(57)【要約】【課題】  ノニルフェノール等のフェノール系化合物の分解能を有する新規な白色腐朽菌の提供と、これを用いた環境浄化方法及び環境浄化剤を提供する。【解決手段】  受託番号FERM P-20061で特定され、フェノール系化合物を分解する白色腐朽菌。この白色腐朽菌を用いて、フェノール系化合物を含む環境を浄化する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM P-20061で特定され、フェノール系化合物を分解する白色腐朽菌。
【請求項２】
請求項１記載の白色腐朽菌を用いて、フェノール系化合物を含む環境を浄化することを特徴とする環境浄化方法。
【請求項３】
上記環境に対して、請求項１記載の白色腐朽菌を作用させることを特徴とする請求項２記載の環境浄化方法。
【請求項４】
上記環境に対して、請求項１記載の白色腐朽菌の培養液、当該培養液精製物及び当該培養液由来物からなる群から選ばれる少なくとも１種を作用させることを特徴とする請求項２記載の環境浄化方法。
【請求項５】
請求項１記載の白色腐朽菌及び/又は当該白色腐朽菌の培養液を主成分とする環境浄化剤。
【請求項６】
請求項１記載の白色腐朽菌と当該白色腐朽菌以外の微生物とからなる混合株、請求項１記載の白色腐朽菌と当該白色腐朽菌以外の微生物との細胞融合株、請求項１記載の白色腐朽菌の変異株、及び請求項１記載の白色腐朽菌の遺伝子組換え株からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項５記載の環境浄化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノニルフェノール等のフェノール系化合物の分解能を有する白色腐朽菌、環境浄化方法及び環境浄化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業技術の発達、社会活動の多様化により事業場から排出される廃棄物の量は近年増大し、さらに複雑多様化している。結果として河川・湖沼・海域をはじめ廃棄物埋め立て地浸出水等に含有される、難分解性かつ生体毒性及び生物濃縮性を有する微量物質の存在が大きな問題となってきている。
【０００３】
例えば、合成洗剤、塗料、化粧品、プラスチック可塑剤等に含まれる化学物質のなかで、ビスフェノールＡ（2,2'-bis(4-hydroxyphenyl)propane：BPA）などのビスフェノール化合物や、ブチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノールなどのアルキルフェノールはごく微量で生体内のホルモンの分泌を撹乱させることが知られている。このような化合物は、一般に環境ホルモンといわれている（内分泌撹乱化学物質とも称される）。
【０００４】
アルキルフェノールは主に、プラスチック重合の際の抗酸化剤、可塑剤や界面活性剤（アルキルフェノールエトキシレート（APE）の形で）として用いられている。世界中で約70万トン/年、日本でも約4万トン/年が生産されている。アルキルフェノールは、エストロゲン様活性を持つと言われており、環境省のリストではこのうちノニルフェノール、4-オクチルフェノール、ビスフェノールAが環境汚染物質として挙げられている。また、アメリカにおいてAPEはノニオン系界面活性剤の25％を占め、主に繊維、ゴム、塗料などの工業分野の洗浄剤・乳化剤、農薬の乳化剤などに広く使用されている。アルキル基がオクチル（ｎ=8）、ノニル（ｎ=9）である避妊製品（マイルーラ（商標）等）にも用いられている。APEが微生物などにより分解されたアルキルフェノールは残留性が高く、生物の脂質中に蓄積する。イギリスの河川での魚の生殖異変の原因物質と見なされている。
【０００５】
環境ホルモンの脅威は、生物の存在を危うくする生殖や発育への深刻な影響であり、メスでは性成熟の遅れ、生殖可能齢の短縮、妊娠維持困難・流産などが、オスでは精巣萎縮、精子減少、性行動の異常などが報告されている。
【０００６】
環境ホルモンを分解する方法として、汚染された土壌を回収して加熱処理により分解する方法（特許文献1参照）、汚染された土壌を微生物で浄化する方法（特許文献2参照）、汚染された土壌で植物を栽培して植物に環境ホルモンを吸収させその植物体を焼却する方法（特許文献3参照）などが提案されているが、これらの方法は、いずれも環境ホルモンの分解能を有する微生物や植物が生育できる土壌系環境でしか浄化できないといった問題点があった。さまざまな異なる環境においてもノニルフェノール等の環境ホルモンを効率的に処理する方法は困難であった。したがって、いろいろな環境においても環境ホルモンを効率的に処理する方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特開平9-192641号
