(57)【要約】      （修正有）【課題】  イノシトール１燐酸を効率よく製造できる技術を確立する。【解決手段】  アエロパイラムペルニクス（Aeropyrum pernix）から、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを単離し、このポリペプチドが、下記(i)及び(ii)の性質を有する耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素であることを見出した。この酵素をグルコース６燐酸に作用させることによりイノシトール１燐酸を高温下で製造することができる。(i)８５℃で３時間処理した後に８０％以上のイノシトール１燐酸合成酵素活性が保持される(ii)７０℃以上で活性を示し、至適温度は９５℃以上である【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(i)及び(ii)の性質を有する耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素：
(i)８５℃で３時間処理した後に８０％以上のイノシトール１燐酸合成酵素活性が保持される
(ii)７０℃以上で活性を示し、至適温度は９５℃以上である
【請求項２】
至適ｐＨが８．８〜９．２の範囲内にある請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
アエロパイラムペルニクス（Aeropyrum pernix）由来の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素である請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
以下の(1)又は(2)に記載のポリペプチド。
（１）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチド
【請求項５】
以下の(3)又は(4)に記載のポリペプチド。
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチド
【請求項６】
以下の(5)、(6)、又は(7)のポリヌクレオチド。
（５）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（６）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（７）  請求項４又は５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項７】
以下の(8)又は(9)のポリヌクレオチド。
（８）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（９）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項８】
請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養し、培養物から耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を回収する、耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の酵素、又は請求項４又は５に記載のポリペプチドの存在下で、グルコース６燐酸の異性化によりイノシトール１燐酸を得る工程を含むイノシトール１燐酸の製造方法。
【請求項１２】
５０℃の温度下で上記異性化を行う請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明は、この遺伝子を用いて遺伝子工学的に耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を製造する方法に関する。更に本発明は、この耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を用いてイノシトール１燐酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシトールは、主として植物中に存在し、人にとってビタミンＢ群に属する必須栄養素のひとつである。そのリン酸エステル、イノシトール燐酸は細胞内のシグナル伝達のセカンドメッセンジャーとして注目を集めている。さらに近年では制癌作用に関与していることが知られており、生理活性を有する食品素材、家畜飼料、化粧品などへの応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、イノシトール燐酸の生理作用のメカニズム、シグナル伝達における役割の詳細に関しては、未だ解明されていない。このため、各研究分野においてアイソトープを用いたトレーサー実験等に利用する為のイノシトール１燐酸を始めとする高純度なイノシトール燐酸の供給法の確立が渇望されている。
【０００４】
これまで行われてきたイノシトール燐酸の製造は、植物から抽出した後に煩雑な操作で精製を行わなければならず、高純度なイノシトール燐酸を生産するためには膨大な労力とコストを要していた。さらに、これまで報告されているイノシトール１燐酸合成酵素は、植物に由来するため、安定性が低く安定的にイノシトール１燐酸を合成することが出来ない。このため、イノシトール１燐酸を効率的に製造するための技術の確立が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、イノシトール１燐酸を効率よく製造できる技術を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ね、高い耐熱性を有するイノシトール１燐酸合成酵素を使用すれば高い温度下で効率よくイノシトール１燐酸の合成反応を行うことができることに着目した。そして、超好熱性古細菌のゲノムＤＮＡ中に高い耐熱性を有するイノシトール１燐酸合成酵素をコードする遺伝子を初めて見出し、この遺伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌を用いてイノシトール１燐酸合成酵素を大量に生産することに成功した。大腸菌で生産された当該酵素は高温下で高い活性を示すとともに、非常に高い耐熱性を有していた。
