(57)【要約】【課題】病原体のビルレンスを試験するためのより時間効率的でありかつコスト効率の良い代替の試験宿主系の提供。【解決手段】宿主生物に対する病原体のビルレンスを評価するための方法であって、該方法は、以下：（ａ）単細胞試験生物の培養物を、該病原体に対して曝露する工程；および（ｂ）該病原体の存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程であって、ここで、該試験生物の増殖の阻害は、該宿主生物に対する該病原体のビルレンスを示す、工程を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主生物に対する病原体のビルレンスを評価するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）単細胞試験生物の培養物を、該病原体に対して曝露する工程；および
（ｂ）該病原体の存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程であって、ここで、該試験生物の増殖の阻害は、該宿主生物に対する該病原体のビルレンスを示す、工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主生物の病原体または毒素のビルレンスを評価する方法に関する。本発明はさらに、宿主生物に対する病原体または毒素のビルレンスを減少する組成物を同定する方法に関する。本発明はまた、宿主生物に対して病原性である毒素または因子をコードする遺伝子を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
病原は、病原体と宿主細胞との相互作用を含む。植物または動物における病原に影響を与える因子もまた、下等真核生物における病原に影響を与え得ることが、示されている。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の同じ細菌性ビルレンス因子（これは蠕虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に影響を与える）はまた、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに影響を与え、そして哺乳動物マウスアッセイにおいてビルレンスを示す（ＷＯ９８／５００８０）。また、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを宿主生物として使用する一般的なビルレンス遺伝子を同定するための方法が、病原性因子のビルレンスを抑制する化合物を同定するために記載されている（ＷＯ９８／５００８０）。
【０００３】
しかし、多細胞生物を使用してビルレンスを試験するためのアプローチは、時間がかかりかつ高価である。さらに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのような生物の使用は、蠕虫がクチクラにより取り囲まれ、そしてその消化管の裏側に寄生栄養膜があるため、病原体と宿主細胞との間の直接接触が全く存在しないという事実により、不利である。これらのバリアは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓビルレンス試験の使用を、蠕虫と接触し得かつその生理学を強力に妨害し得る、拡散可能な因子の評価に制限する。多くの病原体（例えば、細菌病原体）は細胞内で作用するので、重大な制限が存在する。ビルレンス試験におけるＣ．ｅｌｅｇａｎｓの使用はまた、培養の高いコストおよびその生物をスクリーニング試験のために増殖および調製するのに必要な時間により制限される。さらに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのような生物を用いた場合の試験結果の解読は、その生物の複雑性に起因して、困難であり得る。哺乳動物宿主における病原性の評価は、なおさらに時間がかかりかつ高価である。
【０００４】
従って、病原体のビルレンスを試験するためのより時間効率的でありかつコスト効率の良い代替の試験宿主系の必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、単細胞宿主生物に対する病原体または毒素のビルレンスを評価するための方法を提供する。単細胞試験宿主生物（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）の宿主モデルとしての使用は、いくつかの利点を提供する。第１に、単細胞試験宿主生物系の単純さおよび再現性は、哺乳動物系および他の非哺乳動物系の単純さおよび再現性を越える。第２に、単細胞試験宿主系は、宿主−病原体の関連性を分析するための強力な遺伝系を表す。実際に、有効な遺伝子ツールが利用可能であり、病原体に対する感受性が増加または減少した単細胞試験宿主変異体の単離、および対応する遺伝子の同定を可能にする。従って、本発明は、病原体および／または毒素のビルレンスを評価するためのより時間効率的かつコスト効率の良いモデルを提供する。
【０００６】
本発明によると、宿主生物に対する病原体または毒素のビルレンスは、単細胞試験宿主生物を病原体または毒素に曝露し、試験宿主生物の増殖をモニタリングすることによって評価される。病原体または毒素のビルレンスは、単細胞試験宿主生物の増殖の阻害の効率のレベルに比例する（すなわち、病原体または毒素が単細胞試験宿主生物の増殖をより効率的に阻害すればするほど、病原体または毒素のビルレンスは高くなる）。一実施形態において、一定量の試験宿主生物細胞が、種々の濃度（例えば、段階希釈）の病原体または毒素と共にインキュベートされる。代替の実施形態において、種々の量の試験宿主生物（例えば、段階希釈）が、一定濃度の病原体または毒素を用いて評価される。
【０００７】
別の局面において、本発明はさらに、２つの病原体の単細胞試験宿主生物に対するビルレンスを比較するための方法を提供する。この方法は、単細胞試験宿主生物の別個の培養物を、２つの病原体に曝露し、各培養物の増殖をモニタリングする工程を包含する。２つの病原体により誘導される増殖阻害のレベルが比較され、そしてより高い阻害レベルを示す病原体は、単細胞試験宿主生物に対するより高いビルレンスを有する。
【０００８】
なお別の局面において、本発明は、試験宿主生物に対する病原体または毒素の毒性を減少する組成物を同定するための方法を提供する。この方法は、候補組成物の存在下および非存在下で独立して、病原体または毒素に単細胞試験宿主生物を曝露する工程；ならびにその後、その単細胞試験宿主生物の増殖をモニターする工程を包含する。その候補組成物の非存在下よりも高レベルの、その候補組成物の存在下でのその単細胞試験宿主生物の増殖は、その候補組成物が、その単細胞試験宿主生物に対するその病原体の毒性を減少することを示す。
【０００９】
本発明のなお別の局面において、宿主生物に対する病原体または毒素である因子をコードする遺伝子が、試験生物または試験生物の生成物の存在下および非存在下での単細胞試験宿主生物の増殖を、既知の遺伝子変化または同定可能な遺伝子変化と比較することによって、同定され得る。
【００１０】
本発明の方法は、単細胞試験宿主生物の増殖または健康に影響するいかなる毒性因子をも同定および評価する際に有用である。１つの実施形態において、その試験宿主生物は、２つ以上の濃度の病原体または毒素に曝露される。代替の実施形態において、２つ以上の濃度の試験宿主生物が、単一の濃度の病原体または毒素に曝露される。
【００１１】
本発明の方法のために、好ましい単細胞試験宿主生物は、アメーバ種（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種、またはＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種であるがこれらに限定されない）である。好ましいアメーバは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍであり、好ましくはＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍであり、より好ましくはＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１である。その病原体は、細菌、マイコバクテリウム、真菌、および単細胞真核生物であり得る。その病原体は、細胞外病原体であっても、または細胞内病原体（例えば、効率的に殺傷されない細菌）であってもよい。細菌病原体としては、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。その病原体の毒性は、クオラムセンシング（ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ）経路により誘発され得る。病原性マイコバクテリアとしては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられる。病原性真菌としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる
。病原性単細胞真核生物としては、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉが挙げられる。
【００１２】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下に提供される発明の詳細な説明から明らかである。
本発明によって、以下が提供される；
（項目１）  宿主生物に対する病原体のビルレンスを評価するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）単細胞試験生物の培養物を、該病原体に対して曝露する工程；および
（ｂ）該病原体の存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程であって、ここで、該試験生物の増殖の阻害は、該宿主生物に対する該病原体のビルレンスを示す、工程を包含する、方法。
