(57)【要約】【課題】  医薬品中間体として有用な光学活性アルキルアルコール誘導体を、微生物の培養物との混合物から簡便に単離取得する方法を提供する。【解決手段】  沸点または水との共沸沸点が１００℃以下である光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を蒸留して、水との混合物として高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体を取得し、好ましくは、上記高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体をさらに有機溶媒を用いて抽出することにより、光学活性アルキルアルコール誘導体を単離取得する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
沸点または水との共沸沸点が１００℃以下である光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を蒸留して、水との混合物として高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体を取得することを特徴とする、光学活性アルキルアルコール誘導体の単離取得方法。
【請求項２】
光学活性アルキルアルコール誘導体が、１級アルコール又は２級アルコールである請求項１記載の単離取得方法。
【請求項３】
光学活性アルキルアルコール誘導体が、置換基を有しても良い炭素数３〜８の光学活性アルキルアルコール誘導体である請求項１または２記載の単離取得方法。
【請求項４】
蒸留して得られた留出液を、さらに有機溶媒を用いて抽出処理することを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の単離取得方法。
【請求項５】
有機溶媒が、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、塩化メチレン及びクロロホルムからなる群より選択される１種以上の溶媒であることを特徴とする、請求項４記載の単離取得方法。
【請求項６】
光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物が、アルキルカルボニル誘導体に、該誘導体のカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させて、アルキルカルボニル誘導体を還元することにより製造されたものである、請求項１〜５記載の単離取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性アルキルアルコール誘導体、中でも炭素数３〜８の光学活性アルキルアルコール誘導体の単離取得方法に関する。より詳細には、光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物から、高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体を単離取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アルキルアルコール誘導体は、例えば、以下の様な方法により製造することができる。
【０００３】
１）パン酵母を用いてクロロアセトンを不斉還元した後、反応液から酢酸エチルで抽出し、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、収率２０％にて光学純度８３％ｅｅの（Ｒ）−１−クロロ−２−プロパノールを取得する方法（非特許文献１）。
【０００４】
２）加水分解酵素の作用によって、ラセミ体の−３−ブテン−２−オールを光学分割する方法（特許文献１、特許文献２）、
これら１）又は２）などの微生物の培養物を用いて不斉還元、或いは不斉加水分解を行う方法では、光学活性アルキルアルコール誘導体は微生物の培養物との混合物として得られる。従って、高品質の目的物を得る為には、前記混合物から目的物を効率的に単離取得する必要があった。
【０００５】
上記光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物から目的物を単離取得する方法としては、上記１）や２）の様に、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下に除去した後、減圧蒸留又はクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製する方法が知られている。しかしながら、前記混合物には微生物由来物、特に蛋白質、核酸、脂質等の高分子化合物を多く含んでおり、有機溶媒で抽出する際に大量のエマルジョン層が生じる傾向がある。通常、このエマルジョン層への目的物のロスを抑える為には、前記混合物に対して数倍量以上の有機溶媒を使用する必要があり、有機溶媒使用量、溶媒濃縮操作に要する時間等に課題があった。さらに、目的物であるアルコールと有機溶媒との沸点差が小さい場合では、大量の有機溶媒を選択的に留去することは困難であった。このような状況下において、医薬品中間体として有用な光学活性アルキルアルコール誘導体の商業的規模での生産に適した単離取得方法の確立は格別重要な意義を有している。
【非特許文献１】Bull.Chem.Soc.Jpn., 65(3), 631-638 (1992)
【特許文献１】特開平１−１３２３９９公報
【特許文献２】特開平５−３１７０９０公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品中間体として有用な光学活性アルキルアルコール誘導体、中でも炭素数３〜８の光学活性アルキルアルコール誘導体を、微生物の培養物との混合物から簡便に単離取得する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を蒸留し、蒸留物として光学活性アルキルアルコール誘導体を水との混合物を得ることにより、高品質の光学活性アルキルアルコール誘導体を簡便に単離取得する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、沸点または水との共沸沸点が１００℃以下である光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を蒸留して、水との混合物として高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体と水との混合物を取得することを特徴とする、光学活性アルキルアルコール誘導体の単離取得方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法により、医薬品中間体として有用な光学活性アルキルアルコール誘導体、中でも炭素数３〜８の光学活性アルキルアルコール誘導体を、微生物の培養物との混合物から簡便に単離取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
