(57)【要約】【課題】酸性条件下で使用するためのプロモーターを提供する。【解決手段】グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルタンパク質Ｓ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）から選択されるいずれかの遺伝子のプロモーターあるいはそれと同等の活性を有するプロモーターを用いる。これらのプロモーターによれば、当該プロモーターの下流に機能的に結合された遺伝子を酸性条件下においても高発現させることができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下においてプロモーター活性を有する、酸性条件下で使用するためのプロモーター。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下でのプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
【請求項３】
以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドの一部分を有する、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
【請求項５】
以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下での発現用プロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
【請求項７】
以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドの一部分を有する、酸性条件下でプロモーター活性を有し酸性条件下で使用するためのプロモーター。
【請求項９】
微生物における有機酸生産用プロモーターである、請求項１〜８のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項１０】
酵母による有機酸生産用プロモーターである、請求項９に記載のプロモーター。
【請求項１１】
非中和条件下で有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターである、請求項９又は１０に記載のプロモーター。
【請求項１２】
ｐＨが１．０〜３．０において有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターである、請求項９〜１１のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項１３】
宿主のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現が抑制された状態でピルビン酸に由来する有機酸を生産するための有機酸生産用プロモーターである、請求項９〜１２のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項１４】
酸性条件誘導的プロモーターである、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項１５】
前記酸性条件は乳酸酸性条件である、請求項１〜１４のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項１６】
グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルタンパク質Ｓ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）から選択されるいずれかの遺伝子のプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを備える、ＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
前記タンパク質は乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
前記タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素である、請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
さらに、オートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子の遺伝子破壊のための相同組換え用のＤＮＡを備える、請求項１７〜１９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
前記酵母遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
請求項１７に記載のＤＮＡ構築物を保持する形質転換体。
【請求項２３】
前記プロモーター及び前記タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染色体上に組み込まれている、請求項２２に記載の形質転換体。
【請求項２４】
酵母である、請求項２２又は２３に記載の形質転換体。
【請求項２５】
前記酵母はサッカロマイセス属に属するものである、請求項２４に記載の形質転換体。
【請求項２６】
宿主染色体上のオートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子の発現が抑制されている、請求項２４又は２５に記載の形質転換体。
【請求項２７】
前記オートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２８】
前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有する、請求項２２〜２６のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項２９】
請求項２２〜２７のいずれかに記載の形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を有機酸を含む培地において培養する工程と、
を備える、有機酸生産方法。
【請求項３０】
前記培養工程は、前記宿主細胞による有機酸生産により前記培地に有機酸を供給することを含む工程である、請求項２９に記載の物質生産方法。
【請求項３１】
前記培養工程は、前記培地に有機酸を添加することを含む工程である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、
前記培養工程は、乳酸を生産する工程である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記培養工程は、培地を中和することなく前記形質転換体を培養する工程である、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記培養工程は、培地のｐＨが１．０〜３．０の範囲で前記形質転換体を培養する工程である、請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性条件下で使用するためのプロモーター、遺伝子組換え用ＤＮＡ構築物、形質転換体、物質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術の進歩により、微生物、カビ、動植物および昆虫などの宿主で外来遺伝子を発現させ、その形質転換体を増殖させることによって、目的遺伝子産物を取得する技術が発展してきた。例えば、遺伝子組換え酵母などの培養によれば、発酵生産により大量の目的遺伝子産物を生産させることも可能である。Ｌ−乳酸などの有用な有機酸の生産については、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ属に導入し、Ｌ−乳酸を生産させる試みが多数報告されている。
【０００３】
組換え体において目的産物の高生産性を確立するには、安定した遺伝子高発現系を構築することが必要である。本発明者らは、既に、染色体中のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に目的とする有用遺伝子（この場合は、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子）を結合させると同時に、酵母染色体中のＰＤＣ１遺伝子を破壊することによって、本来のＰＤＣ１遺伝子プロモーター機能を利用してＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させつつ、本来の当該プロモーターによって発現されるＰＤＣ１タンパク質の発現を排除するシステムを開発した。このシステムを用いることで、従来困難であった安定した遺伝子高発現系を確立できることを見出している（特許文献１）。
【０００４】
かかる安定した遺伝子高発現系が確立されたといえども、このシステムにおいても組換え産物の生産性をより一層高める要請は依然として存在する。例えば、遺伝子組換え微生物を利用して乳酸を製造する場合、生成する乳酸によって培養液中のｐＨが低下するために、アルカリで中和しつつ培養して乳酸塩として採取するのが一般的である。乳酸塩として採取すると、これを脱塩しフリー乳酸とするプロセスが別途必要になる。乳酸の大量生産を考慮すると、こうしたプロセスを排除することが望まれる。また、中和剤の投入そのものを回避することも望まれる。
【０００５】
また、生産性の向上のためには、新たなプロモーターの探索も必要である。酵母においては、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター（非特許文献１）、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター（非特許文献２）、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）プロモーター（非特許文献３）及びリボゾーマルタンパク質Ｓ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーター（非特許文献４）などが知られているが、これらのプロモーター活性の特徴についてはよく知られていない。
【特許文献１】特開２００３−１６４２９５号
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, Jan. 2003, p.495-503
【非特許文献２】Applied and Environmental Microbiology, June 2002, p.3024-3030
