(57)【要約】      （修正有）【課題】アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質乳漿の製造方法を提供すること。【解決手段】（ａ）グルコンイソフラボン、及びベータ−グルコシダーゼ酵素である残余酵素を含有する植物タンパク質乳漿を得て、（ｂ）前記グルコンイソフラボンを、前記酵素と、２４〜４８時間、４０℃〜６０℃の温度で且つ４．０〜８．０のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する。（ｃ）グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、（ｄ）前記グルコンイソフラボンを、十分な量の酸と、３０分〜１８０分、８０℃〜９０℃の温度で且つ１〜２のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法であって、
（ａ）グルコンイソフラボン、及びベータ−グルコシダーゼ酵素である残余酵素を含有する植物タンパク質乳漿を得て、
（ｂ）前記グルコンイソフラボンを、前記酵素と、２４〜４８時間、４０℃〜６０℃の温度で且つ４．０〜８．０のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する事を特徴とする方法。
【請求項２】
アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法であって、
（ａ）グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、
（ｂ）前記グルコンイソフラボンを、十分な量の酸と、３０分〜１８０分、８０℃〜９０℃の温度で且つ１〜２のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する事を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質及びイソフラボンを含む植物タンパク質乳漿（whey）を１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素又は酸と反応させることにより、実質的にすべてのグルコンイソフラボンをアグルコンに変換し、それによってアグルコン濃縮乳漿を製造する、アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿及び乳漿タンパク質の製造に関する。アグルコン濃縮乳漿タンパク質は、濃縮乳漿からタンパク質を回収することによっても得られる。本願は、米国特許出願第08/135,192号（出願日1993年10月12日）の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボンは、大豆のような植物タンパク質原料を含む、さまざまなマメ科の植物に存在する。これらの化合物には、ダイジン(daidzin)、6-OAcダイジン、6"-OMalダイジン、ダイゼイン(daidzein)、ゲニスチン(genistin)、6"-OAcゲニスチン、6"-OMalゲニスチン、ゲニステイン(genistein)、グリシチン（glycitin）、6"-OAcグリシチン、6"-OMalグリシチン、グリシテイン(glycitein)、ビオカニンＡ(biochanin A)、ホルムオノネチン(formononetin)及びクメストロール(coumestrol)が挙げられる。典型的にはこれらの化合物は大豆独特の苦味と関係があり、工業製品、例えば単離体及び濃縮体などの製造において、興味の中心はこれらの物質を除去することにある。例えば、水性アルカリ性溶媒で大豆フレークを抽出する従来の大豆タンパク質単離体の製造方法において、多量のイソフラボンが抽出物中に溶解し、かつ乳漿中に溶解して残存して、単離体を形成するが、乳漿は通常、タンパク質の酸沈殿の次に捨てられる。酸沈殿されたタンパク質単離体に残っている残存イソフラボンは通常、単離体を激しく洗浄することによって除去される。
【０００３】
大豆のような植物タンパク質に含まれるイソフラボンは、次の文献に記載される乳ガン細胞及び前立腺ガン細胞のようなヒトのガン細胞の成長を阻害できると、最近考えられている。ペターソン(Peterson)及びバーンズ(Barnes)、Biochemical and Biophysics Research，Communications 179巻(No.1)、661-667頁、1991年８月30日“Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells,Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene”；ペターソン（Peterson）及びバーンズ(Barnes)、The Prostate、22巻、335-345頁（1993年）“Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptors Tyrosine Auto-phosphorylation”；及びバーンズ(Barnes)ら、Mutagens and Carcinogens in the Diet、239-253頁（1990年）“Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer”。
