(57)【要約】【課題】ＤＮＡ、ＲＮＡなどの試料液中のポリヌクレオチドと基板に固定したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを高速かつ高収率で行うＤＮＡプローブチップとハイブリダイゼーション法を提供する。【解決手段】ＤＮＡプローブは、該ＤＮＡプローブが固定されているプローブ固定領域側から順に少なくても３つのエリアを構成し、第１エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされ、第２エリアはターゲットポリヌクレオチドのＡＣＧＴのいかなる塩基とも相補的な水素結合を形成しない塩基を含む塩基配列とされ、第３エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされるとともに、第１エリアの塩基長と等しいか、より短かくする。【選択図】図５
2006098185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、該基板上に形成された複数の独立したプローブ固定領域が形成された電極および前記プローブ固定領域のそれぞれに共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブよりなり、前記ＤＮＡプローブは、該ＤＮＡプローブが固定されているプローブ固定領域側から順に少なくても３つのエリアを構成し、第１エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされ、第２エリアはターゲットポリヌクレオチドのＡＣＧＴのいかなる塩基とも相補的な水素結合を形成しない塩基を含む塩基配列とされ、第３エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされるとともに、第１エリアの塩基長と等しいか、より短いことを特徴とするＤＮＡプローブチップ。
【請求項２】
前記第２エリアがターゲットポリヌクレオチドと非相補な塩基配列を少なくても１／３以上含むものである請求項１記載のＤＮＡプローブチップ。
【請求項３】
前記第２エリアがＡＧあるいはＣＴ対に比べエネルギー的に不安定ではあるがターゲットポリヌクレオチドと水素結合を形成することができる塩基配列を含むものである請求項１記載のＤＮＡプローブチップ。
【請求項４】
前記第１エリア、第２エリアおよび第３エリアのターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの安定性が第１エリア、第３エリア、第２エリアの順で低下する請求項１ないし３のいずれかに記載のＤＮＡプローブチップ。
【請求項５】
前記ＤＮＡプローブはプローブ固定領域に固定された末端と異なる末端にマイナス電荷を有する解離基が付加された請求項１ないし４のいずれかに記載されたＤＮＡプローブチップ。
【請求項６】
基板、該基板上に形成された複数の独立したプローブ固定領域が形成された電極および前記プローブ固定領域のそれぞれに共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブよりなり、前記ＤＮＡプローブはＤＮＡプローブが固定されているプローブ固定領域側から順に少なくても３つのエリアを構成し、第１エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされ、第２エリアはターゲットポリヌクレオチドのＡＣＧＴのいかなる塩基とも相補的な水素結合を形成しない塩基を含む塩基配列とされ、第３エリアはターゲットポリヌクレオチドと実質相補の塩基配列とされるとともに、第１エリアの塩基長と等しいか、より短いこととされたＤＮＡプローブチップと、該ＤＮＡプローブチップ表面に対向して配置された部材との間に、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料液を添加する工程、前記電極と前記試料液部位との間に所定の電界を印加して、前記ポリヌクレオチドをＤＮＡプローブチップ表面近傍に濃縮する工程、前記電極と前記試料液部位との間に印加する電界を反転させ、プローブを伸ばした状態でハイブリダイゼーションを開始させる工程からなることを特徴とするＤＮＡハイブリダイゼーション制御法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチド混合試料液中に含まれる種々のターゲットポリヌクレオチドを一度に検査するＤＮＡプローブチップあるいはＤＮＡプローブアレーと呼ばれるものに関する。ＤＮＡ、ＲＮＡなどの試料液中のターゲットポリヌクレオチドと基板に固定したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを高速かつ高収率で行うチップ構造とハイブリダイゼーション法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。
【０００３】
ＤＮＡプローブチップを作るには、光化学反応と、半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに、設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいは、ＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。
【０００４】
これらのチップは、いずれもスライドガラスなどの平面状に多数のプローブを、区画を区切り、アレー状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。
【０００５】
使用方法は、チップ基板上のプローブに、蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどのターゲットポリヌクレオチド（以下単にターゲットポリヌクレオチド）をハイブリダイズさせて、基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、ターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接してターゲットポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴを連結反応（ライゲーション）で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入する蛍光体を検出するのが主流である。
【０００６】
最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを捕捉した後、質量分析機で分析する方法、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。
