(57)【要約】【課題】  本発明は、新規なリゾホスファチジルコリンを製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、アシル化剤およびジアルキルスズ誘導体の存在下に、グリセロホスホリルコリン(I)を選択的にモノアシル化することによって、リゾホスファチジルコリンを製造する方法を提供する。該方法は特に簡便であり、かつ高総収率を示す。2006111624.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアルキルスズ誘導体の存在下でアシル化剤によりsn-1の位置でグリセロホスホリルコリンを選択的にモノアシル化することを含む、リゾホスファチジルコリンの製造方法。
【請求項２】
アシル化剤が、脂肪酸の無水物または塩化物、好ましくは塩化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アシル化剤の使用量が、モル数で、グリセロホスホリルコリンのモル数に対して100〜200％、好ましくは100〜120％の範囲の量である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ジアルキルスズ誘導体が、スズ原子に結合した２個のアルキル基を有し、それらのアルキル基は相互に同じであるか、または異なり、１〜18個の炭素原子を含み、または自然に重合し、そして２個のハロゲン、２個のアルコキシ基もしくはアシルオキシ基、または二重結合により結合した酸素原子を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ジアルキルスズ誘導体がジアルキルスズオキシドである、好ましくはジブチルスズオキシドまたはジオクチルスズオキシドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ジアルキルスズ誘導体の使用量が、モル数で、グリセロホスホリルコリンに対して0.1〜110％、好ましくは5〜100％、より好ましくは20〜100％の範囲である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ジアルキルスズ誘導体の使用量が、グリセロホスホリルコリンに対して触媒量である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
モノアシル化反応を、塩基の存在下で、好ましくは第３アミン、より好ましくはトリエチルアミンもしくは4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在下で行う、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
塩基の使用量が、モル数で、グリセロホスホリルコリンに対して30〜140％、好ましくは100〜120％の範囲である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
反応温度がスタンニレン形成段階では40℃から溶媒の還流温度までの範囲であり、アシル化段階では10〜40℃である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
反応溶媒が、アルコール、エーテル、エステル、芳香族もしくは脂肪族炭化水素、または塩素系溶剤から選択される、請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
反応溶媒が、スタンニレン形成段階ではメタノールであり、そしてアシル化段階ではイソプロパノールである、請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
反応溶媒が、スタンニレン形成段階およびアシル化段階の両方でイソプロパノールである、請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
反応溶媒がイソプロパノールであり、アシル化剤の使用量がグリセロホスホリルコリンに対して約20％過剰なモル数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
