(57)【要約】【課題】  新規微生物株の提供。【解決手段】  本発明は、単離されたラクトバチルス・パラカゼイGM-080を提供するものであり、これはアレルギーを処置するのに有効であることが明らかとなっている。アレルギー関連疾患の処置におけるラクトバチルス・パラカゼイGM-080の使用も提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
CCTCC (the China Cernter for Type Culture Collection)にCCTCC番号：CCTCC M 204012で寄託された、単離された微生物株ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)GM-080。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物株を含んで成る組成物。
【請求項３】
ＩＦＮ−γ分泌を刺激するために使用される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アレルギー関連疾患を処置するために使用される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
アレルギー関連疾患が、気道過敏性及び炎症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、副鼻腔炎、過敏性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、蕁麻疹、湿疹、アナフィラキシー、血管浮腫、アレルギー性頭痛及び片頭痛、特定の胃腸疾患、並びに喘息から成る群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
アレルギー関連疾患が気道過敏性又は炎症である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
アレルギー関連疾患がエアロアレルゲンに対する曝露と関連している、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
微生物株が生きているか、あるいは失活している、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
微生物株が失活している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬組成物、栄養補助食品、食品、健康食品、又はそれらの成分の形態の、請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に、新規微生物株ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)GM-080及びIFN-γ分泌を刺激し、且つアレルギー関連疾患を処置するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、通常無害な物質に対して免疫学的に媒介される有害反応を発症する後天的な潜在性を意味する。アレルギー反応は、掻痒、咳、喘鳴、くしゃみ、涙目、炎症及び疲労のような症候を引き起こす。通常、アレルギー反応は初期の特異的免疫応答及び後期の炎症反応を含むと考えられている。アレルゲン（例えば、花粉及びダニゴミ）は、高親和性の免疫グロブリン（IｇE）受容体を刺激することにより初期のアレルギーを媒介することが報告されている。例えば、肥満細胞及び好塩基球は、アレルゲンによって刺激された場合、ヒスタミンとサイトカインを放出する。肥満細胞及び好塩基球から放出されたサイトカインは、続いて、炎症細胞を動員することにより後期のアレルギーを媒介する。また、好酸球、マクロファージ、リンパ球、好中球及び血小板の流入がひどい炎症サイクルを開始させる。この後期のアレルギーは、初期の免疫応答を増幅させ、これは続いて更なる炎症細胞の放出を引き起こす(Blease et al. Chemokines and their role in airway hyper-reactivity. Respir Res 2000; 1: 54-61)。
【０００３】
アレルギー症状を処置するための種々の治療法が追及されている。それらの中でも、抗アレルギー薬及びヒスタミンH受容体アンタゴニスト（抗ヒスタミン）が使用されている。ヒスタミンアンタゴニストは、アレルゲンの存在に応じて肥満細胞から放出されるヒスタミンの作用を拮抗させるために投与される。それらは、標的組織に対するヒスタミンの作用により引き起こされる紅化、掻痒及び腫脹を軽減させ、そして肥満細胞の脱顆粒から生じる多数の症状を予防又は緩和する役割を果たす。しかしながら、抗ヒスタミンは更に、覚醒状態の低下、反応時間の遅延及び眠気のような有害反応を伴う（米国特許第６，２２５，３３２号）。
【０００４】
また、サイトカインを制御することによりアレルギーを処置することの幾つかの報告がある。それらの中でも、インターフェロン−γ（IFN−γ）はTh2リンパ球におけるサイトカインの過剰発現、特にIL-4の分泌を阻害して、B細胞の増殖を低下させる。また、IFN-γは、Th1の免疫応答を刺激してIgEの合成を抑制することがある(Sareneva T et al. Influenza A virus-induced IFN-α/β and IL-18 synergistically enhance IFN-γ gene expression in human T cells. J Immunol 1998; 160: 6032-6038; Shida K, et al. Lactobacillus casei inhibits antigen-induced IgE production through regulation of cytokine production in murine splenocyte cultures. Int Arch Allergy Immunol 1998;115:278-287)。IFN-γはB細胞の増殖及びIgEの分泌を抑制しうるので、IFN-γはアレルギーを処置するのに有効であると考えられている。
【０００５】
グラム陽性細菌である乳酸菌は、工業的な食品の発酵において一般的に使用されている。近年の研究において、乳酸菌は細胞のIFN-γの分泌を刺激することが証明された(Contractor NV, et al. Lymphoid hyperplasia, autoimmunity, and compromised intestinal intraepithelial lymphocyte development in colitis-free gnotobiotic IL 2 deficient mice. J Immunol 1998: 160: 385-394)。幾つかの特定の乳酸菌、例えばビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)及びラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)亜種は、マウス及びヒト由来の血液中でリンパ球のIFN-γ分泌を刺激することが明らかとなった（米国特許公報番号US2002/0031503 A1;  米国特許第5,556,785号）。また、乳酸菌が、ヒト又はマウス由来のリンパ球を刺激することができ、T細胞及びNK細胞を活性化してIFN-γを分泌させるT細胞刺激性サイトカインであるインターロイキン−１２（IL-12)を分泌させることも報告された(Hessle et al. Lactobacilli from human gastrointestinal mucosa are strong stimulators of IL-12 production. Clin. Exp. Immunol 1999; 116:276-282)。
