(57)【要約】【課題】  活性・機能を保持した状態の生理活性タンパク質を含むバイオマテリアルを簡便に得ることのできる新規な手段を提供する。【解決手段】  絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有するトランスジェニックカイコから得られ、前記融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質を主成分とする生理活性バイオマテリアル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有するトランスジェニックカイコから得られ、前記融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質を主成分とする生理活性バイオマテリアル。
【請求項２】
絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有するトランスジェニックカイコから得られた組換え絹タンパク質から、前記融合タンパク質以外の１以上のタンパク質成分が除去された生理活性バイオマテリアル。
【請求項３】
生理活性タンパク質がヒト線維芽細胞増殖因子である請求項１または２の生理活性バイオマテリアル。
【請求項４】
絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、前記融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質を産生するトランスジェニックカイコ。
【請求項５】
生理活性タンパク質がヒト線維芽細胞増殖因子である請求項４のトランスジェニックカイコ。
【請求項６】
請求項４または５記載のトランスジェニックカイコが産生する絹糸または絹糸線内タンパク質。
【請求項７】
請求項６記載の絹糸を可溶化剤で処理することによって得られる生理活性バイオマテリアル溶液。
【請求項８】
請求項７記載の生理活性バイオマテリアル溶液の生理活性を再生する方法であって、生理活性バイオマテリアル溶液を変性剤で処理し、次いで生理活性バイオマテリアル溶液中の変性剤濃度を減少させることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１または２の生理活性バイオマテリアルを用いて成形加工された生理活性バイオマテリアル加工物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、所与の生理活性を有するバイオマテリアルに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、絹フィブロインと生理活性物質との融合タンパク質を含む絹タンパク質を産生するトランスジェニックカイコと、このカイコが産生する絹タンパク質または前記融合タンパク質を主成分とする生理活性バイオマテリアルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
(１)バイオマテリアル
生体の組織は、細胞と細胞外マトリックスから構成されており、細胞は細胞外マトリックスを足場として、接着、増殖および分化などを含む様々な生理現象を営んでいる。生体の組織に損傷が生じた場合、細胞外マトリックスが存在しなければ、損傷部やその周辺細胞の接着、さらに増殖や分化が迅速に進行しないため、組織の修復・再生がうまく行われない。従って、生体の組織が大きく欠損した場合には、その欠損部位である標的組織に細胞外マトリックスを外部から提供しなくてはならない。そこで、細胞外マトリックスの代用として必要となるのが、生体に親和性のあるバイオマテリアルである。
(２)生理活性タンパク質
細胞の増殖や分化を促進する細胞増殖因子やサイトカインなどの生理活性タンパク質は、組織の修復・再生において極めて重要な役割をはたしている。例えば、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）は、線維芽細胞のみならず、血管内皮細胞、骨芽細胞や神経細胞など幅広い細胞において低濃度で作用し組織の修復・再生を促進する。そこで、損傷部位にこれらの生理活性タンパク質を外部から供給し、修復・再生を早めようとする試みが行われている。しかし、供給した生理活性タンパク質が、標的組織において低濃度であると、組織の修復・再生は速やかに進行しない。従って、単に生理活性タンパク質を損傷部位に投与するだけでは、拡散や分解によって生理活性タンパク質が消失し、損傷組織における生理活性タンパク質の有効濃度を長期間保つことが難しい。例えば、標的組織にbFGFの水溶液を投与した場合、たった4時間で投与した約半分量が拡散により失われてしまう（非特許文献１）。
(３)絹フィブロイン
絹フィブロインは、カイコが吐き出す絹糸において約70 %を構成する主要なタンパク質である。絹フィブロインは天然材料であるうえに、優れた操作性および生体適合性をもつことから、長年にわたって、手術用縫合糸などの体内に埋め込むことが可能な材料として利用されてきた。近年では、絹フィブロインの水溶液化やそれを用いてフィルムやゲルなどを製造する方法が開発され、新たなバイオマテリアルとして利用される可能性が広がりつつある。
【０００３】
例えば、絹フィブロインフィルム上において線維芽細胞の培養を行うと、希薄なコラーゲン水溶液を用いて同様に作製したフィルム上において線維芽細胞の培養を行ったものと同程度の細胞接着性と増殖性が認められており（非特許文献２）、絹フィブロインフィルムを利用した細胞培養用支持体（特許文献１）が提案されている。また、絹フィブロインフィルムのもつ生体表皮等との親和性を利用して、創傷皮膚材（特許文献２）やコンタクトレンズ（特許文献３）などが開発されている。さらには、手術用縫合糸は非吸収性であるが、絹フィブロインフィルムは、生理的条件下において、プロテアーゼXIVやコラゲナーゼIAの消化を受けることが示されており（非特許文献３）、絹フィブロインが生体適合性や生分解性を有することが示唆されている。
【０００４】
あるいはまた、インテグリン認識配列（RGD）（非特許文献４）や、肝細胞表面によって特異的に認識されるβ-ガラクトース残基（非特許文献５）などの細胞接着に関与した分子を化学的な共有結合で絹フィブロインフィルム上に固定化し、細胞親和性を高めた絹フィブロイン材料も開発されている。このように、絹フィブロインを利用して新しいバイオマテリアルを創出しようとする種々の試みがなされている。