【０００４】
上記のイソフラボンのうち、いくつかは、次に示す式の７位にグルコース分子が結合したグルコシドとして、又はグルコンとして存在する。6"-OAcゲニスチンのようないくつかのグルコンは、グルコース分子それ自身の６位に付いたアセテート基を含んでいる。グルコシドを含むすべてのイソフラボンは、医学的評価の関心事である一方、最大の関心事は、特定のイソフラボン、グルコース分子が結合していなアグルコンである。これらのイソフラボンは、グルコン又はグルコシドのような水溶性ではない。このカテゴリーに入る特定のイソフラボンとして、ダイゼイン、ゲニスチン、及びグリシテインが挙げられる。これらのアグルコンは、次の一般式を有する：
【０００５】
2006087440.tif 000002
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、Ｈ、ＯＨ及びＯＣＨ3からなる群から選ぶことができる。したがって、本発明は、アグルコン及びそれらの物質を有する植物タンパク質乳漿又は乳漿タンパク質の濃縮体に関する。
【０００６】
グルコンイソフラボンをアグルコンに変換する方法は、既に当業界で知られており、オバタ(Obata)らの日本国特許第258,669号等に記載されている。これらの方法は、単に適度な変換を達成するのみであり、特に大規模工業生産には望ましくない。また、'669特許に記載されるような既知の方法は、タンパク質原料からイソフラボンを除去することを教示しているが、アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質乳漿をどのようにして調製するのかということについては記載していない。したがって、少なくとも大部分の、好ましくは実質的にすべてのグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する方法、並びにアグルコンイソフラボン濃縮乳漿及び乳漿タンパク質を製造する方法が必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゆえに、本発明の目的は、アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質乳漿、乳漿タンパク質、及びそれらを製造する方法を提供することにある。この目的及びその他の目的は、以下の本発明の詳細な説明によって、特に達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の方法を提供するものである。
（１）アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法であって、
（ａ）グルコンイソフラボン、及びベータ−グルコシダーゼ酵素である残余酵素を含有する植物タンパク質乳漿を得て、
（ｂ）前記グルコンイソフラボンを、前記酵素と、２４〜４８時間、４０℃〜６０℃の温度で且つ４．０〜８．０のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する事を特徴とする方法。
（２）アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法であって、
（ａ）グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、
（ｂ）前記グルコンイソフラボンを、十分な量の酸と、３０分〜１８０分、８０℃〜９０℃の温度で且つ１〜２のｐＨで接触させ、前記乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ変換してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する事を特徴とする方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、乳漿中の少なくとも大部分のグルコンイソフラボンがアグルコンイソフラボンに変換するのに十分な時間、温度、及びｐＨで、グルコンイソフラボンを十分量の１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素と反応させて、それによってアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する工程を有するアグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法を提供する。本発明は、補足的な（supplemental）ベータ−グルコシダーゼを乳漿に添加してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する、上記の乳漿の製造方法も提供する。本発明は、１種以上の酸で処理することによって、上記の乳漿を製造する方法も提供する。さらに、本発明は、アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿及び乳漿生成物を提供する。さらに、本発明は、植物タンパク質原料から乳漿及び乳漿タンパク質中のイソフラボンを、比較的高い比率で回収する方法も提供する。
【００１０】
