(57)【要約】【課題】  廃建材などの木質系バイオマスを用いて安価に効率よくエタノールを製造するエタノール製造方法の提供。【解決手段】  木質系バイオマスから発酵によってエタノールを製造する方法において、木質系バイオマスを加水分解し、その加水分解液を五単糖発酵性細菌と酵母を混合して発酵させてエタノールを製造することを特徴とするエタノール製造方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質系バイオマスから発酵によってエタノールを製造する方法において、木質系バイオマスを加水分解し、その加水分解液を五単糖発酵性細菌と酵母を混合して発酵させてエタノールを製造することを特徴とするエタノール製造方法。
【請求項２】
五単糖発酵性細菌として、アルコール発酵能をもつ遺伝子組換え大腸菌を使用することを特徴とする請求項１に記載のエタノール製造方法。
【請求項３】
木質系バイオマスが廃建材であることを特徴とする請求項１または２に記載のエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、廃建材などの木質系バイオマスを用いて安価に効率よくエタノールを製造するエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生可能資源であるバガスや稲わら、木材チップなどのバイオマス資源からエタノールを製造し、エネルギーや化学原料として利用する試みが内外で進められている。
バイオマス資源の一つである木質系バイオマスでは、先ず酸やアルカリでヘミセルロースを加水分解し、ヘミセルロース由来の糖を得る。ヘミセルロースを構成する糖は、主にキシロース、アラビノースといった五単糖とグルコース、ガラクトース、マンノースといった六単糖であり、これらの量比率は木質系バイオマスの種類によって異なる。
【０００３】
六単糖は、酵母などの一般のエタノール発酵微生物によって発酵されるが、五単糖は通常のエタノール発酵微生物、例えば酵母Saccharomyces cerevisiaeによってはエタノールに変換されない。Pichia stipitisやCandida shehataeなどの酵母の中には、五単糖からもエタノールを発酵するものもあるが、それらはエタノール生産速度やエタノール耐性がSaccharomyces cerevisiaeに比べて低く、木質系バイオマスの加水分解液に含まれる阻害物質に対する耐性も低い。
【０００４】
一方、遺伝子組換えにより五単糖からエタノールを生産する微生物の開発も行われており、その方法としては、Saccharomyces cerevisiaeやZymomonas mobilisに五炭糖の代謝機能を付与する方法と、Escherichia coli（大腸菌）にエタノール変換能を付与する方法に大別される。この中で、エタノール変換能を付与した遺伝子組換え大腸菌は、安定的に遺伝子が導入されており、阻害物質への耐性も比較的高いことから、五炭糖のエタノール発酵微生物として、初めて商業ベースでの利用が行われようとしている。
【０００５】
木質系バイオマスからエタノールを製造する場合、先ず木質系バイオマス原料を加水分解し、ヘミセルロース由来の糖を得た後、残渣を酸や酵素によって加水分解し、セルロース由来の糖を得る。セルロース由来の糖はグルコースとそのオリゴ糖であり、グルコースは酵母などによって容易にエタノールに変換される。木質系バイオマスの加水分解液には、ヘミセルロースに含まれる酢酸、およびフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、レブリン酸、ギ酸などの糖の過分解物質、およびリグニンの可溶化物が含まれ、これらは微生物の増殖や代謝に阻害を及ぼす。特に、木質系バイオマスとして廃建材を原料とした場合、廃建材中に含まれる接着剤や塗料などが加水分解を阻害することがあり、糖の収率低下を防ぐため、それに応じて加水分解条件を強くする必要がある。しかし、加水分解条件を強くするにつれて上記の阻害物質の量も高くなる場合が多い。また、廃建材の加水分解液中には接着剤や塗料などに由来する上記の阻害物質以外の物質も含まれ、発酵に一層影響を及ぼす。
【０００６】
木質系バイオマスの加水分解液をアルコール発酵する工程において、回分培養で微生物に与える負荷が大きく培養が良好に進まない場合、それを解決する方法の一つに、流加培養がある。流加培養は糖液を徐々に供給することによって、糖の濃度を低く保ち、トータルの浸透圧を少なくとも糖の分は抑えるため、微生物に対する負荷は小さくなる。また、阻害物質の中でフルフラールは酵母や大腸菌によって消費されることが知られており（非特許文献１，２参照。）、流加によって、それらの濃度を低く保つ効果もある。
