(57)【要約】      （修正有）【課題】検体中のリパーゼ活性を同時再現性、日差再現性良く測定するためのリパーゼ測定方法であり、調製間差がなく均質で安定なエマルジョン基質を用いた検体中のリパーゼ測定方法および測定試薬を提供する。【解決手段】検体中のリパーゼ活性の測定において、検体をミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液に作用させその生成物を検出することを特徴とするリパーゼ活性測定方法。【選択図】図１
2006180741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質と界面活性剤を混合する際に水溶性有機溶媒を同時に混合し、混合方法として超音波などの振動を与えることを特徴とする、検体中のリパーゼ活性の測定に用いるための基質溶液のミセル径を、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下に均一化する方法。
【請求項２】
検体中のリパーゼ活性の測定に用いるための基質溶液を製造するための方法であって、基質と界面活性剤を混合する際に水溶性有機溶媒を同時に混合し、混合方法として超音波などの振動を与えることを特徴とする、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液を製造する方法。
【請求項３】
検体中のリパーゼ活性の測定に用いるための基質溶液であって、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液。
【請求項４】
検体中のリパーゼ活性を測定するための方法であって、検体を、ミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液に作用させその生成物を検出する工程を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定方法。
【請求項５】
基質溶液が、基質、界面活性剤および水溶性有機溶媒を混合後、少なくとも当該混合物を３０Ｈｚ以上の振動で処理したものである請求項１のリパーゼ活性測定方法。
【請求項６】
基質がオレイン酸、リノール酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸のいずれか１種以上を脂肪酸として含むトリグリセライドである請求項１のリパーゼ活性測定方法。
【請求項７】
界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステロール、コール酸誘導体のいずれか１種以上のＨＬＢが１０〜１６の非イオン界面活性剤である請求項１のリパーゼ活性測定方法。
【請求項８】
水溶性有機溶媒が、メタノールまたはエタノールである請求項１のリパーゼ活性測定方法。
【請求項９】
検体中のリパーゼ活性を測定するための試薬であって、検体をミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液に作用させその生成物を検出することを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
【請求項１０】
検体中のリパーゼ活性を測定するための試薬であって、検体を基質溶液に作用させその生成物を検出する工程に用いるために、ミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
【請求項１１】
検体中のリパーゼ活性を測定するための試薬を製造するための方法であって、検体を基質溶液に作用させその生成物を検出する工程に用いるために、ミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のリパーゼ活性の測定に用いるための基質溶液のミセル径を、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下に均一化する方法、そのような基質溶液を製造する方法、そのようにして得られた基質溶液に関する。
また、本発明は、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）またはリポ蛋白リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３４）活性（本明細書ではこれらを総称してリパーゼとする。）を同時再現性、日差再現性良く測定するためのリパーゼ測定方法であり、調製間差がなく均質で安定なエマルジョン基質を用いた検体中のリパーゼ測定方法および測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは動物、植物を問わず自然界に広く分布している酵素であり、臨床的見地からは、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）は急性膵炎、膵臓癌等の膵疾患の早期発見に有用であり、リポ蛋白リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３４）は高脂血症、特に高トリグリセリド血症でＬＰＬ欠損症が疑われる場合の鑑別診断に有用である。
【０００３】
