(57)【要約】【課題】  強固に酵素が固定化されたアーミング酵母乾燥菌体の製造方法及びかかる製造方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体の提供。【解決手段】  酵素を細胞表層に有するピキア（Pichia）属酵母を、凍結乾燥することによる、アーミング酵母乾燥菌体の製造方法であって、凍結乾燥前のピキア属酵母を、生菌のまま、酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベートすることを特徴とするアーミング酵母乾燥菌体の製造方法；及びかかる製造方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を細胞表層に有するピキア（Pichia）属酵母を、凍結乾燥することによる、アーミング酵母乾燥菌体の製造方法であって、凍結乾燥前のピキア属酵母を、生菌のまま、酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベートすることを特徴とするアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項２】
酵素が分泌型酵素である請求項１に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項３】
酵素が、リゾプス・オリゼア（Rhizopus oryzae）由来のリパーゼである請求項１又は２に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項４】
酵素が、分泌シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項５】
酵素が、分泌シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で、あるいは分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項６】
請求項５の糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくとも細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインを含む部分である、請求項５に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項７】
酵素が、分泌シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアーミング酵母乾燥菌体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか1項に記載の製造方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強固に酵素が固定化されたアーミング酵母乾燥菌体製造方法、さらに詳しくは、表層に当該酵母が産生しない酵素を強固に固定化したアーミング酵母乾燥菌体の製造方法、及びかかる方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表層に酵素を固定化させたアーミング酵母の創製技術により、本来酵母が有していない分泌型酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼなどを表層に固定化することにより、これまで酵母が分解、利用できなかった炭素源等基質が利用できるようになった。このため、アルコール生産やバイオディーゼル燃料の生産などにおいて生産効率が大きく向上した。このアーミング酵母は、酵素が酵母細胞表層に自発的に固定化され酵母自体が固定化担体としての役割を果たすため、通常の固定化酵素の製造過程で行われる分離、精製、固定化のプロセスを経ることなく、目的の酵素を担体に固定化した状態（固定化酵素剤）として回収することが可能である。このため、発酵母体としての利用のみならず、固定化酵素としての利用も注目されている。
【０００３】
ところで、ピキア酵母は増殖が速く、培養が容易であり、菌体収量や物質生産量が多いため、酵素などの有用物質生産のために利用されている。この特性を生かし、ピキア酵母を宿主としたアーミング酵母の創製が実用化に向けて研究されている。通常、水またはある特定の溶媒中での反応に触媒として、ピキア属酵母を宿主として創製したアーミング酵母を利用する場合、生菌の状態ではなく、乾燥菌体を使用することが多い。乾燥菌体は生菌に比べ取り扱い易く、保存性に優れているからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、凍結乾燥などの方法により乾燥した菌体を、水またはある特定の溶媒中での反応に触媒として使用すると、反応中に酵母菌体表層に固定化された酵素が反応液中へ遊離し、徐々にアーミング酵母の活性が低下してしまう。さらに遊離した酵素は反応液中に分散し、反応産物との分離が難しいため、反応産物に不純物として混入してしまう。このことは、アーミング酵母の繰り返し使用、反応産物の高品質維持において大きな問題であり、改善が強く望まれている。
【０００５】
