(57)【要約】【課題】これまで種々の検査手段では確実な検出が困難であった骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）あるいは白血病化ＭＤＳを確実に検出するために有用な造血幹細胞を提供することを課題とする。【解決手段】ＭＤＳ患者が疑われるの骨髄液または末梢血から、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ抗原陰性であることを特徴とするＣＤ４５陰性造血幹細胞の組成物を検出することにより、ＭＤＳの確定診断法を行なうことができる。更にはＣＤ４５陰性造血幹細胞を用いてＭＤＳの新規な治療剤を開発することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４５陰性かつＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ抗原陰性であることを特徴とするＣＤ４５陰性造血幹細胞の組成物。
【請求項２】
Ｌｉｎｅａｇｅ抗原がＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ４１ａ、ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ、ＣＤ３、ＣＤ１９及びＣＤ５６からなる群から選ばれる１種以上の抗原である請求項１に記載の造血幹細胞の組成物。
【請求項３】
細胞組成物が自己再生でき、単球系、赤芽球系、巨核球系、好中球系細胞またはリンパ系の造血系メンバーへの分化を行うことができることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ＭＤＳ）の検出に有用なＣＤ４５陰性造血幹細胞に関する。また、ＣＤ４５陰性造血幹細胞を傷害あるいは正常に分化させることによる、ＭＤＳの新規な治療剤の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【０００３】
ＭＤＳの現在の診断方法としては、血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少、bicytopenia、汎血球減少）を示す症例がいれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄での芽球の比率や染色体の核型分析によって診断する。 
【０００４】
赤血球系では軽度の大球性貧血（ＭＣＶで100〜110 fl）が骨髄異形成症候群を疑うきっかけとなり、骨髄での最も特徴的な所見は、巨赤芽球様変化（ｍｅｇａｌｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｈａｎｇｅ）と環状鉄芽球である。白血球系では、好中球の顆粒減少と偽ペルゲル異常のような核の分葉の減少が、血小板系では巨大血小板と骨髄での小型巨核球が特徴的である。しかし、これらの形態異常は、ビタミンＢ１２欠乏・葉酸欠乏・ＨＩＶなどのウイルス感染、さらに抗癌剤や抗生剤および有機溶媒への暴露などによっても生ずる可能性があるので、鑑別には注意が必要である。
【０００５】
骨髄異形成症候群の10〜15％は低形成性骨髄異形成症候群であり、再生不良性貧血などとの鑑別が難しいこともある。一部には線維症を伴った症例もあることが知られているので、骨髄生検も実施することが重要である。
【０００６】
診断の手順は、骨髄検査により細胞密度および骨髄像を評価する。ＦＡＢ分類では、有核細胞中の芽球が30％未満の場合か、有核細胞中の赤芽球が50％以上ならば赤芽球以外の細胞中の芽球の比率が30％未満の場合に、骨髄異形成症候群と診断したが、新たに提唱されたＷＨＯ分類では芽球の比率が20％以上の場合が急性白血病と定義されている。以下にＦＡＢ分類の5病型について簡単に記載する。（非特許文献１参照）
【０００７】
Ａ）不応性貧血（ＲＡ、ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｎｅｍｉａ）
骨髄異形成症候群の20〜35％を占めている。骨髄の芽球比率は5％未満、環状鉄芽球は15％未満である。 
【０００８】
Ｂ）鉄芽球性貧血（ＲＡＲＳ、ｓｉｄｅｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）
骨髄異形成症候群の2〜20％を占めている。骨髄の鉄芽球の中で環状鉄芽球が15％以上を占めているが、骨髄の芽球比率は5％未満である。 
【０００９】
Ｃ）芽球過剰性不応性貧血（ＲＡＥＢ、ＲＡＥＭ、ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｎｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｅｓｓ  ｏｆ  ｂｌａｓｔ）
骨髄異形成症候群の20％〜1/3を占めている。芽球の比率は、骨髄で５〜20％、末梢血で1〜5％を占める。 
【００１０】
Ｄ）移行期芽球過剰性不応性貧血（ＲＡＥＢ in T、ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｎｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｅｓｓ  ｏｆ  ｂｌａｓｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
ＦＡＢ分類では、芽球の比率が骨髄で21〜30％を占めるものとされていたが、予後が急性白血病と同じことからＷＨＯ分類では削除され、急性白血病として扱われることになった。 
【００１１】
Ｅ）慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＭｏＬ）
骨髄異形成症候群の15〜20％を占め、ＦＡＢ分類では末梢血中の単球数が1,000/μl以上で、芽球の比率が骨髄で20％未満とされていたが、ＷＨＯ分類では骨髄異形成症候群よりも骨髄増殖性疾患（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＭＰＤ）に含まれる病態であると定義されている。
