(57)【要約】【課題】ヒメトビウンカのγ−アミノ酪酸受容体遺伝子を発現する細胞を構築し、これを利用して当該受容体に作用するアゴニスト或いはアンタゴニストをスクリーニングすることにより、ヒメトビウンカ等の害虫に有効な殺虫剤を見出す。【解決手段】ヒメトビウンカよりγ−アミノ酪酸受容体サブユニットの遺伝子をクローニングし、昆虫細胞内で発現させることによりＧＡＢＡ受容体様のイオンチャンネルが形成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１および２に記載の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号３および４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項1に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え細胞を用いたヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＧＡＢＡ（ガンマ-アミノ酪酸：γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）受容体クロライドイオンチャンネルは、殺虫剤の標的作用点として知られている。本発明は、日本の主要害虫であるヒメトビウンカ（半翅目昆虫）のＧＡＢＡ受容体クロライドイオンチャンネルを構成するサブユニット蛋白質をコードする遺伝子、その遺伝子を発現させた組換え細胞、および同細胞を用いたヒメトビウンカなど半翅目害虫に有効な殺虫剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡ（γ-ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）は、興奮を抑制する働きを持つ神経伝達物質である。哺乳類の受容体の構造は、４回膜貫通疎水性領域を含むポリペプチド鎖が５個集合して、その中央に塩素イオン透過孔を形成している。哺乳類ではスプライスバリアントを除いて、１７サブユニット（６α、３β、３γ、１δ、３ρ、１ε、１π、１θ）がクローニングされている。哺乳類脳のＧＡＢＡＡ受容体の主要な構成サブユニットはα１、β２、γ２であり、その化学量論は２α：２β：１γあるいは２α：１β：２γと考えられている。昆虫においては、１９９１年に初めてショウジョウバエからのサブユニット遺伝子Ｒｄｌのクローニングが報告された。このＲｄｌのホモログが他の昆虫からも単離されていることから、このＲｄｌがＧＡＢＡ受容体サブユニットをコードする普遍的な遺伝子と考えられる。しかし、昆虫のＧＡＢＡ受容体がＲｄｌのホモオリゴマーか、未知のサブユニットを含むヘテロオリゴマーかについては、今日でも明らかになっていない。
【０００３】
最近になって、鱗翅目害虫のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓからＲｄｌ遺伝子が単離され、その遺伝子を単独でアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた際に、ＧＡＢＡ受容体のクロライドイオンチャンネルがボルテージクランプ法で検出されることが報告された（Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.  ３（４）：３０５-１５，１９９８）。この遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞やＳｆ９昆虫細胞などに発現させた組換え細胞は、ＧＡＢＡ受容体に作用するアゴニストやアンタゴニストなどの殺虫剤となりうる化合物のスクリーニングに有用である。
【０００４】
これまでに、Ｒｄｌ遺伝子は、上記のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓのほか、ショウジョウバエやカでその遺伝子が単離されたのみであり、様々な昆虫に有効な、ＧＡＢＡ受容体を作用点とする殺虫剤のスクリーニングを行うためには、昆虫ごとにＲｄｌ遺伝子を取得し、スクリーニング系を構築する必要がある。
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.  ３（４）：３０５-１５，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
日本における主要な半翅目害虫としてヒメトビウンカが知られている。ヒメトビウンカの全遺伝子は解読されておらず、ヒメトビウンカに対して有効なＧＡＢＡ受容体を作用点とする殺虫剤のスクリーニング系を構築することは、ＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子（Ｒｄｌ）が単離されていないことから、これまで実施不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討の結果、これまで単離されたことのなかったヒメトビウンカのＲｄｌ遺伝子を初めて単離した。この遺伝子を昆虫細胞などの細胞に発現させるためには、細胞を形質転換可能なベクターに組み込み、常法のベクターで細胞を形質転換する方法により形質転換体を構築することができる。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  配列表の配列番号１および２に記載の塩基配列を有する遺伝子。
［２］  配列表の配列番号３および４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
［３］  上記［１］に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
［４］  上記［３］に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。［５］  上記［４］に記載の組換え細胞を用いたヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００９】
単離した遺伝子を、アフリカツメガエルの卵母細胞に遺伝子導入する方法やＳｆ９昆虫細胞を同遺伝子含有の適当なベクターで形質転換させる方法により組換え細胞を構築し、その細胞を用いて殺虫剤のスクリーニングの実施が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、配列番号1および２に記載のＤＮＡ塩基配列のものであるが数塩基の置換を含む配列も本特許の範疇である。本発明の遺伝子は、実施例に記載のようにヒメトビウンカの受精卵から、容易に調製可能である。
【００１１】
