(57)【要約】【課題】カルボン酸配糖体およびカルボン酸を配糖化する方法を提供すること。【解決手段】カルボン酸の配糖化方法であって、カルボン酸と、グルコースドナーとに水溶液中のスクロースホスホリラーゼを作用させて、カルボン酸配糖体を得る工程を包含し、作用開始時の該水溶液のｐＨが、該スクロースホスホリラーゼがハイドロキノンにグルコースを結合させる反応における至適ｐＨよりも酸性側のｐＨである、方法が提供される。カルボン酸のカルボキシル基と、グルコースの１位、２位、３位または４位のＯＨ基とがエステル結合したカルボン酸配糖体であって、ただし、１位にβ結合した化合物ではない配糖体もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボン酸の配糖化方法であって、カルボン酸と、グルコースドナーとに水溶液中のスクロースホスホリラーゼを作用させて、カルボン酸配糖体を得る工程を包含し、作用開始時の該水溶液のｐＨが、該スクロースホスホリラーゼがハイドロキノンにグルコースを結合させる反応における至適ｐＨよりも酸性側のｐＨである、方法。
【請求項２】
前記ｐＨが、１．０〜７．４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが、３．０〜７．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記作用開始時のｐＨと前記至適ｐＨとの差が０．３〜６．０の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作用開始時のｐＨと前記至適ｐＨとの差が１．０〜３．０の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選択される属に属する細菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記スクロースホスホリラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸の分子量が、４６〜８７０である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カルボン酸がモノカルボン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記カルボン酸が、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基のいずれも有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記カルボン酸が水溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルボン酸が水に難溶性または不溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カルボン酸が植物抽出液中に存在する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記カルボン酸が、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、かつ水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルボン酸が、Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより表され、ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される炭素数０〜２０の基であって、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記カルボン酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、センノシドＡ、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記グルコースドナーが、スクロース、グルコース−１−リン酸またはグルコース−１−フルオリドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
反応開始後の前記水溶液中に前記カルボン酸または酸性物質を添加して、ｐＨがアルカリ側に変化することを抑制する工程を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
反応終了時のｐＨが３．０〜７．０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カルボン酸のカルボキシル基と、グルコースの１位、２位、３位または４位のＯＨ基とがエステル結合したカルボン酸配糖体であって、ただし、１位にβ結合した化合物ではない、配糖体。
【請求項２２】
前記カルボキシル基と、前記ＯＨ基とがα結合している、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２３】
分子量が２０８〜１０３２である、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２４】
前記カルボン酸がモノカルボン酸である、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２５】
前記カルボン酸が、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基のいずれも有さない、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２６】
前記カルボン酸が水溶性である、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２７】
前記カルボン酸が水に難溶性または不溶性である、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２８】
前記カルボン酸が植物抽出液中に存在する化合物である、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項２９】
請求項２１に記載のカルボン酸配糖体であって、該カルボン酸が、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、そして水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択される、配糖体。
【請求項３０】
請求項２１に記載のカルボン酸配糖体であって、該配糖体が、構造Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｇｌｃを有し、ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される炭素数０〜２０の基であって、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されている、配糖体。
【請求項３１】
前記カルボン酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、センノシドＡ、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の配糖体。
【請求項３２】
前記カルボキシル基が、グルコースの１位のＯＨ基とエステル結合している、請求項２１に記載のカルボン酸配糖体。
【請求項３３】
請求項２１に記載のカルボン酸配糖体を含む、食品および食品添加物。
【請求項３４】
請求項２１に記載のカルボン酸配糖体を含む、医薬品および医薬部外品。
【請求項３５】
請求項２１に記載のカルボン酸配糖体を含む、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボン酸配糖体およびカルボン酸を配糖化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の化合物を配糖化して得られた配糖化合物は、配糖化前の化合物よりも安定性および溶解性が高いことが多い。そのため、種々の化合物の配糖化が行われている。これまでに知られている配糖化反応の例としては、以下の反応が挙げられる：
ｉ：糖または糖残基にさらに糖を転移させる反応（例えば、ＣＧＴａｓｅによる配糖化（例えば、酵素処理ヘスペリジン））；
ｉｉ：アルコール性のＯＨに糖を転移させる反応（例えば、α−グルコシダーゼによる配糖化（例えば、α−エチルグルコサイド））；
ｉｉｉ：フェノール性のＯＨに糖を転移させる反応（例えば、転移型α−アミラーゼまたはスクロースホスホリラーゼによる配糖化（例えば、α−アルブチン））。
【０００３】
これらはいずれも、ＯＨ基（水酸基）を配糖化する方法である。
【０００４】
さらに、水酸基以外の官能基を配糖化する反応としては、ｉｖ：チオール基（−ＳＨ）へ糖を転移させる反応（例えば、β−フラクトフラノシダーゼによる配糖化（例えば、Ｓ−フラクトフラノシド））などが知られている。
【０００５】
しかし、糖転移酵素を用いてカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に糖転移する方法は知られていない。
【０００６】
糖転移酵素以外の酵素を用いて、カルボキシル基を配糖化する方法としては、リパーゼによるグルコースとオクタン酸とのエステル化についての報文（非特許文献１：「ＬＩＰＡＳＥ  ＣＡＴＡＬＹＺＥＤ  ＡＣＹＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＬＵＣＯＳＥ」，Ｇｕｄｒｕｎ  Ｌｊｕｎｇｅｒ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａｄｌｅｒｅｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｏ  Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＬＥＴＴＥＲＳ．，Ｖｏｌ．１６  Ｎｏ．１１（１９９４）１１６７−１１７２）が公知である。非特許文献１によれば、リパーゼを用いることにより、オクタン酸のカルボキシル基とグルコースの６位のＯＨ基とを結合することができる。この反応は、リパーゼの縮合反応を利用しており、脂肪酸のカルボキシル基にしか糖残基を結合できない。それゆえ、汎用性が低い。また、グルコースの６位以外の位置で配糖化することはできない。
【０００７】
さらに別の方法として、植物細胞を用いてカルボキシル基へ糖が結合した配糖体を製造する方法が公知である。特許文献１（特開平１０−１７５９８９；「パラアミノ安息香酸配糖体、その製造方法およびそれを有効成分とする製剤」村田允）は、ユーカリ属植物の細胞培養を行い、そこヘパラアミノ安息香酸を投与してパラアミノ安息香酸のカルボキシル基にグルコースが結合した配糖体を製造する方法を開示する。特許文献１は、植物内の配糖化酵素の働きにより、パラアミノ安息香酸のカルボキシル基にグルコース１位のＯＨ基がエステル結合した化合物が得られると記載する。しかし、特許文献１は、この配糖化酵素が具体的にどのような酵素であるかについて記載していない。この方法では、細胞培養を用いるので、この方法により得られる配糖体は、β型の配糖体である。特許文献１は、この方法により得られた配糖体が、紫外線防御剤として有効であると記載している。
【０００８】
酵素を用いた方法でカルボン酸を配糖化する方法は、この方法以外には公知ではない。一方、化学的方法を用いてカルボン酸を配糖化する方法は公知である。
【０００９】
特許文献２（特開平６−２９３７８９号公報；「多価不飽和脂肪酸類配糖体およびその製造法」帝人株式会社）は、多価不飽和脂肪酸類配糖体およびその製造法を開示する。この方法は、多価不飽和脂肪酸をまず誘導体化し、その後化学的に糖を結合させて配糖体を得る方法である。具体的には、ドコサヘキサエン酸などの多価不飽和脂肪酸と糖類とが糖エステルを形成したものが記載されており、糖がその中に１級アルコールを有する場合はその部位で、それ以外の場合は１位でカルボン酸と縮合し、糖エステルを形成する。グルコースの場合は６位で糖エステルを形成する。化学的合成方法では、煩雑な反応ステップが何段階も必要であり、製造コストが非常に高価になるという欠点がある。また、グルコースの６位以外の位置で結合することはできない。
【００１０】
ところで、スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７）は、ショ糖を加リン酸分解して、α−Ｄ−グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）とフラクトースとを生成する反応を触媒する公知の酵素であり、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｒｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓなどの微生物を使用して容易に得ることができる。
【００１１】
スクロースホスホリラーゼは、次の２種の糖転移反応を触媒することが知られている：（１）Ｇ１Ｐ  ＋  Ａｃｐ  ＝  Ｇｌｃ  −  Ａｃｐ  ＋  Ｐｉ  ；および
（２）スクロース  ＋  Ａｃｐ  ＝  Ｇｌｃ  −  Ａｃｐ  ＋  Ｆｒｕ
（Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸；Ａｃｐ：水酸基を有するアクセプター；Ｇｌｃ：グルコース；Ｐｉ：無機リン酸：Ｆｒｕ：フルクトース）。
【００１２】
スクロースホスホリラーゼは、上記２つの反応においてアクセプター（Ａｃｐ）の水酸基（−ＯＨ）にグルコースの１位の水酸基をグルコシド結合させる酵素である。
【００１３】
これらの反応を利用した配糖体の製造方法は公知である。例えば、非特許文献２（「α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ａｒｕｂｕｔｉｎ」，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｋｉｔａｏ，Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓｅｋｉｎｅ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５８  Ｎｏ．１（１９９４）３８−４２）は、スクロースホスホリラーゼを利用した水酸基への糖転移反応を開示する。非特許文献２は、フェノール性ＯＨ基を有する化合物にスクロースなどの存在下でスクロースホスホリラーゼを作用させ、フェノール配糖体を得る方法を開示する。非特許文献２は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のスクロースホスホリラーゼを使用している。非特許文献２は、このスクロースホスホリラーゼが、フェノール性のＯＨ基およびアルコール性のＯＨ基にグルコースを１位で転移できるが、カルボキシル基には糖転移できないと記載している（要約部分）。
【００１４】
特許文献３（特開平５−１７６７８６号公報；「カテキン類配糖体の製造法」キッコーマン株式会社）は、カテキン類とグルコース−１−リン酸またはスクロースとの混合溶液にスクロースホスホリラーゼを作用させ、カテキン類配糖体を得る方法を記載する。特許文献３は、従来の技術として、カテキンと澱粉にサイクロデキストリン合成酵素を作用させてカテキン類グルコシドを生成させる方法（農芸化学会会誌６５巻、３号、第５頁）について言及している。いずれもカテキンの水酸基にグルコースがα結合した形である。特許文献３は、スクロースホスホリラーゼを用いることにより、カルボン酸のカルボキシル基にグルコースを結合させることができることについては全く記載していない。
【００１５】
特許文献４（特開平６−１３５９８７号公報；「フラノン配糖体及びその製造法」キッコーマン株式会社）は、ハイドロキシフラノンに糖供与体存在下、スクロースホスホリラーゼを作用させることによりフラノン配糖体を得る方法を開示する。特許文献４は、糖供与体として、グルコース−１−リン酸またはスクロースを挙げている。特許文献４に開示されるフラノン配糖体は、ハイドロキシフラノンの水酸基にグルコースがα結合した形である。特許文献４は、スクロースホスホリラーゼを用いることにより、カルボン酸のカルボキシル基にグルコースを結合させることができることについては全く記載していない。
【００１６】
特許文献５（特開平６−５６８７２号公報；「コウジ酸配糖体およびその製造法」キッコーマン株式会社）は、コウジ酸にグルコース−１−リン酸またはスクロースの存在下でスクロースホスホリラーゼを作用させ、コウジ酸配糖体を得る方法を開示する。特許文献５に開示される配糖体は、コウジ酸の水酸基にグルコースがα結合した形である。特許文献５は、スクロースホスホリラーゼを用いることにより、カルボン酸のカルボキシル基にグルコースを結合させることができることについては全く記載していない。
【００１７】
特許文献６（特開平６−１５３９７６号公報；「フェノール配糖体の製造法」キッコーマン株式会社）は、フェノール化合物にグルコース−１−リン酸またはスクロースなどの存在下でスクロースホスホリラーゼを作用させ、フェノール配糖体を得る方法を開示する。特許文献６に開示される配糖体は、フェノール性水酸基にグルコースなどの糖類が結合した形である。特許文献６は、スクロースホスホリラーゼを用いることにより、カルボン酸のカルボキシル基にグルコースを結合させることができることについては全く記載していない。
【００１８】
スクロースホスホリラーゼについての文献は多数ある（例えば、非特許文献３〜５）。しかし、これらの文献には、スクロースホスホリラーゼがカルボキシル基に糖転移できるか否かについては全く記載がない。
【００１９】
このように、スクロースホスホリラーゼは従来、水酸基以外の官能基に糖転移を行うという報告はなく、カルボキシル基には糖転移できないと考えられていた。
【特許文献１】特開平１０−１７５９８９号公報（第１〜３頁）
【特許文献２】特開平６−２９３７８９号公報（第１頁）
【特許文献３】特開平５−１７６７８６号公報（第１頁）
【特許文献４】特開平６−１３５９８７号公報（第１頁）
【特許文献５】特開平６−５６８７２号公報（第１頁）
【特許文献６】特開平６−１５３９７６号公報（第１頁）
【非特許文献１】「ＬＩＰＡＳＥ  ＣＡＴＡＬＹＺＥＤ  ＡＣＹＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＬＵＣＯＳＥ」，Ｇｕｄｒｕｎ  Ｌｊｕｎｇｅｒ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａｄｌｅｒｅｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｏ  Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＬＥＴＴＥＲＳ．，Ｖｏｌ．１６  Ｎｏ．１１（１９９４）１１６７−１１７２
【非特許文献２】「α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ａｒｕｂｕｔｉｎ」，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｋｉｔａｏ，Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓｅｋｉｎｅ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５８  Ｎｏ．１（１９９４）３８−４２
【非特許文献３】「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ」，ＪＯＨＮ  Ｊ．Ｍｉｅｙａｌ，Ｍａｒｃｉａ  Ｓｉｍｏｎ，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈ．Ａｂｅｌｅｓ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２４７，Ｎｏ２，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２５（１９７２）５３２−５４２
【非特許文献４】「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａ  Ｇｅｎｅ（ｇｔｆＡ）  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  Ｉｎｇｂｒｉｔｔ」，ＪＯＳＥＰＨ  Ｊ．ＦＥＲＲＥＴＴＩ  ，ＴＩＮＧ−ＴＩＮＧ  ＨＵＡＮＧ，ａｎｄ  ＲＯＹ  Ｒ．Ｂ．ＲＵＳＳＥＬＬＩｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｎｅ（１９８８）１５８５−１５８８
【非特許文献５】「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ｇｔｆＡ  Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ」，ＲＯＹ  Ｒ．Ｂ．ＲＵＳＳＥＬＬ，ＨＩＤＥＨＩＫＯ  ＭＵＫＡＳＡ，ＡＴＳＵＮＡＲＩ  ＳＨＩＭＡＭＵＲＡ，ａｎｄ  ＪＯＳＥＰＨ  Ｊ．ＦＥＲＲＥＴＴＩ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，Ｊｕｎｅ（１９８８）２７６３−２７６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、カルボン酸配糖体およびカルボン酸を配糖化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酸性から弱アルカリ性の条件下でスクロースホスホリラーゼを用いることにより、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）が新規の糖転移反応を触媒し、カルボン酸を配糖化できることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２２】
今回、本発明者らは、スクロースホスホリラーゼを用いた糖転移反応の検討を行い、転移酵素であるスクロースホスホリラーゼがカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する各種物質にグルコースを転移することを初めて明らかにした。
【００２３】
本発明の方法は、カルボン酸の配糖化方法であって、カルボン酸と、グルコースドナーとに水溶液中のスクロースホスホリラーゼを作用させて、カルボン酸配糖体を得る工程を包含し、作用開始時の該水溶液のｐＨが、該スクロースホスホリラーゼがハイドロキノンにグルコースを結合させる反応における至適ｐＨよりも酸性側のｐＨである。
【００２４】
１つの実施形態では、上記ｐＨは、１．０〜７．４であり得る。
【００２５】
１つの実施形態では、上記ｐＨは、３．０〜７．０であり得る。
【００２６】
１つの実施形態では、上記作用開始時のｐＨと上記至適ｐＨとの差は０．３〜６．０の範囲内であり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記作用開始時のｐＨと上記至適ｐＨとの差は１．０〜３．０の範囲内であり得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選択される属に属する細菌由来であり得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来であり得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに由来し得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記カルボン酸の分子量は、４６〜８７０であり得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記カルボン酸はモノカルボン酸であり得る。
