(57)【要約】【課題】遺伝子工学的に製造されるＦｌｔ３リガンドの製造方法の提供。【解決手段】Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を色素担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程に加え、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする精製タンパク質の製造方法。（ａ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をハイドロキシアパタイト担体に接触させ、素通りした画分を回収する工程。（ｂ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をイオン交換担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。（ｃ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をゲル濾過担体に接触させる工程。（ｄ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を銅キレート担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を色素担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程を含むことを特徴とする精製タンパク質の製造方法。
【請求項２】
Ｆｌｔ３リガンドタンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載の精製タンパク質の製造方法。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法。
（ａ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をハイドロキシアパタイト担体に接触させ、素通りした画分を回収する工程。
（ｂ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をイオン交換担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。
（ｃ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をゲル濾過担体に接触させる工程。
（ｄ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を銅キレート担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。
【請求項４】
色素担体がブルー色素を結合させた担体であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法。
【請求項５】
イオン交換担体がアニオン交換担体であることを特徴とする請求項３に記載の精製タンパク質の製造方法。
【請求項６】
Ｆｌｔ３リガンドタンパク質が、Ｆｌｔ３リガンド遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を用いて製造されたものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の精製タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法を含む医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｌｔ３リガンドを遺伝子操作技術によって量産して、以って医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・抗アレルギー）とする事を目的とした、Ｆｌｔ３リガンドを高純度で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は骨髄由来抗原提示細胞であり、免疫系、抗原の取り込み、抗原提示に関与している。ナイーブＴ細胞は樹状細胞によって提示された抗原により活性化され増殖する。このため樹状細胞の重要な役割として、リンパ球が介する免疫システムを誘導し、制御することが挙げられる。近年、癌の免疫療法においてワクチンのアジュバントとして樹状細胞を利用することが注目されている。マウスの腫瘍モデルの実験で、生体外で誘導・活性化した樹状細胞を用いた抗腫瘍効果の報告が多数あり、ヒト腫瘍に対する臨床試験も多くの施設で実施されている。このような樹状細胞を用いた治療は現在のところ、最も有望な腫瘍の免疫治療方法と考えられている。
【０００３】
Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand（特許文献１、以下Ｆｌｔ３リガンドと略記する）は、Ｆｌｔ３レセプターを介したシグナル伝達により造血系の前駆細胞や幹細胞の増殖、分化を制御することが知られている。さらに、Ｆｌｔ３リガンドは樹状細胞の増殖活性を有することが知られており、Ｆｌｔ３リガンドを用いて生体内あるいは生体外で樹状細胞を増幅させることにより、極めて効率的に抗腫瘍免疫を誘導し腫瘍を退縮できることができ、新規癌ワクチン療法としてのヒト臨床応用への可能性が示されている。また、脊髄形成異常症、再生不良性貧血、HIV感染等の感染症を対象にしたＦｌｔ３リガンドを用いた治療も期待されている。
【０００４】
Ｆｌｔ３リガンドの精製法に関して、以下の方法が報告されている。FLAGタグとＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインの融合タンパク質を作製し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する（特許文献１）。あるいは、Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質を作製し、プロテインAセファロースカラムで精製する（特許文献１）。さらに、Ｆｌｔ３受容体とヒト免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる、異種タンパクと融合させないＦｌｔ３リガンドの精製法も報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第５５５４５１２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｆｌｔ３リガンドは膜貫通型と膜貫通型Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインが切断されることで形成される可溶性型の２種類が存在し、その両方が生理活性を持つ（ハナン（Hannum）、「ネイチャー（Nature）」、１９９４年、第３６８巻、ｐ．６４３-６４８）。そのため、遺伝子操作により可溶化Ｆｌｔ３リガンドを作製することで、細胞内から活性型で分泌させることが可能になる。
【０００６】
Ｆｌｔ３リガンドの遺伝子組換え手法を用いた量産により、腫瘍やアレルギー、ウイルス病などの治療薬としての開発が期待される。