【０００７】
本発明は上記知見に基づいて、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下の発明を提供するものである。
【０００８】
項１．  下記(i)及び(ii)の性質を有する耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素：
(i)８５℃で３時間処理した後に８０％以上のイノシトール１燐酸合成酵素活性が保持される
(ii)７０℃以上で活性を示し、至適温度は９５℃以上である
項２．  至適ｐＨが８．８〜９．２の範囲内にある項１に記載の酵素。
【０００９】
項３．  アエロパイラムペルニクス（Aeropyrum pernix）由来の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素である項１又は２に記載の酵素。
【００１０】
項４．  以下の(1)又は(2)に記載のポリペプチド。
（１）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチド
項５．  以下の(3)又は(4)に記載のポリペプチド。
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチド
項６．  以下の(5)、(6)、又は(7)のポリヌクレオチド。
（５）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（６）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（７）  項４又は５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
項７．  以下の(8)又は(9)のポリヌクレオチド。
（８）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（９）配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
項８．  項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【００１１】
項９．  項８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【００１２】
項１０．  項９に記載の形質転換体を培養し、培養物から耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を回収する、耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の製造方法。
【００１３】
項１１．  項１〜３のいずれかに記載の酵素、又は項４又は５に記載のポリペプチドの存在下で、グルコース６燐酸の異性化によりイノシトール１燐酸を得る工程を含むイノシトール１燐酸の製造方法。
【００１４】
項１２．  ５０℃の温度下で上記異性化を行う項１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、８５℃以上という高温条件下で酵素活性を発揮できるので、高温下で効率よくイノシトール１燐酸合成反応を行うことができる。このように、本酵素は、基質特異性が高いという酵素反応のメリットを備え、かつ熱に弱いという酵素のデメリットを克服したものとなる。また、本酵素を用いたイノシトール１燐酸合成反応中に雑菌の繁殖を抑制したり、夾雑酵素の影響を抑えることができるという利点がある。このことから、グルコース６燐酸の異性化物であるイノシトール１燐酸を高純度かつ安価に供給することが可能となる。
【００１６】
また、本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素によれば、耐熱性が高く、すなわち安定性が高いので、長時間の合成反応を行っても活性を安定に保持できる。また、長期保存によっても活性を安定に維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
（Ｉ）耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素
イノシトール１燐酸合成酵素は、グルコース６燐酸に作用して、その異性化により、イノシトール１燐酸を生成する酵素である。
イノシトール１燐酸合成酵素活性測定法
本発明において、イノシトール１燐酸合成酵素の活性は、下記方法により測定した値である。なお、ｐＨが酵素活性に与える影響を検討する際には、ｐＨ条件は種々変更している。また、反応温度が酵素活性に与える影響を検討する際には、温度条件は種々変更している。
【００１８】
先ず、15mM塩化アンモニウム、1 mM酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び5 mM グルコース６燐酸を含むpH9.0の100mM炭酸ナトリウム緩衝液0.23 mlに、検体酵素溶液0.02 ml（0.02 units）)を添加し、85℃で10分間反応させる。反応液に20% トリクロロ酢酸0.125mlを加えることにより反応を停止させた後、反応液の一部0.05mlに0.05mlの0.2MNaIO4を加え37℃で１時間処理する。
【００１９】
この溶液に、0.05mlの1M亜硫酸ナトリウム、0.225mlの1.5% tween-20、及び0.75mlのマラカイトグリーン発色液（4.2%モリブデン酸アンモニウムの塩酸溶液と0.2%マラカイトグリーン水溶液を１：３の割合で混合し濾過したもの）を順次混合し、660 nmにおける吸光度を測定した。反応液の代わりに既知濃度のリン酸溶液を用いて同様に測定した吸光度と比較することにより、生成したイノシトール１燐酸を定量する。生成したイノシトール１燐酸の量を比較することにより、相対的な酵素活性を算出する。
