(57)【要約】  【課題】重油汚染地域の生物的修復に有用な炭化水素分解微生物を選択的に増殖させることのできる栄養組成物を開発する。  【解決手段】２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンなどの尿素−アルデヒド縮合物、及び尿素などの窒素栄養源を含有し、かつ該尿素−アルデヒド縮合物の含有率が９０〜９９重量％の範囲であり、該窒素栄養源の含有率が１〜５重量％である栄養組成物を重油汚染地域の生物的修復に用いる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿素−アルデヒド縮合物と窒素栄養源を含有し、かつ尿素−アルデヒド縮合物の含有率が９０〜９９重量％の範囲であり、窒素栄養源の含有率が１〜５重量％である重油汚染地域の生物的修復用栄養組成物。
【請求項２】
尿素−アルデヒド縮合物が、尿素−ホルムアルデヒド縮合物、尿素−アセトアルデヒド縮合物、尿素−イソブチルアルデヒド縮合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの尿素−アルデヒド縮合物である請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項３】
尿素−アルデヒド縮合物が下記式（１）で表される化合物である請求項１に記載の栄養組成物。
【化１】
2006055696.tif 000006
【請求項４】
尿素−アルデヒド縮合物が２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンである請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項５】
窒素栄養源が尿素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項６】
さらにリンを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項７】
尿素−アルデヒド縮合物と窒素栄養源とリンの混合物を粒状化し、各成分を同一粒子内に存在させてなる請求項６に記載の栄養組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の栄養組成物を用いて重油汚染地域に存在する炭化水素分解菌を選択的に増殖させ、該炭化水素分解菌に重油を分解させることを特徴とする重油汚染地域の生物的修復方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オイルタンカーや石油備蓄基地等からの流出重油で汚染された海岸や河川、石油により汚染された土壌等の重油汚染地域を生物的に修復するための栄養組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油による海洋汚染は近年増加傾向にあり、１９９７年１月に日本海で起こったロシア船籍ナホトカ号の原油流出事故は周辺沿岸部に甚大な被害を及ぼした。また、石油による土壌汚染は、精油所や油槽所などの石油関連施設やボイラー燃料や機械油を取り扱う工場など、様々な業種で数多くの事例が報告されている。このような汚染油の除去処理は困難であり、その有効な処理技術の開発が望まれている。
従来から、石油汚染を微生物により浄化するバイオレメディエーションの試みが多数なされている。石油類の中でも軽質油分は微生物にとって比較的容易に分解するが、重油等の重質油分は微生物にとっては難分解性のものであるため、重油汚染土のバイオレメディエーションは解決すべき大きな課題であった。
微生物を環境浄化資材として用いるバイオレメディエーションでは、利用する微生物が自己の細胞を合成し増殖するための環境条件として、水分、酸素、栄養素、温度、ｐHなどをその汚染物質分解微生物に適したものとする必要がある。これらの条件の中でも、栄養素は、エネルギー源としての炭素源、タンパク質の合成素材であるアミノ酸合成のための窒素源、エネルギー消費のためのリン源等、微生物の増殖活性化にとって重要なファクターである。
【０００３】
従来から提案されている重油汚染土壌のバイオレメディエーションでは、炭素源,窒素源,リン源等の栄養源が用いられており、その中の一つとして尿素−アルデヒド縮合物も微生物用栄養源として用いられてきた。尿素−アルデヒド縮合物を用いた重油汚染土壌のバイオレメディエーションには、汚染土壌中に生息する微生物を利用する方法と汚染土壌へ汚染源分解能を有する微生物を付加的に散布する方法が提案されてきた。
【０００４】
前者としては、尿素−アルデヒド縮合物およびタンパク質を含有する生物的修復用組成物を重油汚染土壌に散布する方法（特許文献１または２参照）等が提案されている。
【０００５】
また、後者としては、当該微生物と尿素−アルデヒド縮合物および大豆カスやカキガラ粉等を含む微生物用栄養分から成る塗料組成物を重油で汚染された基材に塗布する方法（特許文献３〜５参照）等が提案されている。