【０００７】
また、ヒトと同様ぺット、特にイヌにも、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、アレルギー性の皮膚炎、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイルス病などが知られており、その治療薬の開発が求められている。
【０００８】
多成分から成る有用蛋白質を医薬品とする場合、各成分をそれぞれ単独に精製分離し、各成分ごとに毒性試験、薬効試験等詳細な解析を行うことが必要であり、また製剤化の際、それぞれの成分を常に一定含量添加することが義務づけられている。従って、Ｆｌｔ３リガンドを遺伝子組換えの医薬品とする場合、上記の異種タンパク質との融合タンパク質を作製し、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行うことは好ましくない。さらに、Ｆｌｔ３受容体とヒト免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる方法では、高純度のＦｌｔ３受容体タンパク質を作製するという煩雑な行程が入り、同一の品質を保持したアフィニティーカラムの作製が容易ではない。望ましくは市販のカラムを用いて目的の成分を高純度で精製分画することが重要な課題である。 このように多成分の中に存在する異種タンパクを含まないＦｌｔ３リガンドを、市販カラムを用いた精製で活性を維持したまま高純度に大量に分離精製する方法はこれまで知られていなかった。従って、市販のカラム担体を用いてＦｌｔ３リガンドの高純度での製造法を確立することができれば、Ｆｌｔ３リガンドの医薬品としての開発の途がさらに開かれると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はかかる状況に鑑み、各種生産系で生産されたＦｌｔ３リガンドを高純度に精製分離することを目的とし、創意工夫を成し、遺伝子組換え手法を用いて種々の生産系でＦｌｔ３リガンドを生産し、それぞれ純度９０％以上に精製分離する方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。
【００１０】
具体的には、本発明は以下の構成からなる。
（１）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を色素担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程を含むことを特徴とする精製タンパク質の製造方法。
（２）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載の精製タンパク質の製造方法。
（３）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする（１）または（２）のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法。
（ａ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をハイドロキシアパタイト担体に接触させ、素通りした画分を回収する工程。
（ｂ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をイオン交換担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。
（ｃ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液をゲル濾過担体に接触させる工程。
（ｄ）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を銅キレート担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出する工程。
（４）色素担体がブルー色素を結合させた担体であることを特徴とする（１）または（２）のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法。
（５）イオン交換担体がアニオン交換担体であることを特徴とする（３）に記載の精製タンパク質の製造方法。
（６）Ｆｌｔ３リガンドタンパク質が、Ｆｌｔ３リガンド遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を用いて製造されたものであることを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の精製タンパク質の製造方法を含む医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、Ｆｌｔ３リガンドの製造方法を開示する。本発明により、色素担体、好ましくはさらにハイドロキシアパタイト担体、イオン交換担体及び／またはゲル濾過担体を用いたカラム精製方法を利用してＦｌｔ３リガンドを異種タンパク質あるいは夾雑タンパク質を含むことなく精製分離することが可能となる。本発明により腫瘍、アレルギー、感染症を対象とした、Ｆｌｔ３リガンドの医薬品としての開発の途がさらに開かれると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明中のＦｌｔ３リガンドタンパク質は、Ｆｌｔ３受容体を活性化する能力を有する化合物に関する。本明細書中でいう化合物は、哺乳類由来のＦｌｔ３リガンド遺伝子がコードするタンパク質であり、Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインからなるタンパク質もしくはその変異体でもよい。
【００１３】
本明細書中に「Ｆｌｔ３リガンド」と単独で表記されている場合は、上記に標す化合物のことを指す。
【００１４】
本発明でいう変異体とは、Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質のアミノ酸配列の１から４０個のいずれか、好ましくは１から２０個のいずれか、さらに好ましくは１から数個のいずれかのアミノ酸付加、置換または欠失を含む。Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインは、例えばイヌＦｌｔ３リガンドの場合、配列番号１のアミノ酸番号１から１８６番目を指す。また、配列番号１のアミノ酸番号１から２４はシグナル配列と推測されることから、本発明のいう細胞外ドメインは配列番号１のアミノ酸番号２５番目から１８６番目を好ましく用いることができ、さらにこれらタンパク質を構成するアミノ酸数が１または数個異なるものも含む。
【００１５】
変異体はタンパクに対する修飾も含み、タンパクをコードする核酸に対してなされることができ、その例としては、欠失、点突然変異、切頭化、アミノ酸置換およびアミノ酸の付加が挙げられる。
【００１６】
