(57)【要約】【課題】ホルモン様活性を有した微量化学物質である被検知物質を抗原抗体反応や培養細胞を利用することなく簡便な構成で簡単に検知することができ、特異的かつ迅速簡単に検知する方法を提供することを目的とする。【解決手段】認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させることで、被検知物質４が受容体２と結合することによって受容体２が認識配列１５に結合し、受容体２に結合する酵素５がＤＮＡ３を加水分解する。固相面６上のＤＮＡ３を検知することで、加水分解されるＤＮＡ３量を検知することができ、ＤＮＡ３の加水分解を指標にして、被検知物質４の存在を検知することができ、簡便な構成で簡単迅速に微量化学物質である被検知物質４を検知することのできる検知方法が得られる。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体に結合する被検知物質を検知する方法であって、検体中に受容体とＤＮＡを混合しＤＮＡが分解されることを検知することによって検体中の被検知物質の存在を検知することを特徴とした微量化学物質の検知方法。
【請求項２】
被検知物質と結合することによってＤＮＡへの結合し易さを変化させる受容体と前記受容体に結合する分解活性を持った酵素と前記酵素に切断されるＤＮＡを検体中に混合し、前記ＤＮＡの分解を検知することを特徴とした請求項１に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項３】
ＤＮＡが固相面に固定化されており、酵素によって分解されたＤＮＡが固相面から遊離することを利用し、分解されるＤＮＡを検知することを特徴とした請求項１〜２のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項４】
固相面上に固定化されたＤＮＡの量が減少することを指標にＤＮＡが分解されることを検知することを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項５】
固相面上のＤＮＡを検知し易くするための信号物質をＤＮＡに結合してあることを特徴とし、信号物質の減少を指標にして固相面上のＤＮＡが分解されることを検知する請求項４に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項６】
ＤＮＡに結合した信号物質が蛍光色素であることを特徴とし、固相面上の蛍光強度の減少を指標にして固相面上のＤＮＡが分解されることを検知する請求項５に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項７】
信号物質が色素化合物であることを特徴とし、固相面上の色素の減少を指標にして固相面上のＤＮＡが分解されることを検知する請求項５に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項８】
信号物質が磁化特性をもつことを特徴とし、固相面上の磁化特性の変化を指標にして固相面上のＤＮＡが分解されることを検知する請求項５に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項９】
信号物質が酸化還元電位を発生させる物質であることを特徴とし、固相面上の酸化還元電流の減少を指標にして固相面上のＤＮＡが分解されることを検知する請求項５に記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１０】
受容体に認識される認識配列がＤＮＡの分子内にあり、受容体がＤＮＡ上の認識配列に特異的に結合する配列特異性を持つことを特徴とし、受容体に被検知物質が結合することによって認識配列近傍のＤＮＡが酵素によって分解される請求項１〜９のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１１】
受容体に認識される認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面と、認識配列を持たないＤＮＡを固定化した固相面に受容体と酵素と被検知物質の混合物を反応させることを特徴とし、認識配列をもつＤＮＡを固定化した前記固相面上のＤＮＡの量と認識配列を持たないＤＮＡを固定化した前記固相面上のＤＮＡの量を比較することで、認識配列特異的にＤＮＡが分解されることを検知請求項１〜１０のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１２】
受容体に認識される認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面と、前記認識配列とは異なる認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面、あるいはさらに異なる認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した複数の固相面に、それぞれの異なる認識配列に特異的に結合する複数の受容体と酵素と被検知物質の混合物を反応させることを特徴とし、それぞれ異なる受容体に結合する複数の被検知物質を同時に検知する請求項１〜１１のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１３】
ＤＮＡを固定化した固相面上に受容体と酵素と被検知物質の混合物を流動させ、連続的に被検知物質を検知することを特徴とした請求項１〜１２のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１４】
被検知物質と結合する受容体がホルモンレセプターである事を特徴とした請求項１〜１３のいずれかに記載の被検知物質の検知方法。
【請求項１５】
被検知物質が内分泌撹乱物質であることを特徴とした請求項１〜１４のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１６】
加水分解活性を持った酵素が加水分解活性を持った希土類を結合した高分子で構成されていることを特徴とした請求項１〜１５のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１７】
加水分解活性を持った酵素が加水分解活性を持ったキレート化合物を結合した高分子で構成されていることを特徴とした請求項１〜１５のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１８】
加水分解活性を持った酵素がヌクレアーゼ活性を持ったタンパク質であることを特徴とした請求項１〜１５のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【請求項１９】
加水分解活性を持った酵素がヌクレアーゼ活性を持ったＲＮＡで構成されていることを特徴とした請求項１〜１５のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いてホルモンレセプターに結合しそのホルモン作用を撹乱する微量化学物質の存在を検知する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種のレセプターへの結合能を指標とした微量化学物質検知方法は、被検知物質と競合的にホルモンレセプターへ結合するリガンドを用い、被検知物質との競合の結果ホルモンレセプターと結合していないで遊離状態をとっているリガンド量を抗原抗体反応にて検知し、被検知物質の存在を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
以下、その微量化学物質検知方法について図２０を参照しながら説明する。
【０００４】
図２０Ａ）に示すように、既知濃度のレセプター１０１に対し、既知濃度の該レセプター１０１に対するリガンド１０２と測定対象物質１０３とを競合的に溶液中において反応させ、次に図２０Ｂ）に示すように、該溶液中における未結合状態のリガンド１０２の量をリガンド１０２に対するモノクローナル抗体１０４あるいはポリクローナル抗体１０５を用いて抗原抗体反応を利用して検知する。レセプター１０１に未結合状態のリガンド１０２を検知することで測定対象物質１０３のレセプター１０１への結合能すなわち、測定対象物質１０３の存在を検知することができる。
【０００５】
また、この種の微量化学物質検知方法には、生細胞を利用し、ホルモン様活性を示す被検知物質の存在をレポータージーンアッセイで検知しているものもある（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
以下、その微量化学物質検知方法について図１８を参照しながら説明する。
【０００７】
図２１に示すように、ホルモン様物質が結合するレセプター１０１を有し、レセプターが認識する反応配列１０６の下流にレポーター遺伝子１０７を組み込んだＤＮＡを導入した培養細胞１０８に、測定対象物質１０３を反応させることによって、測定対象物質１０３と結合したレセプター１０１が反応配列１０６に結合しレポーター遺伝子１０７を発現させレポーター遺伝子産物１０９が培養細胞１０８に発現する。レポーター遺伝子産物１０９を検知することで測定対象物質１０３のレセプター１０１への結合能すなわち、測定対照物質１０３の存在を検知することができる。
