(57)【要約】      （修正有）【課題】COPDにおける最も重要な予後決定因子である体重減少に関連する遺伝子、および、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域に存在するCOPDにおける体重減少に関連する多型を見出すことを課題とする。【解決手段】上記の課題を解決するために、COPD患者における体重減少を起こす潜在的原因である慢性かつ全身性の炎症に関して、sPLA2の炎症誘発性特性に焦点を当て、グループIIサブファミリーsPLA2の遺伝子の周辺に12個の一塩基多型（SNP）を見出した。  次に、276人の男性COPD患者からのゲノムDNAを使用することにより、COPD患者における体重減少に、SNP10（NCBI SNPリファレンス：rs584367）が、COPD患者におけるBMIの減少に関連している感受性SNPであることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者について、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における変異を検出することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
【請求項２】
体重の減少が予後不良に繋がるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変異が、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に変異をもたらすものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
変異が一塩基多型変異である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
（ａ）被検者におけるPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における多型部位の塩基種を決定する工程。
（ｂ）（ａ）で決定された多型部位の塩基種において、変異が検出された場合に、被検者は慢性閉塞性肺疾患において体重が減少すると判定する工程。
【請求項６】
体重の減少が予後不良に繋がるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多型部位が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における7469位、10001位、または12420位のいずれかの多型部位である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
多型部位が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
塩基種の変異が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位において、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の塩基種が、CからTに変異したものである、請求項５から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
（ａ）被検者における、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異を検出する工程。
（ｂ）（ａ）の結果、タンパク質において変異が検出された場合に、被検者は慢性閉塞性肺疾患において体重が減少すると判定する工程。
【請求項１１】
体重の減少が予後不良に繋がるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質における変異が、アミノ酸置換を伴う変異である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質における変異が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異したものである、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
【請求項１６】
請求項７に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
【請求項１７】
請求項７に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質に結合する抗体を含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異したタンパク質。
【請求項１９】
体重の減少が予後不良に繋がるものである、請求項１５から１８のいずれかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患（以下COPDと表記することもある）における体重減少に関連する遺伝子、および、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNAに存在する、COPDにおける体重減少に関連する多型に関する。また、該多型を利用したCOPDにおいて体重が減少するか否か、すなわち体重減少に伴う予後不良の有無を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患は、世界中の疾病罹患率および死亡率のなかでも高い位置を占めている。The global burden of human illnessの最近の概説において、COPDは致死率、および生活の質を低下させる疾病として第12位にあり、2020年までには第5位に上昇すると予測されている（非特許文献１、２）。この致命的な疾患は、肺のみならず全身性にも重度の慢性炎症が起こることを特徴とする（非特許文献３〜７）。特に、慢性かつ全身性の炎症反応は、生存及び予後に対して重要な影響を及ぼす。進行したCOPDにおける特徴である、原因不明の体重減少（筋肉量減少、筋力低下、および脂肪組織枯渇）は、全身性炎症と関連していることが報告されている（非特許文献３〜１１）。この原因不明の体重減少は、気流閉塞の重症度とは無関係に、身体能力を制限し、生活の質を損ない、そして予後不良にいたらしめる最も重要な因子であるため、臨床的に重大な問題となっている（非特許文献１２、１３）。
【０００３】
COPD患者における慢性かつ全身性の炎症の存在の主な原因は、未だ解明されていない。近年の研究で、COPD患者における全身性の代謝異常と、循環血液中の多機能性サイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）-αのような炎症誘発性メディエーターのレベルの上昇の関係が証明されてきた（非特許文献３〜７）。TNF-α（cachexin）は、慢性消耗性疾患を有する他の悪液質患者と同様に、代謝およびタンパク質の代謝回転の加速と関連しており、骨格筋タンパク質の損失および脂肪組織消耗をもたらす（非特許文献３〜７、１４）。しかしながら、慢性喫煙がCOPDを引き起こすために必要であるが十分ではない要因であるのと同様に、COPD患者の全てが、疾患の進行過程で体重減少を示すわけではない（非特許文献１５）。実際、原因不明の体重減少の発症有病率は、重度のCOPDを有する患者において特に高く、これらの患者のおよそ50％であるが、軽度〜中等度のCOPD患者においてもおよそ10〜15％に見られる（非特許文献１５）。同様に、体重減少の基本メカニズムに関係していると考えられている全身性炎症プロファイルが、COPD患者の各個体で異なっていることや、またCOPD患者において循環血液中の炎症誘発性メディエーターのレベルが広範な分布で観察されることは、興味深い結果である（非特許文献３〜１１）。体重減少は、疾患の重症度（非特許文献１５）や表現型（非特許文献１６）に直結しており、COPDの発症が喫煙者の一部のみに発症する事が遺伝的要因（喫煙感受性遺伝子）の存在によって説明されているように、この重要なCOPDの予後決定因子である原因不明の体重減少もまた遺伝学的な要因（非特許文献１７、１８）によって説明される可能性を、本発明者らは検討した。体重減少過程に関与している可能性のある遺伝子は、これまでに解明されていない。
【０００４】
ホスホリパーゼA2（以下PLA2と表記することもある）は、リン脂質からのアラキドン酸（以下AAと表記することもある）を含む脂肪酸の動員を担う酵素である（非特許文献１９）。PLA2は、高分子量細胞質PLA2（以下cPLA2と表記することもある）と、低分子量分泌性PLA2（以下sPLA2と表記することもある）とに分類されている（非特許文献１９）。敗血症ショックおよび広範囲の熱傷のような全身性炎症性疾患（非特許文献２０、２１）、並びに慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような自己免疫疾患（非特許文献２２、２３）を有する患者の血漿には、大量のsPLA2が放出されることが報告されている。当初、これらの細胞外酵素は、炎症誘発性のプロスタグランジンおよびロイコトリエンへと後に変換され得るAAを放出することにより、炎症において重要な役割を果たすと考えられた。しかしながら、最近の研究では、sPLA2の炎症誘発効果が、AA代謝の開始に限定されないことが示唆されている。むしろ、高レベルの細胞外sPLA2に関連したいくつかの疾患は、TNF-αおよびIL-1βのような炎症誘発性サイトカインの血漿中又は組織中の濃度の有意な増加を特徴とする（非特許文献２４）。さらに、sPLA2は、炎症応答および免疫応答に関与している多様な細胞からの炎症誘発性サイトカインの脱顆粒および産生を、オートクライン機構により誘導することが報告されている（非特許文献１９、２４）。これらの効果は、酵素活性とは無関係のメカニズムにより発揮され、sPLA2に特異的な、または非特異的な膜受容体との相互作用によって媒介される（非特許文献２４）。従って、炎症誘発性サイトカインおよびsPLA2は互いに合成を増強し、それにより、炎症反応の伝播のための増幅回路を形成していると考えられる。
【０００５】
現在までに、10個のsPLA2アイソフォーム（IB、IIA、IIC、IID、IIE、IIF、III、V、X、およびXII）が哺乳動物において同定されている（非特許文献２５）。これらのアイソフォームは、グループIIIアイソフォームを除き、高度に保存された触媒部位、Ca2+結合ループを有し、14〜19kDaという共通の分子量を有する（非特許文献２５）。これらのsPLA2アイソフォームのうち、sPLA2-IIA、sPLA2-IIC、sPLA2-IID、sPLA2-IIE、sPLA2-IIF、およびsPLA2-Vは、同一の染色体遺伝子座（1p34〜p36）でクラスターを形成しており、これらはしばしばグループIIサブファミリーsPLA2と呼ばれる（非特許文献２５）。グループIIサブファミリーsPLA2の生物学的特徴は、sPLA2-IIC（ヒトにおける偽遺伝子）を除き、ほぼ全てのアイソフォームが、炎症過程および免疫過程に関連しているという点である（非特許文献２５）。
【０００６】
sPLA2の炎症誘発性特性が、COPD患者における体重減少にどのような影響を与えるかについては、これまで検討されてこなかった。
【０００７】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Murray CJL, et al. Science. 1996; 274:740-743.
