。これら動物の耳静脈から２週毎に採血し、ｇｐ１８５表現細胞溶解物に対しウェスタンブロット法で、（以下に述べる）ＥＬＩＳＡを基に細胞に対する反応性により、放射性標識した細胞溶解物からのｇｐｌ８５タンパクの免疫沈降により、および放射性標識したＡ４３１細胞溶解物からのｇｐ１７０タンパクの免疫沈降により該血清をアッセイした。これらの血清は２度の追加免疫後のウェスタンブロット法によりｇｐ１８５との強い反応性をもつことが明らかとなりおよびＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性を示すことが立証された。
【０１１２】
ポリクローナル抗体：９．２の調製
Ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパクのＣ−末端における１４アミノ酸からなるペプチドに対する兎ポリクローナル抗血清を作成した。上述と同様の免疫化を利用した。この抗血清はＣ−ｅｒｂＢ−２タンパクを発現する細胞の膜処方物から約１８５ｋｄのタンパクを特異的に沈殿させる。これは該ＥＧＦレセプタと交叉反応しない。
【０１１３】
モノクローナルＣ−ｅｒｂＢ−２抗体の調製
Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーン、ＮＩＨ３Ｔ３ｔ（親切にもＤｒ．Ｓ．アーロンソン（ＮＩＨ）により提供された）を移入した２×１０6〜１×１０7ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔ディフィオレ（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ）等，Ｓｃｉｅｎｅ，１９８７，２３７，ｐｐ．１７８−１８２〕または完全フロインドアジュバント中に１：１（ｖ／ｖ）の割合で乳化した同数のＳＫＢＲ３細胞のいずれかで、腹腔内および皮下経路でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。これらの動物を、不完全アジュバントに乳化した細胞で２〜４週毎に追加免疫した。２週毎に血清を集め、（以下に述べる）ＥＬＩＳＡアッセイで、ホルマリンで固定したＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞に対する反応性につきテストした。正の力価を示す動物を細胞のＰＢＳ溶液で腹腔内または静脈内経路で追加免疫し、細胞融合のために４日後に動物を殺した。脾細胞を、ケーラー＆ミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，ｐｐ．４９５−４９７）の手順に記載されたようにＰＥＧ４０００を用いて、１：１〜７．５：１の比率でＰ３−Ｘ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と融合させた。融合細胞を緩かに洗浄し、ＲＰＭＩ中で１〜４×１０6細胞／μｌの密度で９６−ウェルをもつプレートに塗布した。融合の２４時間後にウェルをＨＡＴ培地で満たし、次いで３日毎に２〜３週間に亘りこの操作を続けた。形成コロニーが肉眼でみえるようになる１０〜１４日後に、培養上澄をＥＬＩＳＡアッセイにおける反応性についてテストした。良好な成長を示したクローンを２４ウェルを備えたプレートに展開し、７〜１０日後に再度スクリーニングした。次いで正のウェルを、流動選別解析（ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により生きたＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞に対する外部ドメイン反応性につきアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイおよび流動選別解析両方に対して正であるハイブリドーマ（親ハイブリドーマという）を、限界希釈クローニングまたは表面免疫グロブリン表現の流動選別解析に基いた脾臓支持細胞を含む９６−ウェルを備えたプレートへの単一細胞付着によりクローニングした。成長がみられたウェルをＥＬＩＳＡで再度テストし、更に１〜３回再クローニング処理した。
【０１１４】
ハイブリドーマクローンからの上澄を、イソタイプおよびサブイソタイプ、流動選別解析によるＮＩＨ３Ｔ３ｔ上での表面発現ｇｐ１８５に対する反応性、および移入細胞からの標識ｇｐｌ８５プロテインの免疫沈降につきテストした。正のハイブリドーマを育生し、プリスタンで感作したＢａｌｂ／ｃマウス、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスまたはＩＲＣＦｌマウス中に腹水生産のために注入した。腹水をベーカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＡＢｘカラム上でのＨＰＬＣで精製し、精製されたモノクローナル抗体（ＴＡｂ＃という）をＰＢＳに対して透析し、−２０℃にて保存した。全精製抗体を放射状免疫拡散法によるイソタイプおよびサブイソタイプにつき（１５％未満の汚染イソタイプ）、流動選別解析による、ｇｐ１８５表現セルラインの細胞表面染色性につき、移入または非移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＥＬＩＳＡアッセイ、標識Ｃ−ｅｒｂＢ−２発現セルラインからのｇｐｌ８５の放射性免疫沈降、放射性標識されたＡ−４３１細胞から放射性標識された１７０ＫＤタンパクが沈殿しなかったことによる密接に関連したＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性の欠如につきテストし、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルデンシトメトリーによる解析を行った（全精製タンパクは９０％以上免疫グロブリンである）。すべてのモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法によるｇｐ１８５タンパクの認識を示さなかった。今日までに発展したＭＡｂｓおよびその反応性の概要を第１表に総める。Ａ２９はモノクローナル抗体、ＴＡＢ２５０−２５４に対する親ハイブリドーマである。初期のいくつかの実験においては、表に示したように、Ａ２９ハイブリドーマからの上澄を使用した。
【０１１５】
【表１】
2006304807.tif 000002
【０１１６】
流動選別解析
ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３ｔ（あるいは他のＣ−ｅｒｂＢ−２表現セルライン）細胞を、ＤＭＥＭ十４％ＦＢＳ中で８０％の集密度で育生した。細胞をパックスベルセン（Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｖｅｒｓｅｎｅ）で収穫し、２度冷ＦＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ（フェノールレッドを含まない）、２％ＦＢＳ、０．２％ナトリウムアジド、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で洗浄した。細胞を１２×７５ｍｍのガラス試験管当たり０．５〜１．０×１０6細胞なる密度で分配し（細胞は９０％以上生存性でなければならない）、ペレット化し、上澄を除去した。これらの試験管を氷上に置き、試験管１本当たり１００μｌの上澄または精製抗体を加えた。各抗体または上澄をＮｌＨ３Ｔ３細胞並びにＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞両方に対してテストした。この抗体を氷上で１時間該細胞と共にインキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２度洗浄し、１００μｌのＦＩＴＣ−複合山羊抗−マウスニ次抗体を添加した。氷上に１時間放置した後、該細胞を２度ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで再懸濁して、５００μｌとした。この再懸濁した細胞はホイルで包んで４℃にて３日まで保存できる。この標識細胞をクールタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＥＰＩＣＳ５４１流動選別機で分析し、平均ピークチャンネル蛍光を５０００細胞につき測定した。ＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞に対する反応性の平均ピークを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する反応性の平均ピークと比較した。ｇｐ１８５の外部ドメインタンパクと反応する抗体について、該ピークは非重複性であった。
