(57)【要約】      （修正有）【課題】癌、特に積極的な術後補助化学療法を必要とする予後不良乳癌の治療薬を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質：  （ａ）乳癌由来の特定な塩基配列で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子、  （ｂ）乳癌由来の特定な塩基配列で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含む核酸、  （ｃ）乳癌由来の特定な塩基配列で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質：
（ａ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、及びリボザイムからなる群から選ばれる請求項１に記載の物質。
【請求項３】
配列番号３及び４で表されるｓｉＲＮＡである請求項１記載の物質。
【請求項４】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質を用いることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項５】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子若しくは核酸、又はそれらが移入された細胞を用いることを特徴とする、該遺伝子若しくは核酸の発現を抑制することにより細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
細胞の増殖を抑制する物質を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を用意し、
（ｂ）請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸を有する細胞に該候補化合物を接触させ、
（ｃ）該候補化合物が該遺伝子又は核酸の発現を抑制するか否かを判定することを含む方法であり、該候補化合物が該遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質である、上記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の機能を抑制する物質による細胞増殖抑制方法。
【請求項８】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の発現を調節する物質。
【請求項９】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質を認識する抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質を用いることを特徴とする該蛋白質の機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の機能を抑制する物質を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を用意し、
（ｂ）該蛋白質又は該蛋白質を発現する細胞に該候補化合物を接触させ、
（ｃ）該候補化合物が該蛋白質の機能を抑制するか否かを判定することを含む方法であり、該候補化合物が該蛋白質の機能を抑制する物質である、上記方法。
【請求項１２】
請求項１〜３及び８のいずれか一項に記載の物質を有効成分として含む医薬品。
【請求項１３】
請求項３に記載の物質を含む医薬品。
【請求項１４】
予後不良乳癌の治療薬である請求項１３記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に癌細胞の増殖に関係する遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質、同物質による細胞の増殖を抑制する方法に関する。本発明はまた、同遺伝子又は核酸がコードする蛋白質の機能を抑制する物質、及び同物質による細胞の増殖を抑制する方法に関する。本発明は更に、該遺伝子、核酸又は蛋白質の機能を調節する物質のスクリーニング、更には該物質を有効成分とする医薬品、特に予後不良乳癌の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界中で一年当たり約百万件の新規症例を伴う、最も一般的な悪性疾患のうちの１つである。乳癌根治手術後の臨床経過は術後短期間で再発するものから、術後１０年以上にわたって無再発で生存するものまで様々である。そのため、多数の研究者達が乳癌術後の再発を正確に予測し、術後補助療法を施行するための指針とするために、信頼性の高い予後因子を求めている。現在臨床医は、リンパ節転移の有無、腫瘍径、ステージ、ホルモンレセプターの有無、年齢を考慮して、術後補助療法の治療方針を決定している（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
近年、分子生物学的手法を用いて、乳癌組織の遺伝子変化と乳癌術後予後との関連性の研究が行われ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２遺伝子やＭＹＣＣ原癌遺伝子の増幅（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、及び非特許文献７）、ＴＰ５３遺伝子の変異や過剰発現（非特許文献８、非特許文献９、及び非特許文献１０）、第７染色体７ｑ３１の欠失（非特許文献１１）、ＣＤＫＮ１Ｂ遺伝子の低発現（非特許文献１２）、サイクリンＥ遺伝子の発現レベル（非特許文献１３）などが報告されている。しかしながら、乳癌根治手術後の再発を正確に予測し、それに対して最適の治療を行うことは現在においてもなお困難である。
【０００４】
乳癌組織中のエストロゲン受容体の有無は術後乳癌の再発予測を考慮する上で重要な予後因子の一つである。エストロゲン受容体陽性の乳癌は術後の抗ホルモン療法に奏効し比較的予後良好であるため、抗ホルモン療法が第一選択となっている（非特許文献１４）。
【０００５】
一方、エストロゲン受容体陰性の乳癌は一般的には予後不良であり、術後化学療法の対象とされているが、同じくエストロゲン受容体陰性の乳癌でも術後長期間再発・転移しない症例と、術後短期間のうちに再発・転移する症例とがある。エストロゲン受容体陰性乳癌において術後短期間で再発・転移することが予測される症例に対しては、再発及び転移を回避するためにより積極的な術後補助治療が必要であるが、術後長期間再発・転移しないと予想される患者に対しては、少なからず副作用が発生する積極的な術後補助治療は必要ではない。しかし、予後良好患者と予後不良患者とを識別することは簡単ではなく、術後治療計画は様々な臨床病理学的因子と臨床医の経験とに基づいて作成されている。
【０００６】
このようにエストロゲン受容体陰性乳癌の一部は術後補助療法として積極的な化学療法を必要とするが、積極的な治療を必要とする予後不良エストロゲン受容体陰性乳癌に対する特異的な治療薬は上市されていないのが現状である。
【０００７】
ＳＥＰＴＩＮはヘテロ重合フィラメント形成蛋白質（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーに属する蛋白質であり、酵母の細胞質分裂に必須である蛋白質として発見され、植物を除く多くの真核生物で同定されている（非特許文献１５、及び非特許文献１６）。ＳＥＰＴＩＮファミリーは全長の２５％近くが同一であり、中央部にｒａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅと類似したＧＴＰと相互作用するモチーフを有している。ＳＥＰＴＩＮ蛋白質の中央部はよく保存されているが、ほとんどのＳＥＰＴＩＮ蛋白質のＮ末側とＣ末側は多様性に富んでおり、蛋白質−蛋白質相互作用に関与するｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ領域を有している。ＳＥＰＴＩＮ１１（以下ＳＥＰＴ１１と言う）は仮想蛋白質ＦＬＪ１０８４９をコードする遺伝子としてクローニングされ、その生化学的かつ細胞生物学的研究結果から最近ＳＥＰＴＩＮファミリーに属する遺伝子として同定された（非特許文献１５，及び非特許文献１６）。ＳＥＰＴ１１遺伝子はクロモソーム４ｑ２１.１にマッピングされている全長８８．９ｋｂであり、５５８２ｂａｓｅのｍＲＮＡが転写される。そのオープンリーディングフレームには４２９個のアミノ残基をコードされている（非特許文献１５）。ＳＥＰＴ１１蛋白質は、ＳＥＰＴＩＮファミリーに特徴的なＧＴＰａｓｅドメインを有し、ｍＲＮＡは白血球を除く各種臓器（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、卵巣、小腸、大腸）で発現することがわかっている（非特許文献１５）。ＳＥＰＴＩＮ蛋白質はＣＯＳ７細胞及びＨｅＬａ細胞において、細胞質のフィラメント構造に局在すること、そのＧＴＰａｓｅ活性はフィラメント構造形成に必要であることはわかっているが、細胞増殖機構への関与などそれ以上の詳細な機能はわかっていない。
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６，ｐ．１７５６−１７６１，１９９２．
【非特許文献２】Ｂｒｅａｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．３２７−３４６，１９８７
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，ｐ．１７７−１８２，１９８７
【非特許文献４】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１，ｐ．４２３−４３０，１９８７
【非特許文献５】Ｃａｎ．Ｒｅｓ．，５０，ｐ．４３３２−４３３７，１９９０
【非特許文献６】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６，ｐ．１３７−１４３，１９９１
【非特許文献７】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８，ｐ．６９７−７００，１９９２
【非特許文献８】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６１，ｐ．７４−７８，１９９０
【非特許文献９】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，２６，ｐ．２２５−２３５，１９９３
【非特許文献１０】Ｃａｎ．Ｒｅｓ．，５４，ｐ．４９９−５０５，１９９４
【０００９】
【非特許文献１１】Ｌａｎｃｅｔ，３３９，ｐ．１３９−１４３，１９９２
【非特許文献１２】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３，ｐ．２２７−２３０，１９９７
【非特許文献１３】Ｎａｔ．Ｍｅｄ，３，ｐ．２２２−２２５，１９９７
【非特許文献１４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９，ｐ．３８１７−３８２７，２００１
【非特許文献１５】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，５６８，ｐ．８３−８８，２００４
