(57)【要約】【課題】野生型遺伝子群に混在する変異遺伝子を迅速、かつ簡便に、そして高感度に検出する方法の提供を目的とする。また、当該方法を用いてＥＧＦＲ変異遺伝子を検出する上で、高感度で、かつ信頼性の高い結果が得られる条件の提供を目的とする。【解決手段】標的部位に対して、野生型遺伝子の配列を有するＰＮＡからなるクランププライマーと、ＬＮＡを含み変異遺伝子の配列を有する変異プローブと、が競合してハイブリダイゼーションするように両者の配列を設計し、遺伝子増幅反応を行うことによって、既知変異遺伝子の検出を高感度で得る「ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法」を提供する。また、この方法を用いて既知のＥＧＦＲ遺伝子の変異を特異的、かつ高感度に検出できる検出法と、それに使用する変異プライマーとクランププライマーを提供する。【選択図】図１
2006288353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、
変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。
【請求項２】
遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、
変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅法はＰＣＲ法である請求項１または２に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記変異プローブはＲＮＡを含む請求項１から３のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記変異プローブは一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている請求項１から４のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を核酸染色剤で染色する請求項１から４のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を蛍光強度の増加によって経時的に検出する請求項１から６のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項８】
前記変異が点突然変異である請求項１から７のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項９】
前記変異が欠失変異である請求項１から８のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１０】
前記クランププライマーの鎖長が１４塩基から１８塩基である請求項１から９のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１１】
前記変異遺伝子は、ヒト上皮成長因子受容体の変異遺伝子である請求項１から１０のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ａｃｃｇｇａｇｃＡｃａｇｃａｃｔｔ−３'なる配列のうちＡがＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ａｃｃｇｇａｇｃＴｃａｇｃａｃｔｔ−３'なる配列のうちＴがＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'− ｔｔｔｇｇｃｃＣｇｃｃｃａａ−３'なる配列のうちＣがＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ａｃｃｃａｇｃＴｇｔｔｔＧｇ−３'なる配列のうちＴとＧがＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'− ｃｔａｔｃａａａａｃａｔｃｔｃｃｇａａａｇｃ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１７】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ｃｇｃｔａｔｃａａｇａｃａｔｃｔｃｃｇ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１８】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'− ｃｔａｔｃａａｇｇａａｔｃａｔｃｔｃｃ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ｃｔａｔｃａａｇｇａａｔｃｇａａａｇｃｃａ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項２０】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ａｔｃａａｇｇａａｃｃａａｃａｔｃｔｃｃ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項２１】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ｔａｔｃａａｇｇｔｔｃｃｇａａａｇｃｃａ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項２２】
請求項１１に記載の方法に用いる変異プローブであって、５'−ａｇａｇａａｇｃａａｃａｃｔｃｇａｔ−３'なる配列のうち少なくとも１つ以上がＬＮＡに置換されたポリヌクレオチド
【請求項２３】
請求項１１に記載の方法に用いるクランププライマーであって、ＮＨ２−ＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴ−ＣＯＮＨ２なる配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチド
【請求項２４】
請求項１１に記載の方法に用いるクランププライマーであって、ＮＨ２− ＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡ−ＣＯＮＨ２なる配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチド
【請求項２５】
請求項１１に記載の方法に用いるクランププライマーであって、ＮＨ２−ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ−ＣＯＮＨ２なる配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチド
【請求項２６】
請求項１１に記載の方法に用いるクランププライマーであって、ＮＨ２−ＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣ−ＣＯＮＨ２なる配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチド
【請求項２７】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２３に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項２８】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２３に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２５に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３０】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２６に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３１】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３２】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３３】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３４】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３５】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３６】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３７】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３８】
遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に後述する変異プローブよりも優先的にハイブリダイゼーションするクランププライマーと、
変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に前記クランププライマーよりも優先的にハイブリダイゼーションする変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。
【請求項３９】
遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、
変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、
遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＮＡからなるクランププライマーとＬＮＡを含む変異プローブとを用いて野生型遺伝子群に混在する既知の変異遺伝子を検出する方法と、当該方法によりヒト上皮成長因子受容体の変異遺伝子を特異的に検出する変異プローブとクランププライマーの提供、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は心疾患、脳血管疾患と並ぶ三大生活習慣病の一つであり、現在日本における最大の死因となっている。癌発生は通常人体を構成する一部の細胞が癌化して、癌細胞となることに端を発する。多くの場合、細胞の癌化は細胞分裂や細胞増殖等に関与する遺伝子の突然変異に起因している。このような癌の原因となる遺伝子の突然変異は、遺伝子の塩基配列上の一つの塩基が他の塩基に置換した点突然変異であることが多い。
【０００３】
癌の早期治療のためには、癌細胞の早期発見が重要となる。癌細胞の有無は通常、検体から病理組織切片や細胞を採取し、固定、染色後に細胞検査士等によって顕微鏡下で診断される。しかし、このような病理診断法は組織形態学の専門的な知識と技術が必要とされる上に、結果が出るまでに数日を要し、また大量な処理が困難であるという問題点があった。そこで近年、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を応用して癌細胞を遺伝子レベルで迅速、かつ簡便に検出する方法が開発されている。例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の核酸類似体をプライマーやプローブとして用いた変異遺伝子検出法が挙げられる。
【０００４】
ＰＮＡとは、ペプチド核酸とも呼ばれる人工的に化学合成された核酸類似物である。五単糖とリン酸から構成される核酸の基本骨格を、グリシンを単位とする電荷の無いポリアミド骨格に置換した構造をもつ。相補的な塩基配列を有する核酸に対してＤＮＡやＲＮＡよりも特異的、かつ強力に結合する。一方で、化学合成物質であることから核酸ポリメラーゼやヌクレアーゼが作用しない性質を有する。このような性質を利用して、非特許文献１のように、野生型ｒａｓ遺伝子に特異的なＰＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲ法を行うことで野生型遺伝子を抑制し、変異遺伝子のみを選択的に増幅させる方法等が知られている。
【０００５】
ＬＮＡは、ロックド核酸とも呼ばれる核酸類似体であり（特許文献１）、リボヌクレオシドのリボース環の２'−酸素と４'−炭素間のメチレン結合によってリンクされた構造をもつ分子の総称である。ＰＮＡと同様に相補的な塩基配列を有する核酸に対して親和性が高く、ＤＮＡやＲＮＡよりも特異的、かつ強力に結合する。一方、ＰＮＡと異なり、ヌクレアーゼに対する感受性を有する他、核酸ポリメラーゼのプライマーとしても機能し得る。このような性質を利用して、非特許文献２のように、ＬＮＡプローブを用いて静脈血栓塞栓症の発症率を高めるＶ因子ライデン変異（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）をＰＣＲ法によって検出する方法も報告されている。
【０００６】
しかし、通常検体から得られる細胞集団の大多数は野生型の遺伝子を有する正常細胞であり、変異遺伝子を有する癌細胞は極僅かに混在するに過ぎない。したがって、上記のような遺伝子増幅法を用いた変異遺伝子検出法を行ったとしても、野生型遺伝子のバックグラウンドが高いために検出感度が低く、また結果の信頼性も十分とは言い難かった。そのため実際臨床で遺伝子検査として使用するにはまだ多くの問題を残していた。しかし、このような多数の野生型遺伝子から変異遺伝子を検出する技術は、癌の早期発見のみならず、臨床上の癌治療においても極めて重要な意味を持つ。その顕著な例が、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：以下ＮＳＣＬＣとする）に対する分子標的薬ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ：商品名「イレッサ」Ｉｒｅｓｓａ）の感受性である。
【０００７】
ＮＳＣＬＳは、肺癌症例の約７５％を占める疾患である。進行性が速いことから半数以上の患者は癌発見時に手術不能な状態であることが多く、また死亡率も高い。このような進行性肺癌には通常抗がん剤としてプラチナ製剤やドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）を用いた化学療法と放射線療法の併用による治療が行われるが、一部の例を除き十分な効果はあげられていない。（非特許文献３）
【０００８】
ゲフィチニブは英国アストラゼネカ社が開発した経口抗癌治療剤である。従来の抗がん剤の作用がＤＮＡ合成や細胞分裂を広く阻害するのに対して、ゲフィチニブは、ヒト上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下ＥＧＦＲとする）を標的とする。ＥＧＦＲは、細胞外ドメインに上皮成長因子（ＥＦＧ）等のリガンドが結合すると二量体を形成し、細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化が起きる。この活性によって自己リン酸化が引き起こされ、下流の細胞内シグナル伝達経路が作動される。ＥＧＦＲの活性化が細胞増殖に関与することや、ＮＳＣＬＣ患者の多くでＥＧＦＲ遺伝子の突然変異が確認されていること、そしてＮＳＣＬＣ患者ではＥＧＦＲタンパク質の過剰発現が見出されること等の結果から、ＥＧＦＲ遺伝子の変異がＮＳＣＬＣの発症の一因であると考えられている。ゲフィチニブは、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害することでシグナルの伝達を遮断する作用を持つために分子標的剤と呼ばれている。
