(57)【要約】【課題】様々な機能性分子を任意にナノレベルで配列させることができ、溶液中での機能性分子間の距離を一定に設定して制御することができ、機能性分子の種類の組み合わせを容易に変えることができ、機能性分子の機能を実質的に損なうことなく任意の溶液中で簡便に機能性分子をスペーサー分子に結合させることができる、機能性高分子複合体の製造方法を提供すること。【解決手段】生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を有する２種のプライマーからなるプライマー対と、鋳型核酸との存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを特徴とする、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）鋳型核酸と、
２）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーに該機能性分子が結合した第１の機能性分子結合プライマーと、
３）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーに該機能性分子が結合した第２の機能性分子結合プライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを特徴とする、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項２】
（Ａ）１）鋳型核酸と、
２’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーと、
３’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより、該機能性分子に対する少なくとも２つの結合性部位を有する高分子複合体を合成する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた高分子複合体に、機能性分子を結合させることにより、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体を合成する工程、
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一種の機能性分子又は異なる種の少なくとも２つの機能性分子が核酸スペーサーを介して連結した機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の評価、医療等の用途に細胞を利用する場合、細胞本来の性質を再現させるために、生体外、すなわち、人工的な基材の上で、細胞の機能、例えば、接着、増殖、分化、未分化、細胞死等を精緻に制御する技術が必要となる。本来の性質を失った細胞の使用は、例えば、薬物の作用の誤った解釈、移植した細胞の生体に対する不適合等を招く場合があるという欠点がある。そのため、人工基材を種々改変する試みが活発になされている。その際に、細胞、特に、細胞表面受容体が認識できる細胞接着性の機能性分子が重要な機能を担うことになる。
【０００３】
機能性分子として、生体内から抽出した細胞外マトリクスであるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を用いて、人工基材を被覆し、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究が古くから行われている（例えば、非特許文献１、２参照。）。また、機能性分子として、ホルモンやサイトカインを用いて、人工基材を被覆する方法を利用することによっても、生体内と同等の環境（濃度、密度等を同等レベルにするという意味での同等の環境）を再現することで細胞機能を制御する研究がなされている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、抽出した細胞外マトリクスによって細胞の機能を制御する方法では、生体内から精製できる細胞外マトリクスの種類が実質的に限られること、微量の抽出困難な細胞外マトリクスを用いることが実質的にできないこと、純度や不純物等の影響により再現性の高い結果を得ることが困難であること等の欠点がある。そのため、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再構成することは困難であるのが現状である。
【０００５】
以上の欠点を解決すること、細胞外マトリクスの作用を単純化して理解すること、さらには移植用材料として抽出マトリクスに起こりうる病原体の混入を回避するため、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリクスに含まれたアミノ酸配列を有し、かつ細胞表面受容体が認識できる合成ペプチド分子を機能性分子として用い、密度及び種類を種々変更して人工基材上に被覆して細胞機能を制御する試みもなされている（例えば、非特許文献４、５）。
【０００６】
前記機能性分子を配列させる方法の１つとして、ナノメーターの長さを有する高分子スペーサーにより機能性分子同士を連結する技術（スペーサー法）が報告されている。
【０００７】
例えば、ダイ（Ｗ．Ｄａｉ）らは、フィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子同士又はラミニン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＹＩＧＳＲ分子同士を、平均分子量約３５００のポリエチレングリコール鎖を介して、２分子結合させ、細胞凝集剤を製造することを報告している（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
また、川崎らは、フィブロネクチン中に含まれる細胞表面受容体中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子と、そのシナジー配列であるＰＨＳＲＮ分子とを、平均分子量２５００〜３４００のポリエチレングリコール鎖を介して結合させ、ヘテロリガンド分子を製造することを報告している（非特許文献７及び８参照）。同様に、フィブロネクチン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤとＥＩＬＤＶとを結合させ、あるいはラミニン中の機能性分子であるＰＤＳＧＲとＹＩＧＳＲとを結合させ、分子を製造することが報告されている（例えば、非特許文献９及び１０参照）。
【非特許文献１】ＰＰ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献２】小出輝、林利彦  編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）
【非特許文献３】Ｙ．Ｉｔｏ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３３３（１９９９）
【非特許文献４】Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５（２００３）
【非特許文献５】Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３（２００３）
【非特許文献６】Ｗ．Ｄａｉ，Ｊ．Ｂｅｌｔ，ＷＭ．Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７９７−８０１（１９９４）
【非特許文献７】Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）
【非特許文献８】Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）
【非特許文献９】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｎｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｙ．Ｋａｎｅｄａ，ｙ．Ｍｕ，ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＫＷ．Ｌｅｍ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，５９５−５９８（１９９７）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｍｕ，Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＴＪ．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，４８５−４８９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、様々な機能性分子を任意にナノレベルで配列させること、溶液中での機能性分子間の距離を一定に設定して制御すること、機能性分子の種類の組み合わせを容易に変えることができること、機能性分子の機能を実質的に損なうことなく任意の溶液中で簡便に機能性分子をスペーサー分子に結合させることができること等の少なくとも１つを可能にする、機能性高分子複合体の製造方法を提供することにある。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載等から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  １）鋳型核酸と、
２）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーに該機能性分子が結合した第１の機能性分子結合プライマーと、
３）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーに該機能性分子が結合した第２の機能性分子結合プライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを特徴とする、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。並びに
〔２〕  （Ａ）１）鋳型核酸と、
２’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーと、
３’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより、該機能性分子に対する少なくとも２つの結合性部位を有する高分子複合体を合成する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた高分子複合体に、機能性分子を結合させることにより、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体を合成する工程、
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、様々な機能性分子を任意にナノレベルで配列させることができるという優れた効果を奏するまた、本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、機能性分子の位置関係をナノメートルオーダーで一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体によれば、機能性分子の位置関係がナノメートルオーダーで規定可能であり、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体は、生体分子内あるいは生体分子間の距離を正確に推定する際に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の１文字表記又は３文字表記により表される場合がある。かかる表記とアミノ酸との対応関係を以下に示す。Ａ又はＡｌａ：アラニン残基；Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基；Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基；Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基；Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基；Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基；Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基；Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基；Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基；Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基；Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基；Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基；Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基；Ｖ又はＶａｌ：バリン残基；Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基；Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基；Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
