(57)【要約】【課題】      マラリアに対する免疫感作のためのペプチドを提供する。【解決手段】  ４種類の熱帯熱マラリア原虫抗原、スポロゾイト周囲タンパク質、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質、スピロゾイト肝細胞結合抗原および肝臓期抗原−１から、ヒト白血球抗原クラス１分子、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ１７に対する実際のまたは潜在的細胞障害性Ｔリンパ球エピトープとして、８〜１１ｍｅｒペプチドを同定する。マラリアに対する免疫感作のためのワクチンは、これらのペプチドまたはそれらをコードするオリゴヌクレオチドを含む。ある選択された抗原または微生物に対して一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法は、スカシガイのヘモシアニン存在下において該選択された抗原または微生物と一緒にリンパ球をエクスビボでインキュベートすることを含む。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示される抗原のサブユニットである、規定のＨＬＡ（ヒト白血球抗原）クラスＩ分子に対するエピトープまたは潜在的エピトープであるペプチド、及びこれらの配列を含むより長いペプチドであって、スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｐ）、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質（ｔｒ）および肝臓期抗原−１（ｌｓ）の３種類の熱帯熱マラリア原虫抗原から選択されるペプチド。
【表１】
2006180865.tif 000006
【請求項２】
請求項１に記載の配列の少なくとも二つを含むペプチド。
【請求項３】
脂質テイルを有するＮ末端またはＣ末端を有する請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
８〜１００個のアミノ酸残基を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ある選択された抗原または微生物に対して一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法であって、Ｔリンパ球のＣＤ４５ＲＡ+サブセットを選択的に刺激するＫＬＨ（スカシガイのヘモシアニン）または任意の他の物質の存在下において該選択された抗原または微生物と一緒にリンパ球をエクスビボでインキュベートすることを含む方法。
【請求項７】
ＩＬ−７（インターロイキン−７）および／またはＩＬ−２（インターロイキン−２）がインキュベーション中にさらに存在する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
規定の抗原のサブユニットである、ＨＬＡ−Ｂ７対立遺伝子を有する個体のマラリアに対する免疫感作のための細胞障害性Ｔリンパ球を誘導するための医薬を製造するための、以下のペプチド、
【表２】
2006180865.tif 000007
およびその配列を含むさらに長いペプチド、並びに前記ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドのいずれか一つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアに対する免疫感作のためのペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
