(57)【要約】【課題】ＰＮＡモノマー単位およびＤＮＡモノマー単位のキメラ分子、ならびにライゲーション産物を生成するためのライゲーション方法におけるその使用すること。【解決手段】テンプレート依存型ライゲーション産物を産生する方法であり、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを、テンプレート核酸およびリガーゼの存在下で、第２プローブに酵素的に連結する工程を包含し、ここでキメラプローブがＰＮＡ部分およびＤＮＡ部分を有し、ＤＮＡ部分が、少なくとも２つのヌクレオチドおよび３’ヒドロキシル末端または５’ヒドロキシル末端を有し、ここで、キメラプローブおよび第２プローブが、それぞれテンプレート核酸にハイブリダイズされ、そして互いに隣接し、そしてＰＮＡ部分の少なくとも一部分がテンプレートにハイブリダイズされ、そしてここで第２プローブはＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート依存型ライゲーションの方法であり、以下の工程：
ａ）ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを、テンプレートの存在下で、第２プローブに酵素的に連結することにより、ライゲーション産物を生成する工程であって、ここで、該キメラプローブおよび該第２プローブは、該テンプレートに相補的であり、そして隣接してハイブリダイズされる、工程であり、ここで、該第２プローブはＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである、工程；および
ｂ）該ライゲーション産物を検出する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記キメラプローブおよび／または前記第２プローブが、非放射線同位体で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
テンプレート依存型ライゲーションのためのキットであって、以下：ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、５〜１５の連続したＰＮＡモノマー単位、２〜１５の連続したヌクレオチド、および３’ヒドロキシル末端を含む該プローブ；ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである第２プローブ；ならびにリガーゼ酵素を含む、キット。
【請求項４】
前記キメラプローブおよび／または前記第２プローブが、非放射線同位体で標識される、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記キメラプローブに相補的な配列を含むか、または該キメラプローブに関して１つ以上のミスマッチを含むテンプレート核酸をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項６】
ポリヌクレオチドキナーゼをさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項７】
二重鎖ハイブリッドであって、以下：
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである第２プローブ、および該キメラプローブに相補的な配列を有するテンプレート核酸か、または該キメラプローブに関して１つ以上のミスマッチを含むテンプレート核酸、を含み、
ここで、該第２プローブの末端は、該テンプレート上で該キメラプローブの末端に隣接してハイブリダイズし、そして該末端はリガーゼ酵素により共に連結され得る、二重鎖ハイブリッド。
【請求項８】
前記キメラプローブおよび／または前記第２プローブが、非放射性同位体で標識される、請求項７に記載の二重鎖ハイブリッド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドキナーゼをさらに含む、請求項７に記載の二重鎖ハイブリッド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、概して、酵素学および核酸アナログの分野に関する。詳細には、本発明は、リガーゼ酵素を用いたＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよびオリゴヌクレオチドのテンプレート依存型ライゲーションに関する。
【０００２】
（ＩＩ．参考文献）
【０００３】
【化１】
2006055177.tif 000002
【０００４】
【化２】
2006055177.tif 000003
【０００５】
【化３】
2006055177.tif 000004
【０００６】
【化４】
2006055177.tif 000005
【０００７】
【化５】
2006055177.tif 000006
【背景技術】
【０００８】
（ＩＩＩ．背景）
リガーゼ酵素による核酸プローブの共有結合は、分子生物学者に利用可能な最も有用なツールの１つである。２つのプローブがテンプレート核酸（ここで、２つのプローブは隣接し、そして介在ギャップを伴わない）にアニーリングされる場合、リガーゼ酵素によりリン酸ジエステル結合が形成され得る（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、１９８９）。一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間に、ライゲーション結合が形成される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アニーリングおよびライゲーションという事象はそれぞれ、連結プローブの配列とテンプレート核酸の配列との間に高レベルの忠実度（すなわち、相補性）を必要とする。塩基対のミスマッチが生じる場合、両事象は効率が悪い。一般に、ＤＮＡリガーゼは、それらがＰＣＲ産物のような変性テンプレート核酸を完全に補完する場合にのみ、２つの隣接するプローブを連結し得る（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，１９８８；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，１９９０）。プローブのライゲーション部位での、またはその近くの一つのヌクレオチドミスマッチでさえ、アニーリングされたプローブのライゲーションを阻止する。
【００１０】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的ＤＮＡサンプルにおいて特異的な配列の存在を検出する。例えば、対立遺伝子識別アッセイは、標的に対する対立遺伝子型の相補的な配列を表すプローブに依存する。共通の、標的に相補的な第２のプローブへのライゲーションは、多型部位の存在を示す（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，１９８８）。ライゲーションの不在は、多型部位がないことを示す。ライゲーションは、対立遺伝子プローブ上の検出可能な標識、およびライゲーション産物の電気泳動分離により検出され得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９９４）。
【００１１】
最適化されたプローブ、ならびにアニーリングおよびライゲーションの方法を提供することが望ましい。このような方法は、より高い精密さおよび正確さから利益を得ることでアッセイおよび試験を改良する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（項目１）
テンプレート依存型ライゲーション産物を産生する方法であり、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを、テンプレート核酸およびリガーゼの存在下で、第２プローブに酵素的に連結する工程を包含し、ここで上記キメラプローブがＰＮＡ部分およびＤＮＡ部分を有し、上記ＤＮＡ部分が、少なくとも２つのヌクレオチドおよび３’ヒドロキシル末端または５’ヒドロキシル末端を有し、
ここで、上記キメラプローブおよび上記第２プローブが、それぞれ上記テンプレート核酸にハイブリダイズされ、そして互いに隣接し、そして上記ＰＮＡ部分の少なくとも一部分が上記テンプレートにハイブリダイズされ、そしてここで上記第２プローブはＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである、方法。
【００１３】
（項目２）
上記ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが以下の構造を有する項目１に記載の方法：
Ｐx−Ｌ−Ｎy 
ここで：
各Ｐは独立して、ＰＮＡモノマーであり；
ｘは３〜１５の整数であり；
各Ｎは独立して、ヌクレオチドであり；そして
ｙは２以上の整数であり；
ＬはＰとＮとの間の共有結合を表す；
ただし、上記末端ヌクレオチドＮが、３’−ヒドロキシル基または５’−ヒドロキシル基を有する。
【００１４】
（項目３）
上記キメラの上記３’−末端ヌクレオチドＮが、３’−リン酸基を含み、そして上記第２プローブの５’末端が、５’−ヒドロキシルを含む、項目２に記載の方法。
【００１５】
（項目４）
上記キメラの上記３’−末端ヌクレオチドＮが、３’−ヒドロキシルを含み、そして上記第２プローブの５’末端が、５’−リン酸基を含む、項目２に記載の方法。
【００１６】
（項目５）
上記キメラの上記５’−末端ヌクレオチドＮが、５’−リン酸基を含み、そして上記第２プローブの３’末端が、３’ヒドロキシルを含む、項目２に記載の方法。
【００１７】
（項目６）  上記キメラの上記５’−末端ヌクレオチドＮが、５’−ヒドロキシルを含み、そして上記第２プローブの３’末端が、３’−リン酸基を含む、項目２に記載の方法。
【００１８】
（項目７）
上記Ｐxが２−アミノエチルグリシンペプチド核酸である、項目２に記載の方法。
【００１９】
（項目８）
上記各ヌクレオチドＮが、独立して、２’−デオキシリボヌクレオチドである、項目２に記載の方法。
【００２０】
（項目９）
上記各ヌクレオチドＮが、独立して、リボヌクレオチドである、項目２に記載の方法。
【００２１】
（項目１０）
上記Ｎyの核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン、および４（３Ｈ）−ピリミドンからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
【００２２】
（項目１１）
上記Ｎyの糖が、２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリル−リボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’，４’−結合ヌクレオチド、および二環式ヌクレオチドからなる群から各々独立に選択される、項目２に記載の方法。
【００２３】
（項目１２）
上記ＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよび／または上記オリゴヌクレオチドが、非放射性同位体で標識される、項目１に記載の方法。
【００２４】
（項目１３）
上記ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、上記ＰＮＡ部分のアミノ末端で標識される、項目１２に記載の方法。
【００２５】
（項目１４）
上記オリゴヌクレオチドが、核酸塩基で標識される、項目１２に記載の方法。
【００２６】
（項目１５）
上記核酸塩基が、上記プリンまたはデアザプリンの７−デアザ位またはＣ−８位、および上記ピリミジンのＣ−５位で標識される、項目１４に記載の方法。
【００２７】
（項目１６）
上記標識が、蛍光色素、蛍光消光剤、ハイブリダイゼーション安定剤、エネルギー移動色素セット（ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｙｅ  ｓｅｔ）、電気泳動移動度変更剤、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素、および親和性リガンドからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００２８】
（項目１７）
上記標識が、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、芳香族置換キサンテン色素、４，７−ジクロロ−フルオレセイン、４，７−ジクロロ−ローダミン、およびシアニンからなる群から選択される蛍光色素である、項目１６に記載の方法。
【００２９】
（項目１８）
上記標識が、ＴＡＭＲＡ、ｄ−ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、ＮＴＢおよびシアニンからなる群から選択される蛍光消光剤である、項目１６に記載の方法。