【特許文献１】特開２０００−２８３９８４号公報
【特許文献２】特開２００３−０１８９８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような従来の抗原抗体反応を利用して微量化学物質を検知する方法においては、抗体および抗体に特異的なリガンドの作製に熟練した技術が必要でなおかつ作製には長期間を必要とし、またその作製コストも高価であるという課題があり、簡単に安価に準備できる材料を用いた簡便な検知方法が要求されている。
【０００９】
そして、培養細胞を利用して微量化学物質を検知する方法では、培養細胞の準備および利用には培養施設や装置など高価な設備が必要であり、また、培養細胞を取り扱うには熟練した技術が必要であるという課題があり、培養細胞を利用しない別の簡単な手段を用いて小さなスペースで行える簡単安価な検知方法が要求されている。
【００１０】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、レセプターへの結合能を持った被検知物質を検知することができ、また、取り扱いに熟練した技術や長期の作製期間を必要とせず簡単に安価に準備できる材料を用いた簡便な被検知物質検知方法を提供することを目的としている。  また、大型で高価な設備を必要とせず、小さなスペースで簡単安価に検知できる被検知物質検知方法を提供することを目的としている。
【００１１】
また、抗原抗体反応や培養細胞を利用した検知方法では、検知時間が長く測定結果を迅速に得ることができないという課題があり、迅速に被検知物質を検知する方法することが要求されている。
【００１２】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、検知時間が短く、迅速に測定結果が得られる微量化学物質である被検知物質の検知方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の微量化学物質の検知方法は上記目的を達成するために、微量化学物質である被検知物質と結合する受容体とＤＮＡを混合しＤＮＡを分解させ、ＤＮＡの分解を検知することによって微量化学物質を検知する方法としたものである。
【００１４】
この手段により抗原抗体反応や培養細胞を利用せずに、熟練した技術や長期の作製期間、を必要としないで、簡単に安価に準備できる材料を用いて簡便に検知することができ、また、大型で高価な設備を利用することなく、小さなスペースで簡単安価に検知することができる簡便な微量化学物質検知方法が得られる。
【００１５】
また、本発明の微量化学物質の検知方法は上記目的を達成するために、固相面上に固定化されたＤＮＡの量が減少することを指標にＤＮＡが分解されることを検知し、微量化学物質である被検知物質を検知するとしたものである。
【００１６】
これにより微量化学物質である被検知物質と受容体の結合に依存したＤＮＡの分解を迅速に検知することができ、迅速に測定結果が得られる被検知物質検知方法が得られる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば微量化学物質である被検知物質を検知するための材料を簡単かつ安価に作製することができる効果のある微量化学物質の検知方法を提供できる。
【００１８】
また、検知するために大型で高価な設備を必要とせず小さなスペースで簡単安価に検知できる効果のある微量化学物質の検知方法を提供できる。
【００１９】
また、本発明によれば短時間で微量化学物質を検知することができ、そして、迅速に測定結果を得ることのできる効果のある微量化学物質の検知方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の請求項１記載の発明は、受容体に結合する微量化学物質である被検知物質を検知する方法であって、検体中に受容体とＤＮＡを混合すると、検体中に被検知物質が存在すれば微量化学物質である被検知物質と受容体が結合し、被検知物質と結合した受容体がＤＮＡに結合しＤＮＡを分解するので、ＤＮＡの分解を検知することによって検体中の被検知物質の存在を検知することができる検知方法としたものであり、受容体へ結合する被検知物質を検知できるという作用を有する。
【００２１】
また、被検知物質と結合することによってＤＮＡへの結合し易さを変化させる受容体と前記受容体に結合する加水分解活性を持った酵素と前記酵素に切断されるＤＮＡを検体中に混合し、前記ＤＮＡの加水分解を検知することを特徴とした請求項１に記載の検知方法としたものであり、受容体へ結合する被検知物質を特異的に検知することができるという作用を有する。
【００２２】
また、ＤＮＡが固相面に固定化されており、酵素によって加水分解されたＤＮＡが固相面から遊離することを利用し、加水分解されるＤＮＡを検知することを特徴とした請求項１〜２のいずれかに記載の検知方法としたものであり、ＤＮＡの分解を簡単に検知することで受容体に結合する被検知物質を簡単に検知できるという作用を有する。
【００２３】
また、固相面上に固定化されたＤＮＡの量が減少することを指標にＤＮＡが加水分解されることを検知することを特徴とした請求項１〜３のいずれかに記載の検知方法としたものであり、ＤＮＡの分解を迅速に検知できることで受容体に結合する微量化学物質である被検知物質を迅速に検知できるという作用を有する。
【００２４】
また、固相面上のＤＮＡを検知し易くするための信号物質をＤＮＡに結合してあることを特徴とし、信号物質の減少を指標にして固相面上のＤＮＡが加水分解されることを検知する請求項４に記載の検知方法としたものであり、信号物質によって容易に固相面上のＤＮＡを簡単に検知することで受容体に結合する微量化学物質である被検知物質を簡単に検知できるという作用を有する。
【００２５】
また、受容体に認識される認識配列がＤＮＡの分子内にあり、受容体がＤＮＡ上の認識配列に特異的に結合する配列特異性を持つことを特徴とし、受容体に被検知物質が結合することによって認識配列近傍のＤＮＡが酵素によって加水分解される請求項１〜９のいずれかに記載の検知方法としたものであり、受容体に結合する微量化学物質である被検知物質を特異的に検知できるという作用を有する。
【００２６】
また、受容体に認識される認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面と、認識配列を持たないＤＮＡを固定化した固相面に受容体と酵素と被検知物質の混合物を反応させることを特徴とし、認識配列をもつＤＮＡを固定化した前記固相面上のＤＮＡの量と認識配列を持たないＤＮＡを固定化した前記固相面上のＤＮＡの量を比較することで、認識配列特異的にＤＮＡが加水分解されることを検知請求項１〜１０のいずれかに記載の検知方法としたもので、精度良く受容体に結合する微量化学物質である被検知物質を特異的に検知できるという作用を有する。
【００２７】
また、受容体に認識される認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面と、前記認識配列とは異なる認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した固相面、あるいはさらに異なる認識配列を分子内に持つＤＮＡを固定化した複数の固相面に、それぞれの異なる認識配列に特異的に結合する複数の受容体と酵素と被検知物質の混合物を反応させることを特徴とし、それぞれ異なる受容体に結合する複数の被検知物質を同時に検知する請求項１〜１１のいずれかに記載の微量化学物質の検知方法としたもので、複数の被検知物質、微量化学物質を同時に検知できるという作用を有する。
【００２８】
また、ＤＮＡを固定化した固相面上に受容体と酵素と被検知物質の混合物を流動させ、連続的に被検知物質、微量化学物質を検知することを特徴とした請求項１〜１２のいずれかに記載の検知方法としたもので、連続的に被検知物質、微量化学物質の存在を検知できるという作用を有する。
【００２９】
また、被検知物質と結合する受容体がホルモンレセプターである事を特徴とした請求項１〜１３のいずれかに記載の検知方法としたもので、ホルモン様物質を迅速簡単に検知できるという作用を有する。
【００３０】
また、被検知物質が内分泌撹乱物質であることを特徴とした請求項１〜１４のいずれかに記載の検知方法としたもので、内分泌撹乱物質を迅速簡単に検知できるという作用を有する。
【００３１】
また、加水分解活性を持った酵素が加水分解活性を持った希土類を結合した高分子で構成されていることを特徴とした請求項１〜１５のいずれかに記載の検知方法としたもので、簡単安価に被検知物質を検知できるという作用を有する。
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００３３】
（実施の形態１）
