(57)【要約】      （修正有）【課題】  変異対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉを評価する方法の提供。【解決手段】  ＲＮＡ分子と、発現に必要な要素の制御下に置かれ、第一のタンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第一のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、前記変異対立遺伝子を含んでなる、第一のベクターと、発現に必要な要素の制御下に置かれた、第一のマーカータンパク質と峻別可能な第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第二のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、前記正常対立遺伝子を含んでなる、第二のベクターとを細胞に導入し、前記第一のマーカータンパク質の発現レベルと、前記第二のマーカータンパク質の発現レベルとを比較することを少なくとも含んでなる方法が提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子が、細胞内において、ＲＮＡｉによって、正常対立遺伝子と比較して、標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価する方法であって、
前記ＲＮＡ分子と、
発現に必要な要素の制御下に置かれ、第一のタンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第一のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、前記標的変異対立遺伝子を含んでなる、第一のベクターと、
発現に必要な要素の制御下に置かれた、前記第一のマーカータンパク質と峻別可能な第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第二のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、前記正常対立遺伝子を含んでなる、第二のベクターと
を細胞に導入し、
前記第一および第二のマーカータンパク質の発現レベルを測定し、
前記第一のマーカータンパク質の発現レベルと、前記第二のマーカータンパク質の発現レベルとを比較することを少なくとも含んでなる、方法。
【請求項２】
前記第一のマーカータンパク質の発現レベルが、前記第二のマーカータンパク質の発現レベルより低い場合、ＲＮＡ分子が、前記標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡiによって特異的に抑制したものとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一および第二のベクターにおいて、前記第一のマーカータンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片および前記第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片とが各々、実質的に同一の構造を有してベクター中に存在している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一および第二のベクターにおいて、前記第一のマーカータンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片と、前記第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片とが各々、同一のプロモーターと連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターが、ＴＫプロモーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第一および第二のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のマーカータンパク質および第二のマーカータンパク質の組み合わせが、ホタル・ルシフェラーゼタンパク質およびウミシイタケ・ルシフェラーゼの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的変異対立遺伝子が、ＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的変異対立遺伝子が、配列番号３で表されるＤＮＡ配列、配列番号７で表されるＤＮＡ配列、配列番号９で表されるＤＮＡ配列、または配列番号１１で表されるＤＮＡ配列を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ分子がsiＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡiによって特異的に抑制するＲＮＡ分子のスクリーニングに用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡ分子が、細胞内において、正常対立遺伝子と比較して標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価するためのキットであって、少なくとも請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第一および第一のベクターを含んでなるものである、キット。
【請求項１６】
細胞内でＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制するための二本鎖ＲＮＡ分子であって、
その二本鎖部分の長さが１９〜２０塩基対からなり、
前記二本鎖ＲＮＡ分子を構成するアンチセンス鎖が、その二本鎖部分において、
（１）配列番号３における第１８番〜４３番で表される、第一の標的配列、
（２）配列番号７における第１８番〜４０番で表される、第二の標的配列、
（３）配列番号９における第１８番〜４０番で表される、第三の標的配列、または
（４）配列番号１１における第１９番〜４１番で表される、第四の標的配列から選択される、標的配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、
前記二本鎖ＲＮＡ分子を構成するセンス鎖が、その３’末端において突出部を有さず、かつその二本鎖部分において、３’末端から順に１以上のヌクレオチド残基が、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基とされ、かつ該ヌクレオチド残基以外のセンス鎖におけるヌクレオチド残基がアンチセンス鎖と相補的である、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記標的配列が第一の標的配列である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記標的配列が第二の標的配列である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記標的配列が第三の標的配列である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記標的配列が第四の標的配列である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記センス鎖における３’末端から順に１〜４個のヌクレオチド残基が、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記センス鎖における３’末端から順に２個のヌクレオチド残基が、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子を含んでなる、アルツハイマー病用治療剤。
