(57)【要約】      （修正有）【課題】  溶液中の被験物質の濃度測定を可能とする物質の定量法の提供。【解決手段】  サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法において、前記被験物質（抗原）３が特異的に結合する結合パートナー（抗体）４を少なくとも含んでなる複合体形成試薬または試薬群であって、複合体形成試薬または試薬群に含まれる少なくとも一種の試薬が、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬であり、該標識により生成されるシグナルが、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである、複合体形成試薬または試薬群が用意され、被験サンプルをこの試薬または試薬群に溶液中で接触させた後に、該溶液中の標識からのシグナル強度を測定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、
（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナーを用意する工程、
（ｂ）前記被験物質に検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識被験物質を用意する工程であって、該シグナルが、該標識被験物質と前記結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、
（ｃ）被験サンプルを用意する工程、
（ｄ）前記被験サンプル、前記所定量の結合パートナーおよび前記所定量の標識被験物質を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルおよび前記標識被験物質を前記結合パートナーに接触させる工程、
（ｅ）工程（ｄ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、
（ａ）被験物質が特異的に結合する結合パートナーに検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識結合パートナーを用意する工程であって、該シグナルが、前記被験物質と前記標識結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、
（ｂ）被験サンプルを用意する工程、
（ｃ）前記被験サンプルおよび前記所定量の標識結合パートナーを溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記標識結合パートナーに接触させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに
（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程
を含んでなる、方法。
【請求項３】
サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、
（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する所定量の第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群を用意する工程であって、前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方が、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬であり、該シグナルが、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである、工程、
（ｂ）被験サンプルを用意する工程、
（ｃ）前記被験サンプルおよび前記複合体形成試薬群を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記複合体形成試薬群に接触させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに
（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程
を含んでなる、方法。
【請求項４】
前記標識が電気化学発光物質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
シグナル強度の測定が、前記標識の電気化学的な反応によって生じる発光の強度を測定することにより行なわれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程が、予め作成しておいた前記シグナル強度と前記被験物質の濃度との関係を示す検量線と、シグナル強度の測定値とを対比することにより行なわれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記被験物質が抗原であり、前記結合パートナーが前記抗原に結合する抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験物質が抗体であり、前記結合パートナーが前記抗体に結合する抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験物質がリガンドであり、前記結合パートナーが前記リガンドに結合するレセプターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験物質がレセプターであり、前記結合パートナーが前記レセプターに結合するリガンドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験物質がリガンドであり、前記結合パートナーが前記リガンドに結合するレセプターであり、前記第三の複合体成分が前記リガンドと前記レセプターとの複合体に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む核酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験物質がレセプターであり、前記結合パートナーが前記レセプターに結合するリガンドであり、前記第三の複合体成分が前記リガンドと前記レセプターとの複合体に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む核酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するためのキットであって、
前記被験物質が特異的に結合する結合パートナー、および前記被験物質に検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識被験物質を含んでなり、該シグナルが、該標識被験物質と前記結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、キット。
【請求項１５】
前記結合パートナーおよび前記標識被験物質が、所定量の前記結合パートナーおよび所定量の前記標識被験物質のそれぞれを含有する溶液の形態で分離されて含まれている、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するためのキットであって、
前記被験物質が特異的に結合する結合パートナーに検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識結合パートナーを含んでなり、該シグナルが、前記被験物質と前記標識結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、キット。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するためのキットであって、
被験物質が特異的に結合する結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群を含んでなり、前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方が、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬であり、該シグナルが、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである、キット。
【請求項１８】
前記標識が電気化学発光物質である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記被験物質が抗原であり、前記結合パートナーが前記抗原に結合する抗体である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記被験物質が抗体であり、前記結合パートナーが前記抗体に結合する抗原である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記被験物質がリガンドであり、前記結合パートナーが前記リガンドに結合するレセプターである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記被験物質がレセプターであり、前記結合パートナーが前記レセプターに結合するリガンドである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記被験物質がリガンドであり、前記結合パートナーが前記リガンドに結合するレセプターであり、前記第三の複合体成分が前記リガンドと前記レセプターとの複合体に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む核酸である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２５】
