(57)【要約】【課題】微生物を検出する方法、及びその計測において、微生物を正確に検出できる微生物検出方法と微生物計測装置を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光染色を必要としない顕微鏡観察手段１で観察した箇所と同じ箇所を観察できる機構をもつ原子間力顕微鏡観察手段２を用いて微生物の外形や表面形状を詳細に観察できるようにしたことで、微生物を迅速に、より正確に検出することができる微生物検出方法と、検出した微生物を微生物計測手段にて計測し、検体中の微生物の個数を正確に把握することができる微生物計測装置が得られる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡観察手段と、原子間力顕微鏡観察手段と、前記顕微鏡観察手段で観察した位置と同じ位置を前記原子間力顕微鏡観察手段にて観察できる構造を備え、前記顕微鏡観察手段及び、前記原子間力顕微鏡観察手段より得られる情報により、微生物を検出する微生物検出方法。
【請求項２】
蛍光観察手段と、前記顕微鏡観察手段で拡大観察した観察点と同じ位置を蛍光観察ができる構造をもつ蛍光観察手段と、前記顕微鏡観察手段で観察した観察点と前期蛍光観察手段で観察した観察点と同じ場所を観察できる前記原子間力顕微鏡観察手段を備え、前記顕微鏡観察手段より得られる観察点の情報と前記蛍光観察手段より得られる蛍光発光情報と前記原子間力顕微鏡観察手段より得られる情報により微生物を検出する請求項１の微生物検出方法。
【請求項３】
前記顕微鏡観察手段および前記蛍光観察手段で観察される観察点から発する光波長のスペクトル分析する光波長分析手段を備え、前記顕微鏡観察手段から得られる情報と、前記蛍光観察手段から得られる蛍光発光情報と、前記原子間力顕微鏡観察手段から得られる情報および前記光波長スペクトル分析手段より得られる光波長分析情報により、微生物を検出する請求項1または２記載の微生物検出方法。
【請求項４】
光波長分析手段の分析箇所を複数箇所とした光波長複数箇所分析手段を備えた、請求項1乃至３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
観察した箇所を撮影し画像データを取得する撮影手段を備えた、請求項1乃至４のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項６】
前記原子間力顕微鏡観察手段を外形及び表面形状を拡大観察する形状拡大観察手段を備えた請求項１乃至５いずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項７】
前記顕微鏡観察手段、前記蛍光観察手段、前記光波長分析手段、前記原子間力顕微鏡観察手段により観察された画像を特定画像と照合する画像認識手段を備えた、請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項８】
検体の硬さを計測する硬さ計測手段を備えた請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項９】
前記検体の電荷の有無もしくは、強さを検出する電荷計測手段を備えた請求項１乃至８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１０】
前記蛍光染色試薬を生きた微生物を染色する試薬とした請求項２乃至８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１１】
前記蛍光染色試薬を死んだ微生物を染色する試薬とした請求項２乃至８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１２】
前記蛍光染色試薬を全微生物を染色する試薬とした請求項２乃至８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１３】
微分干渉観察手段を備えた請求項１乃至１２のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１４】
