(57)【要約】  【課題】哺乳動物における新脈管形成を阻害するか、または脈管奇形を処置する方法の提供。  【解決手段】  哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法であって、1実施形態において、上記哺乳動物がヒトであり、上記アンタゴニストがＥｐｈレセプターを結合し、上記アンタゴニストが抗体を含み、さらに、上記抗体がＥｐｈＢ４レセプターを結合する、方法。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストまたはアゴニストについての使用に関する。特に、本発明は、哺乳動物における新脈管形成を阻害または刺激する方法に関し、この方法は、有効量のＥｐｈレセプターアンタゴニストまたはアゴニストを、それぞれ、この哺乳動物に投与する工程を包含する。これらの方法に関して使用するための製品もまた記載される。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
胚発生の間に内皮細胞に分化することに由来する新たな血管の形成（脈管形成）、または成人期の間の既存の血管に由来する新たな血管の形成（新脈管形成）のいずれも、高等生物における器官の発生、再生、および創傷治癒の必須の特徴である。ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６：８８６−８９２（１９９２）；Ｒｉｓａｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０２：４７１−４７８（１９８８）。
【０００３】
新脈管形成は、種々の障害の病因に関係している。これらの障害としては、固形腫瘍、眼内新生血管症候群（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（例えば、増殖性網膜症または加齢性黄斑変性（ＡＭＤ））、慢性関節リウマチ、および乾癬が挙げられる［Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−２３９（１９９１）；およびＧａｒｎｅｒ  Ａ，「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｇａｒｎｅｒ  Ａ、Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ，編、第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１６２５−１７１０頁（１９９４）］。固形腫瘍の場合において、血管新生は、正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞が増殖に有利な立場、および増殖自律性を獲得することを可能にする。従って、乳癌およびいくつかの他の腫瘍において、腫瘍部分における微小血管の密度と患者の生存と間には相関が観察された［Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２４：１−６（１９９１）；Ｈｏｒａｋら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１１２０−１１２４（１９９２）；およびＭａｃｃｈｉａｒｉｎｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１４５−１４６（１９９２）］。
【０００４】
新脈管形成の正のレギュレーターに対する検索は、多くの候補物をもたらした。これらの候補物としては、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、アンジオゲニン、ＩＬ−８などが挙げられる（Ｆｏｌｋｍａｎら、およびＫｌａｇｓｂｒｕｎら）。これまでに同定された負のレギュレーターとしては、トロンボスポンジン［Ｇｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６６２４−６６２８（１９９０）］、プロラクチンの１６キロダルトンのＮ末端フラグメント［Ｃｌａｐｐら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３３：１２９２−１２９９（１９９３）］、アンギオスタチン［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ、７９：３１５−３２８（１９９４）］およびエンドスタチン［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ、８８：２７７−２８５（１９９６）］が挙げられる。
【０００５】
多くのレセプターチロシンキナーゼが記載されており、これは、脈管発生の別個の段階を支配する［Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１５３−１１５５（１９９６）；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０（１９９７）；Ｒｉｓａｕ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ３８６：６７１−６７４（１９９７）；Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓら，Ｃｅｌｌ，９３：６６１−６６４（１９９８）］。
【０００６】
脈管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）についてのレセプターであるＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）は、内皮細胞および造血前駆体細胞の分化を媒介する［Ｓｈａｌａｂｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：６２−６６（１９９５）；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：４３５−４３９（１９９６）；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２（１９９６）］。ＶＥＧＦはまた、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の連結を通じて新脈管形成の後期を支配する［Ｆｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：６６−７０（１９９５）］。Ｆｌｔ−１を欠如するマウスは、脈管発生の最も初期の段階から内皮細胞の異所性の発生とともに脈管内皮細胞の組織を破壊した。このことは、Ｆｌｔ−１シグナル伝達が、内皮細胞のシートの正確なアセンブリに必須であることを示唆する（Ｆｏｎｇら、前出）。
【０００７】
別のチロシンキナーゼレセプターであるＴｉｅ−２［Ｄｕｍｏｎｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１８９７−１９０９（１９９４）；Ｓａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３７６：７０−７４（１９９５）］ならびにそのリガンドであるＡｎｇ−１［Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１−１１６９（１９９６）；Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１７１−１１８０（１９９６）］およびＡｎｇ−２［Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０（１９９７）］は、内皮細胞ではない脈管壁成分のアセンブリに関与する。Ｔｉｅ−１は、内皮細胞完全性の維持に関与し、そしてその不活化は、浮腫および出血に起因する周産期死亡を生じる［Ｓａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７０−７４（１９９５）］。Ｔｉｅ−２経路は、内皮細胞と周辺の脈管壁成分との間の相互作用を促進することを通じて成熟工程に関与しているようである［Ｓｕｒｉら、前出；およびＶｉｋｋｕｌａら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１８１−１１９０（１９９６）］。
【０００８】
Ｅｐｈチロシンキナーゼサブファミリーは、膜貫通レセプターチロシンキナーゼの最も大きなサブファミリーであるようである［Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：６０８−６１５（１９９７）；ならびにＯｒｉｏｌｉおよびＫｌｅｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３：３５４−３５９（１９９７）］。短期間の間に非常に多くのＥｐｈレセプター遺伝子が異なる種において同定されたので、各遺伝子は、複数の名前が与えられた。従って、統一した命名法が作り出され、ここでＥｐｈレセプターは、配列相同性に基づいて、２つの群に分けられる。ＥｐｈＡ群のメンバーは、膜アンカリングのためにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーとともに、Ｅｐｈリガンドに対して優先的に結合する。このようなＧＰＩ連結リガンドは、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａサブクラスに分類される。ＥｐｈＢ群のメンバーは、膜アンカリングのためにポリペプチド膜貫通領域を保有するリガンドに優先的に結合する。このような膜貫通リガンドは、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂサブクラスに分類される。
【０００９】
Ｅｐｈｒｉｎおよびそれらのレセプターは、おそらく、細胞内斥力を調節することを通じて、正確な細胞移動および神経発生の間の配置を支配する［Ｐａｓｑｕａｌｅ、前出；ＯｒｉｏｌｉおよびＫｌｅｉｎ、前出］。二方向性シグナル伝達は、いくつかのｅｐｈｒｉｎ−Ｂ／ＥｐｈＢリガンド／レセプターの対について観察された［Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：７２２−７２５（１９９６）；およびＢｒｕｃｋｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１６４０−１６４３（１９９７）］。
【００１０】
Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４２１１−１４２１８（１９９４）において開示されたＨｔｋレセプターは、Ｅｐｈファミリーのメンバーである。このレセプター（ＥｐｈＢ４とよばれる）は、心臓内皮細胞および上皮細胞を含む種々の組織において発現される。Ｂｅｎｎｅｔｔら（前出）；Ｃｉｏｓｓｅｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２０８５−２０９５（１９９５）；Ｉｎａｄａら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：２７５７−２７６５（１９９７）；Ｎｉｋｏｌｏｖａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１：２７４１−２７５１（１９９８）。ＥｐｈＢ４レセプター発現は、最近、エストロゲンに関連することが報告された［Ｎｉｋｏｌｏｖａら、前出］。
【００１１】
Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１およびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１は、新脈管形成特性を有すると提唱された［Ｐａｎｄｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：５６７−５６９（１９９５）；およびＳｔｅｉｎら。Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：６６７−６７８（１９９８）］。Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ４レセプターのリガンド）は、最近、早期の新脈管形成の間に動脈区画を示すこと、およびｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２を欠如するマウスは、毛細管床形成において重篤な奇形を示したことが報告された［Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ  ９３：７４１−７５３（１９９８）］。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって、以下が提供される：
（項目１）  哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２）  前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記アンタゴニストがＥｐｈレセプターを結合する、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記アンタゴニストが抗体を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記抗体がＥｐｈＢ４レセプターを結合する、項目４に記載の方法。
（項目６）  前記哺乳動物が、所望されないまたは過剰な血管新生または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患している、項目１に記載の方法。
（項目７）  治療的有効量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを、哺乳動物に投与する工程を包含する、該哺乳動物における癌を処置する方法。
（項目８）  前記アンタゴニストがＥｐｈレセプターを結合する、項目７に記載の方法。
（項目９）  前記哺乳動物が固形悪性腫瘍を有する、項目７に記載の方法。
（項目１０）  前記アンタゴニストが抗体である、項目７に記載の方法。
（項目１１）  前記ＥｐｈレセプターがＥｐｈＢ４である、項目７に記載の方法。
（項目１２）  前記哺乳動物がヒトである、項目７に記載の方法。
（項目１３）  前記アンタゴニストがＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２を結合する、項目７に記載の方法。
（項目１４）  哺乳動物における新脈管形成を刺激する方法であって、該哺乳動物において新脈管形成を刺激するために有効である量のＥｐｈレセプターアゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）  前記哺乳動物がヒトである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前記アンタゴニストがアゴニスト抗体を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）  前記アゴニスト抗体がＥｐｈレセプターを結合する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記アゴニスト抗体がＥｐｈＢ４レセプターを結合する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  哺乳動物における血管ネットワークに対する外傷を処置する方法であって、治療的有効量のＥｐｈレセプターアゴニストを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）  製品であって、以下：
容器；
表示；および
該容器内に含まれる活性薬剤を含む組成物；
を含み、ここで該表示は、該組成物が所望されないまたは過剰の血管新生または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害を処置するために使用され得、そして該組成物中の該活性薬剤がＥｐｈレセプターアンタゴニストであることを示す、製品。
（項目２１）  哺乳動物における疾患または障害を処置するために、該哺乳動物にＥｐｈレセプターアンタゴニストを投与するための説明書をさらに備える、項目２０に記載の製品。
（項目２２）  製品であって、以下：
容器；
表示；および
該容器内に含まれる活性薬剤を含む組成物；
を含み、ここで該表示は、該組成物が新脈管形成を刺激するために使用され得、そして該組成物中の該活性薬剤がＥｐｈレセプターアゴニストであることを示す、製品。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における新脈管形成を阻害するか、または脈管奇形を処置する方法に関し、この方法は、この哺乳動物における新脈管形成を阻害するため、または脈管奇形を処置するために有効な量のＥｐｈレセプターアゴニストを、この哺乳動物に投与する投与する工程を包含する。従って、本発明は、所望されないか、または過剰な新生血管形成により特徴付けられる疾患または障害、例えば、腫瘍（特に固形悪性腫瘍）、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化症、糖尿病および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｓ）（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織の移植、ならびに慢性炎症を、処置の必要がある患者に有効量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを投与することにより処置する方法を提供する。本発明はさらに、所望されないか、または過剰な脈管透過性により特徴付けられる疾患または障害、例えば、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水、メイグス症候群、肺の炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出（例えば、心膜炎に関連するもの）、ならびに胸水を処置する方法を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストを用いて、エストロゲン治療から生じる脈管奇形（例えば、小脈管異常）を処置する。Ｅｐｈレセプターアンタゴニストの投与は、患者のエストロゲンの投与の前または後に行われ得る。付随した治療もまた企図され、例えば、ここで、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストおよびエストロゲンが、同じ組成物中に提供される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、哺乳動物において癌（例えば、固形悪性腫瘍）を処置する方法を提供し、この方法は、その哺乳動物に治療有効量のＥｐｈレセプターアンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物において血管組織を処置するか、または新脈管形成を刺激する方法に関し、この方法は、その血管組織を処置するか、または新脈管形成を刺激するのに有効な量のＥｐｈレセプターアゴニストを、その哺乳動物に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における血管ネットワークに対する外傷を処置する方法を提供し、この方法は、その外傷を患う哺乳動物に、治療有効量のＥｐｈレセプターアゴニストを投与する工程を包含する。この外傷は、例えば、糖尿病性潰瘍あるいは血管または心臓の創傷である。
