(57)【要約】      （修正有）【課題】プロドラッグを用いて、患者の腫瘍細胞を特異的に攻撃する治療法を提供する。【解決手段】腫瘍の治療に有効な、（ａ）細胞の表面上に酵素を発現可能な（ウイルス）ベクター；及び（ｂ）（活性低下の原因となる）糖鎖を欠いたカルボキシペプチダーゼによって、活性のある薬剤に転換可能なプロドラッグを含む、互いに関連して使用するための２つの成分システムを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシペプチダーゼ活性を保持しているが、１又はそれ以上のグリコシル化部位で、該部位でのグリコシル化を阻止するために、置換、欠失又は挿入を含むカルボキシペプチダーゼ。
【請求項２】
請求項１のカルボキシペプチダーゼをコードする核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の紹介および背景
本発明は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法［gene directed enzyme prodrug therapy (ＧＤＥＰＴ)］、および腫瘍を含む疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
”ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法［virus-directed enzyme prodrug therapy (ＶＤＥＰＴ）］”と称される治療アプローチが、プロドラッグを用いて患者の腫瘍細胞を処置する方法として提唱されている。腫瘍細胞は、プロドラッグを活性化し得る酵素をコードする遺伝子を有するウイルスベクターによって標的化される。該遺伝子は、組織特異的なプロモーターまたはエンハンサー配列によって、転写的に調節され得る。ウイルスベクターは、腫瘍細胞に入り酵素を発現し、この結果、プロドラッグは腫瘍細胞内で活性薬物に変換される（ヒューバー(Huber)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）、USA (1991) 88, 8039)。別の方法として、遺伝子運搬（delivery)のために非ウイルス的方法が使用されてきている。そのような方法には、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、直接的ＤＮＡ取り込み法、およびレセプター介在性ＤＮＡ転移法(receptor-mediated DNA transfer)が含まれる。これらは、モーガン・アンド・フレンチアンダーソン(Morgan & French Anderson)、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu. Rev. Biochem.)、1993, 62; 191 に概説されている。用語”ＧＤＥＰＴ”（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（gene-directed enzyme prodrug therapy))は、ウイルスおよび非ウイルスの両方の運搬システムを包含するために用いられる。
【０００３】
ＧＤＥＰＴシステムの成功は、２つの制限因子(limiting factor)に依存する。該システムには、感染されるべきベクターによって標的化されることが必要な細胞が要求される。細胞が感染しなければ、細胞内で活性薬物は産生されないので、殺傷するためには、他の感染細胞内で産生された活性薬物をバイスタンダー・エフェクト(bystander effect)によって細胞に導入する必要がある。細胞内で製造されたすべての活性薬物が、細胞にこれをせしめ得るわけではない。さらに、プロドラッグが細胞に入ることが求められる。プロドラッグの中には細胞膜を通過できないものもある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の開示
これらの問題を解決するために、本発明は：
(a)細胞表面で酵素を発現し得るベクター；および
(b)該酵素によって活性薬物に変換し得るプロドラッグ
を含む、相互に関連して用いられる２成分システムを提供するものである。
該ベクターはＲＮＡ若しくはＤＮＡベクターであってもよい。それはウイルスベクターに由来するものであってもよく、腫瘍細胞の標的化に、当業界で入手し得るあらゆる好適なベクターが含まれる。
【０００５】
本発明はまた、患者の治療法に使用するための本発明のシステム、および治療が必要な患者の腫瘍を処置する方法を提供するものであり、該処置は、細胞表面で発現可能な、酵素をコードするベクター、及び該酵素によって活性薬物に変わることができるプロドラッグの有効量を患者に投与することを包含するものである。
【０００６】
発明の詳細な説明
Ａ．ベクターシステム
好適なベクターシステムの例には、公知の、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクターが含まれる（ラム、ゼット(Ram, Z）ら、キャンサー・リサーチ(Cancer Research) (1993) 53; 83-88; ダルトン・アンド・トレイスマン(Dalton & Treisman), セル(Cell) (1992) 68; 597-612)。これらのベクターは、β−グロビン最少プロモーターで上流をクローンされたマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンハンサーを有している。開始ＡＴＧまでのβ−グロビン５'非翻訳領域は、クローン化された蛋白質の効率よい翻訳をもたらすために供給される。イニシエーターＡＴＧは、ＮｃｏＩ制限部位にまたがっており、ベクターに蛋白質コーディング配列をクローン化するために使用され得る。このベクターは、更に、クローニングを促進するためのポリリンカー、それに続いて、β−グロビン３'−非翻訳領域およびポリアデニレーション部位を含んでいる。ＭＬＶエンハンサーは、強力なエンハンサーであり、かつ大抵のマウスおよびヒトの細胞株中で活性を有するため、特に有用である。
【０００７】
好適なウイルスベクターは、更に、レトロウイルスに基づくベクターを包含する。そのようなベクターは、当業界で広く入手が可能である。ヒューバー(Huber)ら(同書)は、肝癌、胸、結腸または皮膚の細胞の形質転換に両種性レトロウイルスの使用を報告している。カルバー(Culver)ら（サイエンス（Science）(1992) 256; 1550-1552)は、またＧＤＥＰＴにおけるレトロウイルスベクターの使用を述べている。そのようなベクターまたはそのようなベクターから派生したベクターも使用できる。他のレトロウイルスもまた、本発明での使用に適したベクターの調製に使用することができる。そのようなレトロウイルスには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれる。そのようなウイルス由来のプロモーターは、ＭＬＶについて上述した方法と類似の方法で、ベクター中で用いられてもよい。
【０００８】
イングレハード(Englehardt)ら（ネイチャー・ジェネティックス（Nature Genetics）(1993) 4；27-34)は、嚢胞性繊維症トランスメンブラン・コンダクタンス・プロダクト（cystic fibrosis transmembrane conductance product (ＣＦＴＲ）)を細胞に運搬する際における、アデノウイルスに基づくベクターの使用を記載しており、そのようなアデノウイルスに基づくベクターもまた使用され得る。アデノウイルスプロモーターおよび他の制御配列を利用するベクターは、本発明のシステムを肺の中の細胞に運搬するのに役に立ち得るため、肺腫瘍の治療に有用である。
【０００９】
一般的に、ベクターは、ＶＤＥＰＴまたはＧＤＥＰＴ療法で用いられる任意のＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターであってもよい。
【００１０】
Ｂ．酵素
酵素は、特に哺乳類（とりわけヒト）細胞において、常態では細胞表面で発現せず、また血液循環中にも放出されない酵素であって、プロドラッグを活性薬物に変換し得る酵素である。酵素は、ヒトに天然には生じない哺乳類の酵素または常態ではプロドラッグに影響しないヒトの酵素であってもよい。これには、プロドラッグに対して選択的であるように改変された、他の種に由来する酵素および哺乳類の酵素が含まれる。換言すると、かかる改変(alteration)は、天然酵素がプロドラッグを活性薬物に変換する速度が、改変酵素が作動する速度よりも、一若しくはそれ以上の桁数遅いことを意味している。改変酵素は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば酵素のクローニング，その遺伝子配列の決定，および部位特異的突然変異のような方法による遺伝子配列の改変、によって調製されてもよい。
【００１１】
酵素は、通常、プロドラッグから保護基をはずすことにより、プロドラッグを活性薬物に変換する。大抵の場合、保護基はプロドラッグから全体として切断される。しかし、酵素は、保護基の一部を切断するか若しくは単純に改変することが可能であり、この結果として部分的に切断され若しくは改変された保護基が不安定となり、その結果残りの基の自発的な除去が生じる。そのようなプロドラッグは、以下に述べるニトロレダクターゼ酵素に関連して特に有用である。
【００１２】
好ましくは、酵素は非哺乳類の酵素である。好適な非哺乳類の酵素には、細菌の酵素が含まれる。細菌酵素には、ＷＯ８８／０７３７８に開示されるカルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）のようなカルボキシペプチダーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas)のγ−グルタミルヒドロラーゼ ＥＣ3.4.22.12（レビィ・シーシー・アンド・ゴールドステイン・ピー（Levy CC & Goldstein P） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）242; p2933 (1967))、およびＷＯ９３／０８２８８に開示される大腸菌（E.coli）ニトロレダクターゼのようなニトロレダクターゼが含まれる。他の好適な酵素の例には、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、特にＶＺＶまたはＨＳＶｔｋのようなウイルスのｔｋ；およびβ−ラクタマーゼおよびβ−グルコロニダーゼが含まれる。他の酵素には、ペニシリンＶ・アミダーゼ、ペニシリンＧ・アミダーゼおよびシトシン・デアミナーゼが含まれる。
【００１３】
本発明のベクターシステムで発現された酵素は、一般にゴルジ装置および小胞体を通ってプロセッシングを受け、細胞表面に到達する。Ｎ−結合(linked)グリコシル化は、ゴルジ装置および小胞体中で、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸である）の一次アミノ酸配列を有するモチーフで生じ、グリコシル化はそのＡｓｎ残基上で起こる。場合によっては、このグリコシル化は、グリコシル化されていないネイティブフォームと比較して、酵素活性の低下をもたらし得る。このため本発明のベクターは、１若しくはそれ以上のグリコシル化部位が置換、欠失または挿入により変更されるように、改変されることが望ましい。
【００１４】
例えば、ＣＰＧ２の一次アミノ酸配列内には、Ａｓｎ２２２残基、Ａｓｎ２６４残基およびＡｓｎ２７２残基に位置する３つの、このような共通のモチーフがある。これらの部位が１若しくはそれ以上改変されていることが、ＣＰＧ２が本発明で用いられる場合には好ましい。好ましくは、改変は、ロイシンまたはグルタミンへの置換である。
【００１５】
一般に、酵素に対する改変は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿入も可能であるが、特に好ましくは、少なくとも１個から全てのグリコシル化部位のアミノ酸の置換である。少なくとも、酵素が、プロドラッグを活性薬物に変換する能力を、非改変であってグリコシル化されていない酵素と実質的に同じ割合で保持するような改変である。これに関連して、”実質的に変わらない”とは、望ましくは１桁の範囲内であり、より好ましくは約２倍低いものから２倍、５倍若しくは１０倍高いものである。
【００１６】
特異的な変更に加えて、酵素は、上で定義するように酵素活性が実質的に変わらなければ、別の方法で、末端切断(truncation)、置換、欠失もしくは挿入によって改変されてもよい。例えば、Ｎ−および／またはＣ−末端配列での短い切断(truncation)は、ベクターを作成するために必要な操作の結果として生じ得るものであり、当該ベクター中では、酵素をコードする核酸配列が本明細書に記載される種々の他のシグナル配列と結合している。改変された酵素の活性は、実施例に記載されるようなモデルシステム中で測定することができる。
【００１７】
切断された酵素の一例は、配列番号１のアミノ酸２３から４１５を含むＣＰＧ２＊である。
【００１８】
本発明の更なる局面において、１乃至それ以上のグリコシル化部位が、置換、欠失または挿入によって改変されている細菌のカルボキシペプチダーゼを含むベクターが提供される。カルボキシペプチダーゼは、好ましくは、１若しくはそれ以上の置換、欠失または挿入を除いて、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＰＧ２である。更なる置換、欠失または挿入を含みながらも実質的に変わらないカルボキシペプチダーゼ活性を保持している、そのようなカルボキシペプチダーゼの変異体も、本発明のこの局面の更なる一部である。そのような変異体は、例えば上で論じるような末端切断（truncated）された酵素を含んでもよい。
【００１９】
本発明はまた、カルボキシペプチダーゼ等をコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい核酸、およびベクター（当該核酸を有するベクターを含む）を提供する。核酸は、好ましくは配列番号１（１若しくはそれ以上のグリコシル化部位を除去するために変更されたところを除く）で示されるもの、または前述するカルボキシペプチダーゼの変異体をコードするフラグメントである。ベクターは、発現ベクターであってもよく、その中で該核酸は、宿主細胞と適合性のあるプロモーターと作動可能となるように結合している。このように、本発明は本発明の発現ベクターを含む宿主細胞をも提供するものである。宿主細胞は、細菌（例えば、大腸菌（E. coli))、昆虫、酵母または哺乳類（例えば、ハムスターまたはヒト）のものであってもよい。
【００２０】
本発明の宿主細胞は、前述のカルボキシペプチダーゼ酵素またはそのフラグメントの生産方法であって、宿主細胞を、該酵素またはフラグメントが発現する条件下で培養し、実質的に単離されたフォームで該酵素またはフラグメントを回収することを含む生産方法において、使用され得る。酵素またはフラグメントは、融合蛋白として発現されてもよい。
【００２１】
Ｃ．他のベクター成分
