(57)【要約】      （修正有）【課題】プラスミン活性を抑制させたり、ｔ−ＰＡ活性を抑制させたり、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチド及びその利用を提供する。【解決手段】血栓の溶解を抑制させ、特定のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓の溶解を抑制させ、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２】
血栓の溶解を抑制させ、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項３】
血栓の溶解を抑制させ、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項４】
血栓の溶解を抑制させ、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項５】
ウロキナーゼ活性を抑制させる、請求項１、３または４のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項６】
プラスミン活性を抑制させる、請求項２または３に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項７】
組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を抑制させる、請求項４に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を特異的に認識する抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を用い、請求項１から７のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を検出する検出方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の検出方法を用いて得られた、ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１１】
請求項１から７及び１０のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含んでいる血栓溶解抑制薬。
【請求項１２】
請求項１から７及び１０のいずれか一つに記載のポリペプチドまたはその一部のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含有するする組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓の溶解を抑制させるポリペプチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、正常血管の内膜とは異なる表面（例えば、出血傾向にある異物面）と血液とが接触すると、その接触部分で血液凝固反応が引き起こされる。詳細には、微量の組織トロンボプラスチンの存在下で、障害血管に粘着・凝集した血小板の表面に血液凝固因子が濃縮され、タンパク分解を繰り返す血液凝固過程が進行し、最終的にフィブリン（線維素）を生じて血栓が形成され、血液凝固が起こる。
【０００３】
止血のために血管内に血栓が形成されてしまった場合でも、血管内に血栓が生じてしまうと血液循環に障害をきたす虞があり好ましくない。しかし、生体内には不要となったフィブリンを溶解する作用（いわゆる、線維素溶解現象（線溶現象））が存在する。この線溶現象について簡単に説明する。
【０００４】
非特許文献１及び２などに記載されているように、生体内にフィブリンが生じてしまうと、血流中のプラスミノーゲンがフィブリンに吸着されるとともに、血管壁の細胞中に存在している組織プラスミノーゲンアクチベーター（以下、「ｔ−ＰＡ」という。）が血流中へ放出されてフィブリンに吸着される。そして、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲン及びフィブリンからなる三量体が形成されると、プラスミノーゲンはフィブリン上でｔ−ＰＡにより活性化されプラスミンとなる。このプラスミンがフィブリンを分解して可溶性のFDP(fibrin degradation products)となり、これによりフィブリンが溶解されるのである。
【０００５】
以上のようにして、生体内では、血流中にできてしまった血栓は溶解される。ところが、例えば、上述の止血するときなどには、血栓が溶解してしまわない方が好ましい。そのため、この場合には、血栓溶解を抑制させる抗線溶薬が投与される。
【０００６】
抗線溶薬（抗プラスミン薬）の代表的なものとしては、イプシロンアミノカプロン酸やその誘導体であるトラネキサム酸が知られている。これらの薬物はプラスミノーゲンと結合するが、その結合箇所はプラスミノーゲンとフィブリンとが結合する部位（リジン結合部位（Lysine-Binding-Site)）である。そのため、これらの薬物とプラスミノーゲンとが結合することにより、プラスミノーゲンとフィブリンとの結合は阻害される。そして、プラスミノーゲンとフィブリンとｔ−ＰＡとの三量体が形成されなければプラスミンは生成されないため、プラスミノーゲンとフィブリンとの結合が阻害されることによりプラスミンは減少する。これにより、フィブリンに対する溶解率は低下する。すなわち、これらの薬物の作用機序は、フィブリンに結合するプラスミン量の減少により線溶現象が抑制されて血栓の溶解が抑制される、というものである。
【特許文献１】特開２００４−４１１４２号公報
【非特許文献１】編者  松田道生・鈴木宏治、発行名  止血・血栓・線溶、発行国  日本、発行所  中外医学社、発行年  1994年、記載箇所  p258-266
【非特許文献２】編者  福武勝博・山中學、発行名  血液凝固−止血と血栓・上、発行国  日本、発行所  宇宙堂八木書店、発行年  1982年、記載箇所  p166-171
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの薬物ではプラスミンの量を減少させることにより線溶現象が抑制されるため、これらの薬物を投与することにより副作用などを引き起こす虞がある。よって、プラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させることにより線溶現象を抑制させることが好ましい。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、プラスミン活性を抑制させたり、ｔ−ＰＡ活性を抑制させたり、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチド及びその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは上記課題に鑑み鋭意に検討した結果、ウシ由来のヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」と記す）のβ鎖とヒト由来のＨｂのβ鎖との中に、血栓溶解を抑制させる構造が組み込まれていることを発見して本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明は、
（１）血栓の溶解を抑制させ、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（２）血栓の溶解を抑制させ、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（３）血栓の溶解を抑制させ、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（４）血栓の溶解を抑制させ、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（５）ウロキナーゼ活性を抑制させる、上記（１）、（３）または（４）のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（６）プラスミン活性を抑制させる、上記（２）または（３）に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（７）組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を抑制させる、上記（４）に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（８）上記（１）から（７）のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を特異的に認識する抗体、
（９）上記（８）に記載の抗体を用い、上記（１）から（７）のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を検出する検出方法、
（１０）上記（９）に記載の検出方法を用いて得られた、ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（１１）上記（１）から（７）及び（１０）のいずれか一つに記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含んでいる血栓溶解抑制薬、
（１２）上記（１）から（７）及び（１０）のいずれか一つに記載のポリペプチドまたはその一部のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（１３）上記（１２）に記載のポリヌクレオチドを含有するする組換えベクター、
を含んでいる。
【００１１】
ここで、血栓の溶解を抑制させるポリペプチドとは、プラスミン・ｔ−ＰＡ・ウロキナーゼなどの血栓溶解酵素の活性を抑制させるポリペプチドである。例えば、後述のフィブリン平板法を用いてこれらの活性を評価した場合に、ポリペプチドを含む試料溶液による溶解面積が対照試料による溶解面積の誤差範囲よりも小さければ、そのポリペプチドは血栓溶解を抑制させるポリペプチドである。別の表現をすると、血栓の溶解を抑制させるポリペプチドとは、当該物質を併用することによって、血栓溶解剤単独の効果以上の血栓溶解機能を発揮しない物質、すなわち、当該物質を併用することによって、血栓溶解剤単独使用よりも血栓を拡大する方向に顕著な働きをもたらす物質である。具体的には、フィブリン平板法においては溶解面積の縮小やFDPの減少をもたらし、合成発色基質法においては吸光度の減少をもたらし、血栓溶解法においては血栓の拡大・重量の増加や溶解率の減少をもたらす物質である。さらに別の表現をすると、血栓の溶解を抑制させるポリペプチドとは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（u-PA）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）及びプラスミン等線溶剤の効果を抑制する物質である。または、血栓の溶解を抑制させるポリペプチドとは、血栓溶解療法において用いられる血栓溶解剤の作用を抑制する因子である。さらには、血栓の溶解を抑制させるポリペプチドとは、物質の総称として、いわゆる線溶抑制剤あるいは抗線溶薬などと呼ばれるもので、作用名としては、線溶抑制作用、線溶抑制効果等と称されている、物質及び作用について示される範疇を指す。
