(57)【要約】【課題】  本発明は、自己免疫疾患を治療する技術を確立すること。自己免疫疾患の発症について、客観的かつ正確な診断を可能とするための判定方法および自己免疫疾患の治療法などを確立すること。【解決手段】  自己免疫疾患誘導剤、および該自己免疫疾患誘導剤を用いた自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法を提供する。さらに、自己免疫疾患の発症の判定方法および自己免疫疾患の治療剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子を含む、自己免疫疾患誘導剤。
【請求項２】
前記ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子が、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、Staphylococcal enterotoxin B （ＳＥＢ）またはα-galactosylceramide （α−ＧＣ）である、請求項１に記載の自己免疫疾患誘導剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含する、自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項４】
被験体サンプル中のアネルギーに陥らない細胞を検出する工程を包含する、自己免疫疾患の判定方法。
【請求項５】
自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法であって、
被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる工程、および
該ナチュラルキラーＴ細胞を候補因子とともにインキュベートする前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項６】
自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法であって、
被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞を候補因子の存在下または非存在下にてインキュベートする工程、および
該ナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法であって、
請求項３に記載の方法によって作製したモデル動物に候補因子を投与する工程、
該モデル動物からナチュラルキラーＴ細胞を採取する工程、および
該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを測定する工程
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法によってスクリーニングされた、自己免疫疾患の治療剤。
【請求項９】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子を含む、自己免疫疾患誘導剤。
【請求項１０】
前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子が卵白アルブミン（ＯＶＡ）である、請求項９に記載の自己免疫疾患誘導剤。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含する、自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項１２】
被験体サンプル中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程を包含する、自己免疫疾患の判定方法。
【請求項１３】
抗ＣＤ４４抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を備えている、自己免疫疾患の判定キット。
【請求項１４】
抗ＩＦＮ−γ抗体を備えている、自己免疫疾患の判定キット。
【請求項１５】
自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法であって、
請求項１１に記載の方法によって作製したモデル動物に候補因子を投与する工程、
該モデル動物からＣＤ８陽性Ｔ細胞を採取する工程、および
該ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によってスクリーニングされた、自己免疫疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤およびその利用に関するものであり、特に、繰り返し投与によって自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病がある。
【０００３】
これら自己免疫疾患のうち、例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus eryhtematosus：ＳＬＥ）においては、自己抗体、特に抗ＤＮＡ抗体が過剰に産生されて、抗原であるＤＮＡと結合して免疫複合体を形成する。ＳＬＥは、このような免疫複合体の組織沈着に起因する補体系の活性化などを介して惹起される全身性炎症性病変を特徴とする疾患である。
【０００４】
自己免疫疾患の症状は非常に多彩であり、その経過は症状の重症度によって全く異なる。また、自己免疫疾患の予後は、症状の重症度によって異なる。例えば、ＳＬＥの予後は、５年生存率が９５％以上であるが、ループス腎炎、中枢神経ループス、肺高血圧症などの症状が見られる場合の予後は芳しくない。また、ＳＬＥは再発率が高く、ＳＬＥ患者の半数は１回以上の再発を経験する。したがって、自己免疫疾患の患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を背負う。
【０００５】
自己免疫疾患の診断には、米国リウマチ学会の診断基準が用いられている（非特許文献１を参照のこと）。また、上述したように、ＳＬＥは再発率が高いため、疾患活動性を正しく評価して再発の可能性を判定することが重要である。疾患活動性の評価基準としては、カナダのトロント大学から発表されたＳＬＥＤＡＩ（SLE disease activity index）が有用である（非特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
自己免疫疾患の治療方法としては、免疫異常を是正する副腎皮質ステロイド剤、発熱および／または関節炎などを軽減する非ステロイド系消炎鎮痛剤、あるいは免疫抑制剤などが用いられている。例えば、ＳＬＥの治療には、免疫抑制剤として、アザチオプリン、シクロホスファミドなどが用いられている。
【０００７】
自己免疫疾患の発症原因はほとんど解明されていないが、例えば、一卵性双生児でのＳＬＥの一致率は２５％程度であることから、何らかの遺伝的素因に環境因子（例えば、感染、性ホルモン、紫外線、薬物など）が加わって発症すると推測されている。
【０００８】
ところで、実験動物を同一抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。この間にＴ細胞アネルギーの破綻、血清中のリウマチ因子（rheumanoid factor：ＲＦ）の上昇、およびＴｈ２免疫応答が誘導され、その結果として、ＳＬＥなど種々の自己免疫病態が生じることが知られている。
【非特許文献１】ＡＣＲ委員会、Arthritis Rheum 42: 1785 (1999)
【非特許文献２】Bombardier C et al., Arthritis Rheum 35: 630 (1992)
【非特許文献３】Porcelli S et al., Nature 360: 593 (1992)
【非特許文献４】Yoshimoto T et al., Science 270: 1845 (1995)
【非特許文献５】Meiza MA et al., Journal of Immunology 156: 4035 (1996)
【非特許文献６】Sumida T et al., Journal of Experimental Medicine 182: 1163 (1995)
【非特許文献７】Yanagihara Y et al., Clinical Experimental Immunology 118: 131 (1999)
【非特許文献８】住田孝之他、現代医療  ３３：１０３０（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、種々の自己免疫疾患について積極的な研究成果が数多く報告されている。しかしながら、自己免疫疾患の発症メカニズムについて、分子生物学的な知見はほとんど得られていない。
【００１０】
実験動物を同一抗原で繰り返して免疫し続けると、該実験動物において自己免疫病態が生起してくることを上述したが、その過程においてどのような細胞が関与しているのかなどについては、具体的には未解明である。自己免疫疾患の発症を客観的にかつ正確に診断する技術、および自己免疫疾患を確実に治療する技術は、未だ確立されておらず、よって、かような技術の確立が強く望まれている。
