(57)【要約】【課題】抗自己免疫疾患剤の新規なスクリーニング方法の提供。【解決手段】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：(a) 被験物質とCaMKII酵素および基質とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素による基質のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを被験物質を接触させない対照酵素の上記リン酸化レベルと比較する工程、(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する工程、    およびそのスクリーニング方法を用いて得られる物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素による基質のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを、被験物質を接触させない対照酵素の上記リン酸化レベルと比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する工程。
【請求項２】
抗自己免疫疾患剤が、自己免疫疾患予防剤および／または自己免疫疾患治療剤である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗自己免疫疾患剤が、免疫の異常亢進改善剤である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
抗自己免疫疾患剤が、関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制剤、関節破壊の抑制剤、関節変形への進行抑制剤、または身体機能の改善剤である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が40%以上である物質を選択する工程を含む請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が60%以上である物質を選択する工程を含む請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【請求項８】
CaMKII阻害作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【請求項９】
CaMKII阻害作用を有する物質が、10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が40%以上である物質である請求項８記載の抗自己免疫疾患剤。
【請求項１０】
関節リウマチの予防剤および／または治療剤である請求項８または９のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【請求項１１】
関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形への進行抑制、または身体機能の改善のための請求項８または９のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【請求項１２】
式１で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とするCaMKII阻害剤。
式１：
【化１】
2006223228.tif 000020
［式中、Ｄは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＣＯ2Ｒ6、−ＳＲ7、−（ＣＯ）ＳＲ7、−（ＣＳ）ＯＲ7または−ＣＳ2Ｒ7（式中、Ｒ5は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表す。Ｒ6は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環基を表す。Ｒ7は置換されてもよいアルキル基または置換されてもよいアリール基を表す。）を表す。
ＡおよびＢは、一方が、式：
【化２】
2006223228.tif 000021
（Ｅは単結合またはアルキレン基を表す。
２つの破線は、一方が実線と共に２重結合を意味し、他方が実線と共に単結合を意味する。Ｒ1は破線が実線と共に単結合を表す結合に結合する窒素原子に結合する。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、各々独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、ＮＨ基の保護基、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＣＯ2Ｒ6、−ＳＲ7、−（ＣＯ）ＳＲ7、−（ＣＳ）ＯＲ7または−ＣＳ2Ｒ7（式中、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は前記と同義である。）を表す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、このうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成してもよい。また、式：−ＮＲ3Ｒ4は、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44で表される基を表してもよい。
Ｒ43およびＲ44は、以下の（１）または（２）の通りである。
（１）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは１〜３の整数を表す。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎは前記と同義である。Ｒ32は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎは前記と同義である。Ｒ33およびＲ34は独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍは２または３を表す。Ｒ35は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基または−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍは前記と同義である。Ｒ36は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）を表す。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍは前記と同義である。Ｒ37およびＲ38は独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表すか、またはＲ37およびＲ38は一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、フェニルまたはピリジルを表す。）を表す。
（２）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。）
で表される基を表す。
ＡおよびＢは、他方が、式：−Ｊ−Ｇ
（式中、Ｇは置換されてもよいアリール基、もしくは置換されてもよい複素環基を表す。Ｊは−Ｃ（Ｒ8Ｒ9）−または−Ｃ（＝ＣＲ8Ｒ9）−を表す。Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、水素原子、置換されてもよい低級アルコキシ基、または置換されてもよい低級アルキル基を表す。また、Ｒ8およびＲ9が結合して一緒になって、炭素原子と共に、置換されてもよい炭化水素環、置換されてもよい１，３−ジオキサン環または置換されてもよい１，３−ジオキソラン環を形成してもよい。）
で表される基を表す。］
【請求項１３】
Ｅが単結合または低級アルキレン基である請求項１２記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１４】
Ｄが水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、−Ｒ5または−ＣＯ2Ｒ6（式中、Ｒ5およびＲ6は請求項１２における意義と同義である。）である請求項１２または１３のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１５】
Ｄが水素原子、カルボキシ基、−Ｒ5または−ＣＯ2Ｒ6（式中、Ｒ5およびＲ6は請求項１２における意義と同義である。）である請求項１４記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１６】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表すか、式：−ＮＲ3Ｒ4が、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44（Ｒ43およびＲ44は、請求項１２における意義と同義である。）で表される基を表すか、または、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する請求項１２〜１５のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１７】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表すか、式：−ＮＲ3Ｒ4が、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44（Ｒ43およびＲ44は、請求項１２における意義と同義である。）で表される基を表すか、または、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する請求項１６記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１８】
Ｇが置換されてもよいフェニル、置換されてもよいナフチル、置換されてもよいフリル、置換されてもよいチエニル、置換されてもよいインドリル、置換されてもよいイソチアゾリル、置換されてもよいベンゾチエニル、置換されてもよいイソベンゾフラニル、置換されてもよいピロリル、置換されてもよいベンゾフリル、置換されてもよいイミダゾリル、置換されてもよいピラゾリル、置換されてもよいイソキサゾリル、置換されてもよいイソチアゾリル、置換されてもよいチアゾリル、置換されてもよいオキサゾリル、置換されてもよいベンズイミダゾリル、置換されてもよいベンゾチアゾリル、置換されてもよいベンズオキサゾリル、置換されてもよいピリジル、置換されてもよいピラジニル、置換されてもよいピリミジニル、置換されてもよいピリダジニル、置換されてもよいトリアジニル、置換されてもよいキノリル、置換されてもよいイソキノリル、置換されてもよいキナゾリニル、置換されてもよいキノキサリニル、置換されてもよい２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシニルまたは置換されてもよいカルバゾリルである請求項１２〜１７のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
【請求項１９】
式Ａ１：
【化３】
2006223228.tif 000022
［式中、Ｇ1は、フェニル、ビフェニル−４−イル、３−ベンゾイルフェニル、４−ベンゾイルフェニル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、１−ベンゾフラン−５−イル、１−ベンゾフラン−６−イル、キノリル、イソキノリル、フェニルピリジル、フェニルピリミジニル、フェニルピリダジニルまたはフェニルピラジニル（これらにおいて、フェニル、ビフェニル−４−イル、３−ベンゾイルフェニル、４−ベンゾイルフェニル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、１−ベンゾフラン−５−イル、１−ベンゾフラン−６−イル、キノリル、イソキノリル、フェニルピリジル、フェニルピリミジニル、フェニルピリダジニルおよびフェニルピラジニルは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、アセチル、シアノ、−ＣＯ2Ｒ29（Ｒ29は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）および−ＣＯＮＲ30Ｒ31（Ｒ30およびＲ31は、独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）からなる群から任意に選ばれる１または２個の基で置換されてもよい。）を表す。
Ｒ23およびＲ24は、独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、メトキシまたはエトキシを表すか、または一緒になってメチレンを表す。
式：＝Ｃ（ＮＲ25Ｒ26）ＮＲ27Ｒ28は、以下の（１）、（２）または（３）の通りである。
（１）Ｒ25およびＲ26は、以下の（ａ）または（ｂ）の通りであり、Ｒ27およびＲ28は、以下の（ｃ）または（ｄ）の通りである。
（ａ）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は請求項１２における意義と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は請求項１２における意義と同義である。）を表す。
（ｂ）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（ｃ）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｄ）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（２）Ｒ26およびＲ27は、一緒になって２つの窒素原子、炭素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい）を表す。
Ｒ25およびＲ28は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍは前記と同義である。Ｒ36は請求項１２における意義と同義である。）を表す。
（３）式：＝Ｃ（ＮＲ25Ｒ26）ＮＲ27Ｒ28が、式：＝Ｃ（ＮＲ41Ｒ42）Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44を表す。
Ｒ41およびＲ42は、以下の（ａ1）または（ｂ1）の通りであり、Ｒ43およびＲ44は、以下の（ｃ1）または（ｄ1）の通りである。
（ａ1）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｂ1）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（ｃ1）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｄ1）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。］
または、式Ａ２：
【化４】
2006223228.tif 000023
［式中、Ｇ1、Ｒ23およびＲ24は前記と同義である。
式：−Ｎ（Ｒ45）Ｃ（ＮＲ46Ｒ47）＝ＮＲ48は、以下の（１1）または（２1）の通りである。
（１1）Ｒ45は、炭素数１〜３のアルキル基またはアセチルを表す。Ｒ48は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基またはアセチルを表す。
Ｒ46およびＲ47は、以下の（ａ2）または（ｂ2）の通りである。
（ａ2）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｂ2）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（２1）Ｒ45およびＲ46は、一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
Ｒ47およびＲ48は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍおよびＲ36は前記と同義である。）を表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする請求項１２記載のCaMKII阻害剤。
【請求項２０】
式Ａ３：
【化５】
2006223228.tif 000024
［式中、Ｇ2は、２−フルオロ−ビフェニル−４−イル、２’−フルオロ−ビフェニル−４−イルまたは３−ベンゾイルフェニルを表す。Ｒ49は、メチルを表す。Ｒ50は、水素原子、メチル、メトキシまたはエトキシを表す。
式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54は、（１2）、（２2）または（３2）の通りである。
（１2）Ｒ51およびＲ52は、以下の（ａ3）、（ｂ3）または（ｃ3）の通りであり、Ｒ53およびＲ54は、以下の（ｄ3）、（ｅ3）または（ｆ3）の通りである。
（ａ3）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｂ3）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は請求項１２における意義と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は請求項１２における意義と同義である。）を表す。
（ｃ3）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（ｄ3）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｅ3）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｆ3）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（２2）式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54が、式：
【化６】
2006223228.tif 000025
（式中、Ｒ55は、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ56（ｍは前記と同義である。Ｒ56は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）を表す。）で表される基を表す。
（３2）式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54が、式：＝Ｃ（ＮＲ57Ｒ58）Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ59Ｒ60を表す。
Ｒ57およびＲ58は、以下の（ａ4）、（ｂ4）または（ｃ4）の通りであり、Ｒ59およびＲ60は、以下の（ｄ4）、（ｅ4）または（ｆ4）の通りである。
（ａ4）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｂ4）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｃ4）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（ｄ4）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｅ4）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｆ4）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする請求項１２記載のCaMKII阻害剤。
【請求項２１】
式Ａ４：
【化７】
2006223228.tif 000026
［式中、Ｇ2、Ｒ49およびＲ50は、請求項２０における意義と同義である。
式：＝Ｃ（ＮＲ61Ｒ62）ＮＲ63Ｒ64は、以下の（１3）、（２3）または（３3）の通りである。
（１3）Ｒ63およびＲ64は、共に水素原子を表す。
Ｒ61およびＲ62は、以下の（ａ5）、（ｂ5）または（ｃ5）の通りである。
（ａ5）独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。
（ｂ5）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は請求項１２における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ65（ｍは２または３を表す。Ｒ65は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、２−ヒドロキシエチルまたは３−ヒドロキシプロピルを表す。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ66Ｒ67（ｍは前記と同義である。Ｒ66およびＲ67は、独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表すか、またはＲ66およびＲ67は一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）を表す。
（ｃ5）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（２3）式：＝Ｃ（ＮＲ61Ｒ62）ＮＲ63Ｒ64が、式：
【化８】
2006223228.tif 000027
（Ｒ68は、炭素数１〜３のアルキル基、２−ヒドロキシエチルまたは３−ヒドロキシプロピルを表す。）で表される基を表す。
（３3）Ｒ61およびＲ62は、一緒になって窒素原子と共に、モルホリンを表し、Ｒ63およびＲ64は、一緒になって、アミノ−モルホリン−４−イル−メチレンを表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする請求項１２記載のCaMKII阻害剤。
