(57)【要約】【課題】流動床型のバイオリアクターを提供することを課題とする。また、比較的簡易な構造で、連続発酵などの処理ができるバイオリアクター装置を提供することを課題とする。【解決手段】管体の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、前記管体の上方内部には、筒状の隔壁が管体の内周面に対して間隔を空けて設けられており、前記隔壁の下端部が取出口の下方に延出されていることを特徴とするバイオリアクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
管体の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、
前記管体の上方内部には、筒状の隔壁が管体の内周面に対して間隔を空けて設けられており、前記隔壁の下端部が取出口の下方に延出されていることを特徴とするバイオリアクター。
【請求項２】
前記隔壁の周壁には、前記取出口と非対向位置に、処理液が通過可能な通過口が形成されている請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項３】
管体の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、
前記管体の内部には、該内部を区画する小孔板が上下方向に多段状に設けられていることを特徴とするバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌体塊形成能を有し、且つ例えば塩類濃度の高い培地においても高効率で発酵できるチゴサッカロミセス属に属する新規酵母、及び当該酵母菌株を使用する発酵調味料の製造方法、及び流動床型のバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、古来より日本酒などのアルコール類の製造、醤油などの発酵調味料の製造、パンの発酵などの各種の製造に使用されている。
例えば、醤油の醸造は、原料の蒸煮した丸大豆若しくは加工脱脂大豆と焙煎した小麦とを混合し、これに種麹を接種して製麹した後に食塩水を加え諸味を造り、発酵・熟成後にこの諸味を圧搾することにより醤油を製造している（本醸造）。
しかしながら、諸味を発酵・熟成させるには通常約６ヶ月と長期にわたっているために、製造工程の大部分をこの発酵・熟成期間が占めることになる。そのため、この発酵・熟成期間を短縮することが可能になれば、醤油製造においてその製造コストを大幅に削減することが可能になる。
【０００３】
そのため、酵母による発酵工程を、バイオリアクターによって効率的に行わせる研究がなされている。
一般に、バイオリアクターを利用する発酵工程では、生体触媒を固定化して使用する方法が採られている。
【０００４】
生体触媒の固定化方法としては、不溶性担体に担持させる結合法、生体触媒同士を結合させる架橋法、高分子ゲルなどの内部に包み込む包括法、及びこれらの複合法などが知られている。
しかしながら、これらの方法では、固定化担体の購入、固定化担体の殺菌、生体触媒の固定化工程、固定化担体の維持管理、固定化担体の廃棄・処理などのような生体触媒を固定化する上でのコストが必要となる。
また、生細胞（増殖細胞）の固定化が必要となる発酵食品の製造やアルコールの連続生産においては、菌体増殖又は原料液中の化学成分等による高分子ゲルなどの固定化担体の崩壊による目詰まりなどの問題が生じるため、一般には、多孔質無機材料等への担体結合法（物理的吸着）が用いられているが、多孔質セラミック等の多孔質無機材料を固定化担体とした場合には固定化される菌体量が少なく、発酵速度の向上や微生物汚染への抵抗性などに問題がある。
【０００５】
これに対して、菌体の分離・回収が容易にできる凝集性酵母を利用する方法では、酵母菌体の固定化工程や、酵母菌体と発酵液との分離工程を省略できるため、全体のシステムが簡略化され、低コストで且つ効率の良い発酵生産が可能となる。
【０００６】
これまで報告のある凝集性酵母菌株は、サッカロミセス・セレヴィシェ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であり、これらは主に細胞融合技術や遺伝子組換え技術によって育種されている。
しかしながら、これらサッカロミセス・セレヴィシェを改良した菌株では浸透圧耐性（耐塩性を含む）が低いため、塩類や糖濃度の少ない原料を発酵原料として使用することはできるものの、廃糖蜜（例えば、カリウム、マグネシウム、ナトリウムなどの塩類が０．５〜１．５Ｍ程度含まれるもの）や、糖類の加水分解物といった高濃度の塩類、糖類を含む液などを原料として使用する場合は、その原料を希釈する必要があり、このことが発酵・蒸留終了後の廃液処理量の増大につながり、工業的な生産コストを増大させる一因となっている。
【０００７】
また、発酵法による工業的なエタノール生産では、廃糖蜜等の安価な発酵原料を使用し、回分発酵法や、酵母循環法及び固定化酵母法などの連続発酵法が開発されて一部では実用化されているが、従来の技術では酵母菌体を高密度に維持するため、その装置や工程が複雑であり、維持管理の費用が高額となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような点に鑑みて、固定化担体を用いず、且つ高い浸透圧耐性を有する新規酵母、及びこれを用いた発酵調味料の製造方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、比較的簡易な構造で、連続発酵などの処理ができるバイオリアクター装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
