(57)【要約】  【課題】  表面プラズモン等による全反射減衰を利用したセンサーにおいて、センシング物質と被検体の結合の測定精度を低下させずに測定時間を短縮する。  【解決手段】  測定開始から0.5秒間隔で、センシング物質と被検体の結合の状態を反映する全反射減衰角θＳＰの変化量Ｒを測定し、さらに１０秒経過毎に、変化量Ｒ（ｉ）：ただしｉは判定回数、に対する１０秒前の変化量Ｒ（ｉ−１）の比率であるＰ（ｉ）＝Ｒ（ｉ−１）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が0.97以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が３回継続された場合には、結合が終了していると判定して結合状態の測定を終了する。センシング物質への結合速度の早い被検体に関しては、短時間で測定が終了する。また結合速度の遅い被検体に関しては、結合作用が終了するまで長時間測定を継続して、結合状態を正確に判定する。  【選択図】          図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、この薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質、およびこのセンシング物質の上に前記試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の間隔をおいた複数回の検出結果に基づいて、全反射減衰の状態の経時変化を反映した変化量Ｒを測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用したセンサーにおいて、
前記測定ユニットの測定開始から予め設定された判定時間間隔経過毎に、前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ）に対する、予め設定された比較時間間隔前に前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ’）の比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ’）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が予め設定された仮判定基準値以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が予め設定された終了基準回数継続された場合には、結合作用が終了していると判定し終了信号を出力する終了判定手段を備えたことを特徴とする全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項２】
前記終了判定手段から前記終了信号が入力された場合に、測定が終了したことを報知する終了報知手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項３】
前記仮判定基準値が０．９７であることを特徴とする請求項1または２記載の全反射減衰を利用したセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して物質の特性を分析する表面プラズモン測定等の全反射減衰を利用したセンサーに関し、特に詳細には、センシング物質と試料に含まれる特定物質との結合作用の状態を測定する全反射減衰を利用したセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、エバネッセント波を利用したセンサーの１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている。金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。表面プラズモンセンサーは、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料の特性を分析するものであり、種々のタイプのセンサーが提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサーによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサーによって検出することができる。
【０００５】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００６】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００７】
この光強度の低下が生じる全反射角以上の特定入射角θＳＰ（以後全反射減衰角θＳＰと記載）より表面プラズモンの波数が解ると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【数１】
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【０００８】
試料の誘電率εｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料の屈折率等が分かるので、結局、全反射減衰角θＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
また、エバネッセント波を利用した類似のセンサーとして、漏洩モードセンサーも知られている（例えば非特許文献１参照）。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【００１０】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰角θＳＰを知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１１】
