(57)【要約】【課題】乳製品の製造工程で大量に生じるホエーを利用して、酵母による4-trans, 8-trans-sphingadienineを主要な構成スフィンゴイド塩基としてもつセレブロシドの効果的な製造法を提供すること。【解決手段】ホエーあるいはホエー派出物を含む培地にクリヴェロマイセス・マルキシアナスを培養し、培養物から4-trans, 8-trans- sphingadienine を主要なスフィンゴイド塩基として持つセレブロシドを採取することを特徴とするセレブロシドの製造法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエーあるいはホエー派出物を含む培地にクリヴェロマイセス・マルキシアナスを培養し、培養物から4-trans, 8-trans- sphingadienine を主要なスフィンゴイド塩基として持つセレブロシドを採取することを特徴とするセレブロシドの製造法。
【請求項２】
クリヴェロマイセス・マルキシアナスが、クリヴェロマイセス・マルキシアナスNBRC10005株である請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホエーあるいはホエー派生物を含む培地を使用し、クリヴェロマイセス・マルキシアナスによる4-trans, 8-trans- sphingadienine を主要なスフィンゴイド塩基として持つセレブロシドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基を構成分として持つ脂質クラスの総称であり、脂肪酸がスフィンゴイド塩基の２位のアミノ基に酸アミド結合したものがセラミドである。1位の水酸基にグルコースが結合したものがセレブロシドと言われている。
スフィンゴ脂質は、真核生物一般に存在する生体膜脂質成分であり、動物、植物および微生物によって構成スフィンゴイド塩基や構成脂肪酸およびその他の構成分に違いが認められ、生物種固有のスフィンゴ脂質の分子種が存在している。酵母を含む真菌類に存在するセレブロシドを含むスフィンゴ糖脂質の構成スフィンゴイド塩基は、そのほとんどが9-methyl-4-trans, 8-trans-sphingadienineから構成されており、高等植物や動物の場合、9位のメチル基が存在しない構造を持ったスフィンゴイド塩基から構成されている。
【０００３】
ヒトを含めてスフィンゴ脂質の存在意義は依然不明な点が多いが、セラミドは、皮膚の上側層である角質層の主要脂質成分であり、セラミドのようなスフィンゴ脂質を含有する組成物の局所塗布は、例えば皮膚の障壁機能および水分保持特性を改善する（例えば非特許文献１）ことが知られている。セレブロシドを含む組成物に関する特許としては、抗嘔吐剤（特許文献１）、NKT細胞活性化剤（非特許文献２）、エイズ発症予防薬および進行抑制薬（特許文献３）、大腸ガン予防剤および予防食品（特許文献４）などがある。
これまで、化粧品や栄養補助食品等に使用されるセラミドやスフィンゴ糖脂質およびスフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質調製物は、主に動物供給源、特にウシから抽出されていた。しかし、ウシ海綿状脳症(BSE)の発生以来、潜在的な病原性の危険から植物起源へ移行したものの、植物由来のスフィンゴ脂質調製物は非常に高価である。
【０００４】
酵母ピヒア・シッフェリ（Pichia ciferrii）のような微生物は、スフィンゴ脂質、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシンやそれらの誘導体を生成することが発見されており(例えば非特許文献２、特許文献５)、セラミドやスフィンゴ糖脂質の化学合成の出発物質としてのスフィンゴイド塩基の生産法は公知である。
しかし、従来の酵母によるスフィンゴ脂質調製物に含まれる構成スフィンゴイド塩基は、高等生物の構成スフィンゴイド塩基として存在していないアセチル化されたものであった。また、サッカロマイセス属、チゴサッカロマイセス属およびクリヴェロマイセス属酵母にもセレブロシドが存在する(例えば特許文献６、非特許文献３)が、構成スフィンゴイド塩基は高等生物には存在しない9-methyl-4-trans, 8-trans-sphingadienineが多く存在している(例えば非特許文献３)。
このような実情から、動物もしくは植物組織以外で高等生物に共通のスフィンゴイド塩基を持った安全で安価なスフィンゴ脂質の新規供給源が望まれていた。
【０００５】
一方、ホエーはホエイまたは乳清とも呼ばれ、牛の乳などの獣乳からチーズ等の乳製品を製造する際に副生する液状のものである。一般に、それを噴霧乾燥したホエーパウダーとして流通している。主な成分として獣乳からチーズとして移行した成分の残りの成分を含有、すなわち、乳糖、ホエータンパク質、灰分等から構成されている。
