(57)【要約】      （修正有）【課題】インシュリンの放出を刺激する新規なポリペプチドの提供。【解決手段】ヘロデルマ・ホリヅム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍ）またはヘロデルマ・ススペクツム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の分泌産生物から単離されたペプチドをベースとする、特定なる配列：ＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＸ、又は特定なる配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＸの修飾体であるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２
配列番号：１
【化１】
2006176532.tif 000025
（式中、ＸはArg又はTyrを表し、位置１、２、28、29又は30はそれぞれ存在するか又は存在せず、そしてＮ−末端はNR1R2 により表され、ここで
R1 は水素又はアセチルを表し、
R2 は水素を表し、あるいは
R1とR2は一緒になってサクシニルを表し、そして
Ｃ−末端はCOR3により表され、ここで
R3はOH又はNH2であり、
更に、下記の（ａ）〜（ｏ）の修飾：
（ａ）位置１におけるα−アミノ酸が、D−His、Ala、D−Ala、Gly、Lys又はD−Lys である、
（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸が、D−Ser、Thr、D−Thr、Ala、D−Ala、Ile、D−Ile、Val、D−Val、Leu、D−Leu、Cys、D−Cys、Asp、D−Asp、Glu、D−Glu、Phe、D−Phe、His、D−His、Lys、D−Lys、Met、D−Met、Asn、D−Asn、Pro、D−Pro、Gln、D−Gln、Arg、D−Arg、Trp、D−Trp、Tyr又はD−Tyr である、
（ｃ）位置３におけるα−アミノ酸が、D−Glu、D−Asp、AlaまたはD−Ala である、
（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸が、Ser、D−Ser、Tyr、D−Tyr、Ala又はD−Alaである、
（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸が、Ile、D−Ile、Tyr又はD−Tyrである；
（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸が、Tyr、D−Tyr、Ser、D−Ser又はD−Thrである、
（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸が、Ala、TyrまたはThr である、
（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸が、Glu、D−Glu又はD−Asp である、
（ｊ）位置10、11、12、15、16、17、18、19、20、21、24、28、29におけるアミノ酸は、互いに独立して、Ala、D−Ala、Ser、D−Ser、Gly、D−Gly、Gln、D−Gln、Leu、D−Leu、Ile、D−Ile、Lys、D−Lys、Glu、D−Glu、Val、D−Val、Arg、D−Arg、Asn、D−Asn、又はGlyである、
（ｋ）位置13におけるα−アミノ酸が、D−Gln、Tyr、D−Tyr、Ala又はD−Alaである；
（ｌ）位置14におけるα−アミノ酸が、Nle、D−Nle、Ala、D−Ala、Ile、D−Ile、ValまたはＤ−Val である、
（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸が、D−Phe、Tyr又はD−Tyrである、
（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸が、Ｄ−Ile、Val又はＤ−Valである、および
（ｏ）位置25、26又は27におけるα−アミノ酸が、Ala、D−Ala、Val、D−Val、D−Trp、D−Leu又はD−Lysである、
の１〜10個が前記アミノ酸配列に対して行なわれている、前記ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置２において起こっており、当該置換が請求項１において定義した通りである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置14において起こっており、当該置換が請求項１において定義した通りである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置３において起こっており、当該置換が請求項１において定義した通りである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：３〜120のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：５、68、69、71、78〜82または84〜91の１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項７】
インスリンの放出を刺激する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
慣用の担体および補助物質に加えて、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つを含有する製剤。
【請求項９】
糖尿病の治療のための医薬組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真性糖尿病の治療において使用できる新規なエキセンジン(exendin) 類似体、それらの製造方法およびそれらを含有する製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸と外分泌膵臓との間の機能的接続は、血漿中のインスリンの精確な測定が可能となった後、1960年代に証明された。経口グルコース投与後のインスリンの応答は、グルコースの同一血漿レベルに到達した場合でさえ、静脈内グルコース投与後よりも、非常にいっそう強い。この「内分泌作用」は、腸−島軸の機能的組合わせにより説明される。腸のホルモンは、この作用の原因となり、食事後に小腸から放出され、増加する測定可能なレベルで血漿の中を循環し、グルコース誘導インスリン放出を増幅する。古典的内分泌ホルモンに加えて、胃の阻害性ポリペプチドＩ(GIP) 、現在グルカゴン様ペプチド−１(GLP−１）は、現在主要な重要性を有する。比較的短い時間で、 GLP−１は生理学的に最も興味ある内分泌ホルモンの候補から真性糖尿病II型の治療のための潜在的代替物に成熟した。本発明は、天然に存在する GLP−１分子の作用をまねる、新規な物質を記載する。これらの新規な物質は、安定性の増加と同時に効能の維持により特徴づけられる。
【発明の開示】
【０００３】
抗糖尿病誘発作用
GLP−１の注入および皮下注射は、真性糖尿病II型の患者において、インスリン分泌をかなり増加し、そしてグルカゴン放出を阻害する（Gutniak, M. (1992) ; Kreymann, B. (1987) ; Nathan, D.M. (1992) ; Nauck, M. A. (1993ａ＆ｂ））。双方は治療的重要性を有し、 GLP−１の血糖低下作用に関係する：インスリンはその標的組織によるグルコースの吸収を促進し、糖新生を阻害する。さらに、 GLP−１類似体は、末梢におけるグルコースの吸収を増加することが期待されるであろう。グルカゴン分泌の阻害は間接的 GLP−１作用と見なさなくてはならない。なぜなら、グルカゴン産生Ａ細胞は GLP−１レセプターを発現しないからである（Komatsu, R. (1989)) 。反対に、インスリンおよびソマトスタチンの放出の増加は決定的因子であるように見える。双方のホルモンはグルカゴン放出のインヒビターとして知られている。
【０００４】
２つの分子のメカニズムは、真性糖尿病II型における GLP−１誘発インスリン放出に確かに寄与する。グルコース誘発インスリン放出の直接的増幅に加えて、 GLP−１はＢ細胞のサブグループを主要な刺激「グルコース」に向けて感作し（Fehmann, H. C. (1991））そして、また、多分それ以上の刺激因子に向けて感作するので、全体のより多いＢ細胞はインスリンを分泌する。このプライミング作用は、 GLP−１がその比較的短い半減期にかかわらずインスリンの放出の延長に導くという事実の、最も可能性の高い説明である。
【０００５】
