(57)【要約】【課題】より迅速かつ簡便に、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力を検定する方法等を提供すること。【解決手段】物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定方法において、（１）接着性培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、（２）前記接着性培養細胞を蛍光プローブで染色する第二工程、（３）前記接着性培養細胞の蛍光強度を測定する第三工程、（４）第三工程により測定された蛍光強度と対照における蛍光強度とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価する第四工程、を有することを特徴とする検定方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定方法において、
（１）接着性培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記接着性培養細胞を蛍光プローブで染色する第二工程、
（３）前記接着性培養細胞の蛍光強度を測定する第三工程、
（４）第三工程により測定された蛍光強度と対照における蛍光強度とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価する第四工程、
を有することを特徴とする検定方法。
【請求項２】
物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定のための試薬としての、接着性培養細胞の使用。
【請求項３】
物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定のための試薬であって、接着性培養細胞を含有することを特徴とする試薬。
【請求項４】
請求項１記載の方法により検定された、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を選抜する工程を有することを特徴とするホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質の探索方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法により検定された、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする低ホスホリピドーシス誘発性に係る低毒性薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の医薬品又は化学物質等による毒性又は副作用発現の表現型の一つとしてホスホリピドーシスが挙げられる。このホスホリピドーシス誘発能力を示す化合物は、抗うつ剤、抗生物質、抗マラリア剤、抗不整脈剤等の多岐に渡ることが知られており（例えば、非特許文献１参照）、創薬の化合物スクリーニング過程等でも回避すべき毒性の一つと考えられる。
物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定方法に関しては、主として実験動物に被験物質を投与して得られた試料（例えば、臓器等）の形態学的検索、特に透過型電子顕微鏡で特徴的なミエリン様構造の出現を指標として検出する方法が古くから用いられている（例えば、非特許文献２参照）。さらに、被験物質が投与された実験動物より得られた尿中のメガリン結合リガンド（megalin binding ligand）を定量することにより、ホスホリピドーシス誘発能力が検定できることが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
また最近では、浮遊性培養細胞を用いてホスホリピドーシス誘発能力を検出する法法も報告されている（例えば、非特許文献３及び非特許文献４参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第03/102593号パンフレット
【非特許文献１】Toxicologic Pathology，25，53-60，1997
【非特許文献２】Progress in Neurobiology，60，501-512，2000
【非特許文献３】Biochemical Pharmacology，53，1521-1532，1997
【非特許文献４】Cell Biology and Toxicology，19，161-176，2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献２等に記載された検定方法では、通常、実験動物に対する被験物質投与を伴なうことから少量の被験物質での実施は困難である。また、用いられる指標としての電子顕微鏡観察において、電子顕微鏡観察用標本作成に時間を要し、そして多数の検体を一度に処理することが困難である。さらには得られる結果は形態学的変化のために定量化が必ずしも容易ではない。
【０００５】
また、特許文献１に記載された検定方法では、前記検定方法と同様に実験動物を用いた試験が必要となり、少量の被験物質での実施は困難であることや、多数の被験物質を一度に処理することが困難である。さらには測定の標的となるメガリン（Megalin）の発現が腎臓をはじめとした特定の臓器に限定されていること、及び、測定対象を尿としていることから、腎臓以外の臓器におけるホスホリピドーシス誘発能力の検定方法には必ずしも適していない。
【０００６】
一方、非特許文献３及び非特許文献４に記載された浮遊性培養細胞を用いてホスホリピドーシス誘発能力を検定する方法では、培養細胞が浮遊状態である必要があり、多くの臓器由来である接着性培養細胞への適用は容易ではなく、その結果、限られた狭い範囲の培養細胞を対象とした試験しか実施できなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況下、本発明者は、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力を、より迅速かつ簡便に検定するための方法について鋭意検討した結果、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、
１．物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定方法において、
（１）接着性培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記接着性培養細胞を蛍光プローブで染色する第二工程、
（３）前記接着性培養細胞の蛍光強度を測定する第三工程、
（４）第三工程により測定された蛍光強度と対照における蛍光強度とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価する第四工程、
を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定のための試薬としての、接着性培養細胞の使用；
３．物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定のための試薬であって、接着性培養細胞を含有することを特徴とする試薬；
４．前項１記載の方法により検定された、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を選抜する工程を有することを特徴とするホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質の探索方法；