【０００６】
ラクトバチルス・パラカゼイは、長い間チェダーチーズ及びイタリアの雌羊のチーズを製造するのに使用されてきた。それは、生育して熟成の間にチーズの高い生存性を維持することが明らかとなった(Gardiner, G., Ross, R.P., Collins, J.K., Fitzgerald, G. Stanton, C. Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains. Appl Environ Microbiol. 1998; 64: 2192-2199; Angelis, M., Corsetti, A., Tosti, N., Rossi, J., Corbo, M. R., Gobbetti, M. Characterization of non-starter lactic acid bacteria from Italian ewes cheeses based on phenotypic, genotipic, cell-wall protein and peptidase analyses. Appl Environ Microbiol. 2001; 67: 2011-2020)。L. パラカゼイは、抗菌化合物及び抗酵母化合物、例えばH2O2及びタンパク質性の活性物質をヒトの膣及び口腔において産生することが知られている(Atanassova, M., Choiset, Y., Dalgalarrondo, M., Chobert, J.-M., Dousset, X., Ivanova, I., Haertke, T. Isolation and partial biochemical characterization of a proteinaceous anti-bacteria and anti-yeast compound produced by Lactobacillus paracasei subsp. paracasei strain M3 Int J Food Microbiol. 2003; 87: 63-73; Ocana, V. S., Holgado, A. A. P. de R.,, Nader-Macias, M. E. Growth inhibition of Staphylococcus aureus by H2O2-producing Lactobacillus paracasei subsp. paracasei isolated from the human vagina. FEMS Immunol Med Microbiol. 1999; 23: 87-92; Sookkhee, S., Chulasiri, M. Prachyabrued, W. (2001) Lactic acid bacteria from healthy oral cavity of Thai volunteers: inhibition of oral pathogens. Journal of Applied Microbiology 2001; 90: 172-179)。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、新規微生物株ラクトバチルス・パラカゼイGM-080を提供する。
【０００８】
別の側面において、本発明は、当該微生物株ラクトバチルス・パラカゼイGM-080を含んで成る組成物を提供する。
【０００９】
別の側面において、対象者のアレルギー関連疾患を処置するための方法であって、前記対象者に、微生物株ラクトバチルス・パラカゼイGM-080を含んで成る組成物を投与することを含んでなり；その合併症が、好ましくは気道過敏性及び炎症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、副鼻腔炎、過敏性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、蕁麻疹、湿疹、アナフィラキシー、血管浮腫、アレルギー性頭痛及び片頭痛、特定の胃腸疾患、及び喘息から成る群から選択される、方法、を提供する。
【００１０】
更に別の側面において、本発明は、対象者のIFN-γ分泌を刺激するための方法であって、前記対象者に微生物種ラクトバチルス・パラカゼイGM-080を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法、を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、アレルギーを処置することが可能な新規微生物株ラクトバチルス・パラカゼイGM-080を提供する。当該株GM-080は、2004年2月19日にCCTCC M 204012の受託番号のもとCCTCC (the China Cernter for Type Culture Collection)に寄託された。
【００１２】
ラクトバチルス・パラカゼイGM-080は、健康なヒトの胃腸管から単離される。胃、腸又は十二指腸から採取された組織試料を、３７℃で２日間培養された１００μｇ／ｍLアンピシリン含有MRSブロスの培養液中で懸濁し、そしてアガープレート上にストリークプレーティングする。当該プレート上で生育している当該乳酸菌コロニーは、顕微鏡試験で予備的にスクリーニングすることができる。候補株は、続いて脾細胞と共培養する。前記ブロスにおいて脾細胞により結果として産生されたIFN-γの量が決定される。続いて、GM-080は、IFN-γのその高産生能について選択される。
【００１３】
GM-080の菌類学的特性を以下に示す：
（a）形態学的特性
（１）細胞の形状及びサイズ：MRSブロス中３７℃で一晩培養された後に顕微鏡で観察された場合に、縁が丸い棒状の形状を有する桿菌。
（２）運動性：運動型
（３）鞭毛：なし
（４）胞子形成：胞子形成なし
（５）グラム染色：陽性
【００１４】
（ｂ）培養的特性：
（１）培地：MRSブロス（DIFCO（商標）0881）、最終pH6.5±0.2
（２）培養条件：３７℃の嫌気的又は好気的培養
（３）抗生物質耐性：アンピシリン１００μｇ／ｍL
【００１５】
（ｃ）生理学的特性：
（１）カタラーゼ：ポジティブ
（２）オキシダーゼ：ネガティブ
（３）API 50 CHL試験：API 50 CHL系は、乳酸菌の同定に使用する。一連の酵素の応答をアッセイすることにより、当該乳酸の特性が確立される。GM-080のAPI 50 CHL試験結果を表１に列記する。
【００１６】
【表１】
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【表２】
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【００１７】
（ｄ）遺伝的特性：
GM-080の16s rDNA配列解析を決定する。結果は、GM-080が他のラクトバチルス・パラカゼイ株と高度に相同であることを示す（図２に示すとおり）。更に、距離の系統樹を図３に示す。また、ランダム増幅多型DNA（RAPD解析）を実施した。それは、GM-080がラクトバチルス・パラカゼイに属しているが、特定の16s rDNA配列を有することを示している。上記のことを考慮すると、GM-080は新規なラクトバチルス・パラカゼイ株である。