【００１３】
本発明は、１つの側面では、生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を有する２種のプライマーからなるプライマー対と、鋳型核酸との存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを特徴とする、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の製造方法では、ポリメラーゼ連鎖反応を利用するため、目的の塩基長の機能性高分子複合体を選択的に作製することができ、かつ精製が容易であること等の利点を有する。
【００１５】
本発明の製造方法は、生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を有する２種のプライマーからなるプライマー対が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法によれば、機能性高分子複合体の製造に際して、機能性分子を、核酸又はその誘導体からなるスペーサーを介して配置させることができるため、様々な機能性分子を配列させることができという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、前記機能性分子間の位置関係をナノメートルオーダーで一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
なお、本明細書において、前記「スペーサー」とは、２つ以上の機能性分子間に配置され隣接する機能性分子間を対合している２本の分子鎖を介して結合できるものをいう。本発明の製造方法によれば、前記スペーサーは、生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を有する２種のプライマーからなるプライマー対から伸長された核酸又はその誘導体として生成される。
【００１７】
本発明の製造方法は、鋳型核酸と、生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を有する２種のプライマーからなるプライマー対とを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法によれば、鎖長の長いスペーサーを有する機能性高分子複合体を容易に作製できるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
本発明の製造方法によれば、同一種又は異なる種の少なくとも２つの機能性分子が二本鎖のスペーサーを介して連結した構造を有する機能性高分子複合体を得ることができる。
【００１９】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子の種類、数、機能性分子間の距離等は、目的に応じて選択されうる。
【００２０】
前記プライマー対としては、特に限定されないが、例えば、
１）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーと、
２）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーと、
からなるプライマー対等が挙げられる。
【００２１】
第１のプライマーと第２のプライマーとの間の距離は、目的とする機能性高分子複合体における機能性分子間の距離に応じて、適宜設定されうる。第１のプライマーと第２のプライマーとの間の距離は、具体的には、第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、より具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応の効率および、精製の容易さの観点から、３０ヌクレオチド長以上、好ましくは、４０ヌクレオチド長以上、より好ましくは、５０ヌクレオチド長以上であり、ポリメラーゼ連鎖反応の効率及び正確性を良好に発揮させる観点から、１０００ヌクレオチド長以下、好ましくは、８００ヌクレオチド長以下、より好ましくは、５００ヌクレオチド長以下であることが望ましい。
【００２２】
なお、本明細書において、「センス鎖」の用語は、二本鎖核酸中の２種類の一本鎖核酸のうちの一方の一本鎖核酸を、便宜的に示すものであり、「アンチセンス鎖」は、他方の一本鎖核酸を示すものであることを意図する。
【００２３】
前記プライマーの長さは、特に限定されるものではなく、例えば、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、より具体的には、アニーリング位置の正確性の観点から、１５ヌクレオチド長以上、好ましくは、１８ヌクレオチド長以上、より好ましくは、２０ヌクレオチド長以上であり、プライマー合成の収率低下を防ぐ観点から、１００ヌクレオチド長以下、好ましくは、６０ヌクレオチド長以下、より好ましくは、３０ヌクレオチド長以下であることが望ましい。
【００２４】
前記プライマーのＴｍ値（融解温度）は、特に限定されるものではなく、非特異的なアニーリングを抑制する観点から、５０℃〜７０℃の範囲が好ましく、２つのプライマーのＴｍ値の差は１０℃以下、より好ましくは、５℃以下であることが望ましい。
【００２５】
また、前記プライマー対は、かかるプライマー対により目的となるスペーサー部分を合成することが可能なプライマー対であればよい。前記プライマー対は、１つの側面では、鋳型核酸の一部の塩基配列からなるプライマー又は該鋳型核酸の一部の塩基配列を含有したプライマーである。前記プライマーは、別の側面では、鋳型核酸の一部の塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなるものであってもよく、鋳型核酸の一部の塩基配列と１個又は数個のヌクレオチド残基が異なるプライマーであってもよい。
【００２６】
本発明の製造方法において、核酸誘導体の原料として、ヌクレオチド３０量体を超える長鎖の合成し易さなどの観点から、好ましくは、デオキシリボ核酸を利用することが望ましい。特に、二重らせんのＤＮＡ鎖においては、１０塩基対で３．４ｎｍの長さを有するという構造的にも明確であるため、好ましくは、核酸誘導体として二重らせんのＤＮＡ鎖（以下、ｄｓＤＮＡと略称することがある）を使用することが望ましい。
【００２７】
本明細書において、前記「機能性分子」とは、生体高分子との間で結合活性を有する、合成又は天然の分子をいう。ここで、前記生体高分子としては、例えば、細胞、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質等が挙げられる。
【００２８】
前記機能性分子の結合活性は、例えば、表面プラズモン解析、ゲルシフトアッセイ、ファージディスプレイ法等により、評価されうる。例えば、表面プラズモン解析による結合活性の評価は、生体高分子を固定化したチップに、評価対象の機能性分子を含有した溶液を、一定の流速で、送液し、適切な検出手段により相互作用を検出することにより行なわれうる。前記検出手段としては、例えば、蛍光強度、蛍光偏向度等による光学的検出手段；マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析計；これらの組み合わせ等が挙げられる。ここで、機能性分子と生体高分子とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、該機能性分子が結合活性を有することの指標となる。
【００２９】
本発明の製造方法においては、前記「少なくとも２つの機能性分子」は、互いに同一種又は異なる種の機能性分子であってもよい。
【００３０】
本発明の製造方法に用いられる機能性分子は、化学的に誘導体化されたものであってもよい。
【００３１】
また、本明細書において、前記「受容体」とは、細胞に存在し、各種の生理活性物質を特異的に認識し、該生理活性物質の作用を伝達し発現する生体高分子をいう。前記受容体としては、例えば、細胞内に存在する受容体（以下、細胞内受容体ともいう）、形質膜上に存在する受容体（以下、細胞表面受容体ともいう）等が挙げられる。
【００３２】
細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（例えば、プロコラーゲン等）、エラスチン、フィブロイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、アグリン、アンカリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブリノーゲン、プロテオグリカン等が挙げられる。また、前記プロテオグリカンとしては、例えば、アグリカン、アグリン、パールカン、デュリン、フィブロモジュリン、ブレビカン等が挙げられる。
【００３３】
なお、本発明の製造方法においては、前記細胞外マトリクスに由来する一部分の構造、すなわち、生体内の細胞マトリクスの断片又は該断片に対応する合成ペプチドを、機能性分子として用いてもよい。
【００３４】
前記「生体内の細胞マトリクスの断片」とは、細胞外マトリクスの一部分を化学的又は酵素的に切断し精製後に得られる、ある特定の細胞表面受容体が結合可能な精製断片をいう。前記生体内の細胞マトリクスの断片としては、特に限定されないが、例えば、ＣＮＢｒ処理されて得られるＩ型コラーゲンの精製断片〔例えば、ＷＤ．Ｓｔａａｔｚ，ＪＪ．Ｗａｌｓｈ，Ｔ．Ｐｅｘｔｏｎ，ＳＡ．Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（９），４７７８−４７８１（１９９０）に記載の断片等〕；ＣＮＢｒやさらに必要に応じてトリプシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のプロテアーゼで処理をしたＩＶ型コラーゲンの精製断片〔例えば、ＪＡ．Ｅｂｌｅ，Ｒ．Ｇｏｌｂｉｋ，Ｋ．Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｋｕｈｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２（１２），４７９５−４８０２（１９９３）に記載の方法により得られる三重らせん構造を有する断片；ＥＣ．Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ，ＡＳ．Ｃｈａｒｏｎｉｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０３（６），２４６７−２４７３（１９８６）に記載の方法により得られるＮＣ１ドメイン等〕、フィブロネクチンをトリプシン又はペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる細胞接着性の断片〔例えば、ＳＫ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｅ．Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．Ｈａｓｅｇａｗａ，ＫＭ．Ｙａｍａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（２４），１３２５６−１３２６０（１９８５）参照〕等が挙げられる。
【００３５】
また、前記「生体内の細胞マトリクスの断片に対応する合成ペプチド」とは、細胞外マトリクスに含まれるアミノ酸配列を含有し、かつある特定の細胞表面受容体が結合できる最小のアミノ酸配列の単位を有する化学的に合成されたオリゴペプチドをいう。
【００３６】
本発明において機能性分子として利用されうる全てのペプチドには、目的に応じて付加的なアミノ酸残基がそのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合していてもよい。
【００３７】
また、本発明において機能性分子として利用されうる合成ペプチドには、目的に応じて非天然型アミノ酸、化学的な修飾基、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸のどちらか一方又はその両方が含まれていてもよい。
【００３８】
前記合成ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン等に共通して含まれ、受容体が結合する最小のアミノ酸配列の単位として、アミノ酸が３個結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列等が挙げられる。
【００３９】
