(57)【要約】【課題】    ある細胞、胚性幹細胞が存在するかどうか、および未分化細胞が多能性または未分化性を有するかどうかのマーカーとして使用することができる遺伝子を入手すること。【解決手段】  本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子という多能性を有する場合であれば未分化状態に従来より正確に発現するタンパク質を発見し本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカーを生産する方法であって、  Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；およびＣ）Ｂ）工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、を包含する、方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカーを生産する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；および
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記取り出す工程は、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ結合配列を有するＤＮＡとキャリアとの複合体と、前記細胞に由来する成分とを接触させることを包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャリアは、ラテックスまたはフェライトビーズを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、Ｒ１胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複合体がＮａｎｏｇのＳｏｘエレメントに結合するかどうかを判定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓｏｘエレメントは、核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子は核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含む核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｏｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体から、Ｓｏｘ２でもＯｃｔ４でもない分子を分離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳｏｘでもＯｃｔ４でもない分子の分離は、電気泳動、免疫学的手段、クロマトグラフィー、ＤＮＡタンパク質アフィニティー解析、マススペクトトメトリー解析からなる群より選択される１以上の手段を用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞に由来成分の提供は、核抽出物を提供することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子は、標識されているかまたは標識され得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記因子は、放射標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記胚性癌腫細胞は、Ｆ９細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって調製される、タンパク質複合体。
【請求項２２】
請求項４に記載の方法によって調製される、タンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項２４】
請求項１３に記載の方法によって調製される、タンパク質。
【請求項２５】
請求項２４に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項２６】
胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカー。
【請求項２７】
前記マーカーは、Ｏｃｔ４エレメントには結合しない、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項２８】
前記マーカーは、Ｓｏｘエレメントに結合する、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項２９】
前記マーカーは：
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；および
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、
を包含する、方法によって調製される、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３０】
前記マーカーは：
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程；および
Ｄ）該複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程、
を包含する、方法によって調製される、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３１】
Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１の転写を促進する活性を有する、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３２】
前記転写の促進は、Ｏｃｔ４との相互作用に起因する、請求項３１に記載のマーカー。
【請求項３３】
多分化能の有無を判定すること能力を有する、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３４】
前記多分化能は、前記胚性幹細胞にあるが、前記胚性癌腫細胞にはない能力を包含する、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３５】
Ｏｃｔ４との相互作用は、Ｓｏｘ２よりも強いことを特徴とする、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３６】
タンパク質である、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３７】
タンパク質複合体である、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３８】
識別可能な標識で標識される、請求項２６に記載のマーカー。
【請求項３９】
請求項２６に記載のマーカーに対して特異的な因子。
【請求項４０】
前記因子は、抗体である、請求項３９に記載の因子。
【請求項４１】
請求項２６に記載の因子がタンパク質であり、該タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項４２】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、核酸カセット。
【請求項４３】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４４】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項４５】
請求項４１に記載の核酸分子で形質転換される、細胞。
【請求項４６】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、組織。
【請求項４７】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、臓器。
【請求項４８】
請求項４１に記載の核酸分子を含む、生物体。
【請求項４９】
請求項４１に記載の核酸分子がｍＲＮＡとして発現される、細胞。
【請求項５０】
請求項４１に記載の核酸分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸分子。
【請求項５１】
前記生物学的活性は、Ｓｏｘエレメントとの相互作用、Ｏｃｔ４との相互作用およびＳｏｘ２との競合作用からなる群より選択される、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５２】
少なくとも１０の連続するヌクレオチド長を有する、請求項４９に記載の核酸分子。
【請求項５３】
請求項５０に記載の核酸分子に対して特異的な因子。
【請求項５４】
前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項５３に記載の因子。
【請求項５５】
前記因子は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項５３に記載の因子。
【請求項５６】
前記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、請求項５３に記載の因子。
【請求項５７】
前記因子は、プローブとして使用される、請求項５３に記載の因子。
【請求項５８】
前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項５３に記載の因子。
【請求項５９】
前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項５８に記載の因子。
【請求項６０】
（ｉ）請求項２６に記載のマーカーがポリペプチドであり、該マーカーのアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）の配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体、種相同体である、ポリペプチド；
を含む、ポリペプチド。
【請求項６１】
少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
請求項６０に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、因子。
【請求項６３】
前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項６２に記載の因子。
【請求項６４】
前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項６２に記載の因子。
【請求項６５】
前記因子は、プローブとして使用される、請求項６２に記載の因子。
【請求項６６】
前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項６２に記載の因子。
【請求項６７】
前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項６６に記載の因子。
【請求項６８】
細胞の未分化状態を判定するための組成物であって、該組成物は、
Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を含む、組成物。
【請求項６９】
前記ＰＳＢＰ遺伝子は、請求項４１に記載される核酸分子を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記細胞は、幹細胞である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記細胞は、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞、および組織幹細胞を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記細胞は、遺伝子改変されたものかまたは遺伝子改変されていないものである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７３】
細胞の未分化状態を判定する方法であって、
（Ｉ）判定されるべき細胞を提供する工程；
（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該細胞に接触させる工程；および
（ＩＩＩ）該因子と該Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物との特異的反応を検出することによって、該ＰＳＢＰ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認する工程、
を包含し、ここで、該細胞における該ＰＳＢＰ遺伝子の発現は、細胞が未分化状態にあることを示す、方法。
【請求項７４】
前記ＰＳＢＰ遺伝子は、請求項４１に記載される核酸分子を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７５】
前記未分化状態は、全能性を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
さらに、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する工程を包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記他の幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４および／またはＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
未分化状態の細胞を調製する方法であって、
（Ｉ）未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるサンプルを提供する工程；
（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該サンプルに接触させる工程；
（ＩＩＩ）該ＰＳＢＰ遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する工程；および
（ＩＶ）該ＰＳＢＰ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する工程、
を包含する、方法。
【請求項８０】
前記ＰＳＢＰ遺伝子は、請求項４１に記載される核酸分子を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記未分化状態は、全能性を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
細胞の分化状態を判定するキットであって、
（ａ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子；および
（ｂ）該ＰＳＢＰ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認するための手段、
を備える、キット。
【請求項８３】
前記ＰＳＢＰ遺伝子は、請求項４１に記載される核酸分子を含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記分化状態は、多能性を含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８５】
前記分化状態は、全能性を含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８６】
さらに、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段を備える、請求項８２に記載のキット。
【請求項８７】
前記他の幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４および／またはＳｔｍ１遺伝子を含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８８】
試料中の胚性幹細胞の存在を検出する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）該成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、該Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項８９】
前記胚性幹細胞は、胚性癌腫細胞から識別される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞は、Ｒ１胚性幹細胞である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｏｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
Ｓｏｘ２が発現しているかどうかを確認する工程であって、該Ｓｏｘ２が発現していないことは、前記試料中に胚性幹細胞が含まれていることをさらに確証付ける、工程をさらに包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞に由来成分の提供は、核抽出物を提供することを包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記因子は、標識されているかまたは標識され得ることを特徴とする、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記因子は、放射標識される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞に由来する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記胚性癌腫細胞は、Ｆ９細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
試料中の多分化能の状態を検出する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）該成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、該Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０１】
Ｓｏｘ２の発現量を測定し、該Ｓｏｘ２の発現量と前記Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量とを比較して、該Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量の該Ｓｏｘ２に対する相対比が多いことは、前記試料に含まれる細胞の多分化能が高いことの指標である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記因子は、抗体を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
試料中の胚性幹細胞の存在を検出するためのキットであって、
Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する手段；
Ｂ）該Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標であることを示す、指示書、
を備える、キット。
【請求項１０４】
試料中の多分化能の状態を検出するためのキットであって、
Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供するための手段、
Ｂ）該Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標であることを示す、指示書、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の未分化状態に関連する新規遺伝子および遺伝子産物に関する。より詳細には、本発明は、このような遺伝子または遺伝子産物を用いた細胞の未分化状態の判定方法、幹細胞の分離および調製方法ならびにそれらに関連する組成物およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の個体は特有の機能を発揮する様々な組織細胞の集合体として形作られている。高等生物では、この源となる細胞はたった１個の受精卵である。この受精卵と同様の多分化能をもつ細胞が幹細胞である。多分化能とはどの様な分子機構によって獲得および維持されるものかという基礎生物学的な興味に加え、近年では再生医療への応用が脚光を浴び、幹細胞研究の重要性が増している。幹細胞研究を推進する上で未分化細胞に特異的に発現する遺伝子の同定が必須になる。
【０００３】
種々の型の固有組織を発生し、かつ自己複製する能力によって定義される、哺乳動物の多分化能幹細胞は、成体における移植前胚および組織の幹細胞の細胞型として見出され、そして、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞および胚性生殖（ＥＧ）細胞として、インビトロで単離される（非特許文献１）。霊長類において、ＥＳ細胞は、アカゲザル、マーモセットザルおよびカニクイザルの胚盤胞から確立された。ヒトのＥＳ細胞およびＥＧ細胞の首尾よい確立（非特許文献１）は、基礎的な幹細胞研究だけでなく臨床医学の領域における、これらの細胞に関する研究の重要性を増し、臨床医学では、幹細胞が媒介する組織発生が、損傷組織の交換および、薬学的な適用に有用であることが望まれている。
【０００４】
細胞の多分化能状態は、多分化能細胞に特異的に発現するいくつかの鍵となる遺伝子の調節下で維持される。転写因子の哺乳動物ＰＯＵファミリーのメンバーであるＯｃｔ４遺伝子は、多分化能状態の鍵となるレギュレーターとして機能する（非特許文献２−３）。プロモーターでＯｃｔ４と共同して働くことが知られているＳｏｘ２は、Ｆｇｆ４遺伝子、Ｕｔｆ１遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｆｂｘ１５遺伝子を転写的に活性化する（非特許文献４〜７）。さらに、栄養外胚葉性系統で転写される遺伝子、Ｃｄｘ−２およびＨａｎｄ−１は、Ｏｃｔ４によって負に調節される（非特許文献３）。マウスＥＳ細胞の自己複製能および多分化能を維持するための情報伝達経路に関する別の鍵となる分子は、ＬＩＦ（白血病抑制因子）である（非特許文献８−９）。ＬＩＦは、ＬＩＦレセプターとｇｐ１３０のヘテロダイマーへの結合を介するリン酸化によって転写因子ＳＴＡＴ３を活性化させる（非特許文献１０）。最近、血清およびフィーダー細胞が存在しない培養条件下において、ＬＩＦシグナルが、マウスのＥＳ細胞の自己複製を補助するのに十分ではないこともまた示された。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）によって供給されるさらなるシグナルが必要であり、そしてこのシグナルは、神経外胚葉系統への分化を抑制する、分化抑制（Ｉｄ）遺伝子の活性化を誘導する（非特許文献１１）。これらの遺伝子の役割に加え、ショウジョウバエにおけるポリコーム群遺伝子であるｚｅｓｔｅのエンハンサーの哺乳動物ホモログであるＥｚｈ２（非特許文献１２）がＥｅｄ（胚性外胚葉発生）と複合体を形成し、そして、ヒストンＨ３リジン２７のメチル化をベースとする特定のホメオチック遺伝子の抑制を介して、胚盤胞の内部細胞塊の細胞およびＥＳ細胞の多分化能を維持するのに重要な役割を果たす（非特許文献１３−１４）。Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４ともいう）遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子またはＥｚｈ２遺伝子の無発現変異は、初期胚の死亡率をもたらす（非特許文献２、１５，１６）。その一方で、興味深いことに、Ｂｍｐ４遺伝子、Ｌｉｆ遺伝子、Ｌｉｆレセプター遺伝子またはＳｔａｔ３遺伝子は、少なくともマウスの移植前の発生においては、明白な欠損を誘導しない（非特許文献１７−２０）。ＬＩＦが、ヒトのＥＳ細胞の自己複製および多分化能を補助するのに不必要であることが知られている（非特許文献２１）。
これまで未分化細胞特異的遺伝子として、Ｏｃｔ４，ＵＴＦ１，Ｓｏｘ１，Ｒｅｘ１等の遺伝子が報告されているがＵＴＦ１，Ｓｏｘ１，Ｒｅｘ１は分化細胞でも発現が見られる。したがって、従来は、未分化細胞特異的遺伝子としては、Ｏｃｔ４のみが未分化細胞に比較的厳密に特異的であると考えられていた。
【０００５】
Ｏｃｔ４は遺伝子欠損の実験から未分化維持に必須であることが明らかになっている。また、この遺伝子の遺伝子発現量により分化の方向が決定されているらしい（非特許文献３）。Ｏｃｔ４を中心としてその上流および下流に位置する遺伝子の同定により未分化維持機構の解明が待たれている。Ｏｃｔ４遺伝子の発現が未分化のどの状態を反映するかは現在も不明のままであるが、未分化細胞の重要なマーカー遺伝子であることは間違いない。Ｏｃｔ４遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター蛍光遺伝子であるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をつないだ外来遺伝子を導入したトランスジェニックマウスでは、ＧＦＰの発現により未分化な生細胞の精製が可能になってきている。
【０００６】
上述のように、Ｏｃｔ４のような未分化状態を判定するためのツールはあるものの、Ｏｃｔ４などの遺伝子は、未分化状態でない場合にも発現することがあることから、真の意味でのマーカーとして使用することができない。また、Ｏｃｔ４は、胚性幹細胞で発現がみられるものの、未受精卵細胞において発現が見られたり、他の幹細胞（たとえば組織幹細胞）では発現が消失することから、多能性のマーカーとしての精確度は完全ではなく、その用途も限定されている。
【０００７】
ＮＡＮＯＧ（Ｓｔｍ１ともいう）は、新規に同定されたホメオドメインを有するタンパク質で、マウスの移植前胚における多分化能細胞、ＥＳ細胞細胞およびＥＧ細胞（非特許文献２２−２４）ならびにマウスおよびヒトのＥＳ細胞（非特許文献２５）において特異的に転写される、転写因子として作用し得る。多分化能を維持するためのＮａｎｏｇの決定的な機能が、移植直後のＮａｎｏｇ欠損の胚およびＮａｎｏｇを欠損するＥＳ細胞における多分化能の欠失（非特許文献２２）によって、また、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３シグナルによる調節の迂回およびＯＣＴ４レベルの維持を介するＥＳ細胞の、Ｎａｎｏｇの過剰発現依存性のクローン増殖（非特許文献２３）によって同定された。従って、ＮａｎｏｇがＥＳ細胞および初期胚細胞の多分化能および自己複製の能力を維持するための重要なレギュレーターであるということは明らかである。しかし、Ｎａｎｏｇの多分化能細胞特異的な発現がどのようにして制御されるのか、そして、他の幹細胞特異的な遺伝子がＮａｎｏｇ発現にどのように関係するのかは、ほとんど知られていないままである。
【０００８】
また、Ｎａｎｏｇ遺伝子は、どうやら、多分化能および胚性幹細胞の状態と完全にリンクしていないようであることも明らかになりつつある。したがって、より正確な細胞マーカーの同定が必要とされている。
【非特許文献１】Ｔａｄａ  ＴおよびＴａｄａ  Ｍ（２００１）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２６：１４９〜１６０
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊら、（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：３７９〜３９１
【非特許文献３】Ｎｉｗａ  Ｈ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  ＪおよびＳｍｉｔｈ  ＡＧ（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７２〜３７６
【非特許文献４】Ｙｕａｎ  Ｈら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２６３５〜２６４５
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：５４５３〜５４６５
【非特許文献６】Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３
【非特許文献７】Ｔｏｋｕｚａｗａ  Ｙら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：２６９９〜２７０８
【非特許文献８】Ｓｍｉｔｈ  ＡＧら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８８〜６９０
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＬら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８４〜６８７
【非特許文献１０】Ｄａｖｉｓ  Ｓら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１８０５〜１８０８
【非特許文献１１】Ｙｉｎｇ  ＱＬら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：２８１〜２９２
【非特許文献１２】Ｌａｉｂｌｅ  Ｇら、（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３２１９〜３２３２
【非特許文献１３】Ｃｚｅｒｍｉｎ  Ｂら、（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５〜１９６
【非特許文献１４】Ｅｒｈａｒｄｔ  Ｓら、（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：４２３５〜４２４８
【非特許文献１５】Ｏ’Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｄら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：４３３０〜４３３６