【００３０】
（項目１９）
上記標識が、マイナーグルーブ結合剤であるハイブリダイゼーション安定剤である、項目１６に記載の方法。
【００３１】
（項目２０）
上記マイナーグルーブ結合剤が、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシン、ジスタマイシンからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
【００３２】
（項目２１）
上記標識が、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、ペプチド、およびフルオレセインからなる群から選択される親和性リガンドである、項目１６に記載の方法。
【００３３】
（項目２２）
上記オリゴヌクレオチドが、３’末端で標識される、項目１２に記載の方法。
【００３４】
（項目２３）
上記オリゴヌクレオチドが、５’末端で標識される、項目１２に記載の方法。
【００３５】
（項目２４）
上記Ｌが、共有結合、リン酸、ホスホルアミデート、１〜２０の炭素原子からなるアルキルジイル、６〜２０の炭素原子からなるアリールジイル、Ｏ−リンカー、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ここでｍは１〜６である）からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
【００３６】
（項目２５）
上記テンプレート核酸がＤＮＡであり、そして上記リガーゼが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、および熱安定性リガーゼからなる群から選択されるリガーゼである、項目１に記載の方法。
【００３７】
（項目２６）
上記テンプレート核酸がＲＮＡであり、そして上記リガーゼがＲＮＡリガーゼである、項目１に記載の方法。
【００３８】
（項目２７）
上記ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、上記第２プローブ、または上記テンプレート核酸が、固体基材上に固定される、項目１に記載の方法。
【００３９】
（項目２８）
上記ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、上記第２プローブ、または上記テンプレート核酸が、必要に応じて、リンカーの補助を伴い、上記固体基材に共有結合される、項目２７に記載の方法。
【００４０】
（項目２９）
上記固体基材が、ポリスチレン、コントロールド−ポア−ガラス、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、ならびに上記固体基材のいずれかのコポリマーおよびグラフトからなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
【００４１】
（項目３０）
上記固体基材が、微粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、マイクロマシン化チップ、アルカンチオール−金層、非多孔質表面、およびポリヌクレオチド固定化媒体、からなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
【００４２】
（項目３１）
テンプレート依存型ライゲーションの方法であり、以下の工程：
ａ）ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを、テンプレートの存在下で、第２プローブに酵素的に連結することにより、ライゲーション産物を生成する工程であって、ここで、上記キメラプローブおよび上記第２プローブは、上記テンプレートに相補的であり、そして隣接してハイブリダイズされる、工程であり、ここで、上記第２プローブはＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである、工程；および
ｂ）上記ライゲーション産物を検出する工程、
を包含する方法。
【００４３】
（項目３２）
上記キメラプローブおよび／または上記第２プローブが、非放射線同位体で標識される、項目３１に記載の方法。
【００４４】
（項目３３）
テンプレート依存型ライゲーションのためのキットであって、以下：ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、５〜１５の連続したＰＮＡモノマー単位、２〜１５の連続したヌクレオチド、および３’ヒドロキシル末端を含む上記プローブ；ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである第２プローブ；ならびにリガーゼ酵素を含む、キット。
【００４５】
（項目３４）
上記キメラプローブおよび／または上記第２プローブが、非放射線同位体で標識される、項目３３に記載のキット。
【００４６】
（項目３５）
上記キメラプローブに相補的な配列を含むか、または上記キメラプローブに関して１つ以上のミスマッチを含むテンプレート核酸をさらに含む、項目３３に記載のキット。
【００４７】
（項目３６）
ポリヌクレオチドキナーゼをさらに含む、項目３３に記載のキット。
【００４８】
（項目３７）
二重鎖ハイブリッドであって、以下：
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである第２プローブ、および上記キメラプローブに相補的な配列を有するテンプレート核酸か、または上記キメラプローブに関して１つ以上のミスマッチを含むテンプレート核酸、を含み、
ここで、上記第２プローブの末端は、上記テンプレート上で上記キメラプローブの末端に隣接してハイブリダイズし、そして上記末端はリガーゼ酵素により共に連結され得る、二重鎖ハイブリッド。
【００４９】
（項目３８）
上記キメラプローブおよび／または上記第２プローブが、非放射性同位体で標識される、項目３７に記載の二重鎖ハイブリッド。
【００５０】
（項目３９）
ポリヌクレオチドキナーゼをさらに含む、項目３７に記載の二重鎖ハイブリッド。
【００５１】
（ＩＶ．要旨）
本発明は、ＰＮＡモノマー単位およびＤＮＡモノマー単位のキメラ分子、ならびにライゲーション産物を生成するためのライゲーション方法におけるその使用に関する。本発明は、部分的には、リガーゼ酵素が、広範囲の実験条件および実験変数の下で、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと第２のプローブとを連結し得る、という発見に基づく。本発明のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、共有結合で共に結合された少なくとも２つの部分、好ましくは：ｉ）３〜１５のＰＮＡモノマー単位の連続部分、およびｉｉ）少なくとも２つのヌクレオチドの連続部分、を含む。ヌクレオチド部分は、ライゲーション可能な末端を有し、その結果ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは第２のプローブに連結され得る。
【００５２】
第１の局面において、本発明は、リガーゼおよびライゲーション試薬の存在下でテンプレート核酸にアニーリングされたＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを、テンプレート核酸上のキメラプローブに隣接して、アニーリングされた第２のプローブに連結することによる、テンプレート依存型ライゲーション産物を産生する方法を提供する。第２のプローブは、テンプレート依存型ライゲーションを支持することが可能である。第２のプローブは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである。第２のプローブは、５〜１００のモノマー単位またはヌクレオチド（ｎｔ）長であり得る。好ましくは、第２のプローブは、１０〜３０ｎｔである。同時に、キメラプローブおよび第２プローブは、１０〜１００ｎｔであり得る。
【００５３】
本発明の１つの例示的実施形態において、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、式：
Ｐx−Ｌ−Ｎy 
を有する。
【００５４】
ここで、各Ｐは独立して、ＰＮＡモノマーであり、ｘは３〜１５の整数であり、ＬはＰとＮとの間の共有結合を表し、各Ｎは独立して、ヌクレオチドであり、ｙは２〜１５の整数であり、そして末端Ｎは、３’ヒドロキシル基または５’ヒドロキシル基のいずれかを有する。
【００５５】
好ましい実施形態において、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラのＰＮＡ部分（すなわち、Ｐx）は、２−アミノエチルグリシンペプチド核酸である。
【００５６】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラのＤＮＡ部分（すなわち、Ｎy）は、２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および修飾された糖またはそれらのヌクレオチド間結合（特に、より良好な特異性、親和性、ハイブリダイゼーションの速度、および化学安定性を与えるもの）を含み得る。
【００５７】
キメラおよび／または第２のプローブは、非放射性同位体標識で標識され得、その結果ライゲーション産物は非放射性同位体で標識される。標識したＰＮＡ−ＤＮＡキメラを用いる実施形態において、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは以下：（ｉ）核酸塩基（例えば、プリン核酸塩基もしくはデアザプリン核酸塩基の７−デアザ位もしくはＣ−８位、またはピリミジン核酸塩基のＣ−５位）；（ｉｉ）糖；（ｉｉｉ）ＰＮＡ骨格；あるいは（ｉｖ）アミノ基、スルフィド基、ヒドロキシル基、および／またはカルボキシル基、で標識され得る。好ましくは、キメラは、ＰＮＡ部分のアミノ末端で標識される。標識したオリゴヌクレオチドを用いる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好ましくはライゲーション部位（３’または５’）から反対側の末端で標識される。あるいは、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基で標識され得るが、標識がハイブリダイゼーションの親和性または特異性、あるいはリガーゼの効率を妨げない場合は、他の位置でもまた標識され得る。標識は蛍光色素、蛍光消光剤、ハイブリダイゼーション安定剤、エネルギー移動色素対、電気泳動移動度変更剤（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素、および親和性リガンドであり得る。好ましくは、標識は光（例えば、赤外、可視または紫外励起波長でのレーザー源）の照射で検出可能である。
【００５８】
キメラプローブのＰＮＡおよびＤＮＡ部分は、共有結合で共に結合されている。ＰＮＡ部分とＤＮＡ部分との間のその結合（Ｌ）は、例えば、アミド基におけるカルボニル−窒素結合（その部分は、介在原子または複数の原子のリンカーを有することなく結合される）であり得る。その結合は、リン酸ジエステル基またはホスホルアミデート基を含み得る。
【００５９】
テンプレート核酸または標的核酸は、テンプレート指向性の核酸合成を媒介し得る、任意の核酸または核酸アナログであり得る。適切なテンプレート核酸の例としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ消化物、ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ転写物、プラスミド、ベクター、ウイルスＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ＲＮＡ、および合成核酸が挙げられる。テンプレート核酸はまた、中期染色体または間期染色体であり得る。好ましくは、染色体は、ＤＮＡ−ＰＮＡのキメラハイブリダイゼーションおよびライゲーションの前に変性される。テンプレート核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、そして、特定の適用に依存して、わずか約２０〜３０から数百万程ものヌクレオチド（ｎｔ）または塩基対（ｂｐ）の範囲にわたり得る。
【００６０】
テンプレート核酸、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ、または第２プローブは、固体基材上に固定され得る。ライゲーションは、プローブまたはテンプレートの１つが固体支持体または固体表面に付着されている場所で行われ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
