(57)【要約】【課題】Ａｎｔｒｏｄｉａｃ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａの人工培養についての費用効果的プロセスを開発すること。【解決手段】薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａｃ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な液体培地に接種して、第１培養物を生じさせること；（ｂ）工程（ａ）からの第１培養物を、該接種された分離株の更なる培養を可能にする第１期間及び第１の所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、増殖した菌糸体を有する第２培養物を得ること；および（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度よりも速い第２所定速度に設定される第２弾下院の攪拌へ供して、生理学的ストレス下に該分離株を供すること；を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａｃ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な液体培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）で培養された第１培養物を、該接種された分離株の更なる増殖を可能にする第１期間及び第１の所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、増殖した菌糸体を有する第２培養物を得ること；および
（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度よりも速い第２所定速度に設定される第２段階の攪拌に供して、該分離株を生理学的ストレス下に供すること；
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．５〜５．４の範囲のｐＨ値へ各々調整することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．６〜５．３の範囲のｐＨ値へ各々調整することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．７〜５．２の範囲のｐＨ値へ各々調整することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において使用される培地が、ポテトデキストロースブロス、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において使用される培地が、主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）において使用されるＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株がＣＣＲＣ  ９３００３２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３３）、ＣＣＲＣ  ３５３９６、ＣＣＲＣ  ３５３９８およびＣＣＲＣ３５７１６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）から得られる培養物が、腫瘍または癌細胞の増殖抑制活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８にいずれか１項に記載の方法から得られるプロダクト。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法から得られるプロダクトを含有する腫瘍又は癌疾患の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年３月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号１０／１１３，９０３からの優先権を主張し、この開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特に培養の間に攪拌速度および／またはｐＨ値を最適化することによる、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物からの薬理学的に活性な濾液の大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明はまた、一連の分画によって、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法に関する。本発明は、更に、医薬組成物の製造における上記組成物の使用に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
台湾で“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”または“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｋｕ”としても公知である、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ［（Ｚａｎｇ＆Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ＆Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、最近、子実体に見られる円柱形状のその担子胞子、弱いアミロイド骨格菌糸、苦味およびピリエート担子器果に逆向したライトシナモン、ならびに純粋な培養物中の厚膜胞子および分節型分生子（arthroconidia）を特徴とする新規の真菌として報告された。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの詳細な特徴付けおよび分類学的位置は、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ  ｓｐ．ｎｏｖ．ｏｎ  Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｋａｎｅｈｉｒａｉ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．９９（６）：７５６−７５８（１９９５）およびＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ（“ｎｉｕ−ｃｈａｎｇ−ｃｈｉｈ”），Ｎｅｗ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｆｕｎｇｕｓ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：２７３−２７５（１９９７）に記載され、この全開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００４】
台湾の民間薬において、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬(skin itches)および肝臓癌によって引き起こされる症状に対してある種の医療効果を有すると考えられている。しかし、厳しい宿主特異性および自然における珍しさのために、並びに人工培養の失敗のために、“niu-chang-chin”は、地元市場において非常に高価である。明らかに、大規模でのこの真菌の人工培養についての費用効果的プロセスを開発することに大きな産業的価値が存在する。
【０００５】
