(57)【要約】【課題】  検体中血清由来ヒアルロナン結合タンパク質−ヒアルロン酸結合体（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）濃度を簡易に測定する方法およびその方法に使用する測定キットの提供。【解決手段】  検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を抗インター−α−トリプシンインヒビター（抗ＩＴＩ）抗体を使用して抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成し、その含量を測定することによって定量する方法。抗ＩＴＩ抗体を含む測定キット。  固相体に固着されたヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質に、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を結合させ、そこに抗ＩＴＩ抗体を反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）−固相体の複合体を形成し、その含量を測定することによってＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量する方法及び測定キット。  検体として血液、血清または血漿を用いることによりＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度を測定し、リウマチ性関節炎、肝疾患等の診断に用いることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清中に存在する血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ）結合体を測定することにより関節炎を検出することを特徴とする関節炎の検出方法。
【請求項２】
血清中に存在する血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ）結合体を、抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体（抗ＩＴＩ抗体）と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させ、この複合体を、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）の複合体を形成させ、この複合体を測定することにより関節炎を検出することを特徴とする関節炎の検出方法。
【請求項３】
血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ結合体と、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質とを反応させてヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質とＳＨＡＰ−ＨＡ結合体との複合体を形成させ、この複合体を抗ＩＴＩ抗体と反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）の複合体を形成させ、この複合体を測定することにより関節炎を検出することを特徴とする関節炎の検出方法。
【請求項４】
キットの構成成分として抗ＩＴＩ抗体を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法により関節炎を検出するためのキット。
【請求項５】
関節炎患者の血清中に存在する血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ）結合体量を測定し、前記ＳＨＡＰ−ＨＡ量と健常人の血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ量とを比較して、関節炎患者のＳＨＡＰ−ＨＡ量が健常人のＳＨＡＰ−ＨＡ量に比べて高値を示す場合にリウマチ性関節炎と判定することを特徴とする、リウマチ性関節炎の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体を、抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体（抗ＩＴＩ抗体）を用いて測定する方法、この方法を行うための測定キット、この方法を用いて関節炎または肝疾患を診断する方法およびこの診断に使用するための診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ；hyaluronic acid)は軟骨、関節腔の滑液、臍帯、血清、尿、眼の硝子体等の全身組織に広く分布し、組織構築の安定化や関節の円滑な運動性の維持に寄与している。健常人の関節液中のヒアルロン酸はほぼ単独で存在しているが、変形性関節炎やリウマチ性関節炎などの炎症性疾患患部の関節液中にはある種のタンパク質と結合した形態で存在している。また、ウシ血清から従来知られているものとは異なる性質を示すヒアルロン酸結合性タンパク質が単離され、このタンパク質は血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（SHAP;Serum-derived hyaluronan associated protein)と命名された(非特許文献１)。また、ヒト血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ； Serum-derived hyaluronanassociated protein−hyaluronic acid)結合体は関節炎患者の関節液より分離精製され、非還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分子量約85kDaと約 83kDaの２本の主バンドを示し、各バンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造が明らかにされた（特許文献１）。
【０００３】
その後、アミノ酸配列の分析結果からヒトＳＨＡＰがヒトインター−α−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ：Inter-α-TrypsinInhibitor）の長鎖 HC1と HC2に相当することが明らかとなった（非特許文献２)。さらに、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体をプロテアーゼとコンドロイチナーゼＡＣIIで分解して得られた結合部分のマススペクトリー解析により、Ｃ末端アスパラギン酸残基のαカルボキシル基にヒアルロン酸のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基がエステル結合していることが明らかにされた（非特許文献３)。
また、ヒト関節液由来のＳＨＡＰに対する抗体を作成し、この抗ＳＨＡＰ抗体とプロテオグリカン由来のヒアルロン酸結合性タンパク質とを用いたＥＬＩＳＡ系による測定法で関節液中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量することにより関節炎の診断ができることが報告されている（特許文献１)。
