(57)【要約】【課題】  マガキ付着期幼生の検出方法、検出キット、及び検出器、及びマガキ付着期幼生の回収方法、並びにそれらに使用するモノクローナル抗体又はそのフラグメント及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供すること。【解決手段】  ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液を腹腔内に投与して免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合した。その後、ムラサキイガイ付着期幼生の粗抽出液に反応し、マガキ付着期幼生の粗抽出液には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生の粗抽出液に特異的に反応し、その他の二枚貝類の付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定した。これらのモノクローナル抗体を用いることにより、マガキの付着期幼生の検出や回収が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マガキ付着期幼生の検出方法であって、試料に対し、
ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、
マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、
を作用させることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、及びFERM P-20220からなる群から選ばれるいずれかの受託番号で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
マガキ付着期幼生の検出キットであって、
ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、
マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、
を含むことを特徴とする検出キット。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項５に記載の検出キット。
【請求項７】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする請求項５又は６に記載の検出キット。
【請求項８】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、及びFERM P-20220からなる群から選ばれるいずれかの受託番号で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項７に記載の検出キット。
【請求項９】
マガキ付着期幼生の検出器であって、
前記検出器は、イムノクロマトグラフ媒体を含み、
前記イムノクロマトグラフ媒体は、
試料を滴下する又は浸す第一の部分と、
ムラサキイガイ付着期幼生に反応し、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が固定化されている第二の部分と、
マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されている第三の部分と、を含み、
前記第二の部分は、前記第一の部分と前記第三の部分との間に備えられていることを特徴とする検出器。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項９に記載の検出器。
【請求項１１】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の検出器。
【請求項１２】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、及びFERM P-20220からなる群から選ばれるいずれかの受託番号で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１１に記載の検出器。
【請求項１３】
マガキ付着期幼生の回収方法であって、
ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを用いて、試料中のマガキ付着期幼生を回収する工程を含むことを特徴とする回収方法。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１３に記載の回収方法。
【請求項１５】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の回収方法。
【請求項１６】
前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体が、FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、及びFERM P-20220からなる群から選ばれるいずれかの受託番号で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１５に記載の回収方法。
【請求項１７】
マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１８】
受託番号FERM P-20217で寄託されていることを特徴とする請求項１７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１９】
マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が、受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１９に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マガキ付着期幼生の検出方法、検出キット、検出器、及び回収方法、並びにそれらに使用するモノクローナル抗体又はそのフラグメント、及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
マガキの養殖においては、マガキの付着期幼生が発生する場所にホタテ貝の貝殻を吊して、前記貝殻にマガキ付着期幼生を効率よく付着させることが重要だとされている。
【０００３】
マガキ付着期幼生が発生する場所の特定は、ある場所から採取した試料にマガキ付着期幼生が多く存在するか否かを調査することにより行われているが、マガキ付着期幼生は、マガキ以外の二枚貝類の付着期幼生（例えば、ムラサキイガイ、アサリ、バカガイ等の付着期幼生）とその形態が非常に似ているので、専門家であってもマガキ付着期幼生の特定は困難である。そのため、マガキ付着期幼生を特異的に検出する手法や、マガキ付着期幼生を特異的に回収する手法の開発が求められている。
【０００４】
しかしながら、二枚貝類に属するアサリの浮遊幼生を特異的に検出する方法は開発されているものの（特許文献１参照）、マガキ付着期幼生を特異的に検出する方法又は回収する方法は開発されていなかった。
