(57)【要約】【課題】  フルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩は、水溶液にすると、不安定で長期の保存ができず、これまで、固体製剤としてのみ開発され販売されていた。臨床の場面で、直ちに投与できる５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を含有する安定した注射用水溶液製剤の開発が望まれていた。【解決手段】  本発明は、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする安定化された注射用水溶液製剤及び５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の安定化方法を提供する。  本発明製剤では、ｐＨ調整剤と抗酸化剤とを併用することにより、優れた保存安定性効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする注射用水溶液製剤。
【請求項２】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の薬理学的に許容される塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の薬理学的に許容される塩が、カルシウム塩である請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
ｐＨ調整剤と抗酸化剤とが配合された請求項１〜３のいずれか一に記載の製剤。
【請求項５】
抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、及びチオグリコール酸またはその塩から選ばれる請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩である請求項４に記載の製剤。
【請求項７】
抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩とその他の抗酸化剤との組み合わせである請求項４に記載の製剤。
【請求項８】
その他の抗酸化剤が、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、及びチオグリコール酸またはその塩から選ばれる請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
抗酸化剤の配合量が、０．００５〜１ｗ/ｖ％である請求項４に記載の製剤。
【請求項１０】
ｐＨ調整剤が、トロメタミンである請求項４に記載の製剤。
【請求項１１】
ｐＨ調整剤の配合量が、０．０１〜１ｗ/ｖ％である請求項４に記載の製剤。
【請求項１２】
水溶液のｐＨ値が、６〜７に調整された請求項１〜１１のいずれか一に記載の製剤。
【請求項１３】
水溶液のｐＨ値が、８．５〜９．０に調整された請求項１〜１１のいずれか一に記載の製剤。
【請求項１４】
包装形態が、以下から選ばれる少なくとも１を採用する請求項１〜１３のいずれか一に記載の製剤：
１）ガラス製またはプラスチック製容器への封入；
２）内容器と外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への封入；
３）容器内が不活性ガスで置換されている容器への封入；
４）ガラス製またはプラスチック製のプレフィルドシリンジへの封入；
５）内容器のプレフィルドシリンジと外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への封入；
６）容器のプレフィルドシリンジ内が不活性ガスで置換されている容器への封入。
【請求項１５】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする水溶液製剤に、抗酸化剤を添加することを特徴とする５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩含有注射用水溶液製剤の安定化方法。
【請求項１６】
さらにｐＨ調整剤を添加する請求項１５に記載の安定化方法。
【請求項１７】
レボホリナートカルシウムを有効成分とし、アスコルビン酸またはその塩とｐＨ調整剤とを含む注射用医薬水溶液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする安定化された注射用水溶液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明で有効成分として使用される５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸は、別名（６Ｓ）−Ｎ−［４−［［（２−アミノ−５−ホルミル−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸として知られる化合物である。
この化合物は、別名、６Ｓ−ホリニン酸（6S-folinic acid）で、還元型葉酸の誘導体であって、胃ガン、結腸・直腸ガンに対するフルオロウラシルの抗腫瘍効果の増強剤としてそのカルシウム塩である、レボホリナートカルシウム（calcium levofolinate）が販売されている〔商品名、アイソボリン（ワイス−武田薬品）〕。５−ホルミル−テトラヒドロ葉酸は、６位の炭素原子の立体配置により、Ｄ体（６Ｒ−体）、Ｌ体（６Ｓ−体）の光学異性体が存在し、薬効的にはＬ体（６Ｓ−体）が活性体として知られるが、ラセミ体もＬ体も既に上市されている〔ラセミ体の商品名：ロイコボリン（ワイス−武田薬品）〕。