(４)生理活性バイオマテリアル
前記(２)のとおり、生理活性タンパク質を単独で生体に適用した場合には、その活性を長時間維持することは困難である。そこで、生理活性タンパク質を、その生理活性を保ったままバイオマテリアルに固定化させ、バイオマテリアルと共に生理活性タンパク質を損傷部位に供給する技術の開発が望まれている。この技術が確立されれば、必要濃度の生理活性タンパク質を必要な期間だけ標的組織に供給することを可能となり、組織の修復・再生を速やかに進行させることができると期待される。
【０００５】
細胞の増殖や分化を促進する細胞増殖因子やサイトカインなどの生理活性タンパク質を、化学的な共有結合によって、キトサンフィルムなどのバイオマテリアルに固定化し、組織の修復・再生を促進する材料として利用しようとする試みが行われている（非特許文献６）。このとき、固定化に用いられる生理活性タンパク質は、大腸菌や昆虫細胞由来の精製された組換えタンパク質が用いられている。従って、組換えタンパク質の発現、精製、および固定化という、煩雑なステップを経なければ、生理活性タンパク質を固定化したバイオマテリアルを作製することができない。また、この固定化した生理活性タンパク質が高い生物活性を示すには、比較的大量の組換えタンパク質を固定化させる必要がある。固定化する生理活性タンパク質の量的な問題は、生理活性タンパク質を含有するバイオマテリアルを作製する上で最大の問題点である。これは、化学的な固定化を行う過程で、加熱や有機溶媒との接触などにより、生理活性タンパク質の生物活性が低下するためである。
【０００６】
従って、穏和な条件下で生理活性タンパク質をバイオマテリアルへ固定化する方法が望まれている。
(５)トランスジェニックカイコ
この発明の出願者らは、組換えヒトコラーゲンを絹タンパク質の一部として生産するトランスジェニックカイコを発明し特許出願している（特許文献４）。また、遺伝子組換えカイコを用いた組換え型サイトカインの製造方法も考案されている（特許文献５）。このように、カイコは組換えタンパク質を生産するための宿主動物としても注目されている。
【特許文献１】特開平11-243948号公報
【特許文献２】特開平11-70160号公報
【特許文献３】特開平11-52303号公報
【特許文献４】特開2004-16144号公報
【特許文献５】特開2003-325188号公報
【非特許文献１】J. Biomed. Mater. Res. 64A, 177-181 (2003)
【非特許文献２】J. Biomed. Mater. Res. 29, 1215-1221 (1995)
【非特許文献３】Biomaterials 24, 357-365 (2003)
【非特許文献４】J. Biomed. Mater. Res. 54, 139-148 (2001)
【非特許文献５】Biomaterials 25, 1131-1140 (2004)
【非特許文献６】J Biomed. Mater. Res. 64A(1), 177-181 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のとおり、生理活性タンパク質を固定化したバイオマテリアルは、そのタンパク質の「生理活性」とバイオマテリアルの持つ「生体親和性」等の二つの効果によって、医療材料等として大きな可能性を秘めている。
【０００８】
しかしながら、従来の生理活性バイオマテリアルの場合には、生理活性タンパク質とバイオマテリアルとを別個に調製し、それらを結合して作成していたために、固定化した生理活性タンパク質の活性が低下していまうといった問題点を有していた。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、活性・機能を保持した状態の生理活性タンパク質を含むバイオマテリアルを簡便に得ることのできる新規な手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有するトランスジェニックカイコから得られ、前記融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質を主成分とする生理活性バイオマテリアルを提供する。
【００１１】
またこの出願は、第２の発明として、絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有するトランスジェニックカイコから得られた組換え絹タンパク質から、前記融合タンパク質以外の１以上のタンパク質成分が除去された生理活性バイオマテリアルを提供する。
【００１２】
この出願は、第３の発明として、絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、前記融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質を産生するトランスジェニックカイコを提供する。
【００１３】
なお、前記の各発明においては、生理活性タンパク質がヒト線維芽細胞増殖因子であることを好ましい一つの態様としている。
【００１４】
この出願は、第４の発明として、前記第３発明のトランスジェニックカイコが産生する絹糸または絹糸線内タンパク質を提供する。
【００１５】
この出願は、第５の発明として、前記第３発明のトランスジェニックカイコが産生する絹糸を可溶化剤で処理することによって得られる生理活性バイオマテリアル溶液を提供する。
【００１６】
この出願は、第６の発明として、前記第５発明の生理活性バイオマテリアル溶液の生理活性を再生する方法であって、生理活性バイオマテリアル溶液を変性剤で処理し、次いで生理活性バイオマテリアル溶液中の変性剤濃度を減少させることを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
この出願は、第７の発明として、前記第１発明または第２発明の生理活性バイオマテリアルを用いて成形加工された生理活性バイオマテリアル加工物を提供する。
【００１８】
