(57)【要約】【課題】本発明は、１型Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の活性型変異体を心筋特異的に高発現させた新規なトランスジェニックマウス及びそのマウスを利用した拡張型心筋症治療法のスクリーニング系を提供する。【解決手段】本発明は、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質を心筋特異的なプロモーターを用いてマウスに遺伝子導入することによって、拡張型心筋症の病理学的所見及び超音波心電図所見を再現するトランスジェニックマウスに関する。本発明のトランスジェニックマウスは、拡張型心筋症の薬物治療法及び遺伝子治療法のスクリーニング系に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、拡張型心筋症を再現することを特徴とするトランスジェニックマウス。
【請求項２】
前記活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがイヌ由来である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記プロモーターがマウス心筋αミオシン重鎖プロモーターである、請求項１又は２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全て他のアミノ酸に置換された変異体である、請求項１〜３の何れか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全てトリプトファンに置換された変異体である、請求項１〜４の何れか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
拡張型心筋症モデルとして使用される請求項１〜５の何れか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
拡張型心筋症の病理学的所見である心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性をもつことを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
拡張型心筋症の超音波心臓図所見である左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下を特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載のトランスジェニックマウスを用いることを特徴とする、拡張型心筋症治療薬のスクリーニング系。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか一項に記載のトランスジェニックマウスを用いることを特徴とする、拡張型心筋症に対する遺伝子治療法のスクリーニング系。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか一項に記載のトランスジェニックマウスの、拡張型心筋症治療薬スクリーニング系への使用。
【請求項１２】
請求項１〜８の何れか一項に記載のトランスジェニックマウスの、拡張型心筋症に対する遺伝子治療法スクリーニング系への使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異を持つ活性型ＮＣＸ１蛋白質を心筋特異的に高発現するトランスジェニックマウス（ＴＧマウス）に関し、詳しくは、拡張型心筋症を再現するＴＧマウス及び当該ＴＧマウスを用いた拡張型心筋症の治療法のスクリーニング系に関する。
【背景技術】
【０００２】拡張型心筋症は、原因不明の心腔拡大及び心収縮機能障害（心不全）を特徴とする疾患群である。一般に心重量は増加するが、超音波診断装置による心臓図所見では、壁厚増大はわずかで、心房及び心室の内腔拡張が見られる。また、病理学的所見としては、心筋細胞肥大、心筋細胞壊死、間質繊維化が認められる。疾患頻度に関しては、米国では１０万人当たり３６．５人とされ、新規発症が１０万人当たり５〜８人／年間とされている。拡張型心筋症の多発家系を対象とした連鎖解析による原因遺伝子座のマッピングから、これまでに１５以上の遺伝子異常が見つかっている。拡張型心筋症患者では、通常、僧帽弁逆流、致死性不整脈及び血栓症を合併することが多く、診断後５年以内の死亡率が５０％にも達し、予後は不良である。【０００３】拡張型心筋症の内科的な治療には、ジギタリス剤等の強心剤、利尿剤、血管拡張剤等が使用され、最近では「アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬」、「アンジオテンシン受容体阻害薬」等が拡張型心筋症の進行を遅らせ、予後を改善する薬剤として有益とされ、また、合併症の不整脈や血栓症の治療も必要に応じて行われている。しかしながら、上述したとおり予後が不良であり、拡張型心筋症に対する、より効果的な薬剤及び遺伝子治療法の開発が望まれている。【０００４】１型Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ１）は、心筋Ｃａ２＋トランジェントに関与する重要なＣａ２＋輸送体であり、心不全時においてＮＣＸ１の蛋白発現が上昇することが知られているが、ＮＣＸ１と心不全の具体的な関係は未だ明らかでない。ＮＣＸ１の活性は、Ｎａ＋依存性不活性化と呼ばれる活性調節機構により制御されている。電気生理学的な研究から、ＮＣＸ１の細胞内ドメインの特殊領域（ＸＩＰ領城）にＰＩＰ２が結合すると、このＮａ＋依存性不活性化が抑制され輸送活性が増大することが知られている。また、ＸＩＰ領域内に変異を導入すると、Ｎａ＋依存性不活性化の速度が変化することが報告されている。
【非特許文献１】松岡ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．１０９，Ｎｏ．２，２７３−２８６（１９９７）