【０００７】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発するので、この光を検出する。
【０００８】
ＤＮＡプローブチップにおけるハイブリダイゼーションのメカニズムの検討に関していくつかの報告がある。Ｗａｔｔｅｒｓｏｎらの非特許文献４（Langmuir, 16, 4984-4992（2000））記載の内容によると、プローブ平均間隔が３〜７ｎｍの範囲では、チップ表面のプローブ固定密度が高くなると、プローブのマイナス電荷とターゲットポリヌクレオチドのマイナス電荷の斥力により、ターゲットポリヌクレオチドのチップ表面への接近速度とハイブリダイゼーション速度が低下するという。他方、Ｋｕｒｌらによると数〜数十ｎｍ間隔でプローブを固定すると高密度の方が感度が上がる（非特許文献５：Nucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001)）という。
【０００９】
【非特許文献１】Science 251, 767-773 (1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)
【非特許文献４】Langmuir, 16, 4984-4992 (2000)
【非特許文献５】Nucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来技術の項で明らかなように、ＤＮＡプローブチップを用いるターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関しては、ある程度の実験的なメカニズムの検討がなされているものの、それらが実際のＤＮＡプローブチップの構造やハイブリダイゼーションのさせ方に反映されているわけではない。むしろ、チップ上に固定するプローブのコンテンツ開発や計測手段開発が主流であり、プローブごとの速度論的、熱力学的な原理に基づいて優れた条件でのハイブリダイゼーションを行おうとする試みは少ない。
【００１１】
このために、従来の方法では、ハイブリダイゼーションの反応時間として１２時間程度の長い時間が必要となっているのみならず、反応効率も低い。
【００１２】
本発明は、このような難点を解決するためになされたもので、固体チップ表面でのハイブリダイゼーション速度を改善し、短時間で計測が可能で高感度かつ擬陽性ハイブリダイゼーションの少ないＤＮＡプローブチップ，このような問題点を解決するＤＮＡプローブチップの作成法、および、ＤＮＡプローブチップにおけるハイブリダイゼーション法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、
１）プローブは電極表面に固定し、ターゲットポリヌクレオチドをプローブが固定された電極表面近傍に濃縮できる構造とすること、
２）プローブの固定端側が、ターゲットポリヌクレオチドと、よりハイブリダイゼーションし易い構造とすることにより、起立したプローブへの基板側から自由端側に進むようにする。このことにより、周囲のプローブや固相表面の立体障害を受けにくくすること、
により上記の目的を実現する。
【００１４】
上記に加え、さらに、より工夫されたものとして、
３）前記電極表面近傍に濃縮されたターゲットポリヌクレオチドを拡散させるときに、プローブが速やかに起立するよう、プローブは、その自由端にマイナスに解離する残基（マイナス電荷）を導入した構造とすること、
４）プローブは、プローブ主鎖のマイナス電荷が除去されたものとすることにより、ターゲットポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイゼーションしやすいようにする、
ものとして、固体チップ表面でのハイブリダイゼーション速度を、より改善し、短時間で計測が可能で高感度かつ擬陽性ハイブリダイゼーションの少ないものとする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＤＮＡプローブチップ表面に固定したプローブのトポロジーとハイブリダイゼーション形成の方向を制御できるので、プローブチップ上でのプローブのハイブリダイゼーション速度を、従来法の数十倍以上に高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
プローブとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの過程を考察すると、効率よくハイブリダイゼーションを行うには、以下の点を考慮する必要があることに気づく。
【００１７】
１）ＤＮＡプローブチップでは、プローブは固相表面に固定されており、プローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、実質的に、固液界面での相補鎖結合反応となる。このため、溶液中のターゲットポリヌクレオチドがプローブと衝突するにはターゲットポリヌクレオチドが固液界面まで拡散する必要がある。固体表面の拡散層に達するまでは、十分攪拌するか、ターゲットポリヌクレオチドに濃度勾配をつけて、固液界面近傍の濃度を高めることが必要であるが、単に攪拌するだけでは拡散層内はターゲットポリヌクレオチドの拡散係数に頼ることになり時間がかかる。
【００１８】
本発明では、ＤＮＡプローブチップ表面（プローブを固定している固相表面）をプラス電位として、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチドをＤＮＡプローブチップ表面に静電的に引き寄せる。この結果、ＤＮＡプローブチップ表面とターゲットポリヌクレオチドを含む試料液との固液界面から試料液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成することができる。すなわち、ＤＮＡプローブチップ表面に近いほどターゲットポリヌクレオチドの濃度が高い状態とすることが出来る。ＤＮＡプローブチップ表面をプラス電位とするには、ＤＮＡプローブチップ表面にプラスに解離する残基（プラス電荷）を導入して調製するか、あるいは、ＤＮＡプローブチップ表面とＤＮＡプローブチップ表面から離れた位置の試料液の部分とに電極を配し、ＤＮＡプローブチップ表面がプラス電位となるように電圧を印加することで実現する。
【００１９】
２）ＤＮＡプローブチップ上のプローブとターゲットポリヌクレオチドは、いずれも、マイナスに荷電されたポリマーである。ハイブリダイゼーション形成の過程では、プローブとターゲットポリヌクレオチドの最もハイブリダイゼーションしやすい部分が核となり、ハイブリッドを形成し、その領域が広がることにより完全なハイブリダイゼーションが完了すると考えられる。このときに考慮しなくてはならないのが、ＤＮＡプローブチップ表面の影響と隣接するプローブの立体障害である。
