(57)【要約】      （修正有）【課題】PZA耐性菌に関連する新規変異を含むpncA遺伝子を提供することを課題とする。さらに、該新規変異を検出する方法、該新規変異を検出しうるプローブ、及びピラジナミド耐性菌検出用キットを提供する。【解決手段】pncA遺伝子のPZA薬剤耐性に関連する変異を新たに見出したことによる。該変異を新たに見出したことよって提供される、該新規変異の検出方法、該新規変異検出用プローブ、PZA耐性菌検出用キットによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子において、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を含む配列を有する核酸。
【請求項２】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列において、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、及びその相補関係の変異からなる群より選択される少なくとも１つ含む配列を有する核酸：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
【請求項３】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子の、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を検出する方法。
【請求項４】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列の、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、及びその相補関係の変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を検出する方法：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
【請求項５】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子の、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を検出しうるプローブ。
【請求項６】
配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列の、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、又はその相補関係の変異の少なくとも１つを検出しうるプローブ：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
【請求項７】
以下に示すＡ）及びＢ）に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなる群より選択される少なくとも１つのプローブを含む請求項５又は６に記載のプローブ：
Ａ）配列表の配列番号２〜１５に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖；
Ｂ）配列表の配列番号２〜１５に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１に記載のプローブを少なくとも１つ含むピラジナミド耐性結核菌の検出用試薬。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１に記載のプローブを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用キット。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか１に記載のプローブを用いて検査することを特徴とする結核菌の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌においてピラジナミド耐性菌に関連する新規変異を含むpncA遺伝子に関する。さらに、pncA遺伝子の該新規変異の検出用プローブ、ピラジナミド耐性菌検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本では年間数千人が、地球規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれている。結核の治療は、化学療法を中心とする内科的療法が基本であり、内科的療法では治療の目的を達成することが不可能な場合に外科療法を考慮する。
内科的療法で使用する結核治療の薬剤としては、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RFP)、ストレプトマイシン(SM)、エタンブトール(EB)等、多くの種類の薬剤が知られているが、薬剤を患者に投与した場合、突然変異により投与した薬剤に対する耐性を有する耐性菌が生じることが問題となっている。1996年より使用が開始されたピラジナミド（以下単に「PZA」ともいう。）については多くの報告はないものの、その耐性菌の出現は危惧されている。
【０００３】
結核患者が保有する結核菌の薬剤耐性について情報を得るため、結核菌の薬剤感受性試験が行われている。薬剤感受性試験は、所定の薬剤を含有させた薬剤感受性試験用培地における菌体の増殖の有無により、該所定の薬剤に対する耐性の有無を検査する方法が一般的である。例えば薬剤感受性試験用培地として、バクテックMGITTM960（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、結核感受性PZA液体培地（極東製薬株式会社製）等が挙げられる。しかし、結核菌は増殖が遅く、結核菌の増殖の有無を確かめて耐性の有無を判断するまでに数週間を要するという問題がある。
【０００４】