最近、本発明者らは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、液内発酵に供される場合、所望の薬理学的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。USSN09/566,834に開示されるように、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、天然培地（即ち、ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ））、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地において、小規模で、首尾よく培養された。得られた培養物は、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ座標系を使用して測定されるような赤色指数ａ≧３を有する深い暗赤色の色外観を呈し、これは、特定の腫瘍細胞株の増殖に対する有意な抑制効果と同時に起こることが示された。より重要なことには、腫瘍細胞へ作用する活性物質は、同定されていないが、真菌菌糸体から培養物の液相へ分泌されることが見出され、その結果、薬理学的に活性な組成物が、産業使用のために、培養物から容易に収穫され得る。
【０００６】
従って、このような有利な方法が、該真菌培養の大規模産生のために最適化されるならば、望ましいであろう。より好ましくは、粗濾液は、所望の活性に富んだ有用な組成物を得るために、所望の薬理学的活性について更に分画される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
広範な研究が、上述の産業要件を満たすために行われてきた。ここで、驚くべきことに、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの工業的規模の培養のために最適な条件が、特定の範囲内に特定のパラメータを注意深く設定することによって達成され得ることが見出された。この発明において、ｐＨ値および攪拌速度が、培養の間、非常に重要であることがわかった。
【０００８】
従って、本発明の第１局面は、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株(isolate)の菌糸体接種原(mycelial inoculum)を、該分離株の増殖に好適な培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）から培養された第１培養物を、該接種された分離株の更なる増殖を可能にする第１期間の間および第１所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、菌糸体を有する第２培養物増殖を得ること；および
（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度とは異なる第２所定速度に設定される第２段階の攪拌へ供して、生理学的ストレス下に該分離株を供すること、
を含む方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第２局面によれば、薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；および
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を、工程（ｂ）の間中、４．５〜５．４の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養すること、
を含む方法を提供することである。
【００１０】
好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、工程（ｂ）の間中、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００１１】
本発明はまた、所望の薬理学的活性（例えば、抗腫瘍活性）についてＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから分離される、一連の液体フラクションを得るための方法を提供する。従って、本発明の第３局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって薬理学的に活性な溶液を収穫(harvest)すること；および
（ｄ）工程（ｃ）からの溶液を処理して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１２】
好ましくは、得られる組成物は、約３ｋＤａ以下、より好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する。
【００１３】
本発明の第４局面は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって水溶液を収穫すること；
（ｄ）工程（ｃ）からの水溶液を処理して、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ること；および
（ｅ）工程（ｄ）からのフラクションを水非混和性相に通過させ、ここから薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む方法を提供することである。
【００１４】
上記工程（ｅ）からの水非混和性相は、好ましくは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相である。固定相は、薬理学的に活性なフラクションが得られるように、溶出される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、工程（ｅ）からの溶出液は、薬理学的活性を有する多数のフラクションを得るために、更に逆相分配クロマトグラフィー（例えば、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ））へ供される。
【００１６】
本発明は、更に、本発明の方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含む、癌または腫瘍疾患の処置のための医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、更に、癌または腫瘍疾患の処置が必要である患者における癌または腫瘍疾患の処置方法であって、本発明に従う方法のいずれか１つから得られるプロダクトを含有する組成物を該患者に処方することによる方法を提供する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、一般的に、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物からの薬理学的に活性なフラクションの大規模製造に好適である培養条件の確立に関する。本発明によれば、真菌Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、菌糸体状態でのその栄養増殖を維持しそしてその薬理学的活性を促進するに好適な液体培地において培養される。
【００１９】
用語“好適な培地”は、本明細書中で使用される場合、その薬理学的活性を維持しながらＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの増殖に好適な人工的環境を提供する任意の培地を指す。好ましくは、本発明に使用される培地は、菌糸体における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の産生を促進し、そして環境中へのその分泌を促進するに好適である。
【００２０】