本発明は、大豆乳漿に関して記載しており、かつ本方法は、大豆原料からのアグルコンイソフラボン濃縮乳漿の製造に特に好適であるが、それにも関わらず、本方法は一般に、イソフラボンを含むさまざまな植物タンパク源からのアグルコン濃縮乳漿の製造に適用できる。そのような植物タンパク源の例として、マメ又は大豆原料を含有する植物タンパク質原料が挙げられる。本明細書で用いられる『大豆原料』という語は、大豆又はあらゆる大豆誘導体を指すものである。
【００１１】
好ましい態様に関する出発原料は、溶媒抽出で油が除去されている大豆フレークである。このフレークを、そのタンパク質原料の等電点付近を越えたｐＨ、好ましくはｐＨ約6.0〜約10.0、最も好ましくはｐＨ約6.7〜約9.77を有する水性抽出剤で抽出する。所望であれば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び水酸化カルシウムなどの典型的なアルカリ性試薬を用いて、水性抽出剤のｐＨを上げることができる。望ましいイソフラボン化合物は典型的には、水性抽出物に可溶である。水性抽出物にこれらの化合物を最大限に回収するために、タンパク質原料中にできるだけ多くの固有のイソフラボンを溶解させるように、抽出物：大豆フレークの重量比を特別のレベルに制御するのが望ましい。
【００１２】
タンパク質及びイソフラボンの抽出は、水性抽出剤：フレークの重量比を約８：１〜１６：１とする、フレークの向流抽出を含むさまざまな方法で行うことができる。初期抽出物を用いてフレークを抽出し、タンパク質及びイソフラボンの水性抽出物を提供する。また、２段階抽出法を用いることもでき、その場合、第１段階での抽出剤：フレークの重量比が約10：１からなり、次いで新鮮な抽出剤でのフレークの第２抽出物は、抽出剤：フレークの重量比が約６：１で生じ、両段階での抽出剤：フレークの合計の重量比が、抽出剤（全重量比）：フレーク＝１６：１を越えないようにする。
【００１３】
溶解したイソフラボンを有する、得られたタンパク質抽出物のｐＨを、そのタンパク質が沈殿するように、そのタンパク質の等電点付近に調整する。食用の酸、例えば酢酸、硫酸、リン酸、塩酸又は他の好適な試薬などを添加することにより、ｐＨをそのタンパク質の等電点付近に調整する。大豆タンパク質の等電点は典型的には、約４．４〜４．６である。タンパク質原料を、水性抽出物から分離することができるカード（curd）の形態で沈殿させる。出発原料の残りの水性抽出物は、出発原料として用いられた植物タンパク源が何であれ、『乳漿』と言われている。イソフラボンは、乳漿中にその大部分が溶解しており、かつ乳漿中の回収を最大限にするために、沈殿したタンパク質をさらに洗浄するのが望ましく、それによりイソフラボンの完全な回収を確実にすることができる。
【００１４】
酵素との反応、又は酸との反応により、乳漿中のグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する。酵素を用いる変換は、次のように行う。乳漿中のグルコンイソフラボンを反応工程中で十分量の１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素と反応させて、少なくとも大部分の、好ましくは実質的にすべてのグルコン形態のイソフラボンをアグルコンに変換する。ベータ−グルコシダーゼ酵素は、大豆原料に天然に存在するもの、又は本明細書で『残余』酵素とよばれる微生物増殖からのものであってもよく、又は乳漿に添加するものであってもよい。
【００１５】
添加される酵素は、本明細書で『補足的酵素』と称する。一般に、グルコン形態のイソフラボンの少なくとも大部分、好ましくは実質的にすべてをアグルコン形態に変換するのに乳漿中の残余酵素の濃度が不十分なとき、補足的酵素を添加するべきである。イソフラボンの変換を行うのに十分な酵素の量は、存在する酵素のタイプ、酵素濃度の分布、系のｐＨ、及び存在する酵素の活性を含む多数の因子によって変化する。酵素の濃度が、残余酵素、補足的酵素、又はその両者により十分に存在するとき、乳漿に含まれるグルコンイソフラボンの少なくとも大部分、好ましくは実質的にすべてをアグルコン形態に変換するのに十分な時間、温度、及びｐＨで、溶解性イソフラボンを有する乳漿をベータ−グルコシダーゼ酵素と反応させる。
【００１６】
好ましい補足的ベータ−グルコシダーゼ酵素には、バイオペクチナーゼ（Biopectinase）１００Ｌ及び３００Ｌ、バイオペクチナーゼＯＫ ７０Ｌ、ラクターゼＦ、並びにラクトザイム(Lactozyme)が挙げられる。ラクターゼＦは、アマノ国際酵素株式会社(Amano International Enzyme Co，Inc.，P．O．Box 1000 Troy，VA 22974)で市販するものであり、最適ｐＨ範囲が約４〜約６である。ラクトザイムは、ノボ社（Novo Industries，Enzyme Division，Novo Alle，DK 2880 Bagvaerd，Denmark）で市販するものであり、最適ｐＨ範囲が約７である。バイオペクチナーゼ１００Ｌ、バイオペクチナーゼ３００Ｌ、及びバイオペクチナーゼＯＫ ７０Ｌは、クエストインターナショナル(Quest International，Sarasota，Florida)から入手可能である。乳漿に含まれる少なくとも大部分の、好ましくは実質的にすべての溶解性グルコンイソフラボンをアグルコンに変換するのに十分な量で、補足的酵素を添加する。補足的酵素を添加する必要がある場合には、添加する酵素量は、乾燥基準で乳漿固形分の約0.5重量％〜約５重量％である。
