(57)【要約】【課題】  藍染め染色液作製工程における作製時間の短縮化及び工程の省略化を図ることにより、藍染めにおける生産性を向上させること。【解決手段】  インジゴをロイコインジゴに還元する酵素、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉが産生する新規なインジゴ還元酵素、該インジゴ還元酵素を産生する微生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）及び該微生物の培養物から調製するインジゴ還元酵素の製造方法、並びにインジゴ還元酵素の用途を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉが産生のインジゴ還元酵素。
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）である請求項１に記載のインジゴ還元酵素。
【請求項３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）が保有のインジゴ還元酵素遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のインジゴ還元酵素遺伝子を発現させることにより製造されるインジゴ還元酵素。
【請求項６】
Ｎ末端アミノ酸配列が、配列番号１に記載の、Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｘ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕである、請求項１、２又は５のいずれかに記載のインジゴ還元酵素。
【請求項７】
天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料を用いる染色工程において請求項１、２、５又は６に記載のインジゴ還元酵素を用いることを特徴とする染色方法。
【請求項８】
請求項１、２、５又は６に記載のインジゴ還元酵素と天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料とからなる藍染め染色用キット。
【請求項９】
請求項１、２、５又は６に記載のインジゴ還元酵素を有効成分として染毛効果を奏する量、含有することを特徴とする染毛剤。
【請求項１０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉの培養物から調製することを特徴とするインジゴ還元酵素の製造方法。
【請求項１１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）である請求項１０に記載のインジゴ還元酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインジゴ還元酵素及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
徳島の伝統産業である藍染めは、蓼藍の葉を用いて行われている。収穫した藍の葉はその日のうちに細かく刻んで乾燥させ、蔵に山積みにして水をかけながら高温高アルカリ条件下で約３ヶ月間発酵させる。こうして発酵により堆肥状になったものをスクモと呼ぶ。スクモ中に含まれるインジゴは水に不溶の色素であるため、そのままでは繊維に吸着されない。そのため不溶性のインジゴを、還元により水溶性のロイコインジゴに変換して繊維に吸着させ、この繊維を空気に触れさせて再びインジゴに戻し繊維へ固定させることで染色を行う。これを「藍建て」と言い、伝統的な藍染めでは、スクモと消石灰、清酒、水あめ等を混ぜて、常温高アルカリ条件下で発酵還元させ、染色液を作製している。染色液の表面に油膜が張り、藍の花と呼ばれる泡が形成され、ｐＨが１１以下になると染色可能となる。この染色液の仕込から発酵が完了して染色可能となるまでに、夏場で１〜２週間、冬場では３〜４週間も要し、その間染色液を毎日撹拌し、発酵の状態を見ながら消石灰、清酒、水あめ等を添加する等、染色液の作製には大変な時間と労力を必要とする。これらの作業工程は全て職人の勘と経験に基づいて行われているため、同一原料・同一操作で作製しても環境や作製する人により染色液の還元力が異なる。また、このように手間暇かけて染色液を作製しても、１日当たりに染色できる繊維量は染色液５０Ｌに対して２００ｇが限度であり、その間も染色液は温度やｐＨを一定条件に保たなければならず、品質管理が非常に困難である。
【０００３】
インジゴを還元する「藍建て」には、上述したような「発酵建て」の他に「化学建て」と呼ばれる化学薬品を用いた還元方法がある。「化学建て」によるインジゴの還元は、還元剤であるハイドロサルファイトと強アルカリ剤である苛性ソーダを用いる方法が一般的である。この「化学建て」による還元は、「発酵建て」に比べ、職人の勘や経験を必要とせず容易に大量生産を行うことが可能であることから、工業的な合成インジゴを使用した染色には盛んに使用されている。また、天然藍を使用した藍染めにおいても「化学建て」により容易に染色を行うことはできるが、このような化学薬品を使用した方法では布が傷む原因になるばかりか、人体への影響も懸念され、廃液の処理にも手間がかかるといった問題がある。特に苛性ソーダは毒物及び劇物取締法で劇物に指定されており、取り扱いには注意が必要である。
【０００４】
上述した「発酵建て」によるインジゴの還元には高アルカリ性微生物が関与していることが知られている。このようなインジゴの還元に関する微生物として、藍染色醪からＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓを分離したことが報告されている（例えば、非特許文献１〜４）。しかしながら、本発明者らが藍染めの染色液中から数種の微生物を分離し、分離した微生物からＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓを検出したが、インジゴ還元活性を調べたところ、このＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓにはインジゴ還元活性が認められなかった。