【非特許文献１６】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３４，ｐ．４９１−４９６，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は細胞増殖機構に関与する遺伝子又は核酸、及び該遺伝子又は核酸にコードされる蛋白質やｍＲＮＡの機能を抑制する物質を提供し、同物質による細胞増殖、特に癌細胞増殖を抑制する方法並びに該方法に用いられる新規薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、予後不良乳癌に特異的な抗癌剤をスクリーニングするための遺伝子の単離を目的として、鋭意研究を行った結果、予後不良乳癌において高頻度に発現が上昇している複数の遺伝子を見出した。更に研究を進めた結果、その内の一つであるＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制すると非癌細胞の増殖には影響を与えず、癌細胞の増殖速度が低下することを見出し、本発明のＳＥＰＴ１１遺伝子、そのｍＲＮＡ及びポリペプチドが、癌細胞の増殖機構に関与していることを確認した。
【００１２】
本発明ではＳＥＰＴ１１遺伝子の機能を抑制することで非癌細胞の増殖には影響を与えず、癌細胞の増殖が抑制されることを確認し、また、ＳＥＰＴ１１遺伝子又はＳＥＰＴ１１蛋白質を利用したスクリーニングが細胞増殖を抑制する物質の発見に有用であることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、
（１）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質：
（ａ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
（２）  ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、及びリボザイムからなる群から選ばれる（１）に記載の物質。
（３）  配列番号３及び４で表されるｓｉＲＮＡである（１）記載の物質。
（４）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質を用いることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
（５）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子若しくは核酸、又はそれらが移入された細胞を用いることを特徴とする、該遺伝子若しくは核酸の発現を抑制することにより細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
（６）  細胞の増殖を抑制する物質を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を用意し、
（ｂ）（１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸を有する細胞に該候補化合物を接触させ、
（ｃ）該候補化合物が該遺伝子又は核酸の発現を抑制するか否かを判定することを含む方法であり、該候補化合物が該遺伝子又は核酸の発現を抑制する物質である、上記方法。
（７）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の機能を抑制する物質による細胞増殖抑制方法。
（８）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の発現を調節する物質。
（９）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質を認識する抗体。
（１０）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質を用いることを特徴とする該蛋白質の機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
（１１）  （１）に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子又は核酸によりコードされる蛋白質の機能を抑制する物質を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を用意し、
（ｂ）該蛋白質又は該蛋白質を発現する細胞に該候補化合物を接触させ、
（ｃ）該候補化合物が該蛋白質の機能を抑制するか否かを判定することを含む方法であり、該候補化合物が該蛋白質の機能を抑制する物質である、上記方法。
（１２）  （１）〜（３）及び（８）のいずれか一項に記載の物質を有効成分として含む医薬品。
（１３）  （３）に記載の物質を含む医薬品。
に関する。
（１４）  予後不良乳癌の治療薬である（１３）に記載の医薬品。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抑制物質によれば、ＳＥＰＴ１１遺伝子又はＳＥＰＴ１１遺伝子と同等の機能を有する核酸の発現又は機能が抑制され、癌細胞の増殖が抑制される。また、このＳＥＰＴ１１遺伝子の機能を利用して、細胞増殖抑制物質のスクリーニングや同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明で使用される用語につき以下に説明する。
【００１６】
本発明中、遺伝子又は核酸の発現を調節する方法において遺伝子又は核酸（以下「標的核酸」という。）とは、癌細胞の増殖機構に関与していることが本発明者らにより発見された配列番号２記載の塩基配列で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子であるか、又は配列表の配列番号２に示される塩基配列を含む核酸において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含む核酸、若しくは配列表の配列番号２に示す塩基配列を含む核酸と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、配列番号１記載のアミノ酸配列で示される蛋白質、又は該蛋白質と同じ機能を有する蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸であれば、何れでもよい。好ましくは、配列表の配列番号２で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子である。
【００１７】
本発明においてｍＲＮＡとは、標的核酸によりコードされるｍＲＮＡ、又は標的核酸によりコードされる蛋白質をコードするものであればいずれでもよい。好ましくはＳＥＰＴ１１遺伝子でコードされるｍＲＮＡである。
【００１８】
標的核酸によりコードされる蛋白質の機能を抑制することにより癌細胞の増殖を抑制する方法において蛋白質（以下「標的蛋白質」という。）とは、標的核酸によりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質であって、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、並びに該アミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されているアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるＳＥＰＴ１１蛋白質と同じく、癌細胞の増殖機構に関与しているか、少なくともその存在が癌細胞の増殖機構に関与している蛋白質である。
【００１９】
標的核酸の製造
本発明の細胞増殖抑制方法において標的核酸は、以下のようにして得ることができる。まず、ＳＥＰＴ１１蛋白質を産生するヒト細胞又は組織、例えばヒト乳癌組織から既知の方法によりｍＲＮＡを抽出する。ＳＥＰＴ１１蛋白質の産生能力を有する細胞又は組織は、ＳＥＰＴ１１蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、ＳＥＰＴ１１蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。本発明において抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が使用可能であるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。
【００２０】
本発明においてｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、ＳＥＰＴ１１蛋白質を産生するヒト細胞又は組織、例えばヒト乳癌組織から既知の方法により抽出したｍＲＮＡを、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着、溶出させ、精製する方法、又はショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを分画する方法等が使用可能である。また、ｍＲＮＡを抽出せずに市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いてもよい。
【００２１】
得られたｍＲＮＡを鋳型として利用し、ランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマー、及びＳＥＰＴ１１遺伝子のｍＲＮＡ又は一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、目的の遺伝子又は核酸を増幅することができる。本発明において遺伝子又は核酸の精製はアガロースゲル電気泳動等による分画により行うことが可能である。所望により、上記遺伝子又は核酸を制限酸素等で切断し、接続することによって標的核酸を得ることもできる。
【００２２】
標的核酸は上記の方法の他に、常法の遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。例えば精製ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ＤＮＡを合成するＳ１ヌクレアーゼ法（Ｃｅｌｌ，７，ｐ．２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，ｐ．２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ  Ｙｏｏ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，ｐ．１０４９−１０５３，１９８３）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐ．１６１−１７０，１９８２）などが挙げられる。
【００２３】
標的核酸は、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによっても製造できる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機、例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（商品名、Ｂｅｃｋｍａｎ社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）などを用いて合成することができる。