醤油醸造に用いられているチゴサッカロミセス属の酵母が、高い浸透圧耐性を有し、例えば、２．５Ｍ以上の塩化ナトリウム存在下及び／又は５０％（Ｗ／Ｗ）のグルコース培地でも生育、発酵を行うことができる。
そして、本発明者らは、チゴサッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から酵母をスクリーニングしたところ、所定の菌体塊形成能を有する新規な醤油主発酵酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）と命名：生命工研菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕）を単離した。
この菌株の形成する菌体塊は硬く、通気撹拌による剪断力でも崩壊せず、菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含む）は市販の酵母菌より優れていた。ただし、その菌体塊は比較的小さく、バイオリアクターに使用することを想定した場合の沈降性は必ずしも十分ではなかった。
そこで、本発明者らは、更に鋭意研究した結果、この菌株と醤油主発酵酵母とを細胞融合することにより、耐圧性が高く、且つより大きな菌体塊を形成できる優れた酵母を得、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含む）を有するチゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）に属する新規酵母（生命工研菌寄第18252号〔FERM P-18252〕）を提供する。
さらに、本発明は、前記新規酵母を用いる醤油などの発酵調味料の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、管体２の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体２の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口６が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、前記管体２の上方内部には、筒状の隔壁７が管体２の内周面に対して間隔を空けて設けられており、前記隔壁７の下端部が取出口６の下方に延出されているバイオリアクターを提供する。
さらに、本発明は、前記隔壁７の周壁であって、取出口６と非対向位置に、処理液が通過可能な通過口８が形成されている前記バイオリアクターを提供する。
さらに、本発明は、管体２の下方から上方に向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体２の上方に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出口６が設けられており、該水流発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであって、前記管体２の内部には、該内部を区画する小孔板５が上下方向に多段状に設けられているバイオリアクターを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る新規酵母は、自己凝集性が高く、大きな塊状となるため、担体に固定化などしなくても、バイオリアクターなどを用いて効率的な発酵が可能となる。
特に、醤油などの発酵調味料の連続生産に好適である。
また、本発明の新規酵母は、塩類濃度の高い培地においても高効率で発酵処理ができるので、種々の被処理液を用いて発酵処理を行うことができる。さらに、本発明のバイオリアクターは、比較的簡易な構造で、処理液と生体触媒とを分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の新規酵母は、上記のように、チゴサッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から、菌体塊形成能を有する酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）：生命工研菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕。以下、「Ｒ−２株」と略称する場合がある）を取得し、この菌株と市販されているチゴサッカロミセス・ルキシー株（Zygosaccharomyces rouxii）（以下、「市販酵母株」と略称する場合がある）とを細胞融合することにより創製することができる。
【００１４】
細胞融合では、通常、両親株に対して変異処理を行い遺伝的性質で標識することが行われるが、酵母の優良な性質を損ねないという点から、標識処理は行わない方が好ましい。また、細胞融合法は、公知の方法を採用できるが、融合効率が高い点で高電圧パルス細胞融合法が好ましい。得られた融合株を複数回培養した後、より大きな菌体塊の形成できる菌株を選択することにより、本発明の新規酵母、特に醤油主発酵酵母として好適な菌株を得ることができる。
この新規酵母菌株を、チゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ−２ｆ株（Zygosaccharomyces rouxii ZR-2f株。以下、「ＺＲ−２ｆ株」と略称する場合がある）と命名し、これを工業技術院生命工学工業研究所に生命工研菌寄第18252 号〔FERMP-18252〕として寄託した。