【００１２】
最近の疫学調査の結果によれば、ＭＤＳの発症頻度は骨髄系腫瘍の中で最多である（非特許文献２参照）。しかしながら、多くの研究にもかかわらず、未だ有用な治療法は確立されておらず、白血病化ＭＤＳは治療に不応性のことが多い。一方de novo AMLでは治療に良く反応することが多い。したがって、白血病化ＭＤＳであるか、de novo AMLであるかを早期に鑑別することは、その患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。
【００１３】
de novo AMLとＭＤＳの鑑別を行う方法として、ＭＤＳに特異的な遺伝子Ｄ１ｋの発現を検出することによる分子診断法（特許文献1参照）が開示されている。しかし、この方法は、遺伝子発現又は発現産物のレベルを指標とし、ＤＮＡマイクロアレイや二次元電気泳動を使用する複雑な方法であり、感度も低い。
近年、ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノクローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  ＦＣＭ）により、造血器腫瘍細胞の検出、特に白血病の診断が可能となった。
【００１４】
ＦＣＭで白血病細胞を分析する場合、白血病細胞が他の細胞とはっきり区別が出来る場合は問題が無いが、他の細胞のサイトグラムとオーバーラップして何処をゲーティングしてよいかわからない場合や、白血病細胞の数が減少している場合等は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣパラメーターdot-plotを用いたゲート設定法（ＣＤ４５blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる（非特許文献３参照）が、このときCD４５抗原に注目したのは、あくまでも白血病細胞を特定するために過ぎなかった。
【００１５】
さらに、ＣＤ４５以外の細胞表面抗原の発現パターンによって白血病細胞を検出する方法（特許文献２参照）も報告されている。
発明者の一人である緒方は、ＣＤ４５陰性芽球に注目して、ＭＤＳを検出する方法（特許文献３参照）を報告している。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７４号公報
【特許文献２】特開２０００−２４１４２７号公報
【特許文献３】特願２００４−０２８２６６号
【非特許文献１】http://www.ncc.go.jp/jp/ncc-cis/pro/cancer/020302.html（国立がんセンターホームページ、伊藤 国明 著）
【非特許文献２】Aul C,Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features of myelodysplasticsyndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics.Int J Hematol. 2001; 73(4): 405-10
【非特許文献３】Borowitzら, Am. J. Clin.Pathol 100, 534-540, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、骨髄異形成症候群（Myelodysplastic
syndromes：ＭＤＳ）の検出に有用なＣＤ４５陰性造血幹細胞を提供する。更にはまた、ＣＤ４５陰性幹細胞を傷害あるいは正常に分化させる、ＭＤＳの新規な治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球を更に精査することで、ＭＤＳに特有に存在する細胞集団が分化機能に異常を有する造血幹細胞であることを発見し、本発明を完成させた。
【００１８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＣＤ４５陰性かつＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ抗原陰性であることを特徴とするＣＤ４５陰性造血幹細胞の組成物。
（２）Ｌｉｎｅａｇｅ抗原がＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ４１ａ、ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ、ＣＤ３、ＣＤ１９及びＣＤ５６からなる群から選ばれる１種以上の抗原である前記（１）に記載の造血幹細胞の組成物。
（３）細胞組成物が自己再生でき、単球系、赤芽球系、巨核球系、好中球系細胞またはリンパ系の造血系メンバーへの分化を行うことができることを特徴とする、前記（１）または（２）に記載の細胞組成物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の造血幹細胞を用いれば、ＭＤＳの鑑別を速やかに行うことができる。白血病化ＭＤＳとde novo AMLとでは治療方針が異なるため、両者の鑑別が速やかに行えれば、患者の予後推定、治療方針の決定等に非常に重要である。さらに本発明の造血幹細胞を傷害あるいは正常に分化させることによる、ＭＤＳの治療に有用な治療剤を作ることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明においてＭＤＳとは、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【００２１】
一方、de novo ＡＭＬ及び白血病化ＭＤＳは、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo ＡＭＬは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。
【００２２】