【非特許文献２】Pauwels RA, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163: 1256-1276.
【非特許文献３】Oudijk EJ, et al. Eur Respir J. 2003; 46:5S-13S.
【非特許文献４】Gan WQ, et al. Thorax.2004; 59: 574-580.
【非特許文献５】Andreassen H, et al. Eur Respir J. 2003; 46: 2S-4S.
【非特許文献６】Wouters EF, et al. Chest. 2002; 121: 127S-130S.
【非特許文献７】Agusti AG, et al. Eur Respir J. 2003; 21: 347-360.
【非特許文献８】Vernooy JH, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2002; 166: 1218-1224.
【非特許文献９】Takabatake N, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163: 1314-1319.
【非特許文献１０】Takabatake N, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 1179-1184.
【非特許文献１１】Takabatake N, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 159: 1215-1219.
【非特許文献１２】Schols AM, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1791-1797.
【非特許文献１３】Landbo C, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1856-1861.
【非特許文献１４】Argiles JM, et al. FASEB J. 1997; 11:743-751.
【非特許文献１５】Schols AM, et al. Am Rev Respir Dis. 1993; 147: 1151-1156.
【非特許文献１６】Engelen MP, et al. Clin Nutr. 1999; 18: 275-280.
【非特許文献１７】Silverman EK, et al. Chest. 2000; 117: 273S-274S.
【非特許文献１８】Silverman EK, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1770-1778.
【非特許文献１９】Touqui L, et al. Curr Mol Med. 2001; 1: 739-754.
【非特許文献２０】Sorensen J, et al. Intensive Care Med. 1994; 20: 555-561.
【非特許文献２１】Nakae H, et al. Burns. 1995; 21: 422-426.
【非特許文献２２】Lin MK, et al. J Rheumatol. 1996; 23: 1162-1166.
【非特許文献２３】Haapamaki MM, et al. Scand J Clin Lab Invest. 1999; 59: 279-287.
【非特許文献２４】Granata F, et al. Int Arch Allergy Immunol. 2003; 131: 153-163.
【非特許文献２５】Murakami M, et al. J Biochem (Tokyo). 2002; 131: 285-292.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、COPDにおける体重減少に関連する遺伝子、および、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域に存在するCOPDにおける体重減少に関連する多型を見出すことにある。
さらに、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域に存在するCOPDにおける体重減少に関連する多型を指標とした、COPDにおいて体重が減少するか否かを予測判定する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、COPD患者における体重減少を起こす潜在的原因である慢性かつ全身性の炎症に関して、sPLA2の炎症誘発性特性に焦点を当てた。そして、核酸データベースを検索することにより、グループIIサブファミリーsPLA2の遺伝子の周辺に12個の一塩基多型（SNP）を見出した。
【００１０】
次に、本発明者らは、276人の男性COPD患者からのゲノムDNAを使用することにより、COPD患者における体重減少が、これらのSNPから生じるグループIIサブファミリーsPLA2の遺伝子の変換に起因するか否かを検証した。フィッシャーの直接法、ロジスティック回帰分析、およびANCOVAの全てが、SNP10（NCBI SNPリファレンス：rs584367、配列番号：１の10001位）とCOPD患者におけるBMI値の低下との間の統計的有意性を示したため、SNP10がCOPD患者におけるBMIの減少に関連している感受性SNPであることが示された。また、SNP10はsPLA2-IID遺伝子内のアミノ酸変化を引き起こす変異部位であるため、sPLA2-IIDがCOPD患者における体重減少の原因となる感受性遺伝子であることが示唆された。
【００１１】
即ち、本発明者らは、SNP10がCOPD患者におけるBMIの減少に関連している感受性SNPであり、COPD患者における体重減少がsPLA2-IIDの遺伝子の多型に起因することを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、より具体的には以下の（１）〜（１９）を提供するものである。
（１）被検者について、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における変異を検出することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
（２）体重の減少が予後不良に繋がるものである、（１）に記載の方法。
（３）変異が、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に変異をもたらすものである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）変異が一塩基多型変異である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
（ａ）被検者におけるPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における多型部位の塩基種を決定する工程。
（ｂ）（ａ）で決定された多型部位の塩基種において、変異が検出された場合に、被検者は慢性閉塞性肺疾患において体重が減少すると判定する工程。
（６）体重の減少が予後不良に繋がるものである、（５）に記載の方法。
（７）多型部位が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における7469位、10001位、または12420位のいずれかの多型部位である、（５）または（６）に記載の方法。
（８）多型部位が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位である、（５）または（６）に記載の方法。
（９）塩基種の変異が、PLA2G2D遺伝子領域上の部位において、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の塩基種が、CからTに変異したものである、（５）から（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法。
（ａ）被検者における、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異を検出する工程。
（ｂ）（ａ）の結果、タンパク質において変異が検出された場合に、被検者は慢性閉塞性肺疾患において体重が減少すると判定する工程。
（１１）体重の減少が予後不良に繋がるものである、請求項１０に記載の方法。
（１２）タンパク質における変異が、アミノ酸置換を伴う変異である、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）タンパク質における変異が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異したものである、（１０）から（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、（１）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）（７）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
（１６）（７）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
（１７）（７）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
（１８）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質に結合する抗体を含む、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤。
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異したタンパク質。