【０００６】
しかしながら、前者はカゼインやオレイン酸アミド等のタンパク質と尿素−アルデヒド縮合物を混合して重油汚染海砂に散布しており、後者は大豆カスやカキガラ粉等を尿素−アルデヒド縮合物と混合して重油汚染基材に塗布していた。従って、尿素−アルデヒド縮合物は微生物用栄養源の中の一つとして用いられており、尿素−アルデヒド縮合物の効果が不明確であった。また、重油分解促進効果の評価手段が基材表面の重油付着状況を視覚的に観察する等の定性的なものであり定量的に重油分解率を評価していないという問題点があった。また、両者とも海水中での油濁防止を目的としており、海域以外での重油汚染土壌浄化については検討されていなかった。
【特許文献１】特開２００１−８７７５４号公報
【特許文献２】特開２００１−７９５３８号公報
【特許文献３】特開平１１−９２６９３号公報
【特許文献４】特開平１１−９２７５５号公報
【特許文献５】特開平１１−１０６７４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、汚染地域の重油中の炭化水素を効率的に分解・除去するための栄養組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、重油汚染地域を短期間で効率的に分解する方法について鋭意研究を重ねた結果、含有率９０〜９９重量％の範囲の尿素−アルデヒド縮合物と含有率１〜５重量％の窒素栄養源の混合物である栄養組成物を重油汚染土壌に散布することで、重油中の炭化水素に対して高い分解能を有するRhodococcus属細菌を選択的に増殖させ、それにより、従来法より飛躍的に高効率で重油を分解・除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）尿素−アルデヒド縮合物と窒素栄養源を含有し、かつ尿素−アルデヒド縮合物の含有率が９０〜９９重量％の範囲であり、窒素栄養源の含有率が１〜５重量％である重油汚染地域の生物的修復用栄養組成物。
（２）尿素−アルデヒド縮合物が、尿素−ホルムアルデヒド縮合物、尿素−アセトアルデヒド縮合物、尿素−イソブチルアルデヒド縮合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの尿素−アルデヒド縮合物である（１）の栄養組成物。
（３）尿素−アルデヒド縮合物が下記式（１）で表される化合物である（１）の栄養組成物。
【化１】
2006055696.tif 000002
（４）尿素−アルデヒド縮合物が２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンである（１）の栄養組成物。
（５）窒素栄養源が尿素である、（１）〜（４）のいずれかの栄養組成物。
（６）さらにリンを含む（１）〜（５）のいずれかの栄養組成物。
（７）尿素−アルデヒド縮合物と窒素栄養源とリンの混合物を粒状化し、各成分を同一粒子内に存在させてなる（６）の栄養組成物。
（８）（１）〜（７）のいずれかの栄養組成物を用いて重油汚染地域に存在する炭化水素分解菌を選択的に増殖させ、該炭化水素分解菌に重油を分解させることを特徴とする重油汚染地域の生物的修復方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の栄養組成物を重油汚染土壌に散布することにより、従来の窒素栄養源の混合物よりも効率的に重油汚染地域を浄化することができる。前記栄養組成物を重油汚染土壌に散布した場合、重油中の炭化水素に対して高い分解能を有するRhodococcus属細菌などの重油分解微生物が選択的に増殖することにより、従来の窒素栄養源の混合物よりも飛躍的に重油中の炭化水素の分解が促進される。この浄化方法を使用すれば、重油汚染地域を効
率的に浄化することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に用いる窒素栄養源とは、尿素、チオ尿素、グアニル尿素塩、メラミンなどの尿素化合物、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）の金属塩、アミン化合物、アミド化合物、イミド化合物などの含窒素有機化合物、鶏ふん、牛ふん、豚ふんなどの家畜ふんたい肥、油かす、脱脂米ぬか、大豆かす等の有機肥料、カゼイン、コラーゲン、アルブミン、アミノ酸塩,酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のタンパク質、硝安、硫安、塩安、硝酸カリ、石灰窒素などの無機窒素塩等が例示され、これらは所望により２種以上適宜併用してもよいが、土中微生物による重油分解効率がより高められるという点で尿素が最も好ましい。
【００１２】
本発明で用いる尿素−アルデヒド縮合物とは特に限定される物ではなく、複数個の尿素とアルデヒドが縮合したものであってもよく、直鎖状、分岐のある鎖状、環状等の何れの分子構造を持つ尿素−アルデヒド縮合物であっても良い。より詳細には、尿素−ホルムアルデヒド縮合物、尿素−アセトアルデヒド縮合物、尿素−イソブチルアルデヒド縮合物等が例示できる。
