(57)【要約】【課題】  塩基長、分子量が偶々等しい、核酸プローブ複数種をそれぞれ含む、複数種のプローブ溶液であっても、質量分析法を利用することで、各溶液中に含有される核酸プローブの種類を判別することが可能な判別手段を提供する。【解決手段】  標的核酸分子に対して、特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸プローブを含む溶液中に、前記核酸プローブに加えて、質量分析可能であるタグ分子を添加し、その際、該タグ分子の分子量：Ｍtagは、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差（Ｍprobe−Ｍtag）を有するものを選択する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子に対して、特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸プローブを含む溶液であって、
該溶液中には、前記核酸プローブに加えて、タグ分子が添加されており、
該タグ分子は、前記核酸プローブと同時に質量分析可能であって、
該タグ分子の分子量：Ｍtagは、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差（Ｍprobe−Ｍtag）を有する
ことを特徴とするプローブ溶液。
【請求項２】
前記タグ分子は、以下の性質：
（１）水溶性である；
（２）不揮発性である；
（３）前記核酸プローブに対する反応性を有さない；
を具える有機物である
ことを特徴とする請求項１に記載のプローブ溶液。
【請求項３】
前記タグ分子は、
その分子量：Ｍtagが段階的に異なるように設計、合成された分子の群から選択される
ことを特徴とする請求項１または２に記載のプローブ溶液。
【請求項４】
前記タグ分子は、
その分子量：Ｍtagが、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeよりも小さく選択されている
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ溶液。
【請求項５】
前記タグ分子は、
一般式Ｉ：
Ｘ1−（Ｙ）n1−Ｘ2    （Ｉ）
（式中、
Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、ｎ１は、下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかを表す：
（ａ）Ｙは、アミノ酸残基であり、ｎ１は、１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ペプチド鎖のＮ末端とＣ末端に存在する基であり、それぞれ、Ｘ1＝Ｈ、ならびに、Ｘ2＝ＮＨ2である；
（ｂ）Ｙは、塩基数１〜２０のヌクレオチド鎖であり、ｎ１＝１であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｃ）Ｙは、糖またはヌクレオチドであり、ｎ１は１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該糖鎖またはポリヌクレオチドの末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｄ）Ｙは、−ＮＨ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリアミド鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｅ）Ｙは、−Ｏ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリエステル鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｆ）Ｙは、−Ｒ−であり、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示す、１≦ｎ２≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該アルキレン鎖の末端に存在する基であり、それぞれＨ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択される）で示される有機物の群から選択される
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ溶液。
【請求項６】
前記タグ分子は、
一般式II：
Ｘ1−（Ｒ）n1−Ｘ2    （II）
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｘ2は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、ｎ２＝１である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、２≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、２≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、ｎ１＝１に選択される）で示される有機物の群から選択される
ことを特徴とする請求項５に記載のプローブ溶液。
【請求項７】
前記タグ分子は、
アニオン種であり、
一旦、金属カチオン種との塩として、水性媒体に溶解した溶液を調製し、
該溶液中に含まれる金属カチオン種のうち、核酸分子を構成するヌクレオチドのリン酸部分とイオン結合する金属カチオン種について、
陽イオン交換処理を施し、予め除去を行った後、
該陽イオン交換処理済みの溶液として、プローブ溶液に添加されている
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項にプローブ溶液。
【請求項８】
前記タグ分子は、
一般式III：
ＣＨ3（ＣＨ2）n−ＳＯ4-      （III）
（式中、ｎは、２〜７の範囲から選択される整数を表す。）で示される硫酸アルキルアニオン種、または、前記アルキル鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有する硫酸アルキルアニオン種からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ溶液。
【請求項９】
前記タグ分子は、
前記一般式IIIで示される硫酸アルキルアニオン種に対して、前記アルキル鎖中に存在する水素原子を、ハロゲン原子により置換してなる、ハロゲン置換を有する硫酸アルキルアニオン種であって、
該アルキル鎖中の水素原子の置換を行っているハロゲン原子の種類、その総数、または、複数種のハロゲン原子の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるように設計、合成された分子の群から選択される
ことを特徴とする請求項８に記載のプローブ溶液。
【請求項１０】
前記タグ分子は、
請求項１〜９のいずれか一項に記載される基本構成を示す、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeと該タグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝に対して、
その基本構成を規定する変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝において、変数Ｍtagを段階的に変化させて、変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝のバリエーションを増やし、
また、複数のタグ分子を添加して、段階的に変化している変数Ｍtag複数の組み合わせにより、変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝のバリエーションをさらに増すように選択されている
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のプローブ溶液。
【請求項１１】
該プローブ溶液は、
核酸プローブを合成、精製後、水に所定量の核酸プローブを溶解して、核酸プローブの水溶液を調製し、
所定量のタグ分子、または、水性媒体に所定量のタグ分子を溶解しているタグ分子溶液を、前記核酸プローブの水溶液に混合し、攪拌して、均質化することにより調製されている
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブ溶液。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプローブ溶液複数からなるプローブ溶液群であって、