【０００９】
ゲフィチニブは日本では２００２年に承認された。当該治療剤の投与によって一部のＮＳＣＬＣ患者は劇的な治療効果が現れている。一方で、間質性肺炎等の副作用により死亡するという例も発生している。ゲフィチニブのこのような作用効果の二面性については、未だに原因は不明であるが、近年になって非特許文献４、及び５において、ＥＧＦＲの遺伝子変異とゲフィチニブの有効性の密接な関係が発表された。これらの文献によれば、ゲフィチニブの投与によって良好な治療効果が得られたＮＳＣＬＣ患者（ゲフィチニブ感受性患者）は、いずれもＥＧＦＲ遺伝子上の特定の位置に変異を有していた。すなわち、ゲフィチニブはＥＧＦＲの活性阻害剤としてではなく、変異したＥＧＦＲの活性阻害剤として作用することが示唆された。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子上の特定の変異の有無を検出することができれば、ＮＳＣＬＣ患者へのゲフィチニブ投与の是非を検索することが可能となる。
【００１０】
上記の例のように、野生型遺伝子群に混在する変異遺伝子の検出は、癌の早期発見や個々の患者に応じたテーラーメイド治療を実現化する上で極めて重要であり、そのような変異遺伝子を簡便に、かつ高感度に検出できる方法の開発が望まれている。
【特許文献１】特表２００２−５２１３１０
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｄｅ  C．  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  ２４，９８３−９８４
【非特許文献２】Ｏｒｕｍ  H．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  ４５：１１；１８９８−１９０５
【非特許文献３】Ｍｕｈｓｉｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００３，２（７）；５１５−５１６．
【非特許文献４】Ｐａｅｚ  G．J．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００４，  ３０４；１４９７−１５００
【非特許文献５】Ｌｙｎｃｈ  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００４，３５０； ２１２９−２１３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、係る問題点に鑑み、野生型遺伝子群に混在する変異遺伝子を迅速、かつ簡便に、そして高感度に検出できる方法の提供を目的とする。また、当該方法を用いてＥＧＦＲ変異遺伝子を検出するに当たり、高感度で信頼性の高い結果が得られる条件の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、標的部位に対して、野生型遺伝子の配列を有するＰＮＡからなるクランププライマーと、ＬＮＡを含み変異遺伝子の配列からなる変異プローブを用いて遺伝子増幅反応を行うことにより、ＰＮＡからなるクランププライマーやＬＮＡ変異プローブをそれぞれ独で使用して遺伝子増幅反応を行った時よりも変異遺伝子の検出感度が飛躍的に向上することを見出した。本発明は、係る発見に基づいて完成された変異遺伝子検出方法を提供する。また、本発明者らは前記変異遺伝子検出方法により既知のＥＧＦＲ遺伝子の変異を特異的、かつ高感度に検出できる変異プライマーと、クランププライマーを見出した。さらに高い検出効果の得られるこれらの変異プライマーとクランププライマーの組み合わせの方法を見出した。本発明は、そのような発見に基づいて完成されたＥＧＦＲの変異遺伝子の検出法と、それに使用する変異プライマーとクランププライマーを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の有無を迅速に、また簡便に、また高精度に、そして高感度に検出することができる。すなわち、本発明によれば、遺伝子プールにおける変異遺伝子の混在率が０．１％でも検出が可能であり、また、増幅反応に伴うバックグラウンドの出現はほとんど検出されない。さらに結果が出るまでに要する時間は約２時間で済む。その上、本発明の変異プローブとクランププライマーを用いれば既知のＥＧＦＲ遺伝子の変異を特異的、かつ高感度に検出可能することが可能である。当該検出方法を「ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法」と呼ぶ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、各発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
【００１５】
<実施形態１>  実施形態１について説明する。本実施形態は、主に請求項１に関する。本実施形態の概要は、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法である。
【００１６】
実施形態１の要件について説明する。まず、本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、遺伝子発現、コード、相補、鋳型、プロモーター、プローブ、プライマー、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１７】
本発明において「野生型遺伝子」とは、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む遺伝子である。ここで言う遺伝情報とは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
【００１８】
本発明において「変異遺伝子」とは、変異を生じた遺伝子である。「変異」とはＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異遺伝子において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異遺伝子が機能上の変化を有する必要はない。
【００１９】
本発明において「遺伝子プール」とは、多数の遺伝子から構成される遺伝子集団を言う。例えば、患者の胸水に含まれる全細胞から得られるゲノムＤＮＡ等が該当する。このとき、検出の対象である遺伝子における変異遺伝子の存在率は問わない。例えば、１００％が野生型遺伝子であってもよいし、５０%が野生型遺伝子で残り５０％が変異遺伝子であってもよい。また、当該プールの遺伝子は、細胞から得られるゲノムＤＮＡであってもよいし、細胞から調製されたｍＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡであってもよいし、クローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよい。
【００２０】
本発明において「配列」とは、遺伝子、またはプライマー、またはプローブにおける塩基の並びである塩基配列をいう。当該塩基配列はＤＮＡやＲＮＡ等の核酸によって構成されていてもよいし、核酸でＰＮＡやＬＮＡ等の核酸類似体から構成されていてもよいし、またそれらの組み合わせから構成されていてもよい。本発明においては、例えばその塩基配列が特にＤＮＡで構成されている場合は「ＤＮＡ配列」とし、またその塩基配列がＰＮＡで構成されている場合は「ＰＮＡ配列」とする。また、本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＰＮＡ、またはＬＮＡ、あるいはその組み合わせによって構成されているものをいう。
【００２１】
本発明において「標的部位」とは、変異遺伝子において変異が見られる塩基が存在する部位、若しくは変異によって塩基が失われた部位であり、野生型遺伝子を含め、本発明において検出の標的とする部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型遺伝子、変異遺伝子共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異遺伝子においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異遺伝子で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異遺伝子においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型遺伝子においては変異遺伝子で失われた塩基が該当する。当該標的部位の配列は、遺伝情報をコードする配列を有する側（以下センス側とする）を示すものであってもよいし、センス側に対して相補的な配列を有する側（以下アンチセンス側とする）を示すものであってもよい。
【００２２】
本発明において「ＰＮＡ」とは、通常のＰＮＡだけでなく、ＰＮＡを基礎として改良されたＰＮＡに類似の性質を有するＰＮＡ誘導体を含むものとする。例えば、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  社のｇｒｉｐＮＡ等が該当する。
【００２３】
本発明において「クランププライマー」とは、標的部位にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるプライマーをいう。当該クランププライマーは、全配列がＰＮＡによって構成されている。したがって、プライマーとしてハイブリダイゼーションする際に、ＰＮＡの性質により塩基配列に対する非常に高い選択性を示す。また、ＰＮＡが核酸ポリメラーゼやヌクレアーゼに作用しない性質から、当該クランププライマーもプライマーとして機能せず、ヌクレアーゼに対しても完全な耐性を有する。本実施形態においては、当該クランププライマーの塩基配列が野生型遺伝子の配列に相補的な配列であることを特徴とする。当該クランププライマーの塩基配列は標的部位の一部、または全部と特異的にハイブリダイゼーションするものであれば、特に限定はされない。クランププライマーの長さは、１０塩基から２５塩基であれば特に問わない。遺伝子プール中には変異遺伝子の数よりも野生型遺伝子の数が多いことから、クランププライマーが野生型遺伝子に十分にハイブリダイゼーションできるために、遺伝子増幅用反応液中でクランププライマーの濃度が変異プローブの濃度の１０倍以上あることが好ましい。例えば変異プローブの濃度を１００ｎＭとするとき、クランププライマーの濃度は１μＭ、好ましくは５μＭ程度にすることである。なお、クランププライマーの合成はＰＮＡオリゴの委託合成を行っている各業者に委託してもよい。例えば、グライナージャパン社に委託してもよい。
【００２４】
本発明において「ＬＮＡ」とは、通常のオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ等のＬＮＡ変異体はもちろんのこと、ＬＮＡを基礎として改良されたＬＮＡに類似の性質を有するＬＮＡ誘導体の含むものとする。
【００２５】
本発明において「変異プローブ」とは、標的部位にハイブリダイゼーションし、ＤＮＡ配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換された変異プローブである。本実施形態においては、当該変異プローブの塩基配列が変異遺伝子の配列に相補的な配列であることを特徴とする。当該変異プローブの塩基配列は標的部位の一部、または全部と特異的にハイブリダイゼーションし、Ｔｍ値が好ましくは５４℃から５６℃の範囲内であれば特に限定はされない。変異プローブの配列は、マニュアルでデザインし、Ｔｍ値をＬＮＡ  Ｔｍ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ:／／ｌｎａ−ｔｍ．ｃｏｍ／）で確認することが好ましい。当該変異プローブの塩基数は１０塩基から５０塩基であり、好ましくは１５塩基から２５塩基である。ＬＮＡの数は１つ以上存在すればよく、全てがＬＮＡに置換されていてもよい。当該変異プローブにおいてＬＮＡと置換する位置については、標的部位において野生型遺伝子では見られない塩基が存在する場合には、当該塩基の少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。例えば、変異が数塩基の挿入の場合には、挿入された数塩基のうち少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換するとよい。変異プローブの合成はＬＮＡオリゴの委託合成を行っている各業者に委託してもよい。例えば、オランダＥｘｉｃｏｎ社や米国Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社等であってもよい。
【００２６】
本発明において「遺伝子増幅法」とは、増幅プライマーを用いて標的部位を含む検出領域を増幅する方法である。本実施形態で使用する遺伝子増幅反応は、検出領域を増幅できれば特に問わない。例えば、ＰＣＲ法であってもよいし、ＩＣＡＮ法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ法）であってもよいし、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｅｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法）であってもよい。当該遺伝子増幅法において、遺伝子増幅を行うための化学反応を「遺伝子増幅反応」という。
【００２７】
本発明において「遺伝子増幅用反応液」とは、前記遺伝子増幅法において遺伝子増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。当該遺伝子増幅用反応液の組成は、使用する遺伝子増幅法によって多少異なるが、通常は基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、伸長用のプライマーとしての増幅プライマーと、をバッファー中に含むことを基本とする。前記ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００ｎＭから４００ｎＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。前記ＤＮＡポリメラーゼは、当該遺伝子増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＬＡＭＰ法であれば鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用するのがよい。前記マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１ｍＭから６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００２８】
前記「増幅プライマー」とは、遺伝子増幅法で検出領域を増幅するために用いられるプライマーである。増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、またはＬＮＡ、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が１００ｎＭから１μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