【請求項２４】
アルツハイマー病用治療剤の製造における、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＲＮＡ分子の、標的変異対立遺伝子に対する特異的なＲＮＡｉ活性を評価するための方法に関する。さらに、本発明は、ＡＰＰ変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するための二本鎖ＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
背景技術
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される配列特異的な遺伝子転写後抑制機構である。この現象は、ハエ、昆虫、原生動物、脊椎動物、高等植物などの様々な種において観察されている。ＲＮＡｉの分子レベルでの作用機序に関し、ショウジョウバエ（Drosophila）および線虫（Caenorhabditis elegans）における多くの研究により、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ断片がＲＮＡｉにとって必須の配列特異的メディエーターであること（非特許文献１：Hammond, S.M. et al., Nature 404, 293-296, 2000；Parrish, S. et al., Mol. Cell. 6, 1077-1087, 2000；Zamore, P.D. et al., Cell 101, 25-33, 2000）、ならびにこのｓｉＲＮＡが長い二本鎖ＲＮＡから、Dicerと呼ばれるＲＮアーゼIII様ヌクレアーゼにより生成すること（非特許文献２：Brenstein, E. et al., Nature 409, 363-366, 2001；Elbashir, S.M. et al., Genes Dev. 15, 188-200, 2001）がわかっている。
【０００３】
哺乳動物においては、当初、ＲＮＡｉは卵母細胞および着床前の胚においてのみ見られる現象と考えられていた。一般に、哺乳動物細胞は、配列非特異的ＲＮアーゼであるＲＮアーゼＬによる迅速かつ非特異的なＲＮＡ分解経路、およびインターフェロンにより誘導される二本鎖ＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）による迅速な翻訳阻害経路を有しており、これらは共に、３０ヌクレオチド以上の二本鎖ＲＮＡによって活性化される。従って、未分化細胞およびＰＫＲを欠く分化細胞などを除く哺乳動物細胞においては、３０ヌクレオチド以上の二本鎖ＲＮＡへの前記応答により、配列特異的なＲＮＡｉ活性が遮蔽されることがある。最近になって、合成した２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖が、哺乳動物細胞培養物において内因性遺伝子の発現を特異的に阻害しうることが報告されている（非特許文献３：Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。
【０００４】
ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制の原理は、次のように考えられている。まず、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、これがマルチタンパク質複合体と結合し、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）が形成される。次いで、このＲＩＳＣは標的遺伝子からのｍＲＮＡに結合し、そのヌクレアーゼ活性によりｍＲＮＡ中のｓｉＲＮＡが結合した部分を切断する。これにより、標的遺伝子によるタンパク質の発現が阻害される。
【０００５】
最近では、合成ｓｉＲＮＡの細胞への導入によるＲＮＡｉ現象を用いた方法が、遺伝子発現の抑制法として注目され、利用されている。また、ｓｉＲＮＡの構成と遺伝子発現抑制効果との関係も、研究の対象となっている。
【０００６】
例えば、Hohjoh H.の報告（非特許文献４：Hohjoh H., FEBS Letters 521, 195-199, 2002）では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する様々な二本鎖オリゴヌクレオチドについて、哺乳動物細胞における該遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、とりわけ、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’末端における２個のリボヌクレオチドのオーバーハングが好ましいこと、アンチセンス鎖の構造が重要であること、ならびに、対象とする遺伝子における標的配列の違いにより、得られる遺伝子発現抑制効果が異なることが記載されている。
【０００７】
Hamada M.らの報告（非特許文献５：Hamada M. et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12, 301-309, 2002）では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖においてそれぞれの３’末端以外の部分に連続しない１以上の標的配列とのミスマッチを導入したｓｉＲＮＡを用いて、その標的遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、アンチセンス鎖における標的配列とのミスマッチによって遺伝子発現抑制効果が低減されるが、一方で、センス鎖におけるミスマッチは遺伝子発現抑制効果に影響しないことが記載されている。
【０００８】
一方で、常染色体優性遺伝病や多因子疾患に関与する種々の変異対立遺伝子の一つとして、家族型アルツハイマー病の原因遺伝子であるアミロイド前駆タンパク質amyloid precursor protein;APP)遺伝子が知られている。このＡＰＰ遺伝子における遺伝子変異により、ＡＰＰはβ,γ-セクレターゼによって分解されやすくなり、アルツハイマー病の病態形成の中心的役割を果たすβアミロイドを過剰に生じることになる。
【０００９】