【００１１】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己免疫疾患を治療する技術を確立するために利用可能な自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤、および該自己免疫疾患誘導剤を用いた自己免疫疾患モデル動物の作製方法を提供することにある。さらに、自己免疫疾患の発症について、客観的かつ正確な診断を可能とするための判定方法、ならびに自己免疫疾患の治療剤およびそのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、実験動物に対する同一抗原の繰り返し投与（すなわち、遷延感作）に起因する自己免疫病態の生起は、その生起過程において、（１）遷延感作の初期段階において、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）にアネルギーを誘導しないこと、または（２）抑制性機序が誘導されないこと、が必須であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る自己免疫疾患誘導剤は、ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子を含むことを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る自己免疫疾患誘導剤において、上記ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、Staphylococcal enterotoxin B （ＳＥＢ）またはα-galactosylceramide （α−ＧＣ）であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る自己免疫疾患モデル動物の作製方法は、上記の自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る自己免疫疾患の判定方法は、被験体サンプル中のアネルギーに陥らない細胞を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞を候補因子とともにインキュベートする前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程、を包含することを特徴としている。本方法によってスクリーニングされる自己免疫疾患の治療剤としては、例えば、拮抗阻害剤が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞を候補因子の存在下または非存在下にてインキュベートする工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程、を包含している。
【００１９】
本発明に係るスクリーニング方法は、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングするために、上記モデル動物に候補因子を投与する工程、該モデル動物からナチュラルキラーＴ細胞を採取する工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを測定する工程、を包含することを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、上記の方法によってスクリーニングされたことを特徴としている。
【００２１】
また、本発明に係る自己免疫疾患誘導剤は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子を含むことを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る自己免疫疾患誘導剤において、上記ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子が卵白アルブミン（ＯＶＡ）であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る自己免疫疾患モデル動物の作製方法は、上記の自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含することを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る自己免疫疾患の判定方法は、被験体サンプル中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る自己免疫疾患の判定キットは、ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する抗体、ならびにエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する抗体および／またはメモリーＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する抗体を備えていることを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るスクリーニング方法は、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングするために、上記モデル動物に候補因子を投与する工程、該モデル動物からＣＤ８陽性Ｔ細胞を採取する工程、および、該ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程、を包含することを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、上記の方法によってスクリーニングされたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
以上のように、本発明を用いれば、遷延感作の初期段階においてＮＫＴ細胞の活性化異常を誘発する自己免疫疾患誘導剤、または抑制性機序を誘導しない自己免疫疾患誘導剤を用いて、モデル動物を遷延感作することによって、自己免疫疾患を発症させることができるので、自己免疫疾患発症モデル動物を作製することができるという効果を奏する。さらに、上記モデル動物を用いることにより、自己免疫疾患の治療剤ならびにそのスクリーニング方法を提供することができるという効果を奏する。
【００２９】
また、本発明を用いれば、ＮＫＴ細胞の活性化異常またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出することによって、自己免疫疾患の発症を判定することができるので、自己免疫疾患を診断することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
上述したように、本発明者らは、同一抗原で実験動物を遷延感作することによる自己免疫疾患の発症は、ＮＫＴ細胞の活性化異常またはＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常と関連していることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００３１】
すなわち、本発明は、遷延感作の初期段階においてＮＫＴ細胞の活性化異常を誘発して自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤、または抑制性機序を誘導せずに自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤、および、これらの自己免疫疾患誘導剤を用いた自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法を提供する。また、自己免疫疾患の発症を客観的に判断するために、ＮＫＴ細胞の活性化異常またはＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の分化異常を検出し、これらの異常を指標として、自己免疫疾患の発症を判定する自己免疫疾患の判定方法を提供する。さらに、これらの異常を引き起こしている因子を是正する物質のスクリーニング方法、および該物質を主成分とする自己免疫疾患の治療剤を提供する。
【００３２】
以下、本発明に係る自己免疫疾患誘導剤、自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法、自己免疫疾患の発症の判定方法および判定キット、ならびに自己免疫疾患の治療剤およびスクリーニング方法について、以下に詳述する。
【００３３】
〔１：遷延感作により自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤〕
上述したとおり、同一抗原で実験動物を遷延感作すると、該実験動物がＳＬＥなどの自己免疫疾患を発症することは知られていたが、遷延感作に起因する自己免疫疾患の発症について、その詳細なメカニズム（例えば、どのような細胞が関与しているかなど）は不明であった。
【００３４】
そこで、本発明者らは、同一抗原で実験動物を遷延感作することによって誘導される現象（すなわち、Ｔ細胞アネルギー破綻および血清中ＲＦ上昇）についてその原因を詳細に検討した。
【００３５】