該プローブ溶液群を構成する各プローブ溶液は、該溶液中に含有される核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝が、プローブ溶液相互で異なるように、核酸プローブとタグ分子との組み合わせが選択されている
ことを特徴とするプローブ溶液群。
【請求項１３】
前記プローブ溶液群に含まれる、プローブ溶液二種の全て組み合わせにおいて、
該プローブ溶液二種中に含有される核酸プローブは、その分子量：Ｍprobeが等しい、または、前記質量分析において、互いに弁別不可能な分子量差しかない場合、
該プローブ溶液二種中に含有されるタグ分子は、その分子量：Ｍtagは、前記質量分析において、互いに弁別可能な分子量差を示すように選択されている
ことを特徴とする請求項１２に記載のプローブ溶液群。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載のプローブ溶液群を構成するプローブ溶液について、その溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法であって、
前記プローブ溶液群を構成するプローブ溶液に関して、各プローブ溶液中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ、ならびに、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝に関する情報のリストを作成する工程と、
前記溶液中に含有される核酸プローブ種類の特定を行うプローブ溶液に関して、該溶液に含まれている、溶質分子を質量分析し、測定結果に基づき、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を特定する工程と、
質量分析結果に基づき特定される、該プローブ溶液における、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝の実測値と、
前記リスト中に収録される、各プローブ溶液中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ、ならびに、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝に関する情報とを対比させ、
該プローブ溶液における、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝の実測値と一致する、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示すリスト上のプローブ溶液一種を選択する工程と、
リスト上から選択されるプローブ溶液一種中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ情報から、当該プローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する工程とを有する
ことを特徴とするプローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ種類の判別用タグ分子を添加したプローブ溶液、ならびに、該タグ分子を利用したプローブ種類の判別方法に関する。特には、プローブ溶液中に添加される判別用タグ分子を、質量分析法を利用して特定し、かかるプローブ溶液に含まれるプローブ種類を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析及びプロテオミクスにおける最近の進歩によって、各種生体物質の分析、特定手段として、バイオチップを応用する研究が、大規模に進められている。
【０００３】
特に、ハイスループットのゲノム解析手段として、広い分野で利用が進められているものとして、例えば、プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用する核酸分子の検出用の核酸プローブ多数種をガラス基板上に高密度のアレイ状に固定したＤＮＡマイクロアレイがある。従来、ゲノム中に含まれる、各種の遺伝子ＤＮＡの検出するためには、例えば、前記遺伝子ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡを鋳型として、調製されるｃＤＮＡ断片など、鎖長の長い核酸プローブが利用されてきた。一方、各種の遺伝子ＤＮＡの塩基配列が解明されてきた結果、その解明された塩基配列に基づき、検出対象の遺伝子ＤＮＡと特異的なハイブリッド体形成が可能なＤＮＡプローブの設計が進められた。比較的に短い塩基配列であっても、検出対象の遺伝子ＤＮＡと特異的なハイブリッド体形成が可能となるように、これらのＤＮＡプローブの塩基配列は設計されている。すなわち、設計された塩基配列に従って、化学合成されるオリゴＤＮＡが、現在利用されるＤＮＡプローブの主流となっている。また、化学合成されるオリゴＤＮＡは、その末端に、例えば、ガラス基板上へ固定する際利用可能な官能基を付加する形態とされる。現在、大半のＤＮＡマイクロアレイは、前記の末端に官能基を修飾したオリゴＤＮＡ型のＤＮＡプローブを利用して、例えば、ガラス基板上にも対応する官能基を導入した上で、両官能基間の反応に因る共有結合を介して、オリゴＤＮＡを固定化することで作製されている。
【０００４】
オリゴＤＮＡ型のＤＮＡプローブ複数をアレイ状に配置したＤＮＡマイクロアレイを作製する場合に、意図した位置に、意図したＤＮＡプローブが固定されていることが大変重要である。ＤＮＡマイクロアレイを利用する核酸分子の検出では、アレイ状に配置されている各ＤＮＡプローブについて、該プローブと相補的な配列を含む核酸分子とのハイブリッド体の形成の有無を観測する。その観測結果に基づき、ハイブリダイゼーション反応を行ったサンプル中に、各ＤＮＡプローブと相補的な配列を含む核酸分子が含有されているか否かの判定を行う。従って、仮に、ＤＮＡマイクロアレイ上の、特定のスポット点に固定されているＤＮＡプローブが、意図したＤＮＡプローブと異なっていた場合、その誤りに気付かないと、誤った判定を下すことになる。例えば、実際にはサンプル中に含有されている核酸分子について、本来存在すべき、その検出に利用されるＤＮＡプローブがアレイ中に含まれていないと、サンプル中に当該核酸分子は含まれていないと、誤った判定を下すことになる。また、アレイ上、二つのＤＮＡプローブのスポット点が入れ替わっていると、実際にはサンプル中に含有されている核酸分子に代わって、全く別の核酸分子が含まれていると、誤った判定を下すことになる。
【０００５】
例えば、感染症の病因菌に関して、従来は、培養により、その菌の有無を確認していたが、昨今では、これら病因菌のゲノムの遺伝子情報が蓄積され、対応する遺伝子ＤＮＡの有無によって、当該菌の有無を判定する手法が多用されている。具体的には、当該菌の遺伝子において、特徴的な部分塩基配列を有するＤＮＡプローブを設計した上で、検体サンプル中に含まれるＤＮＡ中に、前記菌同定用のＤＮＡプローブとハイブリッド体形成するものが、存在するか否かを判定する。この種の遺伝子の特定する検査においても、複数種のＤＮＡプローブを利用するため、ＤＮＡマイクロアレイが利用される。このＤＮＡマイクロアレイを応用して、複数の遺伝子ＤＮＡについて、同時にその存在の有無を検出する手法は、医学分野において、診断に利用されている。この診断用のＤＮＡマイクロアレイにおいて、特定のスポット点に固定されているＤＮＡプローブが、意図したＤＮＡプローブと異なっていた場合、例えば、本来であれば検出されるべき病因菌が、誤って検出されていないと判断される事態も起こりえる。そのような誤った判定に基づき、診断を行うと、本来の病因を見落とすことに繋がり、患者の生命に係わる、重大な事態となる可能性もある。
【０００６】
ＤＮＡプローブに利用される、化学合成オリゴＤＮＡは、設計された塩基配列に従って、順次、塩基鎖の伸長を行った後、精製され、所望の塩基長を有する標品とされる。実際は、最終精製を終えた合成オリゴＤＮＡは、所定の溶媒中に、所定のＤＮＡ濃度で溶解された溶液として、チューブに収納した状態で、保管、管理される。各チューブには、個別のＩＤコードが付され、このオリゴＤＮＡ溶液中も含まれるオリゴＤＮＡの種類、含有濃度、溶媒種類などの情報は、前記ＩＤコードともに、管理されている。
【０００７】
仮に、二種類のチューブ間で取り違いを起こしたと懸念される場合には、各チューブに収納されているオリゴＤＮＡ溶液は、所望の塩基配列のオリゴＤＮＡのみを含んでおり、含有されているオリゴＤＮＡの塩基配列の確認が可能であれば、別段問題とはならない。
