(57)【要約】【課題】組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用。【解決手段】本発明は、サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中のXhoI部位を具備した挿入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、サイトカインをコードした前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。本発明は、シチメンチヨウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。【選択図】      なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム、領域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
【請求項２】
前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中へ挿入されていて、またシチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現することが可能であることを特徴とする、請求項１に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
【請求項３】
前記の外来性ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項２に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
【請求項４】
前記の外来性ＤＮＡ配列がサイトカインをコードすることを特徴とする、請求項３に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
【請求項５】
前記のサイトカインがニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリのインターフェロン（cIFN）であることを特徴とする、請求項４に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
【請求項６】
抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備した、請求項５に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラであって、該抗原性ポリペプチドが、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルスからなる群より選択される、上記のキメラ。
【請求項７】
S-HVT-145と命名されている、請求項６に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＤＮＡを単離して、その単離されたＤＮＡを細菌プラスミドへクローニングすることが可能であることから、ウイルスワクチン調製の手法が発展した。本願発明で使用した方法では、動物の種々のウイルス性病原体からクローン化したＤＮＡ配列を、挿入、欠失、１またはそれ以上の塩基の変異、により修飾し、それに続いて、この修飾済み配列をウイルスゲノムへ挿入することを行った。外来性配列を付加することの一つの有用性は、外来性配列が、動物のウイルス感染時に発現される外来性タンパク質をコードする時に成し遂げられる。得られる生ウイルスを次いでワクチンに使用して、宿主動物での免疫反応を惹起して、該動物を疾患より保護する。このような特徴を有するウイルスはウイルスベクタと呼ばれるが、それは外来性タンパク質を運び、宿主動物内で外来性タンパク質を発現するからである。実際、それは外来性タンパク質の運搬用の精巧な系となる。
【０００２】
より特異的には本発明は、疾患に対してトリをワクチン接種するためのウイルスベクタとしてのシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを使用することに関する。ヘルペスウイルス群は、以下の数多くの標的種に感染して疫病を引き起こす病原体からなる：ブタ、ウシ、ニワトリ、ウマ、イヌ、ネコ等。それぞれのヘルペスウイルスはそれぞれの宿主に特異的であるが、そのゲノム構造、複製様式に関してはすべて関連していて、宿主動物内での病原性、及びウイルス感染に対する宿主免疫反応の機序に関しては、ある程度関連している。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術を動物ウイルスへ適用することは、比較的歴史が浅い。改変されたウイルスの最初の例は、ゲノムが最も小さいウイルスであった。パポバウイルスの場合は、これらのウイルスが小さく、余分なＤＮＡを保持できないために、遺伝子工学的に使用すると、複製に関して欠損していた。これらのウイルスを利用して、外来性遺伝子の発現を行うには、野生型のヘルパーウイルスが必要であり、細胞培養系に限定されている。アデノウイルスの場合は、外来性ＤＮＡで置換することが可能な、必須でないＤＮＡの量は小さい。アデノウイルスで発現されたと思われる唯一の外来性ＤＮＡは、パポバウイルスのT抗原遺伝子群（Mansour et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985;Thummel et al.，Cell，1983; Scolnick，et al.，Cell，1981; Thummel et al.，Cell，1981）、及び単純ヘルペスウイルス（HSV）のチミジンキナーゼ遺伝子（Haj-Amed and Graham，J．of Virology，1986）がある。これらの文献では、外来性ＤＮＡが挿入されている可能性のある、HVTの非必須領域を同定しておらず、またHVT内で如何に外来性遺伝子を発現させるかについて、すなわちどのようなプロモーターや終結配列を使用するかも教示していない。
【０００４】
改変された別のウイルス群はポックスウイルスである。この群の一つの構成員であるワクシニアは、外来性遺伝子発現に関しての多くの研究主題である。ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質内で複製する、大型のＤＮＡ含有ウイルスである。このウイルスは、正二十面体やら旋の対称性に基づくカプシドを有さないという点において、ユニークな構造を有する。ポックスウイルスは、機能の喪失と縮退により、細菌様の微生物から進化した可能性が高い。一部、このユニークさのため、ポックスウイルスの遺伝子工学でなされた進歩は、他のウイルス系（ヘルペスウイルスやHVTを含む）へ直接適用することができない。ワクシニアウイルスの組換え体構築物は、数多くの研究室で作成されており、以下のような外来性の挿入遺伝子が発現されている：HSVチミジンキナーゼ（Mackett，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1982; Panicali and Paoletti，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,1982）、B型肝炎表面抗原（Paoletti et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,1984; Smith et al.，Nature，1983）、HSV糖タンパク質D遺伝子、インフルエンザ血球凝集素遺伝子（Panicali et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1983; Smith et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1983）、マラリア抗原遺伝子（Smith，et al.，Science，1984，and）、水痘性口内炎ウイルス糖タンパク質G遺伝子（Macket，et al.，Scinece，1986）。ワクシニアの組み換えＤＮＡ技術の全体の一般的特徴は、全てのウイルスで使用するものと同様であり、特に参考文献（Maniatis et al.，Molecular Cloning，1982）に関してはそうである。しかしながら詳細には、ワクシニアでの技術はヘルペスウイルスやHVTには適用できない。ワクチンベクタとしてのワクシニアの利用性には疑問がもたれているが、それはワクシニアがヒトの天然痘ウイルスに近縁であって、またヒトに対して病原性があることが知られているためである。故に、宿主特異的なヘルペスウイルスHVTを使用することは、
家禽のワクチン接種に対する、よりよい解決策である。
【０００５】
霊長類のヘルペスウイルスの中では、ヒトのHSVのみが外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されていて、また、限られてはいるが、リスザルヘルペスウイルスも外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されている。組み換えＤＮＡを使用してHSVを操作した最初の例は、HSVのL-SジャンクションのＤＮＡ断片を、HSVのＤＮＡの長領域（long region）、特にチミジンキナーゼ遺伝子へクローニングしていたものである（Mocarski et al.，Cell，1980）。この挿入物は外来性ＤＮＡ断片ではなくて、ゲノムの他の部位で増幅された、天然のヘルペスウイルスＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片は、タンパク質を発現するために特別に改変したものではなく、よってこの実験にはヘルペスウイルスでのタンパク質発現は行っていない。HSVの次の操作は、組み換えＤＮＡ技術とチミジンキナーゼ選択との組み合わせにより、ウイルスゲノム中の欠失を作りだすことである。この方法を使用して、HSVアルファ-22遺伝子が欠失されていて（Post，et al.，Cell，1981）、また15,000塩基対のＤＮＡ配列がHSVの内部繰り返しより欠失されている（Poffenberger，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1981）。
【０００６】
以下の場合では、タンパク質をコードする遺伝子の、ヘルペスウイルスへの、次のような挿入が行なわれている：HSVの糖タンパク質Cを、HSVのこの遺伝子に関して天然に起こる欠失変異体への挿入(Gibson and Spear，J．of Virology，1983)；２型HSVの糖タンパク質Dの、１型HSVへの挿入(Lee et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1982)（この遺伝子は外来性でないのでプロモーター配列の操作は必要ない）；B型肝炎の表面抗原を、HSVのICP4プロモーター制御下におくHSVへの挿入（Shih et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1984）；SV40プロモーターを伴ったウシ成長ホルモンの、リスザルヘルペスウイルスへの挿入（このプロモーターは、この系では機能しないが、内在性の上流プロモーターがこの遺伝子の転写を行う）（Desrosiers et al.，1984）。二つの付加的外来遺伝子（ニワトリ・オバルブミン遺伝子と、エプスタイン・バールウイルスの核抗原）がHSVに挿入されていて（Arsenakis and Roizman，1984）、また仮性狂犬病ウイルスの糖タンパク質Xも、HSVへ挿入されている（Post et al.，1985）。
【０００７】
遺伝子の欠損、または挿入をヘルペスウイルスへ導入した、以上の例は、組み換えＤＮＡ技術によりヘルペスウイルスを遺伝的に改変することが可能であることを証明している。遺伝子を挿入するのに用いたこの方法では、プラスミドにクローニングされたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞へ形質移入された、精製済みウイルスＤＮＡとの間で相同性組み換えを行わせる。しかしながら、欠損を行わせる位置と、外来性遺伝子の挿入を行わせる部位に関してどの程度一般化できるかは、先行技術からは分からない。
【０００８】
本発明の一つの目標は、マレック病に対するワクチンである。マレック病ウイルス（MDV）は、家禽の麻痺やニワトリの通常のリンパ球増殖性病が含まれるマレック病の病原体である。この疾患は生後２から５ケ月の若いニワトリで最も頻繁に起こる。顕著な臨床的症状は、一つ以上の四肢の進行性麻痺、脚の麻痺による不釣り合い、翼の関与による肢のしおれ、及び首の筋肉の関与により、頭の位置が低くなることがあげられる。急性の場合、重度の抑圧が起きる。腫瘍性がことに高い株の場合は、特徴的な、ブルサ及び胸腺の萎縮がおきる。更に、生殖腺、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺に影響するリンパ腫がある（Mohanty and Dutta，1981）。多くのニワトリは、生涯MDVに対しての保護を与えるワクチン接種を、生後１日で受ける。本発明がなされるよりも前は、MDVに対するワクチン接種方法の原理は、シチメンチョウヘルペスウイルス（HVT）の天然株を使用するものであった。この、生後１日目のワクチンに、他の抗原を取り込ませることは有益であるが、通常のワクチンを組み合わせることの効果は、現在までのところ十分には証明されておらず、これは病原体間での競合と、免疫抑制によるためである。本発明で作成された、多価のHVTベースのワクチンは、数多くの病原体に対して、同時にワクチン接種する新規の方法となる。HVTのゲノムの非必須領域に挿入された外来性遺伝子を有する、組み換えHVTが始めて開示さている。
【０００９】
これらのヘルペスウイルスに対して行なわれた遺伝子工学のタイプには、細菌プラスミドへのウイルスＤＮＡの一部のクローニング、クローン化した状態で前記ウイルスＤＮＡを再構築して該ＤＮＡが、ある配列を欠損するようにすること、そして外来性ＤＮＡ配列を、上記の欠損部分と置き換えるか、または欠損により取り除かれた部位へ加えること、がある。
【００１０】
HVTのゲノムに挿入する標的の外来性遺伝子は興味ある如何なる病原体から得てもよい。典型的には、興味ある遺伝子とは家禽で疾患を引き起こす病原体で、家禽産業に経済的インパクトのあるものである。この遺伝子はすでにワクチンが存在している生物体から得てもよく、誘導（vectoring）技術の新規の利点のため、HVT由来ワクチンはより優れているであろう。さらに、興味ある遺伝子は、現在ワクチンが存在していないが、その疾患を制御する必要性のある病原体から由来するものでもよい。典型的には、興味ある遺伝子は病原体の免疫原性ポリペプチドをコードしていて、表面タンパク質、分泌型タンパク質、及び構造タンパク質であってもよい。
【００１１】
HVTの誘導の標的である、トリの関連した病原体は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）である。ILTVはヘルペスウイルス科の構成員であり、この病原体は、呼吸抑制、息切れ、及び血の滲出した痰で特徴付けられる、ニワトリの急性疾患を引き起こす。ウイルスの複製は、呼吸路の細胞に限られ、ここでは気管での感染が、組織の侵食と、出血を引き起こす。ニワトリでは病変の形成の程度を減少させるか、または臨床的症状を減少させる効果的な薬剤はない。細胞の継代、及び/または煩雑な投与方法で由来した、ILTの種々の修飾体でトリをワクチン接種すると、感受性のニワトリに、許容できる保護が生じる。現在のILTワクチンの中和の度合いのために、正しいレベルのウイルスを維持するための注意が必要である。すなわち保護与えるのには十分であるが、群れの中で疾患を引き起こすのには不十分な程度である。
【００１２】
HVT誘導方の付加的標的としては、ニューカッスル病ウイルスによって引き起こされる、感染性であって伝染性の高い、衰弱性のニューカッスル病がある。NDVは、パラミクソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。NDVの種々の病原型（ヴェロ原性株、亜病原性株、レント原性株）は、疾患の重症度、特異性、及び症状におうじて異なるが、多くの型は呼吸器系、及び神経系に感染するようである。NDVは主に、ニワトリ、シチメンチョウ、及びその他のトリの種に感染する。歴史的には、ワクチン接種が疾患予防のために使われてきたが、母性の抗体干渉、当該トリの寿命、及び投与経路のため、生産者は免疫プロトコールを適応させて特異的な要求にフィットさせる必要がある。
【００１３】
本発明のウイルスベクタで運ばれる治療薬は、ブタポックスウイルス複製の副産物である生物学的分子でなくてはならない。これは、第一分析の治療薬を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質の何れかに限定する。このようなクラスの化合物で、次のような形態の治療薬の例がある：アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（S.Joshi，et al.，J．of Virology，1991）、リボザイム(M.Wachsman，et al.，J．of General Virology，1989)、サプレッサーtRNA（R.A.Bhat，et al.，Nucleic Acids Research，1989）、インターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ、及びインシュリンのようなホルモンから、インターフェロンやインターロイキンのようなリンホカイン、天然のアヘン剤までの種々のタンパク性治療薬の例。これら治療薬が発見され、またそれらの構造と機能が解明されたが、ウイルスベクタによるデリバリーシステムでそのような治療薬を使用する能力については明らかではない。
【発明の開示】
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中のXhoI部位を具備した挿入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、サイトカインをコードした前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００１５】
最後に、本発明は、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させるための相同性ベクター、宿主細胞、ワクチン、及び免疫方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本願は、１９９４年８月９日に出願のU.S．シリアル番号０８／２８８，０６５の一部継続出願である、１９９４年１２月２２日出願の継続出願であり、その内容を本願で参照することにより本願に組み込む。
【００１７】
本願全体を通じて、種々の文献は括弧中のアラビア数字で引用する。参考文献の詳しい内容は、参考文献欄にアルファベット順で記載してある。これらの参考文献を、本願で参照することにより本願に組み込み、本願発明が属する技術分野での最新技術について詳細に記載する。
【００１８】
本発明は、HVTゲノムの非必須部位へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を具備した、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。該外来性ＤＮＡ配列は、組み換えHVTに感染した宿主細胞内で発現することが可能であり、その発現は、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。
【００１９】
本願では、「HVTゲノムの非必須部位」とは、HVTウイルスゲノム中の領域であってウイルス感染、または複製に必要のないものを意味すると定義する。
【００２０】
本願では、「ウイルスゲノム」、または「ゲノムＤＮＡ」とは、天然のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスが含む、ＤＮＡ全体を意味すると定義する。本願では、「外来性ＤＮＡ配列」、または「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに対して外来性である如何なるＤＮＡ、または遺伝子を意味すると定義する。
【００２１】
本願では、「タンパク質読み取り枠」とは、ＤＮＡの分節であって、終止コドンを含まないアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡに転写されるコドンを含むものを意味すると定義する。
【００２２】
本発明は更に、本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築するのに有益な、HVTゲノム内の、複数の適切な挿入部位を提供する。挿入部位には、HVTゲノムのEcoRI＃９断片とBamHI＃１０断片とが含まれ、この両方の断片中の好ましい挿入部位はXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００２３】
このような部位のもう一つは、HVTゲノムのBamHI＃１６断片である。このBamHI＃１６断片中の好ましい挿入部位は、UL43タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内にあり、このタンパク質読み取り枠内の好ましい挿入部位は、XhoI制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００２４】
更に別の挿入部位としては、HVT US2遺伝子があり、この中の好ましい挿入部位はStuI制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００２５】
本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、該シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を含むシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを具備し、上記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現することが可能な、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００２６】
一つの態様において、上記の外来性ＤＮＡ配列は、EcoRI＃９断片のタンパク質読み取り枠(ORF)A内に挿入されている。外来性ＤＮＡ配列をEcoRI＃９断片のXhoI部位へ挿入してORF Aを分断することは、ORF A領域全体が、組換え体の複製にとって非必須であることを意味する。
【００２７】
本発明の目的に適した「組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス」は、当業者らによく知られている技術（例えばDNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUSの実験材料と実験方法の項に記載されている方法）によって創製された、生のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、このウイルスは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質が欠失されていないものである。シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを精製すると、EcoRI＃９断片、またはBamHI#１０断片に外来性のＤＮＡ配列、または遺伝子が安定に挿入されたものが得られる。
【００２８】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、上記の外来性ＤＮＡが、該組み換え型ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性であるポリペプチドをコードする、上記のウイルスを提供する。
【００２９】
一つの態様において、該ポリペプチドは検出可能な標識である。本発明の目的に適した「検出可能な標識であるポリペプチド」は、該ポリペプチドの二量体、三量体、及び四量体である。大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼは４つのポリペプチド、または単量体サブユニットからなる４量体である。一つの態様において、前記のポリペプチドは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼである。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-001、S-HVT-014、またはS-HVT-012と命名されている。
【００３０】
S-HVT-012は1992年10月15日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue ClutureCollection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2382の下に寄託された。
【００３１】
S-HVT-014は１９９３年12月７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2440の下に寄託された。
【００３２】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様においては、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cIFN）である。好ましい態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-144と、命名されている。
【００３３】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのウイルスゲノムが、マレック病ウイルス（MDV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、または伝染性粘液嚢病ウイルス（IBDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡを有する、上記のヘルペスウイルスを提供する。
【００３４】
本発明は、EcoRI＃９断片に外来性ＤＮＡ配列が挿入された、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、または伝染性粘液嚢病ウイルスからなる群から選択した抗原性のポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００３５】
一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、マレック病ウイルス由来であって、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、またはgDをコードしていている。別の態様において、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、又はgDをコードした外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのUS2遺伝子のコード領域のユニークなStuI部位へ挿入されている。
【００３６】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡを有する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドはマレック病ウイルスの糖タンパク質gB、gA、またはgDである。
【００３７】
一つの態様において、外来性のＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTは、IBDV VP2、MDV gA、及びMDV gBをコードする。好ましくは、このような組換え型ウイルスは、S-HVT-137、及びS-HVT−143と命名されているものである。
【００３８】
本発明は更に、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードする外来性ＤＮＡを有するものであり、更に検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを具備する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-004と命名されているものである。
【００３９】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gBをコードする外来性ＤＮＡを有している、組換え型のはシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-045と命名されているものである。
【００４０】
MDVのgBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの、一つの態様も提供され、また、この組換え型HVTは、S-HVT-045と命名されている。S-HVT-045は、１９９２年１０月１５日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2383の下に寄託された。
【００４１】
本発明は更に、MDV抗原をコードする一つより多い数の外来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型のHVTを提供する。例えば、MDVのgA、及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともにHVTゲノム内に運ばれることが可能である。更に組換え型のHVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を含むように構築することが可能である。
【００４２】
S-HVT-046、及びS-HVT-04 ７と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA及びgBをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供し、S-HVT-04 
８、及びS-HVT-０６２と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供する。
【００４３】
S-HVT-０６２は、１９９３年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2401の下に寄託された。
【００４４】
本発明は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTを提供する。このような場合、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合させた大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを具備した組換え型のタンパク質であることが好ましい。このようなウイルスの一つの例は、S-HVT-007と命名されているものである。
【００４５】
本発明は更に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性ＤＮＡ配列と同様に、NDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型HVTを提供する。好ましくは、MDVの抗原性ポリペプチドは、MDVのgB、gD、またはgAであり、またNDVでは、ＦまたはHNである。
【００４６】
本発明の一つの態様においては、組換え型の HVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びNDVのＦをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-048と命名されているものである。
【００４７】
本発明の一つの態様においては、組換え型のHVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びNDVのHNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-049と命名されているものである。
【００４８】
例えば、MDV gA及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともに、HVTゲノム内へ運ばれる。更に、組換え型HVTは、MDV gA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有するように構築することができる。
【００４９】
更に、別の態様においては、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、ニューカッスル病ウイルス由来であって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードするものである。
【００５０】
別の態様においては、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードする上記の外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長領域のEcoRI＃９のXhoI部位へ挿入される。好ましい態様においては、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-136と命名されているものである。
【００５１】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードしている、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備したものを提供する。
【００５２】
本発明は更に、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gD由来の抗原性ポリペプチドをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）をコードした外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の組換え型HVTを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-048と命名されているものである。
【００５３】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-049と命名されているものである。
【００５４】
本発明は、ゲノムＤＮＡが、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）、及び血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-０５０と命名されているものである。
【００５５】
S-HVT-050は、1993年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2400の下に寄託された。
【００５６】
本発明の更に別の態様においては、上記の組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，NDV F，及びNDV HNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このような組換え型HVTは、S-HVT-106、またはS-HVT-128と命名されているものである。
【００５７】
本発明は更に、組換え型のヘルペスウイルスを提供する。更に、一つの態様においては、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gBをコードするもの、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gIをコードするもの、または伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gDをコードする。
【００５８】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、以下のものよりなる群より由来したか、または由来することが可能な抗原性ポリペプチドをコードする：MDV gA，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBVD VP2，IBDV VP3，IBDV VP4,ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス（agent）、サルモネラ.spp、大腸菌（E.coli）、パステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。
【００５９】
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ILTVの糖タンパク質gB、及びILTV gD、またはILTV gIである。
【００６０】
ILTV抗原をコードする、一より多い外来性ＤＮＡ配列を有するように改変された組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスもまた、提供される。例えば、ILTV gB、及びgDは、一緒にHVTゲノム内へ運ばれることが可能であり、ILTV gDとgI、並びにILTV gB、gD、及びgIも同様である。S-HVT-051、S-HVT-052、S-HVT-138と命名されている組換え型HVTは、このような組換え型のウイルスの態様である。
【００６１】
本発明はまた、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列と同様に、ILTV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列を有する、改変済み組換え型HVTを提供する。好ましくは、MDVの抗原性ポリペプチドはMDV gB，gD，またはgAであり、ILTVの抗原性ポリペプチドは、ILTV gB，gD，またはgIである。
【００６２】
本発明の一つの態様において、組換え型のHVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILTV gD，及びILTV gBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している。好ましくは、この組換え型HVTは、S-HVT-123と命名されているものである。
【００６３】
本発明の別の態様においては、組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILTV gI,及びILTV gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、この組換え型HVTは、S-HVT-139、またはS-HVT-140と命名されているものである。
