(57)【要約】【課題】  マイクロ流体チップで行う化学分析や化学反応において、複数のサンプルの厳密な送液制御なしに、容易に均一な混合を実現することが可能な流路合流部の形状を提供する。【解決手段】  複数のサンプル導入口とそこから延びる流路を持ち、それぞれの流路が合流する流路合流部を備えたマイクロ流体チップにおいて、それぞれのサンプル導入口から一定量のサンプルを導入後送液し、流路合流部でサンプルが混合することにより化学反応を起こさせようとする際、送液されるサンプルの液先端を揃えなければ、サンプルが混合する間に気泡を挟むなどして均一な混合ができず、ひいては化学反応が不成功となることがある。そこで、流路合流部を三角形状にすることで、送液しているサンプルの液先端を厳密に揃えなくとも、混合溶液の間に気泡を挟み込むことなく、均一に混合することが可能となるような流路合流部の形状を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを導入可能な複数のサンプル導入口と、導入したサンプルを送液する複数の導入路と、導入路が合流後接続される排出路と、排出路と接続しサンプルを取り出す排出口と、からなる流路パターンを有するマイクロ流体チップにおいて、
流路合流部の形状が流路合流部下流端を頂点とした概ね三角形状であるマイクロ流体混合器。
【請求項２】
請求項１において、流路合流部の内容積が、導入したサンプルの体積の総和の５０〜１５０％であること、すなわち、混合後のサンプル溶液の体積に対して５０〜１５０％であるマイクロ流体混合器。
【請求項３】
請求項１または２において、２つの導入路および１つの排出路が、流路合流部の各頂点に接続されているマイクロ流体混合器。
【請求項４】
請求項１乃至３において、概ね三角形状の流路合流部の底辺が、直線、または流路合流部の概ね三角形状の頂点のなす角以上、かつ１５０°以上１８０°未満の大きさの角度を有する送液方向に向かって凸である二辺で構成されているマイクロ流体混合器。
【請求項５】
請求項１乃至３において、概ね三角形状の流路合流部の底辺が送液方向に向かって凸である曲線で構成されているマイクロ流体混合器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップの分野に属するものであり、遺伝子検査や免疫学的検査等の生化学的検査および診断、または化学分析、化学反応に好適なマイクロ流体チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノテクノロジーに代表される微細加工技術を駆使して、化学分析や化学反応、または遺伝子検査や免疫学的検査などを微細化して行うμ−ＴＡＳ（μ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が注目を集めている。μ−ＴＡＳにおいては、これらの反応をマイクロチップ上に集積化することで、必要試薬量の低減、それによる産業廃棄物の削減、操作の簡便性、さらには比表面積増大による攪拌効率や抽出効率の向上により、分析所要時間の大幅な短縮などが期待されている。
【０００３】
また、装置の小型化による省スペース化、さらには、持ち運び可能な大きさにすることでＰｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（その場分析）の実現も期待されている。例えば、感染症の診断および治療においては、適切な処置を行うために感染している細菌やウィルス種を特定する必要があり、免疫学的検査や遺伝子検査が実施されている。後者においては、細菌やウィルス由来の核酸を増幅するために、ＰＣＲ（ポリメレースチェーンリアクション）法の適用が検討されている。しかしながら、従来の免疫学的検査や遺伝子検査においては、検体の前処理や必要となる試薬類の保存や調製、さらには、大掛かりな検出装置などが必要であり、中央検査室と称される大型の医療機関において主に利用されてきた。
【０００４】
一方、マイクロ流体チップに上記の検査項目を集積化することが可能ならば、小病院への各種検査法の導入のみならず、入院患者がベッドサイドで自ら分析することや、ひいては、自宅で簡便に健康状態を把握することも不可能ではなくなり、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｌｉｆｅ；生活の質）の向上による豊かな暮らしへの貢献が期待されている。
【０００５】