この作用はグルコースレベルの増加（＞ 108mg／dl）に依存する（Goke, R. (1993a)）。それは、グルコースの血漿レベルに対して独立してインスリン分泌に影響を及ぼすスルホニル尿素と GLP−１とを基本的に区別する。グルコース値が 108mg／dlより減少する場合、 GLP−１の静脈内注入でさえインスリン分泌は枯渇する。それゆえ、 GLP−１を治療的に使用するとき、低血糖症はめったに期待されないであろう。事実、低血糖症は、また、従来の臨床的研究において記載されてきていない。しかしながら、 GLP−１の薬理動態特性が問題となる。作用期間は、その非常に短い半減期により制限される。
【０００６】
治療の観点から、安定な、強く有効な GLP−１ペプチド類似体の合成は、いずれの場合においても、望ましい。今回、ペプチド類似性は、真性糖尿病の治療のための作用期間の増加して、分解に対する安定である、改良された治療剤を開発する目的で、エキセンジン分子をベースとして合成された。エキセンジン分子は、トカゲの毒液から独創的に単離された。これらのペプチドは GLP−１と同一の薬理学的作用を有するが、驚くべきことにはかなり長い半減期を有する。
【０００７】
本発明の主題である新規なペプチド配列はインスリン合成およびインスリンの放出およびに対してある影響を有し、そしてインスリンに対する作用は、標的組織、筋肉および脂肪組織の中へのグルコースの吸収、ならびに胃を空にすることに特に影響を与える。
【０００８】
本発明の主題
本発明は、エキセンジン−３およびエキセンジン−４の配列、すなわち、ヘロデルマ・ホリヅム（Heloderma horridum) またはヘロデルマ・ススペクツム（Heloderma suspectum)の分泌産生物から単離されたペプチド、をベースとする（Eng. J. et al., (1990, 1992)）。２つのペプチドのアミノ酸の配列および膵臓に対する作用は、幾人かの著者らにより既に発表された（Eng. J. et al., (1990); Raufamn, J. P. (1992) ; Goke, R. (1993b) ; Thorens, B. (1993)）。
【０００９】
本発明の主題は、エキセンジン−３−（１〜３）またはエキセンジン−４−（１〜30）のアミノ酸の置換からなる新規なトランケートエキセンジンフラグメントであり、ここでこれらの配列のＣ−末端は３アミノ酸まで、好ましくは最大１アミノ酸だけ短縮されることができ、そしてＮ−末端は２アミノ酸まで、好ましくは最大１アミノ酸だけ短縮されることができる。驚くべきことには、アミノ酸の置換は短縮されているが、これらのエキセンジンフラグメントは生物学的に活性である。短縮されたアミノ酸の置換は比較的より長い配列よりも、製造がいっそう経済的である。それゆえ、下記の配列を有するペプチドのフラグメント、特にエキセンジン−３−（１〜30）をベースとするペプチドのフラグメントは特に好ましい（配列番号：１）：エキセンジン−３をベースとする配列番号１：
【００１０】
【化１】
2006176532.tif 000002
【００１１】
エキセンジン−４をベースとする配列番号：２
【化２】
2006176532.tif 000003
【００１２】
ここで位置１，２，28，29または30におけるアミノ酸は、所望の鎖長に依存して配列の一部分であることができる。ペプチドはＮ−末端からＣ−末端までを通して番号を付されている。Ｘ１  はグリシン以外のプロテオジェニックまたは非プロテオジェニックのアミノ酸である。
１〜27の鎖長を有するエキセンジンおよびエキセンジン類似体は好ましく、特に１〜30の鎖長を有するものは好ましい。
【００１３】
Ｃ−末端のカルボキシル基COR3は遊離の形態（R3＝OH）で存在するか、あるいは生理学的に許容されるアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩の形態であることができる。また、カルボキシル基を第一級、第二級または第三級アルコール、例えば、メタノール、分枝鎖状もしくは直鎖状のＣ１  −Ｃ６  アルキルアルコール、特にエチルアルコールまたはｔ−ブタノールでエステル化することができる。しかしながら、カルボキシ基を、また、第一級または第二級アミン、例えば、アンモニア、分枝鎖状もしくは直鎖状のC1−C6 アルキルアミンまたはC1−C6 ジアルキルアミン、特にメチルアミンまたはジメチルアミンでアミド化することができる。
【００１４】
Ｎ−末端におけるアミノ酸のアミノ基NR1R2 は、遊離の形態（R1，R2＝H）で、あるいは生理学的に許容される塩、例えば、塩化物または酢酸塩の形態で存在することができる。また、アミノ基を酸でアセチル化することができるので、R1＝ＨかつR2＝アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチルであるか、あるいはペプチド化学の慣用のアミノ保護基、例えば、Fmoc, Z, Boc, Allocで保護することができるか、あるいはR1 および／またはR2＝C1−C6 アルキルまたはC2−C8 アルケニルまたはC7−C9 アラルキルであるようにＮ−アルキル化することができる。
【００１５】
アルキル残基は、直鎖状、分枝鎖状または必要に応じて環状のアルキル残基、好ましくはメチル、エチル、イソプロピルおよびシクロヘキシルとして理解される。
すべてのエキセンジンのフラグメントは、完全にまたは部分的に保護された誘導体として存在することができる。
本発明の他の主題は、下記の（ａ）〜（ｐ）に記載する修飾の少なくとも１つであるが、最大11が追加的に実施されている、前述の性質および配列の長さを有するエキセンジンのフラグメントである。下記の（ａ）〜（ｐ）に記載する修飾の最大９つを有するエキセンジンのフラグメントは好ましく、最大５つを有するものは特に好ましい。
【００１６】
（ａ）位置１におけるα−アミノ酸は、Ｄ−His, Ala, Ｄ−Ala, Gly, Lys またはＤ−Lys であり、それらのうちのAla, GlyまたはLys は特に好ましい；あるいは
（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸は、Ser ，Ｄ−Ser, Thr, Ｄ−Thr, Gly, Ala ，Ｄ−Ala, Ile, Ｄ−Ile, Val, Ｄ−Val, LeuまたはＤ−Leu 、好ましくはSer, Thr, Gly, Ala, Val, IleまたはLeuである；あるいは
（ｃ）位置３におけるアミノ酸は、Glu ，Ｄ−Glu, Asp, Ｄ−Asp, AlaまたはＤ−Ala 、好ましくはGlu, AspまたはAla である；あるいは
（ｄ）位置４におけるアミノ酸は、Ala ，Ｄ−Ala またはβ−Ala、好ましくはAla である；あるいは
【００１７】
（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸は、Ser, TyrまたはAla である；あるいは
（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸は、Ala, Ile, Val, Leu, ChaまたはTyr 、好ましくはAla, Ile, Val, LeuまたはTyr である；あるいは
（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸は、Ala ，Ｄ−Ala, Tyr, Ｄ−Tyr, Ser, Ｄ−Ser またはＤ−Tyr 、好ましくはAla, TyrまたはSer である；あるいは
（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸は、Ala, TyrまたはThr である；あるいは
（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸は、Ala ，Ｄ−Ala, Glu, Ｄ−Glu またはＤ−Asp 、好ましくはAla またはGlu である；あるいは
【００１８】
（ｊ）位置10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29におけるアミノ酸は、互いに独立して、プロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくはロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは
（ｌ）位置14におけるα−アミノ酸は、Ｌ−ロイシン以外の中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくはNle ，Ｄ−Nle, Ala, Ｄ−Ala, Ile, Ｄ−Ile, ValまたはＤ−Val により置換されており、ここでIle, ValまたはAla は特に好ましい；あるいは
