(57)【要約】      （修正有）【課題】  妊娠中における薬物代謝酵素の予測法の提供。【解決手段】  被験薬物、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質の存在下に小型肝細胞を培養し、薬物代謝関連酵素発現の変動を測定することを特徴とする、妊娠状態における被験薬物の薬物代謝予測法であり、薬物代謝関連酵素発現の変動をＤＮＡチップで測定し、該薬物代謝関連酵素発現の変動が、エストロゲン作用物質及び／又はプロゲステロン作用物質が非存在下の場合と存在下の場合とを対比するものである薬物代謝予測法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験薬物、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質の存在下に小型肝細胞を培養し、薬物代謝関連酵素発現の変動を測定することを特徴とする、妊娠状態における被験薬物の薬物代謝予測法。
【請求項２】
薬物代謝関連酵素発現の変動をＤＮＡチップで測定する請求項１記載の薬物代謝予測法。
【請求項３】
薬物代謝関連酵素発現の変動が、エストロゲン作用物質及び／又はプロゲステロン作用物質が非存在下の場合と存在下の場合とを対比するものである請求項１又は２記載の薬物代謝予測法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠中における薬物の代謝を簡便かつ正確に予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における薬物代謝は、新薬開発における毒性評価、既存薬物の毒性評価、副作用の予測等の点で極めて重要であり、特に新薬開発にあたっては必須の評価項目である。ところで、妊娠期間中は、通常の状態と相違し、エストロゲンとプロゲステロンの血中濃度が高い状態が長期間続くというホルモン異常状態である。従って、妊娠期間中の薬物代謝を評価することは、妊娠時の薬剤投与により母体がどのような影響を受けるかを評価するうえで極めて重要である。
【０００３】
しかしながら、従来、妊娠期間中の薬物代謝についての検討はほとんどなされていない。これは、ヒトの妊娠期間は約９ヶ月あるものの、催奇形性等、安全面で問題があるためであり、実験動物のラットやマウスの妊娠期間は２１日と極めて短く、薬剤の感受性や代謝機序の解析が不可能だったことに起因する。かかる観点から、胎児に対する催奇形性について調べることが義務づけられており、医学的に初期３ヶ月以内のいかなる薬剤投与も禁忌とされている。しかし、妊娠中期以降の安定期における薬剤服用は一般的には行われていると思われる。例えば、風邪やアレルギー症状緩和、不眠時における薬剤の服用等の場合が考えられる。しかしながら、妊娠時における薬物投与は注意しながらの医師による投与という根拠のない処方が多くなされているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、妊娠中における薬物の代謝を、細胞を用いた実験で簡便かつ正確に予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、小型肝細胞の機能及び培養の容易性に着目し、種々検討した結果、小型肝細胞をエストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質の存在下に培養する系に、被験薬物を添加して培養し、薬物代謝関連酵素発現の変動を観察すれば、妊娠状態における被験薬物の肝代謝が正確に予測できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、被験薬物、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質の存在下に小型肝細胞を培養し、薬物代謝関連酵素発現の変動を測定することを特徴とする、妊娠状態における被験薬物の薬物代謝予測法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞を用いた実験系で簡便且つ正確に妊娠中における薬物代謝、ひいては妊娠中に投与された薬物が母体に及ぼす影響を予測できる。本発明は、ヒトでは臨床試験ができない妊娠状態を人為的に作り出して、薬物の反応を推定する方法であり、他に代替する方法が無い画期的な発明であり、薬剤の副作用を未然に防ぐ可能性がある重要な発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の薬物代謝予測法においては、小型肝細胞を用いる。小型肝細胞は肝組織中に存在する肝幹細胞の一種で肝細胞としての機能を持ちながら、非常に高い増殖活性を持っている。また長期間凍結保存した後、再培養を行ってもその能力を失わない。また、小型肝細胞は培養経過とともに薬物代謝酵素の活性が低下することはなく、成熟化を誘導するとその活性も成熟肝細胞に近づく。従って、小型肝細胞は、薬物代謝酵素誘導能の高い状態を長期間に渡って維持することができる特性を有している。