まず、本発明に関わる化合物について説明する。本発明で単離取得できる光学活性アルキルアルコール誘導体としては、その沸点或いは水との共沸沸点が、水の沸点以下、すなわち１００℃以下であれば特に限定されないが、１級アルコール、２級アルコール、又は３級アルコールが挙げられ、好ましくは、１級又は２級アルコールが挙げられる。また、好ましくは置換基を有しても良い炭素数３〜８の光学活性アルキルアルコール誘導体が挙げられ、より好ましくは置換基を有しても良い炭素数３〜６の光学活性アルキルアルコール誘導体が挙げられる。ここでいう、光学活性アルキルアルコール誘導体の沸点或いは水との共沸沸点は、常圧での値である。また、本発明でいう光学活性アルキルアルコール誘導体とは、光学純度６０％ｅｅ以上、好ましくは８０％ｅｅ以上、より好ましくは９０％ｅｅ以上の（Ｒ）体又は（Ｓ）体アルキルアルコール誘導体を表す。
【００１２】
例えば、１級アルコールとしては、（Ｒ）−２−メチル−１−ブタノール、（Ｒ）−２−メチル−１−ヘキサノール、（Ｒ）−２−メチル−１−オクタノール、（Ｓ）−２−メチル−１−オクタノール、（Ｒ）−２−エチル−１−ブタノール、（Ｒ）−２−エチル−１−ペンタノール、（Ｒ）−２−エチル−１−ヘキサノール、（Ｒ）−２−エチル−１−オクタノール、（Ｓ）−２−エチル−１−オクタノール等の光学活性２−アルキル−１−アルカノール誘導体が挙げられる。２級アルコールとしては、（Ｒ）−２−プロパノール、（Ｒ）−２−ブタノール、（Ｒ）−２−ペンタノール、（Ｒ）−２−ヘキサノール、（Ｒ）−２−オクタノール、（Ｓ）−２−オクタノール等の光学活性２−アルカノール誘導体；（Ｒ）−１−クロロ−２−プロパノール、（Ｒ）−１−クロロ−２−ブタノール、（Ｒ）−１−クロロ−２−プロパノール、（Ｒ）−１−クロロ−２−ブタノール、（Ｒ）−１−クロロ−２−ペンタノール、（Ｒ）−１−クロロ−２−ヘキサノール、（Ｒ）−１−ブロモ−２−ヘキサノール、（Ｓ）−１−クロロ−２−ヘキサノール等の光学活性１−ハロ−２−アルカノール誘導体；（Ｒ）−３−ブテン−２−オール、（Ｒ）−３−ペンテン−２−オール、（Ｒ）−３−ヘキセン−２−オール、（Ｒ）−３−オクテン−２−オール、（Ｓ）−３−ブテン−２−オール等の３−アルケン−２−オール誘導体が挙げられる。
【００１３】
前記化合物は、工業的に入手可能な原料から容易に合成することができる。例えば、本発明において、光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物とを含む混合物は、アルキルカルボニル誘導体のカルボニル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源の存在下、アルキルカルボニル誘導体のカルボニル基を還元する反応を行ったあとの、反応混合物として得ることができる。
【００１４】
ここで、「酵素源」とは、上記還元活性を有する微生物の培養物およびその処理物である。「微生物の培養物」とは、該微生物の培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに上記酵素源は、公知の手段で固定化して、固定化菌体として用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。
【００１５】
本発明において、前記アルキルカルボニル誘導体のカルボニル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源としては、安価に入手可能なパン酵母の他、キャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、又はロドコッカス（Rodococcus）属に属する微生物由来の酵素源が挙げら、好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida maris）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）及びロドコッカス・スピーシーズ（Rodococcus  SP.）等の微生物由来の酵素源が挙げられる。
【００１６】
また、上記微生物由来の還元酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合または遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。遺伝子操作された本酵素を生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法により得ることができる（ＷＯ９８／３５０２５）。より好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida maris）ＮＢＲＣ１０００３由来の還元酵素遺伝子で形質転換されたEscherichia coli HB101(pNTFP)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）ＮＢＲＣ１３５８４由来の還元酵素遺伝子で形質転換されたEscherichia coli HB101(pNTDR)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５７）、ロドコッカス・スピーシーズ（Rhodococcus SP.）ＫＮＫ０１由来の還元酵素遺伝子で形質転換されたEscherichia coli HB101(pNTRS)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５４５）等が挙げられる。
【００１７】
Escherichia coli HB101(pNTFP)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１６）は平成１２年４月１１日に、Escherichia coli HB101(pNTDR)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５７）は平成１４年５月２９日に、Escherichia coli HB101(pNTRS)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５４５）は平成１５年１１月１０日に、それぞれ前記の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。
