(57)【要約】【課題】動物から分離培養した肝細胞を長期間生存させることが可能な細胞培養物の提供。【解決手段】肝細胞を含む細胞層と血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層との重層化により得られた重層化細胞培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2個以上の細胞層の重層化により得られた重層化細胞培養物であって、2個以上の細胞層のうちの1個以上が肝細胞を含む細胞層である重層化細胞培養物。
【請求項２】
2個以上の細胞層のうちの他の1個以上が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層である請求項１に記載の重層化細胞培養物。
【請求項３】
肝細胞を含む細胞層と血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層とを隣接させた重層化により得られた請求項２に記載の重層化細胞培養物。
【請求項４】
2個以上の細胞層の何れか1個以上が高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が隣接している多層構造の細胞培養担体を用いて培養された培養細胞層である請求項１〜３の何れか一項に記載の重層化細胞培養物。
【請求項５】
細胞層の重層化が、高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が隣接している多層構造の細胞培養担体を含む細胞培養物の可溶化処理工程を含む請求項４に記載の重層化細胞培養物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の重層化細胞培養物を用いた物質の安全性評価方法。
【請求項７】
物質の安全性評価方法であって、下記工程：
（１）請求項１〜５の何れか一項に記載の重層化細胞培養物を含む培地中に物質を添加する工程及び
（２）該物質の添加後の該培地中の産生物を分析する工程
を含む方法。
【請求項８】
物質の安全性評価用キットであって、請求項１〜５の何れか一項に記載の重層化細胞培養物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重層化細胞培養物に関し、具体的には、肝細胞を含む細胞層及び血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層の重層化により得られた重層化細胞培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、化学物質の安全性の評価は、ラット又はウサギ、イヌ、サル等の大型動物に対する急性毒性試験、亜急性毒性試験、慢性毒性試験を行ない、その結果をヒトに外挿して行われるのが一般的である。しかし、動物を用いるこれらの方法は、いずれも時間とコストがかかるという問題点があり、動物愛護の観点からも、必要最小限の範囲で行われることが望ましい。また、化学物質の肝臓での代謝産生物の評価を行う際には、動物の肝臓での代謝のパターンがヒトと異なるため、動物のデータをヒトに外挿する評価に対しては問題点も指摘されている。従って、代替評価法として、多数の化合物を短時間で評価することができ、また動物種間での代謝パターンの相違の研究への寄与が期待できるインビトロ評価法の確立が望まれている。
【０００３】
インビトロ評価法の確立への試みとしては、動物から分離しシャーレ上で単層培養した肝細胞を用いた毒性及び代謝パターンの研究等がなされており、例えば、マトリゲルを用いた方法（非特許文献１：Bucher,N.L.R.,et al.,Mol.Biol.Cell 5:312a 1994）、コラーゲンを用いた３次元培養(非特許文献２：Biotechnol.Appl.Biochem.21,19-17 1995)、中空糸を用いた培養方法(TESTLIVER -Rat- TOYOBO)、又はインサートセルを用いた培養方法が、現在までに報告されている。そして、これらの方法を用いた研究によっては、株化肝細胞ではなく初代分離肝細胞を使用した研究が動物種間の代謝パターンの探索に有用である可能性が示されている。しかし、単にシャーレ上で単層培養した肝細胞は長期間その機能を維持させたまま生存させることが困難であることから、再現性のあるデータの取得や化学物質の長期曝露の評価は不可能であり、上記のインビトロ評価法には限界がある。
【非特許文献１】Bucher,N.L.R.,et al.,Mol.Biol.Cell 5:312a 1994
【非特許文献２】Biotechnol.Appl.Biochem.21,19-17 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、動物から分離培養した肝細胞を長期間生存させることが可能である細胞培養物を提供することである。さらに本発明の課題は、該細胞培養物を用いて化学物質の長期曝露に対する毒性を評価可能である方法を提供し、動物を用いた安全性評価を最小限とし、肝細胞としてヒトを含む動物の初代肝細胞を用いヒトへの毒性発現を高確率で予想可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、肝細胞を含む細胞層と血管平滑筋細胞を含む細胞層等との重層化細胞培養物が、単層培養した初代肝細胞と比較して、５〜１０倍程度の長期間、肝細胞の代謝能を維持できることを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
