(57)【要約】【課題】本発明は、微生物細胞を含有するか含有する可能性のある検体に対し染色試薬を用いて微生物細胞を検出する方法であり、従来から知られている方法と比較して生菌検出の過小評価を低減させ、正確性を向上させた微生物計量方法及び微生物計量装置を提供すること。【解決手段】死菌試薬に対して生死菌試薬を長波長側にすることを特徴としたものであり、蛍光クロストークによる生菌の過小評価を低減し、正確性を向上させた微生物計量方法および微生物計量装置１を提供することができる。【選択図】図１
2006333812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を染色試薬を用いて染色させ、染色された微生物を検出する方法において、生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出することを特徴とする微生物計量方法。
【請求項２】
微生物を含む検体をフィルタ上に捕捉し、そのフィルタ上の微生物を検出することを特徴とする請求項１記載の微生物計量方法。
【請求項３】
第１の染色試薬および第２の染色試薬を菌または微生物を捕捉したフィルタ上に滴下した後、ろ過することを特徴とする請求項１または２記載の微生物計量方法。
【請求項４】
第１の染色試薬および第２の染色試薬に乾燥防止剤を混合させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物計量方法。
【請求項５】
生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、発色した微生物の波長差および蛍光発色量より微生物を計量する微生物計量装置。
【請求項６】
第２の染色試薬が青色の励起光で発色することを特徴とする請求項５記載の微生物計量装置。
【請求項７】
第１の染色試薬および第２の染色試薬が核酸結合性の化合物であることを特徴とする請求項５または６に記載の微生物計量装置。
【請求項８】
染色された微生物が捕捉されているフィルタ面に一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する１つまたは複数の光源と、前記フィルタ面の一定面積の一部または全ての部分で前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内で、かつ設定した面積の範囲内のときに微生物と判断する微生物判断手段と、前記一定面積を前記フィルタまたは光源または受光手段を連続的あるいは断続的に移動させ、前記フィルタ面の測定に必要な面積を移動させる移動手段と、微生物判断手段によって０．２〜７μｍの大きさであると判断されたものを微生物１個と判断し、その判断した信号を積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する積算手段を有する請求項５〜７のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項９】
染色試薬により発色し、微生物判断手段によって微生物と判断された発色点のうち、設定されたしきい値によって大きさを判断し、大きさによって微生物の種類を分類することを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項１０】
微生物判断手段によって微生物と判断された１つ以上の染色試薬により発色した発色点のうち、第１の染色試薬で発色した発色点が、第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌と判断することを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項１１】
微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、第１の染色試薬で発色した発色点が、第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌として判断する装置において、前記第１の染色試薬および第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えることによって一致させることを特徴とする請求項５〜１０のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項１２】
微生物計量装置において、第１の染色試薬および第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えるとき、初めに補正値を算出し、この値を与えた後に画像化することを特徴とする請求項５〜１１のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項１３】
微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、第１の染色試薬で発色した発色点が、第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌として判断する装置において、第１の染色試薬および第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減する光学手段を有する請求項５〜１０のいずれかに記載の微生物計量装置。
【請求項１４】
