(57)【要約】【課題】  生物学的材料などの核酸を含有する試料から核酸を簡便な操作で高収率に捕捉する方法を提供する。【解決手段】  核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法において、該試料中に存在する核酸よりも実質的に低サイズの分子及び／又は不織布の目詰まりの原因となる物質を排除した後に該試料を不織布に接触させることを特徴とする方法。好ましくは核酸よりも実質的に低サイズの分子をゲル濾過などの分子ふるいにより排除することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法において、該試料中に存在する核酸よりも実質的に低サイズの分子及び／又は不織布の目詰まりの原因となる物質を排除した後に該試料を不織布に接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
核酸よりも実質的に低サイズの分子を分子ふるいにより排除する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子ふるいをゲル濾過により行なう請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸よりも実質的に低サイズの分子がタンパク質及び／又は微粒子である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法に用いるためのキットであって、少なくとも
(a)分子ふるい用担体；及び
(b)不織布
を含むキット。
【請求項６】
さらに(c)洗浄液及び／又は(d)タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、及びアルカリからなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を含む前処理液が組み合わされた請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料などの核酸を含有する試料から核酸を不織布に捕捉する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸分析の用途は、科学研究、医療、及び産業界など様々な分野に広がりつつあり、各種起源からの試料を原料として効率的に、しかも高純度に核酸を抽出し、精製できる方法が求められている。
【０００３】
核酸を含有する試料から核酸を得る方法としてはフェノール・クロロホルム抽出法が古くから利用されてきた。この方法はフェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの水難溶性の検体成分を変性、溶解、又は沈殿させる一方、核酸を水相に溶解するという溶解度の違いを利用する方法である。フェノールやクロロホルムは有毒な溶媒であることから、これらを使用しない代替方法として、核酸結合性担体としてシリカを中心とする固相担体及びカオトロピック物質を使用する核酸の単離方法が知られている（Boom et al. J. Clin. Microbiol. 28:495-503 (1990)、特許第2680462号、特公平7-13077号公報など）。この方法は、カオトロピック溶液を利用してタンパク質、脂質等の夾雑物を水相に可溶化し、核酸をシリカビーズに吸着させて固相で回収した後、核酸を再び水相に溶解する方法である。しかしながら、この方法は遠心分離という煩雑な操作を必要としており、多方面で簡便に利用できる実用性を備えた方法ではない。同様の理由により、超遠心分離、電気泳動法やクロマトグラフィーなどの従来の分離技術を用いる方法も実用性の観点からは到底満足すべきものとは言えない。
【０００４】
また、最終的に精製した核酸の純度及び性状に関しても、その利用面からの制約があり、核酸の分画及び精製には一定の要件が課される。具体的には、増幅又は核酸分析などにおけるポリメラーゼ、ＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、又は逆転写酵素などの基質として直接使用できるような高純度で妨害物質を含まない核酸を必要量確保できることが必要である。このように、生物起源の様々な核酸含有試料から、有毒溶媒を使用することなく、簡便かつ迅速に核酸を分画化でき、しかも核酸を高純度に抽出精製できる方法、理想的には自動化の途も開けている方法が切望されている。
【０００５】
