(57)【要約】      （修正有）【課題】生物の機能を明らかにする簡便で迅速に変異のマッピングができる方法とそのための手段の提供。【解決手段】以下のステップを含む、SSLPマーカーを利用して目的表現型に寄与する変異をマッピングする方法。(a)一系統の目的表現型を示す変異生物と別系統の生物とを交配してF1生物を作出し、F1生物の交配からF2生物を作出する、(b)F2生物の中から目的表現型を示す個体を選抜する、(c)選抜した個体からゲノムDNAを抽出する、(d)一系統と別系統のSSLPマーカーを含む領域を増幅可能なプライマーセットを用いて、前記ゲノムDNAを鋳型とした増幅反応を行う、(e)得られる増幅産物を標識する、(f)一系統と別系統にそれぞれ特異的なSSLPマーカーを含む増幅産物の長さと量を標識のシグナルにより解析し、ゲノムDNA上のSSLPマーカーの存在比をシグナル強度の比から計算する、(g)(f)の結果に基づいて上記目的表現型に寄与する変異の染色体上の位置をマッピングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＳＬＰマーカーを利用して目的表現型に寄与する変異をマッピングする方法であって、以下のステップ：
（ａ）一の系統の目的表現型を示す変異生物と、別の系統の生物とを交配してＦ１生物を作出し、Ｆ１生物の交配からＦ２生物を作出するステップ、
（ｂ）Ｆ２生物の中から目的表現型を示す個体を選抜するステップ、
（ｃ）選抜した個体からゲノムＤＮＡを抽出するステップ、
（ｄ）一の系統と別の系統のＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅することができるプライマーセットを用いて、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｅ）得られる増幅産物を標識するステップ、
（ｆ）一の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物と別の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物の長さと量を標識のシグナルにより解析し、ゲノムＤＮＡ上のＳＳＬＰマーカーの存在比をシグナル強度の比から計算するステップ、
（ｇ）（ｆ）の結果に基づいて、上記目的表現型に寄与する変異の染色体上の位置をマッピングするステップ、
を含む、前記マッピング方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）において、選抜した複数の個体からまとめてゲノムＤＮＡを抽出するものである、請求項１記載のマッピング方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）において、選抜した各個体からのゲノムＤＮＡが混合された状態で増幅反応を行うものである、請求項１又は２記載のマッピング方法。
【請求項４】
標識が蛍光標識である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマッピング方法。
【請求項５】
生物がシロイヌナズナである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマッピング方法。
【請求項６】
系統がシロイヌナズナコロンビア系統及びランズバーグ系統である、請求項５記載のマッピング方法。
【請求項７】
プライマーセットが、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２ｎ（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するリバースプライマーを含むプライマーセットからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマッピング方法。
【請求項８】
プライマーセットが、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むものである、請求項７記載のマッピング方法。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｂ）配列番号２１に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２２に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｃ）配列番号３７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号３８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｄ）配列番号４５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号４６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｅ）配列番号５５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号５６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット
【請求項９】
ＳＳＬＰマーカーが、以下の（ａ）〜（ｅ）群の各群より少なくとも１つ選択されるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマッピング方法。
（ａ）ＣＥＲ４５９７０３、ＣＥＲ４６５６６６、ＣＥＲ４５１９９３、ＣＥＲ４４９７２７、ＣＥＲ４６２４４２、ＣＥＲ４４９１９１、ＣＥＲ４４９０６０、及びＣＥＲ４５２１４７、
（ｂ）ＣＥＲ４６１１７９、ＣＥＲ４６０５８６、ＣＥＲ４５８９５９、ＣＥＲ４５３２９２、及びＣＥＲ４５０１９６、
（ｃ）ＣＥＲ４６５０８０、ＣＥＲ４６５１２８、ＣＥＲ４５５５３７、ＣＥＲ４５６４７８、ＣＥＲ４５６６２２、ＣＥＲ４５７７２０、及びＣＥＲ４５８６７４、
（ｄ）ＣＥＲ４５２８７１、ＣＥＲ４５３５２５、ＣＥＲ４６６５８２、及びＣＥＲ４５２２３８、
（ｅ）ＣＥＲ４５７３４０、ＣＥＲ４５６８３１、ＣＥＲ４５６８０９、ＣＥＲ４５１８８３、ＣＥＲ４５７７７０、ＣＥＲ４５５８５４、ＣＥＲ４５７８２７、及びＣＥＲ４５６７３２
