(57)【要約】【課題】  表面に凹凸の微細パターンや従来技術では作製が困難な気孔率の大小が周期的に変化する構造を極めて簡便に形成させることができ、細胞培養基板や組織再生工学用足場材料として有用な、アパタイトのマイクロパターン形成方法とこの方法で形成されたアパタイトシート並びにその製造方法を提供する。【解決手段】  リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含む酸性水溶液をゲル化し、次いでこのゲルの外部からアルカリ性水溶液を拡散させ、ｐＨ上昇に伴う溶解度低下により沈殿を析出させて、２０〜２００μｍ周期のアパタイトの縞状パターンをゲル中に形成させる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含む酸性水溶液をゲル化し、次いでこのゲルの外部からアルカリ性水溶液を拡散させ、ｐＨ上昇に伴う溶解度低下により沈殿を析出させて、２０〜２００μｍ周期のアパタイトの縞状パターンをゲル中に形成させることを特徴とするアパタイトのマイクロパターン形成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、次いでこのゲルを焼成して、２０〜２００μｍ周期の波状パターンをその表面に形成した焼結体とすることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシートの製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、次いでこのゲルを基材表面に固定し焼成して、最終的に形成されるアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化したマイクロパターンを形成した焼結体とすることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシートの製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法で製造されるアパタイトシートであって、２０〜２００μｍ周期の波状パターンがその表面に形成されてなる焼結体であることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシート。
【請求項５】
請求項３に記載の方法で製造されるアパタイトシートであって、このアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化してなるマイクロパターンが形成された焼結体であることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシート。
【請求項６】
請求項４または５に記載のアパタイトシートを用いて作製した組織再生医工学用足場材料。
【請求項７】
請求項４または５に記載のアパタイトシートを用いて作製した細胞培養基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、アパタイトのマイクロパターン形成方法とこの方法で形成されたアパタイトシート並びにその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水酸アパタイト（ＨＡｐ）は脊椎動物の骨・歯などの生体硬組織の無機主成分であり、生体との親和性が高い。そのため、緻密体・多孔体やコーティング材などの形でインプラント材料として実用応用されている一方、細胞培養基板や組織再生工学用足場材料としても有望である。一般の平板状基板の上で細胞培養を行うと細胞は基板に沿って伸展するので、細胞を任意の形態に配列して組織を構築しようとする場合、基板上に細胞との親和性が異なる材質をマイクロパターニングしたり、あるいは基板表面の凹凸をマイクロパターニングして細胞あるいはその集合体の形態を制御することが考えられる。このため、アパタイトの微細パターンを有する培養基板表面を構築する方法の開発が望まれている。
【０００３】
基板表面にアパタイトのマイクロパターンを生じさせる方法として、基板表面にレジスト材をパターニングした後、リン酸とカルシウムを含む溶液からアパタイトを析出させ、次いでレジストを除去する方法（たとえば、特許文献１参照）、あるいはインクジェット法を用いて基板上にアパタイトの析出を誘起する物質を配置した後、リン酸とカルシウムを含む溶液からアパタイトを析出させる方法（たとえば、特許文献２参照）などが提案されている。またアパタイトセラミックス表面に凹凸パターンを施す方法としては、セラミックス表面を直接機械加工する、あるいは表面にレジスト材をパターニングした後エッチングする方法などが知られている。しかしながら、いずれの方法も製造プロセスが多段階にわたるか、または多くのコストを必要とし複雑な製造工程を必要とするという問題があった。
【０００４】
