(57)【要約】【課題】微生物に過大な温度負荷をかけることなく微生物膜の活性を適正な状態に維持させて、有害物質に対する感度を維持できる環境水中に存在する有害物質を検出する手法を提供する。また、微生物膜の活性低下をできるだけ少なくし、その活性低下が生じたときには、その活性の回復に要する時間をできるだけ少なくした上記有害物質の円滑な検出方法を提供する。【解決手段】微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いて環境水中の有害物質を検出するさいに、前記バイオセンサの設定温度を、前記微生物の生育至適温度以下とし、しかも前記バイオセンサの酸素消費率を所定範囲内に維持する。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いて環境水中の有害物質を検出する方法であって、前記バイオセンサの設定温度を、前記微生物の生育至適温度以下に制御し、前記バイオセンサの酸素消費率を所定範囲内に維持する工程Ａを含むことを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項２】
微生物の生育至適温度以下の所定温度を３〜３０℃とすることを特徴とする請求項１記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項３】
バイオセンサの酸素消費率の減少時閾値と増加時閾値との２つの閾値を設定し、前記酸素消費率が前記減少時閾値と増加時閾値との二つの閾値範囲内となるようにバイオセンサの酸素消費率を維持することを特徴とする請求項１記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項４】
有害物質検出時では、工程Ａから、バイオセンサの設定温度を、前記有害物質検出時のバイオセンサの温度に制御する工程Ｂに切り替わることを特徴とする請求項１記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項５】
有害物質検出時を、所定時間内での呼吸阻害率の上昇幅許容値を超えたときとすることを特徴とする請求項４記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項６】
有害物質検出時では、さらに、異常フラグをセットする工程Ｃ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えるか否かを判断する工程Ｄ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えていると判断されたときには警報を出力する工程Ｅ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えていないと判断されたときには異常フラグを解除し、工程Ｂから工程Ａに切り替える工程Ｆを含むことを特徴とする請求項１記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水を対象として、水中の化学成分をモニタリングすること目的としたバイオセンサ応用水質計測器を用いた環境水中の有害物質の検出方法に関する。とくにバイオセンサの酸素消費率を所定範囲に維持し、しかも微生物の生育至適温度以下の低温側の温度で制御しながら前記酸素消費率を所定範囲に維持することを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法に関する。さらに、有害物質の検出感度が向上した環境水中の有害物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは環境水（以下、試料水あるいは検水ということがある）中の測定対象化学物質を認識する分子識別素子として、酵素や抗体などの生体機能性材料や微生物、細胞など生体そのものを利用し、これらの生物材料を多孔性高分子膜に化学的に包括または共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサと組合せて前記生物材料の分子識別信号を電気信号に変換して試料水中の化学物質の測定を行うセンサである。
バイオセンサは試料水を上記生体材料の固定化膜に接触させ、これによって生ずる生化学反応により生成または消費される物質の濃度変化を検出器で電流や電圧などの電気的な出力（以下、センサ出力と記載する）の変化に変換して測定する。
