(57)【要約】【課題】  プロトカドヘリンＥＣ１領域の立体構造に基づきその機能ドメインを同定し、プロトカドヘリンの生理活性を調節し得るペプチドを提供すること。【解決手段】  本発明は、プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列を含むペプチドおよびプロトカドヘリンのリガンドのスクリーニング方法等に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列からなるペプチド（ここでＸは個別に任意のアミノ酸残基である。ただし配列番号３０９から３１９のいずれかに示される配列を有するペプチドは除く）。
【請求項２】
配列番号１から１５３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数１０８以下のペプチド。
【請求項４】
プロトカドヘリンＥＣ１領域由来の連続する１００以上のアミノ酸残基を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１５４の１からはじまり１００から１０７のうちいずれかで終わるアミノ酸配列を含む、請求項３または４記載のペプチド
【請求項６】
配列番号１５５から３０７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３または４記載のペプチド。
【請求項７】
大腸菌で発現させた、請求項３から６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列に対して１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、該ペプチドと機能的に同等の性質を有する該ペプチドの誘導体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号３０８に記載の塩基配列を含む、請求項９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドが挿入された発現ベクター。
【請求項１２】
プロトカドヘリンのリガンドをスクリーニングする方法であって、請求項１から８のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体と該リガンドの候補物質とを接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトカドヘリンの新規機能ドメインに関する。詳細には、本発明は、プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列を含むペプチドおよびプロトカドヘリンのリガンドのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム依存性細胞接着分子として知られるカドヘリンスーパーファミリー分子は、細胞認識、細胞シグナリング、胚形成時の細胞伝達および中枢神経系における神経回路の形成、のような多くの生物学的プロセスに関与することが知られている（非特許文献１−３）。カドヘリンスーパーファミリーは、幾つかのサブグループに分けられる（非特許文献４）。その内古典的カドヘリンについてはこれまでに機能および構造解析が多く行われている（非特許文献５−１３）。しかしながら古典的カドヘリンは、多様なメンバーを有するカドヘリンスーパーファミリーのほんの一部分を占めるに過ぎない。現在プロトカドヘリンが、カドヘリンスーパーファミリーの中で最も大きいサブグループを構成することが知られている（非特許文献４、９、１１および１４）。脳神経系で特異的に発現するプロトカドヘリンファミリータンパク質は、６個の細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣ）、一回膜貫通領域、および細胞質領域より構成され、とりわけ細胞外のＮ末端部位に位置する第一カドヘリンドメイン（ＥＣ１領域）がファミリー内で高度に保存されている。ＥＣ１領域は古典的カドヘリンで接着活性に関わる最も重要な領域とされてきたが、プロトカドヘリンのＥＣ１領域に関する機能情報はほとんどなかった。
【非特許文献１】Takeichi, M. The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogenesis. Development 102, 639-55 (1988).
【非特許文献２】Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M. & Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 91-100 (2000).
【非特許文献３】Yagi, T. & Takeichi, M. Cadherin superfamily genes: functions, genomic organization, and neurologic diversity. Genes Dev 14, 1169-80 (2000).
【非特許文献４】Nollet, F., Kools, P. & van Roy, F. Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. J Mol Biol 299, 551-72 (2000).
【非特許文献５】Overduin, M. et al. Solution structure of the epithelial cadherin domain responsible for selective cell adhesion. Science 267, 386-9 (1995).
【非特許文献６】Shapiro, L., Kwong, P. D., Fannon, A. M., Colman, D. R. & Hendrickson, W. A. Considerations on the folding topology and evolutionary origin of cadherin domains. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6793-7 (1995).
【非特許文献７】Shapiro, L. et al. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature 374, 327-37 (1995).
【非特許文献８】Shapiro, L. & Colman, D. R. Structural biology of cadherins in the nervous system. Curr Opin Neurobiol 8, 593-9 (1998).
【非特許文献９】Shapiro, L. & Colman, D. R. The diversity of cadherins and implications for a synaptic adhesive code in the CNS. Neuron 23, 427-30 (1999).
【非特許文献１０】Boggon, T. J. et al. C-cadherin ectodomain structure and implications for cell adhesion mechanisms. Science 296, 1308-13 (2002).
【非特許文献１１】Patel, S. D., Chen, C. P., Bahna, F., Honig, B. & Shapiro, L. Cadherin-mediated cell-cell adhesion: sticking together as a family. Curr Opin Struct Biol 13, 690-8 (2003).
【非特許文献１２】Gooding, J. M., Yap, K. L. & Ikura, M. The cadherin-catenin complex as a focal point of cell adhesion and signalling: new insights from three-dimensional structures. Bioessays 26, 497-511 (2004).
【非特許文献１３】Koch, A. W., Manzur, K. L. & Shan, W. Structure-based models of cadherin-mediated cell adhesion: the evolution continues. Cell Mol Life Sci 61, 1884-95 (2004).
【非特許文献１４】Frank, M. & Kemler, R. Protocadherins. Curr Opin Cell Biol 14, 557-62 (2002).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、立体構造情報に基づきプロトカドヘリンＥＣ１領域の機能ドメインを同定し、プロトカドヘリンの生理活性を保持するペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、プロトカドヘリンα４のＥＣ１領域のペプチド（ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１）の大量発現精製に成功し、さらにはＮＭＲ測定によりプロトカドヘリンファミリーで初めての立体構造の決定に成功した。決定された立体構造から、プロトカドヘリンには、古典的カドヘリンにおいて細胞接着に重要な疎水性のポケットが存在しないことが判明し、新しい相互作用様式の存在が示唆された。今回の構造解析の結果初めて、プロトカドヘリンに共通に保存されているＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓという配列が、βストランド間のループに存在し、分子表面に位置していることが判明した。また、ＮＭＲ測定およびＭＳ測定により、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列内の２つのＣｙｓ間でジスルフィド結合が形成されていることも明らかになった。更にこのＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列よりなるドメインは、立体構造上カルシウム結合部位と想定されるアミノ酸によって構成されるカルシウム結合領域内に存在し、カルシウム結合により構造を変化させる可能性が示唆された。このことから、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は、古典的カドヘリンには存在しないプロトカドヘリンファミリー固有のカルシウム反応領域であることが分かり、実際に機能ドメインになっている可能性が強く示唆された。以上の結果に基づき、本発明が完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、以下のものを提供する：
（１）プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列からなるペプチド（ここでＸは個別に任意のアミノ酸残基である。ただし配列番号３０９から３１９のいずれかに示される配列を有するペプチドは除く）、
（２）配列番号１から１５３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、（１）記載のペプチド、
（３）（１）または（２）記載のペプチドのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数１０８以下のペプチド、
（４）プロトカドヘリンＥＣ１領域由来の連続する１００以上のアミノ酸残基を含む、（３）記載のペプチド、
（５）配列番号１５４の１からはじまり１００から１０７のうちいずれかで終わるアミノ酸配列を含む、（３）または（４）記載のペプチド、
（６）配列番号１５５から３０７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、（３）または（４）記載のペプチド、
（７）大腸菌で発現させた、（３）から（６）のいずれかに記載のペプチド、
（８）（１）から（７）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列に対して１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、該ペプチドと機能的に同等の性質を有する該ペプチドの誘導体、
（９）（１）から（８）のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（１０）配列番号３０８に記載の塩基配列を含む、（９）記載のポリヌクレオチド、
（１１）（９）または（１０）に記載のポリヌクレオチドが挿入された発現ベクター、および
