(57)【要約】      （修正有）【課題】チロシン誘導体に対する基質特異性又はアンバーサプレッサーｔＲＮＡに対する反応速度が高められたＴｙｒＲＳの提供。【解決手段】特定アミノ酸配列において、「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」のうちの１以上、又は「Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳ、又はＡｓｐ２８６が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異ＴｙｒＲＳであって、上記アミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表３に示される原子座標の原子番号１から４００６で規定される構造を有する、メタノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶。
【請求項２】
空間群がP3121であり、単位格子が、a=b=86.8Å（8.68nm）、c=156 Å（15.6nm）の寸法を有する、ＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶。
【請求項３】
表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造において、アミノ酸残基Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｇｌｙ３４、Ｐｈｅ３５、Ｇｌｕ３６、Ｌｅｕ６５、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｔｙｒ１５１、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ｇｌｎ１７３、及びＨｉｓ１７７によって規定されるチロシン結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又は「Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項５】
請求項４記載の変異ＴｙｒＲＳにおいて、「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」が「Ｔｙｒ３２、Ａｌａ７０、Ｔｈｒ１５８」に置換された配列、又は「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」が「Ｔｈｒ３２、Ｔｈｒ７０、Ｇｌｕ１５８」に置換された配列からなることを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項６】
請求項４又は５記載の変異体のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項７】
チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも所望のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳを作製する方法であって、
（Ａ）表３に示される原子座標に基づいて、前記チロシン結合ポケット構造を構成するアミノ酸残基から少なくとも１つ選択し、
（Ｂ）選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異ＴｙｒＲＳライブラリーを作製し、
（Ｃ）変異ＴｙｒＲＳライブラリーから、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたものを選択することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記工程（Ａ）において、表３に示される原子座標に基づいて、チロシン結合ポケットを構成するアミノ酸残基から３個選択することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記チロシン誘導体が３位置換チロシンであることを特徴とする、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（Ａ）で選択したアミノ酸残基が、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、及びＡｓｐ１５８の組み合わせ、又は、Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、及びＨｉｓ１７７の組み合わせであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造において、アミノ酸残基Ｐｈｅ２６１、Ｈｉｓ２８３、Ｐｒｏ２８４、Ｍｅｔ２８５、及びＡｓｐ２８６によって規定されるアンチコドンＧ３４結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ。
【請求項１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＡｓｐ２８６が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異ＴｙｒＲＳであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１３】
前記Ａｓｐ２８６が、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換されたものであることを特徴とする、請求項１２記載の変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１４】
請求項１２又は１３の変異ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１５】
チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりもチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳにおいて、配列番号１におけるＡｓｐ２８６に相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換することを特徴とする、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳの作製方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法により作製され得る変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換され、かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列、
又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換され、かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列
からなり、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１８】
請求項１７記載の変異体のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
【請求項１９】
▲１▼細胞抽出液、
▲２▼請求項４乃至６、１２乃至１４、１６乃至１８のいずれか一項に記載の変異ＴｙｒＲＳ、
▲３▼前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ
とを具備した、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット。
【請求項２０】
請求項４乃至６、１２乃至１４、１６乃至１８のいずれか一項に記載された変異ＴｙｒＲＳと、前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
（Ａ）請求項４乃至６、１２乃至１４、１６乃至１８のいずれか一項に記載の変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌を、その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を添加した培地で、適当な条件でインキュベートすることにより、真性細菌内で、チロシン誘導体組み込みポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
（Ａ）請求項４乃至６、１２乃至１４、１６乃至１８のいずれか一項に記載の変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メタノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶、チロシン結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳとその作製方法、アンチコドンＧ３４結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ、野生型のＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳとその作製方法、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳ、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット、ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、今までにない有用な性質をもつタンパク質をデザインし、生産するうえで、人為的に非天然型アミノ酸をタンパク質に導入する方法が注目されている。例えば、非天然型アミノ酸を含むタンパク質 (アロプロテイン（非特許文献１）) は、分子内標識（非特許文献２及び３）、タンパク質同士のクロスリンク（非特許文献４及び５）、X線やNMRによる構造解析（非特許文献６及び７）、さらにシグナル伝達系の解析（非特許文献２及び８）に用いられている。部位特異的に非天然型アミノ酸が導入されたアロプロテインを効率よく生産するためには、アミノアシルtRNA合成酵素 (aaRS) のtRNAやアミノ酸に対する特異性を改変することで、遺伝暗号系を拡張することが不可欠である。
【０００３】
そのためにはまず、改変されたaaRS (aaRS*) は、非天然型アミノ酸を改変されたtRNA (tRNA*) と共有結合させる特性を有しなければならない。一方、tRNA*は61種類のセンスコドンとは対合してはならず、他のコドン、例えばアンバーコドンなどと対合する性質をもたなければならない（非特許文献９）。さらには、そのaaRS*・tRNA*ペアは、宿主翻訳系の他のどのaaRS・tRNAのペアとも相互作用しない、「直交した」関係であることが必須である（非特許文献９）。すなわち、aaRS*はtRNA*以外をアミノアシル化せず、tRNA*はaaRS*以外にアミノアシル化されないことが必要である。
【０００４】
そのような直交したaaRS*・tRNA*ペアを実現するために、他生物種のペアを宿主の系に導入する方法が取られてきた。出芽酵母のフェニルアラニルtRNA合成酵素・tRNAPheペアを大腸菌に導入し、 p-フルオロフェニルアラニンをアンバーコドン特異的に導入したのが最初の試みであった（非特許文献１０）。現在のところ、遺伝暗号の拡張は、真正細菌である大腸菌（非特許文献４、５、及び１１−１３）と、真核生物（小麦胚芽抽出液、非特許文献１４、及び哺乳動物細胞、非特許文献１５）で成功している。いずれの例も、チロシルtRNA合成酵素 (TyrRS)変異体とアンバーサプレッサー化されたtRNATyrのペアの導入で遺伝暗号を拡張している。それらの系では、真正細菌型TyrRS・tRNATyrと古細菌/真核生物型TyrRS・tRNATyrは、それぞれのグループ内ではアミノアシル化するが、互いのグループ同士ではアミノアシル化できない直交の関係にある（非特許文献１６−１８）ことが鍵となっている。
【０００５】
例えば、古細菌Methanococcus jannaschii（以下、M. jannaschiiと記載する）のTyrRS・tRNATyrペアは大腸菌の系で、逆に大腸菌TyrRSとBacillus stearothermophilus tRNATyrのペアは哺乳動物細胞の系で直交したペアとなるために、それらの人工遺伝暗号の拡張に使われた（非特許文献１５及び１９）。
【０００６】
TyrRS・tRNATyrペアの直交性は、古細菌/真核生物と真正細菌の間でのTyrRSのtRNA認識機構の違いに由来する。TyrRSは、対応するtRNAが持っているアイデンティティ決定因子という一部のヌクレオチド配列でtRNAを識別する（非特許文献２０）。古細菌および真核生物のtRNATyrは、特徴的なC1:G72塩基対（非特許文献２１）、アンチコドン、そしてA73をアイデンティティ決定因子として持つ（非特許文献１８及び２０）。一方、真正細菌では、アンチコドン、A73は同じであるが、全く逆のG1:C72塩基対と特徴的な長いバリアブルアーム（非特許文献２１）をアイデンティティ決定因子として持つ（非特許文献２２）(図1)。真正細菌と真核生物のtRNATyrの1:72塩基対をそれぞれC1:G72、G1:C72に逆転させると、バリアブルアームの長さに関わらず、TyrRSによる種特異的な認識が逆転する（非特許文献２３）。そのことから、真正細菌型、古細菌/真核生物型TyrRS共にtRNAの1:72塩基対が認識の要となっていることが示唆されている。
【０００７】
TyrRSの一次構造においても、古細菌、真核生物由来のTyrRSは互いに似ているのに対し、それらのTyrRSと真正細菌のTyrRSとは類似性が低い (図2)。例えば、PSI-BLASTプログラム (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) で配列相同性を解析すると、M. jannaschiiとヒトのTyrRSの間には59%の類似性が見出されるのに対し、M. jannaschiiとB. stearothermophilusのTyrRSの間ではe-valueが0.22と高く、全体的な類似性は見出されない。
【０００８】
【非特許文献１】
コイデ（Koide）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第８５巻、１９８８年、ｐ．６２３７−６２４１
【非特許文献２】
ノワク（Nowak）ら、サイエンス（Science）、 第２６８巻、１９９５年、ｐ．４３９−４４２
【非特許文献３】
ショート（Short）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、第３９巻、２０００年、ｐ．８７６８−８７８１
【非特許文献４】
チン（Chin）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２４巻、２００２年、ｐ．９０２６−９０２７
【非特許文献５】
チン（Chin）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第９９巻、２００２年、ｐ．１１０２０−１１０２４
【非特許文献６】
ヘンドリックソン（Hndrickson）ら、EMBO J.第９巻、１９９０年、ｐ．１６６５−１６７２
【非特許文献７】
ヤブキら、J.Biomol.NMR、第１１巻、１９９８年、ｐ．２９５−３０６
【非特許文献８】
ルー（Lu）ら、Mol.Cell、第８巻、２００１年、ｐ．７５９−７６９
【非特許文献９】
ワング（Wang）ら、Chem.Commun（Camb）、２００２年、ｐ．１−１１
【非特許文献１０】
ファーター（Furter）、Protein Sci.第７巻、１９９８年、ｐ．４１９−４２６
【非特許文献１１】
ワング（Wang）ら、サイエンス（Science）、第２９２巻、２００１年、ｐ．４９８−５００