しかし、従来の測定法では抗ＳＨＡＰ抗体の作成のために抗原であるＳＨＡＰのヒト関節液からの分離精製が必要であり、原料としてヒト関節液の確保が容易でない点、また、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定の対象が関節液であり、関節液の採取の際に患者に苦痛を与えること等多くの欠点があった。
【０００４】
さらにまた、肝疾患の患者の血液中においてヒアルロン酸量が増加することが知られており（非特許文献４）、血中ヒアルロン酸量を固相に結合させたヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）に結合させた後、更に標識したＨＡＢＰを加えてヒアルロン酸に結合した標識ＨＡＢＰ量からヒアルロン酸量を測定することにより肝疾患を診断する方法が知られているが、ヒアルロン酸が低分子化され、ＨＡＢＰとの結合部位を複数カ所有さない場合には、検体中のヒアルロン酸量を検出することができず、正確な診断は不可能であった。
【特許文献１】特開平7-157500号公報
【非特許文献１】J.Biol.Chem., 265, 5247-5257 (1990)
【非特許文献２】J.Biol.Chem., 268, 26725-26730 (1993)
【非特許文献３】J.Biol.Chem., 270, 26657-26663 (1995)
【非特許文献４】Laurent AE, Loof L, Nyberg A, et al,Hepatology, 5, 638-642,1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血中にＩＴＩが豊富に存在する（健常人で約0.4mg/ml) ことから抗原確保が容易であること、およびＩＴＩとＳＨＡＰとに共通構造が存在することから抗ＩＴＩ抗体がＳＨＡＰと反応することに着目してなされたものである。
すなわち、本発明の目的は、患者からの試料採取が容易な血液を測定対象として、この試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を、抗ＩＴＩ抗体を用いてより正確に測定する方法を提供するものである。
また、本発明の他の目的は、この測定系を利用して関節炎または肝疾患を診断する方法および診断用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＨＡとの結合体として存在するＳＨＡＰが抗ＩＴＩ抗体と反応すること、および上記結合体中のＨＡがヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質、特にＣＤ４４等のヒアルロン酸受容体あるいはヒアルロン酸結合性タンパク質と反応することを利用して、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定することができること、および血液中にＳＨＡＰとＨＡとの結合体が存在することを見出した。また、変形性膝関節炎とリウマチ性膝関節炎とを鑑別する方法として関節液中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法が報告（特開平7-157500号公報）されているが、本発明者らは血液中の該結合体を測定することにより簡便にこれら関節炎を識別できることを明らかにした。また、肝疾患患者においても血液中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量が大きく増加することを見出し、上記リウマチ性膝関節症の他に肝疾患の診断を行うことが可能であることを明らかにした。
【０００７】
すなわち、本発明は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を、抗ＩＴＩ抗体と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させることによって検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法、この測定方法を用いて関節炎または肝疾患を診断する方法およびこれらの診断に使用する診断用キットに関する。
本発明の測定方法は、好ましくは、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体を、固相体に固着されたヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質、好ましくはＣＤ４４あるいはヒアルロン酸結合性タンパク質と接触させ、ついで標識物質で標識されたまたは標識され得る抗ＩＴＩ抗体とを接触させることにより、標識された抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）−固相体からなる複合体を形成させ、該複合体を複合体を形成しなかった未反応の抗ＩＴＩ抗体から分離し、該複合体中の標識物質または未反応の標識物質を検出することにより検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明は、抗ＩＴＩ抗体とＳＨＡＰ−ＨＡ結合体との複合体を形成させることによりＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法に使用するキットであって、構成成分として抗ＩＴＩ抗体を含むことを特徴とするＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットに関する。好ましくは、本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットは、抗ＩＴＩ抗体とヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質、好ましくはＣＤ４４あるいはヒアルロン酸結合性タンパク質とから構成され、かつ抗ＩＴＩ抗体、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質のいずれかが、標識物質で標識されたもしくは標識され得るものであり、さらに好ましくは、主としてヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質が固着された固相体と抗ＩＴＩ抗体と標識物質で標識された抗イムノグロブリン抗体から構成されるものである。
【０００９】
さらに本発明は、前記測定方法を用いて、関節炎、肝疾患等を診断する方法に関する。
【００１０】
本発明でいう抗ＩＴＩ抗体はＩＴＩの長鎖 HC1およびHC2 の一方もしくは両方と反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体等である。