【００２０】
従来技術の項で示したNucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001)とLangmuir, 16, 4984-4992（2000）の両者を比較すると、プローブ密度が、十分、疎な状態では熱力学的にプローブ量が多いほうがハイブリダイゼーションに有利であるが、密度が７ｎｍ以下になると、隣接するプローブの電荷反発力によりハイブリダイゼーション効率が低下すると解釈できる。また、本文献には記載されていないが、プローブ密度が高いと立体障害によりハイブリダイゼーション効率が低下する。
【００２１】
マクロ的な観察からは、最適なプローブ密度が存在することになる。しかし、本発明では、上記１）記載のように、ターゲットポリヌクレオチドをプローブ近傍に高密度に存在させて、プローブと衝突させるので、マクロ的な観察で言えるような、最適なプローブ密度が存在することにはならない。すなわち、本発明では、ターゲットポリヌクレオチドはチップ表面上のプローブに到達した状態からハイブリダイゼーションがスタートする。したがって、ハイブリダイゼーションの効率は、プローブの先端がハイブリダイゼーションの核になるか、プローブの根元（チップ表面）の方が核になるかにより、異なることに気づいた。
【００２２】
すなわち、プローブの先端（自由端）がハイブリダイゼーションの核になる場合は、巨大なターゲットポリヌクレオチド分子がプローブＤＮＡに巻き付く（２本鎖を形成する）過程で隣接するプローブと衝突したり、チップ表面に衝突したりすることになるので立体的に不利となり、巻き付く速度が遅くなる。一方、プローブが固定されている側、すなわち、プローブの根元（チップ表面）の方がハイブリダイゼーションの核になる場合は、チップ表面から遠ざかる方向でターゲットポリヌクレオチドがプローブに巻き付く（２本鎖を形成する）。この場合は、チップ表面から遠ざかる方向にハイブリダイゼーションが進行するので立体的な障害は少ない。さらに、隣接プローブの先端部もターゲットポリヌクレオチドが巻き付いた状態ではないので、障害は少ない。
【００２３】
以下、図面を参照しながら、より具体的に説明する。
【００２４】
（実施例１）
図１Ａは、本発明の実施に好適なＤＮＡプローブチップ１００の平面図、図１Ｂは、図１ＡのＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【００２５】
１はＤＮＡプローブチップ基板としてのフロートガラス（２０×４０ｍｍ）である。２は電極であり、基板１の表面に蒸着されている。電極は１０×１０ｍｍで１００ｎｍの厚さのＩＴＯ（Indium-Tin Oxide）である。３はＩＴＯ電極２の表面に形成された１０ｎｍ厚のフッ素表面コーティングである。４はプローブ固定領域であり、フッ素表面コーティングを周期的に除去して電極２の表面を露出させたものである。図１Ａでは、プローブ固定領域４は４×４個として大きな円形状で示したが、実際のプローブ固定領域４は３０μmφ程度の広さとされ、例えば、１００×１００個設けられる。隣接するプローブ固定領域４とは６０μm程度離れているとともに、隣接するプローブ固定領域４間にはフッ素表面コーティングが配されて、プローブ固定領域４は、それぞれ独立した形となっている。
【００２６】
電極２の上面に設けられるフッ素表面コーティング３は、隣接するプローブ固定領域４間のクロスコンタミネーションを防ぐ目的で導入されている。それぞれのプローブ固定領域４には、ピンアレー装置により数百ｐｌのオーダーで、所定のプローブ液が塗布されるので、プローブ液が領域からはみ出さないように、フッ素表面コーティング３は撥水性の性質が要求される。プリント技術で塗布されたフッ素表面コーティング３表面に、マスクを用いて酸素プラズマでアッシングしてフッ素表面コーティングを除去することによりプローブ固定領域４を作成できる。酸素プラズマアッシングによりプローブ固定領域４を作成するため、この領域の露出しているＩＴＯ電極２は親水性となる。
【００２７】
プローブをプローブ固定領域４のＩＴＯ電極２の表面に固定する方法を述べる。ＩＴＯ電極２の表面は酸化状態にあるので、シランカップリング反応を用いてＤＮＡプローブを固定する。ＤＮＡプローブ固定の実施条件、すなわち緩衝液組成、試料ＤＮＡプローブに関してはNucleic Acids Research (2002) 30, No.16 e87記載のハイブリダイゼーション方法に従う。プローブ固定法に関しては、上記文献に従い、ＩＴＯ電極２を３−アミノプロピルトリメトキシシランで処理し、表面にアミノ基を導入する。表面に導入したアミノ基とプローブのＳＨ基の間をＮ−（１１−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｘｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅで架橋する。この方法で５０塩基前後のプローブを固定するとプローブ固定密度がおおよそ１５ｎｍ２に１分子になる。
【００２８】
あるいは、Ａ．Ｋｕｍａｒらの方法（Nucleic Acids Research (2000) 28, No.14 e71記載の方法で、あらかじめ、合成オリゴヌクレオチドの５’末端にトリメトキシシラン残基を導入したシラン化ＤＮＡプローブを、プローブ固定領域４のＩＴＯ電極２の表面に塗布してプローブを固定する。
【００２９】
（実施例２）
図２Ａは、図１を参照して説明したＤＮＡプローブチップ１００の表面にターゲットポリヌクレオチドを含む試料液を導入した状態、図２ＢはＤＮＡプローブチップ１００の表面と試料液との固液界面から試料液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成する最初の手順をとった状態、図２Ｃは濃度勾配を形成する次の手順をとった状態を、それぞれ、断面図の形で示す図である。
【００３０】
ＤＮＡプローブチップ１００の表面に、適当なスペーサー（図示しない）を入れて０．１ｍｍのギャップを空け、カバーガラス１１を乗せる。カバーガラス１１の内面には、１００ｎｍの厚さのＩＴＯ電極１５を設ける。ＤＮＡプローブチップ１００の表面とカバーガラス１１との隙間に４０マイクロリットルのｍＲＮＡ試料液５０を添加する。試料液５０は、スライドガラスを一定の速度で往復運動させ、攪拌される。図２Ａはこの状態を示す図であり、１２−１、１２−２および１２−３は、それぞれ、プローブ固定領域４に固定されたプローブである。１４は、試料液５０内に分散しているターゲットポリヌクレオチドである。この状態では、ターゲットポリヌクレオチドはターゲットポリヌクレオチドの拡散係数に応じて拡散するに過ぎない。
【００３１】