この場合は、変異プローブの５'側である上流にハイブリダイゼーションする増幅プライマーが無いことが好ましい。また、この場合には、プライマーの配列中に標的部位を含んでいてもよい。増幅プライマーの数は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であれば特に問わない。例えば、１つのプライマーが、伸長する方向が向かい合うように単独でハイブリダイゼーションできる場合には、増幅プライマーの数は１つであってもよい。また、伸長する方向がお互いに向かい合う形で鋳型にハイブリダイゼーションできるばあいであれば、異なる１つの増幅プライマーであってもよい。増幅プライマーの塩基数は、１０塩基から４０塩基の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１５塩基から３０塩基であり、特に好ましくは１８塩基から２５塩基である。増幅プライマー間の距離、すなわち検出領域は１００塩基から５０００塩基（５ｋｂ：以下１０００塩基を１ｋｂで表す）の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１５０塩基から２ｋｂである。増幅プライマーの配列は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が５０℃から６５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６０℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｈｔｔｐ:／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）等を用いてもよい。前記変異プローブが増幅プライマーとして機能してもよい。
バッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する遺伝子増幅法によっては、さらにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、遺伝子増幅用反応液は、各遺伝増幅法の反応用として様々なタイプが市販されているが、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを酵素とする場合、当該遺伝子増幅用反応液の組成の基本的な一例を挙げれば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。もちろん、この条件に限られるものではない。
【００２９】
本発明において「検出領域」とは、前記増幅プライマーを用いて前記遺伝子増幅反応を行った結果増幅される標的部位を含む領域である。検出領域の増幅産物は、増幅プライマーに由来する部分を除けばＤＮＡ配列からなる断片として増幅される。本発明によれば、検出領域は変異遺伝子由来のものが選択的に増幅される。したがって、当該検出領域の増幅産物を以降の増幅した核酸の検出に用いてもよい。
【００３０】
本発明において「共存」とは、遺伝子増幅用反応液中で共に存在し、お互いが影響し得る状態にあることをいう。
【００３１】
本実施形態の原理を図１で例示し、以下で説明する。なお、図１の例は変異遺伝子の変異が点突然変異で、遺伝子増幅反応がＰＣＲ法の場合を示している。
【００３２】
（プローブ、およびプライマーの鋳型へのハイブリダゼーション）  まず、野生型遺伝子（０１０３）の標的部位（０１０１）に相補的な配列であるＰＮＡからなるクランププライマー（０１０５）と、変異遺伝子（０１０４）の標的部位（０１０２）に相補的な配列で、かつＬＮＡを含むＤＮＡからなる変異プローブ（０１０６）とを、増幅用プライマー（０１０７）、及び遺伝子プールと共に遺伝子増幅用反応液中に共存させる。通常野生型遺伝子は、遺伝子プール中に多数存在することからクランププライマーは、やや過剰に加えておく。これによって、クランププライマーと、変異プローブと、増幅用プライマーは、検出の対象である遺伝子上のそれぞれに相補的な配列上にハイブリダイゼーションする。標的部位が同じことからクランププライマーと変異プローブは、全部または、一部の塩基配列がお互いに一致する。したがって標的部位への両者のハイブリダイゼーションは本来競合し合う。しかし、ＰＮＡとＬＮＡは相補的な塩基配列に対してそれぞれ高い特異性を有することから、変異がわずか１塩基の相違であっても、実際には図１（Ａ）のようにクランププライマーの大多数は野生型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションし、また変異プローブの大多数は変異型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションする。
【００３３】
（プライマー伸張反応）  次に、当該遺伝子増幅用反応液に対して遺伝子増幅法によりプライマーの伸長反応を行う。図１（Ｂ）で示すようにクランププライマーはプライマーとして機能しないため伸張反応は生じない。したがって、野生型遺伝子の標的部位を含む検出領域の増幅は、クランププライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。一方、ＬＮＡにはＰＮＡのようなプライマー伸長を阻害する性質はない。つまり、変異プローブは、プライマーとして機能し得ることから伸長反応が起こり、図１（Ｃ）のように増幅プライマーとの間で、変異遺伝子の標的部位を含む検出領域が増幅される。
【００３４】
（遺伝子増幅反応サイクル）  伸長反応終了後、クランププライマーと、変異プローブと、増幅用プライマーを、検出の対象である遺伝子上のそれぞれに相補的な配列上に再びハイブリダイゼーションさせる。再ハイブリダイゼーションの反応は、例えば、ＰＣＲ法の場合は９０℃前後にまで加熱させる熱変性処理を加えるが、この処理は遺伝子増幅法によっては必ずしも必要としない。例えば、ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法のように５０℃から６５℃の一定温度で増幅可能な場合が該当する。遺伝子増幅法により遺伝子増幅反応のサイクルを繰り返すことで変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることができる。サイクル数は遺伝子増幅法によって、あるいは使用するＤＮＡポリメラーゼの種類によって異なるが、３０サイクルから５５サイクルの範囲であれば特に問わない。好ましくは３５サイクルから５０サイクル、特に好ましくは４０サイクルから４５サイクルである。
【００３５】
（増幅産物の検出）  記遺伝子増幅法によって、増幅された変異遺伝子の検出領域の検出を行う。当該検出法については変異遺伝子の検出領域の増幅が確認できれば、その検出方法については問わない。例えば、遺伝子増幅反応後の溶液をフェノール・クロロホルム（１：１）溶液で除タンパク処理後、水層を直接か、あるいはエタノール沈殿や適当な精製キットを用いて精製した後、波長２６０nｍの吸光度を吸光光度計を用いて測定してもよいし、増幅産物を電気泳動によりアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで展開した後、適当なプローブを用いてサザンハイブリ法によって検出してもよいし、金ナノ粒子を用いたクロマトハイブリ法によって検出してもよいし、増幅した遺伝子による溶液の濁度を測定してもよい。または増幅プライマーの５'末端を予め蛍光標識しておき、遺伝子増幅反応後にアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、イメージングプレートに蛍光発光を取り込み、適当な検出装置を用いて検出してもよい。以上の検出方法は、前記コントロールの他、それぞれに適当なコントロールの結果と比較することで、より信用性の高い結果を得ることができる。また、シークエンシングにより増幅産物における変異遺伝子の標的部位の存在を確認することで、さらに正確な結果を得ることができる。
【００３６】
<実施形態２>  実施形態２について説明する。本実施形態は、主に請求項２に関する。本実施形態の概要は、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させて遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることにより該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法である。
【００３７】
すなわち、前期実施形態１が検出の対象とする遺伝子のセンス側の配列を鋳型として変異遺伝子を検出する方法であるのに対して、本実施形態は、検出の対象とする遺伝子のアンチセンス側の配列を鋳型として変異遺伝子を検出する方法である。したがって、本実施形態においては、当該クランププライマーの塩基配列が野生型遺伝子のセンス側と同じ配列であることを特徴とする。さらに、当該変異プローブの塩基配列が変異遺伝子のセンス側と同じ配列であることを特徴とする。これは、本発明の変異遺伝子の検出に用いる鋳型は、センス側の配列に限定されるものではなく、アンチセンス側の配列でも使用できることによる。実施形態１とはこの点のみが異なり、その他の要件や原理に関しては実施形態１と同じであることからここではその説明を省略する。
【００３８】
したがって、本発明において鋳型の配列はセンス側とアンチセンス側のいずれを使用してもよい。好ましくは本発明で用いるクランププライマーの配列中のプリン残基の数が少ない側，またはグアニン残基が3つ以上連続しない側にしてもよい．これは，プリン残基の数が増加，またはグアニン残基が3つ以上連続するとPNAの溶解が困難になる事に起因する
【００３９】
<実施形態３>  実施形態３について説明する。本実施形態は、主に請求項３に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１または２の方法を基本として、さらに遺伝子増幅法がＰＣＲ法である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１と同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００４０】
本発明における「ＰＣＲ法」は、最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法の他に、それを基礎として開発されたＰＣＲ法のバリエーション方法も含むものとする。例えば、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法等が該当する。
【００４１】
本実施形態の遺伝子増幅用反応液の条件は、実施形態１の遺伝子増幅用反応液の条件と同様であるので、ここではその説明を省略し、本実施形態に特徴的な方法を以下で説明する。
【００４２】
当該ＰＣＲ法で使用するＤＮＡポリメラーゼの種類は、増幅プライマーを伸長する活性を有するものであれば、特に問わないが、好ましくは熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの他、バイオサイエンス関連の各社が独自に開発している各種熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。
【００４３】
一のサイクルの反応は、熱変性とアニーリング／伸長反応からなる２ステップＰＣＲであってもよいし、熱変性とアニーリングと伸長反応からなる３ステップＰＣＲであってもよい。
【００４４】
また、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を使用する場合、２度目の遺伝子増幅反応の条件は、最初の反応に用いた増幅プライマー（以下、アウター増幅プライマーとする）に代えて、２度目の反応に用いる増幅プライマー（以下、インナー増幅プライマーとする）を使用する点と、最初の遺伝子増幅反応後の遺伝子増幅用反応液を希釈したものを鋳型として用いる点を除けば、非特異的な増幅産物の増幅を抑制することができれば、特に問わない。例えば、最初の反応条件と同じでもよいし、増幅産物の量等に基づいて反応サイクル数を増減する等適宜変更してもよい。１組のインナー増幅プライマーは、少なくとも一方の配列がアウター増幅プライマーの配列よりも１塩基以上３'側（下流側）にあればよい。例えば、一方のインナー増幅プライマーの配列は、アウター増幅プライマーの配列と同一であってもよいし、いずれのインナー増幅プライマーの配列も、アウター増幅プライマーの配列とほとんど重複していてもよい。最初の遺伝子増幅反応後の遺伝子増幅用反応液の希釈は、１／１０７倍から１／１０５倍の範囲で最適な条件を検討すればよい。好ましくは５／１０７倍から５／１０６倍の範囲内である。
【００４５】
ＰＣＲ法は最も広く用いられている遺伝子増幅法であることから当該方法に最適化された様々試薬や機器等が容易に入手できるだけでなく、当該方法に基づいた革新的な技術も多く、汎用性が極めて高い。また、分子生物学、遺伝子工学を行う通常の研究室や検査室では、ＰＣＲ法に必要な試薬や機器が既に設置されていることが多く、新たな試薬や危機の購入を必要としない点からも便利である。
【００４６】
<実施形態４>  実施形態４は、主に請求項４に関する。本実施形態の概要は、実施形態１から３のいずれか一の方法を基本として、さらに変異プローブがＲＮＡを含むことを特徴とする変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から３のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００４７】
本実施形態は、変異プローブの一部がＲＮＡを含む。これによって、例えば後述の実施形態５において変異プローブが増幅産物にハイブリダイゼーションを形成した際に、ＲＮａｓｅＨで処理することにより、当該ＲＮＡが分解されて蛍光物質とクエンチャーが分離することによって蛍光物質の抑制が解除され、蛍光を発することができる。これによって生じる蛍光を測定することで変異遺伝子を検出できる等便利である。
【００４８】
<<実施形態５>>  実施形態５について説明する。本実施形態は、主に請求項５に関する。本実施形態の概要は、実施形態１から４のいずれか一の方法を基本として、さらに変異プローブは一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から４のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００４９】
本発明において「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を言う。標識に用いる蛍光物質は、変異プローブの末端に標識可能なものであれば、特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ等いずれであってもよい。
【００５０】
本発明において「クエンチャー」とは蛍光物質の励起エネルギー吸収物質等をいう。使用する種類はＢＨＱ１、ＢＨＱ２、Ｄａｂｃｙｌ等いずれであってもよい。ただし、当該抑制する物質の種類によって蛍光の抑制範囲が異なるため、一の変異プローブ上で組となる蛍光物質の発光を抑制できるクエンチャーの種類を選択する必要がある。発光を抑制できる選択範囲内では特に問わない。例えば、蛍光物質がＦＡＭやＴＥＴの場合には、抑制範囲の波長がやや短波寄り（４８０ｎｍ〜５８０nm）のＢＨＱ１を、また蛍光物質がＣｙ３やＴｅｘａｓ  ｒｅｄの場合には、抑制範囲の波長がやや長波寄り（５５０ｎｍ〜６５０nm）のＢＨＱ２を、選択してもよい。