【非特許文献３】Journal of Bacteriology, May 1999, p. 3076-3086
【非特許文献４】Journal of Biological Chemistry, vol.273, No.49, Issue of December 4, pp. 32870-32877(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記したＰＤＣ１遺伝子プロモーターは中和剤を用いての有機酸生産においては有効なプロモーターであるが、本発明者らは、酸性条件下ではその発現能が低下するという知見を得ている。また、一層の製造工程の簡略化を考慮すれば、酸性条件下において特異的に高発現する新たなプロモーターが必要となってきていた。
【０００７】
そこで、本発明は、酸性条件下において高発現されるプロモーターを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、組換え産物としてフリーの有機酸を培地から取得できる発酵生産に適したプロモーター、遺伝子組換えＤＮＡ構築物、形質転換体及び物質生産方法を提供することを他の一つの目的とする。また、本発明は、中和剤を使用することなく有機酸発酵させることができるプロモーター、遺伝子組換えＤＮＡ構築物、形質転換体及び物質生産方法を提供することをさらに他の一つの目的とする。さらに、本発明では、酵母のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現を抑制した状態で有機酸生産するのに適したプロモーター、遺伝子組換えＤＮＡ構築物、形質転換体及び物質生産方法を提供することをさらに他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、組換え生物に非中和条件で乳酸発酵させることで培地からフリーの有機酸を取得することに着目し、こうした乳酸発酵が可能なプロモーターを探索した。すなわち、非中和条件下、有機酸生産においては酸性条件下で酵母に乳酸を生産させたときに高発現している遺伝子を探索した。この結果、数十種類の高発現遺伝子を見出し、さらにこれらについて選抜を行い、最終的に、これらの高発現遺伝子のプロモーターの下流に乳酸脱水素酵素遺伝子を結合したとき、非中和条件下において乳酸を高効率で生産する４種類のプロモーターを見出した。これらのプロモーターは、いずれも高発現プロモーターとして知られているものでもないが、特異的に酸性条件に耐性があるプロモーターであるといえる。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００９】
本発明の一つの態様によれば、以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下においてプロモーター活性を有する、酸性条件下で使用するためのプロモーターが提供される。なお、この態様のプロモーターは、上記ポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下での発現用プロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターであってもよい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１０】
また、本発明の他の一つの態様によれば、以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターが提供される。なお、この態様のプロモーターは、上記ポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下での発現用プロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターであってもよい。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１１】
また、本発明の他の一つの態様によれば、以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターが提供される。なお、この態様のプロモーターは、上記ポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下での発現用プロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターであってもよい。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１２】
また、本発明のほかの一つの態様によれば、以下の配列（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下でプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターが提供される。なお、この態様のプロモーターは、上記ポリヌクレオチドの一部分を有し、酸性条件下での発現用プロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターであってもよい。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１３】
さらにまた、本発明の他の一つの態様によれば、微生物における有機酸生産用プロモーターである、上記いずれかのプロモーターが提供される。特に、これらのプロモーターは、酵母による有機酸生産用プロモーターとすることができる。また、非中和条件下で有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターとしてもよいし、ｐＨが１．０〜３．０において有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターとしてもよい。さらに、宿主のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現が抑制された状態でピルビン酸に由来する有機酸を生産するための有機酸生産用プロモーターとしてもよい。
【００１４】
また、上記いずれかのプロモーターは酸性条件誘導的プロモーターとして用いることができる。この酸性条件は乳酸酸性条件とすることができる。
【００１５】
また、本発明の他の一つの態様によれば、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルタンパク質Ｓ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）から選択されるいずれかの遺伝子のプロモーター活性を有する酸性条件下で使用するためのプロモーターが提供される。
【００１６】
本発明の他の一つの態様によれば、上記いずれかのプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを備える、ＤＮＡ構築物が提供される。
【００１７】
この態様においては、前記タンパク質は乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質とすることができる。また、前記タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素とすることができる。さらに、オートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子の遺伝子破壊のための相同組換え用のＤＮＡを備える構築物とすることができる。なお、この酵母遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子とすることができる。
【００１８】
本発明の他の一つの態様によれば、これらのいずれかのＤＮＡ構築物を保持する形質転換体が提供される。
【００１９】
この態様においては、前記プロモーター及び前記タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染色体上に組み込まれていることが好ましい。また、宿主は酵母であることが好ましい。さらに、酵母はサッカロマイセス属に属するものであることが好ましい。また、宿主染色体上のオートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子の発現が抑制されていてもよく、前記オートレギュレーション機構を備える酵母遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子であることが好ましい。さらにまた、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有することが好ましい。
【００２０】
本発明の他の一つの態様によれば、上記いずれかの形質転換体を準備する工程と、この形質転換体を有機酸を含む培地において培養する工程と、を備える、有機酸生産方法が提供される。
【００２１】
この態様においては、前記培養工程では、前記宿主細胞による有機酸生産により前記培地に有機酸を供給することとしてもよい。また、前記培養工程では、前記培地に有機酸を添加するようにしてもよい。また、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記培養工程は、乳酸を生産する工程とすることができる。さらにまた、前記培養工程は、培地を中和することなく前記形質転換体を培養する工程とすることができる。また、前記培養工程は、培地のｐＨが１．０〜３．０の範囲で前記形質転換体を培養する工程とすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（プロモーター）
本発明のプロモーターは、本プロモーターに対して機能的に結合されたタンパク質をコードするＤＮＡの発現を、有機酸の存在下においてはじめて活性化するか、有機酸の存在しないときよりも促進するか、あるいは有機酸の濃度が高まると促進するプロモーター活性を有する（以下、当該活性を本プロモーター活性という。）。ここで、「機能的な結合」とは、結合されたタンパク質をコードするＤＮＡの発現を本プロモーターの影響下あるいは支配下におくような結合をいう。なお、「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、有機酸は、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。「有機酸の存在下」とは、有機酸が本発明のプロモーター保持する宿主の成育環境において存在することを意味し、該有機酸は本発明のプロモーターを保持する宿主が生産するものであってもよいし、培地に対して添加されるなど宿主以外から供給されるものであってもよいし、これらの双方であってもよい。有機酸の培地における濃度は特に限定されず、本発明のプロモーターに機能的に結合されたＤＮＡが発現されあるいは促進される範囲であればよい。
