(57)【要約】【課題】  毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該タンパク質の作成方法および該タンパク質の利用法の提供を課題とする。【解決手段】  上記課題を解決するために、本発明者らは、毛翅目昆虫の絹繊維の構成タンパク質であるフィブロイン遺伝子のクローニングを行い、該タンパク質の単離および一次構造の解明に成功した。本発明により、毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質はいくつかのアミノ酸集合体が反復する構造を持ち、アミノ酸の構成としては、多くのプロリンを含むが、アラニンはほとんど含まないという特徴を持つことが分かった。本発明のタンパク質は水中で繊維化し、長時間水中にあっても強度が変化しない特殊な素材の原料となるため、繊維生産などの分野において新しい繊維素材として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
以下の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のDNA。
〔｛(X1)n1 - X2｝n2 - ｛(X1)n3 - X3 - X4 - (X5)n4 - X6｝2 - X1 - X7 - (X8 - X3 - X4 - X6)n5〕n6 - {(X1)3 - X4 - X6}n7 - X9
式中、n1は3または4、n2は３から５、n3は2または3、n4は0から3、n5は1または2、n6は10から15、n7は２または３の整数を示す。ここで、0とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
X1は、Y1 - Gly - Y2 - Y3 - Y4というアミノ酸配列で示され、Y1は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y2は科学残基質量１００未満のアミノ酸または正荷電アミノ酸、Y3は正荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Y4はGlyまたはArgである。
X2は、Y5 - Asp - Ser - Asp - Ile - Y6 - Gly - Asp - Glyというアミノ酸配列で示され、Y5は脂肪族アミノ酸、Y6はIleまたはMetである。
X3は、Gly - Y7 - Y8 - Y9 - Arg - Pro - Tyr - Glyというアミノ酸配列で示され、Y7は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y8はArgまたはGly、Y9はArgまたはSerである。
X4は、Gly - Tyr - Ser - Ala - Ser - Y10 - Ser - Val - Ser - Y11 - Gluというアミノ酸配列で示され、Y10は正荷電アミノ酸またはGly、Y11は疎水性アミノ酸である。
X5は、（Y12 - Y13 - Y12 - Y14）n8で示されるアミノ酸配列である。n8は１から３の整数を示す。
Y12は、Z1 - Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Z5 - Gluというアミノ酸配列で示され、Z1はSerまたはHis、Z2は正荷電アミノ酸またはGly、Z3は正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸または科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z4は疎水性アミノ酸、正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸、Z5は疎水性アミノ酸である。
Y13は、Z6 - Pro - Z7 - Z8 - Tyr - Z9 - Z10 - Pro - Z11 - Z12 - Z13 - Arg - Z14 - Pro - Lys - Z15というアミノ酸配列で示され、Z6はAla、ArgまたはGln、Z7は脂肪族アミノ酸、Z8は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Z9は正荷電アミノ酸、Z10は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z11は脂肪族アミノ酸、Z12は脂肪族アミノ酸、Z13はValまたはArg、Z14はAlaまたはArg、Z15は脂肪族アミノ酸である。
Y14は、Arg - Ile - Val - Z16 - Pro - Thr - Val - Ile - Thr - Z17 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z16は正荷電アミノ酸またはThr、Z17は正荷電アミノ酸である。
X6は、Gly - Y15 - Y16 - Gly - Y17というアミノ酸配列で示され、Y15はPro、IleまたはArg、Y16はArgまたはSer、Y17は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。
X7は、Val - Trp - Gly - Pro - Ser - Gly - Leu - Tyr - Gly - Asp - Ser - Gly - Ile - Y18 - Asp - Gly - Val - Tyr - Gly - Pro - Gly - Leuというアミノ酸配列で示され、Y18は脂肪族アミノ酸である。
X8は、Y19 - Gly - Pro - Y20というアミノ酸配列で示され、Y19はValまたはHis、Y20はGlyまたはArgである。
X9は、Leu - Arg - Pro - Y21 - Y22 - Gly - Ile - Val - Y23 - Pro - Gly - Val - Ile - Y24 - Y25 -  Gly - Val - Y26 - Ala - Pro - Gly - Leu - Val - Gly - Gly - His - Gly - Gly - Leu - Val - Asn - Val - Gly - Gly - Thr - His - Val - Leu - Pro - Gly - Thr - Ser - Val - Tyr - Thr - Thr - His - Pro - Asp - Pro - Arg - Thr - Val - Arg - Ser - Ser - Cys - Arg - Thr - Ser - Pro - Tyr - Asn - Leu - Leu - Ile - Lys - Val - Gly - Asn - Ala - Arg - Lys - Y27 - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示され、Y21はSerまたはCys、Y22は分子量１２０未満のアミノ酸、Y23は疎水性アミノ酸、Y24は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Y25はSerまたはHis、Y26は脂肪族アミノ酸、Y27は脂肪族アミノ酸である。
【請求項３】
Y1からY27、Z2からZ17が下記のアミノ酸である請求項２に記載の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
Y1がTyr、Trp、LeuまたはIleであり、Y2が任意に含まれていてもよいPro、Ser、ArgまたはGlyであり、Y3がArg、Tyr、His、Leu、PheまたはIleであり、Y5がLeuまたはValであり、Y7がLeuまたはTrpであり、Y10がGly、ArgまたはHisであり、Y11がAlaまたはValであり、Y17がTrpまたはValであり、Y18がValまたはLeuであり、Y22がProまたはSerであり、Y23がValまたはAlaであり、Y24がSerまたはGlyであり、Y26がValまたはIleであり、Y27がLeuまたはValである。
