(57)【要約】      （修正有）【課題】受容体とリガンドとの安定複合体構造を探索する。【解決手段】以下の第一工程から第七工程までを実行する。（a）リガンドの立体配座を発生させる第一工程、（b）受容体の存在し得る座標を、網羅的に探索し、ダミー原子Sを配置する第二工程、（c）ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、結合ポケットを設定する第三工程、（d）第三工程で規定された結合ポケットにおいて、受容体の重原子を選択し、仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する第四工程、（e）第一工程で発生させた重原子が、第二工程でランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる第五工程、（f）リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、スコアが極大となる配座を選択する第六工程、（g）第五工程から第六工程を繰り返し、受容体とリガンドの相対的な配座を選択する第七工程。【選択図】図１
2006113878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
計算機を利用して受容体とリガンドとの安定複合体構造を探索する方法であって、受容体とリガンドとの組み合わせについて以下の第一工程から第七工程を実行することにより、受容体とリガンドが安定して存在し得る構造を特定することを特徴とする方法：
（a）リガンドがとりうる立体配座を網羅的に発生させる第一工程、
（b）受容体の３次元構造モデルにおいて、半径0.5 〜 5 Å の球が受容体分子内の少なくとも４つの重原子と接触して存在し得る座標を、幾何学的な方法により網羅的に探索し、その座標位置に半径1 〜 3 Å のダミー原子Sを配置する第二工程、
（c）ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、少なくとも１つのダミー原子を含む結合ポケットを設定する第三工程、
（d）第三工程で規定された結合ポケットにおいて、ダミー原子Sの周囲3 〜 20 Åの範囲に存在する受容体の重原子を選択し、その座標位置に、−3 Å < r < −0.5 Å の範囲の仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する第四工程、
（e）第一工程で発生させたリガンド立体配座中の一つの重原子が、第二工程で規定されたダミー原子Sからランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる第五工程、
（f）リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、リガンド分子全体を回転及び平行移動させることにより、スコアが極大となる配座を選択する第六工程、
（g）第五工程から第六工程を繰り返し、安定な複合体を形成する受容体とリガンドの相対的な配座を選択する第七工程。
【請求項２】
前記第三工程において、さらに、結合ポケット内のダミー原子S間の距離を全て算出し、互いに 0.1〜2.0Å 以内に近接するダミー原子が複数存在する場合、そのうちの1つを残して近接する他のダミー原子を削除することを特徴とする、請求項１に記載の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
【請求項３】
前記第六工程において、リガンド原子として、リガンド内の重原子のみを考慮することを特徴とする、請求項１に記載の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
【請求項４】
さらに、前記第七工程で得られたリガンドの配置を初期構造として、分子力学計算により受容体との相互作用エネルギー的に安定な構造を求めることを特徴とする、請求項１に記載の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
【請求項５】
受容体とリガンドの安定複合体構造を探索するための処理を情報処理装置に実行させるためのプログラムであって、以下の手順を実行させるプログラム：
（a）リガンドがとりうる立体配座を網羅的に発生させる第一の手順、
（b）受容体の３次元構造モデルにおいて、半径0.5 〜 5 Å の球が受容体分子内の少なくとも４つの重原子と接触して存在し得る座標を、幾何学的な方法により網羅的に探索し、その座標位置に半径1 〜 3 Å のダミー原子Sを配置する第二の手順、
（c）ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、少なくとも１つのダミー原子を含む結合ポケットを設定する第三の手順、
