(57)【要約】【課題】  相互作用から検出に至るまでの一連のアッセイ工程が簡略であり、蛍光ノイズを簡易かつ確実に除去してＳ／Ｎ比の向上を達成する。【解決手段】  プローブ物質（１ａ）とターゲット物質（２ａ）との間の相互作用を検出するための表面であって、蛍光物質（Ｆ１）が標識され、かつ非標識末端が固相表面Ｓに固定されている前記プローブ物質（１ａ）と、前記蛍光物質（Ｆ１）の発光を抑制又は変調する蛍光改変物質（Ｑ１）と、を備え、前記相互作用によって、前記蛍光物質（Ｆ１）の発光又は変調解除が行なわれる検出表面、並びに該検出表面を備えるセンサーチップなどを提供する。【選択図】  図１
2006313118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ物質とターゲット物質との間の相互作用を検出するための表面であって、
蛍光物質が標識され、かつ、非標識末端が固相表面に固定されている前記プローブ物質と、
前記蛍光物質の発光を抑制又は変調する蛍光改変物質と、を備え、
前記相互作用によって、前記蛍光物質の発光又は変調解除が行なわれる検出表面。
【請求項２】
前記蛍光改変物質は、前記プローブ物質自体に結合又は吸着されていることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項３】
前記蛍光改変物質は、前記固相表面と前記プローブ物質との間に介在していることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項４】
前記蛍光改変物質は、前記プローブ物質周辺の固相表面に存在していることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項５】
前記プローブ物質は、自己ループ構造を有する核酸鎖であることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項６】
前記固相表面は、基板又はビーズの表面であることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項７】
前記プローブ物質と相互作用するターゲット物質の末端に、相互作用時にプローブ物質に標識された蛍光物質によって色変調を受ける蛍光物質が標識されていることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項８】
前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項９】
請求項１記載の検出表面を少なくとも備えるセンサーチップ。
【請求項１０】
請求項８記載の検出表面を少なくとも備えるＤＮＡチップ。
【請求項１１】
蛍光物質が標識されたプローブ物質の非標識末端が、前記蛍光物質の発光を抑制又は変調する材料で形成された固相表面に対して固定されていることを特徴とする検出表面。
【請求項１２】
一端に位置する蛍光改変物質と、他端に標識された蛍光物質と、前記蛍光改変物質と蛍光物質の間に介在し、ターゲット核酸鎖と相補鎖を形成し得る塩基配列と、を備え、かつ、自己ループ構造を形成可能なプローブ。
【請求項１３】
ターゲット核酸鎖と相補鎖を形成し得る塩基配列を挟む両側に、自己ループ構造を形成する相補的塩基配列部位を有することを特徴とする請求項１２記載のプローブ。
【請求項１４】
請求項１記載の検出表面を用いて、前記相互作用の検出の弊害となるバックグラウンドノイズ蛍光を低減する方法。
【請求項１５】
請求項１２記載のプローブを用いて、ハイブリダイゼーション検出の弊害となるバックグラウンドノイズ蛍光を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用の検出に係る技術に関する。より詳しくは、物質間の相互作用の検出に有用な検出表面、ＤＮＡチップその他のセンサーチップ、プローブ、並びにバックグラウンドノイズ蛍光の低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子情報を分子レベルで解明しようという試みが盛んに行われ、人に関してはヒトゲノムプロジェクトの完了により、本来有している遺伝子構造が明らかになってきた。これに伴い、遺伝病の診断、治療のために遺伝子の変異を測定するだけでなく、どの時点でどのような遺伝子が発現しているかを測定する事が必要となってきている。
