(57)【要約】【課題】  染色体等の巨大なＤＮＡを断片化することなく調製する方法、及びそのための装置を提供すること。【解決手段】  ＤＮＡ電気泳動装置１の電気泳動槽２には、正負一対の電極３Ａ，３Ｂが設けられている。正極３Ａ側には、プレート状のイオン供給用金属４が設けられており、負極３Ｂ側には、ＤＮＡ回収用セル５が設けられている。セル５の周囲には、透析膜で構成された区画膜６が設けられており、その中には、ＤＮＡが封入されたゲルプラグ８が投入される。電気泳動操作を開始すると、第１段階では、ゲルプラグ８に封入されたＤＮＡが電気泳動溶液中に溶出され、第２段階では、金属イオンとＤＮＡとの結合により、ＤＮＡが溶液中でグロビュール構造に相転移する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正極側からは電気化学的に供給される金属イオンを、負極側からはゲル中に封入されたＤＮＡを、それぞれ電気泳動させることにより、前記ＤＮＡを前記ゲルから正極方向に溶出させた後、アルコールまたはポリエチレングリコールを含む電気泳動溶液中で前記ＤＮＡと前記金属イオンとを結合させることにより、前記ＤＮＡをグロビュール相転移させることを特徴とするＤＮＡのグロビュール相転移方法。
【請求項２】
電気泳動槽と、正負一対の電極と、正極側に配置されるイオン供給用金属と、ＤＮＡが封入されたゲルを入れることが可能であると共に前記金属イオンの通過を許容する一方前記ＤＮＡの通過を規制する区画膜を備えたＤＮＡ回収用セルと、が設けられていることを特徴とするＤＮＡ電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨大ＤＮＡを調製する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム解析を行う際に、巨大ＤＮＡ試料を調製し、その解析を実現することが重要な課題となっている。
特に、染色体ＤＮＡの調製および分離・解析は、注目する遺伝子が存在する染色体を決定する上で極めて重要な役割を果たしており、高速・高精度な手法の開発が求められている。ＤＮＡは、主としてＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、及びＴ（チミン）の四種類の塩基を持つヌクレオチド同士がホスホジエステル結合で糖の間を結合されて長い鎖状重合体をつくっている。染色体ＤＮＡのように巨大なＤＮＡ分子の場合には、１０００万塩基以上を有する場合も多いため、全体として非常に細長い形状の分子となっている。このため、細胞から巨大ＤＮＡを調製する際には、溶液中の微少対流等の影響で容易に切断されてしまい、そのままの状態で調製することが非常に困難であった。
【０００３】
染色体ＤＮＡを調製する手法としては、アガロースゲル中に細胞を封じ込め、攪拌によるＤＮＡ断片化を抑制しながらアガロース中で細胞壁・細胞膜溶解、タンパク質分解、ＲＮＡ分解を行う手法が知られている。この手法を用いて調製したアガロースゲルプラグをパルスフィールド電気泳動法により分離する手法が染色体ＤＮＡの分離法として用いられている。
しかしながら、上記方法では、ＤＮＡの分離に長時間を必要とすること、及び分離できるＤＮＡの長さが約２０００万塩基対程度に制限されること等の欠点がある。
【０００４】
一方、高速でＤＮＡを分離・解析する手法として、蛍光色素によりＤＮＡを染色し、１分子単位で蛍光強度を解析、分離する手法が知られている。しかしながら、この方法を巨大な染色体ＤＮＡに適用した場合には、水溶液中に発生するせん断応力により、容易にＤＮＡが断片化してしまう問題を抱えている。
【０００５】
特開２０００−１２５８６６号公報「相転移を用いた巨大ＤＮＡマニピュレーション法」には、ＤＮＡにグロビュール相転移を誘導することにより、染色体ＤＮＡのような巨大ＤＮＡの断片化を抑制する方法が記載されている。この方法では、ＤＮＡ分子が極度に凝縮する結果、水溶液中の流れに伴うせん断応力によるＤＮＡ断片化を抑制しながら、物理的な操作を行うことが可能になった。
【０００６】
しかしながら、グロビュール相転移を染色体ＤＮＡやバクテリアゲノムＤＮＡの分離・同定に応用する場合には、細胞からＤＮＡを無傷で抽出し、グロビュール相転移を行う技術を開発する必要がある。