（d）第三の手順により規定された結合ポケットにおいて、ダミー原子Sの周囲3 〜 20 Åの範囲に存在する受容体の重原子を選択し、その座標位置に、−3 Å < r < −0.5 Å の範囲の仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する第四の手順、
（e）第一の手順により発生させたリガンド立体配座中の一つの重原子が、第二の手順により規定されたダミー原子Sからランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる第五の手順、
（f）リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、リガンド分子全体を回転及び平行移動させることにより、スコアが極大となる配座を選択する第六の手順、
（g）第五の手順および第六の手順による処理を繰り返し、安定な複合体を形成する受容
体とリガンドの相対的な配座を選択する第七の手順。
【請求項６】
さらに、前記第七の手順によって得られたリガンドの配置を初期構造として、分子力学計算により受容体との相互作用エネルギー的に安定な構造を求める手順を有する、請求項５に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、農薬などの生理活性物質の分子設計に利用できる受容体分子とリガンド分子の安定複合体構造を見出すための計算機を利用した探索方法に関する。本発明はまた、当該方法を実行するためのプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物や生理活性物質の多くは、受容体となる生体高分子（タンパク質、核酸及びそれらを含む複合体）と、特定の部位で結合することによりその薬理活性ないしは毒性を発現する。
受容体の候補となる生体高分子の構造に関しては、 X 線や NMR などの分析機器とその結果を解析するソフトウェアの進歩により、従来に増して短期間で構造決定がなされるようになり、プロテインデータバンクなどのデータベースに登録されて公開されている。また一方、遺伝子の全塩基配列の解読が現実のものとなり、計算機を利用した分子モデリングの技術の進歩により、実験的に構造が確定されていない生体高分子についても、ある程度の立体構造を推定することが可能となっている。
【０００３】
このような生体高分子に結合する比較的低分子量の薬物、阻害剤などの化合物は、一般にリガンドと呼ばれ、ターゲットとなる受容体と安定な結合体を形成する可能性のあるリガンドを効率的に見出すことが、創薬研究において重要な基礎となる。生体高分子とリガンドの原子座標を入力し、生体高分子内のおおまかな結合部位（結合ポケット）を指定した上で、計算機を利用して受容体との妥当な結合様式を見出し、また、この計算を複数のリガンドに対して連続的に適用することにより、結合する可能性のあるリガンドを発見するあるいは、結合する可能性のない化合物をふるい落とすという計算方法は、計算機を利用した創薬研究の効率化の方法として広く知られている。これらの計算方法は、一般にドッキングスタディと呼ばれ、ある程度の精度を犠牲にして、多数のリガンドを高速で比較する場合は、バーチャルスクリーニングとも呼ばれる。また、このように受容体の三次元構造をもとにしてリガンドの分子を設計する研究手法は、構造依存創薬とも総称される。これらの方法を現実の分子系に適用するためには、（i）座標空間の効率的な探索、（ii）結合様式の妥当性を評価するための評価基準の２つを満たすアルゴリズムの開発が必須であり、それぞれ多くの方法が提案されている。しかしながら、複雑なリガンド分子の配座のみならず、その分子が受容体中で存在し得る相対的な位置まで含めた自由度を考慮すると、（i）で探索すべき空間の自由度は膨大なものとなり、完全に網羅的な探索を行うことは、現在の計算機能力をもってしても現実的ではない。また、（ii）の基準を数値化するための評価関数に関しても、完全なものはまだない。このように、計算による完全な探索は、理論的にみて限界があることは明らかではあるが、創薬研究の初期段階でこのような方法を活用することにより実際の合成実験および薬理活性試験の数を減らすことは、開発期間の短縮、 R&D の低コスト化にきわめて有効であるため、多くの研究がなされており（特許文献１または非特許文献１）、主なものは、ソフトウェア パッケージとして公開ないし市販されている（Tripos 社製 FlexX、Accelrys 社製 C2-LigandFit、 Schlodinger 社製 Glide など）。
【特許文献１】特許第2621842号明細書