【非特許文献１６】Ａｖｉｌｉｏｎ  ＡＡら、（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０
【非特許文献１７】Ｓｔｅｗａｒｔ  ＣＬら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：７６〜７９
【非特許文献１８】Ｗａｒｅ  ＣＢら、（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：１２８３〜１２９９
【非特許文献１９】Ｗｉｎｎｉｅｒ  Ｇら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２１０５〜２１１６
【非特許文献２０】Ｔａｋｅｄａ  Ｋら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：３８０１〜３８０４
【非特許文献２１】Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７
【非特許文献２２】Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６３１〜６４２
【非特許文献２３】Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｉら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６４３〜６５５；
【非特許文献２４】Ｗａｎｇ  ＳＨら、（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ３：９９〜１０３
【非特許文献２５】Ｈａｒｔ  ＡＨら、（２００４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３０：１８７〜１９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、ある細胞、特に組織幹細胞を含む未分化細胞が多能性または未分化性を有するかどうかのマーカーとして使用することができる遺伝子を入手することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｎａｎｏｇに関してさらに研究を進めた結果明らかになったことに基づいて上記課題を解決した。その要旨は以下の通りである。
【００１１】
本発明者らは、多分化能細胞特異的な発現の分子機構を解明するために、Ｎａｎｏｇの転写に必要とされる調節因子を解析した。マウスのＥＳ細胞におけるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の未分化状態特異的な発現は、２．５ｋｂの５’フランキング領域を有するレポーター導入遺伝子を伴って再生された。このことは、この領域に転写シス調節因子が存在することを示唆する。５’フランキング領域の欠損したフラグメントを用いるルシフェラーゼアッセイは、１対の近接したＯｃｔａｍｅｒエレメント（Ｏｃｔａｍｅｒ因子が結合するＤＮＡ配列であり、結合因子の一つがＯｃｔ４であり、このようなほかの因子としてＯｃｔ１、Ｏｃｔ６などが未分化細胞で結合することが知られている。未分化細胞以外においても他に結合するＯｃｔａｍｅｒ因子があることが知られている）およびＳｏｘエレメントを含む３８０ｂｐのフラグメントが、転写をアップレギュレーションさせるのに決定的な役割を果たすことを明らかにした。これと一致して、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントにおける配列変異の導入によって、転写がダウンレギュレーションされた。これらのエレメントに結合する因子を同定するために、ＮＡＮＯＧと同時に発現するＯＣＴ４およびＳＯＸ２の結合活性を、電気泳動移動度シフトアッセイによって評価した。Ｆ９  ＥＣ細胞の核抽出物において、ＯＣＴ４のＯｃｔａｍｅｒエレメントへの結合能力およびＳＯＸ２のＳｏｘエレメントへの結合能力が認められた。ＥＳ細胞の抽出物において、ＯＣＴ４と、推定多分化能細胞特異的なＳｏｘエレメント結合タンパク質（ＰＳＢＰ）との複合体は、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘエレメントに優先的に結合する。Ｎａｎｏｇの転写は、Ｏｃｔ４とのクロストークおよび、ＥＳ細胞において顕著に発現し、Ｆ９  ＥＣ細胞においては発現しないＰＳＢＰによって調節されると考えられる。
【００１２】
したがって、本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物という、多能性を有する場合であれば未分化状態に特異的に発現するが、胚性癌腫細胞では発現しない遺伝子を発見し本発明を完成するに至った。さらに、この遺伝子は、Ｓｏｘ２とは異なる。
【００１３】
したがって、別の言い方をすれば、本発明は、オン−オフの特異的なＮａｎｏｇ発現に必要とされる調節エレメントとして、ＰＳＢＰ遺伝子が同定されたことに基づくといえる。
【００１４】
Ｎａｎｏｇは、胚性肝（ＥＳ）細胞の多分化能および自己複製を維持するために必須である転写因子を有するホメオドメインである。Ｎａｎｏｇは、初期胚細胞、生殖細胞ならびにＥＳ細胞および胚性癌腫（ＥＣ）細胞に特異的に発現する。転写調節の分子機構を解明するために、調節エレメントを、５’フランキング領域を欠損したフラグメントを用いるルシフェラーゼアッセイによって決定した。転写開始部位の１８０ｂｐ上流に位置する、近接したＯｃｔａｍｅｒエレメントとＳｏｘエレメントは、多分化能状態に特異的な遺伝子の発現を活性化するのに必要とされた。ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびSｏｘエレメントのいずれかにおける点変異が、ルシフェラーゼ活性の劇的な低下を誘導するため、両方のエレメントがＮａｎｏｇの発現に必要とされることが示唆される。ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントのＤＮＡ配列は、マウス、ヒトおよびサルの間で同一であった。これらのエレメントは、ヒトのＥＳ細胞においても、ＧＦＰレポーター遺伝子の適切な発現を媒介するのに十分であった。Ｆ９  ＥＣ細胞の核抽出物を用いた電気泳動移動度シフトアッセイは、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合するＯＣＴ４およびＳＯＸ２の内因的な発現を明らかにした。注目すべきことに、Ｒ１  ＥＳ細胞の核抽出物を用いる場合、ＯＣＴ４と未分化の多分化能細胞に特異的なＳｏｘエレメント結合因子との複合体は、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに優先的に結合する。Ｎａｎｏｇの転写は、ＯＣＴ４と、ＥＳ細胞で顕著な未決定の因子との相乗的な作用によって調節され得る。
【００１５】
多分化能細胞特異的な遺伝子Ｎａｎｏｇは、細胞の未分化状態を維持するために必要とされる転写因子を有するホメオドメインである。しかし、Ｎａｎｏｇ発現の調節機構は大部分が知られていない。転写調節の分子機構を解明するために、責任エレメントを、５’フランキング領域を欠損したフラグメントを用いたルシフェラーゼアッセイによって解析した。マウス、サルおよびヒトの間で十分に保存されている、１対の近接したＯｃｔａｍｅｒおよびＳｏｘ結合部位は、多分化能状態に特異的な遺伝子の発現を活性化するのに必須であった。さらに、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘのエレメントを含む５’フラグメントは、ヒトの胚性幹（ＥＳ）細胞においても、ＧＦＰレポーター遺伝子の適切な発現を誘導するのに十分であった。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の、このエレメントへの結合能力を、Ｆ９胚性癌腫細胞の抽出物を用いた電気泳動移動度シフトアッセイによって確認した。注目すべきことに、ＥＳ細胞の抽出物中で、ＯＣＴ４と未決定因子との複合体は、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘエレメントに優先的に結合する。Ｎａｎｏｇの転写は、Ｏｃｔ４とのクロストークおよび、ＥＳ細胞で顕著な新規の多分化能細胞特異的なＳｏｘエレメント結合因子によって調節され得る。
【００１６】
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカーを生産する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）上記成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；および
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、上記Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、
を包含する、方法。
（２）上記複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（３）上記取り出す工程は、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ結合配列を有するＤＮＡとキャリアとの複合体と、上記細胞に由来する成分とを接触させることを包含する、項目２に記載の方法。
（４）上記キャリアは、ラテックスまたはフェライトビーズを含む、項目３に記載の方法。
（５）上記細胞は、幹細胞である、項目１に記載の方法。
（６）上記細胞は、胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（７）上記細胞は、Ｒ１胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（８）上記複合体がＮａｎｏｇのＳｏｘエレメントに結合するかどうかを判定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（９）上記Ｓｏｘエレメントは、核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含む、項目１に記載の方法。
（１０）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子は核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含む核酸分子を含む、項目１に記載の方法。
（１１）上記Ｏｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である、項目１に記載の方法。
（１２）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体である、項目１に記載の方法。
（１３）上記複合体から、Ｓｏｘ２でもＯｃｔ４でもない分子を分離する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１４）上記ＳｏｘでもＯｃｔ４でもない分子の分離は、電気泳動、免疫学的手段、クロマトグラフィー、ＤＮＡタンパク質アフィニティー解析、マススペクトリー解析からなる群より選択される１以上の手段を用いて行われる、項目１３に記載の方法。
（１５）上記細胞に由来成分の提供は、核抽出物を提供することを包含する、項目１に記載の方法。
（１６）上記因子は、標識されているかまたは標識され得ることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（１７）上記因子は、放射標識される、項目１に記載の方法。
（１８）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する、項目１に記載の方法。
（１９）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞に由来する、項目１８に記載の方法。
（２０）上記胚性癌腫細胞は、Ｆ９細胞である、項目１９に記載の方法。
（２１）項目１に記載の方法によって調製される、タンパク質複合体。
（２２）項目４に記載の方法によって調製される、タンパク質。
（２３）項目２２に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
（２４）項目１３に記載の方法によって調製される、タンパク質。
（２５）項目２４に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
（２６）胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカー。
（２７）上記マーカーは、Ｏｃｔ４エレメントには結合しない、項目２６に記載のマーカー。
（２８）上記マーカーは、Ｓｏｘエレメントに結合する、項目２６に記載のマーカー。
（２９）上記マーカーは：
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）上記成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；および
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、
を包含する、方法によって調製される、項目２６に記載のマーカー。
（３０）上記マーカーは：
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）上記成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；
Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程；および
Ｄ）上記複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程、
を包含する、方法によって調製される、項目２６に記載のマーカー。
（３１）Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１の転写を促進する活性を有する、項目２６に記載のマーカー。
（３２）上記転写の促進は、Ｏｃｔ４との相互作用に起因する、項目３１に記載のマーカー。
（３３）多分化能の有無を判定すること能力を有する、項目２６に記載のマーカー。
（３４）上記多分化能は、上記胚性幹細胞にあるが、上記胚性癌腫細胞にはない能力を包含する、項目２６に記載のマーカー。
（３５）Ｏｃｔ４との相互作用は、Ｓｏｘ２よりも強いことを特徴とする、項目２６に記載のマーカー。
（３６）タンパク質である、項目２６に記載のマーカー。
（３７）タンパク質複合体である、項目２６に記載のマーカー。
（３８）識別可能な標識で標識される、項目２６に記載のマーカー。
（３９）項目２６に記載のマーカーに対して特異的な因子。
（４０）上記因子は、抗体である、項目３９に記載の因子。
（４１）項目２６に記載の因子がタンパク質であり、上記タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
（４２）項目４１に記載の核酸分子を含む、核酸カセット。
（４３）項目４１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（４４）項目４１に記載の核酸分子を含む、細胞。
（４５）項目４１に記載の核酸分子で形質転換される、細胞。
（４６）項目４１に記載の核酸分子を含む、組織。
（４７）項目４１に記載の核酸分子を含む、臓器。
（４８）項目４１に記載の核酸分子を含む、生物体。
（４９）項目４１に記載の核酸分子がｍＲＮＡとして発現される、細胞。
（５０）項目４１に記載の核酸分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸分子。
（５１）上記生物学的活性は、Ｓｏｘエレメントとの相互作用、Ｏｃｔ４との相互作用およびＳｏｘ２との競合作用からなる群より選択される、項目５０に記載の核酸分子。
（５２）少なくとも１０の連続するヌクレオチド長を有する、項目４９に記載の核酸分子。
（５３）項目５０に記載の核酸分子に対して特異的な因子。
（５４）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目５３に記載の因子。
（５５）上記因子は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、項目５３に記載の因子。
（５６）上記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、項目５３に記載の因子。
（５７）上記因子は、プローブとして使用される、項目５３に記載の因子。
（５８）上記因子は、標識されているかまたは標識され得る、項目５３に記載の因子。
（５９）上記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、項目５８に記載の因子。
（６０）（ｉ）項目２６に記載のマーカーがポリペプチドであり、上記マーカーのアミノ酸配列または上記アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）の配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体、種相同体である、ポリペプチド；
を含む、ポリペプチド。
（６１）少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する、項目６０に記載のポリペプチド。
（６２）項目６０に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、因子。
（６３）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目６２に記載の因子。
（６４）上記因子は、抗体またはその誘導体である、項目６２に記載の因子。
（６５）上記因子は、プローブとして使用される、項目６２に記載の因子。
（６６）上記因子は、標識されているかまたは標識され得る、項目６２に記載の因子。
（６７）上記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、項目６６に記載の因子。
（６８）細胞の未分化状態を判定するための組成物であって、上記組成物は、
Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を含む、組成物。
（６９）上記ＰＳＢＰ遺伝子は、項目４１に記載される核酸分子を含む、項目６８に記載の組成物。
（７０）上記細胞は、幹細胞である、項目６８に記載の組成物。
（７１）上記細胞は、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞、および組織幹細胞を含む、項目６８に記載の組成物。
（７２）上記細胞は、遺伝子改変されたものかまたは遺伝子改変されていないものである、項目６８に記載の組成物。
（７３）細胞の未分化状態を判定する方法であって、
（Ｉ）判定されるべき細胞を提供する工程；
（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、上記細胞に接触させる工程；および
（ＩＩＩ）上記因子と上記Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物との特異的反応を検出することによって、上記ＰＳＢＰ遺伝子が上記細胞において発現しているかどうかを確認する工程、
を包含し、ここで、上記細胞における上記ＰＳＢＰ遺伝子の発現は、細胞が未分化状態にあることを示す、方法。
（７４）上記ＰＳＢＰ遺伝子は、項目４１に記載される核酸分子を含む、項目７０に記載の組成物。
（７５）上記未分化状態は、全能性を含む、項目７３に記載の方法。
（７６）さらに、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する工程を包含する、項目７３に記載の方法。
（７７）上記他の幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４および／またはＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１を含む、項目７６に記載の方法。
（７８）上記Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む、項目７７に記載の方法。
（７９）未分化状態の細胞を調製する方法であって、
（Ｉ）未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるサンプルを提供する工程；
（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、上記サンプルに接触させる工程；
（ＩＩＩ）上記ＰＳＢＰ遺伝子が上記サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する工程；および
（ＩＶ）上記ＰＳＢＰ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する工程、
を包含する、方法。
（８０）上記ＰＳＢＰ遺伝子は、項目４１に記載される核酸分子を含む、項目７９に記載の方法。
（８１）上記未分化状態は、全能性を含む、項目７９に記載の方法。
（８２）細胞の分化状態を判定するキットであって、
（ａ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子；および
（ｂ）上記ＰＳＢＰ遺伝子が上記細胞において発現しているかどうかを確認するための手段、
を備える、キット。
（８３）上記ＰＳＢＰ遺伝子は、項目４１に記載される核酸分子を含む、項目８２に記載のキット。
（８４）上記分化状態は、多能性を含む、項目８２に記載のキット。
（８５）上記分化状態は、全能性を含む、項目８２に記載のキット。
（８６）さらに、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段を備える、項目８２に記載のキット。
（８７）上記他の幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４および／またはＳｔｍ１遺伝子を含む、項目８２に記載のキット。
（８８）試料中の胚性幹細胞の存在を検出する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）上記成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、上記Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、上記Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標である、工程、
を包含する、方法。
（８９）上記胚性幹細胞は、胚性癌腫細胞から識別される、項目８８に記載の方法。
（９０）上記細胞は、Ｒ１胚性幹細胞である、項目８８に記載の方法。
（９１）上記Ｏｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である、項目８８に記載の方法。
（９２）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体である、項目８８に記載の方法。
（９３）Ｓｏｘ２が発現しているかどうかを確認する工程であって、上記Ｓｏｘ２が発現していないことは、上記試料中に胚性幹細胞が含まれていることをさらに確証付ける、工程をさらに包含する、項目８８に記載の方法。
（９４）上記細胞に由来成分の提供は、核抽出物を提供することを包含する、項目８８に記載の方法。
（９５）上記因子は、標識されているかまたは標識され得ることを特徴とする、項目８８に記載の方法。
（９６）上記因子は、放射標識される、項目８８に記載の方法。
（９７）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する、項目８８に記載の方法。
（９８）上記Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞に由来する、項目９７に記載の方法。
（９９）上記胚性癌腫細胞は、Ｆ９細胞である、項目９８に記載の方法。
（１００）試料中の多分化能の状態を検出する方法であって、
Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；
Ｂ）上記成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、上記Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、上記Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標である、工程、
を包含する、方法。
（１０１）Ｓｏｘ２の発現量を測定し、上記Ｓｏｘ２の発現量と上記Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量とを比較して、上記Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量の上記Ｓｏｘ２に対する相対比が多いことは、上記試料に含まれる細胞の多分化能が高いことの指標である、項目１００に記載の方法。
（１０２）上記因子は、抗体を含む、項目１００に記載の方法。
（１０３）試料中の胚性幹細胞の存在を検出するためのキットであって、
Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する手段；
Ｂ）上記Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、上記Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標であることを示す、指示書、
を備える、キット。
（１０４）試料中の多分化能の状態を検出するためのキットであって、
Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供するための手段、
Ｂ）上記Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、上記Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標であることを示す、指示書、
を備える、キット。
【００１７】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００１８】
未分化状態の判定、全能性、多能性のより詳細な判定など、従来の因子では不可能であった、幹細胞の精確な判定が達成された。また、本発明の方法を用いれば、ＥＳ細胞、胚細胞などの幹細胞の精製を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２０】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２１】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２２】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。
【００２３】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００２４】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００２５】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
【００２６】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００２７】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程を回避することができるので好ましい。
【００２８】
本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変（例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。
【００２９】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、本発明のＳｔｍ遺伝子を発現させた細胞は、起源として分化細胞を用いても、多能性を獲得することができる。
【００３０】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、本発明のＳｔｍ遺伝子は、未分化細胞のマーカーとして非常に有用であり得る。
【００３１】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
従って、本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常胚性幹細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。この胚性幹細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（胚性幹細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。胚性幹細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をした胚性幹細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。胚性幹細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、胚性幹細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。このような胚性幹細胞は、受精３．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊の細胞をインビトロ培養に移し，細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより，多分化能を保持し，正常核型を維持したまま無制限に増殖しつづける幹細胞を樹立することに作製することができる。通常、胚性幹細胞の多分化能を維持するには、ＳＴＯ細胞株および／またはマウス胎仔から調製した初代培養繊維芽細胞などのフィーダー細胞層上で胚性幹細胞を培養することが好ましいとされる。
【００３３】