【０００６】
すなわち本発明は、2個以上の細胞層の重層化により得られた重層化細胞培養物であって、2個以上の細胞層のうちの1個以上が肝細胞を含む細胞層である重層化細胞培養物を提供する。本発明の好ましい態様によれば、2個以上の細胞層のうちの他の1個以上が血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層である上記重層化細胞培養物；並びに肝細胞を含む細胞層と血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージからなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層とを隣接させた重層化により得られた該重層化細胞培養物が提供される。
【０００７】
本発明のさらに好ましい態様によれば、2個以上の細胞層の何れか1以上が高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が隣接している多層構造の細胞培養担体を用いて培養された培養細胞層である上記いずれかの重層化細胞培養物；並びに細胞層の重層化が、高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が隣接している多層構造の細胞培養担体を含む細胞培養物の可溶化処理工程を含む該重層化細胞培養物が提供される。
【０００８】
本発明の別の観点からは上記いずれかの重層化細胞培養物を用いた物質の安全性評価方法；
物質の安全性評価方法であって、下記工程；（１）上記いずれかの重層化細胞培養物を含む培地中に物質を添加する工程及び（２）該物質の添加後の該培地中の産生物を分析する工程を含む方法；並びに物質の安全性評価用キットであって、上記いずれかの重層化細胞培養物を含むキットが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、肝細胞の機能を長期間維持できる重層化細胞培養物が提供される。該重層化細胞培養物を用いた物質の安全性評価方法は、薬剤等の物質の長期にわたる代謝及び毒性の判断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、重層化細胞培養物とは2個以上の細胞層の重層化により得られる培養物をいい、2個以上の細胞層が重層化細胞培養物となったあと、実質的に1個の細胞層を形成しているものも含む。本発明において、重層化される細胞層及び重層化細胞培養物はシート状のものが好ましい。
本発明の重層化細胞培養物は、上記細胞層として肝細胞を含む細胞層を含む。肝細胞を含む細胞層及び肝細胞を含む細胞層以外の他の細胞層は、いずれも1個以上であればよく、いずれも1個であるのが好ましい。肝細胞を含む細胞層及び肝細胞を含む細胞層以外の他の細胞層は互いに隣接させて重層化されているのが好ましいが、隣接させて重層化させる際には、両細胞層の間に細胞を含まない層が存在していてもよい。細胞を含まない層としては、後述の高分子含水ゲル層又は細胞接着性ゲル層などが挙げられるが、細胞接着性ゲル層が好ましい。両細胞層の間には細胞を含まない層が存在しないのがより好ましい。また、両細胞層の間には、空隙が存在していてもよいが、空隙は細胞層の面積の10％以下であるのが好ましい。
【００１１】
肝細胞としては肝臓を構成する組織の細胞であればいずれを用いてもよい。肝細胞を含む細胞層以外の他の細胞層としては、動物由来細胞が好ましく、具体的には血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、マクロファージ（クッパー細胞を含む）からなる群より選択される1種以上の細胞を含む細胞層が挙げられる。これらの群のうち好ましいのは、血管内皮細胞又は血管平滑筋細胞である。本発明において用いられる細胞として動物から分離培養した細胞を用いる場合は、初代培養細胞でも、株化継代細胞でもよいが、肝細胞としては初代分離肝細胞を用いるのが好ましい。また、肝細胞及び動物由来細胞についてはいずれの哺乳動物の細胞でもよいが、特に、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ミニブタ、ウサギ、ハムスター、ラット、又はマウスの細胞が好ましく、ヒト、ラット、マウス、又はウシの細胞がより好ましい。重層化されるそれぞれの細胞層に含まれる細胞は、同種の生物由来細胞でも、異種の生物由来細胞でもよい。
【００１２】
重層化前の個々の細胞層の作成方法は特に制限されず、また細胞層として市販の細胞層を用いてもよい。好ましくは、個々の細胞層としてはシャーレ、マイクロプレート等、及び種々の細胞培養担体のうちのいずれかを用いて培養された培養細胞層を用いる。また、重層化の際基盤となる細胞層以外は、細胞層の脱離が可能な細胞担体上で形成されていることが好ましい。
細胞培養担体としては、後述の細胞層の脱離が可能な細胞培養担体を含めた公知の細胞培養担体のいずれを用いてもよい。
細胞層の脱離が可能な細胞培養担体としては、例えば特許第3261456号公報、又は特公平6−104061号公報に記載されている細胞培養担体等が挙げられ、特に制限されないが、特に好ましい例として高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が隣接している多層構造の細胞培養担体（以下「本細胞培養担体」ということがある）を挙げることができる。
【００１３】
