(57)【要約】【課題】  バイオマスを酵素で糖化し、アルコール、化成品原料などの発酵原料となるブドウ糖を製造する方法、特にリグノセルロース材料を基質として糖化酵素により連続的に糖化する経済的な工業的方法を提供する。【解決手段】  基質としてのリグノセルロース材料と糖化酵素とを含有する分散液を連続糖化反応槽に通じることによってリグノセルロース材料を連続的に糖化し、糖化反応液から未反応リグノセルロース材料及び糖化酵素を回収して前記糖化反応槽に仕込まれる分散液における基質及び糖化酵素として循環する連続糖化方法であって、基質としてリグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料を使用し、連続糖化反応槽に供給される前記分散液における全基質量と添加される糖化酵素量の割合を、該分散液に含まれる前記循環される基質を含む全基質の少なくとも９６質量％が滞留時間内に糖化される割合に維持することによって、循環される未反応リグノセルロースの蓄積量の増加を防止しつつ連続的に糖化反応を行うことを特徴とするリグノセルロースの連続糖化方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質としてのリグノセルロース材料と糖化酵素とを含有する分散液を連続糖化反応槽に通じることによってリグノセルロース材料を連続的に糖化し、糖化反応液から未反応リグノセルロース材料及び糖化酵素を回収して前記糖化反応槽に仕込まれる分散液における基質及び糖化酵素として循環する連続糖化方法であって、基質としてリグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料を使用し、連続糖化反応槽に供給される前記分散液における全基質量と添加される糖化酵素量の割合を、該分散液に含まれる前記循環される基質を含む全基質の少なくとも９６質量％が滞留時間内に糖化される割合に維持することによって、循環される未反応リグノセルロースの蓄積を防止しつつ連続的に糖化反応を行うことを特徴とするリグノセルロースの連続糖化方法。
【請求項２】
前記滞留時間が４８時間〜８時間である請求項１記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【請求項３】
前記連続糖化反応槽に供給される分散液に添加される酵素量が、分散液中の全基質１ｇ当たり酵素２００〜１０００単位に維持される量である請求項１又は請求項２に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【請求項４】
前記リグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料が化学パルプを主成分とする古紙であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【請求項５】
前記連続糖化反応槽に供給される分散液における全基質量と糖化酵素量の前記割合が、新たに分散液中に添加される基質の量を増減するか、又は新たに添加される糖化酵素量を増減することによって維持されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスを酵素で糖化し、アルコール、化成品原料などの発酵原料となるブドウ糖を製造する技術に関する。特に、本発明は、リグノセルロース材料を基質として糖化酵素により連続的に糖化する工業的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロース材料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりアルコールのようなガソリンの代替となる燃料、こはく酸や乳酸などのプラスチック原料を製造することができ、循環型社会の形成に極めて有益な技術である。
バイオマス資源中の多糖類から発酵基質となる単糖や少糖類を作る方法は大きく分けて２つの方法がある。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
【０００３】
酸糖化法は酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、デンプン、廃糖蜜などを原料とする方法に比べてまだコストが高く、また、使用した酸の廃棄による環境負荷が問題となっており、実用化の妨げとなっている。酵素糖化法では、最近酵素の価格が下がり、後処理まで含めた全体のコストを考えると酸糖化法のコストに近づいてきたが、まだ酵素自体の価格が高く、実用化には一層の酵素価格の低減が必要である。