【００１３】
環構造を有する尿素−アルデヒド縮合物の例は下記の式（１）で表される化合物があげられる。
【化２】
2006055696.tif 000003
式中、Ｒは水素、炭素数１〜１０のアルキルまたはアルケニルであり、炭素数３〜１０のアルキルまたはアルケニルの場合は直鎖でも分岐鎖でもよい。Ｒは水素、メチル、エチル、ｎ−プロピルなどが好ましく、水素が特に好ましい。また、アルケニルの場合、2重結合の数及び位置は特に制限されない。
【００１４】
尿素−アセトアルデヒド縮合物としては、２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンが例示できる。本発明に用いる尿素−アルデヒド縮合物は、前記例示した縮合物を１種以上使用することができるが、土中微生物による重油分解効率がより高められるという点で２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンが最も好ましい。なお、本発明で用いる尿素−アルデヒド縮合物は通常の尿素とアルデヒドを用いた縮合反応により得ることができる。
【００１５】
本発明で用いる尿素−アルデヒド縮合物は、微生物による重油分解効率がより高められるという点で、栄養組成物中の尿素−アルデヒド縮合物含有率が９０〜９９重量％の範囲であることが必須である。
【００１６】
本発明で用いる窒素栄養源は、微生物による重油分解効率がより高められるという点で、栄養組成物中の窒素栄養源含有率が５重量％以下であることが必須である。また、窒素栄養源含有率は通常１重量％以上、好ましくは２重量％以上、より好ましくは４重量％以上である。
【００１７】
上記尿素−アルデヒド縮合物の中では、重油中の炭化水素に対して高い分解能を有するRhodococcus属細菌などの重油分解微生物が選択的に増殖するという点で、尿素−アセトアルデヒド縮合物がより好ましく、２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンが更に好ましい。係る２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンは下記式（２）で表される分子構造を有する。
【００１８】
【化３】
2006055696.tif 000004
【００１９】
本発明の組成物はさらにリンを含むものであってもよいが、本発明で用いるリンとは、苦土リン安、重過リン酸石灰、過リン酸石灰、アンモニア化過リン酸石灰、溶性リン肥などのリン肥料、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン安等の無機リン酸塩、縮合リン酸塩等の含リン有機化合物などが例示できる。リンは土中微生物による重油分解効率がより高められるという点で栄養組成物中に混合するのが好ましい。リンを混合する場合、その含有率は特に制限されないが、尿素−アルデヒド縮合物に対して０．００１〜３％が好ましく、０．００４〜２．２％がより好ましい。
【００２０】
本発明の組成物の形状は特に制限されないが、例えば、粒状化物が挙げられ、好ましくは、尿素−アルデヒド縮合物と窒素栄養源とリンの混合物を粒状化し、各成分を同一粒子内に存在させてなる粒状化物が挙げられ、より好ましくは、２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンと尿素とリンの混合物を粒状化し、各成分を同一粒子内に存在させてなる粒状化物が挙げられる。２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンと尿素とリンを粒状化し同一粒子内に存在させる方法としては、これらを水と混合して練り合わせた後に粒状化する等の物理的方法が例示できる。具体的には、後述する製造例と同様にして粒状化栄養組成物を調製することができる。
【００２１】
本発明の組成物は炭化水素分解菌を選択的に増殖させることができる。したがって、重油汚染地域に本発明の組成物を散布するなどして供給し、それにより、該地域に存在する炭化水素分解菌を選択的に増殖させ、該細菌に重油を分解させることによって、重油汚染地域を浄化することができる。この場合、外部から炭化水素分解菌をさらに加えて、該細菌も増殖させ、重油分解に利用してもよい。
本発明の組成物によって増殖が促進される炭化水素分解菌としては特に限定される物ではないが、重油に含まれる炭化水素に対して分解能を有するものであればよい。具体的には、Rhodococcus属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Mycobacterium属、Bacillus属、Acinetobacter属、Pseudomonas属などが知られているが、より好ましくはRhodococcus属細菌が、更に好ましくはRhodococcus属、erythropolis種の細菌が例示できる。Rhodococcus erythropolisは、石油に含まれるｎ−アルカン等の炭化水素を資化する菌として単離されたことが既に報告されている。（石油・廃油の深度処理および高度利用のための稀少微生物の分子育種と応用、筑波大学応用生物化学系  研究報告）