【特許文献１】特開平１１−１９６８６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、マガキ付着期幼生を特異的に検出するための検出方法、検出キット、及び検出器、及びマガキ付着期幼生を特異的に回収するための回収方法、並びにそれらに使用するモノクローナル抗体又はそのフラグメント、及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ムラサキイガイの付着期幼生（ペディベリジャー幼生）に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製しようと試み、ムラサキイガイ付着期幼生を腹腔内に注射することにより免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドーマの培養上清を用いて、ムラサキイガイ付着期幼生、アサリ付着期幼生、バカガイ付着期幼生、マガキ付着期幼生、甲殻類プランクトン（コペポーダ類、アルテミアノープリウス幼生等）、及びフジツボ類の付着期幼生（イワフジツボ、アカフジツボ等の付着期幼生（キプリス幼生））の粗抽出液（各幼生又はプランクトンを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）との反応性を調べていたところ、ムラサキイガイ付着期幼生には反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ以外に、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが存在することを見出した。このことから、ムラサキイガイ付着期幼生には反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を利用することにより、マガキ付着期幼生を特異的に検出又は回収することができる方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出方法は、試料に対し、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、を作用させる工程を含む。
【０００８】
また、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出キットは、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、を含む。
【０００９】
さらに、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出器は、前記検出器は、イムノクロマトグラフ媒体を含み、前記イムノクロマトグラフ媒体は、試料を滴下する又は浸す第一の部分と、ムラサキイガイ付着期幼生には反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が固定化されている第二の部分と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されている第三の部分と、を含み、前記第二の部分は、前記第一の部分と前記第三の部分との間に備えられている。
【００１０】
本発明に係るマガキ付着期幼生の回収方法は、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを用いて、試料中のマガキ付着期幼生を回収する工程を含む。
【００１１】
また、本発明に係るハイブリドーマは、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生することを特徴とする。
【００１２】
さらに、本発明に係るモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないことを特徴とする。
【００１３】
ここで、前記マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体としては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号FERM P-20217で寄託されているハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。また、前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキの付着期幼生には反応しない抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそのフラグメントなどである。前記ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体としては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、FERM P-20220等で寄託されているハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、マガキ付着期幼生を特異的に検出するための検出方法、検出キット、及び検出器、及びマガキ付着期幼生を特異的に回収するための回収方法、並びにそれらに使用するモノクローナル抗体又はそのフラグメント、及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上記知見に基づき完成した本発明を実施するための形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
＝＝マガキ付着期幼生の検出及び回収＝＝
ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体は、少なくともマガキ付着期幼生には結合しないことから、ムラサキイガイ付着期幼生を含む幼生の除去に有用であると考えられる。また、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体は、少なくともアサリやバカガイの付着期幼生には結合しないことから、マガキやムラサキイガイの付着期幼生のみを回収するのに有用であるといえる。従って、これらの抗体やモノクローナル抗体を順次又は同時に用いることにより、形態学的に特定が困難とされていたマガキ付着期幼生と、ムラサキイガイ、アサリ、バカガイ等のマガキ以外の二枚貝類の付着期幼生との分離が可能となり、マガキ付着期幼生の検出及び回収を特異的に行うことができる。
【００１７】
＜マガキ付着期幼生の回収方法＞
本発明に係るマガキ付着期幼生の回収方法は、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを用いて、試料（例えば、海水、川水など）中のマガキ付着期幼生を回収する工程を含む。例えば、試料中のムラサキイガイ付着期幼生を、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体を用いて除去し、続いて試料中のマガキ付着期幼生を、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いて回収することができる。また、試料中のマガキ及びムラサキイガイ付着期幼生を、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いて回収し、続いてムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体を用いてムラサキイガイ付着期幼生を除去することによりマガキ付着期幼生を回収することができる。
【００１８】