【００３３】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基のいずれも有さない。
【００３４】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は水溶性であり得る。
【００３５】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は水に難溶性または不溶性であり得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は植物抽出液中に存在する化合物であり得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、かつ水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択され得る。
【００３８】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより表され得、ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される炭素数０〜２０の基であって、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００３９】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、センノシドＡ、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択され得る。
【００４０】
１つの実施形態では、上記グルコースドナーは、スクロース、グルコース−１−リン酸またはグルコース−１−フルオリドであり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明の方法はさらに、反応開始後の前記水溶液中に前記カルボン酸または酸性物質を添加して、ｐＨがアルカリ側に変化することを抑制する工程を包含し得る。
【００４２】
１つの実施形態では、反応終了時のｐＨは３．０〜７．０であり得る。
【００４３】
本発明のカルボン酸配糖体は、カルボン酸のカルボキシル基と、グルコースの１位、２位、３位または４位のＯＨ基とがエステル結合したカルボン酸配糖体であって、ただし、１位にβ結合した化合物ではない。
【００４４】
１つの実施形態では、上記カルボキシル基と、上記ＯＨ基とはα結合し得る。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明のカルボン酸配糖体の分子量は、２０８〜１０３２であり得る。
【００４６】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、モノカルボン酸であり得る。
【００４７】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基のいずれも有さない。
【００４８】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は水溶性であり得る。
【００４９】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は水に難溶性または不溶性であり得る。
【００５０】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は植物抽出液中に存在する化合物であり得る。
【００５１】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、かつ水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択され得る。
【００５２】
１つの実施形態では、上記配糖体は、構造Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｇｌｃを有し得、ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される炭素数０〜２０の基であって、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００５３】
１つの実施形態では、上記カルボン酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、センノシドＡ、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択され得る。
【００５４】
１つの実施形態では、上記カルボキシル基は、グルコースの１位のＯＨ基とエステル結合し得る。
【００５５】
本発明の食品および食品添加物は、上記カルボン酸配糖体を含む。
【００５６】
本発明の医薬品および医薬部外品は、上記のカルボン酸配糖体を含む。
【００５７】
本発明の化粧品は、上記のカルボン酸配糖体を含む。
【発明の効果】
【００５８】
本発明により、カルボン酸配糖体およびその製造方法が提供される。分子内にカルボキシル基を有する化合物は多数存在しており、その中には生理活性を有する物質が多く含まれている（例えば、脂肪酸、アミノ酸、有機酸、漢方成分等）。これらの物質を配糖化することによって次のような効果およびメリットが得られる：
（１）安定性を向上させる；
（２）溶解性を向上させることにより、生体吸収性を向上できる；
（３）味およびにおいがマイルドになる；
（４）配糖体が共存することによってアクセプターおよびアクセプターと構造が類似の化合物の溶解度も向上するという、可溶化効果が得られる；
（５）刺激性および毒性を低下させる。
【００５９】
本発明の製造方法は、カルボン酸配糖体を酵素的に合成できるため、以下のようなメリットが得られる：
（１）化学合成のような繁雑なステップを踏まずに簡便に合成できるため、製造が容易である。製造が容易であることから、コストメリットも得られる；
（２）揮発性の高い有機溶媒を使用せずに製造可能であるので、安全面およびコスト面で有利である；
（３）有機溶媒を使用せずに合成できるので、食品に使用できる可能性がある；ならびに
（４）陰イオン交換樹脂を用いることにより、煩雑なステップを踏まずに１ステップでカルボン酸配糖体とカルボン酸とを容易に分離できるため、精製のコストが安い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００６１】
（１．カルボン酸配糖体）
本明細書中では、カルボン酸配糖体とは、カルボン酸のカルボキシル基と、グルコースの１位、２位、３位または４位のＯＨ基とがエステル結合した化合物をいう。本発明のカルボン酸配糖体においては、好ましくはグルコースがα結合しており、より好ましくはグルコースの１位でα結合している。本発明のカルボン酸配糖体は、１位にβ結合した化合物ではない。本発明のカルボン酸配糖体においては、カルボキシル基は、グルコース中の１位、２位、３位および４位のうちの任意の位置のＯＨ基とエステル結合している。好ましくは、１位においてエステル結合している。
【００６２】
本発明の方法で用いられるカルボン酸がモノカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシドである。本発明の方法で用いられるカルボン酸がジカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシド、２つのグルコースによって配糖化されたジグルコシドまたはそれらの混合物である。本発明の方法で用いられるカルボン酸がトリカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシド、２つのグルコースによって配糖化されたジグルコシド、３つのグルコースによって配糖化されたトリグルコシドまたはそれらの混合物である。４つ以上のカルボキシル基を有するカルボン酸を用いた場合についても同様である。本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、単一のカルボン酸配糖体であっても、種々のカルボン酸配糖体の混合物であってもよい。カルボン酸配糖体は、純粋な化合物であっても、純度の低い混合物であってもよい。
【００６３】
１つの分子中に複数のカルボキシル基を有する化合物を用いた場合に、配糖化されるカルボキシル基の数は、主に、反応時間および酵素量を調節することにより制御され得る。
【００６４】
本発明のカルボン酸配糖体においては、カルボン酸のカルボキシル基と、グルコースのＯＨ基とがエステル結合しているため、体内に投与した場合に体内環境（例えば、酵素、ｐＨの変化など）によってこのエステル結合が分解されて、カルボン酸とグルコースとが生成され得る。そのため、カルボン酸が人体に対して有意な生理活性を有する場合、生体内でその効果を発揮し得る。
【００６５】
本発明のカルボン酸配糖体は、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、かつ水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択されるカルボン酸と、グルコース残基とが結合したカルボン酸配糖体であり得る。
【００６６】
本発明のカルボン酸配糖体は、特定の場合には、構造Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｇｌｃによって示すことができる。ここで、Ｒ１は、任意のカルボン酸残基であり得る。本明細書中では、「カルボン酸残基」とは、カルボン酸から、１つの−ＣＯＯＨを除いて残る部分をいう。
【００６７】
本発明のカルボン酸配糖体が構造Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｇｌｃによって示される場合、Ｒ１は、好ましくは、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されている。
【００６８】
１つの化合物内に、ある基（例えば、アルキル、アリールなど）が２つ以上存在する場合、それぞれの出現箇所での定義は、それ以外の出現箇所での定義とは無関係である。置換基の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物を生じる場合にのみ許容される。
【００６９】
本明細書中では、「アルキル基」とは、直鎖状、分枝鎖状または環状の、飽和炭化水素鎖から１個の水素原子を除いて誘導された一価基を意味する。アルキル基の炭素数は、任意の数であり得るが、好ましくは１個〜２０個であり、より好ましくは１個〜１５個であり、さらに好ましくは１個〜１０個であり、さらにより好ましくは１個〜８個であり、最も好ましくは、１個〜６個である。アルキル基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００７０】
本明細書中では、「アシル基」とは、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−基、アルキル−Ｃ（Ｏ）−基、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−基、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−基またはシクロアルキニル−Ｃ（Ｏ）−基を意味し、ここで、種々の基は、上記の通りである。親部分に対する結合は、カルボニルを介する。好ましいアシルは、低級アルキルを含む。適切なアシル基の非限定的な例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、２−メチルプロパノイルおよびシクロヘキサノイルが挙げられる。アシル基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００７１】
本明細書中では、「アルケニル基」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、直鎖状または分枝鎖状の、脂肪族炭化水素基から１個の水素原子を除いて誘導された基を意味する。アルケニル基の炭素数は、２以上の任意の数であり得るが、好ましくは２個〜２０個であり、より好ましくは２個〜１５個であり、さらに好ましくは２個〜１０個であり、さらにより好ましくは２個〜８個であり、最も好ましくは、２個〜６個である。分枝鎖とは、１つ以上の低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、またはプロピル）が、直鎖アルケニル鎖に結合していることを意味する。「低級アルケニル」とは、鎖中の約２〜約６個の炭素原子を意味し、この鎖は、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。用語「置換アルケニル」とは、アルケニル基が１つ以上の置換基によって置換され得ることを意味し、これらの置換基は、同じであっても異なっていてもよい。アルケニル基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。適切なアルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、および３−メチルブト−２−エニルが挙げられる。
【００７２】
本明細書中では、「アリール基」とは、６個〜１４個の炭素原子を有し少なくとも１個のベンゼノイド環を有する炭素環式基から１個の水素原子を除いて誘導された基を意味する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、インデニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、アントラセニル、フルオレニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基においては、炭素環式基の全ての利用できる置換可能な芳香族炭素原子は、任意の基によって置換され得る。アリール基は、好ましくは、１個、２個または３個の置換基で置換される。アリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００７３】
本明細書中では、「ヘテロアリール基」とは、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ＝からなる群から独立して選択される１個〜３個のヘテロ原子を含有する、５員または１０員の単一またはベンゾ縮合芳香環から１個の水素原子を除いて誘導された基を意味するが、但し、これらの環は、隣接酸素および／またはイオウ原子を含まない。このヘテロアリール基は、好ましくは、１個、２個または３個の置換基で置換される。ヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００７４】
上記で置換が行われ、置換基がアリール基Ｒ２である場合、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換され得る。
【００７５】
本発明のカルボン酸配糖体は、特定の場合には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸（例えば、ｏ−クマル酸、ｐ−クマル酸、またはｍ−クマル酸、より好ましくはｏ−クマル酸またはｐ−クマル酸）、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸（例えば、ｏ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸またはｍ−アミノ安息香酸、より好ましくはｏ−アミノ安息香酸またはｐ−アミノ安息香酸）、ジヒドロキシ安息香酸、トリヒドロキシ安息香酸（例えば、２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸、２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸または３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸ともいう）、好ましくは、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸（例えば、３−メチルサリチル酸、４−メチルサリチル酸、５−メチルサリチル酸または６−メチルサリチル酸、好ましくは４−メチルサリチル酸）、ヒドロキシ安息香酸（例えば、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸ともいう）、３−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸、好ましくは２−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸）、センノシドＡ、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択されるカルボン酸と、グルコース残基とが結合したカルボン酸配糖体であり得る。
【００７６】
（２．カルボン酸）
本発明のカルボン酸配糖体を作製するために用いられるカルボン酸は、任意のカルボン酸であり得る。
【００７７】
本発明の方法で用いられるカルボン酸は、１以上のカルボキシル基を有する。カルボキシル基の数は、構造的に安定な限り、１、２、３またはそれより多数の任意の整数であり得る。カルボキシル基の数が１個である場合、そのカルボン酸をモノカルボン酸という。カルボキシル基の数が２個である場合、そのカルボン酸をジカルボン酸という。カルボキシル基の数が３個である場合、そのカルボン酸をトリカルボン酸という。カルボキシル基の数が４個以上の場合も同様にテトラカルボン酸などという。本発明の方法で用いられるカルボン酸は、好ましくは、モノカルボン酸またはジカルボン酸であり、より好ましくはモノカルボン酸である。
【００７８】
本発明の方法で用いられるカルボン酸は、カルボキシル基以外に、スクロースホスホリラーゼの作用によって配糖化され得る官能基を有してもよく、有さなくてもよい。例えば、カルボン酸は、アルコール性ＯＨ基またはフェノール性ＯＨ基を有し得る。特定の場合には、カルボン酸は、カルボキシル基以外に配糖化され得る官能基を有さない化合物（例えば、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基のいずれも有さないカルボン酸）であり得る。このような化合物の配糖化は困難であると従来考えられていたので、本発明をこれらの化合物に応用することは特に有効である。
【００７９】
本発明のカルボン酸配糖体は、好ましくは、
（１）分子内にカルボキシル基を１つ含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣｎＨ２ｎ−１であり、ｎは、１以上の任意の整数であり、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５である、カルボン酸；
（２）分子内にカルボキシル基を１〜３つ含み、かつ水酸基を１〜４つ含む、ヒドロキシ酸；
（３）分子内にカルボキシル基を２つ含み、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎであり、ｎは１以上の任意の整数であり、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５である、カルボン酸；
（４）アミノ酸；
（５）１つ以上のカルボキシル基で置換された芳香族炭化水素；ならびに
（６）分子中にヘテロ環を含むカルボン酸
からなる群より選択されるカルボン酸であり得る。
【００８０】
（１）のカルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、ピルビン酸およびクロトン酸が挙げられる。
【００８１】
（２）のヒドロキシ酸は、αヒドロキシ酸、βヒドロキシ酸、γヒドロキシ酸などの任意のヒドロキシ酸であり得る。ヒドロキシ酸は好ましくは、αヒドロキシ酸であり、より好ましくは水酸基を１つ有するαヒドロキシ酸である。水酸基を１つ有するαヒドロキシ酸は、一般式Ｒ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨで表され、ここで、Ｒは、アルキル基である。水酸基を１つ有するαヒドロキシ酸の例としては、乳酸およびグリコール酸が挙げられる。カルボキシル基を１つ、ヒドロキシル基を３つ有するヒドロキシ酸としては、例えば、シキミ酸が挙げられる。カルボキシル基を２つ、ヒドロキシル基を１つ有するヒドロキシ酸としては、例えば、リンゴ酸が挙げられる。カルボキシル基を２つ、ヒドロキシル基を４つ有するヒドロキシ酸としては、例えば、粘液酸が挙げられる。カルボキシル基を３つ、ヒドロキシル基を１つ有するヒドロキシ酸としては、例えば、クエン酸が挙げられる。他のヒドロキシ酸の例としては、キナ酸、コーヒー酸、没食子酸およびフェルラ酸が挙げられる。
【００８２】
（３）のカルボン酸の例としては、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸が挙げられる。
【００８３】
（４）のアミノ酸の例としては、葉酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグリシンおよびＬ−ドーパが挙げられる。
【００８４】
（５）のカルボン酸の例としては、Ｌ−ドーパ、クマル酸（例えば、ｏ−クマル酸、ｐ−クマル酸またはｍ−クマル酸、より好ましくはｏ−クマル酸またはｐ−クマル酸）、フェニルグリシン、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、フェルラ酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸（例えば、ｏ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸またはｍ−アミノ安息香酸、より好ましくはｏ−アミノ安息香酸またはｐ−アミノ安息香酸）、ジヒドロキシ安息香酸（例えば、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（β−レゾルシル酸ともいう）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸ともいう）、２，６−ジヒドロキシ安息香酸（γ−レゾルシル酸ともいう）、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，５−ジヒドロキシ安息香酸（α−レゾルシル酸ともいう）、より好ましくは２，４−ジヒドロキシ安息香酸または２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、トリヒドロキシ安息香酸（例えば、２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸、２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸または３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸ともいう）、好ましくは、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸（例えば、３−メチルサリチル酸、４−メチルサリチル酸、５−メチルサリチル酸または６−メチルサリチル酸、好ましくは４−メチルサリチル酸）、ヒドロキシ安息香酸（例えば、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸ともいう）、３−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸、好ましくは２−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸）、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびセンノシドＡが挙げられる。
