(57)【要約】【課題】  本発明は、いちごの品種や系統を正確に、迅速かつ効率的に識別する技術を提供することを目的とする。【解決手段】  対合プライマーＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１〜１３Ｆ・Ｒの中から選ばれた１組又は２組以上の対合プライマーからなるいちご品種識別用プライマーセット；試料から抽出したＤＮＡに対して、前記プライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種の識別方法；前記プライマーセットを含むことを特徴とするいちご品種の識別用キット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（１３）のそれぞれに記載の対合プライマーの中から選ばれた１組又は２組以上の対合プライマーからなるいちご品種識別用プライマーセット。
（１）配列表の配列番号１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ
（２）配列表の配列番号３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ
（３）配列表の配列番号５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ
（４）配列表の配列番号７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒ
（５）配列表の配列番号９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ
（６）配列表の配列番号１１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ
（７）配列表の配列番号１３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ
（８）配列表の配列番号１５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ
（９）配列表の配列番号１７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒ
（１０）配列表の配列番号１９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ
（１１）配列表の配列番号２１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ
（１２）配列表の配列番号２３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒ
（１３）配列表の配列番号２５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒ
【請求項２】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせ、又は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせからなるいちご品種「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」及び「苺香」識別用プライマーセット。
【請求項３】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせ、又は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせからなるいちご品種「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」及び「アスカルビー」識別用プライマーセット。
【請求項４】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とちおとめ」識別用プライマーセット。
【請求項５】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、及び／又はＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とちひめ」識別用プライマーセット。
【請求項６】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒからなるいちご品種「福岡Ｓ６号」識別用プライマーセット。
【請求項７】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「さちのか」及び「はるのか」識別用プライマーセット。
【請求項８】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とよのか」識別用プライマーセット。
【請求項９】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒからなるいちご品種「さがほのか」識別用プライマーセット。
【請求項１０】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「章姫」識別用プライマーセット。
【請求項１１】
請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒからなるいちご品種「苺香」識別用プライマーセット。
【請求項１２】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項２記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」及び「苺香」の識別方法。
【請求項１３】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項３記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」及び「アスカルビー」の識別方法。
【請求項１４】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項４記載のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲを行い、増幅産物中から「とちおとめ」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」の識別方法。
【請求項１５】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項５記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「とちひめ」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちひめ」の識別方法。
【請求項１６】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項６記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「福岡Ｓ６号」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「福岡Ｓ６号」の識別方法。
【請求項１７】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項７記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「さちのか」及び「はるのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「さちのか」及び「はるのか」の識別方法。
【請求項１８】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項８記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「とよのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とよのか」の識別方法。
【請求項１９】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項９記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「さがほのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「さがほのか」の識別方法。
【請求項２０】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項１０記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「章姫」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「章姫」の識別方法。
【請求項２１】
試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項１１記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「苺香」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「苺香」の識別方法。
【請求項２２】
