(57)【要約】【課題】  三次元多孔性支持体の内部まで細胞を効率よく播種する方法および装置を提供することである。【解決手段】  装置であって：１または２以上の開口部を有する気密性チャンバー、；および、フィルター、ここで該フィルターは、三次元多孔性支持体を該フィルター上にチャージし得るように該開口部を覆い、ここで流体が該フィルターを経由して流通可能であり、該フィルター上に該三次元多孔性支持体を載せるとき、該フィルターは該三次元多孔性支持体に密着し得るように柔軟である；該チャンバー内に、環境と比較して陰圧を適用し得る手段；を含み、ここで、該陰圧を適用し得る手段によって該チャンバー内に、陰圧を適用し、該フィルターを介して、陰圧が該三次元多孔性支持体内部に適用され、それによって該三次元多孔性支持体にチャージされる細胞が、該三次元多孔性支持体内に内在化し得る、装置を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であって：
１または２以上の開口部を有するチャンバー；および
フィルター、ここで該フィルターは、該開口部を閉じるように該チャンバーの開口部周辺部に実質的に気密性に固定されており、かつ流体が、フィルター孔を経由して流通可能であり；
環境と比較して陰圧を該チャンバー内に適用し得る器具を、接続可能なアウトレット；
を含み、
ここで、三次元多孔性支持体を該フィルター上に載せ、そして該陰圧を適用し得る器具によって、陰圧を該チャンバー内に適用するとき、該フィルター孔を介して、陰圧が該三次元多孔性支持体内部に適用され、それによって、該三次元多孔性支持体上部にチャージされる細胞が、該三次元多孔性支持体内に内在化し得るものである、装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置であって、ここで該チャンバーの開口部を閉じるように実質的に気密性に配置される筒状部材の頂部を閉じるように、該フィルターが実質的に気密性に固定されている、装置。
【請求項３】
請求項１記載の装置であって、ここで環境と比較して陰圧を該チャンバー内に適用し得る器具が、手動ポンプであり、かつ該手動ポンプが、チューブにより該アウトレットに接続されている、装置。
【請求項４】
細胞を、三次元多孔性支持体内に内在化させるための方法であって：
三次元多孔性支持体に水分を含ませること；
該三次元多孔性支持体を、フィルターの一方の面上に載せること、ここで流体がフィルター孔を介して流通可能である；
細胞を、該三次元多孔性支持体にチャージすること；
該フィルターの他方の面に、環境と比較して陰圧を適用すること；
を含み、
ここで、該陰圧が、該フィルター孔を介して、該三次元多孔性支持体内に適用され、それによって、該細胞が、該三次元多孔性支持体内に内在化するものである、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法であって、該方法は、該フィルターの、三次元多孔性支持体を載せる面上に、水分を存在させることをさらに含む、方法。
【請求項６】
三次元多孔性支持体内に内在化される細胞の、該三次元多孔性支持体内部における深度を制御する方法であって：
三次元多孔性支持体に水分を含ませること；
細胞を、三次元多孔性支持体にチャージすること；
該三次元多孔性支持体を、フィルターの一方の面上に載せること、ここで流体が該フィルター孔を介して流通可能である；
該フィルターの、三次元多孔性支持体を載せる面上に、水分を存在させること；
該フィルターの他方の面に、環境と比較して陰圧を適用すること；
を含み、
ここで、調節された陰圧が、フィルター孔を介して、該三次元多孔性支持体内に適用され、それによって該細胞の、該三次元多孔性支持体における内在化深度を制御し得るものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は三次元多孔性支持体内部までフィルター及び圧力発生装置を用いて効率的に細胞を播種することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
３次元的に細胞を効率良く培養するためには細胞の足場となる３次元の構造物、所謂三次元多孔性支持体に細胞を十分保持させる必要がある。従来この支持体に細胞を保持させるための方法として、注射針等を用いて支持体内に注入する、あるいは細胞懸濁液中に支持体を単純に浸す等の方法が一般的に用いられている（特許文献１）。しかし、このような方法だけでは細胞を支持体内部まで保持させることは難しく、特に三次元多孔性支持体が疎水性の素材でできている場合は細胞懸濁液を三次元多孔性支持体内部に浸透させることすら困難である。この問題のために、特願２００４−２０５７０３は三次元多孔性支持体を液体に浸し、圧力を変化させ、脱気する手法を開示する（特許文献２）。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３５１０１号公報