【特許文献２】特開平9-225450号
【特許文献３】特開平11-333442号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は上述したような実状に鑑み、ノニルフェノール等のフェノール系化合物の分解能を有する新規な白色腐朽菌の提供と、これを用いた環境浄化方法及び環境浄化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
(1)  受託番号FERM P-20061で特定され、フェノール系化合物を分解する白色腐朽菌。
(2)  (1)記載の白色腐朽菌を用いて、フェノール系化合物を含む環境を浄化することを特徴とする環境浄化方法。
(3)  上記環境に対して、(1)記載の白色腐朽菌を作用させることを特徴とする(2)記載の環境浄化方法。
(4)  上記環境に対して、(1)記載の白色腐朽菌の培養液、当該培養液精製物及び当該培養液由来物からなる群から選ばれる少なくとも１種を作用させることを特徴とする(2)記載の環境浄化方法。
(5)  (1)記載の白色腐朽菌及び/又は当該白色腐朽菌の培養液を主成分とする環境浄化剤。
(6)  (1)記載の白色腐朽菌と当該白色腐朽菌以外の微生物とからなる混合株、(1)記載の白色腐朽菌と当該白色腐朽菌以外の微生物との細胞融合株、(1)記載の白色腐朽菌の変異株、及び(1)記載の白色腐朽菌の遺伝子組換え株からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする(5)記載の環境浄化剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、汚染物質としてフェノール系化合物を含有する環境を浄化できる新規な白色腐朽菌を提供することができる。本発明に係る白色腐朽菌を使用することによって、様々な環境を浄化することができ、当該環境に含まれるフェノール系化合物を分解することで環境保護に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係る新規な白色腐朽菌は、ノニルフェノールの分解活性を指標としてスクリーニングされたものである。この白色腐朽菌をNP1158と命名した。白色腐朽菌NP1158は、2004年5月25日付けで特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1  中央第6）に受託番号FERM P-20061として寄託されている。
【００１３】
この寄託番号FERM P-20061であるNP-1158株の菌学的性質は以下の通りである。
Ａ.形態的性質
（1）コロニー色調：白色
（2）細胞形状：糸状、担子器の形成なし。
Ｂ.培養的性質
培養温度については4℃、10℃、20℃、28℃、30℃、37℃の各温度で増殖可能であった。最も生育速度（菌糸の伸び）が良かったのは28℃と30℃であった。4℃および10℃での生育速度はかなり遅かった。
Ｃ.化学分類学的性質
分類学上の位置：本菌は28S rDNA  D1/D2領域およびITS-5.8S rDNA の塩基配列による類縁関係から、 Bjerkandera  sp. 近縁種と推定している。
Ｄ．菌体外分泌酵素
リグニンペルオキシダーゼ（LiP）、マンガンペルオキシダーゼ（MnP）、マンガン非依存性ペルオキシダーゼ（MiP）を菌体外（培養液中）に産生する。
【００１４】
また、本発明に係る白色腐朽菌は、フェノール系化合物の分解活性を有しているが、フェノール系化合物以外の環境ホルモンの分解活性も有している。ここで環境ホルモンとは、生体の恒常性、生殖、発生又は行動に関与する種々の生体内ホルモンの合成、貯蔵、分泌、体内輸送、結合、そしてそのホルモン作用そのもの又はそのクリアランスなどの諸過程を阻害する性質を持つ外来性物質を意味する。当技術分野においては、内分泌撹乱化学物質とも称される。
【００１５】
本発明の白色腐朽菌によって分解できる環境ホルモンとしては、特に限定されないが、フェノール系化合物（例えば、ノニルフェノール以外に4-オクチルフェノール、ビスフェノールA、ビスフェノールAF、ビスフェノールF、ビスフェノールS、ペンタクロロフェノール（PCP）など）、ダイオキシン類（例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-ｐ-ジオキシン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾ-ｐ-ジオキシン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾ-ｐ-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾ-ｐ-