【非特許文献１】DesJarlais R.L., et al., J. Med. Chem. 29, 2149-2153 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、一般にドッキング スタディは、リガンドの配座とそのリガンドが存在
し得る座標の組み合わせからなる無限の自由度を、いかに効率的に簡略化し、全ての座標空間を探索したと同等の効果を短時間であげることが、計算の速度と精度を上げるために必須の要件となっている。
【０００５】
特許第2621842号明細書では、その第1図に示されるように、受容体（生体高分子）の水素結合性官能基の水素結合の相手となりうるヘテロ原子の位置に設定したダミー原子をクラスタリングし、これと、予め配座解析されたリガンドの水素結合性ヘテロ原子からなる水素結合性部分とが一致するかどうかを水素結合様式及び配座に基づいて判定することを特徴とする受容体−リガンド安定複合体構造探索方法が開示されている。
しかしながらこの手法は、（i）一致する水素結合性部分の数が多い系では計算時間が非常に長くなる、（ii）水素結合様式にのみ注目して分類するため、受容体構造から推定される水素結合様式がリガンドと僅かに異なるだけで、実際には複合体として存在し得るリガンド構造を見逃したり、水素結合性ヘテロ原子以外の原子が受容体原子とぶつかる構造を生成してしまう場合がある。これらは、受容体の化学的な特徴に基づく仮定（受容体構造の簡略化）に起因する本質的な問題であり、回避するためには、研究者が経験をもとにマニュアルで重要な部分構造のみを選択ないしは定義しなおすことが必要であり、計算機による全自動のドッキングスタディを行う方法としては、適用範囲に限界がある。
このような状況から、リガンドと受容体の間に働く分子間相互作用を水素結合様式に限定するよりも、むしろ単純に結合ポケットの形状に適合するリガンドの候補構造を効率的に見出すことができれば、全自動のドッキングスタディを行うためには望ましい手法となると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述のような状況に鑑み、本発明者らは、鋭意検討の結果、生体高分子内の結合ポケットの位置推定と、その結合ポケット内に結合しうるリガンドの候補構造を、ポケット内でリガンド原子が存在し得る座標とその周囲の受容体原子の位置に、仮想的なダミー原子を規定し、予め計算化学的方法により発生させたリガンドの多様な配座を、このダミー原子モデルと適合するように配置することによって、受容体中でリガンドが安定複合体として存在する可能性のある配置を短時間で精度よく推定する方法の開発に成功した。さらに、この配置推定を、予め発生させておいた多様なリガンドの配座について連続的に行うことで、配座と結合様式を同時に決定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）計算機を利用して受容体とリガンドとの安定複合体構造を探索する方法であって、受容体とリガンドとの組み合わせについて以下の第一工程から第七工程を実行することにより、受容体とリガンドが安定して存在し得る構造を特定することを特徴とする方法：
（a）リガンドがとりうる立体配座を網羅的に発生させる第一工程、
（b）受容体の３次元構造モデルにおいて、半径0.5 〜 5 Å の球が受容体分子内の少なくとも４つの重原子と接触して存在し得る座標を、幾何学的な方法により網羅的に探索し、その座標位置に半径1 〜 3 Å のダミー原子Sを配置する第二工程、
（c）ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、少なくとも１つのダミー原子を含む結合ポケットを設定する第三工程、
（d）第三工程で規定された結合ポケットにおいて、ダミー原子Sの周囲3 〜 20Åの範囲に存在する受容体の重原子を選択し、その座標位置に、−3  Å < r < −0.5 Å の範囲の仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する第四工程、
（e）第一工程で発生させたリガンド立体配座中の一つの重原子が、第二工程で規定されたダミー原子Sからランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる第五工程、
（f）リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、リガン
ド分子全体を回転及び平行移動させることにより、スコアが極大となる配座を選択する第六工程、
（g）第五工程から第六工程を繰り返し、安定な複合体を形成する受容体とリガンドの相対的な配座を選択する第七工程。
