(57)【要約】【課題】Ｄ−フェニルアラニンなどのＤ−アミノ酸の生産に利用可能な、効率のよい、基質特異性の高い酵素Ｄ−アミノアシラーゼを提供すること。【解決手段】平成１６年８月１０日付けにて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５７として寄託されているマイクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する新規微生物および該微生物が産生する新規Ｄ−アミノアシラーゼを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５７として寄託されているマイクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する新規微生物。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５７号として寄託されているマイクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する新規微生物が産生するＤ−アミノアシラーゼ。
【請求項３】
Ｎ−アシルＤ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼであって、
（Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または
（Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２記載のＤ−アミノアシラーゼ。
【請求項４】
Ｎ−アシルＤ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、
（ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列。
【請求項５】
前記変異塩基配列が、前記配列番号：１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである請求項４に記載の塩基配列。
【請求項６】
請求項２または請求項３記載のＤ−アミノアシラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法
【請求項７】
請求項４または５記載の塩基配列を含むプラスミド。
【請求項８】
請求項７記載のプラスミドにより形質転換された微生物。
【請求項９】
請求項１記載の微生物を培養して、Ｄ−アミノアシラーゼを産生することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項８記載の微生物を培養して、該微生物に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを産生することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを産生する新規な微生物及び該微生物が産生する新規なＤ−アミノアシラーゼとそれをコードする遺伝子を提供する。さらに、該Ｄ−アミノアシラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法及び該アミノアシラーゼの製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸の製造は発酵法では困難であり、酵素法によるのが一般的である。Ｄ−アミノ酸の工業的な製造方法としてはＤ−アミノアシラーゼ法、ヒダントイナーゼ法、アミダーゼ法などが主なものとして知られているが、これらの他にもアミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いるＤ−アミノ酸の合成方法も検討されている。
【０００３】
立体特異的なアミノアシラーゼをアミノ酸の光学分割酵素として用いる技術は１９５７年に開発され、Ｎ−アシルＬ−アミノ酸に特異的に作用するＬ−アミノアシラーゼがＬ−アミノ酸の生産に用いられた。これに対して、Ｄ−アミノアシラーゼを用いる光学分割によるＤ−アミノ酸生産は、適当なＤ−アミノアシラーゼの供給源が見いだされなかったことにより、工業的にはあまり進展しなかった。しかしながら近年、Ｄ−アミノアシラーゼ活性がいくつかの微生物に見いだされるに及んで、Ｄ−アミノアシラーゼを用いるＤ−アミノ酸の生産が確立されることとなった。この方法では、まず原料となるはＮ−アシルＤＬ−アミノ酸を化学的に合成し、これにＤ−アミノアシラーゼを作用させることにより、ラセミ体のうちＤ−体のみを脱アシル化させ、Ｄ−アミノ酸を生成させる。残存するＮ−アシルＬ−アミノ酸は化学的に、もしくはＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いて酵素的にラセミ化し、再び原料として利用する。これを繰り返すことにより、Ｎ−アシルＤＬ−アミノ酸から理論上は１００％のモル収率でＤ−アミノ酸を製造することができる。Ｄ−アミノアシラーゼ活性はこれまでに、アルカリジェネス（Alcaligenes）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、 ストレプトマイセス（Streptomyces）属（特許文献１）、バリオボラックス（Variovorax）属、セベキア（Sebekia）属（特許文献２）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属（特許文献３）、その他の微生物群（特許文献４）に見い出されており、このうち、アルカリジェネス属およびバリオボラックス属 のＤ−アミノアシラーゼについては遺伝子クローニングならびに大量発現も行われている。