(57)【要約】【課題】ホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子を含む単離精製された核酸を提供する。【解決手段】ホップは雌雄異性であり、このうち雌性は球果を付け、この球果のルプリン腺毛にはビールに苦味や香りを付与する二次代謝産物が含有されている。また、この二次代謝産物の中には、薬効成分を有するものが含まれる。こうした有用な二次代謝産物の組成を遺伝子工学技術に基づき操作し、より有用な品種を育種するために、本発明はホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子を含む単離精製された核酸を提供する。この核酸を用いることにより、形質転換技術や分子選抜技術等によるホップの新たな育種法を構築することが可能となる。また、本願はこのルプリン腺毛において遺伝子を特異的に発現させる転写調節領域を含む核酸を提供する。この核酸を用いてホップの品種改良を可能にすることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子またはその一部を含むことを特徴とする単離精製された核酸。
【請求項２】
遺伝子が二次代謝産物の生合成に関与する少なくとも一つのタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
タンパク質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
遺伝子が配列番号２に記載された塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
遺伝子が配列番号２に記載された塩基配列又はその一部とハイブリッド形成することを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
核酸によってコードされるタンパク質がカルコンシンターゼであることを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１の核酸を担持したベクター。
【請求項８】
ホップのルプリン腺毛において遺伝子の発現を特異的に調節する調節配列を含む単離精製された核酸。
【請求項９】
調節配列にはプロモーターが含まれることを特徴とする請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
調節配列が配列番号７に記載された塩基配列を有することを特徴とする請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
調節配列には、配列番号６に記載の配列又はその一部が含まれることを特徴とする請求項８に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項８に記載の核酸を担持したベクター。
【請求項１３】
請求項７に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞。
【請求項１５】
請求項７に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換された植物細胞を生産する方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換された植物細胞を生産する方法。
【請求項１７】
配列番号３、４、５のいずれかからなる核酸プライマー。
【請求項１８】
配列番号３，４，５の塩基配列を有する少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする、ルプリン特異的発現遺伝子の調節配列を検出するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子およびそのプロモーターを含む核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、テルペノイド、アルカロイド、フェノーリスク、サポニンなどの膨大な種類の低分子有機化合物を生産し蓄積している。当初、これらの化合物は、生物の生命維持に直接関与するものでなく、単に副次的な機能しかないと考えられていたことから、便宜的に「二次代謝産物」と呼ばれていた。
【０００３】
近年では、この二次代謝産物が細胞の分化、外的因子から防御として機能することが明らかになりつつあり、また、これら植物の生産する二次代謝産物は、嗜好物、医薬品、染料等の広い分野で利用され、応用されるに至っている。
【０００４】
こうした二次代謝産物はその有用性に着目され植物細胞内での生成過程の解明が進められ、現在ではこれら物質が多数の酵素等が関与した複雑なカスケードを経て生合成されていることが示されている。このようにカスケードを経て生合成される物質の場合、多くは植物から直接抽出することにより単離が行われているが、植物から直接抽出する場合、大量生産などの要請に沿わず、また一般にコスト高になるため培養細胞等を用いた試験管内での合成方法等の開発が進められている。
【０００５】
一方、ホップはビールの爽快な苦味と香りを与える主要な原料であるが、このホップにおいても球果に含まれるルプリン腺毛内で二次代謝産物が多く分泌され、この二次代謝産物がビールの苦味や香りに大きく寄与していることがわかってきている。
【０００６】
こうした経緯から、ホップにおいて、これまでに農業特性に加え、苦味質、精油成分といったルプリン腺毛中に蓄積される二次代謝産物に主眼をおいた様々な品種改良が行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ホップは雌雄異株の植物であり、特に雄株はビールの原料となる球果を付けず、商業上重要視されないことからあまり研究がなされておらず、醸造上有用な遺伝形質についてもほとんど明らかにされていない。そのため、従来の交配によるホップ育種では、経験と勘に頼る部分が多く、特に醸造品質については実際に球果が着生するまで全く予想が付かないというのが現状である。
【０００８】