したがって、本発明は、強固に酵素が固定化されたアーミング酵母乾燥菌体製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかる製造方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酵素の活性発現にとって望ましい酵母の細胞表層の立体構造について検討した結果、ピキア属（Pichia）の酵母、なかでもピキア・パストリス（Pichia pastoris）に着目した。そして、かかるピキア・パストリスの表層に酵素を有するアーミング酵母を、生菌のまま、該酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベート（以下、かかる処理を「前処理」という）した後凍結乾燥してやれば、凍結乾燥菌体を溶媒中で使用しても、前処理をしていないアーミング酵母に比べ、表層に固定化された酵素が反応液中に遊離し難くなり、酵素としての反応性、繰り返し利用性、回収の容易性等が向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、酵素を細胞表層に有するピキア属酵母を凍結乾燥することによる、アーミング酵母乾燥菌体の製造方法であって、凍結乾燥前のピキア酵母を、生菌のまま、酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベートすることを特徴とするアーミング酵母乾燥菌体の製造方法である。
また、本発明は、かかる製造方法により得られるアーミング酵母乾燥菌体を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法を用いれば、従来より酵素が強固に固定化されたアーミング酵母乾燥菌体、すなわち、固定化酵素としての反応性、繰り返し利用性に優れたアーミング酵母を得ることができ、回収の容易性、固定化酵素としての利用性等優れた特性を有するアーミング酵母の有用性をさらに向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（アーミング酵母）
本発明において、アーミング酵母とは細胞表層局在タンパク質と種々の機能性タンパク質（酵素・抗原・抗体・レポータータンパク質など）やペプチドを融合させ、細胞表層にディスプレイさせることにより、通常の酵母では有していない新しい機能を有する、あるいは元来有している機能を増強した酵母細胞のことをいう。また、細胞表層とは細胞膜・細胞壁ならびにその間の空間であるペリプラズムのことであり、これらの層を利用し上記の様な要件を満たす酵母細胞をアーミング酵母という。
本発明におけるアーミング酵母の創製は、公開特許公報（特開平11-290078、ＷＯ02/085935）を基に行われた。
本発明における酵素および該酵素の配列に関しては次に説明する通りである。
【０００９】
（分泌型酵素）
本発明において、分泌型酵素とは、リパーゼ、アミラーゼ類、セルラーゼ類などが挙げられる。
リパーゼとは、油脂から脂肪酸を遊離させ得る活性を有する酵素であり、その起源については特に限定されないが、リゾプス・オリゼア（Rhizopus oryzae）などのカビ由来のリパーゼが好適に用いられる。
アミラーゼ類とはデンプンを加水分解し得る酵素をいう。代表的にはグルコアミラーゼ、α―アミラーゼ、β―アミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼ類の酵素についてもその起源は特に限定されない。
セルラーゼ類とは一般的にエンドβ１，４−グルカナーゼをいうが、本発明においては、β１，４−グルコシド結合を切断し、セルロースからグルコースを生産する一群の酵素を称してセルラーゼという。例えば、β１，４−グルカナーゼ、β―グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼなどが挙げられ、その起源については限定されない。
【００１０】
（細胞表層局在タンパク質）
本発明において、細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα―またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質はＮ末端側に分泌シグナル配列およびＣ末端側にＧＰＩアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はＧＰＩアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は細胞膜通過の際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したＣ末端部分でＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する。
【００１１】
（分泌シグナル配列）
本発明において、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外に分泌されるタンパク質のＮ−末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通して細胞外（ペリプラズムも含む）へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いることができ、その起源は問わない。分泌シグナルとしてはグルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα―またはａ―アグルチニンのシグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列などが好適に用いられている。また、該酵素の活性に影響を与えないのであれば、分泌シグナルの一部または全部が酵素のＮ−末端側に残ってもよい。（特開平11-290078、ＷＯ02/085935参照）
