(57)【要約】【課題】  人工肝臓の機能を長期間維持できるようにするため、肝細胞の効率的な培養手段を提供する。【解決手段】  繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体に、肝細胞を固定して培養することを特徴とする肝細胞の培養方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体に、肝細胞を固定して培養することを特徴とする肝細胞の培養方法。
【請求項２】
多孔質リン酸カルシウム成形体が、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料とを混合し、その混合物を焼成することによって製造されたものであることを特徴とする請求項１記載の肝細胞の培養方法。
【請求項３】
繊維状リン酸カルシウム化合物と混合する可燃性材料の重量が、繊維状リン酸カルシウム化合物の重量の0.1〜20倍であることを特徴とする請求項２記載の肝細胞の培養方法。
【請求項４】
肝細胞の播種を、多孔質リン酸カルシウム成形体中の細胞密度が1×105〜1×107個／ｃｍ３となるように細胞懸濁液を多孔質リン酸カルシウム成形体へ添加することによって行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の肝細胞の培養方法。
【請求項５】
肝細胞、及び繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体とを含むことを特徴とする人工肝臓。
【請求項６】
肝細胞が、多孔質リン酸カルシウム成形体の骨格部に付着していることを特徴とする請求項５記載の人工肝臓。
【請求項７】
多孔質リン酸カルシウム成形体が、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料とを混合し、その混合物を焼成することによって製造されたものであることを特徴とする請求項５又は６記載の人工肝臓。
【請求項８】
繊維状リン酸カルシウム化合物と混合する可燃性材料の重量が、繊維状リン酸カルシウム化合物の重量の0.1〜20倍であることを特徴とする請求項７記載の人工肝臓。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞の培養方法、及びその培養方法を利用した人工肝臓に関する。
【背景技術】
【０００２】
重篤な肝機能障害に陥った場合、その抜本的な治療法は肝臓移植しかないのが現状である。肝臓の移植には生体肝移植と脳死肝移植がある。前者はドナー不足という解決できない問題があり、後者についてはさらに倫理的な問題を含んでいる。そのため移植治療の代替医療として、また劇症肝炎などの肝不全の応急措置としても臨床的に使用できる人工肝臓の開発が我が国だけでなく、グローバルな視点でも重要かつ緊急な課題である。
【０００３】
これまでに人工肝臓の開発に関する多くの報告がある。これらの多くは肝臓をバイオリアクターのひとつとみなし、肝細胞をスフェロイドとして所定の担体に付着・増殖させて肝機能を代替させるというものである。ヒトの肝臓の機能は卓越しており、現在、最高レベルの人工肝臓でも、肝機能を維持できるのは２週間程度にとどまっている。
【０００４】
ところで、本発明者らは、以前、細胞の固定担体として利用できる多孔質リン酸カルシウム成形体について報告を行っている（特許文献１、特許文献２）。しかし、この多孔質リン酸カルシウム成形体を具体的にどのように用いれば、肝細胞を増殖できるかについては明らかにしていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８４９３３号公報
【特許文献２】特開２００３−９３０５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、現在使用されている人工肝臓は短期間でその機能を失ってしまう。本発明は、長期間機能を維持できる人工肝臓を作製するため、肝細胞の効率的な培養手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、前述した多孔質リン酸カルシウム成形体のうち特定のものを肝細胞の固定化担体として用い、また、播種する肝細胞の数を特定の範囲にすることにより、肝細胞を長期間生存、増殖させ得ることを見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（８）を提供するものである。
【０００９】
（１）繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体に、肝細胞を固定して培養することを特徴とする肝細胞の培養方法。
【００１０】
（２）多孔質リン酸カルシウム成形体が、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料とを混合し、その混合物を焼成することによって製造されたものであることを特徴とする（１）記載の肝細胞の培養方法。
