(57)【要約】【課題】  麻痺性貝毒の検出に当たって、検出感度が低いＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分を含む場合であっても、該ＰＳＰ成分の含量を正しく定量できるようにすること。【解決手段】  本発明に係る麻痺性貝毒成分の変換方法は、Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分をヘム関連成分が含まれる中性水溶液に溶解させ、該中性水溶液に電子供与体を添加して混合溶液にし、該混合溶液をインキュベートすることにより前記麻痺性貝毒成分のＮ１位を還元させてＮ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分に定量的に変換させることによって、要するに、抗体に対する反応性の低いＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分を、反応性の高いＮ１−Ｈ型のＰＳＰ成分に変換することで、ＥＬＩＳＡ等の簡易な分析法による定量性を確保することを可能とした。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分をヘム関連成分が含まれる水溶液に溶解させ、
該水溶液に電子供与体を添加して混合溶液にし、
該混合溶液をインキュベートすることにより前記麻痺性貝毒成分のＮ１位を還元させてＮ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分に定量的に変換させること
を特徴とする麻痺性貝毒成分の変換方法。
【請求項２】
前記Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分がネオサキシトキシン、デカルバモイルネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１、ゴニオトキシン４、ゴニオトキシン６、デカルバモイルゴニオトキシン１、デカルバモイルゴニオトキシン４、C３またはC４のいずれか一種または二種以上であり、前記Ｎ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分がサキシトキシン、デカルバモイルサキシトキシン、ゴニオトキシン２、ゴニオトキシン３、ゴニオトキシン５、デカルバモイルゴニオトキシン２、デカルバモイルゴニオトキシン３、C１またはC２のいずれか一種または二種以上であること
を特徴とする請求項１に記載の麻痺性貝毒成分の変換方法。
【請求項３】
前記電子供与体は、還元型グルタチオンなどのチオール化合物や還元型アスコルビン酸などと同等の標準酸化還元電位を有するもしくはこれらよりも低い標準酸化還元電位を有する還元剤のいずれか一種または二種以上であること
を特徴とする請求項１に記載の麻痺性貝毒成分の変換方法。
【請求項４】
前記ヘム関連成分は、ヘミンなどのヘム誘導体、またはヘモグロビンなどのヘムを持つタンパク質もしくはその酵素消化物のいずれか一種または二種以上であること
を特徴とする請求項１に記載の麻痺性貝毒成分の変換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）、ゴニオトキシン１（ＧＴＸ１）またはゴニオトキシン４（ＧＴＸ４）等のＥＬＩＳＡで検出感度が低い、即ち検出困難なＮ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒（ＰＳＰ）成分を、サキシトキシン（ＳＴＸ）、ゴニオトキシン２（ＧＴＸ２）またはゴニオトキシン３（ＧＴＸ３）等のＥＬＩＳＡで検出感度が高い、即ち検出可能な麻痺性貝毒成分（ＰＳＰ成分）に変換して、ＥＬＩＳＡ等を用いて検出できるようにする麻痺性貝毒成分の変換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｈｉｍｉｚｕ（１９８４）は、亜鉛末を含む塩酸または酢酸溶液でｎｅｏＳＴＸを処理することにより、ｎｅｏＳＴＸをＳＴＸに変換できることを報告している。この方法を用いることにより、ＰＳＰ成分のＮ１位だけでなく１１位の硫酸エステルも還元的に脱離されるため、ＧＴＸ１またはＧＴＸ４についてもＳＴＸに変換することができるものである。
【０００３】
前記ＳＴＸは、化学兵器禁止条約（ＣＷＣ）により特定化合物の指定を受けているものである。このＣＷＣの締結に伴い、我が国をはじめとする各国では、ＳＴＸの使用・製造が厳しく制限されており、前記亜鉛末を含む塩酸または酢酸溶液で処理する方法によるＰＳＰ成分のＳＴＸへの変換は、前記ＣＷＣの規制からして、著しく困難な状況にある。
【０００４】
ＰＳＰ成分による貝類の毒化は世界的に拡大傾向にあり、貝を食する諸国ではマウスを用いることによる公定法で貝の毒性をモニターし、毒性が所定のレベルを超える貝については出荷を規制して、毒化貝が市場に流入することを未然に防いでいる。
【０００５】
このようなマウスを用いる試験法は、簡便で信頼性の高い方法であるが、動物試験に関する種々の問題点を有していることから、これに換わる簡易分析法の開発が急務となっている。これまで、いくつかの研究グループにより、ＰＳＰ成分の免疫学的測定法（たとえばＥＬＩＳＡ）等による簡易分析法が開発され、その一部はＥＬＩＳＡキットとして販売されている。
【０００６】
ＥＬＩＳＡキットによるＰＳＰ成分の定量分析法は、生産者や流通関係者などにおける低コストできめ細かな検査体制を敷く（確立させる）ことを可能にするものであり、二枚貝など海産生物資源の安定供給及び食品の安全性の確保という観点からも、早急に確立されるべき技術である。
【０００７】
しかしながら、現在販売されているＥＬＩＳＡキットは、いずれも代表的なＰＳＰ成分であるＳＴＸのグアニジウム基からアルデヒドを用いてキャリアタンパクに結合した抗原をもとに作成した抗体を用いて作成されており、ＳＴＸ、ＧＴＸ２またはＧＴＸ３等のＮ１−Ｈ型ＰＳＰ成分をよく検出できる反面、ｎｅｏＳＴＸ、ＧＴＸ１またはＧＴＸ４等のＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分に対する感度が著しく低く、Ｃ−ｔｏｘｉｎ群などは全く検出することができない。
【０００８】