【００５１】
本発明において「末端」とは変異プローブの塩基配列における５'末端、あるいは３'末端を言う。
【００５２】
本発明において「標識され」とは、前記蛍光物質、およびクエンチャーが化学結合によって変異プローブの末端部に付されていることを言う。すなわち、前記蛍光物質と前記クエンチャーのうち、いずれか一方は５'末端に、また他方は３'末端に化学的に結合されていることを意味する。通常５'末端に蛍光物質が結合していることが多いが、同様の効果が得られるのであれば３'末端に蛍光物質が結合していても、特に問わない。また、３'末端にクエンチャー、あるいは蛍光物質が結合している場合には、変異プローブは増幅用プライマーとしては機能しない。クエンチャーや蛍光物質が伸長反応を阻害するためである。したがって、この場合には、変異プローブの５'側である上流にハイブリダイゼーションする増幅プライマーが少なくとも一つは必要となる。さらに、標的部位にハイブリダイゼーションしている変異プローブが当該増幅プライマーの伸長を妨げることの無いよう、遺伝子増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼが５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するようにすることが望ましい。
【００５３】
（実施形態５の検出方法）  本実施形態における検出方法は、前記蛍光物質から発する蛍光を利用することが好ましい。しかし、本実施形態の変異プローブは、通常状態では一の末端に標識された蛍光物質に励起光を照射しても、他の末端に存在するクエンチャーの抑制により蛍光を発しない。したがって、本実施形態で蛍光を利用するためには、クエンチャーによる抑制を解除する必要がある。クエンチャーによる解除ができれば、方法は特に問わない。例えば、５'末端が蛍光物質で標識されている変異プローブにおいて、当該変異プローブの上流にハイブリダイゼーションする増幅用プライマーと、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを遺伝子増幅用反応液に加え、ＰＣＲ法によって遺伝子増幅反応を行うことで、ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により変異プローブが分解され、蛍光物質が変異プローブから遊離することでクエンチャーによる抑制を解除するようにしてもよい。あるいは、前記実施形態４で述べたように変異プローブの一部をＲＮＡで構成することで、ＲＮａｓｅＨの活性を利用して解除してもよい。
【００５４】
本実施形態の検出の原理の一例を図２で例示し、以下で説明する。なお、図２の例は変異遺伝子の変異が点突然変異で、遺伝子増幅反応が５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法の場合を示している。
【００５５】
（プローブ、およびプライマーの鋳型へのハイブリダゼーション）  まず、野生型遺伝子（０２０３）の標的部位（０２０１）に相補的な配列であるＰＮＡからなるクランププライマー（０２０５）と、変異遺伝子（０２０４）の標的部位（０２０２）に相補的な配列で、かつＬＮＡを含むＤＮＡからなる変異プローブ（０２０６）とを、２種の増幅用プライマー（０２０７）、及び遺伝子プールと共に遺伝子増幅用反応液中に共存させる。この時変異プローブは５'側に蛍光物質（０２０９）が、また３'側にクエンチャー（０２１０）がそれぞれ結合している。通常はクエンチャーが蛍光物質の蛍光発光を抑制している。前記図１の説明と同様に、ＰＮＡとＬＮＡの相補配列に対する強い特異性から、変異がわずか１塩基の相違であっても、図２（Ａ）のようにクランププライマーの大多数は野生型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションし、また変異プローブの大多数は変異型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションする。
【００５６】
（プライマー伸張反応）  次に、当該遺伝子増幅用反応液に対して遺伝子増幅法によりプライマーの伸長反応を行う。図２（Ｂ）で示すようにクランププライマーはプライマーとして機能しないため伸張反応は生じない。また、ＰＮＡのヌクレアーゼ耐性により、伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような５'→３'エキソヌクレアーゼ活性（０２０８）を有する場合であっても、その分解を受けない。したがって、野生型遺伝子の標的部位を含む検出領域の増幅は、例えクランププライマーを挟み込むようにデザインした増幅用プライマー２種を共存させていたとしても、クランププライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。一方、ＬＮＡにはＰＮＡのようなプライマー伸長を阻害する性質や、核酸ヌクレアーゼに対する耐性はない。ただし、変異プローブの３'側にはクエンチャーが結合しているために伸長反応は阻害される。したがって、この場合は２種の増幅用プライマー（０２０７）間で伸長反応が起こる。すなわち、伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性によって変異プライマーは分解され、増幅プライマー間で、変異遺伝子の標的部位を含む検出領域が増幅される。この、分解によって蛍光物質は遊離し、クエンチャーによる抑制が解除される。この遊離した蛍光物質から発せられる蛍光物質を検出することにより、増幅した変異遺伝子を検出できる。
【００５７】
<実施形態６>  実施形態６について説明する。本実施形態は、主に請求項６に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から４のいずれか一を基本として、さらに前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を核酸染色剤で染色する変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から３のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００５８】
本発明において「核酸染色剤」とは、核酸、または核酸類似体に結合、若しくは挿入してそれらを染色する試薬を総称して言う。例えば、２本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして核酸の染色を行うインターカレーターが該当する。インターカレーターも多くの種類が知られている。例えば、エチジウムブロマイド（ＥＢ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、各種Ｈｏｅｃｈｓｔ、各種ＳＹＢＲ、各種ＳＹＮＴＯＸ、各種ＴＯＴＯ等があるが、当該増幅産物を染色する場合には、十分に染色できればその種類は特に問わない。
【００５９】
本発明において「染色」とは、目視によって確認できるような増幅産物の呈色を意味するだけでなく、励起光を照射することで染色が確認できる蛍光染色も含むものとする。
【００６０】
（実施形態６の検出方法）  核酸染色剤は、前記インターカレーターを始めとして、いずれも特定波長の励起光を照射することにより特有の蛍光を発する。したがって、本実施形態における検出方法は、この蛍光発光を利用できるようにすることが好ましい。染色の方法や時期は、結果として染色できれば特に問わない。例えば、遺伝子増幅反応後に核酸染色剤を溶解した染色液中に浸漬して染色してもよいし、反応中に染色してもよい。検出の方法は、染色した増幅産物を検出できれば特に特に問わない。例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、核酸染色剤で染色したゲルをトランスイルミネーター上で励起光を照射し、予想される増幅産物のサイズの位置のバンドとコントロールのバンドとを目視により比較確認してもよいし、ライトキャプチャー（化学発光・蛍光撮影装置）によって蛍光物質から発する発光を検出した後、解析ソフトを用いてコントロールとの蛍光強度の比較定量を行うこと検出してもよい。
【００６１】
<実施形態７>  実施形態７について説明する。本実施形態は、主に請求項７に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から６のいずれか一の方法を基本として、さらに変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を蛍光強度の増加によって経時的に検出する変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から５のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００６２】
本発明における「経時的」とは、時間経過的であることを意味する。したがって、「増幅産物の増加を経時的に検出する」とは、増幅産物の増加を遺伝子増幅反応の時間経過を追って検出することを言う。
【００６３】
検出は「蛍光強度の増加」によって行われる。ここで言う、「蛍光」は、実施形態５で述べた蛍光物質や実施形態６で述べた核酸染色剤が励起されて基底状態に戻る際に発する蛍光等をいう。
【００６４】
（実施形態７の検出方法）  本実施形態の検出法については、増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出できれば、その検出方法については問わない。例えば、実施形態５で述べたように、末端を蛍光ラベルした変異プローブが、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解され５'が遊離することで発せられる蛍光をリアルタイムで検出してもよい（ＴａｑＭａｎプローブ法）。または、末端を蛍光ラベルしたＲＮＡを含む変異プローブが、ＲＮａｓｅＨの添加によりその活性でＲＮＡ部分が分解されることで発せられる蛍光をリアルタイムで検出してもよい（サイクリングプローブ法）。あるいは、実施形態６のようにＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の核酸染色剤を遺伝子増幅用反応液中に加えて、遺伝子増幅反応とともに染色する。増幅産物の増加をインターカレートした当該核酸染色剤から発せられる蛍光の強度を励起光を照射しながら測定してもよい。
【００６５】
<実施形態８>  実施形態８について説明する。本実施形態は、主に請求項８に関する。本実施形態の要は、前記実施形態１から７のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異が点突然変異である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から６のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００６６】
本発明において「点突然変異」とは、検出の対象である遺伝子に関して塩基配列上の１塩基が置換した変異だけでなく、１塩基が挿入した変異を含むものとする。したがって、当該点突然変異においては１塩基の置換、若しくは挿入がされた部位が、標的部位となる。
【００６７】
本実施形態で使用する変異プローブは、標的部位が変異遺伝子の配列を有し、かつ少なくとも標的部位はＬＮＡで置換されていることを特徴とする。例えば、変異が１塩基置換で実施形態１を基本とする場合には、当該変異プローブの配列は変異遺伝子に相補的配列であり、さらに少なくとも置換された当該１塩基の配列がＬＮＡで置換されていることが該当する。これにより野生型遺伝子と変異遺伝子が僅か一塩基の相違であっても、変異プローブは変異遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションすることが可能である。また、野生型遺伝子の配列を有するクランププライマーは、当該変異遺伝子に対してハイブリダイゼーションすることが困難となり、標的部位に対する変異プローブとクランププライマーの配列特異性が明確になる。
【００６８】
<実施形態９>  実施形態９について説明する。本実施形態は、主に請求項９に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から７のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異が欠失変異である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から７のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００６９】
本発明において「欠失変異」とは、検出の対象である遺伝子に関して野生型遺伝子の塩基配列上の一塩基が失われた場合、若しくは二塩基以上の連続性が失われた変異をいう。したがって、遺伝学上の欠失の意味に留まらない。例えば、染色体の転座や逆位、あるいはレトロウィルスの挿入等によって検出の対象である遺伝子が分断された場合も該当する。したがって、当該欠失変異においては、野生型遺伝子の塩基配列上の一塩基が失われた部位、若しくは二塩基以上の連続性が失われた部位が標的部位となる。
【００７０】
本実施形態で使用する変異プローブは、標的部位が変異遺伝子の配列を有し、かつ変異プローブの配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで置換されている。特に、標的部位において野生型遺伝子では見られない特異な塩基配列が存在する場合には、当該特異な塩基配列のうち少なくとも一つ以上はＬＮＡで置換されていることが好ましい。例えば、変異が３塩基挿入の場合には、挿入された３塩基のうち少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。変異プローブは当該特異な塩基配列の全部または一部を有していればよい。また、標的部位において野生型遺伝子で見られる塩基が存在しない場合、すなわち遺伝学上の欠失の場合には、変異プローブの配列のうち、少なくともいずれか一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。特に好ましくは欠失の結果として連結された部位の塩基のうち少なくとも一方がＬＮＡで置換されていることである。本実施形態により変異プローブは、欠失変異であっても変異遺伝子により特異的、かつ強固にハイブリダイゼーションできる。
【００７１】
<実施形態１０>  実施形態１０について説明する。本実施形態は、主に請求項１０に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から９のいずれか一の方法を基本として、さらに前記クランププライマーの鎖長が１４塩基から１８塩基である請求項１から９のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から９のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００７２】