（１２）プロトカドヘリンのリガンドをスクリーニングする方法であって、（１）から（８）のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体と該リガンドの候補物質とを接触させることを含む方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、プロトカドヘリンの新規機能ドメインとして同定されたＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは、プロトカドヘリンの生理活性の調節やプロトカドヘリンのリガンドのスクリーニングに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．ペプチド
本発明は、プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列からなるペプチドを提供する。本発明においてプロトカドヘリンの種は特に限定されず、例えばヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュが挙げられる。特に、配列番号１から１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが本発明のペプチドとして好ましい。
本発明はまた、プロトカドヘリンＥＣ１領域由来のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列を含む、アミノ酸残基数１０８以下のペプチドを提供する。このペプチドのうち、ＥＣ１領域由来の連続する１００以上のアミノ酸残基を含むペプチドを、本明細書では「ＥＣ１ペプチド」またはプロトカドヘリンの名前に「−ＥＣ１」を付して「ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１」のように称する。好ましいペプチドの例として、配列番号１５４の１からはじまり１００から１０７のうちいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。更に、配列番号１５５から３０７のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。また、大腸菌で発現させた本発明のペプチドは、簡便に大量に製造可能な点で好ましい。
【０００８】
Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は、ウィルスの糖タンパク質のタンパク−タンパク相互作用に関与することが知られている。今回この配列がプロトカドヘリンにおいて分子表面に存在することが明らかとなり、かつカルシウム結合により構造を変化させる可能性があることが示唆された。これらの結果は、プロトカドヘリンファミリーのＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列が、リガンドとの接着面として機能し得ることを強く示唆する。また、部分ペプチドであるＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１が、プロトカドヘリンタンパク質と同様の細胞接着活性を示すことも明らかとなった。以上より、本発明のペプチドは、プロトカドヘリンのリガンドをスクリーニングするために使用することができる。更に、本発明のペプチドは、それ自体が生理活性を有し医薬組成物に利用できる可能性がある。例えば、神経細胞膜上のプロトカドヘリンのリガンドであるタンパク質に接着し、プロトカドヘリンと同様のシグナルを引き起こし得る。あるいは、内在性のプロトカドヘリンが異常に発現し病態を引き起こしている場合、本発明のペプチドを含む医薬組成物を部位特異的に投与することにより、内在性のプロトカドヘリンの活性を阻害できる可能性がある。
【０００９】
本発明は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に対して１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、該ペプチドと機能的に同等の性質を有する該ペプチドの誘導体を包含する。「機能的に同等の性質」とは、例えばプロトカドヘリンのリガンドに対する接着活性および／またはプロトカドヘリンの生理活性の誘導もしくは阻害活性と同等の活性を意味する。
【００１０】
また、本発明のペプチドおよび誘導体は、その機能を著しく損なわない程度に、構成アミノ酸またはカルボキシル基等が修飾されていてもよい。例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が結合していてもよく、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
【００１１】
本発明のペプチドおよびその誘導体は、常套的なペプチド合成法または遺伝子工学的手法により製造することができる。大腸菌で本発明のペプチドを発現させる場合、本明細書の実施例に記載の方法を用いることができる。
【００１２】
２．ポリヌクレオチドおよびベクター
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする塩基配列を有する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、常法に従い選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、周知の方法、例えば、プロトカドヘリンを発現する細胞または組織からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、それを鋳型としてＰＣＲを行う等の方法により製造することができる。
【００１３】
本発明のベクターは、本発明のペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターである。本発明のベクターは、宿主細胞に導入され、その細胞を形質転換し、本発明のペプチドまたは誘導体を発現させる。本発明のベクターは、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等であり、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができる。宿主細胞としては、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられる。ベクター、宿主細胞および形質転換方法は当業界にて周知であり、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory などに記載されている。本発明のペプチドまたは誘導体を大量に発現させる観点から大腸菌が宿主細胞として好ましく、その場合好ましいベクターとしてはｐＥＴ−１１ｄベクター（Novagen）等が挙げられる。
【００１４】
本発明のベクターは、宿主細胞における翻訳効率を考慮した塩基配列のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。例として、開始コドンから３０塩基分につき配列番号３０８に記載の塩基配列を含む、大腸菌においてマウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１を発現するベクターが挙げられる。
【００１５】
本発明のベクターは、上記文献に記載されるような常套的方法によって製造することができる。宿主細胞における翻訳効率を考慮した本発明のベクターは、本明細書の実施例に記載の方法によって製造することができる。
【００１６】
６．スクリーニング方法
本発明は、プロトカドヘリンのリガンドをスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、本発明のペプチドまたは誘導体とプロトカドヘリンのリガンドの候補物質とを接触させることを含む。リガンドの候補物質は特に限定されるものではなく、ペプチド、タンパク質、化合物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物などが挙げられる。本発明方法は、例えば次のようにして実施することができる。
本発明のペプチドを結合させたカラムを作成し、リガンド候補のタンパク質を含む試料をそのカラムに導入する。その後、カラムに特異的に結合したタンパク質を溶出し、その溶出物を電気泳動してバンドを切り出し、質量分析（ＭＳ）によりバンドの由来するタンパク質を同定する。また、ペプチドと様々なリガンド候補物質を混合し、混合した状態でＨＳＱＣ（Heteronuclear Single Quantum Coherence）ＮＭＲスペクトルを測定する。ペプチドのＨＳＱＣスペクトルが帰属されており、リガンド候補物質の添加によりスペクトルに動きが見られる場合、混合したリガンド候補物質がペプチド中のある特定の残鎖と結合していると言える。このように、ペプチドのスペクトルの動きを指標にペプチドに結合する物質の同定することで、プロトカドヘリンのリガンドを同定することができる。本方法によれば、ペプチド側の結合領域の同定、即ちプロトカドヘリン側のリガント結合領域の同定も可能となる。
【実施例】
【００１７】
本発明を以下の実施例により更に説明する。
１．配列アライメント
代表的なマウスカドヘリンＥＣ１領域の多重配列アライメント（ClustalW（Aiyar, A. The use of CLUSTAL W and CLUSTAL X for multiple sequence alignment. Methods Mol Biol 132, 221-41 (2000)）を使用）を解析し、プロトカドヘリンファミリーの特徴を一次アミノ酸配列レベルで決定した。このアライメントから計算した系統樹（TreeView（Page, R. D. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci 12, 357-8 (1996)）で描画）は、プロトカドヘリンファミリーが、大きな集団としてカドヘリンスーパーファミリーの他のサブグループから分岐していることをはっきりと示していた（図１Ａ）。古典的カドヘリンで保存されているカルシウム結合部位は、プロトカドヘリンでも保存されていた。しかしながら、古典的カドヘリンの接着面の中心的要素であるＴｒｐ２やそれを受容する疎水性ポケットの構成アミノ酸が、プロトカドヘリンの配列には見られなかった。更に、古典的カドヘリンには全く存在しないＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列が、プロトカドヘリンファミリーのみで共通に保存されていた（図１Ｂ）。これらのプロトカドヘリンと他のカドヘリンスーパーファミリーメンバーとの相違は、プロトカドヘリンファミリーが独自の構造ならびに生理活性を有する可能性を示唆する。さらなる構造解析のため、プロトカドヘリンファミリーの原型として、マウスプロトカドヘリン（ＣＮＲ／Ｐｃｄｈ）α４ＥＣ１領域を選択した。
【００１８】
２．  マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の調製
２．１  発現ベクターの作成
マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４ｃＤＮＡを鋳型としてマウスＣＮＲ／Ｐｃｈｄα４のＥＣ１領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲを行う際、開始コドンより約３０塩基分のコドンにつきコードするアミノ酸を変えない範囲でコドン中の３番目の塩基がランダムにアデニンまたはチミジンとなるようにしたプライマーを用いて、開始コドンから約３０塩基分のコドンにおいてアデニンおよびチミジンリッチとなるように改変されたＤＮＡ断片を得た。具体的には、下記プライマー：
Primer F：5'-GCTGCCATGGGTAAYAGYCARATYCAYTAYTCYATYCCTGAGGAGGCCAAACACGG-3’
(YはCまたはT、RはAまたはGを意味する。5'末端にNco I切断配列（ CCATGG ）導入)；
Primer R：5’- GTTGTCGTTAATGTCCCTCACCTCCAC -3’
（3'末端にXho I切断配列（CTCGAG）導入）を用いた。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素処理後、ｐＥＴ−１１ｄベクター（Novagen）に挿入し、様々な塩基配列を開始コドン以下にもつ発現ベクタープールを完成させた。このベクター群をクローン化し、ミニスケールで発現させ、最も発現効率のよかったプラスミドを同定した（図２）。そのプラスミドが含む配列は以下のように改変されたものであった：
もとの配列      （ATG開始コドン） GGG AAC AGC CAG ATC CAC TAC TCC ATC---；
遺伝子改変後配列（ATG開始コドン） GGT AAT AGT CAA ATT CAT TAT TCT ATT---。
以降の実験では、この改変後の配列（配列番号３０８）を含む発現ベクターを使用した。
【００１９】
２．２  大腸菌における発現
