(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子、及び糖尿病罹患の難易を検出し判定する方法を提供する。またこの検出方法の実施にあたり有効に使用することができる糖尿病易罹患性診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットを提供する。さらに糖尿病発症のリスク低減に有効な成分をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】ヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子としてRBMS3遺伝子を、また、糖尿病疾患感受性SNPマーカーとしてSNP125（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の32,573,955番）を提供する。さらに、糖尿病罹患の難易を検出する方法として、下の工程(a)及び(b)を含む糖尿病罹患の難易を検出する方法を提供する：(a)検体中のゲノムDNAを抽出する工程、及び(b)抽出したゲノムDNAを対象として、その塩基配列について、RBMS3遺伝子上のSNP125部位の塩基を検出し、ＣかＴの別を識別する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第３染色体を対象とした糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーに対する連鎖不平衡解析において、当該染色体領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーを含む領域である下記に示すハプロタイプブロックにオーバーラップする遺伝子であって、当該ハプロタイプブロックの塩基配列の一部またはすべてを含有する糖尿病疾患感受性遺伝子：
−  ヒト第３染色体のゲノム配列中、配列番号１に記載の塩基配列において３０１番目の塩基と、配列番号２に記載の塩基配列において３０１番目の塩基とで挟まれてなる88,130bpからなるハプロタイプブロック。
【請求項２】
ＲＢＭＳ３遺伝子である、請求項２記載の糖尿病疾患感受性遺伝子。
【請求項３】
ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列において、塩基ＣまたはＴを挟んで、5'側及び3'側にそれぞれ配列番号３記載の塩基配列及び配列番号４記載の塩基配列を含有する最長６０１塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、糖尿病易罹患性診断マーカー。
【請求項４】
以下の工程(a)及び(b)を含む糖尿病罹患の難易を検出する方法：
(a)  検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び
(b)  抽出したゲノムＤＮＡを対象として、その塩基配列に、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基を検出し、識別する工程。
【請求項５】
さらに下記の工程(c)を含む、請求項４記載の糖尿病罹患の難易を検出する方法：
(c)  配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基がＣであるかＴであるかを識別し、Ｃである場合に糖尿病易罹患性、またはＴである場合に糖尿病難罹患性であると判定する工程。
【請求項６】
糖尿病がヒト２型糖尿病である、請求項４または５に記載する糖尿病罹患の難易を検出する方法。
【請求項７】
ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子に含まれる配列番号５に記載する塩基配列において、３０１番目に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴ若しくはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴ若しくはポリヌクレオチド、またはその標識物。
【請求項８】
糖尿病罹患の難易を判定するために用いられる、請求項７のオリゴ若しくはポリヌクレオチド、またはその標識物からなるプローブ。
【請求項９】
ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子において、配列番号５に記載する塩基配列の３０１番目に位置する塩基を検出し識別するために用いられる、請求項８に記載するプローブ。
【請求項１０】
任意の固相に固定してなる固相化プローブである請求項８または９に記載するプローブ。
【請求項１１】
ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子に含まれる配列番号５に記載する塩基配列において、３０１番目に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴ若しくはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドを特異的に増幅するために用いられる１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物。
【請求項１２】
糖尿病罹患の難易を判定するために用いられる、請求項１１のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなるプライマー。
【請求項１３】
ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子において、配列番号５に記載する塩基配列の３０１番目に位置するヌクレオチドを検出し識別するために用いられる、請求項１２に記載するプライマー。
【請求項１４】
請求項８乃至１０のいずれかに記載するプローブ、または／及び請求項１２または１３に記載するプライマーを含む、糖尿病易罹患性検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
【請求項１５】
下記の工程を有する、糖尿病発症のリスク低減に有効な成分をスクリーニングする方法：
(1) ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子、またはその遺伝子の一部であって、少なくとも、塩基Ｃを挟んで5'側及び3'側にそれぞれ配列番号６記載の塩基配列及び配列番号７記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有する細胞に対して、被験物質を投与する工程、及び
(2) 投与した被験物質の中から、当該細胞中の上記ポリヌクレオチドの配列番号６記載の塩基配列と配列番号７記載の塩基配列に挟まれた塩基ＣをＴに変換させる物質を、候補物質として選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病、特にヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子に関する。また本発明は、糖尿病罹患の難易を検出し判定する方法に関する。当該方法は、より詳細にはヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、糖尿病の罹患に関連したＳＮＰｓ（単一塩基多型）を検出することにより、該試料提供者（被験者）が糖尿病に罹患する潜在的な危険度を有するか否かを検出し、判定する方法である。さらに本発明は、かかる検出方法の実施にあたり有効に使用することができる糖尿病易罹患性診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットに関する。また本発明は、糖尿病発症のリスク低減に有効な成分をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている疾患である。糖尿病はインスリン依存型の１型糖尿病とインスリン非依存性の２型糖尿病の二タイプに分別できるが、特に後者の２型糖尿病は日本人の糖尿病患者の９割以上を占める疾患であり、早期発見及び早期治療がその予後の点から重要である。
【０００３】
２型糖尿病の原因としては、インスリンの分泌低下またはインスリン感受性機構の異常によるインスリン作用の低下が挙げられる。欧米では多くは後者、すなわちインスリン抵抗性が主な原因であるが、日本の糖尿病患者の多くは前者のインスリン分泌低下が主な原因であるといわれている。しかしながら、このようなインスリン作用の低下を招く要因は多様であり、予想される原因についての知見は乏しいのが現状である。
【０００４】
また糖尿病は高血糖状態が持続することによって代謝異常を生じる疾患であるため、同時に眼、腎臓、神経系、心血管系及び皮膚などに種々の合併症を伴う。例えば糖尿病患者が腎症を併発すると腎障害が原因となって高血圧症や高脂血症を悪化させ、患者の予後を更に悪化させる。こうした糖尿病合併症を招かないためにも糖尿病の発症を事前に予防することが必要である。
【０００５】
ところで、近年のゲノム解析技術の飛躍的進歩に伴って、疾患と遺伝子との関連性が徐々に解明されつつある。例えば、疾患の原因となる遺伝的変異に関するものとして遺伝子多型〔例えば、ＳＮＰｓ(single nucleotide polymorphisms;単一塩基多型)〕が注目されており、遺伝子多型と疾患の関連性の探究が世界中で精力的に行われている。
【０００６】
同様に糖尿病に関しても遺伝子変異と糖尿病発症との関連が検討されている。現在までに明らかになっている、単独の異常によって糖尿病を発症するとされている遺伝子としては、インスリン、インスリン受容体、インスリンプロモーター因子、グルコキナーゼ、ヘパトサイトニュークレアーファクター、アミリン、骨格筋グリコーゲン合成酵素、およびミトコンドリア遺伝子などがある。また、２型糖尿病の発症に関与すると考えられる遺伝子として、インスリン受容体サブストレイト、グルコーストランスポーター、ミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、脂肪酸結合タンパク質、アドレナリンレセプター、グルカゴンレセプター、カリウムチャンネル、及びＣＤ３８等が挙げられる（例えば、非特許文献１参照のこと）。また最近、ＣＤ３８におけるＡｒｇ１４０Ｔｒｐ多型は、糖尿病のリスクを上昇させることが報告されており（例えば、非特許文献２参照のこと）、この多型は日本人の糖尿病患者の約１３％の頻度で見いだされていることから、糖尿病のリスク診断に有用であると考えられている。
【０００７】