【００１７】
補足的酵素として投与するのに好適な酵素の他の種類として、エステラーゼ酵素が挙げられる。これらの酵素は、イソフラボン共役体(conjugate)からアセテート及びマロネート基を除去することにより、アセテート及びマロネート共役体をグルコンイソフラボンに変換するので、本明細書に記載した好ましい態様の方法に十分に好適であると考えられている。最も好ましい態様として、ベータ−グルコシダーゼ及びエステラーゼの双方のタイプを用いるものがよい。
【００１８】
好ましい態様の方法として、１段階工程が好ましく、比較的短時間、比較的容易かつ経済的に、非常に高い程度でイソフラボンの変換（グルコン形態からアグルコン形態への変換）を達成する。本明細書で用いられる『１段階』反応工程という語は、ある種の工程パラメータ値が一般に、反応方法にわたって維持されている反応工程を意味している。これらの工程パラメータには、ｐＨ及び温度が含まれる。
【００１９】
非常に高い程度の変換とは、乳漿中に存在するグルコン形態のイソフラボンの少なくとも大部分、好ましくは実質的にすべてをアグルコン形態に変換するようなことをいう。少なくとも『大部分』という語は、グルコンイソフラボンからアグルコンイソフラボンへの変換が少なくとも約50％である程度をいう。『実質的にすべて』という語は、グルコンイソフラボンからアグルコンイソフラボンへの変換が少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％である程度をいう。
【００２０】
ある特定の理論に結合しているものではないが、本明細書に記載した方法の驚くべき、かつ予期せぬ高い程度の変換は、１段階反応工程の際に用いた工程パラメータの組合せによる結果であると考えられている。反応系のｐＨを、約４〜約８の値に維持するか、又はほぼその値にするのが好ましく、最も好ましくは、１段階反応工程の際にイソフラボン共役体との反応前で酵素が最も活性である値に維持するか、又はほぼその値にするのがよい。典型的には乳漿のｐＨを、特定の酵素との反応前でその酵素が最も活性であるほぼｐＨ範囲に調整する。反応系の温度を、約40℃〜約60℃の温度に維持するか、又はほぼその値にするのが好ましく、最も好ましくは、１段階工程の際に約60℃という温度に維持するか、又はほぼその値にするのがよい。一般に、本明細書で記載される１段階工程を介しての、実質的にすべてのグルコンイソフラボンからアグルコンへの変換を達成するのに必要な時間は、約２時間〜約24時間である。ある例においては、24時間を越える時間、例えば48時間を用いるのが望ましい。
【００２１】
グルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する本発明の目的のための他の方法は、グルコンイソフラボンの少なくとも大部分、実質的にすべてをアグルコンイソフラボンに変換するのに十分なｐＨ、時間、及び温度で、乳漿を１種以上の食用の酸と反応させる方法である。この方法は、タンパク質を不溶性にする傾向があり、それによってそのタンパク質を残存乳漿から分離することができる。この方法に好ましいｐＨ範囲は約1.0から約2.0であり、典型的な温度は約80℃〜90℃又はそれ以上であり、典型的な時間は約30分〜約180分間又はそれ以上である。グルコンイソフラボンからアグルコンイソフラボンへの変換は、より高いｐＨでも発生し得る。効果的な反応は、約ｐＨ4.5と同じ程高いｐＨで発生し得る。しかし、反応は非常に遅く、非常に長い時間が必要となる。例えば、ｐＨ4.5かつ温度50℃で、約24時間が必要である。
【００２２】
アグルコンイソフラボンはグルコンイソフラボンより溶解性がないため、グルコンイソフラボンからアグルコンイソフラボンへの変換に次いで、所望によりタンパク質の乾燥又は除去を行わずに、液状乳漿を用いることができるか、又は乳漿タンパク質を回収してタンパク質中のアグルコンイソフラボンを濃縮することができる。アグルコンイソフラボンで濃縮される乳漿タンパク質の回収は、脱水、加熱凝固（heat coagulation）、及び限外濾過を含む従来の方法により達成することができる。得られた濃縮乳漿タンパク質を従来の手段で脱水し、乾燥してアグルコンイソフラボンで濃縮した乾燥乳漿タンパク質を提供することができる。好ましい態様に関するアグルコンイソフラボン濃縮植物乳漿タンパク質は、乾燥基準のゲニステイン含量約2.6〜約8.7ｍｇ／グラム及び乾燥基準のダイゼイン含量約2.5〜約6.0ｍｇ／グラムを有する。
【００２３】
本発明は、大豆原料のような植物タンパク質原料から、非常に高い比率で、乳漿及び乳漿タンパク質中にイソフラボンを回収する方法も提供する。本明細書に記載される方法により得られる回収レベルは典型的には、出発植物タンパク質原料中の特定のイソフラボンのすべての形態全体をベースとして、少なくとも50％、好ましくは65％、及び最も好ましくは80％である。ある特定の理論に結合するものではないが、高い回収は、本明細書に記載されたさまざまな処理手順と結合した、本明細書に記載した変換反応から生じるものと考えられる。ある特定の処理段階で、比較的溶解性であるグルコンイソフラボン共役体を溶解性のないアグルコン形態に変換することによって、得られた生成物中に、供給原料中の高いパーセンテージでイソフラボンを回収することができる。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するものであって、それに限定されるものではない。