【００２４】
標的核酸は、標的蛋白質の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Ｎａｔｕｒｅ，１０，ｐ．１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望のアミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９  ｐ．ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｉｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐ．５６６２−５６６６，１９８４）等に従って行うことができる。
【００２５】
上記の方法で合成したＤＮＡの配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法（“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ”６５，ｐ．４９９−５５９，１９８０）やＭ１３を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｇｅｎｅ，１９，ｐ．２６９−２７６，１９８２）等により行うことができる。
【００２６】
標的核酸又は標的蛋白質は、レポーター蛋白質遺伝子と標的核酸を融合させることによって、その発現の確認又は細胞内局在の確認をすることができる。レポーター蛋白質としては、例えば、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐ．７８７０−７８７３，１９８５）、ベータガラクトシダーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７，ｐ．２３８−２４４，１９８８）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，ｐ．４４３８−４４４２，１９９１）、ＧＦＰ（Ｇｅｎｅ，１１１，ｐ．２２９−２３３，１９９１）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。これらをコードする塩基配列と標的核酸とをインフレームで融合させたものを組み込んだベクター、又はレポーターアッセイ用の市販ベクターに標的核酸を組み込んだ形質転換細胞は、標的核酸又は標的蛋白質の発現又は機能を調節する物質のスクリーニングに用いることができる。
【００２７】
ベクター及び形質転換細胞
単離された標的核酸は、適当なベクターに組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。更に、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において標的核酸がコードするｍＲＮＡ又は蛋白質を発現させることが可能である。
【００２８】
本発明においてベクターとしてはプラスミドやラムダ系などのファージベクターを使用することができ、標的核酸を挿入させたものである。なお、プラスミドとしては、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド又は動物細胞の染色体に組み込まれるようなプラスミドのいずれでもよい。本発明で使用可能な脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列等を有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，ｐ．８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，ｐ．５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を例示できるが、これに限定されない。例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，２３，ｐ．１７５−１８２，１９８１）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，ｐ．４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞及び同細胞にエプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２９】
本発明において形質転換細胞とは、本発明におけるベクターを宿主細胞にトランスフェクトしたものである。宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に転写プロモーター、転写終結シグナル及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，ｐ．２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，ｐ．５３２２，１９９０）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，ｐ．８４２，１９８７）等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，ｐ．１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，ｐ．４５６−４５７，１９７３）、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いた方法、及び電気パルス穿孔法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，ｐ．８４１−８４５，１９８２）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，ｐ．３２７−３４１，１９８２））等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより標的核酸又は標的蛋白質を安定に発現又は産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＭＡ細胞を用いる場合には、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの発現ベクターを用いて形質転換細胞を得ることができる。
【００３０】
宿主細胞が大腸菌、例えばＤＨα株の場合、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，ｐ．５５７−５８０，１９８３）、即ちＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２又はＲｂＣｌを共存させて調製した宿主細胞に該組換えプラスミドを加える方法により組換えプラスミドを導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を指標として形質転換細胞が得られる。
【００３１】
上記により得られる形質転換細胞の内から、標的核酸がトランスフェクトされた株を選択する方法としては、以下に示す各種方法を採用することができる。即ち直接核酸の存在を確認する方法、ｍＲＮＡ又は蛋白質を発現する株として選択する方法などがある。
【００３２】
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
標的核酸に対応するオリゴヌクレオチドを合成する。この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列、又は考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる。これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを選択する。
【００３３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製したプローブを用いるスクリーニング法
標的核酸の一部に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐ．４８７−４９１，１９８８）を行い、標的核酸を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、創薬標的分子を産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより目的の標的核酸を有する株を選択する。
【００３４】
他の動物細胞で蛋白質を産生させてスクリーニングする方法
標的核酸を組み込んだベクターを動物細胞にトランスフェクトし、標的蛋白質を細胞に産生させる。蛋白質に対する抗体を用いて該蛋白質の発現を検出することにより、目的の標的核酸を有する株を選択する。
【００３５】
セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーションの系を用いる方法
形質転換体から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし標的蛋白質を産生する細胞から抽出したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしないｍＲＮＡを除き、ハイブリダイズしたもののみとした後、ｃＤＮＡからｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白質翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させる。本発明の抗体を用いて標的蛋白質の発現を確認し、目的の株を選択する。得られた目的の形質転換体から標的核酸を採取することも、公知の方法（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従い実施できる。例えば細胞からプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことができる。
【００３６】
上記の形質転換細胞は常法に従って培養することができる。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。標的蛋白質を産生する細胞又は本発明における形質転換細胞（以下発現細胞と言う）において発現される標的蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。具体的には例えば蛋白質を含む細胞分画を可溶化した後に、あるいは蛋白質が分泌された培地を回収後に、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を使用することができる。なお、細胞分画は常法に従って得ることができる。例えば発現細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより細胞分画を得ることができる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ジギトニン等）で蛋白質を可溶化することにより、可溶化後も蛋白質の特性を保持することができる。