しかし、２型糖尿病は遺伝的な素因（しかも多数の遺伝子が関連している）と環境的な素因とが共に関与して発症にいたる多因子疾患（Multifactorial Disease）であるため、一遺伝子の変異や異常からその罹患リスクを判断することは困難である。こうした中で、最近、連鎖解析の結果から、ヒトのゲノムＤＮＡには、民族または人種を越えて繰り返し連鎖している２型糖尿病疾患感受性領域が存在していることが明らかになり、その領域内に各人種に共通な２型糖尿病発症に関する原因変異、すなわち共通祖先遺伝子（Common Disease − Common Variant − Common Origin仮説を満たす疾患感受性遺伝子）が存在している可能性が指摘されている（例えば、非特許文献３〜８等参照のこと）。
【０００８】
しかし、連鎖解析で得られる２型糖尿病疾患感受性領域は広範囲にわたり、連鎖の原因となる「２型糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓ」と「連鎖解析」との直接の関係は未だ充分に解明されていない。
【非特許文献１】門脇孝編、「糖尿病の最前線」、羊土社、東京（1997）
【非特許文献２】ダイアベトロジア（Diabetologia）、41、p.1024-1028（1998）
【非特許文献３】クリニカル・ジェネティクス（Clinical Genetics）、2001年10月、第60巻、第4号、243-254
【非特許文献４】Bektas A et al., ダイアベテス（Diabetes）, 48 (11), p.2246-2251 (1999)
【非特許文献５】Bektas A et al., ダイアベテス（Diabetes） 50 (1), p.204-208 (2001)
【非特許文献６】Pratley RE et al., J. Clin. Invest. 101 (8), p.1757-1764 (1998)
【非特許文献７】Ehm MG et al., Am. J. Hum. Genet 66(6), p.1871-1881 (2000)
【非特許文献８】Wiltsjore S et al., Am. J. Hum. Genet 69 (3), p.553-569 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、人種の壁を超えて複数の民族に共通し得る糖尿病、特にヒト２型糖尿病の発症に関連する遺伝子多型並びに２型糖尿病疾患感受性遺伝子を提供し、さらにこれらの情報をもとにして個々の被験者について糖尿病、特にヒト２型糖尿病の発症危険度を判定するための方法を提供することである。さらに本発明の目的は、当該方法を簡便に実施するために有用な試薬および試薬キットを提供することである。
【００１０】
また本発明は、上記ヒト２型糖尿病の発症に関連する遺伝子多型並びにヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子に関する知見をもとに、糖尿病、特にヒト２型糖尿病の予防剤もしくは改善剤の有効成分を探索する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖尿病、特にヒト２型糖尿病の発症に関与する遺伝子多型を見いだすことを目的として、糖尿病患者及び健常者から単離したＤＮＡ試料を対象として、ヒト第３染色体上に存在する遺伝子について遺伝子多型の頻度を調べた結果、当該ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子のイントロン２の中に糖尿病患者にとりわけ高い頻度で現れる特定の遺伝子多型が１つ存在することを見いだした。そして、個々の被験者について当該遺伝子多型を検出することにより、糖尿病を発症する潜在的な危険度が高い確率で検出できることを見いだし、本発明を完成するにいたった。
【００１２】
すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである：
項１．ヒト第３染色体を対象とした糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーに対する連鎖不平衡解析において、当該染色体領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーを含む領域である下記に示すハプロタイプブロックにオーバーラップする遺伝子であって、当該ハプロタイプブロックの塩基配列の一部またはすべてを含有する糖尿病疾患感受性遺伝子：
−  ヒト第３染色体のゲノム配列中、配列番号１に記載の塩基配列において３０１番目の塩基と、配列番号２に記載の塩基配列において３０１番目の塩基とで挟まれてなる88,130bpからなるハプロタイプブロック。
項２．ＲＢＭＳ３遺伝子である、項２記載の糖尿病疾患感受性遺伝子。
項３．ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列において、塩基ＣまたはＴを挟んで、5'側及び3'側にそれぞれ配列番号３記載の塩基配列及び配列番号４記載の塩基配列を含有する最長６０１塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、糖尿病易罹患性診断マーカー。
項４．以下の工程(a)及び(b)を含む糖尿病罹患の難易を検出する方法：
(a)  検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び
(b)  抽出したゲノムＤＮＡを対象として、その塩基配列に、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基を検出し、識別する工程。
項５．さらに下記の工程(c)を含む、項４記載の糖尿病罹患の難易を検出する方法：
(c)  配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基がＣであるかＴであるかを識別し、Ｃである場合に糖尿病易罹患性、またはＴである場合に糖尿病難罹患性であると判定する工程。
項６．糖尿病がヒト２型糖尿病である、項４または５に記載する糖尿病罹患の難易を検出する方法。
項７．ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子に含まれる配列番号５に記載する塩基配列において、３０１番目に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴ若しくはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴ若しくはポリヌクレオチド、またはその標識物。
項８．糖尿病罹患の難易を判定するために用いられる、項７のオリゴ若しくはポリヌクレオチド、またはその標識物からなるプローブ。
項９．ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子において、配列番号５に記載する塩基配列の３０１番目に位置する塩基を検出し識別するために用いられる、項８に記載するプローブ。
項１０．任意の固相に固定してなる固相化プローブである項８または９に記載するプローブ。
項１１．ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子に含まれる配列番号５に記載する塩基配列において、３０１番目に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴ若しくはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドを特異的に増幅するために用いられる１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物。
項１２．糖尿病罹患の難易を判定するために用いられる、項１１のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなるプライマー。
項１３．ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子において、配列番号５に記載する塩基配列の３０１番目に位置するヌクレオチドを検出し識別するために用いられる、項１２に記載するプライマー。
項１４．項８乃至１０のいずれかに記載するプローブ、または／及び項１２または１３に記載するプライマーを含む、糖尿病易罹患性検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
項１５．下記の工程を有する、糖尿病発症のリスク低減に有効な成分をスクリーニングする方法：
(1) ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子、またはその遺伝子の一部であって、少なくとも、塩基Ｃを挟んで5'側及び3'側にそれぞれ配列番号６記載の塩基配列及び配列番号７記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有する細胞に対して、被験物質を投与する工程、及び
(2) 投与した被験物質の中から、当該細胞中の上記ポリヌクレオチドの配列番号６記載の塩基配列と配列番号７記載の塩基配列に挟まれた塩基ＣをＴに変換させる物質を、候補物質として選択する工程。
【００１３】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００１５】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００１６】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子を指す。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる１塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ（又はＳＮＰｓ）〕と連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。
【００１７】
本明細書において「糖尿病疾患感受性遺伝子」（又は「２型糖尿病疾患感受性遺伝子」）とは、多遺伝子性疾患である糖尿病（２型糖尿病）に罹りやすい体質を決める遺伝子のことをいう。
【００１８】
また、本明細書において「遺伝子頻度」とは、一つの遺伝子の座位について、集団中に存在する全遺伝子数のうち、その対立遺伝子が占める割合をいう。
【００１９】
