(57)【要約】【課題】  軟質樹脂などに形成したキャピラリに、生体関連物質である標的分子を検出するためのプローブを結合したプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイにおいて、表面にプローブを固定化したプローブビーズを簡便に製作する容器及び方法を提供する。【解決手段】  ビーズ１０２とビーズが封入される微小な容器１０１とからなるビーズ処理用キットであって、該容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタ１０３を有する容器１０１にビーズ１０２が封入されたことを特徴とするビーズ処理用キット。【選択図】  図１
2006098205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズとビーズが封入される微小な容器とからなるビーズ処理用キットであって、該容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器にビーズが封入されたことを特徴とするビーズ処理用キット。
【請求項２】
前記容器の容量が処理される所定量のビーズの総容量と一致していることを特徴とする請求項１に記載のビーズ処理用キット。
【請求項３】
前記容器の外部に所定量のビーズを計量する分注機構を有することを特徴とする請求項１に記載のビーズ処理用キット。
【請求項４】
ビーズが封入される微小な容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器に一定量の該ビーズを封入する工程と、該ビーズが封入された微小な容器内に反応液を注入し、該容器内のビーズと化学反応させる工程と、該反応終了後に該容器の器壁の一部であるフィルタの外側から反応液を減圧吸引する工程とを有し、これら操作を繰り返してビーズに各種の化学反応又は洗浄を行うことを特徴とするビーズが封入されたビーズ処理用キットを用いるプローブビーズの製作方法。
【請求項５】
ビーズが封入される微小な容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器の底部又は器壁の一部に、該ビーズの粒径よりやや大きい孔径を持つビーズ取り出し穴を設け、該ビーズ取り出し穴の外部に設置したシャッターを駆動させて該ビーズ取り出し穴の開閉を制御し、該容器から所望の個数の処理されたビーズを取り出し、キャピラリビーズアレイに供給することを特徴とするキャピラリビーズアレイにプローブビーズを供給する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟質樹脂などの上に形成したキャピラリにプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイに係り、特にビーズに対して一連の化学反応を行い、プローブビーズを製作する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟質樹脂などに形成したキャピラリに、生体関連物質である標的分子を検出するためのプローブを結合したプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイに関する従来技術として、下記特許文献１が挙げられる。特許文献１では、ＤＮＡをはじめとする生体関連物質のプローブチップを実用化するためには、少量多品種を安価に作れることや、プローブ固定の均一度が良いことなどが重要であると述べている。特許文献１では、これらの課題を解決するため、「プローブの固体表面への固定と、プローブの配列を別工程にした。これにより、均一に固体表面にＤＮＡプローブを製作することができる」との記載がある。具体的には、「微粒子をプローブを固定する固体として用い、それらを並べることで目的にあった区画サイズのプローブアレイを作製する」ものである。従って、特許文献１に開示された方法では、微粒子の表面にＤＮＡをはじめとするプローブを共有結合により固定化したプローブビーズを製作する必要がある。しかし、特許文献１には、キャピラリビーズアレイにおいてキャピラリに配列するプローブビーズを製作するための手段については記載されていない。
【０００３】
特許文献１に開示されているキャピラリビーズアレイにおいて、プローブビーズを製作するための一般的な方法は以下のような方法である。
（１）プラスチック製又はガラス製の容器に、必要量のビーズを取り分ける。