一方、今日では、形質転換技術や分子選抜技術といった遺伝子工学を用いた育種法が各種の植物において可能となりつつある。これらの方法の場合、経験と勘に頼る部分が多い伝統的な育種法に比べ、より客観的な育種が可能である。形質転換技術は外来遺伝子を植物細胞内に導入、発現させて付与したい形質を直接導入させる技術である。外来遺伝子を発現させるには、遺伝子の発現を制御する植物細胞内で機能可能なプロモーターに目的とする構造遺伝子および植物細胞内で機能可能なターミネーターを連結し、これを植物細胞内に導入する。実験レベルでよく使われるプロモーターとしては、比較的多くの植物で組織を問わず導入遺伝子を発現させることのできるＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターやノパリン合成酵素遺伝子プロモーター（Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｐ.Ｒ.  ｅｔ  ａｌ.  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ,  １５  （１９８７）１５４３−１５５８）等が知られている。また、実用面から考えると導入遺伝子によっては植物の生育等に害を及ぼすこともあるので、目的の組織または目的の時期において目的の量だけ外来遺伝子を発現させるようなプロモーターも必要である。形質転換技術を用いた育種法の従来の伝統的な育種法に対する利点は、比較的確実に目的とする形質を種を問わず短期間のうちに付与することができることにある。またホップの場合、株分けにより増殖させることができるので、付与した形質を固定するといった作業が不必要である。その為、形質転換技術を用いた育種法はホップにおいては特に有効な育種法といえる。
【０００９】
分子選抜技術は、ＲＦＬＰ(Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)などのような遺伝子マーカーを用いた育種方法であり、特にイネやムギ類などにおいては実用段階に入っている。形質転換技術の場合、単一遺伝子に支配される形質の付与に力を発揮する一方で、複数の遺伝子に支配された形質を付与することは難しいとされているが、分子選抜技術はそのような形質転換技術の欠点を補うことができる。
【００１０】
このような遺伝子工学を用いた育種法において必要とされるのが、目的とする形質に関連する遺伝子やその制御を司る遺伝子等を明らかにすることである。特にビール原料、薬効成分資源という見地から考えた場合、雌株の球果に含まれるルプリン腺毛より分泌される二次代謝産物の合成等に関与する遺伝子を明らかにすることができれば、これらの遺伝子を遺伝子工学を用いたホップの育種法に応用することができ、更には、医療分野にも応用が期待できる。
【００１１】
そこで、本願発明は、ルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子を明らかにするとともにその応用を可能にするため、ホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子とそのプロモーターなどの調節遺伝子を単離精製し、その提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述の通り、本発明の単離精製された核酸は、ホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子、ルプリン腺毛において特異的に機能するプロモーター、またはそれらの一部を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
これらの核酸に基けば、従来の経験と勘に頼らざるをえなかったホップの育種方法を遺伝子工学を用いたより客観的な方法に変更することが可能となる。上述したように、ホップ球果においてビール原料や薬効成分として重要な二次代謝産物がルプリン腺毛中で集中的に分泌されることから、上記ルプリン腺毛で特異的に発現し機能している遺伝子が二次代謝産物の生合成に関与していると考えられる。このように二次代謝産物の生合成に関与し得る遺伝子を遺伝子マーカーとして利用することにより、ホップ育種を行なう上で、医薬や食品等の産業的により優れた分子選抜技術を開発することができる。また、形質転換技術を用いて上記遺伝子をホップに導入することにより、産業的に有用な品種の育種が期待される。すなわち、これらの核酸を用いて遺伝子工学技術により育種を行なうことにより、ルプリン腺毛に蓄積する二次代謝酸物の組成等を制御することができる。さらに、本発明の核酸に基けば、ビールにおける醸造のためにホップの品質維持、向上を図り、また医薬品生産へ応用することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、場合により添付の図面を参照しつつ詳細な説明を参照することにより、発明及び前記発明に付随する多くの効果についての完全な理解が容易になされる。
【００１５】
上記において「特異的に発現する」または「特異的に機能する」との語には、一般には、上記遺伝子がルプリン腺毛においてのみ発現または機能する場合のほか、他の器官に比べてルプリン腺毛において、より多く発現または機能している場合も含まれる。すなわち、「特異的」であるか否かは、他の器官に比べた場合のルプリン腺毛における発現量の多さ、機能の強さにより決定することができる。
【００１６】
また、この「特異的に発現する」、「特異的に機能する」とは、発育時期等の全てを通して、上記意味において特異的である場合の他、発育時期や他の外的因子などによりルプリン腺毛における発現、機能が他の器官に比べて有意に高い場合も含まれる。
【００１７】
上記核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、前記核酸中にコードされている「遺伝子」の形態としては、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのいずれの形態をも含む。
【００１８】
また、その一部をも含めることとしているのは、上記核酸の用途によっては完全な長さは必要ではなく、一部配列のみでも機能を有するためである。例えば、ＲＦＬＰなどの分子選抜技術による育種法へ応用する場合には、ハイブリダイゼーションやＰＣＲにより分子識別することになる。この際のプローブやＰＣＲプライマー等は、上記ルプリン特異的遺伝子の一部、例えば、数十から数百ｂｐの連続した一部配列で足りる。