【０００４】
また、酸糖化法では副反応によりフルフラールなどの有害物質が副生するが、酵素糖化法では反応の特異性からこの様な副反応が起きないという特長がある。
リグノセルロース材料を酵素により糖化するためには、糖化に先立ち、セルロース構造を維持し、微生物などの外敵から該構造を維持しているリグニン等の成分を除去する必要があり、そのための手段としてアルカリ抽出、爆砕、酸処理などが用いられることが報告されている。
【０００５】
紙は、リグノセルロース材料から、機械的、又は化学的に繊維成分を取り出し、シートにしたものである。従って、古紙は糖化の原料としてみた場合、既に前処理の済んだリグノセルロース材料と見なすことができる。このようなリグノセルロース材料のうち、リグノセルロース材料をグラインダーやリファイナーで磨り潰して繊維を取り出す機械パルプ化法で得られるパルプ繊維は、リグニンやヘミセルロースが繊維表面に残るため、酵素で完全に糖化することはできない。機械パルプは新聞用紙、雑誌など嵩が高く、不透明度の高さが要求される紙に使用されるが、機械パルプの使用されている紙は、古紙の回収ルートが確立され、高い回収率で有効に再利用されている。
【０００６】
一方、化学パルプはリグニンをほぼ完全に除去したパルプであるので、化学パルプに由来する古紙は、糖化に先立つ前処理を必要としないと言う特長がある。化学パルプは印刷用紙、コピー用紙などの事務用紙、包装用紙などに使用されるが、これらの紙の古紙は、現在ゴミとして廃棄されることが多く、特にオフィスから発生する機密書類の古紙は、その性質上、細かく裁断されるために回収再利用が困難であり、ゴミとして処分されている割合が高い。
このような紙としての再利用が困難な化学パルプ由来の古紙を糖化原料として利用しようという試みは数多く行われているが、いずれの方法でも糖化のコストが高く、実用化は困難である。
【０００７】
古紙の糖化のコストを下げることについては、バイオマス資源と同様にセルロース繊維への酵素のアクセスを容易にする前処理の方法の開発や、結晶性セルロースを効率高く糖化する方法の開発、更には酵素の再利用方法の開発などが考えられる。
Scott, C. D.らは、1994年、古紙の糖化装置として、連続的な磨砕と膜を用いた分離と酵素の再利用、固定化菌体による酵素の生産、高濃度のスラリー状態での処理等により、低コスト化が可能であると予測している。
【０００８】
この方法では、生成物阻害を避けるため、反応液は膜により分離し、限外濾過膜で酵素を回収し、固定化したβ−グルコシダーゼでセロビオースをグルコースに分解し、グルコースは逆浸透膜で濃縮する。酵素を大量（濾紙分解活性で基質１ｇに対して８０−１６０単位）に添加した主反応槽に高速遠心ポンプによる磨砕を行う循環ラインを設けて常にセルロース繊維から新しい表面を露出させ、反応後の液から限外ろ過によって酵素を分離回収しながら行う連続反応槽を想定してコストを予測している。摩砕しながら高い酵素濃度で処理することにより、糖化率は２５時間で１００％であった。この方法では酵素の回収率は２４時間で９５％以上であるが、酵素が残渣に吸着するため、これをｐＨや温度を変えて酵素を基質から剥して回収するとしている。
【０００９】
さらに、以下のような仮定をした場合に初めて実質的にコストが見合う生産が可能になるとしている。すなわち、ａ）固定化したT.reeseiのような菌を酵素の生産用に組み込むことによってコストを下げ、ｂ）原料となる新聞古紙の費用をゼロ、セルロースのエタノールへの変換効率を８０％、リグニンとヘミセルロースは燃料としてエネルギーを回収する、酵素の回収率が８０％、エタノールの収率が理論値の９８％と仮定した場合、利益がでないが、逆有償で古紙を引き取ることで実用化が可能であると計算している（非特許文献１）。しかし、日本では新聞古紙は既に価値を持っており、逆有償での引き取りは困難である。
【００１０】
このように、古紙による酵素の糖化については、現状では、コストがまだ高いことが問題であり、何らかの方法でコストを下げる工夫が必要となっている。