Z2がGly、Lys、ArgまたはHisであり、Z3がHis、Glu、Ala、SerまたはValであり、Z4がVal、Tyr、His、AspまたはGluであり、Z5がAla、ValまたはIleであり、Z7がValまたはIleであり、Z8がValまたはTyrであり、Z9がHisまたはArgであり、Z10がAlaまたはProであり、Z11がIleまたはValであり、Z12がIleまたはValであり、Z15がIleまたはValである。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである請求項３に記載のDNA。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項５】
毛翅目昆虫がHydropsyche angustipennis由来である請求項４に記載のDNA。
【請求項６】
以下の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のDNA。
｛ X1 - X2 ｝n1, X3
式中、n1は０から１０の整数を示す。ここで、０とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
X1は、Tyr - Gly - Arg - Y1 - Gly - Leu - Ser - Gly - Ser - Gly - Asp - Leu - Asp - Gly - Leu - Gly - Gly - Val - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Y2というアミノ酸配列で示され、Y1は、任意に含まれていてもよいArg - Leu - GlyもしくはGly - Leu - Gly、Y2は、GlyもしくはValである。
X2は、Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5,
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5または、
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5で示されるアミノ酸配列である。
Y3は、Arg - Gly - Tyr - Gly - Z1というアミノ酸配列で示され、Z1はSer - Ser - Gly, Pro - Thr - GlyもしくはSerである。
Y4は、Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Val - Gluというアミノ酸配列で示され、Z2は、Ser - Arg, Ser - Val, Ser - GlyまたはThr - Val、Z3は、SerまたはVal、Z4は、ValまたはLeuである。
Y5は、Z5 - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Glyというアミノ酸配列で示され、Z5は、Gly - Gly - Arg, Glu - Gly - Arg, Gly - Val - ArgまたはGly - Gly - Ileである。
Y6は、Arg - Arg - Gly - Lys - Valというアミノ酸配列で示される。
Y7は、Arg - Ile - Val - Thr - Pro - Gly - Z6 - Tyr - Z7 - Z8 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z6は、Val, IleまたはSer、Z7は、ThrまたはSer、Z8は、LysまたはGlnである。
X3は、
Arg - Phe - Gly - Gly - Phe - Val - Ser - Ser - Gly - Ser - Ser - Ser - Val - Glu - Ser - Val - Arg - Pro - Gly - Arg - Val - Leu - Ala - Gly - Leu - Gly - Arg - Val - Gly - Ala - Leu - Gly - Arg - Ser - Gly - Val - Val - Pro - Val - Pro - Ser - Val - Tyr - Thr - Asn - His - Pro - Gly - Asn - Ser - Val - Lys - Ser - Pro - Cys - Lys - Leu - Pro - Asp - Phe - Asn - Leu - Phe - Val - Lys - Val - Gly - Asn - Val - Arg - Lys - Ser - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示される。
【請求項７】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである請求項６に記載のDNA。
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項８】
毛翅目昆虫がLimnephilus decipiens由来である請求項７に記載のDNA。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項１１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
配列番号：１から３または５のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該タンパク質の作成方法および該タンパク質の利用法に関するものである。
【０００２】
本発明のフィブロインH鎖タンパク質は水中で繊維化し、長時間水中にあっても強度が変化しない特殊な素材の原料となるため、繊維生産などの分野において有用である。
【背景技術】
【０００３】
昆虫の作る絹繊維は広く使用されている。しかし、現在のところ市場に流布している大部分の絹繊維は絹糸昆虫であるカイコの作るものに限られている。これはカイコだけが容易に大量に飼育する技術が確立され、繭から大量の絹糸を回収できるためである。例外的には野蚕と呼ばれる絹糸虫に属するテンサン、サクサン、ヒマサンからも特徴のある絹繊維が作られているが、生産量はカイコに比較すると著しく少ない。
【０００４】
これらの昆虫の作る絹繊維は純粋なタンパク質からできており、その構成タンパク質はフィブロインとセリシンである。このうちフィブロインが最終的に絹繊維として残り、セリシンは繭から糸を作る過程で溶液中に流れ出し、絹繊維中にはほとんど残らない。
【０００５】
一方で、多くの昆虫やクモ、貝などの無脊椎動物が絹を作ることが知られている。良く知られているクモの例では、オニグモや女郎グモ等のように小動物を捕えるための巣をフィブロインからなる繊維でつくり、繊維の強度が非常に高いという特徴がある。これらの生物のフィブロインは生体の保護や固定、他生物の捕獲など、目的に応じて異なった性質を持つことが知られている。
【０００６】
また、単離されたフィブロインには創傷、火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促進作用があることから創傷被覆材としての使用や、その保湿効果を利用して化粧料としての使用が試みられている。また、肝機能向上機能、コレステロール低下作用、糖尿病予防などの効果も検討され、食品等への利用も行われている。このようにフィブロインは繊維の原料としてのみ使用されるのではなく、今後様々な分野への応用が期待されている。
【０００７】
しかしながら、カイコやクモ、野蚕の一部以外の昆虫由来フィブロインの遺伝子レベルでの研究はほとんど行われておらず、タンパク質の一次構造および種特有の機能の解明が待たれている。
【０００８】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】特許公開２００１−５７８５１
【特許文献２】特許公開２００１−１６３８９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、毛翅目昆虫の幼虫は水中で生活するため、水中で吐糸し繊維化する特殊な絹を作る。幼虫はこれらの繊維を小動物のトラップやシェルター等の作成に用いている。絹繊維はカイコなどの絹糸虫と同じように、幼虫期に存在する絹糸腺と呼ばれる特殊な器官で作り、口から吐糸する。毛翅目昆虫の絹糸腺は幼虫期にだけ存在し、蛹になると消失することが知られている。毛翅目昆虫が作る絹繊維は水中で繊維化し、長時間水中にあっても強度が変化しない特殊な素材であるが、これまでに、毛翅目昆虫の絹については現象のみが知られ、生化学的な解析は行われていなかった。絹繊維の主な構成成分としては、他の昆虫と同様フィブロインタンパク質が上げられるが、該タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列はこれまで明らかにされていなかった。