【００１８】
（ｅ）GM-080の細胞壁タンパク質：
GM-080の細胞壁タンパク質は、他の常用のラクトバチルス・パラカゼイ株と比較した場合、同様のパターンを示す。GM-080の細胞壁タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図４に示す。
【００１９】
（ｆ）GM-080を同定するために標準化された検出系
微生物を同定するための標準的な検出系は、２００３年５月２９日に出願された米国特許出願番号第１０／４４６，７８１号に開示されており、これは、同定のためのマーカーとして所定の微生物を用いて、又は用いずに試験細胞系を培養した遺伝子発現の差異を用いる。試験した遺伝子を表２に列記する。
【００２０】
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【００２１】
GM-080を同定するための標準的な検出系は、試験細胞系としてジャーカット細胞系を採用する。GM-080を用いて、そして用いずに培養したジャーカット細胞系の発現パターンを比較した場合、表３に列記した遺伝子は有意差がある。更に、他のラクトバチルス・パラカゼイ株CCRC12193及びCCRC12188の検出結果も表３に示す。これは、これらの株は全てラクトバチルス・パラカゼイであるが、異なる株に属することを示した。
【００２２】
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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＋：遺伝子発現が２倍増大
−：遺伝子発現が２倍低下
【００２３】
GM-080は、ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．０）で３時間、続いて胆汁で４時間処理した後活性である。それ故に、GM-080は消化の際活性なままであると認められる。GM-080は健常者から単離され、そして安全で天然の毒性がないものであり、且つＧ．Ｒ．Ａ．Ｓ．（一般に安全と認められる）に合致する。
【００２４】
更に、GM-080は、腸の上皮細胞に強力に接着する。上述のことを考慮すると、GM-080は長期間腸内に留まることができ、その結果生理学的機能を調節するために働く。また、腸の上皮細胞の接着部位を占有することにより、GM-080は、他の病原性細菌が腸に対し接着するのを妨害する。GM-080は良好なプロバイオティック細菌であると認められる。
【００２５】
本発明によると、GM-080はIFN-γ分泌を刺激することが明らかとなっており、そしてアレルギー関連疾患を処置するために使用することができる。
【００２６】
１つの側面において、本発明は、GM-080を含んで成る組成物を提供する。更に好ましくは、GM-080を含んで成る組成物はIFN-γ分泌を刺激するために使用され、これはアレルギー関連疾患を処置するために有用である。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「アレルギー関連疾患」とは、通常無害な環境抗原に対する体系的な反応であって、抗原と抗体又は同一抗原に対する初期曝露により産生するＴ細胞との間の相互作用から生じる反応の疾患を意味する。用語「アレルギー反応」は、本明細書で使用する場合、無害な環境抗原又は既存の抗体若しくはＴ細胞に起因する抗原に対する応答を意味する。アレルギー反応には種々の免疫機構が存在するが、最も一般的な型は、喘息、花粉症、及び他の一般的なアレルギー反応を引き起こす肥満細胞上のIgE抗体に対するアレルゲンの結合である。アレルギー関連疾患には、気道過敏性及び炎症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、鼻炎、副鼻腔炎、過敏性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、蕁麻疹、湿疹、アナフィラキシー、血管浮腫、アレルギー性頭痛及び片頭痛、ある種の胃腸疾患、及び喘息が含まれる。別の側面において、アレルギー関連疾患は、空気中のアレルゲン（エアロアレルゲン）、例えば花粉、かび、動物のふけ、及び昆虫に対する曝露に関連する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「エアロアレルゲン」とは、少なくとも以下の特性を有するものとして定義される：活性レアギン応答を誘起する特定の抗原分類、及び感受性のある対象者において明らかな組織変化を引き起こしうるまでの周囲の曝露レベル。エアロアレルゲンは、呼吸器、皮膚、又は結膜のアレルギーを引き起こしうる空気中の粒子である。ブタクサ花粉の水溶性部分は、例えば呼吸器及び結膜の粘膜に影響を及ぼし、そしてブタクサ花粉の脂溶性アレルゲンは、皮膚の露出部に対して典型的な接触性皮膚炎を引き起こすことがある。
【００２９】
GM-080は、脾細胞及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とin vitroで一緒にインキュベートした場合にIFN-γ分泌を刺激する能力を有するよう選択される。更に、本発明に従うモデルにおいて、エアロアレルゲンで感作し、そして次にGM-080で処理した動物は、IFN-γ分泌を増大することが観察される。更に、エアロアレルゲン特異的なIgEの量が処理後に有意に低下する。他方、アレルゲン特異的なIgGの量は処理前後での有意差を示さない。更に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球数は非常に低下する；しかしながら、ＢＡＬＦ中のマクロファージ及びリンパ球の数は非常に増大する。炎症が緩和されたことが証明された。
【００３０】
本発明により、アレルギーの処置における使用のためのGM-080は生きていても不活性であってもよい。好ましくは、GM-080は不活性である。例えば、生菌株は、加熱段階又は不活性株としての乳酸菌を死滅させるために当業界で一般的に使用されている他の処理で処理されうる。
【００３１】
本発明によると、本乳酸菌株は、医薬組成物、栄養補助食品、食品、健康食品、医療用食品、又はそれらの成分に含めてもよく、これらは通常ヒトに投与される。本発明の好ましい態様において、本乳酸菌株は、食品の形態、例えばミルク中での乳酸菌の発酵を介して調製した、凝固して乳製品の形態で運ばれてもよい。本発明により調製された食品は、幼児又は子供にも簡便に投与することができる。
【００３２】
別の側面において、本発明は、対象者のアレルギー関連疾患を処置するための方法であって、前記対象者に、単離した微生物GM-080を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法を提供する。
【００３３】
更に別の側面において、本発明は、対象者のIFN-γ分泌を刺激するための方法であって、前記対象者に、単離した微生物GM-080を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法を提供する。
【００３４】
以下の実施例は単に例示目的で示しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ラクトバチルス・パラカゼイGM-080の単離
