(57)【要約】  【課題】試料中の分析物の存在又はレベルを検出する方法を提供すること。  【解決手段】試料中の分析物の存在又はレベルを検出する方法であって、下記の工程：(a)該試料を：(i)該分析物と結合し得る第１リガンドを結合して有する固相、及び(ii)第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体が該固相上に形成されるように該分析物又は第１リガンド／分析物複合体と結合し得る第２リガンド、と接触させ、該接触は、該第２リガンドと該固相との間の任意の非特異的結合が実質的に阻止される条件下で且つ十分制限された時間で行なわれ、(b)検出可能な標識を、該第２リガンドに、該第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体の形成の際に該標識部分が該固相上に保持されるように、該第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体の形成の前又は後に結合させ、(c)該標識を検出して、該試料中の該分析物の存在又はレベルを測定することを含む、上記の方法を、提供する。【選択図】図１０Ａ
2006098418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物の存在又はレベルを検出する方法であって、下記の工程：
（ａ）該試料を：
（ｉ）該分析物と結合し得る第１リガンドを結合して有する固相、及び
（ｉｉ）第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体が該固相上に形成されるように
該分析物又は第１リガンド／分析物複合体と結合し得る第２リガンド
と接触させ、該接触は、該第２リガンドと該固相との間の任意の非特異的結合が実質的に
阻止される条件下で且つ十分制限された時間で行なわれ、
（ｂ）検出可能な標識を、該第２リガンドに、該第１リガンド／分析物／第２リガンド
複合体の形成の際に該標識部分が該固相上に保持されるように、該第１リガンド／分析物
／第２リガンド複合体の形成の前又は後に結合させ、
（ｃ）該標識を検出して、該試料中の該分析物の存在又はレベルを測定する
ことを含む、上記の方法。
【請求項２】
接触の工程が下記の工程：
（ａ’）前記の試料を前記の固相と、第１リガンド／分析物複合体が該固相上に形成さ
れるように接触させ、
そして
（ａ''）該第１リガンド／分析物複合体を前記の第２リガンドと、前記の第１リガンド
／分析物／第２リガンド複合体が該固相上に形成されるように接触させる
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触の工程が下記の工程：
（ａ’）前記の試料を第２リガンドと、分析物／第２リガンド複合体が形成されるよう
に接触させ、そして
（ａ''）前記の固相を該分析物／第２リガンド複合体と、前記の第１リガンド／分析物
／第２リガンド複合体が該固相上に形成されるように接触させる
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
接触の工程が、前記の試料を前記の固相及び前記の第２リガンドと、前記の第１リガ
ンド／分析物／第２リガンド複合体が該固相上に形成されるように同時に接触させること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触の工程が、前記の非特異的結合が平衡に到達せず且つ、非特異的な第２リガンド／
固相複合体の形成を時間に対してプロットした第１結合曲線が安定に達しない条件下で十
分に制限された時間で接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接触の工程が、前記の第２リガンドの前記の分析物又は前記の第１リガンド／分析物複
合体への結合が平衡に到達せず且つ前記の第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体の
形成が時間に対してプロットされた第２結合曲線が安定に達しない条件下で十分制限され
た時間で接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
接触の工程が、前記の第１結合曲線及び前記の第２結合曲線の両者がほぼ直線的である
条件下で十分制限された時間で接触させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
接触の工程が、前記の試料を、前記の分析物に比べて実質的に過剰の前記の第１リガン
ドを結合して有する固相と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
接触の工程が、前記の試料を、前記の第１リガンド／分析物複合体に比べて実質的に過
剰の前記の第２リガンドと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、化学的、生化学的及び生物学的アッセイに関係し、特に、リガンドの検出
のための固相アッセイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料と一種以上の試薬とを様々に反応させてリガンド／結合体複合体例えば抗体／抗原
又は類似の複合体を形成し、次いで、それを観察する、試料中の予め決めた部分の存在又
はレベルを測定するためのアッセイは周知である。典型的には、抗体を用いて、その抗体
が特異性を有する抗原の存在をアッセイする。これらのアッセイは、ハプテン例えばホル
モン、アルカロイド、ステロイド、抗原、抗体、核酸及びこれらの断片、酵素並びに細胞
表面レセプターを定量するように拡張された。用語「リガンド／結合体」は、ここで用い
る場合、この広い意味に理解されるべきである。
【０００３】
敏感な免疫アッセイは、典型的には、複合体の標識成分を例えば試薬に組み込み、次い
で、非複合体化標識試薬を複合体化試薬から分離するトレーサー技術を利用する。その後
、この複合体を、標識からのシグナルを観察することにより定量することができる。複合
体の成分又は部分を標識するために、放射性同位体、蛍光性及び化学発光性分子、比色用
標識及び他のマーカーが用いられており、適当な装置を用いて標識からの放射を検出し及
び測定する。
【０００４】
複合体の少なくとも一成分が、最初に、その複合体の形成の前に固体支持体に結合され
るアッセイにおいては、その成分を固体支持体例えばウェルミクロ滴定プレート又はビー
ズに結合させるのに要する典型的に長い時間の故に、又ときには、加熱、攪拌等の処置に
もかかわらずに固相への成分の結合を生じるために時間のオーダーでインキュベーション
時間が必要となるために、基本的な問題が生じる。従って、ミクロビーズ、ディップステ
ィック、マクロビーズ等の利用を含む、このインキュベーション時間を減じる試みに関す
る相当数の従来技術があるが、それにもかかわらず、１０〜２０分のオーダーでのインキ
ュベーション時間が典型的である。
【０００５】
固相アッセイのための多くの形式があるが、それでもなお、それらは、サンドイッチと
競争の２つの型に分類され得る：これらの両者は、当業者には周知である。サンドイッチ
アッセイは、典型的には、抗原が１つ以上の結合体と同時に結合し得ることを要求する。
これらの結合体の一方は、固相に結合され、同時に、他の結合体は標識により標識される
。固相に結合された標識結合体の量は、次いで、試料中の抗原濃度と関係付けられる。サ
ンドイッチアッセイにおける一般的問題は、非特異的結合、即ち、固相上にあるが抗原と
結合してない標識結合体の量である。サンドイッチアッセイをデザインするときには、普
通、シグナルレベルと非特異的結合との間の取捨考量がある。標識結合体の濃度又は標識
結合体のインキュベーション時間を増加させることは、シグナルレベルを増大させるが、
非特異的結合の量をも増大させる。
【０００６】
洗浄緩衝液、洗浄剤、ブロッキング工程、照合等を含む、非特異的結合の影響を減じる
ことを試みる種々のアプローチがなされたが、これらも当業者には周知である。
【０００７】
競争アッセイにおいては、標識部分（抗原への結合体又は抗原のアナログの何れか）を
固相に結合することができる。抗原の存在は、標識部分の固相への結合を減じ又は阻止す
る。シグナルにおける阻止の量は、抗原濃度の尺度である。競争アッセイが十分機能する
ためには、抗原、標識部位及び固相結合部位の量が、ほぼ等しくなければならない。従っ
て、競争アッセイは、通常、サンドイッチアッセイより感度が遥かに低く、直線状範囲が
小さいという欠点も有する。それにもかかわらず、それらは、一度に一つの結合体と結合
することしかできない小さい抗原に対して有用である。
【０００８】
化学的、生化学的及び生物学的アッセイの結果は、重要な決定をするために用いられ、
それ故、結果の正確さ及び信頼性は極めて重要である。これまでは、既知濃度の対照用試
料を定期的にアッセイし、又は測定すべき試料と同時にさえアッセイして、未知試料にお
けるアッセイの操作を較正し及び確認する。この工程は、関心あるアッセイにおける誤り
