(57)【要約】      （修正有）【課題】  種子特異的に発現誘導することができる新規なプロモーターを提供する。【解決手段】  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる種子特異的プロモーター。  (a)ニンジン由来の特定な塩基配列からなるDNA  (b)ニンジン由来の特定な塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA  (c)ニンジン由来の特定な塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる種子特異的プロモーター。
(a)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
【請求項２】
請求項１記載の種子特異的プロモーターを含む組換えベクター。
【請求項３】
上記種子特異的プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項２記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２又は３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項２又は３記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換植物から採取した種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子に特異的に発現促進する活性を有する種子特異的プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
機能遺伝子の発現は、RNAへの転写、タンパク質への翻訳、RNA の安定性、タンパク質の安定性、タンパク質輸送及びタンパク質修飾など、遺伝子が転写されてから機能性分子が機能するまでの多くの過程で制御されている。プロモーターはその中でもRNAへの転写のタイミング、強度、部位などを制御する主たる発現制御因子として知られ、遺伝子のある一部分を指す調節遺伝子の一種であり、DNA分子上にあって、RNA合成酵素が結合してオペロンの転写を開始する部位と定義される。
【０００３】
従って、所定の機能遺伝子の発現を制御するためには、プロモーターの開発が有効である。特に、プロモーターを開発することによって、各種のストレスに応じた遺伝子の発現誘導が可能となったり、各種の組織において遺伝子を特異的に発現調節することが可能となる。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ニンジン由来の組織特異的プロモーターとして、維管束（特に根部における維管束）において特異的に遺伝子の発現誘導活性を示すプロモーターを開示している。また、特許文献２には、罹病や障害等の外的ストレスに応答して遺伝子の発現を誘導するニンジン由来プロモーターが開示されている。
【０００５】
また、特許文献３は、ダイズ由来の種子特異的プロモーターを開示している。しかし、ダイズ由来のプロモーターは、ダイズにおいて使用することができるが、広く植物体に使用することはできないと考えられる。また、特許文献３以外にも種子特異的プロモーターを開示する先例は存在しているが、ニンジン種子において特異的に発現誘導の強弱を確認したプロモーターは知られていない。
【０００６】
したがって、所望の遺伝子をニンジン種子において特異的に発現させ、当該種子の形質を様々に制御する技術は確立されていないのが現状である。
【特許文献１】特開平10-52273号公報
【特許文献２】特開2003-252号公報
【特許文献３】特開平06-189777号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、種子において発現誘導することができるプロモーター、特にニンジン種子において遺伝子の発現制御を可能とするプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する
(1)  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる種子特異的プロモーター。
(a)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
【０００９】
(2)  (1)記載の種子特異的プロモーターを含む組換えベクター。
(3)  上記種子特異的プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする(2)記載の組換えベクター。
(4)  (2)又は(3)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
(5)  (2)又は(3)記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
(6)  (5)記載の形質転換植物から採取した種子。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、全く新規な塩基配列を有する種子特異的プロモーターを提供することができる。また、本発明に係る種子特異的プロモーターを用いることによって、種子特異的に目的遺伝子の発現誘導を行うことができる組換えベクターを提供することができる。さらに、本発明に係る種子特異的プロモーターを用いることによって、種子特異的に発現誘導される目的遺伝子を有する形質転換体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明に係る種子特異的ストレス応答性プロモーターについて説明する。本発明に係る種子特異的プロモーターは、以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる。
【００１２】
(a)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号１〜８のいずれか１に表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子特異的に発現誘導するプロモーターとして機能するDNA
【００１３】
配列番号１〜８の塩基配列は、ニンジン種子由来のcDNA及びニンジン葉由来のcDNAに対して、ディファレンシャルディスプレイ法により種子特異的に発現している候補cDNAを取得した後、当該候補cDNAについて発現特性を評価し、これにより種子特異的に発現していると評価されたcDNAを特定し、特定したcDNAをもとにインバースPCRにより当該cDNAの5’上流領域の塩基配列を同定することによって取得した。
【００１４】