【００３７】
標的蛋白質はマーカー蛋白質とインフレームで融合して発現させることで、発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー蛋白質としては、例えば、ＦＬＡＧ  エピトープ、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃ  エピトープ等がある。また、マーカー蛋白質と標的蛋白質のアミノ酸配列の間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどの、プロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー蛋白質部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサヒスチジンタグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，ｐ．１２３２−１２３８，１９９６）。これらマーカー蛋白質をコードする塩基配列と標的核酸とをインフレームで融合させたものをベクターに組み込んだ形質転換細胞は、標的核酸又は標的蛋白質の機能を調節する物質のスクリーニングに用いることができる。
【００３８】
本発明の抗体とは、標的蛋白質を認識する抗体であって、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体等を指すが、これら抗体は各種動物に該蛋白質やその断片を直接投与することで得ることができる。また、標的核酸を導入したプラスミドを用いてＤＮＡワクチン法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，ｐ．９５１９−９５２３，１９９４；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，ｐ．３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
【００３９】
ポリクローナル抗体は該蛋白質又はその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁させ、腹腔、皮下又は静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等の血清又は卵から製造される。このように製造された血清又は卵からポリクローナル抗体は常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。常法の蛋白質単離精製法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セルロース、ヒドロキシアパタイト、プロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００４０】
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐ．４９５−４９７，１９７５）により当業者が容易に製造することが可能である。すなわち、標的蛋白質又はその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁させた乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損やチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを持つミエローマ細胞、例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１を利用する。また、融合剤としてはポリエチレングリコールを利用する。更にはハイブリドーマ作製における培地として、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、ＲＰＭＩ１６４０などの通常よく用いられているものに、適宜１０〜３０％の牛胎児血清を加えて用いる。融合株はＨＡＴ選択法により選択する。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色法などの周知の方法又は前記のスクリーニング法により行い、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。また、限界希釈法によって、サブクローニングを繰り返すことによりハイブリドーマの単クローン性を保証する。このようにして得られるハイブリドーマは培地中で２〜４日間、あるいはプリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することにより、精製可能な量の抗体が産生される。このように製造されたモノクローナル抗体は培養上清又は腹水から常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は該抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、大腸菌、酵母又は動物細胞に導入して生産させることもできる。
【００４１】
以上のように分離精製された抗体につき、常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法により分離精製することにより、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖを得ることができる。更には、本発明の標的蛋白質に反応する抗体を、クラクソンらやゼベデらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３５２，ｐ．６２４−６２８，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，ｐ．３１７５−３１７９，１９９２）により一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）ＦｖやＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｎａｔｕｒｅ，３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４）に免疫することでヒト抗体を得ることも可能である。
【００４２】
上記に従って得た本発明の抗体は、標的蛋白質の発現確認、該蛋白質の精製又は機能調節、標的核酸又は標的蛋白質の機能を調節する物質のスクリーニング等の用途に使用できる。また、本発明の抗体のうち、標的蛋白質の機能を調節するものは標的蛋白質の発現を調節する物質として、細胞の増殖抑制剤、ひいては癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として利用可能である。
【００４３】
本発明においては標的核酸の発現を抑制する物質が提供される。例えばリボザイム、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどが挙げられる。本発明のリボザイムとはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似の機構により他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断するＲＮＡ分子のことを指す。既知の手法によりＲＮＡの核酸配列を適宜修飾することにより、ＲＮＡ一本鎖中の特定の塩基配列を認識し切断するリボザイムを作製することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐ．１４１２−１４１６，１９８８）。本発明においてはテトラヒメナ型及びハンマーヘッド型（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，ｐ．８９２４−３１，１９８８；Ｇｅｎｅ，８２，ｐ．４３−５２，１９８９）のいずれのリボザイムも含まれる。
【００４４】
本発明のリボザイムは標的核酸の発現を抑制することから、標的核酸の発現を調節する物質として、細胞の増殖抑制剤、ひいては癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として利用可能である。
【００４５】
本発明のｓｉＲＮＡとは標的核酸の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡを指し、ＲＮＡのみからなるものであってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとの融合体であってもよい。例えば、配列番号３及び４で示されるｓｉＲＮＡはＤＮＡとＲＮＡとの融合体になっている。該ｓｉＲＮＡは標的核酸及びＮＣＢＩデータベースの検索により得られた情報から常法に従い作製することができる。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計においては、標的核酸がコードするｍＲＮＡのコーディング領域のうち、できるだけＧＣ含有率が５０％に近い配列を選択する。ＧＣ含有率は４５％から５５％の間が理想的である。ＡＵＧスタートコドン付近の５０から１００ヌクレオチド又はターミネーションコドン付近の５０から１００ヌクレオチドの領域は避け、ＡＡ（アデニン・アデニン）に続く１９ヌクレオチドを選択し、このセンス鎖１９ヌクレオチドの３’末端にはｄＴｄＴ（デオキシチミン・デオキシチミン）を付加する。該ヌクレオチドの塩基配列中には３個以上のグアノシン又はシトシンが連続している配列は避けるべきであり、他のどの遺伝子とも相同性がないことを確認する必要がある。アンチセンス鎖はセンス１９ヌクレオチドの相補鎖とし、３’末端にはｄＴｄＴを付加する。こうして設計された塩基配列に基づき、センス鎖、アンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で合成する。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ＮＡＰ−１０カラムなどによって精製後、濃縮乾燥し、再度バッファーに溶解して加熱し、アニーリングさせて二本鎖のｓｉＲＮＡとする。ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機によるｓｉＲＮＡの調製法以外に、本発明のｓｉＲＮＡ標的配列をループ配列とともに発現ベクターに組み込み、細胞内で発現させて標的核酸の発現を抑制することも可能である。また、本発明のｓｉＲＮＡ標的配列のセンス鎖、アンチセンス鎖を別々に細胞内で発現させて、細胞内でハイブリダイズさせてｓｉＲＮＡとし標的核酸の発現を抑制することも可能である。更には本発明のｓｉＲＮＡ標的配列を含む長いｄｓＲＮＡを細胞内に導入して、細胞内で切断してｓｉＲＮＡとし、標的核酸の発現を抑制することも可能である。
【００４６】
本発明のｓｉＲＮＡは標的核酸（ＳＥＰＴ１１遺伝子）の発現を抑制することから、標的核酸の発現を調節する物質として、細胞の増殖抑制剤、ひいては癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として利用可能である。かかるｓｉＲＮＡは配列番号３及び４に示されている。
【００４７】
