(57)【要約】【課題】被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法の提供。【解決手段】被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを消去する第１工程と、次いで、被検試料中に残存する低密度リポ蛋白中のトリグリセリドを定量する第２工程とから成ることを特徴とする、被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを消去する第１工程と、次いで、被検試料中に残存する低密度リポ蛋白中のトリグリセリドを定量する第２工程とから成ることを特徴とする、被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法。
【請求項２】
前記第１工程は、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することから成る、請求項１記載の被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法。
【請求項３】
前記第１工程で用いられる、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤が、ＨＬＢ値が１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項１又は２記載の被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法。
【請求項４】
前記第１工程の反応が0.1〜5.0 g/dLのアルブミンの存在下で行う請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１工程の反応が、ｐＨ５〜９および温度３０〜４０℃の条件下で行う請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２工程は、前記第１工程の産物に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を加え、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することから成る、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用する界面活性剤が、全てのリポ蛋白に作用するものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第２工程で用いられる、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤が、ＨＬＢ値が１１以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検試料中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は血液中におけるトリグリセリド運搬の主役であり、ＬＤＬ−トリグリセリド（ＬＤＬ−Ｃ）の上昇が冠動脈硬化性疾患の重要な危険因子であることは以前より明らかとなっていた。一方、血中のＬＤＬ−Ｃが正常範囲であっても心筋梗塞を発症する例が数多く存在することも事実であり、最近ではＬＤＬ粒子の質の変化が重要視されるようになってきた（非特許文献１を参照）。
【０００３】
近年、小型で比重の重いsmall, dense  ＬＤＬと冠動脈硬化性疾患の関係がクローズアップされ、正常サイズのＬＤＬを持つ症例に比べ発症率が３倍に達することが指摘されている。Small,  dense  ＬＤＬ粒子の特徴としては小型であることと粒子中のトリグリセリド量が正常のＬＤＬに比べ高いことである。よってＬＤＬ中のトリグリセリドを測定することによりSmall,  dense  ＬＤＬの存在量を推測できるので、ＬＤＬ中のトリグリセリドを簡便に測定し定量できることは臨床上有用である。
【０００４】
ＬＤＬ中のトリグリセリドの定量方法としては、分画とトリグリセリド定量の２つの操作から求める方法がある。
分画操作としては超遠心法、沈殿法、免疫反応を利用した方法等があるが、いずれの方法においても試料を遠心処理またはフィルター処理による操作が必要となる。定量としては分画により得られたＬＤＬを試料に用い、臨床検査の場で用いられている自動分析装置装置とＴＧ試薬により定量を行う方法があるが、いずれにせよ簡便性や経済性において普及しにくい方法である。
【非特許文献１】
芳野原他、「特集  高脂血症の治療  Small, dense LDL」、CURRENT THERAPY 1998, Vol.16, No.1, p.45-53
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、被検試料中のＬＤＬ中のトリグリセリドを簡便に定量する方法の提供を目的とする。具体的には、本発明は、第１工程でＬＤＬ以外のリポ蛋白中トリグリセリドを消去し、第２工程でＬＤＬ中のトリグリセリドを定量する方法の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、ある種の界面活性剤とリポプロテインリパーゼを組み合わせて、被検試料に作用させることにより、被検試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白であるカイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のトリグリセライドとの反応が起こりこれらのリポ蛋白が分解されることを見出した。本発明者らは第１工程で、ＬＤＬ以外のリポ蛋白を分解し、第２工程で残存するＬＤＬと反応する界面活性剤を添加しＬＤＬを分解しＬＤＬ中のトリグリセリドをリポプロテインリパーゼの作用により分解し生成した過酸化水素を定量することによりＬＤＬ中のトリグリセリドを定量し得ると考えた。さらに、鋭意検討を行い、第１工程の反応の結果生じるトリグリセリドの分解産物である過酸化水素が第２工程で検出されてしまうのを抑えるために過酸化水素を消去する反応系を組み込み、さらに第１工程にアルブミンを添加することで、第１工程の反応の残骸物を吸着し、第２工程における反応への干渉を回避できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを消去する第１工程と、次いで、被検試料中に残存するＬＤＬ中のトリグリセリドを定量する第２工程とから成ることを特徴とする方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程では被検試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存トリグリセリドを定量する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白にはＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭがある。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のトリグリセリドが消去されているので、第２工程で定量されるトリグリセリドは、主として被検試料中のＬＤＬ中のトリグリセリドである。
