(57)【要約】【課題】プロテアーゼ活性などの加水分解活性を有した化学物質群あるいは加水分解活性に影響を及ぼす化学物質群に対して汎用性が高く、前記化学物質を特異的かつ迅速簡単に検知する方法を提供することを目的とする。【解決手段】加水分解される基質３が固定化された固相面４を利用し、加水分解活性を有するかあるいは他の加水分解酵素活性を増減させる性質をもった被検知物質を含んだ検体を前記固相面４に反応させ、加水分解されずに固相面４上に残った基質量を検知することで、抗体を用いることなく加水分解活性に依存した被検知物質を特異的に迅速且つ簡単に検知する事のできる検知方法が得られる。【選択図】図１
2006087303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を加水分解する酵素活性を利用した被検知物質検知方法であって、被検知物質は加水分解活性を有するかあるいは他の加水分解酵素活性を増減させる性質をもっており、加水分解される基質が固定化された固相面を利用し、前記被検知物質を含んだ検体と前記固相面を接触させ、加水分解されずに前記固相面上に残った基質を検知することで検体の加水分解活性を検知し、検体中の被検知物質を検知することを特徴とした被検知物質の検知方法。
【請求項２】
被検知物質が加水分解活性を持つ酵素であり、被検知物質によって固相面上の基質が加水分解され、被検知物質量によって固相面上に残る基質量が変化することを特徴とした請求項１記載の被検知物質の検知方法。
【請求項３】
被検知物質が加水分解活性を持つ酵素に対する阻害物質であり、検体は当該被検知物質が阻害する酵素活性を含んでおり、検体の加水分解活性によって固相面上の基質が加水分解され、被検知物質量によって固相面上に残る基質量が変化することを特徴とした請求項１に記載の被検知物質の検知方法。
【請求項４】
被検知物質がプロテアーゼもしくはプロテアーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該プロテアーゼもしくは当該プロテアーゼの阻害物質が阻害するプロテアーゼの認識するアミノ酸配列を含んだポリペプチドからなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項５】
被検知物質がヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該ヌクレアーゼもしくは当該ヌクレアーゼの阻害物質が阻害するヌクレアーゼの認識する塩基配列を含んだ核酸からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項６】
被検知物質がグリコシダーゼもしくはグリコシダーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該グリコシダーゼもしくは当該グリコシダーゼの阻害物質が阻害するグリコシダーゼの認識する糖鎖構造を含んだ糖鎖からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項７】
被検知物質がリパーゼもしくはリパーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該リパーゼもしくは当該リパーゼの阻害物質が阻害するリパーゼの認識する脂肪酸を含んだ有機酸からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項８】
加水分解活性を持つ酵素が認識する認識配列をもつ基質を固定化した固相面と、加水分解活性を持つ酵素が認識する認識配列を持たない基質を固定化した固相面に、被検知物質を含んだ検体を接触させ、認識配列をもつ基質を固定化した前記固相面上に残った基質量と認識配列を持たない基質を固定化した前記固相面上に残った基質量の差を比較することで被検知物質を検知することを特徴とした請求項４〜７のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項９】
加水分解活性を持つ酵素が認識する配列をもつ基質が複数の固相面に異なる濃度で固定化されていることを特徴とし、前記記載の複数の固相面に被検知物質を含んだ検体を接触させ、固相面上に残った基質量の基質濃度依存性を指標に検体中の被検知物質を検知することを特徴とした請求項４〜７のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１０】
被検知物質を含んだ検体を固相面上に接して流れるように反応させることを特徴とし、被検知物質を連続的に検知する請求項１〜９のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１１】
固相面上の基質を検知し易くするための信号物質を基質に結合してあることを特徴とし、信号物質の減少量を指標にして固相面上に残った基質量を検知する請求項１〜１０のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１２】
基質に結合した信号物質が蛍光色素であり、固相面上に残った基質量を蛍光強度の減少量によって測定することを特徴とした請求項１１に記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１３】
信号物質が酸化還元電位を発生させる物質であることを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を酸化還元電流の減少量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１４】
信号物質が磁化特性をもつことを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を磁化特性の変化量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１５】
信号物質が色素化合物であることを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を色素の減少量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１６】
基質が固定化された固相面が電極であることを特徴とし、固相面上の基質の分子量に基づく電極活性の変化を指標にして固相面上に残った基質量を検知する請求項１〜１０のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いて加水分解活性を検知することにより、加水分解活性を持つ化学物質もしくは加水分解活性に影響を及ぼす化学物質が存在することを検知する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の加水分解活性を検知する方法として、プロテアーゼ活性をもつボツリヌス毒素や破傷風毒素を検知するイムノアッセイ法を利用した方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
以下、その毒素検知方法について図１７を参照しながら説明する。
【０００４】
図１７に示すように、ペプチダーゼ活性を持つボツリヌス毒素あるいは破傷風毒素を被検知物質１０１とし、図１７ａ）に示すように前記ペプチダーゼ活性による切断部位１０２すなわち加水分解される部位をもった基質１０３と前記被検知物質１０１を反応させ、図１７ｂ）に示すように前記基質１０３の切断部位１０２を露出させる、次に図１７ｃ）に示すように酵素１０４に連結され前記切断部位を認識する抗体１０５を前記切断部位１０２と反応させ、次に図１７ｄ）に示すように抗体１０５に連結された酵素１０４によって反応基質１０６が生成物１０７に変換される量を検知することによって、ペプチダーゼ活性をもつ被検知物質１０１を検知する。
【特許文献１】特開平１０−５０４８０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のイムノアッセイ法を利用した加水分解活性検知方法では、基質の切断部位を特異的に認識する抗体を作成する必要があるが、抗体作成技術には専門性が必要であり、専門性を有した場合においても目的にかなう特性を有した抗体を作成することは難しく、また抗体作成に要する期間が長期にわたり、かつ抗体は高価であるという課題があり、抗体を利用しないで加水分解活性を特異的に迅速かつ検知する方法が要求されている。
【０００６】
また、イムノアッセイ法の性質上、被検知物質を検知するためには複数の工程、すなわち基質と被検知物質との反応工程と、抗体と基質の切断部位との反応工程と、抗体に連結された酵素の検出工程を続けて行う必要があり、反応工程が複雑であるという課題があり、簡略化した工程で検知する方法が要求されている。
【０００７】
