(57)【要約】  【課題】新たな難聴関連遺伝子を見出して、これを利用した難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）のスクリーニング手段を確立すること。  【解決手段】難聴とは直接的に関係ない機能を有する遺伝子である、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子の変異による先天性難聴又は後天性進行性難聴が存在することを突き止め、これらの遺伝子の変異を検出することにより、難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を遺伝子レベルで検出することができることを見出し、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子のいずれか一方又は双方の遺伝子における変異を検出することにより難聴を検出する、遺伝子の検出方法を提供することで、上記の課題を解決し得ることを見いだした。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子のいずれか一方又は双方の遺伝子における変異を検出することにより難聴を検出する、遺伝子変異の検出方法。
【請求項２】
ヒトＶＥＳＴ１遺伝子における変異が、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子のIVS９領域の−９番目のチミンが欠落することにより規定される遺伝子変異である、請求項１記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項３】
ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子における変異が、（１）ヒトＣＯＬ９Ａ１蛋白質のアミノ酸配列の６４９番目のグリシン残基をコードする塩基における遺伝子の変異、又は、（２）同２９５番目のアルギニン残基をコードする塩基における遺伝子の変異、である、請求項１又は２記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項４】
前記ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子における変異（１）が、当該遺伝子の１９４６番目の塩基であるグアニンが、他の塩基と置き換わることにより規定される遺伝子の変異である、請求項３記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項５】
前記他の塩基がシトシンである、請求項４記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項６】
前記ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子における変異（２）が、当該遺伝子の８８３番目の塩基であるシトシンが、他の塩基と置き換わることにより規定される遺伝子の変異である、請求項３記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項７】
前記他の塩基がチミンである、請求項６記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項８】
前記遺伝子の検出方法において用いる検出手段が、インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子変異を検出する方法である、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項９】
ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子のいずれか一方又は双方の遺伝子における変異を検出するための要素が備わっている、遺伝子変異検出用キット。
【請求項１０】
前記遺伝子検出用キットが、インベーダー・アッセイ法を行って、遺伝子変異を検出するキットである、請求項９記載の遺伝子変異検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの遺伝子の検出方法に関し、より具体的には、ヒトの難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を検出するための指標となり得る遺伝子変異の検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
新生児が難聴を伴う原因としては、生まれつき聴力に障害のある子供（先天性難聴又は後天性進行性難聴）、風疹やヘルペス等のウイルスや細菌の感染による感染症、低出生体重、重症黄疸等が挙げられる。これらのうち、先天性障害が５０％程度を占めるといわれている。
【０００３】
このような幼少時からはじまる難聴に対しては、補聴器、人工内耳、積極的な手話の活用等の手段を講ずることによって対応が行われている。加えて、これらの難聴対策、特に、補聴器や人工内耳による処置を行う場合、その開始時期が非常に重要であることが知られている。すなわち、言語の習得には、２〜３歳頃が最も重要な時期であり、この時期を逃してしまうと、将来の言語能力に必要以上に大きなハンディを残すことになりがちである。よって、可能な限り早期に難聴の幼児を発見し、補聴器や人工内耳によって音情報の入力手段を確保し、言語訓練を行うことが重要となる。
【０００４】
現在、３歳児検診に聴覚検査が採り入れられており、さらに、Ａ−ＡＢＲ（自動聴性脳幹反応）やＯＡＥ（耳音響反射）を利用した新生児の聴覚スクリーニングが導入され、難聴児の早期発見体制が整いつつある。しかしながら、その反面、検査体制の整備の遅れ、検査の精度等の問題が残っており、未だ日常生活における保護者による幼児の観察眼に依存する部分が大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した状況のもと、難聴児の簡便かつ確実な発見手段の確立が望まれているが、上記の難聴児のうち、先天性難聴児又は後天性進行性難聴児は、遺伝子レベルでの問題も予測され、現実にいくつかの難聴関連遺伝子がスクリーニングされている。しかしながら、先天性難聴又は後天性進行性難聴にどの遺伝子が関連しているかは、個々の難聴児においても千差万別であり、１種類でも多くの難聴関連遺伝子を見出して、これを集約的な難聴スクリーニングに利用することにより、確実に先天性難聴又は後天性進行性難聴の検出確度を向上させることが可能となる。