本明細書において「胚性癌腫細胞」または「ＥＣ細胞」とは、交換可能に用いられ、奇形癌腫の増殖を支えている未分化で多分化能を部分的に有する幹細胞。しかし、胚性幹細胞よりも多分化能が限定されている点で峻別される。胚性癌腫細胞は、盛んに分裂し，細胞同士が強く接着し，細胞間の境界が不明瞭な島状のコロニーをつくる。細胞質に占める核の割合が大きく，細胞膜にアルカリ性ホスファターゼ活性が強く，細胞膜表面抗原としてSSEA-1をもつなどの初期胚全能性細胞に似た性質を示すが、本発明のＰＢＰＳは、発現しない。細胞株によってその分化能には差があり、全能性はないとされる。奇形癌腫ＯＴＴ６０５０株から樹立されたＦ９株は、普通には分化能を示さないが，レチノイン酸などの誘導試薬処理や細胞塊をつくらせるなどの培養方法によって，２種類の胚体外膜内胚葉細胞のどちらかに分化させることができる。一般的には胚性癌腫細胞を特定の細胞に任意に分化させることは難しいことから、多分化能がないあるいは限定的な多分化能を有するといえる。
【００３４】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する実質的に全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【００３５】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。したがって、１つの局面において、本発明のＮＡＮＯＧ／Ｓｔｍ１は、全能性の有無またはＥＳ細胞の出発材料としての適切性を判断するのに使用することができるといえる。
【００３６】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
【００３７】
本発明が対象とする臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明の多能性細胞から分化した細胞としては、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。
【００３９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００４０】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００４１】
用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、ＰＳＢＰまたはＮａｎｏｇ（Ｓｔｍ１）遺伝子には、ＰＳＢＰまたはＮａｎｏｇ（Ｓｔｍ１）のスプライス変異体もまた包含され得る。また本明細書においてＰＳＢＰまたはＮａｎｏｇ（Ｓｔｍ１）遺伝子と言う場合には、それぞれＰＳＢＰまたはＮａｎｏｇ（Ｓｔｍ１）遺伝子領域の全てまたは一部を含む転写産物を包含する。
【００４２】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、Ｓｔｍ遺伝子またはその産物と同様の機能を有する限り、そのような複合分子も使用することができる。
【００４３】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００４４】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００４６】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、ＰＳＢＰ遺伝子というときは、通常、ＰＳＢＰの構造遺伝子およびＰＳＢＰのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００４７】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００４８】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００４９】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００５０】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００５１】
用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００５２】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００５３】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギン又はアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミン又はグルタミン酸
Ｘａａ                  不明又は他のアミノ酸。
【００５４】
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニン又はアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシル又はシトシンピリミジン
ｍ    アデニン又はシトシンアミノ基
ｋ    グアニン又はチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニン又はシトシン
ｗ    アデニン又はチミン／ウラシル
ｂ    グアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
ｄ    アデニン又はグアニン又はチミン／ウラシル
ｈ    アデニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
ｖ    アデニン又はグアニン又はシトシン
ｎ    アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００５５】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本明細書において、例えば、マウスＰＳＢＰのポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸に対応するアミノ酸または核酸は、それぞれヒトＰＳＢＰのポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸などが例示される。
【００５６】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスＰＳＢＰの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＰＳＢＰ遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５７】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００５９】
本明細書において「Ｎａｎｏｇ」、「Ｓｔｍ１」または「Ｓｔｍ１遺伝子」とは、未分化細胞、初期胚もしくは生殖細胞のいずれかまたはいくつかの細胞において発現する性質を有する遺伝子であって、例えば、
（Ａ）（ａ）配列番号１、３、５または７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、３、５または７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５または７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において特に区別するとき、遺伝子は斜字体で記載し、例えば、マウスのものはＳｔｍ、ヒトのものはＳＴＭと標記するが、通常は特定の種を意味しない。他方、例えば、タンパク質は斜字体ではないＳＴＭと示して区別することがあるが、通常は特定の種を意味しない。
【００６１】
Ｓｔｍ１のその遺伝子産物を特定するためには、好ましくは、全長アミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製した特異的な抗体を用いる。Ｓｔｍ１遺伝子は、Ｎａｎｏｇと呼ばれる遺伝子と同一であることがわかっているおり、したがって、Ｓｔｍ１とＮａｎｏｇとは本明細書において交換可能に用いられる。
【００６２】
Ｎａｎｏｇ（Ｓｔｍ１）遺伝子に類似する遺伝子に、Ｓｔｍ２遺伝子がある。本明細書において「Ｓｔｍ２」および「Ｓｔｍ２遺伝子」とは、配列番号９または１１に記載される核酸配列または配列番号１０または１２に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む遺伝子ならびにそれに対応する遺伝子（種相同体を含む）をいう。マウスＳｔｍ２はＳｔｍ１に対してｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列が９９．６％相同性のある遺伝子である。しかし、Ｓｔｍ２遺伝子はイントロンレスのシングルエクソンからなる遺伝子構造をもち、４個のエクソンと３個のイントロンをもつＳｔｍ１とは構造が異なる上、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２は異なる染色体上に位置することが解っている。本発明によって、Ｓｔｍ２は、マウス７番染色体７Ｅ３に位置することが明らかになった。なお、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２とは、マウスの場合９９．６％の相同性を有する。
【００６３】
Ｓｔｍ１とＳｔｍ２との決定的な相違は、細胞における発現の有無である。Ｓｔｍ１は発現される遺伝子であるのに対し、Ｓｔｍ２は、通常の細胞では発現されず、偽遺伝子であることが判明している。
【００６４】
本明細書において、「ＮＡＮＯＧ」、「ＳＴＭ」、「ＯＣＴ４」、「ＰＳＢＰ」という表現は、それぞれの遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｓｔｍ、Ｏｃｔ４、Ｐｓｂｐ）のタンパク質形態を示すために使用される。
【００６５】
本明細書において、「Ｎａｎｏｇのプロモーター配列」は、Ｎａｎｏｇ遺伝子に関連するプロモーター配列をいう。そのような配列は、配列番号１３（マウス）およびそれに対応する配列などが挙げられるがそれらに限定されない。Ｓｔｍ１遺伝子の発現制御には、転写開始点から上流３９０ｂｐがあることが好ましく、その塩基配列としては、配列番号１４（ヒト）、１５（マウス）、１６（カニクイサル）に示される配列などが挙げられる。その中でも、Ｏｃｔ（Ｏｃｔａｍｅｒ）／Ｓｏｘ（転写開始点を起点とすれば−１８０位〜−１６６位、ＴＴＴＴＧＣＡＴおよびＴＡＣＡＡＴＧ（Ｏｃｔ／Ｓｏｘモチーフ配列；ここで、ＴＴＴＴＧＣＡＴは、Ｏｃｔモチーフ配列であり、ＴＡＣＡＡＴＧはＳｏｘモチーフ配列である））がモチーフとなる。Ｏｃｔモチーフ配列およびＳｏｘモチーフ配列は、それぞれ、Ｏｃｔ４エレメントまたはＯｃｔエレメント、およびＳｏｘエレメントまたはＳｏｘエレメントともいう。
【００６６】
本明細書において「Ｐｓｂｐ」（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｓｏｘ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、「ＰＳＢＰ」および「Ｐｓｂｐ遺伝子」は、交換可能に用いられ、ゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞に由来する成分であって、Ｓｏｘ２とは異なるものをいう。この遺伝子は、ＤＮＡ結合領域としてＨＭＧ−ｂｏｘ（Goodwin GH, Johns EW, Eur J Biochem 1973, 40:215-219.; Bustin M, MolCell Biol 1999, 19:5237-5246.; Thomas JO, Travers AA, Trends Biochem Sci 2001,26:167-174）を有する可能性が高いと考えられる。Ｐｓｐｂ遺伝子は、胚性幹細胞において発現され、胚性癌腫細胞においては発現されないことから、胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができる。また、多分化能を有する胚性幹細胞において発現され、多分化能を有しない細胞（Ｆ９細胞株）において発現されないことから、多分化能または未分化状態の指標としても用いることができる。
【００６７】
本明細書において「外来遺伝子」とは、ある生物において、その生物には天然には存在しない遺伝子をいう。そのような外来遺伝子は、その生物に天然に存在する遺伝子を改変したものであってもよく、天然において他の生物に存在する遺伝子（例えば、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｐｓｂｐ遺伝子）であってもよく、人工的に合成した遺伝子であってもよく、それらの複合体（例えば、融合体）であってもよい。そのような外来遺伝子を含む生物は、天然では発現しない遺伝子産物を発現し得る。
【００６８】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本明細書において用いられる「増殖因子」とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【００６９】
本発明において、発現されるべき外来遺伝子は、上述の天然型の外来遺伝子と相同性のあるものが使用され得る。そのような相同性を有する外来遺伝子としては、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の外来遺伝子に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸分子または少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド分子が挙げられるが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７０】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００７１】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００７２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００７３】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子（例えば、Ｓｔｍ）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。このようなアンチセンス活性を有する分子をアンチセンス分子という。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。
【００７４】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００７５】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００７６】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００７７】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００７８】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００７９】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【００８０】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００８１】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００８２】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００８３】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
【００８４】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８５】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００８６】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００８７】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８８】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００８９】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００９０】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００９１】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【００９２】
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９３】
本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、エネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプタ−またはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプタ−、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９４】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【００９５】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９６】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【００９７】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
【００９８】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：３７７）を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。
【００９９】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
【０１００】
（遺伝子の改変）
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する核酸分子において行われ得る。
【０１０１】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１０２】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【０１０３】
親水性指数もまた、ポリペプチドの設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１０４】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１０６】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。本明細書では、好ましくは、この保存的置換は、Ｓｔｍ１遺伝子とＳｔｍ２遺伝子との間で共通する部分の置換であることが有利であり得る。保存的置換があったとしてもＳｔｍ１遺伝子とＳｔｍ２遺伝子とを識別することがなおも可能であるからである。
【０１０７】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１０８】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【０１０９】
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
【０１１０】
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１１１】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１１２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１１３】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、生物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【０１１４】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１１５】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１１６】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該分野において多数存在し、販売元により、微妙な違い（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を変えて販売されている。例えば、Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３  （Ｖｏｌｕｍｅ  ３），  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａ３．２  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＵＳＡ，  ２００１）  に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【０１１７】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１１８】
本明細書において使用される組み換えベクターとしては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダＦＩＸベクター（ファージベクター）を、ｃＤＮＡのスクリーニングではラムダＺＡＰベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノムＤＮＡのクローニングにはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−，  ｐＧＥＭ，  ｐＣＲ２．１  ベクター（プラスミドベクター）を主に使用することができる。発現ベクターとしてｐＳＶ２ｎｅｏベクター（プラスミドベクター）を利用することができる。このようなベクターは、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ３．２を参考にして適宜実施することができる。
【０１１９】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１２０】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０１２１】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１２２】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１２３】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１２４】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１２５】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１２６】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示され、そのような細胞は、Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３  （Ｖｏｌｕｍｅ  ３），  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａ３．２  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＵＳＡ  ２００１）  に記載されている。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５が例示され、好ましくは、例えば、Ｃｏｓ１，  ＮＩＨ３Ｔ３，  ＥＳ  （Ｒ１，  ＴＭＡ，  ＮＲ２）細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
【０１２９】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
【０１３０】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１３１】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１３２】
（ポリペプチドの製造方法）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
【０１３３】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１３４】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【０１３５】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０１３６】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
【０１３７】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１３８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【０１３９】
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【０１４０】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
【０１４１】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１４２】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１４３】
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
【０１４４】
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
【０１４５】
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
【０１４６】
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【０１４７】
（変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
【０１４８】
（免疫化学）
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
【０１４９】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。
【０１５０】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。
【０１５１】
このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
【０１５２】
また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。
【０１５３】
本発明ポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。
【０１５４】
当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０１５５】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から作製することができる。ある抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリーまたは抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１５６】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。
【０１５７】
特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１５８】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体などの非ヒト抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂなどの非ヒトｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１５９】
単鎖抗体を製造する場合、単鎖抗体の産生に関する記載された公知の技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、利用され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１６０】
上記のほかに本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、組換え発現技術によって産生され得る。
【０１６１】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０１６２】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０１６３】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１６４】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明の抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１６５】
