(57)【要約】      （修正有）【課題】ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有するタンパク質。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列から、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。図１は、前記タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。【選択図】図１
2006288390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【請求項２】
前記ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼが、ＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸に作用して、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースを生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼが、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースに作用して、ＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
超好熱性古細菌由来である請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）である請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項７記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
【請求項９】
ＧＤＰマンノースのマンノシル基によりペプチドをグリコシル化してグリコペプチドを製造する方法であって、前記グリコシル化により形成されたＧＤＰにリン酸基を転移させてＧＴＰを形成し、酵素反応により前記ＧＴＰとマンノシル−１−リン酸からＧＤＰマンノースを生成する工程を含み、酵素として、請求項１から５のいずれかに記載の耐熱性タンパク質を使用するグリコペプチドの製造方法。
【請求項１０】
Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｃａ2+及びＮｉ2+からなる群から選択される２価金属イオン存在下で前記酵素反応を行う請求項９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託に係る成果の出願である。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは、ＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸に作用して、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースを生成する機能を有する。この酵素の用途の１つとして、ＧＤＰマンノースの再生を伴うマンノースを含むオリゴ糖およびグリコペプチドの合成があげられる（例えば、特許文献１参照）。つまり、Ｄ−マンノース−１−リン酸に、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼを作用させて、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースを生成する。このＧＤＰマンノースのマンノシル基により、例えば、オリゴ糖、グリコプロテインおよびグリコペプチド等の受容体をグリコシル化する。それに伴い生成されるＧＤＰによりＧＴＰを再生し、この反応を繰り返し行うことにより、オリゴ糖およびグリコペプチドが合成される。このような方法によれば、ＧＤＰを再利用するため、副産物の量を低減でき、生産効率にも優れる。
【０００３】
ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは、微生物、植物、動物等において見出されている。しかしながら、耐熱性のＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは知られておらず、耐熱性のＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは、工業的用途を広げるものと期待されている。
【０００４】
他方、前記の生物種以外の超好熱性古細菌（非特許文献１参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）（非特許文献２参照）は、その遺伝子が既に解析されている（非特許文献３参照）。したがって、この超好熱古細菌が、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有するタンパク質を産生するとすれば、それは優れた耐熱性および安定性を有すると予想され、これによって工業的用途がさらに広がる可能性がある。
【０００５】
【特許文献１】米国特許６４８５９３０明細書（特開平７−１１１８９５号公報）
【非特許文献１】Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M. W. W. Adams ed.), Academic Press (1996)
【非特許文献２】Suzuki T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44
【非特許文献３】Kawarabayashi,Y. et al., “Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7”, DNA Res. 8(4), 123-140 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質である。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【０００９】
なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。
【発明の効果】
【００１０】
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。したがって、本発明のタンパク質は、高温下で使用することができ、かつ、高温下で安定性が高く、工業的用途の拡大が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
前記ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは、ＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸に作用して、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースを生成する機能を有する。また、前記ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼは、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースに作用して、ＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸を生成する機能を有する。
【００１２】
前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。
【００１３】
つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。
【００１４】
つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明の発現ベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。
【００１５】
つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。
【００１６】
つぎに、本発明のグリコペプチドの製造方法は、ＧＤＰマンノースのマンノシル基によりペプチドをグリコシル化してグリコペプチドを製造する方法であって、前記グリコシル化により形成されたＧＤＰにリン酸基を転移させてＧＴＰを形成し、前記ＧＴＰとマンノシル−１−リン酸から、酵素反応によりＧＤＰマンノースを生成する工程を含み、酵素として、請求項１から５のいずれかに記載の耐熱性タンパク質を使用する製造方法である。
【００１７】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列からＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を示すタンパク質をコードすると推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の新規耐熱性タンパク質は、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施できる。
【００１９】