（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸は、Ｄ−Phe, Tyr, Ｄ−Tyr, Leu, Ｄ−Leu, Val, Ｄ−Val ，Ｌ−Cha ，Ｄ−Cha ，β−１−Nal，β−２−Nal またはβ−１−Ｄ−Nal であり、ここでTyr, LeuまたはVal は好ましい；あるいは
【００１９】
（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸は、Leu ，Ｄ−Leu ，Ｄ−Ile, Val, Ｄ−Val ，Ｌ−Cha ，Ｄ−Cha, Tyr, Ｄ−Tyr, PheまたはＤ−Phe であり、それらのうちのLeu, Val, Tyr またはPhe は好ましい；あるいは
（ｏ）位置25, 26または27におけるα−アミノ酸は、中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくは中性の、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは
（ｐ）位置30におけるα−アミノ酸は、グリシン以外のプロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくはArg，Ｄ−Arg，TyrまたはＤ−Tyr，ArgまたはTyrは特に好ましい。
【００２０】
新規なエキセンジンのフラグメントの中で、既に述べた性質および配列の長さに加えて、位置10にアミノ酸ロイシンおよび／または位置19にアミノ酸バリン、位置14におけるメチオニンの代わりにアミノ酸イソロイシンまたはアラニンおよび位置30にアルギニンを含有するものは特に好ましい。また、位置10, 14, 19および30における前記特に好ましいアミノ酸に加えて、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸が位置２に存在する、エキセンジンのフラグメントの修飾は特に好ましい。
【００２１】
好ましいエキセンジン類似体は、位置３または14に、特に好ましくは位置２に位置基を有し、特に好ましくは、エキセンジン類似体はプロテイノジェニックのアミノ酸のみを含有する。
新しい短縮されかつ安定化されたエキセンジン−３およびエキセンジン−４の類似体に加えて、本発明は、また、これらの類似体を製造する方法に関し、この方法において、配列でカップリングされかつ類似体中のアミノ酸に相当し、そして天然のエキセンジンペプチドの中に天然に存在しない対応するアミノ酸で必要に応じて補充された、類似体の中に含有された保護されたアミノ酸から、固相合成において類似体を製造する。
【００２２】
エキセンジン−３またはエキセンジン−４の配列の位置におけるグリシンを、他のプロテオジェニックまたは非プロテオジェニックのアミノ酸で置換して、合成の間においてアミノ末端の保護基の切断後のジケトピペラジンの形成を回避する。
エキセンジン−（１〜30）の類似体およびフラグメントは、エキセンジン−１−（１〜30）に比較して有利である。なぜなら、これらの類似体のより短い配列はより高い収率でいっそう容易な合成を可能とするからである。
【００２３】
使用するアミノ酸の略号および定義は、Pure Appl. Chem. 31, 639-45 (1972)および前掲、40, 277-90 (1974) において推奨されているものであり、そしてPCT ルールに相当する（WIPO stndard st. 23 : Recommendation for the Presentation of Nucleotide andAmino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents)。１文字または３文字のコードは下記の通りである：
【００２４】
【表１】
2006176532.tif 000004
【００２５】
D−またはD,L−として特記しない限り、略号はＬ−アミノ酸を表す。D−アミノ酸は１文字コードにおいて小文字で書かれる。ある種の天然のアミノ酸ならびに非天然のアミノ酸はアキラルであり、例えば、グリシンである。表示において、すべてのペプチドのＮ−末端は左側であり、そしてＣ−末端は右側である。
【００２６】
非プロテイノジェニックのアミノ酸の例を、それらの略号と一緒に下に記載する：
【表２】
2006176532.tif 000005
【００２７】
アミノ酸は、それらの物理化学的性質に従い下記の３つの主要なクラスに分割することができる：
酸性：アミノ酸は水溶液中で生理学的pHにおいてプロトンを解放し、結局負の電荷を有する。
塩基性：アミノ酸は水溶液中で生理学的pHにおいてプロトンを受取り、結局正の電荷を有する。
中性：アミノ酸は非水溶液中で生理学的pHにおいて非帯電状態である。
【００２８】
定義
「正／負の電荷を有する」または「非帯電状態である」は、統計学的に平均して、あるクラスのアミノ酸の有意な数（少なくとも25％）が前記状態であるときにおいてのみ適用される。
タンパク質の中へのその組込みが遺伝暗号の情報によりコントロールされる20のいわゆるプロテイノジェニックのアミノ酸に加えて、非プロテイノジェニックアミノ酸は、また、記載する合成法によりペプチド配列の中に組込まれることができる。プロテイノジェニックのアミノ酸のリストおよび前述の３クラスへのそれらの分類を表１に記載する。非プロテイノジェニックのアミノ酸は遺伝的にコードされない。非プロテイノジェニックのアミノ酸の例および酸性、塩基性および中性のアミノ酸へのそれらの分類を表３に記載する。
【００２９】
【表３】
2006176532.tif 000006
【００３０】
本発明の主題であるエキセンジン類似体は、好都合な治療的性質を有する。それゆえ、それらは内分泌膵臓からのインスリン放出の刺激に導き、インスリンの生合成の増加に導き、そして末梢グルコース利用の増加に導く。血糖レベルが同時に増加するときにのみ、これらの作用は観測することができるので、低血糖症はそれらの投与後に起こることは期待されないであろう。さらに、エキセンジン類似体は内分泌膵臓からのグルカゴン放出を阻害し、糖新生の減少に導く。非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM) において、エキセンジン類似体は代謝の状況をかなり改善する。特に、筋肉および脂肪の組織の中に吸収されるグルコースは、インスリン分泌作用に対して独立して増加する。グルカゴン放出に対する阻害作用のために、また、インスリン依存性真性糖尿病においてエキセンジン類似体を投与することは適当である。
【００３１】
グルカゴン様ペプチド１(GLP−1）および既知のエキセンジン−３およびエキセンジン−４の配列に比較して、本発明によるエキセンジン類似体は、驚くべきことには、種々の試験系においてより高い効能を有するので、それらは GLP−１、エキセンジン−３またはエキセンジン−４よりも治療的応用のためにいっそう適する。新規なエキセンジン類似体の利点は、特に次の通りである：分解および代謝に対するより高い安定性、作用のより長い期間、より低い投与量における有効性。特に長い作用期間または特に低い投与量における有効性を示す、エキセンジン−３をベースとする類似体は特に好ましい。
【００３２】
固相および液相の合成はペプチドを合成する慣用の方法である。特定の生成物を合成する方法を粗製の生成物の純度および収率に関して最適化するために、方法のパラメーターおよび使用する物質、例えば、支持物質、基を反応させる試薬、反応すべきではない基をブロックする物質またはブロックする物質を切断する試薬を、合成すべき生成物、合成すべき中間体および出発物質に対して適合させることが必要である。方法の多数のパラメーターの相互依存性に関して、この適合は簡単ではない。
【００３３】
慣用の補助剤物質および添加剤に加えて、本発明によるペプチドを個々に含有するか、あるいは活性物質と一緒に含有する製剤は、好ましくは非経口的（皮下、筋肉内または静脈内）に投与される。しかしながら、すべての他の普通の投与形態、例えば、経口、直腸、経頬（舌下を包含する）、肺、経皮、イオン導入、経膣および鼻内の投与が考えられる。薬剤はインスリン調節作用を有し、これにより好都合な方法において血糖レベルの補償を促進する。20〜50pmol／ｌの血液レベルを達成するとき、薬剤を使用することは好都合である。このために、 0.4〜1.2 pmol／kg／分の注入速度が必要である。皮下または経頬投与の場合において、ガレヌス製剤の形態および意図する作用期間に依存する、５〜500 nmolの量の物質が必要である。
【００３４】
本発明によるエキセンジン類似体またはその薬学上許容される塩は、好ましくは、無菌の凍結乾燥物として貯蔵し、投与前に、適当な等張溶液と混合される。次いで類似体をこの形態において注射し、注入するか、あるいは必要に応じて粘膜を通して吸収させることもできる。注入溶液のための普通の添加剤、例えば、安定剤および可溶化剤を含有する、注射または注入に適当な慣用の等張水性系を溶媒として使用することができる。この場合において、生理食塩水または必要に応じて緩衝剤で等張とした溶液は好ましい。