実験 0.02Ｎリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、噴霧乾燥乳漿の16％水性懸濁液のサンプルを作り、添加酵素配合有りと無しのものについて、45℃で０、３、24時間培養した。補足的酵素を受け入れるサンプルは、バイオペクチナーゼ１００Ｌを濃度0.4重量％で受け取った。イソフラボン含量について、すべてのサンプルを分析した。実験経過で見出したイソフラボンのパーセント分布を以下の表１に示す。
【００２５】
【表１】
2006087440.tif 000003
【００２６】
24時間培養後における、酵素を添加していないサンプルのアグルコンイソフラボンの濃度は比較的低く、例えばゲニステイン10％、ダイゼイン６％、及びグリシテイン８％であった。補足的酵素の添加による有益な効果は、ゲニステイン及びダイゼインの著しく高い濃度、例えばそれぞれ70％及び66％により、示される。本明細書で記載するイソフラボンの各タイプの濃度は、イソフラボンのタイプのすべての形態全体をベースとしている。
他の実験において、乳漿のサンプルをｐＨ７に調整した。サンプルを45℃で培養した。24時間培養後、サンプルの半分のうちの一方に十分量の補足的ベータ−グルコシダーゼ酵素、バイオペクチナーゼ１００Ｌを添加した。これらのすべてのサンプルを45℃に置いて、さらに22時間培養した。サンプルをｔ＝０、５、24、及び46時間で採取し、分析した。イソフラボン含量についてすべてのサンプルを分析した。実験経過で見出された各イソフラボンのパーセントを以下の表２Ａ及び表２Ｂに示す。表２Ａは、補足的ベータ−グルコシダーゼ酵素を添加していないサンプルのイソフラボン含量をまとめたものである。はじめに補足的酵素を添加せずに24時間培養し、その後十分量のバイオペクチナーゼ100Lを受けたサンプル内のイソフラボン分布を表２Ｂに示す。したがって、表２Ｂに示す時間は、補足的酵素をサンプルに添加したことについての時間である。例えば、表２Ｂでｔ＝０時間と示すサンプルは、実際酵素なしで24時間培養した。表２Ｂでｔ＝22時間とリストアップされているサンプルは、補足的酵素の添加前に24時間培養して、補足的酵素の添加後22時間培養した。
【００２７】
【表２】
2006087440.tif 000004
【００２８】
培養24時間後及び培養46時間後のゲニステイン、ダイゼイン、及びグリシテインの濃度は50％未満であるので、表２Ａのデータは、十分な残余酵素濃度をぎりぎりで有するサンプルを示している。酵素添加後、ゲニステイン及びダイゼインについての変換が100％、並びにグリシテインについての変換が87％であるので、表２Ｂのデータは補足的酵素を添加することの利益を示している。
他の一連の実験において、乳漿のサンプルをｐＨ４．５に調整し、補足的酵素ラクターゼＦと共に培養した。ラクターゼＦの濃度は、乳漿100グラム当たりラクターゼＦ0.02グラムであった。52℃での培養中、サンプルをｔ＝０、1.5、５、及び17時間で採取した。実験経過におけるイソフラボンの変化及び分布を、表３に示す。
【００２９】
【表３】
2006087440.tif 000005
【００３０】
表３のデータから、17時間後のグリシテインへの変換が著しいことがわかる。
他の実験において、乳漿のサンプルをオートクレーブに入れて残余酵素及び汚染菌を破壊し、ｐＨを４．５に調整し、サンプルを２つのグループに分けて次のように酵素を添加した。サンプルの第１のグループには、サンプル中の開始時の乳漿各100グラム当たり補足的酵素配合0.1グラムを添加した。サンプルの第２のグループには、乳漿各100グラム当たり補足的酵素配合0.001グラムを添加した（この使用のために酵素を１:100に希釈した）。乳漿サンプルを各々40℃又は60℃で23時間培養した。サブサンプルをｔ＝０、１、２、４、６、及び23時間で引き出した。補足的酵素バイオペクチナーゼ300Lは、クエスト・インターナショナルから提供された。イソフラボン含量についてすべてのサンプルを分析した。実験経過で見出されたイソフラボンの分布を以下の表４に示す。バイオペクチナーゼ300Lはイソフラボン共役体をアグルコンに変換し、乳漿100グラム当たり0.1グラム酵素配合を用いて、ｐＨ4.5、60℃、23時間後に、ゲニステイン90％、ダイゼイン86％、及びグリシテイン60％とした。ゲニステイン70％、ダイゼイン62％、及びグリシテイン44％からわかるように、バイオペクチナーゼ300Lで60℃、１時間のみでかなりの変換が生じていた。変換速度及び乳漿100グラム当たり0.1グラム酵素配合の用量のレベルは、40℃及び60℃の双方に有効であった。100倍希釈した補足的酵素用量(開始時の乳漿100グラム当たり0.001グラム)の速度は、100倍遅かった。
【００３１】
【表４】
2006087440.tif 000006
【００３２】
表４のデータから、本発明の方法により得られる変換の著しい程度がわかる。
