(57)【要約】      （修正有）【課題】ダイオキシン類を従来よりも高いレベルで分解することができる微生物、およびその微生物を用いてダイオキシン類を分解する方法を提供する。【解決手段】河川底泥より単離された微生物Janibacter terrae TN22。この微生物を用いることにより、下記化学構造で表されるダイオキシン類のうち、二塩素化ジベンゾ−ｐ−ジオキシンの分解が可能となる。2006180774.tif 000007【選択図】図１
2006180774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン類分解能を有する微生物Janibacter terrae TN22。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物を用いることを特徴とする、下記化学構造のダイオキシン類のうち、二塩素化ジベンゾ-p-ジオキシンを分解する方法。
【化１】
2006180774.tif 000006
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイオキシン類分解能を有する新規微生物およびその微生物を用いたダイオキシン類分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類とは一般に、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (PCDD)、ポリ塩化ジベンゾフラン(PCDF)、およびコプラナーPCB(Co-PCB)の3種類の化合物の総称である。これらの3種類はいずれも類似の骨格をもち、この骨格に塩素が結合し、その置換位置と置換個数によってPCDDには75種、PCDFには135種、Co-PCBには12種の異性体がダイオキシン類として存在する。このうち、PCDDには、非常に毒性が高いことで知られる2,3,7,8-四塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(2,3,7,8-T4CDD)が含まれる。
【０００３】
ダイオキシン類には、発癌性、体重減少、胸腺萎縮、皮膚障害、肝障害、催奇形性などの強い毒性を持つ化合物もあり、生体内で正常に営まれているホルモン作用に重大な影響を与える内分泌撹乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）と位置付けられている。このダイオキシン類は、廃棄物の焼却処理などにより発生し、その化学的安定性により生体内で分解され難いことから、多くの生物の体内に吸収され、食物連鎖により最終的には生体内に蓄積されることが懸念されている。このように近年では、ダイオキシン類による環境汚染が重大な社会問題となってる。
【０００４】
ダイオキシン類を分解除去する技術としては、従来、燃焼炉分解法（たとえば、溶融固化処理法、加熱脱塩素化処理法、ペレット化焼成法）や、光分解法（たとえば、光触媒、UV法）、化学分解法（たとえば、超臨界水酸化法）などが報告されている（たとえば、非特許文献１を参照）。しかし、微量で広範囲にわたって汚染しているダイオキシン類の処理にはこれらの方法を適用するのは難しく、またコストが高いという問題がある。
【０００５】
近年、環境中に放出された汚染物質を除去する手段の一つとしてバイオレメディエーションが注目されている（たとえば、非特許文献１を参照）。バイオレメディエーションとは、微生物機能により環境汚染物質を最終的に炭酸ガス、水、無機塩などの無害物質にまで変換させて、汚染された環境を修復する技術である。バイオレメディエーションは、他のダイオキシン分解方法と比較し、生物を用いるため反応が常温、常圧で進みコストが安いこと、薬品を使用しないため二次汚染が少ないことなどの利点が挙げられる。バイオメディエーションには、汚染土壌にエネルギー源としての有機物、窒素、リン、酸素等を導入することで現場に生息している微生物を増殖させ、浄化活性を高めるバイオスティミュレーション(Biostimulation)と、汚染現場に微生物を導入して浄化するバイオオーギュメンテーション(Bioaugmentation)の2通りがある。
【０００６】
しかしながら、現在報告されているバイオレメディエーションによる分解能はダイオキシン類を十分なレベルで分解できるとはいい難く、さらなる開発が望まれている。
【非特許文献１】日科技連刊  土壌汚染対策技術(ISBN4-8171-9063-9)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ダイオキシン類を従来よりも高いレベルで分解することができる微生物、およびその微生物を用いてダイオキシン類を分解する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、ダイオキシン類分解能を有する微生物Janibacter terrae TN22を提供する。
【０００９】
また本発明は、微生物Janibacter terrae TN22を用いて、下記化学構造で表されるダイオキシン類のうち、二塩素化ジベンゾ−ｐ−ジオキシンを分解する方法をも提供する。