【請求項１０】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２ｎ（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するリバースプライマーを含む、シロイヌナズナのマッピング用プライマーセット。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｅ）を含む、シロイヌナズナのマッピング用プライマーセット。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｂ）配列番号２１に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２２に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｃ）配列番号３７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号３８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｄ）配列番号４５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号４６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｅ）配列番号５５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号５６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的表現型に寄与する変異をマッピングする方法及びそのためのマッピング用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の機能を明らかにするために、大きく二つの方法が存在すると考えられる。一つは遺伝学的手法で、他方は逆遺伝学手法である。逆遺伝学的な手法は、はじめに目的とする遺伝子に着目し、それがどのような機能を行っているのかを明らかにする手法である。遺伝学的手法では、はじめに表現型に着目し、その表現型を規定する遺伝子を探し出し解析する手法である。目的の表現型から遺伝子同定に至る手法をポジショナルマッピングあるいはポジショナルクローニングなどという（非特許文献１）。この手法は、目的表現型を示す個体を得た後、その個体を他の系統の個体と掛け合わせＦ２雑種を取得するところからはじまる。Ｆ２雑種の各個体から染色体ＤＮＡを単離し、分子マーカーを用いて表現型とマーカー間での相関を調べる（ラフマッピング）。この場合、相関が高いほど原因遺伝子に近い領域である。通常はこの領域を狭めて原因遺伝子を同定する（ファインマッピング）。
【０００３】
ラフマッピングは、シロイヌナズナを用いた場合には通常以下のようにして行う。すなわち、変異処理を行ったシロイヌナズナのコロンビア株（Ｃｏｌ）から、目的の表現型を示す変異体を取得する。この変異体をシロイヌナズナのランズバーグ株（Ｌｅｒ）と交配し、Ｆ２雑種集団を作製する。このＦ２雑種集団の中から目的表現型を示す個体を取得する。ラフマッピングには通常３２個体以上を取得するが、このおのおのから染色体ＤＮＡを単離する。得られたＤＮＡを用いて各染色体上にあるＣｏｌとＬｅｒの間で多型を示す分子マーカーを用いてどちらの型を示すのかを調べる。シロイヌナズナは２ｎ＝１０なので分子マーカーは最低でも５つ（１染色体に１つ）は使用する。通常は各染色体に３個で１５個について調べる。つまり、少なくとも３２個体の１５マーカーについてＰＣＲ産物の解析を行う必要がある（計４８０のＰＣＲ反応を行う）。これらの結果から原因遺伝子の大まかな領域を特定し、ファインマッピングへと移行していく。
【０００４】
一般的には、ラフマッピングが成功すれば、時間的、経済的負担を要するもののファインマッピングによる遺伝子同定は可能である。しかしながら、上述の通り時間や労力がかかるにもかかわらず、ラフマッピングが失敗すると表現型が明らかでも原因遺伝子を同定することは不可能である。そのため、ラフマッピングの結果が成功したか否かを簡便に知ることができれば、変異遺伝子のマッピングの時間的・労力的負担を改善することができると考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】島本ら監修、「新版  モデル植物の実験プロトコール」、株式会社秀潤社、第３章、第55〜74頁、2001年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、簡便かつ迅速に変異をマッピングすることができる方法及びそのための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＳＳＬＰマーカーを用いた変異のマッピング方法において、Ｆ２生物のゲノムＤＮＡ上のＳＳＬＰマーカーの検出を、増幅産物の標識のシグナル強度の比を求めて行うことにより、選抜したＦ２生物のゲノムＤＮＡごとに増幅反応を行ってＳＳＬＰマーカーを検出する必要がなく、また迅速に結果を得られるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のステップを含む、ＳＳＬＰマーカーを利用して目的表現型に寄与する変異をマッピングする方法である。
（ａ）一の系統の目的表現型を示す変異生物と、別の系統の生物とを交配してＦ１生物を作出し、Ｆ１生物の交配からＦ２生物を作出するステップ、
（ｂ）Ｆ２生物の中から目的表現型を示す個体を選抜するステップ、
（ｃ）選抜した個体からゲノムＤＮＡを抽出するステップ、
（ｄ）一の系統と別の系統のＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅することができるプライマーセットを用いて、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行うステップ、
（ｅ）得られる増幅産物を標識するステップ、
（ｆ）一の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物と別の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物の長さと量を標識のシグナルにより解析し、ゲノムＤＮＡ上のＳＳＬＰマーカーの存在比をシグナル強度の比から計算するステップ、
（ｇ）（ｆ）の結果に基づいて、上記目的表現型に寄与する変異の染色体上の位置をマッピングするステップ
【０００９】
上記マッピング方法においては、ステップ（ｃ）において、選抜した複数の個体からまとめてゲノムＤＮＡを抽出することができる。また、上記マッピング方法においては、ステップ（ｄ）において、選抜した各個体からのゲノムＤＮＡが混合された状態で増幅反応を行うことができる。
【００１０】
上記マッピング方法において、使用する標識としては、限定するものではないが、蛍光標識が挙げられる。
【００１１】
また上記マッピング方法において、生物としては、限定するものではないが、シロイヌナズナが挙げられる。また、その系統としては、例えばシロイヌナズナコロンビア系統及びランズバーグ系統が挙げられる。
【００１２】