【０００３】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００４】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等の核酸鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００５】
普及しているＤＮＡチップは、基板上に固定化されたプローブ核酸に対して、予め蛍光色素を修飾（ラベル）した標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、その相互作用の結果を蛍光量（蛍光シグナル）として捉えて検出するという方法が採用されている。しかし、標的核酸を、蛍光標識しながら増幅させる工程には手間がかかる。
【０００６】
また、二本鎖に選択的に挿入結合される色素（インターカレーター）を用いて、ハイブリダイゼーションを検出する技術が提案されている。しかし、この方法でも、インターカレーターの適正添加量の調整が必要であり、ハイブリダイゼーション後に、インターカレーターを導入する工程が必要になる。
【０００７】
加えて、標的核酸に蛍光標識する上記第一の方法やインターカレーターを用いる前記第二の方法のいずれにおいても、ノイズ蛍光の発生という問題を抱えている。具体的には、第一の方法では、ハイブリダイゼーションに関与しなかった標的核酸などからノイズ蛍光が発生し、第二の方法では、基板表面や一本鎖核酸に非特異的に吸着したインターカレーターなどからノイズ蛍光が発する。
【０００８】
これらのノイズ蛍光は、検出精度に無視できない程度に影響を及ぼすので、検出される蛍光シグナルから、ハイブリダイゼーションとは本質的に無関係であるノイズ蛍光を排除し、いわゆるＳ／Ｎ比をどの程度向上できるかということが、ハイブリダイゼーション検出の精度向上に直結する。
【０００９】
このため、ノイズ蛍光を除去する技術が提案されている。代表例として、基板上に存在するノイズ蛍光発生原因となる物質を反応場から洗浄する方法を挙げることができる。しかし、洗浄処理作業では、洗浄条件の設計も精密に行わなければならず、また、洗浄に晒されたときに、正規にハイブリダイゼーションした二本鎖が解離してしまうなどの悪影響も予想される。
【００１０】
洗浄処理以外のノイズ蛍光低減技術として、例えば、特許文献１には、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減するために消光剤を用いる技術が開示されている。また、特許文献２では、ハイブリダイゼーションしていないプローブ核酸をヌクレアーゼで消化することによって基板から除去する方法が提案されている。
【００１１】
また、特許文献３には、蛍光物質と消光物質を有するフレットプローブを用いるインベーダー法によるＳＮＰ解析方法が開示されている。特許文献４には、蛍光部分とクエンチャー部分を含むプローブを用いてＰＣＲを行う方法などが開示されている。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特表２００４−５１９６８９号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献３】特開２００３−３２５２００号公報。
【特許文献４】特表２００４−５０９６１３号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、固相表面上やその周囲の反応場で進行した物質間の相互作用を検出する技術において、相互作用から検出に至る一連のアッセイ工程が簡略であり、蛍光ノイズを簡易かつ確実に除去してＳ／Ｎ比の向上を達成できる新規かつ有用な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、まず、プローブ物質とターゲット物質との間の相互作用を検出するための表面であって、蛍光物質が標識され、かつ非標識末端が固相表面に固定されている前記プローブ物質と、前記蛍光物質の発光を抑制又は変調する蛍光改変物質と、を備えており、前記相互作用によって、前記蛍光物質の発光、又は変調解除が行なわれる検出表面を提供する。
【００１４】
即ち、本発明に係る「検出表面」では、固相表面、例えば、基板やビーズなどの表面に固定された状態にあるプローブ物質それ自体が、相互作用検出のための蛍光情報を有している。そして、このプローブ物質は、ターゲット物質との間での相互作用が進行すると、蛍光改変物質の消光作用から解放されて発光したり、同蛍光改変物質の変調作用から解放されて無変調の蛍光を発したりする。これらの蛍光を測定することで、相互作用の発生や量を検出できる。したがって、この検出系では、ターゲット物質に蛍光標識する作業やインターカレーターを添加する作業が、根本的に不要である。
