(57)【要約】      （修正有）【課題】  アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。【解決手段】超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列から、アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより得た。図１は、前記タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。【選択図】  図１
2006254869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【請求項２】
前記アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性が、限界デキストリンに作用して、その１，６−α−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する機能である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託に係る成果の出願である。
【背景技術】
【０００２】
アミロ−α−１，６−グリコシダーゼは、グリコーゲンが分解される過程で、分枝点であるα１→６結合を切断する酵素である。この機能を利用して、例えば、デンプン加工における原料、飲食用組成物、食品添加用組成物、包接または吸着物形成剤、あるいは生物崩壊性プラスチック用のデンプンの代替物質として有用なグルカンあるいはその誘導体を製造することや、デンプンを工業的に生産することが検討されている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。その他にも、食物繊維の定量や、水田用除草粒剤として利用することが提案されている（例えば、特許文献３および特許文献４参照）。
【０００３】
アミロ−α−１，６−グリコシダーゼは、哺乳類、魚類、および酵母等に広く分布していることが知られている。しかしながら、耐熱性のアミロ−α−１，６−グリコシダーゼは知られておらず、耐熱性のアミロ−α−１，６−グリコシダーゼは、工業的用途を広げるものと期待されている。
【０００４】
他方、前記の菌以外の超好熱性古細菌（非特許文献１参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）（非特許文献２参照）は、その遺伝子が既に解析されている（非特許文献３参照）。したがって、この超好熱古細菌が、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想され、これによって工業的用途がさらに広がる可能性がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−０６５２９１号公報
【特許文献２】米国特許６４１０７１６明細書
【特許文献３】特開２０００−２３２８９９号公報
【特許文献４】特開２００２−２５５７０５号公報
【非特許文献１】Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996)
【非特許文献２】Suzuki T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44
【非特許文献３】Kawarabayashi,Y. et al., “Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7”,  DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質である。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【０００９】
なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。
【発明の効果】
【００１０】
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。したがって、本発明のタンパク質は、高温下で使用することができ、工業的用途の拡大が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
前記アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性は、限界デキストリンに作用して、その１，６−α−Ｄ−グリコシド結合を加水分解する機能である機能である。
【００１２】
前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。
【００１３】
つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。
【００１４】
つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。
【００１５】
つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。
【００１６】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列からアミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の新規耐熱性タンパク質は、アミロ−α−１，６−グリコシダーゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば、配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、本発明は、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えば、ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。
【００２１】
ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
【００２２】
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。
【００２３】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
【００２４】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
【実施例１】
【００２５】
染色体ＤＮＡの調製
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）をＬ培地中で３７℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）を１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡを０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ニワトリ卵白リゾチームを０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを、０．２ｍＬの１０％ＳＤＳに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68, 396-408）。
【実施例２】
【００２６】
発現プラスミドの構築と遺伝子発現
１．発現プラスミドの構築
耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を使用した。
Forward primer（配列番号３）：5'- ATATCATATGGTATTTAGCCATAAAGATAGACCATTAAGA -3'
Reverse primer（配列番号４）：5'- ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTAATATTCAATCCTCCTATA -3'
ＰＣＲ反応後、Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて増幅断片の３’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液からプラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。プラスミド中に期待される大きさのインサートが存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するプラスミドの一部を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロース電気泳動により、耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ遺伝子を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断・精製した後、Ｔ４リガーゼで反応させ、上記の構造遺伝子と連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。
【００２７】
２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。
【００２８】
集菌した菌体に、破砕液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
【００２９】
耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、７１６アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は８３．３ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、アミロ−１，６−α−グルコシダーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００３２】
配列番号１：耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性アミロ−１，６−α−グルコシダーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列
【図１】
2006254869.tif 000003
【配列表】
2006254869000001.app