(57)【要約】【課題】  スーパーオキシドアニオンは生体内で重要な役割を演じており，その定量は重要な分析テーマである。スーパーオキシドアニオンの分析法として化学発光試薬を用いる方法が広く使用されている。しかしながら，生体試料は夾雑物が多く，発光を吸収してしまうことが化学発光法の問題点として挙げられている。本発明の課題はスーパーオキシドアニオンと反応することにより，長波長に，しかも強い発光強度を発光する化学発光試薬を提供することにある。【解決手段】  スーパーオキシドアニオンと反応することにより発光するイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン類などと蛍光色素とをスペーサーを介して結合させた。そして，蛍光色素は，その励起スペクトルがイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン類の発光スペクトルと重なる色素としてローダミン類を選択し，スムーズな発光エネルギー共鳴移動を行なわせることで上記課題を解決した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2006126152.tif 000008
（式中，Ｄは化学発光することができ，Ａは蛍光を発することができ，Ａには少なくとも１以上の遊離スルホン酸あるいはスルホン酸塩を有し，ＳはＤとＡを連結するスペーサーを示す）で示され，Ｄがスーパーオキシドアニオンと反応した後の発光スペクトルとＡの励起スペクトルが重なり，Ａの蛍光が長波長であることを特徴とする新規化学発光試薬。
【請求項２】
Ｄがイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体，Ａが１以上の遊離スルホン酸あるいはスルホン酸塩を有するローダミン１２３，ローダミンＢ，ローダミン６Ｇ，ローダミン１９，ローダミン１１０，ローダミン５７５，あるいはスルホローダミン１０１から選択され，Ｓがアルキレン，アミド結合を有するアルキレン，アザアルキレン，アミド結合を有するアザアルキレン，ポリアザアルキレン，アミド結合を有するポリアザアルキレン，オキサアルキレン，アミド結合を有するオキサアルキレン，ポリオキサアルキレン，あるいはアミド結合を有するポリオキサアルキレンから選択される請求項１記載の新規化学発光試薬。
【請求項３】
Ｄがイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体，Ｓがアミド結合を有するアザアルキレン，Ａがスルホローダミン１０１である下記構造式
【化２】
2006126152.tif 000009
で示される請求項１記載の新規化学発光試薬。
【請求項４】
Ｄがイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体，Ｓがアミド結合を有するアザアルキレンで，Ａがスルホローダミン１０１である下記構造式
【化３】
2006126152.tif 000010
（Ｒはメトキシあるいは水素原子から選ばれる）で示される請求項１記載の新規化学発光試薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は新規化学発光試薬に関するもので，スーパーオキシドアニオンの分析に供するものである。さらに詳しくは，イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン類と長波長に蛍光を有する蛍光色素を適当なスペーサーで結合させた新規化学発光試薬で，分析化学の属する分野，臨床化学の属する分野，および他の分野において要求されているスーパーオキシドアニオンの分析に供するものである。
【背景技術】
【０００２】  スーパーオキシドアニオンは生体内に存在する活性酸素の一種で，解毒作用を始めとする種々の生理活性を有しており，生体内で重要な役割を演じている。その一方，このスーパーオキシドアニオンが生体内に過剰に存在すると正常細胞を破壊し，癌化，老化等を引き起こし，また，生活習慣病の原因物質の一つであることが知られている。そのため，このスーパーオキシドアニオンの検出，定量は，疾病の診断，疾病の研究と多方面で行なわれており，その高感度，簡便な分析手法の開発は重要な分析課題となっている。【０００３】  従来，スーパーオキシドアニオンの分析はＥＳＲ法，蛍光法，化学発光法などが用いられており，中でも化学発光法は簡便な方法として盛んに利用されている。化学発光試薬としては，下記構造式に示すＣＬＡ，ＭＣＬＡ，ＦＣＬＡが知られ，市販もされており，幅広く利用されている。【０００４】
【化１】
2006126152.tif 000003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかしながら，これら化学発光試薬から誘導される発光は，水溶液中，中性条件下ではＣＬＡ，ＭＣＬＡが青色で，ＦＣＬＡが緑色である。これらの発光波長では検体中の夾雑物の影響による消光や検体からの光透過性が低いという欠点を有している。さらに，これまでの化学発光試薬では誘導される発光波長の範囲が狭く，分析の多様化のためにはさらなる長波長域での発光，例えば，橙色，紅色，赤色の発光が可能な化学発光試薬が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  そこで，発明者は鋭意研究を重ねた結果，下記式【０００７】
【化２】
2006126152.tif 000004
【０００８】  （式中，Ｄは化学発光することができ，Ａは蛍光を発することができ，Ａには少なくとも１以上の遊離スルホン酸あるいはスルホン酸塩を有し，ＳはＤとＡを連結するスペーサーを示す）で示され，Ｄがスーパーオキシドアニオンと反応した後の発光スペクトルとＡの励起スペクトルが重なり，Ａの蛍光が長波長であることを特徴と新規化学発光試薬を開発した。すなわち，本発明に係る化学発光試薬はスーパーオキシドアニオンとの反応により励起されたＤ（ドナー分子）が発光を伴わず，その遷移エネルギーを近傍の蛍光団Ａ（アクセプター分子）に移動させ，アクセプター分子を発光させる発光共鳴エネルギー移動現象を利用したものである。このスムーズな共鳴エネルギー移動により長波長での発光と高い感度を達成したものである。【０００９】  本発明の代表的な例として下記構造式（１）で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体を取り上げ，その合成法を例示する。これは例示であり，これに限定されるものではない。【００１０】