また、本発明でいうヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質とはヒアルロン酸結合性タンパク質およびヒアルロン酸受容体から選択される少なくとも１種のタンパク質である。ヒアルロン酸結合タンパク質とは、後述するように、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカン、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカンのコアタンパク質、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン、それらのヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質等である。一方、ヒアルロン酸受容体とは、ＣＤ４４、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質またはそれらの融合タンパク質も含まれる。また、Turleyらが報告しているＲＨＡＭＭ（Receptorfor hyaluronan-mediated motility)、ＲＨＡＭＭのヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質またはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸受容体に含まれる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方法
本発明の測定方法は、少なくとも抗ＩＴＩ抗体と検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体との複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする。
ＩＴＩは寒天ゲル電気泳動において、α１とα２グロブリン領域の中間に泳動され、トリプシン阻害活性を有することで定義されている。ヒトＩＴＩは正常血清中に約0.4mg/mlの濃度で存在し、分子量23万の複合体で、３種類の異なるペプチド鎖、HC1、 HC2およびＨＩ−30からなる。HC1 とHC2 とはそれぞれ80kDa と85kDa の分子量を持ち、分子量の大きさから長鎖と呼ばれる。一方、45〜55kDa
の分子量を示すＨＩ−30は短鎖と呼ばれ、２個の Kunitz 型トリプシンインヒビタードメインからなり、プロテアーゼ阻害活性能はこれに起因する。この２個のKunitz型ドメインよりＨＩ−30をビクニン（bikunin)とも呼ぶ。ビクニンのＮ末端から10番目のセリン残基にはコンドロイチン−４−硫酸が結合し、このペプチド鎖はプロテオグリカンでもある。また、米田らはウシ胎児血清中にヒアルロン酸と強く結合する85kDaおよび83kDa のペプチド鎖から成るタンパク質を発見し、これをＳＨＡＰ(Serum Derived HyaluronanAssociated Protein) と命名した（J.Biol.Chem., 265,5247-5257 (1990))。その後の研究によりＳＨＡＰのペプチド鎖はＩＴＩの長鎖と同一で（J.Biol.Chem.,268, 26725-26730 (1993))、ヒアルロン酸と共有結合していることが明らかにされた（J.Biol.Chem.,270, 26657-26663 (1995))。
【００１２】
本発明で使用される抗ＩＴＩ抗体は、測定すべきＳＨＡＰ−ＨＡ結合体がヒト由来のものであるときは、ヒトＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を構成するＳＨＡＰ、すなわちヒトＩＴＩの長鎖であるHC1およびHC2 の一方または両方と反応するものであればよく、市販の抗ヒトＩＴＩ抗体（バイオピュア社、ダコ社、バインディングサイト社等）、市販のヒトＩＴＩ（バイオピュア社）をウサギ等に免疫して得られるポリクローナル抗体あるいはマウス、ラット、ハムスター等に免役して得られるモノクローナル抗体でもよい。また、ＨＡとの結合体として得られたＳＨＡＰを免疫して得られるポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体でもよい。また、ヒト以外の動物由来ＩＴＩあるいはＳＨＡＰを抗原としても、得られた抗体がヒトＩＴＩの長鎖を認識する抗体であれば本発明の抗ＩＴＩ抗体として使用できる。前述の市販の抗ヒトＩＴＩ抗体は入手が容易であるので好ましい。
【００１３】
本発明で使用されるヒアルロン酸受容体としては、ＣＤ４４、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質あるいはそれらの融合タンパク質が挙げられる。また、ＲＨＡＭＭ（Receptorfor hyaluronan-mediated motility)と呼ばれる膜タンパク質(Biochem. Biophys. Res. Commun. 108, 1016-1024 (1982))およびＲＨＡＭＭのヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質あるいはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸受容体として例示できる。
【００１４】
ＣＤ４４は白血球抗原の１種であり、ヒアルロン酸をリガンドとする接着分子であること、抗ＣＤ４４抗体との反応性等により定義されている。ＣＤ４４は細胞膜貫通型のタンパク質であり、多数の異性体（アイソフォーム）が存在することが知られている。例えば、ヒトの標準型のＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）は、248アミノ酸残基からなる細胞外領域、21アミノ酸残基からなる膜貫通領域および７２アミノ酸残基からなる細胞質内領域からなり、分子量は85〜90kDa であることが知られている。ＣＤ４４の細胞外領域は、アミノ末端側に軟骨プロテオグリカンコアタンパク質とリンクプロテインに相同性（例えば、ＣＤ４４Ｈの場合、約30％の相同性）のあるヒアルロン酸結合領域（例えばＣＤ４４Ｈの場合、アミノ末端から12〜101番目のアミノ酸残基からなる領域等）（以下、「ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域」という。）が存在し、さらにカルボキシル末端側の膜近位領域にコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカンあるいはそのオリゴ糖が結合したものも知られている。ＣＤ４４は、細胞と細胞、細胞と細胞間基質（ヒアルロン酸、コラーゲンＩ型、コラーゲンIV型、フィブロネクチン）等の接着を司る分子であり、白血球全般、繊維芽細胞、上皮細胞等の細胞膜上に発現していることが知られている。ＣＤ４４は、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型およびコラーゲンIV型のレセプター機能、癌転移への関与等多様の機能を有し、その一つとしてヒアルロン酸のレセプターとしての機能を有する。
【００１５】
なお、ＣＤ４４は、Pgp-1 、ECMRIII 、Hermes抗原、gp90HERMES、Ｈ−ＣＡＭ、ln(Lu)-relatedantigen、 Hutch-1、ln(Lu)-related p80、p80A3D8 およびp85等とも呼ばれている（Cell,61,1303-1313(1990)、J. Exp. Med., 172, 69-75(1990)、細胞工学別冊・ハンドブックシリーズ「接着分子ハンドブック」、第298-3076頁、1994年発行）。
