(57)【要約】【課題】核酸との結合速度が速く、ｐＨを上昇させた時に核酸の放出効率が高い物質を利用して、核酸を迅速、かつ高効率で分離する方法を提供することである。【解決手段】核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能基物質とを前記第１ｐＨで接触させ、核酸を二官能基物質に結合させる工程と、結合している核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、二官能基物質が特定の物質である、試料から核酸を分離する方法である。【選択図】図１
2006176521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能基物質とを前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記二官能基物質に結合させる工程と、
結合している前記核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、
前記二官能基物質が、下記化学式（１）：
【化１】
2006176521.tif 000022
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基である；
または下記化学式（２）：
【化２】
2006176521.tif 000023
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表されることを特徴とする、核酸の分離方法。
【請求項２】
前記二官能基物質が、下記化学式（３）：
【化３】
2006176521.tif 000024
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数である；
または下記化学式（４）：
【化４】
2006176521.tif 000025
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、ｍは、１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，００００の整数である；
で表されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸を放出させる工程は、核酸−二官能基物質の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨを有する溶液の中で前記核酸を溶出する工程を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１ｐＨが、２〜３．５であり、前記第２ｐＨが、５〜１０であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記化学式（４）で表される化合物が、−ＯＨ基と、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基とを２：１の割合（モル比）で含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固体基板に固定化されている固定化基板とを前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固定化基板に結合させる工程と、
結合している前記核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、
前記固定化基板上に固定化される官能基が、下記化学式（５）：  
【化５】
2006176521.tif 000026
式中、ｎは、１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基である；
または化学式（６）：
【化６】
2006176521.tif 000027
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表されることを特徴とする、核酸の分離方法。
【請求項７】
前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラス、及びプラスチック物質から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸を放出させる工程は、核酸−二官能基物質の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨを有する溶液の中で前記核酸を溶出する工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１ｐＨが、２〜３．５であり、前記第２ｐＨが、５〜１０であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学式（６）で表される化合物は、−ＯＨ基と、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基とを２：１の割合（モル比）で含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二官能基物質を利用して核酸を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＨ依存性イオン交換マトリクスを利用した核酸の分離方法が知られている。例えば、特許文献１には、イオン化可能な基を有する物質を利用する核酸の分離方法が開示されている。ここで、核酸と結合できるようにイオン化可能な基は第１ｐＨで正電荷を帯びており、イオン化可能な基を有する物質は結合していた核酸を、第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出する。イオン化可能な基を有する物質の例としては、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−トリヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）及びトリヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）などが含まれる。また、特許文献２には、シリカ磁性粒子と複数の第１イオン交換リガンドとを含むｐＨ依存性イオン交換マトリクスを利用して核酸を分離する方法が開示されている。ここで、それぞれの第１イオン交換リガンドは、芳香族炭化水素環、芳香族炭化水素環に共有結合しているスペーサ、及び第１末端でシリカ磁性粒子に共有結合しており、第２末端でスペーサのアミノ末端に共有結合しているリンカーアルキル鎖を有するリンカーを含む。