(57)【要約】【課題】  ＤＮＡ鎖伸長の校正機能である3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有しかつプライマー伸長活性が強い高耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。【解決手段】  分子量がそれぞれ約70±7kDa、約144±14.4kDaである小サブユニットおよび大サブユニットからなり、大サブユニットがインテイン配列を含まないこと、85℃、1時間の加熱処理で少なくとも約50％の活性を保持し、90℃、1時間の加熱処理で少なくとも約20％の活性を保持すること、ならびにDNAポリメラーゼ活性および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする好熱性古細菌由来の耐熱性ヘテロダイマー酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、ならびにこの酵素の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小サブユニット及び大サブユニットからなり、かつ大サブユニットがインテイン配列を含む好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、大サブユニット中のインテイン配列を除去することを特徴とする、改良されたＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項２】
製造されるＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及びプライマー長依存性のプライマー伸長活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
好熱性古細菌がパイロコッカス属に属する古細菌であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
小サブユニットが配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、大サブユニットとダイマーを形成したとき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮するタンパク質である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
製造されるＤＮＡポリメラーゼの大サブユニットが配列番号２に示されるアミノ酸配列中、インテイン配列によりコードされるアミノ酸（９５５番目〜１１２０番目）を除去した配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、小サブユニットとダイマーを形成したとき、改良されたＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
以下のａ）〜ｃ）の工程を含むことを特徴とする、改良されたＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
ａ）請求項４に記載の小サブユニットをコードするＤＮＡと請求項５に記載の大サブユニットをコードするＤＮＡを、同一のまたはそれぞれ異なるベクターに組込む工程、
ｂ）得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る工程、
ｃ）該形質転換体を培養して、これらＤＮＡを共発現させ、培養物から、ＤＮＡポリメラーゼを採取する工程。
【請求項７】
宿主細胞が細菌であることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された性質を有するDNAポリメラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAポリメラーゼはDNAシークエンシング反応、遺伝子増幅反応(PCR反応)、DNAの放射活性標識、変異遺伝子の試験管内合成等に有用な酵素である。現在までに知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の共通性から、大きく４つのファミリーに分類することができる。その中で一般的に遺伝子操作実験用試薬として利用されているのは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩや好熱菌サーマスアクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）に代表されるファミリーＡ（ポルＩ型酵素）と、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼに代表されるファミリーＢ（α型酵素）に属するものである。
【０００３】
今までに至適温度の異なる種々のDNAポリメラーゼが細菌や動植物から発見されているが、多くが常温生物由来のため、耐熱性に乏しく、鋳型DNAの94℃以上での熱変性反応を含むPCR反応等には不適当であった。また、耐熱性DNAポリメラーゼとしてTaq DNAポリメラーゼ等の好熱性細菌由来の酵素が市販されているが、いずれも3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を欠くため、PCR反応等のポリメラーゼ反応中にエラーを誘発しやすく、PCR反応等には不向きである。
さらにまた、高耐熱性で3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を持つα型酵素が、パイロコッカスやサーモコッカス等の超好熱性古細菌より単離され市販されているが、プライマー伸長活性が弱く、長鎖DNAのPCR反応には適さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