具体的に、配列番号１の塩基配列は、Thioredoxin-like U5 small ribonucleoprotein遺伝子と類似性のあるDCSP1遺伝子の上流に存在する。配列番号２の塩基配列は、Seed coat peroxidase遺伝子と類似性のあるDCSP2遺伝子の上流に存在する。配列番号３の塩基配列は、Metallothionein like protein遺伝子と類似性のあるDCSP3遺伝子の上流に存在する。配列番号４の塩基配列は、Cytochrome P450遺伝子と類似性のあるDCSP4遺伝子の上流に存在する。配列番号５の塩基配列は、Metallothionein like protein遺伝子と類似性のあるDCSP6遺伝子の上流に存在する。配列番号６の塩基配列は、Late embryogenesis abundant protein遺伝子と類似性のあるDCSP7遺伝子上流に存在する。配列番号７の塩基配列は、Late embryogenesis abundant protein遺伝子と類似性のあるDCSP8遺伝子上流に存在する。配列番号８の塩基配列は、Aquaporin-like protein遺伝子と類似性のあるDCSP9遺伝子上流に存在する。
【００１５】
例えば一例として配列番号１の塩基配列は、例えば、DCSP1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、いわゆるインバースPCRによって調製することができる。インバースPCRとは、既知の塩基配列の両端に隣接する未知の塩基配列をPCR法を用いて増幅する方法である。具体的には、先ず、既知の塩基配列を含むDNAを適当な制限酵素で切断し、PCR増幅に適した大きさのDNA断片とし、このDNA断片の両端をライゲーションして環状とする。その後、一対のプライマーを、それぞれ環状分子内のコア領域の両端部分には相補的だが、通常のPCRとは逆に、既知の塩基配列から未知の塩基配列に向かって伸長鎖を合成するように設計する。そして、このように設計された一対のプライマーと、環状化されたDNA断片を用いてPCRを行う。これにより、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を増幅することができる。
【００１６】
インバースPCRによって増幅されたDNA断片を用いて、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を決定することができる。そして、決定した塩基配列に基づいて、さらに一対のプライマーを設計し、決定した塩基配列に隣接する未知の塩基配列を同様にして増幅することができる。
【００１７】
このように、インバースPCRによってDCSP1遺伝子の上流に位置する未知の塩基配列を順次増幅し、定法に従って塩基配列を決定することによって、配列番号１で表される塩基配列を得ることができる。一旦、配列番号１で表される塩基配列が決定されると、その後は、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、ニンジンから抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、配列番号１に表される塩基配列を得ることができる。
【００１８】
配列番号１〜８に表される塩基配列は、種子において特異的に発現誘導するプロモーターとして機能する。プロモーターとは、機能遺伝子の上流に配置され、RNAポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された機能遺伝子の発現を調節する塩基配列である。
【００１９】
ここで特異的とは、植物体を構成する各種組織のなかで種子においてのみ発現誘導機能を有すること、及び/又は、種子における発現誘導機能が種子以外の組織における発現誘導機能と比較して高いことを意味する。発現誘導機能は、以下のような手法により定量的に確認することができる。すなわち、発現誘導機能（言い換えるとプロモーターとしての活性）は、例えば、種々のレポーター遺伝子（例えば、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）、ルシフェラーゼ遺伝子（LUC）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（GFP）等）をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入又は一過的に導入した後、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。
【００２０】
より具体的には、配列番号１、４、６及び７いずれか１の塩基配列からなるプロモーターは、植物体を構成する各種組織のなかで種子においてのみ発現誘導機能を有するといった特徴がある。これに対して、配列番号２、３、５及び８いずれか１の塩基配列からなるプロモーターは、植物体を構成する各種組織のなかで種子における発現誘導機能が種子以外の組織における発現誘導機能と比較して高いといった特徴がある。また、配列番号７の塩基配列からなるプロモーターは、発現誘導機能（プロモーター活性）が最も優れており、特定の遺伝子発現を種子においてのみ優れた発現量で誘導することができる。また、配列番号３の塩基配列からなるプロモーターは、発現誘導機能（プロモーター活性）が優れており、葉等の種子以外の組織と比較して種子おいて優れた発現量でもって発現誘導することができる。
【００２１】
一方、本発明に係る種子特異的プロモーターは、配列番号１〜８に表される塩基配列からなるものに限定されず、上記(b)に記載したように、種子特異的なプロモーター活性を示す限り、配列番号１〜８に表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。
【００２２】
例えば、配列番号１〜８に表される塩基配列において、1〜100個の塩基、好ましくは1〜50個の塩基、より好ましくは1〜10個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であっても、種子特異的なプロモーター活性を示す限り本発明に係る種子特異的プロモーターに含まれる。
【００２３】
また、本発明に係る種子特異的プロモーターは、配列番号１〜８に表される塩基配列からなるもの限定されず、上記(c)に記載したように、種子特異的なプロモーター活性を示す限り、配列番号１〜８で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
【００２４】
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、P32で標識下プローブDNAを用いる場合には、５×SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト試薬（0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）及び0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）からなるハイブリダイゼーション溶液中で、温度が45〜68℃、好ましくは60〜68℃である。洗浄ステップにおいては、２×SSC及び0.1％SDSからなる洗浄溶液中で、温度が45〜55℃、より好ましくは、0.1×SSC及び0.1％SDSからなる洗浄溶液中で、温度が45〜55℃である。
【００２５】