（ＶＩ．好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態について詳細に参照する。本発明を、好ましい実施形態と関連して記載するが、それは、それらの実施形態に対して本発明を限定することを意図しないこが理解される。これに対して、本発明は、代替物、変更物、および等価物を包含することを意図し、添付のクレームによって定義されるように本発明の範囲内に含まれ得る。
【００６２】
（ＶＩ．１  定義）
他の記載がない限り、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する。
【００６３】
「核酸塩基」とは、窒素含有複素環式部分（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）のことをいう。代表的な核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンなどである。
【００６４】
「ヌクレオシド」とは、リボース糖のＣ−１’炭素に連結した核酸塩基からなる化合物のことをいう。
【００６５】
「ヌクレオチド」とは、モノマー単位としてか、または核酸内のヌクレオシドのリン酸エステルのことをいう。ヌクレオチドは、リボース糖の構造的特徴を詳しく示すために、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として、時として記載される。「ヌクレオチド５’三リン酸塩」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドのことをいう。三リン酸エステル基は、種々の酸素の代わり硫黄置換物を含み得る（例えば、α−チオヌクレオチド５’三リン酸塩）。
【００６６】
本明細書において使用された場合、用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、そして２’デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味する。この核酸は、全てのデオキシリボヌクレオチド、全てのリボヌクレオチド、またはそのキメラ混合物を構成し得、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の連結により連結し、そして対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ2+、Ｎａ+など）と会合し得る。核酸は、代表的に数個のモノマー単位（例えば、それらが一般にオリゴヌクレオチドといわれる場合、５〜４０）から数千のモノマー単位までの大きさの範囲である。他に記載のない限り、オリゴヌクレオチド配列が示される場合はいつも、ヌクレオチドは、左から右へ５’から３’の順番であり、そして他に記載のない限り、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、チミジンを示すことが理解される。
【００６７】
用語「ワトソン／クリック塩基対形成」とは、二本鎖ＤＮＡにおいて一般に見られる水素結合塩基対形成のことをいう。
【００６８】
「付着部位」とは、リンカーを共有結合する部分（例えば、キメラまたはヌクレオチド）での部位のことをいう。
【００６９】
「リンカー」とは、ある部分が別の部分（例えば：（ｉ）オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−ＤＮＡキメラに対する標識、または（ｉｉ）ＰＮＡ−ＤＮＡキメラにおけるＤＮＡ部分に対するＰＮＡ部分）に連結する部分のことをいう。
【００７０】
「ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、以下を含むオリゴマーのことをいう：（ｉ）ＰＮＡモノマー単位の連続する部分および（ｉｉ）酵素学的に伸長可能な末端を有するヌクレオチドモノマー単位の連続する部分。
【００７１】
「アルキル」とは、親アルカン、親アルケン、または親アルキンの単一炭素原子から１つの水素原子の除去により誘導された飽和炭化水素ラジカル、もしくは不飽和炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、直鎖炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、または環式炭化水素ラジカルのことをいう。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アルキル基は、１〜１２の飽和炭素および／または１〜１２の不飽和炭素からなる。
【００７２】
「シクロアルキル」とは、環式アルキルラジカルのことをいう。シクロアルキル置換物を有する窒素原子は、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、より大きな大員環（ｌａｒｇｅｒ  ｒｉｎｇｓ）およびそれの複素環式の置換された形態を形成し得る。
【００７３】
「アルキルジイル」とは、１〜２０炭素原子の飽和炭化水素ラジカルもしくは不飽和炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、直鎖炭化水素ラジカルまたは環式炭化水素ラジカルのことをいい、そして親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの同じか、または２つの異なる炭素原子から２つの水素原子の除去により誘導される２つの一価のラジカルセンター（ｒａｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）を有する。代表的なアルキルジイルラジカルとしては、１，２−エチルジイル、１，３−プロピジイル、１，４−ブチルジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
「アリールジイル」とは、共役共鳴電子系および親アリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素原子の除去により誘導される少なくとも２つの一価のラジカルセンターを有する、６〜２０の炭素原子の不飽和環式炭化水素ラジカルまたは不飽和多環式炭化水素ラジカルのことをいう。代表的なアリールジイル基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されたラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
「標識」とは、連結伸長産物において検出可能であるか、あるいは所望の機能性または所望の特性をもたらすキメラまたはヌクレオチドに共有結合された任意の非放射性同位体部分のことをいう。
【００７６】
「ライゲーション」は、キメラおよび第２のプローブが、隣接して、そしてテンプレート核酸に対してハイブリダイズ（アニール）する場合の、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと第２のプローブオリゴヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合の形成による酵素的連結である。
【００７７】
（ＶＩ．２  ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）
１つの局面において、本発明は、ＰＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含むキメラプローブを利用する。ＰＮＡ部分は、核酸塩基が付着する非環式結合、アキラル結合、および中性ポリアミド結合の任意の骨格であり得る。ＰＮＡ部分の好ましい形態は、カルボキシル末端アミドを有する部分的な構造において以下に示されたように、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン、ペプチド様、アミド連結単位の骨格（Ｂｕｃｈａｒｄｔ，１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９１）である：
【００７８】
【化６】
2006055177.tif 000007
ＰＮＡオリゴマーそれ自体は、核酸プロセッシング酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）のための基質ではない（Ｌｕｔｚ，１９９９；Ｋｙｇｅｒ，１９９８；Ｌｕｔｚ，１９９７）。
【００７９】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、以下を含むオリゴマーである：１）ＰＮＡモノマー単位の連続する部分および２）ヌクレオチドの連続する部分。この２つの部分は、お互いに共有結合される。キメラのヌクレオチド部分は、２’デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの混合物であり得る。キメラのヌクレオチド部分は、３’ヒドロキシ末端を有する。ＰＮＡ部分の好ましい長さは、３〜１５ＰＮＡモノマー単位であり、最適な酵素活性、ハイブリダイゼーション特異性および親和性、合成試薬の経済性、ならびにキメラ合成および精製の容易さをもたらす。ＤＮＡ部分の長さは、２〜１５ヌクレオチドである。ＤＮＡ部分の好ましい長さは、効率的なライゲーションを促進する最も短い配列である（すなわち、少なくとも２つの２’デオキシヌクレオチド）（図１Ａ）。
【００８０】
１つ以上のＰＮＡモノマー単位中の好ましい核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２−チオピリミジン、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン（Ｆｌａｎａｇａｎ，１９９９）、７−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン（Ｅｇｈｏｌｍ，１９９５）、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、および８−オキソプリン（Ｍｅｙｅｒ，１９９４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ中のＰＮＡ部分により、与えられた増加された親和性および特異性（Ｅｇｈｏｌｍ，１９９３；Ｊｅｎｓｅｎ，１９９７）は、より短いプローブをハイブリダイゼーション実験およびアッセイにおいて使用することを可能にする。（ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，１９９８；Ｕｈｌｍａｎｎ，１９９８；Ｃｏｏｋ；１９９７；Ｕｈｌｍａｎｎ，１９９６）一般的に、より短いプローブは、対応するより長いプローブよりも特異的である（すなわち、相対的な構造の変動は、小さいプローブで大きい。）。また、短いプローブは、より経済的である（すなわち、合成のために安価であり、そして設計のためにより少ない配列情報を必要とする）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、オリゴヌクレオチドおよび他のＰＮＡ−ＤＮＡキメラに連結し、ＰＮＡ含有ライゲーション産物を形成し得る方法を供給することが望ましい。
【００８２】
そのＤＮＡ相補鎖またはＲＮＡ相補鎖へのＰＮＡ−ＤＮＡキメラ中のＰＮＡ部分の結合は、平行配向か、または逆平行配向のいずれかで起こり得る。逆平行二重鎖（ここで、ＰＮＡのカルボキシル末端は、相補的ＤＮＡの５’末端と整列し、そしてＰＮＡのアミノ末端は、ＤＮＡ相補鎖の３’末端と整列する）は、代表的に、平行二重鎖（ここで、ＰＮＡのカルボキシル末端は、ＤＮＡ相補鎖の３’末端と整列し、そしてＰＮＡのアミノ末端は、ＤＮＡ相補鎖の５’末端と整列する）より安定である（Ｋｏｐｐｉｔｚ，１９９８；Ｅｇｈｏｌｍ，１９９３）。本明細書中で示された例示的なキメラは、ＰＮＡ部分が、標的配列と逆平行配向の状態でアニールするように、設計される。ＰＮＡ配列が、一連の文字として表される場合は常に、アミノ末端が左側、そしてカルボキシル基が右側であることが理解される。
【００８３】
キメラ配列は代表的に、標的配列の部分に対して完全に相補的である。しかし、キメラ配列は、混合塩基（「縮退」または「縮重」）部位を含み得る。これにより、キメラサンプルは、２つ以上の異なる核酸塩基により表された１つ以上の塩基位置を有する配列の混合物であり得る。混合塩基部位は、オリゴマーのＰＮＡ部分またはＤＮＡ部分中に位置し得る。混合塩基キメラは、特定の標的配列に対する変化するレベルの相補性を有する配列の混合物である。混合塩基キメラは、ランダムプライミングのためか、もしくはテンプレート配列情報が未知か、または不確定である場合に有用であり得る。
【００８４】
