(57)【要約】      （修正有）【課題】外見では識別困難なフグ種を、安価かつ簡便に同定する方法を提供する。【解決手段】各種フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子をＰＣＲ法により増幅後、各種制限酵素（ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｓｒＤＩ及びＭｓｅＩの５種、またはＭｂｏＩＩ、ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ及びＴａｑＩの４種）を用いて消化し、得られた断片長を比較することにより、非保存塩基を含む４以上の連続する塩基配列を認識する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子の非保存塩基を含む４以上の連続する塩基配列を認識することからなる、フグ種を同定するための方法。
【請求項２】
フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子を制限酵素を用いて消化すること、得られた制限酵素断片長を比較することからなる、フグ種を同定するための方法。
【請求項３】
フグ種が、トラフグ、クサフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、シマフグ、ショウサイフグ、シロサバフグ、クロサバフグ及びキタマクラからなる群より選ばれる１種以上であり、制限酵素が、ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｓｒＤＩ及びＭｓｅＩである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
フグ種が、トラフグ、クサフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、シマフグ、ショウサイフグ、シロサバフグ、クロサバフグ、センニンフグ及びキタマクラからなる群より選ばれる１種以上であり、制限酵素が、ＭｂｏＩＩ、ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ及びＴａｑＩである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号２〜１３のいずれかに示す塩基配列からなる、フグ種の全長シトクロムｂ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フグ種同定方法及びフグ種のシトクロムｂ遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
静岡県の遠州灘で獲ることができるトラフグを地域名産化しつつあるが、別のフグ種への偽装やフグ種の誤認によるフグ中毒が地域名産化への障害となっている。
【０００３】
フグ種については、フグの外観の全体的形状から識別する以外に、有効かつ具体的な同定方法は、実質的に知られていなかったので、加工されて切り身になどにされたフグについては、フグ種を簡便に同定することができないことから、人身事故が生ずる可能性があるという問題があった。
【０００４】
したがって、安価かつ簡便にフグ種を同定する方法の開発が待たれていた。
【０００５】
魚類におけるシトクロムｂ遺伝子を用いる種の同定方法としては、ウナギ種の同定方法知られているが（特許文献１）、フグ種のシトクロムｂ遺伝子の全長配列（配列番号１）は、トラフグが知られているのみであり、シトクロムｂ遺伝子をフグ種の同定に用いることはできなかった。
【特許文献１】特開平１１−２７６１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
外見では識別困難なフグ種を、安価かつ簡便に同定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、シトクロムｂ遺伝子について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによってフグ種を同定することができることを見出し、本発明を完成させたものである。
【０００８】
したがって、本発明は、以下のとおりである。
１．フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子の非保存塩基を含む４以上の連続する塩基配列を認識することからなる、フグ種を同定するための方法。
２．フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子を制限酵素を用いて消化すること、得られた制限酵素断片長を比較することからなる、フグ種を同定するための方法。
３．フグ種が、トラフグ、クサフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、シマフグ、ショウサイフグ、シロサバフグ、クロサバフグ及びキタマクラからなる群より選ばれる１種以上であり、制限酵素が、ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｓｒＤＩ及びＭｓｅＩである、２．に記載の方法。
４．フグ種が、トラフグ、クサフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、シマフグ、ショウサイフグ、シロサバフグ、クロサバフグ、センニンフグ及びキタマクラからなる群より選ばれる１種以上であり、制限酵素が、ＭｂｏＩＩ、ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ及びＴａｑＩである、２．に記載の方法。
５．配列番号２〜１３のいずれかに示す塩基配列からなる、フグ種の全長シトクロムｂ遺伝子。
【０００９】
本発明のフグ種の標準和名、学名及び全長シトクロムｂ遺伝子の塩基配列は、下記の通りである。
クサフグ        Takifugu niphobles         配列番号２
ヒガンフグ      Takifugu pardalis          配列番号３
コモンフグ      Takifugu poecilonotus      配列番号４
シマフグ        Takifugu xanthopterus      配列番号５
ショウサイフグ  Takifugu snyderi           配列番号６
シロサバフグ    Lagocephalus wheeleri      配列番号７
クロサバフグ    Lagocephalus gloveri       配列番号８
キタマクラ      Canthigaster rivulata      配列番号９
センニンフグ    Lagocephalus sceleratus    配列番号１０
カナフグ        Lagocephalus inermis       配列番号１１
マフグ          Takifugu porphyreus        配列番号１２
ヨリトフグ      Sphoeroides pachygaster    配列番号１３
【００１０】
本発明において、非保存塩基とは、フグ種において共通する塩基以外の塩基をいう。より具体的には、マルチプルアラインメント図において、＊を表示していない任意の塩基をいう（図１−１〜１−１９）。
