(57)【要約】【課題】生体分子を固体に固定化して生体分子間の相互作用を観察する方法において、固定化する生体分子の固定化方向を制御することで、生体分子の相互作用測定を容易とする方法に関する。【解決手段】固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察方法において、非対称である生体分子（Ｂ）の嵩高い側が表面から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御して生体分子の相互作用観察を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察方法であって、非対称である生体分子（Ｂ）の嵩高い側が表面から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御する生体分子の相互作用観察方法
【請求項２】
上記固体表面が平面基板である請求項１記載の生体分子の相互作用観察方法
【請求項３】
上記固体表面が金属である請求項１〜２いずれか記載の生体分子の相互作用観察方法
【請求項４】
表面プラズモン共鳴法によって生体分子の相互作用観察を行う請求項１〜３いずれか記載の方法
【請求項５】
表面プラズモン共鳴イメージング法によって生体分子の相互作用観察を行う請求項１〜４いずれか記載の方法
【請求項６】
生体分子（Ａ）をアレイ状に固定化する請求項１〜５いずれか記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子を固体に固定化して生体分子間の相互作用を観察する方法において、固定化する生体分子の固定化方向を制御することで、生体分子の相互作用測定を容易かつ正確にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の生体内における機能を解析する手段として、生体分子の相互作用が調べられてきた。相互作用を調べる手段の一つとして、結合ペアの一方の分子（Ａ）を固体表面に固定化して、測定対象となる分子（Ｂ）との相互作用を解析する方法が一般的に用いられている。
【０００３】
生体分子が固定化される場合に、その固定化方法についても検討されてきた。固定化する方法として、物理吸着、キレート結合、共有結合、イオン結合、水素結合などが使われてきた。それらの知見より、生体分子を固定化する手段が重要であることは既知である。なぜなら生体分子の活性部位（結合部位）に存在する官能基を介して表面に固定化された場合、生体分子はその活性を保つことはできないからである。
【０００４】
一般的に固定化を制御する方法として、生体分子の末端や、活性に関係のない部分に官能基またはグループを導入しておき、その官能基もしくはグループを介して生体分子を表面に固定化する方法が取られてきた。オリゴＤＮＡの場合、５’末端または３’末端にビオチンを導入して合成し、ストレプトアビジン表面に反応させることで、末端でＤＮＡが固定化され中心の配列には固定化による悪影響を与えないことができる（特許文献１）。また、共有結合でオリゴＤＮＡを固定化する方法としては、チオール末端のＤＮＡを合成し、マレイミド基の表面と反応させることで固定化する方法が示されている（特許文献２）。
【０００５】
ペプチドの場合、Ｎ末端もしくはＣ末端にシステインを導入して合成し、ピリジル基を有するジスルフィド表面とチオール−ジスルフィド交換反応させることで固定化する方法が示されている（非特許文献１）。蛋白質の場合は、Ｎ末端もしくはＣ末端にタグを設ける手段により、方向を考慮して固定化する技術が既知である。タグとしてはヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、エラスチン様タンパク（ＥＬＰ）などが挙げられ、融合蛋白質として発現される。
【０００６】
しかし、いずれの場合も固定化する生体分子（Ａ）の活性を保つこと、活性を保つために固定化する向きを制御することが考えられてきたものの、相互作用する対象の生体分子（Ｂ）が基板表面に固定化された（Ａ）に結合しやすいように、（Ａ）の固定化方向が検討されたことは全くなかった。固体表面に生体分子を固定化する場合、固定化の方向によって、相互作用対象の物質が、立体障害によって相互作用しやすいかどうかが異なることが発明者によって見出された。
【０００７】
本発明では固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察において、生体分子（Ｂ）の嵩高い側が基板から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御することで、容易にかつ正確に、生体分子の相互作用を解析することを可能とする。
【０００８】
【特許文献１】米国特許６２０７３８１
【特許文献２】米国特許６１２７１２９
【非特許文献１】Ｗｅｇｎａｒ，  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ，  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４，５１６１−５１６８（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察において、非対称である生体分子（Ｂ）の嵩高い側が基板から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御した形で、生体分子の相互作用を行うことにある
