(57)【要約】  【課題】本発明は、アミド加水分解活性を有する微生物触媒を用いて、２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）からＤＬ−メチオニンを製造する方法を課題とする。  【解決手段】好熱性微生物、例えばスルホロバス(Sulfolobus）属に属する微生物由来のアミド加水分解酵素活性を有する微生物を水性媒体中６１〜９５℃で反応し、生成するアンモニアを水性媒体中から一部回収することにより、２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）からＤＬ−メチオニンを効率よく製造することができる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド加水分解活性を有する微生物触媒を、水性媒体中、６１〜９５℃で２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）に作用させることを特徴とするＤＬ−メチオニンの製造法。
【請求項２】
アミド加水分解活性を有する微生物触媒の作用中に、生成するアンモニアを水性媒体中から一部回収することを特徴とする請求項１記載のＤＬ−メチオニンの製造法。
【請求項３】
アミド加水分解活性を有する微生物触媒が、好熱性微生物由来のアミド加水分解酵素遺伝子または該遺伝子の一部を欠損または改変させた遺伝子を発現させた遺伝子組換え微生物の培養液、該菌体，または該菌体処理物であることを特徴とする請求項１または２記載のＤＬ−メチオニンの製造法。
【請求項４】
好熱性微生物由来のアミド加水分解酵素遺伝子または該遺伝子の一部を欠損または改変させた遺伝子を可溶性タンパク質と同時に発現させることを特徴とする請求項３記載のＤＬ−メチオニンの製造法。
【請求項５】
好熱性微生物がスルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）ＪＣＭ１１３２２、またはスルホロバス・トーコーダイ(Sulfolobus tokodaii)ＪＣＭ１０５４５であることを特徴とする請求項３または４いずれかに記載のＤＬ−メチオニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド加水分解活性を有する微生物触媒を用いて、２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）からＤＬ−メチオニンを製造する方法に関する。ＤＬ−メチオニンは飼料添加物として有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、アミド加水分解活性を有する微生物触媒を用いたメチオニンの製造法として、種々の方法が知られている。しかしながら、それらのほとんどが光学活性メチオニンの製造を目的としたものであり、この場合、ラセミ体基質からの生成収率が一般に５０％を越えることがないため、効率の良い製造法とは言えなかった。特許文献１では、Ｌ−アミノ酸アミドアミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼの併用法が記載されてはいるものの、収率が低く、実用的ではなかった。
ＤＬ−メチオニンの製造を目的としたものはほとんど無いが、特許文献２及び３が知られている。しかしながら、特許文献２記載のＤＬ−メチオニン製造方法は、メチオニン溶解度の低い３５℃，ｐＨ７．０の条件で反応が行われているため、メチオニンを高濃度に蓄積させるとメチオニンが析出して微生物触媒との分離が困難となり、実用性がある方法とは言い難い。特許文献３では３５〜６０℃で反応が行われているが、図１から明らかなように、さらに反応温度を高くするとメチオニンの溶解度が飛躍的に向上するため、メチオニン溶解蓄積濃度をさらに上げることが可能となり、より効率の良い製造法となり得る。また、反応温度が高い条件では、メチオニンの溶解度が高いために、メチオニンと同時に生成するアンモニアを水性媒体中から一部回収しながら反応を行うことも可能となる。アンモニアを水性媒体中から一部回収することは、アミド加水分解活性を有する微生物触媒にとって、アンモニアによる活性阻害や安定性低下を低減できる点で好都合である場合も多い。
【０００３】
微生物触媒に関しては、特許文献２ではブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物由来のアミダーゼが、特許文献３ではシュードノカルディア（Pseudonocardia）属に属する微生物が用いられているが、スルホロバス（Sulfolobus）属に属する微生物由来のアミド加水分解酵素が用いられた例はない。
【特許文献１】特表平３−５００４８４号公報
【特許文献２】国際公開００−２７８０９パンフレット
【特許文献３】特開２００４−２５４６９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、アミド加水分解活性を有する微生物触媒を用いて、２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）からＤＬ−メチオニンを効率よく製造する方法を提供することにある。
アミド加水分解活性とは、アミド化合物を加水分解して対応するカルボン酸とアンモニアに変換する活性を意味している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、メチオニンアミドからＤＬ−メチオニンを効率よく製造する方法について種々検討した結果、高温域で活性および安定性が高いアミド加水分解活性を有する微生物を見出し、本発明を完成するに至った。これらの微生物由来アミド加水分解酵素を用いることにより、メチオニン溶解度が向上する高温域での微生物触媒反応が可能となり、メチオニン溶解蓄積濃度を高くすることができるとともに、微生物触媒との分離が容易な製造法となる。また、アミド加水分解活性を有する微生物触媒にとって活性や安定性の点で好ましくない場合が多いアンモニアを水性媒体中から一部回収しても、メチオニン溶解度が向上する高温域反応条件では、メチオニンが析出してしまうこともなく、アンモニアの回収も容易である。