本発明のシステムにおいて、酵素は、該酵素を哺乳類細胞の表面に導くシグナル配列に結合していてもよい。これは通常、細胞表面に酵素を導く能力を保持した哺乳類のシグナル配列若しくはその配列の誘導体である。これは、酵素がこのことを行う内在性のシグナル配列を有していない限り必要とされる。酵素がそのようなシグナル配列を有している場合でも、これは所望の若しくは適切な他のシグナル配列に置換し得る。好適なシグナル配列には、ｃ−ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）シグナル配列のようなトランスメンブラン・レセプター・チロシンキナーゼ中に見出されたもの、または細胞表面での酵素発現を指示(directed)する能力を保持するその変異体が含まれる。ｃ−ｅｒｂＢ２シグナル配列は、コウセンズ(Coussens)ら（1985) サイエンス（Science) 230; 1132-1139 を参照することによって得ることができる。
【００２２】
本明細書の実施例に記載の実験は、この変異体または他のシグナル配列について、細胞表面での酵素発現の能力を測定するために用いられてもよい。変異体は、分子生物学の分野で公知の標準的な技術（例えばシグナル配列を含むベクターの部位特異的突然変異）を用いて生産されてもよい。
【００２３】
更に好適なシグナル配列には、ヴォン・ヘイジン（von Heijne) (1985) ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.) 184; 99-105)による総説中に見いだされるものが含まれる。
【００２４】
本発明のシステムの酵素は、細胞の表面で発現される。このことは、酵素をプロドラッグと相互作用させるように細胞外に露出させる様式で酵素は発現されるが、適する原形質膜・アンカー（plasma membrane anchor)によって、該酵素は原形質膜にまだ付着していることを意味する。適するアンカーは、該ベクターによって発現されるポリペプチドアンカーである。例えば、細胞膜中に酵素を固定化(anchor)するトランスメンブラン領域である配列に、酵素は連結(link)する。そのようなトランスメンブラン領域は、ｃ−ｅｒｂＢ２、ＥＧＦレセプターおよびＣＳＦ−１レセプターのようなトランスメンブラン・レセプター・キナーゼに由来し得るものである。ｃ−ｅｒｂＢ２トランスメンブラン領域は、下記の実施例において記載される。酵素の活性部位は細胞の外側にあるので、そのようなトランスメンブランの変異体もそれらが細胞膜中に酵素を固定化する能力を保持していることを条件に使用され得る。細胞表面では、例えばペプチドグリカン・アンカー等の他のアンカーは、脂質アンカーであり、これらもまた使用することが可能である。
【００２５】
トランスメンブラン領域に由来するもののようなアンカーは、好適な分子生物学の技術によって、酵素遺伝子のオープン・リーディング・フレームに付着（attached)される。蛋白質が発現されると、酵素／アンカー融合蛋白質として付着したアンカーを有する蛋白質が調製される。次いで、アンカーは膜中に埋まり、そこに酵素を引きとめる。
【００２６】
酵素をコードするベクターは、必要ならば、シグナル配列および／またはトランスメンブラン領域と共に、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、調製してもよい。酵素をコードする配列、シグナル配列およびトランスメンブラン領域は、合成または組換え核酸の配列を一緒にスプライシングするか、または部位特異的突然変異のような技術によって存在する配列を改変することによって構築される。標準組換えＤＮＡ技術の考察については、サムブロック(Sambrook)らによる”モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)”1989、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）が参考になるかもしれない。
【００２７】
Ｄ．プロモーター
酵素は、細胞中で発現可能なようにプロモーターを用いたベクター中で発現される。該細胞にはベクターが標的化されている。プロモーターは、該酵素をコードする配列およびその付随配列と、作動可能なように連結(linked)される。例えば、ｃ−ｅｒｂＢ２プロト−オンコジーン（proto-oncogene)は、低レベルで乳房組織中、および組織限定的様式(in a tissue restricted manner)で発現する。しかしながら、腫瘍の状態により、転写活性を増すために、この蛋白質の発現が増大するものもある。この顕著な例は、乳房組織（腫瘍の約３０％）、卵巣の腫瘍（約２０％）および膵臓の腫瘍（約５０−７５％）である。転写または翻訳を高めるためにｃ−ｅｒｂＢ２の発現が増大しているような腫瘍では、ｃ−ｅｒｂＢ２プロモーターが、細胞に特異的な方法で蛋白質の発現を指示(direct)するために用いられる。
【００２８】
そのような腫瘍を標的にする、ｃ−ｅｒｂＢ２プロモーターを利用した本発明のＧＤＥＰＴシステムを用いると、ｃ−ｅｒｂＢ２プロモーターを有するベクターによる正常細胞のトランスフェクションは、限定量の酵素レベルしか与えず、従ってプロドラッグの活性化は制限されるので、ＧＤＥＰＴの特異性が増強される。
【００２９】
該ｃ−ｅｒｂＢ２プロモーターは、−１５００までシークエンスされており、ハドソン(Hudson)ら、(1990)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.), 265; 4389-4393  を参考にすることにより取得されてもよい。転写の主な出発部位は、イシイ(Ishii)ら (1987) プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ（Proc. Natl. Acad. Sci.), 84; 4374-4378、およびタル(Tal)ら (1987), モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミストリー(Mol. Cell Biol.) 7; 2597-2601 によって決定されている。この出発部位は、＋１として称されており、この番号付けは本明細書に援用される。ｃ−ｅｒｂＢ−２の翻訳は、＋１７８位で始まる。プロモーターは−７５位にＣＡＡＴボックスおよび−２５位にＴＡＴＡボックスを有している。
【００３０】
ホリーウッド(Hollywood)およびフースト(Hurst) (1993) EMBO J. 12; 2369-2375 は、乳房細胞において、−１００位および−２１３位のプロモーターの領域が、転写制御に重要であることを報告している。（また、サーカー(Sarkar)ら (1994) ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 269; 12285-12289も参照されたい。）
【００３１】
ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを利用したベクターからの発現を成し遂げるためには、ホリーウッド(Hollywood)およびフースト(Hurst)（同書）によって乳房細胞に見出されたもののように、ＣＡＡＴボックス、好適にはＴＡＴＡボックスからｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター領域を使用し、上流には、特定の組織中での発現の特異性を担うエレメントの配列を含むことが望ましい。このようにプロモーターは、少なくともＣＡＡＴボックスの上流（５')ヌクレオチドから約２５０番目までの全てを含むことが好ましく、例を挙げると、該５’ヌクレオチドから３００番目、４００番目、５００番目、６００番目、７００番目、８００番目、９００番目まで、若しくは更に転写開始までである。それは、またＴＡＴＡボックスを含むことが好ましい。必要に応じて、ＴＡＴＡボックスの下流のｃ−ｅｒｂＢ−２配列から＋１７８位の翻訳開始部位までを使用することもできる。
【００３２】
ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター配列が好ましいが、該ヒト配列に選択的にハイブリダイズ可能である改変（modified)プロモーター配列を用いてもよい。該ヒトプロモーター配列に選択的にハイブリダイズ可能なプロモーター配列は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個であり、例えば４０個、６０個若しくは１００個またはより近接するヌクレオチドを有する領域に亘り、該ヒトプロモーター領域若しくはそのフラグメントに対して、通常、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０若しくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同性である。
【００３３】
通常、当業者であれば、−２１３位にあるようなある種のプロモーター領域は、ベクターに由来する発現の腫瘍特異性を確実化するために保持されることが必要であるが、一方、プロモーターの他の領域は、特異性に有意な喪失を与えることがないように、改変若しくは欠失されることができるということを認識するであろう。このように、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２と実質的に同じ程度(degree)に、転写的に調節される改変プロモーターが好ましい。そのような候補対象となるプロモーターの調節程度は、ホリーウッドおよびフースト（同書）の記載に従って、例えばＣＡＴアッセイを使用して、当業者により試験し、評価され得る。
【００３４】
”作動可能に連結(linked)された”とは、プロモーターと酵素コード化配列とが、プロモーターの制御下でコード化配列が発現されるような関係にある並列(juxtaposition)のことをいう。このように、いずれもネイティブではないプロモーターとコーディング領域との間に、５’非−コーディング領域のようなエレメントがあってもよい。そのような配列は、プロモーターによるコーディング配列の正しい制御が損なわなければ、ベクター中に含めることも可能である。
【００３５】
他の適切なプロモーターには、哺乳類のレトロウイルスまたはＤＮＡウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターが含まれる。適切なプロモーターには前述するベクターで使用されるもの、例えばＭＬＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、およびアデノウイルスプロモーターが含まれる。好ましいアデノウイルスプロモーターは、アデノウイルス初期遺伝子プロモーターである。強力哺乳類プロモーターもまた適切であるかもしれない。そのようなプロモーターの例は、ミズシマおよびナガタ（(1990), Nucl. Acids Res. 18; 5322)を参照することによって取得されるＥＦ−１αプロモーターである。実質的に類似の転写活性を保持しているそのようなプロモーターの変異体を使用してよい。
【００３６】
ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを有するベクターは、本発明の更なる新しい局面を形成するものであって、標的細胞中でプロドラッグを活性薬物に変換することのできる遺伝子をベクターが発現するシステムの中で用いられてもよい。このように、本発明は、プロドラッグを活性薬物に変換し得る酵素をコードする遺伝子に作動可能に連結したｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを有するウイルスベクターを提供するものである。本発明は、また、ベクターによりコード化された酵素によって活性薬物に変換可能なプロドラッグとともに、前記で定義されるベクターを含むキットを提供する。別の局面において、本発明は、ヒト若しくは動物体の治療方法、特にｃ−ｅｒｂＢ−２プロトオンコジーンが過剰に発現される腫瘍を処置する方法において使用するための、上記定義のベクターまたは上記定義のキットを提供するものである。さらなる局面において、本発明は、腫瘍の処置方法、特にｃ−ｅｒｂＢ−２プロトオンコジーンが過剰に発現される腫瘍を処置する方法を提供するものであり、該方法は、腫瘍を有する者に、(i) 上記定義のベクターの有効量、および(ii) 該ベクターによってコード化された酵素によって活性薬物に変換し得るプロドラッグの有効量を投与することを含む方法である。
【００３７】
Ｅ．プロドラッグ
該システムで使用するためのプロドラッグは、酵素と適合し得るように選択される。言い換えれば、そうすることによって酵素はプロドラッグを活性薬物に変換することができる。プロドラッグの被治療患者に対する毒性は、活性薬物よりも少なくとも１桁低いものであることが望ましい。好ましくは、活性薬物が、数桁、例えば２桁、３桁、４桁またはそれ以上の桁数高い毒性を有していることである。適切なプロドラッグには、ナイトロジェン・マスタード・プロドラッグおよびＷＯ８８／０７３７８、ＷＯ８９／１０１４０、ＷＯ９０／０２７２９、ＷＯ９１／０３４６０、ＥＰ−Ａ−５４０  ２６３、ＷＯ９４／０２４５０、ＷＯ９５／０２４２０、またはＷＯ９５／０３８３０に記載されているような他の化合物が含まれ、それらは引用例としてここに援用される。
【００３８】
Ｅ（ｉ）−ナイトロジェン・マスタード・プロドラッグ
ナイトロジェン・マスタード・プロドラッグには、下式の化合物が含まれる：
Ｍ−Ａｒ−ＣＯＮＨ−Ｒ
式中、Ａｒは、必要に応じて置換された環芳香族環系を示し、Ｒ−ＮＨは、α−アミノ酸Ｒ−ＮＨ２またはオリゴペプチドＲ−ＮＨ２の残基であって、少なくとも１個のカルボン酸基を含むものであり、およびＭは、ナイトロジェン・マスタード基を示す。
【００３９】
アミノ酸Ｒ−ＮＨ残基は、好ましくはグルタミン酸残基である。ＷＯ８８／０７３７８には、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２が、上で示されたタイプの化合物からグルタミン酸部分を脱離されることができ、グルタミン酸部分の脱離によって活性のナイトロジェン・マスタード薬物が生成することが開示されている。
【００４０】
本発明で用いられるこうしたナイトロジェン・マスタード・プロドラッグには、ＷＯ９４／０２４５０の一般式Ｉで示されるプロドラッグおよびそれらの塩、および特に式（Ｉ）：
【００４１】
【化１】
2006042821.tif 000002
【００４２】
〔式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して塩素、臭素、ヨウ素、ＯＳＯ２Ｍｅ、ＯＳＯ２フェニル（式中、フェニルは、必要に応じて、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＣＮまたはＮＯ２の中から独立して選択される１個，２個，３個，４個もしくは５個の置換基で置換されている。）を示し；
Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それぞれ独立して水素、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルを示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４ハロアルキルを示し；
ｎは、０から４の整数であり；
各Ｒ５は、それぞれ独立して、水素、必要に応じて１個の二重結合若しくは１個の三重結合を含むＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、シアノ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである。）を示し、或いは２つの隣接したＲ５基は、共に次のものを示す