本発明における使用に好適な培地としては、“ポテトデキストロースブロス”と呼ばれる天然培地、および主要炭素源としてフルクトースを含む任意の合成培地が挙げられる。ポテトデキストロースブロスは、例えば３００．０ｇの角切りポテト、２０．０ｇのデキストロースおよび１．０Ｌの蒸留水の混合物をオートクレーブすることによって実験室で調製され得るか、または市販源（例えば、ＤＩＦＣＯ）から購入され得る。最も好ましいのは、主要炭素源としてフルクトースを含む合成培地である。必要であれば、他の炭素源、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物およびその組み合わせが、補助として合成培地に含まれ得る。好ましくは、炭素源は、合成培地の総容量に基づいて、１．５〜２．５重量％、そしてより好ましくは１．５〜２重量％の範囲で存在する。
【００２１】
炭素源に加えて、合成培地は、窒素源、無機塩のような微量元素、および必要に応じてビタミンまたは他の増殖因子を含み得る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、イースト抽出物、ペプトン、トリプトン、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によれば、合成培地は、窒素源としてイースト抽出物を含有する。窒素源は、好ましくは、合成培地の総容量に基づいて、０．２〜２．０重量％の範囲で、そしてより好ましくは０．５重量％の量で存在する。
【００２２】
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの任意の利用可能な分離株が、使用される微生物が検出可能な量の薬理学的に活性な代謝物を産生する能力を保有する限り、本発明に従う培養方法において使用され得る。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの有用な分離株としては、ＣＣＲＣ  ３５３９６（１９９４年１２月１日に、ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）のｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＲＣ），Ｈｓｉｎｃｈｕ，  Ｔａｉｗａｎ，  Ｒ．Ｏ．Ｃ．に寄託された）、３５３９８（１９９４年１２月１日）、３５７１６（２０００年５月３日）、３６４０１（２０００年１月２７日）、３６７９５（２０００年１月２７日）および９３００３２（２０００年１月２７日）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２（これはまた、特許手続のために、受託番号ＰＴＡ−１２３３で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＡＴＣＣ）に寄託されている）が、培養濾液の調製のために使用された。
【００２３】
腫瘍細胞の増殖を抑制することにおける能力を評価するために、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液およびそのフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイに供した。
【００２４】
“ＭＴＴ−テトラゾリウムアッセイ”としても公知である用語“ＭＴＴ比色分析アッセイ”は、本明細書で使用される場合、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔによって１９８０年代に確立された抗癌薬スクリーニングスキームを指す（例えば、Alley,M.C.ら、Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.Cancer Res.48:589-601,1988;Scudiero,D. A.ら、Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res.48:4827-4833,1988;Vistica,D.T.ら、Tetrazolium-based assays for cellular viability:a critical examination of selected parameters affecting formazan.Cancer Res.51:2515-2520,1991；およびMonks, A.ら、Feasibility of a high-flux anticancer drug
screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83:757-766,1991を参照のこと）。
【００２５】
アッセイにおいて、植物または微生物から（この場合、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａから）誘導される潜在的な抗癌薬物または天然産物を、各々がヒト悪性腫瘍の主要な臨床的カテゴリーを示す細胞株パネルのグループに対する能力について試験した。１ウェル当たりの生存細胞数は、ホルマザンの産生に直接比例し、これは可溶化による分光光度法で測定され得る。原則として、生物学的に活性な物質または該物質を含有する天然産物は、細胞増殖を抑制または停止さえし得、そして結果としてほとんどホルマザンが形成されない。
【００２６】
ＭＴＴ比色分析アッセイを使用して、真菌培養において重要なパラメータ、即ち攪拌速度およびｐＨ値を、培養時間にわたってＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの薬理学的活性に対するそれらの効果について評価した。
【００２７】
実験の第１セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物を二重にして、それぞれ２つの異なる過程の攪拌を経験させる。ここで、一方の過程は、真菌に一定のしかし激しい攪拌を与えるように行われ、そして他方は、穏やかから激しい２段階攪拌に関する。比較において、本発明に従う２段階攪拌は、薬理学的活性の早期生成を生じる。より早い段階での穏やかな攪拌は、接種された真菌の栄養増殖（nutritious growth）を可能にするために与えられ、その結果、菌糸体が増殖された培養物得られ得る。培養の終わりに収穫される増大されたサイズの菌糸体ペレットは、穏やかな攪拌段階での成功を示す。穏やかから激しい攪拌速度の移行のための適当なタイミングは、選択される真菌分離株に依存して、広範に変化し得る。通常、真菌分離株が培養物の最終容量に基づいて１０％ｖ／ｖで接種される場合、穏やかな攪拌は約３日間（即ち、約７２時間）続き、そしてその後攪拌速度が上昇される。より遅い段階での激しい攪拌は、生理学的ストレス下に真菌を置くために提供される。このようなストレス下で、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、構成的様式で発現されない二次代謝物の産生を促進することを含む、応答における複数の生理学的変化を経る。薬理学的活性のいくつかの真菌分子は、この方法によって“ストレスアウト（stressed out）”され得ると考えられる。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａへ生理学的ストレスを与えるために適用可能な他の培養パラメータ（例えば、曝気速度、栄養改変および熱的ストレス）がまた、単独でまたは本発明に従う攪拌速度のパラメータと組み合わせて使用され得る。好適な攪拌速度は、上述のように経験的に決定され得るか、または例えばPauline M.Doranにより編集され、Academic Press Ltd.により出版されたBioprocess Engineering Principles、(1995)、p.150-151に記載される式に従って、以下に提供される実験に基づいて、概算され得る。いくつかの場合において、2段階攪拌が好適に適用される場合、真菌培養物は、第６日に赤くなるようである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、３Ｌの培地が予めロードされた５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）において行われ、ここで攪拌は、最初、約３００ｒｐｍ以下、好ましくは約２００ｒｐｍ以下の速度で設定され、そしてその後約４００ｒｐｍ以上、好ましくは約５００ｒｐｍ以上の速度へ上昇された。本発明の別の好ましい実施形態において、２段階攪拌は、１６０Ｌの培地が予めロードされた２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）において行われ、ここで攪拌速度は、最初、約４０ｒｐｍに設定され、そしてその後約１５０ｒｐｍへ上昇された。