【０００６】
よって、本発明が解決すべき課題は、さらに新たな難聴関連遺伝子を見出して、これを利用した難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）のスクリーニング手段を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて検討を重ねた結果、難聴とは直接的に関係ない機能を有する遺伝子である、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子の変異による先天性難聴又は後天性進行性難聴が存在することを突き止め、これらの遺伝子の変異を検出することにより、難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を遺伝子レベルで検出することができることを見出した。すなわち、本発明は、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子のいずれか一方又は双方の遺伝子における変異を検出することにより難聴を検出する、遺伝子の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【０００８】
なお、「遺伝子の変異（遺伝子変異）」とは、遺伝子が、その塩基配列において、特定塩基の置換、欠落、挿入等により、通常とは異なる特異的な部位を保有していることを意味する。遺伝子変異は、第１に、特定の遺伝子のコーディング領域の変異で、当該コーディング領域によりコードされるアミノ酸残基の変異として規定される変異を含む。このタイプの変異には、ゲノムＤＮＡにおいては認められず、ゲノムＤＮＡから、ｍＲＮＡ前駆体を経て、ｍＲＮＡになる過程（主に、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの過程）で生ずる変異（この変異は、主にｃＤＮＡにおける変異として特定され得る）も、含まれる。また、第２に、遺伝子変異には、特定の遺伝子の非コーディング領域（典型的には、プロモーター領域、イントロン領域等）の塩基における変異も含まれる。この場合の変異は、主に、ゲノムＤＮＡにおいて規定される変異である。遺伝子変異は、その遺伝子の変異頻度、そのｍＲＮＡの発現量、蛋白発現量、あるいは蛋白の機能等の多角的な解析により、同定される。
【０００９】
また、本明細書において、「野生型」とは、遺伝子変異が認められる塩基またはアミノ酸残基において、具体的には、データベース等において公開されている遺伝子の塩基配列に基づく塩基またはアミノ酸残基である。また、変異塩基または変異アミノ酸残基とは、変異が認められる塩基またはアミノ酸残基における、野生型の塩基またはアミノ酸残基以外の塩基またはアミノ酸残基である。
【００１０】
また、「遺伝子変異の検出」とは、被験者の検体において、遺伝子変異が認められる塩基またはアミノ酸残基が、野生型塩基またはアミノ酸残基であるか、あるいは、変異塩基またはアミノ酸残基であるかを検出することを意味することとする。
【００１１】
ところで、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕、バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ、Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』
【００１２】
また、本明細書中のアミノ酸残基についての表記で、例えば、「Ｇｌｕ４Ｌｙｓ」とは、「対象となるペプチドのアミノ酸配列における４番目の、野生型のアミノ酸残基であるグルタミン酸と、変異アミノ酸残基であるリジンにより規定される、遺伝子変異」を示すこととする。
【００１３】
また、同じく本明細書中の遺伝子の塩基配列についての表記で、例えば、「１０００Ｃ→Ｔ」とは、「対象となる遺伝子の塩基配列における１０００番目の、野生型の塩基であるシトシンと、変異塩基であるチミンにより規定される、遺伝子変異」を示すこととする。さらに、例えば、「−１０delＡ」とは、−１０番目のアデニンが欠落する遺伝子変異を示している。
【００１４】
また、遺伝子変異を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、特に断らない限り、全て、ｃＤＮＡの塩基配列番号である。よって、本願発明に係る遺伝子変異は、全て、少なくともｃＤＮＡにおいて認められる変異であるが、かかるｃＤＮＡの変異に対応するゲノムＤＮＡにおける変異や、ｍＲＮＡにおける変異、に基づくアレルギー素因の検出にかかわる遺伝子の検出方法も、本検出方法の技術的範囲に包含されるものである。
【００１５】
さらに、本願発明に係る遺伝子変異を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、公開データベースにおいて登録されている配列（Gene Bank Accession Number）に基づいて行うこととする。この標記は、本願明細書に添付する配列表における番号とは異なる番号である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、特定の遺伝子変異を指標として難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を検出可能な、遺伝子の検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