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察方法であって、非対称である生体分子（Ｂ）の嵩高い側が表面から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御する生体分子の相互作用観察方法
２．上記固体表面が平面基板である１記載の生体分子の相互作用観察方法
３．上記固体表面が金属である１〜２いずれか記載の生体分子の相互作用観察方法
４．表面プラズモン共鳴法によって生体分子の相互作用観察を行う１〜３いずれか記載の方法
５．表面プラズモン共鳴イメージング法によって生体分子の相互作用観察を行う１〜４いずれか記載の方法
６．生体分子（Ａ）をアレイ状に固定化する１〜５いずれか記載の方法
【発明の効果】
【００１１】
本発明により容易にかつ正確に生体分子の相互作用を解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、固体表面に固定化した生体分子（Ａ）と、溶液内に存在する生体分子（Ｂ）の相互作用観察において、非対称である生体分子（Ｂ）の嵩高い側が基板から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用可能なように、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御した形で、生体分子の相互作用を行う方法を開示している。
【００１３】
生体分子間の相互作用を解析する方法として、結合ペアの一方の生体分子（Ａ）を固体表面に固定化して、測定対象となる生体分子（Ｂ）との相互作用を解析する方法が一般的に用いられている。しかし、固定化する生体分子（Ａ）が固定化される方向によって、生体分子（Ｂ）との相互作用挙動が異なることは容易に想像がつく。従って、生体分子（Ａ）の固定化方向を制御して固体表面に固定化する技術は非常に重要である。
【００１４】
本発明においては固定化される生体分子（Ａ）は、溶液中の生体分子（Ｂ）の嵩高い側が表面から遠くなる形で、生体分子（Ａ）と相互作用するように生体分子（Ａ）の固定化方向が制御される。生体分子（Ｂ）の嵩高い方が、基板に近い方向で相互作用すると、立体障害のために相互作用しにくくなり、正しい解析結果を与えなくなる恐れがあり、好ましくないためである。
生体分子（Ａ）は分子の末端部に存在する官能基もしくはグループを用いて表面に固定化されるのが好ましい。生体分子としては、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ペプチド、蛋白質、抗体、糖鎖などが挙げられるが、分子量５００以下の低分子化合物は含まれない。生体分子の形は特に限定されるものではなく、直鎖状でも枝分かれ状でもよい。生体分子には少なくとも二つの末端が存在しており、そのうちの少なくとも一つの末端部には官能基もしくはグループが存在している。
【００１５】
本発明において、上記官能基もしくはグループは生体分子（Ａ）の末端部には存在するものの、完全な末端でなくてもよい。すなわち、官能基もしくはグループのさらに末端方向に活性部位（結合部位）を有さない配列が存在してもよい。ただし、活性部位（結合部位）に挟まれて官能基もしくはグループが存在する場合は含まない。
【００１６】
官能基もしくはグループとしては、チオール基、マレイミド基、アジリジン基、ビオチン、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５エピトープ、６×Ｈｉｓ−Ｇｌｙエピトープ、ＧＳＴ、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）、チオレドキシン、ストレプトアビジンやニュートラアビジンを含むアビジン類が好ましい。特にチオール基、ビオチン、ＧＳＴが好ましい。逆に生体分子に豊富に存在するアミノ基やカルボキシル基との反応性をもつ官能基であるスクシンイミド基、イソシアネート基、エポキシ基、カルボニルジイミダゾール基などは本発明には好ましくない。
【００１７】
生体分子を固体表面に固定化する方法としては、共有結合、水素結合、イオン結合などが挙げられ、ビオチン−アビジン結合、ＧＳＴ−グルタチオン結合、抗原−抗体反応を含む。
【００１８】
生体分子（Ｂ）としては、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ペプチド、蛋白質、抗体、糖鎖などが挙げられるが、一般的に蛋白質が選ばれることが多い。蛋白質の相互作用においては立体障害の問題が大きく、本発明が非常に意義深いからである。生体分子（Ｂ）が単独の分子であっても、複数の分子の複合体であってもよい。例えば、複合体の場合、複数のサブユニットからなる蛋白質や、ダイマー形成を行うことで活性を発揮する蛋白質などが挙げられる。
【００１９】
