(57)【要約】  【課題】  効率よく、且つ生存率の高いクローン哺乳動物の作成方法の提供、該方法によって得られるクローン動物、その子孫、胚等の提供、当該クローン動物の胚からＥＳ細胞を得る方法、及び該方法によって得られるＥＳ細胞の提供。  【解決手段】  ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とするクローン哺乳動物の作成方法、該方法によって得られるクローン哺乳動物、該クローン動物の胚からＥＳ細胞を得る方法並びに該方法によって得られるＥＳ細胞。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項２】
哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項３】
哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞に由来する核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入して再構築胚を形成し、該再構築胚を宿主哺乳動物に移入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項４】
ナチュラルキラーＴ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項５】
ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項６】
ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項７】
ナチュラルキラーＴ細胞が、臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる組織より採取されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって作成されたクローン非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られるクローン非ヒト哺乳動物の胎仔。
【請求項１０】
請求項８記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１１】
Ｔ細胞上で発現するＴＣＲＶβ鎖が実質的に単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリーで構成されていることを特徴とする、請求項１０記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１２】
単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリーが、ドナー細胞として用いたＮＫＴ細胞のＴＣＲＶβ鎖レパートリーと同一である、請求項１１記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１３】
遺伝子再構成済みのＴＣＲα鎖であるＶα１４−Ｊα２８１を含む対立遺伝子を有しＮＫＴ細胞の数が増加していることを特徴とする、請求項１０記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項１４】
請求項８記載のクローン非ヒト哺乳動物から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項１５】
請求項９記載のクローン非ヒト哺乳動物の胎仔から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項１６】
請求項１０記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項１７】
ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項１８】
治療用、臓器移植用及び／又は細胞移植用である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項１９】
ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とする、クローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２０】
哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２１】
ナチュラルキラーＴ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、請求項１９又は２０記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２２】
ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２３】
ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２４】
ナチュラルキラーＴ細胞が、臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる組織より採取されるものである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法によって作成されたクローン哺乳動物胚。
【請求項２６】
請求項２５記載のクローン哺乳動物胚を胚盤胞期又は前胚盤胞期まで培養し、得られる胚盤胞期又は前胚盤胞期の内部細胞塊から胚性幹細胞を分離することを含む、クローン哺乳動物胚性幹細胞の作成方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法によって得られるクローン哺乳動物胚性幹細胞。
【請求項２８】
請求項２７記載のクローン哺乳動物胚性幹細胞を所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することを含む、クローン哺乳動物の分化細胞、組織、器官又は生産物の作成方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法によって得られるクローン哺乳動物の分化細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項３０】
ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、請求項２９記載の分化細胞、組織、器官又は生産物。
【請求項３１】
治療用、臓器移植用及び／又は細胞移植用である、請求項２９又は３０記載の分化細胞、組織、器官又は生産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクローン哺乳動物胚及びクローン哺乳動物、それを製造する為の方法、及びそれらの用途等に関する。さらに本発明はクローン哺乳動物胚性幹細胞（以下ＥＳ細胞ともいう）、それを製造する為の方法及びそれらの用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
英国でのクローン羊ドリーの誕生以来（非特許文献１参照）、動物のクローンが様々な手法で樹立されたが体細胞由来の核を直接、核除去された卵子に移植してクローンを得る手法は非常に効率が悪く、また移植に使用したドナー細胞の由来を特定することは非常に困難であるため再現性に問題があった。後者を克服するため細胞特異的表面マーカーを発現しているリンパ球がドナーとして使用されたが効率が悪く、余計なプロセスが必要になってしまった。例えばＴ細胞、Ｂ細胞等の末梢リンパ球を使用した場合は１／５００（０.２％）程度の確率でしかＥＳ細胞が樹立されていない（非特許文献２参照）。また神経
嗅覚細胞をドナーとした場合は多少ＥＳ細胞樹立の確率が上昇するがこれらのいずれの場合でもＥＳ細胞の樹立とｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎという二つステップがクローン個体産生に必要不可欠となっている（非特許文献３参照）。このように末梢の終分化した細胞を使用してクローンを作成するのは非常に時間と労力を要するものであった。一方、ヒトへの応用を考えた場合いったんＥＳ細胞を経るということはクローンのＨＬＡがドナーのそれと一致しなくなるため（自己移植の場合を除いて）必然的に免疫拒絶反応を起こしてしまい使用不可能である。そこでこれらの技術的、免疫学的制約を凌駕するドナー細胞として使用可能な体細胞の同定が求められていた。また従来の体細胞クローン技術ではドナー細胞の由来を正確に同定することはほぼ不可能であり、全個体再生能力のある細胞群を特定することは不可能であった。
【０００３】
また、従来行われてきたクローン技術では、胚移植後、実際に産仔に至るのは極めて僅かであり、より産仔に至る確立の高いクローン哺乳動物の作成方法が求められている。
【非特許文献１】Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら,「Ｖｉａｂｌｅ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」，Ｎａｔｕｒｅ，（英国），１９９７年，３８５，ｐ.８１０−８１３
【非特許文献２】Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊａｅｎｉｓｃｈ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｍｉｃｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｕｒｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌｓ．」，Ｎａｔｕｒｅ，（英国），２００２年，４１５，ｐ．１０３５−１０３８
【非特許文献３】Ｅｇｇａｎ，Ｋ．ら，「Ｍｉｃｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．」，Ｎａｔｕｒｅ，（英国），２００４年，４２８，ｐ．４４−４９
【非特許文献４】Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｓ．ら，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ．」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（米国），２００４年，３０３，ｐ．１６６９−１６７４