前記請求項1乃至１３のいずれかに記載の微生物検出方法にて検出した微生物を計測する微生物計測手段を備えた微生物計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を検出し、微生物の個数を計測する微生物検出方法と、微生物計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の微生物検出方法、微生物検出装置としては、特許文献１に示されたものが知られている。
【０００３】
以下、この種の微生物検出方法、微生物検出装置について図８を参照しながら説明する。
【０００４】
微生物検出方法としては、様々な環境から採種した特定微生物を蛍光染色したサンプル１０２から得られる蛍光発光により検出する方法が記載され、微生物検出装置としては、蛍光検出手段１０１、解析装置１０３を備えたものが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−１４４１９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来の微生物検出方法では、微生物を検出するために蛍光染色しなければならす染色という作業が発生し、時間がかかるという課題と、染色した場合には、自家蛍光発光する異物、非特異的に蛍光試薬に染色される異物が混入していた場合、正確に微生物を検出、計測することができないという課題があり、微生物の検出の速度、精度及び計測精度を向上させることが要求されている。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、蛍光染色をせずに微生物が検出できる方法と、異物混入時、微生物をより早く、正確に検出する方法および、検出した結果をより正確に計測する装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の微生物検出方法は、上記目的を達成するために  顕微鏡観察手段と、原子間力顕微鏡観察手段と、前記顕微鏡観察手段で観察した場所と同じ場所を前記原子間力顕微鏡観察手段にて観察できる構造を備え、前記顕微鏡観察手段と前記原子間力顕微鏡観察手段より得られる情報により、微生物を検出するようにしたものである。
【０００８】
この手段により、前記顕微鏡観察手段と同じ位置を前記原子間力顕微鏡観察手段で観察するようにしたことで、検体の詳細な情報から微生物か異物かを正確に判断することができ、蛍光染色の作業を介さずに迅速に微生物を検出ことができる微生物検出方法が提供できる。
【０００９】
また、他の手段は、蛍光観察手段と、前記顕微鏡観察手段で観察した観察点と同じ位置を蛍光観察ができる構造をもつ蛍光観察手段と、前記顕微鏡観察手段で観察した観察点と前期蛍光観察手段で観察した観察点と同じ場所を観察できる前記原子間力顕微鏡観察手段を備えた構成としたものである。
【００１０】
これにより、前記顕微鏡観察手段より得られる観察点の情報と前記蛍光観察手段より得られる蛍光発光情報と前記原子間力顕微鏡観察手段より得られる情報により、微生物か異物かを正確に判断することができ、微生物の検出精度を向上させることができる微生物検出方法が提供できる。
【００１１】
また、他の手段は、前記顕微鏡観察手段及び前記蛍光観察手段で観察される観察点から発する光の光波長のスペクトル分析する光波長分析手段を備えた構成としたものである。
【００１２】
これにより、前記顕微鏡観察手段より得られる情報と、前記蛍光観察手段より得られる蛍光発色情報と、前記原子間力顕微鏡観察手段より得られる情報と、前記光波長分析手段より得られる光波長分析情報により、微生物か異物かをより正確に判断することができ、微生物の検出精度をより向上させることのできる、微生物検出方法を提供できる。
【００１３】
また、他の手段は、光波長のスペクトル分析をする光波長分析手段を複数ポイント分析できる光波長複数箇所分析手段を備えた構成としたものである。
【００１４】
これにより、前記光波長複数箇所分析手段が顕微鏡１視野内の複数箇所の光波長分析情報を得ることができるため、検出対象の決定１度に行うことができ、迅速に微生物の検出ができる、微生物検出方法を提供できる。
【００１５】
また、他の手段は、観察した箇所撮影し画像データを取得する手段を備えた構成としたものである。
【００１６】