また、被検知物質として基質特異性の高い加水分解活性を有した酵素を検知することしかできず、このような被検知物質が限定されるため汎用性が低いという課題があり、汎用性の高い検知方法が要求されている。
【０００８】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、抗体を利用しないで加水分解活性を特異的に迅速かつ検知することができ、また、簡略化した工程で検知することができ、また、基質特異性の高い加水分解活性を有したもの以外の被検知物質に対して汎用性の高い検知方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の被検知物質検知方法は上記目的を達成するために、加水分解される基質が固定化された固相面を利用し、加水分解活性を有するかあるいは他の加水分解酵素活性を増減させる性質をもった被検知物質を含んだ検体と前記固相面を接触させ、加水分解されずに前記固相面上に残った基質を検知することで検体の加水分解活性を検知し、検体中の被検知物質を検知するとしたものである。
【００１０】
この手段により抗体を使用せずに被検知物質を検知することができ、また、簡単な反応工程で被検知物質を迅速に検知できる検知方法が得られる。
【００１１】
また、基質に対して特異性の高い加水分解活性を持っていない被検知物質であっても容易に検知できる検知方法が得られる。
【００１２】
また、加水分解活性を持つもの以外の活性に影響を及ぼす化学物質であればいずれも検知することができ、汎用性の高い検知方法が得られる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば抗体を利用することなく加水分解活性を持った被検知物質を迅速に検知できるという効果のある被検知物質検知方法を提供できる。
【００１４】
また、簡単な反応工程にて被検知物質を検知することができる効果のある被検知物質検知方法を提供できる。
【００１５】
また、基質に対して特異性の高い加水分解活性を持っていない被検知物質であっても容易に検知することができる効果のある被検知物質検知方法を提供できる。
また、本発明によれば加水分解活性を有した被検知物質だけでなく加水分解活性に影響を及ぼすもの、即ち、基質を直接加水分解する物質に対して作用し、その結果間接的に基質に対する加水分解活性に影響を及ぼすものであれば、いずれの化学物質も検知することができる効果のある汎用性の高い被検知物質検知方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の請求項１記載の発明は、基質を加水分解する酵素活性を利用した被検知物質検知方法であって、被検知物質は加水分解活性を有するかあるいは他の加水分解酵素活性を増減させる性質をもっており、加水分解される基質が固定化された固相面を利用し、前記被検知物質を含んだ検体と前記固相面を接触させ、加水分解されずに前記固相面上に残った基質を検知することで検体の加水分解活性を検知し、検体中の被検知物質を検知することを特徴とした被検知物質の検知方法としたものであり、抗体を利用しない簡単な工程で被検知物質を検知し、加水分解活性を有した化学物質以外でも加水分解活性に影響を及ぼす化学物質であればいずれも検知できるという作用を有する。
【００１７】
また、被検知物質が加水分解活性を持つ酵素であり、被検知物質によって固相面上の基質が加水分解され、被検知物質量によって固相面上に残る基質量が変化することを特徴とした請求項１記載の被検知物質の検知方法としたものであり、加水分解活性を有した酵素を選択的に検知することができる。
【００１８】
また、被検知物質が加水分解活性を持つ酵素に対する阻害物質であり、検体は当該被検知物質が阻害する酵素活性を含んでおり、検体の加水分解活性によって固相面上の基質が加水分解され、被検知物質量によって固相面上に残る基質量が変化することを特徴とした請求項１に記載の被検知物質の検知方法としたものであり、加水分解活性を有した酵素に対する活性阻害物質を選択的に検知できるという作用を有する。
【００１９】
また、被検知物質がプロテアーゼもしくはプロテアーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該プロテアーゼもしくは当該プロテアーゼの阻害物質が阻害するプロテアーゼの認識するアミノ酸配列を含んだポリペプチドからなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、プロテアーゼもしくはプロテアーゼの阻害物質を選択的に検知できるという作用を有する。
【００２０】
また、被検知物質がヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該ヌクレアーゼもしくは当該ヌクレアーゼの阻害物質が阻害するヌクレアーゼの認識する塩基配列を含んだ核酸からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、ヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼの阻害物質を選択的に検知できるという作用を有する。
【００２１】
また、被検知物質がグリコシダーゼもしくはグリコシダーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該グリコシダーゼもしくは当該グリコシダーゼの阻害物質が阻害するグリコシダーゼの認識する糖鎖構造を含んだ糖鎖からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、グリコシダーゼもしくはグリコシダーゼの阻害物質を選択的に検知できるという作用を有する。
【００２２】
また、被検知物質がリパーゼもしくはリパーゼの阻害物質であり、固相面上の基質が当該リパーゼもしくは当該リパーゼの阻害物質が阻害するリパーゼの認識する脂肪酸を含んだ有機酸からなることを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、リパーゼもしくはリパーゼの阻害物質を選択的に検知できるという作用を有する。
【００２３】
また、加水分解活性を持つ酵素が認識する認識配列をもつ基質を固定化した固相面と、加水分解活性を持つ酵素が認識する認識配列を持たない基質を固定化した固相面に、被検知物質を含んだ検体を接触させ、認識配列をもつ基質を固定化した前記固相面上に残った基質量と認識配列を持たない基質を固定化した前記固相面上に残った基質量の差を比較することで被検知物質を検知することを特徴とした請求項４〜７のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、認識配列に特異的な加水分解活性に関する被検知物質をより正確に検知できるという作用を有する。
【００２４】
また、加水分解活性を持つ酵素が認識する配列をもつ基質が複数の固相面に異なる濃度で固定化されていることを特徴とし、前記記載の複数の固相面に被検知物質を含んだ検体を接触させ、固相面上に残った基質量の基質濃度依存性を指標に検体中の被検知物質を検知することを特徴とした請求項４〜７のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、基質濃度に依存した加水分解活性を解析することで加水分解活性の速度論的解析が容易となり、加水分解活性の特性を詳しく知ることができるという作用を有する。
【００２５】
また、被検知物質を含んだ検体を固相面上に接して流れるように反応させることを特徴とし、被検知物質を連続的に検知する請求項１〜９のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、被検知物質を連続的にモニタリングすることができるという作用を有する。
【００２６】
また、固相面上の基質を検知し易くするための信号物質を基質に結合してあることを特徴とし、信号物質の減少量を指標にして固相面上に残った基質量を検知する請求項１〜１０のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、固相面上に残った基質量を簡単に検知でき、その結果、被検知物質を簡単に検知できるという作用を有する。
【００２７】
また、基質に結合した信号物質が蛍光色素であり、固相面上に残った基質量を蛍光強度の減少量によって測定することを特徴とした請求項１１に記載の被検知物質の検知方法としたものであり、固相面上に残った基質量を光学的検知によって迅速且つ正確に検知でき、その結果、被検知物質を迅速且つ正確に検知できるという作用を有する。
【００２８】
