(57)【要約】【課題】インフルエンザ感染症特異的な治療製剤としてのオセルタミビルは感染初期での投与でしかその効能が発現されないこと、乳児には投与できないこと、インフルエンザ感染症が重症化した際の特異的な治療法が確立されていないこと。また，予防としてのインフルエンザワクチン接種は、その効能が発現するのに時間を要すること。【解決手段】コンビナトリアル科学法およびファージディスプレイ法を用いてヒトFabを発現する遺伝子群IF1A11を分離し、その遺伝子産物であるFabIF1A11が、インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプに対して効果的に中和活性を有することを発見した。遺伝子産物であるFab IF1A11はヒトFabであり、現在インフルエンザ感染症に対するワクチンによる予防、および特異的治療製剤が持つ欠点を補う可能性のある分子であると思われた。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトFab抗体を発現する遺伝子群（IF1A11）であって、IF1A11は２つの遺伝子からなり、そのうちの一つは発現されるFab抗体の重鎖部分の遺伝情報を持つIF1A11HCであり、もう一つは発現されるFab抗体の軽鎖部分の遺伝情報を持つIF1A11LCであり、前記IF1A11HCの塩基配列は
aggtgcagctgctcgagcagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgcgcagcgtctggtttcatgttcgatgactttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggaatgggtggcagtaatatgggctgatggatttgagaaaaactatgaagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacactatatctccaaatggaccgcctgcgagccgaggacacggctgtttacttctgtgcgagagatggggactcgataacgtttgcgagacttctcgacccgcccttctacaagggtatggacgtctggggccaagggagcatggtcaccgtctcctcaであり、前記IF1A11LCの塩基配列は
gtgttgacgcagtctccagccaccctgtctgcttctcccggggaaagagtcaccctctcctgcagggccagtcagagtgtcggcagcaacttagcctggtaccggcagaggcctggccaggctcccaggctcctcatgtatggtgcttccaccagggtcgctggtgtcccagcccggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcaaccttcagtctgaagattttgcagtctattactgtcagcaatataatgactggcctccgttcacgtttggccaggggaccaaggtggacatcaaacgaactであり、前記塩基配列から得られるアミノ酸配列は、前記IF1A11HCでは、
FR1：EVQLLEQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFMFD、CDR1：DFGMH、FR2：WVRQAPGKGLEWV、CDR2：AVIWADGFEKNYEDSVKG、FR3：RFTISRDNSKNTLYLQMDRLRAEDTAVYFC、CDR3：ARDGDSITFARLLDPPFYKGMDV、FR4：WGQGSMVTVSSであり、前記IF1A11LCでは、
FR1：VLTQSPATLSASPGERVTLSC、CDR1：RASQSVGSNLA 、FR2：WYRQRPGQAPRLLMY  、CDR2 ：GASTRVA、FR3：GVPARFSGSGSGTDFTLTISNLQSEDFAVYY 、CDR3：CQQYNDWPPFT、FR4：FGQGTKVDIKRTであり、この遺伝子群（IF1A11）の遺伝子産物がインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するヒトFab抗体（Fab IF1A11）を発現することを特徴とするヒトFab抗体遺伝子群である。
但し上記FRはフレームワーク部分 (framework region)、CDRはcomplementary determining region 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するヒトFab抗体を発現する遺伝子群に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ感染症を予防する目的の製剤はインフルエンザワクチンがあり、治療する目的の製剤はオセルタミビルがある。また、重症化したインフルエンザ感染症（インフルエンザ脳炎・脳症など）には特異的な治療法が無かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、インフルエンザワクチンはその予防効果が顕在化するまでに時間がかかる。またオセルタミビルはその治療効果は感染初期の投与に限定され、かつ乳児には使用不可能である。