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該タンパク質の生産方法および該タンパク質の利用法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは、毛翅目昆虫の絹繊維の構成タンパク質であるフィブロイン遺伝子のクローニングを行い、該タンパク質の一次構造の解明を行った。
【００１２】
本発明者らは始めに、毛翅目昆虫であるHydropsyche angustipennisとLimnephilus  decipiensの絹糸腺より、メッセンジャーRNAを抽出し、これを利用してcDNAライブラリーを作成した。
【００１３】
次に、このライブラリーの各クローンのDNAをランダムに精製し、クローニングされた遺伝子の3’端をシークエンスした。2種の昆虫について、それぞれ約700と300個のクローンをシークエンスし、これを各昆虫の絹糸腺のESTデータベースとした。このデータベースを解析した結果、これらの昆虫のフィブロインは分子量の大きいＨ鎖と分子量の小さいＬ鎖から構成されていることが分かった。絹繊維としての性質は分子量の大きいフィブロインH鎖によって決まるため、H鎖のクローンを同定した。各データベースのフィブロインH鎖遺伝子のデータを整理した結果、これらの昆虫のフィブロインH鎖遺伝子は特徴のある構造をしており、この構造が水中における繊維化と、水中での強度に関係すると推測された。
【００１４】
即ち、本発明者らは、毛翅目昆虫の絹繊維の構成タンパク質であるフィブロインH鎖遺伝子を単離・同定することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１５】
本発明は、より具体的には、以下を提供するものである。
（１）毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質をコードするDNA。
（２）以下の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１）に記載のDNA。
〔｛(X1)n1 - X2｝n2 - ｛(X1)n3 - X3 - X4 - (X5)n4 - X6｝2 - X1 - X7 - (X8 - X3 - X4 - X6)n5〕n6 - {(X1)3 - X4 - X6}n7 - X9
式中、n1は3または4、n2は３から５、n3は2または3、n4は0から3、n5は1または2、n6は10から15、n7は２または３の整数を示す。ここで、0とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
X1は、Y1 - Gly - Y2 - Y3 - Y4というアミノ酸配列で示され、Y1は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y2は科学残基質量１００未満のアミノ酸または正荷電アミノ酸、Y3は正荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Y4はGlyまたはArgである。
X2は、Y5 - Asp - Ser - Asp - Ile - Y6 - Gly - Asp - Glyというアミノ酸配列で示され、Y5は脂肪族アミノ酸、Y6はIleまたはMetである。
X3は、Gly - Y7 - Y8 - Y9 - Arg - Pro - Tyr - Glyというアミノ酸配列で示され、Y7は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y8はArgまたはGly、Y9はArgまたはSerである。
X4は、Gly - Tyr - Ser - Ala - Ser - Y10 - Ser - Val - Ser - Y11 - Gluというアミノ酸配列で示され、Y10は正荷電アミノ酸またはGly、Y11は疎水性アミノ酸である。
X5は、（Y12 - Y13 - Y12 - Y14）n8で示されるアミノ酸配列である。n8は１から３の整数を示す。
Y12は、Z1 - Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Z5 - Gluというアミノ酸配列で示され、Z1はSerまたはHis、Z2は正荷電アミノ酸またはGly、Z3は正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸または科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z4は疎水性アミノ酸、正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸、Z5は疎水性アミノ酸である。
Y13は、Z6 - Pro - Z7 - Z8 - Tyr - Z9 - Z10 - Pro - Z11 - Z12 - Z13 - Arg - Z14 - Pro - Lys - Z15というアミノ酸配列で示され、Z6はAla、ArgまたはGln、Z7は脂肪族アミノ酸、Z8は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Z9は正荷電アミノ酸、Z10は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z11は脂肪族アミノ酸、Z12は脂肪族アミノ酸、Z13はValまたはArg、Z14はAlaまたはArg、Z15は脂肪族アミノ酸である。
Y14は、Arg - Ile - Val - Z16 - Pro - Thr - Val - Ile - Thr - Z17 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z16は正荷電アミノ酸またはThr、Z17は正荷電アミノ酸である。
X6は、Gly - Y15 - Y16 - Gly - Y17というアミノ酸配列で示され、Y15はPro、IleまたはArg、Y16はArgまたはSer、Y17は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。
X7は、Val - Trp - Gly - Pro - Ser - Gly - Leu - Tyr - Gly - Asp - Ser - Gly - Ile - Y18 - Asp - Gly - Val - Tyr - Gly - Pro - Gly - Leuというアミノ酸配列で示され、Y18は脂肪族アミノ酸である。
X8は、Y19 - Gly - Pro - Y20というアミノ酸配列で示され、Y19はValまたはHis、Y20はGlyまたはArgである。
X9は、Leu - Arg - Pro - Y21 - Y22 - Gly - Ile - Val - Y23 - Pro - Gly - Val - Ile - Y24 - Y25 -  Gly - Val - Y26 - Ala - Pro - Gly - Leu - Val - Gly - Gly - His - Gly - Gly - Leu - Val - Asn - Val - Gly - Gly - Thr - His - Val - Leu - Pro - Gly - Thr - Ser - Val - Tyr - Thr - Thr - His - Pro - Asp - Pro - Arg - Thr - Val - Arg - Ser - Ser - Cys - Arg - Thr - Ser - Pro - Tyr - Asn - Leu - Leu - Ile - Lys - Val - Gly - Asn - Ala - Arg - Lys - Y27 - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示され、Y21はSerまたはCys、Y22は分子量１２０未満のアミノ酸、Y23は疎水性アミノ酸、Y24は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Y25はSerまたはHis、Y26は脂肪族アミノ酸、Y27は脂肪族アミノ酸である。