本実施形態は、クランププライマーが１４塩基から１８塩基である点を特徴とする。ＰＮＡからなるクランププライマーは１３塩基以下では十分なクランピングの効果が得られず、また１９塩基以上はプライマー自体の合成精度が落ちている等の問題がある。しかし、１４塩基から１８塩基の範囲内では、本発明においてはいずれの長さであっても顕著な差異は見出せない。本発明のクランププライマーの鎖長としては最適、かつ十分な長さであるとして本実施形態がある。
【００７３】
<実施形態１１>  実施形態１１について説明する。本実施形態は、主に請求項１１から３７に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から１０のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異遺伝子がヒトＥＧＦＲの変異遺伝子であることを特徴とする変異遺伝子検出法と、ヒトＥＧＦＲの変異遺伝子検出用の変異プローブ及びクランププライマーの提供と、ヒトＥＧＦＲの変異遺伝子検出において高い効果が得られる前記変異プローブ及びクランププライマーを用いた検出方法である。
【００７４】
本実施形態において、前記実施形態１から１０のいずれかと同じ要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００７５】
（検出用遺伝子プールの調製）
【００７６】
本実施形態において使用する遺伝子プールは、ヒトＥＧＦＲの変異遺伝子の有無を検査する目的で、その対象者から得られるゲノムＤＮＡやｃＤＮＡを用いる。好ましくは、当該対象者の喀痰、または胸水、または気管支洗浄液、または手術により得られる組織の一部、病理組織切片等の一般に肺癌診断に使用される全ての試料から得ることである。これらの試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡを調製する方法は、例えばアルカリ法のように広く一般に使用されているゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの調製方法でよい。また、市販のＤＮＡ調製キットやｍＲＮＡ調製キットを用いてもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法も、ＲＴを用いた広く一般に使用されている方法でよい。また、市販のｃＤＮＡ調製キットを用いてもよい。
【００７７】
（ＥＧＦＲの既知の変異遺伝子について）
【００７８】
非特許文献４、及び５にあるように、現在までにＮＳＣＬＣ患者由来のＥＧＦＲ遺伝子変異は、１１種類が報告されている。当該１１種類の変異は、４種類の点突然変異と、７種類の欠失変異の二つに大別される。また、当該全ての変異がＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインをコードする第１８エクソン、または第１９エクソン、または第２１エクソンのいずれかに存在している。以下、本発明の詳細な説明を行う上で必要であることから、各変異遺伝子について具体的に以下で説明する。
【００７９】
１．Ｇ７１９Ｃ：  第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基（開始コドンのＡを１番塩基としたｃＤＮＡ上の塩基番号とする、以下同じ）ＧがＴに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７１９番目のグリシン残基がシステイン残基に置換したものである。
【００８０】
２．Ｇ７１９Ｓ：  第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基ＧがＡに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７１９番目のグリシン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８１】
３．Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１  第１９エクソンにコードされる２２３５番塩基Ｇから２２４９番塩基Ｃまでの１５塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４６番目のグルタミン酸残基から７５０番目のアラニン残基が欠失したものである。
【００８２】
４．Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２  第１９エクソンにコードされる２２３６番塩基Ｇから２２５０番塩基Ａまでの１５塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４６番目のグルタミン酸残基から７５０番目のアラニン残基が欠失したものである。
【００８３】
５．Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓ  第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５１番塩基Ａまでの１２塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５０番目のアラニン残基が欠失し、また７５１番目のチミジン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８４】
６．Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓ  第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５７番塩基Ｃまでの１６塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５２番目のセリン残基が欠失し、また７５３番目のプロリン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８５】
７．Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０P  第１９エクソンにコードされる２２３９番塩基Ｔから２２４７番塩基Ａまでの９塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７４０番目のグルタミン酸残基が欠失し、また７５０番目のアラニン残基がプロリン残基に置換したものである。
【００８６】
８．Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖ  第１９エクソンにコードされる２２３８番塩基Ａから２２５５番塩基Ｃまでの１８塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５２番目のセリン残基が欠失し、また７４６番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換したものである。
【００８７】
９．Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ  第１９エクソンにコードされる２２５４番塩基Ｔから２２７７番塩基Ｃまでの２４塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７５２番目のセリン残基から７５９番目のイソロイシン残基が欠失したものである。
【００８８】
１０．Ｌ８５８Ｒ：  第２１エクソンにコードされる２５７３番塩基ＴがＧに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の８５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換したものである。
【００８９】
１１．Ｌ８６１Ｑ：  第２１エクソンにコードされる２５８２番塩基ＴがＡに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の８６１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換したものである。
【００９０】
（ＥＧＦＲ変異遺伝子の特異的検出用変異プローブ）
【００９１】
本実施形態のＥＧＦＲの変異遺伝子検出方法により前記１１種類の変異遺伝子をそれぞれ特異的に検出可能な変異プローブの配列は、標的部位、変異プローブの長さ、ＧＣ含量を考慮すると限定される。当該限定された配列を用いて検出効果を調べることにより、高い検出効果が得られる変異プローブ用のポリヌクレオチドの配列が決定される。１１種類の変異遺伝子に関して、当該高い検出効果が得られる変異プローブの配列を以下に挙げて説明する。
【００９２】
（１）Ｇ７１９Ｃｐ：  ５'−ａｃｃｇｇａｇｃＡｃａｇｃａｃｔｔ−３'
上記塩基配列のうちＡがＬＮＡに置換されているものであり、請求項１２に関する。当該塩基配列は、前記Ｇ７１９Ｃの点突然変異遺伝子において２１４０番塩基から２１６３番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。ＬＮＡで構成されているＡは、Ｇ７１９Ｃ変異の原因である２１５５番塩基に相当する。したがって、当該Ｇ７１９Ｃｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＧ７１９Ｃの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９３】
（２）Ｇ７１９Ｓｐ：５'−ａｃｃｇｇａｇｃＴｃａｇｃａｃｔｔ−３'
上記塩基配列のうちＴがＬＮＡに置換されているものであり、請求項１３に関する。当該塩基配列は、前記Ｇ７１９Ｃの点突然変異遺伝子において２１４０番塩基から２１６３番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。ＬＮＡで構成されているＴは、Ｇ７１９Ｓ変異の原因である２１５５番塩基に相当する。したがって、当該Ｇ７１９Ｓｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＧ７１９Ｓの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９４】
（３）L８５８Ｒｐ：５'−ｔｔｔｇｇｃｃＣｇｃｃｃａａ−３'
上記塩基配列のうちＣがＬＮＡに置換されているものであり、請求項１４に関する。当該塩基配列は、前記L８５８Ｒの点突然変異遺伝子において２５６６番塩基から２５８０番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。ＬＮＡで構成されているＣは、L８５８Ｒ変異の原因である２５７３番塩基に相当する。したがって、当該L８５８Ｒｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりL８５８Ｒの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９５】
（４）L８６１Ｑｐ：５'−ａｃｃｃａｇｃＴｇｔｔｔＧｇ−３'
上記塩基配列のうちＴがＬＮＡに置換されているものであり、請求項１５に関する。当該塩基配列は、前記L８６１Ｑの点突然変異遺伝子において２５７５番塩基から２５８９番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。ＬＮＡで構成されているＣは、L８６１Ｑ変異の原因である２５８２番塩基に相当する。したがって、当該L８６１Ｑｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりL８６１Ｑの点突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９６】
（５）Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐ：５'−ｃｔａｔｃａａ／ａａｃａｔｃｔｃｃｇａａａｇｃ−３'  （配列中の「／」は欠失部位を示す  以下同じ）
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項１６に関する。当該塩基配列は、前記Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１の欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２２８番塩基から２２３４番塩基と、２２５０番塩基から２２６４番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２５０番塩基ａがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該LＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１の欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９７】
（６）Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２ｐ：５'−ｃｇｃｔａｔｃａａｇ／ａｃａｔｃｔｃｃｇ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項１７に関する。当該塩基配列は、前記Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２の欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２２６番塩基から２２３５番塩基と、２２５１番塩基から２２５９番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２２６番塩基ｇがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該LＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２の欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９８】
（７）Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓｐ：５'−ｃｔａｔｃａａｇｇａａｔ／ｃａｔｃｔｃｃ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項１８に関する。当該塩基配列は、前記Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２２８番塩基から２２３９番塩基と、２２５２番塩基から２２５８番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２３９番塩基ｔと２２５２番塩基ｃがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＬ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【００９９】
