(57)【要約】【課題】迅速で簡便にビブリオ属細菌の総菌数を測定する方法を提供することを提供すること。【解決手段】段階希釈した菌濃度のビブリオ属細菌に対して、TaqMan法によるリアルタイムＰＣＲを行うことによって検量線を作成する一方、菌数の測定対象である検体抽出物を用いて、TaqMan法によるリアルタイムＰＣＲを同様に行い、検体抽出物中のビブリオ属細菌種の菌濃度を算出し、その菌濃度から検体中に存在するビブリオ属細菌種の総菌数を算出する。なお、リアルタイムＰＣＲを行う際、ToxR遺伝子の中で対象としているビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていないＤＮＡ領域に対し、そのビブリオ属細菌種内で複数の異なる株の塩基配列を決定することにより、遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、その多型を含まないように、リアルタイムＰＣＲのためのプライマー及びプローブの位置を決定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に存在する特定のビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を測定する方法であって、
所定の菌濃度の該ビブリオ属細菌種の細菌を粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域を利用して行うリアルタイムＰＣＲを、複数の希釈段階を設けた菌濃度の前記細菌に対して行うことにより、前記菌濃度と、前記リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める工程と、
前記検体を前記粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、前記リアルタイムＰＣＲと同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記結果を得る工程と、
前記相関関係より、前記検体抽出物に対する前記結果から、前記検体抽出物中の該ビブリオ属細菌種の細菌の菌濃度を算出し、その菌濃度から前記検体中に存在する該ビブリオ属細菌種の総菌数を算出する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ct （threshold cycle）値であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リアルタイムＰＣＲを行う際、ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域に対し、前記ビブリオ属細菌種内で異なる遺伝子プールにある複数の細菌株の塩基配列を決定することにより、該遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、該多型を含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプライマーの位置を決定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リアルタイムＰＣＲをTaqMan法によって行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法
【請求項５】
ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域に対し、前記ビブリオ属細菌種内で異なる遺伝子プールにある複数の細菌株の塩基配列を決定することにより、該遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、
該多型を含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプライマー及びプローブの位置を決定することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ビブリオ属細菌種が腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus または ビブリオ・バルニフィカス Vibrio vulnificusであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が水産物または海水であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水や水産物などの検体において、ビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ( Vibrio parahaemolyticus ) 、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)などのビブリオ属細菌は、食中毒や感染症の原因となることが世界中で知られている。これらの細菌は、特に高温の海水中で繁殖することから、夏季に海産物を通して食中毒を起こすことが多い。例えば、汚染した海産物を生で食べた人が最も感染しやすいが、繁殖した細菌を含んだ海水に傷口をつけた人や、加熱不足の海産物、弁当、汚染物と同時に処理した生野菜などを食べた人にも感染することがある。
【０００３】