この問題を解決するための手法として、アガロース中に染色体ＤＮＡ分子を封じ込めた状態で、凝縮誘導試薬の濃度を上昇させて、グロビュール相転移を誘導させる方法が考えられる。しかし、染色体ＤＮＡ分子は、局所的にアガロースゲル繊維に固定されているために、グロビュール相転移はＤＮＡ分子の一部にとどまってしまうという問題がある。
その結果、凝縮誘導試薬で処理したアガロースゲルプラグをアガラーゼまたは温度上昇により融解させても、その際に伴うせん断応力により、染色体ＤＮＡは断片化されてしまう。
【０００７】
特開２０００−２７５２１６号公報「ゲルからの巨大ＤＮＡの回収方法」には、密度境界層を形成することにより対流を抑制しながら電気泳動によりゲルから巨大ＤＮＡ分子を機械的ストレスによる切断を抑制しつつグロビュール相転移誘導溶液に回収する方法、およびクロビュール構造へ相転移した巨大ＤＮＡ分子を調製する方法ならびに装置が記載されている。しかしながら、この方法では、電気泳動に伴う直流電界の印加により発生する気泡により、密度境界層が乱されてしまい、その結果、グロビュール相転移を効率的に誘導できないという欠点を抱えている。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１２５８６６号公報
【特許文献２】特開２０００−２７５２１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、染色体等の巨大なＤＮＡを断片化することなく調製する方法、及びそのための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明に想到した。すなわち、第１の発明に係るＤＮＡのグロビュール相転移方法は、正極側からは電気化学的に供給される金属イオンを、負極側からはゲル中に封入されたＤＮＡを、それぞれ電気泳動させることにより、前記ＤＮＡを前記ゲルから正極方向に溶出させた後、アルコールまたはポリエチレングリコールを含む電気泳動溶液中で前記ＤＮＡと前記金属イオンとを結合させることにより、前記ＤＮＡをグロビュール相転移させることを特徴とする。
【００１１】
ＤＮＡ分子は、溶液中の環境によって、コイル構造と呼ばれる広がった構造と、コンパクトに折りたたまれたグロビュール構造との間を相転移することが知られている。本発明では、巨大ＤＮＡをグロビュール構造に相転移させることにより、断片化することなく調製しようとするものである。
「金属イオン」は、ＤＮＡの陰イオンを中和することで、ＤＮＡのグロビュール相転移を促すものを意味している。例えば、１価またはそれ以上の価数を持つ金属イオン（ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム、銅、亜鉛、アルミニウムなどの金属イオン）を用いることができる。中和効果を考慮すると、１価よりも価数の高いイオン（２価、３価、或いは４価）を用いることが好ましい。この金属イオンは、正極側に設けられたイオン供給用金属から電気化学的に供給される。そのようなイオン供給用金属としては、イオン化傾向の高い金属（例えば、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、マンガン、亜鉛、鉄、ニッケル、スズ、鉛）を用いることが好ましい。なお、正極自体をイオン化傾向の高い金属で構成することにより、イオン供給用金属として作用させることもできる。
【００１２】
「電気化学的に供給される」とは、金属イオンが固体金属から電気分解によって供給されることを意味している。
「ゲル」とは、その中に巨大なＤＮＡを封入しておくものを意味している。そのようなゲルとして、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルを挙げることができる。このうち、巨大なＤＮＡを扱う場合には、アガロースゲルを用いることが好ましい。
【００１３】
本発明者らは、巨大ＤＮＡのグロビュール相転移には、金属イオンと、アルコールまたはポリエチレングリコールという２つの要素が、一定濃度以上必要であることに着目した。すなわち、ゲルから巨大ＤＮＡ分子を回収する溶液中に、金属イオンを電気化学的に供給し、電気泳動により輸送することにより、アルコールまたはポリエチレングリコールを含む電気泳動溶液を攪拌することなく、ＤＮＡのグロビュール相転移を誘導可能であることを見出した。
【００１４】
アルコールは、電気泳動溶液の大部分を占める水に溶解することが好ましい。このため、例えばメタノール、エタノール、プロパノール（特に、２−プロパノール）、ブタノール（特に、ｔ−ブタノール）を用いることが好ましく、エタノール、２−プロパノールを用いることが更に好ましい。