の可能性を減少させる（但し、排除はしない）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記の問題の多くを解決する固相アッセイ法を提供することである。
この発明の他の目的は、他のもののうちで、当業者に公知の標準的競争アッセイと比較し
て増大された測定の直線状範囲、改善された感度、劣化させる試薬又は環境条件における
変動により引き起こされる誤りに対する減少した発生度、泡又は機械的問題により生じる
誤りに対する減少した発生度、自動化の容易さ、及びアッセイの最終結果を得るための減
少した時間を有する「競争的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ−ｌｉｋｅ）」アッセイを提供す
ることである。この発明の「競争的」アッセイは、標準的競争アッセイに類似しているが
、この発明の競争的アッセイの少なくとも一工程が、ここに記載の様式で、時間的に制限
されて、標準的競争アッセイに典型的な競争的平衡が成立しない点が異なる。
【００１０】
この発明の他の目的は、少なくとも一工程が時間制限されて、それにより、非特異的結
合反応と関係する問題及び標準的サンドイッチアッセイに典型的な問題が回避される改良
されたサンドイッチアッセイを提供することである。
【００１１】
この発明の更に他の目的は、固相アッセイ法において時間のかかるインキュベーション
工程を排除すること、及びこのアッセイを行なうのに要する時間を有意に減じることであ
る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［発明の要約］
上記の目的は、固相を利用して結合アッセイを実施する方法を含む本発明により達成さ
れ、そこでは、分析物及び／又はリガンド成分の少なくとも１つ以上は、固相成分との限
られた接触時間しか与えられない。本方法において、固相物質は、好ましくは、実質的に
過剰の結合性リガンドで被覆される。好適具体例において、我々の同時係属中の一般に譲
渡された米国特許出願第０７／９２４，７２０号に記載されたように、固相成分と試薬含
有試料の分析物含有試料との接触時間は、試料を比較的速く固相物質を通り過ぎて流すこ
とにより制限される。本発明は、以下に詳述する幾つかの変法及び改良を含み、その各々
は、制限された固相接触時間を含む。
【００１３】
本発明は、試料中の分析物の存在及びレベルを、固相上の結合している複合体の形成を
検出することにより検出する方法を含む。この発明の好適な「競争的」方法は、下記の工
程を含む：
（ａ）試料を、分析物／第２リガンド複合体が形成されるように前記の分析物と結合す
ることのできる第２リガンドと混合し、
（ｂ）工程（ａ）で生成した混合物を、第２リガンドと結合し得る第１リガンドを結合
して有する固相と接触させて第１リガンド／第２リガンド複合体を形成し、この結合は、
工程（ａ）で形成された分析物／第２リガンド複合体の解離が実質的に阻止される条件下
で十分に制限された時間行ない、
（ｃ）検出可能な標識を、標識部分が第１リガンド／第２リガンド複合体の形成により
固相上に保持されるように、工程（ａ）又は工程（ｂ）の前又は後の何れかにおいて第２
リガンドに結合させ、
（ｄ）試料中の分析物の存在又はレベルを測定することができるように、この標識部分
を検出して、固相上の第１リガンド／第２リガンド複合体の形成を検出する。
【００１４】
当業者により容易に認められるように、かかる競争的アッセイは又、特定の結合リガン
ド例えば抗体についての結合定数を定量するためにも用いることができるであろう。
【００１５】
この発明の好適な「サンドイッチ型」方法は、下記の工程を含む：
（ａ）試料を
（ｉ）分析物に結合することのできる第１リガンドを結合して有する固相；及び
（ｉｉ）この第１リガンドに、又は第１リガンド／分析物複合体に、第１リガンド
／分析物／第２リガンド複合体が固相上に形成されるように結合することのできる第２リ
ガンドと接触させ、この接触は、第２リガンドと固相との間の如何なる非特異的結合も実
質的に阻止される条件下で十分限られた時間行ない、
（ｂ）検出可能な標識を、第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体の形成の前又は
後の何れかに、第１リガンド／分析物／第２リガンド複合体の形成のときに標識の一部が
固相上に保持されるように第２リガンドに結合させ、
（ｃ）この標識を検出して試料中の分析物の存在又はレベルを測定する。
【００１６】
この発明は又、上記の競争的及び／又はサンドイッチ型アッセイと共に用いることので
きる一点較正及び品質保証の方法をも提供する。
【００１７】
本発明は、標準的な競争型及びサンドイッチ型免疫アッセイの感度を、分析物及び／又
はリガンド成分の少なくとも１つ以上を固相デバイス（例えば、ビーズ、毛細管内表面、
ミクロ滴定プレートその他のデバイス）の表面上を流して接触させる工程によって実質的
に増大させることを含み、この固体表面は、予め、分析物及び／又はリガンドの結合パー
トナーで適当に被覆し又は含浸しておく。
【００１８】
下記のように、幾つかの場合には、分析物含有液体を分析物に対する標識又は標識した
結合パートナーと予備反応させる。他の場合には、分析物含有試料を固体表面上を流して
接触させた後に、標識した第２結合パートナー、標識剤又は標識成分を含む少なくとも一
の追加溶液をもこの固体表面上を流して接触させる。次いで、この固体表面を適当な洗浄
溶液で洗い、標識のシグナル強度を直接測定する。
【００１９】
或は、下記の段落に記載の好適具体例におけるように、固相物質上の標識の蓄積は、実
時間で連続的に監視することができる。この場合、少なくとも幾つかのアッセイにおいて
は、シグナルの蓄積速度を上首尾に利用して分析物を正確に定量することができるので、
洗浄工程は不必要である。
【００２０】
好適具体例において、この発明のアッセイは、同時係属中の米国特許出願第０７／９２
４，７２０号中に記載されたフローセルシステムを含むシステムにおいて実施することが
できる。このシステムの好適具体例においては、結合パートナーで被覆された別々のビー
ズの少なくとも一の分離塊を、円筒状のキャピラリー導管内で処理し、該導管は、好まし
くは透明であり且つ収束レンズ手段の焦点範囲内に配置し且つ該範囲を通過する。この円
筒状導管をレンズ手段の光軸を横切るように且つそのレンズ手段の曲率中心の後ろに位置
させる。既に述べたように、この発明のアッセイは、種々の他のシステムにおいても行な
うこともでき、典型的には、下記のように一層感度は低い（免疫学的に被覆されたキャピ
ラリー、ミクロ滴定プレート等を含む）。
【００２１】
このシステムにおいては、ビーズ等の被覆塊が半透明であり且つキャピラリーが半透明
又は透明であるときには、蛍光の発達を、米国特許出願第０７／９２４，７２０号に提出
した光学的測定装置及び電気的検出手段を用いて、アッセイの進行につれて監視し且つ測
定することができる。標識の性質によって、他の固体表面に結合した標識されたリガンド
／結合体複合体の測定を、これまでかかる測定において用いられた測定手段を用いること
によって行なうことができる。
【００２２】
この発明のアッセイは、一般に、固体表面を、実質的に過剰の分析物の結合パートナー
（サンドイッチアッセイ）又はアナログ（競争的アッセイ）で被覆し、分析物含有液体及
び／又は任意の他の液体を、高速で、その固体の表面積を分析物又は他の反応物含有液体
に可能な最大限度まで露出する条件下で、その固体表面上を接触して流すことを企図する
。
【００２３】
この発明の鍵となる要素は、分析物と試薬を含有する溶液と固相物質との接触時間が比
較的短いことであると考えられる。例えば、好適具体例において、比較的少容量の分析物
（約２μｌ）のみが、任意所定の時間、固相物質と接触する。
【００２４】
本発明の競争的アッセイについて、「接触時間」とは個々の分析物／第２リガンド複合
体が固相と接触する時間の平均量をいう。典型的流量において、予備混合した試料の各「
増分」（ここに、「増分」とは、単一分析物／第２リガンド複合体を含む平均容積をいう
）は、固相と、約１分未満、好ましくは、約１０秒未満、最も好ましくは約１秒未満接触
する。例えば、１０００μｌ／分の流量では、予備混合した試料の各増分は、典型的に、
１分間の約１／５００のみの固相との接触する。
【００２５】
本発明の改良されたサンドイッチアッセイについて、「接触時間」とは、第２リガンド
が固相と接触する時間の総量をいう。
最適接触時間は、研究される特定の分析物の結合動力学を含む他のアッセイパラメータ
ーと共に変化し得るが、すべての場合において、最適接触時間は、比較的短いことが予想
される。
【００２６】
この発明のアッセイは、一価及び多価の存在物を含む広い範囲の分析物に適用すること
ができる。これらのアッセイは、これまで直接アッセイすることは困難と考えられてきた
液体の適当に希釈した試料例えば全血液、乳等について、直接、上首尾に行なうことがで
きる。
【００２７】
この発明のアッセイ方法は、当分野で従来用いられてきた方法を超える多大な利点を有
する。これらの利点は、一層早い実施時間、特に低い分析物濃度における一層高い感度、
多くの場合におけるインキュベーション時間の排除及びすべての場合におけるその短縮、