【非特許文献５】Ｗａｋａｙａｍａ，  Ｔ．ら，「Ｍｉｃｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，（米国），１９９９年，９６，ｐ．１４９８４−１４９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はより効率よく、且つ生存率の高いクローン動物の作成方法の提供、該方法によって得られるクローン動物、その子孫、胚等、ならびにそれらから得られる細胞、組織、器官、生産物等の提供を目的とする。本発明の別の目的は、クローン動物胚からＥＳ細胞を得る方法、該方法によって得られるクローン動物ＥＳ細胞、及びそれらから得られる細胞、組織、器官、生産物等を提供することである。本発明のさらなる別の目的は、ドナー細胞の由来を正確に同定し得る体細胞クローン技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、核を提供するドナー細胞としてナチュラルキラーＴ細胞（以下ＮＫＴ細胞ともいう）を用いることによって、得られたクローン胚が、ＥＳ細胞の樹立ならびに逐次的なｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを必要とすることなく発生、産仔に至ることを見出した。さらに得られたクローン動物が正常な生殖能力を有することを確認して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００６】
〔１〕ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔２〕哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔３〕哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞に由来する核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入して再構築胚を形成し、該再構築胚を宿主哺乳動物に移入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔４〕ナチュラルキラーＴ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。〔５〕ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔６〕ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔７〕ナチュラルキラーＴ細胞が、臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる組織より採取されるものである、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法によって作成されたクローン非ヒト哺乳動物。
〔９〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法によって得られるクローン非ヒト哺乳動物の胎仔。
〔１０〕上記〔８〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
【０００７】
〔１１〕Ｔ細胞上で発現するＴＣＲＶβ鎖が実質的に単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリーで構成されていることを特徴とする、上記〔１０〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。〔１２〕単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリーが、ドナー細胞として用いたＮＫＴ細胞のＴＣＲＶβ鎖レパートリーと同一である、上記〔１１〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
〔１３〕遺伝子再構成済みのＴＣＲα鎖であるＶα１４−Ｊα２８１を含む対立遺伝子を有しＮＫＴ細胞の数が増加していることを特徴とする、上記〔１０〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。
〔１４〕上記〔８〕記載のクローン非ヒト哺乳動物から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
〔１５〕上記〔９〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の胎仔から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
〔１６〕上記〔１０〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫から得られる細胞、組織、器官又は生産物。
〔１７〕ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、上記〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の細胞、組織、器官又は生産物。
〔１８〕治療用、臓器移植用及び／又は細胞移植用である、上記〔１４〕〜〔１７〕のいずれかに記載の細胞、組織、器官又は生産物。
〔１９〕ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とする、クローン哺乳動物胚の作成方法。
〔２０〕哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン哺乳動物胚の作成方法。
【０００８】
〔２１〕ナチュラルキラーＴ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、上記〔１９〕又は〔２０〕記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
〔２２〕ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、上記〔１９〕〜〔２１〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
〔２３〕ナチュラルキラーＴ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、上記〔１９〕〜〔２１〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
〔２４〕ナチュラルキラーＴ細胞が、臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる組織より採取されるものである、上記〔１９〕〜〔２３〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。
〔２５〕上記〔１９〕〜〔２４〕のいずれかに記載の方法によって作成されたクローン哺乳動物胚。
〔２６〕上記〔２５〕記載のクローン哺乳動物胚を胚盤胞期又は前胚盤胞期まで培養し、得られる胚盤胞期又は前胚盤胞期の内部細胞塊から胚性幹細胞を分離することを含む、クローン哺乳動物胚性幹細胞の作成方法。
〔２７〕上記〔２６〕記載の方法によって得られるクローン哺乳動物胚性幹細胞。
〔２８〕上記〔２７〕記載のクローン哺乳動物胚性幹細胞を所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することを含む、クローン哺乳動物の分化細胞、組織、器官又は生産物の作成方法。
〔２９〕上記〔２８〕記載の方法によって得られるクローン哺乳動物の分化細胞、組織、器官又は生産物。
〔３０〕ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、上記〔２９〕記載の分化細胞、組織、器官又は生産物。
【０００９】
〔３１〕治療用、臓器移植用及び／又は細胞移植用である、上記〔２９〕又は〔３０〕記載の分化細胞、組織、器官又は生産物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって得られるクローン哺乳動物、クローン哺乳動物胚ならびにそれらから得られる細胞、組織、器官及び生産物は、ドナーと全く同じ組織適合性抗原（例えばＨＬＡ）を有し、又抗原性も同等であり、移植時、投与時の免疫拒絶反応が起こらない。また、ＮＫＴ細胞を用いた場合にはクローン作成にＥＳ細胞の樹立とｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを必要としない。この為大幅な時間と労力の節約ができる。さらにＮＫＴ細胞の核を使用してＥＳ細胞を樹立した場合その効率は約６％であり、従来の末梢マウスＴ細胞、Ｂ細胞をドナーとして用いた場合に比較して非常に高い。又、自家移植によりヒトＥＳ細胞を樹立できる効率（非特許文献４）と比較しても非常に高い。さらに移植した核から個体になる率はおよそ１.５％であり、これまで個体が比較的容易
に得られるとされたＥＳ細胞からのクローン作成の成功率（非特許文献５）に匹敵する。
本発明の方法を用いれば、クローン哺乳動物がより高率でできることから有用動物（例えば生物医薬品等をミルク中に産生するトランスジェニック羊、牛等）を容易にクローン化することが可能となり、これらの医薬品の大量生産、コストダウンが可能となり、総医療費の削減に貢献できる。
さらに、本発明のクローン哺乳動物の子孫は、Ｔ細胞上で発現するＴＣＲＶβ鎖が実質的に単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリーで構成されていることを特徴とし、より詳細にはドナー細胞として用いたＮＫＴ細胞のＴＣＲＶβ鎖レパートリーと同一である。さらに、遺伝子再構成済みのＴＣＲα鎖であるＶα１４−Ｊα２８１を含む対立遺伝子を有する子孫ではＮＫＴ細胞の数が相対的且つ絶対的に野生型と比較して増加している。これらの事実から、本発明のクローン哺乳動物の子孫は、自己免疫疾患等の病態モデル動物として、又、免疫制御におけるＮＫＴ細胞の役割やＴＣＲＶβ鎖のレパートリーの多様性がもたらす意義を解析する手法を与えるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の一例の要約を図１に示す。