【０００５】
このインジゴ還元に関与する微生物を分離し、菌学的性質や還元機構、反応最適条件を解明することができれば、上述した藍染めの染色工程に応用することで、従来職人の技と経験に頼っていた作業を効率良く容易に行うことが可能になると思われる。しかしながら、藍染め染色液中でインジゴ還元に関与する好アルカリ性微生物については、まだ正確に同定されておらず、その還元機構や還元酵素についても明らかにされていない。
【非特許文献１】発酵工学雑誌、３８巻、６号、２９３−２９９頁
【非特許文献２】発酵工学雑誌、３８巻、７号、３２９−３３７頁
【非特許文献３】発酵工学雑誌、４０巻、２号、７７−８４頁
【非特許文献４】発酵工学雑誌、４０巻、３号、１０３−１０７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、従来藍染め染色液の作製は、熟練した職人が多大な労力と時間を費やして行っていた。しかも、このように手間暇かけて染色液を作製しても、１日当たりに染色できる繊維量は制限されており非常に生産性が悪く、染色工程の効率化が望まれていた。
【０００７】
従って、本発明の目的は、藍染め染色液作製工程における作製時間の短縮化及び工程の簡略化を図り、生産性の向上を実現させるため、インジゴをロイコインジゴに還元する酵素、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記の問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、好アルカリ微生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉに属する微生物より得た酵素が、高いインジゴ還元活性を有すること、及び前記微生物を培養することにより前記酵素を生産できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）に記載のものを提供する。
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉが産生のインジゴ還元酵素。
（２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）である上記（１）に記載のインジゴ還元酵素。
（３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）。
（４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）が保有のインジゴ還元酵素遺伝子。
（５）上記（４）に記載のインジゴ還元酵素遺伝子を発現させることにより製造されるインジゴ還元酵素。
（６）Ｎ末端アミノ酸配列が、配列番号１に記載の、Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｘ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕである、上記（１）、（２）又は（５）のいずれかに記載のインジゴ還元酵素。
（７）天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料を用いる染色工程において上記（１）、（２）又は（６）に記載のインジゴ還元酵素を用いることを特徴とする染色方法。
（８）上記（１）、（２）、（５）又は（６）に記載のインジゴ還元酵素と天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料とからなる藍染め染色用キット。
（９）上記（１）、（２）、（５）又は（６）に記載のインジゴ還元酵素を有効成分として染毛効果を奏する量、含有することを特徴とする染毛剤。
（１０）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉの培養物から調製することを特徴とするインジゴ還元酵素の製造方法。
（１１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）である上記（１０）に記載のインジゴ還元酵素の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、インジゴを効率よくロイコインジゴに還元するインジゴ還元酵素が提供される。本発明のインジゴ還元酵素は藍染め染色工程の効率化に有用である。上述したように、従来染色液を作製するには、スクモと消石灰、清酒、水あめ等を混ぜて、常温高アルカリ条件下で発酵させていた為、染色できるまでに１〜４週間程を要したが、本発明のインジゴ還元酵素を染色工程に使用すれば、このような「発酵建て」を行わなくても、スクモと本発明のインジゴ還元酵素を用いて高い還元力を有する染色液を容易に作製することができる。更に、従来の方法で作成した染色液は、微生物に負担がかからないように、一日に染色できる繊維量が制限されていたが、本発明のインジゴ還元酵素を用いて作製された染色液では、微生物の負担を考慮する必要なく染色できる繊維量が制限されないという優れた利点を有する。しかも染色液中に含有されるインジゴを１００％使用することが可能であり非常に経済的である。また、染色液の面倒な品質管理も不要となるため、熟練した職人でなくても染色液の作製から藍染めまでの作業を行うことが可能となる。このように本発明のインジゴ還元酵素を染色工程に使用すれば、化学薬品に頼ることなく容易にインジゴを還元することが可能となり、藍染めの染色工程を効率化することができる。
【００１１】
更に本発明によれば、インジゴ還元酵素を含有する藍染め染色用キットを提供することができる。特に、染料として天然藍染料を含有させた藍染め染色用キットを使用することで、化学薬品を使用しない本物の藍染めを家庭でも気軽に楽しむことができる。