図１に検体１に受容体２とＤＮＡ３を混合することによってＤＮＡ３を分解し、ＤＮＡ３の分解を検知することによって検体１中の被検知物質４の存在を検知する検知方法を示す。図１Ａ）に示すように、検体１に受容体２とＤＮＡ３を混合することによって、図１Ｂ）に示すように検体１中に被検知物質４が存在すれば被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２はＤＮＡ３に結合するようになる。ＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図１Ｃ）に示すようにＤＮＡ３が分解される。ここで、受容体２は被検知物質４と結合することによってＤＮＡ３に結合し易くなる性質を持っており、被検知物質４が存在しない場合は、受容体２とＤＮＡ３の結合は起こりにくく、ＤＮＡ３は分解されにくい。微量化学物質、被検知物質４が存在する場合は、被検知物質４と受容体２が結合し、受容体２がＤＮＡ３に結合し易くなり、ＤＮＡ３が分解されやすくなる。ＤＮＡ３が分解され易さを指標にして、被検知物質４の受容体２への結合能すなわち被検知物質４の存在を検知することができる。また、既知濃度の被検知物質４を含んだ検体を用いて、ＤＮＡ分解量に対する検量線を利用することによって、検体１中に含まれる微量化学物質、被検知物質４の濃度を知ることができる。
【００３４】
図１において、被検知物質４とはホルモンや環境ホルモンと同様にホルモンレセプターに結合しホルモン様の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲン等のホルモンやビスフェノールＡやＰＣＢやダイオキシン等の環境ホルモンであり、受容体２は例えばエストロゲンレセプターやアンドロゲンレセプターやＡｈレセプターなどのホルモンレセプターである。エストロゲンがエストロゲンレセプターに結合することによってエストロゲンレセプターが構造変化し、その結果エストロゲンレセプターはＤＮＡ３に結合しやすくなる。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。
【００３５】
ここで、ＤＮＡ３とは例えばエストロゲンレセプターが特異的に認識して結合するホルモン応答配列を有したデオキシリボ核酸であり、エストロゲンと結合したエストロゲンレセプターがホルモン応答配列に結合する。
【００３６】
図１において、例えばエストロゲンレセプターにＤＮＡ３を加水分解する活性を付加することによって、エストロゲンレセプターを結合したＤＮＡ３は加水分解されるようになる。ここで、加水分解活性を付加する方法として例えばエストロゲンレセプターとヌクレアーゼの融合タンパク質を合成する方法があるが、上記以外の方法であっても、加水分解活性を付与することでエストロゲンレセプターとＤＮＡとの結合を阻害するものでなければ、いずれの方法であっても上記目的の検知が可能である。
【００３７】
なお、エストロゲンレセプターに結合するタンパク質に加水分解活性を付与することで、エストロゲンレセプターに間接的に加水分解活性を付与してもかまわない。また、検体１中の被検知物質４として、例えば血液中のエストロゲンを検知する場合は、採取した血液にエストロゲンレセプターと上記ＤＮＡを混合し一定時間反応させた後、検体１をポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの方法で分離し、分離されたＤＮＡを検知することでＤＮＡが分解されたことを検知しエストロゲンが血中に存在することを検知することができる。ＤＮＡが分解されたことを検知する方法としては、例えば電気泳動ゲル中のＤＮＡの移動速度から分子量を推定することができ、分解前のＤＮＡの分子量と比較することで、ＤＮＡが分解されることを検知することができる。また、電気泳動後のＤＮＡを例えばＥｔＢｒなどの蛍光指示薬で染色し、イルミネーターなどを用いて視覚像を得ることで、ＤＮＡの分子量および、分解量を検知することができる。
【００３８】
また、あらかじめ既知濃度の被検知物質４を用いてＤＮＡの分解量に対する検量線を作成し、検体１と受容体２とＤＮＡ３を混合することによって分解されたＤＮＡ量をあらかじめ作成しておいた検量線と比較することで、検体１中に含まれる未知濃度の被検知物質４の濃度を知ることができる。
【００３９】
上記構成において、抗原抗体反応や培養細胞を利用することなく簡単な材料を用い簡便な方法で、ＤＮＡ３の分解を指標に検体１中に含まれる受容体２に結合する被検知物質４を簡便に検知することができる。
【００４０】
なお、図には示さないが、微量化学物質である被検知物質４と受容体との結合を競合的に阻害し、受容体２とＤＮＡ３が結合することを阻害する物質も同様に検知することができる。この場合、あらかじめ濃度のわかっている被検知物質４のみを混合して反応させたときに生じるＤＮＡの分解量と、被検知物質４と競合物質を混合して反応させた時に生じるＤＮＡの分解量を比較することで、競合物質の存在を検知することができる。
【００４１】
また、あらかじめ既知濃度の競合物質と被検知物質４を用いてＤＮＡの分解量に対する検量線を作成し、検体１と受容体２とＤＮＡ３を混合することによって分解されたＤＮＡ量をあらかじめ作成しておいた検量線と比較することで、検体１中に含まれる未知濃度の競合物質の濃度を知ることができる。
【００４２】
なお、上記構成の検知方法を用いて、特定の化学物質にホルモン様の活性があるかどうか検証することもできる。例えば、ホルモン様活性を有したダイオキシンなどの環境ホルモンの濃度に対するＤＮＡ切断量の検量線をあらかじめ作成し、ホルモン様活性の有無を検証したい特定の化学物質の濃度に対するＤＮＡの切断量を検知し検量線と比較することで、測定した化学物質のホルモン様活性を、ダイオキシンのホルモン様活性を基準にして評価することができる。
【００４３】
（実施の形態２）
実施の形態１と同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【００４４】
図２に検体１に受容体２とＤＮＡ３と酵素５を混合することによってＤＮＡ３を分解し、ＤＮＡ３の分解を検知することによって被検知物質４の存在を検知する方法を示す。図２Ａ）に示すように、検体１に受容体２とＤＮＡ３と酵素５を混合することによって、図２Ｂ）に示すように被検知物質４と受容体２が結合し、微量化学物質である被検知物質４と結合した受容体２はＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５がＤＮＡ３に接近する。ＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図２Ｃ）に示すように酵素５がＤＮＡ３を分解する。ここで、受容体２は被検知物質４と結合することによってＤＮＡ３に結合し易くなる性質を持っており、被検知物質４が存在しない場合は、受容体２とＤＮＡ３の結合は起こりにくく、酵素５はＤＮＡ３に接近することがなくＤＮＡ３は分解されにくい。被検知物質４が存在する場合は、被検知物質４と受容体２が結合し、受容体２がＤＮＡ３に結合しやすくなり、酵素５がＤＮＡ３に接近しやすくなりＤＮＡ３が分解されやすくなる。ＤＮＡ３の酵素５による分解され易さを指標にして、被検知物質４の受容体２への結合能すなわち被検知物質４の存在を検知することができる。
【００４５】
図２において、被検知物質４とはホルモンや環境ホルモンと同様にホルモンレセプターに結合しホルモン様の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンやステロイドホルモン等のホルモンやビスフェノールＡやＰＣＢやダイオキシン等の環境ホルモンであり、受容体２は例えばエストロゲンレセプターやアンドロゲンレセプターやＡｈレセプターなどのホルモンレセプターであり、酵素５は例えばヌクレアーゼ等の加水分解酵素や加水分解活性を有する希土類を結合したタンパク質などＤＮＡを分解する活性をもつ受容体２に結合することのできる物質であれば同様な検知方法ができる。
【００４６】
エストロゲンがエストロゲンレセプターに結合することによってエストロゲンレセプターが構造変化し、その結果エストロゲンレセプターはＤＮＡ３に結合しやすくなる。ここで、ＤＮＡ３とは例えばエストロゲンレセプターが特異的に認識して結合するホルモン応答配列を有したデオキシリボヌクレオチドであり、エストロゲンと結合したエストロゲンレセプターがホルモン応答配列に結合しヌクレアーゼがＤＮＡに接近する。
【００４７】
図２において、例えばエストロゲンレセプターをヌクレアーゼと結合するドメインを融合させた融合タンパク質とすることによってエストロゲンレセプターにＤＮＡ加水分解活性を付与することができる。また、ヌクレアーゼをエストロゲンレセプターと結合するドメインを融合させた融合タンパク質とする事でヌクレアーゼはエストロゲンレセプターに結合することができる。また、微量化学物質である被検知物質４として、例えば血液中のエストロゲンを検知する場合は、採取した血液にエストロゲンレセプターとヌクレアーゼと上記ＤＮＡを混合し、一定時間反応させた後ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などを用いて分解されたＤＮＡを検出し、エストロゲンの存在量に依存して加水分解されるＤＮＡの量と比較することで、血液中のエストロゲン濃度が測定できる。
【００４８】
加水分解されるＤＮＡを検知する方法としては、例えば実施の形態１に記載の方法であり、また、例えばＤＮＡにあらかじめＦＩＴＣやＣｙ３などの蛍光物質を共有結合させて特定の固相面に共有結合させておき、検体反応によって加水分解された後に固相面から遊離する蛍光物質を検知することで分解されるＤＮＡを検知することもできる。遊離したＤＮＡに結合している蛍光物質を検知する手段としては、分光光度計など蛍光検知手段を用いることができる。
