(57)【要約】    【課題】本発明は、複数のレポーター遺伝子を用いて、同細胞サンプルを用いて複数の転写活性を直接比較する方法に関する。さらに詳しくは、正常プロモーターと変異型プロモーター、応答性プロモーターと非応答性プロモーター、などの転写活性を直接比較する方法に関する。    【解決手段】別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が正常型プロモーターの制御下にあり、残りのレポーター遺伝子が変異型プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞、及び哺乳類細胞を異なる培養条件下で培養し、レポーター遺伝子に連結されたプロモーターの転写活性を測定し、サンプル間のプロモーターの転写活性を比較することからなる、プロモーター活性の解析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が正常型プロモーターの制御下にあり、残りのレポーター遺伝子が変異型プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【請求項２】
別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーターが第１の遺伝子多型プロモーターの制御下にあり、残りのレポーターが別の遺伝子多型プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【請求項３】
別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が応答性プロモーターの制御下にあり、残りのレポーター遺伝子が非応答性プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞を異なる培養条件下で培養し、レポーター遺伝子に連結されたプロモーターの転写活性を測定し、サンプル間のプロモーターの転写活性を比較することからなる、プロモーター活性の解析方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞を薬物候補化合物存在下、非存在下で培養し、レポーター遺伝子に連結されたプロモーターの転写活性を測定し、サンプル間のプロモーターの転写活性を比較することからなる、該候補化合物の影響の評価方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子がchloramphenicol acethyltransferase、growth hormone、alkaline phosphatase、β-galactosidase、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質から選択される請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞。
【請求項７】
レポーター遺伝子が1つ以上のルシフェラーゼを含んでなる請求項６に記載の哺乳類細胞。
【請求項８】
ルシフェラーゼを２つ以上のルシフェラーゼを含んでなる請求項７に記載の哺乳類細胞。
【請求項９】
ルシフェラーゼが発光性甲虫由来のルシフェラーゼを含んでなる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
３つ以上のルシフェラーゼが異なる発光波長特性を有する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のレポーター遺伝子を発現可能に組み込んだ細胞サンプルを用いて、同細胞サンプルを用いて複数の転写活性を直接比較する方法に関する。さらに詳しくは、正常プロモーターと変異型プロモーター、応答性プロモーターと非応答性プロモーター、などの転写活性を同一細胞サンプルにおいて直接比較し、プロモーター多型を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型には、塩基配列の置換、挿入、欠失などがある。その中でも、近年、1塩基置換の多型である1塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism）が注目され、研究が進んでいる。SNPとしては、遺伝子発現制御領域にあるｒSNP、タンパクシ質をコードする領域あるcSNP、さらには遺伝子のイントロン（mRNAに転写後、スプライシングにより除去され、タンパク質をコードしない）にあるiSNPがある。SNPを含む遺伝子多型は、個性に応じた医療（オーダーメイド医療）にとって必要な情報と考えられるのは、これらSNPが、例えば血圧、血糖、アレルギーなどの疾患を起こしやすいかどうか、薬の効果などの個人差の少なくとも一部を説明できるのではないかと言う期待があるからである。
【０００３】
SNPのなかでも、cSNPの解析はタンパク質の機能に直接寄与するため注目されてきた。その例としては、神経栄養因子BDNFに存在するＳＮＰs集団においてフラッシュメモリーが劣ることが統計学的に明らかになり、併せて、神経栄養因子−蛍光タンパク質を作成し、本融合タンパク質の局在が変化することを見出し、細胞内での動態の違いを明らかにした（非特許文献１）。一方、一分子多型の解析の重要性は指摘されているが、遺伝子発現制御領域に存在するSNP情報の解析法は充分に確立されていない。そのため、遺伝子発現制御に関わる可能性のあるrSNPは研究が進んでおらず、データの蓄積のcＳＮＰに比べ圧倒的に少ない。
【０００４】
遺伝子発現制御解析を解析する手法として、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列（候補））を含むベクターを適当な細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性測定を行う。これまで、レポーター遺伝子として、大腸菌chloramphenicol acethyltransferase(CAT)、ヒトgrowth hormone、alkaline phosphatase、ホタル（Photinus Pyralis）ｌuciferase、大腸菌β-galactosidase、蛍光タンパク質（GFP）などが用いられてきました。これらの中で、luciferase遺伝子の発光を利用したシステムが感度が高く活性測定が簡便なことから、現在特に用いられている。
【０００５】
レポーターアッセイのサンプル間には、トランスフェクション効率、細胞死、細胞等によるバラツキなど、レポーターの発現量差をもたらす意図されていない要因が存在する。そのため、試験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、コントロールプロモーターに連結された基質特異性（反応性）の異なるレポーター分子を内部標準としてサンプル間を標準化する必要があります。このような場合など、2つ以上の遺伝子発現を同時に測定するには、これまで上記の遺伝子を併用したり、異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）がクローニングされ用いられてきた。