上記マッピング方法において、プライマーセットとしては、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２ｎ（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するリバースプライマーを含むプライマーセットからなる群より選択される少なくとも１つを使用することができる。また、プライマーセットとしては、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むものが好ましい。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｂ）配列番号２１に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２２に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｃ）配列番号３７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号３８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｄ）配列番号４５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号４６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｅ）配列番号５５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号５６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット
【００１３】
上記マッピング方法において、ＳＳＬＰマーカーとしては、以下の（ａ）〜（ｅ）群の各群より少なくとも１つ選択されるものが挙げられる。
（ａ）ＣＥＲ４５９７０３、ＣＥＲ４６５６６６、ＣＥＲ４５１９９３、ＣＥＲ４４９７２７、ＣＥＲ４６２４４２、ＣＥＲ４４９１９１、ＣＥＲ４４９０６０、及びＣＥＲ４５２１４７、
（ｂ）ＣＥＲ４６１１７９、ＣＥＲ４６０５８６、ＣＥＲ４５８９５９、ＣＥＲ４５３２９２、及びＣＥＲ４５０１９６、
（ｃ）ＣＥＲ４６５０８０、ＣＥＲ４６５１２８、ＣＥＲ４５５５３７、ＣＥＲ４５６４７８、ＣＥＲ４５６６２２、ＣＥＲ４５７７２０、及びＣＥＲ４５８６７４、
（ｄ）ＣＥＲ４５２８７１、ＣＥＲ４５３５２５、ＣＥＲ４６６５８２、及びＣＥＲ４５２２３８、
（ｅ）ＣＥＲ４５７３４０、ＣＥＲ４５６８３１、ＣＥＲ４５６８０９、ＣＥＲ４５１８８３、ＣＥＲ４５７７７０、ＣＥＲ４５５８５４、ＣＥＲ４５７８２７、及びＣＥＲ４５６７３２
【００１４】
また本発明は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２ｎ（ｎは１〜３２の整数を表す）に示される塩基配列を有するリバースプライマーを含む、シロイヌナズナのマッピング用プライマーセットである。
【００１５】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む、シロイヌナズナのマッピング用プライマーセットである。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｂ）配列番号２１に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２２に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｃ）配列番号３７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号３８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｄ）配列番号４５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号４６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｅ）配列番号５５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号５６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、変異のマッピング方法が提供される。該方法は、生物における目的表現型に寄与する変異を簡便かつ迅速にマッピングすることができるため、変異遺伝子の探索などに有用である。
【００１７】
また、本発明に係るマッピング用プライマーセットにより、特にシロイヌナズナの変異を簡便かつ迅速にマッピングすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
１．本マッピング方法の概要
マーカーを利用したマッピング方法は、相同染色体間の組換え時におけるマッピング対象の遺伝子とマーカーとの連鎖がその遺伝子とマーカーとの距離に依存するという原理に基づくものである。従って、すでに染色体上の位置が決められているマーカーの中から、マッピング対象の遺伝子の近くに存在する、すなわち該遺伝子と強く連鎖するものを検出し、その間の距離を求めることによって、その遺伝子の染色体上の位置を決めることができる。
【００２０】
図１に示すように、２種類の異なる系統由来の生物の染色体のうち１つに変異ｍが生じ（図１Ａ）、この変異ｍが有用な表現型を示していると仮定する。本発明のマッピング方法は、上記変異ｍが染色体上のどの位置に存在するかを調べるものである。
【００２１】
本発明において、マッピング対象となる生物としては、相同染色体を有する生物であれば限定されるものではなく、動物、植物、真菌類などが含まれる。植物としては、遺伝子多型（ＳＳＬＰマーカー）についての研究がなされている、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、イネ（Oryza sativa）、アブラナ（Brassica napus）、トマト（Lycopersicon esculentum）、トウモロコシ（Zea mays）などが挙げられる。特に、ゲノム配列データが公開されているシロイヌナズナ及びイネが好ましい。また、動物としては、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ラット（Rattus norvegicus）などが好ましい。
【００２２】
また系統とは、同一種が異なる環境に生育するために環境条件に適応して分化した性質が、遺伝的に固定して生じた型を指し、例えばシロイヌナズナの系統としては、Columbia（Ｃｏｌ）、Landsberg erecta（Ｌｅｒ）、Wassilewskija（Ｗｓ）、Niederzenz（Ｎｄ）、Nossen（Ｎｏ）、Rld（ＲＬＤ）、C24（Ｃ２４）、Cape Verdi Islands（Ｃｖｉ）、Enkheim（Ｅｎ）、Bensheim（Ｂｅ）などが知られている。このうち、シロイヌナズナの系統としては全ゲノム配列が公開されているColumbia（Ｃｏｌ）及び全配列ではないが一部の配列が公開されているLandsberg erecta（Ｌｅｒ）が好ましい。
【００２３】
以下、シロイヌナズナを例に、本発明のマッピング方法について説明する。