発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株に導入した。３次元ＮＭＲ測定に用いるペプチドは、［Ｕ−１３Ｃ］−Ｄ−グルコース  １．０ｇ／Ｌおよび１５ＮＨ４Ｃｌ  ０．５ｇ／Ｌをそれぞれ唯一の炭素及び窒素源として含有するＭ９最小培地中で大腸菌を培養することにより１５Ｎおよび１３Ｃ放射性同位体でラベルし発現させた。２次元ＮＭＲ測定のための１５Ｎ−標識ペプチドを発現させる場合には、１３Ｃ−標識グルコースの代わりにＤ−グルコース  １．０  ｇ／Ｌを用いた。細胞を振盪しながら３７℃でインキュベートし、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを添加して一晩培養して、タンパク質の発現を誘導した。
【００２０】
２．３  発現ペプチドの抽出および可溶化
マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１は、既報のようにして精製した（Tsumoto, K. et al. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J Immunol Methods 219, 119-29 (1998)）。説明すると、封入体として得られたＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１を尿素により変性可溶化し、尿素の含有量を段階的に低下させた透析液に対して透析する透析法により巻き戻しを行った（Clark EDB  Refolding of recombinant proteins
Curr Opin Biotechnol. 1998 Apr 1;9(2):157-63）。巻き戻し後のＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１を、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。精製したペプチド溶液の溶媒を、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｕｌｔｒａ−４）により５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３、０．３ｍＭ  PefaBlocおよび８％（ｖ／ｖ）  Ｄ２Ｏ含有）と交換した。ペプチド溶液を円柱状ピストンを用いて５  ｍｍ  シゲミ（Shigemi）マイクロチューブ（ＣＭＳ−００５Ｂ）に密閉した。
【００２１】
２．３  マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の安定性の検討
ＥＣ１領域のＣ末端を最適化するため、３種類のペプチドを作成した（開始コドンとしてのメチオニン（Ｍ）および配列番号１５４の１−１０７（ＥＣ１−Ａ）、１−１０３（ＥＣ１−Ｂ）または１−９８（ＥＣ１−Ｃ）のアミノ酸配列を有する）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより、ＥＣ１−Ａ、ＥＣ１−ＢおよびＥＣ１−Ｃの各種ｐＨにおける安定性を経時的に調べた。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果から、ＥＣ１−Ａは、開始から１週間目には凝集していることが明らかになった。また、この後も更に凝集状態が進行し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもタンパク質の分解によりバンドが２本に分裂している様子が見られた（図３Ａ）。また、ＥＣ１−Ｃでもそれに近いデータが得られた。一方、ＥＣ１−Ｂは、実験開始から約１ヶ月の間ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのいずれにおいてそれほど変化が見られず、安定した状態で存在していた。また、ｐＨ８．０で最も安定であることがわかった（図３Ａ、Ｂ）。
この安定性の相違には、各ペプチドのアミノ酸残基数の違いが寄与している可能性がある。ＥＣ１−Ａでは、ＥＣ１ドメインからＥＣ２ドメインにかけてＣ末端でループを形成する部分がタンパク質の安定性を低下させていると考えられる。また、ＥＣ１−Ｃは、カルシウム結合モチーフを含むアミノ酸残基が過剰に削られていることにより、ＥＣ１−Ｂと比較して安定性が低下したと考えられる。
これらの結果より、以下の実験ではＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１としてＥＣ１−Ｂを使用した。
【００２２】
３．接着実験
発現させたペプチドが機能的であることを確認するため、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の細胞接着活性を調べた。我々は以前の研究で、哺乳類細胞で産生させたＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４のＥＣ１領域のＦｃ融合タンパク質が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して接着活性を有することを示している（Mutoh, T., Hamada, S., Senzaki, K., Murata, Y. & Yagi, T. Cadherin-related neuronal receptor 1 (CNR1) has cell adhesion activity with beta1 integrin mediated through the RGD site of CNR1. Exp Cell Res 294, 494-508 (2004)）。前記文献の方法に従いペプチドをコートしたディッシュに対する細胞の接着を検討することにより、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の細胞接着活性を評価した。その結果、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して接着することが示された（図４）。このことは、今回使用したＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１が、生理学的および機能的に活性な高次構造を保持することを示している。
【００２３】
４．ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の立体構造決定
４．１  ＮＭＲ測定
多次元二重及び三重共鳴ＮＭＲ分光法により、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１の溶液構造を決定した。本ペプチドは、通常ＮＭＲ測定に適さない低タンパク濃度（０．１ｍＭ）および高ｐＨ値（ｐＨ８．０）の条件下でしかＮＭＲ測定に耐え得る安定性を維持できなかった。我々は、極低温検出器および高磁場（８００  ＭＨｚ）ＮＭＲ装置を併用し、この問題を克服した。
【００２４】
表１および図５は、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の立体構造決定の結果を示す。またその座標は、タンパク質データバンクに寄託されている（アクセションコード１ＷＵＺ、http://pdb.protein.osaka-u.ac.jp/pdb/）（出願時未公開、関連論文の発行と共に公開予定）。
【表１】
2006288347.tif 000002
【００２５】
４．２  結果
ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４の全体構造はギリシャキー・トポロジーを示し、古典的カドヘリンのものとよく似ていたが、主にループ領域に古典的カドヘリンとの相違が見られた。配列アライメント上で、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の幾つかのβストランドは、古典的カドヘリンの対応ストランドと位置がずれていた（図６Ａ）。第一に、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のＬ−ＣＤは、古典的カドヘリンのＬ−ＣＤよりかなり短く、インテグリン相互作用のコンセンサス配列として知られるＲＧＤモチーフを含んでいた。第二に、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のＬ−ＦＧは、古典的カドヘリンのものよりも明らかに短かったが、一方でそのＬ−ＢＣは長かった。第三に、古典的カドヘリンには見られないＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列が、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のＬ−ＥＦに挿入されていた。この配列は、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の分子表面に位置していた。また、配列アライメント上のβストランドの位置およびループの長さに加えて、２つのβシート間の相対配向が異なっていた（図６Ｂ：ＲＡＳＭＯＬ（Sayle, R. A. & Milner-White, E. J. RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem Sci 20, 374 (1995)）により描画）。古典的カドヘリンでは、その２つのβシートは互いにほぼ並行に配向しており、古典的ＥＣ１は全体として楕円形をしている。一方、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１はより等方性の形をしており、ほぼ垂直の角度で交差している２つのβシートを有していた。
【００２６】
配列アライメントから予測されたように、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１は、古典的カドヘリンの接着に必須であるＴｒｐ２または疎水性ポケットを有さなかった（図６Ｃ）。このことは、古典的カドヘリンにとって重要な同種親和性の接着界面がプロトカドヘリンには存在しないことを強く示唆する。この結果は、我々が以前タンパク質コート化ビーズを用いる接着実験においてＣＮＲ／Ｐｃｄｈαファミリータンパク質に同種親和性結合活性を検出できなかったことと一致する（Mutoh, T., Hamada, S., Senzaki, K., Murata, Y. & Yagi, T. Cadherin-related neuronal receptor 1 (CNR1) has cell adhesion activity with beta1 integrin mediated through the RGD site of CNR1. Exp Cell Res 294, 494-508 (2004)）。プロトカドヘリンファミリーの幾つかのメンバーはＣａ２＋依存性の同種親和性活性を示したが、その活性は古典的カドヘリンのものと比較して概ね弱かった（Frank, M. & Kemler, R. Protocadherins. Curr Opin Cell Biol 14, 557-62 (2002)；Suzuki, S. T. Recent progress in protocadherin research. Exp Cell Res 261, 13-8 (2000).；Sano, K. et al. Protocadherins: a large family of cadherin-related molecules in central nervous system. Embo J 12, 2249-56 (1993)）。これらの研究は、プロトカドヘリンファミリーには同種親和性結合活性が存在しないか、あるいは古典的カドヘリンのものよりも弱いことを示唆する。我々の構造研究の結果は、プロトカドヘリンと古典的カドヘリンとの同種親和性結合活性の相違の分子的証拠と言える。プロトカドヘリンは、特徴的なループ領域を含む異なる面を機能発現に使用することが示唆される。
【００２７】
古典的カドヘリンドメイン間の接着相互作用はカルシウムイオンを必要とする。古典的カドヘリンと同じく、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈαの保存されたカルシウム結合部位（Ｇｌｕ１１、  Ａｓｐ６５−Ａｒｇ−Ｇｌｕ６７およびＡｓｐ９９−Ｘ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ１０３）は、Ｃ末付近に集合し、ＥＣ１およびＥＣ２領域間のリンカー領域に近接していた（図５Ｃおよび７Ｃ）。カルシウムイオンの存在（１．５ｍＭ）および非存在下の溶液におけるＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の１Ｈ−１５Ｎ異種核単量子相関（ＨＳＱＣ）スペクトルを比較すると、前述の保存されたカルシウム結合部位またはその周辺領域と一致するＧｌｕ１１、Ａｒｇ６６およびＡｓｐ９９を含むクロスピークの一部に、カルシウム誘発性化学シフト変化が見られた（図８）。この結果は、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１が、古典的カドヘリンのように、少なくとも１つのカルシウム結合モジュールを含むことを示唆する。
