(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ＶＧＦポリペプチド（ニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチド）および選択的結合剤、および、ＶＧＦ医薬組成物およびＶＧＦポリペプチドに関連する疾患、症状および障害の診断、治療、改善および／または予防の方法を提供する。【解決手段】特定配列のＶＧＦポリペプチド、水溶性ポリマーによって共有結合的に修飾されているＶＧＦペプチド、及び、ＩｇＧ定常ドメインに融合されたＶＧＦ融合ペプチド。ＶＧＦ関連疾患を防止し、治療へ利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列の断片を含む単離されたポリペプチドであって、断片が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の断片を含む単離されたポリペプチドであって、断片が配列番号２で表されるポリペプチドの活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）１以上の保存的アミノ酸置換を持つ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１以上のアミノ酸挿入を持つ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）１以上のアミノ酸欠失を持つ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）Ｃおよび／またはＮ末端切断を持つ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端切断およびアミノ末端切断より成る群から選択される１以上の修飾を持つ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで表されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
より成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項６】
非相同性アミノ酸配列に融合された請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項７】
非相同性アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメインまたはその断片である、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な調合剤を含む組成物。
【請求項９】
医薬的に許容可能な調合剤が担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤または抗酸化剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含むポリペプチド。
【請求項１１】
水溶性ポリマーによって共有結合的に修飾されている、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールより成る群から選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールおよびデキストランより成る群から選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＶＧＦポリペプチド関連の疾患、障害または症状を治療、防止または改善する医薬の製造における、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
ＶＧＦポリペプチド関連疾患、障害または症状が肥満である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＶＧＦポリペプチド関連疾患、障害または症状が不妊、悪液質、摂食障害、ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過剰症状、機能亢進、機能低下および過剰インシュリン生成より成る群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
摂食障害が過食症および拒食症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
被験者のＶＧＦポリペプチド関連症状またはＶＧＦポリペプチド関連症状に対する感受性を診断する方法であって：
（ａ）請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドの発現の存在または量を決定することと；
（ｂ）ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、ＶＧＦポリペプチド関連症状またはＶＧＦポリペプチド関連症状に対する感受性を診断すること；
を含む方法。
【請求項１９】
ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって：
（ａ）請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物に接触させることと；
（ｂ）ポリペプチドの化合物への結合の程度を決定すること；
を含む方法。
【請求項２０】
化合物に結合した場合のポリペプチド活性を決定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）埋め込みに適した膜と；
（ｂ）前記膜内にカプセル化された細胞であって、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する細胞と；
を含む装置であって、
前記膜が前記タンパク質に対して透過性であり、前記細胞に対して有害な物質には不透過性である装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ＶＧＦポリペプチドおよび選択的結合剤を提供する。本発明は、宿主細胞およびＶＧＦポリペプチドを製造する方法も提供する。本発明はさらに、ＶＧＦ医薬組成物およびＶＧＦポリペプチドに関連する疾患、症状および障害の診断、治療、改善および／または予防の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＧＦは、ニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチドである。Ｃａｎｕら、１９９７，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ４５：４４３−４６。ＶＦＧは視床下部に見られ、電気活動、負傷および体内時計により脳内で調節される。視床下部は、食物摂取およびエネルギー産出の調節に重要な役割を果たすことが示されており、視床下部への損傷が食欲と体重の両方に影響を及ぼすことがわかっている。Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９５，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２６９：９４９−５７。ＶＧＦは代謝においても役割を果たすことがわかっている。
【０００３】
ヒトおよびラットＶＦＧのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られており、相互に相同性が高い。Ｃａｎｕら、同上。ＶＧＦ遺伝子は、当初２．７ｋｂ  ｃＤＮＡフラグメントとして同定され、ニューロトロフィンによってインビトロでニューロンおよび内分泌細胞のサブポピュレーション内で転写される。
【０００４】
肥満および食欲不振は、エネルギーの摂取と消費のアンバランスから生じるエネルギーホメオスタシスの崩壊である。これらの症状を効果的に治療するための需要がある。悪液質、不妊、代謝過多症状、機能亢進、機能低下、インシュリン生成過多、および関連症状ならびに障害の効果的に治療するための需要もある。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。好ましい単離されたポリペプチドは、配列番号２で示すアミノ酸配列を含む。
【０００６】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列の断片を含む、単離されたポリペプチドを提供し、ここで断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有する。好ましい単離されたポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の断片を含み、ここで断片は配列番号２で示されるポリペプチドの活性を有する。
【０００７】
本発明はさらに、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）１以上のアミノ酸挿入を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）１以上のアミノ酸欠損を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠損、カルボキシル末端切断およびアミノ酸末端切断より成る群から選択される１以上の修飾を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列。
【０００８】
非相同アミノ酸配列に融合した上述の１以上のポリペプチドを含む融合タンパク質も提供される。
【０００９】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む１以上のポリペプチドに特異的に結合可能な、抗体などの選択的結合剤も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０、またはその天然形での変異型のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む１以上のポリペプチドの断片に特異的に結合可能な選択的結合剤を提供する。
【００１１】
本発明の選択的結合剤は、これに限定されるわけではないが、ネズミ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト抗体、抗イディオタイプ抗体、および（ＦａｂまたはＦａｂ’断片などの）可変領域断片を含む抗体、またはその断片でもよい。本発明の選択的結合剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの特異性を備えた１以上の相補性決定領域を有する選択的結合剤またはその断片を含む。
【００１２】
本発明の選択的結合剤は、検出可能な標識に任意に結合できる。
【００１３】
ＶＧＦ生物活性に拮抗可能な選択的結合剤も提供される。
【００１４】
好ましい選択的結合剤またはその断片は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を特異的に結合可能である。
【００１５】
本発明は、本発明のポリペプチドまたは選択的結合剤を含む医薬組成物も提供し、１以上の製薬的に許容可能な調合剤も本発明に含まれる。調合剤は適切な担体、アジュバント、可溶化剤、安定化剤または抗酸化剤でもよい。ＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤は、ポリエチレングリコールおよびデキストランなどの水溶性ポリマーによって共有結合的に修飾できる。本発明の医薬組成物を用いて、治療上有効量の本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤を提供する。本発明は、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害を治療する医薬品の製造方法も提供する。
【００１６】
本発明はさらに、患者に本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤の有効量を投与することを含む、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害を治療、予防または改善する方法を提供する。ＶＧＦ関連疾患、症状または障害には、肥満、不妊、悪液質、摂食障害、ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過多症状、機能亢進、機能低下、およびインシュリン生成過多を含む。ＶＧＦ関連摂食障害は、過食症および拒食症を含む。本発明の方法は、本発明のＶＧＦポリペプチドまたは選択的結合剤の組合せの投与も提供することが認識されるであろう。
【００１７】
ＶＧＦポリペプチドの発現の存在または量を判定することと、ＶＧＦポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、ＶＧＦ関連疾患、症状または障害、あるいはＶＧＦ関連、症状または障害に対する感受性を診断することを含む、動物におけるＶＧＦ関連疾患、症状または障害、あるいはＶＧＦ関連、症状または障害に対する感受性を診断する方法も提供される。ＶＧＦ関連疾患、症状または障害、あるいはＶＧＦ関連、症状または障害に対する感受性を診断する好ましい方法において、動物は哺乳類である。さらに好ましい方法では、動物はヒトである。
【００１８】
本発明は、ＶＧＦポリペプチドに結合する試験分子を確認するために、試験分子をアッセイする方法も提供する。本方法は、ＶＧＦポリペプチドを試験分子に接触させることと、試験分子のポリペプチドへの結合の程度を判定することを含む。方法はさらに、そのような試験分子がＶＧＦポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストのどちらであるか判定することを含む。本発明はさらに、ＶＧＦポリペプチドの発言またはＶＧＦポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を含む。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的は、明細書を全体として考慮すると明らかになるであろう。
【００２０】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＶＧＦ−１を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号１）；
図２は、ＶＧＦ−２を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号４）；
図３は、ＶＧＦ−１ａ（配列番号２）の投与後のＶＧＦノックアウトマウスの体重を示す。ＶＧＦ−１ａの投与は第５日に中止した（矢印で示す）。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用する節の見出しは、構成のためだけであり、説明する主題を限定するものとして解釈すべきではない。本出願で引用したすべての参考文献は、本明細書中に特に援用したものである。
【００２２】
定義
「ＶＧＦポリペプチド」という語は、表Ｉに示すアミノ酸配列のいずれかを含むポリペプチド、および本明細書で述べる関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、ＶＧＦポリペプチド断片、オルトログ、変異型、誘導体を含み、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０ので示されるいずれかのＶＦＧポリペプチドの１以上の特性を有する。ＶＧＦポリペプチドは本明細書で定義するように成熟したポリペプチドでもよく、調製方法によってアミノ末端メチオニン残基を備えていなくてもよい。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
「ＶＧＦポリペプチド断片」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるポリペプチドのいずれかのアミノ末端での切断および／またはカルボキシル末端での切断を含むポリペプチドを指す。「ＶＧＦポリペプチド断片」という語は、ＶＧＦポリペプチドオルトログ、変異型または誘導体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端切断も指す。ＶＧＦポリペプチド断片は、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボプロテアーゼ活性から生じる。そのようなＶＧＦポリペプチド断片は随意にアミノ末端メチオニン残基を含む。そのような断片はたとえば、ＶＧＦポリペプチドに対する抗体を生成するのに使用できる。
【００２５】
「ＶＧＦポリペプチドオルトログ」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるＶＧＦポリペプチドのいずれかに一致する別の種からのポリペプチドを指す。たとえば、マウスおよびヒトＶＧＦポリペプチドは相互のオルトログと見なされる。
【００２６】
「ＶＧＦポリペプチド変異型」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるいずれかのＶＧＦポリペプチドと比べて、１以上のアミノ酸配列置換（保存的、非保存的、またはその組合せ）、欠損（内部欠損および／またはＶＧＦポリペプチド断片など）、および／または付加（内部付加および／またはＶＦＧ融合ポリペプチドなど）を有するアミノ酸配列を含む、ＶＧＦポリペプチドを指す。変異型は天然型（たとえばＶＧＦポリペプチド対立遺伝子変異型またはＶＧＦポリペプチドオルトログ）でも、人工的に作成してもよい。
【００２７】
「ＶＧＦポリペプチド誘導体」という語は、化学的に修飾された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるいずれかのポリペプチド、または本明細書で定義するようなＶＧＦポリペプチド断片、オルトログまたは変異型を指す。化学修飾はたとえば、これに限定されるわけではないが、水溶性ポリマー、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物、糖およびリン酸塩を含む、１以上のポリマーの共有結合的付加によってもよい。ＶＧＦポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに付加する分子の種類および位置のどちらかが、天然型ＶＧＦポリペプチドとは異なる方法で修飾される。ＶＧＦポリペプチド誘導体はさらに、ＶＧＦポリペプチドに天然のものでは付加している１以上の化学基の欠損を有するＶＧＦポリペプチドを含む。
【００２８】
「成熟ＶＧＦポリペプチド」という語は、リーダー配列の欠けたＶＧＦポリペプチドを指す。成熟ＶＧＦポリペプチドは、アミノ末端および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解処理（リーダー配列あり、またはなし）、大型の前駆体からの小型のポリペプチドの開裂、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化などの、他の修飾を含むことがある。
【００２９】
「ＶＧＦ融合ポリペプチド」という語は、ＶＧＦポリペプチド、断片、オルトログ、変異型または誘導体のアミノまたはカルボキシル末端における１以上の（非相同ペプチドまたはポリペプチドなどの）アミノ酸の融合を指す。
【００３０】
「生物活性ＶＧＦポリペプチド」という語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの１以上の活性特性を有する、ＶＧＦポリペプチドを指す。加えて、ＶＧＦポリペプチドは、抗体が出現する１以上のエピトープを含む。
【００３１】
「単離されたポリペプチド」という語は、（１）源細胞からの分離時に、ともに自然に発見された、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の約５０％以上から分離され、（２）「単離されたポリペプチド」が天然に結合しているポリペプチドのすべてまたは一部に（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）結合しておらず、（３）天然に結合していないポリペプチドに（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）結合しており、（４）天然に発生しない、本発明のポリペプチドを指す。単離されたポリペプチドは、治療上、診断上、予防上および研究上の使用を妨げる、自然環境で見られる他の汚染ポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
【００３２】
「ベクター」という語は、コーディング情報を宿主細胞に伝達するのに用いる任意の分子（たとえば核酸、プラスミドまたはウィルス）を指すのに用いる。
【００３３】
「発現ベクター」という語は、宿主細胞の形質転換に適しており、挿入された非相同核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含む、ベクターを指す。発現はこれに限定されるわけではないが、転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合はＲＮＡスプライシングなどのプロセスを含む。
【００３４】
「宿主細胞」という語は、核酸配列によって形質転換された、または形質転換され、次に興味のある選択された遺伝子を発現する能力のある細胞を指すのに用いる。この語は、選択された細胞が存在する限り、子孫の形態または遺伝子的性質が元の親細胞と同一であるかどうかにかかわらず、親細胞の子孫を含む。
【００３５】
「同一性」という語は当業者に公知であるように、配列の比較によって決定される、２以上のポリペプチド分子または２以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当業者には「同一性」は、場合に応じて、２以上のヌクレオチドまたは２以上のアミノ酸配列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたは核酸分子間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、２以上の配列の小さいほうと、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（ある場合）との間の同一一致のパーセントを測定する。
【００３６】
「類似性」という語は、関連する概念であるが、「同一性」とは異なり「類似性」は、同一一致および保存的置換一致の両方を含む関連性の測定値を指す。２つのポリペプチド配列がたとえば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、残りはすべて非保存的置換である場合、同一性および類似性のパーセントはどちらも５０％となる。同じ例で、保存的置換の位置がさら５あると、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％となる（１５／２０）。したがって、保存的置換がある場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高くなる。
【００３７】
「核酸配列」または「核酸分子」という語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。この語は、これに限定されるわけではないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかから生成された分子を含む。
【００３８】
「天然にある」または「ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）の」という語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生体物質に関連して用いる場合、天然に発見され、人間によって操作されていない物質をさす。同様に、「非天然型の」または「非ネイティブの（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」は本明細書で使用されるように、天然に発見されないか、人間によって構造的に修飾または合成された物質を指す。
【００３９】
「操作可能に結合した」という語は本明細書で使用されるように、フランキング配列の配置を指し、そのように述べられるフランキング配列は、その通常の機能を果たすように構成または構築される。したがって、コーディング配列に操作可能に結合されたフランキング配列は、コーディング配列の複製、転写および／または翻訳に影響を与えることができる。たとえばコーディング配列は、プロモータがそのコーディング配列の転写を指示できる場合は、プロモータに操作可能に結合されている。フランキング配列は、正しく機能する限り、コーディング配列と近接している必要はない。それゆえたとえば、介在性の未翻訳であるが転写された配列がプロモータ配列とコーディング配列の間に存在可能であり、プロモータ配列はコーディング配列になお「操作可能に結合され」ていると見なされる。
【００４０】
「有効量」および「治療的有効量」という語はそれぞれ、本明細書で示すＶＧＦポリペプチドの１以上の生物活性の観察可能なレベルを維持するのに用いられるＶＧＦポリペプチドの量を指す。
【００４１】
「製薬的に許容可能な担体」または「生理学的に許容可能な担体」という語は本明細書で使用されるように、医薬組成物としてのＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦ選択的結合剤の送達を実施および向上するのに適した１以上の調合物質を指す。
【００４２】
「選択的結合剤」という語は、ＶＧＦポリペプチドに対して特異性を有する１以上の分子を指す。本明細書で使用されるように、「特異的な」および「特異性」という語は、選択的結合剤がＶＧＦポリペプチドに結合し、非ＶＧＦポリペプチドには結合しない能力を指す。しかし、選択的結合剤はＶＧＦオルトログも結合することは認識されるであろう。
【００４３】
「形質導入」という語は、１つの細菌から別の細菌に、通常はファージによって遺伝子を伝達することを指すのに用いる。「形質導入」は、真核細胞配列のレトロウィルスによる獲得および伝達も指す。