なお、前記の各発明において、「生理活性タンパク質」とは、ヒトを含めた動植物の生理機能に対して作用する、少なくとも１つの公知機能を有するタンパク質を意味する。「融合タンパク質」とは、絹フィブロインと生理活性タンパク質が物理的に融合し、通常の使用範囲における操作では分離しないことを意味する。さらに、この発明における融合タンパク質とは、絹フィブロインと生理活性タンパク質とが、それぞれの使用目的に合致した機能、活性を保持した状態で結合していることをも意味する。さらに、「融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質」とは、具体的にはトランスジェニックカイコが産生する絹糸のタンパク質成分または絹糸腺内腔のタンパク質を意味する。また、「主成分」という用語は、この発明の生理活性バイオマテリアルの機能が、組換え絹タンパク質に含まれる融合タンパク質によって実質的に担われている限りにおいては、例えば絹糸や絹糸腺内腔からタンパク質成分を分離したりする際に使用する試薬等が微量に残存していてもよいことを意味する。
【００１９】
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態および実施例の説明において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【発明の効果】
【００２０】
この出願の発明によれば、絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質を含む生理活性バイオマテリアルが、トランスジェニックカイコの産生する組換え絹タンパク質として得られる。従って、従来方法では生理活性タンパク質を絹フィブロインへ固定化するために必要であった個別の精製組換えタンパク質の確保や固定化の操作は省略される。さらに、加熱や有機溶媒による処理を必要としないため、生理活性タンパク質の活性が損なわれることもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
この出願の発明において、活性型の生理活性タンパク質と絹フィブロインとの融合タンパク質を含む生理活性バイオマテリアルは、トランスジェニックカイコの絹糸腺内腔に蓄積された液状絹タンパク質やトランスジェニックカイコによって産生された絹糸である。
【００２２】
トランスジェニックカイコは、生理活性タンパク質と絹フィブロインとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、カイコ染色体に導入することによって作出することができる。
【００２３】
絹フィブロインは、分子量350 kDaのフィブロインH鎖および分子量25 kDaのフィブロインL鎖が会合したタンパク質複合体であり、これらをコードするポリヌクレオチドは公知である（フィブロインH鎖：GenBank Accession No. AF226688；フィブロインL鎖：GenBank Accession No. M76430）。生理活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、フィブロインH鎖またはフィブロインL鎖をコードするポリヌクレオチドのどちらかに連結される。生理活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの連結位置は、フィブロインH鎖またはフィブロインL鎖をコードするポリヌクレオチドの5'側でも3'側でもよい。また、ポリヌクレオチドが直接的に連結されていても、あるいはリンカーを介して間接的に連結されていてもよい。さらに、フィブロインH鎖またはフィブロインL鎖をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質全長をコードする配列であってもよいし、部分配列でもよい。
【００２４】
絹フィブロインと融合される生理活性タンパク質は、細胞に対して様々な生理活性を示すタンパク質群のことを指す。例えば、線維芽細胞増殖因子（FGF）類、骨形成因子（MBP）類、上皮増殖因子（EGF）類、血小板由来増殖因子（PDGF）類、トランスフォーミング増殖因子（TGF）類、インスリン様増殖因子（IGF）類、肝細胞増殖因子（HGF）類、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）類、神経増殖因子（NGF）類などを含む細胞増殖因子類、およびインターロイキン（IL）類、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（CSF）類、腫瘍壊死因子（TNF）類などを含むサイトカイン類を指す。これらの生理活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドも公知であり、例えば以下が例示される。なお、以下において、登録番号は、Xで始まるものはEMBLデータベース（http://www.embl-heidelberg.de/）、それ以外の記号で始まるものはGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で検索可能である。
線維芽細胞増殖因子（FGF）類：
FGF (Fibroblast growth factor)-1；AY601819, FGF-2；J04513, FGF-3；X14445, FGF-4；J02986, FGF-5；M37825, FGF-6；X63454, FGF-7；M60828, FGF-8；AH006649, FGF-9；D14838, FGF-10；AF411527, FGF-11；AY049782, FGF-12；U66197, FGF-13；U66198, FGF-14；U66200, FGF-16；AB009391, FGF-17；AB009249, FGF-18；AF075292, FGF-19；AF110400, FGF-20；AB044277, FGF-21；AY359086, FGF-22；AB021925, FGF-23；AF263537、など
骨形成因子（BMP）類：
BMP (Bone morphogenetic protein)-1；M22488, BMP-2；M22489, BMP-3；M22491, BMP-4；U43842, BMP-5；M60314, BMP-6；M60315, BMP-7；X51801, BMP-8B；M97016, BMP-9；AF188285, BMP-10；AF101441, BMP-11；AF100907、など
上皮増殖因子（EGF）類：
EGF (Epidermal growth factor)；X04571、など
血小板由来増殖因子（PDGF）類：