【００１５】
このチゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ−２ｆ株（FERM P-18252）と、両親株（市販酵母株及びＲ−２株）の菌学的性質を、実験農芸化学下第３版（東京大学農学部農芸化学教室著、（株）朝倉書店発行）に基づいて検討したところ、次の通りである。
〔ＺＲ−２ｆ株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
１）栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
２）栄養細胞の形態：卵型。
３）増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
１）形態：円。
２）隆起：頭状。
３）周縁：円滑。
４）大きさ：１〜３ｍｍ。
５）色調：白色で不透明。
６）表面：円滑で半光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグリコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能である。
〔市販酵母株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
１）栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
２）栄養細胞の形態：卵型。
３）増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
１）形態：円。
２）隆起：頭状。
３）周縁：円滑。
４）大きさ：１〜３ｍｍ。
５）色調：白色で不透明。
６）表面：円滑で光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能であるが時間を要する。
〔Ｒ−２株〕
（ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの菌体の形態：
１）栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ。
２）栄養細胞の形態：卵型。
３）増殖の形態：出芽。
（ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態：
１）形態：円。
２）隆起：頭状。
３）周縁：円滑。
４）大きさ：１〜３ｍｍ。
５）色調：白色で不透明。
６）表面：円滑で半光沢。
（ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソルビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルトースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロース、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、クエン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しない。
（ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地において生育可能である。
【００１６】
本発明の新規酵母は、それ自身が大きな塊状になるため、酵母菌体の固定化工程や、酵母菌体と処理液（発酵液）との分離が簡易に行えるため、特に、醤油、みりんなどの発酵調味料の製造、日本酒、焼酎、ワインなどのアルコール類の製造、糖ヌクレオチド生産時の菌体の製造などにおける流動床式バイオリアクターで好適に使用できる。更に、比較的高い塩濃度環境下でも発酵を行うことができるので、種々の被処理液を発酵処理することができる。
尚、本発明の新規酵母は、パン、味噌などの発酵に使用することも可能である。
【００１７】
本発明の新規酵母は、これを培養して用いられ、発酵処理後に全液を交換する回分発酵システム、被処理液を連続的に供給して発酵処理を行う連続発酵システムの何れの方式にも使用することができ、特に、連続発酵システムに好適に使用できる。
【００１８】
連続発酵システムに使用されるバイオリアクターとしては、従来公知のものを使用してもよいが、本発明に於いては、下記の流動床式のバイオリアクターを用いることが好ましい。
具体的には、図１及び図２に示すように、バイオリアクター１は、例えば、下方部２ａ（導入部２ａ）、中間部２ｂ（生体処理部２ｂ）及び上方部２ｃ（固液分離部２ｃ）の複数の筒部材が連結された管体２と、管体２の下方部２ａに設けられた供給口３と、管体２の中間部２ｂ内に設けられた区画用の小孔板５と、管体２の上方部２ｃに設けられた取出口６と、管体２の上方部２ｃ内であって、上方部２ｃの中央部に設けられた筒状の隔壁７とを備えている。
【００１９】
管体２は、例えば、耐衝撃性ガラス、ステンレスなどの金属などの耐衝撃性を有する公知の素材からなり、被処理液の処理量に応じて適宜の大きさに形成されている。
なお、管体２は、図１のように、下方部２ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの複数の筒部材が連結された構成でも良いし、一体的な筒部材から構成されていても良い。