【０００８】
例えば、オリゴＤＮＡの塩基配列がある程度以上長い塩基長を有する場合には、適当な塩基長のシークエンシング用プライマーを利用し、ジデオキシ法に基づく、汎用のＤＮＡ塩基配列解析装置を利用して、前記シークエンシング用プライマーがハイブリダイズする部位より、５’末端側の部分塩基配列を実際に解析することが可能である。通常、二種類のチューブに本来含有されているべきオリゴＤＮＡは、その５’末端側の部分塩基配列にも相違点が存在するので、それぞれのチューブに収納されているオリゴＤＮＡの区別が可能である。
【０００９】
あるいは、二種類のチューブに本来含有されているべきオリゴＤＮＡが、塩基長が異なっている場合には、キャピラリー電気泳動法によって、その塩基長の差異を確認することで、それぞれのチューブに収納されているオリゴＤＮＡの区別が可能である。
【００１０】
但し、ＤＮＡプローブ用に設計される、多くのオリゴＤＮＡは、通常、２０〜３０塩基長の範囲に設計されており、シークエンシング用プライマーに適する塩基長とほぼ等しく、また、塩基長に差を設けることも困難であり、汎用のＤＮＡ塩基配列解析の利用が適さないものである。
【００１１】
一方、２０〜３０塩基長の範囲の塩基配列を有するオリゴＤＮＡの種類を確認する手段として、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を利用して、全体の分子量を測定する手法がある。例えば、二種類のチューブに本来含有されているべきオリゴＤＮＡが、塩基長が同じであっても、その全体の分子量に明確な差異がある場合には、例えば、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を利用して、全体の分子量を測定することで、それぞれのチューブに収納されているオリゴＤＮＡの区別が可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用して、オリゴＤＮＡ全体の分子量を測定する手法では、その分析用サンプルとして消費される量は、少なく、また、分析に要する時間も、格段に短いという利点があり、２０〜３０塩基長の範囲の塩基配列を有するオリゴＤＮＡの種類を確認する手段として、極めて有用である。しかしならが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用して、オリゴＤＮＡ全体の分子量を測定する手法は、その原理的な限界として、全体の分子量も等しいオリゴＤＮＡの区別を行うことができないという欠点を有している。すなわち、ＤＮＡプローブ用に設計される、オリゴＤＮＡは、狭い塩基長の範囲内で設計されており、塩基長の等しいオリゴＤＮＡが多数存在している。等しい塩基長であっても、その塩基配列自体は、例えば、２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの場合、原理的には、（４）25種類が存在しており、ＤＮＡプローブ用に設計されるオリゴＤＮＡは、塩基配列自体は、相当に異なっている。但し、その塩基配列に含まれる、４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝が偶々等しくなっている、ＤＮＡプローブ用に設計されるオリゴＤＮＡは、少なからず存在している。
【００１３】
このように、その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝が等しい結果、等しい分子量を示すオリゴＤＮＡを含む溶液を収納するチューブを取り違ると、単に、含有されているオリゴＤＮＡの分子量を測定するのみでは、各チューブに収納されているオリゴＤＮＡ溶液を区別することはできない。
【００１４】
プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用して、対象となる核酸分子を検出する際、利用可能な合成プローブとしては、所定の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡがある。いずれの合成オリゴマーを利用する場合も、その塩基長が等しく、かつ、その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ）（またはＮ（Ｕ）），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝も等しい場合、単に、含有されているオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡの分子量を測定するのみでは、各チューブに収納されているオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡ溶液を区別することはできない。
【００１５】
なお、各種の抗体を特定する目的で利用される、ペプチド型プローブ、すなわち、抗原ペプチド鎖においても、そのアミノ酸長が等しく、かつ、分子量も等しくなる場合もある。しかしながら、各種のエンドペプチダーゼを利用して、断片化を行うと、アミノ酸配列の相違に伴い、得られる各断片のアミノ酸長は異なるので、この断片化処理を施した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用して、各断片の分子量を測定することで、二つのペプチド型プローブの区別を行うことができる。
【００１６】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、核酸プローブ・マイクロアレイの作製に利用可能な、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡ型の核酸プローブを含む溶液について、仮に、塩基長と、その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ）（またはＮ（Ｕ）），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝とが偶々等しい、核酸プローブ複数種をそれぞれ含む、複数種の溶液であっても、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用することで、各溶液中に含有される核酸プローブの種類を判別することが可能な判別手段、ならびに、かかる判別手段を利用して、各溶液中に含有される核酸プローブの種類を判別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、塩基長と、その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ）（またはＮ（Ｕ）），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝とが偶々等しい、核酸プローブ複数種をそれぞれ含む、複数種の溶液を区別する手段として、核酸プローブに加えて、タグ分子を添加し、その際、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用して測定される、該核酸プローブの分子量（Ｍprobe）と、弁別可能な分子量差を示すタグ分子の分子量（Ｍtag）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝が、これら複数種の溶液で異なるように、各溶液に添加されるタグ分子を選択すると、各溶液中に含有される核酸プローブの種類を判別することが可能となることを見出した。さらに、添加されるタグ分子は、複数種であってもよく、その際には、タグ分子複数種に分子量（Ｍtag-i；ｉは、各タグ分子の種類を示すインデクスである）を用いて、組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag-1，…，Ｍtag-i，…｝によって、各溶液中に含有される核酸プローブの種類を判別することが可能となることを見出した。
【００１８】
すなわち、本発明にかかるプローブ溶液は、
標的核酸分子に対して、特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸プローブを含む溶液であって、
該溶液中には、前記核酸プローブに加えて、タグ分子が添加されており、
該タグ分子は、前記核酸プローブと同時に質量分析可能であって、
該タグ分子の分子量：Ｍtagは、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差（Ｍprobe−Ｍtag）を有する