試料：内視鏡で採取したヒトの胃、腸又は十二指腸の組織片を、１００μｇ／ｍLアンピシリンを含有している２ｍＬのラクトバチルスMRSブロス(DIFCO（商標）0081)中３７℃で約２日間培養した。当該ブロスをＣａＣＯ3含有ＭＲＳアガー上にプレーティングし、そして３７℃で２日間インキュベートした。当該プレート上で生育する単一のコロニーを選択し、そしてグラム染色にかけた。グラム陽性細菌を続いて選択した。当該株の全てをラクトバチルスMRSブロス中３７℃で定常期まで培養し、そして３０００ｇで１５分間遠心することにより回収し、そして１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２）中で再懸濁し、そして次に９５℃で３０分間加熱し、そして続いてオートクレーブにかけ、そしてＰＢＳ中−２０℃で保存した。
【００３６】
脾細胞の単離：健康なボランティア由来の５ｍＬの血液試料を５ｍＬのFicoll-Hypaque(17-1400-02, Pharmacia)に添加し、そして次に５００ｇで３０分間遠心した。脾細胞を採取した。各脾細胞試料中の細胞密度を５ｘ１０６細胞／試料に調節した。脾細胞試料を２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ｐＨ７．７）中で６時間インキュベートした。
【００３７】
末梢血単核細胞の単離：健康なボランティア由来の５ｍＬの血液試料を５ｍＬのFicoll-Hypaque(17-1400-02, Pharmacia)に添加し、そして次に５００ｇで３０分間遠心した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を試料の界面から採取し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣ（１０5細胞／ｍＬ）を、各ウェルがｐＨ７．７の２ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０倍地が含まれる６ウェルのプレートのウェルに移した。
【００３８】
IFN-γ分泌の刺激：脾細胞又はＰＢＭＣ試料を、所定量のグラム陽性細菌と共培養した。３６時間の共培養の後、各試料中の細胞をそれぞれ回収した。回収した細胞を再懸濁し、そして２０００ｒｐｍで５分間遠心した。各試料のIFN-γレベルの決定のために上清を採取した。
【００３９】
IFN-γレベルの決定：IFN-γレベルは、ＥＬＩＳＡで決定し、これは
−３０μＬの２．５μｇ／ｍＬの精製したマウス抗ヒトIFN-γ抗体（カタログ番号18181D, PharMingen（商標）, USA）を１０ｍＬのコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ９．０）に添加し、そして１００μＬの抗体溶液をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加する段階；
−プレートを４℃で振とうする段階；
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）を洗浄する段階；
−３００μＬのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）をプレートの各ウェルに添加する段階；
−プレートを室温で少なくとも２時間振とうする段階；
−脾細胞試料の１００μＬの上清をプレートの各ウェルに添加する段階；
−プレートを４℃で一晩振とうする段階；
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する段階；
−１５０μＬのビオチンマウス抗ヒトIFN-γ抗体（カタログ番号18112D, PharMingen（商標）, USA）をプレートの各ウェルに添加する段階；
−プレートを室温で１時間インキュベートする段階；
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する段階；
−希釈緩衝液で希釈した１５０μＬのストレプトアビジン−ＡＫＰ（１：１０００）をプレートの各ウェルに添加する段階；
−プレートを１時間室温で振とうする段階；
−プレートの各ウェルを洗浄緩衝液で８回洗浄する段階；
−２００μＬの基質ｐＮｐｐをプレートの各ウェルに添加する段階；
−前記基質反応が完了するまでプレートを室温でインキュベートする段階；
−プレートの各ウェルの４０５ｎｍの吸光度（すなわちＯＤ405）を測定する段階、
を含んで成る。
【００４０】
結果：グラム陽性細菌の中でも、脾臓細胞及びＰＢＭＣにおいてIFN-γを刺激する最も強い能力を有するGM-080が選択された。
【００４１】
実施例２：16s rDNAの配列決定
ＤＮＡ抽出：GM-080及び他の細菌、CCRC12913、CCRC14001及びCCRC16100のゲノムＤＮＡが、QIAamp（商標）Stool Mini Kit (Qiagen（商標）、カタログ番号51504）を用いて抽出された。精製は、以下に列記したような段階に従い実施した：
−１．４ｍＬのＡＢＳ緩衝液を培地に添加し、そしてそれいを１分間ボルテックスにかける段階；
−先の段階で得られた溶液を７０℃で５分間加熱する段階；
−当該溶液を約１５秒間ボルテックスにかけ、そして次にそれを約１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する段階；
−上清を新しい遠心管に移す段階；
−上清にInhibitExタブレットを添加し、そしてそれを振とうして当該タブレットを溶解させ、そして次に室温で１時間インキュベートする段階；
−溶液を約１３，０００ｒｐｍで３分間遠心して細菌をInhibitExに付着させる段階；
−上清を新しい遠心管に移し、そして次に約１３，０００ｒｐｍで３分間遠心する段階；
−２００μＬの上清を新しい遠心管に移し、そしてプロテアーゼＫを添加する段階；
−２００μＬの緩衝液ＡＬを添加し、そしてそれを１５分間ボルテックスにかけて均質溶液を得る段階；
−１５μＬのプロテアーゼＫを前記均質溶液に添加し、そしてそれを１５秒間ボルテックスにかける段階；
−当該溶液を７０℃で１０分間インキュベートする段階；
−２００μＬの９６〜１００％エタノールを添加してボルテックスにかける段階；
−溶液をQIAampスピンカラムに移し、そしてそれを約１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する段階；
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして５００μＬの緩衝液ＡＷ１を添加し、そして次にそれを約１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する段階；
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして５００μＬの緩衝液ＡＷ２を添加し、そして次にそれを約１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する段階；
−QIAampスピンカラムを新しい遠心管に移し、そして２００μＬの緩衝液ＡＥを添加し、そして次にそれを室温で１分間インキュベートする段階；
−約１３，０００ｒｐｍで１分間遠心してＤＮＡを溶出する段階、
を含んで成る。
【００４２】