【非特許文献１２】
ワング（Wang）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２４巻、２００２年、ｐ．１８３６−１８３７
【非特許文献１３】
サントロ（Santoro）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、第２０巻、２００２年、ｐ．１０４４−１０４８
【非特許文献１４】
キガら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第９９巻、２００２年、ｐ．９７１５−９７２３
【非特許文献１５】
サカモトら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第３０巻、２００２年、ｐ．４６９２−４６９９
【非特許文献１６】
チョー（Chow）ら,J.Biol.Chem.第２６８巻、１９９３年、ｐ．１２８５５−１２８６３
【非特許文献１７】
キン（Quinn）ら、Biochemistry、第３４巻、１９９５年、ｐ．１２４８９−１２４９５
【非特許文献１８】
フェクター（Fechter）ら、Eur.J.Bhichem.第２６８巻、２００１年、ｐ．７６１−７６７
【非特許文献１９】
ワング（Wang）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２２巻、２０００年、ｐ．５０１０−５０１１
【非特許文献２０】
ギージェ（Giege）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第２６巻、１９９８年、ｐ．５０１７−５０３５
【非特許文献２１】
マーク（Marck）ら、ＲＮＡ、第８巻、２００２年、ｐ．１１８９−１２３２
【非特許文献２２】
ヒメノら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１８巻、１９９０年、ｐ．６８１５−６８１９
【非特許文献２３】
ワカスギら、EMBO J.第１７巻、１９９８年、ｐ．２９７−３０５
【非特許文献２４】
ブリックら、Journal of Molecular Biology、第２０８巻、１９８９年、ｐ．８３−８９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
M. jannaschiiのＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性の改変は、すでにインビボスクリーニングシステムで成功している（非特許文献４、５、１１−１３、及び２４）。そしてこれまでに、M. jannaschiiのＴｙｒＲＳから、図２４に示す側鎖を有するチロシン誘導体を基質として認識する変異ＴｙｒＲＳが取得されている。ところが、これらの改変は、すべて置換の標的残基は、B.stearothermophilusのＴｙｒＲＳ結晶構造に基づいて選択されたものである。上述の如く、TyrRSの一次構造においても、古細菌、真核生物由来のTyrRSと真正細菌のTyrRSとは類似性が低いことを考慮すると、B.stearothermophilusのＴｙｒＲＳ結晶構造に基づいて古細菌や真核生物のＴｙｒＲＳの改変のための変異箇所を選択することは、その有効性が必ずしも保証されたものではない。
【００１０】
本発明は、メタノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶、チロシン結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳとその作製方法、アンチコドンＧ３４結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ、野生型のＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳとその作製方法、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳ、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット、ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の結晶を提供する。
（１）  表３に示される原子座標の原子番号１から４００６で規定される構造を有する、メタノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶。
（２）  空間群がP3121であり、単位格子が、a=b=86.8Å（8.68nm）、c=156Å（15.6nm）の寸法を有する、ＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の結晶。
本発明は、以下のチロシン結合ポケットを有するＴｙｒＲＳを提供する。
（３）  表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造において、アミノ酸残基Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３３、Ｇｌｙ３４、Ｐｈｅ３５、Ｇｌｕ３６、Ｌｅｕ６５、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｔｙｒ１５１、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ｇｌｎ１７３、及びＨｉｓ１７７によって規定されるチロシン結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ。
本発明は、前記（３）のチロシン結合ポケット構造の情報から、下記の変異ＴｙｒＲＳとその作製方法を提供する。
（４）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又は「Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（５）  （４）の変異ＴｙｒＲＳにおいて、「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」が「Ｔｙｒ３２、Ａｌａ７０、Ｔｈｒ１５８」に置換された配列、又は「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」が「Ｔｈｒ３２、Ｔｈｒ７０、Ｇｌｕ１５８」に置換された配列からなることを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（６）  （４）又は（５）の変異体のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（７）  チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも所望のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳを作製する方法であって、
（Ａ）表３に示される原子座標に基づいて、前記チロシン結合ポケット構造を構成するアミノ酸残基から少なくとも１つ選択し、
（Ｂ）選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異ＴｙｒＲＳライブラリーを作製し、
（Ｃ）変異ＴｙｒＲＳライブラリーから、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたものを選択することを含むことを特徴とする方法。
（８）  前記工程（Ａ）において、表３に示される原子座標に基づいて、チロシン結合ポケットを構成するアミノ酸残基から３個選択することを特徴とする、変異ＴｙｒＲＳを作製する方法。
（９）  前記チロシン誘導体が３位置換チロシンであることを特徴とする、変異ＴｙｒＲＳを作製する方法。
（１０）  前記工程（Ａ）で選択したアミノ酸残基が、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、及びＡｓｐ１５８の組み合わせ、又は、Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、及びＨｉｓ１７７の組み合わせであることを特徴とする、変異ＴｙｒＲＳを作製する方法。
さらに、本発明は下記のアンチコドンＧ３４結合ポケットを有するＴｙｒＲＳを提供する。
（１１）  表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造において、アミノ酸残基Ｐｈｅ２６１、Ｈｉｓ２８３、Ｐｒｏ２８４、Ｍｅｔ２８５、及びＡｓｐ２８６によって規定されるアンチコドンＧ３４結合ポケットを有するＴｙｒＲＳ。
さらに本発明は、前記（１１）のアンチコドンＧ３４結合ポケット構造から得られる情報に基づいて、下記の変異ＴｙｒＲＳとその作製方法を提供する。
（１２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＡｓｐ２８６が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異ＴｙｒＲＳであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（１３）  前記Ａｓｐ２８６が、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換されたものであることを特徴とする、変異ＴｙｒＲＳ。
（１４）  （１２）又は（１３）の変異ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（１５）  チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりもチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳにおいて、配列番号１におけるＡｓｐ２８６に相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換することを特徴とする、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳの作製方法。
（１６）  （１５）の方法により作製され得る変異ＴｙｒＲＳ。
さらに、本発明は、下記の変異ＴｙｒＲＳとその作製方法を提供する。
（１７）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換され、かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列、
又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換され、かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列
からなり、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
（１８）  （１７）の変異ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ。
さらに、本発明は、下記のチロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット及びポリペプチドの製造方法を提供する。
（１９）  ▲１▼細胞抽出液、
▲２▼前記のいずれかの変異ＴｙｒＲＳ、
▲３▼前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ
とを具備した、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット。
（２０）  前記いずれかの変異ＴｙｒＲＳと、前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチド合成方法。
（２１）  （Ａ）前記いずれかの変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌を、その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を添加した培地で、適当な条件でインキュベートすることにより、真性細菌内で、チロシン誘導体組み込みポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（２２）  （Ａ）前記いずれかの変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、チロシン誘導体とは、チロシンを構成する原子のいずれかに任意の置換基が導入されたものをさし、置換基の導入される位置に制限はない。具体的には、例えば、図２４に挙げる側鎖を有するチロシン誘導体が挙げられる。
【００１３】
本発明のＴｙｒＲＳ変異体は、アミノ酸配列の中に特定の位置に変異を有し、所望の活性を維持する限り、その他の位置のアミノ酸残基については、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたものも包含するものとする。
同様に、本発明のＴｙｒＲＳ変異体は、アミノ酸配列の中に特定の位置に変異を有し、所望の活性を維持する限り、その他の位置のアミノ酸残基については、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性を有するものも包含するものとする。
【００１４】
（１）三重複合体の結晶構造
本発明は、高分解能三次元構造及びＸ線結晶学により決定した、三重複合体の原子構造座標を提供する。三重複合体の結晶化、及びその構造座標のＸ線解析のための具体的な方法は、実施例に記載した通りである。
本発明のM. jannaschii のTyrRSとM. jannaschiiのtRNATyrとＬ−チロシンとの三重複合体（以下、ＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体という）の結晶は、空間群がP3121であり、単位格子が、a=b=86.8Å（8.68nm）、c=156Å（15.6nm）の寸法を有するものである。ここで、単位格子とは、結晶の最も小さく単純な体積要素をさし、空間群とは単位格子の対称性をさす。
１．９５Å（1.95×10-1nm）の分解能で得られた本発明のＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の原子構造座標を表３に示す。表３に示した原子座標において、原子番号１から２４１５は、ＴｙｒＲＳ、２４１６から２４２８はＬ−チロシン、２４２９から４００６は、ｔＲＮＡ、４００７から４３７４は捕捉された水に相当する。
本発明において、ＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／Ｌ−チロシンの三重複合体の原子構造座標とは、表３に示された座標と一致又は実質的に一致するものをさし、より具体的には、表３に示した座標に関し、バックボーン原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ及びＯ）を用いてそれを重ね合わせたときに、約１．５Å（0.15nm）以下、好ましくは約１．０Å（0.1nm）以下、より好ましくは０．５Å（0.05nm）以下の二乗平均偏差をもつものを意味する。
【００１５】
表３に示される原子座標は、チロシンｔＲＮＡとＬ−チロシンに結合したM. jannaschiiのＴｙｒＲＳの立体構造を反映するものであり、多くの有用な情報を提供する。中でも、古細菌のＴｙｒＲＳ改変を行なうためのアミノ酸置換の位置の特定に用いることができる。また、上述のごとく、古細菌と真核細胞におけるＴｙｒＲＳの類似性から、表３に示される真核生物のＴｙｒＲＳ改変を行なうためのアミノ酸置換の位置の特定のためにも用いることができると考えられる。
より具体的には、以下に詳述するように、表３の原子座標データを解析した結果、ＴｙｒＲＳに存在するチロシン結合ポケット構造と、アンチコドンＧ３４結合ポケット構造とが明らかになった。また、実施例の欄で詳述するように、ｔＲＮＡのアクセプターステム認識に関与する部位についても、表３の原子座標データより新たな情報を得た。
