(57)【要約】【課題】アルカリ性ホスファターゼ６のうちで IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定する方法およびそれに用いるキットを提供する。【解決手段】IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位および免疫グロブリンＡ部位のそれぞれを認識する抗ヒト臓器非特異的アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体と抗 IgA モノクローナル抗体とを反応させて、得られる、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と抗ヒト臓器非特異的アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体と抗 IgA モノクローナル抗体との結合物のレベルを測定することにより、正確に IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する免疫グロブリンＡ部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルから IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法。
【請求項２】
アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質がヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質である請求項１の測定方法。
【請求項３】
ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質が抗ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体である請求項２の測定方法。
【請求項４】
免疫グロブリンＡ部位認識物質が IgA と結合可能な物質である請求項１から３のいずれかの測定方法。
【請求項５】
IgA と結合可能な物質が抗ヒト IgA モノクローナル抗体である請求項４の測定方法。
【請求項６】
検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６とヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する免疫グロブリンＡ部位認識物質とを反応させ、得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルから IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法。
【請求項７】
免疫グロブリンＡ部位認識物質が IgA と結合可能な物質である請求項６の測定方法。
【請求項８】
IgA と結合可能な物質が抗ヒト IgA モノクローナル抗体である請求項７の測定方法。
【請求項９】
検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、
i）検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼをヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼを、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性を求め、
ii）上記 i）とは独立に、請求項６から８のいずれかの方法により検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベルを求め、
iii）上記 i）で得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性値と上記 ii）で得られる IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベル値との乗法値を求め、その乗法値から検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の量を求める、
ことを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法。
【請求項１０】
検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定するためのキットであって、
i）固相支持体、
ii）IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、
iii）IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する、標識された免疫グロブリンＡ部位認識物質、および
iv）標識を検出するための成分、
を含むキット。
【請求項１１】
アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質がヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質である請求項１０のキット。
【請求項１２】
ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質が抗ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体である請求項１１のキット。
【請求項１３】
免疫グロブリンＡ部位認識物質が IgA と結合可能な物質である請求項１０から１２のいずれかのキット。
【請求項１４】
IgA と結合可能な物質が抗ヒト IgA モノクローナル抗体である請求項１３のキット。
【請求項１５】
虚血性腸疾患診断用である、請求項１０〜１４のいずれかのキット。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかの方法により、虚血性腸疾患が疑われるヒトからの試料中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベルを求め、虚血性腸疾患を診断する方法。
【請求項１７】
アルカリ性ホスファターゼ部位と免疫グロブリンＡ部位とを構成成分として有する IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６からなる虚血性腸疾患マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６（以下、ALP 6-IgA と記載することもある）の測定方法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、本発明は、電気泳動法によるアルカリ性ホスファターゼ６の判定のような煩雑な操作や視覚的判断を必要とせず、正確な定量値として ALP 6-IgA の値を測定できる方法およびそれに用いるキットに関する。本発明の測定方法およびキットは、従来有用なマーカーがなかった、潰瘍性大腸炎などの潰瘍性腸疾患の臨床検査医学の分野で極めて有効である。
【背景技術】
【０００２】
アルカリ性ホスファターゼ（Alkaline Phosphatase:ALP)(EC.3.1.3.1）はリン酸モノエステルを加水分解する酵素のうちでアルカリ側に至適 pH をもち、活性中心に亜鉛イオンを有する酵素の総称である。また生体中での機能は物質やエネルギー輸送、無機リン酸の供給、骨の石灰化に関与するものと考えられている。血清中においては主に肝型、骨型、小腸型、胎盤型や腫瘍型（Nagao 型、Reagan型、Kasahara 型、胎児小腸型など）など臓器特異性を示すアイソザイムが存在し、これまでも肝胆道系疾患、骨疾患、腫瘍などの診断に広く用いられてきた。