上記Rhodococcus属細菌は代表的な放線菌であり、陸地、河川、湖沼、海洋など様々な場所に存在する。この細菌は、ヘキサン、トルエン、ナフタレン（グラム陽性のナフタレン資化性菌Rhodococcus sp.CIR2株のナフタレン初発酸化酵素遺伝子のクーロニングとそ
の解析、1998年度日本生物工学会講演要旨集）などの炭化水素，重油（特開平７−３１３１４５号公報参照）、安息香酸などの分解菌として知られている。また、この細菌はＰＣＢ（グラム陽性細菌Rhodococcus sp.RHA1株のPCB分解能とその分解代謝系、瀬戸祐志博士論文）から塩素を脱離して分解する菌としても知られている。
【実施例】
【００２２】
次に、実施例により本発明をより詳細に説明する。
〔２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジン（ＯＭＵ）の合成〕
尿素60gを水60mlに溶解し、濃塩酸8.5mlを加え、氷冷下にアセトアルデヒド30gを滴下し、50℃で４時間攪拌しながら反応させ析出した結晶を濾過し、水で洗浄した後に減圧乾燥して粉末状のＯＭＵを得た。
【００２３】
〔イソブチリデンジウレア（ＩＢＤＵ）の合成〕
尿素66gを水66mlに溶解し、濃塩酸8.5mlを加え、氷冷下にイソブチルアルデヒド36gを滴下し激しく攪拌した後、析出した結晶を濾過し、水で洗浄した後に減圧乾燥して粉末状のＩＢＤＵを得た。
なお、これら以外の尿素−アルデヒド縮合物も特公昭３７−５３７２号公報の記載に準じた方法により適宜合成することができる。
【００２４】
［製造例］
粒状化栄養組成物の製造例を以下に示す。
難水溶性リン酸質肥料粒子（２重量％、熔成リン肥）と２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジン／尿素粉粒体（９８重量％、１５０μｍの篩いを通ったもの）を、投入量の合計が２０ｋｇとなるように容量５０Ｌの球形混合機に投入し５分間混合後、該混合物１ｋｇを直径１２０ｃｍの回転皿型パン造粒機に入れ、４０ｒｐｍの回転速度で該混合物を転動させながら水および混合物を少量ずつ添加し、平均粒径が２.５ｍｍ程度になるまで造粒した。造粒後、熱風循環乾燥機を用い１２０℃の条件下で６時間乾燥し、更に、振動篩で分級して粒子径が０.７１〜０.８５ｍｍと２.３６〜３.３５ｍｍの粒状肥料を得た。
【００２５】
〔重油分解微生物の単離〕
重油高分解能を有する微生物は以下の方法により単離した。即ち、100mlのスクリュー管に入れた砂質土15gにＯＭＵ0.0475ｇと尿素0.0025gと最大容水量の60％となる蒸留水を添加し混合後25℃で14日間培養し、その培養土の滅菌水懸濁液を3％乾燥ブイヨン寒天平板培地に塗布し、25℃で７日間培養後生育したコロニーを再度乾燥ブイヨン寒天平板培地で単離した。
【００２６】
〔重油分解微生物の同定〕
重油分解微生物の同定は以下の方法により実施した。即ち、単離菌株を3％乾燥ブイヨン液体培地に１白金耳接種し25℃で3日間振とう培養した培養液中のＤＮＡを「Ultra Clean Water DNA Isolation Kit」（MO BIO Laboratories社製）を用いて抽出した。
次に、得られたＤＮＡ溶液を用いて、下記条件にてTakara Ex Taq（ＤＮＡポリメラーゼ溶液,宝酒造株式会社製）を用いて、cool start法を用いながらpolymerase chain reaction法（以下ＰＣＲと略称する）によるＤＮＡ増幅を行った。
対象          ：１６ＳｒＤＮＡ（細菌）
プライマー    ：３４１ＦＧＣ４０（配列番号１の塩基配列を有するオリゴマー）
５１５Ｒ（配列番号２の塩基配列を有するオリゴマー）
増幅条件      ：２μｌのテンプレートＤＮＡ及び２５０ｎＭプライマー
温度−反応条件：ＤＮＡ増幅装置を以下の温度条件で運転した。温度９４℃−反応時間５分を１回行う。次ぎに温度５２℃−反応時間１分、その後温度７２℃−反応時間１分
、その後温度９４℃−反応時間１分を１回行い、これを２９回繰り返す。更に温度７２℃−反応時間１０分を１回行う。
得られたＰＣＲ産物を用いて以下の条件で変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing gradient gel electrophores, 以下ＤＧＧＥと略称する。）を行った。
対象                  ：１６ＳｒＤＮＡ（細菌）
ＰＣＲ産物のアプライ量：２０μｌ
変性剤濃度勾配        ：４５〜６０重量％（７Ｍ尿素、４０重量％ホルムアミドを１００重量％とする）
泳動条件              ：２００Ｖ、５時間、６０℃