前記被験物質がレセプターであり、前記結合パートナーが前記レセプターに結合するリガンドであり、前記第三の複合体成分が前記リガンドと前記レセプターとの複合体に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む核酸である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するための装置であって、
被験サンプル、所定量の結合パートナーおよび所定量の標識被験物質を含む混合溶液を保持するための容器と、
前記混合溶液において、標識により生成されるシグナルの強度を測定するためのシグナル強度測定手段と、
シグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなる、装置。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するための装置であって、
被験サンプルおよび所定量の標識結合パートナーを含む混合溶液を保持するための容器と、
前記混合溶液において、標識により生成されるシグナルの強度を測定するためのシグナル強度測定手段と、
シグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなる、装置。
【請求項２８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のサンプル中における被験物質の濃度を測定する方法を実施するための装置であって、
被験サンプルおよび複合体形成試薬群を含む混合溶液を保持するための容器と、
前記混合溶液において、複合体形成試薬群に含まれる標識により生成されるシグナルの強度を測定するためのシグナル強度測定手段と、
シグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなる、装置。
【請求項２９】
前記シグナル強度測定手段が、前記混合溶液に電圧を印加するための電圧印加手段と、前記混合溶液からの電気化学発光量を測定するための発光量測定手段とを含んでなるものである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３０】
前記容器が、その外部からの前記電気化学発光量の測定を可能とする透明部分または開口部を有するものである、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記容器中において、被験サンプルおよび必要な試薬もしくは試薬群を混合するための混合手段をさらに備えてなる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、サンプル中に存在する被験物質の濃度を測定する方法に関する。
【０００２】
背景技術
サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法として、該被験物質に特異的に結合する結合パートナーを利用する方法が知られている。特に、化学発光物質を標識物質として用いた抗原または抗体の濃度の測定方法は公知である。例えば、試料溶液中に存在する抗原に対応する抗体を化学発光物質で標識し、その標識抗体を予め電極に固定化しておき、抗原を含む試料溶液を添加して標識抗体と免疫反応をさせると、反応後の抗体に標識されている化学物質の電気化学的発光が抑制される。このことを利用して、その時の電気化学的発光量を測定することにより、試料溶液中の抗原の濃度を定量することができる（特許文献１：特開昭６３−２０６３号公報；特許文献２：特開平５−１８９７０号公報）。
【０００３】
しかしながら、上記のような方法では、標識抗体を予め電極に固定化する作業が必要となる。また、標識抗体を固定化した電極では特定の抗原のみしか定量することができないため、多種多様な抗原を定量する場合には、それぞれの抗原について標識抗体を固定化した電極を用意する必要がある。従って、このような方法は、多大な費用を必要とすることが多い。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−２０６３号公報
【特許文献２】特開平５−１８９７０号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、今般、均質な溶液中において、被験物質に特異的に結合する結合パートナーを含む所定の濃度の複合体形成試薬または試薬群を被験サンプルに接触させ、その後、複合体形成試薬または試薬群に含まれる標識からのシグナルの強度を測定することにより、被験物質の定量が可能となることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００６】
従って、本発明の目的は、均質溶液中における競合または非競合アッセイにより、サンプル溶液中の被験物質の濃度測定を可能とする物質の定量法を提供することにある。
【０００７】
そして、本発明の第一の態様による定量法は、サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナーを用意する工程、（ｂ）前記被験物質に検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識被験物質を用意する工程であって、該シグナルが、該標識被験物質と前記結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｃ）被験サンプルを用意する工程、（ｄ）前記被験サンプル、前記所定量の結合パートナーおよび前記所定量の標識被験物質を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルおよび前記標識被験物質を前記結合パートナーに接触させる工程、（ｅ）工程（ｄ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｆ）工程（ｅ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなるものである。
【０００８】
さらに、本発明の第二の態様による定量法は、サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、（ａ）被験物質が特異的に結合する結合パートナーに検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識結合パートナーを用意する工程であって、該シグナルが、前記被験物質と前記標識結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｂ）被験サンプルを用意する工程、（ｃ）前記被験サンプルおよび前記所定量の標識結合パートナーを溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記標識結合パートナーに接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなるものである。
【０００９】
さらに、本発明の第三の態様による定量法は、サンプル中における被験物質の濃度を測定する方法であって、（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する所定量の第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群を用意する工程であって、前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方が、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬であり、該シグナルが、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｂ）被験サンプルを用意する工程、（ｃ）前記被験サンプルおよび前記複合体形成試薬群を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記複合体形成試薬群に接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなるものである。
【００１０】
本発明によれば、結合パートナーを用いた被験物質の定量法において、反応溶液中で生成した結合複合体と、結合しなかった試薬とを分離する必要が無い。また、本発明によれば、サンプル中における被験物質の濃度が極めて希薄な濃度（例えば、１０−１２〜１０−１８Ｍ）であっても、該被験物質を定量することが可能である。さらに、本発明によれば、結合パートナーを用いた被験物質の定量法において、試薬の電極への固定化が不要となる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本発明の一般的説明