また、信号物質が酸化還元電位を発生させる物質であることを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を酸化還元電流の減少量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法としたものであり、固相面上に残った基質量を電気化学的検知によって簡便且つ安価に検知でき、その結果、被検知物質を簡便且つ安価に検知できるという作用を有する。
【００２９】
また、信号物質が磁化特性をもつことを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を磁化特性の変化量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法としたものであり、信号物質の劣化が起こることなく固相面上に残った基質量を磁気センサーによって迅速且つ簡便に検知でき、その結果、被検知物質を迅速且つ簡便に検知できるという作用を有する。
【００３０】
また、信号物質が色素化合物であることを特徴とし、固相面上に残っている基質の量を色素の減少量によって測定する請求項１１に記載の被検知物質の検知方法としたものであり、信号物質の検知手段として特別な検出装置を使うことなく固相面上に残った基質量を簡単且つ安価に検知できその結果、被検知物質を簡単且つ安価に検知できるという作用を有する。
【００３１】
また、基質が固定化された固相面が電極であることを特徴とし、固相面上の基質の分子量に基づく電極活性の変化を指標にして固相面上に残った基質量を検知する請求項１〜１０のいずれかに記載の被検知物質の検知方法としたものであり、信号物質を基質に連結することなく簡単に固相面上に残った基質量を検知することができるという作用を有する。
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００３３】
（実施の形態１）
図１ａ）ｂ）に、加水分解活性を有した被検知物質（Ａ）１を検出する方法を示し、図１ｃ）ｄ）に他の加水分解活性を増減させる性質を持った被検知物質（Ｂ）２を検出する方法を示す。ここで、加水分解活性を増減させる性質とは、例えば加水分解活性を持つものに作用してその加水分解活性を強くしたり、弱くしたりする効果を示す性質である。
【００３４】
図１ａ）に示すように、加水分解活性を有した被検知物質（Ａ）１を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図１ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中の被検知物質（Ａ）１を検知する。
【００３５】
図１ａ）ｂ）において、被検知物質（Ａ）１とは、例えばＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を加水分解する希土類の一種セリウム（ＩＶ）イオンであり、この場合、基質３はＤＮＡやＲＮＡなどの核酸であって固相面４に固定化されている。ＤＮＡやＲＮＡを固定化する固相面４は例えばガラスや酸化スズに代表される導電性酸化物などの鉱物で形成されたものであって、この場合の固定化手段としては、γ―アミノプロピルトリエトキシランなどのシランカップリング剤で処理し導入されたアミノ基にグルタルアルデヒドなどのニ官能性試薬を作用させた後ＤＮＡのアミノ基と反応させる方法がある。なお、被検知物質（Ａ）１は基質３を加水分解するものであれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができ、上記方法以外に、例えば、アビジンを吸着させたガラスなどの固相面４にアビジンを吸着させ、ビオチンを化学結合させたＤＮＡもしくはＲＮＡを反応し結合させる方法がある。なお、基質３は被検知物質（Ａ）１によって加水分解されるものであれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができる。なお、基質３を固定化する手段と固相面４は基質３を堅持させることができれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができる。
【００３６】
また、図１ａ）ｂ）において、被検知物質（Ａ）１を固相面４に接触させる方法としては、例えば被検知物質（Ａ）１であるセリウム（ＩＶ）イオンが溶解した溶液をピペットなどの操作で固相面４上に滴下する方法であり、これ以外の方法であっても被検知物質（Ａ）１を固相面４に接触させる方法であれば同様の検知ができる。
【００３７】
また、図１ａ）ｂ）において、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば基質３であるＤＮＡをあらかじめキレート剤であるＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩによる発光強度をＵＶ励起によって光学的に検知し、被検知物質（Ａ）１を接触させる前と接触させた後の変化量を検知する方法であり、あるいは、ＤＮＡにその他の色素をあらかじめ結合させておき、同様に変化量を検知する方法である。なお、上記記載の方法以外であっても、被検知物質（Ａ）１を固相面４に接触させる前後の基質変化量を検知できるものであればいずれの場合でも同様の検知ができる。
【００３８】
上記構成において、被検知物質（Ａ）１であるセリウム（ＩＶ）イオンに対する抗体がなくても、セリウム（ＩＶ）イオンの持つＤＮＡに対する加水分解活性を指標に、セリウム（ＩＶ）イオンの存在を検出することができるようになる。また、検知するための工程は、被検知物質（Ａ）１と固相面４の接触工程と固相面４上に残った基質３の量を検知するという単純な工程であるため、簡単に被検知物質（Ａ）１を検知することができる。また、被検知物質（Ａ）１が加水分解活性を持つものであれば、その加水分解活性を指標に検知することができるため、様々なタイプの被検知物質（Ａ）１を検知することができ、汎用性が高い検知方法となる。従って、セリウム（ＩＶ）イオンのようにＤＮＡ上の特定の塩基配列に対して高い基質特異性を持たずＤＮＡの塩基配列であれば加水分解活性を示すものであっても、上記方法によって高い基質特異性を持っていなくても簡単に検知することができる。
【００３９】
図１ｃ）に示すように、加水分解活性を増減させる性質を持った被検知物質（Ｂ）２と加水分解活性を有した物質５を結合させ、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図１ｄ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中の被検知物質を検知する。
【００４０】
図１ｃ）ｄ）において、被検知物質（Ｂ）２とは、例えば金属プロテアーゼであるマトリックスメタロプロテイナーゼの補酵素であるＺｎイオンであり、Ｚｎイオンは加水分解活性を有した物質５であるマトリックスメタロプロテイナーゼに結合する事で加水分解活性を増大させる。
【００４１】
また、図１ｃ）ｄ）において、加水分解活性を有した物質５は被検知物質（Ｂ）２と混合した状態で固相面４に接触される必要があり、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼが溶解しＺｎイオンを含んでいない溶液中にＺｎイオンが含まれている溶液を混合し、混合溶液を例えばピペットなどの操作で固相面４に滴下される。
【００４２】
また、図１ｃ）ｄ）において、加水分解活性を有した物質５がマトリックスメタロプロテイナーゼである場合、基質３はゼラチンなどのタンパク質であって固相面４に固定化されている。ゼラチンなどのタンパク質を固定化する固相面４は例えばガラスや酸化スズに代表される導電性酸化物などの鉱物で形成されたものであって、この場合の固定化手段としては、γ―アミノプロピルトリエトキシランなどのシランカップリング剤で処理し導入されたアミノ基にグルタルアルデヒドなどのニ官能性試薬を作用させた後ゼラチンのアミノ基と反応させる方法がある。なお、被検知物質（Ｂ）２は上記記載のもの以外であっても加水分解活性を有した物質５の加水分解活性を増減させるものであればいずれの場合であっても同様の検知ができる。なお、加水分解活性を有した物質５は基質３を加水分解するものであれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができる。なお、基質３は加水分解活性を有した物質５によって加水分解されるものであれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができる。なお、基質３を固定化する手段と固相面４は基質３を堅持させることができれば上記記載のもの以外であっても同様の検知ができる。
【００４３】
また、図１ｃ）ｄ）において、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば基質３であるゼラチンに色素をあらかじめ結合させておき、被検知物質（Ｂ）２と加水分解活性を有した物質５を接触させる前後の変化量を検知する方法である。なお、上記記載の方法以外であっても、被検知物質（Ｂ）２と加水分解活性を有した物質５を接触させる前後の変化量を検知できるものであればいずれの場合でも同様の検知ができる。