（１９）体重の減少が予後不良に繋がるものである、（１５）から（１８）のいずれかに記載の薬剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、COPDにおける体重減少に関連する遺伝子、および、該遺伝子上または該遺伝子の近傍DNA領域における変異を検出することにより、COPDにおいて体重が減少するか否か、すなわち体重減少に伴う予後不良を判定する方法が提供された。本発明の遺伝子上または該遺伝子の近傍DNA領域における多型を検出することで、当該COPD患者においてその後体重が減少するか否かが予測可能となる。本発明によりCOPDにおける体重減少に対する予防や治療における、より効率的な戦略（いわゆるオーダーメイド医療）を立てることが可能になる。具体的にはCOPDにおいて体重が減少するか否かを診断することにより、体重が減少すると判定、すなわち体重減少に伴う予後不良が予測された患者は検査の頻度を上げたり、栄養補助療法を強化したりといった治療方針を決める際の一助となりうるし、さらに体重減少を予防するような新たな治療薬の開発にもつながる可能性があり大いに期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らによって、COPDにおける体重減少に関連する遺伝子および多型が同定された。体重減少が起こるCOPD患者においては、有意にこれら遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域において変異が見出されることから、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における変異の有無を調べることにより、被検者のCOPD患者において体重が減少するか否かの判定を行うことが可能である。
【００１５】
本発明において、「体重が減少する」とは、BMI値の分布または変化を指標として表現することも可能である。BMI値が減少した場合に、体重が減少したものとみなすことが出来る。また、筋肉量減少、筋力低下、または脂肪組織枯渇のいずれかの理由によって、結果的に体重が減少する場合も、本発明の「体重が減少する」症状と同一のものであるとみなすことが出来る。
【００１６】
また、本発明の「体重減少」は、最も直接的に予後不良につながるものである。本発明において「予後不良」とは、最終的には余命の短縮を指す。COPDのうち、体重減少が認められる群（BMI値が減少している群）は、そうでないCOPD患者群に比較して明らかに生命予後が悪い。すなわち、残された平均余命が短いのである。文献によっても異なるが、その相対危険率は約２０倍にもなるという報告がある（Schols AM, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1791-1797.；Landbo C, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1856-1861.）。その原因としては主に肺炎などの下気道感染症などの易感染性、右心不全の増悪、低酸素等による致死的不整脈の合併、また呼吸不全そのものの増悪によるものなどが挙げられる。これら全ての合併症が、体重減少が認められる（BMI値が減少する）に従って発症頻度が上がり、結果的に体重減少が認められない群（BMI値が減少していない群）に比較して平均余命を有意、かつ明らかに短くすることが証明されている（Schols AM, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1791-1797.；Landbo C, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1856-1861.）。すなわち、体重減少という表現型が、合併症や呼吸不全そのものにより予後の不良に繋がる事を示す。
【００１７】
本発明者らによって、COPDにおける体重減少と関連することが見出された遺伝子は、sPLA2-IID遺伝子（GenBankアクセッション番号：NM_012400）内のPLA2G2Dである。
本遺伝子の塩基配列、および本遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、上記のGenBankのアクセッション番号から、容易に取得することが可能である。また当業者においては、上記の遺伝子表記（遺伝子名）を基に、公共の遺伝子データベースあるいは文献データベース等から遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を容易に入手することが可能である。
【００１８】
上記の知見に基づき、本発明は、被検者について、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における変異を検出することを特徴とする、COPDにおいて体重が減少するか否か、すなわち体重減少に伴う予後不良を判定する方法を提供する。
【００１９】
本発明において「COPDにおいて体重が減少するか否かを判定」とは、被検者のCOPD患者において体重が減少する可能性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域において変異が検出された場合に、被検者はCOPDにおいて体重減少する、あるいは体重減少する素因を有すると判定される。または、COPDにおける体重減少に対して抵抗性ではない、あるいは抵抗性の素因を有さないと判定される。
【００２０】
一方、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域において変異が検出されない場合に、被検者はCOPDにおける体重減少に対して抵抗性である、あるいは抵抗性の素因を有すると判定される。または、COPDにおいて体重減少しない、あるいは体重減少する素因を有さないと判定される。
【００２１】
本発明の方法により、COPDに羅患していない被検者であっても、COPDに羅患した場合にCOPDにおいて体重が減少する可能性が高いか低いかを判定することができる。また既にCOPDに羅患している被検者の場合は、体重減少が進行する可能性が高いか低いかを判定することができ、栄養補助療法などの治療方針の決定等に利用する事ができる。
【００２２】
なお、本明細書で用いられる「治療」とは、通常、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書における「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患の素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させることなどもこの「治療」に含まれる。
【００２３】
本発明のPLA2G2D遺伝子のDNA配列、および該遺伝子の近傍DNA配列としては、具体的には、例えば配列番号：１に記載の配列が挙げられる。配列番号：１に記載の配列は、mapping info(NCBI build34)の結果に基づいて作製した配列である。本発明における「遺伝子の近傍DNA領域」とは、通常、該遺伝子の近傍の染色体上の領域を指す。近傍とは、特に制限されるものではないが、通常、本発明の多型部位を含むDNA領域である。
【００２４】
上記本発明の検査方法における「変異」の位置は、予め規定することは困難であるが、通常、上記遺伝子のORF中、あるいは上記遺伝子の発現を制御する領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域等）中に存在するが、これらに限定されるものではない。また、この「変異」とは、上記遺伝子の発現量を変化させる、mRNAの安定性等の性質を変化させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を変化させるような変異であることが多いが、特に制限されない。本発明の変異としては、例えば、塩基の付加、欠失、置換、挿入変異等を挙げることができる。
【００２５】
本発明者らは、被検者における本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域において、COPDにおける体重減少に対して有意に関連する多型変異を見出すことに成功した。従って、本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の多型部位について変異の有無を指標とする（塩基種を決定する）ことにより、COPDにおいて体重減少するか否かの検査を行なうことが可能である。
【００２６】
なお、上記の「遺伝子の近傍DNA領域」とは、通常該遺伝子の近傍の染色体上の領域を指す。近傍とは特に制限されるものではないが、通常、本発明の多型部位を含むDNA領域であり、好ましくは多型部位または多型部位を含むＬＤブロック(連鎖不平衡ブロック)の末端部位から10kb以内の領域を指す。
【００２７】
前後10kbすなわち20kb以内の範囲にある多型は、Gabrielらの報告の通り、連鎖している可能性が高い（Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science 296, 2225-9. 2002）。
【００２８】
PLA2G2D遺伝子および該遺伝子の近傍のDNA配列の一例を配列番号：１に示す。
本発明の好ましい態様においては、本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における多型変異（多型部位における塩基種）を検出することを特徴とする、COPDにおいて体重減少するか否かを検査する方法である。
【００２９】
多型とは、遺伝学的には、人口中1%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されない。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられる。さらに、多型部位の数も、1個に限定されず、複数個の多型であってもよい。
【００３０】
また本発明は、被検者について、本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、COPDにおいて体重減少するか否かを検査する方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法において決定される「多型部位」は、本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域に存在する多型であれば、特に制限されない。具体的には、本発明のCOPDにおける体重減少するか否かの検査方法に利用可能な多型部位として、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における7469位、10001位、12420位のいずれかの多型部位を挙げることができる。（なお、本明細書においては、これらの多型部位を単に『本発明の多型部位』と記載する場合がある）。
【００３２】
本発明で試験されたsPLA2遺伝子中の12の多型を、以下の表１に示す。
【表１】
2006333811.tif 000002
略語の定義：NCBI=National Center for Biotechnology Information;