ポリエチレングリコールは、分子量にかかわらず使用することができるが、低分子量のものを用いた場合には、ＤＮＡのグロビュール相転移を誘導するために高濃度の金属イオンが必要となることに加え、溶液の粘性が低く、対流・撹拌が起こりやすくなる。このため、高分子量のポリエチレングリコール（例えば、分子量が６０００以上のもの）を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明では、第１段階において、陰イオン性のポリマーであるＤＮＡ分子を直流電界によりゲル中から回収する。この操作では、溶液の攪拌を行わないために、機械的ストレスを与えることがないので、ＤＮＡを断片化することなく、ゲルから回収することが可能である。
一般に、精製した巨大ＤＮＡ分子は、コイル構造をとっているために、水溶液中のせん断応力により容易に断片化してしまう。これに対し、特許文献１に記載されているように、ＤＮＡにグロビュール相転移を誘導することにより、染色体ＤＮＡのような巨大ＤＮＡの断片化を抑制することが可能である。しかし、グロビュール相転移誘導試薬を混合する際の流れに伴うせん断応力により、巨大ＤＮＡの断片化が生じてしまう。
【００１６】
金属イオンを電気化学的に供給しつつ、正極側から負極側（ＤＮＡ側）に電気泳動により輸送すると、ＤＮＡ分子は負に帯電しているために、電気泳動溶液中のある地点で金属イオンと出会い、グロビュール相転移が引き起こされる。
このとき、もし予め電気泳動溶液中に金属イオンが存在すると、ＤＮＡの負の帯電を消し去ってしまうため、ＤＮＡがゲルから溶出する際に、溶液界面にて凝集してしまうため、電気泳動によるＤＮＡの回収が不可能になる。
【００１７】
そこで、本発明では、上記事態を回避するために、ゲル界面から一定の距離を置いた地点に金属イオンを与えることができるようにした。この状態で、電気泳動溶液に電圧を印加すると、ＤＮＡはゲル中から電気泳動溶液中に移動する。一方で、金属表面では電極反応が起こり、金属イオンが生成する。この金属イオンは、負極方向に向かって電気的に移動する。その結果、第２段階では、電気泳動溶液中で電気移動により移動したＤＮＡと金属イオンが結合し、グロビュール相転移が引き起こされる。
【００１８】
本発明の方法は、電気的な作用のみで、ゲルからのＤＮＡの抽出、金属イオンの生成、金属イオンとＤＮＡの結合を起こすことができる。この方法の実施中には、断片化の最大の要因である機械的応力は発生しない。そのため、巨大ＤＮＡの完全長を保ったままで、機械適応力に強い形態のグロビュールへとＤＮＡを相転移できるので、その後の操作が可能になる。
【００１９】
第２の発明に係るＤＮＡ電気泳動装置は、電気泳動槽と、正負一対の電極と、正極側に配置されるイオン供給用金属と、ＤＮＡが封入されたゲルを入れることが可能であると共に前記金属イオンの通過を許容する一方前記ＤＮＡの通過を規制する区画膜を備えたＤＮＡ回収用セルと、が設けられていることを特徴とする。本発明においては、正電極とイオン供給用金属とを兼用する構成とすることもできる。
本発明によれば、ゲル中に封入されたＤＮＡは、電気泳動が完了してグロビュール構造を取ったときに、ＤＮＡ回収用セル中に存在しているので、ＤＮＡの回収が容易となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞から巨大ＤＮＡ（例えば、真核生物の染色体ＤＮＡ）を抽出する際に、水溶液中の攪拌を行うことなく、グロビュール相転移条件を満たすことにより、巨大ＤＮＡのグロビュール相転移を引き起こすことができる。このため、巨大ＤＮＡを断片化することなく、容易に水溶液中に回収することができる。
また、本発明の方法は、効率的かつ確実に巨大な染色体ＤＮＡをグロビュール化して水溶液中に回収できるために、蛍光染色による染色体ＤＮＡの効率的・高速な解析、蛍光プローブによる染色体ＤＮＡ上での遺伝子マッピングなどに汎用的に応用されることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本実施形態は、グロビュール相転移を起こした巨大ＤＮＡを調製する方法及び装置に関するものであって、ゲル中で調製した巨大ＤＮＡを高分子溶液に電気泳動で回収しながら、グロビュール相転移に必要な金属イオンを電気泳動で与えることにより、グロビュール相転移を導入する方法等に関するものである。