（項目２）  前記試験生物が、アメーバである、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記アメーバが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種またはＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種である、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記アメーバが、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種である、項目２に記載の方法。
（項目５）  前記Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍである、項目４に記載の方法。
（項目６）  Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍが、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１である、項目５に記載の方法。
（項目７）  前記病原体が、毒素である、項目１に記載の方法。
（項目８）  前記病原体が、細菌、マイコバクテリア、真菌、および単細胞真核生物からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記細菌性病原体が、細胞外細菌性病原体または細胞内細菌性病原体である、項目８に記載の方法。
（項目１０）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、項目９に記載の方法。
（項目１１）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）  前記細菌性病原体のビルレンスが、クオラムセンシング経路によって誘発される、項目９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）  前記宿主生物が、脊椎動物である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）  前記単細胞試験生物が、前記病原体の２以上の濃縮物に対して独立して曝露される、項目１に記載の方法。
（項目１５）  第１病原体の宿主生物に対するビルレンスと、第２病原体の宿主生物に対するビルレンスとを比較するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）単細胞試験生物を第１病原体に対して曝露し、そして該第１病原体の存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程；
（ｂ）該試験生物を第２病原体に対して曝露し、そして該第２病原体の存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程；および
（ｃ）工程（ａ）における該第１病原体によって誘導された増殖阻害のレベルと、工程（ｂ）における該第２病原体によって誘導された増殖阻害のレベルとを比較する工程であって、ここで、工程（ｃ）において、より高いレベルの阻害を示す病原体は、該宿主生物に対してより高いビルレンスを有する、工程
を包含する、方法。
（項目１６）  宿主生物に対する病原体のビルレンスを低減する組成物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）単細胞試験生物を、候補組成物の存在下で該病原体に対して曝露する工程；および
（ｂ）該試験生物を、該候補組成物の非存在下で該病原体に対して曝露する工程；および
（ｃ）該候補組成物の存在下および非存在下での該試験生物の増殖をモニタリングする工程であって、ここで、該候補組成物の非存在下で観察されるよりも高いレベルの、該候補組成物の存在下での該試験生物の増殖は、該候補組成物が、該宿主生物に対する該病原体のビルレンスを低減することを示す、工程
を包含する、方法。
（項目１７）  前記試験生物が、アメーバである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記アメーバが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種またはＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  前記アメーバが、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）  前記Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍが、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  前記病原体が、毒素である、項目１６に記載の方法。
（項目２３）  前期病原体が、細菌、マイコバクテリア、真菌、および単細胞真核生物からなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目２４）  前記細菌性病原体が、細胞外細菌性病原体または細胞内細菌性病原体である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）  前記細菌性病原体のビルレンスが、クオラムセンシング経路によって誘発される、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）  前記宿主生物が、脊椎動物である、項目１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）  前記単細胞試験生物が、前記病原体の２以上の濃縮物に対して独立して曝露される、項目１６に記載の方法。
（項目３０）  宿主生物に対する病原体のビルレンスを低減する組成物を同定するための、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの使用であって、それによって、ビルレンスの低減は、ラット死亡率アッセイにおいて再現可能である、使用。
（項目３１）  単細胞宿主生物に対する病原体のビルレンスを低減する、該宿主生物の該病原体のビルレンス因子中の変異を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該単細胞試験生物の増殖を阻害する病原体を選択する工程；
（ｂ）該病原体の変異体を作製する工程；
（ｃ）該試験生物の第１培養物を工程（ａ）の病原体に曝露し、そして該試験生物の第１培養物の増殖をモニタリングする工程；
（ｄ）該試験生物の第２培養物を、工程（ｂ）の変異体に対して曝露し、そして該試験生物の第２培養物の増殖をモニタリングする工程；および
（ｅ）該第１培養物の増殖を、該第２培養物の増殖と比較する工程であって、ここで、第１培養物を用いて観察されたよりも高いレベルの、該試験生物の第２培養物の増殖は、該変異体が、該宿主生物に対する該病原体のビルレンスを低減させる変異を該病原体のビルレンス因子において有することを示す、工程
を包含する、方法。
（項目３２）  前記試験生物が、アメーバである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）  前記アメーバが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種またはＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）  前記アメーバが、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）  前記Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ種が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）  Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍが、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）  前記病原体が、毒素である、項目３１に記載の方法。
（項目３８）  前記病原体が、細菌、マイコバクテリア、真菌、および単細胞真核生物からなる群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３９）  前記細菌性病原体が、細胞外細菌性病原体または細胞内細菌性病原体である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  前記細胞外細菌性病原体が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）  前記細菌性病原体のビルレンスが、クオラムセンシング経路によって誘発される、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）  前記宿主生物が、脊椎動物である、項目３１〜４２に記載のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４)  前記単細胞試験生物が、前記病原体の２以上の濃縮物に対して独立して曝露される、項目３１に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語の各々はこの節においてその用語の関連付けられた意味を有する。
【００１４】
用語「病原体」は、本明細書中で使用される場合、疾患を引き起こす因子、特に、細菌または真菌のような生存する微生物を包含することを意図される。用語「因子（ａｇｅｎｔ）」および「因子（ｆａｃｔｏｒ）」は、本明細書中で相互に置き換え可能に使用されて、本発明の方法において有用な病原体または毒素を記載する。病原体としては、任意の細菌、ミコバクテリア、真菌、および単細胞真核細胞生物が挙げられ、これらの野生型および変異体を含み、これらは疾患を引き起こし、そして宿主生物に障害（ｄａｍａｇｅ）または損害（ｈａｒｍ）をもたらす。病原体はまた、有毒物質（例えば、毒素）であり得、これは、生細胞または生物によって産生され、そして宿主に導入される場合に疾患を引き起こし得る。