PDGF (Platelet-derived growth factor)-A；X06374, PDGF-B；X02811、など
トランスフォーミング増殖因子（TGF）類：
TGF (Transforming growth factor)-alpha；M31172, TGF-beta1；X02812, TGF-beta 2；Y00083, TGF-beta 3；X14149、など
インスリン様増殖因子（IGF）類：
IGF (Insulin-like growth factor)-I；M29644, IGF-II；M29645
Insulin；J00265、など
肝細胞増殖因子（HGF）：
HGF (Hepatocyte growth factor)；M29145、など
血管内皮細胞増殖因子（VEGF）類：
VEGF (Vascular endothelial growth factor)；M32977, VEGF-B；U52819, VEGF-C；X94216, VEGF-D；AJ000185
PlGF (Placenta growth factor)；X54936、など
神経増殖因子（NGF）類：
NGF (Nerve growth factor)-beta；X52599
BDNF (Brain-derived neurotrophic factor)；M61176
NT (Neurotrophin)-3；M37763, NT-4；M86528、など
インターロイキン (IL) 類：
IL (Interleukin) -1 alpha；M28983, IL-1 beta；M15330, IL-2；U25676, IL-3；M14743, IL-4；M13982, IL-5；X04688, IL-6；M29150, L-7；J04156, IL-8；M26383, IL-9；AF361105, IL-10；M57627, IL-11；M57765, IL-12A；M65291, IL-12B；M65290, IL-13；L06801, IL-15；U14407, IL-16；M90391, IL-17；U32659, IL-18；AY044641, IL-19；AY040367, IL-20；AF212311, IL-21；AF254069, IL-22；AF279437、など
エリスロポエチン（EPO）
EPO (Erythropoietin)；M11319、など
コロニー刺激因子（CSF）類：
GM (Granulocyte macrophage)-CSF；M11220
G (Granulocyte)-CSF；M17706
M (Macrophage)-CSF；M27087、など
腫瘍壊死因子（TNF）類
TNF (Tumor necrosis factor)-alpha；X02910, TNF-beta；M55913、など
これらの絹フィブロインをコードするとポリヌクレオチドと生理活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとは遺伝子工学的手法により連結する。さらに、生理活性タンパク質と絹フィブロインの融合タンパク質を、トランスジェニックカイコの絹糸腺において発現させるためには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、フィブロインH鎖、L鎖またはP25などの絹タンパク質遺伝子由来のプロモーターの下流に連結される必要がある。また、これらプロモーターの転写活性を増大させるために、さらにエンハンサーを連結してもよい。絹タンパク質の転写活性を増強させる効果があるものであれば、エンハンサーは絹タンパク質遺伝子由来のものであっても、絹タンパク質遺伝子以外に由来するものであってもよい。また、カイコ由来であっても、他の動物やウイルスなどに由来するものであってもよい。このようにして融合タンパク質発現カセットが構築される。
【００２５】
この発現カセットは、次いで、トランスジェニックカイコを作出するためのベクターに挿入する。ベクターは、外来遺伝子をカイコの染色体内に挿入することができるものであればどのようなものであってもよいが、例えばDNA型トランスポゾンをもとに作製したベクターを利用することが可能である。これまでに、カイコの染色体中に遺伝子転移する活性が示されているDNA型トランスポゾンには、piggyBac、Mariner、Minosなどがある。中でも、piggyBacを利用したベクターは、田村ら（Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000)）や冨田（Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003)）らによって、実際にトランスジェニックカイコを作出するために用いられている。piggyBacをもとに作製したベクターを利用する場合は、例えば田村らの方法（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）と同様な方法によって行えばよい。すなわち、piggyBacの一対の逆向き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、さらに、このベクター内の逆向き反復配列で挟まれた領域に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとプロモーターを挿入する。そしてこのプラスミドベクターを、piggyBacのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、piggyBacの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはpiggyBacのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。このヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、挿入するポリヌクレオチドを組み込んだベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
【００２６】