しかし、血清中総 ALP 活性が広く用いられて有効である一方で、測定結果単独では疾患の特定に結びつきづらい。それには先の血清中アイソザイムの問題がある。ALP の電気泳動をおこなうと 6、7 本のバンドが分離されるが、抗血清を用いて蛋白質としての抗原性から ALP を考察すると、臓器特異型（Tissue Specific ALP:TSALP) と臓器非特異型 (Tissue-Non Specific ALP:TNSALP) の 2 種類に大きく分類される。臓器特異型 (Tissue Specific ALP:TSALP) と呼ばれている胎盤型 (ALP 4)、小腸型 (ALP 5)、生殖細胞型の 3 種については、2q34-37に存在する遺伝子によって産生されていることがわかっている。次に臓器非特異型 (Tissue-Non Specific ALP:TNSALP) は肝、骨、腎、白血球に見られるタイプで同一のアミノ酸配列を有し、遺伝子 1p34-36.1 から発現することが知られている。その中でも肝型と骨型では同一遺伝子から転写調節の違いで二種類の mRNA が作られるが、酵素の成熟にしたがってまた全く同一の配列を持つようになることが知られている（非特許文献１）。しかし、酵素に結合する糖鎖の違いからN 型糖鎖を 3 本持つ肝型（ALP 2）と N 型糖鎖 2 本と O 型糖鎖 1 本をもつ骨型（ALP 3）が電気泳動上で分けられると考えられる。さらに膜成分、GPI アンカーとの結合から ALP 1、そして免疫グロブリンの結合から ALP 6 が分離確認される。そしてこの全てのアイソザイム活性の総和が血清中 ALP 値として反映されるため、ALP 高値が疾患と一対一対応しにくい現状である。
【０００３】
これらアイソザイムの総和としての ALP 測定では、使用される試薬の基質や緩衝液の種類、pH などにおいて活性が異なるため、近年標準化が盛んに行われるようになり、現在では国際臨床化学連合（IFCC）や日本臨床化学会（JSCC）から勧告法が提示されて総 ALP 測定値の標準化が進んでいる。しかしながら依然としてアイソザイム自体の標準検出法は未だに無い状況にある（非特許文献２）。
アイソザイムの測定法としては、これまでに L-フェニルアラニンによる肝型、骨型（ALP 2、3）の測定、L-ホモアルギニンによる胎盤型、小腸型（ALP 4、5）の測定など阻害アミノ酸を利用してアイソザイムを測定する方法や（非特許文献３)、加熱によって胎盤型 (ALP 4) 活性だけを残し、ALP 4 を特異的に測定する方法 (非特許文献４、非特許文献５)、先に述べた肝型、骨型 ALP 糖鎖の差を利用してレクチンを利用し、肝型 (ALP 2) や骨型 (ALP 3)を測定する方法 (非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９)、骨型 ALP (ALP 3) に対する特異的モノクローナル抗体を使用する方法（非特許文献１０）などが開発されていくつかのアイソザイムは測定が可能となっている。しかし、イムノグロブリン結合型である ALP 6 は臨床的にも意義が唱えられながら依然その絶対値を知る方法がないために電気泳動法から存在の有無を知ることで臨床診断に使用されている状況にある。
【０００４】
はじめ、ALP 6 は ALP 結合型イムノグロブリン (非特許文献１１)として Nagamine らによって、厚生労働省指定難治性疾患である潰瘍性大腸炎において発見された (非特許文献１２)。その後加野らがこの ALP 6 が病態を反映して増減することを報告し（非特許文献１３)、さらに 1981 年に菅野らが全国アンケートを行って病態解析をまとめた（非特許文献１４)。その結果、多くの症例が自己抗体であることがわかった。イムノグロブリンの結合するアイソザイム種については Crofton らが ALP 6 のイムノグロブリン結合 ALP はそのほとんどが TNSALP であると報告している (非特許文献１５)。イムノグロブリンについても最近 Owen らはマクロ ALP に IgG のκ鎖が結合しているという報告をしている (非特許文献１６)。今日では一般に健常人では上記高分子複合体である ALP 6 発現は低頻度であるが、他方総 ALP 活性が 1,000 単位以上にもなるような高活性の ALP を含む血清には高頻度に ALP 6 が検出されるようになること、また慢性関節リウマチや腫瘍などでも ALP 6 が高値となることがあることが知られている。このような状況において臨床的意義をより確立するために ALP 6 の精密測定が行われることが強く望まれていた。
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Com 168,993-1000:1990
【非特許文献２】臨床検査 37(9), 1041-1044:1993
【非特許文献３】Histochem J. 13,941-951:1981
【非特許文献４】Prenat Diagn. 16,1051-1054:1996
【非特許文献５】Enzyme Protein. 49,313-203:1996
【非特許文献６】J Clin Pathol. 1992  45,68-71:1992
【非特許文献７】Clin Chem. 40,1749-1756:1994
【非特許文献８】Clin Chem. 42,1970-1974:1996
【非特許文献９】Calcif Tissue Int. 71:508-518:2002
【非特許文献１０】Clin Chem 44,2139-2147:1998
【非特許文献１１】Clin Chim Acta 65,39-46:1975
【非特許文献１２】日消誌 73,162-168:1976
【非特許文献１３】生物物理化学20,325:1977
【非特許文献１４】酵素結合性免疫グロブリンの我が国での発症頻度ならびに分布                        に関する研究報告:1981
【非特許文献１５】Clin Chim Acta 112,33-42:1981
【非特許文献１６】Ann Clin Biochem 39,523-5:2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床的意義をより確立するために ALP 6 の精密測定が行われることが強く望まれていた状況の中、本発明者らは、検体として健常者血清と高 ALP 血清を用い、かつ、抗体として抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgG モノクローナル抗体を用いて、ALP 6 の量を精密測定し、その結果が電気泳動法による ALP 6 の判定結果とよく一致することを見出した。これに関しては、特願２００３−１３１９４１号として既に特許出願した。