(57)【要約】【課題】酵素を利用したＳ−アリル−Ｌ−システインの新規な製造方法を提供すること。【解決手段】アリルメルカプタンとＬ-セリンをトリプトファンシンターゼの存在下で反応させるＳ-アリル-Ｌ-システインの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリルメルカプタンとＬ-セリンをトリプトファンシンターゼの存在下で反応させるＳ-アリル-Ｌ-システインの製造方法。
【請求項２】
反応のｐＨが、８．５から１０．５である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
トリプトファンシンターゼがエシェリヒア・コリ由来である、請求項２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＳ−アリル−Ｌ−システインの製造方法に関する。詳しくは、アリルメルカプタンとＬ−セリンとをトリプトファンシンターゼの存在下に反応させるＳ−アリル−Ｌ−システインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、医薬品の中間体、食品添加物の原材料としての用途が期待されており、安価な製造法が望まれている。
酵素反応を利用したＳ−アリル−Ｌ−システインの合成方法としては、ピルビン酸、アンモニウム塩及びアリルメルカプタンに、微生物起源のシステインデスルフヒドラーゼを作用させる方法が知られている（特許文献１を参照。）。
【０００３】
一方、トリプトファンシンターゼが、Ｌ−セリンとアルキルメルカプタンまたはチオフェノールとから、Ｓ−アルキル−Ｌ−システインまたはＳ−フェニル−Ｌ−システインを合成できることが知られている（特許文献２及び特許文献３を参照。）。しかし、トリプトファンシンターゼを用いてＬ−セリンとアリルメルカプタンから、Ｓ−アリル−Ｌ−システインが合成できることはこれまで報告されていない。
【特許文献１】特開昭５０−１３２１７８号公報
【特許文献２】特開昭５８−１４６２８７号公報
【特許文献３】特開平９−８４５９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、酵素を利用したＳ−アリル−Ｌ−システインの新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Ｓ−アリル−Ｌ−システインの製造法について鋭意検討した結果、アリルメルカプタンとＬ−セリンとをトリプトファンシンターゼの存在下で反応させることにより、Ｓ−アリル−Ｌ−システインが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、アリルメルカプタンとＬ-セリンをトリプトファンシンターゼの存在下で反応させるＳ−アリル−Ｌ−システインの製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、トリプトファンシンターゼを用いたＳ−アリル−Ｌ−システインの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の製造方法に用いられるトリプトファンシンターゼとしては、アリルメルカプタンとＬ−セリンとからＳ−アリル−Ｌ−システインを製造できるものであれば特に限定されない。このような、トリプトファンシンターゼとしては、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・サーモフィラスなどの原核細胞の微生物、サッカロミセス・セレヴィシエ、あるいはノイロスポラ・クラッサなどの真核細胞の微生物が産生するトリプトファンシンターゼ、これらの微生物が産生するトリプトファンシンターゼのアミノ酸配列の一部のアミノ酸を、ＤＮＡ組み換え技術を利用して、他のアミノ酸に置換、欠失させるか、または微生物が産生するトリプトファンシンターゼにアミノ酸を付加させるなどした、アリルメルカプタンとＬ−セリンとからＳ−アリル−Ｌ−システインを製造する能力を有するトリプトファンシンターゼなどが挙げられる。
【０００９】
前記のトリプトファンシンターゼの中でも、エシェリヒア・コリ由来トリプトファンシンターゼは、アリルメルカプタンとＬ−セリンとからＳ−アリル−Ｌ−システインを製造する能力が高い点で好ましい。エシェリヒア・コリ由来トリプトファンシンターゼとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子で形質転換されたエシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０）が産生するトリプトファンシンターゼが挙げられる。
【００１０】
前記のトリプトファンシンターゼは、これを産生する微生物等を培養して得られる培養物から得ることができる。例えば、トリプトファンシンターゼを産生する微生物を例として、その培養方法を示すとすれば、次のとおりである。
【００１１】
トリプトファンシンターゼを産生する微生物を培養するための培地としては、炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用する炭素源および窒素源は使用菌の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。炭素源としては、グルコ−ス、グリセロール、フラクトス、シュクロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜など種々の炭水化物が使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多くの場合は窒素源であるとともに炭素源にもなり得る。無機物としては、燐酸一水素カリウム、燐酸二水素カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄などが必要に応じて使用できる。