本発明において用いるナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、その存在割合は少ないが免疫系で制御的な役割を担っているリンパ球の一種である。ＮＫＴ細胞はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＮＫレセプターの２つの抗原レセプターを有する。ＮＫＴ細胞は通常のＴ細胞やＮＫ細胞とは異なる特異的なレパートリーを発現している。例えばマウスのβ鎖についてはＮＫＴ細胞の９０％以上は主にＶβ８、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーを発現し、α鎖については均一なＶα１４−Ｊα２８１を発現している。この均一なＴＣＲα鎖は、ＴＣＲ遺伝子の再構成の際に、Ｖ及びＪ遺伝子群からＶα１４遺伝子とＪα２８１遺伝子とが選ばれゲノム上で再構成された結果として作成される(Taniguchi et al.,(2003) Annu Rev Immunol 21,483-513 The regulatory role of Valpha14 NKT cells in innate and aquired immune response)。ヒトではマウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。このような性質は、得られたクローン動物におけるドナー細胞の起源を追跡するのに適している。ＮＫＴ細胞の由来は特に限定されず、ヒトを含む霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタ等の哺乳動物の臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺等から回収することができる。本明細書で用いる「霊長類」という用語は、サル、類人猿、及びヒトが含まれるがこれらに限定されない、哺乳類の群に属する、任意の動物を意味する。具体的には末梢血や肝臓のホモジネートから回収される単細胞の懸濁液を、ＮＫＴ細胞に高度に保持されたＴＣＲに認識され得る、ＣＤ１ｄ分子と結合したα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ若しくはα−ＧＣ）のような抗原糖脂質を用いてＦＡＣＳ解析することによって選別、回収することができる。本発明で用いられるＮＫＴ細胞は活性化されていてもされていなくても構わない。好ましくは抗原刺激されていない状態の細胞が好ましい。また、ＮＫＴ前駆細胞をＮＫＴ細胞分化誘導能を付与する因子の存在下で培養することによって得られるＮＫＴ細胞であってもかまわない。ＮＫＴ前駆細胞は胎児肝細胞あるいは末梢血や臍帯血由来であり得る。
【００１２】
本発明のクローン哺乳動物の作成方法においては、ＮＫＴ細胞をドナー細胞として用いることを特徴とする。具体的にはＮＫＴ細胞の核移植によって実施される。核移植の方法は、ＮＫＴ細胞の核をドナー細胞核として実施され得るものであれば特に限定されない。細胞核を当該細胞核と同じ種の哺乳動物由来の除核卵母細胞に導入する場合と細胞核を当該細胞核と異なる種の哺乳動物由来の除核卵母細胞に導入する場合がある。異なる種の哺乳動物由来の除核卵母細胞への核移植の技術は、絶滅種の復活、絶滅危惧種の保存、増殖に有用である。同じ種の哺乳動物由来の除核卵母細胞への核移植はより効率よく産仔に至る。
【００１３】
ＮＫＴ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入する方法としては、未受精卵子の核が最終的にドナー細胞であるＮＫＴ細胞の核と置き換わればその方法は特に限定されないが、ＮＫＴ細胞の大きさを考慮すると、ＮＫＴ細胞の細胞膜にピペット等で傷をつけ、傷をつけたＮＫＴ細胞をマイクロマニュピレーター等を用いて直接除核卵母細胞に導入する方法が好適に用いられる。ＮＫＴ細胞と除核卵母細胞との細胞融合によって核移植が行なわれても良い。より具体的には例えば、Ｗａｋａｙａｍａら(Nature 394,369-374(1998))、Ｉｎｏｕｅら(Biol.Reprod. 69,1394-1400(2003))によって報告されている方法に準じて、また適宜改変して実施することができる。ＮＫＴ細胞と除核卵母細胞を融合させることで核移植を実施する場合、市販の装置を用いた電気融合法により融合させることができる。
【００１４】
除核を施す哺乳動物の卵母細胞は、ホルモン投与による過排卵処理によって得ることができる。除核は卵母細胞に微小なピペットを用い未受精卵母細胞の核と周りの細胞質を吸い込み、ちぎり取るような操作によって実施するが、そのままでは細胞骨格が壊れ卵母細胞が破壊される。従ってあらかじめ未受精卵母細胞の細胞骨格を消失させる処理を施すことが好ましい。細胞骨格の消失はサイトカラシンを用いることで実施できる。また、核移植後にもサイトカラシン等で処理することが好ましい。核移植が施される卵母細胞は活性化されていなくてもされていても構わないが、活性化されている状態が好ましい。当該活性化は核移植の前後、どちらで施されても構わない。活性化は電気的方法や薬剤処理法によって刺激することによって実施し得るが特に限定されるものではない。特に好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を用いる。活性化は、例えば卵母細胞中の２価のカチオン濃度を上げること、及び／又は卵母細胞中の細胞性タンパク質のリン酸化の程度を低下させることによって行うことができる。これは一般に２価のカチオン、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、カルシウムを、例えばイオノフォアの形で卵母細胞の細胞質に導入することによって行われる。２価のカチオン濃度を増加させる他の方法は、電気ショック、エタノール処理及びケージキレート剤の処理の利用が含まれる。リン酸化の程度は既知の方法、例えばキナーゼ阻害剤、例えば６−ジメチルアミノプリン、２−アミノプリン及びスフィンゴシンのようなセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤の添加によって低減されることがある。あるいは卵母細胞中へのホスファターゼの導入によってリン酸化を阻害することもできる。
【００１５】
ＮＫＴ細胞の核を除核卵母細胞に導入して、再構築胚を形成し、さらに再構築胚を宿主哺乳動物に移植することによって該再構築胚を宿主哺乳動物に発生させ、それによってクローン哺乳動物を得ることができる。
【００１６】
上述したように、ドナー細胞としてＮＫＴ細胞を用いた場合、体細胞核移植により、ＥＳ細胞の樹立ならびに逐次的なｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを必要とすることがなくクローン哺乳動物が得られる。すなわち、ＮＫＴ細胞は全能性を有しているものと予測される。
【００１７】
本明細書で用いる「全能性を有する」という用語は、胚、胎児、及び動物等の発生中の細胞塊中のすべての細胞を生じる細胞を意味する。好ましい態様では、「全能性を有する」という用語は、動物のあらゆる細胞を生じる細胞を意味する。全能性を有する細胞は、１個又は複数の核移植段階から胚を作成する手順で使用されると、発生中の細胞塊のあらゆる細胞を生じることができる。
【００１８】
本明細書で用いる「全能性を有する」という用語は、「多能性を有する」という用語と区別される。後者の用語は、発生中の細胞塊内における細胞の分集団に分化するが、そのような発生中の細胞塊におけるすべての細胞を生じることはできない細胞を意味する。
【００１９】
本明細書で用いる「胚」又は「胚性」という用語は、宿主哺乳動物の子宮膜に着床していない、発生中の細胞塊を含む。したがって本明細書で用いる「胚」又は「胚性」という用語は、受精した卵母細胞、細胞質雑種、前胚盤胞期の発生中の細胞塊、及び／又は、宿主哺乳動物の子宮膜への着床前の発生期にある、他の任意の発生中の細胞塊を意味する場合がある。再構築胚とは、ドナー細胞核を除核卵母細胞に核移植することによって得られる、ドナー細胞由来の核と卵母細胞由来の細胞質成分とで再構成された胚を意味する。
【００２０】
胚は細胞発生の複数の段階を提示する場合がある。例えば１個の細胞胚は接合体と呼ぶことができ、接合体は分割胚から生じる中実で球状の細胞塊であり桑実胚と呼ぶことができ、さらに割腔を有する胚は胚盤胞と呼ぶことができる。
【００２１】
再構築胚の宿主哺乳動物への移植は、当分野で通常実施される方法に従って行うことができる。具体的には再構築胚を２〜８細胞期になるまで培養しつづけて２〜８細胞期の胚を宿主哺乳動物に移植し、さらにその再構築胚を哺乳動物に発生させてクローン哺乳動物を作成する。再構築胚の培養と成熟に適した培地は技術的に良く知られており、除核卵母細胞の起源となる哺乳動物の種類に応じて適宜設定される。さらに再構築胚の培養は所望によりフィーダー細胞と共に、好ましくはフィーダー細胞層上で行ってもよい。再構築胚は宿主哺乳動物に移植するのに適したサイズに達する迄培養される。好ましくは約２〜４００細胞、より好ましくは約４〜１２８細胞（マウスであれば時間にして約４８時間〜７２時間程度）となるまで培養され得る。この培養は適当な条件下、即ち約３７℃〜３８．５℃、約５〜７．５％ＣＯ２存在下で行われ、適宜培地を交換する。宿主哺乳動物は、その中で再構築胚を発生させることができるものであれば特に限定されないが、好ましくは除核卵母細胞と同じ種由来の哺乳動物であり、より好ましくは偽妊娠した雌の哺乳動物である。例えばマウスの場合、偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮等により去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により得られた再構築胚（クローン胚）を子宮内移植、特に卵管内に移植し、妊娠、出産させることによりクローン哺乳動物を作成することができる。クローン胚の着床・妊娠がより確実に起こるようにするために、仮親になる偽妊娠マウスは、除核を施す卵母細胞を採取する雌マウスと同一の性周期にある雌マウス群から選択することが好ましい。
【００２２】
本明細書で用いる「胎仔」という用語は、宿主哺乳動物の子宮膜に着床した発生中の細胞塊を意味する。胎仔は例えば生殖隆起のような明確な特徴を含む場合がある。生殖隆起は当業者により容易に同定される特徴であり、多くの動物種の胎仔で認識可能な特徴である。胎仔の細胞とは、胎仔から単離された、及び／又は胎仔から生じた任意の細胞、又は胎仔に由来する細胞を意味する場合がある。本発明のクローン哺乳動物の胎仔は、上記したクローン哺乳動物の作成過程において、再構築胚を仮親へ移植した後、任意の段階で採取することによって得ることができる。
【００２３】