【００１１】
（３）繊維状リン酸カルシウム化合物と混合する可燃性材料の重量が、繊維状リン酸カルシウム化合物の重量の0.1〜20倍であることを特徴とする（２）記載の肝細胞の培養方法。
【００１２】
（４）肝細胞の播種を、多孔質リン酸カルシウム成形体中の細胞密度が1×105〜1×107個／ｃｍ３となるように細胞懸濁液を多孔質リン酸カルシウム成形体へ添加することによって行うことを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか記載の肝細胞の培養方法。
【００１３】
（５）肝細胞、及び繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体とを含むことを特徴とする人工肝臓。
【００１４】
（６）肝細胞が、多孔質リン酸カルシウム成形体の骨格部に付着していることを特徴とする（５）記載の人工肝臓。
【００１５】
（７）多孔質リン酸カルシウム成形体が、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料とを混合し、その混合物を焼成することによって製造されたものであることを特徴とする（５）又は（６）記載の人工肝臓。
【００１６】
（８）繊維状リン酸カルシウム化合物と混合する可燃性材料の重量が、繊維状リン酸カルシウム化合物の重量の0.1〜20倍であることを特徴とする（７）記載の人工肝臓。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の培養方法により、肝細胞を効率的に増殖させることができるようになる。また、この培養方法を利用して作製された人工肝臓は、長期間肝臓としての機能を発揮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の肝細胞の培養方法は、繊維状リン酸カルシウム化合物の係合により形成され、連続気孔を有する多孔質リン酸カルシウム成形体に、肝細胞を固定して培養することを特徴とするものである。
【００２０】
多孔質リン酸カルシウム成形体は、例えば、特開２００３−９３０５２号公報又は特開２００４−２８４９３３号公報に記載された方法によって製造することができる。即ち、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料とを含む混合スラリを吸引ろ過により脱水して固形体を得て、次いで、該固形体を加熱して該可燃性材料を焼却除去することにより製造することができる。
【００２１】
上記繊維状リン酸カルシウム化合物は、下記の式で定義されるアスペクト比が１０〜２００の範囲にあることが好ましい。
【００２２】
式：アスペクト比＝Ｌ／｛（ａ＋ｂ）／２｝
（Ｌは繊維状リン酸カルシウム化合物の長さ、ａは繊維状リン酸カルシウム化合物の厚さ、ｂは繊維状リン酸カルシウム化合物の幅を示す。）
繊維状リン酸カルシウム化合物の長さ（Ｌ）は、通常は、３０〜１５０μｍの範囲にあり、６０〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２３】
繊維状リン酸カルシウム化合物の材料としては、リン酸三カルシウム［Ｃａ3（ＰＯ4）2］、リン酸水素カルシウム［ＣａＨＰＯ4］、リン酸二水素カルシウム［Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2］、及び水酸アパタイト（ハイドロキシアパタイト）［Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2］の一種、もしくは二種以上の混合物を挙げることができる。なお、水酸アパタイトには、カルシウムの一部が欠損したカルシウム欠損水酸アパタイト［Ｃａ10-x(HPO4)x（ＰＯ4）6-x（ＯＨ）2-ｘ・ｎH2O］などの非化学量論組成水酸アパタイトも含まれ、水酸アパタイトのリン酸イオン、または水酸化物イオンの一部が炭酸イオンで置換された炭酸含有水酸アパタイトも含まれる。
【００２４】
上記繊維状リン酸カルシウム化合物のうちで好ましいのは繊維状水酸アパタイトであり、特に好ましいは、（１００）、（２００）および（３００）面が発達したａ面配向の繊維状水酸アパタイトである。ａ面配向の繊維状水酸アパタイトは、カルシウム塩およびリン酸塩を含む溶液を尿素の存在下にて加熱することにより製造することができる。
【００２５】
上記可燃性材料は、５００〜１５００℃の温度に加熱したときの灰分が１重量％以下となるものであることが好ましい。このような可燃性材料の例としては、ポリメタルクリレート、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびカーボンを挙げることができる。これらのうちで好ましいものはカーボンである。なお、可燃性材料は、球状であることが好ましいが（より好ましくは真球）、必ずしも球状である必要はなく、立方体、直方体、円筒、円柱等であってもよい。可燃性材料が球状の場合、その粒子径は、通常は、５〜５００μｍの範囲にあり、好ましくは１００〜２００μｍの範囲にある。