あるいは、修飾は、例えば開裂、リンカー分子の付加、検出可能部分（例えばビオチン）の付加、脂肪酸の付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換等により、タンパクに対して直接なされ得る。Ｆｌｔ３リガンドのアミノ酸配列は、天然または非天然起源であり得る。即ち、それらは、天然Ｆｌｔ３リガンドを含み得るか、あるいはアミノ酸配列が、Ｆｌｔ３受容体に結合し、細胞にシグナルを伝達し細胞を活性化、例えば細胞増殖促進、する能力を保持する限り、非天然型起源の配列を含み得る。非天然型起源のアミノ酸は人工合成アミノ酸を含むがこれに限定されない。
【００１７】
明細書中でいうＦｌｔ３受容体とは、哺乳動物におけるＦｌｔ３受容体をいう。Ｆｌｔ３受容体は細胞外ドメインと細胞内ドメインからなる膜貫通タンパク質である。２量体のＦｌｔ３リガンドがＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインに結合すると、Ｆｌｔ３受容体が２量体を形成し、Ｆｌｔ３受容体の細胞内ドメインがリン酸化されることで細胞増殖等に必要なシグナルが伝達される。ここでいうＦｌｔ３リガンドのＦｌｔ３受容体への結合は、Ｆｌｔ３リガンドのＦｌｔ３受容体細胞外ドメインへの結合のことを指す。
【００１８】
明細書中でいう、Ｆｌｔ３受容体を活性化する能力を有するとは、Ｆｌｔ３リガンドをＦｌｔ３受容体を発現している細胞に作用させることによりＦｌｔ３受容体を発現している細胞の増殖を促進させる能力のことをいう。Ｆｌｔ３受容体を発現している細胞としては、ヒト白血病株化細胞であるOCI-AML5、末梢血単核球、骨髄由来単核球が好ましく用いられる。
【００１９】
本発明において、精製に使用されるハイドロキシアパタイト担体としては、バイオラット社製のハイドロキシアパタイトバイオゲルＨＴ等、上記以外のものも容易に入手することができる。ハイドロキシアパタイトの官能基はカルシウムイオンの示す２対の陽性荷電（Ｃサイト）と３対のリン酸基がもつ６価の陰性荷電酸素原子（Ｐサイト）からなる。タンパク質のアミノ基はＰサイトに親和性を示すが、Ｃサイトとは反発する。また、タンパク質のカルボキシル基はＣサイトに親和性を示すが、Ｐサイトとは反発するため、この性質を利用してタンパクの分離が可能となる。例えば、ハイドロキシアパタイトバイオゲルＨＴを用いて昆虫細胞で発現させたイヌＦｌｔ３リガンドを精製する場合、昆虫細胞から回収した培養上清に含まれるイヌＦｌｔ３リガンドは担体に結合しないため素通り画分に回収されるが、その他の夾雑タンパク質は担体に結合する。
【００２０】
さらに、色素担体としては、ブルー色素を結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ましく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用される。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロンブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマシャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ハイパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）、マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲルブルー（バイオラット社製）などの商品名で市販されているブルーアガロースゲル、またはブルートリスアクリルーＭ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ社製）などの商品名で市販されているブルーセファロースゲルなどが適当であり、容易に入手することができる。ブルー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎水度などによって決定される。例えば、イヌＦｌｔ３リガンドの場合、中性からアルカリ性付近のｐＨ、好ましくはｐＨ：７から９、さらに好ましくはｐＨ：８付近で分離溶出して、精製することができる。
【００２１】
イオン交換担体としては、アガロース、セルロース、合成ポリマーゲルなどに、例えばジエチルアミノエチル（Diethylaminoethyl）、クオテナリアミノエチル（Quaternary aminoethyl）、クオテナリアンモニウム（Quaternary ammonium）、カルボキシメチル（Carboxymethyl）、スルホプロピル（Sulphopropyl）、メチルスルホネ−ト（Methyl sulphonate）などの官能基を導入したものが挙げられる。好ましくはクオテナリアンモニウムが導入された、Ｑセファロースハイパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）やＱセファロースファーストフロー（アマシャム・ファルマシア社製）など（以下、Ｑセファロース担体と略記する）が用いられる。Ｑセファロース担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度などによって決定される。例えば、昆虫細胞中で生産させたイヌＦｌｔ３リガンドの場合、ｐＨ：８付近でイヌＦｌｔ３リガンドはＱセファロース担体へ結合し、塩濃度０．０１Ｍから１．０Ｍ、好ましくは塩濃度０．０３Ｍから０．５Ｍ、さらに好ましくは塩濃度０．０５Ｍから０．２ＭでイヌＦｌｔ３リガンドの溶出が可能である。
【００２２】
本発明に用いる銅キレート担体とは、銅をキレート結合させた担体のことをいう。銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシメチルイミノ基[−N(CH2COOH)2]などのキレート能を有する交換基が結合した担体を硫酸銅などの銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは、“キレーティングセファロース”（Pharmacia社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレートさせた担体が用いられる。
【００２３】
また、ゲル濾過担体としては、アガロースとデキストランを共有結合させたビーズのゲルを用いることが好ましい。ゲル濾過担体としては次のものが使用される。アマシャム・ファルマシア社製のスーパーデックス７５，スパーデックス２００、セファデックスＧ１０セファデックスＧ２００、セファクリルＳ１００ＨＲ、セファクリルＳ５００ＨＲ、セファロースＣＬ２Ｂ、セファロースＣＬ６Ｂ等。バイオラット社製のBio-Sil SEC, Bio-Silect等。東ソー社製のTSKgel G2000 SW, TSKgel Super-SW 2000, TSKgel G5000PW等、上記以外のものも容易に入手することができる。ゲル濾過クロマトグラフィーは、タンパク質の分子サイズの違いを利用して物質を分離する方法であり、低分子はカラム内の移動速度が遅く、高分子は速く移動する。例えば、スーパーデックス２００を用いて昆虫細胞で発現させたイヌＦｌｔ３リガンドを精製する場合、流速２００μl/minの条件では７０分から８０分の間にイヌＦｌｔ３リガンドを回収できるが、分離条件はこれに限定されない。
【００２４】