他の一連の実験において、乳漿のサンプルをｐＨ７及びｐＨ８に調整し、開始時の乳漿５グラム当たりラクターゼＦ又はラクトザイムを0.05グラム（開始時の乳漿中固形分概算２％のうち酵素５重量％）添加した。サンプルを40℃及び60℃で培養した。酵素を添加する（t＝０）前及び目標温度で24時間培養後にサンプルを取り出した。酵素配合を次のように行った。コントロールは、酵素添加なしで培養したサンプルであった。イソフラボン含量についてすべてのサンプルを分析した。ラクターゼＦ又はラクトザイムのいずれかで24時間培養後の乳漿中のイソフラボンのパーセント分布の変化を、以下の表５に示す。酵素添加前にサンプルは滅菌されておらず、微生物汚染成長はともかく阻害されていなかった。
【００３３】
【表５】
2006087440.tif 000007
【００３４】
表５に関して、培養温度を40℃から60℃に上昇させることによりｐＨ７での24時間培養後のゲニステインの変換が、40％から79％に増加した。同じように、ｐＨ７からｐＨ８に上昇させることにより、同程度の大きさの変換を行うことができる。ゲニステインに関して、24時間、温度60℃でのｐＨ変化により、変換は79％から93％に増加した。
他の一連の実験において、大豆由来の乳漿タンパク質中のゲニステイン及びダイゼインの回収パーセントを調査した。乳漿タンパク質中のゲニステイン（又はダイゼイン）の量を測定し、大豆出発原料中のゲニステイン（又はダイゼイン）のすべての形態の全体をベースにしたパーセンテージで表すことにより、回収パーセントを見出した。脱脂大豆粉100gを、32℃で15分間水1000gで抽出した。スラリーのｐＨは6.7であった。抽出剤：粉の比は10：１であった。その後、このスラリーを５分間遠心分離し廃粉(spent flour)を除去した。この廃粉を、32℃で５分間水600gで２回抽出した。抽出剤：粉の比は６：１であった。５分間遠心分離することにより、第２抽出物を廃粉から分離した。第１及び第２の水性抽出物を合わせた。ＨＣｌを添加することにより、合わせた抽出物をｐＨ4.5に調整し、大豆乳漿からタンパク質を沈殿させた。大豆乳漿を噴霧乾燥し、その後固形分20％のレベルで水に再懸濁した。乳漿スラリーのｐＨを4.5に調整し、温度を50℃に維持した。ベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素ラクターゼＦを、乳漿固形分１重量％添加して、50℃で20時間反応させて、グルコンイソフラボンからアグルコン形態への完全な変換を確実にした。反応に続いて、乳漿タンパク質を不溶性にするために、乳漿スラリーを95℃に１分間加熱した。アグルコンイソフラボンを含む不溶性乳漿タンパク質を遠心分離により回収した。乳漿タンパク質中に回収したゲニステインの量は、出発大豆原料（脱脂大豆粉）中のゲニスチン及びゲニステインのすべての形態の全量の81％であった。同じように、乳漿タンパク質中に回収したダイゼインの量は、69％であった。
【００３５】
イソフラボン含量を次のように定量した。サンプル0.75ｇ（噴霧乾燥したもの又は微粉末）をメタノール／水＝80／20の溶媒50ｍｌと混合することにより、イソフラボンを大豆生成物から抽出した。この混合物をオービタルシェーカー（orbital shaker）で室温２時間振盪した。２時間後、残存する非溶解物質をワットマン42番濾紙で濾過して除去した。濾液５ｍｌを水４ｍｌ及びメタノール１ｍｌで希釈した。
抽出したイソフラボンを、ベックマンＣ18逆相カラムを用いて、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離した。イソフラボンをカラム上に注入し、メタノール88％、水10％及び氷酢酸２％で開始し、メタノール98％及び氷酢酸２％で終了する勾配溶媒で溶出した。流速0.4ｍｌ／分で、すべてのイソフラボン、即ちゲニスチン、6-O-アセチルゲニスチン、6-O-マロニルゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン、6-O-アセチルダイジン、6-O-マロニルダイジン、ダイジン、グリシチン及びその誘導体並びにグリシテインは、きれいに溶解した。ピーク検出は、262mmでの紫外線吸光度による。ピークの同定を質量分析計で行った。
【００３６】
インドファイン化学会社(Indofine Chemical Company，Sommerville，NJ)から購入した純粋標準試薬（ゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン及びダイザイン）を用いて、定量化を達成した。上記化合物のそれぞれについて、応答因子（集積領域／濃度）を計算し、未知のサンプルを定量化するのに用いた。純粋標準試薬が入手できない共役体については、応答因子を親分子のものと推定し、分子量の違いを補正した。グリシチンに対する応答因子は、分子量の違いを補正したゲニスチンの応答因子と推定した。
【００３７】
本方法は、それぞれ個々のイソフラボンの定量を提供する。すべての共役体が、それぞれの非共役体に変換されるのであれば、便宜的に、全ゲニステイン、全ダイゼイン及び全グリシテインを計算することができ、それらの化合物の凝集体重量を表示することができる。酸加水分解を用いて共役体に変換する方法を用いることにより、これらの合計を直接に測定することができる。
【００３８】
本発明の実施態様を以下に示す。