本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば、配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製できる。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製できる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、本発明は、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製できる。また、市販の発現ベクターとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のベクターなどを用いてもよい。これらのベクターは、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。
【００２２】
ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明のタンパク質をコードする遺伝子のほか、例えば、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
【００２３】
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用できるが、これらの方法に限定されない。
【００２４】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製できる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
【００２５】
本発明のタンパク質は、その酵素反応により、例えば、ピロリン酸およびＧＤＰマンノースからＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸を製造できる。したがって、本発明は、その一態様として、酵素反応によりピロリン酸およびＧＤＰマンノースからＧＴＰおよびＤ−マンノース−１−リン酸の製造方法であって、酵素として本発明の耐熱性タンパク質を使用する方法を含む。前記酵素反応は、例えば、７０〜８０℃の温度条件下で行うことができ、好ましくは７５℃である。前記酵素反応は、例えば、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｃａ2+及びＮｉ2+等の２価金属イオン存在下で行うことが好ましく、それぞれ一種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。中でも、Ｍｇ2+存在下が好ましい。前記酵素反応には、例えば、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＣａＣｌ2及びＮｉＣｌ2等を含む反応液を使用できる。また、前記反応液は、さらに、例えば、フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）及びメルカプトエタノール等を含んでいてもよい。前記反応液の緩衝液は特に制限されず、例えば、クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液及びＮａＯＨ／ＮａＨＣＯ3緩衝液等があげられ、中でもＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液が好ましい。前記反応液のｐＨは、例えば、ｐＨ５．５〜７．５の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ５．５である。中でも、温度条件を７５℃とし、ｐＨ５．５（例えば、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液）としてもよい。反応液中の本発明のタンパク質の濃度は、特に制限されないが、例えば、３．６〜３３Ｕ／ｍｇであり、ＧＤＰ−マンノース（基質）の濃度は、例えば、０．１〜２ｍＭである。
【００２６】
つぎに、本発明のグリコペプチドの製造方法は、前述のように、ＧＤＰマンノースのマンノシル基によりペプチドをグリコシル化してグリコペプチドを製造する方法であって、前記グリコシル化により形成されたＧＤＰにリン酸基を転移させてＧＴＰを形成し、酵素反応により前記ＧＴＰとマンノシル−１−リン酸からＧＤＰマンノースを生成する工程を含み、前記酵素として前記本発明の耐熱性タンパク質を使用する方法である。前記本発明の耐熱性タンパク質を用いれば、高温領域での製造が可能である。前記酵素反応における反応条件（例えば、温度条件、２価金属イオン、緩衝液およびｐＨ等）は、前記Ｄ−マンノース１−リン酸の製造方法と同様である。反応液中の本発明のタンパク質及び基質の濃度は、特に制限されず、例えば、前記Ｄ−マンノース１−リン酸の製造における濃度から適宜決定できる。また、本発明のグリコペプチドの製造方法と同様にして、オリゴ糖を製造することもできる。
【００２７】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
【実施例１】
【００２８】
染色体ＤＮＡの調製
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）をＬ培地中で、３７℃で一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ニワトリ卵白リゾチーム溶液０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８溶液０．５ｍＬを加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを０．２ｍＬの１０％ＳＤＳ溶液に溶かして加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68,396-408）。
【実施例２】
【００２９】
発現ベクターの構築と遺伝子発現
１．発現ベクターの構築
耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（東洋紡社製）を使用した。
Forward primer（配列番号３）：5'-TGAAAGCTGTAATCTTGGCTGGAGGTTACGGT-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTATAACTTCTTAAATACTTC-3'
【００３０】
ＰＣＲ反応後、増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その遺伝子断片を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔで末端を平滑化した後、制限酵素ＢａｍＨＩでさらに切断したものを精製し、Ｔ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ、上記の構造遺伝子と連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現ベクターを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。精製ベクターの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列が耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。
【００３１】
２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．１ｍＬをファルコンチューブに移した。その中に上記１．の精製発現ベクターの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ遺伝子を発現させた。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。
【００３２】
集菌した菌体に、菌体破砕液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は前記菌体破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は前記菌体破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
【００３３】
耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、２２８アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は２５．９ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。
【実施例３】
【００３４】