（２）前記第三工程において、さらに、結合ポケット内のダミー原子S間の距離を全て算出し、互いに0.1〜2.0Å以内に近接するダミー原子が複数存在する場合、そのうちの1つを残して近接する他のダミー原子を削除することを特徴とする、（１）の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
（３）前記第六工程において、リガンド原子として、リガンド内の重原子のみを考慮することを特徴とする、（１）の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
（４）さらに、前記第七工程で得られたリガンドの配置を初期構造として、分子力学計算により受容体との相互作用エネルギー的に安定な構造を求めることを特徴とする、（１）の受容体−リガンド安定複合体構造探索方法。
（５）  受容体とリガンドの安定複合体構造を探索するための処理を情報処理装置に実行させるためのプログラムであって、以下の手順を実行させるプログラム：
（a）リガンドがとりうる立体配座を網羅的に発生させる第一の手順、
（b）受容体の３次元構造モデルにおいて、半径0.5 〜 5 Åの球が受容体分子内の少なくとも４つの重原子と接触して存在し得る座標を、幾何学的な方法により網羅的に探索し、その座標位置に半径1 〜 3 Å のダミー原子Sを配置する第二の手順、
（c）ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、少なくとも１つのダミー原子を含む結合ポケットを設定する第三の手順、
（d）第三の手順により規定された結合ポケットにおいて、ダミー原子Sの周囲3 〜 20 Åの範囲に存在する受容体の重原子を選択し、その座標位置に、−3 Å < r < −0.5 Å の範囲の仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する第四の手順、
（e）第一の手順により発生させたリガンド立体配座中の一つの重原子が、第二の手順により規定されたダミー原子Sからランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる第五の手順、
（f）リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、リガンド分子全体を回転及び平行移動させることにより、スコアが極大となる配座を選択する第六の手順、
（g）第五の手順および第六の手順による処理を繰り返し、安定な複合体を形成する受容体とリガンドの相対的な配座を選択する第七の手順。
（６）さらに、前記第七の手順によって得られたリガンドの配置を初期構造として、分子力学計算により受容体との相互作用エネルギー的に安定な構造を求める手順を有する、（５）のプログラム。
【発明の効果】
【０００８】
以上のように、本発明は、計算機を利用したドッキングスタディにおいて、受容体とリガンドの構造のみから自動的に安定複合体構造を短時間で特定するものである。しかも、使用者の経験や知識に頼ることなく、網羅的に構造を探索するにもかかわらず、バーチャルスクリーニングにも適用できる高速化を達成しており、汎用的かつ強力なドッキング手法を提供する。
本発明で開示された新規な探索方法を用いることにより、結合部位が特定されていない受容体に対してさえも短時間で安定複合体構造を特定することが可能となる。したがって、新規生理活性物質の開発のみならず、既知のリガンドが他の受容体と安定複合体を形成するかどうかを検討することにより、新たな薬理活性を見出し、あるいは副作用や毒性をもたらす可能性を事前に推定することができるため、創薬研究のコストと時間を大幅に改善することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において受容体とはリガンドが結合できる物質であれば特に制限されず、タンパク質、核酸、糖などの高分子化合物が挙げられるが、タンパク質が好ましい。尚、受容体は天然のものであっても、それらが改変されたもの、またはそれらを模倣して合成された人工のものであってもよい。受容体は、３次元構造が明らかにされているもの、または３次元構造が既知の受容体の構造に基づき、３次元構造を容易に推定できるものが好ましい。受容体としてタンパク質を用いる場合は、タンパク質の３次元構造は、例えば、プロテインデータバンクジャパン（PDB、 http://pdbj.protein.osaka-u.ac.jp/）から得ることができる。なお、本発明において解析に用いる受容体は1種類でも複数種類でもよい。
【００１０】
また、リガンドとは一般に受容体に比べて小さな分子であり、天然物、化学合成された物質に関わらず、受容体内の特定の部位に、特異的に結合する化合物全般を含む概念である。リガンドには例えば、薬物、または酵素の基質もしくは阻害剤などが含まれる。一般に、リガンドとは受容体の活性部位に結合して薬理作用を発揮するものをいう場合があるが、本発明においては、リガンドは受容体と安定な複合体を成しうるものであればよく、必ずしも活性部位に結合して薬理作用を発揮するものでなくてもよい。