高分子含水ゲルとは親水性高分子を意味し、特に水には溶解しないが高分子中に水を含み系全体にわたって２次元的又は３次元的な支持構造を有する吸水性高分子をいう。本細胞培養担体においては、高分子含水ゲル層として、キレート剤等の物質を層中に拡散させることにより該層の一方の面から他方の面にキレート剤を到達させることができるものを用いる。また、本細胞培養担体においては、高分子含水ゲル層として、該層の一方の面から他方の面にアルギン酸ゲル等のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルは到達させないものを用いる。本細胞培養担体の作製で用いる高分子含水ゲル層は、このような層である限り特に限定されず、合成高分子であっても、天然高分子、生体高分子であってもよい。高分子含水ゲルの例としては、アクリルアミドゲル、架橋アクリル酸ゲル、寒天、ゼラチン、デキストラン、キトサン、シリカゲルなどがあげられるが、キトサンを用いることが好ましい。
本細胞培養担体においては、「高分子含水ゲル層」は支持体であるのが好ましい。ここで、細胞培養担体において支持体であるとは、多層構造の細胞培養担体を作製する際の基盤となる層であることをいう。
【００１４】
本細胞培養担体における高分子含水ゲル層の厚さは0.01μm以上5μm以下が好ましく、0.1μm以上4μm以下がより好ましく、0.5μm以上3μm以下がさらに好ましい。本明細書において層の厚さは、特に言及のない限り充分に乾燥した状態で計測したものを示す。本明細書においては、この層の厚さを「乾燥膜厚」ということもある。層の厚さの計測は、電子顕微鏡断面像、マイクロメータ膜厚計、エリプソメーター、角度可変XPS、光干渉式膜厚計などを用いて行うことができ、好ましくはマイクロメータ膜厚計、電子顕微鏡断面像、光干渉式膜厚計を用いて行うことができる。
【００１５】
本細胞培養担体における高分子含水ゲル層は、一般的に知られている種々の高分子含水ゲル膜の作製方法を用いて作製することができる。例えば、高分子含水ゲルの溶液をキャストする方法（キャスト法）やバーコーターで塗布する方法（バーコート法）、ギャップコーターで塗布する方法（ギャップコート法）などが挙げられるが、これらのうちバーコート塗布法、ギャップコート塗布法が好ましい。
本細胞培養担体におけるアニオン性多糖類としては、アルギン酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸などが挙げられるが、アルギン酸が好ましく用いられる。
【００１６】
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖又は細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばD.potatorum）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばA.nodosum）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばL.flavikans）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。アルギン酸のG/Mの比は特に限定されないが、G/Mの比が大きいほどゲル形成能が大きいので、G/Mの比は大きい方が好ましく、具体的には0.1〜1であるのが好ましく、0.2〜0.5であるのがさらに好ましい。
【００１７】
「アルギン酸ゲル」とは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味し、「アルギン酸ゲル層」とは、層状のアルギン酸ゲルを意味する。アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成し、ゲル化すると考えられている。アルギン酸のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、バリウム（Ba）、鉛（Pb）、銅（Cu）、ストロンチウム（Sr）、カドミウム（Cd）、カルシウム（Ca）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）、コバルト（Co）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、マグネシウム（Mg）等の金属イオンを例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンを例示できる。また、「アルギン酸ゲル」はアルギン酸とカチオン残基を有する有機高分子化合物のポリイオンコンプレックスゲルでもよい。ここでいうカチオン残基を有する有機高分子化合物の例としては、ポリリジン、キトサン、ゼラチン、コラーゲンなどの複数のアミノ基を有する化合物が挙げられる。
【００１８】
アルギン酸のゲル化は、常法に従って行なうことができる。アルギン酸のゲル化は、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じ、アルギン酸カルシウムゲルが得られる。より具体的には、0.2〜５％アルギン酸ナトリウム水溶液を、高分子含水ゲル（例えば、キトサン）層上に塗布後0.01〜1.0 M 塩化カルシウム水溶液中に浸漬して塩化カルシウムをしみ込ませ、20〜30℃で３分〜３時間放置することによりアルギン酸カルシウムゲル層が得られる。このように高分子含水ゲルを用いてアルギン酸のゲル化を行なえば、高分子含水ゲル層と該高分子含水ゲル層上に形成されたアルギン酸ゲル層とを含む細胞培養担体を得ることができる。
【００１９】