また、上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体の溶液（液体試料）を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θＳＰを測定している。液体試料中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θＳＰを測定し、全反射減衰角θＳＰに変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合が行われているか否か、すなわち被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体あるいは抗体と抗体が挙げられ、そのようなものに関する具体的な測定としては、一例として、センシング物質をウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とし、被検体であるヒトＩｇＧ抗体との結合の有無検出とその定量分析を行う測定が挙げられる。
【００１２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角θＳＰの角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用したセンサーに適用する場合であれば、センシング物質に試料液を添加した時点を基準とした微分値の変化は、全反射減衰角θＳＰの角度変化を反映しているため、間欠的に検出を繰り返し、この微分値の変化に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平6−167443号公報
【特許文献２】特開2002−310903号公報
【非特許文献１】「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）、２１〜２３頁および２６〜２７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来提供されている全反射減衰を利用したセンサーにおいては、間欠的に検出を繰り返し、所定時間経過後までの全反射減衰角θＳＰの角度変化を求め、その結果に基づいて、センシング物質と被検体間の結合の有無、すなわち被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定している。近年被検体の種類が増加し、個々の被検体に対する測定時間を短縮することが望まれている。
【００１４】
しかしながら、センシング物質と被検体との結合速度は種々であり、センシング物質への結合速度が早い被検体であれば、測定開始から短時間経過後の検出結果から、結合の有無を容易に判定できるが、センシング物質への結合速度の遅い被検体に関しては、センシング物質との結合の有無を正確に判定するためには、長時間経過後の検出結果に基づいて判定を下す必要がある。このため、個々の測定において、一律に測定時間を短縮した場合には、センシング物質と被検体間の結合の有無の判定精度が低下する虞がある。
【００１５】
本発明は上記の事情に鑑みて、センシング物質と被検体間の結合の有無の判定精度を低下させることなく、測定時間を短縮することのできる全反射減衰を利用したセンサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の全反射減衰を利用したセンサーは、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、この薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質、およびこのセンシング物質の上に前記試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、該光検出手段の間隔をおいた複数回の検出結果に基づいて、全反射減衰の状態の経時変化を反映した変化量Ｒを測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用したセンサーにおいて、前記測定ユニットの測定開始から予め設定された判定時間間隔経過毎に、前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ）に対する、予め設定された比較時間間隔前に前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ’）の比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ’）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が予め設定された仮判定基準値以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が予め設定された終了基準回数継続された場合には、測定が終了していると判定し終了信号を出力する終了判定手段を備えたことを特徴とするものである。
【００１７】
なお、ここで「試料」とは、液体であっても気体であってもよい。また、「試料保持機構」は静止した状態の試料を保持するものであってもよいし、あるいは流れている状態の試料を保持するものであってもよい。また、Ｒ（ｉ）は、ｉ回目の判定を行う時点における変化量Ｒであり、Ｒ（ｉ’）は、ｉ回目の判定を行う時点から比較時間間隔前の時点における変化量である。判定時間間隔と比較時間間隔が同じ値に設定されている場合には、Ｒ（ｉ’）はＲ（ｉ−１）となり、Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ−１）／Ｒ（ｉ）となる。
【００１８】