供給口３は、例えば、管体２の下方部２ａの底面に穿設されている。該供給口３には、空気と被処理液を供給する供給路（図示せず）が取り付けられており、該供給口３から空気と被処理液が管体２の内部に供給されるようになっている（図１の矢印）。
尚、供給口３は、下方部２ａの周壁に形成されていてもよいし、又、２以上の供給口３を設けて、空気と被処理液を別々に供給してもよい。
【００２０】
小孔板５は、管体２内部に充填される被処理液と、生体触媒（例えば、本発明の酵母に係る菌体塊）の全部又は一部と、が通過可能な大きさの孔を有する部材であれば特に限定されず、例えば、１．５〜３ｍｍ、より好ましくは２〜２．５ｍｍの大きさのメッシュ板（例えば、金属製網状板）などが例示される。
この小孔板５を設けることにより、管体２内部に於ける生体触媒の濃度勾配及び／又は生成物の濃度勾配を形成することができる。また、小孔板５を設けることにより、該小孔板５によって区画された各領域で流体の対流が生じる（図１に矢印で示す）。小孔板５は１つでも構わないが、濃度勾配を良好に形成させるためには、小孔板５が上下方向に多段に亘って設けられていることが好ましい。
具体的には、図１に示したように、２ｍｍの網目の大きさのメッシュ板５が２枚所定間隔を置いて設けられている。
【００２１】
取出口６は、管体２の上方部２ｃの周壁の中途部に設けられており、該取出口６から、処理がなされ後の処理液が取り出される。
この取出口６には、キャップ１５が嵌着されており、その中央部には、排出用のパイプ１６が設けられている。本実施態様に於いては、このパイプ１６が実質的に取出口６の役割を担い、このパイプ１６から処理液と空気が排出される（図１の矢印）。
このように下方から供給された空気が上方で排出されることにより（空気の流れにより）、管体２内には、下方から上方に向かって水流が生じるようになっている（水流発生手段に相当する）。
尚、水流発生手段は、空気の給排による構成に限られず、例えば、管体２内に回転翼を設け、これを回転させて水流を生じさせる構成などでもよい。
【００２２】
次に、隔壁７は、例えば、管体２と一体的に形成された円筒状体からなり、その上端部が管体２に連結されている。一方、隔壁７の下端部は、自由端となっており、図１に示すように、取出口６の下端部６ａよりも下方に延出されている。
隔壁７は、中間部２ｂから上昇する水流を受け入れるため、中間部２ｂと同じ開口又は中間部２ｂよりも大きな開口を有し、図１に示すように、隔壁７は、その開口部分１２が中間部２ｂの開口部分１４を囲繞するように対向して配置されている（平面から見た場合に、中間部２ｂが隔壁７に囲われるように配置されている）。かかる構成により、中間部２ｂから上昇する流体（処理液及び生体触媒）は、まず隔壁７の内側にほとんどが集約される。
さらに、この隔壁７は、その外周面が、管体２の内周面に対して液が流れる程度の間隔（隙間１１）を有して配置されている。
【００２３】
また、隔壁７のうち、取出口６と非対向位置（真向に向かい合った位置でないという意味である）には、少なくとも処理液が通過可能な通過口８が形成されている。通過口８としては、例えば、図示したように、取出口６の下端より下方又はそれとほぼ同高の位置に通過口８の一部が位置する切欠部８が例示されるが、その他、孔や複数の小孔の集合などを通過口８として構成してもよい。
通過口８が形成される非対向位置は、図示したように、取出口６と正反対（１８０度水平回転させた）位置が好ましいが、取出口に対して直角位置（図２のＢで示す）などであってもよい。また、通過口８は、正反対位置に１箇所形成されていれば十分であるが、複数箇所に形成されていてもよい。
【００２４】
尚、１０は、管体２内部に連通する操作口を示し、隔壁７の内側に設けられている。１１は、操作口を閉塞するキャップを示す。１２は、管体２内の温度を維持するために温水などを通す通路を示す。
また、管体２の下方部２ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの間などの各部の間には、水密用のパッキンが設けられている。
【００２５】
上記バイオリアクター１は、内部に、（廃）糖蜜などの被処理液と、ＺＲ−２ｆ株などの生体触媒を充填し、空気を供給することにより、生体触媒が流動し、被処理液を発酵、分解、生成などの生物的処理を行い、得られた処理液は、取出口６から排出される。
この際、本発明のバイオリアクター１は、図１〜３（流体の流れを矢印で示す）に示すように、生体触媒と処理された処理液とが、水流発生手段により、管体２の上方部２ｃに上昇する。
上昇した処理液及び生体触媒は、隔壁７の内部で流動し、処理液と一部の生体触媒が通過口８を通じて隔壁７の外部に流出し、隔壁７と管体２との間（隙間１１）を通じて取出口６側へと押し出される。この隙間１１は、隔壁７の存在によって、水流発生手段による上方向きの水流の影響を受けにくいので、隙間１１を通過する途中で、生体触媒は、自重により下降することとなり、ほとんど処理液のみが取出口６へ移動する。従って、処理液と生体触媒の分離を容易に行うことができる。
【００２６】
被処理液としては、（廃）糖蜜、糖質加水分解物など公知のものを用いることができる。
また、生体触媒としては、本発明の新規酵母（ＺＲ−２ｆ株）に限られず、既知の凝集性酵母、担体に固定化された菌体や酵素、ゲルなどに包括された菌体や酵素などを従来公知のものを用いることもできる。
【実施例】
【００２７】
以下に、細胞融合、菌体塊形成能に優れた融合株の選択、選択した融合株の回分発酵および連続発酵試験を具体的に説明する。
ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものでない。また、バイオリアクターなどの説明に於いては、上記実施形態と同じ名称のものは、特段に説明がない限り、上記実施態様と同様のものである。
