(57)【要約】【課題】  本発明は、凍結した酵母のプロトプラストを用いて細胞融合させ、効率的に融合体を製造することを課題とする。【解決手段】  凍結プロプラストの融合に際し、電気的融合法が著しく融合率の向上を図ることができることを見出し、本発明を完成したものであり、すなわち、酵母の凍結されたプロトプラストを電気的融合により細胞融合する方法を提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の凍結されたプロトプラストを用いた酵母の融合体の製造方法であって、凍結されたプロトプラストを溶解し、これを電気的融合により細胞融合することを特徴とする酵母の融合体の製造方法。
【請求項２】
酵母の凍結されたプロトプラストを用いた酵母の融合体の製造方法であって、少なくとも以下のa) 〜 c)の工程を含む酵母の融合体の製造方法。
a) 酵母のプロトプラストを製造する工程
b) a)のプロトプラストを凍結する工程
c) b)の凍結されたプロトプラストを溶解後、電気的融合により細胞融合し、融合体を得る工程
【請求項３】
酵母が、Sporobolomyces 属の酵母である請求項１又は２に記載の酵母の融合体の製造方法。
【請求項４】
ａ）の工程が、Sporobolomyces属の酵母を細胞壁の合成を阻害する条件下において培養した後に、当該酵母を含む溶液に２種以上の細胞壁溶解酵素を添加する工程からなる請求項３に記載の酵母の融合体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法により製造される融合体。
【請求項６】
請求項５に記載の融合体の生産する生産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の融合体の製造方法に関し、詳しくは、凍結保存した酵母のプロトプラストを電気的融合により細胞融合し、酵母の育種を行うための、効率的な融合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の育種手段として広く用いられているプロトプラスト融合法は、複数の遺伝子が関与する形質を導入するのに適した方法であると言われ、様々な産業上有用な菌株の育種に用いられている。
また、近年、プロトプラスト融合法を応用したゲノムシャッフリング法(非特許文献１) のように多数のプロトプラスト細胞を同時に融合する育種も注目されている。
しかしながら、プロトプラスト融合を行うには少なくとも二つ以上のプロトプラスト体を同時に準備する必要があることや、実験のたびにプロトプラストの調整及びその分離操作を行うという多大な労力と時間を費やさなければならず、プロトプラスト融合の実施には様々な障害が存在した。これら諸問題を解決するためにプロトプラスト保存法の開発が行われてきており、いくつかの菌株でプロトプラストの凍結保存が試みられてきた（非特許文献２）が、凍結保存したプロトプラストは再生率や融合率の低さといった問題を抱える事が多く、実際の育種に利用することは非常に困難であった。このことは、遺伝的マーカーや栄養要求性を付与した菌株の融合を行う際には、その融合率はそれほど問題とならないが、一般産業用に利用されている微生物は遺伝的マーカーを持っていないことが多いため、その融合率が低いと、融合体の選択が極めて困難となり致命的であった。このように、プロトプラストを凍結保存し、それを高効率にプロトプラスト融合させることができれば非常に有意義である。
しかしながら、未凍結のプロトプラストを用いた場合、汎用的な細胞融合法であるPEG法で効率的にプロトプラスト融合ができたにも関わらず、凍結されたプロトプラストに適用した場合、著しく融合率が落ちるため、酵母の凍結されたプロトプラストを細胞融合による育種に利用することができなかった。
【非特許文献１】Ying-Xin Zhang, Kim Perry, Victor A. Vinci, Keith Powell,   Willem P. C. Stemmer and Stephen B. del Cardayre (2002) Nature 415, 644-646
【非特許文献２】K. Kuwano, Y. Aruga and N. Saga (1996) Plant Science 116, 117-124
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、凍結した酵母のプロトプラストを用いて細胞融合させ、効率的に融合体を製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ね、凍結プロプラストの融合に際し、電気的融合法が著しく融合率の向上を図ることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は凍結した酵母のプロトプラストを電気的融合により細胞融合し、効率的に融合体を製造する方法を提供するものである。
すなわち本願発明は、以下の構成を有する。
