(57)【要約】      （修正有）【課題】  蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基板表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分には不要な生理活性物質が吸着しない、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供する。【解決手段】  基板表面に、生理活性物質を特異的に捕捉する物質であるキャプチャーをスポット状に固定化してなるバイオチップの製造方法であって、（１）基板表面のキャプチャーを固定化する部分を予めマスキング物質で覆う工程、（２）マスキング物質で覆われた部分を含む基板表面を生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質でコートする工程、（３）マスキング物質を除去する工程、（４）マスキング物質を除去した部分にキャプチャーを含む溶液を接触する工程、を含むバイオチップの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に、生理活性物質を特異的に捕捉する物質であるキャプチャーをスポット状に固定化してなるバイオチップの製造方法であって、
（１）基板表面のキャプチャーを固定化する部分を予めマスキング物質で覆う工程、
（２）マスキング物質で覆われた部分を含む基板表面を生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質でコートする工程、
（３）マスキング物質を除去する工程、
（４）マスキング物質を除去した部分にキャプチャーを含む溶液を接触する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項２】
生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質がホスホリルコリン基を有する高分子、ポリペプチドを有する高分子、スキムミルク、ウシ血清アルブミンより選択される少なくとも１種類である請求項１記載のバイオチップの製造方法。
【請求項３】
キャプチャーが蛋白質である請求項１又は２記載のバイオチップの製造方法。
【請求項４】
更に、（５）基板表面処理としてガンマ線照射、プラズマ処理、紫外線照射の少なくとも１種からなる処理工程、を有する請求項１〜３いずれか記載のバイオチップの製造方法。
【請求項５】
基板の材質がプラスチックである請求項１〜４いずれか記載のバイオチップの製造方法。
【請求項６】
プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である請求項５記載のバイオチップの製造方法。
【請求項７】
基板形状がスライドグラス状である請求項１〜６いずれか記載のバイオチップの製造方法。
【請求項８】
基板表面に流路を有し、流路内にキャプチャーを固定化することを特徴とする請求項１〜７いずれか記載のバイオチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の多数の蛋白質、核酸等の並列検出および分析に用いられるバイオチップの製造方法に関する技術であり、さらに詳しくは、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。
【０００３】
「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして、ＤＮＡチップが開発され、実用化されつつある。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関してはプロテインチップが提唱され、近年研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板）表面に固定化したものを総称する。
【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
蛋白質を捕捉する分子（以下、捕捉分子と略す）を基板上に固定化した後、例えばサンドイッチ法のように該表面上で他の蛋白質（抗原抗体反応の場合、抗原に相当）と反応させ、更に、標識された蛋白質を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、捕捉分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質、即ち、抗原や標識された蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり正確な評価ができなくなる。
【０００６】
また、すべての蛋白質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基板表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分には不要な生理活性物質が吸着しない、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、
（１）  基板表面に、生理活性物質を特異的に捕捉する物質であるキャプチャーをスポット状に固定化してなるバイオチップの製造方法であって、
（1）基板表面のキャプチャーを固定化する部分を予めマスキング物質で覆う工程、
（2）マスキング物質で覆われた部分を含む基板表面を生理活性物質を結合又は吸着を抑制するする物質でコートする工程、
（3）マスキング物質を除去する工程、
（4）マスキング物質を除去した部分にキャプチャーを含む溶液を接触する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法、
（２）  生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質がホスホリルコリン基を有する高分子、ポリペプチドを有する高分子、スキムミルク、ウシ血清アルブミンより選択される少なくとも１種類である（１）記載のバイオチップの製造方法、
（３）  キャプチャーが蛋白質である（１）又は（２）記載のバイオチップの製造方法、
（４）  更に、（5）基板表面処理としてガンマ線照射、プラズマ処理、紫外線照射の少なくとも１種からなる処理工程、を有する（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（５）  基板の材質がプラスチックである（１）〜（４）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（６）  プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも１種である（５）記載のバイオチップの製造方法、