リパーゼの測定法には種々あるが、臨床的に使用されている方法は（１）トリグリセライド主にオリーブ油または高級脂肪酸のグリセロールエステルの懸濁液を基質として用い、リパーゼの作用による濁りの減少量を測定する方法、（２）トリグリセライド以外の合成基質例えばモノグリセリド、１，２−ジグリセライド、ｐ−ニトロフェノールラウリン酸エステル、α―ナフチルパルミテートなどを用いる方法、（３）トリグリセライドを用いリパーゼの作用により生成した脂肪酸またはグリセロールを測定する方法、等がある。しかし、これらの方法はいくつか問題がありリパーゼを正確に再現性よく測定するには不十分であった。（１）の方法は濁りが必ずしもリパーゼ活性を反映せず、乳び検体では正誤差を受けること、また感度が低いという問題がある。（２）の方法は比較的水溶性を考慮したものであるが、依然として保存により不溶化するものもあり、また水溶性を考慮した設計であるがゆえにエステラーゼにも作用を受けることから基質特異性の問題がある。（３）の方法はリパーゼがトリグリセライドに作用し生成した脂肪酸またはグリセロールを測定することでリパーゼ活性を化学量論的に測定する方法と考えられる（特許文献１）。しかし、基質であるトリグリセライドの溶解性が悪いことから、これら非水溶性のトリグリセライドを非イオン界面活性剤を含む水溶液に加え、攪拌しながら加熱し、一度非イオン界面活性剤の曇天より高い温度に上げ、さらに攪拌を続けながら、曇天以下に冷却して可溶化した基質を用いている（特許文献２）。しかしながら、これらの方法では依然として溶解度に調製間差が生じることから、基質の調製ごとまたは基質のロットごとにリパーゼ活性が変動し、更には同じ調製ロットでもバラツキが生じ安定した測定値が得られないという問題がある。
【特許文献１】特公平８−２３１７号公報
【特許文献２】特公昭５９−３９１６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は検体中のリパーゼ活性を同時再現性、日差再現性良く測定するためのリパーゼ測定方法であり、調製間差がなく均質で安定なエマルジョン基質を用いた検体中のリパーゼ測定方法および測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、検体中のリパーゼ活性の測定において、検体をミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液に作用させその生成物を検出することを特徴とするリパーゼ活性測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、検体中のリパーゼ活性を同時再現性、日差再現性良く測定することができる。また、調製間差がなく均質で安定なエマルジョン基質を用いた検体中のリパーゼ測定方法および測定試薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の基質は、リパーゼの基質特異性を考慮し選択されるが、通常ヒト由来のリパーゼまたはヒト由来のトリグリセライドに作用するリパーゼの活性測定に用いられる基質は、オレイン酸、リノール酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸のいずれか１種以上を脂肪酸として含むトリグリセライドであり、これらの混合物としてオリーブ油、大豆油等の植物油が用いられうる。
【０００８】
本発明の基質溶液の調製方法は、基質を界面活性剤を用いて水に溶解する場合に溶解後のミセル径が細粒化かつ均一化することであるが、発明者は特定の範囲のミセル径においてリパーゼ活性測定の再現性が著しく向上することを見出した。リパーゼ活性測定の再現性が良好なミセル径としてはミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である。好ましいミセル経は０．２０μｍ〜０．３５μｍであり、更に好ましくは０．２３μｍ〜０．３２μｍである。
【０００９】
具体的には、基質と界面活性剤を混合する際に水溶性有機溶媒を同時に混合し、混合方法として超音波などの振動を与えることでミセル径を細粒化、均一化する。その後、緩衝剤、コリパーゼ、その他界面活性剤、防腐剤などを添加し攪拌して調製することができるが、リパーゼ活性の再現性向上に寄与する工程はミセル径を細粒化、均一化する工程である。
【００１０】
本発明の基質と界面活性剤、水溶性有機溶媒の混合方法は振動作用を利用することにあるが、振動源としては音波などを用いることができる。振動周波は３０Ｈｚ以上あれば良いが、好ましくは２００００Ｈｚ以上であり、ミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下になるように振動時間を調整する。例えばＴＡＩＴＥＣ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＥＲ  ＶＰ−５  型  を用いることが出来る。
【００１１】
本発明に用いられる界面活性剤としては非イオン界面活性剤またはコール酸誘導体が好ましい。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００１２】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ  ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ  ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ  ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
また、コール酸誘導体としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩
【００１３】
これら非イオン界面活性剤は１種または２種以上を混合して用いられうるが、いずれの場合もＨＬＢとしては１０〜１６が好ましく、更にリパーゼの反応性を考慮すると１２〜１４がより好ましい。
【００１４】
本発明に用いられる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、１，４ジオキサン、メチルアミン、ブタンジオール、ジメチルスルホキシド、トリエタノールアミンなどが挙げられるが好ましくはメタノールまたはエタノールである。これら有機溶媒は基質、界面活性剤の容量に対し５〜５０％（Ｗ／Ｗ）量で添加することができるが、より好ましくは１０〜３０％（Ｗ／Ｗ）量である。
【００１５】
尚、本発明に用いられる水溶性有機溶媒はミセル径の細粒化、均一化に寄与するものであり、特公平４−８０３７に記載の非水溶性有機溶媒であるヘプタン、イソオクタンを用いて水層、有機溶媒層の二層化しリパーゼ活性を高め油脂分解を促進させることとは思想が異なる。