また、AlkPhos direct labeling module（アマシャムバイオテク社製）のキットを用いて、酵素標識したプローブDNAをも散る場合には、当該キットのマニュアルに記載されている組成のハイブリダイゼーション溶液（0.5M NaCl及び4％ブロッキング試薬を含む）中で、温度が55〜75℃である。洗浄ステップにおいては、当該キットのマニュアルに記載されている一次洗浄液（2M尿素を含む）中で、55〜75℃であり、更に、二次洗浄液中で室温である。
【００２６】
さらに、他の検出法であってもよく、その場合には当該検出法の標準的な条件を適宜使用することができる。
【００２７】
一旦、本発明に係る種子特異的プロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る種子特異的プロモーターを得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によって、配列番号１〜８に表される塩基配列に1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を合成することもできる。
【００２８】
なお、配列番号１〜８に表される塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製))などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００２９】
次に、上述した種子特異的プロモーターを用いた組換えベクターについて説明する。組換えベクターは、適当なベクターに、上述した種子特異的プロモーターを連結（挿入）することにより得ることができる。また、上述した種子特異的プロモーターの下流に目的遺伝子を連結（挿入）したものも、本発明に係る組換えベクターに含まれる。ここで「目的遺伝子」とは、例えば、タンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス核酸、アンチセンスRNAデコイをコードする核酸、リボザイムなどが挙げられる。また、「目的遺伝子」としては、RNA干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の原理を利用するための遺伝子であっても良い。
【００３０】
タンパク質をコードする核酸としては、酵素をコードする遺伝子の核酸であってもよく、例えば、種子の休眠を司る遺伝子（アブシジン酸(ABA) の主要な不活性化酵素であるABA 8'-水酸化酵素の遺伝子：CYP707A遺伝子など）、種子の発芽を司る遺伝子（ジベレリン(GA)生合成酵素であるGA 3-oxidaseなど）、植物油の脂肪酸合成を司る遺伝子（アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子、12：0-ACP  チオエステラーゼ遺伝子、16：0-ACP  チオエステラーゼ遺伝子、3-ケトアシル-ACPシンテース、オメガ-6デサチュラーゼ遺伝子、脂肪酸伸長酵素（fatty acid elongation1:FAE1）遺伝子など）、貯蔵タンパク遺伝子（ナピン：napin遺伝子など）、澱粉合成酵素遺伝子（アミロース：澱粉粒結合型でんぷん合成酵素 (GBSS)遺伝子、アミロペクチン：グルコースの直鎖を伸ばす可溶性でんぷん合成酵素(SSS)遺伝子、枝を合成する枝作り酵素(BE)遺伝子、枝をトリミングする枝切り酵素(DBE)遺伝子など）等を挙げられる。
【００３１】
アンチセンス核酸とは、任意のRNA（ゲノムRNA及びmRNA）と相補的な塩基配列を有し、これらと２本鎖を形成することによって該RNAにコードされる遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制するものをいう。アンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意の核酸物質を使用することができる。例えば、DNA、RNA、又は任意の核酸擬似物が挙げられる。従って、発現を抑制させようとする遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンス核酸（オリゴヌクレオチド）配列を設計する。
【００３２】
本発明の目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体も使用することができる。分子類似体は、高安定性、分布特異性などを有するものである。分子類似体には、化学的に反応性である基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものが挙げられる。
【００３３】
RNAデコイをコードする核酸とは、転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するRNAを指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものをいう。
【００３４】
リボザイムとは、特定のタンパク質のmRNAを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、FEBS Letter, 228; 228-230(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のmRNAを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。
【００３５】
RNA干渉とは、二本鎖を形成しているRNA（以下、「二本鎖RNA」又は「dsRNA」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのＲＮＡの塩基配列に相同的な内在性のmRNAが分解される結果、当該mRNAからの遺伝子発現が特異的に抑制される現象である。RNA干渉は、RNAインターフェアランス、RNAiとも称される。RNA干渉の原理を利用するための遺伝子としては、ヘアピン型dsRNA等の宿主内で二本鎖RNAを形成するように、発現を抑制したい遺伝子の塩基配列に基づいて設計される。
【００３６】
目的遺伝子を挿入するためのベクターは、プラスミド型ベクター、又は宿主生物中のゲノムに組み込み可能な染色体導入型ベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC：yeast artificial chromosome）などが挙げられる。
【００３７】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３８】
ベクターに本発明の種子特異的プロモーター及び目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００３９】
組換えベクターにおいて、種子特異的プロモーターは、目的遺伝子の機能が発揮されるように、目的遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、目的遺伝子が導入される宿主生物において種子特異的プロモーターの制御下に目的遺伝子が発現されるように、目的遺伝子と種子特異的プロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。そこで、組換えベクターには、種子特異的プロモーター、目的遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００４０】
このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、上述した組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主に導入することによって作製することができる。宿主としては、特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9等の昆虫細胞が挙げられる。
【００４１】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5α、Y1090などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)] 、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４２】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。
【００４３】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４４】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４５】
宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、例えばナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、セリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００４６】
組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。
【００４７】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、組換えベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著,植物遺伝子操作マニュアル,1990,27-31pp,講談社サイエンティフィック,東京）等に従って宿主（例えば、タバコ、ナタネ、ニンジンなど）の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００４８】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、3〜12cm程度の距離で行う。
【００４９】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００５０】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕種子特異的遺伝子のクローニング
ニンジン種子および葉RNAの調製
低温（4℃）処理したニンジン（Daucus carota L.）（夏蒔鮮紅五寸）の塊根を培養土（赤玉土：腐葉土＝３：１）に植え、25℃、80μmol /m2/s  照明下（16時間明期/８時間暗期のサイクル）、およそ４５日間コイトトロン（小糸工業社製）で生育させた。
開花後２〜４週間の未熟種子（登熟期）および葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場合は、-80℃で保存した）。凍結した未熟種子および葉は、液体窒素下、乳鉢で細かくすりつぶし、RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社製）を用いて全RNAを抽出した。
【００５３】
ゲノムDNAの除去
抽出した全RNAをDNaseI（タカラバイオ株式会社製）で処理し、混入したゲノムDNAを取り除いた。DNaseI処理した全RNA液に、フェノール/クロロホルム(1:1)混液を加え反応を停止させた。10000rpm、5分間遠心し上清を回収し、0.1倍容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8-5.0)と2.5倍容のエタノールを加え、-80℃、20分間静置した。さらに15000rpm、10分間、4℃で遠心しRNAを沈殿させた後、沈殿を自然乾燥させRNaseフリー水に溶解した。
【００５４】
ディファレンシャルディスプレイ法
本実施例においてディファレンシャルディスプレイ（DD）法の実験は、Fluorescence Differential Display Kit （タカラバイオ株式会社製  TAKARA BIO INC.）、Enzyme Set-FDD（タカラバイオ株式会社製）、Cloning-Sequencing Primer Set for FDD（タカラバイオ株式会社製）および蛍光イメージアナライザー（FMBIO II  Multi-View [タカラバイオ株式会社製］）を用いて行った。実験操作は、各キットおよび装置記載の方法に従った。
【００５５】
逆転写反応（１st cDNA合成）
ゲノムDNAを除去した未熟種子および葉由来の全RNA から、Fluorescence Differential Display KitおよびEnzyme Set-FDDを用いて、蛍光Downstream primer（No.1）(配列番号９)をプライマーとしcDNAを合成した。
【００５６】
1回目DD-PCRおよび電気泳動
合成したcDNAを鋳型とし、Fluorescence Differential Display KitおよびEnzyme Set-FDDを用いて、蛍光Downstream primer（No.1；配列番号９）と14種類のUpstream primer（No.1,2,3,4,6,7,8,10,12,13,15,17,18,21）（配列番号１０〜２３）に対して、PCRを行い遺伝子断片の増幅を行った。
【００５７】
DD-PCR反応液を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、蛍光イメージアナライザー（FMBIO II  Multi-View）を用いて、種子および葉の試料間でバンドパターンを比較した。種子で強く現れるバンドをゲルから切り出し、切り出したゲルに50μlの蒸留水を加え、室温で30分放置後、100℃、10分間熱抽出を行った。
【００５８】
2回目のDD-PCRおよび電気泳動
切り出したバンド抽出液に対して、１回目のDD-PCRで用いた同じ蛍光Downstream primer（No.1）とUpstream primer（No.1,2,3,4,6,7,8,10,12,13,15,17,18,21）を用いて、2回目のDD-PCRを行った。2回目のDD-PCR反応液をH.A.-Yellow（タカラバイオ株式会社製）1U/mlを添加した3％NuSieve3:1アガロース（タカラバイオ株式会社製）ゲルで電気泳動し、蛍光イメージアナライザー（FMBIO II  Multi-View）を用いて、種子および葉の試料間でバンドパターンを比較した。種子で強く現れるバンドをゲルから切り出し、切り出したゲルに50μlの蒸留水を加え、室温で30分放置後、100℃、10分間熱抽出を行った。
【００５９】
3回目のDD-PCRおよび電気泳動