【００１２】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌深部培養などの好気的条件下で行う。培養温度は好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養時間は通常１〜３日間である。
【００１３】
前記のようにして得られる微生物等を含む培養物からトリプトファンシンターゼを回収する。例えば、エシェリヒア・コリ由来のトリプトファンシンターゼはザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｖ ｏｌ．２５２，Ｎｏ．１９， ｐ．６５９４〜６５９９（１９７７））に記載されている方法、ノイロスポラ・クラッサ由来のトリプトファンシンターゼは同じくザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｖｏｌ．２５０， Ｎｏ．８，２９４１〜２９４６（１９７５））に記載されている方法と同様にして回収することができる。
【００１４】
本発明の製造方法に使用されるトリプトファンシンターゼは、必ずしも純粋である必要はない。すなわち、トリプトファンシンターゼ生産菌の培養物、培養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、その乾燥菌体、あるいは菌体を破砕、自己消化、超音波処理などによって得られた菌体処理物、該菌体菌体処理物から得られるトリプトファンシンターゼを含む粗精製物を本発明の製造方法に用いることができる。また、これらの固定化酵素または固定化菌体を本発明の製造方法に用いることもできる。
【００１５】
アリルメルカプタンとＬ-セリンを前記のトリプトファンシンターゼの存在下で反応させることにより、Ｓ-アリル-Ｌ-システインを製造することができる。
【００１６】
原料である、Ｌ−セリンおよびアリルメルカプタンはいずれも市販されており容易に入手できる。
【００１７】
アリルメルカプタンとＬ-セリンとの反応は、通常、水溶液中で行われるが、反応に悪影響を与えない範囲で、水と混和する有機溶媒を含む水溶液中で行うこともできる。また、水と混和しない有機溶媒と水との２相系で行うこともできる。水と混和する有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどが挙げられる。また、水と混和しない有機溶媒としては、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒や酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒などが挙げられる。
【００１８】
反応液中のＬ−セリンの濃度は特に制限ないが、好ましくは１〜２０重量％である。
【００１９】
反応液中のアリルメルカプタンの濃度は、酵素反応を阻害しない範囲であれば特に制限されないが、好ましくは１０重量％以下の濃度で使用される。なお、反応中に酵素反応を阻害しない濃度範囲になるように、アリルメルカプタンを逐次添加してもよい。また、反応に際して、基質の他に補酵素であるピリドキサルリン酸を０．１〜１００ｐｐｍの範囲で添加することが望ましい。
【００２０】
反応に用いるトリプトファンシンターゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜変更し得る。
【００２１】
反応はｐＨ８．０〜１０．５で行うことができる。反応のｐＨは、好ましくはｐＨ８．５〜１０．０の範囲である。ｐＨの調製には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などが使用可能である。
【００２２】
トリプトファンシンターゼを用いたL−トリプトファンを合成する反応の最適ｐHは８.０であることが知られている。驚くべきことに、トリプトファンシンターゼを用いたアリルメルカプタンとＬ-セリンとからＳ-アリル-Ｌ-システインを合成する反応の最適ｐHは８.５からｐＨ９.５であることが判明した。
【００２３】
ｐＨが８．５より低い場合、原料であるＬ−セリンは充分にＳ−アリル−Ｌ−システインに転換されない。トリプトファンシンターゼとして、トリプトファンシンターゼを産生する微生物そのもの、又は該微生物からの抽出物などに含まれるトリプトファンシンターゼを使用する場合は、該微生物又は該抽出物中にＬ−セリンを分解する酵素が共存するため、原料であるＬ−セリンの分解が起こる。反応液のｐＨが８．５より低い場合は、Ｓ−アリル−Ｌ−システインを合成するトリプトファンシンターゼの酵素活性に比べて、共存するＬ−セリンを分解する酵素の酵素活性のほうが大きいため、原料であるＬ−セリンの分解反応が優先的に進行し、Ｓ−アリル−Ｌ−システインの反応収率は低くなる。反応液にアンモニウム塩を共存させると、Ｌ−セリンの分解を抑制することもできるが、ｐＨが８．５より低ければ効果は小さい。
【００２４】
ｐＨが８．５〜１０．５である場合、ｐＨが８．５より低い場合に比べて、Ｓ−アリル−Ｌ−システインを合成するトリプトファンシンターゼの酵素活性は増加し、一方、前記のＬ−セリンを分解する酵素の酵素活性は低下するので、Ｓ−アリル−Ｌ−システインの合成が優位となる。このため、ｐＨ８．５〜１０．５ではＳ−アリル−Ｌ−システインの反応収率が飛躍的に向上する。
【００２５】