【００１５】
用語「病原性」は、本明細書中で使用される場合、宿主生物に対して疾患、障害または損害を引き起こす、因子の能力として定義される。
【００１６】
用語「ビルレンス」とは、本明細書中で使用される場合、ある因子の宿主生物に対する病原性の度合の尺度である。ビルレンスは通常、所定の時間基間内で宿主生物中での病理学的応答を誘導する病原体の因子用量または細胞数として表現される。「ビルレンスを低減すること」は、本明細書中で使用される場合、病原体によって媒介される、宿主生物に対する疾患、損傷または損害の発達または進行を、減衰、消滅、低下、抑制または阻止する、化合物の能力として定義される。
【００１７】
用語「宿主生物」は、本明細書中で使用される場合、任意の生存する生物を包含することを意図される。好ましくは、この宿主生物は真核生物（例えば、脊椎動物）である。より好ましくは、宿主生物は哺乳動物である。宿主生物がヒトであることは、最も好ましい。
【００１８】
用語「単細胞試験宿主生物」は、本明細書中で使用される場合、生存する任意の単細胞生物を包含することを意図され、アメーバ、鞭毛虫、繊毛虫、および他の原生寄生動物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、生物は、アメーバ（例えば、ＤＩＣＴＹＯＳＴＥＬＩＵＭ  ＳＰＥＣＩＥＳ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種、またはＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種であるが、これらに限定されない）である。好ましいアメーバは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍであり、好ましくはＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍであり、より好ましくは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１である。
【００１９】
（Ｉ．本発明の病原体）
本発明の細菌性病原体としては、以下が挙げられ得る：Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。本発明の病原性ミコバクテリアとしては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられ得る。本発明の病原性真菌としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられ得る。本発明の病原性単細胞真核生物としては、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉが挙げられる。
【００２０】
本発明は、宿主生物の成長および健康に影響する任意のビルレンス因子を同定し、そして評価するのに有用な方法を提供する。このビルレンス因子は、単細胞試験宿主生物（例えば、Ｄ．  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、例えば、細胞内増殖性の細菌性病原体（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａもしくはＬｉｓｔｅｒｉａの選択株）、またはミコバクテリア病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の細胞内病原体であり得る。あるいは、この病原体は、単細胞試験宿主生物の外部で増殖する細胞外病原体（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの選択株（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、または細胞外で増殖する病原性真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であり得る。
【００２１】
通常、病原体は細菌性病原体である。好ましくは、病原体は細胞外細菌性病原体である。より好ましくは、病原体はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。最も好ましくは、病原体は、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。
【００２２】
病原体のビルレンスは、広範な病原性細菌（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）によって使用される、クオラムセンシング経路によって誘発され得、これによって自己誘導因子の閾値濃度は、病原性プロセスを開始する分泌性ビルレンス因子の協調的な合成を誘発する。好ましくは、病原体のビルレンスは、クオラムセンシング経路によって誘発される。
【００２３】
（ＩＩ．単細胞試験宿主生物を病原体に曝露する方法）
１実施形態において、単細胞試験宿主生物は、この単細胞試験宿主生物の培養物由来の細胞を、病原体の培養物由来の細胞と混合することによって、病原体に曝露される。次いで、この混合物は、寒天プレート上に直ぐにプレートされる。別の実施形態において、単細胞試験宿主生物細胞の連続希釈は、病原体細胞を予め増殖させた下地（ｌａｗｎ）を有する寒天プレート［例えば、ＳＭ寒天（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．Ｒａｐｅｒ、１９８４、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｄｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐ５９）］に塗布される。なお別の実施形態において、病原体は、表面（例えば、ガラスのカバーガラス）上で培養された単細胞試験宿主生物細胞に添加される。しかし、病原体細胞の下地に、単細胞試験宿主生物の培養物由来の細胞の希釈物を添加することは、毒性試験の好ましい方法である。当業者に公知の任意の適切な方法および単細胞試験宿主生物の培養条件は、本発明の方法において使用され得る（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの液体培養）。
【００２４】
試験サンプル調製物は、病原体細胞培養物の上清を含み得る。これは、毒性因子が培養培地中に分泌される場合に特に有用である。例えば、クオラムセンシング経路を誘発する条件は、病原性細菌からの毒性因子の分泌を生じ得る。
【００２５】
特定の培養条件下で、単細胞試験宿主生物は、増殖基質として病原体を使用し得る。単細胞試験宿主生物が病原体基質上で増殖する能力は、病原体の特徴（例えば、病原体毒性）に依存する。他の細菌（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、病原体に曝露される試験宿主生物の培養物に添加され得、そしてアメーバについての増殖補充物として作用し得る。増殖補充物は、病原性細菌または非病原性細菌のいずれかであり得る。
【００２６】
一般に、スターブさせていない単細胞試験宿主生物細胞が、本発明の方法において使用される。例えば、試験宿主生物（例えば、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、本発明の方法における使用のために、接着培養または懸濁培養で培養され得る。ＨＬ５培地（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら、１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０７、２６９１−２７０４）は、本発明における使用のためのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を増殖させるために有用である。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖を維持する任意の培養培地が、アメーバ細胞を生成するために使用され得る。また、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの株は、本発明の方法に必須ではない。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ株（例えば、ＤＨ１（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３４２８７−９２）、ＡＸ−２またはＡＸ−３（共に、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．Ｒａｐｅｒ、１９８４、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｄｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、７４−７５において参照される）が、本発明において使用され得る。このＤＨ１  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍは、本発明の方法における使用のために好ましい株である。
【００２７】
病原体培養の条件は、本発明の方法に必須ではない。このような条件は、試験される病原体に応じて調節され得、そして例えば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  第二版、Ａ．Ｂａｌｏｗｓら、１９９２）中の細菌について、当該分野で記載されている。病原体の毒性がクオラムセンシング経路によって誘発される条件下で、この病原体は、クオラムセンシングの誘導が最大である細胞密度まで増殖し得る。
【００２８】
（ＩＩＩ．単細胞試験宿主生物の増殖をモニタリングする方法）