ことを特徴とするプローブ溶液である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明にかかるプローブ溶液では、溶液中には、核酸プローブに加えて、タグ分子が添加されており、両者を質量分析において、互いに弁別可能な分子量差を有するものとなっており、測定された核酸プローブの分子量（Ｍprobe）とタグ分子の分子量（Ｍtag）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を利用することで、同じ分子量を有する複数種の核酸プローブを含む溶液間では、添加されるタグ分子の分子量（Ｍtag）が相違するように選択している。その選択によって、組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝は、各核酸プローブを含む溶液間で異なるので、それぞれの溶液中に含まれる核酸プローブの種類の判別が、簡便に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明にかかるプローブ種類の判別用タグ分子を添加したプローブ溶液は、
標的核酸分子に対して、特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸プローブを含む溶液であって、
該溶液中には、前記核酸プローブに加えて、タグ分子が添加されており、
該タグ分子は、前記核酸プローブと同時に質量分析可能であって、
該タグ分子の分子量：Ｍtagは、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとは、前記質量分析において、弁別可能な分子量差（Ｍprobe−Ｍtag）を有する
ことを特徴とするプローブ溶液であるが、その好適な形態として、下記する態様を示すことができる。
【００２１】
まず、本発明にかかるプローブ溶液では、
前記タグ分子は、以下の性質：
（１）水溶性である；
（２）不揮発性である；
（３）前記核酸プローブに対する反応性を有さない；
を具える有機物であることが好ましい。
【００２２】
また、前記タグ分子は、
その分子量：Ｍtagが段階的に異なるように設計、合成された分子の群から選択することができる。
【００２３】
通常、前記タグ分子は、
その分子量：Ｍtagが、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeよりも小さく選択されていることが望ましい。
【００２４】
本発明においては、例えば、前記タグ分子は、
一般式Ｉ：
Ｘ1−（Ｙ）n1−Ｘ2    （Ｉ）
Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、ｎ１は、下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかを表す：
（ａ）Ｙは、アミノ酸残基であり、ｎ１は、１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ペプチド鎖のＮ末端とＣ末端に存在する基であり、それぞれ、Ｘ1＝Ｈ、ならびに、Ｘ2＝ＮＨ2である；
（ｂ）Ｙは、塩基数１〜２０のヌクレオチド鎖であり、ｎ１＝１であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｃ）Ｙは、糖またはヌクレオチドであり、ｎ１は１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該糖鎖またはヌクレオチド鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｄ）Ｙは、−ＮＨ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリアミド鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｅ）Ｙは、−Ｏ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリエステル鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｆ）Ｙは、−Ｒ−であり、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示す、１≦ｎ２≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該アルキレン鎖の末端に存在する基であり、それぞれＨ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択される）で示される有機物の群から選択される形態とすると好ましい。
【００２５】
その際、例えば、前記タグ分子は、
一般式II：
Ｘ1−（Ｒ）n1−Ｘ2    （II）
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｘ2は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、ｎ２＝１である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、２≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、２≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、ｎ１＝１に選択される）で示される有機物の群から選択される形態が、より好ましい形態の一例として挙げられる。
【００２６】
一方、本発明においては、
前記タグ分子が、アニオン種である際、
一旦、金属カチオン種との塩として、水性媒体に溶解した溶液を調製し、
該溶液中に含まれる金属カチオン種のうち、核酸分子を構成するヌクレオチドにより、配位を受け、ヌクレオチド錯体形成を起こす金属カチオン種について、
陽イオン交換処理を施し、予め除去を行った後、
該陽イオン交換処理済みの溶液として、プローブ溶液に添加されている態様を選択することが望ましい。
【００２７】
加えて、前記タグ分子は、
一般式III：
ＣＨ3（ＣＨ2）n−ＳＯ4-      （III）
（式中、ｎは、２〜７の範囲から選択される整数を表す。）で示される硫酸アルキルアニオン種、または、前記アルキル鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有する硫酸アルキルアニオン種からなる群より選択される形態が、より好ましい形態の代表的な一例として挙げられる。
【００２８】
その際、前記タグ分子は、
前記一般式IIIで示される硫酸アルキルアニオン種に対して、前記アルキル鎖中に存在する水素原子を、ハロゲン原子により置換してなる、ハロゲン置換を有する硫酸アルキルアニオン種であって、
該アルキル鎖中の水素原子の置換を行っているハロゲン原子の種類、その総数、または、複数種のハロゲン原子の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるように設計、合成された分子の群から選択される態様を利用することが可能である。
【００２９】
前記タグ分子は、上に示す各態様に記載する基本構成に対して、変数を段階的に変化させて、バリエーションを増やし、また前記バリエーションが増えた基本構成の複数の組み合わせによりさらにバリエーションを増やす形態で添加することも可能である。具体的には、前記タグ分子は、
上述の各形態に記載される基本構成を示す、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeと該タグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝に対して、
その基本構成を規定する変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝において、変数Ｍtagを段階的に変化させて、変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝のバリエーションを増やし、
また、複数のタグ分子を添加して、段階的に変化している変数Ｍtag複数の組み合わせにより、変数の組み合わせ｛Ｍprobe、Ｍtag｝のバリエーションをさらに増すように選択されている態様とすることが可能である。
【００３０】
例えば、前記タグ分子は、前記一般式Ｉに含まれる（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組み合わせに示される基本構成に対して、変数ｎ１またはｎ２で規定される鎖数を段階的に変化させて、分子量：Ｍtagのバリエーションを増やし、また前記分子量：Ｍtagのバリエーションが増えた（ａ）〜（ｆ）の各基本構成中から、複数個を組み合わせにより、さらに、前記分子量：Ｍtagの複数個で標識されるバリエーションを増やすように選択する態様を利用することが可能である。