薬剤耐性菌は、特定遺伝子が変異することで薬剤耐性の性質を有することが報告されている。特定遺伝子の変異を検出することによる薬剤耐性菌の検査法が開発されている。結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌及びいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌の、結核菌ゲノム上の結核治療用薬剤耐性関連遺伝子の塩基配列をもとに合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットに関し、開示がある（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社製）は、INH、RFP、SM、カナマイシン(KM)、EBの５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子変異を検出しうるキットである。
【０００５】
ピラジナミド（PZA）に対する耐性菌は、ピラジナミダーゼ（pirazinamidase）をコードするpncA遺伝子の変異により耐性となることが報告されている（特許文献２、非特許文献１〜５）。しかしながら、PZA薬剤耐性に関連する遺伝子の変異はpncA 遺伝子の全領域にわたって数多く存在することが知られており、またそのうちのいずれか１つの変異によりPZA薬剤耐性を獲得するといわれている。つまり、PZA薬剤耐性菌を適切に検出するためには、いずれか１つの変異を漏らすことなく検出できなければならない。PZA薬剤耐性に関連するpncA遺伝子変異にはまだ未知のものが存在する可能性があり、PZA薬剤耐性菌検出のために早急にこれらの変異を突き止める必要がある。
【０００６】
【特許文献１】特開2001-103981号公報
【特許文献２】特表2000-512493号公報
【非特許文献１】J. Korean Med Sci., 16, p.537-543 (2001)
【非特許文献２】Epidemiol. Infect., 128, p.337-342 (2002)
【非特許文献３】J. Clin. Microbiol., 40, 2,p.501-507 (2002)
【非特許文献４】Microbiol. Drug, 3, 7, p.223-228 (2001)
【非特許文献５】Nat. Med., 2, 6, p.662-667 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ピラジナミド（以下、「PZA」という場合もある。）耐性菌に関連する新規変異を含むpncA遺伝子を提供することを課題とする。さらに、該新規変異を検出する方法、該新規変異を検出しうるプローブ、及びピラジナミド耐性菌検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはPZA薬剤耐性は菌が保有するピラジナミダーゼ（pirazinamidase；以下、「PZase」という場合もある。）の変異により獲得されることに着目して鋭意研究を重ねた結果、PZaseをコードするpncA遺伝子のPZA薬剤耐性に関連する新規変異を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子において、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を含む配列を有する核酸。
２．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列において、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、及びその相補関係の変異からなる群より選択される少なくとも１つ含む配列を有する核酸：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
３．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子の、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を検出する方法。
４．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列の、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、及びその相補関係の変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を検出する方法：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
５．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子の、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、及び第525位からなる群より選択される少なくとも１つの位置での変異を検出しうるプローブ。
６．  配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列の、以下に示すａ）〜ｉ）の変異、又はその相補関係の変異の少なくとも１つを検出しうるプローブ：
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
７．  以下に示すＡ）及びＢ）に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなる群より選択される少なくとも１つのプローブを含む請求項５又は６に記載のプローブ：
Ａ）配列表の配列番号２〜１５に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖；
Ｂ）配列表の配列番号２〜１５に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。
８．  前項５〜７のいずれか１に記載のプローブを少なくとも１つ含むピラジナミド耐性結核菌の検出用試薬。
９．  前項５〜７のいずれか１に記載のプローブを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用キット。
１０．  前項５〜７のいずれか１に記載のプローブを用いて検査することを特徴とする結核菌の判別方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においてpncA遺伝子の新規変異を確認したことにより、従来では検出もれの可能性があった、pncA遺伝子の変異により生じるPZA薬剤耐性菌を検出することができる。その結果、結核患者が保有する菌をより正確に判別することができ、PZA耐性菌を保有する結核患者に対して、適切な治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（ピラジナミダーゼをコードするpncA遺伝子）