上述したように、本発明は、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子及びヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子のいずれか一方又は双方の遺伝子（以下、これらの遺伝子を本発明関連遺伝子ともいう）における変異を検出することにより、被験者の難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を検出する、遺伝子変異の検出方法である。
【００１８】
本発明関連遺伝子のうち、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子は、Mechanosensitive ion
channelのドメインとして登録されている蛋白質をコードする遺伝子として、登録されている遺伝子である［Gene Bank Accession Number: NM_052958(AB056652.1.)：配列番号１］。当該遺伝子がコードする蛋白質と難聴との関係については全く報告されていない。
【００１９】
また、ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子は、ヒトIX型コラーゲン［Gene Bank Accession Number: NP_00184252：配列番号２］をコードする遺伝子として知られ、ヒト内耳（蝸牛・前庭）において、特異的に高発現を示す遺伝子でもある(Abe et al.,Am J Hum Genet 48:564-570(2003))。
【００２０】
これらの遺伝子の変異と、これらの変異遺伝子が発現して産生される変異蛋白質により惹起されると考えられる現象、すなわち、難聴との関係を具体的に解析することにより、本検出方法において利用し得る、本発明関連遺伝子の変異を見出すことができる。すなわち、難聴患者と健常人等の組み合わせにおいて、本発明関連遺伝子の変異部位と変異頻度、あるいは、その変異により生ずる蛋白の機能を解析することにより、所望する遺伝子変異を見出すことができる。かかる作業の実際については、後述する実施例において、具体的に記載する。
【００２１】
本発明者は、現在までに、
（１）ヒトＶＥＳＴ１遺伝子における変異として、当該遺伝子のIVS９領域の−９番目のチミンが欠落する遺伝子変異を見出した。この変異は、ヒトＶＥＳＴ１遺伝子のIntron9のbranch siteとsplicing-donor siteの間に位置しており、スプライシングに関わっている可能性がある(Exon10 skippingの可能性があり、タンパクレベルではin-frame deletionが起こることが予測される)。
【００２２】
（２）ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子における変異として、（ａ）当該遺伝子に対応するコラーゲン（ヒトＣＯＬ９Ａ１蛋白質）のアミノ酸配列の６４９番目のグリシン残基をコードする塩基における変異［例えば、ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子の１９４６番目の野生型塩基であるグアニンが、他の塩基、例えば、シトシンに置き換わることによる遺伝子変異（当該変異塩基がシトシンである場合には、上記グリシン残基に対する変異アミノ酸残基はアラニンとして規定される）］、及び、（ｂ）当該アミノ酸配列の２９５番目のアルギニン残基をコードする塩基における遺伝子の変異［例えば、ヒトＣＯＬ９Ａ１遺伝子の８８３番目の野生型塩基であるシトシンが、他の塩基、例えば、チミンに置き換わることにより規定される遺伝子変異（当該変異塩基がチミンである場合には、上記アルギニン残基をコードする遺伝子は、ストップコドンとして規定される）］。
【００２３】
遺伝子変異の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ法(denaturing gradient gel electrophoresis) 法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimid modification)法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ-ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法、インベーダー・アッセイ法〔Third Wave Technologies 社（米国）〕等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（1993）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法については、Myers,R.M.,Shefield,V.,and Cox,D.R.(1988) in Genomic Analysis:A Practical Approach.K.Davies,ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139 等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子変異を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。
【００２４】
図１は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
【００２５】
図１において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。
【００２６】
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、変異検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、変異検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、変異検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
【００２７】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。