【００１１】
本発明で、４以上の連続する塩基配列を認識するとは、当該塩基配列が特定の塩基配列であるか否かを決定することであり、当該塩基配列を認識することができる方法であれば、従来公知の任意の方法を用いることができる。たとえば、ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスによる認識、制限酵素による認識、プライマーやプローブによる認識を挙げることができる。
【００１２】
フグ種から、遺伝子増幅法の鋳型として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法をも採用することができる。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げることができる。第１法では、先ず、フグ種を液体窒素で凍結し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。第２法では、フグ種を１〜２ｃｍに細かく切断するか又は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料とすることができる。なお、試料は生魚の任意の部位、好ましくは切り身に限定されるものではなく、刺身等、どのような成育段階のものや加工された食品であっても構わない。
【００１３】
遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこの分野において周知であり、それらのいずれをも用いることが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例にも、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
【００１４】
本発明の目的のためには、まず、フグ種のミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子のＤＮＡを増幅しておくことが好ましい。ＤＮＡの増幅方法は、ＰＣＲが一般的であり、以下の記載はＰＣＲプライマーに関するが、これに限定されることはなく、従来公知の任意のＤＮＡ増幅技術、たとえば、ＬＡＭＰ法を用いることもできる。
【００１５】
プライマー設定位置は、フグ種のシトクロムｂ遺伝子型間で保存性の高い部位を使用することが望ましい。また、ＰＣＲの増幅効率や特異性は、プライマー設定位置やプライマーの配列にも依存することから、ＰＣＲ増幅効率が良く、かつ特異性の高い部分にプライマーを設定する必要がある。また、増幅の際に、遺伝子型間で増幅効率に大きな差があってはその時点でセレクションがかかってしまい、ハイブリダイズによる遺伝子型判別で正しい結果が得られない可能性がある。
【００１６】
よって、本発明のＰＣＲプライマーとしては、トラフグのシトクロムｂ遺伝子の塩基位置１〜４０３の領域については、ＹＯ１Ｎ３Ｆ（フォワードプライマー：配列番号１４）及びＹＯ２ＮＮＲ（リバースプライマー：配列番号１５）を、また、塩基位置１〜１１３７の領域については、ＹＯ１１（フォワードプライマー：配列番号１６）及びＹＯ１２（リバースプライマー：配列番号１７）を用いることができる。
【００１７】
なお、ＲＦＬＰ法自体はこの分野において周知であり、例えば消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫外線を照射して泳動バンドの位置を調べることにより、消化断片のサイズを調べることができる。また、ゲル電気泳動により消化産物のサイズを測定する場合、通常分子量マーカーが用いられるが、本発明の方法では、予想される泳動パターンが数種類しかないため、種のわかっているウナギのＤＮＡを上記のように増幅し、消化したものを分子量マーカーに代えて対照として用いることもできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のフグ種の同定方法によれば、フグ種の同定を極めて容易にかつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
１．ＤＮＡ試料の調製
ＤＮＡ試料の調製各種フグの筋肉組織を０．１g、乳鉢を用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投入した。ＳＴＥバッファー（１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）２．５ml、０．５MＥＤＴＡ（pH８．０）１．０ml、５MＮａＣｌ１．０ml、１０％ＳＤＳ  ０．５ml、蒸留水４５．０mlを混合して調製）０．５mlとProteinase K溶液（１０mg/ml）４０μｌを加え、５６℃で１晩消化した。消化物をボルテックスミキサーで撹拌後、５分間遠心分離した。その上清を６００μl取り、ＰＣＩ溶液（フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールが体積比で２５：２４：１）６００μｌを加えて、ボルテックスミキサーで撹拌後、遠心分離した。その上清を５００μl取り、５MのＮａＣｌを３０μｌと、冷却した１００％エタノール１ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで撹拌後、−８０℃で３０分間冷却した。その後遠心分離し、液層をデカンテーションで捨て、冷却した７０％エタノール５００μｌを加え、さらに遠心分離し、液層を捨て、遠心真空乾燥を行った。その後１００μｌの１×ＴＥ溶液（１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）０．５ml、０．５MＥＤＴＡ（pH８．０）１０μlに滅菌水４９．５mlを加えて調製）に溶解させた。このうち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
【００２１】
２．ＰＣＲ
市販のＰＣＲキット及び装置を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライマーとしては、上記したＹＯ１Ｎ３Ｆ及びＹＯ２ＮＮＲを用いた。
蒸留水  １４．８μl、１０×ＧＡバッファー（Ｍｇ２＋１．５mM）２．０μｌ、２．５mMｄＮＴＰ１．６μｌ、２５μM各プライマー０．４μl、Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μl）０．２μｌ、ＤＮＡ１．０μl
【００２２】
ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、５６℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃、１分の伸長工程を３５サイクル行った。
【００２３】
３．ＲＦＬＰ
各ＰＣＲ産物を限外ろ過カラム（分画分子量３００００）でろ過し、そのろ液の６μｌと、１０×バッファー１．５μl、各制限酵素０．７５μl及び蒸留水６．７５μlから成る混合物を３７℃、５５℃または６５℃で、１または２時間インキュベートすることにより消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％アガロースゲル電気泳動にかけた。
【００２４】
４．結果