【０１１７】
抗体アッセイ
ポリスチレンプレート（９６−ウェル）を、ＰＢＳで希釈したＣ−ｅｒｂＢ−２表現細胞からの溶解物１００ｎｇを被覆した。この溶解物は、２〜３μｌの冷溶解バッファ（０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ，０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，０．１％デオキシコレート、０．１％  ＳＤＳ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．４、１ｍＭＰＭＳＦ）を２ｘ１０6〜１×１０7細胞に加え、氷上で１５分間インキュベートすることにより調製した。溶解物を１０，０００ｇにて２０〜３０分間遠心処理し、上澄をタンパクについてアッセイし、分割し、−２０℃で保存した。溶解物を加えたプレート（競合プレートという）を、室温にて一夜インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。もう一つの９６−ウェルプレート（インキュベーションプレート）を１％ＢＳＡ（ＰＢＳ溶液）で室温にて１時間遮断した（１００μｌ／ウェル）。これらのプレートを洗浄し、抗原（ｇｐ７５表現ＣＨＯ細胞からの上澄、即ちマウス血清または細胞溶解処方物）を該ウェル中にて５ｎｇ／μｌとなるようにＴＡｂ２５１と混合し、該プレートを室温にて２〜４時間インキュベートした。該競合プレートを同様に１％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断し、洗浄し、１００μｌの該インキュベーション混合物を、該インキュベーションプレートから該競合プレートに移し、室温にて１時間インキュベートした。次いで、これらのプレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄し、ビオチン処理した（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）山羊抗−マウスＩｇＧ抗体を１：４００なる希釈率（ｖ／ｖ）でウェル当たり１００μｌ添加した。これらのプレートを室温にて３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μｌのストレパビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰコンジュゲートを１：８０００なる希釈率（ｖ／ｖ）で加えた。更に室温にて３０分間インキュベートした後、上記の如くアッシュ工程（ａｓｈ  ｓｔｅｐ）を行い、ＴＭＢ基質を１００μｌ／ウェルで加えた。この基質は、５μｌのＴＭＢ母液（１μｇ／μｌの３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンのメタノール溶液）と５μｌのシトレートバッファー、ｐＨ４．５および４μｌの３０％過酸化水素と混合することにより、使用の直前に調製した。室温にて暗所で１５分間インキュベートした後、吸光度を４５０ｎｍにて測定した。ＰＢＳと共に予めインキュートしたＴＡｂ  ２５１を不競合コントロールとして使用して、溶解物で被覆した競合プレートに対する最大結合量を求めた。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ポリスチレンの９６−ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの牛コラーゲン（１μｇ／μｌ滅菌ＰＢＳ溶液）と共に３７℃にて２時間前処理した。ＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞をＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ中で８０％集密度で育生し、温パックスベルセンで収穫し、洗浄し、予備処理した、かつ洗浄したコラーゲンプレート内で３７℃にて一夜１×１０6細胞／μｌ、１００μｌ／ウェルにて塗布した。プレートを穏やかに洗浄し、１００μｌの１０％中性緩衝ホルマリンで１時聞処理した。プレートを再度ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃にて１時間遮断した。次いで、サンプルの上澄または抗体希釈物を、１００μｌ／ウェルで、該被覆し、遮断し、かつ洗浄したプレートに加え、該プレートを３７℃にて２時間インキュベートした。更にＰＢＳ洗浄工程を経た後、１：５００なる希釈率のアルカリンホスファターゼ−複合山羊抗−マウスｌｇＧ  Ｆｃ−特異的二次抗体を加え、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。最後のＰＢＳ洗浄後、バイオラド（ＢｉｏＢａｄ）基質（ＰＮＰＰ＋ジエタノールアミン）を加え、室温にて１０〜１５分聞インキュベートした後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１１９】
イムノペルオキシダーゼ染色
使用したイムノペルオキシダーゼ染色法は、ヒュー（Ｈｅｕ）等のアビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，１９８１，２９，ｐｐ．５７７−５８０）およびホランーハンド（Ｈｏｒａｎ−Ｈａｎｄ）等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８３，４３，ｐｐ．７２８−７３５）に記載の方法の改良法であった。これら文献を本発明の参考文献とする。
以下の実施例は本発明の十分な理解を助け、かつ例示のみの目的で与えられる。これらはいかなる意味においても本発明を何等限定するものではない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
（ＣＨＯ細胞におけるＣ−ｅｒｂＢ−２の発現）
（Ｃ−ｅｒｂＢ−２ベクターの構築）
推定上のＣ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質の細胞外ドメインをコードするＣ−ｅｒｂＢ−２ｃＤＮＡの２．０ｋｂフラグメントをＮｃｏＩおよびＡａｔIIを用いオカヤマ・バーグクローニングベクターｐＳＶ７１８６（ファルマシア社から市販、ｃａｔ＃２７−４９４８−０１）から切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカー（ＮＥバイオラブス、ｃａｔ＃１０７８）とライゲーションした。このＣ−ｅｒｂＢ−２ｃＤＮＡはＤ．スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）（ＵＣＬＡ）によって、胸にアデノカルシノーマを持つ女性の患者から始めて単離された（Ｃ−ｅｒｂＢ−２の完全なヌクレオチド配列は図１６参照）。ＥｃｏＲＩリンカー結合の部分Ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化したｐＦＲ４００のＳＶ４０に基づく誘導体であるｐＦＲＳＶ（ホーウィック（Ｈｏｒｗｉｃｈ）等、１９８５）にサブクローン化した。ｐＦＲＳＶを構築するためにｐＫＳＶ１０（ファルマシア社から市販、ｃａｔ＃２７−４９２６−０１）から２，６ｋｂのＰｖｕII／ＨｐａＩフラグメントを単離し、平滑末端化後ＰｖｕII消化したｐＦＲ４００にクローン化した。ｐＫＳＶ−１０のヌクレオチド５１０７番に位置するＢｇｌII部位を予め部位特異的突然変異誘発（ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ），１９８７）でＥｃｏＲＩ部位とし、最終構築物ｐＦＲＳＶ〕中のユニークなＲＩクローニング部位とする。またこのベクターは優性な選択可能マーカーＤＨＦＲを含んでおり、それをｇｐ７５Ｃ−ｅｒｂＢ−２誘導体の増巾に使用した。ｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃと命名した最終構築物（図３）を大腸菌ＭＣ１０６１株にトランスホームし、そのプラスミドＤＮＡをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（１９８２）の方法で単離した。