【００２８】
第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、変異検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
【００２９】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の変異検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
【００３０】
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、変異検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。
【００３１】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
【００３２】
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、変異検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、変異検出対象塩基において変異塩基が認められない野生型遺伝子であることを検出することができる。
【００３３】
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の変異検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
【００３４】
また、鋳型ヌクレオチド１１が、野生型塩基と変異塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
【００３５】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、遺伝子変異を検出することも可能である。さらに、ここでは、変異塩基を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
【００３６】
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。
【００３７】
ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ-clamp ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Shefield,V.C. et al. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236等を参照のこと〕。
【００３８】
よって、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ-clamp を付加する工程が必要となる。
【００３９】
本検出方法における、本発明関連遺伝子の変異の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。
【００４０】
すなわち、被験者（主に新生児〜乳児）の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子変異（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することができる。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける変異を検出することも可能である。
【００４１】
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子部位に変異塩基が認められた場合、この遺伝子部位の変化と、難聴の有無や程度、さらには種類（例えば、先天性難聴又は後天性進行性難聴の別）と関連付けて、被験者が発症している蓋然性の高い難聴の種類や原因等を特定することができる。これにより、人工内耳や補聴器の適用の可否、適用開始時期等を言語能力の発達を考慮しながら、的確に行うことが可能となる。
【００４２】
本検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子変異の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子変異検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子変異の検出反応を行い、かかる検出反応により、本発明関連遺伝子の変異を検出することができる。このようなマイクロプレートにおける検出を行う場合は、本発明関連遺伝子と共に、それ以外の難聴関連遺伝子の検出を同一プレート上で行うことが可能なように、材料や試薬を設定することが好適である。前述したように、このような場合は、難聴に対する遺伝子変異の出現頻度よりも、むしろ、漏れなく難聴を検出するための遺伝子のバリエーションが揃っていることが重要である。よって、後述するように、本発明関連難聴遺伝子の、先天性難聴又は後天性進行性難聴全体に対して占める頻度は決して大きくはないが、これにより、本検出方法の技術的な価値を否定されるべきものではない。
【００４３】
なお、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、本発明関連遺伝子の遺伝子変異の検出を行うことも可能である。
【００４４】
このように、この遺伝子変異検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４６】
（Ａ）ＶＥＳＴ１遺伝子
ＲＮＡの抽出とＴ７に基づくＲＮＡ増幅
成人の蝸牛、前庭及び内リンパ液嚢は、内耳の切除手術により得たもので、素早く−８０℃で保存した。全ＲＮＡは、RNeasy mini kit(Qiagen社製)を用いて、各々の組織から抽出された。利用可能な内耳ＲＮＡの量は極端に少ないため、DNaseI(Boehringer社製)処理の後に、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅の第１ラウンドが、Luoら(1999)の方法に若干のアレンジを加えて行われた。