本発明の特定の特性を、本明細書中で一本鎖プローブおよびテンプレート核酸を用いて例示したが、プローブおよびテンプレート核酸のいずれもが、二本鎖領域を含み得ることがまた明らかである。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、第２の二重鎖と連結する二重鎖の１つまたは両方の鎖として、ライゲーションを受け得る。ここで、各二重鎖の両方の鎖は、突出（「粘着末端」）を用いて連結され得る。例えば、キメラプローブは、突出鎖が、テンプレート核酸と相補的であるＤＮＡ部分および少なくとも一部のＰＮＡ部分を含み、そして、テンプレートに対するキメラプローブのハイブリダイゼーションにおいて、キメラのプローブの陥凹（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）鎖が、テンプレート核酸の末端の直後に近接するか、または１つ以上のヌクレオチド位のギャップで間隔をあけるかのいずれかで位置するように、粘着末端を有する二重鎖形態において提供され得る。隣接してハイブリダイズされたプローブのライゲーションを可能にする１つ以上のＰＮＡモノマーのＰＮＡ部分を含むテンプレートもまた意図される。
【００８５】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、ＰＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のそれぞれの従来の方法を用いて、実質的に任意の組み合わせまたは配列におけるＰＮＡモノマーとヌクレオチドとの共有結合により合成し得る（Ｖｉｎａｙａｋ，１９９７；Ｕｈｌｍａｎｎ，１９９６；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ，１９９７）。効率的かつ自動化された方法は、市販の自動合成機（例えば、「ＥｘｐｅｄｉｔｅTM」、Ｍｏｄｅｌ  ４３３ＡおよびＭｏｄｅｌ  ３９４合成機（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））において、市販の試薬（Ｕｈｌｍａｎｎ，１９９６；Ｖｉｎａｙａｋ，１９９７；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ，１９９７）を用いて、２〜２５μモルスケールでＰＮＡ／ＤＮＡキメラを合成するために開発された。この方法において、キメラを、１つのカラムおよび１つの合成機で連続的に作製し得る。
【００８６】
代表的に、キメラの合成を、合成カラム中に充填された市販の高架橋、非膨潤性ポリスチレンビーズの５’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基の脱トリチル化により開始する。支持体を、塩基不安定性サクシネート／ヒドロキシメチル安息香酸リンカーを介して、支持体に３’水酸基により連結された５’−ＤＭＴデオキシヌクレオシド（Ａbz、Ｇibu、Ｃbz、Ｔ）を、２０〜３０μモル／ｇで充填する（Ｖｉｎａｙａｋ，１９９７）。５’−ＤＭＴ，３’−シアノエチルホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）デオキシヌクレオシドモノマー（Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９２）を、乾燥アセトニトリルに溶解し、そしてテトラゾール活性化剤と同時に送達し、支持体結合５’水酸基に結合させる。結合の後に、未反応の５’水酸基の無水酢酸でのキャッピング、および５価のヌクレオチド間のリン酸トリエステルに対するヨウ素での酸化を行う。ＤＮＡ合成サイクルを、最後のデオキシヌクレオシドの添加まで繰り返す。ここで、５’モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）アミノヌクレオシドホスホロアミダイトを使用し、キメラにおけるＤＮＡとＰＮＡとの間の結合において、ＰＮＡモノマーに結合するために、支持体結合ＤＮＡ部分に５’アミノ末端を与える。ＭＭＴ基は、これが酸不安定性であるので、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成において骨格アミノの保護のために好都合である。ＭＭＴ基を、キメラに対する脱プリン化または他の損傷を引き起こさない温和な酸性状態下で窒素から効率的に、そして迅速に除去する。
【００８７】
ＰＮＡ部分の合成を開始するために、５’ＭＭＴ基を３％トリクロロ酢酸含有ジクロロメタンを用いて除去し、そしてアミノ基をＰＮＡモノマーおよびカップリング試薬を用いて結合する。ＰＮＡモノマーの骨格アミノ基を好ましくは、ＭＭＴで保護し、そして核酸塩基環外アミンをＡbz、Ｇibu、およびＣbzとして保護する（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ，１９９７；Ｆｉｎｎ，１９９６；Ｗｉｌｌ，１９９５）。任意の従来のペプチドカップリング試薬を使用し得るが、ＨＢＴＵおよびＨＡＴＵは、好ましいカップリング試薬である。ＰＮＡモノマーを、１：１のＤＭＦ：アセトニトリル中に溶解し、約０．２Ｍの濃度にし得る。合成カラムに送達する前に、モノマー溶液をまた、等量の０．２Ｍ  ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）含有ＤＭＦ：アセトニトリル（１：１）と混合する（Ｖｉｎａｙａｋ，１９９７）。この溶液を、０．２Ｍ  ジイソプロピルエチルアミン含有ＤＭＦ：アセトニトリル（１：１）と共に同時にカラムへ送達する。２μモルスケールでＭｏｄｅｌ  ３９４合成機でのキメラにおけるＰＮＡ部分およびＤＮＡ部分のための合成サイクルを以下の表１に要約する。
【００８８】
【表１】
2006055177.tif 000008
合成が完了後、アミノ末端をアセチル化し、移動または環化を最小化し得るか、または標識化において求核試薬として反応し得る。粗キメラを支持体から切断し、そして８〜１６時間、５５℃で濃縮された水酸化アンモニウムを用いて、全ての保護基を除去する。キメラを、逆相ＨＰＬＣまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分析および精製、質量分光法よる分析、ならびに質量と２６０ｎｍでのＵＶ吸収を相関させることにより定量化する。
【００８９】
リボヌクレオチドを含むＤＮＡ部分を有するキメラを、適切なＲＮＡホスホロアミダイトヌクレオシドおよび／または５’ＤＭＴ保護化リボヌクレオチド支持体を用いて合成し得る（Ｖｉｎａｙａｋ，１９９４）。ＲＮＡホスホロアミダイトの２’水酸基を代表的に、第３ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を用いて保護し、そしてＡbz、Ｇdmf、およびＣbzとして核酸塩基の環外のアミノ基を保護する。合成後、ＴＢＤＭＳ基を、フルオライド試薬（例えば、テトラブチルアンモニウムフルオライド含有テトラヒドロフラン）を用いて、除去する。それ以外は、リボヌクレオチド含有ＰＮＡ−ＤＮＡキメラのための合成、精製、および分析方法は、２’デオキシヌクレオチド含有ＤＮＡ部分のみを有するキメラについての方法と実質的に同一である。
【００９０】
本発明のキメラプローブのＰＮＡ部分とＤＮＡ部分との間の結合は、直接結合であり得る（例えば、介在原子なしで、デオキシヌクレオチドの５’位のアミノ基とＰＮＡ部分のカルボキシル末端のカルボキシル基により形成されたアミド結合）（図１Ａ〜１Ｂ）。あるいは、結合Ｌは、ホスホジエステル基またはホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）基であり得る。結合はまた、非塩基対形成部分（例えば、エチレンオキシ）の１つ以上の単位を含み、アミド結合（図２Ｂ）またはリン酸結合（図２Ｃ）によりＰＮＡ部分およびＤＮＡ部分に連結し得る。ＰＮＡ部分とＤＮＡ部分との間のエチレンオキシ結合単位を、カップリング試薬（例えば、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］酢酸の保護化形態）により導入し得る。Ｏリンカーである、２−［２−（２−アミノエトキシ）］酢酸を、ＭＭＴ−アミノ保護化アミド形成カルボン酸、またはホスホロアミダイトシントンとして結合する（図２Ａ）。１つ以上のＯリンカー単位は、可撓性の、非塩基対形成性の、ＰＮＡ部分とＤＮＡ部分との間の結合として作用し得る。図２は、ビスエチレンオキシアセトアミドリンカー（２Ｂ）およびビスエチレンオキシホスフェートリンカー（２Ｃ）を示す。他の例示的なリンカーとしては、アルキジイル基（例えば、ヘキシジイル基（Ｖｉｎａｙａｋ，１９９７）、または１，４−フェニルジイル基）が挙げられる（図２Ａ）。
【００９１】
（ＶＩ．３  オリゴヌクレオチド）
一般に、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト合成方法により調製される。なぜなら、出発ヌクレオシドモノマーの効率的および迅速なカップリングならびに安定性のために好ましいからである（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９２）。ホスホロアミダイト法は、ヌクレオチドモノマー単位の固体支持体上で成長しているオリゴヌクレオチド鎖への周期的な添加を伴なう（最も一般的には、３’末端ヌクレオシドが、合成の始まりで、固体支持体に付着する３’から５’の方向）。この方法は通常、自動化された市販の合成機を用いて行う（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８４）。代表的に、ホスホロアミダイトヌクレオシドモノマー単位は：
【００９２】
【化７】
2006055177.tif 000009
を含む。ここで、Ｒ1は、保護基または置換基（例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、および置換アリール）である；Ｒ2およびＲ3は、アミノ置換基（例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、およびアリール）である；Ｒ４は、環外窒素保護基（例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジン、およびジアルキルアセトアミジン）である；そしてＲ5は、酸不安定性保護基（例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピクシル（ｐｉｘｙｌ）、トリチル、およびトリアルキルシリル）である。
【００９３】
１つ以上のヌクレオシド中の好ましい核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２−チオピリミジン、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン（Ｆｌａｎａｇａｎ，１９９９）、７−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン（Ｅｇｈｏｌｍ，１９９５）、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、および８−オキソプリン（Ｍｅｙｅｒ，１９９４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
１つ以上のヌクレオシド中の好ましい糖としては、２’デオキシリボース、リボース、および２’リボース修飾物または３’リボース修飾物（ここで２’位または３’位は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモであり得る）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
他の好ましい糖としては、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、および２’−４’−結合した二環式糖修飾物ならびに他の「ロックされた」二環式糖修飾物（Ｗｅｎｇｅｌ，１９９９）が挙げられる。
【００９６】
（ＶＩ．４  リガーゼ酵素）
本発明において使用されるリガーゼ酵素は、キメラプローブおよび第２のプローブが、標的テンプレート中の隣接する領域にアニールする場合、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと第２のプローブとのライゲーションを行う任意のリガーゼであり得る。ＤＮＡリガーゼは、隣接する２つのプローブにおいて（すなわち、お互いに、直ぐ隣りとハイブリダイズする）、５’ホスフェートと３’水酸基との間のホスホジエステル結合を形成することによりＤＮＡ配列を連結する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，１９８０；Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，１９８９）。あるいは、あるプローブの３’ホスフェート末端および他のプローブの５’水酸基が、ホスホジエステル結合を形成し得る。本発明において、１つまたは両方のプローブは、ＰＮＡ部分を含む。
【００９７】