ａ）必要に応じて１個の二重結合を有するＣ４アルキレン；
ｂ）Ｃ３アルキレン；または
ｃ）各々必要に応じて、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、シアノおよびニトロからなる群からそれぞれ独立して選択される１個、２個、３個若しくは４個の置換基で、置換された−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−；
Ｘは、基−Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−または−ＣＨ２−Ｃ(Ｏ)−であり；および
Ｚは、−ＣＨ２−Ｔ−Ｃ(Ｏ)−ＯＲ６基［式中、Ｔは、ＣＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＳＯ）−または−(ＳＯ２)−であり、Ｒ６は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキルアミノ、モノ−，ジ−Ｃ１−６アルキルアミノまたはモノ若しくはジＣ３−６シクロアルキルアミノである。但し、Ｒ６が水素のとき、Ｔは−ＣＨ２−である。］である。〕
で示されるもの、および式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される誘導体（塩を含む）が含まれる：
【００４３】
ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。Ｒ１ａ基およびＲ２ａ基は、好ましくはメチルおよび水素であり、特に水素が好ましい。Ｒ３基およびＲ４基の好適なものは、水素、メチルおよびトリフルオロメチル、特に水素である。Ｒ１基およびＲ２基の好適なものは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＯＳＯ２ＭｅおよびＯＳＯ２フェニル（式中、フェニルは、２位および／または４位が１個または２個の置換基で置換されている。）である。Ｉ、ＣｌおよびＯＳＯ２Ｍｅが特に好ましい。
【００４４】
Ｒ５の好適なものは、ｎが１乃至４の整数であるとき、フッ素、塩素、メチル−ＣＯＮＨ２およびシアノである。好ましくは、ｎは０、１または２である。ｎが１または２であるとき、Ｒ５は環の３位および／または５位においてフッ素であることが好ましい。Ｘ基は、好適には、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−である。Ｚは、好ましくは−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ基である。
【００４５】
好適な具体的な化合物には、以下のものが含まれる：
Ｎ−４−［（２−クロロエチル）（２−メシルオキシエチル(mesyloxyethyl)）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸（以下、”ＣＭＤＡ”と称する。）およびその塩；
Ｎ−（４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル）−Ｌ−グルタミン酸およびその塩；
Ｎ−（４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル）−Ｌ−グルタミン酸およびその塩；
Ｎ−（４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸およびその塩；および
Ｎ−（４−［ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸（以下、”プロドラッグ２”と称する。）およびその塩。
【００４６】
興味ある本発明の化合物の特定のサブグループ(sub-group)は、上述した、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ５、ＸまたはＷの特定若しくは一般的な定義のうちのいずれか１つを採用することによって得られ得る。なお、それは、単独であっても、他の、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ５、ＸまたはＷについての特定若しくは一般的な定義を組み合わせたものであってもよい。
【００４７】
他のプロドラッグには、式（II）：
【００４８】
【化２】
2006042821.tif 000003
【００４９】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｎおよびＺは上記の式（Ｉ）の化合物で定義したものと同じである：
ｍは０乃至４の整数であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；および
Ｒ９は水素、ｔ−ブチルまたはアリルである。〕
の化合物、および式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される誘導体が含まれる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｎおよびＺの好適なものは、式（Ｉ）の化合物について上で定義されたものと同じである。ｍの好適なものは、上記でｎについて定義されたように０、１または２である。Ｒ９は好ましくは水素であるが、特に合成中は、アリルまたはｔ−ブチルのような基で保護され得る。
【００５０】
これらのプロドラッグは、カルボキシペプチダーゼ酵素、例えばＷＯ８８／０７３７８またはＷＯ９４／０２４５０に開示されるようなＣＰＧ２によって、腫瘍部位で活性化される。
式（III）：
【００５１】
【化３】
2006042821.tif 000004
【００５２】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｚ１、ｎおよびｍは、式(II)の化合物について定義されたものと同じである。〕
のナイトロジェン・マスタード・プロドラッグ、およびその生理学的に許容される誘導体もまた本発明において用いられる。
【００５３】
これらのプロドラッグは、例えばＷＯ９３／０８２８８に開示されるようなニトロレダクターゼ酵素によって腫瘍部位で活性化され得る。
【００５４】
通常、酵素活性を確実化するためには、ニコチン酸またはニコチンアミドのリボシド(riboside)またはリボチド(ribotide)のような補因子が要求され、それはプロドラッグとともに投与されてもよい。
【００５５】
式(II)および(III)の化合物は、化学の分野における当業者に知られた反応および方法を用いて調製されてもよい。次の方法が特に有用である：
Ａ：Ｚ１が−Ｏ−である式(II)の化合物：
Ｚ１が−Ｏ−である式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）：
【００５６】
【化４】
2006042821.tif 000005
【００５７】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５およびｎは上記定義の通りであり、Ｚ４は−Ｏ−である。］
のナイトロジェン・マスタードを式（Ｖ）：
【００５８】
【化５】
2006042821.tif 000006
【００５９】
［式中、Ｒ５、ｍ、Ｚ２、Ｒ９およびＺ３は上記定義の通りであり、Ｑは水素または離脱基である。］
のリンカーと反応させることによって調製されてもよい。
この反応は、例えばＤＭＦおよびトリエチルアミンといった、塩基の存在下での非プロトン性溶媒中で行われる。好適な離脱基Ｑには、スクシンイミジル基、４−ニトロフェニル・カーボネート基、ペンタフルオロフェニル・カーボネートおよびテトラクロロエチル基ＣＨ（Ｃｌ）ＣＣｌ３が含まれる。
【００６０】
(ii) 式（ＩＶ）の化合物は、必要に応じてＲ５（ｎ）基（上記の定義と同じ）で置換された４−ニトロフェノールから出発して調製されてもよい。フェノール基は、アダマンタニルオキシカルボニル−誘導体となるように保護されている（室温で、出発物質をＴＨＦ中のアダマンタニル−フルオロホルメートおよびトリエチルアミンと反応させることによって）。保護された４−ニトロフェニル・カーボネートは、室温下、ギ酸アンモニウムおよびＰｄ／Ｃ  １０％を触媒として用いたエタノール中での水素移動によって、対応するアミンに還元される。該アミンは、次いで、２０℃下、ＡｃＯＨ中でエチレンオキシドを用いて、ヒドロキシエチル化され、更に所望のナイトロジェン・マスタードに反応される。適する条件については、ＥＰ−Ａ−４３３  ３６０またはＥＰ−Ａ−４９０９７０が参考になる。化合物は、カラムクロマトグラフィーによって精製されてもよい。アダマンチル基を除去する脱保護化は、トリフルオロ酢酸中で行われる。
【００６１】
(iii) 代わりの方法として、式（ＩＶ）のナイトロジェン・マスタードは、非プロトン性溶媒およびトリエチルアミン中でホスゲンまたはトリホスゲンで処理しクロロホルメートとして活性化され、続いて式（ＶＩ）：
【００６２】
【化６】
2006042821.tif 000007
【００６３】
［式中、Ｒ５、ｍ、Ｚ２、Ｒ９およびＺ１は、上記定義の通りである。］
の化合物と結合(coupling)してもよい。
これは、塩基（例えば、トリエチルアミンまたはピリジン）の存在下、ＴＨＦまたは他の非プロトン性溶媒中行われる。
【００６４】
(iv) Ｚ１が−Ｏ−である式（II）に記載される化合物の合成の更なる代替経路には、必要に応じてＲ５（ｎ）基（上記定義と同じ）で置換された４−ニトロフェノールと式（Ｖ）の化合物とを直接結合させるか（direct coupling)、または必要に応じて置換された上記４−ニトロフェノール化合物  クロロホルメートを式（Ｖ）の化合物と反応させて、該反応に続けて、それぞれのケースも、ニトロ基をアミンを経由してマスタード基に変換することが包含される。
【００６５】
Ｂ：Ｚ１が−ＮＨ−である式（II）の化合物
(i) Ｚ１が−ＮＨ−である式（II）の化合物は、塩基の存在下、非プロトン性溶媒中で、Ｚ４が−ＮＨ−である式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）のリンカーとを反応することによって調製されてもよい。Ｚ４が−ＮＨ−である式（ＩＶ）の化合物は、必要に応じてＲ５（ｎ）基（上記で定義の通り）で置換された１−ハロ−４−ニトロベンジル化合物から調製されてもよい。これは、加熱しながらジエタノールアミンで反応することによって、対応する１−ビス−ヒドロキシエチルアミノ−４−ニトロ−ベンジル化合物に変換され、得られた化合物はカラムクロマトグラフィーによって精製される。対応する４−ニトロ・ナイトロジェン・マスタードは、例えば、ピリジン中でメシルクロライドを用いてメシル化し、続いて、必要に応じて他のハロ・マスタード（例えば、ブロモ若しくはヨードマスタード）への反応によって調製されてもよい。４−ニトロ基は、２０℃下で、ギ酸アンモニウムおよびＰｄ／Ｃ  １０％を触媒として用いたエタノール中での水素移動により、還元される。
【００６６】
(ii) 代替法として、上述した１−ビス−ヒドロキシエチルアミノ−４−ニトロベンジル化合物は、２０℃下、エタノール中で、ギ酸アンモニウムおよびＰｄ／Ｃ  １０％を触媒として用いて還元され、対応するフェニレン−ジアミノ誘導体を与える。この誘導体は、上のパラグラフに記載するように、例えば、最初にメシルクロライドでの反応によって、対応する４−アミノ・ナイトロジェン・マスタードに変換され得る。
【００６７】
Ｃ：式（III）の化合物
(i) 式（III）の化合物は、上のセクションＡ(i)に記載されたナイトロジェン・マスタード・フェノール化合物を、必要に応じてＲ５（ｍ）基（上記定義と同じ）で置換された４−ニトロベンジル・クロロホルメートと、２０℃、トリエチルアミンの存在下もしくは非存在下で結合することによって得られてもよい。
【００６８】
(ii) 代わりに、セクションＢ(ii)に記載されるアニリン・ナイトロジェン・マスタードは、上のセクションＣ（ｉ）に記載されるクロロホルメートとともに用いられてもよい。
【００６９】
Ｄ：Ｚ２が−ＮＨ−である式（Ｖ）の化合物
(i) Ｚ２が−ＮＨ−である式（ＩＶ）の化合物は、必要に応じてＲ５（ｎ）基（上記で定義の通り）で置換された４−ニトロベンジルアルコールから調製されてもよい。ヒドロキシル官能基は、２０℃下、非プロトン性溶媒中で３，４−２Ｈ−ジヒドロピランおよびピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）で処理するか、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＡＣ）中でＴＢＤＭＳｉクロライドおよびイミダゾールで処理することにより、それぞれピラニル−、またはｔ−ブチル−ジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）−エーテルとして保護される。このようにして得られた中間体は、２０℃で、ギ酸アンモニウムおよびＰｄ／Ｃ  １０％を触媒として用いてエタノール中で水素移動することにより対応するアミンに還元される。このアミンは、式（ＶII）：
【００７０】
【化７】
2006042821.tif 000008
【００７１】
［式中、Ｒ５、ｍ、Ｒ９およびＺ１は上記定義の通りであり、Ｚ２は−ＮＨ−およびＰｒはピラニル−、またはｔ−ブチル−ジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）−エーテル保護基である。］
のグルタミルエステル中間体に変換される。
【００７２】
これは、６０℃下、トルエン中、トリホスゲンおよびトリエチルアミンでアミンを処理することによって行われ、対応するイソシアネート（isocyante)が得られる。そしてこれは、Ｒ９−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ(ＮＨ２)−Ｚ１（Ｒ９およびＺは上記定義の通り）のグルタメート(glutamate)誘導体で処理される。代わりに、−７８℃で、トルエン中でトリホスゲンおよびトリエチルアミンで処理することによって、対応するグルタメートから得られる、対応のグルタミル−イソシアネートは、ワン・ポット法でアミンと反応させてもよい。
【００７３】
(ii) 式（ＶII）の化合物は、緩やかな酸性媒質を用いて（ＡｃＯＨ、ＴＨＦおよびＨ２ＯまたはＰＰＴＳ、ＥｔＯＨ、５５℃）処理することにより、ＴＢＤＭＳｉ基またはピラニル基が除去され、脱保護化される。これは、Ｐｒが水素である式（ＶII）の化合物を生成する。Ｑが離脱基である式（Ｖ）の化合物は、当業界で公知の標準的な反応を用いて調製されてもよい。
【００７４】
(iii) 例えば、Ｑがスクシンイミジル基であるとき、Ｐｒが水素である式（ＶII）の化合物はアセトニトリル中で、ジスクシンイミジル−カーボネートおよびトリエチルアミンで処理されてもよい。４−ニトロフェニルカーボネート基が望まれるところでは、ＴＨＦ中での４−ニトロフェニル・クロロホルメートおよびトリエチルアミンでの処理を用いてもよい。ペンタフルオロフェニル・カーボネートは、ペンタフルオロフェノールの現場ホスゲン化によって付加され、次いでＰｒが水素である式（ＶII）のリンカーに結合される。
【００７５】
Ｅ：Ｚ２が−Ｏ−である式（Ｖ）の化合物