【００２３】
本発明の酸性条件下で使用するためのプロモーターは、配列番号１に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって酸性条件下においてプロモーター活性を有するものが挙げられる。さらに、このようなプロモーターと相当的なプロモーターとしては以下のプロモーターを使用できる。
【００２４】
一つの相同的プロモーターとしては、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその一部をプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９７５，９８，５０３．）により得ることができる。また、かかるＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．， ｅｔ ａｌ．，Ｓａｉｋｉ， ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７）により合成することもできる。こうしたＤＮＡの単離に好ましく用いられるストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いＤＮＡを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約４２℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、５０％ホルムアミド存在下で約６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００２５】
他の一つの相同的プロモーターとしては、配列番号１に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって酸性条件下でプロモーター活性を有するものが挙げられる。このようなＤＮＡは、既に述べたハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術等によって得ることもできるし、また、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ．＆ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４，３５０）によって、配列番号１に記載の塩基配列に人工的に変異を導入することによっても得ることができる。
【００２６】
なお、これらの相同的プロモーターにおける配列番号１記載の塩基配列との相同性は、単離されたＤＮＡにおいて７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、公知の遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ），ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＳＩＴ／ＦＡＳＴＡ．ｈｔｍｌ）などによって決定することができる。
【００２７】
本発明のプロモーターとしては、配列番号２〜４に記載される塩基配列から選択されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、本プロモーター活性を有するものが挙げられる。これらの各配列番号２〜４については、配列番号１に記載したのと同様の相同的プロモーターを使用できる。
【００２８】
本発明のこれらのプロモーターの配列番号１〜４の記載された塩基配列で示されるプロモーターは、それぞれ、酵母サッカロマイセスセレビジエのグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルタンパク質Ｓ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーター活性を有するＤＮＡ断片として取得されたものである。したがって、本発明のプロモーターは、酵母、あるいはサッカロマイセス属酵母のこれらの遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡあるいはかかるプロモーター領域に相同性を有し、本プロモーター活性を有するＤＮＡであってもよい。このようなＤＮＡは、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部からなるプローブを用いたハイブリダイゼーション技術や、該塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ技術を利用して、酵母から取得することができる。さらに、上述したストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択することができる。
【００２９】
なお、本発明のプロモーターは、本プロモーター活性を有する限りこのような各種形態のＤＮＡの一部分であってもよい。
【００３０】
なお、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなる各ＤＮＡは、ＰＤＣ１遺伝子が破壊されるとともにＰＤＣ１遺伝子プロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した乳酸生産酵母において中和剤を添加しない条件（非中和条件；ｐＨ１．０〜ｐＨ３．０）での乳酸発酵下におけるスクリーニングを経て選択されたものである。スクリーニングは、乳酸生産酵母を用いて前記中和条件下において乳酸発酵を行い、発酵開始後一定期間後において採取されたｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡを、定量的ＰＣＲ技術等により定量することにより高い発現量を示した遺伝子を選抜するものである。このようなスクリーニングにより、前記したような乳酸生産酵母において乳酸生産時（有機酸存在時）において、高発現する遺伝子を探索することができ、かかる遺伝子のプロモーターを単離することで、乳酸生産時（有機酸存在時）において高い転写活性を有するプロモーターを得ることができる。
【００３１】
かかるスクリーニングによって得られるプロモーターは、同時に乳酸などの有機酸による酸性条件を含む酸性条件に対して耐性があるプロモーターであるとともに、こうした酸性条件下において遺伝子の発現を活性化する酸性条件誘導的プロモーターであるといえる。したがって、かかるプロモーターに乳酸脱水素酵素などの有機酸生産に関与する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを機能的に結合することで、有機酸の生産量の増大によって有機酸の生産が抑制されない、あるいは逆に有機酸の生産量の増大によって酸性度が高まるとさらに有機酸の生産が促進される実用的な有機酸生産酵母などの形質転換体を得ることがおおいに期待される。また、ＰＤＣ１プロモーターは恒常的プロモーターであって、酸性下においても一定の乳酸生産能を有するが、乳酸生産が進行して培地中の酸性度が高まるにつれ、プロモーター活性が停滞あるいは低下することが考えられるが、本プロモーターによれば、そうしたプロモーター活性の低下傾向は抑制又は回避される。
【００３２】
このような本発明のプロモーターの活性は、いずれも知られていない特徴である。また、こうしたスクリーニングによって得られるプロモーターは、宿主のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現が抑制されたいわば酵母にとって異常な状態での転写を活性化するプロモーターであるといえるが、本発明者らが見出したこれらの公知のプロモーターは、こうした特定の異常時において強いプロモーター活性を有するプロモーターであると推測される。
【００３３】
したがって、本プロモーターは、微生物における有機酸生産用プロモーターとして使用することができる。また、特に、酵母による有機酸生産用プロモーターとして使用することができる。なお、微生物としての酵母については後段で詳細に説明する。また、本発明のプロモーターは、非中和条件下で有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターとして使用することができる。さらに、本発明のプロモーターは、ｐＨが１．０〜３．０において有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターとして使用できる。さらに、本発明のプロモーターは、宿主のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（典型的には、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）の発現が抑制された状態でピルビン酸に由来する有機酸を生産するための有機酸生産用プロモーターとして使用できる。
【００３４】
なお、取得したＤＮＡが本プロモーター活性を有するか否かは、当業者において公知のレポーター遺伝子を用いたレポーターアッセイにより確認することもできる。レポーター遺伝子としては、特に制限することなく公知の遺伝子を用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、β−グルクロニダーゼ及びグリーンフロッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等を挙げることができる。この他、遺伝子の発現の確認を該遺伝子によってコードされるタンパク質量や該タンパク質（酵素）の活性（例えば、代謝産物の量）を測定可能な遺伝子を用いて、本プロモーター活性の存否を確認することも可能である。さらに他には、遺伝子が発現されることにより得られるｍＲＮＡを利用したノーザンハイブリダイゼーション法や定量的ＰＣＲ法等を用いて遺伝子の転写レベルを測定することによっても本プロモーター活性を確認することができる。なお、本プロモーター活性は、有機酸の存在下において発現を活性化あるいは促進するものであるため、本プロモーター活性の確認にあたっては、有機酸が存在する培地あるいは有機酸を生産する宿主を用いることが好ましい。
【００３５】
なお、本発明のプロモーターを構成するポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的な手法等により人工的に得られたＤＮＡであってもよい。
【００３６】
（ＤＮＡ構築物）