バイオセンサを使用した測定にあたっては、固定化した生体材料が安定に機能するように温度とpH条件を一定の範囲内にすることが必要である。そのため、バイオセンサ応用計測器では、温度を一定の範囲内に保つために試料水を一定温度に加温する熱交換器とセンサ温度を一定にする恒温槽が備えられ、また、pH条件を一定とするために緩衝溶液が用いられている。
すでに、環境水中の有害物質検出用バイオセンサが開発され（たとえば特許文献１を参照）、実用化されている。このバイオセンサは、生体材料と検出器とから構成される。前記生体材料としては有害物質に極めて弱い微生物を用い、この微生物を生きたまま固定化して、たとえば高分子多孔膜で封じ込めた微生物膜が多用される。前記検出器としては溶存酸素電極が多用される。この微生物膜と溶存酸素電極が組合せられた呼吸活性検知型バイオセンサが好適である（図５）。
【０００３】
これに微生物用の基質（栄養源となるもの）および微量栄養成分を一定濃度含む緩衝溶液と試料水を所定の比率となるように混合して連続的に流すことにより、有害物質混入の連続監視を行う（図４）。ここでバイオセンサの生体材料としては有害物質に極めて弱い微生物である硝化細菌を用いる場合が多い。
通常、上記のような硝化細菌を使用するバイオセンサ応用計測器では、微生物膜内の硝化細菌の数や活性をできるだけ長い期間安定に維持するために、硝化細菌の生育至適温度（３０±１℃）、生育至適pH（７〜９）等の至適条件を維持し、生育に必要な微量栄養成分を含む緩衝溶液を用いて測定を行っている。しかし、このような条件下でも試料水の水質や微生物膜内での硝化細菌の増殖サイクルに伴い、微生物膜の活性（硝化細菌の数や活性）は変動する。
例えば、地下水のように試料水が貧栄養な場合には、微生物膜の活性が徐々に低下し、バイオセンサの酸素消費率が30%程度にまで低下すると、有害物質によるセンサ応答と溶存酸素電極のノイズ等の外乱との判別が困難になることから、1ヶ月に1回程度の微生物膜交換が必要となる。
一方、河川の下流域で都市の下排水が混入しているような地域のように試料水が富栄養な場合には、微生物膜の活性が過剰に高い状態となり、センサの酸素消費率が見かけ上100%以上となってしまい、センサにおける有害物質に対する感度が低下するという問題点がある。例えば、酸素消費率を10%低下させるような、有害物質を含む試料水の場合、微生物膜活性が高く、見かけの酸素消費率が110%であったとすると、酸素消費率は110→100%となり、実際のセンサ出力には変動が見られず検出不可能となる。
【０００４】
このような感度低下現象に対して、特許文献２では、微生物膜の活性が過剰に高い場合に、バイオセンサと接触させる試料水を高温（35〜40℃）とすることにより、バイオセンサの微生物の生育能を抑制し、微生物膜の活性を適正な状態に低下させて（酸素消費率100％以下）、有害物質に対する感度を維持する手法が提案されている。
上記手法により有害物質に対する検出感度を維持することが可能となったものの、微生物膜に過大な温度負荷をかけると微生物膜の活性が大きく低下してしまい、微生物が失活して測定不能状態となったり、あるいは、活性が回復するのに長時間を要してしまったりすることとなる。
したがって、上記手法では、センサ出力の変動をモニタリングしながら、あまりに過大な温度負荷をかけないように段階的な温度負荷制御を行う必要がある。そのため、この制御手法では、微生物、とくに硝化細菌の生育能を抑制し、微生物膜の活性を適正な状態に低下させるのに、数日間を要する場合があることから、その期間は有害物質に対する感度が低下した状態のままであるという問題点があった。
【０００５】
一方、微生物膜活性は菌数と菌体活性（酵素活性）に依存する。そして、従来方式の温度操作範囲では、菌数減少による膜活性の低下（長時間応答）と、酵素活性上昇による膜活性の上昇（短時間応答）が拮抗していることが判明した。
ところで、バイオセンサとしては次の相反する２つの要求を満たす必要がある。
（１）有害物質感度を維持するためには、膜活性が低い方が良い。
（２）安定したセンサ出力を得るためには、膜活性が高い方が良い。
しかしながら、従来の温度操作範囲では上述のように膜活性が拮抗状態にあるため、制御性について以下のような問題があった。
過大な温度負荷（急激な温度上昇）では、（菌数の急激な減少に伴い）活性が著しく低下し、活性回復に時間を要し、過小な温度負荷（緩慢な温度上昇）では、（酵素活性上昇の影響を受けて）活性の低下が緩やかなため、感度回復に時間を要する。
【０００６】
