(57)【要約】      （修正有）【課題】マツノマダラカミキリキチナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を解明し、アミノ酸配列を推定し、生物由来の、安全な松くい虫防除剤として有効なキチナーゼ薬剤を開発する。【解決手段】特定なる配列として示される塩基配列を有するＤＮＡ。上記塩基配列が、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼAまたはキチナーゼBの遺伝子のコーディング領域の塩基配列であるＤＮＡ。上記の塩基配列に基づく、特定なる配列のアミノ酸配列からなる、キチナーゼとして作用するタンパク質。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または３に示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
上記塩基配列が、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼＡまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列である請求項１のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１または３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキチナーゼとして作用するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１または２のＤＮＡ。
【請求項４】
昆虫キチナーゼ（family１８）の共通配列（conserved region ２）を含むことを特徴とする請求項１、２または３のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかのＤＮＡ配列の相補的な配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかのＤＮＡによってコードされ、かつキチナーゼとして作用するタンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのタンパク質からなる請求項６のタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、松くい虫防除のためのマツノマダラカミキリキチナーゼをコードするＤＮＡ、および該塩基配列から推定されるキチナーゼとして作用するタンパク質のアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アカマツ、クロマツ、リュウキウマツなどの日本在来のマツ類が被害にあう、松くい虫によるマツ枯損は、マツノザイセンチュウを主原因とすることが明らかになっている。マツノザイセンチュウは、マツノマダラカミキリにより媒介され、マツノマダラカミキリが、マツの小枝の皮をかじる（後食）際に、その後食痕から樹体内に侵入するとされている。マツノザイセンチュウは、マツの樹体内に侵入し増殖し、マツを弱らせるが、その弱ったマツがマツノマダラカミキリの産卵に適したものとなる。ふ化したマツノマダラカミキリの幼虫は、内樹皮を食害して松を枯らしてしまう。このように、マツノマダラカミキリとマツノザイセンチュウの共生により、マツ枯損は拡大されることになる。
【０００３】
従来、マツ樹体内に侵入したマツノザイセンチュウやマツノマダラカミキリの幼虫を直接駆除して、マツの樹勢を回復させる方法として、天敵利用や誘引剤利用があるが、現在のところ実用段階に至ってはいない。また、薬剤の土壌施用は、予防効果が解明されているが、安全性が慎重に検討されている段階で使用は許可されていない。したがって、現在は、マツノマダラカミキリの後食を予防することによる、マツノザイセンチュウの侵入を防ぐ対策がなされている。すなわち、大規模の面積で、薬剤による危被害の恐れがない場合は、空中からスミチオンやセビモールなどの薬剤散布が行なわれ、小規模の面積，または薬剤による危被害の恐れがあるような場合は、樹冠までとどくような強力な噴霧機でスミチオンまたはバイジット等の薬剤を地上から散布している。しかしながら、このような防除方法は、人体へも悪影響を及ぼし、残留された農薬の環境汚染が問題となる。
【０００４】
キチナーゼは、キチン質を加水分解する酵素であり、節足動物及び甲殻類等の脱皮、植物の生体防御、微生物の生育等に利用されている。本発明者らは、すでにヤマイモ由来のキチナーゼが植物病原菌防除剤として有効であることを明らかにしている。（特許文献１）
【０００５】
本発明者らは、特許文献２で、上記ヤマイモ由来のキチナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにし、ヤマイモ由来のキチナーゼがファミリー１９に属することを見出している。
【０００６】
生物を利用したキチナーゼの生産方法としては、すでにいくつか知られており、原生動物由来のキチナーゼをコードするＤＮＡを利用するもの、（特許文献３）、遺伝子操作により細菌が生産するキチナーゼ