単細胞試験宿主生物細胞の増殖（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の増殖）は、当業者に公知の多数の方法でモニタリングされ得る。どのようにして細胞増殖がモニタリングされるかは、使用される病原体曝露方法に一部依存する。単細胞試験宿主生物および病原体（または病原体の組み合わせ）の混合物が、寒天プレート上で培養される場合、この寒天プレートは、コロニー増殖および（例えば、コロニーサイズおよび数の）測定に適する条件下でインキュベートされ得る。例えば、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍおよび病原体（または病原体の組み合わせ）は、本発明の試験化合物中で４〜７日間（１９℃〜２５℃で）培養され得る。インキュベーション期間後、試験化合物の存在下で形成されたコロニーの出現、数およびサイズが記録され、そして試験化合物の非存在下で形成されたコロニーの出現、数およびサイズと比較される。コロニーのサイズは、コロニー直径を決定するための任意の適切な手段によって測定され得る。コロニー直径によって反映される増殖領域を測定することによってコロニーサイズを決定することは、本発明の方法において有用である。
【００２９】
単細胞試験宿主生物の増殖はまた、光学顕微鏡を用いて、単細胞試験宿主生物の細胞骨格を可視化するために使用されるアクチン染色によってモニターされ得る（例えば、以下の図３を参照のこと）。このモニタリングの適用は、特に、単細胞試験宿主生物が病原体添加前に表面（例えば、カバーガラス）上で培養される場合に有用である。単細胞試験宿主生物のアクチン細胞骨格の組織化における欠損を使用して、細胞増殖の詳細をモニターし得る。皮質性アクチン染色の損失または重合化アクチンのパッチの存在は、増殖の指標として受け取られ得る。あるいは、単細胞試験宿主生物の増殖は、単細胞生物の培養によって発光される全蛍光を定量する周知の分析技術によって蛍光定量的にモニターされ得る。培養試験サンプル中の蛍光レベルが、細胞増殖（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）の速度に直接比例することは、当該分野での通常の知識である。あるいは、単細胞試験宿主生物の増殖をモニターするための当該分野で公知の任意の方法（例えば、レポーター遺伝子発現の細胞計数または細胞測定）は、本発明の方法において使用され得る。
【００３０】
（ＩＶ．本発明の抗ビルレンス化合物の特性および効力）
（Ａ．本発明の抗ビルレンス化合物の特性）
宿主生物に対する病原体の毒性を減少する化合物は、任意の合成化合物または半合成化合物を含む。このような化合物は無機化学化合物および有機化学化合物を含む。この化合物は天然に存在し得る。天然に存在する化合物としては、例えば、サッカリド、脂質、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノ配糖体、糖脂質、リポ多糖類またはマクロライド系抗生物質）が挙げられ得る。化合物の正確な供給源は、本発明の方法に対して重要でない。化合物は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から商業的に入手可能な合成化合物ライブラリーまたはＸｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）から入手可能な化合物のような細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態で天然に存在する化合物のライブラリーに由来し得る。この合成（または半合成）化合物または天然に存在する化合物は、当該分野で公知の標準的な化学的方法、物理的方法、または生化学的方法を使用して改変され得る。
【００３１】
試験化合物添加の順序は、本発明の方法に対して重要でない。試験化合物は、単細胞試験宿主生物がアッセイ混合物に添加される前に、病原体に添加され得る。これは、添加の好ましい順序であるが、試験化合物はまた、病原体が単細胞試験宿主生物細胞に接触した後、アッセイ混合物に添加され得る。
【００３２】
試験化合物は、単細胞試験宿主のアッセイ混合物中に存在する病原体によって、アッセイの中で生成され得る。あるいは、単細胞試験宿主生物細胞は、試験化合物を生成しない病原体に曝露する前に、試験化合物生成病原体と予めインキュベートされ得る。
【００３３】
本発明の方法において、１つ以上の試験化合物が、アッセイ混合物において存在し得るか、または生成され得る。好ましくは、１つの化合物が、アッセイ混合物中に存在するか、または生成される。
【００３４】
（Ｂ．抗ビルレンス化合物の効力）
抗ビルレンス活性を有する化合物は、病原体に曝露された単細胞試験宿主生物細胞の増殖を増加する。すなわち、単細胞試験宿主生物細胞の増殖（例えば、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ増殖）は、試験化合物と接触しない単細胞試験宿主生物細胞の増殖と比較した場合、病原体の存在で、試験化合物または試験化合物の混合物との接触によって改善される。アッセイの状態に依存して、抗ビルレンス化合物は、本発明の方法における活性を促進する増殖の範囲を提示する。病原体を用いてチャレンジされた単細胞試験宿主生物細胞の増殖は、抗ビルレンス化合物を含まないコントロールアッセイ混合物中に観察されたアメーバ（ａｍｏｅｂａｌ）細胞の増殖よりも、抗ビルレンス活性化の存在において、３倍以上であった。ラット死亡率アッセイ（例えば、Ｊｏｉｎ−Ｌａｍｂｅｒｔら（２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４５（２）：５７１−６）によって記載されるラット死亡率アッセイ）を使用して、本発明のアッセイ方法において観察される抗ビルレンス活性を実証し得る。
【００３５】
（Ｖ．ビルレンス因子をコードする遺伝子を同定するための本発明の方法の使用）
本発明の別の実施形態において、宿主生物に対するビルレンス因子（例えば、病原体または毒素）をコードする遺伝子は、試験生物の存在下および非存在下での単細胞試験宿主生物（例えば、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖または試験生物の産生を、公知の遺伝
子改変体または同定可能な遺伝子改変体と比較することによって同定され得る。このような遺伝子を同定するために、単細胞試験宿主生物の増殖を阻害する病原体が選択される。病原体の変異体が、当該分野で周知の標準的な技術によって産生される。単細胞試験宿主生物は、変異体病原体と接触され、増殖について評価される。ビルレンスの減少を生じる変異体は、変異体病原体に曝露された単細胞試験宿主生物の増殖が、野生型病原体に曝露された単細胞試験宿主生物の増殖よりも、より大きい場合、同定される。ビルレンスの減少を示す病原体における特定の遺伝子の変異は、当該分野で周知の技術によって同定され、そして特徴付けられる。従って、宿主生物に対するビルレンス因子（例えば、病原体または毒素）をコードする遺伝子は、本発明の方法を使用して同定され得る。
【００３６】
単細胞試験宿主生物の増殖を阻害する病原体は、上記されるように、単細胞試験宿主生物を異なる病原体に曝露し、この単細胞試験宿主生物の増殖をモニタリングすることによって選択され得る。単細胞試験宿主生物の増殖に影響する任意の病原体は、変異され得る。通常、変異された病原体は、細菌病原体である。好ましくは、変異された病原体は、細胞外の細菌病原体である。より好ましくは、変異された病原体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの病原体である。病原体のビルレンスは、上記されるクオラムセンシングシステムによってトリガーされ得る。
【００３７】
変異体は、当該分野で公知の方法に従って、例えば、紫外線照射、インターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）剤での処理または形質導入ファージもしくはトランスポゾンの挿入によって、生成され得る。他方、当該分野で既知の変異型は、使用され得る。この変異体は、当該分野で公知の方法を用いてマーカーとして使用されて、ビルレンス因子をさらに同定し得る。
【００３８】
（図面の詳細な説明）
図１は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによるＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖の阻害およびクオラムセンシングシステムの役割を示す。約２００のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＴ５（ＷＴ，Ｂ）株、ＰＴ４６２（ｒｈｌＲ，Ｃ）株、ＰＴ４９８（ｌａｓＲ，Ｄ）株、ＰＴ５３１（ｒｈｌＲ，ｌａｓＲ，Ｅ）株またはＰＴ７１２（ｒｈｌＡ，Ｆ）株を補充した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌（Ａ）の菌叢にプレートした。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍコロニーを、５日後に観察した。
【００３９】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによるＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの阻害を、２００のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を３００μｌ（６×１０８ｃｆｕ）のＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ培養物および１０μｌ（１０７ｃｆｕ）のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物と混合し、そして即座にＳＭ−寒天上にプレートすることによってアッセイした（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら、１９９４  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０７（Ｐｔ  １０）、２６９１−７０４）。次いで、このプレートを、２５℃で５日間インキュベートした。あるいは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを、２００μｌ（２×１０８ｃｆｕ）のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのみと共にプレートした。