【００１６】
（２）チロシン結合ポケット
本発明において明らかにされた、ＴｙｒＲＳのチロシン結合ポケット構造とは、表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造を有するM. jannaschiiのＴｙｒＲＳにおいて、アミノ酸残基Ｔｙｒ３２（原子番号２５９〜２７０）、Ｉｌｅ３３（原子番号２７１〜２７８）、Ｇｌｙ３４（原子番号２７９〜２８２）、Ｐｈｅ３５（原子番号２８３〜２９３）、Ｇｌｕ３６（原子番号２９４〜３０２）、Ｌｅｕ６５（原子番号５２５〜５３２）、Ａｌａ６７（原子番号５４１〜５４５）、Ｈｉｓ７０（原子番号５６２〜５７１）、Ｔｙｒ１５１（原子番号１２３０〜１２４１）、Ｇｌｎ１５５（原子番号１２６５〜１２７３）、Ａｓｐ１５８（原子番号１２８９〜１２９６）、Ｇｌｎ１７３（原子番号１３９８〜１４０６）、及びＨｉｓ１７７（原子番号１４３５〜１４４４）によって規定されるものである。
【００１７】
このチロシン結合ポケットを拡大した図を図４に示す。図４において、点線は水素結合を意味する。このチロシン結合ポケット構造において、Ｌ−チロシンが認識されるメカニズムは以下の通りであると考えられる。
ポケットの入り口の近くでは、基質のＬ−チロシンのアミノ基とカルボニル基が、Ｇｌｎ１７３、Ｔｙｒ１５１及びＧｌｎ１５５で水素結合ネットワークを形成する。すなわち、基質のＬ−チロシンのアミノ基は、Ｇｌｎ１７３のカルボニル基、Ｔｙｒ１５１のヒドロキシル基及びＧｌｎ１５５のカルボニル基と、各々水素結合を形成し、基質のＬ−チロシンのカルボニル基は、Ｇｌｎ１７３のアミノ基と水素結合を形成し、さらにＧｌｎ１７３のカルボニル基とＧｌｎ１５５のアミノ基で水素結合を形成する。
チロシンの芳香環は、Ｌｅｕ６５、Ｈｉｓ７０、及びＧｌｎ１５５の側鎖により認識され、さらに、Ｉｌｅ３３、Ｇｌｙ３４、Ｐｈｅ３５の主鎖によっても認識される（チロシンの後ろ側、図４には示さず）。チロシンの芳香環のヒドロキシル基は、ポケットの内部のＴｙｒ３２とＡｓｐ１５８で水素結合により認識される。水分子は、Ｈｉｓ１７７とＴｙｒ３２により水素結合で捕捉され、チロシンの側鎖にも近位である。
このチロシン結合ポケットが、野生型のＴｙｒＲＳのチロシンに対する基質特異性を決定するものと考えられる。そこで、ＴｙｒＲＳのチロシンに対する基質特異性を改変するには、このチロシン結合ポケットを構成するアミノ酸残基を変異させることが有効であると考えられる。
【００１８】
（３）ＴｙｒＲＳの基質特異性変異体の作製方法
本発明は、前記チロシン結合ポケット構造の情報に基づき、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも所望のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳ（以下、単に本発明の基質特異性変異ＴｙｒＲＳともいう）を作製する方法を提供する。すなわち、
（Ａ）表３に示される原子座標に基づいて、前記チロシン結合ポケット構造を構成するアミノ酸残基から少なくとも１つ選択し、
（Ｂ）選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異ＴｙｒＲＳライブラリーを作製し、
（Ｃ）変異ＴｙｒＲＳライブラリーから、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたものを選択することを含むことを特徴とする方法である。
本発明において、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳとは、チロシンよりも所望のチロシン誘導体に対する基質親和性が高められた変異ＴｙｒＲＳということもできる。チロシンよりも所望のチロシン誘導体に対する基質親和性が高められたとは、目的のチロシン誘導体に対する活性値（反応速度Ｋｃａｔをミカエリス定数Ｋｍで割った値）が、チロシンに対する活性値よりも大きいものをいう。活性値はインビトロのアッセイによって測定できるが、遺伝学的なデータから活性値の相対的な大きさを判定することもできる。
【００１９】
工程（Ａ）において、置換基を導入する原子は、チロシンの芳香環を構成する炭素のいずれでもよい。特にチロシン芳香環を構成する２位又は３位の炭素原子に置換基を導入したい場合は、チロシンの線対称性により、２箇所ずつとなる。チロシン芳香環の４位のヒドロキシル基を別の置換基に変えたチロシン誘導体でもよい。上述したように、すでに、図２４に示すような種々のチロシン誘導体に基質特異性を有する変異体が取得されていることから、M. jannaschiiの変異より、多様な基質特異性を有し得ることは実証されている。本発明の方法においては、より合理的に変異の箇所が特定できるので、すでに基質となり得ることが知られているチロシン誘導体について、より基質特異性が高められた変異体の取得が可能となるだけでなく、新たな位置や種類の置換基を有するチロシン誘導体に対して基質特異性を有する変異体が取得できる可能性が開かれた。
【００２０】
工程（Ｂ）において、選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異ＴｙｒＲＳライブラリーを作製する。
アミノ酸残基を複数選択した場合は、ＰＣＲ等を用いた公知の遺伝子操作技術によるアミノ酸残基のランダム置換を行なうことができる。
例えば、２通りの３位置換について、アミノ酸残基を３個選択した場合は、試みるべきアミノ酸置換の組み合わせは２０３通りずつ、合わせて１６０００通りである。遺伝子上のこれらの３つの位置に対応するヌクレオチド残基（それぞれ合わせて９残基）をランダムな配列に変えた変異遺伝子のライブラリーをＰＣＲを利用して作製することができる。
従来の報告（非特許文献４、１１、１２及び２４）では、チロシン誘導体特異的M. jannaschii ＴｙｒＲＳを得るために、フェノール環上の置換基の位置に関わらず、B. stearothermophilus ＴｙｒＲＳの立体構造に基づいてチロシン認識に関与するアミノ酸残基を５か所推定して、これらをランダムに置換している。この方法では、１種類の改変体ＴｙｒＲＳを得るために２０５通りのアミノ酸置換の組み合わせを調べる必要があった。本発明を用いると、置換の位置をより限定することができるので、これより少ない置換基を選択してより効率的に目的のＴｙｒＲＳ改変体を得ることが可能である。
【００２１】
工程（Ｃ）における選択は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、大腸菌などで発現させ、チロシン（＋）チロシン誘導体（−）の培地では、アンバーサプレッションが起こらないが、チロシン（＋）チロシン誘導体（＋）の培地ではアンバーサプレッションが起こるものを選択すればよい。例えば、Ｌａｃにアンバー変異を導入した株を、アンバーサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、ランダムな配列に変えた変異遺伝子のライブラリーで形質転換し、チロシン（＋）チロシン誘導体（−）の培地では、アンバーサプレッション（Ｌａｃ−）が起こらないが、チロシン（＋）チロシン誘導体（＋）の培地ではアンバーサプレッション（Ｌａｃ＋）が起こるものを選択すればよい。
このようなポジティブセレクションを用いれば、多くの形質転換株から目的のものを簡便に選択することができる。
【００２２】
以下、本発明の変異ＴｙｒＲＳの作製方法を用いて、M. jannaschii TyrRSのアミノ酸特異性の改変手法の一例について具体的に説明する。
【００２３】
［１］M. jannaschii TyrRS遺伝子の入手
M. jannaschii TyrRS遺伝子の既知の塩基配列（GenBank ID: 1591094）（配列番号２）をもとにPCRプライマー１，２（各々、配列番号３、４）を設計し、これらのプライマーを用いて、遺伝子の全長を、M. jannaschiiゲノムDNA（ATCC bioproducts社から購入）を鋳型としたPCRによって遺伝子の全長を含むDNA断片を得ることができる（ATCC bioproducts, http://www.atcc.org/Products/PurifiedDNA.cfm/）。
【００２４】
［２］M. jannaschii TyrRSの大腸菌内での発現用プラスミドpMYSの作成
［１］で得たDNA断片は両末端に制限酵素NdeI部位とBglII部位をそれぞれ持つので、これら２つの制限酵素で処理した後、同様に処理した発現用ベクターpCBS1（FEBS Letter Vol. 462, pp. 302-306, 1999）とリガーゼによって結合させてプラスミドpMYSを作成する。このプラスミドを大腸菌に導入することにより、M. jannaschii TyrRSの大腸菌内で大量に発現させることができる。
【００２５】
［３］M. jannaschii由来チロシン・サプレッサーtRNA（以下，Mj sup-tRNA）とアンバー変異を含むlac遺伝子のαフラグメント（以下，α-lac(Am)）を両方とも大腸菌内で発現するためのプラスミドpMYR-Lac(Am)の作製
M. jannaschii サプレッサーtRNA遺伝子（非特許文献１１）を含むDNA断片（配列番号５）とその発現用プロモータを含む断片（配列番号６）を、ベクターpACYC184（Journal of Bacteriology Vol. 134, pp. 1141-1156, 1978）のBamHI-HindIII部位，BamHI-SalI部位にそれぞれクローニングしてプラスミドpMYRを作製する。さらに、 pMYRを制限酵素EagIで処理した後、α-lac(Am)を含むDNA断片（配列番号７）とリガーゼによって結合させて、プラスミドpMYR-Lac(Am)を作製する（図３）。
【００２６】
M. jannaschii サプレッサーtRNA遺伝子を含むDNA断片の塩基配列（配列番号５）
2006180701.tif 000002
（１番目と３番目の下線は、BamHI部位とHindIII部位を示す。２番目の下線は、M. jannaschii  サプレッサー-tRNAの構造遺伝子領域を示す。）
【００２７】
発現用プロモータを含むDNA断片の塩基配列（配列番号６）
2006180701.tif 000003
（下線は、各々SalI部位とBamHI部位を示す。）
【００２８】
α-lac(Am)を含むDNA断片（配列番号７）
2006180701.tif 000004
（下線は、各々、α-lac遺伝子の開始コドンとアンバーコドンを示す。）
【００２９】
［４］M. jannaschii TyrRS中のアミノ酸残基でアミノ酸特異性の改変の為に置換する残基の選択
例えば、改変によって3-ヨード-L-チロシン（以下，IY）を特異的に認識する変異TyrRSを得たい場合は、TyrRSのL-チロシン結合部位の立体構造（図４）において、チロシン環３位（左右２カ所）の近傍に位置する次の３残基を選択する。
右側：Ｎ末端から32番目のチロシン残基（Tyr32），His70，Asp158
左側：Tyr32, Asp158, His177
【００３０】
［５］Tyr32，His70，Asp158の３残基を同時にそれぞれ20種類のアミノ酸のいずれかにランダムに置換した変異TyrRS発現プラスミドの作製
M. jannaschii TyrRS遺伝子中の該当３アミノ酸残基に対応する塩基配列をNNK（N：A, G, C, Tのいずれか、K：GまたはT）に置換した遺伝子を次の２段階のPCRによって作製して、［２］に記述した方法で大腸菌内で発現させる。
【００３１】
［PCR第１段階］プライマー１−８を用いた次の４回のPCRを含む。
PCR.1 プライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号８）を用いる。
PCR.2 プライマー４（配列番号９）とプライマー５（配列番号１０）を用いる。
PCR.3 プライマー６（配列番号１１）とプライマー７（配列番号１２）を用いる。
PCR.4 プライマー８（配列番号１３）とプライマー２（配列番号４）を用いる。
反応条件はいずれも次の通りとすればよい。
Pyrobest DNA polymerase (Takara社から購入)、酵素に添付の反応用緩衝液を使用し、反応液の容量は50マイクロリットルとする。プライマーは25ピコモルずつ使用し、鋳型としてプラスミドpMYS を１ナノグラム使用する。反応の温度制御は次の通りとすればよい。
98度５分→（98度10秒→50度15秒→72度ｘ秒）×25回以上→72度５分
ここで、ｘは30以上で、PCRで生成するDNA断片の長さを500で割って60を掛けた値とする。
【００３２】
［PCR第２段階］PCR.1〜4で得られたPCR産物10ナノグラムずつを混合して鋳型としてプライマー１，２を用いて行う。反応条件、温度制御はｘ＝90とする前記PCR第１段階と同じである。
【００３３】
［６］Tyr32，Asp158，His177の３残基を同時にそれぞれ20種類のアミノ酸のいずれかにランダムに置換した変異TyrRS発現プラスミドの作製
前記［５］の手順においてPCR第１段階で用いるプライマーが以下の組み合わせになる以外は同様に実施する。プライマー9、10（各々、配列番号１４、１５）にする以外は全て同じである。
【００３４】
［PCR第１段階］
PCR.1 プライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号８）を用いる。
PCR.2 プライマー４（配列番号９）とプライマー６（配列番号１１）を用いる。
PCR.3 プライマー８（配列番号１３）とプライマー９（配列番号１４）を用いる。
PCR.4 プライマー１０（配列番号１５）とプライマー２（配列番号４）を用いる。
【００３５】
［７］変異体の選択の方法
大腸菌MV1184株をプラスミドpMYR-Lac(Am)で形質転換するMV1184*株を作成する。
MV1184*株に［５］または［６］で作成した変異TyrRS発現プラスミドをそれぞれ形質転換法によって導入し、  LB*プレートに播く。18時間以上37度で保温したのちに生じたコロニー（8000個以上）を集めてLB **(IY)プレートに再び播き、24時間以上保温して再度生じたコロニーの着色を観察する。
各コロニーは、それぞれ１つずつの変異TyrRS遺伝子のクローンを含んでいる。変異TyrRSがプレート中のL-チロシン（または，IYの添加ある場合には，IYまたはL-チロシン）をMj sup-tRNAに結合させる活性を持つならば、α-lac(Am)遺伝子中のアンバー変異をサプレッションして青く着色したコロニーを生じる。
よって、ＬＢ**(IY)プレート上の青く染まったコロニーは、IYまたはL-チロシンをMj sup-tRNAに結合させる活性を持つ変異TyrRS遺伝子のクローンを含んでいることがわかる。そこで、青く染まったコロニーを１つずつLB**プレートとLB **(IY)プレート上にそれぞれ移植して、24時間以上37度で保温して再度着色を観察する。LB **(IY)プレート上では青、LB **プレート上では白になるコロニーは、IYのみをMj sup-tRNAに結合させる活性を持つ変異TyrRS遺伝子のクローンを含んでいる。よって，それぞれのコロニーから変異TyrRS遺伝子を回収する。
各プレートの組成は以下の通りとすることができる。
LB *プレート：１リットルあたりアンピシリン100ミリグラム、クロラムフェニコール25ミリグラムを含んだＬＢプレート。
LB **プレート：１リットルあたりイソプロピル-1-チオ-D-ガラクトピラノシド１mM（最終濃度）、 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド40ミリグラム、IY 0.1グラムを含んだLBプレート。
LB **(IY)プレート：１リットルあたりイソプロピル-1-チオ-D-ガラクトピラノシド１mM（最終濃度）、 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド40ミリグラム、IY 0.1グラムを含んだLBプレート。
