(57)【要約】【課題】  癌免疫療法を始めとする免疫療法に有用な遺伝子治療薬を提供すること。【解決手段】  主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。前記ＤＮＡを含むベクター。前記ＤＮＡ又はベクターを含有する医薬組成物。【選択図】  図１
2006121919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子がII型トランス活性化因子である請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
II型トランス活性化因子をコードするヌクレオチド配列と主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列との間にエンドプロテアーゼ特異的切断配列をコードするヌクレオチド配列をタンデムに配置した請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
さらに、タグとなるタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターであって、主要組織適合抗原及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドを宿主細胞に共発現させることができるベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ又は請求項５記載のベクターを含有する医薬組成物。
【請求項７】
腫瘍の治療及び／又は予防に用いられる請求項６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原ペプチド及び抗原提示分子の共発現を利用した新たな免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫の成立には癌細胞に特異的に発現されているタンパクが10〜20アミノ酸残基程度のペプチドにプロセッシングされること、それらが高い抗原性を有していること、さらにそのプロセッシングされたペプチドが主要組織適合抗原(Major Histocompatibility Complex: MHC)分子にカップリングしたのち細胞膜上に提示されることが必要不可欠である。
【０００３】
主要組織適合抗原は別名白血球型(Human Leukocyte Antigen: HLA)とも呼ばれ、大きくClass I (HLA-A, -B, -C)及びClass II (HLA-DP, -DR, -DQ)に分類される。それぞれのlocusには何十種もの多様性が存在しているため、血縁者であっても完全な一致は示さない。この不一致はしばしば臓器移植時の拒絶反応の要因となっている。また近年の研究により、同じサブクラスの主要組織適合抗原であってもhaplotype毎に結合しうる抗原ペプチド配列が異なることが明らかになってきている。これらの事実は、癌細胞に対して主要組織適合抗原遺伝子導入によりその発現を強める場合には、その担癌患者のhaplotypeに合致したものを選択しなければならず、また癌免疫療法時に使用する有効な抗原ペプチドの配列も担癌患者毎に異なることを示唆している。
【０００４】
世界中の癌免疫研究者が癌特異抗原の同定に精力を注いでいるが、未だに強力な癌免疫を惹起できる癌特異抗原は発見されていない。上記のような複雑な要因が重なっていたために、担癌患者における効果的な癌免疫療法が確立できなかったものと推察される。
【０００５】
II型トランス活性化因子（Class II transactivator: CIITA）タンパクはクラスI及びクラスII主要組織適合抗原遺伝子のプロモーターに結合してそれらの発現を亢進させる作用を有する転写因子であるが、本発明者はこれまでに、癌細胞ではClITAの発現が抑制されており、その結果主要組織適合抗原の発現が微弱になっていることを明らかにしてきた（非特許文献１）。さらに、CIITAを強制発現させることにより、癌の中でも特に悪性度の高い肺小細胞癌細胞や神経芽細胞腫細胞であっても高レベルのMHCを発現させることができた（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献１】JOURNAL OF PATHOLOGY 187:191-199 (1999)
【非特許文献２】American Journal of Pathology, Vol. 161, No.1, July 2002, pp.291-300
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌免疫療法を始めとする免疫療法に有用な遺伝子治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、癌免疫を成立させるための複雑な条件を満たし、あるいは癌免疫を不成立にしている種々の原因を取り除くことができれば、担癌宿主に効果的な癌免疫反応を惹起できるはずであると考えた。そして、癌細胞に主要組織適合抗原を強制的に発現させると同時に主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原性の高いペプチドを人為的に発現させることによって、効果的な癌免疫反応の惹起が可能であることを見出した。本発明は、これらの知見により完成されたものである。
【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
【００１０】
（１）  主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