自動化の容易さ、及び高い再現性、並びに特定の競争アッセイにおける拡大された直線状
範囲を含むが、決してこれらに限定されない。
【００２８】
下記のように、本アッセイ方法を用いて、各分析物に対する特異的動作曲線を確立する
ことができ、それによって、異常に高レベルの結合による偽陰性及び偽陽性並びに動作エ
ラーにより引き起こされる間違った結果を容易に排除することができる。
【００２９】
本発明の方法を用いて、既知の抗原濃度の液体を用いる一点較正を、競争的アッセイに
並びにサンドイッチ型アッセイに用いることができる。これは、特に、異常に低い結合レ
ベルによる偽陰性及び偽陽性（例えば、不活性な抗体の存在により引き起こされるもの）
を排除するのに有用である。本発明の他の及び更なる利点並びに利益は、以下に論じ或は
下記の詳細な議論から明らかとなろう。
【００３０】
［図面の簡単な説明］
図１は、本発明と標準的ＥＬＩＳＡアッセイとの比較を示している；
図２は、特異的（Ｂ）及び非特異的結合（Ｂ0  ）についての代表的結合曲線を示して
いる；
図３は、不備の有無における代表的出力を示している；
図４は、全乳中のゲンタマイシンについての代表的曲線族を示している；
図５は、試料及び較正シグナルのグラフを示している；
図６は、変化させた流量に対する標準曲線を示している；
図７は、幾つかの流量についての、濃度に対する阻止パーセントを示すグラフを示して
いる；
図８は、変化させた抗体希釈についての標準曲線を示している；
図９は、変化させた分析物希釈についての標準曲線を示している；
図１０Ａ及び１０Ｂは、フェリチン濃度に対するシグナルを示している；そして
図１１Ａ及び１１Ｂは、ゲンタマイシン濃度に対するシグナルを示している。
図１２は、典型的な競争的アッセイ（「解離あり」）についての時間に対する複合体形
成のプロットを、予備形成した分析物−第２結合リガンド複合体の解離がない理想化した
競争的アッセイ（「解離なし」）と比較して示している。
【００３１】
［発明の詳細な説明］
本発明は、分析物を含む試料を、例えば、その分析物に対する過剰の免疫学的結合パー
トナーに含浸し又は被覆した固体表面上を接触させて急速に流す工程を含む工程により、
短時間で、再現可能に或は満足な結果にて、競争及びサンドイッチ免疫アッセイを行なう
ことができるという発見に基づいている。
【００３２】
標識の存在は、必須であるが、種々の方法にて達成することができる。従って、希釈し
た分析物試料を標識した抗体と予備反応させ或は標識した抗体の溶液を、分析物を固体表
面上を流した直後に、その固体表面上を接触させて流すことができる。この標識は、分析
物に対する第１抗体に直接結合し、或はそれは、第２抗体に結合することができ、それは
、次いで、（ａ）第１抗体及び分析物と予備反応するか、（ｂ）第１抗体と予備反応し、
その後、生成物は次いで固体支持体（その活性部位の少なくとも幾つかに分析物は既に結
合している）上を接触して急速に流されるか、（ｃ）固体支持体（その少なくとも幾つか
の活性部位に分析物−第１抗体結合体は既に結合している）上を接触して急速に流される
。
【００３３】
既知濃度の分析物の試料を用いた研究において、分析物を含む溶液を、その免疫学的結
合パートナーが結合している固体表面上を流す前に、免疫反応物の幾つか又はすべてが予
備反応されるかに依存して、種々の結合曲線が得られることが見出された。しかしながら
、結合曲線を、既知濃度の分析物試料を用いて行なった実施（各実施では、同じ試薬及び
方法を用いる）に基づいて注意して確立すれば、それを、未知濃度の分析物試料と共に上
首尾に用いて、高度に再現可能で且つ正確な結果を与えることができる。
【００３４】
言い換えると、標識した第１及び第２抗体を含む免疫反応物は、希釈した分析物試料と
、同じ順序で同じ時間混合し、そして免疫学的に処理した固体表面と、同じ順序で同じ流
量で且つ同じ接触の条件並びに影響を持ち得る他の条件例えば撹拌（又はその欠如）及び
温度の下で接触させなければならない。同じ方法の維持は、固体結合した免疫学的結合パ
ートナーへの分析物の曝露の時間が減少するにつれてますます重要になる。
【００３５】
この発明によって競争的免疫アッセイを行なう際に、任意所定の分析物分子又は任意所
定の分析物／第２リガンド複合体と免疫学的結合パートナーが結合した固体表面との接触
時間は非常に小さい。今まで、この発明のアッセイ方法の実験的評価においては、分析物
を含む溶液を、円筒状カラム（直径約１．７ｍｍ）中で、その分析物の免疫学的結合パー
トナーが結合した固体支持体上を接触させて、２５０〜２０００μｌ／分で変化する流量
で流した。一層遅い及び一層早い流量は、ある環境下ではよく機能するが、現在は、この
範囲は、分析物と固体表面上に固定されたその結合パートナーとの間の必要な接触時間を
保証するのに最適であり、上記のように、比較的短い接触時間を確実にすると考えられて
いる。
【００３６】
分析物含有溶液の述べた範囲の流量を用いて、この発明による競争的免疫アッセイは、
これまで、固体支持体が分析物の順次的増加量と約１〜２分間連続的に接触する環境下で
行なわれてきた。この時間は、任意の単一容積増分の分析物と固相物質との間の接触時間
よりも（ここで論じるように、この発明のサンドイッチアッセイについては状況が異なる
にもかかわらず）、この発明の競争的アッセイに対して一層重要でないと考えられる。こ
れまで研究されたすべての競争的アッセイにおいて、任意の単一容積増分の分析物と固相
物質との間の接触時間は、約１分未満、好ましくは約１０秒未満、最も好ましくは約１秒
未満であった。
【００３７】
分析物及びその固定された結合パートナーの性質、固体支持体の構成及び配置、反応温
度及びなおその上恐らく他の変量に依存して、分析物溶液とその固定された結合パートナ
ーとの約２５秒〜５分間（即ち、３００秒）に及ぶ接触時間が幾つかの場合に望ましいこ
とが予期されるが、これまで用いられた時間範囲６０〜１２０秒（即ち、１〜２分間）は
、固体支持体が高い表面積を示す場合例えばビーズ塊（各々約１００ミクロンの平均直径
）を含む場合に特に有効であると考えられる。
【００３８】
この発明の方法は、広範な多様な固体支持体に用いることができ且つ決してビーズを用
いる利用に限定されないことを企図する。ビーズに代わる好適な固体支持体例えば免疫原
に対する支持体として適当な合成ポリマー塊を、泡及び糸状構造において（緩く編んだマ
ット状構造として）及びビーズに加えて他の様々な形態で用いることができる。更に、当
業者に周知のように、免疫学的反応物で被覆したガラス又はプラスチックチューブその他
のデバイスが、固体支持体として適している。本発明の方法においては、例えば、適当な
内部免疫学的被覆を有する毛細管及び被覆したミクロ滴定プレートが、分析物含有試料と
の必要な接触を高速流中で容易に与えることができるであろうことが予期される。
【００３９】
更に、他のデバイス例えばカセット、ミクロフィルター等を、溶液中の分析物と固体結
合した固定された結合パートナーとの間の急速流、接触反応を有利に行なうチャンバーと
して働くように容易に適合させることができると考えられる。
【００４０】
本発明において効率的に機能することが見出された反応チャンバーは、同時係属中の米
国特許出願第０７／９２４，７２０号に記載されたレンズ手段を通るキャピラリー導管で
ある。
【００４１】
上記の同時係属中の出願に記載されたシステムは、特に、蛍光標識の利用及びアッセイ
中に生じる蛍光の光学的検出に適合するように開示されている。本発明は、用いる標識が
、蛍光、発光又は比色型であってよいことを企図する；実際、環境及び健康の理由から好
ましくない周知の放射性標識も又有用である。実際、検出可能なシグナルを生成する任意
の標識を、電気的又は電子工学的手段により、好適に利用することができる。
【００４２】
このことについて、上記の同時係属中の米国特許出願第０７／９２４，７２０号がシグ
ナルを電気的検出器に運ぶ光学的検出システムを用いていることを注意する。この同時係
属中の出願により、免疫アッセイ反応が進行するにつれて、全蛍光が、光学的に、連続的
に検出される。
【００４３】
免疫アッセイ中の全蛍光の監視は、分析物の固定された結合パートナーとの免疫学的結
合を監視することと必ずしも同じではないということを注意すべきである。このアッセイ
のある段階で、発生した全蛍光は、未結合の標識された第１及び第２抗体の存在、非特異
的結合の発生等を含む様々な理由により、免疫学的結合に特有の蛍光を大きく超える。更
に、光学的に検出された全蛍光からのものを含む電気的シグナルは、その光学的に検出さ
れた全蛍光からのシグナルを、分析物が存在しないときに検出され得るシステム自身のノ
イズ又は蛍光のベースライン散乱から分離しない。これらの警告にもかかわらず、アッセ
イ中に発生した全蛍光シグナルを監視すること、特に、アッセイ中のシグナルの蓄積速度
を監視することが、分析物濃度の大いに満足すべき測定（感度、再現性等に関して）を与
えることが見出された（例えば、実施例５及び６を参照されたい）。このリアルタイムで
シグナルを監視する能力も又、下記の品質保証発明の実施には重要である。
【００４４】
一点較正型のアッセイを上首尾に用いて、本発明のサンドイッチ及び競争型アッセイの