まず、変異遺伝子をホモに持つ、すなわち目的表現型を示す個体（例えばコロンビア（Ｃｏｌ））を、異なる系統（例えばランズバーグ（Ｌｅｒ））と交配してＦ１を作出し（図１Ｂ）、その自殖であるＦ２を得る（図１Ｃ）。そして、Ｆ２のうち変異遺伝子をホモに持つ個体をいくつか集めてみる。Ｆ２が変異遺伝子をホモに持つことは、表現型（すなわち変異形質）が他の遺伝子型のものと異なるため識別することが可能である。ここで、選抜するＦ２個体は、少なくとも８個体、好ましくは少なくとも３２個体である。図１Ｄでは、簡便性のため５個体分を例示する。相同染色体が対合すると組換えを起こすため、Ｆ２個体の各染色体は、親（Ｆ１）のＣｏｌに由来する部分とＬｅｒに由来する部分のキメラになっている。そして、変異個体の遺伝形質は変異部位がホモであるため、変異遺伝子ｍの領域は、２本の染色体のいずれもＣｏｌに由来する（図１Ｄ）。そこで、これらの変異型Ｆ２個体からゲノムＤＮＡを調製してマーカーのパターンを調べてみる。
【００２４】
本発明においては、染色体上のマーカーａ、ｂ及びｃを選択した場合の例を示している。ここで、染色体上における遺伝子間の距離が近い場合は連鎖する確率、すなわち２つの遺伝子座が連動して組換えが起こる確率は高く、遠くなれば連鎖する確率は低くなる。従って、図１Ｄに示すように、染色体上に適当な間隔となるようにマーカーを決めておくと、連鎖との関係で変異ｍの位置を知ることができる（マーカーの選択については後述する）。すなわち、図１Ｄにおいてマーカーがａ、ｂ及びｃの３種類存在し（Ｃｏｌ由来のマーカーを○印、Ｌｅｒ由来のマーカーを△印で示す）、マーカーａの近傍に変異ｍが生じているとすると、Ｃｏｌ由来のマーカーａとｍとは連鎖する確率が高くなるため、Ｃｏｌ由来のマーカーａ（○）とＬｅｒ由来のマーカーａ（△）との比は例えば９：１となる。また、マーカーｂについては、ｍと連鎖する確率がやや少なくなるためＣｏｌとＬｅｒとの比は例えば７：３に、同様に、マーカーｃについては例えば５：５となる。従って、変異部位に近いマーカーほど、最初の変異株であるＣｏｌ由来のものの割合が高くなる。そのため、変異部位に近いマーカーは変異株であるＣｏｌのゲノム由来である割合が高くなる。このように、変異の存在位置によってマーカーのパターンが異なる。そして、マーカーの位置は予め分かっているため、これらの結果によって変異部位のおおまかな位置を知ることができる（ラフマッピング）。変異部位が複数存在しなければ目的表現型（形質）を表さないような場合であっても、上記方法に準じて複数箇所の変異部位をマッピングすることが可能である。
【００２５】
本マッピング方法は、マーカーとしてＳＳＬＰマーカーを使用する。そのため、マーカーの検出には、マーカーの検出対象となるゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応により得られる増幅産物の長さの違いを利用する。従来は、Ｆ２個体の各々からゲノムＤＮＡを調製し、それぞれを鋳型とした増幅反応から得られる産物の長さを、例えば電気泳動などを行って確認していた。本マッピング方法においては、増幅産物を標識し、その標識のシグナル強度を利用して増幅産物の長さ（すなわちＳＳＬＰマーカーの種類）を確認し、またシグナル強度の比を利用してＦ２個体におけるＳＳＬＰマーカーの存在比を計算する。具体的に説明すると、Ｃｏｌ系統とＬｅｒ系統とを交配したＦ１個体からのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行った場合、Ｆ１個体は全てＳＳＬＰマーカーについてヘテロ型であるため、Ｃｏｌ系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物と、Ｌｅｒ系統に特異的なＳＳＬＰマーカーを含む増幅産物とが、１：１で得られるはずである。本マッピング方法においては、増幅産物の標識シグナルに基づいて、図２Ａに示すように、増幅産物の長さの違いにより２つのピークが得られ、またそのピークが同程度である（すなわちシグナル比が１：１である）ことから、Ｆ１個体のＳＳＬＰマーカーの存在比が１：１であることを検出することができる。また、Ｆ２個体についてＳＳＬＰマーカーを検出する場合には、図２Ａのように同程度のピークが得られることもあれば、図２Ｂに示すようにピークに顕著な差があることもある。図２Ａのように同程度のピークを示す場合には、Ｆ２個体のゲノムにおけるＳＳＬＰマーカーの存在比が１：１であることを表し、図２Ｂのようにピークに差がある場合には、ピークの比（シグナル比）を求めることにより、複数のＦ２個体のゲノムにおけるＳＳＬＰマーカーの存在比がそのシグナル比に相当することがわかる。このように本マッピング方法においてはＳＳＬＰマーカーの存在比を増幅産物の標識シグナル比により求めるため、Ｆ２個体の各個体についてそれぞれＳＳＬＰマーカーを検出する必要がなく、Ｆ２個体からまとめてＤＮＡを調製し、ＳＳＬＰマーカーの存在比（シグナル比）を求めることによりマッピングを行うことができる。
【００２６】
従って、本マッピング方法においては、図１ＤにおけるＣｏｌ由来のマーカーとＬｅｒ由来のマーカーの存在比は、例えばマーカーａについては９（９／１）であり、マーカーｂについては約２．３（７／３）であり、マーカーｃについては１（５／５）と計算することができる。このように、変異部位に近いマーカーはＣｏｌ由来のものの割合が高くなるため、マーカーの存在比（すなわちシグナル比）は変異部位に近いほどその値が大きくなる。このようにして、マーカーの存在比をシグナル比で求めることによって、変異部位がどのマーカーの近傍に存在するかを簡便かつ迅速に判断することが可能となる。
【００２７】
２．ＳＳＬＰマーカーの選択
本マッピング方法においては、マッピングに使用するマーカーとして核酸増幅法により増幅される断片の長さの違いに基づく多型（単純配列長多型；ＳＳＬＰ）を選択する。それにより、ＳＳＬＰマーカー領域を含む断片を増幅した場合に、得られる増幅産物の大きさが異なることに基づいてそのマーカーを検出することができる。また、そのマーカーの検出結果から、Ｆ２植物の当該マーカー部位が、どの系統に由来するのかを判定することができる。
【００２８】
上記方法に使用するＳＳＬＰマーカーの選択には、公開されているＳＳＬＰのデータベースを利用することができ、例えば、シロイヌナズナ（The Arabidopsis Information Resource；http://www.arabidopsis.org/など）、ヒト（http://ratmap.ims.u-tokyo.ac.jp/menu/RH.htmlなど）、マウス（Mouse Microsatellite Database；http://www.shigen.nig.ac.jp/mouse/mmdbj/top.jspなど）、ラット（http://www.well.ox.ac.uk/rat_mapping_resources/rat_RH_comprehensive_maps.htmlなど）のデータベースなどが公知である。
【００２９】
本発明においては、ＳＳＬＰマーカーの中から、マッピング対象の生物の染色体１本当たり少なくとも１個のＳＳＬＰマーカー、好ましくは染色体１本当たり約３〜１００個のＳＳＬＰマーカーがほぼ均等に存在するように選択することが好ましい。「均等」とは、染色体上の一定領域にＳＳＬＰマーカーが集中しないように、染色体上にほぼ万遍なくマーカーが存在していることをいう。
【００３０】