Gly=グリシン；Ser=セリン；sPLA2=分泌型フォスフォリパーゼA2
【００３３】
また、当業者においては掲載されたdbSNPデータベースのrs番号をもとに、当該部位についての塩基種の情報を適宜取得することができる。また、NCBI SNPリファレンス欄の記載内容は、先頭にrsが付くものはdbSNPデータベースの登録IDのうちNCBIにより一配列に一意に定まるIDを付与されたものである。また、dbSNPデータベースはウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html）に公開されており、NCBI SNPリファレンス欄に記載された登録ID番号を用いてウェブサイト上で検索することにより、塩基配列におけるSNPsの詳細な情報（例えば、染色体上の位置、多型部位の塩基の種類、前後の配列等）が入手できる。これらの情報を用いた場合、当業者においては、本発明に記載する検査を容易に行うことができる。
【００３４】
上記表中に示した多型部位の塩基種は配列表に示した配列に対して相補鎖側にある塩基種を示している場合があるが、本明細書において記載された前後配列、あるいは、dbSNPおよびJSNPデータベースにて公開される前後配列を用いれば異同を確認することは当業者にとって容易であり、検査を行うにあたってはプラス鎖とマイナス鎖のどちらを調べても必然的にもう一方の結果を決定することができる。なお、現在ヒトゲノム配列については、ほぼ最終版といわれているヒトゲノム国際プロジェクトbuild34が発表されており、本明細書に記した配列等はヒトゲノム国際プロジェクトbuild34の結果に基づいている。
【００３５】
当業者においては、通常、本明細書において開示された多型に付与された登録ID番号、例えばdbSNPデータベースにおけるrs番号によって、本発明の多型部位の実際のゲノム上の位置および前後の配列等を容易に知ることができる。これによって、知ることができない場合であっても、当業者においては、配列番号：１で示される塩基配列および多型部位等に関する情報から、適宜、該多型部位に相当する実際のゲノム上の位置を知ることは容易である。例えば、公開されているゲノムデータベース等と照会することにより、本発明の多型部位のゲノム上の位置を知ることができる。即ち、配列表に記載の塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違がみられた場合であっても、配列表に記載の塩基配列を基にゲノム配列と相同性検索等を行うことにより、本発明の多型部位について、実際のゲノム上の位置を正確に知ることが可能である。また、ゲノム上の位置が特定できない場合でも、本明細書に記載の配列表および多型部位の情報から本発明に記載する検査を行うことは容易である。
【００３６】
また、ゲノムDNAは、通常、互いに相補的な二本鎖DNA構造を有している。従って、本明細書においては、便宜的に一方の鎖におけるDNA配列を示した場合であっても、当然の如く、当該配列（塩基）に相補的な配列も開示したものと解釈される。当業者にとって、一方のDNA配列（塩基）が判れば、該配列（塩基）に相補的な配列（塩基）は自明である。
なお、後述する実施例においては、配列番号：１に記載の各配列に対する相補鎖を用いて試験を行なっているものもある。
【００３７】
本発明のCOPDにおいて体重減少するか否かの検査方法においては、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位について塩基種の決定を行なうことが好ましい。
【００３８】
また本発明の好ましい態様においては、本発明のPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の塩基種がT（ヘテロ及びホモ）である場合に、COPDにおいて体重減少すると判定される。COPD患者において体重減少するか否か、すなわち体重減少に伴う予後不良の判定を行うことができる。
【００３９】
本発明においては、上記多型部位以外であっても、該多型部位とその周辺のDNA領域は強く連鎖しているものと考えられることから、上記多型部位の近傍の多型部位について塩基種を決定することによっても、COPDにおいて体重減少するか否かの検査が可能である。即ち、多型部位の塩基種が上記の塩基種であるような、COPD患者で体重減少を発症している患者を含むヒトの小集団について、この「近傍の多型部位」（例えば、上記表１に記載の多型部位）における塩基種を予め決定する。
【００４０】
次いで、この「近傍の多型部位」について被検者における塩基種を決定し、予め決定された前記塩基種と比較することにより、COPDにおいて体重減少するか否かの検査を行うことができる。予め決定された塩基種と同一の塩基種である場合に、被検者はCOPDにおいて体重減少すると判定される。本発明の検査方法により、COPD患者において体重減少するか否かを判定することができ、治療方針の決定や薬剤投与量の決定、また栄養補助療法の有無等に利用することができる。
【００４１】
PLA2G2D遺伝子上の配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位の塩基種がTであるCOPDにおいて体重減少している人を含むヒトの小集団について、近傍の多型部位、例えば12420位の多型部位の塩基種を決定する。この部位の塩基種が上記のCOPDにおける体重減少を発症している人においてTの頻度が、上記COPDにおいて体重減少していない人に比べ高かった場合、被検者について12420位の多型部位の塩基種を調べ、この部位の塩基種が同様にTであった場合には、被検者はCOPDにおいて体重減少すると判定される。
【００４２】
以上のように、本発明により、COPDにおける体重減少に関連する遺伝子上の領域が明らかになったことにより、当業者に過度の負担を強いることなく、上記COPDにおいて体重減少するか否かについて検査を行うことができる。
【００４３】
本発明の多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
【００４４】
本発明の検査方法に供する被検試料は、通常、予め被検者から取得された生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えばDNA試料を挙げることができる。本発明におけるDNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液等から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
即ち本発明は、通常、被検者由来の生体試料（予め被検者から取得された生体試料）を被検試料として検査に供する方法である。
【００４５】
当業者においては、公知の技術を用いて、適宜、生体試料の調製を行うことができる。例えば、DNA試料は、本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって調製することができる。
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。
【００４６】
本発明の多型部位は、通常、その部位の塩基種のバリエーションが既に明らかになっている。本発明における「塩基種の決定」とは、必ずしもその多型部位についてＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれかの塩基種であるかを判別することを意味するものではない。例えば、ある多型部位について塩基種のバリエーションがＡまたはＧであることが判明している場合には、その部位の塩基種が「Ａでない」または「Ｇでない」ことが判明すれば充分である。
【００４７】
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。
【００４８】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アリルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアリルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。
【００４９】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
【００５０】
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例えば、レポーター色素として、あるアリルのアリルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アリルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアリルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アリルＡまたはアリルＢのホモであることが判明する。他方、アリルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である。
【００５１】
［AcycloPrime法］
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、AcycloPrime法も実用化されている。AcycloPrime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、多型検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている多型部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
【００５２】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、多型部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアリルがホモかヘテロかを判定することもできる。
【００５３】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアリルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アリルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
【００５４】
MALDI-TOF/MSを利用した塩基種の決定には、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