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾ-ｐ-ジオキシン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、2,3,4,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8,9-ヘキサクロロジベンゾフラン、2,3,4,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾフランなど）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ：例えば、3,3’,4,4’-テトラクロロビフェニル、3,3’,4’,5-ペンタクロロビフェニル及び3,3’,4,4’,5,5’-ヘキサクロロビフェニルなど）、フタル酸エステル（例えば、ジブチルフタレート、ブチルベンジルフタレート及びジ-2-エチルヘキシルフタレートなど）、クロルピリホス、クロロフェノタン（ＤＤＴ）、ベンゾフェノン、ダイアジノン、フェニトロチオン（ＭＥＰ）、フェンチオン（ＭＰＰ）、ＥＰＮ（フェニルチオホスホン酸Ｏ-エチル-Ｏ-ｐ-ニトロフェニル）等が挙げられる。
【００１６】
本発明の白色腐朽菌は上記環境ホルモンのうちフェノール系化合物の分解に好適に用いられる。本発明においてフェノール系化合物とは、フェニル基の水素原子をヒドロキシ基で置換したヒドロキシフェニル基を少なくとも1個有する化合物及びその誘導体を意味する。誘導体にはベンゼン環の水素原子が炭素数1〜5のアルキル基、炭素数1〜5のエーテル基及びハロゲンから選ばれる1〜5個の置換基で置換されたヒドロキシフェニル基を有する化合物、フェノールのアルキルエーテル部分（例えば、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、プロポキシフェニル基など）を有する化合物などが含まれる。フェノール系化合物としては、具体的には、ビスフェノール、ハロゲン化フェノール、アルキルフェノールおよびこれらの上記誘導体が挙げられる。
【００１７】
ビスフェノールとは、ヒドロキシフェニル基が、好ましくはそれぞれパラ位で、2価の基を介して結合した化合物を意味する。ここで2価の基としてはスルホニル基、スルフィル基、2価の有機基、例えば、炭素数1〜6の直鎖状又は分枝状のアルキレン基、炭素数3〜6の2価の脂環式炭化水素基、フェニレン基、フェニレンジアキリデン（オルト、メタ、パラ）等が挙げられる。これらの2価の有機基は、ハロゲン及びフェニル基等で置換されていてもよい。ビスフェノールとしては、具体的には、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＡＦ、ビスフェノールＳ、ビスフェノールＭ、ビスフェノールＥ、ビスフェノールＰ、ビスフェノールＡＰ、ビスフェノールＺ等が挙げられる。本発明の白色腐朽菌が特に効果的に分解可能なビスフェノールは、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＡＦ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳである。
【００１８】
ハロゲン化フェノールとは、フェノールの水素原子が1個以上のハロゲン（例えば、フッ素、塩素及び臭素、好ましくは塩素）で置換されたフェノールを意味し、本発明の白色腐朽菌が特に効果的に分解可能なハロゲン化フェノール誘導体としては、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、クロロフェノール、ジクロロフェノール等が挙げられ、ハロゲン化フェノール誘導体としては、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールレッド等が挙げられる。
【００１９】
本発明に係る白色腐朽菌は、アルキルフェノールを特に効果的に分解する能力を有する。アルキルフェノールとは、フェノールのベンゼン環に結合した水素原子が1〜5個のアルキル基で置換された化合物を意味する。本発明に係る白色腐朽菌は、炭素数1〜9、好ましくは炭素数4〜9の直鎖状又は分枝状のアルキル基を有するアルキルフェノールの分解に好適に用いられる。
【００２０】