さらに別の方法として、ゲル中での拡散反応に伴って生成する沈殿によって縞状パターンを形成させる方法も知られている。これはリーゼガング・リングとして知られており、ゲル中に予め溶解した電解質とゲルの外部から徐々に拡散する電解質との直接の沈殿反応を利用している。たとえばリン酸カルシウムの沈殿パターンを生じさせる場合にはゲル内部にリン酸塩を溶解しておき、外部からカルシウム塩の溶液を拡散させる。この場合得られる沈殿のパターンはカルシウムイオンとリン酸イオンの拡散速度によって決定される。しかしながら、従来報告されているリーゼガング・リングの周期はほとんどがミリメートルオーダー以上で、かつ徐々に変化して一定していなかった。このため、細胞培養基板や組織再生工学用足場材料への適用を考えた場合、その用途は制限されてしまうという問題があった。
【０００５】
また、以上の方法はいずれも基板表面にアパタイトの凹凸パターンを施す方法であり、アパタイトの気孔率の大小が周期的に変化させた構造とすることは困難であった。
【０００６】
ところで、非特許文献１にはゲル中のアパタイトの沈殿パターンとして周期１０μｍ以下の層状構造の作製方法が報告されている。しかしながら、この方法で作製される沈殿パターンは周期１０μｍ以下の層状構造であるため、１０μｍ以上の周期でゲルシート中に縞状パターンを形成させることができなかった。
【特許文献１】特開２００１−２９４４１１号公報
【特許文献２】特開２００４−６６３６０号公報
【非特許文献１】H. Imai, S. Tatara, K. Furuichi, Y. Oaki, Formation of calcium phosphate having a hierarchically laminated architecture through periodic precipitation in organic gel, Chemical Communications, 15. 1952-1953, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景よりなされたものであって、表面に微細な凹凸パターンや従来技術では作製が困難な気孔率の大小が周期的に変化する構造を極めて簡便に形成させることができ、細胞培養基板や組織再生工学用足場材料として有用な、アパタイトのマイクロパターン形成方法とこの方法で形成されたアパタイトシート並びにその製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含む酸性水溶液をゲル化し、次いでこのゲルの外部からアルカリ性水溶液を拡散させ、ｐＨ上昇に伴う溶解度低下により沈殿を析出させて、２０〜２００μｍ周期のアパタイトの縞状パターンをゲル中に形成させることを特徴とするアパタイトのマイクロパターン形成方法を提供する。
【０００９】
そして、第２には、上記第１の発明によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、次いでこのゲルを焼成して、２０〜２００μｍ周期の波状パターンをその表面に形成した焼結体とすることを特徴とするアパタイトシートを提供する。
【００１０】
また、第３には、上記第１の発明によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、次いでこのゲルを基材表面に固定し焼成して、最終的に形成されるアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化したマイクロパターンを形成した焼結体とすることを特徴とするアパタイトシートを提供する。
【００１１】
そして、本願発明は、第４には、上記第２の発明で製造されるアパタイトシートであって、２０〜２００μｍ周期の波状パターンがその表面に形成されてなる焼結体であることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシートを提供する。
【００１２】
第５には、上記第３の発明で製造されるアパタイトシートであって、このアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化してなるマイクロパターンが形成された焼結体であることを特徴とするマイクロパターンを有するアパタイトシートを提供する。
【００１３】
そして、本願発明は、第６には、上記第４または第５の発明のアパタイトシートを用いて作製した組織再生医工学用足場材料を、第５には、細胞培養基板を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本願発明によれば、リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含む酸性水溶液をゲル化し、次いでこのゲルの外部からアルカリ性水溶液を拡散させることで、リン酸カルシウムの溶解度がｐＨ上昇に伴って低下し沈殿が析出する。これによって、２０〜２００μｍ周期のアパタイトの縞状パターンをゲル中に形成させることができる。
【００１５】
さらに、上記発明によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、次いでこのゲルを焼成することにより、２０〜２００μｍ周期の波状パターンをその表面に形成したマイクロパターンを有するアパタイトシートを簡便に製造することができる。