またアルカリジェネス  キシロソオキシダンス  サブスピーシーズ  キシロソオキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans subsp. Xylosoxydans）Ａ−６株のＤ−アミノアシラーゼは、工業的に生産されＤ−アミノ酸の製造に利用されている。しかしながら、産業上の需要の高いＤ−フェニルアラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファンなどの生産に利用可能な、効率のよい、基質特異性の高い酵素はまだ見つかっていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−０４５１７９
【特許文献２】特開平１１−３１８４４２
【特許文献３】特開２００２−３２０４９１
【特許文献４】特開２０００−０４１６８４
【非特許文献１】吉宗一晃、広瀬芳彦、森口光瞭  バイオサイエンスとインダストリー６１巻、４号、ｐｐ．２３５−２４０（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように従来の技術では、産業上の需要の高いＤ−フェニルアラニンなどのＤ−アミノ酸の生産に利用可能な、効率のよい、基質特異性の高い酵素が存在しないという問題があった。
【０００６】
本発明は、Ｄ−フェニルアラニンなどのＤ−アミノ酸の生産に利用可能な、効率のよい、基質特異性の高い酵素Ｄ−アミノアシラーゼを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを唯一炭素源および窒素源とする寒天培地に生育する微生物の中から、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンにもっとも効率よく作用するＤ−アミノアシラーゼを生産する微生物を鋭意探索した。その結果、そのような、Ｄ−アミノアシラーゼを生産する微生物を取得することができた。この微生物がマイクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する新規微生物であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５７として平成１６年８月１０日付けにて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託されているマイクロバクテリウム属に属する新規微生物および該微生物が産生する新規なＤ−アミノアシラーゼを提供する。
【０００８】
また本発明によれば、Ｎ−アシルＤ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼであって、（Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列、または（Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異アミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼが得られる。
【０００９】
また本発明は、Ｎ−アシルＤ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、（ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または（ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列を特徴とするＤ−アミノアシラーゼを提供する。
【００１０】
さらに、本発明は上記Ｄ−アミノアシラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法並びに上記Ｄ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列を含むプラスミドおよび該プラスミドにより形質転換された微生物によるＤ−アミノアシラーゼの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るＤ−アミノアシラーゼは、Ｎ−アセチルＤ−フェニルアラニンに特に高い活性を有するので、Ｄ−フェニルアラニンの立体特異的生産をより効率よく行えるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の微生物は  黄色のコロニーを形成し、グラム染色陽性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性の非運動性絶対好気性無芽胞桿菌である。ｐＨ５−９で生育可能であり、至適生育ｐＨはｐＨ７．０付近である。主要脂肪酸はイソ・アンティイソ分枝型の組成を示す。Ｇ＋Ｃ含量は６９．１ｍｏｌ％である。１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索の結果から、本発明の微生物がいくつかのマイクロバクテリウム属細菌と高い類似性を示すことが示されるが、近縁種マイクロバクテリウム  アエロラタム（M. aerolatum）、マイクロバクテリウム  フォリオラム（M. foliorum）、マイクロバクテリウム  フィロスフェラエ（M. phyllosphaerae）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性は最大でも１２％である。このことから、本発明の微生物はこれらの近縁種とは明らかに別種であり、新規微生物と判断される。マイクロバクテリウム属細菌についてＤ−アミノアシラーゼ生産菌の報告例はいままでなく、本発明の微生物がその最初の例である。本発明の微生物は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５７として寄託されている。実施例１〜１１に本発明の微生物の分離、微生物学的諸性質ならびに分類学的位置づけの解析について、さらに詳細に記載する。また実施例１２〜１５には本微生物からのＤ−アミノアシラーゼやその遺伝子の取得ならびに該発明に係る酵素の性質について記載する。