現在、食品衛生法施行規則に基づき、鮮魚介類およびその一次加工品を含む水産食品には腸炎ビブリオの検査が義務づけられている。加熱加工品であるゆでだこ及びゆでがにについては腸炎ビブリオ陰性であること、生食用鮮魚介類などでは検体１ｇあたり腸炎ビブリオが100以下であることが決められており、検査方法はできるだけ感度の良いこと及び定量性があることが望まれる（例えば、非特許文献１）。また、ビブリオ属細菌の検査対象は生鮮食料品である場合が多いため、迅速な検査が望まれる。
【非特許文献１】「食品衛生研究」Vol. 51.No.7,p7-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、ビブリオ属細菌数定量方法には、ＭＰＮ（most probable number；最確数検査）法が用いられている。この方法では、検体の希釈系列を作製して各々を複数本培養し、各希釈検体において目的の菌が存在する試験管の本数により、統計学的にもとの検体に含まれていた菌数を算出する。そのため、結果がでるまで最低数日はかかり、途中の操作も煩雑である。
【０００５】
そこで、本発明は、迅速で簡便に特定のビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を測定する方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる、検体中に存在する特定のビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を測定する方法は、所定の菌濃度の該ビブリオ属細菌種の細菌を粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域を利用して行うリアルタイムＰＣＲを、複数の希釈段階を設けた菌濃度の前記細菌に対して行うことにより、前記菌濃度と、前記リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める工程と、前記検体を前記粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、前記リアルタイムＰＣＲと同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記結果を得る工程と、前記相関関係より、前記検体抽出物に対する前記結果から、前記検体抽出物中の該ビブリオ属細菌種の細菌の菌濃度を算出し、その菌濃度から前記検体中に存在する該ビブリオ属細菌種の総菌数を算出する工程と、を含む。この方法において、前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ct （threshold cycle）値であることが好ましい。
【０００７】
また、上記方法において、前記リアルタイムＰＣＲを行う際、ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域に対し、前記ビブリオ属細菌種内で異なる遺伝子プールにある複数の細菌株の塩基配列を決定することにより、該遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、該多型を含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプライマーの位置を決定することが好ましい。
【０００８】
さらに、上記方法において、前記リアルタイムＰＣＲをTaqMan法によって行ってもよい。その場合、ToxR遺伝子の中で該ビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域に対し、前記ビブリオ属細菌種内で異なる遺伝子プールにある複数の細菌株の塩基配列を決定することにより、該遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、該多型を含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプライマー及びプローブの位置を決定することが好ましい。
【０００９】
上記いずれの方法においても、前記ビブリオ属細菌種が腸炎ビブリオVibrio parahaemolyticus または ビブリオ・バルニフィカス Vibrio vulnificusであってもよい。また、前記検体が水産物または海水であってもよい。
【００１０】
ここで、ビブリオ属（Vibrio）細菌種とは、ビブリオ属に属する細菌の種（species）を意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、迅速で簡便に特定のビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を測定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
本発明は、検体中に存在するビブリオ属（Vibrio）細菌種の総菌数を迅速にかつ簡便に測定する方法である。ここで、対象となるビブリオ属（Vibrio）細菌種は、腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus、ビブリオ・バルニフィカス Vibrio vulnificus、コレラ菌Vibrio cholerae、ビブリオ・フルビアリスVibrio fluvialis、ビブリオ・アルギノリティカスVibrio algiolyticus、ビブリオ・ミミカスVibrio Mimicus、ビブリオ・ホリサエVibrio hollisaeなどである。
【００１５】