【００４７】
前庭ｃＤＮＡライブラリーの構築と解析
前記の第１ラウンドで増幅された前庭ＲＮＡは、Xho Iサイトが内側に存在するリンカープライマーとアニールを行った。
5’- AGTCTCGAGTCTAGTCGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGT21-3’
（配列番号３）
【００４８】
２本鎖ｃＤＮＡの合成と、２０ＵのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(Toyobo社製)によるブラント末端処理が行われた。そして、Chroma Spin-200カラム(Clontech社製)が、100bp未満のＤＮＡ断片の除去のために用いられた。サイズが選択されたｃＤＮＡは、EcoRIサイトを含むアダプターと共にライゲートされた。これらのｃＤＮＡは、Uni-ZAP XRベクター(Stratagene社製)でクローニングされた。ランダムにピックアップされた５０６個のプラークは、それぞれ、１５０μLのＳＭ緩衝液の中で懸濁され、次いで、その中の１μLがインサートの長さをチェックするために用いられた。M13とリバースプライマーを用いるＰＣＲ処理は、20mM dNTPs, 6 .68mM MgCL2, 16.6 mM NH4SO4, 6.7mM TrisHCl (pH=8.8), 10mM b-mercapyoethanol, それぞれ10pmol のM13とリバースプライマー、10%DMSO及び 0.75U Ex-Taq polymerase (Takara,社製)を含む２０μLの反応液が調製された。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃２分間の熱変性工程を行い、９６℃３０分、６０℃で３０分、７２℃の１分間（延長）のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で５分間の延長ステップを行った。このＰＣＲ反応は、Perkin-Elmer 9600 thrmal cycler(PE Biosystems社製)で行った。ＰＣＲの産物は、Suprec(Takara社製)で精製し、Big Dye terminatorで標識し、ABI 377XLと3700自動シークエンサーで配列の決定を行った。
【００４９】
相同性の検討
前庭のｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択した５０６個のｃＤＮＡクローンの得られた配列は、BLAST解析で示されるＮＣＢＩ(the National Center for Biotechnology Information)データベースの塩基配列と比較された。高速処理のゲノム配列のデータベースでの比較と、第８染色体のVEST1ｃＤＮＡ(AC083967, AF215842, AC011884, AC016519 , AC067871)におけるBLASTサーチと配列の位置合わせを行うことにより、VEST1遺伝子のゲノムの構成を明らかにした。
【００５０】
RT−PCR解析
上記の前庭のｃＤＮＡライブラリー（当該ライブラリーには、どのようなデータベースにも認められない配列が含まれており、１又は２種類の組織において発現している。）から得られた５０６個のEST断片は、８種の異なるヒトの器官（必要に応じて他の組織）を用いる半定量的なＲＴ−ＰＣＲ解析により検討された。ＧＡＰＤＨは、規格化されたコントロールとして用いられた。複数のヒト器官のｃＤＮＡの量（コントロールのＧＡＰＤＨのシグナルの強度で計測される）は、全てのサンプルにおいて最適化された。これらのＥＳＴの内耳の器官毎の発現を評価するために、２つの膜性の迷路器官の構成要素である蝸牛と前庭に由来する、Ｔ７が基礎となって増幅されたｃＤＮＡにおいてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５１】
ＶＥＳＴ１遺伝子のクローニング
前庭のｃＤＮＡライブラリーから、ＶＥＳＴ１のｃＤＮＡの部分配列を見出した。新規の転写物を含む全長のｃＤＮＡを得るために、λＺＡＰIIベクター（Stratagene社製）でクローン化したヒト胎児の脳のｃＤＮＡライブラリーと分離されたｃＤＮＡクローンのスクリーニングを行った。独立のｃＤＮＡクローンは、プライマーウオーキング法により解読した。ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースのBLASTサーチが行われた。ＶＥＳＴ１のｃＤＮＡ(GenBank accession no. AB056652)の遺伝子配列との比較により、イントロンとエキソンの結合部の配列決定を行った（配列番号１）。
【００５２】
発現の解析
１６種類の異なる組織からのヒトpoly(A)+ RNAsとヒト胎児のブロットを含有する Multiple-tissue Northern blots(Clontech)が用いられた。２４０bpの断片は、プライマー対：5’-CACATTCCAAAAGCGAGCAT-3’（配列番号４）/5’-GATGAATAGGTGTACACGGT-3’（配列番号５）
を用いて、ＶＥＳＴ１の３’非翻訳領域からＰＣＲ増幅を行った。
【００５３】
ＱＩＡgel extraction kit（Qiagen社）を用いるアガロースゲルで精製されたＰＣＲ産物は、プローブとして準備し、rediprime DNA labeling system(Amersham社製)を用いて[α-32P] dCTPをラベルした。フィルターは、5XSSPE, 2XDenhartdt’s solution, 0.1% SDS, and 100 μg/ml of salmon sperm DNA からなるハイブリダイゼーション液で、４２℃下５時間のプレハイブリダイゼーションと１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ブロットは、2XSSC/0.1% SDS 中で、室温にて数回洗浄し、５０℃の0.1XSSC, 0.1% SDS 中で50分間の処理を２回行い、増感スクリーン付きのＫＯＤＡＫフィルムを用いて、−８０℃下、オートラジオグラフィーを行った。