メタノール中でグリセロホスホリルコリンを1等量のジブチルスズオキシドのメタノール溶液と反応させ、そしてそのメタノールをイソプロパノールにより置換した後に1.2等量のトリエチルアミンおよび1.2等量の脂肪酸塩化物を加える、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリゾホスファチジルコリンの製造に関する。特にはジアルキルスズ誘導体を使用したリゾホスファチジルコリンの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾリン脂質は、単一の脂肪酸アシル鎖がエステル結合によってグリセロールに結合したグリセロリン脂質である。
分子内に存在する極性部分と脂溶性部分は、リゾリン脂質に特別な性質を与え、人工細胞壁モデルの場合と同様に細胞壁の構造体の硬度と安定度を調節する。リゾリン脂質は、広く自然界に存在し、動物にも植物にも存在するが、一般的には細胞の脂質成分中の少量を占めるだけである。
【０００３】
最も広く存在し、かつ最も十分に研究されたリゾリン脂質にはリゾホスファチジルコリン（リゾPC）があり、この一般式を化１として示す（R1OH＝脂肪酸かつR2＝H、またはR1＝HかつR2OH＝脂肪酸）。
【０００４】
【化１】
2006111624.tif 000002
【０００５】
リゾPCは、構造的機能の他に、種々の酵素の活性調節因子として機能し、また病理学的状態を示す生物学的マーカーとして使うことが出来る（例JP2002-017398参照）。
リゾリン脂質を薬理学的製剤の材料として使用することは広く記載されている。例えば、リゾPCは鼻腔投与製剤(Illum et al., Int. J. Pharmaceutic 319 (1992 ))や経口製剤（US 4874795）の材料として研究されてきた。
【０００６】
多量のリゾリン脂質は食品産業において乳化剤としても使われている。
有機合成においては、リゾリン脂質は、複合リン脂質の製造のために重要な中間体である(Phospholipids Handbook edited by G. Cevc (1993) pp. 154-155)。例えば、化２に示されるように、POPC4の製造においてリゾPCはその合成の最終中間体(3)である。
【０００７】
【化２】
2006111624.tif 000003
【０００８】
医学分野や生物学分野におけるリゾPCの重要性、また他のリン脂質の合成におけるリゾPCの使用にもかわらず、その製造方法は比較的限られている。
なぜなら、有機組織から分離する方法は製造よりも分析の場合に有用であり、リゾPCの製造は、主に文献に記載されている方法に基づいており、これらは全く望ましくないからである。
【０００９】
これらの方法は実質的に２つの異なる合成経路に基づいている。すなわち、それらは(A)ホスファチジルコリンの単一エステル基の加水分解、または(B)グリセロホスホリルコリン(GPC)のモノアシル化であり、純化学的または化学／酵素的な実験条件で、かつ程度の差はあっても選択性を伴って行われる。
【００１０】
最も広く使われている加水分解法(A)では、化３に示す通り、ホスホリパーゼA2存在下でホスファチジルコリンの位置sn-2に結合しているエステル基だけを選択的に加水分解する。
【００１１】
【化３】
2006111624.tif 000004
【００１２】
この反応は水性媒体中で行われ、その中で続いてアシル基の移動によって生成される２つの形のリゾPC間で平衡が成立する。その２種の比率は典型的には９対１であり、アシル基が位置sn-1に結合した形の方が多い（非特許文献１(Dennis et al., Biochemistry 1743 (1982))）。
【００１３】
しかし、この反応は、たとえ工業的規模で行われたとしても、全く最適ではない。なぜなら、溶解度特性と界面活性の点から、この反応には、水性反応混合液から生成物を回収する際に抽出または分離が困難であるという問題が存在するからである。
【００１４】
もう一つの好ましくない点は、ホスホリパーゼA2の主な供給源が豚の膵臓であり、これがウイルス汚染を導きかねないことである。ウイルス汚染は最終産物を薬剤として使用する場合には非常に好ましくない。
【００１５】
これに対して、リゾリン脂質を製造するためのもう一つの酵素的加水分解法では、リン脂質のグリセロールの位置sn-1に結合しているアシル基を選択的に加水分解する。しかし、この場合、位置sn-1でアシル化されているリゾPCを製造するために、続いてアシル置換基を位置sn-2から位置sn-1に移動させる必要がある。
【００１６】