ｐＨが１０．５を超えた場合、ｐＨが８．５〜１０．５である場合に比べて、前記のＬ−セリンを分解する酵素の酵素活性も低下するが、Ｓ−アリル−Ｌ−システインを合成するトリプトファンシンターゼの酵素活性も低下するので、反応収率は減少する。
【００２６】
ｐＨ８．５以上で反応を行う場合でも、Ｌ−セリンの分解を抑制する目的でアンモニウム塩を共存させることは、反応収率を高める上で好ましい。アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが使用できる。
【００２７】
反応の温度は好ましくは４℃から６０℃で行われるが、酵素の安定性と反応速度の点で、特に好ましくは、２０℃から４０℃である。
【００２８】
反応はアリルメルカプタン及びＳ−アリル−Ｌ−システインの酸化を防止するため、窒素雰囲気下で行うことが好ましい。
【００２９】
反応は、バッチ法もしくは固定化酵素を用いた連続法により、静置もしくは撹拌下に行われる。５％以上のアリルメルカプタン濃度で反応する場合は、攪拌は、ゆるやかに行う方が反応収率がよい。
【００３０】
例えば、反応液中のアリルメルカプタンの濃度を５重量％〜１０重量％で反応させる場合は、反応液の攪拌動力を、２０ＫＷ／ｍ3以下にて行うことが望ましい。
【００３１】
反応時間は通常、５時間から４０時間である。
【００３２】
前記の反応で得られる反応液からＳ−アリル−Ｌ−システインを分離し、回収する方法は、公知のあらゆる方法が使用可能である。一例をあげれば反応液のｐＨを塩酸または硫酸などの適当な酸によって酸性に調整し、活性炭などを濾過助剤として酵素もしくは微生物由来成分を濾別し、減圧下で濃縮を行ったあとイソプロパノールなどのアルコールを貧溶媒として添加して、冷却し晶析することでＳ−アリル−Ｌ−システイン結晶を得ることができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
Ｓ−アリル−Ｌ−システインおよびＬ−セリンの定量方法
ＨＰＬＣ分析条件カラム；ＳｈｏｄｅｘＲＳｐａｋ ＮＮ−８１４（昭和電工製）
移動相；１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4 ＋ １．２ｍＭ リン酸
温 度；４０℃流 速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検 出；ＯＰＡ試薬 Ｅｘ＝３６５ｎｍ Ｅｍ＝４５５ｎｍ
【００３５】
L−トリプトファン合成活性の測定方法
調製試薬１；
Ｌ−セリン溶液Ｌ−セリン１０．６ｇを約４５０ｍｌの純水に溶解し、水酸化カリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で５００ｍｌにしたもの。
調製試薬２；
ＰＬＰ溶液ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約９５０ｍｌの純水に溶解し、水酸化カリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で１０００ｍｌにしたもの。
菌体懸濁液；
湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整したもの）に懸濁したもの。
活性測定方法；
インドール０．４ｇを１００ｍｌ容の三角フラスコに秤量し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１ｍｌを加え、加温してインドールを溶解する。これに、Ｌ−セリン溶液１８ｍｌとＰＬＰ溶液０．５ｍｌを加えて３５℃で５分間インキュベートした後、菌体懸濁液０．５ｍｌを加えて６０分間振とうしながらインキュベートする。６０分後、５Ｎ−ＮａＯＨ１０ｍｌを加えて反応を停止した後、リン酸０．５ｍｌを加えて中和する。この溶液の１ｍｌをマイクロチューブに分取し、ジクロロメタン１ｍｌを加えてよく混和させる。その後、遠心分離を行って水相と有機相に分液し、水相中のＬ−トリプトファン濃度をＨＰＬＣで定量する。Ｌ−トリプトファンのＨＰＬＣ分析条件はＳ−アリル−Ｌ−システインのＨＰＬＣ分析条件と同様である。乾燥菌体１ｇ当たり１時間に生成するＬ−トリプトファンの量（ｇ）をトリプトファン合成活性と定義した。
【００３６】
S−アリル−L−システイン合成活性の測定方法
調製試薬１；
Ｌ−セリン溶液Ｌ−セリン１５．５ｇ、塩化アンモニウム５．６ｇを約４５０ｍｌの純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で５００ｍｌにしたもの。
調製試薬２；ＰＬＰ溶液ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約１５ｍｌの純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で２０ｍｌにしたもの。
菌体懸濁液；
湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整したもの）に懸濁したもの。
活性測定方法；
１００ｍｌ容の三角フラスコにＬ−セリン容液１９ｍｌとＰＬＰ溶液０．２ｍｌを取り、アリルメルカプタン０．５ｍｌを加えて３５℃で５分間インキュベ−トした後、菌体懸濁液０．５ｍｌを加えて６０分間振とうしながらインキュベ−トする。６０分後、３５％塩酸１ｍｌを加えて反応を停止し、溶液中のＳ−アリル−Ｌ−システイン濃度をＨＰＬＣで定量する。乾燥菌体１ｇ当たり１時間に生成するＳ−アリル−Ｌ−システインの量（ｇ）をＳ−アリル−Ｌ−システイン合成活性と定義した。
【００３７】
L−セリン分解活性の測定方法
調製試薬１；