（３）Y1からY27、Z2からZ17が下記のアミノ酸である（２）に記載の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
Y1がTyr、Trp、LeuまたはIleであり、Y2が任意に含まれていてもよいPro、Ser、ArgまたはGlyであり、Y3がArg、Tyr、His、Leu、PheまたはIleであり、Y5がLeuまたはValであり、Y7がLeuまたはTrpであり、Y10がGly、ArgまたはHisであり、Y11がAlaまたはValであり、Y17がTrpまたはValであり、Y18がValまたはLeuであり、Y22がProまたはSerであり、Y23がValまたはAlaであり、Y24がSerまたはGlyであり、Y26がValまたはIleであり、Y27がLeuまたはValである。
Z2がGly、Lys、ArgまたはHisであり、Z3がHis、Glu、Ala、SerまたはValであり、Z4がVal、Tyr、His、AspまたはGluであり、Z5がAla、ValまたはIleであり、Z7がValまたはIleであり、Z8がValまたはTyrであり、Z9がHisまたはArgであり、Z10がAlaまたはProであり、Z11がIleまたはValであり、Z12がIleまたはValであり、Z15がIleまたはValである。
（４）下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである（３）に記載のDNA。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
（５）毛翅目昆虫がHydropsyche angustipennis由来である（４）に記載のDNA。
（６）以下の構造式で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１）に記載のDNA。
｛ X1 - X2 ｝n1, X3
式中、n1は０から１０の整数を示す。ここで、０とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
X1は、Tyr - Gly - Arg - Y1 - Gly - Leu - Ser - Gly - Ser - Gly - Asp - Leu - Asp - Gly - Leu - Gly - Gly - Val - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Y2というアミノ酸配列で示され、Y1は、任意に含まれていてもよいArg - Leu - GlyもしくはGly - Leu - Gly、Y2は、GlyもしくはValである。
X2は、Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5,
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5または、
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5で示されるアミノ酸配列である。
Y3は、Arg - Gly - Tyr - Gly - Z1というアミノ酸配列で示され、Z1はSer - Ser - Gly, Pro - Thr - GlyもしくはSerである。
Y4は、Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Val - Gluというアミノ酸配列で示され、Z2は、Ser - Arg, Ser - Val, Ser - GlyまたはThr - Val、Z3は、SerまたはVal、Z4は、ValまたはLeuである。
Y5は、Z5 - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Glyというアミノ酸配列で示され、Z5は、Gly - Gly - Arg, Glu - Gly - Arg, Gly - Val - ArgまたはGly - Gly - Ileである。
Y6は、Arg - Arg - Gly - Lys - Valというアミノ酸配列で示される。
Y7は、Arg - Ile - Val - Thr - Pro - Gly - Z6 - Tyr - Z7 - Z8 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z6は、Val, IleまたはSer、Z7は、ThrまたはSer、Z8は、LysまたはGlnである。
X3は、
Arg - Phe - Gly - Gly - Phe - Val - Ser - Ser - Gly - Ser - Ser - Ser - Val - Glu - Ser - Val - Arg - Pro - Gly - Arg - Val - Leu - Ala - Gly - Leu - Gly - Arg - Val - Gly - Ala - Leu - Gly - Arg - Ser - Gly - Val - Val - Pro - Val - Pro - Ser - Val - Tyr - Thr - Asn - His - Pro - Gly - Asn - Ser - Val - Lys - Ser - Pro - Cys - Lys - Leu - Pro - Asp - Phe - Asn - Leu - Phe - Val - Lys - Val - Gly - Asn - Val - Arg - Lys - Ser - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示される。
（７）下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである（６）に記載のDNA。
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
（８）毛翅目昆虫がLimnephilus decipiens由来である（７）に記載のDNA。
（９）（１）から（８）のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
（１０）（９）に記載のベクターが導入された形質転換体。
（１１）（１）から（８）のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
（１２）（１０）に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、（１１）に記載のタンパク質の製造方法。
（１３）配列番号：１から３または５のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、毛翅目昆虫の絹繊維の構成タンパク質であるフィブロインH鎖タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。本発明のタンパク質は水中で繊維化し、長時間水中にあっても強度が変化しない特殊な素材の原料となるため、繊維生産などの分野において新しい繊維素材として有用である。近年、多くの組み換えタンパク質が遺伝子から大腸菌や酵母、動物細胞を用いて合成することができるようになってきた。カイコでも絹糸腺でコラーゲンや緑色蛍光タンパク質などが合成でき、繭糸として吐糸できることが明らかにされている。このようにして、作られたタンパク質は繊維化することも可能であり、今回見いだされた新しいフィブロイン遺伝子はこれまでにない特徴を持つ繊維を作る場合に有効であると考えられる。特に水中で繊維化することから、水中でものを接着する場合や耐水性の繊維を作る場合に有効であることが予想され、新しい素材をつくるための遺伝子として今後有効に利用されることが期待される。
【００１７】
また、フィブロインはこれまでに創傷、火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促進作用があることが知られている。本発明のフィブロインタンパク質を用いることで、新たな性質を持った創傷被覆材を開発できるものと考えられる。また、化粧料や食品原料など様々な応用が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、毛翅目昆虫の絹繊維の構成タンパク質であるフィブロインH鎖タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。毛翅目昆虫Hydropsyche angustipennisのフィブロインH鎖タンパク質をコードするcDNAの塩基配列を配列番号：１および３に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２および４に示す。また、毛翅目昆虫Limnephilus decipiensのフィブロインH鎖タンパク質をコードするcDNAの塩基配列を配列番号：５に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