フィルターを用いて細胞から核酸を直接精製する方法がＷＯ００／２１９７３に開示されている。この方法は以下の工程を含んでいる。（１）まず、細胞を含む試料をフィルターにかけて細胞をフィルターに吸着させる。（２）次にフィルターに吸着された細胞を溶解し、（３）フィルターで濾過する。（４）フィルターに吸着された核酸を洗浄する。（５）最後に、核酸をフィルターから溶出する。吸着した核酸は４０℃から１２５℃に加温すると溶出され、溶出バッファーのｐＨは５から１１の範囲で、塩濃度は高くても低くてもよい。精製された核酸のＡ260／Ａ280は１．８であり、ＰＣＲの鋳型として使用可能である。ＷＯ００／２１９７３には、核酸を精製する目的に使用可能なフィルターの例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられており、一方、使用不可能な例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられているが、該方法に適したフィルターは、精製ＤＮＡをフィルターに通しても精製ＤＮＡを捕捉しないことが必須である。また、この方法において、細胞を溶解してからフィルターにかけるとＤＮＡの収率が８０％低下してしまうので実用的ではない。さらに、この方法を用いて血液から核酸を調製する場合、実験者は白血球を溶解する前に赤血球を溶血させる必要がある。加えて、上記のように細胞をフィルターに吸着させてから精製する方法では、細胞の種類に応じてフィルターを選択しなければならないという欠点がある。
【０００６】
これらの欠点を克服したさらに簡便な方法として、不織布を用いて核酸を分離、増幅、及び検出する方法がＷＯ０３／００６６５０に開示されている。この方法は、まず細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させ、次に該不織布に核酸を増幅するための溶液を加えて、該不織布に吸着された核酸を鋳型として核酸を増幅する工程を含んでいる。この方法では特別な試薬を一切用いることなく不織布に試料中の核酸を接触させるという非常に簡便な方法により、核酸を不織布上に精製することが可能である。また不織布上に精製した核酸は核酸合成反応液に接触させることにより、そのまま増幅反応が可能であり、核酸の検出が簡便である。しかしながら、この方法では比較的低濃度（１ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ）の核酸を捕捉する場合に試料中に共存するタンパク質、例えばアルブミンやグロブリンなどの影響で捕捉率が大幅に低下する欠点がある。
【特許文献１】ＷＯ０３／００６６５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、生物学的材料などの核酸を含有する試料から核酸を簡便な操作で高収率に捕捉する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような事情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進めた結果、ＷＯ０３／００６６５０に記載された不織布を用いて核酸を分離、増幅、及び検出する方法において、試料をあらかじめ分子ふるいにかけるなどの手段により核酸よりも低サイズの分子及び／又は不織布の目詰まりの原因となる物質を排除し、その後に試料を不織布に接触させることによって、試料中の核酸を極めて効率的に捕捉できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明により、核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法において、該試料中に存在する核酸よりも実質的に低サイズの分子及び／又は不織布の目詰まりの原因となる物質を排除した後に該試料を不織布に接触させることを特徴とする方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、核酸よりも実質的に低サイズの分子を分子ふるいにより排除する上記の方法；分子ふるいをゲル濾過により行なう上記の方法；核酸よりも実質的に低サイズの分子がタンパク質及び／又は微粒子である上記の方法が提供される。
別の観点からは、本発明により、核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法に用いるためのキットであって、少なくとも(a)分子ふるい用担体及び(b)不織布を含むキットが提供される。このキットには(c)洗浄液及び／又は(d)タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、及びアルカリからなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を含む前処理液が組み合わされていてもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、細胞抽出液などの試料に含まれる核酸を極めて簡便かつ効率的に不織布表面に捕捉することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、ＷＯ０３／００６６５０に記載された核酸の捕捉方法、すなわち核酸を含有する試料を不織布に接触させて該試料中の核酸を不織布表面に捕捉する方法において、該試料中に存在する核酸よりも実質的に低サイズの分子及び／又は不織布の目詰まりの原因となる物質を排除した後に該試料を不織布に接触させることを特徴としている。ＷＯ０３／００６６５０の開示の全てを参照により本明細書の開示に含める。