【００２０】
なお、本発明において、耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の活性単位１Ｕとは、上記測定条件において、１分間に１μモルのイノシトール１燐酸を生産することができる酵素量を意味する。
温度特性
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、８５℃で３時間処理した後にイノシトール１燐酸合成酵素活性が８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上保持されるものである。なお、従来のイノシトール１燐酸合成酵素では、８５℃で３０分間処理すると、活性は完全に消失する。
【００２１】
また、本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、７０℃以上、好ましくは８５℃以上、更に好ましくは９０℃以上、特に好ましくは９５℃以上の温度下で活性を示し、至適温度は９５℃以上である。なお、ここでいう「活性を示す」とは、至適温度における活性を１００％とした場合の相対活性で５％以上を示すことを意味する。
その他の特性
上記特性に加えて、本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、下記のいずれか１以上の特性を備えていることが好ましい。
【００２２】
８５℃の温度下、ｐＨ７〜１０程度の範囲で活性を示す。ここでいう「活性を示す」とは、至適ｐＨにおける活性を１００％とした場合の相対活性で２０％以上を示すことを意味する。また同温度下、ｐＨ８〜９．５程度の範囲で一層高い活性を示し、ｐＨ８．５〜９．３程度の範囲でより一層高い活性を示し、至適ｐＨは８．８〜９．２程度である。
【００２３】
補酵素として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）若しくはその誘導体を必要とする。
【００２４】
活性を高い活性を得る上で、反応液中のNAD濃度は０．０５〜１０mＭ程度が好ましく、０．１〜５mＭ程度が好ましく、０．５〜２mＭ程度がさらにより好ましい。
起源
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、８５℃で３時間処理した場合に８０％以上のイノシトール１燐酸合成活性を示し、７０℃以上で活性を示し、かつ至適温度が９５℃以上の酵素であればよく、その起源は特に限定されないが、好熱性古細菌が生産するものを挙げることができる。好熱性古細菌としては、例えば、アエロパイラム（Aeropyrum）属（例えばアエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix））；パイロコッカス（Pyrococcus）属（例えばパイロコッカスホリコシ（Pyrococcus horikoshii）、パイロコッカスアブシ（Pyrococcus abyssi）、パイロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus））などが挙げられる。温度特性などの点でより好ましいのは、アエロパイラム属由来のイノシトール１燐酸合成酵素であり、中でもアエロパイラム・ペルニクスが生産するものが最も好ましい。
アミノ酸配列
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素として、具体的には、以下の（１）又は（２）のポリペプチドを挙げることができる。
（１）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号１に示すアミノ酸配列は、アエロパイラム・ペルニクスK-1（理化学研究所微生物検討保存施設におけるＪＣＭ９８２０）の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素のアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、パイロコッカス・ホリコシOT3（同施設におけるＪＣＭ９９７４）の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素のアミノ酸配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、パイロコッカス・フリオサス（同施設におけるＪＣＭ８４２２）の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素のアミノ酸配列である。配列番号４に示すアミノ酸配列はパイロコッカス・アブシ（パスツール研究所におけるNCNM I-1302）の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素のアミノ酸配列である。
【００２５】
（２）のポリペプチドにおいて、欠失、置換若しくは付加の範囲は、実質的に同等のイノシトール１燐酸合成酵素活性及び耐熱性を有する範囲であればよく、特に制限されないが、アミノ酸配列の相同性５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、７０％以上がさらにより好ましい。なお、相同性はLipman-Pearson法(Science, 227, 1435(1985))により計算される。配列番号２〜４と配列番号１との間の相同性は全て５３％であり、配列番号２と配列番号３との間の相同性は８６％であり、配列番号２と配列番号４との間の相同性は８９％であり、配列番号３と配列番号４との間の相同性は９０％である。
【００２６】
なお、本発明において「耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有する」とは、グルコース６燐酸の異性化によりイノシトール１燐酸を生成する活性を有することを指す。
【００２７】