プロトプラストの調製
プロトプラストの調製は、基本的には野田らの方法（Agr.Biol.Chem.,54巻,2023頁(1990)）に準じて行った。
すなわち、従来型バイオリアクター（市販酵母株が担持された多孔質セラミック担体を使用）より排出された発酵液の中から速やかに沈降する菌体塊形成酵母チゴサッカロミセス・ルキシーＲ−２株と、市販酵母株であるチゴサッカロミセス・ルキシー（ビオック製、品名：醤油主発酵酵母）をそれぞれ１０％のＮａＣｌを含む公知のＹＰＤ培地１０ｍｌで３０℃で定常期初期（１×108 細胞／ｍｌ）まで振盪培養し、得られた菌体を滅菌した１０％食塩水で洗浄した。ついで、１．２Ｍのソルビトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のメルカプトエタノールを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。この菌体懸濁液にザイモリエース溶液（生化学工業（株）製）を終濃度１ｍｇ／ｍｌになるよう添加し、３０℃で９０分間処理してプロトプラスト化させた。そして、プロトプラストを遠心分離（１，２００×ｇ）して集め、１．２Ｍのソルビトール溶液で３回洗浄して、それぞれ５×107 プロトプラスト／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００２８】
細胞融合
細胞融合は、高電圧パルス細胞融合法（電気細胞融合法）で行った。
すなわち、細胞融合装置（（株）島津製作所製、品名：ＳＳＨ−１０）を用いて行い、融合条件は、電極間隔１ｍｍ、交流周波数１ＭＨｚ、交流初期印加電圧４０Ｖ、パルス幅５００μＳ、パルス電圧４５０Ｖ（電界強度４．５ｋＶ／ｃｍ）、交流２次印加電圧４０Ｖとした。印加処理後のプロトプラスト懸濁液を３０℃で３０分間保温し、これをＳＤプレート（最少培地：０．６７％のイーストニトロゲンベース、アミノ酸不含、２％のグルコース、１．２Ｍのソルビトール、２％の寒天）に０．１ｍｌ塗布し、２５℃、３〜７日間培養して、プロトプラストを再生させた。ついで、この再生した菌体を１５％のＮａＣｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液体培地（ｐＨ５．０）に入れ、同培地５mlをＳＤプレート表面に添加後，生育してきたコロニー（菌体）を分散させ，その０．５ｍｌを植菌し、３０℃で定常期に達するまで（２〜３日）振盪培養を行った。この培養液を５分間静置後、浮遊している菌体を除去し、これに新たな１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌを加えて、さらに３０℃で定常期に達するまで振盪培養を行った。この操作を５〜９回繰り返して行い、菌体塊形成能の向上した菌株の濃縮を行った。その後、沈降した菌体を、滅菌処理した１５％の食塩水で３回洗浄後、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤプレートに塗布し、（１０００倍希釈した懸濁液を０．１ml塗布する）、生育したコロニーを取得した。さらに、これらのコロニーを１５％のＮａＣｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液体培地（ｐＨ５．０）に植菌して（１コロニー植菌する）、３０℃、３日間振盪培養し、菌体塊形成能を有するコロニー（ＺＲ−２ｆ株）を選抜した。
【００２９】
菌体塊沈降速度の評価
菌体塊の沈降速度の評価は、分光光度計（MILTONROY製、品名：SPECTORONIC 20）による濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）の減少速度により行った。
供試菌株を１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、（凝集菌体のかさとして０．５mlを植菌する）、３０℃、４８時間振盪培養し、これをボルテックスミキサー（iuchi 製、品名：AUTOMATIC LABO.MIXER）で１０秒間撹拌後、経時的に６６０ｎｍの吸光度変化を計測した。その結果を図４に示す。
尚、供試菌株は、市販酵母株、Ｒ−２株、上記細胞融合で得られたコロニー（ＺＲ−２ｆ株）の３種を用いた。
【００３０】
市販酵母株では、６６０ｎｍの吸光度に変化が認められず、又、Ｒ−２株では僅かながら変化が見られたのに対して、ＺＲ−２ｆ株では６６０ｎｍの吸光度が急速に減少していた。このことからＺＲ−２ｆ株は、菌体塊が速やかに沈降することがわかった。
又、視覚によってもＺＲ−２ｆ株は、おおよそ直径０．５〜３ｍｍ程度の菌体塊を形成していた。
このＺＲ−２ｆ株の菌体塊形成効果を明確にするため、Ｒ−２株、ＺＲ−２ｆ株、市販酵母株を直径１８ｍｍの試験管に採り、それらの菌体塊の様子を参考写真１に示す。
参考写真１からも明らかなように、ＺＲ−２ｆ株は、Ｒ−２株に比べてはるかに大きい菌体塊を形成していた。
また、Ｒ−２株では、比較的小さいものの、試験管底面部の写真において菌体塊の形成が明らかに認められた。
これに対して、市販酵母株では、試験管側面部の写真はもちろん、試験管底面部の写真においても菌体塊の形成は全く認められなかった。
この結果、ＺＲ−２ｆ株は、きわめて特徴的な菌体塊形成能を有し、Ｒ−２株は、少なくとも市販酵母株とは明確に識別できる菌体塊形成能を有することが判明した。
【００３１】
パルスフィールド電気泳動
