(57)【要約】      （修正有）【課題】歯周疾患の進行程度を認知する診断方法を提供すること。【解決手段】没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドと過酸化水素とを唾液と接触させ、唾液中のペルオキシダーゼを化学発光させて、その発光強度より歯周疾患の進行程度を診断することを特徴とする歯周疾患の診断方法、及び、没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドを含有する診断試薬Ａと過酸化水素を含有する診断試薬Ｂとを備えてなる歯周疾患診断キット。【効果】歯周疾患の有無診断、歯周疾患の進行の予測を迅速、簡単かつ正確に行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドと過酸化水素とを唾液と接触させ、唾液中のペルオキシダーゼを化学発光させて、その発光強度より歯周疾患の進行程度を診断することを特徴とする歯周疾患の診断方法。
【請求項２】
没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドを含有する診断試薬Ａと過酸化水素を含有する診断試薬Ｂとを備えてなる歯周疾患診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唾液中のペルオキシダーゼを化学発光法により測定して歯周疾患の進行程度を認知する歯周疾患の診断方法及び歯周疾患診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、局所における細菌感染とそれに対する免疫防御反応の結果引き起こされる、歯周組織の破壊と歯槽骨の吸収を伴う慢性炎症疾患である。歯周病の初期症状としては、歯肉の発赤、腫脹、出血が挙げられるが、これらの症状は見過ごされる場合が多く、病状は更に進行して歯肉の退縮、歯槽骨の吸収が起こり、最終的には歯の喪失に繋がる。歯の喪失を防ぐには適切な治療、処置が必要であり、そのためには歯周病の有無、程度を的確にとらえる診断が重要である。
【０００３】
現在行われている歯周病の診断には、炎症の程度や出血の有無を目視で判断する（ＧＩ、ＢＩ）、歯周ポケット深さを測定する、歯肉溝滲出液量を測定する、レントゲン撮影により歯槽骨吸収を確認する、歯の動揺を確認する方法等がある。しかし、これらの方法は、歯科医師の経験を積んだ技術が必要であり、しかも一人当たりの検診時間に長時間を要するという欠点がある。
【０００４】
一方、歯垢中の歯周病原性細菌、歯肉溝滲出液や唾液に含まれる特定の酵素や特定の蛋白質などを診断指標として、歯周病の程度を判断するという方法も提案されており、例えば、下記特許文献１〜５に示す方法がある。しかし、これらの方法の結果と歯周疾患の程度との相関は必ずしも高くはなく、診断方法として満足のいくものではなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−６６０３９号公報
【特許文献２】特開平８−７５７２９号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９５８４号公報
【特許文献４】特開２００４−５１５３６号公報
【特許文献５】特許第３１６５７８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、歯周疾患有無の診断あるいはその進行の予測を迅速、簡便かつ正確に行うことができる歯周疾患診断方法及び歯周疾患診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため種々検討したところ、没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドと過酸化水素とを唾液と接触させた場合、唾液から検出される微弱発光と歯周疾患の程度との間に高い相関があることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
ここで、フェノール系化合物と過酸化水素の存在下で発光する物質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼが知られている（文献：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６８（６））。唾液中には元来ペルオキシダーゼが存在しているが、歯周病に罹患すると炎症反応により血液成分が歯肉溝滲出液を通じて唾液中に浸潤してくるため、唾液中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は上昇する。そのため、ペルオキシダーゼと反応して発生する化学発光を測定することにより、歯周疾患の程度を診断し得るものと考えられる。
【０００９】
従って、本発明は、
［Ｉ］没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドと過酸化水素とを唾液と接触させ、唾液中のペルオキシダーゼを化学発光させて、その発光強度より歯周疾患の進行程度を診断することを特徴とする歯周疾患の診断方法、
［ＩＩ］没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジンから選ばれるフェノール系化合物とアセトアルデヒドを含有する診断試薬Ａと過酸化水素を含有する診断試薬Ｂとを備えてなる歯周疾患診断キット
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、歯周疾患の有無診断、歯周疾患の進行の予測を迅速、簡単かつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の歯周疾患の診断方法は、下記フェノール系化合物、アセトアルデヒド、過酸化水素を検体（唾液）と接触させ、検体中に含まれるペルオキシダーゼの化学発光強度から、歯周疾患の有無、進行の程度を診断するものである。この場合、フェノール系化合物とアセトアルデヒドと過酸化水素とは、それぞれ別々に隔離して保持し、使用時（診断時）にこれら３者を混合して検体（唾液）と接触するようにしてもよいが、フェノール系化合物とアセトアルデヒドとを含有する診断試薬Ａと過酸化水素を含有する診断試薬Ｂとを別途用意し、使用時（診断時）にこれら診断試薬Ａ，Ｂを混合して、検体と接触させることが好ましい。