【００１２】
また本発明によれば、インジゴ還元酵素をＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉの培養物から容易に調製することができる。また、本発明のインジゴ還元酵素遺伝子をクローニングし、この遺伝子を大腸菌等に組み換えてインジゴ還元酵素を大量に生産する微生物を作製することで、本発明のインジゴ還元酵素を安価に大量生産することが可能となる。
【００１３】
更に、本発明のインジゴ還元酵素は、染毛剤に応用することが可能である。近年、藍、西洋茜、鬱金等の草木染めに使用される天然染料を用いた染毛剤が市販されており、合成染料では表せなかった色を実現でき、天然素材が髪に弾力やツヤ感を与えてくれるといった理由から人気を呼んでいる。しかしながら、現在市販されている藍を用いた染毛剤は、藍を還元するため化学薬品である還元剤とアルカリ剤とが含有されており、アルカリ剤による頭皮や毛髪へのダメージが懸念される。また化学薬品に過敏な人は使用できないという問題もあった。しかしながら、本発明のインジゴ還元酵素を天然藍染料を含む染毛剤に用いることで、従来必須成分であった還元剤とアルカリ剤とが不要になるため、頭皮や毛髪へダメージを与えることなく、化学薬品に過敏な人でも使用できるという優れた効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、藍染め染色液中からＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉを分離し、この微生物からインジゴ還元に関与する酵素が産生されることを見出した。本発明のインジゴ還元酵素は、以下の理化学的性質を有するものである。
【００１５】
（ａ）作用：本発明のインジゴ還元酵素は、下記反応を触媒する。
インジゴ ＋ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）→ ロイコインジゴ ＋ 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）
（ｂ）至適ｐＨ：７．５付近
（ｃ）至適温度：３０℃付近
（ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．０で安定
（ｅ）熱安定性：３５℃以下で安定
（ｆ）分子量：ゲルろ過により７４ｋＤａ
（ｇ）電子受容体特異性：２，６−ジクロロフェノールインドフェノールに対して特異性を有する。
（ｈ）Ｎ末端アミノ酸配列 ：Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｘ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ（Ｘは未同定のアミノ酸）（配列番号１）
【００１６】
上述したように本発明のインジゴ還元酵素は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤＨ」と略記する。）を補酵素として、インジゴを還元し、ロイコインジゴを生成する能力を有する。下記化学式で示されるこの反応は、酸素非存在下で、ＮＡＤＨ依存的に進行する。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
本発明のインジゴ還元酵素は、インジゴ還元酵素産生能を有する微生物の培養物から取得することができる。このような微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉが好適であり、更に好ましくは藍染め染色液中から分離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）である。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）の菌学的性質を以下に示す。尚、上記菌学的性質の同定はユニオンバイテック社（大阪市東淀川区豊新１−１７−１０）によって行われた。
【００１９】
１．形態
（１）菌の形態：桿菌
（２）グラム染色：＋
（３）芽胞の形：卵円形
（４）芽胞の位置：中央
（５）菌体の膨順：−
２．生理学的性質
（１）カタラーゼ：＋
（２）オキシダーゼ：＋
（３）嫌気性寒天での生育：−
（４）ＶＰテスト：−
（５）グルコースからの酸産生：＋
（６）アラビノースからの酸生成：＋
（７）キシロースからの酸生成：＋
（８）マンニットからの酸生成：＋
（９）カゼイン加水分解：＋
（１０）ゼラチン加水分解：＋
（１１）デンプン加水分解：＋
（１２）硝酸銀の還元：＋
（１３）ウレアーゼ：− 
（１４）２％ＮａＣｌでの生育：＋
（１５）５％ＮａＣｌでの生育：＋
（１６）７％ＮａＣｌでの生育：＋
（１７）１０％ＮａＣｌでの生育：−
（１８）４０℃での生育：＋
（１９）４５℃での生育：−
（２０）５０℃での生育：−
（２１）ＳＣＤ培地でのｐＨ９，１２の好気培養で発育良好
（２２）ＧＡＭ培地でｐＨ１２の嫌気培養で弱い発育
【００２０】
さらに、本菌株について１６Ｓ ｒＲＮＡの１０００ｂｐの塩基配列を決定し、遺伝子工学的同定を行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の取得には、以下の表１に示すプライマーを用いた。得られた１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列について、遺伝子のデータベースに公開登録されている微生物の遺伝子配列とのホモロジー検索を行った結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉに９９％の相同性を認めた。この結果から、本発明者らが藍染め染色液から分離した本菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉに属する細菌であると同定し、本菌株をＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株と命名した。本菌株は、平成１６年７月２３日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託され、その受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−１５である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