【００１３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
Ｄ−アミノアシラーゼ生産菌の単離
微生物源として採取した土サンプル０．１ｇを生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、懸濁液１００μｌをＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン（和光）を唯一炭素源および窒素源とする寒天培地に塗布した。３０℃で２日間静置培養した後、生育したＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン資化性コロニー（５０００株以上）を新しいプレートに一つずつ区分けして植菌し、再度３０℃、２日間静止培養した後、４℃で保存した。単離したコロニーを２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを含有する０．０１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０、５００ｍｌ）に懸濁し、３７℃で一時間菌体反応を行った後、１５０００×ｇで５分間遠心分離することにより上清を得た。上清をシリカゲルプレート（ＭＥＲＣＫ、Silica gel ６０ Ｆ２５４）にスポットして、薄層クロマトグラフィーを行った（展開溶媒組成；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）。展開後、プレートを乾燥し、ニンヒドリンを噴霧した。ニンヒドリン反応により赤紫色のスポットを与える株を、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン分解活性株として検出した。それらの分解活性株の中から、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンに対して最も強い活性を示す株を選抜し、ＴＮＪＬ１４３−２と命名した。１５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むＬＢ培地にＴＮＪＬ１４３−２を懸濁し、−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００１５】
培養性状と試験
フェイバーＧ（日水製薬）を使用してグラム染色を行った。また、カタラーゼテストは次のようにして行った。スライドグラスに３％過酸化水素を１滴のせ、寒天培地で培養したコロニーを白金耳で取り出してよく混ぜて、気泡が発生した場合を陽性とした。オキシダーゼテストはバクトラボオキシダーゼテスト（和光）を用いて行った。
ＴＮＪＬ１４３−２株のコロニーは黄色光沢で円形低凸状であり、周縁は滑らかであった。本菌はグラム染色陽性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性であり、運動性のない無芽胞桿菌であった。細胞の直径は０．５−０．６μｍ、長さは１．５μｍであった。
【実施例３】
【００１６】
生育最適ｐＨ
ＴＮＪＬ１４３−２株をＬＢ培地に２４時間、３０℃振とう培養した。培養液２００μｌをＫＨ２ＰＯ４及びＫ２ＨＰＯ４で調整したｐＨ５〜８のＬＢ培地、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４及び１Ｍ ＮａＯＨで調整したｐＨ４．０及びｐＨ９．０の培地５ｍｌに移し、３０℃で１週間、恒温水槽で静止培養した。各温度での培養液の６００ｎｍにおける濁度を測り、生育可能ｐＨ及び至適ｐＨを決定した。本菌はｐＨ５〜９の広いｐＨ範囲に生育し、その生育最適ｐＨはｐＨ５〜７であった。
【実施例４】
【００１７】
耐塩性試験
ＬＢ培地にＮａＣｌを０〜１０％（ｗ／ｖ）になるように加えた。ＬＢ培地で前培養した菌２００μｌを移し、３０℃で一週間静止培養し、培養液の６００ｎｍにおける濁度を測定した。その結果、本菌は０〜６％の塩化ナトリウムを含むＬＢ培地に生育可能であり、耐塩性があるものと考えられた。しかしながら本菌は７％以上の塩化ナトリウムを含むＬＢ培地には生育しなかった。
【実施例５】
【００１８】
生化学および糖資化性試験
ＡＰＩ Ｃｏｒｙｎｅ （日本ビオメリュー）を用い、メーカーの推奨する方法に従ってＴＮＪＬ１４３−２株の生化学試験および糖資化性試験行った。ＡＰＩ ｃｏｒｙｎｅ ｔｅｓｔを用い、本菌および近縁種であるM. aerolatum ＪＣＭ １２１３７Ｔ 、M. foliorum ＪＣＭ １１５６９Ｔ 、M. phyllosphaerae  ＪＣＭ １１５７１Ｔについて生理・生化学的性状学の試験を行った結果を表１に示す。ＴＮＪＬ１４３−２株は、ピラジナミダーゼ、アルカリフォスフォターゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミンダーゼ、ゼラチンアーゼ陽性を示した。また本菌は硝酸還元反応陰性を示した。これらの結果を表１にまとめた。