【００２６】
上記混合物スラリの溶媒には、水あるいは水とアルコールの混合溶液を用いることが好ましい。溶媒として水とアルコールの混合溶液を用いる場合、その比率は容積比で、水：アルコールが、通常は１：９９〜９９：１の範囲にあり、好ましくは２５：７５〜７５：２５の範囲にある。なお、溶媒として用いるアルコールの種類には特に制限はなく、メタノール、エタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの２価アルコールを用いることができるが、エタノールが好ましい。
【００２７】
上記混合スラリにおいて、繊維状リン酸カルシウム化合物と可燃性材料との配合割合は、繊維状リン酸カルシウム化合物１重量部に対して、可燃性材料が、通常は0.1〜100重量部の範囲にあり、好ましくは0.1〜50重量部の範囲にあり、特に好ましくは0.1〜20重量部の範囲にある。
【００２８】
上記混合スラリを吸引ろ過により脱水することによって、繊維状リン酸カルシウム化合物の物理的な係合により形成された固形体を得ることができる。この固形体は、複数個の可燃性材料を包含する。固形体の加熱温度は、通常は５００〜１５００℃の範囲にあり、好ましくは１０００〜１５００℃の範囲にある。
【００２９】
上記方法によって製造された多孔質リン酸カルシウム成形体は、可燃性材料の焼却除去によって生じる連続気孔を有する。この連続気孔に含まれる気孔（マクロポア）の大きさは、通常、直径が５〜５００μｍの範囲にある。また、この多孔質リン酸カルシウム成形体は、マクロポアとは別により小さい気孔（ミクロポア）も有する。ミクロポアは、リン酸カルシウム化合物の針状結晶の重なりから生じるもので、通常、直径が５μｍ未満である。
【００３０】
多孔質リン酸カルシウム成形体の気孔率は、通常、９０〜９９％の範囲にあり、好ましくは、９５〜９９％の範囲にある。
【００３１】
培養対象とする肝細胞は特に限定されず、例えば、ヒト肝細胞癌由来のＦＬＣ−４、ＦＬＣ−５、ＦＬＣ−７、HuH７細胞、HepG2細胞などを使用できる。また、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトなどの肝臓から単離した肝細胞を使用してもよい。
【００３２】
使用する培地も特に限定されず、肝細胞の培養に用いられる一般的なものでよい。このような培地としては、ＡＳＦ１０４培地、RPMI1640培地、10%FBSを含むMEM培地などを例示できる。
【００３３】
細胞の播種は、肝細胞を懸濁させた培地を多孔質リン酸カルシウム成形体へ添加することにより行う。このときの多孔質リン酸カルシウム成形体中の細胞の密度は特に限定されないが、1×105〜1×107個／ｃｍ３とするのが好ましい。
【００３４】
本発明の培養方法によって培養された肝細胞は、人工肝臓などとして利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３６】
〔実施例１〕
硝酸カルシウム四水和物、リン酸水素二アンモニウム、及び尿素を、それぞれ０．１００ｍｏｌ・ｄｍ−３、０．１６７ｍｏｌ・ｄｍ−３、及び０．５００ｍｏｌ・ｄｍ−３の濃度となるように０．１ｍｏｌ・ｄｍ−３の硝酸（７０％、比重：１．４２）に溶解して、反応原料液を調製した。この反応原料液を、冷却管付きのフラスコに入れ、オイルバスを用いて加熱した。加熱は、８０℃で２４時間と９０℃で７２時間の二回に分けて行った。加熱終了後、フラスコ内の生成物（繊維状リン酸カルシウム化合物）を取り出して、洗浄乾燥した。
【００３７】
繊維状リン酸カルシウム化合物を含むスラリ（２重量％）に、同体積のエタノールを加えた後、平均粒子径が１５０μｍのカーボンビーズ（ニカビーズ、日本カーボン（株）製）を所定の量加え、充分に撹拌し、繊維状リン酸カルシウム化合物とカーボンビーズとの混合物スラリを調製した。この混合物スラリを、底部がろ紙でできた容器に入れ、吸引ろ過を行い、固形物を得た。次いで、この固形物を、水蒸気雰囲気下、１３００℃で５時間焼成して（昇温速度：５℃／分）、カーボンビーズを焼却除去し、多孔質リン酸カルシウム成形体を得た。多孔質リン酸カルシウム成形体は、ＡＦＳ０（カーボンビーズ無添加）、ＡＦＳ１０００（繊維状リン酸カルシウム化合物の１０倍の重量のカーボンビーズを添加）、ＡＦＳ２０００（繊維状リン酸カルシウム化合物の２０倍の重量のカーボンビーズを添加）の３種類作製した。
【００３８】
ＡＦＳ０、ＡＦＳ１０００、及びＡＦＳ２０００の電子顕微鏡写真をそれぞれ図１、図２及び図３に示す。
【００３９】
〔実施例２〕
播種した細胞の数が与える細胞増殖への影響を以下の実験によって調べた。
【００４０】
２４孔プレートに、実施例１で作製したＡＦＳ２０００と無血清培地（ＡＳＦ１０４、味の素製）を入れ、これに肝細胞（ＦＬＣ−４）を播種し、培養を行った。細胞密度は、１．０×１０５個／ｃｍ３、３．０×１０５個／ｃｍ３、又は５．０×１０５個／ｃｍ３になるようにした。また、培養時の温度は３７℃に維持した。