前記ＲＧＤ配列を含む直鎖状の合成ペプチドであって、本発明において、機能性分子として用いうるペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、特に限定されないが、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＶ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＦ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＹＰＣ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号：１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ（配列番号：２）、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号：３）、及びＧＧＧＰＨＳＲＮＧＧＧＧＧＧＲＧＤＧ（配列番号：４）等が挙げられる。
【００４０】
また、ＲＧＤ配列を含むペプチドを環状にすることで、受容体への結合活性を制御した機能性分子も本発明に利用することができる。
【００４１】
前記環状ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＰｅｎ＊ＧＲＧＤＳＰＣ＊Ａ、ＧＡＣ＊ＲＧＤＣ＊ＬＧＡ、ＡＣ＊ＲＧＤＧＷＣ＊Ｇ、シクロ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ）、シクロ（ＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＲＧＤｆＫ）、シクロ（ＲＧＤＥｖ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＬ）、シクロ（ＡＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＶ）等が挙げられる。なお、ペプチド配列を示すアミノ酸一文字表記に含まれる小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。また、前記「Ｐｅｎ」は、ペニシラミンを示し、「＊」は、分子内でジスルフィド結合をしたシステイン残基を示す。以下も同様である。
【００４２】
本発明の製造方法では、前記ＲＧＤ配列以外にも種々の細胞外マトリクスに由来する最小のアミノ酸配列の単位を利用することができる。
【００４３】
細胞外マトリクスの１つであるフィブロネクチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＮＧＲ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ等の配列が挙げられる。
【００４４】
また、細胞外マトリクスの１つであるラミニン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＲＧＤＮ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＣＤＰＧＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＹＦＱＲＹＬＩ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＡ（配列番号：５）等の配列が挙げられる。また、ラミニン由来の最小アミノ酸配列には、例えば、野水基義、蛋白質  核酸  酵素、第４５巻、１５号、２４７５−２４８２（２０００）等に記載の細胞接着活性のあるペプチドの配列等も包含される。前記細胞接着活性のあるペプチドの配列としては、例えば、ラミニンのα１鎖に由来するＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号：６）、α１鎖Ｇドメインに由来するＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号：７）等が挙げられる。
【００４５】
同様に、細胞外マトリクスの１つであるＩ型コラーゲン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＤＧＥＡ、ＫＤＧＥＡ及びＧＰＡＧＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧ（配列番号：８）、ＧＥＲ、ＧＦＯＧＥＲ等の配列が挙げられる。
【００４６】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるエラスチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＡＰＧ、ＶＧＶＡＰＧ、ＶＡＶＡＰＧ等の配列が挙げられる。
【００４７】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるトロンボスポンジン由来の最小アミノ酸配列としては、ＶＴＸＧ等の配列が挙げられる。
【００４８】
前記最小のアミノ酸配列の単位は、機能性分子として用いられる合成ペプチドに含有させることができる。
【００４９】
また、本発明の製造方法においては、細胞外マトリクスに由来するものでなくとも、単純に受容体に結合する物質、例えば、低分子物質として人工的に設計して合成された物質を、機能性分子として用いてもよい。
【００５０】
前記受容体に結合する物質は、細胞外マトリクスに由来する一部分の構造モチーフを含むものであってもよく、該構造モチーフを含まないものであってもよい。前記物質としては、例えば、α５β１インテグリンに対するリガンド分子として、Ｃ＊ＲＲＥＴＡＷＡＣ＊のペプチド等、α６β１インテグリンに対するリガンド分子として、ＶＳＷＦＳＲＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号：９）のペプチド等、αＭβ２インテグリンに対するリガンド分子として、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号：１０）のペプチド等が挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の製造方法においては、ＧＡ．Ｓｕｌｙｏｋ，Ｃ．Ｇｉｂｓｏｎ，ＳＬ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｈｏｌｚｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｗｉｅｓｎｅｒ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４（１２），１９３８−１９５０（２００１）等に記載されているような非ペプチドであって、受容体に結合する低分子物質も機能性分子として利用可能である。
【００５２】
また、受容体のうち、例えば、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４等の受容体は、プロテオグリカンを含有することから、前記受容体中のアミノ酸配列を含有し、プロテオグリカンに対して結合するペプチドを機能性分子として用いることもできる。
【００５３】
プロテオグリカンに対して結合するペプチドのアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＢＢＸＢ、ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ等のコンセンサス配列が挙げられる。なお、前記「Ｘ」は、疎水性アミノ酸、「Ｂ」は塩基性アミノ酸を示す。前記コンセンサス配列としては、具体的には、例えば、ＫＲＳＲ、ＦＨＲＲＩＫＡ（骨シアロタンパク質に由来）、ＰＲＲＡＲＶ（フィブロネクチンに由来）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ等や、より長いペプチド配列として、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号：１１）（フィブロネクチンに由来）、ＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲ（配列番号：１２）（ビトロネクチンに由来）、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号：１３）（ラミニンに由来）等が挙げられる。
【００５４】
本発明の製造方法では、例えば、Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５−４４１５（２００３）、ＪＡ．Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，５６５−５７６（１９９５）、Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３−４３６４（２００３）及びＥ．Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｗ．Ａｒａｐ，Ｄ．Ｒａｊｏｔｔｅ，Ｊ．Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ，Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，４０（５），８８３−８８８（１９９９）等やそれらの引用文献に記載されているような直鎖状又は環状の合成ペプチドを機能性分子として利用することができる。
【００５５】
前記「ホルモン」とは、動物組織の内分泌細胞によって生産・分泌され、血流によって標的細胞へ輸送され、外来性のシグナルとして標的細胞の活性を調節する物質をいう。前記ホルモンとしては、特に限定されないが、例えば、膵臓で生産されるインスリンやグルカゴン、副腎髄質で生産されるアドレナリンやノルアドレナリン、性腺で生産されるアンドロゲン、エストロゲン及びゲスターゲン等が挙げられる。また、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、ホルモンの分子中に含まれるアミノ酸配列を有し、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。
【００５６】
前記「サイトカイン」とは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用等細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子をいう。前記サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、例えば、インターロイキン類、インターフェロン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
【００５７】
サイトカインについても、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、それらの分子中に含まれ、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。かかる物質としては、例えば、骨形成因子（ＢＭＰ）について、ＢＭＰ−２と同様の性質を示すＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩ（配列番号：１４）のペプチド等が挙げられる〔例えば、スズキ（Ｙ．  Ｓｕｚｕｋｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，５０，  ４０５−４０９（２０００）参照）〕。また、前記物質としては、エリスロポエチンについて、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ〔Ｘは数種のアミノ酸で置換可能な位置を示す〕（ＮＣ．Ｗｒｉｎｇｔｏｎ，ＦＸ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｃｈａｎｇ，ＡＫ．Ｋａｓｈｙａｐ，ＦＰ．Ｂａｒｂｏｎｅ，ＬＳ．Ｍｕｌｃａｈｙ，ＤＬ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＷ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＬＫ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，ＷＪ．Ｄｏｗｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，４５８−４６３（１９９６）参照）のペプチド等が挙げられる。
【００５８】
なお、ＣＤ．Ｒｅｙｅｓ，ＡＪ．Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，６５Ａ，５１１−５２３（２００３）に記載されているように、例示されたアミノ酸配列を含むペプチドが幾つか会合したような構造体を機能性分子として用いてもよい。
【００５９】