実際、これまでにいくつかの遺伝子分析や化学分析を行うマイクロ流体チップの報告がなされているが、実用的な臨床診断ツールとして利用させている例は皆無である。
【０００６】
実用的なマイクロ流体チップの実現が困難であることの一因として、従来の技術ではマイクロ流体チップ上における流体制御が難しく、特に、複数のサンプルを流路合流部で定量的に均一に混合することが容易ではない。そのため、チップ上での複数の溶液の混合法が提案されている。混合部後方に垂直及び水平流路を有する基板を複数枚積層する方法（特許文献１および２）や反応流路部に圧電素子を装着し、流路の変形により混合させる方法（特許文献３）、さらには合流部の後方に微細な凹凸面を有する混合器を形成させる方法（特許文献４）等が提案されている。各提案の多くは流動溶液の分割と合流により混合を促進させる方法であり、その実現にはチップ作製の困難性、コスト増大等の問題が残っている。さらに上記手段ではサンプル溶液を継続的に送液する連続流体を前提にしており、臨床診断分野や分析分野のように取り扱えるサンプル量が微量である不連続流体への適用は困難であり、簡便な構造で上記の目的を達成可能な混合機構が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１１３９６７号公報
【特許文献２】特開２００４−１１３９６８号公報
【特許文献３】特開２００４−１８４３１５号公報
【特許文献４】特開２００４−０１６８７０号公報
【特許文献５】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３１４  （２００３）  ７７−８６
【非特許文献２】Ｒｏｍａｎｏ  Ｊ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｍｅｄ．  （１９９６）Ｍａｒ；１６（１）；８９−１０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サンプル量が微量で、不連続流体を均一に混合する必要のあるマイクロ流体チップにおいては、導入したサンプルがマイクロ流体チップ上で混合することで反応がスタートするような系、特に、遺伝子増幅反応においては検体と各種酵素、基質溶液をマイクロ流体チップ上で混合させる場合、各サンプルは定量的に混合されるべきであるが、図３に示すように、各サンプルの流路合流部への到達時間にズレがあると、サンプルが混合している間に空気を挟み込むなどして均一な混合が難しく反応が進行しない原因となっていた。また、流路を送液する複数のサンプルの流路合流部への到達時間を合わせるためには、流路を流れるサンプルの液先端を揃える必要があるが、その目的で送液制御を行うためには、各流路を別々に制御する複数のポンプが必要となり、装置が大掛かりとなってしまい、ひいてはその場分析への対応は不可能となってしまう。
【０００９】
本発明は、マイクロ流体チップに導入されたサンプルを、厳密な送液制御を必要とせずに、均一に混合することが可能な流路合流部の形状をもつマイクロ流体混合器により、簡便かつ低コストで製作可能なマイクロ流体チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、複数のサンプルをマイクロ流体チップ上で混合することにより化学反応が開始するような反応系を実施するに当たり、複数の流路の合流部の形状が流路合流部下流端を頂点とした概ね三角形状であることで、流路内に定量的に導入したサンプルを複雑な送液制御を必要とせず、均一に混合することが可能となることを見出した。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、マイクロ流体チップにおいて複数のサンプルを均一に混合するための流路合流部の形状に関するものであって、複数の流路が合流する流路合流部の形状が流路合流部下流端を頂点とした概ね三角形状であることを特徴とする。
【００１３】
