(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、被検体由来の試料に含まれる特定の塩基配列で表される核酸を効果的に検出する方法を提供することである。【解決手段】  被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、  被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、
被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法。
【請求項２】
非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
前記特定の塩基配列が、配列番号１で表されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いることにより、被検体中にラムダファージが存在するか否かを判別する、請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法において使用するための、担体上にポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体であって、ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、前記プローブ固定化担体。
【請求項９】
担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、請求項８記載のプローブ固定化担体。
【請求項１０】
請求項７に記載のポリヌクレオチドプローブを含む、ラムダファージを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非対称ＰＣＲを用いて特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法、ならびに該方法に使用するためのプライマー、プローブ及びプローブ固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検体において特定のポリヌクレオチドを検出する場合、該ポリヌクレオチドに含まれる特異的な塩基配列のみをＰＣＲ法などで増幅し、増幅された塩基配列を蛍光等で分析する方法がある。
【０００３】
しかし、ＰＣＲ法では、特異的なポリヌクレオチド鎖とその相補鎖のポリヌクレオチド鎖も増幅されるため、特異的な塩基配列を分析する際に、分析の感度を低下させる問題点があった。また、ＰＣＲ法とハイブリタイゼーションは別の溶液を使うため、特定のポリヌクレオチド鎖を増幅するのに相当の時間を要していた。
【０００４】
更に、特定のポリヌクレオチドを検出する場合、試料が極微量の場合、簡便かつ的確な検出法が無い。すなわち特定のポリヌクレオチドの早期検出の観点から評価する限り、従来の培養法や抗体測定法には難点がある。例えばウイルス培養法の場合、日数を要しかつヒト特異的なウイルスであることから手間がかかる。抗体測定について言えば、ＣＦ抗体の場合、急性期から３週間以上経ってから検出が確定するのが通常であり、かつ特異性にも難点がある。また抗体価を測定することに関しても、検出対象が圧倒的に免疫不全状態の患者であることを忘れてはならない。また、感染患者由来の生検組織材料に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるウイルス検出は感度が悪いという難点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、被検体由来の試料に含まれる特定の塩基配列で表される核酸を効果的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、非対称ＰＣＲ反応液を用いて、非対称ＰＣＲとハイブリタイセーションを連続して行うことにより、特定の塩基配列で表される核酸を効果的に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法。
（２）非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う、（１）記載の検出方法。
（３）前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる、（１）又は（２）記載の検出方法。
（４）前記ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないよう設計される、（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記特定の塩基配列が、配列番号１で表されることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いることにより、被検体中にラムダファージが存在するか否かを判別する、（５）記載の検出方法。
（７）配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブ。
（８）（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法において使用するための、担体上にポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体であって、ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、前記プローブ固定化担体。
（９）担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、（８）記載のプローブ固定化担体。
（１０）（７）に記載のポリヌクレオチドプローブを含む、ラムダファージを検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、特定の塩基配列で表される核酸を短時間で増幅することができ、かつ特定の塩基配列を高感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一実施形態においては、被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法に関する。
【００１０】
本発明においてポリヌクレオチドとは、塩基長を限定するものではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの双方を包含するものとする。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれをも包含する。
【００１１】
特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を増幅しうるプライマーの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プライマーの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基である。
【００１２】
プライマーの設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜７０℃であることが好ましい。
【００１３】
プライマーとして特異的なアニーリングが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。また、プライマーは、設計時に鋳型として使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。
