(57)【要約】【課題】溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける試料中のＨＩＶの検出のための新規なＤＮＡプローブ配列を提供すること。【解決手段】ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、  上記オリゴヌクレオチドは、  ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、  核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、  ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、所定の配列からなる群から選択される、合成オリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する工程を包含する、診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を検出するための新規な核酸プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳおよびＡＲＣの病因物質は、ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶ、およびＨＩＶとさまざまに呼ばれている。以下、これをＨＩＶと称する。このウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡの検出は、種々のプローブ配列およびハイブリダイゼーション形式により可能である。
【０００３】
１９８７年８月１１日に出願された特許文献１には、ＨＩＶのＤＮＡまたはＲＮＡの検出にプローブとして用いられる１３個のＨＩＶオリゴヌクレオチドが開示されている。１９８７年６月２２日に出願された特許文献２には、ＨＩＶウイルスの変異株およびそれらのＤＮＡをＡＩＤＳ診断に使用することが開示されている。１９８９年１月２７日に出願された特許文献３には、多発性硬化症に関連する配列を検出するための、ヌクレオチド２４３８〜２４５７位の長さのＨＩＶ  ＤＮＡプローブが開示されている。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応の出現により、主としてｐｏｌ遺伝子およびｇａｇ遺伝子の領域に由来するプローブを用いるアッセイの範囲が刺激された。Ｓｐｅｃｔｏｒら（非特許文献１）およびＫｅｌｌｏｇら（非特許文献２）は、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子由来のプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いる、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの定量アッセイを開示している。Ｌｏｍｅｌｌら（非特許文献３）は、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子ｍＲＮＡの保存領域に相補的な増幅可能ＲＮＡプローブを開示している。Ｃｏｕｔｌｅｅら（非特許文献４）は、ＨＩＶ  ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子由来の配列に相補的なプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応によるＨＩＶ  ＤＮＡの免疫検出を開示している。１９８７年１２月１５日に出願された特許文献４には、ヌクレオチド８５３８〜８５４７位および８６５８〜８６７７位の長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いる、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列のＰＣＲ増幅および検出が開示されている。１９８７年１月９日に出願された特許文献５には、ＨＩＶ  ｇａｇ領域由来のＤＮＡの増幅によるＨＩＶの検出が開示されている。特許文献６には、捕獲プローブおよびリポータープローブを用いて固体支持体に固定する、増幅と溶液ハイブリダイゼーションとを組み合わせる核酸プローブアッセイが開示されている。ＨＩＶのｇａｇ  ｐ  １７領域内の領域は、この技法によって増幅された。
【０００５】
他の方法は、「可逆的標的捕獲」と呼ばれる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（非特許文献５）は、ＨＩＶ  ＲＮＡの「可逆的標的捕獲」を開示しており、ここで市販の入手可能なｄＡテイル化合成オリゴヌクレオチドは、分析される核酸の選択的精製を提供し、そしてＨＩＶ  ｐｏ１遺伝子に相補的な標識アンチセンスＲＮＡプローブはシグナルを提供している。Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら（非特許文献６）は、ＨＩＶ  ＲＮＡの可逆的標的捕獲のためのプローブを開示しており、ここでこのプローブは、ＨＩＶｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド２０９４〜４６８２位に相補的である。
【０００６】
Ｋｕｍａｒらは、ＨＩＶ  ＤＮＡの「プローブシフト」アッセイを開示している。これは、ＨＩＶのｇａｇおよびｐｏ１遺伝子に相補的なＤＮＡ配列を用いる。プローブシフトアッセイは、標識オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅セグメントヘの、溶液中でのハイブリダイゼーションに依存する。そこで形成されるヘミ二重鎖は、非変性ゲル上で分画を行った後検出される。
【０００７】
Ｋｅｌｌｅｒら（非特許文献７）は、ｇａｇコーディング領域のＰｓｔＩ部位に広がるＨＩＶ  ＤＮＡを検出するための、マイクロタイターベースのサンドイッチアッセイを開示している。
【０００８】
Ｖｉｓｃｉｄｉら（非特許文献８）は、固相抗ビオチン抗体およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的な酵素標識モノクローナル抗体を用いる、ＨＩＶ  ＲＮＡのハイブリダイゼーションアッセイを開示しており、ここでプローブはポリメラーゼ遺伝子のほぼ全域およびｇａｇ遺伝子の３’末端に広がる。
【０００９】
１９８９年１１月１６日に出願された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８９３１１８６２号明細書には、核酸を検出するための固体捕獲法を用いる診断キットおよび方法が開示されており、ＨＩＶ  ＤＮＡの検出のために、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子に相補的なＤＮＡ配列を使用することが記載されている。
【００１０】
同一人に譲渡された特許文献７には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
【００１１】
同一人に譲渡された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８８３０９６９７６号には、特許文献８に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのペニシリンおよびテトラサイクリン耐性、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについて開示されている。
【００１２】
１９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願第５５８，８９７号明細書には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。
【００１３】
１９８７年１１月２４日に出願された特許文献９には、プローブの標的への結合を促進するために、分析される核酸に結合して、標的に異なる二次および三次構造を与えるように選択された、「ヘルパー」オリゴヌクレオチドが開示されている。
【特許文献１】国際公開第８８／０１３０２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第８７／０７９０６号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第０３２６３９５号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０２７２０９８号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０２２９７０１号明細書