【００１２】
また、プラスミン活性を抑制させるとは、フィブリンを分解するというプラスミンの酵素活性を抑制させることを意味する。例えば、ポリペプチドがプラスミンよりもフィブリンと容易に結合し、その結果、プラスミンの酵素活性が抑制されてしまうことを意味する。そのため、プラスミン活性が抑制されると、フィブリンを分解して可溶性のFDPを生成する反応、すなわち血栓を溶解する反応が抑制される。その結果、血栓溶解が抑制される。また、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）活性を抑制させるとはプラスミンを生成するというｔ−ＰＡの酵素活性を抑制させることを意味し、ウロキナーゼ活性を抑制させるとはプラスミンを生成するというウロキナーゼの酵素活性を抑制させることを意味する。そして、ｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性が抑制されると、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換する反応が抑制されるため、プラスミンが生成されにくくなる。そして、このプラスミンがフィブリンを分解するため、ｔ−ＰＡ活性の酵素活性やウロキナーゼの酵素活性が抑制されると血栓溶解が抑制される。
【００１３】
また、上記（１）及び（２）に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、ヒトのヘモグロビンのβ鎖を用いて製造されてもよい。
【００１４】
そして、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは後述のＢＨ２８８であり、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは後述のＢＨ２９１であり、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは後述のＢＨ２１０であり、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは後述のＦＯ１５２−２である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリペプチドあるいはそのアミドあるいはそのエステルまたはその塩は、プラスミン活性、ｔ−ＰＡ活性またはウロキナーゼ活性を抑制させることができる。また、このポリペプチドあるいはそのアミドあるいはそのエステルまたはその塩を利用することにより、血栓溶解を抑制させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の実施形態を示す前に、まず、本願発明者らが本発明を完成するに至った経緯を示す。
【００１７】
上述したように、イプシロンアミノカプロン酸やトラネキサム酸などの抗線溶薬の作用機序は、プラスミンの量が減少することにより血栓溶解を抑制させるというものである。
【００１８】
ところで、血栓はプラスミンにより溶解される。そのため、プラスミン活性を抑制させることにより血栓溶解を抑制させることができるのではないか、と本願発明者らは考えた。そして、このプラスミン活性を抑制させるポリペプチドを見つけだしてこのポリペプチドを用いて医薬品を合成すれば、従来の抗線溶薬の作用機序とは全く異なる作用機序を備えた抗線溶薬を合成することができる、と彼らは考え、特許文献１に開示する発明を完成させるに至った。
【００１９】
しかし、特許文献１に開示する発明では、プラスミン活性を抑制させる特定のポリペプチドを示したにすぎなかった。ここで、生体内では、上述のように、プラスミノーゲンがフィブリン上でｔ−ＰＡにより活性化されてプラスミンが合成されて、このプラスミンがフィブリンを溶解する。そのため、ｔ−ＰＡ活性を抑制させることにより血栓溶解を抑制させることができるのではないか、と本願発明者らは考えた。なぜならば、ｔ−ＰＡ活性が抑制されれば、プラスミンが生成されにくくなるためである。また、ウロキナーゼは、フィブリンと結合しないがプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。よって、ウロキナーゼとｔ−ＰＡとは略同一の機能を有しているため、ウロキナーゼについてもｔ−ＰＡと同様に考え、ｔ−ＰＡ活性を抑制させるポリペプチドとウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドとをそれぞれ特定するに至った。
【００２０】
また、本願発明者らは、血栓溶解を抑制させる物質をヒトに投与するため、できれば上記ポリペプチドがヒトのＨｂ由来であることが好ましい、と考えた。そのため、ヒト由来のＨｂから採取したポリペプチドを用いて、プラスミン活性を抑制させるポリペプチド、ｔ−ＰＡ活性を抑制させるポリペプチド及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特定するに至った。
【００２１】
以下に、本発明における実施形態及び実施例を示す。なお、本発明は、以下の実施形態及び実施例に限定されない。
（Ａ）本実施形態におけるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩
−ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩−
以下において、「本実施形態のポリペプチド」と「本実施形態の効果的なポリペプチド」とを記載している。「本実施形態のポリペプチド」には、血栓溶解を抑制させるポリペプチドのみならず血栓溶解を抑制させないポリペプチドも含まれている。「本実施形態の効果的なポリペプチド」は、血栓溶解を抑制させるポリペプチドのみを意味する。
【００２２】
本実施形態におけるポリペプチドは、ヒトのＨｂのβ鎖由来のポリペプチドとウシのＨｂのβ鎖由来のポリペプチドとである。
【００２３】
ヒトのＨｂのβ鎖に由来のポリペプチドは、Ｎ末端側から２０個ずつのアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号：１から８）とＣ末端側がリジンとなるようにヒトのＨｂのβ鎖のアミノ酸配列を切断してなるポリペプチド（配列番号：９から１９）とである。
【００２４】
配列番号：１から８に記載のアミノ酸配列は、それぞれ、以下にＢＨ２８６からＢＨ２９３と記載しているポリペプチドのアミノ酸配列である。そして、具体的には、ＢＨ２８６はヒトのＨｂのβ鎖のＮ末端側の１番目から２０番目までのアミノ酸配列であり、ＢＨ２８７はヒトのＨｂのβ鎖のＮ末端側の２１番目から４０番目までのアミノ酸配列である。ＢＨ２８８以下は同様である。
【００２５】
配列番号：９から１９に記載のアミノ酸配列は、それぞれ、以下にＶＨ８やＳＡ９などのＢＨ以外のアルファベットから始まる記号が付されているポリペプチドのアミノ酸配列である。この記号の先頭の２つのアルファベットはこのポリペプチドのＮ末端アミノ酸及びその隣のアミノ酸を示し、数字はこのポリペプチドが含有しているアミノ酸の個数を示す。具体的には、ＶＨ８は、Ｎ末端アミノ酸がバリン（Ｖ）であり、そのバリンの隣のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）であり、これら２つのアミノ酸を含む８個のアミノ酸からなるポリペプチドである。そして、ＶＨ８のアミノ酸配列は配列番号：９に記載しており、ＳＡ９のアミノ酸配列は配列番号：１０に記載しており、ヒトのＨｂのβ鎖のＮ末端側からＣ末端側へいくにつれて数字が大きくなるように配列番号を付している。なお、これらのポリペプチドを用いた理由は、プラスミンがセリンプロテアーゼであり、Ｃ末端がリジンとなるようにポリペプチドを切断するプロテアーゼであるためである。
【００２６】
ウシのＨｂのβ鎖由来のポリペプチド（配列番号：２０から２５）は、ウシのＨｂのβ鎖のポリペプチドの一部のポリペプチドのアミノ酸配列と酷似したアミノ酸配列を有するポリペプチド（配列番号：２０から２３）と、ウシのＨｂのβ鎖の一部のポリペプチド（配列番号：２４と２５）とである。
【００２７】
配列番号：２０から２３に記載のアミノ酸配列は、それぞれ、以下にＢＨ２０７、ＢＨ２０８、ＢＨ２０９及びＢＨ２１０と記載しているポリペプチドのアミノ酸配列である。なお、タンパク質アミノ酸データベースGenomeNetのCLUSTALWを用いて各ポリペプチドのアミノ酸配列とヒトのＨｂのβ鎖のアミノ酸配列との相同性を求めると、ＢＨ２０７は76.5%の相同性を示し、ＢＨ２０８は80.0%の相同性を示し、ＢＨ２０９は85.7%の相同性を示し、ＢＨ２１０は71.4%の相同性を示している。
【００２８】
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列は以下にＦＯ１５２−１と記載しているポリペプチドのアミノ酸配列である。そして、ＦＯ１５２−１は、ウシのＨｂのβ鎖のＮ末端側の１番目から２０番目までのアミノ酸配列である。また、配列番号：２５に記載のアミノ酸配列は以下にＦＯ１５２−２と記載しているポリペプチドのアミノ酸配列である。そして、ＦＯ１５２−２は、ウシのＨｂのβ鎖のＮ末端側の６１番目から７５番目までのアミノ酸配列において、７３番目のグリシンがアスパラギンに置換され７５番目のリジンがメチオニンに置換されたポリペプチドである。
【００２９】
そして、本実施形態の効果的なポリペプチドは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列（ＢＨ２８８）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸配列（ＢＨ２９１）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列（ＢＨ２１０）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列（ＦＯ１５２−２）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである。
【００３０】