毒化貝には、種々のＰＳＰ成分が含まれており、その組成は原因藻及び貝の種類並びに採取時期により大きく変化するものである。従って、ＰＳＰ成分分析用のＥＬＩＳＡキットは、マウス試験法に比べ著しく定量性が劣ったものになってしまうことから、ＥＬＩＳＡ法によるＰＳＰ成分簡易分析法の普及を阻む要因の一つになっていた。
【０００９】
このＰＳＰ成分簡易分析法としては、ＳＴＸの１１位にスルフヒドリル基を複数持つ任意のチオール化合物を結合させて遊離スルフヒドリル基を持つサキシトキシンスルフヒドリル誘導体を調製し、他方、スルフヒドリル基指向性の官能基をアミノ基に導入したタンパク質を調製し、次いで上記サキシトキシンスルフヒドリル誘導体と上記修飾タンパク質とを反応させて得られる抗原を非ヒト動物に免疫し、該動物から麻痺性貝毒を認識する抗血清を得ることを含む、麻痺性貝毒に対する抗体の製法が公知になっている（特許文献１参照）。
【００１０】
この特許文献１の公知技術においては、チオール化合物を介してＰＳＰ成分分子を１１位からタンパク分子と結合させることにより新規抗原を作成し、該新規抗原を用いて抗体を得るという技術である。
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−１２６９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、前記特許文献１の公知技術においては、従来のＥＬＩＳＡキットでは検出できなかったＣ−ｔｏｘｉｎ群を含む全てのＰＳＰ成分を検出し得るものであるが、Ｎ１−ＯＨ型の成分に対する検出感度が依然低いものであり、貝のＰＳＰ成分含量を正しく定量できるものではなかった。
【００１３】
従って、検出感度が低いＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分を含む場合であっても、該ＰＳＰ成分の含量を正しく定量できるようにするという、解決しなければならない課題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した従来例の課題を解決する具体的手段として本発明に係る麻痺性貝毒成分の変換方法は、Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分をヘム関連成分が含まれる水溶液に溶解させ、該水溶液に電子供与体を添加して混合溶液にし、該混合溶液をインキュベートすることにより前記麻痺性貝毒成分のＮ１位を還元させてＮ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分に定量的に変換させることを最も主要な特徴とする。
【００１５】
この発明において、前記Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分がネオサキシトキシン、デカルバモイルネオサキシトキシン、ゴニオトキシン１、ゴニオトキシン４、ゴニオトキシン６、デカルバモイルゴニオトキシン１、デカルバモイルゴニオトキシン４、C３またはC４のいずれか一種または二種以上であり、前記Ｎ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分がサキシトキシン、デカルバモイルサキシトキシン、ゴニオトキシン２、ゴニオトキシン３、ゴニオトキシン５、デカルバモイルゴニオトキシン２、デカルバモイルゴニオトキシン３、C１またはC２のいずれか一種または二種以上であること；前記電子供与体は、還元型グルタチオンなどのチオール化合物や還元型アスコルビン酸などと同等の標準酸化還元電位を有するもしくはこれらよりも低い標準酸化還元電位を有する還元剤のいずれか一種または二種以上であること；前記ヘム関連成分は、ヘミンなどのヘム誘導体、またはヘモグロビンなどのヘムを持つタンパク質もしくはその酵素消化物のいずれか一種または二種以上であること；を付加的な要件として含むものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る麻痺性貝毒成分の変換方法は、Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分をヘム関連成分が含まれる水溶液に溶解させ、該水溶液に電子供与体を添加して混合溶液にし、該混合溶液をインキュベートすることにより前記麻痺性貝毒成分のＮ１位を還元させてＮ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分に定量的に変換させるものであって、要するに、ＰＳＰのＮ１位のみを選択的に還元し、直接的には貝試料をＥＬＩＳＡ等の抗体を用いる方法で分析する際に、抗体に対する反応性の低いＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分を、反応性の高いＮ１−Ｈ型のＰＳＰ成分に変換することで、ＥＬＩＳＡ等の簡易な分析法による定量性を確保することを可能としたという優れた効果を奏する。
【００１７】
また、例えば、北太平洋沿岸で発生するＰＳＰの主成分は１１位に硫酸エステルを持つＧＴＸ群であり、選択的にＮ１位を還元した際にはＧＴＸ２，３が生じ、ＣＷＣの制限に係るＳＴＸを生じさせないという効果を奏する。
【００１８】
更に、Ｎ１位の還元の選択性は、ＰＳＰの簡易な分析法の実用化を図る上で重要なものであって、本発明によって反応収率が定量的であることをポストカラム蛍光ＨＰＬＣ法により確認することが可能であるという効果も奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を具体的な実施の形態に基づいて詳しく説明する。
本発明に係る麻痺性貝毒成分の変換方法を説明する上で、まず、その前提となる事項について説明する。
【００２０】
以下に、種々の抗原を作成する方法の例と、該抗原によるポリクローナル抗体の作成方法の例とを説明する。
【００２１】
（抗原の作成）
ＰＳＰで毒化したホタテガイの抽出液から、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２及びＢｉｏ−Ｒｅｘ ７０の各カラムクロマトグラフィーによってＧＴＸ２とＧＴＸ３の平衡混合物（ＧＴＸ２＋３）を分離精製した。
【００２２】