本発明の製造方法では、抗体を機能性分子として用いることもできる。前記抗体は、目的に応じて自由に選択でき、特に限定されないが、例えば、種々の細胞、細胞外マトリクス、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、脂質その他の生体高分子に対する抗体等が挙げられる。具体的には、前記抗体としては、モノクローナル抗体、各種の抗インテグリン抗体、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４／ＣＳＰＧ等の細胞表面プロテオグリカンに対する抗体、抗カドヘリン抗体、抗セレクチン抗体等が挙げられる。前記抗体を機能性分子として用いる場合には、抗体そのものを用いてもよく、ペプシンやパパイン等のプロテアーゼ処理によって得られるフラグメント等を用いてもよい。
【００６０】
本発明の製造方法では、糖質を機能性分子として用いることもできる。本発明の製造方法では、機能性分子として、単糖、数個（２〜１０個）の単糖からなる縮合体であるオリゴ糖、さらに多数の単糖からなる多糖等のいずれを用いてもよい。また、オリゴ糖や多糖には構成糖の種類の違い、構成糖間の結合様式の違い、重合度の違い等によりきわめて多種類のものがあるが、本発明の製造方法では、受容体や生体高分子等に結合する能力を有する糖質であれば、機能性分子として用いることができる。
【００６１】
前記糖質としては、例えば、β−ガラクトース、ラクトース又は重合して接着性基質を形成することができる重合性ラクトースモノマー等肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する単糖類等；セレクチンに結合するものとして、シアル酸とフコースを含むオリゴ糖であるシアリルルイスエックス（例えば、Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７３９０−７３９７（１９９４）参照）等；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン類等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の製造方法において、機能性分子として使用できる「細胞間接着の受容体に結合する分子」とは、それぞれの細胞膜外成分に存在する細胞間接着の受容体に結合する分子をいう。前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、特に限定されないが、例えば、ＮＣＡＭ、カドヘリン等が挙げられる。さらに、前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、例えば、セレクチンに対する受容体のうち、合成ペプチドとして、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）等が挙げられる。本発明の製造方法では、前記細胞間接着の受容体に結合する分子を機能性分子として用いることにより、細胞−細胞間相互作用を模倣することができるという優れた効果を発揮する。
【００６３】
本発明の製造方法では、前記機能性分子として、細胞外マトリクス、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質、細胞間接着の受容体に結合する分子等から、それぞれの細胞毎に最適なものを２つ以上選択することができる。機能性分子の配列をナノメートルオーダーで制御した機能性高分子複合体を実用的に製造する観点から、天然由来の機能性分子のフラグメント、合成ペプチド分子、糖類及び人工的に合成された物質（低分子物質を含む）等やこれらの複合体を利用することが好ましい。なお、機能性分子が、ペプチドからなる場合、該ペプチドの鎖長は、アミノ酸３〜１５０残基程度であることが好ましい。また、機能性分子が、糖鎖からなる場合、該糖鎖の鎖長は、単糖１〜１００残基程度であることが好ましい。
【００６４】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子は、プライマー又はスペーサーに、該プライマー上又はスペーサー上の結合性部位を介して、共有結合又は非共有結合によって結合されうる。
【００６５】
前記機能性分子とプライマー又はスペーサーとの結合は、機能性分子及びプライマー又はスペーサーそれぞれに適切な官能基を導入し、該官能基を利用して行なうことが好ましい。
【００６６】
以下、機能性分子に導入する官能基を、「プライマー又はスペーサー結合用官能基」といい、プライマー又はスペーサーに導入する官能基を、「機能性分子結合用官能基」という。また、プライマー又はスペーサー上に導入された機能性分子結合用官能基の存在部位を、「結合性部位」ともいう。
【００６７】
プライマー又はスペーサー結合用官能基及び機能性分子結合用官能基は、特に限定されるものではなく、互いに対応して、該プライマー又はスペーサー結合用官能基と機能性分子結合用官能基とが結合するように、適宜選択されうる。
【００６８】
機能性分子とプライマー又はスペーサーとを結合するための反応は、適宜選択されうる。
【００６９】
また、プライマー又はスペーサーに含まれる機能性分子結合用官能基と、機能性分子に含まれるプライマー又はスペーサー結合用官能基との結合様式は、反応中にプライマー、スペーサー、機能性分子等が分解したり、意図しない部位どうしで非特異的に導入反応が起こったりしなければ、共有結合や非共有結合を問わず何れもが利用できる。
【００７０】
共有結合による導入反応としては、アミド結合形成反応（カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基を縮合させるか、又はアミノ基と予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステルを反応させる方法等が例示できる）、マイケル付加反応（マレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等のα，β−不飽和カルボニル基とチオール基を反応させる方法が例示できる）、チオエーテル形成反応（ハロアセチル基等のハロゲン化アルキル基やエポキシ基、アジリジン基等とチオールの反応が例示できる）、ディールスアルダー環化付加反応（シクロペンタジエン等の共役ジエン類とキノン等のオレフィン類とを反応させる方法が例示できる）、シッフベース形成反応（グリオキシル酸等のアルデヒド基とオキシアミノ基等のアミノ基を反応させる方法等が例示でき、形成されるシッフベース基は適切な還元剤で還元されていてもよい）、チアゾリジン環形成反応（アミノ基及びチオール基が残留したシステインとアルデヒド基を反応させる方法である）等が挙げられる。さらに、アミド結合形成反応としては、チオエステル基とアミノ基とチオール基が残留したシステインとを反応させてアミド結合を形成させる方法も例示される。
【００７１】
非共有結合による導入反応としては、例えば、錯体形成反応（例えば、トリニトリロ酢酸−ニッケル錯体とオリゴヒスチジンの三元錯体形成を利用したＨｉｓ−Ｔａｇ形成反応、金−チオール結合反応等）、生物学的な認識反応（例えば、糖鎖−レクチン反応、アビジン−ビオチン反応、抗原−抗体反応等）等が挙げられる。
【００７２】
導入反応は、機能性分子結合用官能基とプライマー又はスペーサー結合用官能基との組み合わせを上記の反応様式で互いに結合し得るものとしておくことで行うことができる。そのような組み合わせは、上記を参照すれば適宜選択することができる。なお、以上の導入反応は光、熱、振動、時間、脱保護等別の因子によって開始されるものであってもよい。
【００７３】
プライマー又はスペーサー結合用官能基として、機能性分子にもともと含有される反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を用いてもよいし、機能性分子にプライマー又はスペーサー結合用官能基を意図的に導入して用いてもよい。機能性分子にプライマー又はスペーサー結合用官能基を導入する方法としては、プライマー又はスペーサー用官能基を含有し、かつ機能性分子に結合する官能基を同一分子中に含有する二官能性試薬を使って、機能性分子を化学修飾する方法が挙げられる。
【００７４】
ペプチドを含む機能性分子を化学修飾する１つの方法は、機能性分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用して二官能性試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、機能性分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えばＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由に導入することが可能である。糖類を含む機能性分子に関しても同様のことがいえ、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用いることができる。
【００７５】
核酸又はその誘導体に対し、位置特異的に機能性分子結合用官能基を導入する方法として、例えば、高分子学会／バイオ・高分子研究会編「高分子化学と核酸の機能デザイン」、バイオ・高分子研究法６、学会出版センター（１９９６）やＹ．Ｉｔｏ，Ｅ．Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８，１５５−１６６（２００４）及び該文献に記載された参考文献等に記載された方法等が利用できる。
【００７６】
機能性分子結合用官能基を導入した核酸又はその誘導体としては、例えば、リン酸部位やリボース又はデオキシリボース等を含む主鎖や核酸塩基等の部分に機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体、５’末端や３’末端へ機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体等が挙げられる。以上のように機能性分子結合用官能基のプライマー又はスペーサーにおける位置が特定できれば、以上の例示に限定されるものではない。
【００７７】
プライマー又はスペーサーと機能性分子結合用官能基との間及び／又は機能性分子とプライマー又はスペーサー結合用官能基との間にはリンカーを含んでいてもよい。前記リンカーによれば、プライマー又はスペーサーと機能性分子との間の距離を僅かに隔離しておくことができ、プライマー又はスペーサーと機能性分子との間の反応において立体障害等を低減させて導入反応を迅速に進行させる機能や、本発明のナノ構造を有する機能性高分子複合体を細胞と接触させた場合に細胞表面受容体と機能性分子との結合反応を阻害しない機能等を発揮させることができるという優れた効果を発揮する。前記リンカーは、０．１〜５ｎｍ程度までの長さであれば、特に素材等に制限されるものではなく、例えば、アルキル鎖、ペプチド鎖、オキシエチレン鎖、オキシプロピレン鎖等やそれらが混合された構造であってもよい。なお、リンカーは、前記構造に限定されるものではなく、目的により最適なものが選ばれる。リンカーは、例えば、機能性分子結合用官能基、プライマー又はスペーサー結合用官能基の一部としてプライマー又はスペーサーか、機能性分子か、あるいはこれらの両方に導入しておけばよい。
【００７８】
また、前記「鋳型核酸」とは、前記プライマーと相補性のある塩基配列を有している核酸であり、好ましくは、互いに相補的な鎖からなる２本鎖核酸であり、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ等をいう。
【００７９】
前記鋳型核酸は、特に限定されるものではなく、例えば、ヒト組織、哺乳動物細胞、真核微生物、バクテリア等の生体材料から抽出若しくは精製された核酸であってもよく、人工的に合成された核酸であってもよい。
【００８０】
本発明の製造方法におけるポリメラーゼ連鎖反応は、核酸の伸長反応を包含するため、核酸合成酵素の存在下に行なうことが好ましい。前記「核酸合成酵素」とは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、核酸の鎖長を延長する作用を有する酵素をいう。前記核酸合成酵素としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来）、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ由来）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ−８株由来）、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ  由来）等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００８１】
なお、本発明の製造方法においては、核酸合成酵素による核酸の伸長反応を十分に行なえるものであれば、例えば、生体成分との接触条件において、機能性高分子複合体自体の安定性を増加させること、該機能性高分子複合体をエンザイムイムノアッセイ又は蛍光ラベル等によって定量分析すること、微粒子によりラベル化して電子顕微鏡等により観察すること等を可能とする観点から、化学的に修飾されたヌクレオチドアナログの存在下に核酸合成酵素による核酸の伸長反応を行なってもよい。
【００８２】