本発明の蛋白質は、配列番号３および４に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、数アミノ酸の置換、脱落、挿入された配列で、昆虫細胞等に発現させた際にＧＡＢＡ受容体イオンチャンネル機能を有するものも本発明の範疇である。本発明のタンパク質を調製する方法は、配列番号１および２に記載の遺伝子を昆虫細胞で発現可能なベクター（ｐＸｉｎｓｅｃｔ、ｐＩＺＴ、ｐＭＴ、ｐＡＣ５．１、いずれもＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）あるいはバキュロウイルス（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に組み込み、同細胞を培養し、その培養細胞から精製することにより容易に可能である。本発明のベクターは、配列番号１および２に記載の遺伝子を発現可能なベクターあるいはバキュロウイルスであればいずれのものでもよい。これらのベクターは、市販されているものを適宜選択して使用することができる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、調製した蛋白質を用いて合成化合物との親和性を評価するバインディングアッセイや、ＧＡＢＡ受容体を発現させた組換え昆虫細胞を用いたパッチクランプ法、蛍光プローブ法、電位センサープローブ法などが挙げられる。これらの方法により活性を有する合成化合物を効率的にスクリーニングすることができる。
【実施例１】
【００１３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明を制限するものではない。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体的使用方法は市販品のプロトコールに従った。
【００１４】
（Ａ）ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の取得
ヒメトビウンカからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分の調製は以下の手順で行った。まずヒメトビウンカ成虫10頭を氷上にて眠らせた後、ハサミで頭部を切断し、ＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）中に４℃で１晩浸漬した。その後、ガラス製ホモジナイザーで頭部をすり潰し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプロトコールに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分を抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分は使用直前まで−２０℃で保存した。
【００１５】
次に、上記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分を鋳型とし、コンセンサス配列プライマーを用いてＲＴ-ＰＣＲ（ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社）を行った。５’側ＰＣＲ用には配列番号：５のプライマーを使用した。３’側ＰＣＲ用プライマーには配列番号：６および配列番号７のプライマーを使用した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動で解析後、得られた単独バンドをゲルから切り出し、ＤＮＡ断片を抽出した。抽出したＤＮＡ断片はｐＴ７  ｂｌｕｅ  Ｔ-Ｖｅｃｔｏｒを用いたＴＡクローニング法によりクローニングし、塩基配列を解析した。
ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の全長を取得するための第一段階として、上の実験で解析したｃＤＮＡ配列をもとにヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子特異的なプライマーを作製し、ｔｏｔａｌＲＮＡ画分を鋳型としたＲＡＣＥ ＰＣＲ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を行った。３’ＲＡＣＥ ＰＣＲについては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットのプロトコールに従った。まず、キット添付の３’ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマーＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成後、ユニバーサルプライマーミックスＡ（ＵＰＭ）と配列番号：８に示すヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−１１４０Ｆ）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及び配列番号：９のヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−１２３０Ｆ）を用いてネステッドＰＣＲを行った。これにより得られたＤＮＡ断片について、常法に従いＴＡクローニングを行い、ＤＮＡシーケンシングにより３’側配列を取得した。上記と同様にＣｌｏｎｔｅｃｈ社ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用し、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを実施した。まずキットに添付されているＳＭＡＲＴ IIＡオリゴヌクレオチドとＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて末端にＳＭＡＲＴ配列が付加した一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この際、プライマーとして配列番号：１０に示すヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−ＲＴ１Ｐ）を用いた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＮＵＰ及び配列番号：１１に示すヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−５５０Ｒ）を用いてＰＣＲを行った。
【００１６】
次に、得られたＰＣＲ産物を希釈し、ＮＵＰと配列番号：１２のヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−４４０Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物（ＬＳＧ３０）を得た。さらに、得られたＰＣＲ産物ＬＳＧ３０を希釈し、ＮＵＰと配列番号：１３のヒメトビウンカ特異的プライマー（ＬＳＲＤ−３５０Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物（ＬＳＧ３２）を得た。得られたＰＣＲ産物（ＬＳＧ３０とＬＳＧ３２）について、常法に従ってＴＡクローニングを行い、ＤＮＡシーケンシングにより５’側配列を取得した。
【００１７】