山下らは、新聞古紙の糖化を検討したなかで、蒸煮、蒸煮爆砕法を試みたが、余り高い効果は得られず、オゾン処理が有効であることを報告している。新聞古紙に含まれるリグニン分解するためにオゾンを検討した。その結果、予めアルカリで膨潤した古紙を洗浄後固形分濃度５０％まで絞り、気相でオゾンをパルプ当たり８．８％加えることで糖化率８０％を達成している。ただしオゾンの価格がまだ高価であり、実用的ではない（非特許文献２）。
【００１１】
Woodらは、mixed waste office paperをKlebsiella oxytocaとカビ由来の酵素Spezyme CP(Genencor社)、Novozyme 188で併行糖化発酵を行う際に、２４０分に１５分の割合で超音波を照射すると、酵素の使用量をパルプ１ｇに対して、濾紙分解活性で５単位に半減することが出来たと報告している。糖化が促進される理由として、単に超音波によって繊維がほぐれるためではなく、酵素がセルロース繊維に単に吸着して作用できない状態のものを引き剥がして、再度新しい作用点で作用できるようにする効果があるためであると考察している（非特許文献３、非特許文献４）。
【００１２】
また古紙を糖化する様々な装置上の工夫がなされており、連続的に糖化する設備が考案されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
しかしながら、古紙などリグノセルロースから糖類を製造することは、トウモロコシデンプンなどから糖を製造する場合に比べて、酵素による糖化が容易でなく、デンプンを原料とする場合に比べて経済性が劣っていた。
【００１３】
例えば、一般的な酵素処理条件として１ｇのコピー用紙に対して濾紙分解活性が１０単位となるように添加し、４０〜６０℃で糖化を行った場合、２４時間で９０％近く糖化することが可能であるが、残りの１０％は７２時間まで酵素を作用させても、殆ど消化されないで残る（図８参照）。この酵素の添加率でも、酵素の価格が高すぎるため実用的でないが、残渣の分解を促進する目的でさらに酵素の添加率を高めることは、経済性をなくし、実用上使用不可能である。
【００１４】
糖化に要する酵素のコストを下げる方法として、酵素を回収再利用する方法が試みられた。
蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を５％の濃度で糖化槽に加え、２万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、８日間で２ｋｇのシラカンバ材から単糖類を６３０ｇ得ている。この方法で酵素の使用量を２０％節約できたと報告している（非特許文献５）。しかし、２０％の節約ではまだコストが高すぎて、実用化できない。
【００１５】
また、アルカリで前処理したバガスをセルラーゼで糖化した低濃度糖液から、分画分子量１０，０００から２０，０００の限外濾過膜を利用して、酵素を９０％回収している。酵素の添加率は反応液１ｍｌ当たり３０〜２００単位で、基質１ｇに対する添加率はＣＭＣａｓｅで１，０００〜２，８００単位、濾紙分解活性では４５〜１２８単位（ＣＭＣａｓｅが７２０単位のとき、濾紙分解活性が３３単位として計算）と考えられるが、この条件で糖化率は８０％であった。高濃度糖液の場合は糖化残渣が多く、これに吸着されるセルローゼ量が多く酵素の回収量が７５から８０％であった（非特許文献６）。
このような観点から、糖化装置の設計においても酵素を回収再利用する方法が検討されている（特許文献６、特許文献７、特許文献８）。
【００１６】
これらの方法では、セルロースを１〜２０質量％、セルラーゼを０．１〜１０質量％（１ｍｌ中にＣＭＣａｓｅで１００〜３００単位）添加し、３０〜６０℃で２４〜４８時間糖化し、未分解残渣を遠心分離により除去した後、糖溶液を限外濾過で分離した後、非透過画分の酵素を再度糖化に利用する。これらの発明では糖化に伴い大量に発生する未分解の残渣に酵素が吸着し、酵素の回収率が下がるが、ノニオン系の界面活性剤で未分解の残渣を処理することにより、酵素を回収することができる。酵素の回収率については界面活性剤を利用することによって約５０％増加するが、高価な酵素のコストの削減量について記載がない。
【００１７】
特開昭６３−８７９９４号公報では、使用された酵素の質量当たりの活性は明らかではないが、ＣＭＣａｓｅの活性で１００〜３００単位／ｍｌ添加して糖化が終了した時点で、残渣が２０〜３０容量％発生する。その為、連続糖化槽で糖化を行う場合、残渣が時間の経過と共に蓄積するため、残渣を分離する工程が必要となる。