【００４０】
図２は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖の定量的評価の詳細を示す。５０，０００（左上）から１（中下）までの漸減数のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの菌叢上にプレートし、５日間増殖させた。Ａ，ＰＴ５；Ｂ，ＰＴ４９８（ｌａｓＲ）；Ｃ，ＰＴ４６２（ｒｈｌＲ）；Ｄ，ＰＴ５３１（ｌａｓＲ，ｒｈｌＲ）。
【００４１】
純粋なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの菌叢に対するＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ増殖の定量的測定を、ＳＭ−寒天上に２００μｌのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物を最初にプレートすることによって得た。次いで、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の連続希釈物（５０，０００細胞、１０，０００細胞、２，０００細胞など）を含む５μｌの液滴を、細菌の菌叢上にスポットした。このプレートを、２５℃で５日間インキュベートし、そしてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖が目に見える最大の希釈物を記録した。
【００４２】
図３は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ上清のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞のアクチン細胞骨格に対する効果を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、ＨＬ５（Ａ）または初期定常期のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＴ５細菌（Ｂ）もしくはＰＴ５３１細菌（Ｃ）の上清に１時間曝露した。あるいは、これらの細胞を、新鮮なＨＬ５培地（Ｄ）中でＰＴ５細菌に曝露した。次いで、これらの細胞を、固定し、そしてこれらのアクチンを、テキサスレッドファロイジン（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）で染色した。
【００４３】
細菌上清のアクチン細胞骨格に対する効果を可視化するために、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、カバーガラス上で３日間増殖し、次いで、細胞上清（６時間増殖）または新鮮なＨＬ５中の細菌（１細胞当たり１０の細菌）のいずれかに１時間曝露した。次いで、これらの細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し（４％；３０分）、サポリンで浸潤し、そしてアクチン細胞骨格を、テキサスレッドファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で可視化した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０レーザースキャン共焦点顕微鏡で画像化した。
【００４４】
一晩細菌培養物の上清を使用した場合、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００顕微鏡を使用して位相差によって観察し、そして画像を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａカメラを使用して３０秒毎に記録し、そしてＯｐｅｎＬａｂ  ３ソフトウェアで分析した。細胞を計数し、そして、それらの数を、細胞上清添加後の時間の関数としてプロットした。
【００４５】
図４Ａは、濃縮されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ上清に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解物を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、野生型株ＰＴ５（Ａ、上パネル）および二重変異体ＰＴ５３１（Ａ、下パネル）の培養物上清に曝露し、そして位相差顕微鏡下で観察した。矢印は、示された時間枠の間に、野生型上清によって溶解されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を示す。野生体（ＰＴ５）、ｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体（ＰＴ５３１）およびｒｈｌＡ変異体（ＰＴ７１２）の上清によって誘導された細胞溶解の動力学を、ｔ＝０で約１００の細胞を含む視野において、顕微鏡下でＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を計数することによって決定した（Ｂ）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌（ＰＡＯ１、ＰＴ５３１またはＰＴ７１２）をＨＬ５培地中、３７℃で６時間または一晩増殖した。次いで、細菌を、遠心分離（７，０００×ｇで１０分）でペレット化し、そしてこの上清を回収し、そして濾過した（０．２２μｍ）。
【００４６】
図４Ｂは、濃縮されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ上清に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解物を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、野生型株ＰＴ５（Ａ、上パネル）および二重変異体ＰＴ５３１（Ａ、下パネル）の培養物上清に曝露し、そして位相差顕微鏡下で観察した。矢印は、示された時間枠の間に、野生型上清によって溶解されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を示す。野生体（ＰＴ５）、ｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体（ＰＴ５３１）およびｒｈｌＡ変異体（ＰＴ７１２）の上清によって誘導された細胞溶解の動力学を、ｔ＝０で約１００の細胞を含む視野において、顕微鏡下でＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を計数することによって決定した（Ｂ）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌（ＰＡＯ１、ＰＴ５３１またはＰＴ７１２）をＨＬ５培地中、３７℃で６時間または一晩増殖した。次いで、細菌を、遠心分離（７，０００×ｇで１０分）でペレット化し、そしてこの上清を回収し、そして濾過した（０．２２μｍ）。
【実施例】
【００４７】
これらの実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、そして本発明は、これらの実施例に限定されるとは決して解釈されるべきではなく、むしろ、提供される教示の結果として明らかになるあらゆる全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【００４８】
（実施例１  本研究において用いられる株および培養条件）
本研究において用いられるＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ野生型株ＤＨ１−１０は、ＤＨ１（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（４４），３４２８７−９２）のサブクローンである。細胞を、ＨＬ５培地（１４．３ｇ／ｌペプチド（Ｏｘｏｉｄ）、７．１５ｇ／ｌ酵母抽出物、１８ｇ／ｌマルトース、０．６４ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．４９ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．７）（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１０７（Ｐｔ  １０），２６９１−７０４）中で２１℃で増殖させ、そして１週間に２回継代培養した。
【００４９】
本研究において用いた細菌株を、表１に記載する。３つの流出ポンプ過剰発現変異体ＰＴ１４９（ＮｆｘＣ，ＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮ過剰発現体）、ＰＴ６２５（ＮａｌＣ，ＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ過剰発現体）およびＰＴ６４８（ｎｆｘＢ，ＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪ過剰発現体）の遺伝子型を、対応するレギュレーター遺伝子を配列決定することによって決定した。株ＰＴ１４９（ＮｆｘＣ）およびＰＴ６３７（ＮｆｘＣ，ｍｅｘＥ）は、近年詳細に記載された（Ｊｏｉｎ−Ｌａｍｂｅｒｔら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４５，５７１−６）。簡潔に述べると、ｍｅｘＴ転写アクチベーター遺伝子（Ｍａｓｅｄａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９２，１０７−１２）は、本発明者らのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ５において８ｂｐの挿入によって中断されている。ＮｆｘＣ変異体ＰＴ１４９では、８ｂｐの挿入は存在せず、ＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮ流出系の過剰発現を引き起こし得る機能的ｍｅｘＴ遺伝子を生じる。ＰＴ６３７を得るために、ｍｅｘＥ遺伝子をＰＴ１４９において不活化して、野生型の抗生物質感受性を回復した。ＰＴ６２５は、ｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭ流出オペロンのｍｅｘＲレギュレーター遺伝子において何の変異も含まなかった。しかし、この株は、ＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ流出ポンプを過剰発現することがウェスタンブロット分析によって示された（Ｋｏｅｈｌｅｒら，未発表の観察）ので、この株を、ＮａＩＣ変異体であるとみなした（４０）。ＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪシステムを過剰発現する株ＰＴ６４８は、２ｂｐ（ＡＣ）の欠失をその同族リプレッサー遺伝子ｎｆｘＢのコドン１９に含み、ＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪの過剰発現（ｎｆｘＢ表現型）をもたらすことが見出された。