【００１６】
一方、ヒト、ヒヒ、マウス、ラット等のＣＤ４４をコードするｃＤＮＡが知られており、遺伝子工学的手法によって得られたＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端とヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（すなわちヒンジ部、不変部のCH2部分およびCH3 部分）のカルボキシル末端とが結合した融合タンパク質が知られている（Cell,61,1303-1313(1990))。
【００１７】
本発明で使用されるＣＤ４４はヒアルロン酸との結合能を有し、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を有するものであれば特に限定されないが、例えば標準型ＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）、ＣＤ４４変異分子（ＣＤ４４Ｖ）、ＣＤ４４Ｅ、可溶性ＣＤ４４等が挙げられる。また、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含むＣＤ４４の部分タンパク質（例えば、ＣＤ４４の細胞外領域全体もしくはその一部分等）、またはＣＤ４４、ＣＤ４４の部分タンパク質もしくはＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域のアミノ酸配列を有するタンパク質と免疫グロブリン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等のタンパク質を結合させた融合タンパク質等が挙げられる。
好ましい融合タンパク質としては、例えば、ＣＤ４４の細胞外領域のカルボキシル末端と免疫グロブリンのアミノ末端とが結合したものが挙げられ、さらに好ましくは、ＣＤ４４の細胞外領域のカルボキシル末端とＩｇＧのＦｃフラグメントのアミノ末端とが結合した融合タンパク質等が挙げられる。
【００１８】
融合タンパク質は、ヒアルロン酸との結合能を有していれば多量体（例えば２量体等）を形成していてもよい。例えばＩｇＧまたはそのＦｃフラグメントを含む上記融合タンパク質であれば、通常、非還元条件下でジスルフィド結合によってＩｇＧ様の２量体を形成することができる。
【００１９】
ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク質または融合タンパク質の製造方法としては、以下に示す1)〜3)の方法を例示することができる。
1) ＣＤ４４を、タンパク分解酵素（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）で消化する等の公知の手段で分解後、ヒアルロン酸を結合した担体等を用いてヒアルロン酸との結合能を有する部分タンパク質を分離精製する方法。
2) 上記1)の操作において、さらに糖分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ、ヘパリチナーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ等）を作用させる等の方法で部分的にあるいは完全に糖鎖が除かれた部分タンパク質を得る方法。
3) 公知の融合方法（例えば、遺伝子工学的方法やハイブリッドタンパクを得る方法等）を用いて融合タンパク質を得る方法。
【００２０】
本発明で使用されるヒアルロン酸結合性タンパク質としては、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカン（例えば、軟骨プロテオグリカン（アグリカン）、バーシカン、ニューロカン等）、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカンのコアタンパク質（例えば、軟骨プロテオグリカンのコアタンパク質等）、これらの部分タンパク質、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン等が挙げられる。
【００２１】
ヒアルロン酸結合性タンパク質の製造法としては、公知の方法（Leurent et al, Anal.Biochem., 109, 386-394(1980)、特開平 4-26279号公報、Anal.Biochem., 149, 555-565 (1985)等）を用いればよい。例えば軟骨プロテオグリカンの部分タンパク質は、上記Leurentらの方法、特開平 4-26279号公報に記載の方法等にしたがって調製することができる。即ち、例えば軟骨から塩酸グアニジン等を用いてプロテオグリカンを可溶化して抽出し、透析したものにタンパク分解酵素（トリプシン等）を作用させてコアタンパク質を分解し、ヒアルロン酸結合担体（例えば、ヒアルロン酸を結合させた球状セルロース等）等を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより前記部分タンパク質を得る方法等が挙げられる。      
【００２２】
本発明において検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を抗ＩＴＩ抗体を用いて測定するには、通常いわゆるサンドイッチ法（特公平6-41952 等参照）が用いられる。すなわち、結合体中のＳＨＡＰと抗ＩＴＩ抗体との免疫学的親和性とＨＡのヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質に対する親和性を利用し、三者のサンドイッチ状複合体を形成させて複合体を測定する方法であり、通常、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質または抗ＩＴＩ抗体の一方を固相体に固着させ、該サンドイッチ状複合体を分離して測定する方法である。例えば、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体を、固相体に固着されたＣＤ４４と接触させ、次いで標識物質で標識された抗ＩＴＩ抗体と接触させることによって、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体と該ＣＤ４４と該標識物質で標識された抗ＩＴＩ抗体とを反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体からなる複合体を形成させ、前記複合体と遊離の該標識された抗ＩＴＩ抗体とを分離し、前記複合体中の標識物質を検出することにより検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法が挙げられる。
【００２３】