【００１２】
本明細書において、「核酸」の用語はＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ・ＤＮＡ共同体等が含まれ、非天然型の核酸塩基を含むものも包含する概念として用いる。
本発明の方法に用いる試料は、核酸を含有する試料であればその種類は特に限定されない。具体的には、試料として、細胞破砕液、動物若しくは植物の組織、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、尿、糞便、若しくは唾液等の各種体液、細胞培養上清、微生物（具体的には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、サイトメガロウィルスなどの細菌、ウィルス、又は真菌）などが挙げられる。さらに、例えば、インビトロ転写および/またはｃＤＮＡ合成および/または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）後の核酸を含む混合物なども挙げることができる。試料はそのまま使用してもよく、あるいは何らかの目的に合致するように希釈されていてもよい。
【００１３】
血液は、通常の末梢血、動脈血、静脈血、又はこれらに遠心処理等を施してから採取した有形成分、バフィコート（白血球フラクション）であってもよい。全血又は血液の有形成分を対象とする場合、溶血操作を行うことが好ましい。採血にあたって採血管の種類には特に限定されず、ヘパリン採血管、ＥＤＴＡ採血管、又はクエン酸採血管などのいずれを使用してもよい。本発明の方法において血液を試料として用いる場合、血液量は特に限定されず、例えば、数μＬ〜数十ｍＬと極めて広範囲の血液量に対応することができる。なお、細胞溶解及び核酸の捕捉操作などにおいて、温度及び時間の条件は、無用な副反応や核酸の傷害を防止する観点から通常これらの操作を行なう標準的な条件に従うことが望ましい。
【００１４】
一般的に、上記試料中に含まれる核酸は、細胞、細菌、又はウィルス等に内包された形で存在している場合が多い。このような場合には、タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、又はカオトロピック物質などの少なくとも一種を含む前処理液を試料に作用させて、細胞、細菌、又はウィルス等を破壊する前処理を行うことが核酸の捕捉率を高めるために好ましい。
【００１５】
タンパク質分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、プロティナーゼ、ペプチドヒドロナーゼ、ペプチダーゼ、プロナーゼなどを用いることができる。このようなタンパク質分解酵素を試料中に添加することにより、核酸とタンパク質との分離度を上げることができる。プロテアーゼの具体例として、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロテアーゼＫ、プロナーゼ、又はパパインおよびこれらの類似型やサブ系などが挙げられる。これらのタンパク質分解酵素は生物から抽出したものであってもよく、あるいは遺伝子組み換え技術により調製された酵素であってもよい。また、これらの多くの酵素は、市販品を入手可能である。これらは単独で、あるいは組み合わせて使用してもよい。これらのうち、プロテイナーゼＫ又はプロナーゼ等が特に好適に用いられる。前処理液中での濃度は、例えば、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【００１６】
界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤が挙げられ、これらのうち、陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドなどを挙げることができる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、高級アルコール硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、サルコシン、コール酸、又はデオキシコール酸などを挙げることができる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリエチレンエーテル系（Triton）界面活性剤、ポリオキシエチレン系（Brij）界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン系（Tween）界面活性剤、又はポリグリコールエーテル系（Tergitol）界面活性剤などを挙げることができる。両性界面活性剤としては、例えば、フォスファチジルエタノールアミンなどを挙げることができる。これらの界面活性剤は単独で用いてもよく、あるいは２種以上併用することも可能である。これらの界面活性剤の前処理液中の濃度は、通常は０．００５〜１０％（w/v）程度であることが好ましく、０．０１〜５％（w/v）であることがさらに好ましい。