【００１８】
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用することができる。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。
【００１９】
本発明において、アルキルカルボニル誘導体の還元反応は、適当な溶媒中に基質、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び前記微生物の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができる。
【００２０】
反応条件は用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％であり、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは基質に対して０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％、反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応のｐＨは４〜９、好ましくは５〜８であり、反応時間は１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間で行うことができる。基質は一括、または連続的に添加して行うことができる。反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。
【００２１】
還元工程において、一般に用いられる補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系を組み合わせて用いることにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。代表的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及びグルコースを用いる方法が挙げられる。
【００２２】
還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要がないため、より低コストで光学活性アルキルアルコール誘導体を製造することができる。
【００２３】
上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要がないため、より低コストで光学活性アルキルアルコール誘導体を製造することができる。
【００２４】
上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。ここで、酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素が好ましく、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素がより好ましい。また、宿主微生物としては大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。  より好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida maris）ＮＢＲＣ１０００３由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたEscherichia coli HB101(pNTFPG)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１７）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）ＮＢＲＣ１３５８４由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたEscherichia coli HB101(pNTDRG1)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５８）等が挙げられる。
【００２５】
Escherichia coli HB101(pNTFPG)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１７）は平成１２年４月１１日に、Escherichia coli HB101(pNTDRG1)（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５８）は平成１５年８月２５日に前記の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。
【００２６】
なお、本発明の還元工程を、補酵素再生系と組み合わせて実施する、または、酵素源として上記形質転換微生物の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、補酵素として、より安価な酸化型のＮＡＤ（Ｐ）を添加して反応を行うことも可能である。
【００２７】
次に、本発明における光学活性アルキルアルコール誘導体の単離取得方法について説明する。
【００２８】
先に述べたように、光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物から、効率的に目的物を得るためには、優れた単離取得方法が必要である。本発明においては、光学活性アルキルアルコール誘導体の沸点または水との共沸沸点が１００℃以下の場合、光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を蒸留することにより、上記記載の多様な不純物を含有する微生物反応液から、目的物が微生物菌体等に取り込まれてロスすることなく、また、微生物由来不純物等を持ち込むこともなく、高収率にて、高濃度の光学活性アルキルアルコール誘導体と水とが混合した留出液が得られる。また、この高濃度化された留出液から有機溶媒を用いて抽出する際には、エマルジョン層は生成せず、有機溶媒の使用量を大幅に削減することが可能となり、高純度の目的物を効率よく単離取得できる方法を開発するに至った。
【００２９】