その結果、本発明者らは、後述する実施例に示すように、同一抗原で遷延感作することにより発症する自己免疫疾患の指標となるＴ細胞アネルギー破綻および血清中ＲＦ上昇にはＮＫＴ細胞の活性化異常が関与すること、これらの現象の誘導には遷延感作（繰り返し刺激）の初期段階（例えば、８回の抗原繰り返し投与における２〜３回目の投与）においてＮＫＴ細胞がアネルギーに陥らないことが必須であること、を明らかにした。
【００３６】
自己免疫疾患のモデルマウス（例えば、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ、Ｃ３Ｈ  ｇｌｄ／ｇｌｄなど）、およびヒト強皮症、関節リウマチ、シェーグレン症候群などの患者において、ＮＫＴ細胞の量が低下していることが知られている（非特許文献５〜８を参照のこと）。ＮＫＴ細胞は、そのＴＣＲがStaphylococcal enterotoxin B （ＳＥＢ）などの抗原によって刺激されると活性化されて、インターロイキン４（ＩＬ−４）および／またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生する。また、その産生されたＩＬ−４は、Ｔｈ２細胞の分化を誘導する（非特許文献３、４を参照のこと）。しかし、ＮＫＴ細胞がどのようなメカニズムで自己免疫疾患の発症と関連しているのかについて、具体的な知見はこれまで全く得られていなかった。すなわち、ＮＫＴ細胞を標的として自己免疫疾患の診断および／または治療を行う試みは全くなされていなかった。
【００３７】
すなわち、本発明は、遷延感作の初期段階においてＮＫＴ細胞の活性化異常を誘発して自己免疫疾患を発症させる自己免疫疾患誘導剤を提供する。本発明に係る自己免疫疾患誘導剤は、自己免疫疾患を発症させる抗原を含むことを特徴としており、該抗原は、遷延感作の初期段階にてナチュラルキラーＴ細胞の活性化異常を誘発する因子であればよく、その生物学的特性および物理化学的特性については特に限定されない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ＮＫＴ細胞の活性化」は、ＮＫＴ細胞が、細胞の内外からのシグナルに応答して、ＮＫＴ細胞に特有の機能を発現することが意図され、具体的には、ＮＴＫ細胞によって物質の生産、代謝、分泌または吸収が促進されることが意図される。ＮＫＴ細胞を活性化する因子として、ＯＶＡ、ＳＥＢ、α-galactosylceramide （α−ＧＣ）、ＮＫＴ細胞の受容体の刺激剤などが挙げられる。なお、本明細書中で使用される場合、「ＮＫＴ細胞を活性化する因子」は、「ナチュラルキラーＴ細胞の活性化を誘発する因子」と交換可能に使用される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「自己免疫疾患」は、ＤＮＡおよび／または自己成分（例えば、免疫グロブリンなど）に対する抗ＤＮＡ抗体および／または自己抗体（例えば、ＲＦなど）が検出され、自己免疫が病態に関与している疾患が意図される。自己免疫疾患としては、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群など）、および臓器非特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病など）が挙げられる。本発明の適用対象としての自己免疫疾患は、ＳＬＥが特に好ましい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「抗原」は、生体内にて抗体を産生させる物質が意図され、抗原としては、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、ポリペプチド（ペプチド、タンパク質）、糖類（オリゴ糖、多糖類、糖鎖誘導体など）、ならびにその他の高分子化合物または低分子化合物などが挙げられる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「遷延感作の初期段階」は、遷延感作（複数回の抗原投与）にて自己免疫疾患を発症させるために要する感作（抗原投与）の総回数のうち、最初の約１〜３割の回数だけ感作させた段階が意図される。逆に、「遷延感作の最終段階」は、遷延感作にて自己免疫疾患を発症させる際の最後の感作が意図される。ＳＥＢを抗原に用いた場合（例えば、１回につき２５μｇのＳＥＢを、５日に１回、マウスに腹腔内投与したとき、８回の投与で該マウスが自己免疫疾患を発症した場合）、「遷延感作の初期段階」は、ＳＥＢを２〜３回投与した段階であり、「遷延感作の最終段階」は、ＳＥＢを８回投与した段階である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「ＮＫＴ細胞の活性化異常」は、ＮＫＴ細胞によって生産、代謝、分泌または吸収される物質の量が健常者と比べて異なる状態が意図される。ＮＫＴ細胞の活性化異常としては、ＮＫＴ細胞における、（１）アネルギーが誘導されないこと、（２）サイトカイン（例えば、ＩＬ−４およびＩＮＦ−γ）産生の異常、（３）細胞表面抗原の変化の異常などが挙げられる。サイトカイン産生の異常としては、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの異常が挙げられる。
【００４３】
一方、本発明者らは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）で遷延感作したマウスにおいて、代表的な自己免疫疾患の１つであるＳＬＥが発症することを見出した。そこで、本発明者らは、ＯＶＡで遷延感作したＳＬＥ発症マウスを用いて、遷延感作により発症する自己免疫疾患の発症メカニズムを詳細に解析した。
【００４４】
その結果、上記ＳＬＥ発症マウスでは、同一抗原により遷延感作した動物の病理組織上において、ＳＬＥに特徴的な病変、および血清中での自己抗体の上昇が観察された。また、上記ＳＬＥ発症マウスでは、抑制性サイトカインの産生は誘導されなかった。
【００４５】
さらに、本発明者らは、上記ＳＬＥ発症マウスにおいて、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に占めるエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加すること、ならびにＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞が増加していることを示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常（分画の変動）およびＩＦＮ−γの産生が自己免疫疾患の発症の一因になることを明らかにした。
【００４６】
すなわち、本発明は、抑制性機序を誘導せずに自己免疫疾患を発症させる抗原を含む自己免疫疾患誘導剤を提供する。本発明に係る自己免疫疾患誘導剤において、上記抗原は、抑制性機序を誘導せずに自己免疫疾患を発症させる抗原であればよく、その生物学的特性および物理化学的特性については特に限定されない。好ましくは、本発明に係る自己免疫疾患の発症抗原は、ＯＶＡであり得る。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「抑制性機序」としては、抑制性サイトカイン産生などが挙げられる。なお、「抑制性サイトカイン」は、Ｔｈ２細胞から産生されるサイトカインであって、Ｔｈ１細胞の増殖を抑制するサイトカインまたはＴｈ１細胞からのサイトカイン産生を抑制するサイトカインが意図され、抑制性サイトカインとしては、例えば、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）が挙げられる。
【００４８】
本発明に係る自己免疫疾患の発症抗原は、遷延感作によりＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を誘発することが好ましい。本明細書中で使用される場合、「ＣＤ８陽性Ｔ細胞」は、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」と交換可能に使用され、「ＣＤ８を有するＴ細胞」が意図される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「細胞の分化」は、細胞が形態的および／または機能的に特殊化することが意図される。例えば、「Ｔ細胞の分化」を説明すると以下の通りである：
（１）Ｔ細胞は骨髄に由来するリンパ球系の幹細胞が胸腺に入り、プロＴ細胞に分化する。次いで、Ｔ細胞受容体のα鎖とβ鎖の遺伝子が再構成されて、未熟Ｔ細胞に分化し、さらに、成熟Ｔ細胞へと分化する。
（２）抗原による刺激を一度も受けていないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）に対して抗原が感作すると、該ナイーブＴ細胞はエフェクターＴ細胞へと分化する。さらに、エフェクターＴ細胞の一部は、メモリーＴ細胞へと分化する。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「細胞の分化異常」は、分化した細胞の形態および／または機能が健常者と比べて異なる状態、あるいは特殊化した細胞の数もしくは割合が健常者と比べて異なる状態が意図される。
【００５１】
「ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常」の誘発としては、例えば、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞への分化異常の誘発、および／または、ＩＦＮ−γ産生細胞増加の誘発が挙げられ、これらの細胞の存在比率において異常が誘発されていることを指標としてＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出することができる。例えば、ＯＶＡは、遷延感作（繰り返し投与）により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常（分画の変動）を起こし得る。
【００５２】
〔２：自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法〕
本発明に係る自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法は、上述した自己免疫疾患誘導剤でモデル動物を遷延感作する工程を包含していればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されない。
【００５３】
すなわち、１つの局面において、本発明は、本発明に係る自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含する自己免疫疾患モデル動物の作製方法を提供する。本発明に係る自己免疫疾患モデル動物の作製方法において、上記自己免疫疾患誘導剤は、ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子を含むことが好ましく、該ナチュラルキラーＴ細胞活性化因子がStaphylococcal enterotoxin B （ＳＥＢ）またはα-galactosylceramide （α−ＧＣ）であることがより好ましい。
【００５４】
すなわち、他の局面において、本発明は、本発明に係る自己免疫疾患誘導剤で被験体を遷延感作させる工程を包含する自己免疫疾患モデル動物の作製方法を提供する。本発明に係る自己免疫疾患モデル動物の作製方法において、上記自己免疫疾患誘導剤は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子を含むことが好ましく、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常誘発因子が卵白アルブミン（ＯＶＡ）であることがより好ましい。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「モデル動物」は、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物が意図され、モデル動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど）、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【００５６】
本発明に係る自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法において、上記自己免疫疾患誘導剤をモデル動物に投与する方法は、特に限定されない。好ましい投与方法としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的な投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
以上のように、本発明に係る自己免疫疾患発症モデル動物の作製方法によれば、自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ）を発症したマウスを作製することができる。つまり、本発明は、自己免疫疾患発症モデルマウスを用いたＳＬＥの研究（例えば、自己免疫疾患の治療剤のスクリーニングなど）に利用することができる。
【００５８】
〔３：自己免疫疾患の判定方法〕
本発明に係る自己免疫疾患の発症の判定方法は、生体から分離された試料（サンプル）におけるＮＫＴ細胞の活性化異常またはＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出する工程を、少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については特に限定されない。
【００５９】
すなわち、１つの局面において、本発明は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞の活性化異常を検出する工程を包含する自己免疫疾患の判定方法を提供する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「被験体サンプル」は「生体から分離された試料」と交換可能に使用され、常法により人体より容易に取得され得る。被験体サンプルしては、例えば、毛髪、末梢血、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などが挙げられる。また、得られた細胞を培養して増殖させたものを用いてもよい。なお、被験体サンプルには、医師によって、または医師の監督下での専門の知識を有する者によって、生体から分離された試料（サンプル）も包含される。
【００６１】
上記ＮＫＴ細胞の活性化異常を検出する方法は、活性化されたＮＫＴ細胞または活性化されていない細胞に特異的に存在する構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子化合物、および低分子化合物など）、これらの細胞に特徴的な形態（例えば、大きさ、色彩、形状など）および生理活性（例えば、物質生産能、物質分泌能、物質吸収能、物質分解能など）、ならびにこれらの細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを指標として、上記ＮＫＴ細胞の活性化異常を検出する方法であれば、特に限定されない。
【００６２】
一実施形態において、本発明に係る自己免疫疾患の判定方法は、被験体サンプル中のアネルギーに陥らない細胞を検出する工程を包含することが好ましい。
【００６３】
また、本発明に係る自己免疫疾患の発症の判定方法において、上記ＮＫＴ細胞を採取する方法は特に限定されず、当業者は、末梢血、脾臓、リンパ節、肝臓、皮膚、腸粘膜、女性器などの各生体器官または生体組織から公知の方法に従って、ＮＫＴ細胞を容易に採取し得る。
【００６４】
すなわち、他の局面において、本発明は、被験体サンプル中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程を包含する自己免疫疾患の判定方法を提供する。
【００６５】
本発明において、「ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出する工程」は、上述した「ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常」を検出する工程であればよく、特に限定されない。ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出する工程としては、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞の存在比率の異常を検出する工程、または、上記Ｔ細胞におけるインターフェロンγ産生細胞の存在比率の異常を検出する工程が挙げられる。
【００６６】
上記ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する方法は、分化したそれぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に存在する構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子化合物、および低分子化合物など）、これらの細胞に特徴的な形態（例えば、大きさ、色彩、形状など）および生理活性（例えば、物質生産能、物質分泌能、物質吸収能、物質分解能など）、ならびにこれらの細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを指標として、上記ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出する方法であれば、特に限定されない。
【００６７】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を測定する方法が挙げられる。この場合、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌを識別マーカーとして、これらに対する抗体を用いて被験体サンプル中のＣＤ８＋Ｔ細胞を上記３種（すなわち、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞）に分類し、それぞれの存在比率を算出し、次いで、算出した上記３種のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率を、健常者における上記３種のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在比率と比較することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出することができる。