【００３１】
本発明にかかるプローブ溶液は、
核酸プローブを合成、精製後、水に所定量の核酸プローブを溶解して、核酸プローブの水溶液を調製し、
所定量のタグ分子、または、水性媒体に所定量のタグ分子を溶解しているタグ分子溶液を、前記核酸プローブの水溶液に混合し、攪拌して、均質化することにより調製されている形態とすることができる。
【００３２】
さらに、本発明は、上記の構成を有する本発明にかかるプローブ溶液複数種を利用する発明として、プローブ溶液群の発明を併せて提供している。すなわち、本発明にかかるプローブ溶液群は、
上述する構成のいずれか一つを有する本発明にかかるプローブ溶液複数からなるプローブ溶液群であって、
該プローブ溶液群を構成する各プローブ溶液は、該溶液中に含有される核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝が、プローブ溶液相互で異なるように、核酸プローブとタグ分子との組み合わせが選択されている
ことを特徴とするプローブ溶液群である。その際、
前記プローブ溶液群に含まれる、プローブ溶液二種の全て組み合わせにおいて、
該プローブ溶液二種中に含有される核酸プローブは、その分子量：Ｍprobeが等しい、または、前記質量分析において、互いに弁別不可能な分子量差しかない場合、
該プローブ溶液二種中に含有されるタグ分子は、その分子量：Ｍtagは、前記質量分析において、互いに弁別可能な分子量差を示すように選択されていることが好ましい。
【００３３】
また、本発明は、上述するタグ分子を添加している特徴を利用して、プローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法の発明をも提供する。すなわち、本発明にかかるプローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法は、
本発明にかかるプローブ溶液群を構成するプローブ溶液について、その溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法であって、
前記プローブ溶液群を構成するプローブ溶液に関して、各プローブ溶液中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ、ならびに、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝に関する情報のリストを作成する工程と、
前記溶液中に含有される核酸プローブ種類の特定を行うプローブ溶液に関して、該溶液に含まれている、溶質分子を質量分析し、測定結果に基づき、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を特定する工程と、
質量分析結果に基づき特定される、該プローブ溶液における、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝の実測値と、
前記リスト中に収録される、各プローブ溶液中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ、ならびに、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝に関する情報とを対比させ、
該プローブ溶液における、前記核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝の実測値と一致する、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示すリスト上のプローブ溶液一種を選択する工程と、
リスト上から選択されるプローブ溶液一種中に含有されているべき、核酸プローブの種類とタグ分子の種類の組み合わせ情報から、当該プローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する工程とを有する
ことを特徴とするプローブ溶液中に含有される核酸プローブの種類を特定する方法である。
【００３４】
以下に、本発明に関して、その好適な実施の形態を示して、詳しく説明する。
【００３５】
本発明では、予め、該プローブ溶液の構成を、標的核酸分子に対して、特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸プローブに加えて、質量分析可能なタグ分子を添加するものとし、核酸プローブの分子量（Ｍprobe）とタグ分子の分子量（Ｍtag）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を、各プローブ溶液の判別に利用する、「質量分析法を利用して読み取り可能な識別子」として利用する。そのため、核酸プローブ自体が質量分析可能なものであることは勿論のこと、タグ分子も質量分析可能なものが利用される。質量分析を行った際、タグ分子の分子量：Ｍtagと、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとが弁別不能であると、タグ分子が添加されているか、否か、質量分析法では、判別不能となるので、両者の間に弁別可能な分子量差（Ｍprobe−Ｍtag）を有するように、タグ分子を選択する。
【００３６】
通常、本発明にかかる各プローブ溶液の判別を行う際には、該プローブ溶液から、その一部を判別用のサンプルとして採取して、含有されている溶質分子の質量分析を行う。各サンプル中に、核酸プローブと、タグ分子とが均一に含まれる必要があり、プローブ溶液中に均一に溶解する、あるいは、均一に分散するものが利用される。通常、水溶性分子を利用する。プローブ溶液中に含まれる核酸プローブに対して、反応性を示すものであると、核酸プローブと反応を起こし、核酸プローブ自体の変質、劣化などを起こすことが懸念される。その場合、質量分析を行った際、前記反応により派生する、核酸プローブ由来の生成物も同時に測定され、核酸プローブ自体の分子量を特定する際、干渉成分となることもある。従って、通常、核酸プローブに対して、反応性を有さない分子をタグ分子として利用する。
【００３７】
なお、溶液中に含まれる溶質分子の質量分析を行う際には、溶媒成分を蒸散させ、溶質分子を回収した上で、イオン化を行う。この溶媒成分を蒸散させる処理を施す際、含有されているタグ分子も同時に、蒸散すると、質量分析により、タグ分子の分子量を特定する上で必要とされる量が回収できない場合も少なくない。従って、通常、タグ分子として利用する分子種は、プローブ溶液の溶媒成分を蒸散する条件では、実質的に蒸散が起きない、不揮発性分子種を選択する。
【００３８】
溶媒成分を蒸散させる処理を施すと、核酸プローブは析出し、固相となるが、一般に、塩基数が２０以上であり、断片化を起こさない条件でイオン化を行って、その分子量を測定する。塩基数が２０以上の一本鎖核酸分子の質量分析には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを利用することが好ましい。その際、固相サンプル中に含まれるタグ分子に関しても、同時に質量分析を行う形態を採用する。
【００３９】
例えば、タグ分子自体は、アニオン種である場合、対偶のカチオン種として、金属カチオン種を選択する、金属塩の形態で水性溶媒に添加して、溶液を調製した上で、核酸プローブの溶液と混合することができる。核酸分子を構成するヌクレオチドには、その鎖を構成するリン酸部分が、種々の金属カチオン種とイオン結合を起こすもののある。仮に、このヌクレオチド鎖が金属カチオン種とイオン結合した状態で、溶媒成分を蒸散させ、固相とすると、金属カチオン種がイオン結合によって、ヌクレオチド鎖上に付加している核酸分子となる。固相となった時点では、金属カチオン種がヌクレオチド鎖上に付加されている核酸分子は、金属カチオン種の個数が種々なものの混合物の形態となる。この固相の混合物に由来するイオン種は、ヌクレオチド鎖上にイオン結合している金属カチオン種の存在に伴って、核酸分子由来の多価イオン生成は阻害を受ける。核酸分子由来の一価のイオン種では、イオン種の質量数Ｍと電価価数Ｚで決定される、（Ｍ／Ｚ）値が大きいと、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける測定可能な（Ｍ／Ｚ）値の範囲を超える場合も少なくない。そのため、電価価数Ｚが２以上の多価イオン種を利用して、そのイオン種の質量数Ｍを測定し、核酸分子の分子量を決定する場合が多い。
【００４０】