【００５５】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して多型部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど多型部位で増幅産物を切断することができる。
【００５６】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、多型変異に対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物は多型部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
【００５７】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合わせてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。例えばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができる。
【００５８】
［磁気蛍光ビーズを使った多型部位における塩基種の決定］
複数のアリルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアリルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化多型タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
【００５９】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化多型タイピングにおいては、各アリルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アリルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合わせられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アリル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。
【００６０】
アリルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、多型部位の塩基に相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。
【００６１】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の多型部位について、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
【００６２】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アリルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。
【００６３】
アリルプローブは、検出すべきアリルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アリルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アリルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
【００６４】
一方インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアリルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
【００６５】
多型部位がアリルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアリルプローブの両者がアリルにハイブリダイズすると、アリルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアリルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアリルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアリルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。
【００６６】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
【００６７】
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアリルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差がある。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
【００６８】
Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アリルＡとアリルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアリルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TaqMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。
【００６９】
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アリルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
【００７０】
［RCA法］
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
【００７１】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。
【００７２】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAが多型部位の塩基種に応じて生成されれば、RCA法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべき多型部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。多型部位がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アリルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。従って、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、多型部位の塩基種の決定が可能である。
【００７３】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アリル毎に反応を行わなければ、通常、塩基種を決定することができない。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブで塩基種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
【００７４】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アリル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合わせれば、１チューブで塩基種の決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
【００７５】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。
【００７６】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
【００７７】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
【００７８】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【００７９】
具体的には、まずPCR法等によって多型部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
【００８０】
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。
【００８１】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
【００８２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インビトロ(in vitro)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００８３】
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
【００８４】
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の血液、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
【００８５】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
【００８６】
上記方法をより具体的に示せば、被検者から調製した本発明の多型部位を含むDNA、およびヌクレオチドプローブが固定された固相、を取得した後、次いで、該DNAと該固相を接触させる。さらに、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、本発明の多型部位の塩基種を決定する。
【００８７】
本発明において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。本発明の固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。本発明の「固相」としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。