（１）酵母の凍結されたプロトプラストを用いた酵母の融合体の製造方法であって、凍結されたプロトプラストを溶解し、これを電気的融合により細胞融合することを特徴とする酵母の融合体の製造方法。
（２）酵母の凍結されたプロトプラストを用いた酵母の融合体の製造方法であって、少なくとも以下のa) 〜 c)の工程を含む酵母の融合体の製造方法。
a) 酵母のプロトプラストを製造する工程
b) a)のプロトプラストを凍結する工程
c) b)の凍結されたプロトプラストを溶解後、電気的融合により細胞融合し、融合体を得る工程
（３）酵母が、Sporobolomyces 属の酵母である上記（１）又は（２）に記載の酵母の融合体の製造方法。
（４）ａ）の工程が、Sporobolomyces属の酵母を細胞壁の合成を阻害する条件下において培養した後に、当該酵母を含む溶液に２種以上の細胞壁溶解酵素を添加する工程からなる上記（３）に記載の酵母の融合体の製造方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法により製造される融合体。
（６）上記（５）に記載の融合体の生産する生産物。
【発明の効果】
【０００５】
本発明は、これまで高い融合率で細胞融合することはできないと考えられていた酵母の凍結されたプロトプラストを高効率に融合する方法であり、本発明によれば凍結プロトプラストを用いた融合体を効率的に得ることができる。
特に、遺伝子的選択マーカーを持たない酵母又は栄養要求性を有しない酵母等にも適用することができ、このような酵母の細胞融合による育種を容易にすることができる。
さらに、本方法により凍結プロトプラストを用いて効率よく融合体を製造することが可能となったため、プロトプラストの保存方法として実用的な凍結保存方法により保存されたプロトプラストを使うことが実質的に可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（プロトプラストの製造）
酵母のプロトプラストはいずれを用いても良く、例えばSporobolomyces 属の酵母のプロトプラストは以下のように作成される。Sporobolomyces 属の酵母はまず、YPD培地を用いて28℃で24時間培養した後、この培養液500μLをプロトプラスト化用培地50mLに植菌し、20時間後2-D-デオキシグルコース6.5%溶液を500μL添加し、48〜96時間培養を行う。
次に、こうして得られた培養液を遠心分離し、菌体を100mMリン酸緩衝溶液（pH7に調整）で洗浄後、さらにプロトプラスト化用バッファーで２回洗浄する。
洗浄後、プロトプラスト化用バッファー中にWestase(0.5%, Takara製)とCellulase ONOZUKA R-10(2.5%, ヤクルト薬品製)を含んだ細胞壁酵素処理溶液で、菌体濃度がOD4程度になるように菌体を懸濁して、30℃で3〜5時間ゆるやかに浸とうする。これらの処理によりプロトプラスト化率99%以上のプロトプラスト溶液を得ることができる。
【０００７】
また、例えば、Saccharomyces属に属する酵母ではArthrobacterなどに由来するエンド−β−1,3−グルカナーゼ、ホスホマンナーゼ、プロテアーゼ等を用いて細胞壁を溶解し、プロトプラストを得ることができる(Kitamura, K. Arch. Biochem. Biophys., 153, 403〜406 (1972)、参照)。
【０００８】
ここで示すプロトプラスト化率は次の方法により確認した。すなわち、顕微鏡により細胞壁が溶解・除去されたことを確認し、さらに浸透圧ショック法により低浸透圧感受性の細胞数を求め、次式によりプロトプラスト化率を算出した。
より詳細には、本願において等張液とは浸透圧調整剤を添加して細胞内液と等張となった緩衝液を表し、低張液とは蒸留水のことを表す。同量の等張液および低張液中に、同数の細胞を入れ、１分経過後のそれぞれの液体中における細胞数をカウントし、以下の式（１）に従って、プロトプラスト化率を算出した。
【０００９】
プロトプラスト化率 (%)= (等張液中の細胞数−低張液中の細胞数)／等張液中の細胞数×１００（１）
【００１０】
これらのプロトプラストは、そのままでも凍結保存することはできるが、凍結保存する前に凍結保護剤（グリセロールやトレハロ−スなど）を添加したバッファーに置換した後、凍結保存することが好ましい。
【００１１】
本発明に用いるSporobolomyces属に属する酵母とは、Sporobolomyces属であればいずれでもよいが、コエンザイムQ10、カロテノイド類、又はL-カルニチンなどの有用物質を高効率で生産する能力を有する菌が望ましい．具体的には、Sporobolomyces sp. NY205株（受領番号 FERM AP-20491として平成17年4月7日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領された。）が挙げられる。
【００１２】
（プロトプラストの電気融合）