本発明に係る白色腐朽菌は、上記アルキルフェノールが炭素数1〜5のアルキル基、炭素数1〜5のエーテル基及びハロゲンから選ばれる1〜4個の置換基でさらに置換されたアルキルフェノール誘導体の分解にも好適に用いられる。好適なアルキルフェノールとしては、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、イソペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、2,6-ジ-ｔ-ブチル-4-メチルフェノール（ＢＨＴ）等が挙げられ、アルキルフェノール誘導体としては、3-ｔ-ブチル-4-ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等が挙げられる。これらアルキルフェノールは、アルキル基がヒドロキシ基に対してオルト、メタ又はパラ位にあるいずれの異性体についても本発明の方法を適用できる。本発明は、とりわけ、ノニルフェノール（ｏ-ノニルフェノール、ｍ-ノニルフェノール及びｐ-ノニルフェノール、特にｐ-ノニルフェノール）を効果的に分解する能力を有する。ノニルフェノール（C9H19・C6H4OH）の化学構造式は以下の通りである。
【００２１】
【化１】
2006158288.tif 000002
【００２２】
また、本発明に係る白色腐朽菌は、上記アルキルフェノールのアルキルエーテル、例えば、アルキルフェノールメトキシレート、アルキルフェノールエトキシレート及びアルキルフェノールプロポキシレートの分解にも好適である。
【００２３】
例えば、工場から排水された界面活性剤のアルキルフェノールエポキシレート等は河川から海へ流入する過程で、微生物分解を受けてノニルフェノール等のアルキルフェノールになり、河口から沿岸海域を汚染している。したがって、本発明に係る白色腐朽菌は、工場から排水されたアルキルフェノールエポキシレート等を含む水環境の浄化に特に有効である。
【００２４】
一方、本発明に係る白色腐朽菌は、水1ｍ3当り、KH2PO42kg、MnSO4H2O 500g、CaCl 100g、NH4Cl 120g、チアミン1ｇ及びグルコース10ｋｇを含む培地、ポテトデキストロース等の培地で培養することができる。本発明に係る白色腐朽菌の培養条件は、好ましくは、好気的条件下とし、培養温度を15〜45℃とし、pH4〜7とし、培養期間を約2〜14日間程度とする条件である。また、本発明に係る白色腐朽菌は、固体培養を行っても良いし、液体培養を行っても良い。液体培養の場合、振とう培養又は静置培養で行う。
【００２５】
本発明における白色腐朽菌は、4-ノニルフェノールを5mg/50mLの濃度で含む液体培地に接種して、30℃で2週間振とう又は静置培養を行った場合に、上記培地に微生物を添加せずに30℃で2週間振とうさせた対照における4-ノニルフェノール濃度に対して、4-ノニルフェノールを90重量％以上、好ましくは80重量％以上、より好ましくは60〜80重量％以上で分解する能力を有する。
【００２６】
以上説明した本発明に係る白色腐朽菌を用いて環境を浄化することができる。ここで、環境としては、特に限定されないが、例えば、農地、焼却灰、焼却灰を含む焼却場周辺、工場跡地及び原油流出事故現場の土壌を挙げることができる。また、環境としては、河川の底泥を挙げることができる。さらに、環境としては、河川、農業用水、工業用水、湖沼、地下水、工場排水等の水環境を挙げることができる。なお、環境に含まれる環境ホルモン等は一種類であってもよいが複数種類であっても良い。
【００２７】
本発明に係る白色腐朽菌は、上述した各種環境に含まれるフェノール系化合物を分解することができる。また、上記環境に含まれるフェノール系化合物を分解して当該環境を浄化する際には、この白色腐朽菌自体を用いても良いし、この白色腐朽菌を含む培養液（以下、単に「培養液」と呼ぶ）を用いても良い。また、培養液をろ過、遠心分離若しくは抽出等の精製処理を行った後に使用しても良いし、又は培養液を水等で希釈して使用しても良い。
【００２８】
一方、本発明に係る白色腐朽菌の培養液から抽出した、環境ホルモンを分解する分解酵素を使用して上記環境を浄化してもよい。この分解酵素は、汚染物質を分解又は無害化して浄化する作用を有するものであれば特に限定されず、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が挙げられる。分解酵素もまた、そのまま使用しても良いし、又は水等で希釈して使用することができる。
【００２９】
本発明に係る白色腐朽菌を用いて環境を浄化する際には、上述した白色腐朽菌自体、培養液及び/又は分解酵素を、汚染土壌表面に散布する方法、注入管から土壌中に注入する方法などにより汚染土壌に作用させることができる。さらにまた、上述した白色腐朽菌自体、培養液及び/又は分解酵素を不織布等に接種したものを、汚染土壌上に静置して作用させても良い。また、上述した白色腐朽菌自体、培養液及び分解酵素は、それぞれ単独で作用させても良いし、又は適切に組み合わせて作用させても良い。
【００３０】
また、汚染された事業場排水、河川水や湖沼水等を汲み上げ、予め環境ホルモンの吸着・濃縮を行った後で白色腐朽菌または培養液（分解酵素を含む）を添加して環境ホルモンの分解を行っても良い。環境ホルモンを分解する前に、予め吸着・濃縮等を行うことにより、さらに効率的に分解を行うことができる。