前記分離精製したＧＴＸ２，３を凍結乾燥し、該凍結乾燥したＧＴＸ２，３（２５μｍｏｌ）を１００ｍＬの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、これに５ｍｍｏｌの１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）を含むテトラヒドロフラン２５ｍＬを添加混合して室温で２日間穏やかに撹拌させて反応混合液を得た。
【００２３】
この反応混合液を等量のジエチルエーテルで４回抽出し、水相（下層）を４０℃で減圧下約１０ｍＬまで濃縮した。この濃縮した反応混合液の一部を希酢酸で希釈したものと、１０％の２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とで希釈したものを、それぞれ５分間沸騰浴中で加温したものをポストカラム蛍光ＨＰＬＣ法（ＰＳＰアナライザー，Ｏｓｈｉｍａ，１９９５）で分析したところ、１８μｍｏｌのＥＤＴ−ＳＴＸ複合体が得られたことを確認した。
【００２４】
１５ｍｇの牛血清アルブミン（ＢＳＡ，ＲＩＡ ｇｒａｄｅ，Ｗａｋｏ）を２．４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に溶解し、これにＧＭＢＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）１０ｍｇを６００μＬのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したものを添加混合し、室温で３０分間静置した。
【００２５】
これを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で充填したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ｆｉｎｅ，１．５×４５ｃｍ）に添加して、該緩衝液で溶出した。この溶出液の２８０ｎｍの吸収をモニターし、得られた高分子画分を合一して、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨを７．４に調整した。
【００２６】
このｐＨ７．４に調整した溶出液と、前記ＥＤＴ−ＳＴＸ複合体を含む溶液とを混合し、５℃で１晩穏やかに撹拌した後、それぞれ１Ｌの０．０３Ｎ酢酸に対して２回、水に対して２回、ＰＢＳに対して１回、順次透析した。
【００２７】
前記透析した内液をＰＢＳで３０ｍＬに定容し、ＢＳＡ−ＳＴＸ抗原溶液を作成した。この抗原溶液の一部をＵｌｔｒａｆｒｅｅ ｕｎｉｔ（ＮＭＷＬ ５，０００，Ａｍｉｃｏｎ）で処理し、得られた限外ろ液をＭＥ処理してＰＳＰアナライザーで分析した。この分析においては、一部はそのままで、一部はＭＥ処理した後に限外ろ液を調製し、それぞれＰＳＰアナライザーで分析することにより、ＢＳＡに対するサキシトキシン（ＳＴＸ）の結合量を算出した。
【００２８】
同様の手順でヒトのイムノグロブリン（ＨＧ，Ｓｉｇｍａ，Ｇ−４３８６）およびカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｗａｋｏ，０８０−０７６６６）をキャリアとする抗原を作成し、各タンパクに対するＳＴＸ結合量を前記ＰＳＰアナライザーを用いる方法と同様にして算出した。表１に、得られた各抗原溶液中の結合ＳＴＸ濃度ならびに各キャリアタンパクに対するＳＴＸ結合量を示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
（ウサギへの免疫と抗血清の性状）
前記ＢＳＡ−ＳＴＸと、ＨＧ−ＳＴＸとの各抗原溶液を、それぞれ２羽ずつ４羽のウサギ（日本白色種、体重約８００ｇ、雌）に対して以下の手順で免疫した。
【００３１】
前記ＢＳＡ−ＳＴＸと、ＨＧ−ＳＴＸとの各抗原溶液を等量のアジュバント・コンプリート・フロイントに懸濁し、１羽のウサギに対して該懸濁物を１ｍＬずつ皮下接種した。２回め以降についても１回めの場合と同様に、アジュバント・インコンプリート・フロイントで作成した懸濁物を１回めと同等量接種した。
【００３２】
免疫間隔は２週間に１回とし、３回めの免疫を行ったその１週間後（免疫開始７週後）にそれぞれの抗原を接種した４羽のウサギ（ＢＳＡ−５，ＢＳＡ−６，ＨＧ−１，ＨＧ−２）から１〜３ｍＬ採血し、遠心分離して抗血清を調製した。以後、各免疫１週間後に採血して抗血清を得た。
【００３３】
各抗血清５０μＬに等量のＳＴＸのＰＢＳ溶液を混合して１晩５℃に静置した後、限外ろ過して得たろ液をＰＳＰアナライザーで分析し、抗血清に吸収されたＳＴＸ量を定量した。また、抗血清に替えて５０μＬのＰＢＳに等量のＳＴＸ溶液を混合したものを対照とした。
【００３４】
ＳＴＸ溶液はＳＴＸの濃度がＰＢＳに対して１〜５μＭになるように調製したものを使用し、抗血清溶液は力価の上昇に応じて原液をＰＢＳで適時希釈したものを使用した。
【００３５】
図１に、各ウサギから得た抗血清の力価の経時変化を示す。この図１において、力価は血清１ｍＬあたりのＳＴＸ吸収量で表示した。いずれの抗原を免疫したウサギも、免疫開始７週めには血清１ｍＬあたり２ｎｍｏｌ以上のＳＴＸを吸収した。
【００３６】
図１のように、その後力価は徐々に上昇し、１５週めの血清では１ｍＬあたり２７〜５２ｎｍｏｌのＳＴＸを吸収した。その後は力価の急激な低下が認められた。２５週めに得た各抗血清に対し、ＳＴＸに加えてＧＴＸ１＋４（平衡混合物）、ＧＴＸ２＋３（平衡混合物）、Ｃ１＋Ｃ２（平衡混合物）、ｄｃＳＴＸおよびｎｅｏＳＴＸの吸収量を上記と同様にして調べた。
【００３７】
図２に、２５週めに各ウサギから得た各抗血清における各ＰＳＰ成分の吸収量を示す。図２より明らかなように、各血清ともにＳＴＸと、ｄｃＳＴＸとに対して同程度の高い親和性を示すことが確認されたが、ｎｅｏＳＴＸやＧＴＸ１＋４などＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分に対する親和性が低いことが理解できる。
【００３８】
更に、各ＰＳＰ成分における７週め、１１週めならびに１７週めの各抗血清による、各ＰＳＰ成分ごとの吸収量を調べたところ、２５週めとほぼ同一の傾向が認められた。
【００３９】
（ヤギへの免疫と抗血清の性状）