【００１２】
ここで、本発明で診断試薬Ａに使用可能なフェノール系化合物としては、没食子酸及びその誘導体、タンニン酸、ピロガロール、カテコール、カテキン、アントシアニジン等が挙げられる。なお、カテキン、アントシアニジンは単品でも入手可能であるが、それら成分を含有する植物抽出物をより安価な原料として用いることもできる。植物抽出物は、上記フェノール系化合物を含有する植物を溶剤で抽出することにより得られる。抽出溶剤としては、例えば水、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エチルエステル等の低級アルキルエステル、炭化水素、その他公知の溶剤を挙げることができる。抽出方法は、通常用いられているような公知の方法を採用することができる。これら抽出物は市販品を使用することができ、例えば、ブドウ種子抽出物（商品名：グラヴィノール（プロアントシアニジン３８％以上含有）、キッコーマン（株）製）、ローズバッツ抽出物（商品名：ローズバッツエキスパウダー（ポリフェノール（主としてアントシアニジン）１０〜２０％含有、丸善製薬（株）製）、緑茶抽出物（商品名：サンフェノンＢＧ（ポリフェノール（主としてカテキン）７０％以上含有）、太陽化学（株）製）等がある。これらフェノール系化合物の少なくとも１種を溶解、希釈したものを用いることができる。なお、溶媒はイオン交換水又はリン酸緩衝液が好ましい。診断試薬Ａ中の濃度は、フェノール系化合物として０．０１〜２ｇ／１００ｍＬが好ましい。なお、予めアセトアルデヒドを含有する溶媒にフェノール系化合物を溶解させてもよい。
【００１３】
過酸化水素は、過酸化水素水を希釈したものを用いることができる。また、過酸化水素水のほかに過炭酸ナトリウム、過酸化ナトリウム等、溶液中で過酸化水素を生じるものでもよい。希釈液は特に限定されないが、イオン交換水又はリン酸緩衝液が好ましい。診断試薬Ｂ中の濃度は、過酸化水素として０．１〜１０ｇ／１００ｍＬが好ましい。
【００１４】
診断試薬Ａ中のアセトアルデヒド濃度は、０．１〜２０ｇ／１００ｍＬが好ましい。
【００１５】
本発明においては、上記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを質量比で１：１０〜１０：１、特に１：２〜２：１の割合で使用することが好ましい。例えば診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを１０〜１，０００μＬ、特に診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを５０〜２００μＬ使用することが好ましい。
【００１６】
更に、使用時（診断時）に診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを混合し、この混合物と検体と接触させる際の混合割合は、診断試薬Ａ、Ｂの混合物と検体とを質量比で１：１０〜１０：１、特に１：２〜２：１の割合で使用することが好ましい。例えば診断試薬ＡとＢの混合物１００μＬに対して検体を１０〜１，０００μＬ、特に５０〜２００μＬ使用するのが好ましい。
【００１７】
検体は、唾液をそのまま、あるいは遠心分離した上清を用いる。
【００１８】
化学発光の測定は、ＣＣＤカメラや光電子増倍管を用い、検出波長領域は検出器により異なるが、３００〜６５０ｎｍが好ましい。具体的には、マイクロプレートルミノメーター（ＬＭａｘTM、モレキュラーデバイス社製）、ケミルミネッセンスアナライザー（ＣＬＡ、東北電子産業（株）製）、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳシステム（浜松ホトニクス（株）製）等を用いることができる。
【００１９】
本発明の歯周疾患診断キットは、上記フェノール系化合物、過酸化水素、アセトアルデヒドを所用の容器に充填した状態で備える。この場合、これら成分は、互いにそれぞれ単離した状態で、使用時に混合し得るように備えていてもよく、また上記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを別途に用意して使用時に混合できるように備えていてもよい。更に、上記成分は、予め上述した濃度で、診断時に特に希釈しないですむように備えていても、あるいは粉粒状、濃厚液の状態で備え、診断時に希釈し得るように備えていてもよい。この場合、希釈液をキット中に具備させることができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例と比較例に基づき、より具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、下記例で％は質量％を示す。
【００２１】
［実施例１］  ペルオキシダーゼによる化学発光測定
没食子酸（和光純薬工業（株）から購入）１ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて４０ｍＬとし、診断試薬Ａとした。過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて１５ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、和光純薬工業（株）から購入）及びヒト血液由来であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ、コスモバイオから購入）を１ｍｇ秤量し、リン酸緩衝液を加えて１ｍＬとした（１ｍｇ／ｍＬ溶液）。これを、リン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は、以下のように調製した。