【００１１】
（２）  主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子がII型トランス活性化因子である（１）記載のＤＮＡ。
【００１２】
（３）  II型トランス活性化因子をコードするヌクレオチド配列と主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列との間にエンドプロテアーゼ特異的切断配列をコードするヌクレオチド配列をタンデムに配置した（２）記載のＤＮＡ。
【００１３】
（４）  さらに、タグとなるタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む（３）記載のＤＮＡ。
【００１４】
（５）  （１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターであって、主要組織適合抗原及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドを宿主細胞に共発現させることができるベクター。
【００１５】
（６）  （１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ又は（５）記載のベクターを含有する医薬組成物。
【００１６】
（７）  腫瘍の治療及び／又は予防に用いられる（６）記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、効果的な免疫療法が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
１．融合タンパク質遺伝子
本発明は、主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを提供する。
【００２０】
主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子としては、CIITA、インターフェロン-γ（interferon-gamma）を例示することができるが、これらに限定されることはない。癌細胞にCIITA遺伝子を強制的に発現させることにより、担癌患者（癌細胞）の有するhaplotypeの主要組織適合抗原が発現誘導されるようになる。CIITAにより、クラスI主要組織適合抗原もクラスII主要組織適合抗原も発現誘導されるため、どちらのクラスの主要組織適合抗原を介した癌免疫も惹起できる。
【００２１】
主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドは、抗原性の高いオリゴペプチドであるとよく、外来性抗原に由来するオリゴペプチドが好ましく、担癌患者（癌細胞）の主要組織適合抗原haplotypeに結合可能なオリゴペプチドがより好ましい。マウスクラスII主要組織適合抗原の各haplotypeに結合可能なオリゴペプチドについては、I-Akに対しては、Hen Egg Lysozyme (52-60)、Hsp70 (32-40)、Ryuducan (90-98)、mIL-1R (189-197)、DNA-B (97-105)、I-Aβk (41-49)、TransR (106-114)、Cath H (81-89) (Fremont DH et al., Immunity 8:305-307, 1998)、I-Abに対しては、Mycobacterium tuberculosis α antigenのPeptide 25 (280-294)、S35 (21-35) (Kariyone A et al., Infect Immunity 67: 4312-4319, 1999)などがその候補にあげられる。マウスクラスI主要組織適合抗原の各haplotypeに結合可能なオリゴペプチドについては、H2Kbに対しては、ovalbumin (257-264) (Chen W et al., J Exp Med 180: 1471-1483, 1994; Fremont DH et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 2479-2483, 1995)、TRP-2 (181-188) (Bloom MB et al. J Exp Med 185: 453-459, 1997)、H2Kdに対しては、Listeria monocytogenes metalloproteinase (84-92) (Busch DH et al., Infect Immunity 65: 5326-5329, 1997)、H2Dbに対してはinfluenza NP (366-374)、LCMV GP (33-41)、LCMV GP (276-286) (Hudrisier D et al., J Biol Chem 271: 17829-17836, 1996)、H2Kb・H2Dd・H2Ld・H2Kk・H2Dbに対してはMUC1 (Apostolopoulos V et al., Eur J Immunol 27: 2579-2587, 1997)、またヒトクラスII主要組織適合抗原の各haplotypeに結合可能なオリゴペプチドについては、HLA-DRに対してはZPS (bacterial polysaccharides with a zwitterionic charge motif)由来ペプチド(Kalka-Moll WM et al., J Immunol 169: 6149-6153, 2002)、ヒトクラスII主要組織適合抗原の各haplotypeに結合可能なオリゴペプチドについては、HLA-DR8に対しては、Streptococcus mutans由来のGTF(glucosyltransferase)あるいはPAc(surface protein antigen)、ヒトクラスI主要組織適合抗原の各haplotypeに結合可能なオリゴペプチドについては、HLA-A24に対しては、PSMA (prostate-specific membrane antigen)由来LYSDPADYFあるいはNYARTEDFF (Horuguchi Y et al., Clin Cancer Res 8: 3885-3892, 2002)などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００２２】
