(57)【要約】【課題】  生分解性プラスチックとしての性能を高めるため、平均分子量の高いＰＨＢを生産する微生物を提供する。【解決手段】  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含み、平均分子量３００万以上のポリヒドロキシブチレートを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属のポリヒドロキシブチレート生産菌。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含み、平均分子量３００万以上のポリヒドロキシブチレートを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属のポリヒドロキシブチレート生産菌。
【請求項２】
メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２５）である請求項１に記載のポリヒドロキシブチレート生産菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリヒドロキシブチレート生産菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、プラスチックは化石資源である石油から製造され、化学的に非常に安定した化合物である。そのため、本来の利用が行われている限りは分解する等して環境に悪影響を及ぼすことは殆どないと考えられる。
一方、前記プラスチックは、その化学的安定性ゆえに、微生物により速やかな分解を受け難いとされている。そのため、プラスチック製品を使用後、環境中にそのまま廃棄すると、景観を汚す、野生動物を傷つける等の弊害を引き起こす。また、プラスチック製品をごみ焼却炉で焼却すると有毒ガスを発生する、あるいは、高温を発生して焼却炉を傷める等、様々な問題点がある。
【０００３】
生分解性プラスチックは、使用中は、前記プラスチックと同様な利用が可能であり、さらに、使用後は自然界の微生物によって水と二酸化炭素等の無機物に分解され得る。従って、上述したプラスチックを廃棄処分する際の問題点を解決できるものと期待されている。
【０００４】
そのため、生分解性プラスチックの実用化に向けた研究が進められている。生分解性プラスチックには、大別して、澱粉などの天然物を原料とするもの、微生物合成によるもの、及び、化学合成によるものがある。
【０００５】
脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックは、各種の微生物により産生されるとともに、化学合成によっても種々のものが得られ、また、汎用樹脂（前記プラスチック）に近い物性を持つために多方面での応用が考えられている。
この脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックの１つに、ポリヒドロキシブチレート（以下、「ＰＨＢ」と称する。）があり、微生物により産生される。
【０００６】
ＰＨＢを産生する微生物として、メタン資化細菌、メタノール資化細菌、及び、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌が知られている。これら細菌は、それぞれ、メタン、メタノール、糖を炭素源としてＰＨＢを菌体内に蓄積する。
【０００７】
メタノール資化細菌の場合、平均分子量が２０万程度のＰＨＢを生産可能であり、生分解プラスチックとして実用化されている。しかしながら、この程度の分子量のＰＨＢでは伸び率が低く脆いので、用途が限られてしまうという問題点があった（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００８】
一般に、プラスチックの伸び率は平均分子量が高いほど高くなる傾向にあるので、更に高分子のＰＨＢを蓄積可能な微生物が求められている。メタン資化菌の一種であるMethylocystis（メチロシスティス） sp. GB 25 DSMZ 7674では、分子量２５０万のＰＨＢを体内に蓄積することが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００９】
【非特許文献１】井上義夫監修、「グリーンプラスチック最新技術」、シーエムシー出版、２００２年６月、ｐ２７１−２９０
【００１０】
【非特許文献２】Ｋ.Ｄ.ウェンドラント（K.D.Wendlandt）、Ｍ.ジェコレック（M.Jechorek）、Ｊ.ヘルム（J.Helm）、及び、Ｕ.ストットメイスター（U.Stottmeister）、「メタンからの高分子量ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産」（“Producing poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular mass from methane.”）、Journal of Biotechnology 86 (2001) p127-p133
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、更に生分解性プラスチックとしての性能を高めるため、平均分子量の高いＰＨＢを生産する微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的を達成するための本発明のＰＨＢ生産菌の特徴構成は、請求項１に記載されているように、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含み、平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属の細菌である点にある。
【００１３】
上記特徴構成において、請求項２に記載されているように、前記ＰＨＢ生産菌が、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２５）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
発明者らは、上記課題を解決すべく、日本国内の温泉水を対象としてスクリーニングを行なった。この結果、従来知られているより高い平均分子量を有するＰＨＢを蓄積する新規微生物を分離することに成功し、本発明を完成させた。
【００１５】
即ち、本発明は、平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積可能なメタン資化細菌であるＰＨＢ生産菌に関する。具体的には、前記ＰＨＢ生産菌は、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属の細菌であり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含むメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２５）である。
前記メチロシスティス  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株を例に、本発明に係るＰＨＢ生産菌の入手方法及び性質を以下に示す。