【００１２】
（ＧＰＩアンカーおよびＧＰＩアンカリングドメイン）
ＧＰＩアンカーとはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸―６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいう。
ＧＰＩアンカリングドメインは、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。例えば、α―アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列がこれに相当し、この配列には、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であるＧＰＩアンカー認識付着シグナル配列の他に、４カ所の糖鎖結合部位がある。ＧＰＩアンカーの根元部分がＰＩ−ＰＬＣにより切断された後、これらの糖鎖結合部位に結合した糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することで、α―アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合し、α―アグルチニンは細胞表層に保持される。
【００１３】
（糖鎖結合タンパク質ドメイン）
本発明において、糖鎖結合タンパク質ドメインとは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が、細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることのできるドメインをいう。例えば、レクチンなどの糖鎖結合部位や、α―アグルチニン、ａ―アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などの凝集タンパク質の凝集機能ドメインなどが挙げられる。
【００１４】
（凝集機能ドメイン）
細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインとはＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００１５】
本発明において、酵素を細胞表層に発現させるＤＮＡは、以下の配列を有するＤＮＡであることが好ましい。
（１）シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（２）分泌シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（３）分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡ
（４）分泌シグナル配列、酵素の構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
【００１６】
なお、上記（２）、（３）の場合は、糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくとも細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインを含む部分であることが好ましい。
【００１７】
上記（１）〜（４）のＤＮＡは、周知の技術を用いて合成することができる。たとえば（１）のＤＮＡの場合、分泌シグナルと酵素の構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができ、正確な分泌シグナルの切断と活性な酵素が発現できる。さらに、この配列と細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列とを結合すればよい。結合は、適切な制限酵素、リンカー等を用いて行うことかできる。
【００１８】
また、かかるＤＮＡは、プラスミドの形態でも、宿主となるピキア酵母の遺伝子に組み込まれた形態でも、いずれでもよい。
アーミング酵母は、かかるＤＮＡをピキア属酵母に導入することにより得ることができる。
【００１９】
（前処理）
本発明における酵素が強固に固定化されたアーミング酵母の製造方法の特徴は、前処理にあり、この前処理とは、先に示すように、ピキア属酵母、好ましくはピキア・パストリスの表層に酵素を有するアーミング酵母を、生菌のまま、該酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベートすることである。なお、ここで至適温度とは、酵母の表層に結合した酵素の至適温度ではなく、同じ酵素の遊離の状態での至適温度である。また、変性温度とは、酵素が実質的に活性を示さなくなる温度をいう。
第一に、前処理の際、凍結乾燥などの乾燥処理を施したアーミング酵母では酵素が強固に固定化されたアーミング酵母を得ることが難しく、培養したアーミング酵母を集菌後、生きている状態でインキュベートすることが望ましい。
第二に、培養したアーミング酵母を集菌せずに、培養液ごとインキュベートすることもできるが、この場合、タンパク質分解酵素などの影響を受け、アーミング酵母の酵素活性が著しく低下することがあるので、集菌し、菌体を水または適当な緩衝液に懸濁した後、インキュベートすることが望ましい。この際の緩衝液には特に限定はないが、アーミング酵母の細胞表層に固定化された酵素に応じて緩衝液の種類、濃度、ｐＨを選択することが好ましい。例えば、リゾプス・オリゼア由来のリパーゼを細胞表層に固定化したアーミング酵母の場合には、10〜200mMリン酸緩衝液（ｐH６〜８）が適当である。