【特許文献２】特願２００４−２０５７０３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したように三次元多孔性支持体を脱気してその疎水性による影響を回避し、細胞を播種しやすくすることは可能である。また三次元多孔性支持体の厚みが薄い（１．５ｍｍ厚さ以下）ものでは比較的内部まで播種できることも明らかとなっている。しかしながら三次元多孔性支持体の厚みが厚く（１．５ｍｍ以上）なると細胞懸濁液を三次元多孔性支持体上部からチャージするだけでは下層まで十分細胞を到達させることが難しい。
【０００４】
細胞を播種できる三次元多孔性支持体の厚みに限界があると、厚みのある組織の再生に必要とされる細胞を均一に播種した修復材が作れないことが懸念される。例えば軟骨などの欠損を修復するために軟骨層の薄いウサギやラットなどの動物には対応できても、軟骨層の厚いヒトには対応できないという問題が生じうる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討を進めた結果、三次元多孔性フィルター
をフィルターの一方の面上に載せ、細胞を三次元多孔性支持体の上からチャージし、フィルターの例えば下方に陰圧をかけることで、三次元多孔性支持体内部にも陰圧を適用することが可能となった。このような方法で細胞を三次元支持体の任意の深度まで内在化させることが可能となり、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明が提供するのは以下の通りである：
[１]
装置であって：
１または２以上の開口部を有するチャンバー；および
フィルター、ここで該フィルターは、該開口部を閉じるように該チャンバーの開口部周辺部に実質的に気密性に固定されており、かつ流体が、フィルター孔を経由して流通可能であり；
環境と比較して陰圧を該チャンバー内に適用し得る器具を、接続可能なアウトレット；
を含み、
ここで、三次元多孔性支持体を該フィルター上に載せ、そして該陰圧を適用し得る器具によって、陰圧を該チャンバー内に適用するとき、該フィルター孔を介して、陰圧が該三次元多孔性支持体内部に適用され、それによって、該三次元多孔性支持体上部にチャージされる細胞が、該三次元多孔性支持体内に内在化し得るものである、装置。
[２]
[１]記載の装置であって、ここで該チャンバーの開口部を閉じるように実質的に気密性に配置される筒状部材の頂部を閉じるように、該フィルターが実質的に気密性に固定されている、装置。
[３]
[１]記載の装置であって、ここで環境と比較して陰圧を該チャンバー内に適用し得る器具が、手動ポンプであり、かつ該手動ポンプが、チューブにより該アウトレットに接続されている、装置。
[４]
細胞を、三次元多孔性支持体内に内在化させるための方法であって：
三次元多孔性支持体に水分を含ませること；
該三次元多孔性支持体を、フィルターの一方の面上に載せること、ここで流体がフィルター孔を介して流通可能である；
細胞を、該三次元多孔性支持体にチャージすること；
該フィルターの他方の面に、環境と比較して陰圧を適用すること；
を含み、
ここで、該陰圧が、該フィルター孔を介して、該三次元多孔性支持体内に適用され、それによって、該細胞が、該三次元多孔性支持体内に内在化するものである、方法。
[５]
[４]記載の方法であって、該方法は、該フィルターの、三次元多孔性支持体を載せる面上に、水分を存在させることをさらに含む、方法。
[６]
三次元多孔性支持体内に内在化される細胞の、該三次元多孔性支持体内部における深度を制御する方法であって：
三次元多孔性支持体に水分を含ませること；
細胞を、三次元多孔性支持体にチャージすること；
該三次元多孔性支持体を、フィルターの一方の面上に載せること、ここで流体が該フィルター孔を介して流通可能である；
該フィルターの、三次元多孔性支持体を載せる面上に、水分を存在させること；
該フィルターの他方の面に、環境と比較して陰圧を適用すること；
を含み、
ここで、調節された陰圧が、フィルター孔を介して、該三次元多孔性支持体内に適用され、それによって該細胞の、該三次元多孔性支持体における内在化深度を制御し得るものである、方法。
【０００７】
ここでいうチャンバーは、任意の形状のチャンバー、例えば概立方体、概直方体、概円錐台、概ボトル型であり得る。水平方向の断面形状は円形、楕円形、長方形、正方形、５角形、など、任意の形状であり得る。好ましくは、概ボトル型であり得る。チャンバーはフィルターを取り付けるための、１または２以上の開口部を有する。
【０００８】
気密性チャンバーは、１または２以上の開口部を有する。開口部の形状は円形、楕円形、長方形、正方形、５角形、など、任意の形状であり得る。好ましくは、円形である。チャンバーは、開口部以外は実質的に気密性であるものが望ましい。開口部の数は、チャンバーの大きさおよび作業性に依存し得る。
【０００９】