【請求項２２】
Ｇ2が２−フルオロ−ビフェニル−４−イルまたは２’−フルオロ−ビフェニル−４−イルであり、Ｒ50が水素原子またはメチルであり、Ｒ63およびＲ64が共に水素原子であり、Ｒ61およびＲ62が、以下の（ａ6）または（ｂ6）の通りである、請求項２１記載のCaMKII阻害剤：
（ａ6）独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す；
（ｂ6）一緒になって窒素原子と共に、モルホリン（モルホリンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
【請求項２３】
3-[(1S)-1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-5-｛[アミノ(モルフォリン-4-イル)メチレン]アミノ｝イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩を有効成分として含むCaMKII阻害剤。
【請求項２４】
4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾールまたはその薬学上許容される塩を有効成分として含むCaMKII阻害剤。
【請求項２５】
IκBαの分解抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【請求項２６】
サイクリンD1の発現増強に対する抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【請求項２７】
Aktのリン酸化抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【請求項２８】
CaMKII阻害作用を有する物質が、CaMKII遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである、請求項８〜１１のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【請求項２９】
CaMKII阻害作用を有する物質が抗CaMKII抗体である、請求項８〜１１のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【請求項３０】
抗自己免疫疾患剤の製造のための、CaMKII阻害作用を有する物質の使用。
【請求項３１】
請求項１２〜２４のいずれか記載のCaMKII阻害剤を有効成分として含む、免疫の異常亢進改善剤。
【請求項３２】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、またはシェーグレン症候群である請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
自己免疫疾患が、関節リウマチまたは多発性硬化症である請求項２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗自己免疫疾患剤に関する。さらに本発明は、抗自己免疫疾患剤の新規有効成分を探索し取得するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は通常，自己の構成成分(自己抗原)に対しては免疫応答を示さず，免疫学的恒常性が保たれている。このような恒常性は自然免疫寛容と呼ばれている。この寛容状態が破れて，自己抗原と反応する抗体やリンパ球が生じてくることがある。このような現象を自己免疫と呼び，それが引金となって起こってくる病気を自己免疫疾患と呼んでいる。自己免疫疾患には全身性自己免疫疾患と臓器特異的自己免疫疾患がある。代表的なものとして前者は全身性エリテマトーデス、関節リウマチが挙げられ、後者は多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性喀血性貧血、橋本氏甲状腺炎などが挙げられる。全身性の自己免疫疾患は，古くは結合組織の増生を特徴とする膠原病という範疇に入れられていた。しかし近年，それらの成因が研究されてきて，少なくとも部分的には自己免疫が関与していると考えられるようになってきたが，なお不明な点も多い。一方，臓器特異的自己免疫疾患では，自己抗体の病因的役割がはっきりしている場合が多い。これまでの研究から，臓器特異的自己免疫疾患は，抗原刺激を受けた Tリンパ球によって引き起こされるものと推定されるに至っている。自己抗体の産生機序については，さまざまな考えが出されている。第1は特定の自己抗体の産生にあずかる遺伝子の関与説である。第2は，通常血中に微量にしか存在しない抗原がなんらかの原因で多量に放出されること，ないし抗原がなんらかの原因で修飾されることによるとするものである。第3は，抗体産生にあずかるリンパ球側に異常があり，寛容状態から逸脱してしまうことによるとするものである。おそらく，これらが重複して自己抗体が産生されてくると考えられている。
【０００３】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis）は自己免疫疾患の一つで、多発性関節炎を主徴とし、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患であり、寛解と増悪を繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊と変形を来し、やがて運動機能障害を呈し、ときには生命をも脅かす可能性もある疾患である。しかしながら現在の医学では関節リウマチを完全に治癒させることも予防することもできないとされている。従って、現時点での治療目標は早期に診断し、早期から積極的治療を開始し、リウマチ性炎症を可及的速やかにかつ最大限に抑制して、非可逆的変化の出現を防止、ないしはその進展を阻止することにより、患者の身体的、精神的、社会的な生活の質（QOL）の向上を図ることである。
【０００４】
関節リウマチの治療に使用されている主な薬物は、非ステロイド系抗炎症薬（以下、「NSAIDs」と記載する）、疾患修飾性抗リウマチ薬（以下、「DMARDs」と記載する）及び副腎皮質ステロイド薬である。
【０００５】
NSAIDsは慢性関節リウマチ患者に最初に使用される薬物であり、鎮痛効果は速やかに得られるが、抗炎症作用は1〜2週間後に発現する。NSAIDsには炎症の程度を軽減させる作用はあっても、リウマチ性炎症の進行を阻止する作用、関節破壊を防止する作用はない。また、NSAIDsの副作用はその薬理作用（cyclooxygenase-1阻害活性）とは切り離せないものが多く、消化管障害等はしばしば治療の妨げともなる。
【０００６】
DMARDsは、関節リウマチの免疫異常を是正することによりリウマチ性炎症を鎮静化させて、寛解導入を目的とする薬物の総称である。DMARDsは一般に遅効性であるが、効果が発現すると長期間に亘って効果が持続する。DMARDsには鎮痛効果がなく、投与開始時は速効性のNSAIDsや副腎皮質ステロイド薬を併用する。一方、問題点として、まれに骨髄抑制、腎炎、間質性肺炎などの重篤な副作用が出現することや至適用量に個人差があることなどが知られている。さらに、従来のDMARDsは投与を持続することにより耐性を示すことが多く（エスケープ現象）、その効果は2〜3年で減弱し、投与中止に至る例が少なくない。
【０００７】
副腎皮質ステロイド薬はリウマチ性炎症を迅速かつ確実に抑制し、短期間ではあるものの、慢性関節リウマチ患者のQOLを著しく改善するが、長期連用による効果の減弱、離脱困難（反跳現象、離脱症候群）、関節破壊の進行阻止不能、さらに感染症の誘発、副腎機能不全、消化管障害、骨粗鬆症などの重篤な副作用の出現などの弊害も多い。
【０００８】
自己免疫疾患、特に関節リウマチの病態形成には様々な細胞が関与していることが知られている。代表的なものとしては、Tリンパ球、マクロファージ細胞、破骨細胞（関節の破壊に関与している）、線維芽細胞（関節強直に関与している）などが挙げられる。（G. S. Firestein et al., "RHEUMATOID ARTHRITIS"; OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000）
【０００９】
カルシウム/カルモジュリン依存性リン酸化酵素II（CaMキナーゼII：本明細書において「CaMKII」と略記する）は、ラット脳においてトリプトファンヒドロキシラーゼ（神経伝達物質の一つであるセロトニン生合成の律速酵素）を活性化する新しいタイプのカルモジュリン依存性リン酸化酵素として1980年に発見された酵素である。本酵素は、細胞外刺激により細胞内に増加したCa2+とカルモジュリンの複合体により活性化されることが知られている。最近の研究の進展に伴い、本酵素が記憶などの高次神経機能の制御や種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしていることが明らかにされてきている。本酵素は、１）脳に多量に存在する、２）可溶型と顆粒結合型がある、３）基質特異性が広い、４）臓器特異性アイソフォームが存在する、５）自己リン酸化によって活性を制御する、などの際立った特長を備えている。特に当該酵素は、脳神経系において、神経伝達物質の生合成、神経伝達物質の放出、記憶の基本原理と考えられている長期増強作用、記憶、特に空間記憶に関与していることが示唆されている。現在までに、CaMKIIのアイソフォーム（サブタイプ）として、CaMKIIα、β、β’、γおよびδが知られており、γはさらにγＡ、γＢおよびγＣが知られている。これらのうち、CaMKIIα、βおよびβ’のアイソフォームは、脳に局在化している。
しかし、CaMKIIの発現もしくは活性を調節することにより、自己免疫疾患の予防および／または治療が達成できるとの報告は全く知られていなかった。
【００１０】
具体的なCaMKII阻害剤の例としては、例えば、以下のものが知られている。
・KN-93  N-(2-[N-[4-クロロシンナミル]-N-メチルアミノメチル]フェニル)-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド  （特開平６−２９３７３０、非特許文献１）
【００１１】
【化１】
2006223228.tif 000002
・1-[1-オキソ-11-(5,6-ジヒドロ-3-イミノベンゾ[h]シノリン-2(3H)-イル)ウンデシル]-4-(2-ピリミジニル)-ピペラジン（非特許文献２）
【００１２】
【化２】
2006223228.tif 000003
・配列 Lys-Lys-X-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr (式中、XはAlaまたはLysである。)で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（特許文献１）
・配列 Lys-Lys-Ala-Leu-His-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Cys-Leu（ＫＫＡＬＨＲＱＥＡＶＤＣＬ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（特許文献２、特表2001-509808；抗不整脈用途が示唆されている）  
【００１３】
しかしながら、これら具体的なCaMKII阻害剤に関し、自己免疫疾患に対する作用は知られていなかった。
【００１４】
一方、下記式１ａで表される3-[(1S)-1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-5-｛[アミノ(モルフォリン-4-イル)メチレン]アミノ｝イソキサゾール（以下、「化合物（Ｉ）」とも称する）に関して、代表的な関節リウマチのモデル動物であるアジュバント関節炎ラットおよびコラーゲン関節炎マウスに対して抗関節炎作用があることが報告されている（例えば、特許文献３および非特許文献３〜５参照）。
式１ａ：
【００１５】
【化３】
2006223228.tif 000004
【００１６】
また、下記式２で表される4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾール（以下、「化合物（ＩＩ）」とも称する）に関して、アジュバント関節炎ラットにおける抗関節炎作用、およびマウスIII型アレルギー反応試験における浮腫抑制作用が報告されている（例えば、特許文献４参照）。
式２：
【００１７】
【化４】
2006223228.tif 000005
【００１８】
しかし、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）のCaMKIIに対する作用は、これまで全く知られていなかった。
【００１９】
【特許文献１】特開平１１−１５２２９８号公報
【特許文献２】国際公開第９８／３３４９１号パンフレット
【特許文献３】特許第３２３７６０８号明細書
【特許文献４】特公平４−８００３５号公報
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun 1991; 181(3):p.968-75
【非特許文献２】J. Med. Chem., 2002, 45, p.563-566
【非特許文献３】田頭秋三、  「炎症・再生」、Vol.21、No.4、p.472 (2001)
【非特許文献４】F. Nishikaku、"Annals of the Rheumatic Diseases"、 vol.60 supplement 1, p.159 (2001)
【非特許文献５】F. Nishikaku、"Annals of the Rheumatic Diseases", vol.61 supplement 1, p.194 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、新規な作用機序に基づく、優れた抗自己免疫疾患剤を提供することである。さらに本発明は、当該抗自己免疫疾患剤の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下の驚くべき知見を得た。
（１）化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）およびこれらの誘導体がCaMKII阻害作用を示すこと。（実施例１、２）
（２）自己免疫疾患、特に関節リウマチの病態形成に関与する種々の細胞（Tリンパ球、マクロファージ細胞、破骨細胞、線維芽細胞、滑膜細胞など）に対して、化合物（Ｉ）、KN-93等のCaMKII阻害剤が抑制的に作用すること。（実施例３〜７）
（３）CaMKII阻害剤として公知であるKN-93等が自己免疫疾患の動物モデルで有用性を示すこと。（実施例１０）
（４）自己免疫疾患の動物モデルにおいて、罹患部ではCaMKII産生細胞の比率が亢進して
いること、すなわちCaMKIIが自己免疫疾患の病態形成に関与していること。（実施例１２）
（５）CaMKIIによるリン酸化によって変動する各種因子に対し、化合物（I）およびKN-93が以下(a)-(c)の作用を有すること。
(a)化合物（I）およびKN-93がIκBαの分解を抑制すること。（実施例１３）
(b)化合物（I）およびKN-93が、bFGFによるサイクリンD1の発現増強を抑制すること。（実施例１４）
(c)化合物（I）およびKN-93が、Aktのリン酸化を抑制すること。（実施例１４）
（６）単球系細胞において、炎症性刺激によりCaMKIIの発現が誘導されること、すなわちCaMKIIが自己免疫疾患の病態形成に関与していること。（実施例１５）。
（７）CaMKII配列特異的siRNAにより、滑膜細胞の細胞増殖が抑制されること（実施例１６）。すなわち、CaMKIIγの発現を抑制、または活性を阻害することにより、滑膜細胞の異常増殖が抑制され、よって関節リウマチ等の疾患における関節の病態改善（慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形への進行抑制など）が達成されうること。
【００２２】
CaMKIIに関連して変動する因子は、IκBα、細胞質ホスホリパーゼA2（cPLA2）、細胞周期因子サイクリンD1、細胞表面レセプターCD44、EGFレセプター、Stat1など多数知られている（J. Biol. Chem. 276, 36008-36013; J. Biol. Chem. 276, 39653-39660; Exp. Cell Res. 240, 218-227; Biochem. J. 357, 843-850; J. Biol. Chem. 274, 16168-16173; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5971-5976）。
本発明者らは、これらのうちIκBαおよびサイクリンD1に着目し、鋭意検討を行った結果、前記（５）の知見を得た。これら知見より、化合物（I）などのCaMKII阻害剤は、IκBαの分解を抑制し、Ｔリンパ球の活性化を抑制すると考えられる。また、化合物（I）などのCaMKII阻害剤によって、線維芽細胞においてCaMKIIが阻害されることによりAktのリン酸化が抑制され、それを介し下流のサイクリンD1の発現が抑制され細胞周期の停止が起こる、すなわち細胞増殖が抑制されると考えられる。
【００２３】
本発明者らは、上記の知見より、これら化合物（化合物（I）、KN-93など）はCaMKII阻害作用を介して自己免疫疾患の病態改善効果を発揮することを見出すとともに、CaMKIIの発現もしくは活性を阻害する物質が、自己免疫疾患の予防剤および／または治療剤として有効に利用できるとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づき完成するに至ったものである。
【００２４】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］  下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素による基質のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを、被験物質を接触させない対照酵素の上記リン酸化レベルと比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する工程。  
［２］  抗自己免疫疾患剤が、自己免疫疾患予防剤および／または自己免疫疾患治療剤である［１］記載のスクリーニング方法。
［３］  抗自己免疫疾患剤が、免疫の異常亢進改善剤である［１］記載のスクリーニング方法。
［４］  抗自己免疫疾患剤が、関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制剤、関節破壊の抑制剤、関節変形への進行抑制剤、または身体機能の改善剤である［１］記載のスクリーニング方法。
［５］  10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が40%以上である物質を選択する工程を含む［１］−［４］のいずれか記載のスクリーニング方法。
［６］  10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が60%以上である物質を選択する工程を含む［１］−［４］のいずれか記載のスクリーニング方法。
［７］  ［１］−［６］のいずれか記載のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
［８］  CaMKII阻害作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
［９］  CaMKII阻害作用を有する物質が、10μMの濃度におけるCaMKIIの阻害率が40%以上である物質である［８］記載の抗自己免疫疾患剤。
［１０］  関節リウマチの予防剤および／または治療剤である［８］または［９］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
［１１］  関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形への進行抑制、または身体機能の改善のための［８］または［９］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【００２５】
［１２］  式１で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とするCaMKII阻害剤。
式１：
【００２６】
【化５】
2006223228.tif 000006
［式中、Ｄは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＣＯ2Ｒ6、−ＳＲ7、−（ＣＯ）ＳＲ7、−（ＣＳ）ＯＲ7または−ＣＳ2Ｒ7（式中、Ｒ5は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表す。Ｒ6は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環基を表す。Ｒ7は置換されてもよいアルキル基または置換されてもよいアリール基を表す。）を表す。
ＡおよびＢは、一方が、式：
【００２７】
【化６】
2006223228.tif 000007
（Ｅは単結合またはアルキレン基を表す。
２つの破線は、一方が実線と共に２重結合を意味し、他方が実線と共に単結合を意味する。Ｒ1は破線が実線と共に単結合を表す結合に結合する窒素原子に結合する。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、各々独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、ＮＨ基の保護基、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＣＯ2Ｒ6、−ＳＲ7、−（ＣＯ）ＳＲ7、−（ＣＳ）ＯＲ7または−ＣＳ2Ｒ7（式中、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は前記と同義である。）を表す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、このうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成してもよい。また、式：−ＮＲ3Ｒ4は、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44で表される基を表してもよい。