【０００６】
前記方法では、サンプル間を第２の内部標準用のレポータータンパク質活性で標準化し、サンプル間の第１のレポータータンパク質の活性を比較することによって、第１のレポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素の活性を解析する。しかしながら、このような比較では、複数のプロモーター活性の動態比較は間接的である。さらに、この比較の間には、実験操作のバラツキなどによる、擬陽性、擬陰性を含んでしまう可能性がある。特に、SNPなどのプロモーター多型の解析では、単に一つの遺伝子発現情報を解析するだけではSNPの影響を理解できないため、同一細胞で、同一条件下で、しかも第３者の遺伝子発現と比較する必要がある。そこで、これらの問題を克服した方法が必要とされていた。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９９４２１
【非特許文献１】M. F. Egan, M. Kojima, J. H., Callicott, T. E. Goldberg, B. S. Kolachana, A. Bertolino, E. Zaitsev, B. Gold, D. Goldman, M. Dean, B. Lu, D. R Weinberger; The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function.  Cell Cell. 2003 Jan 24;112(2):257-69.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、多型プロモーターを正常型プロモーターとより直接的に比較評価し、変異や多型の転写活性への寄与を解析する方法を提供することである。さらには、変異や多型による薬物応答の違いをより直接的に評価する方法、ならびに薬物のスクリーニング方法を提供することではある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特許文献1において、イリオモテボタル由来の緑、橙色発光タンパク質、鉄道虫由来赤色発光タンパク質を用いて、3つのプロモーター活性を同時に測定する方法を開示している。本発明者らは、さらに鋭意研究を重ねた結果、多型プロモーターを正常型プロモーターとより直接的に比較評価し、変異や多型の転写活性への寄与を解析し、また、変異や多型による薬物応答の違いをより直接的に評価することが可能であることを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００９】
項１．別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が正常型プロモーターの制御下にあり、残りのレポーター遺伝子が変異型プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【００１０】
項２．別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーターが第１の遺伝子多型プロモーターの制御下にあり、残りのレポーターが別の遺伝子多型プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【００１１】
項３．別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が応答性プロモーターの制御下にあり、残りのレポーター遺伝子が非応答性プロモーターの制御下にある遺伝子構築物を、一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞。
【００１２】
項４．項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞を異なる培養条件下で培養し、レポーター遺伝子に連結されたプロモーターの転写活性を測定し、サンプル間のプロモーターの転写活性を比較することからなる、プロモーター活性の解析方法。
【００１３】
項５．項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞を薬物候補化合物存在下、非存在下で培養し、レポーター遺伝子に連結されたプロモーターの転写活性を測定し、サンプル間のプロモーターの転写活性を比較することからなる、該候補化合物の影響の評価方法。
【００１４】
項６．レポーター遺伝子がchloramphenicol acethyltransferase、growth hormone、alkaline phosphatase、β-galactosidase、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質から選択される項１、２に記載の哺乳類細胞。
【００１５】
項７．レポーター遺伝子が1つ以上のルシフェラーゼを含んでなる項６に記載の哺乳類細胞。
【００１６】
項８．ルシフェラーゼを２つ以上のルシフェラーゼを含んでなる項７に記載の哺乳類細胞。
【００１７】
項９．ルシフェラーゼが発光性甲虫由来のルシフェラーゼを含んでなる請求項７または８に記載の方法。
【００１８】
項１０．３つ以上のルシフェラーゼが異なる発光波長特性を有する、請求項９に記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法及び哺乳類細胞により、3つのレポーター遺伝子を用いて、2種類のプロモーター活性、特に正常型プロモーターと変異型プロモーター、応答性プロモーターと非応答性プロモーター、及び1つのコントロールプロモーターを内部標準として、の薬物応答などの動態比較をより直接的に行うことができ、効率よくプロモーター多型を解析することが可能になった。本系においては、3つのレポーター遺伝子として3色の発光タンパク質を用いて光分離測定することにより、1反応で3つのレポータータンパク質活性を測定することにより、より迅速及び／または多量の多型あるいは処理条件を解析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明における「プロモーター」とは、シス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列、あるいはその可能性があると考えられる塩基配列である。Herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) 由来のプロモーターやCytomegalovirus (CMV) 由来のプロモーターの最小単位に連結されたシス作用性塩基配列であってもよい。前記プロモーターは、哺乳類またはウイルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどからクローニングされる。