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の一態様として、アミノ酸配列１〜４において、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は双方から１〜５０個程度、好ましくは１〜２５個程度、さらに好ましくは１〜２０個程度のアミノ酸を欠失しているものを挙げることができる。上記の領域は、本酵素においてイノシトール１燐酸合成酵素活性及び耐熱性のいずれにも影響を与えないと考えられる領域であるため、上記領域の欠失であれば耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を保持できる。また、上記領域内で３０個程度まで、好ましくは１０個程度までであれば、アミノ酸が置換又は付加されていてもよい。アミノ酸の置換の場合は、タンパク質の構造保持の観点から、極栄、電荷、親水性／疎水性などの点で置換前のアミノ酸と共通するアミノ酸に置換すれば、耐熱性及び酵素活性が維持される。
製造方法
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、当該酵素を産生する微生物の培養物から精製することができる。また、本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素は、該酵素をコードするＤＮＡを単離し、これを適当な宿主で発現させることにより得ることができる。
耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素をコードするポリヌクレオチド
上記耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドとして、具体的には、以下の(5)又は(6)のＤＮＡを例示できる：
（５）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（６）配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列（好ましくは配列番号５に示す塩基配列）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明において、ポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、ＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれる。
【００２８】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×SSC、0.5% SDS及び50%ホルムアミドの溶液中で42℃で加温した後、0.1×SSC、0.5% SDSの溶液中で68℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。
【００２９】
なお、配列番号５に示す塩基配列は配列番号１に示すアミノ酸配列に、配列番号６に示す塩基配列は配列番号２に示すアミノ酸配列に、配列番号７に示す塩基配列は配列番号３に示すアミノ酸配列に、配列番号８に示す塩基配列は配列番号４に示すアミノ酸配列に、それぞれ対応している。
【００３０】
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子の取得方法の一例を以下に記載する。配列番号５のポリヌクレオチドは、遺伝子源としてアエロパイラム・ペルニクスのゲノムＤＮＡ、配列番号６のポリヌクレオチドはパイロコッカス・ホリコシのゲノムＤＮＡ、配列番号７のポリヌクレオチドはパイロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡ、配列番号８のポリヌクレオチドはパイロコッカス・アブシのゲノムＤＮＡをそれぞれ用いればよい。これらのゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、配列番号５〜８に基づき設計したプライマーセットを用いてこれらのゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲを行うことにより上記塩基配列のポリヌクレオチドを得ることができる。あるいは、上記塩基配列に基づき設計したプローブを用いてこれらのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、上記塩基配列のポリヌクレオチドを得ることができる。
また上記（６）の変異した耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素ＤＮＡは、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの公知の方法で作成することができる。遺伝子工学的手法としては、入手可能な耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素ＤＮＡに対して、エキソヌクレアーゼを用いたＤＮＡ欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたPCR法による塩基配列の改変などの公知の方法を挙げることができる。また（６）のポリヌクレオチドは、古細菌の上記以外の菌種のゲノムＤＮＡライブラリーを用いて発現ライブラリーを構築し、配列番号１〜４に示すポリペプチドに対する抗体と反応するクローンを選別すればよい。さらに、選別したクローンの生産する酵素の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素活性を測定することで、該酵素の発現を確認することができる。
組換えベクター