本明細書において「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より頻繁に近傍の特定対立と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａ及びｂ（これらの等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃ及びｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０.２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまりａｃという特定の遺伝子型が頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択または集団に導入された時期が進化的にみて最近であることによって生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては連鎖不平衡の様式は異なり、ある集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係である場合もある。連鎖不平衡における遺伝子多型の検出は、当該多型そのものが直接疾患を引き起こさないにも拘わらず、疾患に対する感受性を検出するのに有効である。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａについて、それが疾患の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座Ｙの対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。
【００２０】
本明細書において「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの度合いを解析することをいう。実施例では、２つのマーカー間での連鎖不平衡の強さを示す連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜を非血縁健常者（対照者）１６４例のタイピングデータから算出することで連鎖不平衡解析を実施している。
【００２１】
本明細書において「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について２つの対立遺伝子が存在する場合において、遺伝子頻度の低い対立遺伝子（アレル）をいう。
【００２２】
なお、本明細書に記載する各塩基番号は、Celeraの位置情報に基づくものである。
【００２３】
２．糖尿病疾患感受性遺伝子の同定
本発明者らは、ＳＮＰｓと糖尿病、特にヒト２型糖尿病との関連に着目し、ヒト第３染色体を対象として、ある程度の間隔を有するようにＳＮＰｓをスクリーニングすることによって、糖尿病疾患感受性遺伝子と連鎖不平衡状態にあるＳＮＰｓを効果的に選択することができ、その結果、そのＳＮＰｓを含むハプロタイプブロックに存在する遺伝子を糖尿病疾患感受性遺伝子、特にヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子として同定することに成功した。
【００２４】
そこで、本発明はかかる糖尿病疾患感受性遺伝子、特にヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子を提供する。
【００２５】
なお、本発明の糖尿病疾患感受性遺伝子の同定は、実施例に記載するように、下記の工程を有する同定方法を実施することによって行われた。
(i) 健常対照者由来の試料を用いて、糖尿病疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しない複数のＳＮＰｓマーカーを選定する工程、
(ii) 工程(i)で選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と糖尿病罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択する工程、
(iii)工程(ii)で選択したＳＮＰｓマーカーについて、工程(ii)と異なる健常対照者集団と糖尿病罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定する工程、及び
(iv) 糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行い、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域（ハプロタイプブロック）を特定することにより、遺伝子を同定する工程。
【００２６】
上記工程(i)は、対象候補領域について健常対照者の試料からタイピングされたＳＮＰｓマーカーを選定する工程である。なお、本発明では、対象候補領域としてヒト第３染色体上の遺伝子領域を用いた。ここで、試料としては、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に限定されない。例として、末梢血などの血液、唾液、汗等の体液、体細胞およびそれを含む組織または器官等を挙げることができる。
【００２７】
なお、上記同定の全工程を通じて、用いる健常対照者集団および糖尿病罹患者集団は、糖尿病疾患感受性遺伝子を特定する人種と同じ人種で構成されている必要があり、例えば、日本人の糖尿病疾患感受性遺伝子を同定するには、対照集団は日本人健常者で構成されている必要がある。ＳＮＰｓマーカーは、米国のｄｂＳＮＰデータベース、東京大学医科学研究所および科学技術振興財団によるデータベース（ＪＳＮＰ）などのＳＮＰｓに関する各種データベースを用いて選定することも可能である。しかし、同一人種、同一民族など、比較的遺伝的に均質な母集団に対して、正確に遺伝子同定を行なうには、対象候補領域に対し、所望の母集団に属する健常対照者由来の試料に対し、ＳＮＰｓタイピングすることが好ましい。
【００２８】
ＳＮＰｓタイピングの方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＡＳＰ、ダイレクトシークエンス法、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ｄＨＰＬＣ、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等の当業者に周知の方法（例えば、「ゲノム創薬の最前線」ｐ４４−ｐ５４、野島 博 編、羊土社、参照）を用いることができるが、特に、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、ＴａｑＭａｎシステムを利用したＳＮＰｓタイピング法を採用することが効果的である。
【００２９】
本発明では、健常対照者由来の試料について対象候補領域内のＳＮＰｓタイピングした結果を基に、選択の指標として遺伝子頻度を利用して、糖尿病疾患感受性遺伝子の同定に有用なＳＮＰｓを選択した。具体的には、マイナーアレルの遺伝子頻度が１０％以上、好ましくは１５％以上のＳＮＰｓを選択する。このような遺伝子頻度のＳＮＰｓを用いることにより、信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを選定することができる。また、この遺伝子頻度が高いと、３０〜５０例程度の比較的少ない健常対照者のサンプル数で良好なＳＮＰｓマーカーが選定できるという利点もある。
【００３０】
なお、比較的少ないサンプル数で選定したマーカーについては、さらに別途健常対照者の試料を用いて選定したＳＮＰｓマーカーと比較することで確認したり、またハーディ−ワインベルグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡検定によりサンプリングの妥当性およびアッセイの妥当性を評価することにより、充分に信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを対象候補領域内に選定することができる。
【００３１】
ここで別途の健常対照者の試料を用いて選定したＳＮＰｓマーカーと比較する場合は、マイナーアレルの遺伝子頻度を指標に、選定したＳＮＰｓマーカーが別途の健常対照者の試料についても重複して選定できるか否かを確認することが望ましい。
【００３２】
また、ハーディ−ワインベルグ平衡検定によって評価する場合は、選定したＳＮＰｓマーカーについて検定を行なう。ハーディ−ワインベルグ平衡とは、ゲノム統計学の分野ではよく知られており、遺伝子型のタイピングエラーを評価およびサンプリングの妥当性の評価をする検定である。ＳＮＰｓなどのように２つの対立遺伝子（例えばＣとＴ）が存在し、集団におけるそれぞれの頻度がｐとｑのとき（ｐ＋ｑ＝１）、Ｃ／Ｃホモ、Ｃ／Ｔヘテロ、Ｔ／Ｔホモの遺伝子型頻度はそれぞれｐ2、２ｐｑ、ｑ2となる（ｐ2＋２ｐｑ＋ｑ2＝１）。健常対照者集団においてハーディ−ワインベルグ平衡が成立することが望ましいが、ハーディ−ワインベルグ平衡からのずれが統計学的に有意な差をもつものの個数が有意水準（典型的にはα＝０．０１〜０．０５）における予想範囲内であれば、選定したＳＮＰｓマーカーが妥当であると評価できる。
【００３３】
なお、遺伝子頻度を指標にＳＮＰｓマーカーを選定した場合、ＳＮＰｓマーカーが特定の狭い領域に偏在する場合がある。このような場合、選定した全てのＳＮＰｓマーカーを糖尿病疾患感受性遺伝子の同定に用いると、実験が煩雑になり、また、互いに近傍のＳＮＰｓは連鎖不平衡状態にあることも多く、効率的ではない。そこで、本発明では、おおよそある程度の間隔をもってＳＮＰｓマーカーを選択して選定した。このように、ある間隔をもたせて、マーカーの偏在をなくすことによって、対象候補領域（ヒト第３染色体遺伝子領域）全体にわたって網羅的な関連解析を行うことが可能となり、糖尿病疾患感受性遺伝子の同定を容易にすることができる。このように選定する互いに隣接するＳＮＰｓマーカー間の距離は、好ましくは５ｋｂ以上であり、特に好ましくは、５ｋｂ〜１０ｋｂである。この距離が長すぎると、ＳＮＰｓマーカー間の互いの連鎖不平衡の強さの程度が確認できない領域が生じる可能性がある。また、この距離が短すぎると、互いに強い連鎖不平衡が認められるＳＮＰｓが多く、後の連鎖不平衡解析において実験量が増大し効率的でない。
【００３４】
対象候補領域全体にわたって網羅的にＳＮＰｓマーカーを選定する上で、このＳＮＰｓマーカー間の距離とは別に、マーカーの対象候補領域内での散らばり具合、すなわちゲノムの単位距離あたりのマーカー個数を「マーカー密度」として表現することができる。本発明で選定したＳＮＰｓマーカーのマーカー密度は、ゲノム１０ｋｂあたり０．５ＳＮＰ以上、好ましくは１ＳＮＰ以上、特に好ましくは１ＳＮＰ〜２ＳＮＰｓである。マーカー密度が低すぎると、マーカー間の距離が長すぎ、前述するようにＳＮＰｓマーカー間の連鎖不平衡の強さの程度が確認できない領域が生じる可能性がある。一方、マーカー密度が高すぎると、マーカー間の距離が短すぎ、前述するように、マーカーが過密に選定されて糖尿病疾患感受性遺伝子を同定する場合に実験量が多くなり効率的ではなくなる。