【００３５】
添加剤は、例えば、酒石酸塩またはクエン酸塩の緩衝剤、エタノール、錯化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸またはその無毒の塩）、粘度調節用の高分子量ポリマー（例えば、液状ポリエチレンオキシド）である。注射溶液のための液体担体物質は無菌でなくてはならず、好ましくはアンプルの中に充填される。固体状担体物質は、例えば、澱粉、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、タルク、高分散ケイ酸、高分子量脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、動物または植物の脂肪、固体状高分子量ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）である。経口投与に適当な製剤は、必要に応じて、香味剤または甘味剤を含有することができる。鼻の投与のために、界面活性剤、例えば、コール酸、タウロコール酸、ケノデキシコール酸、グリコール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸およびシクロデキストリンを添加して、鼻の粘膜を通す吸収を改良することができる。
【００３６】
投与すべき１日量は 150〜500nmol の範囲である。生物学的活性の測定は、グルカゴン様ペプチド−１の慣用の試験方法において、グルカゴン様ペプチド−１、エキセンジン−３またはエキセンジン−４の国際基準製剤と比較した測定値に基づく。
本発明によるエキセンジン類似体は、例えば、下記の文献に記載されているペプチド合成における慣用法により製造することができる：固相合成について、J. M. Steward およびJ. D. Young “Solid Phase Peptide Synthesis ”、第２版、Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984)およびJ. Meienhofer Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2 Academic Press, New York (1973)、および液相合成について、E. Schroder およびK. Lubke“The Peptides”, Vol. 1, Academic Press, New York (1965) 。
【００３７】
ペプチド合成の一般的方法
一般に保護されたアミノ酸を、ペプチドの合成のために、生長するペプチド鎖に付加する。第１アミノ酸の側鎖中のアミノ基またはカルボキシル基ならびに反応性基を保護する。この保護されたアミノ酸を不活性支持体にカップリングするか、あるいはそれを溶液中で使用することもできる。ペプチド配列中の次のアミノ酸をアミド結合の形成に好適な条件下に適当に保護し、第１のアミノ酸に付加する。すべての所望のアミノ酸が正しい配列でカップリングされた後、保護基および必要に応じて支持相を切断する。得られる粗製のポリペプチドを再沈降させ、好ましくはクロマトグラフィーにより精製して最終生成物を形成する。
【００３８】
40より少ないアミノ酸を有する生理学的に活性なポリペプチドの類似体を合成する好ましい方法は、固相ペプチド合成からなる。この方法において、α−アミノ官能（Ｎ  ）および反応性側鎖を酸不安定性基または塩基不安定性基で保護する。使用する保護基はアミド結合を結合するの条件下に安定であるべきであるが、形成したポリペプチド鎖を損傷しないで、保護基を容易に切断可能であるべきである。α−アミノ官能に適当な保護基は下記の基を包含するが、これらに限定されない：ｔ−ブトキシカルボニル(Boc) 、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル（Amoc）、α，α−ジメチル−3,5−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シクロ−ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、１−（4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル(Dde) およびその他。Ｎ−保護基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc) を使用することが好ましい。
【００３９】
適当な側鎖の保護基は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アセチル、アリル(All) 、アリルオキシカルボニル(Alloc) 、ベンジル(Bzl) 、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル(Boc) 、ベンジルオキシメチル(Bom) 、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル(tBu) 、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（2−CIZ)、2,6−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル(Dde) 、イソプロピル、４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンジルスルホニル(Mtr) 、2,3,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル(Pmc) 、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル(Tos)、2,4,6−トリメトキシベンジル、トリメチルシリルおよびトリチル(Trt)。
【００４０】
固相合成において、Ｃ−末端のアミノ酸を第１として適当な支持物質にカップリングする。適当な支持物質は、試薬および段階的縮合および切断反応のための条件に対して不活性でありかつ使用する除去媒質中に溶解しない物質である。商業的に入手可能支持物質の例は下記のものを包含する：反応性基で変性されたスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーおよび／またはポリエチレングリコールおよび、また、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー、ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーおよびその他。
【００４１】
４−ベンジルオキシベンジルアルコール（Wang−アンカー（Wang, S. S. 1973））または２−クロロトリチルクロライド（Barlos, K. et al., 1989)で誘導化された、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼンまたはTentagel R (Rapp Polymere, Tubinge)は、ペプチド酸を製造しようとする場合、好ましい。ペプチドアミドの場合において、５−（４’−アミノメチル）−3',5'−ジメトキシフェノキシ）バレリン酸(PAL−アンカー）（Albericio, F. et a., 1987)またはｐ−（2,4−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Rink-Amidアンカー（Rink, H. 1987)）は好ましい。
【００４２】
ポリマーの支持体への結合は、Ｃ−末端のFmoc保護アミノ酸を支持物質と、活性化試薬を添加して、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF) 、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはDMF 中の同様な溶媒中で、室温または高温、例えば、40℃〜60℃、好ましくは室温において、２〜72時間、好ましくは約２×２時間の反応時間の間、反応させることによって達成することができる。
【００４３】