【００４４】
上記構成において、被検知物質（Ｂ）２であるＺｎイオンに対する抗体がなくても、Ｚｎイオンの持つマトリックスメタロプロテイナーゼに対する加水分解活性増減効果を指標に、Ｚｎイオンの存在を検出することができるようになる。また、検知するための工程は、被検知物質（Ｂ）２と加水分解活性を有した物質５を混合させる工程と、固相面４の接触工程と、固相面４上に残った基質３の量を検知するという単純な工程であるため、簡単に被検知物質（Ｂ）２を検知することができる。また、被検知物質（Ｂ）２が加水分解活性を有した物質５の加水分解活性を増減させるものであれば、その加水分解活性増減効果を指標に検知することができるため、様々なタイプの被検知物質（Ａ）１を検知することができ、汎用性が高い検知方法となる。
【００４５】
（実施の形態２）
図２に、被検知物質である加水分解酵素６を検出する方法を示す。
【００４６】
図２ａ）に示すように、加水分解酵素６を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図２ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、加水分解酵素６を検知する。
【００４７】
また、図２ｃ）に示すように、被検知物質である加水分解酵素６が図２ａ）に比べて多く存在する場合は、図２ｄ）に示すように、固相面４上の基質３が図２ｂ）に比べて多く加水分解され、すなわち、加水分解酵素６の存在量に依存して固相面４上に残る基質３の量が変わる。このように固相面４上の基質３の量を検知することで、被検知物質である加水分解酵素の量を検知する。
【００４８】
図２において、加水分解酵素６とは、例えばＤＮａｓｅなどの核酸を加水分解するヌクレアーゼであり、この場合、基質３はＤＮＡであって固相面４に固定化されている。なお、加水分解酵素はヌクレアーゼ以外でもプロテアーゼやグリコシダーゼなど多の加水分解酵素であっても、加水分解酵素によって切断されるタンパク質や糖鎖などの高分子を基質３として用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、被検知物質である加水分解酵素６を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００４９】
上記構成において、加水分解酵素６であるヌクレアーゼがヌクレアーゼの存在量に依存して固相面４上のＤＮＡを切断し、固相面４上に残った基質３はヌクレアーゼの存在量に反比例して減少する。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているヌクレアーゼを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないヌクレアーゼの存在量を検知することができる。このようにして基質３に対して加水分解活性をもった加水分解酵素６を簡単に検知することができる。
【００５０】
（実施の形態３）
図３に、被検知物質である加水分解活性をもった酵素に対する阻害物質７を検出する方法を示す。ここで、酵素に対する阻害物質とは、酵素に直接作用して酵素活性を損なわせる、あるいは酵素と基質との反応を競合的に阻害するものである。
【００５１】
図３ａ）に示すように、加水分解酵素６と阻害物質７を混合し、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図３ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、阻害物質７を検知する。
【００５２】
また、図３ｃ）に示すように、被検知物質である阻害物質７が図３ａ）に比べて多く存在する場合は、図３ｄ）に示すように、固相面４上の基質３が図３ｂ）に比べて多く残り、すなわち、阻害物質７の存在量に依存して固相面４上に残る基質３の量が変わる。このように固相面４上の基質３の量を検知することで、被検知物質である加水分解酵素の量を検知する。
【００５３】
図３において、阻害物質７とは、例えばセルピンの一種であるアンチトロンビンであり、この場合、加水分解酵素６とは、例えばセリンプロテアーゼの一種であるトロンビンである。この場合、基質３はトロンビンによって加水分解されるタンパク質であって固相面４に固定化されている。なお、阻害物質７はセルピン以外であっても、加水分解酵素６の酵素活性を阻害するものであれば加水分解酵素６によって切断される高分子を基質３として用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、被検知物質である加水分解酵素６を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。なお、基質３となるタンパク質を固定化する手段として固相面４に導入されたアミノ基に縮合剤を用いてFmoc−アミノ酸をアミド結合あるいはエステル結合させ、固相面上でタンパク質合成する方法などを用いてもかまわない。
【００５４】
上記構成において、阻害物質７であるアンチトロンビンによって酵素活性を阻害される加水分解酵素が、アンチトロンビンの存在量に反比例して固相面４上の基質３であるタンパク質を切断し、固相面４上に残った基質３はセルピンの存在量に比例して多くなる。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているアンチトロンビンとトロンビンを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないアンチトロンビンの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解する加水分解酵素に対して阻害活性を持った阻害物質７を簡単に検知することができる。
【００５５】
（実施の形態４）
図４ａ）ｂ）に、プロテアーゼ８を検出する方法を示し、図４ｃ）ｄ）にプロテアーゼ阻害物質９を検出する方法を示す。
【００５６】
図４ａ）に示すように、タンパク質やペプチドを加水分解する加勢を持ったプロテアーゼ８を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図４ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中のプロテアーゼ８を検知する。この際、プロテアーゼ８は基質３が持つ認識配列１０を特異的に切断する。
【００５７】
図４において、プロテアーゼ８とは、例えばプロテアーゼ活性をもったボツリヌス毒素であり、この場合、基質３が持つ認識配列１０はボツリヌス毒素が特異的に認識し切断するアミノ酸配列であり、例えばＶＡＮＰやＳＮＡＰ−２５あるいはシンタキシンなどの神経伝達物質の分泌に関与しているタンパク質もしくはこれらタンパク質の一部の配列を含むものである。そして、基質３はＶＡＮＰやＳＮＡＰ−２５あるいはシンタキシンなどのタンパク質そのもの、あるいはこれらタンパク質のアミノ酸配列を持った融合タンパク質であり固相面４に固定化されている。なお、プロテアーゼ８はボツリヌス毒素以外であっても、特定のアミノ酸配列を認識し切断する活性を持つものであれば、認識配列１０として特定のアミノ酸配列を持つ基質３を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、被検知物質である加水分解酵素６を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。なお、基質３となるタンパク質を固定化する手段として固相面４に導入されたアミノ基に縮合剤を用いてＦｍｏｃ−アミノ酸をアミド結合あるいはエステル結合させ、固相面上でタンパク質合成する方法などを用いてもかまわない。
【００５８】
上記構成において、プロテアーゼ８であるボツリヌス毒素によって基質３のもつ認識配列１０が選択的に加水分解され、ボツリヌス毒素の存在量に反比例して固相面４上の基質３であるタンパク質が減少する。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているボツリヌス毒素を用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないボツリヌス毒素の存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するプロテアーゼ８を特異的に検知することができる。
【００５９】
図４ｃ）に示すように、プロテアーゼ８とプロテアーゼ阻害物質９を混合し、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図４ｄ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、プロテアーゼ阻害物質９を検知する。