【００２２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）：リン酸水素２ナトリウム・１２水和物８．６ｇ、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．９９ｇ、塩化ナトリウム２５．５ｇをイオン交換水に溶解、３Ｌとした。
【００２３】
マイクロウェルプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ  ３５−３２９６）に、診断試薬Ａ５０μＬ、ペルオキシダーゼ溶液５０μＬ、診断試薬Ｂ５０μＬを添加、混合し、直後に化学発光測定を行った。化学発光測定には、フォトンカウンテイング用ＣＣＤカメラ（Ｃ−２４００−７５ＡＨ、浜松ホトニクス（株）製、測定波長領域：３５０〜６５０ｎｍ）を用い、測定時間は３０秒間とした。結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＨＲＰ及びＭＰＯの濃度依存的に化学発光強度（ＣＬ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は上昇し、本法によりペルオキシダーゼの測定が可能であることがわかる。
【００２４】
［実施例２］  唾液タンパクの化学発光測定
没食子酸１ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて４０ｍＬとし、診断試薬Ａとした。過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて１５ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。アルブミン、ラクトフェリン、リゾチーム、ヘモグロビン、ムチン、ペルオキシダーゼは、１ｍｇを秤量、リン酸緩衝液１ｍＬに溶解した（１ｍｇ／ｍＬ溶液）。これを、リン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は実施例１と同様に調製したものを使用した。
【００２５】
マイクロウェルプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ  ３５−３２９６）に、診断試薬Ａ５０μＬ、アルブミン、ラクトフェリン、リゾチーム、ヘモグロビン、ムチン、ペルオキシダーゼ溶液５０μＬ、診断試薬Ｂ５０μＬを添加、混合し、直後に化学発光測定を行った。化学発光測定には、フォトンカウンテイング用ＣＣＤカメラ（Ｃ−２４００−７５ＡＨ、浜松ホトニクス（株）製、測定波長領域：３５０〜６５０ｎｍ）を用い、測定時間は３０秒間とした。図２に示すように、ペルオキシダーゼ濃度に依存して化学発光強度は増大するが、他の唾液タンパクによる発光はほとんど認められなかった。このことから、唾液の発光は唾液に含まれるペルオキシダーゼが主要因であることがわかる。
【００２６】
以下、歯周疾患診断薬の組成例（実施例３〜１０、比較例１〜３）を示す。これらの試薬を用いて、ＭＰＯから検出される化学発光を測定した（表１）。具体的な実験方法は、１０μｇ／ｍＬ  ＭＰＯリン酸緩衝溶液、診断試薬Ａ、診断試薬Ｂ各５０μＬをマイクロウェルプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ  ３５−３２９６）に添加、混合した後、化学発光強度を測定した。結果を表１に示す。なお、１０μｇ／ｍＬ  ＭＰＯリン酸緩衝溶液は、実施例１と同様に調製、使用した。
【００２７】
［実施例３］
診断試薬Ａ：２ｇ／１００ｍＬ没食子酸（１０％アセトアルデヒド溶液）
没食子酸（和光純薬工業（株）から購入）０．２ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて１０ｍＬとした。使用直前にボルテックスミキサーで撹拌して使用した。
診断試薬Ｂ：２ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて１５ｍＬとした。
【００２８】
［実施例４］
診断試薬Ａ：１ｇ／１００ｍＬ没食子酸（５％アセトアルデヒド溶液）
没食子酸（和光純薬工業（株）から購入）０．１ｇに５％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：５ｇ／１００ｍＬ過炭酸ナトリウム
過炭酸ナトリウム（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇにイオン交換水を加えて１０ｍＬとした。
【００２９】
［実施例５］
診断試薬Ａ：０．５ｇ／１００ｍＬピロガロール（１０％アセトアルデヒド溶液）
ピロガロール（和光純薬工業（株）から購入）０．０５ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：５ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１．７ｇにイオン交換水を加えて１０ｍＬとした。
【００３０】
［実施例６］
診断試薬Ａ：０．１ｇ／１００ｍＬカテコール（２０％アセトアルデヒド溶液）
カテコール（和光純薬工業（株）から購入）０．０１ｇに２０％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：１０ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）３ｇにイオン交換水を加えて９ｍＬとした。
【００３１】
［実施例７］
診断試薬Ａ：０．８ｇ／１００ｍＬタンニン酸（５％アセトアルデヒド溶液）
タンニン酸（和光純薬工業（株）から購入）０．０８ｇに５％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：２ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて１５ｍＬとした。
【００３２】
［実施例８］