以下に、本発明の単離取得操作について詳細に説明する。例えば前記還元方法によって得られる光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物を、常圧或いは減圧下にて、攪拌しながら所定温度下（好ましくは加温下）、蒸留する。このとき、留出液として、高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体が、水との混合物として得られる。ここでいう、「高濃度」とは、前記微生物との培養物との混合液下におけるアルコール濃度より高濃度であれば特に限定されるものではないが、具体的には、水との混合液中のアルコール濃度が２％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上である。次に、必要に応じて、得られた高濃度化された光学活性アルキルアルコール誘導体を含有する留出液を、少量の有機溶媒を用いて抽出し、得られた有機層を濃縮することにより、目的物である光学活性アルキルアルコール誘導体を効率よく単離取得することができる。また、この場合に、目的物が実質的に水に不溶であれば、必ずしも有機溶媒を用いた抽出操作は必要なく、２層に分離した留出液から目的物を含む有機層を分液することにより、高品質な目的物を単離取得することも可能であるが、分液した水層をさらに有機溶媒で抽出することで回収率を高めることも出来る。
【００３０】
前記蒸留の形態は、特に限定されないが、通常、一般のバッチ式の蒸留で実施することができる。蒸留条件は、使用する光学活性アルキルアルコール誘導体の沸点或いは水との共沸沸点、蒸留装置の能力等による為、特に限定されないが、取り扱い易い操作温度としては、好ましくは約２０〜１２０℃、より好ましくは約３０〜８０℃であり、操作圧力としては、３０ｈＰａ〜大気圧、より好ましくは、５０〜６００ｈＰａである。また、目的物が微生物菌体等に取り込まれることなく、均一に分散していることが望ましく、攪拌強度（Ｐｖ）としては、下限として好ましくは、０．１ｋＷ／ｍ３以上、０．２ｋｗ／ｍ３以上、より好ましくは、０．３ｋＷ／ｍ３以上、０．５ｋＷ／ｍ３以上、さらに好ましくは、０．８ｋＷ／ｍ３以上、１ｋＷ／ｍ３以上であり、上限としては特に定める必要ないが、通常、攪拌装置の能力等を考慮すれば、１０ｋＷ／ｍ３以下である。また、できるだけ高濃度の光学活性アルキルアルコール誘導体を含有する留出液を得る為に、留去率（（留出量／光学活性アルキルアルコール誘導体と微生物の培養物との混合物量）×１００）としては、好ましくは５〜６０％、より好ましくは１０〜５０％である。
【００３１】
前記抽出に用いられる有機溶媒は、特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶剤；トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶剤；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶剤；メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン系溶剤；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル系溶剤；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン系溶剤が挙げられ、これらは単独で用いても良いし、２種以上混合して用いても良い。溶剤コストや取り扱いの容易さ等の総合的観点から好ましくは、酢酸エチル、ヘキサン又はトルエンである。また、抽出操作１回あたりに用いる有機溶媒量としては、抽剤比（有機溶媒量／留出液量）として、好ましくは０〜２、より好ましくは０〜０．５である。
【００３２】
このようにして得られた光学活性アルキルアルコール誘導体は、必要に応じて、更に蒸留し、精製することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）（Ｓ）−１−クロロ−２−プロパノールの単離取得方法
２００ｍＬの四つ口フラスコにパン酵母（オリエンタル酵母社製）５ｇ、グルコース脱水素酵素（アマノエンザイム社製）５ｍｇ、滅菌水５０ｍｌ、グルコース１０ｇ、ＮＡＤ+５ｍｇ及びＮＡＤＰ５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、１−クロロアセトン２．５ｇを５時間かけて添加した。さらに、１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を減圧下にて蒸留し（７０ｈＰａ、沸点３８−３９℃）、留出液２５ｇを得た。この留出液を等倍量の酢酸エチルにより抽出し、抽出溶液を減圧濃縮することにより表題化合物の透明油状物２．２５ｇを取得した（沸点１２６−１２７℃）。下記方法に従い分析した結果、化学純度９８％、光学純度は８１．０％ｅｅであった。
【００３５】
分析条件及び光学純度の計算方法は以下の通りである。
【００３６】
ＧＣ分析条件（化学純度）  カラム：ＴＣ−ＷＡＸ  １５ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬサイエンス社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝７０ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：７０℃、検出時間：（Ｓ）−１−クロロ−２−プロパノール  ４．４分。
【００３７】
ＨＰＬＣ分析条件（光学純度）  カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ  ２５０ｍｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ダイセル社製）、溶離液：ヘキサン／エタノール＝３／７、検出：ＵＶ２５４ｎｍ、カラム温度：４０℃、検出時間（３，５−ジニトロベンゾイル誘導体）：（Ｒ）体  １５．４分、（Ｓ）体  ２４．２分。
【００３８】
光学純度（％ｅｅ）＝（（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ））×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。
（実施例２）（Ｒ）−２−ペンタノールの単離取得方法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１７）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。