本発明のアンチセンス配列を有する核酸とは、標的核酸の発現を抑制する塩基配列を有する核酸であり、常法に従って作製される。まず、標的核酸がコードするｍＲＮＡの標的候補部位を選択するが、この選択方法としては、エネルギー計算に基づくｍＲＮＡ高次構造予測法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８０，ｐ．２６２，１９８９；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１７，ｐ．１６７，１９８８）、ランダムオリゴ／ＲＮａｓｅ  Ｈ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，ｐ．５０１０，１９９７）、逆転写酵素法Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５，ｐ．５３７，１９９７）、蛍光核酸プローブ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７，ｐ．２３８７，１９９９）、ＦＲＥＴ法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，ｐ．１２０５５，１９９２）などが使用できる。次に選択したｍＲＮＡの候補領域からアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を決定する。このとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖長は１５〜３０量体が一般的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド自体が自ら二重鎖や自己ステム−ループ構造を形成しないようにし、Ｇが４個以上連続して並ぶ配列は蛋白質と相互作用する可能性が高いので避け、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の「ＣｐＧ」配列はＢ細胞のレセプターに結合するので避けて設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造としては、リン酸結合型（天然型、ホスホロチオエート型、メチルホスホネート型、ホスホロアミデート型、２’−Ｏ−メチル型）や非リン酸型（モルフォリデート型、ポリアミド核酸）などの選択肢がある。また、細胞透過性を高めるためにペプチドやコレステロールを導入したり、アルキル化剤や光架橋剤を導入して架橋性能を持たせることも可能である。このように設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成機などによって調製し、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動法、エタノール沈殿などによって精製する。
【００４８】
本発明のアンチセンス配列を有する核酸は標的核酸の発現を抑制することから、標的核酸の発現を調節する物質として、細胞の増殖抑制剤、ひいては癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として利用可能である。
【００４９】
以下に本発明の標的核酸又は標的蛋白質（合わせて以下「標的分子」という。）の発現を抑制する物質のスクリーニング方法を記載するが、いずれも本発明はこれらに限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法における被験物質はＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により合成したリボザイム、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンス、試験管内での転写反応により作製したリボザイム、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンス、ｓｉＲＮＡ標的配列単独又はｓｉＲＮＡ標識配列をループ配列とともに発現ベクターに組み込んだプラスミドベクター、細胞内でハイブリダイズして標的配列のｓｉＲＮＡとなるように設計されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を別々に細胞内で発現させる発現ベクター、更には細胞内で切断されて目的とするｓｉＲＮＡとなるように設計された長いｄｓＲＮＡ等の種々のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ前駆体、微生物代謝産物、ペプチド、標的蛋白質を認識する本発明の抗体（ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、標的蛋白質を認識する抗体の活性のある断片）、ケミカルファイルに登録されているが種々のリガンド活性については不明の公知化合物、合成化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，ｐ．８１３５−８１７３，１９９５）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，ｐ．３０１−３１０，１９９１）などを応用して作製されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング法により選択された化合物又はペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドも含まれる。本発明のスクリーニング方法により選択された物質のうち、標的分子の発現又は機能を抑制する物質は、例えば、癌細胞の増殖を抑制し、新規制癌剤となることが期待される。
【００５０】
本発明では標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞を用いた標的分子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法が提供される。例えば、標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞を用い、標的分子の発現を抑制する物質をスクリーニングすることによって癌細胞の増殖を抑制する物質を発見することができる。スクリーニング系の構築にあたっては、例えば、標的分子を発現する細胞又は標的拡散を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞又は、標的核酸とレポーター遺伝子の融合塩基配列を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞を選択する。組換えベクターを導入する細胞としては実施例中で用いたＨＥＫ２９３細胞をはじめ、継代培養可能ないかなる培養細胞株も使用可能である。組換えベクターとしてはｐＳＶ２ｄｈｆｒをはじめとしてあらゆるベクターが可能である。これらの形質転換細胞は選択薬剤によりクローニングして単一の細胞株として調製してスクリーニングに使用しても、クローニングせずに使用してもいずれでもよい。これらの細胞に被験物質を接触させ（被験物質がリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスの場合はリポフェクション法などを用いて導入し）、標的核酸のｍＲＮＡの発現量、又はレポーター蛋白質の活性を測定することによって、標的分子の発現を抑制する物質を探索することができる。
【００５１】
上記のスクリーニング方法において標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞に接触させるか又は導入する被験物質の濃度は、通常、約１ｎＭ〜約１００μＭであればよく、０．１μＭ〜１０μＭが好ましい。当該形質転換細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１時間以上７２時間程度であり、好ましくは２４時間〜７２時間である。形質転換細胞に被験物質を接触させ、経時的若しくは一定時間後に、標的核酸のｍＲＮＡの発現量、又はレポーター蛋白質の活性を測定し、被験物質の非存在下における標的核酸のｍＲＮＡ発現量又はレポーター蛋白質の活性と被験物質存在下における標的核酸のｍＲＮＡ発現量又はレポーター蛋白質の活性とを比較して被験物質存在下における発現量又は活性が減少した場合、該被験物質を標的核酸の発現を抑制する物質とする。標的核酸のｍＲＮＡの発現量を測定する方法としては、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ等、公知の方法により検出することができる。レポーター蛋白質の活性を測定する方法としては、例えば、上記形質転換細胞におけるレポーターの活性を、市販の測定試薬（レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子の場合、プロメガ社より入手可能である）を使用し、測定する方法が挙げられる。
【００５２】
本発明では標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞を用いた細胞増殖抑制する物質を指標にしたものが提供される。例えば、標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞を用い、細胞増殖を抑制する物質をスクリーニングすることによって癌細胞の増殖を抑制する物質を発見することができる。スクリーニング系の構築にあたっては、例えば、上記の標的分子を発現する細胞又は標的核酸を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞又は、標的核酸とレポーター遺伝子の融合塩基配列を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞を選択する。これらの細胞に被験物質を接触させ（被験物質がリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスの場合はリポフェクション法などを用いて導入し）、被験物質を接触させていない細胞の増殖度と被験物質を接触させた細胞の増殖度を比較することによって、標的分子の発現を調節する物質を探索することができる。
【００５３】
上記のスクリーニング方法において標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞に接触させる若しくは導入する被験物質の濃度は、通常、約１ｎＭ〜約１００μＭであればよく、０．１μＭ〜１０μＭが好ましい。当該形質転換細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１時間以上１４４時間程度であり、好ましくは２４時間〜７２時間である。形質転換細胞に被験物質を接触させ、経時的若しくは一定時間後に、細胞数を測定し、被験物質の非存在下における細胞数と被験物質存在下における細胞数とを比較して被験物質存在下における細胞数が減少した場合、該被験物質を細胞増殖を抑制する物質とする。細胞数を測定する方法としては、メチレンブルー染色法、酸化還元系発色試薬を用いた測定法、細胞計数分析装置を用いた測定方法等、公知の方法により測定することができる。
【００５４】