図２Ｂは、ＤＮＡプローブチップ１００の電極２とカバーガラス１１の電極１５との間に、電源２５により、電極２がプラスになるように＋１５Ｖ／ｃｍになるように電界（実効的には電極間で０．１５Ｖ）を印加した状態を示す図である。この結果、ＤＮＡプローブチップ表面側をプラス電位とすることで、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−１，１２−２および１２−３を静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せる。なお、電極１５はカバーガラス１１に貼り付けてある必要はなく、試料液５０内のＤＮＡプローブチップ表面側から離れた部位にあれば良い。
【００３２】
図２Ｃは、電源２５により電圧を印加した３０秒後に、ＤＮＡプローブチップ１００の電極２とカバーガラス１１の電極１５との間に、電源２６により、電極２がマイナスになるように−１５Ｖ／ｃｍの電界（実効的には電極間で０．１５Ｖ）をかけ、０分間から３０分間攪拌を続けた状態を示す図である。電極２がマイナスになるため、静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せられていたマイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−１，１２−２および１２−３は、ＤＮＡプローブチップ表面を離れる。プローブ１２は短いので、短時間で離れ、ターゲットポリヌクレオチド１４は時間をかけて離れることになるが、試料液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度はＤＮＡプローブチップ表面側ほど濃度が高い勾配を持ったものとなる。
【００３３】
すなわち、図２Ｃに示すように、電界を反転させるとプローブ１２のマイナス電荷やターゲットポリヌクレオチド１４のマイナス電荷との反発力が働き、これらがＤＮＡプローブチップ表面から遠ざかる方向に働く。プローブ１２はターゲット１４に対して短い（小さい）ので、より速く遠ざかろうとするが、片端が固定されているので、プローブ分子はすばやくチップ表面に対して直鎖状に起立する。これに対して、ターゲットポリヌクレオチドは分子が大きいので、動きが鈍く、ＤＮＡプローブチップ表面に滞在する時間が長い。すなわち、プローブの固定端近傍のほうが先端近傍よりターゲットポリヌクレオチド濃度が高くなる。
【００３４】
すなわち、図２Ｃはハイブリダイゼーションが始まる前の状態を示すことになるが、ターゲットポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションの確率は、プローブの根元の方が先端部分より高くなる。よって、プローブのチップ表面に近い部分にハイブリダイゼーションの核が確率的に形成する率が高まり、プローブの基板近くの方から先端の方向にハイブリダイゼーションが進行し、ターゲットポリヌクレオチドはＤＮＡプローブチップ表面上のプローブと効率よくハイブリダイゼーションすることになる。
【００３５】
図３は、実施例２の効果を示す図である。図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃで説明したようにしてプローブ１２に捕捉されるターゲットポリヌクレオチドを評価するために、ターゲットポリヌクレオチドに金粒子を結合させておき、ＤＮＡプローブチップに印加する電界の条件をパラメータとして、ターゲットポリヌクレオチドを捕捉する時間を種々変えて調べた。このチップを洗浄し、乾燥させ、走査型電子顕微鏡で表面に残存する金粒子の数をカウントした。横軸は電界をかける時間、縦軸はカウントされた金粒子の数である。
【００３６】
特性曲線１０１は、電源２５により、電極２−１５間に、＋１５Ｖ／ｃｍの電界を印加した後、電源２６により、電極２−１５間に、−１５Ｖ／ｃｍの電界を印加した場合のＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果、１０２は、コントロールとして、いかなる電界も加えないときのＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果、および、１０３は電源２５により、＋１５Ｖ／ｃｍを印加しただけで、電源２６により、−１５Ｖ／ｃｍを印加しなかった場合のＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果を、それぞれ、示す。ここで、１０１と１０３は、最初の＋１５Ｖ／ｃｍを印加する時間は同じとした。
【００３７】
特性曲線１０１に明らかなように、まず、電源２５により、電極２−１５間に、＋１５Ｖ／ｃｍの電界を印加して、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−１，１２−２および１２−３を静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せる。その後、電源２６により、電極２−１５間に、−１５Ｖ／ｃｍの電界を印加して、静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せられていたマイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−１，１２−２および１２−３を、ＤＮＡプローブチップ表面から離す。この手順をとることにより、試料液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度はＤＮＡプローブチップ表面側ほど濃度が高い勾配を持ったものとなり、この結果、効率よくターゲットポリヌクレオチドを捕捉出来たことが分かる。なお、図からも分かるように、ある程度、ハイブリダイゼーションが進めば、捕捉できるターゲットポリヌクレオチドは飽和するので、ハイブリダイゼーション反応を長時間続ける価値はない。
【００３８】
なお、本実施例では金ナノ粒子を標識に用いたが、Ｃｙ３蛍光体を標識した配列番号３を試料としても、同様な傾向の結果を得ることができる。すなわち、蛍光標識を用いる場合は図３の縦軸は相対蛍光強度におきかえればよい。
【００３９】
電源２５により、電極２−１５間に、＋１５Ｖ／ｃｍの電界を印加して、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−１，１２−２および１２−３を静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せただけでは、この電界を取り去っても、引き寄せられたプローブが図２Ｃに示すように、整然と並ばないので、ハイブリダイゼーションの反応が進み難い。
【００４０】
いかなる電圧も印加しないときは、試料液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度勾配は生じないので、ターゲットポリヌクレオチド１４の捕捉率は低いものとなるのは当然である。