上述のような常染色体優性遺伝病や多因子疾患に関与する変異対立遺伝子の発現を、正常遺伝子の発現を抑制することなく、ＲＮＡｉによって特異的にノックアウトまたはノックダウンすることにより、常染色体優性遺伝病や多因子疾患の治療または予防が可能になると考えられる。したがって、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡiによって標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを簡易かつ迅速に評価する手法の創出が望まれるといえる。
【００１０】
【非特許文献１】Hammond, S.M. et al., Nature 404, 293-296, 2000；Parrish, S. et al., Mol. Cell. 6, 1077-1087, 2000；Zamore, P.D. et al., Cell 101, 25-33, 2000
【非特許文献２】Brenstein, E. et al., Nature 409, 363-366, 2001；Elbashir, S.M. et al., Genes Dev. 15, 188-200, 2001
【非特許文献３】Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001
【非特許文献４】Hohjoh H., FEBS Letters 521, 195-199, 2002
【非特許文献５】Hamada M. et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12, 301-309, 2002
【発明の概要】
【００１１】
本発明者は、今般、特定の構造の二つのベクターを用いて、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡiによって標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価することができるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、上記評価方法によって見出された特定の二本鎖ＲＮＡ分子によって、アルツハイマー病の病因遺伝子である、ＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制しうるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明の目的は、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡiによって標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制することを評価するための方法、およびＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制するための二本鎖ＲＮＡ分子を提供することにある。
【００１３】
そして、本発明の第一の態様によれば、ＲＮＡ分子が、細胞内において、ＲＮＡiによって、正常対立遺伝子と比較して、標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価する方法であって、
ＲＮＡ分子と、
発現に必要な要素の制御下に置かれ、第一のタンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第一のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、変異対立遺伝子を含んでなる、第一のベクターと、
発現に必要な要素の制御下に置かれた、第一のマーカータンパク質と峻別可能な第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片を含んでなり、かつ該第二のＤＮＡ断片における３’末端非翻訳領域が、正常対立遺伝子を含んでなる、第二のベクターと
を細胞に導入し、
第一および第二のマーカータンパク質の発現レベルを測定し、
第一のマーカータンパク質の発現レベルと、前記第二のマーカータンパク質の発現レベルとを比較することを少なくとも含んでなる、方法が提供される。
【００１４】
そして、本発明による第二の態様によれば、細胞内でＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制するための二本鎖ＲＮＡ分子であって、
その二本鎖部分の長さが１９〜２０塩基対からなり、
二本鎖ＲＮＡ分子を構成するアンチセンス鎖が、その二本部分において、
（１）配列番号３における第１８番〜４３番で表される、第一の標的配列、
（２）配列番号７における第１８番〜４０番で表される、第二の標的配列、
（３）配列番号９における第１８番〜４０番で表される、第三の標的配列、または
（４）配列番号１１における第１９番〜４１番で表される、第四の標的配列から選択される、標的配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、
二本鎖ＲＮＡ分子を構成するセンス鎖が、その３’末端において突出部を有さず、かつその二本鎖部分において、３’末端から順に１以上のヌクレオチド残基が、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基とされ、かつ該ヌクレオチド残基以外のセンス鎖におけるヌクレオチド残基がアンチセンス鎖と相補的である、二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書において「二本鎖ＲＮＡ」とは、二本の一本鎖ＲＮＡ分子が、全体にわたって、または部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子を意味する。それぞれの一本鎖ＲＮＡを構成するヌクレオチドの数は互いに異なっていてもよい。また、二本鎖ＲＮＡを構成する一方または両方のヌクレオチド鎖は、一本鎖の部分（オーバーハング）を含んでいてもよい。
【００１６】
本明細書において「二本鎖部分」とは、二本鎖ＲＮＡにおいて、両鎖のヌクレオチドが対合している部分、すなわち、二本鎖ＲＮＡ中の一本鎖の部分を除いた部分を意味する。
【００１７】
本明細書において、「センス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相同な配列を有するヌクレオチド鎖を意味し、「アンチセンス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖を意味する。
【００１８】
本明細書において「相補的」とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、およびシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【００１９】
第一の態様
変異対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉとマーカータンパク質の発現