【００６４】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB，マレック病ウイルス糖タンパク質gA、及びマレック病ウイルス糖タンパク質gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD，伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB，及び大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-104と命名されているものである。
【００６５】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００６６】
本発明は更に、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のHVTを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、IBVのスパイクタンパク質、またはIBVのマトリックスタンパク質である。
【００６７】
本発明はまた、IBV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列と同様に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型HVTを提供する。好ましくは、IBV抗原性ポリペプチドは、IBVスパイクタンパク質、またはIBVマトリックスタンパク質であり、またMDV抗原性ポリペプチドは、MDV gB，gD，又はgAである。このような組換え型のウイルスの一つの態様は、S-HVT-066と命名されているものである。
【００６８】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性粘液嚢病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００６９】
更に、一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルス由来である。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2遺伝子をコードする。別の態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3遺伝子をコードする。別の態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP４遺伝子をコードする。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-003、またはS-HVT-096と命名されているものである。
【００７０】
S-HVT-003、及びS-HVT-096と命名されている組換え型HVTはそれぞれ、IBDV由来の抗原性ポリペプチド、及び検出可能な標識をコードした外来性ＤＮＡ配列を具備した組換え型HVTの態様である。S-HVT-003は、1987年７月21日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2178の下に寄託された。
【００７１】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であり、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、または伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gDをコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００７２】
一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、または喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gIをコードする。
【００７３】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列がニューカッスル病ウイルス由来であり、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ、またはニューカッスル病ウイルスのＦをコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００７４】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性粘液嚢病ウイルス由来であり、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、ＶＰ３、またはVP4をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００７５】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性気管支炎ウイルス由来であり、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００７６】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は以下のものよりなる群から由来したか、または由来することが可能な、抗原性ポリペプチドをコードしている：MDV gA，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBDV VP2，IBDV VPD3，IBDV VP4，ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス(agent)、サルモネラ.spp、大腸菌(E.coli)、パステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。好ましい態様においては、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-136と命名されているものである。
【００７７】
このような抗原性ポリペプチドは、以下のものより由来するか、または由来することが可能であるものであってもよい：ネコの病原体、イヌの病原体、ウマの病原体、ウシの病原体、ニワトリの病原体、ブタの病原体、またはヒトの病原体。
【００７８】
別の態様においてヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス、水痘-帯状ヘルペスウイルスヒトヘルペスウイルス６型、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス由来である。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、以下のものからなる群から由来する、マラリア、または悪性腫瘍に関連していてもよい：プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertusis）、及び悪性腫瘍。
【００７９】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼがニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（HN）に融合している、組み換え型のタンパク質を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００８０】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域と、マレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。一つの態様において、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を有し、この外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されうる。
【００８１】
一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となりえる。
【００８２】
別の態様において、ポリペプチドは大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼである。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコードする。別の態様において、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cINF）である。
【００８３】
本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【００８４】
更に、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものからなる群より選択した抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備している：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルス。
【００８５】
本発明は前記の外来性ＤＮＡ配列が内在性の上流のヘルペスウイルスプロモータの制御下にあることを特徴とする組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は異種の上流プロモーターの制御下にある。別の態様においては、がプロモーターは以下のものより選択される：PRV gX，HSV-1アルファ４，HCMV極初期，MDV gA，MDV gB，MDV gD，ILT gB，BHV-1.1 VP8，及びILT gD。
【００８６】
本発明は、以下のものを必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に、外来性ＤＮＡを挿入することにより、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させる相同性ベクターを提供する：(a)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内には通常存在しない、二本鎖の外来性ＤＮＡ；(b)前記外来性ＤＮＡの一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位の一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの；(c)前記外来性ＤＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位のもう一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの。この相同性ベクターの例は、751-87.A８、及び761-7.A1と命名されているものである。
【００８７】
一つの態様において、ポリペプチドとは、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、抗原性ポリペプチドとは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドである。好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドとは、以下のものである：ニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cIFN）、伝染性粘液嚢病ウイルスポリタンパク質、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、マレック病ウイルスの糖タンパク質gD、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質。
【００８８】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列は、ウマの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードしている。ウマの病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルス、またはウマヘルペスウイルスから由来することが可能である。このような抗原性ポリペプチドは、このような抗原性ポリペプチドの例には、次のようなものがある：ウマインフルエンザウイルスA/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/プラハ56ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/マイアミ63ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質B、及びウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質D。
【００８９】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列は、ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザウイルスから由来した抗原性ポリペプチドをコードする。ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザウイルスから由来する抗原性ポリペプチドには次のものがある：ウシＲＳウイルス吸着タンパク質（BRSV 
G）、ウシRSウイルス融合タンパク質（BRSV Ｆ）、ウシRSウイルスヌクレオカプシドタンパク質（BRSV N）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイルス３型血球凝集素・ノイラミニダーゼ。
【００９０】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡは、ヒトの免疫反応を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サイトカインはインターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、及びインターロイキン受容体であることが可能であるが、これらには限定されない。
【００９１】
本発明の一つの態様においては、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのBamHI＃１６断片内に存在するＤＮＡ配列に対して相同性である。好ましくは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUL43タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内に存在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクターは172-29.31と命名されているものである。
【００９２】
本発明の目的に適した「相同性ベクター」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムの特異的部位へ外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミドである。
【００９３】
本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に存在するＤＮＡ配列に相同発明の詳細な説明 
本発明は、HVTゲノムの非必須部位へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を具備した、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。外来性ＤＮＡ配列は、組み換えHVTに感染した宿主細胞内で発現することが可能であり、その発現は、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。
【００９４】
本願では、「HVTゲノムの非必須部位」とは、HVTウイルスゲノム中の領域であってウイルス感染、または複製に必要のないものを意味すると定義する。
【００９５】
本願では、「ウイルスゲノム」、または「ゲノムＤＮＡ」とは、天然のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスが含む、ＤＮＡ全体を意味すると定義する。本願では、「外来性ＤＮＡ配列」、または「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに対して外来性である如何なるＤＮＡ、または遺伝子を意味すると定義する。
【００９６】
本願では、「タンパク質読み取り枠」とは、ＤＮＡの分節であって、終止コドンを含まないアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡに転写されるコドンを含むものを意味すると定義する。
【００９７】
本発明は更に、本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築するのに有益な、HVTゲノム内の、複数の適切な挿入部位を提供する。挿入部位には、HVTゲノムのEcoRI＃９断片とBamHI＃１０断片とが含まれ、この両方の断片中の好ましい挿入部位はXhoI制限酵素部位である。
【００９８】
このような部位のもう一つは、HVTゲノムのBamHI＃１６断片である。このBamHI＃１６断片中の好ましい挿入部位は、UL43タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内にあり、このタンパク質読み取り枠内の好ましい挿入部位は、XhoI部位である。
【００９９】
更に別の挿入部位としては、HVT US2遺伝子があり、この中の好ましい挿入部位はStuIエンドヌクレアーゼ部位である。
【０１００】
本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、該シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を含むシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを具備し、上記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現することが可能な、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１０１】
一つの態様において、上記の外来性ＤＮＡ配列は、EcoRI＃９断片のタンパク質読み取り枠(ORF)A内に挿入されている。外来性ＤＮＡ配列をEcoRI＃９断片のXhoI部位へ挿入してORF Aを分断することは、ORF A領域全体が、組換え体の複製にとって非必須であることを意味する。
【０１０２】
本発明の目的に適した「組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス」は、当業者らによく知られている技術（例えばDNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUSの実験材料と実験方法の項に記載されている方法）によって創製された、生のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、このウイルスは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質が欠失されていないものである。シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを精製すると、EcoRI＃９断片、またはBamHI#１０断片に外来性のＤＮＡ配列、または遺伝子が安定に挿入されたものが得られる。
【０１０３】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、上記の外来性ＤＮＡが、該組み換え型ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性であるポリペプチドをコードする、上記のウイルスを提供する。
【０１０４】
一つの態様において、該ポリペプチドは検出可能な標識である。本発明の目的に適した「検出可能な標識であるポリペプチド」は、該ポリペプチドの二量体、三量体、及び四量体である。大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼは４つのポリペプチド、または単量体サブユニットからなる４量体である。一つの態様において、前記のポリペプチドは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼである。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-001、S-HVT-014、またはS-HVT-012と命名されている。
【０１０５】
S-HVT-012は1992年10月15日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2382の下に寄託された。
【０１０６】
S-HVT-01 ４は199 ３年12月７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2440の下に寄託された。
【０１０７】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様においては、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cIFN）である。好ましい態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-144と、命名されている。
【０１０８】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのウイルスゲノムが、マレック病ウイルス（MDV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、または伝染性粘液嚢病ウイルス（IBDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡを有する、上記のヘルペスウイルスを提供する。
【０１０９】
本発明は、EcoRI＃９断片に外来性ＤＮＡ配列が挿入された、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、または伝染性粘液嚢病ウイルスからなる群から選択した抗原性のポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１１０】
一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、マレック病ウイルス由来であって、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、またはgDをコードしていている。別の態様において、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、又はgDをコードした外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのUS2遺伝子のコード領域のユニークなStuI部位へ挿入されている。
【０１１１】
本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡを有する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドはマレック病ウイルスの糖タンパク質gB、gA、またはgDである。
【０１１２】
一つの態様において、外来性のＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTは、IBDV VP2、MDV gA、及びMDV gBをコードする。好ましくは、このような組換え型ウイルスは、S-HVT-137、及びS-HVT-143と命名されている。
【０１１３】
本発明は更に、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードする外来性ＤＮＡを有するものであり、更に検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを具備する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-004と命名されている。
【０１１４】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gBをコードする外来性ＤＮＡを有している、組換え型のはシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-045と命名されている。
【０１１５】
MDVのgBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの、一つの態様も提供され、また、この組換え型HVTは、S-HVT-045と命名されている。S-HVT-045は、１９９２年１０月１５日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2383の下に寄託された。
【０１１６】
本発明は更に、MDV抗原をコードする一つよりお多い数の外来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型のHVTを提供する。例えば、MDVのgA、及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともにHVTゲノム内に運ばれることが可能である。更に組換え型のHVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を含むように構築することが可能である。
【０１１７】
S-HVT-046、及びS-HVT-04 ７と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA及びgBをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供し、S-HVT-04 ８、及びS-HVT-０６２と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供する。
【０１１８】
S-HVT-０６２は、１９９３年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2401の下に寄託された。
【０１１９】
本発明は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTを提供する。このような場合、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合させた大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを具備した組換え型のタンパク質であることが好ましい。このようなウイルスの一つの例は、S-HVT-007と命名されているものである。
【０１２０】
本発明は更に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性ＤＮＡ配列と同様に、NDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型HVTを提供する。好ましくは、MDVの抗原性ポリペプチドは、MDVのgB、gD、またはgAであり、またNDVでは、FまたはHNである。
【０１２１】
本発明の一つの態様においては、組換え型の HVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びNDVのＦをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-048と命名されているものである。
【０１２２】
本発明の一つの態様においては、組換え型のHVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びNDVのHNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-049と命名されているものである。
【０１２３】
例えば、MDV gA及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともに、HVTゲノム内へ運ばれる。更に、組換え型HVTは、MDV gA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有するように構築することができる。
【０１２４】
更に、別の態様においては、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、ニューカッスル病ウイルス由来であって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードするものである。
【０１２５】
別の態様においては、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードする上記の外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長領域のEcoRI＃９のXhoI部位へ挿入される。好ましい態様においては、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-136と命名されているものである。
【０１２６】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードしている、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備したものを提供する。
【０１２７】
本発明は更に、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gD由来の抗原性ポリペプチドをコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）をコードした外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の組換え型HVTを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-048と命名されているものである。
【０１２８】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-049と命名されているものである。
【０１２９】
本発明は、ゲノムＤＮＡが、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）、及び血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-０５０と命名されているものである。
【０１３０】
S-HVT-050は、1993年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2400の下に寄託された。
【０１３１】
本発明の更に別の態様においては、上記の組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，NDV F，及びNDV HNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このような組換え型HVTは、S-HVT-106、またはS-HVT-128と命名されているものである。
【０１３２】
本発明は更に、組換え型のヘルペスウイルスを提供する。更に、一つの態様においては、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gBをコードするもの、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gIをコードするもの、または伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gDをコードする。
【０１３３】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、以下埜も尾よりなる群より由来したか、または由来することが可能な抗原性ポリペプチドをコードする：MDV gA，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBVD VP2，IBDV VP3，IBDV VP4,ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス（agent）、サルモネラ.spp、大腸菌（E.coli）、パステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。
【０１３４】
本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ILTVの糖タンパク質gB、及びILTV gD、またはILTV gIである。
【０１３５】
ILTV抗原をコードする、一より多い外来性ＤＮＡ配列を有するように改変された組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスもまた、提供される。例えば、ILTV gB、及びgDは、一緒にHVTゲノム内へ運ばれることが可能であり、ILTV gDとgI、並びにILTV gB、gD、及びgIも同様である。S-HVT-051、S-HVT-052、S-HVT-138と命名されている組換え型HVTは、このような組換え型のウイルスの態様である。
【０１３６】
本発明はまた、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列と同様に、比TV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列を有する、改変済み組換え型HVTを提供する。好ましくは、MDVの抗原性ポリペプチドはMDV gB，gD，またはgAであり、ILTVの抗原性ポリペプチドは、ILTV gB，gD，またはgIである。
【０１３７】
本発明の一つの態様において、組換え型のHVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILTV gD，及びILTV gBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している。好ましくは、この組換え型HVTは、S-HVT-123と命名されているものである。
【０１３８】
本発明の別の態様においては、組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILTV gI,及びILTV gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、この組換え型HVTは、S-HVT-139、またはS-HVT-140と命名されているものである。
【０１３９】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB，マレック病ウイルス糖タンパク質gA、及びマレック病ウイルス糖タンパク質gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD，伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB，及び大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-104と命名されているものである。
【０１４０】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１４１】
本発明は更に、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のHVTを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、IBVのスパイクタンパク質、またはIBVのマトリックスタンパク質である。
【０１４２】
本発明はまた、IBV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列と同様に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型HVTを提供する。好ましくは、IBV抗原性ポリペプチドは、IBVスパイクタンパク質、またはIBVマトリックスタンパク質であり、またMDV抗原性ポリペプチドは、MDV gB，gD，又はgAである。このような組換え型のウイルスの一つの態様は、S-HVT-066と命名されているものである。
【０１４３】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性粘液嚢病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有すしている組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１４４】
更に、一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルス由来である。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2遺伝子をコードする。別の態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3遺伝子をコードする。別の態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP ４遺伝子をコードする。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-003、またはS-HVT-096と命名されているものである。
【０１４５】
S-HVT-003、及びS-HVT-096と命名されている組換え型HVTはそれぞれ、IBDV由来の抗原性ポリペプチド、及び検出可能な標識をコードした外来性ＤＮＡ配列を具備した組換え型HVTの態様である。S-HVT-003は、1987年７月21日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2178の下に寄託された。
【０１４６】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であり、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、または伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gDをコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１４７】
一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、または喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gIをコードする。