【００１７】
なおさらなる局面において、本発明は、以下を備える製品を提供する：容器；ラベル；およびその容器に含まれる活性薬剤を含有する組成物。ここで、このラベルは、その組成物を使用して、新脈管形成を阻害し得るか、あるいは所望でないか、または過剰な脈管形成または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害を処置し得ることを表示し、そしてその組成物中の活性薬剤は、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストである。
【００１８】
本発明はまた、以下を備える製品に関する：容器；ラベル；およびその容器に含まれる活性薬剤を含有する組成物。ここで、このラベルは、その組成物を使用して、新脈管形成を刺激し得るか、あるいは血管ネットワークに対する外傷を処置し得ることを表示し、そしてその組成物中の活性薬剤は、Ｅｐｈレセプターアゴニストである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「Ｅｐｈレセプター」とは、Ｅｐｈファミリーのレセプターに属するチロシンキナーゼレセプターをいう。Ｅｐｈファミリーのレセプターは、例えば、Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：６０８−６１５（１９９７）；およびＯｒｉｏｌｉおよびＫｌｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３：３５４−３５９（１９９７）に総説される。Ｅｐｈファミリーは、それほど保存されていない、１４の構造的に関連する膜貫通レセプターチロシンキナーゼを含み、各々は、以下の一連のモジュールを含む細胞外領域を有する；アミノ末端での推定免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、それに続く、一つの膜貫通セグメントに近接するシステインリッチ領域および２つのフィブロネクチンＩＩＩ型反復、膜近傍領域に隣接される高度に保存されたチロシンキナーゼドメイン含む細胞質領域、およびカルボキシ末端テール。欠失、切断、置換または挿入を有する種々の改変体が、この定義に含まれる。さらに、キナーゼ活性を欠くＥｐｈレセプター、Ｍｅｐ、および他の発見されるＥｐｈレセプター分子が、この定義に含まれる。Ｅｐｈレセプターは、配列相同性に基づいて２つの群に分けられ得る。
【００２０】
ＥｐｈＡ群のＥｐｈレセプターは、本明細書中で「ＥｐｈＡレセプター」と称され、（現在５つのリガンドを含む、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａサブクラスの）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合リガンドと優先的に相互作用する。特定のＥｐｈＡレセプターとしては、以下が挙げられる：ＥｐｈＡ１（ＥｐｈおよびＥｓｋとも呼ばれる）；ＥｐｈＡ２（Ｅｃｋ、ｍＥｃｋ、Ｍｙｋ２、Ｓｅｋ２とも呼ばれる）；ＥｐｈＡ３（Ｈｅｋ、Ｍｅｋ４、Ｔｙｒｏ４およびＣｅｋ４とも呼ばれる）；ＥｐｈＡ４（Ｈｅｋ８、Ｓｅｋ１、Ｔｙｒｏ１およびＣｅｋ８としても公知である）；ＥｐｈＡ５（Ｈｅｋ７、Ｂｓｋ、Ｅｈｋ１、Ｒｅｋ７およびＣｅｋ７とも呼ばれる）；ＥｐｈＡ６（ｍＥｈｋ２およびＥｈｋ２とも呼ばれる）；ＥｐｈＡ７（他でＨｅｋ１１、Ｍｄｋ１、Ｅｂｋ、Ｅｈｋ３と名付けられる）；およびＥｐｈ８（ＥｅｋおよびｍＥｅｋとも呼ばれる）、ならびに天然に存在するこれらの改変体。
【００２１】
ＥｐｈＢ群のＥｐｈレセプターは、本明細書中で「ＥｐｈＢレセプター」と称され、（現在３つのリガンドを含む、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂサブクラスの）膜貫通リガンドと優先的に相互作用する。特定のＥｐｈＢレセプターとしては、以下が挙げられる：ＥｐｈＢ１（他でＮｅｔ、ＥｌｋおよびＣｅｋ６と名付けられる）；ＥｐｈＢ２（別名として、Ｅｒｋ、Ｈｅｋ５、Ｄｒｔ、Ｎｕｋ、Ｓｅｋ３、Ｔｙｒｏ５、Ｃｅｋ５およびＱｅｋ５が挙げられる）；ＥｐｈＢ３（Ｈｅｋ２、Ｓｅｋ４、Ｍｄｋ５、Ｔｙｒｏ６、Ｃｅｋ１０およびＱｅｋ１０とも呼ばれる）；ＥｐｈＢ４（Ｈｔｋ、ＨｐＴＫ５、Ｍｙｋ１、Ｍｄｋ２およびＴｙｒｏ１１とも称される）；ＥｐｈＢ５（Ｃｅｋ９とも呼ばれる）；およびＥｐｈＢ６（ＨｅｐおよびＭｅｐがこのレセプターについての別名である）ならびに天然に存在するこれらの改変体。
【００２２】
好ましいＥｐｈレセプターは、「ネイティブ配列」Ｅｐｈレセプター（以下の定義を参照のこと）である。好ましくは、このＥｐｈレセプターは、「ヒトＥｐｈレセプター」（すなわち、ヒト供給源由来のＥｐｈレセプターのアミノ酸配列を有する）である。
【００２３】
「ネイティブ配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド（例えば、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、内因性（すなわち、哺乳動物においてインビボで存在する）であり得るか、天然から単離され得るか、または組換え手段または合成手段によって産生され得る。従って、ネイティブ配列ポリペプチドは、天然に存在する、ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【００２４】
本明細書中の１つの好ましいＥｐｈレセプターは、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１９）：１４２１１−１４２１８（１９９４）（本明細書中に参考として明確に援用される）におけるアミノ酸配列を含むヒトＥｐｈレセプターのような、「ＥｐｈＢ４レセプター」（すなわち、Ｈｔｋレセプター）である。
【００２５】
本明細書中で用語「Ｅｐｈリガンド」とは、Ｅｐｈレセプターに結合し、そして必要に応じてそのＥｐｈレセプターを活性化する（例えば、そのチロシンリン酸化を刺激する）ポリペプチドをいう。
【００２６】
Ｅｐｈリガンドは、「ＧＰＩ結合型Ｅｐｈリガンド」（すなわち、グリコシルホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩアンカーを含む）であり得る。例示的ＧＰＩ結合型Ｅｐｈリガンドとしては、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１（Ｌｅｒｋ１およびＢ６１とも呼ばれる）；Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ２（他で、Ｅｌｆ１およびＣｅｋ７−Ｌとして公知である）；Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ３（Ｌｅｒｋ３およびＥｈｋ１−Ｌとも呼ばれる）；Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ４（Ｌｅｒｋ４とも呼ばれる）；およびＥｐｈｒｉｎ−Ａ５（別名、Ｌｅｒｋ７、Ａｌ１およびＲａｇｓである）、ならびに天然に存在するそれらの改変体が挙げられる。
【００２７】
あるいは、Ｅｐｈリガンドは、「膜貫通Ｅｐｈリガンド」（すなわち、膜貫通ポリペプチドドメインを含み、そして好ましくは細胞質ポリペプチドドメインをさらに含む）であり得る。膜貫通Ｅｐｈリガンドの例としては、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１（Ｌｅｒｋ２、Ｅｌｋ−ＬおよびＣｅｋ５−Ｌとも呼ばれる）；Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（他で、Ｌｅｒｋ５、Ｈｔｋ−ＬおよびＥｌｆ−２としても公知である）；およびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ３（Ｎｌｅｒｋ３およびＥｌｋ−Ｌ３とも称される）、ならびに天然に存在するそれらの改変体が挙げられる。
【００２８】
好ましいＥｐｈリガンドは、膜貫通Ｅｐｈリガンドであり、最も好ましくは、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（すなわちＨｔｋリガンド）であり、これらは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３８８４７（マウスＨｔｋリガンド）またはＬ３８７３４（ヒトＨｔｋリガンド）［また、Ｂｅｎｎｅｔｔら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９２：１８６６−１８７０（１９９５）（本明細書中で参考として明確に援用される）も参照のこと］におけるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドとは幾分かの程度で異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常、アミノ酸配列改変体は、ネイティブ配列Ｅｐｈリガンドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと、またはネイティブ配列Ｅｐｈレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、少なくとも約７０％の相同性を有し、そして好ましくは、このようなレセプターまたはリガンド結合ドメインと、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同である。アミノ酸配列改変体は、ネイティブアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の部位に置換、欠失、および／または挿入を有する。
【００３０】
「相同性」は、配列を整列し、そして必要に応じてギャップを導入して、最大の相同性パーセントを達成した後に同一である、アミノ酸配列改変体中の残基の割合として定義される。整列についての方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。１つのこのようなコンピュータープログラムは、「Ａｌｉｇｎ  ２」である。これは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、１９９１年１２月１０日にＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  ２０５５９にユーザードキュメンテーションと共に提出された。
【００３１】
用語「レセプター結合ドメイン」は、少なくとも対応するネイティブ配列Ｅｐｈリガンドの定量的レセプター結合能力を保持するＥｐｈリガンドの任意の領域を示すために、本明細書中で使用される。ネイティブ配列レセプター結合ドメインのアミノ酸配列改変体および／または誘導体は、この定義の中に包含される。
【００３２】
用語「リガンド結合ドメイン」は、少なくとも対応するネイティブ配列Ｅｐｈレセプターの定量的リガンド結合能力を保持するＥｐｈレセプターの任意の領域を称するために、本明細書中で使用される。ネイティブ配列リガンド結合ドメインのアミノ酸配列改変体および／または誘導体は、この定義の中に包含される。
【００３３】
本明細書中の用語「可溶性Ｅｐｈレセプター」または「可溶性Ｅｐｈリガンド」は、ネイティブ分子の膜結合領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を本質的に含まないＥｐｈレセプターもしくはＥｐｈリガンドの形態、または不活性化された膜結合領域を有する形態をいう。「膜結合領域」とは、ＥｐｈレセプターもしくはＥｐｈリガンドの膜貫通ドメイン（および必要に応じて細胞質ドメイン）、またはＥｐｈリガンドのＧＰＩアンカーを意味する。「本質的に含まない」とは、分子が、このような膜結合領域を１％未満で、好ましくは、このような領域を０．５％から０％で、最も好ましくは、このような領域を０．１％から０％で有することを意味する。
【００３４】
用語「アンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、Ｅｐｈレセプターのような標的分子の生物学的活性の１つ以上を阻害し得る分子をいう。アンタゴニストは、リガンドへのレセプターの結合、およびその逆の結合を妨害することにより、リガンドにより活性化された細胞を活動不能化するかまたは殺傷することにより、ならびに／あるいはレセプターもしくはリガンドの活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）または細胞レセプターへのリガンド結合後のシグナル伝達を妨害することにより作用し得る。アンタゴニストは、レセプター−リガンド相互作用を完全にブロックし得るか、またはこのような相互作用を実質的に減少させ得る。アンタゴニストによる介入のこのような点は全て、本発明の目的のために等価であるとみなされるべきである。従って、本発明の範囲内には、以下が含まれる：Ｅｐｈレセプター、Ｅｐｈリガンド、またはＥｐｈレセプターおよびＥｐｈリガンドの複合体に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）；ＥｐｈレセプターとＥｐｈリガンドとの間の相互作用を拮抗するＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドのアミノ酸配列改変体または誘導体；可溶性Ｅｐｈレセプターまたは可溶性Ｅｐｈリガンド（必要に応じて、免疫グロブリン領域（例えば、免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ））のような異種分子に融合される）；Ｅｐｈリガンドと会合したＥｐｈレセプターを含む複合体；ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドに結合する合成配列ペプチドまたはネイティブ配列ペプチド；小分子アンタゴニスト；および核酸アンタゴニスト（例えば、アンチセンス）。
【００３５】
本明細書中の「アゴニスト」は、Ｅｐｈレセプターのような標的分子の生物学的活性の１つ以上を活性化し得る分子である。アゴニストは、例えば、標的分子を活性化すること、および／またシグナル伝達を媒介することにより作用し得る。本発明の範囲内には、以下が含まれる：ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドそれ自体；Ｅｐｈレセプター、Ｅｐｈリガンド、またはＥｐｈレセプターおよびＥｐｈリガンドの複合体に結合するアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドを活性化するＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドのアミノ酸配列改変体または誘導体（例えば、Ｅｐｈレセプターまたはリガンドを活性化する免疫接着因子のような二価分子）；ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドに結合し、そして活性化する合成配列ペプチドまたはネイティブ配列ペプチド；小分子アゴニスト；およびＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドをコードする遺伝子（すなわち、遺伝子治療のために）。
【００３６】
「処置」とは、治療的処置と、予防的もしくは防止的手段との両方をいう。処置を必要とするものは、その障害を既に有するもの、ならびにその障害が予防されるべきものを含む。
【００３７】
処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物（ヒト、家畜動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を含む）をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本明細書中で処置されるヒトは、胚または胎児（すなわち、ここでは、哺乳動物は子宮中で処置される）、乳児、小児、思春期の成人、または成人を含む。
【００３８】
アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」または「治療有効量」は、処置される状態を防ぐ、その悪化を軽減する、緩和する、または治癒するのに有効な量である。
【００３９】
癌の処置を参照した「治療有効量」は、以下の効果の１つ以上を惹起し得る量をいう：（１）ある程度の腫瘍増殖の阻害（鈍化および完全な増殖阻止を包含する）；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、鈍化、または完全停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、鈍化、または完全停止）；（６）抗腫瘍免疫応答の増強（腫瘍の抑制または拒絶を生じ得るが、必ずしも生じるわけではない）；および／または（７）障害と関連した１つ以上の症状のある程度の緩和。
【００４０】
用語「新脈管形成を阻害する」とは、処置される哺乳動物における血管の発達を実質的に防止するまたは減少させる作用をいう。
【００４１】
「新脈管形成を刺激する」または「新脈管形成を促進する」との表現は、処置される哺乳動物における血管の発達を実質的に増大させる作用をいう。
【００４２】
「所望されないまたは過剰な血管新生により特徴付けられる疾患または障害」は、例として、腫瘍、および特に、固形悪性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、動脈硬化症、糖尿病網膜症および他の網膜症、水晶体後線維増殖、年齢関連黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺肥大（グレーヴズ病を含む）、角膜移植および他の組織移植、ならびに慢性炎症を包含する。
【００４３】
「所望されないまたは過剰な血管透過性により特徴付けられる疾患または障害」の例は、脳腫瘍に付随した浮腫、悪性腫瘍に付随した腹水、メグズ症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出（例えば、心膜炎に付随したもの）、および胸水を包含する。
【００４４】