次に、各供試菌株０．５ｍｌを、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌで３０℃、４８時間振盪培養して得られる各菌体を、遠心分離器で集菌・洗浄して使用した。試料の調製は、染色体ＤＮＡの断片化を防止するため、可能なすべての過程をアガロースゲル中で行い、ゲルブロックを調整した。ゲルは、１％のアガロース（Bio-Rad 社製 Pulsed Field Centrified Agarose）ゲルを用い、泳動には０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した。泳動は、Bio- Rad社製ＣＨＥＦ−ＤＲ III System を用い、泳動電圧６Ｖ／ｃｍ、パルス間隔（開始：ＩＮＴ）６０〜（終了：ＦＩＮ）１２０秒、パルス角１２０度、泳動時間２２時間、槽内温度１４℃で行った。
電気泳動後のバンドを参考写真２に示す。参考写真２からも明らかなように、Ｒ−２株、ＺＲ−２ｆ株、市販酵母株ともに、ほとんど同一の染色体分離パターンであった。ただし、Ｒ−２株及びＺＲ−２ｆ株では、市販酵母株には認められない約８００ｋｂの位置に染色体ＤＮＡが認められた。
このことから、ＺＲ−２ｆ株及びＲ−２株は、同属菌株ではあるものの、市販酵母株とは明らかに異なる菌株であることが確認された。
【００３２】
実施例１
（ジャーファメンターによる回分発酵試験）
上記細胞融合によって得られたＺＲ−２ｆ株２０ｍｌを、前培養として、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地５００ｍｌで３０℃、４８時間振盪培養した。
その後１０分間静置して培養液と共に沈降しない菌体を除去することによって得られたＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持せずに、そのままの状態で発酵試験用培地（酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０％、ＮａＣｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルが入れられたジャーファーメンター（東京理化器械（株）製、品名：MINI FERMENTOR M-100）に充填し、３０℃で発酵させ、経時的にそのアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＣ−９Ａ）によって測定した。その結果を図５に示す。
１回目の発酵は若干遅延時間が長いものの、順調に発酵は進み、発酵５日目には３．７％（Ｗ／Ｖ）のアルコールが生成された。このとき非凝集性となった株が出現するものの、発酵終了後には凝集塊が沈降し、繰り返し回分発酵が可能であった。また、繰り返し回分発酵の２、３回目には遅延時間が短縮され、発酵３日目で３．８％（Ｗ／Ｖ）のアルコールが生産された。
【００３３】
実施例２
（バイオリアクターによるエタノールの連続発酵試験）
実施例２−１．
図６に示す形状のように、管体２０全体が円筒状のバイオリアクター１００（仕様：下方部２０ａが容量約７４ｍｌ、中間部２０ｂが内径（直径）４５ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２０ｃが容量約６０ｍｌで総容積４２０ｍｌ）（東京理化器械（株）製、特注品）を用いて、次の試験を行った。尚、このバイオリアクター１００には隔壁及び小孔板は設けられていない。
このバイオリアクター１００内に、発酵試験用培地（酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０％、ＮａＣｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルを充填し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持せずにそのまま充填し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵させた。その後、同培地を流速１０ｍｌ／ｈｒ〜２５ｍｌ／ｈｒの速さ同バイオリアクター装置に供給して連続発酵させた。
経時的に生産された発酵液をサンプリングし、このアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＡ−９Ａ）により分析し、アルコール生産性を測定した。その結果、菌体の生育と共に凝集塊が増加したが、この増加した菌体塊が１８日目にはバイオリアクターの取出口６に付着し、その取出口６の閉塞が起こり、安定した連続発酵は不可能であった。
【００３４】
実施例２−２．
次に、上記実施形態で説明したバイオリアクター１を用いて同様に連続発酵試験を行った。すなわち、図１に示す形状のバイオリアクター１（仕様：下方部２ａが容量約７４ｍｌ、中間部２ｂが内径（直径）約４５ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２ｃが容量約２７０ｍｌで総容積６３０ｍｌ。隔壁７の内径（直径）７０ｍｍ、各壁７の下端部と取出口６の下端部６ａの高低差Ｈが約２０ｍｍ、隙間の幅約１０ｍｍを作製した。尚、このものには、小孔板５は設けなかった。
そして、これを用いて上記実施例２−１と同様にして循環発酵及び連続発酵を行ったところ、発酵液と、非凝集菌体及び菌体塊との分離が速やかに行われ、取出口６の閉塞が起きることはなかった。
また、非凝集性となった株は発酵液と共に排出されるものの、菌体塊はリアクター内に保持され、凝集塊の増殖が観察されることから、融合株の安定性の欠如は問題とはならなかった。