【００１７】
還元剤は、試料中に含まれるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを失活させる目的で使用される。チオール系還元剤を用いることが好ましく、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、システイン、又はグルタチオンなどが挙げられる。このうち、２−メルカプトエタノール又はジチオスレイトールなどが特に好ましい。還元剤の前処理液中での濃度は、例えば、０．００１〜１０％（w/v）程度であることが好ましく、０．０１〜５％（w/v）であることが特に好ましい。
【００１８】
キレート剤は、二価金属イオンをキレートする作用を有するものが好ましく、例えば、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸塩（ＥＧＴＡ）などが特に好ましい。キレート剤の前処理液中での濃度は、例えば、０．１〜５００ｍＭであることが好ましく、０．５〜２００ｍＭであることが特に好ましい。
【００１９】
カオトロピック溶液を調製するためのアルカリとしては、水溶液中でアルカリ性を示すものであれば任意のものを使用できる。例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属元素の水酸化物、水酸化カルシウムや水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属元素の水酸化物、アルカリ金属元素の炭酸塩、アンモニア、アミンまたはそれらの組み合わせから選ぶことができる。これらのうち、前処理液には水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属元素の水酸化物を特に好ましく用いることができる。アルカリは水溶液（カオトロピック溶液）として用いることが好ましく、その濃度は０．１〜１０．０Ｍが好ましく、０．２〜８．０Ｍがさらに好ましい。
【００２０】
核酸の安定性を保つため、緩衝剤を添加して前処理液のｐＨをｐＨ２〜１３、好ましくはｐＨ５〜１０に調整することも可能である。緩衝剤としては、例えば、トリス−塩酸、リン酸二水素カリウム−リン酸水素二ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、又はクエン酸等があげられ、その使用濃度は１〜５００ｍＭの範囲が好適である。
【００２１】
前処理液で核酸含有試料を処理する条件は特に限定されないが、例えば、核酸含有試料１００μｌ〜１０ｍｌに対して前処理液を１μｌ〜１０ｍｌ加えてよく混合し、４０〜９８℃で１０分以上加温することが好ましい。特に、タンパク質分解酵素を添加する場合は、該酵素活性の至適温度である４５〜７５℃で反応を行なうことが好ましい。なお、試料及び／又は前処理液は水溶液であってもよいが、水性有機溶媒（例えばグリセリンやエチレングリコールなど）を少量含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の方法では、該試料中に存在する核酸よりも実質的に低サイズの分子を排除する工程が必須である。上記の排除を行なうための手段は、上記工程の目的を達成できるものであれば特に限定されず、当業者に利用可能な任意の手段を単独で、あるいは２以上の手段を適宜組み合わせて採用することができる。一般的には下記に説明する分子ふるいの手段を採用することが好ましく、以下では好ましい態様として分子ふるいについて説明するが、上記工程のための手段は分子ふるいに限定されることはない。
【００２３】
分子ふるいは、例えば、分子ふるいクロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせから選ぶことができる。ここで示したクロマトグラフィーのための担体としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、デキストラン、リケナン、イソリケンナン、ラミナラン、カラゲーナン、アガロース、キシラン、マンナン、グルコマンナン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、シリカ、ケイ素、ゼオライト、ビニルなどの有機系ポリマー、またはそれらの高次架橋体などを用いることができる。核酸との疎水的な結合の影響を受けないようにするため、担体表面が親水性でゲルの強度を強めたデキストラン高架橋体が好ましい。
【００２４】