まず、本発明の全ての態様に共通する事項について説明する。
【００１２】
本明細書において「結合パートナー」とは、被験物質が特異的に結合する物質を意味する。このような被験物質とその結合パートナーとの組み合わせは当技術分野において周知であり、例えば、抗原と抗体との組み合わせ、酵素とその基質との組み合わせ、酵素と補酵素との組み合わせ、リガンドとそのレセプターとの組み合わせ、特定の配列を有する核酸とこれに特異的に結合するリガンド／レセプター複合体との組み合わせ、タンパク質とアプタマーとの組み合わせ等、親和性を有する複数種の化合物の組み合わせなどが挙げられる。本発明による定量法においては、このような組み合わせの一方の物質を被験物質とし、他方の物質を結合パートナーとして用いることができる。
【００１３】
本明細書において、被験物質と結合パートナーとの結合について用いられる「特異的結合」という用語は、混合溶液中において被験物質が結合パートナーにのみ結合することを意味する。従って、被験物質が複数種の物質に結合するものであっても、混合溶液中において一種の物質にのみ結合する場合には、この一種の物質は被験物質に特異的に結合する物質とされる。また、結合パートナーは、被験物質以外の物質に結合するものであってもよく、さらには、このような被験物質以外の物質は一定の濃度で反応溶液中に存在していてもよい。ここで「一定の濃度」とは、その物質が、対照サンプルおよび被験サンプルのそれぞれの測定に用いられる混合溶液において同一の濃度で存在することを意味し、例えば、検量線の作製に用いられる反応溶液および被験サンプルの測定に用いられる反応溶液において同一の濃度で存在することを意味する。しかしながら、結合パートナーは、反応溶液中において被験物質にのみ結合するものであることが好ましい。さらに、被験物質および結合パートナーを含む複合体と第三の複合体成分との間の結合について用いられる「特異的結合」という用語も、上記と同様の意味を有する。
【００１４】
本明細書において「試薬」とは、本発明による定量法を用いて被験物質を定量するためにあらかじめ用意される物質を意味する。本発明に用いられる試薬は、市販品であってもよいし、化学的方法または生物学的方法によって調製されたものであってもよい。このような試薬としては、標識被験物質、標識もしくは非標識結合パートナー、標識もしくは非標識第三複合体成分等が挙げられる。
【００１５】
本発明による定量法において被験物質、結合パートナーおよび第三の複合体成分などの試薬（群）に付される標識は、検出可能なシグナルを生成し、かつ、そのシグナルが、標識された試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである。すなわち、前記標識は、遊離している標識試薬からのシグナルに比べて、複合体に組み込まれた標識試薬からのシグナルが増加または消失もしくは減少する性質を有するものである。このような性質を有する標識は、当業者であれば適宜選択することができるため特に制限されないが、好ましくは電気化学発光物質とされる。本明細書において「電気化学発光物質」とは、これを含有する溶液に電圧を印加することにより電気化学的反応によって発光する物質を意味する。電気化学発光物質の具体例としては、例えば、ルミノール、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルテニウム錯体等が挙げられ、特にルミノールが好ましい。前記標識試薬は、物質を標識化する方法として知られている標準的な技術を用いて製造することができる。
【００１６】
本発明による定量法において測定の対象となる被験サンプルは、液体、固体および気体のいずれの形態であってもよい。液体の被験サンプルは、そのままの形で用いてもよいし、また、必要に応じて希釈もしくは濃縮し、または乾燥させた後に用いてもよい。固体または気体の被験サンプルは、そのままの形で用いてもよいし、また、溶媒に溶解させ、得られた溶液を用いてもよい。さらに、被験サンプルは、必要に応じて、濾過による夾雑物の除去工程、各種精製工程などにより処理されたものであってもよい。上記のような被験サンプルは、当業者であれば容易に調製することができる。
【００１７】
本発明による定量法では、被験サンプルと、所定量の標識被験物質、標識もしくは非標識結合パートナー、標識もしくは非標識第三複合体成分等の試薬（群）とが溶液の形態で混合され、得られる混合溶液中において前記被験サンプルが前記試薬（群）に接触する。これにより、均質溶液中での溶液アッセイが行なわれる。このような被験サンプルと試薬（群）との接触は、これらを含む混合溶液を適切な条件下でインキュベートすることによって行なうこともできる。ここで「所定量」とは、上記の試薬（群）が前記混合溶液中において所定濃度となるように予め決められた量を意味する。さらに、「所定濃度」とは、上記の試薬（群）が、対照サンプルおよび被験サンプルのそれぞれの測定に用いられる混合溶液において同一の濃度で存在することを意味し、例えば、検量線の作製に用いられる混合溶液および被験サンプルの測定に用いられる混合溶液において同一の濃度で存在することを意味する。
【００１８】
混合溶液に用いられる溶媒は、被験サンプル中の被験物質、および必要とされる試薬（群）を溶解することができ、かつ、混合溶液に含まれる被験物質および試薬（群）の間での複合体形成を可能とするものであればよい。このような溶媒は、被験物質および使用する試薬（群）に応じて、当業者であれば容易に選択することができる。例えば、抗原と抗体との結合を可能とする溶媒としては、抗原抗体反応を行なうために一般的に用いられる溶媒、例えば緩衝液、が挙げられる。酵素とその基質との結合を可能とする溶媒としては、その特定の酵素による反応に一般的に用いられる溶媒、例えば、その特定の酵素が活性を有する範囲内のｐＨを有する緩衝液、が挙げられる。
【００１９】
混合溶液における標識からのシグナル強度の測定は、標識物質からのシグナルの測定法として一般的に知られる方法により行なうことができる。例えば、標識として電気化学発光物質を用いる場合には、シグナル強度の測定は、標識の電気化学的な反応によって生じる発光の強度を測定することにより行なうことができ、より具体的には、反応溶液に電圧を印加することにより該物質を電気化学的反応によって発光させ、その発光の強度を光子計数装置を用いて測定することにより行なうことができる。
【００２０】
本発明による定量法において試薬に付される標識は、そのシグナルが、標識された試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである。従って、反応溶液において標識により生成されるシグナルの強度は、複合体に組み込まれた標識試薬と、複合体に組み込まれていない遊離の標識試薬とのモル比に応じて変化し、また、複合体中に含まれる標識試薬以外の成分によっても変化する。また、反応溶液中に含まれる試薬（群）の濃度は一定であるため、このモル比および複合体の構成は、被験サンプル中に含まれる被験物質の濃度に応じて変化する。よって、混合溶液において測定される標識からのシグナル強度は、被験サンプル中に含まれる被験物質の濃度を示す。シグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る方法は当技術分野において周知であり、例えば、既知濃度の被験物質を含む対照サンプルにおける測定値と被験サンプルにおける測定値とを比較する方法が挙げられる。このようなシグナル強度からの被験物質濃度の決定は、特に、予め作成しておいた前記シグナル強度と前記被験物質の濃度との関係を示す検量線と、被験サンプルにおけるシグナル強度の測定値とを対比することにより行なわれることが好ましい。検量線は、例えば、既知濃度の被験物質を含む複数の対照サンプルについてシグナル強度を測定し、得られた測定値をグラフ上にプロットすることによって作成することができる。特に、標識としてルミノールなどの電気化学発光物質を用いる場合には、グラフの縦軸および横軸のいずれか一方を光子計数値（発光量の測定値）とし、他方を被験物質濃度の常用対数（１０を底とする被験物質濃度の対数）とする検量線を用いることが好ましい。また、作成された検量線に基づいて、シグナル強度の測定値から被験サンプル中における被験物質の濃度を算出するための数式を作成しておくこともできる。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記被験物質は抗原とされ、前記結合パートナーは前記抗原に結合する抗体とされる。用いられる抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。