「血管ネットワークへの外傷」との表現は、哺乳動物が供される血管または心臓（器官の血管ネットワークを含む）に対する外傷（例えば、傷害）をいう。このような外傷の例は、創傷、切開、および潰瘍（例えば、糖尿病潰瘍、および血管または心臓の創傷または裂傷）を包含する。外傷は、内部事象によって引き起こされる状態、ならびに病原のような外因性因子によって課される状態を包含する。これらは、新脈管形成の促進によって改善され得る。それはまた、血管形成または再内皮形成が治癒のために必要とされる創傷の処置をいう。
【００４５】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広範な意味において使用され、そして特にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントをカバーする。
【００４６】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部を含み、これは、一般には、抗原結合領域またはそれらの可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量において存在し得る天然に存在し得る変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられる異なる抗体を代表的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製とは対照的に、各ポリクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して方向付けられる。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に同質の抗体の集団から得られたものと同様な抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により初めに記載されたハイブリドーマ方法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。この「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００４８】
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一か、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含むが、その鎖の残部は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列ならびにそのような抗体のフラグメントと同一か、または相同である[米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）]。
【００４９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）に由来する超可変領域残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によて置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見い出だされない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに洗練するためになされ得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの実質的なすべてを含み、ここで、全て、または実質的に全ての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域と対応し、そしてすべての、または実質的にすべてのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。必要に応じて、ヒト化抗体はまた、少なくとも一部の免疫グログリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ」または「ＣＤＲ」[すなわち、軽鎖可変ドメイン内の２４〜３４残基（Ｌ１）、５０〜５６残基（Ｌ２）および８９〜９７残基（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン内の３１〜３５残基（Ｈ１）、５０〜６５残基（Ｈ２）および９５〜１０２残基（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）]に由来するアミノ酸残基および／または「超可変ループ」[すなわち、軽鎖可変ドメイン内の２６〜３２残基（Ｌ１）、５０〜５２残基（Ｌ２）および９１〜９６残基（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域内の２６〜３２残基（Ｈ１）、５３〜５５残基（Ｈ２）および９６〜１０１残基（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）]に由来するアミノ酸残基を含む。「Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域残基とは異なるそれらの可変ドメイン残基である。
【００５１】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００５２】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短かすぎて同じ鎖上で２つのドメイン間で対形成ができないリンカーを使用することにより、そのドメインに強制的に別の鎖の相補的ドメインと対形成させて、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより十分に記載される。
【００５３】
本出願全体に渡って使用される場合、表現「直線状抗体」とは、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるＬ−Ｆ（ａｂ’）2抗体を言う。簡潔には、これらの抗体は、直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含み、２つの軽鎖と結合される場合、これは一対の抗原結合領域を形成する。直線状抗体は、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）または単一特異的であり得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、異種「付着因子」タンパク質（例えば、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンド）の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸配列と結合させる抗体様分子を示す。構造的に、免疫接着因子は、抗体（すなわち、「異種」である）の抗原認識部位および抗原結合部位（抗原結合部位）および免疫グロブリン定常ドメイン配列とは異なる所望の結合特異性を有する接着アミノ酸配列の融合を含む。
【００５５】
「抗体−免疫接着因子キメラ」は、少なくとも１つの免疫接着因子（本出願において記載されるような）を抗体（本明細書中で定義される）の少なくとも１つの結合ドメインと結合させる分子を含む。例示的な抗体−免疫接着因子キメラは、Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３−４７２７（１９９１）およびＣｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）において記載される二重特異的ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
【００５６】
「単離された」分子とは、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収された分子である。その天然環境の混入成分は、その分子に対する治療的用途を妨害する無機物であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質溶質または非タンパク質溶質を含み得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤」とは、細胞の機能または増殖を減少させるか、もしくは妨げ、そして／または細胞の崩壊を引き起こす物質を言う。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、およびＲｅ186）、化学療法剤および毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素学的に活性な毒素またはそのフラグメント）を含むことを意図する。
【００５８】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）（例えば、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｌ）（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）およびドクサタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ））、タキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンプラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、カルボプラチン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ダウノマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（米国特許第４，６７５，１８７号）、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義において、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤（タモキシフェンおよびオナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）もまた、含まれる。
【００５９】
用語「エストロゲン」とは、エストロゲン性ホルモン（例えば、エストラジオール）に特有な生物学的な影響を及ぼす任意の物質（天然または合成）を言う。
【００６０】
本出願で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、親ドラッグと比較して腫瘍細胞に対して小さな毒性であり、そして酵素学的に活性化されるか、またはより活性な親形態に変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態を言う。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｏｎｓ、１４、３７５−３８２頁、６１５ｔｈ、Ｍｅｅｔｉｎｇ
Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、（編）２４７−２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、以下が挙げられが、それらに限定されない：ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて、置換型フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて、置換型フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性または細胞増殖抑制性のない薬物に変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグ。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導され得る細胞傷害性薬物または細胞増殖抑制性薬物の例としては、上記のそれらの化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さな小胞であり、これは、哺乳動物に対して薬物（例えば、本明細書に開示されるアンタゴニスト、および必要に応じて、化学療法剤）送達のために有用である。このリポソームの成分は、一般に、二重層形成において配列され、生物学的膜の脂質配列と類似する。
【００６２】
用語「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴ」とは、ＥｐｈレセプターもしくはＥｐｈリガンドのｍＲＮＡまたはＤＮＡの領域とハイブリダイズするポリヌクレオチドを言い、それにより、インビトロまたはインビボでＥｐｈレセプターポリペプチドまたはＥｐｈリガンドポリペプチドの産生を妨害するか、または減少させる。この用語は「改変された」ポリヌクレオチドを含み、その例は、本明細書に記載される。
【００６３】
（ＩＩ．本発明を実行するための様式）
本発明は、Ｅｐｈレセプターアゴニストおよび／またはアンタゴニストを利用する方法に関する。そのような分子を作製するための方法は、以下に詳しく述べられる。以下の実施例に示されるように、Ｅｐｈリガンド経路における潜在的なオーバーラップおよび重複性に起因する新脈管形成に対して、Ｅｐｈレセプターはより明白な効果を有することが予期されるので、好ましくは、このアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｅｐｈレセプター（Ｅｐｈリガンドよりはむしろ）と結合するか、または相互作用する。最も好ましくは、このアゴニストまたはアンタゴニストは、ＥｐｈＢ４レセプターおよび最も好ましくはヒトＥｐｈＢ４レセプターを含み、それに結合するか、またはそれと相互作用する。
【００６４】
その分子が、アゴニストである場合、天然のレセプターまたはリガンドの１つ以上のアゴニスト特性を保持する天然配列ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンド（または改変体もしくはその誘導体）を使用し得る。適切なＥｐｈＢ４レセプター分子（ＨｐＴＫ５レセプター分子）が、１９９７年６月３日に発行された米国特許第５，６３５，１７７号において開示され（はっきりと、参考として本明細書に援用される）、有用なＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２分子（Ｈｔｋリガンド）は、米国特許第５，６２４，８９９号において開示され、はっきりと、参考として本明細書に援用される。一つの実施形態において、可溶性分子が、天然分子の一つ以上のアゴニスト特性を保持する場合、可溶性のＥｐｈレセプターまたはリガンド（例えば、領域を固着する機能性膜を欠失しているレセプターまたはリガンドの短縮型形態）を使用し得る。あるいは、遺伝子治療によって、Ｅｐｈレセプター、Ｅｐｈリガンドをコードする遺伝子またはそのアゴニスト改変体をコードする核酸を投与し得る。他のアゴニスト分子は、本明細書中で以下に開示される。
【００６５】
アゴニスト分子をスクリーニングするために、チロシンリン酸化を決定するための種々の利用可能な任意のアッセイを利用して、Ｅｐｈレセプターおよび／またはリガンドのチロシンリン酸化を刺激する候補分子の能力を評価し得る。例えば、そのレセプターまたはリガンド（内在性または組換え的に導入された）を含む細胞を候補アゴニストに曝露し得、そして抗ホスホチロシン抗体を使用して、レセプターまたはリガンドのチロシンリン酸化を決定し得る（１９９７年６月３日に発行された米国特許５，６３５，１７７号および１９９８年６月１６日に発行された米国特許５，７６６，８６３号を参照のこと；後者の特許は、アゴニストを同定するために都合良く使用され得る「Ｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」を記載している。
【００６６】
あるいは、またはさらに、候補アゴニストの他のアゴニスト特性（例えば、下流のシグナル伝達事象を活性化する能力、例えば、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドと細胞内分子との相互作用）についてスクリーニングし得る。
【００６７】
さらに、インビボまたはインビトロで新脈管形成を刺激する候補アゴニストの能力についてスクリーニングし得る。例えば、Ｆ３４４雌ラット眼球の無血管性角膜における脈管形成活性が、評価され得る[例えば、Ｓｔｒｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１：１２７９（１９９２）を参照のこと]。
【００６８】
代替的な実施形態において、目的の分子は、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストである。種々のアンタゴニスト分子が以下に記載される。好ましいアンタゴニストは、Ｅｐｈレセプターに結合し、そしてそれに対するＥｐｈリガンドの結合をブロックする中和抗体である。ＥｐｈリガンドとＥｐｈレセプターとの間の相互作用をブロックする分子についてスクリーニングするために、リガンドまたはレセプター（またはその結合ドメイン）は、固相上に固定され得、そしてレセプターまたはリガンドの結合の競合阻害は、それぞれ、候補アゴニストによって、標準的技術（例えば、競合的ＥＬＩＳＡ）により分析され得る。あるいは、またはさらに、チロシンリン酸化アッセイ（例えば、１９９７年６月３日に発行された米国特許第５，６３５，１７７号または１９９８年６月１６日に発行された米国特許第５，７６６，８６３号に記載されるような）を使用して、レセプターまたはリガンドのチロシンリン酸化を妨害または減少させるアンタゴニストについてスクリーニングし得る。他のアッセイとしては、下流のシグナル伝達事象を妨害または減少させる候補アンタゴニストの能力を評価するアッセイまたは新脈管形成アッセイにおける新脈管形成を妨害または減少させるアッセイ（上記参照のこと）が挙げられる。あるいは、またはさらに、腫瘍細胞を注入されたヌードマウスにおいて腫瘍サイズを根絶または減少するアンタゴニストの能力が、評価され得る[例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７：４５９３−４５９９（１９９７）を参照のこと]。
【００６９】
（Ａ．抗体）
本発明は、アンタゴニスト（「中和」抗体または「ブロック」抗体）またはアゴニスト（「アゴニスト抗体」）としての抗体の使用を意図する。抗体を生成するための技術は、本明細書中に記載される。アンタゴニスト特性またはアゴニスト特性は、前節にて記載されるようにスクリーニングされ得る。
【００７０】
（（ｉ）抗原調製）
抗体の産生のために使用されるべき抗体は、例えば、単離されたインタクトなＥｐｈレセプターもしくは単離されたＥｐｈリガンドまたはその一つ以上のフラグメントであり得る。あるいは、天然または組換えＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドを発現する細胞は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。その抗原は、必要に応じて、さらに異種分子（例えば、免疫原性ペプチド）を含み得る。抗体を生成するために有用な他の形態のＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドは、当業者に対して明らかである。