【００１９】
本発明の毛翅目昆虫Hydropsyche angustipennis由来のフィブロインH鎖タンパク質の構造解析から導かれた機能的なタンパク質の構造は以下の構造式で示すことができる。
〔｛(X1)n1 - X2｝n2 - ｛(X1)n3 - X3 - X4 - (X5)n4 - X6｝2 - X1 - X7 - (X8 - X3 - X4 - X6)n5〕n6 - {(X1)3 - X4 - X6}n7 - X9
【００２０】
式中、n1は3または4、n2は３から５、n3は2または3、n4は0から3、n5は1または2、n6は10から15、n7は２または３の整数を示す。ここで、0とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
【００２１】
X1は、Y1 - Gly - Y2 - Y3 - Y4というアミノ酸配列で示され、Y1は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y2は科学残基質量１００未満のアミノ酸または正荷電アミノ酸、Y3は正荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Y4はGlyまたはArgである。
【００２２】
X2は、Y5 - Asp - Ser - Asp - Ile - Y6 - Gly - Asp - Glyというアミノ酸配列で示され、Y5は脂肪族アミノ酸、Y6はIleまたはMetである。
【００２３】
X3は、Gly - Y7 - Y8 - Y9 - Arg - Pro - Tyr - Glyというアミノ酸配列で示され、Y7は脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸、Y8はArgまたはGly、Y9はArgまたはSerである。
【００２４】
X4は、Gly - Tyr - Ser - Ala - Ser - Y10 - Ser - Val - Ser - Y11 - Gluというアミノ酸配列で示され、Y10は正荷電アミノ酸またはGly、Y11は疎水性アミノ酸である。
【００２５】
X5は、（Y12 - Y13 - Y12 - Y14）n8で示されるアミノ酸配列である。n8は１から３の整数を示す。
【００２６】
Y12は、Z1 - Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Z5 - Gluというアミノ酸配列で示され、Z1はSerまたはHis、Z2は正荷電アミノ酸またはGly、Z3は正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸または科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z4は疎水性アミノ酸、正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸、Z5は疎水性アミノ酸である。
【００２７】
Y13は、Z6 - Pro - Z7 - Z8 - Tyr - Z9 - Z10 - Pro - Z11 - Z12 - Z13 - Arg - Z14 - Pro - Lys - Z15というアミノ酸配列で示され、Z6はAla、ArgまたはGln、Z7は脂肪族アミノ酸、Z8は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸、Z9は正荷電アミノ酸、Z10は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Z11は脂肪族アミノ酸、Z12は脂肪族アミノ酸、Z13はValまたはArg、Z14はAlaまたはArg、Z15は脂肪族アミノ酸である。
【００２８】
Y14は、Arg - Ile - Val - Z16 - Pro - Thr - Val - Ile - Thr - Z17 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z16は正荷電アミノ酸またはThr、Z17は正荷電アミノ酸である。
【００２９】
X6は、Gly - Y15 - Y16 - Gly - Y17というアミノ酸配列で示され、Y15はPro、IleまたはArg、Y16はArgまたはSer、Y17は芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。
【００３０】
X7は、Val - Trp - Gly - Pro - Ser - Gly - Leu - Tyr - Gly - Asp - Ser - Gly - Ile - Y18 - Asp - Gly - Val - Tyr - Gly - Pro - Gly - Leuというアミノ酸配列で示され、Y18は脂肪族アミノ酸である。
【００３１】
X8は、Y19 - Gly - Pro - Y20というアミノ酸配列で示され、Y19はValまたはHis、Y20はGlyまたはArgである。
【００３２】
X9は、Leu - Arg - Pro - Y21 - Y22 - Gly - Ile - Val - Y23 - Pro - Gly - Val - Ile - Y24 - Y25 -  Gly - Val - Y26 - Ala - Pro - Gly - Leu - Val - Gly - Gly - His - Gly - Gly - Leu - Val - Asn - Val - Gly - Gly - Thr - His - Val - Leu - Pro - Gly - Thr - Ser - Val - Tyr - Thr - Thr - His - Pro - Asp - Pro - Arg - Thr - Val - Arg - Ser - Ser - Cys - Arg - Thr - Ser - Pro - Tyr - Asn - Leu - Leu - Ile - Lys - Val - Gly - Asn - Ala - Arg - Lys - Y27 - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示され、Y21はSerまたはCys、Y22は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Y23は疎水性アミノ酸、Y24は科学残基質量１００未満のアミノ酸、Y25はSerまたはHis、Y26は脂肪族アミノ酸、Y27は脂肪族アミノ酸である。
【００３３】
上記に記載のアミノ酸族はそれぞれ以下のアミノ酸を示す。芳香族アミノ酸は、Phe、His、TrpまたはTyrのいずれかである。脂肪族アミノ酸は、Ile、LeuまたはValのいずれかである。疎水性アミノ酸は、Phe、His、Trp、Tyr、Ile、Leu、Val、Lys、Ala、Gly、ThrまたはMetのいずれかである。正荷電アミノ酸は、His、LysまたはArgのいずれかである。負荷電アミノ酸は、AspまたはGluのいずれかである。科学残基質量１００未満のアミノ酸とは、Ala、Gly、Pro、SerまたはThrのいずれかである。
【００３４】
本発明の毛翅目昆虫Limnephilus decipiens由来のフィブロインH鎖タンパク質の構造解析から導かれた機能的なタンパク質の構造は以下の構造式で示すことができる。
｛ X1 - X2 ｝n1, X3
【００３５】
式中、n1は０から１０の整数を示す。ここで、０とは対象となるアミノ酸配列が存在しないことを示す。
【００３６】
式中、X1〜X3、Y1〜Y7およびZ1〜Z8は、それぞれ独立して、アミノ酸配列を示す。これらは複数のアミノ酸で構成されたペプチドであってもよいし、単一のアミノ酸であってもよい。
【００３７】
