(57)【要約】【解決手段】納豆菌を人工突然変異又は自然突然変異することにより、ＡＥＣ耐性株、ＡＨＶ耐性株又はＨＬ耐性株を誘導・選択し、各々Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン又は分岐鎖アミノ酸の生産性を向上させ、これらのアミノ酸生産菌を用いて納豆を製造する。【効果】本発明によれば、健康と栄養に効果があると期待できるＬ−リジン、Ｌ−スレオニン又は分岐鎖アミノ酸を多く含む納豆を製造し、提供可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジンのアナログに対する耐性を有し、且つＬ−リジンを分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とするＬ−リジン高含有納豆の製造法。
【請求項２】
Ｌ−スレオニンのアナログに耐性を有し、且つＬ−スレオニンを分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とするＬ−スレオニン高含有納豆の製造法。
【請求項３】
分岐鎖アミノ酸のアナログに対する耐性を有し、且つ分岐鎖アミノ酸を分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とする分岐鎖アミノ酸高含有納豆の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、微生物の育種およびその利用に係り、更に詳細には、本発明は、必須アミノ酸、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸の生産性を向上させた納豆菌の育種、その育種納豆菌、その育種納豆菌を用いたこれらのアミノ酸を多く含む納豆の製造法、及びその育種納豆菌を使用して製造した納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸（Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン）は、いずれも必須アミノ酸として重要なアミノ酸であることが知られている。これらのアミノ酸の工業的製造法としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム  グルタミクム、エシェリヒア  コリーなどの変異株または組換え体を使用して糖を主原料とする直接発酵法が主流となっている。【０００３】Ｌ−リジンは蛋白質中に存在し、又アサリ、カラス貝等の貝類、多くの発芽植物に遊離して存在している。生理上重要なアミノ酸で、代表的な必須アミノ酸である。人や家畜はＬ−リジンを体内で生合成することができないため、Ｌ−リジンを食物から摂取する必要がある。米や小麦粉は地球レベルでの主食であり、アミノ酸で構成される蛋白質の重要な供給源である。然し、米や小麦粉では、理想的な母乳のアミノ酸パターンと比較して、Ｌ−リジンが最も不足している。【０００４】Ｌ−スレオニンは重要な蛋白質構成アミノ酸として知られている。代表的な必須アミノ酸であり、小麦粉ではＬ−リジンに次いで不足しているアミノ酸である。【０００５】分岐鎖アミノ酸として、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンが知られている。Ｌ−ロイシンは蛋白質中に存在し、肝臓、脾臓、発芽植物などに遊離の状態で存在している。又、Ｌ−バリンは亜麻仁蛋白質などの蛋白質中に存在し、発芽植物に遊離の状態で存在している。更に、Ｌ−イソロイシンは蛋白質中に存在し、エラスチンやカゼインなどの蛋白質中に存在し、甜菜糖蜜や発芽植物などに遊離の状態で存在している。これらの分岐鎖アミノ酸は、いずれも代表的な必須アミノ酸であり、小麦粉ではＬ−ロイシンはＬ−リジン、Ｌ−スレオニンに次いで不足しているアミノ酸であり、Ｌ−バリンとＬ−イソロイシンも不足しているアミノ酸である。これらの３つの分岐鎖アミノ酸は、生体の蛋白質を増加させる働きや、運動をしたときの筋肉のエネルギー源、運動時の持久力の向上、更には疲労感からの回復効果などさまざまの重要な役割をしている。【０００６】大豆を納豆菌で発酵した大豆発酵食品である納豆は、伝統的な日本発の栄養食品であり、最近は欧米にも愛好者が増えてきた。【０００７】納豆菌で大豆を発酵させると、納豆菌の持つプロテアーゼにより大豆蛋白質が分解されてペプチドやアミノ酸が生成し、蛋白質の消化・吸収を向上させる。【０００８】大豆を納豆菌で発酵させた納豆は、アミノ酸の供給源として極めて好ましい食品といえる。【０００９】しかし、米や小麦粉などを主食とする場合、含有している蛋白質による生理的効果を十分に引き出すには、副食としての現状の納豆に由来の必須アミノ酸であるＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸の含有量のままでは不十分と考えられることから、さらに高濃度にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸を含有する納豆を開発することが必要である。然し、納豆中のＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸含有量を増大させようとする創意・工夫は見当たらない。【００１０】納豆にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸を別途に添加することが考えられるが、安価な納豆のコスト増につながるので、好ましい方法ではない。従って、納豆菌の能力を人為的に向上させることにより、自然な形でＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸の含有量を高めることが求められる。
