(57)【要約】【課題】自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物(ＶＢＮＣ状微生物)の蘇生技術を開発し、これを自然界からの微生物の取得に応用することにより、産業上有用な新規微生物のスクリーニング技術を提供する。【解決手段】自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物を、システイン換算量で１２．５ｍｇ／L以上のシステイン化合物を含む栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする微生物の取得方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物を、システイン換算量で１２．５ｍｇ／L以上のシステイン化合物を含む栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項２】
前記システイン化合物がシステイン、システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質、又はこれらの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質が、グルタチオン、メタロチオネイン、又はこれらの混合物である請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界から産業上有用な微生物を取得するためのスクリーニング技術に関し、更に詳細には、自然界に多く存在し、生存するが培養が困難な微生物群から培養可能な微生物を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界から微生物を分離し、培養し、新たな微生物を得る方法としては、伝統的な平板培養法がコッホにより発明されて以来、様々な方法が開発され、それにより産業上有用な微生物が数多く分離され利用されてきた。
【０００３】
特に最近、いわゆるＶＢＮＣ状態（生きているが培養困難な状態）で自然界に存在する微生物を、培養が可能な状態あるいは平板培養でコロニーを形成する状態にする技術、換言すれば仮死状態にあるＶＢＮＣ状微生物を通常の微生物に蘇生させる技術により、これまで知られていなかった新たな微生物が見出されるようになった。
【０００４】
ＶＢＮＣ状態の微生物の蘇生技術に関しては、例えばカタラーゼを含む培地を用いる技術がこれまで報告されている（特許文献１：特開２００４−８９１０６号公報）。しかしながら、このような方法によっても蘇生しない微生物がまだ数多く存在することが予想されるので、当該技術に代わる新たなＶＢＮＣ状微生物の蘇生・取得方法が求められている。
【０００５】
ところで、システインは還元性物質として知られており、嫌気性細菌培養のための培地に添加した例が知られている。例えば、システインを２５０ｍｇ／ｌ含むルーメン細菌分離用寒天培地（非特許文献１：東京化学同人  新生化学実験講座  第１７巻  微生物実験法  特に４３９頁）や、システインを５００ｍｇ／ｌ含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌用選択培地（非特許文献１：東京化学同人  新生化学実験講座  第１７巻  微生物実験法  特に４４０頁）の知見がある。しかしながら、システインやシステインを含む化合物を好気性微生物の取得に用いた例については、特に報告がない。さらに、システインやシステインを含む化合物が、ＶＢＮＣ状微生物の蘇生について何か影響を及ぼすか否かについては、全く何の知見もない。
【０００６】
システイン残基を含む化合物としてはグルタチオンが知られている。グルタチオンとはγ―L−グルタミルーL―システイニルグリシンで、生体内にて酸化還元の機能に関与している（非特許文献２：岩波書店  生物学辞典第４版  ３６４頁）。さらにシステイン残基を多く含む蛋白質としてメタロチオネインやアルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ−ユビキノン  オキシドレダクターゼが知られている（非特許文献３：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２６７３−２６７８（１９９５））。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−８９１０６号公報
【非特許文献１】東京化学同人  新生化学実験講座  第１７巻  微生物実験法  ４３９〜４４０頁
【非特許文献２】岩波書店  生物学辞典第４版  ３６４頁
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２６７３−２６７８（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この発明の主要な課題は、従来技術とは異なる新規なＶＢＮＣ状態の微生物の蘇生技術を開発し、これを自然界からの微生物の取得に応用することにより、産業上有用で新規な微生物のスクリーニング技術を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の課題についての研究において、ＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術を種々検討した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２を栄養培地で培養し、４８時間培養後の菌体を１２０時間低温に静置してＶＢＮＣ状態を誘導した。このＶＢＮＣ状態を誘導したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２を使用して、熱処理、薬剤処理など、種々の条件にて検討した。その結果、低温処理してＶＢＮＣ状態を誘導したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２をシステインを添加した培地で培養すると蘇生率が５倍に向上することを見出した。これは、報告があったカタラーゼの添加条件より蘇生効果が高いことが明らかとなった。