【特許文献１】特公平７−８５０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１６５８９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の課題は上記問題点を解決することにある。すなわち、微生物に過大な温度負荷をかけることなく微生物膜の活性を適正な状態に維持させて、環境水（以下、試料水あるいは検水ということがある）中に存在する有害物質に対する検出感度を維持する手法を提供することにある。また、微生物膜の活性低下をできるだけ少なくし、その活性低下が生じたときには、その活性の回復に要する時間をできるだけ少なくし、有害物質の円滑な検出方法を提供することにある。さらに本発明では有害物質の検出感度が向上した検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく研究を重ねたところ、上記酸素消費率と液温との関係は、３〜３０℃の範囲ではほぼ相関関係および可逆性が認められるという知見を得た（図１）。
また、この関係の程度（傾き）は微生物の活性に依存していることも判明した。さらに、バイオセンサの有害物質に対する感度も、微生物の活性に依存することから、温度に依存することになる、との知見も得た。
従って、本発明は、バイオセンサの測定温度条件を従来方法で多用される範囲よりも低い温度条件とすることにより、前記課題を解決する。すなわち、バイオセンサで用いる微生物の生育至適温度以下に制御し、しかも微生物による酸素消費率が低過ぎる場合はバイオセンサの設定温度を上げ、該酸素消費率が高すぎる場合には該設定温度を下げることによって、微生物の活性を一定状態に維持し、有害物質の検出感度を安定させながら、有害化学物質の連続モニタリングが可能となる。
【０００９】
すなわち、本発明の請求項１にかかる発明は、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いて環境水中の有害物質を検出する方法であって、前記バイオセンサの設定温度を、前記微生物の生育至適温度以下となるような低温とし、しかも前記バイオセンサの酸素消費率を所定範囲内に維持するよう温度制御することを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法に関する。
その微生物の生育至適温度以下の所定温度を３〜３０℃の範囲内から選ばれる温度とすることを特徴とする請求項１記載の環境水中の有害物質の検出方法が請求項２記載の発明である。
請求項３記載の発明は、バイオセンサの酸素消費率の減少時閾値と増加時閾値との２つの閾値を設定し、前記酸素消費率が前記減少時閾値と増加時閾値との二つの閾値範囲内となるようにバイオセンサの酸素消費率を維持することを特徴とする。
【００１０】
請求項４の発明は、請求項１の発明において、有害物質検出時では、工程Ａから、別な工程である、バイオセンサの設定温度を、前記有害物質検出時のバイオセンサの温度に制御する工程Ｂに切り替わることを特徴とする。
請求項５の発明は、請求項１の発明において、有害物質検出時を、あらかじめ規定されている所定時間内での呼吸阻害率の上昇許容値を超えたときとすることを特徴とする。
請求項６の発明は、有害物質検出時では、さらに、異常フラグをセットする工程Ｃ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えるか否かを判断する工程Ｄ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えていると判断されたときには警報を出力する工程Ｅ、異常フラグのセット中に呼吸阻害率が閾値を越えていないと判断されたときには異常フラグを解除し、工程Ｂから工程Ａに切り替える工程Ｆを含むことを特徴とする。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するバイオセンサは当技術分野で一般的に使用されているものであればとくに限定されないのであり、バイオセンサを構成する要素である、微生物膜、溶存酸素センサ、電極材料、電解液などは一般的なものを使用できる。
バイオセンサの一例として、たとえば、図５に示されるセンサが使用できる。
すなわち、冷蔵保存した微生物膜１をフローセル４内に入れ、その上に溶存酸素電極２を取り付けて微生物膜１と密着させ、有害物質検出用バイオセンサを構成する。センサ出力値はリード線から情報記録装置(図示されていない)などの制御装置(図示されていない)に送られる。
たとえば、図５に示すバイオセンサを有害物質の検出装置に収め、有害物質の検出を行う（図４）。通常では、検出装置内のフローセルの試料流路に、ゼロ点校正のため緩衝溶液と純水とを流し、バイオセンサの安定化したセンサ出力値を記憶する。次に、アンモニア性窒素を含む緩衝溶液と純水とを流し、センサ出力安定化後に検水の測定を開始する。