【００４１】
なお、ＤＮＡプローブチップ表面をプラス電位とするには、上述したように、ＤＮＡプローブチップ表面とＤＮＡプローブチップ表面から離れた位置の試料液の部分とに電極を配し、ＤＮＡプローブチップ表面がプラス電位となるように電圧を印加する方法に限られることは無く、他にも、ＤＮＡプローブチップ表面にプラスに解離する残基（プラス電荷）を導入して調製するものとしても実現できる。図２Ｂの参照符号６（＋の表示とこれを囲う丸）は、このプラスに解離した残基（プラス電荷）である。ＤＮＡプローブチップ表面にプラスに解離する残基（プラス電荷）を導入してＤＮＡプローブチップ表面をプラス電位とした場合には、外部から印加する電界は、図２Ｃに示す反転用の電界のみで良い。
【００４２】
（実施例３）
実施例３ではプローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてのハイブリダイゼーションの核とハイブリダイゼーションの進行方向の影響を考慮した実施例である。
【００４３】
図４Ａはプローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の根元部（ＤＮＡプローブチップの表面に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図であり、図４Ｂはプローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の先端部（自由端部）に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図である。
【００４４】
図４Ａ、図４Ｂにおいて、２１，２２はハイブリダイゼーションの核となった部位である。図４Ａを参照すれば、プローブが固定されている側、すなわち、プローブの根元（チップ表面）の方がハイブリダイゼーションの核になる場合は、チップ表面から遠ざかる方向でターゲットポリヌクレオチドがプローブに巻き付く（２本鎖を形成する）。この場合は、チップ表面から遠ざかる方向にハイブリダイゼーションが進行するので立体的な障害は少ない。さらに、隣接プローブの先端部もターゲットポリヌクレオチドが巻き付いた状態ではないので、障害は少ないことが良く理解できる。一方、図４Ｂを参照すれば、プローブの先端（自由端）がハイブリダイゼーションの核になる場合は、巨大なターゲットポリヌクレオチド分子がプローブＤＮＡに巻き付く（２本鎖を形成する）過程で隣接するプローブと衝突したり、チップ表面に衝突したりすることになるので立体的に不利となり、巻き付く速度が遅くなることが良く理解できる。
【００４５】
プローブの根元（チップ表面）の方がハイブリダイゼーションの核になるようにするためには、試料液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４をＤＮＡプローブチップ表面に引き、ＤＮＡプローブチップ表面に近い位置の試料液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度勾配を大きくすることが有効であることは先に述べた。ここでは、プローブの配列を工夫してプローブの根元（チップ表面）の方がハイブリダイゼーションの核になるようにする例について述べる。
【００４６】
プローブとしてはヒトｍＲＮＡ配列から５０塩基長の配列を抽出して用いる。配列は基板に近い２０塩基とそのほかの部分でのＧＣ量が１５％以上異なる配列部分を優先的に採用する。すなわち、基板に近い方をＧＣ含量を高くする。配列上できない場合は自由端から１０塩基程度の位置から３０塩基程度位置までの間に鋳型となるｃＤＮＡ配列とミスマッチとなる配列あるいはＡＣＧＴのいずれとも安定な相補鎖を形成しないブランク配列を入れた形でプローブ配列を設計する。ただし、ミスマッチ配列あるいはブランク配列を入れすぎると安定性が低下するので、この範囲で２箇所までとする。このような方法でハイブリダイゼーションの安定性を制御することは、プローブの固定端近傍にハイブリダイゼーションの核を形成させる上で重要である。
【００４７】
図５は、プローブ１２−１の一端が本発明の考え方で構成されてプローブ固定領域４に固定されている状態を模式的に示す図である。ＤＮＡプローブ１２−１をプローブ固定領域４から順にエリアに分けて考える。プローブの配列を少なくとも３つのエリアに区切り、それぞれのエリアのハイブリダイゼーション安定性を制御する。すなわち、プローブ固定領域４に近い方がハイブリダイゼーションの安定性が高い構造とする。プローブ固定領域４表面に最も近い第１エリア３３−１は１５〜２０塩基長程度で、ターゲットポリヌクレオチドと実質相補とする。第２エリア３３−２は２７で示す配列がＡＣＧＴのいかなる塩基とも相補的な水素結合を形成しない塩基、あるいは、ターゲットポリヌクレオチドと非相補な塩基配列を少なくても１／３以上含む１５〜２０塩基長のエリアである。第３エリア３３−３はターゲットポリヌクレオチドと実質相補とするが、第１エリアの塩基長より短くしたりして、第３エリアのハイブリダイゼーションの安定性を第１エリアより低くすることが重要となる。
【００４８】
このように改変されたプローブ１２−１について、第１エリア３３−１と第２エリア３３−２を比べると第１エリア３３−１の方がハイブリダイゼーションの安定性が高い。一方、第３エリア３３−３はターゲットポリヌクレオチドと実質相補であるので、ハイブリダイゼーションはするが、第１エリア３３−１の方がハイブリダイゼーションの安定性が高いので、結局、ハイブリダイゼーションは第１エリア３３−１から始まる。
【００４９】
これで基本的にはプローブのプローブ固定領域４側からターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが始まることとなるが、一般にプローブの選択性と安定性を考慮すると、プローブ長は４０〜６０塩基が適当であると言われている。第１エリアをあまり長くするとハイブリダイゼーションの核がプローブ固定領域４近傍にでき難くなる。また、第２エリアを長く取りすぎることも問題である。たまたま、第２エリアが第１エリアに比べＡＴリッチであれば良いが、そうでないと、ターゲットポリヌクレオチドに対してハイブリダイズしない塩基やミスマッチ塩基を多量に入れなくてはならなくなる。これは、ハイブリダイゼーションの選択性を損ねる結果となりかねない。このような塩基は９塩基に１〜３塩基にとどめることが重要である。このため、第２エリア部分の塩基長は最長でも２０塩基程度とするべきである。第３エリア３３−３は、全体の塩基長を所定の長さにしながら、第１エリアのハイブリダイゼーションの安定性を高める効果がある。すなわち、ハイブリダイゼーションの安定性は第１エリア＞第３エリア＞第２エリアとなることが最も望ましい。塩基長としては全体として３０〜５０塩基長程度とする。