【０００７】
流加培養は制御によっては有効な方法であるが、糖液の貯蔵タンクおよび供給ポンプが必要になること、また、廃建材のように組成が変動する原料の場合、流加のタイミングを制御する方法が難しいなどの、商業利用する面での困難さを伴う。また、発酵前にイオン交換や活性炭処理などで不純物の一部を取り除くこともできるが、コストが大きくなる。
【０００８】
発酵前の処理としては、石灰を添加し６０℃程度まで加温しながら一定時間保持する"オーバーライミング"が、阻害物質の除去方法としては比較的フィージブルであるとされている（例えば、非特許文献３参照。）。しかし、オーバーライミングでは、フルフラールやＨＭＦといったフラン類は低減するが、酢酸、ギ酸、レブリン酸などの有機酸は殆ど低減しない。また、リグニンの分解によって生成するフェノール系化合物の低減も認められていない。従って、オーバーライミング法を用いる場合でも、木質系バイオマス、特に廃建材の加水分解液の発酵に用いる微生物は、フラン、有機酸、フェノール化合物への総合的な耐性ができるだけ強いものが好ましい。
【０００９】
不純物に強く、且つ遺伝子組換えによって五炭糖の発酵能力を有する微生物としては、、例えば上述の遺伝子組換え大腸菌が挙げられるが、不純物の種類によっては酵母の方が細菌より耐性をもつ場合がある。例えばSaccharomyces cerevisiaeの中には浸透圧や有機酸への耐性が細菌より強い種類がある。しかし、酵母は五炭糖を発酵できないので、先ず、酵母によって資化できる糖をエタノールに変換した後、必要ならエタノール濃度を下げ、続いて五炭糖発酵性の遺伝子組換え微生物によって残りの糖をエタノールに変換する方法が有効になる（特願２００３−１３９００８参照。）。
【００１０】
しかし、この方法では、酵母による発酵と遺伝子組換え微生物による発酵の合計の発酵時間が７０〜１００時間と長くなる。また、追加の蒸留塔が必要になることもある。
【００１１】
一方、キシロース発酵性の酵母Pichia stipitisとSaccharomyces cerevisiaeを混合し、五炭糖を含む糖を発酵している例は知られている（例えば、非特許文献４〜６参照。）。しかし、非特許文献４では、純粋なキシロースとグルコース培地を用いており、また非特許文献５では木質系バイオマスの加水分解液を用いているものの、発酵阻害物質の除去にイオン交換を用いており、また、エタノール濃度は２０ｇ／Ｌ程度である。イオン交換処理でギ酸や酢酸を９０％以上除去している理由の一つは、P. stipitisの阻害物質に対する耐性が比較的小さいことが考えられる。また、非特許文献６では、アルカリで脱リグニンした麦わらの酵素加水分解液を用いており、糖液中の発酵阻害物質は少ないと考えられる。
【００１２】
また、アルコール発酵性の細菌と酵母を混合培養する方法は提案されている（特許文献１，２参照。）が、これらの目的は六炭糖からの発酵収率と生産性を向上させることであり、五炭糖発酵性の細菌は使用していない。また、木質系バイオマスの加水分解液に含まれる阻害物質に対する発酵安定性の向上を目的としたものでもない。
【非特許文献１】Mohammad J.Taherzadeh, Lena Gustafsson, Claes Niklasson, Gunnar Liden (1999) Conversion of Furfural in Aerobic and Anaerobic Batch Fermentation of Glucose by Saccharomyces cerevisiae, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.87, No.2, 167-174
【非特許文献２】Tony Gutierrez, Marian L. Buszko, Lonnie O. Ingram, James F. Preston (2002) Reduction of Furfural to Furfuryl Alcohol by Ethanologenic Strains of Bacteria and Its Effect on Ethanol Production from Xylose, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 98-100, 327-340