例えば、バクテリオファージＴ４由来ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の両方を連結し得、そしてこのＤＮＡリガーゼは、連結された配列を整列するためにＤＮＡテンプレートまたはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用し得る。ＤＮＡ鎖のみを含む反応は、非常に効率的に進む。塩基対形成された平滑末端を有する２つのＤＮＡ二重鎖をファージリガーゼにより連結し得る。特定のリガーゼは、補因子（例えば、ＮＡＤまたはＡＴＰ）を必要とする。
【００９８】
最近、多くのリガーゼが、好熱性生物から単離されており、６０℃以上で有意な活性を有していて、そしてＤＮＡを変性する条件で生存する。好ましい熱安定性リガーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，１９８４）由来であり、そしてまた組換え的に調製され得る（Ｂａｒａｎｙ，ＷＯ  ９１／１７２３９，１９９１）。この熱安定性リガーゼはまた、平滑末端または短い相補的な突出末端を有する二重鎖ＤＮＡの連結の減少した活性を示す。これらの特徴は、検出の上昇された特異性ならびに多くの分析アッセイおよびライゲーションを含む適用における利便性を生じる。
【００９９】
（ＶＩ．５  標識）
標識化したＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよび標識化オリゴヌクレオチドが、非放射性同位体的に標識化されたライゲーション産物を形成するためにプローブとして酵素学的にライゲーションし得る方法が提供されることが望ましい。蛍光は、多くのライゲーション実験および適用（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよび他のインビトロＤＮＡプローブに基づく診断テスト）のために好ましい検出方法として放射活性に大きく取って代わっている。従って、蛍光性標識は、検出標識の好ましいクラスである。ハイブリダイゼーションの特異性および親和性を向上する標識もまた、好ましい（例えば、マイナーグルーブ結合剤）。親和性リガンド標識もまた、好ましい。ビオチンは、キメラプローブならびにライゲーション産物の捕獲および単離のためのオリゴヌクレオチドのための有用な親和性リガンド標識である。特定の実験において、テンプレート核酸のビオチン標識化は捕獲目的、単離目的、除去目的、または検索目的のために有用であり得る。
【０１００】
ライゲーションに関与するＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよびオリゴヌクレオチドは、共有的に付着した標識を有し得る。標識化は、公知のラベル、結合、連結基、標準試薬および標準反応条件、ならびに分析方法および精製方法を使用する多くの公知の技術のいずれか１つを用いて達成され得る。一般に、色素およびオリゴヌクレオチドまたはキメラを連結している結合は、（ｉ）ライゲーションを妨害せず、（ｉｉ）リガーゼ活性を阻害せず、そして（ｉｉｉ）色素の蛍光特性に有害な影響（例えば、クエンチングまたはブリーチング）を与えないべきである。
【０１０１】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよびオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、アミノエチルグリシン骨格、アミノ、スルフィド、ハイドロキシル、およびカルボキシルを含む部位で標識され得る。核酸塩基標識部位は一般的に、プリンもしくはデアザプリンの７−デアザまたはＣ−８位、およびピリミジンのＣ−５位を含む。標識とキメラまたはオリゴヌクレオチドとの間の結合（ＮＵＣ）は、アセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合であり得る（Ｋｈａｎ，１９９８）。代表的に、標識におけるカルボキシル基は、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）の形成により活性化され、そしてアルキニルアミノ誘導化キメラまたはヌクレオチド、あるいはアルケニルアミノ誘導化キメラまたはヌクレオチドのアミノ基と反応する。得られる結合は、以下の構造を有する３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピン−１−イルである：
【０１０２】
【化８】
2006055177.tif 000010
標識は、以下を含む任意の最適な末端付着部位または内部付着部位において、オリゴヌクレオチドに付着され得る：（ｉ）末端（例えば、５’および／または３’）（Ｍｕｌｌａｈ，１９９８）、（ｉｉ）ヌクレオチド間結合、（ｉｉｉ）糖、または（ｉｖ）核酸塩基。標識は、自動化手順の一環として、蛍光色素（ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ）およびホスホロアミダイト試薬として機能化されている他の標識を用いて最も簡便かつ効率的に５’末端に導入される（Ｔｈｅｉｓｅｎ，１９９２）。
【０１０３】
標識の好ましいクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学的発光による標識化オリゴヌクレオチドの検出のための信号を提供する（Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）。標識化オリゴヌクレオチドのために有用な蛍光性色素としては、フルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ，１９９３）、ローダミン（Ｂｅｒｇｏｔ，１９９４）、エネルギー移動色素（ＬｅｅおよびＳｐｕｒｇｅｏｎ，１９９８）、シアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）、および金属ポルフィン錯体（Ｓｔａｎｔｏｎ，１９８８）が挙げられる。
【０１０４】
フルオレセイン色素の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、および芳香族置換キサンテン色素（Ｂｅｎｓｏｎ，１９９７）が挙げられる。５−カルボキシル、および他のレジオ異性体はまた、有用な検出特性を有し得る。
【０１０５】
標識の別の好ましいクラスは、蛍光消光剤を含む。消光剤の発光スペクトルは、近位の分子内蛍光性色素または分子間蛍光性色素と重複し、その結果、蛍光性色素の蛍光は、蛍光性共鳴エネルギー移動「ＦＲＥＴ」の現象により実質的に減少されるか、またはクエンチされる（Ｃｌｅｇｇ，１９９２）。本発明におけるＦＲＥＴの例では、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを蛍光性色素を用いて標識化し、そして第２のプローブを蛍光消光剤を用いて標識化する。あるいは、キメラを蛍光消光剤を用いて標識化し得、そして第２のプローブを蛍光性色素を用いて標識化する。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの前に、蛍光性色素は、実質的にクエンチされていない。ライゲーション後、ライゲーション産物の蛍光性色素は、ＦＲＥＴにより実質的にクエンチされる。
【０１０６】
特に好ましい消光剤としては、（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群から選択されるローダミン色素、ならびに（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）を含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物などが含まれるがこれらに限定されない。消光剤のニトロ置換形態は、特に好ましい。
【０１０７】
エネルギー移動色素は、キメラ標識およびオリゴヌクレオチド標識の好ましいクラスである。エネルギー移動色素標識は、アクセプター色素に連結されたドナー色素を含む（ＬｅｅおよびＳｐｕｒｇｅｏｎ，１９９８）。第１の波長における光（例えば、レーザーから）は、ドナー色素（例えば、ＦＡＭ）により吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素により吸収される励起エネルギーを放射する。アクセプター色素は、第２のより長い波長で蛍光を発する。エネルギー移動の標識のドナー色素およびアクセプター色素部分は、ドナー色素（例えば、ＦＡＭ）の４’位または５’位およびアクセプター色素の５−カルボキシル基または６−カルボキシル基を連結するリンカーにより付着され得る。他の強固なリンカーおよび強固ではないリンカーが有用であり得る。
【０１０８】
金属ポルフィリン錯体（例えば、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネート（Ｓｔａｎｔｏｎ、１９８８）および化学発光化合物（例えば、１，２−ジオキシエタン（ｄｉｏｘｅｔｈａｎｅ）化学発光部分（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、１９９０）もまた、キメラおよびオリゴヌクレオチド標識の好ましい種類である。
【０１０９】
別の好ましい種類の標識（本明細書中でヒドラジン安定化部分と呼ばれる）は、マイナーグルーブ（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）結合剤（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６、３３７〜４６頁）、インターカレーター、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）およびスペルミン、ならびに架橋官能基が、挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対形成の安定性（すなわち、親和性）またはハイブリダイゼーションの速度（二重鎖の高い熱融解温度（Ｔｍ）により示される）を増加し得る。ハイブリダイゼーション安定化部分はまた、塩基対形成の特異性（完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列との間のＴｍの大きな差異により示される）を増加し得、そして生じた二重鎖はワトソン／クリック塩基対形成の１つ以上のミスマッチを含む。好ましいマイナーグルーブ結合剤としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｒａｊｕｒ、１９９７）、ＣＤＰＩ1-3（Ｋｕｔｙａｖｉｎ、１９９６）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）およびジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）が、挙げられる。他の有用な標識としては、電気泳動移動度変更剤、アミノ酸、ペプチド、酵素、および親和性リガンド（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）が、挙げられる。
【０１１０】
標識とＰＮＡ／ＤＮＡキメラとの間のリンカーは、アミド結合（例えば、活性エステル形態の標識が、このキメラのアミノ基と結合している）であり得る。また、リンカーは、アルキルジイル、アリールジイル、、または１つ以上のエチレンオキシ単位（Ｒａｊｕｒ、１９９７）を含み得る。
【０１１１】
（ＶＩ．６  ライゲーション）
図３Ａは、３’ヒドロキシＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと５’リン酸オリゴヌクレオチド（第２のプローブとして、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズしている）との間を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションしてＰＮＡ−ＤＮＡライゲーション産物を形成する、模式図を示す。第１のプローブは３’ヒドロキシ末端５’リン酸末端を有し、そして第２のプローブは５’リン酸末端を有する。あるいは、第１のプローブは５’リン酸末端を有し、そして第２のプローブは３’ヒドロキシ末端を有する。
【０１１２】
ライゲーション混合物は、一般的に、ＤＮＡテンプレート、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、第２のプローブ（別のＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブまたはオリゴヌクレオチドである）、リガーゼ、および他のライゲーション試薬を含む。このＰＮＡ−ＤＮＡキメラに対応するＤＮＡプローブが、コントロールまたは比較として使用され得る。代表的条件下で、これらのプローブは、最終濃度各約１μＭとして使用される。
【０１１３】
