(57)【要約】  【課題】小スケールであっても遺伝子増幅法に用いるのに十分な質・量の核酸を得ることが可能な、植物試料からの抽出による核酸の製造方法を提供すること。  【解決手段】水酸化アルカリ処理を行った植物試料に対して、核酸抽出処理を行って当該植物試料における核酸を得ることを特徴とする、核酸の製造方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸化アルカリ処理を行った植物試料に対して、核酸抽出処理を行って当該植物試料における核酸を得ることを特徴とする、核酸の製造方法。
【請求項２】
前記核酸の製造方法において、前記水酸化アルカリ処理と液化ガス処理を植物試料に対して行うことを特徴とする、請求項１記載の核酸の製造方法。
【請求項３】
前記核酸の製造方法において、前記水酸化アルカリ処理と液化ガス処理、及び、界面活性剤処理を行うことを特徴とする、請求項２記載の核酸の製造方法。
【請求項４】
前記核酸の製造方法において、一製造単位を１０〜１００００細胞のスケールで行うことを特徴とする、請求項３記載の核酸の製造方法。
【請求項５】
前記液化ガス処理が液体窒素処理であり、かつ、界面活性剤処理がＣＴＡＢ処理であることを特徴とする、請求項３又は４記載の核酸の製造方法。
【請求項６】
核酸が、ゲノムＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載された核酸を鋳型として遺伝子増幅法を行うことにより遺伝子を検出することを特徴とする、遺伝子の検出方法。
【請求項８】
水酸化アルカリ、界面活性剤及び容量０．１〜１．５ｍLの容器を含むことを特徴とする、請求項３〜６の核酸の製造方法を行うための核酸製造用キット。
【請求項９】
水酸化アルカリ処理を行った植物試料に対して、核酸抽出処理を行って当該植物試料における核酸を得ることを特徴とする、核酸の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物試料から抽出して得られる核酸の、効率的な製造方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
近年におけるバイオテクノロジーの発展に伴い、微量の試料からの核酸の抽出方法の確立が望まれている。
【０００３】
例えば、植物の品種改良検定を行う場合、検定時期は可能な限り早期であることが効率的である。しかしながら、種子から発芽した初期の実生の段階で品種改良検定を行う場合、個体の生育に実質的な影響を及ぼさない程度のわずかな組織片から核酸（この場合は、ゲノムＤＮＡ）の抽出を、可能な限り所望の核酸を、低分子化等により変質させないように行うことが必要となる。
【０００４】
現在、植物試料に対して汎用されている核酸抽出法の一つに、ＣＴＡＢ法(Murray M.G.,Thompson W.F.:Nucleic Acids Res.,8,4321〜4325：非特許文献１等)が挙げられる。この方法は、植物試料を液体窒素処理により細胞壁を破砕した後、界面活性剤の一つであるＣＴＡＢ(Cetyl trimethyl ammonium bromide)で処理して細胞膜や核膜を溶解させた後、蛋白質の変成等の一連の核酸の抽出工程を行う方法である。
【非特許文献１】Murray M.G.,Thompson W.F.:Nucleic Acids Res.,8,4321〜4325
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
品種改良検定を行う場合、抽出した微量のＤＮＡをＰＣＲ法等の核酸増幅法で増幅された増幅産物を用いるが、これらの核酸増幅法を行うには、本来の状態が可能な限り保たれた高グレードのＤＮＡを、最低１００００細胞分程度必要である。このような質と量のＤＮＡを、初期の実生から植物の生育に実質的な影響を及ぼさないように得ることは、現状のＣＴＡＢ法等の核酸抽出法では困難であり、現実的には植物の生育が進み、葉等から比較的大量の植物試料が得られる段階になってはじめて品種改良検定を行うことが可能となる場合が多い。
【０００６】
また、植物の発生・分化の初期段階での遺伝子レベルの解析を行うには、植物の細胞の個数自体がごく少数（１〜１００細胞程度）である段階で、遺伝子の解析をする必要がある場合が想定される。このような場合、上記のように最低１００００細胞分程度の植物試料が必要な従来法では対応することができない。
【０００７】