【００１４】
本発明においては、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも１〜２３番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも４７６〜５００番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーとのプライマーセットであって、一方をフォワードプライマーとし、他方をリバースプライマーとして作製される該プライマーセットを用いるのが好ましい。
【００１５】
具体的には、配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーセットが挙げられる。
【００１６】
本発明の検出方法においては、被検体から被検核酸を調製し、該被検核酸に対して上記プライマーを用いて増幅反応を行う。ここで「被検体」は、例えば感染症に感染した患者から、病原菌の種別を判別しようとする動物を意味する。被検体は、特に限定されず、いかなる生物であってもよい。このような被検体としては、植物、動物、菌類、原生生物、原核生物等が挙げられる。特に哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、マウス等挙げられる。また、被検体由来の試料としては、特に限定されないが、血液、汗、尿、唾液、涙、リンパ液、等の体液、培養細胞、細胞破砕物などが挙げられる。
【００１７】
被検核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用することができる。またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料又は被検核酸を用いて、以下に示す増幅反応を行う。
【００１８】
増幅手法としては、非対称ＰＣＲを用いる。増幅は、増幅断片が検出可能なレベルになるまで行う。非対称ＰＣＲは、通常の対称ＰＣＲでは増幅用の２種類のプライマーをそれぞれ等量用いるのに対し、１本鎖として得たい方のプライマーを、もう一方のプライマーよりも多量に入れてＰＣＲを行う方法である。そうすることにより、ＰＣＲサイクルの始めのうちは２本鎖ばかりが作り出されてくるが、少ない方のプライマーが使い尽くされてくると、以後、１本鎖のＤＮＡが毎回作り出されてくるようになる。２本鎖ＤＮＡをターゲットとして用いた場合、このＤＮＡ同士が相互にアニーリングしてしまい、プローブのポリヌクレオチドとハイブリダイズできなくなってしまうために感度が低くなってしまうという問題点があるが、非対称ＰＣＲにより調製した１本鎖ＤＮＡを用いることにより、このような問題がなく高感度な検出が可能になる。
【００１９】
本発明において、非対称ＰＣＲにおける一方のプライマー濃度に対する他方のプライマーの濃度比は、通常１未満、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／２０〜１／３である。
【００２０】
本発明の識別方法においては、上記プライマーを用いて特異的な増幅反応が起こる条件下で増幅反応を行う。そのような条件は、当業者であれば適宜設定することができる。
【００２１】
増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。
【００２２】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【００２３】
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅断片は、目的の増幅断片の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより検出できる。例えば、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより検出できる。通常、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸のうち、増幅された断片に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる。ここで「一部」とは、配列番号１のうち、通常１０塩基以上、好ましくは２０〜１０００塩基、より好ましくは３０〜１００塩基の連続する塩基配列を意味する。
【００２４】
例えば、上記ポリヌクレオチドプローブが固定化された担体を用い、当該プローブ固定化担体に被検体由来の試料を接触させ、試料に含まれる増幅断片と担体上に固定化されたプローブとをハイブリダイズさせ、標識を指標として増幅断片の有無を検出することができる。従って、本発明は、上記ポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体をも包含する。
【００２５】
本発明においては、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出する。すなわち、非対称ＰＣＲを実施した反応液をそのまま使用して、該反応液中にポリヌクレオチドを添加したハイブリダイズ反応を行う。好ましくは、非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う。非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯においてとは、少なくとも一部の時間において、非対称ＰＣＲ反応とハイブリダイズ反応が平行して行われることを意味し、より好ましくは非対称ＰＣＲ反応とハイブリダイズを平行して行う。
【００２６】
この時、ポリヌクレオチドプローブは、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される。この理由は、非対称ＰＣＲにより多量に増幅され１本鎖として存在する増幅断片を対象とした方がハイブリダイズの効率が格段に向上すること、増幅された１本鎖の相補鎖ができにくいことである。また、非対称ＰＣＲに用いるプライマーと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、非対称ＰＣＲ反応液中の未反応プライマーが優先的に増幅断片に結合してしまい充分なプローブとのハイブリダイズ効率が得られないからである。
【００２７】
配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プローブの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１０〜５０００塩基、より好ましくは２０〜１００塩基である。
【００２８】
またプローブの設計の際においても、プローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプローブのＴｍは、ハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウエアを利用することができる。本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜７０℃であることが好ましい。プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。
【００２９】
本発明において、例えばラムダファージを検出する場合、特に配列番号１で表される塩基配列の全部又は一部でコードされる核酸を検出する場合、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブを用いるのが好ましい。
