(57)【要約】【課題】バイオセンサ運転中にバイオセンサの微生物膜の活性を判定し、バイオセンサの有害物質検出感度（呼吸阻害率）を定量的に調整する手段を提供することにある。【解決手段】微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの設定温度を、酸素消費率の温度特性曲線および有害物質検出感度の温度特性曲線を含むバイオセンサ温度特性データベースを基にして、５〜３０℃の範囲内で制御する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの設定温度を、バイオセンサ温度特性データベースを基にして、５〜３０℃の範囲内で変化させることを特徴とするバイオセンサの有害物質検出感度調整法。
【請求項２】
バイオセンサ温度特性データベースが、バイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納されていることを特徴とする請求項１記載の有害物質検出感度調整法。
【請求項３】
バイオセンサ温度特性データベースが、酸素消費率の温度特性曲線および有害物質検出感度の温度特性曲線から成ることを特徴とする請求項１記載の有害物質検出感度調整法。
【請求項４】
微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの校正時に前記環境水の一部である検査水の５〜３０℃における酸素消費率を測定して前記検査水の温度に対する酸素消費率の温度特性を知り、その温度特性を請求項３記載のデータベースと照合することにより要求有害物質検出感度に対するバイオセンサの設定温度を導出することを特徴とする有害物質検出感度調整法。
【請求項５】
微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの校正時に前記環境水の一部である検査水の５〜３０℃における酸素消費率を測定して前記検査水の温度に対する酸素消費率の温度特性曲線を作成し、その酸素消費率の温度特性曲線から予め定めた酸素消費率を基準とした時の温度を酸素消費率の基準点温度として算出し、その基準点温度に対応する有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出し、要求有害物質検出感度に対するバイオセンサの設定温度を導出することを特徴とする有害物質検出感度調整法。
【請求項６】
酸素消費率の温度特性曲線から基準点温度を算出し、バイオセンサ温度特性データベースから前記基準点温度に相当する活性度の微生物膜を用いたときの酸素消費率の温度特性曲線を読み出し、該酸素消費率の温度特性曲線に対応する有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出すことを特徴とする請求項５記載の有害物質検出感度調整法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上下水道の各プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水を対象として、その環境水中の有害物質をモニタリングすることを目的としたバイオセンサ応用水質計測器を用いた環境水中の有害物質の新規な検出感度調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは試料水中の測定対象化学物質を認識する分子識別素子として、酵素や抗体などの生体機能性材料や微生物、細胞など生体そのものを利用し、これらの生体材料を多孔性高分子膜に化学的に包括または共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサと組合せて前記生体材料の分子識別信号を電気信号に変換して試料水中の化学物質の測定を行うバイオセンサである。
バイオセンサは試料水を上記生体材料の固定化膜に接触させ、これによって生ずる生化学反応により生成または消費される物質の濃度変化を検出器で電流や電圧などの電気的な出力（以下、バイオセンサ出力と記載する）の変化に変換して測定する。
【０００３】
バイオセンサを使用した測定にあたっては、固定化した生体材料が安定に機能するように温度とpH条件を一定の範囲にすることが必要である。そのため、バイオセンサ応用計測器では、試料水を一定温度に加温する熱交換器とバイオセンサ温度を一定にする恒温槽が備えられ、また、pH条件を一定とするために緩衝溶液が用いられている。
【０００４】
すでに、特許文献１に示すような水中の有害物質検出用バイオセンサが開発され、実用化されている。生体材料としては有害物質に極めて弱い微生物である硝化細菌を用い、この硝化細菌を生きたまま固定化して高分子多孔膜で封じ込めた微生物膜と、検出器として溶存酸素電極とを組合せた呼吸活性検知型バイオセンサを構成し、これに硝化細菌の基質および微量栄養成分を一定濃度含む緩衝溶液と試料水を所定の比率となるように混合して連続的に流すことにより、有害物質混入の連続監視を行う。なお、硝化細菌とは、アンモニアを亜硝酸に酸化するアンモニア酸化細菌と、亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌の総称である。