上記耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素をコードするポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）を適当なベクターに連結することによって、該遺伝子を含有する組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主において耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を発現させ得るものであれば、特に制限されない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等のベクターを用いることができる。具体的には、大腸菌ベクターのpBR322、pUC19、pKK233-2、pET21a等、バチルス属細菌ベクターのpUB110、pC194、pE194、pTHT15、pBD16等、酵母用ベクターYip5、Yrp17、Yep24等、動物細胞用ベクターのpcDNA、pBAC等を例示できる。
【００３１】
上記組換えベクターには、形質転換された細胞の選択を可能とするために、マーカー遺伝子が含まれていることが望ましい。当該マーカー遺伝子としては、例えば、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、又は薬剤に対する抵抗遺伝子等を挙げることができる。また、上記組換えベクターには、宿主で上記遺伝子の発現を可能にするためのプロモーターやその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）が含まれていることが好ましい。当該プロモーターとして、具体的にはSV40、CMV、ie1、T7、lac、trp、tac等のプロモーターを例示できる。
形質転換体
上記組換えベクターを用いて、宿主を形質転換することによって、該組換えベクターを含む形質転換体を得ることができる。宿主としては、上記耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を生産可能なものであれば、真核生物及び原核生物のいずれを用いることもできる。例えば、大腸菌等の細菌、酵母、糸状菌、動物細胞等を挙げることができる。形質転換は、宿主の種類に応じて、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主として細菌を使用する場合であれば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いることができる。
本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の製造方法
上記形質転換体を培養し、培養物から耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を回収することによって、上記耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を取得することができる。
【００３２】
上記形質転換体の培養は、宿主の種類に応じた通常の方法を採用すればよい。具体的には、炭素源、窒素源、その他微量栄養物を含む培地で培養を行う方法を挙げることができる。培養は、液体培養であっても、また固体培養であってもよい。
【００３３】
培養物から耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の採取は、適当な濃度の緩衝液で行なわれる。使用する緩衝液としては、該酵素に悪影響を及ぼさないことを限度として、特に制限されないが、好ましくはトリス塩酸を挙げることができる。このような緩衝液中で酵素を採取することにより、酵素の活性に悪影響を及ぼすことなく酵素の精製が可能となる。具体的には、培養上清を回収することにより本発明酵素を回収できる。なお、宿主を大腸菌として生産させた酵素のように、耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素が菌体内又は表面に蓄積されている場合には、菌体を回収し、これを上記緩衝液中で破砕又は溶菌して菌体抽出物を得ることにより本発明酵素を回収できる。
【００３４】
さらに、回収した酵素を硫安分画、各種のクロマトグラフィー等により精製することができる。
（ＩＩ）イノシトール１燐酸の製造方法
かくして得られた耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素を、グルコース６燐酸に作用させることによって、転位物であるイノシトール１燐酸を取得することができる。
【００３５】
酵素反応の条件は、使用する耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素が活性を発揮できる条件であればよく、特に限定されない。反応温度、ｐＨは、その酵素の至適条件とするのが好ましい。
【００３６】
例えば、反応温度は、５０℃以上、好ましくは６０℃以上、更に好ましくは７０〜８５℃程度とすればよい。ｐＨは、例えばｐＨ７〜１０程度、好ましくはｐＨ８〜９．５、更に好ましく特に好ましくはｐＨ８．８〜９．２程度とすればよい。ｐＨは、トリス塩酸、炭酸、ホウ酸などの緩衝液を用いて調整すればよい。
【００３７】
反応開始時の反応液中のグルコース６燐酸の濃度は、例えば０．１ｍＭ〜５００ｍＭ程度、好ましくは１〜１００ｍＭ程度、更に好ましくは２〜１０ｍＭ程度とすることができる。耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の使用量は、反応時間等によって異なるが、一例として、グルコース６燐酸１モルに対して、１００〜１０００００Ｕ程度、好ましくは１０００〜５００００Ｕ程度、更に好ましくは５０００〜１００００Ｕ程度の比率が挙げられる。
【００３８】
また、補酵素として、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、例えば０．０５〜１０mＭ程度、好ましくは０．１〜５mＭ程度、更に好ましくは０．５〜２mＭ程度の濃度で使用すればよい。
【００３９】
反応時間は、所望量のイノシトール１燐酸が得られる時間とすればよいが、例えば１分間〜２４時間程度、好ましくは２〜３時間程度とすればよい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４０】