【特許文献６】国際公開第８９／１０９７９号パンフレット
【特許文献７】米国特許第４，８６８，１０５号明細書
【特許文献８】米国特許第４，８６８，１０５号明細書
【特許文献９】米国特許第５，０３０，５５７号明細書
【非特許文献１】Ｓｐｅｃｔｏｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８９年  第３５／８巻  ｐ．１５８１−１５８７，
【非特許文献２】Ｋｅｌｌｏｇら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  第１８９巻  ｐ．２０２−２０８，１９９０年
【非特許文献３】Ｌｏｍｅｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第３５／９巻  ｐ．１８２６−１８３１
【非特許文献４】Ｃｏｕｔｌｅｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１８１巻  ｐ．９６−１０５，１９８９
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８９年  第３５／９巻  ｐ．１７８−１８８１
【非特許文献６】Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９８９年  第３巻ｐ．７３−８６
【非特許文献７】Ｋｅｌｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９年  第ｌ７７巻  ｐ．２７−３２
【非特許文献８】Ｖｉｓｃｉｄｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．  １９８９年  第２７巻  ｐ．１２０−１２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明は、溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける試料中のＨＩＶの検出のための新規なＤＮＡプローブ配列を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の１つの局面は、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の別の局面は、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント；および固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドである。
【００１７】
本発明の別の局面は、ＨＩＶを検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションに用いるためのスペーサーオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
本発明の別の局面は、試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する：
（ａ）  上記試料を、過剰の（ｉ）ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、増幅プローブオリゴヌクレオチド、および、（ｉｉ）ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｂ）  工程（ａ）の生成物を、固相に結合した上記オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｃ）  その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）  工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
（ｅ）  非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）  工程（ｅ）の固相複合体生成物を、上記標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｇ）  非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）  工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
【００１９】
本発明の別の局面は、試料中のＨＩＶの検出のためのキットであって、このキットは以下の組み合わせを含む：
（ｉ）  増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで上記増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントとを含む、セット；
（ｉｉ）  捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで上記捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；
（ｉｉｉ）  核酸マルチマーであって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、マルチマー：および
（ｉｖ）  標識オリゴヌクレオチド。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドを提供する。上記オリゴヌクレオチドは、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００２１】
【化２】
2006254924.tif 000002
2006254924.tif 000003
１つの実施態様では、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、上記第二セグメントが、ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ（配列番号５５）を含む。
【００２２】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドを提供する。上記合成オリゴヌクレオチドは、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００２３】
【化３】
2006254924.tif 000004
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドは、上記第二セグメントが、ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ（配列番号：５６）を含む。
【００２４】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドを提供する。上記オリゴヌクレオチドは、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００２５】
【化４】
2006254924.tif 000005
2006254924.tif 000006
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドは、上記第二セグメントが、ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ（配列番号：５５）を含む。
【００２６】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドを提供する。上記合成オリゴヌクレオチドは、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００２７】
【化５】
2006254924.tif 000007
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドは、上記第二セグメントが、ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ（配列番号：５６）を含む。
【００２８】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドを提供する。上記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
【化６】
2006254924.tif 000008
