(57)【要約】【課題】  食中毒菌感染の予防および／または治療に有効な新規微生物、ならびにそれを含む発酵物、食品および医薬組成物を提供する。【解決手段】  新たに見出された乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＭＣＲＩ  １６４株、ならびに食中毒菌を有効に予防および／または治療することのできる、ラクトバチルス・プランタラムＭＣＲＩ  １６４株を含む発酵物、特に食品、ならびに医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４９を有する乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＭＣＲＩ  １６４株。
【請求項２】
食中毒菌感染の予防および／または治療効果を有する、請求項１記載の乳酸菌を含む発酵物。
【請求項３】
食品である請求項２記載の発酵物。
【請求項４】
食中毒菌感染の予防および／または治療のための、請求項１記載の乳酸菌を含む医薬組成物。
【請求項５】
食中毒菌がサルモネラ菌である請求項２記載の発酵物、請求項３記載の食品、または請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
食中毒菌が病原性大腸菌血清型Ｏ１５７である請求項２記載の発酵物、請求項３記載の食品、または請求項４記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒を抑制することのできる、新たに見出された乳酸菌ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＭＣＲＩ  １６４株に関する（以下、この菌株を「L. planturum ＭＣＲＩ  １６４株」または「ＭＣＲＩ  １６４株」ということもある）。本発明は、食中毒菌、特にサルモネラ菌による感染の予防および／または治療効果を有するＭＣＲＩ  １６４株を含む発酵物、特に食品、ならびに医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
現代人は、不規則な生活、ストレス、過剰な清潔志向といったライフスタイルを原因として、免疫力が低下していると言われている。その例として、近年の結核菌感染者の増加や大腸菌Ｏ１５７、サルモネラなどを原因とする食中毒発生の増加があげられ、現代人の免疫力向上が大きな課題となっている。
【０００３】
食中毒、特にサルモネラ症はヒトの急性胃腸炎原因菌として最も重要なものの一つであり、症状は、悪寒、高熱、嘔吐、下痢、腹痛等を伴い、感染後数時間から24時間後に発症し、その症状は一般に重く、回復が遅いという特徴がある。通常、サルモネラ症には、フルオロキノロン系の抗生物質を投与する治療が行われる。しかし、抗生物質を投与することにより、ショック症状、急性腎不全、過敏症などといった副作用のおそれがあるため、多量に投与するのは好ましくない。また、最近ではフルオロキノロン耐性のサルモネラが出現し、治療上重大な問題となっている。このように、抗生物質投与の多用は、副作用や耐性菌出現の問題があるため好ましくないので、サルモネラの感染を予防および／または治療するための充分な対策が必要とされている。副作用のおそれがなく耐性菌が出現し難いサルモネラ感染予防および／または治療法としては、乳酸菌の投与が考えられる。
【０００４】
乳酸菌を経口投与することによる食中毒菌感染予防については、例えばL. plantarumを用いて、病原性細菌の腸管への付着を阻害するもの（特許文献１）や、L. plantarumと茶抽出物と組み合わせた発酵生成物の形で効果を発揮するもの（特許文献２）が知られている。しかし、経口摂取あるいは経口投与した場合に、免疫機能に直接作用して食中毒菌感染を予防および／または治療する事例は未だ見られない。
【特許文献１】特表平１１−５０２７０３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、食中毒菌感染の予防および／または治療に有効な新規微生物、ならびにそれを含む発酵物、食品および医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、食中毒菌感染の予防および／または治療に有効な乳酸菌Lactobacillus plantarum ＭＣＲＩ  １６４株を新たに見出し、本発明を完成させるに至った。さらに本発明者らは、ＭＣＲＩ  １６４株を経口摂取あるいは経口投与した場合、免疫機能に直接作用して食中毒菌感染を有効に予防および／または治療しうることも初めて見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、
（１）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４９を有する乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＭＣＲＩ  １６４株、
（２）食中毒菌感染の予防および／または治療効果を有する、（１）記載の乳酸菌を含む発酵物、
（３）食品である（２）記載の発酵物、
（４）食中毒菌感染の予防および／または治療のための、（１）記載の乳酸菌を含む医薬組成物、
（５）食中毒菌がサルモネラ菌である（２）記載の発酵物、（３）記載の食品、または（４）記載の医薬組成物、ならびに