【０００９】
小型肝細胞の由来は、ヒト、サルが最も好ましいが、入手可能な動物の中では、ラット、マウス等のげっ歯類由来がよく、ウサギ、ヒツジ、ブタでもよいが、ラット由来が特に好ましい。最近ヒトの小型肝細胞の培養法が報告されているので、これを用いることもできる（特開平１０−１７９１４８号）。
【００１０】
小型肝細胞は、例えばラットの肝臓よりコラゲナーゼ灌流法によって採取された細胞懸濁物から、遠心操作を繰り返すことによって単離することができる。又、同細胞懸濁物から小型肝細胞特異的抗原に対する特異抗体（CD44、BRI3、D6.1A等）やヒアルロン酸を付着した担体などにより分離することができる。
【００１１】
得られた小型肝細胞は、凍結保存することができるので、長期保存可能である。
【００１２】
小型肝細胞の培養にあたっては、被験薬物以外に、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質を共存させる。エストロゲン作用物質としては、１７−βエストラジオール、エストリオール、エストロン、エチニルエストラジオール等が挙げられる。また、プロゲステロン作用物質としては、（遊離型又は結合型）プロゲステロン、プレグナンジオール、メドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、デソゲストレル等が挙げられる。エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質を添加することにより、小型肝細胞を疑似妊娠状態にすることができ、妊娠状態特有の薬物代謝酵素を誘導することができる。培養液中のエストロゲン作用物質の濃度は、１０-10〜１０-4Ｍ、さらに１０-8〜１０-5Ｍ、特に１０-5〜１０-6Ｍが好ましい。プロゲステロン作用物質の濃度は１０-10〜１０-4Ｍ、さらに１０-8〜１０-5Ｍ、特に１０-5〜１０-6Ｍが好ましい。小型肝細胞は、３０〜５０個の細胞よりなるコロニーを形成する培養７〜２０日目（より好ましくは、８日〜１４日、特に好ましくは１０〜１２日）に一旦培養皿より剥がして新しい培養皿に再播種するか、凍結保存した小型肝細胞コロニーを５００〜１００００コロニー/６０-mm  培養皿（より好ましくは、１０００〜５０００コロニー/６０-mm  培養皿、特に好ましくは２０００〜４０００コロニー/６０-mm  培養皿）の濃度で播種し、培養する。
【００１３】
培養は、コラーゲンをコートしたディシュ上で行うのが好ましい。また、培地としては、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。さらに培地中にはＦＢＳ、アスコルビン酸、ＤＭＳＯ、ニコチンアミド、上皮細胞増殖因子（EGF, epidermal growth factor）、デキサメタゾン、インスリンを添加することができる。増殖因子としては、EGFの他に、肝細胞増殖因子[HGF, hepatocyte growth factor]、腫瘍増殖因子[TGF-alpha, Transforming growth factor-alpha]、線維芽細胞増殖因子[FGF, fibroblast growth factor]などが挙げられる。培養は、通常３５±５℃、３〜７％ＣＯ2インキュベーター内の条件で行うのが好ましい。
【００１４】
小型肝細胞を被験薬物の存在下（エストロゲン作用物質及び／又はプロゲステロン作用物質非存在下）に培養した場合には、通常の状態の薬物代謝酵素が誘導される。一方、小型肝細胞を、被験薬物、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質の存在下に培養した場合には、妊娠状態下特有の薬物代謝酵素が誘導される。従って、エストロゲン作用物質及び／又はプロゲステロン作用物質が非存在下の薬物代謝関連酵素発現と、エストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質存在下の薬物代謝関連酵素発現とを対比すれば、妊娠状態における薬物代謝が予測できる。
【００１５】