【００１６】
日本各地の土壌及び温泉水から、高分子量のＰＨＢの生産可能な微生物の探索を行った。具体的には、土壌及び温泉水を試料とし、気相をメタン：空気＝１：１とした無機塩液体培地（表１を参照。）を用いて集積培養を行った。前記無機塩液体培地に1（重量）％になるように寒天を加えて作成した寒天培地を用意し、ここに増殖が観察された集積培養液を接種し、気相をメタン：空気＝１：１として固体培養を行った。尚、集積培養、固体培養とも３０℃で行った。
【００１７】
【表１】
2006320256.tif 000002
【００１８】
前記固体倍地上で単一株に分離された菌株（１０株）について、１６Ｓ ｒＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列を調べることで菌種の同定を行うとともに、生育最適温度、生育速度、ＰＨＢ蓄積率、蓄積ＰＨＢの平均分子量の測定を行った。
【００１９】
上記のスクリーニング操作により得られた菌株の中で、蓄積したＰＨＢの平均分子量が最も大きかったＩ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株の菌学的性質を以下に示す。また、この菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、公知の微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列との比較を行った。結果は以下の通りである。
【００２０】
（ａ）形態的性質
１．細胞の形状      ：球菌（無機塩液体培地）・桿菌状（無機塩液体培地）
２．細胞の大きさ    ：０．２〜０．４μｍ×０．６〜０．８μｍ
３．細胞の多形性    ：あり
４．運動性          ：なし
５．胞子形成        ：なし
【００２１】
（ｂ）培養的性質
１．使用培地        ：ＮＭＳ−ＶＣＲ培地（表２を参照。）
２．培養条件        ：２５℃、空気：メタン＝４：１（容積）、２５日目
３．直径            ：１ｍｍ
４．色調            ：薄いピンク
５．形              ：円状
６．隆起形状        ：半レンズ状
７．周縁            ：全縁
８．表面の形状等    ：スムーズ
９．透明度          ：不透明
１０．粘稠度          ：バター様
【００２２】
【表２】
2006320256.tif 000003
【００２３】
（ｃ）生理学的性質
１．グラム染色性    ：陰性
２．生育至適温度    ：２０〜３７℃
３．生育至適ｐＨ    ：６．９
４．酸素に対する態度：好気性
【００２４】
（ｄ）化学的性質
１．１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列：配列番号１に示す
２．系統的に最も近い菌：Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列を決定した。ＤＮＡ データベース（ＤＤＢＪ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴプログラムを用い、決定した１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列に基づいて相同性検索を行った。この結果、メチロシスティス・エキノイデス（Methylocystis echinoides）と本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は９８．９％、メチロシスティス・パルバス（Methylocystis parvus）と本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は９７．６％であった。他方、メチロシスティス属と近縁種であるメチロシナス（Methylosinus）属に分類される微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡと本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性は、最大でも９６．４％であった。従って、本菌株はメチロシスティス属に分類されるメタン資化菌であると判定した。
【００２５】
更に、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー  第１版」（Ｂｅｒｇｅｒｙ´ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８４））」等を参照にしたが、公知のメチロシスティス属細菌で平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積する菌株は公知ではなく、本菌株がメチロシスティス属に分類される新菌株であることが明らかになった。メチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａと命名された本菌株は、平成１７年２月２２日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２５として受領された。
【００２６】
尚、非特許文献２に開示されたＰＨＢを蓄積するメチロシスティス属の細菌については、菌学的性質及び１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列が開示された刊行物等を発見することができず、本発明に係るＰＨＢ生産菌を含めた他の菌との分類学的な比較はできなかった。しかし、生産するＰＨＢの分子量が、非特許文献２に開示されたメチロシスティス属の細菌では２５０万が上限であるのに対して、本発明に係るＰＨＢ生産菌は平均分子量３００万以上のＰＨＢを生産可能である点で異なり、これらは少なくとも別の菌株であると判断した。
【００２７】
ここで、ＪＩＳ  Ｋ７１２７に従って、平均分子量３００万のＰＨＢの弾性率と平均分子量２５０万のＰＨＢの弾性率とを比較したところ、前者は弾性率が３７９０ＭＰａであったのに対して、後者は３０３０ＭＰａであった。このように、公知の微生物産生ＰＨＢに比べて、本発明に係る微生物が産生したＰＨＢは弾性率が約２５％向上した。ＰＨＢの耐久性を向上させたり用途を拡大したりするためには弾性率を向上させることが重要であり、本発明に係るＰＨＢ生産菌は生分解性プラスチックとして非常に優れたＰＨＢを供給することができる。
【００２８】
本発明に係る１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含み、平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属の他のＰＨＢ生産菌は、前記メチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株と同様なスクリーニング方法によって入手することができる。又、上記微生物に公知の変異処理法（例えば、紫外線照射等）を施して得られ、平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属の変異体等も、本発明に係る微生物に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に本発明の実施の形態を、上掲の新規ＰＨＢ生産菌であるメチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ株を例に挙げて説明する。