【０００５】
前記溶存酸素バイオセンサを長期間連続運転している間に、一般的には化学反応により、析出物が発生する。たとえば、図４の溶存酸素センサにおいて、これら析出物がたとえば前記アノード電極２９と酸素透過膜３１間に入り込むと、センサ出力が低下する。また、絶縁ガラス３２に微少なクラックが入ることでも、同様にセンサ出力は低下する。バイオセンサ日常運転中にも、微生物膜1の表面に気泡が付着するなどしてもセンサ出力は低下する場合がある。
そのため、日常運転で、一日一回程度、溶存酸素センサの校正を行うのが普通である。そのときのセンサ校正値は、基質を含まない緩衝溶液と純水を流した（硝化細菌が溶存酸素を消費しない）時のセンサ出力値Ａと、基質を含む緩衝用液（以後、フィード液と表記）と純水を流した（硝化細菌が溶存酸素を消費する）時のセンサ出力値Ｂの差分（Ａ−Ｂ）を用いる。試料水中に硝化細菌の呼吸を阻害するような有害物質が存在すると、試料水中の溶存酸素濃度が上昇してセンサ出力が増加する。このときのセンサ出力値Ｃとセンサ校正値を用いて、（1）式のように呼吸阻害率を求めることができる。上記センサにおいて、設定した呼吸阻害率の閾値を超えた場合に、一般的には試料水中の有害物質検知の警報を出力するように設定されている。
呼吸阻害率（%）＝（Ｃ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）×100    （1）
【特許文献１】特公平７−８５０７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
通常、上記のような硝化細菌を使用するバイオセンサ応用計測器では、微生物膜内の硝化細菌の数や活性をできるだけ長い期間安定に維持するために、硝化細菌の至適温度条件（３０±１℃）、至適ｐＨ条件（７〜９）等を維持し、成育に必要な微量栄養成分を含む緩衝溶液を用いて、測定を行っている。しかし、このような条件下でも試料水の水質や微生物膜内での硝化細菌の増殖サイクルに伴い、微生物膜の活性（硝化細菌の数や活性）は上下する。微生物膜の活性が上昇した場合、有害物質に対する感度は低くなり、微生物膜の活性が下降した場合、有害物質に対する感度は高くなり、有害物質に対する感度も変動することとなる。そのため、呼吸阻害率のセンサ警報閾値を微生物膜の活性に応じて変更しなければならないが、バイオセンサ運転中の微生物膜の活性を判定する手段がないため、現実的な対応が困難であった。
また、電気的ノイズ等の外乱による誤警報を避けるため、上記警報閾値を例えば１０％から２０％に設定変更した場合、バイオセンサの有害物質検出感度（呼吸阻害率）も２倍にする必要があるが、その感度を定量的に調整する手段がないという問題点があった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、バイオセンサ運転中の微生物膜の活性を判定する手段を提供することにある。また、バイオセンサの有害物質検出感度を定量的に調整する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するためにいろいろ試みた。そして、微生物膜の活性が異なる複数のバイオセンサに３〜３０℃のヒートサイクル試験を行い、酸素消費率を測定した結果、温度低下とともに酸素消費率が低下すること、および、温度に対して可逆性があるとの知見を得た。
また、微生物膜活性が高いほど、一定の酸素消費率となる温度が低下するとの知見も得た。さらに、０．３％Ｖ/Ｖアセトン水溶液を有害物質試料とした時のバイオセンサ検出感度は液の温度低下とともに上昇し、微生物膜活性が低いほど、その上昇度合が大きいとの知見も得た。さらに、一定の酸素消費率での温度を基準として（以下、基準点温度ということがある）、例えば、酸素消費率が約９０％となるようバイオセンサの液温を調整すると前記課題を解決できるのではないか、との考えに到達した。
これらの知見等に基づきさらに検討を重ね本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、請求項１に係る発明は、微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、あらかじめ作成しておいたバイオセンサ温度特性データベースから特定のデータを読み出し、測定値と照合して、前記バイオセンサの設定温度を５〜３０℃の範囲内で変化させることを特徴とするバイオセンサの有害物質検出感度調整法である。
