(57)【要約】    【課題】  安全で、かつ、大量に製造することが可能な、免疫賦活活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドを提供する。    【解決手段】  ビフィドバクテリウム属細菌のゲノムＤＮＡに由来する、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドを、免疫賦活剤の有効成分とする。    【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含有する免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活作用を有するオリゴデオキシヌクレオチド、及び同オリゴデオキシヌクレオチドを含有する免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェンは、リンパ球を活性化し、細胞分裂を誘導、促進させる物質であり、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ等のレクチン類や、細菌由来のＬＰＳ、ＰＰＤ等が知られている。これらのうち、レクチンは、抗腫瘍活性を示すサイトカインＩＦＮ−γの発現を誘導すると報告（非特許文献１）されており、マイトジェン活性は免疫賦活性スクリーニングの指標として利用されている。
【０００３】
また、１９９５年にＫｒｉｅｇらが大腸菌由来ＤＮＡ中の特異的配列がマイトジェン活性を誘導すると報告（非特許文献２）して以来、免疫刺激性ＤＮＡが免疫療法の素材として注目を浴びるようになった。
【０００４】
前記免疫刺激性ＤＮＡ中の特異的配列は、ＣｐＧモチーフと呼ばれる。ＣｐＧモチーフとは、ＤＮＡ上に５’−〜ＣＧ〜−３’配列を含むものである。これらＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、生体内においては樹状細胞等の抗原提示細胞上のＴＬＲ９（Toll-like receptor 9）に認識されることにより、様々な免疫反応を引き起こす。ＯＤＮについては、インビトロではインターフェロン等のＴｈ１サイトカインを誘導し、インビボでは抗腫瘍活性等を示す等、化学合成オリゴヌクレオチドを中心とした研究報告がある（非特許文献２、非特許文献３）。非特許文献３に記載されているＯＤＮ 1826は強いマイトジェン活性を有し、各種サイトカインを誘導し、抗腫瘍活性が期待されるオリゴヌクレオチドである。ＯＤＮの配列と活性に関しては、各種哺乳動物での最適モチーフ（optimal motif）が既に提唱されてはいる。しかしながら、現在まで報告、提唱されているＯＤＮは、病原菌由来や、その配列に基づく化学合成品がほとんどであり、より安全性が高く、強い活性のあるＯＤＮの開発が望まれていた。
【０００５】
ビフィズス菌や乳酸菌は、古くから発酵乳等の発酵食品に利用されており、ヒトに対する安全性が高いと考えられ、免疫賦活剤としては病原菌ＤＮＡよりも受け入れ易い。北澤らは、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡが大腸菌ＤＮＡと同様にＢ細胞を刺激することを見出し、ＤＮＡ中から免疫刺激性のＯＤＮ、sOL-LB7を報告した（非特許文献４）。また、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌起源のＤＮＡでは、抑制性サイトカインの誘導が報告され（非特許文献５）、様々な生理活性が期待されている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１３２巻第５号、第２４４０〜２４４４頁、１９８４年
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、第３７４巻、第５４６〜５４９頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１６７巻、第４８７８〜４８８６頁、２００１年
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８５巻、第１１〜２１頁、２００３年
【非特許文献５】ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３８巻、第１６５〜１７２頁、２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記観点からなされたものであり、安全で、かつ、大量に製造することが可能な、免疫賦活活性を有するＯＤＮを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobbacterium longum）のゲノムＤＮＡから、マウス及びヒトに対して免疫賦活作用を有するＤＮＡ配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
また本発明は、前記オリゴデオキシヌクレオチドを含有する免疫賦活剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、免疫賦活作用を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が提供される。本発明のＯＤＮは、安全に使用できることが期待され、かつ、大量に製造することが可能である。また、本発明のＯＤＮは、ヒトに対して免疫賦活作用を有するため、免疫賦活剤として、あるいは抗腫瘍剤等として、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＯＤＮは、配列番号１に示す塩基配列を有する。このＯＤＮは、本発明を完成するに際しては、ビフィドバクテリウム  ロンガムのゲノムＤＮＡから、末梢血単核球（PBMC）に対するマイトジェン活性を有するものとして見い出されたものである。