（２）該ビーズの表面に、プローブを固定化するための官能基を導入する反応を行う。すなわち、該ビーズの入った容器に、官能基導入用の反応液を注入する。
（３）所定時間、該ビーズと官能基導入用の反応液が入った容器を加温、攪拌及び振とうし、該ビーズの表面に官能基を導入する化学反応を進行させる。
（４）該化学反応終了後、遠心機により該ビーズを容器の底に集める。
（５）マイクロピペッターなどにより容器から反応液を除去する。
（６）容器内にビーズ洗浄用の洗浄液を入れ、ビーズを洗浄する。
（７）該洗浄終了後、遠心機により該ビーズを容器の底に集める。
（８）マイクロピペッターまたは減圧乾燥機により、容器から洗浄液を完全に除去する。このとき、該ビーズの表面には、プローブを固定化するための官能基が導入されている。
（９）該ビーズの表面に、プローブを固定化する反応を行う。すなわち、該ビーズの入った容器に、プローブを含む反応液を注入する。
（１０）所定時間、該ビーズとプローブを含む反応液の入った容器を加温、攪拌及び振とうし、該ビーズの表面にプローブを固定化する化学反応を進行させる。
（１１）反応終了後、遠心機により該ビーズを容器の底に集める。
（１２）マイクロピペッターなどにより容器からプローブを含む反応液を除去する。
（１３）容器内にビーズ洗浄用の洗浄液を入れ、ビーズを洗浄する。
（１４）該洗浄終了後、遠心機により該ビーズを容器の底に集める。
（１５）マイクロピペッターまたは減圧乾燥機により、容器から洗浄液を完全に除去する。このとき、該ビーズの表面には、プローブが固定化されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−３４６８４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
キャピラリビーズアレイのメーカ並びにユーザが上記（１）〜（１５）の方法を実施する際の問題点は以下の通りである。
（１）容器に必要量のビーズを取り分けるのが非常に困難である。該ビーズの粒径は数μｍから数十μｍである。ビーズの比重の値にも依るが、１種類のプローブビーズを製作するために必要なビーズは数ｍｇ程度である。ビーズを正確に秤量することは、該ビーズの表面にプローブを固定化する化学反応において、ビーズとプローブの化学量比を正確に規定するために非常に重要である。しかしながら、乾燥状態のビーズでは、ビーズ同士及びビーズと容器の表面に静電気が発生するため、金属製やプラスチック製のスプーンで数ｍｇのビーズを正確に秤量するのは非常に困難である。
（２）容器の反応液を繰り返し交換する操作に手間がかかる。プローブビーズの製作は様々な化学反応の繰り返しであるから、非常に多種類の反応液並びに洗浄液を使用する。容器の反応液を交換する度に、反応液の注入、遠心力によるビーズの回収、並びにマイクロピペッターまたは減圧乾燥機による反応液の除去を行わなければならない。
（３）容器の反応液を繰り返し交換する操作中、誤操作により製作中のビーズの一部又は全部を失う危険性が非常に高い。容器の反応液の交換が繰り返されるため、液交換の操作中に反応液とともにビーズの一部を誤って廃棄してしまう危険性が非常に高く、貴重なプローブビーズの回収率が落ちてしまう。
【０００６】
従って、キャピラリビーズアレイのメーカ又はユーザが、一定量のビーズを処理し、極少量のプローブビーズを簡単に製作して、キャピラリービーズアレイに供給できる手段が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究した結果、ビーズの粒径よりも小さな孔を有するフィルタ部分を有する微小容器に一定量のビーズを封入したキットを製作することにより上記課題が解決することを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、第１に、本発明は、ビーズとビーズが封入される微小な容器とからなるビーズ処理用キットの発明であり、該容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器にビーズが封入されたことを特徴とする。該フィルターは、収容されたビーズが外部に流出することを防止する一方で、ビーズに対する化学的処理用溶液や洗浄液は処理後に外部に排出するための排出口となる。
【０００９】