【００３６】
（４）基質特異性変異ＴｙｒＲＳ
こうして得られた変異体は、チロシンよりも所望のチロシン誘導体に対する基質親和性が高められた変異ＴｙｒＲＳである。すなわち、
（Ａ）表３に示される原子座標に基づいて、前記チロシン結合ポケット構造を構成するアミノ酸残基から少なくとも１つ選択し、
（Ｂ）選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異ＴｙｒＲＳライブラリーを作製し、
（Ｃ）変異ＴｙｒＲＳライブラリーから、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたものを選択することを含む方法により作製された変異ＴｙｒＲＳは、例えば、後述の方法により、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔRNAと組み合わせて、所望の位置にアンバー変異を受けた所望の遺伝子を発現させることにより、所望の位置に目的のチロシンを組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。
【００３７】
また、本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列（M.jannaschiiの野生型のＴｙｒＲＳのアミノ酸配列；１文字標記で図２５に示す）において、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又はＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３位置換チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳは、例えば、後述の方法により、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔRNAと組み合わせて、所望の位置にアンバー変異を受けた所望の遺伝子を発現させることにより、所望の位置に目的の３位置換チロシンを組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異ＴｙｒＲＳの一態様によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又はＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列を含み、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３位置換チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳである。
【００３８】
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又はＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳは、例えば、後述の方法により、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔRNAと組み合わせて、所望の位置にアンバー変異を受けた所望の遺伝子を発現させることにより、所望の位置に３位置換チロシン、好ましくは３−ハロゲン化チロシン、特に３−ヨードチロシンを組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異ＴｙｒＲＳの一態様によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又はＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列を含み、かつチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳである。
【００３９】
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換された配列（Ｔｙｒ３２−Ａｌａ７０−Ｔｈｒ１５８）、又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換された配列（Ｔｈｒ３２−Ｔｈｒ７０−Ｇｌｕ１５８）からなる変異ＴｙｒＲＳを提供する。この変異体が実際に３−ヨードチロシンに対する特異性が高いことは、前記の選択方法において、チロシン（＋）３−ヨードチロシン（−）の培地では、アンバーサプレッション（Ｌａｃ−）が起こらないが、チロシン（＋）３−ヨードチロシン（＋）の培地ではアンバーサプレッション（Ｌａｃ＋）が起こることにより実証されている。
本発明の変異ＴｙｒＲＳの一態様によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換された配列（Ｔｙｒ３２−Ａｌａ７０−Ｔｈｒ１５８）、又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換された配列（Ｔｈｒ３２−Ｔｈｒ７０−Ｇｌｕ１５８）を含む変異ＴｙｒＲＳである。
【００４０】
３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシンなどの、３−ハロゲン化チロシンは、それ自体で生理活性を有する非天然型アミノ酸であり、ポリペプチドの部位特異的ラベルの標的部位ともなる。したがって３−ハロゲン化チロシンに対する基質特異性が高められた本発明の変異ＴｙｒＲＳは、３−ハロゲン化チロシンを組み込んだアロタンパク質に用いることができ、このようなアロタンパク質は、タンパク質機能・構造解析の材料として有用であり、また創薬のターゲットともなる可能性がある。
【００４１】
（５）アンチコドンＧ３４結合ポケット構造
M. jannaschii TyrRSにおいて、アンチコドンはC末端ドメインによって認識される (図６及び図１５)。そして、アンチコドンの1文字目のG34が引き出されて厳密に認識される (図１５)ことがわかった。
こうして明らかとなった本発明のアンチコドンＧ３４結合ポケット構造は、表３に示される原子座標の原子番号１から２４１５で規定される構造を有するM. jannaschiiのＴｙｒＲＳにおいて、アミノ酸残基Ｐｈｅ２６１、Ｈｉｓ２８３、Ｐｒｏ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ａｓｐ２８６によって形成される、アンチコドンＧ３４結合ポケット構造である。このアンチコドンＧ３４結合ポケットを図５に示す。
このアンチコドンＧ３４結合ポケットにおいては、G34の塩基部分はPhe261とHis283の環の間にスタッキングし、さらに1位の窒素原子と2位のアミノ基は、共にAsp286と水素結合によって認識されている。
【００４２】
この知見に基づき、本発明者らは、tRNATyrのG34C変異体であるアンバーサプレッサーtRNA（チロシンアンチコドンＧＵＡの１文字目ＧがＣに置換されて、アンチコドンがＣＵＡとなったもの）に対するアミノアシル化の効率を上げるためには、286番の残基に変異を導入し、その有効性を確認した。
こうして、本発明の一態様は、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、Ａｓｐ２８６を別のアミノ酸残基で置換した配列を有し、かつアンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応が向上したM. jannaschii由来の変異ＴｙｒＲＳである。
このような変異体を取得する方法としては、公知の方法のいずれを用いても良く、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡを増幅させて、増幅させたＤＮＡ断片を結合させて、全長のａａＲＳの変異体をコードするＤＮＡを得て、これを大腸菌などの宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。この方法において使用するプライマーとしては２０〜７０塩基、好ましくは２０〜５０塩基程度である。このプライマーは改変前の元の塩基配列とは１〜３塩基がミスマッチとなるので、比較的長いもの、例えば２０塩基以上のものを使用するのが好ましい。
【００４３】
本発明者らは、このＡｓｐ２８６置換において、野生型TyrRSにおいてtRNAの34塩基目にシトシンがくる場合、G34と同じように塩基が反転した位置に来たとしても、Asp286と塩基との距離が離れすぎて満足な相互作用は得られない可能性があることを考慮して、Asp286をより大きな側鎖である、Glu、Phe、Ile、Leu、Gln、Arg、Tyrに置換した変異体を作製した。
これらの変異体について、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成の初速度を測定した。その結果を図１７に示す。図１７に示した結果より、その結果、Gln、Arg、Tyr置換体について顕著な活性の向上がみられることがわかる。特に、Ａｒｇ置換体（D286R）では野生型の8倍の初速度を示した。
【００４４】
こうして、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＡｓｐ２８６が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異ＴｙｒＲＳであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳが提供される。特に、Ａｓｐ２８６が、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換されたものであることが好ましい。
本発明において、「反応速度が高い」とは、基質濃度と酵素濃度を一定にしたときにの初速度が高いものをいう。したがって、その基質に対するミカエリス定数Ｋｍが低くなるか、あるいは反応速度定数Ｋcatが高くなるかのいずれでもよい。
すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳ（野生型）に比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳとは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを基質としたときの変異体のミカエリス定数Ｋｍが野生型より低いか、又は変異体の反応速度定数Ｋｃａｔが野生型より高いことを意味する。
この変異ＴｙｒＲＳは、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔRNAと組み合わせて、任意の位置にアンバー変異を導入した核酸を発現させることによるポリペプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異ＴｙｒＲＳの一態様によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＡｓｐ２８６が別のアミノ酸残基で置換された配列を含む変異ＴｙｒＲＳであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳである。
【００４５】
（６）アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳの作製方法
本発明は、さらに、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりもチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳにおいて、配列番号１におけるＡｓｐ２８６に相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換することを特徴とする、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳの作製方法を提供する。
ここで、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりもチロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳとは、上述の「Ｔｙｒ３２、Ｈｉｓ７０、Ａｓｐ１５８」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、又は「Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｈｉｓ１７７」のうちの１以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなる変異ＴｙｒＲＳの他、前記非特許文献４、１１、及び１２などに記載されたチロシン誘導体に対する基質特異性が高められた変異ＴｙｒＲＳが挙げられる。本発明の方法は、これらの基質特異性変異体に対して、さらにＡｓｐ２８６又はこれに相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することによるものである。Ａｓｐ２８６又はこれに相当するアミノ酸残基は、周知の方法で各変異体のアミノ酸配列を決定し、配列番号１のアミノ酸配列と比較することにより、容易に決定することができる。
この変異ＴｙｒＲＳは、Ａｓｐ２８６を置換する前のＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められているので、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、任意の位置にアンバー変異を導入した核酸を発現させることにより、任意の位置にチロシン誘導体を組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。
【００４６】
（７）チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳ
本発明は、さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換され（Ｔｙｒ３２−Ａｌａ７０−Ｔｈｒ１５８）かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列、又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換され（Ｔｈｒ３２−Ｔｈｒ７０−Ｇｌｕ１５８）かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列からなり、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳも提供する。
この変異ＴｙｒＲＳも、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、任意の位置にアンバー変異を導入した核酸を発現させることにより、任意の位置に３位置換チロシン、特に３−ヨードチロシンを組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異ＴｙｒＲＳの一態様によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｈｉｓ７０がＡｌａで置換され、Ａｓｐ１５８がＴｈｒで置換され（Ｔｙｒ３２−Ａｌａ７０−Ｔｈｒ１５８）かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列、又はＴｙｒ３２がＴｈｒで置換され、Ｈｉｓ７０がＴｈｒで置換され、Ａｓｐ１５８がＧｌｕで置換され（Ｔｈｒ３２−Ｔｈｒ７０−Ｇｌｕ１５８）かつＡｓｐ２８６がＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒで置換された配列を含み、チロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性よりも３−ヨードチロシンを基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められ、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＴｙｒＲＳに比べて、アンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異ＴｙｒＲＳである。