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】本発明は、米や小麦粉など穀物由来の蛋白質の栄養価を高め、生体の構成酵素の構成アミノ酸となり、且つ筋肉のエネルギー源としての生理作用が期待できるＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸を市販の納豆よりも高濃度に含有する納豆を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】本発明者等は、納豆のＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸などの遊離アミノ酸の含有量を向上させる手段を各種検討し、納豆菌自体のこれらのアミノ酸の生成能力を人為的に改良することが出来ると考えて本発明を推進した。
【００１３】納豆菌は、稲ワラなどに付着して自然界には広く存在している。分類学的にはバチルス・サチルスに分類されているが、納豆特有の粘質物を生成し且つビオチンを要求することからバチルス・ナットウとして分類したり、バチルス・サチルスの変種として分類する文献もある。
【００１４】納豆菌のＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸の生合成調節機構は完全に解明されておらず、更にこれらのアミノ酸の生合成能を向上させる試みも全く行われていないのが現状であった。
【００１５】そこで、本発明者らは、多様な検討を重ねた結果として、人工的に変異処理して得た変異納豆菌をＬ−リジンのアナログの１つであるＳ−（β−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＡＥＣ）含有培地で培養して得られた耐性株について、Ｌ−リジン分泌能を検討したところ、この耐性株がＬ−リジンを分泌している新知見を得た。更に、他のＬ−リジンのアナログである４−ＡｚａｌｙｓｉｎｅやＯｘａｌｙｓｉｎｅに対する耐性株も上記した特性を有することも見出した。
【００１６】また、本発明者らは、様々なテストを行い、人工的に変異処理して得た変異納豆菌からＬ−スレオニン分解能を欠失させ、次にこの変異株を再び変異処理してＬ−スレオニンのアナログの１種であるα−Ａｍｉｎｏ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＨＶ）含有培地で培養して得られた耐性株について、Ｌ−スレオニン分泌能を検討したところ、この耐性株がＬ−スレオニンを分泌することを見出した。
【００１７】更に、本発明者らは、各種の検討を行い、人工的に変異処理して得た変異納豆菌を分岐鎖アミノ酸のアナログの１つであるβ−Ｈｙｄｒｏｘｙｌｅｕｃｉｎ（ＨＬ）含有培地で培養して得られた耐性株について、分岐鎖アミノ酸分泌能を検討したところ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンを単独又は同時に分泌することを見出した。更に、分岐鎖アミノ酸の他のアナログであるα−Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄやＮｏｒｖａｌｉｎｅに対する耐性株も同様な特性を有することを見出した。
【００１８】すなわち本発明者らは、選択培地としてＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、分岐鎖アミノ酸などのアナログ含有培地を使用してこれらのアミノ酸高分泌性の納豆菌の育種に成功し、次にこのような育種納豆菌を使用して通常の納豆製造法により納豆を製造することにより、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、または／および分岐鎖アミノ酸を多く含む納豆の製造が可能であることを確認して本発明を完成するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】本発明で使用する納豆菌の親株としては、自然界からの分離株、工業的に使用されている菌株、或いは栄養要求性や薬剤耐性を付与した菌株などを用いることが出来る。【００２０】本発明で用いられる納豆菌の変異方法はいかなる変異方法でもよい。即ち、自然突然変異、紫外線照射やエックス線照射などの物理的変異、エチルメチルスルホン酸やＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学的変異を用いることができる。【００２１】本発明では、目的とする育種納豆菌の選択培地に特徴を有するものである。Ｌ−リジンを分泌する納豆菌を取得するには、選択培地にＬ−リジンのアナログを添加することが望ましい。Ｌ−リジンのアナログとしては、ＡＥＣ、４−Ａｚａｌｙｓｉｎｅ，Ｏｘａｌｙｓｉｎｅなどを用いることができる。Ｌ−リジンのアナログの添加濃度は変異操作を行う納豆菌のアナログ耐性度を調べて実施する必要があるが、５０〜５０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２２】また、Ｌ−スレオニンを分泌する納豆菌を取得するには、選択培地にＬ−スレオニンのアナログを添加することが望ましい。Ｌ−スレオニンの分解能を有する納豆菌のときは、予めＬ−スレオニン分解能を変異により欠失するとよい。Ｌ−スレオニンのアナログとしては、ＡＨＶなどを用いることができる。Ｌ−スレオニンのアナログの添加濃度は、使用する納豆菌のアナログ耐性度を検討して決める必要があるが、１００〜８０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２３】更に、分岐鎖アミノ酸を分泌する納豆菌を取得するには、選択培地に分岐鎖アミノ酸のアナログを添加することが望ましい。分岐鎖アミノ酸のアナログとしては、ＨＬ、α−Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｎｏｒｖａｌｉｎｅなどを用いることができる。分岐鎖アミノ酸のアナログの添加濃度は、変異操作を行う納豆菌の耐性度にもよるが、１００〜８０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２４】改良をしたい納豆菌を変異処理し、次にＡＥＣ、ＡＨＶまたはＨＬなどのアナログを添加した固体の選択培地に播菌し、３７℃、５日間培養し、形成したコロニーを純化する。この純化した納豆菌を使用して納豆をつくり、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンまたは分岐鎖アミノ酸を多く含有するようになった納豆菌が取得選択できる。