これにより検体の観察状態が変化しない状態を作ることができ、綿密に微生物か異物かをより正確に判断することができ、微生物の検出精度をより向上させることができる微生物検出方法が提供できる。
【００１７】
また、他の手段は、前記原子間力顕微鏡観察手段として外形及び表面形状を拡大観察する形状拡大観察手段を備えた構成としたものである。
【００１８】
これにより検体の外形及び表面形状の違いから微生物か異物かをより正確に判断することができ、微生物の検出精度をより向上させることができる微生物検出方法が提供できる。
【００１９】
また、他の手段は、前記顕微鏡観察手段、前記蛍光観察手段、前記光波長分析手段、前記原子間力顕微鏡観察手段により観察された画像を特定画像と照合する画像認識手段を備えた構成としたものである。
【００２０】
これにより検体の外形及び表面形状などの画像処理認識処理により照合させることで、微生物か異物かをより正確に判断することができ、微生物の検出精度をより向上させることができる微生物検出方法が提供できる。
【００２１】
また、他の手段は、外形、表面形状及び硬さを検出する硬さ検出手段を備えた構成としたものである。
【００２２】
これにより、検体の外形、表面形状及び硬さの違いから微生物か異物かをより正確に判断することができる微生物検出方法が提供できる。
【００２３】
また、他の手段は、外形、表面形状、硬さ及び電荷検出手段を備えた構成としたものである。
【００２４】
これにより検体の外形、表面形状、硬さ及び電荷量の違いから微生物か異物かをより正確に判断することができる微生物検出方法が提供できる。
【００２５】
また、他の手段は、前記蛍光染色試薬を生きた微生物が発光する染色試薬とした構成としたものである。
【００２６】
これにより、生きた微生物を蛍光させることより、生きた微生物をより正確に検出することができる微生物検出方法が提供できる。
【００２７】
また、他の手段は、前記蛍光染色試薬を死んだ微生物が発光する染色試薬とした構成としたものである。
【００２８】
これにより、死んだ微生物を蛍光させることにより、死んだ微生物をより正確に検出することができる微生物検出方法が提供できる。
【００２９】
また、他の手段は、前記蛍光染色試薬を全微生物が発光する試薬とする構成としたものである。
【００３０】
これにより、全微生物を蛍光させることにより、検体中の全ての微生物をより正確に検出することができる微生物検出方法が提供できる。
【００３１】
また、他の手段は、前記微生物検出方法に前記微分干渉観察手段を備えた構成としたものである。
【００３２】
これにより、検体を微分干渉にて観察するようにしたから、透明で発見しづらい微生物をより正確に検出することができる微生物検出方法が提供できる。
【００３３】
また、他の手段は前記微生物検出方法により検出される微生物を計測する微生物計測手段を備えた構成としたものである。
【００３４】
これにより、微生物を計測することができるようにしたことから、微生物の個数を計測できる微生物計測装置が提供できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、微生物を早く、より高精度に検出できるという効果を有する微生物検出方法を提供できる。
【００３６】
また、本発明によれば、早く微生物を検出し計測することで微生物の存在数量が高精度に早く把握できるという効果を有する生物計測装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の請求項１記載の発明は、検体を拡大観察することのできる顕微鏡観察手段を備え、前記顕微鏡で拡大観察した箇所と同じ位置を原子間力顕微鏡観察手段で観察できる構成としたことにより、検体の形態が詳細に確認できるという作用を有する。
【００３８】
本発明の請求項２記載の発明は、前記請求項１記載の構成に対して、蛍光染色試薬にて標識された検体を観察することができる蛍光観察手段を備え、前記蛍光で観察した位置と同じ位置を観察することができる原子間力顕微鏡観察手段を備えたということで、検出したい微生物の形態をより詳細に観察できるという作用を有する。
【００３９】