（アエロパイラム・ペルニクス由来イノシトール１リン酸合成酵素遺伝子のクローニング）
i）Aeropyrum pernix K1株（ＪＣＭ９８２０）の培養
2 gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを1Lの海水に溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し加圧殺菌した。ついで、チオ硫酸ナトリウムを0.076％となるように加え、ＪＣＭ９８２０を植菌した。この培養液を９０℃で２日振とう培養し、その後遠心分離し集菌した。
ii)染色体ＤＮＡの調製
ＪＣＭ９８２０の染色体ＤＮＡは以下の方法により調製した。培養終了後5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌した。菌体を20mM Tris(pH 7.5)−1mM EDTA 溶液で２回洗浄後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％N-lauroylsarcosine−1mg/ml プロティナーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAをAgaroseブロック中に分離調製した。
iii)イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子の増幅
配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。配列番号５は、Aeropyrum pernix K1株のゲノムにおけるイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子であることが予測される塩基配列である。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。5'末端側に対応するプライマーとしては、配列表の配列番号５に示す塩基配列において、開始コドンの位置に制限酵素NdeIの認識配列が存在するように、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、３'末端側に対応するプライマーとしては、Aeropyrum pernix K1株の染色体DNA配列中の配列番号５に示す塩基配列において、開始コドンの位置に制限酵素NdeIの認識配列の塩基配列の３'末端より下流域に対応するプライマーであって、増幅されたDNA中に制限酵素のBamHIサイトが生じるようなプライマーを合成した。ＰＣＲ反応後、DNAを制限酵素 のNdeI及びBamHIで完全分解（37℃で５時間）した。次いで、イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子を含むDNA断片を精製カラムキットを用いて精製した。
iv)イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子を含有するベクターの構築
ベクターのpET21a（Novagen社製）を制限酵素 NdeIおよびBamHIで切断し、精製した。次いで、切断されたpET21aとイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子を含むDNA断片とをＴ4DNAリガーゼを用いて１６℃で、１６時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌(E. coli JM109株)を形質転換した。形質転換体は、0.05 mg/ml アンピシリンを含むLB寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。得られた形質転換体からイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子を含むプラスミドをアルカリ法で抽出した。
【実施例２】
【００４１】
アエロパイラム・ペルニクス由来のイノシトール１燐酸合成酵素の生産
i) イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子を含有する形質転換体の作製
1.5ml容チューブ内に、大腸菌（E. coli） Rosetta (DE3)株（ Novagen社製）のコンピテントセル0.04ｍl（2,000,0000cfu/μg）と、実施例１で調製したイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子含有プラスミドDNA溶液とを加え氷上に30分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にＳＯＣ培地を０.５mｌ加え、37℃で1時間振とう培養した。次いで、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
ii) イノシトール１燐酸合成酵素の精製
得られた形質転換体をアンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が0.2に達するまで、３７℃で培養した後、10 μMのＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を加えさらに19時間培養した。培養液を7,000rpmで５分間遠心分離することにより集菌した。集菌した菌体に、湿菌体重量の２０倍量の、１mMジチオトレイトールを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）を加え、菌体を９０Ｗの出力で５分間超音波破砕した。破砕した菌液を 18,000rpmで20分間遠心分離し、上清を採取した。夾雑蛋白を沈殿させて除去する目的で、この上清を８５℃で30分間加熱した後、18,000rpmで20分間遠心分離し、上清を採取した。