(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ迅速に、両毒素陽性株およびtoxin A陰性toxin B陽性株による感染症の診断が可能な、クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子検出方法およびそれに用いる技術を提供する。【解決手段】クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得る特定のプライマーセットを用意し、検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくＤＮＡを抽出し、または検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくＤＮＡを抽出し、または
検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項2に記載の方法。
【請求項４】
検体中に含まれる菌体の培養を、クックドミート培地を用いて行う請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検体中の菌体が、toxin A陽性toxin B陽性菌株、およびtoxin A陰性toxin B陽性菌株である場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
クロストリディウム・ディフィシルは、toxinotypeが0、I、III、IV、IX、XII、XVIII、XIX、XX、VIII、XVI、XVIIである場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
【請求項９】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項5に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
請求項8または9に記載のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法を用いたクロストリディウム・ディフィシル(Clostridium difficile)toxin B遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリディウム・ディフィシルは、抗菌薬使用と関連して発症する下痢症／腸炎の主要な原因菌である。院内感染の原因菌としても重要であることから、感受性、特異性が高く迅速な検出方法が必要である。
【０００３】
クロストリディウム・ディフィシルによる感染症の細菌学的診断方法には、以下のような方法がある。
１．Toxin A検出用検査キットによる糞便検体中のtoxin A検出
２．細胞培養および中和試験による糞便検体中のtoxin B検出
３．嫌気培養によるクロストリディウム・ディフィシルの分離培養と分離培養された菌の毒素産生能の同定
分離された菌株の毒素産生能の同定は、以下のように行われる。
１．液体培地で３日以上培養した後に、toxin A検出キットでtoxin Aを、細胞培養法でtoxin Bを検出
２．ＰＣＲ法により毒素遺伝子を検出
【０００４】
現在多くの日本の臨床検査室で施行されているのは、toxin A検出キットによる糞便中のtoxin A検出である。嫌気培養が可能である一部の検査室では培養検査が行われるが、分離菌株の毒素産生性を検討している検査室は非常に少ない。現在、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B産生性は、細胞培養法やPCR法によってしか同定できない。しかし、細胞培養やＰＣＲによる検査は、通常の臨床検査室では特殊な装置が必要であるために、臨床検査室では調べることができないのが実情である（非特許文献１および２）。
【非特許文献１】加藤はる (2003):クロストリディウム・ディフィシル毒素、臨床検査、47:169-174
【非特許文献２】加藤はる (2003):クロストリディウム・ディフィシル関連下痢症、JARMAM、14:121-126
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
クロストリディウム・ディフィシル菌株には、toxin Aとtoxin Bの両毒素を産生する菌株、toxin A陰性:toxin B陽性菌株、およびどちらも産生しない菌株が存在する。toxin A陰性、toxin B陽性菌株も両毒素陽性株と同様に、腸炎／下痢症を引き起こすことが分かっている。従来行われている方法では、以下の点が問題である。
【０００６】
１．糞便中toxin A検出では、toxin A陰性toxin B陽性株による感染症は診断できない。
２．菌が分離培養された場合、toxin Aキットの使用により、toxin A産生性の検討は可能であるが、toxin B産生性を調べることはできない。そのため、toxin A陰性toxin B陽性株の同定はできない。
３．分離菌株のtoxin A産生性を検討するためには液体培地で３日以上嫌気培養する必要があり、時間がかかる。
【０００７】
そこで本発明は、簡便かつ迅速に、両毒素陽性株およびtoxin A陰性toxin B陽性株による感染症の診断が可能な、クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子検出方法およびそれに用いる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために、LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification)を利用した、クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子の検出について、種々検討した。クロストリディウム・ディフィシルのtoxin Aおよびtoxin Bをコードする遺伝子は調節を司る3種類の遺伝子とともにphathogenicity locus(PaLoc)を形成していることが知られている。さらに、このPaLocには、菌株による多様性があることも報告されている。報告されている変異PaLocの数は20種類以上である。(非特許文献１)
【０００９】