Ｒ43およびＲ44は、以下の（１）または（２）の通りである。
（１）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは１〜３の整数を表す。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎは前記と同義である。Ｒ32は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎは前記と同義である。Ｒ33およびＲ34は独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍは２または３を表す。Ｒ35は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基または−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍは前記と同義である。Ｒ36は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）を表す。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍは前記と同義である。Ｒ37およびＲ38は独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表すか、またはＲ37およびＲ38は一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、フェニルまたはピリジルを表す。）を表す。
（２）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。）
で表される基を表す。
ＡおよびＢは、他方が、式：−Ｊ−Ｇ
（式中、Ｇは置換されてもよいアリール基、もしくは置換されてもよい複素環基を表す。Ｊは−Ｃ（Ｒ8Ｒ9）−または−Ｃ（＝ＣＲ8Ｒ9）−を表す。Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、水素原子、置換されてもよい低級アルコキシ基、または置換されてもよい低級アルキル基を表す。また、Ｒ8およびＲ9が結合して一緒になって、炭素原子と共に、置換されてもよい炭化水素環、置換されてもよい１，３−ジオキサン環または置換されてもよい１，３−ジオキソラン環を形成してもよい。）
で表される基を表す。］
【００２８】
［１３］  Ｅが単結合または低級アルキレン基である［１２］記載のCaMKII阻害剤。
［１４］  Ｄが水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、−Ｒ5または−ＣＯ2Ｒ6（式中、Ｒ5およびＲ6は［１２］における意義と同義である。）である［１２］または［１３］のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
［１５］  Ｄが水素原子、カルボキシ基、−Ｒ5または−ＣＯ2Ｒ6（式中、Ｒ5およびＲ6は［１２］における意義と同義である。）である［１４］記載のCaMKII阻害剤。
【００２９】
［１６］  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表すか、式：−ＮＲ3Ｒ4が、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44（Ｒ43およびＲ44は、［１２］における意義と同義である。）で表される基を表すか、または、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する［１２］−［１５］のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
［１７］  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよい複素環基またはアシル基を表すか、式：−ＮＲ3Ｒ4が、式：−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44（Ｒ43およびＲ44は、［１２］における意義と同義である。）で表される基を表すか、または、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの任意の２つが結合して一緒になって、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する［１５］記載のCaMKII阻害剤。
【００３０】
［１８］  Ｇが置換されてもよいフェニル、置換されてもよいナフチル、置換されてもよいフリル、置換されてもよいチエニル、置換されてもよいインドリル、置換されてもよいイソチアゾリル、置換されてもよいベンゾチエニル、置換されてもよいイソベンゾフラニル、置換されてもよいピロリル、置換されてもよいベンゾフリル、置換されてもよいイミダゾリル、置換されてもよいピラゾリル、置換されてもよいイソキサゾリル、置換されてもよいイソチアゾリル、置換されてもよいチアゾリル、置換されてもよいオキサゾリル、置換されてもよいベンズイミダゾリル、置換されてもよいベンゾチアゾリル、置換されてもよいベンズオキサゾリル、置換されてもよいピリジル、置換されてもよいピラジニル、置換されてもよいピリミジニル、置換されてもよいピリダジニル、置換されてもよいトリアジニル、置換されてもよいキノリル、置換されてもよいイソキノリル、置換されてもよいキナゾリニル、置換されてもよいキノキサリニル、置換されてもよい２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシニルまたは置換されてもよいカルバゾリルである［１２］−［１７］のいずれか記載のCaMKII阻害剤。
【００３１】
［１９］  式Ａ１：
【００３２】
【化７】
2006223228.tif 000008
［式中、Ｇ1は、フェニル、ビフェニル−４−イル、３−ベンゾイルフェニル、４−ベンゾイルフェニル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、１−ベンゾフラン−５−イル、１−ベンゾフラン−６−イル、キノリル、イソキノリル、フェニルピリジル、フェニルピリミジニル、フェニルピリダジニルまたはフェニルピラジニル（これらにおいて、フェニル、ビフェニル−４−イル、３−ベンゾイルフェニル、４−ベンゾイルフェニル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル、１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、１−ベンゾフラン−５−イル、１−ベンゾフラン−６−イル、キノリル、イソキノリル、フェニルピリジル、フェニルピリミジニル、フェニルピリダジニルおよびフェニルピラジニルは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、アセチル、シアノ、−ＣＯ2Ｒ29（Ｒ29は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）および−ＣＯＮＲ30Ｒ31（Ｒ30およびＲ31は、独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）からなる群から任意に選ばれる１または２個の基で置換されてもよい。）を表す。
Ｒ23およびＲ24は、独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、メトキシまたはエトキシを表すか、または一緒になってメチレンを表す。
式：＝Ｃ（ＮＲ25Ｒ26）ＮＲ27Ｒ28は、以下の（１）、（２）または（３）の通りである。
（１）Ｒ25およびＲ26は、以下の（ａ）または（ｂ）の通りであり、Ｒ27およびＲ28は、以下の（ｃ）または（ｄ）の通りである。
（ａ）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は［１２］における意義と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は［１２］における意義と同義である。）を表す。
（ｂ）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（ｃ）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｄ）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（２）Ｒ26およびＲ27は、一緒になって２つの窒素原子、炭素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい）を表す。
Ｒ25およびＲ28は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍは前記と同義である。Ｒ36は［１２］における意義と同義である。）を表す。
（３）式：＝Ｃ（ＮＲ25Ｒ26）ＮＲ27Ｒ28が、式：＝Ｃ（ＮＲ41Ｒ42）Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ43Ｒ44を表す。
Ｒ41およびＲ42は、以下の（ａ1）または（ｂ1）の通りであり、Ｒ43およびＲ44は、以下の（ｃ1）または（ｄ1）の通りである。
（ａ1）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｂ1）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（ｃ1）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｄ1）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。］
または、式Ａ２：
【００３３】
【化８】
2006223228.tif 000009
［式中、Ｇ1、Ｒ23およびＲ24は前記と同義である。
式：−Ｎ（Ｒ45）Ｃ（ＮＲ46Ｒ47）＝ＮＲ48は、以下の（１1）または（２1）の通りである。
（１1）Ｒ45は、炭素数１〜３のアルキル基またはアセチルを表す。Ｒ48は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基またはアセチルを表す。
Ｒ46およびＲ47は、以下の（ａ2）または（ｂ2）の通りである。
（ａ2）独立して水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、テトラゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、ピラジニルメチル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数１〜３のアルコキシ基または−ＮＲ39Ｒ40（Ｒ39およびＲ40は前記と同義である。）を表す。
（ｂ2）一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
（２1）Ｒ45およびＲ46は、一緒になって窒素原子と共に、５〜７員飽和含窒素複素環基（ここで、５〜７員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、オキソ基からなる群から任意に選ばれる１または２個の置換基で置換されてもよい。）を表す。
Ｒ47およびＲ48は、独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ36（ｍおよびＲ36は前記と同義である。）を表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする［１２］記載のCaMKII阻害剤。
【００３４】
［２０］  式Ａ３：
【００３５】
【化９】
2006223228.tif 000010
［式中、Ｇ2は、２−フルオロ−ビフェニル−４−イル、２’−フルオロ−ビフェニル−４−イルまたは３−ベンゾイルフェニルを表す。Ｒ49は、メチルを表す。Ｒ50は、水素原子、メチル、メトキシまたはエトキシを表す。
式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54は、（１2）、（２2）または（３2）の通りである。
（１2）Ｒ51およびＲ52は、以下の（ａ3）、（ｂ3）または（ｃ3）の通りであり、Ｒ53およびＲ54は、以下の（ｄ3）、（ｅ3）または（ｆ3）の通りである。
（ａ3）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｂ3）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は［１２］における意義と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は［１２］における意義と同義である。）を表す。
（ｃ3）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（ｄ3）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｅ3）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｆ3）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（２2）式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54が、式：
【００３６】
【化１０】
2006223228.tif 000011
（式中、Ｒ55は、炭素数１〜３のアルキル基、アセチルまたは−（ＣＨ2）m−ＯＲ56（ｍは前記と同義である。Ｒ56は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）を表す。）で表される基を表す。
（３2）式：＝Ｃ（ＮＲ51Ｒ52）ＮＲ53Ｒ54が、式：＝Ｃ（ＮＲ57Ｒ58）Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＲ59Ｒ60を表す。
Ｒ57およびＲ58は、以下の（ａ4）、（ｂ4）または（ｃ4）の通りであり、Ｒ59およびＲ60は、以下の（ｄ4）、（ｅ4）または（ｆ4）の通りである。
（ａ4）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｂ4）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｃ4）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（ｄ4）独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。
（ｅ4）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯＣＨ3（ｎは前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＲ33Ｒ34（ｎ、Ｒ33およびＲ34は前記と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ35（ｍおよびＲ35は前記と同義である。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ37Ｒ38（ｍ、Ｒ37およびＲ38は前記と同義である。）を表す。
（ｆ4）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、または１もしくは２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジン（これらにおいて、ピロリジン、アゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピペリジン−２−オン、ピペリジン−４−オン、チアモルホリン、炭素数１〜３のアルキル基で４位が置換されてもよいピペラジン、炭素数１〜３のアルコキシ基で４位が置換されてもよいピペリジン、４−ヒドロキシピペリジン、および１または２個の炭素数１〜３のアルキル基で置換されてもよいアミノ基で４位が置換されたピペリジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする［１２］記載のCaMKII阻害剤。
【００３７】
［２１］  式Ａ４：
【００３８】
【化１１】
2006223228.tif 000012
［式中、Ｇ2、Ｒ49およびＲ50は、［２０］における意義と同義である。
式：＝Ｃ（ＮＲ61Ｒ62）ＮＲ63Ｒ64は、以下の（１3）、（２3）または（３3）の通りである。
（１3）Ｒ63およびＲ64は、共に水素原子を表す。
Ｒ61およびＲ62は、以下の（ａ5）、（ｂ5）または（ｃ5）の通りである。
（ａ5）独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。
（ｂ5）一方が水素原子を表し、他方が−（ＣＨ2）n−ＣＯ2Ｒ32（ｎおよびＲ32は［１２］における意義と同義である。）、−（ＣＨ2）m−ＯＲ65（ｍは２または３を表す。Ｒ65は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、２−ヒドロキシエチルまたは３−ヒドロキシプロピルを表す。）または−（ＣＨ2）m−ＮＲ66Ｒ67（ｍは前記と同義である。Ｒ66およびＲ67は、独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表すか、またはＲ66およびＲ67は一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）を表す。
（ｃ5）一緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンまたはＮ−メチルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよびＮ−メチルピペラジンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
（２3）式：＝Ｃ（ＮＲ61Ｒ62）ＮＲ63Ｒ64が、式：
【００３９】
【化１２】
2006223228.tif 000013
（Ｒ68は、炭素数１〜３のアルキル基、２−ヒドロキシエチルまたは３−ヒドロキシプロピルを表す。）で表される基を表す。
（３3）Ｒ61およびＲ62は、一緒になって窒素原子と共に、モルホリンを表し、Ｒ63およびＲ64は、一緒になって、アミノ−モルホリン−４−イル−メチレンを表す。］
で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩を有効成分とする［１２］記載のCaMKII阻害剤。
【００４０】
［２２］  Ｇ2が２−フルオロ−ビフェニル−４−イルまたは２’−フルオロ−ビフェニル−４−イルであり、Ｒ50が水素原子またはメチルであり、Ｒ63およびＲ64が共に水素原子であり、Ｒ61およびＲ62が、以下の（ａ6）または（ｂ6）の通りである、［２１］記載のCaMKII阻害剤：
（ａ6）独立して水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す；
（ｂ6）一緒になって窒素原子と共に、モルホリン（モルホリンは、１または２個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
【００４１】
［２３］  3-[(1S)-1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-5-｛[アミノ(モルフォリン-4-イル)メチレン]アミノ｝イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩を有効成分として含むCaMKII阻害剤。
［２４］  4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾールまたはその薬学上許容される塩を有効成分として含むCaMKII阻害剤。
［２５］  IκBαの分解抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
［２６］  サイクリンD1の発現増強に対する抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
［２７］  Aktのリン酸化抑制作用を有する物質を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤。
【００４２】
［２８］  CaMKII阻害作用を有する物質が、CaMKII遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである、［８］−［１１］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
［２９］  CaMKII阻害作用を有する物質が、CaMKII遺伝子に対するsiRNAである［８］−［１１］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
［３０］  siRNAが、以下の配列で表されるsiRNAである、［２９］に記載の抗自己免疫疾患剤：
センス鎖：      5'-CGU GAG GCU CGG AUA UGU CdTdT-3'
アンチセンス鎖：5'-GAC AUA UCC GAG CCU CAC GdTdT-3'