ＤＧＧＥで顕著に濃くなっているバンドを切り出し、滅菌水１００μｌにて洗浄後、滅菌水２０μｌに４℃一晩浸漬し、ＤＮＡを溶出させたＤＮＡ溶液を得た。係るＤＮＡ溶液を、上記同様の条件でＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した結果、単離菌株は配列番号３の塩基配列を有することが判った。
上記塩基配列を基に、ホモロジーサーチを行い、相同性の高い菌の調査を行った結果、前記バンド中の菌がRhodococcus属細菌であることが同定された。
【００２７】
〔実施例１〕
高知県幡多郡大方町の海岸にある乾土（砂質土）15gを100mlのスクリュー管に入れ、最大容水量の60％となるように蒸留水を添加後、Ｃ重油2gを添加攪拌し、Ｃ重油汚染土を調製した。次に、100メッシュのふるいにかけたＯＭＵ0.0475ｇと尿素（和光純薬工業(株)製）0.0025gの混合物（以下ＯＭＵ／尿素）をＣ重油汚染土に添加攪拌後密栓し、25℃のインキュベーターで14日間培養後、試料中の油分を80mlのクロロホルムで抽出した。重油分解率は、重油中の13種の飽和炭化水素、多環式芳香族炭化水素をガスクロマトグラフィー／水素炎イオン化検出装置（(株)島津製作所製）で分析し、各ピーク面積の減少率から平均分解率を算出した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は、カラム：G-100（40m*1.0μm, 1.2mm， (財)化学品検査協会製）  カラム温度：100℃〜260℃（5℃／min，15min）、注入口温度：280℃、検出器温度：340℃、検出器：水素炎イオン化検出器（FID）、キャリアーガス：ヘリウム（20ml／min）、注入量：1μl  とした。
【００２８】
〔実施例２〜５〕
表１（実施例２〜５）に記載の栄養組成物をＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【００２９】
〔実施例６〕
ＯＭＵ／尿素の代わりに、ＯＭＵ／尿素98重量％とリン肥料2重量％を混合し粒状化したもの0.05gとRhodococcus erythropolis NBRC12320株の培養液0.15mlをＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で行った。なお、菌株培養液は前記と同一の方法で調製した。
【００３０】
〔実施例７〕
滅菌した砂質土を用いて調製したＣ重油汚染土に、ＯＭＵ／尿素0.05gとRhodococcus erythropolis NBRC12320株の培養液0.15mlを添加する以外は、実施例１と同様に行った。
【００３１】
〔実施例８〕
滅菌した砂質土を用いて調製したＣ重油汚染土に、ＯＭＵ／尿素0.05gと前記のように培養土より単離した菌株の培養液0.15mlを添加する以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【００３２】
〔比較例１〜５〕
表１（比較例１〜５）に記載の栄養組成物をＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【００３３】
〔比較例６〕
実施例１と同様の方法で、Ｃ重油汚染土のみを試験に供した。
【００３４】
〔比較例７〕
ＯＭＵ／尿素の代わりに硫酸アンモニウム（関東化学（株）製）水溶液（7.682g／100ml蒸留水）1mlをＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で実施した。
【００３５】
〔比較例８〕
ＯＭＵ／尿素の代わりに硝酸アンモニウム（関東化学（株）製）水溶液（4.653g／100ml蒸留水）1mlをＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で実施した。
【００３６】
〔比較例９〜１２〕
表１（比較例９〜１２）に記載の栄養組成物をＣ重油汚染土に添加する以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【００３７】
結果を表１にまとめた。OMU／尿素、ＩＢＤＵ／尿素、尿素などの窒素栄養源を重油汚染土壌に散布することにより重油分解は促進されるが、その効果はOMU／尿素で最も高いことを見出した。また、窒素栄養源中のOMUの含有率が９５重量パーセントでありかつ尿素の含有率が５重量パーセントの場合では更に重油分解効率が高く、OMU／尿素／リンを粒状化した栄養組成物では最も重油分解を促進していることを見出した。OMU／尿素の重油分解効率が高いのは、重油中の炭化水素に対して高い分解能を有するRhodococcus属細菌が選択的に増殖しているためであり、この微生物は炭化水素分解型のRhodococcus erythropolis細菌とほぼ同程度の高い重油分解能を有することを見出した。
【００３８】
【表１】
2006055696.tif 000005
【配列表】
2006055696000001.app