【００２２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記被験物質は抗体とされ、前記結合パートナーは前記抗体に結合する抗原とされる。被験物質である抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記被験物質はリガンドとされ、前記結合パートナーは前記リガンドに結合するレセプターとされる。あるいは、前記被験物質をレセプターとし、前記結合パートナーを前記レセプターに結合するリガンドとしてもよい。さらに、レセプターとリガンドとの複合体は、特定のヌクレオチド配列を含む核酸に特異的に結合することもあり、その場合には、その核酸を第三の複合体成分として用いることもできる。また、このような核酸を被験物質とし、これに特異的に結合するレセプター／リガンド複合体を結合パートナーとすることもできる。この実施態様では多種多様なリガンドとレセプターの組み合わせが利用可能であり、その具体的な組み合わせは当業者により適宜選択される。このようなリガンドとレセプターとの組み合わせの例としては、例えば、エストロゲンとエストロゲンレセプターαまたはβとの組み合わせ、アンドロゲンステロイドとアンドロゲンレセプターとの組み合わせ、グルココルチコイドとグルココルチコイドレセプターとの組み合わせ、プロゲステロンホルモンとプロゲステロンレセプターとの組み合わせ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３とビタミンＤ３レセプターとの組み合わせ、甲状腺ホルモンとそのレセプターとの組み合わせ、レチノイン酸とそのレセプターとの組み合わせ、内分泌攪乱物質（環境ホルモン）とそのレセプターとの組み合わせ等が挙げられる。
【００２４】
第一の態様による定量法
本発明の第一の態様による定量法は、均質溶液中での競合アッセイの様式で行なわれ、該方法は、（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナーを用意する工程、（ｂ）前記被験物質に検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識被験物質を用意する工程であって、該シグナルが、該標識被験物質と前記結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｃ）被験サンプルを用意する工程、（ｄ）前記被験サンプル、前記所定量の結合パートナーおよび前記所定量の標識被験物質を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルおよび前記標識被験物質を前記結合パートナーに接触させる工程、（ｅ）工程（ｄ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｆ）工程（ｅ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなる。
【００２５】
本発明の第一の態様による定量法では、被験サンプル、所定量の結合パートナーおよび所定量の標識被験物質が溶液の形態で混合され、得られる混合溶液中において前記被験サンプルおよび前記標識被験物質が前記結合パートナーに接触する。これにより、均質溶液中において、被験サンプル中に含まれる被験物質と所定濃度の標識被験物質とが結合パートナーへの結合について競合する競合アッセイが行なわれる。
【００２６】
本発明の第一の態様による定量法における結合パートナーおよび標識被験物質の用量は、競合アッセイにおいて一般的に用いられる使用量であればよく、特に制限されない。例えば、反応溶液中に含まれる標識被験物質の量は、標識により生成されるシグナルが定量的に検出されうる強度となるような範囲において、当業者により適宜決定される。また、標識被験物質の結合パートナーに対するモル比（標識被験物質／結合パートナー）は、標識被験物質および結合パートナーのそれぞれに含まれる結合部位の数によって異なり、好ましくは０．５×（結合パートナー中の結合部位の数／標識被験物質中の結合部位の数）以上、より好ましくは０．５〜約１．０×（結合パートナー中の結合部位の数／標識被験物質中の結合部位の数）、さらに好ましくは約１．０×（結合パートナー中の結合部位の数／標識被験物質中の結合部位の数）とされる。例えば、１分子の抗体には２分子の抗原が結合する。従って、標識被験物質が標識抗原であり、結合パートナーが抗体である場合には、標識抗原の抗体に対するモル比（標識抗原／抗体）は１．０以上とすることが好ましく、より好ましくは１．０〜約２．０、さらに好ましくは約２．０とされる。また、標識被験物質が標識抗体であり、結合パートナーが抗原である場合には、標識抗体の抗原に対するモル比（標識抗体／抗原）は１．０以下とすることが好ましく、より好ましくは約０．５〜１．０、さらに好ましくは約０．５とされる。
【００２７】
被験サンプル、標識被験物質および結合パートナーの溶液の形態での混合は、当業者であれば適切に行なうことができるため、その方法は特に制限されないが、好ましくは、溶媒中に被験サンプルおよび標識被験物質を溶解させて均質溶液とした後に、得られる溶液に結合パートナーを溶解させることによって行なわれる。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による定量法において、前記被験物質は抗原とされ、前記結合パートナーは前記抗原に結合する抗体とされる。用いられる抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。この実施態様では、被験物質である被験抗原に特異的に結合する抗体が結合パートナーとして用いられ、被験抗原と同一の抗原に上述の標識が付された標識抗原が標識被験物質として用いられる。また、標識としては、電気化学発光物質を用いることが好ましい。特に、電気化学発光物質が付された標識抗原が抗体と免疫反応複合体を形成したときの電気化学的発光は、標識抗原単独時の電気化学発光に比べて大きく減少する。そのため、前記免疫反応複合体と複合体を形成していない標識抗原が共存する混合溶液に電圧を印加して標識物質を電気化学的に発光させると、混合溶液全体の発光強度は、複合体を形成していない標識抗原中の標識物質による発光強度とほぼ一致する。この実施態様では、被験抗原の量に応じて免疫反応複合体を形成しない標識抗原の量が変化するため、反応溶液の発光強度を測定することにより被験抗原の濃度を正確に測定することが可能になる。
【００２９】
本発明の第一の態様による定量法において、被験物質である被験抗原を、標識として電気化学発光物質を付した標識抗原および該抗原に対するモノクローナル抗体を用いて定量するための原理を、図１に示す。図１において、標識抗原５は、電気化学発光物質１および被験抗原と同一の抗原２から構成されている。標識抗原５に比べて被験抗原３の濃度が著しく低い場合には、標識抗原５の多くが抗体４に結合して免疫反応複合体を形成しているため、遊離した標識抗原５の量が少なく、従って発光強度は弱い（図１Ａ）。被験抗原３の濃度が高くなると、抗体４に結合する被験抗原３の量も増加するため、抗体４に結合することのできない遊離した標識抗原５の量が増加し、発光強度が強くなる（図１Ｂ）。被験抗原３の濃度がさらに高くなると、遊離した標識抗原５の量もさらに増加するため、発光強度はさらに強くなる（図１Ｃ）。このようにして、被験サンプル中の被験抗原の濃度に応じた強度の発光が検出される。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による定量法において、前記被験物質は抗体とされ、前記結合パートナーは前記抗体に結合する抗原とされる。用いられる抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。この実施態様では、被験物質である被験抗体に特異的に結合する抗原が結合パートナーとして用いられ、被験抗体と同一の抗体に上述の標識が付された標識抗体が標識被験物質として用いられる。また、標識としては、電気化学発光物質を用いることが好ましい。この実施態様では、被験抗体の量に応じて免疫反応複合体を形成しない標識抗体の量が変化するため、反応溶液の発光強度を測定することにより被験抗体の濃度を正確に測定することが可能になる。
【００３１】
第二の態様による定量法
本発明の第二の態様による定量法は、均質溶液中での非競合的結合アッセイの様式で行なわれ、該方法は、（ａ）被験物質が特異的に結合する結合パートナーに検出可能なシグナルを生成する標識が付された所定量の標識結合パートナーを用意する工程であって、該シグナルが、前記被験物質と前記標識結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｂ）被験サンプルを用意する工程、（ｃ）前記被験サンプルおよび前記所定量の標識結合パートナーを溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記標識結合パートナーに接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなる。
【００３２】
本発明の第二の態様による定量法では、被験サンプルおよび所定量の標識結合パートナーが溶液の形態で混合され、得られる混合溶液中において、前記被験サンプルが前記標識結合パートナーに接触する。これにより、均質溶液中での非競合的結合アッセイが行なわれる。
【００３３】
本発明の第二の態様による定量法における標識結合パートナーの用量は、結合アッセイにおいて一般的に用いられる使用量であればよく、特に制限されない。例えば、標識結合パートナーの用量は、標識により生成されるシグナルが定量的に検出されうる強度となるような範囲において、当業者により適宜決定される。一般には、標識結合パートナーの量は、被験サンプル中に含まれると予想される被験物質の量に対して過剰量であればよい。