以上のように、ベクターをマイクロインジェクションしたカイコの卵から孵化したF0幼虫を飼育する。このF0カイコを同胞交配あるいは野生型カイコと交配し、次世代（F1世代）のカイコからトランスジェニックカイコをスクリーニングする。ベクター内にマーカー遺伝子が組み込まれている場合には、その表現形質を利用してスクリーニングする。例えばマーカー遺伝子としてGFP等の蛍光タンパク質遺伝子を利用すれば、F1世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することによりスクリーニングすることができる。この他、幼虫やカイコ蛾より抽出したゲノムDNAを用いたPCRやサザンブロット法によってもスクリーニングすることができる。このようにして得られたトランスジェニックカイコには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが染色体内に安定に組み込まれており、その子孫においても失われることがない。
【００２７】
絹フィブロインと生理活性タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するトランスジェニックカイコは、5齢期になると絹糸腺において組換え融合タンパク質を合成する。この組換え融合タンパク質は、その一部に絹フィブロインのアミノ酸配列を有しているため、内在性の絹タンパク質と複合体を形成し、内在性の絹タンパク質と共に絹糸腺細胞から絹糸腺内腔へ分泌される。内腔へ分泌された組換え融合タンパク質を含有する液状絹フィブロインは、吐糸される際に絹糸となり、その絹糸でカイコは繭を形成する。
【００２８】
この発明の生理活性バイオマテリアル（組換え絹タンパク質）を絹糸腺内腔に蓄積された液状絹タンパク質から回収する場合は、例えば以下のような方法によって行うことができる。絹糸を吐く前日のトランスジェニックカイコの体を切開して絹糸腺を取り出し、さらに、後部絹糸腺のみを切断して回収する。回収した後部絹糸腺は約5 mmくらいの長さに細かく切断し、蒸留水に約4時間浸す。その後、後部絹糸腺の組織片をピンセットで摘み出すか、軽く遠心分離することによって除去する。以上のような操作により、生理活性タンパク質と絹フィブロインとの融合タンパク質を含む組換え絹タンパク質（生理活性バイオマテリアル）を水溶液として調製することができる。
【００２９】
トランスジェニックカイコが吐糸した絹糸は、それ自体が生理活性バイオマテリアルとなる。あるいは、トランスジェニックカイコの絹糸は、例えば、絹糸を可溶化剤で処理することによって、生理活性バイオマテリアル溶液（例えば、水溶液）とすることもできる。可溶化剤としては、9 Mチオシアン酸リチウムや臭化リチウムなどのカオトロピック塩と5 % β-メルカプトエタノールなどの還元剤を含む水溶液もしくは塩化カルシウム・エタノール水溶液（塩化カルシウム：水：エタノール=モル比1：8：2）（日蚕雑 61 2, 91-94 (1998)）などを用いることができる。絹糸をこれらの可溶化剤に10〜48時間、好ましくは18〜36時間、特に好ましくは約24時間程度浸漬するなどして可溶化する。さらに、この水溶液を蒸留水などで透析することにより、生理活性バイオマテリアル水溶液として調製することができる。
【００３０】
絹糸線内腔タンパク質（生理活性バイオマテリアル溶液）を単離する課程で、あるいは絹糸から生理活性バイオマテリアル溶液を調製する過程で、生理活性タンパク質が変性し、その生物活性が消失または低下した場合は、例えば、生理活性バイオマテリアル溶液を変性剤で処理し、次いで生理活性バイオマテリアル溶液中の変性剤の濃度を減少させることによって生理活性タンパクの生物活性を再生させ、活性型の生理活性タンパクを含有する生理活性バイオマテリアル水溶液を得ることもできる。すなわち、液状絹タンパク質や絹糸からの絹タンパク質溶液を変性剤（例えば、高濃度のウレアやグアニジン塩酸など）を含んだ緩衝液に溶解し、一旦、完全に変性状態の絹タンパク質溶液にする。そして、あらかじめ調製しておいた酸化型および還元型グルタチオンなどの酸化還元剤などを含んだ再生緩衝液を用いて、段階的に透析や希釈を行うことによって、絹タンパク質溶液中の変性剤の濃度を少しずつ下げていく。すなわち、変性剤の最終濃度を、5％以下、好ましくは3％以下、特に好ましくは1％以下にする。これにより、絹タンパク質溶液中にある生理活性タンパク質は、完全な変性状態から正しい立体構造にリフォールディングされるため、生理活性タンパクの生物活性が再生される。以上の方法は、生理活性タンパク質を再生させるための一例であり、生理活性タンパク質を効率よく再生させるための最適条件は、生理活性タンパク質の種類などにより異なる。従って、活性型の組換え融合タンパク質を含有する生理活性バイオマテリアル溶液を得るためには、最適な条件下で種々の生理活性タンパク質を正しく効率的に再生させることが重要である。例えば、透析や希釈に用いる再生緩衝液は、生理活性タンパク質の種類に応じてpH、温度、イオン強度、還元剤の存在などについて十分な検討が必要であり、再生時の温度や所要時間などといった操作方法についても十分に検討したものを用いなくてはならない。
【００３１】
さらに、この発明の生理活性バイオマテリアルでは、以上の様にして得られた組換え絹タンパク質またはその溶液から、融合タンパク質以外の１以上のタンパク質成分が除去されたものであってもよい。前記のとおり、カイコの産生する絹糸は主としてフィブロイン、P25およびセリシンを含んでいる。この発明の生理活性バイオマテリアルは、生理活性タンパク質を含む絹糸または絹糸線タンパク質から、フィブロイン以外のタンパク質（P25および／またはセリシン）を除去したものであってもよい。特にセリシンは人体に対して抗原性を有することが知られているため、生理活性バイオマテリアルを直接人体に適用する場合には、セリシンを除去することが好ましい。
【００３２】
トランスジェニックカイコの産生する組換え絹タンパク質から絹セリシンを除去する場合には、0.3〜0.5 ％炭酸水素ナトリウム水溶液あるいは石けん水などのアルカリ水溶液中で煮沸する方法、もしくは8 Mウレア水溶液などのタンパク質変性剤水溶液中で80℃において加熱する方法、もしくはトリプシンなどの酵素を用いて消化する方法を用いることができる。
【００３３】
このようにして得られた絹糸状の生理活性バイオマテリアルは、例えば、繊維状の材料として、あるいは、ホモジナイザーなどを用いて粉砕して、粉末状の材料として利用することもできる。
【００３４】