【００２０】
第三に、インキュベートする温度は、該酵素の至適温度を超えて変性温度未満であることが必要である。アーミング酵母の細胞表層に固定化された酵素により至適温度、変性温度が異なる為、一概に具体的な温度を示すことができないが、リゾプス・オリゼア由来のリパーゼの場合、至適温度は４０℃であるのに対し、酵素が強固に固定化されたアーミング酵母を得るためには好ましくは４5℃以上、より好ましくは５０℃以上、特に好ましくは約６０℃でインキュベートする。
第四に、インキュベートする時間は、アーミング酵母の細胞表層に固定化された酵素により最適時間が異なり、一概に具体的な時間を示すことができない。酵素によってはインキュベート時間が１２時間を超えると、徐々にアーミング酵母の酵素活性が低下することがある。リゾプス・オリゼア由来のリパーゼの場合、インキュベート時間は５から８時間が望ましい。
【００２１】
インキュベートする際のアーミング酵母の濃度は、満遍なく加温される濃度が望ましい。
インキュベートには、温度が保つことができればどのような機材を用いてもよいが、アーミング酵母が満遍なく加温されることが望ましい。
至適温度を超えて変性温度未満でインキュベートすると、なぜピキア属酵母、特にピキア・パストリスを用いて得られたアーミング酵母の細胞表層に固定化された酵素が遊離し難くなるかは明確ではないが、次のような理由ではないかと推測される。すなわち、ピキアアーミング酵母の表層に固定化された酵素は、細胞表層に存在する多糖類等の構造体に守られるとともに、酵素のコンフォメーション変化の自由度が少ないと考えられる。このような状況下で、至適温度を超えて変性温度未満でインキュベートされることにより表層に存在する多糖類等と細胞表層局在タンパク質との結合がより強化され、細胞表層に固定化された酵素が遊離し難くなったのではないかと考えられる。
このようにして得られるアーミング酵母は、従来のアーミング酵母に比べて酵素が強固に固定化され、より有用性が高い。
以下、実施例、比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００２２】
（参考例1）
（リゾプス・オリゼア由来のリパーゼ（ROL）をピキア酵母に導入したアーミング酵母の作成）
A（ short型Flo1の遺伝子の取得）
次のようにしてshort型FLO1の遺伝子を取得した。pWIFS (T. Matsumotoら、Appl. Environ. Microbiol., 68:4517 (2002))をテンプレートとし、プライマー（ＤＮＡ合成装置にて合成）として配列番号1および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を用いてPCR増幅し、BglIIおよびBamHIで切断して、約3300bpの長さのBglII-BamHI断片(BglII-BamHI FLO3300bp断片)を得た。この3300bpの断片は、FLO1の5’側の配列(分泌シグナル配列およびFLO1凝集機能ドメイン)を有していると思われる。
B（リパーゼ遺伝子の取得）
次のようにしてRhizopus orezae由来リパーゼの遺伝子を取得した。PWIFSproROL (T. Matsumotoら、Appl. Environ. Microbiol., 68:4517 (2002))をテンプレートとし、プライマーとして配列番号3および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を用いてPCR増幅を行い、BamHIおよびEcoRIで切断して、約1100bpの長さのBamHI-EcoRI断片(BamHI-EcoRIリパーゼ断片)を得た。このリパーゼ断片は、リパーゼのプロ配列および成熟タンパク質配列を有している。
C（ short型Flo1およびプロリパーゼの構造遺伝子をこの順で有するプラスミドの作製）
目的のDNAを有するプラスミドは、上記Aで得られたshort型FLO1遺伝子と上記Bで得られたプロリパーゼ遺伝子を接続することにより得られる。FLO1誘導体とリパーゼとの融合タンパク質を作成するために、以下の操作を行った。作成の模式図を、図１に示す。
まず、インテグレーション型プラスミドpPIC3.5K(Invitrogen Corporation, Carlsbad,   CA)をBamHIで切断し、脱リン酸化後、上記Aで得られたBglII-BamHI FLO3300bp断片を挿入して、プラスミドpPIC3.5KFSを得た。次いで、このプラスミドpPIC3.5KFSを、BamHIおよびEcoRIで切断し、上記Bで得られたBamHI-EcoRIリパーゼ断片を挿入して、pPIC3.5KFSproROLを得た。このプラスミドpPIC3.5KFSproROLに挿入された遺伝子から発現されるタンパク質はshort型FLO1リパーゼ(特開平 11-290078、WO02/085935)と同等のものである。
D（ピキア酵母への遺伝子の導入）
上記Cで得られたプラスミドpPIC3.5KFSproROLをBglIIで切断後、Pichia EasyComp Kit (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を用いてPichia pastoris GS115 (his4) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)ゲノム上へ導入した。これをRD寒天培地(1M ソルビトール、2%グルコース、1.34% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids、4×10-5% ビオチン、0.005% L-グルタミン酸、0.005% L-メチオニン、0.005% L-リシン、0.005% L-ロイシン、0.005% L-イソロイシン)を用いて培養した。生育した酵母を選択し、short型FLO1リパーゼを発現するアーミング酵母、すなわちPichia pastoris GS115/FSproROLアーミング酵母を得た。