【非特許文献３】Alfredo Martinez, Maria E. Rodriguez, Sean W. York, James F. Preston, Lonnie O. Ingram (2000) Effects of Ca(OH)2 Treatments ("Overliming") on the Composition and Toxicity of Bagasse Hemicellulose Hydrolysates, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 69, No.5, September 5, 526-536
【非特許文献４】Masayuki Taniguchi, Toshihiro Tohma, Takahiro Itaya, Michihiro Fujii (1997) Ethanol Production from a Mixture of Glucose and Xylose by Co-Culture of Pichia stipitis and a Respiratory-Deficient Mutant of Saccharomyces cerevisiae, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.83, No.4, 364-370
【非特許文献５】Isabella De Bari, Daniela Cuna, Francesco Nanna, Giacobbe Braccio (2004) Ethanol Production in Immobilized-Cell Bioreactors from Mixed Sugar Syrups and Enzymatic Hydrolysates of Steam-Exploded Biomass, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 113-116, 539-557
【非特許文献６】V.A.Awafo, D.S.Chahal, B.K.Simpson (1998) Optimization of Ethanol Production by Saccharomyces cerevisiae (ATCC 60868) and Pichia stipitis Y-7124: A Response Surface Model for Simultaneous Hydrolysis and Fermentation of Wheat Straw, Journal of Food Biochemistry, 22, 489-509
【特許文献１】特開昭５８−１２９９８３号公報
【特許文献２】特開昭５８−１２９９８５号公報
【特許文献３】米国特許第５８２１０９３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は前記事情に鑑みてなされ、廃建材などの木質系バイオマスを用いて安価に効率よくエタノールを製造するエタノール製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するため、本発明は、木質系バイオマスから発酵によってエタノールを製造する方法において、木質系バイオマスを加水分解し、その加水分解液を五単糖発酵性細菌と酵母を混合して発酵させてエタノールを製造することを特徴とするエタノール製造方法を提供する。
【００１５】
本発明のエタノール製造方法において、五単糖発酵性細菌として、アルコール発酵能をもつ遺伝子組換え大腸菌を使用することが好ましい。
【００１６】
本発明のエタノール製造方法において、木質系バイオマスが廃建材であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のエタノール製造方法は、木質系バイオマスを加水分解し、その加水分解液を五単糖発酵性細菌と酵母を混合して発酵させてエタノールを製造することにより、発酵速度の速い酵母によって、六炭糖は組換え細菌単独の場合より速やかにエタノールに変換されるため、他の六炭糖発酵微生物、例えば乳酸菌などによるコンタミネーションのリスクが小さくなる。
また、遺伝子組換え細菌によるエタノール発酵で五炭糖と六炭糖が共存したときは、五炭糖の消費が遅れる傾向があるが、発酵速度の速い酵母を共存させることで、六炭糖が速やかにエタノールに変換されるため、組換え細菌による五炭糖の発酵も比較的速やかに進行する。