ＤＮＡ組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして発現ベクターを精製し、この発現ベクターを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ（ＤＥ３）を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌し、３７℃で約６時間、前培養した。この前培養液の全量を、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）にて所定の条件（３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａ）でコンピュータプログラム制御し、培養した。なお、ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ  ＨＣｌ（和光純薬社製）および２Ｍ  ＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌の約１８時間前（培養開始約２４時間後）に、前記培地にオートクレーブ済みの発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を３００ｍＬ加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところで（培養開始４２時間後）、大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用いて集菌した。回収した菌体のうち少量を分取し、残りの菌体は−３０℃で保存した。前記分取した菌体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（和光純薬社製）を含む破砕液に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９，１００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清と沈殿に分けた。他方は、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間加熱した後、４℃で９，１００Ｇ、１０分間遠心分離し、上清と沈殿に分けた。得られた沈殿は、前記破砕液に再懸濁した。これら４種の上清および沈殿懸濁液に変性剤（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱して変性させた。各変性タンパク質液を１５％ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用いて電気泳動後のゲルを染色及び脱色した結果、目的タンパク質（耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ）の発現が確認できた。
【実施例４】
【００３５】
１．ＤＮＡ組換えタンパク質の精製
実施例３において、−３０℃で保存した菌体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む破砕液に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この菌体破砕液を７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。この破砕菌体液を大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名Ａｖａｎｔｉ  ＨＰ−３０Ｉ）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。
【００３６】
つぎに、この上清をタンパク質精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＡＫＴＡTM  ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、１．５０Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、疎水性相互作用カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＰｈｅ  ６ｍＬ）に通した。１．５０Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム濃度勾配で溶出させ、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３７】
つぎに、回収した画分を２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．６）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、アフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎTM  ５ｍＬ）に通した。０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、０．１３〜０．２７Ｍ塩化ナトリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３８】
つぎに、回収した画分を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＱ  ６ｍＬ）に通した。０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、０．１１Ｍ塩化ナトリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパクの画分を回収した。
【００３９】
つぎに、回収した画分を２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．６）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、再びアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎTM  ５ｍＬ）に通した。０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、０．１〜０．２３Ｍ塩化ナトリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００４０】
つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮTM  ５０００）を用いて遠心分離して濃縮した。ついで、タンパク質精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＡＫＴＡTM  ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液で平衡化したゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＨｉＬｏａｄTM  １６／６０、ＳｕｐｅｒｄｅｘTM  ７５）に通した。溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００４１】
つぎに、回収した画分を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む溶液に置換した後、遠心濃縮チューブ（ザルトリウス社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮTM  ５０００）を用いて遠心分離して濃縮し、これを以下の測定にサンプルとして使用した。
【００４２】
２．活性測定
０．５ｍＭ  ＧＤＰ−マンノース（ＳＩＧＭＡ製）、５．０ｍＭピロリン酸カリウム（ナカライテスク製）、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（和光純薬製）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（ナカライテスク製）を含む反応液を準備した。前記反応液に、精製した前記サンプルを加えることで反応を開始させ、反応開始直後及び５分後に酵素反応液を２００μＬずつ採取して氷上で急冷した。フィルター（ザルトリウス社製、商品名Ｖｉｖａ  ＳＰＩＮ）を用いて前記各酵素反応液から酵素タンパク質を除去し、前記フィルターから流出した溶液中のＧＴＰ濃度をＨＰＬＣにより定量した。その結果から、前記耐熱性タンパク質により変換されたＧＴＰ量を算出し、それに基づき耐熱性タンパク質１ｍｇが１分あたりに生成したＧＴＰ量（μｍｏｌ）を比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）として算出した。なお、前記サンプルのタンパク質量は、吸光度法により定量した。ＨＰＬＣ条件は、下記に示すとおりである。
【００４３】
（ＨＰＬＣ条件）
終濃度：２０ｍＭ  ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  Ｔｅｔｒａ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
溶出条件：下記の緩衝液Ａ及びＢを用い、ＭｅＯＨ濃度を５％から６０％へ段階的に変化させた（２５ｍｉｎ）。
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ＿Ｃ１８  ＭＧ（商品名、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ製）
温度：室温
注入量：５０μＬ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ：ＳＣＬ−１０Ａ（商品名、Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＳＰＤ−１０Ａ（商品名、Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）
Ａｕｔｏ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ：ＳＩＬ−１０Ａ（商品名、Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）
Ｐｕｍｐ：ＬＣ−１０Ａ（商品名、Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）
【００４４】
【表１】
2006288390.tif 000003
【００４５】
【表２】
2006288390.tif 000004
【００４６】