ＰＳＰ成分のＥＬＩＳＡによる簡易分析の実用化を行うためには、ＥＬＩＳＡを安定して供給できるようにすることが重要であるため、安定供給が可能なモノクローナル抗体を作製することが好ましい。そこで、モノクローナル抗体の作製に先立ち、多量のポリクローナル抗体を確保することを目的として、ヤギに対する免疫を行った。
【００４０】
ヤギの皮下に２週に１回、前記ＫＬＨ−ＳＴＸ抗原を毎回５００μｇ相当量を、初回はアジュバント・コンプリート・フロイント、２回目以降はアジュバント・インコンプリート・フロイントに懸濁して接種した。
【００４１】
毎週採血し、上述のウサギの場合と同様にＳＴＸの血清に対する吸収量の経時変化を調べた。加えて、免疫開始５週めならびに６週めに得た抗血清による、各ＰＳＰ成分の吸収量を測定した。
【００４２】
図３に、ヤギ抗血清の力価（ＳＴＸ吸収量の変化）を示し、図４に、ヤギ抗血清の各ＰＳＰ成分に対する吸収量を示す。ウサギの場合と同様、ヤギから得た抗血清も、Ｎ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分（ｎｅｏＳＴＸ，ＧＴＸ１＋４）に対する親和性が低い傾向が認められた。
【００４３】
（ウサギおよびヤギ抗血清からのイムノグロブリンＧ(ＩｇＧ)及びＭ(ＩｇＭ)の精製）
免疫開始１１週ならびに２７週めのＢＳＡ−６ウサギから得た血清（ＢＳＡ−６／１１ｗおよびＢＳＡ−６／２７ｗ）、および８週めに得たヤギ血清（ＫＬＨ−１／８ｗ）それぞれ５００μＬに、等量の中性飽和硫酸アンモニウムを添加し、３０分間静置した後、遠心分離（５０００ｇ×５ｍｉｎ）して上澄を除去した。
【００４４】
沈澱を５０％飽和中性硫酸アンモニウム５００μＬに懸濁し、遠心分離して得た沈澱を、ＰＢＳに溶解して５００μＬに定容した。得られたグロブリン溶液１２０μＬを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（１６ｘ６００ｍｍ；分画分子量１０−１５００Ｋｄａ）のカラムとＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用いるＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（アマーシャム・バイオサイエンス）上で分画し、ＩｇＧを含む画分とＩｇＭを含む画分に分離した。
【００４５】
それぞれＰＢＳで３６ｍＬに定容し、以下の試験に用いた。ＥＬＩＳＡプレート（ｍａｘｉｓｏｒｐ，９６ｗｅｌｌ，Ｉｗａｋｉ）の各ｗｅｌｌに１００μＭのＳＴＸを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を１００μＬずつ添加し、３７℃で２時間穏やかに撹拌した。
【００４６】
添加したＳＴＸ溶液を回収後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．３％のゼラチン（ＥＩＡ ｇｒａｄｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＰＢＳを各ｗｅｌｌに３００μＬずつ添加して３７℃で１時間穏やかに撹拌し、ブロッキングした。ブロッキング溶液を棄却後、ＰＢＳで１回洗浄してＰＳＰ成分分析用の反応プレートを作成した。
【００４７】
反応プレートの各ｗｅｌｌに、ＳＴＸのＰＢＳ溶液（０．０３〜３０００ｎＭ）を５０ｕＬずつ、次いで上記の抗体希釈液（ＩｇＧ溶液またはＩｇＭ溶液）をそれぞれ５０ｕＬずつ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
【００４８】
溶液を棄却後、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ウサギ抗ＰＳＰ抗体を用いた場合はＨＲＰ標識ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）、ヤギ抗ＰＳＰ抗体を用いた場合はＨＲＰ標識ブタ抗ヤギ抗体（ＤＡＫＯ）をＰＢＳに対して１０００倍に希釈した２次抗体溶液をそれぞれ１００μＬずつ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
【００４９】
溶液を棄却後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ｏ−フェニレンジアミン・タブレット（ＯＰＤ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ、１セットを水２０ｍＬに溶解して使用）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加して３７℃で１０分間インキュベートした。各ｗｅｌｌに２Ｎ硫酸を１００μＬ添加して発色反応を停止し、プレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で４９０ｎｍの吸収を測定した。測定は添加した各濃度のＳＴＸ溶液に対して３連で行なった。
【００５０】
上記の操作で、反応プレートにウサギおよびヤギ抗血清から調製したＩｇＧ画分を使用した場合は、図５に示すように添加したＳＴＸの濃度が高くなるに従って、発色（ＯＤ値）が低下し、プレートに固相化されたＳＴＸと添加したＳＴＸ間での抗体の競合が確認された。これに対してＩｇＭ画分を用いた場合にはＯＤ値の添加したＳＴＸ溶液の濃度に対する依存性が認められなかった。以上の結果は、ウサギ、ヤギ２種の動物が、ＰＳＰ成分に対してＩｇＧを主体とする抗体を生産していることを意味する。このＩｇＧを主体とする抗体がポリクローナル抗体である。
【００５１】
（種々のＰＳＰ成分の間接競合ＥＬＩＳＡ上での挙動）
上記の試験により、ウサギ抗血清中のＩｇＧ画分を用いて代表的なＰＳＰ成分であるＳＴＸを測定できることが確認された。
【００５２】