これらの技術は、ヒト胚性幹細胞において見出され得るような細胞増殖および／または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行ったような細胞集団のような、未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など）を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
【０１６６】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸または本発明のポリペプチドを調節する遺伝子をコードする核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１６７】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１６８】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１６９】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０１７０】
（治療／予防のための投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０１７１】
本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１７２】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１７３】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７４】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１７５】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１７６】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０１７７】
本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１７８】
（再プログラム化）
本明細書において「再プログラム化」とは、細胞（たとえば、体細胞）に作用して、その細胞を未分化状にさせ、多能性を増加または獲得させることをいう。従って、再プログラム化の活性は、ある因子を、分化した細胞（たとえば、体細胞）に、測定すべき量を一定時間（例えば、数時間など）暴露させた後に、多能性を測定し、暴露前のその細胞の多能性と比較して、有意な差異が見出されるかどうかを判定することによって測定される。再プログラム化のレベルは、種々存在し、再プログラム化された細胞の多能性のレベルに対応する。したがって、全能性の幹細胞由来の再プログラム化因子を用いる場合には、再プログラム化は全能性に対応することがあり得る。したがって、再プログラム化状態は、本明細書において、未分化状態とほぼ１：１の関係にある。本発明のポリペプチドは、再プログラム化状態を判定するためにも用いることができる。
【０１７９】
本明細書において、「再プログラム化因子」または「再プログラム化する因子」とは、細胞に作用し、その細胞を未分化細胞化する因子である。胚性幹細胞は体細胞核のインプリントを再プログラム化することはできないが、生殖細胞の発達は可能とするよう、体細胞核のエピジェネティクス状態を再プログラム化した。従って、胚性幹細胞中にそのような再プログラム化因子が含まれることは明らかである。また、胚性幹細胞以外の他の幹細胞にも体細胞を再プログラム化する因子がある可能性があり、本発明の再プログラム化因子はまたこれらの因子をも包含する。体細胞に作用させる胚性幹細胞由来の成分としては、胚性幹細胞中に含まれる成分であれば特に限定されないが、細胞質成分、核成分等、また個々のＲＮＡおよびタンパク質等が挙げられる。雑多な分子を含む細胞質成分または核成分を作用させる場合、慣用な手段により（例えば、クロマトグラフィー等）ある程度の分画を行い、分画された各画分を体細胞に対して作用させても良い。特定の画分が再プログラム化因子を含むことが判明した場合には、該画分をさらに精製し、最終的には一つの分子として特定し、それを利用することもできる。また代わりに、この再プログラム化因子が含まれる画分をそのまま、何ら精製することなく体細胞の再プログラム化に用いることも可能である。また、再プログラム化因子は、一分子が単独でそのような作用を示す場合も考え得るが、複数の分子が相互作用により、体細胞を未分化様細胞へと変化させることも考えられる。従って、本発明の「再プログラム化因子」には、単一分子からなる因子、複数分子からなる因子、および、前記単一分子または複数分子が含まれる組成物が包含される。
【０１８０】
本発明の再プログラム化因子のスクリーニング方法としては、胚性幹細胞由来の成分を体細胞に接触、注入等の手段により作用させ、本発明のＰｓｂｐ遺伝子−ＧＦＰマーカー遺伝子の発現、Ｘ染色体の活性化等の再プログラム化の指標となる活性を基にその作用を検出し、そして、再プログラム化活性を有していた成分を選択することにより行うことができる。
【０１８１】
再プログラム化する因子をスクリーニングする方法は、適当な体細胞に対して、胚性幹細胞由来の成分を作用させ、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出し、そして、再プログラム活性を有する成分を選択することにより達成され得る。本明細書において用いられ得る体細胞としては、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞等を例示することができる。特に、これらに限定されるわけではなく、正常な染色体を有した体細胞であり、安定に増殖させることができ、再プログラム化因子の作用により多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。特に、作用させる胚性幹細胞由来の成分が由来する種由来であることが好ましい（例えば、胚性幹細胞由来の成分がヒト由来である場合、ヒト由来の体細胞）。既に確立されている細胞株を用いることも可能である。
【０１８２】
本発明の細胞より細胞、組織または臓器を製造する方法において、細胞を分化させる方法は、その細胞の核型が実質的に保持されるような状態で細胞、組織または臓器が分化され得るのであれば特に限定されない。例えば、胚盤胞への導入、マウス等の動物への皮下注射によりテラトーマを形成させること等により細胞、組織、および臓器へと分化させることが可能である。所望の細胞、組織または臓器は、それらの分化された胚盤胞またはテラトーマから単離することができる。インビトロで目的とする種類の細胞を得るために必要とされる細胞増殖因子、成長因子等を添加し、細胞から所望の細胞、組織または臓器を誘導してもよい。現在までに、血管、神経細胞、筋肉細胞、造血細胞、皮膚、骨、肝臓、膵臓等への胚性幹細胞からの誘導が報告されており、本発明の多能性幹細胞からの移植個体に対応する細胞、組織または臓器の製造においても、それらの技術を適用することができる（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｌ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１０７１６−２１；Ｂｏｈｅｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｃｚｙｚ，Ｊ．，Ｔｗｅｅｄｉｅ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ａｎｉｓｉｍｏｖ，Ｓ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｗｏｂｕｓ，Ａ．Ｍ．（２００２）．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９１，１８９−２０１）。
【０１８３】
本発明の細胞からの細胞、組織または臓器の製造方法において幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を使用する場合、適当な個体から幹細胞（たとえば、神経幹細胞、胚性幹細胞）を確立して用いることも可能であるが、既に確立されている、種々の生物由来の幹細胞（たとえば、神経幹細胞、胚性幹細胞）を利用することが好ましい。例えば、マウス、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ミンク、ウサギ、アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類、およびヒトの幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を挙げることができる。好ましくは、使用する体細胞と同じ種由来の幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を用いる。
【０１８４】
（Ｐｓｂｐの説明）
Ｐｓｐｂは、本発明において初めて見出された遺伝子であり、以下のような性質を有する。
１）既存の抗ＳＯＸ２抗体ではスーパーシフトしない。
２）ＮａｎｏｇやＦｇｆ４遺伝子のＳｏｘエレメントに結合する。
３）ＳＯＸ２が存在してもＰＳＢＰが優先的にＳｏｘエレメントに結合する。
４）ＰＳＢＰはＨＭＧ−ｂｏｘを持つ可能性が高い。
５）未分化細胞に特異的に発現するか、特異的修飾を受けている可能性が高い。
６）Ｆ９  ＥＣ細胞ではＰＢＳＰが存在しないもしく機能しないが、ＥＳ細胞には存在するまたは機能型としての修飾を受けている。
【０１８５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１８６】
（マーカー生産方法）
１つの局面において、本発明は、胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができるマーカーを生産する方法であって、Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；およびＣ）Ｂ）工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）に特異的な複合体を取り出す工程、を包含する、方法を提供する。
【０１８７】
ここで、細胞に由来する成分は、当該分野において公知の任意の技法を用いて実現することができる。そのような技法としては、例えば、任意の細胞を破壊する技法（例えば、フレンチプレス、超音波法など）を利用することができる。好ましくは、細胞に由来する成分は、核に由来することが好ましい。細胞内の特定成分を調製する方法としては、例えば、遠心分離法、ショ糖などを用いた密度勾配遠心分離方法、硫酸アンモニウム沈澱法などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８８】
本発明において実施されるゲルシフトアッセイは、当該分野において公知の任意の方法を利用することができる。ゲルシフトアッセイは、市販されるキット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａなどが市販される）を用いても良い。例示的なゲルシフトアッセイの概略は以下の通りである。
【０１８９】
１．ポリアクリルアミドゲルを作製する。２．核抽出物とビオチン標識したＤＮＡを反応させる。３．電気泳動による分離を行う。４．メンブレン（例えば、ナイロンなど）へのブロッティングを行う。５．ＵＶを用い，メンブレンへクロスリンクさせる。６．ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと特異的結合させる。７．化学発光基質との反応で発光させる。８．Ｘ線フィルムへ感光させ検出する。これはあくまでも例示であり、例えば、他の標識（放射能など）を用いても実施することができることが理解される。ゲルシフトアッセイは、特定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を電気泳動度の違いにより同定する実験法であり、また、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的因子（例えば、抗体）をそのタンパク質やＤＮＡ配列とともにインキュベートすることにより、電気泳動時のＤＮＡ−タンパク複合体の移動度の差を利用する。この手法をゲルスーパーシフト法といい、特に、ＤＮＡと転写因子の結合解析に有効である。
【０１９０】
このようにスーパーシフトの有無によって細胞を分類した後、本発明では、Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する。この選択は、当業者であれば、分類にしたがって、容易に実施することができる。
【０１９１】
本発明において、上記選択工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４を含むＯｃｔａｍｅｒ結合因子に特異的な複合体を取り出す技法もまた、物質を分離精製する任意の技術を用いることができることが理解される。そのような分離精製の技術としては、例えば、免疫学的技術を利用する方法、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー精製、ゲル濾過など）、遠心分離などを挙げることができるがそれらに限定されない。ここで、分離される複合体自体が、本発明において、幹細胞を識別するために使用されることから、本発明の有用性が複合体においてすでに見出され得ることが理解される。この複合体は、代表的に、Ｏｃｔ４ポリペプチドと、本発明において初めて見出されたＰｂｓｐポリペプチドとを含むことが理解される。
【０１９２】
本発明において、必要に応じて、このような複合体から、Ｏｃｔ４ポリペプチドを取り除いてもよい。このような場合、本発明の上記複合体から、Ｓｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出してもよい。このような特定成分の取り出しは、複合体の各々の成分の相互作用が解放されるような条件に複合体を曝し、代表的に、目的とする特定成分を分離するか、あるいは、目的とする特定成分以外の所望されない成分を分離することによって実現することができる。そのような条件とは、例えば、高塩濃度、特定のｐＨなどを挙げることができるがそれらに限定されない。成分の分離は、当該分野において周知の任意の技法（クロマトグラフィー、電気泳動など）を利用することができることが理解される。
【０１９３】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法における本発明の複合体を取り出す工程は、Ｏｃｔ４がおよそ４５ｋＤａという分子量を有していることを指標に、本発明のＰＳＢＰのおおよその推定分子量に関する情報を利用することができる。分子量による分離は、例えば、電気泳動、ゲル濾過などの公知技術を用いることができることが理解される。
【０１９４】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法における本発明の複合体を取り出す工程は、ｐＩを参酌して分離することを包含する。このようなｐＩによる分子の分離もまた、等電点電気泳動などの技術を用いることによって実施することができることが理解される。
【０１９５】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程をさらに包含する。このようなＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分の取り出しは、当該分野において公知の任意の技法を用いることができる。そのような技法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを挙げることができるがそれらに限定されない。例示的なＰＳＢＰの精製方法を具体的な図をつけて説明する（図９）。ＰＳＢＰの結合する配列であるＯｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ結合配列のＤＮＡをラテックスまたはフェライトビーズに結合させる。このビーズとＥＳ細胞核の抽出液を反応させ、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ配列と結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製する。精製されたタンパク質のアミノ酸配列をマススペクトロメトリー解析により決定する。アミノ酸配列の情報をもとに遺伝子を同定することができる。
【０１９６】
１つの実施形態において、本発明が対象とする細胞は、幹細胞であることが好ましい。幹細胞は、任意の幹細胞であり得るが、好ましくは、胚性幹細胞であり、例えば、Ｒ１胚性幹細胞、Ｅ１４胚性幹細胞、Ｊ１胚性幹細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１９７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の複合体がＮａｎｏｇのＳｏｘエレメントに結合するかどうかを判定する工程をさらに包含する。このような判定工程は、本発明の複合体が、Ｎａｎｏｇの調節領域に結合し、したがって、胚性幹細胞などの未分化状態の指標として適切であるかを確認するのに有用である。
【０１９８】
本発明において利用されるＳｏｘエレメントは、核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含むがそれに限定されない。
【０１９９】
本発明において利用されるＳｏｘ２に特異的な因子は、核酸分子である場合は、核酸配列としてＴＡＣＡＡＴＧを含む核酸分子を含むがそれに限定されない。
【０２００】
本発明において利用されるＯｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である。この抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもそれらの改変体であってもよい。このような抗体は、Ｏｃｔ４ポリペプチド（配列番号１７および１８）が一旦与えられたならば、本明細書に記載されるような任意の公知技術を用いて製造することができることが理解される。
【０２０１】
本発明において利用されるＳｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体である。この抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもそれらの改変体であってもよい。このような抗体は、Ｓｏｘ２ポリペプチド（配列番号１９および２０）が一旦与えられたならば、本明細書に記載されるような任意の公知技術を用いて製造することができることが理解される。
【０２０２】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の複合体から、Ｓｏｘ２でもＯｃｔ４でもない分子を分離する工程をさらに包含する。このＳｏｘでもＯｃｔ４でもない分子の分離は、電気泳動、免疫学的手段、クロマトグラフィー、DNA-タンパク質アフィニティー解析およびマススペクトロメトリー解析からなる群より選択される１以上の手段を用いて行われるがそれらに限定されない。
【０２０３】
本発明において使用される特異的な因子は、標識されているかまたは標識され得る物質であってもよい。このような標識としては、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用することができるがそれらに限定されない。好ましくは、因子は、放射標識される。
【０２０４】
好ましい実施形態において、本発明において実施されるＳｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する。このようなスーパーシフトする成分は、代表的にはＳｏｘ２とＯｃｔ４との複合体を含むがそれに限定されない。そのようなＳｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞（例えば、Ｆ９細胞）に由来する。
【０２０５】
本発明は、本発明の上記方法（Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；およびＣ）Ｂ）工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程）によって調製されるタンパク質複合体を提供する。この複合体は、胚性幹細胞を他の細胞（例えば、胚性癌腫細胞）から識別するため、あるいは未分化状態を判定するために用いられ得る。
【０２０６】
本発明はまた、本発明の上記方法（Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、該Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程；Ｄ）該複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程、または該複合体から、Ｓｏｘ２でもＯｃｔ４でもない分子を分離する工程）によって調製されるタンパク質（例えば、Ｐｓｂｐ）を提供する。
【０２０７】
本発明はまた、本発明の上記タンパク質（例えば、Ｐｓｂｐ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、本発明のタンパク質を精製し、タンパク質のアミノ酸配列を決定すること、および／またはそれに対応する核酸配列をゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーなどから決定すること、ならびにその配列を有する核酸を提供することによって生産することができる。
【０２０８】
（胚性幹細胞の識別することができるマーカー）
別の局面において、本発明は、胚性幹細胞を他の細胞（例えば、胚性癌腫細胞）から識別するためのマーカーを提供する。
【０２０９】
１つの実施形態において、本発明のこのマーカーは、Ｏｃｔ４エレメントには結合しないことを特徴とするがそれに限定されない。別の特徴として、本発明のマーカーは、Ｓｏｘエレメントに結合することが挙げられるがそれらに限定されない。ただし、本発明のマーカーは、既存のＳｏｘ２（配列番号１９および２０）とは異なり得ることが理解される。
【０２１０】
１つの実施形態において、本発明のマーカーは、複合体の形態であって、この形態の場合、Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；およびＣ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４に特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程、を包含する、方法によって調製されることを特徴とする。ここで使用される工程および技法ならびに好ましい実施形態は、上記（マーカー生産方法）に記載される任意の技法を用いることができることが理解される。このマーカーは、胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができる。
【０２１１】
別の好ましい実施形態において、本発明のマーカーは、マーカーは、単体の形態をとり、この場合、ＰＳＢＰとも称され、このマーカーは、Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をゲルシフトアッセイに供し、Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトが見られるが、Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）を用いた場合にスーパーシフトしない成分が由来する細胞を選択する工程；Ｃ）Ｂ）工程で選択された細胞から、Ｏｃｔ４を含むＯｃｔａｍｅｒエレメントに特異的な因子に特異的な複合体を取り出す工程；およびＤ）該複合体からＳｏｘエレメントに特異的に結合する成分を取り出す工程、を包含する、方法によって調製される。このマーカーは、胚性幹細胞と、胚性癌腫細胞とを識別することができる。
【０２１２】
１つの実施形態において、本発明のマーカーは、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１の転写を促進する活性を有し得る。本発明のマーカーは、Ｎａｎｏｇの転写促進活性のある部分に結合する能力を有するからである。ここでいう転写の促進は、Ｏｃｔ４との相互作用に起因していてもよいがそれに限定されない。
【０２１３】
好ましい実施形態において、本発明のマーカーは、多分化能の有無を判定すること能力を有し得る。多分化能が高い（全能性を有し得る）胚性幹細胞において本発明のマーカーが発現され、多分化能が低いあるいはほとんどないとされる胚性癌腫細胞では発現が抑制されていることが見出されているからである。したがって、本発明のマーカーは、細胞の未分化状態を判定するために有用であることが理解される。
【０２１４】
ここで、好ましい実施形態では、上記記多分化能は、胚性幹細胞（例えば、Ｒ１胚性幹細胞）にあるが、胚性癌腫細胞（例えば、Ｆ９細胞）にはない能力を包含する。
【０２１５】
好ましい実施形態では、本発明のマーカーは、単体で存在する場合、Ｏｃｔ４との相互作用は、Ｓｏｘ２よりも強いことが理解される。したがって、本発明のマーカーは、Ｐｓｂｐである場合は、Ｓｏｘ２にはない未分化能を維持する機能があり得ることが理解される。
【０２１６】
１つの実施形態において、本発明のマーカーは、タンパク質であるがそれに限定されない。ここで、タンパク質とは、糖、脂質などで修飾されていても良いことが理解される。
【０２１７】
１つの実施形態において、本発明のマーカーは、タンパク質複合体であっても、タンパク質の単体であってもよい。このような複合体は、Ｏｃｔ４をメンバーの一つとして含んでいてもよいことが理解される。
【０２１８】
本発明のマーカーは、識別可能な標識で標識されていてもよい。そのような標識は、どのようなものでも良いことが理解される。そのような標識としては、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用することができるがそれらに限定されない。
【０２１９】
（本発明のマーカーに特異的な因子）
別の局面において、本発明は、本発明のマーカーに対して特異的な因子を提供する。
【０２２０】
１つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドに対して特異的に相互作用（例えば、結合）する因子およびそれを含む組成物に関する。そのような因子としては、例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、単鎖抗体）、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質、およびそれらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。このような因子は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。より好ましくは、本発明の因子は、抗体またはその誘導体（例えば、単鎖抗体）である。従って、本発明の因子は、プローブおよび／またはインヒビターとして使用することができる。
【０２２１】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。
【０２２２】
好ましい実施形態では、本発明の上記因子は、抗体であり得る。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってもよく、それらの、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体などであってもよい。このような抗体は、本発明の遺伝子の発現を判定する道具として用いることができ、従ってスクリーニングに使用することができる。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明は、本発明のマーカー（例えば、Ｐｓｂｐタンパク質）のポリペプチド形態をコードする核酸分子（例えば、Ｐｓｂｐポリヌクレオチド）に対して特異的に相互作用する因子を含む、組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意の本発明のマーカーのポリペプチド形態をコードする核酸分子またはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明では、本発明のマーカーのポリペプチド形態の発現が、より詳細に未分化状態（特に、多能性、より特定すると全能性）に対応していることが明らかになったことによって、そのような状態、性質を同定するために効率よく使用される。特に、従来のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇよりも多能性、全能性に対する親和性が高く、その検出効率は格段に上がるものと考えられる。このような効果は従来知られておらず、したがって、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果または性質の異なる効果を示す。
【０２２４】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明の核酸分子に特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。
【０２２５】
好ましい実施形態では、本発明の因子は、核酸分子である。本発明の因子が核酸分子である場合、そのような核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得、好ましくは本発明のマーカーの核酸配列に対して特異的に結合し得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ）として使用することができるかまたは所定の因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、本発明のマーカーの全長配列またはその相補体の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２２６】