【００３０】
前掲のスクリーニング方法により分離されたメチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ株は、公知のメタン資化菌と同様に培養できる。即ち、炭素源、窒素源、無機塩類を含有する通常の水性培地であり、炭素源としてメタンを必須とする。前記菌株の培地としては前記ＮＭＳ−ＶＣＲ培地が好適であるが、これに限定されるものではない。例えば、窒素源としては、非限定的に、カゼイン水解物、酵母抽出物、酵母自己消化物、酵母加水分解物、大豆粉、コーンスティープリカー、肉エキス等が使用できる。無機塩類としては、非限定的に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、マンガン、亜鉛、鉄、コバルト、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩等のイオンを放出し得る通常の塩が使用できる。好ましくは、培地のｐＨ６．５〜７．５、２０〜３７℃（３４℃が至適）で、振とう又は通気培養する。
【００３１】
培地雰囲気は、必須成分としてメタンを、例えば、１〜５０容量％程度、好適には１０〜５０容量％程度含む。また、メタン資化菌は偏性好気菌であるため、酸素を１〜５０容量％程度、好適には１０〜５０容量％程度、培地雰囲気に含ませなければならない。前記培地雰囲気は、前掲のメタン及び酸素の他、本発明のＰＨＢ生産菌の生育を妨げない範囲で、窒素、二酸化炭素等の他のガスが含まれることを許容する。例えば、空気：メタン＝４：１（メタン  約２０容積％、酸素  約１６容積％）の雰囲気で本発明に係るＰＨＢ生産菌を培養することができる。
【実施例１】
【００３２】
前記メチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ株の菌体内に蓄積されたＰＨＢの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。以下に、本発明の実施例を説明する。
【００３３】
〔ＰＨＢの産生〕
前記無機塩液体培地２００ｍＬに前記メチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ株を接種し、メタン：空気＝１：４のガスを４００ｍＬ／日の割合で供給しながら、７２時間（振とう又は静置）培養した。次いで、前記培地を遠心分離して菌体のみ採取し、凍結乾燥させた。この凍結乾燥菌体５gを乳鉢でよくすりつぶした後、クロロホルム３００ｍＬを加え、６０℃で５時間加熱した。ガラスフィルターに通して菌体残渣を除去した後、液体画分についてエバポレーター用いてクロロホルムを除去した。
その後、得られたフィルム状物質をメタノールで３回洗浄して脂肪等の不純物を除去したのち、エバポレーターを用いて残留メタノールを除去した。
【００３４】
〔ＰＨＢの平均分子量〕
得られたフィルム状物質をクロロホルムに溶解し、ゲル浸透クロマトグラフィ（以下、ＧＰＣと称する）を用いて、表３に示す条件で平均分子量を測定した。
【００３５】
【表３】
2006320256.tif 000004
【００３６】
ポリスチレンを分子量標準とし、ＧＰＣの結果得られたデータに基づいてＰＨＢの平均分子量を算出したところ、少なくとも３ｘ１０６であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明に係るＰＨＢ生産菌は平均分子量３００万以上の非常に分子量の高いＰＨＢを生産することができる。前記ＰＨＢ生産菌から得られたＰＨＢは伸び率が高いので、強度や耐久性に優れたプラスチックを提供することができる。
【配列表】
2006320256000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月24日(2005.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含み、平均分子量３００万以上のポリヒドロキシブチレートを蓄積可能なメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属のポリヒドロキシブチレート生産菌。
【請求項２】
メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２５）である請求項１に記載のポリヒドロキシブチレート生産菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
上記特徴構成において、請求項２に記載されているように、前記ＰＨＢ生産菌が、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２５）であることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
即ち、本発明は、平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積可能なメタン資化細菌であるＰＨＢ生産菌に関する。具体的には、前記ＰＨＢ生産菌は、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属の細菌であり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に配列番号１に記載の配列を含むメチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２５）である。
前記メチロシスティス  ｓｐ．  Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａ菌株を例に、本発明に係るＰＨＢ生産菌の入手方法及び性質を以下に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
更に、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー  第１版」（Ｂｅｒｇｅｒｙ´ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８４））」等を参照にしたが、公知のメチロシスティス属細菌で平均分子量３００万以上のＰＨＢを蓄積する菌株は公知ではなく、本菌株がメチロシスティス属に分類される新菌株であることが明らかになった。メチロシスティス  ｓｐ．Ｉ４３１−０２９ＩＩ−４Ａと命名された本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受領番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２５として受託された。