【特許文献１】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献２】特開２００２−１７６９９７号公報
【特許文献３】特開２００２−１８６９３８号公報
【特許文献４】特開２００１−２３８６９０号公報
【特許文献５】特開２００２−２３８５９０号公報
【特許文献６】特開昭６１−２６０８７５号公報
【特許文献７】特開平１−２３４７９０号公報
【特許文献８】特開昭６３−８７９９４号公報
【非特許文献１】Scott, C.D., Rothrock, D.S., Appl. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.， ４５/４６, pp.641-653(1994)
【非特許文献２】山下武司、佐藤常明、（社）全国林業改良普及協会編、「木材成分総合利用研究成果集」、pp.313-326(1990)。
【非特許文献３】Wood, B.E.,Aldrich, H.C., Ingram, L.O., Biotechnol. Prog., 13, 232-237(1997)
【非特許文献４】Tomme, P., Warren, A.J., Miller, T.C.J., Kilburn, D.G., Gilkes, M. R., In "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates"(J.N. Saddler ed.) ACS Symposium Ser. Vol 618, pp. 145-163, ACS, San Diego, CA(1995)
【非特許文献５】Ishihara, M., et al., Biotechnol. Bioeng., 37, 948-954(1991)
【非特許文献６】安戸饒、木材学会誌、第35巻12号1067−1072ページ(1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
リグノセルロースなどバイオマスから糖類を製造する技術は、これまで化石資源から製造されていたプラスチックの原料や、循環型社会の構築に役立つ技術である。特に、古紙は国内で季節を問わず大量に発生するため、化石資源に替わるエネルギー、化学原料の資源として有効利用が望まれている。
化学パルプのみを使用した古紙のように、リグニンを高度に除去したリグノセルロースは、セルラーゼやヘミセルラーゼによって高い効率で繊維成分を加水分解することができ、他のバイオマス資源より容易に糖類を製造できる。しかし、先に述べたように、様々な技術が開発されてはいるものの、糖化に要する酵素のコストが高く、経済性がないことが課題となっている。
【００１９】
これを解決するために、これまで糖化に用いた酵素を限外濾過などで回収し、繰り返し使用することにより酵素の使用量を削減しようという試みがなされてきたが、糖化の際に残渣が生じ、これに酵素が強く吸着しているため、回収率が下ってしまい、問題解決には至っていない。
この残渣に酵素が強度に吸着することが、酵素回収の際の最大の問題であり、これを解決できれば酵素のリサイクル性は向上し、コストを低下させ、酵素糖化の経済性は大きく改善できる。それ故、本発明は、リグノセルロース材料の酵素糖化のために投入される酵素を無駄なく有効利用することができる方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、連続的に糖化を行う工程において、大きなコストを占める酵素について、酵素の回収率を高めて繰り返し使用することによりコストを下げる方法を検討し、本発明に至った。本発明は、これまでは酵素の価格が高いことから、その使用量を削減しようという考え方であったものを、逆に所望の時間内に９６％以上、好ましくは９８％以上リグノセルロース材料を分解できるように、経済的に見合う範囲で多量の酵素を添加して糖化反応を行うことにより残渣の蓄積量を低減させ、残渣に吸着される酵素量を減らすという考えに基くものであり、そのために、リグニン除去操作が施されていて酵素反応を受けやすく、残渣が発生しにくいリグノセルロース材料を基質として酵素糖化反応を行なう方法に関するものである。本発明は、以下の各発明を包含する。
【００２１】