【００８５】
（６）のカルボン酸の例としては、ニコチン酸および葉酸が挙げられる。
【００８６】
その他のカルボン酸も利用され得る。例えば、以下のカルボン酸が挙げられる：一般式Ｒ−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸であって、ここで、Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ−３であり、ｎは、１以上の任意の整数である、カルボン酸（例えば、ソルビン酸）；カルボキシル基を１つ、アルコキシ基を１つ有するカルボン酸（例えば、レブリン酸）；カルボキシル基を有する、ペプチドおよびタンパク質；ならびに芳香族以外の多環式カルボン酸（例えば、ウルソール酸、オレアノール酸、ベツリン酸）。
【００８７】
本発明の方法で用いられるカルボン酸はまた、構造Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨによって表され得る。Ｒ１は、好ましくは、Ｈ、アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選択される基であり、Ｒ１の炭素数は好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１０であり、さらに好ましくは０〜５であり、特に好ましくは０〜３であり、ここで、アルキル基、アシル基、アルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状または環状であり得、該アルキル基、アシル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、必要に応じて、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、アリール基Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基およびＣ１〜Ｃ３のアシル基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されており；ここで、アリール基Ｒ２は、必要に応じて、−ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３のアルコキシ基からなる群より選択される１個以上の置換基で置換されている。
【００８８】
「アルキル基」、「アシル基」、「アルケニル基」、「アリール基」、「ヘテロアリール基」などの定義および好ましい範囲は、上記のカルボン酸配糖体についての定義部分に記載したものと同様である。
【００８９】
本発明の方法で用いられるカルボン酸の分子量に特に限定はない。分子量の上限は、好ましくは約１０，０００であり、より好ましくは約５，０００であり、さらにより好ましくは約３，０００であり、なおより好ましくは約１，０００であり、最も好ましくは約８７０である。分子量の下限は特になく、最も小さなカルボン酸はギ酸（分子量４６）であるので、それ以上の分子量であればよい。
【００９０】
本発明の方法で用いられるカルボン酸は、好ましくは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、イソ酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、ｎ−ヘキサン酸、キナ酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、葉酸、Ｌ−ドーパ、クマル酸（例えば、ｏ−クマル酸、ｐ−クマル酸またはｍ−クマル酸、より好ましくはｏ−クマル酸またはｐ−クマル酸）、クエン酸、粘液酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルグルタル酸、フェニル酪酸、フェニルマロン酸、フェニルコハク酸、フェニル乳酸、ケイ皮酸、グリコール酸、リンゴ酸、フェニルグリシン、ピルビン酸、ソルビン酸、シキミ酸、クロトン酸、フェルラ酸、マレイン酸、コーヒー酸、安息香酸、アミノ安息香酸（例えば、ｏ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸またはｍ−アミノ安息香酸、より好ましくはｏ−アミノ安息香酸またはｐ−アミノ安息香酸）、ジヒドロキシ安息香酸（例えば、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（β−レゾルシル酸ともいう）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸ともいう）、２，６−ジヒドロキシ安息香酸（γ−レゾルシル酸ともいう）、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，５−ジヒドロキシ安息香酸（α−レゾルシル酸ともいう）、より好ましくは２，４−ジヒドロキシ安息香酸または２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、トリヒドロキシ安息香酸（例えば、２，３，４−トリヒドロキシ安息香酸、２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸ともいう）好ましくは、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）、バニリン酸、フタル酸、ｏ−トルイル酸、ベラトル酸、アセチルサリチル酸、アニス酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、メチルサリチル酸（例えば、３−メチルサリチル酸、４−メチルサリチル酸、５−メチルサリチル酸または６−メチルサリチル酸、好ましくは４−メチルサリチル酸）、ヒドロキシ安息香酸（例えば、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸ともいう）、３−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸、好ましくは２−ヒドロキシ安息香酸または４−ヒドロキシ安息香酸）、センノシド、ニコチン酸、レブリン酸、ウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸、ホモゲンチシン酸およびベツリン酸からなる群より選択される。
【００９１】
カルボン酸は１つの好ましい実施形態では、水溶性カルボン酸である。水溶性とは、室温（約２０℃）で水１リットルに好ましくは約１０ｇ以上、より好ましくは約５０ｇ以上、さらに好ましくは約１００ｇ以上溶けることをいう。水溶性であれば、一相で反応させることができる。
【００９２】
別の実施形態では、カルボン酸は水に難溶性または不溶性である。水に難溶性または不溶性とは、室温（約２０℃）で水１リットルに、例えば、約１０ｇ未満または約１．０ｇ未満しか溶けないことをいう。水に難溶性または不溶性であって、かつ有機溶媒には可溶性のカルボン酸については、有機溶媒に溶かして有機相を形成することができるので、反応容器中にその有機溶媒溶液と、グルコースドナーおよびスクロースホスホリラーゼを含む水溶液とを入れて有機相／水相の２相状態を形成してその界面付近でカルボン酸配糖体を形成させることができる。
【００９３】
本発明の方法で用いられるカルボン酸は、純粋な物質であっても、他の物質との混合物であってもよい。本発明の方法においては、試薬のように純度の高い物質だけでなく、抽出物、培養液などのような純度の低い混合物中に存在するカルボン酸に対しても配糖化が可能である。抽出物は、固体、液体またはペースト状であり得る。抽出物は、カルボン酸を含みさえすれば、任意の抽出物であり得る。抽出物の例としては、植物抽出物および動物抽出物が挙げられる。植物抽出物は、任意の植物の一部または全体を水、有機溶媒などにより抽出して得られる物質である。植物抽出物は、好ましくは、薬用植物の抽出液であり、より好ましくはサンザシ抽出液、ナツメ抽出液またはサンシュユ抽出液である。動物抽出物は、任意の動物の一部または全体を水、有機溶媒などにより抽出して得られる物質である。動物抽出物の例としては、ビーフエキスおよびポークエキスが挙げられる。培養液の例としては、微生物培養液が挙げられる。培養液は好ましくは、乳酸発酵液またはクエン酸発酵液である。
【００９４】
カルボン酸は好ましくは、天然に地球上に存在する化合物から選択される。
【００９５】
（３．グルコースドナー）
本明細書において、グルコースドナーとは、スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応においてカルボン酸にグルコースを供与し得る化合物をいう。グルコースドナーの例としては、スクロース、グルコース−１−リン酸およびグルコース−１−フルオリドが挙げられる。
【００９６】
スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
【００９７】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくは狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００９８】
グルコース−１−リン酸は反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【００９９】
グルコース−１−フルオリドは、市販のものを使用し得る。
【０１００】
（４．スクロースホスホリラーゼ）
本明細書において「スクロースホスホリラーゼ」および「ＳＰ」は特に示さない限り互換可能に用いられ、スクロースホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。スクロースホスホリラーゼは、ＥＣ．２．４．１．７に分類される。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
（１）Ｇ１Ｐ  ＋  Ａｃｐ  ＝  Ｇｌｃ−Ａｃｐ  ＋  Ｐｉ  ；および
（２）スクロース  ＋  Ａｃｐ  ＝  Ｇｌｃ−Ａｃｐ  ＋  Ｆｒｕ
（Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸；Ａｃｐ：水酸基を有するアクセプター）。
【０１０１】
スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ属およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属からなる群より選択される属に属する細菌が挙げられる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物は、より好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選択される属に属する。
【０１０２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓが挙げられる。
【０１０３】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが挙げられる。
【０１０４】
Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉが挙げられる。
【０１０５】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓが挙げられる。
【０１０６】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌の例としては、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓが挙げられる。
【０１０７】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓが挙げられる。
【０１０８】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが挙げられる。
【０１０９】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが挙げられる。
【０１１０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍが挙げられる。
【０１１１】
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌の例としては、例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍが挙げられる。
【０１１２】
Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓが挙げられる。
【０１１３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。
【０１１４】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒが挙げられる。
【０１１５】
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ  ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍが挙げられる。
【０１１６】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌の例としては、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられる。
【０１１７】
スクロースホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１１８】
本発明の方法に用いられるスクロースホスホリラーゼは、細菌由来であることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、低温菌由来であっても、中温菌由来であっても、高温菌由来であってもよい。スクロースホスホリラーゼは、中温菌由来であることがより好ましい。反応系が高温であるほど反応速度が早くなると考えられるからである。
【０１１９】
本発明の方法に用いられるスクロースホスホリラーゼは、ｐＨ約７．４以下の条件下でグルコース転移反応を触媒する能力を有することが好ましく、より好ましくは、ｐＨ約１．０〜約７．４の条件下でグルコース転移反応を触媒する能力を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼがグルコース転移反応を触媒する能力を有するｐＨの上限は、好ましくは約７．４であり、より好ましくは約７であり、さらに好ましくは約６．５であり、さらにより好ましくは約６．０である。スクロースホスホリラーゼがグルコース転移反応を触媒する能力を有するｐＨの下限は、好ましくは約１．０であり、より好ましくは約２．０であり、さらにより好ましくは約３．０であり、さらにより好ましくは約３．５である。
【０１２０】
このような能力を有するスクロースホスホリラーゼとしては、上記に列挙した細菌由来のスクロースホスホリラーゼが挙げられる。本発明の方法に用いられるスクロースホスホリラーゼは、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｒｂｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓであり、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来であり、最も好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓは、特に、酸性条件下でグルコース転移反応を触媒する能力が高い。
【０１２１】
これらの天然のスクロースホスホリラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は公知である。これらの配列は例示であって、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明の方法においては、例示した配列を有するスクロースホスホリラーゼ以外にも、スクロースホスホリラーゼとしての活性を有する限り、このような、天然に存在する改変体も用い得る。
【０１２２】
スクロースホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。スクロースホスホリラーゼは、天然のスクロースホスホリラーゼであっても、天然のスクロースホスホリラーゼに対して何らかの変異を導入した変異スクロースホスホリラーゼ（例えば、耐熱性を向上させた耐熱化スクロースホスホリラーゼ）であってもよい。
【０１２３】
本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、保存および非保存置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は天然のスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。このようなアミノ酸の変化は、好ましくは保存的変化であり、より好ましくは保存的置換である。また、天然のスクロースホスホリラーゼのＮ末端またはＣ末端へのアミノ酸の付加または欠失は、他の部分への置換、付加または欠失に比較して、スクロースホスホリラーゼの酵素活性に対する影響が少ないと考えられる。それゆえ、アミノ酸の置換、付加または欠失は、Ｎ末端またはＣ末端で行われることが好ましい。そのような１もしくは数個またはそれを超えるアミノ酸の置換、付加または欠失を含むスクロースホスホリラーゼは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
【０１２４】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１２５】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１２６】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０１２７】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【０１２８】
本発明の方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のＳＰを用いた場合に非常に高い配糖化率が達成されるが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のＳＰのみに有効というわけではなく、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のＳＰのアミノ酸構造に対して高い相同性を示す他のＳＰを用いても好適に実施できる。
【０１２９】
本発明の方法においては、ｐＨ７．４以下でグルコース転移反応を触媒し得る限り、任意のスクロースホスホリラーゼが用いられる。好ましくは、スクロースホスホリラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のＳＰのアミノ酸配列（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｊ．Ｊら、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１５８５−８８に記載される）に対して約２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するスクロースホスホリラーゼである。同一性は好ましくは、約２５％以上、より好ましくは約３０％以上、さらにより好ましくは約３５％以上、さらにより好ましくは約４０％以上、さらにより好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約６０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上、さらにより好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上である。
【０１３０】
本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対照となる配列データを、置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋａｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  ４．５  Ｓ  ＲＮＡ
Ｓｐａｃｉｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングをＭａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝１；＊Ｎ＋＝２の条件で用いて算出される。
【０１３１】
本発明の方法で用いられるスクロースホスホリラーゼは、当該分野で公知の方法により入手され得る。スクロースホスホリラーゼを元々発現する細菌から直接入手してもよく、スクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子を宿主に導入し、宿主においてスクロースホスホリラーゼを発現させることにより得てもよく、市販の酵素を購入してもよい。
【０１３２】
本発明の方法で用いられるスクロースホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、スクロースホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子でスクロースホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物からスクロースホスホリラーゼを得てもよい。あるいは、得られた遺伝子を、特定のアミノ酸位置での改変を含むように改変した後、スクロースホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物から耐熱化スクロースホスホリラーゼを得てもよい。
【０１３３】
スクロースホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、スクロースホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。スクロースホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。スクロースホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるスクロースホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１３４】
スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子は、天然のスクロースホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を得て、この第一の核酸を改変した改変塩基配列を含む第二の核酸分子であってもよい。
【０１３５】
改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。部位特異的変異誘発の手法は、当該分野では周知である。例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）を参照のこと。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。
【０１３６】