本発明において、ＭＤＳに罹患していることが疑われるとは、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかに罹患しているが、そのいずれに罹患しているのかは不明の状態であることをいう。
【００２３】
ＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なものは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体であって芽球に富むものであり、例えば、末梢血もしくは骨髄細胞等が挙げられる。
【００２４】
骨髄細胞、または末梢血の採取方法としては、患者への侵襲度の低い方法であればいかなる方法でも良い。例えば骨髄細胞の場合、局所麻酔の後、腸骨の背側（骨盤骨）から骨盤穿刺針を用いて注射器で吸引する等、一般的な方法が用いられる。
【００２５】
検体採取時にはヘパリン等の抗凝固剤を加え、採取後速やかに用いることが好ましい。
しかし、末梢血はそのまま、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ、４℃以下にて２４時間まで保存しておくことができる。また、４〜−８０℃、好ましくは−２０℃から−７０℃の低温条件下で２４時間以上保存しておくこともできる。保存に際しては、変性等を抑制するような保存剤等を必要に応じて添加しても良い。
【００２６】
採取した検体はそのまま用いることもできるが、検体中の芽球比率が低い場合には、適切な試薬を用いて芽球比率を高めてから、解析に用いることができる。芽球比率を高めるための適当な試薬としては、例えば、本願発明者らが開発した芽球精製法に基づき商品化されたBlastretriever（登録商標）試薬（日本抗体研究所、高崎）等が挙げられる。検体中の芽球比率はサイトスピン標本を顕微鏡下に観察する等の方法によって測定することができる。芽球比率が低いとは、検体中の芽球の比率が一定以下、例えば全血球に対して芽球が３０％以下であることをいう。芽球比率が一定以上ある検体について、定法により、混入赤血球の溶血作業をおこなう。
【００２７】
上記検体を用いてＭＤＳに特異的な細胞集団を検出する。ＭＤＳに特異的な細胞集団は、検体に含まれる特定の芽球の集団であり、ＭＤＳとしての特異性はその芽球集団の抗原発現により特徴付けられる。具体的には、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ４５陰性の芽球（本明細書中でＣＤ４５陰性芽球と称する）である。
【００２８】
さらに、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更にＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下している。本発明において、ＣＤ１３陽性率とは、解析対象の芽球集団中でＣＤ１３陽性芽球の占める比率をいう。ＣＤ３３陽性率についても同様である。すなわち、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の集団では、同一検体中のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して、ＣＤ１３陽性芽球及びＣＤ４５陽性芽球の占める比率がそれぞれ低下している。この比率がＣＤ４５陰性芽球の集団においてＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団よりも低い数値となっていれば低下していると判断されるが、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上低下していればより確実である。
【００２９】
赤芽球、血小板、形質細胞等の混入がない検体の場合においては、このようにＣＤ４５が陰性であり、さらにＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団におけるものと比較して低下しているということが、ＭＤＳに特異的な細胞集団として必要にして十分な特徴である。
【００３０】
ＣＤ４５陰性の細胞集団には、赤芽球、血小板、形質細胞が混入していることがあるため、確実な検出のためにはこれらの混入細胞の存在を確認しなければならない。そのためには、末梢血等赤芽球や形質細胞のほとんど含まれない検体を解析するか、以下の方法により、ＭＤＳに特異的な細胞をこれらの混入細胞と区別して解析するのがよい。
【００３１】
本発明においてＬｉｎｅａｇｅ抗原とは、骨髄系抗原、血小板系抗原、赤芽球系抗原、リンパ系抗原等の血球の系統を表す抗原をいう。より詳しくは、骨髄系抗原としては、ＣＤ１３、ＣＤ３３等、血小板系抗原としてはＣＤ４１ａ等、赤芽球系抗原としてはGlycophorin A（ＧＰＡ）等、リンパ系抗原としてはＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６等の血球の系統を表す抗原をいう。そのため、Ｌｉｎｅａｇｅ陰性とはこれらの抗原に陰性であることをいい、赤芽球、血小板、形質細胞が混入していないことを示すものである。
【００３２】
赤芽球や血小板はいずれもＣＤ４５陰性または弱陽性であるが、細胞の大きさや特徴的な抗原の相違を利用してＭＤＳに特異的な細胞と区別することができる。例えば、血小板は通常の細胞よりも小さいこと、特徴的な抗原として赤芽球に発現するＧＰＡや形質細胞に発現するＣＤ３８に着目することにより、ＭＤＳに特異的な細胞とこれらの混入細胞を区別することができる。具体的には、例えば、上述の、ＣＤ４５陰性かつＣＤ１３陽性率及びＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して低下しているという特徴に加えてさらにＧＰＡとＣＤ３８が陰性であることをもって、ＭＤＳに特異的な細胞集団の特徴とすることができる。
【００３３】
このような抗原発現の特徴により、ＭＤＳに特異的な細胞集団を検出することができる。検出の方法としては、抗原の発現および細胞の大きさを判別することのできる方法である必要があるため、上述したＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８等のヒト造血系抗原に特異的な抗体を用いた免疫学的方法を用いるのがよい。