切り出したバンド抽出液に対して、Cloning-Sequencing Primer Set for FDDに含まれる1および2回目のDD-PCRと同じExtended Downstream primer（配列番号２４）およびExtended Upstream primer （No.1,2,3,4,6,7,8,10,12,13,15,17,18,21）（配列番号２５〜３８）を用いて、3回目のDD-PCRを行った。
【００６０】
3回目のDD-PCR反応液をH.A.-Red（タカラバイオ株式会社製）1U/mlを添加した3％NuSieve3:1アガロース（タカラバイオ株式会社製）ゲルで電気泳動し、EtBrで染色後、メインバンドをゲルから切り出した。切り出したゲルは、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）により抽出精製し、48個のDNAフラグメントを回収した。
【００６１】
DNAフラグメントのクローニングとアノテーション
3回目のDD-PCRで得られたDNAフラグメントをTOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。クローニングしたDNAフラグメントは、TOPO-pCR2.1ベクター内のM13Fプライマー（配列番号３９）およびM13Rプライマー（配列番号４０）を用いて、ABI PRISM Dye Terminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。その結果、８つのcDNA遺伝子断片(AD1-U13-4a、AD1-U21-1、AD1-U17-1a、AD1-U1-3a、AD1-U17-2、AD1-U6-5a、AD1-U6-3、AD1-U12-1ｂ)を取得した（配列番号４１〜４８）。
【００６２】
決定した塩基配列について、NCBI-BLAST（BLASTN,BLASTX,TBLASTX）により、塩基配列データベース（GenBank+EMBL+DDBJ）、アミノ酸配列データベース（PDB）に対してホモロジー検索を行い、アノテーションを行った。なお、AD1-U1-3a、AD1-U6-5a及びAD1-U6-3については、実施例４の過程（インバースPCR法による種子特異的プロモーターの取得）で取得した各遺伝子の配列情報に基づいてアノテーションを行った。
【００６３】
その結果、
AD1-U13-4aは、Thioredoxin-like U5 small ribonucleoprotein遺伝子の塩基配列と、
AD1-U21-1は、Seed coat peroxidase遺伝子の塩基配列と、
AD1-U17-1aは、Metallothionein like protein遺伝子の塩基配列と、
AD1-U1-3aは、Cytochrome P450遺伝子の塩基配列と、
AD1-U17-2は、Metallothionein like protein遺伝子の塩基配列と、
AD1-U6-5aは、Late embryogenesis abundant protein遺伝子の塩基配列と、
AD1-U6-3は、Late embryogenesis abundant protein遺伝子の塩基配列と、
AD1-U12-1ｂは、Aquaporin-like protein遺伝子の塩基配列と類似性があった。
【００６４】
〔実施例2〕葉および種子で定常的に発現している遺伝子のクローニング
実施例２では、葉および種子で定常的に発現している遺伝子としてαTublin(αTub) （GenBank登録番号：AY007250）を選定し、αTub遺伝子断片をクローニングした。
【００６５】
ニンジン種子および葉RNAの調製
低温（4℃）処理したニンジン（Daucus carota L.）（夏蒔鮮紅五寸）の塊根を培養土（赤玉土：腐葉土＝３：１）に植え、25℃、80μmol /m2/s  照明下（16時間明期/８時間暗期のサイクル）、およそ４５日間コイトトロン（小糸工業社製）で生育させた。
【００６６】
開花後２〜４週間の葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場合は、-80℃で保存した）。凍結した葉は、液体窒素下、乳鉢で細かくすりつぶし、RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社製）を用いて全RNAを抽出した。
【００６７】
ゲノムDNAの除去
抽出した全RNAをDNaseI（タカラバイオ株式会社製）で処理し、混入したゲノムDNAを取り除いた。DNaseI処理した全RNA液に、フェノール/クロロホルム(1:1)混液を加え反応を停止させた。10000rpm、5分間遠心し上清を回収し、0.1倍容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8-5.0)と2.5倍容のエタノールを加え、-80℃、20分間静置した。さらに15000rpm、10分間、4℃で遠心しRNAを沈殿させた後、沈殿を自然乾燥させRNaseフリー水に溶解した。
【００６８】
逆転写反応（１st cDNA合成）
葉組織のTotalRNA(300ng/μl) 1μlに10μMオリゴｄTプライマー5μlを加え、70℃で10分間加熱後、氷上で急冷した。さらに、急冷したTotalRNAとオリゴｄTプライマーに加えて、下記表１の組成となるように反応溶液を調製した。
【００６９】
【表１】
2006180740.tif 000002
【００７０】
次に、TakaraPCR Thermal Cycler （タカラバイオ株式会社製）で、55℃で30分、95℃で5分及び5℃で5分といった温度条件のもと、RT反応を行った。反応後TEバッファーを80μlずつ加えて、−80℃にて保存した。
【００７１】
αTub遺伝子断片のクローニング
合成したcDNAを鋳型とし、プライマー（αTub rev.1プライマー（配列番号４９）およびαTub 1プライマー（配列番号５０））に対してPCRを行った。増幅した断片をTOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、TOPO-pCR2.1ベクター内のM13Fプライマー（配列番号３９）およびM13Rプライマー（配列番号４０）を用いて、ABI PRISM Dye Terminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。クローニングした遺伝子断片が、αTub遺伝子（GenBank登録番号：AY007250）断片であることを確認した。
【００７２】
〔実施例３〕定量的RT-PCRによる遺伝子発現特性評価
以下、定量的RT-PCRは、TaKaRa Ex Taq R-PCR Version 1.0およびSmartCycler System（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。実験操作は、各試薬および装置記載の方法に従った。
【００７３】
ニンジン種子および葉RNAの調製
低温（4℃）処理したニンジン（Daucus carota L.）（夏蒔鮮紅五寸）の塊根を培養土（赤玉土：腐葉土＝３：１）に植え、25℃、80μmol /m2/s  照明下（16時間明期/８時間暗期のサイクル）、およそ４５日間コイトトロン（小糸工業社製）で生育させた。