【化３】
2006126152.tif 000005
【００１１】  上記構造式で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体は文献未載の新規化合物で，その合成法としては下記の例が挙げられる。【００１２】
【化４】
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【００１３】  第１工程は，スルホローダミン１０１クロリドとエチレンジアミンとを反応させる工程で，スルホローダミンクロリドは市販品あるいは独自に合成したものでもよく，位置異性体の混合物であっても異性体の一方のみでもよい。合成されたエチレンジアミンを導入したスルホローダミンは，位置異性体の混合物あるいは一方の異性体のみでもよい。第２工程は，第１工程で得られたエチレンジアミンを導入したスルホローダミンと公知の６−（４−カルバモイルプロピルオキシフェニル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（例えば，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９８；３０６：１７７−１８７）を縮合剤の存在下，反応させる工程である。得られる本発明化合物（１）は位置異性体の混合物あるいは一方の異性体のみでもよい。【００１４】  第１工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，ＴＨＦ，エーテルのごときハロゲン系溶媒，芳香族炭化水素，エーテル系溶媒，あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−７８℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは−２０℃から室温である。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度などにより異なるが，１分から１２時間の間で適宜選択される。なお，反応混合物に脱酸剤とトリエチルアミンのごとき塩基を添加しても，無添加でもよい。【００１５】  第２工程において使用しうる反応溶媒は四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ベンゼン，トルエン，キシレン，クロロベンゼン，ピリジン，ＤＦＭ，ＴＨＦ，エーテルのごとき溶媒，あるいはこれらの混合溶媒から適宜選択されるが，これに限定されるものではない。反応温度は−７８℃から溶媒の還流温度の間で選択されるが，好ましくは−２０℃から１００℃の間で選ばれる。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，ＤＣＣ，６−メチル−２−ニトロ安息香酸無水物などが挙げられるが，これに限定されるものではない。反応時間は使用する反応溶媒，反応温度，縮合剤などにより異なるが，１分から２４時間で適宜選択される。【００１６】  本発明化合物のその他の例として下記構造式（２）で示されるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体を挙げることができる。【００１７】
【化５】
2006126152.tif 000007
【００１８】  このローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（２）は，ローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）と同様にエチレンジアミンを導入したスルホローダミンと６−（４−メトキシフェニル）−２−（２−カルボキシエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンを脱水縮合することで得られる。【００１９】  以上のように本発明化合物（１）および（２）は簡便な操作で得ることができる。そして，（１）および（２）のイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンはスーパーオキシドアニオンと反応し，発光する。この発光スペクトルは近傍のローダミンの励起スペクトルと重なる。そのため，イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンは発光することなく，ローダミンを励起し，そして，ローダミンは強い蛍光を発する。この蛍光の極大波長は，およそ６１０ｎｍと長波長である。そのため，検体中に共存する夾雑物の影響を受け難く，精度よくスーパーオキシドアニオンの検出，定量が可能である。なお，スーパーオキシドアニオンと並び，生体内で重要な役割を演じている活性酸素である一重項酸素も同様に検出，定量がすることが可能である。【００２０】  スーパーオキシドアニオンの検出，定量は，検体に本発明化合物を混合し，誘導される発光強度を測定することで行なわれる。この際，発光拭薬の濃度は特に限定されず，分析系に影響を与えない濃度で行なわれる。また，必要に応じて緩衝剤，マスキング剤，界面活性剤を加えても，加えなくともよい。発光は，通常，室温で生じるが，必要に応じ，冷却しても加温してもよい。【００２１】  以下に参考例として本発明の代表例であるローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）を用いるスーパーオキシドアニオンの分析を例示し，本発明の有用性をさらに明らかにする。