本発明のインジゴ還元酵素は、例えば、上記菌株を栄養培地に培養し、該培養物から調製することにより製造することができる。上記菌株の培養に使用する培地としては、使用菌株が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源を適量含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用できる。具体的には、上記炭素源としてはグルコース、ラクトース、マルトース等が、窒素源としてはポリペプトンやソイペプトン等の窒素含有天然物が、無機塩類としてはナトリウム塩等が使用できる。具体的には、ＳＣＤ培地（１５％トリペプトン、５％ソイペプトン、５％ＮａＣｌ）が好ましく使用できる。培養は、振盪、好気的条件下で行うのが好ましく、培養温度は２５〜４０℃、好ましくは３７℃、ｐＨは１０〜１２、好ましくはｐＨ１２に調整するのがよい。菌株の培養期間は、通常２〜３日であり、好ましくは４８時間である。このようにして培養することで、インジゴ還元酵素が微生物の菌体内に生成蓄積される。
【００２３】
培養により菌体内に蓄積されたインジゴ還元酵素は、例えば次のようにして分離精製することができる。本発明のインジゴ還元酵素を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、公知の方法で菌体を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結溶解などによって菌体を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗酵素抽出液を得る方法などが適宜用いられる。このようにして得られた抽出液中に含まれる本発明のインジゴ還元酵素の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法などが用いられる。
【００２４】
本発明のインジゴ還元酵素は、前述したようにインジゴ還元酵素の産生能を有する微生物の培養物から取得することができるが、公知の遺伝子工学によっても量産することができる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからインジゴ還元酵素の遺伝子をクローニングし、この遺伝子の発現ベクターを構築の後、これを大腸菌や枯草菌等の宿主に移入し作成した形質転換体を培養することにより本発明に係るインジゴ還元酵素を大量生産することができる。その詳細については、参考例で後述される。
【００２５】
また本発明のインジゴ還元酵素は、天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料を用いる染色工程に利用することで、染色工程の効率化を実現することができる。具体的には、本発明のインジゴ還元酵素、天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料、必要に応じて水を添加することで容易に染色液を作製することができる。前記天然藍染料としては、すくも、沈殿藍、藍の生葉、藍の葉を凍結乾燥させたもの、藍の生葉から色素成分を抽出した抽出液等が上げられる。
【００２６】
更に、本発明のインジゴ還元酵素を藍染め染色用キットとして提供することができる。本発明の藍染め染色用キットは、少なくとも本発明のインジゴ還元酵素と天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料を含んでいる。前記天然藍染料としては、すくも、沈殿藍、藍の生葉、藍の葉を凍結乾燥させたもの、藍の生葉から色素成分を抽出した抽出液等が上げられる。このような藍染め染色用キットを使用すれば、キットに含まれるインジゴ還元酵素と前記染料、更に必要に応じて水を添加することで簡単に藍染め染色液を作製することができるため、いつでも誰でも手軽に藍染めを行うことができる。
【００２７】
本発明のインジゴ還元酵素は、染毛剤に利用することもできる。前記染毛剤は、インジゴ還元酵素を有効成分として染毛効果を奏する量、含有するものである。更に、有効成分として、天然藍染料及び／又は合成インジゴ染料を含有する。好ましくは天然藍染料を含有する。前記天然藍染料としては、すくも、沈殿藍、藍の生葉、藍の葉を凍結乾燥させたもの、藍の生葉から色素成分を抽出した抽出液等が上げられる。更に、他の染料を含有させて色調を調整することもできる。他の染料としては、ヘナ、茜、えんじゅ、うこん、コチニール、すおう、ロッグウッド等の天然草木染料が好ましく用いられる。これらの染料は、２種類以上を混合して使用することもできる。
【実施例１】
【００２８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
（１）培養
分離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）をＳＣＤ培地（１５％ トリペプトン、５％ ソイペプトン、５％ ＮａＣｌ）２００ｍｌに植菌し、３７℃で二昼夜振盪培養した。菌体を２Ｌの培地に植え継ぎ、さらに４８時間振盪培養した。培養後、遠心分離により培地成分と菌体に分離し、８．４ｇの湿菌体を得た。
【００２９】
（２）菌体破砕