前記化学的に修飾されたヌクレオチドアナログとしては、例えば、各種放射性同位元素を含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、[α−32Ｐ]、[α−35Ｓ]、[３Ｈ]デオキシシチジン三リン酸）ブロモデオキシウリジン三リン酸、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン三リン酸、フルオレセイン標識デオキシウリジン三リン酸、ビオチン標識デオキシウリジン三リン酸、ビオチン標識デオキシシチジン三リン酸等が挙げられる。
【００８３】
また、本発明の製造方法においては、核酸合成酵素による核酸の伸長反応で得られた産物に化学的修飾を施してもよい。かかる化学的修飾としては、例えば、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体及びアレクサ等の発色団及び例えば、栗原靖之、武内恒成、松田洋一編「ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール−蛍光の原理と実際：遺伝子解析からバイオイメージングまで」別冊実験医学、羊土社（１９９９）等に記載されている発色団；ビオチン、ブロモデオキシウリジンやジゴキシゲニン等の抗原部位等を導入した化学的修飾体等が挙げられる
【００８４】
本発明の製造方法は、１つの実施態様では、
１）鋳型核酸と、
２）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーに該機能性分子が結合した第１の機能性分子結合プライマーと、
３）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーに該機能性分子が結合した第２の機能性分子結合プライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを特徴とする方法（「製造方法１」という）である。
【００８５】
前記製造方法１によれば、前記第１の機能性分子結合プライマーと、第２の機能性分子結合プライマーとが、プライマー対として用いられているため、前記プライマー対の塩基配列と、鋳型核酸の塩基配列に応じて、少なくとも２つの機能性分子が一定の距離で配列された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００８６】
なお、前記製造方法１においては、前記工程（ａ）に先立ち、機能性分子を、第１のプライマー及び第２のプライマーに結合させる工程を行なってもよい。かかる工程においては、前記のように、共有結合又は非共有結合を形成させることにより、前記機能性分子とプライマーの前駆体とを結合させることができる。また、必要に応じて、機能性分子及び／又は核酸誘導体を処理（例えば、化学的修飾、脱保護等）する工程を含んでいてもよい。
【００８７】
かかる製造方法により得られる機能性高分子複合体は、核酸と同様の分子構造を有し、かつ主鎖の末端又は主鎖の途中の任意の少なくとも１箇所に、生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子が導入されている高分子物質である。なお、前記「核酸」とは、リン酸ジエステル結合を介して主鎖が形成されているデオキシリボ核酸、リボ核酸等をいう。
【００８８】
前記工程（ａ）において、ポリメラーゼ連鎖反応では、鋳型核酸と、前記プライマー対とを適切な条件下に対合させ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とする核酸合成酵素の存在下における触媒反応を行なう。
【００８９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、適切なＤＮＡポリメラーゼ存在下、適切な緩衝液〔例えば、５０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８.４）、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０１重量％  ゼラチン）中、鋳型核酸（生物、例えば、細菌等のゲノムＤＮＡ）  ０．０５μｇ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）  各０．２ｍＭ、２種類のプライマー  各０．５μＭとなるように調製された反応液  ５０μＬを用い、９４℃で１分の熱変性と５８℃で１分のアニーリングと７２℃で１分の伸長反応とを１サイクルとする２５サイクルを行なう条件等により行なわれうる。なお、前記反応液の容量、塩化マグネシウム濃度、鋳型核酸量、プライマー量等は、例えば、産物の発現量、産物の純度等を、慣用のアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により所望の量、純度等であることを確認することにより、適宜設定されうる。
【００９０】
前記製造方法１においては、得られた反応性生物を、ゲル濾過法、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用した精製法、磁気ビーズ法等の慣用の核酸の精製手段により精製することにより、目的とする機能性高分子複合体を得ることができる。
【００９１】
また、前記製造方法１では、ポリメラーゼ連鎖反応は、１つの側面では、
（ａ１）２種の機能性分子結合プライマーが、それぞれ、前記鋳型核酸または他方のプライマーに由来する鎖伸長物に対して相補的に伸長させて、伸長型機能性部位含有高分子複合体を生成させる工程、
（ａ２）工程（ａ１）で生成した伸長型機能性部位含有高分子複合体を変性させ、一本鎖構築物を生成させる工程、及び
（ａ３）工程（ａ２）で生成した少なくとも２種の一本鎖構築物を対合させる工程、
に細分化されうる。かかる工程（ａ１）又は（ａ２）における生成物について、必要量を取り出し、その必要量の生成物のみを、所望とするそれ以降の工程に供することにより、機能性分子の組み合わせを容易に変えることも可能である。
【００９２】
前記「変性」とは、核酸を、溶液の温度上昇、ｐＨの上昇若しくは下降、または適当な薬剤の存在等によって、核酸が本質的に有していた分子構造（３次構造、核酸の高次構造）を維持できない状態にすることをいう。前記変性は、具体的には、例えば、ＤＮＡの２重らせん構造を壊して、２つの一本鎖ポリヌクレオチドへ解離させることをいう。
【００９３】
前記工程（ａ２）において、前記変性は、生成する伸長型機能性部位含有高分子の分解を防ぐ観点から、好ましくは、核酸の溶液の温度を上昇させる方法により行なわれることが望ましい。
【００９４】
前記工程（ａ３）において、前記対合は、慣用のアニーリング、ハイブリダイゼーション等の条件及び手法により行なわれうる。
【００９５】
本発明の製造方法によれば、特定の塩基配列のプライマーを用いた場合、鋳型核酸と対合する位置によって、所望の鎖長を有する機能性高分子複合体を得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、複数の種類の塩基配列のプライマーを用いた場合、鎖長の異なる複数の機能性高分子複合体の混合物が得られる。
【００９６】
なお、本明細書においては、前記製造方法１を、前変性法ともいう。かかる前変性法は、あらかじめ機能性分子を結合させたプライマーを用いる製造方法であるため、プライマーの組み合わせを任意に選択することで、機能性高分子複合体に導入する機能性分子の組み合わせを自在に選択することができるという優れた効果を発揮する。
【００９７】
本発明の製造方法は、他の実施態様では、
（Ａ）１）鋳型核酸と、
２’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有した第１のプライマーと、
３’）生体高分子との間で結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位と、該鋳型核酸のアンチセンス鎖の塩基配列中の連続したヌクレオチド残基からなる核酸又はその誘導体とを含有し、該第１のプライマーの３’末端に対応する鋳型核酸上のヌクレオチドから少なくとも２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを３’末端のヌクレオチドとする第２のプライマーと
の存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより、該機能性分子に対する少なくとも２つの結合性部位を有する高分子複合体を合成する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた高分子複合体に、機能性分子を結合させることにより、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体を合成する工程、
を含む方法（「製造方法２」ともいう）である。
【００９８】
前記製造方法２では、まず、鋳型核酸と、第１のプライマーと、第２のプライマーとの存在下に、ポリメラーゼ連鎖反応を行ない、該機能性分子に対する少なくとも２つの結合性部位を有する高分子複合体を合成する〔「工程（Ａ）」という〕。
【００９９】
前記製造方法２によれば、機能性分子の結合に先立ち、高分子複合体を合成しているため、予め、高分子複合体を合成しておけば、その中の必要量のみを任意の種類又は量の機能性分子の導入に使用することができるという優れた効果を発揮する。
【０１００】
なお、前記工程（Ａ）におけるポリメラーゼ連鎖反応は、前記製造方法１の場合と同様に行われうる。
【０１０１】
ついで、前記製造方法２では、前記工程（Ａ）で得られた高分子複合体に、機能性分子を結合させ、目的とする機能性高分子複合体を得る〔「工程（Ｂ）」という〕。
【０１０２】
前記工程（Ｂ）において、高分子複合体と、機能性分子との結合は、前記と同様の手法により行なわれうる。
【０１０３】
前記製造方法２においては、工程（Ｂ）の生成物を、ゲル濾過法、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用した精製法、磁気ビーズ法等の慣用の核酸の精製手段により精製することにより、目的とする機能性高分子複合体を得ることができる。
【０１０４】
前記製造方法２では、前記工程（Ａ）のポリメラーゼ連鎖反応は、１つの側面では、
（Ａ１）２種のプライマーが、それぞれ、前記鋳型核酸又は他方のプライマーに由来する鎖伸長物に対して相補的に伸長することで、伸長型高分子複合体を生成させる工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で生成した伸長型高分子複合体を変性させ、一本鎖構築物を生成させる工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で生成した少なくとも２種の一本鎖構築物を対合させる工程、
に細分化されうる。
【０１０５】
前記工程（Ａ２）において、伸長型高分子複合体の変性は、前記製造方法１の場合と同様の手法により行なわれうる。
【０１０６】
また、前記工程（Ａ３）において、少なくとも２種の一本鎖構築物の対合は、前記製造方法１の場合の工程（ａ３）と同様の手法により行なわれうる。
【０１０７】
なお、本明細書において、前記製造方法２は、後変性法ともいう。かかる後変性法は、あらかじめ作製した２本鎖核酸スペーサーに対して機能性分子を導入する製造方法であるため、予め、少なくとも２つの結合性部位を有する高分子複合体を合成しておけば、その中の必要量のみを、任意の種類又は量の機能性分子の導入に使用することができるという優れた効果を発揮する。
【０１０８】
本発明の製造方法は、前記前変性法及び前記後変性法のいずれであってもよい。核酸スペーサーに対する機能性分子の導入の簡便さ、及び機能性高分子複合体の製造効率の観点から、前変性法のほうが好ましい。
【０１０９】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体は、スペーサーとして、核酸スペーサーを有するため、機能性分子の間隔を任意の距離に規定し、かつスペーサー部分の分子量が実質的に単一であるナノ構造を有するという優れた性質を発現する。本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体は、例えば、ポリエチレングリコール等の従来用いられているスペーサーを有する物質の場合と比較して、機能性分子間の距離を実質的に分布のない均一なものにすることができるという優れた効果を発揮する。
【０１１０】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体において、ｄｓＤＮＡからなる核酸スペーサーの中で機能性分子を導入する好ましい位置としては、目的に応じて選択でき、特に限定されるものではなく、５’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）、及び３’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）等ｄｓＤＮＡスペーサーの末端部位や核酸塩基部位等ｄｓＤＮＡスペーサーの途中の任意の位置が挙げられる。２つの機能性分子を含有する場合を記載すると、ｄｓＤＮＡ鎖の２つの５’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又は２つの３’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又はそれらの組み合わされた分子（例えば、５’末端及び３’末端のそれぞれに機能性分子が結合した分子等）が挙げられる。３つ以上の機能性分子を導入する場合には空いている末端を利用することもできる。