また、公知のＳＳＬＰマーカーの中には、増幅産物の長さが系統間で大きく異なっているものがある。この場合、増幅反応は、存在する鋳型の量が同量であっても、増幅産物が短い反応を優先的に行う傾向があり、その結果、ＳＳＬＰマーカーを高精度で解析することが困難なこともある。そのため、選択するＳＳＬＰマーカーは、得られる増幅産物の長さが系統間であまり異なっていないものであることが好ましい。例えば、増幅産物の長さの違いが、約１〜３０塩基、好ましくは１塩基〜２０塩基、より好ましくは２塩基〜１０塩基となるＳＳＬＰを選択する。このようなＳＳＬＰマーカーの選択は、当業者であれば上記ＳＳＬＰマーカーのデータベースなどを利用することにより容易に行うことができる。
【００３１】
本発明のマッピング方法を適用するのに好ましいシロイヌナズナの２つの系統、すなわちＣｏｌとＬｅｒとのＳＳＬＰマーカーとしては、図３及び４に示すものが挙げられる。図中、ＳＳＬＰマーカーの名称、例えばＣＥＲ４５９７０３、ＣＥＲ４６５６６６などは、国際的に共通に使用されている名称であり、詳細に関しては、上述したＳＳＬＰマーカーのデータベースを参照することができる（例えば、http://www.arabidopsis.org/Cereon/index.jsp参照）。
【００３２】
図３及び４に示す３２個のＳＳＬＰマーカーは、上記基準を満たすものであり、染色体１本当たり４〜８個で配置されるものである。
【００３３】
図４の「マーカー」の欄にはＳＳＬＰマーカーを記載し、「染色体」の欄にはそのＳＳＬＰマーカーの存在する染色体の番号を、また「位置」の欄には当該染色体上の位置を記載した。
【００３４】
本発明を用いてシロイヌナズナのマッピングを行う場合、図３及び４に示すＳＳＬＰマーカーのうち、少なくとも染色体１本に１つのマーカーを用いることが好ましい。例えば、各染色体の中央領域に位置するＳＳＬＰマーカー、すなわちＣＥＲ４４９７２７、ＣＥＲ４５８９５９、ＣＥＲ４５７７２０、ＣＥＲ４６６５８２、及びＣＥＲ４５１８８３を使用することが好ましい。
【００３５】
本発明のマッピング方法に好適なＳＳＬＰマーカーは、特定の生物種、系統、上記例示したものなどに限定されず、上記ＳＳＬＰマーカーの選択手順に従って選択される全てのＳＳＬＰマーカーが含まれる。
このようにして選択したＳＳＬＰマーカーは、本発明のマッピング方法において、マッピング対象の遺伝子を簡便かつ迅速にマッピングするのに役立つものである。
【００３６】
３．ＳＳＬＰマーカーを検出するためのプライマーの設計
本発明では、上述のように選択されたＳＳＬＰマーカーに基づいてプライマーセットを設計する。本発明において設計するプライマーセットは、ＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅することができるように、フォワードプライマーとリバースプライマーを含むものである。すなわち、一の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーと別の系統に特異的なＳＳＬＰマーカーの両方を増幅できるように、一の系統と別の系統に共通するゲノムＤＮＡ（鋳型）の配列に基づいて設計する。ＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅することができるようなプライマーセットの設計は当技術分野で公知である。
【００３７】
簡単に説明すると、プライマーは、鋳型に対してアニーリング可能な配列を含む。ここで「アニーリング可能な配列」とは、鋳型の配列に対して完全に相同な又は相補的な配列、及び鋳型の配列に対して完全には相同又は相補的ではないが、増幅反応において増幅しようとする鋳型の標的領域と特異的にアニーリングすることができる程度に部分的に相同又は相補的な配列も含む。また、プライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する必要がある。そのため、プライマーは、増幅対象の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と特異的にアニーリングする配列を含む必要があり、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に起こし、非特異的な増幅が起こらないようにする。
【００３８】
例えば、プライマーの長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型とプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認は、当業者に公知の計算法により又は公知のプライマー設計用ソフトウエア、例えばドナシス（日立ソフトウェアー）により行うことができる。
【００３９】
また、ＤＮＡポリメラーゼの性質から条件によっては、増幅産物の３’に「Ａ」の配列が付加されたりすることがある。そのため、そのような付加により得られる増幅産物長が変化しないようにするため、付加を促進する配列（GTGTCTT(5’-3’)）を各フォワードプライマーに付加してもよい（http://www.cidr.jhmi.edu/mouse/mmset.html）。
【００４０】
また本発明において、プライマーは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はＤＮＡ類縁体（例えばLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ））のいずれであってもよいし、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ類縁体のハイブリッド核酸であってもよい。
【００４１】
さらに、本方法においては、増幅産物が標識されるように、標識を付加したプライマーを使用してもよい。増幅産物を標識するためにプライマーを標識する方法は当技術分野で周知である。本発明において使用可能な標識は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、放射性同位体、発光物質などを用いることができる。蛍光物質としては、限定するものではないが、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、テトラメチルローダミン、６−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、マラカイトグリーン、リアクティブレッド４などが挙げられる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。本発明においては、その取り扱い及び検出の簡便性の点から蛍光物質を使用することが好ましい。また、２種類の蛍光を使用して増幅産物を区別して標識し、可視的に区別して検出することもできる。例えば、検出対象のＳＳＬＰマーカーの種類ごとにプライマーを異なる蛍光で標識すると、増幅反応を行った後、一度に複数の増幅産物を用いてＳＳＬＰマーカーを検出することが可能となる。
【００４２】
