(57)【要約】【課題】  取り扱い性の良好な小型肝細胞において、ＣＹＰ２Ｂを安定して誘導する方法の提供。【解決手段】  甲状腺ホルモンの存在下で小型肝細胞を培養することを特徴とする小型肝細胞におけるＣＹＰ２Ｂの誘導法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺ホルモンの存在下で小型肝細胞を培養することを特徴とする小型肝細胞におけるＣＹＰ２Ｂの誘導法。
【請求項２】
ＣＹＰ２Ｂの誘導を、ＣＡＲ発現量及び／又はＣＹＰ２Ｂ発現量で検出する請求項１記載の誘導法。
【請求項３】
被験薬物及び甲状腺ホルモンの存在下で小型肝細胞を培養することを特徴とする該被験薬物のＣＹＰ２Ｂ誘導能の評価方法。
【請求項４】
ＣＹＰ２Ｂの誘導を、ＣＡＲ発現量及び／又はＣＹＰ２Ｂ発現量で検出する請求項３記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝酵素の一つであるＣＹＰ２Ｂを小型肝細胞で誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームＰ４５０２Ｂ（ＣＹＰ２Ｂ）はチトクロームファミリーに属する薬物代謝酵素の一つで、肝臓における薬物代謝において重要な役割を担っている。ラットにフェノバルビタールを投与すると、肝臓におけるＣＹＰ２Ｂ遺伝子及び蛋白質の発現が高まり、活性が上がることが知られている。これは、肝細胞でＣＹＰ２Ｂが産生されることに起因する。ＣＹＰ２Ｂの発現には核内受容体の一つであるＣＡＲとその核内パートナーであるRXRが関与していることが知られている。通常ＣＡＲは細胞質中にＨＳＰ９０と結合して存在し不活性であるが、薬剤によるシグナルが伝達されることによりＣＡＲはＨＳＰ９０と離れて活性型となり、核内に移行する。核内でＣＡＲはＲＸＲと結合してＣＹＰ２Ｂ遺伝子の転写を活性化する。
【０００３】
このようにＣＹＰ２Ｂは、フェノバルビタールやテストステロン投与によって発現誘導が起こる薬物代謝酵素の一つであり、ヒトに薬物を投与した場合の肝毒性に代表される副作用の発生、薬物の有効性の個体差等に大きな影響を与える。従って、新薬の開発にあたっては、これら薬物代謝酵素誘導能の評価は必須になりつつある。しかし、薬物代謝酵素の誘導能をラット、マウス、類人猿などの動物を用いたインビボで評価することは、欧米の動物保護運動の高まりに呼応して、困難になりつつある。従って、インビトロにおいて、薬物のＣＹＰ２Ｂ誘導能を評価する系の開発が望まれている。
【０００４】
初代培養肝細胞においても生体内ほどではないが培養して２日以内なら酵素活性も誘導もされる。しかし、初代培養肝細胞の利用では、大量の薬物の評価には対応できない。一方、肝幹細胞の一種である小型肝細胞は、凍結保存が可能であり、取り扱い性に優れているが、凍結保存後に培養した小型肝細胞では成熟肝細胞と比較してＣＹＰ２Ｂの発現は低く、またフェノバルビタールによる発現誘導もほとんど認められていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、取り扱い性の良好な小型肝細胞において、ＣＹＰ２Ｂを安定して誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、小型肝細胞のＣＹＰ２Ｂ誘導能が低い原因について種々検討したところ、小型肝細胞においては成熟肝細胞と比較してＣＡＲの発現が極めて低いことを見出した。一方、細胞内でＣＡＲと結合してＣＹＰ２Ｂの発現を調節していると考えられているＲＸＲは小型肝細胞においても発現していた。このことから、小型肝細胞におけるＣＹＰ２Ｂの発現抑制は、核内受容体ＣＡＲの低発現によるものと推測された。そこでさらに検討した結果、甲状腺ホルモンの存在下に小型肝細胞を培養すれば、ＣＡＲ及びＣＹＰ２Ｂの発現量が成熟肝細胞レベルにまで回復することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、甲状腺ホルモンの存在下で小型肝細胞を培養することを特徴とする小型肝細胞におけるＣＹＰ２Ｂの誘導法を提供するものである。
また、本発明は、被験薬物及び甲状腺ホルモンの存在下で、小型肝細胞を培養することを特徴とする該被験薬物のＣＹＰ２Ｂ誘導能の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、凍結保存ができ、長期培養可能な小型肝細胞におけるＣＹＰ２Ｂの誘導が可能となった。また、本発明方法を用いれば、薬物代謝酵素の中でも重要なＣＹＰ２Ｂの誘導能に影響を及ぼす薬物の評価が、大量かつ簡便にできるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明方法においては、小型肝細胞を用いる。小型肝細胞は肝組織中に存在する肝幹細胞の一種で肝細胞としての機能を持ちながら、非常に高い増殖活性を持っている。また長期間凍結保存した後、再培養を行ってもその能力を失わない。