ラセミ体は、一般的に安定であるが、Ｌ体は、水溶液中で不安定で加水分解及び酸化分解することが知られている。そのため現在まで上市されているＬ体製剤は凍結乾燥固形製剤である。  
【０００３】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸関連製剤の安定化に関する報告は既に公表されているが、いずれも不満足な結果しか得られていない。
以下に先行技術文献を列挙する。
特許文献１：ロイコボリンの塩、トロメタミン及びモノチオグリセロールからなる注射液として使用する混合物であって、大陽光に対しても長期間安定な製剤を開示する。トロメタミン、即ち（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパネジオール）は緩衝剤、モノチオグリセロールは酸化防止剤として用いられている。しかし、開示されたロイコボリン製剤は、ＤＬ混合型のラセミ体であり、その性状は、Ｌ体とは全く異なるものである。
非特許文献１：ロイコボリンは、還元型葉酸製剤であり、中性または弱アルカリｐＨでより安定であることが開示されている。レボホリナートカルシウムは、Ｌ型であり、（６Ｓ）−ホリナートカルシウムであることが開示されている。
特許文献２：５−ホルミル−テトラヒドロホレートカルシウムの(６Ｓ)−ジアステレオマーの９５重量％以上と５−ホルミル−テトラヒドロホレートカルシウムの(６Ｒ)−ジアステレオマーの５重量％以下との混合物を２００〜２０００ｍｇ及びヒト治療用アクセプタブル担体からなる組成物（ラセミ体）が開示されている。
特許文献３：５−ホルミル−(６Ｓ)−テトラヒドロ葉酸、食品製剤または必須栄養素製剤を含む組成物が開示されている。
特許文献４：５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸−シクロデキストリン−包接化合物が開示されている。
特許文献５：安定な結晶性テトラヒドロ葉酸またはその塩が開示されている。
特許文献６：冷蔵庫温度で安定なホリニン酸水溶液及びその製造法が開示されている。
特許文献７：葉酸誘導体の安定化方法が開示されている。
【特許文献１】特開平３−９００２６号公報（特許第３０４３３８１号）
【特許文献２】特開平１１−１０６３４２号公報
【特許文献３】特表２０００−５０５２８６号公報
【特許文献４】特開平７−１８０８４号公報（特許第２６６７３５４号）
【特許文献５】特開平９−１６９７５９号公報（特許第３３８２１０３号）
【特許文献６】特開平３−５６４１８号公報（特許第２９４５７１８号）
【特許文献７】特開昭５８−０２７０６３号公報（特公平２−２２９０９号）
【非特許文献１】The Merck Index, 13th Edition, 4248  (2001年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
胃ガン、結腸・直腸ガンに対するフルオロウラシルの抗腫瘍効果を増強する、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩は、水溶液にすると、不安定で長期の保存ができなかった。そのため、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の製剤は、固体製剤としてのみ開発され販売されていた。臨床の場面で、直ちに投与できる５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を含有する安定した注射用水溶液製剤の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記事情を考慮して、種々検討していたところ、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする水溶液製剤中に、ｐＨ調整剤と抗酸化剤を添加することにより、保存安定性が極めて向上した水溶液製剤が得られることを見いだした。さらに５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を含有する水溶液製剤には、安定である選択的ｐＨ値領域が存在することを見いだし、加えて水溶液製剤の包装形態を工夫することにより、一層安定な５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩含有水溶液製剤を製造することに成功した。これらの知見に基づき、さらに検討を続けた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
１．５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする注射用水溶液製剤、
２．５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の薬理学的に許容される塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である前項１に記載の製剤、
３．５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の薬理学的に許容される塩が、カルシウム塩である前項１または２に記載の製剤、
４．ｐＨ調整剤と抗酸化剤とが配合された前項１〜３のいずれか一に記載の製剤、
５．抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、及びチオグリコール酸またはその塩から選ばれる前項４に記載の製剤、
６．抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩である前項４に記載の製剤、