［３１］  CaMKII阻害作用を有する物質が抗CaMKII抗体である、［８］−［１１］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
【００４３】
［３２］  哺乳動物体内におけるCaMKIIの発現もしくは活性を、自己免疫疾患の予防および／または治療に有効な程度阻害することを含む、該哺乳動物の自己免疫疾患の予防および／または治療方法。
［３３］  CaMKII阻害作用を有する物質を、自己免疫疾患の予防および／または治療に有効な量哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物の自己免疫疾患の予防および／または治療方法。
［３４］  抗自己免疫疾患剤の製造のための、CaMKII阻害作用を有する物質の使用。
【００４４】
また、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
［３５］  下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII発現細胞を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII発現細胞内のCaMKII蛋白量を測定し、該蛋白量を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記蛋白量と比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの産生を阻害する被験物質を選択する工程。
［３６］  下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII発現細胞を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII発現細胞内のCaMKII遺伝子発現量を測定し、該遺伝子発現量を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記遺伝子発現量と比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの遺伝子発現を阻害する被験物質を選択する工程。  
［３７］  下記の工程(a)、(b)および(c)を含む抗自己免疫疾患剤のスクリーニング方法：
(a) 被験物質と脱リン酸化CaMKII酵素を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを、被験物質を接触させない対照酵素リン酸化レベルと比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性化を阻害する被験物質を選択する工程。
【００４５】
本発明の好ましい態様として、以下のものも挙げることができる。
［３８］  CaMKIIがCaMKIIγまたはCaMKIIδである［１］−［６］のいずれか記載のスクリーニング方法。
［３９］  CaMKIIがCaMKIIγである［１］−［６］のいずれか記載のスクリーニング方法。
［４０］  CaMKIIがCaMKIIγまたはCaMKIIδである［７］−［１１］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
［４１］  CaMKIIがCaMKIIγである［７］−［１１］のいずれか記載の抗自己免疫疾患剤。
［４２］  CaMKIIがCaMKIIγまたはCaMKIIδである［３２］または［３３］記載の予防および／または治療方法。
［４３］  CaMKIIがCaMKIIγである［３２］または［３３］記載の予防および／または治療方法。
［４４］  CaMKIIがCaMKIIγまたはCaMKIIδである［３４］記載の使用。
［４５］  CaMKIIがCaMKIIγである［３４］記載の使用。
【００４６】
また、本発明の別の態様として、以下のものも挙げることができる。
［４６］  ［１］−［６］または［３５］−［３７］のいずれか記載のスクリーニング方法を用いて選択される物質（但し、以下の（１）および（２）を除く）を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤：
（１）［１２］記載の式１で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩；
（２）4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾールまたはその薬学上許容される塩。
［４７］  CaMKII阻害作用を有する物質（但し、以下の（１）および（２）を除く）を有効成分として含む抗自己免疫疾患剤：
（１）［１２］記載の式１で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩；
（２）4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾールまたはその薬学上許容される塩。
［４８］  関節リウマチの予防剤および／または治療剤である［４７］記載の抗自己免疫疾患剤。
［４９］  ［１２］−［２４］のいずれか記載のCaMKII阻害剤を有効成分として含む、免疫の異常亢進改善剤。
［５０］  ［１２］−［２４］のいずれか記載のCaMKII阻害剤を有効成分として含む、関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制剤、関節破壊の抑制剤、関節変形への進行抑制剤、または身体機能の改善剤。
［５１］  自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、またはシェーグレン症候群である［２］記載のスクリーニング方法。
［５２］  自己免疫疾患が、関節リウマチまたは多発性硬化症である［２］記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、新規な作用機序に基づく、優れた抗自己免疫疾患剤を提供することができる。さらに本発明により、当該抗自己免疫疾患剤の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００４９】
アリール基としては、例えば炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、具体的には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェナントリル、アントリル等が挙げられる。好ましくは、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられる。
【００５０】
複素環基としては、例えば１〜６個の窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子を含有する１〜３環の５〜７員環の飽和複素環基または不飽和複素環基が挙げられる。
かかる飽和複素環基としては、具体的にはテトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル等の１〜３環の５員環飽和複素環基、ピペリジル、モルホリニル、チアモルホリニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロ−ピリミジニル等の１〜３環の６員環飽和複素環基、アゼパニル等の１〜３環の７員環飽和複素環基等が挙げられる。
かかる不飽和複素環基としては、具体的にはフリル、チエニル、インドリル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフラニル、ピロリル、ベンゾフリル、イミダゾリル、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、カルバゾリル等の１〜３環の５員環不飽和複素環基、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、１，４，５，６−テトラヒドロ−ピリミジニル、３，６−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］オキサジアジニル、ピリダジニル、トリアジニル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、クロメニル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキサニル等の１〜３環の６員環不飽和複素環基、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−［１，３］ジアゼピニル等の１〜３環の７員環不飽和複素環基等が挙げられる。
【００５１】
置換アリール基および置換複素環基における置換基としては、例えば下記のａ）からｇ）の各群に含まれる任意の基が挙げられ、これらが任意に１または複数個置換してよい。
ａ）：  ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アジド基、メルカプト基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよい低級アルコキシアミノ基、水酸基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシル基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいカルバモイルオキシ基、スルホ基、置換されてもよいスルファモイル基
ｂ）：  −Ｒ10、−ＯＲ10、−ＣＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｒ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10、−Ｃ（＝ＮＯＨ）Ｒ10
［式中、Ｒ10は、フェニル基または単環の複素環基を表す。フェニル基または単環の複素環基は、例えばハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキルカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基および低級アルキルスルホニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００５２】
ｃ）：  アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ（チオカルボニル）基、アルキルチオ基、（アルキルチオ）チオカルボニル基、（アルキルチオ）カルボニル基、アルキルカルボニル基、アルキルチオイル基、アルキルスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキルチオイルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基
［この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいカルバモイルオキシ基、スルホ基、置換されてもよいスルファモイル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）、
低級シクロアルキル基（低級シクロアルキル基は、例えばハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基および低級ハロアルコキシ基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。）、
低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基および低級アルキルチオ基（低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基および低級アルキルチオ基は、例えばハロゲン原子、低級シクロアルキル基、単環の複素環基、フェニル基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキルカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基および低級アルキルスルホニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。）等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００５３】
ｄ）：  アルケニル基
［アルケニル基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10および−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００５４】
ｅ）：  アルキニル基
［アルキニル基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10および−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
ｆ）：  アルケニルオキシ基、アルケニルオキシカルボニル基、アルケニルカルボニル基、アルケニルカルボニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキニルオキシカルボニル基
［この群の各基は、例えばハロゲン原子、オキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、低級アルコキシカルボニル基およびフェニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００５５】
ｇ）：  低級シクロアルキル基、低級シクロアルキルオキシ基、低級シクロアルキルカルボニル基、低級シクロアルキルカルボニルオキシ基、低級シクロアルキルオキシカルボニル基、低級シクロアルケニル基、低級シクロアルケニルオキシ基、低級シクロアルケニルカルボニル基、低級シクロアルケニルカルボニルオキシ基、低級シクロアルケニルオキシカルボニル基
［この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基および低級アルコキシカルボニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００５６】
置換アリール基および置換複素環基の置換基としては、具体的にはメチル、２−メチル−１−プロピル、ヘキシル、２−メチル−２−プロピル、２−プロピル、フェニル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル、６，６，６−トリフルオロヘキシル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、メトキシメチル、ヘキシルオキシメチル、シクロプロピルメトキシメチル、アセトキシメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシメチル、メタンスルホニルオキシメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイルオキシメチル、２−（１−ピロリジニル）エトキシメチル、２−メトキシエチル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルメチル、カルバモイルメチル、アミジノメチル、メチルチオメチル、シアノメチル、アミノメチル、アミノエチル、Ｎ−アセチルアミノメチル、エテニル、２−プロペニル、エチニル、２−プロピニル、２−メトキシカルボニルエテニル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、メルカプト、スルホ、カルボキシ、アミジノ、メトキシ、シクロプロピルメトキシ、２−（１−ピロリジニル）エトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、２−アセトキシエトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、２−メトキシエトキシ、４，４，５，５，５−ペンタフルオロペントキシ、２−メタンスルフィニルエトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、４−メトキシベンジルオキシ、メトキシカルボニルオキシ、１−ピロリジニル、３−ヒドロキシ−１−ピロリジニル、アセチルアミノ、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ、Ｎ−メタンスルホニルアミノ、Ｎ−メタンスルホニル−Ｎ−メチルアミノ、メトキシカルボニル、２−メチル−２−プロピルオキシカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、２−チアゾリジニル、２−オキサゾリジニル、５−テトラゾリル、メタンスルフィニル、スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、トリフルオロアセチル、ホルミル、エチレンジオキシメチル、イミノ、メトキシイミノ等が挙げられる。
【００５７】
かかる置換基において好ましい置換基としては、具体的にはメチル、２−メチル−１−プロピル、ヘキシル、２−メチル−２−プロピル、２−プロピル、フェニル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、メトキシメチル、シクロプロピルメトキシメチル、アセトキシメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシメチル、メタンスルホニルオキシメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイルオキシメチル、２−（１−ピロリジニル）エトキシメチル、２−メトキシエチル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルメチル、カルバモイルメチル、アミジノメチル、メチルチオメチル、シアノメチル、アミノメチル、アミノエチル、Ｎ−アセチルアミノメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、メトキシ、２−（１−ピロリジニル）エトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、２−アセトキシエトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、２−メトキシエトキシ、２−メタンスルフィニルエトキシ、１−ピロリジニル、３−ヒドロキシ−１−ピロリジニル、アセチルアミノ、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ、Ｎ−メタンスルホニルアミノ、Ｎ−メタンスルホニル−Ｎ−メチルアミノ、メトキシカルボニル、２−メチル−２−プロピルオキシカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、メタンスルフィニル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、トリフルオロアセチル等が挙げられる。
アリール基および複素環基における好ましい置換基数は、１、２または３が挙げられる。また、アリール基および複素環基は、無置換であっても好ましい。
【００５８】
アルキル基としては、例えば直鎖または分枝した炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチル−１−プロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−メチルブチル、３−メチルブチル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、ヘプチル、１−エチルペンチル、５−メチルヘキシル、オクチル、１，５−ジメチルヘキシル、２−エチルヘキシル、ノニル、デシル等が挙げられる。低級アルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。
【００５９】
置換アルキル基における置換基としては、例えば下記のａ）からｄ）の各群に含まれる任意の基が挙げられ、これらが任意に１または複数個置換してよい。
ａ）：  ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルアミノ基、置換されてもよい低級アルコキシアミノ基、水酸基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいカルバモイルオキシ基、スルホ基、置換されてもよいスルファモイル基
ｂ）：  低級シクロアルキル基、低級シクロアルキルオキシ基、低級シクロアルキルカルボニル基、低級シクロアルキルカルボニルオキシ基、低級シクロアルキルオキシカルボニル基、低級シクロアルケニル基、低級シクロアルケニルオキシ基、低級シクロアルケニルカルボニル基、低級シクロアルケニルカルボニルオキシ基、低級シクロアルケニルオキシカルボニル基
［この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基および低級アルコキシカルボニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
【００６０】
ｃ）：  アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ（チオカルボニル）基、アルキルチオ基、（アルキルチオ）チオカルボニル基、（アルキルチオ）カルボニル基、アルキルカルボニル基、アルキルチオイル基、アルキルスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキルチオイルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基
［この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてもよいカルバモイル基、置換されてもよいカルバモイルオキシ基、スルホ基、置換されてもよいスルファモイル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）、