をコードするＤＮＡを形成させ、これを用いてキチナーゼ を大量に製造する方法（特許文献４）、放線菌由来のキチナーゼを生産する方法（特許文献５）等がある。
【０００７】
【特許文献１】特開2000-109405公報
【特許文献２】特開2003-250561公報
【特許文献３】特開平9-299091公報
【特許文献４】特開2004-298127公報
【特許文献５】特開2000-093182公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、従来の松くい虫防除剤は、有機合成化合物を利用した薬剤であり、人体や環境への影響が問題になっている。本発明は、マツノマダラカミキリキチナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を解明し、その塩基配列からマツノマダラカミキリキチナーゼのアミノ酸配列を推定し、生物由来の、安全な松くい虫防除剤として有効なキチナーゼ薬剤の開発を可能にしようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号１または３に示される塩基配列を有するＤＮＡを要旨とする。
【００１０】
上記塩基配列が、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼＡまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列であり、その場合、本発明は、配列番号１または３に示される、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼAまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡを要旨とする。
【００１１】
配列番号１または３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキチナーゼとして作用するタンパク質をコードすることを特徴としており、その場合、本発明は、配列番号１または３に示される塩基配列において、より具体的には、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼＡまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列を有する配列番号１または３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキチナーゼとして作用するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを要旨とする。
【００１２】
昆虫キチナーゼ（family１８）の共通配列（conserved  region  ２）を含むことを特徴としており、その場合、本発明は、配列番号１または３に示される塩基配列、より具体的には配列番号１または３に示される、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼＡまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキチナーゼとして作用するタンパク質をコードする塩基配列であって、昆虫キチナーゼ（family１８）の共通配列（conserved  region  2）を含むことを特徴とするＤＮＡを要旨とする。
【００１３】
上記ＤＮＡ配列の相補的な配列からなることを特徴としており、その場合、本発明は、配列番号１または３に示される塩基配列、より具体的には配列番号１または３に示される、マツノマダラカミキリに由来し、キチナーゼＡまたはキチナーゼＢの遺伝子のコーディング領域の塩基配列、あるいは配列番号１または3に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキチナーゼとして作用するタンパク質をコードする塩基配列、好ましくは昆虫キチナーゼ（family１８）の共通配列（conserved  region  ２）を含むことを特徴とする塩基配列からなるＤＮＡ配列の相補的な配列からなるＤＮＡを要旨とする。
【００１４】
また、本発明は、上記のいずれかのＤＮＡによってコードされ、かつキチナーゼとして作用するタンパク質を要旨とする。
【００１５】
さらにまた、本発明は、上記のいずれかのＤＮＡによってコードされ、かつキチナーゼとして作用するタンパク質であって以下の（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるタンパク質を要旨とする。
（ａ）配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【００１６】
生後（産卵後）４０日のマツノマダラカミキリの幼虫から、２種類のキチナーゼ（Chitinase  A,Chitinase  B）をクローニングした。マツノマダラカミキリの幼虫のキチナーゼは、２種類とも他の昆虫のキチナーゼがもっているキチン結合領域（chitin binding domain）をその配列の中に持っていなかった。