その発明において、前記バイオセンサ温度特性データベースが、バイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納されていることを特徴とする発明が請求項２記載の発明であり、また、前記バイオセンサ温度特性データベースが、酸素消費率の温度特性曲線および有害物質検出感度の温度特性曲線から成ることを特徴とする発明が請求項３記載の発明である。
【０００９】
請求項４に係る発明は、微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの校正時にバイオセンサを５〜３０℃の範囲内で走査し、前記環境水の一部である検査水の５〜３０℃における酸素消費率を測定して前記検査水の温度に対する酸素消費率の温度特性を知り、その温度特性を請求項３記載のデータベースと照合することにより要求有害物質検出感度に対するバイオセンサの設定温度を導出することを特徴とする。
請求項５に係る発明は、微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの校正時にバイオセンサを５〜３０℃の範囲内で走査し、前記環境水の一部である検査水の５〜３０℃における酸素消費率を測定して前記検査水の温度に対する酸素消費率の温度特性曲線を作成し、その酸素消費率の温度特性曲線から予め定めた酸素消費率を基準とした時の温度を酸素消費率の基準点温度として算出し、その基準点温度に対応する有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出し、要求有害物質検出感度に対するバイオセンサの設定温度を導出することを特徴とする。
請求項５に係る発明での酸素消費率の温度特性曲線から酸素消費率の基準点温度を算出した後に、さらに、バイオセンサ温度特性データベースから前記基準点温度に相当する活性度の微生物膜を用いたときの酸素消費率の温度特性曲線を読み出し、該酸素消費率の温度特性曲線に対応する有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出すことを付加する発明が、請求項６に係る発明である。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサは一般的に用いられるものを採用すればよいのであり、とくに限定されない。本発明では、上下水道の各プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水中に存在するかもしれない広範囲の有害物質を検出することが可能であるが、とくに、アセトンやシアン系化合物などの有害物質を検出することが可能である。
【００１１】
本発明でいうバイオセンサ温度特性データベースとは、バイオセンサを利用して試料水に存在する有害物質を検出する際に有効なデータを集めたデータベースである。その温度特性データベースの中の好ましい温度特性データとして、フローセル内を通過する試料水の温度とその試料水の溶存酸素率との関係を示すデータ、試料水の液温とその試料水に有害物質を混入した時の呼吸阻害率との関係を示すデータなどを示すことができる。
これらの温度特性データはまずバイオセンサに試料水を通過させて酸素消費率などを測定し、それらの測定値から各種数値を算出し、温度特性データを創りあげることができる。また、バイオセンサに有害物質を混入した試料水を通過させて酸素消費率などを測定し、それらの測定値から呼吸阻害率を算出し、温度特性データを創りあげることができる。
それらは、たとえば以下のような条件で創りあげることができる。
微生物膜の初期活性：微生物膜の使用菌体固定化量で調整可能であるが、例えば２×１０７個/ｍｍ２〜６×１０７個/ｍｍ２とした。
バイオセンサ運転温度：５〜３０℃で５℃間隔ごと。
有害物質濃度：アセトンやシアン系化合物など。たとえばシアン系化合物を０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２ｍｇ/Ｌとなるように調整。
【００１２】
とくに好ましいバイオセンサ温度特性データベースとして、図２に示される硝化細菌バイオセンサの温度特性データがある。図２は硝化細菌バイオセンサの試料水の液温と酸素消費率との関係を示す酸素消費率の温度特性曲線、および硝化細菌バイオセンサの有害物質混入試料水の液温と阻害率との関係を示す阻害率（毒物感度）の温度特性曲線を示す。これはバイオセンサ運転中の３種の微生物膜活性について、バイオセンサ流入水の液温３〜３０℃でのヒートサイクル試験を行い、酸素消費率を測定した結果、得られたデータに基づく。また、他の異なる温度特性曲線として、バイオセンサ流入水の温度と要求有害物質検出感度の関連を示す温度特性曲線を示すことができる。
これらの温度特性データはバイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納しておくことが好ましい。