【００１０】
更に、システイン残基を含む化合物グルタチオンや、システイン残基を多数含み、還元性の高い蛋白質メタロチオネインを添加した培地においても、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の蘇生率が２倍に上昇することを見出した。即ち、システイン、システイン残基を含む化合物、システイン残基を多量に含む蛋白質の添加培養法はＶＢＮＣ状態の微生物を蘇生させる効果があることを見出し、課題を解決することができた。
【００１１】
また、システインやシステイン残基を含む化合物グルタチオン、システイン残基を多数含み、還元性の高い蛋白質メタロチオネインなどに関しては、還元性が高いという共通した性質を有しているが、これまでＶＢＮＣ菌体の蘇生効果を有する物質として報告があったカタラーゼとは異なる性質を有している。
【００１２】
つまりシステインや、システイン残基を含む化合物グルタチオン、システイン残基を多数含み、還元性の高い蛋白質メタロチオネインなどを含む寒天平板培地より、ＶＢＮＣ状態の微生物を蘇生させることによって取得した微生物は、カタラーゼを添加培地より取得した微生物とは異なる可能性が極めて高い。
【００１３】
即ち、本発明によれば、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物を、システイン換算量で１２．５ｍｇ／L以上のシステイン化合物を含む栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする微生物の取得方法が提供される。
さらに、本発明によれば、前記システイン化合物がシステイン、システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質、又はこれらの混合物である前記方法が提供される。
さらに、本発明によれば、前記システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質が、グルタチオン、メタロチオネイン、又はこれらの混合物である前記方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物の取得方法によれば、従来のＶＢＮＣ微生物の蘇生、取得方法では取得できなかった新たな微生物を取得しうる、新たな微生物のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。微生物の分離はシステインを添加した平板培養法による好ましい代表例を示して、これを中心に説明するが、本発明の好ましい代表例として説明するものであり、本発明がこの代表例に限定されることはない。
【００１６】
本発明でいう自然界とは、人工的に分離されていない微生物が存在しうる全ての環境をいい、土壌、泥、湖水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境、或いは深海、深地下、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、強アルカリ性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境が含まれる。又、病院、食品工場における空気および活性汚泥、風味付け汁、果汁等の食品加工産業原料、更に金属表面等の人工的環境も自然界に含める。
【００１７】
本発明で使用する栄養培地は、特定割合のシステイン化合物を含有する。前記システイン化合物としては、システインそのもの、シスチン等のシステインの誘導体、システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質、又はこれらの混合物を用いることができる。ここで、「ペプチド若しくは蛋白質」との記載は、特にペプチドと蛋白質とを明確に峻別するものではなく、ジペプチド以上のポリペプチドを包括的に総称するものである。前記システイン残基を含むペプチド若しくは蛋白質としては、グルタチオン、メタロチオネイン、又はこれらの混合物を用いることができる。
【００１８】
本発明で使用する栄養培地は、システイン化合物を、システイン換算量で１２．５ｍｇ／L（例えば０．２５ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上、好ましくは１２５０ｍｇ／Ｌ（例えば２５ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上含む。ここでシステイン換算量とは、システイン化合物中のシステイン残基の割合として計算することができる。例えば、システイン残基の占める質量割合が約３９．４％であるグルタチオンをシステイン化合物として用いる場合、３１．７ｍｇ／Ｌ（例えば０．６３４ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上のグルタチオンを含有すれば、本発明で使用する栄養培地の範疇に入る。より好ましくは、グルタチオンをシステイン化合物として用いる場合、３７．５ｍｇ／Ｌ（例えば０．７５ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上、さらに好ましくは３７５０ｍｇ／Ｌ（例えば７５ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）とすることが好ましい。また、システイン化合物としてメタロチオネインを用いる場合、メタロチオネイン中のシステイン含有割合にもよるが、例えば分子量6000でシステイン残基を16残基含むメタロチオネインの場合、３8．5ｍｇ／Ｌ（例えば０．77ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上、好ましくは3850ｍｇ／Ｌ（例えば77ｍｇ／２０ｍｌ平板培地プレート）以上とすることができる。
【００１９】
