(57)【要約】【課題】銀ナノ粒子を利用した核酸の精製法を提供する。【解決手段】（ａ）チオール基を有する分子を含む試料と銀ナノ粒子とを混合し、分子と銀ナノ粒子との複合体を含む混合物を形成するステップと、（ｂ）該混合物から複合体を分離して除去するステップと、を含む銀ナノ粒子を利用して標的物質を精製する方法である。これにより、既存の核酸精製法に比べ、チオール基を有する分子を含む試料を溶解する作業を入れたとしても三段階作業で速かにＰＣＲ増幅が可能であるＤＮＡを精製できるので、ＬＯＣに非常に有用に利用可能である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）チオール基を有する分子を含む試料と、銀ナノ粒子とを混合し、前記分子と銀ナノ粒子との複合体を含む混合物を形成するステップと、
（ｂ）前記混合物から前記複合体を分離して除去するステップとを、
含む銀ナノ粒子を利用して標的物質を精製する方法。
【請求項２】
前記試料は、細胞またはウイルスを含み、
前記ステップ（ａ）の前または後に、更に前記細胞またはウイルスを溶解するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的物質は、核酸または糖であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞またはウイルスを溶解する方法は、機械的な粉砕、化学反応、電気化学反応、生化学物質、超音波、音波、極超短波、加熱、レーザ、電場及び電気分解よりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複合体の除去がチオール基を有する構造物を介して行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記チオール基を有する構造物が、３−（メルカプトプロピル）トリメトキシシランにより改質されたガラスファイバ膜であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
銀ナノ粒子のサイズが１ｎｍから１００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
添加される銀ナノ粒子の濃度が、前記混合物の全量に対して１０質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
添加される銀ナノ粒子の濃度が、前記混合物に対して１００質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
銀ナノ粒子は、
前記試料に直接添加されるか、または
銀電極を介した電気分解により前記試料中に生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀ナノ粒子を利用した標的物質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高純度の二本鎖プラスミドＤＮＡ、一本鎖ファージＤＮＡ、染色体ＤＮＡまたはアガロースゲル精製されたＤＮＡ断片などの精製は、分子生物学において非常に重要である。ＤＮＡを精製する理想的な方法は、簡単かつ迅速であり、付加的な試料操作段階が殆ど無い方法である。また、精製されたＤＮＡは、直ちに形質転換、制限酵素分析、ライゲーションまたは配列決定などが行えるように、不純物の混在が少ないことが望まれる。前記特徴の全てを備えた方法は、核酸試料製造の自動化を進めるにおいてに非常に魅力的である。従来技術における核酸の精製方法として、一般的に、アルコール沈殿物からのプラスミドＤＮＡの精製が知られているが前記方法は困難な方法である。他の一般的な方法としてＣｓＣｌ勾配、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、またはＲＮＡ分解酵素、蛋白質分解酵素Ｋ、及び反復されたアルコール沈殿ステップを利用する方法がある。前記方法は、またＣｓＣｌ及びその他の塩、ＥｔＢｒ及びアルコールを除去するために、相当な後処理ステップが必要である。また、従来技術には更なる問題点があり、小さな負電荷の細胞成分がＤＮＡと共に沈殿されうる。その結果、ＤＮＡに、望ましくない水準のＤＮＡ以外の細胞成分が混入する場合がある。
【０００３】