主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子として、CIITAを選択した場合、CIITAのN末端あるいはC末端にあまり長いペプチド鎖が付加されるとCIITAはその機能を喪失してしまうことがわかっているので、stop codonを外したCIITA cDNAとオリゴペプチドcDNAの間にエンドプロテアーゼ特異的切断配列（例えば、ヒューリン(Furin)認識配列(R-X-K/R-R)、PACE4認識配列(R-X-K/R-R)、Kex2認識配列(K/R-R)、PC2認識配列(K/R-R)、PC1/3(K/R-R)をコードするヌクレオチドをタンデムに配置し、オリゴペプチドcDNAのC末端側にstop codonを配置するとよい。この融合タンパク遺伝子が導入された癌細胞では、細胞内において合成された融合タンパクがCIITAと免疫源抗原ペプチドとに切断され、CIITAにより誘導されたクラスIあるいはクラスII主要組織適合抗原に免疫源抗原ペプチドが結合し、細胞膜上に提示されることとなる。またCIITAのC末端側に、上記のような限定分解酵素認識配列cDNA - クラスIあるいはクラスII主要組織適合抗原特異的免疫源抗原ペプチドcDNA - 限定分解酵素認識配列cDNA - クラスIIあるいはクラスI主要組織適合抗原特異的免疫源抗原ペプチドcDNAのように配置することにより、同一細胞内にクラスI主要組織適合抗原特異的免疫源ペプチドとクラスII主要組織適合抗原特異的免疫源抗原ペプチドを発現させることも可能である。
【００２３】
本発明のＤＮＡには、制限酵素部位、タグをコードするヌクレオチド配列などを付加してもよい。タグとしては、HA tag、His6 tagなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。制限酵素部位は、主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列のC末端側、主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列のN末端側に挿入するとよい。また、タグをコードする配列は、主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列のC末端側、主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列のC末端側に挿入するとよい。
【００２４】
CIITA cDNA配列のC末端側にはEco RV siteがある。また、免疫源抗原ペプチド配列のC末端側にも、Xho I siteなどの制限酵素部位があれば、ヒューリン認識配列及び担癌患者の主要組織適合抗原haplotypeに適した抗原ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドのN末端側にEco RV site、C末端側にXho I siteなどの制限酵素部位を付加した60-80bp程度の合成ヌクレオチド対を挿入することにより、担癌患者毎に適した導入遺伝子を作製できるように設計することができる。挿入する合成ヌクレオチドにHA tag、His6 tagなどの配列を挿入することにより、発現した遺伝子産物の局在を観察することが出来る。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、ヒトCIITA-ヒューリン認識配列-免疫源抗原ペプチドという融合タンパクをコードする遺伝子が提供される。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、免疫反応を惹起するための遺伝子治療剤として用いることができる。
【００２７】
遺伝子導入において、外来遺伝子は、通常、ベクターに包含されて標的細胞中に送達される。
【００２８】
遺伝子治療に用いられる場合、本発明のＤＮＡは、導入された外来遺伝子が発現するために適切な調節配列と作動可能に連結されるとよい。調節配列は、ベクターに対して内在性ものであっても、外来性のものであってもよい。調節配列としては、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選択マーカー、ポリＡ付加シグナル、リボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなどを挙げることができる。さらに、本発明のＤＮＡは、レポーター遺伝子などを含んでもよい。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、天然型ＤＮＡのみならず、修飾核酸（例えば、トリステル結合をもつ修飾核酸、メチルホスホネート結合をもつ修飾核酸、ホスホロチオエート結合をもつ修飾核酸、ホスホロジチオエート結合をもつ修飾核酸、ホスホロアミンデート結合をもつ修飾核酸などのリン酸結合部位を修飾した修飾核酸、α−アノマー型修飾核酸、ポリアミド核酸などの糖部を修飾した修飾核酸など）も含むものである。
【００３０】