本発明で使用する栄養培地は、上記特定割合のシステイン化合物を含有する点以外は特に限定されず、その他の成分については、通常の微生物分離法で使用される栄養培地に含まれるものと同様のものを含むことができる。具体的には例えば、下記のものに、適宜所要量のシステイン化合物を加えたものを用いることができる。
【００２０】
例えば温和な環境から採取された試料については完全培地が使用される。具体的に培地について例示すれば、ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ：カゼイン加水分解物  １．０％、酵母エキス  ０．５％、食塩  １．０％、ＤＩＦＣＯ社）、ＴＯＲＹＰＴＩＣ  ＳＯＹ  ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＹＧ培地（グルコース  ０．１％、酵母エキス  ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０３％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ｐＨ６．８）等が使用される。特定の微生物群、例えば乳酸菌の分離を目指す場合にはＧＹＰ−Ｓ培地（グルコース  １％、酵母エキス  １．０％、ペプトン  ０．５％、酢酸ナトリウム  ０．２％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．５％、塩溶液  ０．５％、ｐＨ６．８）、酵母、酢酸菌、乳酸菌等の場合にはＧＹＭＰ培地（グルコース  １％、酵母エキス  ０．５％、麦芽エキス  ０．３％、ペプトン  ０．５％、ｐＨ６．０）等がある。しかしながら、極端な環境から採取した試料の場合には、採取した試料の存在する環境を考慮し、その環境にあった培地を使用することが望ましい。例えば活性汚泥から採取した試料の場合には、活性汚泥を培地の構成成分として加えたり、海洋微生物を分離する際には、海水または人工海水を培地成分として使用する等、培地についての配慮が必要である。
【００２１】
通常、自然界から微生物を分離するには、土壌等の特定の分離源から試料を採取し、採取した試料を段階的に希釈後、平板培地に塗布し、一定時間平板培養後、プレート上に形成されるコロニーを分取する方法、あるいは一旦液体培地で集積培養を行った後、平板培養法で分離する方法が行なわれる。この際、微生物の培養も当然のことながら分離源の環境を考慮した培養条件で培養される。例えば温泉から採取した試料の場合には高温で培養することが望ましい。
【００２２】
本発明の、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物とは、上記特定量のシステイン化合物を含まない他は本発明の特定の栄養培地と同様の培地を用いて上記の方法で培養することが困難な微生物群をいい、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を以下、ＶＢＮＣ状微生物と称する。
【００２３】
上記システイン化合物としてシステインそのものを用いる場合、具体的には例えば、ナカライテスク社の商品カタログに記載されたＬ−システイン塩酸塩一水和物化合物（カタログの商品番号：１０３１３−４２）を水に溶解し、水酸化ナトリウムにてｐH７に中和したものを添加することができる。また上記システイン化合物としてグルタチオンを用いる場合、具体的には例えば和光純薬社製カタログ番号０７３−２０１３を使用することができる。上記システイン化合物としてメタロチオネインを用いる場合、具体的には例えばＳＩＧＭＡ社製のＲａｂｂｉｔの肝臓由来のもの（カタログの商品番号：Ｍ−７６４１）を使用することができる。下記に記載した実施例においてはこれらを使用している。
【００２４】
本発明で使用する栄養培地は、具体的には平板培地を用いることができる。さらに具体的には、一般的な１プレート当たり２０ｍｌの平板培地を用いることができる。上に述べた１Ｌ当たりのシステイン化合物量の１／５０を２０ｍｌ平板培地に添加することにより、本発明の微生物の取得法を良好に実施することができる。
【００２５】
システインを添加した平板培地で、ＶＢＮＣ状微生物を培養するとＶＢＮＣ状微生物が増殖し、コロニーの出現数が増大することで、ＶＢＮＣ状微生物の増殖を確認することができる。例えば上記所定量のシステインを含む培地を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を培養すると、蘇生率が例えば５倍に向上することを観察しうる。また上記所定量のグルタチオンやメタロチオネインを含む培地によっても、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の蘇生率が例えば２倍に向上することを観察しうる。
【００２６】
土壌から採取した試料を、本発明の微生物の取得法で培養すると、システイン無添加の培地での培養に比べて、プレート上のコロニーの出現数を、上記の通り２〜５倍程度に向上させることができる。プレート上のコロニーを分離し、分離した微生物をシステインを含まない培地で培養するといずれの微生物も、繰り返し培養できることから、ＶＢＮＣ状微生物が蘇生していることが示される。
【実施例】
【００２７】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（システインによるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の蘇生能の検討）
（１）まず、ＶＢＮＣ状微生物を実験的に多量取得するために、モデル微生物としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を選択した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株をＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて培養した。４８時間振盪培養した菌体（６６０ｎｍにおける２６倍希釈溶液の濁度、０．２）を４℃に静置した。静置開始後、経時的に生菌数（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｅｌｌ）とコロニー形成菌数（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）を測定した。