微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、第１の染色試薬で発色した発色点が、第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌として判断する装置において、フィルタ面上の発色点を拡大する手段と平行光束を得るための光学手段を備え、あらかじめ定められた波長域の光を分光するための分光手段を平行光束領域に備えることで、前記第１の染色試薬および第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減することを特徴とする請求項５〜１０あるいは１３のいずれかに記載の微生物計量装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を含有するか含有する可能性のある検体に対し蛍光色素を用いて微生物を検出する方法であり、従来から知られている方法と比較してノイズを低減させて正確性を増加させることができる方法および微生物計量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光色素を用いて微生物を検出する手段として、特許文献１に示されたような、生菌染色用の蛍光色素と、死菌染色用の蛍光色素により微生物を染色し、得られた発光物の放つ２種類の蛍光波長域における蛍光強度比から、生菌、死菌を検出する方法が提案されている。これは、生菌を染色する蛍光色素として、エステラーゼ活性をもつ微生物を染色する色素（例えばカルセインＡＭなど）由来の緑色蛍光と、死菌を染色する蛍光色素として、ヨウ化プロピジウム由来の赤色蛍光をフローサイトメトリーにより検出し、発光物のもつ緑色蛍光の強度と、赤色蛍光の強度をそれぞれ検出し、蛍光強度比から、該発光物が生菌か、死菌かを判定するというものである。
【０００３】
また、蛍光色素の２重染色を用いて微生物を検出する手段として、非特許文献１に示されているような選択的に細胞膜の膜透過性を調製した核酸染色色素を利用した、微生物検出方法が提案されている。これは、生菌および死菌の細胞膜に対して選択的に透過性を与えられたモノメチン架橋非対称シアニン色素の一例である色素と、生菌の細胞膜に対して不透過性を示すヨウ化プロピジウムによるものであるが、６２６頁および６２７頁の本文中、及びＦｉｇｕｒｅ１５．３９に示される通り、大腸菌生菌の細胞膜に対して、イソプロピルアルコールを用いて殺菌したものを、大腸菌の生菌が含まれる液体試料に適当な割合で混合し、染色したものを、蛍光分光光度計にて蛍光スペクトルを測定したものである。
【０００４】
この方法によると、モノメチン架橋非対称シアニン色素の蛍光波長による緑色蛍光は、含まれる生菌の割合と共に減少し、一方でヨウ化プロピジウムによる赤色蛍光が増加している。この方法により、生菌および死菌を標識することができるというものである。
【特許文献１】特開平１１−１４６７９８号公報
【非特許文献１】Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  Ｈａｕｇｌａｎｄ著  「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  社出版、２００２年、６２６−６２７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１、非特許文献１に記載されている微生物計量方法によって、かならずしも満足する成果を得られるわけではない。これらは、いずれも生死菌ないし生菌の蛍光波長が緑色であり、死菌の蛍光波長が赤色であるために、蛍光色素の特性から、緑色蛍光の蛍光スペクトルの一部が長波長側の赤色蛍光の波長域と重なる現象、いわゆる蛍光のクロストークが見られ、緑色蛍光のみであっても赤色蛍光を誤って検出してしまう可能性があり、その結果生菌数を過小評価してしまい、生菌数を正確に計測できない恐れがあるためである。また、微生物ごとの染色試薬に対する感受性の差によっては、ある種の微生物で一方の染色試薬に対する発色が強い場合、このような写り込みが見られやすい菌種となり、未知試料においてこのような菌の種類が混在していた場合に、生菌計量の精度が得にくく、安定した生菌検出結果が得られない恐れがある。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、生菌を含有するか含有する可能性のある検体から蛍光色素を用いて微生物を検出する方法であって、従来から知られている方法のような写り込みによる悪影響を排し、正確な生菌の検出を行うことができる方法および微生物検出装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の微生物検出方法は、上記目的を達成するために、請求項１記載の通り微生物を染色試薬を用いて染色させ、染色された微生物を検出する方法において、生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出することを特徴としたものであり、蛍光強度の写りこみの影響を受ける長波長側を生死菌染色色素とすることで、生菌数の過小評価を防ぎ、生菌数検出精度が向上し、安定した計測結果を得ることができる。
【０００８】
また、請求項２記載の微生物計量方法は、請求項１記載の微生物計量方法において、微生物を含む検体をフィルタ上に捕捉し、そのフィルタ上の微生物を検出することを特徴としたものであり、ろ過という手法を用いることで検体量にかかわらず計測範囲を一定とすることができるだけでなく、検体中に含まれる染色阻害成分の影響を除去することができるため、安定した計測を実現することができる。