文献に記載されている選択的なモノアシル化方法の中で、特許文献１（Paltauf他によるEP161519）に記載された方法を述べる。これは、グリセロホスホリルコリン(GCP) (I)の第一アルコール官能基を選択的に保護するためにトリフェニルメチル基を使用することに重点を置いている。この方法では、有利な事に、ホスホリパーゼA2および溶媒としての水が不要になり、しかし反面、かなり面倒であり、収量は必ずしも充分ではなく、中間産物のクロマトグラフィーによる分離を必要とする。そして、トリフェニルメチル基が多数存在するために、相当な量の副産物を生み出す。
【００１７】
固定化酵素の存在下での選択的なモノアシル化反応は、いくつかの脱アシル化リン脂質を製造するための代替方法として提案されている（非特許文献２(Adlercreutz et al., Enz. Microb. Technol. 630 (2000))）。この場合、選択性は良いが、酵素の比活性が低いために、非常に多数の酵素を必要とするので、この方法は工業利用には不適切である。
【００１８】
【特許文献１】EP 161519
【非特許文献１】Dennis et al., Biochemistry 1743 (1982)
【非特許文献２】Adlercreutz et al., Enz. Microb. Technol. 630 (2000)
【非特許文献３】Hanessian, Tetrahedron 643 (1985)
【非特許文献４】Ｈerradon et al., Synlett 455 (1995)
【非特許文献５】Appl. Organometal. Chem. 443 (2000)
【非特許文献６】Roelens et al., JOC 5132 (1990)
【非特許文献７】Moffat et al., JOC 24 (1974)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ここで、本発明者は、上述した製造方法に関連した欠点を克服して、大規模に、一つの化学的方法で、一般に高収量で、市場で容易に得られる安価な試薬を用いて、そして溶媒としての水を不要とし、その結果、単純化された最終分離方法を用いて、リゾPCを合成できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の方法は、市販品であるGPC (I)の位置sn-1において、化４に従ってジアルキルスズ誘導体の存在下でアシル化剤によって選択的にアシル化することを含む。
【００２１】
【化４】
2006111624.tif 000005
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の方法は、ジアルキルスズ誘導体存在下でGPC (I)を選択的にモノアシル化することを含む。
ジオールアシル化反応におけるスズのジアルキル誘導体の使用は文献に報告されており（非特許文献３（Hanessian, Tetrahedron 643 (1985))）、主に炭水化物の選択的な保護に使用されている。
スズ化合物は、化５に示されるタイプのスタンニレンの形成によって基質中の酸素原子の一つを選択的に活性化する機能を持っていると考えられている。
【００２３】
【化５】
2006111624.tif 000006
【００２４】
最も一般的に使われている試薬はジブチルスズオキシドであるが、最近、ジメチルスズオキシドとジメチルスズジメトキシドが、反応性のより高い代替品として提案されている。
スタンニレン形成のために従来技術で最もよく使われている反応溶媒はトルエンである。また、マイクロ波を用いることによって触媒量のジブチルスズオキシドの使用が可能になるということに基づく方法も記載されている（非特許文献４(Ｈerradon et al., Synlett 455 (1995))）。
【００２５】
GPC (I)の溶解度は、スズ誘導体存在下のアシル化反応において一般的に使われるトルエンなどの非極性有機溶媒に対して非常に低い。さらに、その構造中に含まれるリン酸基はジアルキルスズ化合物と強く相互作用をするので（非特許文献５(Appl. Organometal. Chem. 443 (2000))）、該化合物の反応性が変化する。これらの特性から見て、おそらくGPC (I)は、この種のアシル化の基質として適さないと論理的に結論される。
【００２６】