(i) カルバミン結合を有するリンカーのための出発物質は、非置換若しくは置換（Ｒ５（ｎ）基（上記定義の通り）で）の４−ヒドロキシ−ベンジルアルコールである。これらのリンカータイプは、１，４−脱離を受けるために芳香族の核上に余分な電子吸引性基を必要とする。４−ヒドロキシ基は、２０℃でＴＨＦ中、アセチル−ｖ−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジン、１Ｎ  ＮａＯＨで出発物質を処理することによって、特にアセテートとして保護される。アセテートのアルコール官能基は、更に上のセクションＤに記載される方法で、ピラニル−またはＴＢＤＭＳｉ−エーテルとして保護される。次いで、アセテート官能基を脱保護化して、２０℃でＮａＨＣＯ３の水性ＭｅＯＨ溶液中で４−ヒドロキシ基に戻される。得られるフェノール化合物は、上記セクションＤ(i)に記載するようにワン・ポット法で保護化グルタミル−イソシアネートと反応させる。これによって、前述するＺ２が−Ｏ−であり、Ｐｒがピラニル−またはｔ−ブチル−ジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）−エーテル保護基である式（ＶII）の化合物が得られる。
【００７６】
(ii) この化合物の脱保護化は、Ｐｒが水素である式（ＶII）の化合物を生成する。これは、上記セクションＤ(ii) および(iii)に記載される方法と類似の方法によって式（Ｖ）の化合物に変換される。
【００７７】
Ｆ：式（IＶ）の化合物の代替の合成
Ｑが水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、または−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミド）である式（ＩＶ）の化合物は、またＷＯ９５／０２４２０またはＷＯ９５／０３８３０を参照することによっても得ることができる。
【００７８】
Ｅ(ii). 他のプロドラッグ
プロドラッグとして使用される他の化合物には、細胞毒性の化合物であるｐ−ニトロ−ベンジルオキシカルボニル誘導体が含まれる。そのような化合物は、ニトロレダクターゼ酵素と共に使用され得る。ニトロレダクターゼ酵素はプロドラッグのニトロ基をヒドロキシルアミノ若しくはアミノ基に変換し、この結果、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル部は活性化し、次いで自己破壊する（self-immolating)と信じられている。これは活性薬物を放出する。これらの化合物は、次式の化合物を含む：
【００７９】
【化８】
2006042821.tif 000009
【００８０】
ＷＯ９３／０８２８８のニトロレダクターゼ酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような補因子を必要とし、これは、必要に応じて、本発明のシステムに付加的な成分として供給される。
【００８１】
上記参考文献に記載される他の化合物の例には、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシンＣのプロドラッグが含まれる。先の参考文献のプロドラッグは、ニトロレダクターゼまたはＣＰＧ２のいずれかによって活性薬物に変換される。しかし、該プロドラッグは、他の酵素、例えばβ−ラクタマーゼまたはグルクロニダーゼによって切断されうる保護基を有するよう修飾されているかもしれない。
【００８２】
更に、本発明の使用に適したプロドラッグには、一般式：
ＦＴＬｉ−（ＰＲＴ）ｍ’
［式中、ＦＴＬｉは、ファルネシルトランスフェラーゼ(farnesyltransferase)・インヒビター化合物のようなｒａｓインヒビターであり、ＰＲＴは酵素作用によってｒａｓインヒビターから開裂され得るｍ’個の保護基を示す（ｍ’は、１乃至５の整数である。）。］
の化合物またはその塩が含まれるそのような化合物は、ＷＯ９５／０３８３０に開示されている。
【００８３】
好適なＦＴＬｉには、式（VIII）または（ＩＸ）で示される化合物が含まれる。
【００８４】
【化９】
2006042821.tif 000010
【００８５】
〔式中、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、天然に生じるアミノ酸の側鎖［例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ(ＣＨ３)２、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３］であり、それらの酸化形態も含まれる（例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン）。或いは、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、置換もしくは非置換の脂肪族、芳香族またはヘテロ芳香族基であり、好ましくはシクロヘキシル、フェニル、ピリジル、イミダゾリル、または必要に応じて芳香族若しくはヘテロ芳香族環で置換された飽和または不飽和の分岐状若しくは直鎖状の２〜８個の炭素原子であり；
Ｘ１ａは、ＣＨ２ＣＨ２、トランスＣＨ＝ＣＨまたはＣＨ２ＮＨであり；および
Ｘ２ａは、（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎは０、１または２である。］である。好ましくは、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、共にＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３を示す。〕
【００８６】
式（VIII）および式(ＩＸ）の化合物を含む好適なＦＬＴｉ化合物は、ＷＯ９５／０３８３０を参照することによって取得されてもよい。
【００８７】
本発明のシステムで用いられる他の好適なプロドラッグには、糖若しくはβ−ラクタム誘導体で誘導体化されたものが含まれる。例えば、前述したタイプの活性薬物に結合されてもよい好適なリンカーは下式のものである：
【００８８】
【化１０】
2006042821.tif 000011
【００８９】
式中、Ｒ’は水素またはアセチルであり、Ｙ’はフェニル、ベンジルまたはトルリル(toluyl)といったアリールであり、これらは前述した他のプロドラッグと類似の方法で調製されてもよい。
【００９０】
プロドラッグの更なるグループは、一般式：
ＰＴＫｉ−ＰＲＴｍ’
［式中、ＰＴＫｉはＰＴＫ（プロテインチロシンキナーゼ）阻害活性を有する化合物であり、ＰＲＴは酵素作用によってＰＴＫインヒビターから開裂され得る保護基であり、ｍ’は１乃至５の整数である。］
で示されるチルホスチン(tyrphostin)化合物である。
【００９１】
好適なＰＴＫｓには、チルホスチン(tyrphostin)が含まれる。チルホスチンは、プロテインチロシンキナーゼ・ドメインのサブサイトに結合可能なプロテインチロシンキナーゼの低分子量（例えば、２，０００未満）のスチリル含有インヒビターである。好適なチルホスチンには、ガジット(Gazit)ら（ガジットら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）(1989) 32, 2344)、およびガジットら（ガジットら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）(1991) 43; 1896-1907)に記載されたもの、および特に一般式：
【００９２】
【化１１】
2006042821.tif 000012
【００９３】
〔式中、Ｘ１は炭素、窒素または基Ｎ→Ｏを示し；ｎは１乃至３の整数であり；Ｒ１０基はそれぞれ、同一もしくは異なって、水素、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、ホルミル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、カルボキシＣ１−４アルキル、カルボキシＣ２−４アルケニル、Ｃ１−４アルキルスルホキシ、ハロ（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、ニトロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノまたはＣ１−４ジアルキルアミノであり、或いはｎが２または３のとき、２つのＲ１０基は、共にメチレンジオキシ若しくはエチレンジオキシ基を形成していてもよい；Ｒ１１は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、またはＲ１０基（１個または複数）が、結合している環の２位とともに５または６員の脂肪族または複素環式の環を形成し、該５または６員環は、必要に応じてケトン基を含み；
およびＲ１２はシアノ、カルボキシ、カルバモイル、チオカルバモイル、Ｃ(Ｏ)ＨＮＣＨ２ＣＮ基、Ｃ(ＮＨ２)＝(ＣＮ)２基、アルファケト基Ｃ(Ｏ)Ｒ１３［式中、Ｒ１３は３，４−ジヒドロキシフェニルまたは２−チオフェニルである］、またはアルファアミド基Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ１４［式中、Ｒ１４はベンジル、フェニルまたは２，４−ジメトキシフェニルである。］である；但し、Ｒ１０およびＲ１１の少なくとも一方はメルカプト、ヒドロキシまたはアミノである。〕
のチルホスチンが含まれる。
【００９４】
好ましい具体的態様では、Ｘ１はＣであり；ｎは１乃至３の整数であり；Ｒ１０基のそれぞれは、同一若しくは異なって、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、ホルミル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ１−４アルコキシ、カルボキシＣ１−４アルキル、カルボキシＣ２−４アルケニル、ハロ（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ニトロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノまたはＣ１−４ジアルキルアミノであり、或いはｎが２若しくは３のとき、２つのＲ１０基が、共にメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基を形成してもよい；Ｒ１１は、水素、ヒドロキシ、またはＣ１−４アルキルであり；およびＲ１２はシアノ、カルボキシ、カルバモイル、チオカルバモイル、Ｃ(Ｏ)ＨＮＣＨ２ＣＮ基またはＣ(ＮＨ２)＝Ｃ(ＣＮ)２である。最も好ましくは、Ｘ１０は炭素を示し、ｎは１乃至３の整数であり；Ｒ１０基はそれぞれ同一若しくは異なって、水素、ヒドロキシまたはアミノであり；Ｒ１１は水素またはヒドロキシであり；およびＲ１２はシアノ、Ｃ(Ｏ)ＨＮＣＨ２ＣＮ基、Ｃ(ＮＨ２)＝Ｃ(ＣＮ)２、アルファケト基  Ｃ(Ｏ)Ｒ１３［式中、Ｒ１３は、３，４−ジヒドロキシフェニルである。］、またはアルファアミド基Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ１４［式中、Ｒ１４はベンジルである。］である；但し、Ｒ１０基、Ｒ１１基およびＲ１２基の少なくとも一つはヒドロキシまたはアミノである。好ましくは、Ｒ１０はヒドロキシまたはアミノである。Ｒ１１が、Ｒ１０と共に５または６員環を形成するとき、好適な環には、環に一個の窒素原子および４若しくは５個の炭素原子を含む複素環が含まれる。原子の総数には、Ｒ１０基（１個または複数）が結合している環の２個の炭素原子が含まれる。
【００９５】
上述のような適切なチルホスチンは、ＷＯ９５／０２４２０、ガジットら（１９８９および１９９１）、同書、に開示された方法若しくはその類似方法により得ることができ、またそれらはここに引用例として援用される。
【００９６】
チルホスチンは、酵素によって除去可能である、任意の適切な保護基と連結(linked)されてもよい。好適な保護基ＰＲＴは、ＷＯ９５／０３８３０またはＷＯ９５／０２４２０を参照することによって見出されるものであってもよく、構造：
−(Ｚ１−ＣＯ.Ｏ−ＣＨ２−Ｐｈ−ＮＯ２)ｍ’、または
−(Ｚ１−ＣＯ.Ｏ.ＣＨ２−Ｐｈ−Ｚ−ＮＨ−ｇｌｕ)ｍ’
〔式中、Ｚ１は上述で定義したものまたはＳであり、ｍ’は１乃至５の整数であり、Ｐｈは、上記で定義したように、必要に応じて１乃至４個のＲ５基（同一または異なっていてもよい）で置換されたフェニレン環であり、ｇｌｕは−ＣＨＺ−Ｃ(Ｏ)−ＯＲ９［ＺおよびＲ９は、上記で定義した通りである。］である。ニトロ基は、Ｐｈ環に対して望ましくは環の４位であるが、２位にあってもよい。〕
【００９７】
Ｅ(iii)．誘導体
プロドラッグの生理学的に許容される誘導体には、塩、アミド、エステルおよびエステルの塩が含まれる。エステルには、エステル原子団の非カルボニル部分(moiety)が直鎖状または分岐鎖状のＣ１−６アルキル、（メチル、ｎ−プロピル、、ｎ−ブチルまたはｔ−ブチル）から選択されるカルボン酸エステル；またはＣ３−６環状アルキル（例えば、シクロヘキシル）が含まれる。塩には、生理学的に許容される塩基塩、例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム）、アンモニウムおよびＮＲ４”（式中、Ｒ”はＣ１−４アルキルである。）塩のような適切な塩基に由来するものが含まれる。他の塩には、塩酸塩および酢酸塩を含む、酸付加塩が含まれる。アミドには、非置換並びにモノ−およびジ−置換誘導体が含まれる。
【００９８】
Ｆ．本発明の適用
本発明のシステムは、ヒト又は動物の身体の治療方法に使用することが可能である。そのような治療には、治療が必要な患者に本発明のシステムを投与することを包含する新生細胞の増殖を治療する方法が含まれる。本発明は、また、バクテリア、ウイルス又は寄生虫によるヒト又は動物の身体への感染を通じて疾病された細胞を治療するのに使用することも可能である。ウイルスの後期プロモーター（late promoters）は、感染の初期に作られるウイルスの蛋白質にしばしば依存する。感染された細胞の表面に発現されるウイルスの膜蛋白質（coat protein）を、細胞へ遺伝子を入り込ませるためのターゲットとして使用することが可能である。もし、その後、ウイルスの後期プロモーターを、ＧＤＥＰＴ酵素の発現を指示するために使用すると、いかなる感染された細胞も、特に、しばらくの間感染されている細胞は、該蛋白質を発現するであろう。これは、感染された細胞を殺すには十分であろう。寄生虫においては、寄生虫プロモーター及び寄生虫表面蛋白質を、それぞれ発現を指示するため及び寄生虫を感染させるために使用することがある。
【００９９】
バクテリアにおいては、特定のプロモーターは明確にするのはより容易であるべきだが、すべての運搬システムは、おそらく、バクテリアウイルスを使用するように変更する必要があろう。
【０１００】
治療におけるベクターの使用において、ベクターは通常、例えば、ラムら（Ram et al）（上記）中に記載のように、ウイルスの粒子の中にパッケージされ、該粒子は腫瘍の部位に運ばれる。ウイルスの粒子を修飾して、腫瘍のターゲッティングを強化するために、抗体、そのフラグメント（１本鎖を含む）又は腫瘍−結合リガンドを含んでもよい。または、ベクターをリポソームの中にパッケージしてもよい。該リポソームは、特定の腫瘍にターゲットされる。これは、腫瘍−結合抗体をリポソームに付けることによって達成することが可能である。ウイルスの粒子は、また、リポソーム内に組み込まれてもよい。該粒子は、医師の意志で適当な手段によって腫瘍に運ばれる。好ましくは、ウイルスの粒子は、選択的に腫瘍細胞を感染させることが可能であろう。”選択的な感染”とは、ウイルスの粒子が、主に腫瘍細胞に感染し、感染された非−腫瘍細胞の割合は、プロドラッグの投与による非−腫瘍細胞の損傷が、治療された疾患の特徴を考慮すれば受容できるほど低い程度であろうことを意味する。最終的に、これは医師によって決定されるであろう。