【００１１】
本発明のＯＤＮは、例えば、ビフィドバクテリウム  ロンガム、例えばビフィドバクテリウム  ロンガムBL1株の染色体ＤＮＡライブラリーから、リンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することによって、取得され得る。前記BL1株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、FERM BP-7787の受託番号で寄託されている。
【００１２】
また、本発明のＯＤＮは、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、同塩基配列に基づいて化学合成法等によって容易に製造することができる。この方法は、目的のＯＤＮを大量に調製できる点で好ましい。本発明においては、ＯＤＮの合成法は特に制限されず、通常の合成ＤＮＡと同様の方法によって、例えば市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
【００１３】
本発明のＯＤＮは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよいが、一本鎖であることが好ましい。二本鎖の場合は、一方の鎖が配列番号１の塩基配列を有し、他方の鎖が配列番号１の配列に相補的な配列を有する。
【００１４】
本発明のＯＤＮは、通常は、デオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結したものであるが、免疫賦活作用を損わない限り修飾されていてもよい。例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート化することにより、安定性を向上させることができる。
【００１５】
本発明のＯＤＮは、マイトジェン活性に基づく免疫賦活作用を有する。したがって、本発明のＯＤＮは、免疫賦活剤として利用することができる。すなわち、本発明の免疫賦活剤は、本発明のＯＤＮを有効成分として含むものである。尚、免疫賦活作用とは、免疫刺激作用と同義であり、免疫機能を高めること、及び、免疫機能低下を改善することを含む。
【００１６】
本発明の免疫賦活剤は、本発明のＯＤＮを有効成分として含有する以外は、同ＯＤＮの投与に適したものであれば特に制限されず、投与形態に応じて適宜選択することができる。投与形態としては、経口投与、静脈注射、筋肉内注射、鼻腔内投与、気道投与等が挙げられる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００１７】
また、製剤化に際し、ＯＤＮは、目的の細胞、すなわちリンパ球への送達、取込みに適するように、カチオン性リポソームなど正電荷を持つキャリアーとの複合体を形成させてもよい。
【００１８】
本発明の免疫賦活剤の対象となる疾患としては、例えば、肺癌、膀胱癌、大腸癌等の癌、腫瘍、感染症、アレルギー疾患等が挙げられる。また、健常者であっても、本発明の免疫賦活剤の投与によって、各種疾患を予防することができることが期待される。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤中に含まれるＯＤＮの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、製剤中に１００μｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇ含有されることが好ましい。
【００２０】
本発明の免疫賦活剤の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患の治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態は疾患、製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。
【００２１】
本発明の免疫賦活剤の有効成分の投与量は、疾患、用法、患者の年齢、性別、症状の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのＯＤＮの量は、１０μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。また、数日又は数週間に１回の投与とすることもできる。
【００２２】
また、本発明のＯＤＮは、ワクチンや抗体と併用して使用することもできる。例えば、ワクチン又は抗体の投与が必要な対象に、ワクチン又は抗体の投与と同時に、又は別途、本発明のＯＤＮを投与することによって、ワクチン又は抗体の作用を増強することができる。また、ＤＮＡワクチン、例えば抗原をコードするＤＮＡ断片を含むベクターに、本発明のＯＤＮを挿入することによって、前記抗原の作用を増強することができる。
【００２３】
本発明のＯＤＮは、一般的に安全とされているビフィドバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡに由来する配列を有するため、病原菌由来のＯＤＮよりも安全性が高いと考えられる。したがって、本発明のＯＤＮ又はそれを含む組成物は、飲食品に含有させることもできる。飲食品としては、免疫賦活作用を損なわない限り特に制限されず、本発明のＯＤＮ又は必要に応じてその吸収等に適したキャリアーを含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
【００２４】
前記飲食品は、免疫を賦活するためとの用途が表示された飲食品、例えば「免疫賦活用と記載された、免疫賦活剤を含有する飲食品」、あるいは、「免疫賦活用と記載された、オリゴデオキシヌクレオチドを含有する飲食品」等として販売することが好ましい。尚、本発明のＯＤＮは、免疫賦活作用を有することから、抗腫瘍作用等を有すると考えられる。したがって、本発明の飲食品は、抗腫瘍用として使用することができる。