例えば、ＸＩＰ領域内のアミノ酸番号２５５のフェニルアラニン残基がグルタミン酸に置換された変異型ＮＣＸ１では野生型ＮＣＸ１に較べてＮａ＋依存性不活性化の速度が速くなり、一方、ＸＩＰ領域内のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全てトリプトファンに置換された変異型ＮＣＸ１ではＮａ＋依存性不活性化が消失すること（すなわち、活性型変異体になること）が発現細胞を用いた電気生理学的な研究から明らかになっている。【非特許文献２】岩本ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７９，Ｎｏ．９，７５４４−７５５３（２００４）
しかし、この活性調節機構の生理的意義については未だに解明されていない。【０００５】従来、ＮＣＸ１の遺伝子改変マウスとして、ノックアウトマウス及び野生型、変異型ＮＣＸ１を過剰発現するＴＧマウスが報告されたが、拡張型心筋症を再現するＴＧマウスについては未だ報告されていない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】本発明の目的は、拡張型心筋症の治療に有効な薬剤及び当該疾患に対する遺伝子治療法をスクリーニングする当該スクリーニング系に使用することができる拡張型心筋症の動物モデルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】本発明者は鋭意研究を重ねた結果、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがマウス心筋αミオシン重鎖プロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入された、拡張型心筋症を再現することを特徴とするＴＧマウス及び同ＴＧマウスを使用する、拡張型心筋症の治療薬及び遺伝子治療法のスクリーニング系が、上記目的に適うことを見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、拡張型心筋症を再現することを特徴とするＴＧマウスを得、これを使用して拡張型心筋症の治療薬及び遺伝子治療法のスクリーニングを行うことにより実施することができる。特に、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡが、ＮＣＸ１のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が、全て他のアミノ酸に置換された、好ましくは全てトリプトファンに置換された活性型変異体をコードするｃＤＮＡを用いて作成されたＴＧマウスが上記目的には適している。
本発明の特徴を以下に列記する。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつ活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、拡張型心筋症を再現することを特徴とするＴＧマウス。
（２）前記活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡがイヌ由来である、（１）に記載のＴＧマウス。
（３）前記プロモーターが心筋αミオシン重鎖プロモーターである、（１）又は（２）に記載のＴＧマウス。
（４）配列番号２に記載のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全て他のアミノ酸に置換する変異である、（１）〜（３）の何れかに記載のＴＧマウス。
（５）配列番号２に記載のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全てトリプトファンに置換する変異である、（１）〜（４）の何れかに記載のＴＧマウス。
（６）拡張型心筋症モデルとして使用される（１）〜（５）の何れかに記載のＴＧマウス。
（７）拡張型心筋症の病理学的所見である心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性をもつことを特徴とする（１）〜（６）の何れかに記載のＴＧマウス。
（８）拡張型心筋症の超音波心臓図所見である左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下を特徴とする（１）〜（７）の何れかに記載のＴＧマウス。
（９）（１）〜（８）の何れかに記載のＴＧマウスを用いる、拡張型心筋症治療薬のスクリーニング系。
（１０）（１）〜（８）の何れかに記載のＴＧマウスを用いる、拡張型心筋症の遺伝子治療法のスクリーニング系。【０００９】本発明の活性型ＮＣＸ１蛋白質を過剰に発現するＴＧマウスは拡張型心筋症における病理学的所見（例えば、心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性）及び超音波心臓図所見（例えば、左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下）を再現する拡張型心筋症の疾患動物モデルであり、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰと名付けた。このモデル動物（ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ）は今後の拡張型心筋症の原因解明、治療薬及び遺伝子治療法の開発に有用な役割を果たすものである。【００１０】本発明の活性型ＮＣＸ１遺伝子は、Ｎａ＋不活性化機構を欠失させる変異をもつＮＣＸ１をコードするＤＮＡである。その一例として、ＮＣＸ１のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全て他のアミノ酸に置換された変異型ＮＣＸ１をコードするｃＤＮＡが挙げられる。このような変異を導入するＮＣＸ１遺伝子としては、変異型ＮＣＸ１遺伝子が導入されているＴＧマウスが拡張型心筋症における病理学的所見（例えば、心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性）及び超音波心臓図所見（例えば、左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下）を再現するようなものであれば、どのような生物由来のものであってもよいが、その一例として、イヌ由来のものが挙げられる。