【００７１】
（（ｉｉ）ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原またはアジュバンドの多数の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物内で惹起される。免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）に二官能価剤または誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を結合することは有用であり得る。
【００７２】
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３容量のフロイント完全アジュバンドと合わせ、そして皮内の複数の部位にその溶液を注入することにより、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、その動物をフロイントの完全アジュバンド中の最初の量のペプチドまたは結合体の、１／５〜１／１０を用いて、複数の部位における皮下注射によってブーストされる。７〜１４日後、その動物は採血され、その血清が、抗体力価についてアッセイされる。動物は、その力価がプラトーになるまでブーストされる。好ましくは、その動物は、同じ抗原の結合体を用いてブーストされるが、それは異なるタンパク質と、そして／または異なる架橋剤を介して結合体化される。結合体はまた、融合タンパク質として、組換え細胞培養において作製され得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）が、免疫応答を増強するために適切に使用される。
【００７３】
（（ｉｉｉ）モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）より初めに記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製され得る。
【００７４】
ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはマカクザル）が、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、もしくは産生し得るリンパ球を誘発するために本明細書の上記のように免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、ミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する[Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）]。
【００７５】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない、親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する、一つ以上の物質を含む適切な培養培地において播種されて、増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合には、ハイブリドーマに対する培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、この物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【００７６】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって安定な高レベルの抗体の産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のある細胞である。これらの中で、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
ＵＳＡより入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍に由来する細胞株、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡより入手可能なであるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞株）である。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている[Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）]。
【００７７】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗体に対して方向付けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。
【００７８】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定される。
【００７９】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法によって増殖され得る[Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）]。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【００８０】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グログリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような）によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００８１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、そして従来の手順を使用して配列決定される（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。このハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役に立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそのベクターは、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得るために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされる。
【００８２】
（（ｉｖ）ヒト化抗体）
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその抗体に導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と言われ、これは代表的に、「移入」可変ドメインから選び出される。ヒト化は、基本的に、げっ歯類ＣＤＲすなわちヒト抗体の対応配列に対するＣＤＲ配列を置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒおよびその協力者らの方法[Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９９８）]に従って実行され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメインが、決して非ヒト種に由来する対応配列によって置換されているわけではない。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体内の類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【００８３】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。いわゆる「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、そのげっ歯類の配列と最も近親であるヒト配列は、ヒト化抗体に対するヒトＦＲとして受容される[Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）]。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定ＦＲを使用する。同じＦＲは、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る[Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）]。
【００８４】
抗原に対する高度な親和性および他の有利な生物学的特性を保持するようにヒト化される抗体が、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析の過程により、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、かつ当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元コンホメーション構造を例示し、そして表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示の視察は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の有望な役割の分析を可能にする（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析）。このように、ＦＲ残基は選択され得、レシピエントから結合され得、そして配列を移入し得、その結果、所望される抗体の特徴（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成される。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼす際に直接かつ最も実質的に関与する。
【００８５】
（（ｖ）ヒト抗体）
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体が産生され得る。例えば、現在、免疫化に際して、内在性の免疫グロブリン産生の非存在下におけるヒト抗体の十分なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生の完全阻害を生じることが、記載されている。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージデスプレイライブラリーから誘導され得る[Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）；および米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号]。ヒト抗体はまた、活性化Ｂ細胞によってインビトロで産生され得る（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【００８６】
（（ｉｖ）抗体フラグメント）
種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために発展してきた。従来は、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られた[例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと]。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって、直接産生され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、直接Ｅ．ｃｏｌｉから回収され得、そして化学的に結合されてＦ（ａｂ’）2フラグメントを形成し得る[Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）]。別の実施形態において、このＦ（ａｂ’）2は、ロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成され、Ｆ（ａｂ’）2分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）2フラグメントが、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に対して明らかである。
【００８７】
（（ｖｉｉ）多重特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体）
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異的（例えば、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ））抗体を産生することが所望され得る。例示的な二重特異的抗体は、標的抗原上の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗−Ｅｐｈリガンドまたは抗−Ｅｐｈレセプターアームは、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンド発現細胞に対する細胞防御機構に集中するために、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）、またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））に結合するアームと結合され得る。二重特異的抗体はまた、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドを発現する細胞に対して細胞傷害剤を局在化するために使用され得る。これらの抗体は、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンド結合アームおよび細胞傷害剤（例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン）を結合するアームを所有する。
【００８８】
別の実施形態において、二重特異的抗体は、Ｅｐｈリガンドと結合する一方のアームおよびＥｐｈレセプター（例えば、内在性リガンドが結合する同種レセプター）に結合する別のアームを有する。異なるＥｐｈリガンドまたは異なるＥｐｈレセプターと架橋し得る二重特異的抗体がまた、意図される。そのような二重特異的抗体は、それらの生物学的活性に依存してアゴニストまたはアンタゴニストととして使用され得る。
【００８９】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異的抗体）として調製され得る。
【００９０】
好ましい全長の二重特異的抗体を作製するための一つのアプローチに従って、一対の抗体分子間のインターフェースは、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大するように操作され得る。好ましいインターフェースは、少なくとも、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法において、第１の抗体分子のインターフェースに由来する一つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖と置換される（例えば、チロシンまたはトリプトファン）。その大きな側鎖と同一か、または類似するサイズの代償的「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することにより第２抗体分子のインターフェース上に生成される。これは、他の不要な最終産物（例えば、ホモダイマー）を超えるヘテロダイマーの収率を増加するための機構を提供する。１９９８年３月２４日に発行された米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと。
【００９１】
二重特異的抗体は、架橋された抗体または「ヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における一方の抗体は、アビジンと結合され得、他方の抗体は、ビオチンと結合され得る。ヘテロ結合体抗体は、任意の都合の良い架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野において周知であり、そして多くの架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号において開示される。
【００９２】
抗体フラグメントから二重特異的抗体を生成するための技術はまた、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）およびＳｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）を参照のこと。
【００９３】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、かつ単離するための種々の技術もまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されて、モノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的機構を提供してきた。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成が不可能であるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ）と結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、強制的に、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成し、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用することによる二重特異的抗体フラグメントを作製するため別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。あるいは、この二重特異的抗体は、例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，８７０号において記載されるように産生される「直線状抗体」であり得る。
【００９４】
２価を超える抗体が意図される。例えば、三二重特異的抗体が、調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【００９５】
