(57)【要約】【課題】  ホスホリパーゼ処理によりリゾリン脂質を製造する方法において、より簡便かつ工業化可能な手段でリゾリン脂質中のホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸を除去し得る、リゾリン脂質の製造方法を提供すること。【解決手段】  本発明のリゾリン脂質の製造方法は、リン脂質、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程；該反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および、該上清からリゾリン脂質を回収する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程；
該反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および
該上清からリゾリン脂質を回収する工程；
を含む、リゾリン脂質の製造方法。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リン脂質、水、水混和性の極性有機溶媒、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程；
該反応混合物から、水混和性の極性有機溶媒を除去する工程；
該極性有機溶媒を除去した反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および
該上清からリゾリン脂質を回収する工程；
を含む、リゾリン脂質の製造方法。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸である、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾリン脂質の製造方法に関する。より詳細には、ホスホリパーゼを含まないリゾリン脂質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、生体細胞の構成成分として、自然界に広く分布しており、動物の脳、神経、内臓、血液、卵、植物の種子などの種々の部位に多く含まれている。また、生体内の様々な場所において、細胞組織の保護、情報の伝達、物質移動の制御など、生命維持のための多くの機能を果たしている重要な物質である。リン脂質の一種であるリゾリン脂質は、一般的に強い溶血性を示す。そのため、リン脂質やリゾリン脂質は、天然の乳化剤や界面活性化剤として、食品、化粧品、塗料などの工業用途だけでなく、医薬、健康食品用途にも使用されている。
【０００３】
このように産業用途で使用されるリン脂質は、主にホスホリパーゼで処理することにより生産されており、工業化のための種々の生産方法が検討されている。例えば、リン脂質の酵素処理を２相系で行うことにより、酵素処理したリン脂質をより高収率で回収できることが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
しかし、例えば、リン脂質をホスホリパーゼＡ２で処理した場合、通常行われている方法で得られたリゾリン脂質には、ホスホリパーゼＡ２や生成した遊離脂肪酸が残存している。そのため、工業用途の製品中に残存しているホスホリパーゼ活性が、品質の劣化や異臭の発生の原因となる恐れがあり、大きな課題となっていた。これまでに、加熱やプロテアーゼ処理によってホスホリパーゼを失活させること（特許文献２）、および煩雑な溶媒抽出操作によってホスホリパーゼを除去すること（特許文献３）が報告されている。
【特許文献１】特開平３−４７９５号公報
【特許文献２】特公平６−７７５０６号公報
【特許文献３】特公平２−１１２３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ホスホリパーゼ処理によりリゾリン脂質を製造する方法において、より簡便かつ工業化可能な手段でリゾリン脂質中のホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸を除去し得る、リゾリン脂質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、リゾリン脂質の製造方法を提供し、該方法は、
リン脂質、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程； 
該反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程； 
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および
該上清からリゾリン脂質を回収する工程；
を含む。
【０００７】
本発明はまた、リゾリン脂質の別の製造方法を提供し、該方法は、
リン脂質、水、水混和性の極性有機溶媒、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程；
該反応混合物から、水混和性の極性有機溶媒を除去する工程；
該極性有機溶媒を除去した反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；
該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および
該上清からリゾリン脂質を回収する工程；
を含む。
【０００８】
上記のいずれの方法においても、１つの実施態様では、上記ホスホリパーゼはホスホリパーゼＡ２である。
【０００９】
上記のいずれの方法においても、さらなる実施態様では、上記リゾリン脂質はリゾホスファチジン酸である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、得られたリゾリン脂質に残存するホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸を、簡便、安価、かつ工業化可能な手段で除去することができ、ホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸をほとんどまたは全く含まないリゾリン脂質を得ることができる。そのため、本発明の方法によって得られたリゾリン脂質を含有している製品においては、従来品よりも品質の劣化や異臭の発生などが抑制されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（定義）
本発明に用いられるリン脂質は、その起源は特に限定されず、天然物由来（例えば、抽出物、濃縮物）であってもよく、または化学的に合成されたものでもよい。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）などが挙げられ、これらの混合物であってもよい。あるいは、予めホスホリパーゼＤなどで酵素処理（例えば、加水分解）されていてもよい。本発明においては、ＰＡを多く含有するリン脂質が好ましい。