【０１１１】
前変性法により機能性分子を導入するため、核酸スペーサーの原料となる一本鎖ＤＮＡ（以下、「ｓｓＤＮＡ」ともいう）に機能性分子結合用官能基をＤＮＡの化学合成の段階で導入する。機能性分子結合用官能基としては、上述したように種々のものが選択でき、特に限定されるものではなく、反応選択性を発揮する観点から、チオール基またはアミノ基を導入するのが好ましい。
【０１１２】
本発明の製造方法においては、ｓｓＤＮＡにおける機能性分子結合用官能基の導入方法、部位及び官能基の種類、機能性分子における核酸スペーサー結合用官能基の導入方法、部位及び種類は、目的により適宜選択されうる。また、本発明の製造方法においては、核酸スペーサー構造は単純な二重らせんだけではなく、種々の複雑な構造、例えば分岐構造や三次元構造、二次元的、三次元的に多重に核酸スペーサーが連結した構造等を持たせた本発明の機能性高分子複合体を作製できる。
【０１１３】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、単独で用いてもよく、２種以上の機能性高分子複合体を混合して用いてもよい。それぞれの細胞によって最適な使用形態が選択される。
【０１１４】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、必要に応じて、滅菌してもよい。滅菌方法は、特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜選択されうる。前記滅菌方法としては、例えば、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、電子線滅菌、濾過滅菌等が挙げられる。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はそれらにより何ら限定さ
れない。以下の実施例等において使用した測定方法又は評価方法をまとめて示す。
【０１１６】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分析は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ（東ソー株式会社製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、５重量％〜３０重量％のアセトニトリルによる２０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％  トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」ともいう）を含有した５重量％  アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％  ＴＦＡを含有した３０重量％  アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１１７】
（逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＰＲＥＰ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速１０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、１０重量％〜２０重量％のアセトニトリルによる８分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％  トリフルオロ酢酸を含有した１０重量％  アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％  ＴＦＡを含有した２０重量％  アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１１８】
（マススペクトルの測定）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計〔商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ社製）〕により、マトリクスとして、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を用いて、マススペクトルを測定した。
【０１１９】
（逆相ＨＰＬＣによる機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡ（コンジュゲート）の分析）
逆相ＨＰＬＣによるコンジュゲートの分析は、以下のような条件で行なった。カラムとして、商品名：ＯｌｉｇｏＤＮＡ  ＲＰ（東ソー株式会社製）を用いた。流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２６０ｎｍに設定した。コンジュゲート５％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で５分間溶出し、その後、５重量％〜３０ｗｔ
％のアセトニトリルによる５０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、５重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液と、３０重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液とを用いた。
【０１２０】
（ｓｓＤＮＡの濃度測定）
ｓｓＤＮＡ溶液  ２５μＬを、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ９７５μＬに添加して希釈した。得られた希釈物について、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液のみでベース補正した分光光度計で、２６０ｎｍの吸光度を測定した。このとき測定される吸光度に４０を乗じた値をｓｓＤＮＡ溶液のＯＤ値とした。本実施例で用いられるｓｓＤＮＡのＯＤあたりの重量（μｇ）は、それぞれ計算されたＯＤ値から算出できる。ｓｓＤＮＡの分子量を用いることで、前記ＯＤ値を、モル濃度に換算できる。
【０１２１】
（ＤＮＡスペーサーを有する機能性高分子複合体の濃度測定）
以下の実施例で示される機能性高分子複合体の濃度は、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ピアース社製）を用いて決定した。濃度既知のλＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。記載した測定値は、全て３回測定の平均値である。
【０１２２】
以下の実施例では、本発明の１つの実施態様を例示する。すなわち、機能性分子として、ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来する機能性分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来する機能性分子）との２つの機能性分子、その２つの機能性分子間を連結する核酸スペーサーの構造として、相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡ、２つの機能性分子の導入位置として、ｄｓＤＮＡに二箇所存在する５’末端とした。
【０１２３】
ＤＮＡスペーサーの長さは、４０ｎｍ（ＤＮＡとして、１２０量体）、８０ｎｍ（ＤＮＡとして、２４０量体）及び１６０ｎｍ（ＤＮＡとして、４８０量体）とした。以上の概念に従って設計された機能性高分子の構造（模式図）を以下に示す。
【０１２４】
【化１】
2006042812.tif 000002
【０１２５】
ＤＮＡスペーサーの長さが、４０ｎｍ、８０ｎｍ及び１６０ｎｍである機能性高分子複合体を、それぞれ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳという。
【０１２６】
以下の実施例では、機能性高分子複合体を、前変性法により調製した。まず、ｓｓＤＮＡに機能性分子を結合させたコンジュゲートを合成した。核酸スペーサー結合用官能基としてマレイミド基を選択した。ＫＤＧＥＡペプチド分子及びＧＲＧＤＳペプチド分子それぞれのＮ末端に導入されたもの（それぞれ、マレイミド化ＫＤＧＥＡ、マレイミド化ＧＲＧＤＳと呼ぶ）を使用した。また、ｓｓＤＮＡには、機能性分子結合用官能基としてチオール基が５’末端に導入されているものを用いた。より具体的に構造を説明すると、５’末端のリン酸基に対して６−メルカプト−１−ヘキサノールのＯＨ部位が結合した状態となっている合成ｓｓＤＮＡである。合成された直後では、５’末端のチオール部位は、チオール基を有する保護基とジスルフィド結合とにより保護されている。これを脱保護してチオール基を形成させ、マレイミド化ＫＤＧＥＡ又はマレイミド化ＧＲＧＤＳを導入してｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成する。
【０１２７】
実施例１〜３
スペーサーとして４０ｎｍ（１２０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、８０ｎｍ（２４０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ、および１６０ｎｍ（４８０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳを、以下のように調製した。合成プロセスの概略を、図１に示す。
【０１２８】
（マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成）
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（なお、前記「Ｆｍｏｃ」は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌの略称である）が予め導入された樹脂（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）から、マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成を開始した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０重量％  ピペリジン（アプライドバイオシステムズ社製）／ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦともいう）溶液を用いて行なった。また、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応は、前記レジン中のアミノ酸量に対して１０当量のＦｍｏｃ−ａａ（ａａは適切に保護されたアミノ酸を示す）と、縮合試薬として１０当量のＨＢＴＵ〔株式会社島津製作所製，ＨＢＴＵは、２−（１−Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略称である）、１０当量のＨＯＢｔ〔株式会社ペプチド研究所製，ＨＯＢｔは１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅの略称である〕及び２０当量のＤＩＥＡ（アプライドバイオシステムズ社製，ＤＩＥＡはＤｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅの略称である）をＤＭＦに溶解して得られた溶液を、アミノ酸配列に対応して逐次的に前記レジンに添加することにより樹脂上で行なった。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０重量％  ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護した。得られた産物に、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ〔同仁化学株式会社製、ＧＭＢＳは、Ｎ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である〕と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させ、その後、得られた産物に、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、該樹脂を、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。洗浄後の樹脂を減圧乾燥した。樹脂からのマレイミド基含有ペプチドの切断には、９０容積％  ＴＦＡ（株式会社ペプチド研究所製）／５容積％  チオアニソール（アルドリッチ社製）／３容積％  Ｈ2Ｏ／２容積％  アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液を、樹脂に添加し、得られた混合物を、２時間室温で攪拌した。その後、樹脂を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られたペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは、分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間１０．４分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６８４．６０［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＫＤＧＥＡを得た。