（（ｖｉｉｉ）他の改変）
抗体の他の改変が意図される。例えば、本発明の抗体を、エフェクター機能に関して改変することが所望され得る（例えば、癌を処置する際に、抗体の有効性を増強するように）。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域に導入され得、それにより、この領域における内部鎖ジスルフィド結合形成を可能にする。従って、生成されるホモダイマー抗体は、インターナリゼーション能力を改善し得、そして／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体もまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）において記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は、２重のＦｃ領域を有するように操作され得、そしてそれによって補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強し得た。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【００９６】
本発明の特定の実施形態において、例えば、腫瘍侵入を増加するために、インタクトな抗体よりはむしろ抗体フラグメントを使用することが所望され得る。この場合、抗体フラグメントの血清半減期を増加するように、抗体フラグメントを改変することが所望され得る。これは、例えば、サルベージレセプター結合エピトープをその抗体フラグメントに組み込むことによって達成され得る（例えば、その抗体フラグメント内の適切な領域の変異によって、または、エピトープをペプチドタグに組み込み、次いでそれが末端または中間のいずれかの位置で抗体フラグメントに融合されることによって、例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）。米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。
【００９７】
（Ｂ．ポリペプチドの誘導体または改変体）
他の有用なアンタゴニストまたはアゴニストとして、天然のＥｐｈレセプターまたは天然のＥｐｈリガンドの、アミノ酸配列改変体および／または誘導体が挙げられる。これらは、内因性のレセプターまたはリガンドに結合し、そして天然のリガンドとレセプターとの間での相互作用を競合的に阻害する（アンタゴニスト）か、またはレセプターもしくはリガンドを活性化する（アゴニスト）。
【００９８】
例えば、このようなアンタゴニストとして、フラグメントおよびアミノ酸配列の改変体が挙げられる。これらは、Ｅｐｈリガンドのレセプター結合ドメインまたはＥｐｈレセプターのリガンド結合ドメインを含むが、生物学的活性を与えるドメインを欠いているか、またはそうでなければ、細胞性のＥｐｈレセプターまたはリガンドを活性化することができない。
【００９９】
Ｅｐｈリガンド中のレセプター結合ドメインおよびＥｐｈレセプター中のリガンド結合ドメインは、Ｘ線研究、変異分析、および抗体結合研究を含む、当該分野で公知の方法によって決定される。変異によるアプローチとして、回避変異の選択および挿入による変異誘発と組み合わせた、ランダムな飽和変異誘発の技術が挙げられる。結合ドメインの同定に適切な別のストラテジーは、アラニン（Ａｌａ）−スキャン変異誘発として公知である。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１９８５（１９８９）。この方法は、荷電したアミノ酸側鎖を含む領域の同定を包含する。同定されたそれぞれの領域内の荷電した残基（すなわち、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ）は、Ａｌａで置換され（１つの変異分子について１つの領域）、そして結合の特定の領域の重要性を評価するために、得られた改変体の結合が試験される。結合ドメインの位置決定のためのさらなる強力な方法は、中和抗体の使用による。通常は、これらのおよび類似の方法の組み合わせが、レセプターまたはリガンドの結合に関連するドメインを位置決定するために使用される。
【０１００】
置換改変体は、天然の配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そしてその同じ位置に異なるアミノ酸が挿入された改変体である。この置換は、分子内の１つのアミノ酸だけが置換されている場合には、単一であり得、または、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換されている場合には、複数であり得る。
【０１０１】
挿入改変体は、１つ以上のアミノ酸が、天然の配列中の特定の位置で１つのアミノ酸にすぐ隣接して導入されている改変体である。１つのアミノ酸にすぐに隣接するは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに対して連結されていることを意味する。
【０１０２】
欠失改変体は、天然の配列中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている改変体である。通常は、欠失改変体は、分子内の特定の領域において１つまたは２つのアミノ酸残基が欠失している。好ましい欠失改変体は、必要に応じてイムノグロブリン領域のような異種分子または他の分子（例えば、ポリエチレングリコール）に対して融合させられた、可溶性のＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドである。
【０１０３】
フラグメントおよびアミノ酸配列改変体は、天然の因子をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発のような、当該分野で公知の方法によって容易に調製される。変異したＤＮＡは、適切な発現ベクター中に挿入され、次いで、宿主細胞が、組換えベクターでトランスフェクトされる。組換え宿主細胞は適切な培養培地中で増殖させられ、次いで、宿主細胞中で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列改変体が、クロマトグラフィーまたは他の精製方法によって組換え細胞培養物から回収される。
【０１０４】
あるいは、フラグメントおよびアミノ酸改変体は、例えば、天然のＥｐｈレセプターもしくはＥｐｈリガンドのタンパク質溶解によって、またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）によって記載されているような標準的な固相ペプチド合成手順を使用する合成によってインビトロで調製されるが、当該分野で公知の他の同等の化学合成が使用され得る。固相合成が、適切な樹脂に対して保護されたα−アミノ酸をカップリングさせることによって、ペプチドのＣ−末端から開始される。アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための当該分野で周知の技術を使用して、ペプチド鎖に対してカップリングさせられる。
【０１０５】
（Ｃ．免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ））
ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドの１つの好ましい誘導体は、免疫接着因子である。免疫接着因子は、Ｅｐｈリガンドに結合するＥｐｈレセプター（またはその逆）の一部を含み得、従って、内因性のレセプターとリガンドとの間での相互作用を競合的に阻害するように作用する。オリゴマー化またはリン酸基移転反応がレセプターまたはリガンドの活性化に関与している場合は、例えば、適切な立体構造中に２つ以上のリガンドまたはレセプター結合ドメインを含む免疫接着因子が、レセプターまたはリガンドのアゴニストとして作用し得る。
【０１０６】
最も単純なおよび最も率直な免疫接着因子の設計は、ヒンジを有する接着因子（例えば、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））とイムノグロブリンの重鎖のＦｃ領域とを組み合わせる。通常は、本発明の免疫接着因子を調製する場合には、接着因子の結合ドメインをコードする核酸はイムノグロブリンの定常ドメイン配列のＮ−末端をコードする核酸に対してＣ−末端で融合されるが、Ｎ−末端での融合もまた可能である。
【０１０７】
典型的には、このような融合体においては、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも、イムノグロブリンの重鎖の定常領域の、機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを保持している。融合体はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ−末端に対して、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域に対してすぐＮ−末端で作成される。融合が行われる正確な部位は重要ではない；特定の部位は周知であり、そして免疫接着因子の生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択され得る。
【０１０８】
好ましい実施形態においては、接着因子配列は、イムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインのＮ−末端に対して融合される。接着因子配列に対して重鎖の定常領域全体を融合することが可能である。しかし、より好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位（すなわち、残基２１６、１１４である重鎖の定常領域の最初の残基をとる）のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列、または他のイムノグロブリンの同様の部位が融合において使用される。特に好ましい実施形態においては、接着因子アミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域、およびＣＨ２、およびＣＨ３、または（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインに対して融合させられる。
【０１０９】
二重特異的免疫接着因子については、免疫接着因子は、多量体として、そして特に、ヘテロ二量体またはヘテロ四量体として組み立てられる。一般的には、これらの組み立てられたイムノグロブリンは、既知のユニット構造を有する。基本的な４つの鎖の構造のユニットは、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する特定の形態である。４つの鎖のユニットは、より大きな分子量のイムノグロブリン中で反復される；ＩｇＭは、一般的には、ジスルフィド結合によって互いに結ばれた４つの基本的なユニットの五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンおよび時折、ＩｇＧグロブリンもまた、血清中で多量体の形態で存在し得る。多量体の場合には、それぞれの４つのユニットは同じであるかまたは異なり得る。
【０１１０】
本明細書中の範囲内の種々の例示的な組み立てられた免疫接着因子を以下に模式的に示す：
（ａ）ＡＣL−ＡＣL；
（ｂ）ＡＣL−（ＡＣH，ＡＣL−ＡＣH，ＡＣL−ＶHＣH，またはＶL，ＣL−ＡＣH）
（ｃ）ＡＣL−ＡＣH−（ＡＣL−ＡＣH，ＡＣL−ＶHＣH，ＶLＣL−ＡＣH，またはＶLＣL−ＶHＣH）
（ｄ）ＡＣL―ＶHＣH（ＡＣHまたはＡＣL−ＶHＣHまたはＶLＣL−ＡＣH）；
（ｅ）ＶLＣL−ＡＣH−（ＡＣL−ＶHＣHまたはＶLＣL−ＡＣH）；および
（ｆ）（Ａ−Ｙ）n−（ＶLＣL−ＶHＣH）2
ここで、それぞれのＡは、同一であるかまたは異なる接着因子アミノ酸配列を示す。
【０１１１】
ＶLは、イムノグロブリンの軽鎖の可変ドメインである；
ＶHは、イムノグロブリンの重鎖の可変ドメインである；
ＣLは、イムノグロブリンの軽鎖の定常ドメインである；
ＣHは、イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインである；
ｎは、１を超える整数である；
Ｙは、共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１１２】
簡潔さの目的において、上記の構造は鍵となる特徴のみを示す；これらは、連結（Ｊ）、またはイムノグロブリンの他のドメインを示さないだけれはなく、ジスルフィド結合をも示さない。しかし、このようなドメインが結合活性のために必要とされる場合には、これらは、これらがイムノグロブリン分子中で占有する通常の位置に存在するようき構築されるはずである。
【０１１３】
あるいは、接着因子配列は、イムノグロブリンの重鎖と軽鎖の配列の間に挿入され得る。その結果、キメラである重鎖を含有しているイムノグロブリンが得られる。この実施形態においては、接着配列は、ヒンジとＣH２ドメインとの間、またはＣH２とＣH３ドメインとの間のいずれかで、イムノグロブリンのそれぞれのアーム中のイムノグロブリンの重鎖の３’末端に融合される。同様の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
【０１１４】
イムノグロブリンの軽鎖の存在は本発明の免疫接着因子においては必要ではないが、イムノグロブリンの軽鎖は、接着イムノグロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合されるか，または接着因子に直接融合されるかのいずれかで存在し得る。前者の場合には、イムノグロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、代表的には、接着因子イムノグロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時に発現される。分泌の際には、ハイブリッドの重鎖および軽鎖が、２つのジスルフィド結合されたイムノグロブリン重鎖−軽鎖の対を含有しているイムノグロブリン様構造を提供するように、共有的に会合させられる。このような構造の調製に適切な方法は、例えば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０１１５】
免疫接着因子は、イムノグログリンのｃＤＮＡ配列に対してインフレームで接着因子部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合することによって最も簡単に構築される。しかし、ゲノムのイムノグロブリンへの融合もまた、使用され得る（例えば、Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０）；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１）を参照のこと）。後者の型の融合体は、発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＴｇＧ重鎖の定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓、または末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーに由来する公の配列に基づいて、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって単離され得る。「接着因子」および免疫接着因子のイムノグロブリン部分をコードするｃＤＮＡは、選択された縮細胞中での効率的な発現を指向するプラスミドベクター中ににタンデムに挿入される。
【０１１６】
（Ｄ．他のアゴニストまたはアンタゴニスト分子）
本発明はさらなるアンタゴニストまたはアゴニストに関する。
【０１１７】
例えば、アンタゴニストまたはアゴニストは、合成の低分子であり得る。例えば、低分子は、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドの結合部位を模倣し得、それによってアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。あるいは、低分子は、レセプターまたはリガンドのチロシンキナーゼドメイント相互作用し得、それによってチロシンキナーゼドメインを活性化するか、またはその活性化を妨げる。例えば、米国特許第５，７９５，９１０号を参照のこと。
【０１１８】
アンタゴニストまたはアゴニストはまた、例えば、合理的な設計によって、またはファージディスプレイによって生成されたペプチドであり得る（１９９８年８月１３日に公開された、ＷＯ９８／３５０３６号）。従って、選択された分子は、例えば、「ＣＤＲ模倣物」または抗体のＣＤＲに基づいて設計された抗体アナログであり得る。
【０１１９】
あるいは、アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、１９９５年１０月２６日に公開されたＷＯ９５／２８４８５のアプローチに本質的には従って、Ｅｐｈ遺伝子のプロモーターまたは他の調節領域と相互作用し得る。
【０１２０】
目的の別のアゴニストは、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドの２つ以上の結合部位を含む二量体のような分子である。このような分子は、このような分子は、結合ドメインを、二量体中のドメインの安定な相互作用を促進するために、二量体化領域に融合することによって形成され得る。このような分子は、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドの「レセプター相互干渉」またはリン酸基移転反応を容易にするために有用なアゴニストであり得る。
【０１２１】
別の型のアンタゴニストは、アンチセンス核酸である。遺伝子発現のアンチセンス阻害は、複数のレベルで生じ得る。しかし、好ましいアプローチは、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を妨害することを含むアプローチである。このことを達成するために、当業者は、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドのｍＲＮＡに相補的なオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）を使用し得る。このアンチセンスオリゴは、天然のセンスｍＲＮＡに対してワトソンクリック塩基対を形成することによって相補的に結合する。しかし、プラスミドに由来するアンチセンスＲＮＡ（すなわち、アンチセンスＤＮＡは、プラスミド中で提供される）もまた、意図される。ＭｅｒｃｏｌａおよびＣｏｈｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２（１）：４７−５９（１９９５）。別の実施形態である、いわゆる「アンチ遺伝子アプローチ」に従うと、アンチセンス分子は、すでに形成された対との、アンチセンス分子中の第３の塩基のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ（またはアンチ−Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）水素結合を介して、ＥｐｈレセプターまたはＥｐｈリガンドＤＮＡと三重へリックスまたは三本鎖を形成するように結合する分子である。ＭｅｒｃｏｌａおよびＣｏｈｅｎ、前出。アンチセンスオリゴは、どこでもｍＲＮＡ転写物に対して指向され得るが、好ましい標的配列は、その開始コドンにまたがる５’末端である。目的のオリゴは少なくとも、通常は、１５個から１７個の塩基を含む。最も活性なアンチセンス配列を同定するためには、欠失分析が行われ得る。