本発明により、マツノマダラカミキリキチナーゼのｃＤＮＡの塩基配列、およびその塩基配列から推定されるマツノマダラカミキリキチナーゼのアミノ酸配列を提供することができ、それゆえ本発明は、マツノマダラカミキリ由来のファミリー18に属する新規なキチナーゼをコードする遺伝子を提供することができる。その塩基配列から推定されるアミノ酸配列をもったマツノマダラカミキリキチナーゼを生産する可能性が出てきたのであり、生物由来の、安全な松くい虫防除剤として有効なキチナーゼ薬剤の開発の第一歩に寄与することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［キチナーゼ活性の出現］
マツノマダラカミキリのキチナーゼ遺伝子発現時期を解明するため、先ず、キチナーゼ活性が出現する時期を調べた。そのため、マツノマダラカミキリの幼虫を人工飼育し、キチナーゼ活性の生育に伴う毎日の変動を、native PAGE 上で活性染色により追跡した。その結果、産卵後、約40日に、キチナーゼ活性が急激に増加することが分かった。
【００１８】
［mRNAの単離とcDNAのクローニング］
キチナーゼの活性が見られた時期のマツノマダラカミキリの幼虫から全mRNAを抽出し、つぎにmRNA特有のPoly  A  tail  に結合するオリゴTをプライマーに用いてRT-PCR  によりcDNAを合成した。その中から、キチナーゼのcDNAを選ぶため、これまで報告されている昆虫キチナーゼ、特に甲虫のキチナーゼのアミノ酸配列からPCR用のプライマーをデザインした。そのプライマーを用いて、３‘RACE法と５’RACE法により、マツノマダラカミキリ全長のcDNAを得た。さらに、情報に従い塩基配列を解読した。
その結果、キチナーゼAとBは、それぞれ、オープンリーディングフレームは1116と1164bpであり、それらのキチナーゼは371と387個のアミノ酸残基からなり、推定分子量は41.5と42.3 kDa、推定pIは、4.36と4.45の酸性キチナーゼであることが分かった。また、ファミリー18に特有のConserved region 1と2が見られた。マツノマダラカミキリは、これまで昆虫で報告されているようにファミリー18キチナーゼを発現していることが分かった。
【００１９】
［考察］
マツノマダラカミキリキチナーゼのC末端側に、カイコやタバコスズメガの鱗翅目キチナーゼで見られるようなキチン結合領域が欠損していることであった。また、マツノマダラカミキリのキチナーゼが同じ甲虫のSpruce beetle のキチナーゼと同様にキチン結合領域を欠損していることから、甲虫の脱皮においては、キチナーゼの作用においてこのキチン結合領域が無くても良いのかなど、今後の解明が期待される。さらに、この知見は、マツノマダラカミキリに対するバイオ農薬の開発においても重要と思われる。
【００２０】
本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１または3に表示の塩基配列を有するＤＮＡ、キチナーゼA及びキチナーゼBの遺伝子のコーディング領域の塩基配列であって、配列番号１または3表示の塩基配列（塩基）を有する遺伝子が含まれる。また、上記遺伝子の塩基配列とストリンジェントの条件下でハイブリダイズし、かつ類似の活性を有するものが含まれる。
【００２１】
さらに、本発明のアミノ酸配列には、配列表の配列番号2または４に表示のアミノ酸配列、ならびに、マツノマダラカミキリ由来キナーゼ活性を有し、かつ配列表の配列番号2または４に表示のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、削除、付加、挿入を行って得られる誘導体を包含するアミノ酸配列が含まれる。
【００２２】
本発明のＤＮＡの好ましい態様は、キチナーゼをコードする新規な遺伝子であり、微生物中で該遺伝子を発現させることを可能にする遺伝子として高い有用性を有することが期待される。
たとえば、本発明のキチナーゼ遺伝子を微生物プラスミドに組み込むことにより、微生物によりこの遺伝子を発現させることが期待できる。このようなプラスミドは、宿主微生物において機能する（自律複製する）複製起源を少なくとも有していなければならない。また、形質転換株を選択する際のマーカーとして用いる選択マーカー遺伝子を有していることが極めて望ましい。選択マーカー遺伝子としては抗生物質耐性等を賦与することができる遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が良く知られている。更に、前記プラスミドは、構造遺伝子を発現させることができるプロモーター配列を有していることが多いが、プロモーター配列を構造遺伝子とともに挿入しても良い。以上の技術はよく知られているものであり、当業者はこれらの技術の中で適切なものを選択し、使用することができる。
【００２３】