両方を実施することができる。一点較正アッセイの利用は、例えば参考研究室において、
特に魅力を有する。一点較正アッセイの公知の利点のうちの一つであるが、それらは、未
知濃度の分析物の試料のアッセイと本質的に同時の参照標準試料についての別個のアッセ
イを行なう必要を回避する；それらは、同じ固体支持体を用いて、アッセイにおける比較
参照標準／未知試料結合の直接的表示を与える。やはり公知のように、固体支持体上に固
定した結合パートナーが、例えば、ある理由により部分的に不活性であるならば、一点較
正結果は、それにもかかわらず、同じ固体支持体上で同じ試薬を用いて、濃度既知及び未
知の試料の両方を用いて行なわれるので有効である。
【００４５】
示したように、この発明のアッセイは、容易に、全体又は一部を自動化することができ
る。それらは、規定した装置にて、アッセイ反応物（所望の分析物の免疫学的結合パート
ナーで含浸した固体支持体、標識又は標識された抗体、緩衝液及び分析物参照標準を含む
）がキット形態にパッケージされている環境下で実施するようにデザインすることができ
る。かかるキットは、例えば、使い捨ての反応チャンバーデバイス例えばカセット、ビー
ズ容器、被覆したキャピラリー等を含んでよい。
【００４６】
リアルタイムでシグナルを監視する能力は、特定の試薬及び順次的プロセスを用いる所
定の分析物のアッセイのための「品質保証」曲線の確立を与えるという更なる利点を有す
る。品質保証曲線の構築は、下記により達成される：
（１）生の出力データを数学的関数に当てはめること。これは、部分的に、利用すべく
選択したデータパラメーターに依存し、部分的に、プロセスシーケンスに依存する（所定
のアッセイに対する数学的関数は、幾つかの関数からなっていてよく、各々がアッセイの
特定の時間間隔をカバーするので）。一度この関数が確立されれば、標準適合アルゴリズ
ム（最小二乗回帰用アルゴリズム等）を用いて関数パラメーターを変化させて統計学的な
「最適適合」曲線に達する。このアルゴリズムは、「残差」を最小にするように用いる（
ここに、後者は、適合した関数と存在するデータとの間の差として定義される）。
（２）各残差を予めプログラムした域値と比較すること。コンピューターは、この仕事
を実行することができる。
（３）その後、コンピューターを用いて、残差が域値を超える実施を信号で知らせ、ア
ッセイの自動化の程度に応じて、そのアッセイを自動的に再実施するか又は不備として捨
てること。
【００４７】
これらの域値は、良いデータ及び悪いデータの両者のセットを蓄積するための関数を適
合させることにより決定し、更なるデータが得られたときに再評価にかけられる。
可能な限り結合動力学に基づく方程式に適合させることにより、品質保証の利用は、異
常に高い非特異的結合による偽陽性及び偽陰性の拒絶を可能にし得る。とにかく、それは
、アッセイ工程の不調例えば後述の実施例のいくつかで議論される空気の泡により引き起
こされるものによる値を拒絶する。
【００４８】
既知の一次及び二次の現象に基づく種々の動力学的説明が、この発明のアッセイに対し
て提出され、種々の実験結果の説明にかなり成功した。それにもかかわらず、これらの説
明は、仮説と見なされており、ここには、純粋に理解の助けとして含まれ、後述の請求の
範囲に示したこの発明の範囲を制限すると解釈することはできない。
【００４９】
本発明の一具体例において、我々は、競争的アッセイを実施するが、該アッセイで我々
は、分析物を含む試料を分析物特異的な抗体と予備反応させ、次いで、その予備反応させ
た混合物を、やはり分析物特異的抗体と結合することのできる固相を通過して流す。
【００５０】
我々の得たこれらの優れた結果に対する仮の説明は、比較的短い予備反応させた混合物
の容積の各増分と固相との接触時間（１秒よりずっと短い）が、実質的に、古典的な三方
競争的平衡の成立を阻止することである（それは、もし予備形成した分析物／抗体複合体
が解離すれば生じ、一方、抗体／固相複合体が形成される）。それよりも、我々は、観察
されたシグナルは、殆ど完全に、予備反応した混合物中に残った残留の遊離の（即ち、試
料抗原と複合体化してない）抗体の結合によるものであるという仮説を立てている。この
効果は、分析物／抗体複合体の比較的遅い解離速度のために起きると考えられる。本質に
おいて、この短い接触時間中には、非常に僅かの複合体化した抗体／抗原対しか解離しな
い。
【００５１】
この理論の試験として、我々は、それを２つのデータのセットに適合させる。同時係属
中の出願第０７／９２４，２７０号に記載のように、プロトタイプ免疫アッセイシステム
を用いて、一つのデータのセットを得た。他のデータのセットを、標準的ＥＬＩＳＡ技術
を用いて得た。
【００５２】
下記の実施例を、この発明の制限ではなく、説明として提供する。
実施例で与えたアッセイにおいて、蛍光標識からの放出は、上記の同時係属出願の開示
に従って、次の各々を計算するようにプログラムされたコンピューターを含む電気的検出
器に光学的に向けられた。（１）検出されたベースラインと検出された終点との間の差と
して定義される「デルタ」、（２）リアルタイムで監視した際の、シグナル蓄積の勾配、
（３）複数の同一試料での実施の間の標準偏差である「シグマ」、及び（４）これらの同
一の実施の変動の係数である「Ｃ．Ｖ．」。
【００５３】
この発明は、更に、このアッセイの実施中又は一層遅い時間の何れかに、このアッセイ
の「品質保証」分析を実施するための手段を含む。この分析は、アッセイ結果の幾つかを
誤り又は不十分のために拒絶すべきであるかの決定を与える。
【００５４】
この発明は、更に、このアッセイ固相物質及び他の関連分析リガンドの性能を、未知試
料をアッセイするのにこれらの物質を用いる数秒間の時間の内にチェックするのに用いる
ことのできる較正液を含む。この種の較正液はサンドイッチ免疫アッセイ技術においては
周知であるが、競争アッセイ型でのその利用は、未だ達成されていないし或は開示されて
いない。
【００５５】
好適具体例において、この固相は、実質的に過剰の第１結合リガンドを表面に固定して
有する液体透過性の多孔質塊からなる。この多孔性塊は、フローセルに含まれ支持手段例
えば液体透過性スクリーンにより適所に保持される多数の粒子からなってよい。このスク
リーンは、フローセル中に永久に固定してもよく、或は米国特許出願第０８／０２６，５
０７号（参考として、本明細書中に援用する）に記載のように一時的に形成してもよい。
【００５６】
本発明により、分析物含有試料は、比較的短時間、固相物質と密接に接触させられる。
本発明の競争的アッセイの好適具体例において、試料は、固相物質の多孔質塊を通して流
される。この場合において、接触時間は、容積の各増分が固相と接触する時間をいうもの
と理解される。
【００５７】
固相上に固定された第２結合リガンドの量を検出するために標識が必要であることは認
められよう。任意の放射性標識を本発明に使用することができ、それは、蛍光標識、化学
発光標識、生物発光標識、放射性同位体標識、比色標識等を含むが、これらに限られない
。更に、標識がこのアッセイで利用される第１結合リガンドの一つに直接結合し得ること
、或は、適当な第１結合リガンドと複合体を形成し得る中間の第３の結合リガンドを介し
て第１結合リガンドに結合し得るということも認められよう。中間の第３結合リガンドを
利用する技術は、抗体に基づくアッセイの特殊な場合において、典型的には、当業者によ
り「第２抗体技術」と呼ばれる。
【００５８】
好ましくは、本発明の競争的アッセイは、次の工程にて実施する：実質的に過剰の第１
結合リガンド（典型的には、試料分析物又は試料分析物のアナログ）を多孔質固相物質に
結合する。この未知量の分析物を含む試料を典型的に制限量の標識した第２結合リガンド
と混合する。第２結合リガンドと試料の混合物を、次いで、固相物質を通して流す。
【００５９】
当分野で公知のように、標準的競争アッセイは、典型的に、試料中の分析物の存在又は
量を測定するために用いられる。この測定は、典型的に、分析物の不在にて達成した第１
結合リガンド／第２結合リガンド複合体形成のレベル（典型的には、第２結合リガンドに
結合した検出可能標識の存在及び／又は量を検出することによりアッセイする）と、未知
量の分析物を含む試料の存在下で達成した第１結合リガンド／第２結合リガンド複合体形
成（例えば、試料と第２結合リガンドを予備反応させたとき；又は試料、第１結合リガン
ド及び第２結合リガンドをすべて同時に反応させる場合）のレベルとの比較を含む。
【００６０】
本発明の競争的アッセイを、同様にして用いることができる。かかるアッセイのために
は、分析物／第２結合リガンド複合体の形成が第１結合リガンド／第２結合リガンド複合
体の形成を阻止することが重要である。
【００６１】
第２結合リガンドと試料分析物との混合を行なってから、その混合物をフローシステム
に導入することができ、或はそれを、例えば第２結合リガンドを含む流れを分析物含有試
料のフロー流れに注入することにより自動的に達成することができる。
【００６２】
固相上の実質的に過剰の第１結合リガンドを用いて、予備混合した試料及び標識した第
２結合リガンドの固相上の第１結合リガンドとの接触時間を制限することにより、試料分