低級シクロアルキル基（低級シクロアルキル基は、例えばハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基および低級ハロアルコキシ基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。）、
低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基および低級アルキルチオ基（低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基および低級アルキルチオ基は、例えばハロゲン原子、低級シクロアルキル基、単環の複素環基、フェニル基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいカルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキルカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基および低級アルキルスルホニル基等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。）等の群から任意に選ばれる１または複数の基で置換されてもよい。］
ｄ）：  −Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）
【００６１】
置換アルキル基としては、具体的にはトリフルオロメチル、２−ニトロエチル、２−シアノプロピル、４−メルカプトブチル、３−オキソブチル、２−ピペリジノエチル、２−ヒドロキシエチル、３−メトキシプロピル、エトキシカルボニルメチル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルメチル、６−シクロヘキシルヘキシル、３−シクロヘキセニルブチル、２−フェニルブチル、ベンジル、２−ナフチルメチル、フェネチル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、４−ピリジルメチル、２−キノリルメチル、３−キノリルメチル、３−チエニルプロピル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、アミノメチル、アミノエチル、カルボキシメチル、エトキシカルボニルメチル、カルバモイルメチル等が挙げられる。
なお、低級ハロアルキル基とは、１〜５個のハロゲン原子が置換した低級アルキル基をいう。
【００６２】
アルコキシ基とは、アルキル基が結合したオキシ基をいう。具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、１，１−ジメチルエトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が挙げられる。置換アルコキシ基の置換基は、置換アルキル基の置換基と同じものが挙げられる。置換アルコキシ基としては、具体的には、シクロプロピルメトキシ、トリフルオロメトキシ、２−ピロリジノエトキシ、ベンジルオキシ、２−ピリジルメトキシ等が挙げられる。
なお、ハロアルコキシ基とは、１〜５個のハロゲン原子で置換されたアルコキシ基をいう。
アルコキシカルボニル基とは、アルコキシ基が結合したカルボニル基をいう。具体的には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、２−プロポキシカルボニル等が挙げられる。置換アルコキシカルボニル基における置換基としては、置換アルキル基における置換基と同じものが挙げられる。
【００６３】
アルケニル基としては、１〜３個の２重結合を有する炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖のアルケニル基が挙げられる。具体的には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、１，３−オクタジエニル、２−ノネニル、１，３−ノナジエニル、２−デセニル等が挙げられる。好ましいアルケニル基としては、例えばエテニル、１−プロペニル、１−ブテニル基が挙げられる。低級アルケニル基としては、炭素数２〜６のアルケニル基が挙げられる。
置換アルケニル基の置換基としては、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、アシル基、アシルオキシ基、カルボキシ基、置換されてよいカルバモイル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）等が挙げられる。
また、アルケニルオキシ基とは、アルケニル基が結合したオキシ基をいう。
【００６４】
アルキニル基としては、１〜３個の３重結合を有する炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖のアルキニル基が挙げられる。具体的にはエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、４−ペンチニル、１−オクチニル、６−メチル−１−ヘプチニル、２−デシニル等が挙げられる。好ましいアルキニル基としては、例えば１−プロピニル、１−ブチニル基等が挙げられる。低級アルキニル基としては、炭素数２〜６のアルキニル基が挙げられる。
置換アルキニル基の置換基としては、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、置換されてよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてよいカルバモイル基、低級アルコキシカルボニル基、−Ｒ10、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−ＯＣＨ2Ｒ10、−ＳＣＨ2Ｒ10（式中、Ｒ10は前記と同義である。）等が挙げられる。
また、アルキニルオキシ基とは、アルキニル基が結合したオキシ基をいう。
【００６５】
シクロアルキル基としては、例えば炭素数３〜１０のシクロアルキル基が挙げられ、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等が挙げられる。低級シクロアルキル基としては、炭素数３〜６のシクロアルキル基が挙げられる。また、シクロアルキルオキシ基とは、シクロアルキル基が結合したオキシ基をいう。
シクロアルケニル基としては、例えば炭素数３〜１０のものが挙げられ、具体的にはシクロヘキセニル等が挙げられる。低級シクロアルケニル基としては、炭素数３〜６のシクロアルケニル基が挙げられる。また、シクロアルケニルオキシ基とは、シクロアルケニル基が結合したオキシ基をいう。
置換シクロアルキル基および置換シクロアルケニル基の置換基としては、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、オキソ基、チオキソ基、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてよいカルバモイル基、低級アルコキシカルボニル基等が挙げられる。
【００６６】
アシル基としては、例えば、式−Ｚ−Ｒ11（式中、Ｚは−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＳＯ−または−ＳＯ2−を表し、Ｒ11は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環基を表す。）で表されるアシル基等が挙げられる。アシル基としては、具体的にはホルミル、アセチル、プロパノイル、２−プロパノイル、ピバロイル、バレリル、ピバロイル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ナフトイル、ニコチノイル、メタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル等が挙げられる。好ましいアシル基としては、アセチル基等が挙げられる。また、アシルオキシ基とは、アシル基が結合したオキシ基をいう。
【００６７】
置換カルバモイル基における置換基としては、例えばアリール基もしくは複素環基で置換されてもよいアルキル基、およびアリール基、複素環基等が挙げられ、同一または異なった複数のものが独立して置換してもよい。置換カルバモイル基としては、具体的にはエチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、フェニルカルバモイル、２−ピリジルカルバモイル、ベンジルカルバモイル、（３−ピリジルメチル）カルバモイル等が挙げられる。
置換スルファモイル基における置換基としては、例えばアルキル基、アリール基、複素環基等が挙げられ、同一または異なった複数のものが独立して置換してもよい。置換スルファモイル基としては、具体的にはエチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、フェニルスルファモイル、２−ピリジルスルファモイル等が挙げられる。
置換アミノ基における置換基としては、例えばアシル基、アルキル基等が挙げられ、同一または異なった複数のものが独立して置換してもよい。具体的な置換アミノ基としては、アセトアミド、プロピオンアミド、ブチルアミド、２−ブチルアミド、メチルアミノ、２−メチル−１−プロピルアミノ、ジエチルアミノ等が挙げられる。
置換ヒドロキシルアミノ基における置換基は、窒素原子、酸素原子のいずれの原子に置換してもよく、その置換基としては、置換アミノ基における置換基と同じものが挙げられる。
【００６８】
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００６９】
アルキレン基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖または分枝したアルキレン基が挙げられる。具体的には、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、メチルメチレン、エチルメチレン、ジメチルメチレン、１，１−ジメチルエチレン、１，２−ジメチルエチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、１，１−ジメチルトリメチレン、１，２−ジメチルトリメチレン、１，３−ジメチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、１−エチルトリメチレン、２−エチルトリメチレン、１，１−ジエチルトリメチレン、１，２−ジエチルトリメチレン、１，３−ジエチルトリメチレン、２，２−ジエチルトリメチレン等が挙げられる。
低級アルキレン基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖または分枝したアルキレン基が挙げられる。
【００７０】
ＮＨ基の保護基としては、通常用いられる各種の保護基が可能であるが、好適には例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル等のカルバメート型の保護基、アセチル、ベンゾイル等のアミド型の保護基、ベンジル、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル等が挙げられる。
【００７１】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの任意の２つが結合して一緒になって窒素原子と共に形成される置換されてもよい複素環における複素環としては、例えば１〜６個の窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子を含有する（窒素原子を少なくとも１つ含む）５〜７員環の単環もしくは２環の飽和複素環または不飽和複素環が挙げられる。具体的には、ピロリジン、イミダゾリジン、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、ピペリジン、ピペリジン−４−オン、ピペラジン、モルホリン、チアモルホリン、１，４，５，６−テトラヒドロ−ピリミジン、ヘキサヒドロ−ピリミジン、３，６−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］オキサジアジン等が挙げられる。置換複素環における置換基としては、置換複素環基における置換基と同じものが挙げられる。
Ｒ8およびＲ9が結合して一緒になって炭素原子と共に形成される置換されてもよい炭化水素環としては、例えば置換されてもよい炭素数３〜８のシクロアルカン環または置換されてもよい炭素数３〜８のシクロアルケン環等が挙げられる。かかるシクロアルカン環またはシクロアルケン環としては、具体的には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘプテン等が挙げられる。置換炭化水素環における置換基としては、置換シクロアルキル基における置換基と同じものが挙げられる。
【００７２】
式１のイソキサゾール誘導体においてイソキサゾール環に極性を有する官能基を導入した化合物は、特に、体内動態が改善され、副作用も少なく、長期間投与が可能である。
【００７３】
本発明は、式１のイソキサゾール誘導体のあらゆる立体異性体、光学活性体および互変異性体等を包含している。また、本発明は、式１のイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容される塩に関する水和物、アルコール和物等の溶媒和物およびあらゆる態様の結晶形のものも包含している。
【００７４】
式１のイソキサゾール誘導体の薬学上許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、カンファー−スルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
【００７５】
式１のイソキサゾール誘導体は、例えば、特許文献３に記載の方法によって製造することができる。
【００７６】
以下、本発明の抗自己免疫疾患剤、およびそのスクリーニング方法について詳細に説明する。
【００７７】
Ｉ．抗自己免疫疾患剤
一般に「自己免疫疾患」は、自己の組織を構成する成分に反応する抗体あるいはリンパ球が、体内で持続的に産生されることによって組織障害をきたす疾患であり、大別すると下記に掲げる臓器特異的自己免疫疾患と臓器非特異的自己免疫疾患（全身性自己免疫疾患）の２つに分類することができる。
【００７８】
(1) 臓器特異的自己免疫疾患：橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群。
【００７９】
(2)臓器非特異的自己免疫疾患（全身性自己免疫疾患）：関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病。
【００８０】
本発明はこれらの「自己免疫疾患」を任意に対象とするものである。好ましくは、関節リウマチ、及び多発性硬化症を例示することができる。
【００８１】
また本発明の「抗自己免疫疾患剤」とは、上記各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言い換えることもできる。
【００８２】
本発明において「CaMKII阻害作用」とは、その作用機序の別を問うことなく、上記CaMKIIの機能発現を阻害する作用を広く意味するものである。なお、ここで「CaMKIIの機能発現を阻害する作用」には、CaMKIIの蛋白質合成（CaMKIIの遺伝子発現を含む）や分泌を阻害する作用、発現したCaMKIIの活性化（リン酸化）を阻害する作用、活性化したCaMKIIを不活性化（脱リン酸化）する作用、及び活性化したCaMKII酵素活性を阻害する作用が包含される。本明細書では、このようなCaMKIIの機能発現の阻害を単にCaMKII阻害作用またはCaMKIIの阻害ということもある。
【００８３】
なお、本発明の「CaMKII阻害作用を有する物質」は、上記に掲げる阻害作用のいずれか少なくとも１つの作用を有する物質であればよく、その形態や性状の別を何ら問うものではない。また、本発明の「CaMKII阻害作用を有する物質」は、少なくともヒトCaMKIIに対して阻害作用を有するものであればよく、ヒト以外の哺乳類やその他の生物種に由来するCaMKIIに対する阻害作用の有無は、特に制限されない。
【００８４】
CaMKII阻害作用を有する物質には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる。CaMKII阻害作用を有する例えば低分子化合物は、低分子化合物ライブラリー（例えば、CamBridge Research Laboratories社等の低分子化合物ライブラリー）等に対して後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができる。
【００８５】
CaMKII阻害作用を有する物質が抗CaMKII抗体である場合、当該抗体は、CaMKIIを特異的に認識することができるものであればいかなる抗体でもよく、このような抗体はCaMKIIタンパクを用いて、公知の方法で調製することができる。本発明の抗CaMKII抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびFabフラグメント、Fab発現ライブラリーなどによって生成されるフラグメントのような抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００８６】
CaMKII阻害作用を有する物質として、CaMKII遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを例示することもできる。CaMKII遺伝子としては、α、β、β’、γ、δなどいずれのアイソフォームでもよいが、好ましくはCaMKIIγ遺伝子またはCaMKIIδ遺伝子を挙げることができ、さらに好ましくはCaMKIIγ遺伝子を挙げることができる。例えば、GenBankに以下のAccession No.で登録されている遺伝子配列が利用できる。
ヒトCaMKIIα        Accession No. AF145710  
ヒトCaMKIIβ        Accession No. NM_172084  
ヒトCaMKIIγ        Accession No. L07044  
ヒトCaMKIIδ        Accession No. AF071569  
また、GenBankには、CaMKII遺伝子の各アイソフォームにおける種々の変異体の遺伝子配列も登録されており、これらの配列情報を利用することもできる。
【００８７】
ここで相補的なポリヌクレオチド(相補鎖、逆鎖)とは、CaMKII遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列(ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう)に対して、A : TおよびG : Cといった塩基対関係に基づき、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件としては「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００８８】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記CaMKII遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖(逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００８９】
また、CaMKII阻害作用を有する物質としては、CaMKII遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの一態様として、CaMKII遺伝子に対するsiRNA(small interfering RNA)を挙げることもできる。siRNAとは、RNAi（RNA干渉；RNA interference）で使用する21〜23塩基の二本鎖RNAの総称である。RNAiとは、細胞に導入された二本鎖RNAが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現(タンパク質合成)を抑制する現象のことであり、この方法は、標的遺伝子(mRNA)を破壊することで発現を抑制する為、遺伝子の機能解析に有効な方法として近年注目されている。  
【００９０】
CaMKII遺伝子に対するsiRNAは、CaMKII遺伝子（α、β、β’、γ、δなどいずれのアイソフォームでもよい）に関する前記の塩基配列情報（GenBank等）を元に、公知の方法で種々設計し、調製することができる。例えば、siRNAの設計方法として、Chalk et al., "Improved and automated prediction of effective siRNA", Biochem Biophys Res Commun. 2004 ;319(1):264-74、あるいは Reynolds et al., "Rational siRNA design for RNA interference", Nature Biotechnology 2004 ;22, 326-330 に記載の方法を用いることができる。また、インターネット上で利用可能なsiRNA 設計プログラム（例えば、Cold Spring Harbor Laboratory, "siRNA sequence finder", http://www.sinc.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html  など）を利用して適切なsiRNAを設計することも可能である。このようにして設計し、調製したsiRNAは、実施例１６に例示したような試験方法により、実際にCaMKII遺伝子発現を抑制する作用を有するか否かを確認することができる。
【００９１】