（７）  基板形状がスライドグラス状である（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
（８）  基板表面に流路を有し、流路内にキャプチャーを固定化することを特徴とする（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップの製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバイオチップの製造方法によれば、蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基板表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分には不要な生理活性物質が吸着しない、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップを製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の製造方法は、基板作製工程、マスキング工程、基板表面処理（修飾）工程を含む。基板表面処理工程は省いても使用可能であるが、より強固に捕捉物を固定化する為に用いる事が好ましい。
【００１１】
（基板の素材）
本発明に使用する基板の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基板の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等を指す。
本発明に使用する基板の形状は、特に限定しないが、スライドグラス状であることが好ましい。その他、基板表面に流路を有し、流路内にキャプチャーを固定化することも好ましい実施形態の一つである。
【００１２】
（基板のマスキング）
本発明の基板のマスキングに使用する物質としては、基板に固定化でき、マスキング部分を含む基板表面を生理活性物質を結合および又は吸着を抑制する物質でコートした後マスキング物質を除去したときに、マスキング部分に前記マスキング物質が存在しない状態を作り出すことができる物質であればよく、例えばゴム系の物質が挙げられ、特にシリコーンゴムが好ましい。
【００１３】
本発明においては、基板表面のキャプチャーを固定化する部分を予めマスキング物質でスポット状に覆い、次いでマスキング物質で覆われた部分を含む基板表面を生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質でコートし、その後マスキング物質を除去することが好ましい。
生理活性物質を結合又は吸着を抑制する物質としては、ホスホリルコリン基を有する高分子、ポリペプチドを有する高分子、スキムミルク、ウシ血清アルブミンより選択される少なくとも１種類であることが好ましい。
【００１４】
（基板の表面処理）
本発明において、基板の表面処理（修飾）を行うことが好ましい。表面処理方法としては種々の方法が用いられるが、ガンマ線処理を行うと基板表面が改質され、生理活性物質がより強固に固定されるので好ましい。その他にはプラズマ処理、紫外線処理等が挙げられる。
基板の表面処理は、マスキング物質を除去した後に行うことが好ましい。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
ポリスチレン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）の基板に加工した。この基板表面に、主剤と硬化剤からなる液状シリコーンゴムを混合させ、即座にスポット状に塗布して硬化させたのち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板のシリコン塗布部以外に蛋白無吸着処理を施した。次いでシリコーンゴムを取り除いた。
次に、この基板に１０ｋＧｙのガンマ線を照射して表面の改質を行った。
続いて、基板のシリコン塗布部に一次抗体として抗マウスＩｇＧ２ａ抗体をスポットし、室温４℃、飽和状態の湿度の環境下に２４時間静置して固定化させた。固定化後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。その後、抗原であるマウスＩｇＧ２ａ抗体および血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。
【００１６】
（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。基板表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に、該基板に一次抗体として抗マウスＩｇＧ２ａ抗体をスポットし、室温４℃、飽和状態の湿度の環境下に２４時間静置して固定化させた。固定化後、非特異吸着防止の為に大日本製薬（株）製免疫実験用ブロッキング剤「ブロックエース」を純水で４倍希釈した溶液に該基板を浸し、室温で１時間静かに振とうした。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄を行った。続いて、抗原であるマウスＩｇＧ２ａ抗体および血清蛋白の混合物をＣｙ３標識したものを反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。結果を表１に示す。
【００１７】
実施例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製バイオチップスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、解像度３０μｍであった。
実施例は、蛍光強度では比較例より高く、バックグラウンド値は比較例に比べて格段に低く、Ｓ／Ｎ比も大きかった。すなわち、高感度な生理活性物質の検出ができたことが確認された。
【００１８】
【表１】
2006132943.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明のバイオチップの製造方法によれば、蛋白質、またはそれを捕捉する分子等の生理活性物質を基板表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分には不要な生理活性物質が吸着しない、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出が可能なバイオチップを提供することができるので、マイクロフルイディクスを含む各種バイオチップの製造に適用できる。