（１）基質としてのリグノセルロース材料と糖化酵素とを含有する分散液を連続糖化反応槽に通じることによってリグノセルロース材料を連続的に糖化し、糖化反応液から未反応リグノセルロース材料及び糖化酵素を回収して前記糖化反応槽に仕込まれる分散液における基質及び糖化酵素として循環する連続糖化方法であって、基質としてリグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料を使用し、連続糖化反応槽に供給される前記分散液における全基質量と添加される糖化酵素量の割合を、該分散液に含まれる前記循環される基質を含む全基質の少なくとも９６質量％が滞留時間内に糖化される割合に維持することによって、前記循環される未反応リグノセルロースの蓄積量の増加を防止しつつ連続的に糖化反応を行うことを特徴とするリグノセルロースの連続糖化方法。
【００２２】
（２）前記滞留時間が４８時間〜８時間である（１）項記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【００２３】
（３）前記連続糖化反応槽に供給される分散液に添加される酵素量が、分散液中の全基質１ｇ当たり２００〜１０００単位に維持される量である（１）項又は（２）項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【００２４】
（４）前記リグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料が化学パルプを主成分とする古紙であることを特徴とする（１）項〜（３）項のいずれか１項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【００２５】
（５）前記連続糖化反応槽に供給される分散液における全基質量と添加される糖化酵素量の前記割合が、新たに分散液中に添加される基質の量を増減するか、又は新たに添加される糖化酵素の量を増減することによって維持されることを特徴とする（１）項〜（４）項のいずれか１項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、従来、紙原料として再生利用されることが少なかった化学パルプ由来の古紙からアルコール類や各種化学品の原料となる糖類を製造し、供給することができる経済性のある連続的な酵素糖化方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の酵素糖化方法で基質とされるリグニン含量の低い又はリグニンをほとんど含まないリグノセルロース材料としては、針葉樹、広葉樹、林地残材、建築廃材、剪定廃棄物、ソーダスト、ケナフ、稲藁、麦わらなどの農産破棄物等のリグノセルロース材料からアルカリ抽出、アルカリ蒸解等の化学パルプ製造法、オルガノソルブなどの方法により高度にリグニンを除去したセルロース、ヘミセルロースを主成分とする繊維が好ましく、例えば、化学パルプを主成分とする古紙を挙げることができる。特に、化学パルプのみからなる紙が好適である。
【００２８】
糖化反応に用いる酵素の種類については、セルロース、ヘミセルロースを完全に分解できるものであれば特に限定されるものではないが、トリコデルマ（Trichoderma）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フミコーラ（Humicola）属、イルペックス（Irpex）属などに属する菌が生産するセルラーゼを主体とする酵素や、商業的に生産される酵素を、単独で、もしくは組み合わせて用いることができる。好ましくは、プロテアーゼを含まないもの、酵素の安定性を高めるためのメイクアップがなされているものが使用される。
また、必要に応じて、ヘミセルロースを分解する酵素、特に、広葉樹のパルプに含まれるキシランを分解する酵素、キシラナーゼ、針葉樹に含まれるマンナンやガラクタンを分解する酵素を追加することができる。一般に、バイオマスの糖化用に開発されている酵素は、これらの酵素も含むので好適である。
【００２９】
糖化装置については、特に限定されるものではないが、酵素を回収再利用する装置を具備するもの、連続的に基質を投入し、連続的に生成糖を分離できる装置を使用し、長期間にわたって連続的に運転できるように制御された装置が必要である。例えば、図１に示したような基質調整槽１、糖化反応槽２、反応液貯留槽４、糖貯留槽５、限外濾過装置６、精密濾過装置３（例えばスピンフィルター）からなる装置を例示できる。図示の装置で酵素糖化反応を行う場合、基質調整槽１から基質を添加する液量は、限外濾過装置で膜を透過する糖液の液量と同じとし、酵素の添加率は、反応液貯留槽中の酵素の濃度と基質の添加量に応じて所望の滞留時間内に９６％以上糖化することができる酵素量が維持されるような添加率とする。糖化反応槽からの分解産物と酵素液を抜き取る量は、基質の添加量と酵素液の添加量の和と同じになるように調整することによって、糖化反応槽の液量を一定に維持する。