スクロースホスホリラーゼの遺伝子は、既知のスクロースホスホリラーゼの配列を参考にしてプライマーを設計し、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を得ようとするゲノムライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって得ることができる。あるいは、既知の種のスクロースホスホリラーゼの塩基配列に対する相同性に基づいて、この塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによってスクリーニングして、別種のスクロースホスホリラーゼの塩基配列を含む核酸分子を獲得することもできる。このような方法は当該分野で公知である。あるいは、既知のＳＰ遺伝子配列情報をもとに、ゲノムライブラリー作製をへることなく、化学合成により直接ＳＰ遺伝子を作製することも可能である。遺伝子の合成方法は、例えばＴｅ’ｏら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９０巻、１３−１９頁、２０００年）などに記載されている。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。
【０１３７】
得られた天然のＳＰ遺伝子または上記のようにして改変された塩基配列を含む核酸分子は、当業者に周知の方法で、適切なベクターに挿入できる。例えば、大腸菌用のベクターであれば、ｐＭＷ１１８（日本ジーン株式会社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ（株）製）、ｐＫＫ２３３−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ製）などが使用でき、枯草菌用のベクターであれば、ｐＵＢ１１０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入可能）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ（株）製）などが使用できる。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。
【０１３８】
本明細書において核酸分子について言及する場合、「ベクター」とは、目的の塩基配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【０１３９】
本明細書において酵素の「発現」とは、その酵素をコードする塩基配列が、インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。
【０１４０】
発現ベクターを導入する細胞（宿主ともいう）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、スクロースホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。例えば、スクロースホスホリラーゼを高分子量のアミロースの合成に用いる場合、スクロースホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない細胞を用いることが好ましい。このような細胞の例としては、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。より好ましい細胞の例としては、中温菌（例えば、大腸菌、枯草菌）が挙げられる。本明細書において、「中温菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物のことであり、特に生育至適温度が２０℃〜４０℃である微生物をいう。細胞は、微生物細胞であってもよいが、植物、動物などの細胞であってもよい。
【０１４１】
本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ
Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１４２】
発現ベクターが導入されてスクロースホスホリラーゼを発現する能力を獲得した細胞（形質転換細胞ともいう）を培養することにより、スクロースホスホリラーゼを細胞に発現させることができる。形質転換細胞の培養条件は、使用する宿主細胞の種類、発現ベクター内の発現調節因子の種類などに応じて、適切に選択される。例えば、通常の振盪培養方法が用いられ得る。
【０１４３】
形質転換細胞の培養に用いる培地は、使用する細胞が増殖して目的のスクロースホスホリラーゼを発現し得るものであれば特に限定されない。培地には、炭素源、窒素源の他、無機塩、例えば、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋などの塩が必要に応じて、適宜混合して、または単独で用いられ得る。また、必要に応じて形質転換細胞の増殖、目的のスクロースホスホリラーゼの発現に必要な各種無機物または有機物が添加され得る。
【０１４４】
形質転換細胞を培養する温度は、用いる形質転換細胞の増殖に適するように選択され得る。通常１５℃〜６０℃である。形質転換細胞の培養は、スクロースホスホリラーゼの発現のために十分な時間続行される。
【０１４５】
誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合、誘導物質の添加、培養温度の変更、培地成分の調整などにより発現が制御され得る。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。例えば、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現が誘導され得る。
【０１４６】
クローン化した遺伝子について、生産されるスクロースホスホリラーゼが菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。
【０１４７】
このようにして発現されたスクロースホスホリラーゼは、適切な時間の培養後、次いで回収され得る。例えば、発現されたスクロースホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現されたスクロースホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。スクロースホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られたスクロースホスホリラーゼ含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、スクロースホスホリラーゼを含む画分を入手し得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を入手し得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られ得る。
【０１４８】
上述のようにしてスクロースホスホリラーゼを生産することが可能となる。また、発現させたスクロースホスホリラーゼは、耐熱性を有する場合、その耐熱性を利用して簡便に精製され得る。簡単に述べると、耐熱化スクロースホスホリラーゼを含む細胞抽出液を６０℃程度で加熱処理することにより、夾雑酵素が不溶化する。この不溶化物を遠心分離などで除去して透析処理を行うことにより、精製された耐熱化スクロースホスホリラーゼが得られる。
【０１４９】
好ましい実施態様では、スクロースホスホリラーゼは、精製段階の任意の段階でスクロース（代表的には約４％〜約３０％、好ましくは約８％〜約３０％、より好ましくは約８％〜約２５％）の存在下で加熱され得る。この加熱工程における溶液の温度は、この溶液を３０分間加熱した場合に、加熱前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上、より好ましくは８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約５０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約５５℃〜約６５℃である。
【０１５０】
加熱が行われる場合、加熱時間は、反応温度を考慮して、スクロースホスホリラーゼの活性を大きく損なうことがない限り、任意の時間で設定され得る。加熱時間は、代表的には約１０分間〜約９０分間、より好ましくは約３０分間〜約６０分間である。
【０１５１】
（５．カルボン酸の配糖化方法）
本発明の方法は、カルボン酸の配糖化方法（すなわち、カルボン酸配糖体の製造方法）である。本発明の方法は、カルボン酸と、グルコースドナーとに水溶液中のスクロースホスホリラーゼを作用させて、カルボン酸配糖体を得る工程を包含し、作用開始時の該水溶液のｐＨは、このスクロースホスホリラーゼがハイドロキノンにグルコースを結合させる反応における至適ｐＨよりも酸性側のｐＨであり、好ましくは１．０〜７．４であり、より好ましくは３．０〜７．０である。
【０１５２】
本明細書においてスクロースホスホリラーゼの至適ｐＨおよび至適温度とは、非特許文献２に記載されたような、スクロースホスホリラーゼがハイドロキノンにグルコースを結合させる反応における至適ｐＨおよび至適温度をいう。
【０１５３】
本明細書中では、「至適温度」とは、糖転移活性測定を温度のみ変化させて行い、最も糖転移活性が高い温度をいう。糖転移活性は、ドナーからアクセプターへの糖転移率を測定することにより決定され得る。好ましくは、至適温度は、以下のようにして決定される。５０ｍｇのスクロース、１ｍｇのハイドロキノン、５単位のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ活性１単位は２５℃、１分間当り１μモルのスクロースをグルコース−１−リン酸へ変換する酵素量）を含む０．１ｍｌの混合液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳでｐＨ  ７．５に調整）を各種温度にて、１５時間反応させる。反応後の溶液をＨＰＬＣにより分析し配糖化率（ハイドロキノンからα−アルブチンへの変換率）を測定する。ここで、配糖化率が最も高い温度が至適温度である。なお、糖転移活性とは、スクロースホスホリラーゼがドナー（例えば、スクロース）からアクセプター（例えば、フェノール化合物）に糖を転移させる活性であり、ＳＰ活性とは、スクロースホスホリラーゼがスクロースなどを加リン酸分解する活性である。
【０１５４】
本明細書中では、「至適ｐＨ」とは、スクロースホスホリラーゼの糖転移活性測定を特定の温度（例えば、至適温度付近）にてｐＨのみ変化させて行い、最も糖転移活性が高いｐＨをいう。好ましくは、至適ｐＨは、至適温度付近での至適ｐＨである。１つの実施形態では、至適ｐＨは、以下のようにして決定される。５０ｍｇのスクロース、１ｍｇのハイドロキノン、５単位のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ活性１単位は２５℃、１分間当り１μモルのスクロースをグルコース−１−リン酸へ変換する酵素量）を含む０．１ｍｌの混合液（１００ｍＭ  ＭＥＳあるいは１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳで各種ｐＨに調整）を４２℃にて、１５時間反応させる。反応後の溶液をＨＰＬＣにより分析し配糖化率（ハイドロキノンからα−アルブチンへの変換率）を測定する。ここで、配糖化率が最も高いｐＨが至適ｐＨである。
【０１５５】
作用開始時のｐＨは、至適ｐＨよりも低いｐＨ（酸性側のｐＨ）である。作用開始時のｐＨと至適ｐＨとの差は、好ましくは約０．３以上であり、より好ましくは約０．５以上であり、さらに好ましくは約１．０以上である。作用開始時のｐＨと至適ｐＨとの差は、好ましくは約６．０以下であり、より好ましくは約４．０以下であり、さらに好ましくは約３．０以下である。
【０１５６】
作用開始時のｐＨは、具体的には、例えば、約７．４以下であり、好ましくは約７．２以下であり、さらに好ましくは約７．０以下である。作用開始時のｐＨは、具体的には、例えば、約２．０以上であり、好ましくは約３．０以上であり、さらに好ましくは約３．５以上である。
【０１５７】
作用終了時のｐＨは、好ましくは至適ｐＨよりも低いｐＨである。作用終了時のｐＨと至適ｐＨとの差は、好ましくは約０．１以上であり、より好ましくは約０．３以上であり、さらに好ましくは約０．５以上である。作用終了時のｐＨと至適ｐＨとの差は、好ましくは約５．０以下であり、より好ましくは約３．０以下であり、さらに好ましくは約２．５以下である。
【０１５８】
作用終了時のｐＨは、具体的には、例えば、約７．５以下であり、好ましくは約７．４以下であり、より好ましくは約７．２以下であり、さらに好ましくは約７．０以下である。作用終了時のｐＨは、具体的には、例えば、約３．０以上であり、より好ましくは約４．０以上であり、さらに好ましくは約５．０以上である。
【０１５９】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。
【０１６０】
本発明の配糖化方法では、例えば、カルボン酸と、グルコースドナーと、スクロースホスホリラーゼと、これらを溶かしている溶媒とを主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【０１６１】
反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、ドナーとしてスクロースを用いる場合、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１０，０００Ｕ／ｇスクロース、好ましくは約０．１〜５，０００Ｕ／ｇスクロース、より好ましくは約０．５〜１，０００Ｕ／ｇスクロースである。ドナーとしてグルコース−１−リン酸またはグルコース−１−フルオリドを用いる場合、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、代表的には約０．０５〜１０，０００Ｕ／ｇグルコースドナー、好ましくは約０．１〜５，０００Ｕ／ｇグルコースドナー、より好ましくは約０．５〜１，０００Ｕ／ｇグルコースドナーである。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、カルボン酸配糖体の収率が低下する場合がある。
【０１６２】
本発明の配糖化方法に用いられるスクロースホスホリラーゼは、精製酵素または粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（例えば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）が使用され得る。
【０１６３】
本発明の配糖化方法に用いる溶媒は、スクロースホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０１６４】
なお、カルボン酸を配糖化する反応が進行し得る限り、本発明の配糖化方法に用いる材料を溶媒が完全に溶解する必要はない。例えば、カルボン酸の水溶性が低い場合、カルボン酸の全てが水に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、スクロースなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０１６５】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記スクロースホスホリラーゼを調製する際にスクロースホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。溶媒は１種の溶媒を用いてもよく、あるいは２種以上の混和性溶媒を用いてもよく、あるいは、２種以上の非混和性溶媒を用いてもよい。例えば、カルボン酸の水溶性が高い場合、溶媒は、水であることが好ましい。カルボン酸の水溶性が低い場合、主要量のカルボン酸を溶解する有機溶媒と、少量のカルボン酸を溶解する水との２相系で反応を進行させ得る。
【０１６６】
カルボン酸と、グルコースドナーと、スクロースホスホリラーゼとを含む反応溶液中には、スクロースホスホリラーゼとカルボン酸およびグルコースドナーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、酸性物質、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０１６７】
これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。
【０１６８】
本発明の配糖化方法においては、代表的には、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、カルボン酸と、グルコースドナーと、スクロースホスホリラーゼとを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、カルボン酸を含む溶液と、グルコースドナーを含む溶液と、スクロースホスホリラーゼを含む溶液とを混合することによって調製され得る。あるいは、反応溶液は、カルボン酸と、グルコースドナーと、スクロースホスホリラーゼとのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。
【０１６９】
用いるカルボン酸の種類によっては、溶媒にカルボン酸を溶解するだけで上述した適切な範囲内のｐＨが達成され得る。溶媒にカルボン酸を溶解してもこの範囲内のｐＨが達成されない場合、この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意のｐＨ調整剤または緩衝剤を加えてもよい。ｐＨ調整剤の例としては、酸性物質（例えば、塩酸、硝酸、硫酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。緩衝剤は、スクロースホスホリラーゼの基質として作用しない物質であることが好ましい。カルボン酸が配糖化すると酸が減少してｐＨが上昇し、配糖化効率が下がる場合があるので、このような場合は、反応開始後の任意の時点でまたは連続的にｐＨ調整剤を添加して、ｐＨがアルカリ側に変化することを抑制することが好ましい。
【０１７０】
１つの実施形態においては、反応開始後にカルボン酸を追加することにより、その水溶液中のｐＨを調整することもできる。
【０１７１】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約０℃〜約７０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約２０℃〜約６０℃であり、より好ましくは約２５℃〜約５０℃、さらにより好ましくは約３０℃〜約５０℃であり、最も好ましくは約４０℃である。もちろん、用いるスクロースホスホリラーゼによって反応至適温度が異なるので、スクロースホスホリラーゼの作用を発揮し得る温度であれば、任意の温度であり得る。
【０１７２】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるカルボン酸配糖体の量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約３０分間以上であり、より好ましくは約１時間以上であり、さらに好ましくは約２時間以上であり、最も好ましくは約３時間以上である。反応時間に特に上限はないが、例えば、約１００時間以下、約７２時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約２４時間以下などであり得る。下記に説明するようなカルボン酸残基の転位を防ぎたい場合には、反応時間を長くしすぎないことが好ましい。カルボン酸残基の転位を防ぎたい場合、反応時間は、約３６時間以下であることが好ましく、約２４時間以下であることがさらに好ましく、約１２時間以下であることが最も好ましい。カルボン酸残基の転位が望ましい場合には、反応時間が長いことが好ましい。
【０１７３】
本発明の方法で用いられるカルボン酸がモノカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシドである。本発明の方法で用いられるカルボン酸がジカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシド、２つのグルコースによって配糖化されたジグルコシドまたはそれらの混合物である。本発明の方法で用いられるカルボン酸がトリカルボン酸である場合、本発明の方法によって得られるカルボン酸配糖体は、１つのグルコースによって配糖化されたモノグルコシド、２つのグルコースによって配糖化されたジグルコシド、３つのグルコースによって配糖化されたトリグルコシドまたはそれらの混合物である。４つ以上のカルボキシル基を有するカルボン酸を用いた場合についても同様である。
【０１７４】
カルボン酸がアルコール性ＯＨ基、フェノール性ＯＨ基またはその両方を有する場合、本発明の方法においてスクロースホスホリラーゼを作用させると、まず、カルボキシル基、アルコール性ＯＨ基またはフェノール性ＯＨ基のいずれか１つにグルコース残基が結合し、次に、別の基にグルコース残基が結合し、続いてさらに別の基にグルコース残基が結合する。このような場合、反応後の溶液中には、カルボキシル基、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基から選択される１以上の基が配糖化された配糖体が形成され得る。１つの化合物中にカルボキシル基およびアルコール性ＯＨ基が存在すると、この溶液中には、カルボキシル基のみが配糖化された配糖体、アルコール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体およびカルボキシル基とアルコール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体が混在し得る。１つの化合物中にカルボキシル基およびフェノール性ＯＨ基が存在すると、この溶液中には、カルボキシル基のみが配糖化された配糖体、フェノール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体、およびカルボキシル基とフェノール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体が混在し得る。１つの化合物中にカルボキシル基、アルコール性ＯＨ基およびフェノール性ＯＨ基が存在すると、この溶液中には、カルボキシル基のみが配糖化された配糖体、アルコール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体、フェノール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体、カルボキシル基とアルコール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体、カルボキシル基とフェノール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体、アルコール性ＯＨ基とフェノール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体、およびカルボキシル基とアルコール性ＯＨ基とフェノール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体が混在し得る。反応後の溶液中にアルコール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体、フェノール性ＯＨ基のみが配糖化された配糖体またはアルコール性ＯＨ基とフェノール性ＯＨ基とが配糖化された配糖体が混入しても、このような溶液もまた有用である。
【０１７５】
１つの分子中に複数のカルボキシル基を有する化合物を用いた場合に、配糖化されるカルボキシル基の数は、主に、反応時間および酵素量を調節することにより制御され得る。
【０１７６】