【００８８】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
【００８９】
上記オリゴヌクレオチドのうち、PLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、COPDにおいて体重減少するか否かを検査するための試薬（検査薬）として利用できる。これは遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
【００９０】
該オリゴヌクレオチドは、本発明のPLA2G2D遺伝子の多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、該遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域における塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００９１】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のPLA2G2D遺伝子のいずれかの多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００９２】
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。
【００９３】
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜２００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
【００９４】
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
【００９５】
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
【００９６】
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
【００９７】
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
【００９８】
本発明はまた、本発明のCOPDにおいて体重減少する（感受性の素因を有する）か否かの検査方法に使用するための試薬（検査薬）を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む。COPDにおいて体重減少するか否かの検査においてはPLA2G2D遺伝子または該遺伝子の近傍DNA領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における10001位の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーおよび／またはプローブを用いる。
【００９９】
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合わせることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。
【０１００】
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、本発明の多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ベースのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。
【０１０１】
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明のPLA2G2D遺伝子の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、COPDにおいて体重減少するか否かを検査するための試薬である。
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
【０１０２】
また本発明は、被検者（被検者由来の生体試料）におけるPLA2G2D遺伝子の発現量を指標として、COPDにおいて体重減少するか否か、または体重減少する素因を有するか否かの判定を行うことも可能である。即ち本発明は、被検者におけるPLA2G2D遺伝子の発現量が対照と比較して低下している場合に、被検者はCOPDにおいて体重減少する、または体重減少する素因を有するものと判定される、COPDにおいて体重減少するか否か、または体重減少する素因を有するか否かを検査する方法を提供する。
【０１０３】
上記方法においては、通常、被検者由来の生体試料を被検試料とする。該被検試料におけるPLA2G2D遺伝子の発現量の測定は、当業者においては公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。なお、上記「対照」とは、通常、健常者由来の生体試料におけるPLA2G2D遺伝子の発現量を指す。なお、本発明におけるPLA2G2D遺伝子の発現とは、PLA2G2D遺伝子から転写されるmRNAの発現、またはPLA2G2D遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の両方を意味するものである。
【０１０４】
本発明は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する方法に関する。
（ａ）被検者における、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異を検出する工程。
（ｂ）（ａ）の結果、タンパク質において変異が検出された場合に、被検者は慢性閉塞性肺疾患において体重が減少すると判定する工程。
【０１０５】
本発明においてタンパク質の変異とは、アミノ酸の付加、欠損、修飾、または置換による変異等を挙げることができるが、好ましくはアミノ酸置換による変異を挙げることが出来る。また、本発明のタンパク質の変異として、具体的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のアミノ酸の変異を挙げることが出来、より好ましくは配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異することを挙げることが出来る。
アミノ酸配列の変異の検出は、質量分析法、アミノ酸のN末端分析、抗体を用いた免疫化学的方法等、業者に公知の方法により行うことができる。
【０１０６】
免疫化学的方法により、タンパク質のアミノ酸の変異を検出する場合は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質に結合する抗体を使用することが出来る。
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の80位のGlyがSerに変異したタンパク質。
本発明の抗体は上記タンパク質を認識する限り特に限定されないが、特異的に上記タンパク質を認識する抗体であることが好ましい。
【０１０７】
該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。本発明の該タンパク質を認識する抗体は、既に公知の抗体を用いることが可能であり、又、該タンパク質を抗原とし、当業者に公知の方法により抗体を作製して用いることも可能である。
具体的には、例えば、以下のようにして作製することができる。
【０１０８】
該タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該該タンパク質またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、該該タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【０１０９】
また、ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該タンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成し、得られたcDNAの配列を公知の方法により解読すればよい。
【０１１０】
該タンパク質を認識する抗体は、該タンパク質と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体なども使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【０１１１】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい。
【０１１２】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。
【０１１３】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【０１１４】
本発明において好ましい抗体として、低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体とは、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはVHとVLの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（シングルチェインFv）、などを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
【０１１５】
本発明の抗体は、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定するための薬剤として使用することが可能である。上記の薬剤においては、有効成分である抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。また、本発明の抗体を基盤に貼り付けたプロテインチップ等も、慢性閉塞性肺疾患において体重が減少するか否かを判定する際に使用することが出来る。
【実施例】
【０１１６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【０１１７】
<研究集団>