【００１９】
また本発明は、上記ルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子が、ルプリン腺毛において生成される二次代謝産物の生合成に関与するタンパク質をコードしていることを特徴とする。
【００２０】
ここでタンパク質としては、例えば、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するものが含まれる。また本タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば配列番号２に記載された塩基配列を有するものが含まれるが、この配列番号２とは配列が異なるものであっても上記アミノ酸配列が保存される範囲内で核酸配列を異ならせることもできる。また、この塩基配列は上述したプローブやＰＣＲプライマーとして用いる場合にはその機能を保持することができる程度に修飾することもできる。上記アミノ酸配列をコードする全てのアミノ酸は本発明に含まれる。上述した核酸以外の特異的核酸配列は、上述のタンパク質のアミノ酸残基をコードするコドンに対応する遺伝暗号は公知のものを用いて容易に決定される。前記遺伝暗号はＬ.Ｓｔｒｙｅｒ,  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ,  １９８８,  Ｗ.Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ.,に記載されており、その全文を本明細書に引用文献として援用する。
【００２１】
また、本発明の単離精製された核酸には、上記タンパク質としてカルコンシンターゼがコードされた遺伝子が含まれる。このカルコンシンターゼは、植物におけるフェニルアラニン、チロシンの代謝に関与する酵素であり、詳細にはフラボノイド類の生合成において、１モルのクマロイルＣｏＡと３モルのマロニルＣｏＡとから４,２,４,６−テトラヒドロキシカルコン（ナリンゲニンカルコン）への変換を触媒することが明らかになっている。このことから上記核酸を用いることにより、植物におけるフラボノイド類の生合成に関する代謝系の制御や、フラボノイド類に関する形質の遺伝子マーカーとして利用することが可能となる。また近年ホップにおいて、カルコンシンターゼ様の酵素が苦味質であるα酸、β酸の前駆体のフロルイソバレロフェノンやフロルイソブチロフェノンの生合成を触媒するバレロフェノンシンターゼ活性を持つ可能性が示唆されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ,  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ,  ｐ２１５（１９９７）)。このことから、本発明で単離された遺伝子のコードするタンパク質がバレロフェノンシンターゼとして苦味質の生合成に関与していると考えられる。そこで上記核酸を用いることにより、ホップにおける苦味質の生合成に関する代謝系の制御や、苦味質に関する形質の遺伝子マーカーとして利用することが可能となる。
【００２２】
本発明の単離精製された核酸には、ルプリン腺毛において遺伝子を特異的に発現させる調節配列が含まれ、この配列の中には、ルプリン腺毛において活性化されるプロモーターが含まれる。この配列としては、例えば、配列番号７に記載された塩基配列を有するものが含まれる。このルプリン腺毛で特異的な調節配列を用いることにより、その下流に接続した遺伝子のルプリン腺毛内での発現を調節することが容易になる。
【００２３】
さらに、本発明はホップのルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子又はルプリン腺毛において遺伝子の発現を特異的に調節する調節配列を担持したベクターを提供する。
【００２４】
上記ルプリン腺毛において特異的に発現する遺伝子を担持したベクターを用いてホップなどの植物を形質転換することにより、ホップなどの植物を品種改良することができる。特に、ルプリン腺毛内で生成される二次代謝産物の生産の向上・抑制などによる品種改良に有効となる。さらに、このベクターは、植物の品種改良だけでなく、培養細胞内でのルプリン特異的遺伝子、例えば二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子を発現させ、二次代謝産物を生産する場合に利用することができる。このように培養細胞内で二次代謝産物を産生させることが可能となれば二次代謝産物の単離を容易にすることが可能となる。
【００２５】
また、上記発現調節配列を担持したベクターは、上記ルプリン特異的遺伝子の発現に用いる以外にもルプリン腺毛内で発現させたいホップまたは異種由来の遺伝子を調節配列の下流に接続させ、ホップのルプリン腺毛内で所望の遺伝子を特異的に発現させることが可能となる。このようにルプリン腺毛内で所望の遺伝子を発現させることが可能となる。
【００２６】
また、本発明は上記ベクターにより形質転換された植物細胞をも含む。ここで植物細胞は、特に形態または生育段階などに限定はなく、培養細胞、カルス、プロトプラスト、植物体など種々のものを含めることができる。また形質転換された一世代目の植物細胞のみならず、一世代目の植物から発生させた植物をも含めることができる。
【００２７】
上記形質転換された植物は上記ベクターの導入により二次代謝産物をコードする遺伝子をはじめとする所望の遺伝子の発現を可能にし、食品、医薬品などの原料としての有用性を高めることが可能となる。
【００２８】
以下に、本発明を実施の形態に基づいて詳細に説明する。
１、  ホップのルプリン腺毛特異的遺伝子およびその発現調節領域を含む核酸の単離
(１)全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製