また、形成させた抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体の前記複合体に、抗ＩＴＩ抗体に特異的に結合する標識された抗イムノグロブリン抗体を接触させることによって、前記複合体と該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、その標識物質を検出することにより、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定することもできる。前記の抗ＩＴＩ抗体を直接標識する方法に比べ、入手の容易な標識された抗イムノグロブリン抗体を使用する方法の方が簡便であり、好ましい。なお、この方法で使用する抗イムノグロブリン抗体は、抗ＩＴＩ抗体を製造するためにＩＴＩを免疫した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識する抗体である。
【００２４】
上記サンドイッチ法による測定方法においては、固相体に固着する物質としてＣＤ４４の代わりにヒアルロン酸結合性タンパク質を使用することもできる。さらに、ＣＤ４４、ヒアルロン酸結合性タンパク質以外のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を用いることもできる。
前記サンドイッチ法において、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）の複合体形成順序は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である（「蛋白核酸酵素」別冊No.31、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。
【００２５】
これらのサンドイッチ法による本発明の測定方法において、ＣＤ４４等のヒアルロン酸受容体またはヒアルロン酸結合性タンパク質等のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を固着させる固相体としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が好ましい。
これらの固相体にＣＤ４４またはヒアルロン酸結合性タンパク質等のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。特に物理的吸着が、操作が簡便な点で好ましい。
【００２６】
また、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を固着させた固相体の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこへ検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体や他の分子種が固着すると、正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相体と接触させる前にブロッキング物質を添加してヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取できる血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００２７】
また、固相体に固着させたヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質に検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を結合させた後に、固相体の表面を洗浄液で洗浄して非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween) 系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等が挙げられる。
【００２８】
抗ＩＴＩ抗体または該抗体に免疫学的親和性を有する抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、アイソトープ(125 Ｉ、131 I 、3 Ｈ等) 、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。なお、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００２９】
前記の抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。
【００３０】
標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオキシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００３１】
本発明の測定方法においては、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度は、予め既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準液を用いてＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いる方法によって、定量することができる。
【００３２】
本発明の測定方法によれば、関節液、血液、血清、血漿、尿等の体液、細胞もしくは微生物の培養液等の液状試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量することができる。特に、後述の関節炎または肝疾患の診断に本測定法を用いる場合、血液、血清、血漿等を検体とすることができ、患者の負担を軽減することができる。なお、本発明の測定方法に用いるＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体は、予め精製されている必要はない。すなわち、検体中にヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカン、ＩＴＩおよびその他の各種タンパク質が含まれていても、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を選択的に測定することができるため、それらによって測定結果が影響されることはない。
【００３３】
（２）ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キット
本発明のサンドイッチ法によるＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットは、少なくとも抗ＩＴＩ抗体をキットの構成成分として含むものである。しかし、一般的には、標識物質で標識されたまたは標識されうる抗ＩＴＩ抗体とヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質（例えばＣＤ４４等のヒアルロン酸受容体もしくはヒアルロン酸結合性タンパク質）とから構成されるものである。このようなキットにおいて、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を予め固相体に固着されたものを使用すれば、上述した測定方法において、固相体に固着する操作を省くことができる。
【００３４】