本発明の製造法におけるカラム担体を用いた精製操作はそれぞれ単独で行ってもＦｌｔ３リガンドの高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞれを組合わせて行った方がより効果が高い。例えば、昆虫細胞で生産したイヌＦｌｔ３リガンドを含む溶液中には、多くの昆虫細胞およびバキュロウイルス由来の夾雑物が含まれるので、少なくとも上記２つ、好ましくは上記３つ、さらに好ましくは上記４つ、最も好ましくは上記５つのカラム担体を組合わせて精製を実施する。例えば、昆虫細胞中で生産させたイヌＦｌｔ３リガンドの製造においては、初段精製にハイドロキシアパタイト担体を、２段目精製にブルー担体、３段目精製にアニオン交換担体、４段目精製に銅キレート担体、５段目精製にゲル濾過担体を用いることが好ましい。
【００２５】
なお、各カラム担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、Ｆｌｔ３リガンドの量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【００２６】
上記の方法で製造されたＦｌｔ３リガンドタンパク質は，還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により見かけの分子量が決定される。例えば、イヌＦｌｔ３リガンドの場合、見かけの分子量が約１５〜２０ｋＤである。また、本発明の方法で製造されるＦｌｔ３リガンドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で９８％以上、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上である。
【００２７】
上記の方法で製造したＦｌｔ３リガンドは、好ましくは以下に示す方法にてその活性を測定することが可能である。例えば、精製Ｆｌｔ３リガンド存在下と非存在下でヒト白血病株化細胞であるOCI-AML5（AML5）を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。Ｆｌｔ３リガンド存在下の場合におけるAML5のトリチウムチミジンの取り込み量が、Ｆｌｔ３リガンド非存在下の場合におけるAML5のトリチウムチミジンの取り込み量を上回れば、Ｆｌｔ３リガンドの活性を有すると認めるのがよい。また、別の好ましい方法は、末梢血単核球あるいは骨髄由来単核球を用いる方法である。例えば、精製Ｆｌｔ３リガンド存在下と非存在下でこれら細胞を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。Ｆｌｔ３リガンド存在下の場合におけるこれら細胞のトリチウムチミジンの取り込み量が、Ｆｌｔ３リガンド非存在下の場合におけるこれら細胞のトリチウムチミジンの取り込み量を上回れば、Ｆｌｔ３リガンドの活性を有すると認めるのがよい。少なくとも上記の細胞を２種類使って、精製Ｆｌｔ３リガンドの活性を確認することがよい。
【００２８】
Ｆｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡを組込んだ組換えベクターは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、哺乳類由来の細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、各種哺乳類のＦｌｔ３リガンドタンパクをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことにより、Ｆｌｔ３リガンドｃＤＮＡの全長あるいは細胞外ドメインをクローニングすることができる。
【００２９】
臟器などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記の臟器や細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルグウィン（Chirgwin）、外３名、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、１９７９年、第１８巻，ｐ．５２９４-５２９９）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（バーガー（Berger）、外１名、「バイオケミストリー（Biochemistry）、１９７９年、第１８巻，ｐ．５１４３-５１４９」，グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００３０】
臟器やマイトージェンなどで刺激された単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（グブラー（Gubler）、外１名、「ジーン（Gene）」、１９８３年 第２５巻，ｐ．２６３−２６９），Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマ（Okayama）、外１名、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）」,１９８２年、第２巻，p.１６１-１７０；オカヤマ（Okayama）、外１名、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）」,１９８３年、第３巻，p.２８０-２８９）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００３１】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Escherichia coli），バチルス属（Bacillus）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ（夜盗蛾）細胞（Spodoptera frugiperda），キャベツルーパー細胞（Trichoplusiani），カイコ細胞（Bombyx mori），動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００３２】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００３３】
Ｆｌｔ３リガンドを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞を用いて生産する場合、その前駆体タンパクに膜貫通ドメインが存在するため、全長Ｆｌｔ３リガンドは細胞外に分泌されない。Ｆｌｔ３リガンドは細胞外ドメインを含む可溶型でも生物活性があることが知られており、例えば、配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインをコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いることによって活性型イヌＦｌｔ３リガンドを細胞で生産し、かつ培養液から回収することができる。
【００３４】