【００１０】
小型肝細胞の由来は、ヒト、サルが最も好ましいが、比較的入手可能な動物の中では、ラット、マウス等のげっ歯類由来がよく、ウサギ、ヒツジ、ブタでもよいが、ラット由来が特に好ましい。最近ヒトの小型肝細胞の培養法が報告されているので、これを用いることもできる（特開平１０−１７９１４８号）。
【００１１】
小型肝細胞は、例えばラットの肝臓よりコラゲナーゼ灌流法によって採取された細胞懸濁物から、遠心操作を繰り返すことによって単離することができる。又、同細胞懸濁物から小型肝細胞特異的抗原に対する特異抗体（ＣＤ４４，ＢＲＩ３，Ｄ６．１Ａ等）やヒアルロン酸を付着した担体などにより分離することができる。
【００１２】
得られた小型肝細胞は、凍結保存することができるので、長期保存可能である。本発明は、凍結保存された小型肝細胞を使用するのが好ましい。
【００１３】
本発明のＣＹＰ２Ｂ誘導法においては、甲状腺ホルモンの存在下に小型肝細胞を培養する。甲状腺ホルモンとしては、チロキシン（Ｔ4）及び３，３’，５−トリヨードチロニン（Ｔ3）のいずれでもよい。培養液中の甲状腺ホルモンの濃度は、１０-15〜１０-6Ｍ、さらに１０-14〜１０-10Ｍ特に１０-13〜１０-11Ｍが好ましい。小型肝細胞は、３０〜５０個の細胞よりなるコロニーを形成する培養７〜２０日目（より好ましくは８日〜１４日、特に好ましくは１０〜１２日）に一旦培養皿より剥がして新しい培養皿に再播種するか、凍結保存した小型肝細胞コロニーを５００〜１００００コロニー/６０-mm  培養皿（より好ましくは、１０００〜５０００コロニー/６０-mm  培養皿、特に好ましくは２０００〜４０００コロニー/６０-mm  培養皿）の濃度で播種し、培養する。
【００１４】
培養は、コラーゲンをコートしたディシュ上で行うのが好ましい。また、培地としては、甲状腺ホルモンを含むＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。さらに培地中にはＦＢＳ、アスコルビン酸、ＤＭＳＯ、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子（EGF, epidermal growth factor）、デキサメタゾン、インスリンを添加することができる。増殖因子としては、EGFの他に肝細胞増殖因子[HGF, hepatocyte growth factor]、腫瘍増殖因子[TGF-alpha, Transforming growth factor-alpha]、線維芽細胞増殖因子[FGF, fibroblast growth factor]などが挙げられる。培養は、通常３５±５℃、３〜７％ＣＯ2インキュベーター内の条件で行うのが好ましい。
【００１５】
甲状腺ホルモンの存在下に小型肝細胞を培養すれば、ＣＡＲ及びＣＹＰ２Ｂが高発現する。ＣＡＲ及び／又はＣＹＰ２Ｂの発現量の検出は、例えばＲＴ−ＰＣＲ等のＰＣＲ法でＣＡＲ及び／又はＣＹＰ２Ｂの遺伝子を増幅させて検出すればよい。より具体的には、小型肝細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応によってｃＤＮＡを合成しＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ産物はアガロース／エチジウムブロマイドゲル電気泳動により検出し定量を行い、Ｇ３ＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子のＰＣＲ産物量により標準化を行った。
【００１６】
このように甲状腺ホルモンの存在下で小型肝細胞を培養すればＣＡＲ及びＣＹＰ２Ｂが高発現するので、この培養系に被験薬物を共存させれば、被験薬物のＣＹＰ２Ｂ誘導能を評価することができる。該評価方法は、被験薬物を添加する以外は、前記と同様にして行うことができる。すなわち、被験薬物を添加した場合のＣＹＰ２Ｂ誘導量を被験薬物非添加の場合のＣＹＰ２Ｂ誘導量とを対比すれば、該被験薬物のＣＹＰ２Ｂ誘導能を評価することができる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
Ａ：試験方法
１）凍結小型肝細胞の調製
オスのラット肝臓を灌流し、得られた細胞をハンクス緩衝液（表１）に懸濁して５０×ｇ、１min、４℃で遠心し、上清を回収する。この操作を３回繰り返す。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。この操作を３回繰り返す。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳ（表２）に懸濁する。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳに懸濁する。