なお、本センサーは、前記終了判定手段から前記終了信号が入力された場合に測定が終了したことを報知する終了報知手段を備えたものであってもよい。また、前記仮判定基準値は０．９７であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による全反射減衰を利用したセンサーは、測定ユニットの測定開始から予め設定された判定時間間隔経過毎に、前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ）に対する、予め設定された比較時間間隔前に前記測定手段により測定された前記変化量Ｒ（ｉ’）の比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ’）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が予め設定された仮判定基準値以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が予め設定された終了基準回数継続された場合には、結合作用が終了していると判定し終了信号を出力することにより、センシング物質への結合速度の早い被検体に関しては短時間で測定を終了させることができ、かつ結合速度の遅い被検体に関しては結合作用が終了するまで長時間測定を継続して結合状態を正確に判定することができるので、センシング物質と被検体との結合状態の測定精度を低下させることなく、測定時間を短縮することができる。また、それぞれの被検体に対して、結合作用が終了するまで測定を継続するため、結合状態の経時変化を示すセンサーグラムを、結合作用の終了時点まで確実に取得することができる。このため、センサーグラムへ速度方程式をフィッティングして結合曲線を求める場合に、より適切な結合曲線を求めることができる。
【００２０】
終了判定手段から終了信号が入力された場合に、測定が終了したことを報知する終了報知手段を備えた場合には、使用者は結合作用が終了したことを知ることができ、装置の利便性が向上する。
【００２１】
前記仮判定基準値として０．９７を用いれば、結合作用がほぼ終了した時点で仮終了状態であると判定されるため、結合作用が終了していない時点で、測定が終了することを防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の全反射減衰を利用したセンサーを適用した第１の実施形態である表面プラズモンセンサーの全体形状を示すものであり、また図２はこの装置の要部の側面形状を示している。
【００２３】
この表面プラズモンセンサーにおいては、表面プラズモン共鳴による全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定することにより、センシング物質と被検体の結合の状態を測定し、角度変化量の経時変化を示すセンサーグラムを取得し、さらに結合作用の終了を判定するものである。また結合作用の終了後には、解離作用についても測定を行い、解離作用の終了を判定するものである。
【００２４】
図1に示すように、第１の実施形態である表面プラズモンセンサーは、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド100,100に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック101が用いられている。そしてこのスライドブロック101には、上記ガイドロッド100,100と平行に配された精密ねじ102が螺合され、この精密ねじ102はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ103によって正逆回転されるようになっている。
【００２５】
なおこのパルスモータ103の駆動は、モータコントローラ104によって制御される。すなわちモータコントローラ104には、スライドブロック101内に組み込まれてガイドロッド100,100の長手方向における該スライドブロック101の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ2が入力され、モータコントローラ104はこの信号Ｓ2に基づいてパルスモータ103の駆動を制御する。
【００２６】
またガイドロッド100,100の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック101をそれぞれ左右から挟む形で、測定用の光ビーム（レーザビーム）30を発生させる半導体レーザ等のレーザ光源31と、入射光学系を構成する集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。また、該光検出器40には、該光検出器の出力信号Ｓを受けて後述の処理を行なう測定手段61が接続され、さらに該測定手段61には、表示部62が接続されている。なお、表示部62は本発明の終了報知手段として機能するものである。
【００２７】
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体110が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック101にセットされるようになっている。
【００２８】
図２は、このユニット連結体110の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体110は、測定ユニット10が８個、連結部111により連結されてなるものである。
【００２９】
測定ユニット10は図３に示す通り、概略四角形状とされた誘電体ブロック11と、この誘電体ブロック11の一面（図中の上面）に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる金属膜12とを有している。
【００３０】
誘電体ブロック11は例えば透明樹脂等からなり、金属膜12が形成された部分の周囲が嵩上げされた形とされ、この嵩上げされた部分13は試料液を貯える試料保持機構として機能する。なお本例では、デキストラン層16をコートした金属膜12の上にセンシング物質14であるProteinAが固定されている。
【００３１】
以下、簡単に、側手ユニット10における、デキストランコート処理およびProteinA固定化処理について説明する。まず、金属膜として50nmの金が蒸着された誘電体ブロック11をModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）中11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
【００３２】
次に、中11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面を10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。
【００３３】