析物の定量を可能にすることは、本発明の目的である。これは、当業者により、前に理解
された固相結合リガンドの濃度が検出すべき分析物の濃度にほぼ等しくなければならない
実施からの新発展を意味するものと理解されよう。
【００６３】
好ましくは、次の工程を取り入れることにより、一点較正を競争的形式の場合に行なう
ことができる：上記のように競争的アッセイを行なう直前又は直後に、既知の参照液、典
型的には、既知濃度の分析物化合物又はそのアナログを、試料分析物について用いるのと
同じ起源から引き出した標識した第２結合リガンドの他のアリコートと混合する。合わせ
た（それは、上記のように自動的に達成され得る）後に、参照液及び標識した第２結合リ
ガンドの混合物を、再び固相と密接にしかし一時的に接触させる。２つのシグナルを測定
するが、その一つは参照液から生じ、一つは試料から生じる。この参照液は、特性が知ら
れているので、標識した第２結合リガンド活性、第１結合リガンド活性等の変動を補正す
る基準として用いることができる。この一点較正が過剰の固相結合能力により可能となる
ことは認められよう（この能力の効果的な利用が本発明の第１の目的である）。
【００６４】
好ましくは、本発明のサンドイッチアッセイは、次の工程にて行なわれる：関心ある分
析物に結合し得る実質的に過剰の第１結合リガンドを固相物質上に固定する。試料を、流
すことにより、この固相物質と密接にしかし一時的に接触させる。次いで、試料分析物／
第１結合リガンド複合体との複合体を形成し得る第２の標識した結合リガンドを、流すこ
とにより、固相物質と再び密接にしかし一時的に接触させる。次いで、分析物の量を、固
相物質上に保持された標識した結合リガンドの量を測定することにより定量する。当業者
は、分析物の定量というのは、サンドイッチアッセイ中に存在することが常に見出される
非特異的結合（即ち、分析物の不在における標識した第２リガンドの結合）を差し引く必
要があることを認めるであろう。標識した第２結合リガンドと固相物質との間の接触時間
を制限することにより特異的結合の比を非特異的結合を超えて増大させることは、本発明
の目的である。
【００６５】
好ましくは、品質保証方法を、典型的にはコンピューターにより、アッセイ中のシグナ
ル生成の過程を監視し且つ記録することにより、本発明の競争的アッセイ又はサンドイッ
チアッセイの何れかにより実行することができる。時間に対する生成シグナル曲線の形状
を予め測定した標準曲線と比較することにより、空気の泡、その他の機械的問題等による
誤りを容易に検出することができる。
【００６６】
この発明の重要な要素は、分析物及び／又は試薬含有溶液と固相物質との接触時間が比
較的短いということである。例えば、同時係属中の米国特許出願第０７／９２４，７２０
号に十分に記載されているように、キャピラリーフローセル及び多孔質固相を用いる好適
具体例において、比較的小さい容積の分析物（約２μｌ）しか任意所定時間で固相物質と
接触しない。
【００６７】
本発明の典型的な競争的アッセイを、約１０００μｌ／分の流量で行なった。かかるア
ッセイのためには、分析物の各増分を固相と、平均して１分間の約１／５００だけ又は僅
か１秒の１／１０にわたって接触させる。最適接触時間は未だ決定されていないし、最適
時間は、研究される特定の分析物の結合動力学を含む他のアッセイパラメーターと共に変
化すると考えられるが、すべての場合に最適接触時間が比較的短いであろうことは、確か
に予想される。
【００６８】
「比較的短い」とは、ここで用いる場合、試料及び試薬含有溶液と固相との接触時間が
、分析物の結合動力学に依存して、約１分より短く、好ましくは約１０秒より短く、最も
好ましくは約１秒より短いことを意味する。
【００６９】
種々のアッセイにおいて、約２５０〜２０００μｌ／分の範囲の流量が研究された。こ
の範囲の流量は、広範囲の分析及び試料マトリックスに適当であることが見出されている
が、この発明は決してこの範囲の流量に限定されるものではない。
【００７０】
一次の結合動力学に基づく比較的単純なモデルが提出され、種々の実験結果を説明する
のにかなり成功している。これらのモデル及びそれらに基づく説明は、仮のものと見なさ
れ、ここでは純粋に理解を助けるためのものであって、決して、後述の請求の範囲に示し
たこの発明の範囲を制限するものと解してはならない。
【００７１】
本発明の一具体例において、我々は、競争的アッセイを行なうが、該アッセイにおいて
は、未知量の分析物を含む試料を特異的抗体と予備反応させ、次いで、その予備反応させ
た混合物を、実質的に過剰の分析物物質を上に固定して有しそれ故やはり特異的抗体に結
合することのできる固相を通して流す。競争的アッセイにおいて、重要なパラメーターは
、試料の任意の部分の固相との平均接触時間であり、固相と全試料との接触時間ではない
。
【００７２】
如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、我々の得た優れた結果（例えば、
高い感度、高い再現性広い直線状範囲）の仮の説明は、予備反応させた混合物の容積の各
増分の固相との比較的短い接触時間（１秒未満）が本質的に古典的な三方競争平衡の成立
を阻止するというものであると考えられる。その代わりとして、我々は、観察されたシグ
ナルは、殆どすべて、予備反応した混合物中に残った残留の遊離の（即ち、試料抗原と複
合体化してない）抗体の結合によるものであるという仮説を立てている。この効果は、抗
体／抗原複合体の比較的遅い解離速度のために起きると考えられる。本質において、この
短い接触時間中には、非常に僅かの複合体化した抗体抗原対しか解離しない。換言すれば
、固相と予備反応した混合物の増分との間の接触時間を制限することにより、我々は、競
争反応に関連した問題を回避することができる。
【００７３】
この理論の試験として、我々は、２つのアッセイ方法を用いた。その１つは同時係属中
の米国特許出願第０７／９２４，７２０号に記載されたものであり、１つは、標準的ＥＬ
ＩＳＡ技術及びプレートリーダーを用いるものである。両方の場合において、固相物質の
被覆は、比較を容易にすることができるように殆ど同じであった。方程式は、上記の両モ
デル及び標準的三方競争平衡に近づくように導いた。「競争的」モデルに近づくのに用い
た方程式は、標識した抗体が試料中で抗原と平衡に達すること及び残りの遊離の抗体が、
次いで、固相と平衡に達することを仮定した。このモデルは、現実の過程の粗い単純化と
考えられ、決してこの発明の範囲を制限することを意図するものではない。このアッセイ
における未知のパラメーターは、抗体アフィニティー及び固相抗原の有効濃度であった。
図１に示すように、２セットのデータに同時に適合するモデルを与えるこれらのパラメー
ターについての妥当な値（抗体アフィニティー＝４×１０-9及び有効固相抗原濃度＝１×
１０-8モル）が見出された。
【００７４】
この理論を与える別の方法を、図１２に示したグラフ中に具体的に示してある。図１２
は、（ｉ）予備成形した分析物−第２結合リガンド複合体の解離がない「理想化した」競
争的アッセイ（「解離なし」）；及び（ｉｉ）典型的な競争的アッセイ（「解離あり」）
についての接触時間（ここに「接触時間」とは、予備反応した混合物の単一の増分が固相
と接触する時間をいう）に対する複合体形成のプロットを示している。これらの図１２に
示した曲線は、標準的な数学的モデル化技術を用いて計算した（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｋｉ
ｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ．  Ｊ．Ｉ．  Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ  等、  Ｐ
ｒｅｎｔｉｓｓ  Ｈａｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  を参照されたい）。当業者は、関
心ある任意の結合反応について類似の曲線を容易に生成することができる。
図１２を参照して、もし予備反応した混合物と固相との接触時間が５秒未満であるなら
ば（示した特定の会合速度定数について）、観察された現実のシグナルは、解離のない仮
説の場合と事実上同じであることは明白である。従って、この発明の好適な競争的アッセ
イにおいては、予備反応した混合物（試料及び第２結合リガンドを含む）と固相との接触
工程は、固相上の第１結合リガンドと第２結合リガンドとの間の結合反応が、時間に対す
る複合体形成のプロット（例えば、図１２の「解離あり」の曲線）が、予備成形された分
析物／第２結合リガンド複合体の解離がないと仮定して生成された同じパラメーターの理
想化されたプロットから実質的に分かれる点まで進まない条件下で十分制限された時間で
行なう。
【００７５】
比較的低濃度の遊離の抗体の実質的に過剰の固相抗原への結合は、明瞭に大きい遊離抗
体濃度の範囲にわたって、本来的に、直線的過程である（それは、我々の実施例において
観察された比較的大きい直線的範囲の原因であると考えられる）。
【００７６】
上記の競争的アッセイと共に働くように構成された一点較正液の好適具体例において、