【００３５】
実施例２−２の結果を図７に示す。アルコール生産性は発酵開始後、菌体塊の増殖と共に徐々に向上し、２０日後以降において、約１．４ｇ／リットル・ｈｒ以上（１リットルのリアクター反応槽によって１時間あたり１．４ｇ以上のアルコールが生産されることを意味する）を維持した。このことから、固定化担体を用いなくても安定した連続発酵が可能であることがわかる。このときのエタノール濃度は３．８％（Ｗ／Ｖ）であり、エタノール転換率は７４％であった。
【００３６】
実施例２−３．
さらに、菌体密度を増加させて連続発酵試験を行った。
すなわち、菌体として、実施例２−１で得られた菌体塊のみを嵩容量約３０ｍｌ取り出し、これを用いた以外は、実施例２−２と同様にして循環発酵及び連続発酵を行った。その結果を図８に示す。これにより、エタノール濃度４．１％、転換率８０％に向上させることが可能であった。
【００３７】
実施例２−４．
さらに、実施例２−１で得られた菌体塊のみを嵩容量約６０ｍｌ取り出し、実施例２−３と同じ条件で下方部２ａと中間部２ｂの間及び中間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）をそれぞれ介在させたバイオリアクター１（図１のもの）を用いステンレス製メッシュの影響について検討を行った。その結果を図９に示す。ステンレス製メッシュを介在させることにより、生成エタノール濃度及びアルコール生産性がステンレス製メッシュを介在させないものは１９日間の発酵期間でほとんど上昇していないのに対して，ステンレス製メッシュを介在させたものは速やかに向上することがわかる。これは、ステンレス製メッシュを介在させることで菌体増殖の増加と排出菌体量の減少による、槽内菌体密度の上昇のためだと考えられた（発酵終了後の凝集菌体量はステンレス製メッシュを介在させないもので嵩容量約７０ｍｌ、介在させたもので嵩容量約１２０ｍｌであった）。また、生成エタノール濃度及びアルコール生成速度ともステンレス製メッシュを介在させた方がばらつきが少なく、安定した発酵が可能であった。
【００３８】
実施例３
（バイオリアクターによる超うす口生揚げ醤油の連続発酵試験）
実施例３−１．
本実施例では、下方部２ａと中間部２ｂの間及び中間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）をそれぞれ介在させた点を除いては、実施例２−２で用いたバイオリアクター１（図１のもの）と全く同じものを用いた。
このバイオリアクターに、生揚醤油脱色液（全窒素１．４１％、食塩分１７％、直糖分４．５％、アルコール１．６５％、ｐＨ５．１）１リットルを充填し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵させた。その後、同生揚醤油脱色液を流速３０〜６０ｍｌ／ｈｒで同バイオリアクターに供給してエタノール濃度が１％増加するように連続発酵させた。
経時的に生産された発酵液をサンプリングし、このアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＣ−９Ａ）により分析し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１０に示す。
アルコール生産性は発酵開始後急速に向上し、１４日後以降約１．１ｇ／ｌ・ｈｒを維持し、固定化担体を用いなくても安定した連続発酵が可能であった。
【００３９】
実施例３−２．
次に、バイオリアクター１から小孔板５を取り外したバイオリアクター（即ち、実施例２−２と同じバイオリアクター）を用いた以外は、上記実施例３−１と同様の試験を行った。その結果を図１０に示す。
【００４０】
実施例３−３．
実施例３−３は、従来法で行った。すなわち、実施例３−１と同じバイオリアクター１に、生体触媒として、市販酵母株を多孔質セラミック担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持させた固定化担体を約４００ｍｌ（嵩容量）充填し、以後、実施例３−１と同様の試験を行った。その結果を図１０に併せて示す。
この固定化担体を用いた従来法では、ＺＲ−２ｆ株に比して、アルコール生産性は約１／２倍であった。また、得られた発酵液は公知の発酵液（品名：超うすくち生揚げ）との官能上の差は全く認められなかった。
【００４１】
実施例４
（バイオリアクターによる超淡口生揚醤油の連続発酵試験）
バイオリアクター（仕様：下方部が容量３０００ｍｌ、中間部が容量３０００ｍｌ、上方部が容量３０００ｍｌで総容積９リットル）（東京理化器械（株）製、品名：ＭＢＲＢ−３０３）を用いて、次の試験を行った。尚、このリアクターには、下方部と中間部の間及び中間部と上方部の間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板）をそれぞれ介在させた。
このバイオリアクターに、上記実施例１と同様にして前培養し，生揚醤油脱色液によって２日間３０℃で静置培養（時々撹拌）することによって馴化したＺＲ−２ｆ株の約２０００ｍｌを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、生揚醤油脱色液９リットルを通気しながら３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油脱色液を流速９リットル〜２７リットル／日で同バイオリアクターに供給して３０日間連続発酵を行った。