また、ダミー原子とは、計算機上で分子構造を扱う上で、空間上の相対的な位置への分子の移動や重ね合わせなどの処理を行う際の基準とするために、大きさや質量などが任意に設定され、一般にポテンシャルパラメータを持たない仮想的な原子を意味する。
また結合ポケットとは、生体高分子の分子表面に観察される、リガンド分子が結合し得る程度の大きさをもつ内孔ないしは窪みをいう。
【００１１】
本発明の方法を図１のフローチャートを参照しながら、工程ごとに説明する。第１の工程では、まずリガンドのとりうる立体配座を網羅的に発生させる。リガンドは単一のリガンドを用いてもよいし、複数のリガンドを用いてもよい。
リガンドが取り得る多様な配座を効率的に発生させる手法としては、既知のさまざまな方法をとることができる。例えば、リガンド内の回転可能な結合について、順次一定の角度で回転させ、網羅的に全ての構造を発生させるシステマチック サーチ、二面角や原子座標をランダムに変更し、次いで分子力学計算による構造最適化を行うストキャスティックサーチ（Ferguson, D.M., Raber, D.J., J. Am. Chem. Soc. 111, 4371-4378 (1989)）、高温における短時間の分子動力学計算と分子力学計算による構造最適化を繰り返し、長時間の観察により得られるであろう多様な配座をサンプリングするシミュレーティド アニーリング（Nilges, M., et al., FEBS Lett., 239, 129-136 (1988)）などが挙げられる。また、これらの手法を拡張した市販プログラム、例えばカナダ Chemical Computing Group 社製 MOE（商品名）における Conformation Import 機能、 Accelrys 社製 CATALYST（商品名）に搭載されたポーリング法（Smellie, A., Teig, S.L., and Towbin, P., J. Comp. Chem., 16, 171-187 (1995))などを使用することにより、短時間で多様な配座空間を探索することができる。
【００１２】
第二工程では、受容体の３次元構造モデルにおいて、一定の大きさの球が受容体分子内の少なくとも４つの重原子と接触して存在し得る座標を、幾何学的な方法により網羅的に探索し、その座標位置に半径1 〜 3 Å 程度のダミー原子Sを配置する。
受容体中の任意の４つの重原子と接触して存在し得る仮想的な球の座標を網羅的に探索する幾何学的な方法としては、Edelsbrunner らによる方法（Edelsbrunner, H., et al.,Proceedings of the 28th Hawaii International Conference on Systems Science. 256-264 (1995)）及び、このアルゴリズムをもとにした Chemical Computing Group 社製 MOE
に搭載された Alpha Site Finder が挙げられる。
この手法で使用されるアルファ球と称する仮想的な球の大きさは、好ましくは半径0.5 〜 5 Å、さらに好ましくは、1〜2Å である。このようにして決定された球の中心座標は、生体高分子中の少なくとも4つの原子と近接していることから、生体高分子の窪みの中にあり、かつリガンドの重原子が存在し得る十分な空間の中心であるとみなすことができ
る。
次にこの座標位置に半径1 〜 3 Å 程度のダミー原子Sを配置する。ダミー原子Sは前記座標位置に任意に設定することができ、また複数設定してもよい。
【００１３】
第三工程では、ダミー原子Sを座標を基準にクラスタリングすることにより、少なくとも１つのダミー原子を含む結合ポケットを設定する。クラスタリングはダミー原子の座標を基準にして行うことができる。例えば、 1.0〜5.0 Å以内、好ましくは 1.5〜3.5 Å以内の距離にあるダミー原子を一まとめにすることによってクラスタリングを行うことができる。
第三工程においては、複数のダミー原子Sを含む結合ポケットについて、結合ポケット内のダミー原子S間の距離を全て算出し、互いに0.1〜2.0Å以内に近接する複数のダミー原子が存在する場合、1つを残して近接する他のダミー原子を削除することが好ましい。
【００１４】
受容体とリガンドが安定な複合体を形成するためには、リガンドを構成する原子が受容体と重ならない配座を取りうることが重要である。このことを考慮するため、第四工程では、第三工程で規定された結合ポケットにおいて、ダミー原子Sの周囲3 〜 20 Å 程度の範囲に存在する受容体の重原子を選択し、その座標位置に、−3 Å < r < −0.5 Å の範囲の仮想的な半径rを持つダミー原子Xを設定する。