【００３４】
第三の態様による定量法
本発明の第三の態様による定量法は、追加の試薬として、被験物質と結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する第三の複合体成分を用いる非競合的結合アッセイによって行なわれ、この第三の複合体成分を標識化することもできる。よって、本発明の第三の態様による定量法は、（ａ）被験物質が特異的に結合する所定量の結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する所定量の第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群を用意する工程であって、前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方が、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬であり、該シグナルが、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである、工程、（ｂ）被験サンプルを用意する工程、（ｃ）前記被験サンプルおよび前記複合体形成試薬群を溶液の形態で混合し、得られる混合溶液中において前記被験サンプルを前記複合体形成試薬群に接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）により得られる混合溶液において、前記標識により生成されるシグナルの強度を測定する工程、ならびに（ｅ）工程（ｄ）により得られるシグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を知る工程を含んでなる。
【００３５】
本発明の第三の態様による定量法では、被験サンプル、ならびに所定量の結合パートナーおよび所定量の上記第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群が溶液の形態で混合され、得られる混合溶液中において前記被験サンプルが前記複合体形成試薬群に接触する。これにより、均質溶液中での非競合的結合アッセイが行なわれる。
【００３６】
前記第三の複合体成分は、被験物質と結合パートナーとの組み合わせに応じて、当業者により適宜選択される。例えば、リガンドおよびそのレセプターのいずれか一方を被験物質とし、他方を結合パートナーとする場合には、これらの複合体に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む核酸を第三の複合体成分として用いることができる。
【００３７】
本発明の第三の態様による定量法における複合体形成試薬群の用量は、結合アッセイにおいて一般的に用いられる使用量であればよく、特に制限されない。例えば、複合体形成試薬群の用量は、標識により生成されるシグナルが定量的に検出されうる強度となるような範囲において、当業者により適宜決定される。一般には、結合パートナーの量は、被験サンプル中に含まれると予想される被験物質の量に対して過剰量であればよく、また、第三の複合体成分の量は、結合パートナーの量に対して過剰量であればよい。
【００３８】
被験物質を定量するためのキット
本発明による定量法を実施するため、必要な試薬等をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、本発明による定量法に従ってサンプル中における被験物質の濃度を測定するためのキットであって、本発明のそれぞれの態様による定量法に必要となる試薬（群）を含んでなるキットが提供される。
【００３９】
本発明の第一の態様による定量法を実施するためのキットは、前記被験物質が特異的に結合する結合パートナー、および前記被験物質に検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識被験物質を含んでなるものである。標識により生成されるシグナルは、前記標識被験物質と前記結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである。本発明の好ましい実施態様によれば、前記結合パートナーおよび前記標識被験物質は、所定量の前記結合パートナーおよび所定量の前記標識被験物質のそれぞれを含有する溶液の形態で分離されて含まれているものとされる。
【００４０】
本発明の第二の態様による定量法を実施するためのキットは、前記被験物質が特異的に結合する結合パートナーに検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識結合パートナーを含んでなるものである。標識により生成されるシグナルは、前記被験物質と前記標識結合パートナーとの結合により増加または消失もしくは減少するものである。
【００４１】
本発明の第三の態様による定量法を実施するためのキットは、被験物質が特異的に結合する結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する第三の複合体成分を含んでなる複合体形成試薬群を含んでなるものである。前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方は、検出可能なシグナルを生成する標識が付された標識試薬とされる。標識により生成されるシグナルは、該標識試薬の複合体への組込みにより増加または消失もしくは減少するものである。
【００４２】
本発明によるキットは、必要に応じて、反応容器、本発明による定量法の手順について記載した説明書等を含むことができる。
【００４３】
被験物質を定量するための装置
さらに、本発明によれば、本発明による定量法を実施するための装置が提供され、該装置は、被験サンプル、ならびに本発明のそれぞれの態様による定量法に必要とされる試薬（群）（例えば、所定濃度の結合パートナーおよび所定濃度の標識被験物質）を含む混合溶液を保持するための容器と、前記混合溶液において、標識（例えば、標識被験物質の標識）により生成されるシグナルの強度を測定するためのシグナル強度測定手段と、シグナル強度の測定値に基づいて被験サンプル中の被験物質の濃度を算出する手段とを少なくとも備えてなる。本発明による装置は、必要に応じて、前記混合溶液を適切な条件下（例えば、前記被験物質と前記結合パートナーとの結合を可能とする条件下）においてインキュベートするためのインキュベーション手段をさらに含んでなるものとしてもよい。
【００４４】
本発明の第一の態様による定量法を実施するための装置においては、必要な試薬（群）は、所定量の結合パートナーおよび所定量の標識被験物質とされる。本発明の第二の態様による定量法を実施するための装置においては、必要な試薬（群）は、所定量の標識結合パートナーとされる。本発明の第三の態様による定量法を実施するための装置においては、必要な試薬（群）は、複合体形成試薬群とされる。この複合体形成試薬群は、被験物質が特異的に結合する結合パートナー、および被験物質と前記結合パートナーとを含む複合体に特異的に結合する第三の複合体成分を含んでなるものであり、前記結合パートナーおよび第三の複合体成分のいずれか一方は、上述の標識が付された標識試薬とされる。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記シグナル強度測定手段は、前記混合溶液に電圧を印加するための電圧印加手段と、前記混合溶液からの電気化学発光量を測定するための発光量測定手段とを含んでなるものとされる。
【００４６】
前記容器は、その内部に液体を保持することができ、かつ、混合溶液に溶解しない素材からなるものであれば、いかなる容器を用いてもよい。また、容器の色および形状は特に制限されないが、容器は、好ましくはその外部からの前記電気化学発光量の測定を可能とする透明部分または開口部を有するものとされる。このような透明部分または開口部により、反応溶液からの発光量の測定が容易となる。
【００４７】
電圧印加手段は、反応容器中の反応溶液に電圧を印加しうる手段であればよく、典型的には、電源に接続された電極（作用極および対極）を挙げることができる。また、反応溶液における電気化学発光量を安定化させるためには、反応溶液に印加される電圧は正確に制御されることが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、電圧印加手段は、ポテンショスタットなどの電圧制御手段を含むものとされる。ポテンショスタットを用いることにより、作用極と参照極の間の電圧が設定した値になるように、作用極と対極に流れる電流を制御することが可能となる。
【００４８】
発光量測定手段は、液体からの発光量を測定しうる手段であればよく、例えば、当技術分野において周知の様々な発光量測定装置（特に、フォトンカウンター）を挙げることができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様による装置を図４に示す。図４に示される被験物質濃度測定装置６では、電極付透明キュベット７中において混合溶液が保持され、その後、該混合溶液に所定の電圧が印加される。電極付透明キュベット７中に設けられた電極はポテンショスタット８に接続されており、ポテンショスタット８において設定された電圧が混合溶液に印加される。この電圧の印加により生じた混合溶液からの電気化学発光の発光量は、発光量測定装置１８によって測定される。得られた測定値は検量線データを記憶した計算機９に送られ、この計算機９においてサンプル中の被験物質の濃度が算出され、表示される。