ＨＬＡクラスＩ分子のペプチドエピトープの同定は、いくつかの生物医学的科学分野にとって重要である。第一に、このようなエピトープは、感染微生物に対して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介された免疫を与えるように設計されたワクチンの中心成分である。これは、細胞障害性Ｔリンパ球が作用する方法の結果であり；それらは、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示された８〜１１アミノ酸長さのペプチドエピトープを認識する。第二に、ＨＬＡクラスＩ分子上の腫瘍特異的ペプチドを認識しうるＣＴＬをインビボかまたはインビトロで誘導することによって、新形成腫瘍を回復させるまたは治癒させるかもしれない可能性はますます興味深い。第三に、自己免疫疾患において認識されるこのようなエピトープの同定は、病原を洞察させ且つこれらの疾患を治療する新規の具体的な方法を示唆すると考えられる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、第一に、本発明者が特定のＨＬＡクラスＩ分子に対するエピトープまたは潜在的エピトープとして同定しているマラリア寄生虫熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来ペプチドの同定に関する。様々な根拠（参考文献１および１６で引用された）が、ＣＴＬは肝臓期の感染に対して作用することによってこの寄生虫感染および疾患に対する免疫においてある役割を果たすということを示唆している。したがって、これらのエピトープは、熱帯熱マラリア原虫に対して免疫を与えるように設計されたワクチン中に包含するのに価値があるであろう。更に、この研究は、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質（ＴＲＡＰ2）である熱帯熱マラリア原虫抗原中のＣＴＬエピトープを初めて同定し、そしてそれによって、熱帯熱マラリア原虫マラリアに対するＣＴＬ誘導ワクチンの有用な成分としてＴＲＡＰおよび／またはＴＲＡＰ由来ペプチドを同定する。
【０００４】
本発明は、第二に、細胞障害性Ｔリンパ球応答をインビトロで誘導する新規の方法の使用によってＣＴＬエピトープを同定する並びにＣＴＬ系およびクローンを生産する新規の方法に関する。
【０００５】
発明
一つの態様において、本発明は、以下の表に記載された、規定のＨＬＡクラスＩ分子のエピトープまたは潜在的エピトープである８〜１１ｍｅｒペプチド、それらの保守的変異型、および指示された抗原のサブユニットであるこれらの配列を含む更に長いペプチドを提供する。これらのペプチドは、概して、８〜１００アミノ酸残基長さであること、および表に示された配列は存在する主要な機能性エピトープであることが考えられる。請求の範囲それ自体は、全体としての抗原に対して記載されたのでも、抗原の大部分を構成する任意のフラグメントに対して記載されたのでもない。
【０００６】
これらのペプチドの二つまたはそれ以上を配列中で互いに結合することができる。ペプチドは、ＣＴＬ誘導をインビボで促進することが知られている修飾である脂質テイル含有ＮまたはＣ末端を有していてもよい。
【０００７】
更に含まれるものは、規定のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドという用語は、ここでは、約２４〜約３００ヌクレオチド残基を有する核酸鎖を包含するのに用いられる。
【０００８】
更に含まれるものは、マラリアに対する免疫感作のための、定義された通りのペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含むワクチンである。
【０００９】
もう一つの態様において、本発明は、ある選択された抗原または微生物に対して一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法を提供する。この方法は、Ｔリンパ球のＣＤ４５ＲＡ+サブセットを選択的に刺激するＫＬＨ（スカシガイのへモシアニン）または任意の他の物質の存在下において該選択された抗原または微生物と一緒にリンパ球をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートすることを含む。
【００１０】
この方法において、ＫＬＨまたは他のアジュバントは、所望のＣＴＬ応答を刺激するのに適当な濃度で用いられ、その最適濃度は実験によって容易に決定されうる。好ましくは、ＩＬ−７（インターロイキン−７）および／またはＩＬ−２（インターロイキン−２）が、前記インキュベーション中に更に存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ａ節