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける、第一の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを提供する。上記セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、上記セットの各メンパーが、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、
合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００３０】
【化７】
2006254924.tif 000009
2006254924.tif 000010
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドは、上記第二セグメントが、ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ（配列番号：５５）を含む。
【００３１】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける、第一の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを提供する。上記セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、上記セットの各メンバーが、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、
合成オリゴヌクレオチドである。
【００３２】
【化８】
2006254924.tif 000011
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドのセットは、第二セグメントが、ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ（配列番号：５６）を含む。
【００３３】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける、第二の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを提供する。上記セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、上記セットの各メンバーが、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、
合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００３４】
【化９】
2006254924.tif 000012
2006254924.tif 000013
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドのセットは、上記第二セグメントが、ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴ（配列番号：５５）を含む。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける、第二の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを提供する。上記セットは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、上記セットの各メンバーが、
ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、
固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、
合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００３６】
【化１０】
2006254924.tif 000014
１つの実施態様では、上記合成オリゴヌクレオチドのセットは、上記第二セグメントが、ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ（配列番号：５６）を含む。
【００３７】
本発明は、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを提供する。上記セットは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、上記合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、
ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、
合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００３８】
【化１１】
2006254924.tif 000015
本発明は、試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。上記アッセイは、以下の工程を包含する：
（ａ）上記試料を、過剰の（ｉ）第一の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、上記捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した上記オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接舳させる工程であって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的な相補的である多敬の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
【００３９】
本発明は、試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。上記アッセイは、以下の工程を包含する：
（ａ）上記試料を、過剰の（ｉ）第二の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレ
オチドのセットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、上記捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した上記オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメンドに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
【００４０】
１つの実施態様では、上記溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、工程（ａ）が、上記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程をさらに包含し、上記セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイである。
【００４１】
【化１２】
2006254924.tif 000016
１つの実施態様では、上記溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、工程（ａ）が、上記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程をさらに包含し、上記セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイである。
【００４２】
【化１３】
2006254924.tif 000017
本発明は、試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。上記アッセイは、以下の工程を包含する：
（ａ）上記試料を、過剰の（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットおよび（ｉｉ）第一の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、上記増幅プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した上記オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、上記核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
【００４３】