まず、検体を粉砕処理して検体抽出物を得る。検体としては、生の魚介類または加工した魚介類などの水産物、海水、淡水、などを用いることができる。粉砕処理は、すり鉢で擂る、ホモゲナイザーでホモゲナイズする、など、検体を細かく粉砕できればよく、液状になるまで粉砕するのが好ましい。粉砕する際、バッファーなどの溶液を加え、溶液中で検体を粉砕してもよい。
【００１６】
この検体抽出物を用い、ビブリオ属（Vibrio）細菌の有するToxR遺伝子を対象にリアルタイムＰＣＲを行い、検体抽出物に含まれるToxR遺伝子のＤＮＡ量を定量する。腸炎ビブリオ菌は、一部の株がヒトへの病原性を持つとされており、これまで、その遺伝子マーカーとしてＴＤＨが用いられてきた。しかし、環境中や生鮮魚介類における腸炎ビブリオ菌の分布・汚染状況をモニタリングするには、病原性を持たない株も含めた総菌数の定量が必要である。また、日本においては、水産食品の規格基準が腸炎ビブリオ菌の総菌数について設定されているため、総菌数の定量法は重大な意義を有する。ToxR遺伝子は、すべてのビブリオ属細菌が共通に持っているため、この目的には有効な検出対象の遺伝子となる。
【００１７】
このToxR遺伝子内で、検出対象のビブリオ属細菌種では種特異的に保存されているが、他のビブリオ属細菌種では保存されていない領域を利用して、リアルタイムＰＣＲを行うように、プライマーなどの設定をする。図１に、実施例１で用いた、腸炎ビブリオ菌における、そのような領域の一例を挙げる。ここには、腸炎ビブリオ菌の５つの独立した株の塩基配列が並べられており、他のビブリオ属細菌種には、これらの配列と相同性の高い配列は見いだせない。また、これらの株の間でも、ボックスで示したような多型が見出されるため、これらの株はそれぞれ独立した遺伝子プールにあると考えられる。そこで、この領域中で、多型を有する塩基を含まないように、リアルタイムＰＣＲに用いるプライマー配列を決定すれば、腸炎ビブリオ菌において、特に特異性高く、ＤＮＡを増幅させることができる。図２には、実施例２で用いた、ビブリオ・バルニフィカスにおける同様の領域を示す。この塩基配列は、ビブリオ・バルニフィカスの４つの独立した株で保存されており、他のビブリオ属細菌種には、これらの配列と相同性の高い配列は見いだせない。また、これらの株の間にも多型が存在する。そこで、この領域中で、多型を有する塩基を含まないように、リアルタイムＰＣＲに用いるプライマー配列を決定する。
【００１８】
リアルタイムＰＣＲの方法には、5′末端を蛍光物質（FAMなど）で、3′末端をクエンチャー物質（TAMRA など）で修飾したオリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）をＰＣＲ反応系に加えるTaqMan法、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：SYBR Green I）をＰＣＲ反応系に加えるインターカレーター法、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせを利用するサイクリングプローブ法などが開発されているが、ＰＣＲによる検出対象としてToxR遺伝子を用いる場合、リアルタイムＰＣＲとして、TaqMan法またはサイクリングプローブ法を行うのが特に好ましい。なぜなら、TaqMan法及びサイクリングプローブ法では、プライマーだけでなく、プローブも用いるので、検出対象としているＤＮＡに対する特異性が著しく上昇し、非特異的に出現するシグナルによるＤＮＡ量の過剰評価が抑えられるからである。以下の実施例ではTaqMan法によるリアルタイムＰＣＲを行った。なお、TaqMan法においてプローブの塩基配列を決める際にも、検出対象のビブリオ属細菌種で特異的に保存されたＤＮＡ領域中で、多型を有する塩基を含まないように決定することが望ましい。
【００１９】
このようにして決定したプライマー配列及び／又はプローブ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それらを用いて、検体抽出物に対し、リアルタイムＰＣＲを行う。
【００２０】
一方、複数の希釈段階を設けた菌濃度のビブリオ属細菌に対し、検体と同様に粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、それぞれ検体と同様にリアルタイムＰＣＲを行うことにより、菌濃度と、リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める。この相関関係より、検体抽出物に対して得られたリアルタイムＰＣＲの結果から、検体抽出物中のビブリオ属細菌種の菌濃度を算出し、その菌濃度から検体中に存在するビブリオ属細菌種の総菌数を算出する。
【００２１】
例えば、段階希釈したビブリオ属細菌に対し、検体と同様に粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、それぞれ検体と同様にリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成する。この検量線を用いて、検体抽出物で行ったリアルタイムＰＣＲの結果から、検体抽出物中のそのビブリオ属細菌の菌数を算出する。
【００２２】
具体的には、横軸にＰＣＲのサイクル数、縦軸にＰＣＲの産物量を取り、各希釈段階細菌に対するＰＣＲについてプロットすると、Ｓ字曲線が平行に並んだグラフとなる。次に、縦軸に増幅が指数関数的に起こる領域内で所定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle；Ct 値）を、横軸に細胞濃度（log (細胞数／ml)）を取り、各希釈段階についてプロットすると、グラフ（検量線）は直線状になる。検体抽出物で行ったビブリオ属細菌のリアルタイムＰＣＲの結果から、上記所定の増幅産物量になるサイクル数（Ct）を求め、検量線より、検体抽出物中の菌数を算出する。