７．抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩とその他の抗酸化剤との組み合わせである前項４に記載の製剤、
８．その他の抗酸化剤が、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、及びチオグリコール酸またはその塩から選ばれる前項７に記載の製剤、
９．抗酸化剤の配合量が、０．００５〜１ｗ/ｖ％である前項４に記載の製剤、
１０．ｐＨ調整剤が、トロメタミンである前項４に記載の製剤、
１１．ｐＨ調整剤の配合量が、０．０１〜１ｗ/ｖ％である前項４に記載の製剤、
１２．水溶液のｐＨ値が、６〜７に調整された前項１〜１１のいずれか一に記載の製剤、
１３．水溶液のｐＨ値が、８．５〜９．０に調整された前項１〜１１のいずれか一に記載の製剤、
１４．包装形態が、以下から選ばれる少なくとも１を採用する前項１〜１３のいずれか一に記載の製剤：
１）ガラス製またはプラスチック製容器への封入；
２）内容器と外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への封入；
３）容器内が不活性ガスで置換されている容器への封入；
４）ガラス製またはプラスチック製のプレフィルドシリンジへの封入；
５）内容器のプレフィルドシリンジと外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への封入；
６）容器のプレフィルドシリンジ内が不活性ガスで置換されている容器への封入、
１５．５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする水溶液製剤に、抗酸化剤を添加することを特徴とする５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩含有注射用水溶液製剤の安定化方法、
１６．さらにｐＨ調整剤を添加する前項１５に記載の安定化方法、及び
１７．レボホリナートカルシウムを有効成分とし、アスコルビン酸またはその塩とｐＨ調整剤とを含む注射用医薬水溶液製剤に関する。
【発明の効果】
【０００７】
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする注射用水溶液製剤（以下、本発明製剤と略記することがある）は、保存安定性が極めて優れ、臨床に用いる際にも、時間をかけてあらためて固形製剤を溶解する必要がなく、患者に直ちに投与でき、或いは希釈液で適当な濃度に希釈するだけで投与が可能となる。また保存時の水溶液のｐＨ値の低下と透過度の低下が抑制される。これらの性質は、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の有用性をより一層高めるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明製剤において有効成分として使用される５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸は、本発明ではその薬理学的に許容される塩の形態で使用することが好ましい。そのような塩は、慣用の無毒性の塩であって、塩基との塩、例えば無機塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩等）などを挙げることができる。特に好ましくは、カルシウム塩である。またこれらの薬理学的に許容される塩には、無水物である無水塩、水和物である含水塩をともに包含する。本発明製剤の有効成分である５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸は、Ｌ体の光学活性化合物である。これはまた（６Ｓ）体とも呼ばれる。本発明製剤では、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の含量は通常０．０１〜５ｗ/ｖ％が用いられる。
【０００９】
本発明製剤は、好適にはｐＨ調整剤と抗酸化剤とが配合される。ｐＨ調整剤や抗酸化剤は、公知の物質であり、広く公知のｐＨ調整剤と抗酸化剤が利用できる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、塩基性化物質、緩衝化物質等が用いられる。塩基性化物質としては、無機塩基、有機塩基、塩基性の有機酸、金属酸化物などが用いられる。無機塩基としては、アルカリ金属の水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、アルカリ土類金属の水酸化物（例、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等）が例示される。有機塩基としては、トロメタミン（トロメタモール）、コハク酸アミド、アダマンチルアミン、Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、Ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等が例示される。塩基性の有機酸としては、塩基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等）並びに、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸、３−〔シクロヘキシルアミノ〕−１−プロパンスルホン酸、２−〔シクロヘキシルアミノ〕−１−プロパンスルホン酸または２−〔シクロヘキシルアミノ〕−１−エタンスルホン酸のアルカリ金属塩等が例示される。金属酸化物としては、酸化マグネシウム、酸化アルミニウムが例示される。
緩衝化物質としては、例えば、無機酸の塩、有機酸の塩、有機塩基の塩、アミノ酸等が用いられる。