本発明は、試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。上記アッセイは、以下の工程を包含する：
（ａ）上記試料を、過剰の（ｉ）増幅プロ一ブオリゴヌクレオチドのセットおよび（ｉｉ）第二の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、上記増幅プローブオリゴヌクレオチドが、上記ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、上記核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した上記オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｃ）その後、固相に結合していない物質を分離する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、上記マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程；
（ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
（ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。
【００４４】
１つの実施態様では、上記溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、工程（ａ）が、上記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットのセットと接触させる工程をさらに包含し、上記セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで、上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイである。
【００４５】
【化１４】
2006254924.tif 000018
１つの実施態様では、上記溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、工程（ａ）が、上記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットのセットと接触させる工程をさらに包含し、上記セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで上記ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイ：
【００４６】
【化１５】
2006254924.tif 000019
本発明は、試料中のＨＩＶの検出のためのキットを提供する。上記キットは、以下の組み合わせを含む：
（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、上記増幅プローブ
オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、セット；
（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、捕獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セット；
（ｉｉｉ）  核酸マルチマーであって、上記マルチマーが、増幅プローブオリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、核酸マルチマー；および
（ｉｖ）標識オリゴヌクレオチド。
【００４７】
１つの実施態様では、上記キットは、スペーサーオリゴヌクレオチドのセットをさらに含み、ここで、上記スペーサーオリゴヌクレオチドが、以下を含む群から選択される、キットである。
【００４８】
【化１６】
2006254924.tif 000020
１つの実施態様では、上記増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットが、第一の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００４９】
１つの実施態様では、上記増幅プロープオリゴヌクレオチドのセットが、第二の、増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００５０】
１つの実施態様では、上記捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットが、第一の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００５１】
１つの実施態様では、上記捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットが、第二の、捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットである。
【００５２】
１つの実施態様では、上記キットは、それらの使用のための指示書をさらに含む。
【００５３】
溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける試料中のＨＩＶの検出のための新規なＤＮＡプローブ配列が、記載されている。このプローブを用いる増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイが、例示されている。
【発明の効果】
【００５４】
本発明によって、溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける試料中のＨＩＶの検出のための新規なＤＮＡプローブ配列が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（定義）
「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」とは、同一人に譲渡された米国特許第４，８６８，１０５号、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、および米国特許出願第５５８，８９７号に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。
【００５６】
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレオチドは、そのＮ4位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている５’−シチジンである。
【００５７】
「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（すなわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は共有結合によりつくられ、マルチマーは、２つの型のオリゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズした核酸に、および多数の標識プローブにハイブリダイズし得る。このようなマルチマーの組成物および調製は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、および１９９０年７月２７日に出願された米国特許出願第５５８，８９７号に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。
【００５８】
「スペーサーオリゴヌクレオチド」は、分析されるＲＮＡに結合するが、固相に付着するためのいかなる配列をも含まず、そして増幅プローブによるいかなる検出手段をも含まないオリゴヌクレオチドとして意図される。
【００５９】
用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメントと、増幅マルチマーに特異的にハイブリダイズするセグメントまたはセグメントの反復とを有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチドとして意図される。
【００６０】
用語「捕獲プローブ」は、分析される核酸のヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相補的なセグメントとを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。
【００６１】
本明細書中で本発明のコーム型分枝ポリヌクレオチドを記載するのに用いられる「大きな（Ｌａｒｇｅ）」とは、少なくとも約１５個の分枝部位と、標識プローブ結合配列の少なくとも約２０個の反復とを有する分子を意味する。