【０１２１】
（ｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃのトランスフェクション）
このプラスミドの発現をＣＯＳ７細胞およびリン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）トランスフェクション法（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびヴァンデルエブ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）１９７３）を用いてモニターした。トランスフェクションの２４時間前細胞を１００ｍｍ組織培養皿上１：１０に分けた（約３０〜５０％集密度）０．４９μｌ  ２×ＨｅＢＳ中の２０μｇ（１０μｌ）のプラスミド構築物に０．５μｌの０．２５ＭＣａＣｌ2をゆっくり加え（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等編、１９８８参照）１０秒間ボルテックスした後２０〜３０分間室温に放置し、ＤＮＡを沈殿化させた。それからこの沈殿をＣＯＳ７細胞の皿に加え、その細胞／沈殿混合物を３７℃、５％ＣＯ2条件下１５時間インキュベーションした。リン酸緩衝液（ギブコ）で細胞から沈殿を洗い落とし、完全生育培地（ＤＭＥＭ）中でインキュベーションしてからＤＮＡの導入後４８時間までＣ−ｅｒｂＢ−２の発現５を検定した。
【０１２２】
ＣａＰＯ4トランスフェクション法を用いることによりＣＨＯ細胞で安定したｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃの発現が得られた（上述）。ＤＮＡ沈殿は２０μｇのプラスミドＤＮＡおよび４枚のＣＨＯ細胞の１００ｍｍディッシュを用い上述の方法で調製した。プラスミドの導入後７２時間、各トランスフェクト化１００ｍｍディッシュを１：２０に分け、１０％の透析化ウシ胎児血清および２０ｎＭ  ＭＴＸを含むａ−ＭＥＭ（ヌクレオシドおよびヌクレオチドなし）中１８日間培養した。段階的増巾を開始し、細胞を６日毎に濃度を増やしたＭＴＸ（１００ｎＭ、２．５ｍＭ、１２．５ｍＭおよび５０ｍＭ）に曝した。ＭＴＸ中２１日間の増殖後限界希釈によりＭＴＸ耐性集団をクローン化した。これらの集団の１つに由来する１０6個の細胞を以下のように増殖培地（上述）で希釈した：２×１：１００、ついで２×１：１０で希釈し９６穴マイクロプレート（コスター製）のウェル当りおよそ１細胞とする。この細胞を５０ｍＭ  ＭＴＸ中に維持しながら３週間に渡り、２４穴および６穴マイクロプレートついで６０ｍｍディッシュへと連続的に拡げていった。それから放射能免疫沈殿法、免疫蛍光法、およびウエスタンブロット法を用いＭＴＸ耐性クローンのｇｐ７５発現を検定した。
【０１２３】
（免疫蛍光法）
抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ２５２またはその親ハイブリドーマＡ２９の上清を用い、ｇｐ７５の細胞内存在部分を検出した（上述の該ＭＡｂの調製法参照）。ＰＢＳ／５ｍＭＥＤＴＡを用いて細胞を分散させ、ＰＢＳで２回洗った後２μｌの４％ｐ−ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中３７℃、１０分間処理して固定した。この細胞をＰＢＳで洗浄後０．６％ｎ−オクチルーグルコシド／ＰＢＳ中室温で５分間インキュベーションし、膜透過性としてから１０μｇ／μｌのいずれかの抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＭＡｂを含む２％ＦＢＳおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）からなる１×ＨＢＳＳに懸濁した。この一次抗体とのインキュベーションは氷中６０分間行ない、ついでＰＢＳで２回洗浄した。それから細胞をＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ´）２抗マウスｌｇＧ（タゴ製、カタログ＃４９５０）を含む１００μｌのＨＢＳＳに懸濁した。またトランスフェクトした細胞を非特異的マウスミエローマｇＩＧ１（リトンバイオネティクス製）で染色した。
【０１２４】
（放射能免疫沈殿法）
一時的トランスフェクション化または安定発現Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃ細胞を６０mmディッシュで８０％集密度となるよう生育させてから、２μｌ無システイン培地中１時間かけて飢餓化した。ついで細胞を３７℃、５％ＣＯ2条件下２００ｍＣｉの３５Ｓ−システイン（比活性＝６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマーシャム社）で１５時間かけてラベル化した。その上清を回収し１ｍＭ  ＰＭＳＦ中−２０℃で保存した。冷リン酸緩衝液で細胞を２回洗浄してからディッシュ当り０．４μｌの１×ＲＩＰＡバッファ〔０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００（１０μｌ／Ｌ）、１％デオキシコール酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）、０．１％ＳＤＳ（１ｇ／Ｌ＞、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ〕に溶かした。その溶解物をプロテインＡ−セファロースを用いて清澄化した後（溶解物４００μｌ当６０μｌ）、１０μｌの溶解物をＴＣＡ沈殿して取込みをチェックした。この溶解物をサンプル当り４×１０6カウントで標準化し、振とう器を用い４℃で一晩抗体とインキュベートした。この上清を濃縮し、その等価量を一晩抗体とインキュベートした（振とう器を用い、４℃で）。一晩のインキュベーション後このサンプルを６０μｌのプロテインＡ−セファロースを用い４℃、３０分間で沈殿化し、遠心で落とした後４回１×ＲＩＰＡで洗浄した。最後の洗浄後吸着した免疫複合体を３５μｌの２×レムリバッファに懸濁し、５分間煮沸してから７％アクリルアミドゲルで電気泳動した。このゲルを固定化し、乾燥後一晩のフィルム露光に使用した。
【０１２５】
ウエスタンブロットには７％ＳＤＳアクリルアミドゲルで電気泳動し、トリス−グリシン−メタノールバッファを用いてニトロセルロースにプロッティングした。ブロッキングおよびインキュベーションは１０％ミルクおよび２％ＢＳＡ中で行った。検出には基質としてＤＡＢを用いたビオチン−アビジン法を使用した（０．１Ｍトリス、０．０２％過酸化水素溶液中ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）。このプロットは０．０５Ｍトリス、０．２５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％トウィーン２０溶液で洗浄した。
【０１２６】