また、絹糸腺内腔から得られた液状の生理活性バイオマテリアル、あるいは絹糸から調製された水溶液状生理活性バイオマテリアルは、フィルム、ゲル、またはスポンジ状に加工することもできる。例えば、生理活性バイオマテリアル溶液を平板上に流し入れ、風乾させることにより生理活性フィルムを作製することができる。また、より強固なフィルムを作製する場合には、風乾させた後、90 %(v/v)メタノール/蒸留水などに浸してもよい。先にも述べたように、絹タンパク質（特に）を主成分とするフィルムは線維芽細胞などに対する接着性と増殖性を有することが示されているが、この出願の発明における生理活性バイオマテリアルフィルムは、それらの性質に加えて、種々の生理活性タンパク質が有する細胞の増殖や分化の誘導といった生理活性を付加させた高機能性フィルムである。この他にも、生理活性バイオマテリアル水溶液を純水に対して透析を行うことによって脱塩し、凍結乾燥を行うことによって、活性型の生理活性タンパク質機能を有する生理活性バイオマテリアルパウダーを作製することができる。また、このパウダーを50 %グリセロール水溶液に溶解した後、クエン酸緩衝液などを用いて絹フィブロイン水溶液中のpHを弱酸性にすることによって、生理活性バイオマテリアルゲルを作製することもできる。生理活性バイオマテリアル加工物の製造に関しては、これらの形態と方法に限定されることなく、用途に応じて、多様な方法で溶液状、シート状、ゲル状、顆粒状、スポンジ状などの多様な形態に加工すればよい。
【実施例】
【００３５】
以下に、トランスジェニックカイコの絹糸を用いた活性型のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含有する生理活性バイオマテリアルの製造方法に関する実施例を挙げて、この出願の発明を具体的に説明するが、この出願の発明はこの実施例に限定されるものではない。
1．絹フィブロインとヒトbFGFとの融合タンパク質を発現するベクター（pL-bFGF）の構築
絹フィブロインとヒトbFGFとの融合タンパク質を発現するベクター（pL-bFGF）を作製した。pL-bFGFベクターに含まれるインサートDNAは、カイコ絹フィブロインL鎖プロモーター、カイコ絹フィブロインL鎖cDNA、ヒトbFGF cDNA、カイコ絹フィブロインL鎖ポリA付加シグナル配列より構成される。
【００３６】
絹フィブロインL鎖のプロモーターは、pLEベクター（Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003)）を鋳型として、5'末端に制限酵素EcoRIの認識配列を有するプライマー5'-GAATTCGGTACGGTTCGTAAAGTTCACCTG-3'（SEQ ID NO: 1）、および5'末端に制限酵素EcoRIとPstIの認識配列を有するプライマー5'-GAATTCCTGCAGGTCTGTTATGTGACCAATC-3'（SEQ ID NO: 2）を用いたPCRを行うことによって単離した。得られたDNA断片の両末端をEcoRIで切断し、pBluescriptIISK+のEcoRIサイトに組み込んだ。
【００３７】
絹フィブロインL鎖をコードするcDNAは、pLEベクター（Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003)を鋳型として、5'末端に制限酵素PstIの認識配列を有したプライマー5'-CTGCAGTAACAGACCACTAAAATGAAG-3'（SEQ ID NO: 3）、および5'末端に制限酵素BamHIの認識配列を有したプライマー5'-GGATCCGCGTCATTACCGTTGCCAAC-3'（SEQ ID NO: 4）を用いたPCRを行うことによって単離した。得られたDNA断片の両末端をPstIとBamHIで切断し、pBluescriptIISK+のPstIサイトとBamHIサイト間に組み込んだ。
【００３８】
ヒトbFGFをコードするcDNAは、塩基番号495-935（GeneBankデータベース登録番号NM_002006）に相当する配列を含むDNA断片として、ヒト線維芽細胞cDNAを鋳型としたPCRによって所得した。用いたプライマーの配列は、5'末端にBglIIの認識配列を有した5'-AGATCTCCCCGCCTTGCCCGAGGATGGC-3'（SEQ ID NO: 5）、およびXbaIの認識配列を有した5'-TCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG-3'（SEQ ID NO: 6）である。得られたPCR産物をBglIIとXbaIで切断し、上記の絹フィブロインL鎖cDNAを組み込んだpBluescriptIISK+の、フィブロインL鎖cDNAの3'末端に存在するBamHIサイトと、その下流に存在しpBluescriptIISK+のマルチクローニングサイトに由来するXbaIサイト間に挿入し、絹フィブロインL鎖とbFGFの融合タンパク質をコードするcDNAを作製した。さらに、このベクターより、絹フィブロインL鎖cDNAの5'末端に存在するPstIサイトと、ヒトbFGFの3'末端側に存在しpBluescriptIISK+のマルチクローニングサイトに由来するEcoRIサイトを利用して、絹フィブロインL鎖とbFGFの融合タンパク質cDNAを切り出し、上記の絹フィブロインL鎖のプロモーターを組み込んだベクターの、絹フィブロインL鎖プロモーターの3'末端に存在するPstIサイトとEcoRIサイト間に挿入した。
【００３９】
以上のようにして、カイコ絹フィブロインL鎖プロモーターとその下流にカイコ絹フィブロインL鎖とヒトbFGFの融合タンパク質をコードするcDNAを組み込んだプラスミドベクターを作製した。このプラスミドベクターのカイコ絹フィブロインL鎖プロモーターの5'末端とヒトbFGFの3'末端に存在するEcoRIサイトを利用して、フィブロインL鎖のプロモーターと融合タンパク質cDNAからなるインサートDNA断片を切り出し、pBac[3xP3-DsRed/pA]（Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003)）のフィブロインL鎖ポリA付加シグナル配列の上流にあるEcoRIサイトに挿入した。このようにして、マイクロインジェクション用のプラスミドベクター（pL-bFGF）を作製した（図4参照）。
2．  プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入