【００５４】
変異の検出
先天的な又は幼少期に発症する父母両系の感覚神経的な聴覚の喪失が認められる１８７家族に対して検討を行った。これには、優性遺伝の４２家族、劣性遺伝の２０家族、兄弟のうち一人に上記の聴覚の喪失が認められる１２５家族が含まれている。全ての対象についてインフォームドコンセントを行った。対象は、耳の試験（pure-tone 聴力測定法）のシリーズにより臨床的に性格付けが確立しており、軽度から重篤までの範囲の感覚神経的な聴覚の喪失を有している。全ての対象は、側頭部骨に対するＣＴスキャンを行い、１７個人は、内耳の奇形、例えば、蝸牛の発育不全、半規管の発育不全、前庭の水管の肥大等が認められた。各々の家族のうち上記の聴覚の喪失が認められる一人について、ＶＥＳＴ１遺伝子の変異のサーチを行った。ゲノムＤＮＡは、末梢静脈血液の白血球から単離した。変異のサーチは、エキソン１〜１３に隣接するイントロンの配列に相補的な下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われた。
【００５５】
Exon1 sense: 5’ -TGAGGGCAGTAACTTGTAGC- 3’（配列番号６）
Exon1 antisense: 5’ -GAGATGAACACATGAAACCTTTGG- 3’（配列番号７）
Exon2 sense: 5’ -CCTTTGCGTGGGTACATTAT- 3’（配列番号８）
Exon2 antisense: 5’ -CAGATGAAAAGTTGGGCTTC- 3’（配列番号９）
Exon3 sense: 5’ -GATCTTGGTACAGTCTTTCACG- 3’（配列番号10）
Exon3 antosense: 5’ -AGAAATGGGTTATTGGCACAAG- 3’（配列番号11）
【００５６】
Exon4 sense: 5’ -CATTGGTAAAAGGATGTGCC- 3’（配列番号12）
Exon4 antisense: 5’ -GTTGAGACAGTGGAATAAAAGG- 3’（配列番号13）
Exon5 sense: 5’ -CTATCTAGTAGAGTTGGAGG- 3’（配列番号14）
Exon5 antisense: 5’ -GCAGGTCTGAAACTCTCATT- 3’（配列番号15）
Exon6 sense: 5’ -GGATGGGTGTCCAAGAAAGA- 3’（配列番号16）
Exon6 antisense: 5’ -TCCCTAAGACAAGGCTATTC- 3’（配列番号17）
【００５７】
Exon7 sense: 5’ -GTCTCCAACTACGTCTAGAA- 3’（配列番号18）
Exon7 antisense: 5’ -CACAAAAGATCGCTGGAAGG- 3’（配列番号19）
Exon8 sense: 5’ -CAGCTGCAGTGAATTCATGC- 3’（配列番号20）
Exon8 antisense: 5’ -AGAGTCTAGAAGTTCACAGCC- 3’（配列番号21）
Exon9 sense: 5’ -TCCTGACATTATTGTGCCCTTC- 3’（配列番号22）
Exon9 antisense: 5’ -CTTCCCCAACTGTTGAAACAAC- 3’（配列番号23）
【００５８】
Exon10 sense: 5’ -GGACATGACCATTGAACACA- 3’（配列番号24）
Exon10 antisense: 5’ -CTGAAAAGGTGGGAGAATA- 3’（配列番号25）
Exon11 sense: 5’ -GAAGATGCAGTTCATAAAGATTG- 3’（配列番号26）
Exon11 antisense: 5’ -GACCTGAAGGATAGCTTGTC- 3’（配列番号27）
Exon12 sense: 5’ -CAGAATGGCAGCACAGTACA- 3’（配列番号28）
Exon12 antisense: 5’ -TAGAGGTCATGAGGACTACG- 3’（配列番号29）
Exon13 sense: 5’ -GGACACAAAGCCTAACCATA- 3’（配列番号30）
Exon13 antisense: 5’ -CCACAATCCTTTGCCAGGAT- 3’（配列番号31）
【００５９】
増幅は、下記のＰＣＲの条件の下、１０〜２０ngの鋳型ＤＮＡを用いて行った。
「Perkin-Elmer thermal cycler 9700中における、９４℃・２分間の熱変性の後、（９６℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・５０秒）のサイクルを３７回の後、７２℃・５分間の処理を行い、４℃での待機による終了」
【００６０】
ＰＣＲ産物は、取り込まれなかったdNTPsとプライマーを、MultiScreen PCR purification kit (Millipore) を用いて除去した後、直接的に配列決定がなされた。3.2pmolの各々のエキソンプライマーは、ABI BigDye terminators と ABI 3700 sequencer を用いる配列決定の標準サイクルにおいて用いられた。通常の聴覚を有する非血縁の９６人の日本人のＤＮＡサンプルは、コントロールとして用いられた。
【００６１】
ＶＥＳＴ１遺伝子の解析により、IVS9-9delTが、一つの単生児家族において検出されたが、９６人のコントロールには認められなかった。この変異は、イントロン９におけるブランチサイトとドナースプライシングサイトの間に位置するものである。
【００６２】
よって、上記の遺伝子変異が難聴の原因となることが判明し、ＶＥＳＴ１遺伝子における変異を指標とした検出方法を用いることにより、当該変異を有する個体の難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を検出可能であることが明らかになった。
【００６３】
（Ｂ）ＣＯＬ９Ａ１遺伝子
全ＲＮＡの抽出と逆転写