【００１９】
【表１】
2006055131.tif 000002
【００２０】
表１は、ＴＮＪＬ１４３−２ＴがＭ．aerolatum ＪＣＭ１２１３７Ｔ、Ｍ．foliorum ＪＣＭ１１５６９Ｔ、およびＭ．phyllosphaerae ＪＣＭ１１５７１Ｔから区別される生理的性質を示した表である。
微生物１はＴＮＪＬ１４３−２Ｔ、２はＭ．aerolatum ＪＣＭ１２１３７Ｔ、３はＭ．foliorum ＪＣＭ１１５６９Ｔ、４はＭ．phyllosphaerae ＪＣＭ１１５７１Ｔを示し、＋は陽性、−は陰性を示す。
なお、本試験に供した４株はすべて、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、およびβ−グルコシダーゼ活性について陽性であった。また本試験に供した４株はすべてカゼイン分解、β−グルクロニダーゼ、ピロリドニル アクリルアミだーゼ、およびウレアーゼ活性について陰性であった。また本試験に供した４株はすべてグルコース、リボース、キシロース、マンニトール、マルトース、乳糖、ショ糖、グリコーゲンからの酸生成は認められなかった。
【実施例６】
【００２１】
菌体脂肪酸組成分析
ＴＮＪＬ１４３−２株を３０℃で２４時間、ＬＢ培地で培養した。培養菌体をメタノール・水酸化ナトリウム溶液を用いて鹸化処理した後、塩酸・メタノールを用いて脂肪酸をメチルエステル化した。ヘキサン・tert−ブチルメチルエテールを用いて脂肪酸エステルを抽出し、ガスクロマログラフィーで分析した。その結果を表２に示した。
【００２２】
【表２】
2006055131.tif 000003
【００２３】
表２はＴＮＪＬ１４３−２株ならびにその近縁種の菌体脂肪酸組成(ｍｏｌ％)を示す。
【００２４】
分析の結果、ＴＮＪＬ１４３−２株は、その主要な菌体脂肪酸としてＣ１８：０  ａｎｔｅｉｓｏ、Ｃ１５：０  ｉｓｏ、Ｃ１５：０  ａｎｔｅｉｓｏ、Ｃ１７：０  ａｎｔｅｉｓｏなどをもつことが認められ、典型的なイソ・アンティイソ分枝型の脂肪酸組成を示した。Ｃ１５：０  ａｎｔｅｉｓｏは含量が一番多い細胞脂肪酸として４５ｍｏｌ％となり、一方、本菌の菌体脂肪酸のうちＣ１５：０  ｉｓｏが他の近縁株の含量を大きく上回ることは、本菌がこれらとは別の新種であることを示唆している。
【実施例７】
【００２５】
メナキノン分析
凍結乾燥菌体からクロロホルム−メタノール（２：１）によりメナキノン抽出を行った。抽出は５０ｍｌ容の遠心チューブに凍結乾燥菌体とクロロホルム−メタノール混液２５ｍｌを加え、１５分間の振盪抽出を行った。濾過により菌体を除去したのち濃縮乾固した。残渣に小量のアセトンを加え、窒素ガス下で濃縮し、遠心処理して、上清をＨＰＬＣにより分析した。本菌は、主要メナキノン（ＭＫ）系としてＭＫ９、ＭＫ１０、ＭＫ１１、ＭＫ１２を含むことがわかった。
【実施例８】
【００２６】
ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
滅菌水にゲノムＤＮＡを３００〜５００μｇ／ｍｌの濃度に溶かし、１００℃で１０分間保温し、急冷して変性させた。その２０μｌに等量の０．１ｍｇ／ｍｌのヌクレアーゼＰ１溶液（ＤＮＡ−ＧＣ Ｋｉｔ 、ヤマサ醤油；４０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＺｎＳＯ４、ｐＨ５．３）を加え、５０℃で１時間処理した。処理試料を次の条件でＨＰＬＣ分析した。移動相：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰＡＱＵＲＯＵＳ (４．６×２５０ｍｍ、野村化学)、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２７０ｎｍ。ＧＣ含量は次の式により算出した。
Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％＝
［(Ｃｘ／ＣＳ＋Ｇｘ／Ｇｓ)／(Ｃｘ／ＣＳ＋Ａｘ／Ａｓ＋Ｇｘ／Ｇｓ＋Ｔｘ／Ｔｓ)］
×１００
ここで、Ｎｘは検体のｄＣＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰのピーク面積値、Ｎｓは標準ヌクレオチド混合物のｄＣＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰのピーク面積値である。
Ｇ＋Ｃ含量は６９．１％という高い値を示した。この結果も本菌がマイクロバクテリウム属細菌に属することを支持している。
【実施例９】
【００２７】
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析