そこでインフルエンザ感染症を即効的に予防し、かつ患者の年齢、感染病期に拘泥されない特異的でかつ安全、安定的に供給可能なインフルエンザ感染症の予防および治療抗体（製剤）の開発が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、その遺伝子産物Fab抗体分子が上記問題を解決するヒトFab抗体の遺伝情報を有する遺伝子群である。
すなわち本発明は、ヒトFab抗体を発現する遺伝子群（IF1A11）であって、IF1A11は２つの遺伝子からなり、そのうちの一つは発現されるFabの重鎖部分の遺伝情報を持つIF1A11HCであり、もう一つは発現されるFabの軽鎖部分の遺伝情報を持つIF1A11LCであり、前記IF1A11HCの塩基配列は図１−１に示すごとく、
aggtgcagctgctcgagcagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgcgcagcgtctggtttcatgttcgatgactttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggaatgggtggcagtaatatgggctgatggatttgagaaaaactatgaagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacactatatctccaaatggaccgcctgcgagccgaggacacggctgtttacttctgtgcgagagatggggactcgataacgtttgcgagacttctcgacccgcccttctacaagggtatggacgtctggggccaagggagcatggtcaccgtctcctcaであり、前記IF1A11LCの塩基配列は
gtgttgacgcagtctccagccaccctgtctgcttctcccggggaaagagtcaccctctcctgcagggccagtcagagtgtcggcagcaacttagcctggtaccggcagaggcctggccaggctcccaggctcctcatgtatggtgcttccaccagggtcgctggtgtcccagcccggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcaaccttcagtctgaagattttgcagtctattactgtcagcaatataatgactggcctccgttcacgtttggccaggggaccaaggtggacatcaaacgaactであり、前記塩基配列から得られるアミノ酸配列は、図１−２に示すごとく前記IF1A11HCでは、
FR1：EVQLLEQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFMFD、CDR1：DFGMH、FR2：WVRQAPGKGLEWV、CDR2：AVIWADGFEKNYEDSVKG、FR3：RFTISRDNSKNTLYLQMDRLRAEDTAVYFC、CDR3：ARDGDSITFARLLDPPFYKGMDV、FR4：WGQGSMVTVSSであり、前記IF1A11LCのアミノ酸配列は、
FR1：VLTQSPATLSASPGERVTLSC、CDR1：RASQSVGSNLA 、FR2：WYRQRPGQAPRLLMY  、CDR2 ：GASTRVA、FR3：GVPARFSGSGSGTDFTLTISNLQSEDFAVYY 、CDR3：CQQYNDWPPFT、FR4：FGQGTKVDIKRTであり、この遺伝子群（IF1A11）の遺伝子産物がインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するヒトFab（FabIF1A11）を発現することを特徴とするヒトFab抗体遺伝子群である。
但し上記FRはフレームワーク部分 (framework region)、CDRはcomplementary determining region 
【発明の効果】
【０００５】
即ち本発明の前記遺伝子産物FabIF1A11は、インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプのHAタンパク部分を特異的に認識してそれと結合し中和能を示すことが判明したのである。 
そこで本発明において、遺伝子産物としてインフルエンザ感染症に有効な（中和機能を有する）ヒトFab抗体を発現するヒト遺伝子群（IF1A11）は、コンビナトリアル科学とファージディスプレイ法を組み合わせることにより選別した。ヒト抗体であるので、適切に調整した際、副反応の可能性が極めて少なく、理論的には患者年齢、病期に拘泥されないインフルエンザ感染症に特異的な安全な抗体分子（Fab抗体、および完全型IgG1抗体）が作成できる。また抗体分子の大量発現系の構築が可能であるので、本遺伝子群を通じて安定的で安価な抗体製剤を医療現場に供給できる可能性がある。