経時的にアルコール濃度を酸化法により測定し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１１に示す。
【００４２】
アルコール生産性は発酵開始後から順調に向上し、最高で１．４ｇ／ｌ・ｈｒを示した。安定した連続発酵が可能であり、１日でバイオリアクター容量の３倍量の発酵液を得ることができた。また官能上、得られた発酵液は従来法で得られるものとの差は見られなかった。
【００４３】
実施例５
（バイオリアクターによる超淡口生揚の連続発酵試験）
図１２に示す形状のような、管体１２０全体が円筒状に形成されたバイオリアクター１１０（仕様：内径（直径）約３００ｍｍ、高さ約1500ｍｍ、総容積１００リットル）（東京理化器械（株）製，特注品）を用いて、次の試験を行った。
尚、このリアクター１２０の内部には、小孔板５よりも大きな目開きの上面開口型の網籠３０が多段（６個）設けられている（直径２８０ｍｍで高さ２１０ｍｍの底面付き円筒。６個のうち、下方から３番目のものは高さ２８０ｍｍ）。さらに、この網籠３０のうち、図示した網籠３０の底面外側に、目開き１．５〜２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）が設けられている。また、このリアクター１１０の供給口３は、被処理液用供給口３ａと空気用供給口３ｂに別けられている。さらに、取出口６は、管体１２０の上方に設けられており、同様に、管体１２０の上方には、空気排気口３１が別途設けられている。尚、隔壁は設けられていない。
このバイオリアクター１１０に、生揚醤油脱色液１００リットルを充填し、上記実施例４と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株の約７０リットルを、固定化担体に担持させずにそのまま充填し、通気量８．０リットル／ｍｉｎ、３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油脱色液を流速５０リットル〜２００リットル／日で同バイオリアクター１１０に供給して約２２５日間連続発酵を行った。
比較例として、従来法（同バイオリアクター１１０に、生体触媒として市販酵母株を多孔質セラミック担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持させた固定化担体を、約７０リットル（嵩容量）充填したもの）により、同様にして約５６日間連続発酵を行った。尚、従来法では、５６日以後は、発酵ができなくなってしまった。
経時的にアルコール濃度を酸化法により測定し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１３に示す。
【００４４】
アルコール生産性は発酵開始後から順調に向上し、１日でバイオリアクター容量の２倍量の発酵液を得ることができた。得られた発酵液は従来法で得られるものとの官能上の差は見られなかった。また、開始から３週間後、運転を約２週間中断し、その後再運転したが、従来法と比較して復帰が早く、復帰後も順調にアルコール生産性が向上し、安定した運転が可能であった。その後も断続的に運転を中断させたが、同様に復帰した。また、凝集性を有することで、漏洩菌の量が減少したために濾過性がよくなり、作業性が向上した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明のバイオリアクターの一実施形態を示す縦断面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図。
【図３】バイオリアクターの固液分離部（上方部）を示す参考斜視図。
【図４】供試菌株の沈降速度を示すグラフ。
【図５】実施例１の回分発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図６】従来のバイオリアクターを示す縦断面図。
【図７】実施例２−２の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図８】実施例２−３の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図９】実施例２−４の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１０】実施例３の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１１】実施例４の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【図１２】実施例５で用いた本発明のバイオリアクターを示す縦断面参考図。
【図１３】実施例５の連続発酵試験に於ける発酵度合いを示すグラフ。
【符号の説明】
【００４６】
１    バイオリアクター
２    管体
２ａ  下方部
２ｂ  中間部
２ｃ  上方部
５    小孔板
６    取出口
７    隔壁
８    通過口
１１  隙間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2006042827.tif 000010
【図１０】
2006042827.tif 000011
【図１１】
2006042827.tif 000012
【図１２】
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【図１３】
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