【００３０】
具体的には、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブが挙げられる。当該ポリヌクレオチドプローブにおいて、配列番号４の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプローブもまた本発明に包含される。このようなプローブは、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも１〜２３番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも４７６〜５００番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーとのプライマーセット、特に、配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーセット、によって増幅される断片を検出するのに特に有効である。
【００３１】
ここで「一部」とは、配列番号４のうち、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜５００塩基、より好ましくは２０〜１００塩基の連続する塩基配列を意味する。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドプローブには、配列番号４で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部と特異的にハイブリダイズする核酸も包含される。また、ポリヌクレオチドを担体上に固定化するための反応活性基を導入した合成ポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドプローブに包含される。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応は、プローブが配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸と特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。ストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜４０ｍＭ、好ましくは１５〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１６〜１７ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。
【００３４】
ポリヌクレオチドプローブの担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。固定化するポリヌクレオチドプローブがｃＤＮＡやＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面にスポッティングして、ＤＮＡの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。
【００３５】
固定化するポリヌクレオチドプローブが合成ポリヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した担体表面に該ポリヌクレオチドをスポッティグし、共有結合させることができる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入ポリヌクレオチドを反応させる方法、及び該スライドガラスに、アルデヒド基導入ポリヌクレオチドを反応させる方法などがある。
【００３６】
ポリヌクレオチドプローブを固定化する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。
【００３７】
本発明においては、ポリヌクレオチドプローブを固定化する担体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体が好ましい。
【００３８】
上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ 樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。
【００３９】
本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化することができる。
【００４０】
表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種から形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイヤモンドを用いるのが好ましい。
【００４１】
基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成される表面層を形成させる。
【００４２】
表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
【００４３】
表面処理によって形成される表面層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００４４】
基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００４５】
また、前記の基板材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））を形成することにより、表面層としてもよい。
【００４６】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００４７】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００４８】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ Ｂ ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のポリヌクレオチドプローブを高密度で固定化できる点で好都合である。
【００４９】
本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。
【００５０】
静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００５１】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００５２】
静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００５３】
静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００５４】
また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００５５】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００５６】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定化量がより向上する。
【００５７】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００５８】
