(57)【要約】【課題】  レーザ光を試料流路に効率よく照射することを目的としている。    【解決手段】  蛍光色素を付与したサンプル液１１４の試料流路１０４を備えたセル本体１０２と、前記試料流路１０４にレーザ光１１を照射するレーザ光源２２と、前記レーザ光１１の光強度分布を均一化するビームホモジナイザ４０と、前記ビームホモジナイザ４０の光路前方に設けた絞りレンズ１４と、を備えている。この場合において、レーザ光は、照射断面が縦長長方形状であるとよい。【選択図】    図１
2006250686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を付与したサンプル液の流路を備えたセル本体と、
前記流路にレーザ光を照射するレーザ光源と、
前記レーザ光の光強度分布を均一化するビームホモジナイザと、
前記ビームホモジナイザの光路前方に設けた絞りレンズと、
を備えたことを特徴とするフローサイトメータ。
【請求項２】
請求項１記載のフローサイトメータにおいて、
前記レーザ光は、照射断面が縦長長方形状であることを特徴とするフローサイトメータ。
【請求項３】
レーザ光源から出射したレーザ光を集光してフローセルに照射させるフローサイトメータにおけるレーザ光照射方法において、
前記レーザ光の光強度分布を均一化させて試料流路に照射することを特徴とするフローサイトメータにおけるレーザ光照射方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフローサイトメータ及びレーザ光照射方法に関し、特に効果的にレーザ光を照射するフローサイトメータ及びレーザ光照射方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
流体中の粒子や細胞などに蛍光色素でラベルした抗体を結合させて、レーザ光等を照射して、反射する散乱光や蛍光を分析・分離するフローサイトメータがある。このフローサイトメータは工業分野において溶媒の分子測定、あるいは医療分野では血液等の診断に用いられている。
【０００３】
図５にフローサイトメータの概略構成を示す。図示のように、一般にフローサイトメータ２００は、石英などの透光体からなるフローセル２０２の中央にサンプルを流下させる１００μｍ程度と微小の試料流路２０４を形成し、この流路にサンプル液２２０の流れとシース液２２２の流れの層流を流通させる。このとき、シース液２２２及びサンプル液２２０は図示しないコンプレッサによりサンプルチューブから押し出される。サンプル側の圧力をシース側の圧力よりも僅かに低い状態にするとシース流に包含されたサンプル液２２０の流径が非常に小さくなり、サンプル中の粒子が一列に並ぶ。これにより一列に並んだ粒子が順番にフローセル２０２中を流れていくことになる。
【０００４】
そして、サンプル液２２０の流れに直交してレーザ光２０６を試料流路２０４中のサンプル液２２０に照射する。レーザ光２０６は光の方向、波長及び光強度が一定であり、サンプル中の粒子に照射して散乱光や蛍光を発生させることができる。レーザ光２０６はレーザ発光源２０８から絞りレンズ２１０を介してサンプル液２２０の試料流路２０４の照射スポット２１２に照射させている。このときレーザビームを横切るように粒子は一個ずつ順番に流れていく。
【０００５】
サンプル液２２０中に微粒子が存在するとレーザ光２０６が散乱する。また、微粒子に予め蛍光色素を付与しておくとレーザ光２０６の照射によって微粒子が蛍光を発する。レーザ発光源２０８の側向位置には発生した散乱光や蛍光を集光する集光レンズ２１４が配置されている。さらに、集光レンズ２１４によって集光した光を測定する検出器２１６が配置されている。検出器２１６で測定した散乱光や蛍光をデータ処理器２１８で解析することによってフローセル２０２を通過した個々の微粒子の種類を特定することができる。
【０００６】
サンプル液２２０に照射するレーザ光はサンプルに照射する前に、絞りレンズ２１０を構成する垂直レンズによって幅を調整し、ついで水平レンズによって高さを調整することにより、楕円形に集光させている（例えば、特許文献１）。この楕円形のレーザ光の強度分布は図４に示すようなガウス分布となる。
【特許文献１】特開平６−３２３９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、集光レンズで楕円形に集光させたレーザ光は、中心の光強度が最も強く、中心から端部に向かって光強度が弱くなる。このため、レーザ光の照射範囲内で光強度に相違が生じている。
【０００８】
また、流れる細胞は、サンプル液を送り出すコンプレッサの圧力変動など水制御の具合や、測定対象の細胞の大きさ等によって、流れる位置に変動が生じることがある。このため、細胞を完全に流路の同じ位置に流すことは容易ではない。そうすると細胞がレーザ照射スポットを通過する際、通過点の相違によって投入するレーザエネルギーが変化してしまう。よって放射する蛍光強度の強弱が生じ、蛍光強度の分散が大きくなるという問題があった。