このように、多種類に及ぶ変異PaLocが存在するクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を、菌株の種類によらず確実に検出することが、本発明の目的でもある。本発明者らは、この点を考慮して、LAMP法で使用できるプライマーセットの開発を試み、特定の配列を有するプライマーセットを用いることで、簡便かつ迅速に、両毒素陽性株およびtoxin A陰性toxin B陽性株による感染症の診断が可能な、クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子検出方法が実現できることを見いだして、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
[請求項1]クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくＤＮＡを抽出し、または
検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む
検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法。
[請求項2]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む請求項1に記載の方法。
[請求項3]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項2に記載の方法。
[請求項4]検体中に含まれる菌体の培養を、クックドミート培地を用いて行う請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
[請求項5]増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認する請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
[請求項6]検体中の菌体が、toxin A陽性toxin B陽性菌株、およびtoxin A陰性toxin B陽性菌株である場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
[請求項7]クロストリディウム・ディフィシルは、toxinotypeが0、I、III、IV、IX、XII、XVIII、XIX、XX、VIII、XVI、XVIIである場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
[請求項8]検体中の菌体に含まれるクロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
[請求項9]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項5に記載のプライマーセット。
[請求項10]請求項8または9に記載のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のクロストリディウム・ディフィシル毒素遺伝子検出方法は、分離された菌株における毒素産生性を検討する上で以下の点で優れている。
１．菌株におけるtoxin B産生能を調べる場合、ＤＮＡ抽出ステップも含めて、例えば、1.5時間以内にtoxin B遺伝子の存在を調べることが可能である。
２．糞便検体からtoxin B遺伝子を検出する場合、ＤＮＡ抽出ステップも含めて、例えば、３時間以内に解析が可能である。
３．LAMP法を用いるため、増副産物の有無を濁度測定により、あるいは試薬を反応液に加え蛍光目視検出による増副産物の有無の判定が可能であり、電気泳動による判定に比べて短時間での判定が可能である。
４．両毒素陽性株およびtoxin A陰性toxin B陽性株の両方のtoxin B陽性株を同定できる。
５．ＰＣＲ法で必要なサーマルサイクラーや電気泳動装置等が必要ない。
６．細胞培養法で必要な培養細胞および必要な実験装置が必要ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
（１）クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
（２）検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくＤＮＡを抽出し、または検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からＤＮＡを抽出する。
（３）抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
（４）増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。
【００１３】
[プライマーセット]
本発明の方法では、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。前述のように、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子はPaLocに存在するが、PaLocは、菌株の種類によって、他種類の変異が存在する。本発明では、このような多種類の変異PaLocが存在するにも関わらず、菌株の種類によらず確実にtoxin B遺伝子を検出することを目的とする。このような目的を達成するという観点からは、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットとしては、例えば、以下の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００１４】
クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子の塩基配列（部分）を図1に示す。図1に示すセンス鎖を配列番号7に、アンチセンス鎖を配列番号8に示す。図1には、toxin B遺伝子の塩基配列と本発明のプライマーセットの各ＤＮＡとの関係を示す。以下の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることで、クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子の一部のＤＮＡをLAMP法により増幅することができる。増幅されるＤＮＡの最小単位は206bpと計算されるが、LAMP法ではＤＮＡがカリフラワー様に増幅するので、実際には206bp以外の様々なサイズの遺伝子が増幅される。
【００１５】
HK101(FIP): 配列番号１
5'-CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT-3'
HK101(BIP): 配列番号２
5'-GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC-3'
HK101(F3): 配列番号３