今回、検体として電気泳動による ALP 6 陽性検体を用い、抗体として、抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgG モノクローナル抗体との組み合わせ、あるいは抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgA モノクローナル抗体との組み合わせを使用して、ALP 6 の量を精密測定したところ、意外にも、抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgA モノクローナル抗体との組み合わせを使用した場合には、感度良く測定でき、しかも、虚血性腸疾患患者の検体においては、抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgA モノクローナル抗体との組み合わせにより測定して得られる測定値が、抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgG モノクローナル抗体との組み合わせを使用して得られる測定値に比べて、虚血性腸疾患診断上、有用であることを見出した。従って、抗ヒト臓器非特異型アルカリホスファターゼモノクローナル抗体と抗ヒト IgA モノクローナル抗体との組み合わせにより、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することが、虚血性腸疾患診断に有効であり、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６が、有効な虚血性腸疾患マーカーとなり得ることを見出した。本発明は、かかる知見により完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）本発明は、検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼＡ部位認識物質と IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルから IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法である。
（２）より具体的には、本発明は、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６とヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する免疫グロブリンＡ部位認識物質とを反応させ、得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６と免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルから IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定することを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法である。
【０００７】
（３）更に本発明は、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法であって、
i）検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼをヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼを、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性を求め、
ii）上記 i）とは独立に、上記（１）または（２）の測定方法により検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベルを求め、
iii）上記 i）で得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性値と上記 ii）で得られる IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベル値との乗法値を求め、その乗法値から検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の量を求める、
ことを特徴とする、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法である。
（４）更に本発明は、検体中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６を測定するためのキットであって、
i）固相支持体、
ii）IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼの構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、
iii）IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する、標識された免疫グロブリンＡ部位認識物質、および
iv）標識を検出するための成分、
を含むキットである。
（５）更に、本発明は、上記（１）〜（３）のいずれかの方法により、虚血性腸疾患が疑われるヒトからの試料中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６のレベルを求め、虚血性腸疾患を診断する方法である。
（６）更に、本発明は、アルカリ性ホスファターゼ部位と免疫グロブリンＡ部位とを構成成分として有する IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６からなる虚血性腸疾患マーカーである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の測定方法により、これまで使用されてきた電気泳動法による ALP 6 測定よりも、更に精密にしかも感度よく、ALP 6 中の IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６（ALP 6-IgA）を測定することができる。例えば、ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）以外のアイソザイムと殆ど反応しない第一のモノクローナル抗体として、抗 TNSALP モノクローナル抗体を用い、第二のモノクローナル抗体として、ALP 6-IgA の構成成分である免疫グロブリンＡ部位と反応する標識抗ヒト IgA モノクローナル抗体を利用することにより、またはこれら２種の抗体を組み合わせて利用することで、免疫グロブリン非結合血中アイソザイム（肝型、骨型、小腸型、胎盤型、他腫瘍型）の影響を殆ど受けず、ALP 6-IgA のみを特異的に測定することができる。本発明による ALP 6-IgA の測定は虚血性腸疾患のような臨床診断薬として利用可能であり、また自己抗体のメカニズムなど基礎医学の発展にも貢献し利用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、検体とは、ALP 6-IgA を含む可能性のある液体または混合物であれば特に限定しないが、通常、血液、血清、血漿、尿等の生体内試料が好適である。
本明細書において、アルカリ性ホスファターゼ６とは、現在、臨床検査で用いられれているキャピラリ等電点電気泳動法などの Disk 電気泳動法においてアルカリ性ホスファターゼ６として認定されているバンドに由来する蛋白質であって、かつ、アルカリ性ホスファターゼと免疫グロブリンとが結合している蛋白質をいう。アルカリ性ホスファターゼ６は、ALP 6 と記載されることもあり、IgG結合性アルカリ性ホスファターゼ６、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６等が含まれる。
本明細書において、IgA 結合性アルカリ性ホスファターゼ６とは、アルカリ性ホスファターゼ６のうち、アルカリ性ホスファターゼと免疫グルブリンＡとが結合している蛋白質をいうものとし、ALP 6-IgA と略することもある。