【００２５】以上のように納豆菌を育種開発したＬ−リジン、Ｌ−スレオニンまたは分岐鎖アミノ酸の高分泌株を使用して実際の納豆生産に利用するには、従来よりの納豆製造設備の使用がそのまま可能であり、新たな設備投資の必要はない。このようにして、育種開発した納豆菌を用いることにより、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンまたは分岐鎖アミノ酸が高濃度で含有された栄養豊富な新規納豆の生産が可能である。【００２６】本特許の記載技術を用いれば、大豆や各種穀物類を原料として、バチルス属各種微生物の同様な育種株を使用することにより、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンまたは分岐鎖アミノ酸の含有量が向上した発酵食品、飼料などの製造が可能であり、本特許の範囲に含まれる。【００２７】以下に本発明の実施例について記述する。
【実施例１】
【００２８】本実施例において使用した培地は、ＬＢ培地、改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地である。【００２９】ＬＢ培地組成は、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩５ｇ、水１Ｌ、ｐＨ６．８である。固体培地には寒天２％を添加した。【００３０】改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地組成は、グルコース５ｇ、クエン酸Ｎａ１ｇ、硫安２ｇ、燐酸１カリウム６ｇ、燐酸２カリウム１４ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．２ｇ、ビオチン０．１ｍｇ、水１Ｌ、ｐＨ６．８である。固体培地には寒天２％を添加した。【００３１】市販納豆から分離した納豆菌ＮＡ−１株をＬＢ培地で１晩培養し、滅菌生理食塩水で洗浄後、同生理食塩水中で通常の方法によりＮＴＧ変異処理を行った。ＮＴＧ変異処理後の洗浄菌液をＡＥＣ１０００μｇ／ｍｌ含有の改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地に播いた。３７℃で１週間培養し、出現したコロニーをＬＢ培地で純化し、次にＡＥＣ１０００μｇ／ｍｌ含有の改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地にてアナログ耐性を確認した。【００３２】アナログ耐性を確認したＡＥＣ耐性株であるＮｏ．１株およびその親株ＮＡ−１株を用いて、納豆を作製した。大豆を浸漬後、水切りし、次に蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３０００個の胞子を各々植菌し、４５ｇずつＰＳＰトレーに入れ、蓋をして発酵に入れ、４０℃、高湿度下で醗酵を行った。【００３３】作製した２つの納豆について、納豆中の遊離Ｌ−リジン含有量を定量した。その結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合はＬ−リジン含有量６０ｍｇ／納豆１００ｇ、ＡＥＣ耐性株Ｎｏ．１株を使用した場合はＬ−リジン含有量２４０ｍｇ／納豆１００ｇであり、ＡＥＣ耐性株使用の納豆において、Ｌ−リジン含有量の増大が認められた。（図１）
【実施例２】
【００３４】親株ＮＡ−１株からＬ−スレオニン非分解性株を通常の方法で育種し、次に【００３１】に記載した同様な方法により、ＡＨＶ３０００μｇ／ｍｌに耐性を示す変異株Ｎｏ．２株を取得した。ＮＡ−１株及びＮｏ．２株を使用して、上記の方法により納豆を作製した。次に、作製した納豆中のＬ−スレオニン含有量を定量した結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合は、Ｌ−スレオニン含有量５ｍｇ／納豆１００ｇであり、ＡＨＶ耐性株Ｎｏ．２株を使用した場合は、Ｌ−スレオニン含有量２１０ｍｇ／納豆１００ｇであった。
【実施例３】
【００３５】親株ＮＡ−１株から【００３１】に記載した同様な方法により、ＨＬ５０００μｇ／ｍｌに耐性を示す変異株Ｎｏ．３株を取得した。ＮＡ−１株及びＮｏ．３株を使用して、上記の方法により納豆を作製した。次に、作製した納豆中の分岐鎖アミノ酸含有量を測定した結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合は、Ｌ−バリン３５ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−ロイシン８０ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−イソロイシン１５ｍｇ／納豆１００ｇであった。一方、ＨＬ耐性株Ｎｏ．３株を使用した場合は、Ｌ−バリン１５０ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−ロイシン１４５ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−イソロイシン８０ｍｇ／ｍｌであった。【００３６】上記の各実施例で取得した変異株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｎｏ．１株，Ｎｏ．２株及びＮｏ．３株については、各々ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１３５、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１３６、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１３７として、産業技術総合研究所に寄託されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の１例を示す図である。図の縦軸はＬ−リジン含有量（ｍｇ／納豆１００ｇ）、横軸は納豆製造時の親株ＮＡ−１株と育種株Ｎｏ．１株を示す。
【図１】
2006055151.tif 000002