【０１４８】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列がニューカッスル病ウイルス由来であり、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ、またはニューカッスル病ウイルスのＦをコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１４９】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性粘液嚢病ウイルス由来であり、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、ＶＰ３、またはVP4をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１５０】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性気管支炎ウイルス由来であり、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１５１】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は以下のものよりなる群から由来したか、または由来することが可能な、抗原性ポリペプチドをコードしている：MDV gA，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBDV VP2，IBDV VPD3，IBDV VP4，ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス(agent)、サルモネラ.spp、大腸菌(E.coli)、パステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。好ましい態様においては、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-136と命名されているものである。
【０１５２】
このような抗原性ポリペプチドは、以下のものより由来するか、または由来することが可能であるものであってもよい：ネコの病原体、イヌの病原体、ウマの病原体、ウシの病原体、ニワトリの病原体、ブタの病原体、またはヒトの病原体。
【０１５３】
別の態様においてヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス、水痘-帯状ヘルペスウイルスヒトヘルペスウイルス６型、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス由来である。更に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、以下のものからなる群から由来する、マラリア、または悪性腫瘍に関連していてもよい：プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertusis）、及び悪性腫瘍。
【０１５４】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼがニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（HN）に融合している、組み換え型のタンパク質を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１５５】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域と、マレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。
【０１５６】
一つの態様において、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を有し、この外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されうる。
【０１５７】
一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となりえる。
【０１５８】
別の態様において、ポリペプチドは大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼである。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコードする。別の態様において、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cINF）である。
【０１５９】
本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
【０１６０】
更に、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものからなる群より選択した抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備している：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルス。
【０１６１】
本発明は前記の外来性ＤＮＡ配列が内在性の上流のヘルペスウイルスプロモータの制御下にあることを特徴とする組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は異種の上流プロモーターの制御下にある。別の態様においては、がプロモーターは以下のものより選択される：PRV gX，HSV-1アルファ４，HCMV極初期，MDV gA，MDV gB,MDV gD，ILT gB，BHV-1.1 VP8，及びILT gD。
【０１６２】
本発明は、以下のものを必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に、外来性ＤＮＡを挿入することにより、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させる相同性ベクターを提供する：(a)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内には通常存在しない、二本鎖の外来性ＤＮＡ；(b)前記外来性ＤＮＡの一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位の一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの；(c)前記外来性ＤＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位のもう一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの。この相同性ベクターの例は、751-87.A８、及び761-7.A1と命名されているものである。
【０１６３】
一つの態様において、ポリペプチドとは、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、抗原性ポリペプチドとは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドである。好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドとは、以下のものである：ニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインターフェロン（cIFN）、伝染性粘液嚢病ウイルスポリタンパク質、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、マレック病ウイルスの糖タンパク質gD、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質。
【０１６４】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列は、ウマの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードしている。ウマの病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルス、またはウマヘルペスウイルスから由来することが可能である。このような抗原性ポリペプチドは、このような抗原性ポリペプチドの例には、次のようなものがある：ウマインフルエンザウイルスA/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/プラハ56ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/マイアミ63ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質B、及びウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質D。
【０１６５】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列は、ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザウイルスから由来した抗原性ポリペプチドをコードする。ウシＲＳウイルスに由来する抗原性ポリペプチドは、ウシＲＳウイルス吸着タンパク質（BRSV G）、ウシRSウイルス融合タンパク質（BRSV F）、ウシRSウイルスヌクレオカプシドタンパク質（BRSV N）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイルス３型血球凝集素・ノイラミニダーゼである。
【０１６６】
別の態様においては、上記の相同性ベクター内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡは、ヒトの免疫反応を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サイトカインはインターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、及びインターロイキン受容体であることが可能であるが、これらには限定されない。
【０１６７】
本発明の一つの態様においては、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのBajnHI＃１６断片内に存在するＤＮＡ配列に対して相同性である。好ましくは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUL43タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内に存在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクターは172-29.31と命名されているものである。
【０１６８】
本発明の目的に適した「相同性ベクター」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムの特異的部位へ外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミドである。
【０１６９】
本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に存在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクターは172-63.1と命名されているものである。
【０１７０】
本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUS2遺伝子コード領域内に存在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクターは、435-47.1と命名されているものである。
【０１７１】
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、スクリーニング可能な標識をコードするＤＮＡ配列である。スクリーニング可能な標識の例には大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼ、または大腸菌（E.coli）のβ−グルクロニダーゼが含まれるが、これらには限定されない。
【０１７２】
本発明は更に、本発明の有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチンを提供する。
【０１７３】
本発明は、マレック病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７４】
本発明は、ニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７５】
本発明は、伝染性喉頭気管炎病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７６】
本発明は、伝染性気管支炎病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７７】
本発明は、伝染性粘液嚢病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７８】
本発明は、マレック病ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１７９】
本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリを免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１８０】
本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１８１】
本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。
【０１８２】
本発明は更に、家禽を免疫する方法を提供する。本発明の目的に適したこの方法には、以下のものに対して家禽を免疫することが含まれる：伝染性粘液嚢病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス。この方法は、家禽に対して、本発明のワクチンを、免疫的に有効な量で投与することを具備している。このワクチンは、当業者によく知られる方法の如何なるものを使用して投与されてもよく、例としては、筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内接種がある。あるいは、ワクチンは、鼻腔内的、または経口的に投与することが可能である。
【０１８３】
本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞を提供する。一つの態様において、宿主細胞はトリの細胞である。
【０１８４】
本発明の目的に適した「宿主細胞」は、ベクターとその挿入物を増殖させるのに使用される細胞である。細胞感染は当業者らによく知られたもので行なわれたが、例としては、実験材料と実験方法の項の「組み換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」に記載されているものがある。組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築し、選択し、精製する方法は以下に詳しく記載されている。
【０１８５】
本発明は、上記のワクチンを投与されたニワトリ、またはその他の家禽を、天然のマレック病ウイルスに感染したものより識別する方法であって、ニワトリ、またはその他の家禽から得た体液を分析して、天然のマレック病ウイルスに感染したニワトリ、若しくはその他の家禽で通常は発現している少なくとも一つの抗原と、糖タンパク質gGとの存在を調べることを具備した方法であり、感染したニワトリでは通常発現しているこのような抗原が存在するが糖タンパク質gGが存在しないことは上記のワクチン接種を受けたことを示し、天然おマレック病ウイルスに感染したのではないことを示す、上記の方法を提供する。
【０１８６】
本発明は、以下のものを含むがこれらには限定されない、トリ、または哺乳類種においてワクチンとして有益な、外来性ＤＮＡを発現する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、及びヒトを含む霊長類。
【０１８７】
本ワクチンは、不活化、または生の組換え型ウイルスの何れかであってもよい。
【０１８８】
本発明の目的に適した、本発明の「免疫的に効果的な量」の組換え型ネコヘルペスウイルスは、103から109PFU/投与量の範囲にある。好ましい態様においては、免疫量は106PFU/投与量である。
【０１８９】
本方法は、動物に対して本発明のワクチンを免疫的に有効な量で投与することを具備している。ワクチンは当業者によく知られた如何なる方法で投与されてもよく、例としては筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内注射がある。あるいは、ワクチンは鼻腔内的、または経口的に投与されてもよい。
【０１９０】
組換え型ウイルスのための適切な担体は、当業者にはよく知られており、タンパク質、糖等が含まれるが、これらには限定されない。このような適切な担体の一つの例は、生理学的に均衡のとれた培養液であって、加水分解済タンパク質やラクトース等の一つ以上の安定化剤を有するものがある。好ましくは、生のワクチンは組織培養液を採取して、安定化性のある加水分解済タンパク質を加えることで作成される。好ましくは、不活化ワクチンはウイルスの不活化後すぐに組織培養液を使用する。
【０１９１】
本発明は更に、以下に続く実験の詳細な記載部で例示されている。この部分は発明を理解する補助として書かれているが、その後に書かれている発明を、如何なるようにしても限定することを意図しているものではなく、またそのように解釈すべきものでもない。
【０１９２】
＜実験の詳細＞
材料と方法
シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料の調製
２mMグルタミン、１００単位/mlペニシリン、１００単位/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（これらの成分は、Irvine Scientificまたは同等の会社から得られ、以後完全ＤＭＥ培地と呼ぶ）に１％ウシ胎児血清を加えた培地中、０．０１PFU/細胞の感染多重度で組織培養細胞を感染させて、シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料を調製した。細胞変性作用が完了後、培地と細胞を採取し、細胞を臨床用遠心分離機中で３０００rpmで５分遠心分離してペレットにした。感染した細胞を２０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地中に再懸濁し、−７０℃で保存した。
【０１９３】
シチメンチョウのヘルペスウイルスＤＮＡの調製
シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のすべての操作は、ＦＣ−１２６株（ＡＴＣＣ＃５８４−Ｃ）を用いて行なった。感染細胞の細胞質からのＨＶＴウイルスＤＮＡの調製のために、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の増殖が始まる前に広範な細胞変性作用を引き起こすのに充分な感染多重度で感染させた。インキュベートはすべて、空気中に５％炭酸ガスを有する加湿インキュベーター中で行なった。最大に感染したが不完全な細胞溶解を示した単層（典型的には５−７日目）を採取することにより最大のＤＮＡ収率が得られた。細胞掻き取り器（Costarブランド）を用いて、培地中に感染した細胞を採取した。細胞懸濁液をＧＳ−３ロータ(Sorvall Instruments)中で３０００rpmで５℃で１０分遠心分離した。得られたペレットを冷ＰＢＳ（２０ml/ローラービン（Roller Bottle））に再懸濁し、冷却してさらに３０００rpmで１０分遠心分離した。ＰＢＳをデカント後、細胞ペレットを４ml/ローラービンのＲＳＢ緩衝液（１０mMトリス（pＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、および１．５TmM ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。ＮＰ−４０（ノニデットＰ−４０（登録商標）、Sigma）を、０．５％になるように時々攪拌して試料に加えた。試料を３０００rpmで１０分冷却遠心分離して、核をペレットにし、細胞破片を除去した。上清液を注意深く、１５mlのCorex遠心分離管に移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）とＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、ストック２０％）を、それぞれ最終濃度５mMと１％になるように試料へ加えた。試料４mlに対して１００μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（１０mg/ml、Boehringer-Mannheim）を加え、混合し、４５℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、等量の水飽和フェノールを試料に加え、手で静かに混合した。臨床用遠心分離機で試料を３０００rpmで５分遠心分離した。酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍ（ストック溶液３Ｍ、ｐＨ５．２）になるように水層に加え、２．５容量の冷無水エタノールを添加後−７０℃で３０分核酸を沈殿させた。ＨＢ−４ロータ中で５℃で８０００rpmで２０分遠心分離して試料中のＤＮＡをペレットにした。上清を注意深く除去し、ＤＮＡペレットを２５mlの８０％エタノールで洗浄した。真空下で短時間（２〜３分）乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ）の５０μｌ/ローラービンの感染細胞に再懸濁した。典型的にはウイルスＤＮＡの収率は、５〜１０μｌ/ローラービンの感染細胞の範囲であった。すべてのウイルスＤＮＡを約１０℃で保存した。
【０１９４】
ポリメラーゼ埋め込み（fill-in）反応
５０mMトリス（pＨ７．４）、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2、および４種類のデオキシヌクレオチドを各４００μMを含有する緩衝液中にＤＮＡを再懸濁した。１０単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を加え、室温で１５分反応を進行させた。次にＤＮＡをフェノールで抽出し、前述のようにエタノールで沈殿させた。
【０１９５】
ＤＮＡ配列決定
ＵＳＢシーケナーゼキット（Sequenase Kit）と35Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて、配列決定を行なった。ｄＧＴＰ混合物とｄＩＴＰ混合物の両方を用いて、圧縮のある領域を解明した。あるいは、圧縮のある領域をホルムアミドゲルで分離した。鋳型は２本鎖プラスミドサブクローンまたは１本鎖Ｍ１３サブクローンであり、プライマーは、配列決定される挿入体のすぐ外でベクターに、またはあらかじめ得られた配列に作成した。得られた配列を集合させ、Dnastarソフトウェアを用いて比較した。得られた配列の操作と比較は、Coral SoftwareのSuperclone and Superseeプログラムを用いて行なった。
【０１９６】
分子生物学的方法
制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡによる細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法を含む、細菌やＤＮＡの操作方法は、マニアティス（Maniatis）ら（1982）およびサンブルック（Sambrook）ら（1989）により記載されている。種々のＤＮＡの操作に便利な制限部位を導入するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。使用した方法は、インニス（Innis）ら（1990）により記載されたものである。一般に増幅された断片のサイズは５００塩基対未満であり、増幅断片の決定的に重要な領域は、ＤＮＡ配列決定により確認された。特に明記していない限りこれらの方法に若干変更を加えて使用した。
【０１９７】
ＤＮＡのサザンブロッティング
サザンブロッティングの一般的な方法は、マニアティス（Maniatis）ら(1982)の方法を使用した。ＤＮＡを２０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中でニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ ＢＡ８５）にブロットし、３０％ホルムアミド、１×デンハルツ溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％フィコール）、６×ＳＳＣ、５０mM ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．８、２００μg/mlサケ精子ＤＮＡよりなるハイブリダイゼーション溶液中で、５５℃で４〜２４時間プレハイブリダイゼーションを行なった。Bethesda Research Laboratories（ＢＲＬ）のキットと１つの32ｐ−標識ヌクレオチドを用いてニックトランスレーションにより標識した標識プローブＤＮＡを加えた。ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）またはセファデックスＧ５０カラム（Pharmacia）により、取り込まれなかったＤＮＡからプローブＤＮＡを分離した。５５℃で一晩ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で２×ＳＳＣで１回洗浄し、次に０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で５５℃で３０分の洗浄を２回行なった。フィルターを乾燥しオートラジオグラフィーを行なった。
【０１９８】
ｃＤＮＡクローニング操作
ｃＤＮＡクローニングとは、現状の技術を用いてＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換するために使用する方法を意味する。本出願人の方法は、グブラーとホフマン（Gubler and Hoffman 1983）、に記載されている。Bethesda Research Laboratories（Gaithersburg、メリーランド州）は、本出願人の方法にきわめて類似したｃＤＮＡクローニングキットを考案し、これは我々と同じような結果を得るために使用できる試薬のセットと方法を含む。
【０１９９】
ウイルスｍＲＮＡをクローニングするために、ウイルスによる感染に感受性のの＝宿主細胞株を５〜１０プラーク形成単位／細胞で感染させた。細胞変性作用が明らかになったが、完全に破壊される前に、培地を除去し、１０mlの溶解緩衝液（４Ｍグアニジンチオシアネート、０．１％消泡剤Ａ、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍベーターメルカプトエタノール）中で細胞を溶解させた。細胞溶解液を、滅菌したダウンスホモジナイザー中に注ぎ、溶液が均一になるまで氷の上で８〜１０回ホモジネートした。ＲＮＡ精製のために、８mlの細胞溶解液をBeckman ＳＷ４１遠心分離管中の３．５mlのＣｓＣｌ溶液（５．７ＭＣｓＣｌ、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））に静かに重層した。試料をBeckman ＳＷ４１ロータ中で２０℃で３６０００rpmで１８時間遠心分離した。遠心分離管を氷の上に置き、遠心分離管の上清を注意深く除去してＲＮＡペレットを乱さないように残した。ペレットを４００μｌのガラスで蒸留した水に再懸濁し、２．６mlのグアニジン溶液（７．５Ｍグアニジン−塩酸、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５mMジチオスレイトール）を加えた。０．３７容量の１Ｍ酢酸を加え、次に０．７５容量の冷エタノールを加え、試料を−２０℃で１８時間置いてＲＮＡを沈殿させた。
【０２００】
ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００rpmで１０分間遠心分離して沈殿物を集めた。ペレットを１．０mlの蒸留水に溶解し、１３０００rpmで再度遠心分離し、上清を採取した。ペレットからさらに２回上述のように０．５mlの蒸留水でＲＮＡを抽出し、上清をプールした。０．１容量の２Ｍ酢酸カリウム溶液を試料に加え、次に冷エタノールを２容量加えて、試料を−２０℃に１８時間置いた。沈殿したＲＮＡを、ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００rpmで１０分遠心分離して集めた。ペレットを１mlの蒸留水に溶解し、Ａ２６０／２８０の吸光度から濃度を求めた。ＲＮＡを−７０℃に保存した。
【０２０１】
オリゴ−ｄＴセルロース（Pharmacia #27 5543-0）を用いて、ポリアデニル酸テイル（ポリＡ）を含有するｍＲＮＡを選択した。３mgの全ＲＮＡをボイルし、冷却して、結合緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＬｉＣｌ、５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸リチウム）中で１００mgのオリゴ-ｄＴセルロースカラムにかけた。保持されたポリＡ ＲＮＡを、溶出緩衝液（５mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）でカラムから溶出した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中で再びオリゴーｄＴセルロースカラムにのせ、溶出緩衝液で再度溶出した。試料を２００mMの酢酸ナトリウムで沈殿させ、２容量の冷エタノールを加えて、−２０℃で１８時間置いた。ＲＮＡを５０μｌの蒸留水に再懸濁した。
【０２０２】
１０μｇのポリＡＲＮＡを２０mMの水酸化メチル水銀中で２２℃で６分間変性させた。β−メルカプトエタノールを７５mMになるように加え、試料を２２℃で５分インキュベートした。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための反応混合物は０．２５ml中に、１μｇオリゴ−ｄＴプライマー（P-L Bio-chemiclas）または１μｇ合成プライマー、２８単位の胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（Bethesda Research Laboratories#5518SA）、１００mMトリス（ｐＨ８．３）、１４０mM ＫＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2、０．８mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Pahrmacia）、１００μＣｉの32ｐ−標識ｄＣＴＰ(New England Nuclear #NEG-013H)、および１８０単位のＡＭＶ逆転写酵素(Molecular Genetics Resources #MG 101)を含有した。反応物を４２℃で９０分インキュベートし、次に２０mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止させた。試料を等量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、２mMの酢酸アンモニウムと２容量の冷エタノールで−２０℃で３時間沈殿させた。沈殿と遠心分離後、ペレットを１００μｌの蒸留水に溶解した。試料を緩衝液(１００mMトリス(ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００mM ＮａＣｌ）中で１５mlのＧ−１００セファデックスカラム（Pahrmacia）にかけた。溶出するＤＮＡ画分の先端をプールし、容量が約１００μｌになるまでＤＮＡを凍結乾燥して濃縮し、次に酢酸アンモニウムとエタノールで前記したように沈殿させた。
【０２０３】
第１の鎖の全試料を第２の鎖の反応に使用した。第２の鎖の反応は、全量５０μｌ中の５０μｇ/ml ｄＮＴＰ、５．４単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer-Mannheim #642-711）、および１００単位/mlの大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs #205）を用いた以外は、グブラーとホフマン（Gubler and Hoffman（1983））の方法に従った。第２の鎖の合成後、ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し沈殿させた。このＤＮＡを１０μｌの蒸留水に再懸濁し、１μｇのＲＮアーゼＡで２２℃で１０分処理し、４０mMトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）中１％アガロースゲル（SigmaII型アガロース）で電気泳動した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、予想される範囲のサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、８mMトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）で電気泳動した。電気泳動したＤＮＡを凍結乾燥して約１００μｌにし、前記したように酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁した。
【０２０４】
クローニングを促進するためにＤＮＡにオリゴ−ｄＴを加えた。反応物は、５０μｌ中にＤＮＡ、１００mMカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、０．２mMジチオスレイトール、２mM ＣａＣｌ2、８０μモルｄＣＴＰ、および２５単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Molecular Genetics Resources #1001)を含有した。３７℃で３０分後、１０mM ＥＤＴＡで反応を停止させ、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、前記したように沈殿させた。
【０２０５】
ｄＣテイルのあるＤＮＡ試料を、２００μｌの０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の、オリゴ−ｄＧテイル（Bethesda Research Laboratories #5355 SA/SB）を含有する２００ngのプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２分、次に５７℃で２時間アニーリングさせた。新鮮なコンピタント大腸菌（E．coli）ＤＨ−１細胞を調製し、ハナハン（Hanahan（1983））が記載したように、２００μｌの一定分割量の細胞２０個中のアニーリングしたｃＤＮＡ試料の半分を用いて形質転換した。
【０２０６】
形質転換した細胞を１０μｇ/mlテトラサイクリン含有するＬ−ブロス寒天プレートに広げた。Ampscreen（Bethesda Research Laboratories #5537 UA）を用いて、アンピシリン遺伝子中の挿入体の存在についてコロニーをスクリーニングし、陽性のクローンを取り上げて解析した。
【０２０７】
組換えヘルペスウイルス作製のためのＤＮＡ形質移入
本方法は、カワイとニシザワ（Kawai and Nishizawa(1984)）のポリブレン−ＤＭＳＯ法に以下の変更を加えて行なった。組換えＨＶＴウイルスの作製は、ＨＶＴウイルスＤＮＡと、適当なヘルペスウイルスクローン化配列が隣接する目的の外来性ＤＮＡを含有するプラスミド相同性ベクターとの相同的組換えに依存する。形質移入は、６cmのプレート（Corning plastic）の５０％コンフルエンスの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞中で行なった。細胞を前日に、４μg/mlのポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４mg/ml）を含有するＣＥＦ増殖培地（１×Ｆ１０／１９９、５％ウシ胎児血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に広げた。ＣＥＦ細胞への共形質移入（コ・トランスフェクション）のために、５μｇの完全なＨＶＴＤＮＡを、３０μｇ/mlポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４mg/ml）を含有するＣＥＦ培地１ml中に懸濁した。次にＤＮＡ−ポリブレン懸濁液（１ml）を６cmプレートのＣＥＦ細胞に加え、ここから培地を吸引し、３９℃で３０分インキュベートした。接種物を再分散させるために、この間プレートを定期的に揺らせた。この時間の後、４mlのＣＥＦ増殖培地を洗浄プレートに直接加え、３９℃でさらに２．５時間インキュベートした。この時各プレートから培地を除去し、１×ＨＢＳＳ中の３０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、J.T．Baker Chemical Co.）２mlで室温で４分間細胞にショックを与えた。３０％ＤＭＳＯを注意深く除去し、単層を室温で１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次に５mlのＣＥＦ増殖培地を添加後、細胞を３９℃でインキュベートした。翌日、残存するＤＭＳＯを除去し細胞増殖を刺激するために、培地を交換した。６日以内にウイルスの細胞変性作用が明らかになる。この日から通常１週間以内に、より高力価（８０％−９０％ＣＰＥ）の作成が可能になる。感染細胞を、２０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有するＣＥＦ増殖培地中に再懸濁してＨＶＴストック試料を調製し、−７０℃に保存した。
【０２０８】
サブゲノムＤＮＡ断片からの組換えヘルペスウイルスの作製方法
クローン化した重複サブゲノムＤＮＡ断片の共形質移入（コ・トランスフェクション）によるヘルペスウイルスを作製する能力は、仮性狂犬病ウイルス（Zij1ら、1988）について証明されている。欠失および／または挿入は、共形質移入（コ・トランスフェクション）の前に直接サブゲノム断片に行われるなら、この方法によりゲノム変更を含有する高頻度のウイルスが得られ、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大幅に低下させる。この方法は組換えＨＶＴの作製に使用される。