我々は、既知濃度の抗原（較正液）を、試料と混合した標識抗体と同じ位置から引き出し
た標識抗体のアリコートと混合する。次いで、この混合物を固相を通して、典型的には未
知試料と同じ速度で同じ時間流す。透明のキャピラリー中に配備した半透明の固相の好適
具体例（第０７／９２４，７２０号参照）を用いて、シグナル生成をリアルタイムで観察
することが可能である。この場合に、シグナル生成応答の勾配が分析物濃度の信頼できる
指示であることが見出される。この一点較正液の場合、我々は、この勾配を２つの領域で
計算し、１つは較正液に対応し、他は未知試料に対応する。（既知の）較正液からの応答
の勾配は、他方の可能なアッセイ変量例えば抗体活性、温度等に対する基準を与える。
【００７７】
或は、一点較正を、純粋な標識抗体を用いて実行することができる。ゼロ抗原にて較正
液を用いるのに似ているが、試料又は較正液中への抗体の稀釈がないので、異なる。それ
にもかかわらず、この方法も有効な参照を提供することができる。
リアルタイムでシグナル生成を測定する能力のない場合には、この較正を、別々の時間
例えば較正液の通過の前後及び試料抗体混合物の通過の前後にシグナルレベルの変化を測
定することによって実行することができる。
漠然と上記したように、サンドイッチ免疫アッセイの好適具体例は、やはり、出願第０
７／９２４，７２０号に記載の装置を利用する。サンドイッチアッセイの好適具体例は、
やはり、標識した試薬と固相との制限された接触時間の基本概念を含む。ここのモデルは
、やはり仮のものと考えなければならず、制限するものではなく、説明目的でのみ含まれ
るものであるが、幾らか異なっている。
【００７８】
上記の背景の節に記載したように、高感度のサンドイッチ免疫アッセイを実行する際の
一般的困難は、標識抗体の固相への非特異的結合の存在である。すべてのシステムに適用
できるとは保証されていないが、非特異的結合シグナルは平衡に達するのが特異的結合シ
グナルより遅いことがしばしば認められる。漠然と、我々は、標識抗体と固相との接触時
間を制限すること（即ち、標識抗体が固相と接触する全時間を制限すること）により、我
々は非特異的結合を超える特異的結合の比の増大をもたらすことができると考える。この
効果は、図２を参照して仮に理解され得る。
図２は、特異的（Ｂ）及び非特異的（Ｂ0）結合反応を表す単純化した結合曲線を示し
ている。これらの単純化した結合曲線は、当業者により、標準的数学モデル化技術を用い
て容易にプロットされ得る現実の結合曲線の代表である。現実の結合反応の観察と一致し
て、図２に示されたこれらの曲線は、非特異的結合Ｂ0の速度が特異的結合Ｂの速度より
遅いという状況を描いている。
【００７９】
当分野で公知であり、図２に示したように、結合曲線は、３つの基本領域からなる：ゼ
ロから増加するほぼ直線的な領域（曲線Ｂの領域１；曲線Ｂ0の領域１〜３）；結合反応
が安定に達することを表している曲がった領域（曲線Ｂの領域２；曲線Ｂ0の領域４）；
及び長時間の後に、結合反応が平衡に達したときに到達する実質的に一定の領域（曲線Ｂ
の領域の３〜５；曲線Ｂ0の領域５）。
【００８０】
任意の特定の結合曲線について、ほぼ直線的な領域の勾配は、下記式により与えられる
：
ｋａ＊［Ａｂ］＊［Ｓ］
（式中、ｋａは会合速度定数であり、［Ａｂ］及び［Ｓ］はこれらの２つの反応物の濃度
である）。この領域の勾配は、［Ａｂ］及び［Ｓ］が一定である範囲に対してのみ直線的
である。
ｔ＝０において、この結合曲線の勾配は、下記式により与えられる：
ｄ［ＡｂＳ］／ｄｔ＝ｋａ＊［Ａｂ0］＊［Ｓ0］                （１）  
ｔが無限大に近づくときには、この結合曲線の定常領域が接近する値は、下記式により与
えられる：
［ＡｂＳ］＝Ｋ＊［ＡＢ］＊［Ｓ］    （２）  
（式中、Ｋは平衡結合定数である）。
従って、図２に示したこれらの２つの曲線を比較した場合、Ｂ／Ｂ0比は、ｔ＝０及び
ｔが無限大に近づくときには、正確に決定することができる：
ｔ＝０の場合、Ｂ／Ｂ0＝ｋas＊［Ｓ0］／ｋan＊［Ｓon］  （３）
ｔ≒∞の場合、Ｂ／Ｂ0＝Ｋs＊［Ｓ］／Ｋn＊［Ｓn］          （４）
（式中、ｓは特異的結合を表し、ｎは非特異的結合を表す）。
【００８１】
図２を参照して、領域１で示した期間中に、両曲線は直線状であり、Ｂ／Ｂ0比は一定
且つ最大値である。領域２において特異的結合Ｂは安定に達するので、領域３の期間中、
比Ｂ／Ｂ0は、Ｂ0が増加し続けているので減少する。領域４の期間中、Ｂ0が安定に達し
、比Ｂ／Ｂ0は、一層低い、一定の、平衡レベルを呈する。
図２を参照すれば、この発明のサンドイッチアッセイは、好ましくは、標識した第２結
合リガンドを固相物質に接触させる工程が領域３の上界以内に時間制限されるように行な
われることは明白である。即ち、この工程は、非特異的結合レベルが安定に達する機会を
有しないで且つ比Ｂ／Ｂ0が一層低い、一定の、平衡値を呈しないように行なわれる。
【００８２】
この発明の特に好適なサンドイッチアッセイにおいて、この工程は、図２に示したグラ
フの領域２の上界以内に時間制限される。最も好ましくは、この発明のサンドイッチアッ
セイは、この工程で、図２のグラフの領域１の上界以内に時間制限される。
【００８３】
換言すれば、本発明のサンドイッチアッセイは、特異的（即ち、第２結合パートナー／
分析物／第１結合パートナー複合体）及び非特異的（即ち、第２結合パートナー／固相）
結合反応の両者がそれらの各々の結合曲線の直線状領域内にあって且つ平衡に達しない条
件下で十分制限された時間行なうのが最も望ましい。かかる環境下で、特異的結合の非特
異的結合に対する比Ｂ／Ｂ0は、一定である。
【００８４】
本発明のサンドイッチアッセイのこの工程を、図２のグラフの領域１の上界以内に時間
的に制限したならば、この反応工程の時間を更に制限する利益のないことも又、明白であ
る。事実、更なる反応時間の減少は、それらが生成されるシグナルの全量を減じるので望
ましくない。
【００８５】
標準的サンドイッチアッセイにおいて、特異的及び非特異的結合反応の両者は、平衡に
まで進行することができる（図２の領域４以降）。非特異的結合は、かかるアッセイにお
けるバックグラウンド反応「ノイズ」に有意に寄与し得る。標識した第２結合リガンドを
固相物質と接触させる工程が図２のグラフの領域１、２及び／又は３の上界以内に時間制
限される、この発明の方法により行なわれるサンドイッチアッセイは、かかる非特異的結
合が有意にバックグラウンド反応ノイズに寄与する標準的サンドイッチアッセイを超える
改良された感度を示す。
【００８６】
リアルタイムでシグナル生成を監視する能力の更なる利益は、特異的アッセイにおける
ある種の問題を検出するのに用いることのできる「品質保証」曲線の確立を可能にするこ
とである。未だ完全に履行され、試験されてはいないが、品質保証曲線の構築は、下記の
工程を用いて達成される：
１．生の出力データ（空気泡の有無につき、図３に表示）を、破線で示したように、数
学的関数に当てはめる。用いる関数が特定のアッセイ及び用いる特定のタイミング及び流
量に依存することは、予想される。この関数は、それぞれ特定の時間間隔をカバーする幾
つかの関数からなっていてよいことは、予想される。データの関数への当てはめは、標準
的当てはめプログラム例えば最小二乗最適当てはめアルゴリズムを用いて達成され、関数
パラメーターを変え、最適当てはめを得る。この当てはめアルゴリズムは、当てはめた関
数とデータセットとの間の差異を最小化する。
２．当てはめの後に、コンピューターは、当てはめたデータと関数との間の残余の差異
を、予めプログラムした域値と比較する。
３．もし残差が域値を超えるならば、コンピューターは、その実施を不備として知らせ
、自動化のレベルに応じて可能ならば自動的に再実施する。
示したデータにおいて、ｘ軸上の約６５における大きいスパイクは、残差を増大させて
域値を超えさせることが予想される。この域値は、関数を、良い及び悪いデータの大きい
セットに当てはめることにより決定される。
結合動力学から導いた方程式への当てはめは、異常に高い非特異的結合による偽陽性及
び偽陰性を拒絶する品質保証方法の利用を可能にするに違いない。この予想は、データ適
合において、アフィニティー定数パラメーターが許容限界を超えることである。
【実施例１】
【００８７】
この実施例においては、競争的アッセイを、この発明の方法にて実施する。
この競争的アッセイのために、用いた固相は、直径９０〜１２５μｍのＰＭＭＡ粒子で
あった。これらの粒子は、インジアナ、Ｃａｒｍｅｌ在、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から得た。それらを、粒子２００ｍｇを、１ｍｇ／ｍｌのゲンタマ
イシン−ＢＳＡ結合体（ニュージャージー、Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ在、ＯＥＭ  Ｃｏｎｃ
ｅｐｔｓ、ロットＮｏ．１３５−６８７４９）を含むミズーリ、  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  
在、  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）（パーツＮｏ．