（８）Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＣ７５３Ｓｐ：５'−ｃｔａｔｃａａｇｇａａｔ／ｃｇａａａｇｃｃａ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項１９に関する。当該塩基配列は、前記Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２２８番塩基から２２３９番塩基と、２２５８番塩基から２２６６番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２５８番塩基ｃがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＬ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【０１００】
（９）Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Pｐ：５'−ａｔｃａａｇｇａａ／ｃｃａａｃａｔｃｔｃｃ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項２０に関する。当該塩基配列は、前記Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Pの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２３０番塩基から２２３９番塩基と、２２４８番塩基から２２５８番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２４８番塩基ｃがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Pｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＬ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Pの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【０１０１】
（１０）Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖｐ：５'−ｔａｔｃａａｇｇｔ／ｔｃｃｇａａａｇｃｃａ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項２１に関する。当該塩基配列は、前記Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２２９番塩基から２２３７番塩基と、２２５６番塩基から２２６６番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２５７番塩基ｃがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＬ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【０１０２】
（１１）Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌｐ：５'−ａｇａｇａａｇｃａａｃａ／ｃｔｃｇａｔ−３'
上記塩基配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換されているものであり、請求項２２に関する。当該塩基配列は、前記Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌの欠失変異遺伝子に基づく配列であり、野生型遺伝子の２２４２番塩基から２２５３番塩基と、２２７８番塩基から２２８３番塩基のセンス側の配列に該当する。このうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで構成されていればよいが、特に２２４９番塩基ｃと２２５２番塩基ｃがＬＮＡで構成されていることが好ましい。当該Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌｐ変異プローブは、実施形態１１の方法によりＳ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌの欠失突然変異遺伝子を特異的に検出可能なポリヌクレオチドである。なお、当該塩基配列は、ＤＮＡを基礎として構成されているが、一部がＲＮＡから構成されていてもよい。
【０１０３】
（ＥＧＦＲ変異遺伝子の特異的検出用クランププライマー）
【０１０４】
本実施形態のＥＧＦＲの変異遺伝子検出方法において、前記１１種類の変異遺伝子を検出するために使用されるクランププライマーに関しても、変異プローブと同様に、変異の位置、ＧＣ含量、クランププライマーの長さを考慮することにより、その配列は限定される。さらに、変異遺伝子のいくつかについては、標的部位に集合性が見られる。例えば、欠失変異遺伝子はその欠失が全て第１９エクソンで生じている。したがって、そのような集合をなす標的部位については、単一のクランププライマーで全てをカバーできる。ＰＮＡは高額であることから、このような単一で集合をなす標的部位の全ての検出に使用できるクランププライマーは経済的効果もある。以下、１１種類の変異遺伝子に関して使用される、当該高い検出効果が得られるクランププライマーの配列を以下に挙げて説明する。なお、ＮＨ２とＣＯＮＨ２は当該クランププライマーがＰＮＡから構成される故の末端であり、ＤＮＡ配列における５'、 ３'にそれぞれ相当する。
【０１０５】
（Ａ）Ｇ１７９ｃ：ＮＨ２−ＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴ−ＣＯＮＨ２
上記塩基配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチドであり、請求項２３に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、２１４６番塩基から２１５９番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該Ｇ１７９ｃは、実施形態１１の方法により前記Ｇ７１９Ｃ、またはＧ７１９Ｓの点突然変異遺伝子を検出する上で、いずれの点突然変異遺伝子の検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
【０１０６】
（Ｂ）Ｄｅｌｃ１：ＮＨ２−ＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡ−ＣＯＮＨ２
上記塩基配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチドであり、請求項２４に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、２２３９番塩基から２２５６番塩基のセンス側の配列に該当する。当該Ｄｅｌｃ１は、実施形態１１の方法により欠失変異遺伝子を検出する上で、前記７種類のいずれの欠失変異遺伝子の検出用のクランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
【０１０７】
（Ｃ）L８５８c：ＮＨ２−ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ−ＣＯＮＨ２
上記塩基配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチドであり、請求項２５に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、２５６８番塩基から２５８３番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該L８５８cは、実施形態１１の方法により前記Ｌ８５８Ｒの点突然変異遺伝子を検出する上で、検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
【０１０８】
（Ｄ）L８６１c：ＮＨ２−ＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣ−ＣＯＮＨ２
上記塩基配列の全てがＰＮＡからなるポリヌクレオチドであり、請求項２５に関する。当該塩基配列は野生型遺伝子に基づく配列であり、２５７５番塩基から２５８９番塩基のアンチセンス側の配列に該当する。当該L８６１cは、実施形態１１の方法により前記Ｌ８６１Ｑの点突然変異遺伝子を検出する上で、検出用クランププライマーとしても使用できるポリヌクレオチドである。
【０１０９】
（ＥＧＦＲ変異遺伝子の特異的検出用変異プローブとＥＧＦＲ変異遺伝子の特異的検出用クランププライマーとの好適な組み合わせによる変異遺伝子検出方法）
【０１１０】
前記ＥＧＦＲの既知の変異遺伝子を特異的に検出する上で効果の高い変異プローブやＥＧＦＲ変異遺伝子の特異的検出する上で検出効果の高い包括的クランププライマーもそれぞれを検出効果の低い変異プローブやクランププライマーを組み合わせては検出感度が十分に高い結果を得ることはできない。そこで、ヒトＥＧＦＲの各変異遺伝子を高感度に管出する上で好適な変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる変異遺伝子検出方法を以下で示し、説明をする。
【０１１１】
（a）変異プローブＧ７１９ＣｐとクランププライマーＧ７１９ｃの組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１２に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２３に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項２７に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの点突然変異Ｇ７１９Ｃを検出する上で好適である。
【０１１２】
（ｂ）変異プローブＧ７１９ＳｐとクランププライマーＧ７１９ｃの組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１３に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２３に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項２８に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの点突然変異Ｇ７１９Ｓを検出する上で好適である。
【０１１３】
（ｃ）変異プローブＬ８５８ＲｐとクランププライマーＬ８５８ｃの組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１４に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２５に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項２９に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの点突然変異Ｌ８５８Ｒを検出する上で好適である。
【０１１４】
（ｄ）変異プローブＬ８６１ＱｐとクランププライマーＬ８６１ｃの組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１５に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２６に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３０に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの点突然変異Ｌ８６１Ｑを検出する上で好適である。
【０１１５】
（ｅ）変異プローブＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１６に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３１に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１を検出する上で好適である。
【０１１６】
（ｆ）変異プローブＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２ｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１７に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３２に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２を検出する上で好適である。
【０１１７】
（ｇ）変異プローブＬ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１ＳｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１８に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３３に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓを検出する上で好適である。
【０１１８】
（ｈ）変異プローブＬ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＣ７５３ＳｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項１９に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３４に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＣ７５３Ｓを検出する上で好適である。
【０１１９】
（i）変異プローブＬ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０PｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項２０に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３5に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Pを検出する上で好適である。
【０１２０】
（ｊ）変異プローブＬ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６ＶｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項２１に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、
請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３６に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖを検出する上で好適である。
【０１２１】