本発明は、本プロモーターを含むＤＮＡ構築物も提供する。本発明のＤＮＡ構築物は、特に限定しないでプラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。したがって、本ＤＮＡ構築物は、本プロモーターＤＮＡの他、これらのいずれかの態様のベクターとしてのＤＮＡ等を備えることができる。本ＤＮＡ構築物は、好ましくは、プラスミドベクター又はウイルスベクターの形態を採る。また、好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。本ＤＮＡ構築物は、細胞質あるいは宿主細胞において宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。
【００３７】
本ＤＮＡ構築物は、本プロモーターに対して機能的に結合された所望のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、コードＤＮＡともいう。）を備えている。コードＤＮＡは、ｃＤＮＡのみならず、転写されても翻訳されないＤＮＡ配列を含むものであってもよい。タンパク質は特に限定しないが、コードＤＮＡは乳酸等の有機酸生産のためのＤＮＡ、すなわち、有機酸生産に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとすることができる。かかるタンパク質をコードするＤＮＡを本プロモーターに対して機能的に結合させることで、相乗的に有機酸生産が促進されることが期待される。このような酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルＣｏＡシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【００３８】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、好ましくは、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号：６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるＬＤＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５に記載される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。
【００３９】
本ＤＮＡ構築物においては、相同組換えにより本プロモーター及びコードＤＮＡを宿主染色体に組み込むための相同組換え用のＤＮＡ配列を備えることができる。このようなＤＮＡを備えることにより、宿主染色体の所望の部位にこれらのＤＮＡの組み込みを達成する他、所望の遺伝子の破壊を同時に達成することができる。相同組換え用ＤＮＡ配列は、宿主染色体において本ＤＮＡを導入しようとするターゲット部位あるいはその近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡ配列は、一つのターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも１箇所に相同である１の配列を有しており、好ましくは、ターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも２箇所にそれぞれ相同な配列を備えている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡ配列を、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡとのそれぞれに相同なＤＮＡ配列とし、これらの相同組換え用ＤＮＡ配列の間に本プロモーターやコードＤＮＡを連結することが好ましい。
【００４０】
本ＤＮＡ構築物は、宿主染色体上に相同組換えにより宿主染色体に本ＤＮＡを導入する場合であって、適切な相同組換え用ＤＮＡを選択することで、宿主染色体上の所望の部位において、本プロモーター及びコードＤＮＡを組み込んで、本プロモーターＤＮＡによりコードＤＮＡの発現を制御することができるようになる。このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用ＤＮＡの選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用ＤＮＡを選択して相同組換え用ＤＮＡ構築物を構成することができる。
【００４１】
なお、相同組換え用ＤＮＡの選択により、本プロモーターＤＮＡの染色体組み込みと同時に宿主染色体上の所望の遺伝子を破壊することができる。破壊する遺伝子は、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子であることが好ましいが、これについては後述する。例えば、サッカロマイセス属酵母などの酵母において、有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを用いて有機酸を生産する場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（特に、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）を破壊することが好ましい。ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターは強力であるからであり、後述するようにオートレギュレーション機構を備えているからである。該遺伝子を破壊する染色体組み込みにより、ピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制すると同時に外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質を発現させることができる。さらに、本プロモーターによって、外来コードＤＮＡの発現は酸性条件下において発現が活性化されるため、発現されたタンパク質により有機酸生産が促進されることで一層外来コードＤＮＡの発現が促進される。
【００４２】
特に、乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを用いて乳酸を生産する場合には、当該破壊形態が一層有効である。ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子は、乳酸脱水素酵素の基質であるピルビン酸を基質とし乳酸脱水素酵素に対して競合的に作用するからである。該遺伝子を破壊することで、ピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制し乳酸脱水素酵素を発現させることができ、同時に乳酸脱水素酵素は本プロモーターＤＮＡにより有機酸（乳酸）存在下において発現が活性化されるため、乳酸生産がより一層促進されるものと期待される。このような染色体上への組み込みを達成するにあたっては、本ＤＮＡ構築物は、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素の構造遺伝子の一部あるいはその近傍の配列（開始コドンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列（この構造遺伝子のプロモーターを含む）、構造遺伝子内の配列等）、あるいはさらに染色体上の該遺伝子の上流域及び／又は下流側と相同なＤＮＡ配列を含むことができる。好ましくは、サッカロマイセス属（特にセレビシエ）を宿主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとするＤＮＡ構築物とする。
【００４３】
ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターは強力なプロモーターであることから、本プロモーターＤＮＡと組み合わせて使用することができる。すなわち、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（好ましくはピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）の内在部位において、当該遺伝子プロモーターによって本来制御されるべき構造遺伝子に替えて乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを導入する相同組換え用ＤＮＡ構築物と、酵母染色体上の本ＤＮＡプロモーターに内在部位において本ＤＮＡプロモーターによって本来制御されるべき構造遺伝子に替えて乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを導入する相同組換え用ＤＮＡ構築物とを用いることができる。ＰＤＣ（好ましくはＰＤＣ１）遺伝子プロモーターと本プロモーターとの双方による発現促進効果と、ＰＤＣ（好ましくはＰＤＣ１）構造遺伝子の破壊によるピルビン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制とによって、一層効果的な乳酸製造が期待される。また、ＰＤＣ１遺伝子が破壊されていても、代替的に他のＰＤＣ５遺伝子等によりピルビン酸脱炭酸酵素は生合成されるため、酵母の増殖性能は担保されている。なお、このようなＤＮＡ構築物には、ＰＤＣ１プロモーター活性を有するＤＮＡを、プロモーターＤＮＡ及び相同組換え用ＤＮＡの双方の機能を発揮するものとして保持することができる。ＰＤＣ１プロモーターＤＮＡとしては、配列番号：９に記載の塩基配列からなるＤＮＡの他、該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡを用いることができる。このようなＤＮＡは、本プロモーターＤＮＡと同様にして単離することができる。
【００４４】
ＰＤＣ１遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である（特開２００３−１６４２９５号）。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が存在するため、例えば、酵母のＰＤＣ１遺伝子が破壊されたとしても、ＰＤＣ５遺伝子が活性化され、酵母のエタノール生産機能は維持され、生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来ＤＮＡを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。
【００４５】