（Ｂ）ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子のプラスミドベクターへのクローニング
トータルＲＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｋｉｔ  （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１４のプライマー（ＬＳＲＤ−５’Ｆ１）と配列番号：１５のプライマー（ＬＳＲＤ−３’Ｒ１）を用いて１回目のＰＣＲを行い、次に配列番号：１６のプライマー（ＳａｌＩ−ＬＳＲＤ−５’）と配列番号：１７のプライマー（ＬＳＲＤ３’−２−ＢａｍＨI）を用いて２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、上述の通りＴＡクローニングを行い、遺伝子配列を解析し、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子全長配列ＬＳ４７−３(配列番号：１)を得た。同様に、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１４のプライマー（ＬＳＲＤ−５’Ｆ１）と配列番号：１８のプライマー（ＬＳＲＤ−３’Ｒ２）を用いて１回目のＰＣＲを行い、次に配列番号：１６のプライマー（ＳａｌI−ＬＳＲＤ−５’）と配列番号：１９のプライマー（ＬＳＲＤ３’−ＢａｍＨI）を用いて２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、上述の通りＴＡクローニングを行い、遺伝子配列を解析し、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子全長配列ＬＳ５０−２(配列番号：２)を得た。
【００１８】
ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の昆虫細胞での発現を目的とした発現プラスミドを構築するために、まず、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子ＬＳ４７−３(配列番号：１)をＧａｔｅｗａｙ  ｐＥＮＴＲ１Ａベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に組み込んだ。ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子ＬＳ４７−３(配列番号：１)を鋳型として、配列番号：２０のプライマー（ＬＳＧＦ−１）と配列番号：２１のプライマー（ＬＳＧ−ＸｈｏI−３’）を用いてＰＣＲを行い、Ｎ末端側をコードするＤＮＡ断片を取得し、塩基配列を確認した。Ｃ末端側をコードするＤＮＡ断片に関しては、配列番号：２２のプライマー（ＬＳＧ−ＸｈｏI−５’）と配列番号：２３のプライマー（ＬＳＧ−Ｗ−Ｒ−１０１）を用いてＰＣＲ後、ＰＣＲ産物をさらに配列番号：２２のプライマー（ＬＳＧ−ＸｈｏI−５’）と配列番号：２４のプライマー（Ｔａｇ２）でＰＣＲを行うことで、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体のＣ末端にＶ５Ｔａｇを付加した遺伝子(以下、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子と記す)をコードするＤＮＡ断片を取得し、塩基配列を確認した。Ｎ末端側をコードするＤＮＡ断片をＢａｍＨI−ＸｈｏIで切断し、Ｃ末端側をコードするＤＮＡ断片をＸｈｏI−ＮｏｔIで切断し、ｐＥＮＴＲ１ＡベクターのＢａｍＨI−ＮｏｔI部位に挿入して、  Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ（ｐＥＮＴＲ１Ａ―ヒメ＋Ｖ
５Ｔａｇ）を得た。
【００１９】
（Ｃ）バキュロウイルス発現系によるヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の一過性発現
ＬＲ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いてＥｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ（ｐＥＮＴＲ１Ａ―ヒメ＋Ｖ５Ｔａｇ）とＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＤＥＳＴ８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）間で部位特異的組換えを行い、ｐＤＥＳＴ８にヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子を組み込んだプラスミド（ｐＤＥＳＴ８―ヒメＴａｇ）を作製した。次に、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子をウイルスＤＮＡに組み込んだバキュロウイルスを作製した。
【００２０】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞に組み変えバキュロウイルスをｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  （ｍｏｉ）が約１となるように感染させ、ヒメトビウンカＧＡＢＡ＋Ｖ５Ｔａｇ受容体遺伝子の発現を抗Ｖ５抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いて確認した。
【００２１】
抗Ｖ５抗体で免疫沈降後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行うと、予想される分子量の位置に三本バンドのバンドが見られた。三本バンドが見られるのは、Ｎ結合型糖鎖の付加数の違いによると思われる。
【００２２】
さらに、抗Ｖ５抗体で細胞蛍光染色を行ったところ、組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ９細胞の細胞膜にヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇが位置していることが示唆された。
【００２３】
（Ｄ）電位センサープローブ法によるイオンチャンネル機能確認
上記のように構築したヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体発現細胞のイオンチャンネル機能を電位センサープローブ法（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）により確認した。
【００２４】
（Ｅ）Ｓｆ９細胞によるヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の安定発現