２．遺伝子治療
本発明の主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、医薬品として、免疫療法（例えば、腫瘍免疫療法など）に利用することができる。治療対象の疾患としては、肺小細胞癌、神経芽細胞腫、乳癌などの悪性腫瘍、良性腫瘍を例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
例えば、主要組織適合抗原の発現を促進することができる因子をコードするヌクレオチド配列及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを癌細胞に遺伝子導入することにより、強力な癌免疫反応を癌病巣に惹起することができる。
【００３２】
遺伝子治療において、外来遺伝子はベクターにより生体組織あるいは生体外の細胞中に送達される。ベクターは、ウイルスベクターと非ウイルスベクターに分類される。
【００３３】
遺伝子治療に利用可能なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ワクシニアウイルスなどを例示することができる。
【００３４】
遺伝子治療に利用可能な非ウイルスベクターとしては、ＤＯＰＭＡ（Invitrogen社）、ＤＯＴＡＰ（Biontec社）、DC-コレステロールなどのカチオン性脂質で形成されたリポソーム、ポリエチレンイミン、DEAE(diethylaminoethyl)デキストラン、ポリ-L-リジン、キトサンなどの正電荷高分子キャリアーなどを例示することができる。
【００３５】
また、これらの脂質又はポリマーとDNAの複合体（リポプレックス又はポリプレックス）などを利用することもできる。
【００３６】
さらに、裸のプラミスミドDNAを直接投与してもよい。プラスミドとしては、pCAGGS(Gene, 108, 193-200 (1991))、pBK-CMV（Stratagene社）、pcDNA3.1、pZeoSV（Invitrogen社）などを例示することができる。
【００３７】
遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などが挙げられる。
【００３８】
本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより、主要組織適合抗原及び主要組織適合抗原にカップリングしうる抗原ペプチドを宿主細胞に共発現させることが可能となる。
【００３９】
さらに、本発明のベクターを導入した宿主細胞を遺伝子治療剤として利用することもできる。宿主としては、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、糸状菌などの他、治療の対象である疾患部位を含む組織から分離された細胞（例えば、癌細胞）、患者に由来するリンパ球細胞（例えば、細胞障害性Tリンパ球）などを用いることができる。
【００４０】
遺伝子治療に用いるＤＮＡは、局所的または全身的に生体に投与される。生体への投与は、生体内にＤＮＡを導入できる方法であればいかなる投与法によってもよく、例えば、カテーテルによる投与、注射などによるとよい。本発明のＤＮＡ又はそれを含むベクターは直接体内に投与されてもよいし（in vivo法）、患者から細胞を取り出し、本発明のＤＮＡを細胞に導入した後、その細胞を体内に戻してもよい（ex vivo法）。
【００４１】
本発明のＤＮＡ又はそれを含むベクターを含有する医薬製剤は、医薬上許容できる担体を含んでもよい。担体としては、滅菌精製水、注射用水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油などの溶剤、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどの保存剤、水素添加ヒマシ油、ポリソルベートなどの界面活性剤、ベンジルアルコール、クロロブタノールなどの無痛化剤、クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸などの緩衝剤、CMC-Na、ポリビニルピロリドンなどの懸濁化剤などを使用するとよい。
【００４２】
生体への投与にあたっては、予め用いる抗原ペプチドで免疫を行っておくことが望ましい。これにより、抗原ペプチドに反応する免疫系細胞の活性化をすることができる。
【００４３】
本発明のＤＮＡ又はそれを含むベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、患者の症状、年齢、体重、病巣の大きさなどにより適宜調製されるが、例えば、本発明のＤＮＡ（外来遺伝子）を含むベクターをヒトに投与する場合、患者一人当り、1〜100 mg、好ましくは5〜50 mgの１回量で投与するとよい。投与されるベクター中に含有される外来遺伝子の量としては、患者一人当り、1〜150 mg、好ましくは5〜75 mgの１回量で投与するとよい。また、本発明のＤＮＡ又はそれを含むベクターを導入した細胞をヒトに投与する場合には、患者一人当り1.0 x 106〜1.0 x 109個、好ましくは1.0 x 107〜1.0 x 108個の１回量で投与するとよい。上記の投与量のベクター又は細胞を、例えば、100〜1000 mlの生理食塩水とともに患者に投与するとよい。投与は、治療効果が認められるまで、適当な頻度で繰り返すとよい。
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
【００４５】
［実施例１］