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００１／００１８５１３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、イオン化可能な基を有する物質と核酸との結合速度が速く、さらにｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率が高い物質は、依然として要求されている。そこで、本発明の目的は、核酸との結合速度が速く、ｐＨを上昇させた時に核酸の放出効率が高い物質を利用して、核酸を迅速、かつ高効率で分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、核酸との結合が速く、速やかに核酸を吸着でき、ｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率が著しく高い物質を探索した。その結果、カルボキシル基とアミノ基とを含む二官能基物質が所望の機能を発揮しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能基物質とを前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記二官能基物質に結合させる工程と、結合している前記核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、前記二官能基物質が、下記化学式（１）：
【０００６】
【化１】
2006176521.tif 000003
【０００７】
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基である；
または下記化学式（２）：
【０００８】
【化２】
2006176521.tif 000004
【０００９】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表されることを特徴とする、核酸の分離方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固体基板に固定化されている固定化基板とを前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固定化基板に結合させる工程と、結合している前記核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、前記固定化基板上に固定化される官能基が、下記化学式（５）：
【００１１】
【化３】
2006176521.tif 000005
【００１２】
式中、ｎは、１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基である；
または化学式（６）：
【００１３】
【化４】
2006176521.tif 000006
【００１４】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素１〜１０のアルキル基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表されることを特徴とする、核酸の分離方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の核酸分離方法によれば、より速く、かつ高効率で核酸を分離できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、核酸を含む試料と、アミノ基及びカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能基物質とを前記第１ｐＨで接触させて、前記核酸を前記二官能基物質に結合させる工程と、結合している前記核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させる工程と、を含み、前記二官能基物質が、下記化学式（１）：
【００１７】
【化５】
2006176521.tif 000007
【００１８】
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基である；
または化学式（２）：
【００１９】
【化６】
2006176521.tif 000008
【００２０】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表されることを特徴とする、核酸の分離方法を提供するものである。
【００２１】
本発明に用いられる試料は、核酸を含むものであって、例えば、血液及び細胞を含む溶液のような生物学的試料またはＰＣＲ産物を含む溶液のような化学的核酸溶液が含まれる。
【００２２】
本発明において、試料中の核酸が結合する物質は、アミノ基とカルボキシル基とを含む物質であって、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能基物質である。また、そのような物質と同様の構造を有する官能基が固体基板上に固定化されている固定化基板として用いて核酸を分離してもよい。固体基板を構成する材料としては、シリコン、ガラス、及びプラスチック物質から選択することが好ましいが、これらの例に限定されるものではない。
【００２３】
本発明で用いられる二官能基物質の具体例としては、下記化学式（３）：
【００２４】
【化７】
2006176521.tif 000009
【００２５】
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり；
または化学式（４）：
【００２６】
【化８】
2006176521.tif 000010
【００２７】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ、独立して−ＯＨ基及びｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、ｍは、１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表される。
【００２８】
化学式（１）及び化学式（２）の化合物は、それぞれアミノ基とカルボキシル基とを有する化合物である。化学式（１）の化合物は、第１ｐＨで正電荷と負電荷とを約２：１の割合で含み、＋１の正電荷を有することが好ましい。また、化学式（２）の化合物は、−ＯＨ基および、ｎが１〜１０である整数の−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基を２：１の割合（モル比）で含む化学式（４）の化合物であることが好ましい。化学式（４）の化合物の一例は、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２がｎ＝２のエチレンジアミン基である化合物である。
【００２９】
本発明において、化学式（１）の化合物は、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸無水物のようなテトラカルボン酸無水物と、エチレンジアミンのような、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２とを化学反応させることにより得ることができる。また、化学式（２）の化合物は、下記化学式（７）；