本発明では、これら温度特性データベースを適宜利用して、バイオセンサの設定温度を変動させ、バイオセンサの微生物膜の活性を判定し、またバイオセンサの有害物質検出感度を調整することを特徴とする。また、その際、バイオセンサの酸素消費率の任意の値を基準点として、その基準点における温度を基準にしてバイオセンサの設定温度を変動することを特徴とする。なお、酸素消費率の基準点の代表例は約９０％であるが、その値に何ら限定されないのであり、それ以外の値、例えば９３％、８５％、７０％など任意の値としてもよい。
【００１３】
本発明では、バイオセンサ運転状態の指標として、下記のように求められる酸素消費率を定義する。まず、緩衝溶液と純水を流した時のバイオセンサ出力値Ｄを酸素消費率０％とし、バイオセンサ校正を行う。なお、フィード液を流した時に酸素消費率が１００％となる、すなわち微生物膜が水中の溶存酸素を全て消費する場合、バイオセンサ出力値は０ｍＶとなることから、バイオセンサ出力値Ｄの絶対値が校正幅となる。
次に、フィード液と試料水を流した時のバイオセンサ出力値Ｅと校正時のバイオセンサ出力値Ｄを用いて、測定中の任意の時点での酸素消費率を（２）式のように求められる。
酸素消費率（%）＝[（Ｄ−Ｅ）／Ｄ]×100    （２）
例えば、Ｄが４ｍＶ，Ｅが０．４ｍＶである場合、酸素消費率は（4−0.4）／4×100＝90％となる。
また、バイオセンサの有害物質検出感度、すなわち呼吸阻害率は有害物質流入前の酸素消費率Ｆおよび有害物質流入時の酸素消費率Ｇを用いて（３）式のように求められる。
呼吸阻害率（%）＝[（Ｆ−Ｇ）／Ｆ]×100    （３）
例えば、Ｆが90％、Ｇが81%である場合、呼吸阻害率は（90−81）／90×100＝10％となる。
【００１４】
すなわち、本発明は、様々な条件、例えば菌体固定化量で決まる微生物膜活性、毒物混入の有無など、での液温対酸素消費率および毒物感度の温度特性（図２を参照）をデータベースとして予め取得し、対象のセンサ自身の温度特性を取得してデータベースと照合させることで、対象センサの活性の変化を判断でき、その時の最適温度を算出して制御することで、センサ運転中の活性状態とその時点での毒物感度が判定可能であることと、定量的な感度調整が可能である。
具体的な操作としては、まず毒物混入の無いときの微生物活性からの液温特性を取得する。より具体的には、フィード液および純水を流しながら液温を変化させた時の酸素消費率変化データを取ると共に緩衝液および純水を流しながら液温を変化させた時の酸素消費率変化データを取って、それら両者の差から微生物膜活性の温度特性を得る。次に、既にデーターベースとして持っている微生物活性度の違いに対する微生物膜活性の温度特性と比較して、適合（特に、例えば酸素消費率90％となる時の温度を基準点温度として比較の対象点する）したデータベースに対応する毒物の感度特性（センサとして要求される対象毒物とその感度データ）を読み出すことにより行なわれる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、バイオセンサに使用している微生物膜内の微生物の数や活性（微生物膜活性）を、酸素消費率の温度特性曲線の基準点を指標として把握しながら、装置内の温度特性データベースを基に前記バイオセンサの設定温度を調整することにより、有害物質検出感度を定量的に調整することを可能とした。このことにより、種々の環境水に対して、微生物膜活性がどのように変動しても有害物質検出感度を定量的に調整可能となり、より実用性の高いバイオセンサ応用水質計を提供可能である。
【発明の実施の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を、図を用いながら詳しく説明する。
図３に示すように、冷蔵保存した微生物膜をフローセル内に入れ、その上に溶存酸素電極を取り付けて微生物膜と密着させ、有害物質検出用バイオセンサを構成する。
これを図１に示すような恒温槽に取り付ける。
図１において、初めに緩衝溶液と純水とを流し、設定温度を３０℃としてバイオセンサ校正を開始し、バイオセンサ出力が安定するまでの所定時間経過後、バイオセンサ出力値を記憶する。次いで設定温度を３０℃から５℃へ低下させ、適宜の温度におけるバイオセンサ出力値を記憶する。これら温度とそのときのバイオセンサ出力値をプロットし、酸素消費率の温度補正のための酸素消費率０％時でのバイオセンサ出力の温度特性曲線を取得する。
次に、基質を含む緩衝溶液であるフィード液と純水を流し、バイオセンサ出力が安定するまでの所定時間経過後に、バイオセンサ出力値を記憶する。そのバイオセンサ出力値と、前記取得した酸素消費率０％時でのバイオセンサ出力の温度特性曲線を用いて、酸素消費率を算出する。例えば、前記フィード液と純水の温度がＴ℃のときのバイオセンサ出力値がＸＴｍＶならば、前記所得した酸素消費率０％時でのバイオセンサ出力の温度特性曲線を用いて、Ｔ℃のときの前記緩衝溶液と純水のときのバイオセンサ出力値がＹＴｍＶであることを知り、前記式（２）を利用して、酸素消費率を算出することができる。すなわち、設定温度を５℃から３０℃へ上昇させ、各温度での酸素消費率を同様に算出し、それぞれの温度と酸素消費率をプロットすると、酸素消費率の温度特性曲線を取得することができる。