このようにして、カルボン酸配糖体を含有する溶液が生産される。
【０１７７】
このようにして生成されるカルボン酸配糖体は、グルコースの１位の水酸基にカルボキシル基がエステル結合した物質である。反応終了後、短時間（例えば、１〜６時間）のうちに溶媒の水の除去および精製を行うことにより、グルコースの１位の水酸基がカルボン酸に結合した化合物が得られる。
【０１７８】
ｐＨ、温度条件によっては上記反応中に、または上記反応終了後の水溶液を長期（例えば、約１日〜３日）にわたって放置すると、グルコースの２位の水酸基にカルボン酸残基がエステル結合した化合物が得られる。水溶液（特に中性からアルカリ領域の水溶液）中で放置すると、カルボン酸残基が、グルコースの１位から２位に転位するからである。この溶液をさらに放置（例えば、約１〜３日）することにより、カルボン酸残基がグルコースの３位に転位したカルボン酸配糖体が得られる。グルコースの３位に転位した生成物を含む溶液をさらに放置（例えば、約１〜３日）することにより、カルボン酸残基がグルコースの４位に転位した化合物が得られる。カルボン酸残基の転位を防ぎたい場合は、反応終了後速やかに生成物を精製し、水分の少ない状態（例えば、乾燥状態）で保存すること、溶液中で低温に保つこと、または溶液中で低ｐＨに保つことが好ましい。
【０１７９】
また、使用するカルボン酸の種類および反応条件によっては、カルボン酸残基がグルコースの１位に結合したもの、２位に結合したもの、３位に結合したもの、および４位に結合したもののうちの２種類以上が混合物として得られることがあり得る。このような場合には、公知の分離方法（ＨＰＬＣなど）により容易にそれらを分離すれば目的の化合物を単離することができる。得られたカルボン酸配糖体は、純粋な１種類のカルボン酸配糖体になるまで単離して用いてもよく、複数種のカルボン酸配糖体の混合物であるが他の夾雑物をほとんど含まない混合物になるまで単離して用いてもよく、または反応後の溶液のままほとんどもしくは全く精製を行わずに使用してもよい。
【０１８０】
（６．カルボキシル基にグルコースが転移していることの確認方法）
カルボン酸が配糖化されたことは、当該分野で公知の方法により確認され得る。反応後の溶液中に、カルボン酸およびグルコースと異なる生成物が生成していることは、例えば、基質のカルボン酸、グルコースおよび反応後の溶液をＨＰＬＣまたは薄層クロマトグラフィーによって分析し、基質のカルボン酸のピークおよびグルコースのピークとは異なるピークが出現したことを確認することにより、簡便に確認され得る。
【０１８１】
反応生成物の構造をより詳細に確認するためには、反応生成物を精製した後、ＮＭＲおよびＭＳを行うことにより、構造が確認され得る。
【０１８２】
カルボン酸のカルボキシル基とグルコースの１位、２位、３位または４位のＯＨ基とがエステル結合していることは、公知の分析方法により確認され得る。例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲまたはＭＳによる分析は、当業者に周知の方法に従って行われ得る。例えば、実施例３に記載のように、得られた配糖体または得られた配糖体のアセチル化物をＮＭＲで分析することにより、カルボキシル基とグルコースのＯＨ基との結合位置がグルコースの１位であることが確認され得る。カルボキシル基とグルコースのＯＨ基との結合位置がグルコースの２位または３位、４位であることも同様の方法によって確認され得る。また、カルボキシル基とグルコースのＯＨ基とがα結合しているかまたはβ結合しているかは、例えば、１Ｈ−ＮＭＲにおけるアノメリックプロトンの結合定数の違いによって確認され得る。
【０１８３】
（７．カルボン酸配糖体を含む食品および食品添加物）
本発明の食品および食品添加物は、本発明のカルボン酸配糖体を含む。この配糖体は、体内に入ると消化酵素（例えば、グルコシダーゼなど）などの働きにより糖の部分が脱離した化合物（すなわち、基質として用いたカルボン酸）に戻り、体内で所定の作用を奏する。食品は、任意の食品であり得る。食品添加物は任意の食品添加物であり得る。食品および食品添加物は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。食品は、好ましくは、健康食品であり、より好ましくは健康飲料であるが、これらに限定されず、冷菓（例えば、アイスクリーム、アイスミルク、氷菓など）、嗜好性飲料（例えば、清涼飲料、炭酸飲料（サイダー、ラムネ等）、薬味飲料、アルコール性飲料、粉末ジュースなど）、乳製品（牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム、バター、マーガリン、チーズ、ホイップクリーム等）、菓子類（例えば、洋菓子、和菓子、スナック菓子等、例えば、あんこ、羊羹、饅頭、チョコレート、ガム、ゼリー、寒天、杏仁豆腐、ケーキ、カステラ、クッキー、煎餅、スナック菓子等）、パン、餅、水産煉製品（蒲鉾、ちくわ等）、畜肉加工品（ソーセージ、ハム等）、果実加工品（ジャム、マーマレード、果実ソース等）、調味料（ドレッシング、マヨネーズ、味噌等）、麺類（うどん、そば等）、漬物、および蓄肉、魚肉、果実の瓶詰、缶詰類などであり得る。食品添加物とは、食品の製造の過程においてまたは食品の加工もしくは保存の目的で、食品に添加、混和、浸潤その他の方法によって使用する物をいう。食品添加物は好ましくは、保存料、酸化防止剤、着色料、調味料、強化剤、製造用剤、増粘安定剤、苦味料、酸味料、光沢剤などとして添加される食品添加剤である。
【０１８４】
本発明のカルボン酸配糖体を食品または食品添加物に添加するには特別な工程を必要とせず、食品または食品添加物の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を食品または食品添加物の種類および性状に応じて選択する。本発明の食品および食品添加物は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８５】
（８．カルボン酸配糖体を含む医薬品および医薬部外品）
本発明の医薬品および医薬部外品は、本発明のカルボン酸配糖体を含む。医薬品および医薬部外品は、薬理作用が公知であってカルボキシル基を有する化合物を原料として、本発明の方法により合成され得る。この配糖体は、体内に入ると消化酵素（例えば、グルコシダーゼなど）などの働きにより糖の部分が脱離した化合物に戻り、体内で所定の薬理作用を奏する。医薬品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。
【０１８６】
本発明のカルボン酸配糖体を医薬品または医薬部外品に添加するには特別な工程を必要とせず、医薬品または医薬部外品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を医薬品の種類および性状に応じて選択する。本発明の医薬品および医薬部外品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８７】
（９．カルボン酸配糖体を含む化粧品）
本発明の化粧品は、本発明のカルボン酸配糖体を含む。化粧品に含まれるカルボン酸配糖体は、化粧品の成分として有効な作用を有することが公知であってカルボキシル基を有する化合物を原料として、本発明の方法により合成され得る。この配糖体は、配糖体の形態で作用するか、または皮膚表面から吸収された後もしくは皮膚表面で糖の部分が脱離した化合物に戻った形態で作用するかのいずれかにより、身体に対して所定の作用を奏する。化粧品の例としては、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック、口紅、リップクリーム、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラーが挙げられる。化粧品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。
【０１８８】
本発明のカルボン酸配糖体を化粧品に添加するには特別な工程を必要とせず、化粧品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を化粧品の種類および性状に応じて選択する。本発明の化粧品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８９】
（１０．カルボン酸配糖体の他の用途）
本発明のカルボン酸配糖体は、他の種々の用途に用いられ得る。このような用途の例としては、化粧品以外の皮膚外用剤が挙げられる。このような皮膚外用剤の例としては、例えば、養毛剤、育毛剤、シャンプー、リンス、ヘアーリキッド、ヘアートニック、パーマネントウェーブ剤、ヘアカラー、トリートメント、浴用剤、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなどが挙げられる。本発明のカルボン酸配糖体を含む皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１９０】
本発明のカルボン酸配糖体を皮膚外用剤に添加するには特別な工程を必要とせず、皮膚外用剤の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を皮膚外用剤の種類および性状に応じて選択する。本発明の皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１９１】
本明細書中で記述した反応の種々の生成物は、当業者に周知であるように、通常の技術（例えば、濾過、再結晶、溶媒抽出、蒸留、沈殿、昇華、カラムクロマトグラフィーなど）により、単離され、精製され得る。それらの生成物は、当業者に周知の従来の方法（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、融点、質量分析（ＭＳ）、元素分析など）により、純度について分析および／または検査され得る。特に、陰イオン交換樹脂を用いることにより、煩雑なステップを踏まずに１ステップでカルボン酸配糖体とカルボン酸とを容易に分離できる。
【０１９２】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１９３】
（実施例１：酢酸配糖体の合成）
スクロース２００ｍｇと酢酸１０μｌを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ５０単位（１単位は２５℃、１分間当り１μモルのスクロースをグルコース−１−リン酸へ変換する酵素量）を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。
【０１９４】
反応後の混合液（レーン４）を以下の条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。ＴＬＣにおいては、対照として、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液（レーン５）、酢酸を含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液（レーン６）、ならびに２％（重量／容積％）スクロース水溶液（レーン１）、２％（重量／容積％）グルコース水溶液（レーン２）、２％（重量／容積％）フルクトース水溶液（レーン３）を用いた。ＨＰＬＣにおいては、対象として、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液を用いた。
【０１９５】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０
移動相：アセトニトリル／水＝８５／１５
検出：硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０１９６】
図１にＴＬＣの結果を示す。この結果、反応後の混合液中に、対照のものと比較して移動の早い生成物（酢酸反応液において中央付近に見えるスポット）が存在することが確認された（レーン４）。このことから、反応後の混合液中に、スクロース、グルコース、およびフラクトースとは異なる糖が生成されたことが確認された。
【０１９７】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝８０／２０／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０１９８】
図２にＨＰＬＣの結果を示す。この結果、酢酸（対照；図２（ａ））と反応後の混合液（図２（ｂ））との比較から、酢酸が減少し、反応後の混合液中に酢酸よりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。このことから、反応後の混合液中に、酢酸よりも極性が高い生成物が生成されたことが確認された。すなわち、酢酸に糖が転移して酢酸配糖体が形成された。
【０１９９】
（実施例１−２：酢酸配糖体の合成および構造確認）
１Ｍ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．０）１２ｍｌ、４０％スクロース溶液１５ｍｌ、水３ｍｌを混合した溶液にＳＰ活性１５００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液０．６ｍｌを加え、この混合液を３７℃で１０時間反応させた。
【０２００】
反応終了後、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３．０に調整し、反応終了液とした。
【０２０１】
反応終了液を実施例１と同じ方法でＴＬＣおよびＨＰＬＣによって分析した。その結果、酢酸配糖体が生成したことが確認された。
【０２０２】
得られた酢酸配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応終了液に９倍量のアセトンを添加してスクロース、フラクトースなどの糖の一部を沈殿させた。沈殿を除去後、上清に１ｇのワコーゲルＣ２００を加えて減圧乾燥し、酢酸配糖体をワコーゲルＣ２００に吸着させた。酢酸配糖体が吸着されたワコーゲルＣ２００を、アセトニトリルで平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、アセトニトリルにより溶出した。
【０２０３】
このカラムクロマトグラフィーにより得られた配糖体を含む画分を減圧乾燥することにより、酢酸配糖体（精製標品）を約２８ｍｇ得ることができた。この精製標品の構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）およびＭＳにより確認した。ＮＭＲは、ＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲであった。
【０２０４】
ＭＳの結果より、得られた配糖体の分子量は２２２であり、１分子の酢酸が１分子のグルコースと結合していることが示唆された。
【０２０５】
次に、１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナルが６０．５ｐｐｍから９２．０ｐｐｍの間に確認された。また、酢酸のメチル基由来のシグナルが２０ｐｐｍ付近に、酢酸のカルボニル基由来のシグナルが１７０ｐｐｍ付近に確認されたが、酢酸のカルボキシル基由来のシグナルは確認されなかった。これらの結果より、得られた精製標品は、酢酸のカルボキシル基にグルコースが結合した物質であることが確認できた。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（５．９２ｐｐｍ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）の結合定数がα結合であることを示していることから、酢酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合していることが確認された。
【０２０６】
上記分析の結果より、得られた配糖体は酢酸がグルコースの１位の水酸基にα結合した配糖体、すなわち、１−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅであることがわかった。
【０２０７】
（実施例２：安息香酸配糖体の調製および構造確認１）
安息香酸０．４ｇおよびスクロース２０ｇを９０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ４．２に調整した。この溶液にＳＰ活性１００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１０ｍｌを添加した後、上記溶液を３７℃において６時間反応させた。
【０２０８】
ＴＬＣについては実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣについては検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で反応液の分析を行った結果、安息香酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２０９】
安息香酸配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応液を、蒸留水で平衡化したアンバーライトＸＡＤ−７カラムに吸着させた。次いで蒸留水でカラムに吸着している未反応の糖を溶出した後、１００％メタノールにより配糖体および未反応の安息香酸を溶出した。１００％メタノール画分に１ｇのワコーゲルＣ２００を加え減圧乾燥した後、１００％アセトニトリルで平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、１００％アセトニトリルにより溶出した。主成分として配糖体を含む画分を再度１ｇのワコーゲルＣ２００を加え減圧乾燥した後、１００％アセトニトリルで平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、１００％アセトニトリルにより溶出した。このカラムクロマトグラフィーにより得られた配糖体を含む画分を減圧乾燥することにより安息香酸配糖体（精製標品）を約１０ｍｇ得ることができた。この精製標品の構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）およびＭＳにより確認した。
【０２１０】
得られた安息香酸配糖体のＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を図３に、１３Ｃ−ＮＭＲの結果を図４に示す。１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（９２．９０、７５．６０、７３．０７、７０．６８、６９．４６、６０．５７（ｐｐｍ））及び安息香酸由来のシグナル（１６４．４６、１３３．５１、１２９．５２、１２９．２７、１２８．６７（ｐｐｍ））が検出された。１６４．４６ｐｐｍのシグナルがエステル結合のカルボニル炭素のシグナルであることおよび、１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（６．１９ｐｐｍ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）の結合定数がα結合であることを示していることから、安息香酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合していることが確認された。
【０２１１】
ＭＳおよびＮＭＲの結果より得られた配糖体は分子量が２８４であり、安息香酸が１分子のグルコースの１位の水酸基にα結合した配糖体であることがわかった。
【０２１２】
（実施例２−２：安息香酸配糖体のベンゾイル基転位物の調製および構造確認１）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース６ｇを１９ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．６に調整した。この溶液にＳＰ活性３０００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１ｍｌを添加した後、上記溶液を３７℃において４８時間反応させた。なお反応の進行に伴いｐＨの上昇が起きることから、５Ｎ  ＨＣｌを用いて反応液のｐＨが４．８を超えないように調整を行った。
【０２１３】
反応終了後の溶液を実施例２と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した結果、３種類の安息香酸配糖体が生成されたことが確認された。このうちの１種類は、実施例２に記載の安息香酸配糖体（安息香酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合した配糖体）であった。他の２種類の安息香酸配糖体は、ベンゾイル基がグルコースの１位以外の水酸基に転位した安息香酸配糖体であると考えられた。
【０２１４】
これらの２種類の安息香酸配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応液を、蒸留水で平衡化したワコーゲル１００Ｃ１８カラムに吸着させた。次いで蒸留水でカラムに残留している未反応の糖を完全に洗浄した後、１００％メタノールにより、配糖体および未反応の安息香酸を溶出した。１００％メタノール画分に１ｇのワコーゲルＣ２００を加え減圧乾燥した後、酢酸エチル／メタノール＝１００／５の混合溶媒で平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、同混合溶媒により溶出した。これらの２種類の安息香酸配糖体を主成分として含む画分を酢酸エチル／メタノール＝１００／５の混合溶媒で平衡化したＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ  ６０カラムに供し、同じ溶媒により溶出した。このカラムクロマトグラフィーにより、これらの２種類の安息香酸配糖体のうちの１種類を含む画分が得られた。この画分を減圧乾燥することにより、ベンゾイル基がグルコースの１位以外の水酸基に転位した安息香酸配糖体と考えられる１種類の安息香酸配糖体（精製標品）を約１０ｍｇ得ることができた。この精製標品の構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）およびＭＳにより確認した。ＮＭＲは、ＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲであった。
【０２１５】
１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（９０．０、７５．９、７２．９、７１．３、７１．０、６１．７（ｐｐｍ））および安息香酸由来のシグナル（１６６．６、１３４．２、１３０．７、１３０．２、１２９．５（ｐｐｍ））が検出された。グルコースの１位の水酸基のシグナル（ｄ、６．４４ｐｐｍ）が１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおいてグルコースのアノメリックプロトンであると同定されるシグナル（ｄｄ、５．２１ｐｐｍ）と相関関係があること、およびグルコースの１位と２位のプロトンの結合定数がＪ＝３．６（Ｈｚ）であることから、グルコースの１位の水酸基はフリーなα-型の水酸基であることが示された。また、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおいてグルコースの２位のプロトンと同定されるシグナル（ｄｄ、４．５８ｐｐｍ）がカルボニル炭素のシグナル１６４．４６ｐｐｍとＨＭＢＣスペクトルにおける相関関係にあることから安息香酸はグルコースの２位にエステル結合していることが確認された。
【０２１６】
ＭＳの結果より、分析した配糖体は分子量が２８４であり、１分子の安息香酸が１分子のグルコースと結合していることが確認された。
【０２１７】