（６）食中毒菌が病原性大腸菌血清型Ｏ１５７である（２）記載の発酵物、（３）記載の食品、または（４）記載の医薬組成物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、食中毒菌感染の予防および／または治療に有効な新規乳酸菌（Lactobacillus plantarum ＭＣＲＩ  １６４株）が提供される。また、本発明により、食中毒菌感染を有効に予防および／または治療することのできる、ＭＣＲＩ  １６４株を含む発酵物、特に食品、ならびに医薬組成物が提供される。これらを用いて食中毒を有効に予防および／または治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、第１の態様において、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＭＣＲＩ  １６４株に関するものである。上述のごとく、本発明者らは、食中毒菌感染の予防および／または治療に有効な乳酸菌Lactobacillus plantarum ＭＣＲＩ  １６４株を、食品から分離した。これを２００４年１２月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し、２００４年１２月１４日に同センターから受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４９を付与された。ＭＣＲＩ  １６４株は、経口摂取あるいは経口投与された場合に、生きたまま腸管に到達して付着する率が高く、食中毒菌の腸管への付着を競合的に阻害し、また、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善することによって免疫賦活作用を引き起こし、臓器への食中毒菌の侵入を抑えて感染を予防および／または治療するものである。このような詳細な作用機序を明らかにしたのは本発明が初めてである。本発明により有効に感染が予防および／または治療されうる食中毒菌は、サルモネラ菌、血清型Ｏ１５７をはじめとする病原性大腸菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ菌、Vibrio cholerae、Vibrio mimicus、Vibrio fluvalisなどのビブリオ菌、アエロモナス菌、カンピロバクター菌、ウエルシュ菌、セレウス菌、エルシニア菌、プレシオモナス菌、クリプトスポリジウム菌などが挙げられる。なかでも、本発明のＭＣＲＩ  １６４株はサルモネラ菌や病原性大腸菌血清型Ｏ１５７に対する効果が大きい。
【００１０】
本発明は、もう１つの態様において、食中毒菌感染の予防および／または治療効果を有する、ＭＣＲＩ  １６４株を含む発酵物に関するものである。ここで、「発酵物」とは、ＭＣＲＩ  １６４株を増殖させて得られた培養物であればいずれのものであってもよい。本発明の発酵物はＭＣＲＩ  １６４株の菌体であってもよい。ＭＣＲＩ  １６４株の培養は、公知の乳酸菌の培養方法を適用して行うことができる。本発明の発酵物の形状は経口摂取可能であり、ＭＣＲＩ  １６４株を生きたまま腸管に到達させうるものであれば特に限定されず、粉末、顆粒、タブレットなどの固形、ゼリー、ペーストなどの半固形、菌体懸濁液、シロップなどの液状であってもよい。これらの発酵物の製造は、例えば、常法に従いＭＣＲＩ  １６４株を液体培養し、得られた培養物をそのまま発酵物としてもよく、遠心分離等の手段により菌体を集めて発酵物としてもよく、あるいは培養物を凍結乾燥して粉末状にして発酵物としてもよい。
【００１１】
本発明の発酵物は食品であってもよく、とりわけ、ヨーグルトなどの発酵乳、乳酸菌飲料、発酵ソーセージなどの乳酸発酵プロセスが大きな役割を担っている食品が好ましい。これらの食品の製造は、使用乳酸菌の一部または全部を本発明のＭＣＲＩ  １６４株とすることにより行うことができる。また、ＭＣＲＩ  １６４株が食中毒菌感染を有効に予防および／または治療しうるという性質を有することから、ＭＣＲＩ  １６４株を含む食品を健康食品や機能性食品とすることもできる。なお、本発明の発酵物および食品はＭＣＲＩ  １６４株単独による発酵作用のみならず、他の微生物の発酵作用により得られるものを包含することはいうまでもない。ＭＣＲＩ  １６４株菌体またはそれを含む発酵物を、食品添加物または調味料など、あるいはそれらの一成分として用いてもよい。
【００１２】
本発明は、さらなる態様において、食中毒菌感染の予防および／または治療のための、ＭＣＲＩ  １６４株を含む医薬組成物に関するものである。本発明の医薬組成物の剤形に関しては、経口投与可能でＭＣＲＩ  １６４株を生きたまま腸管に到達させうる生菌剤であればいずれの剤形であってもよい。例えば、懸濁液、シロップ、パスタ剤、錠剤、カプセル、粉末、顆粒などであってもよい。これらの剤形は製薬分野で公知の方法により製造することができる。一般的には、本発明の医薬組成物は、水、デンプン、微細結晶セルロース、小麦粉、砂糖などの担体とともに処方される。これらの担体も公知であり、適宜選択して使用することができる。例えば、常法により培養して得られたＭＣＲＩ  １６４株菌体を凍結乾燥粉末とし、砂糖と混合することにより粉末剤を調製してもよい。ＭＣＲＩ  １６４株の湿菌体をシロップ中に懸濁してシロップ剤としてもよい。あるいはＭＣＲＩ  １６４株菌体を適切な錠剤用担体とともに常法により打錠して錠剤を得ることもできる。本発明の医薬組成物は、ＭＣＲＩ  １６４株菌体のほか、必要に応じて他の成分、例えば、他の微生物や有効成分、あるいは甘味料、香料、着色剤などを含有していてもよい。ＭＣＲＩ  １６４株の投与量は、対象の身体的状況、例えば健康状態、体重、年齢、既往症、使用される他の成分などを考慮して、適宜決定することができる。