さらに、このライゲーション混合物は、例えば、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン］および１，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼおよび１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのような試薬を、容量５０μｌにて含み得る。このライゲーション試薬はまた、リガーゼ補因子（例えば、ＮＡＤおよびＡＴＰ）、ポリエチレングリコール、ＥＤＴＡ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール、ＢＳＡ、ＭｇＣｌ2、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、水、ＮａＣｌ、メルカプトエタノール、および他の塩または緩衝液を含み得る。この混合物は、２２〜２５℃にて３時間以上インキュベートされ得る。このライゲーションの間の、１０〜２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのさらなる添加が、このライゲーションに有用であり得る。
【０１１４】
代表的にはインキュベーションの後に、リガーゼ反応産物は、約８０℃で約２０分間熱不活化され、そして氷上または４℃に短い間置かれる。分析のために、代表的には、このライゲーション産物のうちの５〜２５ｐｍｏｌが、最終濃度の１×ローディング緩衝液（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓベース、４５ｍＭホウ酸、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレンシアノ−ル）と混合され、そして９５℃で１０〜２０分変性される。このサンプルが、１０〜１５％の変性ＰＡＧＥゲルにローディングされ、そして１×ＴＢＥ（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１００〜１６０Ｖ、７０℃にて２５〜６０分間泳動される。このライゲーション産物は、このゲルを４０〜１２０ｍｌのＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で１×ＴＢＥ中で１０〜３０分間染色することによって、可視化される。その画像は、ゲル記録システム（例えば、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ  ４０００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）にキャプチャーされ得る。
【０１１５】
図３Ｂは、モデル系におけるライゲーションアッセイのためのテンプレート配列およびプローブ配列を示す。このプローブ配列は、２つのオリゴヌクレオチドプローブ（６ｎｔおよび９ｎｔ）および５つのＰＮＡ−ＤＮＡキメラ（０〜４のＤＮＡ  ２’−デオキシヌクレオチドを含む）を含む。これらのオリゴヌクレオチドおよびキメラは、３８ｎｔ  ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする。このテンプレートは、単離および移入を容易にするために、３’末端または５’末端をビオチンで標識される。
【０１１６】
このオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、既知のＤＮＡ配列改変体間の識別を可能にする、簡便で非常に厳密な方法である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、１９８８）。非常に多型性の遺伝子座の多重分析は、例えば、父系試験のため、および法医学において、器官移植ドナー−レシーバー適合において、遺伝子疾患の診断において、予後において、および出生前カウンセリングにおいて、および多数の遺伝子座での一塩基の差異の識別に依存する他の遺伝子に基づく技術において、有用である（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ、１９９６）。多重オリゴヌクレオチドアッセイ（ＯＬＡ）の産物は、蛍光検出を用いて変性条件下で、互いからそして未結合のプローブから、電気泳動によって分離され得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎ、１９９４）。例えば、図８Ａ〜８Ｃは、２つのＰＮＡ−ＤＮＡキメラ（野生型（ＷＴ）配列キメラおよび変異配列キメラ）が異なる蛍光色素を保有する、異なるアッセイを示す。変異配列が標的サンプル中に存在する場合にのみ、変異配列キメラは、その変異塩基対がライゲーション部位である場合に、隣接してアニールした第２のプローブ（オリゴ）にライゲーションする（図８Ａ）。
【０１１７】
このライゲーション産物は、（ｉ）電気泳動またはクロマトグラフィーを使用してサイズに基づく分離、および／または検出可能な標識に基づく分離よって識別され得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎ、１９９４）。独特の標的配列を標的とする配列を有するキメラに標識された多数の蛍光色素を用いて、多重ＯＬＡが、単一の容器中の１つのサンプルに対して実行され得る。効率の良い多重ＯＬＡの要件は、非常に特異的かつ迅速な様式でアニールおよびライゲーションする、プローブが挙げられる。このキメラ配列および第２のプローブ配列は、変異塩基（または一塩基多型）が、第２のプローブの５’リン酸（図８Ｂ）またはキメラの３’末端（図８Ｃ）であり得るように、選択され得る。
【０１１８】
本発明のＯＬＡ実験は、テンプレート核酸、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ、または第２のプローブが、固体粒子またはビーズ上、あるいは固体の多孔性表面または非多孔性表面上に固定されている、固体基材上で実施され得る。固定されている場合、このテンプレート、キメラまたは第２のプローブは、好ましくは、この固体基材に、例えば、末端モノマー単位を介して共有結合している。この固体基材は、ポリスチレン、コントロールド−ポア−ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁性ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、ならびに上記の固体基材のいずれかのコポリマーおよびグラフト（ｇｒａｆｔ）であり得る。この固体基材の立体配置または形態は、直径約１〜５０μｍの小粒子またはビーズ、膜、フリット（ｆｒｉｔ）、スライド、プレート、マイクロマシン化（ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ）チップ、アルカンチオール−金層、非多孔性表面、およびポリヌクレオチド固定化媒体であり得る。
【０１１９】
例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブは、リンカーによって、アミノ末端で非多孔性無機表面（例えば、ガラス）に共有結合している（Ｇｕｏ、１９９４）。テンプレート核酸サンプルが、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、このキメラプローブにハイブリダイズするのを可能にされる。このテンプレートと相補的な配列を有する第２のプローブが、ハイブリダイズした二重鎖に添加され、そしてこの第２のプローブが、このキメラプローブに隣接するテンプレートにハイブリダイズする。このキメラプローブと第２のプローブは、リガーゼによってともに連結される。このライゲーション産物は、検出および／または単離され得る。この産物において、このキメラプローブ、テンプレート、または第２のプローブが標識または親和性リガンドを保有し、そしてオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイが、それによって実施される。
【０１２０】
好ましい実施形態において、キメラプローブのアレイが、既知の配列のキメラプローブが二次元表面上の規定された領域を占有する、固体基材上にアセンブルされる。任意の特定の表面上のキメラプローブの数は、数百個または数千個でさえあり得、合成、付着、および検出についての空間的要件によって限定される（Ｆｏｄｏｒ、１９９５）。あるいは、プローブのアレイが、ウェルまたは容器中に収容された、ビーズまたは粒子上に固定され得る。テンプレート、またはテンプレートの混合物が、この表面上の固定されたキメラプローブへのハイブリダイゼーションのために添加され得る。十分な配列相補性が、所定のハイブリダイゼーション条件下で存在する場合、二重鎖形成が生じる。第２のプローブの混合物が、ハイブリダイゼーションのために、別々にかまたはテンプレートサンプルとともに添加され得る。リガーゼの存在下で、キメラプローブと第２のプローブが隣接してハイブリダイズしている場合にのみ、ライゲーションが生じる。ハイブリダイズしているないプローブおよびテンプレートサンプルは、ハイブリダイゼーションと維持する条件下または変性条件下で、洗浄によって除去され得る。第２のプローブが標識（例えば、蛍光色素）を保有する場合、このライゲーション産物は、表面上に共有結合により固定され、そして例えば、レーザー誘導蛍光によって検出され得る。固定されたキメラプローブ配列の知識から、テンプレートサンプル中の特定の配列の存在が、このアレイ表面上で検出された蛍光の位置から推定され得る。
【０１２１】
本発明の第２の局面において、ライゲーションのためのキットが提供される。１つの実施形態において、例えば、本発明を実施するために有用なキットは、以下を含む：（ｉ）３〜１５個連続するＰＮＡモノマー単位、２〜１５個連続するヌクレオチド、および３’ヒドロキシを有する、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ；（ｉｉ）第２のプローブ（この第２のプローブは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラまたはオリゴヌクレオチドである）；ならびに（ｉｉｉ）リガーゼ酵素。このキメラおよび／またはオリゴヌクレオチドは、非放射性同位体標識で標識され得る。別の実施形態において、このキットはさらに、このキメラに相補的な配列を含むテンプレートか、またはこのキメラに対する１つ以上のミスマッチを含むテンプレートを含む。別の実施形態において、このキットはさらに、ポリヌクレオチドキナーゼを含む。
【０１２２】
上記の考察から、本発明の種々の特徴および利点を満たす方法が理解され得る。本発明は、非常に感度が高くそして正確である、選択された標的配列を検出するための方法を提供する。選択された標的配列は、以前のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイにおいて使用されたすべてのＤＮＡプローブよりも短い標的特異的配列を含むキメラＰＮＡ／ＤＮＡプローブを使用して、検出され得る。従って、このキメラプローブは、設計するためにより少ない標的配列情報しか必要とせず、そして合成するためにより安価であり得る。さらに、本発明は、広範な種類の標的配列およびアッセイ形式に適合され得、そして容易に自動化され得る。
【実施例】
【０１２３】
（ＶＩ．７  実施例）
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。この実施例は、本発明の純粋な例示であり、そしていかようにも本発明の範囲を限定することは意図しない。
【０１２４】
（実施例１  ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの標識）
（ＴＡＭＲＡおよびＮＴＢ標識）
標識を、１００μｌ  ＤＭＦまたはＮＭＰ、および１０μｌ  ＤＩＥＡに溶解した、ＴＡＭＲＡまたはＮＴＢのＮＨＳエステル５ｍｇを用いて実施する。この標識混合物を、支持体に結合したＰＮＡ−ＤＮＡキメラに添加し、そして２〜１８時間（代表的には、一晩）反応させる。この支持体を、洗浄し、続いてＤＭＡその後ＤＭＦで標識した後、切断する。
【０１２５】
（ＣＤＰＩ標識）