１．(a)グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、 (b)乳漿中の少なくとも大部分のグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換するのに十分な時間、温度、及びｐＨで、グルコンイソフラボンを十分量の少なくとも１種のベータ−グルコシダーゼ酵素及びエステラーゼ酵素と反応させて、それによってアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する工程を有するアグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法。
２．時間が、約２時間〜約48時間である上記１記載の方法。
３．時間が、約24時間である上記２記載の方法。
４．温度が、約40℃〜約60℃である上記１記載の方法。
５．温度が、約60℃である上記４記載の方法。
６．ｐＨが、約４〜約８である上記１記載の方法。
７．ｐＨが、約４．５である上記６記載の方法。
８．時間が約24時間であり、温度が約60℃であり、かつｐＨが約4.5である上記１記載の方法。
９．(c)乳漿からタンパク質原料を回収してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質を提供する工程をさらに有する上記１記載の方法。
10．乳漿タンパク質が、大豆乳漿を含有する上記９記載の方法。
11．乳漿タンパク質が、限外濾過、加熱凝固及び脱水のうちの少なくとも１つにより回収される上記９記載の方法。
12．乳漿タンパク質が、該タンパク質を不溶性にするのに十分なｐＨ、時間及び温度で乳漿を加熱して、その後、乳漿から不溶性乳漿タンパク質を分離する方法により回収される上記９記載の方法。
13．ｐＨが、約１〜約２である上記12記載の方法。
14．温度が少なくとも約80℃で、少なくも約30分間である上記12記載の方法。
15．遠心分離により乳漿から不溶性タンパク質を分離する上記12記載の方法。
16．不溶性タンパク質を脱水する上記12記載の方法。
17．上記１記載の方法から製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿。
18．上記９記載の方法から製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質。
19．実質的にすべてのグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する上記１記載の方法。
20．(a)グルコンイソフラボン、並びにベーターグルコシダーゼ酵素及びエステラーゼ酵素のうちの少なくとも１種である十分量の残基酵素を含有する植物タンパク質乳漿を得て、 (b)乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも大部分をアグルコンイソフラボンに変換するのに十分な時間、温度及びｐＨで、グルコンイソフラボンを酵素と反応させて、それによってアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する工程を有するアグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法。
21．時間が、約２時間〜約48時間である上記20記載の方法。
22．時間が、約24時間である上記21記載の方法。
23．温度が、約40℃〜約60℃である上記20記載の方法。
24．温度が、約60℃である上記23記載の方法。
25．ｐＨが、約４〜約８である上記20記載の方法。
26．ｐＨが、約4.5である上記25記載の方法。
27．時間が約24時間であり、温度が約60℃であり、かつｐＨが約4.5である上記20記載の方法。
28．(c)乳漿からタンパク質原料を回収してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質を提供する工程をさらに有する上記20記載の方法。
29．乳漿タンパク質が、大豆乳漿を含有する上記28記載の方法。
30．乳漿タンパク質が、限外濾過により回収される上記28記載の方法。
31．乳漿タンパク質が、該タンパク質を不溶性にするのに十分なｐＨ、時間及び温度で乳漿を加熱して、その後該乳漿から不溶性乳漿タンパク質を分離する方法により回収される上記28記載の方法。
32．ｐＨが、約１〜約２である上記31記載の方法。
33．温度が少なくとも約80℃で、少なくも約30分間である上記31記載の方法。
34．遠心分離により乳漿から不溶性タンパク質を分離する上記31記載の方法。
35．不溶性タンパク質を脱水する上記31記載の方法。
36．上記20記載の方法により製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿。
37．上記28記載の方法により製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質。
38．実質的にすべてのグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する上記20記載の方法。
39．(a)グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て；