従来技術として、固相物質を利用した核酸の精製方法が公知である。例えば、特許文献１には、核酸に結合する固相物質を利用した核酸の精製方法が開示されている。具体的に、前記方法は、出発物質、カオトロピック物質（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、及び固相物質を混合し、核酸と固相物質を結合させるステップ、前記結合した核酸を有する前記固相物質を液体から分離するステップ及び前記固相物質と核酸との複合体を洗浄するステップを含む。前記カオトロピック物質としては、例えば、チオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）、ヨウ素またはそれらの組み合わせなどが含まれる。固相物質には、シリカ粒子が含まれる。
【０００４】
しかし、前記方法は、長時間を必要とする上に、工程が複雑であり、ＬＯＣ（Ｌａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ、バイオチップ）などに適さない。また、前記方法は、必ずカオトロピック物質を使用せねばならないという問題点があった。すなわち、前記カオトロピック物質を使用しない場合には、固相物質に核酸が結合しない。また、前記カオトロピック物質は、人体に有害な物質であるので、注意して扱わねばならず、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のような、ＤＮＡ精製後に行われうる後続ステップにおいて妨害物質として作用するので、精製過程中または精製が完了した後に、精製された核酸から除去せねばならない。
【０００５】
また、固相物質と核酸との効率的な結合のために、大面積を有する固相物質を開発する研究が進められていたが、相変らず多くの処理ステップが必要であり、時間がかかり、カオトロピック塩が必要であるという短所があった。
【０００６】
また、非特許文献１には、固体相への可逆的な固定化方法が記載されている。該方法は、自動化のための簡単であって容易な方法であるが、これまで病原菌の検出についての例がなく、ＬＯＣ試料の製造に適用するには問題がある。
【０００７】
また、ＧｅｎｅＲｅｌｅａｓｅｒ（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓ社）、ＲｅｌｅａｓｅＩＴ（ＣＰＧ  Ｉｎｃ．）及びＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ（登録商標）  ＲＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）から市販されている単一チューブ試料の製造キットがある。これらは、二段階だけで試料製造が可能であり、１０分から１５分以内にＰＣＲ試料の準備、つまり核酸の精製が完了するという長所があるが、白色重合体試薬のために、リアルタイムＰＣＲが可能ではなく、細胞溶解後に、試薬及びＰＣＲ混合物を添加しなければならないので、不便であって汚染の可能性の問題がある。
【特許文献１】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【非特許文献１】Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５；２３：２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、銀ナノ粒子を利用して核酸を短時間内に効率的に精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、前記のような従来技術を基に核酸の精製法を研究している中で、銀ナノ粒子が試料中のチオール基を有する分子と結合すること、および、銀ナノ粒子がＳＨ改質された構造物により除去可能であるという特性を発見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の目的を達成するために、本発明は、（ａ）チオール基を有する分子を含む試料と銀ナノ粒子とを混合し、前記分子と銀ナノ粒子との複合体を含む混合物を形成するステップと、（ｂ）前記混合物から前記複合体を分離して除去するステップと、を含む銀ナノ粒子を利用した標的物質の精製方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法において、前記試料は、細胞またはウイルスを含み、前記ステップ（ａ）の前または後に、更に前記細胞またはウイルスを溶解するステップを含むことができる。
【００１２】
本発明の方法において、前記標的物質は、核酸または糖でありうる。
【００１３】
本発明の方法において、前記細胞またはウイルスを溶解する法は、機械的な粉砕、化学反応を利用した細胞溶解法、電気化学反応を利用した細胞溶解法、酵素など生化学物質を利用した細胞溶解法、超音波、音波、極超短波、加熱、レーザ、電場、電気分解からなる群より選択される少なくとも１種などを含むことができる。
【００１４】
本発明の方法において、前記複合体の除去がチオール基（以下、「ＳＨ基」とも記載する）を有する構造物を介して行われうる。