細胞数を数え、６×１０4細胞／mlになるようＤＭＥＭ／ＦＢＳで調製する。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
【表２】
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【００２１】
１００-mm  培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に９mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で１０日間培養する。この間、２日に１回培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳで交換する。培養皿から培地を除き６mlのＰＢＳで洗浄し、２mlの０．０２％ＥＤＴＡを加えて攪拌、液を除く。３７℃に温めたＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ）を２ml加え、ＣＯ2インキュベーター内で５min静置する。ＤＭＥＭを１ml加えて細胞を回収、５００rpm、５minで遠心し、沈殿を１ml（４培養皿分）のセルバンカー（三菱化学ヤトロン）に懸濁する。−３０℃で３０min凍結したのち、−８０℃で保存する。
【００２２】
２）成熟肝細胞の調製
オスのラット肝臓を灌流し、得られた細胞懸濁液を５０×ｇ、１min、４℃で遠心し、沈殿を回収する。
ハンクス緩衝液に懸濁し、５０×ｇ、１min、４℃で遠心、この操作を３回繰り返す。
細胞を２５mlのハンクス緩衝液に懸濁し、２１．６ml  パーコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、２．４ml  １０×ハンクス緩衝液に加えて転倒混合する。５０×ｇ、１５min、４℃で遠心し、上清を除く。細胞をＰＢＳで懸濁し、５０×ｇ、１min、４℃で遠心、沈殿を回収する。
【００２３】
３）コラーゲンコート培養皿の調製
ラットの尾から調製したコラーゲン液（５mg／ml）を０．１％  酢酸で１００倍に希釈し、６０-mm  培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｎｇ）に３mlずつ分注した。室温で１hr静置してからコラーゲン液を除き、クリーンベンチ内で一晩乾燥させたのち、紫外線を１hr照射して滅菌、３mlのＰＢＳを加えて３７℃で３０minインキュベートする。その後ＰＢＳを除き、解凍した小型肝細胞を播種する。
【００２４】
４）甲状腺ホルモン存在下での凍結小型肝細胞の培養
凍結小型肝細胞を３７℃インキュベーター内で解凍し、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地１０mlに加えて５０×ｇ、１min遠心する。上清を除き、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地３mlに沈殿した細胞を懸濁してコラーゲンコート培養皿に播種する。ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養し、２４時間後培地を無血清培地（ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ、表３）に交換し、以後２日に１回培地をＤＭＥＭ／ＤＭＳＯで交換する。甲状腺ホルモンは、凍結小型肝細胞を播種する段階から培地に添加する。Ｔ3（ＳＩＧＭＡ）はＤＭＳＯに１０-4Ｍになるよう溶解し、その溶液を甲状腺ホルモン濃度が５×１０-14Ｍ、５×１０-12Ｍ、５×１０-10Ｍ、５×１０-8Ｍになるよう培地に添加する。Ｔ4（ＳＩＧＭＡ）も同様にＤＭＳＯに１０-4Ｍになるよう溶解し、その溶液を甲状腺ホルモン濃度が５×１０-14Ｍ、５×１０-12Ｍ、５×１０-10Ｍ、５×１０-8Ｍになるよう培地に添加する。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
５）培養細胞からのＲＮＡの抽出
２１日間培養した小型肝細胞を３mlのＰＢＳで２回洗浄し、１mlのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を加えて室温で５min静置して細胞溶解液を回収する。成熟肝細胞はＰＢＳに懸濁したのち５０×ｇ、１minで遠心して回収し１mlのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を加えて室温で５min静置して細胞溶解液を回収する。細胞溶解液に０．２mlのクロロホルムを加えて１５ｓｅｃ激しく攪拌後、室温で３min静置する。１２，０００×ｇ、１５min、４℃で遠心して水層を回収し、０．５mlの２−プロパノールを加えて攪拌。室温で１０min静置して１２，０００×ｇ、１０min、４℃で遠心、沈殿を７５％  エタノールでリンスしてから風乾、ＤＥＰＣ処理水に溶解してＲＮＡサンプルとする。濃度は２６０ｎｍの吸光度により測定し、ＯＤ＝１のとき４０μｇ／mlとする。