なお、前記幼生の除去や回収には、幼生と前記抗体又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントとの親和性を利用して行うことができる。例えば、前記抗体又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントが結合したゲルを用いたカラムクロマトグラフィー法、前記抗体又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントが結合したゲルやラテックスを遠心分離等により除去・回収するバッチ法、前記抗体又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントが結合した磁性体を磁石により除去・回収する方法などを利用することができる。また、前記幼生の除去や回収にpanning法を適用してもよい。その他、蛍光物質が結合した前記抗体と、前記蛍光物質と蛍光色素が異なる蛍光物質が結合した前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントとを幼生に結合し、FACS（Fluorescence Activated Cell Sorter）を用いて、マガキ付着期幼生を特異的に回収することもできる。前記蛍光物質としては、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジンなどの公知の物質を用いることができる。
【００１９】
以上のように、本発明に係るマガキ付着期幼生の回収方法により、マガキ付着期幼生の回収が可能となり、養殖産業等に大きく貢献することができるようになると考えられる。
【００２０】
＜マガキ付着期幼生の検出方法＞
本発明に係るマガキ付着期幼生の検出方法は、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを用いることにより行うことができる。例えば、上述のように、試料（例えば、海水、川水などのマガキ付着期幼生が存在すると思われる場所の水）中のムラサキイガイ付着期幼生を、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体を用いて除去し、その後、試料中のマガキ付着期幼生を、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いて免疫学的手法により検出することができる。また、上述のように、試料中のマガキ及びムラサキイガイ付着期幼生を、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いて回収し、その後、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体を用いてムラサキイガイ付着期幼生を免疫学的手法により検出することにより行うこともできる。前記免疫学的手法としては、EIA（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、RIA（Radioimmuno assay）、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。その他、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメント、及びムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体をそれぞれ異なる蛍光でラベルし、上述のようにFACS（Fluorescence Activated Cell Sorter）を用いて検出することもできるし、蛍光顕微鏡で、蛍光色の違いによって検出することもできる。
【００２１】
なお、上述においては、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出方法において、海水又は川水等の試料を用いることとしたが、マガキ付着期幼生が存在すると思われる場所の水を超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物を試料として用いることとしてもよい。このように溶解物を試料として用いる場合には、例えば、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体で吸収した後、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いたウェスタンブロット法やELISA法により、試料中にマガキ付着期幼生が存在していたかどうかを調べることができる。
【００２２】
以上のように、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出は、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを用いることにより行うことができる。従って、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含むキット又は器具は、マガキ付着期幼生の検出キット及び検出器として有用であるといえる。
【００２３】
本発明に係るマガキ付着期幼生の検出器は、試料を滴下する又は浸す第一の部分と、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体が固定化されている第二の部分と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントが固定化されている第三の部分とを含み、第二の部分は第一の部分と第三の部分との間に備えられているイムノクロマトグラフ媒体を含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウムなど）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゲラチン、スキムミルクなど）、免疫学的手法により前記第三の部分に捕捉されたマガキ付着期幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤など）、安定剤（例えば、BSA、ヤギ血清など）等の、抗体又はそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１又は２以上、さらに含ませることとしてもよい。前記イムノクロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカなどの無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロースなどの変性セルロース等を用いることができる。
【００２４】