【００６２】
本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられる「コーム型」とは、バックボーンから伸長している多数の側鎖を有する直鎖状のバックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。
【００６３】
「切断可能なリンカー分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断され得る共有結合を含む分子を意味する。
【００６４】
本明細書中に開示された全ての核酸配列は、５’から３’への方向に記載されている。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されたヌクレオチド記号に従って示す。
【００６５】
（溶液相ハイブリダイゼーションアッセイ）
溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションの一般的なプロトコルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一本鎖核酸プローブセットを入れたマイクロタイターウェル中に入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に実質的に相補的な第一結合配列、および、固体支持体（例えばウェル表面またはビーズ）に結合した核酸に実質的に相補的な第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と実質的に相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕獲プローブの第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。
【００６６】
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの実質的に相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。
【００６７】
分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体）由来であり得、種々の手段（例えば、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ、カオトロピック塩など）によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、０．１ｋｂ程に小さくあり得、通常少なくとも約０．５ｋｂであり、そしてｌｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約０．０５〜０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの組合せ）により行われ得る。
【００６８】
分析される配列に実質的に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌクレオチド、そして約５ｋｂ以下、通常約１ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。
【００６９】
用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影響する。なぜなら、これは用いられるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提供されるシグナルが強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用いるほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられるようになり、それによって偽陽性結果の発生率が減少する。従って、セット中のプローブ数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、より好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好ましくは５〜１００個の捕獲プローブおよび５〜１００個の増幅
プローブである。
【００７０】
ＨＩＶのオリゴヌクレオチドプローブ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ由来の１８個のＨＩＶ株のＤＮＡ配列を並べることにより設計した。ｐｏ１遺伝子内の相同性が最も高い領域を捕獲プローブとして選択し、一方、より相同性の低い領域を増幅プローブとして選択した。非常に異質の領域をスペーサープローブとして選択した。従って、ＨＩＶのより多くの株が同定され配列決定されるのに伴って、さらなるプローブが設計され得るか、または現存の好ましいセットのプローブが改変され得る。これは、新規の株または単離株の配列と、上記で用いられた１８株の配列とを並べ、同様に相同性の最も高い領域およびより低い領域を同定することによって行われ得る。
【００７１】
スペーサーオリゴヌクレオチドは、起こり得る分解からＲＮＡを保護するために、ハイブリダイゼーション反応混液に加えられるように設計した。捕獲プローブ配列および標識プローブ配列は、捕獲プローブ配列に標識プローブ配列が散在するように、または捕獲プローブ配列が、標識プローブ配列に関して共にクラスター形成されるように設計した。
【００７２】
ＨＩＶ核酸に特異的にハイブリダイズする、現存の好ましいセットのプローブおよびそれらの捕獲領域または増幅領域を、実施例２に挙げる。
【００７３】
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。
【００７４】
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。
【００７５】
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％未満の塩基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基が正確に対応するような正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、９０％またはそれ以上の相同性を有することを意味する。
【００７６】
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。オリゴヌクレオチド配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：４０４５；ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２：３４３５；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８３）１１：６１６７；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８５）１３：２３９９；ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１３８：２６７を参照のこと。標識は、実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例
示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが包含される。
【００７７】
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約１．５：１であり、より好ましくは少なくとも２：１である。通例、２：１から１０，０００：１の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約１０-5〜１０-9Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１０-21〜１０-12Ｍまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約１０分から２０時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約２０℃から８０℃の範囲で、より通常には約３５℃から７０℃までで、特に６５℃で行われ得る。
【００７８】