【００４４】
「形質移入」という語は、細胞による外部または外来性ＤＮＡの取り込みを指すのに用い、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されていると、細胞は「形質移入」されている。多数の形質移入技術が当業界で周知であり、本明細書で開示されている。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １９８９）；  Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８６）；  ａｎｄ  Ｃｈｕら、１９８１，  Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。このような技術を用いて、１以上の外来性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入できる。
【００４５】
「形質転換」という語は本明細書で使用されるように、細胞の遺伝的特性における変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡを含有するよう修飾された場合に形質転換されている。たとえば、細胞は自然な状態から遺伝子的に修飾される場合に形質転換される。形質移入または形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組込まれることにより細胞のＤＮＡと組換えるか、複製されずにエピソーム因子として一時的に維持されるか、プラスミドとして独立に複製する。ＤＮＡが細胞分裂に伴い複製される場合、細胞は安定して形質転換されたと見なされる。
【００４６】
ＶＧＦポリペプチドの関連性
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列への保存的修飾によって、ＶＧＦポリペプチドに似た機能的および化学的特徴を持つポリペプチドが生成する。これに対して、ＶＧＦポリペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）たとえばシートまたはらせん形態などの、置換領域の分子主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する影響が著しく異なるＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列中の置換を選択することによって行われる。
【００４７】
たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、置換位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど、または全く影響がないように、ネイティブのアミノ酸残基と非ネイティブのアミノ残基との置換を含む。さらに、ポリペプチドのネイティブの残基は、「アラニン走査突然変異誘発」について以前述べたように、アラニンと置換されることもある。
【００４８】
保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく、一般に化学ペプチド合成によって含まれる非天然型アミノ酸残基も含む。これらはペプチド様アゴニスト、およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形を含む。
【００４９】
天然型残基は、共通側鎖特性に基づいたクラスに分けられる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
たとえば非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバを、他のクラスのメンバと交換することを含む。このような置換残基は、他のＶＧＦポリペプチドオルトログと相同性であるＶＧＦポリペプチドの領域、あるいは分子の非相同性領域に導入してもよい。
【００５０】
このような変更を行う場合、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮する。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。疎水性親水性指標は以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；アルギニン（−４．５）。
【００５１】
タンパク質に相互作用的生物機能を付与する場合、アミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当業界で一般に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−３１）。あるアミノ酸が、同様の疎水性親水性指標またはスコアを持つ他のアミノ酸と置換されるか、なお同様の生物活性を保持していることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更する場合、アミノ酸の置換は、その疎水性親水性指標が±２以内であることが好ましく、±１以内であることが特に好ましく、±０．５以内であることがまたさらに好ましい。
【００５２】
当業界では、特に生物機能が同等のタンパク質またはそれにより生成されるペプチドが、本発明の場合のように特に免疫学的実施形態に用いられる場合、同様のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効率的に行えることが知られている。隣接アミノ酸の親水性によって左右されるように、タンパク質の最大の局所平均疎水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物特性と相関する。
【００５３】
以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う場合、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の値が特に好ましく、±０．５以内の値がまた特に好ましい。親水性に基づいて１級アミノ酸からエピトープを同定してもよい。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００５４】
望ましいアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、当業者によって、そのような置換が望ましいときに決定することができる。たとえば、アミノ酸置換を用いて、ＶＧＦポリペプチドの重要な残基を同定したり、本明細書で述べるＶＧＦポリペプチドの親和性を増加または減少することができる。アミノ酸置換の例は、表２に示す。
【００５５】
【表２】
2006176528.tif 000003
【００５６】
当業者は、既知の技術を用いた適切なＶＧＦポリペプチド変異型を決定することができる。生物活性を損なわずに変更される分子の適切な領域を識別するには、当業者は、活性にとって重要とは思われない領域を標的とする。たとえば、同一種または他の種による、同様の活性を持つ同様のポリペプチドが既知である場合、当業者はＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をそのような同様のポリペプチドと比較する。そのような比較により、同様のポリペプチド内で保存されている分子の残基および部分を同定することができる。そのような同様のポリペプチドに対して保存されないＶＧＦ分子の区域における変化は、ＶＧＦポリペプチドの生物活性および／または構造に悪影響を与えにくいことが認識されるであろう。当業者は、相対的に保存的領域においても、活性を維持しながら、化学的に同様のアミノ酸を天然型残基と置換してもよいこともわかっている（保存的アミノ酸残基置換）。したがって、生物活性または構造にとって重要な領域でさえ、生物活性を損なわずに、またはポリペプチド構造に影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を受ける。
【００５７】
さらに当業者は、活性または構造にとって重要である、同様のポリペプチドにおける残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。そのような比較を考慮して、同様のポリペプチドにおける活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に一致する、ＶＧＦポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのように予測されたＶＧＦポリペプチドの重要なアミノ酸残基化学的に同様のアミノ酸置換を選ぶことがある。
【００５８】
当業者は、３次元構造およびアミノ酸配列を、同様のポリペプチドにおけるその構造に関して分析することもできる。そのような情報を考慮すると、当業者は、３次元構造に関してＶＧＦポリペプチドのアミノ酸残基の配置を予測することもある。当業者は、タンパク質表面にあると予想されるアミノ酸残基に極端な変更をしないことを選択する。なぜならそのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与するからである。さらに当業者は、各アミノ酸残基にアミノ酸置換を１個含む試験変形を作成することがある。変形は、当業者に既知の活性アッセイを用いてスクリーニングできる。そのような変形を用いて、適切な変形に関する情報を集めることができる。たとえば、特定のアミノ酸残基への変更によって、破壊された、望ましくなく減少された、または不適切な活性が生じた場合、そのような変更を備えた変形は避けられる。言い換えれば、そのようなルーチン実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換を単独で、または他の突然変異と組合わせて避ける必要のあるアミノ酸をただちに決定できる。
【００５９】
多数の化学文献が、二次構造の予測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ，  １９９６，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：４２２−２７；  Ｃｈｏら、１９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５；  Ｃｈｏｕら、１９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２；  Ｃｈｏｕら、１９７８，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４７：４５−４８；  Ｃｈｏｕら、１９７８，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２５１−２７６；  ａｎｄ  Ｃｈｏｕら、１９７９，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ２６：３６７−８４を参照。さらに現在、２次構造の予測を支援するためのコンピュータプログラムが利用できる。２次構造を予測する１つの方法は、相同モデル化に基づく。たとえば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似性を有する２個のポリペプチドまたはタンパク質は、同様の構造トポロジーを持つことが多い。最近、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が発達したことにより、ポリペプチドまたはタンパク質内のフォールドの考えられる数を含め、２次構造の予測可能性が向上した。Ｈｏｌｍら、１９９９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２７：２４４−４７を参照。所与のポリペプチドまたはタンパク質内には数が限定された折りたたみがあり、いったん臨界的折りたたみの構造が解決されれば、構造予測の精度は劇的にさらに向上する（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９７７，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ７：３６９−７６）。
【００６０】
２次構造予測の別の方法として、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，  １９９７，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ７：３７７−８７；  Ｓｉｐｐｌら、１９９６，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：４３５５−５８）、および「進化的連結」（Ｈｏｌｍら、同上およびＢｒｅｎｎｅｒら、同上を参照）が挙げられる。
【００６１】
好ましいＶＧＦ変異は、グリコシル化部位の数および／または種類が本発明のＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変化したグリコシル化変形を含む。１つの実施形態において、ＶＧＦポリペプチド変異は、本発明のＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列よりもＮ−結合グリコシル化部位の数が多いまたは少ない。すべてのＮ−結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒという配列を特徴とし、ここでＸで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のアミノ酸残基である。この配列を作成するためにアミノ酸残基を置換すると、Ｎ−結合炭水化物鎖を付加するための潜在的な新しい部位が設けられる。あるいは、この配列を除去する置換によって、既存のＮ−結合炭水化物鎖が除去される。Ｎ−結合炭水化物鎖の再配置も行われ、ここでは１以上のＮ−結合グリコシル化部位（通常は天然型の部位）が除去され、１以上の新しいＮ−結合部位が作成される。さらに好ましいＶＧＦ変形としてシステイン変異があり、ここでは本発明のＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、１以上のシステイン残基が除去されるか、別のアミノ酸（たとえばセリン）と置換される。システイン変形は、不溶性封入体の分離後などに、ＶＧＦポリペプチドを生物活性形態に再度折畳まねばならないときに有用である。システイン変異は一般に、ネイティブのタンパク質よりシステイン残基が少なく、通常、不対システインから生じる相互作用を最小限にするために偶数を備えている。
【００６２】
加えて、ＶＧＦポリペプチドは相同ポリペプチドに融合してホモダイマーを作成するか、非相同ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを作成する。非相同ペプチドおよびポリペプチドは、これに限定されるわけではないが：ＶＧＦ融合ポリペプチドの検出および／または分離を可能にするエピトープ；細胞外領域または膜貫通および細胞内領域などの、膜貫通レセプタータンパク質またはその一部；触媒的に活性である、リガンドまたはその一部；ロイシンジッパー領域などの、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常性領域などの、安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド；本発明のＶＧＦポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチドを含む。
【００６３】
融合は、ＶＧＦポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のどちらかで行える。融合はリンカーまたはアダプターを用いずに直接であるか、リンカーまたはアダプター分子による。リンカーまたはアダプター分子は１以上のアミノ酸残基であり、通常は約２０〜約５０のアミノ酸残基である。リンカーまたはアダプター分子は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼが融合部分を分離できるように、開裂部位を用いて設計してもよい。融合タンパク質はいったん作成すると、本明細書で述べる方法に従って誘導体化できることは認識されるであろう。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、ＶＧＦポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ領域の１以上のドメインに融合する。抗体は２つの機能的に独立した部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、食細胞による補体活性および攻撃などのエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる不変ドメインを含む。Ｆｃは血清半減期が長いが、Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２７−３１。治療用タンパク質とともに構成される場合、Ｆｃドメインは半減期が長くなるか、Ｆｃレセプター結合、タンパク質Ａ結合、補体固定、場合によっては胎盤通過などの機能を含むことができる。Ｉｄ．  表２Ｉは当業者に既知のあるＦｃ融合の使用についてまとめる。
【００６５】
【表３】
2006176528.tif 000004
【００６６】
ある実施例において、ヒトＩｇＧヒンジのＣＨ２およびＣＨ３領域は、当業者に既知の方法を用いて、ＶＧＦポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のどちらかで融合できる。生じたＶＧＦ融合ポリペプチドは、タンパク質Ａ親和性カラムを用いて精製してもよい。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、インビボで未融合の対応物よりも実質的に長い半減期を示すことがわかった。また、Ｆｃ領域への融合によって、融合タンパク質のダイマー化／マルチマー化が可能になる。Ｆｃ領域は天然型Ｆｃ領域であるか、治療的性質、循環時間または凝集低下などの、ある性質を改良するために変更してもよい。
【００６７】
関連ポリペプチドの同一性または類似性は、既知の方法でただちに計算できる。そのような方法としては、これに限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．  Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｕｐｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．  Ｗ．  Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ  １，  Ａ．  Ｍ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｇ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３が挙げられる。
【００６８】
同一性および／または類似性を決定する好ましい方法は、試験を行う配列間の一致が最大となるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、これに限定されるわけではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：３８７；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、同上）より公に入手可能である。既知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムも、同一性を決定するのに使用できる。
【００６９】
２つのアミノ酸配列を並べるある整列方式によって、２つの配列の短い領域のみが一致し、２つの全長配列間に重要な関係がない場合でも、この小規模な整列領域は、非常に高い配列同一性を有する。したがって、好ましい実施形態において、選択された配置方法（ＧＡＰプログラム）によって、請求されるポリペプチドの５０以上の隣接アミノ酸に渡る配置が生じる。
【００７０】
たとえば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプチドは、このそれぞれのアミノ酸の最適一致について配置される（アルゴリズムによって決定される「一致範囲」）。ギャップオープニングペナルティ（３Ｘ平均対角線として計算される；「平均対角線」は使用される比較マトリクスの対角線の平均である；「対角線」は、特定の比較マトリクスによって、完全アミノ酸一致それぞれに割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸張ペナルティ（通常０．１Ｘギャップオープニングペナルティである）は、ＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２などの比較マトリクスと同様に、アルゴリズムとあわせて使用される。標準比較マトリクスは、アルゴリズム（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｕｐｐ．  ３  １９７８）（ＰＡＭ  ２５０比較マトリクス）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリクス）によっても使用される。
【００７１】
ポリペプチド配列比較の好ましいパラメータは、以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−５３；
比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、同上）；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは上のパラメータを用いると有用である。上述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いた、（エンドギャップにはペナルティのない）ポリペプチド比較のデフォルトパラメータである。
【００７２】
他のアルゴリズム例として、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９、１９９７年９月で述べられているアルゴリズムを含め、ギャップオープニングペナルティ、ギャップ伸張ペナルティ、比較マトリクスおよび類似性閾値を使用できる。行うべき特定の選択は、当業者に既知であり、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの、行うべき具体的な比較によって変化する。そしてさらに、比較が（一般にＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）所与の配列間であるか、または（ケースＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＡが好ましい）１個の配列と配列の大規模なデータベースとの間であるかによって変化する。
【００７３】
核酸分子
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸は、化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリスクリーニング、発現ライブラリスクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、制限なく含む、さまざまな方法で容易に入手できる。
【００７４】
本明細書で使用する組換えＤＮＡ法は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）で述べられている方法である。
【００７５】
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、発現タンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を用いた発現クローニングによって同定される。通常、核酸ライブラリは、抗体または他の結合パートナー（たとえばレセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面で発現および表示されるクローン化タンパク質に結合させることによってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、望ましいクローンを発現する細胞を同定する検出可能な標識を用いて修飾される。
【００７６】
以下で述べる説明に従って実施する組換え発現技術に従うと、これらのポリヌクレオチドが生成され、コード化ポリペプチドが発現される。たとえば、ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列を適切なベクター内にコード化する核酸および配列を挿入することによって、当業者は大量の望ましいヌクレオチド配列をただちに製造できる。次に配列を用いて、検出プローブまたは増幅プライマーを作成できる。あるいは、ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドを発現ベクター内に挿入できる。発現ベクターを適切な宿主に挿入することによって、コード化ポリペプチドが大量に製造される。
【００７７】
適切な核酸配列を得る別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、ｃＤＮＡはポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたはＲＮＡ全体より、酵素逆転写酵素を用いて調製される。２個のプライマーは、一般にＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化するｃＤＮＡの２個の独立領域に相補的であり、次に、ＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼとともにｃＤＮＡに添加され、ポリメラーゼは２個のプライマーの間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【００７８】
