(57)【要約】      （修正有）【課題】（１→３）−β−Ｄグルカンの測定方法、及び（１→３）−β−Ｄグルカン感受性因子、ならびに該因子をコードするＤＮＡの提供。【解決手段】真菌の細胞壁の（１→３）−β−Ｄ−グルカンと強い親和性を有するカブトガニ・アメボサイト由来の（１→３）−β−Ｄグルカン感受性因子のａサブユニットのＤＮＡ及びアミノ酸配列を提供する。該ペプチドは、真菌の臨床診断、抗真菌剤と結合させた抗菌剤、あるいは真菌の除去剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列で示されるキシラナーゼドメインであるポリペプチド（配列表１のアミノ酸番号３９１−６５４）を用いる（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。
SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeu
GluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGlu
GlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyr
ArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu
AspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThr
GlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSer
GlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsn
TrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArg
ArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluVal
GlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAsp
LysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGly
SerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeu
SerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIlePro
SerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnVal
AspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsn
IleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カブトガニ・アメボサイト由来の（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子（以下「Ｇ因子」という）のアミノ酸配列で示されるポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ、特に、Ｇ因子のａサブユニットのアミノ酸配列で示されるポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを使用して、エンドトキシンを測定する方法が知られている。この方法は、微量、たとえば１０−９ｇオーダーのエンドトキシンによりライセートが凝固することに基づいており、その後の生化学的解明により、この反応はいくつかの凝固因子の段階的な活性化機構より成ることが明らかにされている（カスケード反応ともいう)（非特許文献１) 。第１図に日本産カブトガニ（Tachypleus  tridentatus)におけるこの凝固カスケード反応を示す。またこの第１図に示す三種のセリンプロテアーゼ前駆体（Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酵素前駆体）とゲル化タンパク質（コアギュローゲン）に関しては、それらの構造がcDNAクローニング等によりすでに明らかにされている(非特許文献２〜４)。
一方、このライセートは、真菌や酵母菌の細胞壁に存在する（１→３）−β−Ｄ−グルカンにも１０−８〜１０−９ｇのオーダーで反応し、ゲル化を引き起こすことが知られている（第１図参照）。この（１→３）−β−Ｄ−グルカンと相互作用し、ゲル化反応を開始させる因子として、Ｇ因子が存在する。Ｇ因子は他の因子と同様にセリンプロテアーゼ前駆体であり、72kDaのａ subunit (サブユニット) と37kDa のｂ subunit(サブユニット) が非共有結合で結ばれた糖タンパク質であることが明らかにされている(1991年第64回日本生化学会にて発表) 。
また、Ｇ因子のａサブユニットには（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的な結合部位が、さらにｂサブユニットにはセリンプロテアーゼ領域が存在し、（１→３）−β−Ｄ−グルカンがａサブユニットに結合するとＧ因子が活性化されセリンプロテアーゼの機能を発現するものと考えられている。しかし、Ｇ因子の全構造は、まだ明らかにされていない。
【非特許文献１】中村隆範他、日本細菌学雑誌、38、781-803 (1983)
【非特許文献２】T.Muta et al (1991) J.Biol. Chem.,266,6554-6561
【非特許文献３】T.Muta et al(1991) J.Biol.Chem.,265,22426-22433
【非特許文献４】T.Miyata et  al(1986) J. Biochem.,100,213-220
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記したような状況を考慮してなされたものであって、カブトガニ・アメボサイト由来のＧ因子、特に（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を有するａサブユニットを単離精製し、その全構造を明らかにしようとするものである。