【００３４】
免疫学的方法としては、細胞を用いて抗原の存在を検出することのできる方法であれば特に限定はされないが、実際の臨床現場において、簡便にかつ迅速に多量の試料を同時に測定できるという利点から、好適にはＦＣＭを用いて複数の蛍光標識抗体を組み合わせて検査を行うのが好ましい。
【００３５】
ＦＣＭの操作方法は公知の方法（例えば、野村和弘ら編「フローサイトメトリー〜手技と実際〜」1984年，蟹書房、河本圭司ら編「フローサイトメトリー入門」1989年，医学書院、河本圭司ら編「応用サイトメトリー」2000年，医学書院）に準じて行うことができる。
【００３６】
また、ＦＣＭで用いる蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein-isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、ＰｅｒＣＰ（peridin-chlorophyll）、ＥＣＤ（phycoerythrin-Texas-Red）、ＰＣ５（phycoerythrin-cyanin5.1）、ＰＣ７（phycoerythrin-cyanin7）等一般的に市販されている蛍光標識を用いることが出来、これらの組み合わせは自由に行うことができる。
【００３７】
また、ＦＣＭは３カラー又は４カラー解析法によって行うことができるが、４カラー解析法によればより効率よく解析を行うことができる。
本発明において、ＣＤ４５陰性芽球とは特願2004−028266号と同様に同定した細胞をさす。
【００３８】
つまりＣＤ４５とＳＳＣで展開した図において、ＣＤ４５-またはＣＤ４５-/±の細胞集団を認めた場合、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとして、次に赤芽球、血小板、形質細胞の混入をＧＰＡ、ＣＤ３８の発現や細胞の大きさ等により調べる。赤血球、血小板、形質細胞の混入が無いか軽度な検体であれば、そのままＣＤ１３とＣＤ３３のそれぞれの陽性率低下を同一症例のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団のＣＤ１３とＣＤ３３の発現と比較し、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性があると判定することができる。ＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率の低下は、通常ＣＤ３８陽性率の低下を伴う。ＣＤ１３陽性率低下とＣＤ３３陽性率低下が見られた場合は、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとする。赤芽球、血小板、形質細胞の混入のある場合は、赤芽球、血小板、形質細胞以外の細胞集団について、ＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率低下を調べる。例えば、ＣＤ４５抗体としてＣＤ４５-ＰｅｒＣＰを用いた場合では、さらに細胞にＧＰＡ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ＦＩＴＣ、ＣＤ１３−ＰＥの３抗体を加え、ＦＩＴＣ陰性細胞のＣＤ１３の発現を評価する。同様にＣＤ１３−ＰＥの代わりにＣＤ３３−ＰＥを使用し、ＣＤ３３の発現を評価する。
【００３９】
上述のように、本発明の方法によりＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なのは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体である。しかしながら、実際の臨床現場においてはＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかであろうと判断される以前の検体を扱う必要も生ずることがある。また、検体の採取状態によって、ＦＣＭ解析の邪魔をする物質が混入することもある。このような検体を用いた場合であっても、ＭＤＳに特異的な細胞集団を確実に検出するために、上記の抗体に加えて、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ７、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ等の一般的なマーカーを用いて解析を行ってもよい。これらの抗体を使用することにより、検出の精度を高め、より確実な診断をすることが可能となる。
【００４０】
例えば、誤って急性リンパ性白血病の検体を検査した場合、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ２０等が陽性となり、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者ではないことが判明する。また、骨髄芽球のゲーティングが困難な試料においてもＣＤ３４を使用することで骨髄芽球を明確にゲーティングができる。また、血小板は色々な細胞に対して付着しやすい性質があるため、ＭＤＳに特異的な細胞に血小板が付着し、見かけ上血小板抗原（ＣＤ４１ａ等）陽性を示すことがある。この場合、さらに細胞の大きさ、ＣＤ４４の発現（血小板は陰性または弱陽性、ＭＤＳ特異的細胞は陽性を示す場合がある）等で、ＭＤＳ特異的細胞の存在を確認してもよい。
【００４１】
ＭＤＳ特異的細胞であるＣＤ４５陰性芽球について、更に純化を行い、その性質の分析を行うことでその性質を明確にすることができる。
純化の方法は、一般的に行われている純化の方法であればいずれでもよく、上記で用いたフローサイトメトリーを用いた細胞分離のほか、抗体で被覆した磁性マイクロビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックス、プレート吸着等のいずれで行っても良い。