【００５０】
具体例として、プローブ配列として、ＰＯＮ１（Homo sapiens paraoxonase 1）のｍＲＮＡで９４０〜９８９塩基部分の配列（配列番号１）を用いる。プローブは化学的方法で作ることは言うまでもない。
５’−AGAATCCTCC TGCATCAGAG GTGCTTCGAA TCCAGAACAT TCTAACAGAA−３’：配列番号１
配列番号１の配列を持ったプローブを５’末端でプローブ固定領域４に固定するとする。このプローブの配列を１０塩基ごとに区切りＧＣ％を計算すると、５’末端側から、５０％、５０％、５０％、４０％、３０％となる。ここで、５’末端側の２０塩基を第１エリア３３−１、２１〜３０塩基を第２エリア３３−２、３１〜５０塩基を第３エリア３３−５とすると、第２エリアのＧＣ量が多く、プローブ固定領域４近傍に位置するプローブの第１エリア（５’末端近傍）にハイブリダイゼーションの核が形成される確率が低下し、第２エリアがハイブリダイゼーションの核になる確率が上がる。そこで、塩基を改変し、２１〜３０塩基目のハイブリダイゼーション安定性を低下させる。また、第２エリアはパリンドローム構造を取り易いので、あわせてこれを破壊するように塩基を改変する。このような改変を行ったプローブ配列を配列番号２として示す。
５’−AGAATCCTCC TGCATCAGAG GTGBTTBGAA TCCAGAACAT TCTAACAGAA−３’：配列番号２
ここで、Ｂはいかなる塩基とも安定な相補鎖を形成しない擬似塩基か、ターゲットポリヌクレオチドと非相補になる塩基である。たとえば塩基部をもたない糖鎖部分のみのスペーサーと、２−チオウラシルのように、塩基部分に原子半径の大きな原子を導入した擬似塩基を用いる。２−チオウラシルはターゲットポリヌクレオチドの対応する配列であるシトシンと安定な水素結合を作ることはできない。これは、塩基に導入した硫黄原子の原子半径が大きいため、グアニンと水素結合を作れないためである。ＢとしてＡを入れると、Ｃとミスハイブリダイゼーションを起こしやすい問題があるのでここでは使用しない。このケースではＢとして２−チオウラシルの他にＴに変換することが有効である。ミスマッチ塩基とする場合はＡ−Ｇ、Ａ−Ａ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｔミスマッチとなるようにプローブ内の塩基を改変すればよい。
【００５１】
この改変された配列番号２の配列を持つプローブの配列を１０塩基ごとに区切りＧＣ％を計算すると、５’末端側から、５０％、５０％、３０％、４０％、３０％となる。この改変プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うと、５’末端側の２０塩基が最初にハイブリダイズし、ここを核にしてプローブ３’末端側にハイブリダイゼーション領域が広がることになる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション用の試料の調製法を説明する。試料としては合成１本鎖ＤＮＡを用いる。モデルのため下記のようにコア部分に配列番号１に相補な配列を有し前後に２０塩基からなるポリＡ（Ａ２０で表示）を結合し、全長を９０塩基としている。
５’−Ａ２０−TTCTGTTAGA ATGTTCTGGA TTCGAAGCAC CTCTGATGCA GGAGGATTCT−Ａ２０−３’（配列番号３）
ここで、５’末端には、スルホローダミン１０１蛍光色素を結合し、ハイブリダイゼーションの評価に利用する。
【００５３】
ここで、ハイブリダイゼーションの核がプローブ固定領域４表面に近い部分に出来るようにした場合と遠い部分に出来るようにした、それぞれのＤＮＡプローブチップのハイブリダイゼーションの効果の比較をするため、二つの異なるＤＮＡプローブチップを準備する。すなわち、一つのＤＮＡプローブチップのプローブ固定領域４には、配列番号２の塩基配列を持つプローブを、５’末端で、上述した方法のいずれかで固定する。同時に、他のＤＮＡプローブチップのプローブ固定領域４には、配列番号１の塩基配列を持つプローブを、５’末端で固定する。
【００５４】
上記の二つの異なるＤＮＡプローブチップのそれぞれを使用して、以下の実験を行う。スペーサーで０．１ｍｍのギャップをあけてチップの上にカバーガラスをのせ、隙間に４０マイクロリットルの配列番号３の蛍光標識ＤＮＡを添加する。試料は攪拌のためにスライドガラスを一定の速度で往復運動させ攪拌する。このとき、電極２と対抗電極３の間に電極４−１が＋１５Ｖ／ｃｍになるように電界（実効的には電極間で０．１５Ｖ）をかける。試料溶液中のｍＲＮＡは基板上のＩＴＯ電極部に速やかに引き寄せられる。３０秒後、電極４−１に−１５Ｖ／ｃｍの電界をかけ、０分間から３０分間攪拌を続ける。洗浄し、エレメント表面からの蛍光（励起：５４５ｎｍ、蛍光：５２０ｎｍ以上）強度を測定する。
【００５５】
図６は、配列番号３を持つ試料を、配列番号２のプローブを５’末端で固定したＤＮＡプローブチップで処理した場合の結果（特性曲線１１１で示す）と配列番号１のプローブを５’末端で固定したＤＮＡプローブチップで処理した場合の結果（特性曲線１１３で示す）とを比較する図である。ここで、電界の印加等の他の条件は、実施例２の結果を示す図３と同じである。明らかに配列番号２記載のプローブを固定したエレメントのからの蛍光強度１１１の方が、配列番号１記載のプローブを固定したエレメントからの蛍光強度１１３よりも、蛍光強度の時間に対する立ち上がりが速い。このことは、プローブ固定端である５’末端が安定なハイブリダイゼーションを形成しやすい方がハイブリダイゼーションの速度が速いことを示す。すなわち、プローブ固定領域４に固定された５’末端近傍の方が３’末端側よりＧＣリッチであると、ハイブリダイゼーションの核が基板近傍にでき、ハイブリダイゼーションは基板近傍から自由端方向に進行し、立体障害や固相表面の影響を受けることが少なく、ＤＮＡプローブチップの構造を設計する上で重要であることがわかる。
【００５６】
（実施例４）
ハイブリダイゼーションの核を基板近傍に、より形成しやすくするには、実施例２で説明したように、プローブを、すばやく起立させることも一つの重要な事項である。実施例４ではこの観点で工夫されたプローブに関する。
【００５７】
図７は、プローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の根元部（ＤＮＡプローブチップの表面に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図４Ａに実施例４のプローブを使用した場合について示す図である。
【００５８】