【０２０９】
重複するＨＶＴサブゲノム断片を含有するサブクローンのライブラリーを、以下のように作製した。ＨＶＴＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ＦＣ−１２６(″Calnek″))から得た。これを剪断し、vanZijlら(1988)が記載したように、４０〜５０kbの断片を挿入体集団として選択して、グリセロール勾配によりサイズ選択した。プールした画分をＴＥで２倍希釈し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタノールを加え、ＤＮＡをBeckman SＷ４１ロータ中で３００００rpmで１時間沈殿させた。３’オーバーハングの除去を促進するために低濃度のＤＮＴＰを用いて、まずＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより剪断した断片を処理し、次にへこんだ３’末端をクレノウポリメラーゼで充填して平滑末端にした。次にこれらの挿入体断片を、ＢａｍＨＩで消化しウシ小腸ホスファターゼで処理しクレノウポリメラーゼで平滑末端としたｐＷＥ１５（Stratagene）コスミドベクターに連結した。連結した混合物を次に、Gigapack XLパッケージ抽出物（Stratagene）を用いてパッケージングした。連結とパッケージングは、製造業者の薦めるように行なった。
【０２１０】
酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、およびＸｈｏＩの公表された制限酵素地図のため、サブクローニングした断片を特異的プローブとして使用して、ゲノムをまたぐサブクローニングのコスミドライブラリーをスクリーニングすることができた。サブクローニングした制限断片からプローブを作製した。次に非放射性システム（Genius，Boehringer-Mannheim）を用いて、断片を標識した。コロニーを取り上げて培地に入れ次に一晩増殖させてスクリーニングを促進した。５個のフィルターとマスタープレートのセットを、マイクロタイタープレートからスタンプして、再び一晩増殖させた。グリセロールを１５％になるようにウェルに入れ、プレートを−２０℃で凍結して、各コロニーのストック培養物を得た。フィルターは、BioRad Colony Lift Membranesであり、製造業者の薦めるように処理しハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６5℃で洗浄した。非放射性プローブとハイブリダイズしたコロニーを、Geniusキットの説明書に従って検出した。
【０２１１】
２つまたはそれ以上の特異的プローブへのハイブリダイゼーションに基づき、さらに解析してコロニーを選択した。次にこれらをＢａｍＨＩで消化し、ＨＶＴの公表されている地図（Buckmasterら、1988）と比較した。こうして３つのコスミド（４０７−３２．２Ｃ３、４０７−３２．ＩＧ７、４０７−３２．５Ｇ６）を得た。各クローンの詳細な説明は後述する。これらのコロニーから妥当な収率のＤＮＡを得るには、クロラムフェニコール増幅（Maniatisら、1982）が必要であることが見いだされた。さらに、１つのコスミドクローン（４０７−３２．５Ｇ６）は不安定であり、満足できるＤＮＡ調製物を得るには、本来の凍結ストックから増殖する必要があった。
【０２１２】
ｐＷＥ１５ベクターは、挿入体をＮｏｔＩで切断することを可能にする。しかし、ＨＶＴゲノムには４つのＮｏｔＩ部位があり、これらの部位にまたがっている挿入体はＮｏｔＩで切断できない。ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片にはＮｏｔＩ部位の２つがあり、この断片は直接ｐＳＰ６４中でクローン化された。他の２つの部位は、ＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークな短い領域中に存在した。この断片は直接ｐＷＥ１５ベクター中でクローン化された。３つの剪断したコスミドと２つのＢａｍＨＩ断片は、ＨＶＴゲノムの末端のすべてのしかし小さな部分をカバーする。これらの領域はゲノムの内部で繰り返されていらため、ゲノム情報のすべてが利用できる。
【０２１３】
ＨＶＴＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は、「組換えヘルペスウイルスを作製するための相同的組換え法」（実施例６）を用いて、外来性ＤＮＡ挿入のための有用な部位として確立されている。ＨＶＴＵＳ２遺伝子は、５つのｓｔｕＩ部位を含有するＢａｍＨＩ＃１断片内に位置する。外来性ＤＮＡの挿入にこの部位の使用を促進するために、ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位をユニークなＨｉｎｄIII部位に変換した。このために、ＢａｍＨＩ＃１サブクローンをＳｔｕＩ部位で部分的に消化し、次にＨｉｎｄIIIリンカーを用いてこの部位内にカノマイシン耐性（NeoR）を与える１０kbの断片を挿入した。カノマイシン耐性遺伝子により、組換えクローンの陽性の選択が可能になった。このNeoR断片はＨｉｎｄIIIで消化して除去し、次に再連結してクローン４３０−８４．２１５を作製した。
【０２１４】
ＨＶＴ挿入部分の外または隣接するサブクローンを切断する酵素で制限消化して、再作製実験のためにＤＮＡを調製した。ある場合には、再作製中の１つのコスミドを消化しないで使用した。消化したＤＮＡをフェノールで１回抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．５〜１μｇ/mlの濃度で再懸濁した。形質移入を仲介するためにウイルス再作製実験をリポフェクチン（ＢＲＬ）を用いて行なった。各サブクローン２〜３μｇを、１％非必須アミノ酸と２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＭＥＭ培地（アール塩溶液）（ＭＥＭ＋）０．５mlに加えた。対照は、ＤＮＡを含ないＭＥＭ＋であり、数μｇのＨＶＴＤＮＡを含むかまたは５つのサブクローンのうち４つを含むものである。別に、３０μｌのリポフェクチンを０．５mlのＭＥＭ＋に加えた。これらの２つの混合物を次に一緒にし、室温で１５分間インキュベートした。
【０２１５】
ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を形質移入のために、以下のように作成した。ＣＥＦ（Spafas）を６つの６ウェルプレート中で、１％非必須アミノ酸、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を含有するＦ１０／Ｍ１９９（１：１）培地（ＣＥＦ＋）中で３９℃で増殖させた。細胞を９０〜９５％のコンフルエンスで形質移入した。形質移入のために、ウェルを吸引し、ＭＥＭ＋で３回洗浄し、次に前記の１mlリポフェクチン／ＤＮＡ混合物とともに３９℃で４時間インキュベートした。次にさらに１mlのＣＥＦ＋をウェルに加え、細胞を一晩インキュベートし、ＣＥＦ＋を与えた。次にプラークの出現について毎日プレートを試験した。
【０２１６】
対照ＨＶＴ ＤＮＡを有するリポフェクチンでは、５日以内にプラークが出現した。５クローンのうち４つのみを使用すると、プラークは得られなかった。ＨＶＴの５つの重複するゲノムの断片を使用してウイルスを再作製すると、最初のリポフェクション後５〜１９日のどこかでプラークが出現した。遅く出現するプラークの場合は、感染した単層に最初プラークは見えず、単層を継代して大きな表面に再度広げるとプラークが現れた。継代後、一般に３日以内にプラークが現れた。組換えウイルスを約３回プラーク精製し、外来性ＤＮＡの挿入について解析した。
【０２１７】
組換えヘルペスウイルスのBluogalスクリーニング
外来性ＤＮＡが酵素β−ガラクトシダーゼをコードする時、その遺伝子を含有するプラークはより容易に目で見えた。プラーク測定の間化学物質Bluogal（登録商標）（Bethesda Research Laboratories）は２００〜３００μｇ/mlのレベルでアガロース重層中に取り込まれ、活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは青くなった。次に青いプラークを取り上げ、さらに青いプラークを単離して精製した。他の外来性ＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換するように相同的組換えにより挿入した。この場合組換えウイルスの精製のために青くないプラークを取り上げた。
【０２１８】
黒いプラーク測定法を用いる組換えＨＶＴでの外来遺伝子発現のスクリーニング
組換えＨＶＴウイルスにより発現される外来性抗原の発現を解析するために、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＨＶＴで感染させて、栄養アガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベートした。プラーク出現後、アガロース重層をプレートから除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄し、１００％メタノールで室温で１０分間固定し、細胞を空気乾燥した。ＰＢＳでプレートを再び水和した後、一次抗体をＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、室温で２時間から一晩細胞単層とともにインキュベートした。次に室温でＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった抗体を細胞から除去した。アルカリ性ホスファターゼ結合２次抗体をＰＢＳで希釈し、細胞とともに室温で２時間インキュベートした。次に室温で細胞をＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった２次抗体を除去した。次に、発色緩衝液（1００mMトリス（ｐＨ９．５）／１００mM ＮａＣｌ／５mM ＭｇＣｌ2）で単層を洗浄し、次に新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中０．３mg/mlニトロブルーテトラゾリウム＋０．１５mg/ml ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）で室温で１０分〜一晩インキュベートした。最後に、基質溶液をＴＥ（１０mMトリス（ｐＨ７．５）／１mM ＥＤＴＡ）で置換して反応を停止させた。正しい抗原を発現するプラークは黒く染色される。
【０２１９】
組換えＨＶＴストックの純度を評価するためのプラークハイブリダイゼーション法
組換えＨＶＴウイルス中の特定の抗原の存在を検出するための適当な免疫学的試薬が存在しない場合、ストックの純度を評価するためにプラークハイブリダイゼーション法が使用される。まずＣＥＦ細胞単層を種々の希釈率のウイルスストックで感染させて、約５０〜１００プラーク／１０cmプレートを得て、栄養アガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベートする。いったんプラークが出現したら、各プラークの位置をプレートの底にマークする。次にアガロース重層を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、残存するＣＥＦ単層をＰＢＳであらかじめ浸潤させたＮＣ膜またはBioRadナイロン膜に形質移入する（プレートに対して膜の位置を記録しておく）。次に膜を１．５mlの１．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ ＮａＯＨに５分間入れて、ＮＣ膜上の細胞を溶解する。膜を１．５mlの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中に５分間入れて中和する。次に溶解した細胞からのＤＮＡを８０℃で１時間ベークしてＮＣ膜に結合させる。この時間の後、膜を、６×ＳＳＣ、３％スキムミルク、０．５％ＳＤＳ、（±）サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ/ml）を含有する溶液中で６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションする。次に、放射標識プローブＤＮＡ（アルファ32Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、膜を６５℃で一晩（約１２時間）インキュベートした。ハイブリダイゼーション後ＮＣ膜を６５℃で２×ＳＳＣで２回洗浄（各３０分）し、次に６５℃で０．５×ＳＳＣでさらに２回洗浄する。次にＮＣ膜を乾燥し、−７０℃で１２時間Ｘ線フィルム（Kodak XOOMT，AR）に露光させる。陽性のシグナルをプレート上のプラークの位置と合わせて、ストックの純度を、全体に対する陽性プラークのパーセントとして記録する。
【０２２０】
ＨＶＴＵＳ２遺伝子へのベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入のための相同ベクターの作製
ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃７断片中のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。マーカー遺伝子はＵＳ２遺伝子と同じ配向である。マーカー遺伝子の詳細な説明は、図７Ａと７Ｂに記載されている。これは標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）を用いて、以下の供給源からの制限断片を図７Ａと７Ｂに記載の合成ＤＮＡ配列と結合させて作製する。断片１は、ＰＲＶＢａｍＨＩ制限断片１０（Lominicziら、1984）の約４１３塩基対のＳａｌ・ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら、1985）の約３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨ  Ｉ制限断片＃７（Lominicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。
【０２２１】
コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ
SPAFAS,Incの３週令のヒヨコからニワトリ脾臓を切開し、洗浄し、そしてシリンジ／針で破壊し細胞を放出させた。間質と破片を沈降させた後、細胞をペレットにし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して赤血球を溶解し、脾臓細胞を回収しＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を、５％ＦＢＳおよび５μｇ/mlコンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩ中に５×１０6細胞／mlで再懸濁し、３９℃で４８時間インキュベートした。グアニジンイソシアネート溶解試薬とPromega ＲＮＡ単離キット（Promega Corporation、マジソン、ウィスコンシン州）の試薬を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。適当なアンチセンスプライマーとＡＭＶ逆転写酵素（Promega Corporation、マジソン、ウィスコンシン州）を含有する各第１の鎖反応物に、４μｇの全ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素反応後の同じ試験管中で適当なセンスプライマーとVetnt(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies，Inc.、ベセスダ、メリーランド州）を用いて行なった。
【０２２２】
サブゲノムクローン１７２−０７．ＢＡ２
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド１７２−０７．ＢＡ２を作製した。これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約２５，０００塩基対領域を含有する。これは、組換えＨＶＴ作製のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約２５，０００塩基対のＢａｍＨＩ＃２断片である。
【０２２３】
相同ベクター１７２−２９．３１
外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド１７２−２９．３１を作製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約３３００塩基対のＢａｍＨＩ＃１６断片である。ＢａｍＨＩ＃１６の完全な配列は配列認識番号３に記載される。この断片は、ＵＬ４３ ＯＲＦがｐＳＰ６４β−ラクタマーゼ遺伝子とは反対の転写配向になるようにクローン化されたことに注意すべきである。
【０２２４】
相同ベクター１７２−６３．１
外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド１７２−６３．１を作製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴの約５５００塩基対のＢａｍＨＩ＃９断片である。ＥｃｏＲＩ断片は、ユニークなＸｈｏＩ部位がｐＳＰ６４ベクター中でユニークなＨｉｎｄIII部位に最も近くなるようにクローン化されたことに注意すべきである。
【０２２５】
相同ベクター２５５−１８．Ｂ１６
ＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子をＨＶＴに挿入するために２５５−１８．Ｂ１６を作製した。ＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子は、ＸｈｏＩ制限部位で相同ベクター１７２−２９．３１中にＳａｌ・断片として挿入した。ＮＤＶ  ＨＮとＦ遺伝子は、親相同ベクター中に同じ転写配向のＵＬ４３  ＯＲＦ中に挿入した。Ｓａｌ・断片の詳細な説明は、図１２Ａ〜１２Ｃに記載される。挿入されたＳａｌ・断片は、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を、図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃに記載の合成ＤＮＡ配列と結合することにより作製することができる。断片１は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片１０（Lomnicziら、1984）の約４１６塩基対のＳａｌ・〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら、1985）の約３００９塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片３は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡの約１２００塩基対のＡｖａII〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。断片４は、プラスミドｐＳＰ６４（Promega）の約１７９塩基対のＥｃｏＲＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片５は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｎの約３５７塩基対のＳｍａＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片６は、全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡの約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｓｔ・制限断片である。断片７は、プラスミドｐＢＲ３２２の約２３５塩基対のＰｓｔ・〜ＳｃａＩ制限断片である。
【０２２６】
サブゲノムクローン３７８−５０．ＢＡ１
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド３７８−５０．ＢＡ１を作製した。これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約２９，５００塩基対領域を含有する。これは、組換えヘルペスウイルス作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えへルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＷＥ１５（Stratagene）の約８１６４塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約２９，５００塩基対のＢａｍＨＩ＃１断片である。
【０２２７】
サブゲノムクローン４０７−３２．１Ｃ１
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．１Ｃ１を作製した。これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約３８，８５０塩基対領域を含有する（図８参照）。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、断片１３の約１２５０塩基対、および断片１の約６，７００塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。これは、プローブＰ１とＰ４（図８に記載）によりスクリーニングして、剪断したＤＮＡライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年３月３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２８で寄託されている。
【０２２８】
サブゲノムクローン４０７−３２．２Ｃ３ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．２Ｃ３を作製した。これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約４０，１７０塩基対領域を含有する（図８参照）。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０、１４、１９、１７、５、および断片２の約２，１００塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。これは、プローブＰ１とＰ２（図８に記載）によりスクリーニングして、剪断したＤＮＡライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４３０で寄託されている。
【０２２９】
サブゲノムクローン４０７−３２．５Ｇ６
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．５Ｇ６を作製した。これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約４０，０００塩基対領域を含有する（図８参照）。この領域は、ＢａｍＨＩ断片９、３、２０、１２、１６、１３、断片２の約１，６５０塩基対、および断片１１の約４，０００塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。これは、プローブＰ２とＰ３（図８に記載）によりスクリーニングして、剪断したＤＮＡライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年３月３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２７で寄託されている。
【０２３０】
相同ベクター４３５−４７．１
外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド４３５−４７．１を作製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＨｉｎｄIII制限酵素部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＨｉｎｄIII部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴの約７３００塩基対のＥｃｏＲＩ＃７断片である。ｐＳＰ６４ベクターのＨｉｎｄIII部位は、サブクローンをＨｉｎｄIIIで消化し、次にクレノウ充填反応と再連結により除去したことに注意すべきである。次に、合成ＨｉｎｄIIIリンカー（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）を、ＥｃｏＲＩ＃７断片のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。
【０２３１】
サブゲノムクローン４３７−２６．２４
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド４３７−２６．２４を作製した。これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１３，６００塩基対領域を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９７０塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片の約１３，６００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である（Buckmasterら、1988）。ＢａｍＨＩ＃２断片は５つのＳｔｕＩ部位を含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記載のようにＨｉｎｄIII部位に変換したことに注意すべきである。
【０２３２】
サブゲノムクローン４３７−２６．２６
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド４３７−２６．２６を作製した。これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約１５，３００塩基対領域を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９７０塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片の約１５，３００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である（Buckmasterら、1988）。ＢａｍＨＩ＃２断片は５つのＳｔｕＩ部位を含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記載のようにＨｉｎｄIII部位に変換したことに注意すべきである。
【０２３３】
相同ベクター４５６−１８．１８および４５６−１７．２２
ＨＶＴにＭＤＶｇＡおよびｇＢ遺伝子を挿入するためにプラスミド４５６−１８．１８および４５６−１７．２２を作製した。ＭＤＶ遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にカセットとして挿入した。ＭＤＶ遺伝子は、平滑末端Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に、平滑末端Ｐｓｔ・〜ＥｃｏＲＩ断片として挿入した（図１０Ａと１０Ｂを参照）。ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ部位は、クレノウ充填反応により平滑化した。Ｐｓｔ・部位は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応により平滑化した。ＭＤＶカセットは両方の配向で挿入されたことに注意すべきである。プラスミド４５６−１８．１８は、親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入されたＭＤＶ遺伝子を含有する。プラスミド４５６−１７．２２は、親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入されたＭＤＶ遺伝子を含有する。ＭＤＶカセットの詳細な説明は、図１０Ａと１０Ｂに記載される。これは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を図１０Ａと１０Ｂに記載の合成ＤＮＡ配列と結合することにより作製することができる。断片１は、ＭＤＶ 
ＥｃｏＲＩの６．９KBゲノム制限断片の約２１７８塩基対のＰｖｕII〜ＥｃｏＲＶ制限サブ断片である（Iharaら、1989）。断片２は、約３８９８塩基対のＳａｌ・〜ＥｃｏＲＩゲノムＭＤＶ断片である（Rossら、1989）。
【０２３４】
相同ベクター５２８−０３．３７
ＨＶＴに伝染性咽頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＤ遺伝子を挿入するためにプラスミド５２８−０３．３７を作製した。ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが後に続くｇＤ遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にカセットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＩＬＴ ＫｐｎＩゲノム制限断片＃８の約２０６０塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ制限サブ断片である（１０．６KB）。第２の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である（Lomnicziら、1984）。これらの断片はＢｃｌＩとＮｄｅＩが隣接するように配置されていることに注意すべきである。
【０２３５】
相同ベクター５２８−１１．４３
ＨＶＴに伝染性咽頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＢ遺伝子（A.M．Grifin、1991）を挿入するためにプラスミド５２８−１１．４３を作製した。ｇＢ遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にＥｃｏＲＩ断片として挿入した。ｇＢ遺伝子は、平滑末端ＨｉｎｄIII部位で平滑末端ＥｃｏＲＩ断片として挿入した。ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ部位は、クレノウ充填反応により平滑化した。ｇＢ遺伝子は、親相同ベクター中にＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入された。ＥｃｏＲＩ断片は、３．０KBのＩＬＴウイルスゲノム断片として得られる。
【０２３６】
相同ベクター５２８−４６．Ｂ３
外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド５２８−４６．Ｂ３を作製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＨｉｎｄIII制限酵素部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＨｉｎｄIII部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの３つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約１６４９塩基対のＰｖｕＩＩ〜Ｓａｌ・制限断片である。第２の断片は、ｐＳＰ６５（Promega）の約１３６８塩基対のＰｖｕＩＩ〜Ｓａｌ・制限断片である。第３の断片は、プラスミド４３７−４７．１の約３４００塩基対のＸｈｏＩ〜ＸｈｏＩ断片である。
【０２３７】
相同ベクター５３５−７０．３
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を挿入するためにプラスミド５３５−７０．３を作製した。Ｆ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にあり、後ろにＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。Ｆ遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・Ｅ断片（D.R. Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｓｔ・制限断片である。最後の断片は、ＨＳＶ−１ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２３８】
相同ベクター５４９−２４．１５
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を挿入するためにプラスミド５４９−２４．１５を作製した。ＨＮとＦ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ遺伝子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。ＨＮとＦ遺伝子は、それぞれＰＲＶ ｇｐＸおよびＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にある。ＨＮとＦ遺伝子は、後ろにそれぞれＰＲＶ ｇＸポリおよびＨＳＶ−１ ＴＫアデニル化シグナルが続く。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片＃１０（Lomnicziら、1984）の約４１３塩基対のＳａｌ・〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８１１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。第３の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。第４の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・Ｅ断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａII制限サブ断片である。第５の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｓｔ・制限断片である。最後の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２３９】
相同ベクター５４９−６２．１０
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮを挿入するためにプラスミド５４９−６２．１０を作製した。ＨＮ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ遺伝子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇｐＸプロモーターの制御下にあり、後ろにＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。ＨＮ遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０（Lomnicziら、1984）の約４１３塩基対のＳａｌ・〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８１１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。最後の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。
【０２４０】
サブゲノムクローン５５０−６０．６
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド５５０−６０．６を作製した。これは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１２，３００塩基対領域を含有する。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ｐＢＲ３２２の約４１７６塩基対のＥｃｏＲＶ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約１２，３００塩基対のＢａｍＨＩ＃２断片である。この断片は、以下の方法で作成した。プラスミド４３７−２６．２６をＨｉｎｄIIIで線状化し、次にExoIII Mung Bean Deletion Kit（Stratagene）で切除した。３および４分反応の試料を一緒にし、ＢａｍＨＩで消化して目的の１２，３００塩基対サブ断片を含有する断片の集団を得た。この集団をｐＢＲ３２２断片にクローン化し、得られるクローンを適当なサイズと制限地図についてスクリーニングした。偶然にもクローン５５０−６０．６を作成した切除されたサブ断片は、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ部位（ＡＴＣＣ）に連結する時第２のＢａｍＨＩを生成するヌクレオチドＧＧで終わった。このプラスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年３月３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２９で寄託されている。
【０２４１】
相同ベクター５６６−４１．５
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢおよびｇＤ遺伝子を挿入するためにプラスミド５６６−４１．５を作製した。ＭＤＶ ｇＤ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ（図１０Ａと１０Ｂを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４５６−１７．２２にＨｉｎｄIII断片として挿入した。ＭＤＶ遺伝子は親相同ベクター中のｇＡおよびｇＢと同じ転写配向で挿入した。ＭＤＶ ｇＤ遺伝子を含有するＨｉｎｄIII断片の詳細な説明は、図１１Ａおよび１１Ｂに記載される。ヘルペスウイルスポリアデニル化シグナルは、ｇＤ遺伝子カセットに加えた。この挿入ＨｉｎｄIII断片は、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を図１１Ａと１１Ｂに記載の合成ＤＮＡ配列に結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、１９８８）の約７８４塩基対のＳｍａ・〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。この断片は、ポリアデニル化配列（ＡＡＴＡＡＡ）が結合部Ｂに最も近く位置するように配向していることに注意すべきである。断片２は、ＭＤＶ ＢｇｌII４．２KBのゲノム制限断片（Rossら、1991）の約２１７７塩基対のＳａｌ・〜ＮｃｏＩサブ断片である。