図１に示したマイクロ流体チップ１において、サンプル導入口２および３に定量的にサンプルを導入し、該導入口から延びる導入路４へサンプルを送液し、流路合流部５でサンプルを混合することで反応がスタートするような化学反応を行う際、マイクロ流体チップに接続されたポンプで加圧または減圧することによりサンプルを送液することとなるが、その際、サンプルの液先端が同時に流路合流部５に到達しなければ、図３に示すようにサンプルの混合液に気泡を噛み込んでしまう。この状態では意図した試薬組成と異なる混合液が生成したこととなり、均一な混合または化学反応が進行しない原因となる。このことを防止するためには、流路を送液する複数のサンプルの液先端を厳密に制御することが必要である。しかしながら、そのためにはサンプル数と同じ数の加圧ポンプのような制御装置が必要となり、小型化、簡便化の妨げとなる。そこで、流路合流部を特徴的な形状にすることで、この問題を解決することが可能となった。すなわち、図４に示すように、サンプルの液先端が揃わずに一方のサンプルが先に流路合流部に到達しても、流路合流部を流路合流部下流端を頂点とした概ね三角形状にすることで、先に到達したサンプルが流路合流部よりも下流に流れていくことなく一旦留まり、遅れて到達したサンプルと混合することにより体積が増加することで流路合流部内を混合液が満たし、排出路へと送液され、下流の検出部等で検出等することが可能となった。これにより、意図した試薬組成の混合液が生成し、目的の化学反応の反応効率が向上する。
【００１４】
前記流路合流部の形状は図２の（Ｂ）に示したように、合流する流路を二辺とし、流路合流部下流端を頂点とするような形状の二等辺三角形であることが好ましく、さらに好適には、図２の（Ｃ）に示したように、上記二等辺三角形の底辺を送液方向に凸となるようにすることが好ましい。具体的には、底辺のなす角θが１５０°以上１８０°以下であることが好ましい。またθは、流路合流部の概ね三角形状の流路合流部下流端の頂点のなす角θ’より大きいことが好ましく、θ’は１５０°以下であることが好ましい。これら図２の（Ｂ）および（Ｃ）を含めて概ね三角形状ということができる。また図２の（Ａ）、（Ｄ）および（Ｅ）については、（Ａ）および（Ｅ）は流路合流部に底辺が無く、（Ｄ）は底辺がサンプル送液方向に向かって凸ではないため、それぞれ概ね三角形状には含まれないとする。また、図２の（Ｂ）および（Ｃ）とは異なる形状であっても流路合流部が概ね三角形状であればよく、たとえば図２の（Ｆ）のように二等辺三角形ではないもの、（Ｇ）のように頂点を形成する２辺が直線ではないもの等もサンプルを均一に混合する効果があり、概ね三角形状に含まれるものとする。（Ｈ）の場合は、底辺が曲線であるものの送液方向に向かって凸である形状であるため、サンプルを均一に混合する効果があり、概ね三角形状に含まれるものとする。なお、本発明において概ね三角形状とは図２のようにマイクロ流体チップの上方から見て概ね三角形状であることを意味する。
【００１５】
本発明における流路合流部の容積は特に限定されないが、流路合流部に送液されるサンプルの総量に対して同程度であることが好ましく、特に５０％以上１５０％以下であることが好ましい。
【００１６】
本発明において流路合流部に接続される２つの導入路および１つの排出路が、概ね三角形状である流路合流部の、三角形の各頂点に接続されていることが好ましい。
【００１７】
マイクロ流体チップの材質は、特に限定されることはなく、目的の形状を作製可能であり、流路内に送液する液体と反応を起こさないものであればどのような材質を用いても構わない。たとえばアクリル樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアセタール等の合成樹脂製や、磁器製、金属製、ガラス製などが例示できる。また、マイクロ流体チップの流路の幅および深さは特に限定されない。
【００１８】
本発明において、混合するサンプルの種類は特に限定されることはなく、たとえば混合後反応が開始される酵素と基質、抗原と抗体などの組み合わせでもよいし、反応が開始されない物質の組み合わせを混合するだけでもよい。
【００１９】
本発明において、１つの流路合流部では２つの導入路が接続されて１つの排出路へと送液されるが、３つ以上のサンプルを混合する場合には、まず２つのサンプルを最初の流路合流部において混合し、その混合液が送液される排出路が再び次の流路合流部の導入路となって、３つ目のサンプルと混合することができる。このように順次サンプルを混合することで、本発明では１つのマイクロ流体チップ上で３つ以上のサンプルを均一に混合することも可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、複数のサンプルを送液可能な複数の導入路を備え、かつそれらの導入路が合流し、複数のサンプルが混合することで反応が進行するような系を備えたマイクロ流体チップにおいて、流路合流部の形状を流路合流部下流端を頂点とした概ね三角形状にすることにより、容易に複数のサンプルを均一に混合することが可能となった。