本発明の抗体は上記スクリーニングにおける候補物質である他、本発明では本発明の抗体は標的分子の発現を抑制する物質又は細胞増殖を抑制する物質のスクリーニングに使用することができる。例えば、本発明の抗体と標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞を用い、標的分子の発現又は細胞増殖を抑制する物質をスクリーニングすることによって標的分子の発現又は細胞増殖を抑制する物質を発見することができる。スクリーニング系の構築にあたっては、例えば、上記の標的分子を発現する細胞又は標的核酸を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞又は、標的核酸とレポーター遺伝子の融合塩基配列を組み込んだスクリーニング用組換えベクターをトランスフェクトした形質転換細胞を選択する。これらの細胞に被験物質を接触させ（被験物質がリボザイム、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスの場合はリポフェクション法などを用いて導入し）、被験物質を接触させていない細胞における標的分子の発現と被験物質を接触させた細胞における標的蛋白質の発現量を比較することによって、標的分子の発現を抑制する物質又は細胞増殖を抑制する物質を探索することができる。
【００５５】
上記のスクリーニング方法において標的分子を発現する細胞又は本発明に係る形質転換細胞に接触させる若しくは導入する被験物質の濃度は、通常、約１ｎＭ〜約１００μＭであればよく、０．１μＭ〜１０μＭが好ましい。当該形質転換細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１時間以上７２時間程度であり、好ましくは２４時間〜７２時間である。形質転換細胞に被験物質を接触させ、経時的若しくは一定時間後に、細胞の培養上清、細胞分画中、又は、細胞膜上の標的蛋白質の発現量を測定し、被験物質の非存在下における標的蛋白質量と被験物質存在下における標的蛋白質量とを比較して被験物質存在下における標的蛋白質量が減少した場合、該被験物質を標的分子の発現を抑制する物質又は細胞増殖を抑制する物質とする。標的蛋白質量を測定する方法としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法等、公知の方法により測定することができる。
【００５６】
上記のスクリーニング方法で得られた候補化合物は上記のスクリーニング方法のうち、異なる方法を用いて再度検討することにより、又は、下記のスクリーニング方法を用いることでその機能を同定することができる。
【００５７】
本発明では更に、標的蛋白質を用いたスクリーニング法も提供される。該スクリーニング方法は蛋白質の生理学的な変化を直接的・間接的に測定するための、蛋白質の活性、機能変化又は修飾の指標を測定する系に被験物質又は上記スクリーニングで得られた候補物質を添加し、該指標を測定する手段を含む。以下のスクリーニング方法の例を挙げるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
ａ）ＧＴＰａｓｅ活性を利用したスクリーニング方法
標的蛋白質はＧＴＰａｓｅ活性を有する蛋白質であるので、ＧＴＰ加水分解法によりスクリーニングを行うことが可能である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，ｐ．１９６００−１９６０６，１９９２）。精製した標的蛋白質２ｐｍｏｌを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），０．０９６５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ溶液中で、１μＭの［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ（４０００−５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）と混合する。被験物質存在下または非存在下、３０℃で３０分間インキュベーションした後、ＭｇＳＯ４とＧＴＰをそれぞれの最終濃度が１０及び０．４ｍＭになるように添加し、加水分解反応を開始する。適当な時間インキュベーションした後に、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ２を含む氷冷２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）をニトロセロースフィルター等で濾過し、フィルターを同バッファーで５回洗浄し、乾燥させた後、液体シンチレーションカウンター等で測定する。被験物質存在下における遊離３２Ｐ放射活性の上昇又は抑制を指標に、標的蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００５９】
ｂ）ＧＴＰγＳ結合法を利用したスクリーニング方法
標的蛋白質はＧＴＰ結合蛋白質であるので、ＧＴＰγＳ結合法によりスクリーニングを行うことが可能である（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０９，ｐ．１１２０−１１２７，１９９３）。標的蛋白質を発現させた細胞から標的蛋白質を粗抽出し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＧＤＰ溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ  ４００ｐＭと混合する。被験物質存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。被験物質存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇又は抑制を指標に、標的蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００６０】
次に本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【実施例】
【００６１】
実施例１：標的核酸の選択
乳癌組織及び正常乳腺組織
１９９５年から１９９７年に原発性乳癌と診断された乳癌症例で、乳癌手術時に乳癌組織の一部を取り、速やかに凍結して−８０℃で保存した検体を使用した。正常組織については、乳癌患者の手術時に腫瘍付近の正常乳腺組織の一部を取り、速やかに凍結して−８０℃で保存した検体を使用した。検体の一部について、ラジオイムノアッセイによりエストロゲンレセプター量を測定し、１ｍｇタンパク当たり５ｆｍｏｌ以上のエストロゲンレセプターを含まない検体をエストロゲンレセプター陰性乳癌として使用した。手術された患者の転帰は手術後５年以上追跡され、乳癌再発の有無、死亡・生存を記録した。ＥＲ陰性５年以内死亡乳癌（以下５ｙＤ）１０症例、ＥＲ陰性５年以上生存乳癌（以下５ｙＳ）１０症例を選択し、ｃＤＮＡマイクロアレイ実験に供した。
【００６２】
ｃＤＮＡマイクロアレイ
ＮＣＢＩ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＵｎｉＧｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅから選択した２５，３４４種の遺伝子に対応するｃＤＮＡのＰＣＲ産物をアマシャムバイオサイエンス社のＡｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩを用いてアマシャムバイオサイエンス社のタイプ７スライドガラスにスポットしてｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００６３】
ＲＮＡ抽出・ハイブリダイゼーション・データ集積
約５０ｍｇの組織検体からトリゾール試薬を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いて精製し、２μｇの精製したＲＮＡを出発材料としてＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７トランスレーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＴ７−ｂａｓｅｄ  ＲＮＡ増幅を２回行った。ハイブリダイゼーションに用いた蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、５〜１０μｇの増幅したＲＮＡ（ａＲＮＡ）を用いて作製した。正常乳腺組織由来のａＲＮＡは蛍光色素結合ヌクレオチドＣｙ３−ｄＣＴＰで、乳癌組織由来のａＲＮＡは蛍光色素結合ヌクレオチドＣｙ５−ｄＣＴＰで標識して用いた。標識したｃＤＮＡプローブ溶液はマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（アマシャムバイオサイエンス社）及びホルムアミドと混合（容量比、１：１：２）し、自動スライドプロセッサー（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは４０℃で１５時間行い、洗浄は１×ＳＳＣ−０．２％  ＳＤＳを用いて５５℃で１０分間、次いで０．１×ＳＳＣ−０．２％  ＳＤＳを用いて室温で１分間、更に０．１×ＳＳＣを用いて室温で１分間洗浄した。洗浄の終了したスライドガラス上の蛍光シグナルはＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａスキャナーで取り込み、ソフトウエアＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ３．０で数値化した。
【００６４】
マイクロアレイデータの解析
各アレイ上のハイブリダイゼーションシグナルはシグナル・ノイズ（Ｓ／Ｎ）比３．０をカットオフ値として、Ｓ／Ｎ比３．０以下のデータは以下の解析には使用しなかった。乳癌組織と正常組織のｍＲＮＡ量の補正は、各アレイブロック上に配置した２７種類のハウスキーピング遺伝子に対するＣｙ３とＣｙ５のハイブリダイゼーションシグナルが等量となるように補正して行った。５ｙＤ群と５ｙＳとの間で発現量に差のある遺伝子を選び出すため、以下のようにデータ解析を行った。まず、アレイ上の各遺伝子に対するハイブリダイゼーションシグナル比の対数（Ｌｏｇ２（Ｃｙ５／Ｃｙ３））を計算し、各遺伝子について５ｙＤ群と５ｙＳ群についてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストを行い、ｐ＜０．０５である遺伝子を選び出した。更に、５ｙＤ群のシグナル比の平均と５ｙＳ群のシグナル比の平均との差が２倍以上である遺伝子を選び出した。その結果、５ｙＤ群での発現が５ｙＳ群での発現よりも高い遺伝子９０種、５ｙＳ群での発現が５ｙＤ群での発現よりも高い遺伝子２０種、計１１０種の遺伝子の発現が５ｙＤ群と５ｙＳ群とで有意に差があることがわかった。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストで有意であると判定された１１０種の遺伝子については更にＲａｎｄｏｍ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎテストを行った。１０，０００回のｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎの結果、危険率ｐ＜０．０５である遺伝子を選び出し、５ｙＤ群での発現が５ｙＳ群での発現よりも高い遺伝子７１種、５ｙＳ群での発現が５ｙＤ群での発現よりも高い遺伝子１５種、計８６種の遺伝子の発現が５ｙＤ群と５ｙＳ群とで有意に差があることがわかった。