凍結プロトプラストは融解後、電気融合するためのバッファーで数回洗浄を行った後、等量ずつ両プロトプラストを混合する。電気融合するためのバッファーは適宜選択可能であるが、例えば、1.4M Sorbitol、0.1mM CaCl2、0.5mM MgCl2からなるバッファーが例示される。プロトプラスト混合溶液は細胞融合装置を用いて、高周波電界を加え、次いで高電圧パルスを加えることにより融合を行うことができる。高周波電界を加える条件としては、周波数が0.25〜2.0MHz、交流電圧が10〜40Vで、そして高周波を加える時間はプロトプラストがパールチェーンを形成するまでの時間であり、一般に5〜90秒である。次に高電圧パルスが加えられるがその電界強度は0.1〜20kV/cmで、パルス幅が5〜500μsである。この際、高電圧パルスを加えた後にポストフュージョン（postfusion）を1〜10秒程度行うことは好ましい。また、電気的融合処理後、10分以上静置し、融合株を安定化させることが好ましい。
なお、融解は、自然融解が望ましく、電気融合は、融解後、融合すべき２種の液体を混合し、直ちに行うことが望ましい。
【００１３】
（融合プロトプラストの再生）
本発明に準じて融合したプロトプラストを、浸透圧調整剤を含む再生培地を用いて再生させることにより融合体を得ることができる。より具体的には、例えば、まず融合したプロトプラストを、栄養源を含むアガーを用いてできる限り低温に保ちつつ包埋し、その後プレートをインキュベーターなどで3〜20日間培養することで融合体を得ることができる。得られた融合体は両親株との栄養要求性や薬剤耐性の相違、生産物の組成や含量の相違などを目安に選択することができる。栄養要求性を目安とする場合は各種アミノ酸などが利用でき、薬剤耐性の場合はアミノ酸アナログ(β-2-チエニルアラニン、エチオニン、5-メチルトリプトファンなど)や核酸関連物質アナログ(6-メルカプトプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル)などが利用できる。
以下、本発明について実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
（凍結保存法）
Sporobolomyces sp. NY205株（FERM AP-20491）をYPD培地に接種し、28℃で24時間培養した。次に、この培養液500μLを下記プロトプラスト化用培地50mLに植菌し、20時間後2-D-デオキシグルコース6.5%溶液を500μL添加し、48〜96時間培養を行った。
培養液を遠心分離して得られた菌体を100mMリン酸緩衝溶液（pH7に調整）で洗浄後、さらにプロトプラスト化用バッファーで２回洗浄した。洗浄後、プロトプラスト化用バッファー中にWestase(0.5%)とCellulase ONOZUKA R-10(2.5%)を含んだ細胞壁酵素処理溶液で、菌体濃度がOD4程度になるように菌体を懸濁して、3〜5時間30℃でゆるやかに浸とうした。この処理によるプロトプラスト化率は99%以上だった。次いで、このプロトプラストを凍結保存用バッファーに懸濁し、-80℃フリーザーで徐々に凍結させることで安定にプロトプラストを保存する。プロトプラスト融解後、プロトプラスト懸濁液をプロトプラスト化用バッファーで適当な濃度に希釈し、希釈液100μL中のプロトプラスト細胞数(A)を血球計算盤を用いて数えた。また、同希釈液100μLを41〜43℃に保温したYPD上層アガーに入れ、下層アガーの上に流し込むことで包埋させ、4〜8日間で28℃でインキュベートして生育するコロニー数(B)をカウントした。(A)及び(B)の値を用いて、次式（２）により再生率を算出したところ、20%という高い再生率を示した。
【００１５】
再生率(%) = (B)／(A)  ×  100   （２）
【００１６】
本実施例及び比較例で用いられる培地及びバッファーの組成は特に断らない限り、以下のものを用いた。
YPD培地
酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%
プロトプラスト化用培地
グルコース          1%
酵母エキス          0.15%
DL-メチオニン       0.02%
DL-ホモシステイン   0.025%
L-システイン        0.15%
KH2PO4              0.35%
Na2HPO412H2O        0.25%
NH4Cl               0.15%
MgSO47H2O           0.02%
CaCl22H2O           0.001%
FeCl36H2O           0.0008%
ZnSO47H2O           0.00001%
プロトプラスト凍結保存用バッファー
0.037Mクエン酸、0.126M Na2HPO412H2O、0.5M tartrate、15重量%グリセロール
プロトプラスト化用バッファー