磁性マイクロビーズを用いた場合は、細胞の試料と接触／インキュベートすることで、特定の抗原を持つ細胞が磁性マイクロビーズに被覆した抗体に結合する。次に、磁気カラムに検体を通すことによって、特定の抗原を持つ細胞は磁性マイクロビーズごとカラムに吸着され、目的となる細胞のみを抽出することができる。
【００４２】
具体的には、ＦＣＭの展開図において、ＣＤ４５陰性芽球を同定し、その同定した図を解析することで、その検体にどのような物質が混入しているのかを判断する。この混入物質は患者ごとに異なるため、それぞれの検体においてLineageが陰性になるように抗体を選別し、磁性マイクロビーズ抗体を選択する。より具体的には、Lineage抗原とは、骨髄系抗原、血小板系抗原、赤芽球系抗原、リンパ系抗原等の血球の系統を表す抗原をいう。そのため、Lineageが陰性であるとはこれらの抗原に陰性であることをいい、赤芽球、血小板、形質細胞が混入していないことを示すものである。この選択した磁性マイクロビーズ抗体を検体に吸着させるために加え、リンパ球、赤血球、成熟骨髄球を除去して、ＣＤ４５陰性造血幹細胞を純化することができる。
【００４３】
造血幹細胞は自分自身を複製する能力（自己複製能）を有し、更にはリンパ球・破骨細胞・樹状細胞などを含む全ての成熟血液細胞を作り出す能力（多分化能）を有することが知られている。これらの造血幹細胞を同定するためにはストローマ細胞との共培養系、in vitroコロニー法、長期骨髄再構築能など様々な方法が知られており、これらのいずれの方法を用いてもよい。
【００４４】
ストローマ細胞との共培養系では、造血幹細胞の分化・増殖に密接に関係がある造血微小環境の再現が可能である。そのため、この培養系では、造血前駆細胞は早期にコロニー形成能を失うのに対して、未分化な造血幹細胞は長期間コロニー形成能や骨髄再構築能を維持できる。このため未分化な造血幹細胞活性の測定にも用いられる。特にヒトにおいてはin vivoの系が用いにくいため、ストローマ細胞上で長期間コロニー形成能を維持できる細胞をＬＴＣ−ＩＣ（Long term culture-initiating cells）として未分化な造血幹細胞の指標として用いられている。これらの方法は既に確立されており、「造血幹細胞−分子から臨床まで−」（三浦恭定編、南江堂）に準じて行うことができる。
ストローマ細胞としては、ＨＥＳＳ−５、ＨＥＳＳ−１、ＣＬ．３等、造血幹細胞の培養に適したものであればどのようなものでも用いることができる。
【００４５】
in vitroコロニー法は造血細胞（骨髄細胞・脾細胞等）を各種サイトカイン存在下にメチルセルロース、軟寒天等の半固形培地中で培養し、形成された細胞集団（コロニー）から造血幹細胞の数や性質を推定する方法である。このコロニーを分析することにより、in vitroにおいて種々の造血前駆細胞や造血幹細胞の分化・増殖過程の観察や測定が可能になっている。混合コロニー（CFU-Mix,CFU-GEMM）や分化能の高いコロニー（HPP-CFC;high
proliferative potential colony forming cells）は、単系統のコロニーを形成する細胞(CFU-GM, BFU-E)等より未分化であり、芽球コロニー形成細胞(CFU-blast)は最も未分化であるとされている。この方法によりin vitroにおいて造血幹細胞や前駆細胞の増殖・分化過程をとらえることができる。また無血清培地を用いたり造血幹細胞の単細胞培養を行うことにより、造血に関与する種々のサイトカインの作用を推定することができる。
【００４６】
本発明はさらに、ＣＤ４５陰性幹細胞の同定に特異的な抗体を含むＭＤＳ又の鑑別用キットを提供する。ＣＤ４５陰性幹細胞の同定に特異的な抗体としては、上述のように、ＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４４等のヒト抗原に対するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００４７】
検出法において標識剤として酵素を用いる場合には、本発明のキットは下記の構成試薬を含むことができる。
（１）酵素標識化モノクローナル抗体
（２）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
【００４８】
（１）モノクローナル抗体
（２）酵素標識化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
【００４９】
（１）ビオチン化モノクローナル抗体
（２）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（３）基質溶液
【００５０】
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法及びビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）モノクローナル抗体
（２）ビオチン化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（４）基質溶液
【００５１】
本発明に使用するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の詳しい作製方法については公知の方法（例えば、富山朔二ら編「単クローン抗体実験マニュアル」1987年，講談社、右田俊介ら翻訳「免疫化学実験法」1992年，西村書店）に準じて行うことができる。
【００５２】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
Ａ．ＭＤＳの鑑別
１．検体の採取
検体としては、ヒトの末梢血または骨髄液を用いた。これらの検体は、MDSが疑われる患者に採取及び研究目的の使用について充分に説明を行い、同意を得たあとに用いた。末梢血、骨髄液のいずれも抗凝固剤としてヘパリンを添加した。
【００５４】
２．検体の調整