熱帯熱マラリア原虫ペプチドおよびエピトープの同定
本発明者は、最近、熱帯熱マラリア原虫のＣＴＬエピトープおよび潜在的ＣＴＬエピトープを同定する新規の方法を記載した1。これは、簡単にいうと、（１）ある特定のＨＬＡクラスＩ分子に対して結合したペプチドのモチーフを決定し、（２）このモチーフと一致する熱帯熱マラリア原虫抗原由来ペプチドを合成し、（３）これらのペプチドがそのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対して結合するかどうかを、ＨＬＡアセンブリ検定として知られる結合検定を用いて試験し、そして（４）マラリアと接触があった個体からのリンパ球が、適当なインビトロ再刺激および培養後にこれらのペプチドをエピトープとして認識できるかどうかを試験することから成った。その研究において、本発明者は、２種類のＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡ−Ｂ５３およびＨＬＡ−Ｂ３５に対するペプチドエピトープおよび潜在的ペプチドエピトープを同定した。ここで、本発明者は、その研究を更に４種類のＨＬＡクラスＩ分子：ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ１７にまで広げた。これらのＨＬＡクラスＩ分子のエピトープであるかまたは潜在的エピトープであることが示された５２種類のペプチドが同定される。
【００１２】
詳細な説明
溶離ペプチドのモチーフ
ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７およびＨＬＡ−Ｂ８のペプチド結合モチーフが記載された。ＨＬＡ−Ａ２については、結合したペプチドの２位および９位で、すなわち、２位のロイシン、イソロイシンおよびメチオニンに対して並びに９位のバリン、ロイシンおよびイソロイシンに対して強い選択が見られた3,4。ＨＬＡ−Ｂ７については、好ましい残基は２位のプロリンおよび９位の疎水性残基であった。ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが好ましい疎水性残基であった5。ＨＬＡ−Ｂ８については、好ましい残基は３位、５位および９位で見られた6。３位および５位にはリシンまたはアルギニンが好ましく、９位にはロイシンまたはイソロイシンまたはバリンが好ましい。ＨＬＡ−Ｂ１７に対して結合したペプチドのモチーフは報告されていないため、本発明者は、細胞系ＣＩＲ−Ｂ３５の代わりに細胞系ＣＩＲ−Ｂ５８を用いて、ＨＬＡＢ３５について記載のように1正確にこれを決定した。したがって、決定されたペプチドモチーフは、厳密に、ＨＬＡ−Ｂ５７と一緒にＨＬＡ−Ｂ１７のサブタイプを構成するＨＬＡ−Ｂ５８についてである。ＨＬＡ−Ｂ５７およびＨＬＡ−Ｂ５８の一次アミノ酸配列は極めて似ており、結合したペプチドの種類が、少なくともそれらの重要なアンカー残基において極めて似ているらしいということを示している。したがって、本発明者は、ＣＩＲ−Ｂ５８について決定されたモチーフをＨＬＡ−Ｂ１７についてのモチーフと称する。ＨＬＡ−Ｂ１７については、好ましいアミノ酸が２位および９位で観察され、２位にはセリンおよびトレオニンが、および９位には疎水性残基（上記Ｂ７についてと同様に定義される）が好ましかった。
【００１３】
ペプチド合成および結合検定
ＨＬＡ−Ｂ３５およびＨＬＡ−Ｂ５３エピトープの同定について前に記載されたように1、４種類の熱帯熱マラリア原虫前赤血球抗原：ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、ＬＳＡ−１およびＳＨＥＢＡの一次アミノ酸配列からこれらの４種類のモチーフに対応するようにペプチドを合成した。１００種類を越えるペプチドを合成した。結合検定7は、選択されたペプチドについて、それらがＨＬＡ−２、Ａ−Ｂ７、−Ｂ８または−Ｂ５８に対して結合するかどうかを決定するため、トランスフェクションされていてないＴ２細胞系（ＨＬＡ−Ａ２について）を用いて、或いはＨＬＡ−Ｂ７によって（ＨＬＡ−Ｂ７に対する結合を評価するのに用いられる）、またはＨＬＡ−Ｂ８によって（ＨＬΛ−Ｂ８に対する結合を評価するのに用いられる）、またはＨＬＡ−Ｂ５８によって（ＨＬＡ−Ｂ５８に対する結合を評価するのに用いられる）トランスフェクョンされたＴ２細胞系を用いて行われた。