【０１２２】
アンチセンスオリゴは、自動化された方法によって容易に合成され得る。１９９６年２月６日に発行された米国特許第５，４８９，６７７号を参照のこと。通常は、インビボでの使用のために意図されるアンチセンスオリゴは、それをヌクレアーゼでの分解に対してあまり敏感ではないようにするように、および／または細胞によってそれが取りこまれる効率を改善するように、改変される。１つの例示的な改変は、「メチルホスホネート」（ＭＯ）オリゴを生じる。このアプローチに従うと、ヌクレオチド間結合中の架橋していない酸素原子の１つが、メチル基で置換される。このことは、オリゴの負の電荷を排除する正味の効果を有する。Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １４（１）：５４−６５（１９９６）。ヌクレアーゼでの分解を減少させるためのＴｏｎｋｉｎｓｏｎらに記載されている別の改変は、イオウで、リンでの架橋していない酸素の１つを置換することを含む、ホスホロチオエート（ＰＳ）改変である。塩基性のオリゴを改変する１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５：３１９−３３９（１９９３）に概説されている。例えば、新規のアナログが報告されている。ここでは、デオキシリボース−ホスフェート骨格全体が、ペプチド様の骨格で置換された、新規のアナログが報告されている。ＭｅｒｃｏｌａおよびＣｏｈｅｎ、前出を参照のこと。細胞性の取りこみを改善するために、アンチセンスオリゴが、リポソーム中にカプセル化され得、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ）と複合体化され、ポリリジンまたはリポフェクチンにカップリングさせられ、そして／またはコレステリル部分に共有結合させられる。Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、前出を参照のこと。
【０１２３】
上記のようなアンチセンス核酸以外に、本発明はまた、本明細書中に記載されているような任意のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする核酸の投与を意図する。例えば、本発明は、遺伝子治療によって細胞中に導入された「内細胞性の抗体」を意図する。
【０１２４】
これらは、インビボおよびエキソビボで患者の細胞内に核酸（必要に応じて、ベクター中に含まれる）を入れるための２つの主要なアプローチである。インビボでの送達については、核酸は、通常は、アゴニストまたはアンタゴニストが必要とされる部位に、患者に直接注射される。エキソビボでの処置については、患者の細胞が採取され、核酸がこれらの単離された細胞中に導入され、そして改変された細胞が患者に直接、または例えば、患者に移植される有孔性の膜内にカプセル化されてのいずれかで、投与される（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号、および同第５，２８３，１８７号を参照のこと）。生存可能な細胞中に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸がインビトロで培養された細胞中に導入されるか、または意図される宿主の細胞中にインビボで導入されるかどうかに依存して変化する。インビトロで哺乳動物細胞中に核酸を導入するために適切な技術として、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。一般的に使用される遺伝子のエキソビボでの送達のためのベクターは、レトロウイルスである。
【０１２５】
現在好ましいインビボでの核酸の導入技術として、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）を用いるトランスフェクション、および脂質に基づく系（例えば、遺伝子の脂質によって媒介される導入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が挙げられる。いくつかの状況においては、標的細胞を標的化する試薬（例えば、表面の膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなど）とともに核酸の供給源を提供することが所望される。リポソームが使用される場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞の表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、キャプシドタンパク質または特定の細胞型について向性であるそのフラグメント、循環においてインターナライズされたタンパク質についての抗体、および細胞内での位置を標的化しそして細胞内での寿命を増大させるタンパク質を、標的化し、そして／またはその取りこみを促進するために使用され得る。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。現在公知の遺伝子マーカーおよび遺伝子治療プロトコールの概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。ＷＯ９３／２５６７３号およびその中で引用されている参考文献をもまた参照のこと。
【０１２６】
（Ｅ．結合体化した分子）
上記のアンタゴニストまたはアゴニストの「結合体」、および異種の分子を利用する方法もまた、意図される。アンタゴニストまたはアゴニスト、および異種分子（単数または複数）は、化学的な架橋、融合タンパク質の産生などを含む種々の異なる様式で連結される。
【０１２７】
本明細書中の好ましい結合体は、その血清半減期を増大させる分子に結合されたアゴニストまたはアンタゴニストを含む。例えば、当業者は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に示されている様式で、種々の非タンパク質性のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の任意の１つに対してアゴニストまたはアンタゴニストを連結し得る。
【０１２８】
別の好ましい結合体は、細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬に結合されたアンタゴニストを含む。このような構築物を生成するために有用な例示的な細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬として、限定的ではないが、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）または放射活性同意元素（すなわち、放射結合体）が挙げられる。
【０１２９】
このような結合体の生成に有用な化学療法剤は、上記に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとして、以下が挙げられる：ジフテリアのＡ鎖、ジフテリア毒素の非毒性の活性なフラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ
ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ。種々の放射性核種が、放射を結合させられたアンタゴニストの産生のために利用可能である。例として、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられる。
【０１３０】
アンタゴニストと、細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬との結合体は、以下のような種々の二官能性のタンパク質カップリング試薬を使用して作製される：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレート（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性の誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性なエステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フロリン化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。例えば、リシンの免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４−で標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、抗体への放射性核種の結合のための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。あるいは、ポリペプチドアンタゴニスト、および細胞毒性または細胞増殖抑制性のポリペプチドを含有している融合タンパク質が、調製され得る。このような分子はまた、例えば、ペプチド合成によって生成され得る。
【０１３１】
別の実施形態においては、アンタゴニストは、腫瘍の予備標的化における利用のために、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合させられ得る。ここでは、アンタゴニスト−レセプター結合体が患者に投与され、その後、キレート化剤を使用して循環から結合した結合体が除去され、次いで細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬に結語させられた「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１３２】
本発明のアンタゴニストはまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性な抗ガン剤に転換するプロドラッグ活性化酵素にアンタゴニストを結合させることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０１３３】
ＡＤＥＰＴに有用なアンタゴニスト結合体の酵素成分として、それをより活性な、細胞毒性の形態に転換するような様式で、プロドラッグに対して作用し得る任意の酵素が挙げられる。
【０１３４】
本発明の方法において有用な酵素として、限定的ではないが、以下のものが挙げられる：リン酸塩を含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩を含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なアリールスルフェート；非毒性の５−フルオロシトシンを抗ガン剤である５−フルオロウラシルに転換するために有用なシトシンデアミナーゼ；セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）のような、ペプチドを含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを転換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なβ−ガラクトシダーゼ、およびノイラミニダーゼのような、炭水化物を切断する酵素；β−ラクタムを用いて誘導された薬物を遊離の薬物に転換するために有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにそれらのアミン窒素でフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基をそれぞれ用いて誘導体化された薬物を遊離の薬物に転換するために有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのような、ペニシリン。あるいは、「アブザイム（ａｂｚｙｍｅ）」としてもまた当業者に公知である、酵素活性を有する抗体が、本発明のプロドラッグを遊離の薬物に転換するために使用され得る（Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム結合体は、腫瘍細胞の集団へのアブザイムの送達のために、本明細書中で記載されているように調製され得る。
【０１３５】
本発明の酵素は、上記で議論されているの異種二官能性架橋剤の使用のような、当該分野で周知の技術によってアンタゴニストに共有結合させられ得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に対して連結された、本発明のアンタゴニストの少なくともＥｐｈレセプター結合ドメインまたはＥｐｈリガンド結合ドメインを含有している融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
【０１３６】
（Ｆ．薬学的組成物）
アゴニストまたはアンタゴニストの治療用の処方物は、最適な生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤とともに、所望の程度の純度を有するアゴニストまたはアンタゴニストを混合することによって、凍結乾燥させられた処方物または水性の溶液の形態で、貯蔵のために調製される。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（およそ１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；モノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロール、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成するカウンターイオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／あるいは非イオン性の界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（ＴＭ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１３７】
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、リポソーム中に処方され得る。目的の分子を含有しているリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているような、当該分野で公知の方法によって調製される。延長された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１３８】
特に有用な免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧによって誘導されるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有している脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、規定された孔の大きさのフィルターを通じて押し出されて、所望の直径のリポソームを生じる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているようなリポソームに対して、ジスルフィド相互交換反応を介して結合させられ得る。化学療法剤（ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）のような）は、必要に応じて、リポソーム中に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１３９】
本明細書中の処方物はまた、１を超える活性な化合物を、処置される特定の適用に必要とされている場合に、含み得る。好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、適切には、意図される目的のために有効な量での組合せで、存在する。例えば、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストは、化学療法剤またはエストロゲンと組み合わせられ得る。
【０１４０】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面の重合（例えば、それぞれ、コロイド状の薬物の送達系（例えば，リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマイクロエマルジョンにおいて、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって、調製されたマイクロカプセル中に捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１４１】
インビボでの投与のために使用される処方物は、滅菌されなければならない。これは、滅菌の濾過膜を通過させる濾過によって容易に達成される。
【０１４２】
徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例として、アンタゴニストを含有している固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形されたものの形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）である。徐放マトリックスの例として、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性のエチレンビニルアセテート、分解性の乳酸−グリコール酸のコポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸のコポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間以上にわたって分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲル放出タンパク質はより短い時間の期間である。カプセル化された抗体が長時間体内に留まる場合には、これらは、３７℃の水分への暴露の結果として、変成するかまたは凝集し得る。その結果、生物学的活性の欠失および免疫原性における可能な変化を生じる。合理的なストラテジーが、関連する機構に依存して安定化のために案出され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド相互交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合であることが発見されると、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性の溶液から凍結乾燥させること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１４３】