本細胞培養担体におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の厚さは0.01μm以上50μm以下であることが好ましく、0.1μm以上10μm以下が好ましく、0.5μm以上5μm以下であることがさらに好ましい。アルギン酸ゲル層の固形分量が少なすぎると充分な膜状の層を形成できず穴が空いてしまい、多すぎると乾燥膜でのカールや割れの発生、培養工程での変形やアルギン酸ゲル溶解工程での溶解不良といった問題が生じる。
【００２０】
本細胞培養担体は、さらに細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層を有していてもよい。
「細胞接着性ゲル層」とは、層状の細胞接着性を有するハイドロゲルを意味し、細胞毒性が無く、通常の培養条件で細胞が付着するゲルであれば天然、合成の化合物いずれでもよいが、好ましくは層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）p.570,東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。「細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックスの構成成分を意味し、その具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸など）、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）、ヒアルロン酸、及びゼラチンを例示できる。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を37℃で10〜20分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。
【００２１】
本細胞培養担体における細胞接着性ゲル層の厚さは0.005μm以上5.0μm以下が好ましく、0. 005μm以上1.0μm以下がより好ましく、0. 005μm以上0.5μm以下がさらに好ましい。細胞接着性ゲル層が厚いと乾燥時に層に亀裂が発生するばかりか、細胞の転写が著しく困難になる。
【００２２】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層上に細胞接着性ゲル層を形成させる際には、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層と細胞接着性成分ゲル層とを別々に作製した後、両者を重ねてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層上に細胞接着性成分含有水溶液を添加した後、該水溶液をゲル化させるのが好ましい。細胞接着性ゲル層は脱着を行なうのに十分な物理的強度を有していないため、細胞接着性ゲル層を形成させた容器（例えばディッシュ、シャーレ等）から細胞接着性ゲル層を剥離するのは困難だからである。また、極薄層の細胞接着性ゲル層は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を再簿接着性成分の溶液に浸漬すること（浸漬法）や塗布すること（塗布法）、又はキャストすること（キャスト法）で簡便に得ることができるが、本細胞培養担体の作成ではこれらのいずれの方法を用いてもよい。このうちキャスト法が好ましく用いられる。例えば、アルギン酸ゲル上にコラーゲンゲル層を形成する場合には、市販の0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を必要により適当な濃度に希釈し、上記の方法で作成したアルギン酸カルシウムゲル上にこの溶液をキャストし、乾燥させることで、アルギン酸ゲル上にコラーゲンゲル層が形成したものが得られる。
【００２３】
本細胞培養担体上に形成された培養細胞層は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理することにより細胞シートとして剥離させることができるため、肝細胞を含む細胞層又は他の細胞層として本細胞培養担体上に形成された培養細胞層を用いることにより、本発明の重層化細胞培養物の作製を容易に行うことができる。
【００２４】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を構成するカチオン成分を除去することにより実施でき、カチオン種が多価金属イオンの場合は、培養細胞層が形成された細胞培養担体を１）リン酸などの多価金属カチオンと錯形成するもしくは難溶性塩を形成するイオンが添加された培地に浸漬する、２）キレート剤水溶液が添加された培地に浸漬する、３）多価金属イオンが低減された培地に浸漬する、又は４）該細胞の培養培地中の多価金属イオンをキレート剤によって隠蔽する方法によって実施できる。通常、細胞培養用の培地にはリン酸イオンが多く存在する。従って、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、多価金属カチオン濃度が通常細胞培養に用いられる最小培地における多価金属カチオンの濃度よりも少なく、かつキレート剤を含む培地を用いて行うことが好ましい。具体的には該濃度は2.6 mM以下であることが好ましく、3μM以下がより好ましく、さらに好ましくは0.5μM以下であり、実質的に0であることが最も好ましい。また、該キレート剤の濃度は2.3 mM以上かつ26000 mM以下が好ましく、2.3 mM以上かつ2600 mM以下がさらに好ましい。上記のように多価金属カチオン濃度を低減した培地を用いることにより、キレート剤の細胞への侵襲を低減したアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化が可能である。