【００２３】
（参考例２）
（ピキア−ROLアーミング酵母の調整）
上記参考例１で創製したPichia pastoris GS115/FSproROLアーミング酵母をBMGY液体培地（酵母エキス 1%、ペプトン 2%、グリセロール 1%、ビオチン4ppm、yeast nitrogen base w/o amino acid 1.34%、100mMリン酸カリウム緩衝液pH6.0）に植菌し、30℃で振盪培養した。生育が定常期に入った時点で、培養液にメタノールを、最終濃度が0.5%となるように添加し、ROLの発現を促した。メタノール添加開始より5日間培地中のメタノール濃度を維持するよう添加を続け、6日目に培養を終了した。その間計時的に培養液をサンプリングし、遠心分離により培地と菌体に分離し、菌体のリパーゼ活性（３０℃）を市販のキット（リパーゼキットS：大日本製薬製）で確認した（データは示さず）。培養終了した培養液を遠心分離により培地と菌体とに分離した。得られた菌体をピキア―ROLアーミング酵母とした。
【実施例１】
【００２４】
（ピキア酵母細胞表層へのリパーゼの強固固定化処理）
上記参考例２で得られたピキア−ROLアーミング酵母を50mMリン酸緩衝液（ｐH7.0）に懸濁し、60℃条件下にて振盪しながら5時間インキュベートした。インキュベート終了後、遠心分離により菌体と上清に分離した。得られた菌体を再び50mMリン酸緩衝液に懸濁し、凍結乾燥することにより、ピキア−ROLアーミング酵母の乾燥菌体を得た。
得られた強固固定化処理したピキア−ROLアーミング酵母を蒸留水に懸濁し、４0℃条件下にて振盪しながらインキュベートした。経時的にサンプリングし、遠心分離により菌体と上清に分離した。それぞれのリパーゼ活性（３０℃）を市販のキット（リパーゼキットS（大日本製薬製））を用いて行った。この結果を図2に示す。
菌体のリパーゼ活性はインキュベート開始前の高い活性が維持されており、活性の低下は認められなかった。一方、上清中のリパーゼ活性を調べてみると、ほとんどリパーゼ活性は検出されず、菌体から上清へのリパーゼの遊離は認められなかった。
【実施例２】
【００２５】
（強固固定化処理に適した温度）
上記参考例２で得られたピキア−ROLアーミング酵母を50mMリン酸緩衝液（ｐH7.0）に懸濁し、30℃、４0℃、50℃、60℃、70℃条件下にて振盪しながら5時間インキュベートした。5時間後に各懸濁液を遠心分離により菌体と上清に分離した。得られた菌体を50mMリン酸緩衝液（ｐH7.0）に懸濁し、凍結乾燥することにより、ピキア−ROLアーミング酵母の乾燥菌体を得た。このようにして得られた、様々な温度で強固固定化処理したピキア−ROLアーミング酵母を蒸留水に懸濁し、４0℃条件下にて振盪しながらインキュベートした。経時的にサンプリングし、遠心分離により菌体と上清に分離した。それぞれのリパーゼ活性（３０℃）を市販のキット（リパーゼキットS（大日本製薬製））を用いて行った。
図３には上清中のリパーゼ活性を示す。６０℃で強固固定化処理した場合、上清中にはほとんどリパーゼ活性は検出されず、酵素の遊離は見られなかったが、50℃、４０℃、３０℃と強固固定化処理温度が低下するにつれて、上清中にリパーゼ活性が検出されるようになり、酵素の遊離が認められた。一方、７０℃で強固固定化処理した場合には６０℃で処理した場合と同様リパーゼ活性が検出されなかったが、菌体にもリパーゼ活性が検出されなかったことより（データ示さず）、酵素自体が失活したものと考えられる。
【００２６】
（比較例１）
（強固固定化未処理のリパーゼ固定化ピキア酵母）
上記参考例２で得られたピキア−ROLアーミング酵母を50mMリン酸緩衝液（ｐH7.0）に懸濁し、凍結乾燥することにより、強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母の乾燥菌体を得た。
得られた強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母乾燥菌体を50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、４0℃条件下にて振盪しながらインキュベートした。経時的にサンプリングし、遠心分離により菌体と上清に分離した。それぞれのリパーゼ活性（３０℃）を市販のキット（リパーゼキットS（大日本製薬製））を用いて行った。この結果を図４に示す。
菌体のリパーゼ活性はインキュベート開始から3時間まではインキュベート前の活性を保持していたが、４時間後より徐々に活性が低下し、12時間後にはインキュベート前の活性の5分の１になってしまった。一方、上清中のリパーゼ活性を調べてみると、インキュベート前には活性が認められなかったが、インキュベート時間の経過と共に活性が増加し、３時間後には４00IU/L以上の高活性を検出した。この結果は、強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母乾燥菌体から酵素が遊離し、上清中に分散してしまうことを示している。
【００２７】
（比較例２）