本発明では生体分子（Ａ）は平面状の固体基板の上に形成されていることが好ましい。ただし、ビーズや粒子などであってもよい。平面であると、生体分子（Ｂ）を含むサンプルの量が低減化できる利点を有する。また、ハンドリングに優れている点も見逃せない。さらにはチップ上に液を流すフローセルを形成できることも大きな利点である。固体基板の形状はとくに限定されるものではなく、プレート状、シート状、ブロック状などの形状が一般的である。
【００２０】
生体分子（Ａ）を固定化する固体表面は金属であることが好ましく、金であるとさらに好ましい。金属を起点として自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）を形成させることで表面に官能基を導入できる。導入された官能基を用いて、生体分子（Ａ）を前述のさまざまな方法によって表面に固定化することができる。金属の厚みは特に限定されるものではないが、通常は２０ｎｍから２００ｎｍの範囲が選択される。また、一成分ではなく、複数の成分が混合されてコーティングされてもよい。または層状に複数の金属が形成されてもよい。金属のコーティング方法も特に限定されるものではないが、蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが用いられる。ただし、金ナノ粒子や金ナノシェルなどの金属粒子であってもよい。
【００２１】
固体基板は透明であることが好ましい。透明であることで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などの光学的検出方法が可能となるために好ましい。ＳＰＲ法はラベルフリーかつリアルタイムに相互作用解析できることが利点である。固定化方向を制御した上で、ラベルフリーなＳＰＲ法を用いると、より正確に生体分子の解析が可能となり、さらに好ましい。透明基板の素材は特に限定されるものではないが、ガラスやポリカーボネート、ポリオレフィンなどの物質を用いることができる。
【００２２】
ＳＰＲの中でも、ＳＰＲイメージング法は広い範囲の相互作用を同時に観察することができるため、さらに好ましい。金属上にアレイ状に生体分子を固定化することで、同時に複数の相互作用を観察することができ、スループットが高くなるため、非常に好ましい。
アレイの区画の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形のスポット、三角形、四角形、それ以上の多角形、線状の領域など、任意の形状を含む。固体表面上に固定化される生体分子の種類は特に限定されるものではなく、１以上である。ただし、固定化された生体分子（Ａ）は、生体分子（Ｂ）の結合方向が考慮されて固定化されており、生体分子（Ｂ）の嵩高い側が、表面から遠くなるように制御されて固定化されている。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例］
（固定化する生体分子の準備）
表１に示した配列のＤＮＡを５種類、キアゲン社に受託合成した。表に示した５種類については５’末端にチオール基を導入した形で合成した。配列に示すように、チオール基の３’側にチミン（Ｔ）を１５塩基並べた配列を設計した。これは表面基板から、目的となる配列までの距離を十分に取るためである。収量は０．２μｍｏｌ、レベルはＨＰＬＣ精製とし、５’末端にチオール基があるＤＮＡ（固定化側ＤＮＡ）に関しては保護基をつけずに合成依頼した。
５種類の５’チオール末端ＤＮＡに対する、相補的なＤＮＡも５種類合成した。この配列は固定化側ＤＮＡのチオール基とチミン１５塩基を取り去った配列に対して相補的なＤＮＡ配列を有する（相補側ＤＮＡ）。
このＤＮＡ配列の中には、ｈＮＱＯ１とｈＮＱＯ１ｒｅｖが含まれる。図１に示すように、ｈＮＱＯ１ｒｅｖはｈＮＱＯ１の逆向きの配列である。５’ａＧｔ３’の配列の方にヘテロダイマーのＮｒｆ２側が結合すると考えられており、ＭａｆＧ１−１２３の分子量は１４ｋＤａ、Ｎｒｆ２は４３ｋＤａである。ＭａｆＧホモダイマーは対称分子であり、固定化されている配列の方向性は問題にならないと予想される。しかし、ＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーは非対称分子であり、Ｎｒｆ２が結合する方向が表面に近い場合は、立体障害のために結合しにくくなると考えられ、ｈＮＱＯ１ｒｅｖの方が固定化方向は好ましいと予想される。
２５μＭ固定化側ＤＮＡと、１００μＭ相補側ＤＮＡの５ＸＳＳＣ（７５ｍＭＳｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）溶液を準備した。この溶液にはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（東京化成社製）を１ｍＭの濃度になるように添加し、末端のチオール基の酸化を抑制した。準備した溶液をサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）で９４℃に５分間保持し、４℃に急冷して１５分、３７℃で３時間インキュベートし、ＤＮＡをアニールさせた。スポッティング操作を行う前に水で５倍に希釈した。
【００２５】
【表１】
2006132962.tif 000002
【００２６】
（チップへの固定化）