ＢＨ２９１及びＢＨ２１０がプラスミン活性を抑制させるポリペプチドである。そのため、これらのポリペプチドはフィブリンを分解して可溶性FDPを生成する反応、すなわち血栓を溶解する反応を抑制させ、それにより血栓溶解は抑制される。また、ＦＯ１５２−２がｔ−ＰＡ活性及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドであり、ＢＨ２８８とＢＨ２１０とがウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドである。そのため、これらのポリペプチドはプラスミノーゲンをプラスミンに変換する反応を抑制させる。そして、プラスミンがフィブリンを分解するため、ｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させることにより血栓溶解が抑制されることとなる。以上より、本実施形態の効果的なポリペプチドは、血栓溶解を抑制させる。
【００３１】
ここで、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。なお、実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
【００３２】
また、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
【００３３】
アミノ酸配列の相同性は、上述のタンパク質アミノ酸データベースGenomeNetのCLUSTALWを用いて計算することができる。また、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information Basic Local Allignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
【００３４】
特に、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、(i) 配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) 配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii) 配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv) 配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００３５】
さらに、このポリペプチドは、血栓の溶解を抑制させる機能を失わない限り、主鎖または側鎖に置換基または官能基が導入されていてもよいし、この官能基が保護されていてもよいし、アミノ基が保護されていてもよいし、カルボキシル基が金属塩などの塩となっていてもよい。すなわち、このポリペプチドには、それらの誘導体も含まれる。
【００３６】
そして、例えば、配列番号：６などで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが意味するところは上述の通りである。
【００３７】
また、上記のポリペプチドは、そのポリペプチドのアミド、そのポリペプチドのエステル、そのポリペプチドの塩であってもよい。すなわち、本実施形態のポリペプチドのＣ末端は、カルボキシル基(-COOH)以外に、カルボキシレート(-COO-)、アミド(-CONH2)、エステル(-COOR)であってもよい。また、エステルにおけるRは、炭素数が６以下のアルキル基、炭素数が３以上８以下のシクロアルキル基、炭素数が６以上１２以下のアリール基、炭素数が７以上１４以下のアラルキル基や、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００３８】
また、本実施形態のポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が炭素数６以下のアシル基などで保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、炭素数が６以下のアシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００３９】
また、塩の具体例としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）とアミノ基などとの塩や塩基（例、アルカリ金属塩）とカルボキシル基などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００４０】
そして、例えば、プラスミン活性を抑制させるＢＨ２９１のアミド、エステルまたは塩であっても、ＢＨ２９１と同様にプラスミン活性を抑制させることができる。また、ｔ−ＰＡ活性を抑制させるＦＯ１５２−２のアミド、エステルまたは塩であっても、ＦＯ１５２−２と同様にｔ−ＰＡ活性を抑制させることができる。また、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドであるＢＨ２１０のアミド、エステルまたは塩であっても、ＢＨ２１０と同様にウロキナーゼ活性を抑制させることができる。
【００４１】
−ポリペプチドなどの製造方法−
本実施形態におけるポリペプチドなどは、公知のペプチドの製造方法を用いて製造することができる。公知のペプチド合成法としては、固相合成法・液相合成法などの化学合成法（ペプチド合成法）、生体・培養細胞から精製単離する方法、遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法などを挙げることができるが、いずれの方法を用いて製造してもよい。
【００４２】
化学合成法を用いて合成する場合、アミノ酸とアミノ酸とのペプチド結合を繰り返し行うことによりポリペプチドを製造する。ポリペプチドの製造後、通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせてポリペプチドを精製単離する。なお、上記の製造方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができる。また、上記の製造方法で得られるポリペプチドが塩である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００４３】
生体・培養細胞から精製単離することにより本実施形態のポリペプチドを採取する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などを用いて抽出し、その抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離すればよい。
【００４４】
遺伝子組み換え技術を用いて生産する場合、ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）として、細菌・酵母・昆虫細胞・哺乳動物細胞などの発現系を用いることができる。このように、遺伝子工学的手法を用いてポリペプチドを製造すると、配列番号：１のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは配列番号：１で表されるポリペプチドの変異体である。なお、ここにいう変異とは、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するとともに、天然に存在する同様の変異体を単離精製したものをも意味する。
【００４５】
そして、配列番号：３、配列番号：６などの比較的短鎖のポリペプチドは、化学合成法を用いて製造すれば容易かつ簡便に取得することができる。また、ある担体に、アミノ基が保護されたアミノ酸を順次導入してポリペプチドを形成させる固相合成法を用いて合成することが好ましい。因みに、多数のアミノ酸からなる長鎖のポリペプチドは、遺伝子組換え技術を用いて製造すれば量産できるため好ましい。
（Ｂ）本実施形態における抗体
−抗体−
本実施形態における抗体は、本実施形態の効果的なポリペプチド、またはこのポリペプチドのフラグメントを特異的に認識する。すなわち、本実施形態の抗体は、本実施形態の効果的なポリペプチドなどを抗原とする抗体である。なお、本実施形態の抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００４６】
また、この抗体は、本実施形態のポリペプチドの関係する動物の疾患やヒトの疾患を治療する抗体医薬品、診断薬として利用できる。具体的には、ある動物から採取した血液などの試料とこの抗体とを免疫反応させる。そして、この試料とこの抗体とが免疫反応をおこせば、この試料に本実施形態の効果的なポリペプチドが含まれていることを意味する。すなわち、この試料の持ち主である動物は本実施形態の効果的なポリペプチドが関係している疾患を発症している、と診断される。逆に、この試料とこの抗体とが免疫反応をおこしていなければ、その試料中には本実施形態の効果的なポリペプチドが存在しないことを意味している。すなわち、この試料の持ち主である動物は本実施形態の効果的なポリペプチドが関係している疾患を発症していない、と診断される。
【００４７】
以上より、抗体は、機能が不明である多くのタンパク質（ポリペプチド）を含む試料から、本実施形態の効果的なポリペプチドと同様の性質を有する可能性のあるポリペプチドを検出するための試薬（検出試薬）として利用することができる。すなわち、ここでいう抗体には、本実施形態に効果的なポリペプチド及びこのポリペプチドと同様の性質を有する可能性のあるポリペプチドを検出するためにこの抗体が含まれている検出試薬も含まれる。
【００４８】
そして、本実施形態の抗体が診断薬として利用される場合、この抗体が担体に固定されてキット化されていることが好ましい。これにより、血液などの試料から、容易に血栓溶解を抑制させるポリペプチドを検出することができる。よって、この抗体は、検出試薬として検出キットに含まれている抗体をも包含する。さらに、この検出キットは、試料とこの抗体との反応の精度を挙げるための試薬、検出用試薬の利便性や保存性等を向上させるための試薬がさらに添加されていてもよい。例えば、試料の保存のために、防腐剤が添加されていてもよい。
【００４９】
なお、上記免疫反応を判定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、蛍光抗体法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、アフィニティークロマトグラフィー法、コロニーブロット法などの公知の手法を用いることができる。
【００５０】
−抗体の製造方法−
本実施形態のモノクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。
【００５１】