【０２４２】
相同ベクター５６７−７２．ＩＤ
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子および伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）マトリックスおよびスパイク遺伝子を挿入するためにプラスミド５６７−７２．ＩＤを作製した。ＩＢＶ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＤ遺伝子(JunctionＣ、図１１Ｂを参照)の上流に位置するユニークなＮｏｔＩ部位で相同ベクター５６６−４１．５にカセットとして挿入した。ＩＢＶスパイクおよびマトリックス遺伝子は、それぞれＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＰＲＶ ｇｐＸプロモーターの制御下にある。ＩＢＶスパイクおよびマトリックス遺伝子の後ろに、それぞれＨＳＶ−１ ＴＫおよびＰＶＲ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。ＩＢＶ遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０（Omnicziら、断片は、ＩＢＶマトリックス遺伝子のアミノ酸１〜２２３を含有する。コード領域は、ＩＢＶのArkansas株のｃＤＮＡクローンから得られた。第３の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Omnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。第４の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第５の断片は、ＩＢＶスパイク遺伝子のアミノ酸４〜１１６２を含有する。コード領域は、ＩＢＶのArkansas株のｃＤＮＡクローンから得られた。最後の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２４３】
相同ベクター６０３−５７．Ｆ１
ＨＶＴにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子を挿入するためにプラスミド６０３−５７．Ｆ１を作製した。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にカセットとして挿入した。ＶＰ２遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にあり、後ろにＨＳＶ−１ 
ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。ＶＰ２遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＩＢＤＶ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号１を参照）の約１０８１塩基対のＢｃｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。ＢｃｌＩ部位は、配列ＣＧＣＡＧＣをＴＧＡＴＣＡに変換することにより、ＶＰ２開始メチオニンのすぐ上流でｃＤＮＡクローンに導入されることに注意すべきである。第１と第２の断片は、ＡｖａII部位とＢｃｌＩ部位が隣接するように配置される。第３の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２４４】
相同ベクター６３３−１３．２７
ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮとｆ遺伝子を挿入するためにプラスミド６３３−１３．２７を作製した。ＨＮ遺伝子とＦ遺伝子は、それぞれＰＲＶ ｇｐＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にある。ＨＮ遺伝子とＦ遺伝子の後ろに、それぞれＰＲＶ ｇＸポリおよびＨＳＶ−１ ＴＫアデニル化シグナルが続く。５つのすべての遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡ、ＮＤＶＨＮ、ＮＤＶ Ｆ、ＭＤＶ ｇＤおよびＭＤＶ ｇＢの順序で挿入した。
【０２４５】
相同ベクター６３４−２９．１６
ＨＶＴにＩＬＴウイルスｇＢとｇＤ遺伝子を挿入するためにプラスミド６３４−２９．１６を作製した。ＩＬＴ ｇＢとｇＤ遺伝子が後に続くｌａｃＺマーカー遺伝子は、ユニークなＸｈｏＩ部位で相同ベクター１７２−２９．３１にカセットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、前記のおよび図７Ａと７Ｂに記載のｌａｃＺマーカー遺伝子から得られる約４２２９塩基対のＳａｌ・〜Ｓａｌ・制限断片である。第２の断片は、ＩＬＴ  ＫｐｎＩゲノム制限断片＃８（1０．６KB）の約２０６０塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ制限サブ断片である。第３の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。第２と第３の断片は、ＢｃｌＩとＮｄｅＩ部位が隣接するように配置されることに注意すべきである。第４の断片は、ｇＢ遺伝子を含有する３．０KBのＩＬＴウイルスゲノムＥｃｏＲＩ断片である。３つのすべての遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向である。
【０２４６】
サブゲノムクローン４１５−０９．ＢＡ１
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４１５−０９．ＢＡ１を作製した。これは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約２９，５００塩基対のＢａｍＨＩ＃１断片を含有する。これは、組換えＨＶＴを作成するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。このコスミドは、以下の供給源からの２つの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、ｐＨＣ７９（Bethesda Research Laboratories，Inc.）とｐＷＥ１５（Stratagene）から得られるｐＳＹ１００５の約４４３０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノム（Buckmasterら、1988）の約２９，５００塩基対のＢａｍＨＩ＃１断片である。
【０２４７】
サブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド６７２−０１．Ａ４０を作製した。これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のサブクローンとして単離した。コスミド６７２−０１．Ａ４０は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１の約１４，０００塩基対のＮｏｔＩ〜ＡｓｃＩサブ断片と約１３００塩基対のＡｓｃＩ〜ＢａｍＨＩサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、ＳｍａＩ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Inc.）から作製した約２７００塩基対のＮｏｔＩ〜ＢａｍＨＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１５，３００塩基対領域である。この領域はＢａｍＨＩ断片１１と７、および断片１３の約１２５０塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴを作成するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
【０２４８】
サブゲノムクローン６５４−４５．１
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド６５４−４５．１を作製した。これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のＡｓｃＩサブクローンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Inc.）の２０００塩基対のＡａｔII〜ＰｖｕII断片から作製した約２０００塩基対のＡｓｃＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約８，６００塩基対のＡｓｃＩ〜ＡｓｃＩ断片である。この領域はＢａｍＨＩ断片１０と２１、および断片６の約１１００塩基対、および断片７の約１３００塩基対を含有する。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９−１３４４；配列認識番号４８）は、合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＰａｃＩ部位に変換された。ＰａｃＩ部位は、ＨＶＴ中のの外来性ＤＮＡの挿入と発現に使用した。（図１３Ａを参照）。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
【０２４９】
サブゲノムクローン６８６−６３．Ａ１
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド６８６−６３．Ａ１を作製した。これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８、１５を参照）のＡｓｃＩサブクローンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Inc.）の２０００塩基対のＡａｔII〜ＰｖｕII断片から作製した約２０００塩基対のＡｓｃＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約８，６００塩基対のＡｓｃＩ〜ＡｓｃＩ断片である。この領域はＢａｍＨＩ断片１０と２１、および断片６の約１１００塩基対、および断片７の約１３００塩基対を含有する。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９−１３４４；配列認識番号４８）は、合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＮｏｔＩ部位に変換された。ＮｏｔＩ部位は、ＨＶＴ中の外来性ＤＮＡの挿入と発現に使用した。（図１３Ｂを参照）。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
【０２５０】
サブゲノムクローン６７２−０７．Ｃ４０
組換えＨＶＴを作成するためにコスミド６７２−０７．Ｃ４０を作製した。これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のサブクローンとして単離した。コスミド６７２−０７．Ｃ４０は、は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１の約１１００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＡｓｃＩサブ断片および約１３，０００塩基対のＡｓｃＩ〜ＮｏｔＩサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、ＳｍａＩ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー含有するｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Inc.）の約２７００塩基対のＮｏｔＩ〜ＢａｍＨＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１４，０００塩基対領域である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片６と１８、およびＢａｍＨＩ断片＃１内の約２６００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＮｏｔＩを含有する。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
【０２５１】
サブゲノムクローン７０６−５７．Ａ３
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７０６−５７．Ａ３を作製した。プラスミド７０６−５７．Ａ３は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーターとＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）により作製した。第１の断片は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーター（Carpenterら、1991）をコードする２０８塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は、ＩＢＲＶ標準的感染（challenge）株（ＵＳＤＡ）ゲノムＲＮＡ（Kibengeら、1990）の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（Sambrookら、1989）により得られるＩＢＲＶ ＶＰ２遺伝子をコードする約１６２６塩基対断片である。逆転写とＰＣＲに使用したアンチセンスプライマーは、５’−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列認識番号５３）である。ＰＣＲに使用したセンスプライマーは、５’−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列認識番号５４）である。ＰＣＲにより作成したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ−Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標）ベクター（Clontech Laboratories，Inc.、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）内にクローン化した。次にＩＢＲＶ ＶＰ２断片を、ＰＣＲプライマーにより作成したＢｃｌＩ部位を用いて、ＶＰ８プロモーターにサブクローニングした。この結合部のＤＮＡ配列は、ＶＰ２活性開始メチオニンの前にアミノ酸メチオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が添加されている。このＤＮＡ断片は、ＶＰ２タンパク質の全コード配列を含有するＩＢＤＶポリタンパク質（配列認識番号２）のアミノ酸１〜アミノ酸５３６のコード配列を含有する。第３の断片は、ＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニル化シグナルをコードする約４９４塩基対断片である。
【０２５２】
サブゲノムクローン７１１−９２．１Ａ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７１１−９２．１Ａを作製した。プラスミド７１１−９２．１Ａは、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ 
ｇＤおよびｇＩ遺伝子は、それぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターと１つの共通の内因性ポリアデニル化シグナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）により作製した。第１の断片は、ＩＬＴＶ Ａｓｐ７１８Ｉゲノム断片＃８（１０．６ kb）の約３５５６塩基対のＳａｌ・〜ＨｉｎｄIII制限断片である。
【０２５３】
サブゲノムクローン７１７−３８．１２
組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７１７−３８．１２を作製した。プラスミド７１７−３８．１２は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたＮＤＶ ＨＮ遺伝子とＦ遺伝子を含有する。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターとＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルを使用する。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターとＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を用いて作製した。第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０（Lomnicziら、1984）の約４１３塩基対のＳａｌ・〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８１１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。第３の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。第４の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・Ｅ断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第５の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株：配列認識番号１２）の約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｓｔ・制限断片である。第６の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２５４】
サブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊ
ＨＶＴのユニークなショートにＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を挿入するため、および組換えＨＶＴを作成するために、コスミド７２１−３８．１Ｊを作製した。コスミド７２１−３８．１Ｊは、ＨＶＴのユニークな短い領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄIIIに変換したＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位に挿入したＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子を含有する。ＭＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域は、Ｓ−ＨＶＴ−０６２から得られた。コスミド７２１−３８．１Ｊは、Ｓ−ＨＶＴ−０６２ ＤＮＡのＢａｍＨＩによる部分制限消化および約３９，３００塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）
を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、コスミドベクターｐＷＥ１５からの約８２００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノムの繰り返し領域からの約９００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１の約１５，５００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である。第３の断片は、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子（図１０と１１を参照）を含有する約８４００塩基対カセットである。第４の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１の約１４，５００塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩサブ断片である。
【０２５５】
サブゲノムクローン７２２−６０．Ｅ２
ＨＶＴのユニークな短い領域にＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、ｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を挿入するため、ならびに組換えＨＶＴを作成するために、コスミド７２２−６０．Ｅ２を作製した。コスミド７２２−６０．Ｅ２は、ＨＶＴのユニークな短い領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄIIIに変換したＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位に挿入したＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を含有する。すべての５つの遺伝子を、ＨＶＴＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で導入した。ＭＤＶとＮＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域は、Ｓ−ＨＶＴ−１０６から得られた。コスミド７２２−６０．Ｅ２は、Ｓ−ＨＶＴ−１０６のＢａｍＨＩによる部分制限消化および約４６，３００塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、ｐＨＣ７９（Bethesda Research Laboratories，Inc.）およびｐＷＥ１５（Stratagene，Inc.）から得られたコスミドベクターｐＳＹ１６２６からの約６１００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノムの繰り返し領域からの約９００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１の約１５，５００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である。第３の断片は、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子（図１０Ａ１０ｂ、配列認識番号８を参照）、ＰＲＶ ｇＸプロモーター（Lomnicziら、1984）、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子(配列認識番号１０)、ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化部位(Lomnicziら、1984)、ＨＣＭＶ極初期プロモーター(D.R．Thomsenら、1981)、ＮＤＶ Ｆ遺伝子（配列認識番号
１２）、ＨＣＶ ＴＫポリアデニル化部位（McGeochら、1985）、ＭＤＶ ｇＤ遺伝子（図１１Ａおよび１１Ｂ）、約４５０塩基対のＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニル化部位、およびＭＤＶ ｇＢ遺伝子（図１０Ａと１０Ｂ）を含有する約１５，４００塩基対カセットである。第４の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１の約１４，５００塩基対のＳｔｕＩ〜ＢａｍＨＩサブ断片である。
【０２５６】
サブゲノムクローン７２９−３７．１
組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７２９−３７．１を作製した。プラスミド７２９−３７．１は、プラスミド６８６−６３．ＡのＮｏｔＩ部位に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＡ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＢ遺伝子は、それぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターを使用し、ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＢ遺伝子は、それぞれＰＲＶ 
ｇＸポリアデニル化シグナルが後に続く。ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＢ遺伝子は、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を用いて作製した。第１の断片は、ＩＬＴＶ Ａｓｐ７１８Ｉゲノム断片＃８（１０．６ kb）の約２０５２塩基対のＳａｌ・〜Ｘｂａ・制限サブ断片である。第２の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の約５７２塩基対のＸｂａ・〜Ａｓｐ７１８Ｉ制限サブ断片である。第３の断片は、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡの約３０５９塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。第４の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の約２２２塩基対のＥｃｏＲＩ〜Ｓａｌ・制限サブ断片である。
【０２５７】
サブゲノムクローン７３９−２７．１６
ユニークな長い領域のＨＶＴ遺伝子とユニークな短い領域のＭＤＶ １型遺伝子を含有する非キメラＨＶＴ／ＭＤＶウイルスを作製するために、コスミド７３９−２７．１６を作製した。コスミド７３９−２７．１６は、ＭＤＶ １型の完全なユニークな短い領域を含有する。この領域は、全ＳｍａＩ Ｂ断片と２つのＳｍａＩ Ｋ断片を含有する。コスミド７３９−２７．１６は、ＭＤＶ ＤＮＡのＳｍａＩによる部分的制限消化と約２９，０００〜３３，０００塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法(Sambrookら、1989)を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、コスミドベクターｐＷＥ１５からの約８２００塩基対のＢａｍＨＩ断片（クレノウＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端にされた）である。第１の断片は、ＭＤＶゲノムの短い内部繰り返し領域からの約４０５０塩基対のＳｍａＩ Ｋ断片である。第２の断片は、ＭＤＶの約２１，０００塩基対断片ＳｍａＩである。第３の断片は、ＭＤＶゲノム（Fukuchiら、1984、1985）の短い末端繰り返し領域からの約３，６５０塩基対のＳｍａＩ Ｋ断片である。
【０２５８】
サブゲノムクローン７５１−８７．Ａ８
組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７５１−８７．Ａ８を作製した。プラスミド７５１−８７．Ａ８は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有する。ｃＭＧＦ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＨＩＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を用いて作製した。以下の断片を、ＨＶＴサブゲノムクローン６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。第１の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・Ｅ断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Sambrookら、1989）により得られたｃＭＧＦ遺伝子（５８）をコードする、約６４０塩基対の断片である。逆転写とＰＣＲに使用したアンチセンスプライマーは、５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列認識番号５７）である。ＰＣＲに使用したセンスプライマーは、５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列認識番号５８）である。ｃＭＧＦ断片は、ＰＣＲプライマーにより作成したＢａｍＨＩ部位を用いて、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの隣でサブクローニングした。このＤＮＡ断片は、成熟ｃＭＧＦタンパク質のアミノ末端の２３個のアミノ酸のリーダー配列と１７８アミノ酸を含有するｃＭＧＦタンパク質（５８）の、アミノ酸１からアミノ酸２０１のコード配列を含有する。第３の断片は、ＨＳＶ−１ 
ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２５９】
サブゲノムクローン７６１−０７．Ａ１
組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７６１−０７．Ａ１を作製した。プラスミド７６１−０７．Ａ１は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロン遺伝子を含有する。ニワトリインターフェロン遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＨＩＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を用いて作製した。以下の断片を、ＨＶＴサブゲノムクローン６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。第１の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａ・Ｅ断片（D.R.Thomsenら、1981）の約１１９１塩基対のＰｓｔ・〜ＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Sambrookら、1989）により得られたニワトリインターフェロン遺伝子（５８）をコードする、約５７７塩基対の断片である。逆転写とＰＣＲに使用したアンチセンスプライマーは、５’−ＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧ−３’（配列認識番号５９）である。ＰＣＲに使用したセンスプライマーは、５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列認識番号６０）である。ニワトリインターフェロン遺伝子断片は、ＰＣＲプライマーにより作成したＢｇｌII部位を用いて、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの隣でサブクローニングした。このＤＮＡ断片は、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質のアミノ末端の３１個のアミノ酸のシグナル配列と１６２アミノ酸を含有するニワトリインターフェロンタンパク質（５９）の、アミノ酸１からアミノ酸１９３のコード配列を含有する。第３の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。
【０２６０】
実施例１ Ｓ−ＨＶＴ−００１
Ｓ−ＨＶＴ−００１は、ＨＶＴゲノムのユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。ＨＶＴの制限酵素地図は公表されている（T．Igarashiら、1985）。この情報は、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するための出発点として使用した。ＨＶＴのＢａｍＨＩ制限酵素地図は、図１Ａに示す。このデータから、外来遺伝子が挿入されるＨＶＴＤＮＡのいくつかの異なる領域がターゲティングされる。挿入のために選択された外来遺伝子は、ＰＲＶで使用した大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子である。プロモーターはＰＲＶｇｐＸプロモーターである。ｌａｃＺ遺伝子をＨＶＴのユニークな長い領域内、特にＢａｍＨＩ＃１６（３３２９塩基対）断片のＸｈｏＩ部位内に挿入し、基質Bluogal（登録商標）（Bethesda Research Laboratories）を用いると青いプラークを形成してＨＶＴ組換え体中で発現されることが証明された。同様に、ｌａｃＺ遺伝子は、ＢａｍＨＩ＃１９（９００塩基対）断片内に含有される繰り返し領域中のＳａｌ・部位に挿入された。
【０２６１】
これらの実験は、ヘルペスウイルスでの外来遺伝子の挿入と発現のための本出願で記載した方法がＨＶＴに応用できることを示している。特に、外来性ＤＮＡの挿入のための２つの部位が同定されている（図１Ｂと１Ｃ）。
【０２６２】
実施例２ Ｓ−ＨＶＴ−００３
Ｓ−ＨＶＴ−００３は、ＨＶＴゲノムのユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子と伝染性粘液嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）Ｓ４０７４７のＲＮＡの大きい断片（ｃＤＮＡコピーとして）（配列認識番号１）を含有するシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。このＩＢＤＶ ＤＮＡは、３つのタンパク質をコードする１つの読みとり枠（５’ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３ ３’）（配列認識番号２）を含有する（このうち２つは、ニワトリのＩＢＤＶ感染を防御する抗原である）。β−ガラクトシダーゼとＩＢＤＶポリタンパク質は、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸ遺伝子プロモーターに支配されている。Ｓ−ＨＶＴ−００３は相同的組換えにより作成した。Ｓ−ＨＶＴ−００３は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1987年７月21日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２１７８で寄託されている。
【０２６３】
ＩＢＤＶ遺伝子は、ｃＤＮＡ「クローン化法」によりクローン化した。ＩＢＤＶのゲノムであるクローンは、真のＩＢＤＶ ＲＮＡを含有するブロットに対して、「ＤＮＡのサザンブロッティング法」によりスクリーニングした。次に、陽性のクローンを群を同定するための制限マッピング法により性状解析した。このようなクローンの２つを同定し、この２つが一緒になってＩＢＤＶの大きな断片のＲＮＡ（３．３kbのdsＲＮＡ）の全コード領域となることを見いだした。１つのｃＤＮＡクローン（２〜８４）は、ＩＢＤＶ遺伝子の前半である約２５００塩基対の断片を含有した。第２のクローン（２〜４０）は、ＩＢＤＶ遺伝子の後半である約２０００塩基対の断片を含有した。全ＩＢＤＶ遺伝子であるプラスミド２−８４／２−４０は、重複配列中に存在するユニークなＰｖｕII部位でクローン２−８４と２−４０を結合させて作製した。ＩＢＤＶゲノムは、約３４００塩基対のＳｍａＩ〜ＨｐａＩ断片としてプラスミド２−８４／２−４０から得ることができる。ＩＢＤＶ遺伝子によりコードされるタンパク質の性質は、クローン（２−８４／２−４０）を大腸菌（E．coli）中で発現し、精製したＩＢＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清を用いるウェスタンブロット上で検出して確認した。ＩＢＤＶ抗原をコードするＲＮＡのＩＢＤＶの大きな断片のｃＤＮＡは、以後ＩＢＤＶ遺伝子と呼ぶ１つの読みとり枠を示す。オーストラリアンＩＢＤＶ株の配列は、出願人の配列に密接な相同性を有するとして公表されている（Hudsonら、1986）。２つのウイルスのアミノ酸の差を比較して、１０１２アミノ酸コード領域内に２９のアミノ酸の変化があることが明らかになった。ＶＰ４については３つのみのアミノ酸の差が、ＶＰ３については８つのみのアミノ酸の差があった。これに対して、ＶＰ２は１８のアミノ酸の変化があり、そのうち１４はアミノ酸１３９〜３３２の間にかたまっていた。
【０２６４】
ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＩＢＤＶ遺伝子のコード領域をＰＲＶ ｇｐＸプロモーターとＨＳＶ ＴＫポリＡシグナル配列の間でクローン化して、プラスミド１９１−２３を作成した。ＩＢＤＶ遺伝子を含有する相同的組換えで作成したＨＶＴ組み換え体の同定を助けるため、プラスミド１０１−２３からのｇｐＸでプロモートしたＩＢＤＶ断片を、ｇｐＸプロモーターにより制御されるｌａｃＺ遺伝子の後ろに（縦列で）挿入した。得られたプラスミド（１９１−４７）は、各ＰＲＶｇｐＸプロモーターの制御下で大腸菌（E．coli）ｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子を含有する。プラスミド１９１−４７の作製において、種々のＤＮＡ断片を、天然に存在する制限部位または合成リンカーＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ法により結合させた。プラスミド１９１−４７中に含有されるこれらの遺伝子の作製の詳細は、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄに記載する。
【０２６５】