【参考例１】
【００２２】  スーパーオキシドアニオンはヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させ，キサンチンを尿酸に変化させる過程で生じる。この系に実施例２で得たスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）を共存させ，スーパーオキシドアニオン検出の性能を明らかにする。また，従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬の中で最も発光波長が長く高い感度を有するＦＣＬＡと比較した。
【００２３】  ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ  ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（２，５ｘ１０−５Ｍ，４０μｌ）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．３７ｕｎｉｔ／ｍｌ，４０μｌ）を加え，アロカ社ルミネッセンスリーダーＢＬ２０１を用いて発光強度を測定した（発光波長による発光量の補正はせず）。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後，すぐに最高強度を示した。比較のためスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体に代えてＦＣＬＡを用いた。得られた相対発光強度はスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）が２５７であり，ＦＣＬＡは２００であった。
【参考例２】
【００２４】  ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（２、５ｘ１０−５Ｍ，４０μｌ）を加え，蛍光分光光度を用いて発光スペクトルを測定した（ただし，励起光は使用しない）。発光スペクトルは最大発光波長約６１０ｎｍを示した。発光スペクトルを図１に示した。
【参考例３】
【００２５】  ＫＣｌ（０．２Ｍ），ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ），３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍｌ）に２５℃で，ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ，０．５ｍｌ），スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）水溶液（最終濃度が２．４ｘ１０−７Ｍから１．８ｘ１０−５Ｍになるように加える）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．３７ｕｎｉｔ／ｍｌ，４０μｌ）を加え，アロカ社ルミネッセンスリーダーＢＬ２０１を用いてスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の各種濃度における発光強度を測定した。発光はキサンチンオキシダーゼ水溶液の添加後，すぐに最高強度を示した。比較のためスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の代わりに従来用いられているスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬のなかでもっとも発光波長が長く高い感度を有するＦＣＬＡも同様にして実験を行なった。得られた相対発光強度の結果を図２に示した。
【発明の効果】
【００２６】  以上のように，スーパーオキシドアニオンの分析において，本発明の代表例であるスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）は，従来の化学発光試薬よりも発光波長が長く，紅色〜赤色の発光を誘導する。スーパーオキシドアニオンと反応して発光する極大波長は約６１０ｎｍであり，効率的なスーパーオキシドアニオンの分析が可能である。また，その発光強度は従来から知られている化学発光試薬より強く，高感度での検出が可能である。従って，本発明は，従来の化学発光試薬を凌駕するスーパーオキシドアニオンの化学発光試薬である。
【実施例】
【００２７】  以下に好ましい実施例を示し，本発明の有用性をさらに明らかにする。この実施例は例示であり，これに限定されるものではない。細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００２８】  エチレンジアミン（１．０ｍｌ）を含むクロロホルム（１００ｍｌ）溶液に０℃でスルホローダミンクロリド［２−クロロスルホニル体と４−クロロスルホニル体の１：１の混合物］の位置異性体混合物（０．１ｇ）を加え，３０分後，減圧濃縮した。その後，メタノール（２０ｍｌ）を加え，再度減圧濃縮し，残さをメタノール−水の混合液で溶解し，イオン交換カラムに供し，水で不純物を溶出後，１Ｍアンモニア水を用いてスルホローダミンエチレンジアミン体を溶出した。溶出液を減圧濃縮，メタノールに溶解し，エチルエーテルを加えて粉体化し，青紫色の粉体を遠心分離により０．０７６ｇ得た。この粉体は，約１：１の位置異性体の混合物であった。
青紫色粉末
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．７−２．１（１６Ｈ，ｍ），２，４−３．８（４０Ｈ，ｍ），６．２８（２Ｈ，ｓ），６．５０（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２４，２９４１，１５９８，１４９７，１８００，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ−１