PAL, Wang またはRinkアンカーへのＮ  保護されたアミノ酸、好ましくはFmocアミノ酸のカップリングは、カップリング試薬、例えば、N,N'−ジシクロヘキシルカーボジイミド(DCC)、N,N'−ジシクロヘキシルカーボジイミド(DIC) または他のカーボジイミド、２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（TBTU）または他のウロニウム塩、ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩(PyBOP) または他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミドまたはオキシムの助けにより、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在において、また、非存在において、実施することができ、好ましくはTBTUの助けによりHOBTを添加して、塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリエチルアミンまたはＮ−メチルピロリドン、好ましくはジイソプロピルエチルアミンを添加するか、あるいは添加しないで、２〜72時間、好ましくは３時間の反応時間において、1.5〜３倍過剰のアミノ酸およびカップリング試薬を使用して、好ましくは２倍過剰において、約10℃〜50℃の温度において、溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジクロロメタン、好ましくはジメチルホルムアミド中で実施することができる。カップリング試薬の代わりに、また、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルまたはその他）、Ｎ−Fmoc−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物を前述の条件下に使用することができる。
【００４４】
Ｎ−保護アミノ酸、好ましくはFmocアミノ酸を好ましくは２−クロロトリチル樹脂に、ジクロロメタン中でDIEAを添加して10〜120 分、好ましくは20分の反応時間において、カップリングさせるが、この溶媒およびこの塩基に限定されない。
【００４５】
保護されたアミノ酸の連続的カップリングは、ペプチド合成において慣用の方法に従い、典型的には自動化ペプチド合成装置において、実施することができる。固相上のカップリングされたアミノ酸のＮ  −Fmoc保護基をピペリジン（10％〜50％）でジメチルホルムアミド中で５〜20分間処理して、好ましくは２×２分間20％のピペリジンでDMF 中で処理して切断した後、３〜10倍過剰、好ましくは10倍過剰の次の保護されたアミノ酸を前のアミノ酸に、不活性、非水性、極性溶媒、例えば、ジクロロメタン、DMF または２つの混合物、好ましくはDMF 中で、約10℃〜50℃の温度、好ましくは25℃において、カップリングさせる。PAL, Wang またはRinkアンカーへの第１Ｎ−Fmocアミノ酸のカップリングについて既に述べた試薬は、カップリング試薬として適当である。代替物として、保護されたアミノ酸の活性エステル、またはその塩化物またはフッ化物または対称無水物を使用することもできる。
【００４６】
固相合成の終わりにおいて、ペプチドを支持物質から切断すると同時に側鎖の保護基を切断する。切断は、トリフルオロ酢酸または他の強く酸性の媒質を使用して、５％〜20％ｖ／ｖの掃去剤、例えば、ジメチルサルファイド、エチルメチルサルファイド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオ、フェノールまたは水を添加して、好ましくは15％ｖ／ｖのジメチルサルファイド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール1:1:1を添加して、 0.5〜３時間、好ましくは２時間の間、実施することができる。
【００４７】
２−クロロトリチルアンカーを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン2:2:6で切断することによって、完全に保護された側鎖をもつペプチドが得られる。保護されたペプチドをシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製することができる。ペプチドをWangアンカーを介して固相に結合する場合かつＣ−末端がアルキルアミド化されたペプチドを製造しようとする場合、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを使用するアミノリシスにより、切断を実施することができる。アミノリシスは、−10℃〜50℃、好ましくは約25℃の温度において、約12〜24時間、好ましくは約18時間の反応時間において実施される。さらに、ペプチドを支持体から、例えば、メタノールを使用して、再エステル化により、切断することもできる。
【００４８】
得られた酸性溶液を３〜20倍の量のエーテルまたはｎ−ヘキサン、好ましくは10倍過剰のジエチルエーテルと混合して、ペプチドを沈澱させ、それゆえ、エーテル中に残留する掃去剤および切断された保護基を分離する。氷酢酸からペプチドを数回再沈澱させることによって、それ以上の精製を実施することができる。得られる沈澱を水またはｔ−ブタノールまたは２つの溶媒の混合物、好ましくはｔ−ブタノール／水の１：１混合物の中に取り、そして凍結乾燥する。
【００４９】
得られたペプチドを下記のクロマトグラフィー法のあるものまたはすべてにより精製することができる：酢酸塩の形態の弱く塩基性の樹脂のイオン交換クロマトグラフィー；非誘導化ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーの疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、 AmberliteＲ  XAD)；シリカゲルの吸着クロマトグラフィー；例えば、カルボキシメチルセルロースの、イオン交換クロマトグラフィー；例えば、SehpadexＲ  Ｇ−25の、分配クロマトグラフィー；向流分配クロマトグラフィー；または高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、特にオクチルまたはオクタデシルシリルシリカ(ODS)  相の逆相HPLC。
【００５０】
要約すると、本発明の一部分は、ポリペプチドの製造およびそれらの製剤学的に有用な塩を包含する。これらの方法は、前述の好ましい鎖長および修飾を有するエキセンジン−３またはエキセンジン−４の生理学的に活性な短縮された相同体および類似体に導き、適当な支持物質上に保護されたアミノ酸の順次の縮合の方法、支持体および保護基を切断する方法および得られた粗製のペプチドを精製する方法を包含する。
【００５１】
アプライド・バイオシステムス・カンパニー（Applied Biosystems Company) (Weiterstadt) からのアミノ酸分析装置 420Ａを使用して、アミノ酸分析を実施した。50〜1000pmolの分析すべき試料を10〜40μｌの溶液中で試料の担体に適用し、引き続いて気相中で 160℃において90分間６Ｎ塩酸で完全に自動的に加水分解し、フェニルイソチオシアネートで誘導化し、微小孔HPLCによりオンラインで分析した。API III 三重−四重質量分析計（SCIEX ; Thornhill, Canada)（イオンスプレーのイオン源を装備する）で、質量スペクトル分析検査を実施した。
保護されたアミノ酸の誘導体は、例えば、ノババイオケム社（Novabiochem GmbH) (Bad Soden) から入手可能である。
【実施例】
【００５２】
下記の実施例は本発明の例示的選択のみを表すが、本発明の主題を限定するものと解釈すべきではない。
実施例１. HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2（配列番号：3 ）
［Nle14,Arg30］−エキセンジン−4−(1-30)−NH2
実施例１を、Multisyn Tech Company （Bochum）から販売されている多重自動ペプチド合成機SyRo IIでの、5−（4'−アミノメチル）−3',5'−（ジメトキシフェノキシ）バレリアニル−アラニル−アミノメチル−ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン（装填率：0.5 mmol/g）に関する固相法により0.02 mmolバッチで合成した。アミノ酸のα−アミノ官能基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）で保護した。
【００５３】
側鎖保護基は、Asp、Glu、Ser及びThrに関してはｔ−ブチル（tBu）、Asn、Gln及びHisに関してはトリチル（Trt）、Lys及びTrpに関してはｔ−ブチルオキシ−カルボニル（Boc）並びにArgに関しては2,2,5,7,8−ペンタ−メチルクロマン−６−スルホニル（Pmc）であった。保護化アミノ酸を、40分の継続時間を２回の二重カップリングを用いて10倍以上に、そして活性化試薬としてN,N−ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾールを用いて、継続的に結合させた。