ここで言うフィルターとしては流体、例えば液体例えば水分、または気体例えば空気が、流通可能に孔を有するものであれば任意のフィルターを使用し得る。フィルターは、軟質または硬質であり得るが、三次元多孔性支持体を載せるために、三次元多孔性支持体の重量に耐えられればよい。フィルターは、若干の凹凸を有し得る三次元多孔性支持体表面と実質的に密着しうるように、ある程度柔軟であってもよい。実質的に密着しうる、とは、若干の空隙があってもよいが、三次元多孔性支持体とフィルターとが、当初の位置よりも接近することをいう。フィルターは、水分によって破損しない強度を有するものが好ましい。
【００１０】
フィルターは、水分を含む場合、フィルター孔は水分でブロックされ得る。それによって、フィルター孔は、気体がブロックされ気体が通過しにくくなる孔サイズが好ましい。具体的なフィルターのタイプの例は、メッシュタイプ、不織布タイプ、多孔性タイプなど孔の開いているものが挙げられる。またフィルターのポアサイズとしては、約０．０１μｍ〜５００μｍが好ましく、更に好ましくは約０．１μｍ〜１００μｍであってもよい。
【００１１】
フィルターを、気密性チャンバーの開口部を閉じるように、気密性チャンバーの開口部周辺部に固定し得る。フィルターとチャンバーの固定部位は、実質的に気密性であってもよい。実質的に気密性とは、フィルター孔以外は、流体流通がない状態を意味し得る。フィルター上に三次元多孔性支持体を載せるために、フィルターを、フィルターがある程度緊張状態を有するように、チャンバーに固定してもよい。フィルターをチャンバーに固定するための条件は、当業者が実験的にまたは経験的に過度の負担なく決定できる。例えばフィルターを、チャンバー開口部周辺部に接着する。
【００１２】
あるいは、フィルターを、筒状部材の一方の開口部に固定し、他方の開口部を前記気密性チャンバーの開口部に接続してもよい。ここでいう筒状部材はフィルターを保持でき、フィルター下部に陰圧をかけることができるものであれば特に限定しないが、好ましくはフィルターをきっちりとはめ込むことができる構造を有するものである。フィルター周辺部には、細胞をチャージし、または水分をフィルター上に提供する作業を容易化するために、漏斗状の辺縁部材を取り付けてもよい。さらに、辺縁部材の上部に、ふたを配置し得る。このような構造物は、例えば商業上入手可能な、培地の濾過滅菌用ボトルトップフィルターを使用できる。
【００１３】
本発明において三次元多孔性支持体とは、内部に連通する多数の微細な孔または空隙を有する成形物を意味する。例えば、三次元多孔性支持体は、細胞を内部に内在化すると同時に血清成分や栄養因子、また老廃物等の循環が円滑に行われるような構造を持つ、細胞培養のための支持体であってもよい。
【００１４】
三次元多孔性支持体の形状は、三次元であれば限定されないが、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状、直方体、立方体、平板状等いずれも有効に用いられる。
【００１５】
三次元多孔性支持体が球状または粒状であるばあい、平均粒径は約５μｍから１０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、最も好ましくは約３０〜６００μｍである。三次元多孔性支持体が概平板上形状である場合、厚みは約０．５ｍｍないし５．０ｍｍ、好ましくは、約１．０ｍｍないし４．０ｍｍ、より好ましくは１．５ｍｍないし３．５ｍｍである。三次元多孔性支持体は、両方の面に約１０μｍの孔を有し、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板状形状を有し、一方または両方の面が開孔処理されているものである、前記多孔質体を含む。概平板状形状とは、完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものをすべて含む。
【００１６】
ここにいう開孔処理は、孔径を拡大させることを意味し、公知の方法、例えばＷＯ２００４／０３５１０１に開示されるような方法によって処理し得る。簡単には、塩溶出法、または剥離法によって処理し得る。それによって、細胞が容易に通過できる孔径約２００〜８００μｍ、好ましくは約２００〜３００μｍ、さらに好ましくは５０〜１５０μｍの孔を確保できる。
【００１７】
三次元多孔性支持体は、限定されないが、例えばガラスビーズ、シリカゲルなどの無機三次元多孔性支持体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機三次元多孔性支持体、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスさらにはこれらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機などの複合三次元多孔性支持体などが代表例としてあげられる。