内径14 mmのガラス製チューブにBlastretriever（登録商標）2.5mlを入れ、その上に末梢血あるいは骨髄液（骨髄液の場合、RPMI-1640培地［SIGMA］で2倍に希釈したものを用いた）2.5mlを静かに重層した。550gで10分間、室温で遠心分離した。中間層のみを回収し、0.5%ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）（以後、ＰＢＳと略す）で懸濁して10分間遠心分離を行って細胞を洗浄した。上清を廃棄し、再度洗浄を行い細胞ペレットに溶血剤（0.83%ＮＨ４Ｃｌ、0.1%ＫＨＣＯ３、0.004%ＥＤＴＡ−４Ｎａ）を十分量加え、室温で５分間放置した。その後室温で遠心分離した後同様に洗浄した。細胞はＰＢＳで懸濁した。
【００５５】
３．染色及び測定
処理後の細胞をPerCP標識のＣＤ４５（Becton-Dickinson）、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ１５、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ａｂｃ（以上Becton-Dickinson）GlycophorinA（Immunotech）と、ＰＥ標識した抗ヒトＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ５６（以上Becton-Dickinson）、ＣＤ１３、ＣＤ１１７（以上Immunotech）、ＣＤ１３３（Miltenyi-Biotec-GmbH）で反応させた。測定はFＡＣＳｃａｎ（Becton-Dickinson）で行い、解析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Becton-Dickinson）で行った。それぞれの細胞集団の細胞表面抗原について解析した結果を図1に示す。それぞれの抗体は20%以上発現している場合を陽性（+）とみなした。
【００５６】
図1のＡはＭＤＳの末梢血から生細胞の領域（R1）を選択したものである。このR1の領域を、横軸にＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ、縦軸にＳｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒをとり、骨髄芽球細胞の集団（Ｒ２）とＣＤ４５陰性芽球（Ｒ３）の細胞集団にゲートをかけて解析した。ＭＤＳ患者末梢血には、骨髄芽球に加えて（図１Ｂ、Ｒ２）、健常人では見られないＣＤ４５陰性芽球細胞集団（図１Ｂ、Ｒ３）が見出された。骨髄芽球をＲ２から分離したのがＣ、Ｅの図である。Ｅは横軸にＣＤ４５、縦軸にＣＤ３４をとっており、ＣＤ４５ｌｏｗ＋ＣＤ３４＋であることを示している。また同様にしてＲ３からＣＤ４５陰性芽球を分離したのがＤ、Ｆの図である。ＣＤ４５陰性芽球がＣＤ４５−ＣＤ３４−（以後、本発明細胞と呼ぶ）であることを示している。この細胞集団はＣＤ３４の発現も認められず（図１Ｆ）、骨髄芽球と明らかに異なる細胞集団であった。
【００５７】
それぞれの患者から採取した検体での結果を表１に示す。参考のため、疾患名と染色体解析結果も示す。
【表１】
2006042665.tif 000002
疾患名に記載のＡＬ−ＭＤＳは白血病化ＭＤＳを示す。患者からＣＤ４５陰性芽球が得られた場合は○を記載した。この結果ＭＤＳ患者からはＣＤ４５陰性芽球細胞が得られることが確認できた。
【００５８】
更にＣＤ４５陰性芽球細胞の細胞形質と、骨髄芽球の細胞形質との差異を調べるために、フローサイトメーターで解析した。骨髄芽球細胞の発現抗原を見たところ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１３、ＣＤ７、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３が陽性であった。また、ＣＤ４５陰性芽球細胞はＨＬＡ−ａｂｃが陽性で、ＣＤ３４、ＣＤ３８が弱陽性であった。ＣＤ４５陰性芽球細胞はほぼすべての抗原を発現していないことから、未分化な細胞であることが示唆された。
【実施例２】
【００５９】
Ｂ．ＣＤ４５陰性芽球が幹細胞であることの証明
１．骨髄芽球およびＣＤ４５陰性芽球細胞の純化
実施例１においてフローサイトメトリーで解析したＣＤ４５陰性芽球細胞を純化するため、各検体のＣＤ４５陰性細胞のフローサイトメトリーのデータを参考に、混入している細胞の抗原に合わせてマイクロビーズ抗体、FCM抗体を選択し、以下の細胞分離に用いた。
抗ヒトＣＤ３マイクロビーズ抗体、抗ヒトGlycophorinAマイクロビーズ抗体、抗ヒトＣＤ１５マイクロビーズ抗体、抗ヒトＣＤ３３マイクロビーズ抗体、抗ヒトＣＤ５６マイクロビーズ抗体（以上Miltenyi-Biotec-GmbH）の中から必要な抗体を加え、３０分間4.0℃でインキュベートした後洗浄し、ＰＢＳで細胞を懸濁した。ＬＤカラム（Miltenyi-Biotec-GmbH）によってＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｏｒｔｉｎｇを行い、リンパ球、赤血球、成熟骨髄球を除去した。Negative画分を洗浄し、抗ヒトＣＤ３４マイクロビーズ抗体を加え、前述と同様にLDカラムでＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｏｒｔｉｎｇを行った。
磁気ビーズによる純化で得られたＣＤ３４陽性およびＣＤ３４陰性画分に抗ヒトＣＤ４５  ＦＩＴＣ抗体（Becton-Dickinson）と抗ヒトＣＤ３４  ＰＥ抗体（Becton-Dickinson）、抗ヒトＣＤ３８  ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ３３  ＰＥ抗体（その他必要に応じて使用）を加え、4.0℃で30分間インキュベートした。その後洗浄を行い、ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（Beckman-Coulter）により、ＣＤ３４陽性画分からＣＤ３４陽性細胞（骨髄芽球）を、ＣＤ３４陰性画分からは本発明細胞を分離した。
【００６０】
２．HESS-5との共培養