すなわち、例えば本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定キットを用いて、固相体に固着させたＣＤ４４にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体を接触させ、次いで抗ＩＴＩ抗体と接触させることによって、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体からなる複合体を形成させ、さらにペルオキシダーゼ標識抗イムノグロブリン抗体を接触させることによって、前記複合体と該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、その複合体に含まれる標識物質（ペルオキシダーゼ）を検出することにより、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度を測定することができる。
【００３５】
前記キットには、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準品、標識物質の検出試薬、抗ＩＴＩ抗体を標識する試薬、抗ＩＴＩ抗体を検出する試薬（標識された抗イムノグロブリン抗体等）等を加えることができる。また、これらの成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
また、これらの成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００３６】
本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットを用いて関節液、血液、血清、血漿、尿、骨髄液等の検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を特異的に測定することができ、測定範囲も広く、かつ高感度である。
【００３７】
本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットを用いてヒトの血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定した場合、健常人は低値であり、変形性膝関節炎患者ではやや高く、リウマチ性関節炎患者では著しく高い値を示すことより、関節炎の診断を簡便に行うことができる。特に、リウマチ性関節炎か変形性膝関節炎かを正確に識別する診断法として非常に有効な診断用キットとなり得る。また、肝疾患患者では著しく高い値を示す傾向が見られることにより、肝疾患の診断法として非常に有効な診断用キットともなり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明のサンドイッチ法による測定方法の好ましい一形態を以下に説明する。  
まず、固相体にＣＤ４４を固着（コーティング）させる。固着方法としては、例えば、ＣＤ４４をpH７〜９程度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相体（例えばマイクロプレートのウェル）に加え、37℃程度で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して固着させる方法等を挙げることができる。
【００３９】
上記固着後、血清アルブミン等のブロッキング物質を添加して、37℃程度で30分〜２時間保存するか、常温（15〜25℃) で１〜２時間保存して、該ＣＤ４４が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。次いで、上記ＣＤ４４が固着した固相体に、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体試料を添加し、例えば、37℃で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、上記ＣＤ４４にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を結合させる。
【００４０】
その後、この複合体が結合した固相体を、トゥイーン系界面活性剤等を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）等の洗浄液で洗浄する。さらに、前記固相体に、標識物質で標識された抗ＩＴＩ抗体または抗ＩＴＩ抗体と標識物質で標識された抗イムノグロブリン抗体を添加して、例えば、37℃で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体に前記抗ＩＴＩ抗体（または抗ＩＴＩ抗体−抗イムノグロブリン抗体）を結合させる。この操作によって、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体からなる複合体を形成させる。次に、前記複合体の標識物質を検出してＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する。
【００４１】
別に、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準品の濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記検量線とを用いて、未知試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量する。
【００４２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【調製例１】
【００４３】
（融合タンパク質の調製）
ＣＤ４４の細胞外領域とヒト免疫グロブリン(Ig)のＦｃフラグメントとの融合タンパク質（以下、単に「融合タンパク質」ということがある）を、シード（B.Seed）らの方法（Cell, 61, 1303-1313(1990))に従って調製した。すなわち、ＣＤ４４の細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、その細胞内領域側（カルボキシル末端側）にヒトIgG1のＦｃフラグメントをコードするｃＤＮＡとそのアミノ末端側にＣＤ５のシグナル配列をコードするｃＤＮＡとをそれぞれ連結したｃＤＮＡ断片を作成し、これをＣＤＭ８ベクターに組み込み、ＤＥＡＥデキストランを用いる公知の方法でＣＯＳ細胞に移入して、融合タンパク質をＣＯＳ細胞に一過性に発現させた。ＣＯＳ細胞は無血清培地で培養し、細胞外に分泌した融合タンパク質を含む培養上清を回収した。融合タンパク質の精製は、その分子中のイムノグロブリン部位を利用し、プロテインＡ結合樹脂を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより行った。
【調製例２】
【００４４】
（ヒアルロン酸結合性タンパク質の調製）
ヒアルロン酸結合性タンパク質を、特開平4-262797号公報に記載の製造例（ヒアルロン酸結合性蛋白）の項に準じて調製した。即ち、牛鼻中隔軟骨から４Ｍ塩酸グアニジン溶液を用いて抽出操作を行い、次いで抽出物の上清を採取し、これを脱イオン水で透析した後、凍結乾燥して粗抽出物を得た。この粗抽出物をトリプシン消化後、ヒアルロン酸結合樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【調製例３】