本発明における「IκBαの分解抑制作用を有する物質」の例としては、本明細書に例示されたCaMKII阻害作用を有する物質を挙げることができる。
本発明における「サイクリンD1の発現増強に対する抑制作用を有する物質」の例としては、本明細書に例示されたCaMKII阻害作用を有する物質を挙げることができる。
本発明における「Aktのリン酸化抑制作用を有する物質」の例としては、本明細書に例示されたCaMKII阻害作用を有する物質を挙げることができる。
【００９２】
以上説明するCaMKII阻害作用を有する物質、IκBαの分解抑制作用を有する物質、サイクリンD1の発現増強に対する抑制作用を有する物質、およびAktのリン酸化抑制作用を有する物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。また抗自己免疫疾患剤の有効成分は、上記に具体的に掲げる物質に特に限定されることなく、下記に記載する本発明のスクリーング方法によって取得することも可能である。
【００９３】
従って、本発明が対象とする抗自己免疫疾患剤には、
（１）上記のCaMKII阻害作用を有する物質、IκBαの分解抑制作用を有する物質、サイクリンD1の発現増強に対する抑制作用を有する物質、またはAktのリン酸化抑制作用を有する物質を有効量含有する製剤；並びに
（２）下記に記載するスクリーング方法によって取得されるCaMKII阻害作用を有する物質を有効量含有する製剤；
がいずれも包含される。なお、ここでCaMKII阻害作用を有する物質の有効量は、それを含有する抗自己免疫疾患剤が結果としてCaMKII阻害効果を発揮するようなCaMKII阻害作用物質の配合量であればよく、特に制限されるものではない。また抗自己免疫疾患剤は、CaMKII阻害作用物質以外に薬学的に許容される担体や各種の添加剤を含有していてもよい。
【００９４】
かかる担体や添加剤の種類、抗自己免疫疾患剤の形態、並びに抗自己免疫疾患剤の用法（投与形態、投与方法、投与量）については、後述の(III)の欄で詳細に説明する。
【００９５】
II．抗自己免疫疾患剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明者らは、後述する実施例に示すように、CaMKIIの機能発現を阻害することによって自己免疫疾患の発症を抑制し、かつ／または病態を改善することができるという新たな知見を取得した。このことから、CaMKII阻害作用を有する物質は抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用と考えられる。本発明のスクリーニング方法は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、被験物質の中からCaMKII阻害作用を有する物質を探索することによって、抗自己免疫疾患剤の有効成分を取得しようとするものである。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法が対象とする「CaMKII阻害作用を有する物質」は、結果としてCaMKIIの機能発現（機能発揮、作用）を阻害し得る物質であればよく、その作用機序を特に限定するものではない。CaMKII阻害作用として、具体的には、１) 活性化したCaMKII酵素活性を阻害する作用、２) CaMKIIの活性化を阻害する作用、３)活性化したCaMKIIを不活性化（脱リン酸化）する作用、及び４) CaMKIIの発現又は分泌を阻害する作用を挙げることができる。CaMKII阻害作用を有する物質は、かかるCaMKII阻害作用の少なくとも１つを有するものであればよい。
【００９７】
抗自己免疫疾患剤の有効成分となり得る候補物質としては、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物（低分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質となりえる物質または該物質を含む試料（これらを総称して「被験物質」という）を対象として実施することができる。さらに、候補物質を含む試料（被験物質）として、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、及び菌体成分などを使用することもできる。
【００９８】
本発明の「CaMKII阻害作用を有する物質」は、薬学的に許容される限りいかなる構造のものでも良く、以下に限定されないが、その具体例として例えば以下のものを挙げることができる。
・式１のイソキサゾール誘導体
式１：
【００９９】
【化１３】
2006223228.tif 000014
［式中、Ａ、Ｂ、およびＤは［１１］と同意義を表す］
・3-[(1S)-1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-5-｛[アミノ(モルフォリン-4-イル)メチレン]アミノ｝イソキサゾール（化合物（Ｉ））
・N'-｛3-[1-(2-フルオロ-ビフェニル-4-イル)-エチル]-イソキサゾール-5-イル｝-N,N-ジメチル-グアニジン塩酸塩（化合物（Ｉｂ））
・N-エチル-N'-｛3-[1-(2-フルオロ-ビフェニル-4-イル)-エチル]-イソキサゾール-5-イル｝-グアニジン塩酸塩（化合物（Ｉｃ））
・4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾール（化合物（ＩＩ））
・KN-93：  N-(2-[N-[4-クロロシンナミル]-N-メチルアミノメチル]フェニル)-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド
・1-[1-オキソ-11-(5,6-ジヒドロ-3-イミノベンゾ[h]シノリン-2(3H)-イル)ウンデシル]-4-(2-ピリミジニル)-ピペラジン
・配列 Lys-Lys-X-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr (式中、XはAlaまたはLysである。)で示されるアミノ酸配列を有するペプチド
・配列 Lys-Lys-Ala-Leu-His-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Cys-Leuで示されるアミノ酸配列を有するペプチド
【０１００】
本発明のスクリーニング方法は、かかる被験物質の中から上記に掲げるCaMKII阻害作用を指標として上記CaMKII阻害作用の少なくとも１つを有する物質を探索することによって実施される。斯くして選別取得される被験物質は、抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法の具体的態様としては、限定されないが、例えば以下に示す方法をあげることができる。
方法１
下記の工程(a)、(b)および(c)を含む、CaMKII阻害作用を有する物質のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素による基質のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを、被験物質を接触させない対照酵素の上記リン酸化レベルと比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する工程。  
方法２  
下記の工程(a)、(b)および(c)を含む、CaMKIIの産生阻害作用を有する物質のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII発現細胞（Jurkat細胞、THP-1細胞など）を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII発現細胞内のCaMKII蛋白量を測定し（ウェスタンブロッティング法など）、該蛋白量を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記蛋白量と比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの産生を阻害する被験物質を選択する工程。  
方法３
下記の工程(a)、(b)および(c)を含む、CaMKIIの遺伝子発現阻害作用を有する物質のスクリーニング方法：
(a) 被験物質とCaMKII発現細胞（Jurkat細胞、THP-1細胞など）を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII発現細胞内のCaMKII遺伝子発現量を測定し（ノーザンブロッティング、RT-PCR法など）、該遺伝子発現量を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記遺伝子発現量と比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの遺伝子発現を阻害する被験物質を選択する工程。  
方法４  
下記の工程(a)、(b)および(c)を含む、CaMKIIの活性化阻害作用を有する物質のスクリーニング方法：
(a) 被験物質と脱リン酸化CaMKII酵素を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させたCaMKII酵素のリン酸化レベルを測定し、該リン酸化レベルを、被験物質を接触させない対照酵素リン酸化レベルと比較する工程、
(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、CaMKIIの活性化を阻害する被験物質を選択する工程。  
【０１０２】
上記の方法１〜方法４において、スクリーニングの際の被験物質濃度、および「CaMKII阻害作用を有する」と判定するための判定基準は、適宜設定することができる。例えば被験物質濃度としては、これに限定されないが、100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、およびこれらの中間的な濃度（5μM、3μM、2μM、0.5μM、0.3μM、0.2μMなど）を挙げることができる。「CaMKII阻害作用を有する」と判定するための判定基準としては、これに限定されないが、対照と比較してのCaMKIIの阻害率が、例えば以下のものを挙げることができる。
（１）被験物質濃度10μMにおいてCaMKIIの阻害率が40%以上；
（２）被験物質濃度10μMにおいてCaMKIIの阻害率が60%以上；
（３）被験物質濃度1μMにおいてCaMKIIの阻害率が40%以上；
（４）被験物質濃度1μMにおいてCaMKIIの阻害率が60%以上；
（５）被験物質濃度0.1μMにおいてCaMKIIの阻害率が40%以上；  および
（６）被験物質濃度0.1μMにおいてCaMKIIの阻害率が60%以上。
好ましい判定基準としては、上記基準の中で、例えば（１）、（２）、（３）または（４）が挙げられる。さらに好ましくは、（３）または（４）が挙げられる。
【０１０３】
また、上記のスクリーニング方法において使用するCaMKIIは、α、β、β’、γ、δなどいずれのアイソフォームでもよいが、好ましくはCaMKIIγまたはCaMKIIδを挙げることができ、さらに好ましくはCaMKIIγを挙げることができる。
【０１０４】
本発明における、CaMKII阻害作用を有する物質のスクリーニング方法は、上記態様には限定されず、当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能である。
【０１０５】
以上説明した、CaMKII阻害作用を有する物質のスクリーニング方法によって被験物質の中から選別された候補物質は、更に、例えばヒトの各種の自己免疫疾患を模倣した病態モデル動物を用いた薬効試験や安全性試験に供することにより、より一層実用的な抗自己免疫疾患剤の有効成分として取得することができる。
【０１０６】
より具体的には、本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質について、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療剤として有用かどうか、特にリウマチ等の慢性炎症に有効かどうかは、関節リウマチの病態モデル動物（例えば、コラーゲン誘導性関節炎 [Trentham DE,Townes AS,Kang AH:Autoimunity to typeII collagens:An experimental model of arthritis J Exp Med 146:857-868,1977]、抗原誘導性関節炎、またはアジュバント誘導性関節炎[Pearson  CM：Development of arthritis,periarthritis and periotitis in rats given adjuvant.Proc Soc Expe Biolo Med 91:95-101,1956]等のいずれかのマウスもしくはラット）を用いた薬効試験を行うことにより評価できる。
【０１０７】
特に、ラットのアジュバント関節炎モデルを用いることにより、当該候補物質について関節リウマチに対する抑制効果（予防効果、治療効果）を詳細に評価することができる。ラットのアジュバント関節炎は、発症機序にＴリンパ球が関与し、関節の軟骨・骨変化および線維化を主体に進行する実験的関節炎であり、慢性炎症の基礎的研究および治療薬の薬効薬理研究における疾患モデルとして広く用いられている。アジュバント関節炎の病態は通常、（１）接種足のみが腫脹する非特異的１次炎症期（ピーク：４〜５日後）、（２）所属リンパ節内に活性化リンパ球が増加する誘導期（期間：５〜９日）、（３）多発性関節炎が発症するアジュバント関節炎の増悪期（ピーク：15〜17日）、および（４）関節の変形・破壊を残し炎症が鎮静化する自然治癒期（25日以降の期間）のように進行する。注射足側はアジュバント感作による非特異的な１次炎症も病態の進行に関与しているのに対し、非注射足側はＴリンパ球の関与により発症し病態が進行していくことから、より関節リウマチに近い現象がみられると考えられる。また、薬物作用は、接種日から投与する予防効果と、関節炎が発症した後に投与を開始する治療効果が検討されている。薬効評価の指標としては、（１）左右後肢それぞれの容積、（２）薬物投与の前後に左右それぞれの後肢容積を測定し、投与前後の容積差を算出することにより得られる浮腫量の変化、（３）軟X線による骨の形態学的評価、および（４）組織切片による病理学的評価などが一般的に用いられている。
【０１０８】
また、選別された候補物質について、多発性硬化症の病態モデル動物（例えばEAE発症誘導マウス）を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について多発性硬化症に対する抑制効果（予防効果、治療効果）を評価することができる。
【０１０９】
このようにして選別、取得された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１１０】
以上のような本発明のスクリーニング方法を用いて選択されるCaMKII阻害作用を有する物質は、前述の如き抗自己免疫疾患剤の有効成分として有用である。ここで自己免疫疾患としては、具体的には本明細書の第Ｉ章に記載する各種の疾病を任意に挙げることができるが、特に本発明が対象とするCaMKII阻害作用物質は、関節リウマチ、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデス、好ましくは関節リウマチ、及び多発性硬化症に対して有効に使用することができる。
【０１１１】
本発明の「抗自己免疫疾患剤」は、各種の自己免疫疾患に対して、その発症を阻害若しくは抑制する作用、その発症を遅延させる作用、発症後その症状を軽減若しくは改善する作用、または疾患を治癒する作用のいずれか少なくとも１つの作用を有するものである。その意味で、上記の「抗自己免疫疾患剤」は、自己免疫疾患予防剤、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患改善剤、または自己免疫疾患治療剤と言うこともでき、よって本発明のスクリーニング方法は、これらの有効成分の探索方法でありえる。
【０１１２】
本発明は、上記のスクリーニング方法により得られるCaMKII阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤を提供するものである。
【０１１３】
III．抗自己免疫疾患剤の用法について
以下、本発明のCaMKII阻害作用を有する物質を有効成分とする抗自己免疫疾患剤の投与形態、投与方法及び投与量等につき説明する。
【０１１４】
CaMKII阻害作用を有する物質が低分子化合物、ペプチドまたは抗体などの蛋白質である場合は、これらの物質について通常用いられる一般的な医薬組成物（医薬製剤）の形態に調製することができ、その形態に応じて経口または非経口的に投与することができる。一般的には以下のような投与形態、及び投与方法が挙げられる。
【０１１５】
投与形態としては、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤及びカプセル剤等の固形製剤や、溶液、懸濁液、乳液、シロップ及びエリキシルなどの液剤などの形態を挙げることができる。これらの各種形態は、投与経路に応じて経口投与剤の他、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤（坐剤）、舌下剤、経膣剤、注射剤（経静脈、経動脈、経筋肉、皮下、皮内）や点滴剤等の非経口投与剤に分類することができる。例えば、経口投与剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、懸濁液、乳液、及びシロップ等が、又は直腸投与剤や経膣剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤などの形態を採ることができる。経皮剤としては、例えばローション等の液剤の他、クリームや軟膏等の半固形剤の形態を採ることもできる。
【０１１６】
注射剤としては、例えば溶液、懸濁液または乳剤等の形態を採ることができ、具体的には無菌処理した水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、０.４重量％濃度の生理食塩水等を例示することができる。さらに注射剤は、液剤に調製した後、凍結処理又は凍結乾燥処理されていてもよく、これにより保存することができる。後者の凍結乾燥処理で調製される凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【０１１７】
上記の医薬組成物（医薬製剤）の形態には、当該分野で行われている通常の手法により、CaMKII阻害作用を有する物質と薬学的に許容される担体を配合することによって調製される。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤及び分散剤などを例示することができる。また、さらに当該分野において通常用いられる添加剤を配合することもできる。かかる添加剤は、調製する医薬組成物の形態に応じて、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張度調節剤、キレート剤、界面活性剤などの中から適宜選択して用いることができる。
【０１１８】
このような形態を有する医薬組成物は、目的とする疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、経口投与、あるいは静脈、動脈、皮下、皮内または筋肉内に投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与してもよいし、また経皮投与や直腸投与も可能である。
【０１１９】
これらの医薬組成物の投与量や投与回数は、投与形態、患者の疾患やその症状、患者の年齢や体重等によって異なり、一概に規定することができないが、通常は成人に対し１日あたり有効成分の量として約０．０００１〜約１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約３００ｍｇの範囲、さらに好ましくは約０．１〜約３００ｍｇの範囲、特に好ましくは約０．１〜約１２０ｍｇの範囲を１日１回または数回に分けて投与することができる。
【０１２０】
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例において、下記の化合物を使用した。
化合物（Ｉ）：3-[(1S)-1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-5-｛[アミノ(モルフォリン-4-イル)メチレン]アミノ｝イソキサゾール（例えば、特許第３２３７６０８号明細書に記載の方法に従って合成できる）
式１ａ：
【０１２１】
【化１４】
2006223228.tif 000015
化合物（Ｉｂ）：N'-｛3-[1-(2-フルオロ-ビフェニル-4-イル)-エチル]-イソキサゾール-5-イル｝-N,N-ジメチル-グアニジン塩酸塩（例えば、特許第３２３７６０８号明細書に記載の方法に従って合成できる）
式１ｂ：
【０１２２】
【化１５】
2006223228.tif 000016
化合物（Ｉｃ）：N-エチル-N'-｛3-[1-(2-フルオロ-ビフェニル-4-イル)-エチル]-イソキサゾール-5-イル｝-グアニジン塩酸塩（例えば、特許第３２３７６０８号明細書に記載の方法に従って合成できる）
式１ｃ：
【０１２３】
【化１６】
2006223228.tif 000017
化合物（ＩＩ）：4-[1-(2-フルオロビフェニル-4-イル)エチル]-2-(メチルアミノ)チアゾール（例えば、特公平４−８００３５号公報に記載の方法に従って合成できる）
式２：
【０１２４】
【化１７】
2006223228.tif 000018
KN-93：N-(2-[N-[4-クロロシンナミル]-N-メチルアミノメチル]フェニル)-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド（特開平６−２９３７３０号公報に記載の方法に従って合成できる）
式３：
【０１２５】
【化１８】
2006223228.tif 000019
【実施例１】
【０１２６】
実施例１    CaMKII阻害活性の検討（１）