全ＲＮＡの調製は公知の方法で行なうことができ、例えば「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、秀潤社、５６頁（１９９５）等に記載の方法で行なうことができる。またこの全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製も公知の方法で行なうことができ、例えば宝酒造社の「Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞」に添付されたプロトコール等に従って行なうことができる。
【００２９】
(２)ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーは、ｍＲＮＡより公知の方法で作製することができる。例えばｃＤＮＡはアマシャム社の「ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ」に添付されたプロトコール等に従って調製することができる。また調製したｃＤＮＡからのライブラリーの作製はアマシャム社の「ｃＤＮＡ  ｒａｐｉｄ  ａｄａｐｔｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ」、「ｃＤＮＡ  ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ」、ストラトジーン社の「ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ」に添付されたプロトコール等に従って行なうことができる。上記で引用した全ての文献は本明細書に引用文献として援用する。
【００３０】
(３)ルプリン特異的プローブの作製
ルプリン特異的プローブとはルプリン腺毛で特異的に発現している遺伝子に相補的な遺伝子断片を意味する。本実施の形態においては、ルプリン特異的プローブは以下の方法により得ることができる。
【００３１】
開花後約１５日を経過した球果を、ルプリン腺毛およびルプリン腺毛の密集している内包基部を主とした画分(ルプリン多含画分)と、ルプリン腺毛の少ない外包を主とした画分(ルプリン少含画分)とにそれぞれ分ける。このルプリン多含画分で発現している遺伝子群からルプリン少含画分においても発現している遺伝子群を差分し、ここで残った遺伝子群がルプリン腺毛で特異的に発現している可能性の高い遺伝子となる。
【００３２】
こうしたルプリン多含画分で発現している遺伝子群からルプリン少含画分でも発現している遺伝子群を差分する方法は、公知の方法を用いることができ、簡便には、例えばクローンテック社の「Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ」に添付されたプロトコール等に従って行なうことができる。
【００３３】
(４)ルプリン特異的ｃＤＮＡの単離
「ルプリン特異的ｃＤＮＡ」とは、ルプリン腺毛で特異的に発現している遺伝子のｃＤＮＡを意味する。ルプリン特異的ｃＤＮＡの単離は、ルプリン多含画分より作製したｃＤＮＡライブラリーをルプリン特異的プローブを用いてスクリーニングすることによって行うことができる。このスクリーニングは公知の方法で行なうことができ、例えば「ＤＩＧシステムを用いてハイブリダイゼーションを行なうためのユーザーガイド」（ベーリンガーマンハイム社、３７頁（１９９５）)に記載の方法等で行なうことができ、本文献は本明細書に引用文献として援用する。
【００３４】
またルプリン特異的プローブの標識も公知の方法で行なうことができる。例えば、ベーリンガーマンハイム社の「ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ」に添付されたプロトコールに従って行なうことができる。
【００３５】
(５)ホップゲノミックＤＮＡの調製
ホップゲノミックＤＮＡの調製は公知の方法で行なうことができ、例えば「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社、５４頁（１９９５）)等に記載の方法で行なうことができ、本文献は本明細書に引用文献として援用する。
【００３６】
(６)ルプリン特異的発現調節領域を含む核酸の単離
「ルプリン特異的発現調節領域を含む核酸」とは、ルプリン腺毛で特異的に機能しているプロモーターを含む発現調節領域を含む核酸を意味する。この核酸はルプリン特異的ｃＤＮＡの塩基配列をプライマーとして逆ＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）を用いた公知の方法で単離することができる。例えば「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社、６９頁（１９９５））等に記載の方法で行なうことができ、本文献は本明細書に引用文献として援用する。
【００３７】
(７)塩基配列の決定
単離された遺伝子の塩基配列は公知の方法で決定することができる。例えば、パーキンエルマー社の「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」に添付されたプロトコール等に従って行なうことができ、本文献は本明細書に引用文献として援用する。ここで決定された塩基配列に基いて、他の植物種で既知の遺伝子の塩基配列との相同性検索を行なうことができる。
【００３８】
(８)ノーザンハイブリダイゼーション解析(以下、ノーザン解析)
単離したルプリン特異的遺伝子が実際にルプリン腺毛で特異的に発現しているか否か、および、前記遺伝子を制御する単離されたルプリン特異的発現調節領域を含む核酸が実際にルプリン腺毛で特異的に機能しているか否かを確認するには、単離したルプリン特異的遺伝子をプローブとしてノーザン解析を行なうことにより実行することができる。ノーザン解析は公知の方法で行なうことができる。例えば「脱アイソトープ実験プロトコール−ＤＩＧハイブリダイゼーション−」（秀潤社、４５頁（１９９４））、「ＤＩＧシステムを用いてハイブリダイゼーションを行なうためのユーザーガイド」（ベーリンガーマンハイム社、４０頁（１９９５））に記載された方法等に基いて行なうことができ、本文献は本明細書に引用文献として援用する。
【００３９】
２．上記単離されたルプリン特異的遺伝子またはルプリン特異的発現調節配列を担持したベクターの調整