ＴＮＪＬ１４３−２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、真正細菌用のユニバーサルプライマー１０Ｆと１５００Ｒを用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、ゲル回収して、Microspin colums Ｓ−４００ ＨＲ（Amersham Biosciences、 Piscataway、ＮＪ、ＵＳ）で精製した。ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲのDye Terminator Cycle Sequencingケミストリープロトコルに従って、塩基配列解析用サンプルの調製を行い、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００ＸＬによって塩基配列の解析を行った。得られた塩基配列を配列番号３に示した。この配列はマイクロバクテリウムのクラスターに含まれ、Ｍ．aerolatum ＤＳＭ １４２１７Ｔ（＝ＪＣＭ１２１３７Ｔ）、Ｍ．foliorum ＤＳＭ １２９６６Ｔ（＝ＪＣＭ１１５６９Ｔ）、Ｍ．phyllosphaerae ＤＳＭ １３４６８Ｔ（＝ＪＣＭ１１５７１Ｔ）、マイクロバクテリウム  ケラタノリティカム（Ｍ．keratanolyticum）ＤＳＭ ８６０６Ｔの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列とそれぞれ９７．６％、９８．６％、９８．７％、９８．１％の類似性を示した。
【実施例１０】
【００２８】
系統樹の作成
ＴＮＪＬ１４３−２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用いて分子系統樹を作成し、近縁種および帰属分類群の推定を行った。GenBank/DDBJ/EMBL databaseからマイクロバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得し、Clustal Ｘプログラムを用いて多重アラインメントを行った後、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成した。樹型の妥当性を示すブートストラップは１０００回発生させた。
得られた系統樹を図１に示した。形成枝付近のブートストラップ値は低いものの、ＴＮＪＬ１４３−２株の１６Ｓ ｒＤＮＡはＭ．aerolatumの１６Ｓ ｒＤＮＡと姉妹群を形成した。このことからＴＮＪＬ１４３−２株はＭ．aerolatumに近縁な菌株と推定された。しかしながら、現時点でＴＮＪＬ１４３−２株とＭ．aerolatumの種の異同を判断することは難しいと考えられ、これらの関係を明確するためにＴＮＪＬ１４３−２株とＭ．aerolatumとの間でＤＮＡ−ＤＮＡ相同値を比較する必要があった。また一般に１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の比較で相同率９７％以上を示す菌株同士は同種である可能性が示唆されることから、Ｍ．foliorumおよびＭ．phyllosphaeraeに関してもＤＮＡ−ＤＮＡ相同値を比較するのが望ましいと考えられた。
【実施例１１】
【００２９】
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
基準株Ｍ．aerolatum ＪＣＭ １２１３７Ｔ、Ｍ．foliorum ＪＣＭ １１５６９Ｔ 、Ｍ．phyllosphaerae ＪＣＭ １１５７１Ｔ は、Japan Collection of Microorganisms（埼玉県和光市）から購入した。ＴＮＪＬ１４３−２株ならびに各基準株の細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成法によりマイクロプレート法を用いて行った。
その結果、ＴＮＪＬ１４３−２株は、いずれの株とも最大で１２％の相同値しか示さないことがわかった（Ｍ．aerolatum ＪＣＭ １２１３７Ｔに対して１２％、Ｍ．foliorum ＪＣＭ １１５６９Ｔに対して１１％、Ｍ．phyllosphaerae ＪＣＭ １１５７１Ｔに対して１２％）。
現在、細菌種に関しては、７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同値を示す菌株同士を同種すると定義されている。このことから、ＴＮＪＬ１４３−２はこれらの基準株とは明らかに別種であり、新種と判断される。
【実施例１２】
【００３０】
Ｄ−アミノアシラーゼの精製
Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン液体培地（Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、０．０１％（ｖ／ｖ）; 酵母エキス、０．５％；ＮａＣｌ、０．５％；ＫＨ２ＰＯ４、０．１％；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００５％；１００ｍｌ）を用いてＴＮＪＬ１４３−２株を３０℃で３０時間振とう培養した(１２０ｒｐｍ)。次いでＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン培地のＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンをＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンで置き換えた３Ｌの培地に前培養液を植菌し、ジャーファーメンター（ミツワ）にて３０℃で３６時間通気攪拌（２５０ｒｐｍ）培養した。遠心分離(６０００ｒｐｍ、 ４℃、２０ｍｉｎ) により集菌後、菌体を０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液で３回洗浄した。洗浄菌体(湿重量；１１１ｇ)を約２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、マルチビーズショッカーＭＢＳ ２００ (安井器械) を用い、４℃で強制冷却しながら直径０．１ｍｍガラスビーズで菌体を破砕した。破砕後に回収したガラスビーズを同じ緩衝液で洗浄し、ビーズに付着した酵素を回収した。破砕液にポリエンチレイミンを終濃度０．１２％となるように添加し、４℃で３０分間放置した。遠心分離(６０００ｒｐｍ)により核酸を除去し、３９０ｍｌの粗酵素液を得た。