無機酸の塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、第二リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等が例示される。
有機酸の塩としては、酢酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ラウリル硫酸等のカリウム塩やナトリウム塩が例示される。有機塩基の塩としては、アミノグアニジン、グアニジン、アダマンチルアミン、Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の炭酸塩や炭酸水素塩等が例示される。アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、セリン、トレオニン等が例示される。
ｐＨ調整剤としてはグリシン、トロメタミンが好ましく、このうちトロメタミンが特に好ましい。
ｐＨ調整剤の添加量は、目的とするｐＨ値とその溶液量によって決定される。本発明の水溶液製剤は、ｐＨ５．５〜７．５またはｐＨ８．３〜９．０、好ましくはｐＨ６.０〜７．０またはｐＨ８．５〜９．０、より好ましくはｐＨ６．０〜７．０であり、ｐＨ調整剤は０．０１〜１ｗ/ｖ％、好ましくは０．０２〜０．５ｗ/ｖ％になるように配合する。溶液のｐＨ値は、酸（例えば塩酸）及び塩基（例えば水酸化ナトリウム水溶液）を適宜用いて調節することが可能である。
【００１０】
抗酸化剤としては、アスコルビン酸またはその塩、ピロ亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリセロール、チオグリコール酸またはその塩、及び亜硫酸ナトリウム等が例示され、好適には、アスコルビン酸またはその塩が用いられ、その塩としてはその薬学的に許容される塩が例示される。最も好ましくは、アスコルビン酸またはそのナトリウム塩が用いられる。抗酸化剤は、例えばアスコルビン酸またはその塩を単独で用いてもよいが、アスコルビン酸またはその塩とその他の抗酸化剤との組み合わせで用いるのがより好ましい。好ましい具体例としては、アスコルビン酸とピロ亜硫酸ナトリウムの組み合わせが挙げられる。抗酸化剤は、０．００５〜１ｗ/ｖ％、好ましくは０．０１〜０．５ｗ/ｖ％になるように配合する。
【００１１】
本発明製剤は、さらに糖類を含有していてもよい。糖類としては、単糖類（例、グルコース、ガラクトース、リボース、キシロース、マンノース、マルトトリオース、マルトテトラオース等）、二糖類（例、蔗糖、乳糖、セロビオース、麦芽糖等）、三糖類（例、ラフィノース）、糖アルコール（例、ソルビトール、イノシトール、マンニトール等）、多糖類（例、デキストラン、コントロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸デキストリン等）、及びその塩、環状糖類（例、シクロデキストリン等）等が例示される。本発明製剤は、さらに必要に応じて、等張化剤（例、グルコース、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール等）、無痛化剤（例、グルコース、ベンジルアルコール、塩酸メピバカイン、塩酸キシロカイン、塩酸プロカイン、塩酸カルボカイン、グリセリン、プロピレングリコール、塩酸リドカイン等）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラオキシ安息香酸エステル、チメロサール、クロロブタノール、ベンジルアルコール等）等を用いることができる。これらの添加量は、当業者が公知の技術に従って容易に設定することができる。
【００１２】
本発明製剤は、さらに所望により光安定化剤を添加してもよい。薬理学的に許容される光安定化剤は、広く利用できるが、糖類として、例えば、グルコース、ショ糖、フラクトース、マルトース等、糖アルコール類として、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等、多価アルコール類として、例えば、グリセリン、プロピレングリコール等を挙げることができる。その他ベンゾトリアゾール誘導体、ベンゾフェノン誘導体、サリチル酸誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、桂皮酸誘導体、ウロカニン酸誘導体、リボフラビン、葉酸等も好適な光安定化剤である。本発明製剤には、これらの光安定化剤の一種または二種以上を配合することができる。その添加量は、０．０１〜１ｗ/ｖ％、好ましくは０．０５〜０．１ｗ/ｖ％である。  
【００１３】
本発明製剤において、最も望ましくは、水溶液のｐＨ値が６〜７、抗酸化剤がアスコルビン酸とピロ亜硫酸ナトリウムの組み合わせ、抗酸化剤の濃度が０．１〜０．３ｗ/ｖ％である。但し、ピロ亜硫酸ナトリウムの濃度が０．２％以上になると、沈殿物が生じてくる。この注射用水溶液製剤をシリンジ等の容器に充填し、この容器（内容器）と外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態で保存するのが最も望ましい。
本発明製剤は、４０℃/４ヶ月間保存（２５℃/２年保存に相当）しても、有効成分である５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウムの含量は９０％以上あり、医薬として十分に使用できるものである。
５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウムの水溶液は、最初にｐＨ６．０〜７．０に調整しても、保存状態で溶液のｐＨ値がしだいに酸性側に移行していく。アスコルビン酸単独でも、この酸性側への移行を抑制することができるが、アスコルビン酸とピロ亜硫酸ナトリウムの組み合わせを用いると、溶液のｐＨ値の低下を一段と抑制することができる。