【００２５】
可溶化処理で用いられるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、1,3-ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸（edta）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸(egta)、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸、1,1-ジホスホノエタン-2-カルボン酸、2-ホスホノブタン-1,2,4-トリカルボン酸、1-ヒドロキシ-1-ホスホノプロパン-1,3,3-トリカルボン酸、カテコール-3,5-ジスルホン酸、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、1-ヒドロキシプロピリデン−1,1-ジホスホン酸、1-アミノエチリデン-1,1-ジホスホン酸やこれらの塩が挙げられる。これらのうち好ましいものとしてはedta、egta、エチレンジアミンテトラホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸が挙げられる。
【００２６】
さらに、上記のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理する際の培地においては，カチオン性アミノ酸の濃度が、通常細胞培養に用いられる最小培地におけるカチオン性アミノ酸濃度より少ない濃度であることが好ましい。具体的には、該濃度は1.0 mM以下であることが好ましく、2μM以下がより好ましく、さらに好ましくは0.5μM以下であり、実質的に0であることが最も好ましい。カチオン性アミノ酸成分とは、L-Lysin（Lys）、L-Arginine（Arg）、L-Histidine（His）、L-Cystine（Cys）及びこれらの塩をいう。
【００２７】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、上記のいずれかの可溶化処理用培地に１回又は複数回浸漬することにより実施すればよい。複数回の場合は用いる可溶化処理用培地は同一でも異なってもよい。
【００２８】
キレート剤を用いたアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理の際、すなわち培養細胞層が形成された細胞培養担体を可溶化処理用の培地に浸漬する際には、高分子含水ゲル層側からキレート剤がしみこむように行うのが好ましい。これによって、高分子含水ゲルとアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層とを容易に分離することができ、培養された細胞層を含む細胞シートを高分子含水ゲル層から容易に剥離させることができる。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理によってアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を完全に除去する必要はなく、可溶化されなかったアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層が残っていてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層はできるだけ可溶化して除去するのが好ましい。
【００２９】
本細胞培養担体上に形成された培養細胞層は、上述のようにアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理することにより細胞シートとして剥離させることができる。本細胞培養担体としては、その際の操作性を向上させるために、細胞接着性ゲル層と反対側の高分子含水ゲル層の面に、物理的な補強治具を設けてもよい。物理的な補強治具の材質は、細胞に影響を与えない材質であれば特に限定はないが、金属類（たとえば鉄、ステンレス、チタン、金など）、プラスチック類（たとえばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリルなど）、陶器などの無機材料類などであり、ステンレス、チタン、プラスチック類が好ましい。
物理的な補強治具は、本細胞培養担体の取り扱い性を向上させることができればいかなる形状をしていてもよいが、板状であることが好ましく、厚さは好ましくは0.1μm以上10 mm以下であり、より好ましくは1μm以上1 mm以下であり、さらに好ましくは10μm以上200μm以下である。
物理的な補強治具は、細胞観察用に本発明の細胞培養担体が見える部分があればその形状は特に限定はないが、円、多角形（三角形、四角形、六角形など）、又はその組み合わせ（扇型など）等が例として挙げられる。そのなかで、円に近い形状であることが好ましい。また、細胞観察用に本発明の細胞培養担体が見える部分は1個でも複数でもよい。また高分子含水ゲル層の補強治具を接着した面の判別を容易にするために、非対称な形状であることが好ましい。
【００３０】
物理的な補強治具は、細胞培養に影響を及ぼさない限りいかなる方法で高分子ゲル膜に接着させてもよい。たとえば、高分子ゲル膜を作製した後市販の接着剤（たとえばアロンアルファ、ボンドなど）を使用して接着させる方法や高分子ゲル膜を作成する際に補強治具を未乾燥状態の高分子ゲル膜におくことで接着させてもよい。