上記においてルプリン腺毛での特異性が確認されたルプリン特異的遺伝子は、公知の方法に従い、適当な発現調節配列を担持したベクターの発現調節配列の下流に接続し、適当な細胞内に導入して、発現させることができる。発現調節配列を担持したベクターには特に限定はないが、後述するルプリン特異的発現調節配列を担持したベクターや、既に市販等されている発現ベクター（例えばｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））などを用いることができる。
【００４０】
また、ルプリン特異的発現調節配列を担持したベクターの構築は、同様に既知のプラスミドから目的に応じて適宜選択し、これに上記発現調節配列、例えば配列番号７を接続することにより実行することができる。この場合、必要に応じて発現調節配列の下流に構造遺伝子を接続するための種々の制限酵素認識部位を有するクローニング領域等を設けることもできる。
【００４１】
３、応用
ホップルプリン腺毛では、二次代謝産物が多く分泌されていることから、上記において単離されたルプリン特異的遺伝子は、ルプリン腺毛で分泌される二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子である可能性が高い。従って、上記において得られた遺伝子を形質転換技術や分子選抜技術に応用することにより、例えば、ホップルプリン腺毛において生成される二次代謝産物の改良に基づいたホップの育種が可能となる。上記形質転換技術は周知の方法を用いることができる。
【実施例１】
【００４２】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［実施例１］ルプリン多含画分およびルプリン少含画分の調製
開花後約１５日を経過したホップ球果を採取し、液体窒素で凍結した。この凍結球果をドライアイス上で解剖し、解剖用ピンセットを用いて主にルプリン腺毛およびルプリン腺毛の密集した内包基部から成る画分と、主にルプリン腺毛の密度の低い外包から成る画分に分けた。それぞれをルプリン多含画分およびルプリン少含画分とし、−８０℃に保存した。
【００４４】
［実施例２］ルプリン多含画分、ルプリン少含画分の全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製
ルプリン多含画分、ルプリン少含画分の全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製は以下の通りに行なった。各画分を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液(２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス(ｐＨ９．５)、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、１％β−メルカプトエタノール)に懸濁して、６５℃で３０分間保温した。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、３／４倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡおよびＲＮＡを析出させた。析出したＤＮＡおよびＲＮＡを水に溶かした後、１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、−２０℃で一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、ＤＮａｓｅ反応バッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５ｍＭ塩化マグネシウム）に溶かし、ＤＮａｓｅを加えて３７℃で保温し、ＤＮＡを分解した。１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、−２０℃で一晩放置後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、沈殿を水に溶かした。溶解液をフェノール・クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿を行なった。得られた沈殿物を水に溶かし、全ＲＮＡサンプルとし、この全ＲＮＡサンプルを基に宝酒造社の「ＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞」を用い、添付されたプロトコールに従ってｍＲＮＡを調製した。
【００４５】
［実施例３］ルプリン特異的プローブの作製
ここでは、ルプリン多含画分ｍＲＮＡからルプリン小含画分中にも存在するｍＲＮＡを除去することによりルプリン特異的プルーブの作成を行った。具体的には、このルプリン特異的プローブの作製は、「Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社）を用い、添付されたプロトコールに従って行なった。
【００４６】
まず、ルプリン多含画分のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。また、ルプリン少含画分のｍＲＮＡをビオチン標識した。ここで調製されたルプリン多含画分ｃＤＮＡとルプリン少含画分ビオチン化ｍＲＮＡとを混合しハイブリッドを形成させ、さらにストレプトアビジンを加えて、形成されたハイブリッド中のビオチン化ｍＲＮＡに結合させた。次いで、フェノール・クロロホルム抽出を行なってビオチン化ｍＲＮＡを除くことにより、上記ルプリン多含画分ｃＤＮＡからルプリン少含画分にも存在するｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを除いた。この結果、ルプリン多含画分だけに存在するｃＤＮＡをプローブ化することができた。得られたルプリン特異的プローブをベーリンガーマンハイム社の「ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ」を用いてジゴキシゲニンにより標識した。
【００４７】
［実施例４］ルプリン特異的ｃＤＮＡの単離