【０１２９】
（マレイミド化ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入されたレジン（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、前記マレイミド化ＫＤＧＥＡの場合と同様の方法で合成した。得られた粗ペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間８．６分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６５６．６１［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＧＲＧＤＳを得た。
【０１３０】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡは、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂの２種類である。なお、図１中、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂは、塩基配列で表記した部分であり、左のｓｓＤＮＡが、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａ、右のｓｓＤＮＡが、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂである。他の原料も同様に示す。
【０１３１】
ＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａを、１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるように、ＴＥバッファー（１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた溶液  ０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍ  ジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．２ｍＬ混合し、その後、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。溶離液〔０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）〕で平衡化したファルマシアバイオテク社製、商品名：ＮＡＰ−５カラムにより精製して、チオール基が脱保護されたＰＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ａを得た。得られた産物について、２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ４０Ａの濃度を決定した。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの場合についても同様に行ない、ＨＳ−ＳＰ８０Ａ、ＨＳ−ＳＰ８０Ｂ、ＨＳ−ＳＰ１６０Ａ及びＨＳ−ＳＰ１６０Ｂを得た。得られたＨＳ−ＳＰ４０Ｂ、ＨＳ−ＳＰ８０Ａ、ＨＳ−ＳＰ８０Ｂ、ＨＳ−ＳＰ１６０Ａ及びＨＳ−ＳＰ１６０Ｂの濃度を、同様に決定した。結果を表１に示す。
【０１３２】
【表１】
2006042812.tif 000003
【０１３３】
（コンジュゲートの調製）
ＨＳ−ＳＰ４０Ａ溶液（濃度１７．０ｎｍｏｌ／ｍＬ）  ０．８ｍＬと、ＨＳ−ＳＰ４０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液  ０．８ｍＬとを混合し、４℃で２４時間インキュベーションし、反応させた。得られた反応溶液を凍結乾燥させた。得られた産物を、０．５ｍＬの１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶液を、溶離液で平衡化したＮＡＰ−５を用いたゲル濾過に供して、マレイミド化ＫＤＧＥＡとＨＳ−ＳＰ４０ＡとのコンジュゲートであるＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ４０Ａを精製した。なお、溶離液として、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。得られた産物について、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＳ−ＳＰ４０Ａ（表１）のデータを利用して濃度を決定した。同様に、マレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ４０ＢとのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂ、マレイミド化ＫＤＧＥＡとＨＳ−ＳＰ８０ＡとのコンジュゲートであるＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ８０Ａ、マレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ８０ＢとのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ８０Ｂ、マレイミド化ＫＤＧＥＡとＨＳ−ＳＰ１６０ＡとのコンジュゲートであるＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１６０Ａ及びマレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ１６０ＢとのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１６０Ｂを得た。結果を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
2006042812.tif 000004
【０１３５】
また、全てのコンジュゲートはＨＰＬＣによりシングルピークであることが確認できた。
【０１３６】
（機能性高分子複合体の調製）
前記ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ４０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ４０Ｂとを、ＰＣＲ用プライマー対として用い、大腸菌１６ｓ  ｒＲＮＡを鋳型核酸として用い、以下のように、１２０量体のＤＮＡスペーサーを含む機能性高分子複合体を調製した。
【０１３７】
前記プライマー対（各５０ｐｍｏｌ）と、商品名：Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）  ２５μＬ、大腸菌懸濁液  ５μＬに蒸留水を添加して、全量５０μＬの反応溶液を得た。なお、前記大腸菌懸濁液は、寒天培地上に生育させた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ３９７２）の１コロニーを、蒸留水  １００μＬに溶解させることにより調製した懸濁液である。得られた反応溶液を用い、９４℃で０．５分と、５５℃で０．５分と、７２℃で１分とを１サイクルとする２４サイクルの反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なった。得られた反応産物を、スピンカラム（商品名：ＱＩＡ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）に供して、精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳを得た。得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ついで、可視化させ、検出した。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳは、１２０量体のｄｓＤＮＡを含むことが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。以上の方法と同様にして、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳについて、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ８０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ８０Ｂとをプライマー対として、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳについて、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ１６０ＡとＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ１６０Ｂとをプライマー対として用いて、機能性高分子複合体を調製した。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの分子量をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。その結果、分子量マーカーとの相対移動度の比較によりそれぞれｄｓＤＮＡ部が２４０、４８０量体であることが確認できた。これにより、それぞれのｄｓＤＮＡからなるスペーサー部位が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量した結果を表３に示す。
【０１３８】
【表３】
2006042812.tif 000005
【０１３９】
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
細胞の機能を制御する性能は、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力を比較することにより評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０重量％  ウシ胎仔由来血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ（ギブコ社製、α−ＭＥＭはＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの略称である）で培養した。その後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、９０％  コンフルエント状態時にトリプシン処理により回収した。１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（シグマ社製）と５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（シグマ社製）と１０重量％  ＦＢＳ（シグマ社製）とを添加したα−ＭＥＭに、１９０００個／ｍＬとなるように、前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を再分散させた。その後、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ又はＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳを以下に示す方法により固定化した１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬとなるように前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種した。この時の細胞密度は、５０００個／ｃｍ2であった。３７℃、５容積％  ＣＯ2を含む湿潤空気中で前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。３日毎に培地の交換を行なった。１１日後にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。前記ＡＬＰ活性をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化度合の指標として、機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能を評価した。
【０１４０】