【０１０１】
投与の適した経路の一つは、粒子を含む滅菌溶液の注射によるものである。プロドラッグにおいては、単独で投与されることは可能であるが、薬学的剤形を与えることが好ましい。剤形は、１又はそれ以上の許容できるその担体とともに該プロドラッグを含み、任意に他の治療成分を含む。１又は複数の担体は、例えばリポソームの様に、剤形の他の成分に影響を及ぼさない意味で”許容される”ものでなければならず、及びその受容体に有害でないものでなければならない。適当なリポソームとして、例えば、正に荷電した脂質、（N[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を含むもの、3β[N-(n',N'-ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール（DC-Chol）を含むものが含まれる。
【０１０２】
例えば、細胞株をパッケージすることから単離されたウイルスを、また、局所灌流又は直接的な腫瘍内への使用、又は、例えば腹膜内注射のような身体の腔への直接的な注射（腔内投与）によって投与してもよい。
【０１０３】
また、筋肉細胞が、裸のＤＮＡを取り込むことができることは知られており、よって、裸のＤＮＡを肉腫に直接注射する本発明のベクターシステムを用いて、肉腫を治療してもよい。
【０１０４】
非経口又は筋肉内投与に適した剤形には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、殺菌性の抗生物質及び剤形を特定の受容者の血液と等張にする溶質を含んでいてもよい、水性又は非水性の滅菌注射溶液；懸濁剤及び濃稠化剤を含んでいてもよい水性又は非水性の滅菌懸濁液、及び血液成分又は１もしくはそれ以上の器官への化合物を標的とするようにデザインされたリポソーム又は他の微粒子システムを包含する。剤形は、例えば、シールされたアンプルやバイアル等のように、１投与量又は多投与量の容器で提供されてもよいし、使用直前に注射のために水のような滅菌した液体担体の添加のみを要求する凍結乾燥の状態で保存されてもよい。注射溶液及び懸濁液は、上記に記載した種類の滅菌した粉末、顆粒及び錠剤から即座に調製されてもよい。
【０１０５】
上記に具体的に記載した成分に加えて、剤形は問題となる剤形の型を考慮する技術分野で伝統的な他の薬剤を含んでいてもよい。可能性のある剤形として、滅菌したパイロジェンを含まない水性又は非水性溶液が好ましい。
【０１０６】
投与量は、連続して、例えば、毎日、毎週又は毎月の間隔で、又は、患者が特別に必要する際に応じて投与してもよい。好ましい投与経路は、経口投与及び注射、典型的には、非経口又は筋肉内注射又は腫瘍内注射である。
【０１０７】
本発明のシステムを使用するにおいて、該プロドラッグは、酵素をコードするベクターの投与の後に通常投与される。典型的には、ベクターを患者に投与し、その後、トランスフェクションを受けた又は感染した（ウイルスベクターの場合）細胞によるベクターの取り込みを、例えば、標的とする組織の生検試料の回収及び分析によって、モニターする。
【０１０８】
正確な投与の型は、もちろん、個々の患者における個々の臨床医によって決定される必要があり、これは、順番に、プロドラッグの正確な特徴及びプロドラッグから放出される細胞毒性剤によってコントロールされるが、ある種の一般的な指示を得ることができる。この型の化学療法は、一般には、プロドラッグと修飾したウイルス共の非経口投与を含み、経静脈経路による投与は、しばしば、もっとも実際的なものとして見受けられる。神経膠芽細胞腫においては、その経路はしばしば腫瘍内である。プロドラッグの典型的な投与量の範囲は、一般には、１日あたり患者ｋｇ当たり約１〜１５０ｍｇの範囲であって、単回又は複数回投与で投与される。好ましくは、投与量範囲は、１日あたり患者ｋｇ当たり約１０〜７５、例えば、約１０〜４０ｍｇの範囲であろう。他の投与量については、患者の状態及び医師の裁量における他の因子に従って使用してもよい。
【０１０９】
本発明のシステムを使用して治療される腫瘍は、ＧＤＥＰＴ又はＶＤＥＰＴシステムによって治療できる又は治療されるいかなる腫瘍をも包含し、いかなるある特定のクラスの腫瘍に限定されない。特に適当な腫瘍のタイプとしては、胸部、結腸及び卵巣の癌、及び膵臓、メラノーマ、神経膠芽細胞腫、肝癌、小細胞肺、非小細胞肺、筋肉及び前立腺の癌を含む。
【０１１０】
本発明のシステムは、また、感染症疾患、及び、例えば、細胞の個体群の根絶を要求する他のあらゆる状態を治療するのに使用してもよい。
【０１１１】
腫瘍の治療に関する限り、治療には、患者における腫瘍の作用を緩和する、医師によって取られたいかなる処置も含まれる。このように、腫瘍の完全な緩解が所望の目的であるが、効果的な治療には、また、腫瘍の部分的な緩解を達成することが可能で、転移を含む腫瘍の増殖速度における減速のいかなる処置も含まれる。そのような処置は、生命の質を長くし及び／又は高め、疾患の症状を軽くするのに効果的である。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例において、本発明を例示する。
【０１１３】
製造例１
哺乳動物細胞の表面上でＣＰＧ２を発現するために、ＣＰＧ２とｃ−ｅｒｂＢ２の一部との融合を構築した。用いたｃ−ｅｒｂＢ２の一部は：−
１．シグナルペプチドコーディング領域（コドン１−２７）：
【０１１４】
【数１】
2006042821.tif 000013
【０１１５】
これは、コドン８において起こる、この位置におけるアミノ酸を変化しないサイレントな天然のＣＧＣからＣＧＴへの突然変異を除けば、クーセンスら(Coussens et al)、(1985)，サイエンス(Science),230, 1132-1139によって公開された配列と同一である。
【０１１６】
２．トランスメンブレン領域（コドン６３６−６８６）：
【０１１７】
【数２】
2006042821.tif 000014
【０１１８】
これは、コドン６５５に保存されたＶａｌ（ＧＴＣ）からＩｌｅ（ＡＴＣ）への置換がおこる、天然の突然変異を除けば、クーセンスら(Coussens et al)、(1985)，サイエンス(Science),230, 1132-1139によって公開された配列と同一である。
【０１１９】
ｃ−ｅｒｂＢ２のシグナルペプチドのＣＰＧ２への結合を容易にするために、ｃ−ｅｒｂＢ２のコドン１−２７及びＢａｍＨ１（ＧＧＡＴＣＣ）制限エンドヌクレアーゼ部位に変換するために変異を受けたコドン２８及び２９を含むＰＣＲフラグメントを調製した。これはプライマー＃４４７８：
【０１２０】
【数３】
2006042821.tif 000015
【０１２１】
と、プライマー＃４４７９：
【０１２２】
【数４】
2006042821.tif 000016
【０１２３】
をともに用いて達成した。
【０１２４】
フラグメントを含むシグナルペプチドを、ＢａｍＨ１及びＮｃｏｌ（イニシエーターＡＴＧ、すなわちＣＣＡＴＧＧにまたがるｃ−ｅｒｂＢ２中に起こる部位）での消化によってＰＣＲ断片から放出する。
【０１２５】
同様のアプローチによって、ＣＰＧ２のコドン２１及び２２をＢａｍＨ１部位に転換させる。同時に、ＥｃｏＲ１部位をＣＰＧ２のコドン４１６（天然の終止コドン）において作成した。これは、ＰＣＲプライマー＃４４７６：
【０１２６】
【数５】
2006042821.tif 000017
【０１２７】
と、プライマー＃４４７７：
【０１２８】
【数６】
2006042821.tif 000018
【０１２９】
をともに用いて行った。
【０１３０】
同様に、ｃ−ｅｒｂＢ２のコドン６３４及び６３５を、ＥｃｏＲ１部位に転換し、コドン６８７及び６８８をＣｌａ１部位に転換した。これは、プライマー＃４４８０：
【０１３１】
【数７】
2006042821.tif 000019
【０１３２】
と、プライマー＃４４８１：
【０１３３】
【数８】
2006042821.tif 000020
【０１３４】
をともに用いて達成した。
【０１３５】
ｃ−ｅｒｂＢ２のトランスメンブレン領域（コドン６３６−６８６）を、ＥｃｏＲ１及びＣｌａ１で消化したＰＣＲフラグメントとして放出した。
【０１３６】
最後に、２種のオリゴヌクレオチドアダプターを用いて、ｃ−ｅｒｂＢ２のトランスメンブレン領域の５’末端に、９Ｅ１０モノクローナル抗体認識部位（エヴァンら（Evan et al ）(1985), Mol Cell Biol 5, 3610-3616参照）を作成した。これは、オリゴヌクレオチド＃４５１３：
【０１３７】
【数９】
2006042821.tif 000021
【０１３８】
及びオリゴヌクレオチド＃４５１４：
【０１３９】
【数１０】
2006042821.tif 000022
【０１４０】
を用い、標準リンカークローニング技術を用いて達成した。種々のフラグメントを、設計された制限エンドヌクレアーゼ部位を通じてお互い結合し、以下の構造：
ｃ−ｅｒｂＢ２（アミノ酸１−２７）：ＧｌｙＳｅｒ：ＣＰＧ２（アミノ酸２３−４１５）：ＧｌｕＰｈｅ：ｃ−ｅｒｂＢ２（アミノ酸６３６−６８６）：ＩｌｅＡｓｐ：９Ｅ１０エピトープ（ＧｌｕＧｌｎＬｙｓＬｅｕＩｌｅＳｅｒＧｌｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕ）：Ａｓｎ＊
を持つ蛋白質を産生するキメラ（chaemera）を生成した。
【０１４１】
融合の各々の部分間の余分のアミノ酸は、設計された制限酵素部位の結果である。この融合遺伝子を、”ＣＰＧ２（表面）”という。この遺伝子の変化は、フレームシフト突然変異をｃ−ｅｒｂＢ２シグナルペプチド及びＣＰＧ２部分間に導入することで作成された。これは、該キメラをＢａｍＨ１で消化し、突出部を末端修復した後プラスミドを再結合させることによって達成された。これは、ずれたフレーム突然変異を産生し、遺伝子がＣＰＧ２（表面）を発現することができない結果となり、”ＣＰＧ２（表面Ｆ／Ｓ）”という。ＣＰＧ２（表面）及びＣＰＧ２（表面Ｆ／Ｓ）を、マウス細胞株中の遺伝子の発現を指示するモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲを使用する、哺乳類の発現ベクターＭＬＶβｐリンクにクローン化した（ダルトン及びトレイスマン(Dalton and Treisman), (1992), Cell 68, 597-612）。これらプラスミドを、それぞれＭＬＶＣＰＧ２（表面）及びＭＬＶＣＰＧ２（表面Ｆ／Ｓ）という。
【０１４２】
比較例１
哺乳動物細胞でのＣＰＧ２（表面）の発現を評価する目的で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の１皿を、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）でのトランスフェクションを行い、ネガティブコントロールとして、細胞１皿をＭＬＶβｐリンクでトランスフェクションを行った。該トランスフェクションは、脂性のトランスフェクション試薬、リポフェクトアミン（lipofectAMINE）（ギブコビーアールエル(GibcoBRL)）を用いて行った。トランスフェクションにおいて、１×１０５個の細胞を３５ｍｍの組織培養皿中にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、リポフェクトアミン：ＤＮＡコンプレックスを、０．４μｇのプラスミドと６μｌのリポフェクトアミン試薬を計３２μｌのＰＢＳＡ中で組み合わせることによって調製し、該コンプレックスを室温で１５分間インキュベートした。細胞を２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、０．８ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中に置いた。リポフェクトアミン：ＤＮＡコンプレックスを、０．２ｍｌの血清を含まない培地で希釈し、細胞に添加した。該細胞を、リポフェクトアミン：ＤＮＡコンプレックスと共に３７℃で６時間インキュベートし、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地２ｍｌで２回洗浄し、２．５ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中に置いた。更に４２時間のインキュベーションの後に、細胞を５ｍｌのＰＢＳＡで２回洗浄し、組織培養皿上で５０μｌのバッファーＡ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５）中に抽出した。抽出物を１．５ｍｌチューブに移し、マイクロ−フュージ中１３，０００ｒｐｍで遠心した。上清を集め、蛋白質の濃度をバイオ−ラッド蛋白アッセイキット（Bio-Rad protein assay kit）で、ＢＳＡを標準物質として測定した。
【０１４３】
蛋白質−イムノブロット分析として、各抽出物１０μｌを１０μｌのＳＤＳ試料バッファーと組み合わせ、該蛋白質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ラミリ(Laemmli)U.K. (1970),Nature 227; 680-685 ）上で分離した。ゲル中の蛋白質をニトロセルロースに電気溶出によって移し、細胞抽出物を、Ｓｆ９昆虫細胞中に発現したＣＰＧ２に対して集められたＣＰＧ２特異的ウサギポリクローナル抗体を用いて、蛋白質−イムノブロッティング（ゲルショーニ(Gershoni) J.M. 及びパラード(Palade)G.E., (1983) Anal. Biochemistry 131; 1-15）で分析した。抗体は１：１０００に希釈して用い、免疫コンプレックスは、ＥＣＬイムノブロッティングキット（アマシャム(Amersham)）を用いて、製品の使用説明書に従って検出した。
【０１４４】
これら結果から、ｐＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞からの抽出物中、分子量が〜５０，０００−６０，０００のスミアーとして移動する、抗体によって認識される蛋白質が存在することが分かる（図１、レーン２）。この蛋白質は、ＭＬＶβｐリンクでトランスフェクションを受けた細胞中には存在せず（レーン１）、それゆえ、ＣＰＧ２（表面）がこれら細胞中で高いレベルで発現されることを示している。
【０１４５】
ＣＰＧ２酵素活性について、３０５ｎｍで光の吸光度を測定することによって検出可能である、ＣＭＤＡプロドラッグを薬剤に切断する能力を測定する（スプリンガーら(Springer et al), Eur J Cancer (1991) 27; 1361-1366）ことによって、抽出物を試験した。アッセイとして、バッファーＡ中に抽出された５μｇのＮＩＨ３Ｔ３蛋白質を、５０μＭのＣＭＤＡプロドラッグを含む１ｍｌのアッセイバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，６０μＭ  ＺｎＣｌ２，ｐＨ７．４）中で３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭになるように添加し、得られた３０５ｎｍにおける吸光度の変化を、出発溶液のそれと比較した。吸光度の減少は、プロドラッグの薬剤への転換を示し、それゆえ、推論によって、ＣＰＧ２の存在を示している。このような条件下、ＭＬＶβｐリンク又はＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞からの抽出物中ではＣＰＧ２活性が検出されず、これは、発現された蛋白質が、不活性であることを示している。
