(57)【要約】      （修正有） 【課題】テアニン合成活性を備えた新規なタンパク質、すなわちテアニン合成酵素、及びその遺伝子を提供する。【解決手段】新たに見出した、特定なる配列のテアニン合成酵素遺伝子の塩基配列、及び、これらの配列に基づくテアニン合成酵素は、植物体において行われていると同等の反応、すなわち、グルタミン酸とエチルアミン誘導体、及びＡＴＰとから、お茶の旨みの主成分であるテアニンを合成することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載の核酸：
（ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸、またはこの核酸と相補的な核酸、
（ｃ）上記（ａ）、または（ｂ）に記載の核酸またはこの核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつテアニン合成活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
次の（ｄ）または（ｅ）に記載のタンパク質：
（ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつテアニン合成活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸が発現可能に結合された発現用組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項２に記載のタンパク質をグルタミン酸、エチルアミン誘導体、及びＡＴＰを含有する溶液中で反応させることを特徴とするテアニンの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアニン合成活性を備えた新規なタンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
テアニンは緑茶の旨味の主要成分として知られ、茶をはじめとする食品の香味成分として重要な物質である。テアニンを含めてγ−グルタミル誘導体は、動植物体における生理活性物質として作用することが指摘されていることから、生理活性物質としての有用性が期待されている。
【０００３】
従来より、テアニンの製造法としては、テアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。例えば、特開２００４−１０５４５には、茶抽出物を芳香族重合体を母体とする合成吸着剤に通液し、夾雑成分群及びテアニンの溶出挙動差を利用した分離によるテアニンの製造方法が開示されている。しかし、この場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１.５％前後程度しか蓄積されないことに加えて、一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、テアニンが速やかに分解され、蓄積量が少ないのが実情である。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では、工業的に十分な量のテアニンを生産することが難しく、実用的ではないことが指摘されている。
【０００４】
このようなことから、工業的生産方法の開発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学的に有機合成する方法が報告されている（特開２０００−２６３８３）。しかし、このような有機合成反応では収率が低く、合成物の分離精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘されている。
また、グルタミナーゼのγ-グルタミル基転移反応を利用して、グルタミンとエチルアミンからテアニンを合成する酵素法も報告されている（特開平１１-２２５７８９）。しかし、グルタミナーゼを用いた場合には、テアニンを合成する反応と共に、加水分解反応によってグルタミン酸が副反応物として合成されてしまう。このため、副産物としてのグルタミン酸が、テアニン精製を煩雑にするという問題点がある。
【０００５】
そもそも植物体においては、テアニンは、グルタミン酸とエチルアミンからテアニン合成酵素によって合成されていると考えられている。このテアニン合成酵素の活性を確認する試験は行われているものの、その実体であるタンパク質については、詳細な検討はなされておらず、これをコードする核酸についても知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１０５４５号公報
【特許文献２】特開２０００−２６３８３号公報
【特許文献３】特開平１１−２２５７８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、テアニン合成活性を備えた新規なタンパク質、すなわちテアニン合成酵素、及びその遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的に鑑み鋭意検討を重ねた結果、植物由来のテアニン合成酵素を抽出し、その塩基配列、及びアミノ酸配列を解明することに成功し、基本的には本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）である。
（１）次の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載の核酸：
（ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（ｂ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸、またはこの核酸と相補的な核酸、
（ｃ）上記（ａ）、または（ｂ）に記載の核酸またはこの核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつテアニン合成活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【０００９】
（２）次の（ｄ）または（ｅ）に記載のタンパク質：
（ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつテアニン合成活性を有するタンパク質。
（３）上記（１）に記載の核酸が発現可能に結合された発現用組換えベクター。
（４）上記（３）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（５）上記（２）に記載のタンパク質をグルタミン酸、エチルアミン誘導体、及びＡＴＰを含有する溶液中で反応させることを特徴とするテアニンの合成方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規なタンパク質であるテアニン合成酵素のアミノ酸配列、及びこのタンパク質をコードする核酸が提供される。このタンパク質を用いることにより、副反応が少なく、かつ大量にテアニンを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施する形態について、詳細に説明する。