（Ｇ．ＥＰＨレセプターアンタゴニストを用いる治療）
治療的な適用のためには、本発明のアンタゴニストは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）に対して、上記に議論されているような薬学的に受容可能な投与量形態で投与される。これには、追加投与としてヒトの静脈内に投与され得るか、または一定の期間にわたる持続的な注入によって、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄こう内、経口、局所、または吸入による経路によって投与され得るものが含まれる。アンタゴニストはまた、局所的および全身的な治療効果を発揮するように、腫瘍内、腫瘍の周囲、病変内、病変の周囲の経路によって適切に投与される。腹膜内経路は、例えば、卵巣の腫瘍の処置において特に有用であると予想される。
【０１４４】
疾患の予防または処置のためには、アンタゴニストの適切な投与量は、上記に定義されているような処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、アンタゴニストが予防目的または治療目的のために投与されるかどうか、過去の治療、患者の臨床的な病歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに手当てする医師の裁量に依存する。アンタゴニストは、一度に、または一連の処置にわたって患者に対して適切に投与される。
【０１４５】
アンタゴニストは、種々の新生物性および新生物性ではない疾患および障害の処置において有用である。処置に敏感に反応するガンおよび関連する状態として、以下が挙げられる：乳ガン腫、肺ガン腫、胃ガン腫、食道ガン腫、結腸直腸ガン腫、肝臓ガン腫、卵巣ガン腫、卵胞膜細胞腫、巣男性胚細胞腫、頚ガン腫、子宮内膜のガン腫、子宮内膜の過形成、内分裂、繊維肉腫、絨毛膜癌、頭部および頚部のガン、鼻咽頭のガン腫、咽頭部のガン腫、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚のガン腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、すい臓ガン腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫、神経鞘腫、乏突起神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨形成性肉腫、平滑筋肉腫、尿管のガン腫、甲状腺ガン腫、ウィルムス腫瘍、腎細胞のガン腫、前立腺ガン腫、母斑症に関連する異常な血管の増殖、浮腫（例えば、脳の腫瘍に関連するもの）、およびメーグス症候群。
【０１４６】
処置に敏感に反応する新生物性ではない状態として、以下が挙げられる：慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、および他の増殖性の網膜症（早熟の網膜症を含む）、水晶体後方線維増殖症、血管新生緑内障、年齢に関連する黄斑部変性、甲状腺の過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織の移植、慢性の炎症、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水症、心外膜滲出液（例えば、心外膜に関連するもの）、および胸膜滲出液。
【０１４７】
疾患の型および重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のアンタゴニストが、例えば、１回以上の別々の投与によるか、または連続的な注入によるかにはかかわらず、患者への投与のための最初の候補の投与量である。典型的な毎日のまたは毎週の投与量は、上記の要素に依存して、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでまたはそれを超える範囲であり得る。状態に依存して数日またはより長い期間にわたって繰り返される投与については、処置は、所望される疾患の症状の抑制が生じるまで繰り返される。しかし、他の投与量レジメが有用であり得る。この治療の進行は、例えば、放射線撮影法による腫瘍の画像化を含む、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１４８】
本発明の別の実施形態に従うと、疾患を予防するかまたは処置することにおけるアンタゴニストの有効性は、アンタゴニストを連続的に投与することによるか、または別の因子と組合せて投与することによって改善され得る。以下のような別の因子が、これらの目的のために有効である：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性または塩基性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の脈管形成性の活性を阻害し得るかまたは中和し得るアンタゴニスト、組織因子、プロテインＣ、またはプロテインＳの凝固活性を阻害し得るかまたは中和し得るアンタゴニスト（１９９１年２月２１日に公開された、ＥｓｍｏｎらのＰＣＴ特許公開番号第９１／０１７５３号を参照のこと）、ＨＥＲ２レセプターに結合し得る抗体のようなアンタゴニスト（米国特許第５，７７２，９９７号を参照のこと）、または以下のような１つ以上の従来の治療薬（例えば、アルカリ化剤、葉酸アンタゴニスト、抗−核酸の代謝の代謝物、抗生物質、ピリミジンアナログ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、チアゾールヌクレオシド、またはコルチコステロイド）。このような他の因子は、投与される組成物中に存在し得るか、または別々に投与され得る。また、アンタゴニストは、放射活性物質の照射または投与を含むかどうかにはかかわらず、放射線医学的な処置と連続して、またはそれと組み合わせて適切に投与される。
【０１４９】
１つの実施形態においては、腫瘍の脈管形成は、組み合わせ治療において攻撃される。アンタゴニストおよび１つ以上の他のアンタゴニストが、例えば、必要である場合には、腫瘍またはその代謝性の主患部の壊死を観察することによって決定されるような、治療的に有効な用量で腫瘍を保有している患者に投与される。この治療は、それ以上の有用な効果を有さないようなこのような時間が観察されるまで、または臨床試験が腫瘍もしくは任意の代謝性の主患部の痕跡を示さなくなるまで継続される。次いで、ＴＮＦが、単独で、または以下のような補助剤ものと組み合わせて投与される：例えば、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、抗−ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン、抗−ヘレグリン抗体、Ｄ−因子、インターロイキン−１（Ｉ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または抗−プロテインＣ抗体もしくは抗−プロテインＳ抗体、またはＣ４ｂ結合タンパク質（１９９１年２月２１日に公開された、Ｅｓｍｏｎら、ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ９１／０１７５３号を参照のこと）のような、腫瘍中の微小血管の凝固を促進する試薬、または加熱もしくは照射。
【０１５０】
補助剤はそれらの有効性において変化するので、従来の様式でのマトリックスのスクリーニングによる、腫瘍に対するそれらの影響を比較することが所望される。アンタゴニストおよびＴＮＦの投与は、所望の臨床的な効果が達成されるまで繰り返される。あるいは、アンタゴニストは、ＴＮＦ、および必要に応じて補助剤（単数または複数）とともに投与される。固形の腫瘍が四肢または他の一般的な循環からの単離に敏感な位置に見出される場合には、本明細書中に記載されている治療薬は、単離された腫瘍または器官に投与される。他の実施形態においては、ＦＧＦまたは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト（例えば、抗−ＦＧＦまたは抗−ＰＤＧＦ中和抗体）が、アンタゴニストと組み合わせて患者に投与される。アンタゴニストでの処置は、必要に応じて、創傷の治癒または所望される血管新生の期間の間は中断され得る。
【０１５１】
１つの実施形態においては、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストは、エストロゲン治療によって生じる脈管の奇形（例えば、小さい血管の奇形）を処置するために使用される。Ｅｐｈレセプターアンタゴニストの投与は、患者へのエストロゲンの投与の前または後であり得る。例えば、Ｅｐｈレセプターアンタゴニストおよびエストロゲンが同じ組成物中で提供される場合には、付随する治療もまた、意図される。エストロゲンの投与量は、以前から既知の量に対応する。
【０１５２】
（Ｈ．ＥＰＨレセプターアゴニストでの治療）
本発明は、哺乳動物にＥｐｈレセプターアゴニストを投与することを含む、脈管形成を刺激する方法を提供する。例えば、アゴニストは、脈管のネットワークに対する外傷の処置のような、血管内皮に関連する状態を処置するために使用され得る。このように処置され得るこのような外傷の例として、限定的ではないが、以下が挙げられる；外科的な切開（特に、心臓に関するもの）、創傷（血管の裂傷、切開、および穿通を含む）、ならびに表面の潰瘍（糖尿病、血友病、および静脈瘤の潰瘍のような血管内皮を含む）。
【０１５３】
上記に言及されている外傷の適用については、Ｅｐｈレセプターアゴニストが処方され、そして処置される特異的な障害、個々の患者の状態、Ｅｐｈレセプターアゴニストの送達部位、投与方法、および医師に公知の他の因子を考慮して、良好な医学的な慣例と一致する様式で投与される。
【０１５４】
Ｅｐｈレセプターアゴニストのさらなる適用は、表皮の潰瘍のような厚み全体の創傷（床ずれ、静脈性の潰瘍、および糖尿病の潰瘍のカテゴリーを含む）、ならびに厚み全体の火傷および傷害（脈管形成が皮膚移植片または皮膚弁について火傷または損傷した部位を調製するために必要とされる場合）の処置である。この症例においては、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、その部位に直接適用されるか、または移植の前に移植される皮膚または皮膚弁を浸すために使用される。同様の様式において、Ｅｐｈレセプターアゴニストが、火傷または他の外傷後に再構成が必要とされる形成外科手術において、または美容目的に使用され得る。
【０１５５】
脈管形成はまた、創傷を清潔に、そして感染していない状態を維持することにおいて重要である。従って、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、一般的な外科手術と組み合わせて、そして切開および裂傷の修復後に使用され得る。これは、高い感染の危険性を有する異常な創傷の処置において特に有用である。血管新生は、骨折の修復の鍵となる。なぜなら、血管は、骨の損傷部位で発達するからである。Ｅｐｈレセプターアゴニストの骨折部位への投与が、従って別の有用性である。
【０１５６】
Ｅｐｈレセプターアゴニストが局所的な創傷の治癒のために使用される場合には、上記のように、これは、血管組織の再内皮細胞化の前に、任意の記載されている経路によって、またはより好ましくは、局所的な手段によって投与され得る。これらの場合においては、これは、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、軟膏、または乾燥粉末のいずれかとして、傷害の部位に直接投与される。傷害部位に対してＥｐｈレセプターアゴニストを指向させてゆっくりと放出するデバイスもまた、使用される。局所的な適用においては、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、約５０から１，０００μｇ／ｍＬまでの範囲の濃度で、１回の適用で、または1週間から数週間の期間についての毎日もしくは数日おきの投与レジメのいずれかで適用される。一般的には、投与される局所的な処方物の量は、創傷の表面積に基づいて、約０．１から１００μｇ／ｃｍ2までのＥｐｈレセプターアゴニストが適用されるに十分な量である。
【０１５７】
Ｅｐｈレセプターアゴニストは、バルーン血管形成術（血管内皮細胞が、アテローム性動脈硬化症のプラークの圧縮とともに除去されているかまたは損傷している場合の手順）において外科手術後に創傷を治癒させる試薬として使用され得る。Ｅｐｈレセプターアゴニストは、静脈内の追加の注射または注入としてのいずれかとして、全身的または局所的な適用によって、内部の血管の尿面に適用され得る。所望される場合には、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、マイクロメーターポンプ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｉｎｇ  ｐｕｍｐ）を使用して経時的に投与され得る。静脈内投与に適切な組成物は、内皮細胞の増殖を促進するために十分な量のＥｐｈレセプターアゴニストおよび非経口的なキャリア物質を含む。Ｅｐｈレセプターアゴニストは、例えば、約５０μｇ／ｍＬから約１，０００μｇ／ｍＬまでの広範な濃度の範囲にわたる組成物中に存在し得る。これは、患者あたり３から１０ｍＬ注射を使用して、１回で投与されるか、または複数回の適用が可能である投与レジメにおいて投与される。任意の公知の非経口のキャリアビヒクル（例えば、通常の生理食塩水または５〜１０％のデキストロース）が、使用され得る。
【０１５８】
Ｅｐｈレセプターアゴニストはまた、血管の移植の外科手術において内皮細胞の形成を促進するために使用され得る。移植された血管または全身的な材料のいずれかを使用する血管の移植の場合においては、例えば、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、血管内皮細胞の増殖を促進するために、移植片の表面に適用され得、そして／または移植片と既存の血管構造との接合部に適用される。このような適用については、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、バルーン血管形成術について上記のように、静脈内に適用され得るか、またはこれは、外科手術の前または後のいずれかで、移植変の表面および／または既存の血管構造に対して直接適用され得る。このような場合においては、厚くなったキャリア材料中のＥｐｈレセプターアゴニストを適用することが所望され得る。その結果、これは、罹患した表面に接着する。適切なキャリア材料として、例えば、１〜５％のカルボポールが挙げられる。Ｅｐｈレセプターアゴニストは、例えば、約５０μｇ／ｍｇから約１，０００μｇ／ｍｇ間での広範なの濃度の範囲にわたってキャリア中に存在し得る。あるいは、Ｅｐｈレセプターアゴニストは、非経口の溶液として、マイクロメーターポンプによってその部位に送達され得る。
【０１５９】
Ｅｐｈレセプターアゴニストはまた、心筋梗塞後の血管の損傷を修復するために、および側副の循環の増殖を刺激することによって、冠状動脈のバイパス手術の必要性を回避するために、使用され得る。Ｅｐｈレセプターアゴニストは、個々の注射において、または上記のような一定の期間にわたってマイクロメーターポンプによって、または損傷した心筋の部位への直接的な注入もしくは注射によってのいずれかで、この目的のために静脈内投与される。
【０１６０】
Ｅｐｈレセプターアゴニストの投与経路は、例えば、特異的な適用については上記のような投与経路、ならびに静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、または病変内の手段による注射または注入の一般的な経路、あるいは以下に示されているような徐放系のような、既知の方法に従う。Ｅｐｈレセプターアゴニストは、注入によって持続的に、または追加の注射によって投与される。一般的には、傷害が許容する場合には、部位特異的送達のためのＥｐｈレセプターアゴニストを処方および投与すべきである。このことは、創傷および潰瘍の場合に便利である。
【０１６１】
治療的に使用されるＥｐｈレセプターアゴニストの有効量は、例えば、治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存する。従って、治療する医師には、投与量を滴定し、そして最適な治療効果を得るために必要とされる場合には投与経路を改変することが、必要とされる。代表的には、医師は、所望の効果を達成する投与量に達するまで、Ｅｐｈレセプターアゴニストを投与する。全身的な処置についての代表的な毎日の投与量は、上記の要素に依存して、約１μｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇ、またはそれを超える範囲であり得る。別の一般的な計画として、Ｅｐｈレセプターアゴニストが処方され、そして標的部位もしくは組織に対して、約０．１ｎｇ／ｃｃより大きく、最大用量（これは、効果的であるが甚だしく毒性ではない）を超えないレベルのＥｐｈレセプターアゴニストを、組織中の確立され得る投与量で送達される。この組織内濃度は、可能である場合には、持続的な注入、徐放、局所的な適用、または経験的に決定された頻度での注射によって、維持されるべきである。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６２】
細胞の増殖および修復を促進することにおいては、Ｅｐｈレセプターアゴニスト治療を、任意の増殖因子（Ｅｐｈレセプターアゴニストを含む）の活性を増強するために、他の新規のまたは従来の治療（例えば、ＶＥＧＦのような増殖因子、酸性もしくは塩基性の繊維芽細胞増殖因子（それぞれ、ａＦＧＦもしくはｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、アナボリックステロイド、ＥＧＦまたはＴＧＦ−β）と組み合わせることは、本発明の範囲内である。このような同時処置薬物は、それ自体が、本発明の組成物中には含まれる必要はないが、これは、このような薬物がタンパク質性である場合には便利である。このような混合物は、適切には、単独で使用されるＥｐｈレセプターアゴニストと同じ様式で、そして同じ目的のために投与される。このような二次的な増殖因子に対する有用なＥｐｈレセプターアゴニストのモル比は、代表的には、１：０．１〜１０であり、好ましくはほぼ等モル量である。
【０１６３】
（Ｉ．製品）