【００１２】
これらのリン脂質の構成脂肪酸は、同一または異種の炭素数８〜２４の飽和または不飽和脂肪酸である。このような脂肪酸としては、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−およびγ−リノレイン酸、エルシン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸などが挙げられる。
【００１３】
本発明に用いられる酵素（ホスホリパーゼ）としては、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢが挙げられる。本発明においては、特にホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）が好ましい。ＰＬＡ２の起源は、特に限定されないが、一般的には微生物起源の酵素が用いられる。このような微生物は、特に限定されず、例えば、ストレプトマイセス属、エスケリチア属、またはマイコバクテリウム属に属する微生物が挙げられる。また、微生物は、天然に存在する野生型あるいは形質転換体のいずれであってもよい。酵素は、一般的には、微生物から単離または抽出された精製酵素または粗精製酵素として用いられる。酵素を固定化して用いてもよく、あるいは微生物菌体自体をそのまま用いてもよい。
【００１４】
本発明において用いられる水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水などが挙げられる。あるいは、必要に応じて、塩類（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）が加えられていてもよい。あるいは、酢酸緩衝液（ｐＨ４〜７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９．５）などであってもよい。
【００１５】
本発明において、炭素数１〜６の低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノールなどが挙げられる。
【００１６】
本発明において、炭素数１〜５の低級脂肪酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などが挙げられる。
【００１７】
本発明においては、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステルが用いられる。このようなエステルとしては、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチルなどが挙げられる。なお、本発明においては、このようなエステルの代わりに、水混和性の極性有機溶媒（例えば、アセトン）を用いてもよい。
【００１８】
本発明に用いるリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒は、通常、融点が４０℃以下であり、本発明の方法において使用する温度で液体であり、そして水に対する溶解度が５％以下である炭化水素が好ましい。このような有機溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、オクタンなどの脂肪族飽和炭化水素；ヘキセン、デセンなどの脂肪族不飽和炭化水素；シクロヘキサン、シクロヘプタンなどの脂環式炭化水素；炭素数１〜８の直鎖または分岐アルカンのハロゲン化物などが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独でまたは２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
（本発明のリゾリン脂質の製造方法）
本発明のリゾリン脂質の製造方法は、リン脂質、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、およびホスホリパーゼＢからなる群より選択される少なくとも１つのホスホリパーゼの存在下で反応させる工程；該反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する工程；該アルコール添加後の該反応混合物から沈殿物を除去して、上清を得る工程；および、該上清からリゾリン脂質を回収する工程を含む。
【００２０】
本発明の方法においては、上記のように、まず、リン脂質、水、炭素数１〜６の低級アルコールと炭素数１〜５の低級脂肪酸とのエステル、およびリン脂質を溶解し得る水不混和性の有機溶媒を含有する混合物を、ホスホリパーゼの存在下で反応させる。
【００２１】
この酵素反応工程において、上記エステルと上記水不混和性有機溶媒との混合物（以下、有機混合溶媒という場合がある）の混合比率は、エステル１容量部に対して、水不混和性有機溶媒が、通常０．１〜１００容量部、あるいは０．２〜２０容量部、あるいは０．５〜５容量部、最も一般的には約１容量部であることが適切である。
【００２２】
リン脂質は、上記有機混合溶媒に、一般的には０．１〜５０ｗ／ｖ％、あるいは１〜３０ｗ／ｖ％の濃度で溶解する。
【００２３】
この工程において、有機混合溶媒と水との混合比率は、水１容量部に対して、有機混合溶媒が、通常１〜２０容量部、あるいは１．２〜５容量部である。
【００２４】
酵素の使用量は、リン脂質１ｇに対して、０．１〜１００００ユニットであり、あるいは１〜３０００ユニットである。ここで、酵素活性の１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのリン脂質を加水分解する酵素量を表す。
【００２５】
この工程において、反応温度は、酵素が失活しない温度であればよく、例えば、５〜７０℃、通常には約２０〜５０℃である。反応時間は、リン脂質の量および酵素の使用量によって異なるが、通常は、２〜７２時間である。
【００２６】
酵素反応終了後、この反応混合物に、炭素数１〜６の低級アルコールを添加する。低級アルコールの添加量は、反応混合物に対して、約１／１０〜約１０／１０容量が適切である。なお、上記の酵素反応工程において、エステルの代わりに、例えば、アセトンを用いた場合は、酵素反応終了後、一旦アセトンを減圧下で除去し、除去したアセトンの１／５〜２／１容量のエステルを新たに添加した後、低級アルコールを添加する。低級アルコールの添加後、一般的には、室温にて１０分〜３時間撹拌する。この低級アルコールの添加により、反応混合物中に沈殿物が生成する。
【００２７】
次いで、上記の生成した沈殿物を、吸引濾過、遠心分離などによって除去し、上清を得る。この除去された沈殿物には、上記の反応に使用した酵素および遊離した脂肪酸が含まれている。したがって、この工程において、反応生成物から酵素が除去され得る。
【００２８】