【００６８】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する他の方法としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの産生細胞の存在を検出する方法が挙げられる。この場合、ＩＦＮ−γを識別マーカーとして、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する割合を、健常者における上記割合と比較することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を検出することができる。
【００６９】
上記識別マーカーは、単独でまたは組み合わせて用いられてもよい。識別マーカーを検出する方法は、それぞれの識別マーカーに応じて、適宜選択可能であり、特に限定されない。識別マーカーを検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、遺伝子導入法、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法、ウェスタンブロッティング法、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、形態学的検出法（例えば、組織免疫染色、細胞免疫染色など）、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化セルソータ（fluorescence-activated cell sorter：ＦＡＣＳ）など）、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなど）、質量分析法などが挙げられ、これらは単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
【００７０】
また、本発明に係る自己免疫疾患の発症の判定方法において、上記ＣＤ８＋Ｔ細胞を採取する方法は特に限定されず、当業者は、末梢血、脾臓、リンパ節、肝臓、皮膚、腸粘膜、女性器などの各生体器官または生体組織から公知の方法に従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞を容易に採取し得る。
【００７１】
〔４：自己免疫疾患の判定キット〕
本発明に係る自己免疫疾患の発症の判定キットは、本発明に係る自己免疫疾患の発症の判定方法を実施するための試薬など（例えば、抗体、プライマー、プローブなど）を備えていれば、その他の構成は特に限定されず、その他の試薬が適宜組み合わせられ得る。
【００７２】
すなわち、１つの局面において、本発明は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞の活性化異常を検出するための試薬を備えている自己免疫疾患の判定キットを提供する。
【００７３】
また、本発明に係る自己免疫疾患の判定キットは、ＮＫＴ細胞に特異的に存在する構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子化合物、および低分子化合物など）、これらの細胞に特徴的な形態（例えば、大きさ、色彩、形状など）および生理活性（例えば、物質生産能、物質分泌能、物質吸収能、物質分解能など）、ならびにこれらの細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを検出する試薬を備えていてもよい。
【００７４】
また、ＮＫＴ細胞において、特異的に発現する遺伝子を検出するキットとしては、該細胞で特異的に発現している遺伝子を増幅し得るように設計されたプライマーを備え、該遺伝子を検出し得るように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、上記遺伝子を検出するために必要な試薬をさらに備えたキットが挙げられる。
【００７５】
なお、上記試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択され得るが、好ましい試薬としては、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素などが挙げられる。さらに、本発明に係るキットには、上記遺伝子を検出することを妨げない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００７６】
他の局面において、本発明は、被験体サンプル中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出するための試薬を備えている自己免疫疾患の判定キットを提供する。
【００７７】
上述したように、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞の存在比率に基づいて自己免疫疾患を判定する場合は、本発明に係る自己免疫疾患の判定キットは、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞を検出するための試薬を備えている。ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞を検出するための試薬としては、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞に対する抗体（例えば、抗ＣＤ４４抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体）が挙げられる。
【００７８】
また、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの産生細胞の存在比率に基づいて自己免疫疾患を判定する場合は、本発明に係る自己免疫疾患の判定キットは、インターフェロンγ産生細胞を検出するための試薬を備えている。インターフェロンγ産生細胞を検出するための試薬としては、インターフェロンγ産生細胞に対する抗体が挙げられる。
【００７９】
また、本発明に係る自己免疫疾患の判定キットは、特定のＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に存在する構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子化合物、および低分子化合物など）、これらの細胞に特徴的な形態（例えば、大きさ、色彩、形状など）および生理活性（例えば、物質生産能、物質分泌能、物質吸収能、物質分解能など）、ならびにこれらの細胞を識別するために用いられる従来公知の識別マーカーを検出する試薬を備えていてもよい。
【００８０】
また、特定のＣＤ８＋Ｔ細胞において、特異的に発現する遺伝子を検出するキットとしては、該細胞で特異的に発現している遺伝子を増幅し得るように設計されたプライマーを備え、該遺伝子を検出し得るように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、上記遺伝子を検出するために必要な試薬をさらに備えたキットが挙げられる。
【００８１】
なお、上記試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択され得るが、好ましい試薬としては、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素などが挙げられる。さらに、本発明に係るキットには、上記遺伝子を検出することを妨げない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「細胞を検出する」は、細胞自体を検出することが意図されるが、細胞を検出した後、その結果に基づいて細胞を分類することもまた含まれる。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「発症の判定」は、発症可能性（発症危険性）を判定することが意図され、発症の判定方法は、疾患の診断方法または疾患の予防方法としても利用可能である。
【００８４】
〔５：自己免疫疾患の治療剤およびそのスクリーニング方法〕