まず、本実施形態の効果的なポリペプチドを温血動物に対して投与する。このとき、担体及び希釈剤とともに投与されることが好ましく、また、投与により抗体産出が可能な部位に投与されることが好ましい。さらに、抗体産生能を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。また、サル・ウサギ・イヌ・モルモット・マウス・ラット・ヒツジ・ヤギ・ニワトリなどの温血動物に投与することが好ましく、より好ましくはマウス及びラットである。
【００５２】
次に、この温血動物から抗体価の認められた個体を選択して最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取する。そして、それらに含まれる抗体産生細胞と同種または異種動物の骨髄腫細胞とを融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。このとき、抗血清中の抗体価の測定は、例えば、標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定するという公知の方法を用いることができる。
【００５３】
このようにして製造されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知の方法によりスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を検出する。スクリーニングにおいて、モノクローナル抗体はポリペプチド抗原を直接または担体とともに吸着させた固相などに結合して検出される場合が多いため、公知の分離精製方法を用いてモノクローナル抗体のみを得る。これにより、本実施形態のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００５４】
本実施形態のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。具体的には、まず、免疫抗原（ポリペプチド抗原）、または免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、この免疫抗原などを温血動物に投与する。そして、その免疫動物から血液・腹水などを採取し、公知のスクリーニング方法によりその採取した体液から本実施形態のポリペプチドに対する抗体含有物（すなわち、本実施形態の抗体を含む化合物）を採取して、分離精製を行う。これにより、本実施形態のポリクローナル抗体を製造することができる。
（Ｃ）本実施形態における検出方法
本実施形態における検出方法は、ポリペプチドを含む試料と血栓溶解を抑制させるポリペプチドを特異的に認識する抗体とを免疫反応させることにより、その試料中から血栓の溶解を抑制させるポリペプチドを検出する方法である。すなわち、この検出方法では、試料と本実施形態の抗体とを免疫反応させる。なお、免疫反応及びその反応の判定方法などについては、上記（Ｂ）に記載した通りである。
【００５５】
本実施形態の抗体が診断薬として利用される場合、この抗体が担体に固定されてキット化されていることが好ましく、これにより、血液などの試料から、容易に血栓溶解を抑制させるポリペプチドを検出することができる。従って、本実施形態の効果的なポリペプチドは、この検出方法により検出されたポリペプチドであってもよい。
（Ｄ）本実施形態におけるスクリーニング方法
本実施形態におけるスクリーニング方法は、フィブリン平板法や合成発色基質法を用いて、ポリペプチドのプラスミン活性などを評価する方法である。以下に、フィブリン平板法及び合成発色基質法を説明する。
【００５６】
−フィブリン平板法−
フィブリン平板法では、まず、フィブリノーゲン及びトロンビンからなるフィブリン膜上に、ポリペプチド及び血栓溶解酵素を含む試料溶液と血栓溶解酵素のみを含む対照溶液とをそれぞれ静置する。すると、試料溶液及び対照溶液に含まれている血栓溶解酵素により、フィブリンが溶解される。静置後一定時間が経過してから、試料溶液による溶解面積と対照溶液による溶解面積とを測定する。そして、試料溶液による溶解面積が対照溶液による溶解面積よりも小さければ、このポリペプチドは血栓溶解酵素活性を抑制させるポリペプチドであると評価される。
【００５７】
−合成発色基質法−
合成発色基質法では、まず、ポリペプチド、血栓溶解酵素及び合成発色基質が含まれている試料溶液と血栓溶解酵素及び合成発色基質が含まれている対照溶液とを調製する。
【００５８】
ここで、合成発色基質は、特定のアミノ酸と色素分子とが結合してなるタンパク質である。しかし、この結合は血栓溶解酵素により解離される。そのため、例えば、試料溶液内のポリペプチドが血栓溶解を抑制させるポリペプチドであれば、アミノ酸と色素分子との結合はほとんど解離されない。なお、この色素分子は、遊離されると特定の波長の光を吸収する。
【００５９】
溶液調製後、試料溶液と対照溶液とに上記光を照射する。そして、試料溶液が示した吸光度の値が対照溶液が示した吸光度の値よりも小さければ、試料溶液中で遊離している色素分子は試料溶液中で遊離している色素分子よりも少ないことを意味する。そのため、このポリペプチドは血栓溶解酵素活性を抑制させるポリペプチドであると評価される。
【００６０】
以上より、フィブリン平板法及び合成発色基質法などのスクリーニング方法を用いれば、血栓溶解を抑制させるポリペプチドのみを採取できる。よって、これらのスクリーニング方法は、血栓溶解を抑制させるポリペプチドの製造方法、すなわち、本実施形態の有効なポリペプチドの製造方法として有用である。
【００６１】
ここで、本実施形態のスクリーニング方法を用いて血栓溶解を抑制させるポリペプチドを製造する方法を示す。
【００６２】
フィブリン平板法を用いて血栓溶解を抑制させるポリペプチドを製造する場合には、まず、試料溶液内のポリペプチドが血栓溶解を抑制させるポリペプチドであるか否かを調べる。具体的には、上述のように、フィブリン膜における試料溶液による溶解面積の大きさと対照溶液による溶解面積の大きさとを比較する。そして、試料溶液による溶解面積の大きさの方が対照溶液による溶解面積の大きさよりも小さければ、その試料溶液からポリペプチドのみを抽出して精製すればよい。なお、この抽出・精製方法は、公知の方法を用いることができる。
【００６３】
また、合成発色基質法を用いて血栓溶解を抑制させるポリペプチドを製造する場合には、まず、試料溶液内のポリペプチドが血栓溶解を抑制させるポリペプチドであるか否かを調べる。具体的には、上述のように、特定の波長における試料溶液の吸光度と特定の波長における対照溶液の吸光度とを比較する。そして、特定の波長における試料溶液の吸光度が特定の波長における対照溶液の吸光度よりも小さければ、その試料溶液からポリペプチドのみを抽出して精製すればよい。なお、この抽出・精製方法は、公知の方法を用いることができる。
【００６４】
以上より、本実施形態のスクリーニング方法を用いて血栓溶解を抑制させるポリペプチドを製造することができる。そのため、本実施形態の効果的なポリペプチドは、このスクリーニング方法により採取されたポリペプチドであってもよい。
（Ｅ）本実施形態におけるポリヌクレオチド及び組換えベクター
本実施形態におけるポリヌクレオチドは、本実施形態の効果的なポリペプチド、本実施形態の検出方法により得られるポリペプチド及び本実施形態のスクリーニング方法により得られるポリペプチドをコードする塩基配列を有するものであればよい。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、アイソトープラベル化されたもの・フルオレセインなどにより蛍光標識されたもの・ビオチン化されたもの・酵素標識されたものなどの公知の方法で標識化されたものであることが好ましい。また、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、ポリヌクレオチドには、本実施形態のポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（UTR）の塩基配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列が含まれていてもよい。
【００６６】
本実施形態のポリペプチドを完全にコードするポリヌクレオチドのクローニングの手段としては、公知のPCR(polymerase chain reaction)法を用いて本実施形態のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成遺伝子プライマーを増幅させる方法、または、本実施形態のポリペプチドの全領域をコードする塩基配列もしくは本実施形態のポリペプチドの一部の領域をコードする塩基配列をベクター配列につなぐことにより本実施形態のポリヌクレオチドを構成し、このポリヌクレオチドを適当な宿主で増幅させることにより本実施形態のポリヌクレオチドを所望に増幅させる方法、などを挙げることができる。
【００６７】
本実施形態の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含有し、哺乳動物において発現する。そして、下記（Ｆ）で示すように、本実施形態のポリヌクレオチド及び組換えベクターを適当な宿生（細菌・酵母など）に導入すれば、本実施形態の効果的なポリペプチドを発現させることができる。
（Ｆ）本実施形態における血栓溶解抑制薬
本実施形態の効果的なポリペプチド、本実施形態の検出方法により得られるポリペプチド及び本実施形態のスクリーニング方法を用いて得られるポリペプチドは、いずれも血栓溶解を抑制させるポリペプチドである。それゆえ、これらのポリペプチドを用いて血栓溶解抑制薬を合成することができる。
【００６８】
具体的には、本実施形態の効果的なポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、本実施形態のポリヌクレオチドを患者に投与して生体内で本実施形態の効果的なポリペプチドを発現させる、細胞に本実施形態のポリヌクレオチドを挿入して本実施形態の効果的なポリペプチドを発現させた後にその細胞を患者に移植する、本実施形態の効果的なポリペプチドを患者に投与する、などによって、患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
【００６９】
本実施形態のポリヌクレオチドを血栓溶解抑制薬として使用する場合は、そのポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本実施形態のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルなどにより、患者の体内へ投与される。
【００７０】