薬物代謝関連酵素の発現は、当該遺伝子の発現、例えば通常のハイブリダイゼーション法により測定できるが、多くの遺伝子を同時に測定できる点から、ＤＮＡチップ(マイクロアレイ)で測定するのが好ましい。ここで、測定対象とできる遺伝子として例えば、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子群を含む第一相及び第二相薬物代謝酵素群、転写因子、各種の受容体などが挙げられる。
【００１６】
ＤＮＡチップの構成としては、各種薬物代謝関連酵素遺伝子（ｃＤＮＡまたは合成オリゴＤＮＡ）を固定化したものが好ましい。細胞から採取したＲＮＡを用いて標識ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡチップ上でハイブリダイズさせ、標識体を検出する。標識としては、蛍光色素、酵素、ラジオアイソトープ等が挙げられるが、検出の容易性、感度の点から蛍光色素が好ましい。
【００１７】
薬物代謝酵素発現の変動は、被験薬物非添加時の薬物代謝酵素発現用標識体と、被験薬物添加時の薬物代謝酵素発現用標識体とを、それぞれ異なる標識体を用い、それらの発現量の比を求める。そして、それらの比がエストロゲン作用物質及び／又はプロゲステロン作用物質非添加時に対してエストロゲン作用物質及びプロゲステロン作用物質添加時にどの程度変動したかを検出すれば判定できる。
【００１８】
得られた薬物代謝関連酵素遺伝子の変動結果から、通常のヒトにおける薬物の肝代謝と妊娠状態における薬物の肝代謝の相違が検出できる。従って、妊娠時の薬剤投与による母体に対する作用、例えば薬剤の副作用、薬剤の効果の遷延の可能性、肝毒性の可能性等が判定できる。その結果、薬剤の投与量、投与間隔の加減、肝庇護剤との併用、妊娠時に投与可能な薬剤の選択等が可能となる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
Ａ：試験方法
１）凍結小型肝細胞の調製
メスのラットの肝臓をコラゲナーゼを含む溶液で灌流し、得られた細胞をハンクス緩衝液（表１）に懸濁し５０×ｇ、１min、４℃で遠心して上清を回収する。この操作を３回繰り返す。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。この操作を３回繰り返す。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳ（表２）に懸濁する。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳに懸濁する。
生細胞数を数え、６×１０4生細胞／mlになるようＤＭＥＭ／ＦＢＳで調製する。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
2006288211.tif 000003
【００２３】
１００-mm  培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に９mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で１０日間培養する。この間、２日に１回培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳで交換する。培養皿から培地を除き６mlのＰＢＳで２回洗浄した後、２mlの０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えて軽く攪拌し、液を除く。３７℃に温めたＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ）を２ml加え、ＣＯ2インキュベーター内で５min静置する。ＤＭＥＭを１ml加えて小型肝細胞コロニーを回収、５０×ｇ、５minで遠心し、４培養皿分の沈殿を１mlのセルバンカー（三菱化学ヤトロン）に懸濁する。−３０℃で３０min凍結したのち、−８０℃で保存する。
【００２４】
２）成熟肝細胞の調製
メスのラットの肝臓をコラゲナーゼを含む溶液で灌流し、得られた細胞懸濁液を５０×ｇ、１min、４℃で遠心し、沈殿を回収する。
ハンクス緩衝液に懸濁し、５０×ｇ、１min、４℃で遠心、この操作を３回繰り返す。
細胞を２５mlのハンクス緩衝液に懸濁し、２１．６ml パーコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、２．４ml １０×ハンクス緩衝液に加えて転倒混合する。５０×ｇ、１５min、４℃で遠心し、上清を除く。細胞をＰＢＳで懸濁し、５０×ｇ、１min、４℃で遠心、沈殿を回収する。
【００２５】