（ＣＨＯ細胞における可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ−２誘導体（ｇｐ７５）の検出）
先に述べたようにｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃ構築物を安定にＣＨＯｄ×１１株に導入し、ＭＴＸ濃度を段階的に増加して予期されるｇｐ７５の増巾の後に細胞溶解物および上清における抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ  ２５２との反応性を検定した。先に示されたＲＩＰ分析を用い、細胞溶解物中にｇｐ７５の主要部分が検出された。ｇｐ７５安定発現ＣＨＯ集団の上清には実質的により少ない量が検出された。免疫蛍光法を行なうことによりこの構築物が疎水性の膜透過ドメインを含まないことからｇｐ７５が生成し、かつｇｐ７５安定トランスフェクト化ＣＨＯの上清に分泌される理由を決定した。免疫蛍光分析によって１つのトランスフェクト化ＣＨＯ集団のおよそ３０％および第２の集団の１０％が抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ  ２５２と反応性を有し、またそのたんぱく質が特定のオルガネラ；たとえばリソソームや核に局在化していないことが示された。我々は各々のｇｐ７５発現ＣＨＯ集団の限界希釈クローニングによるｇｐ７５の分泌画分を増加し得たと考えている。各ＭＴＸ耐性（５０ｍＭ）クローンを単離し、増巾後抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ  ２５２を用いてｇｐ７５発現を検定した。免疫蛍光法、ＲＩＰ分析およびウエスタン分析でｇｐ７５のクローニングおよび発現の成功が確認された。ＣＨＯクローンからの分泌ｇｐ７５の発現レベルは非クローン化集団と比較して約１０〜２０倍大きかった。
【０１２７】
Ｃ−ｅｒｂＢ−２の“可溶性”誘導体がインビトロで生成する可能性を試すため細胞外エピトープを認識する抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ  ２５２に対する結合の競争を行った。この実験に用いた２種の細胞は全長Ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３（キング（Ｋｉｎｇ）等、１９８５）および先に述べたｇｐ７５発現ＣＨＯの１つである。予め３５Ｓ−システインを用いてラベル化したクローンから上清を回収した。競争は−定量の抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体ＴＡｂ２５２、一定量のラベル化ｇｐ７５−ＣＨＯ上清および種々の量の３Ｔ３−Ｃ−ｅｒｂＢ−２非ラベル化細胞溶解物を用いて行った。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより非ラベル化３Ｔ３−Ｃ−ｅｒｂＢ−２（ｇｐ１８５）濃度が増加するにつれて約７５ｋｄのＲＩＰバンドの強度は逆比例して減少することが示された（図４）。このことは“可溶型”がこのたんぱく質の膜結合型を発現する細胞型から“放出”され、かつ種々の細胞型でグリコシル化に明確な不均一性が存在することを示している。ｇｐ７５発現ＣＨＯ細胞の上清はその結合についてＮＩＨ３Ｔ３ｔ溶解物と競合した（図４）。
【０１２８】
（実施例２）
（組換えＣ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質の精製）
（プラスミドの精製）
バクテリアの１リットル培養においてＯＤ６００＝０．８のとき細胞に２００μｇ／μｌのクロラムフェニコールを加えることによリプラスミドＤＮＡを増巾した。３７℃、一晩のインキュベーション後バクテリアをペレット化し、１０μｌの５０ｍＭスクロース、２５ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に懸濁した。この溶液１０μｌの１０μｇ／ｍｌリゾチーム溶液を加え、室温で１０分間インキュベーションした。この混合物に４０ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液をゆっくり添加し、氷中で１０分間インキュベーションした。それから３０ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を加え、この混合物を氷中でもう１０分間インキュベーションしてからベックマンＳＷ２７または同等物を用い２０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。等容量のイソプロパノールを上清に加え、室温で２０分間放置して沈殿化し、その沈殿をソーバール（Ｓｏｒ  ｖａ１１）を用い室温、１２，０００ｇで３０分間遠心して沈降させた。このペレットを２．４ｍｌのＴＥバッファ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ついで４．２ｇ塩化セシウム（ＣｓＣｌ）および０．４ｍｌエチジウムプロミド（ＥｔＢｒ）（１０μｇ／ｍｌ）と混合した。このサンプルをベックマンクィック−シールポリアロマーチューブ中ＣｓＣｌ溶液層約８ｍｌ〈密度＝１，４７０ｇ／ｍｌ，ｎ＝１．３７８０）の下５／８×３のところにロードし、ソーバールＴ１２７中２０℃、５０，０００ｒｐｍで１８時聞遠心した。
【０１２９】
（イムノアフィニティーゲルの調製）
モノクローナル抗体ＴＡｂ２５４（該ＭＡｂの調製法については上記方法のセクション参照〉を業者の指示に従がいＮＨＳ活性化アフィニティーゲル（アフィ・プレップ１０；バイオラッドラブス社、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングした。簡単に云うと精製抗体４．５μｇをカップリングバッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に交換し限外濾過で最終容積１。０ｍｌに濃縮した。この溶液を氷冷カップリングバッファで平衡化した２．０ｍｌのゲルに加え、このスラリーを４℃で一晩混合した。カップリング後、このゲルを焼結ガラスフィルターで回収し、カップリングバッファで洗浄した。濾液サンプル中のたんぱく質をＢＣＡたんぱく質検定法で検定した（ピアス社、ロックフォード、ＩＬ）。濾液全てから回収された総たんぱく質は１．２μｇであった。それゆえＩｇＧ３．３μｇがゲルにカップリングしたと考えられる。
【０１３０】
残存する反応部位を２−アミノエタノールでブロックした。カップリングバッファ中１００ｍＭの２−アミノエタノール５．０ｍｌ（ｐＨ８．５）をゲルに加え、そのスラリーを室温で２時間混合した。それからこのゲルをＰＢＳで十分に洗浄し、４℃で保存した。アジ化ナトリウムを加え（最終濃度０，０２％ｗ／ｖ）、バクテリアの繁殖を防いだ。
【０１３１】
（Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメインの単離および精製）
可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメインたんぱく質を精製するための出発物質としてトランスフェクト化ＣＨＯ上清の１０倍濃縮物を用いた。濃縮上清を融解し、以下に示す最終濃度となるようにプロテアーゼインヒビターを加えた。０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ，２．１μｇ／ｍｌアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１．０μｇ／ｍｌロイペプチン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ。上清のｐＨは１．０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で７．０に調整した。いくつかの実験では限外濾過を用い上清をさらに４倍濃縮した。さらに上清を濃縮すると濁りを生じ、この濁りはクロマトグラフィー前遠心で除去した（１０，０００×ｇ、２０分間）。