９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）の各ｗｅｌｌに１００μＭの濃度のＳＴＸを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５０μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＳＴＸ溶液を回収後、反応プレートに、ＳＴＸの他ｎｅｏＳＴＸ、ＧＴＸ２＋３（ＧＴＸ２とＧＴＸ３の平衡混合物）およびＧＴＸ１＋４（ＧＴＸ１とＧＴＸ４の平衡混合物）の各ＰＳＰ標品を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して段階的に希釈した溶液を添加して、これらＰＳＰ成分ごとの間接競合ＥＬＩＳＡ上での挙動を検討した。１次抗体として、免疫開始後１７週めに得たウサギ抗血清（ＨＧ−１，ＨＧ−２，ＢＳＡ−５，ＢＳＡ−６）を使用した。ＨＧ−１血清およびＨＧ−２血清は０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳＢ）に対して１５０倍、ＢＳＡ−５血清およびＢＳＡ−６血清はＰＢＳＢに対して３００倍に希釈してそれぞれ使用し、以下、上記の方法と同様に検討した。実験は同一のプレート上で３連で行なった。
【００５３】
図中、ＨＧ−１、ＨＧ−２、ＢＳＡ−５、ＢＳＡ−６の各血清をＰＳＰ成分の濃度が０  ｎＭすなわち１次抗体のプレートへの結合量が１００％（Ｂ１００）の場合のＯＤ値を１００％、１次抗体に替えて抗体を含まないＰＢＳＢを用いて行なったブランク（Ｂ０）のＯＤ値を０％として表示した。
【００５４】
図６に示すように、Ｂ１００とＢ０のＯＤの中央値（Ｂ／Ｂ０＝５０％）付近を示す各ＰＳＰ成分の濃度は、用いた抗体によって異なるがＮ１−Ｈ型成分であるＳＴＸやＧＴＸ２＋３は３〜３０ｎＭ、Ｎ１−ＯＨ型成分であるｎｅｏＳＴＸやＧＴＸ１＋４が１００〜３０００ｎＭの範囲にあった。
【００５５】
この結果は、Ｎ１−Ｈ型成分であるＳＴＸやＧＴＸ２，３はＥＬＩＳＡ法で同等の感度で検出できるのに対し、Ｎ１−ＯＨ型のｎｅｏＳＴＸやＧＴＸ１＋４は前者の１０分の１から３０分の１程度の感度でしか検出できないことを意味する。
【００５６】
（二枚貝抽出液のＰＳＰ成分分析）
岩手県大船渡湾産毒化ホタテガイ可食部の抽出液中のＰＳＰ成分を、ＰＳＰアナライザー（ＨＰＬＣ法、Ｏｓｈｉｍａ  １９９５）で分析するとともに、抽出液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で１０，１００および１０００倍に希釈し、前述の段落［００５２］に示した手順と同様に間接競合ＥＬＩＳＡで分析した。
【００５７】
抗体は上述のウサギ抗血清（ＢＳＡ−６、免疫開始後１７週め）を、比較標準には０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して１、３、１０、３０ｎＭに調製したＳＴＸ溶液を使用した。
【００５８】
図７に示すように、ホタテガイ抽出液のＰＳＰ成分含量を、ＨＰＬＣ法とＥＬＩＳＡ法で分析した場合、両者の結果には無視出来ない差が認められる。北日本沿岸に発生するＰＳＰ原因藻Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅのＰＳＰ成分はＧＴＸ４およびＧＴＸ３を主体とする。同藻の発生時、貝にはその組成を反映してＧＴＸ４，ＧＴＸ３およびそれらの異性体であるＧＴＸ１やＧＴＸ２を主成分とするＰＳＰ成分が認められるが、同藻の消失後には徐々にその組成は変化し、ｎｅｏＳＴＸやＳＴＸなどの比率が増加する。このようなＰＳＰ成分の毒化貝体内での変換は、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属以外の渦鞭毛藻が原因となる場合にも認められる。
【００５９】
ＥＬＩＳＡでのＮ１−ＯＨ型成分の検出感度が低いことは、このようなＮ１−ＯＨ型成分を多く含む毒化貝のＰＳＰの、同法による定量化を著しく困難とする主因であると考えられる。
【００６０】
（ヘム関連成分によるＮ１−ＯＨ型ＰＳＰ成分のＮ１−Ｈ型ＰＳＰ成分への変換）
次に、ヘム関連成分によるＮ１−ＯＨ型ＰＳＰ成分のＮ１−Ｈ型ＰＳＰ成分への変換について図８に基づき説明する。
【００６１】
ここで、このヘム関連成分としては例えば、ヘモグロビンなどのヘムタンパク質もしくはそのプロテアーゼ消化物、またはヘミン（Ｈｍ）などのヘムの各種誘導体（ペプチド、ヘミン等を含む）であって、これらの一種または二種以上を用いることが出来る。また、Ｎ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分は、ｎｅｏＳＴＸ、ｄｅｃａｒｂａｍｏｙｌｎｅｏＳＴＸ（ｄｃｎｅｏＳＴＸ）、ＧＴＸ１、ＧＴＸ４、ｄｃＧＴＸ１、ｄｃＧＴＸ４、ＧＴＸ６（Ｂ２）、Ｃ３またはＣ４などのいずれか一種または二種以上のことであり、Ｎ１−Ｈ型のＰＳＰ成分は、ＳＴＸ，ｄｃＳＴＸ、ＧＴＸ２、ＧＴＸ３、ｄｃＧＴＸ２、ｄｃＧＴＸ３、ＧＴＸ５（Ｂ１）、Ｃ１またはＣ２のいずれか一種または二種以上のことである。
【００６２】
精製したＧＴＸ１＋４（ＧＴＸ１とＧＴＸ４の平衡混合物）を１０％の２−メルカプトエタノール（ＭＥ）を含む中性リン酸緩衝液中で５分間煮沸すると１１位の硫酸エステルが還元的に脱離したｎｅｏＳＴＸのみを与える。この反応機構はＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２０００）に記載されている。これに対して、ＧＴＸ１＋４を主成分として含む毒化ホタテガイの中腸腺ホモジネートを同様にＭＥで処理すると、ＳＴＸを与える。この結果はＭＥが、中腸腺に含まれる何らかの生体成分の存在下ではＧＴＸ１＋４の１１位だけでなく、Ｎ１位も還元することを意味する。
【００６３】
このようなＧＴＸ１，４のＳＴＸへの還元は、貝類の中腸腺ホモジネートだけでなく、魚類やブタの肝臓のホモジネート、血球ホモジネート及び市販のヘモグロビン（Ｗａｋｏ）の溶液にＭＥを添加した場合にも認められた。
【００６４】
血球ホモジネートやヘモグロビンだけではこのような還元は認められなかったので、ヘムタンパクがＭＥによるＮ１−ＯＨ型ＰＳＰ成分のＮ１−Ｈ型ＰＳＰ成分への還元変換に必須な触媒として作用しているものと考えられた。
【００６５】
活性中心にヘムを持つチトクロームＣは、このような触媒効果を示さないが、これをタンパク分解酵素で処理したものは顕著な触媒効果を示すことから、本触媒効果にはヘムタンパクのタンパク部分は不要であるものと考えられた。ヘム中心は単独では不安定であるため、類似化合物のヘミン（Ｈｍ）を用いて種々検討したところ、以下の諸点が明かとなった。
【００６６】