本発明の固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。
【００５９】
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００６０】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００６１】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００６２】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００６３】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。
【００６４】
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
【００６５】
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００６６】
担体として上記のような固体支持体を用いることにより、ポリヌクレオチドプローブを強固に固定化することができるため、検出感度と信頼性の高い検出が可能になる。
【００６７】
本発明はまた、上記プローブを含む、被検体においてラムダファージを検出するためのキットに関する。プローブは、上記のような担体上に固定化されていてもよい。
【００６８】
本発明のキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。また、本発明のキットは、プローブを含む場合には、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでもよい。
【００６９】
本発明により、特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみが増幅されるため、検出感度が向上し、特定の塩基配列を迅速に検出することが可能になる。この迅速な検出により、特定の塩基配列で表されるウイルスが原因の感染症に対して早期に感染を発見し、治療することが可能となる。例えばラムダファージの特定の塩基配列に適用できる。
【実施例】
【００７０】
実施例１  固体支持体の作成
３ｍｍ角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコーティングし、カルボキシル基で修飾後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性エステル化し、固体支持体を作製した。
【００７１】
実施例２  プローブ固定化担体
ラムダファージの５００ｂｐのＤＮＡ（配列番号１）の塩基配列のうち、６０塩基を選択し、プローブを合成した（配列番号４）。
配列番号１：gatgagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcccttcggggccattgtttctctgtggaggagtccatgacgaaagatgaactgattgcccgtctccgctcgctgggtgaacaactgaaccgtgatgtcagcctgacggggacgaaagaagaactggcgctccgtgtggcagagctgaaagaggagcttgatgacacggatgaaactgccggtcaggacacccctctcagccgggaaaatgtgctgaccggacatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaactggtcacggtcgtggcactggtgaagctgcatactgatgcacttcacgccacgcgggatgaacctgtggcatttgtgctgccgggaacggcgtttcgtgtctctgccggtgtggcagccgaaatgacagagcgcggcctggccagaatgcaataacgggaggcgctgtggctgatttcgataacc
【００７２】
配列番号４は、上記配列番号１における下線の箇所に等しい。
配列番号４：acatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaact
【００７３】
４μＬのプローブにスポットソリューションを添加し（ＤＮＡ濃度：５μＭ）、スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社製）で実施例１で製造した固体支持体上にスポットを行った。また、各ＤＮＡについても同様にスポットを行った。８０℃で1時間ベーキングを行った。２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（室温）で１５分間洗浄した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（９５℃）で５分間洗浄した。続いて、超純水でリンスし、遠心乾燥を行った。
【００７４】
スポット配置を図１に示す。各スポット位置にスポットした試料は以下のとおりである。
（１）リバースプライマー（配列番号３）
（２）６０ｍｅｒ合成ポリヌクレオチドプローブ（配列番号４）
（３）５００ｂｐ  ＰＣＲ産物（配列番号１）
（４）ラムダファージゲノムＤＮＡ
【００７５】
実施例３  非対称ＰＣＲ
ラムダファージゲノムＤＮＡをテンプレートとして、１ｍＭ  Ｃｙ５‐ｄＣＴＰを１μＬ添加し非対称ＰＣＲを行い、Ｃｙ５を取り込んだ。非対称ＰＣＲにおいて遺伝子を特異的に増幅するために用いたプライマーは以下のとおりである。なお、Ｒｖはリバースプライマーを、Ｆｗはフォワードプライマーを表す。
Ｆｗ：５’−ggttatcgaaatcagccacagcgcc−３’（配列番号２）
Ｒｖ：５’−gatgagttcgtgtccgtacaact−３’（配列番号３）
【００７６】
リバースプライマー濃度はフォワードプライマー濃度の１／１０とし、以下の組成でＰＣＲ溶液を調製した。
テンプレートＤＮＡ（１μｇ/ｍＬラムダファージゲノムＤＮＡ）     ０．５μＬ
２０ｐｍｏｌ／μＬフォワードプライマー                          ０．５μＬ
２０ｐｍｏｌ／μＬリバースプライマー                          ０．０５μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（−ｄＣＴＰ）                                  ５μＬ
１ｍＭ  ｄＣＴＰ                                                    １μＬ
１ｍＭ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ                                            １μＬ
×１０ＰＣＲバッファー                                              ５μＬ
Ｈ２Ｏ                                                            ３７μＬ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ                                        ０．２μＬ
【００７７】
また、コントロールとして、通常のＰＣＲ反応と同様にリバースプライマーを０．５μＬとしたものも調製した。ＰＣＲ反応は、以下の条件で行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