本発明の課題は、このような品種改良検定等の今日における技術的な要求に対応することが可能な、小スケールであっても遺伝子増幅法に用いるのに十分な質・量の核酸を得ることが可能な、植物試料からの抽出による核酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、植物試料に水酸化アルカリ処理を施すことで、一気に植物試料からの抽出による核酸の製造効率を目的とするレベルまで向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、水酸化アルカリ処理を行った植物試料に対して、核酸抽出処理を行って当該植物試料における核酸を得ることを特徴とする、核酸の製造方法（以下、本製造方法ともいう）を提供する発明である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、小スケールであっても遺伝子増幅法に用いるのに十分な質・量の核酸を得ることが可能な、植物試料からの抽出による核酸の製造方法が提供される。この製造方法により製造された核酸を遺伝子増幅法の鋳型とすることにより、所望する遺伝子を的確に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本製造方法において、「植物試料」とは、本製造方法において核酸抽出の対象となる植物体の一部又は全部を意味するものである。核酸抽出の対象となる植物試料の基となる植物は特に限定されず、小葉植物、シダ植物、原裸子植物、ソテツ植物、イチョウ植物、球果植物、マオウ植物、被子植物に対して本製造方法を行うことができる。植物の部位も、所望の核酸を抽出可能な部位であれば全く限定されない。前述したように、本発明においては、初期の実生等の小さな対象を植物試料とする場合であっても、当該植物の生育に実質的な影響を与えない程度のわずかな量の採取であっても、ＰＣＲ法等の増幅法を行うのに十分な質と量の核酸を得ることが可能である。
【００１２】
また、核酸とは、植物試料から抽出可能なシングルストランドおよびダブルストランドの核酸全であり、具体的には、核内ゲノムＤＮＡ、葉緑体ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアゲノムＤＮＡ、mＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＤＮＡおよびｒＲＮＡ、ならびに植物生命現象に伴い生産されるＤＮＡおよびＲＮＡフラグメント等である。
【００１３】
植物試料は、採取した植物体の一部又は全部そのものであってもよいが、必要に応じて裁断等を行ってもよい。
【００１４】
本発明における水酸化アルカリ処理は、植物試料を、当該水酸化アルカリ溶液に浸漬（静置であっても振盪であってもよい）することにより行うことができる。当該アルカリ溶液の濃度は、0.1〜３Ｎ、好適には１．５〜２．５Ｎである。濃度が１Ｎより低いと、所望の効率的な核酸の抽出を行うためのダメージを細胞壁に対して与えることが困難であり、３Ｎより大きいとアルカリが強すぎて、核酸自体の質が低下してしまう可能性がある。水酸化アルカリ溶液における植物試料の浸漬時間は、水酸化アルカリ溶液の濃度を考慮に入れて、少なくとも核酸抽出が効率的に行われる程度に細胞壁にダメージを与えられる時間であることが好適であり、かつ、核酸自体の質の低下が起こる前に水酸化アルカリ処理を終了することが好適である。具体的には、2〜8分が好適であり、4〜6分が特に好適である。
【００１５】
本製造方法においては、植物試料に対して、水酸化アルカリ処理と共に液化ガス処理を行うことが好適である。液化ガスは、例えば、液体窒素、液体酸素、液体ヘリウム、液体水素等を用いることができるが、液体窒素が好適である。この液化ガス処理は、植物試料を液化ガスの低温により瞬間凍結して、これにより植物試料中の植物細胞の細胞壁にダメージを与える処理である。よって、植物試料に直接液化ガスを接触させることも可能であるが、例えば、植物試料を入れた器やチューブに液化ガスを接触させて、当該器やチューブを急速冷却することにより、上記の植物試料と液化ガスとの直接接触と実質的に同一の効果を上げることができる。この間接的な接触法は、液化ガス自体の化学的な性質（例えば、酸化作用）を植物試料に及ぼすことを回避することが可能であり好適である。
【００１６】
また、本製造方法は、これを小スケール、具体的には、一製造単位を、好適には１０〜１００００細胞分、特に好適には１００〜１０００細胞分のスケールで行うことにより、核酸の製造効率を向上させることができるが、この小スケールでの製造単位の器として用いられることが好適なマイクロチューブ［例えば、このようなマイクロチューブ中に細断した水酸化アルカリ処理済みの植物試料を入れることが好適である（用いられるチューブの容積：０．１〜１．５ｍLが好適である）］を、効率的に冷却するために、上記の間接的な液化ガスとの接触は非常に好適である。この小スケール化により、例えば、一製造単位毎に、乳鉢の中で液化ガスとの接触により凍結した植物試料を乳棒で破砕して、約１０mLスケールで本製造方法を行う場合に比べて、１／１０００〜１／１０００００程度までコストダウンすることが可能となる。