【００１５】
本発明の方法において、前記ＳＨ基を有する構造物が３−（メルカプトプロピル）トリメトキシシランにより改質されたガラスファイバ膜、またはチオール基を有するように改質された任意の構造物でありうる。
【００１６】
本発明の方法において、前記銀ナノ粒子のサイズは１ｎｍから１００ｎｍでありうる。
【００１７】
本発明の方法において、前記添加される銀ナノ粒子の濃度は、前記混合物に対して、望ましくは１０質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍであり、より望ましくは、１００質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍでありうる。
【００１８】
本発明の方法において、前記銀ナノ粒子は、前記試料に直接添加されるか、または銀電極を介した電気分解により前記試料中に生成可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の銀ナノ粒子を介した核酸の精製方法は、既存の核酸精製方法に比べ、速やかに核酸を精製できるので、ＬＯＣにきわめて有用に利用可能である。
【００２０】
また、精製条件によってはＰＣＲ増幅用の核酸試料として望ましい純度にまで核酸を精製することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明をステップ別に具体的に説明する。
【００２２】
本発明は、（ａ）チオール基を有する分子を含む試料と銀ナノ粒子とを混合し、前記分子と銀ナノ粒子との複合体を含む混合物を形成するステップと、（ｂ）前記混合物から前記複合体を分離して除去するステップとを含む、銀ナノ粒子を利用して標的物質を精製する方法に関する。
【００２３】
図１は、本発明の各ステップを例示するフローチャートである。図１は、細胞からＤＮＡを精製する方法を例示したものである。図１において、ＤＮＡは標的物質に該当し、蛋白質はチオール基を有する分子に該当する。まず、細胞と銀ナノ粒子とを容器内で混合する。次に、煮沸、超音波処理などの方法を介して細胞を溶解する。細胞が溶解されれば、容器内の銀ナノ粒子が蛋白質と結合する。蛋白質と銀ナノ粒子との結合は、蛋白質を構成するアミノ酸中のシステインおよびメチオニンのチオール基を介してなされると推定される。細胞の溶解過程で、蛋白質が変成されてチオール基が外部に表れれば、銀ナノ粒子が蛋白質のチオール基と結合する。チオールと銀ナノ粒子との結合は、共有結合であるため非常に強く、非可逆的である。次に、蛋白質と銀ナノ粒子との複合体をＳＨ改質されたガラスファイバ膜で濾過する。ＳＨ改質された膜で蛋白質と銀ナノ粒子との複合体を濾過すれば、蛋白質のほとんどが除去されたＤＮＡ溶液が得られる。前記ＤＮＡ溶液は純度が高いためＰＣＲに用いることもできる。
【００２４】
本発明において、前記標的物質としては、核酸または糖などが挙げられる。標的物質は、他のチオール基を有する分子以外のものならば、いかなるものでも可能であり、望ましくは、ＬＯＣに用いるための核酸である。
【００２５】
本発明において、細胞を溶解する方法は、機械的な粉砕、化学反応を利用した細胞溶解法、電気化学反応を利用した細胞溶解法、酵素など生化学物質、超音波、音波、極超短波、加熱、レーザ、電場、電気分解などを利用した細胞溶解法を含むことができる。銀ナノ粒子を添加した状態で、前述の前記細胞溶解法を利用して細胞を溶解しても、ＰＣＲの結果には、さして違いがなかった。
【００２６】
本発明において、蛋白質と銀ナノ粒子との複合体の分離には、ＳＨ基を有する構造物を用いることが望ましく、例えば、ＳＨ改質された膜が用いられうる。前記構造物としてはいかなるものでも可能であるが、３−（メルカプトプロピル）トリメトキシシランにより改質されたガラスファイバ膜が特に望ましい。
【００２７】
本発明において、前記銀ナノ粒子のサイズは１ｎｍから１００ｎｍの範囲が望ましい。銀ナノ粒子のサイズが１００ｎｍを超える場合、銀ナノ粒子と蛋白質との結合の効率が低下するおそれがあり、１ｎｍ未満の場合、銀ナノ粒子が作製し難くなるおそれがある。
【００２８】