【００１７】
次に、上記のようにして得られた酸素消費率の温度特性曲線からの酸素消費率の基準点温度を算出する。次いで、その基準点温度をバイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納されている温度特性データベースと照合して、有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出し、有害物質検出感度に相当する設定温度を導出する。すなわち、図２で示されるような、温度特性データベースから読み出された毒物感度の温度特性曲線から、酸素消費率の基準点温度を基にして、相当する酸素消費率の温度特性曲線を読み出し、つぎにその特性曲線に対応する有害物質検出感度の温度特性曲線を読み出し、有害物質の要求検出感度に対するバイオセンサの設定温度を導出する。
例えば、酸素消費率の基準点を９０％とした時の基準点温度が１９℃であった場合、酸素消費率の温度特性曲線は図２中の活性２の曲線に相当する。次に、要求検出感度が０．３％Ｖ/Ｖアセトン水溶液で呼吸阻害率４０％である場合、活性２の有害物質検出感度の温度特性曲線から設定温度は２８℃と導出され、設定温度を３０℃から２８℃へ変更する。
【００１８】
定期的にバイオセンサの微生物膜における酸素消費率の測定を行い、酸素消費率の温度特性曲線を作成し、得られた酸素消費率の温度特性曲線の基準点温度を算出し、微生物膜活性の変動をチェックする。例えば、微生物膜活性が上昇し、酸素消費率の基準点を９０％とした時の、上記基準点温度が１９℃から１２℃になった場合、酸素消費率の温度特性曲線は図２中の活性１の曲線に相当する。次に、要求検出感度が上記と同様の０．３％Ｖ/Ｖアセトン水溶液で呼吸阻害率４０％である場合、活性１の有害物質検出感度の温度特性曲線から設定温度は２１℃と導出され、設定温度を２８℃から２１℃へ変更する。また、要求検出感度を０．３％Ｖ/Ｖアセトン水溶液で呼吸阻害率２０％に変更する場合、活性１の有害物質検出感度の温度特性曲線から設定温度は２３．５℃と導出され、設定温度を２８℃から２３．５℃へ変更する。
上記手法により、バイオセンサの微生物膜活性の変動に合わせて、バイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納されている温度特性データベースを基にバイオセンサの設定温度を調整することにより、バイオセンサの有害物質検出感度を定量的に調整することが可能となる。
なお、バイオセンサを備えた有害物質検出装置内の制御部に格納されている温度特性データベースの一つである図２に示される毒物感度の温度特性曲線は、微生物膜活性が異なる複数のバイオセンサを用意し、それぞれの試料水の液温とそのときの酸素消費率を測定しプロットする。それと共に、それぞれのバイオセンサに有害物質、例えばアセトンを０．３Ｖ/Ｖ％となるような試料水を流入させ、そのときの液温と呼吸阻害率を測定・算出し、プロットすることにより作成することができる。
【００１９】
これらの記載から本発明を次のように記載することもできる。
（１）微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの設定温度を、バイオセンサ温度特性データベースを基にして、５〜３０℃の範囲内で変化させ、バイオセンサの有害物質検出感度を調整することを特徴とするバイオセンサの有害物質検出感度調整法。
（２）微生物膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いた環境水中の有害物質を検知する方法において、前記バイオセンサの校正時に前記環境水の一部である検査水の５〜３０℃における酸素消費率を測定して前記検査水の温度に対する酸素消費率の温度特性曲線を作成し、その酸素消費率の温度特性曲線から基準点温度を算出し、微生物膜の活性を判定することを特徴とする微生物膜活性判定方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】バイオセンサ応用水質計の構成を示すフロー図
【図２】酸素消費率および有害物質検出感度の温度特性曲線を説明する図
【図３】バイオセンサの構成を示す模式図
【図４】溶存酸素センサの構成図
【符号の説明】
【００２１】
１．微生物膜
２．溶存酸素電極
３．リード線
４．フローセル
５．試料流路
６．バイオセンサ
７．恒温槽
８．熱交換器
９．制御部
１０．エアポンプ
１１．定流量ポンプ
１２ａ．１２ｂ．１２ｃ．１２ｄ．電磁弁
２９．アノード電極
３０．カソード電極
３１．酸素透過膜
３２．絶縁ガラス
３３．電解液
【図１】
2006098351.tif 000003
【図２】
2006098351.tif 000004
【図３】
2006098351.tif 000005
【図４】
2006098351.tif 000006