【００１７】
本製造方法においては、上記の工程（必須の工程として水酸化アルカリ処理工程、及び、選択的工程として液化ガス処理工程）と共に（通常は、当該上記の工程の後に行う）、細胞膜や核膜の溶解を行うために、界面活性剤処理を行うことが好適である。
【００１８】
ここで用いられる界面活性剤としては、細胞から核酸の抽出を行うために用いられ得る界面活性剤であれば特に限定されず、具体的には、例えば、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-2-hydroxy-1-propanesulfonate ［CHAPSO］、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate ［CHAPS］等の両性界面活性剤；Sodium Dodecylsulfate ［SDS］、Lithium Dodecyl Sulfate ［LDS］、Lithium 3,5-Diiodosalicylate、Tris（hydroxymethyl）aminomethane Dodecyl Sulfate［Tris DS］、Sodium Cholate、N-Lauroylsarcosine、Sodium N-Dodecanoylsalcosinate等の陰イオン界面活性剤；Cetyldimethylethylammonium Bromide、Cetyltrimethylammonium Bromide［CTAB］、Cetyltrimethylammonium Chloride、Guanidine Thiocyanate等の陽イオン界面活性剤等を用いることが可能であるが、これらの中でもＣＴＡＢ又はGuanidine Thiocyanateを用いることが好適であり、ＣＴＡＢを用いることが特に好適である。
【００１９】
なお、この界面活性剤処理に代えて、細胞膜や核膜を破壊するために、物理的な方法、例えば、超音波法、ボールミル法等を用いることも可能である。
【００２０】
以下、本製造方法は、通常公知の核酸抽出法に従って行うことができる。すなわち、蛋白質変成（フェノール−クロロホルム法等）、核酸の析出（エタノール法等）等の工程を行うことで、所望の核酸の抽出を行うことが可能である。また、ＤＮＡとＲＮＡの分別方法も公知の手段に従い行うことができる。例えば、代表的な蛋白変成処理方法である酸性条件下のフェノール処理を行う際に、ＤＮＡは疎水性を示すためにフェノール層（下層）に分配され、ＲＮＡは親水性を示すために水層（上層）に分配される性質を利用して、ＤＮＡとＲＮＡを分別することができる。例えば、ＤＮＡ（主にゲノムＤＮＡ）は、ＰＣＲ法、ＤＯＰ−ＰＣＲ法、非相称ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法の鋳型核酸として用いることが可能であり、ＲＮＡ（主に、オリゴdTカラムを用いて、polyA+  ＲＮＡとして収集されたｍＲＮＡ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法等のＲＮＡを用いた遺伝子増幅法の鋳型核酸として用いることができる。その他、得られた核酸の精製法、保存法も通常公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
なお、本発明は、上記水酸化アルカリ、界面活性剤及び容量0.2〜1.5mLの容器を含むことを特徴とする、本製造方法を行うための核酸製造用キットを提供する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を、実施例を用いてさらに具体的に説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００２３】
微量組織からのキュウリ(Cucumis sativus var. Monastyrski)のゲノムＤＮＡの抽出を行い、当該ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行い、遺伝子の増幅を行った。
【００２４】
実施例（新法）