請求項２〜１１のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするいちご品種の識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いちご品種識別用プライマーセット、及びこれを用いたいちご品種識別方法に関し、詳しくは、いちご品種のＤＮＡ配列の差異に基いて、いちごの品種や系統を正確に、迅速かつ効率的に識別するための、いちご品種識別用プライマーセット及びこれを用いたいちご品種識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種苗法による育成者権の保護や、ＪＡＳ法による農産物の表示義務等により、ＤＮＡレベルでの品種識別が重要となっている。
いちごに関しては、ＫｕｎｉｈｉｓａらがＣＡＰＳマーカーを用いた品種識別技術を開発しているが（非特許文献１参照）、検査サンプルの増加や、検査機関への検査の委託に対応するためには、より多くの検体を正確に、迅速かつ効率的に処理する技術の開発を進める必要がある。
そのため、品種特異的なマーカーによる識別方法の確立が求められていた。
【０００３】
【非特許文献１】Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、いちごの品種や系統を正確に、迅速かつ効率的に識別する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を解決すべく鋭意検討を重ね、いちごの組織から抽出したＤＮＡについてＲＡＰＤによる増幅を行い、明瞭な多型でかつ再現性があるものを選抜してＳＴＳ化し、ＤＮＡは、そのままＰＣＲのプライマーとして用いることにより、ＰＣＲの増幅産物を制限酵素などの処理を経ずに識別マーカーを検出することができることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
請求項１記載の本発明は、下記の（１）〜（１３）のそれぞれに記載の対合プライマーの中から選ばれた１組又は２組以上の対合プライマーからなるいちご品種識別用プライマーセットである。
（１）配列表の配列番号１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ
（２）配列表の配列番号３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ
（３）配列表の配列番号５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ
（４）配列表の配列番号７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒ
（５）配列表の配列番号９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ
（６）配列表の配列番号１１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ
（７）配列表の配列番号１３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ
（８）配列表の配列番号１５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ
（９）配列表の配列番号１７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒ
（１０）配列表の配列番号１９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ
（１１）配列表の配列番号２１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ
（１２）配列表の配列番号２３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒ
（１３）配列表の配列番号２５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーであるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒ
【０００７】
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせ、又は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせからなるいちご品種「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」及び「苺香」識別用プライマーセットである。
請求項３記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせ、又は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせからなるいちご品種「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」及び「アスカルビー」識別用プライマーセットである。
【０００８】
請求項４記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とちおとめ」識別用プライマーセットである。
請求項５記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、及び／又はＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とちひめ」識別用プライマーセットである。
請求項６記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒからなるいちご品種「福岡Ｓ６号」識別用プライマーセットである。
請求項７記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「さちのか」及び「はるのか」識別用プライマーセットである。
請求項８記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「とよのか」識別用プライマーセットである。
請求項９記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒからなるいちご品種「さがほのか」識別用プライマーセットである。
請求項１０記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒからなるいちご品種「章姫」識別用プライマーセットである。
請求項１１記載の本発明は、請求項１記載のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒからなるいちご品種「苺香」識別用プライマーセットである。
【０００９】
請求項１２記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項２記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」及び「苺香」の識別方法である。
請求項１３記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項３記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」及び「アスカルビー」の識別方法である。
【００１０】
請求項１４記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項４記載のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲを行い、増幅産物中から「とちおとめ」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちおとめ」の識別方法である。
請求項１５記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項５記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「とちひめ」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とちひめ」の識別方法である。
請求項１６記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項６記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「福岡Ｓ６号」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「福岡Ｓ６号」の識別方法である。
請求項１７記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項７記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「さちのか」及び「はるのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「さちのか」及び「はるのか」の識別方法である。
請求項１８記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項８記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「とよのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「とよのか」の識別方法である。
請求項１９記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項９記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「さがほのか」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「さがほのか」の識別方法である。