本発明の課題は、Ｇ因子の（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を含むポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。
また、本発明の課題は、Ｇ因子のａサブユニットのポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。
さらに、本発明の課題は、ａサブユニットを含むＧ因子のポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、アミノ酸配列Gln-Gln-Trp-Serで示されるモチーフ構造を少なくとも一箇所含むポリペプチドをコードする一本鎖のＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖のＤＮＡおよび該アミノ酸配列で示されるポリペプチドに関する。
また、本発明は、次のアミノ酸配列またはそれと相同性を有する配列で示されるポリペプチドをコードする一本鎖のＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖のＤＮＡおよび該アミノ酸配列で示されるポリペプチドに関する。
SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGly
IleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGly
AsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly
LysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIle
GluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrp
MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle
AspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIle
HisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn
ThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIle
ValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGly
GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsn
MetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPhe
ProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr
SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn
ArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly
AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp
PheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGly
LysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln
GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal
GlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGlu
ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp
AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSer
LysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu
AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGly
AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg
IleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp
LeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly
GlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGly
ThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrp
IleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArg
AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln
LeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys
GluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer
TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer
LeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSer
ThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAsp
LeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIle
AsnTrpIleArgIleThrLysVal
現在までに４種のカブトガニが知られているが、その４種において、アメボサイトの成分であるコアギュローゲンの機能発現に必要な構造部分は互いに非常に類似している（７３〜９９％）。このことより、本発明のポリペプチドも４種のカブトガニ間でアミノ酸配列がコアギュローゲンの場合と同程度に類似していることが予測される。