Ｌ−セリン溶液Ｌ−セリン１５．５ｇを約４５０ｍｌの純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で５００ｍｌにしたもの。
調製試薬２；
ＰＬＰ溶液ピリドキサルリン酸５０ｍｇを約１５ｍｌの純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７〜１１の各ｐＨに調整した後、純水で２０ｍｌにしたもの。
菌体懸濁液；
湿菌体１ｇを１０ｍｌのＰＬＰ溶液（ｐＨ８．５に調整したもの）に懸濁したもの。
活性測定方法；
１００ｍｌ容の三角フラスコにＬ−セリン容液１９ｍｌとＰＬＰ溶液０．２ｍｌを取り、３５℃で５分間インキュベートした後、菌体懸濁液０．５ｍｌを加えて６０分間振とうしながらインキュベートする。６０分後、３５％塩酸１ｍを加えて反応を停止し、溶液中のＬ−セリン濃度をＨＰＬＣで定量する。乾燥菌体１ｇ当たり１時間に分解するＬ−セリンの量（ｇ）をL−セリン分解活性と定義した。
【００３８】
［実施例１］
トリプトファンシンターゼ生産菌であるエシェリヒア・コリ ＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０）を、第１表に示す組成の培地１５０ｍｌ が入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。この培養液６００ｍｌ（フラスコ４本分）から遠心分離により菌体を集菌し、得られた湿菌体をトリプトファンシンターゼ源とした。菌体のL−トリプトファン合成活性、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン合成活性、L−セリン分解活性について、それぞれ反応液のｐＨを変化させて測定した。各ｐＨにおけるそれぞれの活性を第１図に示す。
【００３９】
【表１】
2006288242.tif 000002
【００４０】
［実施例２］
実施例１と同様の方法でエシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２の集菌体を得た。得られた菌体は、乾燥菌体１ｇ当たり５ｇのトリプトファンを合成できるトリプトファンシンターゼ活性を有していた。Ｌ−セリン５．３％、アリルメルカプタン３．７％、ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍ、２００ｍMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む10gの水溶液をｐＨ７．５に ＮａＯＨで調整した。この水溶液に上記遠心菌体を乾燥菌体換算で０．７％濃度となるように加え、３５℃にて１２時間撹拌した。生成したＳ−アリル−Ｌ−システインのＬ−セリンに対するモル収率は６０％だった。
【００４１】
反応終了後、反応液に６規定塩酸を加えてｐＨ１とし、活性炭を０．５ｇ加えて４０℃にて２時間加熱した。その後濾過し、活性炭を少量の水で洗い濾液と合わせた。濾液をＮａＯＨでｐＨ５に調整し、減圧下４０℃にて濃縮し全量を５ｇとした。ＩＰＡ濃度が６０％となるようにＩＰＡを加え、１０℃に冷却後、濾過を行ってＳ−アリル−Ｌ−システインの結晶を分離した。結晶を５℃以下に冷却した少量の濃度６０％ＩＰＡ水溶液にて洗浄した。減圧下にて乾燥し、０．１ｇのＳ−アリル−Ｌ−システインを得た。ＭＳスペクトル分析の結果、親イオンピークとしてｍ／ｚ＝161.2が検出された。ＮＭＲスペクトルのシグナル帰属結果は、Ｓ−アリル−Ｌ−システインの構造を満足した。
【００４２】
さらに、光学分割クロマトグラフィー用カラム CHIRALPAK  WH  （ダイセル化学工業）を用いたＨＰＬＣ分析により、得られた結晶と試薬S-アリル−Ｌ−システイン（東京化成品）が、同一の位置に検出される事を確認した。以上の機器分析結果から、得られた結晶はＳ−フェニル−Ｌ−システインであることを確認した。
【００４３】
［実施例３］
実施１と同様の方法でエシェリヒア・コリ ＭＴ−１０２４２の集菌体を得た。Ｌ−セリン１．１％、アリルメルカプタン０．７４％、ピリドキサルリン酸２５ｐｐｍ、２００ｍMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０，８．０，８．５，９．０，９．５，１０．０，１０．５，１１．０）を含む水溶液を緩衝液と同じｐＨになるようＮａＯＨで調整した。菌体を乾燥菌体換算で０．７％濃度となるように加え、３５℃で２４時間撹拌した。生成したＳ−アリル−Ｌ−システインをＨＰＬＣで定量し、仕込みＬ−セリンに対するモル収率を算出した。その結果を第２表に示した。第２表に示すとおり、ｐＨ８．５から１０．０での反応収率は、他のｐH域の反応収率より高いことが判った。
【００４４】
【表２】
2006288242.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の製造方法は、Ｓ−アリル−Ｌ−システインを工業的規模で製造するのに有用である。また、本発明の製造方法で得られるＳ−アリル−Ｌ−システインは医薬品の中間体、食品添加物の原材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】菌体（エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０））のＬ−トリプトファン合成活性、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン合成活性、Ｌ−セリン分解活性の各ｐＨにおける相対活性を示す図である。
【図１】
2006288242.tif 000004