ビーズ処理のためには、例えば１ｍｇが数百個になる微小なビーズの計量が重要である。そこで、前記容器の容量が処理される所定量のビーズの総容量と一致していることにより、１回のビーズ処理量を擦り切りで正確に計量出来る。また、前記容器の容量に関係なく、前記容器の外部に所定量のビーズを計量する分注機構を設け、該計量機構によってビーズ処理量を正確に計量出来る。
【００１０】
第２に、本発明は、上記ビーズ処理用キットを用いるプローブビーズの製作方法の発明であり、ビーズが封入される微小な容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器に一定量の該ビーズを封入する工程と、該ビーズが封入された微小な容器内に反応液を注入し、該容器内のビーズと化学反応させる工程と、該反応終了後に該容器の器壁の一部であるフィルタの外側から反応液を減圧吸引する工程とを有し、これら操作を繰り返してビーズに各種の化学反応や洗浄を行う。これにより、一定量のプローブビーズを高回収率にて製作することができる。
【００１１】
第３に、本発明は、上記ビーズ処理用キットを用いるキャピラリビーズアレイにプローブビーズを供給する方法の発明であり、ビーズが封入される微小な容器の底部又は器壁の一部に、該容器内に封入された一定量の該ビーズの粒径よりも小さな孔を多数持つフィルタを有する容器の底部又は器壁の一部に、該ビーズの粒径よりやや大きい孔径を持つビーズ取り出し穴を設け、該ビーズ取り出し穴の外部に設置したシャッターを駆動させて該ビーズ取り出し穴の開閉を制御し、該容器から所望の個数の処理されたビーズを取り出し、キャピラリビーズアレイに供給する。
【００１２】
結局、本発明は以下の通りである。
（１）ビーズの粒径よりも小さい孔を有するフィルタ部分を有する微小容器に一定量のビーズを封入したキット。
（２）（１）のキットに反応液及び洗浄液の注入と除去を繰り返すことにより該キットに封入されたビーズの表面で化学反応を行い、プローブビーズを製作する方法。
（３）（１）のキットを、プローブビーズのホルダとし、該キットから所望の個数のプローブビーズを取り出す方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、正確に秤量された極少量のビーズを、極少量かつ多種類の反応液と反応させる操作の煩雑さを大幅に軽減し、貴重なプローブビーズを必要な分量だけ簡便に製作することが可能である。これは、貴重又は高価なプローブ及び反応試薬の使用量の低減、並びに製作したプローブビーズの回収率の向上につながる。また、本発明は、プローブビーズを保存又は輸送するための方法、及びプローブビーズを所望の個数だけ供給するための方法を提供する。以上、本発明により、プローブビーズの製作に要する労力を大幅に低減し、キャピラリビーズアレイのプローブビーズを製作するメーカ及びユーザの物質的並びに時間的資産を大幅に節約する手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、ビーズとはプラスチックやガラス等からなり、粒径が数μｍから数十μｍの球状物である。具体例としてガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズなどがあり、フローサイトメーターなどを利用してその蛍光発色などを読み取ることが可能である。
【００１５】
図１（ａ）は本発明のビーズ処理キットの概念図を示す。微小な容器１０１の一部に、ビーズ１０２の粒径よりも小さい孔を有するフィルタ１０３がある。この微小な容器１０１の形状は問わないが、説明のため、円筒状の微小な容器１０１の底面にフィルタ１０３がある例を示す。フィルタ１０３としてはメンブレンフィルタなど様々な種類のフィルタを使用することが可能であるが、容器１０１への溶液の注入並びに除去の繰り返しに耐える強度を持つ材質のフィルタを選択する。また、本キットで有機溶媒を使用する場合は、ガラスフィルタなどの、有機溶媒に対して耐性を持つ材質のフィルタを選択する。
【００１６】
この微小な容器１０１の開口部１０４から一定量のビーズ１０２を入れる。ビーズ１０２の定量は、ビーズの比重の値を考慮して一定重量のビーズを入れる方法が実用的である。しかし、容器１０１に入れるビーズの個数が数十から数百と極めて少ない場合は、個数を数えて入れるのが最も確実である。また、ビーズ１０２を容器１０１に入れるに際しては、ビーズが乾燥していてもよいが、ビーズをバッファなどの溶液に懸濁し、ビーズの懸濁液を容器に入れる方法であれば、静電気の発生が抑制され、ビーズをハンドリングしやすい。ビーズ懸濁液を容器１０１に入れた後、バッファなどの溶液が不要であれば、容器１０１の底面にあるフィルタ１０３の外側から減圧吸引することにより、容器１０１から溶液を除去し、ビーズ１０２を保持することができる。