ＣＤＰＩ3を、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラのアミノ末端へのＦｍｏｃ−ＣＤＰＩの３つ連続するカップリングによってこのキメラに結合し（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９５）、ＣＤＰＩ3標識ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを作製する。Ｆｍｏｃ（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）で保護したＣＤＰＩモノマー単位（１，２−ジヒドロ−３（Ｈ）−ピロロ（ｐｙｒｒｏｌｏ）[３，２−ｅ]インドールー７−カルボキシレート）を１００μｌ  ＮＭＰに溶解し、そして０．９５等量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０．２Ｍ）および２等量のＤＩＥＡ（ＤＭＦ中０．４Ｍ）によって活性化する。室温で１時間後、この活性化Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ溶液を、支持体に結合したキメラに添加し、そして室温でさらに１時間カップリングさせる。カップリング後、この樹脂を２０ｍｌ  ＤＭＦで洗浄する。このＦｍｏｃを、１：４のピペリジン：ＤＭＦを用いる室温で１０分間の樹脂支持体の処理によって除去する。このカップリングおよび脱保護のサイクルを、さらに２回、合計３回の手動のカップリングの間反復して、ＣＤＰＩ3標識ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成する。
【０１２６】
（実施例２  ライゲーション）
図４は、ライゲーション混合物が、テンプレートおよび２つのプローブ（各々最終濃度１μＭ）、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液[５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン]および１，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を、容量５０ｍｌにて含んだ、ライゲーション実験を示す。Ｔ４リガーゼはまた、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍから購入され得る。約７０単位のＮＥ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、１  Ｗｅｉｓｓ単位のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに等しい。同じ反応を、リガーゼなしでも実行した。２２．５〜２５℃にて３〜４時間のインキュベーションの後、この反応混合物を、８０℃で２０分間加熱した。５μｌの反応混合物を、変性条件（７Ｍ尿素）下で１２０〜１４０Ｖにて２０〜６０分間、（１５％）ポリアクリルゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。オリゴヌクレオチドＤＮＡ３またはＰＮＡ−ＤＮＡキメラへの、５’リン酸オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ２、ＤＮＡ４またはＤＮＡ５）のライゲーションは、表２によるテンプレート（ＤＮＡ１またはＤＮＡ６）に対して実行した。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラと５’リン酸オリゴヌクレオチドとの間のＴ４リガーゼを用いてのライゲーション（上のゲル画像）は、新規なバンドによって、レーン３、４、６、８、１０において明らかである。６個のＰＮＡモノマーを有するキメラと２〜４個の２’−デオキシヌクレオチドモノマーとのライゲーションが、有効であった。２つのオリゴヌクレオチドプローブ間のコントロールライゲーション（レーン２）は、ライゲーション産物のバンドを示す。１つのプローブのみでのコントロールライゲーション（レーン１、５、７、））は、新規なバンドを示さない。Ｔ４リガーゼなしの実験（下のゲル画像）は、テンプレートおよびプローブについてのバンドを示す。
【０１２７】
（表２．図４Ａ〜４Ｂ）
【０１２８】
【表２】
2006055177.tif 000011
（大文字−ＰＮＡ、小文字−ＤＮＡ）。
【０１２９】
図４Ｂは、ＳｐｏｔＤｅｎｓｏプログラムを用いたデンシトメトリーによる、図４Ａにおけるリガーゼ反応の定量評価を示す。箱で囲まれたバンドは、ライゲーション後に残っている、５’リン酸プローブを示す。レーン１、５、７および９におけるネガティブコントロール実験は、ライゲーションが生じなかった場合の、残存する５’リン酸プローブのレベルを立証した。レーン２におけるポジティブコントロール実験は、２つの全てＤＮＡのプローブ間のライゲーション効率を示した。定量されたこれらの値から、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブとのライゲーション効率は、図（右）における面積（ＩＤＶ−積分密度値（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｖａｌｕｅ））から計算され得る。
【０１３０】
図５は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ（ＰＮＡオリゴマ−の３’末端に１〜４個のＤＮＡ塩基が結合する）および第２のプローブ（可変の長さの５’リン酸オリゴヌクレオチド）を用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用するライゲーション実験を示す（レーン４〜７）。このキメラプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブの長さは、等しい長さのライゲーション産物を形成するように選択する（表３）。さらに、このキメラの代わりに、プローブ（レーン２）なし、すべてのＰＮＡプローブ（レーン３）、すべてのＤＮＡプローブ（６ｎｔ）（レーン８）、およびすべてのＤＮＡプローブ（９ｎｔ）を使用した、コントロールライゲーションを行った。このライゲーション混合物は、３８ｎｔ  ＤＮＡテンプレートおよび２つのプローブ（最終濃度各１μＭ）、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液[５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン]、および１，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを、容量５０μｌ中に含んだ。このライゲーション反応混合物を、２２．５〜２５℃にて３〜４時間インキュベートした。インキュベーション後、この反応混合物を、８０℃にて２０分間加熱し、次いで４℃にて貯蔵した。この反応混合物５μｌを、１５％ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、そして変性条件（７Ｍ尿素、７０℃）下で１２０〜１４０Ｖにて２０〜６０分間泳動し、次いでＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎで染色した。図５Ａは、染色したゲルをスキャンした画像を示す。図５Ｂは、ＤＮＡテンプレート（３８ｎｔ）（配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．）９）にハイブリダイズした５’リン酸オリゴヌクレオチドへの、ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよびＤＮＡのライゲーションの模式図である。
【０１３１】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、そのキメラが２、３、または４個のＤＮＡモノマー（２’−デオキシヌクレオチド）を有する場合（それぞれ、レーン５〜７）に連結されるということは、テンプレートバンドの下の新規なバンドから明らかである。全ＰＮＡプローブまたは１個のＤＮＡモノマーのみ含むキメラ（それぞれ、レーン３および４）について、ライゲーションが生じないことは、明らかである。レーン１は、ネガティブコントロールである。レーン８および９は、ポジティブコントロールであり、６ｎｔおよび９ｎｔのオリゴヌクレオチドが、５’リン酸オリゴヌクレオチドに連結している。キメラのライゲーション産物中のＰＮＡの電気泳動での遅れ（レーン５〜７）は、全てＤＮＡのライゲーション産物（レーン８および９）と比較して明らかである。
【０１３２】
（表３．図５Ａ〜５Ｂ）
【０１３３】
【表３】
2006055177.tif 000012
（大文字−ＰＮＡ、小文字−ＤＮＡ）。
【０１３４】
図６は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブとのライゲーションの特異性を示す。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラと５’リン酸オリゴヌクレオチドは、完全な一致として、およびミスマッチを伴って、テンプレート上でライゲーションされた。ライゲーション混合物は、テンプレートおよび２つのプローブ（最終濃度各１μＭ）、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液[５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン]および１，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを、容量５０ｍｌ中に含んだ。ライゲーション反応物を、２２．５〜２５℃にて３〜４時間インキュベーションした。インキュベーション後、この反応混合物を、８０℃にて２０分間加熱し、次いで４℃にて貯蔵した。５μｌの反応混合物を、ＰＡＧＥ分析に使用し、１２０〜１４０Ｖにて２０〜６０分間電気泳動した。
【０１３５】
（表４  図６）
【０１３６】
【表４】
2006055177.tif 000013
（大文字−ＤＮＡ、小文字−ＤＮＡ）
図６の実験は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブは、ライゲーションが生じるために高いレベルの配列相補性を必要とすることを示す。ミスマッチが、キメラプローブまたは第２のプローブのいずれかにおいて生じる場合、示されるシステムの範囲内で、ライゲーションは検出可能ではない。比較により、全てＤＮＡのプローブは特異性が低い。ミスマッチが全てＤＮＡのプローブのいずれかにおいて生じる場合、いくつかのライゲーションがなお明らかである。レーン１は、ポジティブコントロールライゲーションであり、２つのオリゴヌクレオチドが、テンプレートに完全に一致（Ｗ）し、そして予想速度２４ｎｔにて移動するライゲーション産物を形成する。レーン２の実験は、さらに、ライゲーションするミスマッチ（Ｗ＋Ｍ）プローブを有する。これは、完全な一致産物とテンプレート（３８ｎｔ）との間の新規なバンドによって示される。ミスマッチプローブ（ＤＮＡ２Ａ）は、そのライゲーション部位（５’リン酸プローブの５’末端のＡ塩基）にミスマッチを有する。レーン３の実験は、完全に一致するＰＮＡ6−ＤＮＡ3キメラとＤＮＡ２第２プローブを連結して、新規なバンドを生じ、これはテンプレートよりも早く移動する。レーン４の実験は、さらにミスマッチＤＮＡ２Ａプローブを有する。レーンの全てＤＮＡの実験とは異なり、ミスマッチＤＮＡ２Ａは、キメラと連結しない。このことは、ＰＮＡ部分によって付与されるより大きな特異性を示す。レーン５および７の実験は、同様に、このキメラの３’末端にミスマッチを有する。レーン８の実験におけるキメラの３’末端は、欠失およびミスマッチを有する。これらの実験（レーン５、７、８）は、ライゲーション産物を示さない。レーン６の実験は、ＤＮＡ9プローブの付近の終わりから２番目の塩基にミスマッチを有する。この実験において、ライゲーション産物が明らかであり、これは、全てＤＮＡのプローブのライゲーションのより低い特異性を反映する。
【０１３７】
まとめると、このライゲーション実験は、図６において、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブが、オリゴヌクレオチドプローブにライゲーションした場合に、２つの全てＤＮＡのオリゴヌクレオチドプローブ間のライゲーションよりも良好に塩基対ミスマッチ（特異性）を、そのミスマッチがキメラプローブで生じようと、またはオリゴヌクレオチドプローブで生じようと、識別し得ることを、示す。
【０１３８】
（実施例３  ライゲーション産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析）
質量スペクトルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅ  ＤＥ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの事業部）ワークステーションにて得た。脱塩サンプルを、マトリクス溶液（５０μｇ／ｍｌ  ３−ヒドロキシピコリン酸、５０ｍＭクエン酸アンモニウム、および３０％アセトニトリルを含む）と１：１で混合し、そしてサンプルプレート上にスポットする。２０〜５０個の個々のレーザーパルスからの飛行時間データを、過渡（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ディジタイザー上で記録し、そして平均し、その後、平均したスペクトルを、データ処理ソフトウェアによって、自動的に変換する。図７のライゲーション反応。３’ビオチン化２０ｎｔオリゴヌクレオチド（質量６３０３）およびＰＮＡ−ＤＮＡキメラ（質量２５３９）を、５’ビオチン化ＤＮＡテンプレート３８ｎｔ（質量１２３５８）にハイブリダイズさせた。図７Ａは、リガーゼを含まない混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ分析を示す。この分析は、出発物質のイオンピークのみを示す。このライゲーション混合物が、リガーゼを含む場合（図７Ｂ）、予想質量８８２３．８を有するライゲーション産物が、明らかである。