【００１５】
ここで、「蛍光改変物質」とは、蛍光物質の蛍光を抑制（クエンチ）又は変調して色を変化させる機能を有する物質である。この蛍光改変物質は、プローブ物質自体に結合又は吸着された構成、さらには前記固相表面と前記プローブ物質との間に介在している構成などを採用できる。即ち、この構成のプローブ物質は、自己内に蛍光物質とその蛍光を抑制又は変調する蛍光改変物質の両方を備える。あるいは、蛍光改変物質を、プローブ物質周辺の固相表面に存在させた構成などを採用できる。
【００１６】
ここで、「プローブ物質」は、当該物質と特異的に相互作用するターゲット物質を検出するための探り針（検出子）として機能する物質であり、本発明では、基板やビーズなどの固相表面に固定された状態で存在し、相互作用可能なターゲット物質を検出表面上で待ち受けている。
【００１７】
このプローブ物質が、ハイブリダイゼーション検出に利用されるオリゴＤＮＡなどの核酸鎖の場合、自己ループ構造を形成する核酸鎖であることが望ましい。例えば、標的核酸鎖の塩基配列と相補的な塩基配列以外に、自己ループ構造を形成する相補的な塩基配列部位を備えるプローブ核酸鎖、あるいは、相補的な塩基配列なくても自己ループ構造を形成できるプローブ核酸鎖である。
【００１８】
この検出表面上で自己ループ構造を保っているプローブ核酸鎖の遊離末端に標識された蛍光物質は、固相表面に近接するようになるので、該固相表面の近傍に蛍光改変物質を位置させておくと、該蛍光改変物質によって蛍光物質の発光を抑制したり、変調させたりすることができる。そして、該プローブ核酸鎖がターゲット核酸鎖とハイブリダイゼーションする過程で自己ループ構造が開環すると、蛍光物質と蛍光改変物質との間の距離が長くなるため、蛍光改変物質の消光作用から解放されて蛍光物質が発光し、あるいは、蛍光改変物質の変調作用から解放されて変調のない色に変化する。これらの蛍光現象を捉えることにより、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００１９】
また、本発明では、プローブ物質と相互作用するターゲット物質の末端に、相互作用時にプローブ物質に標識された蛍光物質によって色変調を受ける蛍光物質を標識しておいてもよい。このような検出表面では、相互作用に関与しなかったプローブ物質やターゲット物質由来の蛍光（ノイズ蛍光）と、相互作用しているターゲット物質由来の変調蛍光（正規蛍光）を、光の波長によって区別して検出することができるという利点がある。なお、このような構成では、ターゲット物質に蛍光物質を標識する工程が必要となるというデメリットがある。
【００２０】
ここで、本発明における物質間の「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く包含し、例えば、核酸鎖間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応、低分子-高分子間の相互作用などの物質間の化学的結合あるいは解離などに適用できる。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２１】
以上説明したような構成の検出表面は、ＤＮＡチップやタンパクチップなどのセンサーチップに形成することができ、また、この検出表面は、物質間の相互作用を検出する際の弊害となるバックグラウンドノイズ蛍光を低減する方法に利用できる。
【００２２】
次に、本発明が提供する第二の検出表面は、蛍光物質が標識されたプローブ物質の非標識末端が、前記蛍光物質の発光を抑制又は変調する材料で形成された固相表面に対して固定された構成を備えるものである。この検出表面は、固相表面それ自体が、プローブ物質の蛍光を抑制又は変調する蛍光改変機能を有することが特徴である。
【００２３】
続いて、本発明では、一端に位置する蛍光改変物質と、他端に標識された蛍光物質と、前記蛍光改変物質と蛍光物質の間に介在し、ターゲット核酸鎖と相補鎖を形成し得る塩基配列と、を備え、かつ、自己ループ構造を形成可能なプローブを提供する。
【００２４】
なお、前記自己ループ構造の形成は、特に限定されないが、例えば、ターゲット核酸鎖と相補鎖を形成し得る塩基配列を挟む両側に位置する相補的塩基配列によって形成されるものでもよい。このようなプローブを、例えば、その蛍光改変物質側を固相表面に結合して固定することにより、ハイブリダイゼーション検出に利用でき、この場合に得られる蛍光情報は、バックグラウンドノイズ蛍光が少ないので、Ｓ／Ｎ比がよい。
【００２５】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について補足説明する。