（ｋ）変異プローブＳ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌｐとクランププライマーＤｅｌｃ１の組み合わせからなる変異遺伝子検出方法。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドからなる変異プライマーと、請求項２４に記載のポリヌクレオチドからなるクランププライマーとを遺伝子増幅用反応液中に共存させる請求項１１に記載の変異遺伝子検出方法であり、請求項３７に関する。当該変異プローブとクランププライマーの組み合わせによる実施形態１から１０のいずれか一に記載の方法は、ＥＧＦＲの欠失変異Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌを検出する上で好適である。
【０１２２】
<実施形態１２>  実施形態１２について説明する。本実施形態は、主に請求項１２および１３に関する。本実施形態の概要は、まず一つは、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に後述する変異プローブよりも優先的にハイブリダイゼーションするクランププライマーと、変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部に前記クランププライマーよりも優先的にハイブリダイゼーションする変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法と、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、もう一つは、野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法である。
【０１２３】
本実施形態は、実施形態１、および２に類似する。異なる点として挙げられるのは、実施形態１、および２がＰＮＡからなるクランププライマーであるのに対して、本実施形態では「変異プローブよりも優先的にハイブリダイゼーションするクランププライマー」と
している点と、さらに実施形態１、および２が配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブに対して、本実施形態では「前記クランププライマーよりも優先的にハイブリダイゼーションする変異プローブ」としている２点である。分子生物学の技術の進展は著しいものがあり、例えば一の分子ツールが開発されても極めて性質の良く似た別種の分子が直ちに市場に現れることは珍しくない。本実施形態では、かかる事態に備えＰＮＡと類似の性質を有し、かつＰＮＡ誘導体でもない他の物質が開発され、あるいはＬＮＡと類似の性質を有し、かつＬＮＡ誘導体ではない他の物質が開発されることを予期したものである。本発明は、ＰＮＡのような強い相補配列親和性を有し、特定の配列のクランピングが可能で、プライマーとして機能せず、また５'→３'ヌクレアーゼ耐性を有する性質の核酸類似体と、ＬＮＡのような強い相補配列親和性を有し、プライマーとして機能し、さらに５'→３'ヌクレアーゼ耐性を有しない性質の核酸類似体との組み合わせに大きな意味をもつためである。
【実施例１】
【０１２４】
以下に実施例を用いて、本発明をより具体的に説明する。
なお、以下の実施例は、本発明の特定の態様の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【実施例２】
【０１２５】
<ＥＧＦＲの点突然変異遺伝子Ｌ８５８Ｒ検出感度の検証>  実施例では、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在するＥＧＦＲの点突然変異遺伝子Ｌ８５８Ｒの検出を、実施形態１１によって行い、その有効性と検出感度について検証を行った。
【０１２６】
（材料と方法）
【０１２７】
１．ＥＧＦＲ野生型遺伝子と変異遺伝子のクローニング  ヒトＥＧＦＲの野生型遺伝子（Ｕｎｉ  ｇｅｎｅ  Ｈｓ．４８８２９３）は、健常者の抹消血より通常の方法を用いて調製したヒトゲノムＤＮＡを用いた。Ｌ８５８Ｒの変異が存在する第２１エクソンを含む領域をプライマーＦ２１，Ｂ２１を用いて通常のＰＣＲ反応条件によって増幅した。反応に用いたプライマーの配列は以下の通り。Ｆ２１：５'−ｃｔｇｇａｔｇｇａｇａａａａｇｔｔａａｔｇｇｔｃ−３'  Ｂ２１：５'−ｃａｇｃａａｇｔａｃｃｇｔｔｃｃｃａａａｇ−３'。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。これを野生型Ｅｘ２１プラスミドとした。当該野生型Ｅｘ２１プラスミドに、Ｍｅｇａｐｒｉｍｍｅｒ法（非特許文献６）を用いてsite−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、Ｌ８５８Ｒ変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２５７３番塩基ＴをＧに変異させた。その結果、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に、添付のプロトコルに従って挿入し、クローニングした。これをＬ８５８Ｒ型プラスミドとした。次に、前記野生型Ｅｘ２１プラスミドと前記Ｌ８５８Ｒ型プラスミドのそれぞれを鋳型として、約５００塩基の鎖長のＤＮＡ断片が得られる前記プライマーセットＦ２１とＢ２１とを用いて通常のＰＣＲ反応条件によってそれぞれ増幅を行い、直鎖状のＥＧＦＲ野生型遺伝子断片（ＷＴ−２１）とＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒ型遺伝子断片（Ｌ８５８Ｒ-２１）を得た。これらを以降の実験の鋳型として用いた。
【非特許文献６】Ｓａｒｋａｒ  Ｇ。  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ  Ｓ．Ｓ．、１９９０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８:４０４−４０７
【０１２８】
２．遺伝子プールの調製  本実施例の野生型遺伝プールを前記１で調製したＷＴ−２１及びＬ８５８Ｒ-２１を各割合で混合して調製した。混合比は、ＷＴ−２１：Ｌ８５８Ｒ-２１＝１：１、または１０：１、または１００：１、または１０００：１、または１：０（ＷＴ−２１のみ）となるように、それぞれ調製をした。
【０１２９】
３．ＰＣＲ用反応液の調製  「遺伝子増幅用反応液」として以下の試薬を混合して調製した。
２５ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／  ２００μＭ  各ｄＮＴＰ（＝ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）／１．２５Ｕ  ＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラ  バイオ）。上記「遺伝子増幅用反応液」に、「増幅プライマー」１組（ｅｘ２１−Ｆ  &  ｅｘ２１−Ｂ）をそれぞれ２００ｍＭ添加した。この「増幅プライマー」は、Ｌ８５８Ｒの変異が存在する第２１エクソン内の領域を増幅する。配列は以下の通り。ｅｘ２１−Ｆ：５'−ｇｃａｔｇａａｃｔａｃｔｔｇｇａｇｇａｃ−３'  ｅｘ２１−Ｂ：５'−ａｃｃｔａａａｇｃｃａｃｃｔｃｃｔｔａｃ−３'。これらの増幅プライマーは、Ｔｍ値が５５℃から６０℃の範囲になるようにデザインした。
【０１３０】
４．ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液の調製  ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液として以下の（Ａ）から（Ｃ）をそれぞれ調製した。また、これらは最終総量が２５μｌに調節した。
【０１３１】
（Ａ）ＰＮＡ（-）ＬＮＡ（＋）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、末端蛍光標識したＬ８５８Ｒ用の「変異プローブ（Ｌ８５８ＲｐＦ）」のみを１００ｎＭ添加した。配列は以下の通り。Ｌ８５８ＲｐＦ：５'−（６−ＦＡＭ）ｔｔｔｇｇｃｃＣｇｃｃｃａａ（BHQ1）−３'。ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字ＣはＬＮＡを、６−ＦＡＭは蛍光色素を、BHQ1は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。Ｌ８５８ＲｐＦはＩＤＴ社に合成委託した。
【０１３２】
（Ｂ）ＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（-）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、Ｌ８５８Ｒ用の「クランププライマー（Ｌ８５８ｃ）」のみを５μＭ添加した。配列は実施形態１１の通りである。Ｌ８５８ｃはグライナージャパン社に合成委託した。
【０１３３】
（Ｃ）ＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（＋）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、Ｌ８５８Ｒ用の前記「変異プローブ（Ｌ８５８ＲｐＦ）」１００ｎＭと、Ｌ８５８Ｒ用の前記「クランププライマー（Ｌ８５８ｃ）」５μＭを共に添加した。
【０１３４】
上記（Ａ）から（Ｂ）のそれぞれに、前記２で調製した各混合比の遺伝子プールを鋳型として２５μｇ加えて、次のリアルタイムＰＣＲ反応に用いた。
【０１３５】
５．リアルタイムＰＣＲ反応  Ｅｘ  Ｔａｑの５'→３'ヌクレアーゼ活性を利用したリアルタイムＰＣＲは、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ社）を用いてモニタリングした。ＰＣＲ反応のサイクルは、９５℃で３０秒保持した後、９５℃３秒と56℃３０秒のステップを４５サイクルで行った。
【０１３６】
６．ＰＣＲ増幅産物の配列確認  前記５のリアルタイムＰＣＲ反応の結果得られたＰＣＲ増幅産物をＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて精製した後、クローニングで用いた前記Ｆ２１をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて直接、自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０：ＡＢＩ社）で配列を読み、増幅産物がＬ８５８Ｒであることを確認した。以上の得られたデータを解析して、検出感度についての検証を行った。
【０１３７】
（結果）  図３にその結果を示す。各グラブの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。ａからｅは、各ＰＣＲ反応の鋳型に用いたＷＴ−２１：Ｌ８５８Ｒ-２１の混合比を示す。すなわち、ａは１：１、ｂは１０：１、ｃは１００：１、ｄは１０００：１、ｅはＷＴ−２１のみ、である。図３で示すように、（Ａ）のＬＮＡのみを用いたＰＮＡ（-）ＬＮＡ（＋）では、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の混在率は１０％が限界であった。また、（Ｂ）のＰＮＡのみを用いたＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（-）では、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の検出感度は混合比依存的な結果が得られ、ｄの1／１０００量であっても、弱いながら検出ができた。しかし、ｅのＷＴ−２１のみにおいても３５サイクルを越えた辺りからバックグラウンドの増加が検出された。一方、ＬＮＡとＰＮＡの両方を用いた（Ｃ）のＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（＋）では、ｄの1／１０００量であっても、十分な検出が可能であった。しかもｅのＷＴ−２１のみにおいては４５サイクルであってもバックグラウンドは全く検出されなかった。（Ｃ）のｃ、およびｄにおいて、反応後に得られた増幅産物の配列をシークエンスした結果、いずれの増幅産物もＬ８５８Ｒ-２１由来の配列を有することが確認された。
【０１３８】
（考察）  以上の結果から、ＰＮＡとＬＮＡを共に用いた本発明によれば、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在する点突然変異遺伝子の検出は、その混在比率が０．１％であっても可能であることが判明した。従来の方法では、信用性の高い検出感度の限界が約１０％であったことを考えると、本発明の変異遺伝子検出方法は非常に高い検出感度を有するといえる。さらに、極めて重要な点として、ＰＮＡのみを用いた検出方法では、３５サイクル以上からは、野生型のみの場合であってもバックグラウンドが検出された事に対して、本発明によれば４５サイクルであっても、そのようなバックグラウンドが全く検出されなかったことが挙げられる。従来技術でも説明したように、ゲフィチニブの有効性はＥＧＦＲの遺伝子変異と密接な関係があるとされている。したがって、変異を有しない患者への投与は逆に副作用を生じさせる危険性が高い。すなわち、（Ｂ）のＰＮＡのみを用いた検出方法のように、標的の変異を有しないｅのサンプルにおいてバックグラウンドが検出されたことは、当該検出方法に対する信用性を失墜させることとなる。もちろん、臨床上の遺伝子検査法として使用できない。一方、本発明は、非常に高い検出感度と共にバックグラウンドが検出されないという検出精度の高さを併せ持ち、遺伝子検査法としての利用性の高さを示唆している。なお、他の点突然変異の検出感度に関しても、いずれもＬ８５８Ｒ以上の検出感度が見られた。すなわち、最も検出感度の低かったＬ８５８Ｒの実験結果を、当該実施例としている。
【実施例３】
【０１３９】
<ＥＧＦＲの欠失変異遺伝子Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１検出感度の検証>  本実施例では、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在するＥＧＦＲの欠失変異遺伝子Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１の検出を、実施形態１１によって行い、その有効性と検出感度について検証を行った。
【０１４０】
（材料と方法）
【０１４１】