まず抗原ペプチドをコードするoligonucleotidesをCIITA遺伝子にタンデムに挿入できる汎用ベクターを構築し、マウス肺癌(Lewis Lung Cancer, 理化学研究所・バイオリソースセンター細胞材料開発室より分譲)のclass II MHCハプロタイプ(I-Ab haplotype)にマッチした結核菌由来抗原ペプチドを挿入したベクターを構築した。具体的にはRaji細胞(ヒトバーキットリンパ腫細胞株、理化学研究所・バイオリソースセンター細胞材料開発室より分譲)から抽出したmRNA、およびCIITAの5’末端非翻訳領域および3’末端非翻訳領域に合致する遺伝子配列を持つプライマー(自ら設計、5’末端側の上流プライマー：5’-GCTGCCTGGCTGGGATTC-3’（配列番号２８）、3’末端側の下流プライマー：5’-GGGGCTGCCTCTGTCACT-3’（配列番号２９）)を用いてRNA-PCRを行い、完全長の翻訳領域を含むCIITA cDNAを作製し、これをpBluescript II cloning vector (Stratagene社)に挿入し、クローニングを完了した。次にEco RIによりCIITA cDNAを切り出し、pZeoSV2 expression vector (Invitrogen社)に挿入し、pZeo-hCIITAを作製した。次に、CIITA cDNAの5’末端にEcoRI siteを付加し、またstop codonを外して代わりにEco RV siteを付加するため、pZeo-hCIITAを鋳型とし、上流および下流プライマーとして5’-ATCGGAATTCGCGTTGCCTGGCTCCACGCCCTGC-3’（配列番号３０）、5’-CGATGATATCTCATCTCAGGCTGATCCGTGAATC-3’（配列番号３１）を用いたPCRを行い、Eco RI site - CIITA cDNA - Eco RV siteを作製した。このPCR産物をpT7 cloning vector (Invitrogen社)に挿入し、これをEco RIおよびEco RVを用いて切り出し、EcoRIおよびEcoRV処理により開環させたpZeoSV2 expression vectorに挿入した。これをCIITA-ペプチド抗原遺伝子共発現ベクター作製のための汎用ベクターとした。この汎用ベクターにはpZeoSV2 expression vectorのマルチクローニングサイトの残りとしてEcoRI-hCIITA-EcoRVインサートの3’末端にXho I siteが存在しているため、5’末端にEco RV site、3’末端にXho I siteを持ちその内部にはHA、furin cleavage site、抗原ペプチドcoding sequence、6x histidineがタンデムに並ぶ110bp程度のoligonucleotides（配列番号１５〜１７）を化学合成してEco RV site - Xho I site間に挟み込んだ。  限定分解酵素furinはR-X-R/K-R↓（↓は切断部位を示す）配列を特異的に認識して切断する酵素であり、癌細胞にはubiquitousに発現していることから、癌細胞内でCIITA-HA tagと抗原ペプチド-His tagに分解されるようにHA sequenceと抗原ペプチドcoding sequenceの間に配置した（図１）。マウス肺癌株Lewis Lung CancerはC57BL/6マウス由来であり、そのclass II MHC (I-A)のhaplotypeはbである(I-Ab)こと、およびKariyone AらのI-Ab結合モチーフの報告により、I-Abに対する結核菌由来抗原ペプチドをYNAAGGHNA (Tb(b))と決定した。また、Fremont DHらの報告によればI-Akの結合モチーフはP1 = D or N、P4 = I or N or V or L、P6 = Q or T or E or Q or G、P7 = 中性or酸性アミノ酸、P9 = S or Q or T or A or Gと報告されていることから、これらに合致する結核菌α抗原ペプチドを選び出した。その結果、I-Akに対する結核菌由来抗原ペプチドをDIKVQFQSG (Tb(k))およびDIKVQEQSG (Tb(km))と決定した。
【００４６】
次に、上記のごとく作製した発現ベクターpZeo-CIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisの作動を確認するため、遺伝子導入効率の良いヒト肺大細胞癌株TKB5（筑波大学基礎医学系講師、菅間  博博士より供与）への遺伝子導入を試みた。その結果、図２に示すように、pZeo-CIITA-HA-furin-Tb-His導入TKB5細胞におけるHA tagおよびHis tagのシグナルが細胞内に見られた。また図３に示すように、CIITAの発現およびclass II MHC (HLA-DRα)のmRNAレベルでの発現も確認された。
【００４７】
次に、発現ベクターpZeo-CIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisの作動をマウス肺癌細胞株Lewis を用いて確認した。その結果、図４に示すように、pZeo-CIITA-HA-furin-Tb(b)-His導入細胞におけるHA tagおよびHis tagのシグナルが細胞内に見られた。  また 図５に示すように、class I(H2K)およびclass II MHC (I-A)のmRNAレベルでの発現も確認された。
【００４８】
次に、作製した発現ベクターをマウス肺癌細胞株Lewisに遺伝子導入し、それらの安定発現株を作製した。外来抗原ペプチドの抗原性を確認するため、作製した安定発現株を同系マウスに移植し、宿主マウスに惹起される腫瘍免疫反応について病理組織学的に検索した。
【００４９】