被験物質はDMSOに溶解し、CaMKII反応緩衝液 (50mM Tris-HCl :pH7.5, 10 mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol(DTT))(すべてNakalaiTesque社)で各種濃度に希釈した。ラット由来のCaMKIIα (最終濃度 0.75 μg/ml) (Santa Cruz社)を被験物質存在下でCaMKII反応緩衝液に溶解したAutocamtide-2(R)  (40 μM) （CALBIOCHEM社）およびCaMKII活性化緩衝液(1 mM CaCl2,  1 μM calmodulin) (NakalaiTesque社)と混合し、さらにATP (50 μM) (NakalaiTesque社)を加えることで反応を開始した。反応は30℃で５分間行い、その後、SDS-PAGE サンプル緩衝液を加え、5分間のboilingで反応を停止した。反応液中の蛋白は15% SDS-PAGEで分離し、PVDF膜にblottingした。Autocamtide-2に取り込まれたリンは抗リン酸化セリン／スレオニン抗体(Santa Cruz社)を反応させ、ECLシステム(Amersham社)とNIH Image（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ よりダウンロードできる）を用いて定量化した。
各被験物質のCaMKII阻害活性を表１に示した。いずれの各被験物質も1 μMあるいは10 μM 以上の濃度でCaMKIIの活性を阻害する作用を有することが明らかになった。
【０１２７】
表１.  被験物質によるCaMKII 阻害作用
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
被験物質         濃度          阻害率
(μM)            (%)  
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物（I）       10              85
1              47
0.1             39
化合物（II）      10              92
1              62
0.1             45
化合物（Ｉｂ）    10              71
1              42
0.1             13
化合物（Ｉｃ）    10              68  
1              36
0.1             11
KN-93             10              77
1              58
0.1             25
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【実施例２】
【０１２８】
実施例２    CaMKII阻害活性の検討（２）
CaMKIIγ遺伝子は、GenBankの Accession No.L07044の配列をもとに合成したプライマー2種（5'-TC GGA TCC AGC ATG GCC ACC ACC GCC ACC TG-3'［配列番号４］、5'-TA GAA TTC ACA CTG CAG CGG TGC GGC AGG［配列番号５］）と、定法にしたがって調製した培養細胞Jurket T細胞由来のcDNAを鋳型としてPCR法によって調製した。調製したCaMKIIγの遺伝子は、BamHI,EcoRIで切り出して、transfer vectorのpFastBac1のMCSに導入した。このvectorをもとに発現ウイルスを作製、増幅した。詳細はBac-to-Bacバキュロウイルス発現システム(Invitrogen社)のマニュアルに従った。発現したCaMKIIγの精製は、文献記載の方法（Biochemical & Biophysical Research Communications. 173(2):578-84, 1990）に準じて行った。即ち、発現細胞を超音波によって破砕し、遠心操作で得た細胞可溶性画分から、最終濃度60%の硫安分画、カルモジュリンセファロース（Amasham Biosciences社）によるアフィニティー精製により調製した。発現の確認は、γ特異的抗CaMKII抗体、sc1541（SantaCruz社）を用い、western blotting法により行った。
ラット由来のCaMKIIαに替えて、上記手順により調製したヒトCaMKIIγを用い、他の条件は実施例１と同様にして被験物質のCaMKIIγ阻害活性を測定した。
各被験物質のCaMKII阻害活性を表２に示した。KN-93は1 μM以上の濃度で、化合物（I）は10μM以上の濃度で、いずれもCaMKIIの活性を阻害する作用を有することが明らかになった。
【０１２９】
表２.  被験物質によるCaMKII 阻害作用    
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
被験物質         濃度          阻害率
(μM)            (%)  
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
化合物（I）       30              57  
10              33
1               7
KN-93             30             107  
10             101
1              27
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【実施例３】
【０１３０】
実施例３  Tリンパ球に対する作用
Tリンパ球をPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)とCalcium Ionophore A23187で刺激した時のIL-2産生に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
EL-4細胞（マウスTリンパ球系細胞株）を10%仔ウシ血清含有Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。5×104個/wellの割合で細胞を96穴プレートに播き込み、被験化合物を含むDMEM培地と刺激剤としてPMAおよびA23187を含むDMEM培地を添加し、20時間培養した。被験化合物および刺激剤の最終濃度は化合物（I）が1-30μM、KN-93が1-10μM、PMAが25ng/ml、A23187が250ng/mlとなるように調製した。培養後プレートを遠心し、マイクロピペットで上清を回収した。上清中のIL-2量をEnzyme-linked Immunosorbent Assay（ELISA）法で定量した。定量方法はキット（MOUSE IL-2 Immunoassay; R&D Systems）の使用説明書に従って実施した。
図１に示す通り、化合物（I）およびKN-93は用量依存的にIL-2の産生を抑制した。
【実施例４】
【０１３１】
実施例４  マクロファージに対する作用
マクロファージをリポポリサッカライド（LPS）で刺激した時のIL-6産生に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
J774A.1細胞（マウスマクロファージ細胞株）を10%仔ウシ血清含有Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。5×104個/wellの割合で細胞を96穴プレートに播き込み、被験化合物を含むDMEM培地と刺激剤としてLPSを含むDMEM培地を添加し、24時間培養した。被験化合物および刺激剤の最終濃度は化合物（I）が1-30μM、KN-93が1-3μM、LPSが1μg/mlとなるように調製した。培養後プレートを遠心し、マイクロピペットで上清を回収した。上清中のIL-6量をEnzyme-linked Immunosorbent Assay（ELISA）法で定量した。定量方法はキット（MOUSE IL-6 Immunoassay; R&D Systems）の使用説明書に従って実施した。
図２に示す通り、化合物（I）およびKN-93は用量依存的にIL-6の産生を抑制した。
【実施例５】
【０１３２】
実施例５  線維芽細胞の増殖に対する作用
線維芽細胞をbasic fibroblast growth factor (bFGF)で刺激した時の細胞増殖に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
L929細胞（マウス線維芽細胞株）を10%仔ウシ血清含有MEMアール培地（E-MEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。細胞を血清不含のE-MEMに懸濁し2×104個/wellの割合で細胞を96穴プレートに播き込み、72時間培養した。被験化合物を含むE-MEM培地を添加後１時間培養し、刺激剤としてRecombinant human FGF basic （bFGF）を含むE-MEM培地を添加し20時間培養した。各wellに5-bromo 2’-deoxyuridine (Brd-U)溶液を添加し、37℃にて更に4時間培養した。細胞を固定し、取り込まれたBrd-UをCell proliferation ELISA system(Amersham)を用いて検出し、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。この吸光度の値を細胞増殖の指標とした。
図３に示す通り、化合物（I）およびKN-93は用量依存的に線維芽細胞の増殖を抑制した。
【実施例６】
【０１３３】
実施例６  ヒト滑膜由来細胞の増殖に対する作用
ヒト滑膜細胞株SW982細胞の増殖に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
SW982細胞（ヒト滑膜細胞株；ATCCより入手）をFCS（SIGMA社製）含有DMEM培地（GIBCO社製）で培養し、実験に供した。SW982を96well平底プレートに無血清下で4×104／wellで播き込んだ。薬剤は細胞の播き込みと同時に添加し、200μl / wellで培養した。18時間後にalamar blue(R)（BIOSOURCE社）20μlを各wellに添加し、更に6時間培養し、マイクロプレートリーダーにて各wellの吸光度を測定した。吸光度は570nmと600nmの2波長で測定した。A1＝570nmの吸光度(細胞の入っているwell)、A2＝600nmの吸光度(細胞の入っているwell)、B1＝570nmの吸光度(培地のみの入っているwell)、B2＝600nmの吸光度(培地のみの入っているwell)とした場合、(A1-A2) - (B1-B2)の値を算出し、細胞数の指標として表示した。
図４に示す通り、CaMKII阻害剤である化合物（I）およびKN-93は用量依存的にヒト滑膜細胞SW982の増殖を抑制した。これらの結果はSW982の増殖の維持にCaMKII活性が関与していることを示しており、化合物（I）およびKN-93がCaMKII阻害によってSW982の細胞死を誘導していることを強く示唆している。
【実施例７】
【０１３４】
実施例７  破骨細胞の形成に対する作用
破骨細胞の形成に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
コラーゲン関節炎を発症したマウスの罹患足を採取し、10%仔ウシ血清含有α-MEM培地（GIBCO社）中でDispase（合同酒造）およびcollagenase S1（新田ゼラチン）存在下で37℃、5-6時間処理し、単分散細胞浮遊液を回収した。これを遠心、再懸濁により洗浄し実験に供した。2×104個/wellの割合で細胞を96穴プレートに播き込み、被験化合物を含むα-MEM培地を添加し、9日間培養した。培養後、TRAP染色用キット（Sigma社）を用い染色し、顕微鏡下でウェルあたりの破骨細胞数を計測した。TRAP染色はキットの使用説明書に従って実施した。
図５に示す通り、化合物（I）およびKN-93は用量依存的に破骨細胞の形成を抑制した。
【実施例８】
【０１３５】
実施例８  アジュバント誘発関節炎に対する作用
アジュバント誘発関節炎モデルはラットに惹起される代表的な慢性炎症モデルであり、抗炎症剤や抗リウマチ剤の薬理評価に広く用いられている。そこで、このモデルを用い化合物（I）および化合物（II）の効果を治療試験または発症予防試験で検討した。治療試験では、薬物投与による浮腫抑制効果を検討するため、投与期間前後の後肢容積の差を算出し、浮腫量の変化を検討した。発症予防試験では投与期間中、経時的に後肢容積を測定し、長期間にわたる薬物の効果を検討した。なお、薬効評価の指標として後肢容積または浮腫量を用いているが、浮腫量とはアジュバントを感作していない正常の後肢容積からの増加分なので、どちらの指標もほぼ同義に用いることができる。
（実験方法）
Mycobacterium butyricum（アジュバント）の流動パラフィン懸濁液（1mg/200μl）をSDまたはLewisラット（共に雄性、6週齢）の右側後肢足蹠皮下に注入し関節炎を惹起した。治療試験ではアジュバント注入後17日目から、体重100g当たり1mlの投与量になるように調製した化合物（I）または化合物（II）の0.5％メチルセルロース懸濁液を1日1回連続5日間経口投与した。陽性対照として同様に調製したインドメタシン懸濁液を投与した。投与直前および最終投与の5時間後に水置換法にて左右それぞれの後肢容積を測定し、投与直前の値と最終投与5時間後の値との差を算出し浮腫量の変化とした。発症予防試験ではアジュバントを注入した当日から1日1回連続21日間投与した。隔日に水置換法にて左右後肢容積を測定した。また化合物（II）の発症予防試験では対照として抗リウマチ薬D-ペニシラミン懸濁液を同様に投与した。
尚、コントロールとして被験化合物を含まない0.5％メチルセルロースのみを上記と同様にして投与した。
【０１３６】
（結果）
アジュバントを注入すると、10日前後に左後肢に関節炎を発症し、肢容積は17日目前後まで増大し、最大値に達する。そこで、化合物（I）（2.5-80mg/kg）を１日１回５日間経口投与した場合の左後肢における浮腫量の変化を図６に示した。化合物（II）（10-50mg/kg）を１日１回５日間経口投与した場合の左右後肢における浮腫量の変化を図７に示した。また、化合物（I）（2.5-80mg/kg）をアジュバント注入の当日から２１日間経口投与した場合の左右後肢容積を図８に示した。化合物（II）（50mg/kg）をアジュバント注入の当日から２１日間経口投与した場合の浮腫量を図９に示した。比較対照のため、陽性対照インドメタシン（0.5mg/kg）、D-ペニシラミン（50mg/kg）およびコントロール群の結果も各図中に合わせて示した。
図６および図７に示したように、アジュバント注入により引き起こされた左後肢の浮腫が最大値に達してから投与を開始する治療試験において、化合物（I）および化合物（II）投与群では、顕著な浮腫抑制効果がみられた。また、左後肢が浮腫を呈する前に投与を開始する発症予防試験においても、図８および図９に示したように、化合物（I）および化合物（II）は顕著な浮腫抑制効果を示した。
【実施例９】
【０１３７】
実施例９    コラーゲン関節炎マウスに対する作用
関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて、化合物（Ｉ）の薬効評価を行った。コラーゲン関節炎の惹起は常法に従った。すなわち、エーテル麻酔下、マウス（DBA／1J、雄性、日本チャールズリバー）の尾根部に0.1mlのエマルジョンを注入し初回免疫を行った。エマルジョンはウシII型コラーゲン溶液（2mg/ml；コラーゲン研修会）とフロイント完全アジュバント（Difco）を等量混合し作製した。3週間後、同組成のエマルジョンを0.1ml尾根部に注入し追加免疫を行い、関節炎を惹起した。関節炎の程度は次の基準に従いスコアで表示した。
０    ：無症状
１    ：2関節以下の腫脹
２    ：3関節以上の腫脹/手足の軽度の発赤・浮腫
３    ：3関節以上の腫脹/手足の中度の発赤・浮腫
４    ：手足の重度の発赤・浮腫/関節強直
各肢について0-4点で評価する為、1個体で取りうる最大スコアは16となる。
化合物（I）および陽性対照のプレドニゾロンは0.5%メチルセルロース溶液に懸濁し、マウスの体重10 g当たり0.1 mlを経口投与した。対照群には0.5%メチルセルロース溶液のみを経口投与した。投与は初回免疫と同時に開始し、１日１回、35日間連日実施した。
その結果を、図１０および図１１に示す。対照群のマウスは10匹中9匹が関節炎を発症し、その程度も重篤であった。一方、化合物（I） を投与したマウスでは用量依存的に発症を抑制し、関節炎の程度も軽微であった。
【実施例１０】
【０１３８】
実施例１０    実験的アレルギー性脳脊髄炎に対する作用
多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いてKN-93の薬効評価を行なった。実験的アレルギー性脳脊髄炎の惹起はBradleyらの方法（J. Clinical Investigation, 107: 995-1006, 2001）に従った。すなわち、7週齢の雌性 SJL/Jマウス（チャールズリバーより購入）の背後部皮下にFreund完全アジュバントに混和したPLP部分ペプチド（PLP139-151：NH2-HSLGKWLGHPDKF-COOH；配列番号１２）150μgを注射した。症状の重篤さの程度は次の基準に従いスコア（病態スコア）で表示した。
０    ：無症状
０．５：尾の軽い麻痺
１    ：尾の麻痺
２    ：軽度の後肢の麻痺
３    ：中程度から強度の後肢の麻痺、あるいは軽度の前肢の麻痺
４    ：完全な後肢の麻痺、あるいは中程度から強度の前肢の麻痺
５    ：四肢の麻痺あるいは死線期にある
６    ：死亡
KN-93は0.5%メチルセルロース溶液に懸濁（0.1mg/ml）し、マウスの体重10 g当たり0.1 mlを皮下投与した。対照群には0.5%メチルセルロース溶液のみを皮下投与した。投与は感作後7日目から開始し、１日１回、24日間連日実施した。
その結果を、図１２に示す。対照群のマウスは重篤な実験的アレルギー性脳脊髄炎を発症し、試験期間中に10匹中7匹が神経麻痺により死亡した。一方、KN-93(１mg/kg) を投与したマウスも発症はしたが、症状は対照群に比べはるかに軽く、死亡例は10匹中2匹であった。
【実施例１１】
【０１３９】
実施例１１    実験的アレルギー性脳脊髄炎に対する作用
多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いて化合物（Ｉ）の薬効評価を行なった。実験的アレルギー性脳脊髄炎の惹起はBradleyらの方法（J. Clinical Investigation, 107: 995-1006, 2001）に従った。すなわち、7週齢の雌性 SJL/Jマウス（チャールズリバーより購入）の背後部皮下にFreund完全アジュバントに混和したPLP部分ペプチド（PLP139-151）150μgを注射した。症状の重篤さの程度は次の基準に従いスコア（病態スコア）で表示した。
０    ：無症状
０．５：尾の軽い麻痺
１    ：尾の麻痺
２    ：軽度の後肢の麻痺
３    ：中程度から強度の後肢の麻痺、あるいは軽度の前肢の麻痺
４    ：完全な後肢の麻痺、あるいは中程度から強度の前肢の麻痺
５    ：四肢の麻痺あるいは死線期にある
６    ：死亡
化合物（Ｉ）は0.5%メチルセルロース溶液に懸濁してそれぞれ8mg/ml（80mg/kg投与群）、4mg/ml（40mg/kg投与群）および2mg/ml（20mg/kg投与群）の投与液を調製し、マウスの体重10 g当たり0.1 mlを経口投与した。陽性対照としてのプレドニゾロン群では、プレドニゾロンを0.5%メチルセルロース溶液に懸濁して0.3mg/mlの投与液を調製し、マウスの体重10 g当たり0.1 mlを経口投与した。対照群には0.5%メチルセルロース溶液のみを皮下投与した。投与は感作日から開始し、１日１回、４０日間連日実施した。Normal群では、PLP139-151感作および被験物質投与を共に行わなかった。
その結果を、表３、図１３および図１４に示す。化合物（Ｉ）は、病態スコアをいずれの投与量でも抑制し、その作用は用量依存的であった。また、対照群では全例（9匹中9匹）が発症し、試験期間中に9匹中4匹が神経麻痺により死亡したのに対し、化合物（Ｉ）投与群では80mg/kg投与群で10匹中1匹死亡した以外は死亡例がなかった。プレドニゾロンは発症を強く抑制した（10匹中2匹のみ発症）が、対照群や化合物（Ｉ）投与群とは異なり、発育による体重の自然増加を強く抑制した。この結果はプレドニゾロンの連続投与に伴う作用であり、慢性の病態に長期投与を行う場合の問題点となる。即ち、CaMKII阻害剤である化合物（Ｉ）は、代表的なステロイドであるプレドニゾロン投与群において見られた長期投与時の強い体重増加抑制を伴うことなく、実験的アレルギー性脳脊髄炎の病態重症化を用量依存的に抑制することが示された。
【０１４０】
表３. 実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスにおける効果    
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
被験物質        用量    ｎ    発症率    死亡率
(mg/kg)                              
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
対照群                   9      9/ 9      4/ 9
Normal群                10      0/10      0/10
プレドニゾロン     3    10      2/10      0/10      
化合物（I）       20    10      8/10      0/10    