前記検出装置は１日１回程度、前記のようにバイオセンサの自動校正を行いながら連続的に検水のモニタリングを行う。バイオセンサに使用できる微生物はこの技術分野で使用できる微生物であればとくに限定されない。たとえば、水中のシアン系化合物などの有害物質の測定にはニトロソモナス属またはニトロバクタ−属に属する硝化菌類を使用することができる。本発明では、バイオセンサに用いる微生物として硝化菌を用いたバイオセンサがとくに好ましい。そのバイオセンサは、ｐＨ８〜９で安定に機能するため、ｐＨ８〜９付近に緩衝能をもつホウ酸緩衝溶液が用いられている。
【００１２】
本発明では、有害物質検出装置もこの技術分野で使用されている一般的な検出装置を使用することができる。
そのバイオセンサを備えた有害物質の検出装置を用いて有害物質を検出する環境水としては、上下水道の各処理プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水が挙げられるが、それら例示された環境水に限定されるものではない。
本発明では、環境水に含まれる広範囲の有害物質を検出することが可能であるが、とくに、アセトンなどの有機溶剤やシアン系化合物（以下、シアンということがある）などの有機性有害物質および水銀、カドミウムなどの重金属類を検出することが可能である。
【００１３】
本発明では、バイオセンサを用いて有害物質を検出する検出条件に特徴がある。
すなわち、有害物質を検出する温度を微生物の生育至適温度以下とすることを特徴とする。さらに有害物質を検出する温度を３０℃以下、より好ましくは２５℃以下、さらに２０℃以下とすることが望ましい。なお、３℃以上、さらには５℃以上とすることがより望ましい。このように、温度を一定範囲とすることで、微生物膜の活性と有害物質の検出感度とを兼ね備えることができるという点で有効な結果を得ることができる。
【００１４】
本発明では、バイオセンサの酸素消費率を所定範囲とすることも重要な特徴の一つである。
具体的には酸素消費率を１０％以上、好ましくは６０〜１００％、より好ましくは８５〜１００％とすると、有害物質の検出感度が向上され、長時間の連続測定・監視が可能な有害物質検出法となる。  また、実用的な制御管理を達成するためにはたとえば９０％を一つの目標値とし、制御範囲を８５〜９５％としてもよい。
【００１５】
基質を含む緩衝溶液と試料水を試料流路に流したときのセンサの酸素消費率は（１）式から求めることができる。
酸素消費率（%）＝[（ａ−ｂ）／ａ]×100    （１）
式中、ａは基質を含まない緩衝溶液と純水を流した（硝化細菌が溶存酸素を消費しない）時のセンサ出力値を意味し、ｂは任意の時点でのセンサ出力値を意味する。
【００１６】
本発明では、同じ硝化細菌を用い、ただし、その数が異なる三種の微生物膜を調製した。この三種の微生物膜を備えたバイオセンサを調製し、バイオセンサと接触する試料水の液温と、そのバイオセンサの酸素消費率との関係を調べてみたところ、図１に示されるような結果が得られた。すなわち、上記酸素消費率と液温との関係は、３〜３０℃の範囲ではほぼ相関関係および可逆性が認められ、また、活性が低い微生物膜を備えたバイオセンサの酸素消費率を９０％程度としようとするときには、前記液温をほぼ２４．７℃とすればよく、活性が中間の微生物膜を備えたバイオセンサの酸素消費率を９０％程度としようとするときには、前記液温をほぼ１６．７℃とすればよく、活性が高い微生物膜を備えたバイオセンサの酸素消費率を９０％程度としようとするときには、前記液温をほぼ１３．０℃とすればよいことが判明した。  
【００１７】
なお、本発明では、バイオセンサの酸素消費率を所定範囲とするために、バイオセンサの酸素消費率の減少時閾値と増加時閾値との２つの閾値を設定し、前記酸素消費率が前記減少時閾値と増加時閾値との二つの閾値範囲内となるようにバイオセンサの酸素消費率制御する。これら二つの閾値を設定し、バイオセンサの酸素消費率の閾値の範囲内に収まるように制御することにより円滑にバイオセンサの酸素消費率を所定範囲とすることができる。具体的には、バイオセンサからの出力電圧値を測定して、溶存酸素濃度を知ることにより、前記二つの閾値と比較し、酸素消費率の閾値の範囲内に収まるように維持することができる。本発明では、前記酸素消費率の範囲はいろいろととりうるのであり、検出対象水の種類、検出対象物質の種類などにより、適切に決定されるのであり、一概に規定することができないが、たとえば９０％を一つの目標値として、その値を中心にして設定することが望ましく、たとえば、９５〜１０％、９５〜３０％、９５〜６０％、９３〜８７％などの酸素消費率範囲を設定することがある。