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子を調製する別の方法は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  ２８：７１６−３４に記載された方法をなど、当業者に既知の方法を用いた化学合成である。これらの方法は特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート法を含む。そのような化学合成に好ましい方法は、標準ホスホラミダイト化学作用を用いたポリマー支援合成である。通常、ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡは、長さ数百ヌクレオチドとなる。約１００ヌクレオチドよりも大きい核酸は、これらの方法を用いて複数の断片として合成できる。次に断片をともに連結して、ＶＧＦ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を作成することができる。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコード化するＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコード化するＡＴＧを有する。このメチオニンはＶＧＦポリペプチドの成熟型では、宿主細胞内で生成されるポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているかいないかによって、存在する場合と、存在しない場合がある。当業者に既知の他の方法も同様に使用できる。
【００７９】
ある実施形態では、核酸変異型は、所与の宿主細胞中でのＶＧＰポリペプチドを最適に発現するよう改変されたコドンを含む。特定のコドン変化は、発現のために選択されたＶＧＦポリペプチドと宿主細胞によって代われる。このような「コドン最適化」は、たとえば所与の細胞内で高度に発現された遺伝子について好ましいコドンを選択することにより、各種の方法で実施できる。高度に発現した最近遺伝子のコドン優先のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などの、コドン頻度表を含む、コンピュータアルゴリズムを使用するか、ウィスコンシン州大学のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ，」「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ，」および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【００８０】
場合によっては、ＶＧＦポリペプチド変異型をコード化する核酸分子を調製することが望ましい。変異型をコード化する核酸分子は、プライマーが望ましい点突然変異を有する、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適切な方法を用いて作成される（突然変異誘発技術の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上およびＡｕｓｕｂｅｌら、同上を参照）。Ｅｎｇｅｌｓら、同上による方法を用いた化学合成も、このような変異型の調製に用いる。当業者に既知の方法も同様に使用される。
【００８１】
ベクターおよび宿主細胞
ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、標準連結技術を用いて適切な発現ベクター内に挿入される。通常、使用する特定の宿主細胞内で機能するベクターを選択する（すなわちベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が発生するように、宿主細胞機構と適合性がある）。ＶＧＦポリペプチドのアミノ酸配列をコード化する核酸分子は、原核細胞、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞内で増幅／発現される。宿主細胞の選択は一部は、ＶＧＦポリペプチドが翻訳後に修飾されるかどうかによって変わる（たとえば、グリコシル化および／またはホスホリル化）。そのような場合、昆虫または哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）。
【００８２】
通常、何らかの宿主細胞で使用する発現ベクターは、プラスミド維持と外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。ある実施形態において、総称的に「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は、通常、以下のヌクレオチド配列の１以上を含む：プロモータ、１以上のエンハンサ配列、複製源、転写終了配列、供与体および受容体部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコード化する配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコード化する核酸を挿入するためのポリリンカ領域、選択可能なマーカー要素。これらの配列はそれぞれ以下で説明する。
【００８３】
ベクターは随意に、「ｔａｇ」コード化配列、すなわちＶＧＦポリペプチドコード化配列の５’および３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含むことがある；オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓなど）、またはＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウィルス）などの別の「ｔａｇ」、または市販の抗体が存在するｍｙｃをコード化する。このｔａｇは通常、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、宿主細胞からＶＧＦポリペプチドを親和性精製する手段として作用する。親和性精製はたとえば、親和性マトリクスとしてのｔａｇに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって行える。次にｔａｇは随意に、開裂のためのあるペプチダーゼを用いた各種手段によって、精製されたＶＧＦポリペプチドから除去できる。
【００８４】
フランキング配列は相同性（すなわち宿主細胞と同じ種および／または菌株による）、非相同性（すなわち宿主細胞の種または菌株以外の種による）、ハイブリッド（すなわち１以上の供給源によるフランキング配列の組合せ）または合成であり、またはフランキング配列は、通常、ＶＧＦポリペプチド発現を調節するよう機能するネイティブの配列でもよい。そのためフランキング配列源は、フランキング配列が宿主細胞機構において機能し、宿主細胞機構によって活性化可能であれば、原核または真核生物、脊椎または無脊椎生物、または植物でもよい。
【００８５】
有用なフランキング配列は、当業者に既知の複数の方法のいずれかによって実施される。通常、本明細書でフランキング配列−ＶＧＦ遺伝子フランキング配列以外−は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、そのため、適切なエンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織源から分離できる。場合によっては、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が知られている。ここでは、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングについて本明細書で述べた方法を用いて合成されることがある。
【００８６】
フランキング配列のすべて、または一部のみが既知である場合、ＰＣＲを用いて、および／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または、同一または別の種によるフランキング配列断片を用いてゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。フランキング配列が未知の場合、フランキング配列を含むＤＮＡフラグメントは、たとえばコーディング配列またはさらに別の遺伝子を含むＤＮＡのさらに大きな一片より単離される。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを作成するための制限エンドヌクレアーゼ消化によって行われ、、次にアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）を用いた分離、または当業者に既知の他の方法によって行われる。この目的を達成するための適切な酵素を選択は、当業者にはただちに明白となる。
【００８７】
複製源は通常、市販の原核発源ベクターの一部であり、宿主細胞中でのベクター増幅の源補助である。あるコピー数へのベクターの増幅は、場合によってはＶＧＦポリペプチドの最適発現にとって重要である。ベクターをある数に増幅することは、場合によってはＶＧＦポリペプチドの最適発現にとって重要である。選択したベクターが複製部位源を含んでいない場合、既知配列に従って源複製を化学合成し、ベクター内に連結される。たとえばプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ）は、大半のグラム陰性細菌に適しており、各種の源（たとえばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶまたはＢＰＶなどの乳頭腫ウイルス）は哺乳類細胞のクローニングベクターに有用である。一般に複製成分源は、哺乳類発言ベクターには不要である（たとえば、ＳＶ４０源は初期プロモータを含んでいるというだけで使用されることが多い）。
【００８８】
転写終了配列は通常、ポリペプチドコーディング領域末端の３’に位置し、転写を終了させる。一般に原核細胞における転写終了配列は、Ｇ−Ｃが豊富な断片であり、これにポリ−Ｔ配列が続く。配列はライブラリから容易に転写されたり、ベクターの一部として購入されさえするが、本明細書で述べるような核酸合成方法を用いて即座に合成することもできる。
【００８９】
選択可能なマーカー遺伝子要素は、選択的培地で培養される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコード化する。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、または原核宿主細胞へのカナマイシン抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求性欠失を補完する；または（ｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコード化する。好ましい選択的マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も、原核および真核宿主細胞での選択に使用される。
【００９０】
他の選択遺伝子を用いて、発現される遺伝子を増幅することもある。増幅は、成長のために重要なタンパク質の製造に非常に必要な遺伝子を、組換え細胞の連続世代の染色体内で、縦に並べて反復するプロセスである。哺乳類細胞の適切な選択的マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳類細胞形質転換体は、選択圧下で配置され、形質転換体がベクター内に存在する選択遺伝子によって生存するよう独自に調整される。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に変化し、そのことが選択遺伝子とＶＧＦポリペプチドをコード化する遺伝子の両方の増幅につながる条件下で形質転換細胞を培養することによって加えられる。結果としてＶＧＦポリペプチドが増幅ＤＮＡから増量されて合成される。
【００９１】
リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は通常、発現されるＶＧＦポリペプチドのプロモータに対しては３’、コード化配列に対しては５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列は変化するが、通常はポリプリン（すなわちＡ−Ｇ含有率が高い）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列が同定され、それぞれ本明細書で述べる方法を用いて即座に合成され、原核ベクター内で使用できる。
【００９２】
リーダー配列、すなわちシグナル配列を用いて、宿主細胞外部にＶＧＦポリペプチドを指示することもある。通常、シグナル配列をコード化するヌクレオチド配列は、ＶＧＦ核酸分子のコード化領域内に配置されるか、ＶＧＦポリペプチドコード化領域の５’末端に直接配置される。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞内で機能するシグナル配列は、ＶＧＦ核酸分子とともに使用される。したがってシグナル配列はＶＧＦ核酸分子に対して相同性（天然型）または非相同性である。さらにシグナル配列は、本明細書で述べる方法を用いて化学合成される。大半の場合において、信号ペプチドが存在すると、ＶＧＦポリペプチドが宿主細胞から分泌され、それによって分泌されたＶＧＦポリペプチドから信号ペプチドが除去される。シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクター内に挿入されるＶＧＦ核酸分子の一部である。
【００９３】
ネイティブのＶＧＦポリペプチドシグナル配列をコード化する核酸配列がＶＧＦポリペプチドコーディング領域に結合されるか、非相同性シグナル配列がＶＧＦポリペプチドコード化領域に結合される。選択された非相同性シグナル配列は、宿主細胞により、信号ペプチダーゼにより認識および処理、すなわち開裂される非相同性シグナル配列であることが望ましい。ネイティブのＶＧＦポリペプチドシグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌の場合、ネイティブのＶＧＦポリペプチドシグナル配列は、酵母転化酵素、アルファ因子または酸ホスファターゼリーダーによって置換される。哺乳類細胞発現では、他の哺乳類シグナル配列が適している場合があるが、ネイティブのシグナル配列で十分である。
【００９４】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましい一部の場合では、グリコシル化または収量を増加させるために、各種のプリ配列を操作してもよい。たとえば、特定の信号ペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変更したり、プロ配列を添加してもよく、このこともグリコシル化に影響を与える。最終タンパク質生成物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対する）−１位置に、完全には除去されなかった、発現を発生しやすい１以上の付加アミノ酸を持つことがある。たとえば、最終タンパク質生成物は、アミノ酸末端に付加された、ペプチダーゼ開裂部位に見られる１または２のアミノ酸残基を持つことがある。あるいは、一部の酵素開裂部位を用いると、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような区域で切断する場合、でわずかに切断された形の望ましいＶＧＦポリペプチドが生じることがある。
【００９５】
多くの場合、ベクター内に１以上のイントロンが存在すると、核酸分子の転写が増加する；これは、ポリペプチドが真核宿主細胞、特に哺乳類細胞内で生成される場合に特にあてはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはその断片である場合、ＶＧＦ遺伝子内で天然発生することがある。イントロンが遺伝子内で天然発生しない場合（大半のｃＤＮＡに関して）、イントロンは別の源から得られる。イントロンは有効となるように転写されねばならないため、フランキング配列およびＶＧＦ遺伝子に対するイントロンの位置は、一般に重要である。それゆえＶＧＦ  ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は転写開始部位に対して３’、ポリ−Ａ転写終了配列に対して５’である。好ましくは１個または複数のイントロンは、コーディング配列を中断しないように、ｃＤＮＡの片側または反対側（すなわち５’または３’）に配置されることが好ましい。イントロンが挿入される宿主細胞と適合性があれば、ウィルス、原核および真核（植物または動物）生物を含むあらゆる源によるあらゆるイントロンを使用できる。１以上のイントロンを随意にベクター内に使用できる。
【００９６】
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物に認識され、ＶＧＦポリペプチドをコード化する分子に操作可能に結合されるプロモータを含む。プロモータは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンの上流に（すなわち５’）位置する未転写配列である。プロモータは従来、２つのクラスにグループ分けされる：誘発性プロモータと構造性プロモータである。誘発性プロモータは、栄養素の有無または温度変化などの培養条件のある変化に反応して、その制御下でＤＮＡから上昇したレベルの転写を開始する。これに対して、構造性プロモータは連続遺伝子生成物の生成を開始する；すなわち遺伝子発現に対してほとんどまたはまったく制御がない。潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモータが既知である。適切なプロモータは、元のＤＮＡからプロモータを除去し、望ましいプロモータ配列をベクターに挿入することによって、ＶＧＦポリペプチドをコード化するＤＮＡに操作可能に結合される。ネイティブのＶＧＦプロモータ配列を用いて、ＶＧＦ核酸分子の増幅および／または発現を指示できる。しかし、ネイティブのプロモータと比較して発現タンパク質の転写が多く、収量が高いならば、そして、使用するために選択された宿主細胞システムと適合性があるならば、非相同性プロモータが好ましい。
【００９７】
原核宿主による使用に適したプロモータとしては、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系；およびｔａｃプロモータなどのハイブリッドプロモータが挙げられる。他の既知の細菌プロモータも適している。その配列は後悔されているため、当業者は、有用な制限部位を供給するために必要なリンカまたはアダプタを使用して、それらを望ましいＤＮＡ配列に連結できる。
【００９８】
酵母宿主による使用に適した適切なプロモータは当業界で既知である。酵母エンハンサは酵母プロモータと都合よく使用される。哺乳類宿主細胞による使用に適したプロモータは既知であり、これに限定されるわけではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎が含まれ、最も好ましくはサルウィルス４０（ＳＶ  ４０）である。他の適切な哺乳類プロモータとしては、たとえば熱ショックプロモータおよびアクチンプロモータなどの、非相同性哺乳類プロモータが挙げられる。
【００９９】
ＶＧＦ遺伝子の発現で興味のある他のプロモータとしては、これに限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモータ領域、（Ｂｅｒｍｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，  １９８１，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモータ；ラウス肉腫ウィルスの３’長末端反復に含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ら、１９８０，  Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ベータ−ラクタマーゼプロモータなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８０：２１−２５）が挙げられる。組織特異性を示し、遺伝子導入動物で使用されてきた、以下の動物転写制御領域も興味がある：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，  Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｍｉｔｚら、１９８６，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  １９８７，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５２５）；膵臓ベータ細胞で活性であるインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，  Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８，  Ａｄａｍｅｓら、１９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞で活性であるマウス乳房腫瘍ウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，  Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １：２６８−７６）；肝臓で活性であるアルファ−フェト−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １：１６１−７１）；骨髄細胞で活性であるベータ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｒｇｒａｍら、１９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，  Ｃｅｌｌ  ４６：８８−９４）；脳の希突起膠細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，  Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）お��び視床下部で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１００】
ＶＧＦポリペプチドをコード化するＤＮＡのさらに高等な真核生物における転写を向上させるために、エンハンサ配列はベクター内に挿入される。エンハンサはＤＮＡのｃｉｓ−作用要素であり、通常約１０−３００ｂｐ長であり、転写を向上させるためにプロモータに作用する。エンハンサは比較的、方向および位置依存性である。これらは転写単位に対して５’および３’に発見されている。哺乳類遺伝子より入手できる複数のエンハンサ配列が既知である（たとえばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質およびインシュリン）。しかし一般に、ウィルスによるエンハンサが使用される。ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウィルス初期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサおよびアデノウィルスエンハンサは、真核プロモータの活性化のための代表的なエンハンサ要素である。エンハンサはベクター内の、ＢＦＧ核酸分子に対して位置５’または３’にスプライスされるが、通常、プロモータからの部位５’に配置される。
【０１０１】
発現ベクターは、市販ベクターなどの開始ベクターから作成される。このようなベクターは、望ましいフランキング配列をすべて含んでいる場合と、含んでいない場合がある。本明細書で述べる１以上のフランキング配列がまだベクター内に存在しない場合、それらを個々に入手して、ベクター内に連結させる。それぞれのフランキング配列を入手するのに用いる方法は、当業者に既知である。
【０１０２】
好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳類宿主細胞と適合性のあるベクターである。そのようなベクターとしては特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホーヤ、カリフォルニア州）ｐＥＴ１５（Ｎａｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン州）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ピスカタウェイ、ニュージャージー）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９０／１４３６３号）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州）が挙げられる。
【０１０３】
別の適したベクターとしてはこれに限定されるわけではないが、コスミド、プラスミドまたは修飾ウィルスが挙げられるが、ウィルス系は選択した宿主細胞と適合性がなければならないことは認識されるであろう。そのようなウィルスとしては、これに限定されるわけではないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高複写数ＣｏｌＥ１ベースファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ラホーヤ、カリフォルニア州）、Ｔａｑ−増幅ＰＣＲ生成物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（たとえばＴＯＰＯ（商標）  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）および哺乳類、酵母またはバキュロウィルス発現系などのウィルスベクター（ｐＢａｃＰａｋプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州）が挙げられる。