【００２９】
実験の第２セットにおいて、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物が三重にされ(triplicated)、そしてそれぞれ、培養の全期間にわたって、３つの異なる間隔で調整されたｐＨ値で培養される。比較において、ｐＨ４．５〜５．４で行われる培養は、薬理学的活性の早期産生を生じることがわかる。好ましくは、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ値は、培養の全期間にわたって、４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２の範囲内に調節される。
【００３０】
上述のような攪拌およびｐＨ値に関する有用なパラメータを利用して、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養方法が、真菌から誘導される所望の薬理学的活性を維持しながら、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされる。
【００３１】
本発明の方法によれば、種々の産業用途に利用可能なＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａからの薬理学的に活性な濾液が、経済的、効率的および時間節約的な様式で得られ得る。
【００３２】
本発明はまた、有効な精製方法の確立に関し、これによって、薬理学的に活性な物質に富むものの新規の組成物が、種々の医療用途に利用可能である。本発明によれば、該精製方法は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの粗濾液を選択的に分離して、約１０ｋＤａ以下、好ましくは約３ｋＤａ以下、そしてより好ましくは約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ることによって行われる。該分離方法は、分子量に基づいて分子を分離し得る任意の慣用方法（即ち、モレキュラーシーブとして作用する）によって行われ得る、この例としては、ゲル濾過、密度勾配精製、限外濾過、超遠心分離および当該分野において公知の方法が挙げられる。
【００３３】
本発明によれば、約１ｋＤａ以下の分子量を有する分子を含有するフラクションは、更に極性に基づいて分画されて、水非混和性相を得、ここから薬理学的に活性なフラクションが得られる。水非混和性相は、水と非混和性の有機相または不溶性固相であり得る。本発明の好ましい実施形態において、≦１ｋＤａフラクションは、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相を通過される。引き続いて、固定相は、所望の薬理学的活性を有するフラクションを得るために溶出される。手短に言えば、固定相は、≦１ｋＤａフラクションから、所望の薬理学的に活性な物質を恐らく含有する疎水性溶質を選択的に吸着しそして濃縮し、その結果、通過物（flow through）に存在する不活性な物質が容易に除去され得る。固定相に含まれる好適な吸着剤は、移動相から疎水性物質を捕獲するように適応された官能基を備える任意の吸着剤であり得る。吸着剤の例は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）およびその等価物である。分画は、吸着剤の表面上に保持される薬理学的に活性な物質の量が十分である限り、任意の慣用様式によって、例えば１バッチの吸着剤と共に≦１ｋＤａフラクションをインキュベートすること、または吸着剤が充填されたクロマトグラフィーカラムに≦１ｋＤａフラクションを通過させることによって行われ得る。固定相から結合された物質を溶出するために好適な溶出液は、当業者に周知であり、そして従って当業者によって容易に選択され得る。好ましくは、溶出液は、水よりも低い極性、そしてより好ましくはメタノールよりも低い極性を有する有機溶媒である。最も好ましい溶出液としては、酢酸エチルおよびエタノールが挙げられる。
【００３４】
所望の薬理学的活性を示す溶出液は、いくつかの他の物理学的、化学的または生物学的特徴に基づいて、更なる精製手順に供され得る。本発明の好ましい実施形態において、溶出液は、更に疎水性の度合いに基づいて分離され、そしてより好ましくは、分離は、例えばＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ）などにおいて行われる。このように得られる多数のフラクションは、薬理学的に活性であるとわかる。
【００３５】
上記知見は、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａにおける薬理学的活性は、主に１ｋＤａ以下の分子量を有する疎水性化合物から誘導されることを強く示唆する。これは、５００〜２，０００ｋＤａの平均分子量を有する多糖類が、キノコによって保有される抗腫瘍活性の主要源とみなす（Ｍｉｚｕｎｏら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ−ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｖ．Ｉｎｔｌ．１１（１）：２３−６１）、以前の仮説に反する。Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、トリテルペノイド、フラビノイド（flavinoids）、フラボノイド、ステロイド、セスキテルペンラクトン、ならびにフェニルおよびビフェニル化合物のような、低分子量物質に富むと報告される(Chang、前出；Cherngら、Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Pytochem. 41(1) :263-267(1996);Chiangら、A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem.39(1):613-616(1995)；およびYangら、Steroids and Triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum.Pytochem.41(5):1389-1392 (1996))が、これらの物質と真菌種の薬理学的活性とを結びつける教示は報告されていない。
【００３６】
本発明に従う精製方法は、活性物質が濃縮されそして不活性物質が広範に除去されている多数の組成物を提供する。組成物は、明らかに、ヒトまたは動物の被験体に対して増強された薬理学的効果を有し、そして従って種々の産業応用（例えば、医薬組成物または栄養補助剤の製造）に好適である。従って、本発明はまた、このような処置の必要があるヒトまたは動物患者における疾患（特に癌または腫瘍疾患）を処置するための医薬としての、または例えば食品、飲料および／または飼料の形態で処方される栄養補助剤としての、新規の組成物の使用に関する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態に従って、以下の態様の発明が提供される。
項１．  薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種して、第１培養物を生じさせること；
（ｂ）工程（ａ）から培養された第１培養物を、該接種された分離株の更なる増殖を可能にする第１期間の間および第１の所定速度に設定される第１段階の攪拌に供して、菌糸体を有する第２培養物増殖を得ること；および