本発明に用いられるテアニンとは、茶の葉に含まれているグルタミン酸誘導体であり、茶の旨味の主成分であって、呈味を用途とする食品添加物として使用されている。具体的には、γ-グルタミルエチルアミド、Ｌ−グルタミン酸-γ-エチルアミド等とも称される。
【００１２】
本発明のタンパク質は、配列番号２に記載の通り、３５６個のアミノ酸配列を有するテアニン合成酵素、及び配列番号４に記載の３５６個のアミノ酸配列を有するテアニン合成酵素である。本発明のタンパク質は、テアニン合成活性を有するタンパク質であれば、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。更に、タンパク質には、糖鎖が付加され、１個もしくは複数のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加することにより糖鎖の付加を調節することができる。こうして、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、糖鎖の付加を調節されたタンパク質についても、テアニン合成活性を有する限り、本発明のタンパク質に含まれる。
【００１３】
「タンパク質」とは、モノマーであるアミノ酸が、互いにアミド結合で一緒に結合されたポリマーのことを意味する。本明細書中において、「ポリペプチド」または「タンパク質」という語は、いかなるアミノ酸配列も含み、かつグリコプロテインのような修飾されたアミノ酸配列を含む。また、「ポリペプチド」には、自然に生じているタンパク質と共に、組換えまたは化学合成によって形成されたタンパク質をも含む。
「コードする」とは、本発明のタンパク質であるテアニン合成酵素をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、または本発明のタンパク質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含んでいる。
【００１４】
「核酸」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはいずれの核酸の修飾体をも含む。また、核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを含んでいる。本明細書中において、「遺伝子」とは、テアニン合成活性を備えたタンパク質をコードする核酸を意味している。
「テアニン合成活性」とは、グルタミン酸とエチルアミンとから、テアニンを合成する活性を意味する。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）温度約４０℃以上、塩濃度約５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ７．０］、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムである）、好ましくは、（２）約５０℃以上、約２×ＳＳＣ、更に好ましくは、（３）約６５℃以上、約０.１×ＳＳＣでのハイブリダイズ条件をいうが、この条件に制限されるものではない。この条件以外にも、モレキュラー・クローニング（第２版）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ１： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されているハイブリダイゼーションの条件に準じることができる。
【００１５】
「１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の当業者にとって周知の方法により、欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の個数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるということを意味している。
上記（３）の発明では、本発明のタンパク質を取得するための発現用ベクターについて述べているが、本発明の核酸を取得するためには、必ずしも発現用ベクターである必要はなく、本発明の核酸のうちのＤＮＡが結合された組換えベクターであればよいことは、当業者ならば極めて容易に考えつくであろう。
【００１６】
「発現可能」とは、所定のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡが、所定の条件下で、そのアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させる能力を有するという意味である。所定のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡが発現可能に結合されていると、そのＤＮＡは、所定の条件下で、所定のタンパク質を発現するということになる。具体的には、そのＤＮＡは、ベクター中において、発現調節配列に結合されている。ここで、「発現調節配列」とは、他の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを意味しており、他の核酸配列の転写を（好ましくは、翻訳をも）、制御及び調節する。発現調節配列には、適当なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、およびストップコドンが含まれる。
【００１７】
「プロモータ」とは、転写を行うために必要最小限な配列のことを意味している。プロモータには、細胞タイプ特異的、組織特異的、または外部からの信号や調節剤によってプロモータ依存的に遺伝子の発現を制御するプロモータ要素も含まれる。プロモータ要素は、発現されるＤＮＡの５'領域、または３'領域のいずれかに結合される。また、プロモータには、構成的なもの、または誘導的なもののいずれも含まれる。例えば、バクテリアにおいて発現ベクターを作製する場合には、誘導的なプロモータとして、バクテリオファージγのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃのハイブリッドプロモータ）などのプロモータが使用できる。また、哺乳動物細胞において発現ベクターを作製する場合には、哺乳動物細胞由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）や、哺乳動物ウイルス由来のプロモータ（例えば、レトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモータなど）が使用できる。