【００３１】
吸着剤としては特に限定されないが、アルミナ、イオン交換、活性炭、シリカ、木片、炭、活性白土、ゼオライト、アルカリ土類金属があるが、特に活性炭が好ましい。次に濃縮した環境ホルモンに分解菌、ならびに栄養塩、水分、空気等を投入し、白色腐朽菌を増殖させて効率良く分解する。
【００３２】
本発明において、吸着剤による吸着を行う場合、吸着方法としては、汚染水を吸収剤充填カラムに通す方法、又は汚染された地中に吸着剤からなる隔壁を埋設する方法などがある（特開2001-017991号）。
【００３３】
また、例えば、浄化対象の環境が水環境である場合、以下の方法によって浄化することもできる。
【００３４】
１）上記白色腐朽菌又は上記白色腐朽菌の培養液を添加する方法
この方法においては、浄化対象の水環境に対して上述した培地を添加する。このとき、浄化対象の水環境のpHは3〜6の範囲が好ましく、3.5〜4.5の範囲がより好ましい。例えば、浄化対象の水環境に対してアルカリ又は酸を添加し、洗浄対象の水環境のpHを上記範囲に調節することができる。水環境のpHを上記範囲に調節することによって、白色腐朽菌の増殖及びダイオキシン分解酵素等の有機塩素化合物分化酵素の作用が好適になる。
【００３５】
その後、前培養で調整した白色腐朽菌又はこれらの培養液を用いて、浄化対象の水環境に植菌し、白色腐朽菌を水環境中で培養する。培養する際の温度は10〜40℃の範囲、好ましくは20〜37℃である。培養日数は特に限定はなく、浄化対象の水環境に含まれる有機塩素化合物等を充分に分解できる日数である。なお、白色腐朽菌による有機塩素化合物等の分解には、過酸化水素が必須であり、白色腐朽菌が産生する過酸化水素が不足する場合には、適宜添加することが好ましい。
【００３６】
２）上記白色腐朽菌が産生する酵素液を添加する方法
この方法においては、浄化対象の水環境における酵素の作用が好適になるように、アルカリ又は酸を添加し、水環境のpHを調製する。水環境のpHは3〜6の範囲、好ましくは3.5〜4.5である。あるいは、水環境に対してpH緩衝剤(バッファー)を添加することで、水環境のpHを調製することもできる。pH緩衝剤としては、3〜6の範囲、好ましくは3.5〜4.5で緩衝作用を示すものを使用することが好ましい。また、浄化対象の水環境に２価マンガンイオンを存在させることによって、有機塩素化合物等の分解を促進することができる。したがって、浄化対象の水環境に対してMnSO4、MnCL2等を、浄化対象の水環境に含まれる２価マンガンイオン濃度が0.01〜100mM、好ましくは0.1〜1mMの範囲になるように添加する。その後、酵素液を添加し、10〜40℃の範囲、好ましくは20〜37℃で処理する。処理日数は特に限定はなく、有機塩素化合物等が充分に分解できる日数である。
【００３７】
一方、浄化対象の環境が土壌（焼却灰を含む）である場合、以下の方法によって浄化することができる。
【００３８】
１）上記白色腐朽菌又は上記白色腐朽菌の培養液を添加する方法
この方法では、先ず、浄化対象の土壌を水に分散し懸濁液としたものを調製する。そして、上述した浄化対象が水環境の場合の処理に準じて、調製した懸濁液を処理する。また、上記白色腐朽菌又は白色腐朽菌の培養液を浄化対象の土壌に直接添加し、混合して処理することもできる。
【００３９】
２）上記白色腐朽菌が産生する酵素液を添加する方法
この方法においても、先ず、浄化対象の土壌を水に分散し懸濁液としたものを調製する。そして、上述した浄化対象が水環境の場合の処理に準じて、調製した懸濁液を処理する。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
[実施例１]白色腐朽菌ＮＰ-1158株のスクリーニング
国内森林から採取した数千株のうち、パルプ脱色性に優れた白色腐朽菌52株についてノニルフェノールなどの難分解性物質の分解酵素を持つ株のスクリーニングを行った。ノニルフェノールが10〜100ppmの濃度範囲になるように添加したポテトデキストロース液体培地またはBasal ＩＩＩ液体培地（組成について表１及び表２参照）に各菌株を接種して30℃、2週間の分解試験（静置培養）を行った。その結果いずれの菌株も分解活性を示したが、その中で最も分解活性の高かった1株を選抜し、NP1158と命名した。
【００４２】
【表１】
2006158288.tif 000003
【００４３】
【表２】
2006158288.tif 000004
【００４４】