高耐熱性で、ＤＮＡ鎖伸長の校正機能である3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつプライマー伸長活性が強いＤＮＡポリメラーゼを見出し、廉価で安定に供給することが強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、90〜100℃で生育する超好熱性古細菌に着目し、その遺伝子配列から本酵素活性を示すと推測される遺伝子を見出した。さらに、細菌を使ってその遺伝子から酵素を生産し、この酵素が85℃という高温でさえ比較的安定に存在しかつDNAポリメラーゼ活性を示すことを確認しさらに、ここで得られた遺伝子を、他の微生物に組み込み、活性の高い本酵素を多量に生産する方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）小サブユニット及び大サブユニットからなり、かつ大サブユニットがインテイン配列を含む好熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、大サブユニット中のインテイン配列を除去することを特徴とする、改良されたＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
（２）製造されるＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及びプライマー長依存性のプライマー伸長活性を有することを特徴とする、上記（１）に記載の製造方法。
（３）好熱性古細菌がパイロコッカス属に属する古細菌であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）  小サブユニットが配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、大サブユニットとダイマーを形成したとき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮するタンパク質である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）  製造されるＤＮＡポリメラーゼの大サブユニットが配列番号２に示されるアミノ酸配列中、インテイン配列によりコードされるアミノ酸（９５５番目〜１１２０番目）を除去した配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み、小サブユニットとダイマーを形成したとき、改良されたＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮するタンパク質であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）以下のａ）〜ｃ）の工程を含むことを特徴とする、改良されたＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
ａ）請求項４に記載の小サブユニットをコードするＤＮＡと請求項５に記載の大サブユニットをコードするＤＮＡを、同一のまたはそれぞれ異なるベクターに組込む工程、
ｂ）得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る工程、
ｃ）該形質転換体を培養して、これらＤＮＡを共発現させ、培養物から、ＤＮＡポリメラーゼを採取する工程。
（７）宿主細胞が細菌であることを特徴とする、上記（６）に記載の製造方法。
また、本発明は、第1の態様において、分子量がそれぞれ約70±7kDa、約144±14.4kDaである小サブユニットおよび大サブユニットからなり、大サブユニットがインテイン配列を含まないこと、85℃、1時間の加熱処理で少なくとも約50％の活性を保持し、90℃、1時間の加熱処理で少なくとも約20％の活性を保持すること、ならびにDNAポリメラーゼ活性および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする好熱性古細菌由来の耐熱性ヘテロダイマー酵素を提供する。
【０００７】
本発明の実施態様において、好熱性古細菌がパイロコッカス属に属する古細菌である。
本発明の別の実施態様において、該酵素はさらにプライマー長依存性のプライマー伸長活性を示す。
本発明の別の実施態様において、該酵素はさらに至適ｐHが約8.0〜約9.0である。
本発明の別の実施態様において、該酵素はさらに至適Mg2+濃度が約12mM以上である。
【０００８】
本発明は、第2の態様において、下記の性質
（1）DNAポリメラーゼ活性および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有すること；
（2）子量がそれぞれ約70±7kDa、約144±14.4kDaである小サブユニットおよび大サブユニットからなり、大サブユニットがインテイン配列を含まないこと；
（3）適ｐHが約8.0〜約9.0であること；
（4）至適Mg2+濃度が約12mM以上であること；
（5）85℃、1時間の加熱処理で少なくとも約50％の活性を保持し、90℃、1 時間の加熱処理で少なくとも約20％の活性を保持すること；および
（6）プライマー長依存性のプライマー伸長活性を示すこと
を有する耐熱性ヘテロダイマー酵素を提供する。
【０００９】
本発明の実施態様において、本発明の上記酵素類は好熱性古細菌、好ましくは硫黄代謝好熱性古細菌、例えばパイロコッカス属に属する古細菌由来である。
本発明の別の実施態様において、本発明の酵素の小サブユニットは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該アミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含みかつ前記大サブユニットとダイマーを形成したときに前記性質を発現するタンパク質である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明の酵素の大サブユニットは配列番号２に示されるアミノ酸配列中インテイン配列によりコードされるアミノ酸配列(955番目〜1120番目)を除去した配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含みかつ前記小サブユニットとダイマーを形成したときに前記性質を発現するタンパク質である。
【００１１】
本発明は、さらに第3の態様において、上記に定義したいずれかの酵素をコードするＤＮＡを提供する。