【００２６】
まず、「検出表面」とは、物質間の相互作用を検出する目的で形成された固相表面である。なお、この表面は、例えば、プローブ物質を固定化するのに適する表面処理が施されている。
【００２７】
「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を主に意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含み、狭く解釈されない。
【００２８】
「自己ループ構造」は、一本鎖又は二本鎖のヌクレオチド鎖の一部において、ループ形状を形成する構造部分であって、相補塩基対部分によって形成されるものとそうでないものの両方を含む。
【００２９】
「ノイズ蛍光」は、相互作用の蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光を意味する。例えば、相互作用に関与しなかったプローブ物質から発せられる蛍光、相互作用に関与しなかったターゲット物質（蛍光標識されている場合）から発せられる蛍光などが少なくとも含まれる。本発明では、このノイズ蛍光を正規蛍光と区別して検出することを可能とすることや、検出される蛍光中に含まれないようにすることで、Ｓ／Ｎ比を向上させることが主題の一つである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、固相表面上やその周囲の反応場で進行した物質間の相互作用を検出する技術において、相互作用から検出に至る一連のアッセイ工程を簡略化することができ、かつ、蛍光ノイズを簡易かつ確実に除去してＳ／Ｎ比の向上を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる方法の代表的な実施形態を例示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３２】
まず、図１は、本発明に係る検出表面の第一実施形態の概念を模式的に表した図である。
【００３３】
図１で示された固相表面Ｓは、物質間の相互作用の一例であるハイブリダイゼーションの検出のために設計された検出表面である（他の実施形態でも同様）。なお、固相表面Ｓは、特に限定されないが、例えば、生体物質の相互作用の反応場を形成するのに適する、ガラス、合成樹脂、金属などから形成された基板やビーズの表面が好適例である。
【００３４】
この図１に示された実施形態例においては、プローブ物質の代表例として、自己ループ構造をとり得る構成を有するプローブ核酸鎖１ａが採用されており、図１向かって左側の（Ｉ）には、ハイブリダイゼーション前の固相表面Ｓと該表面Ｓ上の反応場Ｒの状態が示されている。
【００３５】
プローブ核酸鎖１ａは、その一端に蛍光改変物質の一例である消光物質Ｑ１が結合され、プローブとなる塩基配列部分を間に挟んで、他端側には蛍光物質Ｆ１が標識されており、前記消光物質Ｑ１側の末端において固相表面Ｓに固定されている（図１参照）。そして、このプローブ核酸鎖１ａは、自らの相補的な塩基配列部位において相補結合し、プローブとなる塩基配列部分がループ状の構造（自己ループ構造）を形成している。なお、プローブとなる塩基配列部分の長さや塩基配列は、ターゲットとなる核酸鎖に合わせて適宜決定すればよい。
【００３６】
プローブ核酸鎖１ａが前記自己ループ構造をとっている状態では、図１の（Ｉ）に示されているように、蛍光物質Ｆ１が固相表面Ｓの近傍に存在している消光物質Ｑ１に近接した状態となる。この結果、蛍光物質Ｆ１は、消光物質Ｑ１の消光（クエンチ）作用を受けて、その蛍光の発光が抑制される。この消光物質Ｑ１としては、例えば、蛍光物質Ｆ１の蛍光波長に重なった吸収スペクトルを有し、かつ蛍光を発しない物質を適宜自由に採用することができる。
【００３７】
図１向かって右側の（II）は、ハイブリダイゼーションが進行した状態が模式的に示されている。ハイブリダイゼーションの過程では、プローブ核酸鎖１ａの自己ループ構造が解けて、プローブ核酸鎖１ａとこれと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸鎖２ａとの間で相補的な二本鎖を形成する。
【００３８】
この二本鎖が形成された状態では、プローブ核酸鎖１ａの蛍光物質Ｆ１は、固相表面Ｓの近傍に位置する消光物質Ｑ１から距離を置いて存在するようになる（図１（II）参照）。このため、蛍光物質Ｆ１は、消光物質Ｑ１の消光作用を受けなくなり、発光を発することが可能となる。なお、蛍光物質Ｆ１は、反応場Ｒに照射される所定波長の蛍光励起光（図示せず。）によって励起されて発光する（以下、同様）。