【００２７】
６）ＲＴ−ＰＣＲ
以下の操作により逆転写反応を行った。（Omniscript Reverse Transcription Kit(Qiagen)を使用）
Oligo (dT)12-18 primer（５００μｇ／ml、Invitrogen）１μｌ、ＲＮＡ（１μｇ／ml）２μｌ、dNTPmix（５mM  each）２μｌ、５×緩衝液  ２μｌ、逆転写酵素  １μｌ、Ｈ2Ｏ  １２μｌを混合し、３７℃で１ｈｒ反応させて逆転写反応液を得る。逆転写反応液は−２０℃で保存する。
【００２８】
以下の操作によりＰＣＲ反応を行う。酵素および緩衝液はＴａＫａＲａ社製を用いる。
１０×緩衝液２μｌ、dNTPmix（２．５mM  each）１．６μｌ、PrimerA（１０μＭ）１μｌ、PrimerB（１０μＭ）１μｌ、rTaq polymerase（５Ｕ／μｌ）０．１μｌ、逆転写反応液２μｌ、Ｈ2Ｏ  １２．３μｌを混合し、サーマルサイクラーで反応（９４℃１min→９４℃３０sec，５４℃３０sec，７２℃２min×２６〜２９cycle→７２℃５min）させる。
ＣＡＲ検出時には２９ｃｙｃｌｅ、ＣＹＰ２Ｂ検出時には２７ｃｙｃｌｅ、Ｇ３ＰＤＨ検出時には２６ｃｙｃｌｅ反応を行う。
【００２９】
７）  ＰＣＲ産物の検出
ＰＣＲ反応液１０μｌに６×loading緩衝液２μｌを加えて攪拌、１％Agarose、１×ＴＡＥ緩衝液、１μg/mlエチジウムブロマイドゲルで電気泳動し、トランスイルミネータで写真撮影およびＤＮＡ量の測定を行う。ＣＡＲ、ＣＹＰ２Ｂ１の発現量は成熟肝細胞由来ＲＮＡを1とし、Ｇ３ＰＤＨの発現量で標準化し、数値化する。
【００３０】
８）プライマー
PCR CAR検出
PrimerA  5' ATGACAGCTACTCTAACACTAGAG 3'（配列番号１）
PrimerB  5' CAGCTGCAAATCTCCCCAAGCAGC 3'（配列番号２）
PCR CYP2B1検出
PrimerA  5' GGGACACCCAAAGTCCCGTGG 3'（配列番号３）
PrimerB  5' GGAAACCATAGCGGAGTGTGG 3'（配列番号４）
PCR G3PDH検出
PrimerA  5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'（配列番号５）
PrimerB  5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3'（配列番号６）
【００３１】
Ｂ．結果
【００３２】
１）図１に、甲状腺ホルモン非存在下（−）、Ｔ3存在下（５×１０-12 Ｍ  Ｔ3）及びＴ4存在下（５×１０-12 Ｍ  Ｔ4）で１４日及び２１日培養した小型肝細胞を示す。
図１から明らかなように、甲状腺ホルモン存在下においても小型肝細胞に生育の障害は見られない。
【００３３】
２）図２に、成熟肝細胞（ＭＨ）、５×１０-14Ｍ〜５×１０-8ＭのＴ3及びＴ4存在下で培養した小型肝細胞から抽出したＲＮＡを用いた、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
図２から明らかに、５×１０-12ＭのＴ3又は５×１０-10ＭのＴ4の添加によりＣＡＲ及びＣＹＰ２Ｂ１の発現量が増加していることがわかる。
【００３４】
３）図３に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を数値化したものを示す。
図３から明らかなように、小型肝細胞ではＣＡＲの発現量が成熟肝細胞と比較して約１／３であるが、５×１０-12ＭのＴ3の添加により、ＣＡＲの発現量は成熟肝細胞とほぼ同程度まで回復していることがわかる。さらに、ＣＹＰ２Ｂ１の発現量も成熟肝細胞と比較して約７割にまで回復していることがわかる。
【００３５】
図１〜３から、培養液中に甲状腺ホルモン（Ｔ3）を５×１０-12Ｍの濃度で添加して小型肝細胞を培養すると、ＣＡＲ  ｍＲＮＡの発現量は成熟肝細胞と同程度まで上昇し、さらにＣＹＰ２ＢのｍＲＮＡの発現量は成熟肝細胞の約7割にまで回復した。また、５×１０-14から５×１０-8Ｍの濃度範囲においてＴ3は小型肝細胞の生育に障害を与えなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】甲状腺ホルモン非存在下、Ｔ3存在下及びＴ4存在下で培養した小型肝細胞の写真である。
【図２】甲状腺ホルモン非存在下、Ｔ3存在下及びＴ4存在下で培養した小型肝細胞から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲの結果を数値化したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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