【００１４】
細胞障害性Ｔリンパ球検定
特定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対して結合することが分かったペプチドのＣＴＬ認識について、前に記載されたように1、マラリアと接触があったガンビア人からのリンパ球を用いる検定で試験した。ペプチド結合モチーフに対応するように合成された少数のペプチドは、関連するアセンブリ検定で試験せず、ＣＴＬ認識についてのみ試験した。全員がマラリアと接触があったガンビア人の成人８２人およびガンビア人の子供５３人からの細胞を、これらの研究の過程で用いた。子供および成人は、前に記載の1細胞または分子技術を用いてＨＬＡ型が決定された。ペプチドを、単独かまたは記載のような1プールで１０〜１００μＭの濃度で細胞と一緒にインキュベートした。ペプチドは、再刺激期間中に細胞と一緒に放置される（報告されたように1）かまたは１時間後に洗浄除去されうる。
【００１５】
細胞を１〜３週間培養した後、標準的なＣＴＬクロム放出検定1を、試験されるペプチドによって予めパルスされたＨＬＡ適合または自己Ｂ細胞系標的を用いて行なった。ペプチドのＣＴＬ認識について、単独でかまたはプールで試験した。１０％またはそれより大を、有意レベルの特異的溶解と見なした。
【００１６】
同定されたペプチド：ＣＴＬエピトープ
論及された全ペプチドの配列を表に示す。
（ｉ）ＨＬＡ−Ａ２
二人のガンビア人が、ＨＬＡ−Ａ２ペプチドに対して正のＣＴＬ応答を示した。一人（Ｚ６２）は、３種類のＴＲＡＰペプチド、ｔｒ２６、ｔｒ２９およびｔｒ３９のプールを認識した。これら３種類のペプチドからエピトープであるものを決定するのに十分な細胞は利用できなかった。しかしながら、二人目の成人（Ｚ６０）もまたこの３種類のペプチドのプールを認識し、そして続いて、ｔｒ３９にパルスされた標的細胞の有意の溶解を示したが、ｔｒ２６−およびｔｒ２９−では示さなかった。したがって、ｔｒ３９はＨＬＡ−Ａ２限定エピトープである。両人とも、ＨＬＡ−Ａ２のサブタイプＨＬＡ−Ａ＊０２０１であった。これらのペプチドの３種類全部が、アセンブリ検定においてＨＬＡ−Ａ２に対して結合した。
【００１７】
マラリアと接触があったガンビア人からのリンパ球を用いる細胞障害性Ｔリンパ球検定から成る更に別の研究は、表に挙げた以下のペプチドが細胞障害性Ｔリンパ球エピトープであることを確証した。ＨＬＡ−Ａ２を有する個体については、少なくとも一つの個体からのＣＴＬがペプチドｔｒ２６、ｔｒ２９、ｃｐ３６、ｃｐ３７、ｃｐ３８およびｃｐ３９を認識することが分かった。ＨＬＡ−Ａ２に対するこれらのエピトープは、前に同定されたｔｒ３９とは別のものである。
【００１８】
（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ７
ＨＬＡ−Ｂ７を有する一人の子供からのＣＴＬは、ペプチドプールｃｐ６、ｃｐ６．１およびｃｐ６．２によって予めパルスされたＨＬＡ−Ｂ７適合標的細胞の有意の溶解を示した。これらのペプチドは、スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子8の同一の部分の対立遺伝子変異体によってコードされており、この配列をＨＬＡ−Ｂ７限定エピトープとして同定する。３種類全部のペプチドが、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ７に対して結合した。一人の成人（Ｚ１７４）からのＣＴＬもまた、ｃｐ６、ｃｐ６．１、ｃｐ６．２およびcｐ２１を含む４種類のペプチドのプールを認識した。
【００１９】
（ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ８