【００３９】
このとき得られる蛍光は、ハイブリダイゼーションに係わったプローブ核酸鎖１ａが反応場Ｒに存在することを示す情報として利用できる。即ち、ハイブリダイゼーションの検出情報として利用できる。
【００４０】
図２は、本発明に係る検出表面の第二実施形態の概念を模式的に表した図である。
【００４１】
この図２に示されたプローブ核酸鎖１ｂ（プローブ核酸鎖１ａと同様に自己ループ構造をとり得るもの）は、その一端に、蛍光改変物質の一例である蛍光変調物質Ｑ２を有し、プローブとなる塩基配列部分を間に挟んで、他端側には蛍光物質Ｆ２が標識されており、前記蛍光変調物質Ｑ２側の末端にて固相表面Ｓに固定されている。
【００４２】
蛍光変調物質Ｑ２として、蛍光物質Ｆ２の蛍光波長に吸収を有し、蛍光物質と異なる波長の蛍光を発する物質を選択したとき、蛍光物質Ｆ２から蛍光を発する励起光を照射した場合、自己ループ構造が解けているとき（図１（II）参照）は蛍光物質Ｆ２から蛍光が得られ、自己ループ構造をとったとき（図１（Ｉ）参照）には、蛍光物質Ｆ２からの蛍光を蛍光変調物質Ｑ２が吸収し、自己ループ構造が解けているときの蛍光物質Ｆ２からの蛍光とは異なる波長の蛍光を発する。この場合、蛍光変調物質Ｑ２のみが吸収する波長で励起光を照射し得られる蛍光量を基準として、蛍光物質Ｆ２を励起する励起光を照射して得られる蛍光変調物質Ｑ２からの蛍光量を測定することにより、基板表面のプローブに対するハイブリダイゼーションの割合を測定することもできる。
【００４３】
したがって、この第二実施形態では、固相表面Ｓにおける蛍光の色調の変化を測定することによって、プローブ核酸鎖１ｂとターゲット核酸鎖２ｂとの間のハイブリダイゼーションの発生状況を検出することができる。
【００４４】
続いて、図３は、本発明に係る検出表面の第二実施形態の概念を模式的に表した図である。
【００４５】
本実施形態で採用されているプローブ核酸鎖１ｃは、一端が固相表面に固定され、プローブとなる塩基配列部分を間に挟んで、他方の遊離末端に蛍光物質Ｆ１が結合されており、かつ、自己ループ構造をとり得るものである。
【００４６】
消光物質Ｑ３は、第一実施形態とは異なって、プローブ核酸鎖１ｃに結合されているのではなく、固相表面Ｓ上に存在し、プローブ核酸鎖１ｃが自己ループ構造をとったときに、蛍光物質Ｆ１の蛍光を消光するように構成されている（図３（Ｉ）参照）。
【００４７】
プローブ核酸鎖１ｃとターゲット核酸鎖２ｃとの間のハイブリダイゼーションが反応場Ｒで進行すると、プローブ核酸鎖１ｃの自己ループ構造が解けて、蛍光物質Ｆ１と固相表面Ｓに存在する消光物質Ｑ３との間の距離が広がるため、蛍光物質Ｆ１は消光物質Ｑ３の作用を受けなくなり、その結果、蛍光を発することが可能となる（図３（II）参照）。
【００４８】
このとき得られる蛍光は、ハイブリダイゼーションに係わったプローブ核酸鎖１ｃが存在することを示す情報として利用できる。即ち、ハイブリダイゼーションの検出情報として利用できる。
【００４９】
図４は、本発明に係る検出表面の第四実施形態の概念を模式的に表した図である。
【００５０】
本実施形態の特徴は、蛍光抑制機能を有する材料、例えば、金（Ａｕ）のような金属材料から形成された基板３によって固相表面Ｓが形成されていることである。これにより、第三実施形態において既述した構成を備えるプローブ核酸鎖１ｃは、自己ループ構造を形成するときには蛍光物質Ｆ１が固相表面Ｓに近接しているため（図４（Ｉ）参照）、その蛍光は抑制される。
【００５１】
プローブ核酸鎖１ｃとターゲット核酸鎖２ｃとの間のハイブリダイゼーションが反応場Ｒで進行すると、プローブ核酸鎖１ｃの自己ループ構造が解けて、蛍光物質Ｆ１と固相表面Ｓとの間の距離が広がるため、蛍光物質Ｆ１は消光作用を受けなくなり、その結果、蛍光を発することが可能となる（図４（II）参照）。
【００５２】
このとき得られる蛍光は、ハイブリダイゼーションに係わったプローブ核酸鎖１ｃが存在することを示す情報として利用できる。即ち、ハイブリダイゼーションの検出情報として利用できる。
【００５３】
図５は、本発明に係る検出表面の第五実施形態の概念を模式的に表した図である。
【００５４】
本実施形態では、既述した構成のプローブ核酸鎖１ａが、自己ループ構造をとった形態で固相表面Ｓに固定されている。この反応場Ｒに、蛍光標識されたターゲット核酸２０ａが投入されると（図５（Ｉ）参照）、該反応場Ｒからは該ターゲット核酸鎖２０ａに結合等された蛍光物質Ｆ３由来の蛍光が発光可能な状態となる。この蛍光は、ターゲット核酸２０ａが未だハイブリダイゼーションしていないことを意味する検出情報となる。