例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のPZA耐性は、PZaseをコードするpncA遺伝子の変異により生じうることは上述の如くである。野生型の結核菌が保有するpncA遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補的な配列である。配列番号１に表された塩基配列の5'末端から数えて81〜83番目の塩基ATGはタンパク質合成の開始コドンに該当し、この81番目の塩基Aを第1位とする。すなわち、配列番号１に表された配列のうち、第1〜3位はタンパク質合成の開始コドンに該当し、第559〜561位は終止コドンに該当し、第-80〜-1位までの塩基はタンパク質合成の上流部分に該当する。
【００１２】
（pncA遺伝子の新規変異）
PZA耐性を誘導するpncA遺伝子の変異は既に公知のものがいくつか存在しており、これらは非特許文献に開示されている。本発明により、公知のもの以外の新規変異を確認することができた。具体的には配列表の配列番号１に表された塩基配列のうち第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、又は第525位の位置で新たに見出された（図１の▼）。各位置で確認することのできた変異を表１に示す。
【表１】
2006180753.tif 000002
これらの変異のうちいずれか１つの変異があれば、PZA耐性結核菌となりうることが新たに判明したので、これらの変異の位置を確認できれば、従来では検出不可能であったPZA耐性菌を検出することができる。
【００１３】
上記変異は次のようにして見出された。
まず、結核患者から喀痰を採取し、雑菌除去し、培養をする。雑菌除去法として、N-アセチル-L-システイン(NALC)・水酸化ナトリウム法が挙げられる。具体的には、NALC-NaOH(4％NaOH(ml)：2.9％クエン酸ナトリウム水溶液(mL)：NALC(g)＝100：100：1)の雑菌処理溶液を喀痰に2倍量加え、5〜20秒間混和した。その後、時々混和しながら15分間室温に放置し、さらにリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH6.8)を加え混和した。遠心後、上清を捨て沈渣をPBSに懸濁させ、得られた結核菌をミドルブルック7H9液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）の結核菌分離培地で培養し、分離された結核菌を最終濃度100mg/LのPZAを含むミドルブルック7H12液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）でPZA感受性試験を行った。具体的には、結核菌にPZAを加えて数日間培養後、硫酸鉄アンモニウムを加えてピラジナミダーゼ活性の有無を測定した。以上のような検査から、PZA耐性があると判別された結核菌からゲノムＤＮＡを、フェノール抽出法で抽出し、シークエンサーで塩基配列を解析した。
【００１４】
上記の方法で、本発明者らは配列番号１に表される核酸において、以下に挙げる変異を新たに発見した。
ａ）第42位の塩基CからGへの変異；
ｂ）第153位の塩基CからGへの変異；
ｃ）第157位の塩基GからAへの変異；
ｄ）第161位の塩基CからTへの変異；
ｅ）第216位の塩基CからGへの変異；
ｆ）第287位の塩基AからCへの変異；
ｇ）第442位の塩基CからAへの変異；
ｈ）第493/494位との間にCの挿入；
ｉ）第525位の塩基GからCへの変異。
【００１５】
（pncA遺伝子の新規変異を含む核酸）
本発明の核酸とは、配列表の配列番号１に表された塩基配列又はその相補配列であるpncA遺伝子において、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、又は第525位のうちの少なくとも１つの位置での変異を含む配列を有する核酸である。核酸とは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または誘導体化された活性なＤＮＡもしくはＲＮＡである。さらに本発明の核酸は、配列表の配列番号１に表された塩基配列のうち、上記表１に示す変異及びこれに相補的な位置及び関係の変異を含む核酸である。
【００１６】
（検出方法）
pncA遺伝子上の上記変異を検出する方法としては、Nollau, et al., Clin. Chem., 43, 1114-1120(1997)、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Landegren, U., et al., Oxford University Press(1996)）、および「ＰＣＲ」第２版（Newton, et al., BIOS Scientific Publishers Limited(1997)）等に記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えばＰＣＲ断片シークエンシング法、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(8), 2766-2770(1989)）、ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield, V. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1), 232-236(1989)）、インベーダー法（Griffin, T. J., et al., Trend Biotech, 18, 77(2000)）、SniPerTM法（Amersham pharmacia biotech）、タックマンPCR法（Livak, K. J., Genel. Anal., 14, 143(1999); Morris, T., et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）、MALDI-TOF/MS法（Griffin, T. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11), 6301-6(1999)）、制限酵素長多型解析法（RFLP：Murray, J. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19), 5951-5955(1983)）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris, K.,et al., J. Med. Genet., 36, 730(1999)）、MasscodeTM法(Qiagen Genomics)等に例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではなく、遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。例えば、ＰＣＲ−配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ : sequence-specific oligonucleotide probes）法を用いることもできる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法とは、変異部位を含む約10〜約30塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法によりで増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。
【００１７】
（プローブ）
本発明のプローブは、上記表１の新規変異の位置での変異、すなわち、配列表の配列番号１に表された塩基配列又はこれに相補的な塩基配列の塩基中、第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、又は第525位のいずれかの塩基の変異のうち少なくとも１つを検出することができるように設計する。各プローブの長さは、検出する時の温度にもよるが、一般的には10〜30、好ましくは12〜26である。このようなプローブは、配列表の配列番号２〜１５に表された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド鎖又はこれらに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド鎖のいずれかからなるプローブであることが好ましい。
【００１８】
（プローブを用いたキット）
本発明のキットとは、本発明のプローブ及び適当な試薬等を含み、ピラジナミド耐性菌を検出するために用いられるものを示す。
【００１９】
具体的なキットとして、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を実施するための検出用試験片を以下に例示する。
検出用試験片は上記プローブを担体表面上に物理的又は化学的に固定して作成することができる。担体は、ビニル系ポリマー又はポリエステルなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成形加工性が容易である有機材料のポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類が好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
【００２０】
プローブは種類ごとに一定間隔で上記坦体にスポッティングする。これらの担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては公知の種々の方法が用いられるが、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を担体表面に被覆することで、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる方法、担体がガラスなどの無機材料の場合に、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄する方法がある。また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られており、本発明にはこの方法により作成された検出用試験片も含まれる。
【００２１】
上記ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法で用いるプライマー対として、全ての変異部位を含むpncA遺伝子を増幅し得るように、全ての変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一又は相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。本発明の好ましいプライマー対の例としては配列番号１６及び１７のオリゴヌクレオチド又はその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
さらに、上記ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検知を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを上記プライマー対に修飾しておくことが好ましい。
また、核酸の増幅は、ＰＣＲ法以外にも、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられ、本発明はこれらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらを準用したキットも含まれる。
【００２３】
（キットを用いた変異検出方法）
１．検体
本発明の検体は、通常結核菌検査に必要な検体であれば良く、例えば喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物及び／又は組織生検物等の体液、並びにこれらから培養して得られた結核菌そのものが挙げられる。
【００２４】
２．検体の前処理方法（ＤＮＡの抽出）
上記検体からのＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が挙げられる。検体を前処理したものを本明細書において試料という。