上記分析の結果より、分析した配糖体は、安息香酸がグルコースの２位の水酸基に結合した配糖体、２−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅであることがわかった。
【０２１８】
（実施例２−４：安息香酸配糖体の作製）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース６ｇを１９ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．０に調整した。この溶液にＳＰ活性３０００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１ｍｌを添加した後、上記溶液を３７℃において２４時間反応させた。なお反応が進行することによってｐＨの上昇が起き、それに伴い配糖化効率が減少することから、５Ｎ  ＨＣｌを用いて反応液のｐＨが４．５を超えないように調整を行った。その結果、配糖化率約７０％の高効率で安息香酸配糖体を作製することができた。それゆえ、反応液のｐＨを低く維持することにより、高い配糖化率を得ることができることが確認された。
【０２１９】
（実施例３：安息香酸配糖体の合成および構造確認２）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース４ｇを２０ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ
ＨＣｌでｐＨ４．８に調整した。この溶液にＳＰ活性２７００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液０．８ｍｌを添加した。上記溶液を４０℃において１時間反応させた。反応液の分析はＴＬＣについては実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣについては検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で分析を行った結果、安息香酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２２０】
この安息香酸配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応液を蒸留水で平衡化したダイヤイオンＰＡ−４１２カラムに通し、未反応の安息香酸を除いた。次いでその流出液を蒸留水で平衡化したワコーゲルＣ１８カラムに吸着させた。さらに蒸留水でカラムを洗浄し、未反応の糖を除いた後、１００％メタノールで配糖体を溶出した。得られた配糖体を含む画分を減圧乾燥することにより安息香酸配糖体２０ｍｇを得ることができた。その後、精製した安息香酸配糖体約１５ｍｇを常法に従い、無水酢酸−ピリジンによるアセチル化を行った。このアセチル化した安息香酸配糖体をシリカゲルカラムで精製した後、構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）により確認した。
【０２２１】
得られたアセチル化安息香酸配糖体のＣＤＣｌ３中での１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を図５に、１３Ｃ−ＮＭＲの結果を図６に示す。１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（８９．６３、６９．３７、７０．００、６７．９３、７０．００、６１．４２（ｐｐｍ））および安息香酸由来のシグナル（１６４．２１、１２８．６６、１２９．８８、１２８．６６、１３３．８４（ｐｐｍ））が検出された。１６４．２１ｐｐｍのシグナルがエステル結合のカルボニル炭素のシグナルであること、および、１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（６．５９ｐｐｍ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）の結合定数がα結合であることを示していることから、安息香酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合していることが確認された。
【０２２２】
以上の結果より、安息香酸配糖体は、安息香酸のカルボキシル基と１分子のグルコースの１位の水酸基とがα結合した配糖体であることがわかった。
【０２２３】
（実施例３−２：安息香酸配糖体のベンゾイル基転位物のアセチル化物の調製および構造確認２）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース６ｇを２０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．６に調整した。この溶液にＳＰ活性２７００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液０．８ｍｌを添加した後、上記溶液を３７℃において２５時間反応させた。なお反応の進行に伴いｐＨの上昇が起きることから、５Ｎ  ＨＣｌを用いて反応液のｐＨが５．０を超えないように調整を行った。
【０２２４】
反応終了後の溶液を実施例２と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した。その結果、３種類の安息香酸配糖体が生成されたことが確認された。このうちの１種類は、実施例２に記載の安息香酸配糖体（安息香酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合した配糖体）であった。他の２種類の安息香酸配糖体は、ベンゾイル基がグルコースの１位以外の水酸基に転位した安息香酸配糖体であると考えられた。
【０２２５】
次に、反応終了後の溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで２．５に調整し、反応液２０ｍＬに対して４０ｍＬのジエチルエーテルを用いて未反応の安息香酸を抽出除去した。抽出後の水層を１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ２．５に調整したのちワコーゲル１００Ｃ１８カラムに供した。蒸留水で未反応の糖を完全に洗浄した後、メタノールで溶出した。メタノール溶出液を速やかにロータリーエバポレーターで溶媒除去した後、凍結乾燥して白色の粉末を得、実施例３と同様の方法でアセチル化した。ＨＰＬＣでアセチル化後の溶液のサンプルを分析した結果、３種類のピークが認められた。
【０２２６】
〔ＨＰＬＣによる分析条件〕
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ  ６０、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．８ｍｌ／分
移動相：ヘキサン／酢酸エチル＝７／３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２２７】
３種類のピークの物質のうちの１種は実施例３に示した１−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ（１α-ＢＧ）のアセチル化物（Ａｃ−１α−ＢＧ）であった。Ａｃ−１α−ＢＧを除く安息香酸配糖体アセチル化物２種を、溶出時間の早い物質から物質１、物質２とし、これらのそれぞれに対して精製操作を行った。アセチル化物をヘキサン／酢酸エチル（１：１）混合溶液に溶解し、ヘキサン／酢酸エチル（６：４）の混合溶媒で平衡化したＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ  ６０カラム（長さ２５０ｍｍ×内径２０ｍｍ）に供し、同じ溶媒によって溶出した。このカラムクロマトグラフィーにより、物質１、物質２をそれぞれ単離することができた。これらの構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）により確認した。
【０２２８】
物質１は、１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（９１．９、７３．０、７２．６、７０．６、６７．８、６１．５（ｐｐｍ））および安息香酸由来のシグナル（１６４．９、１３３．７、１２９．９、１２８．７、１２８．６（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹにおいてグルコースのアノメリックプロトンと予測されるシグナル（ｄ、５．９ｐｐｍ）の結合定数がＪ＝７．２（Ｈｚ）であることから1位のアノマー型がβ-型であることが確認できた。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおいてグルコースの２位のプロトンと同定されるシグナル（ｔ、５．４ｐｐｍ）が安息香酸中のカルボニル炭素のシグナル（１６４．９ｐｐｍ）とＨＭＢＣスペクトルにおける相関関係にあることから、安息香酸はグルコースの２位にエステル結合していることが確認された。これより、物質１は１α-ＢＧのベンゾイル基がグルコースの２位へ転位した、２−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  がアセチル化されたものであることが確認された。すなわち上記反応液中に生成した安息香酸配糖体のうちの１種は２−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅであることが確認された。
【０２２９】
物質２は１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（８９．１、７０．０、６９．８、６９．８、６７．９、６１．４（ｐｐｍ））および安息香酸由来のシグナル（１６５．２、１３３．７、１２９．８、１２８．７、１２８．６（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹにおいてグルコースのアノメリックプロトンと予測されるシグナル（６．５ｐｐｍ）の結合定数がＪ＝３．６（Ｈｚ）であることから1位のアノマー型がα-型であることが確認できた。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおいてグルコースの２位のプロトンと同定されるシグナル（ｄｄ、５．３ｐｐｍ）が安息香酸中のカルボニル炭素のシグナル（１６５．２ｐｐｍ）とＨＭＢＣスペクトルにおける相関関係にあることから、グルコースの２位にベンゾイル基がエステル結合していることがわかり、物質２は２−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅがアセチル化されたものであると確認された。すなわち、上記反応液中に生成した安息香酸配糖体のうちのもう１種は２−Ｏ−Ｂｅｎｚｏｙｌ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅであることが確認された。
【０２３０】
（実施例４：グルコース−１−リン酸を使用した、安息香酸配糖体の合成）
グルコース−１−リン酸２ナトリウム  ２００ｍｇと安息香酸  １ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、５Ｎ−ＨＣｌでｐＨ４．５に調整した。この溶液に特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１００単位を加え、この混合液を４０℃にて、３０分間反応させた。反応後の混合液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０２３１】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸水溶液  ＝  ８０／２０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２３２】
その結果、安息香酸配糖体の生成が確認された。
【０２３３】
（実施例５〜６：ギ酸配糖体および乳酸配糖体の調製）
実施例５〜６として、酢酸の代わりに同じ容量のギ酸（実施例５）または乳酸（実施例６）を用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行い、ＴＬＣについては実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２３４】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２３５】
その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２３６】
（実施例７：マレイン酸配糖体の調製）
酢酸の代わりにマレイン酸を１０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行い、ＴＬＣについては実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２３７】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２３８】
その結果、マレイン酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２３９】
（実施例８：フェルラ酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとフェルラ酸５ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ２００単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。反応液の分析はＴＬＣについては実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣについては検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で分析を行った。その結果、フェルラ酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２４０】
（実施例８−２：フェルラ酸配糖体の合成および構造確認）
フェルラ酸０．２５ｍｇおよびスクロース１０ｇを５０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＮａＯＨで一旦ｐＨを７．０に調整し、フェルラ酸を完全に溶解した後、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．６に調整した。この溶液にＳＰ活性４０００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液２．０ｍｌを添加した。上記溶液を４０℃において８時間反応させた。なお反応の進行に伴いｐＨの上昇が起きることから、５Ｎ  ＨＣｌを用いて反応液のｐＨが４．８を超えないように調整を行った。
【０２４１】
反応液の分析反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２４２】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．８ｍｌ／分
移動相：水／ＭｅＯＨ／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１５／８５／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２４３】
このＨＰＬＣ分析の結果、フェルラ酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２４４】
フェルラ酸配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応液を５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．８に調整後、酢酸エチル抽出をおこなった。得られた酢酸エチル相に１ｇのワコーゲルＣ２００を加え減圧乾燥した後、酢酸エチル／メタノール＝１００／５の混合溶媒で平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、同混合溶媒により溶出した。得られた配糖体を含む画分を無水硫酸Ｎａで脱水後、減圧乾燥することにより、フェルラ酸配糖体（精製標品）１４ｍｇを得ることができた。この精製標品の構造をＮＭＲ（ＪＮＭ−Ａ５００、ＪＥＯＬ社製）およびＭＳにより確認した。ＮＭＲは、ＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲであった。
【０２４５】
１３Ｃ−ＮＭＲにおいてグルコース由来のシグナル（９２．０、７５．２、７３．０、７０．７、６９．５、６０．６（ｐｐｍ））およびフェルラ酸由来のシグナル（１６５．６、１４９．５、１４８．０、１４５．７、１２５．５、１２３．４、１１５．５、１１４．４、１１１．１、５５．７（ｐｐｍ））が検出された。また、１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（６．０５ｐｐｍ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）の結合定数がα結合であることを示していることから、フェルラ酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合していることが確認された。
【０２４６】
ＭＳの結果より、得られた配糖体は、分子量が３５６であり、１分子のフェルラ酸が１分子のグルコースと結合していることが確認された。
【０２４７】
上記分析の結果より、得られた配糖体は、フェルラ酸がグルコースの１位の水酸基にα結合した配糖体、１−Ｏ−Ｆｅｒｕｌｏｙｌ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅであることがわかった。
【０２４８】
（実施例９〜１５：ｏ−アミノ安息香酸配糖体、ｐ−アミノ安息香酸配糖体、２，４−ジヒドロキシ安息香酸配糖体、ニコチン酸配糖体、没食子酸配糖体、バニリン酸配糖体、またはフタル酸配糖体の調製）
実施例９〜１５として、酢酸の代わりにｏ−アミノ安息香酸（実施例９）、ｐ−アミノ安息香酸（実施例１０）、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（実施例１１）、ニコチン酸（実施例１２）、没食子酸（実施例１３）、バニリン酸（実施例１４）、またはフタル酸（実施例１５）を１０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行い、ＨＰＬＣにおいて検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で分析を行った。その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２４９】
（実施例１６〜１７：葉酸配糖体およびＬ−ドーパ配糖体の調製）
実施例１６〜１７として、酢酸の代わりに葉酸（実施例１６）またはＬ−ドーパ（実施例１７）を２ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行った。反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で分析を行った。その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２５０】
（実施例１６−２：葉酸配糖体の合成および構造確認）
スクロース６ｇを１０ｍｌの蒸留水に溶解し加温した後、葉酸０．０５ｇを加えてよく混合する。この溶液にＳＰ活性２７００単位を含有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液０．３５ｍｌを添加した。上記溶液を４０℃において２２時間反応させた後、以下の条件によりＨＰＬＣでの分析を行った。
【０２５１】
[ＨＰＬＣ条件]
カラム：ＴＳＫＧＥＬ  ＯＤＳ-１００Ｖ（トーソー製）
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／アセトニトリル／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝９０／１０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２５２】
ＨＰＬＣ分析の結果、未反応の葉酸以外に新たに葉酸配糖体のピークが確認された。反応液をメタノールと水でコンディショニングしたＳｅｐ  ＰａｋＣ１８カラムに通し、葉酸および葉酸配糖体を吸着させた。さらに蒸留水でカラムを洗浄し、未反応の糖を除いた後、５０％メタノールで配糖体と葉酸を溶出した。得られた配糖体を含む画分を減圧乾燥することにより葉酸配糖体と未反応の葉酸の混合物５ｍｇを得ることができた。この操作によって得られた混合物のマススペクトル（ｃｏｍｐａｃｔ−Ｍａｌｄｉｓｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｍｔ，Ｋｒａｔｏｓ社製）を測定したところ、葉酸の分子量４４１のピーク以外に、６０２および７６４の分子量のピークが認められた。以上の結果より、葉酸配糖体は、葉酸にグルコースが１つ結合した配糖体および葉酸にグルコースが２つ結合した配糖体であることがわかった。
【０２５３】
（実施例１８：ｐ−クマル酸配糖体の調製）
酢酸の代わりにｐ−クマル酸を１０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行った。反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては検出波長が２８０ｎｍである以外は実施例１と同じ条件で分析を行った。その結果、ｐ−クマル酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２５４】
（実施例１９：グルタル酸配糖体の調製）
酢酸の代わりにグルタル酸を１０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行った。反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２５５】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２５６】
その結果、グルタル酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２５７】
（実施例２０：クエン酸配糖体の調製）
酢酸の代わりにクエン酸を２０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行った。反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては実施例１と同じ条件で分析を行った。その結果、クエン酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２５８】
（実施例２１：ピルビン酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとピルビン酸６ｍｇを０．６ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ２５単位を加え、この混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。反応液の分析については、ＴＬＣを行わず、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２５９】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２６０】
その結果、ピルビン酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６１】