【００１６】
尚、本発明のリパーゼ測定試薬には、緩衝剤、酵素、検出物質、防腐剤、キレート剤、フェロシアン化物などの鉄錯体を含んでよい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、グッド緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。酵素は動物、植物、微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的で上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。検出物質としては、還元型または酸化型ＮＡＤＨ、還元型または酸化型ＮＡＤＰＨ、４−アミノアンチピリン、トリンダー試薬などが挙げられる。防腐剤としては、抗生物質、アジ化ナトリウム、ＭＩＴ、ＩＺＵ、ＢＮＤなどが挙げられる。キレート剤としては、ＥＤＴＡまたはその塩などが挙げられる。鉄錯体としてはフェロシアン化カリウム、ＥＤＴＡ・Ｆｅ塩などが挙げられる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記のリパーゼ測定試薬に用いるオリーブ油エマルジョン液を調製した。比較例では、エタノールを添加しない以外は実施例と同様の操作を行なって調製した。
オリーブエマルジョン液のミセル径の測定には、堀場製作所製、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５００を使用した。測定は取扱説明書（第３版  ２０００年５月、ＣＯＤＥ  Ｉ１００００１４０００Ｂ）に従い、最適化しながら進めた。測定条件は、分布形態：標準、データ取り込み回数：２００、反復回数：５０、粒子径基準：体積、試料屈折率：１．４４０（リポソーム）、分散媒屈折率：１．３３３（水）とした。サンプル濃度は取扱説明書に従い適正濃度範囲にあることを確認した。
測定データはＬＢ−５００により自動的に処理され、算術平均径、算術分散、算術標準偏差、幾何平均径、幾何分散、幾何標準偏差など、図１〜図６に記載される各項目についてのデータを得ることができる。各データ項目の処理方法については、図７および図８に記載した。
＜オリーブ油エマルジョン液の調製＞
オリーブ油（ナカライデスク製，リパーゼ測定用特製試薬）５．０ｇと５．０％トリトンＸ−１００溶液（Ｂ）５．０ｍＬの混合液にエタノールを２．０ｍＬ添加し１０分間超音波処理し（２０ＫＨｚ），エマルジョンを調製する。次いでこのエマルジョンに４．０％ＢＳＡ水溶液（Ｃ）２５ｍＬと０．１Ｍ  リン酸Ｋ緩衝液、ｐＨ７．０（Ｄ）１５ｍＬを添加し５分間攪拌して混合した。
【００１８】
結果    図１〜図６に示す。図１〜図３が比較例（上記方法により３ロットを作製）、図４〜図６が実施例（上記方法により３ロットを作製）である。
比較例ではミセル径が０．４２６５μｍ〜１．０５６４μｍと、ロット間でばらつきがあると同時に、ミセル径分布の幾何標準偏差はいずれのロットも０．２５を越えていた。一方、実施例ではミセル径はいずれのロットも０．２８μｍ付近であり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差はいずれのロットも０．１７付近であった。
このことから、実施例は比較例に比べてミセルの均一性がより高いといえる。
【００１９】
（実施例２）
オリーブ油エマルジョン液を次のように調製した。
オリーブ油(ナカライデスク製,リパーゼ測定用特製試薬)５．０ｇと５．０％トリトンX-100溶液（Ｂ）５．０ｍＬの混合液にエタノール添加量を０．５〜３ｍＬと変えて調製し、１０分間超音波処理し(２０ＫＨｚ),エマルジョンを調製する。次いでこのエマルジョンに４．０％ＢＳＡ水溶液（Ｃ）２５ｍＬと０．１Ｍ  リン酸Ｋ緩衝液、ｐＨ７．０（Ｄ）１５ｍＬを添加し攪拌時間を５〜９０分と条件をかえて混合した。
以上のように調製したオリーブ油エマルジョン液を用いて下記のようにリパーゼ測定試薬を調製し、下記の測定手順、活性算出式でリパーゼ添加試料液中のリパーゼ活性を測定した。
得られたリパーゼ活性値より基準値に対する回収率（％）を算出した。
＜リパーゼ測定試薬の調製法＞
Ａ．オリーブ油エマルジョン液
Ｂ．５．０％トリトンＸ−１００溶液
５．０ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１００ｍＬの蒸留水に溶解する。
Ｃ．４．０％ＢＳＡ水溶液
４．０ｇの牛血清アルブミンを１００ｍＬの蒸留水に溶解する。
Ｄ．０．１Ｍ  リン酸Ｋ緩衝液、ｐＨ７．０
Ｅ．０．２Ｍトリクロル酢酸（ＴＣＡ）溶液
３３ｇのトリクロル酢酸を１０００ｍＬの蒸留水に溶解する。
Ｆ．５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５
９．７６ｇの  ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＭＷ＝１９５．２３）を約８５０ｍＬの蒸留水に溶解し，ｐＨを５．０ＮＮａＯＨで６．５に調整後、蒸留水で１０００ｍＬとする。
Ｇ．発色試薬
２００ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５（Ｆ）に下記順序で試薬及び酵素を溶解する。
４．０ｍＬ    ５．０％トリトンＸ−１００溶液（Ｂ）
０．０４ｍＬ  Ｎ，Ｎ−Ｄｉｅｔｈｙｌ−ｍ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ（完全に溶解するまで攪拌する）
４．０ｍｇ  ４−アミノアンチピリン
２４．２ｍｇ  ＡＴＰ・Ｎａ2・３水和物
４０．７ｍｇ  ＭｇＣｌ2・６水和物
２００単位  Ｇｌｙｃｅｒｏｌｋｉｎａｓｅ（東洋紡製，Ｇｒａｄｅ III）
５００単位  Ｌ−α−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡製，Ｇ３Ｏ−３０１・Ｇｒａｄｅ III）