本明細書において、IgG 結合性アルカリ性ホスファターゼ６とは、アルカリ性ホスファターゼ６のうち、アルカリ性ホスファターゼと免疫グルブリンＧとが結合している蛋白質をいうものとし、ALP 6-IgG と略することもある。
本発明の ALP 6-IgA の測定方法においては、ALP 6-IgA の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、ALP 6-IgA の構成成分である免疫グロブリンＡ部位を認識する免疫グロブリンＡ部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と ALP 6-IgA と免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルから ALP 6-IgA を測定定量する。
【００１０】
本発明において、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とは、ALP 6-IgA 中のアルカリ性ホスファターゼ部位と結合可能な物質をいう。具体的には、肝臓由来 ALP 、骨由来 ALP 等のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）に結合可能な物質を例示できる。ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）は、通常、遺伝子 1P34-36.1 から発現する蛋白質を指すが、一般的には、肝型 ALP（ALP 2）、骨型 ALP（ALP 3）、腎臓型 ALP、白血球型 ALP を例示できる。TNSALP に結合可能な物質としては、TNSALP に対する抗体が好ましく挙げられる。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。
ALP 6-IgA を正確に測定するためには、TNSALP に特異的なモノクローナル抗体を用いることが好ましい。具体的には、後述する参考例１に示すように、同じ酵素活性量の小腸型、胎盤型、肝臓型および骨型 ALP と反応させた時に、小腸型 ALP と反応する ALP 酵素活性値と胎盤型 ALP と反応する ALP 酵素活性値との和が、肝臓型 ALP と反応する ALP 酵素活性値と骨型 ALP と反応する ALP 酵素活性値との和の 1/10 以下である抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体が好ましい。特に、骨型 ALP と反応する ALP 酵素活性値が、肝臓型 ALP と反応する ALP 酵素活性値の 0.7 以下である抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体が更に好ましい。本発明に使用可能な抗ヒト TNSALP 抗体としては、本発明者が確立し製造法を後述する製造例１で示すモノクローナル抗体 3-29-3R、2C5-32 および 1A5-7 を例示でき、モノクローナル抗体 3-29-3R および 2C5-32 が好ましい。また、HLMS―1、HLMS―2、HLMS―3、HLMS―4（以上、特開平２−３５０９８号公報 ）等のモノクローナル抗体も好ましく、それらと類似している既知の抗 TNSALP モノクローナル抗体も使用可能である。
【００１１】
本発明において、免疫グロブリンＡ部位認識物質とは、ALP 6-IgA 中の免疫グロブリンＡ部位と結合可能な物質をいう。好ましくは IgA に結合可能な物質、具体的には、 IgA に対する抗体である。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、特に抗ヒト IgA モノクローナル抗体が好ましい。
【００１２】
以上に記載した、例えば TNSALP あるいは IgA に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、それ自体周知の方法により調製することができる。IgA に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、市販品を利用することもできる。以下に、TNSALP に対するモノクローナル抗体を例にとってその調製について詳細に説明する。
本発明に使用可能な抗 TNSALP モノクローナル抗体は、例えば、ヒト血液由来精製 ALP 6 を免疫原として使用することにより得ることができる。また、ALP 6 は、その構造から ALP 部位と免疫グロブリン部位にわけられることから、ALP と免疫グロブリンとをそれぞれを抗原として用いることもできる。ALP 抗原として培養骨芽細胞株による抗原により免疫を行なうことができるが、これに限らず、正常骨芽細胞などの ALP も抗原として用いることができる。遺伝子工学的に作製された完全長の組換え体、変異体、部分抗原を用いることも常套手段であり、これは抗免疫グロブリン抗体作製についても全く同様であって利用されうるものである。
モノクローナル抗体は精製ヒト ALP 6 単独に、または、ALP と免疫グロブリンとを別に、免疫原として動物を免疫し、その抗ヒト ALP 6 抗体産生細胞、または抗 ALP 抗体産生細胞もしくは抗免疫グロブリン抗体産生細胞と、骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【００１３】
ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述したような例えば ALP をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いてともに混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に 1〜3 週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は 1μg〜100 mg の間とされているが、一般的には 50μg 程度が好ましい。免疫回数は 2〜7 回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞を融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットより得ることができる。
【００１４】
融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコール（PEG）を用いることで融合できる。またセンダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。融合した細胞からヒト ALP を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によって HAT 培地及び HT 培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。96 穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒト ALP に対する抗体が含まれている場合には、ヒト ALP をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウス免疫グロブリン-HRP 標識抗体等、二次標識抗体を反応させる ELISA 法により、ヒト ALP に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質には HRP の他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤である BSA のみを結合したアッセイプレートによる ELISA を同時に行うことでヒト ALP 特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒト ALP プレートで陽性であり、BSA による ELISA で陰性のクローンを選択する。また、同時に抗マウス免疫グロブリン抗体をマイクロタイタープレートにまき、ここに融合細胞培養上清を加えて反応させ、更に精製 ALP を加えて活性酵素を結合させて免疫複合体を作製し、この結合酵素活性をフェニルリン酸のような発色基質を利用して測定することもできる。