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε２４５００），２９７（ε１５３００），３６９（ε５５４０），４２４（ε２１００），５８４（ε８３８００）ｎｍ
【実施例２】
【００２９】  実施例１で得られたスルホローダミンエチレンジアミン体の異性体混合物（０．０３ｇ），６−［４−（３−カルバモイルプロピルオキシ）］−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（０．０１５ｇ），１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０２７ｇ）をピリジン（１．５ｍｌ）に溶解し，室温で４時間撹拌した。その後，減圧濃縮した。残さをメタノールに溶解し，シリカゲルカラムに供し，アセトニトリル−水の混合液を流し，スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン化合物［構造式（１）］の位置異性体混合物を溶出させた。溶出液を減圧濃縮し，メタノールに溶解し，アセトンを加え粉体化した後，遠心分離により紅青紫色の粉体としてスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−８−オン化合物［化学式（１），約１：１の混合物］を０．０１ｇを得た。
紅青紫色粉末
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，ＣＤ３ＯＤ−ＤＭＳＯ−ｄ６＝１０：１）１．８−３．６（６４Ｈ，ｍ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．４３（３Ｈ，ｓ），４．００（４Ｈ，ｍ），６．５４（２Ｈ，ｓ），６．５８（２Ｈ，ｓ），６．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）１７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．９０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），８．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｓ），８．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，７．９Ｈｚ）ｐｐｍ
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２３，２９４２，１５９６，１４９６，１２９８，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ−１
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε４７７００），３６９（ε１１８００），４２８（ε１００００），５８４（ε９９１００）ｎｍ
【実施例３】
【００３０】  実施例１で得られたスルホローダミンエチレンジアミン体の異性体混合物（０．０２ｇ），６−（３−メトキシフェニル）−２−（２−カルボキシエチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン，３−オン（０．０１２ｇ），１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．０１８ｇ）をピリジン（１．０ｍｌ）に溶解し，室温で２時間撹拌し，その後減圧濃縮した。残さをメタノールに溶解，逆相ＯＤＳカラムに供し，０．１％ＴＦＡ−メタノールと０．１％ＴＦＡ−水の混合液を流し，スルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（２）を溶出させた。溶出液を減圧濃縮し，青紫色の粉体０．０１ｇを得た。
青紫色粉末
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，２３℃，１．０％ＴＦＡ／Ｄ２Ｏ−ＤＭＳＯ−ｄ６＝１０：１）：１．７−２．０（ｍ），２．４−３．０（ｍ），３．３−３．８（ｍ），６．４４（２Ｈ，ｓ），７．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｓ），８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），８．２６（１Ｈ，ｓ），８．３７（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ．
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２３  ２９３９，１５９７，１４９７，１２９９，１１９８，１１０１，１０３５ｃｍ−１．
ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）：２６８（ε３９４００），３７０（ε９３２０），４３３（ε８０９０），５８７（ε８４８００）ｎｍ．
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】  実施例５で得られたスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）の発光スペクトルを示す図である。横軸は発光波長（ｎｍ）であり，縦軸は発光強度（Ｉｎｔ．）である。
【図２】  実施例７で得られたヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスルホローダミン結合型イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン誘導体（１）およびＦＣＬＡの濃度と発光強度の相関図である。横軸はそれぞれの化合物の濃度（μＭ）であり，縦軸は発光量（カウント／分）である。
【図１】
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【図２】
2006126152.tif 000012