【００４９】
なお、ＤＮＡに蛍光物質以外の磁化物質や酸化還元電位を発生させるような物質を信号物質として結合させておき、遊離したＤＮＡを磁気検知手段や電流検知手段をもちいて簡単に検知することもできる。
【００５０】
上記構成において、抗原抗体反応や培養細胞を利用することなく簡単な材料を用い簡便な方法で、ＤＮＡ３の分解を指標に受容体２へ結合する微量化学物質である被検知物質４の存在を簡便に検知することができる。
【００５１】
（実施の形態３）
実施の形態１、あるいは２と同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【００５２】
図３にＤＮＡ３を固相面６に固定化し、ＤＮＡ３の分解を検知することによって被検知物質４の存在を検知する方法を示す。図３Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、検体１に受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図３Ｂ）に示すように、検体１中に被検知物質４が存在した場合は被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。
【００５３】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図３Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を分解する。ここで、固相面６は例えば、ガラスや酸化スズに代表される導電性酸化物などの鉱物で形成されたものであって、この場合のＤＮＡ３の固定化手段としては、γ―アミノプロピルトリエトキシランなどのシランカップリング剤で処理し導入されたアミノ基にグルタルアルデヒドなどのニ官能性試薬を作用させた後ＤＮＡのアミノ基と反応させる方法がある。
【００５４】
また、高分子デキストランやろ紙などの高分子担体に結合させることでも同様の検知方法ができる。例えば、実施の形態２に記載した方法によってＤＮＡ３が切断されるが、切断されたＤＮＡ３は固相面６上から容易に乖離するため、固相面６から乖離したＤＮＡ３を検知することによって、ＤＮＡ３の分解を容易に検知することができる。切断されたＤＮＡ３を固相面６から乖離させる方法としては、固相面６上の被検知物質４を含んだ溶液をポンプなどの送液手段によって固相面６から除去する方法や、電気泳動によって遊離したＤＮＡを移動させる方法がある。
【００５５】
また、ろ紙など高分子担体にＤＮＡを固定化した場合は、溶液の拡散を利用して遊離したＤＮＡを容易に固相面から分離することができる。固相面６から乖離したＤＮＡを検知する手段としては例えば紫外線の吸光度を検出する方法があり、これ以外であっても、ＤＮＡの存在を検知することのできる方法であればいずれの方法であっても上記目的の検知が可能となる。なお、固相化されたＤＮＡ分子にあらかじめ色素や磁化物質等の信号物質を標識しておき、信号物質の信号量を検知することで、固相面６からＤＮＡ３が遊離することを検知することもできる。この場合、信号物質の検知方法としては、例えば信号物質が色素である場合は、色の濃さの変化を目視や吸光度による計測で検知する方法や、磁気センサなどを用いて磁化物質を検知する方法がある。
【００５６】
上記構成において、受容体２へ結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、分解されたＤＮＡ３を簡単に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を簡単に検知することができる。
【００５７】
（実施の形態４）
実施の形態１乃至３のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００５８】
図４に、固相面６上のＤＮＡ３が減少することを指標にＤＮＡ３が加水分解されることを検知し、被検知物質の存在を検知する検知方法を示す。図４Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、検体１に受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図４Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。
【００５９】
実施の形態３に示した方法で固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図４Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。例えば実施の形態３に記載した方法によってＤＮＡ３が切断されるが、切断されたＤＮＡ３は固相面６上から乖離し、固相面６に固定化された状態から浮遊した状態に変化する。固相面６上に固定化され保持された状態のＤＮＡ３の量を検知し、被検知物質４と受容体２と酵素５の混合物を固相面６に反応させる前の固相面６上に固定化されたＤＮＡ３の量と比較することによって、固定化されたＤＮＡ量が減少することを指標にＤＮＡ３の分解を容易に検知することができる。固相面６上に固定化されたＤＮＡ量を検知する方法としては、例えばＤＡＰＩのようなインターカレーターを用いＤＮＡを染色し、固相面上の蛍光強度を計測することによって容易に検知することができる。
【００６０】
また、固相面６上のＤＮＡ３にあらかじめ色素や磁化物質等の信号物質を標識しておき、反応前後の固相面６上の磁化特性を磁気センサーを用いて検知し比較することで、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３量の変化を検知することができる。なお、上記以外の方法であっても、容易に固相面上のＤＮＡ３量を検知することができる方法であれば上記目的の検知ができ、例えば、水晶振動子を用いた検出方法や、酸化還元電流を用いて計測する方法がある。水晶振動子を用いる場合、例えば固相面６に固定化されたＤＮＡ３に金粒子などの質量の高いものを共有結合させておくことで、ＤＮＡが乖離することによって起こる重量の現象が固相面６の振動に影響を与えるため、ＤＮＡ３が固相面６から乖離するのを容易に検知することができる。
【００６１】
また、酸化還元電流を用いる場合は、ＤＮＡ３にヘキストなどのインターカレーターをインターカレートさせることで発生する酸化電流を固相面６上で測定し、ＤＮＡ３の乖離に伴う酸化電流の減少を検知することで、固相面６上のＤＮＡ３量を検知することができる。
【００６２】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、ＤＮＡ３の分解を迅速簡単に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を迅速簡単に検知することができる。
【００６３】
（実施の形態５）
実施の形態１乃至４のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００６４】
図５に、固相面６上のＤＮＡ３を検知しやすくするための信号物質７をＤＮＡ３上に結合してあることを特徴とし、信号物質７の減少を指標にして固相面６上のＤＮＡ３の分解を検知する検知方法を示す。図５Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、検体１に受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図５Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図５Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を分解する。
【００６５】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。例えば実施の形態３に記載した方法によってＤＮＡ３が切断されるが、切断されたＤＮＡ３は固相面６上から乖離し、固相面６に固定化された状態から浮遊した状態に変化する。固相面６上に固定化され保持された状態のＤＮＡ３の量を検知し、被検知物質４と受容体２と酵素５の混合物を固相面６に反応させる前のＤＮＡ３の量と比較することによって、固定化されたＤＮＡ量が減少することを指標にＤＮＡ３の分解を容易に検知することができる。
【００６６】
あらかじめＤＮＡを検知しやすくする信号物質７をＤＮＡ３に結合してあるため、固定化された状態のＤＮＡ３を検知することが容易となる。ここで、信号物質とは、例えばＦＩＴＣやＣｙ３などの蛍光物質であり、固相面６上のＦＩＴＣの蛍光強度を、フォトダイオードなどを利用した光センサなどを用いて容易に検知することができる。蛍光物質をＤＮＡに結合させる手段としては、例えば、グルタルアルデヒドを用いて架橋する方法があるが、その他の蛍光色素を他の架橋手段を用いて結合させてもかまわない。
【００６７】
なお、信号物質７として希土類などの磁化物質とすることもでき、この場合ＤＮＡ３が固定化された固相面６上の磁化特性を磁気センサを用いて検知し、磁化特性の変化を検知することで、ＤＮＡの分解を検知することができる。