【００１５】
本発明で使用可能な抗体を産生するハイブリドーマとしては、ヒト ALP を特異的に認識するモノクローナル抗体のうち、特に活性型ヒト TNSALP と反応し、かつヒト胎盤型 ALP、ヒト小腸型 ALP と殆ど交差反応しないモノクローナル抗体が産生するものが好ましい。例えば本発明者が樹立したハイブリドーマ 3-29-3R および 2C5-32 が挙げられる。ハイブリドーマ 3-29-3R および 2C5-32 は、平成15年4月16日に工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ、受託番号 FERM BP-8360 および FERM BP-8359 として寄託されている。
【００１６】
ハイブリドーマは、通常細胞培養に用いられる培地、例えばα-MEM、RPMI1640、ASF、S-clone などで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、常法を用いることができる。例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１７】
以上に説明したような抗 TNSALP モノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、抗 IgA モノクローナル抗体等の免疫グロブリンＡ部位認識物質とを、検体中の ALP 6-IgA と反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と ALP 6-IgA と免疫グロブリンＡ部位認識物質との結合物のレベルを求めることにより、検体中の ALP 6-IgA を測定することができる。より具体的には、例えば ELISA 法により、検体中の ALP 6-IgA と抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と抗 IgA モノクローナル抗体とを反応させ、得られる抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体と ALP 6-IgA と抗 IgA モノクローナル抗体との結合物のレベルから検体中の ALP 6-IgA を測定することができる。
ELISA 法により、抗原抗体反応した結合物のレベルを求めるためには、抗 IgAモノクローナル抗体などの免疫グロブリンＡ部位認識物質としては、標識された免疫グロブリンＡ部位認識物質を用いることが好ましい。標識法としては、通常、免疫測定法で標識に使用できるものであれば、とくに限定しないが、ペルオキシダーゼ等の酵素、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１８】
本発明の測定方法として、サンドイッチアッセイ ELISA 法により実施する具体例は、以下の通りである。まず一次抗体として、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質である抗 TNSALP モノクローナル抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、血清などの検体中の ALP 6-IgA のアルカリ性ホスファターゼ部位と反応させ、固相支持体を洗浄する。次いで、吸着した ALP 6-IgA の免疫グロブリン部位と、二次抗体として、免疫グロブリンＡ部位認識物質である、例えばビオチン化した抗 IgA モノクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ALP 6-IgA を検出することができる。また、二次抗体として、直接、HRP 等のペルオキシダーゼにより酵素標識した抗 IgA モノクローナル抗体を用いることにより、ALPと二次抗体と反応させた後、標識酵素に対する基質、例えば、OPD（ｏ-フエニレンジアミン）、DAB（ジアミノベンジジン）、TMB（テトラメチルベンジジン）等と更に反応させて発色させることにより、ALP 6-IgA を検出することもできる。また、二次標識抗体に結合させる標識物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１９】
本発明の測定方法では、上記した測定方法により検体中の ALP 6-IgA のレベルを求め、他方それとは独立に、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）活性を求め、検体中の ALP 6-IgA のレベル値と検体中のヒト TNSALP 活性値との乗法値を求め、その乗法値から検体中の ALP 6-IgA の量を求めることもできる。この乗法値を利用する方法の場合には、上記した測定方法により検体中の ALP 6-IgA のレベルを求める際に実施する、検体中の ALP 6-IgA と一次抗体であるヒト TNSALP に対する抗体との抗原抗体反応において、検体中に存在する ALP 6 以外の他の ALP との競争反応の影響を考慮することができ、従って上記の乗法値は、検体中の ALP 6-IgA の実際の存在量をより反映した値となる。
この乗法値を利用する測定方法において、検体中のヒト TNSALP 活性を求めるには、検体中のヒト TNSALP をヒト TNSALP に反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト TNSALP を、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト TNSALP 活性を求めることにより実施できる。アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質としては、通常用いられる基質を用いることができる。例えば、フェニルリン酸などの発色基質を、抗原抗体反応したヒト TNSALP と酵素反応させて発色させ、吸光度を測定すことにより、検体中のヒト TNSALP を求めることができる。
【００２０】