【０１４６】
比較例２
ＣＰＧ２（表面）は、ゴルジ装置及び小胞体を通じて処理され、細胞の表面に到達する（ｃ−ｅｒｂＢ２によって取られる経路）ようであるので、潜在的にグリコシル化され、酵素活性の欠如を説明できることが考慮された。Ｎ−結合グリコシル化はゴルジ装置及び小胞体中、一次アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘａａはいかなるアミノ酸でもよい）であるモチーフで起こり；グリコシル化はＡｓｎ残基上で起こる。ＣＰＧ２の一次アミノ酸配列内でそのように一致するモチーフが、Ａｓｎ２２２、Ａｓｎ２６４及びＡｓｎ２７２残基の３個所位置する。ＣＰＧ２（表面）がグリコシル化されているかを確認するために、２セットのトランスフェクションを受けた細胞を用意した。各セットはＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞の皿及び、ネガティブコントロールとしてのＭＬＶＣＰＧ２（表面／ＦＳ）でトランスフェクションを受けた皿を含んでいた。トランスフェクションの後に、セット１を１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中で４２時間インキュベートした。セット２も１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中で４２時間インキュベートしたが、ツニカマイシン（最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）をインキュベーションの残りの２４時間に培地中に含めた。ツニカマイシンはヌクレオシド抗生物質でありＮ−結合グリコシル化を阻害する。細胞を、バッファーＡ中に集め、上述のような、蛋白質イムノブロット分析及びＣＰＧ２酵素活性アッセイにかけた。
【０１４７】
イムノブロットのデータより、ＣＰＧ２（表面）が、ツニカマイシンの存在下インキュベートした哺乳動物細胞中で産生されるとき、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でのその移動度が、ツニカマイシン非存在下でインキュベートした細胞と比較して増加することを示している（図２、レーン２及び４を比較して）。更に、該蛋白質は、グリコシル化に起こるブロックを暗示する’ラダーリング（laddering）’を受ける。ある種の蛋白質は、該ブロックを逃れるようだが、これはツニカマイシンを適用する前に合成された蛋白質を示しているようである。コントロールのレーンは、ＣＰＧ２（表面）が、ＭＬＶＣＰＧ２（表面Ｆ／Ｓ）でトランスフェクションを受けた細胞中で産生されていないことを示す（図２、レーン１，３）。
【０１４８】
これら蛋白質抽出物を、上述したようなＣＰＧ２酵素活性について分析した。ＭＬＶＣＰＧ２（表面／ＦＳ）でトランスフェクションを受けた細胞からの抽出物は、ツニカマイシンで処理又は処理されていない細胞中、有意な酵素活性を含有していなかった（図２Ｂ、試料１，３）。ＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションされ、ツニカマイシンで処理されていない細胞からの抽出物もまた、ＣＰＧ２活性を含んでいなかった（図２Ｂ、試料２）。しかしながら、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションされ、ツニカマイシンで処理された細胞からの抽出物は、このアッセイで検出することができるＣＰＧ２活性を高いレベルで含んでいた（図２Ｂ、試料４）。
【０１４９】
これらデータから、ＮＩＨ３ＴＳ細胞中で発現したＣＰＧ２（表面）はグリコシル化され、このグリコシル化はその酵素活性を阻害することがわかる。しかしながら、グリコシル化をブロックすると酵素は活性を有している。
【０１５０】
実施例１
ＣＰＧ２（表面）のグリコシル化を阻害するために、グリコシル化のモチーフを分裂させるようにデザインされた特定のコドン置換を含む一連の突然変異体遺伝子を構築した。第１のシリーズとして、アミノ酸Ａｓｎ２２２、Ａｓｎ２６４又はＡｓｎ２７２をロイシン残基に変換させた、個々の変異を作成した。これらは以下のプライマーを用いて、ＰＣＲによって産生した。
１）Ａｓｎ２２２用  プライマー＃５３８：
【０１５１】
【数１１】
2006042821.tif 000023
【０１５２】
これは、プライマー＃４７３２：
【０１５３】
【数１２】
2006042821.tif 000024
【０１５４】
と共に使用される。
【０１５５】
２）Ａｓｎ２６４用  プライマー＃５３９：
【０１５６】
【数１３】
2006042821.tif 000025
【０１５７】
プライマー＃５４０：
【０１５８】
【数１４】
2006042821.tif 000026
【０１５９】
これらは、プライマー＃４７３３：
【０１６０】
【数１５】
2006042821.tif 000027
【０１６１】
及びプライマー＃５５７：
【０１６２】
【数１６】
2006042821.tif 000028
【０１６３】
と共に使用される。
【０１６４】
３）Ａｓｎ２７２用  プライマー＃５４１：
【０１６５】
【数１７】
2006042821.tif 000029
【０１６６】
プライマー＃５４２：
【０１６７】
【数１８】
2006042821.tif 000030
【０１６８】
これらは、プライマー＃４７３３及び５５７と共に使用される。
【０１６９】
Ａｓｎ２２２において、野生型配列を置換するのに使用したＳｍａ１／Ｓｐｈ１フラグメント上で変異された残基を含むＰＣＲフラグメントを産生した。残基Ａｓｎ２６４及びＡｓｎ２７２において、関連するＰＣＲフラグメントを、Ｓｐｈ１／Ｎｏｔ１フラグメントとして得、これらはＣＰＧ２遺伝子中野生型配列を置換するために用いられる。３種すべての変異体をＭＬＶＣＰＧ２（表面）の枠組みの中にクローン化し、変異体Ａｓｎ２２２ＬｅｕをＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＮと、変異体Ａｓｎ２６４ＬｅｕをＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＮＬＮと、及び変異体Ａｓｎ２７２ＬｅｕをＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＮＮＬという。
【０１７０】
潜在的な部位がグリコシル化されているか試験するために、２セットのＮＩＨ３Ｔ３細胞を用意した。各セットはＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞の１皿、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＮでトランスフェクションを受けた細胞の１皿、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＮＬＮでトランスフェクションを受けた細胞の１皿及びＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＮＮＬでトランスフェクションを受けた細胞の１皿を含んでいた。上述したように、セット１をツニカマイシン非存在下でインキュベートし、セット２はツニカマイシン存在下でインキュベートした。細胞抽出物を、バッファーＡ中に集め、蛋白質イムノブロット分析及びＣＰＧ２酵素活性アッセイを行った。
【０１７１】
イムノブロットのデータは、個々の突然変異の各々は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中ＣＰＧ２（表面）の移動度において増加する結果を示している（図３Ａ、レーン１−４）。ツニカマイシンの存在下、変異体グリコシル化されていない蛋白質の移動度は、ＣＰＧ２（表面）のそれと同一である（図３、レーン５−８）。これらのデータは、ツニカマイシン非存在下で観察された増加した移動度が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でのＣＰＧ２（表面）の移動度における変異の効果によるものではないことを示し、３種の潜在的な部位のそれぞれがＮＩＨ３Ｔ３細胞中グリコシル化されていることを示している。
【０１７２】
該抽出物を、上述のＣＰＧ２酵素活性アッセイにかけた。３種の変異体すべての蛋白質は、ツニカマイシンで処理していないＮＩＨ３Ｔ３細胞中で産生したとき、変異していない蛋白質で観察されたように、非活性であることがわかった（図３Ｂ、試料１−４）。しかしながら、ツニカマイシンで処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞中で産生すると、ＣＰＧ２（表面）ＮＬＮは非活性であると判明したにもかかわらず、ＣＰＧ２（表面）、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＮ及びＣＰＧ２（表面）ＮＮＬは、すべて活性があることが判明した（図３Ｂ、試料５−８）。
【０１７３】
合わせると、これらデータは、それぞれの同定された潜在的なグリコシル化モチーフが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でグリコシル化され、該モチーフを分裂させる変異がグリコシル化を阻害することを示している。残基Ａｓｎ２２２及びＡｓｎ２７２の個々の変異は酵素活性には何らの効果を有しないが、Ａｓｎ２６４の変異は酵素活性をブロックする。
【０１７４】
それゆえ、Ａｓｎ２６４でのグリコシル化モチーフにおける突然変異の変形を生産した。該モチーフ中の第３の位置のＳｅｒ／Ｔｈｒの変異によりグリコシル化をブロックすることが可能である。それゆえ、Ｔｈｒ２６６をプライマー＃７６６：
【０１７５】
【数１９】
2006042821.tif 000031
【０１７６】
及びプライマー＃７６７：
【０１７７】
【数２０】
2006042821.tif 000032
【０１７８】
を、プライマー＃４７３３及び＃５７７と共に用いロイシンに変異させ、続いて残基２６４及び２７２についての変異について同様な方法を行った。変異Ｔｈｒ２６６Ｌｅｕを、変異Ａｓｎ２２２Ｌｅｕ及びＡｓｎ２７２Ｌｅｕの枠組みの中にクローン化し、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬという３ヶ所変異を受けた遺伝子を産生した。これを、ＭＬＶβｐリンクにクローン化し、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬと命名した。
【０１７９】
この蛋白質がグリコシル化されるか及び活性を有するか試験するために、２セットのＮＩＨ３Ｔ３細胞を用意し、各セットはＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞の１皿及びＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬでトランスフェクションを受けた細胞の１皿を含んでいた。上述のように、セット１は、ツニカマイシン非存在下でインキュベートし、セット２はツニカマイシン存在下でインキュベートした。細胞抽出物を、バッファーＡ中に調製し、蛋白質イムノブロット分析及び酵素活性アッセイにかけた。イムノブロット分析の結果より、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で見かけの分子量が〜４７，０００であるタイトなバンドとして移動することがわかる；これはＣＰＧ２（表面）の場合より相当小さい（図４Ａ、レーン１，２）。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬがツニカマイシンと共にインキュベートした細胞中で産生されるとき、その見かけの分子量に変化はない（レーン２，４）、更に、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬは、もっとも速く移動する（それゆえおそらくグリコシル化されていない）、ツニカマイシンで処置されたＮＩＨ３Ｔ３細胞中で産生されるＣＰＧ２（表面）の形態と共に移動する（図４Ｂ、レーン２，３）。
【０１８０】
これらの抽出物の酵素活性を調べた。ＣＰＧ２（表面）と異なり、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬは、ツニカマイシンで処理されていなかった細胞から取った抽出物中に活性が認められた（図４、試料１，２）。ツニカマイシンで処理した細胞由来のＣＰＧ２は、ツニカマイシンで処理した細胞由来のＣＰＧ２（表面）と対照的に、この活性に影響しなかった（試料１，３と２，４を比較して）。
【０１８１】
これらデータは、ＣＰＧ２（表面）における３つのグリコシル化のモチーフのすべての変異が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるそのグリコシル化を完全に阻害することを示す。変異Ａｓｎ２２２Ｌｅｕはその残基でのグリコシル化をブロックし、酵素活性については許容されていた。変異Ａｓｎ２６４Ｌｅｕは、その残基でのグリコシル化を阻害したが、酵素活性もまた阻害した。変異Ｔｈｒ２６６Ｌｅｕは、残基Ａｓｎ２６４でのグリコシル化をブロックし、酵素活性については許容されていた。変異Ａｓｎ２７２Ｌｅｕはその残基でのグリコシル化をブロックし、活性については許容されていた。３ヶ所の変異体Ａｓｎ２２２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ２６６Ｌｅｕ、Ａｓｎ２７２Ｌｅｕはグリコシル化されておらず活性を有していた。
【０１８２】
実施例２
ＣＰＧ２（表面）の、ＣＭＤＡプロ−ドラッグ存在下でのＮＩＨ３Ｔ３細胞を殺す能力を試験した。３セットのＮＩＨ３Ｔ３細胞を用意し、各々ＭＬＶβｐリンクでトランスフェクションを受けた細胞の１皿、ＭＬＶＣＰＧ２（表面）でトランスフェクションを受けた細胞の１皿又はＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬでトランスフェクションを受けた細胞の１皿を含んでいた。細胞をトランスフェクションに続いて４２時間インキュベートし、その後、セット１をプロドラッグビヒクル（５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，０．５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ，ｐＨ７．０；最終濃度）の存在下２４時間インキュベートした。セット２は、ＣＭＤＡプロドラッグ（最終濃度０．５ｍＭ）の存在下３時間インキュベートした。セット３はＣＭＤＡ（０．５ｍＭ）中２４時間インキュベートした。プロドラッグ処理後、細胞を５ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで３回洗浄し、セット１及び３は更に２４時間新鮮な培地中でインキュベートし、セット２は４５時間インキュベートした。その後、細胞を新鮮な培養皿で継代し、２ｍｌ  ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中１×１０５細胞／３５ｍｍ皿で播種した。更に７２時間インキュベーション後、細胞の増殖を[３Ｈ]−チミジンの取り込みによって評価した。
【０１８３】