１０００−３）１ｍｌと混合することにより吸着被覆した。この混合物を、１時間、連続
的に揺り動かしながらインキュベートした。１時間のインキュベーションの後に、これら
の粒子を沈殿させ、上清を吸い出した。次に、１０％の正常ヤギ血清（ペンシルベニア、
Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  在、  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  品番００５−０００−１２１０）のブロッキング溶液１ｍｌを
加えて、再び、これらの粒子を１時間揺すった。次いで、これらの粒子をＰＢＳ中で３０
ｍｌに希釈し、容器中に維持した。
【００８８】
この反応チャンバーは、内径約１．７ｍｍのガラスキャピラリー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログＮｏ．２１−１６４０２Ｊ  ）であって、ほぼ中心に付着さ
せた４８μｍのナイロンメッシュを有するものであった。この反応チャンバーを、管によ
り、コンピューター制御されたシリンジポンプ及びバルブに接続し、これらのアッセイ工
程のシーケンス及びタイミングを正確に制御する。
【００８９】
アッセイを行なうために、最初に、次のように反応チャンバーに粒子を詰める：反応チ
ャンバーを３０秒間バックフラッシュして前のアッセイからの如何なる物質をも除去する
。次に、５００μｌのＰＢＳを２０秒間前向きに反応チャンバーを通して流す。この時間
中、機械的撹拌機が粒子の容器を撹拌してこれらの粒子を均質に懸濁させる。次の３０秒
間にわたって、７５０μｌの粒子含有溶液を、ナイロンメッシュのトップにおいて約５ｍ
ｇの粒子をパックした反応チャンバーを通して流す。その次に、他の６００μｌの前向き
のＰＢＳ流を２４秒間にわたって流す。次は、１０秒間にわたる６０μｌの穏やかなバッ
クフラッシュであり、その後２０秒間は何も流さない。これは、ビーズを重力により沈殿
させて均一なビーズパッキングを確実にするために行なう。最後に、６秒間にわたる１６
０μｌのＰＢＳの前向きの流れが、アッセイのための反応チャンバーを準備する。
【００９０】
抗体溶液を、次のように調製する：マウスの抗ゲンタマイシン抗体（カリフォルニア、
Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ在、  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、品番１６１０
２）を、ＰＢＳにて０．１μｇ／ｍｌまで希釈する。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び２μｇ／
ｍｌのＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗体（ペンシルベニア、  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  
在、  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ、品番１１
５−０９５−０７１０）を加え、この溶液をインキュベートしてこれらの抗体を平衡に到
達させる（約３０〜６０分間）。
【００９１】
この実施例においては、これらの試料を、濃度０、１、３及び１０ｎｇ／ｍｌにてゲン
タマイシンで全乳スパイクした。これらの試料を器械中に置き、その器械は試料１．５ｍ
ｌを流し、他方、更なる１．５ｍｌの抗体混合物を反応チャンバーを通して１２０秒間に
わたってフロー流れ中に注入した。その後に、３ｍｌでの洗浄を１２０秒間行なった。蛍
光出力を、試料／抗体流れの２４０秒間及び洗浄時間の間中監視した。これらの４つの試
料の測定を三連で行ない、生出力を図４に示す。
この実施例中に示したように、約１５秒間（注入点から反応チャンバーまでに要する時
間）の予備インキュベーション時間は適当であり、優れた感度及び再現可能性を与える。
【実施例２】
【００９２】
この実施例は、未希釈標識を参照液として用いる一点較正の概念を示す。これらの粒子
を、実施例１と同じ手順を用いて調製する。反応チャンバーに粒子を詰めた後に、３通り
の濃度（０、１又は１０ｎｇ／ｍｌ）の内の１つにて試料と混合した抗体を、１分間、１
．５ｍｌ／分の速度でこれらの粒子上を及び該粒子を通して流す。その後、同じ速度で１
分間洗う。次に、純粋な未希釈の抗体を同じ速度で４０秒間流して第２の結合シグナルを
起こし、これは、この場合、基準である。その後、更に１分間緩衝液で洗う。
【００９３】
図５は、同じ固相を用いて、２つの順次的結合シグナルを生成することが可能であるこ
とを示している。約１４０〜１７０秒に生じて基準を表している第２の結合勾配は、再現
可能であり且つ約２５〜７０秒に生じている試料結合を変えることにより有意に影響を受
けないので、それらは、全システム性能の直接的測定を与える。
【実施例３】
【００９４】
一連の競争的アッセイの実施を、この発明のアッセイ方法を用いて、感度及び正確さに
影響を与え得る因子の基本的理解を得る目的で、濃度既知のジゴキシンを分析物として用
いて行なった。
これらの実施例においては、濃度１ｍｇ／ｍｌの被覆用溶液を用いて、上記のゲンタマ
イシンの実施例と同じ手順によって、固相粒子をジゴキシン−ＢＳＡ（マサチューセッツ
、  Ｂｏｓｔｏｎ在、  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、  品番６８５）で被覆した
。
これまで、メイン、  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  在、  Ｂｉｎａｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
により商標「Ｐｈａｓｅ  ＩＩ」で販売された、市販のジゴキシン放射免疫アッセイキ
ットに含まれる一連のジゴキシン血清標準を分析物として用いた（ジゴキシン濃度は、ヒ
ト血清１ｍｌ当り、それぞれ、０．０、０．５、１．０、２．０及び４．０ｎｇである）
。各例において、それを下記に別途示さない限り、ＰＢＳ中の１：４０，０００のウサギ
抗ジゴキシンで１：４の比に希釈した。
【００９５】
この一連の実験における第１抗体は、下記に別途示さない限り、ＰＢＳ中の１：４０，
０００の希釈のウサギ抗ジゴキシンであった。
第２抗体は、０．１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ１ｍｌ当り１マイクログラム
のフルオレセインイソチオシアネートに結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンであった。
採用したアプローチは、各流量、第１抗体濃度及び分析物希釈率を、他の２つの因子は
可能な限り一定に保って変化させることであった。
標準的な条件のセットを選び、それからの変動を作成した。これらの条件は：
流量＝７５０マイクロメートル／分
第１抗体濃度（“［ＡＢ］”）＝１：４０，０００希釈
分析物濃度（“［分析物］”）＝１：４希釈
これらの実施のすべてにおいて、被覆したビーズを、上記のゲンタマイシンの実施例と
同じ方法でシステムに導入した。各アッセイの後に、ビーズパックを管からフラッシュし
て出し、新しいものを同様に挿入した。
【００９６】
これらの各アッセイの実施のために、分析物を第１抗体溶液で希釈し、それにより、分
析物と第１抗体とを予備反応可能にする。この分析物希釈物を、選択した流量に等しい容
積で、１分間にわたってキャピラリー導管に導入した。次いで、第２抗体溶液の１，５０
０μｌのアリコートを１２０秒にわたって導入し、次いで、ビーズを３０００μｌのＰＢ
Ｓで１２０秒間洗った。
最初の一連の実験において、試料の流量を下記の表１に示したように変えた。表１に示
した実施について、ビーズにさらされた全試料容積は、各例において、１分間に導入され
た容積であることが理解されよう。
【００９７】
【表１】
2006098418.tif 000003
【００９８】
この表は、１５００μｌ／分の流量においてＣ．Ｖ．データが最良となることを示すが
、すべてのＣ．Ｖ．データは、当分野で一般に許容し得ると考えられる５．０％範囲内に
ある1*。図６は、可変流量データからプロットした標準曲線を示している。予想されるよ
うに、流量の変化は、阻止％曲線（図７）に影響を与えず、殆ど用いた全試料／抗体の変
化のために全体のレベルを変えるだけである。
〈1*この実施例におけるこの数値は、三連の測定値の平均を表している。但し、この
アッセイのセットにおいてなされた４５の全測定の内、４〜９の結果は、フロー導管キャ
ピラリー中の空気泡の発生のために捨てた。〉
【００９９】
第２の実験のシリーズにおいては、第１抗体の希釈を下記の表２に示したように変化さ
せ、他方、流量を毎分７５０μｌに及び現実に用いる試料の容積を７５０μｌに維持した
。やはり三連で実施し、表２に与えた値はこれらの平均である。
【０１００】
【表２】
2006098418.tif 000004
【０１０１】
表２は、完全なシグナル阻止に近づくと乏しい変動係数が得られることを示している（