【００２８】
我々はプロトカドヘリンのＬ−ＥＦにＣｙｓ７０とＣｙｓ７６の間に形成されるジスルフィド結合を発見した（図５Ｃ）。このことは、システイン残基のαおよびβ炭素の特徴的化学シフト値によって予測され、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の質量分光学解析（データ非提示）によって確認された（Sharma, D. & Rajarathnam, K. 13C NMR chemical shifts can predict disulfide bond formation. J Biomol NMR 18, 165-71 (2000)）。
【００２９】
配列Ｃｙｓ７０−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ７６は、マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈαファミリーのメンバー間で高度に保存されている（図７Ａ：ＣｌｕｓｔａｌＸ（Aiyar, A. The use of CLUSTAL W and CLUSTAL X for multiple sequence alignment. Methods Mol Biol 132, 221-41 (2000)）を使用）。また、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は、クラスター型プロトカドヘリンファミリーであるＰｃｄｈα、βならびにγおよびプロトカドヘリン−８（Ａｒｃａｄｌｉｎ）およびＯＬ−プロトカドヘリンのような他の非クラスター型プロトカドヘリンでよく保存されていた（図１および７Ａ）。しかしながら、古典的カドヘリンにはＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は存在しない。
【００３０】
Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は、ウィルスの糖タンパク質のタンパク−タンパク相互作用に関与することが知られている。例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１におけるジスルフィド結合ループは、ｇｐ４１−ｇｐ１２０の会合およびＥｎｖ融合機能に中心的役割を果たしている（Maerz, A. L., Drummer, H. E., Wilson, K. A. & Poumbourios, P. Functional analysis of the disulfide-bonded loop/chain reversal region of human immunodeficiency virus type 1 gp41 reveals a critical role in gp120-gp41 association. J Virol 75, 6635-44 (2001)；Poumbourios, P., Maerz, A. L. & Drummer, H. E. Functional evolution of the HIV-1 envelope glycoprotein 120 association site of glycoprotein 41. J Biol Chem 278, 42149-60 (2003)）。これは、ＣＮＲ／ＰｃｄｈαファミリーのＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列が新規な接着面として機能し得ることを示唆する。
【００３１】
Ｃｙｓ７０−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ７６のジスルフィド結合ループは、Ｃ末近くのカルシウム結合残基のクラスターに空間的に非常に近接していた（図７Ｃ）。更に、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいて、Ｃｙｓ７０、Ｇｌｙ７１およびＳｅｒ７３アミド由来のクロスピークのカルシウム誘発共鳴シフトが観察され（図８）、このループがカルシウムイオンの存在により構造を変化させることが示唆された。Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンのＥＣ１およびＥＣ２領域の結晶構造の解析からそれらのカルシウム結合残基がカルシウム仲介タンパク−タンパク相互作用に関与することが示唆されていることを考慮すると（Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M. & Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature 380, 360-4 (1996)；Pertz, O. et al. A new crystal structure, Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. Embo J 18, 1738-47 (1999)；Tamura, K., Shan, W. S., Hendrickson, W. A., Colman, D. R. & Shapiro, L. Structure-function analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron 20, 1153-63 (1998)）、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のジスルフィド結合ループは、未知のタンパク質との相互作用においてカルシウム結合の影響を受けるのかもしれない。
【００３２】
保存されたＣｙｓ７０およびＣｙｓ７６の間の配列は、Ｐｃｄｈα、βおよびγの間で異なっている（図７Ａ）。これらの相違は、プロトカドヘリンファミリーの接着面の多様性に寄与している可能性がある。
【００３３】
以上より、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列部位は、プロトカドヘリンファミリーに独特の機能ドメインであることが示唆された。このことは、単なるアミノ酸配列の比較からは得ることのできなかった、プロトカドヘリンの機能に関連する重要な情報である。
【００３４】
５．Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓペプチド
以上の特徴から、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列のループを機能ドメインとしてとらえ、その配列よりなる環状ペプチド（ＣＧＲＳＡＥＣ）を合成した。このペプチドのＮＭＲスペクトルを測定したところ、スペクトルを確認することが出来、一定の構造をとっていることがわかった（図９）。従って、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓペプチドは、プロトカドヘリンタンパク質におけるこの配列部位の機能を発揮する可能性が示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
プロトカドヘリンは脳神経系に特異的に発現していることが知られている。従って本発明のペプチドは、神経疾患を対象とする医薬組成物に利用できる可能性があり、更にその発現様式から脳神経系以外の副作用の少ない脳神経系選択的作用薬となることが期待される。また、プロトカドヘリンは、学習記憶に関わるシナプスにも発現しており、記憶障害のあるアルツハイマー病や脳血管性痴呆に対する記憶改善薬となる可能性もある。
本研究においてプロトカドヘリンＥＣ１領域内のＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列は、新たなカルシウム関連機能領域として同定された。生体には細胞接着をはじめとする様々なカルシウム依存的な生理現象が存在するが、本発明は、これまでに知られていない新たなカルシウム反応性の機能モチーフを提供し、ひいては新たな医薬品の作用標的を提供するものである。
【配列の表示】
【００３６】
マウスプロトカドヘリンα由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
v1:配列番号１;CGRSAEC
v2:配列番号２;CGRSAEC
v3:配列番号３;CGRSAEC
v4:配列番号４;CGRSAEC
v5:配列番号５;CGRSAEC
v6:配列番号６;CGRSVEC
v7:配列番号７;CGRSAEC
v8:配列番号８;CGRSAEC
v9:配列番号９;CGQNAEC
v10:配列番号１０;CGRSAEC
v11:配列番号１１;CGRSAEC
v12:配列番号１２;CGRSLEC
c1:配列番号１３;CPAKASC
c2:配列番号１４;CEQRPRC 
【００３７】
ラットプロトカドヘリンα由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
v1:配列番号１５;CGRSTEC
v2:配列番号１６;CGQSAEC
v3:配列番号１７;CGRSAEC
v4:配列番号１８;CGRSAEC
v5:配列番号１９;CGQSAEC
v6:配列番号２０;CGRSAEC
v7:配列番号２１;CGRSAEC
v8:配列番号２２;CGRSAEC
v9:配列番号２３;CGRSAEC
v10:配列番号２４;CGRSAEC
v11:配列番号２５;CGKSAEC
v12:配列番号２６;CGRSAEC
v13:配列番号２７;CGRSAEC
c1:配列番号２８;CGTKAAC
c2:配列番号２９;CEQRPRC
【００３８】
ヒトプロトカドヘリンα由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
v1:配列番号３０;CQWSAEC
v2:配列番号３１;CGRSAEC
v3:配列番号３２;CGRSAEC
v4:配列番号３３;CRRSAEC
v5:配列番号３４;CRRRAEC
v6:配列番号３５;CGRSAEC
v7:配列番号３６;CGRSAEC
v8:配列番号３７;CGRSAEC
v9:配列番号３８;CGRSAEC
v10:配列番号３９;CGRSVEC
v11:配列番号４０;CGQSAEC
v12:配列番号４１;CGRSAEC
v13:配列番号４２;CGRSAEC
C1:配列番号４３;CRAKAAC
C2:配列番号４４;CEQRPRC
【００３９】
ニワトリプロトカドヘリンα由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
v1:配列番号４５;CGKSAPC
v2:配列番号４６;CGKSAPC
v3:配列番号４７;CGKSAPC
v4:配列番号４８;CGKSAPC
v5:配列番号４９;CGKSAPC
v6:配列番号５０;CGKSAPC
v7:配列番号５１;CGKSAPC
v8:配列番号５２;CGKSAPC
v9:配列番号５３;CGKSAPC
v10:配列番号５４;CGKSAPC
v11:配列番号５５;CGKSAPC
v12:配列番号５６;CGKSAPC
c1:配列番号５７;CELKSTC
c2:配列番号５８;CELSPTC
【００４０】
ゼブラフィッシュプロトカドヘリンα由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
v1:配列番号５９;CAGAVAC
v2:配列番号６０;CGRSSKC
v3:配列番号６１;CAKAPKC
v4:配列番号６２;CAKAPKC
v5:配列番号６３;CAKAPKC
v6:配列番号６４;CGQSLKC
v7:配列番号６５;CGQSLKC
v8:配列番号６６;CGRSSRC
v9:配列番号６７;CGRSLKC
v10:配列番号６８;CEQKIRC
v11:配列番号６９;CEQNIKC
v12:配列番号７０;CPASPQC
vc:配列番号７１;CEFSGTC
【００４１】
マウスプロトカドヘリンβ由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
beta1:配列番号７２;CGKSDPC
beta2:配列番号７３;CGPAEPC
beta3:配列番号７４;CGSTEPC
beta4:配列番号７５;CGATEPC
beta5:配列番号７６;CGSVDPC
beta6:配列番号７７;CGATEPC
beta7:配列番号７８;CSTVDPC
beta8:配列番号７９;CGATEPC
beta9:配列番号８０;CSTVDPC
beta10:配列番号８１;CRATEPC
beta11:配列番号８２;CGATEPC
beta12:配列番号８３;CGATEPC
beta13:配列番号８４;CGSTEPC
beta14:配列番号８５;CGSTNPC
beta15:配列番号８６;CGPTEPC
beta16:配列番号８７;CGHTEPC
beta17:配列番号８８;CGPIEPC
beta18:配列番号８９;CGPTEPC
beta19:配列番号９０;CGSTEPC
beta20:配列番号９１;CGSTQPC
beta21:配列番号９２;CSSSEPC
beta22:配列番号９３;CGSTEPC
【００４２】