【００４７】
（８）ポリペプチド生産、精製
こうして、得られた変異ＴｙｒＲＳは、古細菌又は真核生物のサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、インビトロ又はインビボでのチロシン誘導体組み込みポリペプチドの生産に用いることができる。
本発明によれば、前記変異ＴｙｒＲＳと、前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを特徴とする、チロシン誘導体組み込みポリペプチドの製造方法を提供する。
ここで、ポリペプチド合成系は、上記の変異ＴｙｒＲＳ、結合可能なサプレッサーｔＲＮＡ、所望の遺伝子を用いて発現ができる発現系であれば、任意の合成系を用いることができる。
その具体例としては、例えば、無細胞ポリペプチド合成系、真性細菌内でポリペプチドを合成する系などが挙げられる。
【００４８】
本発明において、「無細胞ポリペプチド合成系」は、細胞抽出液を用いて、インビトロでポリペプチドを合成する系を意味するものであり、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でポリペプチドを合成する無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含むものを包含する。
無細胞ポリペプチド合成系に必要なものとしては、
▲１▼任意の細胞抽出液、好ましくは原核細菌抽出液、
▲２▼本発明の変異ＴｙｒＲＳ、
▲３▼前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ
▲４▼所望の位置にアンバー変異が導入された目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ
が挙げられる。
【００４９】
前記無細胞系において、▲１▼の細胞抽出液は、リボゾーム、ｔＲＮＡ、ポリペプチド合成に必要な酵素などを含むものであって、高いポリペプチド合成活性の状態の大腸菌の濃縮細胞抽出液、特に大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を濃縮したものを用いることができる。濃縮細胞抽出液は、前記の粗細胞抽出液を透析、限外濾過、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿などの濃縮法によって濃縮して得ることができる。例えば、大腸菌Ｓ３０細胞抽出液の濃縮は、振とうまたは攪拌可能な閉鎖系で、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）から既知の方法（Ｚｕｂａｙら（１９７３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−２８７）で得られた大腸菌Ｓ３０抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社からも入手可能）を透析内液とし、分子量限界１０００〜１４０００の透析膜を介して透析外液に対して透析を行うことによって得ることができる。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖／エピクロルヒドリン水溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭＡ社製のＦｉｃｏｌｌ）とを含むことができる。
【００５０】
大腸菌由来の細胞抽出液は濃縮されていることが好ましいが、未濃縮であってもよい。本明細書でいう「濃縮細胞抽出液」は、リボソーム、ｔＲＮＡなどのポリペプチド合成に必要な成分を含む真核および原核生物細胞の粗抽出液を透析、限外濾過、ＰＥＧ沈殿（Ｈ．Ｎａｋａｎｏら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４６（１９９６）２７５−２８２）などの既知の濃縮法または新規に見出される濃縮法によって濃縮されたものを意味し、該抽出液はポリペプチドインビボ合成に関与する翻訳系または転写系／翻訳系の成分を含む。「濃縮」は、抽出液中の総タンパク質濃度を指標として、その濃度の増加を意味する。（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
【００５１】
前記細胞抽出液はリボソーム、ｔＲＮＡなどのポリペプチド合成に必要な成分を含む。粗抽出液の調製は例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）に記載の方法を使用できる。具体的には、フレンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら，上掲）やグラスビーズを用いた破砕（Ｋｉｍら，上掲）によって行うことができる。
好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）から既知の方法、例えばＰｒａｔｔら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。
【００５２】
本発明では、前記細胞抽出液はその総タンパク質濃度が増加するように濃縮する必要があるが、濃縮は任意の手段例えば限外濾過（限外濾過遠心を含む）、透析、ＰＥＧ沈殿などによって行うことができる。濃縮の度合いは、通常１．５倍以上、好ましくは２倍以上である。大腸菌由来の細胞抽出液の場合、限外濾過遠心で１．５〜７倍以上、ＰＥＧ沈殿で１．５〜５倍以上まで濃縮可能であるが、4倍を超えるとハンドリングが難しくなる。また、小麦胚芽抽出液の場合、ＰＥＧ沈殿で10倍の濃縮が可能である（Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら，上掲）。ＰＥＧ沈殿による方法では、細胞抽出液にＰＥＧ水溶液を混ぜることによりポリペプチド、核酸を沈殿させて回収し、これを少量の緩衝液に溶かすことにより濃縮細胞抽出液を得ることができる。透析による濃縮は、例えば、振とうまたは攪拌可能な閉鎖系で細胞抽出液を透析内液とし、透析膜（例えば分子量限界１０００〜１４０００）を介して透析外液に対して透析を行うことによって得ることができる。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、ＰＥＧ（例えば＃８０００）、ショ糖／エピクロルヒドリン水溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭＡ社製のＦｉｃｏｌｌ）等の高分子吸収剤とを含むことができる。高分子吸収剤は水分を吸い出すために必須である。
【００５３】
無細胞ポリペプチド合成系（すなわち、ポリペプチド合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含むことができる。その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
【００５４】
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はポリペプチドを構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
【００５５】
▲２▼の変異ＴｙｒＲＳとしては、本発明の変異ＴｙｒＲＳのいずれかを用いることができる。特に、チロシン誘導体を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性が高められた変異ＴｙｒＲＳを用いることは、チロシン誘導体組み込みポリペプチド生産のために有利であり、さらにアンバーサプレッサーｔＲＮＡに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異ＴｙｒＲＳを用いることは生産効率を高めることができるので、有利である。
【００５６】
▲３▼のサプレッサーｔＲＮＡとは、古細菌又は真核生物由来のチロシンｔＲＮＡ変異体であって、好ましくは、アンバーサプレッサーtRNA（チロシンアンチコドンＧＵＡの１文字目ＧがＣに置換されて、アンチコドンがＣＵＡとなったもの）を用いる。M. jannaschii由来チロシン・サプレッサーtRNAは、上述した方法により作製することができる。用いることができる真核生物由来のチロシンｔＲＮＡは、例えば、M.スプリンツルら、Nucleic Acids Research、第１７巻、１−１７２頁、１９８９年に記載されたものが挙げられる。
【００５７】
▲４▼所望の位置にアンバー変異が導入された目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ
チロシン誘導体を組み込ませるポリペプチドの種類は、限定されるものではなく、発現可能ないかなるポリペプチドでもよく、異種の組換えポリペプチドでもよい。
本発明において非天然型アミノ酸を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）を導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。
【００５８】
ポリペプチドに部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)、Zoller, Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Kramer, Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。
【００５９】
本発明では、ポリペプチドは、前記定義のとおり小ペプチドから大ペプチドに至る任意の残基数のものを対象とし、公知のものまたは新規のものを含む。目的のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、真核または原核生物の細胞もしくは組織からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡとして周知の方法（フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心など）で得るか、あるいは、ｃＤＮＡクローニングで合成・単離することができる。あるいは、ポリペプチドのアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列が判明している場合には、ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成することもできる。
【００６０】
温度および攪拌速度などの反応条件は、ポリペプチドの種類に応じて任意の条件を使用できる。ポリペプチドの合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは約３７℃である。また、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のポリペプチドの生成を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
【００６１】
さらに、本発明は、
▲１▼任意の細胞抽出液、好ましくは原核細菌抽出液、
▲２▼本発明の変異ＴｙｒＲＳ、
▲３▼前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡ、
とを具備した、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キットを提供する。
さらに、前記チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キットは、▲１▼〜▲３▼に加えて、
・天然型アミノ酸と、所望のチロシン誘導体とのアミノ酸混合物
・ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰなどのリボヌクレオチド
とを具備するように構成することもできる。
これらのキットの各成分については、前記無細胞ポリペプチド合成系で説明したものと同様のものを用いることができる。
これらのキットは、所望の位置にアンバー変異が導入された目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの発現を、容易に行なうことができ、こうして任意の所望の位置にチロシン誘導体を組み込んだ所望のポリペプチドの生産に用いることができる。
【００６２】
さらに、
（Ａ）前記変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌を、その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を添加した培地で、適当な条件でインキュベートすることにより、真性細菌内で、チロシン誘導体組み込みポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法も提供する。
ここで用いられる真性細菌としては、組換えタンパク質発現系が構築されているものであれば、いかなるものでもよい。具体的には、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５７７２(ATCC 53635)；エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラティア属、及びシゲラ属のような腸内細菌、Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニホルミスのようなバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、及びストレプトマイセス属を含むが、これらに制限されるものではない。
例えば、大腸菌内で、このポリペプチドを発現させるためには、前記の大腸菌内で、M. jannaschiiのＴｙｒＲＳと、サプレッサーｔＲＮＡを発現させた方法に準じて行なうことができる。
さらに、本発明は、
（Ａ）前記変異ＴｙｒＲＳを細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）前記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡを、前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真性細菌も提供する。この真性細菌は、前記のポリペプチドの製造方法に用いることができる。
【００６３】
本発明のＴｙｒＲＳを用いて、前記の大腸菌内で生産したチロシン誘導体組み込みポリペプチドは、培地又は宿主細胞溶解物などから常法に基づき回収し得る。もし膜に結合しているならば、それは適当な界面活性剤(例えばTriton-X100)を用いて又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。細胞は、凍結-融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まない、またはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、タンパク質の立体構造を形成させることができる。
【００６４】
ポリペプチドの単離・精製としては、生産したポリペプチド特有の性質に基づき、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈澱、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行なうことができる。
【００６５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００６６】
【実施例】
実験方法
［全般］