【００１８】
三次元多孔性支持体について、活性炭、及びガラスビーズなどが挙げられるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。その他の三次元多孔性支持体の材料は、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフィルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸エステル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物、またはヒドロキシアパタイト、βＴＣＰ（β-三リン酸カルシウム）などのセラミック化合物からなる群より選択されるがこれらに限定されない。
【００１９】
三次元多孔性支持体の材料は好ましくは、生体適合性材料を含む。好ましくは、この多孔質体の材料はコラーゲンやキチン、キトサン等の生体由来物質、αまたはβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマー、例えばＰＧＡ（ポリグリコール酸重合体）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸共重合体）、ＰＬＬＡ（ポリＬ−乳酸重合体）等の人工物、あるいはそれらのうち２種以上の物質の複合体等前述の構造を実現できる材料であれば特に限定されることはない。
【００２０】
特に好ましくは、グリコール酸と乳酸の共重合体（ＰＬＧＡ）であって、グリコール酸と乳酸の重量比が、約９９：１−１：９９、特に約７５：２５−２５：７５であるである。なお好ましくは、三次元多孔性支持体は、孔径約１０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは孔径約１０以上３００μｍ以下、孔長約２０μｍ以上１ｃｍ以下、好ましくは孔長約５００以上１ｃｍ以下の縦長形状、例えば紡錘状などの孔が並列的に配置され、並置された各孔間は、孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有する、三次元多孔質体を含む。
【００２１】
孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造とは、上記縦長形状の孔の全個数の約５０％以上、好ましくは約７０％以上が、孔径約１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造を意味する。三次元多孔性支持体は、有孔率は約７０％以上であることが好ましいが、細胞密度確保の点から、約７０〜９５％のものがより好ましい。ここで「有孔率」とは、支持体における縦長形状の孔と小孔との合計の割合をいい、単位体積あたりの支持体材料体積に対する空隙体積の合計体積から算出したものである。またこの多孔質体を作製する方法に関しても前述の構造を実現できるものであれば特に限定されることはない。
【００２２】
さらに、この多孔質体の構造も前述の特徴を実現できるものであれば、スポンジ状のものであっても不織布であっても、あるいはそれ以外のものであってもよく、特に限定されるものではない。前記多孔質体は、例えばＷＯ２００４／０３５１０１号公報に見出されるような公知の方法で製造できる。簡単には、多孔質体材料を有機溶媒に溶解し、調製した溶液を型枠に流し込んだ後、約３℃／分以上の冷却速度で凍結し、凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去する、ことによって製造する。
【００２３】
細胞を、三次元多孔性支持体にチャージする手法は、細胞をそのまま、または液体、例えば生理食塩水、培養液、ＰＢＳ、培地などに懸濁した懸濁液として、該支持体上に滴下またはシリンジなどにより注入する事を含む。該チャージされた細胞は、本発明に従って、三次元多孔性支持体に、播種され得る。
【００２４】
チャンバーは、該チャンバー内に、環境と比較して陰圧を提供し得る器具を接続可能なアウトレットを有し得る。アウトレットは公知のコック、三方活栓など、気密性を保持しつつチューブなどと接続し得る連結器具を使用し得る。
【００２５】
また陰圧を適用する器具としては、例えば油圧式真空ポンプ、チューブポンプ（ペリスターポンプ）、手動ポンプ、例えばシリンジ形状の手動ポンプなどが挙げられる。
【００２６】
「該陰圧を適用するための器具」は、人手により制御可能である器具でもよい。これはシリンジなどの器具を、密閉されたチャンバー内部環境に、外部環境と比較して陰圧を適用しうるように、前記装置の１または２以上の部位に、チューブなどを介して、接続したものが望ましい。チューブとシリンジの接続方法は特に限定しないが、発生させた陰圧がフィルターの下部まで損なわれることなく伝達されるものが望ましい。例えば通常のゴムホース、シリコンチューブなどの公知の流体伝達手段が使用できる。