これら標識の種類や標識の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識の導入方法としては、放射性同位体を用いるエンドラベリング法が挙げられる。
【００４３】
また本方法においては、プライマーセットのうち少なくとも１つに、増幅反応時に標識を取り込むためのタグ配列を付加してもよい。「タグ配列」とは、タグ配列に対して相補的な増幅産物が生成された場合に、後述する標識を付加した共通オリゴヌクレオチドがその増幅産物に対して結合可能なように、当該共通オリゴヌクレオチドの配列と実質的に同一の配列を有するものである。ここで「実質的に同一」とは、完全に同一の配列のみならず、生成される増幅産物に対して共通オリゴヌクレオチドが特異的に結合可能な程度の同一性を有する配列が含まれる。このようなタグ配列は、特に限定されるものではないが、標的の鋳型と直接アニーリングするような配列であってはならない。従って、タグ配列は、できる限り短く、かつ増幅対象の鋳型には存在しない配列を含むように設計することが好ましい。例えば、タグ配列の塩基長は、約１５〜３０ｂｐ、好ましくは約１７〜２５ｂｐであることが好ましい。また、タグ配列の塩基組成は、結合の強度の点からＧＣ含量が多いことが好ましい。上記基準を満たすタグ配列として、cccccccccccccctga（配列番号６５）を例示することができる。配列番号６５に示される塩基配列を有するタグ配列は、特にシロイヌナズナのＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行うマッピング法において好ましい。
【００４４】
上記のようにプライマーにタグ配列を付加した場合には、増幅反応において共通オリゴヌクレオチドを使用する。共通オリゴヌクレオチドとは、増幅産物に結合し、増幅産物を標識するために使用することができるものである。従って、共通オリゴヌクレオチドは、上記プライマーのタグ配列と実質的に同一の配列を有する。これにより、プライマーのタグ配列に基づく増幅産物が生成された場合に、そのタグ配列に相補的な配列を含む増幅産物に対して、共通オリゴヌクレオチドは結合することができる。共通オリゴヌクレオチドは、タグ配列を含むものであれば、さらに別の塩基が付加されたものであってもよく、全体として塩基長が約１５〜３０ｂｐ、好ましくは約１７〜２５ｂｐとなるように設計する。
【００４５】
また、共通オリゴヌクレオチドは標識を含む。本発明において使用可能な標識は上述した通りであり、またその標識の共通オリゴヌクレオチドの導入は当技術分野で公知の方法により行うことができる。
【００４６】
本発明者は、シロイヌナズナの２つの系統（Ｃｏｌ及びＬｅｒ）に特異的で好ましいプライマーセットを設計した。そのプライマーセットを図４に示す。図４において、「マーカー」の欄には、プライマーセットにより増幅されるＳＳＬＰマーカー名を示す。「位置」の欄に記載されている記号はＳＳＬＰマーカーの染色体上の位置を示す。また、「フォワードプライマー」及び「リバースプライマー」の欄には、プライマーの塩基配列を示す。リバースプライマー中の「ｎ」は、なし又は任意の数の任意の塩基（例えばタグ配列など）を表す。さらに「増幅産物長の差」の欄に記載の数字は、上記各プライマーを用いてＣｏｌ系統又はＬｅｒ系統を鋳型として増幅反応を行った場合に得られる産物の長さの差を意味する。
【００４７】
本方法においては、上記プライマーセットを用いて、ＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅し、得られる増幅産物の長さの違いに基づいて、ＳＳＬＰマーカーを検出することができる。しかしながら、上記プライマーセットの各プライマーは、それが鋳型のゲノムＤＮＡとアニーリングして目的のＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅することができるものであれば、配列番号１〜６４に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加などされた配列を有するものであってもよい。
【００４８】
上記プライマーセットのうち、本マッピング方法においては、染色体１本につき少なくとも１つのプライマーセットを使用することが好ましい。また好ましくは、以下のプライマーセットを使用することが好ましい。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｂ）配列番号２１に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号２２に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｃ）配列番号３７に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号３８に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｄ）配列番号４５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号４６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット、
（ｅ）配列番号５５に示される塩基配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号５６に示されるリバースプライマーを含むプライマーセット
上記設計したプライマーは、当技術分野で公知のオリゴヌクレオチド合成法、例えば、ホスホロアミダイト法などにより容易に調製することができる。
【００４９】
４．増幅反応
「１．マッピング方法の概要」に記載したように、一の系統の目的表現型を示す変異生物と、別の系統の生物とを交配してＦ１生物を作出し、Ｆ１生物からＦ２生物を作出した後、Ｆ２生物の中から目的表現型を示す個体を選抜し、選抜した個体からゲノムＤＮＡを抽出する。この抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の通り設計したプライマーセットを用いた増幅反応を行う。
【００５０】
ゲノムＤＮＡの抽出は、当技術分野で公知の方法（フェノール・クロロホルム法など）又は市販のキットを用いて行うことができる。Ｆ２生物の中からは、目的表現型を示す個体を少なくとも８個体、好ましくは少なくとも３２個体を選抜するが、それらの選抜した個体からまとめてゲノムＤＮＡを抽出することも可能である。これにより、個々の個体からゲノムＤＮＡを抽出する必要がなく、簡便である。
【００５１】
続いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、「３．ＳＳＬＰマーカーを検出するためのプライマーの設計」の項に記載のように作製したプライマーセットを用いた増幅反応を行う。
【００５２】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等を挙げることができる。
【００５３】