【００４５】
(ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の調製)
ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を、特開平7-157500号公報に記載の実施例（ヒアルロナン結合性タンパク質の調製）の項に準じて調製した。即ち、リウマチ性膝関節炎患者の関節液を採取し、軽く遠心分離して不溶物を取り除き、ハンクス液によって５〜６倍に希釈した。これに１／10体積の４Mグアニジン塩酸塩溶液を加え、アジ化ナトリウムを微量加えた後、塩化セシウムを加えて50％(W/V) とした。超遠心チューブに入れて４℃に静置後、４℃、123,000×g の超遠心（タンパク質非解離条件下での超遠心；アソシエイティブ超遠心）を48時間行うことにより精製した。
【調製例４】
【００４６】
（血清検体の調製）
抗血液凝固剤を入れないで採決した血液３mlを、４℃に１時間静置した後、1,000 ×ｇ、10分間遠心処理することにより血清を得、これを血清検体とした。
【実施例１】
【００４７】
（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量）
調製例１で精製されたＣＤ４４の細胞外領域を含む融合タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水(pH7.2〜7.5 、二価イオン不含）（以下、ＰＢＳ（−）と略す）で、それぞれ２μg/mlに希釈し、この溶液50μl (100ng／ウエル）ずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウエルに加え、４℃で16時間保存することにより、均一にコーティングした。
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウエルの融合タンパク質が被覆されていない部分を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、生化学工業（株）販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。
【００４８】
次いで、このプレートを洗浄液（0.05％トゥイーン20（和光純薬工業（株）製）を含むＰＢＳ (−))で３回洗浄後、調製例３で精製された各濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準液(16〜4000ng/ml の各濃度）50μl を前記プレートに加え、３７℃で60分間静置して反応させた。なお、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ(−) （以下、「反応希釈液」という）を用いた。
【００４９】
この後、このプレートを前記洗浄液にて３回洗浄し、反応液で希釈した１μg/ml抗ＩＴＩ抗体（ダコ社製）25μlおよび反応液で 1,250倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（生化学工業（株）販売）25μl を加え、37℃で60分間静置して反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（モス社製：以下、ＴＭＢと略す）を50μl加え、37℃で15分間反応させ、発色させた。
【００５０】
発色後、プレートに１Ｎ−HC1 を50μl 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長 450nmでの吸光度（対照波長630nm)(A450/630)をウェルリーダーSK601(生化学工業（株）販売）にて測定した。得られた結果を図１に示す。
これにより、本発明の測定法によれば、16〜4,000ng/mlのＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量が可能であることがわかる。
また、該測定法で用いたＣＤ４４の代わりに調製例２で精製したヒアルロン酸結合性タンパク質の溶液をＰＢＳ (−) で10μg/mlに希釈して使用することも可能である。得られた結果を図２に示す。この方法では64〜4,000ng/mlのＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量が可能であり、ＣＤ４４を用いた場合よりやや感度が劣る。
【実施例２】
【００５１】
（ヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼの測定系への影響）
20μg/mlのヒアルロン酸を共存させた10倍希釈血清検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量を実施例１の方法で測定し、測定結果へのヒアルロン酸（ＨＡ）共存の影響を検討した。また、100mU/mlのヒアルロニダーゼで10倍希釈血清検体を37℃で60分間処理した後、実施例１の方法で測定し、測定結果への影響を検討した。無処理の血清検体を測定して得られたＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度を100％としてヒアルロン酸存在下あるいはヒアルロニダーゼ処理した血清検体から得られた測定値を百分率（％）に換算した。ヒアルロン酸結合性タンパク質を固着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図３に、ＣＤ４４を固着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図４に示した。
これらの結果から、本発明の測定方法はヒアルロン酸の共存あるいはヒアルロニダーゼ処理により著しく阻害を受ける。このことはヒアルロン酸結合性タンパク質あるいはＣＤ４４を固着したプレートと検体との反応でＳＨＡＰ−ＨＡ結合体のヒアルロン酸部分を特異的に検出していることが示された。
【実施例３】
【００５２】
（健常人および関節炎患者の血清中ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量）
健常人（10例）、変形性膝関節炎（以下ＯＡと略す）患者（10例）、リウマチ性関節炎（以下ＲＡと略す）患者（10例）の各血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量を実施例１に記載した方法にて行った。ヒアルロン酸結合性タンパク質を固着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図５に、ＣＤ４４を固着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図６に示した。また、これらの測定結果を表１に示した。表１、図５および図６より、ＲＡ患者の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の平均値は、健常人に比べ、ヒアルロン酸結合性タンパク質法で約320倍、ＣＤ４４法で約560 倍の高値を示した。さらにＯＡ患者の血清に対してもＲＡ患者の血清は前者の方法で約115 倍、後者の方法で約380 倍の高値を示した。これらの結果より、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の値はＲＡとＯＡとの識別が可能な診断マーカーとして有用であることが示された。