【０１０４】
ベクターを作成し、ＶＧＦポリペプチドをコード化する核酸分子がベクターの正しい場所に挿入した後、増幅および／またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを適切な宿主細胞内に挿入できる。選択宿主細胞内へのＶＧＦポリペプチドのために発現ベクターは、形質移入、感染、塩化カルシウム電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法、または他の既知の技術を含む、既知の方法で形質転換できる。選択された方法は一部は、使用する宿主細胞の種類の関数となる。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に既知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、同上で述べられている。
【０１０５】
宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）または真核宿主細胞（酵母、昆虫、または脊椎動物細胞）でよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、ＶＧＦポリペプチドが合成され、次に培地からこれを収集できる（宿主細胞が培地中に分泌する場合）か、それを生成する宿主細胞から直接収集できる（分泌しない場合）。適切な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、（グリコシル化またはリン酸化などの）活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾、および生物活性分子内への折畳みのしやすさなどの、各種の因子によって変わる。
【０１０６】
多くの適切な宿主細胞が当業者に既知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、マナッサス、ヴァージニア州から入手できる。例としては、これに限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９７：４２１６−２０）、ヒト胚腎臓２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物製造および精製の方法は、当業者に既知である。他の適切な哺乳類細胞系は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系である。さらに哺乳類細胞の例としては、形質転換細胞系を含む霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系が挙げられる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞菌株も、一次組織片と同様に適している。候補細胞も、選択遺伝子において遺伝子型的に欠陥であるか、優性に作用する選択遺伝子を含む。他の適切な哺乳類細胞系としては、これに限定されるわけではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞系が挙げられる。これらの細胞系はそれぞれ、タンパク質発現の当業者によって既知であり、使用可能である。
【０１０７】
適切な宿主細胞として同様に有用なのは、細菌細胞である。たとえば、大腸菌（たとえばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野では宿主細胞として知られている。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ  ｓｐｐ．、などもこの方法で利用できる。
【０１０８】
当業者に既知の酵母細胞の多くの菌株も、ＶＧＦポリペプチド発現の宿主細胞として利用できる。好ましい宿主細胞としてはたとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１０９】
加えて、好ましい場合は、昆虫細胞系をＶＧＦポリペプチドの発現に使用してもよい。このようなシステムはたとえば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，  １９９３，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７：４５６６−７９で述べられている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１１０】
遺伝子導入動物を用いて、グリコシル化ＶＧＦポリペプチドを発現させてもよい。たとえば、遺伝子導入ミルク生産動物（たとえば牝牛またはヤギ）を使用して、動物ミルク中に存在するグリコシル化ポリペプチドを得てもよい。植物を使用してＶＧＦポリペプチドを製造してもよいが、一般に、植物で発生するグリコシル化は、哺乳類細胞で生成されるものとは異なり、ヒト治療用途に適さないグリコシル化生成物が生じる。
【０１１１】
ポリペプチド生成
ＶＧＦポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に既知の標準培地を用いて培養できる。培地は通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含む。大腸菌細胞を培養するのに適切な培地としてはたとえば、ルリア培養液（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液（ＴＢ）が挙げられる。真核細胞の培養に適した培地としては、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、最少必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらはすべて培養される特定の細胞系により必要に応じて、血清および／または成長因子を補足してもよい。昆虫培養物に適した培地は、必要に応じてイーストレート、ラクタルブミン、加水分解物および／またはウシ胎仔血清を補足したグレース培地である。
【０１１２】
一般に、形質移入または形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物は、培地への補足物として添加する。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミド上に存在する選択可能なマーカー要素によって指示される。たとえば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物はカナマイシンとなる。選択的成長の他の化合物は、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンである。
【０１１３】
宿主細胞によって生成されるＶＧＦポリペプチドの量は、当業者に既知の標準方法を用いて評価できる。そのような方法としては、制限なく、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非非ネイティブのゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈澱および／またはＤＮＡ結合ゲル移動アッセイなどの活性アッセイが挙げられる。
【０１１４】
ＶＧＦポリペプチドは宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大多数は、細胞倍値に見られる。しかしＶＧＦポリペプチドが宿主から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）またはサイトゾル（グラム陰性細菌宿主細胞の場合）に存在する。
【０１１５】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）またはサイトゾル（グラム陰性細菌宿主細胞の場合）に位置するＶＧＦポリペプチドの場合、細胞内物質（グラム陰性細菌の封入体を含む）は、当業者に既知の標準技術を用いて宿主細胞から抽出できる。たとえば、宿主細胞を溶解させて、フレンチプレス、均質化および／または超音波処理後の遠心分離などによって、周辺質／細胞質の内容を放出させることができる。
【０１１６】
ＶＧＦポリペプチドが細胞質中に封入体を生成した場合、封入体は内部および／または外部細胞膜に結合することが多いため、主に、遠心分離後のペレット物質中に見られる。ペレット物質は次に、アルカリｐＨではジチオスレイトールまたは酸性ｐＨではｔｒｉｓカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で、ｐＨ極値にて、または洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体などのカオトロピック剤を用いて処理され、封入体を放出、分解および溶解する。溶解化ＶＧＦポリペプチドは次に、ゲル電気泳動、免疫沈澱などを用いて分析できる。ＶＧＦポリペプチドを分離することが望ましい場合、分離は、本明細書およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８２：２６４−７５で述べる標準方法を用いて行える。
【０１１７】
一部の場合では、ＶＧＦポリペプチドは分離に対して生物活性ではない。ポリペプチドを三次構造に「再折畳み」または変換し、ジスルフィド連結を作成する各種方法を用いて、生物活性を復元できる。そのような方法としては、溶解ポリペプチドを、通常７を超えるｐＨに、特定濃度のカオトロープの存在下で曝露することを含む。カオトロープの選択は、封入体溶解の選択と非常に似ているが、通常、カオトロープはさらに低い濃度で使用され、必ずしも溶解に用いたのと同じカオトロープではない。大半の場合、再折畳み／酸化溶液も、還元剤または特定比の還元剤およびその酸化形を含み、ジスルフィドシャッフリングをタンパク質のシステインブリッジ形成時に発生させる、特定の酸化還元電位を生成する。一般に使用される酸化還元対の一部には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアン、ＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの例において、再折畳みの効率を高めるために、共溶媒が用いられるか、必要となり、この目的に使用される一般的な試薬としては、グリセロール、各種分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１１８】
封入体がＶＧＦポリペプチドの発現時に大量に生成されない場合、ポリペプチドは主に、細胞ホモゲネートの遠心分離後に上澄中に見られる。ポリペプチドはさらに、本明細書で述べるような方法を用いて、上澄から分離される。
【０１１９】
溶液からのＶＧＦポリペプチドの生成は、各種の技術を用いて行うことができる。ポリペプチドがカルボキシルまたはアミノ末端のどちらかに、ヘキサヒスチジン（ＶＧＦポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）などのｔａｇまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  ニューヘブン、コネチカット）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カールスバッド、カリフォルニア州）などの他の小さなペプチドを含む場合、カラムマトリクスがｔａｇに対する高い親和性を有する親和性カラムに溶液を通過させて、１ステッププロセスによって精製できる。
【０１２０】
たとえば、ポリヒスチジンは高い親和性および特異性でニッケルに結合する。それゆえ、ニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムなど）はＶＧＦポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用できる。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｅｌｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９３）を参照。
【０１２１】
さらにＶＧＦポリペプチドは、ＶＧＦポリペプチドを特異的に認識および結合できるモノクローナル抗体を用いて精製してもよい。
【０１２２】
部分的または実質的に汚染物質を含まないように、部分的または完全にＶＧＦポリペプチドを精製することが好ましい場合、当業者に既知の標準方法を使用してもよい。このような方法は、制限なく、電気泳動に続く電気泳動溶出による分離、各種のクロマトグラフィー（親和性、免疫親和性、分子ふるいおよびイオン交換）、ＨＰＬＣおよび分取等電点焦点化法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンフランシスコ、カリフォルニア州）が含まれる。場合によっては２つ以上の精製技術を組合わせて、純度を向上させる。
【０１２３】
ＶＧＦポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：５１３２；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  １９８４）が述べる方法などの当業者に既知の技術を用いた、（固相ペプチド合成などの）化学合成法を用いて調製することもある。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンがあっても、なくても合成される。化学的に合成されたＶＧＦポリペプチドは、これらの文献で述べる方法を用いて酸化され、ジスルフィドブリッジを形成する。化学的に合成されたＶＧＦポリペプチドは、組換えによって精製された、または天然源から精製された対応するＶＧＦポリペプチドに対して匹敵する生物活性を持つことが予想されるため、組換えまたは天然ＶＧＦポリペプチドによって相互に置き換えて使用してもよい。
【０１２４】
ＶＧＦポリペプチドを得る別の手段は、ＶＧＦポリペプチドが天然に見られる供給源組織および／または液体などの生物サンプルからの精製による。そのような精製は、本明細書で述べるタンパク質精製方法を用いて実施できる。精製中のＶＧＦポリペプチドの存在は、たとえば組換え生成されたＶＧＦポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を用いて監視してもよい。
【０１２５】
ポリペプチドを生成する別の方法が当業界で多数知られており、ＶＧＦポリペプチドに対する特異性を持つポリペプチドを生成する方法を使用できる。たとえば、ｍＲＮＡとそのコード化ペプチド間の融合タンパク質の生成について述べている、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２２９７−３０３を参照。Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２６８−７３も参照。
【０１２６】
米国特許第５，７６３，１９２号；第５，８１４，４７６号；第５，７２３，３２３号および第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドの生成プロセスについて述べている。これは、確率的遺伝子またはそのフラグメントを生成し、次にこれらの遺伝子を、確率的遺伝子によってコード化される１以上のタンパク質を生成する宿主細胞に導入して行う。宿主細胞は次に、望ましい活性を有するペプチドまたはポリペプチドを生成するこれらのクローンを同定するために、スクリーニングされる。
【０１２７】
ペプチドまたはポリペプチドを生成する別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ社が提出したＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）で述べられている。「遺伝子発見のための遺伝子発現のランダム活性化」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られるプロセスは、インシトゥ組換え方法による遺伝子の内在性遺伝子発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。たとえば、内在性遺伝子の発現は、相同性または非正統的組換えによって、遺伝子発現を活性化できる標的細胞内に調節配列を組込むことによって、活性化または増加される。標的ＤＮＡは最初に放射線を受け、遺伝プロモータが挿入される。プロモータは最終的に遺伝子の前部に裂目を配置し、遺伝子の転写を開始する。これによって、望ましいペプチドまたはポリペプチドの発現が行われる。
【０１２８】
これらの方法は包括的なＩＬ−１７状のタンパク質発現ライブラリを作成するのにも使用できることが認識されるであろう。このライブラリは次に、生化学アッセイ、細胞アッセイおよび全生体アッセイ（たとえば植物、マウスなど）の各種アッセイにおいて高いスループットの表現型スクリーニングに使用できる。
【０１２９】
合成
当業者は、本明細書で述べるＶＧＦポリペプチド分子が組換えまたは他の手段によって生成することを認識するであろう。
【０１３０】
選択的結合剤
「選択的結合剤」という語は、１以上のＶＧＦポリペプチドに対する特異性を有する分子を指す。適切な選択的結合剤としては、これに限定されるわけではないが、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、および小型分子が挙げられる。適切な選択的結合剤は、当業者に既知の方法を用いて調製される。本発明の代表的なＶＧＦポリペプチド選択的結合剤は、ＶＧＦポリペプチドのある部分を結合可能であり、そのためポリペプチドがＶＧＦポリペプチド受容体に結合するのを阻害する。
【０１３１】
「抗原」という語は、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するために、選択的結合剤によって結合され、さらに動物において使用できる分子または分子の一部を指す。抗原は１以上エピトープを有する。
【０１３２】
「エピトープ」という語は、結合剤の１以上の抗原結合領域において、選択的結合剤によって認識され、結合されることが可能な任意の分子を指す。エピトープは通常、特異的な電荷特性とともに、特異性な三次元構造特性を有するアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学活性表面グルーピングより成る。「阻害エピトープ」および「中和エピトープ」という語は、選択的結合剤によって結合された場合、エピトープを含む分子の生物活性はインビボで、インビトロでまたはインシトゥで、さらに好ましくはインビボで失われ、ＶＧＦポリペプチドのＶＧＦポリペプチド受容体の結合を含む。
【０１３３】
本明細書で使用されるように、「抗原結合領域」という語は、抗原と相互作用し、結合剤に抗原に対する特異性および親和性を結合剤上に付与する、アミノ酸残基を含む選択的結合剤の部分を指す。好ましくは抗原−結合領域は、マウス起源となる。別の実施形態において、抗原−結合領域は、他の動物種、特にウサギ、リスまたはハムスターなどの特定のげっ歯類に由来することが可能である。たとえば、本発明の選択的結合剤の抗原−結合領域は、ヒトＶＧＦポリペプチドに特異性である非ヒト抗体に由来することが好ましい。そのような非ヒト抗体をコード化するＤＮＡの好ましい供給源としては、一般にハイブリドーマとして知られる、ハイブリッド細胞系などの抗体を生成する細胞系が挙げられる。
【０１３４】
ＶＧＦポリペプチドを結合する抗体および抗体断片などの選択的結合剤は、本発明の範囲内である。抗体は、断片；変異型；またはその誘導体と同様に、モノ特異性ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル；組換え；キメラ；ＣＤＲグラフトなどのヒト化；ヒト；単鎖；および／または２特異性でもよい。抗体断片は、ＶＧＦポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む。そのような断片の例としては、全長抗体の酵素開裂によって精製されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）断片が挙げられる。他の結合断片としては、抗体可変領域をコード化する核酸配列を含む組換えプラスミドの発現などのように、組換えＤＮＡ技術によって生成された断片が含まれる。
【０１３５】
ポリクローナル抗体は、抗原によって免疫化された動物の血清から由来する抗体の非相同個体群である。抗原は、さらに動物にその抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するよう促す抗体によって結合できる、分子または分子の一部である。抗原は１以上のエピトープを持つことができる。上で述べた特性反応は、抗原が選択性の高い方法で、その対応する抗体と反応するが、他の抗原によって誘起される多数の他の抗体とは反応しないことを示すものである。
【０１３６】
ＶＧＦポリペプチドに向けて指示するポリクローナル抗体は一般に、ＶＧＦポリペプチドおよびアジュバントを複数回、皮下または腹膜内注射することによって、動物（たとえばウサギまたはマウス）において生成される。ＶＧＦポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシニアン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などの、免疫化される種において免疫原性である担体タンパク質に結合することは有用である。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いると、免疫反応が高まる。免疫化の後、動物から採血し、血清を抗ＶＧＦ抗体力価についてアッセイする。
【０１３７】
モノクローナル抗体は、実質的に抗原に特異性である相同性抗原個体群を含み、この個体群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含む免疫グロブリンクラスとそのサブクラスより成る。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、インビトロ、インシトゥまたはインビボで培養できる。インビボまたはインシトゥで高い力価を生成するのが、生成の好ましい方法である。
【０１３８】
ＶＧＦポリペプチドに向けて指示するモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系による抗体分子の生成について提供されている任意の方法を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製する適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，  １９８４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  １９８７）が挙げられる。本発明によって、ＶＧＦポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系も提供される。
【０１３９】
好ましい抗ＶＧＦ選択的結合剤は、断片およびその領域と同様に、インビボでヒトＶＧＦポリペプチドまたは実質的に同じ特異性結合特性を有する抗体に結合するのを競争的に阻害するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体の特異性と親和性を競合阻害によって決定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｓｉｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｅｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９３）；およびＭｕｌｌｅｒ，  １９８８，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９２：５８９−６０１が挙げられる。
【０１４０】
本発明のモノクローナル抗体は、治療法として使用するために修飾してもよい。ある実施形態は、重（Ｈ）および／または軽（Ｌ）鎖は、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属している抗体内の相当する配列と一致するか相同性である「キメラ抗体」であるが、鎖の残りは、別の種に由来する、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相当する配列に対して一致するか相同性である。そのような抗体の断片も、望ましい生物活性を示す限り含まれている。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１−５５を参照。
【０１４１】
キメラ抗体およびその生成方法は当業者に既知である。Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：３２７３−７７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：６８５１−５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−７０；Ｌｉｕら、１９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：３４３９−４３；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  同上を参照。
【０１４２】
本明細書で使用されるように、「キメラ抗体」という語は、１価、２価または多価免疫グロブリンを含む。１価キメラ抗体は、ジスルフィドブリッジを通じてキメラＬ鎖に結合したキメラＨ鎖によって形成されるダイマー（ＨＬ）である。２価キメラ抗体は、１以上のジスルフィドブリッジを通じて結合した２個のＨＬダイマーによって形成されるテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価キメラ抗体もたとえば、（たとえばＩｇＭ  Ｈ鎖またはμ鎖から）凝集するＣＨ領域を用いて生成可能である。
【０１４３】