以上のように単離した白色腐朽菌NP1158株について、ノニルフェノール分解能を調べた。ノニルフェノールとして、4−ノニルフェノール（5mg/50mL）を含むポテトデキストロース培地に、白色腐朽菌NP1158株を接種し、30℃で２週間静置培養を行った。この試料（試料Ｂ）についてノニルフェノール残存量を測定した。なお、対照として、上記と同様のノニルフェノールを含む培地に、上記菌株を接種せずに30℃で２週間静置培養した試料（試料Ａ）についても、ノニルフェノール残存量を測定した。この結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2006158288.tif 000005
【００４６】
表３から、試料Bにおけるノニルフェノールの実質分解率は、83重量％と算出できる。これは以下の式に基づく。
実質分解率＝（１−試料Bにおける残存質量/試料Aにおける残存質量）×１００
すなわち、白色腐朽菌NP1158株とともに培養した培地ではノニルフェノールが効率的に分解されていることが分かる。
【００４７】
以上の結果から、本実施例で取得したNP-1158株は、フェノール系化合物を分解する能力を有すると結論付けることができる。
【００４８】
[実施例２]白色腐朽菌NP1158株の系統分類
実施例2では実施例1で得られたNP-1158株について以下のような系統分類を行った。
（1）28SｒDNA-D1/D2塩基配列解析
実施例1でノニルフェノールの分解活性の高い株としてスクリーニングされたNP1158株をポテトデキストロース寒天培地（日本製薬）上で増殖させ、集菌後FastPrepFP120（Qbiogene ILLKIRCH CEDEX）とFastDNA Kit（Qbiogene ILLKIRCH CEDEX）を用いてゲノムDNAを分離した。このゲノムDNAをテンプレートとして、28SｒDNA フラグメントのPCR増幅を行った。
【００４９】
PCRはpuReTaq Ready-To-Go PCR beads（Amersham Biosiences）とプライマーITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'：配列番号１）およびNL4（5'-ACCAGGCACAAAGTTCTGCC-3'：配列番号２）を用い、Gene Amp PCR System9600（Applied Biosystems）上でサーマルサイクルを行った。得られたDNAフラグメントはQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製し、サイクルシークエンス反応に供した。サイクルシークエンス反応はABI PRISM BigDye Terminator Kit(Applied Biosystems)とプライマーNL1,NL2,NL3およびNL4を用い、Gene Amp PCR System9600（Applied Biosystems）上で反応を行った。なお、プライマーNL1の塩基配列はGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG（配列番号３）であり、プライマーNL2の塩基配列はGAGAGAAAAGTTTCAAGAAAAGTAGA（配列番号４）であり、プライマーNL3の塩基配列はAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG（配列番号５）である。
【００５０】
反応生成物はDyeEx2.0 Spin Kit（QIAGEN）を用いて精製し、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer （Applied Biosystems）で配列解読を行い、AutoAssembler（Applied Biosystems）を用いて各シークエンス断片を結合し、目的塩基配列を得た。類似の塩基配列をGenBankから検索するため、BLASTによる相同検索を行った。さらに、近隣結合法による分子系統樹を作製した。
【００５１】
検索の結果、Bjerkandera  adustaと相同性は99.8％で、分子系統樹においても単系統となった。
【００５２】
（2）ITS-5.8SｒDNA塩基配列解析
ゲノムDNAをテンプレートとして18SｒDNA 3’末端から28SｒDNA-D1/D2領域までのITS1、ITS2および5.8SｒDNA領域を含むDNAフラグメントのPCR増幅を行った。その後、上記と同様の操作により、目的の塩基配列を得た。類似の塩基配列をGenBankから検索するため、BLASTによる相同検索を行った。さらに、近隣結合法による分子系統樹を作製した。
【００５３】
検索の結果、Bjerkandera  adustaと相同性は98.9％で、分子系統樹においてBjerkandera属を含む系統の5系統群に分かれた。
【００５４】
以上の結果を総合すると、NP-1158は現在公開されているデータの解析からはBjerkandera  adustaと比較的近縁ではあるものの別種であると結論づけた。
【配列表】
2006158288000001.app