【００１６】
また、上記発明によりアパタイトのマイクロパターンをゲルに形成し、このゲルを基材
表面に固定し焼成することにより、最終的に形成されるアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化したマイクロパターンを有するアパタイトシートを簡便に製造することができる。
【００１７】
以上の方法は、製造プロセスが極めて簡便であるため、複雑な製造工程を必要とすることなくマイクロパターンを有するアパタイトシートを安価に製造することができる。
【００１８】
さらには、上記アパタイトシートを用いて、細胞を任意の形態に配列して組織を構築することが可能な、アパタイトの微細パターンを有する組織再生医工学用足場材料や細胞培養基板を作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本願発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００２０】
本願発明は、リン酸イオンおよびカルシウムイオンを含む酸性水溶液をゲル化し、次いでこのゲルの外部からアルカリ性水溶液を拡散させるようにしている。そして、アルカリ性水溶液が拡散することでｐＨが上昇して溶解度が低下し、アパタイトの沈殿を析出させて、ゲル中に２０〜２００μｍ周期のアパタイトの縞状パターンを形成させるようにしている。ここで、アパタイトとは、化学式Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2で表される化合物の
ことで、この構成元素の一部が置換されているものも含む。たとえば、Ｃａ成分の一部が、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｆｅやその他の希土類で置換されていてもよい。また、（ＰＯ4）成分の一部が、ＣＯ3、ＳＯ4、ＢＯ3などで置換されていてもよく、さらに（ＯＨ）成分の一部が、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒなどで置換されていてもよい。
【００２１】
リン酸イオンとカルシウムイオンを含む酸性水溶液は、たとえばＣａ（Ｈ2ＰＯ4）2、
ＣａＨＰＯ4、Ｃａ3（ＰＯ4）2などのリン酸カルシウム粉末を塩酸、硝酸、酢酸などの無機酸、有機酸に溶解して調製される。
【００２２】
本願発明の酸性水溶液のゲル化に際し、用いられるゲルの種類としては特に限定されるものではないが、たとえば寒天、ゼラチン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸などが挙げられる。特に、強酸、強アルカリ条件下で用いること、および後述するシート状で用いる場合には膨潤・収縮特性が小さいことが求められることなどを考慮すると、グルタルアルデヒド架橋したポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好適なゲルとして挙げられる。また、ゲル化後の形状としては、より効果的に縞状パターンを形成させるためにはシート状にすることが望ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
アルカリ性水溶液は、上記ゲルを中性もしくはアルカリ性にし溶解度を低下させてアパタイトの沈殿を析出させるもので、特に限定されるものではないが水酸化ナトリウムを用いることが好適である。ここで、アルカリ性水溶液は外部からゲル中に徐々に拡散させる。そして、反応するリン酸カルシウムと水酸化ナトリウムの濃度勾配の緩やかな領域において、２０〜２００μｍ間隔の規則的な縞状パターンの沈殿が析出する。この縞状の領域の幅は各溶液の濃度を調製して制御することができる。たとえば、ＰＶＡ濃度が４．３ｗｔ％の場合、アパタイト濃度を０．００５〜０．０１ｍｏｌ／ｌ、水酸化ナトリウム濃度を０．４〜１．０ｍｏｌ／ｌとすることが望ましい。
【００２４】
アルカリ性水溶液の外部からのゲルへの拡散方法としては、外部からアルカリ性水溶液をゲル中に拡散することができれば特に限定されるものではなく、たとえば、ガラス管中にリン酸カルシウムを含むゲルを作製して上部からアルカリ性水溶液を注ぐ方法や、シャーレ上にリン酸カルシウムを含むゲルを伸展した後（カバーガラスなし）、その上にアル
カリ性水溶液をゲルの小片に含ませたものを載せる方法などが挙げられる。ただし、前者の方法ではゲルをシート状にできないこと、後者の方法ではゲルが乾燥しやすいことなどから、たとえば、後述する実施例で用いた方法、すなわち長方形のスライドガラスとカバーガラスの間にゲルを形成させ、このゲルの乾燥を防ぐためにカバーガラスの周囲をエポキシ系の接着剤でシールし、カバーガラスの短い辺の一部はシールせずにプラスチック製の筒をとりつけ、この筒にアルカリ性水溶液を導入して短い辺からゲル中へ拡散させる方法が好ましい方法として例示できる。さらに、別の方法として、上記方法において筒の替わりに、カバーガラスの短い辺に沿ってマイクロ流路を設け、この流路にアルカリ性水溶液を導入して、カバーガラスの短い辺から均等に長軸方向に向けて拡散させるようにしてもよい。あるいは、ゲル中にアルカリ溶液を導入するためにカバーガラスの短い辺に沿ってスリットを設けた容器を準備し、この容器にアルカリ溶液を導入して、スリットを介してカバーガラスの短い辺から均等に長軸方向に向けて拡散させるようにしてもよい。