本発明のクローン哺乳動物の子孫は、再構築胚から発生したクローン哺乳動物を第２の哺乳動物と交配させることによって得ることができる。第２の哺乳動物は、クローン哺乳動物（便宜上第１の哺乳動物ともいう）と同じ種の正常な哺乳動物（クローンではない）、あるいはクローン胚から発生したクローン哺乳動物又はその子孫等であり得る。後述するトランスジェニック哺乳動物あるいはトランスジェニック哺乳動物胚から発生したクローン哺乳動物又はその子孫であってもよい。本発明において「子孫」とは、本発明のクローン哺乳動物を親とする仔世代（Ｆ１）、Ｆ１を親とする仔世代（Ｆ２）、Ｆ２を親とする仔世代（Ｆ３）等の本発明のクローン哺乳動物を発生の起源とするものであれば何世代のものであっても構わない。本発明において、上記したクローン哺乳動物、クローン哺乳動物の胎仔、クローン哺乳動物の子孫を用いて任意に細胞、組織又は器官を得ることができる。細胞、組織又は器官の採取・回収は特に限定された方法で行う必要はなく、通常当分野で実施される方法で行われる。さらに、得られた細胞、組織又は器官から分泌、産生、抽出される生産物も本発明の範囲内である。クローン哺乳動物から得られる生産物としては、対象哺乳動物から得られるものと同様多種多様であるが、糖タンパク質、神経ペプチド、イムノグロブリン、酵素、ペプチド及びホルモンが挙げられる。より具体的にはヒトα１アンチトリプシン、ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ、ｔＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、アンチスロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、フィブリノーゲン、ヒト血液凝固因子ＩＸなどが挙げられる。
【００２４】
上記のようにして得られたクローン哺乳動物、その胎仔、子孫に由来する細胞、組織、器官はドナー細胞であるＮＫＴ細胞と同一の組織適合性抗原（例えばヒトではＨＬＡ）を有し、得られたクローン哺乳動物、その胎仔、子孫に由来する細胞、組織、器官を、ドナー細胞の提供者である哺乳動物に移植した場合、非自己と認識されることなく免疫寛容状態となり、免疫拒絶反応が起こらない。
【００２５】
さらに、本発明のクローン哺乳動物の子孫は以下の特徴を有する（後述の実施例に詳細を述べる）。
（１）個体内で発現するＴＣＲＶβ鎖が実質的に単一のＴＣＲＶβ鎖レパートリー、特にドナー細胞として用いたＮＫＴ細胞のＴＣＲＶβ鎖レパートリーと同一である。
（２）ＮＫＴ細胞の数が増加している。
ＴＣＲ遺伝子群の再構成は、そのＴ細胞の分化及び選択に関与する膨大な数のリンパ球のレパートリー形成において重要な役割を果たす。例えば組み換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）の発現は、これらの遺伝子再構成に必須であり、ＲＡＧの異常や欠損により重症複合型免疫不全症やオーメン症候群が発症することが明らかにされている。
上記（１）のような、個体内のＴＣＲがある特定の一種類に限定されるという現象はＴＣＲトランスジェニック動物以外に報告例がなく、このような特徴を有するクローン哺乳動物の子孫を用いることによって、本来１０万個や１００万個に１つといったただ一種類のＴ細胞クローンの分化と選択を個体レベルで観察することができる。例えば単一のＴＣＲＶβ鎖を発現するＴ細胞ではαβ型のＴＣＲを発現しγδ型のＴＣＲの発現が抑制されている。かかる現象は大腸炎等の腸疾患で観察される現象と類似しており、従って本発明のクローン哺乳動物の子孫は、大腸炎等のモデル動物としても有用である。さらに本発明の遺伝子再構成済みのＴＣＲα鎖であるＶα１４−Ｊα２８１を含む対立遺伝子を有するクローン哺乳動物の子孫では、ＮＫＴ細胞の数が増加している。ＮＫＴ細胞の数の増加は、全脾臓細胞に対する割合（ＮＫＴ細胞の割合）においても、また絶対数においても認められる。ＮＫＴ細胞が免疫系を制御する機能を有する細胞であることから、よりＮＫＴ細胞の数の多い本発明のクローン哺乳動物の子孫は、ＮＫＴ細胞が関与している疾患及び／又は病態の研究、特に自己免疫疾患やアレルギー疾患の発症機構、移植骨髄拒絶、腫瘍免疫の解明に大きく貢献することが期待される。より具体的な疾患及び／又は病態としては、ヒトおよび動物における炎症状態、種々の疼痛、膠原病、自己免疫疾患、種々の免疫疾患、特に関節および筋肉における炎症および疼痛（慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節症、尿酸性関節炎等）、皮膚の炎症性状態（湿疹等）、眼の炎症性状（結膜炎等）、炎症を伴う肺の障害（喘息、気管支炎等）、炎症を伴う消化器の状態（アフタ性潰瘍、クローン病、萎縮性胃炎、いぼ状胃炎、潰瘍性大腸炎、脂肪便症、限局性回腸炎、過敏性腸症候群等）、歯肉炎、（手術または障害後の炎症、疼痛、腫脹）、炎症に関連した発熱、疼痛、その他の状態、移植による拒絶、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、多発性軟骨炎、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、炎症性慢性腎状態（糸球体腎炎、ループス腎炎、膜性腎炎等）、リウマチ熱、シェーグレン症候群、ベーチェット病、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、グレーヴス病、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、再生不良性貧血等）、ぶとう膜炎、接触皮膚炎、乾癬、川崎病、Ｉ型アレルギー反応が関与する疾患（アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、花粉症等）、ショック（敗血性ショック、アナフィラキシー性ショック、成人型呼吸窮迫症候群等）、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、ホジキン病、癌（肺癌、胃癌、結腸癌、胃癌、肝癌等）、ウイルス疾患（肝炎）等が例示される。
【００２６】
本発明はまた、上記した再構築胚（クローン胚、あるいはクローン哺乳動物胚ともいう）を用いるクローン哺乳動物ＥＳ細胞の作成方法及びそれによって得られるクローン哺乳動物ＥＳ細胞を提供する。ＥＳ細胞は、好ましくはインビトロ細胞培養で維持された胚から単離された、多能性を有する細胞を含む。ＥＳ細胞は、支持細胞の有無にかかわらず培養することができるが好ましくは支持細胞を用いる。支持細胞としては、当分野で通常用いられるものが利用できるが、例えばマウスＥＳ細胞の場合であればマウス胎仔由来の線維芽細胞を用いることができる。クローン哺乳動物ＥＳ細胞は、胚盤胞期の胚及び前胚盤胞期の胚を含む、任意の発生時期に胚から単離された胚性細胞から樹立することができる。より詳細にはドナー細胞であるＮＫＴ細胞の核を除核卵母細胞に導入し、得られたクローン哺乳動物胚を胚盤胞期及び／又は前胚盤胞期迄培養し、得られた内部細胞塊から単離することによって作成される。本明細書で用いる「内部細胞塊」という用語は、胚本体を生じる細胞を意味する。胚盤胞の外側に並ぶ細胞は、胚の栄養芽層と呼ばれる。胚から内部細胞塊を単離する方法は当業者に公知である。
【００２７】
当該クローン哺乳動物ＥＳ細胞は所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することができ、所望の分化細胞、組織ならびに器官を作成することができる。所望の細胞分化を誘導し得る条件は、その分化の種類や程度により設定されるべきであり、当業者には容易に設定することが可能である。例えば胚性幹細胞を造血幹細胞へと分化誘導し、さらに分化を進めて最終的に赤血球や白血球等の血液細胞を生じさせる。もしくは神経幹細胞に分化させ、個々の神経細胞に分化誘導させてやることが可能である。
【００２８】
本発明において得られた胎仔、産仔がドナー細胞であるＮＫＴ細胞由来であることの確認は、得られた胎仔、産仔の遺伝子、具体的にはＴＣＲ遺伝子を調べることによって行われる。ＮＫＴ細胞はＴＣＲ遺伝子が再構成され、その結果、例えばマウスでは、上述したようにα鎖については特徴的にＶα１４−Ｊα２８１を発現している。さらに遺伝子再構成の済んだＶβ鎖を有する。ＮＫＴ細胞の遺伝情報を引き継いだクローン哺乳動物の胎仔、産仔のゲノムＤＮＡについて、ＴＣＲＶα１４プローブ及び／又はＴＣＲＶβプローブを用いて、好ましくはＴＣＲＶα１４プローブ及びＴＣＲＶβプローブの両方を用いてサザンブロット解析を行い、そのＴＣＲ遺伝子が再構成されたものであるか、特にドナー細胞として用いたＮＫＴ細胞と同じＴＣＲ再構成パターンを示すか否かを確認することによって得られたクローン哺乳動物の胎仔、産仔がドナー体細胞であるＮＫＴ細胞由来であるか否かを判定することができる。また、再構成されたＴＣＲ遺伝子を継承しているか否かはＰＣＲ法によっても確認することができる。具体的な確認の手順は実施例にて後述する。
【００２９】
本発明の上記したクローン哺乳動物を作成する方法は、遺伝子操作された哺乳動物又はトランスジェニックな哺乳動物をクローニングするためにも利用できる。具体的には、ドナー細胞として所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われた哺乳動物のＮＫＴ細胞を用いることを特徴とし、より詳細には、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われた哺乳動物のＮＫＴ細胞の核を除核卵母細胞に導入して再構築胚（トランスジェニック胚）を形成し、該再構築胚を宿主哺乳動物に移入することによって実施される。「トランスジェニック胚」とは、１個又は複数の細胞が人の介入により導入された異種核酸を含む胚を意味する。導入遺伝子は、細胞の前駆体へ導入することにより、意図的な遺伝子操作により、又は組換えウイルスの感染により、細胞に直接又は間接的に導入することができる。本明細書に記載されるトランスジェニック胚では、導入遺伝子により細胞が所望の形質を示しうる構造遺伝子を発現する。しかしながら、導入遺伝子がサイレントな状態にあるトランスジェニック胚も含まれる。該トランスジェニック胚は、ドナー細胞の核が所望の形質を発現するよう遺伝子操作が行われた細胞の核である以外は、上記したクローン哺乳動物の作成の過程で得られるものと同様のものであり同様にして作成される。
【００３０】
本発明のトランスジェニック哺乳動物には、遺伝的変化又は遺伝情報が生殖細胞系に導入されることによって、遺伝情報を子孫に伝達する能力が付与される生殖細胞系のトランスジェニック動物をも包含される。
【００３１】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド又は前駆体の産生に必要な、調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。ポリペプチドは完全長のコード配列にコードされ得るか、又は所望の活性が保持されているかぎりはコード配列の任意の部分にコードされ得る場合がある。