【００６８】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、ＤＮＡ３の分解を高感度に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を高感度に検知することができる。
【００６９】
なお、図には示していないが、ＤＮＡ３が固相面６に固定化されていない場合であっても、分解されたＤＮＡ３を検出する際、信号物質を結合したＤＮＡの分子量を計測することで、ＤＮＡが加水分解されたかどうか検知することが容易にできるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を容易に検知することができる。
【００７０】
（実施の形態６）
実施の形態１乃至５のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００７１】
図６に、ＤＮＡに結合した信号物質が蛍光色素８であることを特徴とし、固相面６上の蛍光強度の減少を指標にして、固相面６上のＤＮＡ３が加水分解されることを検知する検知方法を示す。図６Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図６Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図６Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。
【００７２】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。例えば実施の形態５に記載した方法で、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３を検出する場合、ＤＮＡ３に信号物質である蛍光色素８を結合してあるため、固相面６上の蛍光強度を蛍光検知手段９で検知することができる。ここで、信号物質７とは、例えばＦＩＴＣやＣｙ３などの蛍光物質であり、蛍光検知手段９とは、例えば、発光素子としてＬＥＤを用い、受光素子としてフォトダイオードなどを利用した光センサがある。蛍光物質をＤＮＡに導入する方法としては、例えば実施の形態５に記載した方法がある。
【００７３】
ここで、検体１と反応させる前のＤＮＡ３を固定化した固相面６上の蛍光強度をあらかじめ測定しておき、検体１と受容体２と酵素５の混合物を反応させた後の固相面６上の蛍光強度を比較し、反応後蛍光強度が低下することでＤＮＡ３が分解されたことが検知できる。また、あらかじめ既知濃度の被検知物質４を用いて計測した固相面６上の蛍光強度の減少量を元に検量線を作成し、未知濃度の被検知物質４を反応させた時の固相面６上の蛍光強度の減少量を検量線と比較することで、微量化学物質である被検知物質４の濃度を測定することができる。
【００７４】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、蛍光検知手段９によって、ＤＮＡ３の分解を高感度に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を簡便高感度に検知することができる。
【００７５】
（実施の形態７）
実施の形態１乃至６のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００７６】
図７に、ＤＮＡに結合した信号物質が色素１０であることを特徴とし、固相面６上の色素１０の減少を指標にして、固相面６上のＤＮＡ３が加水分解されることを検知する検知方法を示す。図７Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図７Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図７Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。
【００７７】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。例えば実施の形態５に記載した方法で、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３を検出する場合、ＤＮＡ３に信号物質である色素１０を結合してあるため、ＤＮＡ３の分解が生じることで、固相面６上に保持されていた色素１０が固相面６から乖離し、固相面６上の色素１０が減衰するのを視覚的に容易に知ることができる。
【００７８】
ここで、色素１０とは、例えばルテニウムやなどの金属錯体があり、その他、可視光に吸収ピークのある色素であれば同様に用いることができ、金粒子をＤＮＡ３に標識することでも同様に視覚的に検知することができる。色素をＤＮＡに結合させる方法としては例えば実施の形態５に記載した方法がある。
【００７９】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、肉眼で容易にＤＮＡ３の分解を検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を安価に迅速簡単に検知することができる。
【００８０】
（実施の形態８）
実施の形態１乃至７のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００８１】
図８に、ＤＮＡに結合した信号物質が磁化物質１１であることを特徴とし、固相面６上の磁化特性の変化を指標にして、固相面６上のＤＮＡ３が加水分解されることを検知する検知方法を示す。図８Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図８Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。  固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図８Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。例えば実施の形態５に記載した方法で、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３を検出する場合、ＤＮＡ３に信号物質である磁化物質１１を結合してあるため、磁気検知手段１２を用いて固相面６上の磁化特性の変化を容易に検知できる。ここで、磁化物質１１としては、例えば希土類などの硬質磁性材料があり、この場合磁気検知手段１２としては可飽和コイルなどを用いた磁気センサーを用いて検知する方法がある。なお、上記記載以外のものであっても、磁化特性を有する材料であれば同様に磁気センサーを用いて検知することが可能となり、他の磁気センサーを利用しても同様に検知することができる。
【００８２】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、磁化特性の変化を検知しＤＮＡ３の分解を高感度に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を高感度に検知することができる。
【００８３】
（実施の形態９）
実施の形態１乃至８のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００８４】
図９に、ＤＮＡに結合した信号物質が酸化還元電位を発生させる物質１３であることを特徴とし、固相面６上の酸化還元電流の変化を指標にして、固相面６上のＤＮＡ３が加水分解されることを検知する検知方法を示す。図９Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図９Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図９Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。
【００８５】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。  例えば実施の形態５に記載した方法で、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３を検出する場合、ＤＮＡ３に信号物質である酸化還元電位を発生させる物質１３を結合してあるため、電流検知手段１４を用いて固相面６上の酸化還元電流の減少を検知する。ここで、酸化還元電位を発生させる物質１３としては、例えばＨＲＰなどの酸化還元酵素があり、この場合電流検知手段１４としてはＨＲＰによって過酸化水素が酸化される際に放出される電子をＦＭＡなどのメディエーターを通じて電流値として検知する方法がある。電流検知方法としては例えば、ＤＮＡ３を固定化した酸化スズに代表される導電性酸化物やあるいは金薄膜を形成したガラスの固相面６上で発生する酸化還元電位を銀などの参照電極との電位差とし計測することができる。
【００８６】
なお、酸化還元電位を発生させる物質１３としてヘキストなどのインターカレーターをＤＮＡに結合させ、ヘキストによる酸化電流を検知する方法でもかまわない。なお、希土類などを、酸化還元電位を発生させる物質２２として使用しても同様にＤＮＡを検知することができる。