チミジンの取り込みにおいて、１μＣｉの[メチル−３Ｈ]チミジンを各ウエル（２ｍｌ培地）に添加し、３７℃で５時間インキュベートした。細胞をＰＢＳＡ（４℃）で２回洗浄し、５％ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液で４℃、２０分間固定した。ＴＣＡを除去し、細胞を２ｍｌメタノールで２回洗浄し、空気乾燥した。ＤＮＡを、１ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ，１％  ＳＤＳを用い室温で５分間抽出し、４ｍｌのシンチレーション流体に添加し、取り込まれたチミジンを、シンチレーションカウンティングによって決定した。
【０１８４】
ＭＬＶＣＰＧ２（表面）又はＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬでトランスフェクションを受けた細胞は、ＭＬＶβｐリンクでトランスフェクションを受けた細胞と同じ速度で増殖し、このことは、哺乳動物細胞の表面上でのＣＰＧ２（表面）又はＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬの発現は、細胞の増殖速度に影響を及ぼさないことを示す（図５、試料１−３）。コントロールの細胞のプロドラッグの処理は、その細胞の増殖の速度において最小限の効果を有する（図５、試料１，４，７）。対照的に、ＣＰＧ２（表面）及びＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬを発現する細胞のプロドラッグの処置は、増殖において著しい効果を有する。ＣＰＧ２（表面）を発現する細胞は、３時間のプロドラッグ処置によって影響を受けないが、２４時間プロドラッグ処置後細胞増殖の〜８７％阻害があった（図５、試料２，５，８）。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬを発現する細胞は、３時間のプロドラッグ処置後の細胞増殖において〜２０％減少を示し、続く２４時間プロドラッグ処理後完全な細胞の死を示し、プロドラッグ処置により大きな感受性を有していた。
【０１８５】
これらのデータから、ＣＰＧ２（表面）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をＣＭＤＡプロドラッグで処置すると、細胞増殖は阻害できることがわかる。ＣＰＧ２（表面）のグリコシル化をブロックすることは、酵素活性を増大させ、酵素−プロドラッグシステムの細胞殺傷の可能性を非常に増大させる結果となることがわかる。
【０１８６】
製造例２
１．ベクターの構築
発現カセットを、ＥＦ１ａプロモーター、第１エクソン、第１イントロン及び第２エクソンの部分を含むプラスミドｐＥＦ−Ｂｏｓ（ミジスマ及びナスガタ(Mizishuma and Nasgata)(1990), NAR, 18, 5322）由来の１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲ１フラグメントを、β−グロビン遺伝子に、β−グロビン遺伝子の転写開始に対し位置−４に融合することによって構築した。ポリリンカー及びβ−グロビンの３’の翻訳されていない領域を含有するプラスミドＭＬＶβ−Ｐリンク由来のＮｃｏ−１／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、β−グロビン遺伝子の翻訳開始にまたがって位置する（転写開始に対して、位置＋５０）、β−グロビン遺伝子のＮｃｏ−１部位に融合し、適切なｍＲＮＡプロセッシングのためのポリリンカー及び３’非翻訳領域を与えた。
【０１８７】
この完全なカセットを、ベクターｐＭＣｌＮｅｏ  ＰｏｌｙＡ（ストラタジーン(Stratagene)）にクローン化させた。ｐＭＣ１Ｎｅｏ  ＰｏｌｙＡを最初に修飾して、ＮｅｏＲ遺伝子中に位置するＮｃｏ１部位を破壊し、ＮｅｏＲ遺伝子の３’末端に位置するＢａｍＨｉ、ＨｉｎｃＩＩ及びＳａＩ１部位を除去した。ＥＦ１α発現カセットを、（末端修復された）ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、修飾されたｐＭＣ１Ｎｅｏ  ＰｏｌｙＡプラスミド中の（末端修復された）Ｘｈｏ１部位にクローン化した。ＥＦ１αプロモーター及び反対方向に向かう（ＮｅｏＲ遺伝子の発現をおこなう）ＴＫプロモーターを有するベクターを、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬの発現のために選択した；該ベクターをｐＭＣＥＦ−Ｐリンクと命名する。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬを、Ｎｃｏ１／Ｘｂａ１フラグメントとしてｐＭＬＶＣＰＧ２（表面）からｐＭＣＥＦ−ＰリンクのＮｃｏ１／Ｘｂａ１部位にクローン化した；該プラスミドをｐＭＣＥＦＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬと命名する。コントロールプラスミドとして、ｌａｃＺ遺伝子も、また、プラスミドＭＬＶＢｌａｃＺからＮｃｏ１／Ｘｂａフラグメントとして、ｐＭＣＥＦ−ＰリンクのＮｃｏ１／Ｘｂａ１部位にクローン化した；これをｐＭＣＥＦｌａｃＺと命名する。
【０１８８】
２．安定な細胞株の調製
安定な細胞株を、ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬ、またはコントロールとしてＬａｃＺ遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）を構成的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて調製した。これを行なうために、上記比較例１に記載されるように、ｐＭＣＥＦ−ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬまたはｐＭＣＥＦｌａｃＺでＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションから２日後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌで含む培地に細胞を低密度でプレートした。単一の細胞から生じるコロニーが、約２週間後に観察され得、これらをクローン化し個々に増殖させた。各Ｇ４１８耐性コロニーからの細胞抽出物（上記比較例に記載されるように抽出した）３０ｍｌを、上記比較例１からの抗血清を用いて、イムノプロテインブロッティングすることにより、ＣＰＧ２（表面）の発現を測定した。高レベルのＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬを発現する細胞株＃１６（図６Ａ）およびβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞株＃３（下記を参照）を、さらなる調査のために選択した。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬおよびβ−ガラクトシダーゼの発現を、酵素アッセイによって、細胞株で証明した。これらのアッセイのために、株＃３および＃１６に関する１×10５個の細胞を３５ｍｍ組織培養皿にプレートし、４日間インキュベートした。細胞抽出物を調製し（上記を参照）、５μgのタンパク質をＣＭＤＡ分解アッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイにかけた（ＣＭＤＡアッセイは、上記比較例に記載されている）。細胞中のβ−ガラクトシダーゼ活性のアッセイのために、５μgの抽出タンパク質を、６００μｌのアッセイ用緩衝液（４０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、２６．７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６．７ｍＭＫＣＩ、１ｍＭＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣＬ、０．０６％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．２ｍＭ  ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトピラノシド）に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。２５０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３をサンプルに加え、ＯＤ４２０を測定した。図６Ｂおよび６Ｃの結果は、株＃３からの抽出物（点刻棒）が高レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を含むがＣＰＧ２活性を含まない、ことを示している。株＃１６からの抽出物は、いかなる検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性も含まないが、検出可能なレベルのＣＰＧ２活性を含む。
【０１８９】
実施例３
製造例２で得られた細胞株＃３および＃１６を、ＣＭＤＡプロドラッグによる細胞障害性についてテストした。２４ウェル皿の各ウェルに１×10５個の細胞をプレートし、４０時間インキュベートし、続いて、ＣＭＤＡの濃度を増加させながら、３７℃で６０分間処理した。さらに６時間インキュベーションした後、細胞の１０％を２４ウェル皿に再プレートし、さらに５日間インキュベートし、細胞生存度を［３Ｈ］−チミジン取込みにより測定した。図７の結果は、細胞株＃３（黒塗りの印）はテストされた最高濃度のＣＭＤＡにさえ感受性ではないが、＃１６（白抜きの印）は用量依存性に感受性であり、−１２５μＭのＩＣ５０を示すことを示している。
【０１９０】
実施例４
製造例２で得られた細胞株＃３および＃１６を、表示される種々の濃度で混合することによってバイスタンダー効果を測定し、２４ウェルプレートにウェル毎にトータルで１×10５個の細胞をプレートした。表示されているように２５０μＭまたは１０００μＭ  ＣＭＤＡを用いて、６０分間処理したことを例外として、実施例３に記載されるように細胞をインキュベーションし処理した。細胞の生存度を、実施例３のように測定した。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬを発現している細胞が４０％だけで、８０％以上の細胞がプロドラッグの存在下に殺滅されたので、これらの条件では、ぎりぎりのバイスタンダー効果があることを、図８のこれらの結果は示している。
【０１９１】
製造例３
この実施例では、ＣＰＧ２（表面）の活性の増大を可能にするよう、グリコシル化部位の他の突然変異を作製した。この目的のために、グリコシル化されることが示されている部位である、コドン２２２、２６４および２７２での、保存されたアスパラギンからグルタミンへの突然変異を作製することの生存性をテストした。これは、下記のＰＣＲプライマーを使用して、ＰＣＲ誘導突然変異誘発により行われた。
コドン２２２に関して：
#1171: 5'>GTG CAG GTC CAA ATC ACC GGC<3' および
#1172: 5'>GCC GGT GAT TTG GAC CTG CAC<3'。
コドン２６４に関して：
#926: >5'CTG CGC TTC CAA TGG ACC ATC<3' および
#927: >5'GAT GGT CCA TTG GAA GCG CAG<3'。
コドン２７２に関して：
#1173: 5'>AAG GCC GGC CAA GTC TCG AAC<3' および
#1174: 5'>GTT CGA GAC TTG GCC GGC CTT<3'。
【０１９２】
これは、実施例１に記載される実験プロトコールを使用して行われた。
【０１９３】
コドンＮ２２２／２６４／２７２Ｑ突然変異を含むＣＰＧ２（表面）を、ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱと称し、Ｎｃｏ１／ＸｂａフラグメントとしてＭＬＶβＰリンクにクローニングした；このプラスミドをｐＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＱＱＱと呼ぶ。ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱの酵素活性をテストするために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＭＬＶＣＰＧ２（表面）またはｐＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＱＱＱでトランスフェクトし、細胞抽出物を調製した；これら抽出物を、イムノプロテインブロッティングにより調べ、ＣＰＧ２酵素活性を比較例に記載されるように調べた。イムノプロテインブロットは、ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱタンパク質（図９Ａ、レーン２）が、ＣＰＧ２（表面）タンパク質（図９Ａ、レーン１）と違い、グリコシル化されていないタンパク質と一致する移動度で泳動することを示している。活性アッセイのデータから、類似の量の活性のためには、ＣＰＧ２（表面）タンパク質（黒塗り棒、図９Ｂ）は、ＣＰＧ２（表面）タンパク質（白抜き棒、図９Ｂ）よりも−５０倍高いレベルのＣＰＧ２開裂活性を含むと見ることができる。
【０１９４】
ＭＤＡ２６１Ｂの安定な細胞株の調製
ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱは、ＣＰＧ２（表面）よりも活性であるので、ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱ、またはコントロールとしてβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＭＤＡ２６１Ｂ細胞株を調製した。ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱをｐＭＣＥＦ−ＰリンクにＮｃｏ１／Ｘｂａフラグメントとしてクローニングした；このプラスミドをｐＭＣＥＦＣＰＧ２（表面）ＱＱＱと呼ぶ。比較例に記載されたプロトコールに従って、ＭＤＡ３６１Ｂ細胞を、ｐＭＣＥＦＣＰＧ２（表面）ＱＱＱ、またはｐＭＣＥＦｌａｃＺのいずれかでトランスフェクトし、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に関するようにＧ４１８コロニーを生ずるよう処理した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に関して記載されたように、イムノプロテインブロット分析によって、Ｇ４１８耐性コロニーを、ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱ発現に関してテストした。これらの分析から、β−ガラクトシダーゼを発現するＭ２およびＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを発現するＭ３８の２つの細胞株を、さらなるテストのために選択した。イムノプロテイン分析は、Ｍ３８がＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを発現（図１０Ａ、レーン２）するが、Ｍ２は発現しない（図１０Ａ、レーン１）ことを証明している。株Ｍ２によるβ−ガラクトシダーゼの発現は、酵素アッセイによって確認された（図１０Ｂ、レーン１はＭ２抽出物を含み、レーン２はコントロールの抽出物を含む）。