実施例４では、ＤＮＡプローブチップの表面に固定されているプローブ１２−３の固定端とは逆の末端（自由端）に過剰の解離基２４を導入する。解離基２４としては、硫酸基、あるいはリン酸基のようにマイナス電荷を持つものが使用できる。より大きな効果を期待するなら、これらのマイナス残基を多量に含む分子や粒子を使用する。プローブ先端にマイナス電荷を持つので、図２Ｂで説明したように、ＤＮＡプローブチップ表面側をプラス電位として、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４およびプローブ１２−３を静電的に、ＤＮＡプローブチップ表面に引き寄せた後、電源２６によって、電界を反転させたときは、プローブ先端に導入したマイナス電荷２４との間でより強い斥力が働き、プローブ１２−３がすばやく起立する。
【００５９】
これは、ＤＮＡプローブチップ表面にプラスの静電荷を持つ残基６を恒常的に導入する場合でも同じ効果が得られる。チップ表面は特別な操作をしない限り、導入されたプラスの静電荷によりプラスに帯電しているので、図２Ｂで説明したように、プローブやターゲットヌクレオチドを表面に吸着することができる。この状態で、表面のプラス電荷を打ち消す以上のマイナス電位をチップ表面の電極２と対向電極１５に加えれば、自由端側に過剰のマイナス電荷残基を導入したプローブはすばやく起立する。ターゲットオリゴヌクレオチド１４プローブ１２−３に比較してサイズが大きいので動きが鈍く、ハイブリダイゼーションの核はプローブの基板に近いほうに形成され、プローブの先端に向かってハイブリダイゼーションが進行する。このような系を有効的に実施するにはプローブ長が３０から５０塩基長程度がよい。
【００６０】
（実施例５）
本発明をより効果的にするには、プローブそのものの電荷をなくし、プローブの自由端にマイナス電荷を大量に導入するのが良い。電荷を持たないプローブとしては、合成オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル結合をペプチド結合に変えたＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）や、Ｓ−カルボキシメチル-Ｌ-システインを基本骨格とするＣＡＳ（Cysteine Antiesnse Compound）などを用いることができる。
【００６１】
ＰＮＡもＣＡＳもポリマーとしたときの主鎖に電荷を持たないので、ターゲットポリヌクレオチドとの静電的斥力が働かない。これらは末端がアミノ基とカルボキシル基なので、アミノ基側を固定端に用いると、自由端側は、自ずと、マイナス電荷を持つカルボキシル基となる。もちろん、これに加えて、実施例４と同様にしてマイナス電荷を持つ残基を用いて、より多量のマイナス電荷を導入することで、基板表面の電極操作で速やかにプローブを起立するものとすることができる。また、ＰＮＡやＣＡＳは主鎖に電荷を持たないのでターゲットポリヌクレオチドとの間に斥力が働かない。プローブを起立させることで、ハイブリダイゼーションの席を空けると速やかにターゲットポリヌクレオチドとハイブリサイズする。
【００６２】
プローブとしてＰＮＡやＣＡＳを固定する場合は、以下の方法を採用する。３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの０．５％水溶液（触媒として０．５％の酢酸を含む。シランカップリング剤が溶解しない場合は溶解するまで酢酸を加える。）を３０分間室温（２５℃）で放置し、メトキシ基を加水分解により活性なシラノール基を形成させる。この活性化シラン液を基板表面に塗布し、室温で４５分間放置する。純水で洗浄後、基板上に残る液体をブロアーで飛ばし、１０５℃、３０分間空気中で過熱することでグリシドキシプロピル基を共有結合で導入したＩＴＯ電極を有する基盤を得る。導入したグリシドキシプロピル基をなす原子団の一部がアミノ基との反応性が高いエポキシ基である。ｐＨ１０の水溶液条件下で１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の上記アミノ基を有するＰＮＡあるいはＣＡＳと２５〜１００μＭのＬｙｓを含む混合溶液を塗布する。ここでＬｙｓを混ぜ込むのは、ＰＮＡあるいはＣＡＳを均一に固定する目的とＰＮＡあるいはＣＡＳの固定密度が密になり過ぎないように固定密度をコントロールするためである（ＰＮＡあるいはＣＡＳのみの溶液で固定しようとすると、これらが団子状態でＩＴＯ表面を攻撃するので、アイランド状に固定密度の高い所と低い所ができる）。溶液を１時間５０℃で反応させる。この反応でＰＮＡ、あるいは、ＣＡＳを固定したプローブチップを得ることができる。
【００６３】
以上のプローブ固定で得られる基板表面は電気的にはニュートラルである。次に、表面が正電荷を帯びた基板とする方法について述べる。上記方法に用いるＤＮＡプローブに２５〜１００μＭのアルギニンオリゴマー（Ｌ−Ａｒｇ）６を混合して反応をさせる。プローブがＰＮＡやＣＡＳの場合はＬｙｓの代わりにアルギニンオリゴマーを添加する。これにより、基板表面がプラスにチャージしているプローブチップを得ることができる。
【００６４】
実施例２と同様に電極にかける電界を制御しても、電界の影響は固定するプローブが電荷を持たないので顕著ではない。しかし、プローブの自由端側にスルホン酸基を導入すると、実施例４で説明した過剰の解離基２４と同様の効果が得られ、極めて高速なハイブリダイゼーションが可能となる。試料液を添加すると、基板表面のプラスチャージに試料液中のマイナス電荷を持つターゲットポリヌクレオチドが、プローブを固定したＩＴＯ電極表面に濃縮される。電界を反転させると、プローブの自由端側に修飾してあるスルホン酸基のマイナス電荷が反発し、プローブが速やかに起立する。また、この例でも、実施例３と同様に基板に近いほうがＧＣリッチなようにプローブを固定するほうがハイブリダイゼーション速度が速く、ハイブリダイゼーション収率も高い。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> DNA probe chip and DNA hybridization control method
<130> NT04P1109
<160> 3
<210> 1
<211> 50
<212> mRNA
<213> Homo sapiens paraoxonase 1  （ＰＯＮ１）
<400> 1
940                                                  989
agaatcctcc tgcatcagag gtgcttcgaa tccagaacat tctaacagaa   50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agaatcctcc tgcatcagag gtgbttbgaa tccagaacat tctaacagaa   50