【００１３】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。実施例においては、以下のことに留意した。すなわち、乳酸菌が腸内に定着し、免疫機能に作用するには、生きて消化管を通過し、腸管に付着して、増殖しなければならない。そこで、被験菌株としてL. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株について、胃内を通過するための耐酸性、腸管で生存し増殖するための胆汁耐性、そして腸管に留まるための腸管付着性の評価を行なった。対照菌株として発酵乳製造用スターターとしてよく知られているLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricusの一つとしてＪＣＭ  １１０３９株を用いた。
【実施例１】
【００１４】
（ａ）耐酸性試験
菌株をＭＲＳブロスで３７℃、２４時間培養した培養液を遠心集菌後、滅菌生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を、ｐＨ３および２に調製したＭＲＳブロスに１０７ ＣＦＵ／ｍｌとなるように接種した。３７℃で１および３時間インキュベート後ＭＲＳアガーを用いて塗抹平板培養法により生菌数を測定した。
L. delbrueckii ssp. bulgaricus ＪＣＭ  １１０３９株はｐＨ２では１時間後、ｐＨ３では３時間後には死滅したのに対し、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株はｐＨ２では１時間後でも生存しており、ｐＨ３においては３時間後も当初の菌数を維持していた（表１）。L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は高い耐酸性を有しており、胃内を生きて通過する能力を有していることが分かった。
【表１】
2006180836.tif 000002
【００１５】
（ｂ）胆汁耐性試験
菌株をＭＲＳブロスで３７℃、２４時間培養した培養液を遠心集菌後、滅菌生理食塩水に懸濁した。ウシ胆汁末を０．３から１．０％含有するＭＲＳブロスに１０６ ＣＦＵ／ｍｌとなるように供試菌株を接種し、３７℃で培養した。経時的に波長６２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、菌の増殖に伴う濁度上昇を観察した。その結果、L. delbrueckii ssp. bulgaricus ＪＣＭ  １１０３９株は胆汁０．３％で完全に生育が阻害されたのに対し、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は胆汁１．０％でも増殖可能であった。L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は高い胆汁耐性を示し、腸管内で生存して増殖できることが分かった。
【００１６】
（ｃ）腸管粘膜への付着性試験
腸管への付着性は、腸管粘膜の主成分であるムチンへの付着率を測定して評価した。ムチンはMatsumotoらの方法（Curr. Microbiol. 44:212-215, 2002）に基づいて、ヒト糞便から抽出・精製した。１ｍｇ／ｍｌに調製したムチン２００μｌをポリスチレン製９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し４℃１２時間静置してムチンをプレートに固定した。残ったムチン溶液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、１０３ ＣＦＵ／ｍｌの菌液１００μｌを添加し、３７℃で９０分間静置した。菌液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ツイン８０を０．０２％含有するＰＢＳを用いてピペッティングで付着した菌を剥がし、菌数を測定した。添加した菌数に対する付着した菌数の割合を付着率とした。
L. delbrueckii ssp. bulgaricus ＪＣＭ  １１０３９株のムチンに対する付着率は０．５±０．３％であり、ほとんど付着しないのに対し、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は１８．４±２．９％と高い付着率を示した（図１）。L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は腸管粘膜に付着し、腸管内に定着する能力を有することが判明した。すなわち、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株が腸管に付着することにより、食中毒菌の腸管への付着を競合的に阻害すると考えられた。
【実施例２】
【００１７】
上記結果から、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は、生きて消化管を通過し、腸管に付着して、増殖しうることが確認された。そこで、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株を用い、食中毒菌の一例としてサルモネラ・エンテリチジス（Salmonella enteritidis）Ｓ３８１株（本実施例において「サルモネラ」という）を用いて、食中毒菌感染時における免疫機能への作用ならびに臓器への食中毒菌侵入抑制効果について動物実験によって評価した。