（ｃ）工程（ｂ）から得られた第２培養物を、第１所定速度とは異なる第２所定速度に設定される第２段階の攪拌へ供して、生理学的ストレス下に該分離株を供すること、
を含む、方法。
項２．  前記第２所定速度が前記第１所定速度よりも速い、項１に記載の方法。
項３．  工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．５〜５．４の範囲のｐＨ値へ調節することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、項１に記載の方法。
項４．  工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．６〜５．３の範囲のｐＨ値へ調節することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、項３に記載の方法。
項５．  工程（ａ）からの第１培養物および工程（ｂ）からの第２培養物が、４．７〜５．２の範囲のｐＨ値へ調節することによって工程（ｂ）および工程（ｃ）において培養される、項４に記載の方法。
項６．  前記培地が、ポテトデキストロースブロス、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地からなる群から選択される、項１に記載の方法。
項７．  前記培地が主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地である、項６に記載の方法。
項８．  前記分離株が、ＣＣＲＣ ９３００３２（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１２３３）、ＣＣＲＣ 
３５３９６、３５３９８、３５７１６、３６４０１および３６７９５からなる群から選択される、項１に記載の方法。
項９．  薬理学的活性を有するＡｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物の製造方法であって、
（ａ）Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；および
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を、工程（ｂ）の間中、４．５〜５．４の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養すること、
を含む、方法。
項１０．  工程（ａ）からの培養物を、工程（ｂ）の間中、４．６〜５．３の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養する、項９に記載の方法。
項１１．  工程（ａ）からの培養物を、工程（ｂ）の間中、４．７〜５．２の範囲へ該培養物のｐＨ値を調節することによって培養する、項１０に記載の方法。
項１２．  前記培地が、ポテトデキストロースブロス、および主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地からなる群から選択される、項９に記載の方法。
項１３．  前記培地が主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地である、項１２に記載の方法。
項１４．  工程（ｂ）が所定速度で攪拌することによって行われる、項９に記載の方法。
項１５．  前記分離株が、ＣＣＲＣ ９３００３２（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１２３３）、ＣＣＲＣ 
３５３９６、３５３９８、３５７１６、３６４０１および３６７９５からなる群から選択される、項９に記載の方法。
項１６．  Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、以下：
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって薬理学的に活性な溶液を収穫すること；および
（ｄ）工程（ｃ）からの溶液を処理して、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む、方法。
項１７．  工程（ｄ）で得られる組成物が、約３ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する、項１６に記載の方法。
項１８．  工程（ｄ）のフラクションで得られる組成物が、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する、項１７に記載の方法。
項１９．  Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養物から薬理学的に活性な組成物を得るための方法であって、
（ａ）Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの分離株の菌糸体接種原を、該分離株の増殖に好適な培地に接種すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた培養物を培養すること；
（ｃ）該培養物から不溶性物質の大部分を除去し、それによって水溶液を収穫すること；
（ｄ）工程（ｃ）からの水溶液を処理して、約１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクションを得ること；および
（ｅ）工程（ｄ）からのフラクションを水非混和性相に通過させ、ここから薬理学的に活性な組成物を得ること、
を含む、方法。
項２０．  工程（ｅ）における水非混和性相が、疎水性真菌分子を選択的に吸着し得る有効量の吸着剤を含有する固定相であり、そして該固定相を溶出して前記薬理学的に活性な組成物を得る、項１９に記載の方法。
項２１．  前記固定相が、吸着剤としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４樹脂を含む、項２０に記載の方法。
項２２．  前記固定相が、水よりも低い極性を有する有機溶媒である溶出液によって溶出される、項２０に記載の方法。
項２３．  前記溶出液が、メタノールよりも低い極性を有する有機溶媒である、項２２に記載の方法。
項２４．  前記溶出液が、酢酸エチルおよびエタノールからなる群から選択される、項２３に記載の方法。
項２５．  更に、工程（ｅ）からの組成物について逆相分配クロマトグラフィーを行い、薬理学的に活性なフラクションを得ること、
を含む、項１９に記載の方法。
項２６．  前記薬理学的活性が、腫瘍または癌細胞に対する抑制活性である、項１に記載の方法。
項２７．  前記薬理学的活性が、腫瘍または癌細胞に対する抑制活性である、項９に記載の方法。
項２８．  前記薬理学的活性が、腫瘍または癌細胞に対する抑制活性である、項１６に記載の方法。
項２９．  前記薬理学的活性が、腫瘍または癌細胞に対する抑制活性である、項１９に記載の方法。
項３０．  前記薬理学的活性が、腫瘍または癌細胞に対する抑制活性である、項２５に記載の方法。
項３１．  項１、９、１６、１９および２５のいずれか１項に記載の方法から得られるプロダクト。
項３２．  項１、９、１６、１９および２５のいずれか１項に記載の方法から得られるプロダクトを含有する医薬組成物。
項３３．  癌または腫瘍疾患の処置における使用のための項３２に記載の医薬組成物。
項３４．  癌または腫瘍疾患の処置が必要である患者における癌または腫瘍疾患の処置方法であって、項１、９、１６、１９および２５のいずれか１項に記載の方法から得られるプロダクトを含有する組成物を、該患者に投与することを含む、方法。
【実施例】
【００３８】
本発明を実施するための好ましい実施形態
以下の実施例は、例示のみのために与えられ、そして本発明の範囲を限定する意図はない。
【００３９】
実施例１：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの液体培養物の調製
Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２のストック培養物を、−８０℃で維持し、これから小アリコートの真菌をピックアップし、そしてポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ＤＩＦＣＯから購入した）のプレートへ配置した。回収後、次いで培養物をポテトデキストロース寒天のスラントチューブ（slant tube）へ移した。スラント培養物を２５℃でインキュベートし、そして２ヶ月ごとに継代培養した。スラント培養物を、仕込み培養物（working cultures）として使用した。菌糸体接種原の調製のために、ＰＤＡプレートに、ＰＤＡスラントからの培養物を接種し、そして２８℃で１５〜２０日間インキュベートした。
【００４０】
菌糸体接種原の調製
インキュベーションを、１５〜３０ｍｍの直径を有する菌糸体コロニーが観察されるまで行った。次いで、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体特徴を、汚染が生じていないことを確実にするために、光学顕微鏡下で研究した。全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）中で５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズした。菌糸体懸濁液のアリコートを、液内振盪培養（submerged shake cultures）のための接種原として使用した。接種原を、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードした合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ１：９の容量比で添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカー(orbital 
rotary shaker)において５０ｒｐｍで）で、５日間３０℃でインキュベートした。得られた培養物を、引き続いての大規模培養のための接種原として使用した。
【００４１】
実施例２：真菌濾液の薬理学的活性に対する攪拌速度の効果
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２接種原を、５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に予めロードした２．７リットルの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ  ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約２００ｒｐｍに設定し、そして７４時間インキュベーション後に約５００ｒｐｍへ上昇させた。試料を、菌糸体接種後の４８、１１３、１７０、２１７および２５９時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、引き続いてのＭＴＴ比色分析アッセイのために４℃で保存した。
【００４２】
非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。
【００４３】
ＨｅｐＧ２腫瘍細胞株を、ＭＴＴ比色分析アッセイのために選択した。アッセイの準備として、細胞を、ちょうどＡＴＣＣ培地のように、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中のストックとして維持した。腫瘍細胞株を、細胞培養フラスコから細胞を分離するために、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用して１週間に１または２回継代させた。腫瘍細胞を収穫し、カウントし、そして１ウェル当たり３，０００細胞の濃度で９６−ウェルマイクロタイタープレートへ接種した。各ウェル中の細胞培養培地の総容量を１８０μｌとし、そしてインキュベーションを、５％ＣＯ2で曝気されたインキュベーター中３７℃で一晩行った。
【００４４】
２０μｌアリコートのサンプルを、培養ウェルへ３重で適用し、そして得られた培養物を、上述のインキュベーション条件で７２時間インキュベートした。引き続いて、ＰＢＳ溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中５ｍｇ／ｍｌで予め調製した２０μｌのＭＴＴストック溶液（Ｍｅｒｃｋ）を、各ウェルに添加した。
【００４５】
ＣＯ2インキュベーター中３７℃で更に４時間インキュベーションした後、上澄みを各ウェルから除去し、そしてＭＴＴ−ホルマザン生成物を溶解するために、１００μｌの１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加した。メカニカルプレートミキサーで徹底的に混合した後、５４０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ）で測定した。試験濾液中の腫瘍細胞の相対的生存率は、各実験サンプルの吸光度を対応の非接種化コントロールのそれで除算することによって算出された。
【００４６】
比較例１：
実施例２を、真菌培養物を培養の全期間にわたって約５００ｒｐｍの一定速度でインキュベートしたことを除いて、繰り返した。
【００４７】
実施例２および比較例１からの濾液の処理後の腫瘍細胞の相対的生存率を、表１および図１において比較する。
【００４８】
【表１】
2006288405.tif 000002
【００４９】
表１において、示される時点でサンプルされた濾液を、Ｈｅｐ 
Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１７０時間でピックアップした濾液について、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２は、２００ｒｐｍから５００ｒｐｍへの２段階攪拌を経験した場合、ＭＴＴアッセイにおいて１６％の相対的生存率を提供することがわかり得、これは、３５％のより高い相対生存率が観察される５００ｒｐｍの一定速度で培養した培養物よりも遥かに効果が高い。実施例２および比較例１の抗腫瘍活性は、より遅い時点（第２１７および２５９時間で）でより近く、より遅い段階でのより速い攪拌速度と組み合わせてのより遅い速度での初期攪拌は、培養培地における薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００５０】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５１】
実施例３：真菌濾液の薬理学的活性に対するｐＨ値の効果
３つのバッチの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ  ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））を、それぞれ、約４．５（試験Ａ）、５．０（試験Ｂ）および５．５（試験Ｃ）の初期ｐＨを有するように調製し、これへ実施例１で調製した接種原を１：９の比で添加した。得られた培養物を、各培養物のｐＨ値を所定の時点でモニターしそしてＮａＯＨ溶液の添加によって初期ｐＨ値付近へ注意深く調節したことを除いて、実施例２で記載されるように培養した（表２）。培養は３３６時間継続した。ＮａＯＨ溶液の添加についてのタイミングは、選択されたｐＨ値に依存して変化した。例えば、試験Ｂおよび試験Ｃは、それぞれ約４．９〜５．１および約５．４〜５．６の間のｐＨ値を維持するために、第１９２および第１６８時間からＮａＯＨ溶液のアリコートが添加され、一方ＮａＯＨ溶液は、第２４０時間まで試験Ａへ添加されなかった。
【００５２】
【表２】
2006288405.tif 000003