増幅反応の条件もまた特に限定されるものではなく、当業者であれば、採用する増幅手法に最適な増幅条件を設定することができる。例えば、ＰＣＲを使用する場合、その反応温度条件は、９５℃にて５分の後、（９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒）を４０サイクル行い、６０℃４５分、４℃１０分の後、１０℃で解析まで保持する条件とすることができる。
【００５４】
増幅産物の標識には、当技術分野で公知の方法を利用することができる。例えば、「３．ＳＳＬＰマーカーを検出するためのプライマーの設計」の項に記載のようにプライマーに標識を付加した場合には、プライマーが伸張して得られる増幅産物にはその標識が含まれる。また、プライマーにタグ配列を付加し、タグ配列と同じ配列を有する標識共通オリゴヌクレオチドを使用する場合には、増幅過程において増幅産物中に標識が取り込まれることになる。その他、増幅反応において基質として使用するｄＮＴＰを標識する手法も公知である。
【００５５】
標識に基づいて増幅産物を検出するには、上述した標識を検出するための当技術分野で公知の方法を使用することができる。例えば、標識として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。また標識として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。本マッピング方法においては、標識のシグナルに基づいて増幅産物の長さを区別することができ、また異なる長さの増幅産物に由来するシグナル比を求めるために、ＤＮＡ鎖長解析が可能であることが好ましい。そのため、例えば、蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社モデル３１００）のＤＮＡ鎖長解析機能を利用することができる。
【００５６】
増幅産物の標識のシグナル強度に基づいて、一の系統に特異的な増幅産物と別の系統に特異的な増幅産物の長さを区別し、各増幅産物に由来するシグナルの比を求める。具体的には、一の系統に特異的な増幅産物に由来するシグナル強度を、別の系統に特異的な増幅産物に由来するシグナル強度で除した値を算出する。ここで、各増幅産物量が同程度、すなわちＦ２生物に存在するＳＳＬＰマーカーの存在比が同程度であれば、そのシグナル比の値は約１となる。一方、一の系統に特異的な増幅産物量が多い場合には、すなわちＦ２生物に存在するＳＳＬＰマーカーの多くが一の系統に由来する場合には、そのシグナル比は１以上となる。また一の系統に特異的な増幅産物しか存在しない場合、すなわちＦ２生物に存在するＳＳＬＰマーカーの全てが一の系統に由来する場合には、そのシグナル比は無限大となる。
【００５７】
以上のようにして、シグナル強度に基づいて、Ｆ２生物におけるＳＳＬＰマーカーの存在比を求めることが可能となる。
【００５８】
５．マッピング
「１．本マッピング方法の概要」の項に記載したように、本マッピング方法においては、ＳＳＬＰマーカーの存在比をシグナル比から求め、シグナル比が１より大きい場合には、そのＳＳＬＰマーカーが変異部位の近傍に存在することがわかる。多くのＳＳＬＰマーカーを利用することにより、変異部位をさらに狭い領域に特定してマッピングすることができる。また、検出したＳＳＬＰマーカーの存在比を統計学的に処理して組換え率を計算し、変異部位（目的表現型に寄与する変異）の染色体上の位置をマッピングすることも可能である。
上述のようにして、マッピング対象の遺伝子を高速かつ簡便にマッピングすることができる。
【００５９】
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６０】
なお、以下の実施例においては、本発明者が作製した高温感受性変異体（Ｈ３２Ｓ１００７）を用いて実験を行ったが、この変異体は、野性型ｃｏｌ株をＥＭＳ処理によって変異を導入した種子集団から高温ストレスに対して高感受性になる変異体として取得したものである。
【実施例１】
【００６１】
本実施例においては、染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離を行った。具体的には、Ｃｏｌ株の変異体（Ｈ３２Ｓ１００７）とＬｅｒ株を掛け合わせＦ１を作出した後、Ｆ２雑種集団を作製した。そのＦ２雑種集団からＨ３２Ｓ１００７と同じ表現型（高温感受性）を示す個体を選別した。本実験では、Ｆ２雑種集団から９６個体を選別した。また、本実施例では、本方法を行った後のファインマッピングのことも考えて、この個体それぞれからｇＤＮＡを単離した。しかしながら、本方法においては、全個体からまとめてｇＤＮＡを単離して使用してもよいし、全個体由来のｇＤＮＡを混合して使用することも可能である。また、複数個体からのｇＤＮＡの解析について調べるため、単離したｇＤＮＡを、８個体、３２個体、及び９６個体ごとに混ぜて３種類のｇＤＮＡを作製した。
【００６２】
また、Ｃｏｌ株の植物、Ｌｅｒ株の植物、Ｃｏｌ株とＬｅｒ株を掛け合わせたＦ１の植物からもｇＤＮＡを単離した。
【００６３】
ｇＤＮＡの単離は、以下のようにして行った。すなわち、植物組織（１００ｍｇ）に抽出液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％ＳＤＳ）０．１ｍｌを加えホモジナイザーで組織を破砕した。抽出液０．５ｍｌをさらに加え、フェノール・クロロホルム（１：１）０．５ｍｌを添加し、良く撹拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した。上清を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えて良く撹拌し、１０分放置した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）を行い、上清を捨てて７０％エタノール（０．５ｍｌ）を加え、再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分）を行って上清を捨てた。ペレットを乾燥させて滅菌水（０．１ｍｌ）を加え撹拌し、ｇＤＮＡ溶液を得た。
【実施例２】
【００６４】
本実施例においては、ＳＳＬＰマーカーの選択とプライマーの設計を行った。
公知のＳＳＬＰマーカーの中から、得られる増幅産物の長さがＣｏｌ系統とＬｅｒ系統であまり異なっていないもの、すなわち、得られる増幅産物長の差が１０塩基以内のＳＳＬＰマーカーを選択した。具体的には、モンサント社のデータベース（http://www.arabidopsis.org/Cereon/index.jsp）を参考にしながら、シロイヌナズナの５本の染色体上に適当な間隔を空けてＳＳＬＰマーカーを選択した（図３）。選択したＳＳＬＰマーカーは、１番染色体のＣＥＲ４５９７０３、ＣＥＲ４６５６６６、ＣＥＲ４５１９９３、ＣＥＲ４４９７２７、ＣＥＲ４６２４４２、ＣＥＲ４４９１９１、ＣＥＲ４４９０６０、ＣＥＲ４５２１４７、２番染色体のＣＥＲ４６１１７９、ＣＥＲ４６０５８６、ＣＥＲ４５８９５９、ＣＥＲ４５３２９２、ＣＥＲ４５０１９６、３番染色体のＣＥＲ４６５０８０、ＣＥＲ４６５１２８、ＣＥＲ４５５５３７、ＣＥＲ４５６４７８、ＣＥＲ４５６６２２、ＣＥＲ４５７７２０、ＣＥＲ４５８６７４、４番染色体のＣＥＲ４５２８７１、ＣＥＲ４５３５２５、ＣＥＲ４６６５８２、ＣＥＲ４５２２３８、５番染色体のＣＥＲ４５７３４０、ＣＥＲ４５６８３１、ＣＥＲ４５６８０９、ＣＥＲ４５１８８３、ＣＥＲ４５７７７０、ＣＥＲ４５５８５４、ＣＥＲ４５７８２７、ＣＥＲ４５６７３２である。