2003〜2004年に山形大学附属病院（日本）の外来を受診した日本人COPD患者のうち、遺伝子型決定に関するインフォームドコンセントが書面で得られた後、ゲノムDNAが入手可能であった男性患者276人に対して調査を行った。これらのCOPD患者は、米国胸部疾患学会（American Thoracic Society）により規定された基準に従い診断された（American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 1995; 152: S77-S120.）。不可逆性の慢性気流閉塞は、スパイログラムによって確認した。患者は、少なくとも3ヶ月間臨床的に安定しており、臨床上の症状の悪化の兆候はなかった。前日の夕食後から絶食にし、全患者が、検査当日朝食前に人体計測的測定を受けた。研究プロトコールは、山形大学医学部倫理委員会の承認を受けており、インフォームドコンセントの書面を、全患者から本調査に参加する前に得た。
【０１１８】
<肺機能検査>
FVCおよびFEV1.0は、標準的な肺活量測定機器（CHESTAC-25パートII EX；チェスト株式会社（日本東京））により測定した。少なくとも3回肺活量測定を行い最高値を使用した。基準値は、日本胸部疾患学会（Japanese Society of Chest Diseases）により提唱されたものである（Japanese Society of Chest Disease. Jpn J Thorac Dis 1993;31:appendix.）。動脈血ガスの分析は、座位で酸素を補給しながら、又は補給せずに呼吸している被検者に対し行った（280 Blood Gas System；Ciba Corning Diagnostics Corp.,Medfield,MA）。
【０１１９】
<候補SNP選択および多型遺伝子型決定>
試験に使用されたグループIIサブファミリーsPLA2の遺伝子およびSNPsを、表1に示す。また、それらの染色体位置を、図１に図示した。グループIIサブファミリーsPLA2のSNPsは、dbSNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）、JSNP（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）、およびアプライド・バイオシステムズ・ジェノタイピング・データベース（Applied Biosisytems genotyping Database）（http://myscience.appliedbiosystems.com/genotype/）より抽出した。5個の遺伝子sPLA2-IIE、sPLA2-IIA、sPLA2-V、sPLA2-IID、およびsPLA2-IIFから全部で12個のSNPが導出され、全てのSNPについてCOPDにおける体重減少の程度との関連を試験した。遺伝子型決定は、蛍光ポリメラーゼ連鎖反応により実施した。試験したSNPのアレルおよび遺伝子型頻度を決定し、統計分析を実施するため、臨床データと組み合わせた。
【０１２０】
<型決定法>
遺伝子多型SNP遺伝子型決定の分析は、TaqMan allelic discrimination assay（Livak KJ. Genet Anal. 1999; 14: 143-149.）により実施した。試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Foster City,CA,USA）より購入した。PCR反応の完了時にSNPを区別するタックマン・プローブは、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosisytems）で設計、合成されたものを用いた。一方のアレル・プローブを蛍光FAM色素で標識し、他方を蛍光VIC色素で標識した。PCR反応は、濃度900nMのPCRプライマーおよび濃度200nMのタックマンMGB-プローブを用いて、UNGを含まないTaqMan Universsal Master Mix without UNG（Applied Biosisytems）中で行った。反応は、3.0ngのゲノムDNAを使用し、全反応容量3μlで、384穴フォーマットで行った。次いで、プレートをGeneAmp PCR System 9700（Applied Biosisytems）に設置し、95℃に10分間加熱した後、92℃15秒、60℃1分のサイクルを40回行い、最後に25℃に浸漬した。Prism 7900HT装置（Applied Biosisytems）により、プレートの各ウェル内の蛍光強度を読み取った。各プレートからの蛍光データ・ファイルは、SDS2.0 allele calling software（Applied Biosisytems）により分析した。
【０１２１】
<統計分析>
カイ二乗検定によって、各アリルがハーディ・ワインバーグ平衡（HWE）に適合するか否かの検定を行なった（p>0.05）。遺伝子型とCOPDにおける体重減少（COPD患者におけるBMIの減少）の程度およびその他の臨床的パラメータとの関連を、フィッシャーの直接法、ロジスティック回帰分析、および共分散分析（ANCOVA）（Wildt, Albert R. and Olli T. Ahtola (1978). Analysis of covariance. Quantitative Applications in the Social Sciences series #12. Thousand Oaks, CA: Sage Publications.）により評価した。優性遺伝モデルおよび劣性遺伝モデルの両方を、これらの統計分析に適用した。年齢、肺機能指数、および喫煙指数は、COPD患者に可能性のある交絡変数であり、多変量分析においてはこれらの交絡変数の効果を補償する必要があるため、ロジスティック回帰分析およびANCOVAは、年齢、喫煙指数、および肺機能指数（1秒間あたりの努力呼気容量−期待値に対する割合（％））に関して調整した。特に、ANCOVAは、従属変数が数的変数（本発明においてはBMI）で、独立変数がカテゴリー的かつ数的（本発明においてはSNP遺伝子型）であり、いくつかの交絡変数が存在する場合に、適用され得る。しかしながら、独立変数（SNP遺伝子型）と交絡変数との間に何らかの相互作用が存在する場合には、ANCOVAは適用され得ない。本発明においては、SNP遺伝子型と交絡変数との間に有意な交互作用が存在しないことを確認した（交互作用p値>0.05）。三つの異なる遺伝子型群の臨床値を比較するため、一要因分散分析（ANOVA）検定を、ポストホック修正（post hoc correction ;  Fisher's protected test）と共に使用した。結果は平均±SDとして表し、p<0.05が有意であるとみなした。これらの全てのデータ分析を、SPSS ver.12.0.1J（SPSS Inc.,Chicago,IL,2003）により行った。
【０１２２】
〔実施例１〕フィッシャーの直接法およびロジスティック回帰分析
本発明の目的は、COPD患者における体重減少（予後不良を示唆する臨床上の顕著かつ最も重要な特徴）に対する個体の感受性に関連している可能性がある遺伝子多型を発明者らが発案したグループIIサブファミリーsPLA2のSNP内に焦点を当て同定することである。
そのため、本発明者はまず、BMIが最も低い100人［表現型A群：BMI（kg/m2）；17.13±1.29（12.49〜18.98）、年齢（歳）；73.8±7.1、喫煙指数；1117±573、FEV1.0（期待値に対する割合（％））；40.18±20.37；n＝100］および反対にBMIが最も高い100人［表現型a群：BMI（kg/m2）；23.83±1.98（21.63〜32.74）、年齢（歳）；73.4±6.7、喫煙指数；1089±551、FEV1.0（期待値に対する割合（％））；53.62±23.80；n＝100］のCOPD患者について調査を行った。フィッシャーの直接法［オッズ比（OR）（95％CI）：2.36（1.34〜4.18）、p＝0.004］およびロジスティック回帰［OR：2.10（1.13〜3.90）、p＝0.019］の分析は、劣性モデルにおいて、sPLA2-IID内のSNP10（NCBI SNPリファレンス：rs584367）が、COPD患者における体重減少の程度と有意に関連していることを示した（表２：本発明で試験されたそれぞれのSNPにおけるフィッシャーの直接法とロジスティック回帰分析を示す）。分析は、sPLA2-IID遺伝子（配列番号：１）内のSNP10の変異アレル（チミン：T）が、非変異アレル（シトシン：C）（表現型a群）より2倍以上、COPDにおける体重減少（表現型A群）のリスクを増加させることも示した（p<0.05）。さらに、この核酸変化（C→T）によって、sPLA2-IIDタンパク質のアミノ酸の改変（グリシン：Gly→セリン：Ser）（Gly80Ser）も生じた（表１）。ロジスティック回帰分析は、FEV1.0（期待値に対する割合（％））により評価された肺機能指数が、表現型A群における有意なリスクファクターであり、FEV1.0（期待値に対する割合（％））が1％減少すると、COPDにおける体重減少（表現型A群）の程度のリスクが1.03倍に増加することも示された（p<0.001、データ示さず）。SNP10のハーディ・ワインバーグ平衡の検定値は0.497であり、カイ二乗検定のｐ値は0.481であった。SNP-10-Cのアリル頻度は0.6825、SNP-10-Tのアリル頻度は0.3175であった。sPLA2-IID上のSNPは、SNP10の近傍に位置し強い連鎖不平衡を示すSNP11は有意差を示したが、他のSNPに有意差は認められなかった。
このことから、SNP10が、COPD患者におけるBMIの減少に関連している感受性SNPであることが示唆される。
【０１２３】
【表２】
2006333811.tif 000003
略語の定義：OR=オッズ比; CI=信頼区間（confidence interval）
フィッシャーの直説法；フィッシャーの直接法を用いた表現型A群と表現型a群のSNP遺伝子型の頻度の違いの比較
ロジスティック回帰分析；年齢、喫煙指数、肺機能指数（FEV1.0（期待値に対する割合（％））についてのロジスティック回帰分析
すべての解析データはSPSS ver.12.0.1J (SPSS Inc., シカゴ. IL, 2003)を用いて得た。
【０１２４】
〔実施例２〕ANCOVAおよびSNPの遺伝子型特徴決定の結果