ヒトプロトカドヘリンβ由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
beta1:配列番号９４;CGKADPC
beta2:配列番号９５;CGPTEPC
beta3:配列番号９６;CGPTEPC
beta4:配列番号９７;CGPIEPC
beta5:配列番号９８;CGATEPC
beta6:配列番号９９;CGSTEPC
beta7:配列番号１００;CGPREPC
beta8:配列番号１０１;CGHTEPC
beta9:配列番号１０２;CGPKEPC
beta10:配列番号１０３;CGPKEPC
beta11:配列番号１０４;CGSIEPC
beta12:配列番号１０５;CGSNEPC
beta13:配列番号１０６;CGHTEPC
beta14:配列番号１０７;CGSTEPC
beta15:配列番号１０８;CGPTEPC
beta16:配列番号１０９;CGPTEPC
【００４３】
マウスプロトカドヘリンγ由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
gammaA1:配列番号１１０;CAQSTPC
gammaA2:配列番号１１１;CAQSTPC
gammaA3:配列番号１１２;CAQSAPC
gammaA4:配列番号１１３;CDRSPKC
gammaA5:配列番号１１４;CVQSSPC  
gammaA6:配列番号１１５;CAQSAPC
gammaA7:配列番号１１６;CAQSPRC
gammaA8:配列番号１１７;CAQSTPC
gammaA9:配列番号１１８;CAQSATC
gammaA10:配列番号１１９;CAQSAPC
gammaA11:配列番号１２０;CDTMPSC
gammaA12:配列番号１２１;CMGSIKC
gammaB1:配列番号１２２;CGRKSEC
gammaB2:配列番号１２３;CGKQPQC
gammaB4:配列番号１２４;CGKKLMC
gammaB5:配列番号１２５;CGKKLVC
gammaB6:配列番号１２６;CKGRRKC
gammaB7:配列番号１２７;CKGRRKC
gammaB8:配列番号１２８;CFQSPLC
gammaC3:配列番号１２９;CGTLPSC
gammaC4:配列番号１３０;CGLSASC
gammaC5:配列番号１３１;CGASTSC
【００４４】
ヒトプロトカドヘリンγ由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
gammaA1:配列番号１３２;CAQSMPC
gammaA2:配列番号１３３;CAQSAPC
gammaA3:配列番号１３４;CAQIPLC
gammaA4:配列番号１３５;CDRSPNC
gammaA5:配列番号１３６;CAQSPLC
gammaA6:配列番号１３７;CAQSPRC
gammaA7:配列番号１３８;CAQSARC
gammaA8:配列番号１３９;CAQSPRC
gammaA9:配列番号１４０;CAQSPRC
gammaA10:配列番号１４１;CAQSARC
gammaA11:配列番号１４２;CETVSSC
gammaA12:配列番号１４３;CMGAIKC
gammaB1:配列番号１４４;CGRKLEC
gammaB2:配列番号１４５;CGKQPLC
gammaB3:配列番号１４６;CGKKSTC
gammaB4:配列番号１４７;CGKKPAC
gammaB5:配列番号１４８;CGKKPAC
gammaB6:配列番号１４９;CKERRRC
gammaB7:配列番号１５０;CKERRRC
gammaC3:配列番号１５１;CGLSASC
gammaC4:配列番号１５２;CGLSASC
gammaC5:配列番号１５３;CGASTSC
【００４５】
マウスプロトカドヘリンα４ＥＣ１領域
配列番号１５４；
GNSQIHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDNPPRF
【００４６】
マウスプロトカドヘリンα由来ＥＣ１ペプチド
v1：配列番号１５５；
GSGQIHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVKVKDINDN
v2：配列番号１５６；
GNGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v3：配列番号１５７；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v4：配列番号１５８；
GNSQIHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v5：配列番号１５９；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
v6：配列番号１６０；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSVECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v7：配列番号１６１；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
v8：配列番号１６２；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLELQLPELVPGLFQLDSKGFGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v9：配列番号１６３；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVVSKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGQNAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v10：配列番号１６４；
GSGQLRYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v11：配列番号１６５；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v12：配列番号１６６；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSLECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
c1：配列番号１６７；
AAGQLEYSVLEETEPGVTVGNIASDLKLSAAVLSLRNFRFLSNYRESYFGVDLGSGSLVVQELADREQLCPAKASCILTYELMFEDPLELHKIRVHLLDTNDN
c2：配列番号１６８；
AASQLRYSVPEEQSPGALVGNVARALGLELRRLGPGCLRINHLGAPSPRYLELDLTNGALFVNERIDREALCEQRPRCLLSLEVLAHNPVAVSAIEVEILDIN
【００４７】
ラットプロトカドヘリンα由来ＥＣ１ペプチド
v1：配列番号１６９；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRLASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSTECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVKVKDINDN
v2：配列番号１７０；
GSGQLHYSVTEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGQSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v3：配列番号１７１；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v4：配列番号１７２；
GNSQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v5：配列番号１７３；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRRDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGQSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v6：配列番号１７４；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVATKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEMIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v7：配列番号１７５；
GNSQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECNIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v8：配列番号１７６；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSVHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v9：配列番号１７７；
GSGQLRYSIPEETKHGTFVGRIAQDLELQLPELVPGLFQLDSKGFGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECNIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v10：配列番号１７８；
GSAQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELMELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v11：配列番号１７９；
GSAQLRYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGKSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
v12：配列番号１８０；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECNIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVRDINDN
v13：配列番号１８１；
GAASSTXSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELTELVPRLFRVASKDRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
c1：配列番号１８２；
AAGQLEYSVLEETEPGVTVGNIVSDLKLSAAALSLRNFRFLSNHREPYFGVDLGSGSLVVQEPADRERLCGTKAACILTYELMFEDPLELHKMRVRLLDTNDN
c2：配列番号１８３；
AASQLRYSVPEEQSPGALVGNVARALGLELRRLGPGCLRINHLGAPSPRYLELDLTNGALFVNERIDREALCEQRPRCLLSLEVLAHNPVAVSAIEVEILDIN
【００４８】
ヒトプロトカドヘリンα由来ＥＣ１ペプチド
v1：配列番号１８４；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRVAQDLGLELAELVPRLFRVASKTHRDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCQWSAECSIHLELIADRPLQVFHVEVKVKDINDN
v2：配列番号１８５；
GSGQLRYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELEELVPRLFRVASKRHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHVEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
v3：配列番号１８６；
GSGQLHYSVSEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKRHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVEVKDINDN
v4：配列番号１８７；
GNGQLHYSVSEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKGRGGLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCRRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVRDINDN
v5：配列番号１８８；
GSGQLHYSIPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKGRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCRRRAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVAVKDINDN
v6：配列番号１８９；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRMASKDREDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVRDINDN
v7：配列番号１９０；
GRGQLHYSVPEEAKHGNFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRAVCKFRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVERPLQVFHVDVEVKDINDN
v8：配列番号１９１；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKRHRDLLEVSLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVKDVNDN
v9：配列番号１９２；
GSGQLHYSVPEEAEHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFQLDSKGRGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVKDINDN
v10：配列番号１９３；
GSGQLHYSVYEEARHGTFVGRIAQDLGLELAELVQRLFRVASKRHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSVECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVKDINDN
v11：配列番号１９４；
GSGQLHYSVSEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVQRLFRVASKTHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGQSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVNVEVKDINDN
v12：配列番号１９５；
GSGQLHYSVYEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKRHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREKLCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVDVEVKDINDN
v13：配列番号１９６；
GSGQLHYSVPEEAKHGTFVGRIAQDLGLELAELVPRLFRVASKRHGDLLEVNLQNGILFVNSRIDREELCGRSAECSIHLEVIVDRPLQVFHVEVKVRDINDN
C1：配列番号１９７；
AAGQLEYSVPEETERGVAVGNLSADLRLPAAAMSSRNFRFLSSHRELYFGVDLPSGNLVVREPADREQLCRAKAACVLTYDLVLEDPLELHKIRIHVLDTNDN
C2：配列番号１９８；
AASQLRYSVPEEQAPGALVGNVARALGLELRRLGPGCLRINHLGAPSPRYLELDLTSGALFVNERIDREALCEQRPRCLLSLEVLAHNPVAVSAVEVEILDIN
【００４９】
ニワトリプロトカドヘリンα由来ＥＣ１ペプチド
v1：配列番号１９９；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v2：配列番号２００；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v3：配列番号２０１；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v4：配列番号２０２；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v5：配列番号２０３；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v6：配列番号２０４；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v7：配列番号２０５；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v8：配列番号２０６；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALHLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v9：配列番号２０７；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v10：配列番号２０８；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v11：配列番号２０９；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEAGRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
v12：配列番号２１０；
VGGQVRYSVPEEAEAGTVVGRLAQDLGLEAGEAEARRLRLVARGRRASVEVSGASGALVVSSRLDREELCGKSAPCALRLEVLLDRPLRVFHVEVEVTDINDN
c1：配列番号２１１；
AKGQVVYSIAEGTDRGTFVGNVAKDLGINAAALSARKFRMIIGSSKQYFNINATTGVLSVNEPIDREQLCELKSTCLLNYELVLENPLELYRMEFKVLDVNDN
c2：配列番号２１２；
AGGPLRYSVREELPHGAFVGNVASDLGVDPRRLAERGARLTSGSGRQYLELELGRGALLVRERMDREVLCELSPTCFLSLELVIEQPIEVHNVEVEVLDINDN
【００５０】
ゼブラフィッシュプロトカドヘリンα由来ＥＣ１ペプチド
v1：配列番号２１３；
AQISYNVLEEVKPGTTVGNLAKDINLSVKELQSRGFRIVSGSKKQYFSVNVDTGALQVSERIDREELCAGAVACSVNLEAVVNSPLQLYRVRINILDINDN
v2：配列番号２１４；
ADGQIVYSVSEEVNTGTTVGNLAKDLNLNVQDLERRGFQIVSGPNKQYFDLHARNGILFVRERIDREELCGRSSKCALELEAIVSAPMSIYRFEVKILDVNDN
v3：配列番号２１５；
ASGQLSYSVSEEVSPGTTVGNLAKDLNLNVQELESRMFQIVTGAKKKYFEVNLKTGFLYVNERIDREELCAKAPKCTVSVEAVINNPLKLYQIEINIVDVNDN
v4：配列番号２１６；
ASGQLSYSVSEEVSPGTSVGNIAKDLNLNVQELESRMFQIVTGAKKKYFEVNLKTGFLYVNERIDREELCAKAPKCTVSVEAVINNPLKLYQIEINIVDVNDN
v5：配列番号２１７；
ASGQLSYSVSEEVSPGTTVGNLAKDLNLNVQELESRMFQIVTGAKKKYFEVNLKTGFLYVNERIDREELCAKAPKCTVSVEAVINNPLKLYQIEINIVDVNDN
v6：配列番号２１８；
SSGQIAFSVSEEASPGTTVGNIVKELNLNLQELEHRGFQIV-GPNKRYFDVNMKTGILQVKDKLDREEICGQSLKCALELEAIVNSPLNMYRFEVNVLDVNDN
v7：配列番号２１９；
SSGQIAFSVSEEVSPGTTVGNIVKELNLNLQELEHRGFQIV-GPNKRYFDVNMKTGILQVKDKLDREEICGQSLKCALELEAIVNSPLNMYRFEVNVLDINDN
v8：配列番号２２０；
TDGQIVYSISEEADPGTTVGPIAKDLNLNLHELQLRGFQLVSGPNKRYFDVNLKSGVLLVKERIDRELLCGRSSRCSLEIEAIVNSPLNMYRLEVNVLDINDN
v9：配列番号２２１；
AEGHIVYTVSEETNPGTTVGNLAKDLNLNLQDITNRGFQLVSGANKRYFELNSKTGFLHINDRINRDELCGRSLKCSLPLEAIVNAPLNVYRFEVSIIDINDN
v10：配列番号２２２；
TNGQIVYSISEEANPGTAVGNLAKDFNLNVQDIERRGFQIVSESNKRYFDFNFKTGVLHVKERIDREELCEQKIRCSLPLEAIVNSPLNVYRFEINVLDINDN
v11：配列番号２２３；
AGGQFVYTVSEEANPGTTVGNLVKDFNLNIQDLEARGFHIVRGPNERYFDVNTKTGVLHVKERIDREEICEQNIKCSLPLEAMISSPLNVFRFEINVVDINDN
v12：配列番号２２４；
ASAQVAYSISEEANTGTFVGNIAKDLNLNIQELESRGFHIPAVSGRKYFEVNLKTGVLFVSERIDREAFCPASPQCSVNLEAIVNNPLNLFRIEITILDINDN
vc：配列番号２２５；
TNAQIRYSVQEELESGTVVGDLVRDLGLELRKLSARRIRISSDTARRYFNINHKTGKLVISDRIDRETLCEFSGTCTLSLDVVLESPFEQHSVDVEILDANDN
【００５１】
マウスプロトカドヘリンβ由来ＥＣ１ペプチド
beta1：配列番号２２６；
GAATIRYSVAEEMESGSFVANVAKDLGLEVGKLAERGARLVAEGNRLHFRLHRKTGDLFVKEKLDREALCGKSDPCVLHFEIILAEPLQSFRVEVRVFDINDN
beta2G：配列番号２２７；
GSTIRRYSVEEEAENGVFVANLLKDLGLEVEELAARGPRVISKGKKLNLEFNRQTGDLLLREKLDREELCGPAEPCVVPFQVLLGNPLQIFQAELQIRDINDH      
beta3：配列番号２２８；
GSMSRRYSVAEEKEKGFVIANLATDLGLSIEELAERRAQAISKGNIQYFQLSHQTGDLLLVEKLDREDLCGSTEPCVLHFQILLHDPLQFITNELEVIDVNDH
beta4：配列番号２２９；
GSEAIKYSMPEETESGYLVANLAQDLGIRVGELAAREARVHHRGNKDLLQLDAETGNLFLKEKLDREGLCGATEPCVLHFQIILKNPVQFFQTELQLTDINDH
beta5：配列番号２３０；
LMVPTRYSVLEESESGSFVAHLAKDLGLGAGELAARSARVVSDHDKQQFILDSETGDLLLREKLDREELCGSVDPCVLHFQVFLEKPVQFFQGELLIQDINDN
beta6：配列番号２３１；
GSEAIRYSIPEETESGYLVAHLAKDLGFRVGELATRRARIHHRGNKELLQLDVETGNLLLKEKPDREALCGATEPCVLHFQIILENPVQFFQTELQLTDINDH
beta7：配列番号２３２；
SEPTTQYSILEETESGSFVAHLAKDLGLGARELAARSARVVSDDYKQRLLLDPETGDLLLREKVDREEVCSTVDPCVLHFQVTLEKPVQYFQGELLIQDINDH
beta8：配列番号２３３；
SSEAISYSMPEETESGYLVANLAQDLGLRVGELTTRGARIHHNGNKELLQLDAERGNLLLKEKPDREALCGATEPCVLHFQIILENPVQFFQTDLQFTDINDH
beta9：配列番号２３４；
SEPTIRYSILEETESGSFVAHLAKDLGLGARELAARSARVLSDDYKQRLLLDPETGDLLLREKVDREEVCSTVDPCVLHFQVTLEKPVQYFQRELLIQDINDH
beta10：配列番号２３５；
CADAIIYSIPEETESGYLVANLAKDLGLRVGELAIRGARIHYKGNKELLQLDAETGNLFLKEKPDREVLCRATEPCVLHFQIILENPVQFFQTELQLTDINDH
beta11：配列番号２３６；
GSGATRYSMPEEKESGYLVANVAKDLGLRVGELATRGAQIHYKGNKELLQMDAETGNLFLKEKLDREALCGATEPCVLHFQVILENPVQFFQTELQLTDINDH
beta12：配列番号２３７；