【００２９】
生菌数の測定は、松下エコシステム社製、微生物迅速検査装置バイオプローラ（商品名）を使用した。コロニー形成数の測定はＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＩＣＯ）寒天培地を用いて実施した。その結果４℃に静置後、４０日間で９９％の微生物がＶＢＮＣ状態になることが確認された。
【００３０】
（２）次に、ＶＢＮＣ状態にしたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌体を使用して蘇生条件の検討（コロニー形成能の復活検討）を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２をＶＢＮＣ状態に誘導するため（１）と同一の培地中３７℃で４８時間培養した後、４℃の低温下で、４０日間、静置反応を行い、ＶＢＮＣが進行した状態の菌体を含む培地を調製した。
【００３１】
（３）蘇生用の培地として、表１に示す各種濃度のシステインを含むＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＩＣＯ）寒天培地を調製した。ここでシステインの添加は、ナカライテスク社の商品カタログに記載されたＬ−システイン塩酸塩一水和物化合物（カタログの商品番号：１０３１３−４２）を水に溶解し、水酸化ナトリウムにてｐH７に中和したものを添加することにより行った。表１に示すシステイン濃度は、システイン（HSCH2CH(COOH)NH2）としての濃度である。これらの寒天培地を、２０ｍｌ平板培地とし、これらのそれぞれに上記（２）で調製したＶＢＮＣ状態の菌体を含む培地を適宜希釈して接種し、37℃で20時間培養した後、コロニー数を計数した。結果を表１に示す。表１において、コロニー数は、上記（２）で得た培地１ｍｌあたりのコロニー数として表現した。
【００３２】
表１に示すようにシステインの添加量に応じてコロニー形成数の増大が見出された。また、表１に示すように、システイン添加によるＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の蘇生効果は、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＩＣＯ）寒天培地でプレートあたり０．２５ｍｇ／ｐｌａｔｅ以上、好ましくは２５ｍｇ／ｐｌａｔｅ以上のシステイン添加において、顕著であることが見出された。
【００３３】
【表１】
2006288272.tif 000002
【００３４】
また、そのシステインの添加によるＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の蘇生効果は、表２に示したように、特許文献１において報告されていたカタラーゼの添加より、大きいことが明らかとなった。
【表２】
2006288272.tif 000003
【００３５】
実施例２（グルタチオン及びメタロチオネインによるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の蘇生能の検討）
培地にシステインを添加する代わりに、表３に示す濃度のグルタチオン（和光純薬社製カタログ番号０７３−２０１３）又はメタロチオネイン（ＳＩＧＭＡ社製のＲａｂｂｉｔの肝臓由来のもの（カタログの商品番号：Ｍ−７６４１））を添加した他は、実施例１と同様に操作し、蘇生したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のコロニー数を計数した。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
2006288272.tif 000004
【００３７】
実施例４（新規微生物の取得）
次に、人工的に誘導したＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の蘇生に対するシステイン、グルタチオンおよびメタロチオネインの添加効果を、自然分離源の例として、ＶＢＮＣ状微生物が多いことが知られている土壌からの分離に応用した。川崎の土壌から採取したサンプルを０．８％の生理食塩水にて適当に希釈した。この溶液を、ＹＧ培地（対照区）、システインを２５ｍｇ／ｐｌａｔｅを加えたＹＧ培地（システイン添加区）、グルタチオンを７ｍｇ／ｐｌａｔｅを加えたＹＧ培地（グルタチオン添加区）、及びメタロチオネインを１ｍｇ／ｐｌａｔｅ添加したYG培地（メタロチオネイン添加区）に塗布した。３０℃で平板培養し、１週間後にプレート上に形成したコロニー数をカウントした。その結果を表４に示す。表４のように、システイン、グルタチオン、メタロチオネインの添加によって、コロニー形成数が増大し、新たなコロニー形成菌の出現が認められた。
【００３８】
【表４】
2006288272.tif 000005
【００３９】
次に、対照区から取得した微生物１０株と、システイン、グルタチオン、メタロチオネイン添加区より取得した微生物１０株を選択し、選択した微生物について新規性を調べた。選択した微生物の１６SｒRNA遺伝子の塩基配列の解析を行い、データーベース上での相同性が９７％以下を示す微生物を新規性有りと判定した。その結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
2006288272.tif 000006
【００４１】
表５に示すように、培地へのシステイン、グルタチオン、メタロチオネイン添加により、新規微生物の取得率が向上することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の微生物の取得方法によれば、従来のＶＢＮＣ微生物の蘇生、取得方法では取得できなかった、新たな、産業上有用な微生物を取得しうる。