【００１８】
それらの閾値を設定した後、バイオセンサと接触する液温を制御する方法の具体例を以下に説明する。（図２）
試料水を測定している最中に、酸素消費率（ＯＣＲ）（％）が制御下限値を下回ったとき（有害物質検出時を除く）には、そのときの設定温度Ｔ（℃）に制御量ΔＴ（℃）を加算し、以後時間Δｔ（分）が経過する毎にその時の設定温度にΔＴ（℃）を加算して行く。但し、設定温度が制御上限温度に達している場合は、警告を出力するだけで、加算は行わない。
酸素消費率ＯＣＲ（％）が制御上限値を超えたときには、そのときの設定温度Ｔ（℃）から制御量ΔＴ（℃）を減算し、以後時間Δｔ（分）が経過する毎にその時の設定温度からΔＴ（℃）を減算して行く。但し、設定温度が制御下限温度に達している場合は、警告を出力するだけで、減算は行わない。なお、前記ΔＴ（℃）およびΔｔ（分）の数値は制御上限値あるいは制御下限値に応じて、操作しやすい数値となるよう適宜決定される。また、設定温度の減算後、一定時間内は有害物質検出判定を行わない。これは、設定温度減算後のバイオセンサ応答が有害物質流入時のそれと類似しており、誤警報を防止するためである。前記一定時間は、該誤警報を防止できるための必要な時間であり、試料水、バイオセンサの性状などにより異なるので、一概に規定することができない。
本発明では、バイオセンサに使用される微生物膜の活性の程度が高いもの、低いもの、その中間のものなど、いろいろな活性の程度を持つ微生物膜を採用することができる。例えば、３種の微生物の活性について酸素消費率を同一の90％に設定するには、活性高の場合１３℃、活性中の場合１６．７℃、活性低の場合２４．７℃にバイオセンサの設定温度を変更すればよい。
【００１９】
試料水中に硝化細菌の呼吸を阻害するような有害物質が存在すると、試料水中の溶存酸素濃度が上昇してセンサ出力（電圧値）が増加する。このセンサ出力が急激に上昇（酸素消費率は低下することになる）したときを有害物質検出時といい、センサ異常が発生したか、あるいは有害物質が流入したと判断し、異常フラグをセットすると共に、そのときのバイオセンサの設定温度を保持する制御に、それまでの設定温度を一定の温度範囲内で変動する制御から、切り替える。ここで、急激な上昇とは、所定時間内での上昇幅許容値を超えた場合を意味し、バイオセンサ出力の高周波ノイズや微生物膜活性の低周波変動による誤警報防止のため、例えば所定時間は１〜５分程度であり、上昇許容値はバイオセンサ出力０．１〜０．１２ｍＶである。これはバイオセンサの温度特性やバイオセンサ内付着物による校正値の変動により、呼吸阻害率として２〜８％程度に相当する。
また、呼吸阻害率は下式（２）により求めることができる。
呼吸阻害率（%）＝[１−（ｄ／ｃ）]×100        （２）
式中、ｄは異常フラグのセット中の酸素消費率の測定値であり、ｃは異常フラグをセットする前の酸素消費率の測定値である。
異常フラグがセットされている間にさらに酸素消費率が低下し、呼吸阻害率の閾値を越えた場合には、有害物質流入による酸素消費率の低下と判断し、警報を出力する。一方、異常フラグがセットされている間に呼吸阻害率の閾値を越えず、規定時間を経過した場合には、有害物質流入による酸素消費率の低下と判断せず、異常フラグを解除する。ここで、呼吸阻害率の閾値の数値は試料水の性状、有害物質の種類などにより変動するが、例えば１０〜２０％程度である。また、規定時間は試料水の性状、有害物質の種類、警報出力後の緊急対応内容などにより変動するが、例えば１〜６０分程度である。
有害物質の流入が止まり、酸素消費率が上昇し（これは微生物膜の活性が回復したことを意味する）、呼吸阻害率の閾値未満となった時点で、警報および異常フラグを解除し、バイオセンサの設定温度を、有害物質検出時の温度を保持する制御から、一定の温度範囲内で変動する制御に切り替える。
有害物質の流入停止時が明らかな場合には、微生物膜の活性を早期に回復させるために、呼吸阻害率の閾値以上であっても、手動で有害物質検出時の温度を保持する制御から、一定の温度範囲内で変動する制御に切り替え、バイオセンサの設定温度を早期に上昇させることもできる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、バイオセンサに使用している微生物膜内の微生物の数や活性（微生物膜活性）を、酸素消費率を指標として把握しながら、液温による微生物膜活性および有害物質に対する感度の可逆的制御を可能とした。このことにより、高温負荷による制御のように微生物の生育能を阻害することなく、安定したセンサ運転が可能であり、且つどのような試料水に対しても有害物質に対する感度が維持可能となり、感度維持のための微生物膜初期活性の調整が不要であり、より実用性の高いバイオセンサ応用水質計を用いた有害物質の検出法を提供することができる。