本発明に係るマガキ付着期幼生の検出器の一例としては、上述のようなイムノクロマトグラフ媒体において、さらに、第三の部分のモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等の二次抗体が固定化された第四の部分を有し、第二の部分と第三の部分は第一の部分と第四の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子など）、重金属（例えば、金、白金など）、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジンなど）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含むものを挙げることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、試料中に存在する全てのムラサキイガイ付着期幼生、又はその溶解物中のムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体に対する抗原が、第二の部分に補足されてその位置で標識物質により検出が可能となる。また、試料中に存在するマガキ付着期幼生、又はその溶解物中のマガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントに対する抗原は、第三の部分に補足されてその位置で標識物質により検出が可能となる。さらに、第四の部分を備えることにより、マガキやムラサキイガイの付着期幼生には反応しなかった、標識物質で標識されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントが、第四の部分に固定化された二次抗体により補足されてその位置で標識物質により検出が可能となり、これをもって検出試験が終了したことの判断をすることが可能になる。なお、上記のイムノクロマト媒体において、第二の部分が濃く標識された場合には、試料中に存在するムラサキイガイ付着期幼生等の一部が、第三の部分に流れて捕捉されている可能性が考えられるので、再度、試料を希釈した後、検出試験を行うことが好ましい。これにより、試料中にマガキ付着期幼生が存在するかどうかを正確に調べることが可能となる。
【００２５】
また、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出キットは、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体と、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含むものであればどのようなものでもよく、これら以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウムなど）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゲラチン、スキムミルクなど）、上述のムラサキイガイ付着期幼生を除去するための物質、上述のマガキ付着期幼生を回収するための物質、試料からムラサキイガイ付着期幼生を除去した後又は溶解物中の、ムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しない抗体に対する抗原を除去した後に上述の免疫学的手法によりマガキ付着期幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤など）、安定剤（例えば、BSA、ヤギ血清など）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは上述のような検出器（ムラサキイガイ付着期幼生を別途除去する場合には、検出器に上述の第二の部分が含まれていなくてもよい。）、又はこれらのうち２以上を組み合わせたものがさらに含まれていてもよい。
【００２６】
なお、前記標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジンなど）、金などのコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金など）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（PE）、フィコシアニン（PC）など）、放射性同位元素（例えば、3H、32P、35S、125I、131Iなど）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、上述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（DAB）、o-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、BCIP/Nitro-TB（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、pNPP（para-nitorophenylphosphate）などを用いることができる。前記発色増強剤としては、上述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸などを用いることができ、前記二次抗体としては、例えば、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応し、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体などが産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗Ig(H+L)、抗Ig(Fc)などを用いることができる。
【００２７】
以上のように、本発明に係るマガキ付着期幼生の検出方法、検出器、又は検出キットを用いることにより、マガキ付着期幼生の存在の有無の確認、マガキ付着期幼生の同定、マガキ付着期幼生の量の測定が可能となる。
【００２８】
なお、本実施の形態において用いられる上述のムラサキイガイ付着期幼生に反応し、マガキ付着期幼生には反応しない抗体は、モノクローナル抗体であってもかまわないが、ポリクローナル抗体であってもよい。なお、このポリクローナル抗体は、ムラサキイガイ付着期幼生を抗原として用い、常法により製造することができる。
【００２９】
＝＝モノクローナル抗体又はそのフラグメントの製造方法＝＝
上述のムラサキイガイ付着期幼生又はその粗抽出液に反応し、マガキ付着期幼生又はその粗抽出液には反応しないモノクローナル抗体や、上述のマガキ及びムラサキイガイの付着期幼生又はそれらの粗抽出液に特異的に反応し、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体は、それぞれのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いることにより得ることができる。
【００３０】
上述のハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、上述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サルなど）の腹腔内に投与することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、培養上清又は培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、又は哺乳類動物から採取した血液若しくは腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなど）、ゲル濾過等の方法、又はこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。
【００３１】
上述のムラサキイガイ付着期幼生に反応するが、マガキ付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号FERM P-20216、FERM P-20218、FERM P-20219、又はFERM P-20220で寄託されている細胞株を用いることができる。また、上述のマガキ及びムラサキイガイの付着期幼生に特異的に反応するが、アサリやバカガイの付着期幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号FERM AP-20217で寄託されている細胞株を用いることができる。