【００３２】
「導入遺伝子」という用語は、動物のゲノムへ導入される任意の核酸を広く意味し、おそらく通常はゲノム上に存在しない配列を有する遺伝子もしくはＤＮＡ、存在するが所与のゲノムでは通常は転写及び翻訳（発現）されない遺伝子、又はゲノムへの導入が望まれる、他の任意の遺伝子もしくはＤＮＡを含むが、これらに限定されない。導入遺伝子には、非トランスジェニックゲノム上に通常存在するが、発現の変更が望まれる遺伝子、又は変更型又は異型としての導入が望まれる遺伝子が含まれる場合がある。導入遺伝子は、特異的に、限定された遺伝子座に向けられる場合があり、染色体内に無作為に組み込まれる場合があり、又は染色体外で複製するＤＮＡとなる場合がある。導入遺伝子は、１つ又は複数の転写調節配列、及び選択された核酸が適切に発現するために必要であり得る、イントロン等他の任意の核酸を含む場合がある。導入遺伝子は、コード配列又は非コード配列、又はそれらの組み合わせの場合がある。導入遺伝子は、適切な条件下で１つ又は複数の導入遺伝子の発現を駆動する能力をもつ、調節エレメントを含む場合がある。
【００３３】
「所望の形質を示しうる構造遺伝子」という用語は、例えば所望する形質（例えば生物学的な活性を示す）を示すタンパク質又はアンチセンスＲＮＡを発現する、構造遺伝子を意味する。構造遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌のゲノムもしくはエピソーム、真核生物の核ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は化学合成されたＤＮＡを含む、当技術分野で公知の任意の供給源に、全体として又は部分的に由来する場合がある。構造遺伝子配列は例えば、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞内情報伝達タンパク質、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、又はレポータータンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）等のポリペプチドをコードする場合がある。さらに構造遺伝子は心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫異常、老化等の特定の疾患又は障害に関連する遺伝子であってもよい。
【００３４】
構造遺伝子は、発現生産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、又は発現制御様式に影響を及ぼしうる１個又は複数の改変をコード領域又は非翻訳領域に含む場合がある。このような改変には、１個又は複数のヌクレオチドの変異、挿入、欠失、及び置換が含まれるがこれらに限定されない。構造遺伝子は連続したコード配列を構成しうるか、又は適切なスプライス接合に結合した、１個もしくは複数のイントロンを含みうる。構造遺伝子は融合タンパク質をコードする場合もある。
【００３５】
上記した本発明のクローン哺乳動物ＥＳ細胞の作成方法に準じた方法で、トランスジェニックの胚細胞を用いてトランスジェニック哺乳動物のＥＳ細胞を作成することもできる。得られたトランスジェニック哺乳動物ＥＳ細胞は、上述のクローン哺乳動物ＥＳ細胞と同様、所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することができ、所望の分化細胞、組織ならびに器官を作成することができる。得られた分化細胞、組織ならびに器官は所望の形質を示しうる構造遺伝子を有し、該遺伝子を発現することによって所望の形質を有する分化細胞、組織ならびに器官、あるいはそれらから産生される生産物を得ることができる。細胞、組織ならびに器官、あるいはそれらから回収される生産物の回収は当分野で通常実施されている方法を用いて行うことができ、所望の形質に応じて適宜設定される。さらに本発明で説明された方法を用いて、特定の疾患に関連した遺伝子を発現しうる、トランスジェニック霊長類のＥＳ細胞を作成することもできる。したがって本発明で説明された方法ならびに得られるＥＳ細胞等により、ヒトの多くの疾患を治療することができる。
【００３６】
本発明は、上記したように、クローン哺乳動物を作成する方法だけでなく、トランスジェニックなクローン哺乳動物を作成する可能性も提供する。このようなトランスジェニック哺乳動物は、重篤なヒト疾患の研究モデル、ならびに遺伝子及び細胞の治療方針の効力を評価するためのモデルとしても用いることが可能である。さらに本発明によって得られる幹細胞は、多くの疾患（例えば老化、エイズ、癌、アルツハイマー病、自己免疫異常、代謝障害、肥満、器官形成、精神疾患、及び生殖）の研究に極めて重要であると言える。
【００３７】
本発明のクローン哺乳動物及びトランスジェニック動物のＴＣＲＶβ鎖は単一でＮＫＴ細胞数が相対的、絶対的に増加していると考えられる。
【００３８】
クローン動物及びトランスジェニック動物を利用して、疾患の発症機構を発見し、かつ分子医学的な治療法の作成ならびに最適化を行うことができる。例えば、特定遺伝子に関して遺伝子ノックアウトにより作成した哺乳動物により、癌、心臓病及び脳卒中を引き起こす動脈硬化、先天性代謝異常、ならびに他の胎児性疾患及び新生児性疾患の治療法の発見が促進されうる。このような動物はまた、糖尿病、肝障害、腎障害、人工臓器の発達、創傷治癒、心臓発作による損傷、脳卒中による脳損傷、脊椎損傷、記憶喪失、アルツハイマー病、及び他の痴呆症、筋肉及び神経の損傷を含む、疾患の細胞療法の評価及び改善に適している。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。本出願全体を通して引用されたすべての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００４０】
実施例１：ＮＫＴ細胞由来のクローンマウスの作成
８週齢〜２３週齢（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ）Ｆ１雌性マウスの肝臓より単核細胞をＰｅｒｃｏｌｌ（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）比重遠心法により取得した。これらの細胞を自家で調製したＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）−α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（α−ＧＣ）が結合したＣＤ１ｄテトラマー（α−ＧＣ  ｌｏａｄｅｄ  ＣＤ１ｄ−ｔｅｔｒａｍｅｒ；Matsuda, J.L., O.V. Naidenko, L. Gapin, T. Nakayama, M. Taniguchi, C.R. Wang, Y. Koezuka, and M. Kronenberg. 2000. Tracking the response of natural killer T cells to a glycolipidantigen using CD1d tetramers. J Exp Med 192:741-754.）ならびにｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏ
ｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）−抗ＴＣＲＶβ抗体（Ｈ５７）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）で染色し、両者によって染められる細胞をＮＫＴ細胞とした（即ち、ＮＫＴ細胞は、α−ＧＣ  ｌｏａｄｅｄ  ＣＤ１ｄ−ｔｅｔｒａｍｅｒ＋／ＴＣＲβ＋で定義される）。
これらの細胞をｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＦＡＣＳ）（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社  ＭｏＦｌｏ（登録名））によりＰＥ＋／ＦＩＴＣ＋の細胞集団として純化し核移植のドナーとして使用した。ＮＫＴ細胞のソーティングは２回繰り返し、純度９９％以上でＮＫＴ細胞を得た。
【００４１】
レシピエントの卵子を排卵誘発剤処理されたＢ６Ｄ２Ｆ１の雌マウスより卵巣ｆｌｕｓｈｉｎｇによって取り出し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除いた後に、倒立顕微鏡下でピエゾマイクロマニピュレーターを用いて除核し核移植に用いた。ＮＫＴ細胞をピペット内に吸引しながらピエゾマイクロマニピュレーターの物理的刺激によりその細胞膜に傷をつけた。続いてピエゾマイクロマニピュレーターにより除核卵子の透明帯と細胞膜に窄孔しＮＫＴ細胞核を細胞質内に注入することによって核移植を行った。同様にしてＴ細胞を用いて、Ｔ細胞核を細胞質内に注入して得られる再構築卵子を得、対照として用いた。
核移植１時間後に再構築卵子をサイトカラシン及びストロンチウム入りＫＳＯＭ培地中で１時間活性化した後に、サイトカラシンのみを含むＫＳＯＭ培地で５時間培養、さらにＫＳＯＭ培地中で培養し、経時的に観察した。培養２４時間後にはＮＫＴ細胞由来及びＴ細胞由来のいずれの再構築胚でも、そのほとんどがＧ０期と思われる２細胞期の状態であった。さらに２４時間培養（合計４８時間）すると、Ｔ細胞由来の核を移植して得られた再構築胚では２細胞期のまま停止していたが、ＮＫＴ細胞由来の核を移植して得られた再構築胚では４細胞期に移行していた。さらに培養を続けると（合計７２時間）、ＮＫＴ細胞由来の核を移植した再構築胚では７１％がモルーラ・ブラストシストとなったのに対し、Ｔ細胞由来の核を移植した再構築胚ではその割合は１２％に過ぎなかった。
４８時間から７２時間（それぞれ４細胞ステージ、モルーラ・ブラストシストに対応）培養し、偽妊娠一日目のＩＣＲマウスの卵管に戻した。１９日後に帝王切開によって産仔を取りだした（図１）。
２７２個の胚を偽妊娠マウスに移植したところ４匹のマウスが生まれた（約１．５％の確率）。また胎盤のみの受胎産物が１３個あった（約４．８％の確率）。これらの結果は、ドナーとしてＥＳ細胞を用いた結果に酷似しており、分化した体細胞であるＮＫＴ細胞はマウスの再生産の為のゲノムの再プログラミングにＥＳ細胞と同様効果的であることがわかった。クローニングされた胎盤は全て、マウス体細胞クローニングに認められる胎盤過形成を中程度に、あるいは高程度に示した。上記の結果を表１及び図１１にまとめる。