このようなＤＮＡは、例えば、イヌＮＣＸ１遺伝子をコードするｃＤＮＡを鋳型とし、ＮＣＸ１のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基をコードするＮＣＸ１遺伝子の塩基を全て他のアミノ酸をコードするように置換したミスセンス変異導入プライマーを用いたＰＣＲによって、得ることができる。以下の実施例に、このミスセンス導入操作に用いられる、ミスセンス変異導入プライマーの一例を示す。【００１１】前記活性型ＮＣＸ１の変異としては、配列番号２に記載のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全てトリプトファンに置換する変異が好ましい。【００１２】本発明のＤＮＡは過剰発現されることが望ましい。過剰発現は、例えば、本発明のＤＮＡが適当なベクター内のプロモーターの制御下に配置された組換えＤＮＡによって行うことができる。本発明に用いられるプロモーターとしては、作製するトランスジェニックの心筋細胞における発現を特異的に強化するものが好ましい。その一例として、心筋αミオシン重鎖プロモーターが挙げられる。【００１３】本発明のＴＧマウスは、アミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基に相当するアミノ酸残基が全て他のアミノ酸に置換された活性型ＮＣＸ１蛋白質をコードするｃＤＮＡが、プロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡを導入されている、拡張型心筋症における病理学的所見（例えば、心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性）及び超音波心臓図所見（例えば、左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下）を再現する拡張心筋症ＴＧマウスである。【００１４】本発明のＴＧマウスは、具体的には、例えば、活性型ＮＣＸ１変異体���伝子が強力なプロモーターの制御下に配置されるように組換えＤＮＡを構築し、得られた組換えＤＮＡをマウスの受精卵の前核にマイクロインジェクションし、その受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、マウスを飼育し、生まれた仔マウスから前記組換えＤＮＡを有する仔マウスを選択することによって得ることができる。生まれた仔マウスの中から組換えＤＮＡを有する仔マウスの選択は、例えば、マウス尾より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＮＣＸ１遺伝子の塩基配列の一部を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、前記組換えＤＮＡの導入の判定を確認する方法により、行うことができる。【００１５】本発明の組換えＤＮＡを導入する受精卵は、雄マウスと雌マウスを交配することにより得ることができる。本発明の組換えＤＮＡを導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法を用いることができる。【００１６】本発明のＴＧマウスが再現する拡張型心筋症における病理学的所見及び超音波心臓図所見は次のようにして確認することができる。病理学的所見は、ＴＧマウスから調製された心臓切片をヘマトキシリン・エオジン染色、アザン染色及び抗ＮＣＸ１抗体染色し、顕微鏡下に観察することができる。また、麻酔したマウスの超音波心臓図所見は、超音波診断装置（左室Ｍモード）を用いて観察することができる。【００１７】本発明者が作製し、継代可能なＮＣＸ１−ｍＸＩＰＴＧマウスは、活性型ＮＣＸ１変異体を心臓特異的に高発現する新しいＴＧマウスである。ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ  ＴＧマウスは、病理学的には拡張型心筋症に見られる心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性を再現する拡張型心筋症の疾患モデル動物である。さらに、このマウスは、超音波心臓図検査から左心室拡張期径及び左心室収縮期径の増大及び左室内径短縮率の低下が認められる。これらの所見は、すなわち、ことを示している。【００１８】具体的に、本発明のＴＧマウスを拡張型心筋症治療薬のスクリーニング系として、例えば、次のように用いることができる。本発明のＴＧマウスを被験群及び対照群に分け、被験群に試験する治療薬を投与し又は遺伝子治療を施し、その後、被験群及び対照群のそれぞれから心臓組織を調製し、心肥大、繊維化、心筋壊死及び変性などの病理変化の改善を観察することにより、並びに、超音波心臓図検査（左心室拡張期径、左心室収縮期径及び左室内径短縮率の評価）により、各群を比較し、その心不全改善効果を検討し、拡張型心筋症の治療法をスクリーニングすることができる。【００１９】以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本願発明は限定されるものではない。
【実施例】（１）活性型ＮＣＸ１変異体をコードする発現ベクターの構築
イヌ心臓から調製したＲＮＡからの逆転写反応より得られたｃＤＮＡから、ＰＣＲによりＮＣＸ１ｃＤＮＡの完全長（配列番号１）を取得した。そのＰＣＲプライマーセットとしては、フォワードプライマーとしてＦ−ＮＣＸ１（配列番号３）をリバースプライマーとしてＲ−ＮＣＸ１（配列番号４）を用いた。これらプライマーは、遺伝子データベースＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号Ｍ５７５２３に記載されたイヌＮＣＸ１の遺伝子配列を元に作製し、プライマーの末端には、ベクターに挿入するための制限酵素認識部位（開始コドンの前にＳａｌＩ配列と停止コドンの後にＨｉｎｄＩＩＩ配列）を付加した。【００２０】配列番号２に示されるイヌ正常型ＮＣＸ１蛋白質のアミノ酸番号２５６、２５８、２６０及び２６３の４種のチロシン残基をトリプトファン残基に置換する変異（Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ）を導入するため、イヌ正常型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）に変異を導入するためのミスセンス変異導入用プライマーを作製した。