本発明の請求項３記載の発明は、請求項２の記載の発明に対して前記顕微鏡観察手段および前記蛍光観察手段で観察されるポイントから発する光波長のスペクトル分析する光波長分析手段を備えることで、検出したい微生物の蛍光波長スペクトル分析ができるという作用を有する。
【００４０】
本発明の請求項４記載の発明は、請求項３記載の発明に対して光波長をスペクトル分析する光波長分析手段を複数箇所備えることで、検出したい微生物の反射光波長、蛍光波長スペクトル分析が複数箇所同時にできるという作用を有する。
【００４１】
本発明の請求項５記載の発明は、請求項４記載の発明に対して観察した箇所を撮影し画像データを取得する撮影手段を備えることで、状態変化のない観察像を用いて微生物の観察ができるという作用を有する。
【００４２】
本発明の請求項６記載の発明は、請求項１乃至５の記載の発明に対して外形及び表面形状を拡大観察できる形状観察手段を備えたことで、検出したい微生物の表面形状を高分解能で観察できるという作用を有する。
【００４３】
本発明の請求項７記載の発明は、前記顕微鏡観察手段、前記蛍光観察手段光波長分析手段、前記原子間力顕微鏡観察手段により観察された画像を特定画像と照合する画像認識手段を備えたことで、微生物を特定画像と比較照合できるという作用を有する。
【００４４】
本発明の請求項８記載の発明は、請求項１乃至７の発明に硬さの計測手段を備えることで微生物の硬さを計測できるという作用を有する。
【００４５】
本発明の請求項９記載の発明は、請求項１乃至８の発明に電荷検出手段を備えることで微生物の電荷を計測できるという作用を有する。
【００４６】
本発明の請求項１０記載の発明は、請求項２乃至８の記載の蛍光染色試薬を生きた微生物を染色する試薬としたことで、生きた微生物を蛍光観察できるという作用を有する。
【００４７】
本発明の請求項１１記載の発明は、請求項２乃至８記載の蛍光染色試薬を死んだ微生物を染色する試薬としたことで死んだ微生物を蛍光観察できるという作用を有する。
【００４８】
本発明の請求項１２記載の発明は、請求項２乃至８記載の蛍光染色試薬を全微生物を染色する試薬としたことで、全微生物が蛍光観察できるという作用を有する。
【００４９】
本発明の請求項１３記載の発明は、請求項１乃至１２記載の発明に微分干渉観察手段を備えたことにより、透明な検体を観察し易くするという作用を有する。
【００５０】
本発明の請求項１４記載の発明は、請求項１乃至１３記載の発明により検出される微生物の検出個数を計測する計測手段を備えたことにより、検体中の微生物の個数を計測できるという作用を有する。
【００５１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００５２】
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１の構成図である。図１において、微生物検出方法は、顕微鏡観察手段１と、原子間力顕微鏡観察手段２から構成される。
【００５３】
上記構成において、蛍光染色を必要としない顕微鏡観察手段１にて拡大観察された観察物を前記原子間力顕微鏡観察手段２により、さらに大きく拡大し、外形の微妙な形状の違いや、拡大率をさらにあげることで、表面形状の違いが詳細観察できることになり、蛍光染色をしないことで、迅速に、詳細観察ができることで微生物か異物かの判定がより正確にできることとなる。
【００５４】
また、顕微鏡観察手段１と原子間力顕微鏡観察手段２の切り換えは、顕微鏡観察手段１で使用する対物レンズ３取り付け部の一つに原子間力顕微鏡観察手段２の原子間力顕微鏡計測部４を取り付け、前記対物レンズ３の切り換えと同じ要領で切り換えができる。
【００５５】
さらに、原子間力顕微鏡観察手段２で観察する場合、顕微鏡観察手段１の観察点の中心と原子間力顕微鏡観察手段２の原子間力顕微鏡計測部４が一致するよう顕微鏡観察手段１の対物レンズ３視野の中心を調節し、顕微鏡観察手段１の観察点と原子間力顕微鏡観察手段２の観察点が同じ位置に来るようになる。
【００５６】
ここでいう顕微鏡観察手段１の１例としては、正立型顕微鏡があり、原子間力顕微鏡観察手段２の一例としては、原子間力顕微鏡がある。
【００５７】
また、検出対象となる微生物一例としては、比較的大きなプランクトンや、酵母などの比較的大きな微生物を含む河川水や、アルコール飲料などがあげられる。
【００５８】
（実施の形態２）