特に、マイクロ流体チップの流路に導入した一定量のサンプル同士を、一定の割合で混合することが必要な場合、従来は送液するサンプルの液先端を揃える必要があったが、本発明によれば、送液するサンプルの液先端を厳密に揃えなくとも、先に到達したサンプル溶液が流路合流部で留まり、遅れて到達したサンプルと混合してから下流の流路へ流れていく。これにより、意図した反応試薬組成通りの混合が可能となり、マイクロ流体チップ上で行う各種化学反応の反応効率が向上すると期待できる。このような単純な機構で均一な混合が達成可能であるため、複雑な送液制御の必要がなくなるため装置の単純化や小型化、低コスト化に繋がり、マイクロ流体チップの応用が期待されているＰＯＣ分野への対応の可能性が向上した。また、本発明によるマイクロ流体混合器はサンプル量が微量である不連続流体の均一な混合を可能としており、臨床診断分野や分析分野への応用が可能となる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
【００２２】
さまざまな形状の流路合流部を備えたマイクロ流体チップにおける核酸増幅反応。
（１）図２の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）または（Ｅ）の形状の流路および流路合流部と、それぞれの導入路にサンプルを導入可能な導入口を有し、かつ、流路合流部からサンプルが送液される排出路を備えたアクリル樹脂製マイクロ流体チップと、ＴＲＣ反応（特許文献５および非特許文献１）に用いる試薬（基質試薬、酵素試薬、プライマー試薬、標的核酸溶液）を用意した。基質試薬と酵素試薬、およびプライマー試薬と標的核酸溶液を予め混合し、それぞれＡ液、Ｂ液とした。マイクロ流体チップの流路は幅、深さ共に３００μｍであり、全ての混合器の内容積は１２μｌである。
【００２３】
Ａ液
１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
３４ｍＭ  塩化マグネシウム
２ｍＭ  ＤＴＴ
０．４Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
７．２ｍＭ  ＩＴＰ
各６ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
４％  ソルビトール
０．２４ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
１１．３６Ｕ／μｌ  Ｔ７ＲＮＡポリメレース
０．５３Ｕ／μｌ  ＡＭＶ逆転写酵素
容量調整用蒸留水
Ｂ液
２２０ｍＭ  塩化カリウム
２．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）
２．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）
０．３２μＭの第三のオリゴヌクレオチド（３’末端をアミノ基修飾）
２０．８％  ＤＭＳＯ
１０００コピー／１５μｌ  標準ＲＮＡ
容量調整用蒸留水
（２）使用した標準ＲＮＡは、ｍｅｃＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素ＰＢＰ２’遺伝子配列（非特許文献２参照）を含む２１８３塩基のＲＮＡ）。この標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１０００コピー／５μｌになるように調製しＲＮＡ試料とした。
（３）オリゴヌクレオチドの塩基配列
第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）
５’−ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＡ−３’
第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）
５’−ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ−３’
第三のオリゴヌクレオチド（３’末端をアミノ基修飾）
５’−ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  Ｔ−３’ＮＨ２
（４）先に調製したＡ液、Ｂ液を、それぞれ異なるサンプル導入口に５μｌずつ導入し、それぞれの導入口には、空気圧によりサンプルを送液するためにシリンジポンプを接続した。