Ｆｌｔ３リガンドは、例えば、夜盗蛾由来の昆虫細胞、例えばSf-9、Sf-21あるいはHigh Fiveに感染する夜盗蛾科由来のバキュロウイルスより組換えウイルスを作製することによって、昆虫細胞発現系を用いて生産することができる。組換えバキュロウイルスは、Ｆｌｔ３リガンドの蛋白質をコ−ドするＤＮＡをバキュロウイルス用のクローニングベクターに連結して作製した組換え体プラスミドとバキュロウイルスＤＮＡとを、昆虫細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。
【００３５】
すなわち、Ｆｌｔ３リガンドのタンパク質をコードするＤＮＡ部分を、例えばpAcAB3（Pharmingen社製）などのクローニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドとバキュロウイルスＤＮＡとを、文献（藤井著、「蛋白質  核酸  酵素」、１９９２年、第３７巻、p.２７０１−２７０６）のような方法で昆虫細胞、例えばSf-9にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスはＦｌｔ３リガンドを発現していることから、組換えウイルスのクローンから産生されるＦｌｔ３リガンドを抗Ｆｌｔ３リガンド抗体を用いて検出することで、野性型ウイルスと容易に区別できる。Ｆｌｔ３リガンドの生産は、前記の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞中で増殖させることにより行なう。
【００３６】
昆虫細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。昆虫細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したTC-100培地を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清からＦｌｔ３リガンドを回収する。
【００３７】
さらに、Ｆｌｔ３リガンドは、例えば、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによって、カイコ発現系を用いて生産することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルスは、Ｆｌｔ３リガンドの蛋白質をコ−ドするＤＮＡをカイコのクローニングベクターに連結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。
【００３８】
すなわち、Ｆｌｔ３リガンドの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＫ２８３などのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、文献（ホリウチ（Horiuchi）、「アグリカルチュアル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）」, １９８７年、第５１巻，p.１５７３−１５８０）のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。Ｆｌｔ３リガンドの生産は、前記の組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させることにより行なう。
【００３９】
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したＴＣ−１００培地を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清からＦｌｔ３リガンドを回収する。
【００４０】
カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、合成飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清からＦｌｔ３リガンドを回収する。
【００４１】
また、哺乳動物発現系を用いることでＦｌｔ３リガンドを製造することも可能である。Ｆｌｔ３リガンドをコードするDNAを有する哺乳動物細胞発現用ベクターを構築し、例えば、サルの株化細胞COS1あるいはCOS7、チャイニーズハムスターの株化細胞CHO等にトランスフェクトすることで、Ｆｌｔ３リガンドの産生が可能となる。哺乳類細胞中でのＦｌｔ３リガンド発現のための好ましい系は、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子（安定トランスフェクト化細胞株の選択を促す）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列のような選択可能マーカーを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CAから入手可能）のような系である。さらに、霊長類またはイヌ細胞株中での発現に適しているのは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含有し、多コピー染色体外素子としてのプラスミドの保持を促すｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）である。別の発現ベクターは、in vitroでの転写を効率的に刺激するポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含有するｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。本プラスミドは、ミシズマ（Mishizuma）ら（「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic acids research）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．５３２２）により記載されており、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えばデモウリン（Demoulin）ら（「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）、１９９６年、第１６巻、ｐ．４７１０−４７１６」により開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、スタンフォード-ペリカウデット（Stratford-Perricaudet）らにより記載されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパク質を欠いている（「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インバスティゲーション（The Journal of clinical investigation）」、１９９２年、第９０巻、ｐ．６２６−６３０）。Adeno.Ｐ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの使用は、Ｐ１Ａに対する免疫感作のためのマウスにおける皮内注射において、ワーニアー（Warnier）らにより開示されている（「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（International journal of cancer）」、１９９６年、第６７巻、ｐ．３０３−３１０）。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。実施例に使用するＦｌｔ３リガンドとしてイヌＦｌｔ３リガンドの例を示す。