【００３０】
【化９】
2006176521.tif 000011
【００３１】
式中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
の化合物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２とを化学反応させることにより得ることができる。前記化学式（７）の好ましい一例は、下記化学式（８）：
【００３２】
【化１０】
2006176521.tif 000012
【００３３】
式中、ｍは、１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
の化合物である。その結果得られる化学式（２）の化合物の中の−ＯＨ基と−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基との比率は、反応物の中のＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２の濃度を調節することにより調整できる。
【００３４】
化学式（７）の化合物は、ポリ無水物である。このポリ無水物は、遠心分離のような分離過程によって溶液から容易に分離されうる。したがって、核酸と、化学式（７）から得られる化学式（２）の二官能基物質とを結合させて得られる核酸−二官能基物質の複合体を溶液から分離し、分離された前記複合体から核酸を第１ｐＨより高い第２ｐＨで溶出することにより、核酸を容易に前記複合体から分離できる。
【００３５】
本発明では、固体基板上に下記化学式（５）：
【００３６】
【化１１】
2006176521.tif 000013
【００３７】
式中、ｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、［］部分の基は、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、及び１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸無水物と、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のアミノ基との反応によって生成される基であり；
または下記化学式（６）
【００３８】
【化１２】
2006176521.tif 000014
【００３９】
式中、Ｒ１と及びＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、Ｒ３は、炭素１〜１０のアルキル基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である；
で表される官能基が固体基板に固定化されている固定化基板を、第１ｐＨで試料と接触させ、核酸を前記官能基に結合させてもよい。
【００４０】
化学式（５）の官能基は、第１ｐＨで正電荷と負電荷とを２：１の割合で含むことができる。また、前記化学式（６）の基は、好ましくは、−ＯＨ基と、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基とを２：１の割合（モル比）で含むことが好ましい。化学式（６）の基の一例は、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２がエチレンジアミンである。
【００４１】
前記化学式（５）及び化学式（６）の一例は、それぞれ下記化学式（９）及び化学式（１０）の官能基である：
【００４２】
【化１３】
2006176521.tif 000015
【００４３】
式中、ｎは、１〜１０の整数である；
【００４４】
【化１４】
2006176521.tif 000016
【００４５】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及び、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、ｍは、１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００４６】
化学式（９）の官能基は、第１ｐＨで正電荷と負電荷とを２：１の割合で含むことが好ましい。また、前記化学式（１０）の官能基は、−ＯＨ基と、ｎが１〜１０の整数である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基とを２：１の割合（モル比）で含むことが好ましい。化学式（１０）の官能基の一例は、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２とがエチレンジアミン基である。
【００４７】
本発明で用いられる固体基板を構成する材料としては、好ましくはシリコン、ガラス、及びプラスチック物質から選択することができるが、それらの例に限定されるものではない。また、固体基板は、化学式（９）または化学式（１０）で表されるような官能基を固定化するために、活性化されうる。例えば、アミノ基のような活性基がコーティングされている固体基板を用いることができる。
【００４８】
本発明において、固体基板上に化学式（９）または化学式（１０）のような官能基が固定化された固定化基板は、当業界で公知の任意の固定化方法によって製造することができる。例えば、ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のようなアミノ基でコーティングされている固体基板（例えば、シリコン、ガラスまたはプラスチック物質から構成される）に１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸無水物を化学反応させて固体基板上に固定化した後、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２の化合物（例、エチレンジアミン）を化学反応させることにより製造することができる。また、化学式（１０）の官能基が固定化されている固定化基板は、例えば、化学式（８）のポリ無水物を、アミノ基がコーティングされている固体基板上に化学反応させることにより固定化した後、ｎが１〜１０の整数であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２の化合物（例、エチレンジアミン）を化学反応させることにより製造することができる。
【００４９】
本発明において、第１ｐＨは、化学式（１）、化学式（２）の化合物中の、または化学式（５）、化学式（６）の官能基内のカルボキシル基のｐＫａ値より低いｐＨであることが好ましい。具体的に、好ましい第１ｐＨは、２〜３．５である。
【００５０】