本発明は、さらに第4の態様において、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する小サブユニットをコードするＤＮＡおよび配列番号２に示されるアミノ酸配列中インテイン配列 (955番目〜1120番目)を除去した配列を有する大サブユニットをコードするＤＮＡを共発現可能に含む１つまたは２つからなる組換えベクターを提供する。
【００１２】
ここで「１つまたは２つからなる」とは、大および小サブユニットをコードするＤＮＡが共発現可能である限り、単一のベクターＤＮＡ中に両方の該ＤＮＡが挿入されていてもよいし、あるいは異なるベクター中に各々の該ＤＮＡが挿入されていてもよい、ことを意味する。
【００１３】
本発明の実施態様により、組換えベクターにおいて、小サブユニットをコードするＤＮＡは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有し、および大サブユニットをコードするＤＮＡは配列番号１に示されるヌクレオチド配列中インテイン配列をコードする配列(2863番目〜3360番目)を除去したヌクレオチド配列を有する。
【００１４】
本発明は、さらに第5の態様において、上記のいずれかの酵素の製造方法であって、上記定義のＤＮＡまたは組換え体ベクターで宿主細胞を形質転換すること、形質転換宿主細胞を培地中で培養し、小サブユニットをコードするＤＮＡと大サブユニットをコードするＤＮＡを共発現させること、および小サブユニットと大サブユニットから構成される該酵素を回収することを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明の実施態様において、宿主細胞は細菌である。
本明細書中「インテイン」とは、タンパク質性のイントロンを指す。また「プライマー長依存性のプライマー伸長活性」とは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素のプライマー伸長活性がプライマーの長さに依存して高まる傾向を指す。さらに、本明細書中で使用される「１もしくは数個の」とは、10個以下、好ましくは7個以下、より好ましくは5個以下を意味する。
【００１６】
本発明のベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド(例えばコスミド)、ウイルスなどの形態をとることができ、好ましくはプラスミドである。そして小サブユニットおよび/または大サブユニットをコードするＤＮＡは同一のまたは異なるベクターＤＮＡ、好ましくは同一のベクター上に存在することができる。あるいは、これらの大および小サブユニットをコードするＤＮＡは共発現可能なように宿主のゲノムに相同組換え法により組み込まれてもよく、この場合宿主はこれらのＤＮＡが由来する細菌またはその近縁種が好ましい。本発明の組換えベクターは通常、目的の２つのＤＮＡが共発現可能なように同一のまたは異なるプロモーターを含み得る。本明細書中「共発現可能」とは、宿主内で２つのＤＮＡが同時に発現されて、各ＤＮＡによってコードされるタンパク質が生成可能であることをいう。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、Long-PCR等に有用と考えられる、高温環境下で長鎖DNAを高速かつ正確に複製するDNAポリメラーゼが提供できる。また、本酵素を用いた遺伝子配列解析に関する新手法の開発が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明を具体的に説明する。
本発明の酵素は、上記の性質を有し、天然からまたは人工的に得ることができる。例えば、該酵素は超好熱性細菌、好ましくは好熱性古細菌、より好ましくは硫黄代謝好熱性古細菌から得ることができる。好熱性古細菌の例としてはパイロコッカス(Pyrococcus)属[例えばパイロコッカス・ホリコシ(P.horikoshii)、パイロコッカス・フリオサス(P. furiosus)、パイロコッカス・ウォーセイ(P. woesei)など]、サーモコッカス( Thermococcus)属[サーモコッカス・リトラリス(T. litoralis)、サーモコッカス・セラー(T. celer)、サーモコッカス・プロファンダス(T. profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(T. peptonopjilus)など]、ピロバキュラム(Pyrobaculum)属[ピロバキュラム・イスランジカム(P. islandicum)など]などを挙げることができる。あるいは、該酵素はＤＮＡ組換え技術を使用して作製してもよい。
【００１９】
本発明の酵素を得るための方法としては、該酵素を含むと考えられる上記のような細菌を適切な培地にて培養増殖した後、例えばホモジナイゼーションなどの細胞破壊によって培養細胞を破壊し、酵素精製のための一般的な手法を任意に組み合わせて使用して目的の酵素を得ることができる。このような手法の例として、塩析法、加熱処理、溶媒抽出法、溶媒沈殿法、限外濾過法、免疫化学的方法、カラムクロマトグラフィー法（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど）、HPLC、電気泳動法、等電点電気泳動法などを挙げることができる。これらの手法の具体的記述として、例えば日本生化学会編、新生化学実験講座１、タンパク質I、分離・精製・性質、1990年、東京化学同人を参照することができる。また細菌の培養は細菌の種類に応じて異なり既知の培養条件にて行うことができる。
例えば好熱性古細菌の場合、その多くは嫌気性菌であるため培養中に窒素ガスなどを連続的に通気するか、または流動パラフィンなどの物質を重層して空気を遮断しながら、約85〜100℃の温度で約1〜4日間、NaCl０〜４％の存在下でNaSO2,KCl,Na2SO4,KBr,H3BO3, MgCl2,CaCl2,SrCl2,NH4Cl,K2HPO4などの無機物,CH3COONa,トリプトン,酵母エキスなどの有機物,MnSO4,FeSO4,ZnSO4などの微量元素を含有する培地中で培養することができる（例えば公庄千寿ら、生化学72巻3号203〜206頁、2000年参照）。