【００２７】
また、「環境と比較して陰圧」の強さとしては手動によりシリンジなどで発生される圧力から吸引ポンプなど機械的な方法で発生される圧力までが考えられる。具体的には、フィルターを介して、三次元多孔性支持体に伝達される陰圧が、細胞を、該三次元多孔性支持体表面から、多孔性支持体内部に内在化させるのに十分である陰圧が好ましい。
【００２８】
本明細書にいう「該フィルターの、三次元多孔性支持体を載せる面上に、水分を存在させる」は、この水分は任意の水溶液であってよいが、生理食塩水、培養液、ＰＢＳなどが好ましい。さらに好ましくは、細胞を培養する際に使用している培地である。好ましい培地の例は：ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）またはＭＥＭ培地（ナカライ社製）である。
【００２９】
驚くべきことに、フィルター面上に水分がある場合、三次元多孔性支持体内部に陰圧を適用することは、フィルター面上に水分が存在しない場合と比較して、きわめて容易である。これは、フィルター孔が水分でブロックされることによって、フィルター孔を介する気体の流通が抑制されるためであり得る。なお驚くべきことに、多孔質体内に含まれる水分と、フィルター面上の水分とが連結し、水柱を形成し得る。それによって、細胞を内在化させるのに十分な陰圧を、三次元多孔性支持体内部に容易に適用し得る。この場合陰圧を、例えば、手動ポンプにより適用可能ある。
【００３０】
該陰圧は、フィルターが破損しない程度の圧力強度が好ましい。この際陰圧としては好ましくは-0.001MPaから-0.5MPaまで、更に好ましくは-0.005MPaから-0.1MPaである。もっとも好ましくは-0.01MPaから-0.09MPaまである。この場合の三次元多孔性支持体は、縦約１０ｍｍ×横約１０ｍｍ×厚さ約３．５ｍｍ、開孔処理されていない面の孔径約１０μｍ、開孔処理されている面の孔径約３００μｍ、紡錘状の縦長型の小孔径約１０〜３００μｍのものである。もっとも該陰圧の大きさは、フィルターの種類、フィルター孔サイズ、チャンバーの大きさ、フィルターの面積、三次元多孔性支持体の形状および性状などに依存して変化し得るが、当業者が過度の実験なくして実験的にまたは経験的に設定可能である。
【００３１】
「三次元多孔性支持体内部における深度を制御する」ために、手動で圧力をシリンジの内筒を引き、最適な陰圧強度を調節しつつ、保持させることで陰圧状態を維持することなどが挙げられる。もっとも、自動化された装置によって、最適な陰圧強度を調節し得、それを保持させることで陰圧状態を維持することも可能である。
【００３２】
また三次元多孔体の任意の深度とは支持体の表側表面から縦方向に向かって底までの任意の位置を意味する。
【００３３】
前記気密性チャンバー、筒状部材のような本装置の部材の構造材料は、ポリマーまたは金属または合金を含む。該ポリマーは、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー等；ハロゲン化ポリマー、例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレンおよびヘキサフルオロプロピレン等;ポリアミド；ポリスルホン；ポリカーボネート；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリビニルクロリドアクリルコポリマー；ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン;ポリスチレン;等を含む。容器のために有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、および窒化チタン被覆ステンレス鋼を含む。とくに好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。
【００３４】
該材料は、γ線、電子線、エチレンオキサイド、またはオートクレーブ等何らかの方法により滅菌できる材質であってもよい。
【００３５】
該チャンバーの製造方法は、金属材料を使用する場合は、例えば鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接などによって、樹脂材料を使用する場合は、例えば圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型、接着などによって形成できる。容器およびピストンのために、適当な大きさである、商業的入手可能な任意の同様の機能を有するもの、例えばシリンジ、シリンジ等を転用できる。架台、三方活栓のために、当業者に明らかな公知の部材または手段を使用できる。容器の底部の孔および液体が流通可能である部分は、機械的ドリリング、レーザードリリング、鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接、圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型などによって形成できる。