【００３５】
次いで工程(ii)及びそれに続く工程(iii)は、上記工程(i)により、対象候補領域内（ヒト第３染色体上の遺伝子領域）に偏在することなく、ある間隔をあけて選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と糖尿病罹患者集団の間で観察される遺伝子頻度を比較することにより、糖尿病とＳＮＰｓマーカーの関連解析を行ない、糖尿病に関連するＳＮＰｓを選択する工程である。
【００３６】
関連解析は、典型的には、各ＳＮＰｓマーカーの遺伝子頻度を糖尿病罹患者集団と健常対照者集団とで比較し、頻度の差が統計学的に有意なものであるか否かについてχ2検定（統計学入門−基礎統計学Ｉ，東京大学教養学部統計学教室編、東大出版会、参照）することによるが、各ＳＮＰｓマーカーについての遺伝子型頻度、対立遺伝子陽性率での頻度によっても行うことができる。また、χ2検定以外にも、糖尿病罹患者集団と健常対照者集団とで比較すること、即ち、それについて複数集団に分けられる疾患等の表現形質と遺伝子多型の関連を検定することが可能であれば、他の周知の統計学的処理によって行なうことができる。
【００３７】
本発明では、糖尿病罹患者集団と健常対照者集団のそれぞれについて同一母集団由来の異なるサンプリング集団で関連解析を行なった。最初（１次）の関連解析では有意水準を緩くすることで検出力を上げ、偽陽性検出も含めて幅広く検出し、引き続いて実施される第２次関連解析については１次解析で選択されたマーカーＳＮＰｓのみを対象に通常の有意水準で疾患感受性ＳＮＰｓを検出し特定する（工程(ii)）。２次解析には１次解析で選択されたマーカーＳＮＰｓのみを対象とすることにより多重検定による偽陽性率の増加を効果的に抑えられる（工程(iii)）。
【００３８】
より具体的には次のように行なわれる（遺伝子頻度と疾患の独立性を検定するχ2検定の場合）。
【００３９】
まず、罹患者集団Ｄ１と健常対照者集団Ｈ１とから得られたそれぞれの試料について、対象候補領域内に選定したＳＮＰｓマーカーに対する関連解析（遺伝子頻度と疾患の独立性を検定するχ2検定）を行なう（工程(ii)）。Ｄ１とＨ１との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差を示すＳＮＰｓ、好ましくは有意水準α≦０．１０で有意差を示すＳＮＰｓ（Ｐ＜０．１０）、さらに好ましくは、有意水準α≦０．０７で有意差を示すＳＮＰｓ（Ｐ＜０．０７）を、疾患感受性ＳＮＰｓの候補ＳＮＰｓとして選択する。またＰ値について、Ｐ値が大きければ糖尿病との関連性が低く、小さければ関連性が高いことを示す。しかし、候補ＳＮＰｓを選択する場合に、Ｐ値のあまりに小さいものだけを選択すると、糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーの検出力を著しく低下させ、候補ＳＮＰｓの数が少なくなりすぎる危険がある。この段階での候補ＳＮＰｓの選択は、糖尿病疾患感受性を示す可能性のあるマーカーＳＮＰｓを統計学的偽陽性によって検出されたものも含めて幅広く拾い上げることである。
【００４０】
次に、この選択された候補ＳＮＰｓについて、先の集団Ｄ１および集団Ｈ１とは異なる糖尿病罹患者集団Ｄ２および健常対照者集団Ｈ２に由来する試料を用いて、関連解析を行なう（工程(iii)）。この関連解析は、先の関連解析と完全に独立して行なわれることが好ましいが、集団Ｄ２のサンプル数が集団Ｄ１のサンプル数よりも大きければ、完全に独立していなくても行なうことも可能である。また、集団Ｈ２のサンプル数は、集団Ｈ１のサンプル数よりも大きいことが好ましい。集団Ｄ２と集団Ｈ２についての関連解析（遺伝子頻度と糖尿病の独立性を検定するχ2検定）は、集団Ｄ１と集団Ｈ１についての関連解析の結果得られた候補ＳＮＰｓに対して行なう。ここで、Ｄ２とＨ２との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差を示すＳＮＰｓを糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定する。
【００４１】
このように２つの関連解析を独立して行ない、先に候補ＳＮＰｓを穏やかな条件で選択し、後に厳しい条件で疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを特定することで、２回の検定で連続して関連が検出されたより確実性の高いＳＮＰｓマーカーだけを特定でき、１次解析において偽陽性として検出されてきたＳＮＰｓ群は２次解析において排除することができる。ここで、「穏やかな条件」および「厳しい条件」とは、独立に行なった２つの関連解析の相対的な条件である。例えば、先の関連解析の有意水準の値α１と、後の関連解析の有意水準の値α２を比較して、α１＞α２であれば、先の関連解析が「穏やかな条件」で行なわれ、後の関連解析が「厳しい条件」で行なわれたことを示す。一般に、有意水準はα＝１×１０-3、α＝１×１０-4など小さければ小さいほど信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを選択することができるが、α１＞α２の条件下で、先の関連解析の有意水準をα１≦０．１０、好ましくはα１≦０．０７、さらに好ましくはα１≦０．０５である定数に定め、後の関連解析の有意水準をα２＜０．１０、α２＜０．０５、さらに好ましくはα２＜０．０１である定数とすることによって、より確実性の高いＳＮＰｓマーカーだけを特定することが可能になる。
【００４２】
次いで行われる工程(iv)は、上記で特定された糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを用いて、連鎖不平衡解析により糖尿病疾患感受性遺伝子を同定する工程である。
【００４３】
連鎖不平衡解析は、当業者に周知の方法であって、従来行なわれている各種の連鎖不平衡解析（例えば、「ポストゲノム時代の遺伝統計学」、p.183-201、鎌谷直之編、羊土社、参照）で行なうことができる。連鎖不平衡解析を行なうにあたり、例えば、ＳＮＰ疾患関連解析ソフト「ＳＮＰＡｌｙｚｅ ｖｅｒ． ２．１」（株式会社ダイナコム製）などの市販のプログラムを用いることができる。より具体的には、ＥＭ法による連鎖不平衡解析により、連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ＬＤ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を算出して解析することができる。連鎖不平衡解析は、上記で特定した糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとその近傍にある他のマーカーについて行なうが、先に対象候補領域内に選定したＳＮＰｓマーカーについて行なうことが好ましい。用いるマーカーの個数は、糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含めて、４ＳＮＰｓ以上、好ましくは２０ＳＮＰｓ以上、特に好ましくは３２ＳＮＰｓ以上であり、これら複数のＳＮＰｓマーカーを含む一連のＳＮＰｓマーカー群に対して行なう。
【００４４】
該ＳＮＰｓマーカー群のマーカー数は、同定する糖尿病疾患感受性遺伝子と関連するハプロタイプブロック（連鎖不平衡ブロック）を形成する領域の大きさによって、適宜、変更することができる。また、予めブロックの切れ目が予想されている場合は、そのブロックをはさんで６ＳＮＰｓ程度で行なうことも可能である。さらに、はじめに疾患感受性ＳＮＰｓマーカーをはさみ両側に５ＳＮＰｓの合計１１ＳＮＰｓに対して連鎖不平衡解析を行ない、必要に応じて、解析するマーカー数を増やしていってもよい。
【００４５】
連鎖不平衡解析の結果、対象候補領域内でＳＮＰｓが連鎖している領域（互いに強い連鎖不平衡が認められるＳＮＰｓマーカー群を含むハプロタイプブロック）を特定する。ハプロタイプブロックの特定は、連鎖不平衡の強度により、当業者が適宜なすことができるが、例えば、ガブリエルらの報告〔Gabriel SB et al., Science 296 (5576)：2225-2229 （2002）〕に準じて行なうことができる。なお、本発明では「ハプロタイプブロック」を、ほとんど歴史的組み換えが認められないゲノムを分割する範囲であって、その範囲内に強い連鎖不平衡が存在する領域と規定する。ここで「強い連鎖不平衡」とは、｜Ｄ'｜の９５％信頼区間上限が０．９８を超え、９５％信頼区間下限が０．７より上である状態をいい、「強い歴史的組み換えの証拠がある」とは、｜Ｄ'｜の９５％信頼区間上限が０．９未満である状態をいう。
【００４６】
本発明では、特に、選定されたＳＮＰｓマーカーについて全ての２ＳＮＰｓ間の組み合わせについて連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜を算出し、｜Ｄ'｜＞０．９を示した組み合わせを選択し、そのうち、もっとも遠いＳＮＰｓで挟まれる領域を含む一連の領域を「ハプロタイプブロック」と考え、ハプロタイプブロックの外で連続する３ＳＮＰｓは、ハプロタイプブロック内のＳＮＰとは、いずれの組み合わせでも｜Ｄ'｜は０．９以下であることを確認できた領域とした。
【００４７】
このようにしてハプロタイプブロックが特定されれば、例えば、その領域について、ゲノムに関するデータベース等を利用し、注目するハプロタイプブロックに存在する遺伝子を特定することができる。なお、データベースを利用しない場合でも、ハプロタイプブロック領域内に存在するＳＮＰｓマーカー近傍の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列から遺伝子を特定することも可能である。
【００４８】
斯くして同定した糖尿病疾患感受性遺伝子、好適にはヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子は、ヒト第３染色体を対象とした糖尿病疾患感受性マーカーに対する連鎖不平衡解析において、当該染色体領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域である「ハプロタイプブロック」にオーバーラップする遺伝子であり、当該ハプロタイプブロックの塩基配列の一部またはすべてを含有する遺伝子として特定される。ここでハプロタイプブロックは、ヒト第３染色体のゲノム領域中、配列番号１に記載する塩基配列において３０１番目の塩基と、配列番号２に記載する塩基配列において３０１番目の塩基とで挟まれてなる塩基長８８,１３０ｂｐからなる領域である。ここで「ハプロタイプブロックにオーバーラップする遺伝子」とは、ハプロタイプブロックの一部の領域と同じ塩基配列を有するか、またはハプロタイプブロックの全領域の塩基配列と同じ塩基配列を有する遺伝子の両方を意味する。