４℃：∞
得られた非対称ＰＣＲ反応液（５０μＬ）をそのままハイブリダイゼーションに用いた。
【００７８】
実施例４  ハイブリダイゼーション
実施例３で得られた非対称ＰＣＲ反応液と実施例２で製造したプローブ固定化固体支持体をＰＣＲチューブに入れ、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡＢＩ社製）で５０℃、１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００７９】
反応液中から固体支持体を取り出し、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した。２×ＳＳＣでリンスした後、遠心乾燥を行った。蛍光スキャナーＦＬＡ８０００（富士写真フィルム社製）で蛍光画像をスキャンした。非対称ＰＣＲ産物（非対称ＰＣＲ反応液）をターゲットとした結果を図２左に、対称ＰＣＲ産物をターゲットとした結果を図２右に示す。
【００８０】
図２の結果から、非対称ＰＣＲ産物をターゲット試料とした場合、配列番号４で表される塩基配列をもつ６０ｍｅｒのポリヌクレオチドプローブのスポットで、高感度に検出することができた。
【００８１】
本発明により、１本鎖ＤＮＡをプローブとし、かつ非対称ＰＣＲ産物をターゲットとしてハイブリダイズを実施することにより、高感度な検出が可能になり、ハイブリダイゼーションの時間を短縮できることが明らかとなった。
【００８２】
実施例５  非対称ＰＣＲ−ハイブリダイゼーションの連続反応
上記、実施例２で製造したプローブ固定化固体支持体を、実施例３と同様に調製した非対称ＰＣＲ反応液と共にチューブに入れ、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡＢＩ社製）を用いて、以下の条件で反応を行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
９４℃：５分
５０℃：３０分
【００８３】
反応液中から固体支持体を取り出し、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した。２×ＳＳＣでリンスした後、遠心乾燥を行った。蛍光スキャナーＦＬＡ８０００（富士写真フィルム社製）で蛍光画像をスキャンした。結果を図３に示す。
【００８４】
図３の結果より、配列番号４で表される塩基配列からなる６０ｍｅｒのＤＮＡのスポットでシグナルを検出することができたことから、非対称ＰＣＲ反応液中にプローブを固定化した固体支持体を入れて、非対称ＰＣＲ反応−ハイブリダイズ反応を連続して実施できることが明らかとなった。
【００８５】
また、非対称ＰＣＲ反応中に、固定化した６０ｍｅｒのポリヌクレオチドプローブとＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションが同時に行なわれたことが示唆される。このことから、固定化した６０ｍｅｒのＤＮＡをプライマーとして伸長反応が行なわれたと考えられる。
【００８６】
本発明により、非対称ＰＣＲ反応−ハイブリダイズ反応を同時に行なうことができ、操作工程の省略化および、反応時間の短縮を実現できることが明らかとなった。
【００８７】
実施例６  プライマー濃度比の検討
非対称ＰＣＲにおいて目的とする核酸を増幅することができるプライマー濃度比を明らかにするために、非対称ＰＣＲ反応用溶液を以下の組成で調製した。
テンプレートＤＮＡ（５５ｐｇ／μＬ  ラムダファージゲノムＤＮＡ）      １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー                                                ５μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                                  ５μＬ
２０μＭ  フォワードプライマー                                    ０．５μＬ
リバースプライマー                                                ０．５μＬ
Ｈ２Ｏ                                                              ３８μＬ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ                                          ０．２μＬ
【００８８】
このときリバースプライマーの濃度は０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、２０μＭに調製した。フォワードプライマー、リバースプライマーの配列を以下に示す。
Ｆｗ：5’-ggttatcgaaatcagccacagcgcc-3’（配列番号２）
Ｒｖ：5’-gatgagttcgtgtccgtacaact-3’（配列番号３）
ＰＣＲ反応は、以下の条件で行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
４℃：∞
【００８９】
非対称ＰＣＲ反応液に５μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。１．２％のアガロースゲルに１０μＬずつアプライし、１００Ｖで３０分間、電気泳動を行なった。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで５分間、染色を行なった。ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム社製）を用いて４７０ｎｍの励起波長を照射し、蛍光を観察した。結果を図４に示す。このときレーンＭは分子量マーカーｐＨＹ（タカラバイオ）を示しており、レーン１からレーン５はリバースプライマーの濃度をそれぞれ
レーン１    ０．２μＭ
レーン２    １μＭ
レーン３    ２μＭ
レーン４    １０μＭ
レーン５    ２０μＭ
として得られた非対称ＰＣＲ産物（非対称ＰＣＲ反応液）を示している。
【００９０】
図４の結果から、リバースプライマーの濃度比１／１０以上で、非対称ＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅が可能であることがわかった。以上からプライマー濃度比１／１０以上で増幅された非対称ＰＣＲ産物は、基板上のＤＮＡとハイブリダイズさせることで容易に検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】実施例２におけるスポット配置を表す。
【図２】実施例４でハイブリダイゼーション反応を行った後、蛍光画像をスキャンした結果を表す。
【図３】実施例５で反応を行った後、蛍光画像をスキャンした結果を示す。
【図４】実施例６で非対称ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動を行った結果を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号２〜４：合成ＤＮＡ
【図１】
2006055065.tif 000003
【図２】
2006055065.tif 000004
【図３】
2006055065.tif 000005
【図４】
2006055065.tif 000006
【配列表】
2006055065000001.app