そこで、上記従来技術の問題点を改善するため、本発明は、レーザ光を試料流路に効率よく照射することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のフローサイトメータは、蛍光色素を付与したサンプル液の流路を備えたセル本体と、前記流路にレーザ光を照射するレーザ光源と、前記レーザ光の光強度分布を均一化するビームホモジナイザと、前記ビームホモジナイザの光路前方に設けた絞りレンズと、を備えたことを特徴としている。
【００１０】
この場合において、前記レーザ光は照射断面が縦長長方形状であるとよい。
本発明のフローサイトメータにおけるレーザ光照射方法は、レーザ光源から出射したレーザ光を集光してフローセルに照射させるフローサイトメータにおけるレーザ光照射方法において、前記レーザ光の光強度分布を均一化させてサンプル液に照射することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
上記のごとくなっている本発明は、ビームホモジナイザによりレーザ光照射の光強度分布を均一化させることができる。これにより測定対象が照射スポットを通過する際、通過点に相違が生じても、レーザ光を一定強度で照射させることができる。このため、細胞が照射スポットを通過する位置のバラツキによって生じる蛍光強度の分散を極力低減することができる。
均一化したレーザ光は照射断面を縦長長方形状にしている。このため、通過する細胞の照射時間を長く取れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係るフローサイトメータ及びレーザ光照射方法の実施形態を添付の図面に従い以下詳細に説明する。
図１はフローサイトメータの構成概略を示す図である。図１に示すようにフローサイトメータ１０は、蛍光色素を付与したサンプル液１１４の試料流路１０４を備えたセル本体１０２と、前記試料流路１０４にレーザ光１１を照射するレーザ光源２２と、前記レーザ光１１の光強度分布を均一化するビームホモジナイザ４０と、前記ビームホモジナイザ４０の光路前方に設けた絞りレンズ１４と、前記セル本体１０２から放射する蛍光を集光する集光レンズ１６とを基本的な構成としている。
【００１３】
セル本体１０２は、石英ガラスなどの透光体によってその形状を矩形に形成してある。また、セル本体１０２の長手方向の中心軸には、上下方向に貫通した試料流路１０４を形成してある。本実施形態に係るセル本体１０２は矩形形状であるため、加工が容易で低コスト化を測ることができる。
前記試料流路１０４は、その直径が１００μｍ程度の微小の通路である。また、試料流路１０４には、セル本体１０２上部に設置したフローチャンバー１１２からサンプル液１１４とシース液１１６が図示しないコンプレッサによって圧送され、試料流路１０４の上方から下方に流下させている。
【００１４】
レーザ光源２２は、サンプル中の粒子にレーザ光１１を照射する装置である。レーザ光１１は、サンプル中の粒子に散乱光や蛍光を発生させるのに好適な、光の方向、波長、強度を一定とする光である。なお、レーザ光源２２には、例えば、不活性ガスを用いたガスレーザ等を用いることができる。
【００１５】
ビームホモジナイザ４０は、前記レーザ光源２２から出射するレーザ光の光路上に設置してあり、レーザ光１１のガウス分布を均一化させる。ビームホモジナイザ４０は、例えば強度レンズと位相レンズの組み合わせによって構成することができる。強度レンズは入射したレーザ光の高強度を拡散することでその強度を弱め、低強度を収束することでその強度を強めることができる。位相レンズは強度レンズによって強度調整したレーザ光の位相を調整してレーザ光を均一化させることができる。
【００１６】
なお、ビームホモジナイザ４０には、シリンドリカルレンズ、ビームエキスパンダー、フライアイレンズなどレーザ光を均一化させる作用のあるその他のレンズを用いることができる。
ビームホモジナイザ４０によるレーザビームの強度分布は、図３に示すように略正方形となり光強度が均一化している。
【００１７】
絞りレンズ１４は、サンプル液１１４の流れに直交した方向から照射するレーザ光１１の光路上で、ビームホモジナイザ４０とセル本体１０２の間に設置している。絞りレンズ１４は、ビームホモジナイザ４０からのレーザ照射をレンズによって集光して試料流路１０４に対し照射断面が縦長長方形状のレーザ光を照射させている。
【００１８】
そして照射スポット１５を通過したレーザ光１１は前方散乱光１９となり第２集光レンズ３０によって集光される。集光した前方散乱光１９は光検出器３２に導入し、この検出信号に基づいて蛍光及び散乱光を計測している。また、前方散乱光１９の強度は、流れる粒子の大きさを測定する情報として利用することができる。すなわち粒子に光をあてたときに散乱光の角度やパターンが異なることを利用したミー散乱理論により、例えば粒子径を測定することができる。
【００１９】
集光レンズ１６は、図１に示すようにレーザ光源２２の側向位置であって同一平面状に配置している。また、集光レンズ１６は散乱光が混入する影響の少ないレーザ照射方向と直角方向に配置している。集光レンズ１６は、照射スポット１５のレーザ照射によって発光した蛍光を集光する。
【００２０】