なお、宿主が本プロモーターを内在遺伝子のプロモーターとして宿主染色体上に備えている場合には、適切な相同組換え用ＤＮＡを選択することで、宿主染色体上において本プロモーターが本来的に存在する部位において、本プロモーター及びコードＤＮＡを組み込むこともできる。こうすることで、染色体上の本プロモーターが本来制御すべき内在性コードＤＮＡに替えて、本プロモーターによって外来性コードＤＮＡを制御させることができる。この結果、本来発現が活性化されるべき内在性コードＤＮＡの発現を抑止する一方、本プロモーターＤＮＡが本来的に存在する染色体上の部位において、本プロモーターＤＮＡによって外来性のコードＤＮＡの発現を活性化させることができる。このようなＤＮＡ構築物は、本プロモーターと、本プロモーターによって制御される内在する構造遺伝子の少なくとも一部を相同組換え用ＤＮＡとして備えることでこのような宿主染色体上への組み込みが可能となる。
【００４６】
なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。
【００４７】
(形質転換体)
本ＤＮＡ構築物は、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。これにより本発明の形質転換体を得ることができる。本ＤＮＡ構築物の導入後、その宿主細胞は、選択培地で培養される。
【００４８】
宿主細胞は、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株を例示できる。
【００４９】
なお、本ＤＮＡ構築物が宿主に導入されたか否か、あるいは染色体上の所望の部位に本ＤＮＡ構築物が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【００５０】
本ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分である本プロモーターやコードＤＮＡ等が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換えを達成できる相同組換え用ＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体上の所望の位置に本プロモーターと該ＤＮＡに対して機能的に結合されたコードＤＮＡを保持する形質転換体が得られる。
【００５１】
宿主染色体に対する相同組換えにより得られる形質転換体の好ましい一形態は、本プロモーターが本来内在する染色体上の部位において、本プロモーターに対して機能的に結合されたコードＤＮＡを備える形態である。かかる形質転換体によれば、酸性条件下において本プロモーターによりコードＤＮＡの発現が活性化されるため、酸性条件下にて目的産物を効果的に得ることができる。この形態においては、好ましくは、コードＤＮＡは、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードしている。かかる形質転換体は、当該乳酸脱水素酵素活性により乳酸を製造し、さらに該乳酸製造によりさらなる該酵素活性の発現が促進され、乳酸製造が促進される。
【００５２】
また、本発明の形質転換体の好ましい他の一形態は、宿主（酵母等）染色体上のオートレギュレーション機構を備える遺伝子の発現が抑制されているとともに、該遺伝子のプロモーターに替えて本プロモーターと該ＤＮＡに機能的に結合されたコードＤＮＡを備える形態である。かかる形質転換体によれば、特に、これらのＤＮＡによって、宿主に致命的な機能障害を与えることなく、コードＤＮＡを発現させることができる。コードＤＮＡとして乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いる場合、宿主の増殖性等に障害を及ぼすことを抑制して乳酸を製造することができる。なお、遺伝子の発現が抑制されているとは、該遺伝子が外来遺伝子の導入によって破壊されるか、あるいは該遺伝子において人工的あるいは天然の変異によって転写物や発現産物の活性が低下している場合などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
また、本発明の形質転換体の好ましい他の一形態は、宿主（酵母等）染色体上のＰＤＣ遺伝子（好ましくはＰＤＣ１遺伝子）が破壊されているとともに、該遺伝子のプロモーターに替えて本プロモーターＤＮＡと該ＤＮＡに機能的に結合されたコードＤＮＡを備える形態である。かかる形質転換体によれば、特に、コードＤＮＡとして乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いる場合、競合するピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制して、本プロモーターＤＮＡにより乳酸脱水素酵素を発現させることができ、乳酸製造に適した形質転換体を得ることができる。既に述べたようにＰＤＣ１遺伝子を破壊しても、該遺伝子には、オートレギュレーション機構が存在するため、宿主の増殖性等が保持されている。
【００５４】
さらに他の好ましい形質転換体の一形態としては、宿主染色体上に本プロモーターＤＮＡと該ＤＮＡに機能的に結合したコードＤＮＡを備えるとともに（例えば、上記した好ましい三形態のいずれかあるいはこれらの組み合わせで）、宿主染色体上あるいは宿主染色体外において、ＰＤＣ１プロモーターと該ＤＮＡに機能的に結合したコードＤＮＡを備える形態である。かかる形態によれば、コードＤＮＡをいずれも乳酸等の有機酸の生合成に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするものとしたとき、ＰＤＣ１プロモーターにより構成的に有機酸の生合成酵素の発現が活性化される一方、本プロモーターにより有機酸誘導的に有機酸生合成酵素の発現が活性化されるため、高効率な有機酸生産が期待される。特に、ＰＤＣ１プロモーターとして宿主染色体上に内在するものを利用する形態であることが好ましい。この場合、ＰＤＣ１プロモーターによる安定的な発現が可能となる。
【００５５】
なお、これらの形質転換体においては、宿主は酵母であることが好ましく、なかでも、サッカロマイセス属酵母であることが好ましく、さらに、サッカロマイセスセレビジエであることが好ましい。さらに、コードＤＮＡは、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましく、より好ましくは、ウシ由来の乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡである。
【００５６】
本発明においては、宿主染色体において本プロモーターによりコードＤＮＡを発現させることが重要である。特に、本来有機酸を生産しないあるいは本来の有機酸生産量より当該生産量を増大させるような形質転換体として取得しようとするとき、２μｍＤＮＡを利用したＹＥＰタイプのプラスミドベクターによる方法がよく用いられているが、この場合、かかるコードＤＮＡは保持されにくいことが報告されている。しかしながら、本発明においては、このようなＤＮＡ保持率が単に高いことのみによるとは思えない高い発現活性が見出されている。したがって、本発明によれば、酸性条件下で本プロモーターを染色体上において利用し、該ＤＮＡに機能的に結合したコードＤＮＡの発現を活性化することでコードＤＮＡの安定かつ予想を超える高発現性を備える遺伝子発現系を構築することができる。さらに、コードＤＮＡが乳酸脱水素酵素のように有機酸の生合成に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするものとした場合には、本プロモーターによって発現が活性化されたコードＤＮＡの最終産物たる有機酸によってさらに本プロモーターによるコードＤＮＡの発現の活性化が期待できる。すなわち、相乗的かつ連続的なタンパク質の生合成及び最終産物の生合成の促進が期待できる。
【００５７】
また、コードＤＮＡとして乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いた場合において、本プロモーターとコードＤＮＡを宿主染色体のＰＤＣ１遺伝子に導入し破壊することにより、上記した効果に加えて、ＰＤＣ１遺伝子の破壊によるピルビン酸脱炭酸酵素発現の抑制効果によって、効果的に乳酸製造を促進することができる。
【００５８】
本発明のプロモーターの下流に乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを結合させて染色体中に導入するのにあたり、乳酸生産量の増大を目的として、この遺伝子導入断片を染色体中に複数個導入した形質転換体を作ることができる。この場合、本プロモーターは単一の種類を使用することができる他、本プロモーターを２種類以上組み合わせて使用することもできる。ここで、本プロモーターを２種類以上組み合わせて使用する形態とは、それぞれのプロモーターにコードＤＮＡを結合させてそれぞれのプロモーターにより乳酸脱水素酵素を発現させる形態をいう。例えば、本プロモーターのうち２種類以上のプロモーターＤＮＡのそれぞれに乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを結合させて作製した１種あるいは２種類以上の遺伝子導入断片を導入した形質転換体を作ることができる。より具体的に例示すると、ＴＤＨ１遺伝子プロモーターの下流にコードＤＮＡを結合させた遺伝子導入断片と、ＴＰＩ１遺伝子プロモーターの下流にコードＤＮＡを結合させた遺伝子導入断片とを宿主に導入することで、ＣＣＷ１２遺伝子プロモーターによる乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質の発現と、ＲＰＳ３１遺伝子プロモーターによる乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質の発現とが同一形質転換体内で組み合わされて発現される形質転換体を得ることができる。
【００５９】
本発明を拘束するものではないが、このように宿主染色体上で該染色体上に本来的に内在するプロモーター（本プロモーターやＰＤＣ１プロモーター）を用いて乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を活性化することにより、予測を超えた乳酸生産量の増大が得られたことは、染色体上のこれらのプロモーターの本来内在される部位において、これらのプロモーターにより本来制御されるべき構造遺伝子に替えて乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させたことに主たる起因があると考えられる。すなわち、染色体上のこれらのプロモーター部位において該プロモーターを利用して他の乳酸脱水素酵素を代替的に発現させるか、あるいは該プロモーター及び構造遺伝子に替えて他のプロモーターにより乳酸脱水素酵素を代替的に発現させることが重要であると考えられる。さらに、これらの起因事項に加え、ＰＤＣ１プロモーターについては、ＰＤＣ１プロモーターが強力な構成的プロモーターであり、かつオートレギュレーション機構を備える遺伝子のプロモーターであることも乳酸生産量の増大に寄与していると考えられ、また、本プロモーターについては、有機酸（乳酸）の存在下において発現を活性化する誘導的プロモーターであることが寄与していると考えられる。