【００１５】
次いで、上記第二〜第四工程で設定されたダミー原子群に、第一工程で配座が決定されたリガンドを重ね合わせ、その重なりの程度を見積もることにより、結合ポケットへのリガンド形状の適合性を評価する。
【００１６】
具体的には、第五工程で、第一工程で発生させたリガンド立体配座中の一つの重原子が、第二工程で規定されたダミー原子Sからランダムに選択された一つと重なるように、リガンド分子をランダムに回転及び平行移動させる。
第六工程では、リガンド原子とダミー原子S及びXとの重なりの程度をスコアとして算出し、リガンド分子全体を回転及び平行移動させることにより、スコアが極大となる配座を選択する。なお、この工程においてはリガンド原子として、リガンド内の重原子のみを考慮することが好ましい。
第七工程では第五工程から第六工程を繰り返し、受容体と安定な複合体を形成するリガンドの相対的な配座を選択する。
【００１７】
異なる分子について静電荷と体積の重なりを極大化させる方法としては、 Kearsley と
Smith の SEAL 法 (Kearsley, S., & Smith, G.M., Tetrahedron Computer Methodology, 3, 615-633, (1990)) がある。
重なりの程度は、ダミー原子とリガンド原子の距離dと、原子の半径rの関数として、たとえば、下記のような関数で定義することで、容易に算出することができる。
【数１】
2006113878.tif 000003
ここで、m、nは、それぞれダミー原子とリガンド原子の数、ri, rjは、それぞれ、ダミー原子、リガンド原子の原子半径、 α は Gauss 型関数の減衰定数、dは、ダミー原子とリガンド原子の中心間距離を表す。
【００１８】
この関数は、 α が小さいほど遠くの原子間の重なりの影響は小さくなる。 α の値は、一般的には 0.1〜 1、好ましくは、 0.3〜0.7 を用いる。また、dが小さいほど大きな値を与え、 d = 0 のとき、設定された原子半径の積、 ri × rj の値をとる。従って、f
の値が極大化するようにリガンドの分子を並行及び回転移動させることで、より重なりの大きな配置を見出すことができる。なお、実際のプログラミングにあたっては、一般的な数値解析法を用いることにより、fに−1をかけた値を極小化する条件を探索する方法を採用することもできる。
さらに、ここで、ダミー原子Xは、仮想的に負の値の半径をもつと規定されているため、Xと重なるリガンド原子があれば、その重なりの程度に応じてfの値に負の寄与をすることになる。したがって、リガンド分子を構成する各原子のダミー原子Sとダミー原子Xへの重なりの程度の総和を算出し、その値を極大化することにより、受容体中の活性ポケットの形状に適合し、かつ壁とぶつかることが少ないリガンドの配置を同時に見出すことができる。
なお、ここで使用される−fを極小化するための数値解析法としては、Steepest Descent (SD)法、Conjugate Gradients (CG)法、Newton Rapthon法(NR)、Truncated Newton (TN)法などがあり、これらを単独で、ないしは2つ以上を組み合わせて連続的に実行することにより、短時間で極小値を得ることができる。
この計算により出力される安定複合体の候補となるリガンド構造は、活性ポケットの壁面へ多少重なるところがあったとしても、リガンド分子全体としては、活性ポケットによく適合した形状をとる。
【００１９】
受容体の構造は、必ずしも固定したものではなく、リガンドとの複合体形成によって受容体の構造も多少は変化しうる。また、X 線、 NMR などの手法で得られる受容体の座標は、通常のタンパク質で、 1 〜 3 Å 程度の誤差があることも周知の事実である。
従って、本発明の方法により得られるリガンドの構造は、最安定な複合体構造を見出すための初期構造として妥当なものと考えられるが、必要に応じて分子力学計算により、受容体構造とともに微調整することができる。具体的には、第七工程で得られたリガンド構造のリストに対して、分子力学計算によって、リガンド−受容体複合体構造の最適化を行うことにより、安定な複合体構造を決定することができる。分子力学計算における精度は、使用する力場に依存するため、ドッキングの計算においては生体高分子と低分子であるリガンドのいずれにも対応するパラメータをもつ力場を使用することが必要となる。