請求項２０記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項１０記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「章姫」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「章姫」の識別方法である。
請求項２１記載の本発明は、試料から抽出したＤＮＡに対して、請求項１１記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から「苺香」識別マーカーを検出することを特徴とするいちご品種「苺香」の識別方法である。
請求項２２記載の発明は、請求項２〜１１のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするいちご品種の識別用キットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、いちご品種識別用プライマーセットを構成する各対合プライマーを組み合わせることにより、試料中に含まれる特定の、或いは複数のいちごの品種や系統を正確に、迅速かつ効率的に識別することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のいちご品種識別用ＤＮＡは、請求項１に記載するように、配列表の配列番号１〜２６に記載の各塩基配列からなる、２６種類のＤＮＡである。
ここで、いちごとは、Ｆｒａｇａｒｉａ属に属する植物であり、例えば、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎｎａｓａ、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｎｉｌｇｅｌｔｅｎｓｉｓなどに分類されるものを意味する。いちご品種については、系統や原産地などについては特に限定されず、代表的なものとして、国内主要品種を含む「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号（あまおう）」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」「苺香（メイヒャン：韓国）」の１７品種・系統を挙げることができる。また、「ＵＣ−５」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、「ＵＣ−１０」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、「ワイルドストロベリー」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）などにも適用可能である。更に、上記以外の品種および将来開発される新品種にも適用可能である。
本発明において、いちご品種を識別するとは、試料に１種類又は２種類以上のいちごの品種が含まれるかどうかを検出することを意味する。
【００１３】
本発明のいちご品種識別用プライマーセットは、以下の表１に示すと共に（１）〜（１３）で説明する対合プライマー１３種類の中から選ばれた１組または２組以上の対合プライマーとして、いちご品種の識別に利用することができるものである。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
（１）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちおとめ」、「とちひめ」、「栃の峰」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００１６】
（２）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちひめ」「栃の峰」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００１７】
（３）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちひめ」のＤＮＡにおいてのみバンドが検出されないが、他の品種ではバンドが検出されるマーカーを増幅させることができる。
【００１８】
（４）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちひめ」のＤＮＡにおいてのみバンドが検出されないが、他の品種ではバンドが検出されるマーカーを増幅させることができる。
【００１９】
（５）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２０】
（６）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「女峰」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「レッドパール」「アスカルビー」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２１】
（７）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「紅ほっぺ」「濃姫」「アスカルビー」「福岡Ｓ６号」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２２】
（８）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
また、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒは、「ＵＣ−５」「ＵＣ−１０」及び「ワイルドストロベリー」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるマーカーを増幅させることができる。
【００２３】
（９）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１７記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号１８記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちおとめ」「女峰」「栃の峰」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「アスカルビー」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２４】
（１０）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号１９記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２０記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちひめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「福岡Ｓ６号」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２５】
（１１）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号２１記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２２記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご１７品種のうち「とちおとめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２６】
（１２）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号２３記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２４記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒは、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち「とちおとめ」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「福岡Ｓ６号」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーを増幅させることができる。
【００２７】
（１３）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒ
配列表の配列番号２５記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ：フォワードプライマー）と配列表の配列番号２６記載のＤＮＡ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｒ：リバースプライマー）とからなる対合プライマーである。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒは、次の４つのマーカーを増幅させることができる。すなわち、上記した国内主要品種を含むいちご品種のうち、「とちおとめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「福岡Ｓ６号」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカー；「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」「福岡Ｓ６号」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるマーカー；「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「麗紅」「章姫」「紅ほっぺ」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカー；「とちおとめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「福岡Ｓ６号」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーの４つを増幅させることができる。
更に、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒは、「ＵＣ−５」「ＵＣ−１０」及び「ワイルドストロベリー」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるマーカーを増幅させることができる。
【００２８】
これらの対合プライマーは、基本的には、ＲＡＰＤによるＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ増幅産物から、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト）を用いて、Ｔｍ値６０〜７０、プライマー長１８〜２２ｍｅｒ、ＧＣ含量５０％以下になるようにして設計されたものである。
このような本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する各プライマーは、各ＤＮＡを構成する塩基配列に応じて人工的に合成することができる。
【００２９】
本発明のいちご品種識別用プライマーセットは、上記１３組の対合プライマーＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１ないし１３Ｆ・Ｒの中から選ばれた１組又は２組以上の対合プライマーを、識別の対象であるいちご品種に応じて適宜組み合わせたプライマーセットとして、ＰＣＲに用いることができる。
すなわち、上記ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１ないし１３Ｆ・Ｒのうちの１組又は２組以上を、例えば下記の（Ａ）〜（Ｊ）に示すような組み合わせのプライマーセットとして、試料から抽出したＤＮＡに対するＰＣＲに利用して、増幅産物中から識別マーカーを検出することにより、いちご品種を識別することができる。
【００３０】
（Ａ）国内主要品種を含む１７品種の識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを組み合わせて、或いはＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを組み合わせて、いちご品種、特に、上記した国内主要品種を含むいちご品種「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号（あまおう）」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」「苺香（メイヒャン：韓国）」１７品種の識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３１】
（Ｂ）主要な現行栽培品種を含む８品種の識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを組み合わせて、或いはＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを組み合わせて、いちご品種、特に、主要な現行栽培品種を含む「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号（あまおう）」「アスカルビー」の８品種の識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３２】
（Ｃ）いちご品種「とちおとめ」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーは、いちご品種「とちおとめ」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３３】
（Ｄ）いちご品種「とちひめ」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーのいずれか、或いは両方を、いちご品種「とちひめ」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３４】
（Ｅ）いちご品種「福岡Ｓ６号」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーを、いちご品種「福岡Ｓ６号」（あまおう）識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３５】
（Ｆ）いちご品種「さちのか」及び「はるのか」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの３組の対合プライマーを、いちご品種「さちのか」及び「はるのか」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３６】
（Ｇ）いちご品種「とよのか」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒは、いちご品種「とよのか」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３７】
（Ｈ）いちご品種「さがほのか」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒの３組の対合プライマーは、いちご品種「さがほのか」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３８】
（Ｉ）いちご品種「章姫」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーを、いちご品種「章姫」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００３９】
（Ｊ）いちご品種「苺香」識別用プライマーセット
本発明のいちご品種識別用プライマーセットを構成する対合プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒの３組の対合プライマーは、いちご品種「苺香」識別用プライマーセットとして利用することができる。
【００４０】
上記（Ａ）〜（Ｊ）の各いちご品種識別用プライマーセットは、試料から抽出したＤＮＡに対して、各プライマーセットを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中から識別マーカーを検出することにより、対応するいちご品種の識別を行うことができる。
また、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒは、「ＵＣ−５」、「ＵＣ−１０」、及び「ワイルドストロベリー」を他の品種から識別するためのプライマーセットとして利用することができる可能性がある。
【００４１】
試料としては、果実、がく、葉（未展開葉（幼葉）、成葉）、根、茎などのいちご植物体を構成する組織を用いることができる。
試料からのＤＮＡの抽出は、改変ＣＴＡＢ法や、Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用して行うことができる。
【００４２】
改変ＣＴＡＢ法の場合、まず、試料を液体窒素中で粉砕し、加熱した２×ＣＴＡＢ混合液及びＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを順次加えて混合し、更に２−メルカプトメタノール及びｐｏｌｙｃｌａｒ  ＶＴ（不溶性）を追加して混合する。尚、ダマができないよう薬さじ等を使ってなくなるまで混合することが好ましい。
続いて、振とうしながらクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、その後条件で遠心して上清を採取し、再びクロロホルム：イソアミルアルコールを添加して振とう、遠心する。得られる上澄みにイソプロパノールを添加し、静かに混合するとＤＮＡが析出するので、ＤＮＡだけをチューブに残して溶液を取り除く。
ＲＮａｓｅの入ったＴＥ−ＮａＣｌを添加し、沈殿が完全に溶けるまで３０分〜２時間処理した後ＤＮＡ溶液に１ｍｌのイソプロパノールを加えて静かに混合し遠心する。上清を除去して７０％エタノールを添加して遠心し、更に、上清を除去して１００％エタノールを添加して遠心し、再度上清を除去してエバポレーターで乾燥し、ＴＥ−ＲＮａｓｅを添加して処理して、ＤＮＡを得る。
【００４３】
Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔによる抽出の場合は、まず、試料を液体窒素中で粉砕し、ｒｅａｇｅｎｔ１及び２００ｕｌのｒｅａｇｅｎｔ２を順次加えて混合し、振とうし、氷上で静置する。尚、ｒｅａｇｅｎｔ１及びｒｅａｇｅｎｔ２は、キットに添付の反応液である。