【００３０】
酵素の使用量は、基質となる繊維成分を所望の時間に９６％以上、好ましくは９８％以上分解できる量であることが必要であるが、経済性のある範囲で行う必要がある。具体的には、糖化反応槽での滞留時間を１２時間に設定した場合、基質１ｇに対して、濾紙分解活性で２００単位以上、１，０００単位以下、更に好ましくは２６０単位以上、４００単位以下である。しかしながら、酵素によって特性が異なるため、必ずしも、この添加量が適切でない場合もあるが、残渣の濃度が１％を越えないようにする酵素の量であることが好ましい。更に好ましくは０．８％を越えないようにする酵素の量であることが好ましい。また、１，０００単位を超えて過剰の酵素を添加することは経済性を損なうので好ましくない。
【００３１】
糖化反応槽は、使用する酵素の最適温度に保つことが好ましく、例えば、トリコデルマ起源の市販酵素の場合、４０℃から５０℃が好ましい。また、カビ類に由来する酵素も、一般に３０℃から５０℃に保つことが好ましい。糖化反応槽中の液のｐＨは使用する酵素の最適ｐＨに保つことが好ましく、例えば、トリコデルマ起源の市販の酵素の場合、ｐH４から７の間が好ましい。
【００３２】
未反応基質を含む残渣の量が増加した場合には、不足している酵素を追加するか、もしくは基質の供給を一時的に止めることで残渣の量を低減することが可能である。未反応基質を含む残渣を系内から濾過、遠心分離などの操作によって除去することも可能であるが、残渣を除去する場合には残渣から酵素を回収、再利用することが重要であり、作業が繁雑となるので好ましくない。
【００３３】
本発明において、糖化率は、基質の有機分当りの生成糖量と定義する。基質の有機分は、基質中の水分、灰分を除いた質量とする。生成糖量は、糖化反応槽、反応液貯留槽、糖貯留槽の上清中に含まれる全糖量をそれぞれ測定し、加水分解によって付加された水の量を差し引いた質量の和を生成糖量とする。
【００３４】
また、各酵素の活性は以下のように測定する。
１）ＣＭＣａｓｅ活性
１．２５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む１２５ｍＭ酢酸緩衝液（  ｐＨ４．０）４０μｌに、酵素液１０μｌを加え、５０ ℃、１０ｍｉｎ反応させ、生  成した還元糖をＡｖｉｃｅｌａｓｅ活性測定と同様にＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法  で測定し、１分間２１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素の量を１単位とした。
【００３５】
２）ＣＢＨ Ｉ活性
１．２５ｍＭ  4-Methyl-umberiferyl-cellobiosideを含む１２５ｍＭ  酢酸緩衝液  （ｐＨ４．０）１６μｌに、酵素液４μｌを加え、５０℃、１０ｍｉｎ反応を行ったの  ち、５００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１００ μｌを添  加し、反応を停止させた。これを３５０ｎｍの励起光での４６０ｎｍの蛍光を測定し、  １分間２１μｍｏｌのウンベリフェロンを生成する酵素の量を１単位とした。
【００３６】
３）濾紙分解活性
７５ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）５００μｌに２５０ｕｌ の培養上清を添加  し７５０μｌにした。これにワットマンＮｏ．１の濾紙を０．５×６ｃｍ にカットし  カールさせたものを１つ添加し、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、ＤＮＳ法  で生成した還元糖を測定した。検量線はグルコースで作成し、１分間に１μｍｏｌの還  元糖を生成する酵素の量を１単位とした。
【００３７】
４）グルコース濃度
溶液中のグルコースの濃度はグルコースセンサー（王子計測機器製ＢＦ−４００型）で定量した。
【００３８】
５）糖化反応槽中のリグノセルロースの残渣の量
糖化反応槽のリグノセルロースの残量は次のように定義する。