すなわち、ポリペプチド間に相同性がある場合、アミノ酸配列は同一ではないにもかかわらず、その類似のアミノ酸配列により、同一あるいは類似した機能を発現する。したがって、上記に示されたアミノ酸配列そのものだけでなく、それと相同性を有するアミノ酸配列も本発明に包含されることは当業者にも容易に理解されるところである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下本発明について詳しく説明する。
まずＧ因子は、カブトガニ血球抽出液より種々のカラムクロマトグラフィーの操作、例えばデキストラン硫酸−セファロース CL-6B（Dextran sulfate-Sepharose CL-6B)およびコンカナバリンＡ−セファロース 4B(Con A-Sepharose 4B）によるアフィニティークロマトグラフィー、さらにセファクリル(Sephacryl) S-200HR によるゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる(T.Morita etal(1981)FEBS Lett.,129(2),318-321、特公平3-399 号公報)。さらに、Ｇ因子を構成するａサブユニットおよびｂサブユニットは、Ｇ因子を変性剤（界面活性剤等）により変性し、分子篩を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分画することにより得ることができる。各々のサブユニットの部分アミノ酸配列は、それぞれのサブユニットを還元・アルキル化後、酵素消化することにより得られるペプチド断片のアミノ酸配列をペプチドシークエンサー等を用いて決定することにより得ることができる。また、カブトガニ血球より単離した poly(A)＋  RNAより作製したcDNAライブラリーから前述した各々のサブユニットの部分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドまたは各々のサブユニットに対する抗体等を用いることによりそれぞれのサブユニットをコードするcDNAを単離し、それらの塩基配列をダイデオキシチェインターミネーション法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,5463-5467 (1977) Sanger, F. et al.) 等により決定することができる。また、このように決定された塩基配列と上記部分アミノ酸配列を基に各サブユニットのアミノ酸配列を決定することができる。
以上の方法によって、配列番号１で示されるＧ因子のａサブユニットであるポリペプチドをコードするＤＮＡ（AGC ・・・・・・GTG;塩基番号１１４〜２０７５）およびそれに対応するアミノ酸配列（Ser ・・・・Val;アミノ酸番号１〜６５４）を明らかにした。
また、Ｇ因子のａサブユニットは、そのアミノ酸配列よりドメイン構造を有していることを明らかにした。
すなわち、ａサブユニットのアミノ末端側（Pro ・・・・Ala;アミノ酸番号４〜２３６）にはβ−１，３−グルカナーゼのカルボキシル末端側の配列と類似した配列をもつグルカナーゼドメインが存在した（第２図）。一方、カルボキシル末端側には 126個のアミノ酸から構成される繰り返し構造（Ser ・・・・Ile;アミノ酸番号３９１〜５１６及び Ser・・・・Val ；アミノ酸番号５２９〜６５４）が存在し、またこの配列はキシラナーゼＺのアミノ末端側の配列と類似していた（第３図）。さらに、これらのグルカナーゼドメインとキシラナーゼドメインとの間には”ＱＱＷＳ（Gln-Gln-Trp-Ser)”モチーフを含み、さらにキシラナーゼＡの配列と類似した配列が三回繰り返して存在した(Leu ・・・・ Leu;アミノ酸番号２４７〜２９３、Glu ・・・・Val;アミノ酸番号２９４〜３４０及びGly ・・・・Ser;アミノ酸番号３４１〜３８７）（第４図）。
なお、第２図〜第４図においては各アミノ酸を１文字表記で表わした。
本発明では、これらのペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターを調製し、これを宿主に組み込み、培養あるいは飼育する、いわゆる遺伝子工学的手法によって、これらのペプチドを産生採取することができる。
以下、本発明の具体的実施例を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
１．Ｇ因子の精製
（１）血球抽出液の調製
カブトガニ(Tachypleus tridentatus) の血球 113ｇに0.02Mトリス−塩酸緩衝液, pH8.0 (50mM 塩化ナトリウム含有)400mlを加え、高速ホモジナイザー (商品名、ヒスコトロン、日本精密工業（株))で３分間ホモジナイズした後、8000rpm 、30分間遠心し、上清を得た。さらに、遠心の際に生じた沈澱物に同一緩衝液300 mlを加え、前記操作と同様、ホモジナイズと遠心を行い再び上清を得た。この沈澱物に同一緩衝液を加えて遠心し、上清を回収する操作を、さらに２回繰り返し、遠心操作で得られた全ての上清を集め、1250mlの血球抽出液を得た。
（２）血球抽出液からのＧ因子の精製方法
a.  デキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラムクロマトグラフィー
前記抽出液1250mlを、あらかじめ抽出用緩衝液で平衡化したデキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラム(5X17.8cm)（調製法は特公平3-399 号公報の調製例２参照）に添加し、充分に同緩衝液で洗浄した後、0.02Mトリス−塩酸緩衝液，pH8.0  (0.15M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着した余分なタンパク質を洗い流した。次いで、0.02Mトリス−塩酸緩衝液，pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、Ｇ因子画分を得た。
b.  コンカナバリンＡ−セファロース  4Bカラムクロマトグラフィー