そのプライマーセットとしては、フォワードプライマーとしてＦ−Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ（配列番号５）をリバースプライマーとしてＲ−Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ（配列番号６）を用いた。【００２１】プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングしたイヌ正常型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Ｆ−Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３ＷとＲ−ＮＣＸ１のプライマーセット、並びにＲ−Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３ＷとＦ−ＮＣＸ１のプライマーセットを用いてそれぞれ別々にＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３分を１サイクル、９４℃、１０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分を２６サイクル、７２℃、１０分を１サイクルの反応条件で行った。得られたＰＣＲ産物（約０．９ｋｂ及び約２．１ｋｂ）を混合し、鋳型ＤＮＡとして、Ｆ−ＮＣＸ１とＲ−ＮＣＸ１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡクローンを得た。ＰＣＲは、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３分を１サイクル、９４℃、１０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３分を２６サイクル、７２℃、１０分を１サイクルの反応条件で行った。【００２２】プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングしたＹ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡ（約３．０ｋｂ）の全配列はＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００ジェネティックアナライザーにより確認された。このｃＤＮＡは、マウス心筋αミオシン重鎖発現ベクター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６６、Ｎｏ．３６、２４６１３−２４６２０（１９９１））のＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入された。マウスαミオシン重鎖プロモーター（約５．５ｋｂ）、Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡ及びＳＶ４０ポリＡ付加部位を含む約９．０ｋｂのＮｏｔＩ制限消化断片は、活性型ＮＣＸ１変異体ＴＧマウスを作製するためのトランスジーンとして使用された。【００２３】（２）活性型ＮＣＸ１変異体ＴＧマウスの作製
Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１  ｃＤＮＡを挿入したマウス心筋αミオシン重鎖発現ベクターをＮｏｔＩ制限消化することにより、約９．０ｋｂの遺伝子導入断片（図１）を切り出し、電気泳動により精製した。Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１遺伝子は、マウス心筋αミオシン重鎖プロモーターの支配下にあり、ＳＶ４０ポリＡ付加部位を含む。【００２４】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌）の受精卵の前核に、精製した遺伝子導入断片をマイクロインジェクションした。その後、生き残った受精卵を精管結さつマウスと交配させて偽妊娠状態にしておいた受容雌マウスの卵管に移植した。移植後、１９日目に帝王切開し、生まれてきたマウスを里親マウスに育てさせた。この操作により、ＴＧマウスの３系統（ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３）を作製した。生後４週齢で尾から染色体ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ制限消化した後、ランダムプライム法により３２Ｐ標識したＮＣＸ１ｃＤＮＡのＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をプローブとしてサザンブロッティングを行うことにより、遺伝子型の判定を行なった。その結果、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３のＴＧマウスは、それぞれ２コピー、１コピー及び１０コピーのトランスジーンが挿入されていることが判明した。【００２５】（３）活性型ＮＣＸ１変異体ＴＧマウスの性質
全てのマウスは室温２２±１℃、照明１２時間（８：００−２０：００）の飼育条件下で個別飼育し、餌と水は自由に摂取させた。活性型ＮＣＸ１変異体ＴＧマウスのヘテロ接合体は正常な妊娠、誕生及びリターサイズを有し、発育的に正常で、生育可能である。これらのＴＧマウスの外観及び挙動も正常である。しかし、２０週齢以上になると、まれに突然死を起こすことがある。【００２６】（４）活性型ＮＣＸ１変異体の発現