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒａｌ ６５０Ｍカラム（東ソー；３×２０ｃｍ）を緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０）にて平衡化し、粗酵素液を負荷した。負荷後、カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（０〜１Ｍ；総容積；１０００ｍｌ） により酵素活性を溶出した。活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析した（５００倍）。
【００３１】
Fast Protein Liquid Chromatography（ＦＰＬＣ、Amersham Biosiences）によりＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒａｌ ６５０Ｍの再度クロマトグラフィーを行った。緩衝液Ａでカラムを平衡化し、透析後の活性画分を負荷した。負荷後、カラム容積の緩衝液Ａでカラム洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（０〜１Ｍ；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、９０ｍｉｎ)により酵素活性を溶出した。活性画分を集め、硫酸アンモニウムを２０％飽和となるように加えた。
２０％硫酸アンモニウムを含有する緩衝液Ａにて平衡化したHiPrep Phenyl FF High-Subカラム(Amersham Biosiences、 １．６×１０ｃｍ)に、上に述べた酵素液を負荷した。平衡化緩衝液にて１．０ｍｌ／ｍｉｎで２０分間カラムを洗浄した。次いで硫酸アンモニウム濃度（２０％飽和〜０％飽和）およびエチレングリコール濃度［０〜６０％(ｗ／ｗ)］の直線濃度勾配（１．０ｍｌ／ｍｉｎ、７０ｍｉｎ）によりタンパク質を溶出させた。酵素活性は６０％(ｗ／ｗ)ethylene glycol洗浄画分に見出された。活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析した（５００倍以上）。
【００３２】
緩衝液Ａにて平衡化したMono Q HR10/10 (Amersham Biosiences) に透析内液を負荷した緩衝液Ａにて０．５ｍｌ／ｍｉｎで２０ｍｉｎカラム洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配（０〜１Ｍ；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、１００ｍｉｎ）により酵素活性を溶出した。活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析した（５００倍）。透析内液をCentricon 10 (Millipore) により４ｍｌにまで濃縮した。
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａにて平衡化したSuperdex 200HR10/30カラム（Amersham Biosiences）に酵素液を負荷した。平衡化緩衝液を０．５ｍｌ／ｍｉｎで送液することにより、酵素を溶出した。
【００３３】
以上によりＤ−アミノアシラーゼをほぼ均一状態に精製した。活性収率は４％、精製倍率は３９倍であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定された分子質量は約５６ｋＤａであり、一方、Superdex 200カラムを用いた未変性条件下でのゲル濾過クロマトグラフィーにおいては、本酵素の分子質量は約５６ｋＤａであると見積もられた。したがって、本酵素は単量体であることが示唆された。
【実施例１３】
【００３４】
基質特異性
各種のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を用いて、本酵素の基質特異性を調べた。本酵素はＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンに対して、最も高い活性を示した。本酵素はまたＮ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンにも活性を示した。対応するＬ−体のＮ−アセチルアミノ酸には全く活性を示さなかった。本酵素の基質特異性とこれまでに知られている各種のＤ−アミノアシラーゼの基質特異性との比較を表３に示した。本酵素は他のＤ−アミノアシラーゼと比べてＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンにより高い活性を示したことから、Ｄ−フェニルアラニンの生産に向けて本酵素は利用価値が高い。
【００３５】
【表３】
2006055131.tif 000004
【００３６】
表３は本発明のＤ−アミノアシラーゼの基質特異性を、既知のＤ−アミノアシラーゼの基質特異性と比較した表である。
表中、１はＴＮＪＬ１４３−２株のＤ−アミノアシラーゼ（該発明）、２はアルカリジェネス  フェーカリスＤＡ−１株のＤ−アミノアシラーゼ、３はアルカリジェネス  キシロソオキシダンス  サブスピーシーズ  キシロソオキシダンス  Ａ−６株のＤ−アミノアシラーゼ、４はバリオボラックス  パラドキサス Iso１株のＤ−アミノアシラーゼ、５はストレプトマイセス  オリバセウスのＤ−アミノアシラーゼを示す。表中の数値はＮ−アセチル−Ｄ−ロイシンに対する活性を１００%としたときの相対値である。ＮＤは活性が検出されないことを示す。