前記のＧ因子画分を、あらかじめ0.02M トリス−塩酸緩衝液，pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有)で平衡化したCon A-Sepharose4Bカラム（ファルマシアバイオテク（株）)(2X16cm）に添加し、平衡化緩衝液で充分に洗浄した後、0.02M トリス−塩酸緩衝液，pH8.0(0.5M塩化ナトリウム含有) で再度カラムを充分に洗浄した。洗浄後、0.02M トリス−塩酸緩衝液，pH8.0(0.5M塩化ナトリウム、0.5Mメチル−α−Ｄ−グルコシド含有)でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、Ｇ因子画分を得た。
c.セファクリル S-200 HRカラムクロマトグラフィー
前記のＧ因子画分を限外濾過により濃縮した後、あらかじめ0.05M リン酸ナトリウム緩衝液，pH6.5 で平衡化したSephacrylS-200HR カラム（ファルマシアバイオテク（株)) (2.7X98cm）に添加し、同緩衝液でタンパク質を溶出した。このクロマトグラフィーで最後に溶出され、280 nmの波長でわずかな吸収しか示さないタンパク質の画分を集めた。このようにして得られたタンパク質をＧ因子の最終精製標品とした。最終的に 113ｇの血球より、牛血清アルブミン換算で約 300μｇのＧ因子を得た。
【０００７】
２．Ｇ因子のa サブユニットの部分配列の決定
（１）Ｇ因子のａサブユニットとｂサブユニットの分離
Ｇ因子のａサブユニットとｂサブユニットのｃＤＮＡクローニングを行うために必要なＧ因子のａ、ｂサブユニットの部分アミノ酸配列を明らかにするため、まずＧ因子のａサブユニットとｂサブユニットを分離した。前記１で得られたＧ因子を脱塩と濃縮とを兼ねて、メタノールとクロロホルムを用いて沈澱させた後(Methods in Enzymology vol.182, p78-79, (1990)) 、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液に溶解し、100 ℃で５分間加熱した。この加熱した試料を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液，pH7.0 (0.1％ＳＤＳを含む）を移動相として用いた、二本を連結したTSKgel G3000SWによるゲル濾過に付すことにより、Ｇ因子のａ、ｂサブユニットを分離した。
（２）Ｇ因子のａサブユニットの酵素消化
前記２（１）で得られたＧ因子のａサブユニットの画分に終濃度で17.4％(W/V）になるようにトリクロロ酢酸（TCA)を加えてＧ因子のａサブユニットを沈澱させた。Paul Matsudaira の方法 (A Practical Guide to Protein and Peptide Purifica-tion for Microsequencing, p42-43  ,1989, Academic Press,Inc.発行）に従い、沈澱させたＧ因子のａサブユニットを0.4M重炭酸アンモニウム（8M尿素を含む）に溶解し、ヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化を行い、次いで水を加えて尿素濃度を4Mに希釈した後、酵素−基質重量比1:60のリシルエンドペプチダーゼ(lysyl endopeptidase，和光純薬工業（株）) を加え37℃で20時間酵素消化した。この消化物をあらかじめ0.06％(V/V) トリフルオロ酢酸で平衡化したμBondasphere ５μC8-300Å(2.1X150mm) （ウォーターズ社) に添加し、充分にカラムを洗浄した後、５分後に０％（V/V)、65分後に24％(V/V) 、125分後に56％(V/V) 、135分後に80％(V/V) までアセトニトリル濃度を連続的に上昇させた直線的濃度勾配法を用いて、 0.2ml／min の流速で吸着したタンパク質を溶出した。この際溶出される各ペプチドは210nm の紫外部吸収でモニターし、全て分取した。
（３）部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を気相シークエンサー477A（アプライド  バイオシステムズ  ジャパン（株))を用いて決定した。この結果を第１表に示す。
【０００８】
【表１】
2006087435.tif 000002
ただし、Xaa は自然界に存在するアミノ酸のいずれかを示す。
【０００９】
３．オリゴヌクレオチドの合成
第１表の決定したアミノ酸配列の中から、２種のアミノ酸配列A:-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe- 、B:-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met- を利用して、A をセンスに、B をアンチセンスに逆翻訳し、さらに 5′末端側に制限酵素認識配列とDNA の保護のための２塩基を付けた以下に示す様なそれぞれ25個と26個のオリゴヌクレオチドの混合物をＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ（アプライド  バイオシステムズ  ジャパン（株））を用いて合成した。
【数１】
2006087435.tif 000003
ここに示すオリゴヌクレオチド A′及び B′はそれぞれ、AおよびBに相当する配列あるいは相補的配列の全ての可能性を包括している (但し、 AのPhe のコドン（TT(C/T))中の３番目のヌクレオチド(T, C)は除かれている) 。
【００１０】
４．Ｇ因子をコードするmRNAを含む poly(A)＋  RNA の調製
Ｇ因子はカブトガニ血球より精製されることから、 poly(A)＋  RNA はカブトガニ血球より単離した。
（１）全ＲＮＡの調製
カブトガニ血球11.8ｇよりAGPC法 (実験医学Vol.9, p1937〜1940を参照) を用いて、全RNA 約11mgを分離した。
（２） poly(A)＋  RNA の調製
分離した全RNA のうち約2mg の全RNA よりOligotex-dT 30 Superキット（日本ロシュ（株))を用いて poly(A)＋  RNA を単離した。さらに、一度単離した poly(A)＋  RNA は、より純度を高めるために、同様の操作をもう一度繰り返した。このように２度のOligotex-dT 30 Superキットの操作により、2 mgの全RNA から34.5μｇの高純度の poly(A)＋  RNA を得た。
【００１１】
５．カブトガニ血球ｃＤＮＡのライブラリーの作製
（１）ｃＤＮＡの合成