本発明のキメラ抗体は、それぞれＨおよび／またはＬ免疫グロブリンを含む。好ましいキメラＨ鎖は、ＣＨ１またはＣＨ２などの、ヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも一部に連結したＶＧＦポリペプチドに特異性の非ヒト抗体のＨ鎖に由来する抗体−結合領域を含む。好ましいキメラＬ鎖は、ヒトＨ鎖Ｌ領域（ＣＬ）の少なくとも一部に連結したＶＧＦポリペプチドに特異性の非ヒト抗体のＬ鎖に由来する抗体−結合領域を含む。
【０１４４】
同一または異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する選択的結合剤は、個々のポリペプチド鎖を適切に結合することによっても調製できる。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）およびＨａｒｌｏｗら、同上を参照。この手法を用いると、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞は、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞から個別に培養され、免疫グロブリン鎖は個別に回収され、次いで結合される。あるいは、宿主細胞は共培養可能であり、鎖は培地中で自発的に結合し、次に集まった免疫グロブリンが回収される。
【０１４５】
本発明は、抗体、断片、領域またはその誘導体などの、選択的結合剤の「誘導体」も提供し、この語は、機能的に免疫グロブリン断片に似た分子種を生成する切断または修飾遺伝子によってコード化される、タンパク質を含む。修飾としては、これに限定されるわけではないが、植物および細菌毒素などの細胞毒性タンパク質をコード化する遺伝子配列の添加が挙げられる。断片および誘導体は、本発明のどの宿主細胞からも生成できる。あるいは、ＶＧＦポリペプチド受容体を持つ細胞を選択的に殺す細胞毒性抗ＶＧＦ抗体を提供するために、抗体、断片およびその領域などの抗ＶＧＦ選択的結合剤は、細胞毒性タンパク質または化合物にインビトロで結合させることができる。
【０１４６】
適切な断片としてはたとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖが挙げられる。これらの断片は、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠失しており、循環からさらに迅速に消滅し、無傷の抗体よりも低い非特異性組織結合を持つことができる。Ｗａｈｌら、１９８３，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２４：３１６−２５を参照。これらの断片は、たとえばパパイン（Ｆａｂ断片を生成するため）またペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するため）などの酵素を用いたタンパク質分解開裂によって、当業者に既知の方法を用いて無傷の抗体から生成される。本発明のモノクローナル抗体によって認識されるこのような抗原−結合領域および／またはエピトープの同定は、本出願の実施形態に匹敵する、同様の結合特性および治療または診断有用性を備えた別のモノクローナル抗体を生成するのに必要な情報を提供する。
【０１４７】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界で既知である。米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３７６２号を参照。一般にヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、たとえば、当業界で述べられる方法を用いて（Ｊｏｎｅｓら、１９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）、ヒト抗体の対応する領域をげっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部で置換することによって実施できる。
【０１４８】
モノクローナル抗体の生成をバイパスする、抗体分子の抗体−結合領域（すなわちＦａｂまたは可変領域断片）の組換えＤＮＡバージョンを作成する技術は、本発明の範囲に含まれる。この技術では、抗体特異性メッセンジャーＲＮＡ分子は、免疫化動物から採取された免疫系細胞から抽出され、、ｃＤＮＡ内に転写される。ｃＤＮＡは次に細菌発現系内にクローン化される。本発明の実施に適したそのような技術の１例は、発現Ｆａｂタンパク質が周辺質空間（細菌細胞膜と細胞壁の間）に移動させるか、分泌させるリーダー配列を有する、バクテリオファージラムダベクター系を使用する。抗原を結合するこれらに対して、多数の機能Ｆａｂ断片を迅速に生成およびスクリーニングできる。このようなＶＧＦ結合分子（ＶＧＦポリペプチドに対する特異性を持つＦａｂ断片）は特に、本明細書で使用する「抗体」という語の範囲に含まれる。
【０１４９】
適切な抗体特異性のマウス抗体分子による遺伝子を、適切な生物活性（ヒトの補体を活性化し、ＡＤＣＣを伝達する能力など）ヒト抗体分子による遺伝子とスプライシングすることによるキメラ抗体の生成のために開発された技術も本発明の範囲内である。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：６８５１−５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２：６０４−０８。この技術によって生成された抗体などの選択的結合剤は、本発明の範囲内である。
【０１５０】
本発明はマウスまたはラットのモノクローナル抗体に限定されないことは認識されるであろう；実際に、ヒト抗体も使用できる。このような抗体は、ヒトハイブリドーマを用いて得ることができる。Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ７７（１９８５）を参照。したがって、ＶＧＦポリペプチドを結合するヒト抗体も十分に本発明の範囲内である。そのような抗体は、内在性免疫グロブリン生成が行われない場合にヒト抗体のレパートリーを生成可能なＶＧＦ抗原（随意に担体に結合される）遺伝子導入動物（たとえばマウス）で免疫化させることによって生成される。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９３，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．  ７：３３−４０を参照。
【０１５１】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に結合する独自の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、モノクローナル抗体源として同じ種および遺伝子型の動物（たとえばマウス菌株）を抗Ｉｄを調製するモノクローナル抗体によって免疫化して調製できる。免疫化動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を生成して、それに反応する。たとえば米国特許第４，６９９，８８０号を参照。抗Ｉｄ抗体は、また別の動物において免疫反応を誘起し、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を生成する「免疫原」としても使用できる。それゆえ、モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基を抗体を使用することによって、同一特異性の抗体を発現する他のクローンを同定できる。
【０１５２】
本発明では、ＶＧＦポリペプチドを結合するヒト抗体も含まれる。内在性免疫グロブリン生成が行われない場合にヒト抗体のレパートリーを生成可能な遺伝子導入動物（たとえばマウス）を使用して、随意に担体に結合された、ＶＧＦポリペプチド抗原（すなわち６以上の連続アミノ酸を持つ）を用いて免疫化することによって、そのような抗体が生成される。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９３，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．  ７：３３を参照。１つの方法において、そのような遺伝子導入動物は、免疫グロブリン重および軽鎖をコード化する内在性遺伝座を無能力にし、ヒト重および軽鎖タンパク質をそのゲノムに挿入することで生成される。そして部分的に修飾された動物、すなわち修飾が全補足よりも少ない動物は、望ましい免疫系修飾すべてを有する動物を得るために交雑される。免疫源を投与した場合、これらの遺伝子導入動物は、これらの高原に対して免疫特異性である可変領域を含む、ヒト（たとえばネズミ以外）のアミノ酸配列を持つ抗体を生成する。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照。米国特許第５，５４５，８０７、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、およびＥＰ出願第５４６０７３Ｂ１号および第５４６０７３Ａ１号にも別の方法が述べられている。ヒト抗体も、宿主細胞の組換えＤＮＡの発現によって、または本明細書で述べる、ハイブリドーマ細胞中での発現によって生成できる。
【０１５３】
別の実施形態では、ヒト抗体はファージ表示ライブラリから生成することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：３８１；Ｍａｒｋｅら、１９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１）。これらは、糸状バクテリオファージ表面の抗体レパートリーの表示によって模倣免疫選択を処理し、次に選択する抗体への結合により、ファージの選択を処理する。そのような技術は、そのような手法を用いた、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体のための高親和性および機能的アゴニスト抗体の分離について述べた、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４で述べられている。
【０１５４】
キメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体は通常、組換え法によって生成される。抗体をコード化する核酸は、宿主細胞内に導入され、本明細書で述べられ、当業者に既知の材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態では、抗体はＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞内で生成される。モノクローナル（たとえばヒト）抗体は、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現によって、または本明細書で述べるハイブリドーマ中での発現によって生成される。
【０１５５】
本発明の抗ＶＧＦ抗体は、ＶＧＦポリペプチドの検出および定量化のために、結合タンパク競合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈澱アッセイなどの既知のアッセイ方法で使用できる（Ｓｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  １９８７）。抗体はＶＧＦポリペプチドを、使用するアッセイ法に適した親和性で結合する。
【０１５６】
ある実施形態において、診断用途のために抗ＶＧＦ抗体を検出可能部分で標識してもよい。検出可能部分は、検出可能信号を直接または間接に生成できるいずれの部分でもよい。たとえば検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａなどのラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素でもよい（Ｂａｙｅｒ，ら、１９９０，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  １８４：１３８−６３）。
【０１５７】
結合タンパク競合アッセイは、限定量の抗ＶＧＦ抗体と結合するための、試験サンプル分析物（ＶＧＦポリペプチド）と競合する標識標準（たとえばＶＧＦポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＶＧＦポリペプチドの量は、抗体と結合するようになる標準の量と反比例する。結合するようになる標準の量を決定しやすくするために、抗体に結合した標準および分析物が未結合のままの標準および分析物から都合よく分離するように、抗体は通常、競合前後に不溶化される。
【０１５８】
サンドイッチアッセイは通常、検出および／または定量されるタンパク質の各種の免疫原性部分、すなわちエピトープにそれぞれ結合可能な、２種類の抗体を使用する。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物は通常、固体担体上に固定された第１の抗体に結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、それゆえ不溶性の３成分複合体が生成される。たとえば米国特許第４，３７６，１１０号を参照。第２の抗体自体は、検出可能部分によって標識される（直接サンドイッチアッセイ）か、検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定される（間接サンドイッチアッセイ）。たとえば、ある種のサンドイッチアッセイは酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能部分は酵素である。
【０１５９】
抗ＶＧＦ抗体を含む選択的結合剤は、インビボ画像診断でも有用である。検出可能部分で標識される抗体は動物に、好ましくは血流ないに投与され、宿主内の標識抗体の存在および位置が分析される。抗体は、当業者に既知の核磁気共鳴、放射線医学、または他の検出手段のいずれかにかかわらず、動物内で検出可能などの部分によっても標識される。
【０１６０】
本発明の選択的結合剤は、抗体を含め、治療学として使用できる。これらの治療剤は一般に、ＶＧＦポリペプチドの１以上の生物活性をそれぞれ向上または低下させるという点で、作用薬またはアンタゴニストである。ある実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボまたはインビトロでＶＧＦポリペプチドの機能活性を抑制または除去できる抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合剤、たとえばアンタゴニスト抗体は、約５０％以上の、好ましくは約８０％以上のＶＧＦポリペプチド機能活性を抑制する。別の実施形態において、選択的結合剤は、ＶＧＦポリペプチド結合パートナー（リガンドまたは受容体）と相互作用し、そのためＶＧＦポリペプチド活性をインビトロまたはインビボで抑制また除去可能な抗ＶＧＦポリペプチド抗体でもよい。選択的結合剤は、アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＶＧＦポリペプチド抗体を含め、当業者に既知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６１】
本発明は、ＶＧＦ選択的結合剤（抗体など）および生体サンプル中のＶＧＦポリペプチドレベルの検出に有用な他の試薬を含むキットにも関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性制御サンプルおよび検出試薬を含むことがある。
【０１６２】
化学誘導体
ＶＧＦポリペプチドの化学修飾誘導体は、本明細書で述べる開示を考慮すると、当業者によって調製できる。ＶＧＦポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに天然結合する分子の種類および位置のいずれかが異なる方法で修飾される。誘導体は、１以上の天然結合化学基をを除去して生成される分子を含むことがある。ＶＧＦポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって修飾される。たとえば、選択されたポリマーは通常水溶性であるため、結合されるタンパク質は生理学的環境などの水性環境では沈殿しない。ポリマー混合物は、適切なポリマーの範囲に含まれる。最終生成物調製物を治療に使用するには、ポリマーが製薬的に許容可能であることが好ましい。
【０１６３】
ポリマーはそれぞれどんな分子量でもよく、分岐でも直鎖でもよい。ポリマーのそれぞれの平均分子量は通常、約２ｋＤａから約１００ｋＤａである（「約」という語は、水溶性ポリマーの調製物において、ある分子の分子量が、表示された分子量よりも多いか、やや少ないことを示す）。各ポリマーの平均分子量は好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、さらに好ましくは約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａであり、最も好ましくは約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａである。
【０１６４】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、これに限定されるわけではないが、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリロキシ−またはアリロキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質の誘導体化に使用されたＰＥＧの形を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（たとえば約空６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセロール）およびポリビニルアルコールが挙げられる。本発明は、共有結合したＶＧＦポリペプチドマルチマーを調製するのに用いる二機能性架橋分子も含む。
【０１６５】
一般に化学誘導化は、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に用いる適切などの条件下でも実施できる。ポリペプチドの化学誘導体の調製方法は一般に次のステップを含む：（ａ）ＶＧＦポリペプチドが１以上のポリマー分子に結合するようになる条件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップと（ｂ）反応生成物を得るステップである。最適反応条件は、既知のパラメータと望ましい結果に基づいて決定される。たとえば、ポリマー分子のタンパク質に対するポリマー分子の比が大きくなると、結合するポリマー分子のパーセンテージが大きくなる。ある実施形態において、ＶＧＦポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一ポリマー分子部分を有する。たとえば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照。
【０１６６】
ポリペプチドのペギル化は、当業者に既知のどのペギル化反応を用いても特異的に実施できる。このような反応は、たとえば以下の文献で述べられている：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２，  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；ＥＰ公報第１５４３１６号および第４０１３８４号；米国特許第４，１７９，３３７号。たとえばペギル化は、本明細書で述べる反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアクリル化反応またはアルキル化反応によって実施できる。アクリル化反応の場合、選択したポリマーは反応性エステル基１個を有する必要がある。還元性アルキル化の場合、選択したポリマーは反応性アルデヒド基１個を有する必要がある。反応性アルデヒドはたとえば、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、そのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリロキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。
【０１６７】
別の実施形態において、ＶＧＦポリペプチドはビオチンに化学結合される。ビオチン／ＶＧＦポリペプチド分子は次にアビジンに結合され、４価アビジン／ビオチン／ＶＧＦポリペプチド分子が生じる。ＶＧＦポリペプチドも、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはニトロフェノールに結合され、生じた結合体は抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭと沈殿して、１０価の十量体結合体を生成する。
【０１６８】
一般に、本発明のＶＧＦポリペプチド誘導体の投与によって軽減または調節される症状には、ＶＧＦポリペプチドについて本明細書で述べる症状が含まれる。しかし、本明細書で開示されたＶＧＦポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比べて、別の活性、向上または低下した生物活性、またはたとえば延長または短縮した半減期などの他の特性を有することがある。
【０１６９】
ＶＧＦポリペプチド活性の他のモジュレータのアッセイ
ある状況では、ＶＧＦポリペプチドの活性のモジュレータ、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストである分子を同定することが望ましい。ＶＧＦポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書で述べるような、１以上のスクリーニングアッセイを用いて同定される。そのような分子はインビトロ方法、または注射による、あるいは経口投与、埋め込み器具などによるインビボ方法のどちらで投与してもよい。
【０１７０】
「試験分子」とは、ＶＧＦポリペプチドの活性を調節（すなわち上昇または低下）する能力を評価されている分子を指す。最も一般的には、試験分子はＶＧＦポリペプチドと相互作用する。しかし試験分子が、ＶＧＦ遺伝子発現に影響を与えることによって、またはＶＧＦポリペプチド結合パートナー（たとえば受容体またはリガンド）に結合することによって、ＶＧＦポリペプチド活性を間接的にも調節することも考えられる。ある実施形態において、試験分子は約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、さらに好ましくは約１０−９Ｍ、またさらに好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数を持つＶＧＦポリペプチドに結合する。
【０１７１】
ＶＧＦポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、またはＶＧＦポリペプチドと相互作用してその活性を調節する低分子量分子でもよい。ＶＧＦポリペプチド発現を調節する分子としては、ＶＧＦポリペプチドをコード化する核酸に対して相補性の核酸、またはＶＧＦポリペプチドの発現を指示または制御する核酸配列に対して相補性の核酸、発現のアンチセンスレギュレータとして作用する核酸が挙げられる。
【０１７２】
いったん試験分子がＶＧＦポリペプチドと相互作用することが確認されると、分子はさらに、ＶＧＦポリペプチド活性を上昇または低下させる能力について評価される。試験分子のＶＧＦポリペプチドとの相互作用の測定は、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイ、イムノアッセイを含む、複数の形式で実施できる。一般に、試験分子はＶＧＦポリペプチドによって規定時間だけインキュベートされ、ＶＧＦポリペプチド活性は、生物活性を測定する１種類以上のアッセイによって決定される。
【０１７３】
試験分子とＶＧＦポリペプチドとの相互作用も、イムノアッセイにおいてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて直接分析される。あるいは、本明細書で述べるエピトープタグを含むＶＧＦポリペプチドの修飾形も溶液およびイムノアッセイで使用してもよい。
【０１７４】
ＶＧＦポリペプチドが結合パートナー（たとえば受容体またはリガンド）との相互作用によって生物活性を示す場合、各種のインビトロアッセイを用いて、ＶＧＦポリペプチドの対応するパートナー（選択的結合剤、受容体またはリガンドなど）との結合を測定するのに用いる。これらのアッセイを用いて、試験分子がＶＧＦポリペプチドをその結合パートナーに結合する速度および／または程度を上昇または低下させる能力について、試験分子をスクリーニングできる。あるアッセイにおいて、ＶＧＦポリペプチドはマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。次に放射線標識ＶＧＦポリペプチド結合パートナー（たとえばヨウ化ＶＧＦポリペプチド結合パートナー）および試験分子を、（どちらかの順番で）一度に１つずつ、または同時にウェルに加えることができる。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、シンチレーションカウンタを用いて放射能をカウントして、結合パートナーがＶＧＦポリペプチドに結合する程度を決定する。通常、分子は濃度範囲にわたって試験され、試験アッセイの１以上の要素が欠けた一連の対照ウェルは、結果評価での精度に用いることができる。この方法の代わりの方法は、タンパク質の「位置」の逆転、すなわちＶＧＦポリペプチド結合パートナーをマイクロタイタープレートウェルへの固定化、試験分子および放射線標識ＶＧＦポリペプチドを用いたインキュベーション、ＶＧＦポリペプチド結合の決定を含む。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕａｌｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９５）を参照。
【０１７５】