【０００９】
また、請求項３記載の微生物計量方法は、請求項１または２記載の微生物計量方法において、前記第１の染色試薬および前記第２の染色試薬を菌または微生物を捕捉したフィルタ上に滴下した後、ろ過することを特徴としたものであり、染色工程を簡便かつ迅速に行うことができる。
【００１０】
また、請求項４記載の微生物計量方法は、請求項１〜３いずれかに記載の微生物計量方法において、前記第１の染色試薬および前記第２の染色試薬に乾燥防止剤を混合させることを特徴としたものであり、染色色素の褪色による計測の不安定さを軽減し、高い検出精度を維持することができる。
【００１１】
また、請求項５記載の微生物計量装置は、生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、発色した微生物の波長差および蛍光発色量より菌を計量することを特徴としたものであり、励起光源と受光手段を含む構成によって染色試薬の波長と発色量とを検出することで、高感度な計量装置を提供することができる。
【００１２】
また、請求項６記載の微生物計量装置は、請求項５記載の微生物計量装置において、第２の染色試薬が青色の励起光で発色することを特徴としたものであり、自家蛍光とのＳＮ比が高い青色励起の波長域を用いることによって、高感度に微生物を計量することができる。
【００１３】
また、請求項７記載の微生物計量装置は、請求項５または６記載の微生物計量装置において、前記第１の染色試薬、第２の染色試薬が核酸結合性の化合物であることを特徴したものであり、酵素活性のような微生物種による感受性の差が少ないため、未知試料などを過小評価することなく、安定した計測を提供することができる。
【００１４】
また、請求項８記載の微生物計量装置は、請求項５〜７いずれかに記載の微生物計量装置において、染色された微生物が捕捉されているフィルタ面に一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する１つまたは複数の光源と、前記フィルタ面の一定面積の一部または全ての部分で前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内で、かつ設定した面積の範囲内のときに微生物と判断する微生物判断手段と、前記一定面積を前記フィルタまたは光源または受光手段を連続的あるいは断続的に移動させ、前記フィルタ面の測定に必要な面積を移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさであると判断したものを微生物１個と判断し、その判断した信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有することを特徴としたものであり、前記フィルタ上に含まれる微生物の生死状態および／または数若しくは有無を同時に、かつ迅速に把握することができ、励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による化合物の褪色を抑えることができるものである。さらに蛍光強度のしきい値を設けることで微生物と異物の区別が可能であり、一定面積に含まれる微生物の数量の計量を迅速かつ同時に行うことができる微生物計量装置が得られる。
【００１５】
また、請求項９記載の微生物計量装置は、請求項５〜８いずれかに記載の微生物計量装置において、前記染色試薬により発色し、前記微生物判断手段によって微生物と判断された発色点のうち、設定されたしきい値によって大きさを判断し、大きさによって微生物の種類を分類することを特徴としたものであり、細菌と酵母のように、大きさの異なる菌種ごとに計数することで、一度により詳細な情報を得ることが可能となり、菌種ごとに必要な検査に要する時間を短縮でき、コストを削減することができる。
【００１６】
また、請求項１０記載の微生物計量装置は、請求項５〜９いずれかに記載の微生物計量装置において、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌とする判断手段を有することを特徴としたものであり、前記第１、第２の発光点を照合することで、それぞれの波長域に含まれるノイズの加算による数の不安定性を軽減し、検出精度を高めることができる。
【００１７】
また、請求項１１記載の微生物計量装置は、請求項５〜１０いずれかに記載の微生物計量装置において、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌として判断する装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えることによって一致させることを特徴としたものであり、前記第１、第２の染色試薬それぞれの発光点を含む２つの画像の間に存在する機械的な誤差に由来する座標の誤差を補正するための手段として、画像の発光点をそれぞれ検出した後、それらを比較することで、最適な補正値を算出し、発光点を照合することができ、簡易的な装置構成で高精度な測定を実現することができる。
【００１８】
また、請求項１２記載の微生物計量装置は、請求項５〜１１いずれかに記載の微生物計量装置において、前記微生物計量装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えるとき、初めに補正値を算出し、この値を与えた後に画像化することを特徴としたものであり、発光点の照合に必要な最低限の処理時間のみで、高精度な計測を行うことができ、迅速な測定を実現することができる。
【００１９】