【００１８】
「組換えベクター」とは、プラスミド、またはウイルスを含む。一般的には、発現用組換えベクターは、複製開始点、プロモータおよび、その発現用組換えベクターが細胞に導入されたときに選択を許容する特別な遺伝子を含んでいる。本願発明のために適切なベクターとしては、バクテリアシステムにはＴ７に基づく発現ベクター、哺乳動物細胞システムにはｐＭＳＸＮＤ発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、昆虫細胞システムにはバキュロウイルス由来のベクター、その他にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等が含まれる。また、当業者であれば、本発明の実施のために、これら以外の適当なベクターを極めて容易に選択することができる。なお、使用されるベクターに従って、多くの適切な転写および翻訳要素、例えば構成的または誘導的なプロモータ、転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等を使用できるが、これらの要素は、当業者にとって公知のものである。酵母においても、構成的または誘導的プロモータを含んでいる多くのベクターを使用することができる。例示すれば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２のような構成的なイーストプロモータや、ＧＡＬのような誘導的なプロモータがある。また、外来性ＤＮＡ配列が、イーストクロモソームへ組み込まれることを促進するベクターも使用できる。
【００１９】
「形質転換」とは、ある細胞にとって新しい（外来性の）ＤＮＡを導入することによって、その細胞が永久的な遺伝子変化を起こすことを意味している。細胞が哺乳動物細胞である場合には、永久的な遺伝子変化は、その細胞のゲノム中にＤＮＡが導入されることによって達成される。
「形質転換体」とは、その細胞、あるいはその細胞の祖先の細胞が、組換えＤＮＡ技術によって、本発明のタンパク質をコードしているＤＮＡ（を含むベクター）が導入された細胞であることを意味している。組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換することは、当業者にとって周知な方法によって行うことができる。宿主が原核細胞（例えば大腸菌）であるときには、ＤＮＡの取り込み能力を有するコンピテント細胞は、当業者に周知の手順によって、塩化カルシウム法で処理することで準備できる。トランスフォーメーションは、エレクトロポレーション等の代替方法によっても実行することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、原核生物においてそのタンパク質をコードしている核酸を発現させることによって得ることができる。原核生物としては、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含むバクテリオファージ・プラスミドＤＮＡ・コスミドＤＮＡ発現用組換えベクターによって形質転換された微生物（例えばバクテリア）が例示できるが、本発明の技術的範囲は、これによって限定されるものではない。また、本発明のタンパク質は、インビトロ試験系において、大腸菌を大規模スケールで培養することによって、発現させることが可能である。
【００２１】
そのタンパク質を微生物から精製するには、例えばニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程で純化するための標識をタンパク質の配列中に持たせることによって単純化できる。そのような標識としては、例えば、複数個（好ましくは、５個〜１５個）のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン標識を本発明のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に組み込むことができる。そのようなポリヒスチジン標識によって、ニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程でタンパク質の単離を効率よく行うことができる。本発明のタンパク質には、回収を良好にする目的で、適当な酵素の切断部位を含むように設計することもできる。
【００２２】
宿主が真核生物である場合には、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルスベクターによって、ＤＮＡをトランスフェクションすることができる。また、真核細胞には、本発明のタンパク質をコードしているＤＮＡ分子と、選択可能な形質（例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子）をコードしている第２のＤＮＡ分子とを共にトランスフェクションすることができる。別の方法としては、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を使用して、一時的に真核細胞にウイルスベクターを感染させて形質を転換させ、タンパク質を発現させることが可能である。
【００２３】
真核細胞では、タンパク質が発現された後に適当な翻訳後修飾が生じる。転写一次産物の適切なプロセシング（例えばグリコシル化、リン酸化）を行ったり、遺伝子産物を分泌するための細胞内機構を持っている真核細胞では、蛍光性指示薬によって発現を確認できるような宿主細胞として使用できる。このような宿主細胞株としては、例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、またはＷＩ３８が挙げられる。
【００２４】