本実施形態の効果的なポリペプチドを血栓溶解抑制薬として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたポリペプチドを使用するのが好ましい。
【００７１】
本実施形態の効果的なポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤・カプセル剤・エリキシル剤・マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的（好ましくは皮下投与）に使用できる。例えば、本実施形態の効果的なポリペプチドを生理学的に認められる担体・香味剤・賦形剤・ベヒクル・防腐剤・安定剤・結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００７２】
錠剤・カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン・コーンスターチ・トラガント・アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチゼラチン・アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖・乳糖・サッカリンのような甘味剤、ペパーミント・アカモノ油・チェリーのような香味剤などを挙げることができる。調剤単位形態がカプセルである場合には、さらに油脂のような液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油・椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００７３】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水・ブドウ糖・その他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール・Ｄ−マンニトール・塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）・ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール・ポリエチレングリコールなど）・非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80TM・HCO-50など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油・大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル・ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液・酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム・塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン・ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール・フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
（Ｇ）本実施形態における効果
以上より、本実施形態の効果的なポリペプチドは、プラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させ、その結果、血栓溶解を抑制させることができる。そのため、本実施形態の効果的なポリペプチドは、従来の抗線溶薬の作用機序とは全く異なる作用機序を備えた医薬品を提供できる。そして、本実施形態の効果的なポリペプチドが含有されている医薬品、すなわち本実施形態の血栓溶解抑制薬を投与しても、副作用を引き起こしにくい。
【００７４】
また、本実施形態の抗体は、プラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特異的に認識する。また、本実施形態の検出方法では、これらのポリペプチドを検出することができる。以上より、この抗体を用いてこの検出方法により検出されたポリペプチドは、確実に血栓溶解を抑制させる。
【００７５】
さらに、本実施形態のスクリーニング方法では、ポリペプチドがプラスミン活性を抑制させるか否か、ポリペプチドがｔ−ＰＡ活性を抑制させるか否か、ポリペプチドがウロキナーゼ活性を抑制させるか否かを評価する。そして、例えば、このスクリーニング方法でプラスミン活性などを抑制させると評価されたポリペプチドは、確実に血栓溶解を抑制させる。
【００７６】
また、本実施形態のポリヌクレオチド及び組換えベクターは、プラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドをコードする。そのため、このポリヌクレオチド及び組換えベクターを患者の体内に投与することにより、患者の体内でプラスミンなどの活性を抑制させることができる。
【００７７】
本明細書および図面において、アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
【実施例】
【００７８】
以下に、実施例１から実施例４を示す。これらの実施例では、配列番号：１から２５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（実施例では、単に、「配列番号：１のポリペプチド」などという。）をスクリーニングして、プラスミン活性を抑制させるポリペプチド、ｔ−ＰＡ活性を抑制させるポリペプチド及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特定した。
＜実施例１＞
実施例１では、配列番号：１から８の８個のポリペプチドの中で、プラスミン活性を抑制させるポリペプチド及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特定することを試みた。具体的には、上記実施形態に記載のフィブリン平板法を用いて８個のポリペプチドをそれぞれスクリーニングした。以下に、プラスミン活性、ウロキナーゼ活性の順に、その手法及び結果を示す。
（Ａ）プラスミン活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：１のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、0.1mg/mL、1mg/mL、 10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLのポリペプチドの濃度が異なる５種類のポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のプラスミン（Plasminogen from human plasma, P5661、SIGMA-ALDRICH FINE CHEMICALS, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理的食塩水に溶かして、0.5IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【００７９】
次に、0.1mg/mLのポリペプチド溶液とプラスミン溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。また、プラスミン溶液と0.85%生理食塩水とを等量混合して、対照溶液を調製した。
【００８０】
続いて、以下に示す２通りの測定方法を用いて、フィブリン膜における溶解面積を測定した。１つ目の測定方法では、調製後すぐに、試料溶液及び対照溶液をそれぞれ20mLずつはかりとってフィブリン膜上にそれぞれ静置した。そして、18時間後に試料溶液による溶解面積及び対照溶液による溶解面積をそれぞれ測定した。２つ目の測定方法では、調製後、試料溶液を37℃で1時間加温させ、試料溶液内でプラスミンとポリペプチドとを充分に反応させた。その後、その試料溶液及び対照溶液をそれぞれ20mLずつはかりとってフィブリン膜上にそれぞれ静置し、18時間後に試料溶液による溶解面積及び対照溶液による溶解面積をそれぞれ測定した。
【００８１】
そして、試料溶液及び対照溶液に対して、フィブリン膜への静置作業から溶解面積の測定作業までの作業をそれぞれ2回行い、その2回の測定結果を平均して試料溶液による溶解面積及び対照溶液による溶解面積とした。それから、対照溶液による溶解面積を基準として試料溶液による溶解面積と対照溶液による溶解面積との差（比率）を求めた。以上の作業を、濃度が1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLのポリペプチド溶液に対しても行った。そして、５種類の試料溶液が示す比率の最大値をこのポリペプチド溶液が示す比率として採用した。上記一連の作業を、配列番号：２のポリペプチドから配列番号：８のポリペプチドに対しても行った。
【００８２】
表１に結果を示す。なお、表１において、「直ちに測定」は上述の１つ目の測定方法により測定した結果であり、「37℃、1時間加温」は上述の２つ目の測定方法により測定した結果である。そして、この表に記載されている数値は、上述の比率の最大値である。
【００８３】
【表１】
2006180841.tif 000002
【００８４】
表１に記載されている数値は上述の比率の最大値である。この比率が大きければ大きいほど血栓溶解は抑制されないため（血栓溶解は亢進されるため）、プラスミン活性を抑制させるポリペプチドはこの表において−に大きな値を示しているポリペプチドである。
【００８５】
表１に示すように、ＢＨ２９１だけがプラスミン活性を著しく抑制させた。
（Ｂ）ウロキナーゼ活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：１のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、0.1mg/mL、1mg/mL、 10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLのポリペプチドの濃度が異なる５種類のポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、25IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【００８６】
次に、0.1mg/mLのポリペプチド溶液とウロキナーゼ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。また、ウロキナーゼ溶液と0.85%生理食塩水とを等量混合して、対照溶液を調製した。その後は本実施例１の（Ａ）に記載の手順に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【００８７】