要するに、Ｎ１−ＯＨ型の麻痺性貝毒成分、例えば、ｎｅｏＳＴＸ、ＧＴＸ１またはＧＴＸ４等のいずれか一種または二種以上を、ヘム関連成分、例えば、ヘミンまたはヘモグロビン等のいずれか一種または二種以上が含まれる水溶液に溶解させ、該水溶液に電子供与体、例えば、アスコルビン酸またはチオ硫酸ナトリウム等の無機成分を添加して混合溶液にし、該混合溶液をインキュベートすることにより前記麻痺性貝毒成分のＮ１位を還元させてＮ１−Ｈ型の麻痺性貝毒成分、例えば、ＳＴＸ、ＧＴＸ２またはＧＴＸ３等のいずれか一種または二種以上を定量的に変換させることができるようになるのである。このとき、ヘム関連成分が含まれる水溶液としては、弱酸性または弱塩基性等の水溶液であっても良いが、中性水溶液にすることが好ましい。
【００６７】
アスコルビン酸などの電子供与体の存在下では、Ｎ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分をヘミンなどのヘム関連成分が効率良く触媒してＮ１−Ｈ型成分に還元することが分かった。このことは、貝の抽出液中のＰＳＰ成分を抗体との反応が互いにほぼ同等になるＮ１−Ｈ型成分に全て変換し得ること、即ち、これまで不可能とされてきたＥＬＩＳＡによる貝などのＰＳＰ成分の定量を可能にできることを意味するものである。
【００６８】
つまり、
１）ＨｍとＭＥを混合した水溶液中で、ＧＴＸ１，４やｎｅｏＳＴＸはＳＴＸに還元され  る。
２）Ｈｍと、電子供与体、例えば、アスコルビン酸（ＡｓＡ）等とを含む水溶液中で、Ｇ  ＴＸ１，４はＧＴＸ２，３に還元される。
３）ＡｓＡのみの水溶液はｎｅｏＳＴＸをＳＴＸには還元しない。
４）ヒドロキノンなど酸化還元電位が比較的高い電子供与体は、Ｈｍの存在下でｎｅｏＳ  ＴＸをＳＴＸに還元しない。
５）これらの還元は中性付近でのみ効率良く進行する。
６）青酸カリウムを反応系に添加  すると、反応が抑制される。
７）Ｈｍから鉄中心を除去したヘマトポルフィリンは全く触媒効果を示さない。
８）塩化鉄やフェリシアン化カリウムは、殆ど触媒効果を示さない。
というものである。
【００６９】
以上の結果から、図９に示すような機構でヘムがＮ１−ＯＨ型成分の還元に触媒として機能しているものと推定した。ｎｅｏＳＴＸなどのＮ１−ＯＨは中性付近でＮ−Ｏ−の形に解離することが確認されている。
【００７０】
分子模型を組んで検討したところ、解離した酸素原子の陰電荷は、ｎｅｏＳＴＸの２つのグアニジウムの陽電荷が、ヘムのＣ環とＤ環上に位置する側鎖のカルボキシル基の陰電荷に引き寄せられる際、ヘム中心に位置する鉄原子の陽電荷と相対する位置に向き合うことが明かとなった。
【００７１】
ヘムはヘモグロビンだけでなく、酸化還元に関わる種々の酵素の活性中心として、生物に広く普遍的に分布している。これら酵素のタンパク部分は、反応に基質特異性を与える機能を有する。本研究の結果は活性中心であるヘム自身がＰＳＰ成分の変換反応に対して基質特異性を有することを意味し、ＰＳＰ成分の生物学的意義を考える上で重要な手がかりとなるものである。
【００７２】
還元されるＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分に対して十分量のヘミンとＡｓＡ（＝ＶＣ）やＭＥなどの水素供与体を含む中性水溶液中で煮沸した場合には、Ｎ１−ＯＨ型の成分はほぼ定量的にＮ１−Ｈ型成分に還元される。毒化ホタテガイ中腸腺の希塩酸熱浸抽出液を１００倍量の０．１ｍＭヘミン／５ｍＭ ＡｓＡ／０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）中、あるいは１００倍量の０．１ｍＭヘミン／１０％ ＭＥ／０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）中で５分間煮沸すると、ＡｓＡを用いた場合には、主要成分であるＧＴＸ１，４は全てＧＴＸ２，３に変換されるが、ＭＥを用いた場合には全ＰＳＰ成分がＳＴＸに変換される（図１０）。
【００７３】
（Ｎ１−ＯＨ型成分の変換を用いるＥＬＩＳＡ分析の定量化）
標準溶液を用いた場合にはＧＴＸ２，３などのＮ１−Ｈ型成分はＥＬＩＳＡ上でＳＴＸとほぼ等しい感度で検出されるが、一方、Ｎ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分はＨｍ／ＡｓＡ混合溶液で処理することにより、定量的にＧＴＸ２，３などのＮ１−Ｈ型の成分に変換されることが明らかになった。
【００７４】
以上の事実は、毒化貝のＰＳＰ成分を全てＮ１−Ｈ型成分に導くことにより、ＥＬＩＳＡでＰＳＰ成分の総量を定量することが可能であることを意味する。
【００７５】
そこで２００３年度の貝毒モニタリングで得た大船渡湾産ホタテガイにつき、以下に示す手順で抽出液を処理したものにつき、上記試験の場合と同様にＥＬＩＳＡで分析した。すなわち、上記の試験で得た毒化ホタテガイの希塩酸熱浸抽出液を、０．１ｍＭ Ｈｍ／１０ｍＭ ＡｓＡ／０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で１０倍に希釈して、５分間煮沸した。
【００７６】
同溶液（１ｍＬは中腸腺０．０５ｇに相当）を、ＰＢＳで１０倍および１００倍に希釈して、前記と同一の間接競合ＥＬＩＳＡにより分析した。図１１に、本試験のＥＬＩＳＡで得たホタテガイ可食部のＰＳＰ含量（線グラフ）を、希塩酸熱浸抽出液のＨＰＬＣによる分析の結果（棒グラフ）と併せて示した。図１１に示すように、両者の分析値は、いずれの時期に採取した貝試料においても、ほぼ一致することが確認された。
【００７７】
以上説明したように、
１）ＥＬＩＳＡキット開発のための抗麻痺性貝毒（ＰＳＰ成分）抗体の安定供給を目的と  して、複数のキャリアタンパクにＳＴＸを導入した抗原を作成し、これらをウサギ、ヤ  ギに接種することにより、ほぼ同等の性状を持つ抗体を得ることができ、
２）抗体に対して親和性の低いｎｅｏＳＴＸやＧＴＸ１，４などのＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ  成分を、ヘム関連成分（ヘミン等）が含まれる中性水溶液に、電子供与体（アスコルビ  ン酸等）を添加した混合溶液にし、該混合溶液をインキュベートした状態で処理するこ  とにより、抗体に対して高い親和性を持つＮ１−Ｈ型のＰＳＰ成分に変換することがで  き、