【００５０】
容器内における電極の配置は、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、図６に示す斜視図、図７に示す側面断面図、および図８に示す上面図で表されるように、四角柱型のキュベット１４において、一つの内壁の底部付近に作用極１７を配置し、これに向かい合う内壁の底部付近に対極１６および参照極１５を並列に配置することができる。あるいは、図９に示す斜視図、図１０に示す側面断面図、および図１１に示す上面図で表されるように、四角柱型のキュベット１４において、その底部に、参照極１５、作用極１７および対極１６をこの順番で並べることもできる。
【００５１】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明による装置は、前記容器中に予め標識被験物質などの試薬（群）を含んでなるものとされる。これにより、本発明による装置、特に該装置に含まれる容器は、特定の被験物質の定量を目的としたものとなる。この実施態様においては、前記容器は、本発明による装置に脱着可能なものとすることが好ましく、さらには、脱着可能な使い捨て容器とすることもできる。容器中に予め含まれる標識被験物質などの試薬（群）は、粉末などの固体、水溶性ゲル、または溶液等、容器に被験サンプル溶液が投入されたときにこれらとの混合を可能とする形態とすることができる。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による装置は、前記容器中において、被験サンプルおよび必要な試薬もしくは試薬群（例えば、標識被験物質および結合パートナー）を混合するための混合手段をさらに備えてなるものとされる。このような混合手段としては、容器内で液体を攪拌することのできる液体攪拌手段、例えば、マグネチックスターラーなどを挙げることができる。また、混合手段は、被験サンプル溶液、および必要な試薬または試薬群の溶液（例えば、標識被験物質溶液および結合パートナー溶液）の一つ、またはこれらの任意の組み合わせを自動的に容器中に投入するための溶液注入手段をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様による、前記混合手段を備えた装置を図５に示す。図５に示される被験物質濃度測定装置１０では、サンプル溶液用容器１１、標識被験物質溶液用容器１２、および結合パートナー溶液用容器１３が設けられており、これらの容器から混合溶液を構成する各溶液がポンプを通じて電極付透明キュベット７中に適宜注入され、そこで混合される。このポンプは、各溶液の注入量を個別に調整しうるものとされる。あるいは、各溶液のそれぞれについて、独立した別個のポンプを設けることもできる。電極付透明キュベット７中において混合溶液が形成された後は、図４について上述したように、本発明による定量法が実施される。
【００５４】
本発明による定量法は、アッセイ（例えば競合アッセイ）により生成した結合複合体と結合しなかった試薬とを分離する必要がなく、試薬の電極への固定化が不要であるため、従来の方法よりも簡便な操作により被験物質を検出および定量することができるという利点を有する。従って、本発明による定量法は、実験室以外の場所においても容易に実施することができ、環境センシング技術などへの応用も可能である。本発明による定量法はさらに、サンプル中に含まれる微量の被験物質を正確に定量できるという利点を有することから、ハイスループットな臨床診断等の医療用途への応用も可能である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００５６】
実施例１：競合アッセイによるヒト血清アルブミンの定量（１）
本実施例では、ヒト血清アルブミンを、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体に対する所定濃度の標識ヒト血清アルブミンとの競合アッセイによって定量した。
【００５７】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（和光純薬工業株式会社製）を、化学発光物質であるルミノール（ICN Biomedical社製）とのカップリング反応により標識化し、得られた標識アルブミンをサイズ排除クロマトグラフィーおよび透析により精製した（参考文献：Sensors and Actuators B 35-36, 458-462, 1996）。得られた標識アルブミン画分中のルミノールを、３４９ｎｍにおける吸光度の測定により定量した。また、標識アルブミン画分中のアルブミンを、タンパク質定量キット（Pierce社製）を使用した５６２ｎｍにおける吸光度の測定により定量した。これらの定量では、既知濃度のルミノールまたはアルブミンを含む試料について同様の吸光度測定を行なうことにより得られた検量線を用いた。その結果、調製した標識アルブミンの標識比は３０．４であった。
【００５８】
この標識アルブミンを標識抗原として、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、標識抗原中のルミノール濃度が１．０×１０−５Ｍとなるように溶解した。次いで、検量線を作製するために、被験抗原としてのヒト血清アルブミンを、標識アルブミンに対するモル比（アルブミン／標識アルブミン）が１０−１０、１０−８、１０−６、および１０−５となるように上記緩衝溶液に加えて十分に攪拌した。得られた各緩衝溶液に、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体（株式会社バイオテスト研究所製）を、標識抗原に対するモル比（抗ヒト血清アルブミン抗体／標識アルブミン）が０．５となるように添加し、５分間３７℃でインキュベートした。その後、過酸化水素を１００μＭとなるように各緩衝溶液に添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により化学発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
【００５９】
得られた結果を図２に示す。図２から明らかなように、被験抗原が２．２ｆｇ／ｍｌ〜２２０ｐｇ／ｍｌという希薄な濃度において、非常に高い相関係数（Ｒ＝０．９９８６）を有する検量線を得ることができた。さらに、既知濃度の被験抗原を含有する数種の抗原溶液について、上記と同様にして発光量を測定し、図２に示す検量線から抗原濃度を求めたところ、得られた測定値は既知の抗原含有量と良く一致していた。
【００６０】
実施例２：競合アッセイによるヒト血清アルブミンの定量（２）
本実施例では、実施例１において用いた条件の一部を変更して、ヒト血清アルブミンを、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体に対する所定濃度の標識ヒト血清アルブミンとの競合アッセイによって定量した。
【００６１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（和光純薬工業株式会社製）を、化学発光物質であるルミノール（ICN Biomedical社製）とのカップリング反応により標識化し、得られた標識アルブミンをサイズ排除クロマトグラフィーおよび透析により精製した（参考文献：Sensors and Actuators B 35-36, 458-462, 1996）。得られた標識アルブミン画分中のルミノールを、３４９ｎｍにおける吸光度の測定により定量した。また、標識アルブミン画分中のアルブミンを、タンパク質定量キット（Pierce社製）を使用した５６２ｎｍにおける吸光度の測定により定量した。これらの定量では、既知濃度のルミノールまたはアルブミンを含む試料について同様の吸光度測定を行なうことにより得られた検量線を用いた。その結果、調製した標識アルブミンの標識比は１８．０であった。
【００６２】
この標識アルブミンを標識抗原として、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、標識抗原中のアルブミン濃度が２２μｇ／ｍｌとなるように溶解した。次いで、検量線を作製するために、被験抗原としてのヒト血清アルブミンを、標識アルブミンに対するモル比（アルブミン／標識アルブミン）が１０−１１、１０−９、１０−７、１０−６、１０−５、および１０−４となるように上記緩衝溶液に加えて十分に攪拌した。得られた各緩衝溶液に、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体（株式会社バイオテスト研究所製）を、標識抗原に対するモル比（抗ヒト血清アルブミン抗体／標識アルブミン）が０．５となるように添加し、５分間３７℃でインキュベートした。その後、過酸化水素を１００μＭとなるように各緩衝溶液に添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により化学発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