これに氷冷クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）とＮｕｃｌｅｏｎ  Ｒｅｓｉｎを添加して緩やかに転倒混和した後遠心した。得られる上清に同様に氷冷クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）とＮｕｃｌｅｏｎ  Ｒｅｓｉｎを添加して転倒混和した。試料がいちごのがく、実、成葉の場合は、更に同様の操作を繰り返す。上清を採取し、静かに混合するとＤＮＡが析出するので、これを遠心する。
上清を除去して７０％エタノールを添加して転倒混和し、更に、上清を除去して１００％エタノールを添加して転倒混和し、更に、上清を除去してエバポレーターで乾燥し、ＴＥ−ＲＮａｓｅを添加して処理して、ＤＮＡを得る。
【００４４】
ＰＣＲは、識別したいいちご品種に応じて上記した各プライマーセットから適宜選択し、試料から抽出したＤＮＡを鋳型として行う。ここで、複数の対合プライマーからなるプライマーセットを用いる場合は、各対合プライマーの最適条件で、それぞれの対合プライマーごとにＰＣＲを行うが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒについては、同時に用いていわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることができる。マルチプレックスＰＣＲの場合は、ポジティブコントロールとなる対合プライマー（例えば、後述の実施例で用いるｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来の対合プライマー（配列表の配列番号２７及び２８参照））と共に用いることができる。
ＰＣＲは、常法に従って行うことができ、ＰＣＲ反応液を調製して、所定の温度サイクルを繰り返して処理することにより、ＰＣＲ増幅産物を得る。ＰＣＲ反応液組成や温度サイクルの条件は、各対合プライマーを用いたＰＣＲにおいて高感度でＰＣＲ増幅産物を得られるような温度を予備実験等により適宜設定することができ、例えば、アニーリング温度は５０〜７０℃、好ましくは表５に示すような温度とすることができ、また、ＤＮＡ量は３０〜６０ｎｇ、好ましくは４５〜５５ｎｇとすることができる。
尚、ＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
【００４５】
増幅産物中からの識別マーカーの検出は、各対合プライマーのＰＣＲ増幅産物をアガロースによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光との組み合わせ等常法により行うことができる。
検出した識別マーカーのバンドの有無については、予め品種と識別マーカーの対応表を作成しておいた上で、任意のプライマーを用いた実際の検出結果と照合して確認することもできる。
【実施例】
【００４６】
製造例１（プライマーセットの開発）
ＲＡＰＤによりいちご品種識別マーカーの選抜を行い、更にそのＳＴＳ化を行いいちご品種識別用のプライマーセットの開発を行った。
【００４７】
１．ＲＡＰＤマーカーの検出
まず、いちごの「とちおとめ」、「とよのか」、「さちのか」、「章姫」、「女峰」、「福岡Ｓ６号（あまおう）」、「さがほのか」、「アスカルビー」、「レッドパール」、「とちひめ」、「栃の峰」、「はるのか」、「濃姫」、「紅ほっぺ」、「麗紅」、「久留米４９号」、及び「苺香（メイヒャン、韓国育成品種）」１７品種・系統のいちご品種それぞれの葉組織から、ＤＮＡを抽出した。抽出は、各いちご品種のがく、果実、及び成葉から、改変ＣＴＡＢ法又はＮｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＤＮＡ抽出を行った。Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔによる抽出の際には、Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｒｅｓｉｎ処理を３回行った。
【００４８】
改変ＣＴＡＢ法による抽出の場合は、まず、各いちごの葉組織１ｇを液体窒素中で粉砕し、５０ｍｌチューブに移して−８０℃で保存した。これに１０ｍｌの２×ＣＴＡＢ混合液（沸騰直前まで加熱したもの）及び１ｍｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを順次加えて混合し、更に０．２ｍｌ  ２−メルカプトメタノール及び１００ｍｇ  ｐｏｌｙｃｌａｒ  ＶＴ（不溶性）を追加して混合した。尚、混合の際は、ダマができないよう薬さじ等を使ってなくなるまで混合した。
続いて、６０℃、２０ｒｐｍで６０分振とうし、１０ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加して室温、１５分、２０ｒｐｍの条件で振とうし、その後７，０００ｒｐｍ、１５分の条件で遠心する。上清８〜９ｍｌを採取し、これに前記と同様の１０ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加して同様の条件で振とう、遠心した。得られる上澄み８〜９ｍｌに溶液と等量のイソプロパノールを添加し、静かに混合するとＤＮＡが析出したので、ＤＮＡだけをチューブに残して溶液を取り除く。
ＲＮａｓｅの入った１ｍｌのＴＥ−ＮａＣｌを添加し、沈殿が完全に溶けるまで５５℃、１時間処理した。ＤＮＡ溶液を２．０ｍｌチューブに移し、１ｍｌのイソプロパノールを加えて静かに混合した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去して２ｍｌの７０％エタノールを添加して１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。更に、上清を除去して２ｍｌの１００％エタノールを添加して１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。再び、上清を除去してエバポレーターで１０分間乾燥し、５００μＬ  ＴＥ−ＲＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間処理し、４℃で保存した。
【００４９】
Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔによる抽出の場合は、まず、各いちごの組織（未展開葉（幼葉）、成葉、がく、及び実）１００ｍｇを液体窒素中で粉砕し、１．５ｍｌチューブに移して−８０℃で保存した。これに６００ｕｌのｒｅａｇｅｎｔ１（１０ｍｌのβ−メルカプトエタノール含む）及び２００ｕｌのｒｅａｇｅｎｔ２を順次加えて混合し、６５℃、２０ｒｐｍで１０分間振とうし、氷上で１０分間静置した。尚、ｒｅａｇｅｎｔ１及びｒｅａｇｅｎｔ２は、キットに添付の反応液である。
これに５００ｕｌの氷冷クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）と１００ｕｌ  Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｒｅｓｉｎを添加して室温、１０分の条件で緩やかに転倒混和した後１５，０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心した。得られる上清７００ｕｌに同様に氷冷クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）と１００ｕｌ  Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｒｅｓｉｎを添加して転倒混和し、この操作を、試料が未展開葉（幼葉）の場合は２回、成葉、がく、及び実に関しては３回繰り返した。更に上清５００ｕｌを採取し、静かに混合するとＤＮＡが析出するので、１５，０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心した。
上清を除去して１，０００ｕｌの７０％エタノールを添加して転倒混和した。更に、上清を除去して１，０００ｕｌの１００％エタノールを添加して転倒混和した。再び、上清を除去してエバポレーターで１０分間乾燥し、５００μＬ  ＴＥ−ＲＮａｓｅを添加して３７℃で３０分間処理し、４℃で保存した。
【００５０】
次に、ランダムプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの試薬組成は、鋳型ＤＮＡ  ５ｎｇ、ｒＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）１Ｕ、０.５ｕＭ  プライマー、２００ｕＭ  ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲバッファー  計２５ｕｌとした。ランダムプライマーは、４６５種類（和光純薬（１２ｍｅｒ）：３００種類、Ｏｐｅｒｏｎ（１０ｍｅｒ）：１６５種類）を用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃１分→（９４℃１分→４４℃２分→７２℃２分）×４５回→７２℃５分とした。
ＰＣＲ産物を１.５％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、ＵＶ光下でバンドを検出し、明瞭な多型でかつ再現性があるものを選抜した。
これらのバンドを基に、下記の手順でＳＴＳ化を行った。
【００５１】
２．ＳＴＳ化プライマーの作製
上記ＲＡＰＤマーカー検出の際に得られたＰＣＲ産物を、１.５％アガロースで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｔｙｐｅＩ染色を行い、目的するバンドを切り出した。
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＴＡクローニングを行った。