【００４２】
【表１】
2006081542.tif 000002
【００４３】
得られたクローンマウスがＮＫＴ細胞由来であることを証明するためこの細胞特有のＴＣＲのサブユニットであるＶα１４を検出するサザンブロットを行った。
ＮＫＴ細胞はＴＣＲＶα鎖がＶα１４−Ｊα２８１のみの組み合わせを有する。もし作成されたクローンマウスがＮＫＴ細胞由来であるならば、このマウス、ならびに胎盤のゲノムＤＮＡはＶα１４−Ｊα２８１という遺伝子再構成済みのゲノムＤＮＡを持っているはずである。また同様にしてＶβ鎖も遺伝子再構成済みのゲノムＤＮＡを持っているはずである。サザンブロット用プローブは以下のようにして調製した。
サザンブロット用プローブの調製
以下のプライマーセットを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスの尾から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行った。各プライマーはＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社のカスタムプライマー合成を利用して作成した。
尚、ＰＣＲ産物の塩基配列はＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによって確認されている。＜ＴＣＲＶα１４サザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー＞
プライマー配列１：５’−ＣＧＣＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号１）
プライマー配列２：５’−ＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号２）
＜ＴＣＲＶβサザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー＞
プライマー配列３：５’−ＧＧＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号３）
プライマー配列４：５’−ＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号４）
図２にＴＣＲＶα１４サザンプローブの、図３にＴＣＲＶβサザンプローブのゲノム上での位置を示した。図２はＶα１４遺伝子近傍の様々なＶαフラグメントを模式的に表している。エクソン部は四角で描かれている。図３は、各Ｖβ、Ｄ、Ｊ、Ｃセグメントを模式的に表している。
ＥｃｏＲＩ（ＴＣＲＶα１４の場合）もしくはＢａｍＨＩ（ＴＣＲＶβの場合）でゲノムＤＮＡ５−３０μｇを消化後電気泳動によってＤＮＡ断片を分離し、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ＵＶクロスリンク後、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録名、ＴＯＹＯＢＯ社）液でプレハイブリダイゼーションを行い（６８℃，６０分）、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によってＲＩラベルされたＴＣＲＶα１４サザンプローブ、あるいはＴＣＲＶβサザンプローブを加え、６８℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ（６８℃）溶液で５分二回、さらに０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ（６８℃）溶液で１５分二回洗浄した。洗浄後のナイロン膜はＩｍａｇｅ  ｐｌａｔｅ（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）にて露光させ、同社のＩｍａｇｅ  ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＢＡＳ  ２５００にて解析を行った。
【００４４】
生まれてきた全てのマウスでＶα１４鎖の遺伝子再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が見られた。結果を図４に示す。
遺伝子再構成の起きていないｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎを有するゲノムＤＮＡではＶα−Ｊαという再構成された産物が存在しないためＶα１４プローブを用いてサザンブロットを行うと、１２９／Ｓｖ−ｔｅｒマウス由来の対立遺伝子を持つ場合２．５ｋｂのバンドを生じ（図４、レーン２）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の対立遺伝子を持つ場合約１３ｋｂのバンドを生じる（図４、レーン１）。これはＥｃｏＲＩで消化したときに生ずる断片が１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ由来の場合とＣ５７ＢＬ／６由来の場合とで異なる為である。ドナー細胞が由来するＣ５７ＢＬ／６ｘ １２９／Ｓｖ−ｔｅｒマ
ウスでは両方の対立遺伝子を有し、約２．５ｋｂのバンドと約１３ｋｂのバンドの両方を生じる（図４、レーン３）。クローンマウス＃１、＃３及び＃４では、遺伝子再構成を終了したＶα１４遺伝子座を持つゲノムＤＮＡでは組換えにより８ｋｂのバンドが検出されるようになるが約１３ｋｂと２．５ｋｂのバンドはそのままであった（図４、レーン４及びレーン５、レーン８、レーン９）。後述するＴＣＲＶα鎖の塩基配列決定の結果ともあわせて考えると、この８ｋｂのバンドはクローンマウスにおいてＣ５７ＢＬ／６由来の対立遺伝子に由来するものであることがわかる。尚、遺伝子再構成後も約１３ｋｂのバンドが残るのはＣ５７ＢＬ／６種の対立遺伝子中においてＶα１４の遺伝子が二つ存在しており、一方が偽遺伝子のためと考えられる。
また、クローンマウス＃２では、遺伝子再構成を終了したＶα１４遺伝子座を持つゲノムＤＮＡでは組換えにより８ｋｂのバンドが検出されるようになり、約１３ｋｂのバンドはそのままであったが２．５ｋｂのバンドが消失していた。このことから１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ由来の対立遺伝子にも遺伝子再構成が起こったことが予想される（図４、レーン６及びレーン７）。ＤＮＡ塩基配列の結果（図６）からクローンマウス＃２においては１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ由来のＶα１４−Ｊα２８１が使用されていることが明らかになった。
【００４５】
同様にＴＣＲＶβのサザンブロットを行ったところ片側もしくは両方の対立遺伝子がｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔしていた。遺伝子再構成の起きていないｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎのゲノムＤＮＡでは１０．４ｋｂのバンドしか生じないのに対して遺伝子再構成を終了した遺伝子座を持つものは組換えによりさまざまな大きさのバンドを生じる。結果を図４に示す。
【００４６】
また、クローンマウスの作成過程で、産仔に至らず空の胎盤のみを得る場合がある。得られた空の胎盤のゲノムＤＮＡを抽出し同様にＴＣＲＶα１４とＴＣＲＶβのサザンブロット解析を行った。その結果、空の胎盤由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットパターンは、クローンマウスの尾由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットパターンとＶα１４鎖、Ｖβ鎖とも一致していた。（但し、胎盤由来のゲノムＤＮＡには仮母親由来のバンドが観察される場合もある。ＴＣＲＶβの場合は１０．４ｋｂ）。
【００４７】
さらにこれらのゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行いＶα鎖とＪα鎖のＤＮＡ配列を検討した。クローンマウス（クローンマウス＃１、＃２及び＃４）の尾あるいはその胎盤よりゲノムＤＮＡを抽出し、Ｖα１４−Ｊα２８１の配列をＰＣＲによって増幅させた。もし、これらのゲノムＤＮＡの対立遺伝子が両方とも遺伝子再構成以前のｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）ならばＰＣＲ産物は生じない。なぜならＶα１４とＪα２８１の遺伝子断片は数メガｂ以上離れて存在する為、ＰＣＲで増幅することができないからである。しかし遺伝子再構成された場合には３３０ｂｐ程度のＰＣＲ産物を生じるはずである（図５参照）。さらにＶα１４遺伝子中に配列ポリモルフィズムが存在するので得られた産物のＤＮＡ配列を決定すればそのＶαが１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ由来なのかＣ５７ＢＬ／６由来なのか区別が付く（ドナーＮＫＴ細胞はＣ５７ＢＬ／６と１２９／Ｓｖ−ｔｅｒとのＦ１である）（図６参照）。
Ｖα１４−Ｊα２８１検出用ＰＣＲプライマーは以下の通りである。図５に各プライマーのゲノム上での位置を模式的に示した。
＜Ｖα１４−Ｊα２８１検出用ＰＣＲプライマー＞
プライマー配列５：５’−ＣＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＣＴ−３’（配列番号５）
プライマー配列６：５’−ＡＧＧＴＡＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣ−３’（配列番号６）
クローンマウスの胎盤ならびに尾よりのゲノムＤＮＡを鋳型にして上記プライマー（プライマー５ならびに６）の組み合わせによりＰＣＲを行った（鋳型ＤＮＡ５０ｎｇについて、各プライマー濃度０．２μＭでＡＢＩ社のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを使用し、９４℃で１０分処理し、９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分のサイクルを３６回行った）ところ約３３０ｂｐ程度のＰＣＲ産物が得られた（図５、ＰＣＲ図、それぞれレーン２及びレーン９）。一方、コントロールであるＣ５７ＢＬ／６、１２９／Ｓｖｊ、もしくは血液幹細胞由来クローンマウスのゲノムＤＮＡでは予想どおり産物が得られなかった（図５）。このＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列を決定したところ図６に示すように遺伝子再構成済みインフレームのＴＣＲＶα１４−Ｊα２８１を有していることがわかった。クローンマウス＃１及び＃４はＣ５７ＢＬ／６型であり、クローンマウス＃２は１２９／Ｓｖ−ｔｅｒ型であった。