【０１３２】
この上清を０．４５ｍｍメンブレンで濾過した後２５４イムノアフィニティーゲル（１．０ｍｌベッド容積〉を充填した０．５×５ｃｍカラムにロードした。このカラムは毎分０．２ｍｌの流速で運転した。１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で非特異的結合物質を洗い流した。洗浄は２８０ｎｍの吸収ベースラインが安定するまで行った。特異的結合物質は流速０．２ｍｌ／ｍｉｎの１００ｍＭグリシンーＨＣｌ（ｐＨ２．５）のステップグラジェントで溶出した。各１．０ｍｌのフラクションを採取した。その後カラムはＰＢＳで十分に洗浄した。サンプルロード、洗浄および溶出は４℃で行った（図１）。
【０１３３】
カラムフラクション中のＣ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で測定した（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。ウエスタンブロット分析の場合抗原はポリクローナル抗体９２Ａの１／２０００希釈物（この調製法は上述の方法のセクション参照）で検出した。ピーク反応性を含むフラクションを回収し、上述のプロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳに対して透析した。この透析物を限外濾過で濃縮した。最終的たんぱく質収量は標準物質としてウシガンマグロブリン（バイオラドラブス社、リッチモンド、ＣＡ）を用いたＢＣＡたんぱく質検定法で測定した。
１回のクロマトグラフィーサイクルからの総たんぱく質収量は約９０μｇであった。このことはＩＲＭＡで測定された１０倍濃縮上清５００ｍｌ中の抗原活性の約９０％に相当する。同じカラムで５回のサンプルロードおよび溶出サイクルを行ったが抗原結合容量のロスはなかった。溶出物プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥは約７５ｋＤの非常に接近した２つのバンドおよび９０ｋＤの１つのマイナーバンドを示した。これらのサイズの差はたんぱく質のグリコシル化の差またはたんぱく質分解の差によるものであろう。
【０１３４】
（実施例３）
（イムノラジオメトリックサンドイッチアッセイ（ＩＲＭＡ））  ヨードゲン法を用いＴＡｂ  ２５１および２５５−２６５を１０−２０ｍＣｉ／μｇの比活性となるよう放射能ラベルした。イムロンエリムーバル９６穴プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１０μｇ／ｍｌの以下のＴＡｂ：２５１、２５５−２６５の１つを用い、４℃一晩でコーティングした。それからこのプレートをＰＢＳで洗浄し、ついでＰＢＳ中１％ＢＳＡを用い、３７℃１時間でこれをブロックした。さらに洗浄した後、ＰＢＳで希釈した１００ｍｌのサンプル（細胞溶解物または上清、部分精製ｇｐ１８５またはｇｐ７５たんぱく質または血清サンプル）をＴＡｂコーティングウェルに加え、このプレートを３７℃で２〜５時問インキュベートした。プレート洗浄後ウェルに放射能ラベルしたトレーサー抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２００，０００ｃｐｍ／１００ｍｌに調整したもの）を添加した。室温での２〜２４時間のインキュベーション後、このプレートを洗浄し、各ウェルをガンマカウンターで計数した。結合率（１％Ｂ）は以下の式で計算した。
％Ｂ＝（サンプルｃｐｐｍ／全ｃｐｍ）×１００
アフィニティー精製したｇｐ７５たんぱく質（トランスフェクトＣＨＯ細胞系列由来）が使用可能な検定ではシグモイド曲線関数を用いて標準曲線を作製し、そこからｎｇ／ｍｌで表わされるｇｐ７５等価物として未知濃度を測定した。
【０１３５】
第２表はモノクローナル抗体を組合せるとサンドイッチ・ＩＲＭＡ様式でｇｐ７５たんぱく質を検出し得ることを示している。準精製ｇｐ１８５もｇｐ７５標準物質と同様にＩＲＭＡ様式のテストを行った。興味深いことに、捕獲抗体としてＴＡｂ  ２５１およびラベル化抗体としてＴＡｂ  ２５５を用いたこの様式のテストでＣ−ｅｒｂＢ−２発現細胞系列溶解物およびＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分精製したｇｐ１８５たんぱく質からのシグナルは検出できたがＣ−ｅｒｂＢ−２誘導腫瘍を有するヌードマウス血清からのシグナルまたはｇｐ７５たんぱく質は検出できなかった。第３表にまとめた競争検定法に基づくこれらのデータは最終的検定様式がヌードマウス血清中のシグナルも検出するｇｐ７５たんばく質検出に必要であることを示している。ｇｐ７５同様ｇｐ１８５に対しても適正な感度および特異性を示すこの最終的検定様式は捕獲抗体としてＴＡｂ  ２５９およびトレーサー抗体としてＴＡｂ  ２５６を用いる。この検定では０．５〜１ｎｇ／ｍｌの感度で部分精製したｇｐ７５たんぱく質が検出され、部分精製したｇｐ１８５、ｇｐ１８５を過剰発現する細胞溶解物中およびヌードマウス血清中のシグナルが検出された（第３表にまとめた）。ｇｐ７５に対する感度を示す本検定の標準曲線を図７に示す。ＴＡｂ  ２５６／２５９ＩＲＭＡ検定を用いて細胞培養上清のシグナルを定量した。Ｃ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質ポジティブの細胞系列はこのＩＲＭＡ検定で検出および定量される抗原を放出している。第４表は、コントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞系列の放出抗原レベルがバックグランドレベルであり、一方ｇｐ１８５を過剰発現し、放射能免疫沈殿法で検出されるｇｐ７５を上清中に放出する細胞系列もサンドイッチ１ＲＭＡで検出可能で２２〜７０ｎｇ／ｍｌのｇｐ７５等価物として定量される抗原を放出することを示している。放出される抗原のレベルは培養物の集密度およびＣ−ｅｒｂＢ−２過剰発現のレベルに依存する。
【０１３６】
この様式の方法を用いて全てのマウスおよびヒト血清サンプル、および細胞上清および細胞溶解物を分析、定量した。競争およびサンドイッチ検定の結果を第３表にまとめた。この結果は部分精製したｇｐ７５外部ドメインたんぱく質の検出能とＣ−ｅｒｂＢ−２誘導腫瘍を有するヌードマウス由来の血清サンプルまたはヒト胸部がん患者由来の血清サンプル中の放出抗原検出能の相関関係を示している。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
（実施例４）
（ヌードマウス腫瘍増殖および治療〉
実験を開始する前にＢａｌｂ／ｃヌードマウスを尾の静脈から放血させた。それからこの動物に２００ｍｌのＰＢＳ中５×１０6〜１×１０7個のＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞を背中中央に沿って皮下注射した（０日目）。これらの細胞のは９０％以上が注射後も生存していた。細胞注射から２〜３日後（腫瘍容積が１０ｍｍ3に達する前）この処理動物に２〜３日毎にＰＢＳ、１００〜５００μｇ／３００ｍｌのＩｇＧコントロール抗体またはＴＡｂ抗体を腹腔注射した。バーニアキャリパーを用いて腫瘍の長さ、巾および高さを測定し、容積を計算することにより増殖を測定した。腫瘍は３−４日毎に測定した。１〜２週間毎に尾の静脈から放血させた。この実験は２８〜３１日間続けた。実験の終りに最後の放血を行ない、腫瘍を測定し、次の免疫組織学的実験に用いるためこれを切り取った。
（ヌードマウス血清中の放出抗原の検出）
【０１４１】