【００２３】
なお、菌濃度ではなく、抽出したＤＮＡ量を基にして作成した検量線を用いて、そのビブリオ属細菌のゲノム量を用いて総菌数を計算することも理論上は可能である。しかし、ＤＮＡを抽出する際の効率などの問題があり、実際上１００％のＤＮＡが抽出されているわけではないため、菌濃度を基にして検量線を作成し、その検量線を用いて、検体抽出物中の総菌数を算出するのが好ましい。
【実施例】
【００２４】
＜実施例１＞腸炎ビブリオ菌の総菌数の測定
海産物試料として、ムラサキイガイ（blue mussel）及びアサリ（short-neck clam）を用いた。これらの貝の組織約２５ｇに２２５ｍｌのＰＢＳ（２％ＮａＣｌ含有）を加え、ホモゲナイズし、貝抽出物を得た。
【００２５】
検量線の作成のため、
（１）８時間培養した腸炎ビブリオ菌ＶＰ１５株をＴＢＳ（２％ＮａＣｌ含有）で１０〜１０７倍まで１０倍ずつ希釈した菌培養液
（２）腸炎ビブリオ菌で汚染されていない市販のムラサキイガイ及びアサリより得た１ｍｌのムラサキイガイ抽出物及びアサリ抽出物並びに腸炎ビブリオ菌で汚染されていない海水試料に対し、ＰＢＳ（２％ＮａＣｌ含有）で１０〜１０７倍まで１０倍ずつ希釈した菌培養液を０．１ｍｌずつ添加した人工汚染貝抽出物及び海水試料
を準備し、ＤＮＡをMag Extractor（TOYOBO社）で抽出した。
【００２６】
これらのＤＮＡを用いて、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。反応液５０μｌは以下のように調整した；２５μｌTaqMan universal PCR maseter mix （アプライド・バイオシステム社）、５μｌ鋳型ＤＮＡ（10ng/μl）、９００ｎＭ下記プライマー、２５０ｎＭ下記 TaqMan プローブ。なお、プライマー及びプローブの塩基配列は、図１に示されているように、腸炎ビブリオ菌で保存されており、他のビブリオ属細菌種で保存されていないＤＮＡ領域のうち、多型を示す塩基対を含まないように決定した。なお、複数のビブリオ属菌種に対し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、腸炎ビブリオ菌に対してのみ増幅ＤＮＡが得られ、他のビブリオ属菌種では増幅ＤＮＡが得られなかったことから、これらのプライマーが腸炎ビブリオ菌特異的に機能することを確認した。
【００２７】
Vp tox-265: ＧＡＣＧＣＡＡＴＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号１）
Vp tox-381: ＧＣＡＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＡＴＡＧＴＧＣＣＡＡ（配列番号２）
TaqMan probe: ＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧ（配列番号３）
【００２８】
こうして調製された反応液に対し、ABI PRISM 7000 sequence detector （アプライド・バイオシステム社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。条件は２段階ＰＣＲプロトコールに従い、５０℃２分、９５℃１０分処理後、９５℃１５分−６５℃１分を４５サイクル行った。ＰＣＲを行っている最中の蛍光強度の測定は自動的に行われた。また、ＤＮＡ増幅データは、ABI PRISM 7000 SDS softwareによって解析された。各試料における菌の初期濃度（log (菌数)/ml）に対し、検出した蛍光強度が検出閾値に達した時（ここでは０．２５）のサイクル数（Ct）をプロットし、検量線を作成した（図３）。菌培養液、人工汚染アサリ抽出物、及び海水試料を用いた場合、ほぼ３本の検量線は重なったが、人工汚染ムラサキイガイ抽出物を用いた場合、検量線は他の３本と平行にずれた。この結果は、用いる海産物によっては、菌培養液や海水試料とは異なる検量線となることを意味し、従って、検量線は、ＤＮＡの初期濃度ではなく、菌の初期濃度に対して、Ct値をプロットする方が好ましいといえる。
【００２９】
次に、総菌数の測定対象である、実際に海岸から取得したアサリ、ムラサキイガイ、及び海水試料、を、検量線を作成したのと同様の方法で、ＡＰＷ（alkaline peptone water；ニッスイ）中で粉砕した。それらの抽出物に対し、同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行い、検出した蛍光強度が検出閾値に達した時（ここでは０．２５）のCtを求め、図３の検量線で菌の初期濃度を求めた（表１）。この菌の初期濃度に検体の重さをかけると、総菌数が算出される。なお、比較のため、同じ試料に対し、従来のＭＰＮ法を用いて、腸炎ビブリオ菌の濃度を測定した。上記の粉砕物を１０倍ずつ段階希釈し、１０ｍｌ〜１０−３ｍｌまでを最終１０ｍｌになるように調製した試料を各３本ずつ、３５〜３７℃で１８時間インキュベートした。培養後の培地を一部取って、CHROMagar Vibrio agar（CHROMagar社）に蒔いて、３０℃で２４時間インキュベートした後、腸炎ビブリオ菌に特徴的なコロニーが観察された培地の数を数え、最確数表によりＭＰＮを求めた（表１）。
【表１】
2006087406.tif 000002
【００３０】