ＤＮＡの第１のセグメント（セグメント１、図２Ａ）は、ｇｐＸ遺伝子の最初の７つのアミノ酸をコードする残基を含むｇｐＸプロモーターを含有し、約８００塩基対のＳａｌ・部位〜ＢａｍＨＩ断片としてＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃１０のサブクローンから得られた。ＤＮＡの第２のセグメント（セグメント２、図２Ａ）は、アミノ酸１０〜アミノ酸１０２４の大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼコード領域を含有し、後に約４０塩基対のＡｖａＩ〜ＳｍａＩ断片が続く、約３３００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｌＩ断片として、プラスミドｐＪＦ７５１（Jim Hoch，Scripps Clinic and Research Foundationから得た）から得られた。ＤＮＡの第３のセグメント（セグメント３、図２Ａ）は、ｇｐＸポリＡシグナル配列を含有し、約７００塩基対のＮｄｅＩ〜ＳｔｕＩ断片としてＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃７断片のサブクローンから得られた。「ポリメラーゼ充填反応」に従って充填したＮｄｅＩをＳｍａＩ部位に連結して、セグメント３をセグメント２に結合させた。ＤＮＡの第４のセグメント（セグメント４、図２Ａ）はｇｐＸプロモーター（ＴＡＴＡボックスとｃａｐ部位）を含有し、約３３０塩基対のＮａｅＩ〜ＡｌｕＩ断片としてＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃１０断片のサブクローンから得られた。さらに、セグメント４は、合成ＤＮＡリンカー（McKnight and Kingbury, 1982）を介してＰｓｔ・部位がＡｌｕＩ部位に結合しているＰｓｔ・〜Ｂｇｌ  ＩＩ断片として、約３６塩基対のＨＳＶ  ＴＫ５’非翻訳リーダー配列を含有する。ＤＮＡセグメント４〜６は、ｇｐＸポリＡシグナル配列の３’に存在するセグメント３のユニークなＫｐｎ・部位にユニットとして挿入した。ＤＮＡの第５セグメント（セグメント５、図２Ａ）は、ＩＢＤＶの大きな断片のＲＮＡの全コード領域（ｃＤＮＡクローン）を約３４００塩基対のＳｍａＩ〜ＨｐａＩ断片として含有する。セグメント５のＳｍａＩ部位は、「ポリメラーゼ充填反応」に従って充填したセグメント４のＢｇｌII部位に融合した。ＩＢＤＶ遺伝子（５’ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３ ３’）は、ｇｐＸプロモーター（セグメント４）の制御下にあるが、その自然の開始コドンと停止コドンを利用する。ＤＮＡの第６のセグメント（セグメント６、図２Ａ）は、ＨＳＶ ＴＫポリＡシグナル配列を約８００塩基対のＳｍａＩ断片（シカゴ大学のBernard Roizmenから得た）として含有する。セグメント５のＨｐａＩ部位は、合成ＤＮＡリンカーを使用してセグメント６のＳｍａＩ部に融合させた。
【０２６６】
要約すると、Ｓ−ＨＶＴ−００３（プラスミド１９１９−４７）を作製するために使用する構築物は、（５’から３’へ）ＰＲＶプロモーター、ｇｐＸＴＡＴＡボックス、ｇｐＸキャップ部位、ｇｐＸの最初の７アミノ酸、大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ＰＲＶポリＡシグナル配列、ＰＲＶ ｇｐＸプロモーター、ｇｐＸＴＡＴＡボックス、ｇｐＸキャップ部位、ｇｐＸ非翻訳５’リーダー内のＩＢＤＶ遺伝子への融合、ＩＢＤＶ開始コドン、ＩＢＤＶ非翻訳３’末端内のＨＳＶ ＴＫ非翻訳３’末端への融合、およびＴＫポリＡシグナル配列を含有する。これらの遺伝子を含有するカセットは、２つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接されるように作成した。その結果、ｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子の両方を含有する約９１００塩基対断片が、ＥｃｏＲＩによる消化により得られる。以後、９１６１塩基対ＥｃｏＲＩ断片を、ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットと呼ぶ。以下の方法を用いて、相同的組換えによりＳ−ＨＶＴ−００３を作成した。ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットを、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１６断片のサブクローン内に存在するユニークなＸｈｏＩ部位に挿入した。これをおこなうために、まずＥｃｏＲＩリンカーを用いてＸｈｏＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に変換した。この部位は、あらかじめｌａｃＺ（Ｓ−ＨＶＴ−００１）の挿入によりＨＶＴには必須ではないことが証明されている。また、ＢａｍＨＩ＃１６断片中の隣接する相同性領域は、相同的組換えに効率的であることが証明されている。図３Ａと３Ｂには、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＢａｍＨＩ＃１６断片地図のゲノムの位置を示す。ＢａｍＨＩ＃１６断片の長さは、約３３２９塩基対である（配列認識番号３、４、５、６、および７）。ＨＶＴ ＤＮＡは、「ヘルペスウイルスＤＮＡの調製」法に従って調製した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞への共形質移入（コ・トランスフェクション）は、「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」に従って行なった。共形質移入（コ・トランスフェクション）ストックから生ずる組換えウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、３回連続してプラーク精製を行って精製した。１００％のプラークが青くなった時、「ＤＮＡのサザンブロッティング」法によりＩＢＤＶ遺伝子の存在についてＤＮＡを解析した。ＥｃｏＲＩ消化したＳ−ＨＶＴ−００３ＤＮＡをＩＢＤＶに特異的なニックトランスレーションしたプローブ（プラスミド２−８４／２−４０）とプローブ結合させるサザンブロットにより、９１００塩基対のＥｃｏＲＩ断片の存在が確認された。この結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３がそのゲノム内にｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子を取り込んで含有していることを確認している。ＢａｍＨＩ＃１６に特異的なプローブを用いるさらなるサザンブロットにより、ＢａｍＨＩ＃１６中の適当な位置で配列が起きること、および欠失は発生しないことが確認された。野生型ウイルス（Ｓ−ＨＶＴ−０００）に比較してＳ−ＨＶＴ−００３の増殖には、インビトロで差が観察されなかった。
【０２６７】
Ｓ−ＨＶＴ−００３からのＩＢＤＶ特異的タンパク質の発現は、「ウェスタンブロッティング法」を用いてインビトロで測定した。細胞溶解物は、「ヘルペスウイルス細胞溶解物の調製」に記載したように調製した。簡単に説明すると、Ｓ−ＨＶＴ−００３の細胞溶解物中に含有されるタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、そして変性させた精製ＩＢＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清、またはＩＢＤＶ４０kd（ＶＰ２）カプシドタンパク質の予測される免疫優性領域に対応する合成ペプチドに対して作成した抗血清のいずれかとプローブ結合させた。フィルターを洗浄し、［125Ｉ］プロテインＡで処理して、結合抗体の位置を検出した。図４は、変性させた精製ＩＢＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清を用いて得られた結果を示し、これは本出願人により主にＶＰ３（３２kdタンパク質）と反応することが証明されている。図から明らかなように、Ｓ−ＨＶＴ−００３は、完全なＩＢＤＶウイルス粒子の真正のＶＰ３タンパク質とは免疫学的に区別できないタンパク質を産生する。さらに、ポリタンパク質は正しく処理されて、真正のＶＰ３タンパク質と同時に移動するＶＰ３種を産生するようである。オーストラリアンＩＢＤＶ株を用いた最近の証拠は、成熟したＶＰ２およびＶＰ３タンパク質種への前駆体ポリタンパク質の処理にＶＰ４が関与していることを示唆している（Jagadishら、1988）。図５は、ＩＢＤＶ ＶＰ２（４０kd）カプシドタンパク質の１４アミノ酸領域と相同である合成ペプチドに対して作成したウサギ抗血清を用いて得られた結果を示す。図から明らかなように、Ｓ−ＨＶＴ−００３は、真正のウイルスＶＰ２タンパク質とは免疫学的に区別できないタンパク質を産生する。さらに、Ｓ−ＨＶＴ−００３から産生されるＶＰ２タンパク質は、完全なＩＢＤＶウイルス粒子から単離されたＶＰ２の４０kd種と同時に移動する。この分子種は、感染性（完全）ウイルス粒子の主要な成分である。
【０２６８】
要約すると、Ｓ−ＨＶＴ−００３からのＩＢＤＶ特異的タンパク質の発現の解析は、ポリタンパク質はＣＥＦ細胞培養物中で処理され、ウェスタンブロット上のＶＰ２またはＶＰ３タンパク質のいずれかに特異的な免疫学的試薬と反応する適当なサイズのタンパク質を産生することを証明した。
【０２６９】
以下のセットの実験は、血清転換（seroconversion）データ、血清中和結果、およびＩＢＤＶ抗原刺激からの防御により測定した、Ｓ−ＨＶＴ−００３内に含有されるＩＢＤＶ遺伝子のインビボの発現を解析するために、ニワトリ中で行なった。
【０２７０】
第１の実験は、Ｓ−ＨＶＴ−００３でワクチン化するとニワトリのＩＢＤＶへの血清転換が起きることを証明するように計画した。ＨＶＴとＩＢＤＶに対して血清陰性の１１羽の１１週令のニワトリを、SPAFAS Inc.から得た。６羽のニワトリを、Ｓ−ＨＶＴ−００３（４０，０００PFU/ml）を含有するＣＥＦ細胞の細胞懸濁液０．５mlを腹部に皮下投与してワクチン化した。この実験ですべてのニワトリから、７日毎に８週間血清試料を採取した。２８日目（第４週）に、これらのニワトリの３羽にＳ−ＨＶＴ−００３を追加免疫し、他の３羽には不活性化ＩＢＤＶワクチン０．５mlを首の皮下に接種した。さらに３羽のニワトリには、２８日目に不活性化ワクチンのみを投与した。２羽のニワトリは接触対照として、ワクチン接種をしなかった。５６日目にすべてのニワトリを屠殺し剖検を行なった。表１は、ＩＢＤＶに対する血清中和測定法の結果を示す。Ｓ−ＨＶＴ−００３のみを投与したニワトリには、ＳＮ活性は検出されなかった。さらに、不活性化ワクチンのみを投与された３羽のニワトリのうちの１羽のみが、低いが検出可能なＳＮ活性を示した。Ｓ−ＨＶＴ−００３を投与された後不活性化ＩＢＤＶワクチンの追加免疫をされた３羽のニワトリのうちの１羽でも、ＳＮ力価が検出された。これらの力価は、不活性化ＩＢＤＶワクチンのみの場合よりはるかに高レベルであった。これらの結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３は、ＩＢＤＶに対する２次的応答についてニワトリをプライミングすることを示唆している。「ウェスタンブロッティング」による血清試料のインビトロ解析は、２８日目に投与した追加免疫の前でも後でも、Ｓ−ＨＶＴ−００３によるワクチン接種によりＩＢＤＶに対してニワトリが血清転換されたことを確認している。
【表１】
2006055171.tif 000002
【０２７１】
第２の実験で、２５羽の１週令のＳＰＦヒヨコをＳ−ＨＶＴ−００３（２０羽は０．２mlを皮下に、５羽は両目に点眼）でワクチン接種した。２０羽のヒヨコを対照とした。感染後４日目と７日目に、５羽のワクチン接種ヒヨコと２羽の対照ヒヨコを出血させ、屠殺し、脾臓を取り出してウイルスを単離した。脾臓細胞懸濁液を標準的方法で作成し、３mlのニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞増殖培地中の約１×１０6細胞を、直接２次細胞に接種した。培養物を６〜７日間インキュベートし、次に細胞の形態を観察して測定して細胞変性作用（ＣＰＥ）を採点した。培養物を再度継代し、ＣＰＥについて再度採点した。ワクチン接種していないすべての対照ヒヨコは、４日目と７日目の脾臓細胞単離物についてＨＶＴは陰性であった。Ｓ−ＨＶＴ−００３をワクチン接種した５羽のヒヨコのうち４羽は、第１と第２の継代について４日目にＨＶＴは陽性であった。１羽はウイルスを産生せず、これはワクチン化が成功しなかったせいかも知れない。５羽のヒヨコのうち５羽は継代１と２の両方でＨＶＴは陽性であった。全体的に、ベクター回収実験はＳ−ＨＶＴ−００３がインビボで野生型ＨＶＴウイルスと同様に複製し、ＢａｍＨＩ＃１６のＸｈｏＩ部位へのＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットの挿入は、ウイルスの検出可能な弱毒化を引き起こさないことを示している。「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて回収されたウイルスを調べる以後の実験は、１００％のウイルスでβ−ガラクトシダーゼ発現を証明することにより、Ｓ−ＨＶＴ−００３のインビボの安定性を確認した。
【表２】
2006055171.tif 000003
【０２７２】
感染後０、４、７、１４、２１、および２７日目に、残りのニワトリから血液試料を得て、ＩＢＤＶおよびＨＶＴ抗原に対する血清ＥＬＩＳＡ力価測定、およびＩＢＤＶに対するウイルス中和試験を行なった。さらに、感染後２１日目に、５羽の対照と１４羽のワクチン接種ヒヨコに両目の点眼により病原性ＩＢＤＶで抗原刺激した（１０３−８ＥＩＤ５０）。すべてのヒヨコを抗原投与６日後に屠殺し、体重に対する嚢の重量比を計算した。結果の要約をそれぞれ表３と４に示す。表３に示すように、ワクチン接種後２１〜２７日目より前では、ＥＬＩＳＡによりＨＶＴ抗原に対する抗体は検出されなかった。ヒヨコでは、軒化後最初の２週間は免疫応答は未成熟で抑制されており、従ってこれらの結果は全く予想外ではない。これに対して、ＩＢＤＶのＥＬＩＳＡではワクチン接種後２１日目まで陰性であり、２７日目に抗原刺激後にわずかに検出されたのみであった。ワクチン接種後２７日目に見られるＥＬＩＳＡレベルは、ＩＢＤＶに対する一次応答を示している。抗原刺激した対照とワクチン接種／抗原刺激した群についての嚢対体重比を比較する表４は、有意差を示していない。これらの条件下でのＳ−ＨＶＴ−００３のワクチン接種は、抗原刺激後４羽のワクチン接種したヒヨコが死亡したことから明らかなように、ＩＢＤＶ抗原刺激によるワクチン接種ヒヨコの感染を防止しなかった。
【表３】
2006055171.tif 000004
【表４】
2006055171.tif 000005
【０２７３】
値は平均値である。抗原刺激したヒヨコはあまり餌を食べなかったため、体重は対照群で異なる。４羽の抗原刺激−処理ヒヨコは死亡した。
【０２７４】
第３の実験は、免疫応答性ヒヨコ（３週令）を用いて、実験２を繰り返した。６羽の３週令のＳＰＦレッグホーンニワトリに、０．２mlのＳ−ＨＶＴ−００３を腹腔内投与して種々のワクチン接種した（各目に１滴）。血清試料を７日毎に６週間得て、ワクチン接種後４３日目にニワトリを病原性ＵＳＤＡ標準的抗原刺激ＩＢＤＶウイルスで刺激した。抗原刺激後６日目に、対照、ワクチン接種−抗原刺激、および抗原刺激群を屠殺し、嚢を取り出して抗−ＩＢＤＶモノクローナル抗体（ＭＡＢ）（Virginia-Maryland Regional College of Veterinary MedicineのDavid Snyder博士から提供された）でプローブ結合させた。嚢ホモジネートを１mlの０．５％ＮＰ４０と混合して調製した。次に嚢を摩砕し、短時間超音波処理した。ホモジネートの上清を、プロテインＡ結合を介して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに結合したＲ６３ＭＡＢと反応させた。インキュベート後、Ｒ６３ＭＡＢのビオチン標識調製物を加えた。洗浄後、アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体を加えてインキュベートした。試験体をトリス−マルケート（Tris-malcate）緩衝液（ＴＭＢ）＋Ｈ2Ｏ2基質で発色させた。試験結果を表５に示す。データは、ワクチン接種−抗原刺激群と抗原刺激群のすべての嚢で高レベルのＩＢＤＶ抗原が存在することを示している。対照群にはＩＢＤＶ抗原は検出されなかった。ＩＢＤＶ特異的抗原は、１／１０００を越える希釈率でも検出され、ワクチン接種と非ワクチン接種抗原刺激群の間に差はないようである。ＥＬＩＳＡで測定したＨＶＴ力価は、ワクチン接種した６羽のうち４羽で７日目に検出可能になった。１４日目までに、ワクチン接種した６羽のうち６羽でＨＶＴ力価が証明された。６羽のニワトリはすべての、実験の間中ＨＶＴ力価を示し続けた。抗原刺激の前にはＩＢＤＶ ＳＮ力価は見られなかった。これに対して、これらの同じ血清試料のウェスタンブロットによる解析は、ウイルスの刺激の投与前にＳ−ＨＶＴ−００３によるＩＢＤＶへの血清転換を示した。しかし抗原刺激で追加免疫をしない場合は応答のレベルは小さい。ワクチン接種／抗原刺激群と刺激のみの群の比較では、ウェスタンブロットによる反応性のレベルは、ワクチン接種／抗原刺激群ではるかに高かった。これらの結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３はワクチン接種したニワトリをＩＢＤＶに血清転換しており、ＩＢＤＶ特異的発現のレベルは、ニワトリで中和応答を誘発するのに充分なほど高くはないことを示唆する。
【０２７５】
Ｓ−ＨＶＴ−００３は、本出願人が発明したワクチン接種アプローチの利点を示す。ＨＶＴは、これらのタンパク質に対する免疫応答により宿主中で認識される外来性抗原（β−ガラクトシダーゼとＩＢＤＶ抗原）を同時に発現するように作成された。
【表５】
2006055171.tif 000006
【０２７６】
実施例３ Ｓ−ＨＶＴ−００４
Ｓ−ＨＶＴ−００４は、ユニークな長い領域内に挿入されたマレック病ウイルス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ａ（ｇＡ）遺伝子と、ユニークな長い領域内に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等抗原より正しい抗原応答を誘発し易い。
【０２７７】
ＭＤＶ ｇＡ（配列認識番号８と９）遺伝子は、標準的ＤＮＡクローニングｇＡ法によりクローン化された。ＥｃｏＲＩ制限断片は、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子（Isfortら、1984）を含有することは報告されており、この断片はＤＮＡクローン中でサイズにより同定された。ｇＡ遺伝子を含有すると報告されたＤＮＡの領域は本出願人により配列決定され、予想されるように糖タンパク質遺伝子を含有することが見いだされた。この遺伝子からのＤＮＡを用いて、「ＤＮＡのサザンブロッティング」法によりＨＶＴ中で対応する遺伝子を見いだし、非常によく似た配列を含有するＨＶＴ中の遺伝子が同定された。この遺伝子は従来ｇＡと呼ばれていたものと同じ遺伝子である（Isfortら、1984）。
【０２７８】
ＭＤＶ ｇＡ遺伝子はすでに良好なヘルペスウイルスシグナル配列を有するであろうから、ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子をそのまま用いた。ｌａｃＺ遺伝子をＢａｍＨＩ断片＃１６中のＸｈｏＩ部位断片内に挿入し、ＭＤＶ ｇＡ遣伝子を、図６Ａと６ｂに示すようにｌａｃＺの後ろに挿入した。ＢａｍＨＩ＃１６中の隣接領域を、相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡを、「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックからのウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて連続的プラーク精製により精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった時、ＤＮＡをＭＤＶ ｇＡ遺伝子の存在について解析した。Ｓ−ＨＶＴ−００４は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子とＭＤＶ ｇＡ遺伝子の両方をゲノム内に取り込んだ組換えウイルスである。
【０２７９】
図６Ｃは、Ｓ−ＨＶＴ−００４の構造を示す。
【０２８０】
実施例４ ニューキャッスル病ウイルス
ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、全体の構造がＰＩ−３に密接に関連している。ＰＩ−３の血球凝集（ＨＮ）遺伝子と融合（Ｆ）遺伝子を、ＩＢＲ（ｒｅｆ）中で発現するために作成した。同様に血球凝集（ＨＮ）遺伝子と融合（Ｆ）遺伝子を、ヘルペスウイルスデリバリーシステム（シチメンチョウのヘルペスウイルス、ＨＶＴ）で使用するためにＮＤＶからクローン化した。
【０２８１】
発現のためのヘルペスウイルス制御配列の作製に使用した方法をＮＤＶに応用した。
【０２８２】
伝染性気管支炎ウイルス
伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、全体の構造がＴＧＥに密接に関連したニワトリのウイルスである。ＴＧＥの主要な中和抗原を、ＰＲＶ（ｒｅｆ）中で発現するために作成した。同様に主要な中和抗原を、ＩＢＶの３つの株（Massachusetts（配列認識番号１４と１５）、Connecticut（配列認識番号１８と１９）、およびArkansas-99（配列認識番号１６と１７））から、ヘルペスウイルスデリバリーシステム（シチメンチョウのヘルペスウイルス、ＨＶＴ）で使用するためにクローン化した。
【０２８３】
発現のためのヘルペスウイルス制御配列の作製に使用した方法をＩＢＶに応用した。
【０２８４】
実施例５ Ｓ−ＨＶＴ−０４５
Ｓ−ＨＶＴ−０４５は、ユニークな短い領域内に挿入されたマレック病ウイルス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。このＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より正しい抗原応答を誘発し易い。Ｓ−ＨＶＴ−０４５は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年１０月１５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２３８３で寄託されている。
【０２８５】
ＭＤＶ ｇＢ遺伝子は、ｃＤＮＡクローン化法によりクローン化した。ＭＤＶ ｇＢ遺伝子は、既知のヘルペスウイルスｇＢ遺伝子の間で保存されていることがわかっている領域中のＨＳＶ ｇＢ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、３．９ kbのＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ・断片に局在化された。制限地図３．９ kb  ＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ・断片は、公表された地図に類似している（Rossら、1989）。
【０２８６】
ｇＢ遺伝子はすでに良好なヘルペスウイルスシグナル配列を有するであろうから、ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＭＤＶ ｇＢ遺伝子をそのまま用いた。ＭＤＶ ｇＢ遺伝子を、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片から得られたクローン化した１７．１５kbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片内に挿入した。挿入に使用した部位は、Ｓ−ＨＶＴ−０１２の作製にすでに使用したＨＶＴ ＵＳ２内のＳｔｕＩ部位である。この部位は最初ユニークなＨｉｎｄIIIリンカーの挿入により改変し、標準的ＤＮＡクローニング法によりＭＤＶ ｇＢ遺伝子を挿入した。１７．１５kbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片中の隣接領域を、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、残りのクローン化ＨＶＴ断片とともに使用した。形質移入ストックから得られたウイルスをプラーク精製し、ＤＮＡをＭＤＶ ｇＢ遺伝子の存在について解析した。Ｓ−ＨＶＴ−０４５は、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＳｔｕＩ部位でゲノム内に挿入されたＭＤＶ ｇＢ遺伝子を含有する組換えウイルスである。
【０２８７】
組換えＳ−ＨＶＴ−０４５の試験
病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対するこれらの組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスの有効性を証明するために、２つに実験を行なった。実験Ａでは、１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０４５またはＳ−ＨＶＴ−０４６をワクチン接種した。ワクチン接種７日後、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、マレック病ウイルスの病原性の強いＭＤ−５株で抗原刺激した。刺激後６週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断ができる病変を調べた。表６に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワクチン接種対照ヒヨコの９０％でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。
【０２８８】
第２の実験で１日令のヒヨコを、Ｓ−ＨＶＴ−０４５またはＳ−ＨＶＴ−０４７のいずれかをワクチン接種した。第３の群のヒヨコを、ＨＶＴとＳＢ−１よりなるＵＳＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチン接種５日後に、ワクチン接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原性のマレック病ウイルスＲＢ１Ｂ株で抗原刺激した。８週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、剖検し、マレック病の病変を調べた。実験は、ＨＶＴ−０４５とＨＶＴ−０４７の抗原刺激に対する完全な防御を与えたことを示した。市販のワクチンは９６％の防御を与え、非ワクチン接種ヒヨコの７９％はマレック病を発病した。
【表６】
2006055171.tif 000007
【０２８９】
実施例６ Ｓ−ＨＶＴ−０１２
Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、ユニークな短い領域中に大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換え型ヘルペスウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（”Calnek”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年１０７月１５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２３８２で寄託されている。
【０２９０】
ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨＶＴのクローン化したＥｃｏＲＩ断片＃７（すなわち、ＨＶＴのＵＳ２遺伝子内にＳｔｕＩ部位を含有する断片）のユニークなＳｔｕＩ部位に導入した（方法と材料中に記載されている）。ＥｃｏＲＩ断片＃７の隣接領域を、相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった時、ｌａｃＺ遺伝子の有無についてＤＮＡを解析した。Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、ＨＶＴのＵＳ２遺伝子内にＳｔｕＩ部位でゲノムに導入されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである。
【０２９１】
Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方することができる。ヒヨコに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイルスに対して防御を与える。
【０２９２】
実施例７ ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入部位
適当な挿入部位を規定するために、ＨＶＴ ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限断片のライブラリーを作成した。これらの制限断片のいくつか（ＢａｍＨＩ断片＃１６と＃１３、ＥｃｏＲＩ断片＃６、＃７、および＃９（図１を参照））に対して、制限マッピング解析を行なった。各断片で１つのユニークな制限部位を、挿入部位候補として同定した。これらの部位は、ＢａｍＨＩ断片＃１３と＃１６とＥｃｏＲＩ断片＃９中のＸｈｏＩ部位、およびＥｃｏＲＩ断片＃６中のＳａｌ・部位、およびＥｃｏＲＩ断片＃７中のＳｔｕＩ部位である。候補部位のそれぞれにβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を挿入した。
【０２９３】
このような外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを、外来性ＤＮＡを含有するＨＶＴを「作製」するための「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」に従って使用した。この方法が成功するためには、挿入部位が、ＨＶＴの複製にとって必須ではなく、その部位は、ウイルスとプラスミドＤＮＡの間の相同的組換えを仲介するのに適したＨＶＴ ＤＮＡが隣接していることが重要である。ｌａｃＺマーカー遺伝子を含有するプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トランスフェクション）」に従って使用した。組換えウイルスの作成は、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」により測定した。５つの部位のうちの３つは、組換えウイルスを作成するのに使用して成功した。各場合で、得られたウイルスは容易に１００％に精製でき、外来性ＤＮＡの挿入のために適当な部位であることを明らかに証明している。これらの部位を規定するために使用した３つの相同ベクターは、後述する。
【０２９４】
実施例７Ａ 相同ベクター１７２−２９．３１
相同ベクター１７２−２９．３１は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１６断片を含有し、ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド１７２−２９．３１は、ユニークなＸｈｏＩ部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクローン化される。相同ベクター１７２−２９．３１中のＸｈｏＩ部位は、少なくとも３つの組換えＨＶＴ（実施例１〜３を参照）を作製して、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するのに使用することができる。
【０２９５】
相同ベクター１７２−２９．３１を、ＤＮＡ配列解析によりさらに性状解析した。ＢａｍＨＩ＃１６断片の完全な配列を決定した。隣接ＢａｍＨＩ＃１３断片の約２０９２塩基対の配列も決定した（配列認識番号３を参照）。この配列は、ＨＶＴ糖タンパク質Ａ（ｇＡ）をコードする読みとり枠は、ＢａｍＨＩ＃１６〜ＢａｍＨＩ＃１３結合部にまたがることを示す。ＨＶＴ ｇＡ遺伝子は、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）に相同である。ＸｈｏＩ部位は、ＨＶＴ ｇＡ遺伝子のすぐ上流にあるＯＲＦを妨害する。このＯＲＦは、ＰＲＶ ｐ４３とＶＺＶ遺伝子１５に対してアミノ酸配列の相同性を示す。ＰＲＶとＶＺＶ遺伝子は、ＨＳＶ−１ ＵＬ４３の同族体である。従って、このＯＲＦをＨＶＴ ＵＬ４３と名付けた(配列認識番号５を参照)。ＨＶＴ ＵＬ４３はＨＶＴ ｇＣ同族体の上流に位置するが、ＨＶＴ ｇＡと同じＤＮＡ鎖上にコードされ、ＨＶＴ−１ ＵＬ４３はＨＳＶ−１ ｇＣに対して反対の鎖の上にある。ＸｈｏＩ部位は大体アミノ酸６でＵＬ４３を妨害し、ＵＬ４３遺伝子はＨＶＴ複製に必須ではないことを示唆している。
【０２９６】
実施例７Ｂ 相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７
相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７は、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃７断片を含有し、ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド４３５−４７．Ｒ１７は、ユニークなＨｉｎｄIII制限部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクローン化される。プラスミド中のＨｉｎｄIII部位は、ＥｃｏＲＩ断片＃７の天然に存在するＳｔｕＩ部位にＨｉｎｄIIIリンカーを挿入することにより得られる。相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７中のＨｉｎｄIII部位は、少なくとも２５の組換えＨＶＴの作製により、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するために使用することができる。
【０２９７】
ＳｔｕＩでのＤＮＡ配列解析は、この断片が、ＵＳ１０、ＵＳ２、およびＵＳ３をコードする読みとり枠を含有することを示した。ＳｔｕＩ部位は大体アミノ酸１２４でＵＳ２を妨害し、ＵＳ２遺伝子はＨＶＴ複製に必須ではないことを示唆している。
【０２９８】
実施例７Ｃ
相同ベクター１７２．６３．１
相同ベクター１７２．６３．１は、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃９断片を含有し、ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド１７２．６３．１は、ユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクローン化される。相同ベクター１７２．６３．１中のＸｈｏＩ部位は、Ｓ−ＨＶＴ−０１４の作製により、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するために使用することができる（実施例８を参照）。
【０２９９】
実施例８ Ｓ−ＨＶＴ−０１４
Ｓ−ＨＶＴ−０１４は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（”Calnek”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。
【０３００】
ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、クローン化したＥｃｏＲＩ断片＃９のユニークなＸｈｏＩ部位に導入した（方法と材料中に記載されている）。ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ断片＃９内のＸｈｏＩ部位は、実施例１６〜１９に記載のシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスの作製のために使用したＢａｍＨＩ＃１０断片内のＸｈｏＩ部位と同じである。ＥｃｏＲＩ断片＃９の隣接領域を相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ 
ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった。Ｓ−ＨＶＴ−０１４は、ＨＶＴのＥｃｏＲＩ＃９断片内にＸｈｏＩ部位でゲノムに導入されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである。
【０３０１】
Ｓ−ＨＶＴ−０１４は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方することができる。ニワトリに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイルスに対して防御を与える。
【０３０２】
実施例９ Ｓ−ＨＶＴ−００５
Ｓ−ＨＶＴ−００５は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（”Calnek”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。
【０３０３】
ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨＶＴのＸｈｏＩ＃９断片の約１３００塩基対欠失内に導入した。ユニークなＭｌｕＩ部位とＥｃｏＲＶ部位の間に位置する欠失は、ＨＶＴ ｇＡ遺伝子の完全なコード領域を除去している（配列認識番号３を参照）。ＸｈｏＩ断片＃９の隣接領域を相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなり、ＤＮＡをｌａｃＺ遺伝子の存在について解析した。Ｓ−ＨＶＴ−００５は、ＨＶＴの欠失したｇＡ遺伝子の代わりにゲノムに導入されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである。
【０３０４】
Ｓ−ＨＶＴ−００５は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方することができる。ニワトリに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイルスに対して防御を与える。
【０３０５】
実施例１０ マレック病ワクチン
マレック病ウイルスからの糖タンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病のために優れたワクチンとなる。我々は、ＭＤＶ糖タンパク質を発現するいくつかの組換えＨＶＴを作製した：Ｓ−ＨＶＴ−００４（実施例３）、Ｓ−ＨＶＴ−０４５（実施例５）、Ｓ−ＨＶＴ−０４６（実施例１０Ａ）、Ｓ−ＨＶＴ−０４７（実施例１０Ｂ）、Ｓ−ＨＶＴ−０６２（実施例１０Ｃ）。
【０３０６】
実施例１０Ａ Ｓ−ＨＶＴ−０４６
Ｓ−ＨＶＴ−０４６は、短いユニークな領域に挿入されたマレック病ウイルス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ａ（ｇＡ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。
【０３０７】
Ｓ−ＨＶＴ−０４６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．２２。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３０８】
実施例１０Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０４７
Ｓ−ＨＶＴ−０４７は、短いユニークな領域に挿入されたＭＤＶ ｇＢおよびｇＡ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入される。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。
【０３０９】
Ｓ−ＨＶＴ−０４７は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．１８。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３１０】