３）コラーゲンコート培養皿の調製
ラットの尾から調製したコラーゲン液（５mg／ml）を０．１％  酢酸で１００倍に希釈し、６０-mm  培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に３mlずつ分注する。室温で１hr静置してからコラーゲン液を除き、クリーンベンチ内で一晩乾燥させたのち、紫外線を１hr照射して滅菌、３mlのＰＢＳを加えて３７℃で３０minインキュベートする。その後ＰＢＳを除き、細胞を播種する。
【００２６】
４）凍結小型肝細胞の培養
凍結小型肝細胞を３７℃インキュベーター内で解凍し、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地１０mlに加えて５０×ｇ、１min遠心する。上清を除き、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地３mlに沈殿した細胞を懸濁してコラーゲンコート培養皿に播種する。ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養し、２４時間後培地を無血清培地（ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ、表３）に交換し、以後２日に１回培地をＤＭＥＭ／ＤＭＳＯで交換する。擬似妊娠状態として培養する場合には、女性ホルモンを添加した培地を細胞播種及び培地交換に用いる。１７−βエストラジオール（ＳＩＧＭＡ）及びプロゲステロン（ＳＩＧＭＡ）はＤＭＳＯに溶解し、それぞれが１０-5Ｍの濃度になるよう培地に添加し、培地に含まれるＤＭＳＯ濃度が１％以下になるよう調製する。
培養２１日目から培地に薬剤を添加し、培養を続ける。フェノバルビタール（ＳＩＧＭＡ）、アセトアミノフェン(ＳＩＧＭＡ)はＤＭＳＯに溶解し、それぞれ２ｍＭ、５ｍＭになるよう培地に添加し、培地に含まれるＤＭＳＯ濃度が１％以下になるよう調製する。薬剤添加培地を毎日交換して４日間培養したのちに、細胞からのＲＮＡ抽出あるいはタンパク質抽出を行う。
【００２７】
【表３】
2006288211.tif 000004
【００２８】
５）蛋白質の抽出とウェスタンブロッティング
解凍後２５日間培養した小型肝細胞を３mlのＰＢＳで２回洗浄を行い、１mlのリシス緩衝液（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，５mＭ  ＥＤＴＡ，１５０mＭ  ＮａＣｌ，５μｇ／mlペプスタチンＡ，５μｇ／mlロイペプチン）を加えて４℃で１hr静置する。緩衝液に細胞を懸濁させて回収し、氷上で超音波処理（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，５０％ｄｕｔｙ，ｏｕｔｐｕｔ１，３０ｓｅｃ）を行った後、１，２００×ｇ、５min、４℃で遠心して上清を回収し、蛋白質溶液とする。溶液はＢＣＡプロテインアッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ）でタンパク濃度を測定し、濃度標準はＢＳＡを用いる。
【００２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは以下の条件で行う。
スタッキングゲルは、５％  アクリルアミド、０．１％  ＳＤＳ、１２５mＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）。
ランニングゲル、１０％  アクリルアミド、０．１％  ＳＤＳ、３７５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）。
調製した溶液に３／２００量の１０％  過硫酸アンモニウム（和光純薬工業）、１／１００量のＴＥＭＥＤ（関東化学）を加えて重合した。
サンプルは等量のサンプル緩衝液（６２．５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％  グリセロール、２％  ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノール、２５μｇ／mlブロモフェノールブルー（関東化学）と混合し９５℃で２min熱変性してから２０μｇタンパク／レーンでアプライする。
分子量マーカーは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｒｋｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
【００３０】