本発明の別の実施形態においては、上記に記載されている傷害の処置に有用な材料を含有している製品が提供される。この製品は、容器およびラベル（例えば、添付説明書）を含む。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成され得る。容器は、組成物を含む。組成物は、症状を処置するために有効であり、そして滅菌のアクセス口を有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射の針によって突き刺すことができるストッパーを有し得るバイアルであり得る。）。組成物中の活性な試薬は、アンタゴニストまたはアゴニストである。容器上のまたはそれに付随するラベルは、選択された症状を処置するために組成物が使用されることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液のような薬学的に受容可能な緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジなどを含む、市販のおよび使用者の観点から所望される他の材料をさらに含み得る。
【０１６４】
以下の実施例は、例示の目的にのみで提供され得、限定のためには提供されない。本明細書において引用されるすべての文献の開示は、本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【０１６５】
（実施例１）
この実施例は、ＥｐｈＢ４レセプターが、始原毛細管ネットワークの脈管形成性の改造を促進するために必須であることを示す。ＥｐｈＢ４を欠損しているマウスは、より早熟な表現形を有し、そしておよそＥ９．５〜Ｅ１０で死亡した。心臓は膨張し、そして主要な動脈および静脈は、重篤な異形症であった。最も顕著には、始原胚体外および胚体内の毛細管ネットワークの脈管形成性の改造が完全に中止しており、そして大きな内皮のシートが巨大なほとんど組み立てられていない洞様血管に組み立てられていた。従って、ＥｐｈＢ４経路は、始原血管系が新芽形成および腸重積症を通じて再編成を開始する場合に、初期段階の脈管形成を支配する。
【０１６６】
ＥｐｈＢ４遺伝子を、マウスの胚幹（ＥＳ）細胞を図１に示されている置換ベクターでトランスフェクトすることによって不活化した。相同組換えが、２００のＧ−４１８およびガンシクロビル耐性ＥＳ細胞コロニー中で約１の頻度で起こり、そしてシグナルペプチドを含むタンパク質の最初の３８２個のアミノ酸残基をコードするＥｐｈＢ４遺伝子の領域のネオマイシン耐性遺伝子での置換を生じた。標的化されたＥＳ細胞中、および生殖系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）キメラの子孫における変異したＥｐｈＢ４遺伝子の構造を、サザンブロット分析によって同定した（図２）。変異についてヘテロ接合型であるマウスは、明らかな表現形の異常は有さず、そして繁殖性であった。しかし、ＥｐｈＢ４−／−マウスは、ヘテロ接合型の交配によって１１４の子孫の間では見出されなかった。ＥｐｈＢ４変異が致死となる時間を決定するために、Ｆ１雑種に由来する胚を種々の段階で試験した。Ｅ９．５〜Ｅ１０．０まででは、生存性のＥｐｈＢ４−／−胚が、予想されるメンデルの比で存在した。Ｅ１０．５では全てのヘテロ接合型の改変体の胚が、大量のアポトーシスおよび／または壊死によって実証されるように死亡した。
【０１６７】
Ｅ９．５の胚におけるインサイチュハイブリダイゼーションのホールマウントが、耳のベシクルを含む膨張した系において優先的に特異的なＥｐｈＢ４の発現を明らかにした（図３Ａ）。特異的な発現はまた、発達中の心臓において見出された。一方、発現は拡散し、そしておそらく大きな間葉性である。これは四肢の芽においていくつかの優勢を伴う。変異胚は、ゆっくりと増殖し、そして一貫して拡張した心臓を有した（図３Ｂ）。組織学的な分析は、小さい血管のレベルでの、突き刺されている血管の欠損を明らかにした。従って、神経管のまわりの毛細血管（将来、脳軟膜および脈絡膜の叢）は、非常に拡張した（図４Ａ）。内皮細胞のマーカーとしての血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）の免疫染色は、増殖している四肢の芽の結果によって例示されるような、体を通じる膨大な毛細血管の拡大を明らかにした（図４Ｂ）。大きな血管が通常は存在し、そして組織の切片中では明らかな異常は示さないが（図４Ｃ）、抗−ＰＥＣＡＭ抗体での全量の染色がまた、大動脈および大静脈の療法の重篤な異常を明らかにした（図４Ｄおよび４Ｅ）。これらの血管は、一般的には正常な大きさであるが、形態不全（ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｃ）であり、そして不ぞろいな形状である。驚くべきことに、集まる血管の分岐および統合が、基本的な頭部の静脈によって示されているように、崩壊された（図４Ｅ）。
【０１６８】
血管の不全は、卵黄嚢において最も劇的である。これは、通常は血液の島状構造である始原毛細管ネットワークの代わりに、大きな内皮の洞様血管から構成される（図５Ａ）。大きな血管は、ビテリン動脈および静脈を除いて、検出することができない。これらの洞様血管にそって並び、そして卵黄嚢の上皮細胞を覆う内皮層は、組織学的および電子顕微鏡の両方によって試験した場合に、明らかな異常は示さず、そして内皮細胞は、正常な密度で存在した（図５Ｂ）。赤血球の発達は、ヘモグロビンのベンジジン染色によって明らかであるように、正常であり、そして変異体Ｅ９．５胚は、機能的な心臓血管系を有した。なぜなら、血球を、血管系を通じて観察したからであった。しかし、おそらく、低い抹消血管耐性が、致死性の血液動態の不全症を引き起こしたのかもしれない。
【０１６９】
従って、造血幹細胞および血管芽細胞前駆体からの血管芽細胞の分化、神経周囲の血管叢のような離れた部位への血管芽細胞の移動、ならびに始原毛細管ネットワークの形成を含む、血管の発達の初期段階は、ＥｐｈＢ４遺伝子の不活化によって罹患されていないまま維持された。従って、変異体Ｅ９．５の胚を通じて形成された病理学的な内皮の洞様血管（ここでは、毛細血管の床は、通常は、血管の末梢組織に対して出発する）は、成熟した毛細管ネットワークの形成の基礎となる脈管形成の改造のプロセスにおける重篤な欠損を反映する。これらは、新規の新芽形成、およびすでに存在している血管の分断または重積の相互作用を通じて形成されると考えられる。Ｅ９．５  ＥｐｈＢ４−／−胚の卵黄嚢中で最も顕著に観察された欠損は、始原血管が血管の再生が経管腔（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ）での分配を通じて開始前に、統合される段階での停止を反映する。新芽形成性の脈管形成（これは、例えば、神経管の心室周辺での層で産生されたＶＥＧＦに応答して生じる）もまた、ＥｐｈＢ４−／−胚に影響を与え得る。なぜなら、変異胚の神経上皮は、血管形成することができないからである（図６）。実際、正常に分化した内皮細胞は、間葉組織および神経上皮との間の界面で停止し、そして上皮層に侵入するかわりに連続的な内皮のシートを形成することが見られる。この段階で、ＥｐｈＢ４の発現は、最も顕著である（図３Ａ）。
【０１７０】
（方法）
ＥｐｈＢ４遺伝子の標的化された崩壊：マウスのＥｐｈＢ４の、細胞外ドメイン全体および細胞内ドメインの一部をコードする１８ｋｂの遺伝子のフラグメントを、マウスのＥｐｈＢ４  ｃＤＮＡプローブ（Ａｎｄｒｅｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１４６１−１４６７（１９９４））を使用してλＤａｓｈＩＩ株１２９Ｓｖライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離し、そして４個のＸｂａＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にサブクローニングした。置換ベクターを、ポリオーマエンハンサープロモーターによって駆動される単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に隣接して、ｐＴＫ．ｎｅｏ．ｕｍｓ（Ｒｅｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４７９８−４８０６（１９９４））中の翻訳開始コドンの上流の配列を含有している１．１ＫｂのＢｓｐＭＩＩ−ＡｐａＩフラグメント、およびｐＴＫ．ｎｅｏ．ｕｍｓのＣｌａＩ中に未熟なタンパク質のアミノ酸３８３−５６３をコードするエキソンを含有している４．０ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｂａＩフラグメントを挿入することによって構築した。標的化構築物を、ＰＧＫプロモーターの制御下に配置したネオマイシン耐性遺伝子を有する１１ｋｂのＥｐｈＢ４遺伝子で置換し、それによって、ＥｐｈＢ４タンパク質の最初の３８２アミノ酸をコードする遺伝子部分を欠失させた。ＥＳ細胞（Ｒｅｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４７９８−４８０６（１９９４））を電気泳動し、そして記載されているようにコロニーを選択した（Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：５７１−５７８（１９９８））。相同組換え体を、標的化ベクターの５’末端のすぐ上流のゲノム配列に対応するＥｐｈＢ４特異的な正方向プライマー（ｐＨＴＫｃ１、ＡＣＴＴＡＡＣＧＴＧＣＡＣＧＣＡＣＴＧＡＴ−配列番号１）、およびネオマイシン耐性遺伝子について特異的な逆方向プライマー（ｐＨＴＫｃ２、ＡＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧ−配列番号２）を使用して、ＰＣＲによって検出した。相同組込みを、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって、標的化ベクターの下流のゲノム配列に由来する３２−Ｐ標識した１．５ＫｂのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩプローブを使用して、確認した。ポジティブなクローンを、ＥｐｈＢ４野生型対立遺伝子に典型的な９ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに加えて、６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの存在によって同定した。
【０１７１】
発生学的な分析：遺伝子型を、ネオマイシン耐性遺伝子について特異的なプライマーの対（ｐＮｅｏ４７４＋、ＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣ−配列番号３−、およびｐＮｅｏ１５１３−、ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴ−配列番号４）、またはＥｐｈＢ４遺伝子内の欠失を含むプライマーの対（ｐＨｔｋＶ７−２  １５２＋、ＣＴＴＴＡＴＧＴＧＡＧＧＹＴＧＧＧＧＡＣＡ−配列番号５、およびｐＨｔｋ  ｐ４６９−ｗｔ、ＣＣＧＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＴＣＧＴ−配列番号６）を使用して、卵黄嚢または胚のＤＮＡから決定した。
【０１７２】
Ｅ８．５からＥ１１．５までの間を除去した胚を、４％のパラホルムアルデヒドで２時間、室温で固定した。組織学的分析のために、胚および卵黄嚢を脱水し、パラフィンで包埋し、断片化（一般的には、８μｍ）、そして標準的なプロトコールに従ってＧｉｌｌのヘマトキシリンでカウンター染色した。
【０１７３】
全ての（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）のインサイチュハイブリダイゼーション：ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションを、記載されているように行った（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．「Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｍｂｒｙｐｓ」、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏ．，（１９９２）７５−８３頁）。ＥｐｈＢ４のアンチセンスプローブを、ｐＢＩＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングしたＳｓｔＩ  ＥｐｈＢ４  ｃＤＮＡフラグメント（ＥｐｈＢ４のオープンリーディングフレームのヌクレオチド２〜６４４を含む）から合成した。
【０１７４】
免疫組織化学：ホールマウント免疫組織化学を、本質的には記載されているように行った（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：１０８９−１０９８（１９９５））。簡潔には、パラホルムアルデヒドで固定した胚および卵黄嚢をＰＢＳ中でリンスし、メタノール中で脱水し、メタノール中の５％の過酸化水素中で室温で４〜５時間漂白し、、そしてメタノールでリンスした。サンプルを再水和し、４℃で１時間、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ＰＢＳＴ）および１０％のＦＣＳを含有しているＰＢＳ中でインキュベートし、そして抗−ＰＥＣＡＭ  Ｍａｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＭＥＣ１３．３，１／２５０稀釈）とともに、一晩、４℃でインキュベートした。続いて、サンプルを、ＰＢＳＴ中で４℃で１時間を５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＴＡＣＯ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃６４７０、１／１００稀釈）とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳＴ中で４℃で１時間を５回洗浄し、そして０．２％のＢＳＡ（ＰＢＴ）を補充したＰＢＳＴ中で室温で２０分間を１回インキュベートした。ペルオキシダーゼ染色を、ＰＢＴ中の０．３ｍｇ／ｍｌのＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間のインキュベーション、続いて０．０３％の最終濃度に水素ペルオキシダーゼを添加して、行った。１０分後、反応を、ＰＢＴおよびＰＢＳＴ中でリンスすることによって停止させた。染色した胚を、４％のパラホルムアルデヒド中に固定した。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、マウスＥｐｈＢ４を概略的に示し、このマウスＥｐｈＢ４は、９８７アミノ酸を有し、そしてシグナルペプチド、グロブリン様ドメイン、システインリッチドメイン（アミノ酸１８４〜３７３）、２つのフィブロネクチンＩＩＩ反復（ＦＮＩＩＩ、アミノ酸３２４〜４０８、４３４〜５０９）、および細胞質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫ、アミノ酸６１５〜８７８）を含み、これらは、全てＥｐｈファミリー内で保存されている。マウスＥｐｈＢ４レセプター遺伝子のゲノム構造は、部分的にのみ決定された。黒四角：既知のエキソン；白四角：マッピングされていない。
【図２】図２は、ＥｃｏＲＩ消化した、Ｅ９．５胚由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。プローブ：１．５ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（隣接プローブ）は、その標的化ベクターの下流のゲノム配列に由来する（図１を参照のこと）。
【図３】図３Ａは、Ｅ９．５のホールマウント（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションを示す。図３Ｂは、Ｅ９．５  ＥｐｈＢ４＋／−（左）およびＥｐｈＢ４−／−（右）の胚の暗視野表示である。
【図４−１】図４Ａ〜Ｅは、抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚の組織学的分析およびホールマウント分析を示す。図４Ａは、Ｅ９．５胚の冠状頭部断面（×２４０）を示す。図４Ｂは、Ｅ．９．５胚の前肢芽（×９６０）の断面を示す。図４Ｃは、Ｅ９．５胚の冠状体幹断面（×２４０）を示す（ｄａ、背部大動脈；ｃｖ、主静脈）。図４Ｄは、ホールマウント抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚を示す（ｄａ、背部大動脈；ａａ、大動脈弓）。図４Ｅは、前主動脈の上流の前部集合頭部静脈（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｈｅａｄ  ｖｅｉｎ）（ａｃｖ）の拡大図である。
【図４−２】図４Ａ〜Ｅは、抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚の組織学的分析およびホールマウント分析を示す。図４Ａは、Ｅ９．５胚の冠状頭部断面（×２４０）を示す。図４Ｂは、Ｅ．９．５胚の前肢芽（×９６０）の断面を示す。図４Ｃは、Ｅ９．５胚の冠状体幹断面（×２４０）を示す（ｄａ、背部大動脈；ｃｖ、主静脈）。図４Ｄは、ホールマウント抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚を示す（ｄａ、背部大動脈；ａａ、大動脈弓）。図４Ｅは、前主動脈の上流の前部集合頭部静脈（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｈｅａｄ  ｖｅｉｎ）（ａｃｖ）の拡大図である。
【図４−３】図４Ａ〜Ｅは、抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚の組織学的分析およびホールマウント分析を示す。図４Ａは、Ｅ９．５胚の冠状頭部断面（×２４０）を示す。図４Ｂは、Ｅ．９．５胚の前肢芽（×９６０）の断面を示す。図４Ｃは、Ｅ９．５胚の冠状体幹断面（×２４０）を示す（ｄａ、背部大動脈；ｃｖ、主静脈）。図４Ｄは、ホールマウント抗ＰＥＣＡＭ免疫染色したＥ９．５胚を示す（ｄａ、背部大動脈；ａａ、大動脈弓）。図４Ｅは、前主動脈の上流の前部集合頭部静脈（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｈｅａｄ  ｖｅｉｎ）（ａｃｖ）の拡大図である。
【図５】図５Ａは、抗ＰＥＣＡＭ染色したＥ１０．０卵黄嚢の断面（×１２０）を示す。図５Ｂは、抗ＰＥＣＡＭ染色したＥ９．５卵黄嚢の断面（×４８０）を示す。
【図６】図６は、Ｅ９．５胚の冠状頭部断面；感覚上皮の拡大（×９６０）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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