この点を考慮して、タグ分子自体は、アニオン種である場合、対偶のカチオン種として、金属カチオン種を選択する、金属塩の形態で水性溶媒に添加して、溶液を調製した上で、核酸プローブの溶液と混合する際には、前記金属カチオン種を予め、陽イオン交換処理を施し、除去を行うことが好ましい。この陽イオン交換処理による除去を行う場合、ナトリウム、カリウムなどの、アルカリ金属の一価のカチオン種（Ｎａ+、Ｋ+）を、プロトン型陽イオン交換カラムを利用して、プロトン（Ｈ+）へと交換する形態が好適に利用できる。
【００４１】
プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用して、対象となる核酸分子を検出する際、核酸プローブとして利用可能な合成核酸分子としては、所定の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡがある。いずれの合成オリゴマーを利用する場合も、その塩基長が等しく、かつ、その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ）（またはＮ（Ｕ）），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝も等しい場合、実際の塩基配列は異なっていても、それらのオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴＰＮＡの分子量の測定値は同じものとなる。また、アデニン塩基の式量：１３５．１３と、グアニン塩基の式量：１５１．１３との差異：１６．００と、シトシン塩基の式量：１１１．１０と、チミン塩基の式量：１２６．１１との差異：１５．０１とを比較すると、その差は、僅かに１である。従って、４種の塩基それぞれの個数が、｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝と、｛Ｎ（Ａ）−１，Ｎ（Ｔ）−１，Ｎ（Ｃ）＋１，Ｎ（Ｇ）＋１｝または｛Ｎ（Ａ）＋１，Ｎ（Ｔ）＋１，Ｎ（Ｃ）−１，Ｎ（Ｇ）−１｝とでは、全体の分子量差は、１となる。全体の分子量差が１の二つの核酸分子について、その多価イオン種の（Ｍ／Ｚ）値を測定する場合、測定誤差により、その相違が、弁別不能となることも多い。そのため、本発明では、プローブ溶液二種中に含有される核酸プローブは、その分子量：Ｍprobeが等しい、または、前記質量分析において、互いに弁別不可能な分子量差しかない場合、それぞれのプローブ溶液中に添加されているタグ分子の分子量：Ｍtagが、相互で明確に相違するように、添加されるタグ分子を選択する。
【００４２】
その塩基配列に含まれる４種の塩基それぞれの個数；｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ）（またはＮ（Ｕ）），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝が等しい、同じ分子量の核酸分子に加えて、｛Ｎ（Ａ）−１，Ｎ（Ｔ）−１（またはＮ（Ｕ）−１），Ｎ（Ｃ）＋１，Ｎ（Ｇ）＋１｝または｛Ｎ（Ａ）＋１，Ｎ（Ｔ）＋１（またはＮ（Ｕ）＋１），Ｎ（Ｃ）−１，Ｎ（Ｇ）−１｝である、分子量が１（または２）相違するのみの核酸分子のように、互いに弁別不可能な分子量差しかないものを含めると、タグ分子による区別を必要とする核酸プローブ溶液種類の総数は、相当の個数に達することがある。
【００４３】
そのような場合には、タグ分子として、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるように設計、合成された分子の群から選択することで、類似の分子構造を有するタグ分子を利用することができる。
【００４４】
例えば、タグ分子自体も、
一般式Ｉ：
Ｘ1−（Ｙ）n1−Ｘ2    （Ｉ）
（式中、
Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、ｎ１は、下記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかを表す：
（ａ）Ｙは、アミノ酸残基であり、ｎ１は、１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ペプチド鎖のＮ末端とＣ末端に存在する基であり、それぞれ、Ｘ1＝Ｈ、ならびに、Ｘ2＝ＮＨ2である；
（ｂ）Ｙは、塩基数１〜２０のヌクレオチド鎖であり、ｎ１＝１であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｃ）Ｙは、糖またはヌクレオチドであり、ｎ１は１≦ｎ１≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該糖鎖またはポリヌクレオチドの末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択される；
（ｄ）Ｙは、−ＮＨ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリアミド鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｅ）Ｙは、−Ｏ−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｎ１は１≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該ポリエステル鎖の末端に存在する基であり、それぞれ、Ｈ、ならびに、ＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、Ｏ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または該アルキレン鎖中に存在する水素原子がハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示し、１≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である；
（ｆ）Ｙは、−Ｒ−であり、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、ｎ２は、該アルキレン鎖の炭素鎖長を示す、１≦ｎ２≦２０の範囲から選択される整数であり、
Ｘ1、Ｘ2は、該アルキレン鎖の末端に存在する基であり、それぞれＨ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択される）で示される有機物の群から選択される形態とすることが好ましい。例えば、モノマー単位Ｙの繰り返し数ｎ１と、モノマー単位Ｙの種類との組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子を、数十種程度の簡便に用意することが可能となる。
【００４５】
なお、上記（ａ）〜（ｆ）の組み合わせの一例を示すと：
（ａ）の一例は、アミノ酸数１〜２０のペプチド鎖であり、Ｃ末は、−ＣＯＯ-またはアミド化（−ＣＯＮＨ2）されていてもよく、そのアミノ酸配列、アミノ酸数との組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。（ｂ）の一例は、塩基数１〜２０のヌクレオチド鎖であり、その３’末端は、リン酸が存在し、５’末端は、脱リン酸化された形態であり、その塩基配列、塩基数との組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。（ｃ）の一例は、鎖長１〜２０の糖鎖、ポリヌクレオチドであり、その鎖末端は、ともにＯＨで終端されており、その鎖長、糖、ヌクレオチドの種類の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。（ｄ）の一例は、鎖長１〜１２のポリアミドであり、その鎖末端は、−ＮＨ2、−ＣＯＯ-または−ＣＯＮＨ2となっており、その鎖長、ユニットの種類（炭素数）の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。（ｅ）の一例は、鎖長１〜１２のポリエステルであり、その鎖末端は、−ＯＨ、−ＣＯＯ-または−ＣＯＮＨ2となっており、その鎖長、ユニットの種類（炭素数）の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。（ｆ）の一例は、炭素数１〜２０の直鎖のアルカン酸、アルキル硫酸、それらのハロゲン置換体であり、その炭素数や、ハロゲン置換数の組み合わせによって、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子となる。
【００４６】
例えば、タグ分子として、
一般式II：
Ｘ1−（Ｒ）n1−Ｘ2    （II）