【００２２】
定常発現プロモーターに連結されたレポータータンパク質の活性は、サンプル間のトランスフェクション効率、細胞数、細胞の生育状態のバラツキを標準化するために用いることが望ましい。定常発現プロモーターとしては、ウイルス由来のHSVtkプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、哺乳類細胞由来のハウスキーピング遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【００２３】
変異型プロモーター、遺伝子多型プロモーターとしては、１つ以上の塩基が置換（または相違）、欠失、または挿入されたプロモーターであり、個人や人種の違いから取得されたプロモーターである。また、プロモーターの特定部位の塩基配列の活性への寄与を調べるため、人為的に塩基が部位特異的に置換、欠失、または挿入されたプロモーターであってもよい。変異導入部位としては、TATAボックス、CAATボックス、GCボックス、これ以外にも転写因子の結合部位、SRE(serum responsive element)、TRE(TPA responsive element)など、プロモーター活性に影響を与える可能性がある部位が挙げられる。さらに、ある疾病などの集団で多頻度に認められる多型プロモーターと健常人の正常プロモーターの動態の比較を行うことも可能である。
【００２４】
このようなアッセイを行うことで、多型プロモーターに起因する転写活性の変動、あるいは（正常）プロモーターの機能を調べることが可能である。
【００２５】
例えば、c-fosのSRE、TRE部位に変異（欠失を含む）導入することにより、c-fosのPMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)、血清や成長因子などによるc-fosの応答性の変化を観察することができる。
【００２６】
従来、遺伝子のコーディング領域の変異（ｃSNP）についてよく研究されてきたが、プロモーターの変異はあまり調べられていなかった。本発明により、プロモーター多型と遺伝子発現について詳細な検討が可能になるので、今後プロモーター多型の解析、さらにはプロモーターの機能の解明に役立つと期待される。また、疾患と遺伝子との関係、薬の効果の個人差の関係においても、プロモーター（多型）の関与がより詳細に解明され得る。
【００２７】
例えば、２型糖尿病患者のcytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase（PDK１）遺伝子プロモーターにおいて-２３２位にC→GのSNPが認められ、−２３２位がCのプロモーターと比較するとインスリンによるダウンレギュレートを示さず、定常状態の発現の増大が認められたとの報告がある。このようなSNPによる応答性の変化は、多型プロモーターと正常プロモーターを同じ細胞で評価することによって、より直接的に、より効率的に見出すことが可能である。
【００２８】
応答性プロモーターとしては、TPA(PMA)やcAMP、血清など、さまざまな誘導因子の存在に依存した発現誘導活性能を有する、cＡＭＰ応答配列（CRE）,TPA応答配列（TRE）,熱ショックエレメント（HSE）,グルココルチコイド応答配列（GRE）,金属応答配列（MRE）,ステロイド応答配列（ERE）,外来薬剤応答配列（XRE）,血清応答配列（SRE）などの応答配列あるいはそれに類似の配列を持つプロモーター、組織特異的な発現誘導性を示すプロモーター、発生・分化状態に特異的な発現誘導性を示すプロモーターなどがあげられる。ある刺激に応答性のあるプロモーター制御下にある第２のレポーター遺伝子と非応答性のプロモーターの制御下にある残りのレポーター遺伝子を共存させることによって、あるサンプル中にそのような応答プロモーターを刺激するような薬物が含まれるかどうかの検査、薬物スクリーニング等、より精度の高い評価が可能となる。より精度の高い評価についてもう少し説明すると、非応答性プロモーターのみのサンプルではある刺激が実際に細胞に加えられ、その刺激に対するシグナル伝達が細胞内に実際にあったが、応答しなかったことを証明するシグナルがないため、そのサンプルではある刺激を上手く加えることができなかったために応答が認められなかった可能性を含む。応答性プロモーターのみでは他の要因により刺激された可能性も含む。
【００２９】
これらのプロモーターは、レポーター遺伝子の上流に連結される。レポーター遺伝子は哺乳類細胞で効率よく発現させるため、哺乳類型のコドンユーセージに変更されていることが望ましい。さらに、翻訳を効率化するため、Kozak配列が挿入されてることが好ましい。
【００３０】
哺乳類細胞へのこれらの遺伝子構築物の導入方法としては、市販のリポフェクション系試薬やリン酸カルシウムなどによる化学的方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの物理的方法、ウイルスベクターを用いた生物学的方法のいずれであってもよい。プロモーターの転写活性は、哺乳類細胞内で合成されたレポータータンパク質の活性または量を測定することによって相対値化される。
【００３１】
哺乳類としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌが挙げられ、好ましくはヒトである。
【００３２】
レポーター遺伝子としては、chloramphenicol acethyltransferase、growth hormone、alkaline phosphatase、β-galactosidase、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質より選択される。例えば、前記chloramphenicol acethyltransferaseはクロラムフェニコールを、前記ルシフェラーゼはルシフェリンを基質とした反応により活性が測定される。前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ  （Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び種々のアミノ酸置換を導入した改変型などが挙げられる。蛍光タンパク質は励起光を照射し、蛍光を測定することにより相対量が測定される。しかしながら、蛍光タンパク質を用いた解析は定量性が低いといわれる。より好ましくは、ルシフェラーゼを用いる。ルシフェラーゼの発光測定は簡便で、定量性が高い。
【００３３】