５．前項１記載の方法により検定された、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする低ホスホリピドーシス誘発性に係る低毒性薬；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法により、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力をより迅速かつ簡便に検定することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法において用いられる接着性培養細胞は、培養器材底面に接着して初めて生存・増殖できるような細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、種々の臓器由来である初代培養細胞や株化細胞等の接着性培養細胞をあげることができる。
【００１１】
本発明方法の第一工程は、接着性培養細胞と被験物質とを接触させればよい。
接着性培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、1日間以上を、好ましくは１日間以上１４日間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、１０℃〜４０℃程度を、好ましくは２０℃〜４０℃程度をあげることができる。
【００１２】
本発明方法の第一工程における接触系内での被験物質の濃度としては、例えば、０．００１μＭ〜１０ｍＭ程度で、好ましくは０．０１μＭ〜５ｍＭ程度をあげることができる。
本発明方法の第一工程における接触系内での接着性培養細胞の密度としては、例えば、1×103cell／cm2〜1×105cell／cm2程度で、好ましくは3×103cell／cm2〜3×104cell／cm2程度をあげることができる。
【００１３】
また、前記の被験物質処理後に、必要に応じて前記接着性培養細胞をグルタールアルデヒド等の固定液で固定することもできる。固定液の濃度としては、例えば、１〜４％程度を、好ましくは１％〜３％程度をあげることができる。接着性培養細胞と固定液との接触保温温度としては、例えば、４℃〜３０℃程度を、好ましくは４℃〜１０℃程度をあげることができる。接着性培養細胞と固定液との接触時間としては、例えば、約５分間以上を、好ましくは約５分間以上約２時間以内をあげることができる。
【００１４】
本発明方法の第二工程は、前記接着性培養細胞を蛍光プローブで染色すればよい。例えば、第一工程において被験物質と接触させられた接着性培養細胞と蛍光プローブとを接触させればよい。蛍光プローブとしては、例えば、Cell Biology and Toxicology, 19, 161-176, 2003、The Journal of Cell Biology, 100, 965-973, 1985等に記載されるような蛍光色素であって、具体的には、ニールレッド（NileRed）、ベンズピレン、ＮＢＴ−アミノドデカン酸等の蛍光色素をあげることができる。
前記接着性培養細胞と蛍光プローブとの接触時間としては、例えば、５分間程度以上を、好ましくは約５分間以上約６０分間以内をあげることができる。前記接着性培養細胞と蛍光プローブとの接触保温温度としては、例えば、約５℃以上約３０℃以下を、好ましくは約１０℃以上約２５℃以下をあげることができる。
【００１５】
本発明方法の第二工程における蛍光プローブの濃度としては、例えば、０．１μg／mL〜３０μg／mL程度で、好ましくは１０μg／mL〜３０μg／mL程度をあげることができる。
本発明方法の第二工程における前記培養細胞の濃度としては、例えば、1×103cell／cm2〜1×105cell／cm2程度で、好ましくは3×103cell／cm2〜3×104cell／cm2程度である。
【００１６】
本発明方法の第三工程は、第二工程後、例えば、市販の蛍光光度計等を用いて、前記接着性培養細胞の蛍光強度を測定すればよい。具体的には、Exitation：485nm、Emmision：635nmの条件下で、第二工程後の接着性培養細胞の蛍光強度を測定し、当該測定値に基づき下記の計算式に従って蛍光強度率を求める。
【００１７】
蛍光強度率（％）＝｛被験物質における蛍光強度−ブランク（細胞を含まない条件）における蛍光強度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における蛍光強度−ブランク（細胞を含まない条件）における蛍光強度｝
【００１８】
本発明方法の第三工程において、上記のようにして算出された蛍光強度（率）と対照における蛍光強度（率）（即ち、基準物質等のポジティブコントロール、ネガティブコントロール等）とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価する。この場合には、被験物質における蛍光強度（率）が対照（基準物質等のポジティブコントロール）における蛍光強度（率）よりも高い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりもホスホリピドーシス誘発能力が高いと評価する。このようにして被験物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の検定をより迅速かつ簡便に行うことができる。
本発明方法において、測定された蛍光強度（率）と対照における蛍光強度（率）とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールであってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質等のポジティブコントロール）が有するホスホリピドーシス誘発能力を基準としながら他方の被験物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００１９】
尚、ホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量を評価するための指標となる蛍光強度（率）が統計学的に有意な値を示す物質、例えば具体的には、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、上記の式における蛍光強度（率）が１０％以上の高値を示す物質を、好ましくは２０％以上の高値を示す物質を、ホスホリピドーシス誘発能力を有する物質として選抜すればよい。一方、対照としてポジティブコントロールを用いた場合には、上記の式における蛍光強度（率）がプラス値であり、好ましくは５％以上の高値を示す物質を、ホスホリピドーシス誘発能力を有する物質として選抜すればよい。
【００２０】
ホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を探索するには、本発明方法結果に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を選抜すればよい。尚、当該物質は、ホスホリピドーシス誘発能力を有さない限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００２１】
接着性培養細胞は、上記のように、ホスホリピドーシス誘発能力を検定するための試薬として使用することができる。
【００２２】
さらに本発明方法は、ホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明方法により検定された、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力の有無又はその程度若しくはその量に基づきホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を選抜することによって、ホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質を探索することができる。