本発明による評価方法は、ＲＮＡ分子が、細胞内において、ＲＮＡiによって、正常対立遺伝子と比較して標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価するためのであり、標的変異対立遺伝子を含む第一のベクターと、正常対立遺伝子を含む第二のベクターとを用いる。上記評価は、第一のベクターおよび第二のベクターと、ＲＮＡ分子とを細胞に導入して行われる。この際、標的変異対立遺伝子の発現レベルが、第一のベクター由来の第一のマーカータンパク質の発現レベルに対応し、正常対立遺伝子の発現レベルが第二のベクター由来の第二のマーカータンパク質の発現レベルに対応することから、第一のマーカータンパク質の発現レベルと、第二のマーカータンパク質の発現レベルとを比較することにより、ＲＮＡ分子が、標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制しているかどうか、さらにはその特異的な抑制の程度を簡易かつ迅速に評価することができる。そして、本発明にあっては、各々対立遺伝子を含む二つのベクターを細胞に同時にトランスフェクトすることから、細胞内で標的となる対立遺伝子のペアは、ヘテロの状態で同時に細胞中に存在し、評価されるということになる。この特徴は、変異対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉを正確かつ適切に評価するためには有利である。
【００２０】
図１は、本発明による二つのベクターの構造、およびこれらのベクターとＲＮＡ分子とを細胞に導入することを示す模式図である。
まず、図１において、第一のベクターは（ａ）で表され、第二のベクターは（ｂ）で表される。第一のマーカータンパク質ＤＮＡ（ｅ）および第二のマーカータンパク質ＤＮＡ（ｈ）は、いずれも通常プロモーター（ｄ）の下流に位置する。そして、第一のベクター（ａ）において、第一のマーカータンパク質ＤＮＡ（ｅ）は、その３’末端非翻訳領域（ｇ）に標的変異対立遺伝子（ｆ）を含んでなる。同様に、第二のベクター（ｂ）において、第二のマーカータンパク質ＤＮＡ（ｈ）は、その３’末端非翻訳領域（i）に正常対立遺伝子（j）を含んでなる。標的変異対立遺伝子（ｆ）および正常対立遺伝子（ｊ）はそれぞれ、非翻訳領域中に存在することから、マーカータンパク質の発現を妨げない。
そして、本発明にあっては、第一のベクター（ａ）、第二のベクター（ｂ）、およびＲＮＡ分子（ｃ）を細胞（ｋ）へ導入する。
【００２１】
図２は、細胞内において、ＲＮＡ分子がＲＮＡｉを介して標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制した場合のメカニズムを示す模式図である。
まず、第二のベクター（Ａ）にあっては、正常対立遺伝子（Ｃ）を含む第二のマーカータンパク質ＤＮＡ（Ｂ）は、ｍＲＮＡ（Ｄ）を発現しても、ＲＮＡｉによって分解されることなく、そのまま翻訳されて第二のマーカータンパク質（Ｅ）を発現する。一方、第二のベクター（Ｆ）にあっては、標的変異対立遺伝子（Ｇ）を含む第一のマーカータンパク質ＤＮＡ（Ｈ）がｍＲＮＡ（Ｉ）を発現した後、ＲＮＡ分子（Ｊ）と、標的変異体遺伝子に相当する配列を含むｍＲＮＡ（Ｉ）とは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（Ｋ）を形成する。そして、ｍＲＮＡが分解（Ｌ）し、その結果、第一のマーカータンパク質（Ｍ）は発現しないことになる。
【００２２】
よって、正常対立遺伝子と比較し、標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉによって特異的に抑制する場合には、第二のマーカータンパク質の発現レベルと比較して、第一のマーカータンパク質（Ｍ）の発現レベルは低くなる。したがって、本発明にあっては、第一のマーカータンパク質の発現レベルが、第二のマーカータンパク質の発現レベルより低い場合、ＲＮＡ分子が、前記標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡiによって特異的に抑制したものとする。本発明にあってはまた、第一のマーカータンパク質の発現レベルと、第二のマーカータンパク質の発現レベルの差を評価の指標とするができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、第一のマーカータンパク質の発現のレベルと、第一のマーカータンパク質の発現のレベルと差を、標的変異対立遺伝子に対する特異的なＲＮＡｉの活性レベルの指標とする。二つのマーカータンパク質の発現レベルは、例えば、コントロールマーカーを発現するベクターを細胞へ導入し、適切に補正される。
【００２３】
標的変異対立遺伝子
本発明にあっては、標的変異対立遺伝子およびその正常対立遺伝子は、適宜選択してよいが、常染色体優性遺伝病や多因子疾患に関与する変異対立遺伝子を選択した場合、本発明は、正常遺伝子の発現を抑制することなく、ＲＮＡｉによって特異的に病因変異対立遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするＲＮＡ分子を同定するために有利に利用することができる。そして、標的変異対立遺伝子としては、好ましくは、家族型アルツハイマー病の原因遺伝子であるＡＰＰ遺伝子の変異対立遺伝子であり、具体的には、配列番号３で表されるＤＮＡ配列、配列番号７におけるで表されるＤＮＡ配列、配列番号９で表されるＤＮＡ配列、または配列番号１１で表されるＤＮＡ配列を有するものが挙げられる。
【００２４】
ベクターとマーカータンパク質
本発明は、上記二つのマーカータンパク質の発現レベルを比較することにより、標的対立遺伝子に対する特異的なＲＮＡｉの活性を評価するものであるから、評価の確実性を考慮すれば、第一のマーカータンパク質ＤＮＡと、第二のマーカータンパク質ＤＮＡとは、それぞれのベクター上で同一の構造カセットとして存在することが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様によれば、第一のマーカータンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片と、前記第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片とは、実質的に同一の構造を有してベクター上に存在していることが好ましい。とりわけ、プロモーターは、マーカータンパク質の発現に与える影響が大きいことから、二つのベクターにおけるプロモーターを一致させることが好ましい。よって、本発明の好ましい態様によれば、第一のマーカータンパク質をコードする第一のＤＮＡ断片と、第二のマーカータンパク質をコードする第二のＤＮＡ断片とは各々、ベクター中の同一のプロモーターと連結されてなる。そして、プロモーターは、マーカータンパク質の発現効率や宿主細胞などを考慮して適宜選択されてよく、好ましくはＴＫプロモーターである。
また、本発明の好ましい態様によれば、ベクターはプラスミドであることが好ましい。
【００２５】
本発明によるベクターが発現する、第一のマーカータンパク質と、第二のマーカータンパク質は、タンパク質の物理的性状または化学的性状により、峻別可能なものである。そして、本発明の好ましい態様によれば、第一のマーカータンパク質および第二のマーカータンパク質としては、好ましくは蛍光タンパク質である。そして、本発明における、第一のマーカータンパク質と、第二のマーカータンパク質との組み合わせは、特に好ましくはホタル・ルシフェラーゼタンパク質またはウミシイタケ・ルシフェラーゼタンパク質の組み合わせである。ルシフェラーゼタンパク質は、検出感度が高く、発現時間が短時間であるのに加え、ベクターのトランスフェクション効率に影響を受けにくく、優れた定量性を有する。したがって、本発明における標的変異対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉの簡易かつ迅速な検出に有利に用いることができる。