【００３１】
物理的な補強治具は、その材質にもよるが、補助治具の縁が鋭利である場合がある。この場、補助治具の鋭い縁によって高分子含水ゲルが破けるばかりでなく、取り扱う作業者にも危険を及ぼす懸念がある。したがって、鋭い縁をなくすことが好ましい。鋭い縁をなくす方法として、細胞培養に支障がない限りいかなる方法を用いてもよいが、物理的な研磨（たとえば、やすりなどで磨くなど）や化学処理（たとえば、ケミカルエッチングなど）する方法が挙げられる。本細胞培養担体において、物理的な補強治具はステンレス製の場合、ケミカルエッチングなどの化学処理を行うことが好ましい。
【００３２】
本細胞培養担体上に形成された培養細胞層を細胞シートとして剥離させる際の操作性を向上させるために、細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層を有する細胞培養担体においては、該細胞培養面側最表面の一部に該細胞接着性ゲル層未修飾部分、すなわち該細胞接着性ゲル層が形成されていない部分を設けてもよい。細胞接着性ゲル層未修飾部分は、高分子含水ゲル層又はアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層となる。細胞接着性ゲル層未修飾部分を設けることによって、高分子含水ゲル層と細胞接着性ゲル層を剥離する際の取り扱い性を向上させることができる。すなわち、細胞接着性ゲル層未修飾部分の高分子含水ゲル層をピンセットなどでつかむことにより細胞接着性ゲル層に触れないで高分子含水ゲル層を取り除くことができるため、細胞に悪影響が少ない。細胞接着性ゲル層未修飾部分は、本細胞培養担体における高分子含水ゲル層の隅の部分であることが好ましい。
【００３３】
細胞接着性ゲル層未修飾部分を設ける方法としては細胞培養に支障がない限りいかなる方法を用いてもよいが、例えば一般的に良く知られているマスキング法が挙げられる。すなわち、高分子含水ゲル層上で細胞接着性ゲル層未修飾とする部分をあらかじめ別材料で覆い、該高分子含水ゲル層を細胞接着性ゲル成分で修飾した後、覆っていた別材料を除去することによって、細胞接着性ゲル層未修飾部分を設ける方法である。
細胞接着性ゲル層未修飾部分を設けるために覆う別材料の材質は、細胞培養に支障がない限りいかなる材質のものを用いてもよく、例えばシリコンゴム、市販のマスキングテープや粘着テープ、プラスチック類（例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリルなど）、金属類（例えば鉄、ステンレス、チタン、金など）などが挙げられるが、シリコンゴム、市販のマスキングテープが好ましい。
【００３４】
細胞接着性ゲル層未修飾部分の形状は、細胞培養に支障がない限り特に限定はないが、円もしくは多角形（三角形、四角形、六角形）又はこれらの組み合わせ（扇型など）であることが好ましく、三角形、扇形であることが好ましい。細胞接着性ゲル層未修飾部分の大きさは、細胞培養に支障がない限り特に限定はないが、円相当で好ましくは直径0.1 mm以上10 mm以下、より好ましくは直径1 mm以上5 mm以下である。
【００３５】
本細胞培養担体を作製する際、密着性を改善する目的で、カルボジイミド類を含んだ調製液を用いてもよい。カルボジイミド類及びN-ヒドロキシコハクイミドはいかなる層の調製液に添加してもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層調製液もしくは予め高分子含水ゲルに含浸させておくこと、あるいはアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層塗布後に塩化カルシウムと共溶解した液に浸漬することが好ましい。該カルボジイミド類は水溶性のものが好ましく、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩などが挙げられる。該カルボジイミドを用いる場合その濃度としては0.01 mg/L以上200 g/L以下が好ましい。このときN-ヒドロキシコハクイミドを触媒として使用してもよく、濃度としては該カルボジイミドに対して1質量％以上50質量％以下が好ましい。
本細胞培養担体においては、特に必要がない限りカルボジイミドは用いないことが好ましい。
【００３６】
本細胞培養担体は、いかなる方法で滅菌されてもよいが、電子線、γ線、X線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、電子線、γ線、紫外線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。電子線滅菌の照射線量としては0.1 kGy以上65 kGy以下が好ましく、1 kGy以上40 kGy以下が特に好ましい。EOG滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性層やアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。
滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施されてもよく、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００３７】