さらに５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウムの水溶液の透過度は、保存状態で低下し、着色していくが、アスコルビン酸はこの透過度の低下を抑制することができる。アスコルビン酸とピロ亜硫酸ナトリウムの組み合わせを用いるとこの透過度の低下をさらに抑制することができる。  
これらの抑制効果は、ピロ亜硫酸ナトリウムがアスコルビン酸の安定化に寄与し、これによりアスコルビン酸が長期間にわたって５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム溶液に存在することによって得られる。
内容器と外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態で保存すると、本発明製剤の透過度の低下をさらに一段と抑制することができる。
【００１４】
本発明製剤は、必要に応じて、他の薬物（例、５−フルオロウラシル、ウラシル、マイトマイシン等の抗悪性腫瘍剤等）を含有していてもよく、また他の薬物を別に包装し、本発明製剤とキット製品としてもよい。
本明細書にて注射用水溶液製剤とは、最終形態での注射剤に限らず、用時に溶解液（希釈液）を用いて最終注射液に調製することができる注射液前駆体〔例えば、液状注射剤（濃厚または濃厚注射剤）〕製剤をも含む意味に用いる。
本発明製剤は、自体公知の方法により製造することができる。例えば、塩化ナトリウム、トロメタミン、アスコルビン酸、レボホリナートカルシウムを含む水溶液のｐＨ値を所定の値に調整後、所定のレボホリナートカルシウム濃度に希釈する。その後無菌条件下にて除菌ろ過し、アンプル、バイアル、シリンジ（プレフィルドシリンジ）等の容器に充填し、密封することにより製造することができる。
【００１５】
本発明製剤は、その一層の保存安定性の確保のために包装形態が、以下から選ばれる少なくとも１を採用する；
１）ガラス製またはプラスチック製容器への本発明製剤の封入
これは、保存期間中の容器壁を通じての空気の混入を排除し、空気（酸素）による５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の分解を最小限にするためである。ガラスまたはプラスチックの材質は、空気透過性が排除されたものであれば広く公知の材質が使用できる。プラスチック材質の場合は、空気の透過性の完全排除は困難な場合もあり、以下の他の手段２）、３）とプラスチック容器との併用が好ましい。
２）内容器と外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間の空間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への本発明製剤の封入
これは容器自体の空気不透過性が完全でなくとも２重袋とすることで、一層の空気不透過性を達成し、加えて内容器と外袋からなる２重包装の中空に脱酸素剤〔エージレス、商品名、三菱ガス化学（株）等〕を装填することで空気（酸素）の容器内への通過を防ぐものである。
脱酸素剤としては、例えば、鉄系脱酸素剤：エージレスＺＨ（商品名）、エージレスＺＰ−５０（商品名）、有機化合物系脱酸素剤：エージレスＧ（商品名）、エージレスＧＬ（商品名）〔以上三菱ガス化学(株)製〕、カテコール系脱酸素剤：タモツＡ（商品名）、タモツＤ（商品名）〔以上王子タック(株)製〕等が用いられる。
内容器には、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、エチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）等のプラスチック容器を使い、内容器内と外袋の間の空気の移動を可能とし、外袋には一層空気不透過性の高い材質、例えば密度の高い材質あるいは金属材質等を用いる。
３）容器内が不活性ガスで置換されている容器への本発明製剤の封入
本発明製剤が封入される容器内が空気でなく、窒素等の不活性ガスで置換されていることによって、空気中の酸素による分解が防止可能である。
４）ガラス製またはプラスチック製のプレフィルドシリンジへの封入
注射器機能を担持し、また水溶液保持機能をもつ、いわゆるプレフィルドシリンジ内に本発明製剤が封入されうる。プラスチック材質の場合、上記１）と同様、以下の手段５）、６）との併用が好ましい。
５）内容器のプレフィルドシリンジと外袋からなる２重包装で、内容器と外袋の間に脱酸素剤を装填した包装形態からなる内容器への封入
６）容器のプレフィルドシリンジ内が不活性ガスで置換されている容器への封入。
【００１６】
本発明製剤の投与方法は、非経口投与、特に静脈投与が一般的である。また、その投与量は、従前公知の用法・用量に準じて決定できる。注射剤としての手技を例示すれば、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩を含有する製剤（例えば５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を１０〜１００ｍｇ、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を５〜１００ｍｇ、ｐＨ調整剤、例えばトロメタミンを１０〜５０ｍｇ含有する２〜３０ｍＬの液状製剤）を、必要に応じて生理食塩水または５％ブドウ糖液または電解質維持液などの溶液で希釈し、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸として０．０１〜０．１ｗ/ｖ％含有する溶液を点滴静注する。その際、１分間に体重１ｋｇあたり０．５〜３０μｇの点滴速度で投与する。投与は、フルオロウラシル療法の抗腫瘍効果増強作用のためにはフルオロウラシル剤の投与と同時に一日１〜３回行う。