表２に結果を示す。なお、表２において、「直ちに測定」及び「37℃、1時間加温」が意味するところは上述の通りである。
【００８８】
【表２】
2006180841.tif 000003
【００８９】
表２に記載されている数値も上述の比率の最大値であるため、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドはこの表において−に大きな値を示しているポリペプチドである。
【００９０】
表２に示すように、いずれのポリペプチドの比率も＋の値を示したため、これらのポリペプチドにはウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドは存在しない。
＜実施例２＞
実施例２では、配列番号：１から８に記載している８個のポリペプチドと配列番号：２０から２５に記載している６個のポリペプチドとを用いて、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特定することを試みた。具体的には、上記実施形態に記載のフィブリン平板法及び合成発色基質法を用いて各ポリペプチドをそれぞれスクリーニングした。以下に、フィブリン平板法、合成発色基質法の順に、その手法及び結果を示す。
【００９１】
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：１のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLのポリペプチドの濃度が異なる５種類のポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理食塩水に溶かして、25IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【００９２】
次に、0.1mg/mLのポリペプチド溶液とウロキナーゼ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。その後は上記実施例１の（Ａ）に記載の手順に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。なお、本実施例における比率(Fibrinolytic activity)は、対照溶液による溶解面積に対する試料溶液による溶解面積の比率である。
【００９３】
図１に結果を示す。なお、図１では、対照溶液を「control」として表記している。
【００９４】
図１に示すように、対照溶液によるFibrinolytic activityを100%としている。そのため、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドは、Fibrinolytic activity値が100%より小さい値を示しているポリペプチドである。
【００９５】
図１に示すように、ヒト由来のＨｂではＢＨ２８８がウロキナーゼ活性を抑制させ、ウシ由来のＨｂではＢＨ２１０及びＦＯ１５２−１がウロキナーゼ活性を抑制させた。
【００９６】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：１のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1g/Lの４種類のポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2444(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、1mMの合成発色基質S-2444溶液を生成した。また、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(UK、ウロキナーゼ、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理食塩水に溶かして、50IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【００９７】
次に、125mg/Lのポリペプチド溶液を5mLと、合成発色基質S-2444溶液を50mLと、ウロキナーゼ溶液を2.5mLと、50mM、pH8.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して試料溶液を調製した。そして、250mg/Lのポリペプチド溶液、500mg/Lのポリペプチド溶液及び1g/Lのポリペプチド溶液を用いて、上記の方法に従いポリペプチド濃度の異なる４種類の試料溶液を調製した。また、合成発色基質S-2444溶液を50mLと、ウロキナーゼ溶液を2.5mLと、50mM、pH8.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して対照溶液を調製した。
【００９８】
そして、各試料溶液及び対照溶液に対して、Benchmark microplate reader(BIO-RAD Lab.製)を用いて405nmにおける吸光度の変化を30分に亘って測定した。上記一連の作業を、配列番号：２のポリペプチドから配列番号：８のポリペプチド及び配列番号：２０のポリペプチドから配列番号：２５のポリペプチドに対しても行った。
【００９９】
図２に結果を示す。なお、図２では、対照溶液を「control」として表記している。
【０１００】
ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドは、対照溶液の吸光度よりも小さな値の吸光度を示すポリペプチドである。そして、図２に示すように、ＦＯ１５２−１がウロキナーゼ活性を抑制させた。
＜実施例３＞
実施例３では、配列番号：９から１９に記載している１１個のポリペプチドとリジンとを用いて、プラスミン活性を抑制させるポリペプチド、ｔ−ＰＡ活性を抑制させるポリペプチド及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドを特定することを試みた。具体的には、フィブリン平板法及び合成発色基質法を用いて、各ポリペプチドをそれぞれスクリーニングした。以下に、プラスミン活性、ｔ−ＰＡ活性及びウロキナーゼ活性の順に、その手法及び結果を示す。
（Ａ）プラスミン活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のプラスミン（Plasmin from human plasma, P4895、Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理食塩水に溶かして、1IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【０１０１】
次に、ポリペプチド溶液とプラスミン溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。また、プラスミン溶液と0.85%生理食塩水とを等量混合して、対照溶液を調製した。
【０１０２】
続いて、試料溶液及び対照溶液をそれぞれ20mLずつはかりとって、フィブリン膜上にそれぞれ静置し、そのフィブリン膜を37℃で18時間加温した。その後、試料溶液による溶解面積及び対照溶液による溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１０３】
そして、試料溶液及び対照溶液に対して、フィブリン膜への静置作業から溶解面積の測定作業までの作業をそれぞれ2回行い、その2回の測定結果を平均して試料溶液による溶解面積及び対照溶液による溶解面積とした。それから、上記実施例２に記載した比率  (Fibrinolytic activity)を求めた。上記一連の作業を、配列番号：１０のポリペプチドから配列番号：１９のポリペプチドに対しても行った。
【０１０４】
図３に結果を示す。なお、図３では、対照溶液を「control」として表記している。
【０１０５】
対照溶液のFibrinolytic activity値を100%としているため、プラスミン活性を抑制させるポリペプチドはFibrinolytic activity値が100%より小さい値を示しているポリペプチドである。そして、図３に示すように、ＹＨ２やＶＶ１２などのＣ末端側のポリペプチドがプラスミン活性を若干、抑制させた。
【０１０６】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1g/Lの４種類のポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2251(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、1mMの合成発色基質S-2251溶液を生成した。また、ヒト由来のプラスミン（Plasmin from human plasma, P4895、Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理食塩水に溶かして、1IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【０１０７】
次に、125mg/Lのポリペプチド溶液を5mLと、合成発色基質S-2251溶液を50mLと、プラスミン溶液を2.5mLと、50mM、pH7.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して試料溶液を調製した。そして、250mg/Lのポリペプチド溶液、500mg/Lのポリペプチド溶液及び1g/Lのポリペプチド溶液を用いて、上記方法に従いポリペプチド濃度の異なる４種類の試料溶液を調製した。また、合成発色基質S-2251溶液を50mLと、プラスミン溶液を2.5mLと、50mM、pH7.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して対照溶液を調製した。その後は上記実施例２の合成発色基質法に記載の方法に従い、405nmにおける吸光度の各変化をそれぞれ測定した。
【０１０８】
図４に結果を示す。なお、図４では、対照溶液を「control」として表記している。
【０１０９】
プラスミン活性を制御させるポリペプチドは、「control」のabsorbance値よりも小さなabsorbance値を示しているポリペプチドである。そして、図４に示すように、Lysineが、プラスミン活性を若干、抑制させた。
（Ｂ）ｔ−ＰＡ活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA、single-type tissue-type plasminogen activator, T-7770, Sigma Chemical Co.製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、200IU/mLのｔ−ＰＡ溶液を生成した。