本発明において、上記したように、例えば ELISA 法により検体中の ALP 6-IgA の測定を行うときは、ELISA 用のキットを用いて実施することができる。ELISA 法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ALP 6-IgA を測定するためのキットであって、i) 固相支持体、ii) TNSALP に対するモノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、iii) 抗 IgA モノクローナル抗体等の標識された免疫グロブリンＡ部位認識物質及び iv)標識を検出するための成分を含むキットを用いることによって、効率良く ALP 6-IgA を測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素水を含む試薬であり、標識がペルオキシダーゼの場合、OPD （ｏ−フエニレンジアミン）、DAB（ジアミノベンジジン）、TMB（テトラメチルベンジジン）等のペルオキシダーゼ基質を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄剤液含んでもよい。本発明において、このキットを使用するときは、検体中の ALP 6-IgA を一次抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、EDTA・2Na 等のキレート剤、食塩等の無機塩、またはタンパクの非特異吸着を防ぐために BSA 等の動物性タンパク質を加えてもよい。
【００２１】
以上に詳細に説明した ALP 6-IgA の測定方法およびそれに用いるキットにより、虚血性腸疾患を診断することができる。具体的には、虚血性腸疾患が疑われるヒトから得られた、血液、血清、血漿、尿等の生体内試料中の ALP 6-IgA レベルを本発明の測定方法およびキットにより求め、そのレベルを正常人のそれと比較して、高い場合には、虚血性腸疾患と診断できる。
以上に説明したところから明らかなとおり、ALP 6 のうち、アルカリ性ホスファターゼと免疫グロブリンＡとを構成成分として有する、ALP 6-IgA は、虚血性腸疾患マーカーとして使用することができる。
【００２２】
以下、本発明を製造例、参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。
製造例１  
抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体の製造
（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
本発明者達は抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体作成のための抗原として、TNSALP を発現していることが知られているヒト骨芽細胞株 Saos-2 由来の ALP を精製した。以下に精製法を述べる。
Saos-2（HTB-85）は ATCC（American Type Culture Collection）より入手し、10% 牛胎児血清（FCS）を含むα-MEM（大日本製薬）にて培養した。80% 程度細胞がコンフルーエントになったら、50 mMトリス緩衝液（pH 7.5）にて 3 回デイッシュを洗浄し、0.5% アデカトール SO-135 を含む 50 mMトリス緩衝液（pH 7.5）を加えた。ラバーポリスマンを使用して上記細胞を回収し、氷上にて超音波ホモジナイザーにて 1 分間ホモジナイズした。その細胞破砕液を遠心分離（22,000 rpm 30 min RT）操作してその上清を40% 硫安分画した。遠心分離（10,000 rpm 30 min RT）を行って、その上清に硫安を追加溶解して 60% 硫安となるように調整し再分画を行った。この 40-60% 硫安分画沈殿を 50 mM トリス緩衝液（pH 7.5）に再溶解して 50 mM トリス緩衝液（pH 7.5）に対して透析した。透析済みサンプルを DEAE カラム（アマシャム  バイオサイエンス社）にアプライし、吸着したタンパク質は NaCl を含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（0-0.5 M NaCl）で溶出した。
ピークの ALP 活性は日立 7150 自動分析装置を使用して、N−アッセイ ALP-LS 試薬（日東紡）を用いて測定した。活性のあったフラクションは限外ろ過法によって濃縮し、S-300 カラム（アマシャム  バイオサイエンス）によって精製した。この活性フラクションを先の DEAE と同様に濃縮して SDS-PAGE により確認するとほぼ TNSALP がメジャーになっており、これを免疫用抗原として使用した。
【００２３】
（２）免疫
精製 TNSALP を 1 mg/ml となるように 50 mM トリス酸緩衝液（pH 7.5）で希釈し、50μg（50μl）をとってフロインド完全アジュバンド（WAKO）50μl と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液を Balb/c 6週齢  雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。2 週間後には同量の TNSALP （50μg/ml）をフロインド不完全アジュバンド（和光純薬）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降 2 週間後に同様の操作を行い、4 回目には最終免疫として TNSALP 50μg/ml を 50 mM トリス酸緩衝液（pH 7.5）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
【００２４】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より 3 日後に TNSALP により感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Nature. 256, 495. 1975）に従って行われ、ポリエチレングリコール（PEG 4000）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞 P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) を融合した。その融合比率は脾臓細胞数 10×107 個に対して骨髄腫細胞 P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) 2×107 個で、 5:1 であった。 融合細胞は 10% FCS（インビトロジェン）α-MEM（アーバイン）HAT（コスモバイオ）培地に分散し 96 穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して 37 ℃、5% CO2 条件にて培養した。
【００２５】
（４）スクリーニング
約 2 週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製した TNSALP を 50 mM トリス酸緩衝液中に溶解し、0.5 μg/100μl/well となるように 96 穴ウエル（ヌンク社）に分注した。プレートを 4℃ で 2 晩静置した後に 0.05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1.5% BSA 溶液を 200μl 分注して、更に 4℃ で 1 晩静置した。完成したプレートを 0.05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄した後に培養上清 100μl を反応させ、更に洗浄を行った後に二次抗体である HRP 標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ザイメッド社) を加えて反応させた。洗浄後に HRP の発色基質である 3 mg/ml o-フェニレンジアミン (OPD) (ナカライテスク社)クエン酸発色溶液を 100μl 加えて一定時間の発色後、1 N 硫酸を停止液として更に 100μl 添加し、測定波長 492 nm にて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。