【発明の実施の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を図を用いて説明する。
硝化細菌の一種であるNitrosomonas europaea (ATCC25978)を固定した微生物膜を用いるバイオセンサの場合に基づいて説明する。図６に基づいて、具体的に説明すると、バイオセンサを、隔膜３４をもつ溶存酸素電極２、固定化微生物膜１、４０〜１００メッシュ、厚さ０．１〜０．２ｍｍの金属製のネット３６とフローセル４で構成し、溶存酸素電極のＦＥＰ（４フッ化エチレン−６フッ化プロピレンコポリマ）製隔膜３４と固定化微生物膜３５とが平面で密着するフローセルタイプの構造とするバイオセンサを使用する。なお、前記金属製のネットの代わりにナイロン製、あるいはフッ素樹脂製のネットを使用してもよい。
【００２２】
溶存酸素電極２は、円筒形本体に高分子フィルム（ＦＥＰ）からなる酸素透過性隔膜３４(以下、隔膜と記す)が張られ、内部に電解液３３が充填される。内部のガラス管中央先端には白金からなるカソード３１、ガラス管の付け根部分には鉛からなるアノード３２を有するガルバニ式酸素電極の構成となっている。
溶存酸素電極２を用い固定化微生物膜１内の菌の呼吸量すなわち酸素消費量を測定する場合、固定化微生物膜１と溶存酸素電極２の隔膜３４を密着させる必要があるため、溶存酸素電極２の先端の隔膜３４は、所定の量を突出している。 
図４に本発明の検出装置のフロー図を示す。図４に基づいて説明すると、はじめに前記バイオセンサ６を図４に示すように３０℃に設定された恒温槽７に取り付ける。
まず、ゼロ点校正のための緩衝溶液１１と純水９とをそれぞれ電磁弁７ｄ、７ｂおよび送液ポンプ１３ｂ、１３ａを経て、熱交換器１４で所定の温度に調整した後、恒温槽７に流し、バイオセンサ６の内生呼吸状態のセンサ出力値を表示部１９、制御部２０、記録計２１などからなる制御部に送り、記憶させる。
次に、純水９および基質を含む緩衝溶液(図示していない)を流し、バイオセンサの設定温度30℃で冷蔵保存により低下した活性を酸素消費率90〜100%まで早期回復させ、そのときのセンサ出力値を前記制御部に送り、記憶させる。
次に、バイオセンサの酸素消費率の減少時閾値と増加時閾値との２つの閾値を設定する。すなわち、酸素消費率が運転目標値（例えば酸素消費率90％±３％）となるように、バイオセンサの設定温度を調整し、正常状態のセンサ出力値を前記制御部に送り、記憶させる。
次に、純水を試料水に替えて測定を開始する。
【００２３】
バイオセンサと接触する試料水の液温を制御する方法の具体例として、活性が高い状態のバイオセンサを用いて制御した例を、図３に基づいて、以下に説明する。
図３の（１）に基づいて以下説明すると、バイオセンサと接触する試料水の温度を一定の温度範囲内で変動する制御（約１１．４℃に制御）し、微生物の酸素消費率が９０％程度に維持されているときに、試料水に０．３％アセトンを添加する。酸素消費率が急激に低下したので、異常フラグをセットし、試料水の温度を１１．４℃程度に保持する制御に切り替える。異常フラグのセット中にさらなる酸素消費率の低下を知り、警報を出力する。実際の水処理プラントで水処理を行うときには、この段階で水処理操作を中止することになるのであるが、ここではさらに酸素消費率の変動を測定する。試料水の酸素消費率は次第に低下するが、その後酸素消費率は増加に転じていく。酸素消費率が上昇し、呼吸阻害率の閾値未満となった時点で、警報および異常フラグを解除し、バイオセンサの設定温度を、有害物質検出時の温度に保持する制御から、一定の温度範囲内で変動する制御に切り替える。やがて、試料水の酸素消費率はほぼ９０％程度で落ち着く。
次に試料水に０．５％アセトンを添加する。酸素消費率の変動はほぼ０．３％アセトンと同様である。
試料水の酸素消費率がほぼ９０％程度で落ち着いたことを確認した後、０．０５ｍｍｇ/Ｌシアンを試料水に添加し、酸素消費率を測定する。０．５％アセトンを添加したときとほぼ同様の酸素消費率の変動を確認し、酸素消費率が上昇に転じた後の酸素消費率がほぼ６５％程度のときに、手動でバイオセンサの設定温度を、有害物質検出時の温度に保持する制御から、一定の温度範囲内で変動する制御に切り替える。液温が次第に上昇し、酸素消費率も上昇する。