選抜されたホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質若しくはその薬学的に許容される塩は、低毒性薬の有効成分として用いてもよい。当該有効成分を薬学的に許容される担体中に製剤化することにより、低毒性薬を製造することができる。
【００２３】
上記のホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質は、前述のように、当該物質の薬学的に許容される塩（例えば、酸付加塩又は塩基付加塩）の形で低ホスホリピドーシス誘発性に係る低毒性薬の有効成分として利用してもよい。酸付加塩としては、例えば、無機酸付加塩又は有機酸付加塩が挙げられ、無機酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸塩等が挙げられ、有機酸付加塩としては、例えば、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩等が挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、無機塩基付加塩又は有機塩基付加塩が挙げられ、無機塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、有機塩基付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸付加塩等が挙げられる。かかる塩は公知の手段によって製造することができる。
また、上記のホスホリピドーシス誘発能力を有さない物質は、当該物質の薬学的に許容される塩の水和物等の溶媒和物の形で低ホスホリピドーシス誘発性に係る低毒性薬の有効成分として利用してもよい。
【００２４】
当該低毒性薬の投与は、通常の投与経路、例えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻孔内等により行うことができる。投与量及び投与回数は投与経路、症状の程度、年齢、体重等によって異なるが、通常は成人１日当たり約１ｍｇ乃至１ｇを１日１回又はそれ以上の回数で投与される。投与剤形としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤、注射剤、経鼻剤等が挙げられる。製剤化の際は、通常の製剤担体を用い、常法により製造することができる。即ち、経口用製剤を調製する場合には、必要に応じて結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤等を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、必要に応じてｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により注射剤とすることもできる。
【００２５】
本発明は、本発明方法に基づくシステム工程を有する、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力を検定するための装置も含み、また本発明方法により検定して得られた毒性情報を有する電子情報記録媒体等も含むものである。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例はこれらの例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
大日本製薬（株）から購入したヒト肝由来の接着性培養細胞株HepG2を使用した。当該接着性培養細胞を培養器材からトリプシン-EDTA（0.05% トリプシン、0.53mM EDTA・4Na）を用いて細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を低速遠心（1,000×ｇ、３分間）することにより沈殿を得て、これを10mLの下記の培養液に懸濁した。
このようにして調製された細胞懸濁液の中の細胞の数をトリパンブルー染色により計数した後、当該細胞懸濁液を下記の培養液を用いて1.4×105cell／mLに希釈した。希釈された細胞懸濁液を96ウエルプレート（Iwaki）に撒いた後（100μL/ウエル）、これを３７℃、５％CO2存在下で３日間培養することにより、細胞を接着させた。
【００２８】
培養液としては、Minimum  Essential  Medium  （LIFE  TECHNOLOGIES社製）  500mLに下記の成分（LIFE  TECHNOLOGIES社製）が添加されたものが用いられた。
・Fetal Bovine Serum  50mL
・MEM非必須アミノ酸溶液（10mM）5mL
・MEMピルビン酸ナトリウム溶液（100mM） 5mL
・ペニシリン（10,000U/mL）-ストレプトマイシン（10,000μg/mL）5mL
このようにして、本試験に用いる接着性培養細胞を調製した。
【００２９】
次に、ホスホリピドーシス誘発能力を有することが既知であるイミプラミン（Imipramine）、アミオダロン（Amiodarone）又はマプロチリン（Maprotiline）をそれぞれ0μＭ〜30μＭの濃度で培養液に添加した。
このようにして調製された被験物質含有培養液を、上記で調製された接着性培養細胞に添加した後、さらに３７℃、５％CO2存在下で７日間培養を続けることにより、前記接着性培養細胞と前記被験物質とを接触させた。
培養終了後、培養液を廃棄し、当該接着性培養細胞を1.25％グルタール・アルデヒド液で室温、２０分間固定した。リン酸緩衝食塩水（以下、PBSと記すこともある。）で２回洗浄した後、蛍光プローブとしてニールレッド（Nilered）染色液（20μg/mL）を用いて、室温、遮光下で１時間染色した。染色後、前記接着性培養細胞をPBSで２回洗浄した。このようにして得られた接着性培養細胞の蛍光強度（Exitation：485nm、Emmision：635nm）を、蛍光吸光マイクロプレートリーダー（スペクトラフルオ、和光純薬）を用いて測定した。また測定結果から下記の式に従って蛍光強度率を算出した。算出された値について、陰性対照群と被験物質処理群との間で有意差検定（Bartlettの等分散検定を行い、有意でない場合にはDunnettの多重比較検定を、有意な場合にはSteelの多重比較検定）を行った。その結果を図１に示した。
【００３０】
蛍光強度率（％）＝｛被験物質における蛍光強度−ブランク（細胞を含まない条件）における蛍光強度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における蛍光強度−ブランク（細胞を含まない条件）における蛍光強度｝
【００３１】
図１から明らかなように、被験物質としてホスホリピドーシス誘発能力を有するイミプラミン（Imipramine）、アミオダロン（Amiodarone）又はマプロチリン（Maprotiline）を用いた試験区では前記被験物質の濃度に依存した接着性培養細胞の蛍光強度率における増加が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明方法により、物質が有するホスホリピドーシス誘発能力をより迅速かつ簡便に検定することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ホスホリピドーシス誘発能力を有することが既知であるイミプラミン（Imipramine）、アミオダロン（Amiodarone）又はマプロチリン（Maprotiline）を被験物質として用いた試験での、培養細胞の蛍光強度率を示す図である。尚、各試験区における反復数は６であった。また***は、統計学的解析で陰性対照群（control）に対して統計学的に有意差（p<0.001）を認めたことを表している。
【図１】
2006112947.tif 000002