X1は、Tyr - Gly - Arg - Y1 - Gly - Leu - Ser - Gly - Ser - Gly - Asp - Leu - Asp - Gly - Leu - Gly - Gly - Val - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Leu - Gly - Gly - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Y2というアミノ酸配列で示され、Y1は、任意に含まれていてもよいArg - Leu - GlyもしくはGly - Leu - Gly、Y2は、GlyもしくはValである。
【００３８】
X2は、Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5,
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5もしくは、
Y3 - Y4 - Y5 - Y6 - Y4 - Y7 - Y4 - Y5 - Y3 - Y4 - Y5で示されるアミノ酸配列である。
【００３９】
Y3は、Arg - Gly - Tyr - Gly - Z1というアミノ酸配列で示され、Z1はSer - Ser - Gly, Pro - Thr - GlyもしくはSerである。
【００４０】
Y4は、Z2 - Ser - Z3 - Ser - Z4 - Ser - Val - Gluというアミノ酸配列で示され、Z2は、Ser - Arg, Ser - Val, Ser - GlyもしくはThr - Val、Z3は、SerもしくはVal、Z4は、ValもしくはLeuである。
【００４１】
Y5は、Z5 - Arg - Arg - Gly - Pro - Trp - Glyというアミノ酸配列で示され、Z5は、Gly - Gly - Arg, Glu - Gly - Arg, Gly - Val - ArgもしくはGly - Gly - Ileである。
【００４２】
Y6は、Arg - Arg - Gly - Lys - Valというアミノ酸配列で示される。
【００４３】
Y7は、Arg - Ile - Val - Thr - Pro - Gly - Z6 - Tyr - Z7 - Z8 - Ileというアミノ酸配列で示され、Z6は、Val, IleもしくはSer、Z7は、ThrもしくはSer、Z8は、LysもしくはGlnである。
【００４４】
X3は、
Arg - Phe - Gly - Gly - Phe - Val - Ser - Ser - Gly - Ser - Ser - Ser - Val - Glu - Ser - Val - Arg - Pro - Gly - Arg - Val - Leu - Ala - Gly - Leu - Gly - Arg - Val - Gly - Ala - Leu - Gly - Arg - Ser - Gly - Val - Val - Pro - Val - Pro - Ser - Val - Tyr - Thr - Asn - His - Pro - Gly - Asn - Ser - Val - Lys - Ser - Pro - Cys - Lys - Leu - Pro - Asp - Phe - Asn - Leu - Phe - Val - Lys - Val - Gly - Asn - Val - Arg - Lys - Ser - Asn - Gly - Asn - Cysというアミノ酸配列で示される。
【００４５】
毛翅目昆虫Hydropsyche angustipennis は小動物を捕獲するためのネットを水中で作ることが知られている（図1）。この昆虫の幼虫は捕獲された獲物を食べて成長するため、このネットの強度は水中でもかなり高い。また、水中で作られしかも長時間放置されるため、この網を作っているフィブロインは水中で繊維化する性質があり、かなりの期間その強度を保つことのできる構造をしている。このようなタンパク性の繊維はこれまで知られておらず、その一次構造がどの様なものであるかを知ることは、絹繊維の性質を探る上でも重要であると考えられていた。同じく毛翅目の昆虫の一種Limnephilus decipiensの幼虫は、水中で一種のシェルターを作ることが知られている（図2）。この昆虫のフィブロインは水中で繊維化するばかりでなく、木の葉などを水中で接着することができる。このような水中で接着機能を持つフィブロインの一次構造を知ることは、絹に別の用途を見いだせる可能性があり、興味深いものであった。本発明者らは、複雑なステップを経て遂に単一の遺伝子として該遺伝子を単離し、一次構造を解明することに成功した。
【００４６】
本発明のタンパク質は水中で繊維化し、長時間水中にあっても強度が変化しない特殊な素材の原料となるため、繊維生産などの分野において新しい繊維素材として有用である。近年、多くの組み換えタンパク質が遺伝子から大腸菌や酵母、動物細胞を用いて合成することができるようになってきた。カイコでも絹糸腺でコラーゲンや緑色蛍光タンパク質などが合成でき、繭糸として吐糸できることが明らかにされている。このようにして、作られたタンパク質は繊維化することも可能であり、今回見いだされた新しいフィブロイン遺伝子はこれまでにない特徴を持つ繊維を作る場合に有効であると考えられる。特に水中で繊維化することから、水中でものを接着する場合や耐水性の繊維を作る場合に有効であることが予想され、新しい素材をつくるための遺伝子として今後有効に利用されることが期待される。
【００４７】
また、フィブロインはこれまでに創傷、火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促進作用があることが知られている。本発明のフィブロインタンパク質を用いることで、新たな性質を持った創傷被覆材を開発できるものと考えられる。また、化粧料や食品原料など様々な応用が考えられる。
【００４８】
本発明のフィブロインH鎖タンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、毛翅目昆虫であるHydropsyche angustipennisと Limnephilus decipiensの絹糸腺からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、３または５）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、３または５）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、毛翅目昆虫であるHydropsyche angustipennisと Limnephilus decipiensの絹糸腺から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００４９】
本発明は、配列番号：２、４または６に記載のフィブロインH鎖タンパク質（Hydropsyche angustipennis由来、もしくはLimnephilus decipiens由来）と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「フィブロインH鎖タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質がフィブロインタンパク質の繊維化能を有することを指す。このようなDNAは、好ましくは毛翅目昆虫由来であり、より好ましくはHydropsyche angustipennis由来もしくは、Limnephilus decipiens由来である。
【００５０】
このようなDNAには、例えば、配列番号：２、４または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００５１】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のフィブロインH鎖タンパク質をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のフィブロインH鎖タンパク質（配列番号：２、４または６）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００５２】