・一般遺伝子操作については，特に指定がなければ「Molecular Cloning 3rd Ed. Vol. 1-3, written by J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001」に準拠して行った。
・     PCRは，特に指定がなければ，次の条件で行った。
Pyrobest DNA polymerase (Takara社から購入)，酵素に添付の反応用緩衝液を使用し，反応液の容量は50マイクロリットルとする．プライマーは25ピコモルずつ使用し，鋳型DNA をｘナノグラム使用する。
反応の温度制御は次の通りとした。
98度５分→（98度10秒→50度15秒→72度ｙ秒）×ｚ回→72度５分
ｘ：x=1でDNAの増幅が認められないときは，xを10, および100としてPCRを行う。
ｙ：yは30以上で，PCRで生成するDNA断片の長さを500で割って60を掛けた値とする。
ｚ：z=25でDNAの増幅が認められないときは，30, および35としてPCRを行う。
【００６７】
M. jannaschii TyrRS遺伝子のクローニングと大量発現系の構築
すでに同定されているM. jannaschii TyrRS遺伝子配列 (GenBank ID:1591094)をもとに、PCRプライマーを設計し、遺伝子全長をM. jannaschiiゲノムDNAを鋳型にしてPCR法で増幅した。増幅した断片を発現ベクターpET-3a (Novagen) に組み込んだ。得られたプラスミド (pET-YRSと名づける) を、大腸菌マイナーコドン相補プラスミドpRARE (Novagen)を導入した大腸菌BL21 star(DE3) (Invitrogen) に導入し、大量発現系を構築した。
【００６８】
M. jannaschii TyrRSの精製
pET-YRSを形質転換した前記の大腸菌を100 μg/ml アンピシリンを含むLB培地2 l中で培養した。O.D.600が0.4〜0.6になった時点で、終濃度1 mMとなるようにイソプロピル-1-チオ-D-ガラクトピラノシド (IPTG) を添加し、TyrRSの発現を誘導した。発現誘導から3〜4時間後、集菌した。
得られた菌体に対して超音波破砕を行い、上清画分を分離した。それを80°Cで15分間熱処理することで大腸菌由来のタンパク質を変性、沈殿させ、上清画分を遠心によって分離した。得られた上清を、陰イオン交換カラムQ Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) およびアフィニティーカラムHiTrap Heparin HP (Amersham Biosciences) の二段階のカラムクロマトグラフィーにより、結晶化に適した純度まで精製した。培養液1 l当たり約30 mgの精製標品を得た。
【００６９】
M. jannaschii tRNATyrの調製
T7RNAポリメラーゼ転写反応でtRNATyrを試験管内合成する場合、古細菌のtRNATyrは5´末端がシチジン残基であるために、そのままでは転写量が少ない。そのため、tRNAをまずハンマーヘッドリボザイム融合体 (transzyme) としてT7RNAポリメラーゼで転写し、その後自己切断によってtRNATyrをつくることとした。tRNATyrコード領域の5´末端にハンマーヘッドリボザイムと、転写促進配列が付加した配列27をもつDNAを合成プライマーの貼り合わせでつくり、それをpUC119に導入した。大腸菌を形質転換後、プラスミドを大量に調製した。得られたプラスミドを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼ転写反応を行い、transzyme RNAを合成した。transzymeに対し、85°C 30秒と60°C 9分の温度サイクルを12〜14サイクル行うことで、ハンマーヘッドリボザイムの自己切断反応を促進した。その後、8 M尿素-15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、陰イオン交換カラムResource Q (Amersham Biosciences) によるカラムクロマトグラフィーでtRNATyrを精製、脱尿素し、結晶化に適した標品を得た。
【００７０】
TyrRS・tRNATyr・L-チロシン複合体の調製
精製されたtRNATyrは20 mM Tris-Cl (pH 7.5)、20 mM 塩化マグネシウム溶液に溶解し、80°Cで変性後、徐冷して高次構造を形成させた。精製されたTyrRS溶液は、Vivaspin 2 (Vivascience) を用いて限外ろ過法で20 mM Tris-Cl (pH 7.9)、20 mM 塩化マグネシウム、2 mM L-チロシン、10 mM 2-メルカプトエタノール溶液に溶液置換し、濃縮した。得られたTyrRS溶液とtRNA溶液を6〜8 mg/ml TyrRS、TyrRS:tRNATyr (モル比) =1:1.2になるように混合した。それを50°Cで10分間反応させることで複合体を形成させた。得られた溶液を結晶化用標品とした。
【００７１】
複合体の結晶化
前記で得られた複合体溶液1 μlに対して、等量の結晶化バッファー [30% (v/v) 1,6-ヘキサンジオール、50 mM 酢酸ナトリウム (pH 4.0)、200 mM 塩化アンモニウム、10 mM 塩化マグネシウム、1 mM 酢酸亜鉛] と混合し、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化を行った。レザーバー溶液は、結晶化バッファーの1,6-ヘキサンジオール濃度を35% (v/v) に変更したものを用いた。30°Cで1週間平衡化させることにより、六角両錘状の結晶が現れ、約3週間後には0.15×0.15×0.45 mmまで成長した (図１９)。
【００７２】
セレノメチオニン (SeMet) 標識TyrRS・tRNATyr・L-チロシン複合体の結晶化
プラスミドpET-YRSをメチオニン要求性大腸菌株B834(DE3) (Novagen) のcodon plusプラスミド (Stratagene) 保有株に導入した。得られた大腸菌を、セレノメチオニンを含むLeMaster培地（非特許文献６）で培養し、native TyrRSと同様に調製することで、結晶化に適した純度のSeMet標識TyrRSが得られた。結晶化はnativeの複合体における方法に準じるが、結晶化バッファーのpHが4.6の条件が最適であった。得られた結晶は図１９に示す。
【００７３】
X線回折データの収集とスケーリング
回折データの収集は、高輝度放射光施設SPring-8のビームラインBL41XUで行った。結晶は、抗凍結剤として30% (v/v) エチレングリコールを含む結晶化バッファーに浸した後、100 Kまで瞬間冷却した。100 Kに保ったまま、native、SeMet標識体とも振動角1°、露光時間2秒で回折データを収集した (図２０)。SeMet標識複合体については、位相決定に必須なSe原子の異常分散効果を強めるために、X線吸収微細構造 (XAFS) スペクトルを測定して、その吸収端波長 (0.9793Å（0.09793nm）) で回折データの測定を行った。測定されたXAFSスペクトルは図２１に示す。
全ての回折データはDENZO、SCALEPACKを用いて指数付け、スケーリングを行った。native、SeMet標識複合体ともに、結晶は空間群P3121に属していた。格子長は、nativeはa=b=86.8Å（8.68nm）、c=156Å（15.6nm）、SeMet標識体はa=b=87.2 Å（8.72nm）、c=157Å（15.7nm）であった。全データセットについての統計値は表１に示した。
【００７４】
【表１】
2006180701.tif 000005
【００７５】
位相計算とモデルの構築
SeMet標識複合体の初期位相は単波長異常分散 (SAD) 法を用いて解析した。SeMet標識複合体のスケーリングデータをもとに、プログラムSnBを用いて、直接法によりSe原子の初期座標を決定した。Collaborative Computational Project No.4 (CCP4) program suiteのMLPHAREを用いて、2.5Å（0.25nm） 分解能までのSe原子の座標の精密化と初期位相の計算を行った。プログラムRESOLVEを用いて2.1Å(0.21nm)までの位相の拡張と、溶媒平滑化およびヒストグラムマッチングによる電子密度の改良を行ったところ、明確に解釈可能な電子密度が得られた。異常分散に対する差フーリエ図を図２２に示す。
モデルの構築はプログラムOを用いて行った。構築した複合体のモデルはプログラムCNSを用いて、個々の原子の温度因子を精密化し、simulated annealingを繰り返すことで精密化した。全データのうち無作為に選んだ10%をクロスバリデーションのために精密化の対象から外している。
改善されたモデルは、native複合体の1.95Å(1.95×10-1nm)分解能までのデータに対して精密化し、さらに水分子をCNSで自動的に拾い、数ラウンドの精密化を行った。最後にマニュアルで水分子を拾い、最終的に分解能50Å（5nm）から1.95Å (1.95×10-1nm)までのR因子が18.8% (Rfree=23.9%) になるまで精密化を行った。
位相決定およびモデル精密化の際の統計値を表1に示した。決定した複合体の座標データおよび構造因子はProtein Data Bank (PDB) に登録されている (PDB ID: 1J1U)。
【００７６】
Asp286置換体およびtRNATyr G34C変異体の調製とアミノアシル化アッセイ
TyrRS変異体およびtRNATyr変異体の作成については、PCR法により変異導入を行い、遺伝子構築した。それぞれの調製については、野生型と同様に行った。
アミノアシル化反応は37°Cで行った。反応溶液の組成は、100 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、15 mM 塩化マグネシウム、0.05 mg/mlウシ血清アルブミン、1 mMジチオトレイトール、10 mM ATP、12 μM L-[14C]-チロシン溶液を用いた。反応溶液中の酵素濃度は10 nMもしくは100 nMとし、tRNA濃度を0.25〜64 μMに変化させたときの反応初速度をトリクロロ酢酸沈殿画分の放射活性の時間変化から求め、Lineweaver-Burkプロットにより、反応速度論定数を求めた。
【００７７】
TyrRS・tRNATyr・L-チロシン複合体の全体構造
M. jannaschii TyrRS・tRNATyr・L-チロシン複合体の結晶構造はSAD法を用いて解析し、最終的に1.95Å(1.95×10-1nm)分解能で、R因子が18.8% (Rfree=23.9%) になるまで精密化した。非対称単位には一つのTyrRSサブユニットとtRNATyr、チロシン分子が含まれていた。TyrRSはゲルろ過法で示唆されていた通り、ホモダイマーを形成しており、ホモダイマー中の二つのサブユニットは互いに二回対称軸で関連付けられている (図２３)。三重複合体の全体構造を図６に、チロシン結合部位付近の電子密度を図８に示す。tRNATyrとの複合体中のM. jannaschii TyrRSの立体構造は、一次配列上の類似性から予想されたとおり、ヒトmini-TyrRS単体の構造とよく重なり合い、主鎖の原子同士の平均二乗変位 (r.m.s.d.) は2.38Å(0.238nm)であった (図９ａ)。それに対して、M. jannaschii TyrRSと真正細菌であるB. stearothermophilus、S. aureus、およびT. thermophilus由来のTyrRSとは、一次構造と同様に類似性はより低く、それぞれに対するr.m.s.d.は5.08Å(0.508nm)、5.20Å(0.52nm)、4.13Å(0.413nm)であった (図９ｂ)。  M. jannaschii TyrRSのサブユニット（図７）は5つの領域に分けられる (図６)。短いN末端ドメインに続いてRossmannフォールドドメインがある (図６)。全てのTyrRSは、Rossmannフォールドを触媒ドメインとして持つクラスI aaRSに属する。決定された立体構造では、チロシン1分子がRossmannフォールドドメインに結合している (図６及び図８)。一般にクラスI aaRSのRossmannフォールドに挿入されているCP1 (connective-peptide 1) ドメインは、二量体形成に働いている。クラスIの保存配列であるKMSKSループはRossmannフォールドドメインとC末端ドメインをつないでいる。KMSKSループの一部 (残基203〜209) については、TyrRSの基質のひとつであるATPが結合した状態でないためか、ディスオーダーしている。
複合体のtRNATyrのヌクレオチド残基は3´末端以外は安定な構造をとっている。二つのtRNATyr分子はホモダイマーの二つのサブユニットにまたがっていて、tRNAのアクセプターステムは片方のサブユニットで、アンチコドンループはもう一方のサブユニットと相互作用している。M. jannaschii TyrRSはtRNAアクセプターステムを主溝側から認識している (図６)。真正細菌であるT. thermophilus由来のTyrRSでも同様の認識が見られる。しかし、それらはクラスII aaRSに特徴的なtRNA認識であり、他の構造決定されているクラスI aaRSは副溝側からアクセプターステムを認識する。
M. jannaschii複合体において、C末端ドメインはtRNAのアンチコドンと相互作用している (図６)。M. jannaschiiとT. thermophilusのTyrRSはいずれも同じ5´-GUA-3´のアンチコドンを認識するにもかかわらず、C末端ドメインの構造は異なっている。両者のTyrRSとtRNAの複合体の立体構造を重ね合わせてみると、M. jannaschiiでは、特徴的なβ-310-β構造がα11とα12 (T. thermophilusではα13とα14に対応) の間に挿入されている (図９ｂ, 図１０)。ヒトのTyrRSにもこのモチーフが存在する(図９ａ)。一方、T. thermophilus TyrRSはアンチコドン結合ドメインの後に、さらなるC末端ドメインをもっており、それが真正細菌に特徴的な長いバリアブルアームを認識している(図９ｂ)。T. thermophilus TyrRSに結合しているtRNAは、M. jannaschiiのものと比較して、約18°だけ二回軸まわりに回転して結合している (図１１)。
【００７８】
tRNAアクセプターステム認識
M. jannaschii tRNATyrにおいて、アクセプターステムのC1:G72塩基対はTyrRS・tRNATyrペアの直交性に最も重要な要素である。アクセプターステムはRossmannフォールドドメインとCP1ドメインによって認識されている (図１２)。G72の塩基部分はアクセプターステムの他の塩基平面と平行であるのに対し、C1の塩基はそれに対して約20°ねじれ、さらに20°傾いている (図１３)。このねじれた位置にあるC1塩基は、厳密に酵素によって認識されている。C1塩基の2位のカルボニル基と3位の窒素原子はArg174のグアニジノ基と水素結合し、4位のアミノ基はArg132によって捕捉された水分子と水素結合している。また、Met178の側鎖とも疎水的な相互作用をしている (図１３)。G72は主にLys175の側鎖のアミノ基によって認識されている。Arg132、Arg174、およびLys175は古細菌および真核生物由来TyrRSの間で高度に保存されている (図2)。C1の厳密な認識が、TyrRSにおけるC1:G72特異性の基盤と考えられる。事実、M. jannaschii TyrRSは、U1:A72塩基対に変換した酵母tRNATyr変異体を、野生型tRNATyrと比べて1/200の効率でしか認識しない（非特許文献１８）。A73もtRNATyrの強力なアイデンティティ決定因子であり、それをグアニンやウラシルに置換するとM. jannaschii TyrRSには認識されなくなる（非特許文献１８）。実際、その6位のアミノ基と1位の窒素原子はそれぞれVal195の主鎖のカルボニル基とアミノ基により認識されている (図１３)。そのほかには、Arg132がG71を、Thr126とGlu182がtRNAのリン酸骨格を認識している (図１２)。