次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。
【００３４】
続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。以上の処理によりデキストラン層16が金属膜上にコートされた。
【００３５】
その後、上記測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのバッファ液で3回洗浄した。バッファ液を100μl入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモンセンサーに設置し、チップ内をProteinA溶液(ProteinAを50μg/mlになるようバッファ液に溶解したもの)に入れ替え30分間放置し、センシング物質14であるProteinAを固定した。その後、チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。さらに、チップ内を100μlのバッファ液で10回洗浄した。
【００３６】
集光レンズ32は図３に示す通り、光ビーム30を集光して収束光状態で誘電体ブロック11に通し、誘電体ブロック11と金属膜12との界面12ａに対して種々の入射角が得られるように入射させる。この入射角の範囲は、上記界面12ａにおいて光ビーム30の全反射条件が得られ、かつ、表面プラズモン共鳴が生じ得る角度範囲を含む範囲とされる。
【００３７】
なお光ビーム30は、界面12ａに対してｐ偏光で入射する。そのようにするためには、予めレーザ光源31をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板や偏光板で光ビーム30の偏光の向きを制御してもよい。
【００３８】
光検出器40は、多数のフォトダイオードが１列に配されてなるフォトダイオードアレイであり、フォトダイオードの並び方向が図３中の矢印Ｘ方向となるように配されている。
【００３９】
なお、測定ユニット10へ試料液を給排する際には、ピペット等を用いることができるが、図３に示すように流路ユニット70を測定ユニット10へ取り付けて、流路を介して試料の給排を行うこともできる。
【００４０】
この流路ユニット70は、図４に示すように、概略四角錐の一部が切り取られた形状に形成されている流路ホルダ71に、液体試料を供給するための供給口72および液体試料を排出するための排出口73が取り付けられ、測定ユニット10内に簡単に着脱することができる。供給口72および排出口73には、それぞれテフロン（登録商標）チューブ74および75が接続されている。この流路ユニット70を測定ユニット10に取り付けた場合には、図３に示すように、金属膜12および流路ユニット70によりシールされた測定流路76が形成される。
【００４１】
流路ユニット70の供給路72に接続されたテフロン（登録商標）チューブ74には、切り替えポンプ77が接続され、該切り替えポンプ77には試料液供給路78、バッファ液供給路79およびエアー供給路80が接続されている。試料液供給路78には、試料液としてmouse IgG溶液（mouse IgGを１μｇ／mlとなるようにバッファ液に溶解したもの）等が準備されている不図示の液供給部が接続され、バッファ液供給路79には、バッファ液が準備されている不図示の液供給部が接続され、エアー供給路80には、不図示のエアー供給部が接続されている。なお、各供給路に接続される供給部は交換可能であり、必要に応じて交換される。
【００４２】
測定手段61は、図５に示すように、光検出器40に接続された差動アンプアレイ63と、ドライバ64と、コンピュータシステム等からなる信号処理部65とから構成されている。
【００４３】
図示の通り上記ドライバ64は、差動アンプアレイ63の各差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力をサンプルホールドするサンプルホールド回路52ａ、52ｂ、52ｃ……、これらのサンプルホールド回路52ａ、52ｂ、52ｃ……の各出力が入力されるマルチプレクサ53、このマルチプレクサ53の出力をデジタル化して信号処理部65に入力するＡ／Ｄ変換器54、マルチプレクサ53とサンプルホールド回路52ａ、52ｂ、52ｃ……とを駆動する駆動回路55、および信号処理部65からの指示に基づいて駆動回路55の動作を制御する制御回路56から構成されている。
【００４４】
信号処理部65では、測定開始から0.5秒間隔で、全反射減衰角θＳＰの経時変化、すなわちセンシング物質と試料液中の被検体との結合状態の経時変化または解離状態の経時変化を反映する変化量Ｒを算出する。変化量Ｒの詳細は後述する。また、結合作用の終了または解離作用の終了を判定する終了判定部66を備えている。
【００４５】
終了判定部66では、結合作用の終了を判定する場合には、測定ユニット10の測定開始から判定時間間隔である１０秒毎に判定を繰り返す。判定回数ｉ回目に測定された変化量Ｒを変化量Ｒ（ｉ）とし、比較時間間隔である１０秒前に測定された変化量Ｒを変化量Ｒ（ｉ’）とし、変化量Ｒ（ｉ）に対する変化量Ｒ（ｉ’）の比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ’）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が結合仮判定基準値である0.97以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が終了基準回数である３回継続された場合には、結合状態の測定が終了していると判定し結合測定終了信号を表示部62へ出力する。
【００４６】
また、解離状態を判定する場合には、同様に比率Ｐ（ｉ）を算出し、解離仮判定基準値である1.07以下であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が３回継続された場合には、解離状態の測定が終了していると判定し解離測定終了信号を表示部62へ出力する。
【００４７】