【００６３】
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、被験抗原が２２０ａｇ／ｍｌ（３．３ａＭ）〜２．２ｎｇ／ｍｌ（３３ｐＭ）という希薄かつ広範な濃度領域において、非常に高い相関係数（Ｒ＝０．９８９）を有する検量線を得ることができた。さらに、既知濃度の被験抗原を含有する数種の抗原溶液について、上記と同様にして発光量を測定し、図３に示す検量線から抗原濃度を求めたところ、得られた測定値は既知の抗原含有量と良く一致していた。
【００６４】
実施例３：非競合アッセイによる１７β−エストラジオールの定量（１）
本実施例では、１７β−エストラジオールを、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）との特異的結合、ならびに該結合により得られる複合体とルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）との特異的結合を利用する非競合アッセイによって定量した。
【００６５】
(1)エストロゲンレセプターα（ＥＲα）溶液の調製
ＥＲα（和光純薬工業株式会社製）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を４００ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００６６】
(2)ルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）溶液の調製
エストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）としては、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ，AGGTCANNNTGACCT：配列番号１）を含むオリゴヌクレオチド：5'-GTCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTT-3’（配列番号２，下線部はエストロゲン応答配列，John D. Obourn et al., Biochemistry 32, 6229-6236, 1993）を用いた。５’末端にアミノ基を導入したＥＲＥ核酸を合成し、これをリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）中でイソチオシアネートルミノールと反応させて、ルミノール標識核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）を得た。これをリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を２００ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００６７】
(3)１７β−エストラジオール溶液の調製
１７β−エストラジオール（１６，１６，１７−ｄ３）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を０．０２〜２０ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００６８】
(4)アッセイ
各濃度に調整した１７β−エストラジオール溶液１００μｌとＥＲα溶液１００μｌを混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、Ｌ−ＥＲＥ核酸溶液１００μｌを加えて混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、４００μＭの濃度で過酸化水素を溶かしたリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）１００μｌを添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
【００６９】
(5)結果
得られた結果を図１２に示す。図１２によれば、本方法では０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１７β−エストラジオールの定量が可能となることがわかる。
【００７０】
実施例４：非競合アッセイによる１７β−エストラジオールの定量（２）
本実施例では、１７β−エストラジオールを、ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）との特異的結合、ならびに該結合により得られる複合体とエストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）との特異的結合を利用する非競合アッセイによって定量した。
【００７１】
(1)ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）溶液の調製
ＥＲα（和光純薬工業株式会社製）を、カップリング反応によりルミノールで標識した。得られたＬ−ＥＲαをゲル濾過クロマトグラフィーおよび透析により精製し、リン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させて、その濃度を４００ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００７２】
(2)エストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）溶液の調製
エストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）としては、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ，AGGTCANNNTGACCT：配列番号１）を含むオリゴヌクレオチド：5'-GTCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTT-3’（配列番号２，下線部はエストロゲン応答配列，John D. Obourn et al., Biochemistry 32, 6229-6236, 1993）を用いた。ＥＲＥ核酸を合成し、これをリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させて、その濃度を２００ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００７３】
(3)１７β−エストラジオール溶液の調製
１７β−エストラジオール（１６，１６，１７−ｄ３）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を０．０２〜２０ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００７４】
(4)アッセイ
各濃度に調整した１７β−エストラジオール溶液１００μｌとＬ−ＥＲα溶液１００μｌを混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、ＥＲＥ核酸溶液１００μｌを加えて混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、４００μＭの濃度で過酸化水素を溶かしたリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）１００μｌを添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
(5)結果
得られた結果を図１３に示す。図１３によれば、本方法では０．１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度の１７β−エストラジオールの定量が可能となることがわかる。
【００７５】
実施例５：非競合アッセイによる１７β−エストラジオールの定量（３）
本実施例では、１７β−エストラジオールを、ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）との特異的結合を利用する非競合アッセイによって定量した。
【００７６】
(1)ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）溶液の調製
ＥＲα（和光純薬工業株式会社製）を、カップリング反応によりルミノールで標識した。得られたＬ−ＥＲαをゲル濾過クロマトグラフィーおよび透析により精製し、リン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させて、その濃度を４００ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００７７】
(2)１７β−エストラジオール溶液の調製
１７β−エストラジオール（１６，１６，１７−ｄ３）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を０．０２〜２０ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００７８】