【００２６】
第一および第二のベクターは、上述のプロモーターの外に、目的とする遺伝子を効率よく発現させるための配列を含んでいてよく、そのような配列としては、調節エレメント、例えば、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化シグナル配列などが挙げられ、また必要に応じて制限酵素切断部位を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明によるベクターは、当技術分野で周知となっている標準的方法により構築することができ、例えば、Sambrook, J.らの「Molecular Cloning: a laboratory manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1989）に記載に従って構築することができる。
【００２８】
ＲＮＡ分子
被検物質であるＲＮＡ分子としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられるが、好ましくはｓｉＲＮＡある。種々の構造を取るＲＮＡ分子を適宜合成して評価し、ＲＮＡ分子の構造が標的変異対立遺伝子の発現に与える影響について知見を得るために、本発明は有利に利用することができる。
【００２９】
細胞への導入方法
本発明による評価方法にあっては、上述の通り，第一のベクターと、第二のベクターと、ＲＮＡ分子とをまず、細胞へ導入する。この際、２つのベクターに与えられる影響などを考慮し、これらは時に細胞へ導入することが好ましい。この際、コントロールベクターをあわせて導入してもよい。この細胞への導入は、トランスフェクションまたは形質転換方法として当該技術分野において公知の方法を用いることが可能であるが、好ましくはリポフェクション法である。この際、細胞の生育およびマーカータンパク質の発現に適切な条件下にて行われ、条件は適宜設定されてよい。
また、上記細胞は、ベクターの性質等を勘案して適宜選択されてよいが、このような細胞として、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト由来細胞である。
【００３０】
マーカータンパク質の発現レベルの測定
本発明による評価方法にあっては、細胞への導入後、第一および第二のマーカータンパク質の発現レベルを測定し、第一のマーカータンパク質の発現レベルと、前記第二のマーカータンパク質の発現レベルとを比較する。マーカータンパク発現レベルの測定手法は、マーカータンパク質の種類、性質を考慮して適宜決定されてよい。マーカータンパク質として蛍光タンパク質を用いた場合には、蛍光顕微鏡による観察、フローサイトメトリーなどにより行われてよい。このような方法を用いることにより、ＲＮＡ分子の標的変異対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉ活性を定性的のみならず、定量的に知ることが可能となる。この際、スクリーニングは細胞の生育およびマーカータンパク質の発現に適切な条件下にて行われ、条件は適宜設定されてよい。
【００３１】
また、本発明による評価方法は、標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡiによって特異的に抑制する、ＲＮＡ分子のスクリーニングのために用いることができる。したがって、本発明による評価方法は、好ましくは標的変異対立遺伝子の発現をＲＮＡiによって特異的に抑制する、ＲＮＡ分子のスクリーニングに用いられる。
【００３２】
また、本発明の別の態様によれば、ＲＮＡ分子が、細胞内において、ＲＮＡiによって、正常対立遺伝子と比較して、標的変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するかどうかを評価するためのキットであって、少なくとも第一および第二のベクターを含んでなる、キットが提供される。このキットは、マーカータンパク質の種類等に応じて、その測定に必要な試薬などを適宜含むことができる。
【００３３】
第二の態様
ＡＰＰ前駆タンパク質の変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、上述の通り、本発明における第一の態様による評価方法によって見出されたものであり、細胞内でＡＰＰの変異対立遺伝子の発現をＲＮＡｉにより特異的に抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子である。そして、この二本鎖ＲＮＡ分子は、上述のアルツハイマー病の病因となるＡＰＰのアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異部位を含む、ＡＰＰの変異対立遺伝子におけるＤＮＡ配列の一部を標的配列として設計されたものである。
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡiによって、ＡＰＰの正常対立遺伝子と比較して、変異対立遺伝子の発現を特異的に抑制するものであり、このような対立遺伝子特異的な抑制作用は、アルツハイマー病の治療において意義がある。
【００３４】
そして、このような標的配列としては、４つのＤＮＡ配列が挙げられる。
第一の標的配列は、ＡＰＰにおけるアミノ酸変異が、第６７０番目のリシン残基がアスパラギン残基に変異し、かつ第６７１番目のメチオニン残基がロイシン残基に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ」という）である場合に対応するＤＮＡ配列である。そして、第一の標的配列は、配列番号３における第１８番〜４３番で表され、その第２７番〜３２番のヌクレオチド残基は、Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌに対応する。
【００３５】
第二の標的配列は、ＡＰＰにおけるアミノ酸変異が、第７１７番目のリシン残基がイソロイシン残基に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｋ７１７Ｉ」という）である場合に対応するＤＮＡ配列である。そして、第二の標的配列は、配列番号７における第１８番〜４０番で表され、その第２９番〜３２番のヌクレオチド残基は、Ｋ７１７Ｉに対応する。
【００３６】
第三の標的配列は、ＡＰＰにおけるアミノ酸変異が、第７１７番目のリシン残基がフェニルアラニン残基に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｋ７１７Ｆ」」という）である場合に対に対応するＤＮＡ配列である。そして、第三の標的配列は、配列番号９における第１８番〜４０番で表され、その第２９番〜３２番のヌクレオチド残基は、Ｋ７１７Ｆに対応する。
【００３７】