【００３２】
上述のモノクローナル抗体のフラグメントとしては、該モノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメントなどを用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、上述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、FabフラグメントやF(ab’)2フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
【００３３】
＝＝＝ハイブリドーマの作製＝＝＝
上述のハイブリドーマは、例えば、以下の方法により作製することができる。まず、ムラサキイガイ付着期幼生又はその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原（アジュバントと併用してもよい。）を哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サルなど）の静脈内、皮下、腹腔内等に（１〜複数回）投与して免疫する。その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの培養上清等を用いて、ムラサキイガイ、マガキ、アサリ、及びバカガイ等の二枚貝類の付着期幼生又はそれらの粗抽出液との反応性を確認することにより、得ることができる。
【００３４】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）などの融合促進剤を含む培養培地で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを一緒に培養することにより行うことができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して行うこともできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチンなどの補助剤を培養培地に含ませることとしてもよい。
【００３５】
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞などを用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、又は末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地など）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いることとしてもよい。
【００３６】
上述のハイブリドーマは、常法のスクリーニングやクローニングを繰り返し行って、より特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択したものであることが望ましい。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（EIA：Enzyme ImmunoAssay、ELISA：Enzyme-Linked Immunosorbent Assays）、放射線免疫測定法（RIA：Radio Immuno Assay）、ウェスタンブロット法等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。
【００３７】
なお、上述のハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ムラサキイガイ、マガキ、アサリ、及びバカガイ等の二枚貝類の付着期幼生又はそれらの粗抽出液との反応性を調べればよいが、さらに、二枚貝類の付着期幼生以外に、フジツボの付着期幼生（キプリス幼生）、甲殻類プランクトン等の他の幼生若しくはプランクトン又はそれらの粗抽出液との反応性を調べる方が好ましい。これにより、より特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることが可能となる。
【００３８】
以上のようにして得られたハイブリドーマから産生される、ムラサキイガイ付着期幼生又はその粗抽出液に反応し、マガキ付着期幼生又はその粗抽出液には反応しないモノクローナル抗体や、マガキ及びムラサキイガイの付着期幼生又はそれらの粗抽出液に特異的に反応し、アサリやバカガイの付着期幼生又はそれらの粗抽出液には反応しないモノクローナル抗体を用いることにより、様々な幼生又はプランクトンを含む試料（例えば、海水など）中からマガキ付着期幼生を特異的に回収することが可能となり、また、様々な幼生又はプランクトンを含む試料（例えば、海水など）中からマガキ付着期幼生を特異的に検出、すなわち、マガキ付着期幼生の存在の有無の確認、マガキ付着期幼生の同定、マガキ付着期幼生の量の測定等を行うことが可能になる。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
［実施例１］
室内飼育により得られたムラサキイガイ付着期幼生（ペディベリジャー幼生）を抗原として用いた。
【００４１】
7週齢のBALB/cマウスの腹腔内に抗原を6回注射し（1〜5回目の注射：幼生300個/100〜150μl PBS、6回目の注射（最終免疫）：幼生1000個/200μl PBS；1回目の投与から22日目に2回目の投与を、2回目の投与から24日目に3回目の投与を、3回目の投与からおよそ半年後に4回目の投与を、4回目の投与から半月後に5回目の投与を、5回目の投与からおよそ80日目に6回目の投与を行った。）、マウスを免疫した。
【００４２】
最終免疫から3日後にマウスを解剖して脾臓を摘出し、10％のFBS（Fetal Bovine Serum；GIBCO）及び1％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic；GIBCO）を含むRPMI1640（GIBCO）培地中で滅菌ステンレスメッシュにより裏漉した後、分散・懸濁することにより浮遊細胞を得た。この浮遊細胞を10％のFBS を含むRPMI1640培地（FBS+培地）で洗浄・遠心した後、RPMI1640培地（FBS-培地）で3回遠心・洗浄し、脾臓細胞（108個程度）を回収した。
【００４３】
次に、ミエローマ細胞株P3U1（5×107個）と脾臓細胞（108個程度）を混合し、その後遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに1gのPEG4000（ポリエチレングリコール；MERCK社 Article No.9727）とFBS-培地1mlとを混合した溶液をゆっくりと添加しながら撹拌し、さらに１分間緩やかに撹拌した。その後、FBS-培地2mlをゆっくり加えながら１分間撹拌して、細胞融合を行った。
【００４４】
細胞融合処理後、さらにFBS-培地8mlを１分間かけてゆっくりと添加し、続いて遠心分離（1000rpm×5分間）して上澄みを吸引除去した。これにFBS-培地10mlを添加して懸濁し、FBS+HAT培地（10％のFBS、1％の抗生物質、及びHAT supplement medium（SIGMA；粉末1バイアルを50倍に希釈したものを使用）×0.5を含むRPMI1640培地（GIBCO））が入った分室シャーレ5枚にそれぞれ2ml播種し、37 ℃，5% CO2の条件下で5日間培養した。
【００４５】
