(57)【要約】【課題】  血液試料などの妨害物質を含む試料についても、良好な定量性を維持しながら、目的物質を繰り返しまたは連続的に測定することが可能なバイオセンサの提供。【解決手段】  透析膜によって隔てられた試料用薄層流路と透析液用薄層流路とを含むフローセルを含み、透析液用薄層流路は少なくとも１つの電極を含むバイオセンサであって、試料用薄層流路に目的試料を含む分析試料を導入し、透析液用薄層流路に透析液を導入して、目的試料の透析および電気化学的検出を同時に行うことを特徴とするバイオセンサ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透析膜によって隔てられた試料用薄層流路と透析液用薄層流路とを含むフローセルを含み、前記透析液用薄層流路は少なくとも１つの電極を含むバイオセンサであって、
前記試料用薄層流路に目的試料を含む分析試料を導入し、前記透析液用薄層流路に透析液を導入して、前記目的試料の透析および電気化学的検出を同時に行うことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記少なくとも１つの電極は、生体成分と特異的に反応する酵素によって表面修飾されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記透析膜は、血液中のタンパク質や血栓の付着を抑制する修飾を施されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記透析膜は、目的試料を測定する際に妨害物質として働く分子を除く修飾を施されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記試料用薄層流路および透析液用薄層流路は、１μｍ以上１００μｍ以下の厚さを有することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液や尿などの体液中に存在する生体分子やイオンを、間欠的あるいは連続的に定量を行うためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場において患者の血液や尿などの体液中に含まれる生体成分を分析することは、病気の診断や治療方針の決定に重要な要素であり、現在様々な手法により各種生体成分の測定が行われている。現在、これら生体成分の分析には主として液体クロマトグラフィ装置やＩＣＰ発光分析装置が用いられ、患者から採血された血液試料は一旦臨床検査施設に送られ、専門技術者が分析を行うのが一般的である。このため、採血から分析、データが得られるまでに数日を要している。
【０００３】
近年、ベッドサイドでの分析や在宅医療を目的とした、小型分析装置の開発が行われている。これは、現在血液中に含まれる生体成分の分析においては、液体クロマトグラフィ装置などの高価で大型の装置が主に用いられており、個人病院や在宅での自己診断は困難なためである。このため、小型かつ迅速に血液成分の分析が可能となるバイオセンサの開発が重要である（非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】医歯薬出版（株）、メディカル・テクノロジー「携帯検査・ベッドサイド検査のすべて」、１９９９年、ｌ２７巻、１０号、ＩＳＳＮ−０３８９−１８８７
【非特許文献２】Analytica Chimica Acta, 350, 77 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在までに血液中の生体成分の迅速な測定を目的としたバイオセンサがいくつか報告されている。しかしながら、血液試料の測定においては血液中に含まれるタンパク質や血球のセンシング部分への吸着により感度が低下していまい、定量性良く目的物質を繰り返し測定することや連続的に目的物質を測定することは非情に難しい（非特許文献２参照）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、２つの流路が透析膜によって隔てられたフローセルを作製し、一方の流路中に目的物質を検出する電極を形成した。さらに、もう一方の流路に生体試料を流すことにより、電極上には透析された分子量の小さな分子のみが拡散してくるが、吸着性のあるタンパク質などの高分子は電極上に拡散してこないため長期間にわたり安定した感度が得られる。また２つの流路をともに薄層流路とすることにより、透析膜に対して垂直方向の目的成分の拡散距離を小さくし、高効率に目的とする生体成分の透析を行うことが可能となり、高感度に目的成分を検出可能となる。