【００６０】
図４において、プロテアーゼ阻害物質９とは、例えばα２−マクログロブリンであり、この場合、共存させるプロテアーゼ８とは例えばトロンビンなどである。この場合、基質３はトロンビンによって加水分解されるタンパク質であって、例えば分子内にバリン−プロリン−アルギニンといったトロンビンに選択的に切断される認識配列１０を持っており固相面４に固定化されている。なお、プロテアーゼ阻害物質９はα２−マクログロブリン以外であっても、プロテアーゼ８の酵素活性を阻害するものであればプロテアーゼ８によって特異的に切断される認識配列１０を持ったタンパク質あるいは認識配列１０を含んだ融合タンパク質あるいはペプチドを基質３として用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、被検知物質である加水分解酵素６を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００６１】
上記構成において、プロテアーゼ阻害物質９であるα２−マクログロブリンによって阻害されるプロテアーゼ８が、α２−マクログロブリンの存在量に反比例して固相面４上の認識配列１０を持った基質３を特異的に切断し、固相面４上に残った基質３はα２−マクログロブリンの存在量に比例して多くなる。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているα２−マクログロブリンを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないα２−マクログロブリンの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するプロテアーゼ８に対して阻害活性を持ったプロテアーゼ阻害物質９の量を特異的に検知することができる。
【００６２】
上記構成の検知方法を用いることで、プロテアーゼである毒素や、血液中に含まれる臨床マーカーを抗体の使用なしに簡単に特異的に検知することができる。
【００６３】
上記方法の検知方法で検知可能なものとしては、プロテアーゼ活性を持ったボツリヌス毒素や破傷風毒素のほかある種の蛇毒や、癌マーカーのひとつであるアンジオスタチンやエイズウイルスに含まれるＨＩＶプロテアーゼや、ネフローゼ症候群のマーカーであるα２マクログロブリンなどその他プロテアーゼ活性やプロテアーゼ阻害活性を持ったものが挙げられる。
【００６４】
（実施の形態５）
図５ａ）ｂ）に、ヌクレアーゼ１１を検出する方法を示し、図５ｃ）ｄ）にヌクレアーゼ阻害物質１２を検出する方法を示す。
【００６５】
図５ａ）に示すように、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を加水分解する活性を持ったヌクレアーゼ１１を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図５ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中のヌクレアーゼ１１を検知する。この際、ヌクレアーゼ１１は基質３が持つ認識配列１０を特異的に切断する。
【００６６】
図５において、ヌクレアーゼ１１とは、例えばヌクレアーゼ活性をもった制限酵素ＳｍａＩであり、この場合、基質３が持つ認識配列１０は−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列であり、基質３は認識配列１０を含んだＤＮＡであり固相面４に固定化されている。なお、ヌクレアーゼ１１は制限酵素ＳｍａＩ以外であっても、ＤＮＡ上の特定の塩基配列を認識し切断する活性を持つものであれば、認識配列１０として特定の塩基配列を持つ基質３を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、ヌクレアーゼ１１を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。なお、基質３となるＤＮＡを固定化する手段として固相面４をポリ−Ｌ−リジンで被覆し、静電的に固定化する方法などを用いてもかまわない。
【００６７】
上記構成において、ヌクレアーゼ１１であるＳｍａＩによって基質３のもつ認識配列１０が選択的に加水分解され、ＳｍａＩの存在量に反比例して固相面４上の基質３であるＤＮＡが減少する。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているＳｍａＩを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないＳｍａＩの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するヌクレアーゼ１１を特異的に検知することができる。
【００６８】
図５ｃ）に示すように、ヌクレアーゼ１１とヌクレアーゼ阻害物質１２を混合し、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図５ｄ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、ヌクレアーゼ阻害物質１２を検知する。
【００６９】
図５において、ヌクレアーゼ阻害物質１２とは、例えば−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列を持ったＤＮＡであり、この場合、共存させるヌクレアーゼ１１とは例えば制限酵素であるＳｍａＩである。この場合、基質３はＳｍａＩによって特異的に切断される−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列を持った認識配列１０を持っており、固相面４に固定化されている。ここで、ヌクレアーゼ阻害物質１２と認識配列１０は同じ塩基配列を持っており、ヌクレアーゼ阻害物質１２が存在することでヌクレアーゼ１１が認識配列１０を切断する活性を競合的に阻害する。なお、ヌクレアーゼ１１とヌクレアーゼ阻害物質１２の組み合わせは上記以外のものであっても、特異的な配列を認識して切断するヌクレアーゼ１１であれば、ヌクレアーゼ阻害物質１２と同じ塩基配列を持った認識配列１０を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、ヌクレアーゼ阻害物質１２を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００７０】
上記構成において、ヌクレアーゼ阻害物質１２である−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列を持ったＤＮＡによって阻害されるヌクレアーゼ１１が、ヌクレアーゼ阻害物質１２の存在量に反比例して固相面４上の認識配列１０を持った基質３を特異的に切断し、固相面４上に残った基質３はヌクレアーゼ阻害物質１２の存在量に比例して多くなる。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっている−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列を持ったＤＮＡを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからない−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列を持ったＤＮＡの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するヌクレアーゼ１１に対して阻害活性を持ったヌクレアーゼ阻害物質１２の量を特異的に検知することができる。
【００７１】
（実施の形態６）
図６ａ）ｂ）に、グリコシダーゼ１３を検出する方法を示し、図６ｃ）ｄ）にグリコシダーゼ阻害物質１４を検出する方法を示す。
【００７２】
図６ａ）に示すように、糖鎖を加水分解する活性を持ったグリコシダーゼ１３を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図６ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中のグリコシダーゼ１３を検知する。この際、グリコシダーゼ１３は基質３が持つ認識配列１０を特異的に切断する。
【００７３】