本発明において、添加される銀ナノ粒子の濃度は、望ましくは１０質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍであり、より望ましくは、１００質量ｐｐｍから１，０００質量ｐｐｍである。銀ナノ粒子の濃度が１０質量ｐｐｍ未満の場合には、蛋白質が除去されないおそれがあり、１，０００質量ｐｐｍを超える場合には、ＳＨ濾過を行った後にも銀ナノ粒子が残留するおそれがある。従って、銀ナノ粒子の濃度が高ければ、変性蛋白質を多く除去できるが、ＰＣＲ増幅が困難となるおそれがあるために、ＳＨ濾過などの銀ナノ粒子の分離／除去ステップによっては、添加する銀ナノ粒子の濃度に限界がある。また、銀ナノ粒子の濃度が１００質量ｐｐｍ以下である場合には、ＳＨ濾過に関係なくＰＣＲ阻害は起こりにくい。また、銀ナノ粒子の濃度が１０質量ｐｐｍ以下である場合には、ＰＣＲに殆ど影響を与えないということが分かった。しかしながら、ＳＨ濾過装置において、膜を複層に使用するか、または膜の表面積を大きくすることにより、銀ナノ粒子の濃度を増加しても、ＰＣＲ増幅に影響を与えない程度に銀ナノ粒子を分離／除去することもできる。銀ナノ粒子の濾過を強化するか、銀ナノ粒子の使用量を抑制するかは目的に応じて適宜決定することができる。
【００２９】
本発明において、前記銀ナノ粒子は、試料に直接添加してもよいし、または銀電極を介した電気分解により前記試料中に生成することも可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例を介して具体的に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１：銀ナノ粒子によるＰＣＲ阻害効果）
銀ナノ粒子のＰＣＲ増幅に対する阻害効果を知るために、銀ナノ粒子の濃度を変化させ、ＰＣＲ阻害作用が発生しない濃度を調べた。
【００３２】
ＨＢＶプラスミドＤＮＡ水溶液は、濃度別に準備された銀ナノ粒子水溶液を利用し、２倍に希釈して（細胞：銀ナノ粒子水溶液＝２５０μｌ：２５０μｌ）準備した。このとき使われた銀ナノ粒子水溶液中の銀ナノ粒子の濃度は、それぞれ０．１、１、１０、１００、１，０００質量ｐｐｍ（超純水を利用して連続希釈を実施）であり、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ水溶液は、１０５コピー／μｌを使用した。前記準備された試料は、下記の二種の方法でリアルタイムＰＣＲ（ＴＭＣ１，０００）を実施した。１つの方法では、精製過程を経ずに直接ＰＣＲを行い、他の１つの方法では、ＳＨ濾過を利用して銀ナノ粒子を除去した後でＰＣＲを実施した。
【００３３】
ＳＨ濾過を行う為のＳＨ改質されたガラスファイバ膜（以下、「ＳＨフィルタ」とも記載する）は、室温で、ガラスファイバ膜をＭＰＴＳ（３−（メルカプトプロピル）トリメトキシシラン）５３．８ｍＭ含有イソプロパノールに浸漬した後、イソプロパノールで二回洗浄し、８０℃のオーブンで５分間乾燥させた後、蒸溜水で洗浄することにより製造した。
【００３４】
あらかじめ準備された５００μｌのＨＢＶプラスミドＤＮＡ水溶液と銀ナノ粒子水溶液との混合溶液をＳＨフィルタで濾過し、銀ナノ粒子を分離／除去した後、濾液を１分以内に遠心分離機を利用して１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、ＤＮＡを集めた。
【００３５】
上述の実験の結果は、Ｃｔ（Ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）及びＰＣＲ産物濃度（ｎｇ／μｌ）で確認した。Ｃｔとは、蛍光信号による標的物質の検出が可能となるまで繰り返される、ＰＣＲのサイクル数をいう。すなわち、初期ＤＮＡ濃度が高いほど、小さいＣｔでも標的物質の増幅量は多くなるため、蛍光信号が検出可能であり、逆に初期ＤＮＡ濃度が低いほどＣｔは大きくなる。Ｃｔはまた、ＤＮＡ精製とも関連があるが、ＤＮＡの純度が高いほどＣｔは小さく、ＤＮＡの純度が低いほどＣｔは大きい。従って、Ｃｔが小さいほど溶液中のＤＮＡは、精製されているということが分かる。
【００３６】
図２は、銀ナノ粒子の濃度によるＰＣＲの結果をＣｔで表したものである。銀ナノ粒子の濃度が１０質量ｐｐｍ以下では、濾過をしてもしなくてもＰＣＲに影響を与えないことがわかる。ＳＨ濾過をしていない場合には、銀ナノ粒子の濃度が１００質量ｐｐｍ以上であるときにＰＣＲされていないが、ＳＨ濾過をした場合には、銀ナノ粒子の濃度が１，０００質量ｐｐｍ以上であるときにＰＣＲされていないことが分かる。銀ナノ粒子の濃度は高い方がチオール基を有する分子の除去量が向上するため好ましいが、多すぎるとＰＣＲを阻害してしまうおそれがある。ＳＨ濾過を行うと、ＰＣＲ前にチオール基と結合した銀ナノ粒子を除去することができるため、１，０００質量ｐｐｍ未満まで銀ナノ粒子を使用することができる。これは、ＳＨ濾過を使用する場合には、１００質量ｐｐｍの銀ナノ粒子の濃度がＳＨ濾過により１０質量ｐｐｍ以下に低下するということを意味する。従って、銀ナノ粒子を利用して実験する場合に、ＳＨ濾過を使用しない場合には、銀ナノ粒子濃度１００質量ｐｐｍ未満で使用することが好ましく、実施例１の条件でＳＨ濾過を使用する場合には、銀ナノ粒子濃度は１０００質量ｐｐｍ未満まで使用可能である。