組換えタンパク質を長期間に渡って高い収率で生産するためには、安定的な発現系を構築することが好ましい。そのためには、ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりは、むしろ宿主細胞が、適切な発現調節要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）によって制御され、かつ本発明のタンパク質をコードしているＤＮＡと、選択可能なマーカーとによって形質転換されていることが好ましい。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、細胞に対して選択に対する耐性を授け、安定してプラスミドをそれらのクロモソームに組み込んで、順番にクローンをつくることが可能でありかつ細胞株として確立できるような細胞コロニーを形成することができるようなものが好ましい。例えば、宿主となる細胞に対して外来性ＤＮＡを導入し、その細胞を１〜２日間を栄養素の豊富な培地で培養した後に、選択用培地に変更して培養する。そのような選択系としては、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼがある。各選択系において、選択用遺伝子は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、およびａｐｒｔ−である。また、代謝系をブロックする選択系として、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｔｒｐＢ、ｈｉｓＤ、ＯＤＣなどがある。ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与える遺伝子であり、ｇｐｔはミコフェノール酸への耐性を与える遺伝子であり、ｎｅｏはアミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与える遺伝子であり、ｈｙｇｒｏはハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子である。また、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを許容する遺伝子であり、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを許容する遺伝子であり、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子）は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を与える遺伝子である。このような選択用遺伝子を用いることもできる。
【００２５】
本発明のタンパク質が発現された後の単離または精製の技術については、従来より公知の手段、例えばクロマトグラフ分離、硫安沈殿、及び抗原または抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）を利用した免疫学的な分離方法によって行うことができる。
次に、本発明の核酸およびタンパク質の単離方法等について説明する。
【００２６】
本発明の核酸は、以下（１）〜（３）のステップを経て単離することが可能である。
（１）茶幼植物核酸ライブラリーの調製
核酸ライブラリーには、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡが含まれる。このうち、ｃＤＮＡの調製は、例えば Eur. J. Biochem, 268, 3354-3359 (2001) に開示された公知方法に従って行うことができる。
この他に、ゲノミックＤＮＡを用いることもできる。
【００２７】
（２）テアニン合成酵素遺伝子の単離
テアニン合成酵素遺伝子については、従来は知られていない。このため、本発明者は、活性が類似のタンパク質であるグルタミン合成酵素の既知配列の一部を利用することができる。すなわち、グルタミン合成酵素の保存領域の遺伝子配列に基づき、縮重合入りプライマーを設計し、これを用いる。具体的には、配列番号６〜配列番号９に記載のＰＣＲプライマーを適宜に用い、茶幼植物核酸ライブラリーからＰＣＲ法によって、テアニン合成酵素遺伝子の単離を行うことができる。例えば、ライブラリーがＲＮＡの場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法により、テアニン合成酵素遺伝子を単離することができる。また、ｍＲＮＡを精製した後に、ｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により、テアニン合成酵素遺伝子を単離することもできる。
また、得られた部分断片の５’−、又は３’−に存在する未知の遺伝子領域は、ＲＡＣＥ法などの公知の方法を用いることで単離できる。
【００２８】
（３）塩基配列の決定
単離された遺伝子の塩基配列は、ダイデオキシ法などの公知の方法により決定することができる。また、決定された塩基配列に基づいて、既知遺伝子の塩基配列との相同性検索を行うことができる。
（４）単離したテアニン合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質の機能解析
単離したテアニン合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質は、テアニン合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このベクターを大腸菌に導入することにより大腸菌の菌体内で発現させることができる。テアニン合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質の発現、及びタンパク質の精製は、例えば「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）に添付のプロトコールに記載の方法に基づいて行うことができる。また、この大腸菌で発現、精製したテアニン合成酵素タンパク質の機能は公知の方法で確認することができる。例えば、 FEBS Lettes, 562, 171-176 (2004) に開示された公知方法に従って行うことができる。
【００２９】
（５）本発明に係る遺伝子またはタンパク質への変異の導入
本発明に係る遺伝子の塩基配列に１個もしくは複数の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加といった変異を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、亜硫酸ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシンをウラシルに置換するトランジション変異を起こさせる方法、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行いＤＮＡ合成時のヌクレオチド取り込みの正確さを低下させることにより変異を導入する方法等のランダムな変異の導入方法、アンバー変異を導入する方法等の部位特異的に変異を導入する方法が挙げられる。
【００３０】
また、本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加といった変異を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、上記のようにして調整された変異遺伝子を用いて組み換えタンパク質を転写・合成する方法が挙げられる。
【００３１】
（６）本発明の核酸またはタンパク質の利用