【０００６】
すなわち、本発明は、アミド加水分解活性を有する微生物触媒を、水性媒体中、６１〜９５℃で２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）に作用させることを特徴とするＤＬ−メチオニンの製造法（請求項１）、アミド加水分解活性を有する微生物触媒の作用中に、生成するアンモニアを水性媒体中から一部回収することを特徴とする請求項１記載のＤＬ−メチオニンの製造法（請求項２）、アミド加水分解活性を有する微生物触媒が、好熱性細菌由来のアミド加水分解酵素遺伝子または該遺伝子の一部を欠損または改変させた遺伝子を発現させた遺伝子組換え微生物の培養液、該菌体，または該菌体処理物であることを特徴とする請求項１または２記載のＤＬ−メチオニンの製造法（請求項３）、好熱性微生物由来のアミド加水分解酵素遺伝子または該遺伝子の一部を欠損または改変させた遺伝子を可溶性タンパク質と同時に発現させることを特徴とする請求項３記載のＤＬ−メチオニンの製造法（請求項４）、好熱性微生物がスルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）ＪＣＭ１１３２２、またはスルホロバス・トーコーダイ(Sulfolobus tokodaii)ＪＣＭ１０５４５であることを特徴とする請求項３または４記載のＤＬ−メチオニンの製造法（請求項５）である。
【発明の効果】
【０００７】
好熱性微生物、例えばスルホロバス(Sulfolobus）属に属する微生物由来のアミド加水分解酵素活性を有する微生物を用いることにより、２−アミノ−４−メチルチオブチルアミド（メチオニンアミド）からＤＬ−メチオニンを効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、用いられる微生物はアミド加水分解活性を有する微生物であれば、特に限定されるものではないが、高温域での高い活性および高い安定性が期待される好熱性微生物が好ましく、特にスルホロバス（Sulfolobus）属に属する好熱性微生物由来のアミド加水分解酵素遺伝子を発現させた遺伝子組換え微生物が好ましい。スルホロバス（Sulfolobus）属に属する微生物としては、例えばスルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）ＪＣＭ１１３２２、あるいはスルホロバス・トーコーダイ（Sulfolobus tokodaii）ＪＣＭ１０５４５、等を挙げることができる。これらの菌株は、独立行政法人  理化学研究所  微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）から容易に入手することができる。
【０００９】
また、該微生物よりクローニングしたアミド加水分解酵素遺伝子を任意の宿主で発現させた遺伝子組換え微生物も本発明でいうアミド加水分解活性を有する微生物に含まれる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Escherichia coli）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス（Bacillus）属菌、サーマス（Thermus）属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失もしくは挿入することにより、触媒性能を更に向上させた変異型のアミド加水分解酵素を発現させた遺伝子組換え微生物も本発明でいうアミド加水分解活性を有する微生物に含まれる。
【００１０】
本発明における微生物を本発明の製造方法に使用するに際しては、該微生物の培養液、該菌体、または該菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学，生物工学，遺伝子工学，等の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離・回収して得る方法が挙げられる。
【００１１】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のアミド加水分解活性画分を分離精製して得られる分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはアミド加水分解活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当する。
該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・分離物を固体化するための担体としては、セルロース，デキストラン等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミド，ポリビニルアルコール，イオン交換樹脂等の合成高分子、グルテン，アルギン酸，カラギーナン等の天然高分子、多孔性ガラス，アルミナ，シリカゲル，木炭，金属酸化物等の無機物質を挙げることができる。また、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・分離物を担体と架橋及び／または不溶化するために、１つまたはそれより多い化学薬剤を用いてもよい。
【００１２】
メチオニンアミドをＤＬ−メチオニンとアンモニアに変換する反応は、上記微生物触媒とメチオニンアミドを水性媒体中にて静置またはゆるやかな撹拌下に接触させることにより行われる。水性媒体中には、必要により緩衝能を有する物質を適宜添加してもよい。基質であるメチオニンアミドの濃度には特に制限はないが、通常は０．１〜３０重量％程度である。また、メチオニンアミドは連続的または間欠的に反応液に添加しても良い。微生物の培養液、該菌体、または該菌体処理物の反応液への添加量は、特に制限はないが、乾燥菌体重量換算で０．１〜６０ｇ／ｌの範囲で添加すればよい。メチオニンアミドをＤＬ−メチオニンとアンモニアに変換する反応は、ＤＬ−メチオニンが結晶として析出しない条件であれば特に制限はないが、反応温度は通常０〜１００℃、好ましくは６１〜９５℃、反応ｐＨは通常３〜１３、好ましくは７〜１２の範囲で行われる。