【００１８】
日本ＳＬＣより７週齢で購入したwistarラット（ＳＰＦ、雄）を７日間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間および実験期間を通して室温２２℃、相対湿度５５％の感染動物飼育室（照明時間８時〜２０時）で飼育した。なお、ラットのサルモネラ菌感染時の週齢は、９週齢とした。ラットは１匹／ゲージとし、滅菌蒸留水を給水瓶にて、またラット用放射線滅菌固形試料（ＣＥ−２、日本クレア）を給餌器にて、それぞれ自由に与えた。これらの飼育器具は全て滅菌したものを使用した。
【００１９】
１群５匹からなる３群を構成し、それぞれ被験菌投与群、対照群、非感染群とした。被験菌投与群においては、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株をサルモネラ感染前９日間（１日１回）および感染２時間後の合計１０回、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。投与容量はラット当り１０９ ＣＦＵとした。被験菌投与および対照群については実験開始１０日目にサルモネラ１０９ ＣＦＵを経口投与した。非感染群においては、被験菌およびサルモネラいずれも投与を行わなかった。
【００２０】
実験開始１５日目に各ラットから肝臓、脾臓および腸間膜リンパ節を取り出し、臓器侵入サルモネラ菌数を測定した。摘出した各臓器をホモジナイズし、生理食塩水で段階希釈後、塗抹平板培養法により菌数を測定した。また、摘出した脾臓１／２より全細胞を回収しヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ０、Ｔｈ１およびＴｈ２）の細胞数を測定した。すなわち、抗ラットＣＤ４抗体、抗ラットＩＦＮ−γ抗体、抗ラットＩＬ−４抗体を用いた三重染色によりヘルパーＴリンパ球を識別し、フローサイトメトリー解析により各細胞数を測定した。ＣＤ４陽性リンパ球中のうち、ＩＦＮ−γ陽性かつＩＬ−４陰性をＴｈ１細胞、ＩＦＮ−γ陰性かつＩＬ−４陽性をＴｈ２細胞、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４共に陽性をＴｈ０細胞とした。
【００２１】
ヘルパーＴ細胞のうちＴｈ１細胞は細胞性免疫に関与し、とりわけサルモネラなど細胞内寄生菌に対して重要な生体防御応答を誘導するので、サルモネラ感染においては全ヘルパーＴ細胞数に対するＴｈ１細胞の占める割合が、感染を抑える上で重要な指標となる。対照群においては、Ｔｈ１細胞数の割合が８．７％と減少しＴｈ１／Ｔｈ２バランスが崩れ、症状が悪化する傾向にあるのに対し、被験菌投与群においては、Ｔｈ１細胞数の割合が１９．１％を示し、非感染群と同等のレベルまでＴｈ１／Ｔｈ２バランスが改善され、症状を抑える傾向が確認された（図２）。
【００２２】
細胞侵入性であるサルモネラは、腸管上皮細胞から侵入し、更に腸間膜リンパ節、肝臓および脾臓といった各臓器に侵入し増殖して、宿主の症状を悪化させていくので、臓器への侵入を抑制することは症状悪化を防止するために重要である。被験菌投与群においては、腸間膜リンパ節および肝臓へのサルモネラ侵入を抑制する傾向がみられ、特に肝臓においては対照群と比較して被験菌投与群ではサルモネラ菌数が有意に少なく、およそ１／１０の菌数に減少していた（図３）。これは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが改善された結果によるものと考えられた。
【００２３】
以上のように、本発明の乳酸菌L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株は、発酵乳やその他生菌剤の形で経口投与することによって、生きて腸管に達し定着する。そして、サルモネラが侵入してきた際、競合的にサルモネラの腸管付着を阻害し、また、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善して免疫賦活を誘導し、臓器へのサルモネラ侵入を妨げる効果を有する。このように、L. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株の経口投与はサルモネラ感染を予防する効果がある。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明のＭＣＲＩ  １６４株、ならびにそれを含有する発酵物、食品および医薬組成物は、食品、特に健康食品、機能性食品の分野、医薬品の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】L. delbrueckii ssp. bulgaricus ＪＣＭ  １１０３９株およびL. plantarum ＭＣＲＩ  １６４株の腸管ムチンへの付着率を比較した図である。
【図２】非感染群、対照群、および被験菌投与群におけるヘルパーＴリンパ球細胞数を比較した図である。
【図３】腸間膜リンパ節、肝臓、および脾臓における侵入サルモネラ菌数を、対照群および被験菌投与群において比較した図である。
【図１】
2006180836.tif 000003
【図２】
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【図３】
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