放射線標識の代わりとして、ＶＧＦポリペプチドまたはその結合パートナーをビオチンに結合し、次に、比色定量によって、またはストレプトアビジンの蛍光標識付によって検出可能な、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素に結合したストレプトアビジンを用いて、ビオチン化タンパク質の存在を検出できる。ＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パートナーに指示された抗体は、ビオチンに結合されており、複合体のインキュベーション後に、ＡＰまたはＨＲＰに結合した酵素結合ストレプトアビジンを用いる検出に使用してもよい。
【０１７６】
ＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パートナーは、アガロースビード、アクリルビードまたは他の種類のそのような不活性固体相基質への結合により固定化することもできる。基質−タンパク質複合体は、相補性タンパク質および試験化合物を含む溶液中に配置される。インキュベーション後、ビードは遠心分離によって沈殿させることができ、ＶＧＦポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量は、本明細書で述べる方法を用いて評価できる。あるいは基質−タンパク質複合体は、カラム内に固定化でき、試験分子および相補性タンパク質がカラムを通過する。次のＶＧＦポリペプチドとその結合パートナーとの複合体の形成は、本明細書で述べるどの技術（たとえば放射線標識または抗体結合）を使用しても評価できる。
【０１７７】
ＶＧＦポリペプチド結合タンパク質とＶＧＦポリペプチド結合パートナーとの複合体形成を増加または減少させる試験分子を同定するのに有用な別のインビトロアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  ピスカタウェイ、ニュージャージー）などの表面プラズモン共鳴検出システムである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造者によって指定されたとおりに利用する。このアッセイは実質的に、ＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パートナーのどちらかと、検出器内に位置するデキストラン被覆センサチップの共有結合を含む。次に試験化合物および他の相補性タンパク質は、同時に、または連続的にセンサチップを含むチャンバに注射できる。結合する相補性タンパク質の量は、センサチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子質量の変化に基づいて評価可能であり、分子質量は検出器システムによって測定される。
【０１７８】
場合によっては、ＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナーの複合体の形成を増加または減少させる能力について、２以上の試験化合物をともに評価することが望ましい。このような場合、本明細書で述べるアッセイは、そのような追加の試験化合物を同時に、あるいは第１の試験化合物に続いて加えることによって、即座に改良できる。アッセイの残りのステップは本明細書で述べるとおりである。
【０１７９】
本明細書で述べるようなインビトロアッセイを使用すると、多数の試験化合物をＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナーの複合体の形成に対する効果について都合よくスクリーニングできる。アッセイを自動化して、ファージ表示で生成する化合物、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリをスクリーニングできる。
【０１８０】
ＶＧＦポリペプチドおよびＶＧＦポリペプチド結合パートナーの複合体の形成を増加または減少させる化合物も、細胞およびＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド結合パートナーのどちらかを発現する細胞系を用いた細胞培養でスクリーニングできる。細胞および細胞系は、任意の哺乳動物から得られるが、ヒトまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供給源によることが好ましい。ＶＧＦポリペプチドの、ＶＧＦポリペプチド結合パートナーを発現する細胞の表面への結合は、試験分子の不在時に評価され、結合の程度はたとえば、ＶＧＦポリペプチド結合パートナーにビオチン化抗体を用いるフローサイトメトリーによって決定される。細胞培養アッセイを都合よく使用して、本明細書で述べるタンパク質結合アッセイで陽性となる化合物をさらに評価することができる。
【０１８１】
薬剤候補の影響をスクリーニングするために、細胞培養物も用いることができる。たとえば、薬剤候補はＶＧＦ遺伝子の発現を増加または減少させる。ある実施形態において、生成されるＶＧＦポリペプチドまたはＶＧＦポリペプチド断片の量は、細胞培養物を薬剤候補に曝露した後に測定する。ある実施形態において、薬剤候補の細胞培養物への実際の影響を検出する。たとえば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に特定の影響を持つ。そのような場合、薬剤候補が遺伝子の発現を増加または減少させる能力、または細胞培養物に対する特定の影響を防止または抑制する能力を試験する。他の実施例において、ポリペプチドの断片などの特定の代謝生成物は、疾患または疾病症状を生じるか、それらに関連する。そのような場合、薬剤候補が細胞培養物においてそのような代謝生成物の生成を減少させる能力を試験する。
【０１８２】
インターナライズタンパク質
（ＨＩＶによる）ｔａｔタンパク質配列を用いて、タンパク質を細胞内にインターナライズできる。たとえばＦａｌｗｅｌｌら、１９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：６６４−６８を参照。たとえばＨＩＶ  ｔａｔタンパク質（「タンパク質形質導入ドメイン」またはＴＡＴ  ＰＤＴと呼ばれる）の１１のアミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１１）は、細胞の細胞質膜および核膜に渡る仲介送達として説明されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９８８，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４：１４４９−５２を参照。これらの手順では、腹膜内投与後に組織に浸透するＦＩＴＣ作成物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１２）が調製され、そのような作成物の細胞への結合は、蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質によって処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注射後、そのような作成物の発現は、肝臓、腎臓、肺、心臓、脳組織を含む、多くの組織で検出できる。そのような作成物は、細胞内に入るためにある程度の変性を受けると考えられるため、細胞へ入った後に再折畳みが必要となることがある。
【０１８３】
それゆえ、ｔａｔタンパク質配列を用いて望ましいポリペプチドを細胞内にインターナライズすることは認識されるであろう。たとえば、ＶＧＦ分子の活性を抑制するために、ｔａｔタンパク質配列を用いて、ＶＧＦアンタゴニスト（抗ＶＧＦ選択性結合剤、小型分子、溶解性受容体、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を細胞内に投与できる。本明細書で使用されるように、「ＶＧＦ分子」という語は、本明細書で定義されるＶＧＦ核酸分子とＶＧＦポリペプチドの両方を指す。望ましい場合、ＶＧＦタンパク質自体もこれらの手順を用いて、細胞内に内部的に投与される。Ｓｔｒａｕｓ，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１４６６−６７も参照。
【０１８４】
治療用途
本発明のＶＧＦポリペプチドおよび選択的結合剤を用いて、本明細書で再引用されたものを含め、多数の急性および慢性疾患または症状を治療、診断、改善、または防止することができる。
【０１８５】
ＶＧＦ関連疾患、症状および障害としては、肥満、不妊、悪液質、摂食障害、ＡＩＤＳ関連複合体、代謝過剰症状、機能亢進、機能低下および過剰インシュリン生成が挙げられる。
【０１８６】
望ましくないレベルのＶＧＦポリペプチドによって誘起または仲介される他の疾患は、本発明の範囲に含まれる。望ましくないレベルには、過剰レベルのＶＧＦポリペプチドおよび半正常レベルのＶＧＦポリペプチドが含まれる。
【０１８７】
ＶＧＦポリペプチド組成物および投与
治療用組成物は、本発明の範囲内にある。こうしたＶＧＦポリペプチド医薬品組成物は、投与方法に適するように選択される製薬上または生理学上許容され得る配合剤との混合物の形態で治療上有効な量のＶＧＦポリペプチドを含むことができる。医薬品組成物は、投与方法に適するように選択される製薬上または生理学上許容され得る配合剤との混合物の形態で治療上有効な量の一つ以上のＶＧＦポリペプチド選択性結合剤を含むことができる。
【０１８８】
好ましくは、許容され得る配合材料は、用いられる投薬量および濃度で受容者に対して非毒性である。
【０１８９】
医薬品組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透性、粘度、透明度、色、等張性、におい、不稔性、安定性、溶解または放出速度、吸収、または浸透を変え、持続または保存するための配合材料を含有することができる。適する配合材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）、抗菌薬、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、またはその他の有機酸など）、充填剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖類、２糖類、およびその他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、たんぱく質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色、着香および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、保存薬（塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン、コレステロールまたはチロキサパールなど）、安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）、強壮増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または製薬助剤が含まれるが、それらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）を参照のこと。
【０１９０】
最適な医薬品組成物は、例えば、意図する投与経路、送達フォーマット、および望ましい投薬量に依存して、熟練した医師によって決定されるであろう。例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。こうした組成物は、ＶＧＦ分子の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス率に影響を及ぼし得る。
【０１９１】
医薬品組成物における主たるビヒクルまたは担体は、本来、水性であってもよいし、または非水系であってもよい。例えば、注射に適するビヒクルまたは担体は、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり、非経口投与用組成物に一般的なその他の材料を追加してもよい。さらに例となるビヒクルには、中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水がある。例となるその他の医薬品組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液が含まれ、これらは、さらにソルビトールまたは適する代用品を含むことができる。本発明の一つの実施形態において、ＶＧＦポリペプチド組成物は、保存用に、所望の純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で調製することができる。さらに、ＶＧＦポリペプチド生成物は、スクロースなどの適する賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方することができる。
【０１９２】
ＶＧＦポリペプチド医薬品組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、この組成物は、吸入用、または経口などの消化管を通した送達用に選択することができる。こうした医薬品として許容され得る組成物の調製は、当該技術の範囲内にある。
【０１９３】
配合成分は、投与部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持する。
【０１９４】
非経口投与を考慮する場合、本発明に用いるための治療用組成物は、製剤上許容され得るビヒクル中に所望のＶＧＦ分子を含む発熱物質を含まない非経口条件に適う水溶液の形態である。注射剤用に製剤上適するビヒクルは、無菌希釈水であり、ＶＧＦ分子は、その中に適切に保存された無菌等張液として処方される。さらにもう一つの調製法は、生成物の制御放出または持続放出のために供給し、その後、蓄積注射によって送達することができる注射可能マイクロスフェア、生体分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズ、またはリポソームなどの薬剤と所望の分子とを配合することを含むことができる。ヒアルロン酸を用いることもでき、これは、循環における持続時間を増進する効果を及ぼすことができる。所望の分子を導入するために適するその他の手段には、移植可能な薬物送達装置が挙げられる。
【０１９５】
一つの実施形態において、医薬品組成物は、吸入用に処方することができる。例えば、ＶＧＦポリペプチドは、吸入用乾燥粉剤として処方することができる。ＶＧＦポリペプチドまたは核酸分子吸入溶液は、噴射剤を用いてエアゾール送達用に処方することもできる。さらにもう一つの実施形態において、溶液を霧状にすることができる。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載されており、この特許は、化学的に変性したたんぱく質の肺送達を記載している。
【０１９６】
一定の製剤は、経口投与することができることも考慮した。本発明の一つの実施形態において、このように投与されるＶＧＦポリペプチドは、習慣的に用いられているような担体を用いて、または用いずに、タブレットおよびカプセルなどの対応する固体剤形に処方することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大であり、前全身性分解が最小である時、胃腸管内にある時点で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。ＶＧＦポリペプチドの吸収を助長するために追加の薬剤を含むことができる。希釈剤、着香剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、タブレット崩壊剤、および結合剤を用いてもよい。
【０１９７】
もう一つの医薬品組成物は、タブレットの製造に適する非毒性賦形剤との混合物での有効量のＶＧＦポリペプチドを含むことができる。無菌水、または別の適するビヒクル、溶液にタブレットを溶解することによって、単位剤形に調製することができる。適する賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸または重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴムなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９８】
持続または制御放出性製剤中にＶＧＦポリペプチドを含む製剤を含むその他のＶＧＦポリペプチド医薬品組成物は、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生体分解性微粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射などの多様なその他の持続または制御放出手段を策定する技術も当業者には知られている。医薬品組成物の送達のための多孔質高分子微粒子の制御放出を記載するＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。
【０１９９】
持続性放出製剤のさらなる例には、成形品、例えば、フィルムまたはマクロカプセルの形態での半透性ポリマー材料が挙げられる。持続性放出材料には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許公報０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら．、上記文献）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州公報１３３９８８号）を挙げることができる。持続性放出組成物は、リポソームも含むことができ、これは、当該技術分野において知られている幾つかの方法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２；および欧州公報０３６６７６号、０８８０４６号および１４３９４９号を参照のこと。
【０２００】
インビボで投与に用いることができるＶＧＦ医薬品組成物は、典型的に、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する時、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および解凍の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液状態で保管することができる。さらに、非経口組成物は、一般に、無菌進入口を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通され得るストッパーを有する静脈液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２０１】
一旦、医薬品組成物を処方すると、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または無水または凍結乾燥粉剤として無菌バイアル内で保管することができる。こうした製剤は、すぐに用いることができる形態で保管することもできるし、または投与前に解凍を要する形態（例えば、凍結乾燥状態）で保管することもできる。
【０２０２】
特定の実施形態において、本発明は、１回量の投与単位を製造するためのキットに割り当てられる。このキットは、各々、乾燥たんぱく質を有する第一容器と水性製剤を有する第二容器の両方を具備することができる。単一および複数のチャンバーを有する予備充填された注射器（例えば、液体注射器および離液型注射器）を具備するキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０２０３】
治療に用いるべきＶＧＦ医薬品組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に依存するであろう。従って、当業者には、治療に適する投薬レベルが、送達される分子、用いられているＶＧＦ分子についての指示、投薬経路、および患者のサイズ（体重、体表または器官のサイズ）および状態（年齢および全身の健康）に一部依存して変化するであろうことはご理解いただけよう。従って、臨床医は、投薬量をタイターし、投薬経路を改良して、最適な治療効果を得ることができる。典型的な投薬量は、上述の因子に依存して約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲にわたり得る。他の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲にわたり得る。
【０２０４】
投薬頻度は、用いられる製剤中のＶＧＦ分子の薬物動態因子に依存するであろう。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与するであろう。従って、組成物は、１回量として、ある期間にわたって２回以上の量（同じ量の所望分子を含有してもよいし、含有しなくてもよい）として、または移植装置またはカテーテルによる持続注入として投与することができる。適切な投薬量のさらなる改善は、通常の当業者によって日常的に行われており、彼らが日常的に行う仕事の領域に入る。適切な投薬量は、適切な用量応答データを用いることによって把握することができる。
【０２０５】
医薬品組成物の投薬経路は、例えば、経口的に；静脈内経路、腹膜内経路、大脳内経路（実質組織内経路）、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路または病巣内経路による注射を通して；持続性放出システムによって；または移植装置によって行われる既知の方法に従う。所望される場合、組成物は、大量注射によって、または点滴によって持続的に、または体内移植装置によって投与することができる。
【０２０６】
あるいは、またはさらに、所望の分子を吸収まはた被包する膜、スポンジ、またはその他の適する材料を移植することによって、組成物を局所的に投与することができる。移植装置を用いる場合、この装置は、あらゆる適する組織または器官に移植することができ、拡散投与、時効性大量投与、または持続性投与によって所望の分子を送達することができる。
【０２０７】
場合によっては、エクスビボ方式でＶＧＦポリペプチド医薬品組成物を用いることが望ましい。こうした例では、患者から除去した細胞、組織または器官をＶＧＦポリペプチド医薬品組成物に暴露し、その後、それらの細胞、組織または器官を患者に移植して戻す。
【０２０８】
他の場合、ＶＧＦポリペプチドは、本明細書中に記載するものなどの方法を用いてＶＧＦポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子設計した一定の細胞を移植することによって送達することができる。こうした細胞は、動物細胞であってもよいし、またはヒトの細胞であってもよく、また、オートロガスであってもよいし、ヘテロロガスであってもよいし、またはキセノジェニックであってもよい。任意に、細胞を不死化してもよい。免疫応答の機会を減少させるために、細胞を被包して、周囲組織の侵入を回避してもよい。被包材料は、典型的に、たんぱく質生成物（複数を含む）を放出するが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からのその他の有害な因子による細胞の崩壊を防止することができる生物学的適合性の半透性高分子エンクロージャーまたは膜である。
【０２０９】
本明細書中で論じるように、単離細胞集団（基幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニュートロンなど）を一つ以上のＶＧＦポリペプチドで処理することが望ましい場合がある。これは、単離細胞が細胞膜への透過が可能な形態である場合、単離細胞を直接ポリペプチドに暴露することによって達成することができる。
【０２１０】
本発明のさらなる実施形態は、治療用ポリペプチドのインビトロでの生成と遺伝子療法または細胞治療による治療用ポリペプチドの生成および送達との両方のための細胞および方法（例えば、相同的組換えおよび／またはその他の組換え生成法）に関する。相同的組換え法およびその他の組換え法を用いて、通常転写沈黙ＶＧＦ遺伝子または不完全発現遺伝子を含む細胞を修飾することによって、治療上効能のある量のＶＧＦポリペプチドを発現する細胞を生じることができる。
【０２１１】
相同的組換えは、標的遺伝子が転写活性遺伝子における変異を誘導または修正するために本来開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基礎技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定領域に導入するための方法（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈａｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠陥遺伝子内の特定の変異を修正するための方法（Ｄｏｅｔｓｃｈａｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−７８）として開発された。相同的組換え技術の例は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許公報９１９３０５１号および５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９５５に記載されている。
【０２１２】
相同的組換えを通して、ゲノムに挿入すべきＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに取付けることによって対象となる遺伝子の特定領域に割り当てることができる。標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に対して相補的（相同適）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定領域に対して相補的である標的ＤＮＡの小片をＤＮＡ複製プロセス中に親鎖と接触させる。ハイブリッド形成することによって、共有相同領域を通して内在性ＤＮＡのその他の断片と組換えることが、細胞に挿入されたＤＮＡの一般的性質である。変異もしくは異なる配列または別のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドにこの相補鎖が取付けられると、これは、組換えの結果として新しく合成された鎖にも組み込まれる。このプルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新しい配列は、テンプレートとして働くことができる。このようにして、転移ＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２１３】