その結果、MHC haplotypeにマッチした結核菌由来抗原ペプチドを発現しているLewis-pZeo-CIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisでは、図６に示すように強い腫瘍免疫反応が皮下腫瘍内に惹起されていることが病理組織学的に確認され、図７に示すように、効果的な腫瘍拒絶反応が見られることが明らかとなった。一方Lewis-pZeo-emptyでは図６左および図９に示すように、腫瘍組織内に腫瘍拒絶反応は認められず、また図７に示すようにMHC haplotypeが合致しない抗原ペプチドTb(km)を発現させることによりかえって腫瘍の進行が促進された。
【００５０】
［比較例１］
上記実施例１と対比するために、図８に示すごとくCIITAのみを強制発現させるベクター（上記pZeo-hCIITA）を用い、これをマウス肺癌細胞株Lewisに上記と同様の方法で遺伝子導入することにより安定発現株を樹立し、これを同系マウスに皮下移植した。その結果、単にCIITAを強制発現させるだけでは、図10に示すようにある程度の腫瘍拒絶反応は惹起されるものの、図７に示すように腫瘍の拒絶には至らず、樹立株によってはかえって腫瘍の進行が促進されるという結果を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、効果的な免疫療法が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１で用いた発現ベクターの構成を示す。
【図２】pZeo-empty及びpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisをそれぞれ導入したTKB5細胞におけるhCIITA-HA及びTb(b)-Hisの局在を示す染色図である。TKB5-pZeo-empty:空ベクターを導入したTKB5細胞。TKB5-pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-His: pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisを導入したTKB5細胞。anti-HA:抗HA tag抗体 (Sigma社)による免疫蛍光染色像。シグナルが核に認められる。anti-His: 抗6x His tag抗体 (ICN Cappel社)による免疫蛍光染色像。シグナルが細胞質に認められる。Nuclei: Propium iodide染色により、核の位置を示す。
【図３】pZeo-empty及びpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisをそれぞれ導入したTKB5細胞におけるclass I MHC (MHC-I)及びclass II MHC (MHC-II)の発現を示す電気泳動写真である。TKB5-pZeo-empty:空ベクターを導入したTKB5細胞。TKB5-pZeo-empty+IFN-γ: IFN-γを同時投与した、空ベクター導入TKB5細胞。TKB5-pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-His: pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisを導入したTKB5細胞。
【図４】pZeo-empty及びpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisをそれぞれ導入したLewis細胞におけるhCIITA-HA及びTb(b)-Hisの局在を示す染色図である。Lewis-pZeo-empty:空ベクターを導入したLewis細胞。Lewis-pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-His: pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisを導入したLewis細胞。anti-HA:抗HA tag抗体 (Sigma社)による免疫蛍光染色像。シグナルが核に認められる。anti-His: 抗6x His tag抗体 (ICN Cappel社)による免疫蛍光染色像。シグナルが細胞質に認められる。Nuclei: Propium iodide染色により、核の位置を示す。
【図５】pZeo-empty及びpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisをそれぞれ導入したLewis細胞におけるMHC-I(H2K)及びMHC-II(I-A)の発現を示す電気泳動写真である。Lewis-pZeo-empty:空ベクターを導入したLewis細胞。Lewis-pZeo-empty+IFN-γ: IFN-γを同時投与した、空ベクター導入Lewis細胞。Lewis-pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-His: pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisを導入したLewis細胞。
【図６】pZeo-empty及びpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-Hisをそれぞれ導入したルイス肺癌細胞を同系マウスに移植した後の癌細胞の組織像を示す。LPF:弱拡大の写真。HPF:強拡大の写真。
【図７】pZeo-empty、pZeo-hCIITA、pZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(b)-His、およびpZeo-hCIITA-HA-furin-Tb(km)-Hisをそれぞれ導入したLewis肺癌細胞を同系マウスに移植した後の癌組織の体積を示す。ｐは有意差検定における危険率を示す。