本細胞培養担体を用いて、肝細胞又は血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、脂肪細胞、血球細胞、及びマクロファージ等の他の細胞層に含まれる細胞を培養する際には、通常、細胞濃度1〜1.5万cells/mlの培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を細胞培養担体上に（細胞接着性ゲル層を有する場合は細胞接着性ゲル層上になるように）添加する。細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。細胞接着性ゲル層上で細胞を培養する場合には、通常、細胞接着性ゲル層上にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行なう。
【００３８】
細胞層作製のための培養は例えば次のようにして行なうことができる。細胞培養担体をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち12〜24時間放置し、培養液を細胞培養担体中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体の細胞接着性ゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加する。37℃で１〜２時間放置し、細胞接着性ゲル層に保持（接着）させた後、37℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養0.5〜２日ごとに培養液を交換する。
【００３９】
本発明の細胞層の重層化の方法としては、細胞培養担体や市販のコラーゲン膜等を使用する方法などが挙げられ、特に限定されない。
細胞培養担体として高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が高分子含水ゲル層と隣接している多層構造の細胞培養担体が用いられている場合には、細胞層の重層化は、本細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を細胞培養面が向き合うように基盤となる細胞層上に荷重をかけた状態又はかけない状態で重ね、さらに培養した後、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化することにより行ってもよいし、本細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を可溶化処理して得られる細胞層を含む細胞シートを基盤となる細胞層上に重ねて同様に培養することにより行ってもよい。
【００４０】
荷重をかけた状態の細胞の培養法とは、細胞が転写される細胞もしくは基材にムラが生じない程度に充分荷重がかけられていればいかなる方法でもよい。ここで、荷重をかける際に細胞が密閉されると窒息をすることから、基盤となる細胞層も一方の細胞培養基材が水透過性のゲルや親水性高分子ゲルもしくはこれらの組み合わせからなる細胞培養担体に保持されていることが好ましい。また、ムラ無く転写するには細胞面を充分に覆う状態で荷重をかける必要があるが、均一に接触することで酸素の拡散を妨害することとなるため、不織布（ナイロン、ポリエステル、ステンレスなど）等を介して酸素の拡散を妨げないで荷重することが好ましい。
【００４１】
荷重をかけた細胞の培養法の荷重は0.1 g/cm2以上50 g/cm2以下であることが好ましく、0.5 g/cm2以上10 g/cm2以下であることがさらに好ましい。荷重をかけた細胞の培養の時間は充分な細胞の転写が実現できれば制限はないが4時間以上72時間以下が好ましく、6時間以上48時間以下がさらに好ましい。本発明においては、荷重をかけない状態で培養することが好ましい。
【００４２】
肝細胞を含む細胞層及び他の細胞層のいずれを基盤となる細胞層としてもよい。また、両方の細胞層を高分子含水ゲル層及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み両ゲル層が高分子含水ゲル層と隣接している多層構造の細胞培養担体上で作製し両者又は何れかの細胞培養担体のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して重層化を行うこともできる。
【００４３】
本発明の重層化培養物の培養は、培養器として、培養フラスコ、培養チューブ、シャーレ、マイクロプレート、インサートセルのいずれを用いて行ってもよいが、マイクロプレート、インサートセルを用いて行われるのが好ましい。培養は２５℃から３７℃、CO2濃度０％から６％の間で行うことができる。培養の際には、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地等の培地を使用できる。
【００４４】
本発明の重層化培養物は単層培養した肝細胞と比較して、長期間の細胞の代謝能を維持できるため、本発明の重層化培養物を用いて長期にわたる肝細胞における物質の代謝を評価することが可能である。従って、本発明の重層化培養物を用いて多様な物質の安全性をより確実に評価することがきできる。物質としては特に限定されないが、ヒトの体内に侵入する可能性のある薬物等の化学物質が挙げられる。具体的には医薬品、一般化学物質、環境汚染物質、及び天然物などが挙げられる。
【００４５】
本発明の物質の安全性評価方法は、好ましくは、
（１）本発明の重層化細胞培養物を含む培地中に物質を添加する工程及び
（２）該物質の添加後の該培地中の産生物を分析する工程