アマシャム社の「ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅ」、「ｃＤＮＡ  ｒａｐｉｄ  ａｄａｐｔｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ」、「ｃＤＮＡ  ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ−ＭＯＳＳｌｏｘ」、ストラトジーン社の「ＧＩＧＡＰＡＣＫＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ」を用いて、ルプリン多含画分ｍＲＮＡよりＭＯＳＳｌｏｘをベクターとしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーをジゴキシゲニン標識ルプリン特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション法によりスクリーニングを行なった。
【００４８】
具体的には、上記ｃＤＮＡライブラリーにおける各プラークをメンブレンフィルターに転写し、このフィルターをハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、１００ｍＭリン酸バッファー、７％ＳＤＳ、２％ブロッキング試薬、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、５０％ホルムアミド、５０μｇ／ｍｌ魚精子ＤＮＡ)によりブロッキングした。その後、上記ハイブリダイゼーションバッファーに上記プローブを加え、４２℃で１晩保温した。保温後、洗浄液（１％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ）を用いて５６℃、５分間の洗浄処理を２回、さらに、洗浄液（０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ）により６８℃、１５分間の洗浄処理を２回行なった。洗浄後、陽性のプラークを検出することにより、ルプリン特異的ｃＤＮＡを単離した。
【００４９】
［実施例５］ルプリン特異的ｃＤＮＡの塩基配列および翻訳産物のアミノ酸配列の決定
得られたルプリン特異的ｃＤＮＡおよびルプリン特異的プロモーターを含む遺伝子断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定にあたり、各遺伝子断片をｐＵＣベクターまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングした。塩基配列の決定はパーキンエルマー社の「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  ＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ」およびＤＮＡシークエンサー(パーキンエルマー社、ＡＢＩ３７３Ｓ型)を用いて行なった。
【００５０】
ここで決定されたルプリン特異的ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。またこの塩基配列より推定される翻訳産物のアミノ酸配列を配列番号１に示す。なお、この配列番号１に記載のアミノ酸配列は、配列番号２の36〜38番目の開始コドン（ＡＴＧ）から１２１８〜１２２０番目の終止コドン（ＴＡＡ）までの塩基配列に相当する。
【００５１】
［実施例６］ホップゲノミックＤＮＡの調製
ホップゲノミックＤＮＡの調製は以下の通りに行なった。ホップの葉または球果を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液(２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、１％  β−メルカプトエタノール)に懸濁して、６５℃で３０分間保温した。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、３／４倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡおよびＲＮＡを析出させた。析出したＤＮＡおよびＲＮＡを高塩濃度（Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ）ＴＥバッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、ＲＮａｓｅを加えて６０℃で保温し、ＲＮＡを分解した。２倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを析出させ、７０％エタノールで洗浄後、水に溶かしゲノミックＤＮＡサンプルとした。
【００５２】
［実施例７］ルプリン特異的遺伝子の発現調節配列の単離
ルプリン特異的遺伝子の発現調節配列の単離は以下に示す逆ＰＣＲ法（ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ）を用いて行なった。なお、この実施例７における操作を図１に模式的に示した。
【００５３】
まず、制限酵素、Ｘｈｏ  Ｉを用いて、実施例６で得られたホップゲノミックＤＮＡを消化した（Ｓ１、Ｓ２）。Ｘｈｏ  Ｉ消化後の断片を「ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ.１」（宝酒造社）を用い添付されたプロトコールに従って、分子内ライゲーション（Ｓｅｌｆｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を行なわせた（Ｓ３）。
【００５４】
次に、このライゲーション反応液の一部を鋳型とし、ルプリン特異的ｃＤＮＡ内の配列を有するプライマーを用い、ルプリン特異的遺伝子のプロモーターを含むフランキング領域をＰＣＲにより増幅合成した（Ｓ４）。ここで用いたプライマー対を配列番号３（プライマー１）及び配列番号４（プライマー２）に示す。なお、配列番号３は、配列番号２に記載の１３７番目から１６６番目の配列に相補的な配列であり、また、配列番号４は配列表の配列番号２の３０３番目から３３２番目の配列である。
【００５５】