【００４３】
参考例１：Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAのクローニング
イヌおよびヒト末梢血よりHistopaque-1077（Sigma社製）を用いた密度勾配遠心によりヒトおよびイヌ末梢血単核球（以下PBMCと略記する）を分離した。PBMC分離後、イヌＰＢＭＣは10%牛胎児血清（以下FBSと略記する）を含むERDF培地（極東製薬（株）製）で培養し、ヒトＰＢＭＣはＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco社製）にで培養した。イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンドの発現を誘導するために、10μg/mlのコンカナバリンA（Sigma社製）で１日刺激した。刺激したイヌおよびヒトPBMCから、TRIZOL（Gibco社製）を用いて総RNAを調整した。得られたRNAの５μgから、SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen社製) を用いて、添付のプロトコールに従いcDNA（総量２０μl）を調整した。
【００４４】
PCRは１μlの刺激イヌおよびヒトリンパ球由来cDNA、それぞれ２種類のプライマー（配列番号２と配列番号３）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼ（Toyobo社製）となるように各試薬と添付のバッファーを加え全量を５０μlとし、Bio Rad社製のThermal Cyclerを用いて行った。なお、配列番号２と配列番号３のプライマーには制限酵素部位のEcoRIが挿入してあり、さらに配列番号３には終止コドンが付加されている。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。TAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて調整したDNAをベクターへ挿入し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems社製ABI PRISM 3100）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、調整したＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００４５】
参考例２：Ｆｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを挿入した組換えバキュロウイルスの作製
参考例１により得られたベクター（イヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列の１から１８２番目が挿入されている）を制限酵素EcoRIで切断後、Klenow Fragment（Takara社製）で平滑末端化を行った。バキュロウイルス発現ベクターとしてpAcAB3（Pharmingen社製）を用いた。ポリヘドリンプロモーター下流のXbaIサイトを制限酵素XbaI（Takara社製）で切断後、Klenow Fragmentで平滑末端化を行い、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をした。調整したベクターとイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片を連結し、組換えベクターを作製した。添付マニュアルに従い、作製した組換えベクターと昆虫細胞Ｓｆ９（Spondoptera frugeruda由来、Gibco社製）を用いて組換えウイルスrAcCaFLを作製した。
【００４６】
７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ９細胞を血清非含有の培地Sf-900 II（Gibco社製）で置き換え、組換えバキュロウイルスrAcCaFLを感染させ、４日間培養した後、培養上清を回収した。
【００４７】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を３％スキムミルク含有リン酸緩衝液で４℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。0.1% Tween-20を含むリン酸緩衝液（以下PBSTと略記する）で３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【００４８】
参考例３：哺乳動物細胞によるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
哺乳動物発現ベクターのpcDNA3.1（Invitrogen社製）をEcoRIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をし、参考例１により得られたベクターを制限酵素EcoRIで切断後に得られるイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片と連結し、組換えベクターを作製した。作製した組換えベクターをCOS1細胞へトランスフェクトし、その４日後に培養上清を回収した。
【００４９】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【００５０】
実施例１：昆虫細胞で製造したＦｌｔ３リガンドの精製
参考例２で得られたＦｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を用いてハイドロキシアパタイト担体によるイヌＦｌｔ３リガンドの分画を検討した。精製はｐＨ：６で行った。培養上清を、ハイドロキシアパタイト担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６）でカラムを洗浄した。溶出はリン酸緩衝液（ｐＨ：６）の濃度を０．１Ｍから０．５Ｍまで０．１Ｍ刻みで行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは、ハイドロキシアパタイト担体に結合することなく素通りの画分で検出された。なお、昆虫細胞およびバキュロウイルス由来の夾雑物の大部分はハイドロキシアパタイト担体に結合した。
【００５１】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄結果、イヌＦｌｔ３リガンドが溶出された。