【００１０】
【化１】
2006180774.tif 000003
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、例えば水溶液中などにおいてダイオキシン類による汚染を浄化することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のダイオキシン類の分解方法は、下記化学構造のダイオキシン類のうち、二塩素化ジベンゾ-p-ジオキシンをその分解対象とする。
【００１３】
【化２】
2006180774.tif 000004
【００１４】
（式中、ｍ、ｎは０〜４の整数を示す。）
本発明の方法は、以下の菌学的性質を有する微生物Janibacter terrae TN22によって、上述したダイオキシン類を分解することをその特徴とするものである。
【００１５】
〔１〕形態学的性質（培養温度：25℃）
(1) 細胞形態：0.8×(0.9〜1.0)μmの短桿菌
(2) 胞子：陰性
(3) 運動性：陰性
(4) コロニー形態（培地：Nutrient agar、培養時間：48h）
・円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色
〔２〕生理学的性質
(1) 生育温度範囲
・37℃：陽性
・45℃：陰性
(2) グラム染色：陽性（グラム染色不定、KOHテスト陰性）
(3) オキシダーゼ活性：陰性
(4) ウレアーゼ活性1)：陰性
(5) β-ガラクトシターゼ活性1)：陰性
(6) アルギニンヒドロラーゼ活性1)：陰性
(7) カタラーゼ活性：陽性
(8) チトクロームオキシダーゼ活性1)：陰性
(9) 加水分解能
1.カゼイン：陽性
2.ゼラチン1)：陽性
3.Tween 80：陽性
4.チロシン：陰性
5.エスクリン1)：陰性
(10) グルコースの酸化1)：陰性
(11) グルコースからの酸生成：陰性
(12) H2S産生：陰性
(13) メラニン様色素産生：陽性
(14) インドール産生1)：陰性
(15) 硝酸塩還元1)：陽性
(16) 炭素源資化1)
1. ブドウ糖：陽性
2. Ｌ−アラビノース：陰性
3. Ｄ−マンノース：陰性
4. Ｄ−マンニトール：陰性
5. Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
6. マルトース：陽性
7. グルコン酸カリウム：陽性
8. ｎ−カプリン酸塩：陰性
9. アジピン酸塩：陰性
10. ｄｌ−リンゴ酸塩：陽性
11. クエン酸ナトリウム：陰性
12. 酢酸フェニル：陰性
(17) 発酵性試験 2)
1. グリセロール：陰性
2. エリスリトール：陰性
3. Ｄ−アラビノース：陰性
4. Ｌ−アラビノース：陰性
5. リボース：陰性
6. Ｄ−キシロース：陰性
7. Ｌ−キシロース：陰性
8. アドニトール：陰性
9. β−メチル−Ｄ−キシロース：陰性
10.ガラクトース：陰性
11. グルコース：陰性
12. フラクトース：陰性
13. マンノース：陰性
14. ソルボース：陰性
15. ラムノース：陰性
16. ズルシトール：陰性
17. イノシトール：陰性
18. マンニトール：陰性
19. ソルビトール：陰性
20. α−メチル−Ｄ−マンノース：陰性
21. α−メチル−Ｄ−グルコース：陰性
22. Ｎ−アセチルグルコサミン：陰性
23. アミグダリン：陰性
24. アルブチン：陰性
25. エスクリン：陽性
26. サリシン：陰性
27. セロビオース：陰性
28. マルトース：陰性
29. 乳酸：陰性
30. メリビオース：陰性
31. 白糖：陰性
32. トレハロース：陰性
33. イヌリン：陰性
34. メレチトース：陰性
35. ラフィノース：陰性
36. 澱粉：陰性
37. グリコーゲン：陰性
38. キシリトール：陰性
39. ゲンチオビオース：陰性
40. Ｄ−ツラノース：陰性
41. Ｄ−リキソース：陰性
42. Ｄ−タガトース：陰性
43. Ｄ−フコース：陰性
44. Ｌ−フコース：陰性
45. Ｄ−アラビトール：陰性
46. Ｌ−アラビトール：陰性
47. グルコネート：陰性
48. ２−ケトグルコン酸：陰性
49. ５−ケトグルコン酸
(18) 耐塩性（ＮａＣｌ）
・ 2.0%：陽性
・ 4.0%：陽性
・ 6.0%：陽性
・ 8.0%：反応弱
・10.0%：陰性
なお、上述の生理学的性質試験において、1)を付記した試験はAPI 20NE system(bioMerieux, Marcy l’Etoire, France)、2)を付記した試験はAPI 50CHB system(bioMerieux, Marcy l’Etoire, France)による。
【００１６】
〔３〕化学分類学的性質
（１）主要な呼吸鎖キノン：MK-8(H4)
（２）細胞壁脂肪酸組成
・iso-C16:0（42.5％）
・C17:1ω8c（11.1％）
・iso-C15:0（7.1％）
・C18:1ω9c（6.4％）
・anteiso-C17:0（6.2％）
〔４〕16S rRNA塩基配列