本発明の新規テアニン合成酵素は、グルタミン酸とエチルアミンとから、テアニンを合成することができる。この合成方法は、植物体においてテアニンが合成されている方法と同じであるため、従来の方法（つまり、グルタミナーゼを用いて、グルタミンとエチルアミンからテアニンを合成する方法）に比べると、副反応が少なく、反応後のテアニン精製ステップを簡易とすることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例および試験例により本発明をより詳細に説明する。これらの例は、本発明の一部を示すものであり、本発明の技術的範囲は、これらの実施例および試験例によって限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、ＰＣＲ法については、Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手順書に従った。また、塩基配列は、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサにより、両ストランドを解析した。
実施例１  茶幼植物若葉からのｃＤＮＡの調製
茶幼植物の若葉からのｃＤＮＡの調製は以下のようにして行った。
すなわち、茶幼植物若葉を摘み取り、速やかに液体窒素中にて冷凍した。全ＲＮＡをＡＧＰＣ（acid guanidium thiocyanate / phenol / chloroform）法により調製した。このＲＮＡを逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｃｒｉｐｔ：Ｗａｋｏ）、及び配列番号５に記載のオリゴｄＴプライマー（ＲＡＣＥ３２）を用い、逆転写酵素の手順書に従って、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に溶解し、ＰＣＲ法において鋳型として用いた。
【００３３】
実施例２  テアニン合成酵素遺伝子の単離
塩基配列が既知のグルタミン合成酵素のアミノ酸配列のうち、種を通じて比較的保存されている領域に相当する遺伝子の塩基配列を基に、配列番号６〜配列番号９に記載の二組のＰＣＲプライマーセットを作製した。実施例１で調製したｃＤＮＡについて、配列番号６と配列番号８の組からなる第１プライマーセットにより、一度目のＰＣＲ反応を行った後、配列番号７と配列番号９の組からなる第２プライマーセットにより、二度目のＰＣＲ反応を行うことにより、ネステッドＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ法の条件は、９４℃、０.５分間の熱変成、４２℃、０.５分間のアニーリング、及び７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとして、３０サイクルを行った後、最後に１０分間の伸長反応を行った。ゲル精製したＰＣＲ産物は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、塩基配列を解析した。
【００３４】
実施例３  テアニン合成酵素遺伝子の塩基配列の決定
上記実施例２において、２種類のテアニン合成酵素Ａ，Ｂを得た。配列番号１及び配列番号２には、テアニン合成酵素１の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示した。また、配列番号３及び配列番号４には、テアニン合成酵素２の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示した。
これら２つのクローンは、図１に示すように、互いに微妙に異なる配列を示し、他の植物由来のグルタミン合成酵素の配列とアミノ酸レベルで９０％程度の相同性を示した。
【００３５】
実施例４  テアニン合成酵素遺伝子を有する発現用組換えベクターの構築
これら２種のクローンのそれぞれについて、全長ｃＤＮＡ配列をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、各クローンをそれぞれ大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込んだ。この結果、それぞれのクローンは、Ｃ末端にヒスチジンタグを有する組み換え酵素として、大腸菌において異種発現されるように組み込まれた。なお、構築した発現用組換えベクターについては、ＤＮＡ配列を確認した。
【００３６】
実施例５  発現用組換えベクターによる形質転換、及び組換えタンパク質の発現
実施例４で構築した発現用組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを宿主として形質転換した。形質転換した大腸菌は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で、吸光度 Ａ６００ ＝ ０.６になるまで３０℃で培養し、次に０.４ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄｅを添加し、さらに１６℃で１４時間培養した。
【００３７】
実施例６  テアニン合成酵素の精製
実施例５で培養した大腸菌を集菌の後、０.１Ｍ ＮａＣｌを含む ４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.９に懸濁し、ソニケーターで細胞を破砕し、１５，０００ｇで４０分間遠心した。
次に、上清をＰｒｏ−ＢｏｎｄTM Ｎｉ2+ アフィニティ担体(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)カラムに通し、０.５Ｍ ＮａＣｌ及び４０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.９でカラムを洗浄の後、組み換え酵素を１０％グリセリン及び５００ｍＭイミダゾールを含む１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.５で溶出した。
【００３８】
実施例７  テアニン合成酵素の活性評価
実施例６で調製したテアニン合成酵素の酵素活性を次の方法で測定した。すなわち、14Ｃ標識グルタミン酸及びエチルアミンを基質とし、ＡＴＰ、Ｍｇ2+の存在下インキュベーションを行ったところ、14Ｃを含むテアニンが認められたことから、テアニン合成酵素活性を検出した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】既知の植物グルタミン合成酵素と、テアニン合成酵素１及び２（Ｃｌｏｎｅ１、Ｃｌｏｎｅ２）のアミノ酸配列を比較しつつ示した図である。
【図１】
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【配列表】
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