(3)アッセイ
各濃度に調整した１７β−エストラジオール溶液１００μｌ、Ｌ−ＥＲα溶液１００μｌおよびリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）１００μｌを混合して十分に撹拌した。次いで、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、４００μＭの濃度で過酸化水素を溶かしたリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）１００μｌを添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
【００７９】
(4)結果
得られた結果を図１４に示す。図１４によれば、本方法では０．２〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度の１７β−エストラジオールの定量が可能となることがわかる。
【００８０】
実施例６：非競合アッセイによるエストロゲンレセプターα（ＥＲα）の定量
本実施例では、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）を、１７β−エストラジオールとの特異的結合、ならびに該結合により得られる複合体とルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）との特異的結合を利用する非競合アッセイによって定量した。
【００８１】
(1)ルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）溶液の調製
エストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）としては、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ，AGGTCANNNTGACCT：配列番号１）を含むオリゴヌクレオチド：5'-GTCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTT-3’（配列番号２，下線部はエストロゲン応答配列，John D. Obourn et al., Biochemistry 32, 6229-6236, 1993）を用いた。５’末端にアミノ基を導入したＥＲＥ核酸を合成し、これをリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）中でイソチオシアネートルミノールと反応させて、ルミノール標識核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）を得た。これをリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を１０ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００８２】
(2)１７β−エストラジオール溶液の調製
１７β−エストラジオール（１６，１６，１７−ｄ３）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を１００ｐｇ／ｍｌに調整した。
【００８３】
(3)エストロゲンレセプターα（ＥＲα）溶液の調製
ＥＲα（和光純薬工業株式会社製）をリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）に溶解させ、その濃度を０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌに調整した。
【００８４】
(4)アッセイ
各濃度に調整したＥＲα溶液１００μｌと１７β−エストラジオール溶液１００μｌを混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、Ｌ−ＥＲＥ核酸溶液１００μｌを加えて混合した後、得られた混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、４００μＭの濃度で過酸化水素を溶かしたリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）１００μｌを添加し、９００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を作用電極に印加し、標識物質であるルミノールを電気化学的反応により発光させ、その発光量を３００秒間積算した。
【００８５】
(5)結果
得られた結果を図１５に示す。図１５によれば、本方法では０．０５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＥＲαの定量が可能となることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、被験物質を抗原とし、結合パートナーを抗体とした場合における本発明の原理を示すモデル図である。
【図２】図２は、ヒト血清アルブミンを、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体および標識ヒト血清アルブミンを用いて定量する場合における、ヒト血清アルブミン濃度と発光量との関係を示す検量線である。
【図３】図３は、ヒト血清アルブミンを、抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体および標識ヒト血清アルブミンを用いて定量する場合における、ヒト血清アルブミン濃度と発光量との関係を示す検量線である。
【図４】図４は、本発明の好ましい実施態様による被験物質濃度測定装置を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の他の好ましい実施態様による被験物質濃度測定装置を示す概略図である。
【図６】図６は、本発明の第一の実施態様による電極付キュベットを示す斜視図である。
【図７】図７は、本発明の第一の実施態様による電極付キュベットを示す側面断面図である。
【図８】図８は、本発明の第一の実施態様による電極付キュベットを示す上面図である。
【図９】図９は、本発明の第二の実施態様による電極付キュベットを示す斜視図である。
【図１０】図１０は、本発明の第二の実施態様による電極付キュベットを示す側面断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の第二の実施態様による電極付キュベットを示す上面図である。
【図１２】図１２は、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）およびルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）を用いて１７β−エストラジオールを定量する場合における、１７β−エストラジオール濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）およびエストロゲン応答核酸（ＥＲＥ核酸）を用いて１７β−エストラジオールを定量する場合における、１７β−エストラジオール濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ルミノール標識エストロゲンレセプターα（Ｌ−ＥＲα）を用いて１７β−エストラジオールを定量する場合における、１７β−エストラジオール濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図１５】図１５は、１７β−エストラジオールおよびルミノール標識エストロゲン応答核酸（Ｌ−ＥＲＥ核酸）を用いてエストロゲンレセプターα（ＥＲα）を定量する場合における、ＥＲα濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８７】
１  標識抗原中の化学発光物質
２  標識抗原中の抗原
３  被験抗原
４  抗体
５  標識抗原
６  被験物質濃度測定装置
７  電極付透明キュベット
８  ポテンショスタット
９  検量線データを記憶した計算機
１０  被験物質濃度測定装置
１１  サンプル溶液用容器
１２  標識被験物質溶液用容器
１３  結合パートナー溶液用容器
１４  キュベット
１５  参照極
１６  対極
１７  作用極
１８  発光量測定装置
【図１】
2006126162.tif 000003
【図２】
2006126162.tif 000004
【図３】
2006126162.tif 000005
【図４】
2006126162.tif 000006
【図５】
2006126162.tif 000007
【図６】
2006126162.tif 000008
【図７】
2006126162.tif 000009
【図８】
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【図９】
2006126162.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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