上記担体の形状は特に限定されず、任意の形態の担体を用いることできる。例えば、担体は粒子状、繊維状、シート状、チューブ状、又は板状などの形状であってもよい。担体は、フィルターなどの適当な構造体として用いることもできる。核酸混合物を収容する容器またはその一部を担体の一部として含んでいてもよい。好ましい形態は、担体に結合した物質と遊離物質とを容易に分離し得る形態であり、上記の中で、粒子状のものが特に好ましい。粒子の形状としては、例えば球形、楕円体形、錐体、立方形、又は直方体形などが挙げられる。これらのうち、球形粒子の担体は製造がしやすく好ましい。粒子の粒径は、０．１μｍ〜４ｍｍ、好ましくは０．５μｍ〜３ｍｍである。
【００２５】
分子ふるいカラムに使用する担体の量は特に限定されないが、例えば、核酸含有試料１００μｌに対して０．１〜２ｍｌｂｅｄが好ましく、０．５〜１ｍｌｂｅｄがさらに好ましい。ビーズ状の多糖担体である場合は、その大きさおよび表面粗さによって使用量は異なるが、例えば核酸含有試料１ｍｌにつき５ｍｌｂｅｄ程度である。分子ふるいの方法はカラムクロマトグラフィー方式が好ましい。
【００２６】
分子ふるい工程において、核酸含有試料に含まれる種々の成分は分子ふるい効果により異なる時間で流出する。例えば、ＤＮＡに対し２００００ｂｐがカットオフ分子量となる担体を使えば、ゲノムＤＮＡなどの２００００ｂｐ以上のＤＮＡは担体の細孔部分に侵入せずに先に流出する。一方、生体試料中に混入するタンパク質、脂質、電解質と前処理過程で混入するタンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、又はアルカリなどは、一般的に核酸より実質的にサイズが小さく、上記のカットオフ分子量よりも小さい分子として挙動するので、担体の細孔部分に侵入して流出が遅くなる。このように分子ふるい過程では、例えば、タンパク質、脂質、電解質、タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、又はアルカリに比べてゲノムＤＮＡは先に流出する。試料を分子ふるい工程で処理することにより、捕捉対象となる核酸よりも実質的にサイズが小さい分子を排除し、これによって不織布表面への拡散の捕捉効率を大幅に高めることができる。
【００２７】
本明細書において、「核酸よりも実質的にサイズが小さい分子」とは、一般的な分子ふるい工程において核酸よりも遅れて流出する分子のことを意味しており、捕捉対象となる核酸よりも分子量が小さいか、あるいは分子の長さが短いなどの理由により、分子ふるいにおいてふるい効果により核酸よりも流出が遅くなる分子のことである。この用語は、いかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。分子ふるいの原理に従い、捕捉すべき核酸のサイズに応じた細孔を有する担体を使用することが望ましい。特に目的の核酸を細孔に導入せず、かつタンパク質、脂質、電解質、タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、又はアルカリなどを細孔に導入するような担体を使用することが好ましい。
【００２８】
不織布で核酸を捕捉させる工程において、不織布を詰まらせる微粒子が存在すると捕捉効率が低下する場合がある。分子ふるい工程では、不織布を詰まらせる原因となる物質の除去を行なうことも好ましい。「不織布の目詰まりの原因となる物質」とは、多孔質物質のフィルターを用いた濾過操作において液体とは分離可能であり、かつ液体に対して不溶性の物質のことである。多孔質物質のフィルターとしては、例えば、濾紙、ガラスフィルター、不織布、メンブランフィルター等が例示される。濾過操作において液体と分離できる固体は、一般的には球状や多面体等を形成するが、球状であれば通常は直径数百nm以上の粒子である。例えば、核酸含有試料としての細胞破砕液、動植物の組織、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、尿、糞便、唾液等の各種体液、細胞培養上清、又は微生物（具体的には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、サイトメガロウィルスなどの細菌、ウィルス、真菌）中には、数百ｎｍから数十μｍの微粒子が試料中に夾雑することがあり、これらの粒子が不織布で捕捉され、多量に存在する場合は不織布を詰まらせて核酸の捕捉効率を低下させる原因となる。これらの微粒子を分子ふるいで排除した後の試料を不織布に接触させることが好ましい。微粒子の排除は、一般的には上記の分子ふるい工程を行なうことにより同時に達成できる。
【００２９】
分子ふるい工程を経た試料を不織布に接触させることによって、試料中の核酸を不織布表面に効率的に捕捉させることができる。本発明の方法では、特別な試薬を用いることなく、不織布に試料中の核酸を接触させるという非常に簡便な方法により、核酸を不織布上に極めて効率的に捕捉させることができ、その後の核酸の精製及び濃縮などを達成することが可能である。