【００２２】
図１には、本実施形態のＤＮＡ電気泳動装置１を示した。この装置１の電気泳動槽２には、正負一対の電極３Ａ，３Ｂが設けられている。正極３Ａ側には、プレート状のイオン供給用金属４が設けられている。また、負極３Ｂ側には、ＤＮＡ回収用セル５が設けられている。セル５の周囲には、透析膜で構成された区画膜６が設けられており、その中には、ＤＮＡが封入されたゲルプラグ８が投入されている。電気泳動槽２の内部に注がれる電気泳動溶液中には、ポリエチレングリコールを含有させておく。
【００２３】
次に、図２〜図４を参照しつつ、装置１の作動方法について説明する。図２は、電気泳動を開始する前の状態を示す模式図である。電気泳動を開始すると、図３に示すように、第１段階において、陰イオン性のポリマーであるＤＮＡ７がゲルプラグ８から正極方向に移動し、電気泳動溶液中に回収されてくる。このとき、電気泳動溶液の攪拌を行わないので、ＤＮＡ７に対して機械的ストレスを与えることがない。こうして、巨大ＤＮＡ７を断片化することなく回収することができる。
【００２４】
また、このとき正極側では、イオン供給用金属４から電気化学的に陽性の金属イオン９が供給される。この金属イオン９は、正極側から負極方向（つまり、ＤＮＡ７方向）に電気泳動により輸送される。
そして、第２段階では、金属イオン９とＤＮＡ７とが互いに接近し、電気泳動溶液中のある地点で結合すると、図４に示すように、ＤＮＡ７がグロビュール相転移を起こし、グロビュール構造１０をとる。
【００２５】
次に実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
酵母染色体ＤＮＡを回収対象として行った実験を実施例として説明する。ビール酵母を培養後、細胞濃度３×１０８個／ｍＬ、アガロースゲル濃度０.７５％(InCertR agarose gel (Cambrex Co.))、容積８０μＬのアガロースゲルプラグを調製し、標準法に従い、酵母染色体ＤＮＡゲルプラグを調製した。このとき、８０μＬのアガロースゲルプラグ中には、１.６μｇの染色体ＤＮＡが含まれていた。
【００２６】
本実施例に使用したＤＮＡ電気泳動装置２１を図５に示した。この装置２１には、電気泳動槽２２の内側に、小型の電気泳動用セル３０が挿入されている。この電気泳動用セル３０の内部には、イオン供給用金属２４とＤＮＡ回収用セル２５が設けられている。電気泳動用セル３０は、従来型の電気泳動槽２２の内部に浸漬することにより、ゲル２８からのＤＮＡの回収操作を行うことができる。このため、一部の構成を共用できることから、本発明に好適に用いることができる。ＤＮＡ回収用セル２５の大きさは、１ｃｍ（Ｗ）×１ｃｍ（Ｌ）×１.５ｃｍ（Ｈ）である。また、電気泳動用セル３０の大きさは、１.５ｃｍ（Ｗ）×８ｃｍ（Ｌ）×２ｃｍ（Ｈ）である。
【００２７】
回収用セル２５の内部は、１５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）２００００を１×ＴＡＥ緩衝液（40mM Tris, 40mM acetic acid, 2.0mM EDTA (pH8.0))に溶解した溶液で満たした。また、電気泳動用セル３０の内部は、１×ＴＡＥ緩衝液で満たした。回収用セル２５、及び電気泳動用セル３０の周囲は、それぞれ透析膜(MWCO:12000〜14000, Spectra/Por)により構成された区画膜６で囲まれている。なお、その他の構成について、図１に示す装置１と同様の作用を示す構成については、同一の符号を付して説明を省略する。
予めＤＮＡを封入したアガロースゲルプラグ２８を回収用セル２５に入れ、イオン供給用の金属マグネシウム板２４（１ｃｍ×１.５ｃｍ、厚さ０.３ｍｍ）を電気泳動用セル３０の所定の位置にセットした。このとき、金属マグネシウム板２４とアガロースゲルプラグ２８の距離は、１ｃｍとした。
【００２８】
アガロースゲル繊維へのＤＮＡ分子の不可逆的な捕捉を抑制するために、周期的に逆転する電界を印加した。その際の周期は酵母染色体ＤＮＡの分離に適しているといわれている条件を採用し、電界強度は５Ｖ／ｃｍとした。２０℃の条件下で、この電界を２時間印加し、その後、ＤＮＡを含む試料を回収用セルからマイクロピペットにより回収した。図６には、回収されたグロビュールＤＮＡ分子の蛍光顕微鏡写真を示した。観察されたＤＮＡ分子は、全てグロビュール構造をとっていた。