【００５３】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１９２、２４０、２８８および３３６時間での培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨによってｐＨ７へ調節し、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、実施例２に示されるように、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイのためのネガティブコントロールとして使用した。
【００５４】
【表３】
2006288405.tif 000004
【００５５】
表３に示されるように、示される時点でサンプルしたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液を、Ｈｅｐ 
Ｇ２腫瘍細胞に対する抑制効果について比較する。菌糸体接種後第１９２時間でピックアップした濾液について、試験Ａおよび試験Ｂにおいて培養したＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２は、試験Ｃにおいて観察されるものよりも低い相対的生存率を生じることがわかる。抗腫瘍効果におけるこのような差異は、第２４０時間で最大となり、そしてより遅い時点で徐々に減少し、ｐＨ４．５〜５．４、好ましくは４．６〜５．３、そしてより好ましくは４．７〜５．２で行われた培養は、培養培地において薬理学的に活性な物質（単数または複数）の早い産生を達成することを示唆する。
【００５６】
首尾一貫した結果が、ＭＴＴアッセイにおいてＡＧＳ、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７腫瘍細胞株を使用する対応実験において観察された（データは示されない）。
【００５７】
実施例４：２５０Ｌ 発酵槽中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａのスケールアップ（scaled-up）培養
実施例１で調製したＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２を、２５０Ｌ発酵槽（Ｂｉｏ−Ｔｏｐ）に予めロードした１６０リットルの合成培地（１．５％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ
ＢＲＬ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、１：９の容量比で添加した。培養物を、０．６Ｌ／分の曝気速度で３０℃でインキュベートした。培養物のための攪拌速度を、最初、約４０ｒｐｍに設定し、そして７０時間インキュベーション後に約１５０ｒｐｍへ上昇させた。培養物のｐＨ値を、培養の全期間にわたって４．９〜５．１の範囲内に調節した。
【００５８】
試料を、菌糸体接種後第９６、１４４、１６８、１８６．５、２４４、および２８４時間で培養物からサンプルし、次いで不溶性物質の大部分を除去するために、慣用方法で濾過した。このように収穫した濾液を、ＮＨ4ＯＨでｐＨ７へ調節して、そしてオートクレービングによって滅菌した。得られたサンプルを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、ここでＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を、１ウェル当たり１，０００、３，０００、３，０００および３，０００細胞の開始濃度で試験した。非接種培地を、ＭＴＴアッセイについてのネガティブコントロールとして使用した。結果を表４および図４に示す。
【００５９】
【表４】
2006288405.tif 000005
【００６０】
表４および図４は、本発明に従うＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養プロセスが、実施例２および３に記載されるような所望の範囲内に攪拌速度およびｐＨ値を設定することによって、１６０リットル容量まで首尾よくスケールアップされることを示す。
【００６１】
実施例５：合成培地中のＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの培養濾液の調製
ＰＤＡプレートにおいて培養されたＡ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の全菌糸体を細かい断片へ切断し、次いで３０秒間ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）において５０ｍｌの滅菌水で無菌的にホモジナイズし、その結果、菌糸体懸濁液を得た。１Ｌ 
Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに予めロードされた２００ｍｌの合成培地（２％のフルクトース、０．５％（ｗ／ｖ）のイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫＨ2ＰＯ4（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ））へ、２０ｍｌの菌糸体懸濁液を添加した。液内培養物を、一定の攪拌（Ｈｏｔｅｃｈから購入したオービタルロータリーシェイカーにおいて７５ｒｐｍで）で、１４日間３０℃でインキュベートした。インキュベーション後、真菌培養物を、吸引濾過漏斗、フラスコおよび真空機のシンプルな濾過アセンブリを通過させた。粗濾液を引き続いての分析のために使用した。
【００６２】
実施例６：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液からの活性フラクションの調製および分析
実施例５（Ｆ０）からの粗濾液を、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、低速度での遠心分離によって、Ｃｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０（１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する、Ａｍｉｃｏｎから購入した市販のミニカラム）を通過させた。一次通過溶液を、フラクションＦ１と称する。次いで、カラムを脱イオン水で再充填し、そして遠心分離を繰り返して二次通過溶液Ｆ２を回収した。カラムに保持された真菌分子を収穫し、そしてＦ３と呼ぶ。
【００６３】
Ｆ１を、３ｋＤａの分子量カットオフ値を有するＣｅｒｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ３ミニカラム（Ａｍｉｃｏｎ）によって更に分画し、その結果、一次通過物（Ｆ４）、二次通過物（Ｆ５）、およびミニカラムに保持されたフラクション（Ｆ６）を上述のように得た。精製スキームを図５に示す。
【００６４】
得られたフラクションを、ＭＴＴ比色分析アッセイへ供し、腫瘍細胞の増殖を抑制する際の能力を評価した。この場合、ＨｅＬａ細胞を、１ウェル当たり１５００細胞の開始濃度で試験し、一方、ＭＲＣ−５、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２およびＭＣＦ−７細胞を１ウェル当たり３，０００細胞を有するように最初にロードした。図６に明らかに実証されるように、Ｆ１およびＦ４の両方によって示される抗腫瘍活性は、粗濾液（Ｆ０）のそれと匹敵する。濾液に存在する薬理学的に活性な物質のほとんどは、全部ではないにしても、低分子量、特に約３ｋＤａ以下の分子量であることを示唆する。
【００６５】
実施例５からの粗濾液（Ｆ０）をまた一連のメンブレンフィルターで分画し、そして、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有するフラクション（Ｆ７）を得た。抗腫瘍活性がＦ７と共分画されるという事実（図７、最も左のパネル）は、薬理学的に活性な物質の見かけの分子量は約１ｋＤａ以下へ下がり得ることを示す。