【００４９】
かかるハプロタイプブロックにオーバーラップする遺伝子として、好適には図１に示すように、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子を挙げることができる。なお、ＲＢＭＳ３遺伝子は、ヒト第３染色体のゲノム配列中、塩基番号32,386,925番から33,110,355番に位置する723,430bpの遺伝子であり（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483、Gene Name: Homo sapiens RNA binding motif, single strand interactin protein）、その中間領域の32,529,499番から32,617,629番の塩基領域が上記ハプロタイプブロックとオーバーラップする。ここで糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（特にヒト２型糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー）は、ハプロタイプブロックの中央に位置する32,573,955番目のＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である（以下、かかる糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーを単に「SNP125」とも称する）。
【００５０】
よって、本発明は、糖尿病疾患感受性遺伝子、特にヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子として、ＲＢＭＳ３遺伝子を提供する。なお、ＲＢＭＳ３遺伝子の蛋白質コード領域の塩基配列を配列番号８に示す。
【００５１】
３．糖尿病罹患性診断マーカー
本発明は、ヒト第３染色体を対象とした糖尿病疾患感受性マーカーに対する連鎖不平衡解析において、当該染色体領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ当該糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーを含む領域である上記の「ハプロタイプブロック」に存在する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含み、且つヒトゲノム上で特異的に認識されるオリゴまたはポリヌクレオチドを、糖尿病易罹患性診断マーカーとして提供する。
【００５２】
これらのオリゴまたはポリヌクレオチドの長さ（塩基長）は、ヒトゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、その限りにおいて特に制限されない。通常１０塩基長以上、好ましくは２０塩基長以上である。従って、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483）の塩基配列において、上記ハプロタイプブロックに存在する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を中心として、必要に応じて、５１塩基（SNP125の5'側及び3'側各25塩基ずつ）、２０１塩基（SNP125の5'側及び3'側各100塩基ずつ）、６０１塩基（SNP125の5'側及び3'側各300塩基ずつ）などとすることができる。具体的には、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483）の塩基配列において、塩基ＣまたはＴ（SNP125）を挟んで、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるポリヌクレオチドを例示することができる。
【００５３】
これらの塩基配列で特定されるオリゴまたはポリヌクレオチド（DNA断片）は、糖尿病、特にヒト２型糖尿病の遺伝的素因マーカーである。ゆえに、当該マーカーを含む遺伝子を検出することにより、被験者における糖尿病、特にヒト２型糖尿病発症の遺伝的素因を検査・診断することができる。この意味で、上記オリゴまたはポリヌクレオチドは、糖尿病易罹患性診断マーカーとして規定され、かつ使用することができる。
【００５４】
これらの糖尿病易罹患性診断マーカーの具体例としては、例えば塩基長５１のマーカーの例として、配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる糖尿病罹患性診断マーカーを、また塩基長６０１のマーカーの例として、配列番号１０に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる糖尿病罹患性診断マーカーをそれぞれ例示することができる。
【００５５】
４．糖尿病罹患の難易を検出する方法
本発明は、また被験者について糖尿病罹患の難易（糖尿病に罹り易いか罹り難いかの別）を検出する方法を提供する。本発明の糖尿病罹患の難易検出方法は、以下の工程(a)及び(b)を有するものであり、その限りにおいて、特に制限されるものではない：
(a)  検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び
(b)  抽出したゲノムＤＮＡを対象として、その塩基配列に存在する、配列番号３記載の塩基配列（好ましくは配列番号６記載の塩基配列）と配列番号４記載の塩基配列（好ましくは配列番号７記載の塩基配列）により挟まれた塩基を検出し識別する工程。
【００５６】
ここで、配列番号３または配列番号６で示される塩基配列は、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列において、前述する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）の塩基（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位の塩基）の5'側（上流側）に位置する、それぞれ２５塩基長または３００塩基長の塩基配列に該当し、配列番号４または配列番号７で示される塩基配列は、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列において、上記糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）の塩基の3'側（下流側）に位置する、それぞれ２５塩基長または３００塩基長の塩基配列に該当する。すなわち、検出する対象の塩基は、配列番号３（または配列番号６）及び配列番号４（または配列番号７）で示される各塩基配列に挟まれた、糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカーであるSNP125（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位の塩基）である。
【００５７】
当該検出によって、SNP125の塩基がＣ（シトシン）である場合、当該ゲノムＤＮＡ試料を提供した被験者は糖尿病、特にヒト２型糖尿病に罹患しやすい（糖尿病を発症する危険度が相対的に高い）と判断することができる。逆に、SNP125の塩基がＴ（チミン）である場合、当該ゲノムＤＮＡ試料を提供した被験者は糖尿病、特にヒト２型糖尿病に罹患しにくい（糖尿病を発症する危険度が相対的に低い）と判断することができる。
【００５８】
上記本発明の方法は、さらに下記の工程(c)を有することが好ましい：
(c) 配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基がＣであるかＴであるかを識別し、Ｃである場合に糖尿病罹患に罹りやすい（糖尿病易罹患性）、またはＴである場合に糖尿病罹患に罹りにくい（糖尿病難罹患性）と判定する工程。
【００５９】
当該方法によれば、糖尿病易罹患性及び糖尿病難罹患性の別、すなわち糖尿病発症危険度を判定することができる。当該糖尿病発症危険度の判定は、SNP125のＴ→Ｃ変異を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行なうことができる。このため、本発明の方法は、糖尿病の発症危険度の検出方法と言うこともできる。
【００６０】
なお、上記工程(a)（ゲノムＤＮＡの抽出）と工程(b)（目的塩基の検出）は、公知の方法〔例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
【００６１】
工程(a)においてゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００６２】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., "Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)"Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第３染色体上のＲＢＮＳ３遺伝子またはそのイントロン２を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、ＲＢＮＳ３遺伝子またはそのイントロン２にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００６３】
工程(ｂ)において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、糖尿病、特にヒト２型糖尿病に極めて関連性の深い糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー、すなわち上記（１）で詳説したＳＮＰ１２５の塩基を検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第３染色体上のＲＢＮＳ３遺伝子、好ましくはそのイントロン２の塩基配列を直接決定し、当該イントロン２の３３９６６番目（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位の塩基）に位置する塩基の変異（Ｔ／Ｃ）を調べる方法によってもよい。