ルシフェラーゼ遺伝子としては、ホタル由来のルシフェラーゼ、ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼ、ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ、鉄道虫由来のルシフェラーゼ、渦鞭毛藻由来のルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来のルシフェラーゼなどが挙げられる。より好ましく、同一基質、D-ルシフェリンを基質とする、発光性甲虫由来のルシフェラーゼが好ましい。さらに好ましくは、発光スペクトルがpHの影響を受けず、半値幅がより小さいイリオモテボタル由来の緑色、橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色、緑色ルシフェラーゼから選択されることが好ましい。
【００３４】
ルシフェラーゼの活性測定は、界面活性剤を含む細胞溶解剤、または超音波処理などにより細胞を破砕し、ルシフェリン、ATPなどを含む発光基質溶液と混合し、発光を測定する。細胞培養液にルシフェリンを添加し、そのまま発光を測定することも可能である。複数の発光色ルシフェラーゼを用いる場合は、光分離機能付きルミノメーターで分離測定することによって1つの反応で複数のレポータータンパク質（ルシフェラーゼ）の活性を測定することが可能である。
【００３５】
解析の例としては、例えば正常型プロモーターと変異型プロモーターの活性変動をより直接的に解析することにより当該プロモーター多型の転写活性への影響を調べたり、正常型または変異型プロモーターの発現制御のいずれかのみ影響を与える化合物をより直接的にスクリーニングできる。
【００３６】
別の解析の例としては、例えば応答配列プロモーターと非応答性配列プロモーターの活性変動を比較することにより、より確実に、より特異的に作用する化合物のスクリーニング、未知試料中に応答配列を刺激する化合物が存在するかどうかを調べることが可能である。
【００３７】
解析した結果は、創薬などに利用されうる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例１  ｃ−fosプロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド1、2（PRORIGO）（配列番号１、２）を用いて、5% DMSO存在下でKOD -plus（東洋紡績）によりPCR増幅した。増幅断片、赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-test（東洋紡績）を制限酵素Bgl II、EcoR Iで処理し、Ligation high（東洋紡績）を用いて連結した(pSLR-cfos１)。
実施例２  変異型（欠失型）ｃ−fosプロモーターのクローニング
pSLR-cfosを鋳型として、オリゴヌクレオチド３（PRORIGO）（配列番号３）及び２を用いて、KOD -plus（東洋紡績）によりPCR増幅した。増幅断片、橙色発光ルシフェラーゼベクターpSLO-test（東洋紡績）を制限酵素Bgl II、EcoR Iで処理し、Ligation high（東洋紡績）を用いて連結した(pSLO-cfos２、pSLO-cfos３)。
実施例３  CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×105 cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-cfos1 0.5μg、pSLO-cfos2 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、1μM PMA (TPA、Sigma)、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例４  ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図2は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型プロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、変異型（欠失型）プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
実施例5  annexin6プロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド4、5（PRORIGO）（配列番号4、5）を用いて、5% DMSO存在下でKOD -plus（東洋紡績）によりPCR増幅した。増幅断片、赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-test（東洋紡績）を制限酵素Bgl II、EcoR Iで処理し、Ligation high（東洋紡績）を用いて連結した(pSLR-annexin6)。
実施例６  CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×105 cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-annexin6 0.5μg、pSLO-cfos 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例７  ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図３は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の複数のレポーター遺伝子を用いて、同細胞サンプルを用いて複数の転写活性を直接比較する方法は、正常プロモーターと変異型プロモーターのより直接的に比較し、遺伝子多型を解析する系として、さらに薬剤応答への直接比較による薬剤スクリーニング系、未知試料中の刺激因子の存在の有無の検査系として利用することができ、創薬などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】正常型c-fosプロモーター、欠失型c-fosプロモーターの配列上の比較図である。
【図２】緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型c-fosプロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、多型（欠失型）プロモーターc-fos2では応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【図３】緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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