【００２５】
３．核酸の増幅
ＰＣＲ法で核酸を増幅する場合、例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
また、測定の感度を向上させるために上記ＰＣＲ反応後にさらにＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法などで核酸を増幅してもよい。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法におけるプライマーは、上記ＰＣＲ反応において用いたプライマーよりも内側の配列を選択することができる。
【００２６】
４．遺伝子変異検出方法
結核菌の変異の検出は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出することができる。より簡便には、固定されたプローブの数と、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの数を比較することにより検出することもできる。例えば、配列番号２〜１５に示したプローブを使用する場合、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法におけるハイブリダイズは約６０〜６５℃の温度で行えば、非特異吸着反応が起きにくいため好ましい。検出されたスポットの数が、固定されたプローブの数と同数であれば、結核菌は表１記載の位置での変異を有さないものであり、検出スポット数が固定プローブ数より少なければ結核菌は表１記載の位置での変異を有するためPZA耐性を有すると判断することができる。また、結核菌のPZA耐性を効率的に検出するために、配列番号２〜１５のプローブに加えて既知の遺伝子変異を検出するためのプローブを併せて使用することも可能である。
【００２７】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの数を容易にカウントするためには、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質を修飾したプライマー対を用いて核酸を増幅することが好ましい。上記標識物質を用いた検出方法は、比較的安価で容易に実施できるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が好ましい。具体的には、上記プライマーの3'又は5'末端にビオチンを修飾したプライマー対を用いて、核酸を増幅する。末端にビオチンを有する増幅された核酸は、ＤＮＡハイブリダイゼーション後、ストレプイトアビジンに接触させた後、ＮＢＴ、ＢＣＩＰと反応させることにより発色させることができる。
【００２８】
（プローブ及びプライマーの調製方法）
プローブ及びプライマーの配列は、標準的なプログラム及びプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザー等の標準的な方法を用いて合成することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、本発明の理解を深めるために実施例を示して具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでないことは明らかである。
【００３０】
［実施例１］  ピラジナミド感受性試験
１．試験用溶液の調製
ミドルブック液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）に、最終濃度100mg/Lのピラジナアミド及び蛍光発色基質であるトリス-４,７-ジフェニル-１,１０-フェナントロリン塩化ルテニウム五水和物リウムを溶解して試験用培地を調製した。この試験用培地にあらかじめミドルブック液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）または小川培地で培養しておいた結核菌を含む培養液を0.5mLを入れ、３７℃で培養した。
【００３１】
２．ピラジナミド感受性試験
結核患者７０名の喀痰から精製培養した結核菌を上記試験用溶液に添加し、３７℃で４日間から２１日間培養した。薬剤の添加されていないチューブで発育が観察された時、薬剤の添加されたチューブで発育が認められた場合を耐性とした。発育の確認は発育とともに増加する蛍光発色の有無により行った。その結果、１０検体がピラジナミドに耐性を有することが明らかとなった。
【００３２】
［実施例２］  ピラジナミダーゼ活性測定
１．試験用溶液の調製
0.5mLのグリセロールを含有した蒸留水に、1.9gの寒天加ミドルブルック培地（ベクトン・ディッキンソン社製）、0.01gのピラジナミド及び0.2gのピルビン酸ナトリウムを溶解して試験用溶液を調製した。試験管にこの試験用溶液を5mL入れ、１２１℃で１５分間の加温滅菌後、使用するまで４℃にて保存した。
【００３３】
２．ピラジナミダーゼ活性測定
結核患者７０名の喀痰から精製培養した結核菌を上記試験用溶液に添加し、３７℃で４日間培養した。その後、1％硫酸アンモニウム鉄水溶液を1mL添加し、ピンク色のバンドが生じる場合を陽性、見られない場合を陰性と判定した。その結果、９検体がピラジナミダーゼ活性陰性であることが明らかとなった。
【００３４】
［実施例３］  ピラジナミド耐性結核菌の遺伝子解析
１．pncA遺伝子の抽出
実施例２でピラジナミド耐性結核菌と判定された９検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。
【００３５】
２．pncA遺伝子の増幅
次に、以下に示すプライマーを用いてpncA遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
プライマー１  ggcgtcatgg accctatatc  （配列番号１６）
プライマー２  caacagttca tcccggttc  （配列番号１７）
【００３６】
３．ピラジナミド耐性結核菌の遺伝子解析
増幅された９例のpncA遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、今回報告した新たな変異が９例中５例も発見された。したがって、従来の報告の変異のみではピラジナミドの薬剤耐性の判定は不十分であることが明らかとなった。
【００３７】
新たに発見された変異を表２に示す。