【００５３】
[表１]
健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の血清中の
ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体（タンパク質）含量
____________________________________＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
測定方法     平均 (μg/ml)   ±Ｓ．Ｄ
____________________________________＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ヒアルロン酸結合性タンパク質法
健常人                       1.17            0.39 (n=10)
ＯＡ患者                     3.28            4.54 (n=10)
ＲＡ患者                   379.49          445.96 (n=10)
__________________________＿_________＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿_
ＣＤ４４法
健常人                       0.20            0.02 (n=10)
ＯＡ患者                     0.29            0.13 (n=10)
ＲＡ患者                   111.72           90.88 (n=10)
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
【実施例４】
【００５４】
（健常人、関節炎患者及び肝疾患患者の血清中ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量と比較）
健常人（87例）、関節炎患者（OA:42 例、RA:82 例）及び肝疾患患者（54例）の各血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量を、実施例１に記載した方法に準じ、ヒアルロン酸結合タンパク質を固着したプレートを用いた測定方法によって行った。なお、測定値はｕｎｉｔに変換して結果を図７に示した。図中に記載のunit/mlとは、450nm における吸光度が０．５となる標準検体のＳＨＡＰ−ＨＡ濃度を１unit/ml としたとき、測定検体のこの標準検体に対する希釈率の逆数として表した値である。当該単位を用いて標準検体の検量線を作成した後、検体の測定値のunitへの変換を前記検量線を用いて行った。ＲＡ患者群同様に肝疾患患者群も血清中ＳＨＡＰ−ＨＡ量が高値を示す傾向が見られた。この結果より、本発明測定法はＲＡの識別と同様に肝疾患の識別が可能な診断マーカーとしても有用であることが示唆された。
また、仮に２unit/ml を血中ＳＨＡＰ−ＨＡ濃度の正常値と異常値の臨界値とした場合の各検体の異常値を示す割合は、正常（健常人）が1.10％（87検体中１検体）、ＯＡ患者が19.00％（42検体中８検体）、ＲＡ患者が 74.40％（82検体中61検体）及び肝疾患患者が 42.59％（54検体中23検体）となり、診断マーカーとしての有用性が裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方法によりＩＴＩに対する抗体およびヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を用いた方法で血液等に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を簡便に測定することが可能であり、かつ、関節炎の診断においてＯＡかＲＡかを正確に識別し、また肝疾患の検出を行う診断法として有効な方法である。また、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の生理的意義は不明であるが高転移性ガン細胞は多量にヒアルロン酸を持ち、血清存在下で培養すると細胞周囲のヒアルロン酸にＳＨＡＰが結合し、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体が形成することが報告されている(生化学、67, 458-465 (1995)）。このことより、癌の転移にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体が関与している可能性が考えられ、本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定法は癌転移機構の解明および医薬品開発の有用な評価方法となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例１のＣＤ４４を用いて測定したＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量の標準曲線を示す。
【図２】実施例１のヒアルロン酸結合性タンパク質を用いて測定したＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量の標準曲線を示す。
【図３】実施例２の検体（血清）中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼの阻害作用（ヒアルロン酸結合性タンパク質使用）を示す。
【図４】実施例２の検体（血清）中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼの阻害作用（ＣＤ４４使用）を示す。
【図５】実施例３の健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度を示す（ヒアルロン酸結合性タンパク質使用）。
【図６】実施例３の健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度を示す（ＣＤ４４使用）。
【図７】実施例４の健常人、ＯＡ患者、ＲＡ患者および肝疾患患者の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度(unit/ml) の比較を示す（ヒアルロン酸結合性タンパク質使用）。
【図１】
2006126216.tif 000002
【図２】
2006126216.tif 000003
【図３】
2006126216.tif 000004
【図４】
2006126216.tif 000005
【図５】
2006126216.tif 000006
【図６】
2006126216.tif 000007
【図７】
2006126216.tif 000008