上記ＰＣＲ反応は「Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ベーリンガーマンハイム社）を用いて、添付されたプロトコールに従って行なった。また反応条件は［９４℃１分、５５℃１分、６８℃４分］を３０サイクル行なった後、７２℃で６分間反応させた。
【００５６】
ここで得られた反応液を電気泳動により確認し、増幅断片１の他に、非特異的に増幅した断片も含まれている可能性が考えられたためさらに異なるプライマーを用いて目的断片のみを選択的に増幅することを試みた（Ｓ５）。すなわち、上記ＰＣＲ反応液の一部を用いプライマー１よりもさらにルプリン特異的遺伝子の上流配列と相補するプライマー３（配列番号５）及び上記プライマー２とを用いてPCRを行い、ルプリン特異的プロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した（Ｓ６）。なおこのプライマー３（配列番号５）はルプリン特異的ｃＤＮＡ（配列番号２）の１１４番目から１４３番目の配列に相補的な配列からなる。また、ＰＣＲは上述した条件及び装置を用いて行った。このプライマー２及び３により得られたＰＣＲ増幅断片２を用いて、次に塩基配列の決定を行った。
【００５７】
［実施例８］ルプリン特異的遺伝子の発現調節配列の塩基配列決定
上記において得られた増幅断片２の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、上記実施例５と同様に上記増幅断片をｐＵＣベクターまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングし、パーキンエルマー社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＤＮＡシークエンサー(パーキンエルマー社、ＡＢＩ３７３Ｓ型)を用いて行なった。その結果を配列番号６に示す。
【００５８】
この増幅断片は逆ＰＣＲ法により得られたものであることから、増幅断片にはルプリン特異的遺伝子（一部）の間にプロモーター等の発現調節配列が含まれることが予想される。そこで、この発現調節配列を同定するためにここで増幅されたＤＮＡ断片とルプリン特異的ｃＤＮＡとの塩基配列の比較をした。これらの比較からここで増幅されたＤＮＡ断片（配列番号６）はルプリン特異的ｃＤＮＡの配列にプロモーターの配列が挟まれていることが判った。具体的には、配列番号６の１〜６９０番目の配列はルプリン特異的ｃＤＮＡ（配列番号２）の３０３〜９９２の配列に相当していた。また、配列番号６の３２９６〜３４３８の配列はルプリン特異的ｃＤＮＡ（配列番号２）の１〜１４３の配列に相当していた。従って、配列番号６の６９１〜３２９５の領域にルプリン特異的遺伝子のプロモーターなどの発現調節配列が含まれ、この配列を配列番号７に示した。
【００５９】
［実施例９］ルプリン特異的ｃＤＮＡおよびルプリン特異的遺伝子の発現調節配列のノーザンブロット解析
上記ルプリン特異的ｃＤＮＡが実際にルプリン腺毛で特異的に発現しているか、および上記ルプリン特異的遺伝子のプロモーターが実際にルプリン腺毛で特異的に機能しているのかを確認した。この確認試験は、ルプリン多含画分およびルプリン少含画分からそれぞれ調製した全ＲＮＡに対し、実施例５のルプリン特異的ｃＤＮＡ（配列番号２）を基に作製された標識ＤＮＡをプローブとしてノーザン解析により行った。
【００６０】
先ず、ルプリン多含画分およびルプリン少含画分の全ＲＮＡは、実施例２と同様の方法により調製した。ここで調製したルプリン多含画分および少含画分の全ＲＮＡを変性アガロースゲル（１％アガロース、１８％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７）を用いて電気泳動を行なった。ＤＩＧシステムを用いてハイブリダイゼーションを行なうためのユーザーガイド（ベーリンガーマンハイム社、４０頁（１９９５）)に従い、アガロースゲル内で分画されたＲＮＡをナイロンメンブレンに転写した後、得られたｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。
【００６１】
ハイブリダイゼーションは次の条件により行なった。実施例４と同組成のハイブリダイゼーションバッファーを用いて上記メンブレンをブロッキングした。上記ルプリン特異的ｃＤＮＡをジゴキシゲニンで標識し、プローブとした後、このプローブを上記ハイブリダイゼーションバッファーに添加し、この混合液にブロッキングした上記メンブレンを浸けて５０℃で一晩保温した。保温後、洗浄液（１％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ）を用いて５６℃、１０分間の洗浄処理を２回、さらに、洗浄液（０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ）により６８℃、３０分間の洗浄処理を２回行なった。洗浄後、プローブと融合したバンドの検出を行なった。その結果を図２に示す。
【００６２】
図２に示す通り、得られた遺伝子のｍＲＮＡはルプリン少含画分にも若干は存在するものの、明らかにルプリン多含画分に多く存在することから、この遺伝子はルプリン腺毛で特異的に強く発現していると考えられる。またこの遺伝子の発現を制御しているのが、ゲノミックＤＮＡにおいて構造遺伝子の上流に存在するプロモーターなどの発現調節領域を含む核酸であり、この発現調節領域を含む核酸については上記実施例において単離されまた同定された核酸である。このことは、上記において単離された発現調節領域を含む核酸がルプリン腺毛で特異的に強く機能していることをも示す。なお、低分子側に帯状に出ているシグナルは、得られた遺伝子のｍＲＮＡの分解産物と考えられる。
【００６３】
［実施例１０］ホモロジー検索