【００２０】
あるいは、本発明酵素を得るための別法として、ＤＮＡ組換え技術を用いる方法を挙げることができる。超好熱性細菌の遺伝子配列から本酵素活性を示すと思われる遺伝子を、例えば該細菌由来のゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリーからスクリーニングして定法により目的のクローンを得るか、あるいは、適切なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって目的のＤＮＡを増幅した後、フェノール、クロロホルムなどの有機溶剤での処理やショ糖もしくはセシウムクロライド密度勾配遠心によりＤＮＡを調製、単離し、蛋白質発現用プラスミド(例えばpET11aまたはpET15b)などの適当なベクターに、該ＤＮＡが発現可能なように挿入し、そのプラスミドを適当な宿主(例えば大腸菌、枯草菌などの細菌類、場合により酵母、担子菌などの菌類)に導入し、該宿主の培養と通して本発明の酵素の生産を行うことができる。一般にベクターには、宿主に応じて選択可能なプロモーター、選択マーカーの他に、例えば複製起点、リボソーム結合部位（またはシャイン・ダルガルノ配列）、転写開始部位、ターミネーター、ポリリンカー（複数の制限酵素部位からなる配列）などが適宜含まれる。生産された目的の酵素は、上記の慣用の酵素精製手法を適宜組み合わせることによって単離・精製される。
【００２１】
本発明の酵素は、分子量約144±14.4kDaと約70±7kDaの二つのサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質で、ＤＮＡを鋳型として相補鎖を合成する活性と、3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性とを保持する、所謂ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに分類される酵素である。この酵素は500 mM NaClと10 mM MgCl2を含む50ｍトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中で85℃で1時間処理しても処理開始前の活性の少なくとも約50%を保持することから、比較的耐熱性であり、また、この酵素を用いてＤＮＡ鎖の伸長を行うときプライマー長が約15merでは伸長活性が認められず約30merを超えると伸長活性が認められ、プライマー長が増すにつれて伸長活性がより高まる傾向を示す、という独特の性質も有している。
【００２２】
本発明の酵素は、具体的には下記に示すようにパイロコッカス属細菌であるパイロコッカス・ホリコシ（特に理化学研究所に寄託された菌株JCM9974）由来のDNAを基にＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。しかしながら意外にも、DNA合成活性のある本発明酵素を調製しようとする場合、該酵素を構成する大サブユニットをコードするヌクレオチド配列からインテイン配列をコードする配列（例えば配列番号１の2863番目〜3360番目）を欠失させる必要があることが判明した。このようにして得られる酵素はしたがって、例えば配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する小サブユニットと、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列中インテイン配列によりコードされるアミノ酸配列(例えば955番目〜1120番目)を除去した配列を有する大サブユニットとのヘテロダイマーから構成される。もし大サブユニット中にインテイン配列が存在すると、たとえ小サブユニットとヘテロダイマーを形成しても非常に低いＤＮＡ合成活性しか示さない(後述の実施例11の表１参照)。このような低活性は、小サブユニットのみの場合、大サブユニットのみの場合、インテイン配列が除去された大サブユニットのみの場合にも認められる。したがって、本発明の酵素が実用的なＤＮＡ合成活性を示すためには、大サブユニットからインテイン配列(存在する場合)を除去する必要がある。
【００２３】
本発明には、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含むサブユニットタンパク質からなる酵素も包含される。このような置換、欠失または付加からなる変異操作は、例えば部位特異的変異誘発法、ＰＣＲ法などの当業者に周知される手法を用いて実施することができる。
本発明の酵素を合成するために使用されるＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、部位特異的変異誘発法などの具体的記述として、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はそれらの実施例に限定されないものとする。
＜実施例１＞  菌の培養
パイロコッカス・ホリコシ（理化学研究所受託番号JCM９９７４）は次の方法で培養した。
13.5ｇの食塩、4gのNa2SO4, 0.7 gのKCl, 0.2g のNaHCO3 、0.1gのKBr、30 mg のH3BO3、10gのMgCl2・6H2O、1.5g のCaCl2 、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを1Lに溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、JCM９９７４を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で２〜4日間培養し、その後遠心分離し集菌した。
【００２５】
＜実施例2＞  染色体ＤＮＡの調製
JCM9974の染色体DNAは以下の方法により調製した。
培養終了後5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を10mM  Tris(pH 7.5)- 1mM EDTA 溶液で２回洗浄後InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入する。このブロックを１％N-ラウロイルサルコシン（lauroylsarcosine）, 1mg/mlプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAはAgaroseブロック中に分離調製される。