第四の標的配列は、ＡＰＰにおけるアミノ酸変異が、第７１７番目のリシン残基がグリシン残基に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｋ７１７Ｇ」という）である場合に対応するＤＮＡ配列である。そして、第三の標的配列は、配列番号１１における第１９番〜４１番で表され、その第２９番〜３２番のヌクレオチド残基は、Ｋ７１７Ｇに対応する。
【００３８】
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、その二本鎖部分の長さが１９〜２０塩基対からなる。
そして、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を構成するアンチセンス鎖は、上述の四つの標的配列に基づいて設計されたものであり、その二本鎖部分において、上記標的配列と相補的なヌクレオチド配列を有するものである。そして、アンチセンス鎖は３’末端に突出部を有していてもよく、この突出部は好ましくは、２個のヌクレオチド残基を有するものである。
【００３９】
また、二本鎖ＲＮＡ分子を構成するセンス鎖は、３’末端において突出部を有さない。さらに、その二本鎖部分において、３’末端にアンチセンス鎖と相補的でないヌクレオチド残基を有し、かつそのヌクレオチド残基以外のセンス鎖におけるヌクレオチド残基がアンチセンス鎖と相補的である。センス鎖が、３’末端において突出部を有さないこと、かつその二本鎖部分の３’末端にアンチセンス鎖と相補的でないヌクレオチド残基を有することは、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子が、ＡＰＰ遺伝子において、正常遺伝子と比較して、アルツハイマー病の病因となる変異対立遺伝子に対し、より特異的にＲＮＡiによる発現抑制を生ずるために必要である。そして、本発明にあっては、センス鎖における３’末端から順に１〜４個のヌクレオチド残基は、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基とされる。さらに、本発明のより好ましい態様によれば、センス鎖における３’末端から順に２個のヌクレオチド残基は、アンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチド残基とされる。
【００４０】
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を細胞に導入する方法は、二本鎖核酸分子を細胞中に導入しうるものであればいかなる方法であってもよく、特に制限されない。本発明による方法において、特に好適な二本鎖ＲＮＡ分子の細胞中への導入法は、リポソーム、好ましくはカチオン性リポソームを用いたトランスフェクション法であり、これは、Lipofectamine2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社製）、Oligofectaminトランスフェクション試薬（Invitrogen社製）、jetSIトランスフェクション試薬（Polyplus-transfection社製）、TransMessenger（Qiagen社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いて容易に行なうことができる。
【００４１】
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、上述の通り、アルツハイマー病の原因遺伝子である、ＡＰＰの変異遺伝子の発現を特異的に抑制することができることから、アルツハイマー病の治療に有利に用いることができる。従って、本発明によれば、治療上有効量の本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を被験者に投与することを含んでなる、アルツハイマー病の治療方法、ならびにアルツハイマー病の治療剤の製造における、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子の使用が提供される。ここで、「治療」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。上記被験者は哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類などであり、好ましくはヒトである。
【００４２】
投与される二本鎖ＲＮＡ分子の量は治療上有効量であればよく、このような量は当業者であれば容易に決定することができる。また、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣などによって調整することが好ましいが、このような投与量の調整は、医師または獣医によって適宜行なわれる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００４４】
実施例１
対立遺伝子に特異的なＲＮＡｉの評価を行うことを目的として、以下の手法により２種類のレポーター遺伝子発現プラスミドを作製した。
標的変異対立遺伝子の調製
標的変異対立遺伝子として、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子である、ＡＰＰ変異遺伝子を選択した。ＡＰＰ変異遺伝子としては、Swedish型（Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌのアミノ酸変異を有するものをいう）、およびLondon型「Ｖ７１７Ｉ」、「Ｖ７１７Ｆ」、または「Ｖ７１７Ｇ」を有するものをいう）を選択した。そして、それぞれの標的変異対立遺伝子について正常対立遺伝子および変異対立遺伝子に対応する標的ＤＮＡ配列を合成した。各種標的ＤＮＡ配列を表１に示す。表１では、各標的ＤＮＡ配列のセンス鎖を「ss」とし、アンチセンス鎖を「as」とした。また、各標的ＤＮＡ配列の名称において、「ｓｗ」はＳｗｅｄｉｓｈ型変異に対応する配列であることを表し、さらに、「Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ」はそのアミノ酸変異型を表す。また、「Ｌｏｎｄｏｎ」はＬｏｎｄｏｎ型変異に対応する配列であることを表し、さらに、「Ｖ７１７Ｉ」、「Ｖ７１７Ｆ」、および「Ｖ７１７Ｇ」は、そのアミノ酸変異型に相当する配列であることを表す。また、「ＷＴ」は、正常対立遺伝子に相当する配列であることを表す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
レポーター遺伝子発現プラスミドの調製
レポーター遺伝子としては、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子およびウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を選択した。そして、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターとしては、phRL-TKプラスミド（プロメガ社製）を用いた。一方、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターとしては、pGL3-TKプラスミドを用いた。ここで、pGL3-TKプラスミドは、pGL3-controlベクター（プロメガ社製）からルシフェラーゼ遺伝子を含むHind III―Xba I断片を単離し、このHind III―Xba I断片をphRL-TKプラスミドにおけるウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子をコードするHind III―Xba I領域と入れ替えて、構築した。このような操作によって、二つのベクターにおけるプロモーターを一致させた。