【０１１０】
次に、ポリペプチド溶液とｔ−ＰＡ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。その後は本実施例の（Ａ）のフィブリン平板法で記載の方法に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１１１】
結果を図５に示す。
【０１１２】
図５に示すように、ＶＮ４２及びＬＨ２５などの比較的長鎖のポリペプチドが、ｔ−ＰＡ活性を若干、抑制させた。
【０１１３】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1g/Lの４種類のポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2288(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、1mMの合成発色基質S-2288溶液を生成した。また、ヒト由来のｔ−ＰＡ(single-type tissue-type plasminogen activator, T-7770, Sigma Chemical Co.製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、1IU/mLのｔ−ＰＡ溶液を生成した。
【０１１４】
次に、125mg/Lのポリペプチド溶液を5mLと、合成発色基質S-2288溶液を50mLと、ｔ−ＰＡ溶液を2.5mLと、50mM、pH8.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して試料溶液を調製した。その後は上記実施例２の合成発色基質法に記載の方法に従い、405nmにおける吸光度の各変化をそれぞれ測定した。
【０１１５】
図６に結果を示す。
【０１１６】
図６に示すように、ｔ−ＰＡ活性を著しく抑制させるポリペプチドはなかった。
（Ｃ）ウロキナーゼ活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(UK、ウロキナーゼ、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、50IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【０１１７】
次に、ポリペプチド溶液とウロキナーゼ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。その後は本実施例の（Ａ）のフィブリン平板法に記載の方法に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１１８】
図７に結果を示す。
【０１１９】
図７に示すように、Lysineがウロキナーゼ活性を若干、抑制させた。
【０１２０】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：９のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、125mg/L、250mg/L、500mg/L、1g/Lの４種類のポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2444(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、1mMの合成発色基質S-2444溶液を生成した。また、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(UK、ウロキナーゼ、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、50IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【０１２１】
次に、125mg/Lのポリペプチド溶液を5mLと、合成発色基質S-2444溶液を50mLと、ウロキナーゼ溶液を2.5mLと、50mM、pH8.4のTris/HCl bufferを200mLとを37℃に加温したマイクロプレート内で攪拌して試料溶液を調製した。その後は上記実施例２の合成発色基質法に記載の方法に従い、405nmにおける吸光度の各変化をそれぞれ測定した。
【０１２２】
図８に結果を示す。
【０１２３】
図８に示すように、Lysineがウロキナーゼ活性を若干、抑制させた。
＜実施例４＞
実施例４では、配列番号：２０から２５に記載している６個のポリペプチドを用いて、プラスミン活性を抑制させるポリペプチド、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチド及びｔ−ＰＡ活性を抑制させるポリペプチドを特定した。以下に、プラスミン活性、ウロキナーゼ活性、ｔ−ＰＡ活性の順に、その手法及び結果を示す。
（Ａ）プラスミン活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のプラスミン（Plasmin from human plasma, P4895、Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理的食塩水に溶かして、0.2IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【０１２４】
次に、ポリペプチド溶液とプラスミン溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。また、プラスミン溶液と0.85%生理食塩水とを等量混合して、対照溶液を調製した。その後は上記実施例１の（Ａ）に記載した方法に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１２５】
表３に結果を示す。なお、表３における「直ちに測定」及び「37℃、1時間加温」は、上記実施例１で記載した通りである。
【０１２６】
【表３】
2006180841.tif 000004
【０１２７】
表３に記載されている数値は、上記実施例１における比率の最大値である。そのため、プラスミン活性を抑制させるポリペプチドは、この表において−に大きな値を示しているポリペプチドである。
【０１２８】
表３に示すように、ＢＨ２０７とＢＨ２０８とＢＨ２１０とでは、「直ちに測定」して求まった比率がいずれも−を示した。また、「37℃、1時間加温」すると、ＢＨ２０７の比率は＋になり、ＢＨ２０８の比率は若干大きくなり、ＢＨ２１０の比率は非常に小さくなった。従って、これらのポリペプチドでは、ＢＨ２１０がプラスミン活性を抑制させるポリペプチドである。
【０１２９】
−フィブリノーゲン溶液を用いたスクリーニング法−
リジンセファロースカラムクロマトグラフィにより、プラスミンが予め除去されたウシ由来のフィブリノーゲン(0.4% Clottable protein)溶液を用いて、プラスミン活性を測定した。
【０１３０】
まず、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のプラスミン（Plasmin from human plasma, P4895、Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理的食塩水に溶かして0.4IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【０１３１】
次に、２種類の試料溶液を調製した。第１の試料溶液として、ポリペプチド溶液とフィブリノーゲン溶液とを混合後、プラスミン溶液を混合してなる溶液を調製した。第２の試料溶液として、ポリペプチド溶液とプラスミン溶液とを混合後、フィブリノーゲン溶液を混合してなる溶液を調製した。なお、両試料溶液には、50mLのポリペプチド溶液と、25mLのプラスミン溶液と、2mLのフィブリノーゲン溶液と、2mLの50mM、pH7.4のTris/HCl bufferとが混合されていた。また、25mLのプラスミン溶液と、2mLのフィブリノーゲン溶液と、2mLの50mM、pH7.4のTris/HCl bufferとを混合して、対照溶液を調製した。
【０１３２】
続いて、以下に示す２通りの測定方法を用いて、280nmにおける吸光度を測定した。１つ目の測定方法では、調整後すぐに、溶液を恒温セルホルダー(131-0040温度計セルホルダー、株式会社日立製作所製)に入れて、分光光度計(U-3210型自記分光光度計、株式会社日立製作所製)を用いて、30秒ごとの280nmにおける吸光度の変化を37℃の恒温下で5分間測定した。２つ目の測定方法では、調整後、溶液を37℃で1時間加温させ、その後、その溶液を恒温セルホルダー(同上、同社製)に入れて、分光光度計(同上、同社製)を用いて、30秒ごとの280nmにおける吸光度の変化を37℃の恒温下で5分間測定した。
【０１３３】
そして、各測定方法において、対照溶液の吸光度に対する第１の試料溶液の吸光度の割合と対照溶液の吸光度に対する第２の試料溶液の吸光度の割合とを求めた。上記一連の作業を、配列番号：２１のポリペプチドから配列番号：２５のポリペプチドに対して行った。
【０１３４】
表４に結果を示す。なお、表４における「ペプチド+Fbg」は第１の試料溶液を意味し、「ペプチド+Pln」は第２の試料溶液を意味する。また、「直ちに測定」及び「37℃、1時間加温」の意味するところは上述の通りである。
【０１３５】
【表４】
2006180841.tif 000005
【０１３６】
表４に示すように、ＢＨ２０９は、どちらの測定法を用いて測定してもどちらの溶液を用いて測定しても、プラスミン活性を抑制させた。
【０１３７】
また、ＢＨ２１０は、「ペプチド+Fbg」を用いて「37℃、1時間加温」したとき以外では、プラスミン活性を抑制させた。そのため、ＢＨ２１０では、プラスミンによるフィブリノーゲンの作用部位をブロックする機能は低いが、プラスミン活性は抑制された。
【０１３８】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2251(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、1mMの合成発色基質S-2251溶液を生成した。また、ウシ由来のプラスミン（Plasmin from bivine plasma, P7911、Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA製）を0.85%生理的食塩水に溶かして、0.1IU/mLのプラスミン溶液を生成した。
【０１３９】