泳動後ゲルを１０mＭＣＡＰＳ  緩衝液で１０min×２回洗浄し、ウェット式転写装置でメンブレン（ＰＲＯＴＲＡＮ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写（１hr，４℃）する。
転写後メンブレンはブロックエース（大日本製薬）中で室温、１hr振とうしてブロッキングしてから一次抗体と反応させる。
抗ラットＣＹＰ１Ａ２抗体（Ｒａｂｂｉｔ，第一化学薬品）、抗ラットＣＹＰ２Ｅ１抗体（Ｇｏａｔ、第一化学薬品）は１％  ブロックエース（ｉｎ  ＰＢＳ）で希釈し、それぞれの抗体を含むＰＢＳにメンブレンを浸して室温で１hr振とうする。
メンブレンを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｉｎ  ＰＢＳ）で５min×３回洗浄し、１％ブロックエース（ｉｎ  ＰＢＳ）で１万倍希釈した二次抗体（ＡＰ標識）液に浸して室温で１hr振とうする。
メンブレンを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  （ｉｎ  ＰＢＳ）で５min×３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）で発色、検出を行う。
【００３１】
６）妊娠ラット肝及び培養細胞からのＲＮＡの抽出
解凍後２５日間培養した小型肝細胞を３mlのＰＢＳで２回洗浄し、１mlのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を加えて室温で５min静置して細胞溶解液を回収する。成熟肝細胞はＰＢＳに懸濁したのち５０×ｇ、１minで遠心して回収し１mlのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を加えて室温で５min静置して細胞溶解液を回収する。細胞溶解液に０．２mlのクロロホルムを加えて１５ｓｅｃ激しく攪拌後、室温で３min静置する。１２，０００×ｇ、１５min、４℃で遠心して水層を回収し、０．５mlの２−プロパノールを加えて攪拌。室温で１０min静置して１２，０００×ｇ、１０min、４℃で遠心、沈殿を７５％エタノールでリンスしてから風乾、ＤＥＰＣ処理水に溶解してＲＮＡサンプルとする。濃度は２６０ｎｍの吸光度により測定し、ＯＤ＝１のとき４０μｇ／mlとする。
【００３２】
７）マイクロアレイによる解析
ＣｙＳｃｒｉｂｅ  Ｐｏｓｔ−Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＲＮＡから標識ｃＤＮＡを合成する。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ３０μｇにＡｎｃｈｏｒｅｄ  ｏｌｉｇｏ  （ｄＴ）を２μｌ加え、ヌクレアーゼフリーＨ2Ｏで１１μｌにメスアップしてから７０℃で５min熱変性したのち室温で１０min静置する。
５×ＣｙＳｃｒｉｂｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、ヌクレオチドミックス  １μｌ、アミノアリル−ｄＵＴＰ  １μｌ、ＣｙＳｃｒｉｂｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌを加えて攪拌、４２℃で９０minインキュベートする。
２μｌの２．５Ｍ  ＮａＯＨを加えて攪拌し、３７℃で１５minインキュベートする。
１０μｌの２Ｍ  ＨＥＰＥＳを加えて攪拌し、さらに３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７５μｌのエタノールを加えて攪拌、−８０℃で１時間静置する。
１２，０００×ｇ、３０min、２５℃で遠心して上清を除き、１mlの７５％エタノールを加えてさらに１２，０００×ｇ、１５min、２５℃で遠心、上清を除き沈殿を風乾させてから１５μｌのヌクレアーゼフリーＨ2Ｏに溶解する。
１５μｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．０）に溶解したＣｙＤｙｅを加えて攪拌、遮光した。室温で１時間静置後、１５μｌの４Ｍ  ヒドロキシルアミンＨＣｌを加えて攪拌し１５min静置する。
ＣｙＳｃｒｉｂｅ  ＧＦＸ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて標識ｃＤＮＡを精製した。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡ溶液、及びＣｙ３標識ｃＤＮＡ溶液を各４５μｌずつ混合し、５００μｌのキャプチャー緩衝液を加えて攪拌してからスピンカラムにアプライする。