上記条件で、標準物質としてＧＴＰ、α−Ｄ−マンノース  １−リン酸及びＧＤＰ−マンノース（各２００ｍＭ）をそれぞれ５０μＬずつ注入したところ、溶出時間はそれぞれ１３．２分、１５．４分及び６．４分であった。
【００４７】
３．至適温度の決定
反応液を所定の温度（２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５及び９５℃）として活性測定を行った以外は、前記「２．活性測定」と同様に測定を行った。その結果を図２に示す。同図に示すように、７５℃で最も高い活性を示した。
【００４８】
４．至適ｐＨの決定
温度条件を７５℃とし、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液に代えて下記表３に示す緩衝液を使用し、様々なｐＨで酵素活性の測定を行った以外は、前記「２．活性測定」と同様に測定を行った。その結果を図３に示す。同図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、ｐＨ５．５〜７．５の幅広い範囲で高い活性を示し、中でもｐＨ５．５で最も高い活性を示した。
【００４９】
【表３】
2006288390.tif 000005
【００５０】
５．熱安定性
（１）ＣＤ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ
前記耐熱性タンパク質のサンプルを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた後、溶液温度を９５℃から１５℃に下降させるか、又は、１５℃から９５℃に上昇させながらθ222値を測定した。なお、測定には、商品名Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ  Ｊ−７２０−Ｗ（日本分光製）を用いた。この結果を図４に示す。同図において、上のグラフが、温度を下降させた場合のθ222値の変化を示すグラフであり、下のグラフが、温度を上昇させた場合のθ222値の変化を示すグラフである。同図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、１５〜９５℃の範囲で安定であった。なお。高温側では吸光度の上昇が見られたが、９５℃に達した際にセル内に沈殿は発生していなかったことから、この上昇は、測定時の誤差又はベースラインのシフトによるものと考えられる。
【００５１】
（２）活性測定
前記耐熱性タンパク質のサンプルを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ５．５）に０．３６ｍｇ／ｍＬとなるように加え、所定の温度（７５、８５及び９５℃）でインキュベーションし、１、２及び３時間後にそれぞれ１０μＬずつ採取し、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ活性を測定した。なお、活性測定は、前記「２．活性測定」と同様に測定を行った。その結果を図５に示す。図５（ａ）は、比活性を示し、図５（ｂ）は、０分を１００％とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、７５℃では２時間後まで高い活性を示し、安定であった。
【００５２】
６．ｐＨ安定性
前記耐熱性タンパク質のサンプルを、下記表４に示す所定のｐＨの緩衝液に０．３６ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１２時間インキュベーションした後（商品名ＭＩＲ−２６２：ＳＡＮＹＯ製）、前記「２．活性測定」と同様にして活性を測定した。その結果を図６に示す。図６（ａ）は、比活性を示し、図６（ｂ）は、ＭＥＳ（ｐＨ５．５）緩衝液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、すべてのｐＨの範囲で失活することがなく酵素活性を示し、特に中性付近で高い酵素活性を示した。
【００５３】
【表４】
2006288390.tif 000006
【００５４】
前記耐熱性タンパク質のサンプルを、下記表５に示す所定のｐＨの緩衝液に０．３６ｍｇ／ｍＬとなるように加え、７５℃で３０分間インキュベーションした後（商品名ＤＴＵ−Ｎ：ＴＡＩＴＥＣ製）、前記「２．活性測定」と同様にして活性を測定した。その結果を図７に示す。図７（ａ）は、比活性を示し、図７（ｂ）は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）緩衝液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、全ての範囲で酵素活性を示し、特にｐＨ５．５〜９．５の広い範囲で酵素活性を示した。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
７．Ｋｍ値及びＶｍａｘ値の算出
ＧＤＰマンノース、ピロリン酸及びＭｇＣｌ2についてＫｍ及びＶｍａｘを求めた。その結果を下記表６に示す。なお、活性測定は、前記「２．活性測定」と同様の方法で行った。
【００５７】
【表６】
2006288390.tif 000008
【００５８】
８．２価金属、ＥＤＴＡ、メルカプトエタノール及びＰＭＳＦの阻害効果
ＮｉＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＰＭＳＦ（以上、全て和光純薬製）、ＣｕＣｌ2（以下、全てナカライテスク製）、メルカプトエタノール（Ｍｅｒ−ＥｔＯＨ）及びＥＤＴＡをそれぞれ反応液に加え、これらの耐熱性タンパク質の酵素活性への影響を調べた。活性測定は、前記「２．活性測定」と同様の方法で行い、ＥＤＴＡの終濃度は５ｍＭ又は２０ｍＭ、その他の終濃度は１ｍＭとした。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、比活性を示し、図８（ｂ）は、ＭｇＣｌ2を含む反応液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、Ｍｇ2+を含まない反応液では酵素活性を示さず、また、２価金属のキレーターであるＥＤＴＡを大量に（２０ｍＭ）加えた反応液では活性が低下したことから、前記耐熱性タンパク質の酵素活性にはＭｇ2+が必須であることがわかった。なお、２価金属塩、ＰＭＳＦ、メルカプトエタノール及び５ｍＭのＥＤＴＡを加えた場合には大きな影響はなかった。
【００５９】
９．金属依存性
ＭｇＣｌ2に代えて、その他の２価金属（ＮｉＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＣｏＣｌ2及びＣｕＣｌ2）を反応液に加えた以外は、前記「２．活性測定」と同様にして酵素活性を測定した。その結果を図９に示す。図９（ａ）は、比活性を示し、図９（ｂ）は、ＭｇＣｌ2を含む反応液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、前記耐熱性タンパク質は全ての金属において活性を示し、ＣａＣｌ2を含む反応液では活性が低下したものの、その他の金属を含む反応液では高い活性を示した。したがって、前記耐熱性タンパク質は、Ｍｇ2+の他にＭｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+及びＮｉ2+存在下において酵素反応を行うことができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の熱安定性を示すグラフである。
【図５】図５（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図５（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。
【図６】図６（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図６（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。
【図７】図７（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図７（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。
【図８】図８（ａ）は、本発明のその他の実施例における各種金属等を添加した反応液でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図８（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。
【図９】図９（ａ）は、本発明のその他の実施例における各種金属の存在下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図９（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１：耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列
【図２】
2006288390.tif 000009
【図３】
2006288390.tif 000010
【図４】
2006288390.tif 000011
【図５】
2006288390.tif 000012
【図６】
2006288390.tif 000013
【図７】
2006288390.tif 000014
【図８】
2006288390.tif 000015
【図９】
2006288390.tif 000016
【図１】
2006288390.tif 000017
【配列表】
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