３）毒化貝中のＰＳＰ成分を、上記の技術でＮ１−Ｈ型成分に変換することにより、ＥＬ  ＩＳＡによるＰＳＰ成分の定量分析ができるようになった。
【００７８】
このように、貝試料を抗体を用いるＥＬＩＳＡ等で分析する際に、該抗体に対する反応性の低いＮ１−ＯＨ型のＰＳＰ成分を反応性の高いＮ１−Ｈ型成分に変換することにより、ＥＬＩＳＡ等の簡易分析法による定量性を確保することを可能とする。北太平洋沿岸で発生するＰＳＰ成分の主成分は、１１位に硫酸エステルを持つＧＴＸ群であり、本発明により選択的にＮ１位を還元した際にはＧＴＸ２、３が生じ、ＣＷＣの制限の対象となるＳＴＸを生じることがない。この還元の選択性は、ＰＳＰ成分の簡易分析法の実用化を図る上で重要なものであると考えられる。なお、本発明における反応収率が定量的であることは、ポストカラム蛍光ＨＰＬＣ法で確認された。
【００７９】
ｎｅｏＳＴＸやＧＴＸ群、Ｃ−ｔｏｘｉｎ群などのＰＳＰ成分はＳＴＸに比べ不安定であること、およびプレートに対する吸着性に劣ることから、これまで述べてきたＥＬＩＳＡにはＳＴＸが固相化抗原ならびに比較標準用抗原として用いられていた。ＳＴＸは前述のようにＣＷＣにより、その製造、譲渡、使用が厳しく制限されており、ＳＴＸに替るＥＬＩＳＡ分析用抗原の開発が必要であると考えられた。
【００８０】
（新規ＥＬＩＳＡ分析用抗原の作成）
ＳＴＸの代替となるＥＬＩＳＡ分析用抗原（ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ）は、図１２に概略的に示す作成手順（方法）により作成した。すなわち５０ｍｇのＮ−［２−（２−ｐｙｒｉｄｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ塩酸塩（Ｗａｋｏ，蛍光ラベル化用、以下ＰＡＥＭ）を、３００ｍｇのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｗａｋｏ，ＳＨ基酸化防止用）とともに１０ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に混合し、室温で３０分間静置した。これを水で充填したＢｉｏ−Ｒｅｘ ７０ のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈ＋型、ｆｉｎｅ、２．５×５ｃｍ）に添加し、１００ｍＬの０．０３Ｍ酢酸でカラムを洗浄後、０．２Ｍ酢酸で溶出する画分を５ｍＬずつ捕集した。３０８ｎｍに吸収を示す画分を合一し、凍結乾燥してＰＡＥＭ−ＤＴＴ結合体を得た。
【００８１】
上記のＰＡＥＭ−ＤＴＴ結合体（約１９０μｍｏｌ）を２０μｍｏｌのＧＴＸ２，３とともに、１０ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に混合し、３７℃で一晩静置した。反応混合液を、０．０３Ｍ酢酸で充填したＢｉｏ−Ｒｅｘ ７０のカラム（Ｈ＋型、ｆｉｎｅ、１×２０ｃｍ）に添加し、０．０３Ｍ酢酸５００ｍＬから１．５Ｍ酢酸５００ｍＬまでの直線濃度勾配法で溶出した。溶出液は１０ｍＬずつ捕集し、３０８ｎｍの吸光度を測定するとともに一部を希釈してＨＰＬＣ法でＧＴＸ２，３ならびにＳＴＸの濃度を調べるとともに、別の一部を１００倍量の２−メルカプトエタノール（ＭＥ）：０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４） （１：９ ｖ／ｖ）に混合し、５分間煮沸して遊離するＳＴＸ量を調べた。ＧＴＸ２，３およびＳＴＸを含まず、ＭＥ処理後にＳＴＸが遊離し、かつ３０８ｎｍに吸収が認められる画分を合一し、凍結乾燥した。
【００８２】
これを水で充填したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｆｉｎｅ、１×１０ｃｍ）に添加し、水５００ｍＬから１Ｍ酢酸５００ｍＬまでの直線濃度勾配法で溶出した。溶出液を１０ｍＬずつ捕集し、上記Ｂｉｏ−Ｒｅｘ ７０の場合と同様の方法で目的成分であるＰＡＥＭ−ＤＴＴとＳＴＸの結合体（ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ）を検出し、同成分を単離した。
【００８３】
（新規抗原のＥＬＩＳＡへの応用）
ＳＴＸ、ＰＡＥＭ−ＥＤＴ−ＳＴＸ（特許公開２００３−１２６９９）および上記で得たＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸを種々の濃度で１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、ＥＬＩＳＡプレート（ＩＷＡＫＩ ３８０１−０９６）の各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加して３７℃で２時間加温した。プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで１回洗浄した後、０．３％のゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＥＩＡ ｇｒａｄｅ）を含むＰＢＳを各ｗｅｌｌに３００μＬずつ添加し、３７℃で１時間加温した。
【００８４】
上記のプレートを０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで１回洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液に対して種々の濃度に調製したＳＴＸ溶液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加した。
【００８５】
これにさらに２５週めに採血した抗ＰＳＰウサギ血清（ＢＳＡ−６、２５ｗ）を０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳに対して２００倍に希釈した溶液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加して、３７℃で１時間加温した。そして、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳに対して１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ−ブタ抗体（ＤＡＫＯ，Ｐ０３９９）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加して、３７℃で１時間加温した。