一般に入手できる力場としては、 CVFF（P. Douber-Osguthorpe et al,,Proteins: Struct. Funct. Genet., vol. 4, p31, 1988）、 CFF(M.J.Hwang et al, J.Am. Chem. Soc., vol 116, p2515, 1994)、 OPLS-AA(Jorgensen W. L., et al,,J. Am. Chem. Soc., vol. 117, p11225-11236, 1996)、 MMFF94、 MMFF94s、 MMFF94x(いずれもT.A.Halgren, J. Comp. Chem. vol. 17, No. 5&6, p490, 1996) などが挙げられる。また、これらのパラメータを含む分子力学計算エンジンとしては、 Discover (登録商標、Accelrys Inc.(米))、 CHARMM (Cornell W. D., et al,,J. Am. Chem. Soc., vol. 117, p5179, 1995)、 MOE-Minimizer(商標、Chemical Computing Group Inc.（加）)、 Direct Force Field (商標、Aeon Technology, Inc.（米）)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
さらに、第一工程から第七工程までを、ないしは、その後に続く分子力学計算工程までを、複数のリガンドおよび／または複数の受容体について連続的に実行し、受容体とリガンドが安定して存在し得る構造を特定することにより、新規生理活性物質の候補化合物の発見、あるいはリガンドが結合し得る受容体の既知の機能から、リガンドの生理活性の推定を行うことができる。
【００２０】
本発明は、通常、受容体及びリガンドの座標、元素名など計算機上で分子の三次元構造を再現するに十分なデータを含むファイルに対して、本発明で規定された工程を適当なコンピュータ言語で記述したプログラムを実行することにより実施する。コンピュータ言語としては、 C, C++, FORTRAN, JAVA, SVL（CCG 社 Scientific Vector Language） など、通常科学計算に使用される言語であれば、特に規定しない。また、本発明を実施するためのプログラムとしては、全工程を記述した一貫したプログラムを使用するばかりでなく、各工程ないしはその一部を実施する機能を有する公開されたプログラムを組み合わせて
、当該機能を実現する関数等を呼び出すようなスクリプトをまとめたものも使用可能である。
【実施例】
【００２１】
本発明の方法の有効性を示すために、本発明の工程を連続的に実行することの可能なプログラムを作成し、三次元構造が既知の複合体について、受容体とリガンドを分離した上でこのプログラムを適用し、既知のリガンド−受容体複合体構造を短時間で再現し得ることを確認した。
なお、ここでは、ケミカルコンピューティンググループ社（加）製計算化学システムMOE（2004.03 版）に搭載された言語 SVL と関数を使用してプログラムを作成した。分子力学計算では、生体高分子はもとより、広範囲のリガンドに対するパラメータを有し、複合体の構造再現精度が高いメルク力場（MMFF94x）を使用した。それでも不足するパラメータに対しては、このメルク力場を補完するルール依存力場を用いることにより、どのような分子間相互作用も自動的に計算できるようにした。
【００２２】
PDB に登録されている複合体の内、エントリー 1AQW、1C5C、1CBS、1CVU、1D0L、1D3D、1D3P、1DG5、1EI1、1BXO、1CKP、1DD7、1F0R、1F0S、1LIC、3ERT について実施した。ここでは、 3ERT のエストロゲンレセプタとリガンド OHT （4-Hydroxy-tamoxifen）の複合体を例にとって手順を説明する。
なお、プロテインデータバンクに登録された立体構造は、 X 線により決定されたものであり、水素原子の座標は含まれていない。本発明の方法を適用する前に、この構造を、
MOE に読み込み、水素原子を付加した上で、分子力学計算により水素原子の位置を決定した。このとき、実験により得られた構造を保持するべく、水素以外の原子の座標は固定して、水素原子の位置のみ分子力学計算による最適化を行った。
【００２３】
第一工程は、MOEに搭載されたConformation_Import 関数を使用し、リガンド OHT が取り得る配座を網羅的に発生させ、エネルギーの低い順に100種類を保存した（図２）。
【００２４】