DSEAIRYSMPEEKESGYLVANVAKDLGLRVEELATRGAQIHYRGNKELLQMDAETGNLFLKEKLDREALCGATEPCVLHFQIILENPVQFFQTELQLTDINDH
beta13：配列番号２３８；
GSGSIQYAMLEETESGTFVANLTKHLGLRVGELAARDARVVFKGNRQYLQLDPQTQDLMLNENLDREELCGSTEPCVLSFRVLLKNPLQFYQAELRVIDINDH
beta14：配列番号２３９；
GSATITYSVLEETDRGSLVGNLAKDLGLSLRELITRGAQILSKGNKQLLQLEQKSGNLLLKEKLDREELCGSTNPCILHFQVLLKSPVQFIQGEIQLQDVNDH
beta15：配列番号２４０；
SAEQLQYSVAEETERGTFLANLAKDLGLGLGELSAREARIVSDQNTRFLLLSPLTGELILNEKLDREELCGPTEPCVLTFQLLLERPFQIYRAALHIKDINDN
beta16：配列番号２４１；
AGELRRYSVVEEKEGRSFVTNLVKDLGLGQLELSRRGAKVISKGNKLHLQLDQETGDLLLNEKVDREKLCGHTEPCLLSFQVLLDNPLDIFQAELEVTDINDH
beta17：配列番号２４２；
GAELGPYSIEEETERGSFVANLGKDLGVDLAEISNRRARIISQENKEHLQLNLQSGDLLINEKLDREELCGPIEPCVLHFQVLMENPLEVFQAELRVMDINDY
beta18：配列番号２４３；
GSELGRYSVTEETERGSFVANLAKDLGLGVEALAAKRTRVVCDDNKQHLFLDSHTGDLLTNEKLDREKLCGPTEPCMLYFQILMDNPFQIYRAELRILDINDH
beta19：配列番号２４４；
HSEAGRLSVVEEMLSGALVGNLVKDLGLQVDELSAREAQVASSDNKLPLQLNINTGDLLLSEPLDREELCGSTEPCVLHFQVLLKNPLKILQAELQVTDVNDN
beta20：配列番号２４５；
SAESLRYSVAEETEIGSFVANLAKDLGLGVAELSSREARVVSDDNKKHLLLNLLTGDMLLNERLDREELCGSTQPCVLPFQVVLENPLQFYRAELHVRDINDH
beta21：配列番号２４６；
SVLATTWRYSVPEEMETGSSIANIIKDMDVGDLAARGARVIFDDYQPYLRLELETGNLLLNEKLDREALCSSSEPCILHFQVLLENPLQFFQAELLIEDINDH
beta22：配列番号２４７；
GSEPRRYFVMEETPSGTVLADLVQDLGLGVAELAARGAQVVSEEKESRLQLDLQTGKLILNEKLDREELCGSTEPCVTHFQVLLKKPLEIFQAELRVGDINDH
【００５２】
ヒトプロトカドヘリンβ由来ＥＣ１ペプチド
beta1：配列番号２４８；
DATTIRYSVAEEMESGSFVANVAKDLGLEVGKLAARGARLVSEGNKMHFRLHRKTGDLFVKEKLDRESLCGKADPCVLHFEVVLVEPLQSFRAEVRVFDINDNAPVF
beta2：配列番号２４９；
SCQPRHYSVAEETESGSFVANLLKDLGLEIGELAVRGARVVSKGKKMHLQFDRQTGDLLLNEKLDREELCGPTEPCVLPFQVLLENPLQFFQAELRIRDINDHSPVF
beta3：配列番号２５０；
GSESRRYSVAEEKEKGFLIANLAKDLGLRVEELAARGAQVVSKGNKQHFQLSHQTGDLLLNEKLDREELCGPTEPCILHFQILLQNPLQFVTNELRIIDVNDHSPVF
beta4：配列番号２５１；
RLEPIRYSVLEETESGSFVAHLAKDLGLGIGELASRSARVLSDDDKQRLQLDRQTGDLLLREKLDREELCGPIEPCVLHFQVFLEMPVQFFQGELLIQDINDHSPIF
beta5：配列番号２５２；
GSEAVRYSIPEETESGYSVANLAKDLGLGVGELATRGARMHYKGNKELLQLDIKTGNLLLYEKLDREVMCGATEPCILHFQLLLENPVQFFQTDLQLTDINDHAPEF
beta6：配列番号２５３；
GSESIQYSVLEETESGTFVANLTKDLGLRVGELASRGARVVFKGNRQHLQFDPQTHDLLLNEKLDREELCGSTEPCVLPFQVLLENPLQFFQASLRVRDINDHAPEF
beta7：配列番号２５４；
GAEPLRYFVAEETERGTFLTNLAKDLGLGVGELRARGTRIVSDQNMQILLLSSLTGDLLLNEKLDREELCGPREPCVLPFQLLLEKPFQIFRAELWVRDINDHAPVF
beta8：配列番号２５５；
AAEPRSYSVVEETEGSSFVTNLAKDLGLEQREFSRRGVRVVSRGNKLHLQLNQETADLLLNEKLDREDLCGHTEPCVLRFQVLLESPFEFFQAELQVIDINDHSPVF
beta9：配列番号２５６；
GSGFGRYSVTEETEKGSFVVNLAKDLGLAEGELAARGTRVVSDDNKQYLLLDSHTGNLLTNEKLDREKLCGPKEPCMLYFQILMDDPFQIYRAELRVRDINDHSPVF
beta10：配列番号２５７；
GSGFGRYSVTEETEKGSFVVNLAKDLGLAEGELAARGTRVVSDDNKQYLLLDSHTGNLLTNEKLDREKLCGPKEPCMLYFQILMDDPFQIYRAELRVRDINDHAPVF
beta11：配列番号２５８；
GSETWSFSVAEEMQSGSFVGNLAKDLGLKVRELSSRGARVVSNDKKQRLQLDINTGDLLLSETLDREELCGSIEPCVLHLQVLMQNPTQFLQIELQVRDINDHSPIF
beta12：配列番号２５９；
GSETGNFLVMEELQSGSFVGNLAKTLGLEVSELSSRGARVVSNDNKECLQLDTNTGDLLLREMLDREELCGSNEPCVLYFQVLMKNPTQFLQIELQVRDINDHSPVF
beta13：配列番号２６０；
AAEPRSYSVVEETEGSSFVTNLAKDLGLEQREFSRRGVRVVSRGNKLHLQLNQETADLLLNEKLDREDLCGHTEPCVLRFQVLLESPFEFFQAELQVIDINDHSPVF
beta14：配列番号２６１；
GTESAHYSVAEETEIGSFVANLARDLGLGVEELSSREARVVSDDNKKYLHLDLLTGNLLLNEKLDRDELCGSTEPCVLHFQVVLENPLQFFRFELCVKDINDHSPTF
beta15：配列番号２６２；
GWEPRRYSVMEETERGSFVANLANDLGLGVGELAERGARVVSEDNEQGLQLDLQTGQLILNEKLDREKLCGPTEPCIMHFQVLLKKPLEVFRAELLVTDINDHSPEF
beta16：配列番号２６３；
GAELGSYSVVEETERGSFVANLGKDLGLGLTEMSTRKARIISQGNKQHLQLKAQTGDLLINEKLDREELCGPTEPCILHFQVLMENPLEIFQAELRVIDINDHSPMF
【００５３】
マウスプロトカドヘリンγ由来ＥＣ１ペプチド
gammaA1：配列番号２６４；
GAGNIRYSVPEETDKGSFVGSIAKDLGLETRELMERGIRIVSRGRSQLFSLNPRSGSLVTAGRIDREELCAQSTPCVVSFNILMEDEMKLLPIEVEIIDINDN
gammaA2：配列番号２６５；
KAGQIRYSVPEEIDKGSFVGSIAKDLGLEPQALEERGVRIVSRGKSQLFALNPRSGSLVTAGRIDREELCAQSTPCLVNFNLLLEDKLTIYSVEVEVTDVNDN
gammaA3：配列番号２６６；
GFRQIRYSVPEELDKGSFVGNISKDLGLEPRELAERGVRIISRGKSQLFSLDPRSGSLVTRGRIDREELCAQSAPCLVSFNILVEDKLKIFEVEVDISDINDN
gammaA4：配列番号２６７；
RAEQIRYSVPEELERGSVVGNLAADLGLEPGKLAERGVRIVSRGKTQLFALNPRSGSLVTAGRVDREGLCDRSPKCTANLEILLEDKVRILAIEVEIIDVNDN
gammaA5：配列番号２６８；
GKGQIRYSVREELDKGSFVGNISKDLGLEPRELAERGVRIISRGRSQLFSLNPRGGSLVTAGRIDREELCVQSSPCLVSFNILVENKMKIYGVEVEILDINDN      
gammaA6：配列番号２６９；
EAGQLRYSIPEEVEKGSFVGSIAKDLGLQPRELAERGIRIISRGRSQLFSLNQRSGSLVTAGRIDREELCAQSAPCLVSFNILIEDKLNLYPVEVEIVDINDN
gammaA7：配列番号２７０；
WAGQILYSVSEETDKGSFVGNITKDLGLQPRELAERGVRIITKGKTQLFSLNPRSGSLVTAGRIDREELCAQSPRCLVSFNILIEDKMNLYPIEVEIMDVNDN
gammaA8：配列番号２７１；
SVGQIRYSVPEETDKGTVVGNISKDLGLEPRELAERGVRIVSRGRSQLFSLNPRGGSLVTAGRIDREELCAQSTPCLVNINILVEEKGKLFGVEIEITDINDN
gammaA9：配列番号２７２；
RAGQIRYSVPEETEKGYIVGNISKDLGLEPRELAERGVRIISKGKTQLFSLSPRSGSLVTAGRIDREELCAQSATCLLNFKVLVEDRVKLYGVEVEVVDINDN
gammaA10：配列番号２７３；
AARQIRYSVPEELEKGSFVGNIAKDLGLEPRQLAERGVRIISRGRSQLFSLNPRGGSLVTAGRIDREELCAQSAPCLVSFNILVEDRVKLFGIEIEVTDVNDN
gammaA11：配列番号２７４；
GTGQIRYSVPEETDKGFFVGNISKDLGLEPWEVAERGVRIISRGQSQLFSLNPRGGSLVTAGRIDREELCDTMPSCMLNLEILVEETLKIYGVEVEVLDINDN
gammaA12：配列番号２７５；
GSTQIRYSVPEELEKGSRVGNISKDLGLEPRELEKRGVRIVSRGRAQLFALNPRSGSLVTAGRIDREELCMGSIKCQLNLEILMEDIGKIYGVEIEVRDINDN
gammaB1：配列番号２７６；
GALSQPIHYSIPEELAKGSLVGSLAKDLGLSIQELPARKLRVSAEKDYFSVSAESGDLLVSGRIDREKICGRKSECALEFESVTENPMNIFHVTVAIQDINDN
gammaB2：配列番号２７７；
GALADQIRYSIPEELAKNSIVGNLARDLGLSVQNLPTRKLRVSAEKDYFTVNPESGDLLVGDRIDREQVCGKQPQCVLEFDIVAEKPLNIFHVAVILQDVNDN
gammaB4：配列番号２７８；
PTLSEQIRYKIPEEMPTGSVVGNLAKDLGFSVQELPTRKLRISSEKPYFSVSSESGELLVSSRLDREQICGKKLMCALEFEAVAENPLNFYHLSVELEDINDH
gammaB5：配列番号２７９；
PALSEQIRYKIPEEMPTGSVVGNLAKDLGFSVQELPTRKLRISSEKPYFSVSSESGELLVSSRLDREQICGKKLVCALEFEAVAENPLNFYHVSVELEDINDH
gammaB6：配列番号２８０；
PALGQPVRYSIPEELDRGSVVGKLAKDLGLSVLEVSSRKLRVSAEKLHFSVDSESGDLLVKDRIDREQICKGRRKCELQLEAVLENPLNIFHVVVGIEDVNDN
gammaB7：配列番号２８１；
PALGQPVRYSIPEELDRGSVVGKLAKDLGLSVLEVSARKLRVSAEKLHFSVDSESGDLLVKDRIDREQICKGRRKCELQLEAVLENPLNIFHVVVEIEDVNDH
gammaB8：配列番号２８２；
TGLSEQVRYSIPEEMAMGSVVGNLAEDLGLPVQDLLTRNLRVIAEKPYLSVNPENGNIVVSDRIDREFLCFQSPLCVLPLEIVAENPLNVFHVSVVIEDINDN
gammaC3：配列番号２８３；
ASTIIHYEILEERERGFPVGNVVTDLGLDLGSLSARRLRVVSGASRRFFEVNWETGEMFVNDRLDREELCGTLPSCTVTLELVVENPLELFSAEVVVQDINDN
gammaC4：配列番号２８４；
VYGQIRYPVPEESQEGTFVGNVAQDFLLDTESLSARRLQVAGEVNQRHFRVDLDSGALLIKNPIDREALCGLSASCIVPLEFVTEGPLEMYRAEVEIVDVNDH