従って、１つの例示的な実施形態において、本発明の因子は、本発明のマーカーのポリペプチド形態をコードするポリヌクレオチドの核酸配列に対して相補的な配列またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有する核酸分子であり得る。
【０２２７】
本発明の核酸分子に対して特異的な上記因子は、標識されているかまたは標識され得る。この標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用することができいるがそれらに限定されない。
【０２２８】
（核酸形態のマーカーおよびその利用）
別の局面において、本発明は、本発明のマーカーの核酸形態を提供する。例示的には、（ａ）そのようなＰｓｂｐ遺伝子は、本発明の手法（例えば、実施例に記載される手法）によって同定される塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）本発明の手法（例えば、実施例に記載される手法）によって同定されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）（ｂ）のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子であり得る。
【０２２９】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｐｓｂｐ遺伝子産物と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０２３０】
別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、上記（ｂ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、未分化性維持などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。Ｐｓｂｐは細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。具体的にはホメオドメインをもつことから組織細胞に分化を誘導する様な下流遺伝子の発現を抑制していると推測される。この活性を測定するためには、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０２３１】
別の好ましい実施形態において、対立遺伝子変異体は、上記（ａ）の核酸配列と少なくとも９０％の相同性を有することが好ましい。同一系統内のものなどでは、例えば、そのような対立遺伝子変異体は少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。さらに好ましくは、そのような対立遺伝子変異体は、９９．７％以上の相同性を有することが有利である。特に、そのような対立遺伝子変異体は、Ｐｓｂｐ遺伝子とＰｓｂｐ２遺伝子との間で相違する配列は相違したままであることが好ましい。
【０２３２】
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明のＰｓｂｐ遺伝子をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明のＰｓｂｐ遺伝子の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、上記（ａ）の核酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、上記（ａ）の核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０２３３】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２３４】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチドであり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは上記（ａ）の配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２３５】
より好ましい実施形態において、本発明は、（ａ’）上記（ａ）の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；または（ｂ’）上記（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【０２３６】
ここで、より好ましい実施形態では、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２３７】
好ましい実施形態において、本発明のＰｓｂｐ遺伝子をコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、上記（ａ）の配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２３８】
（ポリペプチド形態のマーカーおよびその利用）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチド形態を提供する。この本発明のポリペプチドは、
（ａ）本発明の手法（例えば、実施例に記載される手法）によって同定されるアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）本発明の手法（例えば、実施例に記載される手法）によって同定される塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチドのスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）上記（ｂ）のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、ポリペプチドであり得る。
【０２３９】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｂ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｐｓｔｂポリペプチド（または遺伝子産物）と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０２４０】
別の好ましい実施形態において、上記（ｃ）における対立遺伝子変異体は、上記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは（ｃ）における対立遺伝子変異体は、上記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも約９９％の相同性を有する。
【０２４１】
別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、上記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、上記（ｃ）の核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０２４２】
別の好ましい実施形態において、上記（ｅ）における上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、上記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、転写制御活性、未分化性維持などが挙げられるがそれらに限定されない好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。Ｓｔｍは細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。具体的にはホメオドメインをもつことから組織細胞に分化を誘導する様な下流遺伝子の発現を抑制していると推測される。この活性を測定するためには、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０２４３】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２４４】
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、目的とする用途（例えば、免疫原、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、上記（ａ）の配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。
【０２４５】
ここで、さらに好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２４６】
（本発明の核酸分子の遺伝子工学形態）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現カセットおよびベクターに関する。本発明の発現カセットおよびベクターは、好ましくは、本発明の核酸分子に作動可能に連結された制御配列をさらに含む。このように制御配列を含むことによって、本発明の核酸分子の発現の制御が容易になる。そのような制御配列としては、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、イントロン配列などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような制御配列は、本発明の核酸分子の発現を誘導することができる。
【０２４７】
さらに好ましい実施形態において、本発明の発現カセットおよびベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含み得る。そのような選択マーカーとしては、例えば、外来遺伝子、細胞性遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるがそれらに限定されない。細胞性遺伝子としては、例えば、増殖因子のようなサイトカインをコードする遺伝子、増殖因子レセプターをコードする遺伝子、シグナル形質導入分子をコードする遺伝子、および転写因子をコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、選択マーカーは、不死化遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２）であり得る。あるいは、選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、毒性産物をコードする遺伝子、自殺基質と組合せて条件により活性な毒性遺伝子産物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）と組合せた単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ））、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子であり得る。
【０２４８】
（細胞形態）
別の局面において、本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子をコードする核酸配列（例えば、本発明の核酸分子）を含む（例えば、形質転換された）細胞に関する。本発明の核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において上記節において詳述されている。あるいは、そのような細胞は、細胞を含むサンプル中において、その核酸分子を含む細胞をスクリーニングすることによって、同定することができる。本発明の核酸分子を含む細胞は、好ましくは、未分化状態であり得る。本発明の核酸分子が発現している細胞は、通常未分化状態である。したがって、そのような核酸分子が制御可能に発現されるように導入された細胞は、その未分化状態を制御することができる。あるいは、そのような細胞を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０２４９】
別の実施形態では、この細胞は、本発明が核酸分子がｍＲＮＡとして発現されていてもよい。
【０２５０】
（組織形態）
別の局面において、本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子をコードする核酸配列を含む組織に関する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような組織は、動物組織であってもよく、他の生物（例えば、植物）の組織であってもよい。あるいは、そのような組織を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０２５１】
（臓器形態）
別の局面において、本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子をコードする核酸配列を含む臓器に関する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような臓器は、動物臓器であってもよく、他の生物（例えば、植物）の器官であってもよい。あるいは、そのような臓器を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０２５２】
（生物形態）
別の局面において、本発明は、Ｐｓｂｐ遺伝子をコードする核酸配列を含む生物（例えば、動物）に関する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような生物は、動物であってもよく、他の生物（例えば、植物）であってもよい。あるいは、そのような生物を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。Ｐｓｂｐ遺伝子が分化細胞に特異的な遺伝子の発現を抑制するとすれば、ある方向への分化誘導を抑制する可能性がある。つまり、分化の方向を決定づける働きがあり再生医療への応用の可能性が考えられる。
【０２５３】
（未分化判定組成物）
別の局面において、本発明は、細胞の未分化状態を判定するための組成物に関する。この組成物は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を含む。このような因子は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に相互作用する因子（例えば、相補配列を有する核酸分子、転写因子のようなポリペプチドなど）、あるいは、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に対する抗体、単鎖抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。ここで使用されるＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物は、本明細書において上述したような配列を有する核酸分子またはポリペプチドであり得るがそれらに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２５４】
本発明の細胞の未分化状態を判定するための組成物の判定対象は、好ましくは、幹細胞を包含する。本発明において、従来の因子（例えば、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ４など）よりも多分化能の程度に比例して発現することが判明した。特に、胚性幹細胞とそれ以外の細胞（たとえば、胚性癌腫細胞など）とを識別することを容易にした。このような特徴は、従来のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１のような因子ではなかった。したがって、本発明のこのような組成物は、従来の因子を用いた系よりも、より正確に多分化能について判定することができるという利点を有する。そのような利点は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１などの従来の因子では達成が困難であった格別の効果であるといえる。また、下流遺伝子の発現制御について、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１との関係について考慮するとより精度の高い判定を行うことができるといえる。
【０２５５】
ある好ましい実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞、および組織幹細胞からなる群より選択される細胞であり得る。本発明の組成物は、特に、胚性幹細胞を含む、多分化能の高い多能性幹細胞全般の判定に使用することができるという新たな利点を有する。なぜなら、従来のマーカーでは、多分化能の程度を正確に判定することが困難であったからである。本明細書において意図される幹細胞としては、通常、胚性幹細胞などが挙げられるがそれに限定されない。理論に束縛されないが、本発明の効果としては、全能性のものをより正確に判定できることも挙げられる。従って、本発明は、再プログラム化の状況を判定するために用いられ得る。
【０２５６】
本発明の組成物が対象とする細胞は、遺伝子改変されたものであっても、遺伝子改変されていないもの（すなわち、天然に存在する細胞）であってもよい。遺伝子改変の方法は、当該分野において周知であり、そのような方法は、本明細書に記載した文献に詳述されている。当業者は、そのような周知慣用技術を用いて、適宜細胞を遺伝子改変することができる。したがって、そのような細胞は、分化細胞に対して、未分化化（すなわち、多能性付与）するような遺伝子操作がされていてもよい。
【０２５７】
（未分化判定法）
別の局面において、本発明は、細胞の未分化状態を判定する方法を提供する。この方法は、（Ｉ）判定されるべき細胞を提供する工程；（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該細胞に接触させる工程；および（ＩＩＩ）該Ｐｓｂｐ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認する工程、を包含する。ここで提供される細胞は、判定が所望される細胞であれば、どのような細胞であってもよい。そのような細胞は、どのような状態でも提供され得るが、好ましくは、アッセイに適切な形態で提供され得る。そのようなアッセイに適切な形態としては、例えば、適切な培地または緩衝液中での提供などが挙げられるがそれに限定されない。Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に反応することができる限り、どのような形態でもよい。そのようなＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物は、判定を目的とする細胞の生物種と同一種由来のものであることが好ましい。同一種由来であれば、ほぼ１：１の関係でＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物の有無を判定することができるからである。ただし、上記因子に関するＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物の由来種は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物の判定をすることができる限り、判定を目的とするＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物の由来種と異なっていてもよい。種間で交叉反応することが頻繁に発生するからである。上記Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物は、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２５８】
本発明の細胞の未分化状態を判定する方法は、好ましくは、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する工程をさらに包含する。他の幹細胞マーカーの発現を判定することによって、より精確度の高い未分化状態の判定が行うことができるからである。そのような他の幹細胞マーカーとしては、例えば、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ４、ＵＴＦ１、Ｓｏｘ１、Ｒｅｘ１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５９】
（未分化細胞調製法）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製する方法に関する。この調製方法は、（Ｉ）未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるサンプルを提供する工程；（ＩＩ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該サンプルに接触させる工程；（ＩＩＩ）該因子と該Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物との特異的反応を検出することによって、該Ｐｓｂｐ遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する工程；および（ＩＶ）該Ｐｓｂｐ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する工程、を包含する。上述のサンプルは、未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるものであれば、どのようなものでもよい。ここで用いられる細胞はどのような細胞であってもよいが、好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目）の細胞であり、より好ましくは、ヒトの細胞であり得る。サンプルの調製方法は当該分野において周知の技術を使用することができる。そのような技術は、本明細書において記載された文献にも詳述されており、例えば、細胞を動物から取り出し、その後、適切な培地または緩衝液中に入れることなどが挙げられるがそれらに限定されない。サンプルと、本発明の因子とを接触させる方法は、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような方法としては、例えば、サンプル中に、本発明の因子を含む溶液を加えることなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の因子とＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物との特異的反応の検出は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。検出の簡便のため、その因子は標識されていることが好ましい。そのような標識は、どのような標識でもよく、例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射能標識などが挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。遺伝子の発現は、そのような特異的反応の有無と相関付けることができる。例えば、発現の程度が既知である細胞の発現レベルと、特異的反応の強度とを相関付けて標準曲線を作成し、このような標準曲線を利用することによって特異的反応から遺伝子発現を定性的または定量的に判定することができる。
【０２６０】
未分化状態の細胞を調製する方法において用いられるＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物は、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２６１】
（未分化判定キット）
別の局面において、本発明は、細胞の分化状態を判定するキットを提供する。このキットは、（ａ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子；および（ｂ）該Ｐｓｂｐ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認するための手段を備える。Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子としては、本明細書において記載されるような因子であれば、どのようなものでも使用することができ、そのような因子としては、例えば、抗体、核酸分子などが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、このような因子は、Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に相互作用する因子（例えば、相補配列を有する核酸分子、転写因子のようなポリペプチドなど）、あるいは、Ｐｓｂｐ遺伝子に対する抗体、単鎖抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。遺伝子発現の確認手段は、当該分野において周知の技術を用いて実施することができる。そのような確認手段としては、例えば、ドットブロット分析、ノーザンブロット分析のような遺伝子産物としてのｍＲＮＡの分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡなどの遺伝子産物としてのポリペプチドの分析など挙げられるがそれに限定されない。そのような分析には、例えば、マイクロタイタープレート、マイクロアレイなどを用いることができる。
【０２６２】
本発明の、細胞の分化状態を判定するキットにおいて用いられるＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２６３】
好ましい実施形態において、本発明の細胞の分化状態を判定するキットは、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段をさらに備える。そのような他の幹細胞マーカーの発現を確認する手段は、原理的には、本発明のＰｓｂｐ遺伝子の発現を確認する手段と同じものを使用してもよく、異なる原理のものを使用してもよい。好ましくは、そのような他の幹細胞マーカーの発現を確認する手段によって提示される結果は、本発明のＳｔｍ遺伝子の発現を確認する手段が提示する結果と混同しないような表示（例えば、異なる色、異なる蛍光など）をすることが好ましい。そのような他の幹細胞マーカーとしては、例えば、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ４、ＵＴＦ１、Ｓｏｘ１、Ｒｅｘ１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６４】
（未分化細胞調製キット）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製するためのキットを提供する。このキットは、（Ｉ）Ｐｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子；（ＩＩ）該Ｐｓｂｐ遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段；および（ＩＩＩ）該Ｐｓｂｐ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する手段、を備える。
【０２６５】
本発明の未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいて使用されるＰｓｂｐ遺伝子またはＰＳＢＰ遺伝子産物に特異的に反応する因子は、原理的には、本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。好ましくは、細胞の分離または濃縮に適切な形態の因子が使用され得る。例えば、抗Ｐｓｂｐ抗体または抗Ｓｏｘ２抗体を用いた細胞ソーティングキットで、セルソーターをもちたいり、Ｓｔｍ１抗体のついたビーズを用いた精製等が考えられる。
【０２６６】
Ｐｓｂｐ遺伝子がサンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段もまた、原理的には、本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。好ましくは、未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいても、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段をさらに備え得る。そのような他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段は、原理的には本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。
【０２６７】
本発明の未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいて使用されるＰｓｂｐ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する手段は、当該分野において使用される細胞分離または濃縮手段であれば、どのようなものでも使用することができる。そのような細胞分離または濃縮手段としては、例えば、磁気分離、パニング、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、アフィニティークロマトグラフィーなどを使用することができる。
【０２６８】
（胚性幹細胞の検出方法）
別の局面において、本発明は、試料中の胚性幹細胞の存在を検出する方法であって、Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をＯｃｔａｍｅｒエレメントに特異的な因子およびＳｏｘエレメントに特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、該Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標である、工程、を包含する、方法を提供する。本発明の上記のようなスーパーシフトのパターンは、従来予測されていなかったものであり、これにより、胚性幹細胞が他の細胞と区別することができるとは予測されていなかった。なぜなら、従来は、どのような幹細胞であっても、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２とが複合体を形成し、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１の上流に結合すると考えられていたからである。例えば、胚性癌腫細胞などでは、スーパーシフトは、Ｏｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子の両方で見られる。