ＶＧＦポリペプチドの発現と相互作用、またはこれを制御することができるＤＮＡの領域、例えば、隣接配列を標的ＤＮＡのこれらの断片に取付ける。例えば、プロモータ／エンハンサ要素、サプレッサ、または外在性転写変調要素を、意図する宿主細胞のゲノムに、所望のＶＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすために十分な近接および向き付けで挿入する。制御要素は、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＶＧＦポリペプチドの発現は、ＶＧＦ遺伝子それ自体をコードするＤＮＡの転写によってではなく、むしろＶＧＦ遺伝子を転写するための認識可能な信号を有する外在性遺伝子配列を供給するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（対象となる外在性遺伝子との相同領域を含む）を用いることによって達成することができる。
【０２１４】
例となる方法では、細胞内の所望の標的とする遺伝子（すなわち、所望の外在性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エクソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入により、予め選択された部位での細胞遺伝子への相同的組換えによって変更される。これらの成分は、結果として（ＤＮＡ構成体中に存在する調節配列、エクソンおよびスプライスドナー部位が外在性遺伝子に作動的に結合する）新しい転写単位が実質的に生成されるような方法で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される。これらの成分の染色体ＤＮＡへの導入の結果として、所望の外在性遺伝子の発現が修飾される。
【０２１５】
本明細書中に記載するような修飾された遺伝子発現は、得られるような細胞内では通常沈黙している（発現しない）遺伝子を活性化すること（すなわち、発現させること）、ならびに得られるような細胞内では生理学上有意なレベルでは発現しない遺伝子の発現を増加させることを含む。この実施形態は、さらに、得られるような細胞内で発生する調節または導入のパターンとは異なるように調節または導入パターンを変化させること、および得られるような細胞内で発現する遺伝子の発現を減少させること（排除することを含む）を含む。
【０２１６】
相同的組換えを用いて細胞の外在性ＶＧＦ遺伝子からのＶＧＦポリペプチドの生産を増加させる、すなわちそれをさせることができる一つの方法は、最初に相同的組換えを用いて、部位特定組換えシステム（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｓｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）から組換え配列を、細胞の外在性ゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の上流（すなわち、それに対して５’）に配置することを含む。ゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された部位に対して相同な組換え部位を含むプラスミドを適切な組換え酵素とともに修飾細胞系統に導入する。この組換え酵素によって、細胞系統内のゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された組換え部位にプラスミドの組換え部位を媒介としてプラスミドが組み込まれることとなる（Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている一切の隣接配列（例えば、エンハンサ／プロモータ、イントロン、翻訳エンハンサ）は、このプラスミド内に適切に配置される場合、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらす新しいまたは修飾された転写単位を創り出すように組み込まれる。
【０２１７】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＶＧＦポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された細胞系統を用いるさらなる方法は、相同的組換えを用いて、細胞系統のゲノム内のほかの場所に第二組換え部位を導入することである。その後、適切な組換え酵素をこの二組換え部位細胞系統に導入して、組換え現象（欠失、逆位、および転座）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これによって、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらす新しいまたは修飾された転写単位が創り出されることとなる。
【０２１８】
細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からのＶＧＦポリペプチドの発現を増加させるかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらす方法で遺伝子（一つまたは複数）（例えば、転写因子）の発現を増加させるかまたは引き起こすことおよび／または遺伝子（一つまたは複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを含む。この方法は、細胞の内在性ＶＧＦ遺伝子からの新規または増加ＶＧＦポリペプチドの生産をもたらすような、細胞への非自然発生ポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに接合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）の導入を含む。
【０２１９】
ＶＧＦポリペプチド細胞治療、例えば、ＶＧＦポリペプチドを生産する細胞の移植も考慮する。この実施形態は、生物活性形態のＶＧＦポリペプチドを合成することおよび分泌することができる細胞を移植することを含む。こうしたＶＧＦポリペプチド生産細胞は、ＶＧＦポリペプチドの自然生産者である細胞であることができ、あるいは所望のＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子でまたはＶＧＦポリペプチドの発現を促進する遺伝子で形質転換することによって、ＶＧＦポリペプチドを生産する能力を強化した組換え細胞であってもよい。こうした修飾は、遺伝子を伝達すること、ならびにその発現および分泌を促進することに適するベクターによって達成することができる。異種のポリペプチドの投与によって発生し得るようなＶＧＦポリペプチドを投与した患者における潜在的免疫反応を最小化するために、ＶＧＦポリペプチドを生産する天然細胞がヒト由来であり、ヒトＶＧＦポリペプチドを生産することが好ましい。同様に、ＶＧＦポリペプチドを生産する組換え細胞は、ヒトＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２２０】
移植細胞を被包して、周囲組織の侵入を回避することができる。ヒトまたはヒト以外の動物細胞は、ＶＧＦポリペプチドを放出することができるが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からのその他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する生物学的適合性の半透性高分子エンクロージャーまたは膜に入れて患者に移植することができる。あるいは、エクスビボでＶＧＦポリペプチドを生産するように形質転換された患者自身の細胞をこうした被包を施さず患者に直接移植することができる。
【０２２１】
生体細胞を被包する技術は、当業者に既知であり、被包細胞の調製および患者への移植は日常的に達成することができる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら．（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物活性分子を有効に送達するための遺伝子設計細胞を収容する膜カプセルを記載している。このカプセルは、生物学的適合性であり、容易に修復することができる。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植するとインビボでのダウンレギュレーションを受けないプロモータに作動的に結合する生物活性分子についてのＤＮＡ配列コーディングを含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞を被包する。この装置は、生体細胞から受容者内の特定部位に分子を送達するために供給される。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２号、および第５，１０６，６２７号を参照のこと。生体細胞を被包するためのシステムは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら．）に記載されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら．）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２９６−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ  ３８：１７−２３も参照のこと。
【０２２２】
インビボおよびインビトロでの遺伝子治療用ＶＧＦポリペプチド送達も構想する。遺伝子治療技術の一つの例は、構成または誘導性プロモータに作動的に結合して、「遺伝子治療用ＤＮＡ構成体」を形成することができるＶＧＦポリペプチドをコードする核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいずれか）を用いることである。このプロモータは、構成体が挿入される細胞または組織タイプ内で活性であることを条件として、内在性ＶＧＦポリペプチドに対して相同的であってもよいし、または非相同的であってもよい。遺伝子治療用ＤＮＡ構成体のその他の成分は、任意に、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同的組換えに有用な内在性配列）、組織特異的プロモータ、エンハンサまたはサイレンサー、親細胞上に選択的利点をもたらすことができるＤＮＡ分子、形質転換細胞を特定するラベルとして有用なＤＮＡ分子、負の選択システム、細胞特異的結合剤（例えば、細胞標的用など）、細胞特異的内在化因子、ベクターからの発現を強化する転写因子、およびベクター生産を可能にする因子が挙げられる。
【０２２３】
次に、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて、遺伝子治療用ＤＮＡ構成体を（エクスビボまたはインビボのいずれかで）細胞内に導入することができる。遺伝子治療用ＤＮＡ構成体を誘導するための一つの手段は、本明細書中に記載するようなウイルスベクターによるものである。レトロウイルスベクターなどの一定のベクターは、ＤＮＡ構成体を細胞の染色体ＤＮＡに伝達し、遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むことができる。その他のベクターは、エピソマーとして機能し、遺伝子治療用ＤＮＡ構成体は、細胞質中に残るであろう。
【０２２４】
さらにその他の実施形態において、標的細胞内でＶＦＧ遺伝子を制御発現させるために、調節エレメントを含むことができる。こうした要素は、適切なエフェクターに応答して活動を始める。このようにして、治療用ポリペプチドを所望時に発現することができる。一つの通常の制御手段は、小分子ダイマライザー、またはＤＮＡ結合たんぱく質または転写活性たんぱく質などの小分子結合ドメインと生物学的プロセスを開始させることができるドメインとを含むキメラたんぱく質を二量化するためのラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を含む（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８、およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。たんぱく質の二量化を用いてトランスジーンの転写を開始させることができる。
【０２２５】
別の調節技術は、凝集体またはクラスターとしての細胞内部の対象となる遺伝子から発現されるたんぱく質を貯蔵する方法を用いる。対象となる遺伝子は、条件凝集ドメインを含む融合たんぱく質として発現され、その結果、その小胞体内に凝集たんぱく質を保持することとなる。貯蔵たんぱく質は、細胞内部で安定であり、不活性である。しかし、条件凝集ドメインを除去し、その結果、凝集体またはクラスターを特異的にばらばらに分解して、たんぱく質を細胞から分泌することができる薬物（例えば、小分子リガンド）を投与することによって、このたんぱく質を放出することができる。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２２６】
その他の適する制御手段または遺伝子スイッチには、本明細書中に記載する系が挙げられるが、それらに限定されない。ミフェプリストーン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）（ＲＵ４８６）をプロゲステロン拮抗薬として用いる。修飾プロゲステロン受容体リガンド結合ドメインのプロゲステロン拮抗薬への結合は、後に核酸に入ってＤＮＡに結合する二つの転写因子の二量体を形成することによって転写を活性化する。リガンド結合ドメインを修飾して、受容体が天然リガンドに結合する能力を排除する。修飾ステロイドホルモン受容体系は、米国特許第５，３６４，７９１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７にさらに記載されている。
【０２２７】
さらにもう一つの制御システムは、エクジソン受容体（細胞質受容体）に結合し、これを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を用いる。次に、この受容体を細胞核に転座させて、特異的ＤＮＡ応答要素（エクジソン応答遺伝子からのプロモータ）に結合させる。エクジソン受容体は、転写を開始させるために、トランスアクティベーションドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、米国特許第５，５１４，５７８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている。
【０２２８】
もう一つの制御手段は、正のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を用いる。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに結合した突然変異ｔｅｔリプレッサーたんぱく質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節性トランス活性化因子たんぱく質を生じる突然変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわち、それらがテトラサイクリンの存在のもとでｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。こうしたシステムは、米国特許第５，４６４，７５８号、第５，６５０，２９８号、および第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２２９】
さらなる発現制御システムおよび核酸構成体は、Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．の米国特許第５，７４１，６７９号および第５，８３４，１８６号に記載されている。
【０２３０】
インビボでの遺伝子治療は、ＶＧＦポリペプチドをコードする核酸分子を局部注射によって、またはその他の適切なウイルスもしくは非ウイルス伝達ベクターによって、細胞に導入することにより達成することができる。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１４１８−３５。例えば、ＶＧＦポリペプチドをコードする核酸分子は、標的とする細胞への伝達のためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに収容することができる（例えば、Ｊｏｈｏｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能性プロモータおよびポリアデニル化配列と作動的に結合するＶＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆向き末端反復配列を含む。
【０２３１】
別の適するウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイスルベクター、レンチウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、および乳頭腫ウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボイルス媒介遺伝子伝達システムを記載している。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療用たんぱく質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒトの細胞を伝達することによる、患者に治療用たんぱく質を供給するプロセスの例を提供している。遺伝子治療技術を実践するためのその他の方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、第５，６７２，５１０号（レトロウイルスを含む）、第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０２３２】
非ウイルス型伝達法には、リポソーム媒介伝達、裸ＤＮＡ伝達（直接注射）、受容体媒介伝達（リガンドＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、それらに限定されない。遺伝子治療材料および方法は、ベクターによる発現およびベクター製造方法を強化するために、誘導性プロモータ、組織特異的エンハンサ／プロモータ、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞上に選択的利点をもたらすことができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を特定するためのラベル、負の選択システムおよび発現制御システム（安全手段）、細胞特異的結合剤（細胞標的用）、細胞特異的内在化因子、および転写因子も含むことができる。遺伝子治療技術を実践するためのこうした追加の方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、第５，６７９，５５９号（遺伝子伝達のためのリポたんぱく質含有システムを記載している）、第５，６７６，９５４号（リポソーム担体を含む）、第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載している）、および第４，９４５，０５０号（生物活性粒子を細胞に対して一定速度で噴射することによって、粒子が細胞の表面を貫通して、細胞の内部に組み込まれる方法を記載している）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載されている。
【０２３３】
ＶＦＧ遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞（複数を含む）における一つ以上の追加のポリペプチド（複数を含む）の伝達をさらに含むことができることも考慮される。こうした細胞は、親細胞に別々に導入してもよいし、または細胞を上記被包膜などの単一の移植可能装置に収容してもよいし、または細胞をウイルスベクターによって別々に修飾してもよい。
【０２３４】
遺伝子治療によって細胞内の内在性ＶＧＦポリペプチド発現を増加させるための手段は、一つ以上のエンハンサ要素をＶＧＦポリペプチドプロモータに挿入することであり、エンハンサ要素は、そこでＶＧＦ遺伝子の転写活性を増大させるために働くことができる。用いられるエンハンサ要素は、遺伝子を活性化することを望む組織を基に選択されるであろう−その組織においてプロモータの活性化をもたらすことが知られているエンハンサ要素が選択されるであろう。例えば、ＶＧＦポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｔ細胞において「活動を始める」ことができる場合には、ｌｃｋプロモータエンハンサ要素を用いることができる。ここで、追加すべき転写要素の機能部分は、標準クローニング技術を用いて、ＶＧＦポリペプチドプロモータを含むＤＮＡの断片に挿入すること（および任意に、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入すること）ができる。「相同的組換え構成体」として知られるこの構成体は、その後、エクスビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入することができる。
【０２３５】
遺伝子治療を用いて、内在性プロモータのヌクレオチド配列を修飾することによってＶＧＦポリペプチドの発現を減少させることができる。こうした修飾は、典型的に、相同的組換え法によって達成される。例えば、不活性化のために選択されるＶＧＦ遺伝子のプロモータのすべてまたは一部を含有するＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモータの断片を除去および／または置換するように設計することができる。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモータの転写活性化因子の結合部位は、標準的な分子生物学技術を用いて欠失させることができる。こうした欠失はプロモータの活性を抑制し、その結果、対応するＶＧＦ遺伝子の転写を抑制することができる。ＴＡＴＡボックスまたはプロモータにおける転写活性化因子結合部位の欠失は、置換、欠失および／または一つ以上のヌクレオチドの挿入によって、一つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位ヌクレオチドを変異させるＶＧＦポリペプチドプロモータのすべてまたは関連部分を含むＤＮＡ構成体を（調節されるＶＧＦ遺伝子と同じまたは関連種から）生成することによって達成することができる。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性が低下してしまい、完全に不活性になる。修飾されたプロモータセグメントに隣接する天然（内在性）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００個のＤＮＡ塩基を典型的に含有するこの構成体は、直接に、または本明細書中に記載するようなウイルスベクターによって、（エクスビボまたはインビボのいずれかで）適切な細胞に導入することができる。典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへの構成体の組込みは、相同的組換えによるであろう。この場合、プロモータ構成体における５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによる修飾プロモータ領域の組込みを助長するために働くことができる。
【０２３６】
ＶＧＦポリペプチドの使用
ＶＧＦポリペプチドは、治療する状態に適するように、一つ以上のサイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症物質、および／または化学療法薬と併用（同時にまたは逐次的に）することができる。
【０２３７】
一つ以上のＶＧＦポリペプチドの活性を抑制することが望ましい場合には、その他の方法を用いることもできる。こうした抑制は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＶＧＦｍＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によって行われる。例えば、少なくともＶＧＦ遺伝子の一部に相補的である配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を細胞に導入することができる。アンチセンスプローブは、本明細書中で開示するＶＧＦ遺伝子の配列を用いて利用できる技術によって設計することができる。典型的に、こうしたアンチセンス分子各々は、選択ＶＧＦ遺伝子各々の出発部位（５’末端）に相補的であろう。アンチセンス分子を、その後、対応するＶＧＦｍＲＮＡにハイブリダイズする時、このｍＲＮＡの翻訳は、妨げられるか低下させられる。アンチセンス抑制因子は、細胞または器官におけるＶＧＦポリペプチドの減少または不在に関わる情報を提供する。
【０２３８】
あるいは、遺伝子治療を用いて、一つ以上のＶＧＦポリペプチドの優性陰性抑制因子を生じることができる。この状況において、選択された各ＶＧＦポリペプチドの突然変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、本明細書中に記載するようなウイルス法または非ウイルス法のいずれかを用いて患者の細胞に導入することができる。典型的には、こうした突然変異体各々が、その生物学的役割において内在性ポリペプチドに匹敵するように設計される。
【０２３９】