【実施例】
【００１７】
以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なおＲＨは、相対湿度（％）を示す。
【００１８】
実施例１  抗酸化剤の安定化効果
（１）アスコルビン酸含有製剤
塩化ナトリウム０．２２４ｇ及びレボホリナートカルシウム０．５５０ｇに注射用水２５ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し、窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、トロメタミン０．１２ｇ及びアスコルビン酸０．０４ｇを加えた後、注射用水を加えて全量を３０ｍｌとした。この溶液に５％（重量／容量％、以下同様）塩酸を少しずつ滴下してｐＨ値を８．１に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
（２）ピロ亜硫酸ナトリウム含有製剤
塩化ナトリウム０．２２４ｇ及びレボホリナートカルシウム０．５５０ｇに注射用水２５ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し、窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、トロメタミン０．１２ｇ及びピロ亜硫酸ナトリウム０．００８ｇを加えた後、注射用水を加えて全量を３０ｍｌとした。この溶液に５％塩酸を少しずつ滴下してｐＨ値を８．１に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
（３）チオグリセロール含有製剤
塩化ナトリウム０．２２４ｇ及びレボホリナートカルシウム０．５５０ｇに注射用水２５ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し、窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、トロメタミン０．１２ｇ及びチオグリセロール０．０８ｇを加えた後、注射用水を加えて全量を３０ｍｌとした。この溶液に５％塩酸を少しずつ滴下してｐＨ値を８．１に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
（４）塩酸システイン含有製剤
塩化ナトリウム０．４４８ｇ及びレボホリナートカルシウム１．１００ｇに注射用水５０ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し、窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、トロメタミン０．２４ｇを加えた後、注射用水を加えて全量を６０ｍｌとした。この溶液３０ｍｌをとり、塩酸システイン０．０９ｇを加え、５％塩酸を少しずつ滴下してｐＨ値を８．１に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
（５）チオグリコール酸含有製剤
上記（４）の操作において、塩酸システイン０．０９ｇの代わりにチオグリコール酸０．０９ｇを加え、５％塩酸の代わりに１％水酸化ナトリウム溶液を用いた。
（６）亜硫酸水素ナトリウム含有製剤
塩化ナトリウム０．２２４ｇ及びレボホリナートカルシウム０．５５０ｇに注射用水２５ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し、窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、グリシン０．１８ｇを加えた後、５％塩酸でｐＨ値を７．０に調整し、ついで亜硫酸水素ナトリウム０．００８ｇを加えた後、注射用水を加えて全量を３０ｍｌとした。この溶液に１％水酸化ナトリウム溶液を少しずつ滴下してｐＨ値を７．０に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
（７）亜硫酸ナトリウム含有製剤
塩化ナトリウム０．２２４ｇ及びレボホリナートカルシウム０．５５０ｇに注射用水２５ｍｌを加え、加温（４５〜５０℃）溶解し，窒素ガスをバブリングしながら撹拌下、トロメタミン０．１２ｇ及び亜硫酸ナトリウム０．０１２ｇを加え、注射用水を加えて３０ｍｌとした。この溶液に５％塩酸を少しずつ滴下してｐＨ値を７．０に調整し、ついで注射用水を加えて全量を４０ｍｌとした。
【００１９】
上記（１）〜（７）で調製された水溶液製剤をそれぞれろ過フィルター（孔径０．２μｍ、ミリポア（株）製、以下同様）でろ過した後、窒素ガスで置換した５ｍｌガラスアンプルに溶液の５ｍｌずつ充填、溶封して注射用水溶液アンプルを製造した。
【００２０】
安定性評価試験
上記水溶液製剤（１）〜（３）について、６０℃／３週間の安定性評価試験を行った。
水溶液中に残存するレボホリナートカルシウム含量は、高速液体クロマトグラフ法を用いて下記条件（以下の実験においても同様）にて測定した。
供試製剤の２ｍｌを量り取り、これに下記に記載の内標準溶液（以下の実験においても同様）１０ｍｌを加え、ついで水を加えて全量を５０ｍｌとし試料溶液とした。別にレボホリナートカルシウム６２．５ｍｇを水に溶かして全量を２５ｍｌとした。この溶液１０ｍｌに内標準溶液１０ｍｌを加えた後、水で全量を５０ｍｌとし、標準溶液とした。標準溶液及び試料溶液２０μｌにつき、次の条件で液体クロマトグラフ法によりレボホリナートカルシウム含量の測定を行った。