【００４７】
次に、上記２種類のプラスミド、pGL3-TKまたはphRL-TKにおけるルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域のXba I-Not Iサイトにおいて、正常対立遺伝子または変異対立遺伝子に相当する上記標的ＤＮＡ配列を常法に従って挿入した。このようにして、ルシフェラーゼ遺伝子および標的ＤＮＡ配列を同時に備えた種々のベクターを得た。
【００４８】
実施例２
各種二本鎖ＲＮＡ分子の調製
評価対象として、ＡＰＰ遺伝子におけるＳｗｅｄｉｓｈ型変異またはＬｏｎｄｏｎ型変異に対応するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従い、合成した。
設計したオリゴヌクレオチドを下記の表２〜７に示す。
【００４９】
表２〜７では、各二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖を「ss」とし、アンチセンス鎖を「as」をとして記載している。また、二本鎖ＲＮＡ分子の名称において、「T６/C７」は、二本鎖ＲＮＡ分子における５’末端から第６番目および７番目のヌクレオチド残基が、Ｓｗｅｄｉｓｈ型変異（Ｋ６７０Ｎ−Ｍ６７１Ｌ）における置換塩基ＴＣに対応することを表す。また、「T７/C８」「T８/C９」「T9/C10」、「T10/C11」、「T11/C12」、および「T12/C13」についても、「T６/C７」と同様の規則に従い命名している。
また、「A8」は、二本鎖ＲＮＡ分子における５’末端から第８番目のヌクレオチド残基がLondon型変異のＶ７１７Ｉにおける置換塩基Ａに対応することを表す。また、「A9」「A10」「A11」および「A12」についても、「A8」と同様の規則に従い命名している。
また、「T8」は、二本鎖ＲＮＡ分子における５’末端から第８番目のヌクレオチド残基がLondon型変異のＶ７１７Ｆにおける置換塩基Ｔに対応することを表す。「T9」「T10」「T11」および「T12」についても「T8」と同様の規則に従い命名している。
また、「G8」は、二本鎖ＲＮＡ分子における５’末端から第８番目のヌクレオチド残基がLondon型変異のＶ７１７Ｇにおける置換塩基Ｔに対応することを表す。「G9」「G10」「G11」および「G12」についても「G8」と同様の規則に従い命名している。
また、「conv.」は、ミスマッチを含んでいない二本鎖ＲＮＡ分子を表す。また、「Fork」は、その二本鎖ＲＮＡ分子が、センス鎖の３’末端における２つのヌクレオチド残基にミスマッチを導入しているものを表す。「Fork」の場合、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、「conv.」を同様である。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【００５６】
上記の各オリゴリボヌクレオチドを合成した後、それぞれの２０μＭをアニーリング緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１００ｍＭ酢酸カリウム、および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中に添加し、９０℃で３分間の熱変性を行なった後、３７℃で一昼夜のアニーリングを行なった。これにより、各二本鎖ＲＮＡ分子を得た。
【００５７】
実施例３
本例では、アルツハイマー病の原因遺伝子であるＡＰＰ遺伝子のＳｗｅｄｉｓｈ型変異をターゲットとして用い、以下の実験を行った。なお、以下の実験において、正常対立遺伝子、疾患関連対立遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子の発現抑制効果は、コントロール（対照）であるβ−ガラクトシダーゼの活性に対するそれぞれの対立遺伝子を持ったルシフェラーゼの活性の比で示される。そして、これら二種類のルシフェラーゼ活性の比は、遺伝子発現抑制を起こさないsiRNA二量体（siCont）(Qiagen社)を用いた対照サンプルについて得られたものを１．０として標準化した値を示す。各データは少なくとも4回の独立した実験からの平均値であり、また、各データに付されたエラーバーは標準偏差を表わす。
【００５８】
正常対立遺伝子に対応するプラスミドとして、pGL3-TK（ホタル・ルシフェラーゼ発現ベクター）にAPPｓｗ／WTを挿入したプラスミド、およびSwedish変異型対立遺伝子に対応する含むプラスミドとして、phRL-TK（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現ベクター）にAPPｓｗ／K670N-M671Lを挿入したプラスミドを用いた。コントロールプラスミドとしては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミド（プロメガ社製）を用いた。二本鎖ＲＮＡ分子分子（二量体）としては、T7/T8、T8/C9、T9/C10、T10/C11、T11/C12、およびT12/C13を用いた。
【００５９】
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Life Technologies社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Life Technologies社製）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma社製）中において、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。
【００６０】
上記２種のレポータープラスミド、二本鎖ＲＮＡ分子のいずれか一つ、およびコントロールプラスミドを、ＨｅＬａ細胞に共トランスフェクションした。２４時間後に、ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性の測定値をβ−ガラクトシダーゼ活性の測定値で除した値を、標準化されたレポーターの発現量として評価した。
【００６１】
結果は、図３に示される通りであった。いずれの二本鎖ＲＮＡ分子を用いた場合においても、正常対立遺伝子に発現に対応するホタル・ルシフェラーゼよりも、変異型対立遺伝子に対応するウミシイタケ・ルシフェラーゼの発現が低い傾向が確認された。
【００６２】
実施例４
実施例３において、２種のプラスミドに対し挿入した標的ＤＮＡ配列を逆転させ、実施例３と同様な実験を行った。すなわち、正常対立遺伝子に対応するプラスミドとして、phRL-TKにAPPｓｗ／WTを挿入したプラスミドを用いた。Swedish変異対立遺伝子に対応する含むプラスミドとして、pGL3-TKにAPPｓｗ／K670N-M671Lを挿入したプラスミドを用いた。