しかし、驚いた事に、本発明者は、これらの好ましくない推測にもかかわらず前述のモノアシル化で高い収量を得る事が可能であり、そしてまたこれは、マイクロ波装置および好ましくない毒性特性をもつ上記ジメチルスズ誘導体を用いなくても、触媒量のスズ化合物を用いることによっても可能であるということを見出した。
【００２７】
脂肪酸の無水物または塩化物、好ましくは塩化物をこの反応においてアシル化剤として用いる事ができる。この脂肪酸は飽和でも不飽和でも多価不飽和でもよく、炭素数６〜30の種々の鎖長を持つ。一般的に、該アシル化剤は、グリセロホスホリルコリン１モルに対して100％〜200％、好ましくは100％〜120％の間のモル量で使われる。
【００２８】
一般的に、これらの化合物は市販されており、または既知の方法によって調製される。
この方法に使われるスズ化合物は、２つのアルキル基がスズ原子に結合している構造を持ち、これらの基は相互に同一でも異なってもよく、１〜18個の炭素原子を含み、または自然に重合しうる。
【００２９】
最後に述べたケースでは、該スズ化合物を反応の最後で単純ろ過によって取り除き、該試薬を次の反応に再利用することができる。
また、スズ原子は２つのハロゲンに結合し（例ジアルキルスズジクロリド）、または２つのアルコキシ基（例ジアルキルスズジアルコキシド）もしくはアシルオキシ基（例ジアルキルスズジアセテート）に結合し、あるいは二重結合によって酸素原子に結合する（ジアルキルスズオキシド、例ジブチルスズオキシド）。
【００３０】
本発明によると、好ましいスズ誘導体はジアルキルスズオキシドであり、そのうちジブチルスズオキシドおよびジオクチルスズオキシドが最適である。
一般的に、これらの化合物は市販されており、または既知の方法によって調製される。
【００３１】
長いアルキル鎖を持ったスズ誘導体、特にオクチル誘導体は本方法において特に好ましい。なぜなら、それらは、下記のラットにおける急性経口毒性値によって示されるように毒性が低いからである(Sax and others, Dangerous Properties of Industrial Materials, edition VII)。
ジブチルスズオキシド      LD50=44.9 mg/kg
ジオクチルスズオキシド    LD50=2500 mg/kg
【００３２】
該スズ誘導体は、基質に対して0.1〜110モル％、好ましくは5〜100％、より好ましくは20〜100％の量で使われる。
触媒量のジアルキルスズ誘導体の使用を実現するには、一般的には、反応が完全になるまでアシル化剤の量を増やすことで足りる。通常、ジアルキルスズ対基質の化学量論比がモル数で0.2：１である場合、約50％過剰のアシル化剤で十分である。
【００３３】
本発明のモノアシル化方法では、反応経過中に溶媒が酸性に傾くのを制御するために、塩基、好ましくはアミン塩基を使うのが有利である。
アシル化反応中の塩基の量は、基質に対して30〜140モル％、好ましくは100〜120％である。
塩基としてトリエチルアミンや4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)などの種々のアミンが使われる。これらは反応の選択性に影響しうる。
【００３４】
特には、トリエチルアミンを使った場合、グリセロールの位置sn-1でアシル化された生成物と位置sn-2でアシル化された生成物との比率は９：１であった。これは、モノアシル誘導体の水中平衡反応によって得られる比率、そしてまた、上述したとおり、ホスホリパーゼA2による加水分解法によって得られる比率と等しい。
それゆえに、この新しい方法によって得られる生成物は、最終混合構成品として、従来の方法によって得られるものと直接的に置き換えることが出来る。
【００３５】
本発明のもう一つの態様では、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)を塩基として用いることによって、さらに選択性が改善された。
この場合、最終リゾPCにおける位置sn-1対sn-2のアシル化の比率は、約50：１であることが分かった。
本発明では、好ましい塩基はアミンであり、より好ましくは第三アミン、さらに好ましくはトリエチルアミンとDMAPである。
【００３６】
反応温度は、０℃から、使用する溶媒の沸点まで変化しうる。温度は、スタンニレン形成段階では、好ましくは40℃から溶媒の還流温度までの範囲であり、アシル化段階では10〜40℃である。
本方法は、アルコール、エーテル、エステル、芳香族もしくは脂肪族炭化水素、または塩素系溶剤などの色々な有機溶媒中で行われる。