一人の成人（Ｚ４２）からのＣＴＬは、ｔｒ４２、ｔｒ４３、ｔｒ４４およびｔｒ４５を含むペプチドプールの有意の溶解を示した。これら４種類のペプチドの内の二つ、ｔｒ４２およびｔｒ４３は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ８に対して結合した。つぎに、同一のＣＴＬ系はｔｒ４２の特異的溶解を示し、これがＨＬＡ−Ｂ８限定ＣＴＬエピトープと定義された。もう一人の成人（Ｚ１３０）からのＣＴＬは、ｔｒ４３ペプチドの特異的溶解を示し、これがＨＬＡ−Ｂ８のもう一つのＣＴＬエピトープとして同定された。ｔｒ４２およびｔｒ４３エピトープは重なり合っている。他の二人の成人（Ｚ８０およびＺ１６９）は、４種類のＣＰＳペプチド、ｃｐ４３、ｃｐ４４、ｃｐ４５およびｃｐ４６のプールによって予めパルスされた標的細胞の有意の溶解を示した。これら４種類の内の一つ、ｃｐ４３だけがＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ８に対して結合し、これがＨＬＡ−Ｂ８限定ＣＴＬエピトープとして同定された。
【００２０】
（ｉｖ）ＨＬＡ−Ｂ１７
一人の成人からのＣＴＬは、細胞培養の２週間後に、ＴＲＡＰペプチド（ｔｒ４９〜６４）のプールの１８％の特異的溶解を示した。１週間後、ｔｒ５７、ｔｒ５８、ｔｒ５９、ｔｒ６０が一つのサブプールを構成し且つｔｒ６１、ｔｒ６２、ｔｒ６３およびｔｒ６４がもう一つのサブプールを構成しているペプチドの二つのサブプールに対して有意の溶解が観察された。これらのデータは、これらのＴＲＡＰペプチドサブプールのそれぞれに一つのＣＴＬエピトープが存在することを示している。二人の成人（Ｚ６１およびＺ６３）は、肝臓期抗原（ＬＳＡ−１）からのペプチドの多量のプールの有意の溶解を示し、これらのペプチド中に少なくとも一つのＣＴＬエピトープが存在することを示した。このプールは、以下の１３種類のペプチド：ｌｓ３６、ｌｓ３７、ｌｓ３９、ｌｓ４０、ｌｓ４２、ｌｓ４５、ｌｓ４８、ｌｓ４９、ｌｓ５０、ｌｓ５１、ｌｓ５３、ｌｓ５４、ｌｓ５５を含んだ。
【００２１】
追加のペプチド
上記で同定されたこれらのエピトープの他に、追加のペプチドが以下のように「潜在的エピトープ」として同定された。「潜在的エピトープ」という呼称は以下のように正当化される。これらのペプチドはいずれも、ＣＴＬ認識の標的であることが示されている抗原に由来する。それらは、更に、特定のＨＬＡ−クラスI分子に対して高親和性で結合することができる。それらは、マラリアと接触があった個体から増殖したＣＴＬによって認識されることは示されていないが、関連するクラスＩ分子に対して結合するそれらの能力は、それらがインビボのマラリア感染肝細胞の表面上に提示されるらしいことを示している。したがって、マラリアと接触があった個体においてこれらのペプチドに対する検出可能な量のＣＴＬが見出されなかったとしても、これらのペプチドに対するＣＴＬの誘導は、熱帯熱マラリア原虫マラリアに対して免疫感作する有用な手段でありうる。
【００２２】
（ｉ）ＨＬＡ−Ａ２
以下のペプチド、ｌｓ１０、ｌｓ１１、ｌｓ１９、ｌｓ２３は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ａ２に対して結合することが示されており、したがって、潜在的ＣＴＬエピトープである。ペプチドｃｐ３６はまた、マラリアと接触がなかった個体において一次ＣＴＬ応答を誘導することができた（以下を参照されたい）。
【００２３】
（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ７
以下のペプチド、ｃｐ２１、ｌｓ６、ｔｒ６、ｔｒ１３、ｔｒ１５、ｔｒ２１、ｓｈＬ ｓｈ６は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ７対して結合することが示されており、したがって、潜在的エピトープである。
【００２４】
（ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ｂ１７
以下のペプチド、ｃｐ４８、ｃｐ５５、ｃｐ５６および、ＨＬＡ−Ｂ１７を有する二人によって認識されたプール中に存在している上記に挙げられた１３種類のｌｓペプチド全部は、ＨＬＡアセンブリ検定においてＨＬＡ−Ｂ１７対して結合することが示されており、したがって、潜在的エピトープである。
【００２５】
マラリアワクチンにおけるペプチドｔｒ４３、ｃｐ３６およびｃｐ３６の変異体（ｃｐ３７〜３９）の潜在的有用性のもう一つの根拠を以下に示し、そこにおいて本発明者は、マラリアと接触がなかった個体からこれらのペプチドに対するＣＴＬをインビトロで生じさせることができるということを示している。