【００３７】
しかしながら本発明は上記試験方法に限定されず、ＳＨ濾過装置で、膜を複層使用するか、または膜の表面積を広げることにより、ＰＣＲ増幅に影響を与えずに使われる銀ナノ粒子の濃度を１，０００質量ｐｐｍに高めることができる。銀ナノ粒子の濾過を強化するか、銀ナノ粒子の使用量を抑制するかは目的に応じて適宜決定することができる。
【００３８】
（実施例２：ＳＨ改質された膜による銀ナノ粒子複合体の除去）
ＳＨ改質された膜が銀ナノ粒子複合体を除去するか否かを知るために、ＳＨ濾過前後の銀ナノ粒子の濃度を測定した。ＳＨ改質されたガラスファイバ膜は、室温で、ガラスファイバ膜をＭＰＴＳ（３−（メルカプトプロピル）トリメトキシシラン）５３．８ｍＭ含有イソプロパノールに浸漬した後、イソプロパノールで二回洗浄し、８０℃のオーブンで５分間乾燥させた後、蒸溜水で洗浄することにより製造した。１００質量ｐｐｍの銀ナノ粒子水溶液（ＮＡＮＯＶＥＲ（登録商標）製コロイド溶液の１／１０希釈液）を利用し、ＳＨフィルタ濾過前後の銀ナノ粒子の濃度を、誘導結合プラズマ原子放出分光器（ＩＣＰ）を利用して測定した結果、濾過前の銀ナノ粒子の濃度は、１００質量ｐｐｍである一方、濾過後の銀ナノ粒子の濃度は、０．００２２質量ｐｐｍであった。これにより、１００質量ｐｐｍの銀ナノ粒子は、ＳＨフィルタによりほとんど完全に除去されるということが分かった。
【００３９】
（実施例３：銀ナノ粒子と音波溶解とを利用した大腸菌細胞の核酸精製）
本発明の方法を大腸菌検出のための試料製造法に適用できるか否かを知るために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に対して本発明の方法を利用して核酸を精製してＰＣＲを行った。
【００４０】
遺伝子組み換えＢ型肝炎ウイルス（ｒＨＢＶ）の遺伝子が組み込まれた大腸菌の菌株ＢＬ２細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を３７℃で対数期（ＯＤ６００＝１．５）までＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）で好気条件の下で培養した。前記大腸菌を遠心分離で回収し、３ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で二回洗浄した。次に、大腸菌細胞をＰＢＳで再懸濁させた（細胞密度：１×１０６細胞／ｍｌ）。
【００４１】
得られたｒＨＢＶを含む大腸菌細胞（８×１０２細胞／μｌから８×１０３細胞／μｌ）に銀ナノ粒子を１００質量ｐｐｍ添加した後、音波溶解（＞５００Ｈｚ、１分）し、実施例２で作製したＳＨ改質されたガラスファイバ膜を用いてＳＨ濾過を行い、ＰＣＲを行った。
【００４２】
細胞溶解をモニタリングし、溶解された細胞から放出されたＤＮＡを検出するために、下記のＰＣＲプライマ対を使用した：順方向プライマ（ａｇｔｇｔｇｇａｔｔ  ｃｇｃａｃｔｃｃｔ：配列番号１）、逆方向プライマ（ｇａｇｔｔｃｔｔｃｔ  ｔｃｔａｇｇｇｇａｃ  ｃｔｇ：配列番号２）。これらのプライマ対は、ＨＢＶ核酸をコーディングする遺伝子の各末端に相補的である。
【００４３】
ＰＣＲは、下記に列挙した各物質を含む総体積１μｌの反応混合物を利用し、シリコン−ガラスマイクロＰＣＲチップで行った：１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ緩衝液（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、それぞれ１ｍＭの順方向及び逆方向プライマ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰｓ（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）、５％グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５００ｍＭホルムアミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２ｎｇ／μｌＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び０．１ユニット／μｌ  Ｔａｑ重合酵素（ＳｏｌＧｅｎｔ．Ｃｏ，Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）。
【００４４】