【００６６】
上述のＭＴＴアッセイにおいて、減少した生存率が、濾液処理ＭＲＣ−５細胞（正常肺線維芽細胞）において観察され、真菌濾液およびその活性フラクションは、正常な細胞に対して特定の抑制効果を示し得ることを示す。しかし、ＭＲＣ−５細胞は、例えば１ウェル当たり１０，０００細胞まで接種される場合、抑制効果は劇的に減少する。比較として、真菌濾液およびその活性フラクションの有効性は、増加量の腫瘍細胞によって、遥かに少ない影響しか受けなかった（データは示さず）。このインビトロ観察は、本発明に従う組成物は、生存する被験体へ投与されると、正常組織に対して薬理学的に好都合であるが、同時に腫瘍に対しては過酷な影響を与えるであろうという推定に至る。
【００６７】
実施例７：Ａｍｂｅｒｉｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４樹脂におけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例６からのフラクションＦ７を、穏やかに攪拌しながら、１バッチのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。インキュベーションの完了後、樹脂ビーズを遠心分離によって沈殿させた。吸着されていない物質を含有する上澄みおよび樹脂ビーズを、別々に収穫した。その後、ビーズを、等容量の脱イオン水、メタノールおよび酢酸エチルで連続して溶出し、そして３溶出工程からの溶出液を別々に回収した。メタノール溶出液および酢酸エチル溶出液を、減圧下で蒸発乾固させ、そして少量のエタノールに再溶解させた。このように得られたエタノール溶液を、好適な量の滅菌水と共に加えて、続くＭＴＴ比色分析アッセイにおけるエタノールの最終濃度を０．５％以下へ調節した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、ネガティブコントロールとして、非接種培地または水中０．５％エタノールを使用して、実施例６に記載されるように行った。結果を図７に示す。
【００６８】
図７において、酢酸エチル溶出液は、全ての５つのタイプの細胞に対して優れた抗腫瘍活性を有することが示され、一方、水およびメタノール溶出液は、細胞に対して有意な効果を示さない。残存する抗腫瘍活性が、上澄み部分において観察され、これは、樹脂による疎水性物質の不完全な吸着から生じると考えられる。結果は、濾液中に存在する薬理学的活性は、主に、約１ｋＤａ以下の分子量の疎水性物質に由来することを示唆する。
【００６９】
実施例８：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ １８カラムにおけるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液の分離
実施例７からの酢酸エチル溶出液を、更に、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラム（Ｈｉｂａｒ、予め充填されたカラムＲＴ  ２５０−２５；７μｍ；Ｍｅｒｃｋから購入）において分離した。勾配溶出を、５．７ｍｌ／分の流速で、２００分にわたって、４０％〜１００％のアセトニトリル割合を含むアセトニトリル／水の溶出液を使用して行った。２５４ｎｍでの吸光度を、測定しそして図８にプロットする。１２ｍｌのフラクションを回収し、表５に示されるように、いくつかのフラクションへ合わせた。
【００７０】
【表５】
2006288405.tif 000006
【００７１】
フラクションを減圧下で蒸発乾固させ、そして実施例７に記載されるように、作用溶液に調製した。ＭＴＴ比色分析アッセイを、実施例６に記載されるように行った。結果を図９〜１１に示した。
【００７２】
図９〜１１に実証されるように、フラクションＧ、ＫおよびＬは、ＡＧＳ細胞に対して有意な抑制効果を示し、一方、隣接フラクションＧおよびＨは、Ｈｅｐ Ｇ２細胞の生存率を５０％未満のレベルへ抑制する。ＭＣＦ−７細胞は、フラクションＢ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＲによって抑制されるブロードスペクトルを有する。しかし、酢酸エチル溶出液中に見られるＨｅＬａ細胞に対する抑制活性は、逆相分配クロマトグラフィーにおける精製の間にほとんど排除され、Ａ．Ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液におけるいくらかの薬理学的活性は、種々の分子の協同作用から生じ得、そしてこの協同は、激しい精製に対して相当に攻撃を受けやすい。
【００７３】
本発明は、上記の特定の実施形態を参照して記載されたが、当業者に明らかであろう種々の改変および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに成され得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
本発明の上記および他の主題および特徴は、添付の図面と関連してなされる好ましい実施形態の上述の説明を参照して明らかとなるであろう。
【図１】図１は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導される濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、２つの異なる攪拌条件下で培養される。
【図２】図２は、培養時間にわたる３つのＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物のｐＨ変動を実証するダイヤグラムである。
【図３】図３は、図２に記載されるＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムであり、ここでＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａは、３つの異なる間隔で制御されたｐＨ値で培養される。
【図４】図４は、Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａの大規模（scaled-up）培養物から誘導された濾液の抗腫瘍活性を実証するダイヤグラムである。
【図５】分子量に基づいてＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ濾液についての精製スキームを例示するフローチャートである。
【図６】図６は、図５に従って分離された培養濾液の抗腫瘍活性を実証する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図７】図７は、１ｋＤａ以下の分子量を有する真菌分子を含有する濾液フラクションからＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を比較する棒グラフであり、ここで試験された細胞株は、、ＭＲＣ−５、ＨｅＬａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＭＣＦ−７を含む。
【図８】図８は、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ（登録商標）ＲＰ−１８カラムにおいて分画された図７の酢酸エチル溶出液のスペクトルプロフィールである。
【図９】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１０】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１１】図９〜１１は、図８において分離されたフラクションの抗腫瘍活性を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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