pL-bFGFベクターを塩化セシウム密度勾配法で精製し、このベクターとヘルパープラスミドであるpHA3PIG（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）を混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、pL-bFGFとpHA3PIGの濃度がそれぞれ200μg/ mlずつになるようにインジェクション緩衝液（0.5 mMリン酸緩衝液 pH 7.0, 5 mM KCl）に溶解した。このDNA溶液を産卵から2〜8時間後の前胚盤葉期のカイコ卵に、一つの卵あたりに約15-20 nlの液量で微量注入した。合計2423個の卵にマイクロインジェクションを行った。
3.  トランスジェニックカイコのF1幼虫のスクリーニング
ベクターをマイクロインジェクションした卵を25℃でインキュベートしたところ、595個の卵が孵化した。孵化したF0幼虫の飼育を続けた後、蛾になったところで、同胞交配を行い、67グループのF1卵塊を得た。産卵日から5〜6日目のF1卵塊を蛍光顕微鏡（Gフィルター：励起フィルター 546/ 10 nm、吸収フィルター 590 nm）を用いて観察した結果、67グループのうち、9グループのF1卵塊において、スクリーニングマーカーの赤色蛍光タンパク質（DsRed）の発現が検出された。DsRedの蛍光が検出された卵のみを25℃において飼育したところ、81頭のF1成虫が得られた。これらの成虫を野生型成虫と交配させることにより、F2卵塊を得た。81頭のF1成虫から抽出したゲノムDNAを鋳型に、サザンブロッティング解析を行った結果、15系統のトランスジェニックカイコが得られていることが分かった。
4.  トランスジェニックカイコの絹糸における絹フィブロインとヒトbFGFの融合タンパク質の検出
トランスジェニックカイコが産生した絹糸を、ホモジナイザーを用いて粉砕した。粉砕した絹糸を、5 mg/mlの濃度でトリプシン溶液（50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.6 に溶解された0.5 mg/ mlの濃度のトリプシン水溶液）に懸濁し、一晩振盪させることによって、絹糸に含まれる絹セリシンの消化を行った。この後、遠心での分別により、絹フィブロインを回収し、消化された絹セリシンを除去した。回収した絹フィブロインを、中性緩衝液でよく洗浄した後、9 Mチオシアン酸リチウムと5 % β-メルカプトエタノールの混合溶液に5 mg/ mlの濃度で懸濁し、4℃において一晩振盪させることにより溶解した。そして、遠心操作により、溶け残った絹フィブロインを除き、絹フィブロイン溶液を回収した。この絹フィブロイン溶液をSDS-サンプルバッファーと混合し、溶液に含まれるタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により展開しクマシー染色を行った（図1A）。また、ゲルに展開したタンパク質を、定法によりニトロセルロース膜（PROTRAN）に転写した。このニトロセルロース膜をブロッキング液（5 ％ Skim milk/ 50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.5、150 mM NaCl）で4℃において16時間処理した後に、TBS（50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.5、150 mM NaCl）溶液で200倍に希釈した抗ヒトbFGF ポリクローナル抗体（R&D Systems、AF-233-NA）と室温で約2時間反応させた。次に、ブロッキング溶液で3000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヤギIgGポリクローナル抗体（VECTOR、PI-9500）と室温で約1時間反応させた。最後に、抗体が反応したタンパク質をECL Western Blotting Detection Reagents（Amersham Biosciences）を用いて検出した。この結果、トランスジェニックカイコが産生した絹フィブロインに、絹フィブロインL鎖とヒトbFGFとの融合タンパク質が含まれていることを確認した（図2A）。
5．  トランスジェニックカイコの絹糸からのヒトbFGFを含有した絹フィブロイン材料の作製
上記4の形質転換カイコの絹糸から得られた絹フィブロイン溶液を透析カップ（MWCO 8000、Bio-Rad）に入れ、可溶化緩衝液（8 Mウレア、1 mM ジチオトレイトール、50 mM トリス塩酸緩衝液 pH 8.0、200 mM NaCl）に対して12時間透析を行った。続いて、透析外液の約半分量を捨て、これと等量の再生緩衝液（2.0 mM還元型グルタチオン、0.2 mM  酸化型グルタチオン、1 mM ジチオトレイトール、50 mM トリス塩酸緩衝液 pH 8.0、200 mM NaCl）（Growth Factors 18, 261-275 (2001)）を透析外液へ加えることによって、透析外液中のウレアの最終濃度を4 Mとし、12時間透析を行った。このような透析外液を再生緩衝液と半分量ずつ交換して透析する操作を繰り返し行うことにより、透析外液中のウレアの最終濃度を段階的に0.5 Mまで下げていき、変性剤であるチオシアン酸リチウムやウレアの除去を行うとともに、変性したbFGFの活性を再生させた。最終的に、ヒトbFGFとフィブロインL鎖との融合タンパク質を含有した絹フィブロインは、変性剤を含まない中性緩衝液（50 mM トリス塩酸緩衝液 pH 8.0、200 mM NaCl）に対して透析を行うことによって、中性緩衝液に溶解された状態で得ることができた。
6．  bFGF を含有した絹フィブロイン材料の生物活性の測定
上記5の、中性緩衝液に溶解されたヒトbFGFを含有した絹フィブロイン溶液中のbFGF量をELISAキット（Human FGF basic Immunoassay、R&D Systems）を用いて定量した。bFGFの生物活性は、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（KURABO）に対する増殖促進効果として測定した。
【００４０】