実施例１０Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−０６２
Ｓ−ＨＶＴ−０６２は、短いユニークな領域に挿入されたＭＤＶ ｇＢ、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびｇＡ遺伝子を含有するシチメンチヨウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。Ｓ−ＨＶＴ−０６２は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年２月23日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２４０１で寄託されている。
【０３１１】
Ｓ−ＨＶＴ−０６２は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６０．６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．２２。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３１２】
ＭＤＶ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験
病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれらの組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスの有効性を証明するために、２つに実験を行なった。実験１では、１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０４５、Ｓ−ＨＶＴ−０４６、またはＳ−ＨＶＴ−０４７をワクチン接種した。ワクチン接種５日後、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ＭＤＶで抗原刺激した。刺激後６週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断ができる病変を調べた。表７に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワクチン接種対照ヒヨコの８４％でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。
【０３１３】
第２の実験で１日令のヒヨコを、Ｓ−ＨＶＴ−０６２でワクチン接種した。さらに２群のヒヨコを、ＨＶＴ、およびＨＶＴとＳＢ−１の組合せよりなるＵＳＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチン接種５日後に、ワクチン接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原性のＭＤＶを抗原刺激した。８週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、剖検し、マレック病の病変を調べた。実験は、Ｓ−ＨＶＴ−０６２の、抗原刺激に対する１００％の防御を与える能力を示した（表７）。市販のワクチンはそれぞれ８１％と９５％の防御を与え、非ワクチン接種ヒヨコの１００％はマレック病を発病した。
【表７】
2006055171.tif 000008
【０３１４】
実施例１１ ニューキャッスル病とマレック病に対する２価ワクチン
ＮＤＶからタンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病とニューキャッスル病の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＮＤＶタンパク質を発現するいくつかの組換えＨＶＴを作成した：Ｓ−ＨＶＴ−００７（実施例１１Ａ）、Ｓ−ＨＶＴ−０４８（実施例１１Ｂ）、Ｓ−ＨＶＴ−０４９（実施例１１Ｃ）、Ｓ−ＨＶＴ−０５０（実施例１１Ｄ）、およびＳ−ＨＶＴ−１０６（実施例１１Ｅ）。
【０３１５】
実施例１１Ａ Ｓ−ＨＶＴ−００７
Ｓ−ＨＶＴ−００７は、ユニークな長い領域に挿入されたＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御される大腸菌（E．coli）ｌａｃＺ ＮＤＶ ＨＮハイブリッドタンパク質遺伝子と、ＨＳＶ−１ α４プロモーターに制御されるＮＤＶ Ｆ質遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤＶ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３１６】
Ｓ−ＨＶＴ−００７を作製するために、ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミド２５５−１８．Ｂ１６を、「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックから得られる青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった。
【０３１７】
実施例１１Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０４８
Ｓ−ＨＶＴ−０４８は、ユニークな短い領域に挿入されたＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御されるＭＤＶ ｇＢとｇＡ、およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶとＮＤＶ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３１８】
Ｓ−ＨＶＴ−０４８は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５３５−７０．３。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３１９】
実施例１１Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−０４９
Ｓ−ＨＶＴ−０４９は、短いユニークな領域に挿入されたＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御されるＭＤＶ ｇＢとｇＡ、およびＮＤＶ ＨＮ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶとＮＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３２０】
Ｓ−ＨＶＴ−０４９は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５４９−６２．１０。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３２１】
実施例１１Ｄ Ｓ−ＨＶＴ−０５０
Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、ＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子、ならびにＮＤＶ ＨＮ遺伝子（配列認識番号１０と１１）およびF（配列認識番号１２と１３）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤＶ遺伝子はそれぞれＰＲＶ ｇＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。すべての４つの遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。
【０３２２】
Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５４９−２４．１５。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年２月23日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２４００で寄託されている。
【０３２３】
実施例１１Ｅ Ｓ−ＨＶＴ−１０６
Ｓ−ＨＶＴ−１０６は、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、ｇＤ遺伝子、およびＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤＶ遺伝子はそれぞれＰＲＶ ｇＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。すべての５つの遺伝子は、ユニークな短い領域内にＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３２４】
Ｓ−ＨＶＴ−１０６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない６３３−１．２７。
【０３２５】
ＮＤＶ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験
病原性ニューキャッスル病ウイルスおよびマレック病ウイルスによる抗原刺激に対するこれらの組換えＨＶＴ／ＭＤＶ／ＮＤＶウイルスの有効性を証明するために、２つに実験を行なった。実験１では、１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０４８、Ｓ−ＨＶＴ−０４９、Ｓ−ＨＶＴ−０５０またはＮＤＶ Ｂ１／Ｂ２ウイルスよりなるＵＳＤＡに認可された従来のワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種後３週間、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ＮＤＶで抗原刺激した。次に疾患に典型的な臨床症状を観察した。表８に示す結果は、これらの組換えウイルス（Ｓ−ＨＶＴ−０４８とＳ−ＨＶＴ−０５０）は、非ワクチン接種対照ヒヨコの１００％でニューキャッスル病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−０４９は、ニューキャッスル病に対して部分的な防御を与えた。
【０３２６】
第２の実験で１日令のヒヨコを、１日令のヒヨコをＳ−ＨＶＴ−０５０でワクチン接種した。さらに２群のヒヨコに、ＨＶＴ、およびＨＶＴとＳＢ−１ウイルスの組合せよりなるＵＳＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチン接種５日後に、ワクチン接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原性のＭＤＶを抗原刺激した。８週間マレック病に典型的な臨床症状についてヒヨコを観察してから、剖検し、マレック病の病変を調べた。この実験は、市販のマレック病ワクチンより強い防御を与えるＳ−ＨＶＴ−０５０の能力を示した。
【表８】
2006055171.tif 000009
【０３２７】
実施例１２ 伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する２価ワクチン
ＩＬＴウイルスから糖タンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病と伝染性咽頭気管炎の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＩＬＴウイルス糖タンパク質を発現するいくつかの組換えＨＶＴ、Ｓ−ＨＶＴ−０５１（実施例１２Ａ）、Ｓ−ＨＶＴ−０５２（実施例１２Ｂ）、およびＳ−ＨＶＴ−１０４（実施例１１Ｃ）を作成した。
【０３２８】
実施例１２Ａ Ｓ−ＨＶＴ−０５１
Ｓ−ＨＶＴ−０５１は、ユニークな短い領域に挿入されたＩＬＴウイルスｇＢ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＬＴ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３２９】
Ｓ−ＨＶＴ−０５１は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５２８−１１．３４。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３３０】
実施例１２Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０５２
Ｓ−ＨＶＴ−０５２は、短いユニークな領域に挿入されたＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＬＴ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入される。
【０３３１】
Ｓ−ＨＶＴ−０５２は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５２８−０３．３７。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３３２】
実施例１２Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−１０４
Ｓ−ＨＶＴ−１０４は、６つの外来遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。大腸菌（E.coli）ｌａｃＺマーカー遺伝子とＩＬＴ ｇＢおよびｇＤ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向でＢａｍＨＩ＃１６領域に挿入される。
【０３３３】
Ｓ−ＨＶＴ−１０４を作製するために、Ｓ−ＨＶＴ−０６２のＤＮＡとプラスミド６３４−２９．１６を、「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に共形質移入（コ・トランスフェクション）した。
【０３３４】
ＩＬＴ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験
病原性伝染性咽頭気管炎ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれらの組換えＨＶＴ／ＩＬＴウイルスの有効性を証明するために、以下の実験を行なった。１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０５１、Ｓ−ＨＶＴ−０５２、Ｓ−ＨＶＴ−０５１とＳ−ＨＶＴ−０５２の組合せ、またはＩＬＴウイルスよりなるＵＳＤＡに認可された従来のワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種後２〜３週間、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ＩＬＴで抗原刺激した。次に疾患の臨床症状を観察した。表９に示す結果は、これらの組換えウイルス（Ｓ−ＨＶＴ−０５１とＳ−ＨＶＴ−０５２）は、ＩＬＴウイルスによる抗原刺激に対して、市販のＩＬＴワクチンに匹敵する防御を与えたことを示している。
【０３３５】
ここに記載したワクチンでワクチン接種したヒヨコは、病原性のＩＬＴに感染したヒヨコから容易に区別できる。これは、ｇＢまたはｇＤ以外の任意のＩＬＴ抗原に対する抗体について、疑わしいヒヨコを試験することにより行われる。
【０３３６】
そのような抗原の例は、ＩＬＴ糖タンパク質Ｃ、Ｅ、およびＧである。ワクチン接種した感染していないトリは、これらの抗原が陰性であり、感染したトリは陽性である。
【表９】
2006055171.tif 000010
【０３３７】
実施例１３ 伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する２価ワクチン
ＩＢＤＶからタンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病と伝染性粘液嚢病の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＩＢＤＶタンパク質を発現するいくつかの組換えＨＶＴを作製した。これらのウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−００３（実施例２）とＳ−ＨＶＴ−０９６である。
【０３３８】
Ｓ−ＨＶＴ−０９６は、ユニークな短い領域に挿入された、ＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御されるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３３９】
Ｓ−ＨＶＴ−０９６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６０．６とＢａｍＨＩ、および切断しない６０２−５７．Ｆ１。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３４０】
Ｓ−ＨＶＴ−０９６を、黒プラークとウェスタンブロット解析によりＶＰ２の発現について測定した。両方の測定法は、このウイルスが、ＩＢＤＶ中和性モノクローナル抗体と特異的に反応する高レベルのタンパク質を発現することを示した。このウイルスは、伝染性粘液嚢病に対するワクチンとして有用であろう。
【０３４１】
実施例１４ 伝染性気管支炎およびマレック病に対する２価ワクチン
Ｓ−ＨＶＴ−０６６は、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＤおよびｇＡ遺伝子、ならびにＩＢＶスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＶスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子は、それぞれＨＣＭＶ極初期プロモーターとＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御される。すべての５つの遺伝子は、短いユニークな領域に挿入された。ＭＤＶ遺伝子とＩＢＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
【０３４２】
Ｓ−ＨＶＴ−０６６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６０．６とＢａｍＨＩ、および切断しない５６７−７２．１Ｄ。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。
【０３４３】
Ｓ−ＨＶＴ−０６６を、黒プラークとウェスタンブロット解析によりＩＢＶスパイクタンパク質の発現について測定した。両方の測定法は、このウイルスが、ＩＢＶ中和性モノクローナル抗体と特異的に反応する高レベルのタンパク質を発現することを示した。このウイルスは、伝染性気管支炎に対するワクチンとして有用であろう。
【０３４４】
実施例１５
種々の病原体からの抗原を発現するためにＨＶＴを利用するワクチン
以下の病原体からの抗原は、家禽のワクチンを開発するのに利用できるかも知れないと予想する：ヒヨコ貧血ウイルス（物質）、トリ脳脊髄炎ウイルス、トリレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリアデノウイルス、鶏痘ウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、サルモネラ種大腸菌（Salmonella spp E．coli）、パスツレラ（Pasterrella）種、ヘモフィルス（Haemophilus）種、クラミジア種、マイコプラズマ種、キャンピロバクター種、ボルデテラ種、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽原虫（エイメリア（Eimeria）種、ヒストモナス（Histomonas）種、トリコモナス（Trichomonas）種）。
【０３４５】
実施例１６
伝染性咽頭気管炎、マレック病およびニューカッスル病に対する３価のワクチン、および伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する２価のワクチンを記載する。伝染性咽頭気管炎に対する優れた防御は、Ｓ−ＨＶＴ−１２３（ＩＬＴＶ ｇＢとｇＤを発現する）をＳ−ＨＶＴ−１３８、−１３９、または−１４０（ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩを発現する）と組合せたワクチンで得られる。
【０３４６】
実施例１６Ａ Ｓ−ＨＶＴ−１２３
Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＮｏｔＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇＢとｇＤ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ｂと１５；配列認識番号４８）。Ｓ−ＨＶＴ−１２３はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入したＭＤＶ ｇＡ、ｇＤとｇＢ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ遺伝子とＭＤＶ遺伝子は、それぞれのプロモーターを使用する。Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３４７】
Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７２１−３８．１Ｊ、７２９−３７．１とＡｓｃＩ。
【０３４８】
実施例１６Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−１３８
Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ｂと１５；配列認識番号４８）。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と反対の転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、内在性ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体として発現され、それら自身の内在性ポリアデニル化シグナルを共有する。
【０３４９】
Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３５０】
Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
【０３５１】
Ｓ−ＨＶＴ−１３８をワクチン接種したヒヨコの血清は、ウェスタンブロットでＩＬＴＶ ｇＩタンパク質と反応し、Ｓ−ＨＶＴ−１３８ワクチンはＩＬＴＶタンパク質を発現し、トリで免疫応答を誘発しないことを示している。Ｓ−ＨＶＴ−１３８をワクチン接種したヒヨコは、病原性の伝染性咽頭気管炎ウイルスによる抗原刺激から防御された。
【０３５２】
実施例１６Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−１３９
Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦＡ）と反対の転写配向である（図１３Ａと１５；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１３９はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、それら自身の内因性ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体として発現され、ＭＤＶ遺伝子もまた、それ自身の内因性プロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３５３】
Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、切断しない７２１−３８．１Ｊ。
【０３５４】
実施例１６Ｄ Ｓ−ＨＶＴ−１４０
Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ａと１５）。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と反対の転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１４０はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含有する。ＩＬＴ ＶｇＤとｇＩ遺伝子は、それら自身の内因性ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体として発現され、ＭＤＶ遺伝子もまた、それ自身の内因性プロモーターから発現される。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写され、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、伝染性咽頭気管炎、マレック病、およびニューキャッスル病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３５５】
Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、切断しない７２２−６０．Ｅ２。
【０３５６】
実施例１７
伝染性粘液嚢病、マレック病およびニューキャッスル病に対する３価のワクチン、ならびに伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する２価のワクチンが記載される。
【０３５７】
実施例１７Ａ ＨＶＴ−１２６
Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３５８】
Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
【０３５９】
実施例１７Ｂ ＨＶＴ−１３７
Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１３７はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、それら自身の各内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３６０】
Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、切断しない７２１−３８．１Ｊ。
【０３６１】
実施例１７Ｃ ＨＶＴ−１４３
Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１４３はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子、ならびにＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含有する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、それぞれの内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写され、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、伝染性粘液嚢病、マレック病、およびニューキャッスル病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３６２】
Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、切断しない７２２−６０．Ｅ２。
【０３６３】
実施例１８ ＨＶＴ−１２８
Ｓ−ＨＶＴ−１２８は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１３Ａと１５）。Ｓ−ＨＶＴ−１２８はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから発現され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１２８は、ニューキャッスル病、およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３６４】
Ｓ−ＨＶＴ−１２８は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１７−３８．１２。これらの６つのコスミドの混合物に、ユニークな短い領域に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子（ＨＶＴ−０６２を参照）と、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＮｏｔＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位内に挿入したＰＲＶ ｇＸプロモーター−ｌａｃＺ遺伝子を含有する、組換えＨＶＴウイルスの限界希釈物を加えた。ｌａｃＺ陰性である組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１２８を選択した。
【０３６５】
実施例１８Ｂ ＨＶＴ−１３６
Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＮＤＶ 
ＨＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図１４；配列認識番号４８と５０）。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから発現され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、ニューキャッスル病、およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３６６】
Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１７−３８．１２、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
【０３６７】
実施例１９ Ｓ−ＨＶＴ−１４５
ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウイルスワクチン
Ｓ−ＨＶＴ−１４５は、マレック病に対して防御するＭＤＶとＨＶＴゲノム配列を含有する組換えウイルスワクチンであり、病原性の作成した血清型２の関連する防御性抗原をコードする遺伝子を含有するＭＤＶゲノムＤＮＡのコスミドと、ＨＶＴゲノムＤＮＡのコスミドを、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って組合せて産生される。得られるウイルスは、病原性のＭＤＶ血清型２に対する防御性免疫応答およびＨＶＴの弱毒化増殖特性も有するワクチンである。１つの態様において、ユニークな短い領域のＭＤＶ遺伝子とユニークな長い領域のＨＶＴ遺伝子を含有するキメラウイルスワクチンは、ニワトリのマレック病に対するワクチンとして有用である。ユニークな短い領域内のＭＤＶ防御性抗原（ｇＤ、ｇＥおよびｇＩ）はＭＤＶに対する防御性免疫応答を誘発し、ＭＤＶのユニークな長い領域内に存在する病原性の成分（５５、５６、５７）は、ＨＶＴの弱毒性のユニークな長い配列により置換される。その結果、マレック病に対して防御性の弱毒化ウイルスワクチンが得られる。マレック病、伝染性咽頭気管炎、伝染性粘液嚢病、ニューキャッスル病、または他の家禽病原体に対する多価防御性は、ＩＬＴＶ ｇＢ、ｇＤ、およびｇＩ遺伝子、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子、ＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子、または家禽病原体からの抗原遺伝子を、ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウイルス（図１３と１５）のユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位またはＮｏｔＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入することにより得られる。
【０３６８】
全てのＭＤＶのユニークな短い領域を含有するコスミドを作製した。ＭＤＶゲノムＤＮＡは、ウイルスのユニークな長い領域、および内部と末端繰り返し部分にいくつかのＳｍａＩ部位を含有するが、ウイルスのユニークな短い領域にはＳｍａＩ部位はない。ＭＤＶの全てのユニークな短い領域は、ＭＤＶゲノムＤＮＡをＳｍａＩで部分的制限分解することにより単離された。約２９，０００〜３３，０００塩基対のＤＮＡ断片を単離し、コスミドベクターｐＷＥ１５の平滑末端部位にクローン化した。ＨＶＹ−１４５を作製するために、ＭＤＶのユニークな短い領域を含有するコスミドであるＨＴＶ／ＭＤＶキメラウイルスを、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＨＶＴのユニークな長い領域を含有するコスミドと一緒にした。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７．３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、および７３９−２７．１６とＮｏｔＩ。
【０３６９】
得られるウイルスは、マレック病に対する優れた防御性、またはマレック病、伝染性咽頭気管炎、伝染性粘液嚢病、ニューキャッスル病、または他の家禽病原体に対する多価防御性ワクチンとして優れた防御性を与える。ＨＶＴ／ＭＤＶキメラワクチン中のＭＤＶ遺伝子の発現が安全であり、ＨＶＴとＭＤＶ１型（ＳＢ−１）またはＨＶＴのみを含有する現在入手可能なワクチンよりマレック病に対する防御性が優れているため、このワクチンは優れている。第２に、診断と制御の両方の目的のために、相同性のＨＶＴ遺伝子の非存在下でＭＤＶ糖タンパク質遺伝子を発現することができる。ＭＤＶ糖タンパク質に対する抗体は相同性のＨＶＴ糖タンパク質と交差反応するため、これは有用である。最後に、各糖タンパク質遺伝子の単一のコピーを含有する組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスは、相同的組換えにより欠失するかも知れないＨＶＴとＭＤＶからの相同性糖タンパク質遺伝子の２つのコピーを含有する組換えウイルスより安定である。
【０３７０】
別の態様において、ユニークな長い／内部繰り返し結合部とユニークな長い／末端繰り返し結合部のＭＤＶ病原性の遺伝子を有効に避けて、ユニークな長い領域（ＭＤＶ ｇＢおよびｇＣ）からのＭＤＶ防御性抗原遺伝子を含有するコスミドと、ユニークな短い領域とユニークな長い領域からのＨＶＴ遺伝子配列を含有するコスミドを一緒にした（５５、５６、５７）。
【０３７１】
ＳＢ−１株は、病原性が弱毒化されたＭＤＶ血清型１である。ＨＶＴとＳＢ−１の生きたウイルスの組合せでワクチン接種をすると、病原性のＭＤＶ抗原刺激に対して、いずれか単独でワクチン接種するよりも良好な防御性を与える。本発明の別の態様において、組換えウイルスワクチンは、非病原性のＭＤＶ血清型１と３の弱毒化遺伝子と組合せた病原性のＭＤＶ血清型２の防御性抗原を含む（例えば、ＳＢ−１とＨＶＴ）。ユニークな長い領域に対応するゲノムＤＮＡは、ＳＢ−１血清型の寄与である。ユニークな短い領域に対応するゲノムＤＮＡは、ＨＶＴ血清型の寄与である。ＭＤＶ血清型２からの３つの主要な糖タンパク質抗原（ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ）が、ウイルスのユニークな短い領域に挿入される。
【０３７２】
ユニークな短い領域を再作製するためにＨＶＴのサブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０、６７２−０７．Ｃ４０および７２１−３８．１Ｊを用いて、組換えウイルスが作製される。サブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊは、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＡ、およびｇＤ遺伝子の挿入を含有する。これらのクローンのモル大過剰量を、サブ感染性量のＳｂ−１ゲノムＤＮＡと共形質移入（コ・トランスフェクション）する。適当なサブ感染性用量を決定するために、ＳＢ−１の形質移入を、細胞培養物中でウイルスプラークが出なくなる用量まで力価測定をする。
【０３７３】
このような用量は、ＨＶＴのユニークな短いサブゲノムクローンと再結合するＳＢ−１のユニークな長い領域をまたぐサブゲノム断片を含有する。従って、ＳＢ−１とＨＶＴサブゲノム断片の重複する相同性領域の間の組換えにより得られるウイルスは非常に好ましい。あるいは、ユニークな長い領域からのＳＢ−１ゲノム断片をコスミドベクターにサブクローニングする。ＭＤＶ ｇＢ、ｇＡ、およびｇＤ遺伝子とともにＳｂ−１ユニークな長い領域とＨＶＴユニークな短い領域を含有する組換えウイルスは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って産生した。この方法はまた、ＨＶＴサブゲノムクローンとともに使用して、伝染性咽頭気管炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよび伝染性粘液嚢病ウイルスを含む（ただし、これらに限定されない）他の鳥類病原体からの抗原遺伝子を挿入した。
【０３７４】
実施例２０
ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）を発現する組換えＨＶＴは、マレック病ウイルスに対するワクチンとして、および家禽の他の疾患に対する免疫応答を増強するために有用である。
【０３７５】
ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物Ｇ−ＣＳＦやインターロイキン−６タンパク質（５８）と関係があり、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）は哺乳動物１型インターフェロン（５９）と相同性がある。前記実施例で記載したワクチンと組合せて使用すると、Ｓ−ＨＶＴ−１４４またはｃＩＦＮを発現するＨＶＴは、鳥に疾患を引き起こすウイルス（例えば、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性粘液嚢病ウイルスがあるが、これらに限定されない）に対する粘液性、体液性または細胞性免疫を与えるのに有用である。ｃＭＧＦまたはｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、実施例１５に記載の鳥類の疾患を引き起こす生物に対して増強された免疫を与えるのに有用である。
【０３７６】
実施例２０Ａ Ｓ−ＨＶＴ−１４４
Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ｃＭＧＦ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内の読みとり枠（ＯＲＦＡ）と反対の転写配向である（図１４；配列認識番号４８と５０）。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３７７】
Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
【０３７８】
実施例２０Ｂ ニワトリインターフェロンを発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えＨＶＴは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
【０３７９】
ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
【０３８０】
鳥類サイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するために鳥類の疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。ＨＶＴ中で発現され、免疫刺激作用を有する追加のサイトカインには、トランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体があるが、これらに限定されない。これらのサイトカインは、トリの種またはヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌもしくはブタを含む他の動物由来である。
【０３８１】
実施例２０Ｃ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ 
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
【０３８２】
ＭＤＶ遺伝子とｃＩＦＮ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７１７−３８．１Ｊ。
【０３８３】
実施例２０Ｄ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ 
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
【０３８４】
ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２２−６０．Ｅ２。
【０３８５】
実施例２０Ｅ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(ｃＭＧＦ)遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ｃＭＧＦおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
【０３８６】
ｃＭＧＦ遺伝子およびＭＤＶ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。
【０３８７】
実施例２０Ｆ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子、およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(ｃＧＭＦ)遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。ｃＧＭＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
【０３８８】
ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＧＭＦ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７５１−８７．Ａ８、および切断しない７２２−６０．Ｅ２。
【０３８９】
実施例２１ 疾患を引き起こす微生物からの抗原を発現するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、鳥類の種とともに動物からの疾患を引き起こす微生物の抗原を発現するのに有用である。組換えＨＶＴは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、およびネコを含む（しかし、これらに限定されない）動物のワクチンとして有用である。
【０３９０】
組換えＨＶＴは、疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ウマの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス−１およびウマヘルペスウイルス−４があるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ウシの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ウシヘルペスウイルス−１、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシRSウイルス、ウシパラインフルエンザウイルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ブタの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、仮性狂犬病ウイルス、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ネコまたはイヌの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、および糸状虫（Dirofilaria imitis）（心糸状虫症）があるが、これらに限定されない。イヌの疾患を引き起こす微生物には、イヌヘルペスウイルス、イヌジステンパー、イヌアデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイルス２型（呼吸系疾患）、パラインフルエンザウイルス、レプトスピラカニコーラ（Leptospira canicola）、黄痘性出血病、パルボウイルス、コロナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、イヌヘルペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、イヌ糸状虫（Dirofilaria imitis）（心糸状虫症）および狂犬病があるが、これらに限定されない。
【０３９１】
実施例２２ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスをベクターとして用いるヒトワクチン
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、ヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。例えば、ヒトのインフルエンザウイルスは、中和性ウイルスエピトープが急速に変化する急速に進化するウイルスである。有用な組換えＨＶＴワクチンはインフルエンザウイルス中和性エピトープがインフルエンザウイルスの新しい株に対して防御するように急速に変化するものである。ヒトのインフルエンザＨＡとＮＡ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して組換えＨＶＴにクローン化される。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、他のヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘−帯状庖疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス（hantaan virus）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、おたふくかぜウイルス、マラリア（Plasmodium falciparum）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ジフテリア、リケッチア・プロワゼキイ（Richetsia prowazekii）、ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrelia bergdorferi）、破傷風毒素、悪性腫瘍抗原があるが、これらに限定されない。
【０３９２】
ヒトサイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するためにヒトの疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。追加のサイトカイン（ヒトおよび他の動物のトランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性腫瘍壊死因子受容体があるが、これらに限定されない）は、ＨＶＴ中で発現され、免疫刺激作用を有する。
【０３９３】
実施例２３ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスワクチンの改良製造法
インターフェロンやインターロイキンのようなサイトカインは、培養細胞や動物のウイルスの複製を阻害する。細胞性インターフェロンまたはインターロイキンの産生の阻害は、細胞培養による組換えＨＶＴの増殖を改良する。組換え豚痘ベクターから発現されるニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）を、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞培養物に加え、β−ガラクトシダーゼを発現するＳ−ＨＶＴ−０１２で感染させた。細胞培養培地に加えたｃＩＦＮは、β−ガラクトシダーゼの発現とＳ−ＨＶＴ−０１２力価の両方を用量依存的に低下させた。この結果は、ＨＶＴの増殖は、ニワトリインターフェロンの外因性添加により制限されることを示す。ＣＥＦ細胞中でニワトリインターフェロン活性を除去または不活性化することにより、ＣＥＦ細胞中のＨＶＴの増殖を改良するためにいくつかの方策が利用可能である。
【０３９４】
１つの態様において、ニワトリインターフェロン中和性抗体は、ニワトリインターフェロン活性を阻害し、ＣＥＦ細胞培養物中の組換えＨＶＴの増殖を改良するために、培地に加えられる。抗−ｃＩＦＮ抗体は、ニワトリインターフェロンタンパク質を注射したマウスまたはウサギの血清から得られ、好ましくはｃＩＦＮは、ニワトリインターフェロンを発現する組換え豚痘ウイルス由来である。
【０３９５】
ポックスウイルスは、免疫逃避方法としてサイトカイン阻害性タンパク質を分泌する。ある型のポックスウイルス免疫逃避機序では、サイトカインを不活性化しウイルスの複製を可能にするインターロイキン、インターフェロン、または腫瘍壊死因子のポックスウイルス可溶性受容体が関与する（６０）。本発明の１つの態様において、鶏痘ウイルスは、ニワトリインターフェロン阻害性タンパク質および他の免疫逃避タンパク質の供給源として有用である。インターフェロン活性を阻害しＨＶＴ力価を増加させるために、ＦＰＶ感染ＣＥＦ細胞培養物からの調整培地をＨＶＴ感染ＣＥＦ細胞に加える。さらなる態様において、組換えニワトリインターフェロン阻害性タンパク質または他のポックスウイルス免疫逃避タンパク質は、ＨＶＴ力価を増加させるためにＨＶＴワクチン組成物とともにベクター中で発現される。
【０３９６】
外来遺伝子を発現するために、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞が作成された（６１）。さらなる態様において、ニワトリインターフェロンのアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞株に導入して、インターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株を作製する。インターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、インターフェロン産生性ＣＥＦ細胞株中で増殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。さらなる態様において、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞に導入して、ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株を作製する。ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、ｃＭＧＦ陰性ＣＥＦ細胞株中で増殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。
【０３９７】
前記実施例で概説したように、本発明の組換えＨＶＴは、マレック病および他の疾患に対するワクチンとして有用である。ＣＥＦ細胞での組換えＨＶＴの増殖効率が上昇すれば、ワクチンの生産に有用である。
【０３９８】
なお、本発明によれば、以下のものを提供することも可能である。  
サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI＃９断片におけるXhoI部位を含む挿入領域に挿入されている組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることができるサイトカインをコードする組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０３９９】
前記のサイトカインが、ニワトリの骨髄単球性成長因子（cMGF）、ニワトリのインターフェロン（cIFN）、インターロイキン−２、インターロイキン−6、インターロイキン−12、インターフェロン群、穎粒球−マクロファージコロニー刺激性因子、またはインターロイキン受容体であることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４００】
第二の外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０１】
前記の外来性ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードしていることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０２】
前記のポリペプチドが、抗原性であることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０３】
前記のポリペプチドが大腸菌（E.coli）のベータガラクトシダーゼであることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０４】
S-HVT-144と命名されている、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０５】
抗原性ポリペプチドをコードする、前記の外来性ＤＮＡ配列が、US2遺伝子内のユニークなStuI部位を具備するシチメンチョウ・ヘルペスウイルスの挿入領域へ挿入されていることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０６】
前記のＤＮＡ配列が、以下のものよりなる群から選択される抗原性ポリペプチドを具備することを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性粘液嚢病ウイルス。
【０４０７】
前記外来性ＤＮＡ配列が、マレック病ウイルスの糖タンパク質Ａ、マレック病ウイルスの糖タンパク質Ｂ、マレック病ウイルスの糖タンパク質Ｄ、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｂ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｉ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｄ、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3、または伝染性粘液嚢病ウイルスのVP4をコードすることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０８】
前記のサイトカインが、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモータの制御下にあることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４０９】
前記のサイトカインが、異種の上流プロモータ制御下にあることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４１０】
前記のプロモータが、PRVgX、HSV-1アルファ４、HCMV極初期、MDV gA、MDV gB、MDV gD、ILT gB、BHV-1.1 VP8、及びILT gDの中から選択されることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４１１】
以下の(a)〜(c)を必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムの中に、サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を挿入することによって、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させるための相同性ベクター：
(a)通常はシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノム内には存在しない外来性の二本鎖ＤＮＡ；
(b)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI＃９断片の一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記外来性ＤＮＡの一方の末端に存在するシチメンチョウ・ヘルペスウイルス２本鎖ＤＮＡ；
(c)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI＃９断片のもう一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記外来性ＤＮＡのもう一方の末端に存在する、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス２本鎖ＤＮＡ。
【０４１２】
前記のサイトカインが、ニワトリの骨髄単球性成長因子（cMGF）、ニワトリのインターフェロン（cIFN）、インターロイキン−2、インターロイキン−6、インターロイキン−12、インターフェロン群、顯粒球・マクロファージコロニー刺激性因子、またはインターロイキン受容体であることを特徴とする、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
【０４１３】
抗原性ポリペプチドをコードする第二の外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の相同性ベクター。
【０４１４】
前記の抗原性ポリペプチドが、必須的に以下のものよりなる群から選択されることを特徴とする、上記の相同性ベクター：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性粘液嚢病ウイルス。
【０４１５】
前記の抗原性ポリペプチドが、必須的に以下のものよりなる群から選択されることを特徴とする、上記の相同性ベクター：マレック病ウイルスの糖タンパク質Ａ、マレック病ウイルスの糖タンパク質Ｂ、マレック病ウイルスの糖タンパク質Ｄ、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｂ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質１、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｄ、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3、及び伝染性粘液嚢病ウイルスのVP4。
【０４１６】
前記の外来性ＤＮＡ配列が、スクリーニング可能な標識をコードすることを特徴とする、上記の相同性ベクター。
【０４１７】
前記のスクリーニング可能な標識が、大腸菌（E. coli）のベータガラクトシダーゼ、または大腸菌（E. coli）のベータグルクロニダーゼであることを特徴とする、上記の相同性ベクター。
【０４１８】
７５１−８７．A８と命名されている、上記の相同性ベクター。
【０４１９】
７６１−０７．A１と命名されている、上記の相同性ベクター。
【０４２０】
トリをマレック病ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチンであって、上記の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。
【０４２１】
トリをニューカッスル病ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチンであって、上記の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。
【０４２２】
トリを伝染性喉頭気管炎ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチンであって、上記の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。
【０４２３】
トリをマレック病ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスに対して免疫にするのに有益な多価ワクチンであって、上記の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを具備したワクチン。
【０４２４】
トリをマレック病ウイルスに対して免疫するための方法であって、上記の効果的な投薬量のワクチンをトリに投与することを具備した方法。
【０４２５】
上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞。
【０４２６】
前記の宿主細胞がトリの細胞であることを特徴とする、上記の宿主細胞。
【参考文献】
【０４２７】
2006055171.tif 000011
2006055171.tif 000012
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【図面の簡単な説明】
【０４２８】
【図１Ａ】図１A−１CはHVT構築とマップデータの詳細である。凡例はB=BamHI、X=XhoI、H=HindIII、P=PstI、S=SalI、N=NdeI、R=EcoRIである。図１Aは、HVTゲノムのBamHI消化断片のマップを示す図である。断片は、大きい順番に番号が付けられ、文字は、比較上の大きさが決定されていない小断片を示す。
【図１Ｂ】図１Bは、HVTゲノムの、BamHIの＃１６断片を示し、これはS-HVT-001中のベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。
【図１Ｃ】図１Cは、HVTゲノムの、BamHIの＃１９断片を示し、これはベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。
【図２Ａ】図２A−２D：プラスミド191-47中への挿入。図２Aはプラスミド191-47中へ組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す図である。図２A−２Dは、プラスミド191-47中のＤＮＡ断片の間のそれぞれの結合部に位置する配列を示す（配列認識番号：20、21、22、23、24、25、26、及び27）。
【図２Ｂ】図２A−２Dは、プラスミド191-47中のＤＮＡ断片の間のそれぞれの結合部に位置する配列を示す（配列認識番号：20、21、22、23、24、25、26、及び27）。
【図２Ｃ】図２A−２Dは、プラスミド191-47中のＤＮＡ断片の間のそれぞれの結合部に位置する配列を示す（配列認識番号：20、21、22、23、24、25、26、及び27）。
【図２Ｄ】図２A−２Dは、プラスミド191-47中のＤＮＡ断片の間のそれぞれの結合部に位置する配列を示す（配列認識番号：20、21、22、23、24、25、26、及び27）。
【図３Ａ】図３A-３Bは、S-HVT-003の構築の詳細である。図３Aは、HVT ＤＮＡの、BamHI＃１６断片の領域での制限酵素地図を示す。この断片は、HindIII大断片内に含まれる。図３Aは更に、リンカと標準的なクローニング手法によりEcoRI（R）部位へまず変換された、XhoI部位を示している。図３Aは更に、相同性組み換えのためにBamHI断片に組み込まれたベータgal遺伝子、及びIBVD遺伝子の構築の詳細を示している。両方の遺伝子はともに、PRV gX遺伝子プロモータ（gX）の制御下にある。
【図３Ｂ】図３Bは、S-HVT-003ゲノムを示し、これには二つの挿入外来遺伝子、ベータgal及びIBVDの位置が含まれている。図３において、H=HindIII、B=BamHI、X=XhoI、R=EcoRI、Xb=XbaI、Hp=HpaI、S=SmaI、UL=ユニークな長領域（unique long region）、IR=内部繰り返し領域、TR=末端繰り返し領域である。
【図４】変性済みIBDVウイルス粒子に向けられた過免疫のラット抗血清を使って行った、ブロットのプロービングにより、S-HVT-003に感染した細胞（３２kDが存在する）、及びS-HVT-001に感染した細胞（３２kDが存在しない）の細胞抽出液中のIBVDの３２kDaの抗原の差動的発現を示すウェスタンブロット。この血清は、主として免疫優勢な３２kDの抗原（IBDV VP3）に反応する。ブロット中の各レーンは次のとおりである：１）タンパク分子量標準；２）非感染CEF細胞；３）S-HVT-001感染細胞；４、５、及び６）IBDVウイルス粒子のポリペプチド。
【図５】S-HVT-003に感染した細胞（４２kDが存在する）、及びS-HVT-001に感染した細胞（４２kDが存在しない）の細胞抽出液中のIBVDの４２kDaの（VP2）抗原の差動的発現を示すウェスタンブロット。VP2特異的ウサギ抗ペプチド抗血清を使って、IBDV特異的ポリペプチドが同定された。各レーンは次のとおりである：１）タンパク分子量標準；２）野生型HVTに感染したCEF細胞；３）S-HVT-001に感染した細胞；４）S-HVT-003に感染したCEF細胞、５）S-HVT-003に感染したCEF細胞、６）IBDVウイルス粒子のポリペプチド。
【図６】図６Ａ-６Ｃ：S-HVT-004構築物の詳細を示す。図６AはBamHI＃１６領域に関しての、HVT DNAの制限酵素地図である。この断片は、Hind III大断片内に含まれている。また、XhoI部位（Ｘ）も示されているが、これは挿入が行なわれた部位である。挿入前に、リンカと標準的なクローニング方法により、XhoIをまずEcoRI（R）に変換した。図６Bは相同組み換えで使用する、BamHI＃１６断片に挿入されたβ−gal遺伝子及びMDV gA遺伝子の構築の詳細を提供している。β−galは、PRV gX遺伝子プロモータ（gX）の制御下におかれ、一方MDV gA遺伝子は自身のプロモーターの制御下におかれている。図６Cは、S-HVT-004ゲノムを示し、二つの挿入外来遺伝子（β−gal、及びMDV gA）の位置を示している。図６において、Ｈ：HindIII、Ｂ＝BamHI、Ｘ＝XhoI、Ｒ＝EcoRI、Ｘｂ＝XbaI、UL：ユニークな長領域、US:ユニークな短領域、IR:内部繰り返し領域、TR:末端繰り返し領域である。
【図７Ａ】図７A-7Bは相同性ベクター４６７−２２.A12内へのβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）標識遺伝子の挿入に関しての詳細な記載である。図７Aは、標識遺伝子内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す図である。それぞれの断片の起源は、実験材料と実験方法の項に記載されている。図７Aと図７Bは、ＤＮＡ断片と標識遺伝子（配列認識番号28,29,30,31,32,及び33）の末端との間の結合部分に位置するＤＮＡ配列を示す。図７A及び図７Bは更に、適切な結合部におけるそれぞれのＤＮＡ断片を創製するのに使用した制限酵素部認識部位、及びlacZ遺伝子のコード領域の位置を示す。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限部位は、構築過程で破壊された部位の残遺物を示す。以下の略語を使用した:仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ラクトースオペロンZ遺伝子(lacZ)、大腸菌（E.coli）、ポリアデニル化シグナル（pA）、及び糖タンパク質X（gpX）。
【図７Ｂ】図７Aと図７Bは、ＤＮＡ断片と標識遺伝子（配列認識番号28,29,30,31,32,及び33）の末端との間の結合部分に位置するＤＮＡ配列を示す。図７A及び図７Bは更に、適切な結合部におけるそれぞれのＤＮＡ断片を創製するのに使用した制限酵素部認識部位、及びlacZ遺伝子のコード領域の位置を示す。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限部位は、構築過程で破壊された部位の残遺物を示す。
【図８】HVTゲノムのBamHI、及びNotI制限酵素地図である。ユニークな長領域（UL）、及びユニークな短領域（US）を示している。長及び短領域の繰り返しは四角でかこって示している。BamHI断片はサイズの大きい順に番号を付しているプローブP1-P4の位置を示してある。それぞれのプローブの起源は以下のとおりである:P1-BamHI＃６、P2-BamHI＃２、P3-BamHI＃１３、P4-HVTゲノムのXbaI断片＃５（８.０kb）の、Bgl IIからStuIまでの4.0ｋｂのサブ断片。
【図９】プラスミドpSY229の構築手順を示す図。
【図１０Ａ】図１０A-１０Bは、相同性ベクター456-18.18及び456-17.22内の、MDV遺伝子カセット挿入物の詳細な記載である。図１０A及び１０Bは、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向き、並びにMDVgA、及びgB遺伝子の位置を示す概略図である。それぞれの断片の起源は、実験材料及び実験方法の項に記載されている。それぞれの断片の間の結合部、及び標識遺伝子の末端に位置する配列は、図１０A及び１０Bに示されていて、これにはジャンクションA（配列認識番号３４）、ジャンクションB（配列認識番号３５）、及びジャンクションC（配列認識番号３６）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素認識部位は、適切な結合部（ジャンクション）に示されている。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限酵素認識部位は、構築過程中に破壊された部位の残遺物を示す。
【図１０Ｂ】図１０A及び１０Bは、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向き、並びにMDVgA、及びgB遺伝子の位置を示す概略図である。それぞれの断片の起源は、実験材料及び実験方法の項に記載されている。それぞれの断片の間の結合部、及び標識遺伝子の末端に位置する配列は、図１０A及び１０Bに示されていて、これにはジャンクションA（配列認識番号３４）、ジャンクションB（配列認識番号３５）、及びジャンクションC（配列認識番号３６）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素認識部位は、適切な結合部（ジャンクション）に示されている。
【図１１Ａ】図１１A-１１Bは相同性ベクター556.-41.5内のHind III断片挿入物の詳細な記載である。図１１A及び１１Bの該略図は、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す。それぞれの断片の起源は、実験材料と実験方法の項に記載されている。図１１Aと１１Bは更に、プラスミドのそれぞれのＤＮＡ断片の間の結合部、及び標識遺伝子の末端に位置するＤＮＡ配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号３７）、ジャンクションB（配列認識番号３８）、及びジャンクションC（配列認識番号３９）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切な結合部（ジャンクション）に記載されている。MDV gD及びgI遺伝子の一部の位置もまた、示されている。括弧（）内の番号はアミノ酸を意味し、括弧[]内の制限酵素部位は、構築過程で破壊された部位の残遺物を示す。
【図１１Ｂ】図１１A及び１１Bの該略図は、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す。それぞれの断片の起源は、実験材料と実験方法の項に記載されている。図１１Aと１１Bは更に、プラスミドのそれぞれのＤＮＡ断片の間の結合部、及び標識遺伝子の末端に位置するＤＮＡ配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号３７）、ジャンクションB（配列認識番号３８）、及びジャンクションC（配列認識番号３９）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切な結合部（ジャンクション）に記載されている。MDV gD及びgI遺伝子の一部の位置もまた、示されている。
【図１２Ａ】図１２A-１２Cは、相同性ベクター255-18.Ｂ16内のSalI断片挿入物の詳細な記載である。。図１２Aは、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す該略図を示す。それぞれの断片の起源は実験材料と実験方法の項に記載されている。図１２Aから１２Cまでは更に、それぞれの配列の間での結合部（ジャンクション）、及び標識遺伝子の末端に位置する配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号４０）、ジャンクションＢ(配列認識番号４１)、ジャンクションC(配列認識番号４２)、ジャンクションD（配列認識番号４３）、ジャンクションE（配列認識番号４４）、ジャンクションF(配列認識番号４５)、ジャンクションＧ（配列認識番号４６）、及びジャンクションH（配列認識番号４７）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切なジャンクションに示されている。NDV F及び1acZ-NDV HNハイブリッド遺伝子の位置が示されている。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限酵素部位は、構築過程で破壊された残遺物を示す。
【図１２Ｂ】図１２Aから１２Cまでは更に、それぞれの配列の間での結合部（ジャンクション）、及び標識遺伝子の末端に位置する配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号４０）、ジャンクションＢ(配列認識番号４１)、ジャンクションC(配列認識番号４２)、ジャンクションD（配列認識番号４３）、ジャンクションE（配列認識番号４４）、ジャンクションF(配列認識番号４５)、ジャンクションＧ（配列認識番号４６）、及びジャンクションH（配列認識番号４７）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切なジャンクションに示されている。NDV F及び1acZ-NDV HNハイブリッド遺伝子の位置が示されている。
【図１２Ｃ】図１２Aから１２Cまでは更に、それぞれの配列の間での結合部（ジャンクション）、及び標識遺伝子の末端に位置する配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号４０）、ジャンクションＢ(配列認識番号４１)、ジャンクションC(配列認識番号４２)、ジャンクションD（配列認識番号４３）、ジャンクションE（配列認識番号４４）、ジャンクションF(配列認識番号４５)、ジャンクションＧ（配列認識番号４６）、及びジャンクションH（配列認識番号４７）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切なジャンクションに示されている。NDV F及び1acZ-NDV HNハイブリッド遺伝子の位置が示されている。
【図１３Ａ】図１３A-１３Bは、HVTゲノムのBamHI＃１０断片の、ユニークなXhoI部位が、XhoI部位（ヌクレオチド＃1333-1338；配列認識番号４８）への合成ＤＮＡの挿入によってどのようにPacI部位、及びNotI部位へ変換されたかを示している。図１３Aは、プラスミド654-45.1(配列認識番号55)を創製するためにPacI部位へ変換されたXhoI部位を示す。
【図１３Ｂ】図１３Bはプラスミド686-63.A1（配列認識番号５６）を創製するためにNotIに変換されたXhoI部位を示す。
【図１４】HVTの長いユニーク部分（配列認識番号４８）内の挿入部位を取り囲む配列の制限酵素地図とタンパク質読み取り枠。この地図は、外来性遺伝子の挿入に使用された、XhoI制限部位（配列認識番号４８；ヌクレオチド1333-1338）を示す。また、この配列内の４つのタンパク質読み取り枠も示されている。ORF Aは、XhoI部位へのＤＮＡの挿入により分断されている。このORF Aのアミノ酸配列（配列認識番号５０；ヌクレオチド1402-602；267アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。UL54（配列認識番号４９；ヌクレオチド146-481；112アミノ酸）、及びUL55（配列認識番号51；ヌクレオチド1599-2135；179アミノ酸）は、それぞれ、単純ヘルペスウイルス１型のUL54及びUL55タンパク質に顕著な配列相同性を示している。ORF B（配列認識番号52；ヌクレオチド2634-2308；109アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。ブラスト・ソフトウェア（Blast software）を使用してNCBIデータベースのサーチを行った。
【図１５】コスミド407-32.1Ｃ1、672-01.A40、672-07.Ｃ40、及び654-45.1の制限酵素地図。HVTゲノムＤＮＡ断片であるEcoRI＃９とBamHI＃１０との重なり合う部分を示している。EcoRI＃９とBamHI＃１０断片内のユニークなXhoI部位は、プラスミド654-45.1内ではPacI部位に変換され、またプラスミド686-63．A1内ではNotI部位に変換された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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