(b)ベーターグルコシダーゼ酵素及びエステラーゼ酵素のうちの少なくとも１種である補足的酵素を乳漿に加えて、乳漿中の酵素の全濃度を、乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも大部分を変換するのに十分なものとして；かつ (c)乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも大部分をアグルコンイソフラボンに変換するのに十分な時間、温度、及びｐＨで、グルコンイソフラボンを酵素と反応させて、それによってアグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する工程を有するアグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法。
40．時間が、約２時間〜約48時間である上記39記載の方法。
41．時間が、約24時間である上記40記載の方法。
42．温度が、約40℃〜約60℃である上記39記載の方法。
43．温度が、約60℃である上記42記載の方法。
44．ｐＨが、約４〜約８である上記39記載の方法。
45．ｐＨが、約4.5である上記44記載の方法。
46．時間が約24時間であり、温度が約60℃であり、かつｐＨが約４．５である上記39記載の方法。
47．(d)乳漿からタンパク質原料を回収してアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質を提供する工程をさらに有する上記39記載の方法。
48．乳漿タンパク質が、大豆乳漿を含有する上記47記載の方法。
49．乳漿タンパク質が、限外濾過により回収される上記47記載の方法。
50．乳漿タンパク質が、該タンパク質を不溶性にするのに十分なｐＨ、時間及び温度で乳漿を加熱して、その後乳漿から不溶性乳漿タンパク質を分離する方法により回収される上記47記載の方法。
51．ｐＨが、約１〜約２である上記50記載の方法。
52．温度が少なくとも約80℃で、少なくも約30分間である上記50記載の方法。
53．遠心分離により乳漿から不溶性タンパク質を分離する上記50記載の方法。
54．不溶性タンパク質を脱水する上記50記載の方法。
55．上記39記載の方法により製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿。
56．上記47記載の方法により製造したアグルコンイソフラボン濃縮乳漿タンパク質。
57．実質的にすべてのグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンに変換する上記39記載の方法。
58．(a)グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て、 (b)乳漿中のグルコンイソフラボンの少なくとも大部分をアグルコンイソフラボンに変換するのに十分なｐＨ、時間、及び温度で、グルコンイソフラボンを十分量の酸と反応させて、アグルコンイソフラボン濃縮乳漿を製造する工程を有するアグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質乳漿の製造方法。
59．ｐＨが、約１〜約２である上記58記載の方法。
60．温度が、約80℃〜約90℃である上記59記載の方法。
61．時間が、約30分間〜約180分間である上記59記載の方法。
62．ｐＨが、約4.5である上記58記載の方法。
63．時間が、約24時間である上記62記載の方法。
64．温度が、約50℃である上記62記載の方法。
65．乾燥基準ゲニステイン含量が約2.6〜約8.7ｍｇ／グラムであり、かつ乾燥基準ダイゼイン含量が約2.5〜約6.0ｍｇ／グラムであるアグルコンイソフラボン濃縮植物乳漿タンパク質。
66．ｐＨが、グルコンイソフラボンとの反応前に酵素が最も活性である値である上記１記載の方法。
67．ｐＨが、グルコンイソフラボンとの反応前に酵素が最も活性である値である上記20記載の方法。
68．ｐＨが、グルコンイソフラボンとの反応前に酵素が最も活性である値である上記39記載の方法。
69．(a)イソフラボンを含有する植物タンパク質乳漿を得て；
(b)乳漿中の少なくとも大部分のイソフラボンを難溶性イソフラボンに変換するのに十分な時間、温度、及びｐＨで、イソフラボンを十分量の酵素と反応させて、それによってイソフラボン濃縮乳漿を製造し；かつ (c)該乳漿からタンパク質原料を回収して植物タンパク質原料に含まれるイソフラボンの少なくとも50％を含む乳漿タンパク質を製造する工程を有する、植物タンパク質原料からのイソフラボンの少なくとも50％を乳漿タンパク質中に回収する方法。
70．乳漿タンパク質が、植物タンパク質原料に含まれるイソフラボンの少なくとも65％を含む上記69記載の方法。
71．乳漿タンパク質が、植物タンパク質原料に含まれるイソフラボンの少なくとも80％を含む上記69記載の方法。
72．上記69記載の乳漿タンパク質。
73．上記70記載の乳漿タンパク質。
74．上記71記載の乳漿タンパク質。
75．植物タンパク質原料が、大豆原料を含有する上記69記載の方法。
76．酵素が、ベータ−グルコシダーゼ酵素及びエステラーゼ酵素からなる群から選ばれる上記69記載の方法。
【００３９】
前述の記載はもちろん、本発明の単に好ましい実施態様であって、添付した請求の範囲に示す精神及びその広範囲の面から離れなければ、さまざまな変化又は変更をすることができると考えられ、添付した請求の範囲は、均等論を含む特許法の原則により解釈すべきであると考えられる。