【００７４】
開花後２〜４週間の未熟種子（登熟期）および葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場合は、-80℃で保存した）。凍結した未熟種子および葉は、液体窒素下、乳鉢で細かくすりつぶし、RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社製）を用いて全RNAを抽出した。
【００７５】
ゲノムDNAの除去
抽出した全RNAをDNaseI（タカラバイオ株式会社製）で処理し、混入したゲノムDNAを取り除いた。DNaseI処理した全RNA液に、フェノール/クロロホルム(1:1)混液を加え反応を停止させた。10000rpm、5分間遠心し上清を回収し、0.1倍容の3M酢酸ナトリウム(pH4.8-5.0)と2.5倍容のエタノールを加え、-80℃、20分間静置した。さらに15000rpm、10分間、4℃で遠心しRNAを沈殿させた後、沈殿を自然乾燥させRNaseフリー水に溶解した。
【００７６】
逆転写反応（１st cDNA合成）
種子及び葉組織のTotalRNA(300ng/μl) 1μlに10μMオリゴｄTプライマー5μlを加え、70℃で10分間加熱後、氷上で急冷した。さらに、急冷したTotalRNAとオリゴｄTプライマーに加えて、表２に示す組成となるように反応溶液を調製した。
【００７７】
【表２】
2006180740.tif 000003
【００７８】
次に、TakaraPCR Thermal Cycler （タカラバイオ株式会社製）で、55℃で30分、95℃で５分及び5℃で5分といった温度条件のもと、RT反応を行った。反応後TEバッファーを80μlずつ加えて、−80℃にて保存した。
【００７９】
プライマー設計
ディファレンシャルディスプレイ法によって取得し、BLAST検索によってAquaporin like proteinをコードしていると推定されたｃDNA配列AD1-U12-1ｂについて、その種子及び葉組織での遺伝子発現強度を、SmartCycler System（タカラバイオ株式会社製）によって解析した。使用するプライマーとしては、同ｃDNA配列の3’UTRに相当する領域にAD1-U12-1ｂprQrev.1プライマー（配列番号５１）、その約100bp上流に、AD1-U12-1ｂprQ1プライマー（配列番号５２）を設計した。
【００８０】
反応液の調製
本実施例の定量法は、インターカレーターとしてSYBR  Green  Iを用いるインターカレーター法を用いた。定量PCR用反応液は表３の組成で調製した（下記組成は、1反応チューブ当たりの分量）。
【００８１】
【表３】
2006180740.tif 000004
【００８２】
プラスミド希釈系列の調製
AD1-U12-1をTOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングしたプラスミドDNA溶液（10ng/μl）を用いて、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl、0.01pg/μl、0.001pg/μlおよび0.0001pg/μl  の計６つの希釈DNA系列を作製した。
【００８３】
サンプルの調製
14本のチューブをSmartCycler専用チューブロックにのせ、氷上で静置した。各チューブには、先に調製した定量PCR用反応溶液を20 μlずつ分注した。さらに、各チューブに、テンプレートとなる希釈系列6種、種子ｃDNA、葉ｃDNA及び、コントロールとなるdH2Oをそれぞれ2本のチューブに5μlずつセットした（表４）。
【００８４】
【表４】
2006180740.tif 000005
【００８５】
次に、チューブをロックし、10分間の遠心処理で溶液を底部に落とし、遠心チューブの検出部（チューブ下部）に液が移動したこと、気泡がないことを確認した。
【００８６】
定量的PCR
サンプル16本を、SmartCyclerにセットし、表５のサイクル反応を実施した。各サンプル毎に、各サイクルごとに蛍光強度を測定し、その蛍光強度変化が平衡に、すなわち増幅反応が飽和状態に達したサイクル数を測定した。
【００８７】
【表５】
2006180740.tif 000006
【００８８】
データ解析
縦軸にプラスミド量、横軸に増幅が指数関数的におこる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle ; Ct値）をとったグラフに希釈系列の計12の結果をプロットし、検量線を作成した（図１）。また、Ct値と初発の希釈系列濃度に相関関係がある範囲を定量有効範囲とし、測定結果として用いた。同検量線を用いて、種子及び葉組織由来のｃDNA（TotalRNA由来）に含まれるAD1-U12-1ｂ断片の量を算出した。結果を表６に示す。
【００８９】
【表６】
2006180740.tif 000007
【００９０】
コントロール遺伝子の評価
葉および種子で定常的に発現しているαTubをコントロール遺伝子とした。AD1-U12-1ｂと同様にプライマー（αTub prQrev.1プライマー（配列番号５３）、αTub prQ1プライマー（配列番号５４））に対して、SmartCyclerを用いたPCRによってαTubの発現量を求めた結果を表７に示す。
【００９１】
【表７】
2006180740.tif 000008
【００９２】
組織別発現強度の算出
ｃDNA合成時の反応効率の差を相殺するために、各組織で定常的に発現することで知られるαTubの種子及び葉組織でのRNA発現を発現比１：１とし、他の遺伝子のSmartCyclerで得た種子/葉発現量比を補正した。
【００９３】
αTubの種子/葉発現比を１：１とした場合のAD1-U12-1ｂの種子/葉発現比は、約21倍となった。また、種子に発現強度については、用いたテンプレートｃDNAが同一であることから測定値そのものを、各遺伝子間の発現強度比として用いた。結果、発現強度比はαTubの約2.5倍となった。
【００９４】
また、各遺伝子(AD1-U13-4a、AD1-U21-1、AD1-U17-1a、AD1-U1-3a、AD1-U17-2、AD1-U6-5a、AD1-U6-3)の発現量定量は、AD1-U12-1ｂと同様に各遺伝子につきプライマーを設計し、同様な条件で実施した。すなわち、AD1-U13-4aにつきAD1-U13-4a prQrev.1プライマー（配列番号５５）及びAD1-U13-4a prQ1プライマー（配列番号５６）を設計した。AD1-U21-1につきAD1-U21-1 prQrev.1プライマー（配列番号５７）及びAD1-U21-1 prQ1プライマー（配列番号５８）を設計した。AD1-U17-1aにつきAD1-U17-1a prQrev.1プライマー（配列番号５９）及びAD1-U17-1a prQ1プライマー（配列番号６０）を設計した。AD1-U1-3aにつきAD1-U1-3a prQrev.1プライマー（配列番号６１）及びAD1-U1-3a prQ1プライマー（配列番号６２）を設計した。AD1-U17-2につきAD1-U17-2 prQrev.1プライマー（配列番号６３）及びAD1-U17-2 prQ1プライマー（配列番号６４）を設計した。AD1-U6-5aにつきAD1-U6-5a prQrev.1プライマー（配列番号６５）及びAD1-U6-5a prQ1プライマー（配列番号６６）を設計した。AD1-U6-3につきAD1-U6-3 prQrev.1プライマー（配列番号６７）及びAD1-U6-3 prQ1プライマー（配列番号６８）を設計した。