【００８６】
上記のプレートを０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、発色試薬溶液（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、３７℃で１５分間加温した。各ｗｅｌｌに１００μＬずつの２Ｎ硫酸を添加して発色を停止した後、プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｍｏｄｅｌ ６８０）上で４９０ｎｍの吸収を測定した。実験は添加した同一濃度のＳＴＸに対して３連で行ない、この濃度が０すなわちＳＴＸ溶液に代えてリン酸緩衝液を添加した場合をＢ１００とした。
【００８７】
その結果、図１３に示すようにＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ（ＰＤ−ＳＴＸ）ならびにＰＡＥＭ−ＥＤＴ−ＳＴＸ（ＰＥ−ＳＴＸ）を固相化したプレートを用いた場合、添加したＳＴＸの濃度が増加するに従って吸光度（ＯＤ）が顕著に低下するのに対し、ＳＴＸを固相化したプレートではＢ１００に対応するＯＤ値が低く、添加したＳＴＸの濃度の増加に伴うＯＤ値の減少も顕著ではなかった。ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸはかなりの低濃度でも充分固相抗原として使用することが可能であることが明かとなった。
【００８８】
１００ｎＭのＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸを固相化し、０．３％ゼラチンでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレート上に、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して種々の濃度に調製したＳＴＸ、ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸならびにＰＡＥＭ−ＥＤＴ−ＳＴＸをそれぞれ５０μＬずつ添加した。以下、前記［００８５］〜［００８６］に記載した手順により、これらＳＴＸ誘導体とＳＴＸのＥＬＩＳＡ上での挙動を比較検討した。
【００８９】
その結果、図１４に示すように同一濃度を添加した場合のＰＡＥＭ−ＥＤＴ−ＳＴＸならびにＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸを添加した場合に得られるＯＤ値は、いずれの濃度においてもＳＴＸのそれとほぼ同一であることを確認した。以上の結果から、ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸはＥＬＩＳＡ分析において比較標準としてＳＴＸの代替となることが確認された。
【００９０】
このようにＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸなどの人工誘導体を用いることにより、ＣＷＣに抵触するＳＴＸを一切使用することなしに、ＥＬＩＳＡによりＰＳＰ成分を分析することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】２種の抗原を２羽ずつ免役した４羽のウサギから得た各血清の力価の経時変化を示すグラフである。
【図２】免疫開始２５周めに得た４羽のウサギ抗血清による種々のＰＳＰ成分の吸収量をそれぞれ示すグラフである。
【図３】ＫＬＨ−ＳＴＸを免役したヤギから得た抗血清の力価の経時変化を示すグラフである。
【図４】免疫開始５周めおよび６周めのヤギ抗血清による種々のＰＳＰ成分の吸収量をそれぞれ示すグラフである。
【図５】ウサギおよびヤギ抗血清から調整したＩｇＧ区分ならびにＩｇＭ区分を用いる間接競合ＥＬＩＳＡ（固相：ＳＴＸ）上での、添加したＳＴＸの濃度とＯＤ値の関係をそれぞれ示すグラフである。
【図６】間接競合ＥＬＩＳＡ上で濃度ごとに２連で行った実験においいて各ＰＳＰ成分の挙動をそれぞれ示すグラフであり、１次抗体として、免疫開始１７週後に得た抗血清で、ＰＢＳＢによりＢＳＡ−５，ＢＳＡ−６は３００倍に、ＨＧ−１，ＨＧ−２は１５０倍にそれぞれ希釈したものを使用した例である。
【図７】ホタテガイのＰＳＰ含量の推移をＨＰＬＣ（棒グラフ）並びにＥＬＩＳＡ（線グラフ）で算出した値を示すグラフである。
【図８】ＰＳＰ成分のＮ１位およびＣ１１位における還元変換の状況を示す説明図である。
【図９】ヘムと電子供与体によるＮ１−ＯＨ型ＰＳＰ成分のＮ１−Ｈ型ＰＳＰ成分への還元状況を示す説明図である。
【図１０】毒化ホタテガイの希塩酸抽出液を未処理の場合とＡｓＡ処理およびＭＥ処理した場合における抽出液中のＰＳＰ成分の変換状況を示すグラフである。
【図１１】ホタテガイのＰＳＰ含量の推移をＨＰＬＣ（棒グラフ）並びにＥＬＩＳＡ（線グラフ）で算出した値を示すグラフである。
【図１２】ＳＴＸの代替えとなるＥＬＩＳＡ分析抗原（ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ）の作成手順を略示的に示した説明図である。
【図１３】同ＥＬＩＳＡ分析抗原（ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ）を用い、ＳＴＸ、ＰＤ−ＳＴＸおよびＰＥ−ＳＴＸを固相化したプレートを用いるＥＬＩＳＡ上でのＳＴＸ評品の反応をそれぞれ示すグラフである。
【図１４】同ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸ固相化プレートと抗ＰＳＰウサギ血清（ＢＳＡ−６、２５週目）を用いるＥＬＩＳＡ上でのＳＴＸ、ＰＡＥＭ−ＤＴＴ−ＳＴＸおよびＰＡＥＭ−ＥＤＴ−ＳＴＸ標準溶液の挙動を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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