図２は、実施の形態２の構成図の一例である。図２は、図１記載の微生物検出方法に蛍光観察手段６として、蛍光フィルター７を備えた構成としたものである。
【００５９】
上記構成において、観察検体として、蛍光染色検体５作成し、蛍光染色検体５をまず、顕微鏡観察手段１にて観察し、検出したい微生物か否かを判断し、その部分をさらに前記蛍光フィルター７を挿入し、染色した蛍光試薬の発光色で蛍光するか否かを観察し、蛍光している場合は、次に原子間力顕微鏡観察手段２によりさらに外形形状を詳細に拡大観察する。検体を染色し、蛍光が発行するか否かで、微生物かどうかの判断をすることができ、原子間力顕微鏡観察手段２を使用せずに微生物か否かの判断ができることと、顕微鏡観察手段１では小さくて透明な微生物は観察しにくかったが、これらの微生物も蛍光染色をすることで明確に観察できるになり、より早くより正確に微生物の検出ができることとなる。
【００６０】
また、前記蛍光染色検体５の染色用試薬試薬として生きた微生物のみを染色する試薬、死んだ微生物のみを染色する試薬、全ての微生物を染色する試薬を使用することができる。
【００６１】
生きた微生物のみを染色する試薬を用いた場合は、生きた微生物をより正確に検出できることとなる。
【００６２】
死んだ微生物のみを染色する試薬を用いた場合は、死んだ微生物をより正確に検出できることとなる。
【００６３】
全ての微生物を染色する試薬を用いた場合は、全ての微生物をより正確に検出できることとなる。
【００６４】
なお、全ての微生物を染色する試薬と、死んだ微生物を染色する試薬を混合させで前記蛍光染色検体５作成することで一つの検体中の、全ての微生物、死んだ微生物、全ての微生物から死んだ微生物を差し引くことで、生きた微生物を検出することも可能になる。
【００６５】
ここで微生物とは、実施の形態１で示したほかに、大腸菌、黄色ブドウ球菌などのさらに小さいものをいう。
【００６６】
また、生きた微生物を染色する試薬とは６―カルボキシフルオレセインジアセテートなどをさし、死んだ微生物を染色する試薬とは、プロピデュームイオダイドなどをさし、全微生物を染色する試薬とは４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドール２塩酸塩などをさす。
【００６７】
また、生きた微生物とは、増殖能力のある微生物などをいい、死んだ微生物とは微生物の外壁に穴が開いた状態の微生物などをさし、全微生物とは生きた微生物と、死んだ微生物をあわせたものをいう。
【００６８】
（実施の形態３）
図３は、実施の形態３の構成図の一例である。図３は、図２記載の微生物検出方法に光波長分析手段８として、分光計測装置９と、光ファイバー１０を備えた構成としたものである。
【００６９】
上記構成において、蛍光観察手段６で蛍光観察をした後で、蛍光染色検体５から発生する蛍光波長及び、顕微鏡観察手段１観察時に放射される反射光波長を光ファイバー１０を経由し分光計測装置９で波長のスペクトラムに分解する。分光計測装置９により各波長のスペクトラムが観測でき、スペクトラムの強さにより、微生物が蛍光染色によって発光した光か、異物が自家蛍光によって発光した光かを判断できる。原子間力顕微鏡観察手段２を使用せずに微生物か異物かの判断をすることができることで、より早い微生物検出が可能になる。また、測定対象除外物を光波長を使って排除することができるので、より正確な微生物検出が可能になる。
【００７０】
また、光ファイバー１０を複数本で構成することで、複数箇所の光波長分析が可能になり観察画像１視野内での観察対象箇所の特定を早くすることができる。
【００７１】
（実施の形態４）
図４は、実施の形態４の構成図の一例である。図４は、図３記載の微生物検出方法に画像認識手段１１として画像照合装置１２と、ビームスプリッター１３とＣＣＤカメラ１４を備えた構成としたものである。
【００７２】
上記構成において、画像照合装置１２へは、前記ビームスプリッター１３により切り換えられた光を前記ＣＣＤカメラ１４にて撮影された画像と、原子間力顕微鏡観察手段により計測された画像が送られる。画像照合装置１２には、あらかじめ検出すべき微生物の顕微鏡拡大観察画像と、蛍光観察画像と、原子間力顕微鏡観察画像が登録されており、この登録画像とＣＣＤカメラで撮影され送られてきた画像及び、原子間力顕微鏡観察手段で計測された画像とを照合し、微生物か否かを判断することとなる。このように画像照合を用いることでより正確な微生物検出が可能となる。