【００５０】
細菌を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上で３７℃で一晩増殖させた。シングルコロニーを、５０ｍｌフラスコ中の５ｍｌ  ＰＢ（２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、０．３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｋ２ＳＯ４）（Ｅｓｓａｒら、１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２（２），８８４−９００）中に接種し、そして使用前に３７℃で８時間にわたって増殖させた。種々の株の増殖を、培養物の光学密度（６００ｎｍ）を接種後の種々の時点で測定することによって、リッチ培地（ＰＢ）において試験し、そして使用した全ての株において同等であることが見出された。これらの条件下で、同様のＯＤ６００が各株について得られ、そしてクオラムセンシング誘導が最大であった。最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、微小希釈方法（Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙら，１９８３  ＮＣＣＬＳ，３，４８−５６）によってＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスにおいて決定した。
【００５１】
（実施例２  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖を阻害する：ｒｈｌクオラムセンシングシステムの役割）
Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバは、細菌（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を食作用によって摂食する単細胞生物である。２００個のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞をＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌にプレーティングした場合、各アメーバは、細菌ローンにおいてプラークを作製し、このプラークでは、細菌が貪食された（図１Ａ）。対照的に、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌のローンへの野生型Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＴ５の添加は、このアメーバの増殖を完全に阻害した（図１Ｂ）。これらの結果は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａがＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍに関する特に不適切な細菌増殖基質であることを実証した、より初期の研究（Ｒａｐｅｒら，１９３９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３８，１６−３２，１６−３２；Ｄｅｐｒａｉｔｅｒｅら，１９７８，Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ），１２９  Ｂ（３）：４５１−６１）と一致する。
【００５２】
クオラムセンシングシステムによって制御される既知のビルレンス因子の産生に対するこの増殖阻害の関係を調査した。興味深いことに、Ｐ．ａｅｎｘｇｉｎｏｓａ変異体は、ｒｈｌシステムに影響を与えた、すなわち、ｒｈｌＲ変異体ＰＴ４６２は、図２Ｃ（表２）に示すように、本発明者らのプレーティング試験においてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ増殖の阻害を全く引き起こさなかった。しかし、このｌａｓシステムは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの増殖阻害にはそれほど重要ではなかった。なぜなら、ｌａｓＲ変異体ＰＴ４９８が、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの非常に減少した増殖のみを可能にしたからである（図１Ｄ）。
【００５３】
しかし、これらの実験において、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍを、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌の両方の存在下で増殖させた。従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの存在下でのこの観察されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖阻害が、このアメーバに対する直接的な病原的影響であるか、またはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの栄養ローンの増殖を殺傷もしくは阻害するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓによって引き起こされる二次的な影響であるかは明らかでなかった。後者の可能性を排除するために、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞がＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのみのローン上で増殖する能力を試験した（表２）。アメーバの個々のコロニーは、特定の許容性株のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（例えば、ｒｈｌＲ，ｌａｓＲ二重変異体ＰＴ５３１）を用いた場合にのみ増殖した。より定量的な結果を得るために、より多数のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を用いて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのローンにおいてプラークを作製するためにどれくらいの数のアメーバが必要であるかを決定した。これに関しては、８滴の小滴を純粋なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのローン上に塗布し、各小滴は、規定された数のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を含んでいた。５０，０００個のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞でさえ、野生型Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのローンにプラークを作製することができなかった（図２Ａ）。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの増殖を規模測定する際に、これは、０として示された。ｌａｓＲ変異体ＰＴ４９８を用いた場合、５０，０００個のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞はプラークを作製したが、次の希釈物（１０，０００細胞）はプラークを作製できなかった（図２Ｂ）。従って、ｌａｓＲ変異体でのＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの増殖は、１としてスコアが付けられた。ｒｈｌＲ変異体ＰＴ４６２のローン上では、アメーバ増殖は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの最初の５つの希釈物において観察され得た（図２Ｃ；５とスコア付けられた）。二重変異体ｒｋｌＲ−ｌａｓＲは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖を充分に許容し、そしてアメーバ増殖は、最も希釈された条件でさえ観察され得た（小滴８において１滴あたり１細胞；図２Ｄ）。これらの結果は、０〜８のスケールを規定し、ここで、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの最も許容性の高い株は８とスコアが付けられ（図２Ｄ）、そして最も許容性の低い株は０とスコアが付けられる（図２Ａ）。
【００５４】
この試験を用いて、ｒｈｌクオラムセンシングシステムは、細菌の病原性に必須であることが明らかであった。なぜなら、ｒｈｌＲ変異体およびｒｈｌＩ変異体は両方とも、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍに関して野生型細胞よりもずっと許容性が高かったからである。ｌａｓＲおよびｌａｓＩにおける変異のみでは、病原性における微小な低下しかもたらさなかったが、ｒｈｌ変異と組み合わせた場合、これらは、充分に許容性の株をもたらしたことに留意すべきである（表２）。