本発明の装置は、自体公知の部材を組み立てることにより製造できる。本発明の装置は金属材料を使用する場合は、例えば鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接などによって、樹脂材料を使用する場合は、例えば圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型、接着などによって形成できる。本発明の装置の開口部は、機械的ドリリング、レーザードリリング、鋳造、旋盤加工、鍛造、溶接、圧縮成型、射出成型、押出し成型、ブロー成型、注型成型などによって形成できる。
【００３６】
次に、図面を参照して、本発明の実施態様を例示する。
【００３７】
図１は、気密性チャンバー（１−１）にフィルター（１−２）を結合した、細胞内在化装置の例示である。気密性チャンバーの開口部（１−３）を閉じるように、フィルターが固定されている。該フィルター上に該三次元多孔性支持体（１−４）を載せる。アウトレット（１−５）から内部空気を吸引し（１−６）、チャンバー内を陰圧にすることができる。チャンバー内に適用された陰圧は、フィルター（１−２）を介して、多孔性支持体（１−４）内部にも適用され、矢印（１−７）にしたがってチャージされる細胞が、多孔性支持体内に、内在化する。特に、三次元多孔性支持体とフィルターの間に水分が存在するとき、該フィルターは該三次元多孔性支持体に密着しやすい。
【００３８】
図２は、短い筒状部材からなるボトルトップフィルター（２−１）、気密性チャンバーを形成するボトル（２−２）、吸引ポンプ（２−３）をシリコンチューブ（２−４）で接続した、細胞の、三次元多孔性支持体（２−５）への細胞内在化装置の例である。ボトルトップフィルター（２−１）は、筒状部材の上部開口部に、フィルター（２−６）が実質的に気密性を確保するように結合されている。該フィルター（２−６）上に、三次元多孔性支持体（２−５）を載せる。該ボトル（２−２）は、シリコンチューブ（２−４）によって吸引ポンプ（２−３）に接続されている。シリコンチューブには、圧力計（２−７）を接続してもよい。細胞懸濁液を、シリンジなどにより、矢印（２−８）にそって、三次元多孔性支持体（２−５）にチャージする。ボトルトップフィルターは、縁部材（２−９）を含む。辺縁部材は、フィルター上に水分を供給するために作業性を改善するが、なくてもよい。
【００３９】
図３は、短い筒状部材からなるボトルトップフィルター（３−１）、気密性チャンバーを形成するボトル（３−２）を、シリコンチューブ（３−３）によって接続した装置である。該ボトルトップフィルターの上面にフィルター（３−４）が結合されている。フィルター（３−４）上に、三次元多孔性支持体（３−５）を載せる。該ボトルは、シリコンチューブ（３―３）によって吸引ポンプ（３−６）に接続されている。シリコンチューブには、圧力計（３−７）を接続してもよい。細胞を矢印（３−８）にそって、三次元多孔性支持体（３−５）にチャージする。ボトルトップフィルターは、縁部材（３−９）を含む。
【００４０】
この実施態様では、特に水分を、フィルター（３−４）上に存在させる場合、フィルター（３−４）と三次元多孔性支持体（３−５）との密着が容易化し得る。またフィルター（３−４）のうち三次元多孔性支持体（３−５）と接しない部分において、フィルターの空気の透過性が低下する。またフィルター上の水分と、三次元多孔性支持体内の水分が連続し、水柱を形成し得る。そのため、比較的小さい陰圧であっても、細胞が三次元多孔性支持体内に内在化し得る。それによって、シリンジ（３−６）による比較的弱い吸引力でも、細胞の、三次元多孔性支持体内への内在化が十分に実現される。したがって、シリンジ（３−６）によれば、作業者が細胞の内在化の深度を確認しながら、手動により陰圧の強度を調整し得ることとなる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば厚みのある組織再生用の支持体に細胞を播種する場合、直接細胞を上から播種するだけでは十分支持体内に内在化させることができなかったが、本技術はフィルターを用いて吸引操作を施すことにより効率的に細胞を支持体中の任意の深さに内在化させることを可能とするものである。本発明によれば、厚みのある三次元多孔性支持体に細胞をチャージする場合、直接細胞を上からチャージするだけでは十分支持体内に内在化させることができなかったが、本技術はフィルターを用いて吸引操作を施すことにより効率的に細胞を支持体中の任意の深さに内在化させることを可能とするものである。また簡便な手動操作を用いて実施可能なことから電動または油圧ポンプなどの吸引設備の十分整っていない場合でも対応することができる。このように均一に支持体内に細胞が播種されると1箇所に細胞が偏在して壊死することなく組織構築が良好に行われ、ひいてはこの支持体と細胞の複合体を用いた体内の欠損部位の修復が従来よりも極めて良好に行われ、治療効果の向上につながる。