【００２６】
この研究は、ＴＲＡＰを、風土病性マラリアと接触があった個体において細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導する熱帯熱マラリア原虫抗原として同定する。ＴＲＡＰは、スポロゾイト9並びに血液期マラリア寄生虫で発現され、したがって、感染肝細胞中に存在するであろう。ここで、本発明者は、ＴＲＡＰが、３種類の極めて一般的なＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ２、−Ｂ８および−Ｂ１７）に対するＣＴＬエピトープを有し、したがってＴＲＡＰに対するＣＴＬの誘導は、熱帯熱マラリア原虫に対する有効なＣＴＬ誘導ワクチンの重要な要件でありうることを示す。
【００２７】
抗原全体を用いるよりもエピトープまたは一定量のフランキング配列を有するエピトープを用いて、より良いＴＣＬ応答をインビボで誘導することができるという根拠が存在するため、ここで用いられるエピトープは、インビボでのＣＴＬ応答の誘導に特に価値がありうる15。
【００２８】
本明細書は、熱帯熱マラリア原虫寄生虫と接触があったヒトにおける抗原ＴＲＡＰに対するＣＴＬ応答の存在を初めて同定するものである。齧歯類マラリアの研究からおよび間接的にはヒト熱帯熱マラリア原虫マラリア16の研究から、ＣＴＬは防御的役割を果たしているらしいことが知られているが、これらのＣＴＬの標的抗原は明らかではなかった。ヒトにおけるＣＴＬ応答の標的としてＴＲＡＰを同定することにより、本発明者は、それを、防御的ＣＴＬ応答を誘導するように設計されたワクチン中に包含するのに好都合な抗原として同定している。更に、本発明者は、ここで、ＴＲＡＰが、コーカサス人においては最も支配的なＨＬＡ−Ａまたは−Ｂ分子である極めて一般的なクラスＩ抗原ＨＬＡ−Ａ２に対する保存ＣＴＬエピトープを含むことを示し、コーカサス人集団のＣＴＬによる免疫感作に特に重要なＴＲＡＰを製造する。
【００２９】
ここで同定されたＣＴＬエピトープを用いてヒトにおいてインビボで免疫応答を刺激することができるいくつかの手段がある。ペプチドかまたはそれらを含む一層長いペプチドは、単独でまたはアジュバントと一緒に、例えば、不完全フロイントアジュバント17若しくはＱＳ−２１18若しくはＮＡＧＯ19若しくはＡＦ20と一緒に、またはインビボでＣＴＬ誘導を促進することが示されている手段である付加された脂質テイルを含むペプチドとして用いることができる。或いは、エピトープは、それらをコードしているヌクレオチドを、組換え体Ｔｙ−ウイルス様粒子22または組換え体Ｂ型肝炎ウイルス抗原粒子23などの粒子をコードする遺伝子中に組換えることによって供給することができる。或いは、これらのエピトープをコードしているヌクレオチドを、ワクシニアウイルスまたは弱毒化ワクシニアウイルス24などの組換え体ウイルス中に包含させることができる。もう一つの手段は、これらのエピトープをコードしているヌクレオチドを有する組換え体サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの組換え体細菌を生じることである25。もう一つの手段は、同定されたエピトープをコードしているヌクレオチドを、免疫感作後にこれらのエピトープを発現することができるＤＮＡワクチン26などの発現ベクター中に包含することである。最後に、これらのエピトープをコードしているリボヌクレオチドをＲＮＡ系ワクチン27として用いて、これらのエピトープをインビボで発現することができる。
【００３０】
Ｂ節
二次ＣＴＬ応答をインビトロで誘導する方法