【００５５】
次に、プローブ核酸鎖１ａとターゲット核酸２０ａとの間のハイブリダイゼーションが進行すると、ターゲット核酸鎖２０ａに結合等された蛍光物質Ｆ３は、プローブ核酸鎖１ａの遊離末端側に結合等された蛍光物質Ｆ１からのエネルギー移動により変調を受けて、一本鎖状態の前記蛍光とは異なる色に変調された蛍光を発する（図５（II）参照）。この蛍光は、ターゲット核酸２０ａがハイブリダイゼーションしていることを意味する検出情報となる。
【００５６】
このようなハイブリダイゼーションの過程では、プローブ核酸鎖１ａの中には、その自己ループ構造が解かれてはいるものの、ターゲット核酸２０ａとの間のハイブリダイゼーションに関与することなく、未だ一本鎖状態のままで存在することが予想される（図５の符号１'ａ参照）。
【００５７】
この一本鎖プローブ核酸鎖１ａ'から発せられる蛍光は、ハイブリダイゼーションに関連しないノイズ蛍光となる。しかし、このノイズ蛍光は、プローブ核酸鎖１ａと相補鎖を形成したターゲット核酸鎖２０ａから発せられる正規蛍光とは、色調で区別することが可能となる。したがって、反応場Ｒから取得される二種類の蛍光を、ダイクロイックミラー等を用いて光学的に区別して検出することにより、正規蛍光成分とノイズ蛍光成分を分離して取得することが可能となる。
【００５８】
ここで、図６を参照しながら、本発明で採用できる検出表面の好適な作製工程例を、以下に説明する。
【００５９】
まず、シリコン基板やシリコンビーズ等のように活性な表面水酸基を有する固相表面Ｓを利用する（図６（Ｉ）参照）。この固相表面Ｓにシランカップリング反応によって遊離アミノ基（-NH２）を生成する（図６（II）参照）。
【００６０】
次に、この遊離アミノ基に対して、例えば、コハク酸（HOOC(CH2)2COOH）のようなジカルボン酸の一方のカルボキシル基（-C00H）をアミド結合させるとともに、他方に遊離カルボキシル基末端を形成する（図６（III）参照）。
【００６１】
続いて、この遊離カルボキシル基末端に対して、蛍光消光作用、あるいは蛍光変調作用を有する「化学式１」に示すような芳香属アゾ化合物である蛍光改変物質Ｑを結合する（図６（IV）参照）。
【００６２】
【化１】
2006313118.tif 000003
【００６３】
そして、前記蛍光改変物質Ｑが有する遊離カルボキシル末端に対して、蛍光物質が標識されたプローブ核酸鎖（図６では符号Ｘで示す。）に予め形成されたアミノ基末端を結合させる（図６（Ｖ）参照）。このようにして、固相表面Ｓに、蛍光改変物質Ｑを介して、次の「化学式２」に示すような蛍光物質が標識されたプローブ核酸鎖Ｘを固定することができる。
【００６４】
【化２】
2006313118.tif 000004
【００６５】
なお、このプローブ核酸鎖Ｘの基本的な構成例を図７に示す。この図７に示すように、このプローブ核酸鎖Ｘは、自己ループ構造を形成し得る相補的な塩基配列部分（-ＡＡＡＡ-，-ＴＴＴＴ-）と、その間に介在するプローブＰ（ターゲット核酸鎖と相補鎖を形成する塩基配列部位）と、標識された蛍光物質Ｆと、を備える。蛍光物質Ｆは、上記化学式２で示されたような蛍光物質に限定されず、シアニン色素、ローダミン色素などの蛍光性色素から目的に合わせて自由に選択できる。
【００６６】
なお、コハク酸の遊離カルボキシル末端に対して、蛍光改変物質Ｑを介さずに、蛍光標識されたプローブ核酸鎖Ｘを直接結合することによって、図３、図４に示すようなプローブ核酸鎖１ｃや検出表面を形成することもできる（図８参照）。
【００６７】
以上説明したような検出表面を、ガラスや合成樹脂で形成された基板上に形成することによって、目的の物質間の相互作用を蛍光検出できるセンサーチップを得ることができる。検出表面は、基板上に形成されたウエル形状などを呈する反応場に望む表面部位に形成してもよい。このようなセンサーチップは、一例を挙げれば、ハイブリダイゼーションを検出するためのＤＮＡチップとして利用できる。なお、蛍光検出は、所定波長に設定された蛍光励起光を反応場Ｒに向けて、外部光源から出射し、励起された蛍光を外部に配置されたフォトディテクタなどの光検出手段によって検出することにより実施することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明に係る実施例について説明する。なお、本実施例は、本発明に係るプローブ核酸鎖を用いたハイブリダイゼーション検出の有効性を実証するための実験である。
【００６９】