【００６４】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００６５】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００６６】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（ HYPERLINK "http://www.talara.co.jp" http://www.takara.co.jp）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００６７】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明の糖尿病発症危険度の判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００６８】
なお、ＳＮＰ１２５のタイピングには、実施例で示すように、好適には、順方向のプライマーとして配列番号１１に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、逆方向のプライマーとして配列番号１２に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、ＶＩＣプローブとして配列番号１３に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、さらにＦＡＭプローブとして配列番号１４に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＴａｑＭａｎ法を行うことによって実施することができる（実施例参照）。
【００６９】
本発明の方法によって、糖尿病を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病の発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病の発症を予防するための、さらには糖尿病合併症の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００７０】
５．糖尿病易罹患性検出用試薬、これを含むキット
（１）プローブ
目的とする塩基（糖尿病疾患感受性SNPマーカー、SNP125）並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子上の糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰマーカー（SNP125）を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記ＲＢＭＳ３遺伝子上においてＳＮＰ１２５を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００７１】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰ１２５を含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００７２】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子に含まれる配列番号５に記載する塩基配列において、３０１番目に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７３】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について糖尿病、特にヒト２型糖尿病に対する易罹患性の有無を判定するために、ヒト第３染色体上のＲＢＭＳ３遺伝子上に位置する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含むオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００７４】
さらに好ましくは、当該プローブは、ＳＮＰ１２５を含むオリゴヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００７５】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適には糖尿病疾患感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。
【００７６】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００７７】
例えば、ＡＳＯ法の一例であるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal 14, 143 (1999), Morris T et al., J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)〕の場合、糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含む領域に相補的な２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5'末端を蛍光色素、3'末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5'側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。
【００７８】
ＡＳＯ法の別の１例であるＩｎｖａｄｅ法〔Lyamichev V. et al., Nat Biotechnol 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3'側と5'側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。
【００７９】
（２）プライマー
本発明は、またヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子上の糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125)を含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００８０】
このようなプライマー（オリゴヌクレオチド）は、ＲＢＭＳ３遺伝子において、ＳＮＰ１２５のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの１部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００８１】
以上のことから、ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子上の糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125)近傍の１５塩基以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、ＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００８２】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al., Nature Medicine vol.3, No.12, 1413-1416, (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常１５塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。
【００８３】
（３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００８４】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３'−オリゴラベリングシステム等）。
【００８５】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５'末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００８６】
本発明の１つの実施形態である、遺伝子多型検出法としてＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法を用いる場合、ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子上の、糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含む塩基配列を検出するためのフォワードプライマー（順方向のプライマー）としては、好適には配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの他、配列番号５に示す塩基配列において１〜３００番の領域に位置する塩基配列にハイブリダイズする１５塩基長以上（好ましくは１５〜３０塩基長）の連続した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを例示することができる。また、リバースプライマー（逆方向のプライマー）としては、好適には配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの他、配列番号５に示す塩基配列において３０２〜６０１番の領域に位置する塩基配列にハイブリダイズする１５塩基長以上（好ましくは１５〜３０塩基長）の連続した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００８７】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、糖尿病易罹患性検出用試薬として利用することができる。
【００８８】
（４）糖尿病易罹患性検出用試薬キット
本発明はまた、上記糖尿病易罹患性検出用試薬をキットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明のキットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【００８９】
６．糖尿病発症リスク低減方法