１：１００，０００希釈の実施）。図８は、第１抗体の希釈を変化させたときの標準曲線
のプロットであり、予想されるように、第１抗体の希釈率が増大するにつれて感度が増加
することを示している。これは、シグナルを阻止するジゴキシンの濃度（ゼロ濃度から２
標準偏差に等しい量）を計算することにより明確になる。この実施例については、１：２
０，０００は、．４９４ｎｇ／ｍｌを与え、１：４０，０００は、．３９２ｎｇ／ｍｌを
与え、そして１：１００，０００は、．０５０ｎｇ／ｍｌを与える。
【０１０２】
実施の第３のシリーズ（やはり三連で実施）を行なって分析物の希釈の変化の影響を試
験した。分析物を第１抗体溶液で希釈するので、各分析物希釈率の変化は、この変化が計
算されなかったときでも、分析物及び第１抗体希釈の変化を生じるということは注意すべ
きである。すべての場合に、分析物溶液を、１：４０，０００第１抗体溶液で希釈した。
表３は、この一連のアッセイ実施の各々の平均デルタ及びＣ．Ｖ．値を示している：
【０１０３】
【表３】
2006098418.tif 000005
【０１０４】
これらのデータは、一般に許容し得る限界内のＣ．Ｖ．を示している。図９は、各希釈
率についてのジゴキシン濃度に対するシグナルのプロットである。それは、再び、第１抗
体の希釈を増すにつれて、即ち、遊離の第１抗体濃度が減じるにつれて、感度が増加する
という我々の理解に従う。
【実施例４】
【０１０５】
サンドイッチ型アッセイを、前述の実施例と同じシステムを用いて行なった。実施例１
で同定したのと同じビーズを、実施例１に記載した方法で、ＰＢＳ中の濃度０．１ｍｇ／
ｍｌのヒツジ抗ウマフェリチンで被覆した。これらの被覆したビーズを、実施例１に示し
た方法で、ＰＢＳ中の１０％ヒツジ血清でブロックした。
【０１０６】
各測定において、実施例１に記載したレンズ手段のキャピラリー導管中に、ビーズパッ
クを確立した。分析物試料を、既知量のフェリチン（ウマ脾臓由来）を、ＰＢＳ１ｍｌ当
り０．０ｎｇ、５．０ｎｇ及び５０ｎｇの濃度レベルでＰＢＳ中に加えることにより調製
した。
【０１０７】
ＦＩＴＣで標識したヒツジ抗ウマフェリチンを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に、１
μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、「サンドイッチ」抗体として用いた。
【０１０８】
これらのアッセイを、次のように行なった：４００μｌの分析物溶液を、ビーズパック
を通して、２０秒間流し、次いで、７５０μｌの標識したヒツジ抗ウマフェリチンを、ビ
ーズパックを通して、３０秒間流し、その後、ビーズパックを、１５００μｌのＰＢＳで
、６０秒間洗った。各濃度の分析物について、二連で実施した。下記の表４は、３つのフ
ェリチン濃度のすべてについて、デルタ及び勾配値を、関連するそれぞれのシグマ及びＣ
．Ｖ．値と共に示している。
【０１０９】
【表４】
2006098418.tif 000006
【０１１０】
図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれ、これらのアッセイについての、フェリチン濃度（ｎ
ｇ／ｍｌ）に対するデルタシグナルのプロット及びフェリチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対す
る勾配のプロットである。
【実施例５】
【０１１１】
競争的アッセイを、乳中ゲンタマイシンの濃度を変化させて行なった。
ビーズを、実施例に記載した方法で調製した。各アッセイ用のビーズパックを、実施例
１に記載した流量及びタイミングを用いて確立した。
第１及び第２抗体を、室温で１時間のインキュベーションにより調製した。第１抗体（
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度の抗ゲンタマイシン）を第２抗体（
同緩衝液中の４μｇ／ｍｌの濃度）と合わせてインキュベーションを進行させた。
【０１１２】
分析物溶液を、乳１ｍｌ当り２８ｎｇのゲンタマイシンを含む全乳の連続希釈法により
調製して、乳中のゲンタマイシンの濃度レベルが０．０、０．１１、０．２２、０．４４
、０．８８、１．７５、３．５、７及び１４μｇ／ｍｌの試料を得た。これらの一連の希
釈物の各々を、等容量の予備インキュベートした第１／第２抗体溶液と合わせてアッセイ
測定を行なった。
【０１１３】
各アッセイにおいて、１５００μｌの合わせた試料／抗体溶液を、ビーズパックを通し
て、６０秒間流し、次いで、３０００μｌのＰＢＳを、洗浄として、ビーズを通して、１
２０秒間流した。表５は、すべてのゲンタマイシン濃度レベルについて、二連のアッセイ
についての平均デルタ及び勾配（算出値）を、各々のシグマ及びＣ．Ｖ．と共に示してい
る。
【０１１４】
【表５】
2006098418.tif 000007
【０１１５】
最初の０．０ｎｇ、０．１１ｎｇ、０．４４ｎｇ、１．７５ｎｇ及び７．０ｎｇのセッ
トの測定を、残りのアッセイと異なる日に行なった（従って、０．０ｎｇのアッセイは反
復した）。
図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれ、ゲンタマイシン（ｎｇ／ｍｌ）に対するデルタシグ
ナル及びゲンタマイシン（ｎｇ／ｍｌ）に対する計算した勾配のプロットである。図１１
Ａ及び１１Ｂは又、本発明の「競争的」アッセイシステムの大きい直線的範囲のグラフ表
示をも与える。
【実施例６】
【０１１６】
ゲンタマイシン一点較正液の研究を行なった。この研究においては、ビーズを、実施例
１に記載のように被覆し且つブロックした。各アッセイのために、実施例１に記載のよう
に、キャピラリー導管中に、ビーズパックを確立した。
第１／第２抗体試薬を、実施例１におけるように調製した。
分析物試料を、全乳中のゲンタマイシンの連続希釈により調製して、乳中の終濃度を０
．０、１．２５、２．５、５．０及び１０．０ｎｇ／ｍｌとした。次いで、各々を、等容
積の第１／第２抗体試薬と混合した。
基準物質又は較正液は、分析物試料と同じ方法で調製した５ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシ
ン（乳中）であった。
【０１１７】
較正液と分析物試料とを、同じ方法で実施したが、それは、１５００μｌの較正液をビ
ーズを通して６０秒間流し、その後、１５００μｌの分析物を含む試料をビーズパックを
通して１２０秒間流し、その後、１５００μｌのＰＢＳを６０秒間流し、次いで、３００
０μｌのＰＢＳを１２０秒間流すことを必然的に伴った。
各試料を、較正液及び未知試料を用いて、三連で、一列の各時間にて行なった。勾配の
値についての平均の結果を、関連するシグマ及びＣ．Ｖ．と共に、表６に示す：
【０１１８】
【表６】
2006098418.tif 000008
【０１１９】
この表は、再び、勾配の優れた再現可能性を示し、試料濃度に依存しない。
前述の実施例は、単に、本発明の説明であって、制限することを意図するものではない
。更に、前述したものは、単に、本発明のある好適具体例の詳細な説明であることは理解
されるべきである。それ故、後述の請求の範囲に記載のように、本発明の精神及び範囲か
ら離れることなく種々の変法及び同等物を作成し得ることは、当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明と標準的ＥＬＩＳＡアッセイとの比較を示している。
【図２】特異的（Ｂ）及び非特異的結合（Ｂ0）についての代表的結合曲線を示している。
【図３】不備の有無における代表的出力を示している。
【図４】全乳中のゲンタマイシンについての代表的曲線族を示している。
【図５】試料及び較正シグナルのグラフを示している。
【図６】変化させた流量に対する標準曲線を示している。
【図７】幾つかの流量についての、濃度に対する阻止パーセントを示すグラフを示している。
【図８】変化させた抗体希釈についての標準曲線を示している。
【図９】変化させた分析物希釈についての標準曲線を示している。
【図１０Ａ】フェリチン濃度に対するシグナルを示している。
【図１０Ｂ】フェリチン濃度に対するシグナルを示している。
【図１１Ａ】ゲンタマイシン濃度に対するシグナルを示している。
【図１１Ｂ】ゲンタマイシン濃度に対するシグナルを示している。
【図１２】典型的な競争的アッセイ（「解離あり」）についての時間に対する複合体形成のプロットを、予備形成した分析物−第２結合リガンド複合体の解離がない理想化した競争的アッセイ（「解離なし」）と比較して示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006098418.tif 000016
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2006098418.tif 000019
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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