【００２６】
＜実施例3＞  染色体DNAを含むライブラリークローンの作製
実施例2で得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIで部分分解後、アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断片を調製した。このDNA断片と制限酵素HindIIによって完全分解したBacベクターpBAC108L及びpFOS1とをT4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクターpBAC108Lを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合には結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold （ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBAC及びFosmidライブラリーとした。ライブラリーからJCM9974の染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行った。
【００２７】
＜実施例4＞  各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列決定
整列化されたBAC或いはFosmidクローンについて順次以下の方法で塩基配列を決定した。大腸菌より回収した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のDNA断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に挿入したショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン当たり500クローン作製した。各ショットガンクローンの塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列読み取り装置373または377を用いて決定した。各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定した。
【００２８】
＜実施例5＞  DNAポリメラーゼ遺伝子の同定
上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列の大型計算機による解析を行い、DNAポリメラーゼの大サブユニットをコードする遺伝子（図1）と小サブユニットをコードする遺伝子（図３）が同定された。
【００２９】
＜実施例6＞  小サブユニット発現プラスミドの構築
小サブユニット構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdeIとBamHI）サイトを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した：
上部プライマー: PolS1; 5'-TTTTGTCGACGTACATATGGATGAATTCGTAAAG-3'
（配列番号５；下線部はNdeIサイトを示す）；
下部プライマー: PolS2; 5'-TTTTGAGCTCTTTGGATCCTTAGAAGCTCCATCAGCACCACCT-3'
（配列番号６；下線部はBamHIサイトを示す）。
ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとBamHI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子を精製した。さらに、pET11a或いはpET15b（ともにNovagen社製）を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL1-BlueMRF1 （Stratagene社製）のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。
得られた発現プラスミドは各々pET11a/PolS或いはpET15b/PolSと略記された。構造遺伝子上にランダム変異がないことはDNA配列決定により確認された。
【００３０】
＜実施例7＞  完全長の大サブユニットを発現するためのプラスミドの構築
完全長の大サブユニット遺伝子を2段階でpGEMEX-1ベクター（プロメガ社製）にクローニングした。前半部のDNA断片は以下の二つのプライマーを用い、PCR法で得た：
上部プライマー: PolL1; 5'-CTCGACTTTAGCATATGGCTCTGATGGAGC-3'
（配列番号７；下線部はNdeIサイトを示す）；
下部プライマー: PolL2; 5'-GCTTGTCGACGCCATAAACTTTGACATTATCCATTGCGCGCTTAAGCAAC-3'
（配列番号８；下線部はSalIサイトを示す）。
このPCR産物をNdeIとSalIで完全消化した後、pGEMEX-1ベクターにクローニングし、pGEM/PolL1-2と略記した。
【００３１】
後半部のDNA断片は以下の二つのプライマーを用い、PCR法で得た：
上部プライマー: PolL3; 5'-TTTATGGCGTCGACAAGCTGAAGG-3'
（配列番号９；下線部はSalIサイトを示す）；
下部プライマー: PolL4; 5'-TATAACTTATGCATTGTGGTTATTTCGCTGAGAAG-3'
（配列番号10；下線部はNsiIサイトを示す）。
このPCR産物はSalIとNsiIで完全消化した後、先に調製したpGEM/PolL1-2にクローニングし、完全長の大サブユニット遺伝子を含むpGEM/PolLを得た。
【００３２】
＜実施例8＞  インテインを除去した大サブユニットを発現するためのプラスミドの構築