16s rDNAフラグメント増幅：Ｌ領域を増幅するためのプライマーは、ラクトバチルス・パラカゼイ16S rRNA V1領域、5'-CAC CGA GAT TCA ACA TGG-3'（配列番号１）及びラクトバチルス保存16S rRNA、5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'（配列番号２）に従い設計した(Ward, L.J.H. and Timmins, M.J. (1999). Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol 29, 90-92)。GM-080、CCRC12913、CCRC14001及びCCRC16100のゲノムＤＮＡが、ＰＣＲ反応を実施するための鋳型として採取された。16s rDNA PCR増幅プログラムは以下の通りである：（１）９５℃で１０分間；（２）９５℃で４５秒間；（３）４６℃で４５秒間；（４）７２℃で１分間；（５）７２℃で７分間；段階２〜５は３０サイクル繰り返した。
【００４３】
16s rDNAの配列決定：GM-080、CCRC12913、CCRC14001及びCCRC16100のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ（図２）、そして配列決定した。配列は、多数の配列アラインメントデータセット(NCBI blastn http://www/ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)に対して、ＡＲＢ配列エディター（リリース８．１）を用いてアラインした。また、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＰＢ４、ＡＹ１８６０４６；Ｆ３１、ＡＦ２４３１４７；ＫＬＢ５８、ＡＦ２４３１６８の16s rDNA配列は、図３に示す通りGM-080のものと同様であった（VectorNTI（商標）, InforMax（商標）Inc.で作成）。更に、16s rDNAの距離の系統樹は、図４に示すように、EMBL-EBI ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)で作成した。当該16S rDNA解析により、GM-080はラクトバチルス・パラカゼイ株ＫＬＢ５８と高度に関連していたが、ＫＬＢ５８とはなおも異なっている。上述のことを考慮すると、GM-080はラクトバチルス・パラカゼイに属している。
【００４４】
実施例３：ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ解析）
GM-080、ラクトバチルス・パラカゼイATCC 25598, 25302, 335, 11582,及び27216のＤＮＡ抽出は、実施例２に記載のように実施した。
【００４５】
ランダム増幅のためのプライマーは5'-ATGTAACGCC-3'とした(Gardiner, G., Ross, R.P., Collins, J.K., Fitzgerald, G. and Stanton, C. Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains. App Environ Microbiol. 1998; 64, 2192-2199)。
【００４６】
ＲＡＰＤの結果を図５に示した。ＲＡＰＤ解析によると、GM-080は常用のラクトバチルス・パラカゼイと異なっていた。上述のことを考慮すると、GM-080は新規ラクトバチルス・パラカゼイ株であった。
【００４７】
実施例４：GM-080の細胞壁タンパク質の抽出及び解析
細胞壁タンパク質は、Angelisにより説明されている方法(Angelis, M.D., Corsetti, A., Tosti, N., Rossi, J.,. Corbo, M. R., and Gobbetti, M. (2001) Characterization of Non-starter Lactic acid bacteria (NSLAB) from Italian ewe cheeses based on phenotypic, genotipic, cell-wall protein analyses. Appl. Environ Microbiol. 2001; 67: 2011-2020)に従い精製された。ＭＲＳブロス(Difco（商標）)中で一晩培養した細胞は収集し、そして次に０．１Ｍ  ＣａＣｌ2含有０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、そして１．０ｍｌの同一の緩衝液中で１０．０のＯＤ600に再懸濁した。８，０００ｘｇでの５分間の遠心の後、細胞壁タンパク質は、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０１Ｍ  ＮａＣｌ、及び２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳを含有する１．０ｍｌの抽出緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてペレットから抽出した。懸濁液を室温で６０分間保存し、１００℃で５分間加熱し、そして１１，６００ｘｇで１０分間４℃で遠心した。上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、そしてクーマシーブルーで染色した。
【００４８】
結果を図６に示した。GM-080のパターンは、以前の研究(Angelis et al. 2001)で報告されたラクトバチルス・パラカゼイのものと同様の３つの特異的なバンドＰ１，Ｐ２及びＰ３を有していた。それ故に、GM-080はラクトバチルス・パラカゼイに属することが証明された。
【００４９】
実施例５：GM-080を同定するために標準化された検出系
刺激：ジャーカット細胞は、新しい培地を添加することによってリフレッシュされ、そして１６時間培養された。次に、細胞を２つの群に分け、一方を乳酸菌を含む培養液とし、そして他方を乳酸菌を含まない培養液とした。細胞濃度が１ｘ１０7／１０ｍＬに達したとき、細胞は、１ｘ１０7の異なる乳酸菌(CCRC12193, GM-080又はCCRC12188)を用いて、又は用いずに２４時間刺激された。刺激後、細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＲＮＡ単離に使用した。
【００５０】
ＲＮＡ単離及び標識：ＲＮＡは、トリゾール試薬(Life Technologies（商標）, Gaithersburg, Md.)を取扱説明書通りに用いることで細胞から抽出した。８ＬのＲＮＡ（１０ｇ）及び２Ｌのオリゴポリ−ｄＴ（１２〜１８量体、１ｇ／Ｌ）を十分に混合し、そして７０℃で１０分間維持し、そして次に氷で２分間冷却した。当該ＲＮＡと、逆転写標識混合物及び３Ｌ  Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（１ｍＭ）、２Ｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（２００Ｕ／Ｌ）、並びにRNasin（ＩＬ）を暗がりで混合した。当該混合物を５０℃で２時間逆転写のためにインキュベートし、そしてこの反応は１．５Ｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することにより終結させた。標識後、ＲＮＡはＮａＯＨ処理で除去し、そしてＨＣｌで中和した。ｃＤＮＡを直ちにＹＭ３０精製キットで精製した。
【００５１】
マイクロアレイの作成：選択した何百の遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、そして分光光度法により２６０ｎｍで定量した。全ての精製したＰＣＲ産物を５０％のジメチルスルホキシド中で０．１μｇ／μｌの濃度に調整し、そして、UltraGAPS（商標）コートスライド(Corning（商標）、Inc., Corning, N.Y.)上に２回スポッティングした。プリンティングの後、マイクロアレイを700mJoulesandでＵＶ架橋し、そしてデシケーター内のスライドコンテナに室温で保存した。遺伝子は、上文で言及したように、表２に列記した。