次いで、得られた上清からリゾリン脂質を回収する。リゾリン脂質の回収は、当業者が通常用いる方法で行われ得る。例えば、上清を、塩類水溶液で洗浄した後、水層をアセトン中に滴下して、沈殿として回収する方法が挙げられる。塩類水溶液としては、塩化ナトリウム水溶液、塩化カリウム水溶液などが挙げられ、そしてその濃度は約２〜３０ｗ／ｖ％、あるいは約１０ｗ／ｖ％が適切である。塩類水溶液は、上清に対して、約１／２０〜１／２容量、あるいは１／１０〜１／３容量を用いることが適切である。アセトンは、洗浄後の水層の約３〜１０倍容量、あるいは約５倍容量が用いられる。アセトン中で生じた沈殿物を、吸引濾過、遠心分離などによって回収し、真空乾燥などによって乾燥させる。
【００２９】
得られた沈殿物中には、主としてリゾリン脂質が含まれ得る。リン脂質としてＰＡを用い、酵素としてＰＬＡ２を用いた場合には、主としてリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が含まれ得る。
【００３０】
上記の方法によって得られたリゾリン脂質中には、ホスホリパーゼはほとんどまたは全く含まれていない。また、酵素反応によって遊離した脂肪酸もほとんど含まれていない。したがって、本発明の方法によれば、ホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸のないリゾリン脂質が、容易に得られ得る。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
レシチン（ＡＤＭ社ウルトラレックＰ）を１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／酢酸エチルを１／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／２容量のホスホリパーゼＤ（２００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、３０℃にて２０時間撹拌して反応させた。酵素反応終了後、反応混合物に対して１／５容量のエタノールを添加して、室温にて３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を除去した。得られた上清に、１／５容量の１０％塩化ナトリウム水溶液を添加して、３０分間撹拌した後、分液操作によって上層を回収した。得られた上層を、上層に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収し、真空乾燥させて、ＰＡ含有レシチンを得た。
【００３２】
得られたＰＡ含有レシチンを１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／酢酸エチルを２／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／１０容量のホスホリパーゼＡ２（１５００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、４０℃にて２０時間撹拌して反応させた。酵素反応終了後、反応混合物に対して３／５容量のエタノールを添加して、３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を除去した。得られた上清に、１／５容量の１０％塩化ナトリウム水溶液を添加して、３０分間撹拌した後、分液操作によって下層を回収した。得られた下層を、下層に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収し、真空乾燥させて、ＬＰＡ含有レシチンを得た。
【００３３】
得られたＬＰＡ含有レシチンについて、ホスファチジルコリン（シグマ社）を基質として、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬社）を用いて、ホスホリパーゼＡ２活性を測定した。その結果、ホスホリパーゼＡ２活性は検出限界（０．２Ｕ／ｇレシチン）未満であった。さらに、同キットを用いて遊離脂肪酸も測定した。その結果、遊離脂肪酸量も検出限界（０．５μｍｏｌ／ｇレシチン）未満であった。したがって、残存酵素および遊離脂肪酸の両方とも除去されたことを確認した。
【００３４】
（実施例２）
酵素反応終了後にエタノールの代わりにイソプロピルアルコールを用いたこと以外は、上記実施例１と同様に操作を行って、ＬＰＡ含有レシチンを得た。得られたＬＰＡ含有レシチン中のホスホリパーゼＡ２活性は、検出限界未満であった。
【００３５】
（実施例３）
上記実施例１に記載のＰＡ含有レシチンを１０ｗ／ｖ％となるように、ヘプタン／アセトンを９／１（容量比）の割合で混合した有機混合溶媒に溶解した。この有機混合溶媒に対して、１／１０容量のホスホリパーゼＡ２（１５００Ｕ／ｇレシチン）および０．２Ｍ塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加して、４０℃にて２０時間撹拌して反応させた。反応液をエバポレーターで２倍濃縮してアセトンを除去した後、酢酸エチルをヘプタンの１／２容量添加した。この反応混合物に対して３／５容量のエタノールを添加して、３０分間撹拌した後、吸引濾過によって沈殿物を除去した。得られた上清に、１／５容量の１０％塩化ナトリウム水溶液を添加して、３０分間撹拌した後、分液操作によって下層を回収した。得られた下層を、下層に対して５倍容量のアセトン中に滴下した。生成した沈殿物を吸引濾過によって回収し、真空乾燥させて、ＬＰＡ含有レシチンを得た。
【００３６】
得られたＬＰＡ含有レシチンについて、ホスファチジルコリン（シグマ社）を基質として、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬社）を用いて、ホスホリパーゼＡ２活性を測定した。その結果、ホスホリパーゼＡ２活性は検出限界（０．２Ｕ／ｇレシチン）未満であった。さらに、同キットを用いて遊離脂肪酸も測定した。その結果、遊離脂肪酸量も検出限界（０．５μｍｏｌ／ｇレシチン）未満であった。したがって、残存酵素および遊離脂肪酸の両方とも除去されたことを確認した。
【００３７】
（実施例４）
酵素反応終了後にエタノールの代わりにイソプロピルアルコールを用いたこと以外は、上記実施例３と同様に操作を行って、ＬＰＡ含有レシチンを得た。得られたＬＰＡ含有レシチン中のホスホリパーゼＡ２活性および遊離脂肪酸量は、検出限界未満であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法によれば、得られたリゾリン脂質に残存するホスホリパーゼや遊離脂肪酸を、簡便、安価、かつ工業化可能な手段で除去することができ、ホスホリパーゼおよび遊離脂肪酸をほとんどまたは全く含まないリゾリン脂質を得ることができる。そのため、本発明の方法によって得られたリゾリン脂質を含有している製品においては、従来品よりも品質の劣化や異臭の発生などが抑制されている。したがって、食品、化粧品、医薬、健康食品用途での使用に適切である。また、本発明の方法は、機能性リゾリン脂質の有用な製法であり得る。