ＰＣＲでインサートをチェック後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミド抽出した。
ＣＥＱ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）でシーケンスを行い、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト）でプライマーを設計後、プライマーを委託合成（Ｅｓｐｅｃｏｌｉｇｏ）した。
この手順により、ＳＴＳ化プライマーとして、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの１３種類の対合プライマーを作成した。
【００５２】
実施例１
「とちおとめ」「とちひめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号」「アスカルビー」「レッドパール」「麗紅」「はるのか」「べにほっぺ」「濃姫」「栃の峰」「久留米４９号」及び「苺香」の１７品種から抽出したＤＮＡを鋳型として、製造例１で得られた各種対合プライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、品種の識別や同定に有用なＳＴＳ化マーカーが検出されるかどうかを確認した。
【００５３】
まず、ＰＣＲを行った。鋳型となるいちご品種のＤＮＡは、製造例１と同様の条件で抽出したものを用いた。ＳＴＳ化プライマーとしては、上記製造例１で得た１３種類の対合プライマーＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１〜１３Ｆ・Ｒを用いた。ここで、対合プライマーのうちＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒは、ポジティブコントロール（配列表の配列番号２７記載の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８記載の塩基配列からなるリバースプライマー）と組み合わせていわゆるマルチプレックスＰＣＲを行ったが、その他の対合プライマー（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３〜１３Ｆ・Ｒ）は、各対合プライマーごとにＰＣＲを行った。
ＰＣＲの試薬組成は、マルチプレックスＰＣＲの場合は表２、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３，５，６，８〜１１Ｆ・Ｒの場合は表３、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４，７Ｆ・Ｒの場合は表４とした。
ＰＣＲの条件は、９５℃５分→（９４℃０.５分→５２〜６７℃（各プライマーの任意アニーリング温度：表５参照）０.５分→７２℃１分）×３５サイクル→７２℃７分とした。尚、各プライマーのアニーリング温度（表５）は、グラジエントＰＣＲ（アニーリング温度：５０℃〜７０℃）により最適な温度を決定した。
【００５４】
【表２】
2006254710.tif 000003
【００５５】
【表３】
2006254710.tif 000004
【００５６】
【表４】
2006254710.tif 000005
【００５７】
【表５】
2006254710.tif 000006
【００５８】
ＰＣＲ産物は、１.５％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、ＵＶ光下でバンドを検出し、ＳＴＳ化マーカーの有無を確認した。
その結果を、図１〜図１２に示す。尚、図１〜図１２中、Ｍは分子量マーカー（２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を示し、１〜１７は、「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」「福岡Ｓ６号」「さがほのか」「苺香」の結果を示す。また、矢印はマーカーの箇所を示し、特に図１中の３つの矢印は、上段からｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールによるマーカー、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒによるマーカー、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒによるマーカーを示す。
【００５９】
これらの結果から、設計した１３個のＳＴＳ化プライマーを用いることにより、１５の多型が得られることが明らかとなった。
まず、図１は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ及びｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールを用いたマルチプレックスＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
図１の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒにより、「とちおとめ」、「とちひめ」、「栃の峰」及び「苺香」（図１において「苺香」のバンドは明確でないが、検出可能である）のバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。一方、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒにより、「とちひめ」「栃の峰」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかった。このことは、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいて、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒではバンドが検出されるがＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒではバンドが検出されないものがあったのは「とちおとめ」のみであることが確認できる。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーを用いることにより、いちご品種「とちおとめ」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６０】
図２及び図３は、それぞれＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
図２及び図３の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒのいずれを用いた場合にも、「とちひめ」のみバンドが検出されなかったのに対し他の品種はいずれもバンドが検出されたことが分かる。すなわち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒのいずれか或いは両方を用いたＰＣＲにおいて、バンドが検出されなかったのは「とちひめ」のＤＮＡのみであることが確認できる。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒ及び／又はＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒを用いることにより、いちご品種「とちひめ」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６１】
図４〜図１２は、それぞれＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いた場合の電気泳動結果を示すものである。
図４の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒを用いた場合「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図５の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒを用いた場合、「女峰」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「レッドパール」「アスカルビー」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図６の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒを用いた場合、「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「紅ほっぺ」「濃姫」「アスカルビー」「あまおう」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
【００６２】
図７の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒを用いた場合、「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図８の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒを用いた場合、「とちおとめ」「女峰」「栃の峰」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「アスカルビー」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図９の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒを用いた場合、「とちひめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「あまおう」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図１０の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒを用いた場合、「とちおとめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