【００８７】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、酸化還元電流の減少を検知しＤＮＡ３の分解を簡便に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を簡便に検知することができる。
【００８８】
（実施の形態１０）
実施の形態１乃至９のいずれかと同一部分は同一番号を付し詳細な説明は省略する。
【００８９】
図１０に、受容体２に認識される認識配列１５がＤＮＡ３の分子内にあり、受容体２がＤＮＡ３上の認識配列１５に特異的に結合する配列特異性を持つことを特徴とし、受容体２に被検知物質４が結合することによって認識配列１５近傍のＤＮＡが酵素５によって加水分解される検知方法を示す。図１０Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、検体１と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図１０Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。
【００９０】
ここで、近傍とは、酵素５による加水分解活性が有効である範囲のことであり、酵素５とＤＮＡ３が直接相互作用することを可能にする距離を超えない範囲のことである。図１０Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を認識配列１５近傍で特異的に加水分解するため、ＤＮＡ３の加水分解産物は常にほぼ同じ長さとなる。ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。例えば実施の形態９に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、受容体２としてエストロゲンレセプターを使用する場合は、応答配列としては、エストロゲン応答配列が利用できる。  エストロゲンレセプターがエストロゲン応答配列に対して特異的に結合するため、酵素５によるＤＮＡ３の加水分解が特異的に起こる。
【００９１】
図１０において、例えば実施の形態９に記載した方法で固相面６上に固定化され保持された状態のＤＮＡ３の量を検知し、被検知物質４と受容体２と酵素５の混合物を固相面６に反応させる前のＤＮＡ３の量と比較することによって、固定化されたＤＮＡ量が減少することを指標にＤＮＡ３の分解を容易に検知することができる。
【００９２】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、ＤＮＡ３の分解を特異的に検知することができるため、被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。なお図１０には示していないが、酵素５によって切断されたＤＮＡ３を電気泳動法などで分離し、ＤＮＡの塩基の長さを検出することで、認識配列１５の近傍に特異的に切断されたＤＮＡ３の断片量を検知することができ、従って、受容体２による認識配列１５に対する特異的結合に基づくＤＮＡの加水分解を検出することができ、より特異的に微量化学物質である被検知物質４の存在を検知することができる。
【００９３】
（実施の形態１１）
実施の形態１乃至１０のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【００９４】
図１１に、受容体２に認識される認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６と、認識配列１５を持たないＤＮＡ３を固定化した固相面６に受容体２と酵素５と被検知物質４の混合物を反応させることを特徴とし、認識配列１５をもつＤＮＡ３を固定化した前記固相面６上のＤＮＡ３の量と認識配列１５を持たないＤＮＡ３を固定化した前記固相面６上のＤＮＡ３の量を比較することで、認識配列特異的にＤＮＡが加水分解されることを検知する検知方法を示す。図１１Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６と認識配列１５を持たないＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させる。図１１Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は認識配列１５を分子内に持ったＤＮＡ３にのみ結合するようになり、認識配列１５を持たないＤＮＡ３には結合しない。図１１Ｃ）に示すように酵素５が認識配列１５近傍でＤＮＡ３を特異的に加水分解するため、認識配列１５を分子内にもつＤＮＡ３を固定化した固相面６上のみで、ＤＮＡ３の加水分解が生じる。
【００９５】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。例えば実施の形態１０に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、認識配列１５をもつＤＮＡ３を固定化した前記固相面６上のＤＮＡ３の減少量と認識配列１５を持たないＤＮＡ３を固定化した前記固相面６上のＤＮＡ３の減少量を比較することで、容易に認識配列１５を持ったＤＮＡに特異的に起こった加水分解を検知することができ、受容体２による認識配列１５に対する特異的結合に基づくＤＮＡの加水分解を検出することができ、簡単な構成で簡便に微量化学物質である被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。
【００９６】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、ＤＮＡ３の分解を単純な構成で特異的に検知することができるため、微量化学物質である被検知物質４の存在を単純な構成で特異的に検知することができる。
【００９７】
（実施の形態１２）
実施の形態１乃至１１のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【００９８】
図１２に、受容体２に認識される認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６と、前記認識配列１５とは異なる第２の認識配列１６を分子内に持つ第２のＤＮＡ１７を固定化した第２の固相面１８に、それぞれの異なる認識配列に特異的に結合する複数の受容体と酵素と被検知物質の混合物を反応させることを特徴とし、それぞれ異なる受容体に結合する複数の被検知物質を同時に検知する検知方法を示す。図１２Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６と第２の認識配列１６を持つ第２のＤＮＡ１７を固定化した第２の固相面１８に、被検知物質４と第２の被検知物質１９と受容体２と第２の受容体２０と酵素５を混合したものを反応させる。図１２Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は認識配列１５を分子内に持ったＤＮＡ３にのみ結合するようになり、一方、第２の被検知物質１９と第２の受容体２０結合し、第２の被検知物質１９と結合した第２の受容体２０は第２の認識配列１６を分子内に持った第２のＤＮＡ１７にのみ結合するようになる。
【００９９】
図１２Ｃ）に示すように酵素５が認識配列１５あるいは第２の認識配列１６の近傍でＤＮＡ３あるいは第２のＤＮＡ１７を特異的に加水分解するため、認識配列１５を分子内にもつＤＮＡ３を固定化した固相面６上と第２認識配列１５を分子内にもつ第２のＤＮＡ１７を固定化した第２の固相面１８上でＤＮＡの加水分解が生じる。ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。例えば実施の形態１０に記載の方法によって、固相面６上あるいは第２の固相面１８上のＤＮＡ減少量を検知することができ、それぞれの固相面上に固定化されているＤＮＡの認識配列に特異的に結合する受容体に結合する被検知物質を同時に検知することができる。ここで、第２の認識配列１６とは、例えばアンドロゲン応答配列であり、第２の被検知物質１９とは例えばアンドロゲンであり、第２の受容体２０とは、例えばアンドロゲンレセプターである。
【０１００】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４と第２の受容体２０に結合する第２の被検知物質１９をＤＮＡ３と第２のＤＮＡ１７の切断を指標に同時に検出することができ、ＤＮＡ３と第２のＤＮＡ１７の分解を単純な構成で特異的に同時に検知することができるため、被検知物質４と第２の被検知物質１９を単純な構成で特異的に同時に検知することができる。
【０１０１】
なお、図には示さなかったが、その他の被検知物質と結合する受容体と、その被検知物質と結合した受容体が特異的に結合する認識配列を同時に用いることで、複数の微量化学物質である被検知物質を同時に検知することが可能となる。
【０１０２】
（実施の形態１３）
実施の形態１乃至１２のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１０３】