【００３０】
不織布とは、短繊維またはフィラメントを機械的、熱的、又は化学的な手段を用いて接着または交絡させて作るシート状またはウェブ構造のものである（第２版  繊維便覧  繊維学会編  丸善）。不織布はさまざまな方法で生産されるが、基本的な工程はウェブ（繊維の方向がある程度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程と、ウェブの接着工程、それに仕上げ工程である。不織布には天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられているが、一般的に用いられているのは、例えば、綿、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、ナイロンであり、その他アクリル、ビニロン、ガラス繊維、パルプ、又は炭素繊維なども使用される。ウェブを形成する方式は、湿式、乾式、又は直接式に大別される。直説法は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡糸された繊維を集めて直接ウェブとする工程である。これに含まれる方法は、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法などであるが、本発明にはメルトブロー法でつくられた超極細繊維不織布が最も適している。
【００３１】
不織布を核酸含有試料に接触させる方法は特に限定されず、不織布の表面に溶液状態の核酸含有試料が接触可能な方法であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、不織布を溶液状態の核酸含有試料に浸漬する方法、あるいは該溶液を不織布に透過させる方法などが挙げられる。例えば、溶液を透過させる方法としては、不織布を図１に示すように筒体で挟み込んで不織布固定化カラムを作製し、チューブなどの管を何らかの方法で接続して、その管中を経由して核酸含有試料溶液を不織布に誘導することにより、不織布表面に核酸を捕捉することが可能である。試料中の核酸を濃縮する目的で、短時間に多量の核酸含有試料溶液を処理して溶液中の核酸を不織布表面に捕捉する場合には透過のほうが好ましい。
【００３２】
核酸含有試料と不織布との接触を終えた後、必要に応じて不織布を洗浄してもよい。洗浄液としては、例えば、分子ふるい工程で使用した溶離液と同じ組成の溶液またはその他の水溶性溶媒、あるいはリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液を例示することができるが、これらに限定されることはない。分子ふるい工程で使用した溶液と洗浄液とは同一の緩衝系であってもよく、あるいは異なる緩衝系であってもよい。緩衝液の組成を変更することにより、具体的にはイオン強度、ｐＨ、又は含有する塩類の種類を変化させることによって、洗浄効率を高めることができる場合がある。
【００３３】
核酸の検出のための手段としては多様な形態が想定でき、当業者は目的に応じて所望の態様を選ぶことができる。具体的には、不織布表面に捕捉された核酸をそのまま核酸分析に使用してもよく、あるいは不織布から煮沸または溶媒抽出などにより目的の核酸を溶出回収してもよい。核酸分析などのための核酸増幅法は特に限定されないが、例えば、ロシュ社のＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ（Transcription mediated amplification-hybridization protection assay）法、アボット社のＬＣＲ（Ligase chain reaction）法、栄研化学社のＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification of ＤＮＡ）法、宝酒造社のＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid）法等を利用することができる。本発明の方法によればＤＮＡ又はＲＮＡのいずれも分離可能であり、しかも得られる核酸はさらに精製する必要がなく、そのままＰＣＲ法や各種の核酸分析又は遺伝子検査などに供することができる。
【００３４】
本発明の核酸の捕捉方法は、核酸の捕捉とその後の核酸増幅などの一連の処理の自動化を実現するのに好都合であり、自動化により、操作の熟練や高度の知識を必要とせずに迅速に大量の試料を処理することが可能にする。したがって、上記工程の自動化は、遺伝子工学及び遺伝学的診断をはじめとして核酸分析を必要とする各分野において広範な利用形態及び用途を提供できるため、極めて重要な意義をもつ。本発明の方法は、上述したその特質から、多数の試料から機械的に核酸を迅速に捕捉して分離又は濃縮などを行なう目的、すなわち自動処理化のためにも極めて好適である。