【００６３】
図１１の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒを用いた場合、「とちおとめ」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「あまおう」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されなかったことが分かる。
図１２の結果から、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いた場合、次の４つのマーカーを増幅させることができることが分かる。すなわち、「とちおとめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「あまおう」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカー；「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」「あまおう」「さがほのか」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるマーカー；「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「麗紅」「章姫」「紅ほっぺ」「アスカルビー」及び「苺香」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカー；「とちおとめ」「女峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「はるのか」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「あまおう」及び「さがほのか」のＤＮＡにおいてバンドが検出されるが、他の品種ではバンドが検出されないマーカーである。
【００６４】
これらの結果から総合すると、以下の考察が可能である。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒのいずれを用いたＰＣＲにおいてもバンドが検出されなかったものは、「福岡Ｓ６号」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーを用いることにより、いちご品種「福岡Ｓ６号」（あまおう）の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６５】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒのいずれを用いたＰＣＲにおいてもバンドが検出されたものは、「さちのか」のＤＮＡのみであった。
また、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいてはバンドが検出されなかったが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいてバンドが検出されたものは、「はるのか」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの３組の対合プライマーを用いることにより、いちご品種「さちのか」及び「はるのか」をそれぞれ識別が可能なことが明らかとなった。
【００６６】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいて第２のマーカーのみバンドが検出されたものは、「さちのか」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＳＴＳ化プライマーのうち、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いることにより、いちご品種「とよのか」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６７】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいてはバンドが検出されなかったが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいてはバンドが検出されたというパターンを示したものは「さがほのか」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒの３組を用いることにより、いちご品種「さがほのか」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６８】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいてはバンドが検出されなかったが、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいては第２及び第３のマーカーのバンドが検出されたというパターンを示したものは、「章姫」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの２組の対合プライマーを用いることにより、いちご品種「章姫」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００６９】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲにおいていずれもバンドが検出されたものは、「苺香」のＤＮＡのみであった。
このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒの３組の対合プライマーを用いることにより、いちご品種「苺香」の識別が可能なことが明らかとなった。
【００７０】
更に、プライマー１３組をすべて用いなくとも、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせか、或いはＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせを用いることにより、上記１７品種すべての識別が可能なことが明らかとなった。
そして、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせか、或いはＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒの組み合わせを用いることにより、「とちおとめ」「とよのか」「さちのか」「章姫」「女峰」「さがほのか」「福岡Ｓ６号（あまおう）」「アスカルビー」の８品種の識別が可能なことが明らかとなった。
【００７１】
実施例２
「ＵＣ−５」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、「ＵＣ−１０」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、「ワイルドストロベリー」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、及び「雲南」（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｎｉｌｇｅｌｔｅｎｓｉｓ）の各いちご品種から抽出したＤＮＡを鋳型として、製造例１で得られた対合プライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、各対合プライマーが実施例１で用いた以外の品種の識別にも利用可能かどうかを確認した。
鋳型となるいちご品種のＤＮＡは、製造例１と同様の条件で抽出したものを用いた。実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後、実施例１と同様にしてバンドを検出し、ＳＴＳ化マーカーの有無を確認した。各品種のバンド増幅の有無を表６に示す。
【００７２】
【表６】
2006254710.tif 000007
【００７３】
表６から明らかなように、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８及び１３Ｆ．Ｒを用いた場合に各品種で異なるバンド増幅が認められた。これらの各対合プライマーを用いた場合の泳動結果を、比較のための「とちひめ」「女峰」「とちおとめ」「さちのか」「章姫」及び「とよのか」（いずれもＦｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）について同様の操作を行った結果と共に、図１３〜図２４に示す。尚、図１３〜図２４中、Ｍは分子量マーカー（２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を示し、１〜１０はそれぞれ「ＵＣ−５」「ＵＣ−１０」「ワイルドストロベリー」「雲南」「とちひめ」「女峰」「とちおとめ」「さちのか」「章姫」「とよのか」の結果を示す。矢印はマーカーの位置を示し、特に図１３中の３つの矢印は、上段からｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールによるマーカー、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒによるマーカー、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒによるマーカーを示す。