【００２６】
（５）抗体の確認
ELISA によって精製 TNSALP との反応性を確認し、発明者達はクローン 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 の 3 種類が TNSALP を認識したものとして選択した。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（アマシャム  バイオサイエンス社）にて検定した結果を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】
2006132946.tif 000002
【００２８】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（５）で得られたハイブリドーマ 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 細胞 1×107細胞個をプリスタン（アルドリッチ社）0.5 ml 投与後 2 週間の Balb/c マウス（日本クレアー社）、10 週齢、雌性に腹腔内投与し、約 2 週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行った ELISA 法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安 40% で処理し、PBS に透析した後、3-29-3R、1A5-7 はプロテイン G カラム（アマシャム  バイオサイエンス社）により精製して SDS-PAGE により確認した。2C5-32 は S-300 を用いて精製した。その結果 3-29-3R、1A5-7 は非還元では分子量約 150,000 に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 50,000 のバンドと 25,000 の 2 本のバンドが確認された。2C5-32 は非還元では分子量約 900,000 に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 70,000 のバンドと 25,000 の ２ 本のバンドが確認された。精製されたモノクローナル抗体 3-29-3R、1A5-7、2C5-32 ともにマウス１匹あたりそれぞれ約 10mg 以上であって工業的利用を行うには十分量であった。
【００２９】
参考例１
抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体の特異性検定
モノクローナル抗体 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 の特異性を調べるためにさまざまなアイソザイム、すなわち、Saos-2 由来 TNSALP、肝型 ALP (常光)、骨型 ALP (常光)、小腸型 ALP (常光)、胎盤型 ALP（シグマ社）を用いて下記の実験を行った。測定方法は以下のとおりである。
固層プレート（ヌンク社）上に精製したモノクローナル抗体を 2μg/100μL PBS/well になるように分注し、4℃で 2 日間静置した。0.05% Tween 20 を含む 20mM トリス緩衝液（pH 7.0）洗浄液にて 3 回洗浄した後、1.5% BSA トリス緩衝液（pH 7.0）を 200μl 加えて 4℃で一晩ブロッキングした。このようにして作製したプレートを先の洗浄液で 1 回洗浄して、各種アイソザイムを反応させた。アイソザイムの酵素活性は Kind-King 変法（ホルマザン法，日東紡 N−テスト ALP K-K キット使用）試薬を用いて測定し、全て 25IU/L にあわせてその 100μl を抗体結合プレート上に加えた。室温で 2 時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて 3 回洗浄して Kind-King 変法（ホルマザン法）に従い酵素活性を測定した。すなわち、抗体プレートに結合した ALP に、100μl の基質溶液（フェニルリン酸二ナトリウムと 4−アミノアンチピリン溶液とを含む溶液）を加えて、37℃、1 時間反応させて、抗体が捕らえた ALP 酵素と合成基質とで酵素反応させ、ついで、得られる混合物に発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液）を加えて発色させ、492nm で吸光度を測定した。このときのデータを表２に示す。なお、このとき、ALP を入れないで同様に操作して得られるブランク値を求め、各測定値からブランク値を差し引いた値が抗体に対する各 ALP の活性値となる。
【００３０】
【表２】
2006132946.tif 000003
【００３１】
表２から分かるように、抗体 3-29-3R、2C5-32 は Saos-2 由来 TNSALP、肝型、骨型としか反応せず、他アイソザイムとの交差反応性を殆ど示さないことからヒト TNSALP に特異性の高いモノクローナル抗体であることがわかった。すなわち、抗体 3-29-3R、2C5-32 は、TNSALP に特異的、例えば、小腸型 ALP 活性値と胎盤型 ALP 活性値との和が、肝臓型 ALP 活性値と骨型 ALP 活性値との和の 1/10 以下であることが判明した。
また、1A5-7 は Saos-2 由来 TNSALP をはじめ全てのアイソザイムとよく反応した。つまり 1A5-7 はあらゆる ALP アイソザイムと反応することがわかった。
尚、2 つのモノクローナル抗体の 25 IU/L における肝型、骨型反応比率（肝：骨  反応比率）はそれぞれ 3-29-3R が 1：0.50 であり、2C5-32 が 1：0.93 であった。ところで、高 ALP 検体の電気泳動結果で一般的に骨型よりも肝型が強くなった場合に ALP 6 が現れやすい。そのため、抗体 3-29-3R では、骨型 ALP 活性が肝型 ALP 活性の 0.7 以下なので、本発明に用いると、より有効である。
【００３２】
参考例２
免疫酵素活性測定法による血清中の TNSALP 値の測定
上記方法によって作製、精製されたモノクローナル抗体 3-29-3R 、1A5-7 を参考例１と全く同様の方法で Nunc 社製プレートに 2μg/100μL PBSで分注、ブロッキングして抗体結合プレートを作製した。使用前にそのプレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 200 μL で 1 回洗浄し、ここにインフォームド・コンセントを行ったボランティア及び患者検体 10 μL と 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 90μL を加えて室温、1 時間反応させた。反応終了後、そのプレートを 0.05% Tween 20 を含む 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 200 μL で 3 回洗浄した。次いで、そのプレートに 100 μl の N テスト ALP Kind-King 試薬 (日東紡) の基質溶液、すなわち、フェニルリン酸二ナトリウムと4-アミノアンチピリンを含む溶液を加えて更に 37℃、pH 10 で 1 時間、酵素反応させた。さらに、その反応液に、発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液) 100 μL を添加してその発色値を 492 nm にて比色することにより TNSALP 値を求めた。測定範囲を超える高値検体については希釈して再測定をした。