図８では、１：５血清希釈物（ｖ／ｖ）のＩＲＭＡ検定における結合シグナルの割合を血清採取時における腫瘍の大きさに関してグラフ化した。これらの血清はｃ−ｅｒｂＢ−２トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導される腫瘍を有する動物に由来する。この検定法は腫瘍サイズが約３０００ｍｍ3になるまでシグナルが増加しつづけ、その後一定になることを検出できた。非常に強いシグナルと血清量に限りがあることから血清を１／５〜１／６２５（ｖ／ｖ）に希釈して分析した。一番高い希釈率のときでもしばしば強いシグナルが検出できた。腫瘍含有マウスをＰＢＳまたはＩｇＧ１コントロール抗体で処理した場合ＩＲＭＡ検定法で検出されたシグナルは未処理のマウスと同じであった（図９）。しかし、この動物はｃ−ｅｒｂＢ−２外部ドメインを認識するＴＡｂで処理したとき、この検定法で検出可能な放出抗原量は腫瘍サイズが３０００ｍｍ3となるまで厳しく抑制された。腫瘍サイズが＞３０００ｍｍ3のときでさえ、シグナルはテストした血清の約半分に抑制された。これらのデータはｃ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメインまたはその一部分を認識する抗体はサンドイッチＩＲＭＡ検定における検定可能シグナルのレベルを抑制することを示している。
【０１４２】
またヌードマウス中で生育させたｇｐｌ８５たんぱく質を過剰発現するヒトの乳腺または卵巣細胞系列も第５表に示したとおりｃ−ｅｒｂＢ−２ＩＲＭＡ検定で検出可能な抗原を放出した。このシグナルは腫瘍のサイズと相関関係を示した。ＭＣＦ７誘導腫瘍は小さいままであり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を放出しなかった。ＭＤＡ４６８細胞系列は実質的な腫瘍増殖（＞２０００ｍｍ3）を誘導し、実質的量のＥＧＦｖを有していたがサンドイッチＩＲＭＡ検定で検出可能な抗原を放出しなかった（第５表）。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
この競争実験を使用しエクトドメイン反応性ＭＡｂであるＴＡｂ  ２５１の結合についてトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物と競合するｇｐ７５抗原を検出した。図１３はヒトの乳腺細胞系列ＢＴ−４７４およびヒト卵巣細胞系列ＳＫＯＶ３などｃ−ｅｒｂＢ−２ｇｐ１８５を発現する細胞系列由来の溶解物がＮＩＨ３Ｔ３ｔ溶解物と同レベルにＮＩＨ３Ｔ３ｔ溶解物への結合を競争し得ることを示している。トランスフェクトされていないコントロール３Ｔ３細胞は競争できなかった。同様にｇｐ７５外部たんぱく質でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清はＮＩＨ３Ｔ３ｔ溶解物への結合を争うことが示され（図１４）、このことはＴＡｂ  ２５１がエクトドメインを認識し、かつこの結合だけでＭＡｂのｇｐ１８５に対する結合と競争するのに十分であることを確証している。
【０１４５】
ＮＩＨ３Ｔ３ｔトランスフェクトした細胞によって誘導される大きな腫瘍を有するマウス由来のヌードマウス血清は図１５に示されているようにＮＩＨ３Ｔ３（ｃ−ｅｒｂＢ−２発現細胞）溶解物への結合を競争し得る。競争能は腫瘍の大きさに相関しているが、この検定法では１／１６０（ｖ／ｖ）以下の血清希釈物について非特異的妨害から区別できるシグナルを検出するのに十分な感度は得られていない。
【０１４６】
（実施例５）
（ヒト腫瘍細胞培養上清における放出されたＣ−ｅｒｂＢ−２の検出）
ヒト胸部腫瘍細胞系列をＴｌ５０フラスコ中で培養し、１５μｌの無システインおよび無メチオニン培地中４００ｍＣｉの３５Ｓ−システインを用いてラベルした（ダルベッコ修正イーグル培地、ＤＭＥ  Ｈ２１  ４．５ｇ／ｌグルコース含有）。細胞は３７℃で一晩かけてラベルした。２４時間後、培地を回収し、プロテアーゼインヒビター（ロイペプチン１μｇ／μｌ、ベーリンガーマンハイム社、アプロチニン２．１μｇ／μｌ、シグマ社；ペプスタチンＡ２．５μｇ／μｌ、ベーリンガーマンハイム社；およびＰＭＳＦＯ．１ｍＭ、シグマ社）を加えてからアミコンセントリプレップ３０を用い４００μｌになるまで濃縮した。
【０１４７】
免疫沈殿前、プロテインＡ−セファロースビーズの５０％スラリー１００μｌと４℃で４時問インキュベーションすることにより非特異的プロテインＡ結合を取り除いた。このビーズおよび非特異的結合物をマイクロフユージによる３０秒遠心で除去し、その上清を新しいチューブに移した。それから抗体（約１０μｌを含む２０μｌ）を加え、この混合物を振とう器中４℃で２４時間インキュベーションした。次の日、５０μｌのプロテインＡスラリーをこのサンプルに加え振とう器中４℃で４時間インキュベーションした。次にビーズをマイクロフユージの３０秒遠心でペレット化し、氷冷ＲＩＰＡバッファ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸塩、１０μｇ／μｌウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）で５回洗浄した。３回目と４回目の洗浄の間にチューブを交換した。最後にペレットを１％ベーターメルカプトエタノールを含むレムリサンプルバッファ５０μｌに懸濁した。このサンプルを７５℃で５分間加熱し、マイクロフユージの３０秒間遠心した後７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。
【０１４８】
泳動は約１２０ｍＡ−時間で停止し、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノール溶液で４５分〜１時間かけてゲルの固定を行った。蒸留水で素早く洗浄した後、そのゲルを新鮮な蒸留水２５０μｌ中に１時間浸した。このゲルに９０分間かけて２５０μｌのエンハンス（デュポン社）を浸透させ、２％グリセリン溶液で平衡化してから濾紙上で乾燥させた。この乾燥したゲルで−８０℃で３日間かけてコダックＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ−５Ｘ線フィルムを感光させた。
【０１４９】
（ヒト腫瘍細胞の培地上清中の可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ−２誘導体（ｇｐ７５）の検出）
図５は種々の抗体で濃縮沈殿化したＳＫＢＲ３細胞の組織培養上清のオートラジオグラムを示している。細胞外ドメインと反応するＣ−ｅｒｂＢ−２抗体（Ａ２９およびＴＡｂ  ２５２）で処理したこれらのサンプル中には明確な約７５ｋｄの単一バンドが存在した。一方、Ｃ−ｅｒｂＢ−２Ｃ−末端ペプチドに対して作製したウサギポリクローナル抗血清またはＥＧＦレセプターに対して特異的なモノクローナル抗体（アマーシャム社）のいずれかで処理した上清にはバンドは出現しなかった。さらにＳＫＢＲ３細胞由来の７５ｋｄのバンドの特異性はＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンでトランスフェクトした３Ｔ３細胞由来の同一分子量の分子種を沈殿化する同モノクローナル抗体、ＴＡｂ  ２５２の能力で示された（図６）。また、ＭＤＡ４６８の上清由来の７５ｋｄバンドをＴＡｂ  ２５２が沈殿させないことも図６に示されている。その細胞系列は大量のＥＧＦレセプターを発現するが検出可能なレベルのＣ−ｅｒｂＢ−２は発現しない。約１０５ｋｄのより大きな分子がこれらの細胞から抗ＥＧＦレセプターモノクローナル抗体によって沈殿した。
沈殿化はＣ−ｅｒｂＢ−２および検出可能なＥＧＦレセプターを発現しない上清でも行ったが（図６）、７５ｋｄおよび１１０ｋｄのいずれにもバンドは検出されなかった。
【０１５０】
（実施例６）
（ヒト血清中に放出された抗原の検出）
連続的採血が可能な胸部がん患者の２０人のヒト血清をこの検定法で試験した。この検定で健康入の血清は１．６８％のバックグランドレベルを示したが（図１０）、３人の患者由来の血清（患者４、７および１９）は有意にバックグランドレベル以上の放出抗原レベルを示した（図１１）。これらの血清のシグナルはｇｐ７５標準物質と平行して希釈率をあげるに従がい減少した（図１２）。別に８８種の胸部がん血清もこの検定法でテストし、そのうちの１３個の血清がバックグランドより有意に高い９．９〜１５１１ｎｇ／μｌｇｐ７５等価物のレベルでポジティブであることが示された。サンドイッチｇｐ７５ＩＲＭＡで測定した放出抗原量とセントコア社から市販されている診断検定法による値には相関関係はみられなかった（第６表〉。セントコア検定法は数年間市販されてきているヒト胸部がん診断用のＦＤＡ認可の検定法である。このセントコア検定法はムチンを測定するものでＩＲＭＡｇｐ７５検定でポジティブと判定された１３名の胸部がん血清の各々はこの方法でもポジティブであった。しかしＩＲＭＡｇｐ７５検定は各患者でわずかに異なるｇｐ７５プロフィールを示すがムチンレベルのセントコア検定では各患者について差はでてこない。ｇｐ７５レベルの差は患者ごとの病状の差を示している。