（５）試薬導入後、４３℃に設定されたホットプレート上にマイクロ流体チップを乗せ、５分間放置して導入したサンプルおよびマイクロ流体チップが暖まるのを待った。
（６）毎分１０μｌの送液速度に設定したシリンジポンプを動作させ、導入口に導入した試薬を空気圧により送液した。Ａ液、Ｂ液が流路合流部で混合し、さらに下流の排出路に送液され、混合液の全量が流路合流部を通過後にシリンジポンプによる送液を一旦停止した。但し、（Ｅ）の流路合流部形状を有するマイクロ流体チップにおいては、混合液の全量が流路合流部の下流に設置された混合部を通過後に送液を停止した。この状態で２０分間放置し、ＴＲＣ反応を進行させた。
（７）２０分経過後、毎分５０μｌの送液速度に設定したシリンジポンプを動作させ、サンプル排出口からＡ液とＢ液の混合液を回収し、アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩで染色し、デンシトメーターでＲＮＡ増幅産物のバンド濃度を定量した。
【００２４】
図５に示したように、アガロースゲル電気泳動で増幅産物量を数値化した結果、流路合流部が（Ｂ）の形状であるマイクロ流体チップにおける増幅産物量は、概ね三角形状の流路混合部のない（Ａ）、（Ｄ）および（Ｅ）のマイクロ流体チップにおける増幅産物量よりも顕著に多く得られ、さらには、増幅産物量の再現性が高いことが分かった。また、（Ｄ）および（Ｅ）のように丸型の流路合流部または丸型の混合部を備えたものは、増幅産物量、再現性共に特徴的な流路合流部を備えていないマイクロ流体チップと同程度であった。また、Ａ液とＢ液の合流の際に、（Ｂ）の形状の流路合流部により顕著に気泡の混入が抑制され、均一に混合されている様子が観察された。これらのことから、流路合流部を（Ｂ）のような形状にすることにより、定量的に導入したＡ液とＢ液が均一に混合し易くなり、ＴＲＣ反応の成功率を向上させることが分かった。このように、ＴＲＣ反応に限らず、流路に導入した試薬をマイクロ流体チップ上で混合させることにより反応がスタートするような化学反応を行う際には、本発明により導入サンプルの均一な混合が達せられることにより、目的反応の反応効率を向上させることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】複数のサンプル導入口（２）、（３）とそこから延びる導入路（４）、それらの流路が合流する流路合流部（５）、さらに下流に排出路（６）と排出口（７）を有するマイクロ流体チップの模式図である。
【図２】流路合流部の拡大図であり、それぞれ以下のような特徴を示している。（Ａ）二本の流路が合流するＹ字型の流路合流部を有するＹ字流路（Ｂ）流路合流部が流路合流部下流端を頂点とする三角形状である流路（Ｃ）流路合流部が概ね三角形状であるが、底辺に角度を有するものであり、その角度θはθ’＜θ、かつ１５０°≦θ＜１８０°である流路（Ｄ）流路合流部が丸型の流路（Ｅ）流路合流部は（Ａ）と同様にＹ字型であるが、流路合流部の下流に丸型の混合部を有する流路（Ｆ）流路合流部が三角形状である流路（Ｇ）流路合流部が概ね三角形状であるが、頂点を形成する２辺が直線ではない流路（Ｈ）流路合流部が概ね三角形状であるが、底辺が送液方向に向かって凸な曲線である流路
【図３】Ｙ字流路（図２における（Ａ））における流路合流部での二液の合流の様子の模式図であり、二液の先端が揃って流路合流部に到達しなければ、図のように混合液に空気を挟み込むことを示している（時間の流れはＰｈａｓｅ１からＰｈａｓｅ４の方向である）。
【図４】流路合流部が流路合流部下流端を頂点とする三角形状（図２における（Ｂ））での二液の合流の様子の模式図である。このように二液の先端が揃っていなくても、先に到達したサンプルが流路合流部内に留まり、もう一方のサンプルが到達すると同時に二液が合流し、均一な混合液となり下流へと送液されることを示している（時間の流れはｐｈａｓｅ１からｐｈａｓｅ４の方向である）。なお、図２における（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）の形状の流路混合部でも同様の結果となる。
【図５】マイクロ流体チップ上でＴＲＣ反応を行った際のＲＮＡ増幅効率であって、流路合流部が三角形状であることにより増幅産物量が向上し、かつ再現性が向上していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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