ＭＰＮとの比較より、本実施例では、TaqMan法を用いた腸炎ビブリオ菌の菌数の測定には、検体に存在する菌濃度が約１０個以上／ｇが好ましく、約１００個以上／ｇがより好ましいことがわかった。
【００３１】
＜実施例２＞ビブリオ・バルニフィカスの総菌数の測定
まず、TaqMan法を用いたリアルタイムＰＣＲのためのプライマー及びプローブの位置を決定するため、ビブリオ・バルニフィカスの４つの独立した株においてtoxR遺伝子の多型を調べた。ビブリオ・バルニフィカスでは保存されているが、他のビブリオ属菌種では保存されていないＤＮＡ領域をＰＣＲで増幅し、塩基配列を決定した（図２）。ＰＣＲの反応系（総量１００μｌ）は、10mM Tris-Hcl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、50pmol 各下記プライマー、0.2mM dNTPs、2.5U TaKaRa Taq DNA pol、5ng DNAを用い、９４℃１分−６０℃１分−７２℃１分を３５サイクル行った。
【００３２】
ToxAll 1: ＧＡＧＣＡＧＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴ（配列番号４）
ToxAll 2: ＧＴＴＴＴＧＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣ（配列番号５）
増幅したＤＮＡをUltrafree-MC 30,000 NMWL filter unit（ミリポア社）を用いて精製した後、pT7blueベクター（Novagen社）にクローニングし、塩基配列を決定した。図２に決定された塩基配列を示す。
【００３３】
この領域において、多型を含まないようにTaqMan法を用いたリアルタイムＰＣＲのためのプライマー（Tox-130, Tox-200）及びプローブ（Tox-152）の塩基配列を決定した。以下にその塩基配列を示す。なお、複数のビブリオ属菌種に対し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、ビブリオ・バルニフィカスに対してのみ増幅ＤＮＡが得られ、他のビブリオ・バルニフィカスでは増幅ＤＮＡが得られなかったことから、これらのプライマーがビブリオ・バルニフィカス特異的に機能することを確認した。
【００３４】
Tox-130: ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号６）
Tox-200: ＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＴＣＡＴＴＣ（配列番号７）
Tox-152: ＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＧ（配列番号８）
【００３５】
本実施例では、ビブリオ・バルニフィカスの総菌数を測定するための試料は、海水を用いた。即ち、ビブリオ・バルニフィカスで汚染されていない海水試料に対し、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲを行って、検量線を作成し、実際に７カ所の海岸で取得した海水試料に対して、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲを行って、ビブリオ・バルニフィカスの総菌数を測定した。なお、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲは、上記反応系を用い、腸炎ビブリオ菌の総菌数を測定する場合と同じ条件で行った。また、生存細菌数（ビブリオ・バルニフィカス以外の細菌も含む）と、比較として、２００μｌの海水をCHROMagar Vibrioに播種した時に得られたビブリオ・バルニフィカスのコロニー数を数えた。図４に、得られた検量線を示し、表２に算出したビブリオ・バルニフィカスの菌濃度を示す。
【表２】
2006087406.tif 000003
【００３６】
本実施例では、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲによる測定の感度は、単にプレートに海水試料を播種したときと比べ、同程度か、より高いことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の実施例１において、腸炎ビブリオ菌の総菌数の測定のために行われたTaqman法を用いたリアルタイムＰＣＲの際、利用されたToxR遺伝子の領域並びにプライマー配列及びプローブ配列を示した図である。この領域に存在する多型をボックスで囲んで示した。
【図２】本発明の実施例２において、ビブリオ・バルニフィカスの総菌数の測定のために行われたTaqman法を用いたリアルタイムＰＣＲの際、利用されたToxR遺伝子の領域並びにプライマー配列及びプローブ配列を示した図である。この領域に存在する多型をボックスで囲んで示した。
【図３】本発明の実施例１において、対照検体を用い、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲによって作成された検量線を示す図である。
【図４】本発明の実施例２において、対照検体を用い、Taqman法を用いたリアルタイムＰＣＲによって作成された検量線を示す図である。
【図１】
2006087406.tif 000004
【図２】
2006087406.tif 000005
【図３】
2006087406.tif 000006
【図４】
2006087406.tif 000007
【配列表】
2006087406000001.app