gammaC5：配列番号２８５；
VSGQLRYSVVEESEPGTLVGNVAQDLGLKGTDLLSRRLRLGSEENGRYFSLSLVSGALAVSQKIDRESLCGASTSCLLPVQVVTEHPLELTRVEVEILDLNDN
【００５４】
ヒトプロトカドヘリンγ由来ＥＣ１ペプチド
gammaA1：配列番号２８６；
GAGNIHYSVPEETDKGSFVGNIAKDLGLQPQELADGGVRIVSRGRMPLFALNPRSGSLITARRIDREELCAQSMPCLVSFNILVEDKMKLFPVEVEIIDINDNTPQF
gammaA2：配列番号２８７；
RAGQIRYSVREEIDRGSFVGNIAKDLGLEPLALAEQGVRIVSRGRSQLFALNPRSGSLVTANRIDREELCAQSAPCLLNFNILLEDKLTIYSVEVEITDINDNAPRF
gammaA3：配列番号２８８；
GSGQIRYSVSEELDKGSFVGNIANDLGLEPRELAERGVRIVSRGRTQLFSLNPQSGSLVTAERIDREELCAQIPLCLVKINILVEDKLKIFEVEIEIKDINDNAPNF
gammaA4：配列番号２８９；
RAEQILYSVFEEQEEGSVVGNIAKDLGLAPRELAERGVRIVSRGRTQLFALNPRSGTLVTAGRIDREELCDRSPNCVTNLEILLEDTVKILRVEVEIIDVNDNPPSF
gammaA5：配列番号２９０；
GSGQIRYSMPEELDKGSFVGNIAKDLGLEPQELAERGVRIVSRGRTQLFALNPRSGSLVTAGRIDREELCAQSPLCVVNFNILVENKMKIYGVEVEIIDINDNFPRF
gammaA6：配列番号２９１；
AAAQIRYSIPEELEKGSFVGNIVKDLGLEPQELAEHGVRIVSRGRMQLFSLNPRNGSLVTAGRIDREELCAQSPRCLVSFNILVEDKLNLYPVEVEIVDINDNTPRF
gammaA7：配列番号２９２；
WAGRILYSVSEETDKGSFVGDIAKDLGLEPRELAERGVRIISRGRTQLFALNQRSGSLVTAGRIDREEICAQSARCLVNFNILMEDKMNLYPIDVEIIDINDNVPRF
gammaA8：配列番号２９３；
GRGQIRYSVPEETDKGSFVGNISKDLGLDPRKLAKHGVRIVSRGRTQLFALNPRSGSLITAGRIDREELCAQSPRCLININTLVEDKGKLFGVEIEIIDINDNNPKF
gammaA9：配列番号２９４；
RASQIRYSVPEETEKGYIVGNISKDLALEPRELAERRVRIVSRGRTQLFSLNPRSGTLVTAGRIDREELCAQSPRCLVNFKVLVEDRVKLYGIEIEVTDINDSAPKF
gammaA10：配列番号２９５；
GARQISYSIPEELEKGSFVGNISKDLGLAPRELAERGVRIVSRGRTQLFSLNPRSGSLITAGRIDREELCAQSARCVVSFNILVEDRVKLFGIEIEVTDINDNAPKF
gammaA11：配列番号２９６；
RARQIRYSVPEETEKGSFVGNISKDLGLEPRELAKRGVRIVSRGKTQLFAVNPRSGSLITAGRIDREELCETVSSCFLNMELLVEDTLKIYGVEVEIIDINDNAPSF
gammaA12：配列番号２９７；
GCTQIRYSVPEELEKGSRVGDISRDLGLEPRELAERGVRIIPRGRTQLFALNPRSGSLVTAGRIDREELCMGAIKCQLNLDILMEDKVKIYGVEVEVRDINDNAPYF
gammaB1：配列番号２９８；
CGAISQQIRYTIPEELANGSRVGKLAKDLGLSVRELPTRKLRVSAEDYFNVSLESGDLLVNGRIDREKICGRKLECALEFETVAENPMNVFHVVVVIQDINDNAPRF
gammaB2：配列番号２９９；
GALPVQIRYSIPEELAKNSVVGNLAKDLGLSVRDLPARKLRVSAEKEYFTVNPESGDLLVSDRIDREQICGKQPLCVLDFDTVAENPLNIFYIAVIVQDINDNTPLF
gammaB3：配列番号３００；
QVLSEPIRYAIPEELDRGSLVGNLAKDLGFGVGDLPTRNLRVIAEKKFFTVSPENGNLLVSDRIDREEICGKKSTCVLEFEMVAEKPLNFFHVTVLIQDINDNPPTF
gammaB4：配列番号３０１；
PALCEQIRYRIPEEMPKGSVVGNLATDLGFSVQELPTRKLRVSSEKPYFTVSAESGELLVSSRLDREEICGKKPACALEFEAVAENPLNFYHVNVEIEDINDHTPKF
gammaB5：配列番号３０２；
PALCEQIRYRIPEEMPKGSVVGNLATDLGFSVQELPTRKLRVSSEKPYFTVSAESGELLVSSRLDREEICGKKPACALEFEAVAENPLNFYHVNVEIEDINDHTPKF
gammaB6：配列番号３０３；
PTLSEPIRYSIPEELAKGSVVGNLAKDLGLSVLDVSARKLRVSAEKLHFSVDAESGDLLVKNRIDREQICKERRRCELQLEAVVENPLNIFHVIVVIEDVNDHAPQF
gammaB7：配列番号３０４；
PTLCEPIRYSIPEELAKGSVVGNLAKDLGLSVLDVSARELRVSAEKLHFSVDAQSGDLLVKDRIDREQICKERRRCELQLEAVVENPLNIFHVIVVIEDVNDHAPQF
gammaC3：配列番号３０５；
VCGQIRYPVPEESQEGTFVGNVAQDFLLDTDSLSARRLQVAGEVNQRHFRVDLDSGALLIKNPIDREALCGLSASCIVPLEFVTEGPLEMYRAEVEIVDVNDHAPRF
gammaC4：配列番号３０６；
VCGQIRYPVPEESQEGTFVGNVAQDFLLDTDSLSARRLQVAGEVNQRHFRVDLDSGALLIKNPIDREALCGLSASCIVPLEFVTEGPLEMYRAEVEIVDVNDHAPRF
gammaC5：配列番号３０７；
VSGQLRYSVVEESEPGTLVGNVAQDLGLKMTDLLSRRLQLGSEENGRYFSLSLMSGALAVNQKIDRESLCGASTSCLLPVQVVTEHPLELIRVEVEILDLNDNSPSF
【００５５】
マウスＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１発現のための改変ＤＮＡ配列
配列番号３０８；
GGT AAT AGT CAA ATT CAT TAT TCT ATT
【００５６】
ウィルスタンパク質由来Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列
配列番号３０９；CSGKLIC
配列番号３１０；CSGRLIC
配列番号３１１；CSGRHIC
配列番号３１２；CSGRAVC
配列番号３１３；CAFRQVC
配列番号３１４；CSGKTIC
配列番号３１５；CSGKAVC
配列番号３１６；CKGKLVC
配列番号３１７；CSWAQVC
配列番号３１８；CAFKQVC
配列番号３１９；CAFKQIC
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】（Ａ）マウスカドヘリンスーパーファミリータンパク質のＥＣ１領域の系統樹を示す図である。プロトカドヘリンファミリーは、最大の集団としてカドヘリンスーパーファミリーの他のサブグループから分岐している。（Ｂ）マウスカドヘリンスーパーファミリーの代表的メンバーのＥＣ１領域の多重配列比較を示す図である。タイプＩ、タイプＩＩおよびデスモソームカドヘリンの接着界面（Ｔｒｐ２）並びにプロトカドヘリンファミリーで保存されるＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列が示されている。ＤＳＧ：デスモグライン（desmoglein）;ＤＳＣ：デスモコリン（Desmocollin）。
【図２】大腸菌におけるＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１の発現を示す図面代用写真である。塩基配列の改変により、大腸菌における大量発現が可能となった。
【図３】ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１のＣ末端およびｐＨ条件の検討の結果を示す図面代用写真である。ＥＣ１−Ｂ、ｐＨ８．０が最も安定であることがわかった。
【図４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１の細胞接着活性を示す図面代用写真である。ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１がコートされたディッシュではＨＥＫ細胞のディッシュへの結合が優位に亢進しており、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα−ＥＣ１が細胞接着活性を有することがわかった。
【図５】（Ａ）ＮＭＲ測定により得られたＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の３０構造の重ね合わせを示す図である。（Ｂ）ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１領域の構造のリボン図を示す図である。（Ｃ）ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のグリークキートポロジーを示す。矢印はβストランドを示す。Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列中のＣｙｓ間のジスルフィド結合を点線で示す。カルシウム結合アミノ酸が丸で囲まれている。
【図６】（Ａ）古典的カドヘリンとＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４のＥＣ１領域の構造に基づく配列ホモロジー比較を示す図である。ＣＮＲ／Ｐｃｄｈαの幾つかのβストランドは、古典的カドヘリンの対応するβストランドと比較して位置がずれている。（Ｂ）ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１ならびにＣ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリン（それぞれＰＤＢ  アクセションコード１Ｌ３Ｗ、１ＮＣＩおよび１ＳＵＨ）のＥＣ１領域の構造のリボン図である。ＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４は、古典的カドヘリンとβシートの相対配向が異なっていた。（Ｃ）カドヘリンスーパーファミリーのＥＣ１領域の結合部位の比較を示す図である。Ｎ末から見た骨格構造モデルおよび上記（Ｂ）と同じ方向から見た空間充填モデルにおいて、古典的カドヘリン（Ｎ−カドヘリン）の接着に重要な疎水性ポケットを形成する残基と、それらに対応するＣＮＲ／Ｐｃｄｈαの疎水性残基が、黒色で示される。古典的カドヘリンで保存される疎水性ポケットは、ＣＮＲ／Ｐｃｄｈαではアミノ酸側鎖によってふさがれていた。
【図７】（Ａ）様々な種のＣＮＲ／ＰｃｄｈαファミリーメンバーのＣｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ配列の配列比較を示す図である。（Ｂ）図６Ｂと同じ方向、および、（Ｃ）Ｃ末底面、から見たＣＮＲ／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１の空間充填モデルを示す図である。カルシウム結合部位が黒色、Ｃｙｓ−（Ｘ）５−Ｃｙｓ部位が（Ｂ）の右下および（Ｃ）の中央に灰色で示される。
【図８】１．５ｍＭ  カルシウムイオン存在下（Ａ）および非存在下（Ｂ）のＣＮＲ１／Ｐｃｄｈα４−ＥＣ１のＨＳＱＣスペクトルを示す図である。（Ｃ）はＣｙｓに相当するアミノ酸のスペクトルのある部分の拡大図であり、両条件下のスペクトルを重ね合わせている。重なっているものにアステリスク（＊）を付し、カルシウムイオン存在下のみで存在するスペクトルには対応アミノ酸を表示した。カルシウムイオンの有無によりペプチドの構造が変化することが示唆された。
【図９】環状合成ペプチド（ＣＧＲＳＡＥＣ）のＮＭＲスペクトルを示す。スペクトルを確認することができ、本ペプチドが一定の構造をとっていることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月11日(2005.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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