【表２】
2006180753.tif 000003
【００３８】
［実施例４］  検出用試験片の作製
１．プローブの選択 
配列表の配列番号１に表された塩基配列に相補的な配列の第42位、第153位、第157位、第161位、第216位、第287位、第442位、第494位、又は第525位のいずれかの塩基の変異を検出しうるプローブとして、以下に示すプローブ１〜１４（それぞれ、配列表の配列番号２〜１５に対応）を構築した。
【００３９】
プローブ１    ccaccctcgc agaagtcgtt  （配列番号２）
プローブ２    cgagccaccc tcgcagaag  （配列番号３）
プローブ３    gatgtggaag tccttggttg c  （配列番号４）
プローブ４    cgggtcgatg tggaagtc  （配列番号５）
プローブ５    tggtcacccg ggtcgatgt  （配列番号６）
プローブ６    cgctgacgca atgcggtg  （配列番号７）
プローブ７    ccttgtagaa caccgcctcg a  （配列番号８）
プローブ８    tccggtgtag gcacccttgt ag  （配列番号９）
プローブ９    cgtaccgcgt cctcggccgt  （配列番号１０）
プローブ１０  aagccattgc gtaccgcgtc  （配列番号１１）
プローブ１１  tcggccgaca cacccgct  （配列番号１２）
プローブ１２  ggtggtatcg gccgacac  （配列番号１３）
プローブ１３  cgcatctcct ccagcgcggc  （配列番号１４）
プローブ１４  cggtgcgcat ctcctccag  （配列番号１５）
【００４０】
２．プローブの固定化
実施例１に示した配列番号２〜１５に示されるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの5'末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（30unit/μL）を0.4μL、チミジン三リン酸（10pmol/μL）を2μL、オリゴヌクレオチドプローブ（50mM）を2μL、製品添付の反応緩衝液を2μL、精製水3.6μLを添加して反応溶液を調製した後、３７℃で４時間反応させ、10×ＳＳＣ緩衝液90μLを加えることで、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ1pmol/μLを得た。
その後、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブをポリエステル膜上に一定間隔でそれぞれ0.5μLずつ塗布し、312nmの紫外線を２分間照射して固定化することで、検出用試験片を作成した。
【００４１】
［実施例５〜９］  pncA遺伝子の変異の検出
１．pncA遺伝子の抽出
本実施例では、結核菌そのものを検体とし、pncA遺伝子の変異検出を行った。各実施例に用いた検体の結核菌を下記の表２に示した。各検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製し、試料とした。
【表３】
2006180753.tif 000004
【００４２】
２．pncA遺伝子の増幅
本発明の上記プローブを用いて、PZA耐性菌を検出するために、検体中に存在しうるPZase関連遺伝子であるpncA遺伝子を増幅する必要がある。核酸増幅法としてＰＣＲ法が一般的であり、便利である。pncA遺伝子をＰＣＲ法で増幅するためのプライマーとして、以下のものを使用した。
プライマー１  ggcgtcatgg accctatatc  （配列番号１６）
プライマー２  caacagttca tcccggttc  （配列番号１７）
ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。これにより増幅したＤＮＡにはビオチンが結合している。
【００４３】
３．プローブを用いた検出
増幅したＤＮＡ溶液10μLに、水酸化ナトリウム（5M）、エチレンジアミン四酢酸（0.05M）の溶液（10μL）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（0.01w/v%）、塩化ナトリウム（1.8w/v%）、クエン酸ナトリウム（1.0w/v%）の溶液（1mL）及び実施例４で作成した検出用試験片１枚を加え、反応温度６２℃の下で３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出用試験片上の各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼを発色させた。
【００４４】
４．検出結果
実施例５〜９における検出結果を図２（写真）に示した。本発明のプローブはpncA遺伝子の新規の変異を検出できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明おいてpncA遺伝子の新規変異が確認されたことにより、該新規変異を検出することが可能となり、pncA遺伝子の変異の位置のいずれか少なくとも１つで変異することにより誘導されるPZA薬剤耐性菌のうち、これまで検出不可能であった耐性菌を検出することができる。その結果、結核患者が保有する菌をもらさずに、より確実にモニタリングすることができ、PZA耐性菌を保有する結核患者に対して適切な治療方法を提供することができる。このことにより、不要な薬剤投与を防ぐことができ、患者の負担が軽減化され、さらに無駄な医療費を削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１−１】pncA遺伝子の配列と、本発明の新規変異の位置（▼）、本発明のプローブの位置を示す図である。
【図１−２】pncA遺伝子の配列と、本発明の新規変異の位置（▼）、本発明のプローブの位置を示す図である。
【図２】実施例４の検出用試験片を用いた実施例５〜９の検出結果を示す図である。
【図１−１】
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【図１−２】
2006180753.tif 000006
【図２】
2006180753.tif 000007
【配列表】
2006180753000001.app