【発明の効果】
【０００７】
以上のような構成を採って、電極と透析膜を集積化したバイオセンサを用いることにより、妨害物質を含む血液のような試料においても、定量性よく安定した電気化学的検出が可能である。また、透析膜にタンパク質や血栓の付着を抑制する修飾を施すことによって、前述の効果を高めることができる。さらに、透析膜に妨害物質の透過を防止する修飾を施すことによって、そのような妨害物質が存在する試料についても、本発明のバイオセンサによる電気化学的検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のバイオセンサは、透析膜によって隔てられた試料用薄層流路と透析液用薄層流路とを含むフローセルを含み、前記透析液用薄層流路は少なくとも１つの電極を含む構成を有する。試料用薄層流路に分析試料を導入し、前記透析液用薄層流路に透析液を導入して、前記目的試料を透析して、分析試料中の目的試料を透析液中に移動させ、そして透析液用薄層流路中に設けられた少なくとも１つの電極によって目的試料の電気化学的検出を行うことを特徴とする。
【０００９】
図１に、本発明の例示的構成を示す。図１の構成においては、アクリル基板１と両面粘着性シート２によって試料用薄層流路が構成され、アクリル基板５と両面粘着性シート４によって透析液用薄層流路が構成され、そして、両流路が対向するように透析膜３に貼り合わせられている。試料用薄層流路には、試料導入キャピラリ６と試料排出キャピラリ７が設けられて、分析試料の導入／排出を行う。透析液用薄層流路には、透析液導入キャピラリ８と透析液排出キャピラリ９が設けられて、透析液の導入／排出を行う。さらに、図１の構成においては、透析液用薄層流路中に、目的試料の電気化学的検出を行うための対向電極１０、参照電極１１および作用電極１２が設けられ、それぞれの電極は独立的に電極パッド１３に電気的に接続されている。
【００１０】
試料用薄層流路は、基板表面に形成された凹部であってもよいし、図１に示したように、平坦な基板１の表面に対して孔を設けた薄膜（両面粘着性シート２）を貼り合わせて形成されていてもよい。基板としては、アクリル樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂およびシリコーン樹脂などの樹脂基板、ガラス基板、Ｆｅ、Ａｌ、Ｃｕ等の金属基板などを用いることができる。あるいはまた、ガラス基板または金属基板の表面を前述の樹脂で被覆した樹脂被覆基板を、基板として用いてもよい。
【００１１】
透析液用薄層流路も、試料薄層流路と同様の構成であってもよい。ただし、後述する検出用の電極を設ける必要があるため、透析液用薄層流路を形成するために用いられる基板は、少なくともその表面において絶縁性であることが必要である。したがって、透析液用薄層流路の作製にあたっては、樹脂基板、ガラス基板、または樹脂被覆基板を用いることが望ましい。
【００１２】
試料用薄層流路および透析液用薄層流路は、１μｍ以上１００μｍ以下の厚さを有することが望ましい。このような厚さを有することによって、測定対象となる目的試料の基板表面に対して垂直方向（流動方向に直交する方向）への拡散距離を短くして、高い透析率を実現し、それによって高感度のバイオセンサを作製することができる。
【００１３】
試料用薄層流路および透析液用薄層流路には、それぞれ試料用または透析液用の導入手段および排出手段が設けられる。図１に示す試料用薄層流路に関しては、試料導入キャピラリ６および試料排出キャピラリ７が、それぞれ導入手段、排出手段に相当する。本発明のバイオセンサにおいては、試料用薄層流路の一端に導入手段を、他端に排出手段を設けて、分析試料が基板表面に平行に、該流路の一端から他端へと流れるようにして、流路中に分析試料が不必要に滞留しないようにすることが望ましい。透析液用薄層流路についても同様であり、図１の構成においては、透析液導入キャピラリ８および透析液排出キャピラリ９が、それぞれ導入手段、排出手段に相当する。本発明のバイオセンサにおいては、分析試料の流動方向と透析液の流動方向を一致させることが、高い感度を実現する上で好ましい。