光電子倍増管１８は、前記集光レンズ１６と同様にレーザ光源２２の側向位置に配置している。光電子倍増管１８は、光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として信号を出力する。そして検出器２０に出力信号を送信している。
検出器２０は、サンプル液１１４が照射スポット１５を通過することによって散乱された散乱光や、サンプル液１１４に標識した蛍光色素から蛍光を計測する。
【００２１】
上記構成によるフローサイトメータ１０のレーザ照射方法について以下説明する。フローチャンバー１１２からセル本体１０２の中央に形成した試料流路１０４にサンプル液１１４及びシース液１１６の層流を流通させる。そして、レーザ発光源２２からセル本体１０２の照射スポット１５に向けてレーザ光１１を照射する。このときレーザ光路上に設けたビームホモジナイザ４０にレーザ光１１が入射すると、強度レンズ及び位相レンズの通過によって光強度分布を均一化させたレーザ光が発生する。
【００２２】
そして均一化したレーザ光１１は絞りレンズ１４によって集光して照射スポット１５に照射させる。このときレーザ光１１はサンプル液１１４の流れに対して直交方向から照射させている。
図２は試料流路に照射するレーザ光の説明図を示す。同図（１）は楕円形のレーザ光による試料流路の照射側面図及び蛍光強度頻度分布を示す。同図（２）は均一化したレーザ光による試料流路の照射側面図及び蛍光強度頻度分布を示す。
【００２３】
同図（１）に示すように楕円形のレーザ光５０を試料流路１０４内に形成されたサンプル流路１０６に照射するとレーザ光中心部５２が最も光強度が強く端部ほど光強度が弱い。細胞５４は照射スポットを通過する際に、水制御によって通過位置が異なる場合がある。
そうすると蛍光強度頻度分布グラフに示すように、細胞５４の通過位置によって最も光強度の高い中心部５２から外れる頻度が多くなり、蛍光強度の分散は図中Ａのような幅を生じる。
【００２４】
一方、均一化したレーザ光を試料流路１０４に照射した場合、同図（２）に示すように、レーザ光６０の照射断面は縦長長方形状であるため、試料流路１０４に対して一定強度で照射させることができる。このため、細胞５４の通過位置のばらつきに係らず、通過する細胞５４を常に一定の光強度で照射することができる。そうすると蛍光強度頻度分布グラフに示すように、蛍光強度の分散が少なくなり、蛍光強度の分散は図中Ｂの幅まで低減することができる。
【００２５】
そしてサンプル中に微粒子が存在するとレーザ光１１が散乱する。また、蛍光色素を付与した微粒子にレーザ光１１を照射すると蛍光を発する。この散乱光及び蛍光は照射スポット１５から放射状に発光する。
照射スポット１５を通過したレーザ光１１は前方散乱光１９となり第２集光レンズ３０によって集光される。集光した前方散乱光１９は光検出器３２に導入し、この検出信号に基づいて蛍光及び散乱光を計測している。
【００２６】
また、集光レンズ１６側で発光した蛍光は集光レンズ１６で集光して光電子倍増管１８に導入する。光電子倍増管１８では光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として検出器２０に出力信号を出力する。検出器２０では、サンプル液１１４が照射スポット１５を通過することによって散乱された散乱光や、サンプル液１１４に標識した蛍光色素から蛍光を計測する。さらに計測結果は図示しないデータ処理器に出力され、データ処理器では散乱光や蛍光を解析することによってセル本体１０２を流下したサンプル液１１４の特性を得る。
【００２７】
このようなフローサイトメータでは、照射スポットに照射するレーザ光の光強度分布を均一化させているので、サンプル液中の細胞の通過位置に相違が生じても、常に一定強度のレーザ光を均一に照射することができる。このため、測定データの分散を低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施形態に係るフローサイトメータの構成概略を示す図である。
【図２】試料流路に照射するレーザ光の説明図である。
【図３】ビームホモジナイザによるレーザ光の強度分布を示す図である。
【図４】楕円形のレーザ光の強度分布を示す図である。
【図５】従来のフローサイトメータの計測装置の説明図である。
【符号の説明】
【００２９】
１０………フローサイトメータ、１１………レーザ光、１４………絞りレンズ、１５………照射スポット、１６………集光レンズ、１８………光電子倍増管、２０………検出器、２２………レーザ光源、３０………第２集光レンズ、３２………光検出器、４０………ビームホモジナイザ、１０２………セル本体、１０４………試料流路、１０６………サンプル流路、１１２………フローチャンバー、１１４………サンプル液、１１６………シース液、２００………フローサイトメータ、２０２………フローセル、２０４………試料流路、２０６………レーザ光、２０８………レーザ発光源、２１０………絞りレンズ、２１２………照射スポット、２１４………集光レンズ、２１６………検出器、２１８………データ処理器、２２０……サンプル液…、２２２………シース液。
【図１】
2006250686.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006250686.tif 000007