【０１９５】
実施例５
これらの細胞株を、ＣＭＤＡプロドラッグおよびプロドラッグ２に対する感受性に関してテストした。１×10５個の細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルにプレートした。細胞を４８時間３７℃でインキュベーションした。続いて、ＣＭＤＡまたはプロドラッグ２の濃度を増加させながら、それらを６０分間３７℃でインキュベートし、２回洗浄し、培地に戻して、さらに５日間インキュベートした。次に、細胞の生存度を、［３Ｈ］−チミジン取込みを用いて測定した。結果は、ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを発現する細胞株（株Ｍ３８、図１１Ａおよび１１Ｂ、白抜きの印）が、β−ガラクトシダーゼを発現する株（株Ｍ２、図１１Ａおよび１１Ｂ、黒塗りの印）よりも、両方のプロドラッグに対してより感受性であったことを示す。
【０１９６】
プロドラッグＣＭＤＡに関しては、Ｍ２がプロドラッグに対していかなる感受性も示さなかったので、Ｍ３８がＭ２よりどれくらい多く感受性であるかは、テストされた最高濃度でさえ、判断できなかった。しかしながら、プロドラッグ２を用いると、その差違は実質的なものであり、Ｍ３８細胞はＭ２細胞よりも、プロドラッグに対して２００倍のオーダーでより感受性であった。
【０１９７】
実施例６
プロドラッグ２はまた、製造例３で得られたＭＤＡ  ＭＢ３６１トランスフェクト細胞で、スルホローダミンＢ細胞障害性アッセイを用いてアッセイされ（図１２）、これは９６ウェルマイクロタイター皿のウェルごとに５０００細胞をプレートすることにより為された。細胞を、１６０μｌのＤＭＥＭ培地にプレートした。終夜インキュベートした後、５％血清を含むＤＭＥＭで作製された薬剤または適切なコントロールを、４０μｌ体積でウェルに加えた。標準的条件下で、細胞を４日間インキュベートした。この後、培地を除去し、細胞を、氷上の氷冷１０％  ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を用いて約３０分間処理した。ＴＣＡを除去し、１８μｌの０．４％スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を加えるために、細胞をすすいだ。該スルホローダミンＢは、細胞を１０分間染色するために残した。染色の後、細胞をＴＣＡ中ですすぎ、１８μｌの１０ｍＭ  ＴＲＩＳを加える前に空気乾燥し、続いて、細胞の生存度を読んだ。各株が等しく感受性であることを確実にするために（即ち、ＣＰＧ２発現株が細胞殺滅剤に対しより感受性とされなかったことをチェックするために）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）をコントロールとして使用した。コントロールのＩ２Ｃ−Ｚ株と比較して、ＣＰＧ２−発現株に関しては、ＣＤＤＰに対する感受性の間にいかなる差違も見い出されなかった。（図１２を参照）
【０１９８】
実施例７
ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを構成的に発現するＭＤＡ  ＭＢ  ３６１細胞によるバイスタンダー効果を調べるために、Ｍ３８細胞株、Ｍ２細胞株、またはＭ３８：Ｍ２細胞の１：１０混合物を、２４ウェルプレートのウェルにプレートし（１×10４個の細胞）、４８時間インキュベートした。続いて、細胞を、種々の濃度のプロドラッグ２で６０分間処理し、新鮮な培地で２回洗浄し、新鮮な培地中で５日間インキュベートした。次に、［３Ｈ−メチル］チミジン取込みによって、細胞の生存度を測定した。結果は、Ｍ３８細胞株（ＩＣ５０  〜１μＭ）が、Ｍ２細胞株（ＩＣ５０  〜２００μＭ）よりも、プロドラッグに対して〜２００倍、より感受性であることを示す。しかしながら、細胞の僅か１０％がＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを発現し実質的なバイスタンダー効果を明示していた事実にも拘わらず、これら２つの細胞株を１：１０の割合で混合するとき、ＩＣ５０は〜１０倍減少した（〜２０μＭ）。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
図面の簡単な説明
【図１】図１.ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＣＰＧ２（表面）の発現  ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＭＬＶβｐリンク（レーン１）またはＭＬＶＣＰＧ２（表面）（レーン２）でトランスフェクションされた。該細胞は緩衝液Ａ中に抽出され、各サンプルは１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドゲルで電気泳動され、ニトロセルロースに移され、ＣＰＧ２特異的ポリクローナル抗体でプローブされた。図１は、ＣＰＧ２（表面）の泳動位置を示し、図の左側には標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。
【図２Ａ】図２．ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＣＰＧ２（表面）の発現に対するツニカマイシンの影響  （Ａ）イムノブロット分析：ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、各々ＭＬＶＣＰＧ２（表面Ｆ／Ｓ）（レーン１，３）またはＭＬＶＣＰＧ２（表面）（レーン２，４）でトランスフェクションされた。該細胞はツニカマイシンの非存在下（レーン１，２）またはツニカマイシンの存在下（レーン３，４）でインキュベーションされた。抽出物を調製し、図１に記載するようにして分析した。図は、ＣＰＧ２（表面）の泳動位置を示し、図の左側には標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。
【図２Ｂ】図２．ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＣＰＧ２（表面）の発現に対するツニカマイシンの影響  （Ｂ）ＣＰＧ２酵素活性アッセイ：（Ａ）部での細胞から抽出された酵素についてＣＰＧ２酵素活性を分析した。サンプル番号は（Ａ）部のレーン番号に対応している；サンプル５はネガティブコントロールとして細胞抽出物の代わりに抽出緩衝液を含む。活性は緩衝液コントロールに対して任意な値として表わされる。
【図３Ａ】図３．発現されたＣＰＧ２（表面）に対するグリコシル化変異の影響  （Ａ）イムノブロット分析：ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＭＬＶＣＰＧ２（表面）（レーン１，５）；ＭＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＮ（レーン２，６）；ＭＶＣＰＧ２（表面）ＮＬＮ（レーン３，７）；ＭＶＣＰＧ２（表面）ＮＮＬ（レーン４，８）またはＭＬＶβｐリンク（レーン９，１０）でトランスフェクションされた。サンプルは、コントロール細胞（レーン１、２、３、４、９）またはツニカマイシンで処理された細胞（レーン５、６、７、８、１０）に由来するものである。サンプルは図１と同様に分析された。種々の形態のＣＰＧ２（表面）と図の左側には標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。
【図３Ｂ】図３．発現されたＣＰＧ２（表面）に対するグリコシル化変異の影響  （Ｂ）ＣＰＧ２酵素活性アッセイ：（Ａ）部に由来する細胞抽出物をＣＰＧ２酵素活性アッセイにより分析した。サンプル番号は（Ａ）部のレーン番号に対応している。活性は緩衝液コントロールに対して任意な値として表わされる。
【図４Ａ】図４．ＣＰＧ２（表面）における潜在的なグリコシル化部位全ての変異の影響  （Ａ）イムノプロテインブロット分析．ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＭＬＶＣＰＧ２（表面）（レーン１，３）またはＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬ（レーン２，４）でトランスフェクションされた。抽出物はコントロール細胞（レーン１，２）、またはツニカマイシンで処理された細胞（レーン３，４）に由来する。サンプルは図１と同様に分析された。ＣＰＧ２（表面）プロテインと各レーンの左側には標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。
【図４Ｂ】図４．ＣＰＧ２（表面）における潜在的なグリコシル化部位全ての変異の影響  （Ｂ）ＣＰＧ２酵素活性アッセイ．（Ａ）部に由来する細胞抽出物をＣＰＧ２酵素活性アッセイにより分析した。サンプル番号は（Ａ）部のレーン番号に対応する；更にネガティブコントロールとして、コントロール細胞（サンプル５）またはツニカマイシンで処理された細胞（サンプル６）のいずれかに由来する、ＭＬＶβｐリンクでトランスフェクションされた細胞由来のサンプル（サンプル５，６）を含む。結果を緩衝液コントロールに対する任意な値として表わす。
【図５】図５．細胞毒性アッセイ  ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＭＬＶβｐリンク（サンプル１，４，７）ＭＬＶＣＰＧ２（表面）（レーン２，５，８）またはＭＬＶＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬ（レーン３，６，９）でトランスフェクションされた。トランスフェクション後４２時間して、細胞を、コントロールとしてプロドラッグ・ビヒクルで２４時間（レーン１−３）、ＣＭＤＡプロドラッグで３時間（レーン４−６）またはＣＭＤＡプロドラッグで２４時間（レーン７−９）で処理した。回復期間後、細胞を新鮮な組織培養ディッシュで継代し、３日後、細胞の生存度を［メチル−３Ｈ］チミジンの取り込みを測定することによって求めた。取り込まれたチミジンの量は、各サンプルのｄｐｍ値で示される。
【図６Ａ】図６（Ａ）イムノブロット分析．図はＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬの構成性（constitutive）発現を示す。ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬの電気泳動位置と図の左側には標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。レーン１および２はそれぞれ細胞株(cell line)＃３および＃１６である。
【図６Ｂ】図６（Ｂ）β−ガラクトシダーゼの酵素活性アッセイ．（Ｂ）および（Ｃ）において、（Ａ）由来の細胞抽出物が分析された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞株＃３に対する結果を白抜きバーで示し、細胞株＃１６に対する結果を黒塗りバーで示す。活性は緩衝液コントロールに対する任意の値で示す。
【図６Ｃ】図６（Ｃ）ＣＰＧ２の酵素活性アッセイ．（Ｂ）および（Ｃ）において、（Ａ）由来の細胞抽出物が分析された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞株＃３に対する結果を白抜きバーで示し、細胞株＃１６に対する結果を黒塗りバーで示す。活性は緩衝液コントロールに対する任意の値で示す。
【図７】図７．ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬまたはβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株のプロドラッグＣＭＤＡに対する感度。
【図８】図８．ＣＰＧ２（表面）ＬＮＬＬまたはＣＭＤＡプロドラッグを構成的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞で見られるバイスタンダー・エフェクト。
【図９Ａ】図９（Ａ）イムノブロット分析：ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＣＰＧ２（表面）およびＣＰＧ２（表面）ＱＱＱの一過性の発現。ＣＰＧ２（表面）およびＣＰＧ２（表面）ＱＱＱの泳動位置および図の左側に標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置を示す。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）ＣＰＧ２の酵素活性アッセイ．（Ａ）由来の細胞抽出物を分析した。サンプル番号は（Ａ）由来のレーン番号に対応する。活性を緩衝液コントロールに対する任意の値として表す。
【図１０Ａ】図１０（Ａ）イムノブロット分析：ＭＤＡ  ＭＢ３６１細胞中でのＣＰＧ２（表面）ＱＱＱの構成的発現．ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱの泳動位置を、図の左の標準分子量マーカー（ｋＤａ）の泳動位置として表す。
【図１０Ｂ】図１０（Ｂ）ＭＤＡ  ＭＢ３６１細胞株Ｍ２およびＭ３６で発現されたβ−ガラクトシダーゼの酵素活性．（Ａ）由来の細胞抽出物を分析した。サンプル番号は（Ａ）由来のレーン番号に対応する。活性は、緩衝液コントロールに対する任意の値として表す。
【図１１Ａ】図１１（Ａ）ＣＰＧ（表面）ＱＱＱまたはβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＭＤＡ  ＭＢ  ３６１細胞のプロドラッグＣＭＤＡに対する感度。
【図１１Ｂ】図１１（Ｂ）ＣＰＧ（表面）ＱＱＱまたはβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＭＤＡ  ＭＢ  ３６１細胞のプロドラッグ２に対する感度。
【図１２】図１２  ＣＰＧ２を構成的に発現するＭＤＡ  ＭＢ  ３６１細胞のプロドラッグ２に対する感度−スルホローダミンアッセイ。
【図１３】図１３  ＣＰＧ２（表面）ＱＱＱを構成的に発現するＭＤＡ  ＭＢ  ３６１細胞株で見られるプロドラッグ２とのバイスタンダー・エフェクト。
【０２００】
【表１】
2006042821.tif 000033
【０２０１】
【表２】
2006042821.tif 000034
【０２０２】
【表３】
2006042821.tif 000035
【図１】
2006042821.tif 000036
【図２Ａ】
2006042821.tif 000037
【図２Ｂ】
2006042821.tif 000038
【図３Ａ】
2006042821.tif 000039
【図３Ｂ】
2006042821.tif 000040
【図４Ａ】
2006042821.tif 000041
【図４Ｂ】
2006042821.tif 000042
【図５】
2006042821.tif 000043
【図６Ａ】
2006042821.tif 000044
【図６Ｂ】
2006042821.tif 000045
【図６Ｃ】
2006042821.tif 000046
【図７】
2006042821.tif 000047
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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