【００２５】
以上のようにして縞状パターンを形成させたゲルを８００℃〜１３００℃の温度範囲で所定時間焼成することで、２０〜２００μｍ周期の波状パターンをその表面に形成した焼結体としてのマイクロパターンを有するアパタイトシートを得ることができる。このアパタイトシートは、その構造が緻密で、表面には上述したような波状パターン、すなわち断面が凹凸状の、凹凸パターンが形成されるものである。このような微細な凹凸パターンが形成されたアパタイトシートは組織再生医工学用足場材料や細胞培養基板として好適に用いることができ、微細な凹凸の存在によって、たとえば破骨細胞や骨芽細胞などがとりついて活動しやすくなり、新生骨と置きかえられやすくなるなど効果的である。
【００２６】
また、縞状パターンを形成させたゲルを基材表面に固定し８００℃〜１３００℃の温度範囲で所定時間焼成することで、最終的に形成されるアパタイトシートの気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化した、表面がフラットのマイクロパターンを形成した焼結体としてのアパタイトシートを得ることができる。ここで、気孔率が大きいとは、アパタイトシートが緻密でなく密度が小さい状態のことを意味しており、気孔率が小さいとは、緻密になっていて密度が大きい状態のことを意味している。そして、気孔率の大小が２０〜２００μｍ周期で変化したとは、緻密になっている部分が２０〜２００μｍ周期で形成されていることを意味するものである。
【００２７】
このアパタイトシートについても、気孔率の規則的な大小が効果的に作用し、組織再生医工学用足場材料や細胞培養基板としてより好適に用いることができる。ここで用いられる基材としては、アパタイトシート形成のための焼成に耐えることができる材質のものであれば特に限定されないが、このアパタイトシートの適用法を考慮するとアパタイト焼結体であることが好適とされる。
【００２８】
以下に、本願発明による実施例を示す。もちろん、本願発明は前述の実施の形態及び以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００２９】
リン酸カルシウムを含むゲルを作製するため以下の各溶液を調製した。まず３７％濃塩酸を希釈し、１２．３ｗｔ％塩酸を調製した。これにリン酸カルシウム粉末を溶解し、カルシウムとリン酸の濃度がそれぞれ２Ｍ、１．２Ｍの水溶液を調製した。Ｃａとリン酸の濃度比は５：３で、水酸アパタイト（ＨＡｐ）の化学式をＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2と
するとこの溶液は０．２Ｍのアパタイト溶液ということができる。ｐＨは約０．１で、リン酸はＨ3ＰＯ4とＨ2ＰＯ4-の混合状態にある。
【００３０】
一方ＰＶＡを水に加えて７５℃で４時間撹拌し、８．６ｗｔ％の水溶液を作製した。ゲ
ル化はグルタルアルデヒドによる架橋により行った。グルタルアルデヒドは希釈して０．１Ｍ水溶液を用意した。
【００３１】
調製したアパタイト水溶液とＰＶＡ水溶液および濃度調整のための適当量の水を所定の割合で混合し、グルタルアルデヒド水溶液を加えた。ＰＶＡ濃度は４．３ｗｔ％（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌモノマー単位１Ｍに相当）、グルタルアルデヒドは５ｍＭ（ＰＶＡのモノマー単位に対して０．５ｍｏｌ％）とした。
【００３２】
混合溶液をよく撹拌し、生じた泡を除くために数十秒間超音波洗浄器にかけた。
【００３３】
図１（ａ）は、ゲルにマイクロパターンを形成させるための装置を模式的に示した図で、図１（ｂ）は図１（ａ）のａ−ａ間の断面図である。２００μｌを測り取ってスライドガラス１上に滴下し、２２ｍｍ×５０ｍｍのカバーガラス２で覆い、厚さ１００〜２００μｍに広げた。ゲル化は約１０分で開始し、１時間程度で完了した。ゲル化が完了した時点で乾燥を防ぐためにカバーガラス２の周囲をエポキシ系の接着剤でシールした。短い辺の一部はシールせず、かわりにプラスチック製の筒３をとりつけた。
【００３４】
プラスチック製の筒３に所定の濃度に調製した水酸化ナトリウム４の水溶液２００μｌを入れて蓋をし、室温（約２０℃）で静置した。筒３内の水酸化ナトリウム水溶液４は筒３の底部からスライドガラス１とカバーガラス２の間のゲルシート５に拡散した。この水酸化ナトリウム水溶液４の拡散に伴ってゲルシート５中に生じる沈殿パターンを光学顕微鏡で観察した。
【００３５】
ここでは典型的な例として、ＨＡｐ濃度７２ｍＭ（カルシウムイオン濃度０．７２０Ｍ、リン酸イオン濃度０．４３２Ｍ）、水酸化ナトリウム溶液濃度２Ｍの場合における結果を示した。