第二、第三工程の結合ポケットの探索、ダミー原子の配置、クラスタリングは、 Edelsbrunner らの方法（Edelsbrunner, H., et al., 1995）を拡張した MOE-Alpha Site Finder 機能を使用して、半径 1.4 〜 1.8 Å の球が入りうる座標を決定し、その全ての位置に、エネルギーを持たない、炭素原子と同じ半径をもつダミー原子を配置した。  このダミー原子間の距離を全て測定し、 2.5 Å 以内の距離にあるものを一まとめにして、それぞれ結合ポケットとした。この系では、 21個のグループ（クラスター）に分割された（図３）。このうち、最も大きなポケットに含まれるダミー原子以外は、全て削除した。
第三工程ではまた、このダミー原子間の距離を全て測定し、全てのダミー原子が、0.8 Å以内の距離に他のダミー原子が一つも存在しないように、余分なダミー原子を削除した。
【００２５】
第四工程では、排除体積領域として、全てのダミー原子から 4.5 Å 以内の距離にある受容体の水素原子以外の原子の座標を検出し、それぞれの座標上に、その重原子の座標と同じ絶対値で、符号が負となる半径をもつ仮想的なダミー原子を配置した（図４）。
【００２６】
第一工程で発生させた最もエネルギーが低い配座について、第五、第六工程に従ってこのダミー原子モデルと重ね合わせを行い、安定複合体となる可能性のある配置を50見出した（図５）。
ついで、そのリガンド構造と第一工程で得られたほかのコンフォメーションのRMSD（平均二乗距離の平方根）を算出し、最も構造が異なるコンフォメーションについて、同様に第五、第六工程を実施した。  この操作を繰り返し、200の初期構造が出力されるまで続けた。
【００２７】
この初期構造のリストを、スコアfの大きさで並べ替え、スコアが良い100構造のみについて、順次、受容体の中に配置し、分子力学計算による構造最適化を行った。リガンドの内部エネルギーと、リガンドと受容体の相互作用エネルギーの合計が小さいものほど、複合体として安定と考えられるため、この合計エネルギーの最も小さいものから順に並べ替え、構造を観察した。  この系において、合計エネルギーの最も低い構造は、X線結晶構造解析により決定されたデータと比較して、重原子の RMSD が 0.59 となり、実験データをよく再現していることを確認した（図５）。
【００２８】
また、同様の方法によって他のリガンドと受容体の組合せについても解析した。結果を表１に示した。Best RMSD は、計算結果と X 線結晶構造とのリガンドの重原子間の距離の２乗平均の平方根の中で最も良いもの、 Etotalは、その構造の全相互作用エネルギーとリガンドの内部エネルギーの和、 Score は、その構造のスコアf、 Best RMSD No. in Scoreは、 RMSD が 最もよい構造の Score での順位、 Best RMSD No. in Etotal は、RMSD が 最もよい構造の Etotal での順位、 Time は、 Intel Xeon 3.06 GHz × 2 マシンで計算にかかった時間を示している。
これによれば、本発明の方法によって得られたBest RMSDの構造は、スコア f やEtotalにおいても上位にランクされ、本発明の方法を用いることにより、リガンドと受容体の複合体構造を短時間で正確に予測できることがわかった。
【００２９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の方法のフローチャートを示す図。
【図２】実施例１の第一工程で発生させたリガンド OHT の多様なリガンド配座の例を示す図。
【図３】実施例１の第二工程で得られたダミー原子と受容体の分子モデルを示す図。実線は受容体のエストロゲンレセプタ、球は炭素原子に置き換えたアルファ球を空間充填モデルで表示し、その集合が結合候補ポケットを示す。
【図４】実施例１の第三工程で得られたアルファ球と、第四工程で得られた排除体積からなる ASE モデルを示す図。白がアルファ球で、黒が排除体積を示す。アルファ球より手前にある排除体積の一部の表示は省略してある。
【図５】実施例１の第五工程で得られたリガンドの初期配置を、第六工程でスコアが極大になるように回転及び並行移動させた結合構造の候補（球棒モデル）の例を示す図。白い小球がアルファ球で、黒い小球が排除体積を示す。アルファ球の前後の排除体積の一部の表示は省略してある。リガンドの原子がアルファ球の領域内にあり、排除体積とは重なっていない。
【図６】実施例１の第六工程で得られたリガンドのスコア極大配置を相互作用エネルギーを極小化した最安定複合体の構造（棒モデル）のステレオ図。実線が受容体、球棒モデルがリガンドの X 線結晶構造、表面は、アルファ球に接する受容体のポケット表面を示す。リガンドよりも手前の受容体原子とポケット表面の裏側は表示を省略してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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