また、廃建材など発酵阻害物質が多く含まれ、組成変動がある原料で、遺伝子組換え細菌による発酵が完全に阻害されるロットの場合でも、より耐性の強い酵母によって少なくとも六炭糖はエタノールに変換することで、生産量の大幅な低下を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のエタノール製造方法は、木質系バイオマスを加水分解し、その加水分解液を五単糖発酵性細菌と酵母を混合して発酵させてエタノールを製造することを特徴としている。
【００１９】
本発明において、原料として用いる木質系バイオマス原料としては、木材、稲わら、籾殻、バガスなどが挙げられる。その中でも、国内では発生量が多く、収集ルートが確立している廃建材が望ましい。廃建材は主に木造家屋の解体によって発生し、用いられている樹種としては、杉、松、栂などの針葉樹の比率が高い。
【００２０】
原料は適当なサイズに粉砕した後、酸やアルカリを用いてヘミセルロース分を加水分解する（一次加水分解）。希硫酸を用いる場合、加水分解の条件は硫酸濃度０．１〜５質量％（以下、質量％は％と略記する。）、好ましくは０．５〜３％、温度１４０℃〜２３０℃、好ましくは１６０℃〜２１０℃、反応時間は１〜２０分、好ましくは５〜１０分である。
【００２１】
木質系バイオマス原料は、ヘミセルロース分を加水分解した後、糖液と残渣に固液分離し、糖液は中和し、発酵に用いる。固液分離は、ろ過、遠心分離などによって行うことができるが、所要エネルギーコストが小さい底でろ過が好ましい。固液分離した糖液の中和方法としては、石灰を用いたオーバーライミングが好ましい。
【００２２】
前記加水分解物を固液分離した残渣は、酸や酵素を用いてセルロース分を加水分解する（二次加水分解）。酸で加水分解した場合、糖液は同様にオーバーライミングによって中和し、アルコール発酵に用いる。
【００２３】
アルコール発酵は、ヘミセルロース分の加水分解液（一次加水分解液）とセルロース分の加水分解液（二次加水分解液）の各々について行うこともできるし、両者を混合して行うこともできる。また、工業的には組換え菌の性質保持、コンタミネーションのリスクを回避するため、アルコール発酵は回分式で行う方が好ましい。なお、セルロース分の加水分解液は殆どがグルコースなので通常のSaccharomyces cerevisiaeで発酵を行うことができる。
【００２４】
中和したヘミセルロース分の加水分解液には適当な栄養源を添加する。栄養源としてはコーンスティープリカー，酵母エキス，ペプトンなどを用いることができるが、商業的には安価なコーンスティープリカーが好ましい。
【００２５】
続いて、予め別々に前培養した五炭糖発酵性細菌と酵母を加水分解液に添加し、適当な温度及びｐＨ条件下で培養を行い、エタノールを製造する。培養温度は３０℃〜４０℃、好ましくは３３℃〜３７℃に制御する。また、ｐＨは両微生物の最適なｐＨを考慮して検討する必要があるが、遺伝子組換え大腸菌とSaccharomyces cerevisiaeを混合して用いる場合、ｐＨは５．５〜８．０、好ましくは６．０〜７．５に制御する。
【００２６】
Saccharomyces cerevisiaeの場合、通常の株は、発酵温度３０℃程度、最適ｐＨは５．０〜６．０なので、遺伝子組換え大腸菌との混合培養に適した株を用いる必要がある。例えば、Saccharomyces cerevisiae  ＡＭ−１２株は、３５℃、ｐＨ６．０〜７．５に設定した遺伝子組換え大腸菌との混合培養で良好なエタノール収率を示した。またAlltech社の市販酵母（商品名Super Start）も同様の条件で良好なエタノール収率を示した。
【００２７】
五炭糖発酵性細菌と酵母を用いるアルコール発酵において、通気は両微生物の生育に応じ、微量行うこともあるが、通常は行わない。発酵時間は原料の種類、糖濃度にも依存するが、合板比率が２０％程度以下の廃建材加水分解液で、糖濃度が１００ｇ／Ｌ程度の場合、５０〜６０時間で完了する。
【００２８】
培養開始から２４時間〜１００時間、好ましくは３６時間〜７２時間の培養後、エタノール含有液を得る。得られたエタノール含有液は、蒸留することによってエタノールを分離する。
【実施例】
【００２９】
以下の実験条件によって本発明のエタノール製造方法を実施した。
【００３０】
［原料］
廃建材（ボード原料用）を使用した。４種類のロットを用いた（以下、廃建材−１，２，３，４と記す。）。
【００３１】
［加水分解］
各廃建材を破砕し、希硫酸（硫酸濃度１．５％）と混合し、１６０℃（オートクレーブ中）、１０分間加熱した。
【００３２】
［中和］
加水分解物のろ液１０００ｍＬに対し、水酸化カルシウムを約２５ｇ／Ｌ添加し、６０℃、３０分保持した。