【００６５】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる正常組織と比較して乳癌組織において高頻度に発現上昇を示す遺伝子の選択
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に用いた症例とは別の乳癌２５症例から抽出した２μｇの全ＲＮＡを出発材料としてオリゴ（ｄＴ）１２-１８プライマーを用いて逆転写酵素Ｒｅｖｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（和光純薬）により逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成された各症例のｃＤＮＡはハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤ（グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素）遺伝子を用いてその発現量が等量になるように希釈してｃＤＮＡ濃度を揃えた。３０μＬの反応系にｃＤＮＡ溶液１μＬ、フォワードプライマー０．７μＭ、リバースプライマー０．７μＭ、デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）２００μＭ、Ｔａｐポリメラーゼ１ｕｎｉｔ、１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを含ませ、９４℃で５分間変性を行った後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを２５〜３５サイクル繰り返してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの配列は配列表の配列番号５及び６に示す。ＰＣＲ後のＰＣＲ産物は２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロミド染色を行い、デジタル画像処理システムＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ３３００  （Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて記録した。５ｙＤ群での発現が５ｙＳ群での発現よりも有意に高い７１遺伝子に関し、ｃＤＮＡマイクロアレイ実験に用いた症例とは別の乳癌患者２５症例について、同一症例の正常乳腺組織と乳癌組織における遺伝子の発現を検討した。その結果、２５症例中８症例以上で正常乳腺よりも乳癌組織での発現が高く（高発現症例）、かつ、正常乳腺よりも乳癌組織において発現が低い症例（低発現症例）が少ない遺伝子、すなわち（高発現症例数）−（低発現症例数）＞（２症例）であることを示した遺伝子を同定した。これらの遺伝子は予後不良乳癌での発現量が高く、更に正常乳腺よりも乳癌組織で高頻度に発現が高いため、細胞増殖機構に関与している可能性があると考えられた。
【００６６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる予後良好乳癌よりも予後不良乳癌での発現が高いことの確認
上記の半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＳＥＰＴ１１は２５症例中１７症例の乳癌組織において、対応する正常乳腺組織よりも発現が高いことが示された。さらに、ＳＥＰＴ１１は予後良好乳癌（５ｙＳ群）における発現よりも予後不良乳癌（５ｙＤ群）における発現が高いことを確認するため、より定量性の高いＴａｑＭａｎ法により、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。マイクロアレイ解析に用いた増幅前の全ＲＮＡを出発材料として、オリゴ（ｄＴ）１２-１８プライマーを用いて逆転写酵素Ｒｅｖｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（和光純薬）により逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。ＧＡＰＤに対するＴａｑＭａｎ試薬（製品番号：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）及びＳＥＰＴ１１に対するＴａｑＭａｎ試薬（製品番号：Ｈｓ００２１７３４２＿ｍ１）はアプライド・バイオシステムズ社より購入した。ＴａｑＭａｎ反応は、ｃＤＮＡを１μＬ、ＴａｑＭａｎ試薬１．２５μＬ、Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）１２．５μＬを含む２５μＬの反応系で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００を用いた標準プロトコールによってリアルタイム検出を行った。定量方法は、標準サンプルを４段階の濃度で増幅し、蛍光強度の増幅率から検量線を作成して試料の濃度を計算した。各サンプルについてＳＥＰＴ１１とＧＡＰＤの濃度を算出し、ＳＥＰＴ１１／ＧＡＰＤの比（補正後ＳＥＰＴ１１濃度）を計算した。その結果、予後不良群におけるＳＥＰＴ１１濃度は６．３４±６．９（平均±標準偏差）、予後良好群におけるＳＥＰＴ１１濃度は１．０６±０．７３であり、両群間におけるＳＥＰＴ１１の発現量には統計学的な有意差があった（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ、ｐ＝０．００３９）。
【００６７】
実施例２：標的核酸を抑制するｓｉＲＮＡのスクリーニングと同定
ｓｉＲＮＡの設計と合成
予後不良乳癌での発現量が高く、更に正常乳腺よりも乳癌組織で高頻度に発現が高い遺伝子の内、配列表の配列番号２の塩基配列で表されるＳＥＰＴ１１遺伝子及びＮＣＢＩデータベースの検索により得られた情報から、ＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを作製した。すなわち、（１）ＳＥＰＴ１１のｍＲＮＡのコーディング領域にある塩基配列からＧＣ含有率が５０％近くであり、（２）スタートコドン付近の５０から１００ヌクレオチド又はターミネーションコドン付近の５０から１００ヌクレオチドは除き、（３）ＡＡ（アデニン・アデニン）で始まる２１ヌクレオチドを探し、３’末端にＴＴ（チミン・チミン）を付加したヌクレオチドを設計した。更に、これらの設計されたヌクレオチドの塩基配列中に３個以上のグアノシン又はシトシンが連続している配列を有するものは除外し、合成した。
【００６８】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（リポフェクション法）
上記の合成されたｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ懸濁緩衝液（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、ｐＨ７．４）に溶解して９０℃で１分間加熱した液、３７℃で１時間インキュベーションし、ｓｉＲＮＡ溶液とした。１０％ウマ血清含有最少必須培地（ＭＥＭ、インビトロジェン）を用いてヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞を１穴あたり５×１０５個になるように６穴プレートにまき、２４時間後ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。陰性コントロールとしてはノンサイレンシングコントロール（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（キアゲン社）ｓｉＲＮＡを用い、同様のトランスフェクション操作を行った。トランスフェクションはＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。トランスフェクションの３時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、１０％ウマ血清含有ＭＥＭを１穴あたり２ｍＬ添加して３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した。
【００６９】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（エレクトロポレーション法）
３×１０６個の乳癌細胞（ＭＣＦ７細胞またはＴ４７Ｄ細胞）を８０μＬのヌクレオフェクターＶ溶液（Ａｍａｘａ社）に懸濁し、上記のｓｉＲＮＡ溶液を２０μＬ加えて混合し、Ａｍａｘａ社の遺伝子導入システムＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置を用いて、エレクトロポレーションを行った。ｓｉＲＮＡ導入後、ＭＣＦ７細胞に対しては１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｔ４７Ｄ細胞に対してはＧＩＴ培地（日本製薬株式会社）３ｍＬを加えて混合し、あらかじめ１穴当り１ｍＬの培地を入れて３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で暖めておいた６穴培養容器に、１穴当り１ｍＬずつ添加して、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した。陰性コントロールとしてはノンサイレンシングコントロール（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（キアゲン社）ｓｉＲＮＡを用い、同様の操作を行った。
【００７０】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ
トランスフェクションまたはエレクトロポレーションの４８時間後にＲＮｅａｓｙミニキットを用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した２μｇの全ＲＮＡを出発材料としてオリゴ（ｄＴ）１２-１８プライマーを用いて逆転写酵素Ｒｅｖｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（和光純薬）により逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤ（グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素）遺伝子を用いてその発現量が等量になるように希釈してｃＤＮＡ濃度を揃え、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの配列は配列表の配列番号５及び６に示す。ＰＣＲ後のＰＣＲ産物は２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロミド染色を行い、デジタル画像処理システムＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ３３００を用いて記録した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＧＡＰＤに対するＴａｑＭａｎ試薬（製品番号：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）及びＳＥＰＴ１１に対するＴａｑＭａｎ試薬（製品番号：Ｈｓ００２１７３４２＿ｍ１）はアプライド・バイオシステムズ社より購入し、ＴａｑＭａｎ法で行った。ＴａｑＭａｎ反応は、ｃＤＮＡを１μＬ、ＴａｑＭａｎ試薬１．２５μＬ、Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）１２．５μＬを含む２５μＬの反応系で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００を用いた標準プロトコールによってリアルタイム検出を行った。定量方法は、標準サンプルを４段階の濃度で増幅し、蛍光強度の増幅率から検量線を作成して試料の濃度を計算した。各サンプルについてＳＥＰＴ１１とＧＡＰＤの濃度を算出し、ＳＥＰＴ１１／ＧＡＰＤの比（補正後ＳＥＰＴ１１濃度）を計算した。