0.037Mクエン酸、0.126M Na2HPO412H2O、0.5M tartrate
YPDアガー
酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%、0.6M Sorbitol、2%Agar
YPD上層アガー
酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%、0.6M Sorbitol、1.5%Agar 
YPD下層アガー
酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%、0.6M Sorbitol、2%Agar
SD培地
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids (Difco, 0919-15-3)、2%グルコース、2%アガー
【実施例２】
【００１７】
（変異株の作成）
Sporobolomyces sp. NY205株をYPD培地で28℃で24時間培養し、集菌後、100mMリン酸緩衝溶液（pH7に調整）で2回洗浄した後、本バッファー20mLに懸濁する。600μLのEthyl methanesulfonateを添加し、懸濁液を激しく攪拌した後、28℃で１時間ゆるやかに浸とうした。変異処理１時間後、集菌した菌体を5%チオ硫酸ナトリウムで2回洗浄し、菌体を1mLの滅菌蒸留水に懸濁し、希釈懸濁液100μLをYPDプレートに塗布して、28℃で72〜120時間培養し、変異株のコロニーを得た。得られたコロニーのアミノ酸要求性を調査したところ、ロイシン要求性株、リジン要求性株、メチオニン要求性株、アルギニン要求性株を取得した。各要求性株はYPDアガーには生育可能であるが、SD培地には生育不可能であった。
なお、それぞれロイシン要求性株のロイシン生産能自然復帰率、リジン要求性株のリジン生産能自然復帰率、メチオニン要求性株のメチオニン生産能自然復帰率、アルギニン要求性株のアルギニン生産能自然復帰率は共に、1/105以下であった。
【００１８】
（凍結したプロトプラストの融合）
作出したNY205変異株であるロイシン要求性株及びリジン要求性株を実施例1に記載の手法でプロトプラスト化させ、凍結保存した。融解後、それぞれのプロトプラストを等量混ぜ合わせ、電気融合用バッファー（1.4M Sorbitol、0.1mM CaCl2、0.5mM MgCl2）で2回洗浄後、本バッファーでプロトプラスト濃度が108個／mLになるように調整した。プロトプラスト溶液を電極間0.5mmのセルに加え、細胞融合装置(ネッパジーン製、LF101)を用いて、周波数1MHz、交流電圧15Vを10秒間かけた後、直流電圧を600V(パルス幅 10μsec)で2回(パルス間隔 0.1sec)かけ、ポストフュージョンを2秒間行った。このときの高電圧パルスの電界強度は12,000V/cmであった。10分間静置した後、細胞融合後の溶液を適当な濃度に希釈して、その希釈液を41〜43℃に保温したYPD上層アガーに入れ、下層アガーの上に流し込み、4〜10日間、28℃でインキュベートして細胞融合後のプロトプラストを生育させた。これらのプレートに生育したコロニーを細胞融合しなかったプロトプラストが生育できないSDプレートへ植菌した。28℃で2〜5日間培養し、SDプレートに生育してきた融合体のコロニー数(X)をカウントし、全植菌数(Y)を用いて、次式（３）により融合率を算出したところ、これらの融合実験は4%以上の高い融合率を示した。
【００１９】
融合率(%) = (X)／(Y) × 100  （３）
【比較例１】
【００２０】
(従来PEG法による凍結したプロトプラストの融合)
実施例2に記載の手法により作出したNY205変異株であるロイシン要求性株及びアルギニン要求性株を実施例1に記載の手法でプロトプラスト化させ、凍結保存した。融解後、それぞれのプロトプラストを等量混ぜ合わせ、遠心した後、上澄みを除去した。このプロトプラストをプロトプラスト細胞濃度が108個／mLになるようにPEG4000溶液(100mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG4000、pH7.5)を加え、30℃で20分間静置した。細胞融合した溶液は適当な濃度に希釈して、その希釈液を41〜43℃に保温したYPD上層アガーに入れ、下層アガーの上に流し込み、4〜10日間、28℃でインキュベートして融合株生育させた。この手法による融合率は0.05%以下であった。
【比較例２】
【００２１】
(従来PEG法による凍結したプロトプラストの融合)
PEG8000溶液、PEG6000溶液、PEG3350溶液、PEG6000S6溶液、PEG6000S3溶液、PEG6000K3溶液、PEG4000S6溶液、PEG4000S3溶液あるいはPEG4000K3溶液を用いて融合する以外は比較例1と同様の方法で凍結したプロトプラストの融合を行い、融合株を生育させたところ、これら9種の方法ともすべて、0.05%以下の融合率であった。