【００５４】
15％エタンジチオール／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾール（1:1:1 v/v/v）の存在下で、室温で１２０分間、トリフルオロ酢酸（85％）中の保護基を同時に切断しながら、ペプチドを高分子支持体から切断した。次に、ペプチドを無水ジエチルエーテルで沈殿させた後、無水ジエチルエーテルで数回洗浄して、チオールを完全に除去した。水／tert−ブタノル（1:1）から沈殿物を凍結乾燥して、６２ｍｇの粗製ペプチドを得た。37％〜42％アセトニトリル／0.9％TFAの勾配を用いて逆相HPLCにより、粗製ペプチドを30分以内に精製した。溶出液を蒸発させ、凍結乾燥して、≧97％の純度の白色固体を収量29g で得た。
【００５５】
アミノ酸分析：Ala 1.08（１）；Asx 1.91（２）；Glx 6.10（６）；Phe 1.78（２）；Gly 3.10（３）；His 1.00（１）；Ile 0.88（１）；Lys 2.02（２）；Leu 3.24（３）；Nle 1.10（１）；Arg 1.98（２）；Ser 2.04（２）；Thr 1.99（２）；Val 0.91（１）；Trp 0.87（１）．ESI−MS：3488,2。
【００５６】
実施例２. HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH2（配列番号：4 ）
[Nle14,Tyr30]−エキセンジン−4−(1-30)NH2
実施例２を、Multisyn Tech Company （Bochum）から販売されている多重自動ペプチド合成機SyRo IIでの、Rink−アミドアンカー（４−（2',4'−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基）で誘導されたTentaGel（Rapp Polymers, Tubingen ）（装填率：0.18 mmol/g）に関する固相法により0.0076 mmolバッチで合成した。使用した保護化アミノ酸は、実施例１と同様であった。保護化アミノ酸を、40℃で40分の継続時間の単一カップリングで８倍以上に、攪拌しながら、継続的に結合させた。２−（1H−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを活性化試薬として用い、ジイソプロピルエチルアミンを付加した。ペプチドを切断し、実施例１と同様に精製した。＞95％の純度の白色固体18.1g を得た。
【００５７】
アミノ酸分析：Ala 1.03（１）；Asx 1.90（２）；Glx 6.24（６）；Phe 1.94（２）；Gly 3.12（３）；His 1.02（１）；Ile 1.09（１）；Lys 2.01（２）；Leu 3.06（３）；Nle 1.08（１）；Arg 0.97（１）；Ser 1.98（２）；Thr 1.80（２）；Val 0.93（１）；Trp 1.01（１）；Tyr 0.90（１）．  ESI−MS：3494,8。
【００５８】
実施例３. HSDGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2（配列番号：5 ）
[Nle14,Arg30]−エキセンジン−3−(1-30)−NH2
実施例３を、実施例２に関して記載した方法と同様に合成した。
≧99％の純度の白色固体17.6 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 0.99（１）；Asx 2.98（３）；Glx 5.16（５）；Phe 2.08（２）；Gly 2.16（２）；His 0.95（１）；Ile 1.03（１）；Lys 2.04（２）；Leu 2.91（３）；Nle 1.05（１）；Arg 1.04（１）；Ser 3.00（３）；Thr 2.05（２）；Val 1.01（１）；Trp 1.18（１）；Tyr 0.98（１）．  ESI−MS：3504,4。
【００５９】
実施例４. HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH2（配列番号：6 ）
［Arg３０］−エキセンジン−4−(1-30)−NH2
実施例４を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。
≧96％の純度の白色固体17.9 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 0.96（１）；Asx 2.01（２）；Glx 6.00（６）；Phe 1.80（２）；Gly 3.21（３）；His 0.96（１）；Ile 1.07（１）；Lys 1.92（２）；Leu 2.98（３）；Met 1.06（１）；Arg 1.90（２）；Ser 1.91（２）；Thr 2.09（２）；Val 0.97（１）；Trp 0.84（１）．  ESI−MS：3508,4
【００６０】
実施例５. GEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2  （配列番号：7 ）
［Nle14,Arg30]−エキセンジン−4−(2-30)−NH2
実施例５を、実施例２に関して記載した方法と同様に合成した。
≧97％の純度の白色固体13.2 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 1.04（１）；Asx 1.98（２）；Glx 6.08（６）；Phe 1.86（２）；Gly 2.91（３）；Ile 0.96（１）；Lys 1.84（２）；Leu 2.98（３）；Nle 1.04（１）；Arg 1.90（２）；Ser 1.94（３）；Thr 1.92（２）；Val 0.96（１）；Trp 0.85（１）．  ESI−MS：3350,8
【００６１】
実施例６. HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH2（配列番号：8 ）
［Ala21,Arg30]−エキセンジン−4−(1-30)−NH2
実施例６を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。
≧95％の純度の白色固体11.1 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 2.08（２）；Asx 1.93（２）；Glx 6.07（６）；Phe 1.74（２）；Gly 2.97（３）；His 0.98（１）；Ile 0.87（１）；Lys 2.15（２）；Leu 2.02（２）；Met 0.96（１）；Arg 2.13（２）；Ser 1.87（２）；Thr 2.07（２）；Val 1.04（１）；Trp 0.87（１）．  ESI−MS：3466,3
【００６２】
実施例７. HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH2（配列番号：9 ）
［Ala28,Arg30]−エキセンジン−4−(1-30)−NH2
実施例７を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。
≧97％の純度の白色固体15.0 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 1.98（２）；Asx 0.98（１）；Glx 6.22（６）；Phe 1.92（２）；Gly 3.03（３）；His 0.99（１）；Ile 1.03（１）；Lys 2.05（２）；Leu 3.03（３）；Met 0.96（１）；Arg 1.84（２）；Ser 1.98（２）；Thr 2.09（２）；Val 1.01（１）；Trp 0.72（１）．  ESI−MS：3465,4
【００６３】
実施例８. HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH2（配列番号：10）
［Ala21,28,Arg30］−エキセンジン−4−(1-30)−NH2
実施例８を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。
≧95％の純度の白色固体18.4 mgを得た。
アミノ酸分析：Ala 3.12（３）；Asx 0.99（１）；Glx 6.04（６）；Phe 1.80（２）；Gly 3.00（３）；His 0.96（１）；Ile 1.02（１）；Lys 1.84（２）；Leu 1.97（２）；Met 0.98（１）；Arg 2.03（２）；Ser 1.91（２）；Thr 1.88（２）；Val 0.99（１）；Trp 0.99（１）．  ESI−MS：3423,3
【００６４】
実施例９.