プラスミドは、微生物細胞内に導入されて微生物細胞内で機能する。プラスミドを微生物細胞内に導入する方法は良く知られており、当業者はそれら既知の方法の中から適切なものを選択し、使用することができる。宿主微生物は、バチラス・サチラス、エシェリヒア・コリ（以下「大腸菌」）、サッカロマイセス・セレビシエが良く知られ、使用されている。特に大腸菌は、遺伝子の増幅、選択に多く用いられる。枯草菌、大腸菌、酵母等の宿主の具体例と用いられるプラスミドの具体例は、数多くの文献に記載されており、当業者はそれらの中から適切なものを選択し、使用することができる。
【００２４】
プラスミドにより形質転換された微生物を培養してキチナーゼを得ることは特殊な方法である必要はない。即ち、上記微生物が良く生育できる培地及び条件下でこの微生物を培養し、培地中に、細胞内に又は細胞膜周辺にあるキチナーゼを採取する。キチナーゼ等のポリペプチドを単離、精製する方法もまた良く知られた方法があり、当業者は、これらの既知の方法を組み合わせることにより単離、精製することができる。
【００２５】
以上のようにして得られる本発明のキチナーゼは、昆虫表皮キチンのみならず中腸の栄養囲膜キチンを加水分解する作用を持つことから、昆虫防除剤として使用することができる。昆虫防除剤として使用する場合は、キチナーゼ含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、注入、被覆、散布、および浸漬を含む処理法によって、マツノマダラカミキリに直接与えるかあるいは、マツの幹に適用することができる。
【００２６】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実験手法（図１参照）
１．マツノマダラカミキリにおけるキチナーゼの出現時期の特定
マツノマダラカミキリ幼虫を産卵後から数えて60日間人工飼料で飼育した。キチナーゼのmRNAを単離するため、キチナーゼの出現時期を調べた。そのため、マツのマダラカミキリの幼虫を、その体重の３倍量の４℃の10mMのリン酸バッファー（pH  7.5）でホモゲナイズし、遠心分離（10,000rpm、１０分間）によりその上澄みを集めた。その上澄み（１０micro  L）を中酸性用のnative  PAGEで分離後、基質（glycol  chitin）入りのゲルに電気でトランスブロットし、キチナーゼの活性染色を行った。キチナーゼの活性バンドは
Fluostain（キチンに結合して、紫外線照射により青い蛍光を出す蛍光色素）で染色して検出した。キチナーゼ活性の検出方法については、下記論文に基づいた
（D.  Koga et al.:  Induction  pattern  of  chitinases  in  yam  callus  by  inoculation  with  autoclaved  Fusarium  oxysporum,  ethylene,  and  chitin  and  chitosan  oligosaccharides.  Biosci.  Biotechnol.  Biochem.,  56,  280-285  (1992)  ）。
【００２８】
検出結果を図２に示す。産卵後から39から40日後に高いキチナーゼ活性（2バンド以上）が見られた。
【００２９】
２．マツノマダラカミキリにおけるキチナーゼのmRNA抽出
キチナーゼが発現されている産卵後40日目の液体窒素で凍らせた幼虫20mgを乳鉢で粉砕し、RNAeasy  Mini Kit (QIAGEN)を用いて、全RNAを抽出した。
【００３０】
３．3’RACE法（3’Rapid amplification of cDNA ends）によるcDNAの配列決定
まず、マツノマダラカミキリキチナーゼのmRNAの3’側の配列を明らかにするため、3’側のprimerとしては、mRNAに共通したpoly A tailに相補的なoligo dTにアダプターを付加したものを用いて、また、前項２で作成した全RNAを鋳型として、Omniscript  RT  kit（QIAGEN）を用いて、RT-PCRと２本鎖のcDNAの合成まで行った（図３参照）。
【００３１】
さらに、そのcDNAを鋳型にして、5’側のprimerとして、数種の昆虫キチナーゼ（family 18）共通配列（conserved region 2）からDegenerate primerを作成して用い（図４，５参照）、一方、3’側のprimerとしては、上記のアダプターを用いてPCR（2.5U  Taq
DNA  polymerase,  10  mM  Tris-HCl.  PH  8.3,  1.5  mM  MgCl2,  50mM  KCl,  0.2mM  dNTPs,  100  p  mole  each  primer）を行った（図３の下の部分の反応）。そして、そのPCR産物（そのアガロース電気泳動の結果は図６）を、大腸菌を用いてサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、マツノマダラカミキリキチナーゼのmRNAと思われる塩基配列を得ることができた（図７）。
【００３２】
４．5’RACE法（5’Rapid  amplification  of  cDNA  ends）によるcDNAの配列決定  