5'-GTATCAACTGCATTAGATGAAAC-3'
HK101(B3): 配列番号４
5'-CCAAAGATGAAGTAATGATTGC-3'
【００１６】
本発明の方法では、上記4種類のプライマーは、それぞれ上記で示した全配列を有することが、検体中にtoxin B遺伝子が存在する場合、toxin B遺伝子を菌株の種類によらず確実に増幅するという観点から好ましい。但し、各プライマーともその一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、同様のプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号1〜4のいずれかの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅することができるプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部または全部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００１７】
本発明のプライマーセットは、前記４種類のＤＮＡに加えて、以下のＤＮＡ（ｌｏｏｐプライマー）をさらに含むことができる。
HK101(Loop-F): 配列番号５
5'-AATAGTTGCAATTATAGG-3'
HK101(Loop-B): 配列番号６
5'-AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG-3'
【００１８】
本発明の方法において、プライマーセットは、上記ｌｏｏｐプライマーを含まなくても、toxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅することはできる。しかし、上記ｌｏｏｐプライマーを含む場合の方が、増幅時間を大幅に短縮でき、好ましい。
【００１９】
上記ｌｏｏｐプライマーにおいても、各プライマーの一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、ｌｏｏｐプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号５または６の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつtoxin B遺伝子の少なく一部をLAMP法によって増幅する際のｌｏｏｐプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００２０】
尚、本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、より好ましくは１から３個、さらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個を意味する。
【００２１】
本発明の上記プライマーセットを構成する各ＤＮＡは、前記塩基配列に基づいて、既知のＤＮＡ調製方法により適宜入手することができる。
【００２２】
本発明は、上記プライマーセットを用いる、クロストリディウム・ディフィシルのtoxin B遺伝子の検出方法に関するが、本発明は、上記プライマーセット自体を発明として包含する。さらに本発明は、上記本発明のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるクロストリディム・ディフィシルのtoxin B遺伝子をLAMP法により検出するためのキットも包含する。
【００２３】
本発明のプライマーセットは、例えば、1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量の前記4種類または6種類のプライマー(ＤＮＡ)を含む形態であることができる。1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量のプライマー(ＤＮＡ)量は、例えば、5 〜 40 pM / 反応チューブの範囲である。
【００２４】
[ＤＮＡ抽出]
本発明の方法では、検体中に含まれる菌体から、菌体を培養することなくＤＮＡを抽出するか、または検体中に含まれる菌体を培養し、培養した菌体からＤＮＡを抽出する。具体的には、DNA抽出のステップとして以下の３つの方法を挙げることができる。
【００２５】
１．糞便検体から分離培養（通常はサイクロセリン・セフォキシチン・マニトール寒天培地などの選択培地を用いて嫌気培養を行う）された菌株からDNA抽出を施行しDNAテンプレイトとする。具体的には、平板培地上のコロニーをかきとり、蒸留水あるいはバッファーに懸濁し、15分間95℃でインキュベートし、遠心した上清をDNAテンプレイトとして用いる。
【００２６】
２．糞便検体から培養ステップを経ずにDNAを抽出し、DNAテンプレイトとする。具体的には、市販のDNA抽出キットを用いて糞便検体から直接DNAを抽出する。
【００２７】
３．検体中に含まれる菌体の培養を、クックドミート培地を用いて行う。クックドミート培地とは、牛肉片の入った液体培地で、特に芽胞を形成するクロストリディウムの培養や保存によく用いられる。嫌気下で培養を行うことなく、クロストリディウムの培養が可能である。嫌気培養や糞便検体からのDNA抽出のような、設備と手間のかかる方法は一般の臨床検査室では難しい場合が多い。それに対して、クックドミート培地を用いた方法は、嫌気状態にする実験装置（嫌気チェンバーや嫌気パウチなど）やキット使用による糞便検体からのDNA抽出を必要としないので、上記1や2の方法が不可能な検査室での診断検査を可能とする。具体的には、糞便検体をクックドミート培地に滅菌綿棒で接種し、一晩好気下で培養を行う。培養液を遠心し沈査に蒸留水あるいはバッファーを加えて懸濁し、15分間95℃でインキュベートし、遠心した上清をDNAテンプレイトとして用いる。
【００２８】
[LAMP法による増幅]
本発明の方法では、抽出したＤＮＡ（DNAテンプレイト）を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水）を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイトを加える。次いで、例えば、62℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
【００２９】
[増幅されたＤＮＡの確認]
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中にtoxin B遺伝子が含まれている場合、増幅操作によりtoxin B遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中にtoxin B遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるＤＮＡはない。