ＰＣＲ増幅のリアルタイムモニタリングを新しく開発されたＧｅｎＳｐｅｃｔｏｒ（登録商標）ＴＭＣ−１０００システムを利用して行った。ＰＣＲ増幅は、９１℃で１分間の予備変性後、４０サイクル（９２℃で１秒間変性及び６２℃で１５秒間アニーリング−伸長）を行った。増幅サイクルを完了した後に、融解曲線は、試料を６０℃から９０℃にゆっくり加熱（０．１℃／秒）して収得した。増幅の４０サイクル及び融解分析にかかる総時間は、２５分未満であった。リアルタイムＰＣＲの成功を確認するために、増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動をＤＮＡ５００分析規模の試薬セットを利用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を利用して行った。
【００４５】
他の実験として、本発明と比較するために、音波溶解の後にＱｉａｇｅｎ精製キットを用いた精製を行い、同様にしてＰＣＲを行った。
【００４６】
更に他の実験として、精製度を検討するために、音波溶解の後に精製を行わずにＰＣＲを行った。
精製方法および精製するしないに係らず好ましいＰＣＲ結果が得られた。しかし、本発明の方法は他の方法に比べて精製ステップ及び精製時間が少なくかかるので、ＬＯＣの具現のために大腸菌細胞にも効率的に適用できるということが分かる。
【００４７】
（実施例４：銀ナノ粒子と音波溶解とを利用したバチルス  メガテリウム細胞の核酸精製）
本発明の方法をグラム陽性バクテリア検出のための試料製造法に適用できるか否かを知るために、バチルス  メガテリウム細胞から核酸を精製してＰＣＲを行った。
【００４８】
銀ナノ粒子を１００質量ｐｐｍ添加し、バチルス  メガテリウム（６．５×１０２細胞／μｌから６．５×１０３細胞／μｌ）を音波処理（１分）し、実施例２で作製したＳＨ改質されたガラスファイバ膜を用いてＳＨ濾過を行い、ＰＣＲを行った。
【００４９】
ＰＣＲは、下記プライマを用いたことを除いては、前記実施例３のものと同一に行った：順方向プライマ（ｙｃｃａｋａｃｔｃｃ  ａｔａｃｇｇｇａｇｇ  ｃ：配列番号３）、逆方向プライマ（ｇａｔｔｔａｃｃｇｃ  ｒｒｃｔｇｇｃａｃ：配列番号４）。
【００５０】
他の実験として本発明と比較するために、音波溶解の後にＱｉａｇｅｎ精製キットを用いた精製を行い、同様にしてＰＣＲを行った。
【００５１】
更に他の実験として、精製度を検討するために、音波溶解の後に精製を行わずにＰＣＲを行った。
【００５２】
図３からは、グラム陽性バクテリアであるバチルス  メガテリウム細胞の場合、音波溶解後に直接ＰＣＲした場合にはＰＣＲがなされず、本発明の方法で精製した後はＰＣＲがなされることがわかる。また、図３からは本願発明はＱｉａｇｅｎ精製キットで精製した方法に比べて試料精製時間がはるかに短く、精製ステップが簡単なのにも係らず、前記方法に非常に近い精製の効果をあげられることがわかる。
【００５３】
（実施例５：銀ナノ粒子と音波とを利用したｒＨＢＶの核酸精製）
本発明の方法をウイルス検出のための試料製造法に適用できるか否かを知るために、再組合Ｂ型肝炎ウイルス（ｒＨＢＶ）から核酸を精製してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、実施例３と同様に行った。
【００５４】
銀ナノ粒子を１００質量ｐｐｍ添加し、ｒＨＢＶ細胞（８×１０２細胞／μｌから８×１０３細胞／μｌ）を音波処理（１分）し、実施例２で作製したＳＨ改質されたガラスファイバ膜を用いてＳＨ濾過を行い、実施例３と同様にＰＣＲを行った。
【００５５】
更に他の実験として、精製度を検討するために、音波溶解の後に精製を行わずにＰＣＲを行った。
【００５６】
図３からは、ウイルスであるｒＨＢＶの場合、音波溶解後に直接ＰＣＲした場合にはＰＣＲがなされず、本発明の方法で精製した後にはＰＣＲがなされることがわかる。また、図３からは本願発明はＱｉａｇｅｎ精製キットで精製した方法に比べて試料精製時間がはるかに短く、精製ステップが簡単なのにも係らず、前記方法に非常に近い精製の効果をあげられることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の銀ナノ粒子を利用した核酸の精製法は、例えば核酸や糖などの精製関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の一例の全体的な過程を示すフローチャートである。
【図２】銀ナノ粒子濃度によるＰＣＲ結果をＣｔで表したグラフである。
【図３】大腸菌細胞、バチルス  メガテリウム細胞及びｒＨＢＶからそれぞれの核酸精製法によるＰＣＲ結果を最終生成物濃度（ｎｇ／μｌ）で表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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