本発明の方法は、核酸が結合した複合体から第１ｐＨより高い第２ｐＨで核酸を分離する工程を含む。核酸を分離させる工程は、核酸が結合した複合体を混合物から分離し、第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液中から核酸を溶出する工程を含む。
【００５１】
第２ｐＨは、第１ｐＨより高いものであればよいが、好ましくは、５〜１０である。核酸が結合した複合体の溶出に使用される溶液は、水及びバッファなどである。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲が実施例に限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１：化学式（９）の官能基が固定化された固体基板への核酸の結合＞
本実施例では、ｎが２である化学式（９）の基が固定化されている固体基板を製造し、ｐＨによるＤＮＡの結合量を測定した。
【００５４】
まず、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の１００ｍＭ１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸無水物に１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。得られた１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸無水物が共有結合されたガラス基板を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の１００ｍＭエチレンジアミン中に１時間浸漬させた後、エタノールで洗浄し、ｎが２である化学式（９）の官能基でコーティングされたガラス基板を得た。
【００５５】
得られたガラス基板と５’末端がＣｙ３でラベルされた配列番号１のＤＮＡ（５’−ｇｇｃｃｔｃａｃｔｔ  ｃｃｔｇｇｇｇｔｃａ  ｔｇａｃｃｃｃａｇｇ  ｃｃｔｇｇａｇｇｃｃ  ｔｇｃｔｔｃｃｃｔｔ−３’）とを、さまざまなｐＨ（例えば、３、７及び１０）で反応させた。反応は、ＤＮＡ１μＭを含む溶液を基板上に添加して蓋を被せ、室温で３０分間静置することにより行った。この際、ｐＨ３、ｐＨ７及びｐＨ１０に対して０．１５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、０．１５ＭＴｒｉｓバッファ、及び０．１５Ｍ炭酸ナトリウムバッファをそれぞれバッファ溶液として使用した。ｐＨ３、７及び１０に対しそれぞれ０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１５ＭＴｒｉｓバッファ、及び０．１５Ｍ炭酸ナトリウムバッファで洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３００）でＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して結合しているＤＮＡ量を測定し、結果を得た。図１は、それぞれｐＨ３、ｐＨ７及びｐＨ１０で結合しているＤＮＡ量を観察した結果を示す図である。対照群として、ｎが２である化学式（９）の官能基がコーティングされていない状態のガラス基板、すなわち、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）を使用した。図１で観察された蛍光強度を、下記表１に示す。
【００５６】
【表１】
2006176521.tif 000017
【００５７】
図１及び表１に示すように、ｐＨ３では多くのＤＮＡが基板上に結合するが、ｐＨ７及びｐＨ１０では、その結合量が著しく減少した。これは、溶液のｐＨが大きくなるにつれ、表面の電荷が＋から−に変換したということを表す。
【００５８】
＜実施例２：化学式（９）の官能基が固定化された固体基板を利用した核酸の回収＞
本実施例では、実施例１で製造したｎが２である化学式（９）の官能基が固定化された固体基板に、ＤＮＡをｐＨ３で結合させた後、ｐＨ３、ｐＨ５及びｐＨ７で核酸−基板の複合体から放出されるＤＮＡの量を測定した。
【００５９】
得られたガラス基板と、５’末端がＣｙ３でラベルされた配列番号１のＤＮＡとを、ｐＨ３で反応させた。反応は、ＤＮＡ１μＭを含む溶液を基板上に添加し、蓋を覆って室温で３０分間静置することにより行った。この際、バッファ溶液としては、０．１５Ｍの酢酸ナトリウムバッファを使用した。反応後に０．１５Ｍの酢酸ナトリウムバッファで、それぞれｐＨ３、５、７で洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３８０）でＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して、結合しているＤＮＡ量を測定した。図２は、ｐＨの変化によって放出されるＤＮＡの量を観察した結果を示す図である。対照群として、ｎが２である化学式（９）の基がコーティングされていない状態のガラス基板、すなわち、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）を使用した。
【００６０】
図２で観察された蛍光強度を下記表２に示す。
【００６１】
【表２】
2006176521.tif 000018
【００６２】
図２及び表２に示すように、洗浄溶液をｐＨ３から順次ｐＨを上昇させた場合、本発明の基板では、ｐＨ７で８０％（〔｛１５１４７−２９９１｝／１５１４７｝］×１００＝８０．３〕）のＤＮＡが回収されるのに対し、対照群では、６６％（〔｛３７０４１−１２６０２｝／３７０４１｝］×１００＝６６．０〕）のみが回収されることが分かった。したがって、本発明の基板はＤＮＡ放出効果、すなわち、回収効果が著しく、ＤＮＡ分離効率が著しく高いということが分かる。
【００６３】
＜実施例３：化学式（１０）の官能基が固定化された固体基板を利用した核酸の回収＞
本実施例では、下記化学式（１０）の官能基が固定化された固体基板を製造し、第１ｐＨでＤＮＡを結合させた後、第２ｐＨでＤＮＡ−基板の複合体から核酸を回収した。
【００６４】
本実施例では下記化学式（１０）：
【００６５】
【化１５】
2006176521.tif 000019
【００６６】
式中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同じであるか、または異なり、それぞれ独立して−ＯＨ基及びｎが２である−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２基から選択され、ｍは、２であり、ｌは、１〜３０，０００である；
が使用され、Ｒ１及びＲ２のアミノ基とカルボキシル基との比率は、ＮＨ２（ＣＨ２）２ＮＨ２が導入される反応条件によって調節された。
【００６７】