上記に説明するように、本発明によりヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子に位置する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位の塩基）に位置する塩基の変異（Ｔ→Ｃ）が糖尿病、特にヒト２型糖尿病の発症（易罹患性）に大きく関わっていることが判明した。このことから、当該ＳＮＰ１２５部位の変異（Ｔ→Ｃ）を正常な状態に戻す（Ｃ→Ｔ）ことによって、糖尿病、特にヒト２型糖尿病の発症危険度（易罹患性）を低減することができる。
【００９０】
こうした考えのもとで、本発明は糖尿病発症リスク低減方法並びに当該糖尿病発症リスク低減に有効な成分を提供するものでもある。なお、糖尿病発症リスク低減方法は、同様の考えのもと、糖尿病の発症を予防する方法（糖尿病予防方法）並びに糖尿病を改善する方法（糖尿病改善方法）として位置づけることができる（本発明における「糖尿病発症リスク低減方法」には、「糖尿病予防方法」及び「糖尿病改善方法」がいずれも含まれるものとする）。当該方法は、被験者のゲノムＤＮＡのヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子に位置する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）（Genbank Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位）に位置する塩基をＣ（シトシン）からＴ（チミン）に変異させることによって達成できる。上記目的が達成できる方法であれば、具体的な手法は特に制限されず、従来公知の方法並びに将来開発される手法がいずれも使用できる。
【００９１】
７．糖尿病発症リスク低減に有効な成分をスクリーニングする方法
また、本発明は、上記糖尿病発症リスク低減方法（糖尿病予防方法、糖尿病改善方法）を実現するために有用な医薬品や食品を開発するために有効な方法、具体的には糖尿病発症リスクを低減させるのに（糖尿病を予防または糖尿病を改善するために）有効な候補物質を選別するための方法（スクリーニング方法）を提供する。
【００９２】
当該スクリーニングは、例えば下記の工程によって実施することができる：
(1)  ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子、またはその遺伝子の一部であって、少なくとも塩基Ｃ（シトシン）を挟んで5'側及び3'側にそれぞれ配列番号６記載の塩基配列及び配列番号７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有する細胞に対して、被験物質を投与する工程、及び
(2)  投与した被験物質の中から、当該細胞中の上記ポリヌクレオチドの配列番号６記載の塩基配列と配列番号７記載の塩基配列に挟まれた塩基Ｃ（シトシン）をＴ（チミン）に変換させる物質を、候補物質として選択する工程。
【００９３】
なお、上記(2)の工程（候補物質の選択工程）は、ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子に位置する糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）（Sequence Accession IDs: NM_014483の配列中、32,573,955位）の塩基の変換（Ｃ→Ｔ）を直接評価する方法に限らず、間接的にそれが評価できる方法であればよい。例えば、当該ＳＮＰ１２５部位の塩基がＣからＴに変換することによって、生じる（増加する）〔または消失（低下）する〕機能、活性または特定の蛋白質量を測定する方法を例示することができる。
【００９４】
上記工程(1)で使用される細胞は、ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子、または少なくともＲＢＭＳ３遺伝子のイントロン２領域を含む遺伝子を導入することができ、且つそれを安定に保有し得る細胞であればよく、その由来（例えば、原核細胞及び真核成分の別や、昆虫細胞及び動物細胞の別など）は特に制限されない。なお、遺伝子導入や細胞培養等は、当業界において従来公知の方法を任意に使用して実施することができる〔例えば、Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning- A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratry, NY, 1982; ＷＯ2002-52000；「新生化学実験講座１８  細胞培養技術」日本生化学会編、東京化学同人、1990等〕。当該細胞は、糖尿病発症リスクを低減させるのに有効な候補物質を選別するための方法（スクリーニング方法）においてスクリーニングツールとして有効に利用することができる。
【００９５】
当該方法で用いられる被験物質としても特に制限されない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質及びペプチド等の単一化合物；並びに化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等の組成物を例示することができる。
【００９６】
(2)の工程（候補物質の選択工程）で選択された候補物質は、必要に応じてさらに他の薬理試験や臨床試験並びに毒性試験を経ることによって、よりヒトに対して有効で且つ安全な糖尿病発症のリスク低減剤（糖尿病予防薬、糖尿病の改善薬、健康食品）の有効成分として取得することができる。
【００９７】
斯くして得られる候補物質は、公知の方法によって処方並びに製剤化することによって糖尿病発症のリスク低減剤（糖尿病予防薬、糖尿病の改善薬、または健康食品）として提供することができる。
【発明の効果】
【００９８】
本発明によれば、糖尿病、特に２型糖尿病を発症する相対的な危険度を簡便に判定することができる。本発明の判定方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の判定方法によって糖尿病を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病の発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病の発症を予防するための、さらには糖尿病合併症の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００９９】
さらに本発明は上記判定法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【０１００】
また本発明によれば、本発明によって得られた糖尿病の発症に関連した新規遺伝子多型を利用した糖尿病発症リスク低減方法が提供できる。当該リスクの低減は、糖尿病の発症を予防したり、また発症した糖尿病の改善に有効に利用することができる。さらに本発明は糖尿病発症リスクを低減する有効成分のスクリーニング方法を提供するものであり、当該方法によれば有効成分の取得によって、糖尿病発症リスクの低減、ひいては糖尿病予防又は治療に有効な医薬品を開発することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
ヒト２型糖尿病遺伝子の同定
ヒト２型糖尿病は、従来から熱心に研究がされており、特にその連鎖解析は多数報告されている〔Bektas A et al., Diabetes 48(11) 2246-51 (1999); Bektas A et al., Diabetes 50(1) 204-8 (2001); Pratley RE et al., J Clin Invest 101(8) 1757-64 (1998); Ehm MG et al., Am J Hum Genet 66(6) 187-81 (2000); Wiltshire S et al., Am J Hum Genet 69(3) 553-69 (2001)〕。
【０１０３】
本発明では、ヒト第３染色体の３ｐ２４−３ｐ２２の領域を、複数の異なる研究・異なる人種で共通して認められるヒト２型糖尿病疾患感受性領域を同定するための対象候補領域として用いて、以下の実験を行った。
【０１０４】
１.試料
健常者集団（対照集団）及び糖尿病罹患者集団は、糖尿病疾患感受性遺伝子を特定する人種と同じ人種で構成されている必要があり、例えば、日本人の糖尿病疾患感受性遺伝子を同定するには、対照集団もまた日本人の健常者で構成されている必要がある。こうした観点から、本発明では日本人非血縁２型糖尿病患者及び日本人非血縁健常者（対照者）を対象とし、これらの対象者から末梢血を採取し、常法により全ゲノムＤＮＡを抽出したものを試料とした。
【０１０５】
２. 日本人非血縁健常者（対照者）についてのＳＮＰsタイピング
日本人非血縁健常者（対照者）に由来する試料４６例について、対象候補領域に対してＳＮＰsタイピングを行った。ＳＮＰsタイピングは、一部Assay-on-Demand（登録商標：アプライドバイオシステムズ製）を利用し、TaqMan法によって行った。また、Dual384-well GeneAmp（登録商標）PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ製）及びABI PROSM（登録商標）7900HT Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ製）の機器を用いた。
【０１０６】
なお、反応条件はABI PRISM（登録商標）7900HT Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ製）に添付の説明書に従った。反応系組成及びＰＣＲの条件は、それぞれ表１及び表２に示すとおりである。
【０１０７】
【表１】
2006254735.tif 000002
【０１０８】
【表２】
2006254735.tif 000003
【０１０９】
ＳＮＰｓタイピングの結果、対象候補領域内に、マイナーアレルの遺伝子頻度が１５％以上であり、かつ各ＳＮＰ間の距離が１０ｋｂ程度のＳＮＰが５０８個選択された（Japanese Common SNPs）。
【０１１０】
３．関連解析
次いで、信頼性が確認されたＳＮＰsマーカー（Japanese Common SNPs）及びタイピングデータを用いて関連解析を行った。なお、このＳＮＰsマーカー（Japanese Common SNPs）は、これまで当業界で比較的多用されているエクソン領域に偏って設定されたマーカーとは異なり、イントロン、非翻訳領域、遺伝子上流・下流領域を含めてほぼ等間隔に設定されたマーカーセットであり、その遺伝子領域の連鎖不平衡等の情報を効率的に把握することができるものである。