また、請求項１３記載の微生物計量装置は、請求項５〜１０いずれかに記載の微生物計量装置において、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発色点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌として判断する装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減する光学手段を有するものであり、機械的に誤差を低減させる機構を持たせることで、画像処理を簡略化することができ、画像処理にかかる時間、画像処理ソフトを開発する時間を短縮することができ、迅速化および低コストな開発を行うことができる。
【００２０】
また、請求項１４記載の微生物計量装置は、請求項５〜１０あるいは１３いずれかに記載の微生物計量装置において、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌として判断する装置において、フィルタ面上の発光点を拡大する手段と平行光束を得るための光学手段を備え、あらかじめ定められた波長域の光を分光するための分光手段を平行光束領域に備えることで、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減することを特徴としたものであり、前記第１の染色試薬、第２の染色試薬に由来する発光点の照合のための画像処理にかかる時間を必要とせず、より短時間で高精度な測定を実現することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の微生物計量方法および微生物計量装置によれば、生死菌を染色するための第１の染色試薬と、死菌を染色するための第２の染色試薬において、第１の染色試薬を第２の染色試薬よりも、長波長側のものを使用することにより、短波長側の蛍光強度の長波長側への写りこみによる検出精度の低下、生菌数の過小評価をすることなく、正確な測定により安定した計測結果を得ることができる微生物計量方法、微生物計量装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の請求項１記載の発明は、微生物を染色試薬を用いて染色させ、染色された微生物を検出する方法において、生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出することを特徴としたものであり、蛍光クロストークによる短波長側の染色試薬の長波長側への写りこみの影響を考慮して、短波長側に死菌染色試薬、長波長側を生死菌染色試薬としている。このように死菌の蛍光発光を生死菌側に写りこませる方向にすることで、生菌、死菌の判別に正確性を持たせることができ、菌数計量への影響を根本的に無くし、計量が安定化するという作用を有する。
【００２３】
また、請求項２記載の発明は、微生物を含む検体をフィルタ上に捕捉し、そのフィルタ上の微生物を検出することを特徴としたものであり、該微生物捕捉用フィルタにろ過可能な量の範囲内において変わらずに測定することができ、また検体中に含まれる染色阻害成分の影響を除去することができるため、安定した染色を行うことができ、安定したサンプリング、染色方法を得ることができ、安定した計測を行うことができるという作用を有する。
【００２４】
また、請求項３記載の発明は、前記第１の染色試薬および前記第２の染色試薬を菌または微生物を捕捉したフィルタ上に滴下した後、ろ過することを特徴としたものであり、染色工程を簡便化でき、誰でも容易に扱える汎用的な手法を提供することで、本方法を普及させることができるという作用を有する。
【００２５】
また、請求項４記載の発明は、前記第１の染色試薬および前記第２の染色試薬に乾燥防止剤を混合させることを特徴としたものであり、染色色素の乾燥による褪色を防止することができ、微生物による発光強度の変動を減少させ、微生物の検出、計量の不安定さを軽減し、高い検出精度が得られるという作用を有する。
【００２６】
また、請求項５記載の発明は、生死菌のいずれとも反応して生死菌のいずれをも発色させる第１の染色試薬と、死菌とのみ反応して死菌のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の染色試薬とを同時に微生物に接触させ、前記第１の染色試薬は前記第２の染色試薬よりも長い励起波長で発色し、その波長差および発色量の差から生菌と死菌の両方を同時検出するための装置で、光源と受光手段を設け、発色した微生物の波長差および蛍光発色量より微生物を計量することを特徴としたものであり、微生物を高精度で判別、計量することができ、必要最低限の構成とすることで、小型、低コストな装置を提供することができるという作用を有する。
【００２７】
また、請求項６記載の発明は、第２の染色試薬が青色の励起光で発色することを特徴としたものであり、紫外励起などと比較して自家蛍光とのＳＮ比が高い青色励起の波長域を用いることによって、高感度な計量を行うことができるという作用を有する。また第１の染色試薬を長波長側に設定してもオレンジ〜赤色の可視光領域とすることができ、青色励起の染色試薬と波長の差を与えることが容易で、生菌、死菌の判別を精度よく行うことができるという作用を有する。
【００２８】
また、請求項７記載の発明は、前記第１、第２の染色試薬が核酸結合性の化合物であることを特徴したものであり、細胞内に保持されている酵素を指標とするような手法のように微生物種や環境による感受性の差が少ないため、未知試料などを過小評価することなく、安定して染色を行うことができるという作用を有する。