【００１３】
本発明において、生成するアンモニアの水性媒体中からの一部回収は、反応蒸留法や不活性ガスの流通法で実施することができる。アンモニアの回収率は、メチオニンが結晶として析出しない範囲であれば、特に制限はない。このようにして反応を行うと反応液中には、ＤＬ−メチオニンとアンモニアが蓄積する。この反応液から微生物触媒は通常の方法で分離することができる。微生物触媒分離後、この反応液から残りのアンモニアを回収すると、ＤＬ−メチオニン結晶が析出・分離できる。
【００１４】
以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
スルホロバス・ソルファタリカスＪＣＭ１１３２２由来アミダーゼの大腸菌用発現ベクターの構築
【００１６】
スルホロバス・ソルファタリカスＪＣＭ１１３２２株を表１のスルホロバス・ソルファタリカス液体培地（ｐＨ４．０）５ｍｌに接種して７０℃で７日間振とう培養し、培養液２ｍｌを遠心分離（１７７００×ｇ、１分間）して湿菌体を得た。この湿菌体より宝酒造社製の「Ｇｅｎとるくん（登録商標）（酵母・グラム陽性菌用）」キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。操作はキット指定のグラム陽性菌用プロトコールに従い、ゲノムＤＮＡをＴＥ溶液（５０μｌ）として得た。
【００１７】
【表１】
2006180751.tif 000002
【００１８】
スルホロバス・ソルファタリカスＪＣＭ１１３２２株由来のアミダーゼ遺伝子を増幅するため、該遺伝子の公知の塩基配列に基づいて以下の２種類のＰＣＲ用プライマーを合成した。なお、プライマーＳＳＡＭＦ（配列番号１）およびプライマーＳＳＡＭＲ（配列番号２）には各々制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位および制限酵素ＳａｃＩ切断認識部位が導入されており、増幅ＤＮＡ産物を両制限酵素で切断することにより、後述する発現ベクターｐＥＴ−２３ｄ（＋）のＮｃｏＩ部位−ＳａｃＩ部位間に容易に挿入することが可能となる。
【００１９】
先に調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ゲノムＤＮＡ溶液４μｌ、プライマーＳＳＡＭＦおよびプライマーＳＳＡＭＲを各々４０ｐｍｏｌと宝酒造社製のＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９４℃）１５秒、アニーリング（４０℃）３０秒、伸長反応（７２℃）２分の条件でＰＣＲを３０サイクル行なった。東洋紡社製の「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−」を用いてＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去し、増幅ＤＮＡ産物を得た。この増幅ＤＮＡ産物を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、制限酵素反応液をアガロースゲル電気泳動（Ｃａｍｂｌｅｘ社製ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧアガロースを使用；アガロース濃度１重量％）に供した。電気泳動後のアガロースゲルから約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル片を切り出し、キアゲン社製のＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてアミダーゼ遺伝子断片を回収した。
【００２０】
次に、大腸菌用発現ベクタープラスミドｐＥＴ−２３ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、制限酵素反応液をアガロースゲル電気泳動（ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧアガロースを使用；アガロース濃度１重量％）に供した。電気泳動後のアガロースゲルから約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてベクターＤＮＡ断片を回収した。このベクターＤＮＡ断片と先に得られたアミダーゼ遺伝子断片を東洋紡社製のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて連結し、ライゲーション反応後のＤＮＡ溶液を用いて宝酒造社製の大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテント細胞を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（１重量％バクト（登録商標）トリプトン、０．５重量％バクト（登録商標）酵母エキス、１重量％塩化ナトリウム、１．５重量％寒天；ｐＨ７．０）上に形質転換処理後の菌液を５０μｌ塗布して３７℃で一晩培養し、約１５０個のコロニーを得た。得られた形質転換体コロニーより数クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（以下ＬＢ−Ａｍｐ培地）３ｍｌに接種して３７℃で一晩振とう培養し、東洋紡社製の「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−Ｐｌａｓｍｉｄ−」を用いて培養液からプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動（アガロース濃度１重量％）により分析し、アミダーゼ遺伝子増幅断片（１．５ｋｂｐ）が正しく連結されているクローンを選んでプラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＭと命名した。このプラスミドの塩基配列をＤＮＡシーケンサーを用いて解析し、スルホロバス・ソルファタリカスＪＣＭ１１３２２株由来のアミダーゼ遺伝子の全長が誤りなく挿入されていることを確認した。