各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーをピックアップし、HT培地（10％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells，HYBRIMAX；SIGMA）、100μMヒポキサンチン、及び16μMチミジンを含むRPMI1640培地）の入った96穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、ELISA法により抗体の産生を確認した。
【００４６】
（１）ムラサキイガイのペディベリジャー幼生30000個体に600μlの50mM Tris-HCl（pH 7.5）を加え、氷中でホモジナイズ・超音波（数秒×5回）処理を行い、5000rpm×20分間遠心することにより、ムラサキイガイ幼生粗抽出液（タンパク質濃度：39.5mg/ml）を調製した。  
（２）（１）で得られたムラサキイガイ幼生粗抽出液（100μg/ml）50μlを、96穴イワキELISAプレートの各ウェルに加え、４℃で抗原をウェル底面に吸着させた。  
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをTBS（0.5 M NaCl及び20 mM Tris-HCl（pH7.5））200μlで洗浄した。  
（４）各ウェルを1％ BSAを含むTBS 100μlで1時間ブロッキングした。  
（５）各ウェルをTTBS（0.05％ Tween20を含むTBS）200μlで3回洗浄した。  
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（1次抗体）50μlを各ウェルに加え、1時間反応させた。  
（７）各ウェルをTTBS 200μlで4回洗浄した。  
（８）各ウェルに2次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG（H+L）ヤギ抗体；ZYMED laboratory）溶液（TBSで1000倍に希釈した溶液）50μlを加えて1時間反応させた。  
（９）各ウェルをTTBS 200μlで5回洗浄した。  
（10）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット；BIO-RAD）溶液 100μlを加え、室温で1時間振盪することにより発色させた。  
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550；405nm）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度を測定した。
【００４７】
上述のELISA法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、段階的に希釈した培養液をさらにELISA法により抗体価を測定し、抗体産生能が高いハイブリドーマをピックアップするという操作を3回繰り返して行い（2回目の培養は、HTを含まない、10％ FBS及び1％ 抗生物質を含むRPMI1640を用いた。）、ムラサキイガイ幼生粗抽出液に対してより高い抗体産生能を示すハイブリドーマ（A12-1-2b、B2-3-4-4a、C4-3-4c、C4-3-4b、及びF10-4-1c）を得た。
【００４８】
［実施例２］
次に、実施例１により得られた５つのハイブリドーマの培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に対して特異的に反応するかいなかを調べるため、ムラサキイガイペディベリジャー幼生、ムラサキイガイ以外の二枚貝類（アサリ、バカガイ、マガキなど）のペディベリジャー幼生、甲殻類プランクトン（コペポーダ類、アルテミア（Artemia salina）ノープリウス幼生）、イワフジツボ（Chthamalus challengeri Hoek）キプリス幼生、アカフジツボキプリス幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度；100μg/ml）との反応性を、実施例１に記載のELISA法と同様に確認した。なお、各粗抽出液は、各幼生又はプランクトンを50mM Tris-HCl（PH7.5）に加えてホモジナイズ・超音波（数秒×5回）処理し、5000rpm×20分間の遠心を行うことにより調製した。ELISAの結果を表１に示す。
【００４９】
［表１］
2006250825.tif 000002
【００５０】
表１に示すように、ハイブリドーマ細胞株A12-1-2b、C4-3-4c、及びC4-3-4bの上清は、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して非常に強い反応性を示し、形態学的に非常に似ているマガキ、アサリ、バカガイ等のムラサキイガイ以外の二枚貝類のペディベリジャー幼生の粗抽出液や、二枚貝類以外の幼生やプランクトンの粗抽出液に対して反応性を示さなかった。また、ハイブリドーマ細胞株F10-4-1cの上清は、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して非常に強い反応性を示すとともに、形態学的にムラサキイガイペディベリジャー幼生と全く異なるコペポーダ類の粗抽出液に対して非常に弱い反応性を示し、その他の幼生の粗抽出液には反応性を示さないことが明らかになった。
【００５１】
一方、ハイブリドーマ細胞株B2-3-4-4aの上清は、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液以外にマガキペディベリジャー幼生の粗抽出液に非常に強く反応性を示し、ムラサキイガイ及びマガキのペディベリジャー幼生以外の幼生及びプランクトンの粗抽出液全てに対して反応性を示さないことがわかった。
【００５２】
以上のことから、ハイブリドーマ細胞株A12-1-2b、C4-3-4c、C4-3-4b、及びF10-4-1cは、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生し、ハイブリドーマ細胞株B2-3-4-4aは、マガキ及びムラサキイガイペディベリジャー幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生することが明らかになった。また、ハイブリドーマ細胞株B2-3-4-4aが産生するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株A12-1-2b、C4-3-4c、C4-3-4b、F10-4-1c等が産生するモノクローナル抗体とその特異性が異なることから、それぞれの抗原認識部位が異っていることが示唆された。さらに、ハイブリドーマ細胞株B2-3-4-4aが産生するモノクローナル抗体と、ハイブリドーマ細胞株A12-1-2b、C4-3-4c、C4-3-4b、F10-4-1c等が産生するモノクローナル抗体とを用いることにより、マガキペディベリジャー幼生を特異的に検出したり、回収したりすることができるのではないかと考えられた。そこで、これらのハイブリドーマ細胞株を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した（A12-1-2b：受託番号FERM P-20216、B2-3-4-4a：FERM P-20217、C4-3-4c：受託番号FERM P-20218、C4-3-4b：FERM P-20219、F10-4-1c：FERM P-20220）。