【０１１１】
なお、関連解析は、多重検定による偽陽性率の増加を抑制するために２つのステージに分けて行った。具体的には、下記に示すように、２型糖尿病患者集団と健常者（対照者）集団をそれぞれ２つの独立したパネルセット（第１セットと第２セットの２セット）に分割し、第１セットについて１次関連解析を行い、さらに第２セットについて２次関連解析を行った。詳細には、最初の１次関連解析（第１ステージ）では有意水準を緩くすることで検出力を上げ、偽陽性検出も含めて幅広く検出し、そして、引き続いて実施する２次関連解析（第２ステージ）では１次関連解析で選択されたＳＮＰsマーカーのみを対象として、通常の有意水準で糖尿病感受性ＳＮＰsを検出し、特定する。２次関連解析で１次関連解析で選択されたＳＮＰsマーカーのみを対象とした。こうすることによって、多重検定による偽陽性率の増加を効果的に抑えることが可能となる。
【０１１２】
（１）１次関連解析：第１ステージ
先に得られた５０８ＳＮＰｓ（100％）を対象に、日本人非血健常者（対照者）由来の試料１６４例および日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料１６４例について関連解析（第１ステージ；遺伝子頻度でのχ2検定）を行った。
【０１１３】
その結果、Ｐ＜０.０５となったのは２７ＳＮＰｓ、Ｐ＜０.０１となったのは０ＳＮＰｓであった。これを含めＰ＜０.１０を示した５２ＳＮＰｓ（全体の10.24％）を、次の関連解析（第２ステージ）の対象候補ＳＮＰｓとした。なお、かかるＰ値は、値が大きければ疾患との関連性が低く、小さければ関連性が高いことを示す。しかし、Ｐ値があまりにも小さいものだけを選択すると、糖尿病感受性ＳＮＰsマーカーの検出力を著しく低下させ、候補ＳＮＰsの数が少なくなりすぎる危険がある。従って第１ステージでの候補ＳＮＰsの選択は、当該疾患感受性を示す可能性のあるマーカーＳＮＰsを統計学的偽陽性によって検出されたものをも含めて幅広く広い上げた。
【０１１４】
なお、各ＳＮＰｓのタイピングは、Assays-on-Demand（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用したり、dbＳＮＰデータベース等を用いて、当該ＳＮＰｓの周辺配列を知り、適宜、プライマー等を設計し、常法により行うことができる。
【０１１５】
（２）２次関連解析；第２ステージ
上記で選択された５２個（全体の10.24％）の候補ＳＮＰｓについて、上記第１ステージで用いた集団とは異なる日本人非血縁健常者（対照者）集団に由来する試料２６２例および日本人非血縁２型糖尿病患者集団に由来する試料２０４例を対象に２次関連解析（第２ステージ）を行った。ここではより厳しい条件である、Ｐ＜０.０５を採用した。その結果、２型糖尿病疾患感受性ＳＮＰとして５つのＳＮＰｓ（全体の0.98％）が選択された。
【０１１６】
そこで、総サンプル〔日本人非血縁健常者（対照者）集団に由来する試料３６８例、および日本人非血縁２型糖尿病患者集団に由来する試料４２６例〕の関連解析にて糖尿病と遺伝子多型の関連の有無を確認した結果、２ＳＮＰｓ（全体の0.39％）が糖尿病疾患感受性ＳＮＰｓであると判断された。
【０１１７】
下記表３に、選択された２つのＳＮＰｓのうち、ＳＮＰ１２５について、アレル含有率（アレル１、アレル２）、ハーディ−ワインベルグ平衡検定におけるＰ値（HWE-P）、ローリスクアレルに対するハイリスクアレルのオッズ比（OR）を示す。当該ＳＮＰ１２５は、ハーディ−ワインベルグ平衡状態を満たし、ヒト２型糖尿病との関連が確認された。
【０１１８】
【表３】
2006254735.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2006254735.tif 000005
【０１２０】
６．連鎖不平衡解析
次いで、連鎖不平衡解析により２型糖尿病感受性遺伝子を同定する。
本発明では、上記で選択された２型糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125)について、その近傍にある３１個のＳＮＰｓ（ＳＮＰ１０９−ＳＮＰ１２４、ＳＮＰ１２６−ＳＮＰ１４０）とともに、連鎖不平衡解析を行った。
【０１２１】
解析対象サンプルとして、日本人非血縁健常者（対照者）由来の試料１６４例を用いた。なお、解析には、ＳＮＰ疾患関連解析ソフト「ＳＮＰＡ１ｙｚｅ ｖｅｒ．２．１」（株式会社ダイナコム製）を用い、一部ＥＭ法を利用した連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜（pair-wise LD coefficient）を算出して解析をした。
【０１２２】
（１）ＳＮＰ１２５及びＳＮＰ１２５近傍での連鎖不平衡解析
解析対象ＳＮＰｓとしてＳＮＰ１０９−ＳＮＰ１４０の３２個のＳＮＰｓを用いて連鎖不平衡解析を行った。結果を図２に示す。図２は、２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜の一覧と、各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図である。
【０１２３】
この結果から、対象候補領域内でＳＮＰsが連鎖している領域（互いに強い連鎖不平衡が認められるSNPsマーカー群を含むハプロタイプブロック）を特定した。当該ハプロタイプブロックの特定は、連鎖不平衡の強度を指標として当業者が適宜行うことができるが、例えばガブリエルらの報告〔Gabriel SB et al., Science 296 (5576): 2225-2229 (2002)〕に準じて行うことができる。特定するハプロタイプブロックは、殆ど歴史的組み換えが認められないゲノム範囲であり、その領域内では強い連鎖不平衡が存在すると考えられる。通常、｜Ｄ'｜の９５％信頼区間の上限が０.９未満の場合、その領域は「歴史的組み換えの証拠がある」領域として判断され、一方、｜Ｄ'｜の９５％信頼区間の上限が０.９８を超え、その下限が０.７より上である場合、その領域は「強い連鎖不平衡が存在する」領域として判断できる。斯くしてハプロタイプブロックが特定されれば、例えばその領域について対象としたゲノムに関するデータベース等を利用して、当該ハプロタイプブロックに存在する遺伝子を特定することができる。
【０１２４】
本発明では、２型糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含むＳＮＰ１０９−ＳＮＰ１４０の３２個のＳＮＰｓマーカーについて、全て２ＳＮＰｓ間の組み合わせについて連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜を算出し、｜Ｄ'｜＞０.９０を示す組み合わせを選択した。図１に示すように、少なくともＳＮＰ１２２からＳＮＰ１３０を含む８８.１３ｋｂ程度に亘り、｜Ｄ'｜＞０.９０を示す連鎖不平衡の非常に強いハプロタイプブロックが形成されていることが示された。このハプロタイプブロックは、ゲノム解析上、ヒト第３染色体に存在するＲＢＭＳ３遺伝子の一部分の領域であることがわかった。斯くして、ＲＢＭＳ３遺伝子は、ヒト２型糖尿病感受性遺伝子であることが同定された。
【実施例２】
【０１２５】
ヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子の解析
実施例１で同定されたヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子は、ヒト第３染色体上に存在するＲＢＭＳ３遺伝子（Genbank Sequence Accession 番号：NM_014483）であることがわかった。ＲＢＭＳ３遺伝子の塩基配列は、Genbankにおいて公表されている。
【実施例３】
【０１２６】
ＲＢＭＳ３遺伝子の多型と糖尿病との関連
ヒト第３染色体のＲＢＭＳ３遺伝子のイントロン２に存在する遺伝子多型（SNP125）と２型糖尿病との関連を関連解析法（アソシーエーション法）により解析した。有意差検定には、χ2乗法を用いた（フィッシャーら、バイオスタティスティクス(Biostatistics)、John Willey & Sons社、1993年、「基礎医学統計学  改訂第４版」、加納克己、高橋秀人共著、南江堂、1995年）。有意水準は危険率５％とし、危険率５％未満のものを有意差ありと判断した。
【０１２７】
◇２型糖尿病とＲＢＭＳ３遺伝子上のＳＮＰ１２５との関係
日本人の健常者４２４名、日本人のヒト２型糖尿病患者３６２名について、ＲＢＭＳ３遺伝子のＳＮＰ１２５部位におけるアレル頻度を算出し、アソシエーション法によりヒト２型糖尿病との関連を解析した。結果を表５に示す。
【０１２８】
【表５】
2006254735.tif 000006
【０１２９】
表５において、ＲＢＭＳ３遺伝子のイントロン２上のＳＮＰ１２５の塩基がシトシンの場合は「Ｃ」、チミンの場合は「Ｔ」として記載されている。表５の結果から、健常者とヒト２型糖尿病患者との間において、ＳＮＰ１２５の塩基の多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＲＢＭＳ３遺伝子のイントロン２上のＳＮＰ１２５の塩基の多型を調べることによって、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを確かに示すものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ヒト第３染色体上の糖尿病疾患感受性遺伝子（RBMS3遺伝子）、糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）、及びハプロタイプブロックの位置関係を示す模式図である。
【図２】糖尿病疾患感受性ＳＮＰマーカー（SNP125）を含む、２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ'｜の一覧および各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図を示す図である。
【図１】
2006254735.tif 000007
【図２】
2006254735.tif 000008
【配列表】
2006254735000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月16日(2005.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006254735000001.app