mRNAの5’側の塩基配列を明らかにするために、5’RACE法を用いた（図８、９）。図８、９に示される方法は、前項２で抽出した全RNAを鋳型として、Omniscript  RT  kit（QIAGEN）を用いて、RT-PCRと２本鎖のcDNAの合成まで行ったところまでは３’RACE法と同じであるが、異なる点は．RT-PCR後、5’側にterminal  deoxynucleotidyl  transferase  を用いてoligo dCを付加した点である。これを鋳型とし、5’側のprimerには、その相補塩基配列にアダプターを付加したもの（2nd  PCRからはアダプターのみ）をprimerとし、一方、3’側のprimerは3’RACE法で解明された塩基配列を基にして作成したものを用いて、PCRを行った。
【００３３】
そのPCR産物（そのアガロース電気泳動の結果は図１０）を大腸菌にサブクローニングして、塩基配列を解析した（図11、12）。
【００３４】
５．cDNA全長配列決定
マツノマダラカミキリキチナーゼのmRNAの全長を解析するため、5’RACE法により解明された塩基配列を基に合成した5’側のprimerと  3’RACE法で用いたアダプターを3‘側のprimerに用い、また、3’RACE法により作成したcDNA（first  strand  cDNA）を鋳型にして、信頼性の高いDNA  polymerase  のElongase  Enzyme  Mixture  (GIBCO  BRL)を用いてPCRを行った（図１３）。
【００３５】
そのPCR産物を、大腸菌にサブクローニングし、その塩基配列を解析した。その結果、図１４、１５に示す2つのマツノマダラカミキリキチナーゼのcDNAの塩基配列を明らかにすることができた（配列表配列番号１、２）。また、アミノ酸配列も推定することできた（配列表配列番号２、４）。このキチナーゼのアミノ酸配列から、２つともファミリー18キチナーゼであると再確認できた。しかし、このマダラカミキリのキチナーゼの特徴として、他の昆虫キチナーゼでみられている、C末端側に付加的に存在している、キチン結合領域を、２つとも持っていなかった（図１６）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
「松くい虫」に関係するマツノマダラカミキリのキチナーゼのｃＤＮＡをクローニングすることができた。この遺伝子は、我々が「松くい虫対策」として開発を進めているバイオ農薬に必要な遺伝子である。この遺伝子によって産生されるマツノマダラカミキリのキチナーゼは元来自分自身の脱皮に必要な酵素であるが、口から摂取すると逆に自分自身の消化管を消化（分解）し、死に至ることが期待される（『毒をもって毒を制す』）。そのため、本発明のcDNAは、「松くい虫対策」における世界初のバイオ農薬として、価値があるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】キチナーゼｃＤＮＡクローニングの流れを説明する図面である。
【図２】生後（産卵後）３７〜４２日のカミキリの幼虫を用いたキチナーゼ活性染色の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】逆転写（Reverse transcription）と3’RACE法の原理を説明する図面である。
【図４】典型的な糖加水分解酵素Family18キチナーゼの構造を説明する図面である。
【図５】Region 2部分の配列比較と Degenerate primerの設計を説明する図面である。
【図６】生後３７〜４０日のカミキリの幼虫を用いた3’RACEの結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】生後４０日のカミキリの幼虫での3’RACE産物のシーケンスの結果１を示す図面である。
【図８】５’RACE法の原理を説明する図面である。
【図９】５’RACE法の原理を説明する図８の続きの図面である。
【図１０】生後４０日のカミキリの幼虫でのChitinase A,Chitinase Bそれぞれの5’RACEの結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】Chitinase Aの5’RACE産物のシーケンス結果を示す図面である。
【図１２】Chitinase Bの5’RACE産物のシーケンス結果を示す図面である。
【図１３】全長Chitinase A  を得るためのＲＴ−ＰＣＲを説明する図面および図面に代わる写真である。
【図１４】Chitinase A の全塩基配列と推定されるアミノ酸配列を示す図面である。
【図１５】Chitinase B の全塩基配列と推定されるアミノ酸配列を示す図面である
【図１６】典型的なFamily18 キチナーゼとマツノマダラカミキリのキチナーゼ（Chitinase A,Chitinase B）の構造比較を説明する図面である。
【図２】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１６】
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【配列表】
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