図2のようにパイロコッカス・ホリコシ(P. horikoshii)のDNAポリメラーゼの大サブユニット遺伝子の中には（蛋白質性のイントロンをコードする）インテインが一つ含まれるので、プライマーPolL3とPolL6（下記）を用いたPCR法でインテインの上流のDNA断片を増幅し、プライマーPolL5（下記）とPolL4を用いたPCR法でインテインの下流のDNA断片を増幅した。この２断片とプライマーPolL3とPolL4を用い、インテインの除かれたDNA断片をオーバーラップPCRで増幅した。次にこの産物を制限酵素SalIとNsiIで完全消化した後、先に調製したpGEM/PolL1-2にクローニングし、インテインの除かれた大サブユニット遺伝子を含むpGEM/PolL(-Intein)を得た。
PolL5: 5'-CACGCTGCAAAGAGGAGAAATTGCGATGGTGATGAAGATGCT-3'
（配列番号11）
PolL6: 5'-AGCATCTTCATCACCATCGCAATTTCTCCTCTTTGCAGCGTG-3'
（配列番号12）
【００３３】
＜実施例9＞  小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットを共発現するプラスミドの構築
目的のヘテロダイマーDNAポリメラーゼの安定した生産を図るために両サブユニットを共発現するプラスミドの構築を行った。まず、pET15b/PolSのBamHIサイトの直上流域に新しいマルチクローニングサイトを導入するためにプライマーPolS1とPolS3（下記）を用いPCR反応を行った。なお、下記のようにPolS3には5'-末端より順番にBamHI、NsiI、SalI、SacIIサイトがコードされている。PCR産物をNdeIとBamHI処理し、pET15bに挿入することにより、小サブユニットの終止コドンとBamHIサイトの間にマルチクローニングサイトを含むpET15b/PolS(M)を造成した。次に、pGEM/PolL(-Intein)を鋳型DNAとし、プライマーPolL7（下記）とPolL2を用いPCR反応を行った。得られた産物は新しいSacIIサイトを5'-末端にもち、pGEM/PolL(-Intein)のタンパク質発現ユニットのうち、リボソーム結合サイトからコード領域中のSalIサイトまでを含んでいる。これをSacIIとSalI処理し、pET15b/PolS(M)に造成されたマルチクローニングサイトに挿入した。このプラスミドはpET15b/PolSL1-2と略記される。さらに、pGEM/PolL(-Intein)をSalIとNsiI処理し、大サブユニットの後半部分の遺伝子（インテインを含まない）を単離し、これをpET15b/PolSL1-2のタンパク質発現ユニットの最後に残ったSalIとNsiIサイトに挿入した。得られたプラスミドはpET15b/PolSL(-Intein)と略記される。この発現プラスミドpET15b/PolSL(-Intein)によりアミノ末端にヒスチジンタグが付加した小サブユニットとインテインを含まない大サブユニットの共発現が可能になった。
PolS3: 5'-CGGGATCCATGCATGGTCGACACCGCGGTCAGCACCACCTACTAAAGTCGAG-3'
（配列番号13；下線部は5'-末端より順番にBamHI, NsiI, SalI, SacIIサイトを示す。）
PolL7: 5'-GGTGTCCGCGGCTCACTATAGGGAGACCAC-3'
（配列番号14；下線部はSacIIサイトを、太字はpGEMEX-1ベクターのリボソーム結合サイトを示す。）
【００３４】
＜実施例１０＞  組換え遺伝子の発現
大腸菌（E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL移した。その中に発現プラスミド溶液0.005ｍＬを加え氷中に30分間放置した後42℃でヒートショックを30秒間行い、ＳＯＣmedium  0.9mLを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。この形質転換体をE. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/ pET15b/PolSL(-Intein)と命名して工業技術院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目１の３)に平成12年4月14日に寄託し、受託番号FERM P-17816を与えられた。
得られた形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ培地（２リットル）で600ｎｍの吸収が1に達するまで培養した後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を加え30℃でさらに8時間培養した。培養後遠心分離（6,000ｒｐｍ，20分）により集菌した。
【００３５】
＜実施例１１＞  耐熱性酵素の精製
集菌した菌体を-20℃で凍結融解し、２倍量の10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）と1 mgのDNaseを加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を37℃で30分保温した後、10分間超音波照射した。さらに８５℃で30分加熱後、遠心分離(11,000 rpm、20分)し上澄液を得た。これを粗酵素液とした。次にこの粗酵素液をNi-カラム（Novagen,  His・Bind metal chelation resin &  His・Bind buffer kitを使用）に添加し、親和性クロマトグラフィーを行った。ここで得られた60mMイミダゾール溶出画分をセントリプレップ30(アミコン社)で100mMリン酸緩衝液(pH6.0)に置換した。さらに、これをHiTrap SP（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行った。