表面に金がコーティングされたガラスからなり、アルカンチオール分子が固定されてアミノ基が導入されているＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ  ＮＨ２チップ（東洋紡績製）を使用した。スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解させた。この溶液２５０μｌをＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ  ＮＨ２チップ上に滴下し、チップ表面のアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応させ、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入した。
【００２７】
得られたマレイミド化表面にＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績社製）を用いて、アニールさせた５’末端ＤＮＡ溶液をスポッティングした。スポットの大きさは直径約５００μｍであり、スポットの中心間の距離は１ｍｍである。溶液をスポット後、チップを湿潤な環境に１８時間放置し、表面のマレイミド基とＤＮＡのチオール基を反応させ、ＤＮＡを表面に固定化させた。
【００２８】
（固定化されなかったＤＮＡの除去）
リン酸バッファーでチップを洗浄したのち、チップを０．１％ＳＤＳ含有１ＸＳＳＣ溶液に１５分間浸漬、次に０．１％ＳＤＳ含有０．２Ｘ  ＳＳＣ溶液に１５分間浸漬、最後に０．２Ｘ  ＳＳＣに１５分間浸漬し、フリーのＤＮＡを除去した。
【００２９】
（測定対象となる蛋白質の準備）
ＭａｆＧホモダイマーについては、Ｃ末端側３９アミノ酸残基を省略し、Ｈｉｓタグ（６ＸＨｉｓ）蛋白として大腸菌で発現させた（ＭａｆＧ１−１２３）ＭａｆＧ１−１２３はＥＨＲとｂＺｉｐモチーフを有している。蛋白を発現させたライゼートをＳＰセファロース（ファルマシア）とＰｒｏＢｏｎｄレジン（インビトロジェン）を用いて精製した。組み換え蛋白はトロンビンでタグ部分を消化し、ＳＰセファロースで再度精製した。
ＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーについては、  ＨｉｓタグＮｒｆ２と、タグを除去したＭａｆＧを別々に大腸菌内で発現させ、混合することでヘテロダイマーを形成させた。ＨｉｓタグＮｒｆ２はｂＺｉｐドメインをエンコードするｐＫＩ−２５６からのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントをｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン）のＸｈｏＩサイトに入れてクローンを作製した。形成したヘテロダイマーはニッケルアフィニティカラムを用いて回収した。
【００３０】
（表面プラズモン共鳴の測定）
二重鎖のＤＮＡを固定化したアレイを形成したチップをＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ＳＰＲイメージング機器（東洋紡績社製）にセットし、転写因子測定用緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）をフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、２００ｎＭ  ＭａｆＧホモダイマーを約１５分間ＳＰＲ装置に流しいれ、次に転写因子測定用緩衝液を流しいれて洗浄した。その際のシグナル変化を図２に示す。また、同様のプロトコールで１．５μＭ  ＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーを流しいれた場合の結果を図３に示す。
【００３１】
（結果と考察）
対称分子であるＭａｆＧホモダイマーの結合を観察した結果では、予想通り、ｈＮＱＯ１とｈＮＱＯ１ｒｅｖの差は全く見られなかった。
しかし、非対称分子であるＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーの結合においては、ｈＮＱＯ１とｈＮＱＯ１ｒｅｖで結合曲線に大きな差がみられ、ｈＮＱＯ１ｒｅｖの方が好ましいと考えられた。このようにヘテロダイマーの結合を考慮した形で、固定化するＤＮＡの固定化方向を制御する手法は、生体分子の解析に非常に効果的である。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
溶液中の生体分子（Ｂ）の結合を考慮した形で、生体分子（Ａ）の結合方向を制御することで、より容易にかつ正確に生体分子の相互作用を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例でのｈＮＱＯ１とｈＮＱＯ１ｒｅｖの固定化方向の違いを示す図。
【図２】実施例でのＭａｆＧホモダイマーの結合によるＳＰＲシグナル変化
【図３】実施例でのＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーの結合によるＳＰＲシグナル変化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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