それとは対照的に、T. thermophilus TyrRSでは、G1:C72が異なった様式で認識されている(図１４)。G1についてはあまり認識されておらず、C72がGlu154との1本の水素結合で認識されているのみである。M. jannaschii TyrRSには対応する部分にプロトンアクセプターはない (図１３)。さらに、M. jannaschii複合体ではヘリックスの軸から投げ出されていたA73塩基部分が、T. thermophilusではヘリックスの延長上にあるという違いが明らかとなった (図１３及び１４)。
このように、古細菌と真正細菌のTyrRSは、主鎖構造が似ているにもかかわらず、アクセプターステムを全く異なる残基で認識している。G1:C72塩基対をもつtRNAの場合、M. jannaschii TyrRSではG1の官能基がArg174側鎖から遠く離れ、しかもC72の4位のアミノ基と水素結合できるようなプロトンアクセプターがないために、認識されないと考えられる。実際、生化学的な解析もそれを支持している（非特許文献１８）。一方、T. thermophilusはC1:G72塩基対を認識しない。G72の7位の窒素原子の近傍にはプロトンドナーがないために、水素結合ができず、M. jannaschii TyrRSでArg174に対応する残基であるArg198は、A73とC1を同時に認識することができないためである (図１４)。以上の認識・識別のメカニズムの違いが、真正細菌TyrRS・tRNATyrペアと古細菌/真核生物TyrRS・tRNATyrペア間の直交性の源になっていると考えられる。
【００７９】
tRNAアンチコドン認識
M. jannaschii TyrRSにおいて、アンチコドンはC末端ドメインによって認識される (図６)。アンチコドンの1文字目のG34が引き出されて厳密に認識されている (図１５)。G34の塩基部分はPhe261とHis283の環の間にスタッキングし、さらに1位の窒素原子と2位のアミノ基は、共にAsp286と水素結合によって認識されている。実際に、D286A置換体ではアミノアシル化の速度が野生型の1/10以下になることが知られている。アンチコドンのほかの塩基はタンパク質とあまり塩基特異的な相互作用はせず、U35の3位の窒素原子がCys231の主鎖のカルボニル基と、そしてA36のリボースがLys288の側鎖およびLys228の主鎖と相互作用している程度である (図１５)。そのほかには、C28のリン酸基がLys228の側鎖と水素結合している。これらのことが、M. jannaschii TyrRSにおいて、アンチコドンの1文字目が他の塩基に比べてはるかに強く識別されている（非特許文献１８）理由であると考えられる。
Asp286は古細菌と真核生物のTyrRSにおいて高度に保存されており、β-310-βモチーフ (図１０) 上にあるPhe261に対応する芳香族残基と、His283に対応するヒスチジン残基もまたよく保存されている (図2)。例えば、ヒトTyrRSではTrp283、Asp308、His305がそれぞれM. jannaschii TyrRSのPhe261、Asp286、His283に一次配列の上で対応している (図2)。さらにヒトTyrRSの立体構造上のTrp286とAsp308側鎖の向きは、M. jannaschii TyrRSのPhe261とAsp286とほぼ同じである。酵母においても、tRNAのG34に変異を導入するとTyrRSによるアミノアシル化が低下することから、アンチコドンの一文字目を厳密に認識する機構は、古細菌と真核生物の間で保存されていると考えられる。
それに対して、T. thermophilus TyrRSはM. jannaschii TyrRSとは全く異なった機構でアンチコドンを認識している。まず、T. thermophilus TyrRS・tRNATyr複合体では、G34はA36にスタッキングしており、修飾塩基であるシュードウリジン残基35が反転している(図１６)。そして、G34は一次構造上M. jannaschii TyrRSのAsp286とは対応しないAsp259によってカルボニル基が認識されている (図２、 １６)。シュードウリジン残基35は主にAsp423によって認識されているが、その残基は真正細菌TyrRS特有のC末端ドメインに属しており、古細菌/真核生物のTyrRSでは対応する残基は存在しない (図２及び１６)。
【００８０】
立体構造に基づいたアンチコドン認識の改変
前記のように、M. jannaschii TyrRSのAsp286は、アンチコドンの1文字目であるG34を特異的に認識するための鍵となる残基である。そこで、tRNATyrのG34C変異体であるアンバーサプレッサーtRNAに対するアミノアシル化の効率を上げるために、286番の残基に変異を導入することとした。野生型TyrRSにおいてtRNAの34塩基目にシトシンがくる場合、G34と同じように塩基が反転した位置に来たとしても、Asp286と塩基との距離が離れすぎて満足な相互作用は得られないと考えられる。そこで、Asp286をより大きな側鎖である、Glu、Phe、Ile、Leu、Gln、Arg、Tyrに置換した変異体を作成し、アンバーサプレッサーtRNAに対するアミノアシル化の活性を測定した。比較的高いアンバーサプレッサーtRNA濃度で反応初速度を求めたところ、Gln、Arg、Tyr置換体について顕著な活性の向上がみられた。特に、D286Rでは野生型の8倍の初速度を示した (図１７)。
D286R変異体について、反応速度論定数を求めた。
【００８１】
【表２】
2006180701.tif 000006
【００８２】
表２において、野生型と変異体のＴｙｒＲＳについて、ミカエリス定数と、反応速度定数を示す。野生型TyrRSではアンバーサプレッサーtRNAに対するアミノアシル化活性は野生型tRNATyrと比べて約1/300であった。しかし、D286R変異体は、野生型tRNATyrと同程度アンバーサプレッサーtRNAをアミノアシル化することが明らかとなった。さらに、D286R変異体は野生型酵素よりも65倍もよくtRNAを認識することがわかった。その変異体ではアンバーサプレッサーtRNAに対するKmが主に低下しており、kcatはあまり変化していなかった。
以上のように、わずか1アミノ酸残基の置換によって、M. jannaschii TyrRSがアンバーサプレッサーtRNAをはるかに効率よくアミノアシル化するように改変することに成功した。部位特異的に非天然型アミノ酸をタンパク質に導入するためには、アンバーコドンに非天然型アミノ酸をコードさせることが現在のところ最も有効な手段である（非特許文献２−５、７、１０−１５）。これまでの野生型TyrRSによるアンバーサプレッサーtRNAのアミノアシル化は効率的ではなく、アンバーコドンの抑圧効率はアロプロテインの大量調製を目指すうえでは不十分であった。本発明で得られたD286R、D286Q、およびD286Y変異体はin vivoあるいはin vitroの系で抑圧効率を向上させることが期待される。それらの変異を、非天然型アミノ酸を特異的に認識するためのアミノ酸結合部位の変異と組み合わせることによって、大量のアロプロテインが生産できると考えられる。
【００８３】
TyrRSのアミノアシル化反応機構の解析
今回決定したM. jannaschii TyrRSと、すでに構造決定されていたT. thermophilus TyrRSはいずれも他のクラスI aaRSとは逆のtRNAアクセプターステム認識様式をとっていた。アミノ酸がtRNAのCCA末端のリボースにあるヒドロキシル基とエステル結合をつくる際に、一般的にクラスI aaRSはリボースの2´-OH基を、クラスII aaRSは3´-OH基をアミノアシル化するとされている。生化学的な解析では、酵母のtRNATyrは、3´-OH基と2´-OH基の両方がアミノアシル化されるが、主に3´-OH基よりも2´-OH基がアミノアシル化されるという報告がある。しかし、T. thermophilus、M. jannaschii TyrRSともに、立体構造中ではtRNAのCCA末端がディスオーダーしているため、どちらが本当の標的であるかの検証はできていない。今回得られた複合体の構造では、ATPを結合するKMSKSループとCCA末端がともにディスオーダーしていたことから、両者に何らかの関連があるのではないかと考えている。
【００８４】
Ｌ−チロシン認識
M. jannaschii TyrRSによるＬ−チロシン認識の構造についても有用な知見を得た。チロシンは、酵素にある深いチロシン結合ポケット（図４）に収容される。チロシン結合ポケットの入り口の近くに、チロシンのアミノ基とカルボニル基が、Ｇｌｎ１７３、Ｔｙｒ１５１及びＧｌｎ１５５で水素結合ネットワークを形成している（図４）。チロシンのフェニル環は、Ｌｅｕ６５、Ｈｉｓ７０、及びＧｌｎ１５５の側鎖により認識され、さらに、Ｉｌｅ３３、Ｇｌｙ３４、Ｐｈｅ３５の主鎖により認識される（チロシンの後ろ側、図には示さず）。チロシンの側鎖のヒドロキシル基は、ポケットの内部のＴｙｒ３２とＡｓｐ１５８で水素結合により認識される（図４）。水分子は、Ｈｉｓ１７７とＴｙｒ３２により水素結合で捕捉され、チロシンの側鎖にも近位である（図４）。チロシンフリーのヒトmini-ＴyｒＲＳも、このタイプのアミノ酸結合ポケットを有している。したがって、古細菌と真核生物のＴｙｒＲＳは保存されたチロシン結合部位を有している。
チロシン結合ポケットの残基も、細菌で良く保存されている。深いポケットを形成する残基の配置は、B.stearothermophilusとS.aureusＴｙｒＲＳ構造と類似している。M. jannaschiiでＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８、Ｇｌｎ１５５、Ｇｌｎ１７３、及びＴｙｒ１５１は、B.stearothermophilusでＴｙｒ３４、Ａｓｐ１７６、Ｇｌｎ１７３、Ｇｌｎ１９５、及びＴｙｒ１６９に対応する。これらの残基は、よく保存されて、２つのＴｙｒＲＳで、チロシン結合においてほぼ同じ役割を果たしている。T. thermophulusのＴｙｒＲＳは、チロシンのヒドロキシル基を認識するために、Ｔｙｒの代わりに例外的にＬｙｓを有しているが、チロシンとの水素結合の他の残基は保存されている。
しかしながら、ＴｙｒＲＳのチロシン結合部位の詳細は、古細菌／真核生物と細菌で異なっている。例えば、M.jannaschiiiＴｙｒＲＳのＨｉｓ７０とＨｉｓ１７７は、B.stearothermophilusＴｙｒＲＳには存在しない。さらに、チロシンと直接相互作用しない残基の配置は、M. jannaschiiとB.stearothermophilusで異なる。Ａｓｎ１２３の側鎖は、B.stearothermophilusＴｙｒＲＳのチロシンのヒドロキシル基から約４Å（0.4nm）であるが、M. jannaschiiのＴｙｒＲＳの対応する残基であるＧｌｕ１０７はチロシンから１３Å（1.3nm）離れている。
M. jannaschiiのＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性の改変は、すでにインビボスクリーニングシステムで成功している（非特許文献４、５、１１−１３、及び２４）。以前の実験で、置換の標的残基は、B.stearothermophilusのＴｙｒＲＳ結晶構造に基づいて選択された。しかしながら、上述したように、M. jannaschiiのＴｙｒＲＳの実際のチロシン結合部位は、いくらか異なっている。例えば、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを特異的に認識するＴｙｒＲＳ変異体は、４置換（Ｙ３２Ｑ、Ｅ１０７Ｔ、Ｄ１５８Ａ及びＬ１６２Ｐ）で作製された（非特許文献１１）。１つの構造によれば、Ｙ３２ＱとＤ１５８Ａ変異は、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン結合ポケットを形成するのに必要とされている。これに対して、Ｅ１０７ＴとＬ１６２Ｐ変異は、結合チロシンに近くないため、自然又は間接的に影響のある変異のいずれかのようである。B.stearothermophilusＴｙｒＲＳ構造に基づくM.janashiiiＴｙｒＲＳ構造のコンピューターシュミレーションは、Ｇｌｕ１０７とＬｅｕ１６２がチロシン結合部位から離れて位置していて、間接的にＬ−チロシンの排除に寄与することも示されている。こうして、図４に示した構造によれば、非天然型アミノ酸特異性をより有効に創出するためのアミノ酸結合部位の詳細についての新規な情報を得ることができる。
【００８５】
M. jannaschii TyrRS変異体の構造解析
本発明でアンバーサプレッサーtRNA (tRNATyrのC34G変異体) を効率よく認識するD286R変異体が得られた。この変異体は、サプレッサーtRNAに対するKmが低いので、そのtRNAとの共結晶化が可能であると考えられる。また、M. jannaschii TyrRSについては、様々な非天然型アミノ酸に対して、それぞれを特異的に認識する変異体が得られている（非特許文献４、５、１１−１３、及び２４）。今回決定された複合体の構造では、チロシン結合部位におけるチロシン側鎖の認識機構は、これまでに構造決定されていたB. stearothermophilus TyrRS ADDIN ENRfu 42と似ていることが明らかとなった。しかし、非天然型アミノ酸特異的なTyrRS変異体が、なぜ本来の基質であるチロシンを認識せず、非天然型アミノ酸を特異的に認識するのかは、その構造だけでは完全には説明できない。これらのtRNAやアミノ酸認識に対する改変体とそれぞれの基質の立体構造を決定することにより、人工遺伝暗号の拡張に向けたTyrRSの基質特異性の改変戦略についての新たな知見が得られると考えられる。
【００８６】
立体構造を利用したTyrRSの基質特異性の改変
M. jannaschii複合体の立体構造が決定されたことで、基質結合部位とtRNA結合部位の構造情報に基づいた改変が可能となる。特に、これまでは基質結合部位の構造を類推するためにB. stearothermophilus TyrRSの立体構造を用いていたが、細かい残基の配置が異なっていた。例えば、M. jannaschii TyrRSのGlu107は一次配列上、B. stearothermophilus TyrRSのAsn123に相当するが、B. stearothermophilus TyrRSでAsn123は基質のチロシンから約4Å(0.4nm)と近傍にあるのに対し、M. jannaschii TyrRSのGlu107はチロシンから約13Å(1.3nm)も離れている。今回の立体構造を利用することで、従来の非天然型アミノ酸を認識させるための改変よりも、より効率よく、かつ幅広いアミノ酸に対応した改変ができると期待される。
【００８７】
2006180701.tif 000007
2006180701.tif 000008
2006180701.tif 000009
2006180701.tif 000010
2006180701.tif 000011
2006180701.tif 000012
2006180701.tif 000013
2006180701.tif 000014
2006180701.tif 000015
2006180701.tif 000016
2006180701.tif 000017
2006180701.tif 000018
2006180701.tif 000019
2006180701.tif 000020
2006180701.tif 000021
2006180701.tif 000022
2006180701.tif 000023
2006180701.tif 000024
2006180701.tif 000025
2006180701.tif 000026
2006180701.tif 000027
2006180701.tif 000028
2006180701.tif 000029
2006180701.tif 000030
2006180701.tif 000031