「残渣の量」＝「投入したリグノセルロースの重量」−（「各槽中に生成した糖を全糖として測定した量の総量」−「各糖の水の分子量分」）
【実施例】
【００３９】
以下、添付した図面中の図１の連続糖化装置を使用する実施例にしたがって、本発明の方法を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
図１の連続糖化装置において、符号１は基質調整槽を示し、２は糖化反応槽、３はスピンフィルター、４は反応液貯留槽、５は糖貯留槽、６は限外濾過装置、７は窒素ボンベ、８はフィードコントローラー、Ｐ１〜Ｐ３は送液ポンプ、１１〜１５は送液ラインを示している。
【００４０】
図１の連続糖化装置における各設備は、それぞれ次のように調整した。
（基質調整槽１）
容量は７Ｌ、コピー用紙 １．２５％（ｗ／ｗ， 絶乾)となるように懸濁し、撹拌速度１８０ｒｐｍで攪拌した。基質の送り出しは、窒素ボンベを接続し、窒素ガスの圧力により容器内を加圧し、基質をライン１１を通して糖化反応槽に１時間に５０ｇ（フィードコントローラーにより自動制御）の速度で連続的に圧送した。
【００４１】
（糖化反応槽２）
反応液量３ｋｇ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製ＧＣ２２０酵素液を濾紙分解活性でコピー用紙１ｇについて２６０単位、コピー用紙 ０．２５％（ｗ／ｗ， 絶乾)を加えて、希釈率０．０８３ｈ-1，滞留時間１２時間、５０℃、２５０−３００ｒｐｍ；ライン１２からの流入量１時間に ２００ ｇ（固定流速）となるように運転し、スピンフィルター３を通してライン１３ からの流出量を１時間に２５０ ｇとなるようにフィードコントローラーで自動制御した。連続運転開始後２００時間で定常状態に達した。２００時間後からの経時変化を図２に示した。
【００４２】
（反応液貯留槽４）
糖化反応槽からスピンフィルター３を通しての流出液量では、限外濾過装置に必要な流速、圧力が不足するために、緩衝作用を持たせるために反応液貯留槽４を設置した。
【００４３】
（限外濾過装置６）
（Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦ Ｃａｐｓｕｌｅ，１０Ｋ ｍｅｍｂｒａｎｅ，日本ポール社）を使用し、ライン１４の流出量が１時間に５０ｇとなるようにフィードコントローラーでライン１５の流量、圧力を自動制御した。
【００４４】
結果は、図２〜５に示すとおりである。図２は、連続糖化装置に、古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合の糖化率を示す。糖化率は、各経過時間後の糖化反応槽、反応液貯留槽、糖貯留槽中の全糖量の合計又はグルコースの合計を、添加した古紙の全糖量をグルコースとキシロースの合計として換算したもので除したものである。また、７４４時間目に濾紙分解活性で７８０単位を追加している。
【００４５】
図３は、連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合の基質添加量、全糖生成量、紙の残量を示す。また、７４４時間目に濾紙分解活性で７８０単位を追加している。
【００４６】
図４は、連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合のＣＢＨＩ活性の経時変化を示す。また、７４４時間目に濾紙分解活性で７８０単位を追加している。
【００４７】
図５は、連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合の糖化率を示す。糖化率は、各経過時間後の糖化反応槽、反応液貯留槽、糖貯留槽中の全糖量の合計又はグルコースの合計を、添加した古紙の全糖量をグルコースとキシロースの合計として換算したもので除したものである。
【００４８】
図６は、連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合の基質添加量、全糖生成量、紙の残量を示す。
【００４９】
図７は、連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合のＣＢＨＩ活性の経時変化を示す。
【００５０】