さらに、生物学的に活性であるかまたは活性でないＶＧＦポリペプチドは、イムノゲンとして用いることができる。すなわち、ポリペプチドは、抗体を発生することができる少なくとも一つのエピトープを含有する。（本明細書中に記載するような）ＶＧＦポリペプチドに結合する選択的結合剤は、インビボおよびインビトロでの診断のために用いることができ、これには、標識された形態で用いて、体液または細胞サンプル中のＶＧＦポリペプチドの存在を検出することが挙げられるが、それに限定されない。この抗体を用いて、本明細書中で列挙するものを含む多数の疾病および障害を予防、治療、または診断することもできる。抗体をＶＧＦポリペプチドに結合させて、ＶＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活性特性を低下させるかまたは阻害してもよいし、またはポリペプチドに結合させて、ＶＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活性特性を増大させてもよい（ＶＧＦポリペプチドの薬物動態を増大させることによるものを含む）。
【０２４０】
本発明のＶＧＦポリペプチドは、発現クローニング手段を用いてＶＧＦポリペプチド受容体のクローンを作るために用いることができる。放射線ラベル（１２５−ヨウ素）ＶＧＦポリペプチドまたは親和性／活性標識ＶＧＦポリペプチド（Ｆｃ融合またはアルカリ性リン酸分解酵素融合など）は、ＶＧＦポリペプチド受容体を発現する細胞タイプまたは細胞系統または組織を特定するための結合分析に用いることができる。こうした細胞または組織から単離したＲＮＡをｃＤＮＡに転化させて、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、哺乳動物細胞（ＣＯＳまたは２９３細胞など）にトランスフェクションして、発現ライブラリを作ることができる。放射線ラベルまたは標識ＶＧＦポリペプチドは、その後、それらの表面にＶＧＦポリペプチド受容体を発現する細胞のサブセットをこのライブラリから特定し、単離するための親和性リガンドとして用いることができる。その後、ＤＮＡをこれらの細胞から単離し、哺乳動物細胞にトランスフェクションして、ＶＧＦポリペプチド受容体を発現する細胞のフラクションが、元のライブラリにおけるものより何倍も高い第二発現ライブラリを作ることができる。この濃縮プロセスは、ＶＧＦポリペプチド受容体を含有する単一組換えクローンが単離されるまで、反復して繰り返すことができる。ＶＧＦポリペプチド受容体の単離は、ＶＧＦポリペプチドの通信経路の新規作用物質および拮抗物質を特定または開発するために有用である。こうした作用物質および拮抗物質には、溶解性ＶＧＦポリペプチド受容体、抗ＶＧＦポリペプチド受容体抗体、小分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらは、本明細書中に記載する一つ以上の疾病または障害を治療、予防または診断するために用いることができる。
【０２４１】
以下の実施例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる点においても本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。
【０２４２】
実施例１：抗ＶＧＦポリペプチド抗体の生成
標準ペプチド合成プロトコルを用いてＡｍｇｅｎ  Ｂｏｕｌｄｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグループによって合成されたＶＧＦポリペプチドをウサギに注射することによって、ＶＧＦポリペプチドに対する抗体を生成した。ペプチド合成後、異なるバッチからＶＧＦポリペプチドをプールし、凍結乾燥した。各ＶＧＦポリペプチドについてのペプチド含量をＨＣｌでの加水分解によって決定した。
【０２４３】
システイン残基を欠くＶＧＦポリペプチド（ＶＧＦ−１；配列番号１、またはＶＧＦ−２；配列番号４；表Ｉ）からポリクローナル抗ＶＧＦポリペプチド抗体を調製するために、５ｍｇのＶＧＦポリペプチドおよび０．５ｍＬのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）ＥＤＣ結合緩衝剤（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）を２ｍＬのバイアルに移し、この混合物を渦巻攪拌した。２０ｍｇバイアルのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）キーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）を２ｍＬの滅菌水中で希釈し、この溶液の０．５ｍＬをＶＧＦポリペプチド溶液に添加した。キーホールリンペットヘモシアニンの添加後、０．１ｍＬのＥＤＣ（１ｍＬの滅菌水中１０ｍｇのＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ））をＶＧＦポリペプチドに添加し、この溶液を室温で、少なくとも２時間インキュベーションした。
【０２４４】
インキュベーション後、結合ＶＧＦポリペプチドを１０００の分子量をカットオフするＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６透析管（カルフォルニア州、ランチョドミンゲスのＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、２ＬのＰＢＳ中で一晩、４℃で透析して、サンプルから既知の抗凝固物質であるＥＴＤＡを除去した。透析した結合ＶＧＦポリペプチド溶液を１５ｍＬの円錐型試験管に移し、ＰＢＳを添加して、溶液の量を４ｍＬにした。各々１ｍＬのアリコートを２ｍＬのネジ付き試験管に移して、各アリコートを２ｍＬのガラス製注射器に注入し、その後、１ｍＬのＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）リサーチアジュバント（ジョージア州、ノルクロスのＣｙｔＲｘ）を注入した。
【０２４５】
注射器に１８ゲージ混合針を取付け、溶液を混合して乳化させた。次に、ウサギに筋肉内注射するために、この混合物を２本の１ｍＬ注射器に移した。ウサギには、０．１ｍＬのＶＧＦポリペプチド／アジュバント溶液を二つの注射部位に注射し、その後、４週間および６週間後にウサギにブーストした。第二ブースト後にウサギから試験採血（約５ｍＬ採血）し、その後２週間後に再び試験採血した。生成物のブリードが許容可能と考えられる場合には、ウサギに再びブーストして、このブーストから２週間後、６週間、週に１回採血した（約４０ｍＬの採血）。図１および２は、ＶＧＦ−１またはＶＧＦ−２のいずれかを注射したウサギの抗体力価レベルを示す。
【０２４６】
システイン残基を有するＶＧＦポリペプチドからポリクローナル抗ＶＧＦポリペプチド抗体を調製するために、５ｍｇのＶＧＦポリペプチドおよび０．５ｍＬのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）マレイミド結合緩衝剤（Ｐｉｅｒｃｅ）を２ｍＬのバイアルに移し、その混合物を渦巻攪拌した。２０ｍｇバイアルのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）キーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）を２ｍＬの滅菌水中で希釈し、０．５ｍＬのこの溶液をＶＧＦポリペプチド溶液に添加した。キーホールリンペットヘモシアニンの添加後、ＶＧＦポリペプチド溶液を室温で少なくとも２時間インキュベーションした。
【０２４７】
インキュベーション後、結合ＶＧＦポリペプチドをＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６透析管に移し、２ＬのＰＢＳ中で一晩、４℃で透析して、サンプルからＥＴＤＡを除去した。透析した結合ＶＧＦポリペプチド溶液を１５ｍＬの円錐型試験管に移し、ＰＢＳを添加して、溶液の量を４ｍＬにした。各々１ｍＬのアリコートを２ｍＬのネジ付き試験管に移して、各アリコートを２ｍＬのガラス製注射器に注入、その後、１ｍＬのＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）リサーチアジュバント（ＣｙｔＲｘ）を注入した。
【０２４８】
注射器に１８ゲージ混合針を取付け、溶液を混合して乳化させた。次に、ウサギに筋肉内注射するために、この混合物を２本の１ｍＬ注射器に移した。ウサギには、０．１ｍＬのＶＧＦポリペプチド／アジュバント溶液を二つの注射部位に注射し、その後、４週間および６週間後にウサギにブーストした。第二ブースト後にウサギから試験採血（約５ｍＬ採血）し、その後２週間後に再び試験採血した。生成物のブリードが許容可能と考えられる場合には、ウサギに再びブーストして、このブーストから２週間後、６週間、週に１回採血した（約４０ｍＬの採血）。
【０２４９】
実施例２：ノックアウトマウスにおけるＶＧＦポリペプチドの生物活性
標準ペプチド合成プロトコルを用いて、Ａｍｇｅｎ  Ｂｏｕｌｄｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙグループによって合成されたＶＧＦポリペプチド用いて、ノックアウトマウスにおけるＶＧＦポリペプチドの生物活性を分析した。ペプチド合成後、異なるバッチからＶＧＦポリペプチドをプールし、凍結乾燥した。各ＶＧＦポリペプチドについてのペプチド含量をＨＣｌでの加水分解によって決定した。
【０２５０】
ＶＧＦ遺伝子のノックアウトマウスは、ニューヨーク州、ニューヨークのＭｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｔｅｖｅ  Ｓａｌｔｏｎから入手した。ＶＧＦポリペプチドの投与に先立ち、ノックアウトマウスをＬＤ  １２：１２条件（すなわち、昼１２時間、夜１２時間）で収容した。ＶＧＦポリペプチドを注射する２４時間前、ノックアウトマウスを個別におりに入れて、一時的住居に移し、その場所で、マウスを残りの実験のために、１２：１２条件のもとで飼った。
【０２５１】
２ｍｇのＶＧＦ−１ａ（配列番号２；表１）の腹膜内注射によって、ＶＧＦポリペプチドを１日２回（午前９：００および午後６：００に）ノックアウトマウスに投与した。注射前、ＶＧＦ−１ａポリペプチドは、ＣＳＦ溶液緩衝剤（１２６．６ｍＭのＮａＣｌ、２．６ｍＭのＫＣｌ、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２および１．４ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．４）中１６％に希釈した。ノックアウトマウスに５日間ＶＧＦ−１ａポリペプチドを投与して、各マウスの体重を毎日測定した。処理マウスの体重は、ＶＧＦ−１ａポリペプチドの投与停止後３日間、毎日測定した。
【０２５２】
図３は、ＶＧＦ−１ａの投与後のＶＧＦノックアウトマウスの体重を示す。４匹の処理マウスのうち３匹は、体重が１０〜１５％増加した。この実験から体重の増加が食物または水の摂取増加の結果であるか否かの判定を下すことは不可能であった。
【０２５３】
実施例３：ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質
ＶＧＦポリペプチドは、それらのカルボキシル−またはアミノ末端におけるヒト免疫グロブリンＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域との融合たんぱく質として発現される。適切なＰＣＲプライマーおよび標準ＰＣＲ増幅手順を用い、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に関するＤＮＡ配列コーディングをＶＧＦ−１（配列番号１）ポリペプチド、ＶＧＦ−１ｂ（配列番号３）ポリペプチド、またはＶＧＦ−２（配列番号４）ポリペプチドをコードするものとフレーム内で融合させることによって、ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合構成体を調製する。
【０２５４】
ＰＣＲによって発生させたＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合生成物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化して、ベクターｐＡＭＧ２１にライゲーションした後、標準技術を用いてコンピテント大腸菌株２５９６細胞に形質転換させる。組換えたんぱく質生成物を生産する能力および正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を有する能力についてクローンをスクリーニングする。
【０２５５】
大腸菌株ＧＭ２２１におけるＦｃ融合構成体を含む細菌培養物を、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地中、３７℃で増殖させる。ｌｕｘＰＲプロモータからの遺伝子生成物の発現の誘導は、合成自己誘導物質Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを培地に添加して、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬにした後、遂行する。培養物を３７℃でさらに３時間インキュベーションする。このインキュベーション後、細菌培養は、封入体の存在について顕微鏡による試験を行い、その後、遠心分離によって回収する。１０％のβ−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に再懸濁させることによって、細胞ペレットを直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２５６】
ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質は、高圧均質化（すなわち、１４，０００ＰＳＩで２回パス）を用いて、最初に細胞を水中で破砕することによって精製する。封入体は、１時間、Ｊ−６Ｂにおいて４２００ＲＰＭで遠心分離することによって回収し、その封入体を６Ｍのグアニジン、５０ｍＭのトリス、８ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．７に１時間、１：１０の比率で溶解する。その後、溶解混合物は、２Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス、１６０ｍＭのアルギニン、３ｍＭのシステイン、ｐＨ８．５に２０倍に希釈する。この混合物を一晩、冷間で攪拌して、限外濾過によって約１０倍に濃縮し、その後、１０ｍＭのトリス、１．５Ｍの尿素、ｐＨ９で３倍に希釈する。その後、この混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整する。遠心分離によって沈殿物を除去し、２０ｍＭのＮａＡｃ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５中で平衡させたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（１０ｍｇ／ｍＬたんぱく質充填；室温）にこの上澄を充填する。１００ｍＭのＮａＣｌ〜５００ｍＭのＮａＣｌの範囲の同じ緩衝液中の２０カラム量の成分を用いてたんぱく質をカラムから溶離する。カラムからのプールを３倍に希釈し、２０ｍＭのＮａＡｃ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５中のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（１０ｍｇ／ｍＬたんぱく質充填；室温）に充填する。１５０ｍＭのＮａＣｌ〜４００ｍＭのＮａＣｌの範囲の同じ緩衝液中の２０カラム量の成分を用いてたんぱく質をカラムから溶離する。ピークをプールして、濾過する。
【０２５７】
本明細書中に記載する方法または通常の当業者に知られた方法を用いて、ＶＧＦポリペプチド−Ｆｃ融合たんぱく質の活性を評価する。
【０２５８】
実施例４：トランスジェニックマウスにおけるマウスＶＧＦポリペプチドの発現
ＶＧＦポリペプチドの生物活性を評価するために、標準プロトコルを用いて、シナプシンプロモータの制御下にあるマウスＶＧＦポリペプチドをコードする構成体を調製した。この構成体の伝達によって、ＶＧＦポリペプチドの機能に関する情報を与える病理学的変化を生じることが予想される。同様に、標準プロトコルを用いて、β−アクチンプロモータの制御下にあるＶＧＦポリペプチド全長を含有する構成体を調製した。この構成体の伝達によって、偏在発現が生じることが予想される。
【０２５９】
これらの構成体を発生させるために、ＰＣＲを用い、所望の配列の５’および３’末端に対応すると共に制限酵素部位を組み込こんで増幅生成物の発現ベクターへの挿入を可能にするプライマーを用いて、マウスＶＧＦポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅させた。増幅後、ＰＣＲ生成物をゲル精製し、適する制限酵素で消化して、標準組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクトルにライゲーションさせた。Ｇｒａｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２−７４、およびＲａｙら、１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５−７３を参照のこと。
【０２６０】
ライゲーション後、反応混合物を用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌宿主株を形質転換させ、形質転換株を薬物耐性のために選択した。選択されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列に従わせて、適切な挿入の存在および突然変異の不在を確認した。ＶＧＦポリペプチド発現ベクターは、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を２回繰り返すことによって精製して、適する制限酵素を用いて切断し、マウスＶＧＦポリペプチドトランスジーンを含む線状化フラグメントは、ゲル電気泳動法によって精製した。２μｇ／ｍＬの濃度で、精製フラグメントを５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４および０．２ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させた。
【０２６１】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１  交配マウスからの単個細胞胚を記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射した。肺をＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、１５〜２０の二細胞胚を偽妊娠ＣＤ１メスマウスの卵管に移植した。顕微注射した胚の移植によって得られた子孫を次のようにゲノムＤＮＡサンプルにおける組込みトランスジーンのＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。耳断片を２０μＬの耳緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＳＤＳ０．５％、および５００ｍｇ／ｍＬのプロティナーゼＫ）中、５５℃で一晩消化した。その後、サンプルを２００μＬのＴＥで希釈し、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応に用いた。
【０２６２】
トランスジェニックファウンダー動物を特定し、これらを用いてＦ１マウスを発生させた。これを行うために、Ｆ１マウスから脾臓、肝臓および全脳部分を除去して、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全細胞ＲＮＡを脾臓から単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってトランスジーンの発現を決定した。秘蔵から回収したＲＮＡを次のようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換した。発現ベクター内のＶＧＦポリペプチドトランスジーンに対して３’に配置した適するプライマーを用いて、トランスジーン転写体からのｃＤＮＡの合成を起動する。トランスジェニックファウンダーの肝臓、脳および脾臓組織から調製した１０ｍｇの全ＲＮＡおよび対照を１ｍＭのプライマーとともに１０分間７０℃でインキュベーションして、氷上に置いた。その後、この反応物に１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭのＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を補給した。５０分間４２℃でインキュベーションした後、１５分間７２℃で加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ  Ｈを用いて２０分間３７℃で消化した。その後、マウスＶＧＦポリペプチドに対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによってサンプルを増幅した。
【０２６３】
トランスジェニック陽性Ｆ１マウスからの同腹子を交雑してＦ２同型接合マウスを発生させる。Ｆ２マウスにおけるＶＧＦｍＲＮＡの発現レベルは、本明細書中に記載したとおりに決定する。
【０２６４】
実施例５：Ｆ２トランスジェニックマウスにおけるマウスＶＧＦポリペプチドの生物活性
安楽死させる前に実施例４で得られたＦ２トランスジェニック動物の体重を測定し、イソフルオランによって麻酔して、心臓穿刺によって血液を取る。サンプルを血液学および血清化学分析にかける。終末全採血後、Ｘ線撮影を行う。肉眼解剖し次第、主要内臓を重量分析にかける。
【０２６５】
肉眼解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、全胃腸管、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ腺および骨格筋）を除去し、組織学試験のために１０％緩衝Ｚｎ−ホルマリン中に固定する。固定後、組織を処理してパラフィンブロックにし、３ｍｍの切片標本を得る。すべての切片標本をヘマトキシリンおよびエクソシンで染色し、その後、組織学分析にかける。
【０２６６】
トランスジェニックマウスおよび対照マウス両方の脾臓、リンパ腺およびバイエル板を、次にように、Ｂ細胞およびＴ細胞特異的抗体を用いて免疫組織学分析にかける。ホルマリン固定パラフィン埋没切片を脱パラフィン化し、脱イオン水中で水和する。切片標本を３％の過酸化水素で急冷し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（ペンシルバニア州、ピッツバーグのＬｉｐｓｈａｗ）を用いてブロックして、ネズミモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（インディアナ州、インディアナポリスのＨａｒｌａｎ）中でインキュベーションする。発色原としてＤＡＢ（カルフォルニア州、サンタバーバラのＢｉｏＴｅｋ）を伴うビオチニル化ウサギ抗ネズミ免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合ストレプタビジン（カルフォルア州、サンラモンのＢｉｏＧｅｎｅｘ）によって抗体結合を検出する。切片標本をヘマトキシンで対比染色する。
【０２６７】
剖検後、トランスジェニック動物および対照同腹子からＭＬＮおよび脾臓と胸腺の切片を除去する。１００ｍｍのナイロン製細胞染色器（ニュージャージー州、フランクリンレイクのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の底に対して注射器の平坦な端で組織を穏やかに摩砕することによって、単個細胞懸濁液を調製する。細胞を２回洗浄し、カウントしてた後、各組織からの約１×１０６の細胞を１０分間、体積２０μＬの０．５μｇＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）とともにインキュベーションする。その後、０．５μｇのＦＩＴＣの抗体またはＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４、またはＣＤ８に対するＰＥ結合モノクローナル抗体（カルフォルニア州、サンディエゴのＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を伴う体積１００μＬのＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を含まない）、０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のアジ化ナトリウム中で、３０分間、２〜８℃でサンプルを染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、その後、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析する。
【０２６８】
本発明を好ましい実施形態の面から説明してきたが、当業者が変型および改造を思い浮かべるであろうことが考えられる。従って、特許請求する本発明の範囲内に入るこうした同意義の変型のすべてを添付のクレームによってカバーするつもりである。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】ＶＧＦ−１を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号１）。
【図２】ＶＧＦ−２を注射したウサギの抗体力価レベルを示す（配列番号４）。
【図３】ＶＧＦ−１ａ（配列番号２）の投与後のＶＧＦノックアウトマウスの体重を示す。ＶＧＦ−１ａの投与は第５日に中止した（矢印で示す）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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