【００７４】
図１３〜図２４に示すように、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いた場合には、「ＵＣ−５」、「ＵＣ−１０」、及び「ワイルドストロベリー」のＤＮＡにおいてバンドが検出された。このことから、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒ及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒは、「ＵＣ−５」、「ＵＣ−１０」及び「ワイルドストロベリー」を他の品種から識別するためのプライマーセットとして利用することができる可能性があることが分かる。
以上の結果から、本発明のプライマーセットは、多種多様ないちごの品種の識別に用いることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、いちご品種識別用プライマーセットを構成する各対合プライマーを組み合わせることにより、試料中に含まれる特定の、或いは複数のいちごの品種や系統を正確に、迅速かつ効率的に識別することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ及びｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールを用いたマルチプレックスＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図３】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図４】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図５】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図６】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図７】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図８】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図９】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１０】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１１】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１２】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１３】ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒ、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒ及びｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールを用いたマルチプレックスＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１４】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１５】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−４Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１６】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−５Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１７】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−６Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１８】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−７Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図１９】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−８Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２０】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−９Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２１】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１０Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２２】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１１Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２３】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１２Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【図２４】実施例２におけるＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１３Ｆ・Ｒを用いたＰＣＲの電気泳動結果を示すものである。
【符号の説明】
【００７７】
図１〜１２中、Ｍは分子量マーカー（２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を示し、１〜１７は、それぞれ「とちおとめ」「とちひめ」「女峰」「栃の峰」「久留米４９号」「麗紅」「さちのか」「とよのか」「はるのか」「章姫」「紅ほっぺ」「レッドパール」「濃姫」「アスカルビー」「福岡Ｓ６号」「さがほのか」「苺香」の結果を示す。また、矢印はマーカーの箇所を示し、特に図１中の３つの矢印は、上段からｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールによるマーカー、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒによるマーカー、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒによるマーカーを示す。
図１３〜図２４中、Ｍは分子量マーカー（２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を示し、１〜１０はそれぞれ「ＵＣ−５」「ＵＣ−１０」「ワイルドストロベリー」「雲南」「とちひめ」「女峰」「とちおとめ」「さちのか」「章姫」「とよのか」の結果を示す。矢印はマーカーの位置を示し、特に図１３中の３つの矢印は、上段からｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ由来のポジティブコントロールによるマーカー、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ−１Ｆ・Ｒによるマーカー、及びＲＡＰＤ−ＳＴＳ−２Ｆ・Ｒによるマーカーを示す。
【図１】
2006254710.tif 000008
【図２】
2006254710.tif 000009
【図３】
2006254710.tif 000010
【図４】
2006254710.tif 000011
【図５】
2006254710.tif 000012
【図６】
2006254710.tif 000013
【図７】
2006254710.tif 000014
【図８】
2006254710.tif 000015
【図９】
2006254710.tif 000016
【図１０】
2006254710.tif 000017
【図１１】
2006254710.tif 000018
【図１２】
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【図１３】
2006254710.tif 000020
【図１４】
2006254710.tif 000021
【図１５】
2006254710.tif 000022
【図１６】
2006254710.tif 000023
【図１７】
2006254710.tif 000024
【図１８】
2006254710.tif 000025
【図１９】
2006254710.tif 000026
【図２０】
2006254710.tif 000027
【図２１】
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【図２２】
2006254710.tif 000029
【図２３】
2006254710.tif 000030
【図２４】
2006254710.tif 000031
【配列表】
2006254710000001.app