培地は12.5%ウマ血清（HS）（JRH）-12.5%胎児ウシ血清（FCS）-αMEM（GIBCO）を用いた。さらに、培養液にインターロイキン３（IL-3）（KIRIN）を終濃度10ng/mlになるように加え、さらにステムセルファクター（SFC）、トロンボポイエチン（TPO）（以上KIRIN）、Flt3-L（IBL）を終濃度50ng/mlになるように加えた。細胞はマウスストローマ細胞株のＨＥＳＳ−５細胞と共培養させた。ＨＥＳＳ−５細胞は96穴プレート（NUNC）で10%ＨＳ−αＭＥＭ培地によって培養し、80％程度コンフルエントになった状態で15Gyの放射線を照射したものを共培養に用いた。細胞は37℃、5.0％CO2でインキュベートした。
【００６１】
骨髄芽球細胞をＨＥＳＳ−５存在下で８日間培養した結果を図２Ａに示す。骨髄芽球細胞はＨＥＳＳ−５の下にもぐりこみ、大きなコロニーを形成していた。骨髄芽球細胞をＨＥＳＳ−５の非存在下で８日間培養した結果を図２Ｂに示す。骨髄芽球は増殖しているが、死滅した細胞も多く見られ、細胞増殖はＨＥＳＳ−５と共培養していた場合と比較すると低下していた。
【００６２】
本発明細胞をＨＥＳＳ−５細胞と20日間共培養した結果を図２Ｃに示す。骨髄芽球と比べるとコロニー形成を始める時期も遅く、増殖能も低いが、ＨＥＳＳ−５に潜り込み増殖していた。本発明細胞をＨＥＳＳ−５非存在下で20日間培養した結果を図２Ｄに示す。細胞は１週間程で死滅し、以後増殖はみられなかった。
【００６３】
これらの結果から、ＭＤＳ患者から採取される本発明細胞ではストローマ細胞と共培養しないと細胞が１週間以内に死んでしまい、その後も培養を続けていても細胞は増殖しないことが判明した。また、共培養下での骨髄芽球と本発明細胞で増殖の様子を比べると、骨髄芽球では急速にその数を増やすが、本発明細胞は培養8日目程度で細胞の増殖が観察され始め、培養2週間目あたりで20〜30細胞ほどで構成されるコロニーを作るが、増殖する一方で死細胞も現れはじめ、それ以上大きくなることはなかった。しかし増殖が見られた５例中１例では本発明細胞を100日以上培養し続けることができた。
【００６４】
３．共培養後の細胞の表面抗原の解析
共培養後、培養液を15mlチューブに採った。付着細胞を回収するためにウェルにＥＤＴＡ添加ＰＢＳを入れて10分程度放置した。ＨＥＳＳ−５細胞がウェルからはがれたところで充分ピペッティングし、先に採った培養液に加えた。5分間遠心分離後、上清を取り除き、細胞をＰＢＳで懸濁した。回収された細胞は抗ヒトＣＤ４５  ＰｅｒＣＰと、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ１４と、ＰＥ標識した抗ヒトＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３と反応させた。測定はＦＡＣＳｃａｎで行い、解析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔで行った。
【００６５】
解析結果を図３に示す。
Ａは骨髄芽球の解析結果であり、左から培養日数ごとに記載した。右上の数値はＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞の割合である。ＣＤ３４陽性発現は失われ、培養24日から35日では殆ど見られなくなった。Ｂは共培養後の本発明細胞であり、右上の数値はＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞の割合である。本発明細胞は９日目でＣＤ４５、ＣＤ３４陽性を発現し、以後ＣＤ３４陽性細胞は減少したが、骨髄芽球よりも長期間にわたって見られた。Ｃは本発明細胞によるその他の表面抗原の発現を確認したものである。骨髄芽球ではＣＤ３４やＣＤ３８といった造血幹・前駆細胞の表面抗原の発現は落ち、成熟した細胞の表面抗原であるＣＤ１３、Ｄ１１ｂ、ＣＤ１４の発現が高くなっていった。本発明細胞のうち図３に示した細胞では、培養９日目でＣＤ３４陽性細胞発現細胞が最も多く確認された。以後、ＣＤ３４陽性細胞の割合は落ちていったが、培養35日目の解析でも４%弱残っていることが確認できた。その他の表面抗原は培養９日目でＣＤ３８、ＣＤ１３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４の発現が確認され、その後はＣＤ３８の発現は落ち、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂの発現は高くなっていった。
【００６６】
４．共培養の細胞の形態観察
２で共培養を行った骨髄芽細胞と本発明細胞を50μlの10%FCS（日本バイオテスト研究所）-RPMI1640中に5000〜2万個懸濁し、シランコーティングスライドガラス（MATSUNAMI）の上に2分間遠心して貼り付かせた。貼り付けた細胞はスライドガラスごと100％メタノール（和光）に5分間浸けて固定し、冷風乾燥させた。これをメイグリシュンワルド染色液（ナカライテクス）で3分間静置して染色した。等量のＰＢＳ（10mM  NaPB,
0.15% NaCl）を加え静かに混和して1分間静置した。流水で洗浄し、10％Ｇｉｅｍｓａ液（メルク・ジャパン）に10分間浸した。染色後、顕微鏡で形態を観察し、100×10倍率で撮影したものを図４に示す。
【００６７】
Ａは骨髄芽球を観察したものである。（ａ）純化直後の細胞は芽球特有な形態を示した。（ｂ）ＨＥＳＳ−５と共培養させ９日目の細胞は前骨髄球が大半で、骨髄球も観られた。（ｃ）培養17日目では前骨髄球は減少し、骨髄球や後骨髄球が増え、（ｄ）培養24日目や（ｅ）35日目では後骨髄球ばかり観察された。Ｂは本発明細胞を観察したものである。（ａ）純化直後の細胞の中には骨髄芽球よりも小さな芽球の形態を示すものが多く見られた。（ｂ）培養９日目ではほとんど前骨髄球で、骨髄芽球もみられた。（ｃ）培養１７日目でも前骨髄球が多く、骨髄芽球も確認された。骨髄球も現れ始めた。（ｄ）培養２４日目でも多くの前骨髄球が観察された。骨髄芽球や後骨髄球の割合が増えてきた。（ｅ）培養35日目では成熟細胞の方が多く観られたが、前骨髄球も存在した。（Ｃ）培養24日目の骨髄芽球細胞。異常形態の後骨髄球が観察された。（Ｄ）培養49日目の本発明細胞で、過分様の後骨髄球を発見した。