【００６０】
（有機酸などの物質生産方法）
本発明の物質生産方法は、これらの形質転換体のいずれかを準備する工程と、この形質転換体を有機酸を含む培地において培養する工程と、を備えている。本ＤＮＡ構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養液などの培地中に外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を生成させることができる。このような物質生産方法によれば、酸性条件下においてコードＤＮＡの発現が促進されるため、培地に有機酸を添加するなどにより有機酸を培地に存在させることで、有用タンパク質の生産を促進することができる。また、コードＤＮＡが有機酸生産に関与するタンパク質をコードするものである場合には、形質転換体による有機生産によって有機酸を培地に供給して有機酸を培地に存在させることができる。この結果、該コードＤＮＡの発現が促進されて有機酸が生産されれば、それによって、さらにコードＤＮＡの発現が促進される。なお、コードＤＮＡが有機酸生産に関与するタンパク質をコードするものであっても、培地に外部から有機酸を添加することができる。
【００６１】
本発明の方法において、前記培養工程は、培地を中和することなく前記形質転換体を培養することができる。培地を中和しないことで、中和操作を省略できる。また、本発明方法によって乳酸等の有機酸を製造する場合には、中和によって生じた有機酸の塩を再び脱塩してフリーの有機酸とする工程を省略できる。こうした培養工程は、例えば、有機酸としての乳酸の生産方法の場合には中和剤を使用しない場合には、ｐＨは１．０〜３．０の範囲となることが通常であり、この範囲になるように有機酸や無機酸を添加することもできる。この範囲は、本発明のプロモーターが特異的に高発現するｐＨ条件だからである。また、より好ましいｐＨは２．０以上であり、さらに好ましくは、２．５以上である。また、３．０以下であることが好ましく、より好ましくは、２．８以下である。
【００６２】
その他の培養条件として、静置培養、振とう培養、または通気攪拌培養等の通気条件を適宜選択して行うことができる。温度は、２５℃〜４０℃程度とし、また、培養時間は２４〜１２０時間程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００６３】
なお、この他、培養工程においては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。乳酸などの有機酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。なお、有機酸としては、必ずしも添加する必要はないが、酢酸、プロピオン酸、乳酸等の有機酸を添加することができる。
【００６４】
培地から有機酸を分離する工程を実施することにより、有機酸を得ることができる。なお、本発明において培地とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本方法においてアルカリの中和剤を使用することなく培養工程を実施して乳酸などの有機酸を生産する場合には、有機酸がフリーの状態で培地に含まれるので容易に分離でき、このため脱塩プロセス及びその後の回収プロセスを省略できる。
【００６５】
培養終了後、培養物から遺伝子産物を分離するには、通常の乳酸精製手段を使用することができる。例えば、形質転換細胞内に生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などに細胞を破壊して、遺伝子産物を細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、培養上清に遺伝子産物が生産された場合には、この溶液を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。
【００６６】
これらの粗抽出画分に対しては、従来公知の各種精製分離法等を利用して、乳酸を精製することができる。また、必要に応じて、当該粗抽出画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。
【実施例１】
【００６７】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
（定量的ＰＣＲ法によるプロモーターの発現解析）
乳酸生産能をもつ組換え酵母として、特開２００３−２５９８７８（特願２００２−６５８７９）で作製した組換え酵母を用い、中和剤を使用しない非中和条件下（ｐＨ１．０〜ｐＨ３．０）で乳酸発酵を行い、発酵開始６時間後と、３０時間後の菌体を採取し、これよりＲＮＡを調整した。ＲＮＡの調整にはＲｎｅａｓｙＭｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いた。得られたＲＮＡをファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従って、ｃＤＮＡ合成を行った。
【００６８】
なお、使用した前記組換え酵母は、酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発行研究所登録株）のトリプトファン合成欠損株を１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌およびＴＥバッファーによる洗浄を行い、ついで、０．５ｍｌＴＥバッファーと０．５ｍＭ酢酸リチウムを加え、３０℃で振盪培養を行った後に、後述するｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いずれも宝酒造製）で処理して添加し、得られたコロニーをトリプトファン選択培地にて培養して安定性が確認できた選抜株について安定したトリプトファン合成能と所定の染色体位置への前記ＤＮＡ断片の導入を確認した株として取得することができる。
【００６９】
上記試料と、後述する標的遺伝子のプライマー、およびライトサイクラーＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を混合させた後、定量的ＰＣＲ解析装置ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によって発現解析を行った。詳細は付属のプロトコールに従い行った。また、各遺伝子断片量４ｆＭ、２０ｆＭ、１００ｆＭを同様にセットし、これをコントロールとして発現量の測定を行った。
【００７０】
ＤＮＡマイクロアレイ等によって一次スクリーニングして得られた合計で１５種類の遺伝子を標的遺伝子としてその発現について解析を行った。なお、高発現する遺伝子としてのコントロールとして、ＰＤＣ１遺伝子についても解析した。定量的ＰＣＲの結果、ＴＤＨ１遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１遺伝子プロモーター、ＣＣＷ１２遺伝子プロモーター、ＲＳＰ３１遺伝子プロモーターが選択された。乳酸生産酵母におけるこれらの遺伝子は、ＰＤＣ１遺伝子と比較して、高い発現を示していた。これらの遺伝子は、いずれも非組換え株における発現量よりも高い発現量を示すことができる。以上のことから、これらの遺伝子は、酸性条件下において誘導的に発現されるプロモーターによって発現が活性化されていることがわかった。
【００７１】
最終的に有効な発現を確認できた高発現候補遺伝子４種類について、使用したプライマー配列とライトサイクラーで解析した際のＴｍ値を表１に示す。また、コントロールとして用いたＰＤＣ１遺伝子についても、同様にプライマー配列とＴｍ値を示す。
【００７２】
【表１】
2006288318.tif 000002
【実施例２】
【００７３】
（プロモーターの取得と塩基配列決定）
実施例１において有効な発現を示した高発現候補プロモーターとして、上記４種類の遺伝子のプロモーターのＤＮＡ断片をクローニングした。またプロモーター評価のコントロールとして、高発現プロモーターとして知られるＰＤＣ１遺伝子プロモーターも取得した。
【００７４】
プロモーター取得における当該遺伝子資源としては、酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人・発酵研究所に登録されている菌株）のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法によって単離した。本株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、これにゲノムＤＮＡ調整キット、Ｇｅｎとるくん（商標）−酵母用−（タカラバイオ社製）を用いて、ゲノムＤＮＡを調整した。また、調整したゲノムＤＮＡは、分光光度計Ｕｒｔｒｏ  ｓｐｅｃ  ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【００７５】
ＰＣＲ反応には増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （東洋紡社製）を使用した。調製した酵母ＩＦＯ２２６０株のゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇ、プライマーＤＮＡ  ５０ｐｍｏｌ×２、１０倍濃縮ＫＯＤ酵素反応用バッファー  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ  ５μｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    １．０ユニットを加えた合計で５０μｌの反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によってＤＮＡ増幅した。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃  ２分の熱処理を行った後、９６℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で６０秒の３つの温度変化を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し、最後に４℃とした。本反応試料５μｌを１％  ＴＢＥアガロースゲル（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）にて電気泳動し、本ゲルを２５４ｎｍの紫外線照射（フナコシ社製）によってＤＮＡのバンドを検出し、遺伝子増幅の確認を行った。