【００５２】
マイクロアレイハイブリダイゼーション：蛍光標識したｃＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ及び２５％ホルムアミド）中１００℃で５分間変性させ、周囲温度に冷却し、そしてスライド上に蒸着させた。ハイブリダイゼーションは、５５℃で１８時間実施した。ハイブリダイゼーション後、スライドを低度にストリンジェントな緩衝液（１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ）、中程度にストリンジェントな緩衝液（０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ）、高度にストリンジェントな緩衝液（０．１ｘＳＳＣ）中で連続的に洗浄し、そして最終的に圧縮Ｎ2で乾燥させた。
【００５３】
シグナル検出及びデータ解析：Ｎ2で乾燥させたスライドは、GenePix 4000Bスキャナー(Axon Instruments（商標）, Inc.)上で、各スライドにつき同一の光電子増倍管レーザー出力及び感度レベルで直ちにスキャンした。生の蛍光データが得られ（１０ｎｍの解像度）、そして次の処理及びデータの視覚化がMicrosoft Excel（商標）において実施された。独立したハイブリダイゼーション実験の結果を比較するために、ローカルなバックグラウンドシグナルは、それぞれ別個のスポットのハイブリダイゼーションシグナルからサブトラクションされ、そして次にハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンで分離した。各遺伝子の最終的な発現は、二回一組の平均で表した。乳酸菌を用いて培養した、そして用いずに培養したジャーカット細胞の遺伝子発現プロファイルがその結果得られた。乳酸菌を用いずに培養したものに対して乳酸菌(CCRC12193, GM-080又はCCRC12188)で培養したジャーカット細胞において２倍超アップレギュレート又はダウンレギュレートされた遺伝子群が選択された。結果を表３に示した。この差異は、異なる種又は株が細胞の異なる遺伝子をオン又はオフに切り替えることができることを示した。故に、当該遺伝子発現プロファイルから、CCRC12193, GM-080及びCCRC12188はL. パラクゼイ(paracusei)であるが、異なる株に属することが示された。
【００５４】
実施例６；腸の上皮細胞に対するGM-080の接着
Caco-2細胞を本実施例の上皮細胞として採用した。Caco-2細胞は、機能的な微絨毛を有し、且つその上に加水分解酵素を付着させており、それは腸の成熟上皮細胞の分化した形態及び機能をin vitroで示した。
【００５５】
細胞：Caco-2は、５％ＦＢＳを添加した最少必須培地(MEM, GIBCO（商標）)中、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気で培養した。接着アッセイのために、２ｍｌの単層Caco-2細胞(（３ｘ１０5細胞／ｍｌ）が、６ウェルプレート内に据えられたガラスのカバースリップ上で調製された。培養液を２日おきに交換し、そして当該単層を２週間のインキュベーションの後に接着アッセイに使用した。使用直前、当該単層をＰＢＳで２回洗浄し、そして１．５ｍｌのＭＥＭを各ウェルに添加して、細菌の接種前に１時間インキュベートした。
【００５６】
接着：ＰＢＳで一回洗浄し、且つ１．５ｍｌのＭＥＭ培地中で再懸濁した１．５ｍｌの（４ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌ）のGM-080をCaco-2細胞に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、単層細胞をＰＢＳ緩衝液で４回洗浄し、３ｍｌのメタノールで固定し、そして５〜１０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、風乾させ、そしてグラム染色した。接着細菌は、カバースリップ当たり１５の確率場を計数することにより顕微鏡で油浸した条件のもと（ｘ１００）検出し、そして場当たり接着している細菌の平均±ＳＤを決定した。
【００５７】
結果：計数後、１０２±２３．６のGM-080細菌がCaco-2細胞に接着していた。従って、GM-080は、Jacobsen等によって確立された標準(Jacobsen, C. N., Nielsen, R. V., Hayford, A. E., Moller, P. L., Michaelsen, K. F., Parregaard, A., Sandstrom, B., Tvede, M. and Jakobsen, M. Screening of Probiotic Activities of Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp. by In Vitro Techniques and Evaluation of the Colonization Ability of Five Selected Strains in Humans. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 4949-4956)によるとCaco-2細胞に強力に接着することが認められた。
【００５８】
実施例７：胃腸管を模倣した環境におけるGM-080及び他の乳酸菌の活性
酸：一晩培養したGM-080、Ｌ．プランタラム(plantarum)、Ｌ．アシドフィラス(acidophilus)、Ｌ．カゼイ(casei)、及びＬ．バルガリカス(bulgarcus)に、２．０、２．５、そして３．２の異なるｐＨ値を有する９ｍＬのＰＢＳを添加し、そして次にこれを更に３７℃で３時間培養した。培養後、１ｍＬの細胞を９ｍＬのｐＨ７．４のＰＢＳで連続希釈した。酸処理前後の細胞数を推計し、そして下文の表４において列記するように示した。
【００５９】
胆汁：一晩培養したGM-080、Ｌ．プランタラム(plantarum)、Ｌ．アシドフィラス(acidophilus)、Ｌ．カゼイ(casei)、及びＬ．バルガリカス(bulgarcus)に、２．０のｐＨ値を有する９ｍＬのＰＢＳを添加し、そして次に、これを更に３７℃で３時間培養した。培養後、１ｍＬの細胞を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で懸濁した。溶液に、更に、０．３％（ｗ／ｖ）の雄牛の胆汁を含む１０ｍＬのＭＲＳブロスを添加した。細胞を培養し、そして１ｍＬの試料を３、１２、そして２４時間目に採取した。試料は９ｍＬのｐＨ７．４のＰＢＳで連続希釈した。胆汁処理前後の細胞数を推計し、そしてまた表４に示した。これは、これらの乳酸菌が胃腸管を模倣した環境において活性なままであることを示している。
【００６０】
【表１６】
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【００６１】
実施例８：動物モデル
動物：雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを台湾のNational Laboratory Animal Centerから入手し、そして光と温度が共に制御された部屋で２週間飼育した。