１３，８００×ｇ、３０ｓｅｃ、２５℃で遠心し、溶出液を廃棄する。
カラムに６００μｌの洗浄緩衝液（８０％ＥｔＯＨ）をアプライし１３，８００×ｇ、３０ｓｅｃ、２５℃で遠心し、溶出液を廃棄する。この操作を計３回繰り返す。
もう一度１３，８００×ｇ、３０ｓｅｃ、２５℃で遠心して溶出液を廃棄する。
５０℃に保温した溶出緩衝液を６０μｌアプライし室温で遮光して５min静置後、１３，８００×ｇ、３０ｓｅｃ、２５℃で遠心して溶出液を回収する。この操作を計２回繰り返す。
回収した溶液を遠心エバポレーターで７．５μｌに濃縮し、９５℃で２min熱変性してから氷上に静置する。ＣｙＳｃｒｉｂｅ  Ｐｏｓｔ−Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）付属の４×ハイブリダイゼーション緩衝液を２．５μｌ加えて攪拌する。
ＴａＫａＲａ  ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ  Ｒａｔ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＣＨＩＰ  ｖｅｒ．１．０（http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C1416）を用いて解析を行う。（表４、表５）アレイ上にギャップ付カバーグラスをかぶせ、標識ｃＤＮＡ液をアプライする。ハイブリチャンバー（ＴａＫａＲａ）内にＨ2Ｏを１００μｌ滴下してからアレイをセットし、６０℃にセットしたウォーターバスにチャンバーを沈め、１８時間ハイブリダイゼーションを行う。
アレイは以下の手順で洗浄を行う。洗浄液は全てアレイ１枚あたり５０mlで、５０ml  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で洗浄を行う。２×ＳＳＣ、１０min→２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、５５℃、１０min振とう×３回→０．０６×ＳＳＣ、１０ｓｅｃ。
アレイをスピンドライヤーで１min遠心して水分を飛ばし、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＡＸＯＮ）により解析を行う。
データはマーカーの蛍光値により補正を行って均一化し、バックグラウンドを除いたＭｅｄｉａｎ値を採用してＣｙ５／Ｃｙ３値を算出する。
【００３３】
【表４】
2006288211.tif 000005
【００３４】
【表５】
2006288211.tif 000006
【００３５】
８）オリジナルアレイを用いた解析
薬剤代謝酵素を中心に１４３遺伝子の塩基配列を乗せたアレイを作成した。（図１、表６、表７、表８、表９）６０ｍｅｒの合成ＤＮＡをスライドグラス上に固定化し、スーパーアルデヒドコートでブロッキングした。
アレイの解析は基本的に７）の方法と同様だが、以下の点で異なる。
ＲＮＡにＰａｎｏｒａｍａ  Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ  Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｂ１４４４（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を１μｌ加えてｃＤＮＡを合成し、同配列を載せたスポットの蛍光強度で標準化を行う。
アレイにｃＤＮＡ溶液をハイブリさせる前に、スライドグラスに以下の前処理を行う。
０．２％ＳＤＳ、２min×２→Ｈ2Ｏ、２min→Ｈ2Ｏ、ｂｏｉｌ、３min→ｄｒｙ  ｕｐ→２５％  Ｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ＮａＢＨ4（ｉｎ  ＰＢＳ）、５min→０．２％ＳＤＳ、１min×２→Ｈ2Ｏ、１min→Ｈ2Ｏ、ｂｏｉｌ、５ｓｅｃ→ｄｒｙ  ｕｐ
【００３６】
【表６】
2006288211.tif 000007
【００３７】
【表７】
2006288211.tif 000008
【００３８】
【表８】
2006288211.tif 000009
【００３９】
【表９】
2006288211.tif 000010
【００４０】
Ｂ：実験結果
（１）図２に、オリジナルアレイを用いた、妊娠ラットにおける薬物代謝酵素遺伝子の発現解析結果を示す。図２中、Ｃｙ３標識（緑色、モノクロではグレー）はメスの正常ラットの成熟肝細胞からのｃDNA、Ｃｙ５標識（赤色、モノクロでは白色）は妊娠１９日目ラットの成熟肝細胞からのｃDNAである。この結果、in vitro妊娠ラット肝細胞では薬剤代謝に関わる多くの遺伝子が発現低下していることが確認された（表１０）。