【００７６】
プライマー配列は以下の表２に示す。
【表２】
2006288318.tif 000003
【００７７】
取得したＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社製）へサブクローニングした。一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行った。すなわち、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ（いずれもタカラバイオ社製）処理した上記ベクターに、同様の制限酵素で処理した各プロモーター断片をＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによって連結した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ反応には、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（プロメガ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。
【００７８】
次に、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応液を大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌を形質転換した。大腸菌コンピテント細胞はＪＭ１０９株（東洋紡社製）を使用し、詳細な取り扱いは付属のプロトコールに従った。抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレート下でコロニー選抜を行い、各選抜コロニーからプラスミドＤＮＡを調整し、これに表２に記載のプライマーＤＮＡを用いてコロニーＰＣＲで確認することにより、それぞれのプロモーター配列をサブクローニングした。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  〜Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  〜  （Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ．  １９８９）に従った。
【００７９】
単離したプロモーター配列を含む各ベクターを、アルカリ抽出法によって調製し、これをＧＦＸ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にてカラム精製した。次に、分光光度計Ｕｌｔｒｏ  ｓｐｅｃ  ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にてＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ塩基配列キットＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に従ってシークエンシング反応を行った。反応試料を塩基配列解析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にセットし、６種類のプロモーターの塩基配列を決定した。なお、機器の使用方法の詳細は本装置付属のマニュアルに従った。配列解析によって決定したＤＮＡ配列を配列番号：１〜４に示す。
【実施例３】
【００８０】
（組換えベクターの構築）
新たに構築したこの染色体導入型ベクターをそれぞれ、ｐＢＴＲＰ−ＴＤＨ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＴＰＩ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＣＣＷ１２Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＲＳＰ３１Ｐ−ＬＤＨベクターと名付けた。また、プロモーター比較のコントロールとして、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター下でＬ−ＬＤＨ遺伝子が発現可能なベクターについても構築し、これをｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターと名づけた。以下に、本実施例におけるベクター構築工程の詳細を図１に基づいて説明するが、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。なお、ベクター構築における一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行い、一連の酵素類はタカラバイオ社製のものを使用した。
【００８１】
（プレベクターの構築）
一般的なＤＮＡサブクローニング法に従って、プレベクターｐＢＴＲＰ−ＬＤＨの構築を行った。本発明者らが既に構築したｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクター（特開２００３−２５９８７８号公報に記載）を制限酵素ＡｐａＩ、ＰｓｔＩ処理して得られた断片を、同様の制限酵素で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社製）に導入し、ｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１Ｄベクターを構築した。続いて本ベクターに、ＰＣＲ増幅によって取得しこれを制限酵素ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ処理したＴＲＸ１断片（７００ｂｐ）と、ＰＣＲ増幅によって取得しこれを制限酵素ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ処理したＬＤＨＫＣＢ断片（２０００ｂｐ）とを順次連結し、プレベクターｐＢＴＲＰ−ＬＤＨを構築した。
【００８２】
なお、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターは、以下の方法で構築したものである。すなわち、高等真核生物であるウシ由来のタンパク質であるＬ−乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイセス・セレビシエ属において効率的に生産するために、ウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して、以下の項目を設計指針として、天然にない新規な遺伝子配列（配列番号：２７）を設計し、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を用いて該ＤＮＡを合成した（合成したＤＮＡをＬＤＨＫＣＢ配列と称した）。全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を用いて、酵母染色体導入型ベクターｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢを構築した。なお、ＬＤＨＫＣＢ配列をＥｃｏＲＩにて酵素処理し、同様に、ＥｃｏＲＩにて酵素処理したｐＣＲ２．１ＴＯＰＯＶｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に常法により連結し、ｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称した。 
【００８３】
１．ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢ構築のためのＰＤＣ１Ｐ断片は、サッカロマイセス・セレビシエYPH株（Stratagene社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したPCR増幅法によって単離を行った。サッカロマイセス・セレビシエYPH株のゲノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるFast DNA Kit（Bio 101社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ ｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるPyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によってＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃で２分の熱処理を行った後、９６℃で３０秒と、５３℃で３０秒と、７２℃で６０秒とのサイクルを２５サイクル行い、その後４℃とした。ＰＤＣｌプライマーの増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断片の確認を行った。なお反応に使用したプライマーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノロジー社）を用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下の通りであった。
・ＰＤＣＩＰ−ＬＤＨ−Ｕ（３１ｍｅｒ，Ｔｍ値５８．３℃）未端に制限酵素ＢａｍH1サイトを付加：ata tat ggatcc gcg tttatt tac ctatctc （配列番号：２８）
・ＰＤＣｌＰ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．４℃）末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加：atatatgaat tctttgattg atttgactgt g（配列番号：２９）
【００８４】
２．遺伝子断片であるＰＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣＩＰ）９７１ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅には、以下のプライマーを使用した。
・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｕ（３４ｍｅｒ、Ｔｍ値５５．３℃）未端に制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加：ata tat ctc gag gcc agctaa ctt cttggtcga c （配列番号：３０）