【００３５】
本発明により、核酸含有試料から核酸を捕捉するための方法のほか、上記方法を簡便に達成するための手段としてのキットも提供される。より具体的には、本発明により、少なくとも(a)分子ふるい用担体及び(b)不織布を含むキットが提供され、さらにこのキットには(c)洗浄液及び／又は(d)タンパク質分解酵素、界面活性剤、還元剤、キレート剤、及びアルカリからなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を含む前処理液が組み合わされていてもよい。これらの(a)ないし(d)の要素に関しては上述したとおりである。各要素は別個に用意してもよく、あるいは支障がない限り共存させていてもよい。キットは溶液を含んでもよく、あるいはそのような溶液を配合するための成分が濃縮又は凍結乾燥された形態であってもよい。さらに必要に応じて、本キットは補助剤、専用容器、及び／又はその他の必要なアクセサリーなどを含んでもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
例１
（淋菌試料の調製）
チョコレート寒天培地上に植菌後、CO2インキュベーター内で３７℃４８時間培養した淋菌を白金耳で回収して生理食塩水で縣濁した後、生理食塩水で希釈率１０3〜１０6の範囲で適当な濃度に希釈して淋菌試料とした。陰性コントロールとして淋菌なしの生理食塩水も用意した。
（尿試料の調製）
健常人から採取した尿1mlを1.5mlトレフチューブに入、上記の方法で調製した淋菌試料10μlをいれボルテックスミキサーで攪拌した。
（前処理）
この尿試料に0.5M EDTAを100μl、8N NaOH(和光純薬)を30μl加え2〜3回転倒混和し前処理を施した。
【００３７】
（分子ふるい操作）
前処理を施した尿試料をスラリー法で作製した5mlbedのゲル濾過カラム（担体：アマシャムバイオサイエンス社セファクリルS-1000、カラム：アマシャムバイオサイエンス社PD-10エンプティカラム）にロードし、その後トリス緩衝塩溶液（100mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl）を2mlロードした。ロードしたすべての溶液（3ml）を回収して分子ふるい操作を完了した。
（不織布接触）
回収した溶液をタイゴンチューブを介してシリンジに接続した不織布固定化カラム（図１）に吸引通水した。その後1mlトリス緩衝塩溶液を通水し、不織布固定化カラムを洗浄した。
【００３８】
（核酸増幅反応）
ＬＡＭＰ反応は、次のように行った。配列番号１のＦＩＰプライマー、配列番号２のＢＩＰプライマー、配列番号３のＦ３プライマー、配列番号４のＢ３プライマー、配列番号５のＦｌｏｏｐプライマー、配列番号６のＢｌｏｏｐプライマーをデザインして、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。ＬＡＭＰ増幅の反応液には、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーをそれぞれ２．５μＭ、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーをそれぞれ２０μＭ、ＬｏｏｐＦプライマーとＬｏｏｐＢプライマーをそれぞれ３０μＭ、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．８Ｍ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、６．４  ｕｎｉｔｓのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含み、ＭｇＳＯ4濃度が８ｍＭになるように加えた。試料通水後の不織布固定化カラムをＬＡＭＰ反応溶液の入った専用チューブ(栄研化学、LMP901)に入れた。同時にLAMP増幅反応の陽性コントロールとしてLAMP増幅の反応液に20pgの淋菌精製ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８２５）を加えたものと陰性コントロールとしてLAMP増幅の反応液以外何も加えないものも用意した。これらをLAMP反応測定装置（Realtime Tubidimeter TERAMECS LA-200）で64℃、1時間反応させた。その間濁度（OD660nm）を測定し、OD660nm＝0.1となる時間をプロットした。結果を図２に示す。
【００３９】
比較例１
例１と同様にして、淋菌試料の調製から核酸増幅反応までを行なった。ただし、分子ふるい処理は行なわなかった。結果を図３に示す。
比較例２