なお、信号処理部65では、終了判定部66において測定が終了していることが判定された場合には、変化量Ｒの経時変化を示すセンサーグラムに基づいて、該センサーグラムへフィッティングする速度方程式である結合曲線および解離曲線を求める。また、センサーグラム、結合曲線、解離曲線、結合曲線から求めた結合速度定数および解離曲線から求めた解離速度定数を表示部62へ出力する。
【００４８】
また、予め不図示の入力手段から判定時間間隔および比較時間間隔として10秒、結合仮判定基準値として0.97、解離仮判定基準値として1.07、終了基準回数として3回が入力されている。
【００４９】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる表面プラズモン共鳴による全反射減衰角θＳＰの角度変化量の測定動作について説明する。まず、スライドブロック101を移動させ、所望の測定ユニット10を測定位置、すなわち左右からレーザ光源31と、入射光学系を構成する集光レンズ32および光検出器40とによりはさまれる位置に移動させる。切り替えポンプ76により、チューブ74へ試料液供給路78が接続され、測定ユニット10の測定流路76へ試料液を供給する。なお、測定流路76が試料液により充填された時点で、試料液の供給を停止する。以後の測定は、測定流路76が試料液により充填された状態で行われる。
【００５０】
なお、測定時間ｔは、測定ユニット10に試料液が供給された時点を基準に、不図示のタイマーにより計測されている。
【００５１】
この状態で、レーザ光源31が駆動され、そこから発せられた光ビーム30が前述のように収束する状態で、誘電体ブロック11と金属膜12との界面12ａに入射する。この界面12ａで全反射した光ビーム30は、光検出器40によって検出される。
【００５２】
本例における光検出器40は、複数のフォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……が１列に配設されてなるフォトダイオードアレイであり、図１の図示面内において、光ビーム30の進行方向に対してフォトダイオード配設方向がほぼ直角となる向きに配設されている。したがって、上記界面12ａにおいて種々の反射角で全反射した光ビーム30の各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……が受光することになる。
【００５３】
上記フォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……の各出力は、差動アンプアレイ63の各差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……に入力される。この際、互いに隣接する２つのフォトダイオードの出力が、共通の差動アンプに入力される。したがって各差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力は、複数のフォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……が出力する光検出信号を、それらの配設方向に関して微分したものと考えることができる。
【００５４】
各差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力は、それぞれサンプルホールド回路52ａ、52ｂ、52ｃ……により所定のタイミングでサンプルホールドされ、マルチプレクサ53に入力される。マルチプレクサ53は、サンプルホールドされた各差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力を、所定の順序に従ってＡ／Ｄ変換器54に入力する。Ａ／Ｄ変換器54はこれらの出力をデジタル化して信号処理部65に入力する。
【００５５】
図６は、界面12ａで全反射した光ビーム30の入射角θ毎の光強度と、差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力との関係を説明するものである。ここで、光ビーム30の界面12ａへの入射角θと上記光強度Ｉとの関係は、同図（１）のグラフに示すようなものであるとする。
【００５６】
界面12ａにある特定の入射角θＳＰで入射した光は、金属膜12とセンシング物質14との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθＳＰが全反射減衰角であり、この角度θＳＰにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。この反射光強度Ｉの低下は、図３にＤで示すように、反射光中の暗線として観察される。
【００５７】
また図６の（２）は、フォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……の配設方向を示しており、先に説明した通り、これらのフォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……の配設方向位置は上記入射角θと一義的に対応している。
【００５８】
そしてフォトダイオード40ａ、40ｂ、40ｃ……の配設方向位置、つまりは入射角θと、差動アンプ63ａ、63ｂ、63ｃ……の出力Ｉ’（反射光強度Ｉの微分値）との関係は、同図（３）に示すようなものとなる。
【００５９】
信号処理部65は、Ａ／Ｄ変換器54から入力された微分値Ｉ’の値に基づいて、全反射減衰角θＳＰを算出する。
【００６０】
前述したように測定ユニット10の金属膜12（図３参照）に接しているセンシング物質14と被検体が結合すると、センシング物質14の屈折率が変化して、全反射減衰角θＳＰの角度も変化する。ここで、測定ユニット10の測定流路76に試料液を供給して最初の測定を行ったときの全反射減衰角θＳＰをθＳＰ（０s）とし、測定開始からt秒経過後の全反射減衰角θＳＰをθＳＰ（ｔs）とし、θＳＰ（ｔs）とθＳＰ（０s）との差分を求め全反射減衰角θＳＰの変化量Ｒと定義する。すなわち
時間ｔにおける  Ｒ＝θＳＰ（ｔs）−θＳＰ（０s）