次に、各画分のSDS-電気泳動を行い、含まれるタンパク質の分子量を測定した。遺伝子配列より当該DNAポリメラーゼのサブユニットの分子量は約144,000 Daと約70,000 Daと予測されたので、この分子量のタンパク質を含む画分を集め、セントリプレップ30を用い50 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.0）へ置換した。これをさらに次の親和性クロマトグラフィーカラムであるHiTrap ヘパリン（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い精製酵素を得た。
【００３６】
＜実施例１２＞  酵素反応条件および酵素の性質
1.酵素反応条件
（１）PCR反応
目的のDNAポリメラーゼの活性検出のために、前記の２種のDNAオリゴマー（Upper primerとLower primer）と当該DNAポリメラーゼの小サブユニットをコードする発現ベクターpET15b/PolSを鋳型DNAとしてPCR反応を行った。反応温度条件は１サイクルが３ステップ（94℃：１分、61℃：２分、70℃：３分）からなり、３５サイクルを繰り返した。反応液組成(100 ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8）,10 mM KCl, 4 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.375 mM dNTP mix, 100 pmol Upper primer, 100 pmol Lower primer, 0.1 μg  DNAポリメラーゼであった。
【００３７】
（２）DNA合成反応
DNA合成反応はKornbergらの方法（Aposhian, H. V.と Kornberg, A., (1962) J. Biol. Chem., 237:519-525、およびKornberg, R. S., Zimmerman, B. S.と Kornberg, A., (1961) J. Biol. Chem., 236:  1487-1493）に従った。反応液組成(200 μl)は20 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8）,10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.25 mM dNTP mix,  0.37 Mbq の(α-32P) dATP, 20 μg の加熱急冷処理サケ精巣DNA, 0.1 μg の DNAポリメラーゼであった。反応は75℃で30分間行い、反応後これに0.5 mgの氷冷サケ精巣DNAを加え、500 μlの氷冷1N過塩素酸と500μlの氷冷水を添加し、酸不溶性画分を遠心分離（9000xg 5分間）で得た。この沈殿を300μlの0.2N NaOHに溶解し、再度300 μlの氷冷1 N過塩素酸と300 μlの氷冷水を加え、遠心分離で酸不溶性画分を得た。この沈殿を1 mlの1 N酢酸で洗浄し、遠心分離後沈殿を0.4 mlの2 Nアンモニア水に溶解し、この放射活性をCherenkov効果で液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。また、75℃の30分間の合成反応において10 nmolのdNTPを取り込む酵素量を1単位( Unit)と規定した。
【００３８】
（3）至適pH
至適pHは、上記測定条件における反応温度を75℃に固定し、酵素反応液のpHを、酸性域はリン酸緩衝液を、アルカリ域はトリス塩酸緩衝液を用いpH5.8から9.5まで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取り込みにより決定した。
（4）至適Mg2+濃度
至適Mg2+濃度は上記DNA合成反応で反応温度を75℃に固定し、MgSO4濃度を0 mMから20 mMまで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取り込みにより決定した。
【００３９】
（5）熱安定性
加熱処理用の酵素液(100 ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 、 25 ℃）, 500mM NaCl, 10 mM MgSO4と0.1 mg/ml濃度の目的酵素を含む。これをGeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) で60℃から95℃まで1時間加熱処理し、残存活性を上記DNA合成反応を用い、酸不溶性画分への放射活性の取り込みで測定した。
【００４０】
（6）プライマー伸長活性
プライマー伸長活性は以下のように測定した。M13ファージ一本鎖DNA(0.2mg)とこれに相補的な配列を有し、32P で5'-ラベル化された0.5 pmol のプライマー(15mer, 34mer, 50mer)を各々20 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.5)中でアニールさせ、10mM  MgCl2存在下、0.05 UnitのDNAポリメラーゼを加え、75℃で反応させた。反応は2分後、10分後に、反応停止(Stop)液を加えることで停止させた。反応産物は8M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析された。
【００４１】
（7）3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
32P で5'-ラベル化された50merのプライマー(0.5 pmol )を用いて3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を測定した。反応液は20ml反応液中に20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）、12mM MgCl2、4ngのラベル化DNAを含み、これに0.05  UnitのDNAポリメラーゼを加え、75℃で反応させた。反応は30分後に、Stop液を加えることで停止させた。反応産物は8M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析された。
【００４２】
2.酵素の諸性質
（１）タンパク質化学的性質