（実施例２２：粘液酸配糖体の調製）
ピルビン酸の代わりに粘液酸を２ｍｇ用いたこと以外は実施例２１と同じ条件で反応を行い、実施例１８と同じ条件で分析を行った結果、粘液酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６２】
（実施例２３：キナ酸配糖体の調製）
ピルビン酸の代わりに同じ重量のキナ酸を用いたこと以外は実施例２１と同じ条件で反応を行い、反応液の分析については、ＴＬＣを行わず実施例１と同じ条件で分析を行った結果、キナ酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６３】
（実施例２４〜２５：アスパラギン酸配糖体およびグルタミン酸配糖体の調製）
実施例２４〜２５として、酢酸の代わりに５ｍｇのアスパラギン酸（実施例２４）またはグルタミン酸（実施例２５）を用いたこと以外は実施例１と同じ条件で反応を行い、ＴＬＣについては行わず、ＨＰＬＣについては以下の条件で分析を行った。
【０２６４】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷ  内径７．５ｍｍ、長さ３００ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２６５】
その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６６】
（実施例２６：プロピオン酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとプロピオン酸１０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．２に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１００単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。反応後の混合液を実施例１と同じ条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。その結果、プロピオン酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６７】
（実施例２７〜３０：ｎ−酪酸配糖体、イソ酪酸配糖体、ｎ−吉草酸配糖体およびイソ吉草酸配糖体の調製）
実施例２７〜３０として、プロピオン酸の代わりに同じ重量のｎ−酪酸（実施例２７）、イソ酪酸（実施例２８）、ｎ−吉草酸（実施例２９）またはイソ吉草酸（実施例３０）を用いたこと以外は実施例２６と同じ条件で反応を行い、実施例１と同じ条件でＴＬＣ、ＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６８】
（実施例３１〜３２：不飽和モノカルボン酸配糖体の調製）
実施例３１〜３２として、プロピオン酸の代わりに同じ重量のクロトン酸（実施例３１）またはレブリン酸（実施例３２）を用いたこと以外は実施例２６と同じ条件で反応を行った。実施例１と同じ条件でＴＬＣ、ＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２６９】
（実施例３３〜３６：直鎖ジカルボン酸配糖体の調製）
実施例３３〜３６として、プロピオン酸の代わりに同じ重量のコハク酸（実施例３３）、グルタル酸（実施例３４）、アジピン酸（実施例３５）またはピメリン酸（実施例３６）を用いたこと以外は実施例２６と同じ条件で反応を行った。反応液の分析を以下の条件で行った。
【０２７０】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０
移動相：アセトニトリル／酢酸／水＝８５／５／１０
検出：硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０２７１】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝８０／２０／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２７２】
これらの結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２７３】
（実施例３７：メタノール混合系を用いた、脂肪酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとｎ−ヘキサン酸５μｌ、メタノール０．２ｍｌを０．８ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．２に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。反応液を実施例１と同じ条件で分析した。その結果、メタノールの配糖体とは異なる配糖体、すなわちｎ−ヘキサン酸配糖体が生成されたことが確認できた。
【０２７４】
（実施例３８：二相系を用いた、不飽和モノカルボン酸の調製）
難水溶性物質については、以下に示すような水−有機溶媒の二相系での反応を行い、配糖体を得た。
【０２７５】
スクロース１００ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えた混合液に、ソルビン酸５μｇをクロロホルム０．５ｍｌに溶解した溶液を静かに加えた。水相、クロロホルム相の界面が乱れないように注意しながら、この混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。
【０２７６】
反応後の混合液を以下の条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。反応混合液の水相、クロロホルム相の両方について分析を行った。ＴＬＣにおいては、対照として、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液、ならびに１％スクロース水溶液、１％フラクトース水溶液を用いた。ＨＰＬＣにおいては、対照として、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液を用いた。
【０２７７】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０
移動相：アセトニトリル／酢酸／水＝８５／５／１０
検出：硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０２７８】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝２０／８０／０．３
検出波長：２６５ｎｍ。
【０２７９】
ＴＬＣの結果より、反応後の混合液中に、対照のものと比較して移動の早い生成物が存在することが確認された。このことから、反応後の混合液の水相に、スクロース、およびフラクトースとは異なる糖が生成されたことが確認された。またクロロホルム相においては、反応液、対照、共にスポットが検出されず、スクロースおよびフラクトースまたはそれ以外の糖のいずれも存在しないことが確認された。
【０２８０】
ＨＰＬＣの結果より、水相部分について、反応後の混合液中にソルビン酸よりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。このことから、反応後の水相部分混合液中に、ソルビン酸よりも極性が高い生成物が生成されたことが確認された。また、反応後のクロロホルム相混合液中で、対照と比較しソルビン酸が減少していた。また、反応後の水相部分とクロロホルム部分のソルビン酸の合計は、対照と比較して減少していた。これらのことから、クロロホルム中のソルビン酸に糖が転移してソルビン酸配糖体が形成されたことが確認された。
【０２８１】
（実施例３９〜４１：易水溶性フェノール性物質の配糖体の調製）
実施例３９〜４１として、スクロース２００ｍｇと易水溶性フェノール性物質（例えば、ホモゲンチシン酸（実施例３９）、クロロゲン酸（実施例４０）または２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸）（実施例４１））５〜１０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ５０単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。ＴＬＣ、ＨＰＬＣとも対照は実施例１と同様の方法で分析した。
【０２８２】
反応後の混合液を以下の条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。
【０２８３】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０  Ｆ２５４
移動相：アセトニトリル／水＝８５／１５
検出：紫外線を照射して、感光するスポットを確認後、硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０２８４】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝８０／２０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２８５】
その結果、それぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０２８６】
（実施例４２〜５７：難水溶性フェノール性物質の配糖体の調製）
実施例４２〜５７として、スクロース２００ｍｇと難水溶性フェノール性物質（例えば、ｏ−トルイル酸（実施例４２）、ベラトル酸（ｖｅｒａｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）（実施例４３）、フェニルグルタル酸（実施例４４）、コーヒー酸（実施例４５）、アセチルサリチル酸（実施例４６）、アニス酸（実施例４７）、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（実施例４８）、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（β−レゾルシル酸）（実施例４９）、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）（実施例５０）、４−メチルサリチル酸（実施例５１）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（実施例５２）、フェニル酪酸（実施例５３）、フェニルマロン酸（実施例５４）、フェニルコハク酸（実施例５５）、フェニル乳酸（実施例５６）、および桂皮酸（実施例５７））５ｍｇを２０％メタノール溶液１ｍｌに溶解させた。完全に溶解しない場合は遠心分離した後、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得て、実施例１に示す方法でスクロースホスホリラーゼを反応させた。
【０２８７】
反応後の混合液を以下の条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。
【０２８８】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０  Ｆ２５４  
移動相：アセトニトリル／水＝８５／１５
検出：紫外線を照射して、感光するスポットを確認後、硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０２８９】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝５０／５０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２９０】
その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体の生成が確認された。
【０２９１】
（実施例５８：センノシドＡ配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとセンノシドＡ５ｍｇを２０％メタノール溶液１ｍｌ中でよく撹拌し遠心分離した後、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得て、実施例１に示す方法でスクロースホスホリラーゼを反応させた。反応後の混合液を以下の条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。
【０２９２】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０  Ｆ２５４  
移動相：１−プロパノール／酢酸エチル／酢酸／水＝１／１／１／１
検出：紫外線を照射して、感光するスポットを確認後、硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０２９３】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝５０／５０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０２９４】
その結果、センノシドＡ配糖体の生成が確認された。
【０２９５】
（実施例５９：クエン酸配糖体の調製）
スクロース  ２００ｍｇとクエン酸  ２０ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、５Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ４．７に調整した。特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えこの混合液を４０℃にて、１８時間反応させた。反応後の混合液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０２９６】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸水溶液  ＝  １００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０２９７】
その結果、クエン酸配糖体の生成が確認された。
【０２９８】
（実施例６０：グリコール酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとグリコール酸１０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えこの混合液を４０℃にて、１８時間反応させた。
【０２９９】
反応後の混合液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０３００】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸水溶液  ＝１００／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０３０１】
その結果、グリコール酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０３０２】
（実施例６１：リンゴ酸配糖体の調製）
スクロース１００ｍｇとリンゴ酸１０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１００単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。
【０３０３】
反応後の混合液をＴＬＣは行わずに以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０３０４】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷ  内径７．５ｍｍ、長さ３００ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１００／０．３
検出波長：２１０ｎｍ。
【０３０５】
その結果、リンゴ酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０３０６】
（実施例６２：グリコール酸配糖体の調製）
リンゴ酸の代わりに同じ重量のグリコール酸を用いたこと以外は実施例６１と同じ条件で反応を行った。分析はＴＬＣを行わずに実施例２７と同じ条件でＨＰＬＣを行った結果、グリコール酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０３０７】
（実施例６３：ｏ−クマル酸配糖体の調製）
リンゴ酸の代わりに同じ重量のｏ−クマル酸を用いたこと以外は実施例６１と同じ条件で反応を行った。反応後の混合液をＴＬＣは行わずに以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０３０８】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：メタノール／水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝８０／２０／０．３
検出波長：２８０ｎｍ。
【０３０９】
その結果、ｏ−クマル酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０３１０】
（実施例６４：キナ酸配糖体の調製）
スクロース２００ｍｇとキナ酸２ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４．０に調整して混合液を得た後、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  
ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１００単位を加えこの混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。
【０３１１】
分析については、ＴＬＣを行わずに実施例６１と同じ条件でＨＰＬＣを行った。その結果、グリコール酸配糖体が生成されたことが確認された。
【０３１２】
（実施例６５〜６６：シキミ酸配糖体およびフェニルグリシン配糖体の調製）
実施例６５〜６６として、キナ酸の代わりに同じ重量のシキミ酸（実施例６５）またはフェニルグリシン（実施例６６）を用いたこと以外は実施例６４と同じ条件で反応を行った。
【０３１３】
分析は、検出波長が２５４ｎｍである以外は実施例６１と同じ条件でＨＰＬＣを行った。その結果、それぞれの実施例においてそれぞれのカルボン酸に対応する配糖体が生成されたことが確認された。
【０３１４】
（実施例６７：サンザシ抽出液に含まれるカルボン酸化合物の配糖化）
カルボン酸化合物としてウルソール酸、オレアノール酸、クロロゲン酸などを含有することで知られるサンザシ抽出液（サンザシ果実の２０％エタノール抽出液の５倍濃縮液）の配糖化を行った。
【０３１５】
３０％ショ糖水溶液５００μｌにサンザシ抽出液２５０μｌ、蒸留水２５０μｌを加え１ｍｌとした。この溶液に特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えこの混合液を４０℃にて、１８時間反応させた。
【０３１６】
反応後の混合液のｐＨ変化を確認するとともに、以下の条件でＨＰＬＣにより分析を実施した。なおＨＰＬＣにおいては、対象として、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は混合液と同じ組成の溶液を上記と同様に反応させた溶液を用いた。
【０３１７】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＮＨ２、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：１．０ｍｌ／分
移動相：アセトニトリル／水／８５％リン酸水溶液  ＝  ７５／２５／０．３
検出波長：２１５ｎｍ。
【０３１８】
ＨＰＬＣでの分析の結果、スクロースホスホリラーゼを添加し反応させた混合液では、対象との比較において配糖体合成による新たなピークが出現した。また反応開始時のｐＨ４．１が反応終了後の混合液においてはｐＨ４．３に上昇していたことからも抽出液に含まれるカルボン酸がエステル化されていることが確認された。
【０３１９】
（実施例６８〜６９：ナツメ抽出液およびサンシュユ抽出液に含まれるカルボン酸化合物の配糖化）
実施例６８〜６９として、サンザシ抽出液の代わりに同じ容量の下記の表１に示す植物抽出液を用いたこと、および酵素添加前の混合液のｐＨが５．２を超えるものについては、１Ｎ  ＨＣｌによりｐＨ４．０から５．１の範囲に収まるように調整したこと以外は実施例６７と同じ条件で反応および分析を行った結果、下記の表１に示す、サンザシ抽出液と同様の方法で調製した植物抽出液に含まれるカルボン酸化合物が配糖化されていることが確認できた。
【０３２０】
【表１】
2006180875.tif 000002
（評価例１：配糖化によるにおい低減効果の確認）
（１）イソ吉草酸のにおい低減効果
スクロースホスホリラーゼによってカルボン酸を配糖化することにより得られた配糖体が、カルボン酸と比較して優れた効果を有することを確認するために、以下の官能評価を行った。生理活性物質にはカルボキシル基を含む物質が多く含まれるが、その中には独特のにおいを有しているために摂取しにくいものも多い。そこでカルボキシル基の配糖化によりにおい低減効果が得られるか否かを確認した。イソ吉草酸は、独特の不快臭を有する。そこで、イソ吉草酸にＳＰを反応させて配糖化した場合、イソ吉草酸独特のにおいに変化があるかどうかを確認した。
【０３２１】
サンプルを以下の通りに調製した。まず、イソ吉草酸０．５ｍｌ、水９ｍｌおよび４０％（重量／容積％）スクロース溶液１０ｍｌを混合し、混合液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ４．２に調整した。次いで、このｐＨ調整後の混合液１９．４ｍｌに、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１６００単位を含む水溶液または水０．６ｍｌを添加し、４０℃で１６時間インキュベートし、配糖化を行った。配糖化後、この反応液の５倍希釈液を用いて官能評価を行った。
【０３２２】
官能評価を以下の手順で行った。まず、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）入りまたはなしの各サンプルを蓋付チューブに入れ、周囲ににおいが散漫しないようにドラフト内に置き、パネラーが一人ずつにおい強度を評価した。パネラーは、熟練した研究者６名であった。パネラーにはサンプルの内容を知らせず、前半３名は、（ｉ）ＳＰなし混合液をコントロールとして（ｉｉ）ＳＰ反応混合液のにおい評価を行い、後半３名は（ｉｉ）ＳＰ反応混合液をコントロールとして（ｉ）ＳＰなし混合液のにおい評価を行った。
【０３２３】
この結果、６名のパネラー全員が、イソ吉草酸にＳＰを反応させた反応混合液は、ＳＰの入らない混合液と比較して、においが減少していると答えた。結果を表２に示す。
【０３２４】
【表２】
2006180875.tif 000003
（実施例７０：配糖化によるソルビン酸の可溶化効果）
クロロホルムを用いて、ソルビン酸の二相系スクロースホスホリラーゼ配糖化反応を行った。難水溶性物質であるソルビン酸のＳＰによる配糖化を、クロロホルムを用いた二相系の反応で行ったところ、ソルビン酸配糖体が主に水相に生成していることが確認された。
【０３２５】
ソルビン酸配糖体の存在により、主にクロロホルム相に溶解していたソルビン酸が水相に移行した。すなわち、スクロースホスホリラーゼを含まない以外は反応液と同じ組成の溶液と比べて、水相のソルビン酸濃度が約１０％上昇していた。これは、ソルビン酸配糖体の存在により、ソルビン酸の水への溶解性が向上したためと考えられる。