【００９５】
各遺伝子(AD1-U13-4a、AD1-U21-1、AD1-U17-1a、AD1-U1-3a、AD1-U17-2、AD1-U6-5a、AD1-U6-3、AD1-U12-1ｂ) cDNA遺伝子断片を、それぞれDCSP1-4、6-9とした。結果を表８に示した。
【００９６】
【表８】
2006180740.tif 000009
【００９７】
なお、表８において、「特異性」の欄における数値は、葉における発現量に対する種子における発現量比であり、「特異性」の欄における「種子特異的」は、種子のみで発現を確認できたものを意味する。
【００９８】
〔実施例４〕インバースPCR法による種子特異的プロモーターの取得
実施例３において、発現特性を評価したcDNA断片（DCSP1-4, 6-9）の5’上流領域に存在することが予想される種子特異的プロモーターを、インバースPCR法（Nucl. Acids Res.，16，8186，1988）を用いて同定した。インバースPCR法は、まず、クローニングし塩基配列が明らかになったcDNA断片領域（配列既知領域）と、その5’上流の未知の領域にまたがるゲノムDNA制限酵素処理断片をセルフライゲーションすることにより、ゲノムDNAを環状化する。次に、配列既知領域の制限酵素認識部位の5’側に、外側向きに設定したプライマーを用いてPCRすることにより、未知の領域を特異的に増幅する方法である。
【００９９】
ニンジンゲノムDNAの調製
RNAの調製と同様に、低温（4℃）処理したニンジン（Daucus carota L.）（夏蒔鮮紅五寸）の塊根を培養土（赤玉土：腐葉土＝３：１）に植え、25℃、80μmol /m2/s  照明下（16時間明期/８時間暗期のサイクル）、およそ４５日間コイトトロン（小糸工業社製）で生育させた。葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場合は、-80℃で保存した）。凍結した葉は、液体窒素下、乳鉢で細かくすりつぶし、DNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社製）を用いてニンジンゲノムDNAを調製した。
【０１００】
ニンジンゲノムDNAの制限酵素処理と環状化
ニンジンゲノムDNAに対して、以下の組み合わせで制限酵素処理を行った。
1.BamHIおよびBglII 
2.BlnI、NheI、SpeIおよびXbaI
3.XhoIおよびSalI 
4.EcoRV、PvuIIおよびSmaI
【０１０１】
またニンジンゲノムDNAに対して、BamHI、BglII、BlnI、NheI、SpeI、XbaI、XhoI、SalI、EcoRV、PvuIIおよびSmaIを単独に処理した。処理した各々のDNAは、電気泳動（0.8%アガロースゲル）により断片化を確認し、QIAGEN PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用いて精製した。これをTakara Ligation Kit ver.2 sol.IおよびT4 Ligase（タカラバイオ株式会社製）を用いて、16℃、12時間、ライゲーション反応を行い、環状化ゲノムDNAを調製した。環状化ゲノムDNAは、再度、QIAGEN PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用いて精製した。
【０１０２】
インバースPCR
cDNA断片（DCSP1-4、6-9）に存在する制限酵素認識部位の5’側に、外側向きに設定した各々のプライマーを設計した。具体的には、DCSP1についてAD1-U13-4a prI2プライマー（配列番号６９）及びAD1-U13-4a prIrev.2プライマー（配列番号７０）を設計した。DCSP2について、AD1-U21-1prI2プライマー（配列番号７１）及びAD1-U21-1 prIrev.2プライマー（配列番号７２）を設計した。DCSP3について、AD1-U17-1aprI2プライマー（配列番号７３）及びAD1-U17-1a prIrev.2プライマー（配列番号７４）を設計した。DCSP4について、AD1-U1-3aprI2プライマー（配列番号７５）及びAD1-U1-3a prIrev.2プライマー（配列番号７６）を設計した。DCSP6について、AD1-U17-2prI2プライマー（配列番号７７）及びAD1-U17-2 prIrev.2プライマー（配列番号７８）を設計した。DCSP7についてAD1-U6-5aprI2プライマー（配列番号７９）及びAD1-U6-5a prIrev.2プライマー（配列番号８０）を設計した。DCSP8についてAD1-U6-3prI2プライマー（配列番号８１）及びAD1-U6-3 prIrev.2プライマー（配列番号８２）を設計した。DCSP9についてAD1-U12-1ｂ prI2プライマー（配列番号８３）及びAD1-U12-1ｂ prIrev.2プライマー（配列番号８４）を設計した。
【０１０３】
そして、各々のcDNA断片（DCSP1-4, 6-9）に対するプライマーを含む反応液を、表９の組成となるように調製した。
【０１０４】
【表９】
2006180740.tif 000010
【０１０５】
次に、反応液をTakaraPCR Thermal Cycler （タカラバイオ株式会社製）にセットし、表１０に示す条件で１回目のインバースPCRを行うことにより、cDNA断片（DCSP1-4, 6-9）の5’側未知領域を増幅させた。
【０１０６】
【表１０】
2006180740.tif 000011
【０１０７】
次に、1回目のPCRで使用したプライマーの外側に各々プライマー（prI1, prIrev.1）を設定した。具体的には、DCSP1についてAD1-U13-4a prI1プライマー（配列番号８５）及びAD1-U13-4a prIrev.1プライマー（配列番号８６）を設計した。DCSP2について、AD1-U21-1 prI1プライマー（配列番号８７）及びAD1-U21-1 prIrev.1プライマー（配列番号８８）を設計した。DCSP3について、AD1-U17-1aprI1プライマー（配列番号８９）及びAD1-U17-1a prIrev.1プライマー（配列番号９０）を設計した。DCSP4について、AD1-U1-3aprI1プライマー（配列番号９１）及びAD1-U1-3a prIrev.1プライマー（配列番号９２）を設計した。DCSP6について、AD1-U17-2prI1プライマー（配列番号９３）及びAD1-U17-2 prIrev.1プライマー（配列番号９４）を設計した。DCSP7についてAD1-U6-5aprI1プライマー（配列番号９５）及びAD1-U6-5a prIrev.1プライマー（配列番号９６）を設計した。DCSP8についてAD1-U6-3prI1プライマー（配列番号９７）及びAD1-U6-3 prIrev.1プライマー（配列番号９８）を設計した。DCSP9についてAD1-U12-1ｂ prI1プライマー（配列番号９９）及びAD1-U12-1ｂ prIrev.1プライマー（配列番号１００）を設計した。