１）測定条件
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２５４ｎｍ）
カラム：内径４．０ｍｍ，長さ１５ｃｍのステンレス管に５μｍの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した。
カラム温度：４５℃付近の一定温度
移動相：０．００８ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム水溶液 / メタノール /
４０％テトラブチルアンモンニウムヒドロキシド水溶液の混合液〔385 : 110 : 1.3（容量比）〕にリン酸を加えてｐＨ値を７．５に調節した。 
流量：レボホリナートカルシウムの保持時間が約１０分になるように調整した。
内標準溶液：パラオキシ安息香酸メチル０．０４ｇに水を加えて全量を１００ｍｌとした溶液。
２）結果
結果を表１−１に示す。表１−１は、レボホリナートカルシウムの初期値（製剤製造直後）を１００としたときの変異を示したものである。抗酸化剤の添加で安定化効果が確認されたが、特にアスコルビン酸の添加の場合に極めて優れた安定化効果が確認された。
各抗酸化剤による安定化効果を高速液体クロマトグラフ法で分析したが、各安定化剤の安定化効果には、有意な特異性が確認された。
【００２１】
【表１−１】
2006111614.tif 000002
【００２２】
上記水溶液製剤（４）〜（７）について６０℃／２週間の安定性評価試験を上記と同様に行った。結果を表１−２に示す。各抗酸化剤による安定化効果を高速液体クロマトグラフ法で分析したが、各安定化剤の安定化効果には、有意な特異性が確認された。
【００２３】
【表１−２】
2006111614.tif 000003
【００２４】
実施例２  ｐＨ値の影響の検討
注射用水約８０ｍｌをビーカー（容量２００ｍｌ）にとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム０．５６ｇ、トロメタミン０．３ｇ及びアスコルビン酸０．５ｇを加えて撹拌溶解させた。ついでレボホリナートカルシウム１．３７５ｇ（５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸として１．１ｇ）を加え、加温（４５−５０℃）撹拌溶解後、５％塩酸を少しずつ滴下して溶液のｐＨ値を５．０に調整した。
５％塩酸の代わりに１％水酸化ナトリウム溶液を用いること以外、上記と同様な操作を行い、溶液のｐＨ値をそれぞれ６．０、７．０、８．０及び９．０に調整した溶液を製造した。それぞれの溶液に注射用水をさらに加えて全量を１００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。窒素ガスで置換した５ｍｌガラスアンプルに得られた注射用溶液の５ｍｌを充填して、溶封した。
【００２５】
このようにして調製された各水溶液製剤の６０℃での安定性評価試験を行い、残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定した。
表２は、レボホリナートカルシウムの初期値を１００としたときの変異を示したものである。ｐＨ６．０〜７．０前後の場合に極めて優れた安定化効果が確認された。
【００２６】
【表２】
2006111614.tif 000004
【００２７】
実施例３  ｐＨの影響の検討
注射用水約８０ｍｌをビーカー（容量２００ｍｌ）にとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム０．５６ｇ、トロメタミン０．３ｇを加えて加温（４５−５０℃）撹拌溶解させた。ついでレボホリナートカルシウム１．３７５ｇ（５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸として１．１ｇ）を加え、撹拌溶解後、５％塩酸を少しずつ滴下して溶液のｐＨ値を６．０に調整した。上記と同様な操作を行い、溶液のｐＨ値をそれぞれ７．０、７．５、７．９、８．１、８．３、８．７、９．０、９．２及び９．５（５％塩酸の代わりに１％水酸化ナトリウム水溶液を使用）に調整した溶液を製造した。
それぞれの溶液に注射用水をさらに加えて全量を１００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。窒素ガスで置換した５ｍｌガラスアンプルに得られた注射用溶液の５ｍｌを充填して、溶封した。
【００２８】
このようにして調製された、各水溶液製剤の６０℃での安定性評価試験を行い、残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定した。表３は、レボホリナートカルシウムの初期値を１００としたときの変異を示したものである。ｐＨ６．０〜７．０、及びｐＨ８．７〜ｐＨ９．０前後の場合に極めて優れた安定化効果が確認された。
【００２９】
【表３】
2006111614.tif 000005
【００３０】
実施例４  アスコルビン酸添加量の検討
注射用水約８０ｍｌをビーカー（容量２００ｍｌ）にとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム０．５６ｇ、トロメタミン０．３ｇ及びレボホリナートカルシウム１．３７５ｇ（５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸として１．１ｇ）を加え、撹拌溶解させた（本操作を５回行った）。ついで、それぞれの溶液にアスコルビン酸０（無添加）、０．０５ｇ、０．１ｇ、０．３ｇ、０．５ｇ、及び１．０ｇを加えて撹拌溶解させ、６種の溶液を製造した。アスコルビン酸添加量０（無添加）、０．０５ｇ、及び０．１ｇの場合、５％塩酸を、アスコルビン酸添加量０．３ｇ、０．５ｇ、及び１．０ｇの場合、１％水酸化ナトリウム水溶液を少しずつ滴下して溶液のｐＨ値を８．１に調整した。溶液に注射用水をさらに加えて全量を１００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。窒素ガスで置換した５ｍｌガラスアンプルに得られた注射用溶液の５ｍｌを充填して、溶封した。