【実施例２】
【００２１】
スルホロバス・ソルファタリカスＪＣＭ１１３２２由来のアミダーゼを発現する形質転換大腸菌株によるメチオニンアミドのメチオニンへの変換
【００２２】
実施例１で得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＭを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＳＳＡＭを得た。この形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ培地３ｍｌに接種して３７℃で５時間振とう培養した。得られた前培養液の２ｍｌをＬＢ−Ａｍｐ培地５０ｍｌに接種して３７℃、１６０回転／分で旋回培養した。培養開始から１．６時間後、培養液の濁度（波長６００ｎｍ）が０．５６に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、さらに４．４時間培養した。この培養液を遠心分離（１６００×ｇ、３０分間）して上清を除き、湿菌体を１２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁したのち再び遠心分離（１６００×ｇ、３０分間）することによって湿菌体１２６ｍｇを得た。得られた湿菌体６３ｍｇを９４μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、濃度２０％のＤＬ−メチオニンアミド溶液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整したもの）を１５７μｌ添加して室温で１５分間静置した。この反応液の一部（２０μｌ）をサンプリングし、遠心分離により菌体を除いて得られた上清をＨＰＬＣ（東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム、溶離液  水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸＝９５０：５０：１）により分析したところ、ＤＬ−メチオニンアミドの濃度は９．２５ｗ／ｖ％（０．６２４Ｍ）であった。反応液の残りを７０℃で２０時間静置した後、反応液から遠心分離により菌体を除いて得られた上清をＨＰＬＣにより分析したところ、ＤＬ−メチオニンアミドは完全に消失しており、メチオニンの生成が認められた。メチオニンの蓄積濃度は９．３０ｗ／ｖ％（０．６２３Ｍ）であり、反応収率は１００％であった。また、生成したメチオニンを光学異性体分離用薄層クロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製ＣＨＩＲＡＬＰＬＡＴＥ（登録商標）、展開溶媒メタノール：水：アセトニトリル＝１：１：４）で分析したところ、ラセミ体であった。
【実施例３】
【００２３】
スルホロバス・トーコーダイＪＣＭ１０５４５由来アミダーゼの大腸菌用発現ベクターの構築
【００２４】
スルホロバス・トーコーダイＪＣＭ１０５４５株を表２のスルホロバス（Ｂ）液体培地（ｐＨ３．５）５ｍｌに接種して７５℃で２日間振とう培養し、培養液４．５ｍｌを遠心分離（１７７００×ｇ、１分間）して湿菌体を得た。この湿菌体より宝酒造社製の「Ｇｅｎとるくん（登録商標）（酵母・グラム陽性菌用）」キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。操作はキット指定のグラム陽性菌用プロトコールに従い、ゲノムＤＮＡをＴＥ溶液（５０μｌ）として得た。
【００２５】
【表２】
2006180751.tif 000003
【００２６】
スルホロバス・トーコーダイＪＣＭ１０５４５株由来のアミダーゼ遺伝子を増幅するため、該遺伝子の公知の塩基配列に基づいて以下の２種類のＰＣＲ用プライマーを合成した。なお、プライマーＳＴＯＡＭＦ（配列番号３）およびプライマーＳＴＯＡＭＲ（配列番号４）には各々制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位および制限酵素ＢａｍＨＩ切断認識部位が導入されており、増幅ＤＮＡ産物を両制限酵素で切断することにより、発現ベクターｐＥＴ−２３ｄ（＋）のＮｃｏＩ部位−ＢａｍＨＩ部位間に容易に挿入することが可能となる。また、プライマーＳＴＯＡＭＦへの制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位の導入に伴い、増幅されるアミダーゼ遺伝子において開始コドンの次のコドンが元のＡＡＧ（リジン）からＧＧＧ（グリシン）に置換される。
【００２７】
先に調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ゲノムＤＮＡ溶液４μｌ、プライマーＳＴＯＡＭＦおよびプライマーＳＴＯＡＭＲを各々４０ｐｍｏｌと宝酒造社製のＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９４℃）１５秒、アニーリング（４９℃）３０秒、伸長反応（７２℃）２分の条件でＰＣＲを３０サイクル行なった。東洋紡社製の「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−」を用いてＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去し、増幅ＤＮＡ産物を得た。この増幅ＤＮＡ産物を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断し、制限酵素反応液をアガロースゲル電気泳動（Ｃａｍｂｌｅｘ社製ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧアガロースを使用；アガロース濃度０．７重量％）に供した。電気泳動後のアガロースゲルから約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル片を切り出し、キアゲン社製のＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてアミダーゼ遺伝子断片を回収した。