ＰＣＲ解析を行うために、３匹のC57B6マウスの内耳が摘出され、速やかに液体窒素による凍結を行った。これらの組織は、ホモジナイズされ、トリゾール(Life Technologies社製)が、全ＲＮＡを抽出するために用いられ、Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit (Takara社製)で精製した。約０．５μgのpolyA+ RNAが、オリゴ（ｄT）プライマーで逆転写された。
【００６４】
リアルタイムＰＣＲ解析
増幅産物は、SYBR Green intercalater法により検出した。１μLのcＤＮＡ溶液と、0.005 U のTaKaRa EX TaqTM DNA polymerase, 0.5 μMのGenBank の配列に基づくNIHプライマーソフトウエア (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)により設計された特異的上流プライマーと下流プライマーを含有するＰＣＲ混合物がSYBR Green と一緒に混合され、Smart Cycler System (Takara社製)により増幅を行った。各々の遺伝子を増幅するために用いられたプライマーは、下記のごとくである。
【００６５】
col9a1-F：(5’ -CTGGTGTACCTGGGTCTCGT -3’) (配列番号32)
col9a1-R：(5’ -TTCTCCTTTCGCCCCTTTAT -3’)（配列番号33）
col9a2-F：(5’ -AGTGGGGCTACCAGGTTTCT -3’)（配列番号34）
col9a2R：(5’ -AACCCCTCCCTCACTGAACT -3’)（配列番号35）
col9a3-F：(5’ -GCAAAGATGGTCGAGATGGT -3’)（配列番号36）
col9a3-R：(5’ -GTAGCCAGCCACTGTCCATT -3’)（配列番号37）
【００６６】
スタンダードとしてβ−アクチンを、特異的なプライマー（Applied Biosystems社製）で解析した。
【００６７】
動物
コラーゲンタイプIXノックアウトマウスは、公知の方法（Fassler et al., 1994)により、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子の標的破壊を行うことにより作出した。不活性なＣＯＬ９Ａ１遺伝子を有するマウスにおいては、Col9a2 とCol9a3 ポリペプチドが発現しない（しかしながら、両Col9aサブユニットは通常通り翻訳される）。それゆえ、ＣＯＬ９Ａ１が働かないマウスは、コラーゲンタイプIXの機能的なノックアウトマウスであると考えられている。コラーゲンタイプIXノックアウトマウスは、非炎症性の関節疾患を発現する。当該マウスは、誕生時には検出可能な変異は示さないが、成長すると、ヒトの骨関節症に相当するひどい関節疾患が顕れる。
【００６８】
聴覚テスト
５つの野生型（８週令、オス２匹、メス３匹）と５匹のホモ接合体（８週令、オス２匹、メス３匹）コラーゲンタイプIXノックアウトマウスは、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）で評価した。マウスは、腹膜内注射でケタミン(100 mg/kg)とxylazine (10 mg/kg)により麻酔され、静かな室内でＡＢＲの測定が行われた。クリック刺激は、０．１ms durationのスクエアパルスとデジタルシグナル−プロセッシングプラットフォーム(Tucker-Davis Technologies社製)を用いる規格化した振幅で発生させ、PowerLab（登録商標） systems (ADInstruments社製)で解析した。記録のために、汚れのない鉄針電極を、頭頂と腹側部から左右の耳に配置した。クリックで発生させる聴覚刺激は、正中線から離れたところにある導管に差し込んだ連結器で修飾されたツイーターを通して動物に伝達される。ＡＢＲの波形は、５〜１０dBのインターバルで、最大振幅である８５dBから波形が目に見えなくなるまで記録された。
【００６９】
その結果、野生型では聴覚が維持されていたが、ホモ接合体では、進行性の難聴が認められた。
【００７０】
形態学的解析
形態学的検討として、蝸牛の組織を２．５％のグルタールアルデヒドで染色し(0.1M phosphate buffer saline: PBS, pH7.4中)、四酸化オスミウム(in 0.1M PBS, pH7.4中)で処理した。脱水は、変性エタノールとプロピレンオキシドで行われ、Durcupan (ACM, Fluka).中に包埋した。光学顕微鏡観察のために、半薄切片はtoluidine blueで染色された。電子顕微鏡観察のために、超薄切片はウラニル酢酸とクエン酸鉛でポスト染色を行い、JEOL-200CX TEM.で観察した。
【００７１】
その結果、上記ノックアウトマウスには、蓋膜の変化、コラーゲン線維の走行の乱れが認められた。
【００７２】
免疫組織化学的解析
動物は麻酔を施され、全身の４％パラホルムアルデヒド（0.1 M phosphate buffer, pH 7.25中）による心臓環流の前に、同一の固定剤を、鼓膜を貫いて注射した。環流後、側頭部骨は手早く取り去り、４％パラホルムアルデヒドを４℃で３時間のポスト固定を行った。そして、組織は、１０％と３０％のショ糖溶液中で冷凍保護処理が行われた（各々２４時間処理）。連続冷凍切片（厚さ１５μm）が切られ、シランコーティングスライドの上に配置した。ダブル染色のタイプIIとタイプIXのコラーゲンを調製するために、下記の溶液で標本をインキュベートした。
【００７３】
（１）0.3% Triton-X-100で希釈された抗タイプIIコラーゲンマウスモノクローナル抗体(Neomarkers社製)と抗タイプIXコラーゲンウサギポリクローナル抗体(LSL)で、オーバーナイト（室温）インキュベート；
（２）ビオチン化抗マウスIgG (H+C) (Vector Laboratories社製)とヤギF (ab’) 2 抗ウサギIgG (H+C) TRITC (Leinco Technologies社製)の第２抗体の混合物で、２時間（室温）；