【実施例１４】
【００３７】
安定性、反応最適条件、特異性と阻害剤
本酵素は３７℃で１時間の処理では、図２（Ｂ）に示すようにｐＨ６．０〜８．５の領域で安定であった。また、図２（Ａ）に示すように反応至適ｐＨは８．０付近にあった。一方、本酵素は図３（Ｂ）に示すようにｐＨ７．０で１時間の処理では４５℃付近まで安定であった。また、図３（Ａ）に示すように反応至適温度は５０℃付近であった。
本酵素は１ｍＭのＣｕ２＋、Ｚｎ２＋により顕著な阻害を受けた。一方、本酵素は１ｍＭのＥＤＴＡにて全く阻害を受けず、２０ｍＭのＥＤＴＡで処理した後も６５％の残存活性を保持していた。これまでに知られているＤ−アミノアシラーゼは１ｍＭ程度のＥＤＴＡで完全に阻害されことが報告されており、本酵素について得られた結果はそれとは対照的であった。
【実施例１５】
【００３８】
遺伝子クローニング
精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(１０％ゲル) にて電気泳動後、 ＰＶＤＦ膜(Bio-Rad) に転写した。転写は180ｍＡ（２ｍＡ／ｃｍ２）の定電流で１時間通電することにより行った。転写後のＰＶＤＦ膜をMilli Q水で軽く洗った後、ＣＢＢ染色液で５分間染色した。部分脱色後、膜を乾燥させた。タンパクバンドを切り出して、アクロモバクター  リシルエンドペプチダーゼにより消化（３５℃、ｐＨ８．５、２０時間）を行った。生成したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離し、いくつかのペプチドについてそのＮ末端アミノ酸配列を気相シーケンサーにて分析した。また、本酵素のＮ末端アミノ酸配列も気相シーケンサーにて分析した。
このようにして決定した本酵素のアミノ酸配列をもとに縮重プライマーを設計し、菌体より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＦａｉｌＳａｆｅＴＭ ＰＣＲキット(EPICENTRE) を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。既知のＤ−アミノアシラーゼにおける配列の位置から、増幅されるべき塩基長は８００ｂｐであると予想され、アガロースゲル電気泳動におけるその付近のバンドを切り出して、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＴＭ Agarose Spin Column (Sigma) を用いてゲル回収を行った。増幅断片について、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット(Invitrogen)を用いてＴＡクローニングをおこない、大腸菌ＴＯＰ １０を形質転換した。形質転換体を３７℃で一晩培養し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＴＭ Plasmid Miniprep キット(Sigma)を用いて培養菌体からプラスミドを回収、それをテンプレートとしてDey Terminator法により塩基配列を行った。解析にはCEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Court) を使用した。次に解析された配列にもとづいてプライマーを作成し、これらとベクターの配列からなるプライマーを用いてゲノムライブラリーを鋳型に、本酵素遺伝子の５’および３’−領域のＰＣＲ増幅を試みた。この結果、本酵素遺伝子の５’、３’−と推定される塩基配列が決定され、１４８５ｂｐからなる本酵素の全長酵素遺伝子（ＯＲＦ）を取得できた。その塩基配列を配列番号１に示した。この遺伝子をAcyMと命名した。塩基配列から推定されるAcyMのアミノ酸配列を配列番号２に示した。AcyMは４９５アミノ酸残基からなり、その中には、精製酵素標品について決定した部分アミノ酸配列がすべて見つかり、この遺伝子がＤ−アミノアシラーゼをコードしていることが示された。なお、本遺伝子の開始コドンはＡＴＧではなくＧＴＧとなっていた。既知のＤ−アミノアシラーゼ遺伝子では開始コドンがＧＴＧのものはないが、細菌由来の遺伝子には他にも多数の例がある。
配列比較の結果を表４に示した。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
本発明のＤ−アミノアシラーゼのアミノ酸配列を他の公知のタンパク質のアミノ酸配列と比較したときの類似性（同一性）を示したものである。＊を付した生物については、本酵素と類似性を示したタンパク質の機能は確かめられていない。＊を付していない生物の本酵素と類似性を示したタンパク質はＤ−アミノアシラーゼである。
【００４１】
本酵素も他のＤ−アミノアシラーゼと同様にアミドヒドロラーゼスーパーファミリーに帰属されるものと考えられた。しかしながら興味深いことに、これまでに遺伝子が取られているＤ−アミノアシラーゼ同士、例えばバリオボラックス属細菌やアルカリジェネス属細菌の酵素どうしでは５０％以上のアミノ酸配列同一性が認められるのに対し、AcyMはそれらとは格段に低い配列同一性（２４〜２７％）しか示さなかった。
【００４２】