３００単位  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（プルプロカリン単位）（東洋紡製，Ｇｒａｄｅ III）
＜測定手順＞
(1)オリーブ油エマルジョン液（Ａ）２．０ｍＬを試験管に採り３７℃で約５分間予備加温する。
(2)酵素溶液０．２ｍＬ加え、反応を開始する。
(3)３７℃で正確に１５分間反応させた後，ＴＣＡ溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加えて反応を停止する。
(4)生成する不溶物を濾紙濾過で除く（東洋濾紙Ｎｏ．１３１あるいはＷｈａｔｍａｎＮｏ．４２）。
(5)濾液の０．０５ｍＬを試験管に採り、発色試薬（Ｇ）３．０ｍＬを加えて混合した後、３７℃にて１５分間加温し、５４５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
(6)盲検はオリーブ油エマルジョン液（Ａ）２．０ｍＬ３７℃で１５分間放置後，ＴＣＡ溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加え、次いで酵素溶液０．２ｍＬを加えて調製し、以下上記同様（(4)〜(5)）に操作して吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
＜活性算出式＞
Ｕ／ｍＬ＝｛△ＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）Ｘ４．２（ｍＬ）Ｘ３．０５（ｍＬ）Ｘ希釈倍率｝÷｛２８．２×１／２×１．０×１５（分）Ｘ０．２（ｍＬ）×０．０５（ｍＬ）｝
２８．２  ：  Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光度係数（ｃｍ2／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１／２  ：  Ｈ２０２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子である事による係数
１．０  ：  光路長（ｃｍ）
【００２０】
【表１】
2006180741.tif 000003
【００２１】
結果    表１に示す。比較例では活性回収率が低く、オリーブ油エマルジョン液の攪拌時間で回収率にバラツキがみられるが、実施例では回収率が１００±６％以内と良好でありオリーブ油エマルジョン液の攪拌時間で回収率にバラツキがほとんどないことがわかる。
【００２２】
（実施例３）
実施例１で調製したオリーブ油エマルジョン液を用いて、実施例２に示す＜リパーゼ測定試薬の調製法＞によりリパーゼ測定試薬を調製した。この操作を１５回実施し１５ロットのリパーゼ測定試薬を調製し、各々の試薬ロットで実施例２の測定手順、活性算出式でリパーゼ５．６Ｕ／ｍＬ添加試料液中のリパーゼ活性を測定した。得られた活性値についてＮ＝１５の平均値、標準偏差（Ｓ．Ｄ）、ＣＶ（％）を算出した。比較例として、実施例１で比較例として調製したオリーブ油エマルジョン液を用いて同様の操作を行なった。
【００２３】
【表２】
2006180741.tif 000004
【００２４】
結果    表２に示す。比較例では平均値５．０Ｕ／ｍＬ（回収率８９％）、ＣＶ１６．１％と回収率、バラツキともに大きいのに対し、実施例では試薬ブランクの上昇傾向、溶血の影響の増大がみられるのに対し、実施例では平均値５．５３Ｕ／ｍＬ（回収率９９％）、ＣＶ３．３％と回収率、バラツキとも良好な結果を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明のリパーゼ活性測定方法および測定試薬は、検体中のリパーゼ活性を同時再現性、日差再現性良く測定することができる。また、調製間差がなく均質で安定なエマルジョン基質を用いた検体中のリパーゼ測定方法および測定試薬を提供することができることから、臨床検査分野または工業用酵素または臨床検査試薬用酵素の品質管理に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１の比較例で調製したオリーブエマルジョン液の１ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。図１から図６において、ヒストグラムはミセル径の頻度分布を示し、横軸は粒子径の対数目盛、縦軸は頻度％である。また、図１から図６において、曲線はミセル径の通過分積算を示し、横軸は粒子径の対数目盛、縦軸は通過分積算％である。
【図２】実施例１の比較例で調製したオリーブエマルジョン液の３ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。
【図３】実施例１の比較例で調製したオリーブエマルジョン液の３ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。
【図４】実施例１で調製したオリーブエマルジョン液の１ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。
【図５】実施例１で調製したオリーブエマルジョン液の２ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。
【図６】実施例１で調製したオリーブエマルジョン液の３ロット目のミセル径の測定結果を示すデータである。
【図７】堀場製作所製、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５００を用いて測定した各データ項目の処理方法を示す。（その１／２）
【図８】堀場製作所製、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５００を用いて測定した各データ項目の処理方法を示す。（その２／２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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