【０２６９】
本発明の上記方法で使用されるゲルシフトアッセイおよびスーパーシフトなどの技術は、本明細書において他の場所において詳述されるように、当該分野において公知の任意の技法を用いることができることが理解される。
【０２７０】
１つの実施形態では、本発明により、上記胚性幹細胞は、胚性癌腫細胞（例えば、Ｆ９細胞）から識別される。好ましくは、胚性幹細胞は、Ｒ１胚性幹細胞である。
【０２７１】
別の実施形態では、本発明において用いられるＯｃｔ４に特異的な因子は、抗Ｏｃｔ４抗体である。この抗体は、標識されているかまたは標識可能であることが好ましい。
【０２７２】
別の実施形態では、本発明において用いられるＳｏｘ２に特異的な因子は、抗Ｓｏｘ２抗体であるこの抗体は、標識されているかまたは標識可能であることが好ましい。
【０２７３】
ここで好ましくは、本発明の方法は、Ｓｏｘ２が発現しているかどうかを確認する工程であって、該Ｓｏｘ２が発現していないことは、試料中に胚性幹細胞が含まれていることをさらに確証付ける、工程をさらに包含する。Ｓｏｘ２と本発明のＰｓｐｂとは、識別可能に発現されることが本発明により示されている。したがって、このようなマーカーを使用することによって、胚性幹細胞の有無、多能性のレベルなどを判定することができる。
【０２７４】
別の実施形態において、本発明は、前記細胞に由来成分の提供は、核抽出物を提供することを包含する。ゲルシフトアッセイは、通常核抽出物に含まれる産物（例えば、転写因子）の解析を行うことを目的とするからであるが、それに限定されないことが理解される。
【０２７５】
別の実施形態では、本発明において使用される因子（たとえば、抗体）は、標識されているかまたは標識され得る。このような標識としては、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用することができるがそれらに限定されない。好ましくは、因子は、放射標識される。
【０２７６】
別の実施形態では、本発明は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトしない成分を選択する工程は、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分と比較することを包含する。このような工程を包含することによって、胚性幹細胞が含まれているかどうかをより詳細に判定することができる。さらに、胚性幹細胞以外の細胞がどの程度含まれているかも判定することができる。
【０２７７】
他の好ましい実施形態では、他の細胞マーカーを用いても良い。そのような他の細胞マーカーとしては、例えば、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ４、ＵＴＦ１、Ｓｏｘ１、Ｒｅｘ１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２７８】
ここで、好ましくは、Ｓｏｘ２に特異的な因子を用いた場合にスーパーシフトする成分は、胚性癌腫細胞（好ましくは、Ｆ９細胞）に由来する。
【０２７９】
他の局面において、本発明は、試料中の多分化能の状態を検出する方法であって、Ａ）細胞に由来する成分を提供する工程；Ｂ）該成分をＯｃｔ４に特異的な因子およびＳｏｘ２に特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する工程であって、該Ｏｃｔ４に特異的な因子ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標である、工程、を包含する、方法を提供する。ここで、ゲルシフトアッセイ、スーパーシフトなどの技術は、当該分野において公知の任意の技法を用いることができることが理解される。
【０２８０】
特に好ましい実施形態では、本発明において、Ｓｏｘ２の発現量を測定し、該Ｓｏｘ２の発現量と前記Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量とを比較して、該Ｓｏｘ２に特異的な因子でスーパーシフトしない量の該Ｓｏｘ２に対する相対比が多いことは、前記試料に含まれる細胞の多分化能が高いことの指標である。
【０２８１】
（胚性幹細胞の検出キット）
別の局面において、本発明は、試料中の胚性幹細胞の存在を検出するためのキットであって、Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔａｍｅｒエレメントに特異的な因子およびＳｏｘエレメントに特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供する手段；Ｂ）該Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトしないことは、胚性幹細胞であることの指標であることを示す、指示書、を備える、キットを提供する。
【０２８２】
別の局面において、本発明はまた、試料中の多分化能の状態を検出するためのキットであって、Ａ）細胞に由来する成分をＯｃｔａｍｅｒエレメントに特異的な因子およびＳｏｘエレメントに特異的な因子を用いてゲルシフトアッセイに供するための手段、Ｂ）該Ｏｃｔ４に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトが見られるが、該Ｓｏｘ２に特異的な因子（好ましくは、特異的抗体）ではスーパーシフトしないことは、多分化能を有することの指標であることを示す、指示書、を備える、キットを提供する。
【０２８３】
ここで、ゲルシフトアッセイに供する手段は、当該分野において公知の任意の手段を含む。そのような手段としては、例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはその調製用試薬、ビオチン、放射能など標識したＤＮＡまたは標識のための試薬、電気泳動装置、メンブレン（例えば、ナイロンなど）、紫外線発生器、必要に応じてＨＲＰ標識ストレプトアビジンなどの特異的試薬、化学発光基質、Ｘ線フィルム、イメージングプレート、合成ＤＮＡなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２８４】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０２８５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２８６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２８７】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、京都大学において規定される基準を遵守した。
【０２８８】
まず、以下の実施例で使用される主な方法および材料を説明する。
【０２８９】
（材料および方法）
（細胞培養および分化）
マウスのＲ１  ＥＳ細胞およびＦ９  ＥＣ細胞を、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノールおよび１０００単位／ｍｌの組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ−１を、２０％のノックアウト血清代替添加物、２ｍＭのＬ−グルタミン（非必須アミノ酸）および１０−４Ｍの２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ中で培養した。マウスおよびヒトのＥＳ細胞は、マイトマイシンＣで不活化したマウスの初代胚性線維芽フィーダー細胞上で維持した。５日間の培養の懸濁によってＥＢが形成した。１０−６Ｍの全てトランス型のレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて化学分化誘導を行った。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＣＯＳ−１細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。分化実験を、ＬＩＦを含まない培地で行った。
【０２９０】
（遺伝子導入細胞株）
ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−ｐＡレポーターカセット、２．５ｋｂの５’ゲノムフラグメントおよび３．９ｋｂの３’ゲノムフラグメントを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で導入遺伝子ＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰを構築した。鎖状化した後、導入遺伝子を、Ｇｅｎｅ  Ｐｌｕｓｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を使用して、２５０Ｖ／５００μＦの条件下で、１×１０７個のＲ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレ−ションした。ピューロマイシン耐性クローンから得られたゲノムＤＮＡを、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングした。
【０２９１】
（サザンブロットハイブリダイゼーション解析）
制限酵素で消化したゲノムＤＮＡを、１．０％アガロースゲル中で電気泳動し、アルカリブロッティングによりＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。この膜を、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した、５’プローブ（５００ｂｐ）または３’プローブ（７５０ｂｐ）と、４２℃で一晩ハイブリダイズした。これを２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で３０分間洗浄し、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で１５分間洗浄した。
【０２９２】
（レポーターおよび発現ベクターの構築）
マウスＮａｎｏｇプロモーターの欠損フラグメントを、ＸｈｏＩ認識配列（転写開始部位から＋５０ｂｐ）を有する一般的なプライマー；５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２３）、およびＸｈｏＩ認識配列を有する種々の正方向プライマー（−２３４２ｂｐ；５’−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣ−３’（配列番号２４）、−３３２ｂｐ；５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号２５）および−１５３ｂｐ；５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＴ−３’（配列番号２６））マウスのゲノムからＰＣＲで増幅した。ＸｈｏＩで消化した各ＰＣＲ生成物を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＣＭＶプロモーターマイナスのｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｈｏＩ部位に連結した。センスプライマー（転写開始部位から−３８０ｂｐ）；５’−ＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２７）およびアンチセンスプライマー（＋２４ｂｐ）；５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴ−３’（配列番号２８）ヒトのＥＳゲノムから増幅したヒトＮａｎｏｇプロモーターのＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに連結した。ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ（−３８０〜＋２４ｂｐ）、ＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ（−１２３〜＋２４ｂｐ）およびＮｏｔＩ−ＳｔｙＩ（−１０１〜＋２４ｂｐ）フラグメントを平滑末端化し、ＣＭＶプロモーターマイナスのｐＥＧＦＰーＮ１ベクターに再クローン化した。オリゴヌクレオチド指向性の変異を、ヌクレオチドの置換を伴うプライマーを用いるＰＣＲによって、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントに導入した。
【０２９３】
ＥｃｏＲＩ−Ｏｃｔ４−ＯＲＦ−Ｆプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２９）、ＢｇｌＩＩ−Ｏｃｔ４−ＯＲＦ−Ｒプライマー；５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣ−３’（配列番号３０）、ＥｃｏＲＩ−Ｓｏｘ２−ＯＲＦ−Ｆプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧ−３’（配列番号３１）およびＢｇｌＩＩ−Ｓｏｘ２−ＯＲＦ−Ｒプライマー；５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号３２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲで増幅したＯｃｔ４およびＳｏｘ２のＯＲＦを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにサブクローニングした。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ発現ベクターおよびｐＣＭＶ−ＨＡ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した（それぞれ、プラスミドｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−Ｏｃｔ４およびｐＣＭＶ−ＨＡ−Ｓｏｘ２）。
【０２９４】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一過性の発現アッセイを行い、実験サンプルをトランスフェクションの２日後に分析した。
【０２９５】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ＥＳ細胞（５．０×１０５個）、Ｆ９細胞（５．０×１０５個）およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（２．５×１０５個）を６ウェル組織培養プレートにて２４時間インキュベートした。各レポーター構築物（１．２５ｐｍｏｌ）およびｐｈＲＬ−ＴＫベクター（０．１２５ｐｍｏｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部コントロールとして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞抽出物を調製し、ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を評価した。各実験構築物のルシフェラーゼ活性は、コントロールベクターであるｐＧL３−Ｂａｓｉｃの活性と相対して算出した。全てのトランスフェクション実験を三つ組みで繰り返した。プロモーター活性は、平均±ＳＥとして示す。
【０２９６】
（ウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって１２％  ポリアクリルアミドゲル中で分離された細胞抽出物（２０μｇ／レーン）を、ＰＲＯＴＲＡＮニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中３％のスキムミルクで１時間ブロッキングした後、これらを抗ＮＡＮＯＧ抗体（１：１０００希釈）（Ｈａｔａｎｏら、準備中）、抗ＯＣＴ４抗体（１：５００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＳＯＸ２抗体（１：５００）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗ＧＦＰ抗体（１：１０００）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、抗Ｍｙｃ抗体（１：１０００）（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ＨＡ抗体（１：１０００）（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ＨＩＳＴＯＮＥ  Ｈ３抗体（１：３０００）（ＡｂＣａｍ）または抗β−ＡＣＴＩＮ抗体（１：３０００）（ＡｂＣａｍ）と、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でリンスした後、この膜をＨＲＰ結合体化二次抗体（１：３０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と９０分間反応させた。ＥＣＬブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてバンドを検出した。
【０２９７】
（電気泳動移動度シフトアッセイ）
ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−Ｏｃｔ４発現ベクターおよびｐＣＭＶ−ＨＡ−Ｓｏｘ２発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。全細胞溶解物を収集した（Ｋｕｂｏｔａ  Ｈら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：１２５〜１２９）。前の報告（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ＨＢおよびＧｉｌｍａｎ  ＭＺ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：７９〜８３）に従って、Ｆ９  ＥＣ細胞およびＲ１  ＥＳ細胞の核抽出物を調製した。二本鎖合成オリゴヌクレオチドプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。全細胞抽出物（１０μｇ）および核抽出物（１０μｇ）を、２０ｍｌの反応緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトールおよび１０％グリセロ−ル）中２μｇのポリ（ｄＧ−ｄＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下、氷上で１０分間前もってインキュベートし、その後、０．１ｎｇの放射標識プローブと３０分間インキュベートした。放射標識プローブでの処理前に、１〜３００倍過剰の冷競合剤を添加するか、または１μｇのウサギ抗ＯＣＴ４ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ヤギル抗ポリクローナＳＯＸ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）もしくはウサギ抗ＳＯＸ２ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加することによって、競合実験またはスーパーシフト実験を行った。プローブＤＮＡ−タンパク質複合体を、４℃、０．２５×ＴＢＥバッファー中４％ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動（１５０Ｖ、１３５分間）によって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０２９８】
（実施例１：ＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子の多分化能状態特異的な発現）
多分化能の安定性および細胞の自己複製の調節におけるＮａｎｏｇの機能を調べるために、発明者らは、ＯＲＦの５’末端の上流に位置する２．５ｋｂのゲノムフラグメントおよび、ＯＲＦの３’末端の下流に位置する３．９ｋｂのゲノムフラグメントを有するターゲティングベクター（ＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ）を構築した（図１Ａ）。Ｎａｎｏｇの全長ＯＲＦを、ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−ｐＡレポーターおよび選択カセットで置換した。構築物のＲ１  ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションによって、試験したＧＦＰ陽性の１１クローンのうち、９クローンが導入遺伝子のランダムな挿入を有するクローンとして単離された。サザンブロットハイブリダイゼーション解析は、９クローンのうち２クローン（ＴＧ６およびＴＧ７）がインタクトな５’の２．５ｋｂのゲノムフラグメントおよび３’の３．９ｋｂのゲノムフラグメントを有することを示した。ＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩで消化したゲノムＤＮＡを、５’プローブを用いてハイブリダイズすると、ＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの５’ゲノムフラグメントは、３．４ｋｂのバンドとして検出され、内因性のフラグメントは４．１ｋｂのバンドとして検出された。ＸｂａＩ−ＮｃｏＩで消化したゲノムＤＮＡを、３’プローブを用いてハイブリダイズすると、３’ゲノムフラグメントは、４．１ｋｂのバンドとして検出され、内因性のフラグメントは１１．０ｋｂのバンドとして検出された（図１Ｂ）。５’フラグメントおよび３’フラグメントの両方において、導入遺伝子のバンドは内因性のバンドの半分の強度を示し、このことは、ＴＧ６クローンおよびＴＧ７クローンにおいて、単一コピーの導入遺伝子が挿入されたことを示す。全ての未分化なＴＧ６コロニーは、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性であり、ＧＦＰタンパク質は、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析によって、ＴＧ６においては検出されるが、Ｒ１  ＥＳ細胞においては検出されないＧＦＰ特異的なバンドとして確認した（図１Ｃ）。導入遺伝子のダウンレギュレーションが、内因性の遺伝子と同様に細胞分化と関連して起こるか否かを解明するために、５日齢の胚様体（ＥＢ）、ならびにＬＩＦおよびフィーダー細胞を加えない５日齢のＥＢの、３日目の接着培養について、ＧＦＰの発現を解析した（図１D）。ＥＢの表面上の内胚葉細胞、および接着コロニーの周辺にある未分化細胞において、ＧＦＰ発現が消失した。ＧＦＰ発現のダウンレギュレーションが内因性のＮＡＮＯＧ発現のダウンレギュレーションと関連するか否かを決定するために、ＴＧ６  ＥＳクローンを、レチノイン酸（ＲＡ）を用いて化学誘導により分化させた。５日の連続的なＲＡ処理の後、細胞の表現型は明らかに変化し、ＧＦＰシグナルは完全に消失した（図１Ｅ）。ウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析は、ＧＦＰレベルの劇的な減少は、ＲＡ処理後の、内因性のＮＡＮＯＧ発現の減少とよく相関することを明らかにした（図１Ｆ）。ＴＧ７クローンにおいても同様の状況が見出された。これらのデータは、多分化能状態特異的なＮａｎｏｇの調節に必要とされる調節エレメントが、導入遺伝子のゲノムフラグメントに含まれることを示した。
【０２９９】
（実施例２：Ｎａｎｏｇ発現に必要とされるＯｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘエレメント）
Ｎａｎｏｇ発現に必要とされる５’ゲノムフラグメントおよび３’ゲノムフラグメントの領域を狭めるために、５’ゲノムフラグメントの−２３４２または−３３２を有する２つの型のＧＦＰレポーター遺伝子を構築し、ＥＳ細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞にトランスフェクトした。ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞において、内因性のＮａｎｏｇが抑制された。いずれの構築物でも、ＧＦＰは、ＥＳ細胞においては高発現し、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞においては発現しなかった（図２Ａ）。このことは、多分化能状態特異的な発現に必須の調節エレメントは、５’ゲノムフラグメントの３８３ｂｐに位置付けられることを示す。転写活性を評価するために、Ｒ１  ＥＳ細胞、Ｆ９  ＥＣ細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを、５’フランキング領域の欠損フラグメントを用いて、ルシフェラーゼアッセイによって決定した（図２Ｂ）。ＥＳ細胞におけるＧＦＰレポーターアッセイと一致して、−３２２フラグメントは、高いレベルのルシフェラーゼ発現を誘導する活性を有した。−２３４２フラグメントに対し、約８５％のルシフェラーゼ活性が、−３２２フラグメントにおいて残存した。この１５％の減少は、統計的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてＰ＜０．０５）であったが、ルシフェラーゼ活性のより顕著な減少が、−１５３フラグメントにおいて検出され、鍵となるシス作用エレメントは−３３２領域と−１５３領域の間に位置することが示された。ＥＳ細胞における−１５３フラグメントのルシフェラーゼ活性は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞において見られるようなバックグラウンドレベルであった。Ｆ９  ＥＣ細胞においても同様の傾向が見出された。
【０３００】
−３３２ｂｐと−１５４ｂｐの間の５’フランキング領域のＤＮＡ配列を決定した。−１６６と−１８０の間の位置にＯｃｔａｍｅｒエレメント（ＴＴＴＴＧＣＡＴ）およびＳｏｘエレメント（ＴＡＣＡＡＴＧ）の配列が見出された（図２Ｃ）。ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントのシス調節エレメントとしての機能を調べるために、いずれかのエレメントかまたは両方のエレメントのＤＮＡ残基を置換することにより、３つの点変異を導入した（図２Ｄ）。変異したＯｃｔａｍｅｒエレメント、変異したＳｏｘエレメントまたは変異したＯｃｔａｍｅｒエレメントおよび変異したＳｏｘエレメントを有する−３３２フラグメントのルシフェラーゼアッセイは、全ての場合において、ルシフェラーゼ活性の劇的な減少を明白に示した（図２Ｅ）。変異を有する−３３２フラグメントで検出されたルシフェラーゼの発現レベルは、−１５３フラグメントで見出されたものと同様であった。これらのデータは、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合する因子が、多分化能状態特異的な様式でのＮａｎｏｇ発現の調節において決定的な役割を果たすことを示した。
【０３０１】
（実施例３：ヒトＥＳ細胞においてＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントによって制御される発現）
Ｎａｎｏｇは、ヒトおよびサルにおいても同定されており、未分化なＥＳ細胞の核へのこれらの限定的な発現は、特異的な抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いた免疫細胞化学的解析によって検出された（Ｈａｔａｎｏら、準備中）。このように、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントがマウス、ヒトおよびサルの間で保存されているか否かを調べるために、ヒトＮａｎｏｇおよびサルＮａｎｏｇの５’フランキング領域のＤＮＡ配列を決定した。転写開始部位から−３００ｂｐの比較解析は、ＤＮＡ配列は、ヒトとサルの間で高く保存されていた（９３．２％）が、ヒトとマウスの間（５４．１％）およびサルとマウスの間（５１．７％）では高く保存されていなかったことを明らかにした。注目すべきことは、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントがヒトおよびサルにおいて見出され、そしてこれらの配列は、３つの種の間で同一であった（図３Ａ）。
【０３０２】
ヒトにおいて、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントがＮａｎｏｇの転写に対するシス調節エレメントとして必要とされるか否かを解明するために、ヒトの−ｈ３８０フラグメント、−ｈ１２３フラグメントおよび−ｈ１０１フラグメントを、マウスおよびヒトのＥＳ細胞にトランスフェクトした。ヒトのＥＳ細胞において、一過性発現アッセイが、比較的高いレベルのＧＦＰ発現が−ｈ３８０および−ｈ１２３フラグメントで観察される一方で、−ｈ１０１フラグメントでは、低いレベルの発現のみが観察され、ここでＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントは欠損していることを示した（図３Ｂ）。−ｈ１２３フラグメントと比較して−ｈ１０１フラグメントでのＧＦＰ発現の劇的な減少を、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析で確認した（図３Ｃ）。マウスのＥＳ細胞において、ヒトのシス調節エレメントは、−ｈ３８０フラグメントおよび−ｈ１２３フラグメントでの高いレベルのＧＦＰ発現によって見られ、−ｈ１０１フラグメントでは見られないように機能した。このことは、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントが、ヒトおよびマウスにおけるＮａｎｏｇの転写調節において、同様の役割を果たすことを示す（図３Ｂ）。
【０３０３】