化学式（１０）の官能基の基板上への固定化は、次の通りに行われた。まず、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の２００ｍＭ（反復単位基準）のポリ無水物であるエチレン−無水マレイン酸交互共重合体（分子量Ｍｗ１００，０００−５００，００００）に室温で１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。ポリ無水物が結合したガラス基板を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の種々の濃度のエチレンジアミンに、室温で１時間浸漬させた後、エタノールで洗浄して乾燥した。エチレンジアミンの濃度は、それぞれ５００ｍＭ（実験群１）、４５０ｍＭ及び水５０ｍＭ（エチレンジアミン：Ｈ２Ｏ＝９：１（モル比））（実験群２）、４００ｍＭ及び水１００ｍＭ（エチレンジアミン：Ｈ２Ｏモル比＝８：２（モル比））（実験群３）、３００ｍＭ及び水２００ｍＭ（エチレンジアミン：Ｈ２Ｏ＝６：４（モル比））（実験群４）、２００ｍＭ及び水３００ｍＭ（エチレンジアミン：Ｈ２Ｏ＝４：６（モル比））（実験群５）であった。
【００６８】
化学式（１０）の基がコーティングされたガラス基板と、５’末端がＣｙ３でラベルされた配列番号１のＤＮＡとを、ｐＨ３で反応させた。反応は、ＤＮＡ１μＭを含む０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を基板上に添加して蓋を被せて、室温で５分間静置することにより行った。反応後、０．１５Ｍの酢酸ナトリウムバッファでそれぞれｐＨ３及びｐＨ７で洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３５０）でＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定結果を下記表３に示す。対照群として、化学式（１０）の官能基がコーティングされていない状態のガラス基板、すなわち、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）を使用した。
【００６９】
【表３】
2006176521.tif 000020
【００７０】
表３に示すように、ＤＮＡの回収率は、実験群５、すなわち、エチレンジアミン：Ｈ２Ｏのモル比が４：６である場合が最も高かった。
【００７１】
＜実施例４：化学式（１０）の官能基が固定化された固体基板を利用した核酸の回収＞
本実施例では、実施例３で実験群５、すなわち、エチレンジアミン：Ｈ２Ｏのモル比率を４：６にして反応させて得られる化学式（１０）の官能基がコーティングされた基板を利用して、多様な反応時間で反応させ、核酸を分離した。
【００７２】
実験群５のガラス基板と、５’末端がＣｙ３でラベルされた配列番号１のＤＮＡとを、ｐＨ３で、異なる反応時間で反応させた。反応は、ＤＮＡ１μＭを含む０．１５Ｍ酢酸ナトリウム溶液を基板上に添加して蓋を被せて、室温でそれぞれ１、５、１０、及び３０分間静置することにより行った。反応後、０．１５Ｍの酢酸ナトリウムバッファでそれぞれｐＨ３及びｐＨ７それぞれで洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３５０）でＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定結果を下記表４に示す。対照群１は、化学式（１０）の官能基がコーティングされていない状態のガラス基板、すなわち、アミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）を同じ方法で使用したものである。対照群２は、ＤＮＡ１μＭを含むＱｉａｇｅｎ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）結合バッファをピラニア（Ｈ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４＝１：３）溶液の中のアミノ基でコーティングされたガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社）に添加して蓋を被せて、室温で３０分間静置することにより反応させたものである。反応後、Ｑｉａｇｅｎ洗浄バッファでｐＨ３及びｐＨ７でそれぞれ洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３５０）でＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して蛍光強度を測定した。
【００７３】
【表４】
2006176521.tif 000021
【００７４】
表４に示すように、実験群５の基板を利用する場合、ＤＮＡの９５％を反応後１分以内に回収することができた。これは、対照群１及び対照群２に比べて、著しく優れた回収率を示すものである。
【００７５】
＜実施例５：ＥｔＢｒ染色によって結合された核酸の確認＞
本実施例では、実施例３で実験群５、すなわち、エチレンジアミン：Ｈ２Ｏのモル比率を４：６にして反応させて得られる化学式（１０）の官能基がコーティングされた基板に、バクテリアゲノムＤＮＡを反応させた後、結合されている核酸をＥｔＢｒ染色により確認した。
【００７６】
実験群５のガラス基板上に、５’末端がＣｙ３でラベルされたバクテリアゲノムＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを使用して抽出する）をｐＨ３及びｐＨ７でそれぞれ２０分間反応させた。反応は、ＤＮＡ１０ｎｇ／μｌを含む０．１５Ｍ酢酸ナトリウム溶液を基板上に添加し、蓋を被せて室温で２０分間静置することにより行われた。反応後、ｐＨ３とｐＨ７それぞれで０．１５Ｍの酢酸ナトリウムバッファにより洗浄した後、ＥｔＢｒを含む溶液中に基板を添加して、核酸をＥｔＢｒで染色し、オートラジオグラフィを利用して染色された核酸を確認した。化学式（１０）と同じ官能基を含み、ＤＮＡ処理を行っていない試料を対照群として使用した。図３は、ｐＨ３とｐＨ７とでバクテリアゲノムを反応させた基板をＥｔＢｒで染色した結果を示す図である。図３に示す結果から、本発明の核酸の分離方法によれば長いＤＮＡを精製することも可能であるということが示される。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、核酸分離関連の技術分野に好適に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】それぞれｐＨ３、７及び１０で結合したＤＮＡの量を観察した結果を示す図である。
【図２】ｐＨ変化によって放出されるＤＮＡの量を観察した結果を示す図である。
【図３】ｐＨ３及びｐＨ７でバクテリアゲノムと反応させた基板をＥｔＢｒで染色した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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