前記４で得た poly(A)＋  RNA 34.5μｇのうち 5μｇの poly(A) ＋  RNA からアマシャム社のｃＤＮＡ synthesisキットを利用し、ｃＤＮＡを合成した。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）で合成したｃＤＮＡからアマシャム社のｃＤＮＡクローニングシステムλgt10アダプター法を利用し、カブトガニ血球ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１２】
６．Ｇ因子のａサブユニットのｃＤＮＡクローニング
前記４（２）で得られた poly(A)＋  RNA を鋳型とし、さらに前記３で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、PCR 法(Saiki,R.K. et al, Science, 239,487-491,1988)を行いＧ因子のａサブユニットの一部をコードするｃＤＮＡフラグメントを増幅した。このｃＤＮＡフラグメントをマルチプライム-DNAラベリングキット (日本ジーン（株））を利用して[ α−３２Ｐ]dCTP でラベルしたものをプローブとして、前記５.(２）で作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、長さが最も長い約2,400bp のインサートｃＤＮＡを含む二つのポジティブクローンを得た。これらのクローンのインサートｃＤＮＡは、5'末端側と3'末端側の長さが数塩基異なることを除けば、全く同一であった。また両者の塩基配列を決定し、それらを複合した塩基配列は、開始コドンと poly(A)＋  tailを含み、2,408bpの大きさを示した。
【００１３】
７．Ｇ因子のａサブユニットをコードするｃＤＮＡ塩基配列の決定
上記６．で得られたインサートｃＤＮＡをpUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターに組み込んだ。pUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターにクローニングしたｃＤＮＡの全塩基配列を決定するために、ｃＤＮＡ断片上の制限酵素認識部位ならびにキロ−シークエンスデレーションキット（宝酒造（株））を用いたデレーションによるサブクローニングを行った。上記方法により作製したクローン中のｃＤＮＡの塩基配列を螢光ラベルしたヌクレオチドプライマーを使用したDNA シークエンサー370A（アプライド  バイオシステムズ  ジャパン（株））(Smith, L. M. et al(1986) Nature 321, 674-679)を用いて決定した。
このように決定したＧ因子のａサブユニットのｃＤＮＡの塩基配列、ならびにそれより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号１の配列表に示した。このアミノ酸配列中に、２（３）で決定した部分アミノ酸配列（第１表）が全て含まれており、今回塩基配列を決定したインサートｃＤＮＡはＧ因子のａサブユニットを確かにコードしていた。
【００１４】
８．Ｇ因子またはそのサブユニットの発現および精製
上記で得られたクローンからＧ因子のａサブユニットをコードする遺伝子の全部あるいは一部を超音波処理、制限酵素処理またはこの技術分野において知られた他の方法により切り出し、適当なベクターに組み込む。ベクターとしては宿主微生物体内あるいは細胞内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み替え用として構築されたもの、つまり適当なプロモーター、ＳＤ配列、翻訳開始コドンＡＴＧ、あるいはさらに適当な構造遺伝子を含むようなものが適している。この構築したベクターを適当な宿主生物または細胞に移入することに、より形質転換体を得ることができる。宿主としては、種々の大腸菌株、種々の酵母菌株、ハツカネズミ、ラット、チャイニーズハムスター等の動物の卵母細胞（ＣＨＯ）のような動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動植物昆虫宿主等である。このようにして得られた形質転換体を栄養培地で培養することにより、あるいは栄養食で飼育することにより多量のＧ因子またはそのサブユニット（以下、Ｇ因子等という）を安定して生産することができる。形質転換体の培養あるいは飼育条件は、Ｇ因子等を生産する範囲で適宜変更可能であるが、用いた宿主が生育し、この技術分野において一般に知られている条件を用いるとよい。培養物中のあるいは飼育物中のＧ因子等は、菌体あるいは細胞を含む培養液あるいは個体を適当な機械的な方法で破砕した抽出液をそのまま採取し、利用することもできる。しかし、一般には常法に従って、Ｇ因子等が培養液中あるいは抽出液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりＧ因子等含有溶液と菌体、細胞あるいは個体の破砕破片とを分離した後に利用される。Ｇ因子等が菌体内、細胞内あるいは個体の臓器膜内に存在する場合には、得られた培養物あるいは破片を濾過または遠心分離などの手段により、菌体、細胞あるいは破片を採取し、次いでこの物を機械的方法または超音波処理またはリゾチーム等の酵素的方法またはＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加してＧ因子等を可溶化して分離採取する。このようにして得られたＧ因子等含有溶液からのＧ因子等の単離は、通常知られているタンパク質の精製方法に従うことにより可能である。
この際、Ｇ因子等をキメラポリペプチドとして発現していれば、他方のタンパク質の性質を利用して容易に単離することが可能である。例えば他方のタンパク質のある物との親和性を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に単離することが可能である。
実際にＧ因子ａサブユニットは、次のような方法で発現できる。