【００６２】
アレルゲンの精製：チリダニアレルゲンであるDer p 5は、グルタチオン−アガロース結合クロマトグラフィーで精製されうる組換えDer p 5−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として、ＰＧＥＸ−２Ｔ発現ベクターを含んで成るエスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)において発現した。所望のアレルゲンを発現することができる特定のＥ．コリ株を培養して誘導した。この細菌を回収し、そしてＴＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄し、そして０．１Ｍフッ化フェニルメチルスルホニルを添加した。細胞をＤＮアーゼＩ、Ｔｗｅｅｎ２０及びリゾチームの添加、そして凍結融解法により破壊した。この混合溶液にＥＤＴＡを添加し、そして残渣を遠心で除去し、組換えDer p 5-グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を含む上清を得た。当該上清は、融合タンパク質を吸着させるためにグルタチオン−アガロースアフィニティーカラムにかけられた。当該カラムは続いて４℃のＴＢＳ緩衝液で洗浄し、そして次にカラムから当該タンパク質を分離するためにＴｒｉｓ塩基のグルタチオン（ｐＨ８．０）で還元した。当該タンパク質の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定し、そして濃度もアッセイした。
【００６３】
感作：マウスは、１０μｇのDer p 5と４ｍｇの水酸化アルミニウムの腹腔注射により能動的に感作した。最初の感作から１４及び２１日後に、マウスを０．１％の精製Der p 5のエアロゾルに３０分暴露して吸入誘発を実施した。
【００６４】
処理：感作したマウスを本実験のために３つの群に分けた。Ａ群のマウスに、コントロール群として、２週間の内に１０回ＭＲＳブロスを給餌した。Ｂ群のマウスに、２週間の内に１０回ラクトバチルス・カゼイを投与し、そして１０9ＣＦＵの細菌を毎回投与した。Ｂ群はポジティブコントロールとして扱い、これは、Ｌ．カゼイがＩｇＥ分泌を阻害するのに有効であることが証明されていたためである。Ｃ群のマウスには２週間の内に１０回GM-080を投与し、そして１０9ＣＦＵの細菌を毎回投与した。
【００６５】
実施例９：ＩｇＧ及びＩｇＥ分泌
Der p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥの決定：最後の吸入誘発から１８時間後、５００μＬの血液試料を尾から採取した。血液試料を室温で１時間維持し、そして次に遠心にかけた。血清を−８０℃で保存した。Der p5特異的ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＥの量をＥＬＩＳＡで決定した。９６ウェルのタンパク質高結合プレートを、コーティング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した２００μＬの精製Der p 5でコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そしてこれに３００μＬのブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ）を添加した。２時間室温で振とうした後、プレートを再びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。血清は１：１０希釈でＩｇＧ測定に使用し、そして１：４希釈でＩｇＥ測定に使用した。試料を室温で２時間振とうした。一晩４℃でインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そしてこれに２００μＬのビオチン化ラット抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体、又はラット抗マウスＩｇＧ  ｍＡｂを添加した。試料を室温で２時間振とうし、そして次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。２００μＬのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１：１０００）を続いて添加し、そしてこの試料を室温で１時間振とうした。６回洗浄した後、呈色反応を２００μＬのホスファターゼ基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩（ｐＮＰＰ）(Sigma（商標）N-2770, USA)の添加で開始した。プレートはマイクロプレートオートリーダー(Metertech（商標）、台湾）において４０５ｎｍで読み取った。
【００６６】
統計解析：ＩｇＥ及びＩｇＧのレベルの変化をアッセイするために、一元ＡＮＯＶＡ解析の反復測定を実施して、前記群の間の差異を比較した。分散解析の後、ダンカンの多重範囲試験を使用して、実験群とコントロール群との間の差異を区別した。ｐ＜０．０５の値は、統計的有意差を示すのに使用した。
【００６７】
結果：結果を図７に示した。GM-080で処理した動物の血清におけるＩｇＥ分泌は大きく低下し、そして処理無しのもののわずかに２５％であった。他方、GM-080で処理した動物の血清におけるＩｇＧ分泌は２倍に上昇した。ＩｇＧ分泌はＴｈ１  Ｔ細胞反応を表すので、GM-080は、アレルギー関連疾患と関連付けられるＩｇＥ分泌を排除するための対象となる。
【００６８】
実施例１０：気管支肺胞洗浄液の細胞数
試料の調製：感作から１８時間後、気管開口術を介して導入したポリエチレンチューブを通じて、０．９％滅菌生理食塩水の５ｘ０．５ｍｌアリコートでマウスを洗浄した。洗浄液を遠心し（５００ｇで１０分間、４℃）、そして細胞のペレットを１ｍｌのＰＢＳ溶液中で再懸濁した。分化細胞の計数は、Ｌｅｕ染色で染色したサイトスピン調製物で行った。
【００６９】
統計解析：細胞数の変化をアッセイするために、一元ＡＮＯＶＡ解析のための反復測定を実施して前記群間の差異を比較した。分散解析の後、ダンカンの多重範囲試験を使用して、実験群とコントロール群との間の差異を区別した。ｐ＜０．０５の値は、統計的有意差を示すのに使用した。
【００７０】
結果：結果を図８に示した。ＢＡＬＦにおける血球の型の寄与は、炎症の程度を表す。更に、アレルギー性喘息の主な症候は、気道の慢性的炎症及び好酸球の浸潤である。GM-080で処理した動物のＢＡＬＦ中の好酸球は、５％から１％へと大きく低下した。他方、GM-080で処理した動物のＢＡＬＦ中のマクロファージ及びリンパ球は有意に上昇した。
【００７１】
実施例１１：気管支肺胞洗浄液中でのＩＦＮ−γ分泌
試料の調製：感作の２４時間後、気管開口術を介して導入したポリエチレンチューブを通じて、０．９％滅菌生理食塩水の５ｘ０．５ｍｌアリコートでマウスを洗浄した。洗浄液を遠心し（５００ｇで１０分間、４℃）、そして上清を実施例１に記載のようにＩＦＮ−γ定量解析にかけた。
【００７２】
結果：結果を図９に示した。GM-080を給餌した動物はＢＡＬＦにおいて１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを生成したことが示された。他方、コントロール群はＢＡＬＦにおいてわずかに２０〜４０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを生成した。GM-080はアレルギー性の炎症を阻害するのに有効であった。
