(57)【要約】【課題】アルツハイマー病等による記憶・学習障害の改善に有効な、学習記憶の促進作用を有する物質を得ることが本発明の課題である。【解決手段】Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは学習記憶の促進作用を有している。よって本発明により学習記憶促進剤として有用な機能性ペプチド、および上記ペプチドを用いて学習記憶を促進する方法が与えられた。本発明のペプチドは優れた機能性ペプチドであり、アミノ酸残基が短くて特殊なアミノ酸も含まれていないために、安価に調製することができ、安全性が高い素材であり、更には経口投与で有効であるという利点も有する。【選択図】図１
2006016347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、学習記憶促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の学習記憶促進剤を有効成分として含有する医薬品。
【請求項３】
請求項１記載の学習記憶促進剤を有効成分として含有する機能性食品。
【請求項４】
請求項１記載の学習記憶促進剤を有効成分として含有する栄養補助食品。
【請求項５】
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを用いて学習記憶を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有する学習記憶促進剤に関する。更に本発明は、そのペプチドを用いて学習記憶を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会の高齢化に伴い、アルツハイマー性の記憶・学習障害の患者は今後30〜40年の間に３倍に達すると言われている。そこで、その様な疾患を治療ないし予防するための手段が求められている。そのような状況の下で、学習記憶機能を促進する機能性ペプチドについてこれまでにいくつかの特許出願が行われている（特開平９−１２５９７号公報）。
【０００３】
しかし特開平９−１２５９７号公報に係るペプチドは酸性線維芽細胞増殖因子の１−２９アミノ酸残基フラグメントの１６位アミノ酸システインが他のアミノ酸で置換されたペプチドフラグメントであり、アミノ酸残基数が長い。
【０００４】
ところでエンテロスタチンは、脾臓のプロコリパーゼがトリプシンによってコリパーゼに変換される際にアミノ末端から派生する5残基の内因性ペプチドであり、高脂肪食給餌ラットにおいて摂食抑制作用およびインスリン分泌抑制作用を有することが既に知られている。ラットのエンテロスタチンの配列はＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｒｇおよびＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである。一方、ヒト及びマウスのエンテロスタチンはＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのみである。
【０００５】
本発明者らは上記のラット型エンテロスタチン（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）が生体に及ぼす効果について検討し、そのペプチドおよびそのフラグメントがスコポラミンにより誘導された健忘症の予防・改善と血清コレステロール低下に有効である事を見出し、その知見について特許出願を行っている（特開２００２−８０３９３号公報）。またヒト型エンテロスタチン（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）については、コレステロール低下作用と抗鎮痛作用があることを本発明者らは報告している（農芸化学会２００３年度大会予稿集）。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１２５９７号公報
【特許文献２】特開２００２−８０３９３号公報
【非特許文献１】農芸化学会２００３年度大会予稿集（平成１５年３月１５日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
学習記憶機能を増強するペプチドについて、特開平９−１２５９７号公報及び特開２００２−８０３９３号公報などの知見があるにも関わらず、アルツハイマー性あるいは非アルツハイマー性の記憶・学習障害の病態やその発現態様には個人差が大きい事を考えると、かかる病態を改善することができる活性を有する物質が更に求められている。また、老人性疾患に有効な物質は長期間服用することが必要であることを考えると、かかる物質は安全性が高く且つ経口投与が可能であることが望ましい。よって、そのような利点を有する学習記憶機能促進ペプチドを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ヒト型エンテロスタチンＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＡＰＧＰＲ）が学習記憶に対して及ぼす作用はこれまで検討されていなかった。よって本発明者らはそのペプチドに注目して検討した結果、ヒト型エンテロスタチン（ＡＰＧＰＲ）は学習記憶の促進に有効であることが見出された。上記で述べたように当該ペプチドは血清コレステロール低下作用を持つ事が知られており、高齢化社会が急速に進展している事を考えると、かかる機能を併せ持つ学習記憶促進ペプチドが本発明により提供された事の意義は非常に大きいと考えられる。
【０００９】
なお、ラット型エンテロスタチンはスコポラミン誘導健忘ラットには有効であったが、正常ラットに対しては学習記憶促進作用を示さなかった。本発明のヒト型エンテロスタチン（ＡＰＧＰＲ）は正常ラットの学習記憶を促進した事から、本発明のヒト型エンテロスタチンとラット型エンテロスタチンの効果は本質的に異なると考えられる。
【００１０】
よって本発明は、ＡＰＧＰＲで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、学習記憶促進剤を提供するものである。更に本発明は、ＡＰＧＰＲで表されるペプチドを投与することにより、学習記憶を促進する方法も提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
ＡＰＧＰＲは学習記憶の促進作用を有している。よって本発明により学習記憶促進剤として有用な機能性ペプチド、および上記ペプチドを用いて学習記憶を促進する方法が与えられた。本発明のペプチドは優れた機能性ペプチドであり、アミノ酸残基が短くて特殊なアミノ酸も含まれていないために、安価に調製することができ、更に経口投与で有効であるという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記で述べたように本発明は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする学習記憶促進剤と、そのペプチドを投与することにより学習記憶を増強させる方法を提供するものである。本発明のペプチドの学習記憶増強剤を用いて、医薬品、機能性食品、栄養補助食品（いわゆるサプリメント）を開発することが可能である。ここでＡｌａはアラニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｇｌｙはグリシン、Ａｒｇはアルギニンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【００１３】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ)等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００１４】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１５】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１６】