【００２８】
次に、大腸菌用発現ベクタープラスミドｐＥＴ−２３ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断し、制限酵素反応液をアガロースゲル電気泳動（ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧアガロースを使用；アガロース濃度０．７重量％）に供した。電気泳動後のアガロースゲルから約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてベクターＤＮＡ断片を回収した。このベクターＤＮＡ断片と先に得られたアミダーゼ遺伝子断片を東洋紡社製のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて連結し、ライゲーション反応後のＤＮＡ溶液を用いて東洋紡社製の大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテント細胞を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に形質転換処理後の菌液を１００μｌ塗布して３７℃で一晩培養し、約１２０個のコロニーを得た。得られた形質転換体コロニーより数クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種して３７℃で一晩振とう培養し、東洋紡社製の「ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）−Ｐｌａｓｍｉｄ−」を用いて培養液からプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動（アガロース濃度０．７重量％）により分析し、アミダーゼ遺伝子増幅断片（１．２ｋｂｐ）が正しく連結されているクローンを選んでプラスミドｐＥＴ−ＳＴ１と命名した。このプラスミドの塩基配列をＤＮＡシーケンサーを用いて解析した結果、先に述べたプライマーＳＴＯＡＭＦに由来する人為的な塩基配列の改変箇所を除いてスルホロバス・トーコーダイＪＣＭ１０５４５株由来のアミダーゼ遺伝子の全長が誤りなく挿入されていることを確認した。
【実施例４】
【００２９】
スルホロバス・トーコーダイＪＣＭ１０５４５由来のアミダーゼを発現する形質転換大腸菌株によるメチオニンアミドのメチオニンへの変換
【００３０】
実施例３で得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＴ１を宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＳＴ１を得た。この形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌに接種して３７℃で４時間振とう培養した。得られた前培養液の１ｍｌをＬＢ−Ａｍｐ培地５０ｍｌに接種して３７℃、１６０回転／分で旋回培養した。培養開始から２．５時間後、培養液の濁度（波長６００ｎｍ）が０．６に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍＭとなるように添加し、さらに３時間培養した。この培養液を遠心分離（１６００×ｇ、３０分間）して上清を除き、湿菌体を１２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁したのち再び遠心分離（１６００×ｇ、３０分間）することによって湿菌体２６６ｍｇを得た。得られた湿菌体６２ｍｇを１９３μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、濃度２０％のＤＬ−メチオニンアミド溶液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整したもの）を５５μｌ添加して室温で１５分間静置した。この反応液の一部（２０μｌ）をサンプリングし、遠心分離により菌体を除いて得られた上清をＨＰＬＣ（東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム、溶離液  水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸＝９５０：５０：１）により分析したところ、ＤＬ−メチオニンアミドの濃度は３．３０ｗ／ｖ％（０．２２３Ｍ）であった。反応液の残りを７０℃で２０時間静置した後、反応液から遠心分離により菌体を除いて得られた上清をＨＰＬＣにより分析したところ、ＤＬ−メチオニンアミドは完全に消失しており、メチオニンの生成が認められた。メチオニンの蓄積濃度は３．３２ｗ／ｖ％（０．２２３Ｍ）であり、反応収率は１００％であった。また、生成したメチオニンを光学異性体分離用薄層クロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製ＣＨＩＲＡＬＰＬＡＴＥ（登録商標）、展開溶媒メタノール：水：アセトニトリル＝１：１：４）で分析したところ、ラセミ体であった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＤＬ−メチオニンおよび等モルのアンモニア存在下でのＤＬ−メチオニンの５〜９５℃における水溶解度を求めた結果を示す図である。
【図１】
2006180751.tif 000004
【配列表】
2006180751000001.app