【００２９】
また、請求項８記載の発明は、染色された微生物が捕捉されているフィルタ面に一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する１つまたは複数の光源と、前記フィルタ面の一定面積の一部または全ての部分で前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内で、かつ設定した面積の範囲内のときに微生物と判断する微生物判断手段と、前記一定面積を前記フィルタまたは光源または受光手段を連続的あるいは断続的に移動させ、前記フィルタ面の測定に必要な面積を移動させる移動手段と、微生物判断手段から０．２〜７μｍの大きさであると判断したものを微生物１個と判断し、その判断した信号を順次積算することで前記検体接触手段の微生物の数量を積算する手段を有することを特徴としたものであり、前記フィルタ上に含まれる微生物の生死状態、数若しくは有無を同時に、かつ迅速に計量ことができるという作用を有する。また励起光の照射面積及び時間を最小限にすることで励起光による染色試薬の光褪色を抑えることで、発光強度の検出を安定して行うことができるという作用を有する。さらに蛍光強度のしきい値を設けることで微生物と異物の区別を行う方法を提供し、一定面積に含まれる微生物の計量を高精度、迅速に行う装置を提供することができるという作用を有する。
【００３０】
また、請求項９記載の発明は、前記染色試薬により発色し、前記微生物判断手段によって微生物と判断された発色点のうち、設定されたしきい値によって大きさを判断し、大きさによって微生物の種類を分類することを特徴としたものであり、細菌と酵母のように、大きさの異なる菌種ごとに計数することで、一度に詳細な情報を得ることが可能で、より複雑な情報を提供することができるという作用を有する。また、菌種ごとに必要となる検査時間を短縮できるため、測定時間の短縮と、測定の低コスト化を図ることができるという作用を有する。
【００３１】
また、請求項１０記載の発明は、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌とする判断手段を有することを特徴としたものであり、前記第１、第２の発光点を照合する手段によって、微生物一つ一つがどのような発光を示すかを正確に検出することができ、さらにそれぞれの波長域に含まれるノイズの加算による数の不安定性を軽減し、検出精度を高めることができるという作用を有する。
【００３２】
また、請求項１１記載の発明は、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌として判断する装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えることによって一致させることを特徴としたものであり、前記第１、第２の染色試薬それぞれの発光点を含む２つの画像の間に存在する機械的な誤差に由来する座標のずれによる微生物一つ一つの発光状態の測定を困難とする要因を解決することができ、ソフト上での処理であるため、大掛かりな計量装置でなくとも、発光点を正確に照合することができ、小型、低コストな装置構成で高精度な測定を実現することができるという作用を有する。
【００３３】
また、請求項１２記載の発明は、前記微生物計量装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を、いずれか一方に補正値を与えるとき、初めに補正値を算出し、この値を与えた後に画像化することを特徴としたものであり、全ての画像の座標を求めることによる画像情報の巨大化と、発光点の照合に必要となる処理時間を短縮することができ、高精度で迅速に行うことができるという作用を有する。
【００３４】
また、請求項１３記載の発明は、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発色点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発色点を生菌として判断する装置において、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減する光学手段を有するものであり、装置側で誤差を低減させる機構を持たせることで、ソフトによる画像処理を簡略化することができ、画像処理にかかる時間を短縮し、測定を迅速に行うことができるという作用を有する。また画像処理ソフトを開発する時間を短縮することができるため、開発コストを少なくすることができるという作用を有する。
【００３５】
また、請求項１４記載の発明は、前記微生物判断手段で微生物と判断された１つ以上の発色点のうち、前記第１の染色試薬で発色した発光点が、前記第２の染色試薬で発色していないときにその発光点を生菌として判断する装置において、フィルタ面上の発光点を拡大する手段と平行光束を得るための光学手段を備え、あらかじめ定められた波長域の光を分光するための分光手段を平行光束領域に備えることで、前記第１、第２の染色試薬による発色点の座標の差を低減することを特徴としたものであり、前記第１、第２の染色試薬による各画像に含まれる発光点の照合のための画像処理にかかる時間を必要とせず、高精度な測定をより迅速に行うことができるという作用を有する。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