様々な感染微生物に対する二次（すなわち想起）ＣＴＬ応答は、現在（例えば、マラリアについて上記に記載のように）検出されうるが、ＣＴＬは、抗原または微生物と接触がなかった個体からこの方法では増殖させることができない（参考文献１および未公開データ）。本発明者は、ここで、「一次」ＣＴＬを、すなわち、予め感作されなかった個体からのＣＴＬを増殖させる新規の方法を記載する。この方法は、各種方法において、すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子に対して結合するペプチドのプール中から潜在的エピトープを同定するのに；細胞表面上のＨＬＡ分子によって提示されたペプチドをＣＴＬ検定を用いて同定するのに；感染性または腫瘍性疾患の治療のためのインビボ治療使用に有用でありうる細胞系およびクローンを生じさせるのに用いることができる。本発明者は、熱帯熱マラリア原虫由来の２種類のペプチドに対して、この寄生虫と接触がなかったまたは感染しなかった３個体のリンパ球からＣＴＬ系およびクローンを生じさせることを記載することによってこの方法を実証する。
【００３１】
一次ＣＴＬ応答をインビトロで誘導するためのここで記載された方法は、癌免疫療法において特に有用でありうる。マウスでの研究は、エクスビボ培養されたＣＴＬによる治療の可能性を実証し28、そしてヒト腫瘍特異的ＣＴＬは、黒色腫および腎細胞癌の患者からの末梢血または腫瘍浸潤性リンパ球において同定されている29,30。更に、ウイルス抗原エピトープに対するインビトロでのＣＴＬの誘導は、ＨＩＶなどのウイルス感染の治療において有用でありうる31。
【００３２】
詳細な説明
マラリアと全く接触がなかった個体からの末梢血単核細胞をフィコール・ハイパクーで分離し、そして２０〜１００μＭのペプチドによって予め２時間感作した。ＨＬＡ−Ａ２の２個体の場合、ペプチドはｃｐ３６であり；ＨＬＡ−Ｂ８の１個体の場合、ペプチドはｔｒ４３であった。次に、細胞を１回洗浄し、そして５００万個の細胞を２ｍｌウェル中（５％ＣＯ2の標準的な給湿インキュベーター中）において、自己熱失活ヒト血清およびスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア、米国）２μｇ／ｍｌを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、英国）中でインキュベートした。後者の添加は、これがＣＤ４ Ｔリンパ球のＣＤ４５ＲＡ+（ナイーブ）サブセットを選択的に刺激するという本発明者の以前の教示10,11に基づいた。このＣＤ４ Ｔリンパ球サブセットは、従来、ＣＤ８ Ｔ細胞活性を促進することが分かっている12。
【００３３】
７２時間後、インターロイキン−２（シータス（Ｃｅｔｕｓ）、カリフォルニア、米国）を１０単位／ｍｌの濃度で加え、細胞を更に４日間培養した。次に、５０００個の細胞を、１０％自己ヒト血清を含むα−ＭＥＭ １５０μｌ中において、最初の刺激に用いられたものと同一のペプチド２０μＭ中で予め１時間感作された１００，０００個の照射自己末梢血リンパ球によって再刺激した後、１回洗浄した。翌日、３単位のＩＬ−２をウェルに加え、そしてインキュベーションを更に８日間続けた。次に、標準的なＣＴＬ検定を、エフェクター対標的比率５〜１０：１で行った。１０％過剰のペプチド特異的溶解が５〜１５％のウェルで観察された。このＣＴＬ活性はペプチド特異的で且つＣＤ８+リンパ球に依存性であった。ｃｐ３６の場合、ＣＴＬ応答はＨＬＡ−Ａ２．１に限定されることが分かった。ペプチドｔｒ４３の場合、ＣＴＬ応答はＨＬＡ−Ｂ８に限定された。
【００３４】
【表１−１】
2006180865.tif 000002
【表１−２】
2006180865.tif 000003
【００３５】
＊ペプチドは、二次細胞障害性Ｔリンパ球応答に対するエピトープとして同定された。
表：特定のＨＬＡクラスＩ分子に対するＣＴＬエピトープとしてまたは潜在的ＣＴＬエピトープとしてここで同定された４種類の熱帯熱マラリア原虫抗原、スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｐ）、トロンボスポンジン関連匿名タンパク質（ｔr）、スピロゾイト肝細胞結合抗原（ｓｈ）および肝臓期抗原−１（ｌｓ）からのペプチド。エピトープを肉太活字で示す。公開されたアミノ酸配列（ＣＳＰ−参考文献１３；ＬＳΛ−１−参考文献１４；ＴＲＡＰ−参考文献２）中のペプチドの最初のアミノ酸の位置を示す。ｔｒ５７は１１アミノ酸長さであることに注目されたい。標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。
【表２−１】
2006180865.tif 000004
【表２−２】
2006180865.tif 000005