結果を図２に示す。図２より、ＢａｎII、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅIIIで３７℃、２時間インキュベート後、バッファーを交換し、ＢｓｒＤＩで５５℃、１時間インキュベート後、ＭｓｅＩで６５℃、１時間インキュベート、消化することにより、各種フグを識別することができることがわかる。各種類に応じて種々のパターンが得られ、９種のフグ種の判別が可能であることがわかる。
【実施例２】
【００２５】
プライマーとしてＹＯ１１、ＹＯ１２を用いた以外は実施例１と同様の操作によって得られたＰＣＲ産物限外ろ過精製物を、ＭｂｏII，ＲｓａＩで３７℃、１時間インキュベート後、２．５ＭのＮａＣｌを５μｌ加え、ＨｉｎｆＩで３７℃、１時間インキュベートし、さらにＴａｑＩで６５℃、１時間インキュベートし、消化反応を行った。
【００２６】
２．結果
結果を図３に示す。図３より、図１同様に各種フグを識別することができることがわかる。各種類に応じて種々のパターンが得られ、１０種のフグ種の判別が可能であることがわかる。
【実施例３】
【００２７】
１．シークエンシング反応
プライマーとしてＹＯ３Ｆ（配列番号１８）、ＹＯ４Ｒ（配列番号１９）を用いた以外は実施例１と同様の操作によって得られたＰＣＲ産物限外ろ過精製物を、ＭｂｏII，ＲｓａＩで３７℃、１時間インキュベート後、２．５ＭのＮａＣｌを５μｌ加え、ＨｉｎｆＩで３７℃、１時間インキュベートし、さらにＴａｑＩで６５℃、１時間インキュベートし、消化反応を行った。
ＹＯ３ＦとＹＯ４ＲのＰＣＲ産物を３回限外ろ過を行ったあと、市販のシークエンシング反応キットおよびＰＣＲ装置を用いシークエンシング反応を行った。シークエンシング反応混合物は以下の通りであった。
【００２８】
ＹＯ５Ｆ（配列番号２０）、ＹＯ６Ｒ（配列番号２１）、ＹＯ７Ｆ（配列番号２２）、ＹＯ８Ｒ（配列番号２３）、ＹＯ９Ｆ（配列番号２４）、ＹＯ１０Ｒ（配列番号２５）、
Ready Reaction Premix  １μl、５×Sequencing Buffer  ４μl、プライマー（１ pmole/μl）２μl（上記ＹＯ５ＦからＹＯ１０Ｒのいずれか)、限外ろ過精製済みＤＮＡ１μl、滅菌水１２μl
【００２９】
シークエンシング反応は、９５℃３０秒の変性工程、５０℃３０秒のアニーリング工程及び６０℃１分の伸長工程を２５サイクル行った。
【００３０】
２．精製
シークエンシング反応物の精製にはエタノール沈殿法を用いた。反応物に、１２５mMＥＤＴＡ  ４μl、２M酢酸ナトリウム  ６μl、１００％エタノール  １００μlを加え、ボルテックスミキサーで撹拌後、１５分間、室温で静置した。
【００３１】
３．シークエンシング
遠心分離を行った後、チューブを反転してさらに遠心分離し、液層を取り去った。７０％エタノール８０μlを加え、再び遠心分離した。再度チューブを反転してさらに遠心分離し、液層を取り去り、次いでバッファー１２μｌを加え、蓋をして９５℃のヒートブロックで５分加熱した。その後、直ちに氷冷し、遠心分離した後、４℃に保存した。これを９６穴カセットにいれキャピラリーシークエンサーに供した。
【００３２】
２．結果
得られた配列を配列番号２〜配列番号１３に示した。また、塩基配列が公知のトラフグを含む、全１３種類のフグのシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントを図１に示した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、生体や刺身のフグ種の同定に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−２】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−３】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−４】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−５】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−６】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−７】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−８】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−９】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１０】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１１】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１２】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１３】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１４】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１５】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１６】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１７】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１８】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図１−１９】フグ種のシトクロムｂ遺伝子の塩基配列のマルチプルアラインメントである。
【図２】ＢａｎII、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅIII、ＢｓｒＤＩおよびＭｓｅＩを用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す。レーンは、左からマーカー（φＸ１７４）、クサフグ、トラフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、シマフグ、ショウサイフグ、クロサバフグ、シロサバフグ、キタマクラ、マーカー（１００bp）、マーカー（φＸ１７４）である。
【図３】ＭｂｏII，ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩおよびＴａｑＩを用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す。レーンは、左からマーカー（φＸ１７４）、クサフグ、トラフグ、シマフグ、ショウサイフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クロサバフグ、シロサバフグ、キタマクラ、センニンフグ、マーカー（１００bp）である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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