次に、２種類の試料溶液を調製した。第１の試料溶液として、ポリペプチド溶液と合成発色基質S-2251溶液とを混合後、プラスミン溶液を混合してなる溶液を調製した。第２の試料溶液として、ポリペプチド溶液とプラスミン溶液とを混合後、合成発色基質S-2251溶液を混合してなる溶液を調製した。なお、両試料溶液には、50mLのポリペプチド溶液と、500mLの合成発色基質S-2251溶液と、25mLのプラスミン溶液と、2mLの50mM、pH7.4のTris/HCl bufferとが混合されていた。また、25mLのプラスミン溶液と、500mLの合成発色基質S-2251溶液と、2mLの50mM、pH7.4のTris/HCl bufferと、50mLの0.85%生理食塩水とを混合して、対照溶液を調製した。
【０１４０】
続いて、以下に示す２通りの測定方法を用いて、405nmにおける吸光度を測定した。１つ目の方法では、調整後すぐに、その溶液を恒温セルホルダー(同上、同社製)に入れて、分光光度計(同上、同社製)を用いて、30秒ごとの405nmにおける吸光度の変化を37℃の恒温下で5分間測定した。２つ目の方法では、調整後その溶液を37℃で1時間加温させ、その後、この溶液を恒温セルホルダー(同上、同社製)に入れて、分光光度計(同上、同社製)を用いて、30秒ごとの405nmにおける吸光度の変化を37℃の恒温下で5分間測定した。そして、各測定方法において、対照溶液の吸光度に対する第１の試料溶液の吸光度の割合と、対照溶液の吸光度に対する第２の試料溶液の吸光度の割合とを求めた。上記一連の作業を、配列番号：２１のポリペプチドから配列番号：２５のポリペプチドに対しても行った。
【０１４１】
表５に結果を示す。なお、表５における「ペプチド+S-2251」は上記第１の試料溶液を意味する。また、「ペプチド+Pln」、「直ちに測定」及び「37℃、1時間加温」の意味するところは上述の通りである。
【０１４２】
【表５】
2006180841.tif 000006
【０１４３】
表５に示すように、ＦＯ１５２−１が、「直ちに測定」したときにプラスミン活性を抑制させただけで、それ以外のポリペプチドについては、どちらの測定方法で測定してもどちらの溶液を用いて測定しても、プラスミン活性は抑制されなかった。
（Ｂ）ウロキナーゼ活性
−フィブリン平板法−
まず、ウシ由来のフィブリノーゲン （Fibrinogen from bovine plasma、ITOHAM FOODS Inc., Hyogo, Japan製）を1%NaCl添加1/15Mリン酸緩衝液（pH7.4）に溶かして、0.4%のClottable proteinとなるように調製して、フィブリノーゲン溶液を生成した。また、ヒト由来のトロンビン （日本薬局方ヒト・トロンビン、トロンビンーヨシトミ、三菱ウェルファーマ株式会社製、大阪）を0.85%生理的食塩水に溶かして、50IU/mLのトロンビン溶液を生成した。
【０１４４】
次に、フィブリノーゲン溶液を8mLと、1/15M、pH7.4のPhoshate buffer溶液を8mLとを9cm径のペトリ皿に分注して、ヒト由来のトロンビンを0.1mL加えて水平面に1時間静置してフィブリン平板を作製した。
【０１４５】
続いて、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLの５種類のポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、三菱ウェルファーマ製)を.85%生理的食塩水に溶かして、50IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【０１４６】
そして、0.1mg/mLのポリペプチド溶液とウロキナーゼ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。その後は本実施例の（Ａ）のフィブリン平板法に記載の方法に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１４７】
表６に結果を示す。
【０１４８】
【表６】
2006180841.tif 000007
【０１４９】
表６に示すように、どのポリペプチドにおいても、ウロキナーゼ活性は抑制されなかった。
【０１５０】
−合成発色基質法−
まず、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、1g/Lのポリペプチド溶液を生成した。また、合成発色基質S-2444(Chromogenix製)を蒸留水に溶かして、2mMの合成発色基質S-2444溶液を生成した。また、ヒト由来のウロキナーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、三菱ウェルファーマ製)を0.85%生理的食塩水に溶かして、50IU/mLのウロキナーゼ溶液を生成した。
【０１５１】
次に、２種類の試料溶液を調製した。第１の試料溶液として、ポリペプチド溶液と合成発色基質S-2444溶液とを混合後、ウロキナーゼ溶液を混合してなる溶液を調製した。第２の試料溶液として、ポリペプチド溶液とウロキナーゼ溶液とを混合後、合成発色基質S-2444溶液を混合してなる溶液を調製した。なお、両試料溶液には、21mLのポリペプチド溶液と、6mLの合成発色基質S-2444溶液と、21mLのウロキナーゼ溶液と、162mLの3mM、pH8.8のTris/HCl bufferとが混合されていた。また、6mLの合成発色基質S-2444溶液と、21mLのウロキナーゼ溶液と、162mLの3mM、pH8.8のTris/HCl bufferと21mLの0.85%生理食塩水とを混合して、対照溶液を調製した。その後は本実施例の（Ａ）の合成発色基質法に記載の方法に従い、405nmにおける吸光度の各変化をそれぞれ測定した。
【０１５２】
表７に結果を示す。なお、表５における「ペプチド+S-2444」は上記第１の試料溶液を意味し、「ペプチド+UK」は上記第２の試料溶液を意味する。また、「直ちに測定」及び「37℃、1時間加温」の意味するところは上述の通りである。
【０１５３】
【表７】
2006180841.tif 000008
【０１５４】
表７に示すように、ＦＯ１５２−１がウロキナーゼ活性を抑制させた。特に、「ペプチド+S-2444」を用いて「37℃、1時間加温」した場合に、ウロキナーゼ活性を最も著しく抑制させた。そのため、ＦＯ１５２−１が合成発色基質S-2444におけるウロキナーゼの作用部位をブロックする機能を備えていることがわかった。
（Ｃ）ｔ−ＰＡ活性
−フィブリン平板法−
まず、配列番号：２０のポリペプチドを0.85%の生理食塩水に溶かして、0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1mg/mLの５種類のポリペプチド溶液を生成した。また、ヒト由来のｔ−ＰＡ(Single-chain t-PA From human melanoma cell culture, Sigma Chemical Co.製)を0.85%生理的食塩水に溶かして50IU/mLのｔ−ＰＡ溶液を生成した。
【０１５５】
そして、0.1mg/mLのポリペプチド溶液とｔ−ＰＡ溶液とを等量混合して、試料溶液を調製した。その後は本実施例の（Ｂ）のフィブリン平板法に記載の方法に従い、各溶解面積をそれぞれ測定した。
【０１５６】
表８に結果を示す。
【０１５７】
【表８】
2006180841.tif 000009
【０１５８】
表８に示すように、ＢＨ２０７とＢＨ２１０とＦＯ１５２−２とが、ｔ−ＰＡ活性を抑制させた。
＜実施例のまとめ＞
上記実施例１及び２より、プラスミン活性を抑制させるポリペプチドはＢＨ２９１である。また、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドはＢＨ２８８である。
【０１５９】
上記実施例３で用いたポリペプチドには、プラスミン活性、ｔ−ＰＡ活性及びウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドはなかった。
【０１６０】
上記実施例１及び４より、プラスミン活性を抑制させるポリペプチドはＢＨ２１０である。また、ウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドはＢＨ２１０とＦＯ１５２−２とである。
【０１６１】
そして、ポリペプチドがプラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させるポリペプチドであれば、そのポリペプチドは血栓溶解を抑制させるポリペプチドであるといえる。よって、ＢＨ２８８、ＢＨ２９１、ＢＨ２１０及びＦＯ１５２−２は、血栓溶解を抑制させるポリペプチドである。そのため、これらのポリペプチドの少なくとも一つを含む医薬品は血栓溶解抑制薬であるとともに、従来の抗線溶薬と異なりプラスミン活性やｔ−ＰＡ活性やウロキナーゼ活性を抑制させることにより血栓溶解を抑制させることができるため副作用を引き起こす虞は極めて低い。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
以上説明したように、本発明は、血栓溶解を抑制させるポリペプチド及びその利用について有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】実施例２におけるフィブリン平板法によるポリペプチドのウロキナーゼ活性の評価結果を示す図である。
【図２】実施例２における合成発色基質法によるポリペプチドのウロキナーゼ活性の評価結果を示す図である。
【図３】実施例３におけるフィブリン平板法によるポリペプチドのプラスミン活性の評価結果を示す図である。
【図４】実施例３における合成発色基質法によるポリペプチドのプラスミン活性の評価結果を示す図である。
【図５】実施例３におけるフィブリン平板法によるポリペプチドのｔ−ＰＡ活性の評価結果を示す図である。
【図６】実施例３における合成発色基質法によるポリペプチドのｔ−ＰＡ活性の評価結果を示す図である。
【図７】実施例３におけるフィブリン平板法によるポリペプチドのウロキナーゼ活性の評価結果を示す図である。
【図８】実施例３における合成発色基質法によるポリペプチドのウロキナーゼ活性の評価結果を示す図である。
【図１】
2006180841.tif 000010
【図２】
2006180841.tif 000011
【図３】
2006180841.tif 000012
【図４】
2006180841.tif 000013
【図５】
2006180841.tif 000014
【図６】
2006180841.tif 000015
【図７】
2006180841.tif 000016
【図８】
2006180841.tif 000017
【配列表】
2006180841000001.app