また、16S rRNA遺伝子解析を行った結果判明した16S rRNAのcDNAの塩基配列を配列表配列番号１に示す。16S rRNAの配列相同性検索結果で本発明の微生物は、Janibacter属細菌に99%の相同性を示した。Janibacter属は近年提唱された比較的新しい属の細菌で、現在J.limosusおよびJ.terrae（J.brevisを含む）の２種が知られているのみである。本発明の微生物の系統的な位置関係を明らかにするために系統樹を作成したところ、J.terraeに属する細菌であることが分かった。
【００１７】
以上の菌学的性質および16S rRNA解析結果から、この微生物はJanibacter terraeに属する新規の細菌株と判断し、TN22と命名して、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに寄託した（受領日：2004年12月14日、受領番号：NITE AP-50）。当該新規微生物は、河川底泥より単離されたものである。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００１９】
〔１〕ダイオキシン類分解能を有する微生物Janibacter terrae TN22の単離
55地点のサンプルからジベンゾフラン(DF)を唯一の炭素源として生育できる菌の単離を集積培養により試みた。資化菌の集積培養および単離は以下に示す方法を用いて行った。
【００２０】
(1) 55地点のサンプルについて、まず、炭素源を含まない無機塩液体培地（CFMM 組成は下記表１を参照）5mlにヘキサンに溶解させたDFを終濃度0.1%となるようにCFMMに加え、ヘキサンを蒸発させた。その後好気性条件で25℃、250rpmにて振とう培養を行った。
【００２１】
(2) 1週間毎に培養液の一部(50μl)を新しい培地に植え継ぎ、この作業を1ヶ月間繰り返した。
【００２２】
(3) 1ヶ月間集積培養したものを無機ゲランガム培地に塗布し、シャーレの蓋のところにDFを置くとともに、アセトンに溶解した2,3-ジハイドロオキシビフェニール、カテコール、3-メチルカテコール、4-メチルカテコールをサンプルに噴霧し培養した。
【００２３】
(4) メタ開裂酵素を持ち黄色に変色したサンプルを上述したDF含有液体CFMM培地に移し、生育を確認した。
【００２４】
(5) 単離した菌は10%グリセロールストックを行い、-80℃で保存した。
【００２５】
【表１】
2006180774.tif 000005
【００２６】
〔２〕ダイオキシン類の分解試験
(1) まず、CFMM培地に生育基質としてDF結晶を終濃度1g/lとなるように加え、TN22株を対数増殖期(OD660=0.8)まで培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体はリン酸緩衝液(50mM,pH=7.0)を用いて2回洗った後、同じ緩衝液に懸濁し、休止菌体の調整を行った。さらに、吸着したDFを取り除くために、反応基質を加える前に飢餓培養を2時間行った。
【００２７】
(2) ダイオシン類として1-一塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(1-CDD)、2-一塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(2-CDD)、2,7-二塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(2,7-DCDD)をN,N’-ジメチルホルムアミドに溶解し、上述したようにして調製したTN22株の休止菌体5mlに、終濃度10mg/lとなるように加えた。コントロールとしては、熱処理を行った菌体を用いた。
【００２８】
(3) 30℃、24時間の振とう培養後、酢酸エチルで抽出を行い、エバポレーターで濃縮後、GC-MS分析を行った。実験は3連で行った。
【００２９】
(4) 結果、24時間の培養で1-CDDを25%以上、2-CDDを40%以上、2,7-DCDDを9%分解した。これらを図１に示す。
【００３０】
今回開示された実施の形態、実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の微生物Janibacter terrae TN22のダイオキシン類の分解能を示すグラフである。
【図１】
2006180774.tif 000008
【配列表】
2006180774000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月24日(2005.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
以上の菌学的性質および16S rRNA解析結果から、この微生物はJanibacter terraeに属する新規の細菌株と判断し、TN22と命名して、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：2004年12月14日、受託番号：NITE P-50）。当該新規微生物は、河川底泥より単離されたものである。