【０３２６】
スクロース１００ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ８０単位を加えた混合液に、ソルビン酸５μｇをクロロホルム０．５ｍｌに溶解した溶液を静かに加えた。水相、クロロホルム相の界面が乱れないように注意しながら、この混合液を４０℃にて、１６時間反応させた。この反応系の模式図を図８に示す。上層が水相であり、下層がクロロホルム層である。スクロースおよびスクロースホスホリラーゼは水溶性であるので主に上層に存在し、ソルビン酸は難水溶性でありクロロホルムには溶解するので主に下層に存在する。ソルビン酸配糖体は、これら２層の界面で形成されると考えられる。
【０３２７】
反応後の混合液を以下の条件でＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析した。
【０３２８】
［薄層クロマトグラフィーによる分析の条件］
プレート：シリカゲル６０
移動相：アセトニトリル／酢酸／水＝８５／５／１０
検出：硫酸／メタノール＝１／１をプレートに噴霧し、１３０℃で３分間加熱することにより、試料中の有機物を炭化して発色させた。
【０３２９】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝２０／８０／０．３
検出波長：２６５ｎｍ。
【０３３０】
ＴＬＣおよびＨＰＬＣの結果、反応後ＳＰ（＋）において、ソルビン酸より極性の高い新しいピークが確認できた。反応後のＳＰ（＋）はＳＰ（−）に比べて水相のソルビン酸が増加していた。ソルビン酸配糖体の出現により、ソルビン酸自体の溶解度が上昇したと考えられる。
【０３３１】
（評価例２：配糖化によるにおい低減効果の確認）
配糖化による酢酸のにおい低減効果を確認した。
【０３３２】
酢酸０．１ｍｌおよびスクロース１ｇを５ｍｌの蒸留水に溶解し、５N ＮａＯＨでｐＨ４．１に調整した。この溶液にＳＰ活性５００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液０．１ｍｌを添加した。上記溶液を３７℃において２４時間反応させた後、以下の条件でＨＰＬＣにより分析したところ、未反応の酢酸以外に新たに酢酸配糖体のピークを確認した。反応液に９倍量のアセトンを加え静置することにより大部分の糖類が液状の沈殿となり除去することができた。得られたアセトン抽出液に１ｇのワコーゲルＣ２００を加え減圧乾燥した後、１００％アセトニトリルで平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、１００％アセトニトリルにより溶出した。この工程により未反応の酢酸およびスクロースやフラクトース等の糖類は全て除去することができた。このカラムクロマトグラフィーにより得られた配糖体を含む画分を減圧乾燥することにより酢酸配糖体を約１００ｍｇ得ることができた。この酢酸配糖体は酢酸特有の匂いが酢酸と比較して顕著に低減していることが確認できた。
【０３３３】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ１８、内径４．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝８０／２０／０．３
検出波長：２１０ｎｍ。
【０３３４】
（評価例３：配糖化による味質改善効果の確認）
（評価例３−１：配糖化による酢酸の味質改善効果の確認）
酢酸配糖体を評価例２と同様の方法で作製し、酢酸水溶液および酢酸配糖体水溶液について６名のパネラーによって官能評価を行った。
【０３３５】
酢酸および酢酸配糖体を用いて、それぞれ、濃度が０．２Ｍとなるように水溶液を調整してサンプルとした（酢酸水溶液の場合１．２％  ｗ/ｖ）。６名のパネラー一人ずつに両方の水溶液を飲み比べてもらい、それぞれの水溶液の酸味の強さを評価した。パネラーにはサンプルの内容を知らせず、前半３名は（ｉ）酢酸水溶液→（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液の順に、後半３名は（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液→（ｉ）酢酸水溶液の順に評価を行った。その結果、６名のパネラー全員が（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液の方が酸味が弱いと回答した。つまり、酢酸を配糖化することによって酢酸特有の酢角が取れマイルドな味質へと改善することができた。
【０３３６】
（評価例３−２：配糖化による穀物酢の味質改善効果の確認）
ミツカン穀物酢５００μｌと４０％スクロース溶液５００μｌとを混合し、ＳＰ活性５０単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液を２０μｌ加え、３７℃で反応を行った。反応の停止は５Ｎ  ＨＣｌを加えて反応液のｐＨを３．０に調整することにより行った。ＨＰＬＣにより酢酸の配糖化率を測定し、配糖化率が１５％あるいは６０％となったところで反応を停止し、穀物酢配糖化液（（ｉ）酢酸配糖化率１５％溶液、（ｉｉ）酢酸配糖化率６０％溶液）のサンプルとした。
【０３３７】
サンプルの評価は（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれの液と上記の反応液において酵素の代わりに水を添加したコントロール溶液との比較により行った。
【０３３８】
水溶液の官能評価は、上記と同様に６名のパネラーによって行った。サンプルとしては、コントロール溶液および穀物酢反応液を５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ４．０に調整した後、水で５倍希釈したものを用いた。６名のパネラー一人ずつに両方の水溶液を飲み比べてもらい酸味の強さを評価した。パネラーにはサンプルの内容を知らせず、前半３名は（ｉ）コントロール溶液→（ｉｉ）穀物酢反応液の順に、後半３名は（ｉｉ）穀物酢反応液→（ｉ）コントロール溶液の順に評価を行った。その結果、６名のパネラー全員が、配糖化率（ｉ５％あるいは６０％）の違いによらず、（ｉｉ）穀物酢反応液の方が酸味が弱いと回答した。つまり、穀物酢中の酢酸および有機酸を一部配糖化することによって穀物酢特有の酢角が取れマイルドな味質へと改善することができた。また、味質改善効果は、配糖化率が低くても得られることがわかった。
【０３３９】
（実施例７１：スクロースホスホリラーゼの性能比較）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来の酵素だけでなくＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母社製）の酵素でも反応を行ったところ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来の酵素においても同様にカルボキシル基を配糖化した。
【０３４０】
【表３】
2006180875.tif 000004
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来のスクロースホスホリラーゼを用いた場合とＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来の酵素を用いた場合に配糖化率に差があるが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ由来の酵素においてもｐＨ５〜６付近でカルボキシル基への糖転移は行われているようである。これまで知られているスクロースホスホリラーゼの反応の至適ｐＨは中性域（７．５付近）であるが、カルボキシル基への糖転移反応は酸性域で良好に進行する。ｐＨが高くなると、糖転移率が低下する。従って、配糖化反応をｐＨ７．５で行ったキッコーマンの方法（非特許文献２）では配糖化が進行しなかったものと考えられる。また、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ由来の酵素は酸性下（ｐＨ４付近）では酵素活性が低いために、反応開始時のｐＨが３．９の場合は配糖化反応が起こらなかったと考えられる。
【０３４１】
（実施例７２：イオン交換樹脂を用いた安息香酸配糖体の部分精製）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース６ｇを１９ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．６に調整した。この溶液にＳＰ活性３０００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１ｍｌを添加した後、上記溶液を３７℃において１６時間反応させた。ＨＰＬＣについて実施例２と同じ条件で反応後の溶液の分析を行った結果、３種類の安息香酸配糖体が生成されたことが確認された。この３種類の安息香酸配糖体は、実施例２−２と同じ位置にピークが得られたので、安息香酸がグルコースの１位にα結合でエステル結合した配糖体と、安息香酸がグルコースの２位にα結合でエステル結合した配糖体と、安息香酸がグルコースの３位にα結合でエステル結合した配糖体とであることが確認された。
【０３４２】
反応後の溶液中には安息香酸と安息香酸配糖体が混在しているが、両者にはカルボキシル基の有無という違いが生じているため、陰イオン交換樹脂を用いればこれらの混合物を分離できると考えた。
【０３４３】
反応後の溶液を、蒸留水で平衡化したダイヤイオンＰＡ−４１２カラムに通したところ、未反応の安息香酸を除くことができた。すなわち、反応後の溶液を陰イオン交換カラムに通すことによって、カルボキシル基を有する安息香酸は吸着されるが、カルボキシル基がグルコースで配糖化されている安息香酸配糖体は吸着されなかった。このことから、陰イオン交換カラムに通すだけでカルボン酸とカルボン酸配糖体とを分離できることが明らかとなった。
【０３４４】
（評価例４：配糖化による酢酸の皮膚刺激性軽減効果の確認）
酢酸配糖体を評価例２と同様の方法で作製し、この酢酸配糖体の水溶液および酢酸水溶液の皮膚刺激性について６名のパネラーにより評価を行った。
【０３４５】
酢酸および酢酸配糖体のそれぞれについて２．０Ｍとなるように水溶液を調整してサンプルとした（酢酸水溶液の場合６．０％  ｗ／ｖ）。６名のパネラー一人ずつの皮膚にそれぞれの水溶液を塗布することによって皮膚への刺激性の強さを評価した。パネラーにはサンプルの内容を知らせず、前半３名は（ｉ）酢酸水溶液→（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液の順に、後半３名は（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液→（ｉ）酢酸水溶液の順に水溶液を塗布して評価を行った。その結果、６名のパネラー全員が、（ｉｉ）酢酸配糖体水溶液の方が皮膚への刺激性が弱いと回答した。従って、酢酸を配糖化することによって酢酸の刺激性を改善することができたことが確認された。
【０３４６】
（評価例５：配糖化によるリンゴ酸の味質改善効果の確認）
リンゴ酸０．２ｇおよびスクロース２ｇを１０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ４．２に調整した。この溶液に活性２７００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼ溶液０．４ｍｌを添加して反応用混合液を得た。この反応用混合液を４０℃において３時間反応させた後、以下の条件でＨＰＬＣにより分析したところ、未反応のリンゴ酸以外に新たにリンゴ酸配糖体のピークが確認された。反応液中の配糖体の転位反応を防ぐため、反応後の溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．６に調整した。別にインベルターゼ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｂａｋｅｒｓ  ｙｅａｓｔ  由来、３５５Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）２８ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。このインベルターゼ溶液０．５ｍＬを、ｐＨ２．６に調整した反応後の溶液に加え、４０℃で３時間反応させ、未反応のスクロースを分解した。この溶液を、蒸留水で平衡化させたダイヤイオンＷＡ２０カラムに供し、未反応のリンゴ酸を吸着させ、溶出液を得た。続いてこの溶出液を、蒸留水で平衡化させた活性炭カラムに供し、リンゴ酸配糖体を吸着させた。このリンゴ酸配糖体を吸着した活性炭カラムを蒸留水および５％エタノールで洗浄した後、１００％エタノールでリンゴ酸配糖体を溶出させ、溶出液中の溶媒を減圧乾燥させてリンゴ酸配糖体を得た。この工程により、未反応のグルコース、フラクトース等の糖類を除去することができた。
【０３４７】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：ＯＤＳ−１００Ｖ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝１０００／０．３
検出波長：２１０ｎｍ。
【０３４８】
このリンゴ酸配糖体およびリンゴ酸を用いて、それぞれ、リンゴ酸換算で０．５％（ｗ／ｗ）の水溶液を作成し、６人のパネラーの試飲し、どちらが酸味が少ないかをアンケートした。アンケートの結果、全員が、リンゴ配糖体の水溶液の方が酸味が少ないと答えた。このことから、リンゴ酸を配糖化することで酸味を低減できることが確認できた。
【０３４９】
（評価例６：配糖化によるリンゴ酸の皮膚刺激性軽減効果の確認）
リンゴ酸配糖体およびリンゴ酸を用いて、それぞれ、リンゴ酸換算で１５％の水溶液を作製し、１０人のパネラーの皮膚に塗布した。その結果、全員から、配糖体の水溶液の方が皮膚への刺激が少ないという結果が得られた。これによって、リンゴ酸を配糖化することで皮膚への刺激を抑えられることが確認できた。
【０３５０】
（評価例７：配糖化による安息香酸の極性上昇効果の確認）
安息香酸ナトリウム０．４ｇおよびスクロース４ｇを２０ｍｌの蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．６に調整した。この溶液に活性２７００単位を含有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼ溶液０．８ｍｌを添加した。上記溶液を４０℃において１時間反応させた後、ＨＰＬＣにより分析（ＯＤＳカラムＲＰ−１８を用い、メタノール２０部と水８０部とリン酸０．３部とから成る溶液により溶出し２８０ｎｍにより検出した）したところ、未反応の安息香酸以外に新たに安息香酸配糖体のピークが確認された。
【０３５１】
図７および図８に示す疎水性カラムによるＨＰＬＣ試験によってわかるように、安息香酸配糖体は安息香酸よりも保持時間が短くなっていることから、配糖化することによって極性が高くなっていることが確認できた。つまり、配糖化により溶解性が高くなっていることが示された。
【０３５２】
（評価例８：配糖化によるプロピオン酸のにおい軽減効果の確認）
プロピオン酸０．６ｇおよびスクロース６ｇを３０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ３．９に調整した。この溶液に活性２７００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１ｍｌを添加した。上記溶液を４０℃において３０時間反応させた後、以下の条件でＨＰＬＣにより分析したところ、未反応のプロピオン酸以外に新たにプロピオン酸配糖体のピークが１つ確認された。
【０３５３】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：ＯＤＳ−１００Ｖ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝９０／１０／０．３
検出波長：２１０ｎｍ。
【０３５４】
プロピオン酸は、独特の不快臭を有する。そこで、プロピオン酸にＳＰを反応させて配糖化した場合、プロピオン酸独特のにおいに変化があるかどうかを確認した。
【０３５５】
配糖化後の反応液の５倍希釈液を用いて官能評価を行った。
【０３５６】
官能評価を以下の手順で行った。まず、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を添加して反応させた反応液のサンプルまたは無添加のサンプルの各々を蓋付チューブに入れ、周囲ににおいが散漫しないようにドラフト内に置き、パネラーが一人ずつにおい強度を評価した。
【０３５７】
この結果、１２名のパネラー全員が、プロピオン酸にＳＰを添加して反応させた反応液のサンプルは、ＳＰ無添加のサンプルと比較して、においが減少していると答えた。これによって、プロピオン酸を配糖化することによりプロピオン酸の独特のにおいを低減させることができることが確認できた。
【０３５８】
（評価例９：プロピオン酸配糖体の安定性確認）
プロピオン酸０．６ｇおよびスクロース６ｇを３０ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ３．９に調整した。この溶液に活性２７００単位を含有する特開２００２−３４５４５８の実施例１．１に記載の方法にて調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ溶液１ｍｌを添加して反応用混合液を得た。この反応用混合液を４０℃において３０時間反応させた後、以下の条件でＨＰＬＣにより分析したところ、未反応のプロピオン酸以外に新たにプロピオン酸配糖体のピークが１つ確認された。
【０３５９】
グルコース内での転位反応を防ぐため、反応溶液を５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．１に調整し、この溶液にアセトニトリル６０ｍＬを加え、抽出操作を２回行った。アセトニトリル層は白濁していたため、遠心分離によって沈殿を除去した。アセトニトリル層にワコーゲルＣ２００を１．５ｇ加え、減圧乾燥させて樹脂に溶液中の成分を吸着させ、アセトニトリルで平衡化したワコーゲルＣ２００カラムに供し、９５％アセトニトリルで配糖体を溶出した。この溶出画分を減圧乾燥し、白色のプロピオン酸配糖体を得た。
【０３６０】
このプロピオン酸配糖体２０ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶かし、１Ｎ  ＨＣｌおよび１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ２．２、ｐＨ４．７、ｐＨ５．２、またはｐＨ６．１に調整した。各ｐＨの溶液５ｍＬを４０℃でインキュベートし、ＨＰＬＣでの配糖体のピークによって安定性を考察した。
【０３６１】
［ＨＰＬＣによる分析条件］
カラム：ＯＤＳ−１００Ｖ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：水／メタノール／８５％リン酸溶液（和光純薬）＝９０／１０／０．３
検出波長：２１０ｎｍ。
【０３６２】
インキュベート開始１時間後、５時間後および２４時間後の反応液のサンプルをＨＰＬＣで試験した結果、ｐＨ２．２の条件ではピークの形状に変化はなく、配糖体が安定な状態であることがわかった。ｐＨ５．２の条件およびｐＨ６．１の条件では、インキュベート開始１時間後で速やかにピークの形状が変化し、５時間以降は一定の状態であった。ｐＨ４．６の条件ではゆっくりと変化がおこり、最終的にはｐＨ５．２の場合およびｐＨ６．１の場合と同じ状態になった。このことより、酵素反応によって最初に生成する配糖体は、溶液のｐＨがｐＨ４付近よりも高い場合は構造が不安定で転位反応が起こりやすく、中性付近ではさらに転位速度が速くなり、別の安定な平衡状態に達するということが予測される。しかしながらｐＨ４．６以下では、グルコース残基の１位での結合が安定であることも示された。
【０３６３】
（評価例１０：安息香酸配糖体の安定性確認）
実施例３と同様に合成、精製した安息香酸配糖体５ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶解し、０．１Ｎ  ＮａＯＨおよび０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ２．０、ｐＨ４．５、ｐＨ６．０またはｐＨ８．７に調整した。各ｐＨの溶液５ｍＬを４０℃でインキュベートし、ＨＰＬＣでの配糖体のピークによって安定性を考察した。ＨＰＬＣの操作条件は実施例１と同様であった。
【０３６４】
インキュベート開始後２時間、４時間、６時間および２０時間後の反応液のサンプルをＨＰＬＣで試験した結果、ｐＨ２．０の条件ではピークの形状に変化はなく、配糖体が安定な状態であった。ｐＨ６．０の条件およびｐＨ８．７の条件では、インキュベート開始２時間後で速やかにピークの形状が大きく変化し、４時間以降は一定の状態であった。ｐＨ４．５の条件ではゆっくりと変化がおこりｐＨ２．０とのピークの違いは小さかった。このことより、酵素反応によって最初に生成する配糖体はｐＨ４付近よりも高い場合は構造が不安定で転位反応が起こりやすく、中性付近ではさらに転位速度が速くなり、別の安定な平衡状態に達するということが予測される。しかしながらｐＨ４．５以下では安定であることも示された。
【０３６５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３６６】
分子内にカルボキシル基を有する化合物は多数存在しており、その中には生理活性を有する物質が多く含まれている（例えば、脂肪酸、アミノ酸、有機酸、漢方成分等）。カルボン酸配糖体は、医薬品および食品の分野で広く利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】図１は、実施例１における薄層クロマトグラフィーの結果を示す。レーン１は、２％（重量／容積％）スクロース水溶液を、レーン２は２％（重量／容積％）グルコース水溶液を、レーン３は２％（重量／容積％）フルクトース水溶液を、レーン４は、酢酸およびスクロースにスクロースホスホリラーゼを作用させた混合液を、レーン５は、スクロースホスホリラーゼを含まない以外はレーン４の混合液と同じ組成の溶液をレーン４の混合液と同様に反応させた溶液を、そしてレーン６は、酢酸を含まない以外はレーン４の混合液と同じ組成の溶液をレーン４の混合液と同様に反応させた後の溶液をロードした。
【図２】図２は、実施例１におけるＨＰＬＣの結果を示す。図２（ａ）は、酢酸をロードした場合を、図２（ｂ）は酢酸およびスクロースにスクロースホスホリラーゼを作用させた後の混合液をロードした場合を示す。
【図３】図３は、実施例２の安息香酸配糖体の１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を示す。
【図４】図４は、実施例２の安息香酸配糖体の１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果を示す。
【図５】図５は、実施例３のアセチル化安息香酸配糖体の１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を示す。
【図６】図６は、実施例３のアセチル化安息香酸配糖体の１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果を示す。
【図７】図７は、評価例７における疎水性カラムでのＨＰＬＣの結果を示す。図７は、安息香酸をロードした場合を示す。
【図８】図８は、評価例７における疎水性カラムでのＨＰＬＣの結果を示す。図８は、安息香酸およびスクロースにスクロースホスホリラーゼを作用させた後の混合液をロードした場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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