【００３７】
好ましい溶媒は、2級アルコールなどのアルコール、特にイソプロパノールである。
本発明の好ましい態様では、イソプロパノールを、全行程において、すなわち準備的なスタンニレン形成段階と次のアシル化段階の両行程において有利に使用できることが分かった。同様の反応について従来技術に述べられている方法と比較すれば、本実験方法は相当に簡単である。
【００３８】
なぜなら、ジブチルスズオキシドの補助による1,2-ジオールのモノアシル化には、通常、トルエンなどの芳香族溶媒中で共沸脱水することによりスタンニレンを形成するという準備段階があり、その長い段階の後でのみ、クロロホルムなどの別の溶媒中でアシル化が適正に続けられるからである（非特許文献６(Roelens et al., JOC 5132 (1990))）。
【００３９】
文献の中には、アルコール（メタノール）溶媒中でジブチルスズオキシドを使用したヌクレオシドのモノアシル化に関する報告もある（非特許文献７(Moffat et al., JOC24 (1974))）。しかし、この変換は、基質に対して400〜900モル％の過剰なアシル塩化物を必要とする。
【００４０】
しかし、驚いた事に、本発明者は、GPC (I)のモノアシル化反応の完了のために必要なものは、溶媒がイソプロパノールである場合、通常約20％程の適度に過剰なモル量のアシル化剤のみであり、またアシル化剤とアルコール溶媒との付随反応は非常に限定されていることを見出した。
【００４１】
本方法の変種として複合方法も可能である。この方法では、メタノール中でスタンニレンを調製し、その反応溶媒をイソプロパノールに置き換え、この後者の溶媒中でアシル化を行って、本方法を継続する。
【００４２】
本発明の特に好ましい態様では、メタノール中でGPCを１等量のジブチルスズオキシド（メタノール中）と反応させ、そしてそのメタノールをイソプロパノールに置換した後で、1.2等量のトリエチルアミンと1.2等量の脂肪酸塩化物を加える。
【００４３】
本方法の変換収率は一般に高く、典型的には80〜100モル％である。使用する試薬は安価であり、かつ市場で容易に調達でき、必要ならば、文献に報告されている慣用的な方法で脂肪酸の塩化物または無水物を調製する事が出来る。これらの理由により、この方法は、大規模にリゾPCを製造するのに都合が良い。
【００４４】
この方法の更なる利点は、溶媒として水を用いることなく本反応を実施できることである。これにより、当業者に周知のとおり、リゾPCの分離を非常に簡略化することができる。結晶化やクロマトグラフィー分離のような慣用的な分離技術を用いることができる。特に好ましい点は、結晶化、すなわち適当な有機溶媒を反応混合液に加えて、それを冷却することによって、高収量かつ高純度で生成物の分離が可能になったことである。
【００４５】
本発明をもっと分かりやすく説明するために、下記の実施例を提供する。これらの実施例は本発明の可能な態様の一部を表すものに過ぎず、決してその範囲を制限するものではない。
【００４６】
略号
GPC：sn-グリセロ-3-ホスホコリン (I)
DBTO：ジブチルスズオキシド
DOTO：ジオクチルスズオキシド
TEA：トリエチルアミン
DMAP：ジメチルアミンピリジン
IPA：イソプロパノール
【実施例１】
【００４７】
パルミトイル−リゾPC
2.5 gのGPC (I)（1等量）、2.5 gのDBTO（1等量）および35 mlのメタノールからなる懸濁液を、透明な溶液になるまで還流で撹拌し（1.5時間）、そして残量5 mlになるまでメタノールを蒸発させた。25 mlのIPAを加え、その混合液を再び残量5 mlになるまで常圧で濃縮し、また25 mlのIPAを加えた。1.6 mlのTEA（1.2等量）および3.2 gの塩化パルミトイル（1.2等量）を25℃で滴下した。滴下終了時、転換率（31P-NMR）は99％超であった。2種のリゾPCの比率は1：9であり、sn-1の位置でアシル化された化合物が多かった。
【実施例２】
【００４８】
ステアロイル−リゾPC
0.5 gのGPC、0.5 gのDBTO（1等量）および10 mlのメタノールからなる懸濁液を、透明な溶液になるまで還流で撹拌した（１時間）。残量1 mlになるまで溶液から溶媒を蒸発させた。5 mlのIPAを加え、その混合液を再び残量1 mlになるまで常圧で濃縮し、また5 mlのIPAを加えた。0.324 mlのTEA（1.2等量）および0.62 gの塩化ステアロイル（1.2等量）を25℃で滴下した。滴下終了時、転換率（31P-NMR）は92％であった。2種のリゾPCの比率は1：9であり、sn-1の位置でアシル化された化合物が多かった。