【００１４】
透析膜３は、セルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリスルホン、ポリアミド、ポリエステル系ポリマーアロイなどの材料から作製することができる。
【００１５】
特に分析試料として血液などの生体試料を用いる場合、透析膜３に対して、血液中のタンパク質および／または血栓の付着を防止する修飾を施してもよい。たとえば、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ヘパリンなどによって、前述の透析膜を修飾することができる。このような修飾透析膜を用いることによって、タンパク質および／または血栓の付着を防止して、生体試料分析時の透析膜の透析率低下を抑制することができる。これによって、長期間にわたって安定した感度で生体試料の分析を行うことが可能となる。
【００１６】
あるいはまた、分析試料中に目的試料の電気化学的検出を妨害する妨害物質が含まれている場合、透析膜３に対して妨害物質の分子を除くための修飾を施してもよい。そのような修飾の例としては、イオノマーによる修飾（分子の帯電状態による選別）、あるいはシリカポリマーコンポジットプロトン交換膜もしくは過酸化ポリピロールによる修飾（アスコルビン酸、尿酸などの除去）などを挙げることができる。たとえば、アニオン性イオノマーであるナフィオンなどを用いて、アニオン性物質が透析膜を透過するのを防止ないし低減することが可能である。このような修飾によって、妨害物質分子の透析液中への移動を防止し、たとえ妨害物質を含有する試料であっても、長期間にわたって安定した感度で目的試料の分析を行うことが可能となる。
【００１７】
透析液用薄層流路内に設けられる電極は、試料用薄層流路中の分析試料中から透析膜を透過して透析液用薄層流路内に入る目的試料を電気化学的に検出するためのものである。たとえば、図１の構成においては、対向電極１０、参照電極１１、および作用電極１２が設けられ、参照電極１１の電位を基準として作用電極１２を定電位に設定し、作用電極１２および対向電極１０の間を流れる電流（応答電流）をモニターすることにより、目的試料の電気化学的検出が行われる。透析液用薄層流路内に設けられる１つまたは複数の電極は、それぞれ独立的に電極パッドに対して電気的に接続されており、該電極パッドを経由して、外部回路に接続される。
【００１８】
本発明の１つまたは複数の電極は、金、白金、銀、銅、パラジウム、チタン、アルミニウム、モリブデン、クロムのような金属またはそれら金属を含む合金を用いて作製することができる。電極材料は、検出する目的試料の種類に応じて選択することが望ましい。また、必要に応じて、複数の金属層からなる積層構造の電極を用いてもよい。積層構造の電極は、目的試料の検出に最適な金属の導電率が小さいとき、または該金属が高価であるときに特に有効であり、高い導電率を有する金属からなる下層の表面上に、検出に最適な金属からなる上層を設けることによって、高感度および高導電率を両立した電極を提供することが可能となる。
【００１９】
あるいはまた、本発明の少なくとも１つの電極、特に作用電極を、目的試料である生体成分と特異的に反応する酵素によって表面修飾してもよい。表面修飾に用いることができる酵素としては、種々のペルオキシダーゼ、乳酸酸化酵素などを挙げることができる。これらの修飾物質は、必要に応じて有機高分子等を用いて電極上に固定化されていてもよい。このような修飾を行うことによって、目的試料に対する感度を高めること、または応答の特異性を高めることが可能となる。一方、参照電極１１は、その表面を目的試料と電気化学的反応を起こさないような導電性材料で修飾することが望ましい。
【００２０】
図２に、本発明のバイオセンサを用いた測定システムの一例を示す。図１に構造を示したバイオセンサ１４の各電極１０〜１２はそれぞれに対応する電極パッド１３を介して、ポテンシオスタット１９に接続されている。ポテンシオスタット１９は、収集したデータを処理するためのパーソナルコンピュータ２０に接続されている。また、試料導入用キャピラリ６および透析液導入キャピラリ８は、それぞれ試料導入用シリンジポンプ１７および透析液導入用シリンジポンプ１８に接続されている。さらに試料導入用キャピラリ６には、分析試料注入口（不図示）が設けられている。