【００３０】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認することができる。増幅産物の濁度の測定は、具体的には、以下のように行うことができる。リアルタイム濁度測定装置により経時的に、あるいは濁度測定装置により最終増幅産物の濁度を測定する。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、UVランプを当てることにより目視で反応液の蛍光発色を観察することで行うことができる。
【００３１】
本発明の方法では、検体中の菌体が、toxin A陽性toxin B陽性菌株、およびtoxin A陰性toxin B陽性菌株である場合には、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる。従来の方法(普及しているtoxin A検出用キット)では、toxin A陽性toxin B陽性菌株は検出できても、toxin A陰性toxin B陽性菌株は検出できなかった。しかし、本発明の方法によれば、toxin A陰性toxin B陽性菌株であるかも検出できる。但し、本発明では、toxin B遺伝子のみを対象としているので、toxin A陽性toxin B陽性株とtoxin A陰性toxin B陽性株の区別はできない。糞便検体から抽出したDNAにおけるLAMP法では、toxin A陽性toxin B陽性菌株だけでなくtoxin A陰性toxin B陽性株のtoxin B遺伝子の検出が可能であり、分離菌株におけるLAMPにおいては、toxin A陽性／陰性にかかわらず、toxin B陽性クロストリデイウム・ディフィシルの同定が可能である。
【００３２】
さらに前述のように、クロストリディウム・ディフィシルの菌株の種類によって、PaLoc種々の変異が存在するが、上記プライマーセットを用いる本発明の方法では、クロストリディウム・ディフィシルのtoxinotypeが0、I、III、IV、IX、XII、XVIII、XIX、XX、VIII、XVI、XVIIである場合に、toxin B遺伝子が増幅されて検出できる。
【００３３】
本発明は、前記方法で説明したプライマーセットを包含する。さらに、本発明は、本発明のプライマーセットを含むキットも包含する。キットに含まれるものは、例えば、以下の物であることができる。
１．Bst DNAポリメラーゼ
２．反応バッファー
３．dNTPs
４．プライマーセット(本発明のプライマー)
５．コントロールDNA（陽性コントロール）
６．反応チューブ
７．説明書
【００３４】
前述のように、本発明の方法では、ＤＮＡの増副産物の有無を濁度測定または蛍光目視検出により行うことができる。蛍光目視で検出する場合は、上記キットに蛍光目視試薬を含めることができる。濁度測定装置を使用する場合には、キットには蛍光目視検出試薬は含めない。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
１．原理と方法
（１）遺伝子増幅と検出
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)法により遺伝子を増幅し、反応液の濁度変化によって増幅を検出し、電気泳動により確認した。
（２）使用したプライマー
配列番号1〜6のＤＮＡを含むプライマーセット
【００３６】
増幅反応は、以下の条件で行った。
25μｌ反応液中
Tris HCl (pH8.8)          20mM
KCl                       10mM
MgSO4                      8mM
(NH4)2SO4                 10mM
Tween20                   0.1%
ベタイン                  0.8M
dNTPs                    1.4mM
Bst DNAポリメラーゼ     1.0μｌ
プライマー
FIP                       40pM
BIP                       40pM
Loop-F                    20pM
Loop-B                    20pM
F3                         5pM
B3                         5pM
テンプレートDNA   1〜2μｌ (100ng〜1pg)
インキュベーション温度：62℃
【００３７】
実施例1 
標準菌株2株における解析
使用菌株：VPI 10463株（toxin A陽性toxin B陽性株）
DNA量25ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え経時的に濁度を測定した。濁度測定装置として栄研化学のLA-320Cを使用した。結果を図2に示す。
さらに、5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図3に示す。
図2および3に示す結果から、DNA量25ng〜0.25pg/25μl反応液 (lanes 1-6)で30分〜1時間のインキュベーションで増幅反応が認められた。
【００３８】
使用菌株：GAI 95601株（toxin A陰性toxin B陽性株）
DNA量35ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え経時的に濁度を測定した。結果を図4に示す。5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図5に示す。これらの結果から、DNA量35ng〜0.35pg/25μl反応液 (lanes 1-6)で、30分〜１時間のインキュベーションで増幅反応が認められた。
【００３９】
実施例2
臨床分離株における解析例
臨床分離株34株における、toxin A産生性、toxin B産生性、およびPCRによるtoxin B遺伝子検出および本発明によるtoxin B遺伝子検出法の結果を表1に示す。臨床分離株34株は、以下の表１に示す。
【００４０】
【表１】
2006333785.tif 000002
【００４１】