【００６８】
これらの結果から培養9日目まではどちらの細胞集団でも大半が前骨髄球で芽球も観られた。17日目の骨髄芽球培養細胞では前骨髄球と骨髄球、後骨髄球が混在していたが、一方の本発明細胞では17日目でも前骨髄球の割合は高く、芽球も観られた。さらに骨髄芽球を培養して24、35日目では後骨髄球ばかりであるのに対し、本発明細胞では成熟細胞が大半を占めるものの、前骨髄球も観られた。以上のフローサイトメーターによる解析や細胞形態から本発明細胞が骨髄芽球より未分化な細胞集団である可能性が考えられ、さらに分化能を有することが確認された。
【００６９】
５．ＦＩＳＨ（fluorescent in situ hybridization）解析
４で使用した細胞を70％エタノールでメイギムザ染色の脱色を行った。冷風で乾燥させ、室温の75 mM ＫＣｌ低張液に10分間浸した。次にカルノア固定液（酢酸：メタノール＝1：3）に5分間浸け、冷風乾燥後、室温で各1〜2分間70％、85％、100％エタノール（和光）で順次脱水し風燥させた。37℃のエージング溶液（2×SSC, 0.1％NP-40）に30分間浸した。前述同様に70％、85％、100％エタノールで脱水した。73±1℃のdenaturing solution（Vysis）が入ったジャー5分間浸した。-20℃の70％エタノール、4℃の85％エタノール、4℃の100％エタノールで急速に冷やし、ＤＮＡのアニーリングを防ぎながら脱水した。自然乾燥させ45℃で2分弱加熱した。Probe（Vysis）を5.0μl乗せてカバーガラスで均一に広げ、ボンドでシールした。これを湿潤箱に入れて2〜3日放置した。37〜42℃の50％ホルムアミド（ホルムアミド 25 ml＋4×SSC 25 ml）に浸し、細胞が傷つかないように注意しながらカバーガラスを取った。この液中に10〜15分間標本を浸した。次に遮光し、37〜42℃の4×SSCに浸してロータリーシェーカーで2分間振盪した。さらに37〜42℃の0.1％ Triton-100/4×SSCに浸し2分間振盪した後、室温の4×SSCに入れ、2分間振盪させた。室温の2×SSCに浸け、2分間静置した。標本が少々湿った状態でDAPI（通常はDAPI２（125 ng／ml, Vysis）を使用）を滴下し、カバーガラスを載せて全体に広げ、細胞の厚さをできるだけ薄くさせるために十分抑え、マニキュアでカバーガラスを留めた。標本を蛍光顕微鏡で観察し、染色体異常を確認したところ、骨髄芽球と同じ染色体異常を示した。そのため、ＭＤＳ患者から採取した本発明細胞はMDS異常細胞であることが確認できた。つまりMDSが本発明細胞の腫瘍化を起源にしていることが示唆される。
【００７０】
６．コロニーアッセイ
セルソーターで純化した直後の1000個の細胞をMethoCult（Stem  Cell  Technology）1.0mlに懸濁し、直径35mmのグリット付きディッシュ（NUNC）に入れて37℃、5.0％CO2でインキュベートした。また、1000cells/wellでＨＥＳＳ−５細胞と共培養し、17日目、28日目あるいは35日目に細胞を回収し、同様にアッセイを行った。コロニー数の平均をとるため、同じ培養日数の細胞を２枚以上アッセイした。２週間後、コロニーの種類とその数を顕微鏡で観察しカウントした。
骨髄芽球の場合、純化直後の細胞でコロニーが形成されたが、培養期間が長期なるほどコロニーは形成されなくなっていった。また形成されたコロニーは顆粒球・マクロファージコロニーであった。
【００７１】
本発明細胞は検体純化直後ではコロニーを形成しないが、ＨＥＳＳ−５との培養によってコロニーを形成した。長期に（28あるいは35日間）培養した場合、構成細胞数の少ないクラスターを作っていた。コロニーおよびクラスターはすべて顆粒球・マクロファージコロニーであった。
【００７２】
以上の結果から、本発明細胞は、ストローマとの共培養によって維持することができ、培養後の細胞の表面マーカー解析と形態観察から成熟した細胞へ分化する能力を持っていることから、造血幹細胞であることがわかる。更に骨髄芽球細胞と比較検討した結果、骨髄芽球よりも未分化な細胞集団である事が確認できた。
【００７３】
今までに知られている検出方法を用いると、ＣＤ４５造血幹細胞はＭＤＳに特異的に検出される。しかし一般的に、ある疾患で初めて発見された細胞は、これに対応する細胞が健常者にも存在することが証明される場合が多い。したがって、本ＣＤ４５造血幹細胞も健常者にも存在しうることが容易に想像できる。この健常者由来のＣＤ４５陰性造血幹細胞を単離することができれば、ＭＤＳの治療のほか、種々の疾患の治療に役立てることが可能である。例えば、白血病などの造血幹細胞移植や他臓器、心筋へ分化させ移植することで心臓病の治療に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
CD45陰性造血幹細胞は従来の方法を用いて検出する場合は、ＭＤＳに特異的に現れることから、ＣＤ４５陰性造血幹細胞を検出することでＭＤＳを鑑別することができる。また、ＣＤ４５陰性造血幹細胞を傷害あるいは正常に分化させることにより、ＭＤＳの新規な治療剤の開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】セルソーターによるＭＤＳ患者末梢血から骨髄芽球及びＣＤ４５陰性幹細胞を純化するときの図を示す。
【図２】骨髄芽球及びＣＤ４５陰性幹細胞をＨＥＳＳ−５細胞存在、または非存在下での培養図を示す。
【図３】共培養後の骨髄芽球及びＣＤ４５陰生幹細胞における表面抗原の発現解析図を示す。
【図４】骨髄芽球及びＣＤ４５陰性幹細胞の培養後の細胞形態を示す。
【図１】
2006042665.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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