図１３に、ＤＮＡ３を固定化した固相面６上に受容体２と酵素５と被検知物質４の混合物を流動させ、連続的に被検知物質４を検知することを特徴とした検知方法を示す。  図１３Ａ）に示すようにＤＮＡ３を固定化した固相面６上に接するように、被検知物質４と受容体２と酵素５の混合物を流動させる。図１３Ｂ）に示すように、被検知物質４混入した時点で被検知物質４が受容体２と結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３に接近する。固相面６上のＤＮＡ３に受容体２が結合することによって図１３Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。微量化学物質である被検知物質４が存在しない場合は、ＤＮＡ３の分解は起こらないが、被検知物質４がひとたび混入されれば、ＤＮＡ３が加水分解を受けることになり、ＤＮＡ３の加水分解を連続的にモニタリングすることによって、被検知物質４の混入を検知することができる。ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。
【０１０４】
例えば実施の形態９に記載した方法で、固相面６上に固定化されたＤＮＡ３を検出し、被検知物質４の存在を検知するが、固相面６上に混合物を流動させる方法は、例えば、固相面６上に溶液の流れる流路を設け、流路に被検知物質４を含んだ検体をポンプなど用いて流入させる方法がある。
【０１０５】
上記構成において、受容体２に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に連続的に検知することができ、簡単な構成で連続的に微量化学物質である被検知物質４の混入をモニタリングすることができる。
【０１０６】
（実施の形態１４）
実施の形態１乃至１３のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１０７】
図１４に、被検知物質４と結合する受容体がホルモンレセプターである事を特徴とした検知方法を示す。図１４Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４とホルモンレセプター２１と酵素５を混合したものを反応させ、図１４Ｂ）に示すように、被検知物質４とホルモンレセプター２１が結合し、被検知物質４と結合したホルモンレセプター２１は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、ホルモンレセプター２１に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。ホルモンレセプター２１は認識配列１５に特異的に結合するため、ホルモンレセプター２１に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。
【０１０８】
ここで、被検知物質４とはホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質のことであり、例えばエストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンであり、ダイオキシンやＰＣＢなどの環境ホルモン物質である。被検知物質４は環境ホルモン等の微量化学物質である。
【０１０９】
例えば、実施の形態１０に記載した方法で固相面６上のＤＮＡ３を検出し、被検知物質４の存在を検出するが、ここでホルモンレセプター２１とは、例えばエストロゲンレセプターであり、この場合、エストロゲンレセプターに結合する被検知物質４としてはエストロゲンのようなホルモンや、エストロゲン用の活性をもつビスフェノールＡであり、その他ホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質であれば、いずれの物質であっても同様に検知することができる。
【０１１０】
上記構成において、ホルモンレセプター２１に結合する被検知物質４をＤＮＡ３の切断を指標に検出することができ、ホルモン用活性を持った物質を単純な構成で特異的に検知することができる。
【０１１１】
（実施の形態１５）
実施の形態１乃至１４のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１１２】
図１５に、被検知物質が内分泌撹乱物質２２である事を特徴とした検知方法を示す。図１５Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、内分泌撹乱物質２２と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図１４Ｂ）に示すように、内分泌撹乱物質２２と受容体２が結合し、内分泌撹乱物質２２と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。
【０１１３】
例えば、実施の形態１０に記載した方法で固相面６上のＤＮＡ３を検出し、内分泌撹乱物質２２の存在を検出するが、ここで内分泌撹乱物質２２とは、例えばヒドロキシＰＣＢや植物エストロゲンであり、この場合、受容体２としてはエストロゲンレセプターのようなホルモンレセプターである。なお、内分泌撹乱物質２２として、上記記載以外の微量化学物質であってもホルモンレセプターに結合することでホルモン用の活性を示す物質であれば、いずれの物質であっても同様に検知することができる。
【０１１４】
上記構成において、ホルモン用活性を持った内分泌撹乱物質２２を単純な構成で特異的に検知することができる。
【０１１５】
（実施の形態１６）
実施の形態１乃至１５のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１１６】
図１６に、加水分解酵素を持った酵素５が加水分解活性を持った希土類２３を結合した高分子で構成されていることを特徴とした検知方法を示す。図１６Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図１６Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。
【０１１７】
ここで、近傍とは、酵素５による加水分解活性が有効である範囲のことであり、酵素５とＤＮＡ３が直接相互作用することを可能にする距離を超えない範囲のことである。図１６Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を認識配列１５近傍で特異的に加水分解するため、ＤＮＡ３の加水分解産物は常にほぼ同じ長さとなる。
【０１１８】
例えば実施の形態１０に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、希土類とは例えばＣｅイオンであり、この場合Ｃｅイオン錯体としてタンパク質などの高分子に結合させることによって、加水分解活性を持った酵素５として利用することができる。また、これ以外の希土類であっても、ＤＮＡ分子を加水分解する活性を有するものであれば同様に被検知物質４を検知することができる。
【０１１９】
上記構成において、ＤＮＡ３を加水分解する酵素５を簡単に作製することができ、簡単な構成で微量化学物質である被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。
【０１２０】
（実施の形態１７）
実施の形態１乃至１６のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１２１】
図１７に、加水分解酵素を持った酵素５が加水分解活性を持ったキレート化合物２４を結合した高分子で構成されていることを特徴とした検知方法を示す。図１７Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図１７Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合する酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。
【０１２２】
受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。ここで、近傍とは、酵素５による加水分解活性が有効である範囲のことであり、酵素５とＤＮＡ３が直接相互作用することを可能にする距離を超えない範囲のことである。図１７Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を認識配列１５近傍で特異的に加水分解するため、ＤＮＡ３の加水分解産物は常にほぼ同じ長さとなる。
【０１２３】
例えば実施の形態１０に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、キレート化合物２４は例えばＥＤＴＡであり、この場合ＦｅイオンをキレートさせることでＤＮＡを加水分解活性を持たせることができる。また、ＦｅイオンをキレートしたＥＤＴＡをタンパク質に結合させることによって受容体２と結合する酵素５として作製することができる。この場合、タンパク質にＥＤＴＡを結合させる手段としては、例えばＭｅａｒｅｓ試薬を用いてタンパク質のＣｙｓ残基に結合させる方法がある。また、これ以外のキレート化合物であっても、ＤＮＡ分子を加水分解する活性を有するものであれば同様に被検知物質４を検知することができる。
【０１２４】