【００５２】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにアニオン交換担体を充填したカラムにアプライし、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍから１Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは０．１ＭのＮａＣｌ濃度でにより溶出された。
【００５３】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらに銅キレート担体を充填したカラムにアプライし、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄後、イミダゾールの濃度を０ｍＭから５０ｍＭまで変化させて溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは２０ｍＭのイミダゾールの濃度で溶出された。
【００５４】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにゲル濾過担体を充填したカラムにアプライし、０．０１％のPluronic F-68（Gibco社製）を含むPBSを十分量カラムに展開した。スーパーデックス２００を用いた場合、流速２００μl/minの条件では７０分から８０分の間にイヌＦｌｔ３リガンドが回収できた。イヌＦｌｔ３リガンドの純度は、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上であった。
【００５５】
以上の結果を図１に示す。
【００５６】
実施例２：哺乳動物細胞で製造したＦｌｔ３リガンドの精製
参考例３で得られたＦｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を用いてブルーセファロース担体によるイヌＦｌｔ３リガンドの分画を検討した。培養上清をブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍから１Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは１．０Ｍ  ＮａＣｌの濃度で溶出された。結果を図２に示す。
【００５７】
参考例４：精製イヌＦｌｔ３リガンドの活性の確認
実施例１で得られた精製イヌＦｌｔ３リガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性測定は以下のようにして行った。ヒト白血病株化細胞であるOCI-AML5（DSMZ製、以下AML5と略記する）は、Ｆｌｔ３リガンドおよびGM-CSF依存的に増殖する細胞株である。AML5は、20% FBSと10 ng/mlのGM-CSFを含むalpha-MEM培地（Gibco社製）で培養し、培養開始後１ヶ月以内の細胞を解析に用いた。
【００５８】
洗浄したAML5を5% FBSを含むalpha-MEMで懸濁し、細胞が3 x 104 / 100 μl / wellとなるように96穴プレートに移した。10 μlの精製イヌＦｌｔ３リガンドを添加し、5% CO2, 37℃の条件で66時間培養した。なお、培養開始から４８時間後にそれぞれの培養液に１μＣｉづつのトリチウムチミジン（Amersham社製）を添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。図２に示すように、精製イヌＦｌｔ３リガンドはAML5の増殖を促進させ、作製したイヌＦｌｔ３リガンドはＦｌｔ３リガンドの活性を有することが確認された。
【００５９】
参考例５：精製イヌＦｌｔ３リガンドの活性のイヌＰＢＭＣ増殖活性の確認
イヌ末梢血よりHistopaque-1077を用いた密度勾配遠心によりイヌＰＢＭＣを分離した。洗浄したイヌＰＢＭＣをAIM-V培地で懸濁し、細胞が5 x 104 / 100 μl / wellとなるように96穴プレートに移した。イヌＦｌｔ３リガンドを含む培養上清、ヒトGM-CSF（Genzyme社製）とヒトIL-4（Genzyme社製）を添加し、5% CO2, 37℃の条件で７日間培養した。なお、培養開始から６日目にそれぞれの培養液に１μＣｉづつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。1000U/mlのヒトGM-CSFと1000U/mlのヒトIL-4の存在下で精製イヌＦｌｔ３リガンドを加えたところ、図３に示すように、イヌPBMC由来の細胞の増殖を促進することが確認された。
【００６０】
実施例３：カイコによるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
カイコ核多角体病ウイルス発現ベクターのp283（日本農産工業（株）製）をEcoRIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をし、参考例１により得られたベクターを制限酵素EcoRIで切断後に得られるイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片と連結し、組換えベクターを作製した。添付マニュアルに従い、作製した組換えベクターとBmN4細胞（フナコシ（株）製）を用いて組換えウイルスrBmCaFLを作製した。
【００６１】
作製したrBmCaFLを５齢のカイコに皮下接種し、３日後に体液を回収した。
【００６２】
Ｆｌｔ３リガンドタンパク質を含む回収した体液を用いてブルーセファロース担体によるイヌＦｌｔ３リガンドの分画を検討した。培養上清をブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０Ｍから１．０Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは０．６Ｍ  ＮａＣｌの濃度で溶出された。銀染色の結果を図５に示す。
【００６３】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した体液に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【００６４】
実施例４：大腸菌によるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
大腸菌にてイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質を発現させるための発現ベクターの構築は以下の方法により実施した。PCRは、参考例１でTAクローニングキットを用いて作製したベクターを１μl、それぞれ２種類のプライマー（配列番号４と配列番号５）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼとなるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cyclerを用いて行った。なお、プライマーには制限酵素部位のNdeIが挿入してあり、配列番号５には終止コドンが挿入してある。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。
【００６５】