１．ＥＧＦＲ野生型遺伝子と変異遺伝子のクローニング  ヒトＥＧＦＲの野生型遺伝子は、実施例１で調製のものを用いた。また、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１変異遺伝子のクローニングの方法は、実施例１におけるＬ８５８Ｒのクローニングの方法と同様であることから、異なる点のみを以下で説明し、その他の説明は省略する。Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１の変異が存在する第１９エクソンを含む領域を増幅するプライマーＦ１９，Ｂ１９の配列は以下の通り。Ｆ１９：５'−ｃｔｇｇａｔｇａａａｔｇａｔｃｃａｃａｃｇ−３'  Ｂ１９：５'−ｔｇｇｇｔａｇａｔｇｃｃａｇｔａａｔｔｇｃ−３'。このプライマーセットによって調整されたプラスミドを野生型Ｅｘ１９プラスミドとした。野生型Ｅｘ１９プラスミドを用いてsite−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２２３５番塩基Ｇから２２４９番塩基Ｃまでの１５塩基を欠失させた。その結果、得られたプラスミドをＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１型プラスミドとした。次に、前記野生型Ｅｘ１９プラスミドと前記Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１型プラスミドのそれぞれを鋳型として、約５００塩基の鎖長のＤＮＡ断片が得られるプライマー前記プライマーセットＦ１９とＢ１９とを用いて通常のＰＣＲ反応条件によってそれぞれ増幅を行い、直鎖状のＥＧＦＲ野生型遺伝子断片（ＷＴ−１９）とＥＧＦＲ−Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１型遺伝子断片（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１−１９）を得た。これらを以降の実験の鋳型として用いた。
【０１４２】
２．遺伝子プールの調製  本実施例の野生型遺伝プールを前記１で調製したＷＴ−１９及びＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１−１９を各割合で混合して調製した。混合比は、実施例１と同じである。
【０１４３】
３．ＰＣＲ用遺伝子増幅用反応液の調製  「遺伝子増幅用反応液」として以下の試薬を混合して調製した。遺伝子増幅用反応液の組成は以下の増幅プライマーの種類を除き、実施例１と同じであることから、その説明は省略する。本実施例の「増幅プライマー」（ｅｘ１９−Ｆ  &  ｅｘ１９−Ｂ）は、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１の変異が存在する第１９エクソン内の領域を増幅する。配列は以下の通り。ｅｘ１９−Ｆ：５'− ｇｔｇｃａｔｃｇｃｔｇｇｔａａｃａｔｃｃ−３'  ｅｘ１９−Ｂ：５'−ｔｇａｇｇｔｔｃａｇａｇｃｃａｔｇｇａｃ−３'。 
【０１４４】
４．ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液の調製  ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液として以下の（Ａ）から（Ｃ）をそれぞれ調製した。また、これらは最終総量が２５μｌに調節した。
（Ａ）ＰＮＡ（-）ＬＮＡ（＋）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、末端蛍光標識したＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１用の「変異プローブ（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐＦ）」のみを１００ｎＭ添加した。配列は以下の通り。Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐＦ：５'−（６−ＦＡＭ）ｃｔａｔｃａａＡａＣａｔｃｔｃｃｇａａａｇｃ（BHQ1）−３'。ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字ＣはＬＮＡを、６−ＦＡＭは蛍光色素を、BHQ1は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐＦはＩＤＴ社に合成委託した。
（Ｂ）ＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（-）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、欠失変異共用の「クランププライマー（Ｄｅｌｃ１）」のみを５μＭ添加した。配列は実施形態１１に示した通りである。Ｄｅｌｃ１はグライナージャパン社に合成委託した。
（Ｃ）ＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（＋）：上記「遺伝子増幅用反応液」に、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１用の前記「変異プローブ（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐＦ）」１００ｎＭと、欠失変異共用の前記「クランププライマー（Ｄｅｌｃ１）」５μＭを共に添加した。
【０１４５】
上記（a）から（ｃ）のそれぞれに、前記２で調製した各混合比の遺伝子プールを鋳型として２５μｇ加えて、次のリアルタイムＰＣＲ反応に用いた。
【０１４６】
５．リアルタイムＰＣＲ反応
【０１４７】
反応条件は実施例１と同じであることから、その説明を省略する。
【０１４８】
６．ＰＣＲ増幅産物の配列確認
ＰＣＲ増幅産物のシークエンスニに用いたプライマーは前記Ｆ１９である。その他は実施例１と同じであることから、その説明を省略する。
【０１４９】
（結果）  図４にその結果を示す。各グラブの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。ａからｅは、各ＰＣＲ反応の鋳型に用いたＷＴ−１９：Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１−１９の混合比を示す。すなわち、ａは１：１、ｂは１０：１、ｃは１００：１、ｄは１０００：１、ｅはＷＴ−１９のみ、である。図４で示すように、（Ａ）のＬＮＡのみを用いたＰＮＡ（-）ＬＮＡ（＋）では、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の混在率は実施例１と同様１０％が限界であった。また、（Ｂ）のＰＮＡのみを用いたＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（-）では、１％が限界であった。一方、ＬＮＡとＰＮＡの両方を用いた（Ｃ）のＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（＋）のｄでは、弱いながらも０１％までの検出ができた。このｄにおいて、反応後に得られた増幅産物の配列をシークエンスした結果、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１−１９由来の配列を有することが確認された。
【０１５０】
（考察）  以上の結果から、ＰＮＡとＬＮＡを共に用いた本発明によれば、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在する欠失変異遺伝子の検出は、その混在比率が０．１％までは検出が可能であり、シークエンスによりアーティファクトでないことも確認された。ＬＮＡのみの方法では１０％、ＰＮＡのみの方法では１％が検出の限界であったことを考えると、本発明の変異遺伝子検出方法は欠失変異であっても非常に高い検出感度を有することが判明した。なお、他の欠失変異の検出感度に関しても、いずれもＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１とほぼ同程度の検出感度が見られた。
【実施例４】
【０１５１】
<ＥＧＦＲ欠失変異遺伝子における変異プローブの検出感度の特異性の検証>  ＥＧＦＲの欠失変異Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１とＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２は欠失部位がお互いにわずか１塩基ずれているだけであり、欠失塩基数も等しい。そこで本実施例では、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１用の検出プローブＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１ｐを用いて、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在するＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２の検出が可能か否かを実施形態１１によって行い、検出プローブの特異性について検証をした。
【０１５２】
（材料と方法）
【０１５３】
１．ＥＧＦＲ野生型遺伝子と変異遺伝子のクローニング  ヒトＥＧＦＲの野生型遺伝子は、実施例１で調製のものを用いた。また、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２変異遺伝子のクローニングの方法は、実施例２におけるＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２のクローニングの方法と同様であることから、異なる点のみを以下で説明し、その他の説明は省略する。前記実施例２で得られた野生型Ｅｘ１９プラスミドを用いてsite−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２２３６番塩基Ｇから２２５０番塩基Ａまでの１５塩基を欠失させた。その結果、得られたプラスミドをＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２型プラスミドとした。次に、このＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２型プラスミドを鋳型として、約５００塩基の鎖長のＤＮＡ断片が得られる前記プライマーセットＦ１９とＢ１９とを用いて通常のＰＣＲ反応条件によってそれぞれ増幅を行い、ＥＧＦＲ−Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２型遺伝子断片（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２−１９）を得た。これらを以降の実験の鋳型として用いた。
【０１５４】
２．遺伝子プールの調製  前記実施例２の野生型遺伝プールを前記１で調製したＷＴ−１９及びＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２−１９を各割合で混合して調製した。混合比は、実施例１と同じである。
【０１５５】
３．ＰＣＲ用遺伝子増幅用反応液の調製  「遺伝子増幅用反応液」の組成は実施例２と同じなので省略する。
【０１５６】
４．ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液の調製
ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ遺伝子増幅用反応液は実施例２（Ａ）から（Ｃ）と同じなので省略する。
上記（Ａ）から（Ｃ）のそれぞれに、前記２で調製したＥ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２型遺伝子を含む各混合比の遺伝子プールを鋳型として２５μｇ加えて、次のリアルタイムＰＣＲ反応に用いた。
【０１５７】
５．リアルタイムＰＣＲ反応  反応条件は実施例１と同じであることから、その説明を省略する。
【０１５８】
６．ＰＣＲ増幅産物の配列確認  反応条件は実施例１と同じであることから、その説明を省略する。
【０１５９】
（結果）  図５にその結果を示す。各グラフの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。ａからｅは、各ＰＣＲ反応の鋳型に用いたＷＴ−１９：Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２−１９の混合比を示す。すなわち、ａは１：１、ｂは１０：１、ｃは１００：１、ｄは１０００：１、ｅはＷＴ−１９のみ、である。図５で示すように、（Ａ）のＰＮＡ（-）ＬＮＡ（＋）、および（Ｃ）のＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（＋）ではいずれの混合比の場合も検出できなかった。これに対して（Ｂ）のＰＮＡ（＋）ＬＮＡ（-）では、ｃ以上、すなわち混合比率が１％以上では蛍光が検出された。
【０１６０】
（考察）  以上の結果から、ＰＮＡとＬＮＡを共に用いた本発明によれば、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在する非特異的な変異プローブによる欠失変異遺伝子の検出は、変異がわずか１塩基ずれただけで、検出されなかった。同一変異プローブによる実施例２の結果と比較するとその差は顕著であり、本発明の変異プローブは、変異に対する特異性が極めて高いことを意味する。一方、ＰＮＡのみを用いた方法は、実施例２では１％程度までは検出ができたが、本実施例においても１％まで弱いながらも蛍光が検出された。これは、ＰＮＡのみの使用では感度が高くなるが精度が低いことを示唆している。したがって、本発明の変異遺伝子検出方法は、感度、精度共に非常に高い効果を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、変異遺伝子検出のための遺伝子検査法として、臨床上の利用性が非常に高い。また、発明の実施に関しても、専用の装置等を必要とせず、一般的な臨床検査室に設置された機器や機材の利用が可能である。さらに、従来の病理組織切片や細胞診用による臨床検査にあっては、結果の判断に専門的知識と熟練が必要とされることから、事業化には細胞検査士等の養成等も必須であった。しかし、本発明によれば、一定の操作技術のみを習得すれば、特段の専門的知識や熟練性を必要としない。また、検査のルーチン化が極めて容易であり、大量のサンプルを短時間で処理できる。したがって、事業化も容易である。
【０１６２】
特に、ＥＧＦＲの変異遺伝子の検出によりゲフィチニブの感受性を直接検索することが可能であることから、ＮＳＣＬＣ患者に対するゲフィチニブ投与の早期判断や、ゲフィチニブへの感受性が低い患者への投与の回避が可能となる。すなわち、本発明によりＮＳＣＬＣに対する最も実現性の高いテーラーメイド治療が可能となる。したがって、社会的なニーズは非常に高い。
【０１６３】
また、ＥＧＦＲ遺伝子の既知の変異において、各変異を特異的に検出可能な変異プローブとクランププライマー、及びそれらの組み合わせによる検出効果の高い検出方法の発明により、ＥＧＦＲの変異遺伝子を検出するためのキット化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】実施形態１の原理を説明するための図
【図２】実施形態５の原理を説明するための図
【図３】実施例１の結果
【図４】実施例２の結果
【図５】実施例３の結果
【符号の説明】
【０１６５】
０１０１  野生型遺伝子の標的部位
０１０２  変異遺伝子の標的部位
０１０３  野生型遺伝子
０１０４  変異遺伝子
０１０５  クランププライマー
０１０６  変異プローブ
０１０７  増幅プライマー
０２０８  ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性
０２０９  蛍光物質
０２１０  クエンチャー
【図１】
2006288353.tif 000003
【図２】
2006288353.tif 000004
【図３】
2006288353.tif 000005
【図４】
2006288353.tif 000006
【図５】
2006288353.tif 000007