次に医薬品として用いる場合について説明する。本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい。本発明の学習記憶促進ペプチドは、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１７】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１８】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１９】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００２０】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２１】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００２２】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２３】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２４】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００２５】
更に本発明の学習記憶促進剤を、機能性食品や栄養補助食品（いわゆるサプリメント）の形で投与することも本発明の一態様である。本発明の学習記憶増強剤を一般に飲食されている物や調味料などの中に配合することが可能であり、そのような飲食物は通常の方法で製造されるものであって特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、新規ペプチドについて以下のように合成を行った。
【００２８】
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。
【００２９】
得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００３０】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを得た。本品をプロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製４９２Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。
【００３１】
（学習促進作用の評価）
学習能に対するペプチドの効果を、ステップスル−装置を用いた受動的回避実験により検討した。ｄｄｙマウス（オス、体重１８−２０ｇ）を明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電流（０．１２ｍＡ）を与えて、暗室が危険なことを教育する（訓練試行）。訓練試行直後にＡＣＳＦ（人工脳質髄液）に溶解した本発明のペプチド（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ：ＡＰＧＰＲ）を３、１０、３０または１００ｎｍｏｌ／マウスの用量で側脳質内投与し、トレーニングから２４時間後にテスト試行を行った。
【００３２】
即ちマウスを再び同じ装置に入れ、明暗に止まっている時間を測定することにより、本発明のペプチドの有無におけるマウスの学習能を比較した。なおＡＣＳＦのみを投与したマウスをコントロールとした。なおＡＣＳＦの組成は、１３８．９ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、４．０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５．６ｍＭ  グルコースからなり、ｐＨは７．４である。
【００３３】
ＡＰＧＰＲを側脳質内投与（３ｎｍｏｌ／マウス、１０ｎｍｏｌ／マウス、３０ｎｍｏｌ／マウス、１００ｎｍｏｌ／マウス）することによる影響を検討した（図１）。即ち、ケージの明室へ入れられたマウスが暗室へ移動するまでの時間（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｔｅｎｃｙ：ｓｅｃ）を指標として、上記ペプチドの学習促進作用を検討した結果を図１に示す。マウスは暗室へ移動する性質を有しているが、学習により暗室が危険である事を記憶していると明室に留まるので、マウスが学習した場合にはｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈｌａｔｅｎｃｙが長くなる。
【００３４】
図１の結果より、ＡＰＧＰＲを投与することによりｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｔｅｎｃｙは延長され、よって本発明のペプチドを投与することによりマウスの学習能が促進していることが示された。なお６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マン  アンド  ホイットニ−（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、１０ｎｍｏｌ／マウスの用量でＡＰＧＰＲを側脳質内投与した群において、コントロール（ＡＣＳＦ）と比較した有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００３５】
更に、ＡＰＧＰＲを経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ）することによる影響を検討した（図２）。図２の結果においても、ＡＰＧＰＲ投与群においてｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｔｅｎｃｙは延長され、本発明のペプチドを投与することによりマウスの学習能が増強されていることが示された。なお６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マン  アンド  ホイットニ−（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、３００ｍｇ／ｋｇの用量でＡＰＧＰＲを経口投与した群において、コントロールと比較した有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００３６】
既に述べたように、ラット型のエンテロスタチン（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ：ＶＰＤＰＲ）はコレステロール低下作用及びスコポラミン処理したマウスに対する抗健忘作用を有するが、正常マウスに対して学習記憶促進作用は示さない。その点で、正常動物の学習記憶を促進する本発明のヒト型エンテロスタチン（ＡＰＧＰＲ）の作用は、ラット型エンテロスタチンとは明らかに異なっている。
【００３７】
なおデータは示さないが、ＡＰＧＰＲの学習記憶促進作用は、コレシストキニンのアンタゴニストであるｌｏｒｇｌｕｍｉｄｅを投与することにより抑制された。この結果から、ＡＰＧＰＲの作用はコレシストキニンを介したものであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
ＡＰＧＰＲは学習記憶の促進作用を有している。よって本発明により学習記憶促進剤として有用な機能性ペプチド、および上記ペプチドを用いて学習記憶を促進する方法が与えられた。本発明のペプチドはアミノ酸残基が短くて特殊なアミノ酸も含まれていないために、安価に調製することができ、安全性が高い素材であり、更には経口投与で有効であるという利点も有する。よって本発明のペプチドは、医薬品、機能性食品、サプリメントとして利用される大きな可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明のペプチドを脳室内投与することによるｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｔｅｎｃｙの変化を示したグラフである。＊はｐ＜０．０５の有意差を表す。
【図２】図２は、本発明のペプチドを経口投与することによるｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｔｅｎｃｙの変化を示したグラフである。＊はｐ＜０．０５の有意差を表す。
【図１】
2006016347.tif 000003
【図２】
2006016347.tif 000004