１つの局面において、本発明は、ＮＫＴ細胞の活性化異常を引き起こしている因子を是正する物質を主成分とする自己免疫疾患の治療剤を提供する。本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、ＮＫＴ細胞の活性化異常を引き起こしている因子を是正する物質を主成分とする治療剤であればよく、その他の含有成分、製造方法、製造装置など、その他の構成について、特に限定されない。本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、ＮＫＴ細胞の活性化に異常が見られる自己免疫疾患の患者の治療に用いられ得る。なお、本明細書中で使用される場合、「因子を是正する」は、該因子が有する機能が阻害または増進されることが意図される。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、上記「因子」は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、ペプチド（ポリペプチド、タンパク質）、糖類（オリゴ糖、多糖類、糖鎖誘導体等）などの高分子化合物、および低分子化合物が意図される。また、上記因子は、ＮＫＴ細胞の活性化に直接的に関与しても、他の因子を介して間接的に関与してもよい。また、上記因子は、ＮＫＴ細胞の活性化を促進するものが意図される。ＮＫＴ細胞を活性化する因子として、ＳＥＢ、α-galactosylceramide （α−ＧＣ）、ＯＶＡ、ＮＫＴ細胞の受容体の刺激剤などが挙げられる。
【００８６】
他の局面において、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を引き起こしている因子を是正する物質を主成分とする自己免疫疾患の治療剤を提供する。本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常を引き起こしている因子を是正する物質を主成分とする治療剤であればよく、その他の含有成分、製造方法、製造装置など、その他の構成について、特に限定されない。本発明に係る自己免疫疾患の治療剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常が見られる自己免疫疾患の患者の治療に用いられ得る。
【００８７】
上述したように、上記「因子」は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、ペプチド（ポリペプチド、タンパク質）、糖類（オリゴ糖、多糖類、糖鎖誘導体等）などの高分子化合物、および低分子化合物が意図されるまた、上記因子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に直接的に関与しても、他の因子を介して間接的に関与してもよい。また、上記因子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常に関与するものであればよく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を促進するのであってもよいし、抑制するものであってもよい。例えば、ＯＶＡは、繰り返し投与することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に異常を起こすことができる。
【００８８】
いずれの局面においても、臨床適用のための治療剤の投与条件が、本明細書に記載した自己免疫疾患のモデル動物系を用いて決定され得る。すなわち、上記モデル動物を用いて、投与量、投与間隔、投与ルートなどの投与条件を検討し、適切な予防効果または治療効果を得るための条件が決定され得る。このような治療剤は、自己免疫疾患に対する予防または治療のための医薬となる。
【００８９】
また、治療剤は、薬学的に受容可能な任意のキャリアをさらに含む組成物であり得る。キャリアとしては、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、本発明において使用可能なキャリアとしては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素などが挙げられる。
【００９０】
本発明に係る治療剤が製剤化される場合の剤型は、特に制限されず、例えば、溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセル、錠剤などであってもよい。例えば、本発明に係る治療剤を徐放剤と組み合わせるかまたは徐放性容器（例えば、カプセル）中に格納することにより、自己免疫疾患を呈する疾患部位を標的とするドラッグデリバリーを行うことが可能となり、効果的な治療が行われ得る。
【００９１】
本発明に係る治療剤の患者への投与経路は、有効成分の性質に応じて適宜選択され、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われ得るがこれらに限定されない。また、本発明に係る治療剤は全身的または局所的に投与され得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、治療剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者は適宜選択し得る。
【００９２】
また、本発明の治療剤は、目的物質を総組成物の０．１〜９０重量％含む。本発明の治療剤中に含まれる目的物質の投与量は、非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、治療に対する患者の個々反応、治療剤が投与される組成物の種類、投与形態、病気の経過の段階、または投与の間隔に依存して、これら投与頻度は適宜調整され得る。なお、投与は、１回〜数回に分けて行われ得、１日あたり１〜５回投与され得る。
【００９３】
治療対象となる個体としては、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サルなど）、ならびにその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト自己免疫疾患に対する予防法または治療法を開発するためにも有用である。例えば、非ヒト哺乳動物を用いて作製したモデル動物を用いることにより、自己免疫疾患の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。
【００９４】
なお、別の局面において、本発明は、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供する。
【００９５】
一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、自己免疫疾患のモデル動物に候補物質を与える工程、該モデル動物からナチュラルキラーＴ細胞を採取する工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを測定する工程、を包含することを特徴としている。別の実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、自己免疫疾患のモデル動物に候補物質を与える工程、該モデル動物からＣＤ８陽性Ｔ細胞を採取する工程、および、該ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化異常を検出する工程、を包含することを特徴としている。
【００９６】
さらなる実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞を候補因子とともにインキュベートする前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程、を包含することを特徴としている。なおさらなる実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、被験体サンプル中のナチュラルキラーＴ細胞を候補因子の存在下または非存在下にてインキュベートする工程、および、該ナチュラルキラーＴ細胞をナチュラルキラーＴ細胞活性化因子によって活性化させる前後での該ナチュラルキラーＴ細胞の活性化レベルを比較する工程、を包含することを特徴としている。
【００９７】
上述した本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、上述した自己免疫疾患の治療剤を得ることができる。
【００９８】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９９】
本発明について、実施例および図１〜図１１に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１００】
［実施例１：遷延感作によるＴ細胞アネルギー破綻］
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、以下の処理（１）〜（６）のいずれかの処理を施し、これら処理後のマウスを用いて、アネルギー解析を行った。アネルギー解析において、各処理を施したマウスの脾細胞中のＳＥＢ応答性Ｔ細胞におけるインターロイキン２（ＩＬ−２）の産生量、および細胞分裂回数を測定することによる細胞増殖を、アネルギーが破綻したかまたは維持されているかの指標とした。ＩＬ−２の産生量を、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（BIOSOURCE社）を用いるＥＬＩＳＡ法によって定量した。また細胞分裂回数を、細胞内に取り込まれたＣＦＳＥ（Molecular Probes社）をフローサイトメーターで検出することによって測定した：
・処理（１）：ＳＥＢを２回投与（２５μｇ／１回）
・処理（２）：ＳＥＢを８回投与（２５μｇ／１回）
・処理（３）：Staphylococcal enterotoxin A（ＳＥＡ）を２回投与（２５μｇ／１回）、
・処理（４）：ＳＥＡを８回投与（２５μｇ／１回）