ホエーに関しては詳しい成書が多くあり、その産業的利用に関しても詳しく言及されている（例えば非特許文献４）。また、ホエーに類似したものとして、乳またはホエーを限外濾過（UF）等の技術によってタンパク質を回収することで得られる透過液（パーミエート）がある。このようなホエー派生物は、主成分が乳糖と灰分からなる。
ホエーを培地として用いて酵母を培養し、各種のバイオマス生産を行うことは古くから知られているが、ホエー派生物も乳糖を主要な炭素原とするという意味でホエー同様に利用できる。ホエーおよびホエー派生物は、食品素材として用いることが可能な素材であるが、大量に生じるため、付加価値が低く、産業上の高度な利用が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開平０６−２７１５９８
【特許文献２】ＷＯ９８／４４９２８
【特許文献３】特開平０９−３１５９８０
【特許文献４】特開２００１−２１３７８２
【特許文献５】特表２００２−５１９０７０
【特許文献６】特表２００４−８９０４７
【非特許文献１】Eur. J. Dermatol, １巻，ｐ．３９−４３，１９９１年
【非特許文献２】J.  Bacteriol., ８０巻，ｐ．４８４−４９１，１９６０年
【非特許文献３】FEMS Yeast Res., ４巻, ｐ．５５３−５５８， ２００２年
【非特許文献４】Whey and lactose processing, Elsevier Applied Science, １９９２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高等生物には広く存在するものの、これまで真菌類ではほとんど蓄積しないとされている4-trans, 8-trans-sphingadienineをセレブロシドの主要な構成スフィンゴイド塩基として含む酵母を検索し、炭素源としてホエーあるいはホエー派生物を含む培地に当該酵母を培養し、ヒトに安全なセレブロシドを安価に製造する方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、生物学的に安全で、増殖能が活発な酵母に、高等生物と同様の構造を持ったスフィンゴ糖脂質が存在すれば、高付加価値なスフィンゴ脂質調製物の安全で、安価な供給源となりうると仮定を立て、係る微生物を用いてホエーあるいはホエー派生物などの安価な炭素源を含む培地で培養すれば、従来以上に安価なスフィンゴ脂質調製物が供給できることが可能になると考えた。
【０００９】
このような着想のもとに、微生物の検索を行い、4-trans, 8-trans- sphingadienine を主要なスフィンゴイド塩基として持つセレブロシドを含むスフィンゴ脂質を蓄積する酵母を見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成された。
請求項１に記載の発明は、ホエーあるいはホエー派出物を含む培地にクリヴェロマイセス・マルキシアナスを培養し、培養物から4-trans, 8-trans- sphingadienine を主要なスフィンゴイド塩基として持つセレブロシドを採取することを特徴とするセレブロシドの製造法である。
請求項２に記載の発明は、クリヴェロマイセス・マルキシアナスが、クリヴェロマイセス・マルキシアナスNBRC10005株である請求項１記載の製造法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安価、かつ安定的に入手できるホエーあるいはホエー派出物を用いて、ヒトに安全なセレブロシドを安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者らは、生物学的に安全で、増殖能が活発な酵母の中から、本発明に使用できる酵母を以下の方法で検索した。
まず、ラクトース資化性を有する乳酵母の中から、ブレッタノマイセス・アノマルス（Brettanomyces anomalus） NBRC 0796、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia） NBRC 0761、キャンディダ・ケフィール（Candida kefyr） NBRC 10287、キャンディダ・テヌイス（Candida tenuis） NBRC 10315 、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii） NBRC 0083、クリヴェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） ATCC 12426、Kluyveromyces