次に、フィッシャーの直接法およびロジスティック回帰分析の結果を確認するため、全COPD患者（n＝276）を分析した。ANCOVA検定も、SNP10の劣性モデルにおいて、変異群（CT＋TT）のBMI値（対数変換）と非変異群（CC）のBMI値との間の有意差を示した［平均（SE）：1.293（0.005）対1.317（0.006）、p＝0.003、表3：本研究で試験されたそれぞれのSNPにlog BMIのためのTテスト、およびlog BMIのためのANCOVA］。全登録COPD患者を、通常用いられるBMI値の４つのクラスに層化した（Schols AM, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1791-1797.）。さらに、ANCOVAを用いてBMI値を補正し６つのクラスへの層化も行なった。変異アレルであるTアレルを持つもの（CT+TT）は、BMI値（図２ａ）（フィッシャーの直接法:p=0.00329）とANCOVAで補正されたBMI値（図２b）（フィッシャーの直接法:p=2.33x10-17）において、変異アレルを持たないもの（CC）とは有意に分布が異なった。この表現型（COPDにおける体重減少）と遺伝子多型の関連は、変異型であるTアレルを持つものはより低いBMI値の層に多いという結果となった（図２ａ、図２ｂ）。変異「Ser」群（Gly/Ser＋Ser/Ser：n＝148）のBMI平均値は、他方の非変異群（Gly/Gly：n＝128）より1.2（kg/m2）低かった（p＝0.0017、図３ａ）。二群（Gly/Ser＋Ser/Ser：n＝143、Gly/Gly：n＝118）間のANCOVAによる調整されたBMIの有意差は、より顕著なp値（p<0.0001、図３ｂ）を示した。sPLA2-IID内のSNP10の三つの遺伝子型（CC：Gly/Gly、CT：Gly/Ser、およびTT：Ser/Ser）別のCOPDの重症度に関する他の診断パラメータは、表4に要約されている。肺機能を含むこれらのパラメータのレベルの有意差は、三群間に存在しなかった。ヘテロの組み合わせ「Gly/Ser」のBMIおよびANCOVAによる調整されたBMIの平均値は、ホモの組み合わせ「Ser/Ser」のものより低かった。これらの結果は、ホモの検体の数が少なく、それらが当分析において比較的大きな偏差を有していたために引き起こされた可能性がある。これらの結果は、それぞれ図４ａおよび４ｂにも図示される。
【０１２５】
また、SNP10の隣接SNP（SNP11）は、大部分は統計的有意性には達しなかったが、劣性モデルにおいて低いp値を示したため、sPLA2-IIDがCOPD患者における体重減少の原因となる感受性遺伝子であることも示唆される。
【０１２６】
【表３】
2006333811.tif 000004
log BMに対するt検定；Tテストによる2つの群のLog BMIの平均値の比較
log BMIに対するANCOVA；年齢、喫煙指数、肺機能指数（FEV1.0（期待値に対する割合  （％））についてのANCOVA
すべての解析データはSPSS ver.12.0.1J (SPSS Inc., シカゴ. IL, 2003)を用いて得た。
【０１２７】
sPLA2-IIDタンパク質は、20残基のプレペプチドに続く125アミノ酸からなっており（Mr＝14,500、配列番号：２）、システイン残基の数および位置並びに全体同一性（48％）に関してsPLA2-IIAと最も類似している（Ishizaki J, et al. J Biol Chem. 1999; 274: 24973-24979.）。sPLA2-IIDは、ヒトの免疫器官および消化器官において構成性発現がされており、マウスの肺、胸腺、および脾臓のようないくつかの制限された組織において全身性炎症誘発刺激によってアップレギュレートされることから、炎症過程の進行における機能的役割が示唆される（Ishizaki J, et al. J Biol Chem. 1999; 274: 24973-24979., Murakami M, et al. Eur J Biochem. 2002; 269: 2698-2707.）。実際、核酸データベースの検索によって、炎症誘発シグナルに関連した誘導可能な性質と一致して、ヒトsPLA2-IID遺伝子の5'隣接プロモーター領域におけるTATAボックス並びにAP-1およびNF-κBとの結合モチーフの存在が明らかになっている。SNP10（NCBI SNPリファレンス：rs584367）のSNP型は、ミスセンス変異であり、sPLA2-IIDタンパク質のアミノ酸変化（Gly80Ser）を引き起こす。このアミノ酸多型の位置は、グループIIサブファミリーsPLA2において高度に保存されている触媒ドメインにもCa2+結合ループにもないが、それは、グループIIサブファミリーsPLA2において完全に保存されているシステイン残基の隣に位置する（Ishizaki J, et al. J Biol Chem. 1999; 274: 24973-24979., Suzuki N, et al. J Biol Chem. 2000; 275: 5785-5793.）。従って、単一アミノ酸変化がsPLA2-IIDタンパク質の構造的改変をもたらし、その結果、何らかの程度でこの分子の機能的特性に影響を与えると考えられる。
【０１２８】
本発明の結果を基に、COPD患者における体重減少とsPLA2-IIDタンパク質のアミノ酸多型（SNP10）との間の病態生理学的関連性を考察する。第一に、炎症細胞の特異的又は無差別的な膜受容体による炎症誘発性サイトカインを脱顆粒又は合成する能力が、sPLA2-IIDタンパク質のアミノ酸変化（Gly→Ser）により修飾又は増強される可能性があると考えられる。持続性かつ全身性の過剰炎症状態は、遺伝子型がヘテロの組み合わせ「Gly/Ser」又はホモの組み合わせ「Ser/Ser」であるCOPD患者において、体重減少をもたらす（表４：SNP10遺伝子型によるCOPD患者の特徴、および図４）。第二に、sPLA2-IIDタンパク質の一つの考えられる機能は、栄養物中のリン脂質の消化である（Ishizaki J, et al. J Biol Chem. 1999; 274: 24973-24979.）。アミノ酸多型（SNP10）によるsPLA2-IIDタンパク質のこの特性の機能的変化が、COPD患者におけるリン脂質消化の効率に影響を与えると考えられる。即ち、遺伝子型がヘテロの組み合わせ「Gly/Ser」又はホモの組み合わせ「Ser/Ser」であるCOPD患者は、より低いリン脂質消化効率を示し、その結果、栄養補助療法にも関わらず、体重減少に陥ると考えられる（表４および図４）。
【０１２９】
【表４】
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略語の定義：Gly=グリシン；Ser=セリン；BMI=肥満度指数（Body Mass Index）；FVC=強制肺活量（forced vital capacity）；FEV1.0=1秒間努力呼気容量；BW(kg)：p<0.05, BMI（kg/m2）：p<0.01, ANCOVAによる調整されたBMI（kg/m2）：年齢、喫煙指数、肺機能指数（FEV1.0（期待値に対する割合（％））についてのANCOVA；値は平均値±SD 、p<0.0001 一元配置分散分析；Gly/Gly  vs. Gly/SerおよびGly/Gly vs. Ser/Ser：フィッシャーのＰＬＳＤ法（Fisher's protected least significant difference test）；動脈PO2 (torr)および動脈PCO2（torr）：相当数の患者が採血中に酸素補給を受けた試験。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明に使用したグループIIサブファミリーsPLA2の遺伝子およびSNPの染色体位置を示す図である。グループIIサブファミリーsPLA2は、同一染色体遺伝子座（1p34〜p36）にクラスターを形成しており、本発明に使用された12個のSNPは、dbSNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）、JSNP（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）、およびアプライド・バイオシステムズ・ジェノタイピング・データベース（Applied Biosisytems genotyping Database）（http://myscience.appliedbiosystems.com/genotype/）より抽出した。
【図２】全登録COPD患者の、BMI値の分布を示す図である。全登録COPD患者を通常用いられる４つのクラスのBMI値に層化し（Schols AM, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1791-1797.）、さらに、ANCOVAを用いてBMI値を補正し６つのクラスへの層化も行なった。変異アレルであるTアレルを持つもの（CT+TT）は、BMI値（図２ａ）（フィッシャーの直接法:p=0.00329）とANCOVAで補正されたBMI値（図２b）（フィッシャーの直接法:p=2.33x10-17）において、変異アレルを持たないもの（CC）とは有意に分布が異なった。ANCOVA検定においては、喫煙歴に関する正確な情報が欠けていたため、15人の患者を解析から除外した。
【図３】図３ａは、sPLA2-IID内のSNP10の遺伝子型による変異「Ser」群（Gly/Ser＋Ser/Ser：n＝148）および他方の非変異群（Gly/Gly：n＝128）のBMI値（kg/m2）［平均（95％CI）］を比較した図である。この図により変異群の有意差が証明された（スチューデントt検定；p＝0.0017）。図３ｂは、sPLA2-IID内のSNP10の遺伝子型によるこれらの二群（Gly/Ser＋Ser/Ser：n＝143、Gly/Gly：n＝118）のANCOVAによる調整されたBMIの値［平均（95％CI）］を比較した図である。ANCOVA検定により、さらに顕著な有意性が証明された（p<0.0001）。ANCOVA検定においては、喫煙歴に関する正確な情報が欠けていたため、15人の患者を解析から除外した。
【図４】図４ａは、sPLA2-IID内のSNP10の三つの遺伝子型別のBMI値（kg/m2）のボックスプロットを示す図である。この図により三群間の有意差が証明された（ポストホック修正としてFisher's protected testを使用したANOVA検定；p<0.01、表４でも説明）。図４ｂは、sPLA2-IID内のSNP10の三つの遺伝子型別のANCOVAによる調整されたBMI値（kg/m2）のボックスプロットを示す図である。三群間のより顕著な有意差が証明されている（p<0.0001、表４でも説明）。ANCOVA検定においては、喫煙歴に関する正確な情報が欠けていたため、15人の患者を解析から除外した。飛び値は図から削除した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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