（３）ストレプトアビジン−フルオロセイン（FITC）(Amersham社製)で、２時間（室温）。
【００７４】
イメージングは、Leica TCS SP2 AOBS Spectral Confocal Scanning System.を用いて行われた。
【００７５】
上記の解析の結果、蝸牛蓋膜にタイプIIとタイプIXのコラーゲン蛋白局在が認められた。蓋膜は音の振動を有毛細胞に伝える際に重要な働きをしており、蓋膜の障害により難聴が生ずることが推測される。
【００７６】
変異の検出
変異の検出は、後述する（１）（２）の対象に対して、各エクソンに隣接する塩基配列に相補的な、下記の増幅用プライマーを用いたダイレクト法により行った。鋳型となるゲノムＤＮＡは、末梢静脈血液の白血球から単離した。
【００７７】
【表１】
2006158349.tif 000002
【００７８】
【表２】
2006158349.tif 000003
【００７９】
（１）感覚神経的な聴覚の障害が認められない１４７人の日本人と１２人の韓国人の家系の発端者についての変異の検出を行った。検出対象は、下記の通りである。すなわち、常染色体の優性又はミトコンドリア性の家族（２世代以上罹患）由来の９５名の対象；常染色体の劣性の家族（通常の聴力の両親と２人以上の罹患した兄弟）由来の１５名の対象；散発性の難聴（劣性遺伝又は非遺伝性の聴力の喪失を含む）４９名の対象。
【００８０】
これらの患者には、他の神経性の兆候は認められなかった。コントロール群は、聴覚テストにより通常の聴力として評価された１５０名の血縁関係のない日本人からなる。全ての対象は、このプロジェクトへの参加のためにインフォームドコンセントを受け、調査は、Ethical Committee of Shinshu Universityに是認された。COL9A1 (Pihlajamaa et al., 1998)の各々のエキソンと隣接するイントロン配列は、ＰＣＲ法で増幅した。プライマーはPrimer3 Web-Based Server (
1102470495375_0.cgi
)を用いてエキソンとイントロンの境界の隣接部位に対してデザインされた。ゲノムＤＮＡサンプル（末梢血液の白血球から単離した）を４０ngは、Ex-Taq polymerase (Takara)を用いた下記の工程にて増幅された。
【００８１】
９５℃５分間の熱変性工程を行い、９５℃３０分、５３〜６３℃で３０分、７２℃の１．５分間（延長）のサイクルを３７サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の延長ステップを行った。最後に、４℃で反応を停止した。このＰＣＲ反応は、Perkin-Elmer 9600 thrmal cycler(PE Biosystems社製)で行った。得られたＰＣＲ産物は、２３０〜７６０bpであった。そしてそれらは、０．１μLエクソヌクレアーゼＩ（Amersham社製）と、３７℃で３０分間反応を止め、８０℃で１５分の不活を行った。増幅産物が全て精製された後、ABI 377 自動シークエンサー（Applied Biosystems社製）においてABI Big Dye terminatorsを用いた標準のサイクル−配列決定反応を行った。
【００８２】
その結果、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子のＣＯＬ２ドメインにおいてコードされるコラーゲンタイプIXのアミノ酸配列（配列番号２）の６４９番目のグリシン残基がアラニン残基へと置換されているミスセンス変異（ＣＯＬ９Ａ１遺伝子の１９４６番目のグアニンがシトシンに置換している変異）が、１家系において認められた。
【００８３】
この変異は、正常コントロールグループでは認められないこと、また、家系内で難聴者のみに見出されていること、さらに、この変異は、マウス、ラットのＣＯＬ９Ａ１遺伝子で保存されている塩基部位における変異である。よって、上記変異（１）は、難聴の原因となる変異と結論付けられる。
【００８４】
（２）次に、検出対象者を、感覚神経的な聴覚の障害が認められない１４０名のベルギー人として、上記（１）と同様の変異の検出を行った。
【００８５】
この１４０名のうち、４９名（それぞれ独立した４９家系）は難聴者であり（難聴群）、残り９１名（コントロール群）は聴覚テストにより通常の聴力として評価された者からなる。
【００８６】
その結果、難聴群には難聴者が１名認められ、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子のＣＯＬ３ドメインにおいてコードされるコラーゲンタイプIXのアミノ酸配列（配列番号２）の２９５番目のアルギニン残基以降が存在せず、当該アミノ酸配列が短くなっていることが認められた。これは、Ｌ９Ａ１遺伝子の８８３番目の塩基であるシトシンがチミンと置き換わることにより、アルギニンをコードするコドンから、ストップコドンへと変わってしまったことによる変異であり、かつ、当該遺伝子変異のホモ接合体であった。これに対して、難聴が認められない他の難聴群と、コントロール群においては、当該遺伝子変異のホモ接合体は全く認められなかった。さらに、この変異部位は、ラットとマウスで種を超えて保存されている部分である。これらのことを勘案すると、上記変異（２）は、難聴の原因となる変異と結論付けられる。
【００８７】
なお、さらに、当該遺伝子変異者１名の家族１２名［うち難聴者４名（当該遺伝子変異者を含む）］について上記と同様の検討を行ったところ、当該４名の難聴者にのみ、同一のホモ変異が認められた。
【００８８】
よって、上記の遺伝子変異が難聴の原因となることが判明し、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子における変異を指標とした検出方法を用いることにより、当該変異を有する個体の難聴（先天性難聴又は後天性進行性難聴）を検出可能であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】インベーダー法の概略について説明した図面である。
【図１】
2006158349.tif 000004
【配列表】
2006158349000001.app