【００２９】
次に、回収した試料をパルスフィールド電気泳動用のアガロースゲルのウェルに投入し、逆相転移させた後、パルスフィールドゲル電気泳動を行い、回収されたＤＮＡ分子のサイズの検討を行った。
図７には、パルスフィールドゲル電気泳動を行った後のゲルの写真を示した。左右両端ラインのＭは、本実施例のＤＮＡ回収操作を行う前の酵母染色体ＤＮＡのバンドパターンを示している。また、内側ラインのＲは、本実施例の回収操作を行った後のグロビュール酵母染色体ＤＮＡのバンドパターンを示している。ＭとＲのバンドパターンが一致したことから、本実施例の方法により、酵母染色体ＤＮＡを断片化させることなく、回収できたことがわかった。
【００３０】
＜実施例２＞
Ｔ４ファージＤＮＡ（１６６ｋｂｐ）のコイル状態とグロビュール状態との間の可逆的相転移の条件を、ＰＥＧ濃度とマグネシウムイオン（ＭｇＣｌ２を使用）濃度とを変化させることにより、確認した。Ｔ４ファージＤＮＡは、当業者に周知の定法に従って調製した。
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）２００００をリン酸緩衝液（20mM Na-phosphate buffer, pH7.2）に、２０、３０、４０、６０、及び１００ｍｇ／ｍＬ（それぞれ、２、３、４、６、及び１０％（Ｗ／Ｖ））に溶解した溶液中を用意した。各溶液中に、ＤＮＡを適量溶解した。この状態では、各濃度のＰＥＧ含有溶液中のいずれにおいても、ＤＮＡはコイル状態であった。各溶液に対して、塩化マグネシウムを１０ｍＭ〜１２０ｍＭとなるように、滴下し、ＤＮＡの状態を顕微鏡で観察した。
【００３１】
結果を図８に示した。図中、（Ａ）領域では、ＤＮＡはコイル状態であり、（Ｂ）領域では、ＤＮＡはコイル状態とグロビュール状態とが共存した状態であり、（Ｃ）領域では、ＤＮＡはグロビュール状態であった。この結果より、巨大染色体ＤＮＡがグロビュール相転移を起こすには、ＰＥＧと金属イオンとが、適当な濃度以上を必要とすることがわかった。また、実施例１の結果より、電気化学的に供給される金属イオンは、この条件を満足するものであることがわかる。
【００３２】
このように、本実施形態によれば、細胞から巨大ＤＮＡ（例えば、酵母染色体ＤＮＡ）を抽出する際に、水溶液中の攪拌を行うことなく、グロビュール相転移条件を満たすことにより、巨大ＤＮＡのグロビュール相転移を引き起こすことができた。このため、巨大ＤＮＡを断片化することなく、容易に水溶液中に回収することができた。
また、本方法は、効率的かつ確実に巨大な染色体ＤＮＡをグロビュール化して水溶液中に回収できるために、蛍光染色による染色体ＤＮＡの効率的・高速な解析、蛍光プローブによる染色体ＤＮＡ上での遺伝子マッピングなどに汎用的に応用されることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本実施形態のＤＮＡ電気泳動装置の構成を示す図である。
【図２】ＤＮＡ電気泳動装置の操作状態を示す図（１）である。
【図３】ＤＮＡ電気泳動装置の操作状態を示す図（２）である。
【図４】ＤＮＡ電気泳動装置の操作状態を示す図（３）である。
【図５】実施例に使用したＤＮＡ電気泳動装置の構成を示す図である。
【図６】本実施例の方法により回収されたグロビュールＤＮＡ分子の蛍光顕微鏡写真図である。
【図７】回収されたＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動で分離した結果を示すゲル写真図である。
【図８】巨大ＤＮＡがグロビュール相転移するためのＰＥＧ濃度と金属イオン濃度との関係を調べたときの結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３４】
１，２１…ＤＮＡ電気泳動装置
２，２２…電気泳動槽
３Ａ…正極
３Ｂ…負極
４，２４…イオン供給用金属
５，２５…ＤＮＡ回収用セル
６…区画膜
７…ＤＮＡ
８，２８…ゲル
９…金属イオン
１０…グロビュール構造ＤＮＡ
３０…電気泳動用セル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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【図７】
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