2006180701.tif 000032
2006180701.tif 000033
2006180701.tif 000034
2006180701.tif 000035
2006180701.tif 000036
2006180701.tif 000037
2006180701.tif 000038
2006180701.tif 000039
2006180701.tif 000040
2006180701.tif 000041
2006180701.tif 000042
2006180701.tif 000043
2006180701.tif 000044
2006180701.tif 000045
2006180701.tif 000046
2006180701.tif 000047
2006180701.tif 000048
2006180701.tif 000049
2006180701.tif 000050
2006180701.tif 000051
2006180701.tif 000052
2006180701.tif 000053
2006180701.tif 000054
2006180701.tif 000055
2006180701.tif 000056
2006180701.tif 000057
2006180701.tif 000058
2006180701.tif 000059
2006180701.tif 000060
2006180701.tif 000061
2006180701.tif 000062
2006180701.tif 000063
2006180701.tif 000064
2006180701.tif 000065
2006180701.tif 000066
2006180701.tif 000067
2006180701.tif 000068
2006180701.tif 000069
2006180701.tif 000070
2006180701.tif 000071
2006180701.tif 000072
2006180701.tif 000073
2006180701.tif 000074
2006180701.tif 000075
2006180701.tif 000076
2006180701.tif 000077
2006180701.tif 000078
2006180701.tif 000079
2006180701.tif 000080
2006180701.tif 000081
2006180701.tif 000082
2006180701.tif 000083
2006180701.tif 000084
2006180701.tif 000085
2006180701.tif 000086
2006180701.tif 000087
2006180701.tif 000088
2006180701.tif 000089
2006180701.tif 000090
2006180701.tif 000091
2006180701.tif 000092
2006180701.tif 000093
2006180701.tif 000094
2006180701.tif 000095
2006180701.tif 000096
2006180701.tif 000097
2006180701.tif 000098
2006180701.tif 000099
2006180701.tif 000100
2006180701.tif 000101
2006180701.tif 000102
2006180701.tif 000103
2006180701.tif 000104
2006180701.tif 000105
2006180701.tif 000106
2006180701.tif 000107
2006180701.tif 000108
2006180701.tif 000109
2006180701.tif 000110
2006180701.tif 000111
2006180701.tif 000112
2006180701.tif 000113
2006180701.tif 000114
2006180701.tif 000115
2006180701.tif 000116
2006180701.tif 000117
2006180701.tif 000118
2006180701.tif 000119
2006180701.tif 000120
2006180701.tif 000121
2006180701.tif 000122
2006180701.tif 000123
2006180701.tif 000124
2006180701.tif 000125
2006180701.tif 000126
2006180701.tif 000127
2006180701.tif 000128
2006180701.tif 000129
2006180701.tif 000130
2006180701.tif 000131
2006180701.tif 000132
2006180701.tif 000133
2006180701.tif 000134
2006180701.tif 000135
2006180701.tif 000136
2006180701.tif 000137
2006180701.tif 000138
2006180701.tif 000139
2006180701.tif 000140
2006180701.tif 000141
2006180701.tif 000142
2006180701.tif 000143
2006180701.tif 000144
2006180701.tif 000145
2006180701.tif 000146
2006180701.tif 000147
2006180701.tif 000148
2006180701.tif 000149
2006180701.tif 000150
2006180701.tif 000151
2006180701.tif 000152
2006180701.tif 000153
2006180701.tif 000154
2006180701.tif 000155
2006180701.tif 000156
2006180701.tif 000157
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、M. jannaschii複合体の立体構造が決定され、この立体構造から基質認識及び結合部位である、チロシン結合ポケット及びアンチコドンＧ３４結合ポケットの構造が解明されたことで、基質結合部位とtRNA結合部位の構造情報に基づいた改変が可能となる。この改変は、古細菌はもちろん、古細菌と真核生物との類似性から、真核生物由来酵素を改変する際にも、有用な情報を提供し得る。
さらに、これまで基質となり得ることが知られていたチロシン誘導体だけでなく、任意のチロシン誘導体を基質とし得る変異ＴｙｒＲＳが得られる可能性があり、未知のアロポリペプチド生産の可能性を開くものである。
本発明により明らかにされた立体構造からM. jannaschiiのＴｙｒＲＳ改変のための置換位置を選択することは、これまで類似性の低いBacillus stearothermophilusの立体構造から推定した方法に比べて、より効果的かつ効率的である。本発明のチロシン結合ポケットの情報から得られる変異体は、チロシン誘導体に対する基質特異性が高められたものである。また、Ｇ３４結合ポケットの情報から得られる変異体は、アンバーサプレッサー効率が高められたものである。そして、これら２つの変異を併せ持つ変異体は、チロシン誘導体に対する基質特異性が高められ、かつ、アンバーサプレッサー効率が高められるものである。
これらの変異体は、古細菌又は真核生物由来のアンバーサプレッサーチロシンｔＲＮＡ、すなわち、アンバーコドンに相補するアンチコドンを有するチロシンｔＲＮＡの変異体と組み合わせて、インビボ又はインビトロの系で、所望の位置にチロシン誘導体を導入した非天然型アミノ酸組み込みポリペプチドの生産効率を挙げることができる。
【００８９】
【配列表】
2006180701.tif 000158
2006180701.tif 000159
2006180701.tif 000160
2006180701.tif 000161
2006180701.tif 000162
2006180701.tif 000163
2006180701.tif 000164
2006180701.tif 000165
【図面の簡単な説明】
【図１】  チロシンｔＲＮＡとＴｙｒＲＳの配列の比較を示すもので、チロシンｔＲＮＡ種の二次構造を示す図である。M.janaschiiとイーストのチロシンｔＲＮＡ配列は、転写体として示される。矢印で示す文字と枠で囲んだ領域は、各チロシンｔＲＮＡの同じアイデンティティエレメントを示す。
【図２】  ＴｙｒＲＳの配列アラインメントを示す図である。配列は順にＭethanococcus jannaschii、Archaeoglobus fulgidus、ヒト、酵母（細胞質）及びBacillus stearothermophillus、Thermus thermophilusである。M.jannaschiiとT.thermophilusＴｙｒＲＳの二次構造エレメントを、各々、アラインメントの上と下に示した。コイルはαへリックスであり、矢印はβストランドである。（色は図２と同じ）。緑の文字は、保存されている残基を示す。アラインメントは、CLUSTAL X(トンプソンら、Nucleic Acids Research、第２５巻、４８７６−４８８２頁、１９９７年)で行ない、M.jannaschiiとT.thermophilusの二次構造に基づき互いに修正した。
【図３】  プラスミドｐＭＹＲ−Ｌａｃ（Ａｍ）の構造を示す図である。ＭＪＹＲ１：M.jannaschiiサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片。ＰＥＹＲ：発現用プロモータを含む断片。ＬａｃＺ（ａｍｂ）：α−ｌａｃ（Ａｍ）を含むＤＮＡ断片。
【図４】  M.jannaschiiＴｙｒＲＳのチロシン結合ポケットを示す図である。黒はＯ、斜線はＮを表す。
【図５】  M.jannaschiiＴｙｒＲＳの、チロシンｔＲＮＡアンチコドンのＧ３４結合ポケットを示す図である。黒はＯ、斜線はＮを表す。
【図６】  M.jannaschiiＴｙｒＲＳ／チロシンｔＲＮＡ／チロシン複合体の構造を示す、リボンモデルのステレオ図である。２つのチロシン分子は、ＣＰＫモデルにより示される。チロシンｔＲＮＡ分子の残基２０３−２０９と３´末端ＣＣＡ鎖は、ディスオーダーされているので示されていない。
【図７】  １つのＴｙｒＲＳサブユニットの分子構造のステレオ図である。Ｃα位だけが示される。各２０番目の残基が、黒丸で示される。
【図８】  １．９５Å(1.95×10-1nm)解像度でのチロシン結合ポケットの周囲の｜ＦＯ−Ｆｃ｜シュミレーテッドアニーリングオミット電子密度図（３．０σ）のステレオ図である。
【図９】  ＴｙｒＲＳ・チロシンｔＲＮＡの全体構造を比較するもので、ａは、M. jannaschiiとヒトとを重ね合わせたステレオ図、ｂは、M. jannaschiiとT.thermophilusを重ね合わせたステレオ図である。
【図１０】  M.jannaschiiＴｙｒＲＳのＣ末端ドメイン中に挿入されたβ−３１０−βモチーフを示す図である。
【図１１】  図９ｂに相当するものを二回軸からみた重ね合わせを示す図である。
【図１２】  ＴｙｒＲＳのアクセプタ−ステム認識を示す図であって、M.jannaschiiＴｙｒＲＳのアクセプタ−ステム結合部位のステレオ図である。
【図１３】  M.jannaschii複合体のチロシンｔＲＮＡの最初の塩基対の周囲の概略図（ステレオ図）である。ｔＲＮＡをリボザイムの自己切断反応によって生成させたため、チロシンｔＲＮＡの５´末端のリン酸がない。各チロシンｔＲＮＡのヌクレオチド１、７２、７３がスティックモデルで示される。水素結合と他の相互作用は、破線で示す。リボンモデルでは、Ｎ末端領域Ｔ、ロスマンフォールドドメイン、ＣＰ１ドメインが示される。
【図１４】  T.thermophilusでの対応する図である。各チロシンｔＲＮＡのヌクレオチド１、７２、７３がスティックモデルで示される。水素結合と他の相互作用は、破線で示す。リボンモデルでは、Ｎ末端領域Ｔ、ロスマンフォールドドメイン、ＣＰ１ドメインが示される。
【図１５】  ＴｙｒＲＳのアンチコドン認識を示すもので、M.jannaschiiＴｙｒＲＳによるアンチコドン認識を示すステレオ図である。水素結合は破線で示される。アンチコドントリプレットは、スティックモデルで示される。Ｃ末端ドメインはリボンモデルで示される。
【図１６】  T.thermophilus複合体の対応図（ステレオ図）である。水素結合は破線で示される。アンチコドントリプレットは、スティックモデルで示される。Ｃ末端ドメインはリボンモデルで示される。
【図１７】  野生型と、いくつかの変異体によるアミノアシレーションの初期速度の比較を示すグラフである。
【図１８】  Ｌ−チロシンの側鎖を認識するＴｙｒＲＳのアミノ酸残基を示す（ステレオ図）もので、ａはM. jannaschii３重複合体のアミノ酸結合部位を示し、ｂは、B.stearothermophilus対応図である。M. jannaschiiの２つの残基、Glu107、Leu162は、各々、B.stearothermophilusのAsn123とLeu180に対応する。
【図１９】  ネイティブ（左）及びセレノメチオニン標識（右）ＴｙｒＲＳ・チロシンｔＲＮＡ・チロシン複合体の結晶の写真である
【図２０】  ネイティブ結晶の回折像である。矢印は１．９５Å(1.95×10-1nm)分解能に相当する。
【図２１】  セレノメチオニン標識複合体結晶のＳｅ原子のＸＡＦＳスペクトルを示す。回折データの測定は矢印で示すピーク波長で行なった。
【図２２】  セレノメチオニン標識複合体の異常分散差フーリエ図（４σカットオフ）である。セレノメチオニン側鎖をスティックモデル、ＴｙｒＲＳの主鎖はリボンモデルで示す。
【図２３】  ＴｙｒＲＳ・チロシンｔＲＮＡ複合体のクリスタルパッキング（ステレオ図）を示す図である。中央に、結晶学的対称でダイマー化した分子が見える。
【図２４】  M. jannaschiiのＴｙｒＲＳ変異体によって特異的に認識される非天然型のアミノ酸を示すもので、側鎖のみを示した図である。
【図２５】  M. jannaschiiのＴｙｒＲＳのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2006180701.tif 000166
【図２】
2006180701.tif 000167
【図３】
2006180701.tif 000168
【図４】
2006180701.tif 000169
【図５】
2006180701.tif 000170
【図６】
2006180701.tif 000171
【図７】
2006180701.tif 000172
【図８】
2006180701.tif 000173
【図９】
2006180701.tif 000174
【図１０】
2006180701.tif 000175
【図１１】
2006180701.tif 000176
【図１２】
2006180701.tif 000177
【図１３】
2006180701.tif 000178
【図１４】
2006180701.tif 000179
【図１５】
2006180701.tif 000180
【図１６】
2006180701.tif 000181
【図１７】
2006180701.tif 000182
【図１８】
2006180701.tif 000183
【図１９】
2006180701.tif 000184
【図２０】
2006180701.tif 000185
【図２１】
2006180701.tif 000186
【図２２】
2006180701.tif 000187
【図２３】
2006180701.tif 000188
【図２４】
2006180701.tif 000189
【図２５】
2006180701.tif 000190