上記で得られた湿菌体を１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５ｍｌに懸濁した後、超音波により破砕した（処理時間：５分×３回）。菌体破砕後、遠心分離により固形物を沈殿させ、得られた上清を粗酵素抽出液として精製に用いた。
【００３０】
（３）酵素の粗精製
上記方法により得られた粗酵素抽出液を１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムにかけ、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌによる直線濃度勾配で溶出し、酵素の活性画分を集めた。こうして得られた粗酵素液を用いて本酵素の性質を以下のごとく調べた。
【００３１】
（４）酵素の理化学的性質
［活性測定試験］
インジゴ還元酵素の活性の測定は、インジゴカルミンを基質として３５℃で反応を行い、インジゴカルミンの６１０ｎｍでの吸光度変化を測定する。反応液は最終組成が、２００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ  インジゴカルミンとなるように調製し、粗酵素液とイオン交換水を加えて総量１ｍｌとする。具体的には、インジゴカルミンとＮＡＤＨ以外の反応液を試験管に調製し、パラフィルムで試験管口を塞いで、窒素ガスを３分間吹き込む。その後、素早く試験管口をパラフィルムで塞ぎ、３５℃の恒温槽に５分間浸けた後、インジゴカルミンとＮＡＤＨで反応を開始させ、減少する６１０ｎｍの吸光度を測定する。ここでインジゴカルミンとＮＡＤＨは、あらかじめ窒素ガスを５分間吹き込み、反応を開始させる時はマイクロシリンジを用いて添加する。
【００３２】
［至適ｐＨおよびｐＨ安定性］
本発明の酵素の至適ｐＨを求めるため、上述した活性測定試験において反応液中の緩衝液のｐＨを３．５から９．５まで変化させ（ｐＨ３．５−５．５：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５−７．０：ビストリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０−８．０：ヘペス緩衝液、ｐＨ８．０−９．０：トリス塩酸緩衝液、ｐＨ９−９．５：グリシンナトリウム緩衝液）、それぞれのｐＨにおける酵素活性を測定した。結果を図１に示す。その結果、本酵素の至適ｐＨは７．５付近であることが示された。次に本酵素のｐＨ安定性を調べるために、本酵素を１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ３．５−９．５）存在下、４０℃で１０分間保温し、その後ｐＨ７．０で残存活性を同様の方法で測定した。結果を図２に示す。その結果、本酵素はｐＨ６．５〜８．０の間で安定であることが示された。
【００３３】
［至適温度および熱安定性］
本酵素の至適温度を求めるため、上述した活性測定試験において反応時の反応温度を２０℃から５５℃まで変化させ、その時の反応性を調べた。結果を図３に示す。その結果、本酵素は反応温度の上昇とともに活性が増大し、４０℃以上で顕著な活性の低下が認められた。次に、本酵素の熱安定性を調べるために、本酵素を２０℃から５５℃までの間の温度でそれぞれ１０分間保温し、その後の残存活性を３５℃で測定した。結果を図４に示す。その結果、本酵素は３５℃まで安定であることが示された。
【００３４】
［見かけのＫｍ値］
本酵素のＮＡＤＨ及びインジゴカルミンに対する見かけのＫｍ値を、次のようにして求めた。上述した活性測定試験において、ＮＡＤＨの最終濃度を０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．１ｍＭとして活性測定を行ったところ、ＮＡＤＨに対する見かけのＫｍ値は０．１８ｍＭとなった。また、上述した活性測定試験において、インジゴカルミンの最終濃度を０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭとして活性測定を行ったところ、インジゴカルミンに対する見かけのＫｍ値は０．０３ｍＭとなった。
【００３５】
［電子受容体特異性］
上述した活性測定試験のインジゴカルミンの代わりに、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールを最終濃度が０．１ｍＭになるように加え、６０５ｎｍでの吸光度の経時的な減少を測定した。同様にして、本酵素に種々の電子受容体を共存させた場合の各電子受容体での活性を測定し、相対活性として表２に示した。その結果、表２に示すように２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの活性が最も高く、本酵素は２，６−ジクロロフェノールインドフェノールに対して電子受容体特性を有することがわかった。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
［分子量の測定］
ゲルろ過クロマトグラフィーにより本酵素の分子量を求めた。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を担体に用いた。また標準タンパクとしてフェリチン（分子量：４４ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５．８ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、キモトリプシン（２５ｋＤａ）、リボヌクレアーゼ（１３．７ｋＤａ）を含むタンパク質分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。標準タンパクから検量線を作成し本酵素の分子量を求めたところ、７４ｋＤａであることが示された。
【００３８】
［Ｎ末端アミノ酸配列の決定］