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を合有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント（０．１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０．０１７〜０．１７Ｍ））、フィコール、ポリピニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、一般的に２〜５０％の範囲内の量で存在する。
【００７９】
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジェンシーを変化させる。
【００８０】
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメー夕ーまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメー夕ー、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。
【００８１】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
【実施例】
【００８２】
（実施例Ｉ）
（コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成）
本実施例は、１５個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸長とを有する、コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌクレオチドは、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載の溶液相ハイブリダイゼーションに用いられるように設計した。
【００８３】
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ）で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、ＰｈｏｓｔｅｌTM試薬（ＡＢＮ）を用いる５’リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的なＡＢＩプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた（例えば、１．２サイクル）と示されている場合、ＡＢＩにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Ａｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成機で行われる、サイクル１．
２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。
【００８４】
以下の構造のコーム体を最初に調製した：
【００８５】
【化１７】
2006254924.tif 000021
ここで、Ｘ’は分枝モノマーであり、そしてＲは過ヨウ素酸切断可能リンカーである。
【００８６】
１５個の（ＴＴＸ’）繰り返しによるコーム体の部分を、３３．８ｍｇのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス（ＣＰＧ）（２０００Å、支持体１グラム当り７．４マイクロモルチミジン）を用いて、１．２サイクルプロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった：
【００８７】
【化１８】
2006254924.tif 000022
ここでＲ2は
【００８８】
【化１９】
2006254924.tif 000023
を表す。
【００８９】
コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴが０．１Ｍ、分枝部位モノマーＥが０．１５Ｍ、およびＰｈｏｓｔｅｌTM試薬が０．２Ｍであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー（ｓｔｅｐｐｅｄ  ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５’ＤＭＴをアセチル基で置換した。
【００９０】
切断可能リンカーＲおよび式３’−ＲＧＴＣＡＧＴｐ（配列番号：１）の６塩基の側鎖
伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基（上式のＲ2）の
除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にＣＰＧ支持体を保持している間に、手動的に行った。Ｒ2がレブリニルである場合、０．５Ｍヒドラジン水和物のピリジン／
氷酢酸（１：１  ｖ／ｖ）溶液を加え、１５分ごとに液体を取り替えながら９０分間ＣＰＧ支持体と接触させておき、続いてピリジン／氷酢酸（１：１  ｖ／ｖ）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカーＲおよび６塩基側鎖伸長を、６．４サイクルを用いて加えた。
【００９１】
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、０．１Ｍであった（０．２ＭのＲおよびＰｈｏｓｔｅｌTM試薬を除く；Ｒは、２−（４−（４−（２−ジメトキシトリチルオキシ）エチル−）フェノキシ  ２，３−ジ（ベンゾイルオキシ）−ブチルオキシ）フェニル）エチル−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった）。
【００９２】
脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（１：１  ｖ／ｖ）の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「ＣＥ  ＮＨ3」を用いて３８０Ｂで自動
的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を４ｍｌのスクリューキャップＷｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０℃で１２時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレー夕ーで除去し、残渣を１００μｌの水に溶解した。
【００９３】
以下の構造の３’バックボーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した。
【００９４】
【化２０】
2006254924.tif 000024
粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、７Ｍ尿素および１ＸＴＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。
【００９５】
３’バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４ｐｍｏｌ／μｌ）、３’バックボーン伸長（６．２５ｐｍｏｌ／μｌ）、側鎖伸長（９３．７５ｐｍｏｌ／μｌ）、および連結テンプレート（５ｐｍｏｌ／μｌ）を、１ｍＭ  ＡＴＰ／５ｍＭ  ＤＴＴ／５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０／１０ｍＭ  ＭｇＣ
ｌ2／２ｍＭスペルミジン中で、０．５単位／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと合
わせた。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで水浴中で９５℃に加熱し、次いで約１時間かけて３５℃未満まで冷却した。２ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、および０．２１単位／μｌ  Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。ＤＮＡをＮａＣｌ／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭスペルミジン、０．５単位
／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μｌ  Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【００９６】
連結反応および精製を行った後、生成物の一部を32Ｐで標識し、Ｒ部位での切断を行い、これは、水性ＮａＩＯ4で１時間酸化することにより達成された。次いで、試料をＰＡ
ＧＥにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で４５個の標識プローブ結合部位を有していることが分かった。
【００９７】
（実施例２）
（マルチマーを用いるＨＩＶ  ＤＮＡのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ）
本実施例は、ＨＩＶ  ＤＮＡアッセイに本発明を使用することを例示する。
【００９８】
「１５×３」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式を、本実施例で用いた。「１５×３」の呼称は、この形式が２つのマルチマーを用いることに由来する：（１）増幅プローブは、ＨＩＶ核酸に結合する第一セグメント（Ａ）と、（２）増幅マルチマーにハイブリダイズする第二セグメント（Ｂ）とを有し、（２）増幅マルチマーは、セグメント（Ｂ）にハイブリダイズする第一セグメント（Ｂ＊）と、セグメント（Ｃ）の１５個の反復とを有し、ここでセグメントＣは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００９９】
本アッセイで用いた増幅プローブおよび捕獲プローブのＨＩＶ特異的セグメント、およびそれらの個々の名称は以下の通りであった。
【０１００】
【化２１】
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2006254924.tif 000026
2006254924.tif 000027
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各増幅プローブは、ＨＩＶ配列に対して実質的に相補的な配列に加えて、増幅マルチマーのセグメントに相補的な以下の５’伸長を含んでいた：
【０１０１】
【化２２】
2006254924.tif 000029
（配列番号：５５）。
【０１０２】
各捕獲プローブは、ＨＩＶ  ＤＮＡに対して実質的に相補的な配列に加えて、固相に結合したＤＮＡに対して相補的な以下の下流配列（ＸＴ１＊）を含んでいた：
【０１０３】
【化２３】
2006254924.tif 000030
（配列番号：５６）。
【０１０４】
増幅プローブおよび捕獲プローブに加えて、以下のＨＩＶスペーサーオリゴヌクレオチ
ドのセットをハイブリダイゼーション混合物中に含有した。
【０１０５】
【化２４】
2006254924.tif 000031
マイクロタイタープレートを以下のようにして調製した。Ｗｈｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  １  Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウェル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した。各ウェルに２００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いで、このプレートをｌＸ  ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに２００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。プレートを再びｌＸＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【０１０６】
ポリ（ｐｈｅ−ｌｙｓ）をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ：ｌｙｓを１：１のモル比で有しており、平均分子量は４７，９００ｇｍ／ｍｏｌである。平均長さは３０９アミノ酸であり、１５５アミン／ｍｏｌを含む。ポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２Ｍ  ＮａＣｌ／１Ｘ  ＰＢＳと混合し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）にした。各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、３０℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１Ｘ  ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【０１０７】
プレートにオリゴヌクレオチドＸＴ１＊をカップリングするのに、以下の手順を用いた。ＸＴ１＊の合成は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載された。２０ｍｇのジスクシンイミジルスベレートを、３００μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ＸＴ１＊の２６  ＯＤ260単位を、１００μｌカップリング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．８）に加えた。次いで、カップリング混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に加え、マグネチックスターラーで３０分間攪拌した。ＮＡＰ−２５カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化した。カップリング混合物ＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を２ｍｌの
１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５に４℃で加えた。この混合物をボルテックスにかけて混合し、平衡化したＮＡＰ−２５カラムにかけた。ＤＳＳ活性化ＸＴ１＊  ＤＮＡを、３．５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５でカラムから溶出した。溶出したＤＳＳ活性化ＸＴ１＊  ＤＮＡの５．６  ＯＤ260単位を、１５００ｍｌの５０ｍＭリン
酸ナトリウム、ｐＨ７．８に加えた。各ウェルに、この溶液を５０μｌずつ加え、プレートを一晩インキュベートした。次いで、プレートを１ＸＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。
【０１０８】
プレートの最終的なストリッピングは、以下のようにして行った。０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２００μＬの０．２Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、６５℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを１Ｘ  ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。
【０１０９】
ＨＩＶ  ＤＮＡの標準曲線は、ＨＩＶ陰性ヒト血清でクローン化ＨＩＶ  ＤＮＡを希釈し、１０〜２００ｔｍｏｌ（１ｔｍｏｌ＝６０２分子または１０-21ｍｏｌ）の範囲に相
当する希釈液のアリコートを、上記のように調製したマイクロタイター皿のウェルに配付することにより調製した。
【０１１０】
試料の調製は、１２．５μｌのＰ−Ｋ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０／１％ＳＤＳ／４０μｇ／ｍｌの音波処理サケ精子ＤＮＡ）を各ウェルに配付することから成り立った。プレートを覆い、攪拌して試料を混合し、６５℃でインキュベートし、核酸を遊離させ、次いでベンチトップで５分間冷却した。
【０１１１】
上記に挙げたＨＩＶ特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液を各ウェルに加えた（ウェル当り捕獲プローブ５０ｆｍｏｌ、増幅プローブ５０ｆｍｏｌ）。プレートを覆い、穏やかに攪拌して試薬を混合し、次いで６５℃で３０分間インキュベートした。
【０１１２】
次いで、中和緩衝液を各ウェルに加えた（０．７７Ｍ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸／１．８４５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１８５Ｍクエン酸ナトリウム）。プレートを覆い、６５℃で１２〜１８時間インキュベートした。
【０１１３】
各ウェルの内容物をアスピレートして、全ての流体を除去し、そしてウェルを洗浄緩衝液（０．１％ＳＤＳ／０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）で２回洗浄した。