上清に固形硫酸アンモニウムを50％飽和になるように加え、生じた蛋白質の沈澱を遠心分離機で集め、1mMジチオトレイトールを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）で透析した後、1mM ジチオトレイトールを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）で平衡化した、HiTrap Q（ファルマシア社製）カラムを用いて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。さらに、活性画分を1mMジチオトレイトールを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）中で透析した後、1.5Ｍになるように固形硫酸アンモニウムを加え、1.5Ｍ硫酸アンモニウム、1 mM ジチオトレイトールを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）で平衡化した、HiTrap Phenyl（ファルマシア社製）カラムを用いて疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーを行った。活性画分には、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれていた。また、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、耐熱性イノシトール燐酸合成酵素の分子量は42kDaであった。
＜精製工程におけるイノシトール１燐酸合成酵素の検出方法＞
精製工程におけるイノシトール１燐酸合成酵素の検出は、以下の方法でグルコース６燐酸からイノシトール１燐酸を生成する活性を測定することにより行った。
【００４２】
15mM塩化アンモニウム、1 mM酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）、5 mM グルコース６燐酸を含むpH9.0の100mM炭酸ナトリウム緩衝液0.23 mlに、検体酵素溶液0.02 mlを添加し、85℃で10分間反応させる。反応液に20% トリクロロ酢酸0.125mlを加えることにより反応を停止させた後、反応液の一部0.05mlに0.05mlの0.2MNaIO4を加え37℃で１時間処理する。これに0.05mlの1M亜硫酸ナトリウムと0.225mlの1.5% tween-20を混合した後、0.75mlのマラカイトグリーン発色液（4.2%モリブデン酸アンモニウムの塩酸溶液と0.2%マラカイトグリーン水溶液を１：３の割合で混合し濾過したもの）を加え、660 nmにおける吸光度を測定し、反応液の代わりに既知濃度のリン酸溶液を用いて同様に測定した吸光度と比較することにより、生成したイノシトール１燐酸を定量する。生成したイノシトール１燐酸の量を比較することにより、相対的な酵素活性を算出する。
【実施例３】
【００４３】
超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1株のイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子の同定
実施例１で得られた超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1株の染色体ＤＮＡ中のイノシトール１燐酸合成酵素遺伝子の塩基配列を同定した。この塩基配列を配列番号５に示す。
【００４４】
また、実施例２で得られたAeropyrum pernix K1株のイノシトール１燐酸合成酵素のアミノ酸配列を同定した。このアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【実施例４】
【００４５】
耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の性質
前記の方法で得られたAeropyrum pernix K1株由来のイノシトール１燐酸合成酵素の諸特性を評価した。
・  至適pH
以下のイノシトール１燐酸合成酵素の活性測定方法により至適pHを求めた。すなわち、15mM塩化アンモニウム、1 mM酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）、5 mM グルコース６燐酸を含む様々なpHの緩衝液0.23 mlに、検体酵素溶液0.02 mlを添加し、85℃で10分間反応させた。反応液に20% トリクロロ酢酸0.125mlを加えることにより反応を停止させた後、反応液の一部0.05mlに0.05mlの0.2MNaIO4を加え37℃で１時間処理した。反応液に0.05mlの1M亜硫酸ナトリウムと0.225mlの1.5% tween-20とを混合した後、0.75mlのマラカイトグリーン発色液（4.2%モリブデン酸アンモニウムの塩酸溶液と0.2%マラカイトグリーン水溶液を１：３の割合で混合し濾過したもの）を加え、660 nmにおける吸光度を測定し、反応液の代わりに既知濃度のリン酸溶液を用いて同様に測定した吸光度と比較することにより、生成したイノシトール１燐酸を定量した。生成したイノシトール１燐酸の量を比較することにより、相対的な酵素活性を算出した。
【００４６】
比較する緩衝液としては、ｐＨ6.0〜8.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液およびpH8.0〜10.0の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液を用いた。
【００４７】
得られた結果を図１に示す。なお、図１の縦軸は、最大活性を示すｐＨ（ｐＨ７．８）での活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。図１から分かるように、本酵素の至適ｐＨは８．８〜９．２であった。
ii)耐熱性
実施例２で得たイノシトール１燐酸合成酵素溶液（0.23 mg/ml）を1mMジチオトレイトールを含む0.1M Tris-HCl,pH8.0中で７０℃、８５℃、１００℃で３時間インキュベートし、残存活性（％）を測定した。
【００４８】