バイオセンサの設定温度を運転開始時の生育至適温度である３０℃から図３のように１２℃と低下させ、酸素消費率を１００％（つまり有害物質の無い３０℃）から９１％（つまり有害物質の無い１２℃）へ低下させておくことにより、図３（１）に示すように０．０５ｍｇ/Ｌシアン系化合物などの有害物質に対する感度、すなわち呼吸阻害率を大幅に向上させることができた。（表１、表２）
上記式（２）において、ｃ値を表１に記載の酸素消費率（測定値）、ｄ値を表２記載の測定値を代入すると、表１の呼吸阻害率が計算できる。
【００２４】
（表１）
2006098327.tif 000003
【００２５】
表中、酸素消費率は有害物質が混入する前（異常フラグをセットする前）の測定値（上記式（２）のｃ値）である。
【００２６】
（表２）
有害物質が混入した時の最も低い酸素消費率の測定値（上記式（２）のｄ値）である。
2006098327.tif 000004
【００２７】
図３の（２）は、有害物質（０．０５ｍｇ/Ｌシアン）を試料水へ混入させたことによる酸素消費率が低下した後に、やがて毒物の混入も無くなり、正常水の測定に戻る系において、バイオセンサの酸素消費率の減少時閾値として８７％、増加時閾値として９３％を設定したときの、酸素消費率の制御の一例である。
バイオセンサの酸素消費率は８０％程度であり、バイオセンサの設定温度を一旦１℃程度上昇させたが、酸素消費率が８５％程度までしか回復しないので、再度バイオセンサの設定温度をさらに１℃程度上昇させた。すると酸素消費率が上がり過ぎ、増加時閾値である９３％を超えたため、バイオセンサの設定温度を５℃程度下降させ、酸素消費率を下げた。酸素消費率が下がり過ぎ、減少時閾値である８７％を下回ったため、バイオセンサの設定温度を上げながら、３℃程度上昇させ、酸素消費率が９０％程度に達する状況、すなわち、バイオセンサの設定温度を上げながら、酸素消費率の目標範囲に復帰している状況を示している。
図２の（３）では、校正時のセンサ出力値変動による酸素消費率の変化が、バイオセンサの設定温度を制御することで目標範囲（酸素消費率が９０％程度）に復帰している状況を示している。
【００２８】
以上の説明から、本発明を次のように記載することもできる。
（１）微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成されるバイオセンサを用いて環境水中の有害物質を検出する方法であって、前記バイオセンサの設定温度を微生物の生育至適温度以下に制御することを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法。
（２）バイオセンサの酸素消費率を微生物の生育至適温度以下の温度で制御することを特徴とする前記（１）記載の環境水中の有害物質の検出方法。
（３）バイオセンサの電気的出力の値によって、バイオセンサの設定温度を、前記微生物の生育至適温度以下の温度で制御することを特徴とする前記（１）記載の環境水中の有害物質の検出方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】酸素消費率の温度依存性を説明する図
【図２】本発明の実施の一形態を説明する図
【図３】本発明の検出方法を適用した結果を説明する図
【図４】バイオセンサ応用水質計を含む有害物質検出装置の構成を示すフロー図
【図５】バイオセンサの構成を示す模式図
【図６】バイオセンサの縦断面図を示す図
【符号の説明】
【００３０】
1      固定化微生物膜
2      溶存酸素電極
4      フローセル
5      試料流路
6      バイオセンサ
7      恒温槽
8      検水
9      純水
10      酸洗浄水
11      緩衝液      
12a〜12f      電磁弁
13a〜13b      送液ポンプ
14      熱交換器
15      エアポンプ
16      圧力センサ
17      ローラークランプ
18      二方切換三方弁
19      表示部
20      制御部
21      記録計
22      測定部
31      カソード
32      アノード
33      電解液
34      隔膜
36      ネット
38a〜38b      リード線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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