【００２５】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包
装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的方法により提供する行為、等が例示できる。
【００２６】
しかしながら、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、例えば、特定保健用食品（健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号））としての表示（特に保健の用途の表示）が最も好適である。
なお、以上のような表示を行うために使用する文言は、「免疫賦活用」という文言のみに限られるわけではなく、それ以外の文言であっても、免疫性を賦活する効果を表す文言、又は免疫賦活によって二次的に生じる効果であれば、本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。そのような文言としては、例えば、「抗腫瘍用」が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されない。
【００２８】
ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）BL1株から、QIAGEN genomic-tip kitを用いてゲノムＤＮＡを抽出、精製した。このゲノムＤＮＡを制限酵素Sau3AIで消化し、500bp以下のＤＮＡ断片をベクターpUC119と連結し、エシェリヒア・コリJM109株を形質転換した。Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むプレートで白色を示す形質転換体のコロニー約５０個からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により挿入ＤＮＡ断片を増幅した。それぞれの増幅断片のシークエンスを決定して分子量を計算し、マウス脾臓細胞に対するマイトジェン活性を測定した。
【００２９】
６〜10週齢の雄SPF BALB/cマウス（Japan SLC、静岡）の脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。脾臓細胞（２×106細胞/ml）に上記増幅ＤＮＡ断片試料を終濃度50pmol/ml（50nM）となるように添加し、32時間培養した後、3H標識チミジン（46.25kBq/ml）を添加し、その16時間後に細胞を回収して、取り込まれたチミジン量を測定した。対照として、前記脾臓細胞にＤＮＡ断片を添加しない以外は、同様にして培養した。活性値は、対照細胞に対する相対値（Stimulation Index : SI）として表した（図１）。
【００３０】
上記の試験の結果、有意な活性を有したクローン間で、ＤＮＡシークエンスの相同性解析を行った。その結果から、共通性のある20merの配列を20個選抜して、それらの配列を有するＯＤＮをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Model 394、Applied Biosystem社製）を用いて化学合成し、終濃度10μMでのマウス脾臓細胞に対するマイトジェン活性を測定した。比較対照として、既知のＯＤＮであるsOL-LB7（Internationnal Journal of Food Microbiology, 85, 11-21, 2003、配列番号２）を使用した。活性値は、対照細胞に対する相対値（Stimulation Index : SI）として表した。結果を図２に示す。その結果、上記の20個のＯＤＮの中では、特にＯＤＮ BL-07（配列番号１) が高い活性を示した。ＯＤＮ BL-07の塩基配列から、このＯＤＮは新規なCpG-like ＯＤＮの１種であると考えられる。
【００３１】
次に、ＯＤＮ BL-07のヒト末梢血単核球（PBMC）に対するマイトジェン活性を測定した。健常人ボランティアの血液から、Sigma HISTOPAQUE-1077を用いてヒトPBMCを調製した。このPBMC（2×106 cell/ml）に、ＯＤＮ（終濃度10μM）を添加して刺激を行い、32時間培養した後に、3H標識チミジンを添加し、その16時間後に細胞を回収して取り込まれたチミジン量を測定した。比較対照として、既知のＯＤＮであるＯＤＮ 1826（The Journal
of Immunology, 167, 4878-4886, 2001、配列番号３）を使用した。活性値は、対照細胞
に対する相対値（Stimulation Index : SI）として表した。結果を図３に示す。その結果、ＯＤＮ BL-07は有意な活性を示したが、ＯＤＮ 1826は活性を示さなかった。
【００３２】
以上の結果から、ＯＤＮ BL-07は、マウスだけでなく、ヒトに対しても免疫賦活作用を示す、hybrid typeの新規CpG-like ＯＤＮであることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ビフィドバクテリウム属細菌のゲノムＤＮＡ断片のマウス脾臓細胞に対するマイトジェン活性を示す図。星印は、相同性解析に使用した有意な活性があるＤＮＡ断片を示す。
【図２】マイトジェン活性を有するＤＮＡ断片の共通配列をに基づいて作製されたＯＤＮのマウス脾臓細胞に対するマイトジェン活性を示す図。「**」は、危険率ｐ＜０．０１で対照との有意差があることを示す。
【図３】本発明のＯＤＮ BL-07と、既知のＯＤＮ 1826のヒト末梢血単核球（PBMC）に対するマイトジェン活性を示す図。「*」は、危険率ｐ＜０．０５で比較対照との有意差があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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