【００４２】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）電動吸引ポンプを用いて細胞を支持体に播種した場合の到達深度
Ｔ７５フラスコ（ファルコン製）に正常ヒト間葉系細胞を５ｘ１０5個／フラスコに
なるように播種し、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳで１０日間、細胞をコンフルエントまで培養した。その後細胞を回収し、生細胞を染色するＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＫＩＴ（モレキュラープローブ社製  Ｌ−３２２４）を用いてラベルした。ＬＩＶＥ試薬（カルセインＡＭ）は製造者指示の方法に記載されているように細胞懸濁液に直接添加（約２０００倍希釈）し、３０ｍｉｎ静置し、２回ＰＢＳ（ｐＨ＝7.4）で洗浄した。
【００４４】
この間に細胞が蛍光顕微鏡で発光する状態までラベルできた。規定染色時間経過後は５Ｘ１０6／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。
次にＰＬＧＡ支持体（縦約１０ｍｍ×横約１０ｍｍ×厚さ約３．５ｍｍ、開孔処理されていない面の孔径約１０μｍ、開孔処理されている面の孔径約３００μｍ、紡錘状の縦長型の小孔径約１０〜３００μｍ）を用意し、内部の空気を十分除去し、培地に置換する脱気を行った。ここで実施した脱気方法はまずＰＬＧＡ支持体をテルモ社５０ｍＬ注射器（シリンジ）に入れ、注射器先端に三法活栓を取り付けた後、支持体体積の約１０倍量の培地を注射器内に三法活栓を通して入れた。その後三方活栓を閉鎖し、注射器のピストン部分を最大ストロークまで引き、内部を陰圧にした。この操作で支持体内部に残存している空気を支持体外部に放出させた。これと同時に支持体内部の空隙に空気が入っていた領域を培地で置換させた。注射器内部にピストンをストロークさせることで
泡が発生した場合は三法活栓を開放し、外部（注射器の外）に放出させた。
脱気終了は注射器内の支持体が常圧下でも簡単に培地中を重力で沈む状態を確認し、操作終了とした。
【００４５】
容量１５０ｍＬポアサイズ０．４５μｍのボトルトップフィルター（コーニング  ４３０６２７）の下部に濾過受け容器として１２５ｍＬストレージボトル（コーニング  ８３８８）を接続し、電動吸引ポンプ（日東工器製  ＬＩＮＩＣＯＮ  ＬＶ１２５）はシリコンチューブを介してボトルトップフィルターと接続した（図１）。
【００４６】
またこの図１においてフィルター下部にかかる負圧を測定した。具体的にはボトルトップフィルターとの流路と三方活栓で遮断して吸引ポンプを直結させた。吸引ポンプの最大負圧を測定した。三方活栓の全てを開放にして、メンブランードライ時の最大負圧を測定した。メンブラン−ウエット時の最大負圧の測定はまずメンブランにＰＢＳを加え、全体を吸引後、メンブラン上に脱気したＰＬＧＡ支持体を置いた。その後メンブラン−ウエット時の最大負圧を測定した。
その結果、３種類いずれのボトルトップフィルターを用いても、メンブランがドライの時よりもウェットの時の方が最大負圧は大きかった。このことからメンブランを濡らした方がより吸引効果が高まることがわかった。
【００４７】
【表１】
2006081468.tif 000002
この装置を組んだ後、ボトルトップフィルター上に脱気した支持体を載せ、支持体内の培地（支持体の空隙に入り込んだ水分に相当）を吸引ポンプで初めに抜いた。直ちに細胞懸濁液（５Ｘ１０6／ｍＬ）を１００μＬ、支持体の上部にマイクロピペットを用いて播種し、吸引した。吸引後はポンプのスイッチをＯＦＦにし、また同様に細胞懸濁液を同量播種した。このように細胞播種、吸引を繰り返し、合計７回実施した。（細胞懸濁液合計７００μＬ）    この操作が終了した時点で支持体への播種密度は１×１０7／ｃｍ3となった。
【００４８】
播種が終わった後、同様の操作で培地を細胞懸濁液と同量添加し、洗浄操作を行った。（洗浄用培地合計７００μＬ）。播種、洗浄が終わった支持体は直ちに蛍光実体顕微鏡（波長は４９４ｎｍ／５１７ｎｍ観察倍率は通常で８．４倍、拡大で３０倍）で観察できるように縦方向に切断し、厚さ２ｍｍの切片を作製した。
切片は蛍光実体顕微鏡に横（上部から細胞が到達した深度がわかるように）に載せ、蛍光波長を当てた。発色した蛍光像をモニターに写し、結果画像としてパソコンに取り込んだ。使用した解析ソフトはＲＯＰＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社のフォトメトリックシステム  ＲＳＩイメージ  Ｖｅｒ１．７．３を用いた。結果から電動吸引ポンプを用いて支持体の内部まで播種できることがわかった（図４）。