２００μLの２倍に希釈したCTAB液に対して０．４μLのメルカプトエタノールを入れた処理液を調製した（CTAB処理液１）。上述のキュウリの（例えば、発芽4-7日目の実生を3-10mmにカットした組織片、および0.5-２mmにカットした根端等）を、１Nの水酸化ナトリウム溶液中に５分間浸漬処理して１．５mL容のアルミチューブに入れた。このチューブを、液体窒素によって十分に冷却したアルミチューブラックに配置して、チューブを急冷した。次いで、これらのチューブの内容物を、ホモジナイゼーション用ペッスルを用いてホモジナイズした。このホモジナイズ処理を完了したチューブに、CTAB処理液１を２００μL入れた（直ちに凍結した）。解凍後、当該解凍物を1.5mL容のチューブに入れ、５５℃で１時間静置した（ただし１０分おきに軽く攪拌した）。静置後、当該チューブに等量（２００μL）のクロロホルム：イソアミルアルコール（容量比２５：１）を加えて、１５０００rpmで２０℃にて１０分間の遠心を行い、上澄み（ＤＮＡ層）を全て回収して、同容量のチューブに入れた。次いで、この回収物に対して、再び、等量（２００μL）のクロロホルム：イソアミルアルコール（容量比２５：１）を加えて、１５０００rpmで２０℃にて１０分間の遠心を行い、上澄み（ＤＮＡ層）を１８０μL以上回収した。これにイソプロパノールを、重層するように１６０μL入れて、静かに混合して、−２０℃で２時間保存後、１５０００rpmで４℃にて１０分間の遠心を行った。７０％エチルアルコールで２回ペレット及び管壁を洗浄し、ドライアップを行った後、１０μLのトリエタノールアミンに溶解した（３回行った）。
【００２５】
このようにして得られたＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った。このＰＣＲ法に用いた増幅用プライマーは、下記の市販のＩＴＳプライマーを用いた。
【００２６】
Y5プライマー(forward)：5’- TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAA -3’（配列番号１）
Y4プライマー(reverse)：5’- CCCGCCTGACCTGGGGTCGC -3’（配列番号２）
【００２７】
また、熱サイクルは、市販のサーマルサイクラーにて行った。具体的には、９５℃・１２０秒を１回行った後、「９４℃・１０秒→５３℃・３０秒→７２℃・８０秒」を３０サイクル行い、７２℃・７分を１回行った後、４℃まで冷却することで、熱サイクル工程を終了した。
【００２８】
なお、仮に、本実施例において、ＤＯＰ−ＰＣＲ法を行う場合には、プライマーとしては、例えば、
6MWプライマー（市販品）：5’- CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG -3’（配列番号３）
（Tm=62℃,  N = A, T, G or C）
を用い、
【００２９】
熱サイクルは、９５℃（１２０秒程度）を１回行った後、「９４℃・６０秒→３０℃・９０秒→７２℃・１８０秒」を５サイクル程度行い、さらに、「９４℃・１５秒→６２℃・９０秒→７２℃・２０秒」を３５サイクル程度行った後、４℃まで冷却することで、熱サイクル工程を行うことができる。
【００３０】
本実施例では、比較例（従来法）として、水酸化ナトリウム処理工程を除く他は、上記の実施例と同様の操作で得たＤＮＡ相当物を鋳型として、上記のＰＣＲ反応を行った（３回行った）。
【００３１】
ポジティブコントロールとして、上記キュウリの葉を従来法、すなわち、乳鉢内に静置したキュウリの葉一枚（約0.1g）に液体窒素をかけて急速凍結を行い、乳棒でパウダー状にすり潰した。これを１０倍量のCTAB処理液１中に入れ、ゆっくりと攪拌した。等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（容量比２５：１）を加えて、１５０００rpmで２０℃にて１０分間の遠心を行い、上澄み（ＤＮＡ層）を全て回収した。以下、上記実施例の方法に従ってＤＮＡを回収し、これを鋳型として用いたＰＣＲ反応を、上記と同様に行った。
【００３２】
ネガティブコントロールとして、植物材料なしで、上記の実施例の工程を行った例を行った。
【００３３】
このようにして得られたＰＣＲ産物を、それぞれ常法により、ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。図１は、その電気泳動像である。図１から明らかなように、実施例（新法）においては、３例全てにおいて１ｋｂ付近に、ポジティブコントロールに匹敵するような明らかなバンドが認められるが、比較例では、３例それぞれにバンドは全く認められなかった。
【００３４】
この結果により、本製造方法によれば、わずかな量の植物試料でＰＣＲ法の鋳型とするのに十分な質と量のＤＮＡが得られることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の核酸の製造方法により製造された核酸を鋳型としてＰＣＲ法を用いて増幅した増幅産物の電気泳動像を示した図面である。
【図１】
2006254831.tif 000002
【配列表】
2006254831000001.app