【０００９】
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
第１工程における「トリグリセリドを消去」とは、トリグリセリドを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるトリグリセリドを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００１１】
すなわち、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
【００１２】
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、いずれの方法を用いてもよく、さらにこれらの方法に限定されるものではない。
【００１３】
第１工程の反応液中のリポプロテインリパーゼ濃度は５０〜５００  ＩＵ／ｍＬ程度が好ましく、グリセロールキナーゼの濃度は０．３〜  ３．０  ＩＵ／ｍＬ程度が好ましく、グリセロール３リン酸オキシダーゼの濃度は２〜１５  ＩＵ／ｍＬ程度が好ましい。さらに、過酸化水素を水と酸素に分解する場合のカタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、この際に添加するフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００１４】
第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
【００１５】
ＨＬＢ値が１３以上１４以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１４以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／Ｌ程度である。
第１工程は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
【００１７】
第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好ましい。
第１工程の反応温度は３０〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００１８】
本発明の方法では、第１工程をアルブミンの存在下で行う。アルブミンの存在下で行うことにより、第工程の反応の結果生じる残骸物がアルブミンに吸着され、第２工程でこれらの残骸が反応に干渉することを防止できる。アルブミンは、アルブミンであれば何ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを好適に用いることができる。また、アルブミンの起源も何ら限定されるものではなく、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ等いずれの動物であってもよく、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度は0.1〜5.0 ｇ／ｄＬが好ましく、0.3〜3.0ｇ／ｄＬがさらに好ましい。
【００１９】
第１工程において、界面活性剤、リポプロテインキナーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロールからなるＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用しこれらのリポ蛋白を分解する酵素、ならびにカタラーゼ等の過酸化水素を消去するための酵素は同時に添加してもよいし、また別々に添加してもよい。好適には、これらの試薬の総てを含む試薬を調製しておき、被検試料と混合する。
【００２０】
続く第２工程では、被検試料中の残存ＬＤＬ中のトリグリセリドを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加え反応系に残っているリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
【００２１】
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好ましくは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
【００２２】
ＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／Ｌ程度である。
第２工程のその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
【００２４】
生じた過酸化水素の定量は、過酸化水素存在下でペルオキシダーゼの作用により４−アミノアンチピリンとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とを酸化縮合させ、生じた色素を定量すればよい。フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物としては、例えば、５-ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ-エチル-Ｎ-（３-メチルフェニル）-Ｎ’-サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられる。
【００２５】
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（試薬）
次の組成からなるＬＤＬトリグリセリド定量試薬を調製した。
2006180707.tif 000002
【００２６】
（試料）
臨床検体１２例を準備した。
（測定方法）
試料各４μLに、あらかじめ３７℃に加温した第１試薬３００μLを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μLを加え５分間反応させ６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度から事前に測定していた既知濃度試料の吸光度と比較を行い、ＬＤＬトリグリセリド濃度を算出した。
【００２７】
比較対照として超遠心法でＬＤＬ分画を採取し、市販のトリグリセリド試薬（デンカ生研社製  FG-TG(S)試薬を使用）でＬＤＬ中のトリグリセリド濃度を求めた。なお、超遠心法は「新生化学実験法講座４  脂質Ｉ  中性脂肪とリポタンパク質」、（株）東京化学同人出版に記載されている方法を実施した。
【００２８】
【表１】
2006180707.tif 000003
(単位:mg/dL)
表１の結果より本法と超遠心法の良好な関係が確認できる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法により、ＬＤＬ中のトリグリセリドを遠心操作等を行うことなく簡便に定量することができる。