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｘ2は、Ｈ、ＳＯ3-、ＯＳＯ3-、Ｓ-、ＣＯＯ-、ＮＨ2からなる群より選択され、
Ｒは、−（ＣＨ2）n2−で示されるアルキレン鎖、または、該アルキレン鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有するアルキレン鎖であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、ｎ２＝１である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、２≦ｎ１≦１２の範囲から選択される整数であり、
該アルキレン鎖の炭素鎖長ｎ２が、２≦ｎ２≦１２の範囲から選択される整数である際には、該モノマー単位Ｒの繰り返し数ｎ１は、ｎ１＝１に選択される）で示される有機物の群から選択される形態を利用することができる。その場合、モノマー単位Ｒのアルキレン鎖炭素数が、２〜１２の範囲、さらには、このアルキレン鎖に置換するハロゲン原子数を０〜３個程度としても、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子を、２０〜３０種程度の簡便に用意することが可能となる。
【００４７】
すなわち、タグ分子として、
一般式III：
ＣＨ3（ＣＨ2）n−ＳＯ4-      （III）
（式中、ｎは、２〜７の範囲から選択される整数を表す。）で示される硫酸アルキルアニオン種、または、前記アルキル鎖中に存在する水素原子が、ハロゲン原子により置換されてなる、ハロゲン置換を有する硫酸アルキルアニオン種からなる群より選択される形態を利用すると、そのアルキレン鎖炭素数の相違と、このアルキレン鎖に置換するハロゲン原子数の相違とを利用して、その分子量：Ｍtagが段階的に異なるタグ分子を、２０〜３０種程度の簡便に用意することが可能となる。
【００４８】
通常、核酸プローブの含有濃度と比較して、タグ分子の添加濃度は低く設定した上で、
タグ分子の分子量：Ｍtagを、核酸プローブの分子量：Ｍprobeよりも小さく選択することが望ましい。すなわち、核酸プローブの分子量：Ｍprobeの特定では、その多価イオン種の（Ｍ／Ｚ）値を利用する際、タグ分子の分子量：Ｍtagの特定には、その一価イオン種の（Ｍ／Ｚ）値を利用する形態がより好ましい。一般に、タグ分子の分子量：Ｍtagが適度に小さい場合、一価イオン種の生成効率は、多価イオン種の生成効率よりも格段に高いので、タグ分子の添加濃度は低く設定した場合でも、十分に測定が可能となる。
【００４９】
この利点を利用すると、タグ分子の分子量：Ｍtagが適度に小さい場合には、その添加濃度の総和が一定範囲を超えない範囲で、二種のタグ分子を添加する形態を選択することもできる。例えば、三種類のタグ分子から、一種を添加する形態と、二種を添加する形態とを利用すると、合計六種のプローブ溶液の区別を図ることが可能となる。
【００５０】
上述するように、各プローブ溶液の識別子として、核酸プローブの分子量（Ｍprobe）とタグ分子の分子量（Ｍtag）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を利用することで、プローブ溶液複数からなるプローブ溶液群に関して、
このプローブ溶液群を構成する各プローブ溶液は、該溶液中に含有される核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝が、プローブ溶液相互で異なるように、核酸プローブとタグ分子との組み合わせを選択しておくと、
質量分析法を利用して、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を特定すると、そのプローブ溶液自体の特定が可能となる。各プローブ溶液は、調製の際、予め、核酸プローブとタグ分子との組み合わせは、控えられており、核酸プローブの分子量：Ｍprobeとタグ分子の分子量：Ｍtagとの組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を特定すると、含有されている核酸プローブの種類も特定できる。その際、プローブ溶液群に含まれる、プローブ溶液二種の全て組み合わせにおいて、プローブ溶液二種中に含有される核酸プローブは、その分子量：Ｍprobeが等しい、または、前記質量分析において、互いに弁別不可能な分子量差しかない場合、プローブ溶液二種中に含有されるタグ分子は、その分子量：Ｍtagは、質量分析において、互いに弁別可能な分子量差を示すように選択する。
【００５１】
以上説明したように、本発明によれば、例えば、ＤＮＡマイクロアレイの作製に利用する予定の、大量の種類のＤＮＡプローブ中に、塩基配列が異なるが同一分子量を有するＤＮＡプローブが多数存在する場合でも、簡単に安価に正確に、各プローブ溶液に含まれるＤＮＡプローブの確認を実施することは可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下に、具体例を挙げて、本発明をより詳しく説明する。これら具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明は、かかる形態に限定されるものでない。
【００５３】
（実施例１）
＜合成オリゴＤＮＡ＞
ＤＮＡマイクロアレイの作製に利用する、ＤＮＡプローブとして、約３００種の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを設計し、外部の合成会社に化学合成を委託した。
【００５４】
合成会社から納入された、化学合成オリゴＤＮＡは、その５’末端に基板への固定に利用される官能基として、スルファニル基（−ＳＨ）が導入されている。これら化学合成オリゴＤＮＡについて、その塩基配列に加えて、オリゴＤＮＡ鎖部分の塩基長、全体の分子量を、納入時の保証データに基づき、リストにまとめた。オリゴＤＮＡ鎖部分の塩基長が２２である、一群のオリゴＤＮＡについて、配列中に含まれる４種の塩基の個数を確認したところ、｛Ｎ（Ａ），Ｎ（Ｔ），Ｎ（Ｃ），Ｎ（Ｇ）｝＝｛５，４，４，９｝となる三種のオリゴＤＮＡが含まれていることに気が付いた。当然、この３種の合成オリゴＤＮＡ型プローブの分子量（Ｍprobe）は等しく、その値は、Ｍprobe＝6480.529であった。
【００５５】
＜合成オリゴＤＮＡ水溶液の調製＞
表１に、この三種の合成オリゴＤＮＡの塩基配列と、分子量（Ｍprobe）を示す。
【００５６】
【表１】
2006304731.tif 000002
【００５７】
前記三種の合成オリゴＤＮＡを所定量（６４．８  μｇ）を入れたチューブ中に、１００μＬの超純水を入れ、ミキサーで攪拌し溶解する。溶解後、遠心分離し、合成オリゴＤＮＡを溶解する水溶液を調製する。
【００５８】
＜タグ分子溶液の調製＞
各プローブ溶液中に添加するタグ分子として、
一般式IV：
ＣＨ3（ＣＨ2）m−ＳＯ4-      （IV）
で示される硫酸アルキル型アニオン種のうち、表２に示す三種の硫酸アルキルナトリウム由来のアニオン種を利用する。
【００５９】
【表２】
2006304731.tif 000003
【００６０】
前記三種の硫酸アルキルナトリウムを一旦水溶液として、陽イオン交換カラムを使用して、イオン解離したＮａカチオンの脱離処理を施す。前記の処理によって、金属カチオン種を完全に除去し、硫酸アルキル型アニオン種を含む溶液を調製する。
【００６１】
＜プローブ溶液の調製＞
三種の合成オリゴＤＮＡを溶解する水溶液を入れたチューブに、タグ分子として、三種の硫酸アルキル型アニオン種をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ添加する。ミキサーで攪拌し溶解した後、遠心分離し、合成オリゴＤＮＡとタグ分子を含有するプローブ溶液三種を調製する。表３に、各プローブ溶液に溶解している、核酸プローブとタグ分子種、ならびに、分子量の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示す。
【００６２】
【表３】
2006304731.tif 000004
【００６３】
＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定＞
マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）で利用する、マトリックスを準備する。
【００６４】
マトリックスに利用する３−ヒドロキシピコリン酸を、水／アセトニトリル（体積比で７０：３０）中に濃度２０ｍｇ／ｍＬになるように溶解する。
【００６５】