【００１７】
図１（ｂ）に、このキットを用いて、プローブビーズを製作する手順を示す。微小な容器１０１に一定量のビーズ１０２を入れた後、容器１０１の上側の開口部１０４並びにフィルタ１０３の外側にキャップ１０５並びに１０６を取り付ける。これにより、一定量のビーズ１０２が封入された処理キットが完成する。本処理キットを用いて、ビーズ１０２の保存並びに輸送を容易に行うことができる。本処理キットによりビーズ１０２を保存並びに輸送する場合、容器１０１にビーズ１０２とともに、ビーズを保存するためのバッファ液などを封入し、ビーズを懸濁液の状態にしてもよい。
【００１８】
容器上側のキャップ１０５を取り外し、容器内に反応液又は洗浄液を注入する。再び容器上側のキャップ１０５を取り付け、容器からビーズ１０２並びに反応液が流出しないようにする。容器内でビーズ１０２の表面の化学反応又は洗浄を行う。ビーズ１０２の表面の化学反応又は洗浄を効率良く均一に進行させるため、容器１０１全体を所定の温度に保ちながら、回転又は振とうする。所定の反応時間が経過したら、容器１０１のフィルタ１０３側のキャップ１０６を取り外す。フィルタ１０３の外側から減圧吸引し、容器１０１にビーズ１０２を保持したまま、反応液又は洗浄液を除去する。再び容器１０１にキャップ１０６を取り付け、容器１０１に、次の操作に必要な反応液を注入する。以上の手順に従い、容器１０１に一定量のビーズ１０２を保持したまま、反応液や洗浄液の注入と除去を繰り返すことにより、ビーズ１０２の表面に各種の化学反応を行い、プローブビーズを簡便かつ回収率良く製作することができる。
【００１９】
本処理キットを、各種の反応液を自動で供給することのできる送液装置、並びに減圧吸引装置と組み合わせることにより、プローブビーズの製作を自動化することが可能である。また、この処理キットを複数個同時に処理することにより、多種類のプローブビーズの製作を自動化することが可能であることは自明である。さらに、本処理キットを複数個並べるのと同じ目的で、多数のウェルを持ち、各ウェルの底面にフィルタを有するような、プローブビーズ製作用マルチウェルプレートの使用により、多種類のプローブビーズを製作する作業をさらに効率化することが可能である。
【００２０】
図１（ｃ）に本発明の処理キットを用いて、プローブビーズをキャピラリビーズアレイに供給する手順を説明する。この処理キットでは、プローブビーズが容器に保持されている。これは、特許文献１に開示されている、プローブビーズが収納されているプローブビーズホルダーと見なすことができる。該キット容器１０１の上側のキャップ１０５を取り外し、プローブビーズ１０７の粒径よりも少し大きい孔を持つビーズ取り出し穴１０８を設けた穴付きキャップ１０９を取り付ける。該キットの外部に設けたシャッター１１０などにより、ビーズ取り出し穴１０８の開閉を制御する。これにより、該キットは、プローブビーズ１０７を所望の個数だけ取り出すためのプローブビーズホルダーとなる。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明によれば、正確に秤量された極少量のビーズを、極少量かつ多種類の反応液と反応させる操作の煩雑さを大幅に軽減し、貴重なプローブビーズを必要な分量だけ簡便に製作することが可能である。これは、貴重又は高価なプローブ及び反応試薬の使用量の低減、並びに製作したプローブビーズの回収率の向上につながる。また、本発明は、プローブビーズを保存又は輸送するための方法、及びプローブビーズを所望の個数だけ供給するための方法を提供する。以上、本発明により、プローブビーズの製作に要する労力を大幅に低減し、キャピラリビーズアレイのプローブビーズを製作するメーカ及びユーザの物質的並びに時間的資産を大幅に節約する手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】一定量のプローブビーズを簡便かつ回収率良く製作するためのビーズ処理キットの概念図並びに使用法の概略図である。
【符号の説明】
【００２３】
１０１・・・微小な容器、１０２・・・ビーズ、１０３・・・フィルタ、１０４・・・開口部、１０５・・・キャップ、１０６・・・キャップ、１０７・・・プローブビーズ、１０８・・・ビーズ取り出し穴、１０９・・・穴付きキャップ、１１０・・・シャッター。
【図１】
2006098205.tif 000003