同様の方法で、以下のエキセンジン誘導体を高純度で調製することができた（Ex−4＝エキセンジン−４、Ex−3＝エキセンジン−３）。
【００６５】
【化３】
2006176532.tif 000007
【００６６】
【化４】
2006176532.tif 000008
【００６７】
【化５】
2006176532.tif 000009
【００６８】
【化６】
2006176532.tif 000010
【００６９】
【化７】
2006176532.tif 000011
【００７０】
【化８】
2006176532.tif 000012
【００７１】
【化９】
2006176532.tif 000013
【００７２】
以下の実施例を、アミノメチルポリスチレン（１％）ジビニルベンゼンがRink−アミドアンカー（４−(2',4'−ジメトキシフェニル−アミノメチル)−フェノキシ基）により誘導されるＲＡＭ樹脂（Rapp Polymers, Tubingen ）に関する固相法により0.02 mmolバッチで合成した（装填率：0.5 mmol/g）。使用した保護化アミノ酸は、実施例１と同様であった。保護化アミノ酸を、攪拌しながら、40℃で40分の継続時間の単一カップリングで５倍以上に、継続的に結合させた。ジイソプロピルエチルアミンを付加した２−(1H−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）を活性化試薬として用いた。ペプチドの切断及び精製を、実施例１と同様に実行した。前記のようにして合成されたペプチドの収量、純度及び分析データを、以下の表４〜表８に列挙する。
【００７３】
【表４】
2006176532.tif 000014
【００７４】
【表５】
2006176532.tif 000015
【００７５】
【表６】
2006176532.tif 000016
【００７６】
【表７】
2006176532.tif 000017
【００７７】
【表８】
2006176532.tif 000018
【００７８】
実施例10. 薬理学的データ
エクトペプチダーゼ製剤又は腎臓微小絨毛膜標本におけるペプチド代謝
背  景
エクトペプチダーゼの１群は、ペプチドホルモンの分泌後代謝に関与する。これらの酵素は、種々の種類の細胞の原形質膜と結合する。それらの活性部位は、細胞外間隙に向けて配向される。さらに、これらの酵素は近位腎細管の刷子縁膜中に高濃度で存在する。したがって、腎刷子縁微小絨毛膜（BBM）は関連するエクトペプチダーゼの適切な供給源であり、合成ペプチドの代謝安定性に関するin vitro試験として用い得る。あるいは、エクトペプチダーゼ製剤を用いることもできる。ヒト中性エンドペプチダーゼ24.11、並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶは、GLP−１がこれらの両エクトペプチダーゼの基質であるために、例として用いられた。
【００７９】
刷子縁微小絨毛膜の調製
ラット及びブタ腎臓皮質の微小絨毛膜を、示差的遠心分離法を用いた非細胞分別により単離した（Booth and Kenny（1975))。膜の純度の程度及び収量を査定するために、４つの刷子縁エクトペプチダーゼを蛍光定量的に検査し、その他のマーカーは比色定量的に測定した。
【００８０】
エクトペプチダーゼ製剤
精製ヒト中性エンドペプチダーゼ２４．１１はGenentech （SanFrancisco, USA）から組換え体形態で入手し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶはCalbiochem（Bad Soden ）からヒト胎盤からの単離物として入手した。
【００８１】
インキュベーションプロトコール
微小絨毛膜（0.5〜1μgタンパク質）又はそれぞれのエクトペプチダーゼ製剤（60〜300 ng）を、50 mM NaClを含有するHEPES緩衝液（50 mM、pH 7.4）100 μl中の10 μgのペプチド（約3 nmol）とともにインキュベートした。沸騰により、予定時間（１時間まで）で反応を終結させた。その後、試料を遠心分離（10,000 x g）し、0.1％TFA 150μlで希釈して、逆相（RP）HPLCにより分析した。
各試料を二重に測定した。
【００８２】
HPLC分析
下記の成分を有する系をＨＰＬＣ分析に用いた：A2248低圧ポンプ（Pharmacia-LKB, Freiburg ）；WISP 10B自動注入器（Gynkotec, Berlin）；低圧混合系（Pharmacia-LKB, Freiburg）；及びプログラムマネジャーソフトウエアコントロールPharmacia-LKB, Freiburg ）。移動溶媒Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）及びＢ：アセトニトリル：水：TFA（70：29：0.1）を用いた二成分勾配によりLichrospher C-8，5μ,4ｘ124 mm（Merck, Darmstadt）上で分離を実行した。移動溶媒Ａで平衡させたカラム上に試料溶液244 μlを注入後、インキュベーション生成物を80分で０％〜80％Ｂの線状勾配で溶離し、215 nm UV吸収で検出した。
【００８３】
タンパク質分解速度の計算
各ペプチドのインキュベーション中に２つの測定を実行し、基質ピークの平均ピーク高を時間に対してプロットした。例としてGLP−1を用いて、ピーク高が試料溶液中のペプチドの量と線状に比例することを示すことができた。さらに、時間に伴うピーク高の線状低減が、微小絨毛膜又はペプチダーゼとのインキュベーションの１時間以内に観察された。それゆえ、タンパク質分解速度は基質ピークの高さの低減から確定され、［基質μmol／タンパク質mg／分］と表される。
【００８４】
エキセンジン類似体の分解安定性
ヒト中性エンドペプチダーゼ24.11bとのインキュベーション
［Nle14,Arg30]−エキセンジン−4−(1−30)−NH2（配列番号：３）を前記のように中性エンドペプチダーゼ２４．１１と一緒にインキュベートし、分解速度を確定した。GLP−1−(7−36)NH2 は対照として役立った。結果を表９に示す。
【００８５】
【表９】
2006176532.tif 000019
【００８６】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶとのインキュベーション
表10に列挙したペプチドを、前記のようにジペプチジルペプチダーゼ（DDP−ＩＶ）と一緒にインキュベートした。GLP−1−(7−36)−NH2が50％加水分解を示した時点で各インキュベーションを終結させた。基質ピークの各ペプチドをrpHPLC行程から収集し、切形生成物を除外するために、質量分光により検査した。
【００８７】
【表１０】
2006176532.tif 000020
【００８８】
刷子縁微小絨毛膜とのインキュベーション
前記のプロトコールにより刷子縁微小絨毛膜（BBM）とのインキュベーション後に算出されたタンパク質分解速度を、表11に示す。GLP−1−(7−36)NH2は対照として役立った。
【００８９】
【表１１】
2006176532.tif 000021
【００９０】
単離島細胞によるインスリン分泌器官除去
麻酔（0.3〜0.5 mlネンブタール／等張食塩溶液１：４腹腔内投与）マウスの腹部を正中切開及び二側切開により開存し、腹膜を固定して、横隔膜に沿って肋骨弓で切り開いた。全器官を膨張させ、左心室に中性赤を注入して赤色に染色した。膵臓を、胃及び十二指腸に沿って腸間膜まで、注意深く除去した。消化まで、ハンクス平衡塩溶液（HBBS）及び２〜３滴の中性赤を入れた氷冷ペトリ皿中に膵臓を置いた。
【００９１】
島標本
２個の膵臓にセルロースを張り付け、試験管に入れて、新たに調製したコラゲナーゼ溶液（HBBS/水 1:9，pH 7.4中にコラゲナーゼ（Cl，組織溶解）0.74 U/mg、Serva 2mg/ml）5 mlを付加して、それらを振盪しながら37℃で18分間インキュベートした。その後、1000 rpmで１分間、遠心分離を実行した。上清を捨てた。二次消化工程で、コラゲナーゼ溶液（1mg/ml）5mlを４分間インキュベートし、振盪して、未消化組織を沈殿させた。上清をデカントし、全工程を４〜５回反復した。