（実施例４：ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに対する結合能力）
Ｏｃｔ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子は、多分化能細胞において発現され、Ｏｃｔａｍｅｒエレメント結合タンパク質およびＳｏｘエレメント結合タンパク質として十分に特徴付けられた因子である。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２は、Ｆｇｆ４遺伝子、Ｕｔｆ１遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子およびＦｂｘ１５遺伝子のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合する能力を有することが示されており、これらは、多分化能細胞において発現され、そしてこれらの遺伝子の転写を相乗的に活性化する（Ｙｕａｎ  Ｈら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２６３５〜２６４５；Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：５４５３〜５４６５；Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３；Ｔｏｋｕｚａｗａ  Ｙら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：２６９９〜２７０８）。従って、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の、ＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合する能力を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって評価した。外因性のＭｙｃタグ化Ｏｃｔ４（Ｍｙｃ−Ｏｃｔ４）遺伝子およびＨＡタグ化Ｓｏｘ２（ＨＡ−Ｓｏｘ２）遺伝子を、内因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２が抑制されたＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭｙｃおよびＨＡに対する抗体を用いるウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析は、導入遺伝子を有するＣＯＳ−１細胞由来の全抽出物において外因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２が大量であったことを示した（図４Ａ）。ＮａｎｏｇまたはＦｇｆ４のＯｃｔａｍｅｒエレメントまたはＳｏｘエレメントを含むオリゴ合成ＤＮＡを設計し、ＮａｎｏｇプローブおよびＦｇｆ４プローブとしてＥＭＳＡに適用した（図４Ｂ）。３２Ｐ標識化Ｆｇｆ４プローブのＣＯＳ−１細胞との反応の後に、Ｆｇｆ４において見られたように、プローブに結合するＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体が検出された（図４Ｃ）。注目すべきことに、ＳＯＸ２のＳｏｘエレメントに対する結合親和性は、ＨＡ−Ｓｏｘ２を有するＣＯＳ−１細胞由来の抽出物でのかすかなバンドによって明らかにされるように、非常に弱かった。これとは無関係に、ＯＣＴ４プローブ、ＳＯＸ２プローブおよびＮａｎｏｇプローブは、Ｍｙｃ−ＯＣＴ４およびＨＡ−ＳＯＸ２の両方を含む抽出物での強いバンドに示されるように、効率的にタンパク質−ＤＮＡ三元複合体を形成した。外因性のＯＣＴ４および／またはＳＯＸ２の結合は、抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体を用いるスーパーシフト解析によって確認した（図７）。これらのデータは、ＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントが、それぞれＯＣＴ４およびＳＯＸ２と結合する能力を有することを明白に示した。
【０３０４】
（実施例５：ＥＣ細胞抽出物におけるＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントへのＯＣＴ４およびＳＯＸ２の結合）
Ｆ９細胞は、発癌を経たＥ６．０胚由来の胚性癌腫（ＥＣ）細胞であり、不完全な多分化能を有する（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｃら、（１９８０）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．．５８：２８９〜３０２）。内因性のＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧは、ウェスタンブロッティングハイブリダイゼーション解析で示されるように、Ｒ１  ＥＳ細胞と同様にＦ９  ＥＣ細胞の核において発現した（図５Ａ）。ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメント上の内因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２の結合を調べるために、Ｆ９細胞由来の核抽出物をＥＭＳＡに適用した。３２Ｐ標識化Ｎａｎｏｇプローブとの反応の後に、電気泳動分離によってＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体の位置に顕著なバンドが出現した一方、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のバンドはかすかであった（図５Ｂ）。バンドの移動度は、外因性のＭｙｃ−ＯＣＴ４およびＨＡ−ＳＯＸ２を含むＣＯＳ−１細胞の抽出物のＥＭＳＡによって見出されたものと似ていた。
【０３０５】
ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合する因子を解析するために、非標識ＮａｎｏｇプローブまたはＯｃｔａｍｅｒエレメントに変異を有するＮａｎｏｇプローブ（Ｏｃｔｍｕｔ）、Ｓｏｘエレメントに変異を有するＮａｎｏｇプローブ（Ｓｏｘｍｕｔ）、または両方に変異を有するＮａｎｏｇプローブを用いて、結合競合アッセイを行った（図５Ｃ）。Ｓｏｘエレメントに結合する因子のＯｃｔｍｕｔ競合プローブによる枯渇は、競合プローブの濃度に相関して、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体の結合を減少し、ＯＣＴ４の結合を増加した。Ｏｃｔａｍｅｒエレメントに結合する因子のＳｏｘｍｕｔ競合プローブによる枯渇は、競合プローブの濃度に相関して、ＯＣＴ４およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体の結合を減少した。Ｏｃｔｍｕｔ／Ｓｏｘｍｕｔによる枯渇は、何の効果ももたらさず、一方で、非標識Ｎａｎｏｇプローブによる枯渇は、競合プローブの濃度に相関して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体の結合の減少をもたらした。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体の結合もまた、非標識Ｆｇｆ４プローブによる枯渇を用いた競合アッセイによって確認した。これらの所見は、内因性のＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体がＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合し得ることを示した。
【０３０６】
ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントへのＯＣＴ４およびＳＯＸ２の結合は、ＯＣＴ４またはＳＯＸ２に対する抗体、およびウサギまたはヤギのＩｇＧを用いて、スーパーシフトアッセイによって確認した（図５Ｄ）。抗ＯＣＴ４抗体は、ＯＣＴ４およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２のバンドをスーパーシフトし、抗ＳＯＸ２抗体は、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２のバンドをスーパーシフトしたが、ウサギおよびヤギのコントロールＩｇＧではバンドのシフトが観察されなかった。従って、内因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２は、Ｆ９  ＥＣ細胞抽出物におけるＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントと、タンパク質−ＤＮＡ三元複合体を形成し得た。
【０３０７】
（実施例６：ＥＳ細胞抽出物における、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合する新規の因子Ｐｓｂｐの同定）
Ｒ１  ＥＳ細胞およびＦ９  ＥＣ細胞は、自己複製ならびにＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の発現プロファイルにおける強い能力のような、重要な性質を共有するが（図５Ａ）、多分化能はＲ１  ＥＳ細胞では保持されるが、Ｆ９  ＥＣ細胞では保持されていない。注目すべきことに、Ｒ１  ＥＳ細胞が、発癌を経る必要のないＥ３．５胚の内部細胞塊から単離される一方で、Ｆ９  ＥＣ細胞は、発癌を経るＥ６．０胚由来である。従って、多分化能の維持に関与するＥＣ細胞の因子は、ＥＳ細胞の因子から逸脱し得る。ＥＳ細胞由来の核抽出物におけるＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに対する結合因子を決定するために、ＥＭＳＡ、結合競合アッセイおよびスーパーシフトアッセイを行った。注目すべきことに、ＥＳ細胞の抽出物における主要な複合体の電気泳動移動度は、ＥＣ細胞の抽出物において検出されるＯＣＴ４／ＳＯＸ２複合体のものとは明らかに異なった（図６Ａ）。ＯｃｔｍｕｔまたはＳｏｘｍｕｔ競合プローブを用いる結合競合アッセイによる、ＥＳの主要な複合体のバンド強度の低下は、ＥＳの主要な複合体がＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合することを示した（図６Ｂ）。スーパーシフトアッセイは、ＥＳの主要な複合体のバンドの大半が、抗ＯＣＴ４抗体との反応の後にシフトした一方で、ヤギ抗ＳＯＸ２抗体ではわずかなバンドのみがシフトした（図６Ｃ）。同様の状況がウサギ抗ＳＯＸ２抗体でも検出された（データは示さず）。これらのデータは、ＯＣＴ４はＥＳの主要な複合体の１成分であるが、ＳＯＸ２はＥＳの主要な複合体の１成分でないことを示した。別の未同定の成分（ＰＳＢＰ；多分化能細胞特的Ｓｏｘエレメント結合タンパク質）は、優先的にＯＣＴ４と結合し、Ｎａｎｏｇプロモーター領域のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントで複合体を形成した。
【０３０８】
ＯＣＴ４／ＰＳＢＰ複合体が、ＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに特異的に結合するか否かを理解するために、Ｆｇｆ４プローブを用いてＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイを行った。ＥＳ細胞の核抽出物において、ＥＭＳＡは、ＯＣＴ４／ＰＳＢＰ複合体がＦｇｆ４プローブを用いて形成され（図６Ａ）、そしてＯＣＴ４／ＰＳＢＰ複合体のバンドは、抗ＯＣＴ４抗体との反応により消失し、抗ＳＯＸ２抗体との反応では消失しなかった（補図）。それゆえ、ＥＳ細胞において、シス調節エレメントとしてＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントを有するいくつかの遺伝子は、ＯＣＴ４とＳＯＸ２よりむしろ、ＯＣＴ４とＰＳＢＰの相乗的な作用によって活性化され得る。
【０３０９】
多分化能状態に特異的なＮａｎｏｇは、マウスにおいて、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントの周囲にある転写開始部位の３３２ｂｐ上流にある調節領域の制御下で転写された。このＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントは、マウス、サルおよびヒトのＮａｎｏｇ遺伝子の５’フランキング領域の間で保存されており、ヒトのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントは、マウスおよびヒトのＥＳ細胞におけるＧＦＰレポーター遺伝子の活性をアップレギュレートするのに十分であった。Ｆ９  ＥＣ細胞の核抽出物において、未分化な幹細胞に同時に発現しているＯＣＴ４およびＳＯＸ２は、それぞれＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントに結合し得た。興味深いことに、ＥＳ細胞の核抽出物においては、ＯＣＴ４が、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントに優位に結合する一方、未同定の因子（ＰＳＢＰ）は、Ｓｏｘエレメントに優先的に結合した（図６Ｄ）。Ｎａｎｏｇ発現は、ＥＳ細胞において、ＯＣＴ４およびＰＳＢＰのクロストークによって優位に制御され得る。
【０３１０】
ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントがマウスおよびヒトのＮａｎｏｇ転写のアップレギュレーションに必要とされ、そしてこれらのエレメントに対する結合因子は、相乗的な分子相互作用を介してＮａｎｏｇの転写を促進することにおいて機能することは明らかである。近接するＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントは、Ｆｇｆ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｕｔｆ１遺伝子およびＦｂｘ１５遺伝子においてシス調節エレメントとして見出されており、これらは、ＥＣ細胞およびＥＳ細胞において胚発生の間に発現される（Ｙｕａｎ  Ｈら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２６３５〜２６４５；Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：５４５３〜５４６５；Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３；Ｔｏｋｕｚａｗａ  Ｙら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：２６９９〜２７０８）。Ｓｏｘ２は、ＤＮＡ結合ＨＭＧドメインおよび、転写調節に関するドメインを有するＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）遺伝子のメンバーであり、多分化能な胚性細胞および神経細胞において発現する（Ａｖｉｌｉｏｎ  ＡＡら、（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０）。多分化能の胚性細胞におけるＳｏｘ２発現は、少なくとも２つの調節領域（ＣＣＡＡＴボックスを含む５’フランキング領域ならびにＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントを含む３’フランキング領域）によって支配される（Ｗｉｅｂｅ  ＭＳら、（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４６：３８３〜３９３；Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３）。Ｆｇｆ４において、これは、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーであり、胚盤胞の内部細胞塊および発生途中の胚、ならびにＥＳ細胞およびＥＣ細胞において発現されるが（Ｎｉｓｗａｎｄｅｒ  ＬおよびＭａｒｔｉｎ  ＧＲ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１４：７５５〜７６８）、遺伝子内の３’非翻訳領域に位置付けられるＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメント、ならびに、３’フランキング領域にあるＧＴボックスモチーフの両方が、Ｆｇｆ４の最適な転写活性化を媒介するために必要とされる（Ｌｕｓｔｅｒ  ＴＡら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５７：４〜１５；Ｌｕｓｔｅｒ  ＴＡおよびＲｉｚｚｉｎｏ  Ａ（２００３）Ｇｅｎｅ  ３２３：１６３〜１７２）。従って、多分化能の胚性細胞におけるこれらの発現は、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントによってだけでなく、他のシス調節エレメントによってもまた達成される。Ｎａｎｏｇにおいて、ＥＳ細胞の抽出物を用いたルシフェラーゼアッセイは、５’の−２３４２ゲノムフラグメントによって制御されるルシフェラーゼ活性が、５’の−３３２ゲノムフラグメントによって制御されるものよりも約１５％高かったことを示し、これは、−３３２〜−２３４２の領域内に存在する未同定のシス調節エレメントが、Ｎａｎｏｇ活性の特異性を増強かつ決定することにおいて、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントを伴って機能し得ることを示唆する。
【０３１１】
Ｎａｎｏｇを欠損したＥＳ細胞または胚性細胞における多分化能の欠失（Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６３１〜６４２；Ｈａｔａｎｏら、準備中）、ならびにＬＩＦ−ＳＴＡＴ３シグナルによる調節の迂回およびＯＣＴ４レベルの維持を介する、ＥＳ細胞のクローン増殖依存性のＮａｎｏｇ過剰発現（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｉら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６４３〜６５５）によって示されるように、Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞および胚性細胞の多分化能を維持することにおいて鍵となる機能を果たす。それゆえ、Ｎａｎｏｇの発現が、どのようにして幹細胞特異的な調節ネットワークにおける分子の基礎的な情報交換を介して他の胚性因子と協調するかを知ることが重要である。発明者らのＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイのデータは、ＳＯＸ２の存在下であっても十分に形成される、ＯＣＴ４／ＰＢＳＰ／ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントのタンパク質−ＤＮＡ三元複合体が、ＥＳ細胞において、Ｎａｎｏｇの転写を活性化することを、明白に示した。胚発生において、マウスのＮａｎｏｇ  ＲＮＡおよびＮａｎｏｇタンパク質の発現は、桑実期の胚からＥ７．５胚の原外胚葉までにおいて検出される（Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６３１〜６４２；Ｈａｒｔ  ＡＨら、（２００４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３０：１８７〜１９８；Ｈａｔａｎｏら、準備中）。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の発現は、Ｎａｎｏｇの発現と時間的に重なる。興味深いことに、Ｅ７．５胚において、Ｎａｎｏｇの発現は、原外胚葉の尾側領域（原条領域）において、空間的に増強されるが（Ｈａｒｔ  ＡＨら、（２００４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３０：１８７〜１９８；Ｈａｔａｎｏら、準備中）、Ｓｏｘ２の発現は、前側領域および後側領域から除外された領域（原条領域）における推定神経外胚葉に限定され（Ａｖｉｌｉｏｎ  ＡＡら、（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０）、このことは、Ｎａｎｏｇの発現がインビボでＯＣＴ４／ＰＳＢＰ複合体によって活性化され得ることを示唆する。Ｅ７．５胚の始原生殖細胞において、Ｏｃｔ４およびＰＧＣ７／Ｓｔｅｌｌａは発現するがＳｏｘ２は発現せず、他方では、Ｎａｎｏｇが抑制される（Ｙｏｅｍ  ＹＩら、（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８８１〜８９４；Ｓａｉｔｏｕ  Ｍ．Ｂａｒｔｏｎ  ＳＣおよびＳｕｒａｎｉ  ＭＡ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２９３〜３００；Ｈａｔａｎｏら、準備中）。従って、Ｎａｎｏｇの発現は、Ｏｃｔ４による調節ネットワークと密接に関係するが、Ｏｃｔ４の発現は、Ｎａｎｏｇの発現を誘導するのに十分でない。Ｎａｎｏｇの発現は、Ｓｏｘエレメントに効率的に結合する、同時活性化因子であるＰＳＢＰによって密接に調節され得る。
【０３１２】
ＮａｎｏｇとＯｃｔ４の間の関係を理解するために、Ｏｃｔ４欠損胚（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｉら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６４３〜６５５）におけるＮａｎｏｇの転写を解析した。インサイチュハイブリダイゼーション解析におけるｍＲＮＡは、Ｎａｎｏｇの発現が、Ｏｃｔ４変異に関してホモ接合性の胚盤胞の内部細胞塊において維持されることを示し、このことは、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントに結合する他の多分化脳細胞特異的な遺伝子が、代替的な転写調節機構に寄与し得ることを示唆した。ＯＣＴ１およびＯＣＴ６が、多分化能の胚性細胞において発現すること（Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲら、（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：２５４３〜２５５０；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎら、（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３７２３〜３７３２）、そしてＦｇｆ４、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１およびＲｅｘ−１（Ｚｆｐ−４２）においてＯｃｔａｍｅｒエレメントに結合する能力を保持すること（Ｄａｉｌｅｙ  Ｌ，Ｙｕａｎ  ＨおよびＢａｓｉｌｉｃｏ  Ｃ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：７７５８〜７７６９；Ｂｅｎ−Ｓｈｕｓｈａｎ  Ｅら、（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：１８６６〜１８７８；Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：５４５３〜５４６５；Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３）が示されている。従って、ＯＣＴ４の代わりに、ＯＣＴ１およびＯＣＴ６が、ＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントにおいて、ＳＯＸ２またはＰＳＢＰとＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するのに関与し得る。実際、ＯＣＴ１ではなくＯＣＴ６が、Ｓｏｘ２のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントにおいてＳＯＸ２と複合体を構築したことが報告されている（Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｍら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３２０２〜３２１３）。しかし、ＯＣＴ１およびＯＣＴ６のＮａｎｏｇのＯｃｔａｍｅｒエレメント（ＴＴＴＴＧＣＡＴ）に対する結合能力は、コンセンサスなＯｃｔａｍｅｒエレメントに対するものと比較して低い（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍら、（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：５４５３〜５４６５）。他の多分化能遺伝子が、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントの媒介によってＮａｎｏｇ活性のアップレギュレートに寄与するか否か、そして、Ｏｃｔ４無発現変異におけるＮａｎｏｇの発現が正常胚における発現と定量的に等価であるか否かは、調査中である。
【０３１３】
ＥＳ細胞は、再生医療における使用のための、治療物質の無制限の細胞供給源として役立つ見込みである。臨床適用において、多数の細胞分裂を通じてＥＳ細胞の未分化状態をモニタリングし、培養中に、自発的に分化する細胞の世代を選択的に切除することが決定的である。さらに、組織特異的な細胞分化を誘導した後の、多分化能のＥＳ細胞の選択的な排除のための手段が、インビボで悪性腫瘍を産生する潜在的な供給源の混入を避けるのに必要とされる。このような目的のために、Ｒｅｘ−１およびＳｏｘ２のプロモーター制御下の、ＧＦＰまたはＬａｃＡレポーター遺伝子がそれぞれ、ヒトおよびマウスのＥＳ細胞にトランスフェクトされた（Ｅｉｇｅｓ  Ｒら、（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：５１４〜５１８；Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ＫＡおよびＧａｇｅ  ＦＨ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１８６６〜１１８７２）。Ｓｏｘ２は、多分化能の胚性細胞および神経細胞において発現したが（Ａｖｉｌｉｏｎ  ＡＡら、（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１２６〜１４０）、ジンクフィンガー遺伝子Ｒｅｘ−１は、多分化能の胚性細胞、栄養外胚葉および成体の精巣の減数分裂生殖細胞において転写される（Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＢ，Ｈｏｓｌｅｒ  ＢＡおよびＧｕｄａｓ  ＬＪ（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：８１５〜８２４）。これらの遺伝子と比較すると、Ｎａｎｏｇの発現は、多分化能の胚性細胞に限定されており（Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋら、（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３：６３１〜６４２；Ｈａｒｔ  ＡＨら、（２００４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３０：１８７〜１９８；Ｈａｔａｎｏら、準備中）、このことは、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントの周囲にあるＮａｎｏｇの最小プロモーターが、未分化な幹細胞の正および負の選択に適した手段であることを示唆する。さらに、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を有する、遺伝的に操作されたヒトＥＳ細胞は、インビトロおよびインビボの分化の後に、ガンシクロビルを用いて、未分化なＥＳ細胞の選択的な消失に適用される（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  ＪおよびＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：２５７〜２６５）。この状況において、ヒトのＮａｎｏｇプロモーターは、自殺遺伝子の多分化能細胞特異的な発現を調節するエレメントの候補である。Ｎａｎｏｇの調節機構のさらなる理解はまた、再生医療に適用される幹細胞操作の分野に寄与する。
【０３１４】
（実施例７：Ｐｓｂｐ遺伝子の同定）
本実施例では、Ｐｓｂｐ遺伝子の同定を行う。
【０３１５】
ＰＳＢＰの結合する配列であるＯｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ結合配列のＤＮＡをラテックスまたはフェライトビーズに結合させる。このビーズとＥＳ細胞核の抽出液を反応させ、Ｏｃｔａｍｅｒ／Ｓｏｘ配列と結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製する。精製されたタンパク質のアミノ酸配列をマススペクトロメトリー解析により決定する。アミノ酸配列の情報をもとに遺伝子を同定することができる（図９）。図１０には、この方法において使用されるオリゴマーの構造を示す。
【０３１６】
（実施例８：Ｐｓｂｐの発現解析）
（ＲＮＡの回収）
各組織からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い、添付のプロトコールに従って回収する。組織は、８週齢の成体マウスの脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、筋肉、およびＥ６．５、Ｅ７．５、Ｅ８．５、Ｅ９．５、Ｅ１２．５、Ｅ１８．５日齢のマウス胎児を用いる。さらに、Ｅ１２．５日齢雄および雌マウス胎児の生殖隆起、未受精卵、桑実胚、胚盤胞、胚性幹細胞およびＥＧ細胞からもＲＮＡを回収し実験に用いる。
【０３１７】
（ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析）