ＬＲ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いてＥｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ（ｐＥＮＴＲ１Ａ―ヒメ＋Ｖ５Ｔａｇ）とＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）間で部位特異的組換えを行い、ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８にヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子を組み込んだプラスミド（ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８―ヒメＴａｇ）を作製した。
【００２５】
Ｓｆ９細胞を６０ｍｍディッシュ２ｘ１０６播種し、翌日、セルフェクチン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いて１μｇのヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子発現プラスミドｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８―ヒメＴａｇと２０μｇのネオマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミド、ｐＢｍＡ：ｎｅｏ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）をトランスフェクションした。５時間後に１０％ＦＣＳを含む新鮮な培地Ｓｆ９００II−ＳＦＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に置き換え、次の日に、抗生物質Ｇ４１８を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように添加した。１週間後と２週間後に新鮮なＳｆ９００II−ＳＦＭ−１０％ＦＣＳ−１ｍｇ／ｍｌＧ４１８培地に交換した後、コロニーが２mm程度の大きさになった段階で、クローニングリングを用いてシングルコロニー由来の細胞を９６ウェルマイクロプレートに移した。細胞がコンフルエントに達したら、２４ウェルプレート、６ウェルプレートに拡大培養し９５クローンを薬剤耐性細胞株として保存した。
【００２６】
９５クローンの薬剤耐性細胞株の中から、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子を発現している細胞を選択するために、保存した細胞を起こして培養後、抗Ｖ５抗体で細胞免疫染色を行い、24株の安定発現株を取得した。
【００２７】
（Ｆ）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によるヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子の一過性発現
ＬＲ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いてＥｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ（ｐＥＮＴＲ１Ａ―ヒメ＋Ｖ５Ｔａｇ）とＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）間で部位特異的組換えを行い、ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８にヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子を組み込んだプラスミド（ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８―ヒメＴａｇ）を作製した。
【００２８】
ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８―ヒメＴａｇをＤ−ｍｅｌ２細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）にセルフェクチンを用いてトランスフェクションし、３時間後に  ＣｕＳＯ４を１００  μＭ濃度になるように添加し、４０時間後に発現を調べた。
【００２９】
抗Ｖ５抗体で免疫沈降後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行うと、予想される分子量の位置にバンドが見られた。
【００３０】
さらに、抗Ｖ５抗体で細胞蛍光染色を行ったところ、ｐＭＴ−ＤＥＳＴ４８―ヒメＴａｇを導入した細胞の細胞膜にヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇが位置していることが示唆された。
【００３１】
（Ｇ）ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子を恒常発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞由来安定発現株の確立
ｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）のＳａｌＩ部位にｐＣｏＨｙｇｒｏのハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入しｐＡｃ５．１−Ｈｙｇｒｏを作製した。次に、ａｔｔＲ１−Ｌａｃプロモーター−ＬａｃＺα−ａｔｔＲ２をコードするＸｂａＩ−ＭｌｕI断片をｐＡｃ５．１−ＨｙｇｒｏのＸｂａＩ−ＭｌｕＩ部位に挿入して、Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｃ−ｌａｃ−Ｈｙｇｒｏを得た。ＬＲ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを用いてＥｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ（ｐＥＮＴＲ１Ａ―ヒメ＋Ｖ５Ｔａｇ）とＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｃ−ｌａｃ−Ｈｙｇｒｏ間で部位特異的組換えを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養後、白いコロニーを選択して、ｐＡｃ−ｌａｃ−ＨｙｇｒｏのＬａｃＺα遺伝子がヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体＋Ｖ５Ｔａｇ遺伝子と入れ替わったプラスミド、ｐＡｃ−Ｈｙｇｒｏ−ヒメＴａｇを取得した。
【００３２】
ｐＡｃ−Ｈｙｇｒｏ−ヒメＴａｇをＤ−ｍｅｌ２細胞にセルフェクチンを用いてトランスフェクションし、ハイグロマイシン耐性株をシングルコロニーから確立し、保存した。29株の薬剤耐性細胞株の中から、ヒメトビウンカＧＡＢＡ受容体遺伝子を発現している細胞を選択するために、保存した細胞を起こして培養後、抗Ｖ５抗体で細胞免疫染色を行い、11株の安定発現株を取得した。
【配列表】
2006288302000001.app