とする。このとき、この変化量Ｒは、全反射減衰角θＳＰの経時変化を示すもの、すなわちセンシング物質と試料液中の被検体との結合状態の経時変化を反映するものとなる。なお、測定毎に変化量Ｒはそのときの測定時間ｔと対応して、信号処理部65の不図示の記憶部へ記憶される。また、同時に表示部62へも出力され、図７および図８に示すような経過した時間ｔと変化量Ｒの関係を示す図（センサーグラム）が順次表示される。すなわち測定中は測定が行われた時点までの変化量Ｒが表示される。なお、図7及び図８では、横軸（時間）の単位は秒であり、縦軸（変化量Ｒ）の単位はRU（レゾナンスユニット）である。なお、1000RUが角度0．1度に対応している。
【００６１】
さらに、信号処理部65は、測定ユニット10の測定開始から１０秒毎に判定を繰り返す。判定回数ｉ回目に測定された変化量Ｒを変化量Ｒ（ｉ）とし、１０秒前に測定された変化量Ｒを変化量Ｒ（ｉ’）とし、比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ’）／Ｒ（ｉ）を算出する。なお、本実施の形態では、判定時間間隔と比較時間間隔が同じ１０秒に設定されているため、Ｒ（ｉ’）はＲ（ｉ−１）となり、比率Ｐ（ｉ）＝Ｒ（ｉ−１）／Ｒ（ｉ）となる。
【００６２】
比率Ｐ（ｉ）が結合仮判定基準値である０．９７以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が終了基準回数である３回継続された場合には、結合状態の測定が終了していると判定し結合測定終了信号を表示部62へ出力する。
【００６３】
例えば測定された変化量Ｒが図7に示すように変化した場合であれば、4回目の判定時、すなわち最初の測定から40秒経過した時点において、比率Ｐ（４）＝変化量Ｒ（３）／変化量Ｒ（４）は０．９８となり、０．９７を超える。信号処理部65では、仮終了状態であると判定する。その後10秒経過毎に、比率Ｐ（５）＝変化量Ｒ（４）／変化量Ｒ（５）＝０．９９および比率Ｐ（６）＝変化量Ｒ（５）／変化量Ｒ（６）＝０．９９となり、それぞれ仮終了状態であると判定する。信号処理部65は、3回継続して仮終了状態であると判定した時点、すなわちＰ（６）を仮終了状態であると判定した時点（６０秒時点）で、結合状態の測定が終了していると判定し結合測定終了信号を表示部62へ出力する。また変化量Ｒの経過変化経時変化を示すセンサーグラムへ速度方程式をフィッティングした結合曲線、および該結合曲線から求めた結合速度定数を表示部62へ出力する。表示部62では、センサーグラムに加え、結合測定終了表示および結合速度定数を表示する。なお、必要に応じて、センシング物質情報や、試料液情報等の種々の情報を表示することが好ましい。なお、測定された変化量Ｒが図８に示すように変化した場合であれば、仮終了状態であると3回判定した時点、すなわちＰ（１０）を仮終了状態であると判定した時点（１００秒時点）で、結合状態の測定が終了していると判定する。
【００６４】
次に、測定流路76内の試料液をバッファ液に置き換え、解離状態を判定する場合の動作について説明する。結合状態の測定の終了後、切り替えポンプ77により、チューブ74へバッファ液供給路79が接続され、測定ユニット10の測定流路76へバッファ液が供給される。なお、測定流路76がバッファ液により充填された時点で、バッファ液の供給を停止する。以後の測定は、測定流路76がバッファ液により充填された状態で行われる。なお、バッファ液を供給する前にエアーを供給し、いったんエアーを測定流路76に充填した後に、バッファ液を充填してもよい。なお、この置き換えは、手動操作により行ってもよいし、測定手段61および切り替えポンプ77と接続されている不図示の制御手段による自動操作により行ってもよい。
【００６５】
解離状態を判定する場合には、10秒毎に、比率Ｐ（ｉ）を算出し、解離仮判定基準値1．07以下であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定を3回継続した場合に、解離状態の測定が終了していると判定する。測定された変化量Ｒが図７に示すように変化した場合であれば、仮終了状態であると3回判定した時点、すなわちＰ（１２）を仮終了状態であると判定した時点（１２０秒時点）で、解離状態の測定が終了していると判定する。信号処理部65は、解離測定終了信号を表示部62へ出力する。
【００６６】
また変化量Ｒの経過変化経時変化を示すセンサーグラムへ速度方程式をフィッティングした解離曲線、および該解離曲線から求めた解離速度定数を表示部62へ出力する。表示部62では、センサーグラムに加え、解離測定終了表示および解離速度定数を表示する。なお、必要に応じて、センシング物質情報や、試料液情報等の種々の情報を表示することが好ましい。なお、測定された変化量Ｒが図８に示すように変化した場合であれば、仮終了状態であると3回判定した時点、すなわちＰ（１６）を仮終了状態であると判定した時点（１６０秒時点）で、結合状態の測定が終了していると判定する。
【００６７】
以上の説明で明らかなように、本実施形態では、測定ユニット10の測定開始から0.5秒間隔で、センシング物質と被検体の結合の状態を反映する全反射減衰角θＳＰの変化量Ｒを測定し、さらに１０秒経過毎に、変化量Ｒ（ｉ）：ただしｉは判定回数、に対する１０秒前の変化量Ｒ（ｉ−１）の比率であるＰ（ｉ）＝Ｒ（ｉ−１）／Ｒ（ｉ）を算出し、該比率Ｐ（ｉ）が0.97以上であった場合には、仮終了状態であると判定し、該仮終了状態であるとの判定が３回継続された場合には、結合が終了していると判定し終了信号を出力することにより、センシング物質への結合速度の早い被検体に関しては、短時間で測定を終了させることができ、かつ結合速度の遅い被検体に関しては、結合作用が終了するまで長時間測定を継続して、結合状態を正確に判定することができるので、センシング物質と被検体との結合状態の測定精度を低下させることなく、測定時間を短縮することができる。また、それぞれの被検体に対して、結合作用が終了するまで測定を継続するため、結合状態の経時変化を示すセンサーグラムを、結合作用の終了時点まで確実に取得することができる。このため、センサーグラムへ速度方程式をフィッティングして結合曲線を求める場合に、より適切な結合曲線を求めることができる。
【００６８】