【００４１】
細胞の増殖状態は、多孔質リン酸カルシウム成形体に含まれるＤＮＡ量によって判断した。ＤＮＡの定量は、以下のように行った。
【００４２】
多孔質リン酸カルシウム成形体をホモジナイズし、細胞懸濁液（０．５ｃｍ３）を得、これに１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（０．７５ｃｍ３）を加えた。この溶液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ．、３分）により、上清を得、上清１ｃｍ３に１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４溶液０．０４ｃｍ３を加え、試料溶液とした。この試料溶液（０．７５ｃｍ３）に蛍光試薬（０．７５ｃｍ３）を加えた後、試料溶液の蛍光強度を測定し（励起波長：３６０ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ）、成形体中に含まれていたＤＮＡを定量した。また、対照として、多孔質リン酸カルシウム成形体を用いずに培養した場合のＤＮＡも同様に定量した。
【００４３】
培養１日後及び培養７日後のＡＦＳ２０００中のＤＮＡ量を図４に示す。図４に示すように、細胞密度を５．０×１０５個／ｃｍ３とした場合は、他の細胞密度の場合に比べ、著しくＤＮＡ量が多かった。
【００４４】
〔実施例３〕
実施例１で作製した３種類の多孔質リン酸カルシウム成形体を用いて培養を行い、どの成形体が肝細胞の増殖に適しているかを調べた。
【００４５】
ＡＦＳ０、ＡＦＳ１０００、又はＡＦＳ２０００を２４孔プレートに入れ、実施例２と同様にして肝細胞の培養を行った。播種時の細胞密度は５．０×１０５個／ｃｍ３とした。培養開始から１日、３日、５日、７日、１４日、及び２１日後の各成形体中に含まれるＤＮＡを定量した。この結果を図５に示す。
【００４６】
図５に示すように、いずれの成形体を用いた場合も、コントロールに比べ、ＤＮＡ量は多かったが、ＡＦＳ１０００とＡＦＳ２０００を用いた場合には特にそれが顕著であった。
【００４７】
〔実施例４〕
肝細胞が多孔質リン酸カルシウム成形体中でどのように増殖していくのかを調べるため、５日間培養した後の各成形体を、グルタルアルデヒドで固定したのち、凍結乾燥して走査型電子顕微鏡で細胞形態を観察した。コントロール、ＡＦＳ０、ＡＦＳ１０００、及びＡＦＳ２０００の切片の電子顕微鏡写真をそれぞれ図６、図７、図８及び図９に示す。なお、コントロールは細胞培養用のポリスチレンプレートで位相差顕微鏡で観察した。これらの図に示すように、ＡＦＳ１０００及びＡＦＳ２０００の気孔の壁には細胞が付着していた。
【００４８】
また、１０日間培養した後のＡＦＳ１０００を、ホルムアルデヒド溶液（４℃）に１時間浸漬し、固定した後、１％ゼラチン溶液に浸漬し、１時間減圧処理を行った。減圧処理を行った成形体を凍結用包埋剤（ＯＣＴコンパウンド）に入れ、液体窒素で凍結させた。クライオスタッドを用いて厚さ１８μｍの切片を作製し、これをスライドガラスに貼付け、ヘマトキシリン・エオジン染色した後、光学顕微鏡で観察した。
【００４９】
ヘマトキシリン・エオジン染色は以下のように行った。切片をカラッチのヘマトキシリン液に２０分間浸漬した後、１％塩酸７０％エタノール溶液で分別した。８０％エタノール溶液に通した後、エオジン液に１０分間浸漬し、次いで、脱水、７０％エタノール溶液及び１００％エタノールで洗浄した後、キシレンとカナダバルサムを用いて封入した。
【００５０】
ＡＦＳ１０００のヘマトキシリン・エオジン染色切片の顕微鏡写真を図１０及び図１１に示す。これらの図から、肝細胞はＡＦＳ１０００の骨格部分に接着し、そこから徐々に伸展していくことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＡＦＳ０の電子顕微鏡写真。
【図２】ＡＦＳ１０００の電子顕微鏡写真。
【図３】ＡＦＳ２０００の電子顕微鏡写真。
【図４】播種した細胞の密度と、培養後の細胞固定化担体中に含まれるＤＮＡ量との関係を示す図。
【図５】細胞固定化担体作製の際のカーボンビーズの添加量と、培養後の細胞固定化担体中に含まれるＤＮＡ量との関係を示す図。
【図６】５日間培養後の24孔プレートの位相差顕微鏡写真。
【図７】５日間培養後のＡＦＳ０の電子顕微鏡写真。
【図８】５日間培養後のＡＦＳ１０００の電子顕微鏡写真。
【図９】５日間培養後のＡＦＳ２０００の電子顕微鏡写真。
【図１０】１０日間培養後のＡＦＳ１０００のＨＥ染色顕微鏡写真。
【図１１】１０日間培養後のＡＦＳ１０００のＨＥ染色顕微鏡写真。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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