１ｃｍ角に切断したシリコン基板を用意し、このシリコン基板を洗浄した後、オゾン処理、過酸化水素水処理により表面を清浄化し、１２０度で３０分加熱乾燥した。トルエン中にアミノプロピルシランをトルエンに対する体積比で２％添加し、これに洗浄したシリコン基板を浸漬した。５０度で３０分反応させた後、トルエン、水で洗浄した。次に、コハク酸無水物１００ｍｇを１０ｍLのジメチルホルムアミドに溶解した溶液に前記基板を浸漬し、５０度２時間アミド化反応を行った。その後、基板を洗浄し１００ｍｌの水に５ｇのＥＤＣおよび、Ｎヒドロキシコハク酸イミド５ｇを溶解した反応液を用い活性エステルを形成し、水洗後真空乾燥を行った。
【００７０】
続いて、上記化学式１の構造を有する化合物（消光物質）１００ｍｇをジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解した溶液に基板を浸漬し５０度で２時間反応させ、ジメチルホルムアミド、水の順に洗浄を行った。
【００７１】
ついで、上記化学式２の構造を有する化合物（蛍光物質）で標識された合成ＤＮＡオリゴマー（自己ループ構造を形成するプローブ核酸鎖（３８ｍｅｒ）、塩基配列：AAAACATTTCTTACATCTCCCAAACATCCCTCACTTTT）を純水に溶解し（濃度１０μＭ）、加湿下８０度で１時間反応させた（１ｍｍスポット）。
【００７２】
ハイブリダイゼーションは、前記プローブ核酸鎖として用いた前記ＤＮＡオリゴマーと相補鎖を形成する合成ＤＮＡオリゴマー試料１（３０ｍｅｒ、塩基配列：GTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATG）、及び前記プローブ核酸鎖と完全相補鎖を形成しない合成ＤＮＡオリゴマー試料２（３０ｍｅｒ、塩基配列：GTGAGGGATGTTTGGTAAATGTAAGAAATG）を、それぞれをHEPESバッファー液中１ｎＭに調整し、基板上に１０μL液盛し、加湿下６５度で４時間反応させた。反応後、バッファーで洗浄し、励起光４５０nmで基板の蛍光を顕微鏡で観察した。その結果を図６に示す。
【００７３】
蛍光標識され、かつ蛍光改変物質を備えるプローブ核酸鎖（のプローブ塩基配列部位）と相補鎖を形成しないミスマッチのＤＮＡオリゴマー試料２とを反応させた系の蛍光量（図９の試料２参照）は、対称区である反応を行わなかった基板からの蛍光（図９の対照区参照）と同等であった。この結果から、ハイブリダイゼーションすることなく反応場に存在する前記プローブ核酸鎖からの蛍光、即ちバックグラウンドノイズとなる蛍光を低減できることを実証できた。
【００７４】
一方、前記構成のプローブ核酸鎖と相補鎖を形成するＤＮＡオリゴマー試料１をハイブリダイゼーションさせた系では、該プローブ核酸鎖に標識された蛍光物質から十分な蛍光を得ることができることを実証できた（図９の試料１参照）。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、物質間の相互作用を蛍光検出する技術として利用できる。特に、ノイズ蛍光を低減又は消失させ、Ｓ／Ｎを向上させる技術として利用できる。また、従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程などを行わなくてもよいハイブリダイゼーションなどの相互作用検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に係る検出表面の第一実施形態の概念を模式的に表した図である。
【図２】同検出表面の第二実施形態の概念を模式的に表した図である。
【図３】同検出表面の第三実施形態の概念を模式的に表した図である。
【図４】同検出表面の第四実施形態の概念を模式的に表した図である。
【図５】同検出表面の第五実施形態の概念を模式的に表した図である。
【図６】本発明で利用できる検出表面の好適な作製工程例を示す図である。
【図７】本発明に係るプローブ核酸鎖の一例の構成を示す図である。
【図８】第三実施形態（図３）や第四実施形態で利用できるプローブ核酸鎖（１ｃ）や検出表面の具体例を示す図である。
【図９】実施例に係る結果を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００７７】
１ａ，１ｂ，１ｃ  プローブ物質の例であるプローブ核酸鎖
２ａ，２ｂ，２ｃ，２０ａ  ターゲット物質の一例であるターゲット核酸鎖
Ｆ（Ｆ１〜Ｆ３）  蛍光物質
Ｑ（Ｑ１〜Ｑ３）  蛍光改変物質
Ｒ  反応場
Ｓ  固相表面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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