さらに、終了判定部66において結合作用が終了したと判定された場合、および解離作用が終了したと判定された場合には、それぞれ結合終了信号および解離終了信号が表示部62へ出力され、表示部62において結合作用の終了および解離作用の終了が表示されるため、使用者はそれぞれの作用が終了したことを直ちに知ることができ、センサーの利便性が向上する。また、結合仮判定基準値として０．９７を用いれば、結合作用がほぼ終了した時点で仮終了状態であると判定されるため、結合作用が終了していない時点で、測定が終了することを防止できる。なお、より判定精度を向上させたい場合には、設定する際に判定基準値を1.0に近づけるあるいは終了基準回数を増加させればよい。また、判定精度が多少低下しても、測定時間を短縮したい場合には、設定する際に、結合判定基準知を小さくし、解離判定基準値を大きくし、さらに終了基準回数を少なくすればよい。
【００６９】
なお、判定時間間隔、判定基準値および終了基準回数は、装置の工場出荷時に設定することとしてもよいし、あるいはユーザーが自由に設定することとしてもよい。また、一連の実験中で、被検体の種類によって予め異ならせて設定できるようにしてもよいし、センシング物質の種類によって予め異ならせて設定できるようにしてもよい。
【００７０】
次に、図１および図９を参照して本発明の第２の実施形態について説明する。第２の実施の形態の全体構成は第１の実施形態とほぼ同様であるため、図１において、異なる構成部の番号のみ図中に付記する。また図９においては、図３中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００７１】
この第２実施形態の全反射減衰を利用したセンサーは、先に説明した漏洩モードセンサーであり、測定ユニット90を用いるように構成されている。この測定ユニット90の誘電体ブロック11の一面（図中の上面）にはクラッド層91が形成され、さらにその上には光導波層92が形成されている。
【００７２】
誘電体ブロック11は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層91は、誘電体ブロック11よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層92は、クラッド層91よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層91の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層92の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００７３】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源31から出射した光ビーム30を誘電体ブロック11を通してクラッド層91に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビーム30が誘電体ブロック11とクラッド層91との界面91ａで全反射するが、クラッド層91を透過して光導波層92に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層92を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層92に取り込まれるので、上記界面91ａで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７４】
光導波層92における導波光の波数は、該光導波層92の上のセンシング物質14の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、センシング物質14と被検体間の結合の状態を測定することができる。また、光検出器40の隣接したフォトダイオードの検出値の差分である微分値Ｉ’に基づいて各測定ユニット90における、全反射減衰の状態の経時変化を反映する変化量Ｒを測定することができる。また、被検体とセンシング物質14との結合作用の終了を判定することができる。
【００７５】
本実施形態でも、信号処理部65の終了判定部66において、第１実施形態と同様に、被検体とセンシング物質14との結合作用の終了および解離作用の終了を判定することができる。このため、センシング物質と被検体との結合作用の終了の判定精度を低下させることなく、測定時間を短縮することができる。また、他の効果に関しても、第１実施形態と同様の効果を得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の第１の実施形態による表面プラズモンセンサーの全体図
【図２】上記表面プラズモンセンサーに用いられるユニット連結体の概略構成図
【図３】上記表面プラズモンセンサーの要部を示す一部破断側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーに用いられる流路ユニットの概略構成図
【図５】上記表面プラズモンセンサーに用いられる測定手段のブロック図
【図６】上記表面プラズモンセンサーにおける光ビーム入射角と光検出器による検出光強度との関係、および光ビーム入射角と光強度検出信号の微分値との関係を示す概略図
【図７】上記表面プラズモンセンサーにおけるセンサーグラムの一例を示すグラフ
【図８】上記表面プラズモンセンサーにおけるセンサーグラムの一例を示すグラフ
【図９】本発明の第２の実施形態による漏洩モードセンサーの要部を示す一部破断側面図
【符号の説明】
【００７７】
10、90    測定ユニット
11    誘電体ブロック
12    金属膜
12ａ  誘電体ブロックと金属膜との界面
13    試料液保持枠
14    センシング物質
16    デキストラン層
30    光ビーム
31    レーザ光源
32    集光レンズ
40    光検出器
61    測定手段
62    表示部
65    信号処理部
66    終了判定部
70    流路ユニット
91    クラッド層
91ａ  誘電体ブロックとクラッド層との界面
92    光導波層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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