【０１１４】
次いで、増幅マルチマーを各ウェルに加えた（５０％ウマ血清中２．５ｆｍｏｌ／μｌの溶液４０μｌ／０．０６Ｍ  ＮａＣｌ／０．０６Ｍクエン酸ナトリウム／４Ｘ  ＳＳＣと１：１で混合した０．１％ＳＤＳ／０．１％ＳＤＳ／０．５％「ブロッキング試薬」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，カタログ番号１０９６  １７６））。プレートを覆い、攪拌してウェル中の内容物を混合した後、５５℃で１５分間インキュベートした。
【０１１５】
室温でさらに５分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄した。
【０１１６】
次いで、アルカリホスファターゼ標識プローブ（ＥＰ第８８３０９６９７６号に開示されている）を、各ウェルに加えた（２．５ｆｍｏｌ／μｌを４０μｌ／ウェル）。５５℃で１５分間インキュベートした後、室温で５分間おき、ウェルを、上記のように２回洗浄し、次いで０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した
。
【０１１７】
酵素のトリガーとなるジオキセタン（Ｓｃｈａａｐら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．（１９８７）２８：１１５９−１１６２およびＥＰＡ公開第０２５４０５１号）をＬｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．から得、これを用いた。２０μｌのＬｕｍｉｐｈｏｓ
５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩いて試薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。ウェルを覆い、３７℃で４０分間インキュベートした。
【０１１８】
次いで、プレートをＤｙｎａｔｅｃｈ  ＭＬ  １０００ルミノメー夕ーで読み取った。出力を、反応の間に生じた光の総積分として示した。
【０１１９】
結果を以下の表に示す。各標準試料に対する結果は、陰性コントロールの平均値プラス２倍の標準偏差値と、試料の平均値マイナス２倍の標準偏差値との差（デルタ）として表す。デルタが０より大きい場合、試料は陽性であるとみなされる。
【０１２０】
ＨＩＶプローブの標準曲線から得られる結果を表Ｉに示す。これらの結果より、これらのプローブの能力は、５０ｔｍｏｌのＨＩＶ  ＤＮＡ標準から検出し始めることが分かった。
【０１２１】
【表１】
2006254924.tif 000032
（実施例３）
（ＨＩＶウイルスＲＮＡの検出）
ＨＩＶ  ＲＮＡを、上記と本質的に同じ手順を用いて、以下の改変を行って検出した。
【０１２２】
ＨＩＶ  ＲＮＡの標準曲線を、ＨＩＶウイルス貯蔵品を正常ヒト血清で１２５〜５０００ＴＣＩＤ50／ｍｌの間の範囲に連続的に希釈することにより調製した（ＴＣＩＤ50は、５０％の組織培養物が感染する用量の終点である）。１０ｍｇのプロテイナーゼＫを、−２０℃で貯蔵したホルムアミド中で７％にした５ｍｌのＨＩＶ捕獲希釈剤（５３ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８／１０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ／１．３％ＳＤＳ／１６μｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ／５．３Ｘ  ＳＳＣ／１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に加えることにより、プロテイナーゼＫ溶液を調製した。捕獲プローブ、標識プローブ、およびスペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を、各プローブの最終濃度が１６７０ｆｍｏｌ／ｍｌとなるようなプロテイナーゼＫ溶液に加えた。上記のように調製したマイクロ夕イタープ
レートの各ウェルに、プローブ／プロテイナーゼＫ溶液を３０μｌずつ加えた後、各ウェルに適当なウイルス希釈物を１０μｌずつ加えた。プレートを覆い、振盪して混合し、次いで６５℃で１６時間インキュベートした。
【０１２３】
プレートをインキュベーターから取り出し、ベンチトップで１０分間冷却した。ウェルを、上記実施例２に記載のようにして２回洗浄した。１５×３マルチマーをＡｍｐ／Ｌａｂｅｌ希釈剤で１ｆｍｏｌ／μｌに希釈した（２．２２ｍｌ  ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏ（ＤＥ
ＰＣはジエチルピロカルボネート）、１．３５ｍｌの１０％ＳＤＳ、２４０μｌの１ＭトリスｐＨ８．０、２０μｌのウマ血清を混合することにより調製し、プロテイナーゼＫ中２ｍｇ／ｍｌに調整して６５℃で２時間加熱し、次いでこれを２４０μｌの０．１Ｍ  ＰＭＳＦに加えて３７℃で１時間加熱し、この後、４ｍｌのＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏ、４ｍｌの
１０％ＳＤＳ、および８ｍｌの２０Ｘ  ＳＳＣを加えた）。希釈した１５×３マルチマーを４０μｌ／ウェルで加え、プレートを封じ、振盪し、５５℃で３０分間インキュベートした。
【０１２４】
次いでプレートを室温で１０分間冷却し、上記のように洗浄した。アルカリホスファターゼ標識プローブをＡｍｐ／Ｌａｂｅｌ希釈剤で２．５ｆｍｏｌ／μｌに希釈し、各ウェルに４０μｌを加えた。プレートを覆い、振盪し、５５℃で１５分間インキュベートした。
【０１２５】
プレートを室温でｌ０分間冷却し、上記のように２回洗浄し、次いで０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。基質を加え、発光を上記のようにして測定した。アッセイの感度は、以下の表に示したように約１．２５  ＴＣＩＤ50であった。
【０１２６】
【表２】
2006254924.tif 000033
（実施例４）
（クラスター形成プローブセットと散在プローブセットとの比較）
ＨＩＶ  ＲＮＡを、以下の改変を行ったこと以外は、実施例３と本質的に同じ手順を用いて検出した。ＲＮＡ標準は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、プラスミドｐＢＨＢＫ１０Ｓ（Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：２３，１９９０）からの９．０ＫＢのＨＩＶ転写物の転写により調製した。このＨＩＶ  ＲＮＡを、ＨＡＰクロマトグラフィーにより捕獲されたｇａｇプローブおよびｐｏｌプローブとのハイブリダイゼーションにより定量した。ＲＮＡ標準を、上記のプロテイナーゼＫ希釈剤で１ｍｌ
当り２．５〜１００ａｔｏｍｏｌの間の範囲に連続的に希釈し、捕獲プローブ、標識プローブ、およびスペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を加え、各プローブの最終濃度が１６７０ｆｍｏｌ／ｍｌとなるようにした。捕獲プローブと標識プローブとの２つの配置をテストした：分散（ｓｃａｔｔｅｒｅｄ）捕獲プロープ（捕獲プローブには標識プローブが散在している）およびクラスター形成捕獲プローブ（捕獲プローブは標識プローブに関して連続したクラスターの形で配置されている）。クラスター形成プローブのセットを、以下に示す。
【０１２７】
【化２５】
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３０μｌの分析物／プローブ／プロテイナーゼＫ溶液を各ウェルに加えた後、１０μｌの正常ヒト血清を加え、実施例３に記載のようにアッセイを行った。表ＩＩＩに示すように、分散捕獲配置に対するクラスター形成捕獲配置を用いるアッセイの感度は、類似していた。クラスター形成捕獲伸長物を用いると、感度は５０〜ｌ００ｔｍｏｌであるが、分散捕獲伸長物を用いると、感度は１００〜５００ｔｍｏｌであった。
【０１２８】
【表３】
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上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１２９】
（配列表）
【表４】
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【０１３０】
【表５】
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