【００４９】
（実施例２）シリンジを用いて細胞を支持体に播種した場合の到達深度
細胞の調製方法及び細胞のラベル方法は実施例１と同じであった。容量１５０ｍＬポアサイズ０．４５μｍのボトルトップフィルター（コーニング  ４３０６２７）の下部に濾過受け容器として１２５ｍＬストレージボトル（コーニング  ８３８８）を接続し、手動で陰圧を発生させる装置として５０ｍＬシリンジ（テルモ社製  ＳＳ−５０ＥＳＺ）を三方活栓及びシリコンチューブを介してボトルトップフィルターと接続した。（図３）
またこの図３においてフィルター下部にかかる負圧を測定した。具体的にはボトルトップフィルターとの流路と三方活栓で遮断してシリンジを直結させた。シリンジの最大負圧を測定した。三方活栓の全てを開放にして、メンブランードライ時の最大負圧を測定した。メンブランーウエット時の最大負圧の測定はまずメンブランにＰＢＳを加え、全体を吸引後、メンブラン上に脱気したＰＬＧＡ支持体を置いた。その後メンブランーウエット時の最大負圧を測定した。
【００５０】
その結果、メンブランがドライの時よりもウェットの時の方が最大負圧は大きかった。このことからメンブランを濡らした方がより吸引効果が高まることがわかった。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
この装置を組んだ後、フィルターをＰＢＳで湿らせた。均一にフィルターが湿ったことを確認し、ボトルトップフィルター上に脱気した支持体を載せ、支持体内の培地（支持体の空隙に入り込んだ水分に相当）を吸引ポンプで初めに抜いた。直ちに細胞懸濁液（５Ｘ１０6／ｍＬ）の１００μＬを、支持体の上部にマイクロピペットを用いてチャージし、シリンジをフルストロークまで引き、５秒間保持し、細胞懸濁液を支持体内部へ引き込んだ。吸引後は三方活栓のバルブを切り替え、シリンジのストロークを戻し、シリンジで発生した陰圧を伝達できるバルブ位置に切り替えた。また同様に細胞懸濁液を同量チャージした。このように細胞播種、吸引を繰り返し、合計７回実施した。（細胞懸濁液合計７００μＬ）
【００５３】
この操作が終了した時点で支持体への播種密度は１×１０7／ｃｍ3となった。  播種が終わった後、同様の操作で培地を細胞懸濁液と同量添加し、洗浄操作を行った。（洗浄用培地合計７００μＬ）
チャージ、洗浄が終わった支持体は直ちに蛍光実体顕微鏡（波長は４９４ｎｍ／５１７ｎｍ、観察倍率は通常で８．４倍、拡大で３０倍）で観察できるように縦方向に切断し、厚さ２ｍｍの切片を作製した。
切片は蛍光実体顕微鏡に横（上部から細胞が到達した深度がわかるように）に載せ、蛍光波長を当てた。発色した蛍光像をモニターに写し、結果画像としてパソコンに取り込んだ。結果からシリンジ（手動ポンプ）を用いても支持体の内部まで播種できることがわかった（図５）。
【００５４】
（実施例３）    細胞の調製方法及び細胞のラベル方法は実施例１と同じ。
吸引による播種方法と吸引を行わない方法での支持体内部への到達深度を比較した。      
【００５５】
吸引を行わない方法は脱気したＰＬＧＡ支持体を水分を含ませた状態でキムワイプ上に置き、内部の水分（培地）を除去した。水分を除去した支持体はシャーレの上に載せ、直ちに実施例１の方法で調整、ラベルした５×１０7／ｍＬの細胞懸濁液を１００μＬ  １回播種した。（吸引方法の様に１０倍希釈した細胞懸濁液では量が多くなり支持体から溢れるため）播種後は洗浄は行わず、すぐに実施例１と同じように切片を作製し、蛍光像を解析した。吸引を行った方法は実施例１、２の方法で得られた結果を解析した。
【００５６】
その結果、吸引をしないで高濃度の細胞を播種した場合は細胞が支持体上層に留まり、支持体中間層から下層までには到達しないことが確認された。これに対して吸引により播種した方では支持体中間層から下層にかけても細胞が到達し、細胞を全層において局在化させることが可能であることがわかった（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】フィルターをチャンバーに接続した、細胞内在化装置である。
【図２】ボトルトップフィルター、ボトル、電動吸引ポンプを接続した支持体への            細胞内在化播種装置である。
【図３】ボトルトップフィルター、ボトル、シリンジを接続した細胞内在化装置である。
【図４】図２の装置を用いて細胞を支持体に播種し、その断面を蛍光顕微鏡で観察            したものである。
【図５】図３の装置を用いて細胞を支持体に播種し、その断面を蛍光顕微鏡で観察            したものである。
【図６】吸引法と非吸引法で細胞を支持体に播種した断面を蛍光顕微鏡で比較したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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