・ＰＤＣＩＤ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．４℃）末端に制限酵素ＡｐａＩサイトを付加：ata tat gaa ttc tttgat tga ttt gac tgtg （配列番号：３１）
【００８５】
３．上記反応にて取得したＰＤＣ１Ｐ及びＰＤＣ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行った。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｌｏｎ（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ．１９８９）に従った。制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）及び脱リン酸化酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１Ｐ断片をＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応によって連結させた。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応には、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。
【００８６】
４．次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コンピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップによるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理による確認を行い、ベクターｐＢＰＤＣ１Ｐを単離した。
【００８７】
５．ついで、先に構築されたｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した。
【００８８】
６．一方、既に構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製した。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸菌に導入され（名称：「Ｅ．ｃｏｌｌ ｐＹＬＤ１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７４２３としてブダベスト条約に基づき国際寄託されている（原寄託日：平成１１（１９９９）年１０月２６日）。
【００８９】
７．続いて、このベクターをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターを作製した。最後にｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したものに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを構築した。
【００９０】
８．次に、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理したＴｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した。
【００９１】
（最終ベクターの構築及び確認）
プレベクターｐＢＴＲＰ−ＬＤＨを制限酵素ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩ処理し、これに上記実施例３において取得したプロモーター配列を同様の制限酵素にて処理後、それぞれ連結させた最終ベクターを作製した。今回作製したｐＢＴＲＰ−ＴＤＨ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＴＰＩ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＣＣＷ１２Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＲＳＰ３１Ｐ−ＬＤＨベクターおよび比較コントロールとして作製したｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターについての詳細なマップを図２〜図５に示す。
【００９２】
なお、上記の一連のＤＮＡ連結反応は、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（プロメガ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。また、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニー用いたコロニーＰＣＲを行うことで、目的のベクターであるかを確認した。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  “Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ．  １９８９）に従った。
【実施例４】
【００９３】
（形質転換酵母の作製）
宿主である酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人・発酵研究所に登録されている菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株をＹＰＤ培養液１０ｍｌにて、３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例４にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素ＰｖｕＩＩ処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、ｐＢＴＲＰ−ＴＤＨ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＴＰＩ１Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＣＣＷ１２Ｐ−ＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＲＳＰ３１Ｐ−ＬＤＨベクターおよび比較コントロールとして作製したｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターの５種類である。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【００９４】
得られたそれぞれのコロニーを新たなトリプトファン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、これにゲノムＤＮＡ調整キット、Ｇｅｎとるくん（商標）−酵母用−（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調整した。調整した各ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【実施例５】
【００９５】
（発酵試験による各プロモーターの検証）
作製した形質転換体におけるＬ−乳酸生産量を測定し、高発現プロモーターとして知られるＰＤＣ１プロモーターを用いた乳酸生産量と比較することで、取得した４種類のプロモーターの非中和条件下での活性を検証した。得られた４種類の形質転換酵母をＹＰＤ液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩、振盪培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝１．２のものを初発菌体とした。このうちの２ｍｌを１０％グルコース含有ＹＰＤ培養液２０ｍｌ、および１０％相当のショ糖を含有したケーンジュース培養液２０ｍｌにそれぞれ植菌し（全量２２ｍｌ）、中和剤として炭酸カルシウム（ナカライテスク社製）１ｇを添加したものを、３０℃で、４日間静置培養した。乳酸生産量の測定には、多機能バイオセンサＢＦ−４装置（王子計測機器社製）を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図６に示す。
【００９６】
図６に示すように、ＴＤＨ１遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１遺伝子プロモーター、ＲＳＰ３１遺伝子プロモーター及びＣＣＷ１２遺伝子プロモーターについては、対照としたＰＤＣ１プロモーター以上の発現強度を確認できた。特に、ＴＤＨ１遺伝子プロモーターについては、平均して１１４％（１０５〜１１７％）、ＴＰＩ１遺伝子プロモーターについては、平均で１１７％（１１３〜１２６％）という高い発現強度を確認できた。
【００９７】
これらのプロモーターは、いずれも、強力な構成的プロモーターであるＰＤＣ１プロモーターと同等以上の活性を有するともに、酸性条件下において高い転写活性を有するプロモーターであることから、乳酸などの有機酸が培地中に蓄積しても高い転写活性を維持することのできる有機酸生産に適した高発現プロモーターであることがわかった。また、これらのプロモーターはいずれも、宿主酵母のＰＤＣ１遺伝子を破壊し当該遺伝子座においてＬＤＨ遺伝子を発現するものであることから、酵母における当該遺伝子の発現が抑制された状態で乳酸などの有機酸を生産するのに適したプロモーターであることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号：７〜２６  合成プライマー
配列番号：２７  修飾されたウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ
配列番号：２８〜３１  合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】染色体導入型ベクター構築工程を示す図である。
【図２】ｐＢＴＲＰ−ＴＤＨ１Ｐ−ＬＤＨベクターのマップを示す図である。
【図３】ｐＢＴＲＰ−ＴＰＩ１Ｐ−ＬＤＨベクターのマップを示す図である。
【図４】ｐＢＴＲＰ−ＣＣＷ１２Ｐ−ＬＤＨベクターのマップを示す図である。
【図５】ｐＢＴＲＰ−ＲＳＰ３１Ｐ−ＬＤＨベクターのマップを示す図である。
【図６】各種形質転換酵母株における乳酸発酵試験の結果（ＹＰＤ培養液）を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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