・処理（５）：ＳＥＡおよびα-galactosylceramide （α−ＧＣ）を同時に８回投与（ＳＥＡ：２５μｇ／１回、α−ＧＣ：５μｇ／１回）
・処理（６）：賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを８回投与
なお、５日に１回または１５日に１回の腹腔内投与によって投与した。
【０１０１】
Ｔ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を図１に示す。図１における縦軸は、処理（６）を施したマウスの脾細胞におけるＩＬ−２の産生量を１００とした場合のそれぞれの処理を施したマウスの脾細胞におけるＩＬ−２の産生量の割合を示す。
【０１０２】
処理（２）を施したマウスでは、アネルギーを生じて低減していたＩＬ−２の産生量は約６０％まで回復しており、アネルギーが破綻したことが確認された。これに対して、処理（４）を施したマウスでは、ＩＬ−２の産生量は低く、アネルギーが持続していたことがわかる。しかし、処理（５）を施したマウスでは、ＩＬ−２の産生量は約４０％まで回復しており、処理（２）を施したマウスと同様にアネルギーが破綻していた。
【０１０３】
また、細胞増殖（細胞分裂回数）を調べたところ、ＩＬ−２の産生量の結果と同様に、処理（４）を施したマウスでは、細胞の増殖は見られなかったが、処理（２）または（５）を施したマウスでは、一旦アネルギーに陥った細胞が再び増殖していた（データは示さず）。
【０１０４】
なお、投与間隔を５日毎と１５日毎とで行ったが、どちらの場合も８回目まで繰り返し免疫をすることによって処理（２）または（５）を施したマウスにおいてアネルギーの破綻が観察された。これにより、アネルギーの破綻に必要なのは投与間隔ではなく、繰り返し投与（すなわち、遷延感作）であることがわかった。
【０１０５】
［実施例２：遷延感作による血清中ＲＦ量の上昇］
実施例１における処理（２）、（４）、（５）、（６）、および以下に示す処理（７）を施したマウスにおいて、各処理の最後の投与から２日目に採血を行い、血清を回収し、活性化ＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体であるＲＦの産生量を、レビスリウマチ因子ＩｇＧ型マウスＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（シバヤギ社）を用いたＥＬＩＳＡ法によって測定した：
・処理（７）：α−ＧＣを８回投与（５μｇ／１回）
なお、投与方法は５日に１回、または１５日に１回、腹腔内投与を行った。
【０１０６】
マウス血清中のＲＦ産生量を測定した結果を図２に示す。処理（６）を施したマウスと比較して、処理（２）を施したマウスでは、ＲＦの産生量が有意に増加していた。一方、処理（４）を施したマウスでは、ＲＦの産生量は処理（６）を施したマウスと有意差はなかった。しかし、ＳＥＡおよびα−ＧＣの同時投与（処理（５））を施したマウスでは、処理（６）を施したマウスと比較して、ＲＦの産生量が有意に増加していた。
【０１０７】
なお、投与間隔を５日毎と１５日毎で行ったが、どちらの場合も８回目まで繰り返し投与をすることによって処理（２）または（５）を施したマウスにおいてＲＦの産生が観察された。これにより、ＲＦの産生に必要なのは投与間隔ではなく、繰り返し投与であることがわかった。
【０１０８】
［実施例３：遷延感作によるＮＫＴ細胞へのアネルギー誘導および破綻］
実施例１における処理（１）、（２）、および以下に示す処理（８）を施したマウスにおいて、ＮＫＴ細胞におけるアネルギー解析を行った。アネルギー解析において、各処理を施したマウスの脾細胞から採取したＮＫＴ細胞におけるインターロイキン２（ＩＬ−２）の産生量、および細胞分裂回数を測定することによる細胞増殖を、アネルギーが破綻したかまたは維持されているかの指標とした。ＩＬ−２の産生量を、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（BIOSOURCE社）を用いるＥＬＩＳＡ法によって定量した。また細胞分裂回数を、細胞内に取り込まれたＣＦＳＥ（Molecular Probes社）をフローサイトメーターで検出することによって測定した：
・処理（８）：ＰＢＳを８回投与
なお、投与方法は５日に１回、腹腔内投与を行った。ＮＫＴ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を図３に示す。
【０１０９】
実施例１にて示した通り、通常のＴ細胞は２度のＳＥＢ刺激（処理（１））によってアネルギーに陥いる。アネルギー状態のＴ細胞からのＩＬ−２産生量はコントロール（処理（８））の１％以下であるが、８回投与後（処理（２））によってＩＬ−２産生量は４０〜６０％まで回復する。しかし、ＮＫＴ細胞においては、２回のＳＥＢ投与（処理（１））後のＮＫＴ細胞からＩＬ−２産生量は、コントロール（処理（８））の約４０％、８回投与（処理（２））のマウスではほぼ１００％まで回復していた。
【０１１０】
また、細胞増殖（細胞分裂回数）を調べたところ、ＩＬ−２の産生量の結果と同様に、処理（１）を施したマウスで、細胞増殖しているＮＫＴ細胞が確認された（データは示さず）。このことから、ＮＫＴ細胞は通常のＴ細胞よりアネルギーに陥りにくいことがわかった。
【０１１１】
［実施例４：α−ＧＣでの遷延感作によるＴ細胞アネルギー破綻］
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、以下の処理（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの処理を施した。最終投与の２日後にマウスから採血して血清を回収した。また最終投与の９日後に屠殺したマウスから脾細胞を単離し、単離した脾細胞をＳＥＢで２４時間刺激しながら培養し、培養上清中のインターロイキン２（ＩＬ−２）の産生量を、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（BIOSOURCE社）を用いるＥＬＩＳＡ法によって定量した：
・処理（Ｉ）：ＰＢＳを２回＋ｖｅｈｉｃｌｅを８回投与
・処理（ＩＩ）：ＳＥＢを２回＋ｖｅｈｉｃｌｅを８回投与（ＳＥＢ；２５μｇ／１回）
・処理（ＩＩＩ）：ＳＥＢを２回＋α−ＧＣを２回投与（ＳＥＢ；２５μｇ／１回、α−ＧＣ；５μｇ／１回）
・処理（ＩＶ）：ＳＥＢを２回＋α−ＧＣを８回投与（ＳＥＢ；２５μｇ／１回、α−ＧＣ；５μｇ／１回）
なお、５日に１回の腹腔内投与によって投与した。
【０１１２】
ＳＥＢ応答性Ｔ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を図５に示す。Ｉ群は、ＳＥＢ応答性Ｔ細胞がアネルギーではない状態の対照群であり、ＩＩ群は、ＳＥＢ応答性Ｔ細胞がアネルギー状態の対照群である。α−ＧＣを２回投与したＩＩＩ群では、ＩＬ−２の産生量は低かったが、α−ＧＣを８回投与したＩＶ群では、ＩＬ−２の産生量がＩ群の約８０％まで回復した。
【０１１３】
単離した脾細胞にＣＦＳＥ（Molecular Probes社）を取り込ませ、ＳＥＢで７２時間刺激しながら細胞を培養し、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの蛍光強度をフローサイトメーターで検出することによって細胞分裂回数を測定した。
【０１１４】
結果を図６に示す。ＩＬ−２産生量が低かったＩＩＩ群では細胞の増殖が見られなかったが、ＩＶ群ではＩ群と同数の細胞分裂が観察され、細胞が増殖していることが確認された。
【０１１５】
以上より、ＳＥＢの投与によって生じたＴ細胞アネルギーは、α−ＧＣでＮＫＴ細胞を繰り返し刺激することによって破綻することが示された。
【０１１６】
［実施例５：α−ＧＣでの遷延感作による血清中ＲＦ量の上昇］
実施例４にて回収した血清中のＲＦ量を、レビスリウマチ因子ＩｇＧ型マウスＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（シバヤギ社）を用いたＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０１１７】
結果を図７に示す。ＳＥＢ応答性Ｔ細胞においてアネルギーの破綻が観察されたＩＶ群では、ＲＦを産生する個体が観察された。このことは、Ｔ細胞アネルギーの破綻によりＲＦが産生されることを示す。
【０１１８】
［実施例６：遷延感作によるＳＬＥ発症］
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、以下の処理（８）〜（１１）のいずれかの処理を施した。最終投与の２日後にマウスから尿を回収し、最終投与の９日後に屠殺したマウスから腎臓を摘出し、ＳＬＥ様腎炎の発症の有無を調べた。アルブスティックス（バイエル社）を用いたテトラブロムフェノールブルーによる呈色反応によりタンパク尿の検出を行った：
・処理（８）：ＰＢＳを８回投与
・処理（９）：ＳＥＢを８回投与（２５μｇ／１回）
・処理（１０）：ＰＢＳを１２回投与
・処理（１１）：ＯＶＡを１２回投与（５００μｇ／１回）
なお、５日に１回の腹腔内投与によって投与した。
【０１１９】
結果を図８に示す。処置（８）〜（１０）のいずれかを施したマウスではタンパク尿は検出されなかったが、処理（１１）を施したマウスではタンパク尿が検出された（図８（ａ）を参照のこと）。