【図８】比較例１で用いた発現ベクターの構成を示す。
【図９】比較例１において、空ベクターを導入したマウス肺癌細胞を同系マウスの皮下に移植して作製した腫瘍の顕微鏡写真である。上は弱拡大の写真、下は強拡大の写真である。
【図１０】比較例１において、CIITAの発現ベクターを導入したマウス肺癌細胞を同系マウスの皮下に移植して作製した腫瘍の顕微鏡写真である。上は弱拡大の写真、下は強拡大の写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
＜配列番号１＞
配列番号１は、hCIITAのDNA配列(EMBL/GenBankに登録されているAccession No. X74301)を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、hCIITAのアミノ酸配列(EMBL/GenBankに登録されているAccession No. X74301)を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、HAのDNA配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、HAのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒューリン認識配列をコードするDNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒューリン認識配列のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(b):FDQAYNAAGGHNAVF）（I-Ab haplotype用）のDNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(b):FDQAYNAAGGHNAVF）（I-Ab haplotype用）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(k):SMGRDIKVQFQSGGN) （I-Ak haplotype用）のDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(k):SMGRDIKVQFQSGGN) （I-Ak haplotype用）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(km):SMGRDIKVQEQSGGN) （I-Ak haplotype用）のDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、マウスクラスII MHCにカップリングする抗原ペプチド（Tb(km):SMGRDIKVQEQSGGN) （I-Ak haplotype用）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、His（6xhistidine tag）のDNA配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、His（6xhistidine tag）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、開始コドン-hCIITA-EcoRV-HA-furin cleavage site-Tb(b)-6xHis-停止コドンのDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、開始コドン-hCIITA-EcoRV-HA-furin cleavage site-Tb(k)-6xHis-停止コドンのDNA配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、開始コドン-hCIITA-EcoRV-HA-furin cleavage site-Tb(km)-6xHis-停止コドンのDNA配列を示す。
＜配列番号１８〜２５＞
配列番号１８〜２５は、マウスクラスII MHCのハプロタイプI-Akに特異的なペプチドモチーフを含むアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２６〜２７＞
配列番号２６〜２７は、マウスクラスII MHCのハプロタイプI-Abに特異的なペプチドモチーフを含むアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、CIITAの5’末端側の上流プライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、CIITAの5’末端側の下流プライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、Eco RI site - CIITA cDNA - Eco RV siteをPCRで作製するために用いた上流プライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、Eco RI site - CIITA cDNA - Eco RV siteをPCRで作製するために用いた下流プライマーのDNA配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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