また本発明のヒトFab抗体遺伝子群が発現する抗体分子は、インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプのHAタンパク部分に特異的に結合し、これを中和するため、インフルエンザ感染症の診断等にも応用が可能である等の優れた効果を得ることができる。
本発明の上記ヒトFab抗体遺伝子群は、表１に記載のように次の３つの定量的効能を有する。  
1）．遺伝子産物である上記ヒトFabIF1A11はインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプOkayama株を0.1μg/mLの濃度で、ウイルス量を初期投与量の50%に減弱できる。
2）．遺伝子産物であるヒトFabIF1A11はインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプKitakyusyu株を1.0μg/mLの濃度で、ウイルス量を初期投与量の50%に減弱できる。
3)．遺伝子産物であるFabIF1A11抗体は、基本的にヒトタンパク分子であり、ヒト投与による異種抗原反応性は理論上存在しない。
ここでOkayama株は2001年の分離株であり、Kitakyusyu株は1993年の分離株である。すなわちFabIF1A11抗体は、この間約8年間に分離されたインフルエンザウイルスA型H3N2株に対して効果的な中和を示すものとと思われる。
上記遺伝子産物FabIF1A11抗体のインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプに対する中和効果を表１に示す。
【０００６】
【表１】
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【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
実施例で具体的に詳述するが、本発明のIF1A11遺伝子群を発現ベクターに組み込み、大腸菌などに、上記ヒトFabIF1A11抗体を大量に発現させることができる。アフィニティーカラムなどを用いれば、FabIF1A11抗体部分だけを分離・精製することができる。
また、本FabIF1A11抗体遺伝子をヒト抗体Fc部分を含む特殊な発現ベクターに組み替え、CHO細胞などの動物培養細胞などで発現させると、より効率的にインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプのHAタンパク部分を特異的に認識して結合して中和し、かつ血中半減期の長い完全型ヒトIgG1分子（IgG1IF1A11抗体）の産生が可能となる。
【実施例１】
【０００８】
本実施例によるヒトFab抗体遺伝子は、目標とする作用効果を、インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプOkayama株を2.0μg/mLの濃度で細胞への感染を90%以上阻止し、また0.1μg/mLの濃度で同株初期投与量の細胞への感染を50％阻止することに設定した。
またインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプKitakyusyu株を20μg/mLの濃度で培養細胞への感染を90%以上阻止し、1.0μg/mLの濃度で同株初期投与量の細胞への感染を50%阻止することに設定した。
以下に特殊ベクター（pComb3H）による本発明の遺伝子抽出方法と、遺伝子群からの遺伝子産物FabIF1A11抗体発現方法と、アフィニティーカラムでFabIF1A11抗体を分離・精製する方法を具体的に詳述する。
(1)、遺伝子抽出方法（使用ベクターの具体例と新発見遺伝子釣り上げ方法）
インフルエンザ回復後の健康人ボランティアの同意を得て末梢血リンパ球を採取し、そこから全mRNAを抽出の後、oligo-dTを用いた逆転写反応によりcDNAに変換する。ヒト抗体特異プライマー（重鎖部分9対、軽鎖部分７対）を用い、作成したcDNAをテンプレートにヒトFab部分の重鎖、軽鎖部分に相当する塩基配列分子をPCRで増幅する。増幅産物をpComb3Hベクターにそれぞれ組み込み、ヒトFabライブラリーを構築する。大腸菌（XL1-Blue）を構築したFabライブラリーで形質転換し、ヘルパーファージを重感染させると、組み込んだFab部分をファージ表面に発現する（ファージプール）。ポリスチレン製のプレートに市販のインフルエンザHAワクチン（北里研究所、２５μg/mLに希釈）を固層化する。同ワクチンにはインフルエンザウイルスA型H1N1サブタイプ、H3N2サブタイプ、およびインフルエンザウイルスB型のHAタンパクが多く含有されており、そこにFabを発現したファージプールを反応させると、特異的にインフルエンザウイルスHAタンパクに結合するFabを発現するファージが残存し，結合しないものは洗浄除去する。これらの行程を３〜４回行うと、インフルエンザウイルスHAタンパク抗原特異Fab発現ファージが濃縮される。インフルエンザウイルスHAタンパク抗原特異Fab発現ファージが濃縮されたファージプールを大腸菌（XL1-Blue）に感染させ、プラスミドを得る。