５’−ＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＡ−３’の配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、さらに５’末端をリン酸化する。次いでこのオリゴヌクレオチドをＧ因子のａサブユニットをコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドより調製した一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズし、Klenow fragment などのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行い、この際生じる一本鎖部分を Mung bean  nucleaseなどのＤＮＡヌクレアーゼで切断し、二本鎖ＤＮＡとする。この二本鎖ＤＮＡをＳｐｈ  Ｉ制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔあるいはＢｌｕｎｔｉｎｇキットにより平滑化する。この二本鎖ＤＮＡをあらかじめＮｃｏ  Ｉ制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼあるいはＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔあるいはＢｌｕｎｔｉｎｇキットにより平滑化したｐＴＶ１１８Ｎ（アンピシリン耐性遺伝子を含む）に組み込んだ。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９あるいはＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４に導入し、形質転換体を得る。この際、必要な形質転換体はプラスミドの性質を利用した一般的な方法で選択することができる。すなわち、アンピシリンを含むＬＢプレート（５−ブロモ−４−クロロ−３−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）／イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）をあらかじめ塗布したもの）上で培養し、目的のプラスミドの導入された白色コロニーを拾い上げて選択する。さらに正しい配列をもつプラスミドは、５’−ＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＣＡ−３’の合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングして得ることができる。さらにＲＶ−Ｎプライマー（宝酒造（株））をシークエンシングプライマーとして用いたＤＮＡシークエンシングにより正しくプラスミドが構築されたことをさらに確認することができる。正しい配列をもつプラスミドが導入されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９あるいはＭＶ１１８４を１００μｇ／ｍｌ アンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧを含む３％Nutrient broth(日水製薬（株））にて３０℃、２４時間培養する。この培養上清あるいは菌体抽出液より、一般的に用いられている方法によりＧ因子のａサブユニットを精製する。このとき抗体あるいはＧ因子のａサブユニットに親和性をもつリガンドなどを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、より簡単に精製することが可能である。
【実施例２】
【００１５】
１．Ｇ因子のｂサブユニットの部分アミノ酸配列の決定
（１）Ｇ因子ｂサブユニットの単離
実施例１の２．（１）でＧ因子をａサブユニットとｂサブユニットに分離することにより、ｂサブユニットも同様に得た。
（２）Ｇ因子のｂサブユニットの酵素消化
前記（１）で得られたＧ因子のｂサブユニットから実施例１の２．（２）と同じ方法でペプチド断片を得た。
（３）部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を実施例１の２．（３）と同様に決定した。この結果を第２表に示す。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
２．オリゴヌクレオチドの合成
決定したアミノ酸配列の中から、２種のアミノ酸配列Ｃ：-Asn-Glu-Gln-Cys-(Asn)-Lys、Ｄ：-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-の配列を利用して、ＣをセンスにＤをアンチセンスに逆翻訳し、実施例１の３．と同様の方法で以下に示す様なそれぞれ25個のオリゴヌクレオチドＣ’およびＤ’の混合物を合成した。前記Ｃ中-(Asn)- は、Asnと推定したことを示す。
【数２】
2006087435.tif 000005
ここに示すオリゴヌクレオチドC'およびD'はC およびD に相当する配列あるいは相補的配列の全ての可能性を包括している（但し、C およびD のC 末端アミノ酸のLys ならびにD のThrのそれぞれコドン(AA(A/G)および(AC(A/C/G/T)) の３番目のヌクレオチド（それぞれA,G およびT,C,A,G)は除かれている）。
【００１８】
４．Ｇ因子のｂサブユニットのｃＤＮＡクローニング
実施例１の４．（２）で得られた poly(A)＋  RNA を鋳型とし、
さらに前記２で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、以下実施例１の６．と同様の方法で実験を行い、1,979bpのｃＤＮＡを含むポジティブクローンを得た。このクローンのインサートｃＤＮＡの塩基配列を解析したところ、前記１.(２）で得られたＧ因子のｂサブユニット由来のペプチドのアミノ酸配列に相当する塩基配列を含んでおり、さらに poly A付加シグナルが存在し、またその大きさからこのクローンは全長のｃＤＮＡであると思われる。
【００１９】
５．Ｇ因子のｂサブユニットをコードするｃＤＮＡ塩基配列の決定
Ｇ因子のｂサブユニットのｃＤＮＡの塩基配列は、実施例１の７．と同様の方法で決定した。このように検討した結果、明らかになったＧ因子のｂサブユニットのｃＤＮＡの塩基配列ならびにそれより明らかにされたＧ因子のｂサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２の配列表に示した。
このアミノ酸配列中に実施例２の１（３）で決定した部分アミノ酸配列（表２）が全て含まれていることから、今回塩基配列を決定したインサートｃＤＮＡはＧ因子のｂサブユニットを確かにコードしていた。