【００２１】
図２に示した構成では、収集したデータを処理するためにパーソナルコンピュータ２０を接続した例を示したが、各電極からの出力電流を適正に処理して表示ないし紙などの記録媒体への出力ができる限りにおいて、当該技術において知られている任意の装置（プリンタ、プロッタなど）を用いることができる。同様に、図２においては試料および透析液を送液するためのポンプの例としてシリンジポンプを示したが、一定速度で液体を送液することができ、かつ脈流などが発生しないことを条件として、当該技術で知られている任意のポンプ（ダイヤフラム型、ベローズ型、蠕動型など）を用いることができる。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
アクリル基板５上に、メタルマスクを重ね、マグネトロンスパッタ装置（日本シード社製）に取り付け、厚さ５ｎｍのチタンおよび厚さ１００ｎｍの金を堆積させて、アクリル基板５上に積層構造の対向電極１０、参照電極１１および作用電極１２、ならびにそれら電極をポテンシオスタット１９に接続するための電極パッド１３を形成した。参照電極１１の表面を、参照物質として用いる銀ペーストで修飾した。
【００２３】
その後、アクリル基板５に、透析液導入キャピラリ８および透析液排出キャピラリ９を接続するための穴を２カ所、ドリルにより形成した。そして、それぞれの穴に透析液導入キャピラリ８および透析液排出キャピラリ９を接続して、ＵＶ硬化性接着剤により固定化した。また、同様にして、アクリル基板１に試料導入キャピラリ６および試料排出キャピラリ７を接続した。
【００２４】
次に、厚さ５０μｍ（きもと社製）の両面粘着性シートを準備し、カッティングプロッタ（ＭＩＭＡＫＩ社製）を用いて２６×１０ｍｍに切り出した後、さらにカッテングプロッタを用いて切り出した両面粘着性シートの中央に２０×１ｍｍの穴を形成して、穴開け加工を行った両面粘着性シート４および５を得た。次に、図１に示すように、両面粘着性シート４および５を用いて、電極を形成したアクリル基板５、セルロースアセテートからなる透析膜３、およびアクリル基板１を接着して、図１に示す構造を有する本発明のバイオセンサを作製した。本実施例においては、それぞれの両面粘着性シートの中央に開けられた長さ２０ｍｍ×幅１ｍｍ×深さ５０μｍの穴が、それぞれ、透析液用薄層流路（アクリル基板５側）および試料用薄層流路（アクリル基板１側）に相当する。
【００２５】
以上のように得られた本発明のバイオセンサをドーパミンセンサとして用いた例を以下に示す。最初に、試料導入用キャピラリ６に接続された試料導入用シリンジポンプ１７から、バイオセンサ１４の試料用薄層流路に対して、ｐＨ＝７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を流速５μｌ／分で連続的に導入した。また透析液導入キャピラリ８に接続した透析液導入用シリンジポンプ１８から、透析液としてのＰＢＳを、バイオセンサ１４の透析液用薄層流路に対して、流速５μｌ／分で連続的に導入した。ポテンシオスタットを用いて、作用電極１２に対して、参照電極１１を基準として＋４５０ｍＶの電位を印加し、作用電極１２および対向電極１０の間を流れる電流値の変化をパーソナルコンピュータ２０で記録した。
【００２６】
試料用薄層流路および透析液用薄層流路の両方にＰＢＳを流して、安定したベースラインを得た。次に、試料用薄層流路に対して１００μＭドーパミンを含むＰＢＳを導入すると、素早く電流値が増加し、一定の電流値を示した。これは、導入されたドーパミンがセンサ内の透析膜３を透過し、作用電極１２上で酸化されたことによる酸化電流を検出したものである。次に、試料用薄層流路に対して１００μＭドーパミンに１０％（試料の総重量を基準とする）になるように妨害物質である馬血清を加えた試料を導入した場合でも、若干の電流値の低下が認められるものの、ほぼ同じ大きさの応答電流値を得ることが出来た。さらに、再び試料用薄層流路に対してＰＢＳを流して電流値がベースラインに戻った後に、試料用薄層流路に対する１０％馬血清含有１００μＭドーパミン試料の導入を繰り返したが、その電流値はほとんど変化しなかった。これは、馬血清中に含まれるタンパク質などの高分子は透析膜３を通過しないため、各電極１０〜１２を汚染することなく、定量性良く生体成分を検出可能であることを示している。図３に、上記測定を行った際の電流値変化のグラフを示す。