上記構成において、ＤＮＡ３を加水分解する酵素５を簡単に作製することができ、簡単な構成で微量化学物質である被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。
【０１２５】
（実施の形態１８）
実施の形態１乃至１７のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１２６】
図１８に、加水分解酵素を持った酵素５がヌクレアーゼ活性を持ったタンパク質２５あることを特徴とした検知方法を示す。図１８Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２とタンパク質２５を混合したものを反応させ、図１８Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合するタンパク質２５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合するタンパク質２５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。ここで、近傍とは、タンパク質２５による加水分解活性が有効である範囲のことであり、酵素５とＤＮＡ３が直接相互作用することを可能にする距離を超えない範囲のことである。図１８Ｃ）に示すようにタンパク質２５が固相面６上のＤＮＡ３を認識配列１５近傍で特異的に加水分解するため、ＤＮＡ３の加水分解産物は常にほぼ同じ長さとなる。
【０１２７】
例えば実施の形態１０に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、タンパク質２５は例えばＤＮエースやＲＮエースなどのヌクレアーゼであり、この場合ヌクレアーゼを受容体と結合する受容体結合ドメインとの融合タンパク質として作製することで、上記目的の被検知物質検知方法が可能になる。なお、特定の細菌から抽出されるような耐熱性ヌクレアーゼなどを利用し、酵素５の加水分解活性を安定させることもできる。
【０１２８】
上記構成において、ＤＮＡ３を加水分解するタンパク質２５を簡単に作製することができ、簡単な構成で微量化学物質である被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。
【０１２９】
（実施の形態１９）
実施の形態１乃至１８のいずれかと、同一部分は同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１３０】
図１９に、加水分解酵素を持った酵素５がヌクレアーゼ活性を持ったＲＮＡ２６で構成されていることを特徴とした検知方法を示す。図１９Ａ）に示すように認識配列１５を分子内に持つＤＮＡ３を固定化した固相面６に、被検知物質４と受容体２と酵素５を混合したものを反応させ、図１９Ｂ）に示すように、被検知物質４と受容体２が結合し、被検知物質４と結合した受容体２は固相面６上のＤＮＡ３に結合するようになり、受容体２に結合するタンパク質２５が固相面６上のＤＮＡ３を加水分解する。受容体２は認識配列１５に特異的に結合するため、受容体２に結合する酵素５はＤＮＡ３を認識配列１５近傍で加水分解する。
【０１３１】
ここで、近傍とは、酵素５による加水分解活性が有効である範囲のことであり、酵素５とＤＮＡ３が直接相互作用することを可能にする距離を超えない範囲のことである。図１９Ｃ）に示すように酵素５が固相面６上のＤＮＡ３を認識配列１５近傍で特異的に加水分解するため、ＤＮＡ３の加水分解産物は常にほぼ同じ長さとなる。例えば実施の形態１０に記載した方法によってＤＮＡ３が切断され、ＤＮＡの切断を指標に被検知物質４の存在を検知するが、ここで、ＲＮＡ２６は例えばヌクレアーゼ活性を有したリボザイムであり、この場合例えば、リボザイムのＲＮＡと結合するタンパク質を受容体２と結合する受容体結合ドメインとの融合タンパク質として作製することで、上記目的の被検知物質検知方法が可能になる。
【０１３２】
上記構成において、ＤＮＡ３を加水分解する酵素５を簡単に作製することができ、簡単な構成で微量化学物質である被検知物質４の存在を特異的に検知することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の被検知物質検知方法を用いて、ホルモン様活性を有する微量化学物質を受容体への結合能を指標に検知することができ、抗原抗体反応や培養細胞を利用することなく、簡便な方法で迅速且つ安価に検知することができる。また、本発明の検知方法を応用したバイオセンサーを環境中で連続的に使用し被検知物質の存在をモニタリングすることで、環境中に暴露されているホルモン様物質の量を監視することができるようになる。また、本発明の検知方法を用いることで特定化学物質のホルモン様活性を計測し毒性評価を行う場合や、ホルモン様物質をスクリーニングする場合のように研究目的にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明の実施の形態１の微量化学物質の検知方法を示す図
【図２】本発明の実施の形態２の微量化学物質の検知方法を示す図
【図３】本発明の実施の形態３の微量化学物質の検知方法を示す図
【図４】本発明の実施の形態４の微量化学物質の検知方法を示す図
【図５】本発明の実施の形態５の微量化学物質の検知方法を示す図
【図６】本発明の実施の形態６の微量化学物質の検知方法を示す図
【図７】本発明の実施の形態７の微量化学物質の検知方法を示す図
【図８】本発明の実施の形態８の微量化学物質の検知方法を示す図
【図９】本発明の実施の形態９の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１０】本発明の実施の形態１０の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１１】本発明の実施の形態１１の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１２】本発明の実施の形態１２の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１３】本発明の実施の形態１３の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１４】本発明の実施の形態１４の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１５】本発明の実施の形態１５の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１６】本発明の実施の形態１６の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１７】本発明の実施の形態１７の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１８】本発明の実施の形態１８の微量化学物質の検知方法を示す図
【図１９】本発明の実施の形態１９の微量化学物質の検知方法を示す図
【図２０】従来の微量化学物質の検知方法を示す図
【図２１】従来の微量化学物質の検知方法を示す図
【符号の説明】
【０１３５】
１  検体
２  受容体
３  ＤＮＡ
４  被検知物質
５  酵素
６  固相面
７  信号物質
８  蛍光色素
９  蛍光検知手段
１０  色素
１１  磁化物質
１２  磁気検知手段
１３  酸化還元電位を発生させる物質
１４  電流検知手段
１５  認識配列
１６  第２の認識配列
１７  第２のＤＮＡ
１８  第２の固相面
１９  第２の被検知物質
２０  第２の受容体
２１  ホルモンレセプター
２２  内分泌撹乱物質
２３  希土類
２４  キレート化合物
２５  タンパク質
２６  ＲＮＡ
１０１  レセプター
１０２  リガンド
１０３  測定対象物質
１０４  モノクローナル抗体
１０５  ポリクローナル抗体
１０６  反応配列
１０７  レポーター遺伝子
１０８  培養細胞
１０９  レポーター遺伝子産物
【図１】
2006132956.tif 000003
【図２】
2006132956.tif 000004
【図３】
2006132956.tif 000005
【図４】
2006132956.tif 000006
【図５】
2006132956.tif 000007
【図６】
2006132956.tif 000008
【図７】
2006132956.tif 000009
【図８】
2006132956.tif 000010
【図９】
2006132956.tif 000011
【図１０】
2006132956.tif 000012
【図１１】
2006132956.tif 000013
【図１２】
2006132956.tif 000014
【図１３】
2006132956.tif 000015
【図１４】
2006132956.tif 000016
【図１５】
2006132956.tif 000017
【図１６】
2006132956.tif 000018
【図１７】
2006132956.tif 000019
【図１８】
2006132956.tif 000020
【図１９】
2006132956.tif 000021
【図２０】
2006132956.tif 000022
【図２１】
2006132956.tif 000023