【０１５１】
（結論）
ハイブリッド微生物、組換えＤＮＡ分子およびたんぱく質／ポリペプチドおよび本発明のこれらのものに適用し得る方法などは先に示した好ましい態様物で述べたものに限定されないことを理解すべきである。ハイブリッド生物、組換えＤＮＡ分子およびたんぱく質／ポリペプチドは生産の過程、またはその後に従来法によってより利点の多いものに修正し得る。たとえばＣ−ｅｒｂＢ−２配列の転写により有効なコントロール配列を使用する、望ましくない産物の合成を減少させる変異も導入する、宿主内のプロテアーゼレベルを減少させる、Ｃ−ｅｒｂＢ−２配列を含む熱誘導可能なライソジェンを宿主染色体に組込む、あるいは細胞中の配列コピー数を増加させるか、または目的とするたんぱく質／ポリペプチドを生産する上で細胞の生産性を増加するその他の修正および操作を行ない得る。  これまで述べてきた事項に加えて本発明に種々の修正が可能なことはこれまでの説明から当業者にとって明白であろう。このような修正は特許請求の範囲内にあると考える。
【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
概  要
Ｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジーンを過剰発現する悪性腫瘍を同定するための方法および組成物が提供される。悪性腫瘍の診断および予防に有用な方法で腫瘍を有する哺乳動物の生物学的液体中のＣ−ｅｒｂＢ−２の外部ドメイン、糖たんぱく質ｇｐ７５の検出およびｇｐ７５レベルの定量を行う方法が提供される。
さらにＣ−ｅｒｂＢ−２オンコジーン（ｇｐ７５遺伝子）の外部ドメインＤＮＡ配列またはそのフラグメントによってコードされ、組換え的、合成的および他の生物学的に生産される新しいたんぱく質およびポリペプチドが公開される。このようなｇｐ７５たんぱく質は単独で、または化学療法試薬と組合せてがん治療に用いられるワクチンとして有用である。また診断や治療に有用なｇｐ７５たんぱく質に対する抗体も公開される。さらに本発明の検定法を行うテストキットも公開される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＣＨＯ細胞から発現した組換Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメイン蛋白質（ｇｐ７５）のイムノアフィニティークロマトグラムを示す。
【図２Ａ】図１に示した組換的に生産したＣ−ｅｒｂＢ−２  ｇｐ７５のイムノアフィニティーカラムフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２Ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換フラグメントｇｐ１８５に対して生起させたウサギポリクローナル抗体（抗体９２Ａ）を使用して膜をプローブ分析したウェスタンブロットである。
【図３】クローニングベクターｐＦＲＳＶの部分制限地図である。
【図４】各レーンに負荷したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図５】組織培養上清からのｇｐ７５の放射活性免疫沈降を示す。
【図６】ｃ−ｅｒｂＢ−２陽性及び陰性細胞系からの上清の放射活性免疫沈降を示す。
【図７】ＴＡｂ  ２５９を捕獲抗体として、ＴＡｂ  ２５６を放射活性標識第２抗体として使用したサンドウィッチＩＲＭＡアッセイにおける、部分的に精製したｇｐ１８５及びｇｐ７５タンパク質の標準曲線を示す。
【図８】ＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチＩＲＭＡアッセイで試験した場合における、ｃ−ｅｒｂＢ−２形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するヌードマウス血清中に出現した抗原の検出を示す。
【図９】ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子により形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するマウスから得られＴＡｂ  ２５２又はＰＢＳ又はｌｇＧ１により処理されＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチ１ＲＭＡで試験されたヌードマウス血清の分析を示す。
【図１０】１：５の希釈度（容量／容量）において、ＴＡｂ  ２５９／２５６サンドウィッチＩＲＭＡにおける、正常な志願者からの１２人の血清に対する試験結果を示す。
【図１１】１：５の希釈度において、ＴＡＢ  ２５９／２５６ＩＲＭＡ検定における、２０人の乳癌患者からの連続的な出血に対する試験結果を示す。
【図１２】ＴＡｂ  ２５９／２５６ＩＲＭＡ検定における、乳癌患者からの３人の血清をｇｐ７５標準および正常な人の血清と比較した滴定曲線を示す。
【図１３】Ｃ−ｅｒｂＢ−２遣伝子で形質移入（トランスフェクション）されるＮＩＨ３Ｔ３細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合に拮抗するいろいろな細胞溶解液の能力が試験された拮抗検定結果を示す。
【図１４】Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のｇｐ７５部分でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞系からの上澄液がＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合と拮抗する拮抗検定に対する結果を示す。
【図１５】Ｃ−ｅｒｂＢ−２でトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導された動物が持つ腫瘍からのヌードマウスの血清はＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞から溶解物へのＴＡｂ  ２５１の結合と拮抗し得ることを表わす試験結果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月18日(2006.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液を可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の存在についてインビトロにおいて試験する方法であって、可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体を含む組成物を哺乳動物の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を測定することを含み、前記抗体が細胞表面に発現されたC-erbB-2のインタクト細胞外ドメインに対して産生された抗体である、上記方法。
【請求項２】
哺乳動物の体液を可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の存在についてインビトロにおいて試験する方法であって、可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体を含む組成物を哺乳動物の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を測定することを含み、前記抗体が、組換え技術により、合成によりまたは他の生物学的方法により製造されたC-erbB-2細胞外ドメインに対して産生された抗体である、上記方法。