Ｄ−アミノアシラーゼやそのホモログのアミノ酸配列により系統解析をおこなった結果を図４に示した。AcyMは既知のＤ−アミノアシラーゼとは系統進化的に隔たったところに位置するユニークなＤ−アミノアシラーゼであることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明に係るＤ−アミノアシラーゼは、Ｄ−アミノ酸、より好ましくはＤ−フェニルアラニンの生産に適用できる。また本発明によって製造されたＤ−アミノアシラーゼを用いて製造されたＤ−アミノ酸は、医薬、農薬の原料もしくは中間体として広く用いることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列にもとづくＴＮＪＬ１４３−２株ならびにマイクロバクテリウム属細菌の系統樹を示した図面である。微生物の学名は次の通りであり、学名のうしろに括弧で示した番号は配列データベース（Genbank）における登録番号である。Microbacterium oxydans：マイクロバクテリウム  オキシダンスM. liquefaciens：マイクロバクテリウム  リケファシエンスM. saperdae：マイクロバクテリウム  サペルダエM. luteorum：マイクロバクテリウム  ルテオラムM. paraoxydans：マイクロバクテリウム  パラオキシダンスM. testaceum：マイクロバクテリウム  テスタセウムM. resistens：マイクロバクテリウム  レジステンスM. keratanolyticum：マイクロバクテリウム  ケラタノリティカムM. aerolatumu：マイクロバクテリウム  アエロラタムM. foliorum：マイクロバクテリウム  フォリオラムM. phylosphaerae：マイクロバクテリウム  フィロスフェラエM. arborescens：マイクロバクテリウム  アルボレッセンスM. imperiale：マイクロバクテリウム  インペリアレM. lacticum：マイクロバクテリウム  ラクティカムM. schleiferi：マイクロバクテリウム  シュライフェリM. aurum：マイクロバクテリウム  アウルムM. terregens：マイクロバクテリウム  テレゲンスM. kitamiense kitami：マイクロバクテリウム  キタミエンス  キタミM. M. chocolatum：マイクロバクテリウム  チョコラタムM. flavescens：マイクロバクテリウム  フラベッセンスM. trichotecenolyticum：マイクロバクテリウム  トリコテセノリティカムM. arabinogalactanolyticum：マイクロバクテリウム  アラビノガラクタノリティカムM. esteraromaticum：マイクロバクテリウム  エステラロマチクムM. barkeri：マイクロバクテリウム  バーケリCurtobacterium albidum：クルトバクテリウム  アルビダムC. citreum：クルトバクテリウム  シトレウム
【図２】図２の（Ａ）は、本発明のＤ−アミノアシラーゼの反応のｐＨ依存性を示したものであり、（Ｂ）は、本発明のＤ−アミノアシラーゼをさまざまなｐＨで３７℃で１時間熱処理したときの残存酵素活性（ｐＨ安定性）を示した図面である。
【図３】図３の（Ａ）は、本発明のＤ−アミノアシラーゼの反応の温度依存性を示したものであり、（Ｂ）は、本発明のＤ−アミノアシラーゼをさまざまな温度でｐＨ７．０で１時間熱処理したときの残存酵素活性（熱安定性）を示した図面である。
【図４】図４は、アミノ酸配列にもとづいて作成した本発明のＤ−アミノアシラーゼの進化的位置づけを示した図面である。AcyMは該発明のＤ−アミノアシラーゼである。Ｄ−アミノアシラーおよび関連タンパク質の生産微生物は次の通りである。Pirellula sp. 1：ピレルラ  スピーシーズ１Mycobacterium tuberculosis：マイコバクテリウム  ツベルクロシスVariovorax paradoxus Iso1：バリオボラックス  パラドキサス  Iso1Alcaligenes faecalis：アルカリジェネス  フェーカリスA. xylosoxidans A-6：アルカリジェネス  キシロソオキシダンス  サブスピーシーズ  キシロソオキシダンス A-6Pyrococcus abyssi：ピロコッカス  アビッシStreptomyces coelicolor：ストレプトマイセス  セリカラーBordetella pertussis TohamaI：ボルデテラ  ペルツシス  トハマIGloeobacter violaceus：グレオバクター  ビオラセウス  ＊を付した生物については、本酵素と類似性を示したタンパク質の機能は確かめられていない。＊を付していない生物の本酵素と類似性を示したタンパク質はＤ−アミノアシラーゼである。０．１という数字を付した横線は、一部位につき０．１アミノ酸置換に相当する進化距離を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１は、本発明の新規微生物が産生するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列を示す。
配列番号２は、本発明の新規微生物が産生するＤ−アミノアシラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、本発明の新規微生物であるＴＮＪＬ１４３−２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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