40    10      7/10      0/10  
80    10      8/10      1/10  
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【実施例１２】
【０１４１】
実施例１２    コラーゲン関節炎（CIA）マウス関節炎罹患部におけるCaMKIIの発現
CIAマウスの関節炎罹患部の組織切片を作成し、免疫染色法により炎症部位におけるCaMKII蛋白の発現を検討した。
CIAは常法により惹起した。すなわち、エーテル麻酔下、マウス（DBA/1J、雄性、日本チャールズリバー）の尾根部に0.1mlのエマルジョンを注入し初回免疫を行った。エマルジョンはウシII型コラーゲン溶液（2mg/ml；コラーゲン研修会）とフロイント完全アジュバント（Difco）を等量混合し作製した。3週間後、同組成のエマルジョンを0.1ml尾根部に注入し追加免疫を行い、さらに4週間飼育した後、関節炎を発症したマウスの後肢を採取し、4％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定した後肢から病理組織標本を作製し免疫染色に用いた。免疫染色はベクタステイン(R) ABC-PO（ウサギIgG）キット（Vector社）を用い、一次抗体としてラビット抗CaMKIIポリクローナル抗体（M-176；Santa Cruz Biotechnology）を50倍希釈で用い、モイストチャンバー内で一晩反応させた。その他はキットの使用説明書に従って実施した。
図１５に示す通り、正常滑膜ではCaMKII発現細胞はほとんど見られないが、滑膜炎部位ではCaMKII発現細胞が多数みられる。また図１６に示す通り、炎症の亢進したパンヌス（肉芽状組織）において、CaMKII発現細胞が多数観察された。以上の知見は、CaMKIIがリウマチの病態形成に関与していることを示唆している。
【実施例１３】
【０１４２】
実施例１３  IκBαの分解に対する作用の検討
Tリンパ球をPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)とCalcium Ionophore A23187で刺激した時の  IκBαの分解に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
EL-4細胞（マウスTリンパ球系細胞株）を10%仔ウシ血清含有Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。サブコンフルエントに増殖した細胞を遠心回収し、5×106cells/tubeとなるようにエッペンドルフチューブに分注した。化合物（I）（final 30μM）またはKN-93（final 10μM）を添加し37℃ウォーターバスでプレインキュベーションした後、PMA（final 125ng/ml）およびA23187（final 1μg/ml）で刺激した（total volume 500μl）。刺激後15分または30分インキュベーションした後、ice cold Stop Solution(1×PBS、1mM Na3VO4、5mM EDTA)1ml添加し反応を停止させた。遠心洗浄後、TNE buffer(50mM Tris-HCl、1% NP-40、20mM EDTA、100μg/ml PMSF、30μl/ml Aprotinin、1mM Na3VO4、5mM NaF、12mM β-glycerolphosphate)で溶解した。12％ SDS-PAGE後、タンパクをPVDF membraneに転写し、抗IκBα抗体(C-21、Santa Cruz社)を用いてwestern blottingを行った。
図１７に示す通り、化合物（I）およびKN-93はIκBαの分解を抑制した。
【実施例１４】
【０１４３】
実施例１４  サイクリンD1の発現およびAktのリン酸化に対する作用の検討
線維芽細胞をbasic fibroblast growth factor (bFGF)で刺激した時のサイクリンD1の発現およびAktのリン酸化に対する化合物（I）およびKN-93の作用を評価した。
L929細胞（マウス線維芽細胞株）を10%仔ウシ血清含有MEMアール培地（E-MEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。細胞を血清不含のE-MEMに懸濁し72時間培養した。被験化合物を含むE-MEM培地を添加後１時間培養し、刺激剤としてRecombinant human FGF basic （bFGF）を含むE-MEM培地を添加しさらに培養した。RIPA bufferで細胞を溶解し、total cell lysateを得た。SDS-PAGE後、タンパクをPVDF membraneに転写し、抗cyclin抗体または抗Akt抗体(共にSanta Cruz社)を用いてwestern blottingを行った。
図１８および図１９に示す通り、化合物（I）およびKN-93はサイクリンD1の発現増強を抑制し、Aktのリン酸化も抑制した。
【実施例１５】
【０１４４】
実施例１５  炎症性刺激によるCaMKIIの発現変動
ヒト単球系細胞株であるTHP-1(大日本製薬より購入)を実験に供した。10％FCS（SIGMA）を含むRPMI1640培地（GIBCO）を用いてTHP-1細胞を5x105 cells/mlの濃度に調製し、24wellプレートの各wellに0.5mlずつ加えた。さらに、10％FCS（SIGMA）を含むRPMI1640培地（GIBCO）を用いて4 μg/mlに調製したリポポリサッカライド（LPS: Difco）と400 U/mlに調製したIFN-γ（ナカライテスク）をそれぞれ0.25μlずつ添加して培養を開始した。無刺激群には10％FCS（SIGMA）を含むRPMI1640培地（GIBCO）のみを添加した。その後、経時的に細胞を回収し、RIPA Bufferで細胞溶解液を調製後、蛋白量測定キット（Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD）を用いて蛋白量を定量した。細胞溶解液50μgを8-16%グラジュエントゲル（旭テクノグラス）に添加してSDS-PAGEを行なった。PVDFメンブレンへトランスファー後、ブロッキング剤 (ECL Blocking agent: Amersham)を１時間反応させ、その後、１次抗体である抗CaMKIIγ抗体（Santa Cruz）あるいは抗CaMKIIδ抗体（Santa Cruz）を５00倍にブロッキング剤で希釈したものを１時間室温で反応させた。メンブレンを洗浄後、２次抗体であるhorseradishi peroxidase標識抗ヤギIgG抗体(Amersham)をブロッキング剤で2000倍に希釈したものを40分間反応させた。その後、メンブレンを洗浄し、ECL Plus (Amersham)を用いてメンブレンにブロットされた蛋白を検出した。
結果を図２０に示す。THP-1細胞において、炎症性刺激によりCaMKIIの発現が誘導されることが明らかとなった。
【実施例１６】
【０１４５】
実施例１６  ヒト滑膜由来細胞の増殖に対するsiRNAの作用
CaMKIIと自己免疫疾患の関連をより明確にするため、CaMKII配列に特異的なsiRNAを設計、作製し、ヒト滑膜由来細胞株であるSW982細胞を用いてCaMKII配列特異的siRNAの影響を検討した。
１．CaMKII配列特異的siRNA(small interfering RNA)の設計、及び作製
CaMKII配列特異的siRNAとして、CaMKIIγ遺伝子（GenBank Accession No.L07044）の塩基配列情報に基づき、表４に示す3種の特異的な siRNA 配列を設定し、センス鎖とアンチセンス鎖により二本鎖が形成された siRNA を日本バイオサービス社より購入した（3種のsiRNAを、以下CaMKIIγ siRNA(A)、(B)および(C)と称する）。
表４．CaMKIIγ siRNAの配列
siRNA名                            配列               配列番号  位置
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
(A) センス鎖        5'-CGU GAG GCU CGG AUA UGU CdTdT-3'  ４    199-217
(A) アンチセンス鎖  5'-GAC AUA UCC GAG CCU CAC GdTdT-3'  ５    
(B) センス鎖        5'-CAU CCA AAC AUC GUG CGC CdTdT-3'  ６    229-247
(B) アンチセンス鎖  5'-GGC GCA CGA UGU UUG GAU GdTdT-3'  ７    
(C) センス鎖        5'-GCA GAU GCC AGC CAC UGU AdTdT-3'  ８    352-370
(C) アンチセンス鎖  5'-UAC AGU GGC UGG CAU CUG CdTdT-3'  ９    
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
（「位置」は、GenBank Accession No.L07044に登録されているCaMKIIγ配列中の位置番号を表す。）
コントロールとして哺乳類に存在しない配列で作製されたsiRNAであるScramble II Duplex (DHARMACON)を用いた。
２．CaMKIIγ 発現抑制による細胞増殖に対する効果 
SW982細胞（ATCCより入手）はFCS（SIGMA）含有DMEM培地(GIBCO)で培養し、実験に供した。この細胞を24wellプレートに1x105 cell/well添加し、24時間後に、CaMKIIγ siRNA 3μl(60pmol)およびGeneSilencer（Gene Therapy Systems, Inc） 10.5μlを各wellに加えた。
siRNAの導入効率を検討するために、蛍光を標識したsiRNAであるFluorescein Labeled Luciferase GL2 Duplex (DHARMACON)をCaMKIIγ siRNAの代わりに添加した。２4時間の培養後、siRNAの導入効率は細胞内に取り込まれたFluorescein Labeled Luciferase GL2 Duplexをフローサイトメーターで測定した。また、細胞内のCaMKII量はsiRNAの導入３日後に細胞を回収し、RIPA Bufferで細胞溶解液を調製後、蛋白量測定キット（Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD）を用いて蛋白量を定量し、50μgを8-16%グラジュエントゲル（旭テクノグラス）に添加してSDS-PAGEを行った。PVDFメンブレンへトランスファー後、ブロッキング剤 (ECL Blocking agent: Amersham)を１時間反応させ、その後、１次抗体である抗CaMKIIγ抗体（Santa Cruz）を５00倍にブロッキング剤で希釈したものを１時間室温で反応させた。メンブレンを洗浄後、２次抗体であるhorseradishi peroxidase標識抗ヤギIgG抗体(Amersham)をブロッキング剤で2000倍に希釈したものを40分間反応させた。その後、メンブレンを洗浄し、ECL Plus (Amersham)を用いてメンブレンにブロットされた蛋白を検出した。
細胞の増殖はAlamar Blue(R)の取り込みを指標に測定した。すなわち、siRNAを導入後に3日間細胞を培養し、血清を含まないDMEM培地に交換してさらに24時間培養した。その後、Alamar Blue(R)を各wellに添加し、1時間後に蛍光光度計で蛍光強度を測定した（励起: 544nm、波長:590nm）。
その結果、本実験の条件下では約80%の細胞にsiRNAが導入されることが確認された（図２１および図２２）。3種類のsiRNAの効果をCaMKIIγの発現量で検討した結果を図２３に示した。SW982細胞ではCaMKIIγの発現が認められたが、(A)配列のsiRNAを細胞内に導入することでCaMKIIγの発現抑制が観察された。また、(A)配列のsiRNAを導入した細胞のみで増殖の抑制が認められた（図２４）。
３．考察
以上、CaMKII阻害剤である化合物（Ｉ）またはKN-93を添加するとヒト滑膜由来細胞SW982の細胞増殖がほぼ完全に抑制されること（実施例６）、および、CaMKIIγの発現を抑制するsiRNAであるCaMKIIγ siRNA(A)を導入したSW982では細胞増殖が抑制されること（本実施例）より、SW982の細胞増殖にはCaMKIIγの発現が深く関与していることが明らかとなった。このことは、CaMKIIγの発現を抑制、または活性を阻害することにより、滑膜細胞の異常増殖が抑制され、よって関節リウマチ等の疾患における関節の病態改善（慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形への進行抑制など）が達成されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、新規な作用機序に基づく、優れた抗自己免疫疾患剤を提供することができる。さらに本発明により、当該抗自己免疫疾患剤の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】マウスTリンパ球系細胞株EL-4細胞をPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)とCalcium Ionophore A23187で刺激した時のIL-2産生量を示すグラフである。結果は各群とも6ウェルの平均値と標準偏差で示す。化合物（I）添加群（1-30μM）、KN-93添加群（1-10μM）およびコントロール群の結果を示す。
【図２】マウスマクロファージ細胞株J774A.1細胞をリポポリサッカライド（LPS）で刺激した時のIL-6産生量を示すグラフである。結果は各群とも6ウェルの平均値と標準偏差で示す。化合物（I）添加群（1-30μM）、KN-93添加群（1-3μM）およびコントロール群の結果を示す。
【図３】マウス線維芽細胞株L929細胞をRecombinant human FGF basic （bFGF）で刺激した時の細胞増殖を示すグラフである。細胞増殖の指標としてブロモデオキシウリジン（Brd-U）の取り込みを波長450nmの吸光度として測定した。結果は各群とも6ウェルの平均値と標準偏差で示す。化合物（I）添加群（0.3-10μM）、KN-93添加群（1-30μM）、無刺激コントロール群および刺激コントロール群の結果を示す。
【図４】ヒト滑膜由来細胞であるSW982細胞の増殖を示すグラフである。結果は各群とも6ウェルの平均値で示す。化合物（I）添加群（1-30μM）、KN-93添加群（1-30μM）、およびコントロール群の結果を示す。
【図５】コラーゲン関節炎マウス関節炎罹患部由来細胞を培養した時の破骨細胞形成数を示すグラフである。結果は各群とも6ウェルの平均値と標準偏差で示す。化合物（I）添加群（0.5-20μM）、KN-93添加群（0.3-5μM）およびコントロール群の結果を示す。
【０１４８】
【図６】ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の浮腫量の変化を示すグラフである。結果は各群とも10例の平均値と標準偏差で示す。化合物（I）投与群（2.5-80mg/kg）、インドメタシン投与群（0.5mg/kg）およびコントロール群の結果を示す。
【図７】ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢の浮腫量の変化を示すグラフである。化合物（II）投与群（10-50mg/kg）（各群７例の平均値と標準偏差）およびコントロール群（８例の平均値と標準偏差）の結果を示す。
【図８】ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢容積の経日推移を示すグラフである。グラフ中、○は化合物（I）（2.5mg/kg）投与群の結果を示す。■は化合物（I）（5mg/kg）投与群の結果を示す。□は化合物（I）（10mg/kg）投与群の結果を示す。▲は化合物（I）（20mg/kg）投与群の結果を示す。△は化合物（I）（40mg/kg）投与群の結果を示す。●は化合物（I）（80mg/kg）投与群の結果を示す。◇はインドメタシン（0.5mg/kg）投与群の結果を示す。×は被験化合物非投与群（コントロール群）の結果を示す。各群とも10例の平均値で示す。
【図９】ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢浮腫量の経日推移を示すグラフである。グラフ中、●は化合物（II）（50mg/kg）投与群の結果を示す。△はD−ペニシラミン（50mg/kg）投与群の結果を示す。○は被験化合物非投与群（コントロール群）の結果を示す。各群10-12例の平均値で示す。
【０１４９】
【図１０】関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて化合物（Ｉ）を試験した時の、関節炎発症率を示すグラフである。
【図１１】関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて化合物（Ｉ）を試験した時の、関節炎スコアを示すグラフである。
【図１２】多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いてＫＮ−９３を試験した時の、病態スコアを示すグラフである。
【図１３】多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いて化合物（I）を試験した時の、病態スコアを示すグラフである。
【図１４】多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いて化合物（I）を試験した時の、体重増加に及ぼす作用を示すグラフである。
【０１５０】
【図１５】CIAマウスの滑膜部位におけるCaMKIIの免疫染色の結果である。黒色に見える細胞はCaMKII発現細胞を示している。
【図１６】CIAマウスのパンヌス（肉芽状組織）におけるCaMKIIの免疫染色の結果である。黒色に見える細胞はCaMKII発現細胞を示している。
【０１５１】
【図１７】マウスTリンパ球系細胞株EL-4細胞をPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)とCalcium Ionophore A23187で刺激した時の細胞質内におけるIκBαの発現をウェスタンブロッティングで検出した結果である。化合物（I）30μM添加、KN-93 10μM添加およびコントロールの結果を示す。
【図１８】マウス線維芽細胞株L929細胞をRecombinant human FGF basic （bFGF）で刺激した時の細胞内におけるサイクリンD1の発現をウェスタンブロッティングで検出した結果である。化合物（I）添加（1.25-20μM）、KN-93添加（5-20μM）、無刺激コントロールおよび刺激コントロールの結果を示す。
【図１９】マウス線維芽細胞株L929細胞をRecombinant human FGF basic（bFGF）で刺激した時の細胞内におけるリン酸化AktおよびAktの発現をウェスタンブロッティングで検出した結果である。化合物（I）20μM添加、KN-93 20μM添加、無刺激コントロールおよび刺激コントロールの結果を示す。
【０１５２】
【図２０】ヒト単球系細胞株THP-1細胞をLPS+IFNγで刺激した時の、細胞内におけるCaMKIIγおよびCaMKIIδの発現をウェスタンブロッティングで検出した結果である。
【図２１】蛍光標識siRNAを用いて最適な導入条件を検討した際の、対照としてのトランスフェクションがない場合のフローサイトメーター解析の結果を示す。縦軸は細胞数を表し、横軸は蛍光強度をLogスケールで表す。
【図２２】蛍光標識siRNAを用いて最適な導入条件を検討した際の、最適な条件時（siRNA 60pmol）のフローサイトメーター解析の結果を示す。縦軸は細胞数を表し、横軸は蛍光強度をLogスケールで表す。
【図２３】ヒト滑膜由来細胞SW982細胞に、CaMKIIγ siRNA(A)、(B)および(C)をそれぞれ導入した時のCaMKIIγの発現をウェスタンブロッティングで検出した結果である。図中の(A)、(B)および(C)はCaMKIIγ siRNA(A)、(B)および(C)を、それぞれ導入した場合の結果を示す。SCは、コントロールとしてScramb1e II Dup1ex(SC)を導入した場合の結果を示す。Mockは、siRNAを何も含まず導入用試薬だけでトランスフェクションを行った場合の結果を示す。図中に、「CaMKIIγ→」で示したバンドがCaMKIIγのバンドである。
【図２４】ヒト滑膜由来細胞SW982細胞に、CaMKIIγ siRNA(A)、(B)および(C)をそれぞれ導入した時の細胞増殖を示すグラフである。細胞増殖の指標として、A1aｍar B1ue(R)添加後、蛍光強度(励起:544nm、波長:590nm)を測定した。図中の(A)、(B)および(C)はCaMKIIγ siRNA(A)、(B)および(C)を、それぞれ導入した場合の結果を示す。SCは、コントロールとしてScramb1e II Dup1ex(SC)を導入した場合の結果を示す。Mockは、siRNAを何も含まず導入用試薬だけでトランスフェクションを行った場合の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１：  阻害剤ペプチド
配列番号２：  阻害剤ペプチド
配列番号３：  阻害剤ペプチド
配列番号４：  プライマー
配列番号５：  プライマー
配列番号６：  siRNA
配列番号７：  siRNA
配列番号８：  siRNA
配列番号９：  siRNA
配列番号１０：  siRNA
配列番号１１：  siRNA
配列番号１２：  PLP(139-151)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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