目的酵素の大サブユニットはインテイン除去前と除去後では各々1434アミノ酸残基と1268アミノ酸残基より構成され、その分子量は各々163,000 Daと144,000 Daであった。小サブユニットは623アミノ酸残基より構成され、その分子量は70,000 Daであった。
【００４３】
（２）小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットを共発現することによる活性型酵素の高効率発現
各サブユニットを単独発現させると極めて不安定で、安定的高発現は不可能である。そこで共発現系を構築することにした。これにより活性型酵素の高発現が可能になり、物理化学的性質の解析と熱安定化機構の解明を行うことができた。
【００４４】
（３）DNA合成活性の検出と PCR反応
大腸菌組み換え体からの粗酵素液を用いて、DNA合成活性を調べた。表１に示すように、サブユニット単独では活性は検出されなかった。また、小サブユニットとインテインが含まれた大サブユニットとの組み合わせでも非活性であった。
これらの結果より、小サブユニットとインテインが除去された大サブユニットからなるヘテロダイマー構造が活性発現に必須であることが明らかとなった。
【００４５】
さらに、小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットからなるヘテロダイマー酵素pET15b/PolSL(-Intein)を精製し、精製酵素(0.1μg)と10 mM MgSO4を用い、DNA合成活性を調べた。酵素添加系では非添加系に比べ175倍以上の放射活性の上昇を検出した。次に該精製酵素を用い、PCR反応を行った結果、目的DNAフラグメントと同じ長さ（1.9 kb）の増幅反応産物をアガロースゲル電気泳動で確認した。また、当該酵素を含まない反応系では PCR反応産物は検出されなかった。さらに、以上の事実より、小サブユニットとインテインが除去された大サブユニットからなる該ヘテロダイマーDNAポリメラーゼは十分活性であることが明らかになった。
【００４６】
【表１】
2006180886.tif 000002
【００４７】
（４）至適pH
75℃で至適pHは8.5であった（図4）。
（５）至適Mg2+濃度
本酵素の至適Mg2+濃度は12 mMであった（図5）。
（６）熱安定性
図6に示すように、本酵素は85℃、1時間の加熱処理でも50%の活性を保持していた。さらに、90℃、1時間の加熱処理でも20%の活性を有した。
【００４８】
（７）プライマー伸長活性
図7に示すように本酵素は15merプライマーでは伸長活性が検出されなかったが、プライマー長が34mer、50merと伸びるに従い、強いプライマー伸長活性が認められた。このようなプライマー伸長活性のプライマー長依存性は他のDNAポリメラーゼでは報告されていない。
【００４９】
（８）3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
図8に示すように本酵素は50merのオリゴヌクレオチドに対し強い3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示した。このことから本酵素は、分子量144kDaと70kDaの二つのサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質で、DNAを鋳型とし、相補鎖を合成し、3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を保持するDNA依存性DNAポリメラーゼであることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本酵素の大サブユニットの遺伝子配列（A）とアミノ酸配列（B）を示す。下線部は（蛋白質性のイントロンをコードする）インテイン配列を示す。
【図２】公知の超好熱菌由来ホモログ（Metha. jaおよびPy. furi由来）との併置によるインテイン配列の同定を示す。本酵素（Py. hori由来）のインテインは955番目のシステインから始まり1120番目のグルタミンで終わる。
【図３】本酵素の小サブユニットの遺伝子配列（A）とアミノ酸配列（B）を示す。
【図４】本酵素のpHプロフィール（至適pH）を示す。
【図５】本酵素の至適Mg2+濃度を示す。
【図６】本酵素の加熱処理後の残存活性を示す電気泳動写真である。
【図７】本酵素のプライマー伸長活性を示す電気泳動写真である。レーン１〜３は15merプライマーを、レーン４〜６は34merプライマーを、レーン7〜9は50merプライマーを使用した。レーン１、4、7は酵素存在下で2分反応させた。レーン2、5、8は酵素存在下で10分反応させた。レーン3、6、9はコントロールで酵素は反応系に加えられていない。
【図８】本酵素の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す。50merのオリゴヌクレオチドを基質として使用した。レーン1は酵素存在下での30分間反応を、レーン2はコントロールで酵素は反応系に加えられていない。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
配列番号１：蛋白質性イントロンをコードするインテイン。
配列番号２：インテイン。
配列番号４：プライマー。
配列番号５：プライマー。
配列番号６：プライマー。
配列番号７：プライマー。
配列番号８：プライマー。
配列番号９：プライマー。
配列番号１０：プライマー。
配列番号１１：プライマー。
配列番号１２：プライマー。
配列番号１３：プライマー。
配列番号１４：プライマー。
【図１】
2006180886.tif 000003
【図２】
2006180886.tif 000004
【図３】
2006180886.tif 000005
【図４】
2006180886.tif 000006
【図５】
2006180886.tif 000007
【図６】
2006180886.tif 000008
【図７】
2006180886.tif 000009
【図８】
2006180886.tif 000010
【配列表】
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