前記（３）の粗酵素液をＳＤＳ処理した後、ＳＤＳポリアクリルゲル電気泳動を行った。その間に、ろ紙をトランスファー緩衝液（１０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ＮａＯＨでｐＨ１１に調整）に浸し、ＰＶＤＦ膜もメタノールで６０秒間洗浄後、トランスファー緩衝液に浸しておいた。電気泳動終了後、重ねたゲルとＰＶＤＦ膜をろ紙で挟み、転写装置にセットして２０Ｖで１時間半通電させた。転写後、ＰＶＤＦ膜を超純水で５分間、２回洗浄した後、洗浄緩衝液（１０ｍＭ  ホウ酸、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ８に調整）で５分間、２回洗浄し、更に超純水で５分間、２回洗浄を行った。続いて、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ染色液で５分間染色した後、脱色液でバンドが明確になるまで脱色を行った。このＰＶＤＦ膜を自然乾燥させた後、分子量７４ｋＤａの目的バンド部分を切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列の決定に供した。Ｎ末端アミノ酸配列の分析はプロテインシークエンサー（株式会社島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）を用いて行った。その結果、得られたＮ末端アミノ酸配列は、Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｘ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ（Ｘは未同定のアミノ酸）であった。更に、前記Ｎ末端アミノ酸配列をコードするコドンとその縮重に基づき、次の合成ヌクレオチド、ＡＴＧＴＡＹＧＡＲＹＴＩＣＣＮＣＡＲＹＴＩＣＣ（ＹはＴ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＩはＩｎｏｓｉｎｅ、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ）をプローブとして作製した。尚、配列番号１は、上記Ｎ末端アミノ酸配列を示し、配列番号２は、上記合成ヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００３９】
（参考例）
＜インジゴ還元酵素遺伝子のクローニングとその発現による該酵素の量産＞
これには公知の方法を用いることができる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ  ＢＣ−００１株（製評機構  受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１５）からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡを抽出・精製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを作成の後、そのライブリーからインジゴ還元酵素遺伝子を選別あるいはスクリーニングする。このスクリーニングは、インジゴ還元酵素のＮ末端アミノ酸配列、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列のコドンに基づく合成オリゴヌクレオチド（配列番号２）や、インジゴ還元酵素に対する抗体等をプローブあるいはマーカーとして用いる、サザンハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等により行うことができる。これにより得られたクローンが長いＤＮＡ断片の場合には、更に、サブクローニングを行うことにより、より短いＤＮＡ断片としてインジゴ還元酵素遺伝子を特定し、クローンとして得ることができる。得られたインジゴ還元酵素遺伝子クローン（ＤＮＡ断片）につき、塩基配列を決定すると共に、その塩基配列に基づきコーディング領域（開始コドンから終止コドンまでの領域）を解読する。次いで、解読したインジゴ還元酵素遺伝子コーディング領域を含むＤＮＡ断片を大腸菌や枯草菌等のベクターに挿入連係することにより発現ベクターを構築の後、このベクターを宿主である大腸菌や枯草菌等に移入することにより形質転換体を得る。そして、この形質転換体を培養することによりインジゴ還元酵素を量産することができる。上記の詳しいプロトコルについては、例えば、常用のテキストMolecular Cloning A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., J. Sambrookら著, CSHL Press 2001年発行（http//www.MolecularCloning.com）に記載されている。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のインジゴ還元酵素を藍染めの染色工程に使用すれば、インジゴを容易に還元することが可能となり、藍染めの染色工程を効率化することができる。また本発明のインジゴ還元酵素を藍染め染色用キットとして提供することで、家庭でも手軽に藍染めを楽しむことができる。更に、本発明のインジゴ還元酵素を染毛剤に用いることで、従来必須成分であった還元剤とアルカリ剤とが不要になるため、頭皮や毛髪へダメージを与えず、化学薬品に過敏な人でも使用できる優れた染毛剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のインジゴ還元酵素の至適ｐＨを示すグラフ図である。
【図２】本発明のインジゴ還元酵素のｐＨ安定性を示すグラフ図である。
【図３】本発明のインジゴ還元酵素の至適温度を示すグラフ図である。
【図４】本発明のインジゴ還元酵素の熱安定性を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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