【００７３】
（実施の形態５）
図５は、実施の形態５の構成図の１例である。図５は、図４記載の微生物検出方法に、検体の硬さを計測する前記硬さ計測手段１５及び、検体の電荷の有無もしくは電荷の強さを計測する電荷計測手段１６を備えた構成としたものである。
【００７４】
上記構成において、外形及び表面形状だけでなく、検体の硬さや、電荷を計測するようにしたことで、より精度の高い微生物検出が可能となる。
【００７５】
なお、本実施の形態５では、検体の硬さと電荷を両方計測することとしたが、検体の硬さ、電荷をそれぞれ一方だけ計測して、微生物を検出することも可能である。
【００７６】
（実施の形態６）
図６は、実施の形態６の構成図の１例である。図６は、図５記載の微生物検出方法に、微分干渉観察手段１７を備えた構成としたものである。
【００７７】
上記構成において、顕微鏡拡大観察後に微分干渉観察手段を用いて微分干渉観察を行うようにしている。顕微鏡拡大観察後に微分干渉観察を行うようにしたことで、前記顕微鏡観察手段１では、確認しづらかった透明な検体が確認しやすくなり、より精度の高い微生物検出が可能となる。
【００７８】
（実施の形態７）
図７は、実施の形態７構成図の一例である。図７は、微生物検出手段１８と、計数手段１９と場所判定手段２０と場所移動手段２１と結果表示手段２２を備えた構成としたものである。
【００７９】
上記構成において、結果表示手段２２は、微生物検出手段１８にて検出された微生物を計数手段１９にて計測し、その後計測した箇所がどこかを判断する場所判定手段２０にて、最後の計測箇所でなければ、場所移動手段２１にて計測箇所を移動し、微生物検出手段１８にて微生物の検出を行い、最後に、結果表示手段２２で、計測結果の表示を行うようにしたことで、検体中に存在する微生物の個数を正確に把握することが可能となる。
【００８０】
ここで、微生物検出手段１８は、本発明の微生物検出方法であり、計数手段１９は、検出された微生物の個数を計数するプログラムであり、場所判断手段は計測した場所がどこか、そこが最後かどうかを判断するプログラムであり、場所移動手段とは、計測箇所を移動させる電動ステージなどであり、結果表示手段は、液晶などの表示装置である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の微生物捕集方法および微生物計測装置は、検体の微生物を微生物捕集用フィルターを用いて計測する場合において、微生物が異物かをより早く、正確に検出できるという効果および微生物をより正確に計測できるという効果を有し、微生物の迅速で正確な検出方法、計測装置として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の実施の形態１の微生物検出方法の構成図
【図２】本発明の実施の形態２の微生物検出方法の構成図
【図３】本発明の実施の形態３の微生物検出方法の構成図
【図４】本発明の実施の形態４の微生物検出方法の構成図
【図５】本発明の実施の形態５の微生物検出装置の構成図
【図６】本発明の実施の形態６の微生物検出装置の構成図
【図７】本発明の実施の形態７の微生物検出装置の構成図
【図８】従来技術の微生物検出装置図
【符号の説明】
【００８３】
１  顕微鏡観察手段
２  原子間力顕微鏡観察手段
３  対物レンズ
４  原子間力顕微鏡計測部
６  蛍光観察手段
７  蛍光フィルター
８  光波長分析手段
９  分光計測装置
１１  画像認識手段
１２  画像照合装置
１５  硬さ計測手段
１６  電荷計測手段
１７  微分干渉観察手段
２２  結果表示手段
１０１  蛍光検出段
１０２  サンプル
１０３  解析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006158207.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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