【０１０８】
そして、各々のcDNA断片（DCSP1-4, 6-9）に対するプライマーを含む反応液を、表１１の組成となるように調製した。
【０１０９】
【表１１】
2006180740.tif 000012
【０１１０】
次に、反応液をTakaraPCR Thermal Cycler （タカラバイオ株式会社製）にセットし、表１２に示す条件で２回目のインバースPCRを行うことにより、cDNA断片（DCSP1-4, 6-9）の5’側未知領域を増幅させた。
【０１１１】
【表１２】
2006180740.tif 000013
【０１１２】
増幅産物のクローニングと塩基配列の解析
２回目のインバースPCR増幅産物を電気泳動（0.8％アガロースゲル）し、分離されたDNA断片をゲルから切り出した。DNA断片は、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）により抽出精製した。回収したDNA断片は、TOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。
【０１１３】
クローニングしたDNA断片は、TOPO-pCR2.1ベクター内のM13Fプライマー（配列番号３９）およびM13Rプライマー（配列番号４０）を用いて、ABI PRISM Dye Terminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。目的とする未知配列が完全に取得できなかった場合、既知とした塩基配列の5’端付近配列に、新たなInversePCR用プライマーを設計し、再度InversePCRを実施して目的配列を取得した。
【０１１４】
また各々のInversePCRから取得した配列に基づき、実施例1で取得したcDNA遺伝子断片（DCSP1-4, 6-9）の5’側上流配列を決定した。DCSP1の塩基配列を配列番号１０１に示し、DCSP2の塩基配列を配列番号１０２に示し、DCSP3の塩基配列を配列番号１０３に示し、DCSP4の塩基配列を配列番号１０４に示し、DCSP6の塩基配列を配列番号１０５に示し、DCSP7の塩基配列を配列番号１０６に示し、DCSP8の塩基配列を配列番号１０７に示し、DCSP9の塩基配列を配列番号１０８に示す。
【０１１５】
プロモーターの取得
インバースPCRにより取得した各cDNA遺伝子断片の5'側上流配列（配列番号１０１〜１０８）をもとに、5'端プライマーと3'端プライマー（開始コドン前）を設計し、ニンジンゲノムDNAに対してPCRを行った。具体的に、DCSP1遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１０９）及び3'端プライマー（配列番号１１０）を設計した。また、DCSP2遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１１１）及び3'端プライマー（配列番号１１２）を設計した。また、DCSP3遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１１３）及び3'端プライマー（配列番号１１４）を設計した。また、DCSP4遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１１５）及び3'端プライマー（配列番号１１６）を設計した。また、DCSP6遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１１７）及び3'端プライマー（配列番号１１８）を設計した。また、DCSP7遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１１９）及び3'端プライマー（配列番号１２０）を設計した。また、DCSP8遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１２１）及び3'端プライマー（配列番号１２２）を設計した。また、DCSP9遺伝子の5'側上流を増幅するための5'端プライマー（配列番号１２３）及び3'端プライマー（配列番号１２４）を設計した。
【０１１６】
反応後、PCR増幅産物を電気泳動（0.8％アガロースゲル）し、分離されたDNA断片をゲルから切り出した。DNA断片は、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）により抽出精製した。回収したDNA断片は、TOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。
【０１１７】
クローニングしたDNA断片は、TOPO-pCR2.1ベクター内のM13Fプライマー（配列番号３９）およびM13Rプライマー（配列番号４０）を用いて、ABI PRISM Dye Terminater Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列を確認し、連続した各遺伝子の5'上流DNA（プロモーター）を取得した。
【０１１８】
これにより、DCSP1遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号１）を同定することができた。同様に、DCSP2遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号２）を同定することができた。また、DCSP3遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号３）を同定することができた。さらに、DCSP4遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号４）を同定することができた。さらにまた、DCSP6遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号５）を同定することができた。さらにまた、DCSP7遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号６）を同定することができた。さらにまた、DCSP8遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号７）を同定することができた。さらにまた、DCSP9遺伝子の上流に存在し、種子特異的に発現誘導する機能を有するプロモーターの塩基配列（配列番号８）を同定することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】縦軸にプラスミド量、横軸に増幅が指数関数的におこる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle ; Ct値）をとったグラフに希釈系列の計12の結果をプロットし、検量線を作成した結果を示す特性図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号９〜４０、４９〜１００、１０９〜１２４は合成DNAである。
【図１】
2006180740.tif 000014
【配列表】
2006180740000001.app