2x103のヒトさい帯静脈血管内皮細胞を、組織培養用96穴プレート（Falcon）の1穴（直径6.4 mm）に播種し、正常培地（2 ％ウシ胎児血清、10 ng/ ml EGF、1μg/ mlハイドロコーチゾン、50μg/ mlゲンタマイシン、50 ng/ mlアンフォテリシン、10μg/ mlヘパリン、および5 ng/ mlヒト組換え型bFGFを含む血管内皮細胞基礎培地Humedia-EB2（KURABO））で4時間培養した。その後、培地を除きHEPES緩衝液を用いて細胞を2回洗浄し、bFGFを含まない上記培地を加えた。さらに、ヒトbFGFを含有した絹フィブロイン溶液を、bFGFあたりの最終濃度が125 pg/ mlおよび250 pg/ mlになるように加えた。37℃で3日間培養した後、Cell Counting Kit（同仁化学）を用いたWST-1法により、細胞増殖を調べた（図2）。その結果、培地に加えた絹フィブロイン溶液中のヒトbFGFの濃度が125 pg/ mlおよび250 pg/ mlの両方の場合において、細胞が増殖していることが明らかになった。bFGF量あたりの増殖の程度は、陽性コントロールとして用いた大腸菌で発現させたヒト組換え型bFGFと同等であった。以上のように、絹糸から調製したbFGF を含有する絹フィブロイン溶液は、高い生物活性を有していることが確かめられた。
7．  bFGFを含有した絹フィブロインフィルム上でのヒトさい帯血管内皮細胞の培養
ポリスチレン製の直径35 mmの細胞培養皿（Falcon）に、上記5 で得られた中性緩衝液に溶解されたヒトbFGFを含有した絹フィブロイン溶液2.0 mlを入れて静置し、一晩クリーンベンチ内で送風しながら風乾させることにより、培養皿表面上に絹フィブロインフィルムを作製した。HEPES緩衝液を用いて、絹フィブロインフィルムの表面を2回洗い、bFGFを含まない正常培地に懸濁した6x104のヒトさい帯血管内皮細胞を播種した。また、コントロールとして、野生型のカイコの絹糸から調製した絹フィブロイン溶液、および野生型カイコの絹フィブロイン溶液に大腸菌で発現させたヒト組換え型bFGFを混合した絹フィブロイン溶液からも同様にして絹フィブロインフィルムを作製し、ヒトさい帯血管内皮細胞を播種した。37℃で3日間培養を行った結果、野生型のカイコの絹糸から調製した絹フィブロインフィルム上での培養に比べ、トランスジェニックカイコの絹糸から調製したヒトbFGFを含有した絹フィブロインフィルム上での培養においては、有意な細胞増殖促進効果が認められた（図3）。また、ヒト組換え型bFGFを混合させた絹フィブロイン溶液を用いて作製した絹フィブロインフィルム上においては、細胞の増殖促進効果が認められなかった。これは、絹フィブロインフィルム上に細胞を播種するために、フィルム表面の洗浄を行った際に、ヒト組換え型bFGFは、絹フィブロインフィルムから洗い流されてしまったためであると考えられる。
【００４１】
以上のように、bFGFを含有した絹フィブロイン材料は、細胞の増殖や分化などの生物活性を付加した機能的なバイオマテリアルとして有用である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上、詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、活性型の生理活性タンパク質を含有した生理活性バイオマテリアルが提供される。この生理活性バイオマテリアルをフィルム、シート、ゲル、スポンジ、および繊維などに加工することにより、医療などの産業分野で利用することができる新しいバイオマテリアルが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】トランスジェニックカイコの絹糸における絹フィブロインとヒトbFGFの融合タンパク質の発現。図Aは、野生型のカイコとトランスジェニックカイコの絹糸から調製した絹フィブロインサンプルを展開したSDSポリアクリルアミドゲルをクマシー染色した結果である。図BはSDSポリアクリルアミドゲルに展開されたタンパク質を転写したニトロセルロース膜を抗ヒトbFGFポリクローナル抗体でイムノブロット解析を行った結果である。レーンMにはタンパク質マーカーを、レーンWには野生型カイコの絹フィブロインサンプルを、レーン1と2には系統が異なるトランスジェニックカイコの絹フィブロインサンプルを、レーンFGFには大腸菌で発現させたヒト組換え型bFGFを展開している。右脇の鏃マークは絹フィブロインL鎖とヒトbFGFとの融合タンパク質の位置を示す。
【図２】トランスジェニックカイコの絹糸から調製したヒトbFGFを含有した絹フィブロイン溶液の生物活性。WST-1法を用いて、定量的にヒトbFGFを含有した絹フィブロイン溶液の生物活性を調べた結果である。グラフの各カラムの下には、培地に加えた絹フィブロイン溶液中のヒトbFGFの濃度を示している。カラムは、正常培地（5 ng/ mlヒト組換え型bFGFを含む）においてヒトさい帯血管内皮細胞の培養を行った場合の細胞の増殖を100 %、bFGFを含まない培地においてヒトさい帯血管内皮細胞の培養を行った場合の細胞の増殖を0 %として、bFGFを含まない培地に絹フィブロイン溶液を加えて細胞の培養を行った場合の細胞の増殖を相対的に示している。実験はn=3で行い、結果は平均値±標準偏差で表した。グラフには示していないが、絹フィブロイン溶液中のヒトbFGF によるトさい帯血管内皮細胞の増殖は、大腸菌で発現させたヒト組換え型bFGFを、bFGFを含まない培地に同様に加えて培養を行った場合の細胞の増殖と等しかった。
【図３】絹フィブロインフィルム上でのヒトさい帯血管内皮細胞の増殖。野生型のカイコ（A）とトランスジェニックカイコ（B）の絹フィブロイン溶液から作製した絹フィブロインフィルム上にヒトさい帯血管内皮細胞を播種した。bFGFを含まない正常培地を加え３日間培養を行った後、位相差顕微鏡によって細胞を観察した。スケールバーは、100μmである。
【図４】実施例で作成したベクターpL-bFGFの構造図である。このベクターには、一対のpiggyBacの逆向き反復配列とその間に、3xP3プロモーターによって発現が制御される赤色蛍光タンパク質（DsRed）をコードするポリヌクレオチドと、絹フィブロインプロモーターによって発現が制御される絹フィブロインとbFGFとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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