PCRにより得られたDNA断片を制限酵素NdeI（Takara社製）で切断後、あらかじめ制限酵素NdeIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理したpET-30a（Novagen社製）へ組み込み、大腸菌用発ベクターを作製した。宿主として大腸菌BL21（DE3）（Takara社製）を使用した。トランスフォームしたBL21のシングルコロニーをカナマイシン（終濃度15μg/ml）含有LB培地でOD600が約0.5になるまで３７℃で培養後、終濃度で1mMになるようにIPTGを添加してさらに２５℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を5,000xgで4℃、30分間遠心し、沈殿物を0.5% Triton X-100とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）の存在下で超音波にて破砕した。その後、16,000xgで4℃、30分間、遠心し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。
【００６６】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗イヌFlt3リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図６に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。また、参考例５に示す方法により、本大腸菌発現系で生産したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ハイドロキシアパタイト担体、ブルー色素担体、アニオン交換担体、銅キレート担体、ゲル濾過担体およびこれら５種類のカラムを組み合わせた場合での、昆虫細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの精製状況を銀染色にて検出した図である。
【図２】ブルー色素担体を用いた場合での、哺乳動物細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの精製状況を銀染色にて検出した図である。
【図３】ヒト白血病株化細胞AML-5を用いて、精製イヌＦｌｔ３リガンドがＦｌｔ３リガンドの活性を有することを示す図である。
【図４】ヒトGM-CSFとヒトIL-4の存在下でイヌＦｌｔ３リガンドを添加することによりイヌ末梢血単核球由来細胞の増殖が促進することを示す図である。
【図５】ブルー色素担体を用いた場合での、カイコで製造したイヌＦｌｔ３リガンドの精製状況を銀染色にて検出した図である。
【図６】ブルー色素担体を用いた場合での、大腸菌で製造したイヌFlt3リガンドの精製状況を銀染色法にて検出した図である。
【符号の説明】
【００６８】
１  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパク質を示す図である。
２  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをハイドロキシアパタイト担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
３  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをブルー色素担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
４  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをアニオン交換担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
５  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをゲル濾過担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
６  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをハイドロキシアパタイト担体、ブルー色素担体、アニオン交換担体、銅キレート担体の４種類のカラムを用いて精製した後のタンパク質を示す図である。
７  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養上清由来のタンパクをハイドロキシアパタイト担体、ブルー色素担体、アニオン交換担体、銅キレート担体、ゲル濾過担体の５種類のカラムを用いて精製した後のタンパク質を示す図である。
８  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
９  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１０  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１１  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１２  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１３  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１４  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを哺乳動物細胞へトランスフェクトし、その培養上清由来のタンパク質を示す図である。
１５  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを哺乳動物細胞へトランスフェクトし、その培養上清由来のタンパクをブルー色素担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
１６  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
１７  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させたカイコの体液由来のタンパク質を示す図である。
１８  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを感染させたカイコの体液由来のタンパクをブルー色素担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
１９  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を示す図である。
２０  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを大腸菌で発現させブルー色素担体で精製した後のタンパク質を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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