（強固固定化未処理のリパーゼ固定化ピキア酵母）
上記参考例２で得られたピキア−ROLアーミング酵母を50mMリン酸緩衝液（ｐH7.0）に懸濁し、凍結乾燥することにより、強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母の乾燥菌体を得た。
得られた強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母乾燥菌体を50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、６０℃条件下にて振盪しながらインキュベートした。計時的にサンプリングし、遠心分離により菌体と上清に分離した。それぞれのリパーゼ活性（３０℃）を市販のキット（リパーゼキットS（大日本製薬製））を用いて行った。この結果を図５に示す。
菌体のリパーゼ活性はインキュベート開始から２時間まではインキュベート前の活性を保持していたが、３時間後より徐々に活性が低下し、12時間後にはインキュベート前の活性の5分の１以下になってしまった。一方、上清中のリパーゼ活性を調べてみると、インキュベート前には活性が認められなかったが、インキュベート時間の経過と共に活性が増加し、３時間後には100IU/L以上の活性を検出した。この結果は、強固固定化していないピキア−ROLアーミング酵母乾燥菌体から酵素が遊離し、上清中に分散してしまうことを示している。４0℃でインキュベートした比較例１に比べ、60℃でインキュベートした場合には上清中のリパーゼ活性が約４分の１程度に留まったが、これは菌体から遊離したリパーゼが60℃という高温により失活したためと考えられる。すなわち、菌体からの遊離による活性の増加と失活による活性の低下の相殺した結果であると推察する。
【００２８】
以上の比較例に示すように、強固固定化処理を施していないピキア−ROLアーミング酵母乾燥菌体からはリパーゼの遊離が起こる。水またはある特定の溶媒中での反応に触媒として使用した際、反応中に酵母菌体表層に固定化された酵素が反応液中へ遊離してしまうことは、アーミング酵母の繰り返し使用、反応産物の高品質維持において大きな問題である。しかしながら、実施例３に示すように、凍結乾燥などの乾燥処理を行う前に、ピキア−ROLアーミング酵母に対して強固固定化処理すること、すなわち、酵素の至適温度を超えて変性温度未満の温度でインキュベートすることで容易に解決することができた。
本発明の作用機序については現時点では証明されていないが、アーミングされた酵素への付加された糖鎖も一因となっているのではないかと考える。
例えば、ピキア−ＲＯＬアーミング酵母を適当な緩衝液に懸濁し、ガラスビーズ等で菌体を破砕し、アーミング酵母より不溶性画分を回収した。これらにＳＤＳ抽出用緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱することで細胞表層画分を得ることができる。細胞表層画分をウサギ由来の抗ＲＯＬ抗体を用いたウエスタンブロティング法により分析すると、ピキア−ＲＯＬアーミング酵母から得られた細胞表層画分は、細胞表層局在タンパク質とROLからなる融合タンパク質の予想される分子量よりも大きいところにバンドが検出された（データは示さず）。このことは、ピキア−ＲＯＬアーミング酵母の細胞表層に提示されたＲＯＬは何らかの修飾を受けているものと考えられる。融合した細胞表層局在タンパク質には糖鎖結合ドメイン（FLO1凝集機能ドメイン）が含まれていることから、糖鎖による修飾の可能性が高い。また、ピキア−ＲＯＬアーミング酵母より得られた細胞表層画分をＮ−グルコシダーゼＦで処理した後、上記ウエスタンブロッティング法により解析すると、多少は分子量の低下がみられるが、タンパク質として予想される分子量よりも遙かに大きい分子量のバンドが検出された（データは示さず）。このことは、Ｎ−グルコシダーゼＦでＮ―型糖鎖を除去しても依然としてタンパク質は糖鎖の修飾を受けていることを示唆するものであり、多くのＯ―型糖鎖での修飾を受けているものと推定される。Ｏ―型糖鎖は分子構造をリジットにするという報告があり（Ｎ．Jentoftら  Trends Biochem. Sci., 15, 291 （1990））、このことが本発明における強固な酵素の固定化をもたらしているのではないかと考えている。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の製造方法は、高活性の酵素を製造するのに有用である。また、本発明のアーミング酵母は、グリーン・サステイナブル・ケミストリーへの活用が大いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】FLO1誘導体とリパーゼとの融合タンパク質を作成するための模式図である。
【図２】６０℃で前処理を行った凍結乾燥菌体を４０℃でインキュベートしたときの、リパーゼ活性の経時変化を示すものである。
【図３】各温度で前処理を行った凍結乾燥菌体を４０℃でインキュベートしたときの、上清中のリパーゼ活性の経時変化を示すものである。
【図４】前処理を行わなかった凍結乾燥菌体を４０℃でインキュベートしたときの、リパーゼ活性の経時変化を示すものである。
【図５】前処理を行わなかった凍結乾燥菌体を６０℃でインキュベートしたときの、リパーゼ活性の経時変化を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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