例１と同様にして、淋菌試料の調製から核酸増幅反応までを行なった。ただし、分子ふるい処理は以下のとおり行なった。前処理を施した尿試料をスラリー法で作製した5mlbedのゲル濾過カラム（担体：アマシャムバイオサイエンス社セファクリルS-1000、カラム：アマシャムバイオサイエンス社PD-10エンプティカラム）にロードし、その後トリス緩衝塩溶液（100mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, ）を2mlロードする。ロードしたすべての溶液（3ml）を回収して分子ふるい操作を完了した。その溶液5μlを反応溶液に入れて核酸増幅反応を行なった。結果を図４に示す。
比較例３
例１と同様にして、淋菌試料の調製から核酸増幅反応までを行なった。ただし、前処理及び分子ふるい処理は行なわず、尿試料5μlを反応溶液に入れて核酸増幅反応を行なった。結果を図５に示す。
【００４０】
参考例１：ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるタンパクと核酸の分離操作
0.3μg/mlλDNA、1.5%γ-globlin、1.5% human serum albmin各試料1mlをスラリー法で作製した5mlbedのゲル濾過カラム（担体：アマシャムバイオサイエンス社セファクリルS-1000、カラム：アマシャムバイオサイエンス社PD-10エンプティカラム）にロードし、その後トリス緩衝塩溶液（100mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl）を5mlロードした。ロードしたすべての溶液（6ml）を分画回収して分子ふるい操作を完了した。γ-globlin、human serum albminは96穴プレートに100μlづつ分注しプレートリーダーで紫外吸収光強度（Abs280nm）を測定した。λDNAは96穴プレートに100μlづつ分注しSYBR Green（moleculer probe S-7563）で染色し蛍光強度（Ex485nm、Em538nm）を測定した。結果を図６に示す。ゲル濾過により、タンパク質を核酸から除去できることがわかる。
【００４１】
参考例２：ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるマイクロビーズの除去
2.0μmのポリスチレン粒子（Polybead 19814、2.5% solids Latex）1mlをスラリー法で作製した5mlbedのゲル濾過カラム（担体：アマシャムバイオサイエンス社セファクリルS-1000、カラム：アマシャムバイオサイエンス社PD-10エンプティカラム）にロードし（ロードした試料はOD660＞2.00）、その後トリス緩衝塩溶液（100mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl）を5mlロードした。カラム先端から流出するすべての溶液（6ml）を回収して分子ふるい操作を完了した。回収した溶液（6ml）を遠心分離にかけて上清を除去し、1mlのトリス緩衝塩溶液に再縣濁して濁度（OD660nm）を測定したところ、OD660=0.00であった。よって、ゲル濾過によりポリスチレン粒子が除去されたことがわかる。なお、2.0umのポリスチレン粒子（Polybead 19814 、2.5% solids Latex）1mlをゲル濾過せずに、不織布固定化カラム（図１）に吸引通水することを試みたが、目詰まりを起こし、通水できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】例１で用いた不織布を固定化したカラムの構造を示した図である。
【図２】例１で行なった核酸増幅反応の結果を示した図である。図中、Ｆ５／２８：健常人尿ａ、Ｆ６／１０：健常人尿ｂ、Ｆ６／２９：健常人尿ｃ、Ｆ６／３０：健常人尿ｄ、Ｉ５／２７：健常人尿ｅ、Ｉ６／１：健常人尿ｆ、Ｉ６／２９：健常人尿ｇ、Ｉ６／３０：健常人尿ｈ、Ｓ６／３：健常人尿ｉ、Ｓ６／２８：健常人尿ｊ、Ｓ６／３０：健常人尿ｋ、Ｓ７／１：健常人尿ｌ、Ｓａｌｉｎｅ：生理食塩水、２０ｐｇ−ｐｏｓｉ：核酸増幅反応陽性コントロール、ｂｌａｎｋ：対照を示す。
【図３】比較例１で行なった核酸増幅反応の結果を示した図である。図中、ｐｏｓｉ ２０ｐｇ：核酸増幅反応陽性コントロールを示し、その他の記号は図２と同じである。
【図４】比較例２で行なった核酸増幅反応の結果を示した図である。図中、ｐｏｓｉ−２０ｐｇ核酸増幅反応陽性コントロールを示し、その他の記号は図２と同じである。
【図５】比較例３で行なった核酸増幅反応の結果を示した図である。図中、ｐｏｓｉ−２０ｐｇ：核酸増幅反応陽性コントロールを示し、その他の記号は図２と同じである。
【図６】参考例１で行なったゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるタンパクと核酸の分離操作の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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