ＴＧマウス（１５週齢）の心臓におけるＹ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１の発現は、ウエスタンブロット法により確認した。すなわち、マウス心臓から調製した膜分画の蛋白質（３０μｇ）を７．５％アクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ電気泳動により分離した後、メンブレンフィルターに転写した。そして、このメンブレンフィルターを特異的な抗ＮＣＸ１抗体をプローブとして解析したところ、１２０ｋＤと１５０ｋＤの位置に内因性ＮＣＸ１及びＹ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１が検出された。図２に示すように、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３のＴＧマウスの心臓にはＹ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１が内因性ＮＣＸ１に較べて高発現していることが確認された（図２）。【００２７】免疫組織化学
ＴＧマウス（１５週齢）の心臓から凍結切片を取得した後、一晩冷凍庫内で乾燥して−２０℃のアセトンで１５分間固定した。この切片を一次抗体として抗ＮＣＸ１ウサギポリクローナル抗体、二次抗体として抗ウサギ・ビオチン化ヤギＩｇＧ抗体、次いでペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させ、最後に３．３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）にて発色させた。その結果、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウスの心臓切片の心筋細胞膜及び横細管膜には、Ｙ２５６Ｗ／Ｙ２５８Ｗ／Ｙ２６０Ｗ／Ｙ２６３Ｗ変異型ＮＣＸ１が内因性ＮＣＸ１に較べて高発現していることが示された（図３）。同様の抗体染色は、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３マウスにおいても観察された。【００２８】組織形態学的検討
ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス（８週齢、１４週齢及び３０週齢）の心臓切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、心臓の水平断面像及び垂直断面像を観察した。その結果、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウスは１４週齢から右心室壁が減厚しはじめ、３０週齢では右心室及び左心室ともに顕著な拡張が認められた（図４）。さらに、３０週齢のＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウスの心臓切片をアザン染色し、心臓組織の光学顕微鏡像を得たところ、心筋の繊維化および壊死が認められた（図５）。このように、ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウスは３０週齢で典型的な拡張型心筋症の所見を示した。ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３マウスにおいても同様の所見が観察された。【００２９】超音波心臓図検査
生存状態で心機能を評価するために、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で麻酔したＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス（２５週齢）及び野生型マウス（同週齢）について経胸壁超音波心臓図検査を行った。Ｍモードにおいて、左心室拡張期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮期径（ＬＶＥＳＤ）及び左室内径短縮率％（ＦＳ％）を計測した。ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウスでは、同週齢の野生型マウスに較べて左心室拡張期径及び左心室収縮期径が増大し、また左室内径短縮率％が顕著に低下しており、典型的な心不全状態に陥っていることが確認された（図６）。ＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−２マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−３マウスにおいても同様の所見が観察された。
【発明の効果】
【００３０】本発明の活性型ＮＣＸ１変異体を心筋特異的に高発現するＴＧマウスは、拡張型心筋症の動物モデルとして当該疾患の発生機序を解明し、治療薬及び遺伝子治療法を開発するためのスクリーニング系として有用である
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、遺伝子導入断片を示す図である。
【図２】図２は、活性型ＮＣＸ１変異体ＴＧマウス３系統の心臓から調製した膜分画の抗ＮＣＸ１抗体によるウエスタンブロットを示す図（写真）である。
【図３】図３は、野生型マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス心臓の抗ＮＣＸ１抗体による免疫染色を示す図（写真）である。
【図４】図４は、野生型マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス心臓の水平断面像及び垂直断面像（ヘマトキシリン・エオジン染色）の経時的な変化を示す図（写真）である。
【図５】図５は、野生型マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス心臓（３０週齢）のアザン染色による光学顕微鏡像を示す図（写真）である。
【図６】図６は、野生型マウス及びＮＣＸ１−ｍＸＩＰ−１マウス心臓（２５週齢）の超音波心臓図（Ｍモード）及び心機能パラメーターの計測値（平均値±標準誤差、ｎ＝５）を示す。ＬＶＥＤＤ：左心室拡張期径、ＬＶＥＳＤ：左心室収縮期径、ＦＳ％：左室内径短縮率％。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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