【０１２０】
上記処理を施したマウスの腎臓におけるＩｇＧ沈着を図８（ｂ）に示す。腎臓の組織切片を蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、ＩｇＧの沈着を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、処理（８）〜（１０）のいずれかを施したマウスではＩｇＧの沈着は見られなかったが、処理（１１）を施したマウスでは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特徴的な病変であるＩｇＧの沈着が観察された。
【０１２１】
以上のことから、ＯＶＡでの遷延感作によってＳＬＥ様腎炎が発症していることがわかった。
【０１２２】
［実施例７：遷延感作による自己抗体の産生］
実施例６にて示した処理を施したマウスの血清中における自己抗体を測定した。測定した自己抗体は、リウマチ因子（ＲＦ）、抗Ｓｍ抗体（核内低分子ＲＮＡとタンパクの複合体であるｓｎＲＮＰに対する自己抗体）、抗ｓｓＤＮＡ抗体（１本鎖ＤＮＡに対する自己抗体）、および抗ｄｓＤＮＡ抗体（２本鎖ＤＮＡに対する自己抗体）である。
【０１２３】
図９（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、ＲＦ、抗Ｓｍ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体、および抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生量を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。ＲＦ産生量の測定にはレビスリウマチ因子ＩｇＧ型マウスＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（シバヤギ社）を用いた。また、抗Ｓｍ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体および抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生量の測定には、陽性対照として疾患モデルマウスＭＲＬ／ｌｐｒの血清を用いた。
【０１２４】
図９（ａ）および（ｂ）に示すように、処理（９）を施したマウスの６０％において、ＲＦおよび抗Ｓｍ抗体の産生量の増加が見られた。一方、処理（１１）を施したマウスでは、全ての個体でＲＦ、抗Ｓｍ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体および抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生量が増加した。
【０１２５】
［実施例８：ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常の測定］
実施例６にて示した処理を施したマウスの脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞表面上でのＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現をフローサイトメーターで検出して、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に分類した。
【０１２６】
結果を図１０に示す。なお、図中（ａ）はＣＤ８＋Ｔ細胞をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（図中、「ｎａiｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ」）、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞（図中、「ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＣＤ８＋  Ｔ」）およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図中、「ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８＋  Ｔ」）に分類した結果を示し、
（ｂ）は、（ａ）の結果を棒グラフとして表したものである。
【０１２７】
図１０に示すように、処理（８）〜（１０）を施したマウスでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分画に違いが見られなかったが、処理（１１）を施したマウスでは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加していた。
【０１２８】
また、上記処理をしたマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞内染色し、ＩＦＮ−γを産生しているＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメーターで検出した。
【０１２９】
結果を図１１に示す。なお、図中（ａ）は、抗原の繰り返し投与後にＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を計測した結果を示す。また、
（ｂ）は、（ａ）の結果を棒グラフとして表したものである。
【０１３０】
図１１に示すように、処理（１１）を施したマウスにおいて、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に高かった。
【０１３１】
以上のことより、ＯＶＡで遷延感作したマウスでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常が自己免疫疾患に寄与することがわかった。
【０１３２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
以上のように、本発明では、抑制性機序を誘導しない自己免疫疾患誘導剤または遷延感作の初期段階においてＮＫＴ細胞の活性化異常を誘発する自己免疫疾患誘導剤で、モデル動物を遷延感作することによって、自己免疫疾患を発症させることで、自己免疫疾患発症モデル動物を作製し得る。したがって、本発明は、自己免疫疾患の診断のための医薬品、自己免疫疾患の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニング試験などに好適に用いることができる。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化異常またはＮＫＴ細胞の活性化異常を検出することにより、自己免疫疾患の発症を判定することができるため、自己免疫疾患の発症の判定方法および判定キットに代表される診断医療の分野に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＳＥＢ応答性Ｔ細胞またはＳＥＡ応答性Ｔ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＦ産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＫＴ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＥＢ応答性Ｔ細胞からのＩＬ−２の産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスから採取したＣＤ４Ｔ細胞の細胞分裂回数を測定した結果を示すグラフである。
【図６】本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスから回収した血清中のＲＦ量を測定した結果を示すグラフである。
【図７】図７（ａ）および（ｂ）は、本実施例において、抗原の繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＬＥ様腎炎の発症を調べた結果を示す図である。
【図８】図８（ａ）〜（ｄ）は、本実施例において、抗原を繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける自己抗体の産生を調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９（ａ）および（ｂ）は、本実施例において、抗原の繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の各分画の動態変化を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】図１０（ａ）および（ｂ）は、本実施例において、抗原の繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの産生細胞の変動を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図７】
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