図６において、グリコシダーゼ１３とは、例えばシアル酸を加水分解する活性をもったインフルエンザウイルスのノイラミンデースであり、この場合、基質３が持つ認識配列１０はノイラミンデースが特異的に加水分解するノイラミン酸であり、基質３は認識配列１０を含んだ糖鎖であり固相面４に固定化されている。なお、グリコシダーゼ１３はノイラミンデース以外であっても、糖鎖構造の特定の糖鎖を認識し切断する活性を持つものであれば、認識配列１０として特定の糖鎖構造を持つ基質３を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、グリコシダーゼ１３を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。なお、基質３となる糖鎖を固定化する手段として固相面４をアビジンで被覆し、ビオチン標識した糖鎖をビオチンーアビジン反応によって固定化する方法などを用いてもかまわない。
【００７４】
上記構成において、グリコシダーゼ１３であるノイラミンデースによって基質３のもつ認識配列１０が選択的に加水分解され、ノイラミンデースの存在量に反比例して固相面４上の基質３である糖鎖が減少する。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているノイラミンデースを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないノイラミンデースの存在量を検知することができ、インフルエンザウイルスの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するグリコシダーゼ１３を特異的に検知することができる。
【００７５】
図６ｃ）に示すように、グリコシダーゼ１３とグリコシダーゼ阻害物質１４を混合し、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図６ｄ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、グリコシダーゼ阻害物質１４を検知する。
【００７６】
図６において、グリコシダーゼ阻害物質１４とは、例えばインフルエンザ治療薬などのノイラミン酸の誘導体であり、この場合、共存させるグリコシダーゼ１３とはノイラミンデースである。この場合、基質３はノイラミンデースによって特異的に切断されるノイラミン酸を含んだ糖鎖である認識配列１０を持っており固相面４に固定化されている。なお、グリコシダーゼ１３とグリコシダーゼ阻害物質１４の組み合わせは上記以外のものであっても、特異的な糖鎖構造を認識して切断するグリコシダーゼ１３であれば同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、ヌクレアーゼ阻害物質１２を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００７７】
上記構成において、グリコシダーゼ阻害物質１４であるノイラミン酸誘導体によって阻害されるグリコシダーゼ１３が、グリコシダーゼ阻害物質１４の存在量に反比例して固相面４上の認識配列１０を持った基質３を特異的に切断し、固相面４上に残った基質３はグリコシダーゼ阻害物質１４の存在量に比例して多くなる。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているノイラミン酸誘導体を用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわかっていないノイラミン酸誘導体の存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するグリコシダーゼ１３に対して阻害活性を持ったグリコシダーゼ阻害物質１４の量を特異的に検知することができる。
【００７８】
上記構成の検知方法を用いることでインフルエンザウイルスなどを抗体の利用なしに特異的に簡単に検知することができ、また、上記方法を用いて効果的なインフルエンザ治療薬をスクリーニング方法としても利用することができる。
【００７９】
（実施の形態７）
図７ａ）ｂ）に、リパーゼ１５を検出する方法を示し、図７ｃ）ｄ）にリパーゼ阻害物質１６を検出する方法を示す。
【００８０】
図７ａ）に示すように、脂肪酸を加水分解する活性を持ったリパーゼ１５を、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図７ｂ）に示すように、固相面４上に残った基質３を検知することで、加水分解活性を検知し、検体中のリパーゼ１５を検知する。この際、リパーゼ１５は基質３が持つ認識配列１０を特異的に切断する。
【００８１】
図７において、リパーゼ１５とは、例えばスフィンゴミエリンを加水分解する活性をもったスフィンゴミエリナーゼあり、この場合、基質３が持つ認識配列１０はスフィンゴミエリナーゼが特異的に加水分解するスフィンゴミエリンであり、基質３は認識配列１０を含んだ脂肪酸であり固相面４に固定化されている。なお、リパーゼ１５はスフィンゴミエリナーゼ以外であっても、脂肪酸の特定の構造を認識し切断する活性を持つものであれば、認識配列１０として特定の脂肪酸を持つ基質３を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、リパーゼ１５を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００８２】
上記構成において、リパーゼ１５であるスフィンゴミエリナーゼによって基質３のもつ認識配列１０が選択的に加水分解され、スフィンゴミエリナーゼの存在量に反比例して固相面４上の基質３である糖鎖が減少する。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているスフィンゴミエリナーゼを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからないスフィンゴミエリナーゼの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するリパーゼ１５を特異的に検知することができる。
【００８３】
図７ｃ）に示すように、リパーゼ１５とリパーゼ阻害物質１６を混合し、加水分解される基質３が固定化された固相面４に接触させ、図５ｄ）に示すように、固相面４上に残った基質３の量を検知することで、リパーゼ阻害物質１６を検知する。
【００８４】
図７において、リパーゼ阻害物質１６とは、例えばスフィンゴミエリナーゼに加水分解されるスフィンゴミエリンであり、この場合、共存させるリパーゼ１５とは例えばスフィンゴミエリナーゼである。この場合、基質３はスフィンゴミエリナーゼによって特異的に切断されるスフィンゴミエリンを持った認識配列１０を持っており固相面４に固定化されている。ここで、リパーゼ阻害物質１６と認識配列１０は同じ脂肪酸を含んであり、リパーゼ阻害物質１６が存在することでリパーゼ１５が認識配列１０を切断する活性を競合的に阻害する。なお、リパーゼ１５とリパーゼ阻害物質１６の組み合わせは上記以外のものであっても、特異的な配列を認識して切断するリパーゼ１５であれば、リパーゼ阻害物質１６と同じ脂肪酸を持った認識配列１０を用いることで同様の検知ができる。また、基質３を固相面４に固定化する方法としては、例えば実施の形態１に示した方法などがあり、また、リパーゼ阻害物質１６を固相面４に接触させる方法としては、例えば実施の形態１に記した方法があり、また、固相面４上に残った基質３を検知する手段としては、例えば実施の形態１に記した方法がある。
【００８５】
上記構成において、リパーゼ阻害物質１６であるスフィンゴミエリンによって阻害されるリパーゼ１５が、リパーゼ阻害物質１６の存在量に反比例して固相面４上の認識配列１０を持った基質３を特異的に切断し、固相面４上に残った基質３はリパーゼ阻害物質１６の存在量に比例して多くなる。そして、固相面４上に残った基質３の量を検知し、あらかじめ存在量のわかっているスフィンゴミエリンを用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわかっていないスフィンゴミエリンの存在量を検知することができる。このようにして基質３を分解するリパーゼ１５に対して阻害活性を持ったリパーゼ阻害物質１６の量を特異的に検知することができる。
【００８６】
上記構成の検知方法を用いることでウルシュ菌のもつα毒素などリパーゼ活性を持った酵素を抗体の使用なしに特異的に簡単に検知することができる。
【００８７】
（実施の形態８）
図８には、酵素の認識配列１０を含んだ基質３を固定化した固相面４と認識配列１０を含まない基質３を固定化した固相面４に被検知物質（Ａ）１を反応させ、両固相面４に残った基質３量の差を比較することで被検知物質（Ａ）１を検知する方法を示した。