【００４８】
ＮＫＴ細胞においてＴＣＲＶβ鎖はＴＣＲＶα鎖と異なり一義的に決定されていない。そこでどのＶβ鎖が使用されているのかを調べるためさまざまなＶβ鎖を検出しうるプライマーを使用してクローンマウス＃１の尾と胎盤ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行いＤＮＡ塩基配列を決定した（各プライマーのゲノム上の位置は図３参照）。使用したＰＣＲプライマーの組み合わせは下記に示すプライマーの群Ａから任意の一本とプライマーの群Ｂの任意の一本である。この場合もＴＣＲＶα鎖と同様、遺伝子再構成の終了しているＴＣＲＶβ遺伝子座を有する対立遺伝子からはＰＣＲの産物が得られるのに対しｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎをもつ通常の対立遺伝子からは産物が得られない。
【００４９】
＜ＴＣＲＶβ検出用ＰＣＲプライマー＞
プライマー群Ａ（ＴＣＲＶβ側）；
プライマー配列７（Ｖβ２用）：５’−ＣＡＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＡＣＧＧＡＧＣ−３’（配列番号７）
プライマー配列８（Ｖβ３用）：５’−ＴＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号８）
プライマー配列９（Ｖβ４用）：５’−ＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴ−３’（配列番号９）
プライマー配列１０（Ｖβ５用）：５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１０）
プライマー配列１１（Ｖβ６用）：５’−ＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号１１）
プライマー配列１２（Ｖβ７用）：５’−ＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１２）
プライマー配列１３（Ｖβ８用）：５’−ＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＣＡ−３’（配列番号１３）
プライマー配列１４（Ｖβ１１用）：５’−ＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）
プライマー配列１５（Ｖβ１２用）：５’−ＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１５）
プライマー群Ｂ；
プライマー配列１６：５’−ＧＡＡＧＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴＴＡＣＣＴＴ−３’（配列番号１６）
プライマー配列１７：５’−ＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴ−３’（配列番号１７）
【００５０】
塩基配列決定した結果を図７に示す。クローンマウス＃１は遺伝子再構成済みインフレームのＶβ８Ｓ２−Ｄ1−Ｊβ２Ｓ５の枠組みを有し、クローンマウス＃２は、Ｖβ８Ｓ３−Ｄ１−Ｊβ１Ｓ４であった。さらにＶβ表現型についてクローンマウス＃１及び＃２の末梢血をＦＡＣＳで解析したところ、ドナー細胞のそれとは異なりその殆ど全てがＴＣＲＶβ８陽性であった（図１２）。このことは、両クローンマウスにおいて対立遺伝子排除が起こっていることを示している。これらのクローンマウスは外見上何の異常も認められず誕生より１２ヶ月以上経た現在でも少々の肥満傾向以外は全く正常である（２００５年６月現在）。
【００５１】
以上の結果より、本発明で得られたクローンマウスの由来は、遺伝子再構成の済んだ末梢のＮＫＴ細胞であることが確認された。
【００５２】
実施例２：ＮＫＴ細胞からのＥＳ細胞株の樹立
ＮＫＴ細胞由来の核を用いて実施例１で記載した直接核移植方法によりＥＳ細胞樹立を試みた。９７ヶのＮＫＴ細胞をピペットで傷をつけ前述の方法で脱核した卵子に移植した。移植後６０時間（Ｄａｙ２．５、８細胞状態、ｅｍｂｒｙｏ）でＥＳ用培地（ＦＣＳ、Ｌ−ｇｌｕ、ＮＥＡＡ、Ｐ／Ｓ、ＬＩＦ及び２ＭＥを含有するＤＭＥＭ）を用いて細胞を洗浄し、予め準備された胎児性線維芽細胞上に播き直した（１  ｅｍｂｒｙｏ／培養皿）。その後３７℃、７％ＣＯ２条件下で内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ；ＩＣＭ）が十分に成長するまで培養を行ったところ（７〜１０日程度）１６ヶのＩＣＭをもつ細胞が得られた。さらにＩＣＭをシリンジ、針を用いて小片に分断しＥＳコロニーが確認されるまで培養を継続した。これら一連の工程により１１ヶのＥＳ細胞株が得られた。これらのうち５ヶは分化してしまったが６ヶのＥＳ細胞株を樹立できた。さらにこれら６ヶのＥＳ細胞株のキメラマウス形成能を検討したところ４ヶのＥＳ細胞についてキメラマウスを作成させる能力が確認できた。一連の経過をまとめたものを表２に示す。
【００５３】
【表２】
2006081542.tif 000003
【００５４】
さらに得られたＥＳ細胞について、実施例１と同様にしてＴＣＲＶα遺伝子座をＰＣＲにより解析した（図５、レーン３〜８）。結果、いずれも３３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、遺伝子再構成が行われていることが証明された。さらに実施例１と同様にしてサザンブロット解析を行った。結果、ドナー細胞であるＮＫＴ細胞と同じ遺伝子再構成されたＴＣＲＶα１４鎖を有し、又ＴＣＲＶβ鎖についても遺伝子再構成されていることを確認した（図８、レーン１〜６）。
【００５５】
実施例３：クローンマウスの子孫（クローンマウスの生殖能力）
ＮＫＴ細胞由来のクローンマウスの生殖能力を調べるため、クローンマウス＃１をＩＣＲ、Ｃ５７ＢＬ／６株の雌マウスと交配させた。その結果三ヶ月で４７匹の子供が生まれた。この事実よりこのクローンマウスの生殖能力は正常であると判断される。これらの子供（子孫Ｆ１）においてゲノムＤＮＡがどのようになるのかサザンブロット解析を行った。クローンマウス由来の遺伝子再構成済みのＴＣＲＶα１４由来の８ｋｂのバンドを受け継いだＦ１が雄１番、雌６番に見られ、クローンマウスの遺伝子再構成の終了した対立遺伝子ＴＣＲＶα１４鎖が生殖細胞に受け継がれていることが確認された（図９、上段、矢印）。また親であるクローンマウス＃１由来のＴＣＲＶβを含む対立遺伝子はそれぞれ約９ｋｂと８ｋｂに分離している（図４参照）が、各Ｆ１は母親マウス由来の１０．４ｋｂのバンド（図９、下段、白矢頭）と約９ｋｂもしくは８ｋｂのバンドを受け継いでいる（図９、下段、黒矢頭）。例えば雄の１番、ならびに雌の３、６及び７番は約９ｋｂのバンドを、雄２〜６、雌１、２、４、５及び８番は約８ｋｂのバンドを受け継いでいることがわかる。すなわち、ＴＣＲＶβ鎖については父親のクローンマウスのもつ遺伝子再構成済みのゲノムを含む対立遺伝子がそれぞれ一本ずつ引き継がれていくことが判明した（図９）。これらの事実よりこれらの遺伝子再構成済みゲノムＤＮＡは子孫に伝播されていくことが証明された。
【００５６】
遺伝子再構成された対立遺伝子を持つＮＫＴクローンマウスの子孫のＴ細胞、ＮＫＴ細胞の細胞表面抗原をＦＡＣＳによって解析した。ＮＫＴクローンマウスＦ１の脾臓並びに肝臓で解析した。脾臓は２枚のスライドガラス上で押しつぶして単細胞にして赤血球を除去し染色に用いた。また肝臓は７５μｍの網目の直径をもつ金属性のメッシュですりつぶし、Ｐｅｒｃｏｌｌの密度勾配によって単核細胞まで調製し、その後赤血球を除去し単細胞として染色に用いた。これらの細胞は全ＴＣＲＶβを認識する抗体である抗ＴＣＲＶβ抗体（実施例１で用いたものと同じ）並びにＴＣＲＶβ８のみを認識する抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社商品番号５５３８６１）で染色してＦＡＣＳ解析することによりクローンマウス子孫におけるＴＣＲＶβ８の割合を調べた。結果を図１０の上段に示す。又、同様に脾臓及び肝臓を単一細胞まで分解した後、ＣＤ１ｄテトラマー（実施例１で用いたものと同じ）及び抗ＴＣＲＶβ抗体（実施例１で用いたものと同じ）で染色してＦＡＣＳ解析することによりクローンマウス子孫におけるＮＫＴ細胞の割合を調べた。結果を図１０の下段に示す。ＴＣＲＶβ８を発現する割合は脾臓においては野生型がＴ細胞の２０％強であるのに対してＴＣＲＶβ８をインフレームで受け継いだマウス（図１０、２のパネル）ではほぼ１００％であった。肝臓においても同様の傾向が見られた。野生型の脾臓細胞においてはα−ＧＣ  ｌｏａｄｅｄ  ＣＤ１ｄ−ｔｅｔｒａｍｅｒ＋／ＴＣＲβ＋で定義されるＮＫＴ細胞の割合は全脾臓細胞のおよそ０．５％であったが、遺伝子再構成済みＶα１４−Ｊα２８１を受け継いだもの（図１０、３のパネル）では約１３％まで上昇していた。このマウスにおいて全脾臓細胞数は野生型の半分程になっていたがＮＫＴ細胞の絶対数では１３倍程度になっていた（図１０）。
以上の結果より、遺伝子再構成済みのインフレームのＴＣＲＶβ鎖を遺伝的に受け継いだクローンマウスの子孫は、そのＴ細胞上に発現するＴＣＲＶβ鎖はほぼ全てインフレームで規定された一義的なＶβ鎖レパートリーで構成されている。すなわちトランスジェニックマウスで観察されるようないわゆる対立遺伝子排除が観察される。さらにＴＣＲＶα１４−Ｊα２８１を受け継いだ子孫はＮＫＴ細胞の絶対数、割合とも野生型に比較して１０〜２０倍に上昇している。尚、これらの結果はＩＣＲとのＦ１の結果であるがＣ５７ＢＬ／６と交配したＦ１でも同様の傾向が観察された。
【００５７】
実施例４：クローンマウスの子孫（ＮＫＴ細胞の働き）
本実施例では、クローンマウスの子孫のＮＫＴ細胞の働きについて確認した。α−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）で刺激した場合のサイトカイン産生をインビトロ及びインビボで調べた。
クローンマウス＃１とメスＣ５７ＢＬ／６とを掛け合わせてＦ１を作成した。その後このＦ１の雄のうち遺伝子再構成済みであるＶa１４−Ｊa２８１を含むものをＩＶＦ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によってＳＰＦ化し再びメスＣ５７ＢＬ／６と掛け合わせて子孫を得た（Ｖα１４−Ｊα２８１マウス）。三ヶ月齢のＶα１４−Ｊα２８１マウスと、齢を適合させた同腹仔（対照マウス）を用いて実験を行った。