図２から明らかなように１，０００時間に及ぶ連続運転に際し、糖化率は９８％以上を保っていた。このときの残渣の蓄積量は、図３に示したように、１００時間から１５０時間にかけて３ｋｇの反応液中に蓄積量が約７ｇ（反応液中の濃度：０．２３％）まで上昇した。このとき、図４に示したようにＣＢＨＩの回収率が半分以下になったので、初期の活性になるように酵素を追加した。
その結果、残渣の量が減り、５００時間まで酵素の追加をせずに１００％の糖化率を維持することができた（図２）。
【００５１】
５００時間から６００時間にかけて、再び残渣の蓄積が起こり（図３）、６００時間後には残渣の蓄積量が３ｋｇの反応液中に２３ｇ（０．７６％）まで増加した。これに伴って図２に示したように糖化率が低下した。
６００時間目に新たな基質の添加を止め、残渣の分解を促進すると、それに伴って図４に示したようにＣＢＨＩの活性が回復し、糖化率が１００％に回復した。
しかし、酵素の活性が元の水準まで回復しないため、７４４時間目にＣＢＨＩの活性を指標に元の水準まで酵素を追加した。
【００５２】
以上のように、投入する基質に対する残渣の蓄積量を５％以下に保つことにより、あらたな酵素を追加せずに繰り返し回収、再使用することが可能となり、酵素のコストを削減することが可能となる。酵素の活性低減率から計算すると同一の酵素を、糖化反応１２時間で１００％近く糖化するバッチ処理の５０回分以上使用することができた。このように従来の方法に比べて糖化時間を短縮し、酵素のコストを大幅に削減することが可能となった。
【００５３】
（比較例１）
実施例１で、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製ＧＣ２２０酵素液を濾紙分解活性で２６０単位／Ｌ用いる代わりに、酵素の添加量を１３０単位で行った。
糖化率は反応初期より下降し続けており（図５参照）、短期間に糖化残渣の上昇が起こっている（図６参照）。これに伴い、酵素の回収率の低下が起こり（図７参照）、糖化率が下がるという悪循環が起こっている。そのため、生成した糖に対する酵素のコストを安価にするためには残渣を分離し、残渣に吸着する酵素を回収する必要がある。
【００５４】
（比較例２）
実施例１で、クラフトパルプを主成分とする古紙の代わりに新聞古紙を用いる以外は実施例１と同様に行った。糖化率は６０％であり、急激に残渣の量が増加、酵素の回収率が下がり、４８時間以降の連続糖化の続行は実質的に不可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、酵素のコストを大幅に削減することができ、リグノセルロース原料から糖類を製造する経済性を高めることが可能となる。したがって、糖類を発酵基質としてアルコールや化学原料を供給する経済性を高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】連続糖化装置を示す図。
【図２】連続糖化装置に、古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合の糖化率を示す図。
【図３】連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合の基質添加量、全糖生成量、紙の残量を示す図。
【図４】連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して２６０単位添加した場合のＣＢＨＩ活性の経時変化を示す図。
【図５】連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合の糖化率を示す図。
【図６】連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合の基質添加量、全糖生成量、紙の残量を示す図。
【図７】連続糖化装置に古紙を基質とし、酵素を古紙１ｇに対して１３０単位添加した場合のＣＢＨＩ活性の経時変化を示す図。
【図８】一般的な酵素によるセルロース糖化処理における処理時間と糖化率の関係を示す図。
【符号の説明】
【００５７】
１：基質調整槽
２：糖化反応槽
３：スピンフィルター
４：反応液貯留槽
５：糖貯留槽
６：限外濾過装置
７：窒素ボンベ
８：フィードコントローラー
Ｐ１〜Ｐ３：送液ポンプ
１１〜１５：送液ライン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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