調製されたプローブ溶液を一部とり、合成オリゴＤＮＡ濃度を１０ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈する。
【００６６】
３−ヒドロキシピコリン酸溶液１μｌと、希釈したプローブ溶液１μｌとをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの核酸専用サンプルホルダー（ＭＴＰ  Ａｎｃｈｏｒ  ＣｈｉｐTM４００／３８４  ＴＦ）上に載せ、乾燥して、３−ヒドロキシピコリン酸の結晶化を行う。
【００６７】
サンプルホルダー上の試料に含まれる、核酸プローブとタグ分子種を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ブルカー・ダルトニクス株式会社  装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ）にて質量分析する。
【００６８】
質量分析スペクトル中から、核酸プローブ由来のイオン種、タグ分子種由来のイオン種を特定する。実測されたイオン種の質量数に基づき、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）と、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）を決定する。表４に、各プローブ溶液に含まれる、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）、ならびに、対応する分子量（理論値）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示す。
【００６９】
【表４】
2006304731.tif 000005
【００７０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定に基づき決定される、各プローブ溶液に含まれる、核酸プローブとタグ分子種の分子量実測値の組み合わせ｛Ｍprobe-obs，Ｍtag-obs｝を比較すると、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）は、実質的に等しい値となっている。一方、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）は、プローブ溶液毎に明確な差異が確認される。
【００７１】
従って、核酸プローブとタグ分子種の分子量実測値の組み合わせ｛Ｍprobe-obs，Ｍtag-obs｝と、核酸プローブとタグ分子種の分子量（理論値）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝とを比較することで、対象となるプローブ溶液が、実際に、想定されるプローブ溶液と同じであるか否かを確認できる。この対比によって、対象となるプローブ溶液中に含有される、核酸プローブの種類を特定できる。
【００７２】
（実施例２）
＜合成オリゴＤＮＡ水溶液の調製＞
実施例１に記載の三種の合成オリゴＤＮＡについて、同じ手順に従って、合成オリゴＤＮＡを溶解する水溶液を調製する。
【００７３】
＜タグ分子溶液の調製＞
各プローブ溶液中に添加するタグ分子として、
ヘプチル硫酸アニオン種中のドデシル基上の水素原子をハロゲン原子で置換したハロゲン置換ヘプチル硫酸アニオン種のうち、
表５に示す三種の硫酸（ブロム置換ヘプチル）ナトリウム由来のアニオン種を利用する。
【００７４】
【表５】
2006304731.tif 000006
【００７５】
なお、前記三種の硫酸（ブロム置換ヘプチル）ナトリウムは、ブロム置換される炭素原子は、不斉炭素となるが、光学異性体の分子量は等しいので、特に、特定の光学異性体を選択して、利用することはしていない。また、このタグ分子種への利用では、その立体配置は問題とならない。
【００７６】
前記三種の硫酸（ブロム置換ヘプチル）ナトリウムを一旦水溶液として、陽イオン交換カラムを使用して、イオン解離したＮａカチオンの脱離処理を施す。前記の処理によって、金属カチオン種を完全に除去し、硫酸（ブロム置換ヘプチル）型アニオン種を含む溶液を調製する。
【００７７】
＜プローブ溶液の調製＞
三種の合成オリゴＤＮＡを溶解する水溶液を入れたチューブに、タグ分子として、三種の硫酸（ブロム置換ヘプチル）型アニオン種をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ添加する。ミキサーで攪拌し溶解した後、遠心分離し、合成オリゴＤＮＡとタグ分子を含有するプローブ溶液三種を調製する。表６に、各プローブ溶液に溶解している、核酸プローブとタグ分子種、ならびに、分子量の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示す。
【００７８】
【表６】
2006304731.tif 000007
【００７９】
＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定＞
マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）で利用する、マトリックスを準備する。
【００８０】
マトリックスに利用する３−ヒドロキシピコリン酸を、水／アセトニトリル（体積比で７０：３０）中に濃度２０ｍｇ／ｍＬになるように溶解する。
【００８１】
調製されたプローブ溶液を一部とり、合成オリゴＤＮＡ濃度を１０ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈する。
【００８２】
３−ヒドロキシピコリン酸溶液１μｌと、希釈したプローブ溶液１μｌとをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの核酸専用サンプルホルダー（ＭＴＰ  Ａｎｃｈｏｒ  ＣｈｉｐTM４００／３８４  ＴＦ）上に載せ、乾燥して、３−ヒドロキシピコリン酸の結晶化を行う。
【００８３】
サンプルホルダー上の試料に含まれる、核酸プローブとタグ分子種を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ブルカー・ダルトニクス株式会社  装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ）にて質量分析する。
【００８４】
質量分析スペクトル中から、核酸プローブ由来のイオン種、タグ分子種由来のイオン種を特定する。実測されたイオン種の質量数に基づき、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）と、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）を決定する。表７に、各プローブ溶液に含まれる、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）、ならびに、対応する分子量（理論値）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝を示す。
【００８５】
【表７】
2006304731.tif 000008
【００８６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定に基づき決定される、各プローブ溶液に含まれる、核酸プローブとタグ分子種の分子量実測値の組み合わせ｛Ｍprobe-obs，Ｍtag-obs｝を比較すると、核酸プローブの分子量実測値（Ｍprobe-obs）は、実質的に等しい値となっている。一方、タグ分子種の分子量実測値（Ｍtag-obs）は、ブロム置換数に従って分子量が変化しており、プローブ溶液毎に明確な差異が確認される。
【００８７】
従って、核酸プローブとタグ分子種の分子量実測値の組み合わせ｛Ｍprobe-obs，Ｍtag-obs｝と、核酸プローブとタグ分子種の分子量（理論値）の組み合わせ｛Ｍprobe，Ｍtag｝とを比較することで、対象となるプローブ溶液が、実際に、想定されるプローブ溶液と同じであるか否かを確認できる。この対比によって、対象となるプローブ溶液中に含有される、核酸プローブの種類を特定できる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
核酸プローブに加えて、タグ分子が添加されている、本発明にかかるプローブ溶液の構成を、核酸プローブの分子量が等しい、複数種の核酸プローブをそれぞれ含むプローブ溶液の調製に応用することで、各プローブ溶液の判別を、質量分析法を利用することで、簡便に行うことができる。
【配列表】
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