まず、検体接触手段である微生物採取用フィルタの上方から液体試料を吸引してろ過し、フィルタ表面に微生物細胞を２次元的に捕捉する。本発明において菌を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水や燐酸緩衝液などに遊離させて液状検体とする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体を微生物採取用フィルタで吸引濾過することでフィルタ上に菌を捕捉することができる。
【００３８】
次に乾燥防止成分を混合し、生死菌染色試薬または死菌染色試薬のいずれか、または両方を一定濃度含む染色試薬をフィルタ表面に０．１〜１ｍｌ程度の一定量を滴下する。
【００３９】
蛍光の染色試薬には、核酸結合性の化合物が好ましく、生死菌試薬として、オレンジ色から赤色の蛍光を発するもので、例えばヨウ化ヘキシジウム、ＬＤＳ−７５１や、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ８３、ＳＹＴＯ８４、ＳＹＴＯ８５などのトリメチン架橋非対称シアニン色素系化合物が使用できる。また、死菌試薬としては、青色から緑色蛍光を発するもので、例えばアクリジン２量体、チアゾールオレンジ２量体、オキサゾールイエロー２量体などのモノメチン架橋非対称シアニン色素２量体や、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−１などのモノメチン架橋非対称シアニン色素系化合物などが使用できる。
【００４０】
なお、２種類以上の異なる染色試薬は、微生物を含む試料に対して、あらかじめ０．１から１００μＭとなるようを混合しておき、同時に作用させるか、もしくは別々に、時間を置かず、もしくは適当な時間間隔を開けて作用させることとする。
【００４１】
なお、微生物採取用フィルタ上に捕捉した菌を含む物質表面が、測定中に乾燥し、発光強度が変化することを防ぐための手段として、染色試薬には１０から６０％ｗ／ｖのグリセロールや、１から１０％ｗ／ｖのポリビニルアルコール、１０から９０％ｖ／ｖのプロピレングリコールやエチレングリコール、またはＤ（−）−マンニトールやＤ−ソルビトールなどの成分のいずれかを１種類以上混合させておく。
【００４２】
なお、微生物採取用フィルタとしては、例えば、孔径が０．２μｍ〜１μｍの公知のものを用いることができる。
【００４３】
蛍光染色された生菌が展開されているフィルタに対し、集光レンズなどを用いて、照射範囲が、例えば直径が３ｍｍ程度の一定面積となるよう励起光を照射し、発光点を得る。
【００４４】
この操作は、例えば、トリメチン架橋非対称シアニン色素の場合には、波長が５４０ｎｍから６１０ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長が５６０ｎｍから６３０ｎｍ付近の蛍光を発し、またモノメチン架橋非対称シアニン色素は波長が４８０ｎｍから５１０ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長が５１０ｎｍから５４０ｎｍ付近の蛍光を発する。
【００４５】
そのため励起光源としては発光ダイオードの場合、青色のものでは、好ましくは４８０ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３５ｎｍ付近の波長を発することができるもの、黄色のものでは、好ましくは５６０ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。
【００４６】
また、固体レーザーを用いる場合には、青色のものでは、好ましくは４７５ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３５ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。
【００４７】
また、ハロゲンランプや水銀ランプを使用する場合には、適当な分光フィルタとして、染色試薬の励起波長に合わせて最適なバンドパスフィルタ等を使用することができる。また、０．１から１０ｎｍの波長分解能を有する反射型や透過型の回折格子により、最適な角度を与え、任意の波長を含む励起光を取り出すことができる。
【００４８】
また蛍光フィルタとしては、緑色のものでは、好ましくは５１０ｎｍから５４０ｎｍまでの範囲に透過性能をもつもの、オレンジ色では、好ましくは５８０ｎｍから６１０ｎｍまでの範囲に透過性能をもつもの、赤色では５９０ｎｍから６３０ｎｍまでの範囲に透過性能をもつものをそれぞれ使用する。当該蛍光は拡大レンズ系を通し、光電変換素子であるＣＣＤカメラを用いて露光時間０．１秒から１０秒程度の露光時間で画像撮影することにより取得される。
【００４９】
これらの操作により取得された蛍光画像は、生菌の蛍光由来による発光点を含むものであるが、これらの発光点は微生物判断手段によってあらかじめ設定されたしきい値により、適切な発光強度をもち、細菌や真菌などの微生物の大きさに基づいて設定した場合、直径が０．２から７μｍの大きさであると判断されたものを微生物１個であるとして抽出され、個数を積算して計量する手段によって微生物数が求められる。微生物以外の不純物は、蛍光を発しないが、励起光の散乱光など発し、受光時に影響を受けることがあるため、受光した光量がある一定値以上を示した場合を微生物と判断する。また、不純物の種類によっては微生物以上の蛍光を発する場合も想定されるため、設定した光量の範囲内のときに微生物と判断させ、基本的には、範囲内の光量を受光した場合を１個の微生物として計量する。