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ａ２０-ttctgttaga atgttctgga ttcgaagcac ctctgatgca ggaggattct-Ａ２０   90
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】本発明の実施に好適なＤＮＡプローブチップ１００の平面図である。
【図１Ｂ】図１ＡのＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図２Ａ】図１Ａ、図１Ｂを参照して説明したＤＮＡプローブチップ１００の表面にターゲットポリヌクレオチドを含む試料液を導入した状態を示す図である。
【図２Ｂ】ＤＮＡプローブチップ１００の表面と試料液との固液界面から試料液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成する最初の手順をとった状態を示す図である。
【図２Ｃ】濃度勾配を形成する次の手順をとった状態を、それぞれ、断面図の形で示す図である。本発明に係る第１の製造工程を示す図である。
【図３】実施例２の効果を示す図である。
【図４Ａ】プローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の根元部（ＤＮＡプローブチップの表面に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図である。
【図４Ｂ】プローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の先端部（自由端部）に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図である。
【図５】プローブ１２−１の一端が本発明の考え方で構成されてプローブ固定領域４に固定されている状態を模式的に示す図である。
【図６】配列番号３を持つ試料を、配列番号２のプローブを５’末端で固定したＤＮＡプローブチップで処理した場合の結果（特性曲線１１１で示す）と配列番号１のプローブを３’末端で固定したＤＮＡプローブチップで処理した場合の結果（特性曲線１１３で示す）とを比較する図である。
【図７】プローブ１２−３とターゲットポリヌクレオチド１４が、プローブ１２−３の根元部（ＤＮＡプローブチップの表面に近い部位）をハイブリダイゼーションの核としてハイブリダイゼーションをするときの模様を模式的に示す図４Ａに実施例４のプローブを使用した場合について示す図である。
【符号の説明】
【００６６】
１…ＤＮＡプローブチップ基板（フロートガラス）、２，１５…電極、３…フッ素表面コーティング、４…プローブ固定領域、６…プラスに解離した残基（プラス電荷）、１１…カバーガラス、１２−１，１２−２，１２−３…プローブ、１４…ターゲットポリヌクレオチド、２１，２２…ハイブリダイゼーションの核となった部位、２４…解離基、２５，２６…電源、３３−１…プローブ１２−１の第１エリア、３３−２…プローブ１２−１の第２エリア、３３−３…プローブ１２−１の第３エリア、２７…プローブ１２−１の第２エリアの一部の配列、５０…ｍＲＮＡ試料液、１００…ＤＮＡプローブチップ、１０１，１０２，１０３，１１１，１１３…特性曲線。
【図１Ａ】
2006098185.tif 000003
【図１Ｂ】
2006098185.tif 000004
【図２Ａ】
2006098185.tif 000005
【図２Ｂ】
2006098185.tif 000006
【図２Ｃ】
2006098185.tif 000007
【図３】
2006098185.tif 000008
【図４Ａ】
2006098185.tif 000009
【図４Ｂ】
2006098185.tif 000010
【図５】
2006098185.tif 000011
【図６】
2006098185.tif 000012
【図７】
2006098185.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月7日(2005.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
実施例２と同様に電極にかける電界を制御しても、電界の影響は固定するプローブが電荷を持たないので顕著ではない。しかし、プローブの自由端側にスルホン酸基を導入すると、実施例４で説明した過剰の解離基２４と同様の効果が得られ、極めて高速なハイブリダイゼーションが可能となる。試料液を添加すると、基板表面のプラスチャージに試料液中のマイナス電荷を持つターゲットポリヌクレオチドが、プローブを固定したＩＴＯ電極表面に濃縮される。電界を反転させると、プローブの自由端側に修飾してあるスルホン酸基のマイナス電荷が反発し、プローブが速やかに起立する。また、この例でも、実施例３と同様に基板に近いほうがＧＣリッチなようにプローブを固定するほうがハイブリダイゼーション速度が速く、ハイブリダイゼーション収率も高い。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> DNA probe chip and DNA hybridization control method
<130> NT04P1109
<160> 3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> miscellaneous feature
<223> product = paraoxonase 1   (PON1)
<400> 1
agaatcctcc tgcatcagag gtgcttcgaa tccagaacat tctaacagaa   50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> variation
<222> 24,27
<223> n stands for 2-thiouracil or spacer
<400> 2
agaatcctcc tgcatcagag gtgnttngaa tccagaacat tctaacagaa   50
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 
<223> Synthesized DNA
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttctgttaga atgttctgga ttcgaagcac ctctgatgca
ggaggattct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   90