【００２７】
このように電極と透析膜を集積化したバイオセンサを用いることにより、血液試料中でも定量性よく安定した応答を得ることが可能である。
【００２８】
（実施例２）
透析膜としてＭＰＣを含浸させたセルロースアセテートを用いたことを除いて、実施例１の手順を繰り返してバイオセンサを作製した。ＭＰＣの含浸処理は、透析膜を非水溶性のＭＰＣのアルコール溶液中に浸漬させ、乾燥させることによって行った。
【００２９】
得られたバイオセンサに対して、実施例１と同様の手順によって１００μＭドーパミン試料を導入し、電流値がベースラインに戻った後に、１００μＭドーパミンの１０％馬血清含有試料を導入した。その結果、最初の１００μＭドーパミン試料の場合と、次の１００μＭドーパミンの１０％馬血清含有試料の場合とにおいて、同等の電流値が得られた。
【００３０】
この結果は、透析膜をＭＰＣによって修飾したことによって、血中タンパク質の付着および血栓の付着を有効に防止することができたためと考えられる。
【００３１】
本比較例のバイオセンサは、一体として形成された薄層流路（２０ｍｍ×１ｍｍ×１００μｍ）中を試料および透析液の両方が流れる構造を有する。
【００３２】
（比較例１）
透析膜を用いなかったことを除いて、実施例１の手順を繰り返してバイオセンサを作製した。本比較例のバイオセンサは、一体として形成された薄層流路（２０ｍｍ×１ｍｍ×１００μｍ）中を試料および透析液の両方が流れる構造を有する。
【００３３】
本比較例のバイオセンサを用いて、実施例１の記載と同様に、１００μＭドーパミン試料、続いて複数回の１０％馬血清含有１００μＭドーパミン試料の導入を行った。図４にその際の電流値変化のグラフを示す。このグラフから、１０％馬血清含有１００μＭドーパミン試料を導入した場合に、馬血清を含まない試料と比較して応答電流値の低下が認められる。また、馬血清含有試料の導入を繰り返すにつれて、徐々に応答電流値が低下していくことも認められる。これは、電極表面に血清中に含まれるタンパクが吸着したためである。このように血液試料を直接センサに導入した場合、定量性良く目的物質を安定に検出することは困難であり、再現性に乏しい。
【００３４】
（実施例３）
作用電極１２を以下のように修飾したことを除いて、実施例１と同様の手順によりバイオセンサ１４を作製した。作用電極を、電子移動層としてオスミウム錯体高分子を含む西洋わさびペルオキシターゼによって修飾した。さらに２％牛血清アルブミン水溶液に乳酸酸化酵素を１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、さらに終濃度が０．１％になるようにグルタルアルデヒドを加えた混合溶液を作製し、架橋反応が進行している上記混合溶液を用いて、乳酸酸化酵素を含む架橋アルブミン層を電子移動層上に作製した。本実施例のバイオセンサは、乳酸センサとして機能する。
【００３５】
次に、作用電極１２に対して、参照電極１１を基準として−５０ｍＶの電位を印加し、実施例１と同様に、試料用薄層流路および透析液用薄層流路の両方にＰＢＳを流速５μｌ／分で連続的に導入して、ベースラインを安定させた。
【００３６】
次に、試料用薄層流路に対して１ｍＭ乳酸を含むＰＢＳを流速５μｌ／分で導入すると、素早く電流値が増加し、一定の電流値（−６００ｎＡ）を示した。これは、導入された乳酸がセンサ内の透析膜３を透過し、作用電極１２上の架橋アルブミン層中に固定化された乳酸酸化酵素により乳酸が酸化され、さらに該酵素反応により生成した過酸化水素が電子輸送層中の西洋わさびペルオキシターゼにより還元されたことによる還元電流を検出したものである。次に、１００μＭ乳酸試料に対して終濃度が１０％になるように妨害物質である馬血清を混入した場合でも、馬血清を含まない場合と同様の応答電流値（−６００ｎＡ）を得ることができた。さらに、電流値がベースラインに戻った後に１０％馬血清含有１ｍＭ乳酸試料の添加を繰り返したが、その電流値はほとんど変化しなかった。これは、馬血清中に含まれるタンパク質などの高分子は透析膜３を通過しないため、各電極１０〜１２を汚染することなく、定量性良く生体成分を検出可能であることを示している。