【００４１】
【表１０】
2006288211.tif 000011
【００４２】
（２）図３に、in vitro疑似妊娠状態における薬物代謝酵素の発現（ウェスタンブロッティング）結果を示す。図３から明らかなように、in vitroでは、女性ホルモン存在下（妊娠ラットにおけるホルモン濃度に近い状態を作る）で小型肝細胞を培養し、ＣＹＰ遺伝子の発現を調べた結果、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１はin vivoと同様に発現低下することを確認した。
【００４３】
（３）図４に、ＴａＫａＲａ  ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ  Ｒａｔ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＣＨＩＰ  ｖｅｒ．１．０による解析結果を示す。
図４の、左側中、Ｃｙ５標識は、妊娠１９日目ラットの成熟肝細胞からのｃDNAであり、Ｃｙ３標識は正常ラットの成熟肝細胞からのｃDNAである。
右側中、Ｃｙ５標識は女性ホルモン添加培養した小型肝細胞からのｃDNAであり、Ｃｙ３標識は女性ホルモン非添加培養した小型肝細胞からのｃDNAである。
この結果、妊娠ラットで発現低下する薬剤代謝に関わる遺伝子のいくつかが、in vitro妊娠状態で培養した小型肝細胞でも同様に発現低下していることがわかった（表１１）。
【００４４】
【表１１】
2006288211.tif 000012
【００４５】
（４）図５にアセトアミノフェン添加による薬物代謝酵素の発現を示す。図５中、Ｃｙ５標識は、５mMアセトアミノフェン添加培養４日後の小型肝細胞からのｃDNAであり、Ｃｙ３標識は、コントロールである。左側は、女性ホルモン添加（１０-5Ｍ  １７−βエストラジオール＋１０-5Ｍ  プロゲステロン）、右側は女性ホルモン非添加である。アセトアミノフェン添加時の薬物代謝酵素の発現変動を示す。表１２中の数値はＣｙ５／Ｃｙ３値（normal:女性ホルモン非添加、Preg:女性ホルモン添加）である。
【００４６】
【表１２】
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【００４７】
（５）図６にフェノバルビタール添加による薬物代謝酵素の発現を示す。図６中、Ｃｙ５標識は、２mMフェノバルビタール添加培養４日後の小型肝細胞からのｃDNAであり、Ｃｙ３標識は、コントロールである。左側は女性ホルモン添加（１０-5Ｍ  １７−βエストラジオール＋１０-5Ｍ  プロゲステロン）、右側は女性ホルモン非添加である。フェノバルビタール添加時の薬物代謝酵素の発現の変動を示す。表１３中の数値はＣｙ５／Ｃｙ３値（normal:女性ホルモン非添加、Preg:女性ホルモン添加）である。
【００４８】
【表１３】
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【００４９】
アレイの結果から、薬剤代謝酵素のデータを抽出し、さらに通常の培養条件と妊娠状態での発現変動が異なる遺伝子を抽出した。表１２及び表１３より妊娠状態において薬剤を添加することにより、幾つかの薬剤代謝酵素が通常とは異なる発現変動を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】オリジナルアレイのスポット図及びスポットされた遺伝子の分類を示す。ＣｏｌｕｍｎとＲｏｗの番号は表６、表７、表８、表９の番号に一致する。
【図２】オリジナルアレイを用いた、妊娠ラットにおける薬物代謝酵素遺伝子の発現解析結果を示す。
【図３】in vitro疑似妊娠状態における薬物代謝酵素の発現（ウェスタンブロッティング）結果を示す。
【図４】タカラ社ＤＮＡチップによる解析結果を示す。画像は全スポット領域のうち左上（Ｂｌｏｃｋ１）の領域である。
【図５】アセトアミノフェン添加による薬物代謝酵素の発現を示す。画像は全スポット領域のうち左上（Ｂｌｏｃｋ１）の領域である。
【図６】フェノバルビタール添加による薬物代謝酵素の発現を示す。画像は全スポット領域のうち左上（Ｂｌｏｃｋ１）の領域である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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