インビボ刺激によるサイトカイン産生
（方法）
２μｇ／マウスの用量でα−ＧＣをマウスに腹腔内投与してインビボ刺激を行った。インビボ刺激したマウスの血清を所定の時間で採取し、血清中の各種サイトカイン濃度をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で測定した。
（結果）
結果を図１３に示す。Ｖα１４−Ｊα２８１マウス（遺伝子再構成済みＶα１４−Ｊα２８１をｇｅｒｍｌｉｎｅでヘテロに受け継ぐマウス）についてサイトカイン（ＩＬ（インターロイキン）−２，４，１０、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＬ−１β、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）、ＩＦＮ（インターフェロン）−γ）産生能力の増強が確認された。実施例３で確認されたＮＫＴ細胞の絶対数及びその割合の上昇に加え、その機能も維持されていることが確認された。
【００５８】
インビトロ刺激によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生
（方法）
ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてマウス（Ｖα１４−Ｊα２８１マウス、あるいは同腹仔の対照マウス）の脾臓から樹状細胞（ＤＣ）を得た。各マウス由来の樹状細胞をα−ガラクトシルセラミド（２００ｎｇ／ｍＬ）で６時間刺激し、それぞれのマウス由来の脾臓細胞（ＳＰＣ）と混合した。これらの細胞を７２時間共培養しＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生をＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＴＥＣＨＮＥ，Ｍｅｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。
（結果）
結果を図１４に示す。対照マウスに比べてＶα１４−Ｊα２８１マウス由来の脾臓細胞においてＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生能が増大されていることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号１：ＴＣＲＶα１４サザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１）
配列番号２：ＴＣＲＶα１４サザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー（プライマー配列２）
配列番号３：ＴＣＲＶβサザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー（プライマー配列３）
配列番号４：ＴＣＲＶβサザンプローブ調製用ＰＣＲプライマー（プライマー配列４）
配列番号５：ＴＣＲＶα１４−Ｊα２８１検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列５）配列番号６：ＴＣＲＶα１４−Ｊα２８１検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列６）配列番号７：ＴＣＲＶβ２検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列７）
配列番号８：ＴＣＲＶβ３検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列８）
配列番号９：ＴＣＲＶβ４検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列９）
配列番号１０：ＴＣＲＶβ５検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１０）
配列番号１１：ＴＣＲＶβ６検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１１）
配列番号１２：ＴＣＲＶβ７検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１２）
配列番号１３：ＴＣＲＶβ８検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１３）
配列番号１４：ＴＣＲＶβ１１検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１４）
配列番号１５：ＴＣＲＶβ１２検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１５）
配列番号１６：ＴＣＲＶβ検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１６）
配列番号１７：ＴＣＲＶβ検出用ＰＣＲプライマー（プライマー配列１７）
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＮＫＴ細胞由来のクローンマウス作成並びにＥＳ細胞株の樹立の概要を示す模式図である。
【図２】ＴＣＲＶα鎖遺伝子座の模式図ならびにプライマーの位置を示す模式図である。
【図３】ＴＣＲＶβ鎖遺伝子座の模式図ならびにプライマーの位置を示す模式図である。
【図４】ＮＫＴクローンマウス＃１（尾と胎盤）、＃２（尾と胎盤）、＃３（胎盤）、＃４（死産、胎盤）のゲノムＤＮＡを使用したサザンブロット解析の結果を示す図（電気泳動写真）である。白抜き矢頭は遺伝子再構成の起こったバンドを、黒塗り矢印は遺伝子再構成の起こる以前のバンドを示している（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）。
【図５】クローンマウスにおいてＴＣＲＶα１４−Ｊα２８１遺伝子再構成が行われていることをＰＣＲ法を利用して証明した図（電気泳動写真）である。
【図６】ＮＫＴ細胞由来クローンマウスにおけるＴＣＲＶα鎖塩基配列を示した図である。
【図７】ＮＫＴ細胞由来のクローンマウスにおけるＴＣＲＶβ鎖塩基配列を示した図である。
【図８】ＮＫＴ細胞由来のＥＳ細胞（レーン１〜６）ゲノムＤＮＡを使用したサザンブロット解析の結果を示した図（電気泳動写真）である。プローブはクローンマウス解析に使用したものと同じである。ＴＣＲＶα１４プローブによって１３ｋｂのバンドのシフトが見られる（レーン１〜６）とともにレーン３及び４のＥＳ細胞では２．５ｋｂのバンドの消失が観察された。また、ＴＣＲＶβプローブを用いた場合にも遺伝子再構成の済んだバンドが観察された。白抜き矢頭は遺伝子再構成の起こったバンドを示している。黒塗り矢印は遺伝子再構成の起こる以前のバンドを示している（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）。
【図９】ＮＫＴクローンマウス＃１とＩＣＲ種マウスとの掛け合わせによるＦ１でのサザンブロット解析の結果を示した図（電気泳動写真）である。クローンマウス由来の遺伝子再構成済みのＴＣＲＶα１４由来８ｋｂのバンドを受け継いだＦ１が雄１番、雌６番に見られる（上部パネル、矢印）。又、クローンマウス＃１由来のＴＣＲＶβを含む対立遺伝子はそれぞれ約９ｋｂと８ｋｂに分離している（図４参照、黒塗り矢頭）。各Ｆ１は母親マウス由来の１０．４ｋｂのバンド（白抜き矢頭）と約９ｋｂ若しくは８ｋｂのバンドを受け継いでいる。
【図１０】ＮＫＴクローンマウス＃１とＩＣＲ種との掛け合わせによるＦ１でのＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。上段はクローンマウス子孫におけるＴＣＲＶβ８の割合を全ＴＣＲＶβ陽性細胞中に占める割合として示した。下段はクローンマウス子孫におけるＮＫＴ細胞の割合を示す。パネル１は、コントロールのＩＣＲ種マウス（野生型）の、パネル２は、遺伝子再構成の終了したＴＣＲＶβ８をインフレームで遺伝的に継承するマウスの、パネル３は、Ｖα１４−Ｊα２８１の遺伝子再構成が終了しこれを継承するマウスの結果をそれぞれ示している。ＮＫＴ細胞群を円で囲み、全細胞数に対するＮＫＴ細胞の数としてパーセント（％）で示した。
【図１１】ＮＫＴ細胞核あるいはＴ細胞核を移植して得られる再構築胚のインビトロ培養（４８ならびに７２時間）における分化あるいは生存の状況を解析した結果を示す図であり、表１の４８ならびに７２時間での結果をグラフ化したものである（マウスの誕生は除く）。縦軸は培養胚の経時的な生存率を示したもの、あるいは偽妊娠マウスに再構築胚を導入した場合の個体の発生率（移植胚の誕生率）を示したものである。＊ｐ＜０．０００１；＊＊ｐ＜１×１０−２５
【図１２】クローンマウス（＃１、＃２）の末梢リンパ球のＦＡＣＳ解析の結果（ＴＣＲＶβ  ｖｓ  ＴＣＲＶβ８）を示す図である。
【図１３】α−ＧＣ刺激後、０、４、１２、２４時間経過後のマウスから血清を採取し、得られた血清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）レベルをＥＬＩＳＡ法により測定した。各測定時で４匹のマウスについて測定した。縦軸に各サイトカイン濃度を示し、横軸に測定ポイントを示す。データは平均±標準偏差で表した。
【図１４】あらかじめa−ＧＣ処理を施した樹状細胞（ＤＣ）（５×１０４細胞）と応答細胞となる脾臓細胞（ＳＰＣ）（１×１０６細胞）との混合培養物の培養上清中のＩＬ−４及びＩＦＮ−γの量を測定した。縦軸に各サイトカインの濃度を示し、横軸に脾臓細胞の由来を示す。データは３回測定してその平均±標準偏差で表した。
【図３】
2006081542.tif 000004
【図６】
2006081542.tif 000005
【図７】
2006081542.tif 000006
【図１１】
2006081542.tif 000007
【図１３】
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【図１４】
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【図１】
2006081542.tif 000010
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2006081542.tif 000016
【図１２】
2006081542.tif 000017
【配列表】
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