【００７１】
標的核酸を抑制するｓｉＲＮＡの選択
半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、トランスフェクションした合成ｓｉＲＮＡの内、配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＳＥＰＴ１１のｍＲＮＡ量が抑制されていた。配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞における半定量的ＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動の結果を図１に示す。ＳＥＰＴ１１のｍＲＮＡの発現は、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによって４８時間後に強く抑制された。ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ３３００によって、バンドのシグナル強度を算出し、本ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制率を計算したところ、ＳＥＰＴ１１  ｍＲＮＡの発現は、ノンサイレンスｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合と比較して９２％抑制されていた。
【００７２】
ＨＥＫ２９３細胞の増殖を抑制せず、乳癌細胞の増殖を抑制するｓｉＲＮＡの同定
配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを上記同様にヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。トランスフェクションの１日後、５日後、７日後に細胞数をカウントした結果（ｎ＝３）を図２のグラフに示す。この結果から明らかなように、配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを用いてＨＥＫ２９３細胞におけるＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制しても、陰性コントロールであるノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞数と比較して差は認められなかった。
【００７３】
配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを上記同様にヒト乳癌細胞由来のＭＣＦ７細胞にエレクトロポレーションし、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。トランスフェクションの２日後、６日後、８日後に細胞数をカウントした結果（ｎ＝２）を図３のグラフに示す。この結果から明らかなように、配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを用いてＭＣＦ７乳癌細胞におけるＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制すると、陰性コントロールであるノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＭＣＦ７乳癌細胞と比較して細胞増殖が強く阻害された。上記ｓｉＲＮＡをＭＣＦ７細胞にエレクトロポレーションした後、４８時間後にＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にてＳＥＰＴ１１  ｍＲＮＡの発現量を測定したところ、ノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションしたＭＣＦ７細胞と比較して、ＳＥＰＴ１１  ｍＲＮＡの発現量は７３％阻害されていた。
【００７４】
配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを上記同様にヒト乳癌細胞由来のＴ４７Ｄ細胞にエレクトロポレーションし、３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。トランスフェクションの１日後、４日後、７日後に細胞数をカウントした結果（ｎ＝３）を図４のグラフに示す。この結果から明らかなように、配列番号３及び４に示すｓｉＲＮＡを用いてＴ４７Ｄ乳癌細胞におけるＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制すると、陰性コントロールであるノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＴ４７Ｄ乳癌細胞と比較して細胞増殖が非常に強く阻害された。上記ｓｉＲＮＡをＴ４７Ｄ細胞にエレクトロポレーションした後、４８時間後にＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にてＳＥＰＴ１１  ｍＲＮＡの発現量を測定したところ、ノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションしたＴ４７Ｄ細胞と比較して、ＳＥＰＴ１１  ｍＲＮＡの発現量は９４％阻害されていた。また、上記ｓｉＲＮＡをＴ４７Ｄ細胞にエレクトロポレーションした後、１１日間培養し、中性ホルマリンで細胞を固定し、ギムザ染色をしたところ、ノンサイレンシングコントロールｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションしたＴ４７Ｄ細胞と比較して明らかに細胞増殖は低下していた（図５）。
【００７５】
考察
乳癌組織でその発現が高頻度に上昇しているＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制すると、非癌細胞であるＨＥＫ２９３細胞の増殖には影響がなく、乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞及びＴ４７Ｄ細胞の増殖が抑制されることから、ＳＥＰＴ１１遺伝子及びＳＥＰＴ１１遺伝子のコードするｍＲＮＡや蛋白質は、乳癌細胞の細胞増殖機構に関与していることが推測され、制癌剤の標的分子として非常に有用であるといえる。また、該ｓｉＲＮＡはＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を強く抑制し、非癌細胞の増殖には影響を与えないが、乳癌細胞の増殖を強く抑制したことから、非癌細胞への影響の少ない乳癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として有用であり、更にはｓｉＲＮＡと同様に核酸であって、ＳＥＰＴ１１遺伝子の発現を抑制する機能が有るアンチセンスや、リボザイムも細胞の増殖抑制剤、ひいては癌細胞の増殖を抑制する制癌剤として有用であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ発現抑制実験における半定量的ＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動の結果を示す。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡは陰性コントロールであるｓｉＲＮＡを、ＳＥＰＴ１１  ｓｉＲＮＡは配列表の配列番号３及び４に対応するｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした後、４８時間後にＨＥＫ２９３細胞から抽出したＲＮＡを鋳型とした半定量的ＲＴ−ＰＣＲ後のバンドである。
【図２】ｓｉＲＮＡのＨＥＫ２９３非癌細胞に対する細胞増殖への影響を検討した実験の結果を示す。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌは陰性コントロールであるｓｉＲＮＡを、ＳＥＰＴ１１  ｓｉＲＮＡは配列表の配列番号３及び４に対応するｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした後、１日後、５日後及び７日後に細胞数をカウントした。
【図３】ｓｉＲＮＡのＭＣＦ７乳癌細胞に対する細胞増殖への影響を検討した実験の結果を示す。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌは陰性コントロールであるｓｉＲＮＡを、ＳＥＰＴ１１  ｓｉＲＮＡは配列表の配列番号３及び４に対応するｓｉＲＮＡをＭＣＦ７乳癌細胞にエレクトロポレーションした後、２日後、６日後及び８日後に細胞数をカウントした。
【図４】ｓｉＲＮＡのＴ４７Ｄ乳癌細胞に対する細胞増殖への影響を検討した実験の結果を示す。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌは陰性コントロールであるｓｉＲＮＡを、ＳＥＰＴ１１  ｓｉＲＮＡは配列表の配列番号３及び４に対応するｓｉＲＮＡをＴ４７Ｄ乳癌細胞にエレクトロポレーションした後、１日後、４日後及び７日後に細胞数をカウントした。
【図５】ｓｉＲＮＡのＴ４７Ｄ乳癌細胞に対する細胞増殖への影響を検討した実験の結果を示す。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌは陰性コントロールであるｓｉＲＮＡを、ＳＥＰＴ１１  ｓｉＲＮＡは配列表の配列番号３及び４に対応するｓｉＲＮＡをＴ４７Ｄ乳癌細胞にエレクトロポレーションした後、１１日後に中性ホルマリンで細胞を固定し、ギムザ染色を行った。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１：ＳＥＰＴ１１アミノ酸配列
配列番号２：ＳＥＰＴ１１塩基配列
配列番号３：ｓｉＲＮＡセンス
配列番号４：ｓｉＲＮＡアンチセンス
配列番号５：フォワードプライマー
配列番号６：リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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