【００３６】
図２は十分に時間が経過して拡散がゲル全体に達した後のゲルシートを光学顕微鏡で観察した結果である。この図２において、図中のＡはプラスチック製の筒３部位を示し、Ｂは壁状構造部を示し、Ｃは縞状マイクロパターン部を示している。
【００３７】
水酸化ナトリウムの拡散が開始してしばらくの間、反応するリン酸カルシウム、水酸化ナトリウムの濃度がともに高い領域では沈殿は数百μｍから数ｍｍの間隔で離散的に分布する壁状の形態を成した（図２中のＢの部位）。拡散の進行に伴ってその端部での濃度勾配が緩やかになると、沈殿パターンは５０〜２００μｍ間隔の規則的な縞状となった(図
２中のＣの部位)。
【００３８】
この規則的な縞状パターン部位を観察した結果を図３に示す。
【００３９】
縞状の領域の幅は各溶液の濃度を調節することによって制御できる。たとえば、図４にＰＶＡゲル中でアパタイト溶液と水酸化ナトリウム溶液が出会ったときに生じる沈殿の様子を、その近傍のそれぞれの溶液の濃度の組合わせに対してプロットしたものである。図中の「△」印は均一に沈殿が生じて縞状パターンが形成されないことを示しており、水酸化ナトリウム溶液の拡散速度が速すぎる領域である。この拡散速度が徐々に遅くなって０．１μｍ／秒以下（ＰＶＡ濃度４．３ｗｔ％の場合）になり、図中の「●」印で示した領域、すなわち図中の破線で囲まれた領域（アパタイト濃度０．００５〜０．０１ｍｏｌ／ｌ、水酸化ナトリウム濃度を０．４〜１．０ｍｏｌ／ｌ）に入ると規則的な縞状パターンが得られた。まず周期２００μｍ程度の縞が現れ、拡散速度が遅くなるにつれて間隔はわずかに広くなるもののその縞の間にさらに細かい周期の縞が現れた。規則的な縞状パターンは２０〜２００μｍ周期であった。さらに、拡散速度が遅くなって図中の「×」印の領
域に入ると、壁状の厚い沈殿ができ水酸化ナトリウムの拡散は停止した。したがって、この系によれば、反応部分のアパタイト濃度０．００５〜０．０１ｍｏｌ／ｌ、水酸化ナトリウム濃度を０．４〜１．０ｍｏｌ／ｌに保つことが望ましいことが確認された。さらに、ＰＶＡ濃度を１〜８ｗｔ％で変化させた場合でも図４は大きく変化しないことが確認された。これは、ゲル濃度が変わると水酸化ナトリウムだけでなくリン酸カルシウムの拡散速度も同時に変わるためと思われる。
【００４０】
なお、水酸化ナトリウムが全体に十分に拡散した後の沈殿は、粉末Ｘ線回折、赤外吸収分光分析、ラマン分光分析、電子線プローブＸ線分析、透過型電子顕微鏡観察の結果、水酸アパタイトとして同定された。
【００４１】
次いで、縞状の沈殿パターンをもつゲルシートを１２００℃で焼成し、ＳＥＭにより観察した。ゲルシートの一部はＰＶＡ水溶液を接着剤としてアパタイト焼結体基板上に固定し、また一部は自由に収縮できる状態にして焼成した。
【００４２】
図５（ａ）は基板上に固定して焼成したときののＳＥＭ像で（ｂ）はその拡大図、（ｃ）は一部自由に収縮できる状態で焼成したときのＳＥＭ像で（ｄ）はその拡大図である。
【００４３】
焼結前の縞状パターンの周期は約９０μｍであった。ゲルを基板に固定して焼結すると縞状パターンは気孔率の大小によるものとなり、周期は９０μｍのまま維持された（図５（ａ）（ｂ））。また、表面状態はフラットであった。なお、図５（ａ）の矢印で示した部分が、気孔率が小さく緻密であることを示している。
【００４４】
自由状態で焼結すると全体が収縮して緻密化し、周期約５０μｍの波状パターンを有するセラミックシートとなった（図５（ｃ）（ｄ））。なお、図５（ｃ）（ｄ）で観察されるＡ部は断面が凸状となっており、波状パターンが形成されている。図５（ｃ）で観察されたセラミックシートの断面形状の模式図を図５（ｅ）示した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】（ａ）ゲルにマイクロパターンを形成させるための装置を模式的に示した図で、（ｂ）は（ａ）のａ−ａ間の断面図である。
【図２】水酸化ナトリウム溶液の拡散がゲル全体に達した後のゲルシートを光学顕微鏡で観察した結果である。
【図３】縞状パターン部位を観察した結果である。
【図４】ＰＶＡゲル中でアパタイト溶液と水酸化ナトリウム溶液が出会ったときに生じる沈殿の様子を、その近傍のそれぞれの溶液の濃度の組合わせに対してプロットした図である。
【図５】（ａ）ゲルシートを基板上に固定して焼成したときののＳＥＭ像で（ｂ）はその拡大図、（ｃ）ゲルシートを一部自由に収縮できる状態で焼成したときのＳＥＭ像で（ｄ）はその拡大図、（ｅ）は（ｃ）で観察されたセラミックシートの断面形状の模式図である。
【符号の説明】
【００４６】
１    スライドガラス
２    カバーガラス
３    筒
４    水酸化ナトリウム水溶液
５    ゲルシート
【図１】
2006256900.tif 000003
【図４】
2006256900.tif 000004
【図２】
2006256900.tif 000005
【図３】
2006256900.tif 000006
【図５】
2006256900.tif 000007