【０１３９】
【化９】
2006055177.tif 000014
Ａｃ＝アセチル化アミノ末端
（大文字−ＰＮＡ、小文字−ＤＮＡ）。
【０１４０】
（実施例４  ＣＦＴＲ遺伝子座についての多重オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）
ＣＦＴＲ遺伝子座についてのＯＬＡ反応を、１つのチューブにおいて多重化した。２つの示差的に標識した（すなわち、５’部位でＦＡＭ標識またはＴＥＴ標識した）ＰＮＡ−ＤＮＡキメラおよび１つの５’リン酸化ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、各変異の分析に使用した。このプローブおよびテンプレートの配列を、図８に示す。すべての多重ＯＬＡ反応を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１〜５０ｎＭ各プローブ、５〜１０μｌのプールしたＰＣＲ産物、および２〜１０単位の熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼ）を含む、２０μｌの反応容器において実行する。産物の線形増幅が、Ｍｏｄｅｌ  ９７００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ事業部）９４℃にて３０秒および３０〜５０℃にて１〜３分を２０〜３０サイクル、続いて９５℃にて１０〜２０分間の加熱によって達成される。
【０１４１】
各多重ＰＬＡ産物のアリコート２μｌを、２．５μｌの脱イオンホルムアミド、０．５μｌのデキストランブルーローディング緩衝液、および０．５μｌのＧＥＮＥＳＣＡＮ−５００  ＴＡＭＲＡサイズマーカーと混合した。この混合物を、９５℃にて３分間変性し、次いで、ゲルにローディングする前に氷上で迅速に冷却した。ＯＬＡ産物を、Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ蛍光スキャニングＤＮＡ配列決定機（ＰＥ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ事業部）上に２，５００Ｖにて３．５時間電気泳動した。このゲルは、８．３Ｍ尿素、８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、８％アクリルアミド、１９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド、変性ゲルを使用した。得られたゲルデータを、ＧＥＮＥＳＣＡＮ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰＥ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ事業部）を使用して、ピークの色およびフラグメントのサイズを分析する。
【０１４２】
図９は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子座における変異を識別するための、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いてのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す。ライゲーション混合物は、テンプレートおよび２つのプローブ（最終濃度各１μＭ）、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液[５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン]および１，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを、容量５０μ中に含んだ。この混合物を、２２．５〜２５℃にて３〜４時間インキュベーションした。インキュベーション後、この反応混合物を、８０℃にて２０分間加熱し、次いで４℃にて貯蔵した。この反応混合物５μｌを、ＰＡＧＥ分析に使用し、１２０〜１４０Ｖにて２０〜６０分間電気泳動した。（９Ａ）ヒトｐＣＦＴＲ６２１Ｇ−Ｔ：エキソン４；（９Ｂ）ヒトｐＣＦＴＲ１０７８ｄｅｌＴ：エキソン７；（９Ｃ）ヒトｐＣＦＴＲＧ５５１Ｄ：エキソン１１。（大文字−ＰＮＡ、小文字−ＤＮＡ）。
【０１４３】
図９Ｄは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブおよび全てＤＮＡのコントロールプローブを用いた、ＯＬＡ実験をスキャンした画像を示す（レーン１０）。Ｔ４リガーゼを用いた、ＣＦＴＲ遺伝子座６２１Ｇ−Ｔでの、ＰＮＡ10−ＤＮＡ3キメラとの３’−ＴＡＭＲＡ標識５’リン酸オリゴヌクレオチドのライゲーションは、ＵＶ光下で染色なしで目に見える、蛍光標識産物を生じ（９Ｄ、上のゲル）、そしてＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎで染色することによって目に見える、蛍光標識産物を生じた（９Ｄ、下のゲル）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラとのライゲーション産物もまた、レーン３およびレーン９において、実験から明らかである。
【０１４４】
（表５  図９Ｄ）
【０１４５】
【表５】
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すべての刊行物および特許出願は、本明細書中で、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が、参考として援用されると、特にそして個々に示されたのと同じ程度に、参考として援用される。
【０１４６】
特定の実施形態が上記に詳細に記載されているが、当業者は、多くの改変が、好ましい実施形態において、その教示を逸脱しないで可能であることを、明らかに理解する。このような改変すべては、上記の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、ＰＮＡおよびＰＮＡ−ＤＮＡキメラの構造を示す：（１Ａ）２つの２’−デオキシヌクレオチド、および（１Ｂ）３つの２’−デオキシヌクレオチド、Ｂは核酸塩基。
【図２Ａ】図２Ａは、リンカー剤および結合の構造を示す：（２Ａ）アミド結合およびホスホジエステル結合を形成するリンカー剤。
【図２Ｂ】図２Ｂは、リンカー剤および結合の構造を示す：（２Ｂ）２−（２−アミノエトキシ）エトキシ酢酸のビス−アミド結合。
【図２Ｃ】図２Ｃは、リンカー剤および結合の構造を示す：（２Ｃ）２−（２−アミノエトキシ）エタノールのアミド、リン酸エステル結合。
【図３Ａ】図３Ａは、ライゲーションの一般化した図式を示す：（３Ａ）３’−ヒドロキシルＰＮＡ−ＤＮＡキメラと５’−リン酸オリゴヌクレオチドとの間（ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされ、ＰＮＡ−ＤＮＡライゲーション産物を形成する）
【図３Ｂ】図３Ｂは、ライゲーションの一般化した図式を示す：（３Ｂ）ライゲーション実験のための、プローブの配列および３８ｎｔの完全一致ＤＮＡテンプレート。
【図４Ａ】図４Ａは、ライゲーション実験のＰＡＧＥ分析のスキャンされたイメージを示す：（４Ａ  上）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼあり、および（４Ａ  下）リガーゼなし。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ライゲーション実験のＰＡＧＥ分析のスキャンされたイメージを示す：（４Ｂ）デンシトメトリー（ＳｐｏｔＤｅｎｓｏプログラム）によるライゲーションの定量的評価。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション実験のＰＡＧＥ分析の、スキャンされたイメージを示す：（５Ａ）ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ染色されたゲルイメージ。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション実験のＰＡＧＥ分析の、スキャンされたイメージを示す：（５Ｂ）ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ、およびＤＮＡの、ＤＮＡテンプレート３８ｎｔにハイブリダイズされた５’−リン酸オリゴヌクレオチドへのライゲーションの図式。
【図６】図６は、野生型配列および変異型配列を検出するＰＮＡ−ＤＮＡキメラリガーゼ反応のＰＡＧＥ分析の、スキャンされたイメージ、ならびにオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドライゲーションと比較した、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブ：オリゴヌクレオチドライゲーションの特異性を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ライゲーション反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す：（７Ａ）リガーゼなし。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ライゲーション反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す：（７Ｂ）リガーゼあり。
【図８Ａ】図８Ａは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を示す：（８Ａ）異なる色素標識を用いて遺伝子座の性質を決定する工程。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を示す：（８Ｂ）異なる長さのオリゴヌクレオチドの５’−リン酸でのミスマッチ塩基および／または移動度変更剤を用いる、複合的なＯＬＡ。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を示す：（８Ｃ）異なる長さのＰＮＡ−ＤＮＡキメラの３’末端でのミスマッチ塩基および／または移動度変更剤を用いる、複合的なＯＬＡ。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒトＣＦＴＲの遺伝子座における変異を識別するための、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す：（９Ａ）ヒトｐＣＦＴＲ６２１Ｇ−Ｔ：エキソン４。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒトＣＦＴＲの遺伝子座における変異を識別するための、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す：（９Ｂ）ヒトｐＣＦＴＲ１０７８ｄｅｌＴ：エキソン７。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ヒトＣＦＴＲの遺伝子座における変異を識別するための、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す：（９Ｃ）ヒトｐＣＦＴＲＧ５５１Ｄ：エキソン１１（大文字−ＰＮＡ、小文字−ＤＮＡ）。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ヒトＣＦＴＲの遺伝子座における変異を識別するための、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す：（９Ｄ）ＣＦＴＲ遺伝子座６２１Ｇ−ＴにＰＮＡ10マー−ＤＮＡ3マーを有するＯＬＡ。ＵＶ照明下で（上）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色で（下）、視覚化され、そして記録された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【配列表】
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