表３に、モノクローナル抗体 3-29-3R、1A5-7 を用いて得られる TNSALP 値の結果を示す。これらの結果を、Total ALP 活性値 (JSCC 準拠値) と比較した。
【００３３】
【表３】
2006132946.tif 000004
【００３４】
モノクローナル抗体 3-29-3R を用いて得られる TNSALP 値と Total ALP 活性値とは、検体 15 のデータにおいて強く乖離している。一方、モノクローナル抗体 1A5-7 を用いて得られる TNSALP 値と、Total ALP 活性値（JSCC 準拠値）とは、検体 15 のデータも含め、両値に相関関係が強くみられる。つまり、抗体 3-29-3R を用いて得られる TNSALP 活性値は、胎盤型 ALP や小腸型 ALP の活性値は含まれない点で Total ALP 活性値とは異なり、妊娠、腫瘍からくる胎盤型（ALP）の上昇や血液型 O、B 型の食後における小腸型分泌（ALP）による ALP 上昇などの原因で ALP 値が上昇するのを排除できている。したがって、一次抗体として抗体 3-29-3R を用いることは、ALP 6-IgA を ELISA 法で測定する際にさらに有利と考えられる。
【００３５】
実施例１
ELISA 法による ALP 6-IgA 値とALP 6-IgG 値、及び Disk 電気泳動による ALP6 測定の感度等の比較
Disk 電気泳動で ALP 6 が 陽性だったヒト血清 2検体 80-21, 81-23 を用い、ELISA 法による ALP 6-IgA 値と ALP 6-IgG 値を求めた。次いで、それらの測定法と Disk 電気泳動による ALP 6 測定法の感度等を比較した。以下に詳述する。
ELISA 法は、一次抗体として 3-29-3R プレートを用い、免疫グロブリン結合物質である二次抗体として、1/200 希釈 HRP 標識抗ヒト IgA モノクローナル抗体及び IgG モノクローナル抗体（ザイメッド社）を用いた。まず、抗体 3-29-3R プレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mMトリス緩衝液（pH 7.5）200μL で 1 回洗浄した。次いで、これらのプレートに、ALP 6 陽性検体を１倍、10倍、20倍、40倍、80倍、希釈し、各検体 50 μL と100 mM トリス緩衝液（pH 7.5）50μL を加えて室温、1 時間反応させた。一次抗体反応終了後、そのプレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mMトリス緩衝液（pH 7.5）200μL で 3 回洗浄し、100μl の二次標識抗体  HRP 標識抗ヒト IgA モノクローナル抗体又は IgG モノクローナル抗体（ザイメッド社）を加えて更に 室温、1 時間反応させた。1 時間後に洗浄を行い、標識 HRP に対する基質溶液（OPD 溶液）を反応させ、一定時間後に発色停止試薬 1 N 硫酸 100μL を添加してその発色値を 492 nm にて比色し ELISA 法による ALP 6-IgA 値及び ALP 6-IgG 値を求めた。
一方、Disk 電気泳動は ALP アイソザイム検出キット「アルフォー」(常光)を用いた。検体として ELISA 法で使用したものと同一の ALP ６ 陽性患者検体を１倍、10倍、20倍、40倍、80倍、希釈し、各 25μL 使用した。操作方法は ALPアイソザイム検出キット「アルフォー」(常光)の能書に従って実施した。
【００３６】
電気泳動の結果を図１に、ELISA の結果を図２に示す。結果として、電気泳動ではサンプルとして検体原液を用いたもののみ ALP 6 が確認されたが、ELISA 法では検体が 40〜80倍希釈されたところまで数値が確認された。電気泳動と比較すると ELISA 法では、ALP 6-IgA が 40〜80倍の感度で検出されることが判明し、良好な希釈直線性が認められた。一方、 ALP 6-IgG はこれにおよばなかった。このことから、ELISA 法ではこれまで電気泳動法では検出できなかった微量の ALP 6-IgA の検出と定量ができることが判明した。
【００３７】
実施例２
乗法値法による ALP 6-IgA 測定による虚血性腸疾患の診断
一次抗体として抗体 3-29-3R を用い、二次抗体としてHRP 標識抗 IgA モノクローナル抗体及び IgG モノクローナル抗体を用いて、ELISA 法により検体中の ALP 6-IgA 値及び ALP 6-IgG 値、また、乗法値による検体中の ALP 6-IgA 値及び ALP 6-IgG 値を測定して、虚血性腸疾患の診断に適用できるかどうかを検討した。検体としては、インフォームド・コンセントを行った健常人ボランティア検体 69 検体及び虚血性腸疾患患者血清 98 検体を用いた。ELISA 法による ALP 6-IgA 値及び ALP 6-IgG 値は、実施例１と同様な方法により求めた。また、TNSALP 値をモノクローナル抗体 3-29-3R を用いて参考例２の記載の方法により測定した。乗法値による ALP 6-IgA 値又は ALP 6-IgG 値は、「ELISA 法による ALP 6-IgA 値又はALP 6-IgG 値」と「TNSALP 値」との乗法値を計算して求めた。
ELISA 法による ALP 6-IgA 値及び ALP 6-IgG 値の平均値の結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
2006132946.tif 000005
【００３９】
【表５】
2006132946.tif 000006
【００４０】
このALP 6-IgA 値で、健常人と虚血性腸疾患患者検体で平均値の差の検定を行ったところ、 t 検定における p 値  0.0006 で 2 つのグループには有意差がみとめられた。この結果により、2次抗体に HRP 標識抗ヒト IgA モノクローナル抗体を用いると虚血性腸疾患をより特異的に診断できることが判明した（陽性率 51%）。一方、ALP 6−IｇG 値では、正常者と患者で、平均値が、ほとんど違いはなかった。
以上の結果から本発明の反応系例（一次抗体：ヒト TNSALP 認識モノクローナル抗体、二次標識抗体：HRP 標識抗ヒト IgA モノクローナル抗体）を用いて ALP 6-IgA を精密測定することが可能となり、しかも、それにより虚血性腸疾患診断の指標となりうることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の測定方法においては、従来測定できなかったALP 6-IgA を簡単に測定することができる。さらに、従来、血液検体を用いた有用な虚血性腸疾患診断マーカーはなかったが、本発明では、血液中の ALP 6-IgA を測定するにより、虚血性腸患が診断可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Disk 電気泳動の結果を示す。矢印に示すように、検体原液を用いたときのみ、ALP 6 のバンドが確認できる。
【図２】検体中の ALP 6-IgA 及び ALP 6-IgG の希釈直線性を示す。縦軸に吸光度、横軸には、原液を 1.0 としたときの希釈濃度を示す。ALP 6-IgAの測定では、80 倍希釈の検体でも数値として検出可能である。
【図１】
2006132946.tif 000007
【図２】
2006132946.tif 000008