【００５５】
（実施例３  Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞における、分泌されたビルレンス因子の影響）
クオラムセンシングシステムの制御下に配置された多数のビルレンス因子（例えば、色素（ピオシアニン）、ラムノリピド（ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）またはプロテアーゼ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌される。分泌された因子が、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの増殖阻害を担うという仮説を試験するために、野生型株ＰＡＯ１およびｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体ＰＴ５３１の濾過した培養上清を調製し、そしてＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍに対するそれらの影響を試験した。野生型株ＰＴ５（初期定常期、すなわち、６時間増殖）の上清とのＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の１時間のインキュベーション後、代表的な皮質アクチン染色の欠如を伴う、アクチン細胞骨格の構成における重大な欠陥が観察された（図３Ｂ）。ＰＴ５３１細菌の上清とのインキュベーションは、アクチン細胞骨格に対して何の影響も有さなかった（図３Ｃ）。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、新鮮なＨＬ５培地中に再懸濁したＰＴ５とともにインキュベーションした場合には、何の影響も見られなかった（図３Ｄ）。
【００５６】
分泌された因子が、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの増殖阻害を少なくとも部分的に担うか否かを試験するために、野生型株およびｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体ＰＴ５３１の濾過した培養上清を、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞とともにインキュベートした。位相差顕微鏡による検鏡は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の迅速な溶解が、野生型上清への１０分間の曝露後に完了することを示した（図４Ａ、上のパネル）。同じ条件下で、ｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体ＰＴ５３１の上清は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の有意な溶解を誘導しなかった（図４Ａ、下のパネル）。これらの結果は、野生型細菌が、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を破壊して迅速な溶解をもたらす１つまたはいくつかの因子をクオラムセンシングシステムの制御下で分泌することを示す。
【００５７】
ｒｈｌシステムにおける変異体は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖を特に許容するので、ラムノリピド（この合成は、主にｒｈｌシステムに依存する）を、これらがＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の迅速な溶解に関与するか否かを見るために、これらを試験した。それゆえ、ｒｈｌＡ変異体ＰＴ７１２（これは、ラムノリピド合成が特異的に欠損しているが、クオラムセンシング回路に影響がない（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，５９９０−６））由来の上清の影響を試験した。ラムノリピドは、バイオサーファクタント（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）および溶血因子の両方として作用するラムノース含有グリコリピドであり（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２９（３），１０２８−３３）、そしてｒｈｌクオラムセンシングシステムの制御下で産生される。
【００５８】
このｒｈｌＡ変異体由来の上清は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解を引き起こさなかった（図４Ｂ）。このことは、ラムノリピドがこの影響に必須であることを示唆する。次いで、ラムノリピドを野生型株ＰＴ５の上清から精製し、そして１０μｇ／ｍｌの最終濃度のこれらのラムノリピドが、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解を引き起こし得ることを示した（データは示さず）。
【００５９】
まとめると、これらの結果は、ラムノリピドが、これらの細胞の溶解を誘導することによってＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖を阻害する役割を果たすことを実証した。しかし、ｒｈｌＡ変異体は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖について部分的にしか許容性でなかった（表２）ので、その遺伝子がクオラムセンシングシステムの制御下にあるいくつかの他の体外産物（ｅｘｏｐｒｏｄｕｃｔ）もまた、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖の阻害に関与する可能性がある。
【００６０】
（実施例４  ｎｆｘＣ変異体は、減少したビルレンスを示す）
以前の研究では、ｒｈｌクオラムセンシングシステムは、通常、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓビルレンスには、ｌａｓクオラムセンシングシステムほどには重要でないと考えられてきた。上記の結果を、哺乳動物システムにおいて得られた以前の結果と比較するために、２つの他のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株をまた調べた。ＰＡＯ１−ＢＩ株および誘導されたｌａｓＲ変異体ＰＡＯ−Ｒ１は、いくつかの哺乳動物ビルレンスモデルにおいて用いられてきた（Ｇａｍｂｅｌｌｏら，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３（９），３０００−９）。驚くべきことに、本発明者らの細胞システムでは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞は、株ＰＡＯ１−ＢＩにおいては、本研究において用いた本発明者らの野生型株ＰＴ５においてよりもずっと良好に増殖したようであり（表２）、このことは、別個のＰＡＯ１単離株が、ビルレンスにおける非常に大きなバリエーションを示し得ることを示す。ＰＡＯ１−ＢＩバックグラウンドでは、ｌａｓＲ変異（ＰＡＯ−Ｒ１）は、充分に許容性の株をもたらした（表２）。ＰＡＯ１−ＢＩおよびＰＡＯ−Ｒ１株は両方とも、ｎｆｘＣ表現型を示し、その結果、ＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮ流出系の過剰発現をもたらすことが以前に見出された（以下の表３）。これは、これらの株のｎｆｘＣ表現型が、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおけるそれらのそれほど顕著でないビルレンスの原因であり得る可能性を生じた。それゆえ、本発明者らの野生型ＰＴ５から誘導したｎｆｘＣ変異体ＰＴ１４９、ならびにＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ流出ポンプおよびＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪ流出ポンプをそれぞれ過剰発現するｎａｌＣ（ＰＴ６２５）誘導体およびｎｆｘＢ（ＰＴ６４８）誘導体（表２）を、本発明者らのモデルシステムにおいて分析した。興味深いことに、ｎｆｘＣ変異体ＰＴ１４９（これは、ＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮ流出ポンプを過剰発現する）は、親株ＰＴ５ほどにはＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖を阻害しなかった（表２）。これに反して、ｎａｌＣ変異体およびｎｆｘＢ変異体は、野生型と同等に阻害性であった（表２）。ｎｆｘＣ表現型と低減したビルレンスとの間の関係をさらに特徴付けするために、ｍｅｘＥ遺伝子を、ＰＴ１４９株において不活化した。これは、この株（ＰＴ６３７）のビルレンスを、同系遺伝子型野生型細菌のレベルまで回復した（表２）。このことは、その低減したビルレンスの原因が、ＰＴ１４９におけるＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮ流出ポンプの過剰発現であることを実証する。
【００６１】
（実施例５  インビトロでのＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍビルレンス活性は、哺乳動物ビルレンスと正に相関する）
Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍと哺乳動物宿主システムとの間の相関をさらに確立するために、流出ポンプ変異体ＰＴ６２５（ｎａｌＣ）、ＰＴ６４８（ｎｆｘＢ）およびＰＴ１４９（ｎｆｘＣ）を、ラットにおける急性肺炎のモデルにおいて試験した。細菌をラットの気管に注射し、そして死亡率および死亡するまでの時間を評価することによって株のビルレンスを決定した。これらの実験において、ｎｆｘＣ変異体ＰＴ１４９は無毒性（１００％生存）であったが、ｎｆｘＢ変異体およびｎａｌＢ変異体は、わずかに低減したビルレンスのみを示した（表４）。ｍｅｘＥの不活化もまた、ｎｆｘＣ変異体におけるビルレンスを野生型レベルまで回復させた（ＰＴ６３７株）。罹病した動物の肺における細菌の負荷の分析によって、試験した全ての株について、死亡が、重篤な肺炎に起因することが確認された（表４）。本研究において用いた全ての変異体は、野生型の増殖曲線に類似した増殖曲線を示した。このことは、ｎｆｘＣ変異体の低減したビルレンスが、低減した全体的適応度に起因しないことを示唆する。
【００６２】
（実施例６  アジスロマイシンによるインビボでのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのビルレンスの低減）
マクロライド抗生物質であるアジスロマイシンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのクオラムセンシング回路をインビトロで阻害することが報告されている。本発明の方法を用いて、マクロライドが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのクオラムセンシング回路をインビボで阻
害し、ビルレンス因子産生の低減をもたらし、そしてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのビルレンスをインビボで低減するか否かを試験し得る。
【００６３】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のローンを、２μｇ／ｍｌのアジスロマイシンの存在下で一晩増殖させる。次いで、３日後、この細菌ローンに種々の希釈のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１−１０を播種し、そしてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１−１０コロニーの外観をモニタリングする。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１−１０のコロニーの増殖を記録し、そして抗生物質の非存在下での０のスコアと比較して、１と２との間にスコア付けする（図２と同じスケール）。
【００６４】
アジスロマイシンの存在下でのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ  ＤＨ１−１０のコロニーの増殖は、アジスロマイシンの非存在下においてよりも有意に大きいと期待される。このことは、マクロライド（例えば、アジスロマイシン）が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのクオラムセンシング回路をインビボで阻害し、それによってビルレンス因子産生の低減をもたらし、その結果、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのビルレンスをインビボで低減することを示唆する。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
【表４】
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（等価物）
本発明の特定の実施形態の上記の詳細な説明から、宿主生物に対する病原体もしくは毒素のビルレンスを低減する化合物を同定する独特の方法、または宿主生物に対する病原体もしくは毒素である因子をコードする遺伝子を同定する独特の方法が記載されていることが明らかであるはずである。特定の実施形態を本明細書中で詳細に開示してきたが、これは、例示の目的のために例として行ったに過ぎず、そして添付の特許請求の範囲の範囲に関して限定することを意図しない。特に、種々の置換、変更および改変が、特許請求の範囲によって規定される発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることが本発明者によって意図される。例えば、特定の病原体もしくは毒素、または病原体もしくは毒素の組合せ、または特定の単細胞試験宿主生物または単細胞試験宿主生物に対する病原体もしくは毒素の曝露方法の選択は、本明細書中に記載される実施形態の知識のある当業者にとって慣用的な事柄であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
本発明は、図面を参照して上記説明からさらに理解される。
【図１】図１は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによるＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ増殖の阻害およびクオラムセンシング（ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ）系の役割を示す。約２００個のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＴ５（ＷＴ，Ｂ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＴ４６２（ｒｈｌＲ，Ｃ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＲＴ４９８（ｌａｓＲ，Ｄ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＴ５３１（ｒｈｌＲ，ｌａｓＲ，Ｅ）またはＰＴ７１２（ｒｈｌＡ，Ｆ）を補充した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌（Ａ）のローンとともに配置した。Ｄ．ｄｉｃｏｉｄｅｕｍコロニーの増殖を、５日間後に観察した。
【図２】図２は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ上でのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ増殖の定量的評価を示す。５０，０００個（左上）から１個（中央下）への漸減数のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのローン上に配置し、そして５日間増殖させた。Ａ，ＰＴ５；Ｂ，ＰＴ４９８（ｌａｓＲ）；Ｃ，ＰＴ４６２（ｒｈｌＲ）；Ｄ，ＰＴ５３１（ｌａｓＲ，ｒｈｌＲ）。
【図３】図３は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｌｉｕｍ細胞のアクチン細胞骨格に対するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ上清の効果を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、ＨＬ５に１時間曝した（Ａ）か、または定常期初期のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＴ５細菌の上清に１時間曝した（Ｂ）か、または定常期初期のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＴ５３１細菌の上清に１時間曝した（Ｃ）。あるいは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、新鮮なＨＬ５培地中でＰＴ５細菌に曝した（Ｄ）。その後、これらのＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、固定し、そしてそのアクチンを、テキサスレッド−ファロイジンで染色した。
【図４Ａ】図４は、濃縮Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ上清に曝したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、野生型株ＰＴ５の培養上清（Ａ、上パネル）および二重変異体ＰＴ５３１（Ａ、下パネル）に曝し、そして位相差顕微鏡にて観察した。矢印は、示した時間枠の間に野生型上清により溶解されている個々のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を示す。野生型（ＰＴ５）の上清、ｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体（ＰＴ５３１）の上清およびｒｈｌＡ変異体（ＰＴ７１２）の上清により誘導される細胞溶解の速度論を、ｔ＝０にて約１００個の細胞を含む視野にて顕微鏡（Ｂ）下でＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を計数することによって決定した。
【図４Ｂ】図４は、濃縮Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ上清に曝したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞の溶解を示す。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、野生型株ＰＴ５の培養上清（Ａ、上パネル）および二重変異体ＰＴ５３１（Ａ、下パネル）に曝し、そして位相差顕微鏡にて観察した。矢印は、示した時間枠の間に野生型上清により溶解されている個々のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を示す。野生型（ＰＴ５）の上清、ｌａｓＲ−ｒｈｌＲ二重変異体（ＰＴ５３１）の上清およびｒｈｌＡ変異体（ＰＴ７１２）の上清により誘導される細胞溶解の速度論を、ｔ＝０にて約１００個の細胞を含む視野にて顕微鏡（Ｂ）下でＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を計数することによって決定した。
【図４Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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