分離菌株からPCRおよびLAMPによってtoxin B遺伝子を検出する場合、DNAは同一のDNAサンプルを使用した。すなわち、寒天平板上のコロニーをかきとり、バッファーに懸濁し15分間95℃でインキュベートしたものを遠心し、その上清をDNAテンプレイトとして用いた。PCRによるtoxin B遺伝子検出は、Kato, H. et al. 1998. Identification of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficile by PCR. J Clin Microbiol 36: 2178-82.に記載の方法を用いた。
【００４２】
【表２】
2006333785.tif 000003
【００４３】
aToxin Aおよびtoxin B産生性は、クロストリディウム・ディフィシルをブレインハートインフュージョン液体培地にて３日間嫌気培養した培養液において、抗toxin Aモノクローナル抗体を使用したキットによりtoxin Aを、抗toxin B抗体による中和試験を伴う細胞培養法によりtoxin Bを検出した。
b検討菌株数。
【００４４】
上記で検討した34株については、toxin B陽性株の同定において、LAMPによる同定結果は、他の方法による同定結果と完全に一致した。
【００４５】
実施例3
糞便検体から抽出したDNAにおける解析例
27検体における糞便検体中毒素検出、クロストリディウム・ディフィシル培養、およびLAMPによる検体からのtoxin B遺伝子検出(本発明の方法)の結果の比較を表2に示す。本発明によるtoxin B遺伝子検出法は、DNA量 約5〜20 ng/μlで行った。
【００４６】
クロストリディウム・ディフィシル培養
糞便検体を同量の99%エタノールを加え、30分間室温でインキュベートした。予備還元したセフォキシチン・サイクロセリン・マニトール培地(CCMA)にこの混合物を0.1ml接種し、48時間嫌気培養した。認められた黄色のコロニーをCCMA培地に継代し、コロニー形態、グラム染色、クロストリディウム・ディフィシルのグルタメートデヒドロゲナーゼを検出するラッテクス凝集反応（CDチェック、シオノギ）による反応などにより同定した。
【００４７】
糞便からのDNA抽出
QIAamp DNA stool mini kit （キアゲン）を使用した。
【００４８】
【表３】
2006333785.tif 000004
【００４９】
a糞便検体中toxin Aは、抗toxin Aモノクローナル抗体を使用したキット(ユニクイック（関東化学）)により検出した。
【００５０】
b糞便検体中toxin Bは、抗toxin B抗体を用いた中和試験を伴う細胞培養法で検出。
(Wilkins, T. D. and Lyerly, D. M. 2003. Clostridium difficile testing: after 20 years, still challenging J Clin Microbiol 41: 531-4. Borriello, S.P. et al. 1992. Molecular, immunological, and biological characterization of a toxinA-negative, toxin B-positive strain of Clostridium difficile. Infect Immun 60:4192-9.)
【００５１】
c菌株の毒素産生能はPCRによる毒素遺伝子検出により同定。A+B+, toxin A陽性toxin B陽性; A-B+, toxin A陰性toxin B陽性。
【００５２】
検討した27検体中、細胞培養法(gold standard)でtoxin B陽性であった検体は17検体で、そのうち16検体でLAMP法によるtoxin B遺伝子検出が陽性であった。細胞培養法でtoxin B陰性であった９検体は、LAMP法によるtoxin B遺伝子検出も陰性であった。検体中のToxin A陽性であった13検体では、すべての検体においてtoxin A陽性toxin B陽性株が分離培養され、LAMP法によるtoxin B遺伝子検出も陽性であった。Toxin A陰性toxin B陽性株が分離された検体(no.27)では、検体中toxin A陰性、toxin B陽性で、LAMP法によるtoxin B遺伝子検出は陽性であった。
【００５３】
クロストリディウム・ディフィシル培養法の結果と比較すると、培養陽性であった19検体中17検体でLAMP法によるtoxin B遺伝子検出陽性であった。分離培養された菌株の毒素産生能を調べたところ、18検体ではtoxin A陽性toxin B陽性株が、１検体(no.27)でtoxin A陰性toxin B陽性株が分離された。
【００５４】
（１）LAMP法による検体からのtoxin B遺伝子検出は、細胞培養法による検体中toxin B検出とほぼ同等の感度であった。
（２）細胞培養法のよる検体中toxin B検出は、検査に24時間あるいは48時間かかるが、LAMP法では2〜3時間以内に検査可能であった。(サンプル数が少なければ2時間で可能である)
（３）Toxin A検出キットでは検出できないtoxin A陰性toxin B陽性菌株が分離された検体においても、LAMP法では検出可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、診断分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】クロストリディウム・ディフィシルtoxin B遺伝子（部分）を示す。
【図２】リアルタイム濁度測定装置LA320-C（栄研化学）による濁度測定結果。VPI 10463株についてDNA量25ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え解析した結果を示す。
【図３】最終増幅産物の5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動像。VPI 10463株についての5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】リアルタイム濁度測定装置LA320-C（栄研化学）による濁度測定結果。GAI 95601株についてDNA量35ng/μlから10倍希釈系列を作製し、各々のDNA 1μlを25μl反応液に加え解析した結果を示す。
【図５】最終増幅産物の5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動像。GAI 95601株についての5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月3日(2005.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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