既知のアミノ酸配列と得られたルプリン特異的ｃＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列との相同性を比較した。その結果、この遺伝子は、植物においてフラボノイド類の生合成に関与する、ナリンゲニンの合成を触媒するカルコンシンターゼの遺伝子と高い相同性を有していた。具体的には、他の植物（アラビドプシス（Ｐｌａｎｔ  Ｊ.  ８  （５）,６５９−６７１  （１９９５））、オオムギ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  １６:１１０３−１１０６  （１９９１））、エンドウ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  Ｘ８０００７）、ペチュニア（Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  １１  （２）,１３１−１３５  （１９９５））、ライムギ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  Ｘ９２５４７））のカルコンシンターゼと比較して、遺伝子レベルで６５〜７０％、アミノ酸レベルで７０〜７５％のホモロジーが認められた。
【００６４】
また近年ホップにおいて、カルコンシンターゼ様の酵素が苦味質であるα酸、β酸の前駆体のフロルイソバレロフェノンやフロルイソブチロフェノンの生合成を触媒するバレロフェノンシンターゼ活性を持つ可能性が示唆されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ,  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ,  ｐ２１５（１９９７））。このことから得られた遺伝子の翻訳産物がバレロフェノンシンターゼとして苦味質の生合成に関与している可能性が示唆された。
【００６５】
従って、このルプリン腺毛で特異的に発現している遺伝子がカルコンシンターゼをコードする場合には、この核酸を植物におけるフラボノイド類の改良に利用することができる。また、この遺伝子がバレロフェノンシンターゼをコードする場合には、この核酸をホップにおける苦味質の改良に利用することができる。さらにホップの苦味質であるα酸、β酸に薬理活性があることから（Ｂｉｏｓｃｉ.  Ｂｉｏｔｅｃｈ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.,  ６１（１）,  １５８,  １９９７）、上記核酸を医薬品生産に応用することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上の通り、本発明におけるホップルプリン腺毛において特異的に発現している遺伝子を含む核酸によれば、ホップルプリン腺毛内で発現されている二次代謝産物の観点からホップを遺伝子工学技術により育種することが可能となる。また、前記ルプリン特異的遺伝子を担持したベクターを用いた場合には、培養細胞などの天然の植物外において二次代謝産物の生産を実現させることが期待される。こうした二次代謝産物には食品、医薬として重要な物質が含まれており、フラボノイド類の生合成にはカルコンシンターゼが、苦味質成分の生合成にはバレロフェノンシンターゼが関与していることから本発明は食品、医薬品の原料の開発、改良に大きく寄与することが期待される。
【００６７】
さらに本発明におけるルプリン腺毛で特異的プロモーターについては、その下流に所望の遺伝子を連結してホップ植物体に導入することにより、ルプリン腺毛に蓄積する精油成分や苦味質成分等の二次代謝産物の改良等に利用することができる。また、ホップにその他の新規な性質を付与する目的にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ルプリン特異的遺伝子の調節配列を単離する際のインバースＰＣＲの手順を模式的に示している。
【図２】ルプリン腺毛から回収したＲＮＡを電気泳動し、その後、ルプリン特異的遺伝子をプローブとしてノーザン解析を行った結果を示す。この解析結果は、ルプリン腺毛内におけるルプリン特異的遺伝子の発現の特異性が示されている。
【図１】
2006288401.tif 000002
【図２】
2006288401.tif 000003
【配列表】
2006288401000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月26日(2006.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップのルプリン腺毛において特異的に発現し、ビールの原料として使用されてビールの苦味や香りに寄与する二次代謝物の生合成に関与するタンパク質をコードする核酸であって、下記の群から選択される核酸：
ａ）配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
ｂ）配列番号２に記載された塩基配列を有する核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を担持したベクター。
【請求項３】
ホップのルプリン腺毛において遺伝子の発現を特異的に調節する調節配列を有する核酸であって、配列番号７に記載された塩基配列を有する核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を担持したベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞。
【請求項６】
請求項４に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞。
【請求項７】
請求項２に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換された植物細胞を生産する方法。
【請求項８】
請求項４に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換された植物細胞を生産する方法。
【請求項９】
配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対。
【請求項１０】
配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対。
【請求項１１】
請求項９又は１０のプライマー対を含むことを特徴とする、ルプリン特異的発現遺伝子の調節配列を検出するキット。