得られた結果を図２に示す。図２から分かるように、本酵素は、８５℃で３時間処理しても、活性が９９％以上残存していた。このような熱安定性を有するイノシトール１燐酸合成酵素は今まで存在しない。
iii)至適温度
15mM塩化アンモニウム、1 mM酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）、5 mM グルコース６燐酸を含むpH9.0の100mM炭酸ナトリウム緩衝液0.23 mlに、検体酵素溶液0.02 mlを添加し、５０，７０，８５，９５℃で10分間反応させた。反応液に20% トリクロロ酢酸0.125mlを加えることにより反応を停止させた後、反応液の一部0.05mlに0.05mlの0.2MNaIO4を加え37℃で１時間処理した。反応液に0.05mlの1M亜硫酸ナトリウムと0.225mlの1.5% tween-20を混合した後、0.75mlのマラカイトグリーン発色液（4.2%モリブデン酸アンモニウムの塩酸溶液と0.2%マラカイトグリーン水溶液を１：３の割合で混合し濾過したもの）を加え、660 nmにおける吸光度を測定し、反応液の代わりに既知濃度のリン酸溶液を用いて同様に測定した吸光度と比較することにより、生成したイノシトール１燐酸を定量した。
【００４９】
得られた結果を図３に示す。図３の縦軸は、最大活性を示す温度（９５℃）での活性を１００とした際の相対活性（％）を示す。図３から分かるように、本発明の酵素は、至適温度が９５℃以上であると考えられる。
【実施例５】
【００５０】
イノシトール１燐酸合成酵素によるイノシトール１燐酸の生産
実施例２で得られたAeropyrum pernix K1株由来のイノシトール１燐酸合成酵素を用いて、以下の方法に従って、イノシトール１燐酸の製造を行った。
【００５１】
１ｍｌの５ｍＭグルコース６燐酸、１ｍＭ 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１５ｍＭ塩化アンモニウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０に、実施例２で得られた酵素０．０５ｍｇを混合し、８５℃で２時間インキュベートした。その後、反応液に20% トリクロロ酢酸０．５ｍｌを加えることにより反応を停止させた後、反応液の一部0.05mlに0.05mlの0.2MNaIO4を加え37℃で１時間処理した。反応液に0.05mlの1M亜硫酸ナトリウムと0.225mlの1.5% tween-20とを混合した後、0.75mlのマラカイトグリーン発色液（4.2%モリブデン酸アンモニウムの塩酸溶液と0.2%マラカイトグリーン水溶液を１：３の割合で混合し濾過したもの）を加え、660 nmにおける吸光度を測定し、反応液の代わりに既知濃度のリン酸溶液を用いて同様に測定した吸光度と比較することにより、生成したイノシトール１燐酸を定量した。その結果、グルコース６燐酸５μモルから、２６ｎモルのイノシトール１燐酸が生成していることが確認された。
【実施例６】
【００５２】
パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素
Pyrococcus horikoshii OT3（ＪＣＭ９９７４、理化学研究所微生物検討保存施設）を用いて、実施例１の方法に従って、Pyrococcus horikoshii由来の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の遺伝子（配列番号６）及び該遺伝子を含むベクターを調製できる。
【００５３】
また、実施例２の方法に従って、上記遺伝子を含有する形質転換体を作製し、それを使用してPyrococcus horikoshii由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素（配列番号２）を製造することができる。
【実施例７】
【００５４】
Pyrococcus furiosus由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素
Pyrococcus furiosus（ＪＣＭ８４２２、理化学研究所微生物検討保存施設）を用いて、実施例１の方法に従って、Pyrococcus furiosus由来の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の遺伝子（配列番号７）及び該遺伝子を含むベクターを調製できる。
【００５５】
また、実施例２の方法に従って、上記遺伝子を含有する形質転換体を作製し、それを使用してPyrococcus furiosus由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素（配列番号３）を製造することができる。
【実施例８】
【００５６】
Pyrococcus abyssi由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素
Pyrococcus abyssi（CNCM I-1302、パスツール研究所）を用いて、実施例１の方法に従って、Pyrococcus abyssi由来の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子（配列番号８）及び該遺伝子を含むベクターを調製できる。
【００５７】
また、実施例２の方法に従って、上記遺伝子を含有する形質転換体を作製し、それを使用してPyrococcus abyssi由来耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素遺伝子（配列番号４）を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の耐熱性を示す図である。
【図３】本発明の耐熱性イノシトール１燐酸合成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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