lactis NBRC 0433、Kluyveromyces lactis NBRC 0648、クリヴェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） NBRC 1090、クリヴェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） NBRC 1267、クリヴェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） NBRC 1673、クリヴェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） NBRC 1903、クリヴェロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus） NBRC 10005、クリヴェロマイセス・ヴィッケルハミイ（Kluyveromyces wickerhamii） NBRC 1675、ロドトルラ・マイニュータ（Rhodotorula minuta） NBRC 0387、ヤマダツィマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa） NBRC 1163を選抜し、これらを培養し、培養物からセレブロシドを分離してスフィンゴイド塩基の組成を調べることによって、目的とするスフィンゴ脂質調製物の供給源となり得る微生物を検索した。すなわち、上記の微生物をそれぞれ500ml容の三角フラスコに入れた100mlのYPD培地で培養を行い、菌体を回収後、全脂質を抽出した。
【００１２】
得られた全脂質を100ml容のナス型フラスコに移して濃縮乾固の後、0.4規定のメタノール性水酸化カリウム50mlを加えて37℃で2時間保持した。反応後、クロロホルム-メタノール-水が8:4:3になるように300ml容の分液ロートへ移して1昼夜保持した。液が2層に分離したことを確認した後、上精をアスピレーターで除去して、等量のクロロホルム-メタノール-水(3:48:47)の加えて良く撹拌した後、2層になるまで放置した。この作業は2回繰り返して行った。下層をナス型フラスコに移し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固してアルカリ安定脂質（粗セレブロシド）画分を得た。
次に、このアルカリ安定脂質（粗セレブロシド）画分を、調製用ケイ酸薄層クロマトグラフィー（TLC）に供してクロロホルム-メタノール-酢酸(90:10:1 v/v)で展開後、標準品(sigma社製牛脳由来セレブロシド)と移動率（Rf）が一致するセレブロシドを分離精製した。得られたセレブロシドはジオキサン性5%水酸化バリウムを用いて分解し、生成したスフィンゴイド塩基の組成を常法によって分析した。
その結果、クリヴェロマイセス・マルキシアナス NBRC 10005由来のセレブロシドは、真菌に特徴的な9-methyl-4-trans, 8-trans-sphingadienineをほとんど含有せず、80％以上が4-trans, 8-trans-sphingadienineから構成されていることを見出した。
【００１３】
このようにして、本発明に使用する酵母を選抜した。すなわち、本発明には、4-trans, 8-trans-sphingadienineを主要な構成スフィンゴイド塩基とするセレブロシドを含むスフィンゴ脂質を蓄積できるクリヴェロマイセス属の酵母であれば使用することができる。好ましい酵母は、クリヴェロマイセス・マルキシアナスであり、特に好ましい酵母は、クリヴェロマイセス・マルキシアナス NBRC 10005である。
クリヴェロマイセス・マルキシアナスの培養には、液体培地が用いられ、該培地には炭素源としてホエーあるいはホエー派生物を含むことが必要である。なお、当該酵母が生育でき、目的とするセレブロシドを生産することができるのであれば、他の炭素源を含む培地（例えばYPD培地など）使用することができる。
【００１４】
ホエーやその派生物としては、甘性ホエー、酸性ホエー、ホエーパーミエート（ホエーを限外ろ過などの技術でタンパク質を回収することで得られる透過液）などがある。これらは液状でも粉状でもよいが、除タンパク処理したものが好適である。培地中のホエー濃度は、ラクトース換算で0.5〜20%、好ましくは2〜10％が適当である。
培地成分としては、炭素源の他に、上記酵母の生育に有用な窒素源、無機塩類などを含むことが望ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカーなどがあり、単独で用いても、組合わせて用いてもよい。なお、培地中の濃度は、硫酸アンモニウムは0.5〜5％、コーンスティープリカーは0.5〜10％程度が適当である。また、無機塩類としては限定されず、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウムなどが用いられる。