【００６３】
結果は、図４に示される通りであった。いずれの二本鎖ＲＮＡ分子を用いた場合においても、正常対立遺伝子に対応するウミシイタケ・ルシフェラーゼよりも、変異型遺伝子に対応するホタル・ルシフェラーゼの発現が低い傾向が確認された。
【００６４】
実施例５
評価対象の二本鎖ＲＮＡ分子として、３’末端にミスマッチを含まないConv.T12/T13と、３’末端にミスマッチを含むFork.T12/T13とを用い、これらの対立遺伝子特異的なＲＮＡｉ活性を実験１と同様の手法により評価した。この際、正常対立遺伝子に対応するベクターとしてpGL3-TK（ホタル・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPsw/WTを挿入したプラスミドを用い、APPsw/K670N-M671Lを挿入したプラスミドの代えて、Swedish型のK670N-M671L変異対立遺伝子に対応するプラスミドとして、phRL-TK（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPsw/K670N-M671Lを挿入したプラスミドを用いた。
結果は、図５に示される通りであった。ミスマッチを含まないConv.T12/T13よりも３’末端にミスマッチを含むFork.T12/T13が、より選択的に変異型アレルに対応するウミシイタケ・ルシフェラーゼの発現を抑制する傾向が確認された。
【００６５】
実験例６
評価対象の二本鎖ＲＮＡ分子として、３’にミスマッチを含まないConv.Ａ８、Conv.Ａ１０、およびConv.Ａ１１と、そのFork型二本鎖ＲＮＡ分子に対応するFork.Ａ８、Fork.Ａ１０、およびFork.Ａ１１とを用い、これらの対立遺伝子特異的なＲＮＡｉ活性を試験例７と同様の手法により評価した。この際、正常対立遺伝子に対応するベクターとしてphRL-TK（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPLondon/WTを挿入したプラスミドを用い、London型のK670N-M671L変異対立遺伝子に対応するプラスミドとして、pGL3-TK（ホタル・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPLondon/V717Fを挿入したプラスミドを用いた。
【００６６】
結果は、図６に示される通りであった。ミスマッチを含まないConv.Ｆ８、Conv.Ｆ１０およびConv.Ａ１１よりも、３’末端にミスマッチを含むFork.Ａ８、Fork.Ａ１０、およびFork.Ａ１１が、より選択的に変異対立遺伝子に対応するホタル・ルシフェラーゼの発現を抑制する傾向が確認された。
【００６７】
実施例７
評価対象の二本鎖ＲＮＡ分子として、３’にミスマッチを含まないConv.Ｆ８、Conv.Ｆ１０、およびConv.Ｆ１１と、そのFork型二本鎖ＲＮＡ分子に対応するFork.Ｆ８、Fork.Ｆ１０、およびFork.Ｆ１１とを用い、これらの対立遺伝子特異的なＲＮＡｉ誘導を試験例６と同様の手法により評価した。この際、正常対立遺伝子に対応するベクターとしてphRL-TK（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPLondon/WTを挿入したプラスミドを用い、London型のK670N-M671L変異対立遺伝子に対応するプラスミドとして、pGL3-TK（ホタル・ルシフェラーゼ発現プラスミド）にAPPLondon/V717Fを挿入したプラスミドを用いた。
【００６８】
結果は、図７に示される通りであった。ミスマッチを含まないConv.Ｆ８、Conv.Ｆ１０、およびConv.Ｆ１１よりも、３’末端にミスマッチを含むFork.Ｆ８、Fork.Ｆ１０、およびFork.Ｆ１１が、より選択的に変異型対立遺伝子に対応するホタル・ルシフェラーゼの発現を抑制する傾向が確認された。
【００６９】
実施例８
評価対象として、二本鎖ＲＮＡ分子としてＴ９／１０二本鎖を用い、対立遺伝子特異的なRNAiの評価において、ルシフェラーゼの発現を指標とする場合と、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現を指標にする場合とを比較するため、以下の実験を行った。
【００７０】
ルシフェラーゼを指標とする場合は、上述の実施例３と同様の手法を用い、ＰＣＴについては、SYBR green PCRキット（Applied  Bio systems社製）を用いて行なった。
【００７１】
結果は図８および図９に示される通りであった。図８に示されるルシフェラーゼの発現傾向は、ＲＴ−ＰＣＴにおけるｍＲＮＡの発現傾向と同様であった。ここで、図８および図９において、ＷＴは正常型を示し、Ｓｗｅｄｉｓｈ型であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、第一のベクターおよび第二のベクターの構造、およびこれらを細胞中へＲＮＡ分子とともに導入することを示す模式図である。
【図２】図２は、本発明における対立遺伝子に特異的なＲＮＡiのメカニズムを説明する図である。
【図３】図３は、変異型対立遺伝子を有するベクターをウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現ベクターとし、正常対立遺伝子を有するベクターをホタル・ルシフェラーゼ発現ベクターとして、二本鎖ＲＮＡ分子の変異対立遺伝子特異的なＲＮＡi活性を評価した結果を表す。
【図４】図４は、変異型対立遺伝子を有するホタル・ルシフェラーゼ発現ベクターとし、正常対立遺伝子を有するベクターをウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現ベクターとして、ＲＮＡiを評価した結果を表す。
【図５】図５は、センス鎖の３’末端にミスマッチを含まない二本鎖ＲＮＡ分子(conv.T12/C13)と、センス鎖の３’末端(Fork.T12/C13)にミスマッチ含む二本鎖ＲＮＡ分子に関する変異対立遺伝子特異的なＲＮＡi活性を評価した結果を表す。
【図６】図６は、センス鎖の３’末端にミスマッチを含まない二本鎖ＲＮＡ分子(conv.Ａ８、conv.Ａ１０、conv.Ａ１１)と、センス鎖の３’末端にミスマッチ含む二本鎖ＲＮＡ分子(Fork.Ａ８、Fork.Ａ１０、Fork.Ａ１１)に関する変異対立遺伝子特異的なＲＮＡiを評価した結果を表す。
【図７】図７は、センス鎖の３’末端にミスマッチを含まない二本鎖ＲＮＡ分子(conv.Ｆ８、conv.Ｆ１０、conv.Ｆ１１)と、センス鎖の３’末端にミスマッチ含む二本鎖ＲＮＡ分子(Fork.Ｆ８、Fork.Ｆ１０、Fork.Ｆ１１)に関する変異対立遺伝子特異的なＲＮＡiを評価した結果を表す。
【図８】図８は、変異対立遺伝子特異的なＲＮＡiの指標としてルシフェラーゼを用いた、二本鎖ＲＮＡ分子の評価結果である。
【図９】図９は、変異対立遺伝子特異的なＲＮＡiの指標としてｍＲＮＡを用いた、二本鎖ＲＮＡ分子の評価結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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