配列番号：２、４または６に記載のフィブロインH鎖タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、フィブロインH鎖遺伝子の塩基配列（配列番号：１、３または５）もしくはその一部をプローブとして、またフィブロインH鎖遺伝子（配列番号：１、３または５）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、毛翅目昆虫や他の昆虫からフィブロインH鎖遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるフィブロインH鎖タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
【００５３】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、フィブロインH鎖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４または６）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００５４】
本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。該ベクターとしては、例えば、任意の時期に誘導可能なプロモーターの下流に、本発明のDNAが結合した（機能的に結合した）ベクターが挙げられる。ここで、「機能的に結合した」とは、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域に転写因子が結合することにより、本発明のDNAの発現が誘導されるように、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域と本発明のDNAとが結合していることをいう。従って、本発明のDNAが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００５５】
また、上記任意の時期に誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなどが挙げられる。ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなど任意の時期に誘導可能なプロモーターの下流に、本発明のDNAが結合したベクターのコンストラクトは、文献（Uhlirova M et al. : Dev.Genes.Evol., 212:145-151、Bello, B. et al. : Development 125, 2193-2202, 1998）を参考に作製し、使用することができる。
【００５６】
また、本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持させたり、本発明のタンパク質を発現させるために利用することもできる。このようなベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。
【００５７】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
【００５８】
本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【００５９】
また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００６０】
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００６１】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK- RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００６２】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６３】
一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning, 5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
【００６４】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明のベクターが導入される形質転換体としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００６５】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００６６】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００６７】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
【００６８】
これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
【００６９】
一方、in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするDNAを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
【００７０】
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
【００７１】
例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【００７２】
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。また、カイコの絹糸腺に目的のタンパク質をコードするDNAを導入すると、コラーゲンや緑色蛍光タンパク質などが合成でき、繭糸として吐糸できることが明らかにされている。この技術を用いることで、カイコに新機能を持った新しい絹繊維を合成させることも可能である。
【００７３】
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
【００７４】
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
【００７５】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
【００７６】
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００７７】
また、本発明は、本発明のDNAまたは本発明のベクターで形質転換された個体を提供する。このような個体としては、上述の個体が例示できるが、好ましくは形質転換された節足動物個体、より好ましくは昆虫個体が挙げられる。piggyBacなどの新しいトランスポゾンを使うことによって、色々な昆虫での形質転換が可能になっている（Handler A.M. Insect Biochem. Molec. Biol. 31:118-128., 2001、Atkinson, P.W. &James, A.A. Adv. Genet. 47:49-86.,2002.、Tamura, T. Nature Biotechnol. 18:81-84, 2000.）。
【００７８】
本発明はまた、本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７９】
ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合はU）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上（例えば、96%、97%、98%あるいは99%以上）の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。また、「オリゴヌクレオチド」にはポリヌクレオチドも含まれる。
【００８０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該DNAの発現を検出するためのプローブやプライマーとして使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。