このようにして調製された、各水溶液製剤の６０℃での安定性評価試験を行い、残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定した。表４は、レボホリナートカルシウムの初期値を１００としたときの変異を示したものである。
【００３１】
【表４】
2006111614.tif 000006
【００３２】
実施例５  アスコルビン酸添加量の検討
注射用水約８０ｍｌをビーカー（容量２００ｍｌ）にとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム０．５６ｇ、トロメタミン０．３ｇ及びレボホリナートカルシウム１．３７５ｇ（５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸として１．１ｇ）を加え、撹拌溶解させた（本操作を５回行った）。ついで、それぞれの溶液にアスコルビン酸０．０５ｇ、０．０７５ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ及び０．３ｇを加えて撹拌溶解させ、５種の溶液を製造した。アスコルビン酸添加量０．０５ｇ、０．０７５ｇ、及び０．１ｇの場合、５％塩酸を、アスコルビン酸添加量０．２ｇ、及び０．３ｇの場合、１％水酸化ナトリウム水溶液を少しずつ滴下してそれぞれの溶液のｐＨ値を８．７に調整した。溶液に注射用水をさらに加えて全量を１００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。窒素ガスで置換した５ｍｌガラスアンプルに得られた注射用溶液の５ｍｌを充填して、溶封した。
このようにして調製された、各水溶液製剤の６０℃での安定性評価試験を行い、残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定した。表５は、レボホリナートカルシウムの初期値を１００としたときの変異を示したものである。
【００３３】
【表５】
2006111614.tif 000007
【００３４】
実施例６  複数抗酸化剤の添加
注射用水約１１００ｍｌをビーカーにとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム８．０４ｇ、トロメタミン３．６ｇ、アスコルビン酸３．６ｇ及びピロ亜硫酸ナトリウム１．２ｇを加え、撹拌溶解させた。得られた溶液にレボホリナートカルシウム１５．６２ｇを加え、撹拌溶解させた。５％塩酸を少しずつ滴下して溶液のｐＨ値を６．２に調整した。注射用水をさらに加えて全量を１２００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。得られた注射用溶液の５ｍｌを窒素ガスで置換したポリプロピレン製シリンジ（容量５ｍｌ）に充填した後、１０５℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行った。この滅菌されたシリンジを脱酸素剤、エージレスＺＰ−５０〔商品名、三菱ガス化学(株)製〕とともにバリア性プラスチックフィルムで包装した。
このようにして製造された水溶液製剤の安定性評価試験（６０℃及び４０℃／７５％ＲＨ）を行い、一定期間保存後に残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定し、結果を表６に示した。
表６には、レボホリナートカルシウムの初期値を１００とした時のレボホリナートカルシウムの残存率（％）を示す。
【００３５】
【表６】
2006111614.tif 000008
【００３６】
実施例７  アスコルビン酸０．１％添加
注射用水約１１００ｍｌをビーカーにとり、窒素ガスをバブリングしながら、塩化ナトリウム８．０４ｇ、トロメタミン３．６ｇ、及びアスコルビン酸１．２ｇを加え、撹拌溶解させた。得られた溶液にレボホリナートカルシウム１５．６２ｇを加え、撹拌溶解させた。５％塩酸を少しずつ滴下して溶液のｐＨ値を６．２に調整した。注射用水をさらに加えて全量を１２００ｍｌとした後、窒素ガスのバブリングをやめ、溶液をろ過フィルターでろ過して注射用溶液を得た。得られた注射用溶液の５ｍｌを窒素ガスで置換したポリプロピレン製シリンジ（容量５ｍｌ）に充填した後、１０５℃で３０分間高圧蒸気滅菌を行った。この滅菌されたシリンジを脱酸素剤、エージレスＺＰ−５０〔商品名、三菱ガス化学(株)製〕とともにバリア性プラスチックフィルムで包装した．
このようにして製造された水溶液製剤の安定性評価試験（６０℃及び４０℃／７５％ＲＨ）を行い、一定期間保存後に残存するレボホリナートカルシウム含量を高速液体クロマトグラフ法で測定し、結果を表７に示した。
表７には、レボホリナートカルシウムの初期値を１００とした時のレボホリナートカルシウムの残存率（％）を示す。
【００３７】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の注射用水溶液製剤は、極めて安定な製剤であり長期間保存することができる。
本発明製剤は５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸またはその薬理学的に許容される塩の新たな産業上の利用可能性を提供するものである。