【請求項３】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体、および
(b)前記抗体の前記可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質への結合を検出する検出手段、
ここで前記抗体は細胞表面に発現されたC-erbB-2のインタクト細胞外ドメインに対して産生された抗体である。
【請求項４】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体、および
(b)前記抗体の前記可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質への結合を検出する検出手段、
ここで前記抗体は組換え技術により、合成によりまたは他の生物学的方法により製造されたC-erbB-2細胞外ドメインに対して産生された抗体である。
【請求項５】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)細胞表面に発現されたC-erbB-2のインタクト外部ドメインに対して産生された抗体であって、スクリーニングアッセイにより可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有することが見出された抗体、および
(b)前記抗体が前記可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質へ結合するか否かを検出する検出手段、
【請求項６】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)一以上のC-erbB-2外部ドメインエピトープを含むラベル化したタンパク質／ポリペプチドであって、組換え技術により、合成によりまたは他の生物学的方法により製造されたタンパク質／ポリペプチド、および
(b)(i)前記ラベル化したタンパク質／ポリペプチドと、
(ii)ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の
制限量の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体への競合的結合を検出する検出手段、
ここで前記抗体は細胞表面に発現されたC-erB-2のインタクト細胞外ドメインに対して産生された抗体であるか、組換え技術により、合成によりまたは生物学的方法により、製造されたC-erbB-２細胞外ドメインに対して産生された抗体である。
【請求項７】
患者体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検出及び定量することにより患者におけるC-erbB-2タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の存在をインビトロにおいて検出する方法であって、以下の(a)および(b)を含む方法：
(a)体液試料を可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体と接触させること、および
(b)該抗体に結合した可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の量を検出すること、ここで、正常体液中の結合レベルを超えた結合レベルの増加はC-erbB-2を過剰発現する腫瘍細胞の存在を示すものである。
ここで前記抗体は細胞表面に発現されたC-erB-2のインタクト細胞外ドメインに対して産生された抗体であるか、組換え技術により、合成によりまたは生物学的方法により製造されたC-erbB-2細胞外ドメインに対して産生された抗体である。
【請求項８】
ヒトの体液中のC-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体を検出及び定量するインビトロ検定方法であって、C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質／ポリペプチドまたは一以上のC-erB-2細胞外ドメインエピトープを含むタンパク質／ポリペプチドを用いること、及び前記C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質／ポリペプチドまたは一以上のC-erB-2細胞外ドメインエピトープを含むタンパク質／ポリペプチドが組換え技術により、合成によりまたは生物学的方法により製造されたものである、上記方法。
【請求項９】
前新生物形成性／新生物形成性疾患の患者の体液試料中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質のレベルの変化をインビトロにおいて検出する方法であって、前記患者から経時的に採取した体液試料中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質のレベルを免疫学的に検出及び定量し、それらのレベルを比較して変化を検出する、上記方法。
【請求項１０】
前新生物形成性／新生物形成性疾患の患者の体液試料中のC-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性のレベルの変化をインビトロにおいて検出する方法であって、C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質／ポリペプチドまたは一以上のC-erB-2細胞外ドメインエピトープを含むタンパク質／ポリペプチドを用いて、前記患者から経時的に採取した体液試料中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質のレベルを免疫学的に検出及び定量し、それらのレベルを比較して変化を検出することを含み、前記C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質／ポリペプチドまたは一以上のC-erB-2細胞外ドメインエピトープを含むタンパク質／ポリペプチドが組換え技術により、合成によりまたは生物学的方法により製造されたものである、上記方法。
【請求項１１】
ガン治療後に、あるいは患者から腫瘍を除去する手術後に行う、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、ELISA、RIA、ウェスタンブロット、粒子アッセイ、放射測定アッセイまたは蛍光分析アッセイの形式である、請求項１〜３及び８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞表面上に発現されたC-erbB-2のインタクト細胞外ドメインに対し産生された抗体の使用を含み、前記抗体がスクリーニングアッセイにより可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有することが見出された抗体である、請求項１、７、９、１１及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
検定が、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、ELISA、RIA、ウェスタンブロット、粒子アッセイ、放射測定アッセイまたは蛍光分析アッセイの形式で行われる、請求項３〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
細胞表面上に発現されたC-erbB-2のインタクト細胞外ドメインに対し産生された抗体の使用を含み、前記抗体がスクリーニングアッセイにより可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有することが見出された抗体である、請求項３または６に記載のキット。