培地の初期ｐＨは7.5〜9.0に調整することが望ましく、8.0〜9.0がより好ましい。ｐＨの調節には、水酸化ナトリウム、アンモニア、炭酸ナトリウムなどが用いられる。
液体培地にクリヴェロマイセス・マルキシアナスを接種し、15〜35℃、好ましくは15〜25℃の温度で振盪培養を行う。培養時間は、セレブロシドが十分に生産されるまで、通常は24〜72時間、好ましくは24〜48時間である。
【００１５】
培養終了後、微生物菌体を回収して全脂質を分離し、脂質中に存在するスフィンゴ糖脂質の定量・定性分析を行う。この方法は既知の方法に従って実施すればよく、例えば蒸発光散乱検出器付高速液体クロマトグラフィー（HPLC-ESLD）やガスクロマトグラフィー（GC）を用いて行うことができるが、これらの分析法等に限定されるものではなく、当該技術分野において公知の様々な方法で行うことができる。
【実施例】
【００１６】
本発明の詳細を以下の実施例によって説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門(NBRC)より入手したクリヴェロマイセス・マルキシアナス NBRC10005Tを一白金耳かきとり、試験管中の液体培地(3ml)に接種して種培養を行った。菌体が増殖して白濁した培養液(1ml)を、500ml容の三角フラスコ中の液体培地100mlへ接種して培養を行った。
使用した液体培地はホエーパウダー(2%ラクトース相当量、よつ葉乳業社製)、0.5％硫酸アンモニウム、1％コーンスティープリカー、0.075％リン酸カルシウムおよび0.075％硫酸マグネシウムを含むもの（ｐH5.5）を用い、25℃、135rpmでの振盪培養を行った。約24時間後定常期に達した菌体は、遠心分離および蒸留水による洗浄を３度繰り返したのち、湿菌体を凍結乾燥し、供試材料とした。
【００１８】
凍結乾燥菌体0.5gを、5mlのメタノールと共に超音波破砕機（UD-200、Tomy Seiko、Tokyo、Japan）で10分間破砕し、全脂質は引き続き5mlのクロロホルム-メタノール（2:1および1:2、 v/v）でそれぞれ2回ずつ10分撹拌抽出した。得られた抽出液にクロロホルム-メタノール-蒸留水の比が8:4:3になるようにクロロホルムと蒸留水を加えて静置後、下層を濃縮して全脂質画分とした。
【００１９】
全脂質を100ml容のナス型フラスコへ移して濃縮乾固し、20mlの0.4規定メタノール性水酸化カリウムを加え超音波処理を行って完全に懸濁させた後、37℃で１時間保持した。
次いで、100ml容の分液ロートへクロロホルム−メタノール−水(8:4:3 v/v)になるように移した後、得られた下層を弱アルカリ安定画分とした。得られた弱アルカリ安定画分を、調製用ケイ酸薄層クロマトグラフィー（TLC）に供してクロロホルム-メタノール-酢酸(90:10:1 v/v)で展開した。その後、標準品(sigma社製牛脳由来セレブロシド)と移動率（Rf値）が一致するセレブロシドを分離精製した。
セレブロシドの構成成分分析では、スフィンゴイド塩基分析の際はジオキサン性5%水酸化バリウムを、脂肪酸および構成糖分析の際は5%無水メタノール性塩化水素を用いて分解し、得られた構成成分（スフィンゴイド塩基、脂肪酸、糖）の組成を常法によって分析した。また、ヒドロキシ脂肪酸の分析は、メチルエステル誘導体を更にアセチル誘導体として、CP-Sil 88キャピラリーカラム（0.25mm×50m、 Chrompack社製）を用い、160〜220℃（昇温5℃/min）の温度条件でGC分析に供した。
【００２０】
その結果、クリヴェロマイセス・マルキシアナス NBRC10005T由来セレブロシドは表１に示したような構成成分からなることが判明した。
【００２１】
【表１】
2006055071.tif 000002
【００２２】
構成成分分析の結果、クリヴェロマイセス・マルキシアナス NBRC10005Tは、従来知られている真菌由来セレブロシドの特徴である9-メチル型スフィンゴイド塩基をほとんど蓄積せず、高等生物で特徴的なスフィンゴイド塩基である4-trans, 8-trans-sphingadienineと16:0(2-OH)およびグルコースからなるセレブロシドがほとんどを占めることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明によれば、乳製品の製造工程で大量に生じるホエーを利用して発酵生産を行うことにより、安全性の高いセレブロシドを効率よく製造することができる。このセレブロシドは、化粧品、食品などの分野において幅広く利用される。