【００８８】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質を検知する際、図８のａ）に示したように、被検知物質（Ａ）１を、認識配列１０を含んだ基質３を固定化した固相面４と認識配列１０を含まない基質３を固定化した固相面４に接触させ、図８のｂ）に示したように、認識配列１０を含んだ基質３のみ加水分解させ、認識配列１０を含まない基質３は加水分解されない状況をつくる。そして両固相面４上に残った基質３の量を比較し、認識配列１０を含んだ基質３の方が認識配列１０を含まない基質３よりも減っていた場合は認識配列１０を特異的に加水分解する被検知物質（Ａ）１が存在していると判断される。ここで、認識配列１０を含んだ基質３と認識配列１０を含まない基質３が同等に減っていた場合は、認識配列に特異的でない加水分解活性を持った被検知物質（Ａ）１が存在していると判断される。ここで、例えばヌクレアーゼ１１である制限酵素ＳｍａＩを被検知物質（Ａ）１とした場合、認識配列１０として−ＣＣＣＧＧＧ−で示される塩基配列があり、−ＣＣＣＧＧＧ−塩基配列を持ったＤＮＡと−ＣＣＣＧＧＧ−塩基配列を持たないＤＮＡをそれぞれ固相面４に固定化する。固定化手段と固相面は例えば実施の形態１に示した方法がある。また、固相面４上に残った基質３を検知する方法としては例えば実施の形態１に示した方法がある。
【００８９】
すなわち図８ｃ）のフローチャートに示したように、被検知物質（Ａ）１を含んだ検体を固相面４に反応させ基質３を切断させる工程、認識配列１０を含んだ基質３の残量と認識配列１０を含まない基質３の残量を検知する工程、両基質３の残量を比較判断し、認識配列１０を含んだ基質３特異的に減った量を検知する工程、認識配列１０を含んだ基質３特異的に減った基質３量を元に加水分解活性を検知し、被検知物質（Ａ）１量に換算する工程を含む。
【００９０】
なお、ここでは認識配列１０が１種類の場合において認識配列１０を持つ基質３の残量と持たない基質３の残量を比較する場合を示したが、複数の認識配列１０を別々の固相面４に固定化することで、加水分解活性を持つ複数の被検知物質を同時に検知することができるようになる。
【００９１】
上記構成において、被検知物質（Ａ）１の存在量に依存して認識配列１０を含んだ基質３が加水分解され、認識配列１０に特異的な加水分解活性を指標に被検知物質（Ａ）１を検知することができる。そして、あらかじめ存在量のわかっている被検知物質（Ａ）１を用いて検知した固相面４上に残った基質３の量と比較することで、存在量のわからない被検知物質（Ａ）１の存在量を検知することができる。このようにして認識配列１０に対して特異的な加水分解活性をもった被検知物質（Ａ）１を簡単に検知することができる。
【００９２】
（実施の形態９）
図９には、加水分解活性を持つ酵素が認識する配列をもつ基質３が複数の固相面４に異なる濃度で固定化させ、被検知物質（Ａ）１を反応させた後固相面４上に残った基質量の基質濃度依存性を指標に被検知物質（Ａ）１を検知する方法を示した。
【００９３】
実施の形態１〜７に示した被検知物質を検知する際、図９ａ）に示したように、被検知物質（Ａ）１を、認識配列１０を含んだ基質３を異なる濃度で固定化した固相面４に接触させ、図９ｂ）に示したように、認識配列１０を持った基質３の濃度に依存して被検知物質（Ａ）１が基質を加水分解する状況をつくる。そして、これら異なる濃度の認識配列１０を持つ基質３が固定化された固相面に残った基質量を検知し比較することで、加水分解活性の異なる基質濃度に対する分解速度を知ることができる。異なる基質濃度に対する分解速度をプロットすることで、被検知物質（Ａ）１を特徴付ける酵素活性の反応速度論的な解釈、即ち、加水分解される基質の生成速度から個々の加水分解酵素特有の加水分解速度を推測することができる。図９ｃ）に示したようなプロット図から、酵素活性のＶmaxを知ることができ、被検知物質（Ａ）１の酵素活性がどの程度特異性を持っているか知ることができ、また、酵素は特有の分解速度を有していることから、被検知物質（Ａ）１を特定することも可能となる。
【００９４】
上記構成において、被検知物質（Ａ）１を検知することができ、また、異なる濃度の認識配列１０を持った基質３に対する分解速度を知ることができ、被検知物質（Ａ）１の加水分解活性の反応速度論的解釈が可能となる。
【００９５】
また、上記記載の方法を利用して、被検知物質（Ａ）１の酵素活性に影響する物質で、例えばウイルスの治療薬などをスクリーニングすることも可能となる。
【００９６】
（実施の形態１０）
図１０に、被検知物質（Ａ）１を含んだ検体１７を固相面４上に接して流れるように反応させることを特徴とし、被検知物質を連続的に検知する方法を示した。
【００９７】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質を検知する際、図１０ａ）〜ｃ）に示したように、被検知物質（Ａ）１を含む検体１７を固相面４上に接する要に連続的に流す。連続的に流す手段としては、例えば固相面４上に溶液の流れる流路を設け、流路に被検知物質（Ａ）１を含んだ検体をポンプなど用いて流入させる方法がある。また、図１０ａ）に示したように、検体１７中に被検知物質（Ａ）１以外の混合物質１８が多数含まれており、被検知物質（Ａ）１が含まれていない時は、被検知物質（Ａ）１によって特異的に加水分解される認識配列１０を持った基質３は分解されない。図１０ｂ）に示したように、被検知物質（Ａ）１が含まれた検体１７が固相面４上に流れてきたさい、被検知物質（Ａ）１によって固相面４上の基質３が認識配列１０で加水分解される。固相面４上の基質量を連続的にモニタリングすることで、基質３が加水分解されるタイミングを知ることができる、検体１７中に被検知物質（Ａ）１が混入されたタイミングを知ることができる。
【００９８】
上記構成において、認識配列１０に対して特異的は酵素活性を持った被検知物質（Ａ）１を連続的にモニタリングすることができる。
【００９９】
（実施の形態１１）
図１１に、基質を検知しやすくするための信号物質１９を基質３に結合させた検知方法を示した。
【０１００】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、固相面４上に残った基質３の量を検知する必要がある。固相面４上に固定化されたタンパク質やＤＮＡなどの高分子を検知しやすくするための信号物質１９として、例えばＦＩＴＣなどの蛍光物質やＧＦＰなどの蛍光タンパク質、あるいは、磁化特性や酸化還元力を持った希土類などを利用することで、信号物質の量を蛍光強度あるいは磁力あるいは酸化還元電流を検知し、基質量を検知することができるようになる。また、信号物質１９を基質３である高分子に結合させる手段として、例えばグルタルアルデヒドなどの架橋試薬を用いる方法があり、あるいはＧＦＰやＨＲＰなどの酵素を結合させる方法としては、基質３であるタンパク質もしくはペプチドと融合タンパク質として合成する方法がある。なお、信号物質１９を重量のある大きな高分子とする場合は固相面４に金を用い、表面プラズモンを利用して検知することもできる。
【０１０１】
上記構成において、基質３単独では検知しにくい場合であっても、信号物質１９を結合することで基質３量を簡単に検知することができるようになり、被検知物質（Ａ）１を簡単に検知することができるようになる。
【０１０２】
（実施の形態１２）
図１２に信号物質を蛍光色素２０とした検知方法を示す。
【０１０３】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、図１２ａ）ｂ）に示したように蛍光色素２０を結合させた基質３を固相面４に固定化させ、蛍光検知手段２１を用いて蛍光色素２０を検知する。蛍光色素２０としては、例えばＦＩＴＣなどがあり、蛍光色素２０を基質３に結合させる手段としてはグルタルアルデヒドを用いて架橋する方法があるが、その他の蛍光色素２０を他の架橋手段を用いて基質３に結合させてもかまわない。なお、蛍光色素２０としてＧＦＰなどの蛍光タンパク質を用いる場合は、基質３であるタンパク質と融合タンパク質として合成してもかまわない。また、蛍光検知手段２１としては発光素子としてＬＥＤを用い、受光素子としてフォトダイオードなどを利用した光センサなどを用いて蛍光強度を検知する方法がある。
【０１０４】
また、図１２ａ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる前の蛍光強度と図１２ｂ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させた後の蛍光強度を比較することで、被検知物質によって特異的に加水分解された基質３の量を知ることができる。
【０１０５】
上記構成において、蛍光色素２０による蛍光強度を蛍光検知手段２１で検知することで簡単に固相面４上の基質３を検知することができるようになり、被検知物質（Ａ）１を簡単に高感度に検知することができるようになる。
【０１０６】
（実施の形態１３）
図１３に、信号物質として、酸化還元電位を発生させる物質２２を利用した検知方法を示す。