プラスミドからgeneIII遺伝子を除去し、組み込まれたFab遺伝子群が乳糖誘導体(IPTG)の添加によりFab分子を、大腸菌培養液中に遊離発現できるようにする。ここで発現されたFabのうち、インフルエンザウイルスHAタンパク抗原に特異的に結合するものを抗原―抗体反応（ELISA法）を利用することにより選別する。選別したFab発現クローン群から、インフルエンザウイルスHAタンパクによる赤血球凝集を効果的に抑制するFab抗体を発現するクローンを、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集抑制試験（HI法）を行うことで決定する。一般的にHI能と中和活性能とは強い相関がある．強いHI能を示したFab抗体を、インフルエンザウイルスA型H1N1サブタイプ、インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプ、インフルエンザウイルスB型によるBHK細胞への感染を阻止する試験（中和試験）で、それぞれのインフルエンザウイルスに対する中和活性を決定する。以上のように、効果的にインフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを中和するFab抗体を発現する遺伝子をつりあげた。
(2)、遺伝子からのFab抗体発現方法
前記(1)で選別したインフルエンザウイルスを効果的に中和するFab抗体を発現する遺伝子が組み込まれたpComb3Hベクターから、定法どおりFab抗体を発現させる。つまり同Fab抗体遺伝子群を含むpComb3Hベクターにより大腸菌（XL1-Blue）を形質転換する。抗生物質アンピシリンを含んだスーパーブロス等に乳糖誘導体（IPTG）を添加し、30度で一夜振揺培養する。遠心により大腸菌沈渣を集め中性緩衝液に懸濁する。超音波により大腸菌を破砕し、大腸菌内部に発現蓄積されたFab抗体を遊離させる。これを「Fab抗体粗精製標品」とする。1.0 Lの大腸菌培養液から約10mLのFab抗体粗精製標品が得られる。
(3)、アフィニティーカラムでFab抗体だけを純化する方法（アフィニティーカラムも詳述）
定法のとおり、希釈した抗ヒトF(ab)2抗体（市販）をNHS活性化カラム（市販）に充填し、ヒトFab抗体捕捉用アフィニティーカラムを作成する。作成したアフィニティーカラムを液体クロマトグラフィーモジュールであるアクタ・プライム（アマシャム社製）に装着する。上記（２）で作成した「インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するFab抗体粗精製標品」約2.0 mLをカラムに充填する。低pH緩衝液（グリシン塩酸溶液：pH2.7など）を用い、速度1.0 mL/分で溶出するとヒトFab精製標品を含む分画が分取されてくる。pHを中性に調節後、不要な塩を透析除去し、限外ろ過膜でFabを含む部分を濃縮する。約10mLのFab抗体粗精製標品から約1.0 mg程度の精製ヒトFab抗体が回収される。
(4)、抗体製剤にする方法
FabIF1A11抗体はヒト抗体分子であるので理論的にはヒトに投与可能である。本Fab抗体遺伝子群をヒト完全型IgG1発現ベクターなどに組み替え、培養細胞などにIgG1抗体を発現させる。大量に培養し、アフィニティーカラムであるプロテインAまたはプロテインGカラムなどを用いてIgG1抗体部分を分離・精製する。適切な施設・設備のもとで培養・精製を行うと高純度の産物が得られる。定法どおりタンパク安定剤などで調整し、凍結乾燥粉末とする。使用時に要時調整して抗体製剤として用いる。IgG1抗体の効能部分を決定するのはFab抗体部分の前記特徴に記載の遺伝子配列情報である。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
インフルエンザ感染症は毎年地球規模で大きな流行を起こす。ワクチンによる効果的な感染予防は確立しているが、接種後効果発現まで１ヶ月前後かかるのが難点である。インフルエンザ感染症の特異的な治療製剤としてオセルタミビルがあるが、感染初期の投与でしか治療効果が期待できないこと、および１歳未満の乳児への使用は禁忌であるのが難点である。本発明のIF1A11遺伝子群によりヒト抗体を発現させ、臨床医学領域に抗体製剤を供給すれば、１．即効的なインフルエンザ感染症の予防という観点、２．重症インフルエンザ感染症に至った際の特異的な治療製剤という観点、３．患者の年齢、および病期に拘泥されないインフルエンザ感染症予防および治療製剤などの観点で大きな貢献が見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するヒトFab 抗体FabIF1A11を発現する遺伝子群IF1A11の塩基配列を示す。
【図１−２】インフルエンザウイルスA型H3N2サブタイプを効果的に中和するヒトFab 抗体FabIF1A11のアミノ酸配列を示す。
【符号の説明】
【００１１】
【図１−１】
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【図１−２】
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