【００８１】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bp であり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００８２】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
【００８３】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００８４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００８５】
本発明の毛翅目昆虫由来のフィブロインH鎖タンパク質は、他の昆虫由来のフィブロインと同様、細胞増殖促進作用を示すと考えられるので、細胞培養液、創傷被覆材もしくは化粧料としての利用が可能である。創傷被覆材もしくは化粧料として利用する場合には、フィブロインをゲル、フィルム、粉末等にして創傷部や、皮膚に接触させることが好ましい。また、軟膏基剤、クリーム基剤、パップ基剤等を配合することで、軟膏剤、クリーム剤、パップ剤としても使用することができる。
【００８６】
また、本発明のフィブロインは、粉末状もしくは液体状にすることで、飲料、菓子類、水産加工物、畜産加工物、レトルト食品、機能性食品等へ混合することも可能である。食品へ適用することで、肝機能向上機能、コレステロール低下作用、糖尿病予防などの効果が期待される。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００８８】
[実施例１]   フィブロインH鎖タンパク質の単離・同定
絹タンパク質の主成分はフィブロインであり、絹糸腺と呼ばれる幼虫にのみ存在する特殊な器官で合成される。そのため、最初に毛翅目昆虫から絹糸腺を集めてRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作出した。体外に出されるフィブロインのようなタンパク質は一般に他のタンパク質に比べて遙かに大量に作られる。そのため、大量のメッセンジャーRNAが絹糸腺の細胞内には蓄積していることが予想される。また、cDNAライブラリーにおける各クローンの数はメッセンジャーRNAの量にほぼ比例することから、ライブラリーから見いだされる各クローンの頻度の高いものがフィブロイン遺伝子であることが予想された。
【００８９】
毛翅目昆虫Hydropsyche angustipennisとLimnephilus decipiensとしてはチェコ・チェスケーブデェヨビツェ近郊の野外で採集したものを用いた。野外から持ち帰った幼虫は生理食塩水またはリン酸緩衝液中で解剖し、そのままRNAを抽出するか、または−80℃の超低温フリーザー中で保存した。
【００９０】
RNAの抽出はNippon  Geneの RNA抽出用の試薬ISOGEN-LSを用いて行った。得られたRNAはアガロースゲル電気泳動により抽出過程での分解が無いことを確かめた後、株式会社タカラバイオに委託し、Strategene社のZAP-cDNA合成キットを用いたcDNAライブラリーの構築を行った。ライブラリーの各クローンのDNAはクラボウ社のプラスミド自動精製装置によって精製し、ABI  PRISM3700シークエンサーにより3’側の塩基配列を決定した。得られた塩基配列の解析にはソフトウエアAuto-Assembler(ABI)を用いた。
【００９１】
以上の結果、Hydropsyche angustipennisからは約700のcDNAがESTとして塩基配列が決められ、コンピューターにより同じ配列を持つものがグループ化された。グループ化により、150以上ものESTが同じグループに属する遺伝子が見いだされた。これらのESTの塩基配列を整列させることにより、約2500bpのシークエンスが決められた。また、Limnephilus decipiensでは約300のESTのうち、33のESTが同じグループに属し、塩基配列を整列した結果、約1700bpのシークエンスが明らかになった。後に述べるように塩基配列から遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を調べた結果、いずれも予想通りフィブロインのH鎖遺伝子に見られる反復構造が検出された。このことにより、これらの遺伝子は目的とするフィブロインH鎖遺伝子であることが明らかになった。
【００９２】
得られたシークエンスのサイズをノーザンブロットの結果と比較すると、それぞれの昆虫のメッセンジャーRNAの大きさは100,000bp以上であると考えられるため、この研究で得られた塩基配列はいずれも遺伝子の一部であると推定された。他生物のフィブロインH鎖の分子量はこのRNAのサイズと一致することからも、このことは明らかである。しかし、フィブロインＨ鎖遺伝子の場合、これまで分かっているどの生物のものも反復配列から構成されている。そのため、反復の単位となっている構造が分かれば、タンパク質の基本的な性質は推定できると考えられ、全体を決める必要は無いと判断された。
【００９３】
[実施例２]   フィブロインH鎖タンパク質の一次構造解析
Hydropsyche angustipennis及びLimnephilus decipiensから得られたフィブロインH鎖遺伝子の塩基配列から、タンパク質の一次構造を推定し、そのアミノ酸組成をハチミツガ（Galleria mellonella）, カイコ（Bombyx mori）、 サクサン（Antheraea pernyi）のフィブロインH鎖と併せて表1に示した。既に明らかにされているカイコ(B. mori)やサクサン(A. pernyi)、ハチミツガ(G. mellonella)に比較すると、Hydropsyche angustipennisやLimnephilus  decipiensのフィブロインでは多くのプロリンが含まれアラニンはほとんど含まれないという特徴が解明された。繊維特性にプロリンが関与している可能性が考えられ、水中での繊維化と何らの関係があることが予測された。
【表１】
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【００９４】
次に、Hydropsyche angustipennisのフィブロインの一次構造を図３に、塩基配列を配列番号：１および３にそれぞれ示した。また、Limnephilus  decipiensのフィブロインの一次構造を図４に塩基配列を配列番号：５にそれぞれ示した。Hydropsyche angustipennisではH鎖はHA,  HB,  HC,  HDの4つのユニットに分けられる。それぞれのユニットに若干の変異があり、これらの4つが組合わさって大きな別の単位を作り、これが反復して、全体構造を作り上げていることが分かる。また、Limnephilus  decipiensには3つのユニットがあり、ユニット間の変異は少なく、3種のユニットが組み合わさって一つの単位を作っていることがわかった。
【００９５】
以上の結果から、本発明により、毛翅目昆虫のHydropsyche angustipennisとLimnephilus  decipiensのフィブロインH鎖の構造が明らかになり、その遺伝子の一部がクローニングされたと結論された。フィブロインに関するこれまでの研究では、水中で繊維化する遺伝子についての研究はなく、今回これまでとは全くタイプの異なるフィブロインの存在が明らかにされたといえる。タンパク構造において、ほとんどアラニンが含まれず、プロリンが非常に多いことは、タンパク質の性質に深く関与しているものと推定される。 
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】Hydropsyche angustipennisのネットを示す写真である。
【図２】Limnephilus  decipiensのシェルターを示す写真である。
【図３】毛翅目昆虫Hydropsyche angustipennisのフィブロインH鎖遺伝子の反復構造を示す図である。Ａはメジャー配列を、Ｂはマイナー配列を示す。
【図４】毛翅目昆虫 Limnephilus  decipiensのフィブロインH鎖の反復構造を示す図である。反復の単位としてLA, LB  and LCが存在する。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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