【００２２】
上記比較例２で用いた各PEG溶液の組成を以下に示す。
PEG8000溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG8000、pH7.5)
PEG6000溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG6000、pH7.5)
PEG3350溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG3350、pH7.5)
PEG6000S6溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG6000、0.6M Sorbitol、pH7.5)
PEG6000S3溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG6000、0.3M Sorbitol、pH7.5)
PEG6000K3溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG6000、0.3M KCl、pH7.5)
PEG4000S6溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG4000、0.6M Sorbitol、pH7.5)
PEG4000S3溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG4000、0.3M Sorbitol、pH7.5)
PEG4000K3溶液(100 mM Tris、50mM CaCl2、35重量%PEG4000、0.3M KCl、pH7.5)
【比較例３】
【００２３】
(プロトプラスト融合)
実施例２に記載の手法により作出したNY205変異株であるメチオニン要求性株及びアルギニン要求性株を用いた以外は、比較例１と同様の方法でプロトプラストの融合を行い、融合株を生育させたところ、この手法による融合率は1.04%であった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、これまで高い融合率で細胞融合することはできないと考えられていた酵母の凍結されたプロトプラストを高効率に融合する細胞融合法を提供するものであり、特に、遺伝子的選択マーカーを持たない酵母又は栄養要求性を有しない酵母にも適用することが出来、このような酵母の細胞融合による育種を容易にすることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月16日(2005.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明に用いるSporobolomyces属に属する酵母とは、Sporobolomyces属であればいずれでもよいが、コエンザイムQ10、カロテノイド類、又はL-カルニチンなどの有用物質を高効率で生産する能力を有する菌が望ましい．具体的には、Sporobolomyces sp. NY205株（受託番号 FERM P-20491として平成17年4月7日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領された。）が挙げられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（凍結保存法）
Sporobolomyces sp. NY205株（FERM P-20491）をYPD培地に接種し、28℃で24時間培養した。次に、この培養液500μLを下記プロトプラスト化用培地50mLに植菌し、20時間後2-D-デオキシグルコース6.5%溶液を500μL添加し、48〜96時間培養を行った。
培養液を遠心分離して得られた菌体を100mMリン酸緩衝溶液（pH7に調整）で洗浄後、さらにプロトプラスト化用バッファーで２回洗浄した。洗浄後、プロトプラスト化用バッファー中にWestase(0.5%)とCellulase ONOZUKA R-10(2.5%)を含んだ細胞壁酵素処理溶液で、菌体濃度がOD4程度になるように菌体を懸濁して、3〜5時間30℃でゆるやかに浸とうした。この処理によるプロトプラスト化率は99%以上だった。次いで、このプロトプラストを凍結保存用バッファーに懸濁し、-80℃フリーザーで徐々に凍結させることで安定にプロトプラストを保存する。プロトプラスト融解後、プロトプラスト懸濁液をプロトプラスト化用バッファーで適当な濃度に希釈し、希釈液100μL中のプロトプラスト細胞数(A)を血球計算盤を用いて数えた。また、同希釈液100μLを41〜43℃に保温したYPD上層アガーに入れ、下層アガーの上に流し込むことで包埋させ、4〜8日間で28℃でインキュベートして生育するコロニー数(B)をカウントした。(A)及び(B)の値を用いて、次式（２）により再生率を算出したところ、20%という高い再生率を示した。