【００３９】
２００ｍＬの四つ口フラスコに上記組換え大腸菌の培養液５０ｍｌ、グルコース９．６ｇ及びＮＡＤ+２．５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、２−ペンタノン２．５ｇを５時間かけて添加した。さらに、１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を減圧下にて蒸留し（７０ｈＰａ、沸点３６−３８℃）、留出液２２．３ｇを得た。この留出液を有機層と水層の２層に分液し、水層をヘキサン５ｍｌで抽出した後、有機層と併せて減圧濃縮することにより表題化合物の透明油状物２．２３ｇを取得した（沸点１１９−１２０℃、水との共沸沸点９１．７℃）。実施例１と同様の方法にて分析した結果、生成物の純度は９８％、光学純度は９９％ｅｅであった。
（実施例３）  （Ｒ）−３−ブテン−２−オールの単離取得方法
２００ｍＬの四つ口フラスコに実施例２で得た組換え大腸菌の培養液５０ｍｌ、グルコース７．９ｇ及びＮＡＤ+２．５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、２−オキソ−３−ブテン２．５ｇを５時間かけて添加した。さらに、１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を減圧下にて蒸留し（８０ｈＰａ、沸点５０−５１℃）、留出液８ｇを得た。この留出液を等倍量の塩化メチレンにより抽出し、抽出溶液を常圧で濃縮することにより表題化合物の透明油状物２ｇを取得した（沸点９６℃）。実施例１と同様の方法にて分析した結果、生成物の純度は９６％、光学純度は９９％ｅｅであった。
（実施例４）  （Ｓ）−２−ペンタノールの単離、取得方法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５４５）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。
【００４０】
２００ｍＬの四つ口フラスコに上記組換え大腸菌の培養液５０ｍｌ、グルコース脱水素酵素５００Ｕ、グルコース７．９ｇ及びＮＡＤ+２．５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、２−ペンタノン２．５ｇを５時間かけて添加した。さらに、１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を減圧下にて蒸留し（７０ｈＰａ、沸点３６−３８℃）、留出液２２．３ｇを得た。この留出液を有機層と水層の２層に分液し、水層をヘキサン５ｍｌで抽出した後、有機層と併せて減圧濃縮することにより表題化合物の透明油状物２．２３ｇを取得した（沸点１１９−１２０℃、水との共沸沸点９１．７℃）。実施例１と同様の方法にて分析した結果、生成物の純度は９８％、光学純度は９９％ｅｅであった。
【００４１】
（実施例５）  （Ｒ）−２−メチルヘキサノールの単離取得方法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５８）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。
【００４２】
２００ｍＬの四つ口フラスコに上記組換え大腸菌の培養液５０ｍｌ、グルコース６．９ｇ及びＮＡＤ+２．５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、（Ｒ）−２−メチルヘキサナール２．５ｇ（９６％ｅｅ）を５時間かけて添加した。さらに１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を減圧下にて蒸留し（７０ｈＰａ、沸点３８−３９℃）、留出液２２．０ｇを得た。この留出液を有機層と水層の２層に分液し、水層をヘキサン５ｍｌで抽出した後、有機層と併せて減圧濃縮することにより表題化合物の透明油状物２．４ｇを取得した。実施例１と同様の方法にて分析した結果、生成物の純度は９８％、光学純度は９９％ｅｅであった。
（実施例６）  （Ｒ）−２−メチルヘキサノールの単離取得方法（攪拌強度の影響）
２００ｍＬの四つ口フラスコに、実施例５と同様の方法により得た反応液５５ｇを加え、攪拌数２００〜５００ｒｐｍ、減圧下にて蒸留し（７０ｈＰａ、沸点３８−３９℃）、留出液約１６．５ｇを得た。この留出液をヘキサン３０ｍｌで抽出した後、実施例１と同様の方法にて有機層に含まれる（Ｒ）−２−メチルヘキサナール濃度を分析し、回収率（反応液中に含まれる（Ｒ）−２−メチルヘキサナール量に対する回収率）を求めた。その結果を下表に示した。
【００４３】
【表１】
2006288342.tif 000002
（比較例１）（Ｓ）−１−クロロ−２−プロパノールの単離取得方法
２００ｍＬの四つ口フラスコにパン酵母（オリエンタル酵母社製）５ｇ、グルコース脱水素酵素（アマノエンザイム社製）５ｍｇ、滅菌水５０ｍｌ、グルコース１０ｇ、ＮＡＤ+５ｍｇ及びＮＡＤＰ５ｍｇを添加した後、３０℃、ｐＨ６．５にコントロールしながら、１−クロロアセトン２．５ｇを５時間かけて添加した。さらに、１７時間攪拌して原料の消失を確認した。反応液を１００ｍｌの酢酸エチルで抽出したところ、エマルジョンを形成し分液不調となった。そこで、酢酸エチル３００ｍｌを加えて抽出、分液した後、残った水層を４００ｍｌの酢酸エチルで再度抽出した。使用した酢酸エチルの総量は８００ｍｌである。得られた有機層を併せて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、減圧下に有機溶媒を留去した後、常圧で蒸留し（沸点１２６−１２７℃）、０．６ｇの（Ｓ）−１−クロロ−２−プロパノールを得た。実施例１と同様の方法にて分析した結果、光学純度は８１％ｅｅであった。
（比較例２）（Ｒ）−３−ブテン−２−オールの単離取得方法
２００ｍＬの四つ口フラスコに実施例２で得られた培養液５０ｍｌ、グルコース９．６ｇ、ＮＡＤ+２．５ｍｇ、２−オキソ−３−ブテン２．５ｇを加えて、３０℃で攪拌した。その間、反応液のｐＨは６ＮＮａＯＨによって６．５に維持した。２４時間の反応ののち、反応液を２５０ｍｌの塩化メチレンで５回抽出し（総量は１２５０ｍｌ）、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、常圧で蒸留し、１．６ｇの（Ｒ）−３−ブテン−２−オールを得た（沸点９６℃）。実施例１と同様の方法にて分析した結果、光学純度は９９％ｅｅ以上であった。