【００５０】
なお、染色試薬の発色は蛍光とすることで、高感度に検出することが可能となり、微小な検体も高感度に検出することができる。
【００５１】
なお、これらの画像取得操作は、染色試薬ごとに行われ、生死菌画像、死菌画像をそれぞれ取得するものであり、励起光を照射する微小面積を連続的あるいは断続的に移動させて行われる。これらの移動には例えば、モーターとベルト、ギア、位置センサを組み合わせたような移動手段を用いて行われる。
【００５２】
また、受光手段に含まれる複数の光電変換素子を線状に配置することによってＸ軸方向（配列方向）への移動を不要なものとし、Ｙ軸方向（移動方向）のみの移動によって一定範囲の検知を実施することが可能となり、計量を迅速に実施することもできる。受光手段としては目的の波長の光を受光できれば良く、受光フィルタ、光電変換素子等がある。
【００５３】
なお、得られた生死菌画像と同位置の死菌画像にそれぞれ含まれる発光点を照合することで、発光点が生菌か死菌かを判断し、それぞれ数を求めて積算し、計量していくものである。
【００５４】
これにより、もとの微生物試料に含まれていた微生物の生菌数および死菌数を計量することができるのである。
【００５５】
また、第１、第２の染色試薬に含まれる化合物は、できるだけ無害な試薬を選定することとする。本微生物計量装置は主に食品工場などで使用させることが多く、検体の対象が調理器具などの場合、例え無害であっても、その試薬を含んだ検体接触手段を接触させるのは、衛生上好ましくない。また、試薬の特性によっては励起光に照射する直前に検体に反応させた方が望ましい場合もあり、第１、第２の染色試薬に含まれる化合物は、綿棒や検体接触手段とは別に、容器に貯蔵し、フィルタ上には計測する直前に添加した方が良い場合がある。本観点を踏まえた上で、例えば、生死菌染色試薬には生死菌の細胞膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つであるＳＹＴＯ８２を使用し、フィルタ部分と接し、別に設けられた検体試薬含有部からフィルタ上に採取された微生物に浸透させるという方法が考えられる。また、同時に死菌の細胞膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合する試薬の一つであるＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎを用いて二重染色する場合にも同様である。それぞれに特異的な波長の励起光を照射して発色させることで採取された微生物の生死を判定することができる。
【００５６】
また、フィルタ上に含まれる微生物から得られた信号を、二値化した点座標として認識し、微生物判断手段であるマイコン等と接続して使用される外部操作端末などによって得られた点座標の数を検出、積算することにより、検体接触手段に含まれる微生物を容易にかつ迅速に計量することができる。また、近隣した信号を一つの信号と認識することで培養法との相関性を高めることができる。さらに近隣した信号から検体接触手段に付着した付着物の形状を把握することができ、微生物以外の形状のものは計量から除去することが可能となり、精度を向上することができる。
【００５７】
図１は、本発明の微生物計量方法を好適に実施するための微生物計量装置の一態様を示す概念図である。この微生物計量装置１は、光源３、光源集光手段としての集光レンズ５、受光部１０を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光は集光レンズ５を経て検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２（別途の操作によりフィルタ上に染色された菌を捕捉してあるもの）上に集光される。光源３から発せられた励起光は、集光レンズ５によって集光されるが、その際、集光レンズ５によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。ここで、微小な一定面積とは、微生物の大きさとして０．２から７μｍとしたものに基づいて設定した場合、直径１ｍｍ程度の範囲を指し示す。励起光を照射する範囲（微小な一定面積）は、フィルタ上をモーター１２、ベルト１３などからなる移動手段により連続的にまたは断続的に移動させられる。励起光により生菌が発する蛍光は、受光部１０に到達する。さらに目的の蛍光のみを取り出すための蛍光分光フィルタ８とレンズ７を経て、受光部１０に内蔵された光電変換素子９に到達し、信号化される。これにより得られた信号は画像化され、微生物判断手段である演算部１１によって画像処理される。演算部１１、すなわち微生物判断手段としては、詳細は図２に示されるような手順による画像処理をプログラミングされたマイコン等であり、外部接続した端末などによって操作されるソフトウェアと通信して使用されるものも該当する。
【００５８】
図２（ａ）は生死菌画像、（ｂ）は死菌画像、（ｃ）はその生菌、死菌判定結果をそれぞれ示す概念図である。生死菌画像に含まれるそれぞれの発色点ａからｃまで１４、１５、１６と、死菌画像に含まれる発色点ＡからＣまで１７、１８、１９が図のように示される。このとき、１４と１６、１５と１８、１６と１９とがそれぞれ座標ずれ（ｘ、ｙ）を値として持つとする。このとき、補正値は（−ｘ、―ｙ）として算出され、１７、１８、１９の座標の値に演算される。これにより、１４、１５、１６と１７、１８、１９とはそれぞれ同一の発光点を示すものであることがわかり、そのうち死菌画像では発光輝度が低い１８の発光点が生菌、どちらも発光している１７、１９は死菌として検出し、個数を求めて積算し、計量する。これにより、生菌数および死菌数を求めることができるのである。