【００６５】
また、上記ＳＳＬＰマーカーを含む領域を増幅するためのプライマーセット３２セットを設計した（図４）。プライマーの設計にはドナシス（日立ソフトウェアー）を用いた。ここで得られた配列を蛍光標識法で反応できるように各リバース（Ｒ）プライマー（図４）にタグ配列（cccccccccccccctga(5’-3’)；配列番号６５）を付加した（図４中、ｎで表す）。また、ＤＮＡポリメラーゼの性質から条件によっては３’に「Ａ」の配列が付加されたりすることがある。そのため、付加を促進する配列（GTGTCTT(5’-3’)）を各フォワード（Ｆ）プライマー（図４）に付加した（http://www.cidr.jhmi.edu/mouse/mmset.html）。
【００６６】
このようにしてＰＣＲプライマーをＳＳＬＰマーカーごとに作製した（北海道システムサイエンス株式会社へ合成依頼）。また、リバースプライマーに付加したタグ配列を利用して増幅産物を蛍光標識するために、上記タグ配列と同一の配列（配列番号６５）を有する共通オリゴヌクレオチドを作製し、これに蛍光標識（ＦＡＭ）を行った（ＡＢＩ社へ合成依頼）。
【００６７】
上記の通り設計したプライマーセットを用いて、鋳型としてＣｏｌとＬｅｒを用いた場合にそれぞれに特有のマーカーが検出されるか否かを確認した。ここで、ＰＣＲの反応温度条件は、９５℃にて５分の後、（９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒）を４０サイクル行い、６０℃４５分、４℃１０分の後、１０℃で解析まで保持した。反応液組成は、鋳型０．５マイクロリットル、Ａｍｐｌｉｔａｇ  ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）５マイクロリットル、フォワードプライマー１００ピコモル、リバースプライマー１ピコモル、及び標識した共通オリゴヌクレオチド１００ピコモルを加えて１０マイクロリットルとした。この増幅反応により、共通オリゴヌクレオチドによって増幅産物が蛍光標識される。反応後、増幅産物を、蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社モデル３１００）のＤＮＡ鎖長解析機能を用いて鎖長を解析した。その結果、設計したプライマーセットを用いて、ＣｏｌとＬｅｒのＳＳＬＰマーカーをそれぞれ検出できることがわかった。
【実施例３】
【００６８】
本実施例においては、実施例２において設計したプライマーセットを用いて、ＣｏｌとＬｅｒを掛け合わせたＦ１植物４個体について解析を行った。その結果を図２Ａ及び５に示す。図２Ａに示すように、各マーカーからのＣｏｌとＬｅｒのピーク比（シグナル比）は概ね１であり、一定であった（図５の平均及び標準誤差を参照）。このことから、実施例２で設計したプライマーセットを用いて増幅した産物の標識シグナルにより、増幅産物の長さ（すなわちＳＳＬＰの種類）を識別し、またシグナルの比からＳＳＬＰマーカーの存在比を求めることができ、ＳＳＬＰマーカーを検出できることがわかった。
【実施例４】
【００６９】
本実施例においては、実施例２において設計したプライマーを用いて、サンプルとの反応を行った。
【００７０】
その結果を図２Ｂ及び図６に示す。図２Ｂに示すように、ＳＳＬＰマーカーの中には、シグナル比が異なるところがあった。このシグナル比（Ｃｏｌシグナル／Ｌｅｒシグナル）を図６にまとめる。図６において、スコアが１の場合にはそのサンプルのＳＳＬＰマーカーがＦ１（Ｃｏｌ／Ｌｅｒ）と同じこと、すなわちＳＳＬＰマーカーの存在比が約１：１であることを意味する。また、数字が大きければ、Ｆ２個体のゲノムＤＮＡが、最初の変異株の系統（Ｃｏｌ）からのＳＳＬＰマーカーを有する確率が高く、従って、変異の原因遺伝子座に近いことを示す。
【００７１】
実施例１で調製した、変異株Ｈ３２Ｓ１００７から得たＦ２植物のｇＤＮＡを用いて解析を行ったところ、ほとんどのマーカーのピーク比はＣｏｌとＬｅｒの掛け合わせたＦ１植物のものとほぼ同じ（約１）であった。８個体及び３２個体を混ぜたｇＤＮＡでは２番染色体上腕及び５番染色体下腕でスコアーが変化している（図６、マーカー９、１０、１２、２９〜３２）。９６個体を混ぜたｇＤＮＡでは５番染色体下腕でスコアーの有意な変化が認められた（図６、マーカー２９〜３２）。このことから、５番染色体下腕付近が原因遺伝子座であると示唆された。Ｆ２雑種から取得する変異型表現系を示す個体の数は、多い方が安定したデータを示すことが分かった。
【００７２】
その後ファインマッピングを行った結果、原因遺伝子座内に存在する遺伝子に塩基置換が認められた（図７）。この変異は、５番染色体の２０．５Ｍｂ上に存在し、マーカーＣＥＲ４５５８５４（マーカー３０）とＣＥＲ４５７８２７（マーカー３１）との間に存在する。従って、実際の変異の位置は、上記実験の結果（図６）、すなわちマーカー２９〜３２の付近でスコアーの有意な変化が認められ、特にマーカー３０及び３１付近ではスコアーが顕著に変化しているという結果と一致するものであり、本方法によって変異の原因遺伝子座を簡便、迅速かつ効率的に特定することができることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、変異のマッピング方法が提供される。該方法は、生物における目的表現型に寄与する変異を簡便かつ迅速にマッピングすることができるため、変異遺伝子の探索などに有用である。
また、本発明に係るマッピング用プライマーセットにより、特にシロイヌナズナの変異を簡便かつ迅速にマッピングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本マッピング方法の概要を示す。
【図２】本マッピング方法において、増幅産物のシグナルからＳＳＬＰマーカーの種類と存在比を求める例を示す。
【図３】シロイヌナズナの変異をマッピングするために使用するのに好ましいＳＳＬＰマーカーの位置を示す。
【図４】シロイヌナズナの変異をマッピングするために使用するのに好ましいＳＳＬＰマーカーとプライマーセットを示す。
【図５】Ｆ１個体について設計したプライマーセットを用いて得られた結果を示す。
【図６】Ｆ２個体について設計したプライマーセットを用いて得られた結果を示す。
【図７】Ｈ３２Ｓ１００７株の変異部位の染色体上の位置を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１〜６５：合成オリゴヌクレオチド（ｎはなし又は任意の数の任意の塩基を表す）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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