【００３７】
このように、酵素修飾バイオセンサにおいても透析膜を集積化することにより、血液試料中でも定量的かつ安定した応答を得ることが可能である。
【００３８】
（比較例２）
透析膜を用いなかったことを除いて、実施例３の手順を繰り返してバイオセンサを作製した。本比較例のバイオセンサは、一体として形成された薄層流路（２０ｍｍ×１ｍｍ×１００μｍ）中を試料および透析液の両方が流れる構造を有する。
【００３９】
実施例３と同様に、作用電極１２に対して、参照電極１１を基準として−５０ｍＶの電位を印加し、ベースラインを安定させた後に、１０％馬血清を含む１ｍＭ乳酸試料溶液を導入した場合、乳酸に対する応答電流値は−７００ｎＡ程度と、透析をしない場合に比べ、大きな応答電流値を得ることが出来た。しかしながら、１０％馬血清を含む１ｍＭ乳酸試料溶液を繰り返して導入すると、応答電流値は徐々に低下し、２時間後には−４００ｎＡ程度に減少した。これは、上記溶液中に含まれるタンパク質が検出電極を汚染するため、徐々に検出感度が低下していくことを示している。
【００４０】
（実施例４）
実施例１の手順に従ってバイオセンサ１４を作製した。次に、バイオセンサの試料導入キャピラリ６から流速５μｌ／分にて５％ナフィオン（登録商標）を含むメタノール溶液を試料用薄層流路内に１分間送液する処理を行い、透析膜３の試料用薄層流路側表面をアニオン性ポリマーであるナフィオン（登録商標）で修飾した。
【００４１】
本実施例のバイオセンサをドーパミンセンサとして用いた例を示す。最初に、試料用薄層流路および透析液用薄層流路の両方にＰＢＳを流して、安定したベースラインを得た。次に、試料用薄層流路に対して１００μＭドーパミンを含むＰＢＳを導入すると、素早く電流値が増加し、一定の電流値（７０ｎＡ）を示した。これは、導入されたドーパミンがセンサ内の透析膜３を透過し、作用電極１２上で酸化されたことによる酸化電流を検出したものである。次に、１００μＭドーパミンに１００μＭアスコルビン酸を含む試料を導入した場合でも、ほぼ同じ大きさの応答電流値を得ることが出来た。これは、透析膜にアニオン性のポリマーを修飾する事により、試料中で負に帯電しているアスコルビン酸分子の透析膜透過を抑制し、ドーパミンのみが電極が配置された透析液薄層流路側に選択的に透析されたことを示している。このように、センサ内の透析膜３をイオノマーを修飾する事により、分子量の大きさのみでなく、分子の帯電状態により目的とする分子のみを検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明によって作製された薄層流路および透析膜を有する微小バイオセンサの模式図である。
【図２】本発明によって作製されたセンサを用いた生体試料の測定システムの模式図である。
【図３】実施例１にしたがって作製されたセンサを用いて、ドーパミン試料および血清含有ドーパミン試料を測定した際のセンサの応答電流値の変化を示すグラフである。
【図４】従来構造を有する比較例１で作製されたセンサを用いてドーパミン試料および血清含有ドーパミン試料を測定した際のセンサの応答電流値の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４３】
１，５    基板
２，４    両面粘着性シート
３    透析膜
６    試料導入キャピラリ
７    試料排出キャピラリ
８    透析液導入キャピラリ
９    透析液排出キャピラリ
１０    対向電極
１１    参照電極
１２    作用電極
１３    電極パッド
１４    ドーパミンセンサ
１７    試料導入用シリンジポンプ
１８    透析液導入用シリンジポンプ
１９    ポテンシオスタット
２０    パーソナルコンピュータ
【図１】
2006126092.tif 000003
【図２】
2006126092.tif 000004
【図３】
2006126092.tif 000005
【図４】
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