反応中、石灰を追加することによってｐＨ約１０を維持した。最終的なｐＨは９．５〜１０．１であった。
【００３３】
［微生物］
五炭糖発酵性細菌：遺伝子組換え大腸菌  ＫＯ１１株（ATCC 55124）（以下、大腸菌と記す）。
酵母：Ａ）市販酵母  （Alltech社製，商品名  Superstart（商標），種類  Saccharomyces cerevisiae  ）（以下、酵母Ａと記す。）。
Ｂ）  Saccharomyces cerevisiae ＡＭ−１２株（以下、酵母Ｂと記す。）。
【００３４】
［培地］
基質：加水分解液（石灰で中和後）の組成を表１に示す。ロットによって糖および有機酸、フラン類の比率に差が見られる。
栄養源：コーンスティープリカー５０ｇ／Ｌ。
ｐＨ：水酸化カリウムで初期ｐＨ７．５に調整、以後は無調整。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
［前培養］
大腸菌：キシロース４０ｇ／Ｌ、ＬＢ（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）を含む培地で３５℃、１２時間培養した液を培養液１００ｍＬに対し５ｍＬ添加した。
酵母Ａ，Ｂ：グルコース５０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー５ｇ／Ｌ、尿素０．８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．２ｇ／Ｌ培地で３５℃、１２時間培養した液を培養液１００ｍＬに対し５ｍＬ添加した。
【００３７】
［培養］  
２００ｍＬ三角フラスコに９５ｍＬの培地および５ｍＬの前培養液を添加し、嫌気条件下で振とう培養した。培養後、培養液中のエタノール量をガスクロマトグラフィーにより定量分析した。
【００３８】
廃建材−１〜廃建材−４のそれぞれについて、培養時の使用微生物を変えた実施例１，２及び比較例１〜３の条件での培養（アルコール発酵）を行い、エタノール量の経時変化を調べ、比較した。
実施例１：大腸菌＋酵母Ａ。
実施例２：大腸菌＋酵母Ｂ。
比較例１：大腸菌のみ。
比較例２：酵母Ａのみ。
比較例３：酵母Ｂのみ。
【００３９】
廃建材−１を用い、実施例１，２及び比較例１〜３の条件での培養（アルコール発酵）を行った結果を表２及び図１に示す。
廃建材−２を用い、実施例１，２及び比較例１〜３の条件での培養（アルコール発酵）を行った結果を表３及び図２に示す。
廃建材−３を用い、実施例１，２及び比較例１〜３の条件での培養（アルコール発酵）を行った結果を表４及び図３に示す。
廃建材−４を用い、実施例１，２及び比較例１〜３の条件での培養（アルコール発酵）を行った結果を表５及び図４に示す。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
表２〜表５及び図１〜図４に示した通り、大腸菌と酵母Ａの混合（実施例１）と大腸菌と酵母Ｂの混合（実施例２）では、大腸菌のみ（比較例１）より、エタノール生産速度、最終的なエタノール生産量ともに高くなった。また、酵母のみ（比較例２，３）は糖の中の五炭糖を発酵できないため、エタノール生産は六炭糖分からのみに止まり、エタノール生産量は実施例１，２よりも低くなった。
廃建材−１，２，３，４についての発酵結果を表６にまとめた。
【００４５】
【表６】
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【００４６】
表６の結果から、大腸菌のみの発酵では、ロットによって発酵が阻害される場合があったが（廃建材−１，３に相当）、酵母との混合により８０％以上の発酵率が安定して得られた。
以上より、五炭糖発酵性細菌と酵母を混合することにより、原料中の阻害物質に対する発酵安定性を高めることができた。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明に係る実施例のエタノール製造結果の第１の例を示すグラフである。
【図２】本発明に係る実施例のエタノール製造結果の第２の例を示すグラフである。
【図３】本発明に係る実施例のエタノール製造結果の第３の例を示すグラフである。
【図４】本発明に係る実施例のエタノール製造結果の第４の例を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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