培養後の細胞をトリプシン処理により回収し、０．５ｍＬのＰＢＳに再分散した。得られた分散液を用い、細胞数を、ビルケルチルク氏血球計算盤で計数した。その後、分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性の測定を行なった。ＡＬＰ活性測定は、基質溶液〔商品名：ＦＡＳＴ  ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＴＡＢＬＥＴ  ＳＥＴＳ（シグマ社製）を溶解して使用した〕を用いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）法により行なった。ここで、基質であるｐＮＰＰが、ＡＬＰによりｐ−ニトロフェノールとなり黄色を呈することを利用し、一定時間に生じるｐ−ニトロフェノール量で酵素活性値を示した。ｐ−ニトロフェノールの生成量は、ｐ−ニトロフェノールをＰＢＳに溶解させたものを検量線の作成に使用した。また、細胞膜の溶解には、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（シグマ社製）を用いた。９６ウェルプレートに、細胞液又は検量線溶液  １００μＬと、０．３重量％  ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００  ５０μＬと、基質溶液  １００μＬとを入れ、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションして反応を行なった。得られた反応産物に、３Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液  ５０μＬを添加し、酵素反応を停止させた。その後、得られた産物について、マイクロプレートリーダー（デカン社製ジェニオス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。１個の細胞あたりのＡＬＰ活性（細胞１個あたりのｐ−ニトロフェノールの生成速度（ｆｍｏｌ／分／細胞））を算出した。
【０１４１】
試験例１
（ポリ−Ｌ−リジン表面の調製）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）塩酸塩（ペプチド研究所製、平均分子量８０００以上）を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。なお、これ以降の操作は、安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行なった。得られた溶液を０．２μｍ内径のフィルターを通して濾過滅菌し、ＰＢＳでさらに１０倍に希釈して、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液を得た。得られたＰＬＬ溶液を、ヌンク社製のデルタ処理１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、ついで、プレートを密封した。前記プレートを３７℃で２時間インキュベーションすることにより、該プレートにＰＬＬを吸着させた。その後、前記プレートからＰＬＬ溶液を吸引してウェル内から除去した。さらに、前記プレートに、１ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳを添加して３分間放置し、アスピレーションする洗浄操作を３回行ない、ＰＬＬ表面を調製した。
【０１４２】
（ポリイオンコンプレックス形成によるポリ−Ｌ−リジン表面への機能性高分子複合体の固定化）
全ての操作は安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行なった。実施例１〜３で調製した機能性高分子複合体、すなわち、すなわち、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳをそれぞれ目標密度となるように、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。得られた希釈物を、０．２μｍ内径のフィルターで濾過滅菌した。滅菌後の産物を、ＰＬＬ表面を形成させた１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。ここで、前記産物  ０．５ｍＬ中にＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳをそれぞれ０．４５ｐｍｏｌ含むように調製した。１２ウェルプレートの場合、１ウェルに液体  ０．５ｍＬを添加すると、液体が覆う面積は、約４．５ｃｍ2となる。したがって、この場合の機能性高分子複合体が全てＰＬＬ表面に結合したときの密度は、１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2と判断される。その後、４℃において１２時間以上吸着させた。吸着後の機能性高分子複合体溶液を回収した。ついで、得られた機能性高分子複合体溶液について、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによりｄｓＤＮＡ濃度を測定し、添加した機能性高分子複合体がどの程度ＰＬＬ表面に固定化されているかを確認した。その結果を表４に示す。
【０１４３】
【表４】
2006042812.tif 000006
【０１４４】
その結果、機能性高分子複合体がＰＬＬ表面に固定化されたことがわかった。
【０１４５】
試験例２
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例１〜２で作製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ又はＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳを固定化したＰＬＬ表面が有する細胞の機能を制御する性能を、前記と同様に、ＡＬＰ活性を測定することにより、評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して１１日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表５に示す。
【０１４６】
【表５】
2006042812.tif 000007
【０１４７】
その結果、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及びＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳにより、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）が、成熟骨芽細胞に分化されることがわかった。
【０１４８】
比較例１
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子の調製）
リガンド分子としてＫＤＧＥＡ分子とＧＲＧＤＳ分子とを含有し、かつ平均分子量が３０００のポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称することがある）をスペーサーとする機能性高分子を合成した。Ｆｍｏｃ基により保護されたアミノ基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル基をもう１つの末端に持つＦｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＥＫＴＡＲ社製，分子量３４００）をＰＥＧスペーサー結合部位として用いた以外は、Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）およびＹ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）に記載された方法を適用し、ＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを合成した。
【０１４９】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子のディッシュ表面への固定化）
Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）およびＹ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）に記載された方法に従って、９ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを純水に溶解させた。得られた溶液を、１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製、デルタ処理）のウェルに、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加した。前記プレートを、そのままクリーンベンチ内で放置し、溶液を風乾した。前記プレートのウェルに、３重量％  ウシ血清アルブミン／ＤＭＥＭ（ギブコ社製、ＤＭＥＭはＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍの略称である）を１ウェルあたり２ｍＬ添加して室温１時間静置した。その後、溶液を吸引した。０．１重量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ溶液を、前記プレートの１ウェルあたり２ｍＬ入れてアスピレーションする一連の洗浄操作を３回行なって、機能性高分子を固定化した表面を調製した。
【０１５０】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子を固定化した表面による細胞機能制御）
以上のように調製した１２ウェルプレートを用いて、実施例１の機能性高分子複合体を用いた場合と全く同じ条件で、かつ同時に細胞機能の評価を行なった。その結果、１１日間培養を続けるとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がプレート底面から剥がれてしまった。また、１細胞あたりのＡＬＰ活性は、２８ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌであり、きわめて低かった。かかる結果は、比較例１で得られたプレートの表面では細胞機能の制御ができなかったことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体を用いて、細胞表面、細胞外マトリクス、その他の生体組織表面におけるタンパク質、糖質等の生体高分子内の特定の部位間の距離あるいは、複数の同一又は異なるタンパク質、糖質その他の生体分子間の距離を推定することは、細胞、細胞外マトリクス、その他の生体組織の構造を知る上で、また、それらの生体分子間の相互作用の有無を推定する上で有用である。また、細胞表面上の複数の特定の部位に同時に結合することによって、細胞に対して同時に信号を与え、その細胞の反応を観察することは、それらの生体分子の機能を調べることは細胞生理学上非常に有用である。本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体は、例えば、前記学問の発展により、医療、診断、医薬品等有用物質の製造等の分野に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、スペーサーとして４０ｎｍ（１２０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ４０−ＧＲＧＤＳ、８０ｎｍ（２４０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ８０−ＧＲＧＤＳ及び１６０ｎｍ（４８０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ１６０−ＧＲＧＤＳの構造と、それらの機能性高分子複合体の調製に用いたコンジュゲートの構造を示す概略図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号：１は、リガンドの配列を示す。
【０１５４】
配列番号：２は、リガンドの配列を示す。
【０１５５】
配列番号：３は、リガンドの配列を示す。
【０１５６】
配列番号：４は、リガンドの配列を示す。
【０１５７】
配列番号：５は、リガンドの配列を示す。
【０１５８】
配列番号：６は、リガンドの配列を示す。
【０１５９】
配列番号：７は、リガンドの配列を示す。
【０１６０】
配列番号：８は、リガンドの配列を示す。
【０１６１】
配列番号：９は、リガンドの配列を示す。
【０１６２】
配列番号：１０は、リガンドの配列を示す。
【０１６３】
配列番号：１１は、リガンドの配列を示す。
【０１６４】
配列番号：１２は、リガンドの配列を示す。
【０１６５】
配列番号：１３は、リガンドの配列を示す。
【０１６６】
配列番号：１４は、リガンドの配列を示す。
【０１６７】
配列番号：１５は、リガンドの配列を示す。
【図１】
2006042812.tif 000008
【配列表】
2006042812000001.app