実施例２で採取したポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む組み換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物、適当な動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞に移入した後、ベクターのマーカーと（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合能とを指標としてスクリーニングして取得した、該組み換えＤＮＡベクターを保持する微生物、動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞を培養あるいは飼育し、本発明のポリペプチドを採取することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明ではカブトガニのアメボサイト・ライセートのＧ因子のａサブユニットを単離精製し、そのアミノ酸配列およびそれをコードするｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
その結果、この配列中に（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位の配列が含まれており、これらのｃＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法によりその結合部位に相当するポリペプチドを得ることができる。得られるポリペプチドは、次の種々の効果を示す。
（１）近年、免疫不全患者の増加、高齢化に伴って、カンジダ、
アスペルギルス等のように通常病原性の弱い二次病原体による日和見真菌感染が目立って増加している。しかし特に真菌による内臓等の深在性真菌症は一部の特殊な病型を除いては侵襲的な手段によらない限り臨床診断が困難であり、そのため剖検後初めて診断されることが多い（微生物学辞典、１９８９年、技報堂）。
上記深在性真菌症の診断は、該（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を含むポリペプチドまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンを放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質などの標識物質を用いてラベル化したものを用いてリガンドーレセプター・アッセイ法によって（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定することによって行うことができる。また、該ポリペプチドをマイクロプレート、試験管、ビーズなどの固相に結合して（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に捕捉して検出する方法等の測定法によることもできる。このような測定法より体液中の真菌由来の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に測定し、深在性真菌症の診断を簡便かつ迅速に行うことができる。
（２）また、（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を含むポリペプチドに抗真菌剤を結合させた医薬は病巣に強い親和性を有し、（１→３）−β−Ｄ−グルカンが細胞壁に存在する病巣の真菌を特異的に殺菌する新たな選択的抗真菌剤となりうる。
（３）さらに、近年の遺伝子操作技術の発達に伴い、目的タンパク質を発現する際に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの宿主として、酵母菌が繁用されている。これは、糖タンパク質の生産が可能で、細菌と同じく大量培養が可能であるためである。しかし、問題点として、生産物中に極微量の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを構成成分として持つ酵母菌の残渣が含まれることが多く、その定量及び除去が必要となる。この場合に、（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を含むポリペプチドを支持体に結合したアフィニティー担体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、特異的に酵母菌の残渣の除去、あるいは定量を行うことができ、また除去後の生産物に酵母菌菌体成分が存在しないことの確認も、（１）に述べたような（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合部位を含むポリペプチドを用いた定量法を行うことによって、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いた場合に比べてより簡便で特異性の高い確認が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１図はカブトガニ血球のエンドトキシン感受性および（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性の凝固カスケード反応の機構を示す。
【図２】第２図はＧ因子のａサブユニットのグルカナーゼドメイン  (アミノ酸番号４〜２３６）のアミノ酸配列を示す。図中、FGAはＧ因子のａサブユニットのアミノ酸番号４〜２３６のアミノ酸配列、βG1 A1 はβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸番号４２１〜６８２のアミノ酸配列を示す。
【図３】第３図はＧ因子のａサブユニットのアミノ酸番号３９１〜６５４のドメインを示す。図中、FGA はＧ因子のａサブユニットのアミノ酸番号３９１〜６５４のアミノ酸配列、Xyn Z はキシラナーゼＺのアミノ酸番号２９８〜４３４のアミノ酸配列を示す。
【図４】第４図はＧ因子のａサブユニットのアミノ酸番号２４７〜３８７のドメインを示す。図中、FGA はＧ因子のａサブユニットのアミノ酸番号２４７〜３８７のアミノ酸配列、Xln A はキシラナーゼＡのアミノ酸番号３５１〜４７７のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
[配列表]
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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