汎用プロトコール  （Ａｌｗｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，  １９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ７４：  ５３５０．）をもとにノーザンブロットハイブリダイゼーション解析を行う。胚性幹細胞、ＥＧ細胞およびＥ１２．５日齢のマウス胎児から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０ｕｇを水に溶かして１％  ホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動を行った後Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  に一晩ブロットした。ブロットしたメンブレンは４２℃でプレハイブリダイゼーションを２時間、特異的なプローブでのハイブリダイゼーションを一晩行った後、６５℃２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで１回洗った。プローブは、Ｓｔｍ１  ｃＤＮＡの全長に対してＭｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて［α−３２Ｐ］  ｄＣＴＰ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  ＲＩ標識する。
【０３１８】
（ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析）
ＲＴ−ＰＣＲによるＰｓｂｐ、Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ４、Ｇ３ｐｄｈ遺伝子の発現解析を目的に、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを使用しｃＤＮＡ合成を行った。ＤＮａｓｅＩ  でＲＮＡサンプルを処理した後、ＲＴ反応はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて製品のプロトコールに従って行った。ＰＣＲ増幅はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １  μｇを用いて行う。プライマー設計は、当該分野において耕地の技法により行う。
【０３１９】
ＰＣＲ反応は９４℃で５分インキュベーションした後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で５分インキュベーションする条件で行う。
【０３２０】
（実施例９：Ｐｓｂｐ遺伝子の細胞内発現）
Ｐｓｂｐ遺伝子の細胞内発現を見る目的で、Ｐｓｂｐ遺伝子にｍｙｃタグをつけたｍｙｃ−Ｐｓｂｐコンストラクトを作製する。ＰｓｂｐのｃＤＮＡは適切なプライマーセットを用いて得られた産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）でＴＡクローニングしたものを用いる。
【０３２１】
このプラスミドを適切な制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ）で切断し、平滑末端処理したｃＤＮＡフラグメントをｐＣＭＶ−ｍｙｃ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）  のＳａｌＩサイトの平滑末端処理した部分にクローニングすることでプラスミドを作製する（ｐＣＭＶ−ｍｙｃ−Ｐｓｂｐ）。１×１０５の胚性幹細胞にこのプラスミド１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して遺伝子導入する。
【０３２２】
（細胞免疫染色）
ｐＣＭＶ−ｍｙｃ−Ｐｓｂｐを遺伝子導入した胚性幹細胞を、４％  ＰＦＡで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，  １９８５．Ａｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，  ｐｐ．１−１３．）  に従い免疫染色を行う。ブロッキングは０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳ／２％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを用い室温で一時間、洗いは０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳを用い室温で５分を４回行う。一次抗体はｃ−ｍｙｃ  モノクローナル抗体  ２００  μｇ／ｍｌ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を１／１００希釈したものを、二次抗体はＦＩＴＣ標識ｇｏａｔ  抗−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  （ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，  ＩＮＣ）を１／２００希釈したものを使用する。二次抗体の反応後はｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），  ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）の順に染色を行いシグナルを検出する。
【０３２３】
（抗体作製）
次に、ＰＳＢＰタンパク質の全長アミノ酸配列を用いてウサギポリクローナル抗ＰＳＢＰ遺伝子産物の抗体を作製した。この抗体量を用いることによって、ＲＮＡ量に対応した細胞内のＰＳＢＰタンパク質を検出することができる。
【０３２４】
これらを総合すると、本発明の遺伝子は、未分化な胚性幹細胞で発現しているとして知られるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１よりも未分化で多能性を示す領域により特異的であることが示されていることになる。したがって、本発明の遺伝子は、未分化性または多能性（好ましくは、全能性）の特定を、従来では達成できなかった程度に正確に達成するという効果を提供する。
【０３２５】
（実施例１０：ゲノムの多型解析）
亜種関係にあるＭｕｓ  ｍｕｓｕｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（汎用実験マウス）およびＭ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ  （実験動物化野性マウス）由来の胚性幹細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、適切なプライマーでＰＣＲ増幅を行う。産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍでＴＡクローニングし、Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄおよびＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いた配列決定反応により両方向からのＤＮＡ塩基配列を決定する。シークエンスはキャピラリーシークエンサーＣＥＱ  ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）  を用いて行う。塩基配列データを亜種間で比較し、由来を区別できる塩基配列を決定することができる。
【０３２６】
（実施例１１：未分化マーカー遺伝子としてのＰｓｂｐ）
ここでは、本発明が未分化マーカーとして使用できるかどうかを実証する。体細胞核が再プログラム化され未分化細胞と同様に振る舞うことが可能であることが、体細胞および胚性幹細胞の細胞融合および体細胞核の除核未受精卵への核移植実験により明らかになっている。前者はクローン細胞を、後者はクローン個体を作製するために有効な方法であることが経験的に明らかになっているが、再プログラム化の機構は全くわかっていない。未分化細胞に特異的なＰｓｂｐ遺伝子は、少なくとも以下の２つの応用が考えられる。１）体細胞核の未分化細胞核への再プログラム化マーカー、２）Ｎａｎｏｇ／Ｓｔｍ１および／またはＯｃｔ４遺伝子との比較による再プログラム化機構の解明。１）に迫る目的で、以下のような細胞融合および核移植の実験を行うことができる。
【０３２７】
（細胞融合および核移植）
細胞融合実験において、体細胞核からおよび胚性幹細胞核からのＰｓｂｐ転写産物を区別する目的で、胚性幹細胞または体細胞をＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来のものを用いた。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の胚性幹細胞は当研究室で新たに樹立した。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓゲノムは汎用されるマウス系統  Ｍ．ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓに対して塩基配列の多型に富むため、ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓおよびｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの融合細胞を用いることで転写産物の由来を決定できる。融合細胞作製の方法を図４Ａに示した。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の胚性幹細胞を用いた融合細胞がＭｘＲ，ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の体細胞を用いた融合細胞がＨ×Ｊである。Ｓｔｍ１は体細胞である胸腺細胞での発現が認められない、一方胚性幹細胞では発現している。Ｍ×ＲおよびＨ×Ｊの融合細胞クローンの発現の様子が分かる。Ｐｓｂｐ遺伝子が胚性幹細胞核および再プログラム化体細胞核両者から発現していることを確認する目的で、適切なプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化する。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来およびｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ転写産物は、それぞれに特異的なバンドが検出され得る。Ｍ×Ｒ及びＨ×Ｊ融合細胞でも、特異的なバンドが検出され得る。このことから胚性幹細胞核および再プログラム化体細胞核の両方からＰｓｂｐが転写されているかどうかを示すことができる。Ｐｓｂｐ遺伝子は体細胞核の再プログラム化マーカー遺伝子として応用可能である。
【０３２８】
（未分化マーカー）
Ｐｓｂｐが体細胞核移植での再プログラム化マーカー遺伝子として応用可能か否かを確かめる目的で、（Ｂ６×ＣＢＡ）Ｆ１マウス（ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の未受精卵から核を除き、ＪＦ１マウス（ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）卵丘細胞（体細胞）核を移植する。得られたクローン胚盤胞でのＰｓｂｐの発現を観察する。観察により、種々の細胞における発現パターンを手に入れることができる。体細胞および胚性幹細胞の細胞融合および体細胞核核移植の実験からＰｓｂｐが未分化マーカー遺伝子として有用であることが示される。
【０３２９】
次いで、体細胞核移植クローン胚盤胞におけるＰｓｂｐ遺伝子の発現を調べる（ｍｏｌｘｄｏｍ）。Ｆ１クローン胚盤胞由来のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。陽性コントロールとしてＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１および／またはＯｃｔ４遺伝子を用いる。得られたＰＳＢＰ産物を、必要に応じて適切な制限酵素で消化する。例えば、ｍｏｌ由来およびｄｏｍ由来の産物は、特定のパターンを示し得る。
【０３３０】
（実施例１２：Ｐｓｂｐ遺伝子の改変体の機能）
Ｐｓｂｐ遺伝子の改変体の機能を調べるため、その塩基配列にポイントミューテーションを入れることでコードするアミノ酸配列を変更し、それぞれのミューテーションをもとに領域のもつ機能を検索する。領域を部分的にノックアウトすることで、それぞれの機能を検討する。
【０３３１】
例えば、Ｐｓｂｐの変異体について、特定の部分を欠損することで、細胞の未分化維持機構が破綻すれば、この領域が制御に重要な役割を果たすことが明らかになる。
【０３３２】
（実施例１３：Ｐｓｂｐ遺伝子の機能）
コンディショナルノックアウトの実験により初期胚および生殖細胞といった特定の未分化組織細胞での機能に解析する。ＰＳＢＰタンパク質の機能の多くは不明であるが、ＰＳＢＰまたはＰｓｂｐにより制御される下流遺伝子の発現調節より細胞を未分化な状態へと変化させる作用があることが実証され得る。
【０３３３】
（実施例１４：未分化細胞の分離）
本実施例では、Ｐｓｂｐの再生医療応用への展開として、Ｐｓｂｐを用いた幹細胞の分離を行う。
【０３３４】
Ｐｓｂｐが特に胚性幹細胞の未分化細胞マーカーとして応用可能であることから、Ｐｓｂｐの発現の有無を指標に発現している細胞のみを収集することによって、胚性幹細胞を分離することができる。このような場合、ＰＳＢＰポリペプチドに対する標識抗体などを用いて、セルソーターによって胚性幹細胞の生細胞を濃縮することが可能になる。また、胚性幹細胞の中でも高い未分化性を維持する細胞のみを選択することが可能である。
【０３３５】
したがって、Ｐｓｂｐ遺伝子は、未分化細胞のマーカーとして使用することができることが判明する。
【０３３６】
（実施例１５：Ｐｓｂｐの応用例）
本実施例では、幹細胞の選択的濃縮を例示する。
【０３３７】
上記実施例のように、PSBPの転写制御機構が解明することにより、任意の遺伝子を未分化細胞特異的に発現したり、抑制したりすることで幹細胞の選択的濃縮や排除が可能になる。
【０３３８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３３９】
従来の因子では不可能であった、幹細胞の精確な判定が達成された。したがって、本発明は、ＥＳ細胞などの幹細胞の正確な判定、精製など種々の用途に使用することができ、有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】図１は、ＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子の未分化状態特異的な発現である。
【０３４１】
（Ａ）は、５’および３’のフランキング領域を含むＬＲ／Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ導入遺伝子の構造を示す。Ｐ：ＰｖｕＩＩ、Ｘ：ＸｂａＩ、Ｂ：ＢｇｌＩＩおよびＮ：ＮｃｏＩである。（Ｂ）は、ＴＧ６およびＴＧ７遺伝子導入株および親のＲ１  ＥＳ細胞株のサザンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。導入遺伝子特異的な３．４ｋｂのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントおよび４．１ｋｂのＸｂａＩ−ＮｃｏＩフラグメントが、それぞれ５’プローブおよび３’プローブで検出された。（Ｃ）は、未分化（ＵＤ）なＴＧ６  ＥＳ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。ＧＦＰの発現は、蛍光顕微鏡解析および抗ＧＦＰ抗体を使用するウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析によって可視化された。ＨＩＳＴＯＮＥ  Ｈ３はコントロールである。（Ｄ）は、５日齢の胚様体（ＥＢ）の中心、および５日齢ＥＢの接着培養後３日のコロニーの中心に位置付けられる未分化なＥＳ細胞に限定されたＧＦＰの発現を示す。（Ｅ）は、レチノイン酸（ＲＡ）を用いるインビトロ分化による、ＧＦＰ発現のダウンレギュレーションを示す。（Ｆ）は、ＲＡ誘導性の細胞分化の間の、ＧＦＰおよび内因性のＮＡＮＯＧのウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。ＨＩＳＴＯＮＥ  Ｈ３は、コントロールである。
【図２】図２は、Ｎａｎｏｇ発現に必要とされるＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントを示す。
【０３４２】
（Ａ）は、Ｒ１  ＥＳ細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞における−２３４２  ５’フラグメントまたは−３３２  ５’フラグメントを用いたＧＦＰ導入遺伝子の一過性の発現を示す。（Ｂ）は、Ｒ１  ＥＳ細胞、Ｆ９  ＥＣ細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞における欠損構築物を用いたルシフェラーゼアッセイを示す。ルシフェラーゼ活性は、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃとの相対比として示す。棒は、３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。（Ｃ）は、マウスの−３３２ｂｐと−１５４ｂｐの間の５’フランキング領域のＤＮＡ配列を示す。Ｏｃｔａｍｅｒ（Ｏｃｔ）エレメントおよびＳｏｘエレメントを、それぞれ赤と青の長方形で囲む。（Ｄ）は、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントにおけるヌクレオチド残基置換による配列変異の導入を示す。（Ｅ）は、Ｒ１  ＥＳ細胞、Ｆ９  ＥＣ細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントにおける、変異を有するかまたは変異を有さない−３３２  ５’フラグメントを用いたルシフェラーゼアッセイを示す。ルシフェラーゼ活性は、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃとの相対比として示す。棒は、３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図３】図３は、マウスおよびヒトのＥＳ細胞におけるヒトＮａｎｏｇレポーター遺伝子の発現を示す。
【０３４３】
（Ａ）は、マウス、サルおよびヒト間のＮａｎｏｇの５’フランキング領域におけるＤＮＡ配列の比較解析を示す。Ｏｃｔａｍｅｒ（Ｏｃｔ）エレメントおよびＳｏｘエレメントを、それぞれ赤と青の長方形で囲む。赤丸は、推定転写開始部位を示す。これらの種の間で同一のヌクレオチドを黒で強調した。（Ｂ）は、マウスおよびヒトのＥＳ細胞におけるヒトＮａｎｏｇプロモーターの制御下での一過性のＧＦＰ発現を示す。−ｈ３８０  ５’フラグメントおよび−ｈ１２３  ５’フラグメントが、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントを含む一方で、−ｈ１０１  ５’フラグメントは、これらのエレメントを含まない。（Ｃ）は、ヒトＥＳ細胞におけるＧＦＰ発言のウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。ＨＩＳＴＯＮＥ  Ｈ３はコントロールである。
【図４】図４は、ＣＯＳ−１細胞における外因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントへの結合を示す。
【０３４４】
（Ａ）は、外因性のＭｙｃタグ化ＯＣＴ４およびＨＡタグ化ＳＯＸ２の発現の、抗ＯＣＴ４抗体、抗ＳＯＸ２抗体、抗Ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体を用いたｓウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。ＡＣＴＩＮはコントロールである。（Ｂ）は、ＮａｎｏｇプローブおよびＦｇｆ４プローブのＤＮＡ配列を示す。量体（Ｏｃｔ）エレメントおよびＳｏｘエレメントを長方形で囲む。（Ｃ）は、ＮａｎｏｇプローブおよびＦｇｆ４プローブを用いた電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ＯＣＴ４−ＤＮＡ複合体、ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体のバンドを矢印で示す。
【図５】図５は、Ｆ９  ＥＣ細胞における内因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントへの結合を示す。
【０３４５】
（Ａ）は、Ｆ９  ＥＣ細胞およびＲ１  ＥＳ細胞の核抽出物（Ｎ．Ｅ．）および細胞質抽出物（Ｃ．Ｅ．）における内因性のＯＣＴ４およびＳＯＸ２のウェスタンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。（Ｂ）は、Ｆ９  ＥＣ細胞の核抽出物におけるＮａｎｏｇプローブを用いた電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ＯＣＴ４−ＤＮＡ複合体、ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体のバンドを矢印で示す。（Ｃ）は、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントに変異を有するかまたは変異を有さない未標識プローブを用いた比較アッセイを示す。ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメント上の結合タンパク質（Ｂ．Ｐ．）の相対量を灰色の棒で表す。ＯＣＴ４−ＤＮＡ複合体、ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体のバンドを矢印で示す。Ｏｃｔｍｕｔ（Ｏｍ）はＯｃｔａｍｅｒエレメントに３重の変異を有するＮａｎｏｇプローブを表し、Ｓｏｘｍｕｔ（Ｓｍ）は、Ｓｏｘエレメントに３重の変異を有するＮａｎｏｇプローブを表す。（Ｄ）は、Ｆ９  ＥＣ細胞の核抽出物における、抗ＯＣＴ４抗体または抗ＳＯＸ２抗体を用いたスーパーシフトアッセイを示す。ＯＣＴ４−ＤＮＡ複合体およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体のバンドを矢印で示し、スーパーシフトされたバンドをアスタリスクで示す。ウサギＩｇＧおよびヤギＩｇＧは、コントロールとして使用した。
【図６】図６は、Ｒ１  ＥＳ細胞における、内因性のＯＣＴ４および多分化能細胞特異的Ｓｏｘエレメント結合タンパク質（ＰＳＢＰ）のＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメントへの結合を示すを示す。
【０３４６】
ＯＣＴ４−ＤＮＡ複合体およびＯＣＴ４／ＳＯＸ２−ＤＮＡ複合体のバンドを矢印で示し、ＯＣＴ４／ＰＳＢＰ−ＤＮＡ複合体のバンドを白丸で示し、そしてスーパーシフトしたバンドをアスタリスクで示す。（Ａ）は、Ｒ１  ＥＳ細胞の核抽出物におけるＮａｎｏｇプローブおよびＦｇｆ４プローブを用いた電気泳動移動度シフトアッセイを示す。（Ｂ）は、Ｏｃｔａｍｅｒエレメントおよび／またはＳｏｘエレメントに変異を有するかまたは変異を有さない未標識プローブを用いた比較アッセイを示す。（Ｃ）は、Ｒ１  ＥＳ細胞の核抽出物における、抗ＯＣＴ４抗体または抗ＳＯＸ２抗体を用いたスーパーシフトアッセイを示す。ウサギＩｇＧおよびヤギＩｇＧは、コントロールである。（Ｄ）は、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの転写調節のモデルである。Ｆ９  ＥＣ細胞ではなく、Ｒ１  ＥＳ細胞において、ＯｃｔａｍｅｒエレメントおよびＳｏｘエレメント上のＯＣＴ４／ＰＳＢＰ複合体は、相乗作用を介して、優位にＮａｎｏｇ転写をアップレギュレートする。ＳＯＸ２よりむしろＰＳＢＰが、Ｓｏｘエレメントに優先的に結合する。
【図７】図７は、トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞におけるＭｙｃ−ＯＣＴ４およびＨＡ−ＳＯＸ２の外来性タンパク質のＮａｎｏｇプローブに対する結合を示す。
【０３４７】
標識されたＮａｎｏｇプローブを、ＣＯＳ−１全細胞抽出物（Ｍｙｃ−ＯＣＴ４および／またはＨＡ−ＳＯＸ２を含む）とインキュベートした。スーパーシフトアッセイを、抗Ｍｙｃ抗体または抗ＨＡ抗体のいずれかを用いて行った。マウス抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体に対するコントロールとしてマウスＩｇＧを用いた。Ｍｙｃ−ＯＣＴ４およびＨＡ−ＳＯＸ２の結合は、それぞれ抗体Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体を用いた場合のスーパーシフトバンドの存在として同定された。
【図８】図８は、胚性幹細胞核抽出物においてＦｇｆ４プローブにおけるＯＣＴ４／ＰＳＢＰの形成を示す図である。
【０３４８】
標識したＦｇｆ４プローブを、Ｆ９胚性癌腫（ＥＣ）細胞またはＲ１胚性幹細胞の核抽出物とともにインキュベートした。ＥＣ細胞は、抗ＯＣＴ４または抗ＳＯＸ２抗体（アステリスク）のいずれでもスーパーシフトした。しかし、胚性幹細胞の主要な複合体（丸印）は、抗ＯＣＴ４抗体ではスーパーシフトしたものの、抗ＳＯＸ２抗体ではスーパーシフトしなかった（アステリスク）。ＯＣＴ４およびＰＳＢＰを含む複合体が存在することがここで示される。ウサギおよびヤギのＩｇＧを、それぞれ、ウサギ抗ＯＣＴ４抗体およびヤギ抗ＳＯＸ２抗体のコントロールとして夫々使用した。
【図９】ＰＳＢＰの精製方法の例である。
【図１０】ＰＳＢＰの精製において使用され得るＤＮＡオリゴマーを例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０３４９】
（配列表の説明）
配列番号１および２：ヒトＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号３および４：マウスＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号５および６：カニクイサルＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号７および８：ラットＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号９および１０：ヒトＳｔｍ２核酸およびアミノ酸配列
配列番号１１および１２：マウスＳｔｍ２核酸およびアミノ酸配列
配列番号１３：マウスのＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１のプロモーター配列。
配列番号１４：ヒトのＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１のプロモーター配列（ほぼ転写開始点から上流３９０ｂｐ）。
配列番号１５：マウスのＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１のプロモーター配列（転写開始点から上流３９０ｂｐ）。
配列番号１６：カニクイサルのＮａｎｏｇ／Ｓｔｍ１のプロモーター配列。
配列番号１７および１８：Ｏｃｔ４の核酸配列およびアミノ酸配列。
配列番号１９および２０：Ｓｏｘ２の核酸配列およびアミノ酸配列。
配列番号２１：Ｆｇｆ４プローブ（図４Ｂ参照）
配列番号２２：Ｎａｎｏｇプローブ（図４Ｂ参照）
配列番号２３：ＸｈｏＩ認識配列（転写開始部位から＋５０ｂｐ）を有する一般的なプライマー：５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡ−３’
配列番号２４：ＸｈｏＩ認識配列を有する正方向プライマー−２３４２ｂｐ：５’−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣ−３’
配列番号２５：ＸｈｏＩ認識配列を有する正方向プライマー−３３２ｂｐ：５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡ−３’
配列番号２６：ＸｈｏＩ認識配列を有する正方向プライマー−１５３ｂｐ：５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＴ−３’
配列番号２７：センスプライマー（転写開始部位から−３８０ｂｐ）：５’−ＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣ−３’
配列番号２８：アンチセンスプライマー（＋２４ｂｐ）：５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴ−３’
配列番号２９：ＥｃｏＲＩ−Ｏｃｔ４−ＯＲＦ−Ｆプライマー：５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧ−３’
配列番号３０：ＢｇｌＩＩ−Ｏｃｔ４−ＯＲＦ−Ｒプライマー：５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣ−３’
配列番号３１：ＥｃｏＲＩ−Ｓｏｘ２−ＯＲＦ−Ｆプライマー：５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧ−３’
配列番号３２：ＢｇｌＩＩ−Ｓｏｘ２−ＯＲＦ−Ｒプライマー；５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴ−３’
【図１】
2006042663.tif 000002
【図２】
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【図３】
2006042663.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006042663.tif 000008
【図８】
2006042663.tif 000009
【図９】
2006042663.tif 000010
【図１０】
2006042663.tif 000011
【配列表】
2006042663000001.app