【実施例３】
【００４９】
オレオイル−リゾPC
350 mlのIPA中に10 gのGPC (I)および10.65 gのDBTOを含む懸濁液を還流で１時間加熱した。0℃まで冷却した後、その生成懸濁液に、5.96 mlのTEAおよび12.9 gの塩化オレオイルを滴下した。その溶液を室温で15分間撹拌し、その混合液標本をHPLCで分析した。オレオイル−リゾPC：GPCの比率は97：3であった（カラム：Lichrospher Diol 100、ELS検出器）。
【実施例４】
【００５０】
パルミトイル−リゾPC
2.5 gのGPC (I)（1等量）、0.5 gのDBTO（0.2等量）および35 mlのメタノールからなる懸濁液を、透明な溶液になるまで還流で１時間撹拌し、その溶液から残量5 mlになるまでメタノールを蒸発させた。25 mlのIPAを加え、その溶液を残量5 mlになるまで蒸発させ、その残りに25 mlのIPAを加えた。1.6 mlのTEA（1.2等量）滴下し、その温度を40℃まで上げ、そして3.2 gの塩化パルミトイル（1.2等量）を滴下した。滴下終了時に反応液からサンプルを採取した。
さらに0.8等量のTEAを加え、そして0.8等量の塩化パルミトイルを滴下した。転換率（31P-NMR）は最初の行程後90％であり、２番目の滴下行程後99％超であった。
上記溶液に25 mlのヘプタンを加え、0℃まで冷却し、そして濾過した。これにより7.6 gの湿生成物を得て、これをヘプタノールとIPAの混合液により再結晶することにより、乾燥後に4.4 gのリゾPCを得た（収量92％）。
【実施例５】
【００５１】
パルミトイル−リゾPC
2.5 gのGPC (I)、3.5 gのDOTO（1等量）および35 mlのメタノールを、窒素ガス下で三つ首フラスコに加え、還流温度で2時間撹拌した。白色の懸濁液が形成され、そこに24 mlのIPAを加え、それから常圧で蒸発させた。残渣にIPA(50 ml)を加え、その懸濁液を25℃に冷えるまで放置した。温度が安定したら、1.62 mlのTEA（1.2等量）および3.24 gの塩化パルミトイル（1.2等量）を滴下した。転換率（31P-NMR）は99％超であった。2種のリゾPCの比率は1：9であり、sn-1の位置でアシル化された化合物が多かった。
【実施例６】
【００５２】
パルミトイル−リゾPC
125 mlのIPA中に2.5 gのGPC (I)および2.5 gのDBTOを含む懸濁液を還流温度で1時間撹拌した。その温度を40℃まで上げた後、1.62 mlのTEAおよび3.24 gの塩化パルミトイルを滴下した。パルミトイル−リゾPCへの転換率（31P-NMR）は88％であった。
【実施例７】
【００５３】
パルミトイル−リゾPC
0.5 gのGPC (I)、0.5 gのDBTO（1等量）および10 mlのメタノールからなる懸濁液を、透明な溶液になるまで還流で撹拌し（1時間）、そして残量1 mlになるまでメタノールを蒸発させた。5 mlのIPAを加え、その溶液を再び残量1 mlになるまで常圧で濃縮し、その後5 mlのIPAを加えた。25℃で0.220 gのDMAP（1.2等量）を加え、そして0.64 gの塩化パルミトイル（1.2等量）を滴下した。滴下終了時、転換率（31P-NMR）は86％であった。2種のリゾPCの比率は1：50であり、sn-1の位置でアシル化された化合物が多かった。
【実施例８】
【００５４】
パルミトイル−リゾPC
2.5 gのGPC (I)、2.5 gのDBTO（1等量）および35 mlのメタノールからなる懸濁液を、透明な溶液になるまで還流で撹拌し（1.5時間）、その後残量5 mlになるまでメタノールを蒸発させた。25 mlのIPAを加え、その混合液を再び残量5 mlになるまで常圧で濃縮し、また25 mlのIPAを加えた。1.6 mlのTEA（1.2等量）および3.2 gの塩化パルミトイル（1.2等量）を25℃で滴下により加えた。滴下終了時、転換率（31P-NMR）は98％超であった。その懸濁液に25 mlのヘプタンを加え、0℃まで冷却し、0℃で30分間保持し、そして濾過することにより5.2 gの固体を得た。この固体をヘプタノール／IPA中で再結晶することにより、乾燥後に4.7 gの高純度生成物を得た（収量98％）。