診断試薬Ａ：２ｇ／１００ｍＬブドウ種子抽出物（２０％アセトアルデヒド溶液）
ブドウ種子抽出物（商品名：グラヴィノール、キッコーマン（株）製）０．２ｇに２０％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：１ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇにイオン交換水を加えて１５ｍｌとした。
【００３３】
［実施例９］
診断試薬Ａ：０．２ｇ／１００ｍＬローズバッツ抽出物（８％アセトアルデヒド溶液）
ローズバッツ抽出物（商品名：ローズバッツエキスパウダー、丸善製薬（株）製）０．０２ｇに８％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：０．５ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）０．２５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１５ｍＬとした。
【００３４】
［実施例１０］
診断試薬Ａ：１ｇ／１００ｍＬ緑茶抽出物（１０％アセトアルデヒド溶液）
緑茶抽出物（商品名：サンフェノンＢＧ、太陽化学（株）製）０．１ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて溶解し、１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：１．５ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）０．７５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１５ｍＬとした。
【００３５】
［比較例１］
診断試薬Ａ：１ｇ／１００ｍＬ没食子酸（イオン交換水溶液）
没食子酸（和光純薬工業（株）から購入）０．１ｇにイオン交換水を加えて１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：２ｇ／１００ｍＬ過酸化水素
過酸化水素水（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１５ｍＬとした。
【００３６】
［比較例２］
診断試薬Ａ：イオン交換水
診断試薬Ｂ：１０ｇ／１００ｍＬ過炭酸ナトリウム
過炭酸ナトリウム（和光純薬工業（株）から購入）１ｇにイオン交換水を加えて１０ｍＬとした。
【００３７】
［比較例３］
診断試薬Ａ：２ｇ／１００ｍＬブドウ種子抽出物（１０％アセトアルデヒド溶液）
ブドウ種子抽出物（商品名：グラヴィノール、キッコーマン（株）製）０．２ｇに１０％アセトアルデヒド水溶液を加えて１０ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：リン酸緩衝液
実施例１と同様に調製したものを使用した。
【００３８】
【表１】
2006180770.tif 000002
【００３９】
表１の結果から、フェノール系化合物とアセトアルデヒドを含有する診断試薬Ａと過酸化水素を含有する診断試薬Ｂとペルオキシダーゼを反応させると、化学発光が観測され、ペルオキシダーゼの測定が可能であることがわかる。
【００４０】
［実施例１１］  ヒト唾液の化学発光測定とＣＰＩとの関係（ＣＰＩ：歯周疾患指数）
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８０４  Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、この遠心上清を唾液溶液とする。マイクロウェルプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ  ３５−３２９６）に、実施例１と同様に調製した診断試薬Ａ５０μＬ、唾液溶液５０μＬ、実施例１と同様に調製した診断試薬Ｂ５０μＬを添加、混合し、直後に化学発光測定を行った。歯周疾患指数（ＣＰＩ）と化学発光強度との関係を図３に示す。なお、ＣＰＩコードとは、歯周病の進行に伴って起こる出血や歯周ポケットの進行を総合して判断する指標で、その基準は以下の通りである。
ＣＰＩコード基準
コード０＝歯周病の所見がみられない（健全である）
コード１＝プロービング後に出血がある
コード２＝歯石が付着している
コード３＝歯周ポケットの深さ４ｍｍ以上６ｍｍ未満
コード４＝歯周ポケットの深さ６ｍｍ以上
ＣＰＩ値が高くなると化学発光強度は上昇し、解析の結果、ＣＰＩ値と化学発光強度は有意に相関することがわかった（ｐ＜０．０１）。このことから、本発明により、歯周疾患の程度の診断が可能であることが確認された。
【００４１】
［比較例４］  ヒト唾液のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）測定とＣＰＩとの関係
唾液は、実施例１１と同様に採取、処理して、唾液のＡＬＰ活性を測定した。測定は、市販のＡＬＰ測定キット（和光純薬工業（株）製、ラボアッセイTMＡＬＰ）を用いた。歯周疾患指数（ＣＰＩ）とＡＬＰ活性との関係を図４に示す。ＣＰＩが高いとＡＬＰ活性も上昇する傾向が確認されたが、解析の結果、ＣＰＩとＡＬＰ活性の間に有意な相関は得られなかった（ｐ＞０．０５）。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ペルオキシダーゼ濃度と化学発光強度との関係を示すグラフである。
【図２】各種唾液タンパクの濃度と化学発光強度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例１１における唾液化学発光強度とＣＰＩコードとの関係を示すグラフである。
【図４】比較例４における唾液ＡＬＰ活性とＣＰＩコードとの関係を示すグラフである。
【図１】
2006180770.tif 000003
【図２】
2006180770.tif 000004
【図３】
2006180770.tif 000005
【図４】
2006180770.tif 000006