【００５９】
（実施の形態２）
図３は、本発明の微生物計量方法を好適に実施するための微生物計量装置の別の一態様を示す概念図である。この微生物計量装置２０は、光源３、光源集光手段としての集光レンズ５、受光部１０を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光される。励起光は集光レンズ５を経て検査台６にセットされた微生物採取用フィルタ２（別途の操作によりフィルタ上に染色された菌を捕捉してあるもの）上に集光される。励起光により微生物が発する蛍光は、拡大手段であるレンズユニット２１を介して拡大され、２次元の位置情報を保持したまま平行光束となる。ここで蛍光は、目的の波長のみを取り出すために蛍光分光フィルタユニット２２を経て、コリメータレンズ２３により結像され、その場所に設置された光電変換素子９に到達し、信号化される。これにより得られた信号は画像化され、演算部１１によって画像処理を経て生菌および死菌の発光を示す発光点を検出し、数を計量する。これにより、生菌数を求めることができるのである。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００６１】
実施例１：本発明の微生物計量法について
１つの前培養した大腸菌をろ過滅菌蒸留水などに懸濁し、液体試料を調製した。液状検体を孔径が０．４５μｍの微生物採取用メンブレンフィルタに、マニホールドを用いて吸引濾過し、フィルタ上に大腸菌を捕捉した。
【００６２】
濃度５μＭのＳＹＴＯ８２を含む第１の染色試薬と、５μＭのＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎを含む第２の染色試薬がある。これらはともに５０％ｗ／ｖグリセロールの混合水溶液に調製されたものである。まず第１の染色試薬をメンブレンフィルタ上に滴下し、室温にて５分間染色する。再びメンブレンフィルタ上の余分な試薬を吸引ろ過してフィルタ上の液状成分を除去し、続いて第２の染色試薬をメンブレンフィルタ上に滴下し、室温にて５分間染色する。メンブレンフィルタ上の残存試薬は吸引ろ過染色により液状成分を完全に除去する。この微生物採取用フィルタ２を微生物計量装置１の検査台６にセットする。そして、演算器より微生物計量装置１に運転の指令を与えると微生物採取用フィルタ２をセットした検査台６は、集光レンズ５の下方に移動させられ、フィルタ上に励起光が照射され画像が撮影される。
【００６３】
図４は、死菌試薬であるＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎの死菌試薬の蛍光スペクトル２４と死菌試薬の蛍光分光フィルタ透過率２７、生死菌試薬であるＳＹＴＯ８２の生死菌試薬の蛍光スペクトル２５と生死菌試薬の蛍光分光フィルタ透過率２８、そしてＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎの蛍光強度がＳＹＴＯ８２の蛍光波長に写り込む加算分である死菌試薬の蛍光クロストークによる生死菌試薬への蛍光強度加算分２６を示したものである。このように死菌画像には、生死菌の写りこみを防ぐことができ、一方、生死菌画像では死菌試薬の写りこみによって、生死菌試薬の輝度に死菌試薬の写りこみ分の輝度が積算され、輝度が増加する。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、微生物を含んだ検体から染色試薬によって生菌および死菌を計量する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確かつ安定性を併せ持たせた微生物の計量を行うことができる方法および微生物計量装置を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の実施の形態１の微生物計量装置を示す概念図
【図２】本発明の実施の形態１の微生物計量装置で取得された生死菌画像、死菌画像、生菌、死菌判別結果を示す概念図（（ａ）生死菌画像（ｂ）同死菌画像（ｃ）同生菌、死菌判別結果）
【図３】本発明の実施の形態２の微生物計量装置を示す概念図
【図４】本発明の実施例１の染色試薬と蛍光分光フィルタの波長を示す図
【符号の説明】
【００６６】
１    微生物計量装置
２    微生物採取用フィルタ
３    光源
４    励起光分光フィルタ
５    集光レンズ
６    検査台
７    レンズ
８    蛍光分光フィルタ
９    光電変換素子
１０  受光部
１１  演算部
１２  モーター
１３  ベルト
１４  発色点ａ
１５  発色点ｂ
１６  発色点ｃ
１７  発色点Ａ
１８  発色点Ｂ
１９  発色点Ｃ
２０  微生物計量装置
２１  レンズユニット
２２  蛍光分光フィルタユニット
２３  コリメータレンズ
２４  死菌試薬の蛍光スペクトル
２５  生死菌試薬の蛍光スペクトル
２６  死菌試薬の蛍光クロストークによる生死菌試薬への蛍光強度加算分
２７  死菌試薬の蛍光分光フィルタ透過率
２８  生死菌試薬の蛍光分光フィルタ透過率
【図１】
2006333812.tif 000003
【図２】
2006333812.tif 000004
【図３】
2006333812.tif 000005
【図４】
2006333812.tif 000006