を含む。ここで、培地としてはD-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地等の培地を使用できる。分析としては、代謝産物の同定、定量等が挙げられ、具体的には、出発物質から毒性化又は無毒化された代謝産生物の同定、定量などが挙げられる。本発明の重層化細胞培養物を含む培地中の産生物を分析することにより、種々の動物の肝臓での代謝のパターンを短期間で判断することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
〔例１〕細胞培養担体の作製
（１）含水キトサンゲル膜の調製
ダイキトサン１００D（大日精化工業株式会社製）の6ｇを1質量％の酢酸水溶液500ｇに徐々に添加して室温で7時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。
ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、ポリエチレンテレフタレートフイルム（縦20 cm、横20 cm、フイルム厚190μm）上にアプリケータで乾燥膜厚2μmとなるように塗布し、37℃にて一晩乾燥させた。得られた膜を、1.9質量％の水酸化ナトリウムのメタノール溶液浴に30分間浸漬し、引き続きPBS（Dulbecco's Phosphate buffered Saline）溶液浴に30分間浸漬した。その後、蒸留水浴に30分浸漬してキトサンゲル膜を得た。こうして得たキトサンゲル膜を室温で1晩乾燥後、ビニール袋に入れ保存した。
（２）高分子含水キトサンゲル膜／アルギン酸カルシウム積層膜の調製
上記（１）で得られたキトサンゲル膜上に、２質量％のキミカアルギンB-1水溶液(株式会社キミカ製)をアプリケータで乾燥膜厚が６μmとなるように塗布した。この塗布物を0.03モル／リットルの塩化カルシウムを含む25％メタノール水溶液浴に20分間浸漬したのち、蒸留水浴に３０分間浸漬し含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜を得た。
【００４７】
（３）コラーゲン層修飾
上記（２）で得られた乾燥させていない高分子含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜上にシリコンゴムとアルミ金属製（内径縦12 cm、横7 cm、厚み5 mm）の枠を置いた。Cellmatrix I-P（新田ゼラチン社製）8 mlに１０倍濃縮されたHam'ｓ F-12培地1 mlを添加して，氷冷下で１分間スターラー混合した後、さらにこの混合物に、氷冷下で緩衝液（NaHCO3 2.2 g又は4.7 gを0.05N  NaOH水溶液100 mlに溶解したもの）1 mlを添加して泡立てないように混合した溶液を、上記枠内に6.5 mlキャストした。これを室温下で一晩乾燥させ、蒸留水で洗浄後再度乾燥させて高分子含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜を得た。
【００４８】
〔例２〕重層化細胞培養物の作製
１２穴マイクロプレート（FALCON社製、No.3505）にラット初代肝細胞(組織培養の技術〔第二版〕  日本組織培養学会編  朝倉書店  P１３５に記載の方法により採取)を50000個/well播種し37℃、5％CO2条件化で２４時間培養した。一方、例１で作製した細胞培養担体を20 mmシャーレ（FALCON社製  No.2163）底面に少量の滅菌水で付着させ、ラット血管内皮細胞A-10（大日本製薬社製）を20000個播種し、37℃、５％CO2条件下で７２時間培養した。培地は共に１０％FBS  イーグルMEM培地  GIBCO社製を使用した。
得られたラット血管内皮細胞培養物を細胞生育面がラット初代肝細胞上になるように、上記の１２穴マイクロプレートのラット初代肝細胞上に静かにおき、37℃、５％CO2条件下で２４時間培養した。培養後、１mMエチレンジアミンテトラスルホン酸を添加し37℃、５％CO2条件下で１０分間培養し、上面に浮き出すキトサン膜をピンセットにて除去し、重層化細胞培養物を得た。
【００４９】
〔例３〕重層化細胞培養物におけるP-450活性
生化学実験講座第２巻  朝倉書店  P４５３に記載の方法に従い、例２で得られた重層化細胞培養物及び単層培養した肝細胞のP-450活性P-450(1A)の活性を経時測定した。結果を図１に示す。図１から分かるように、重層化細胞培養物に含まれるラット初代肝細胞は４０日間P-450活性を維持した。それに対し、単層培養した初代肝細胞（ラット初代肝細胞のみを播種したもの）では、５日間でP-450活性は認められなくなった。
〔例４〕重層化細胞培養物を用いた肝臓代謝産生物の分析
例２で作製した重層化細胞培養物及び単層培養した初代肝細胞にクロルプラマジン0.1μg/mlを添加し、培地中に放出されるAST量を経時で測定した。結果を図２に示す。図２からわかるように、例４と同様に単層培養した初代肝細胞ではASTは検出されず、５日後に細胞が死滅したが、本発明の重層化細胞培養物ではAST量の上昇が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の重層化細胞培養物及び単層培養した肝細胞のP-450活性を示す図である。播種直後のP-450（１A）活性を１００として、相対値でグラフを示す。
【図２】本発明の重層化細胞培養物及び単層培養した肝細胞のクロルプラマジンによるASTの上昇を示した図である。
【図１】
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【図２】
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