【００７３】
実施例１２：アレルギーを処置するための不活性GM-080
不活性GM-080の調製：凍結乾燥したGM-080粉末を蒸留水中で懸濁し、そしてマウスに給餌する前にオートクレーブにかけた（１２１℃、１５分）。
【００７４】
マウス及び感作：雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）をNational Laboratory Animal Center（台湾の台北）から購入した。全ての動物が、温度（２４±２℃）及び湿度（６０±５％）を制御し、且つ特定の病原のいない条件下で１２時間の明暗サイクルで維持したケージで個別に維持した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、４ｍｇの水酸化アルミニウムに吸着した１０ｇの組換えヤケヒョウダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)アレルゲンDer p5-6xHis融合タンパク質を腹腔内注入した。当該マウスには、１日当たり、マウスにつき１０7、１０9及び１０11ＣＦＵのGM-080を給餌した。当該マウスに、１４日目に感作と同量のアレルゲンで追加免疫し、そして感作から２１日後にＰＢＳで希釈した０．１％のDer p5-6xHisを曝露した。吸入誘発は、エアロゾルミストを生成するDeVilbiss（商標）pulmosonicネブライザー（モデル２５１２；DeVilbiss（商標）Corp., Somerset, PA)に繋いだ１Ｌのチャンバー内で実施した。１８時間後、血清を尾の静脈の出血により回収し、そしてＩｇＥを実施例９に記載のようにＥＬＩＳＡで決定した。
【００７５】
結果：結果を図１０に示した。これは、ダストアレルギーDer p-5を曝露したＢＡＬＢ／ｃマウスは、未処置群と比較した場合有意に上昇した血清ＩｇＥレベルを有していたことを示している（ｐ＜０．０５）。これは、アレルギー感作したマウスモデルが首尾よく誘発されうることを示唆している。２１日間１日当たり異なる量のGM-080を給餌した後、GM-080群における血清ＩｇＥは、コントロール群と比較して有意に低下した（ｐ＜０．０５）。この結果は、不活性GM-080は、アレルゲン特異的ＩｇＥを減少させることによりアレルギー性の応答が低下しうることを示した。
【００７６】
本発明の態様を例示して説明したが、種々の変更及び改良が当業者によってなされうる。本発明は例示したような特定の形態に限定されず、且つ本発明の精神及び範囲を逸脱しない全ての変更が特許請求の範囲において規定されるような範囲内のものであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、グラム染色にかけられたGM-080の１０００倍の顕微鏡写真を例示する。
【図２】図２は、GM--080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001及びCCRC16100のPCR増幅した16s rDNAフラグメントのアガロースゲル解析の結果を例示する；Mは分子マーカーを表し；１はGM-080を表し；２はCCRC12913を表し；３はCCRC14001を表し；そして４はCCRC16100を表す。
【図３Ａ】図３Ａは、GM-080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001、CCRC16100、KLB58、PB4、及びF31の16s rDNA配列アラインメントを例示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、GM-080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001、CCRC16100、KLB58、PB4、及びF31の16s rDNA配列アラインメントを例示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、GM-080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001、CCRC16100、KLB58、PB4、及びF31の16s rDNA配列アラインメントを例示する。
【図３Ｄ】図３Ｄは、GM-080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001、CCRC16100、KLB58、PB4、及びF31の16s rDNA配列アラインメントを例示する。
【図３Ｅ】図３Ｅは、GM-080並びに乳酸菌株CCRC129313、CCRC14001、CCRC16100、KLB58、PB4、及びF31の16s rDNA配列アラインメントを例示する。
【図４】図４は、本発明のGM-080と関連の乳酸菌とを比較する16s rDNAの距離の系統樹を例示する。
【図５】図５は、GM-080及び常用の乳酸菌株のRAPD解析を例示する；M：100-bpラダー、レーン１：GM-080；レーン２：ラクトバチルス・パラカゼイATCC 25598；レーン３：ラクトバチルス・パラカゼイATCC 25302；レーン４：ラクトバチルス・パラカゼイATCC 335；レーン５：ラクトバチルス・パラカゼイATCC 11582；レーン６：ラクトバチルス・パラカゼイATCC 27216。
【図６】図６は、GM-080、常用のラクトバチルス・パラカゼイ及びラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)株の細胞壁タンパク質のSDS-PAGEパターンを例示する；ここで、Mはタンパク質の分子量を表し；レーン１はラクトバチルス・パラカゼイを表し；レーン２はラクトバチルス・パラカゼイGM-080を表し；レーン３はラクトバチルス・ファーメンタムを表し；F1はラクトバチルス・ファーメンタム特異的なバンドを表し；そしてP1, P2及びP3はラクトバチルス・パラカゼイ特異的なバンドを表す。
【図７】図７は、Der p 5の吸入で誘発したDer p ５感作BALB/cマウスの血清中のDer p 5特異的IgG（白棒）及びIgE（黒棒）を例示する；AはMRSブロスで処理した群を表し；BはL. カゼイで処理した群を表し；そしてCはGM-080で処理した群を表す。
【図８】図８は、Der p ５感作マウスの気管支肺胞洗浄液中のマクロファージ、リンパ球及び好酸球の細胞数を例示する；AはMRSブロスで処理した群を表し；BはL. カゼイで処理した群を表し；そしてCはGM-080で処理した群を表す。
【図９】図９は、Der p ５感作マウスの気管支肺胞洗浄液におけるIFN-γ分泌を例示する；AはMRSブロスで処理した群を表し；BはL. カゼイで処理した群を表し；そしてCはGM-080で処理した群を表す。
【図１０】図１０は、Der p ５感作BALB/cマウスにおけるIgE産生に対する不活性GM-080の効果を例示する。Der p ５感作マウスは、三週間毎日異なる量のGM-080又は蒸留水（コントロール）を経口投与された。血清のDer p5特異的IgEレベルはELISAで決定された。コントロール群と比較したが、*（ｐ＜０．１）及び**（ｐ＜０．０５）はクラスカル−ワリスH検定では有意に異なっており、そして帰納的な比較がダネットｔ検定で使用された。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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