【００９２】
次に上清を1000 rpmで１分間遠心分離し、コラゲナーゼ溶液を捨てた。残留ペレットを氷冷HBBSと一緒に振盪し、氷上で約10分間沈殿させた。この洗浄工程をさらに３回反復した。立体拡大鏡下で薄桃色に染色された島を洗浄ペレットから抜き取り、培地（100 mlのRPMI 1640（Gibco ）、1 mlのグルタミン、1 mlのペニシリン、1 mlのCibrobay抗生物質（Bayer ）、10 mlのウシ胎仔血清、2 mlのHepes緩衝液１M）に移した。純粋に近い培養を得るために、島を２〜３回抜き取って、新鮮な培地に移した。
【００９３】
島の刺激
培地からの島細胞を、エッペンドルフ容器当たり島10個の量で200 mlの刺激緩衝液（118 mM NaCl、0.2 mM NaH2PO4、0.565 mM MgCl2、1.25 mM CaCl2、4.7 mM KCl、10 mM Hepes、１％BSA、3.3 mM グルコース；pH 7.4）を含入するエッペンドルフ容器中に分配し、37℃で１時間、インキュベーターに入れた。その後、試験すべきペプチドを付加し、刺激緩衝液を500 mlまで満たし、37℃で１時間インキュベートした。島を1000 rpmで１分間遠心分離した。Ｃ−ペプチドの量を、インスリン−RIA（DPC Biermann, Nauheim ）を用いて上清中で測定した。各試験物質を四重に確定した。
【００９４】
エキセンジン類似体の活性
いくつかのエキセンジン類似体を、インスリン分泌活性に関して単離された島細胞で、上記のように試験した。データを一連として下記の表に示す。
10 mMグルコース存在下での１時間後の単離島からのインスリン放出（mIU/時間/10島）
【００９５】
【表１２】
2006176532.tif 000022
【００９６】
内分泌膵臓のＢ細胞（クローンＢ細胞株INS−1）中の細胞質ゾルカルシウム濃度の増大の測定
INS−１細胞の培養（Asfari, M., 1992）：
95%空気及び5%CO2の大気中で、10％FCS、10 mM HEPES緩衝液（pH 7.4）、２mM Ｌ−グルタミン、100 IU ペニシリン/ml、100μg ストレプトマイシン/ml、１mM ピルビン酸塩（ナトリウム塩）及び50 μM ２−メルカプトエタノールを含有するRPMI 1640培地中で、37℃で、INS−１細胞を培養した。プラスチック細胞培養プレート上で６〜８日間増殖させた後、PBS（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄して、等張食塩溶液中の0.025％トリプシン及び0.27 mM EDTAと一緒に37℃で４分間インキュベートすることにより、亜融合性細胞を底から剥がした。
【００９７】
カルシウム測定のための細胞の調製：
剥離細胞を、Spinner 培地（前期と同様であるが、５％FCS及び25 mM HEPESを含有する培地）中に再懸濁し、攪拌棒で攪拌しながらSpinner 瓶中で2.5時間インキュベートした。その後、遠心分離により培地を除去し、細胞をSpinner 培地中に再懸濁した。次にそれらを、前記と同様の条件下で２μM Fura−２/アセトキシメチルエステルと一緒に37℃で30分間インキュベートした。細胞のFura負荷は、細胞をSpinner 培地で１回洗浄する（室温で）ことにより終結させた。その後、細胞を室温で、Spinner培地中に再懸濁した（2ｘ107 細胞/ml)。次に、カルシウム測定のために、細胞をこの懸濁液から取り出した。
【００９８】
細胞質ゾルカルシウム濃度の測定：
136 mM NaCl、4.8 mM KCl、2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3、10 mMグルコース、250μM スルフィンピラゾン（培地中へのFura−2流出を阻止するために）及び25 mM HEPES緩衝液（NaOHでpH 7.4に調整）を含有する変法クレブス−リンガー緩衝液（KRBH）中で、37℃で測定を実行した。細胞濃度は１〜２ｘ106/mlであった。1.5 mlの細胞懸濁液を用いて、37℃で分光蛍光計で、攪拌棒で攪拌しながらキュベット中で、測定を実行した。励起波長は340 nm、発光波長は505 nmであった。
【００９９】
細胞外Furaの蛍光を一時的に抑制することにより、測定された蛍光に対する細胞外蛍光指示体の割合を確定するために、測定終了時に、50 μM MnCl2を付加し、その後100 μm DTPA（ジエチレントリアミンペンタアセテート）を付加した。DTPA付加後、全Furaを先ずカルシウム飽和状態に、次にカルシウム無含有状態に転換して、それぞれの測定値に関する較正値Ｆmax （カルシウム飽和）及びＦmin（カルシウム無含有）を確定した。このために、0.1％TritonX−100を付加して細胞を溶解した。高濃度の細胞外カルシウムと接触させることにより、染料をカルシウムで飽和させた。その後、染料をカルシウム無含有形態に完全に転換するために、5 mM EGTA（エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−テトラアセテート）及び20 mM Tris溶液を付加した。
【０１００】
Tsien と同僚（Grynkiewicz, G., 1985 ）により紹介された算法にしたがって、細胞質ゾルカルシウムイオン濃度を算出した：
［Ca2+]cyt ＝((Ｆ−Ｆmin)／(Ｆmax−Ｆ))×KD
（式中、Ｆ：それぞれの測定点の蛍光；KD：Fura，250 nMのカルシウム錯体の解離定数(Grynkiewicz, G., 1985)）。
【０１０１】
（この計算の前に、細胞外Furaの存在に関して補償を実行する。このために、マンガン付加により確定される蛍光量（細胞外Fura）を先ず測定点の蛍光値から差し引く。次に、この量を差し引くことによりＦmax を修正する。最後に、Ｆmin に関する修正値を確定する。このために、マンガン付加により確定される蛍光量を2.24で割る。2.24という値は、励起波長340 nm（非エステル化、Fura無含有で測定）でのカルシウム飽和及びカルシウム無含有Ｆｕｒａの蛍光の間の固有の計器比例因子として確定された。この方法で得られた修正値をＦmin から差し引いた。
検査したペプチドは、CaCl2及びグルコースを含有しないKRBH中の1000倍濃縮溶液(10-5M）として付加された。
【０１０２】
エキセンジン類似体の活性
その生物学的活性に関して、前記のようなINS−1細胞におけるカルシウム検定で、いくつかのエキセンジン類似体を試験した。データは、一例として図１並びに表13に示す。
【０１０３】
【表１３】
2006176532.tif 000023
【０１０４】
内分泌膵臓のＢ細胞（クローンＢ細胞株INS-1）におけるGLP-1-(7−36)−NH2との競合
INS−1−細胞の培養（Asfari, M., 1992）
カルシウム濃度の測定参照。
競合実験
剥離細胞を取り出し、クレブス−リンガー緩衝液（25 mM Tris、120 mM NaCl、1.2 mM MgSO4、5 mM KCl、1 mM Na−EDTA、15 mM CH3COONa、pH 7.4に調整し、１％HSA及び0.1％バシトラシンを補充）中に懸濁した。反応混合物様にこの懸濁液から各時点で250 mlを取り出して、20 mlのトレーサー（125I−GLP−1−(7−36)−NH2、20,000 cpm）及び30 mlの検査すべきペプチドと対応する希釈液中で混ぜ合わせた。その後、37℃で30分間インキュベートし、13,000 rpmで４分間遠心分離し、緩衝液で３回洗浄して、ペレットと結合した放射能を測定した（γ−計数器）。試験すべきペプチドの10種類の異なる希釈液（クレブス−リンガー緩衝液中10-10〜10-6M）と一緒にインキュベートすることにより、競合曲線を観察した。
【０１０５】
エキセンジン類似体の受容体親和性
データを一例として表14に示す。GLP−1−(7−36)−NH2は標準として役立った。
【表１４】
2006176532.tif 000024
【０１０６】
参考文献
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