【０１０７】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、図１３ａ）ｂ）に示したように酸化還元電位を発生させる物質２２を結合させた基質３を固相面４に固定化させ、電流検知手段２３を用いて酸化還元電流を検知する。酸化還元電位を発生させる物質２２としては、例えばＨＲＰなどの酸化還元酵素があり、この場合電流検知手段２３としてはＨＲＰによって過酸化水素が酸化される際に放出される電子をＦＭＡなどのメディエーターを通じて金電極を用いて電流知として検知する方法がある。なお、基質３をＤＮＡとした場合、へキストなどのインターカレーターをＤＮＡに結合させ、ヘキストによる酸化電流を検知する方法でもかまわない。なお、希土類などを酸化還元電位を発生させる物質２２として使用することもできる。
【０１０８】
また、図１３ａ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる前の電流量と図１３ｂ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる後の電流量を比較することで、被検知物質（Ａ）１によって特異的に加水分解された基質３の量を知ることができる。
【０１０９】
上記構成において、酸化還元電位を発生させる物質２２により発生する酸化還元電流を電流検知手段２３で検知することで、被検知物質（Ａ）１を簡単に検知することができるようになる。
【０１１０】
（実施の形態１４）
図１４に、信号物質として、磁化特性をもった磁化物質２４を利用した検知方法を示す。
【０１１１】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、図１４ａ）ｂ）に示したように磁化物質２４を結合させた基質３を固相面４に固定化させ、磁気検知手段２５を用いて磁気を検知する。磁化物質２４としては、例えば希土類などの硬質磁性材料があり、この場合磁気検知手段２５としては可飽和コイルなどを用いた磁気センサーを用いて検知する方法がある。なお、上記記載以外のものであっても、磁化特性を有する材料であれば同様に磁気センサーを用いて検知することが可能となる。
【０１１２】
また、図１４ａ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる前の磁気量と図１４ｂ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる後の磁気量を比較することで、被検知物質（Ａ）１によって特異的に加水分解された基質３の量を知ることができる。
【０１１３】
上記構成において、磁化物質２４の磁化特性を磁気検知手段２５で検知することで、被検知物質（Ａ）１を簡単に検知することができるようになる。
【０１１４】
（実施の形態１５）
図１５に、信号物質として、可視できる色素２６を利用した検知方法を示す。
【０１１５】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、図１５ａ）ｂ）に示したように色素２６を結合させた基質３を固相面４に固定化させ、肉眼で基質量を確認する。色素２６としては、例えばルテニウムなどの金属錯体があり、その他、可視光に吸収ピークのある色素であれば同様に用いることができる。図１４ａ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる前の色素量と図１４ｂ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる後の色素量を比較することで、被検知物質（Ａ）１によって特異的に加水分解された基質３の量を知ることができる。
【０１１６】
上記構成において、色素２６を用いることで、被検知物質（Ａ）１を特別な検知手段を必要とせず簡単に検知することができるようになる。
【０１１７】
（実施の形態１６）
図１６に、電極２７を固相面とし、電極２７に基質３を固定化し、電極２７上の基質３の分子量に基づく電極２７の電極活性を指標にして、電気化学測定法にて基質量を検知する方法を示す。ここで電極活性とは、電極界面の電子の移動しやすさのことである。
【０１１８】
実施の形態１〜７に示した様に被検知物質（Ａ）１を検知する際、図１６ａ）ｂ）に示した様に固相面を電極２７とし、電極２７上に基質３を固定化してある。固定化された基質量は、基質３の分子量に応じて電極２７の電極活性が変化することを利用して検知される。電極としては、白金、金、グラッシーカーボン、グラファイトや酸化スズに代表される導電性酸化物などで構成されており、電極２７の電極活性を検知する手段としては、例えば水などの電解質を介し基質３を固定化した電極と基質３を固定化していない電極間を流れる電流を測定する方法があり、電極２７上に固定化された基質３の分子量に応じて電極間を流れる電流が阻害されるため、流れる電流量から基質３の量を見積もることができる。なお電気化学的に電極の特性を測定する方法であればいずれの場合であっても同様の検知方法ができる。また、図１５ａ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる前の基質量と図１５ｂ）に示すような被検知物質（Ａ）１を反応させる後の基質量を比較することで、被検知物質（Ａ）１によって特異的に加水分解された基質３の量を知ることができる。
【０１１９】
上記構成において、特別な信号物質を基質３に導入することなく電極活性の変化を利用することで基質量を検知することができ、簡単な構成の固相面を用いて被検知物質（Ａ）１を検知することができるようになる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の被検知物質検知方法を用いて、加水分解活性に関与する様々な化学物質を選択的に検知することができ、且つ抗体の特性に依存しないバイオセンサーをつくることができる。本発明の検知方法を利用したバイオセンサーを用いることで、食品中に混入したボツリヌス毒素に代表されるプロテアーゼ活性を有した毒素を容易に検知することができ、また、血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に代表される様々な疾患マーカーを容易に検知することができ、また、ノイラミンデース活性を有したインフルエンザウイルスやプロテアーゼ活性を有したダニアレルゲンなど空気中を浮遊し人体の健康に悪影響を及ぼす化学物質を検知することにも応用できる。また、加水分解活性を有した酵素やその阻害物質等のスクリーニング、活性測定などの研究用途にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明の実施の形態１の被検知物質検知方法を示す図
【図２】本発明の実施の形態２の被検知物質検知方法を示す図
【図３】本発明の実施の形態３の被検知物質検知方法を示す図
【図４】本発明の実施の形態４の被検知物質検知方法を示す図
【図５】本発明の実施の形態５の被検知物質検知方法を示す図
【図６】本発明の実施の形態６の被検知物質検知方法を示す図
【図７】本発明の実施の形態７の被検知物質検知方法を示す図
【図８】本発明の実施の形態８の被検知物質検知方法を示す図
【図９】本発明の実施の形態９の被検知物質検知方法を示す図
【図１０】本発明の実施の形態１０の被検知物質検知方法を示す図
【図１１】本発明の実施の形態１１の被検知物質検知方法を示す図
【図１２】本発明の実施の形態１２の被検知物質検知方法を示す図
【図１３】本発明の実施の形態１３の被検知物質検知方法を示す図
【図１４】本発明の実施の形態１４の被検知物質検知方法を示す図
【図１５】本発明の実施の形態１５の被検知物質検知方法を示す図
【図１６】本発明の実施の形態１６の被検知物質検知方法を示す図
【図１７】従来の被検知方法を示す図
【符号の説明】
【０１２２】
１  被検知物質（Ａ）
２  被検知物質（Ｂ）
３  基質
４  固相面
５  加水分解活性を有した物質
６  加水分解酵素
７  阻害物質
８  プロテアーゼ
９  プロテアーゼ阻害物質
１０  認識配列
１１  ヌクレアーゼ
１２  ヌクレアーゼ阻害物質
１３  グリコシダーゼ
１４  グリコシダーゼ阻害物質
１５  リパーゼ
１６  リパーゼ阻害物質
１７  検体
１８  混合物質
１９  信号物質
２０  蛍光色素
２１  蛍光検知手段
２２  酸化還元電位を発生させる物質
２３  電流検知手段
２４  磁化物質
２５  磁気検知手段
２６  色素
２７  電極
１０１  被検知物質
１０２  切断部位
１０３  基質
１０４  酵素
１０５  抗体
１０６  反応基質
１０７  生成物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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