(57)【要約】【課題】本発明の１つの目的はＮＧＦファミーに属する第４の神経栄養因子を同定すること、並びにそのような因子をコードする核酸を得ることである。【解決手段】神経栄養因子−４（ＮＴ−４）と命名された新規なポリペプチドをヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって同定した。本発明は、診断およびＮＴ−４の組換えによる製造に有用なＮＴ−４をコードする核酸を提供するものである。また、ＮＴ−４の天然に存在するアミノ酸配列変異体であるＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△をコードする核酸を提供するものである。本発明の神経栄養因子は神経細胞の治療および診断分析に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＴ−４をコードする単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経組織の成長、調節または維持に関与するタンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明はＮＧＦと相同性を有する神経−誘導因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ＮＧＦ）は末梢神経系の感覚神経および交感神経の発達に優先的に作用するタンパク質である。該ＮＧＦは、感受性を有するニューロンの細胞表面の特異的な受容体を介して作用し、神経細胞の生存を支え、軸索の外側への成長を促進し、神経化学的分化を進める。ＮＧＦ作用は神経細胞膜（コノレーら（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．），１９８１，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９０：１７６；スケーパー（Ｓｋａｐｅｒ）およびバロン（Ｖａｒｏｎ），１９８０，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９７：３７９）、神経タンパク質のりん酸化状態（ユら（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．），１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４８１；ハレクオ（Ｈａｌｅｑｕｏｕａ）およびパトリック（Ｐａｔｒｉｃｋ），１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：５７１）の変化を伴い、ある種のｍＲＮＡおよびタンパク質が豊富な状態で神経細胞の分化および機能に寄与しているようである（チェルシー（Ｔｉｅｒｃｙ）およびシューター（Ｓｈｏｏｔｅｒ），１９８６，Ｊ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．１０３：２３６７）。
【０００３】
前脳神経もＮＧＦ反応性であり、その栄養面の支持にＮＧＦを必要とすると思われる（ヘフティ（Ｈｅｆｔｉ），１９８６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６：２１５５）。実際、ＮＧＦおよび中枢神経系（ＣＮＳ）におけるその受容体の分布および個体発生は、ＮＧＦが前脳基底のコリン作用性神経のための、標的一誘導性神経栄養因子であることを示唆している（コルシング（Ｋｏｒｓｃｈｉｎｇ），Ｎｏｖ／Ｄｅｃ  １９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ．，ｐｐ５７０−５７３）。
【０００４】
ＮＧＦ相同性の動物性物質が多く知られるようになったが、ＮＧＦに幾分の相同性を有するにもかかわらず、明らかに区別し得る神経成長因子が同定されたのは最近である（レイブロックら（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．），１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１４９）。この因子、脳一誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または今日ではＮＴ−２と呼ばれるが、はブタ脳から精製され、Ｎ−末端および開裂後の断片の両者の部分アミノ酸配列が決定された。幾つかのオーバーラップする断片から編集された最長の配列を用いて２組のオリゴヌクレオチドを合成し、それをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によりブタゲノム鋳型を増幅した。２個のプライマーの間のヌクレオチド配列を決定し、それを用いて、ブタ脳の上丘から単離した全ＲＮＡの逆転写によって得た相補的ＤＮＡ鋳型に対するＰＣＲに用いる特異的プライマーを合成した。このようにして得たヌクレオチド配列は４個のインフレーム（フレーム内）ストップコドン後方に最初に見出されるメチオニンから始まる、２５２アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有していた。Ｌｅｉｂｒｏｃｋらは、ＢＤＮＦとＮＧＦのみが、構造と機能的特徴を共有する神経栄養性タンパク質ファミーのメンバーであるとする理由は全くないとしており、著者らは、これらの共通の構造上の特徴が、他のメンバーの発見に役立つだろうと期待している。
【０００５】
より最近では、神経細胞因子（ＮＦ）またはニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）と呼ばれる、βＮＧＦおよびＢＤＮＦに密接に関連した他の新規な神経栄養因子が発見された。（ホーンら（Ｈｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：３３９；マイソンピエールら（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．），１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４４６；ローゼンタールら（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，ｅｔ  ａｌ．），１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ  ４：７６７）。ＢＤＮＦとＮＴ−３は、そのアミノ酸の約５０％がβＮＧＦと共通である。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３をコードするｍＲＮＡは、成熟囓歯類の脳に高レベルで存在する。βＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３はヒナ鶏の感覚神経細胞の選択されたものの生存を支持しており、これは発生の過程での神経細胞生存の調節に別個の役割を有することを示唆している。
【０００６】
神経細胞の生存および成長はまた、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮性成長因子、およびインシュリン様成長因子等の非神経細胞に対する成長因子の影響をも受ける（モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：７２；ウオリック（Ｗａｌｉｃｋｅ），１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６１８；バット（Ｂｈａｔ），１９８３，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１：３１５）。ベイシックＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は分離した囓歯類胎児神経細胞の培養中での初期（一次）の生存および以後の繊維の成長を支える。多くの脳領域からの神経細胞が影響を受けるが、生存する神経細胞集団が脳領域闇で変化していることは、神経細胞の亜集団がｂＦＧＦに応答性を有することを示唆している（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：７５３７；Ｗａｌｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３０１２）。ｂＦＧＦは、遊離されるタンパク質に典型的なシグナル配列を持たないので、そして、脳におけるｂＦＧＦレベルは、βＮＧＦやＢＤＮＦのそれよりもはるかに大きいので、ｂＦＧＦが神経栄養因子として生理学的な役割を担っているか否かが疑問視され、ｂＦＧＦは細胞破壊に関連する事件に際し放出される「障害因子」として作用すると提案された（トーエネンら（Ｔｈｏｅｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９８７，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０９：１４５）。
【０００７】
末梢神経系の異常に治療効果を有する可能性のある他の神経栄養因子としては、線毛神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）がクローン化され、発現された。（リンら（Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１０２３）。成熟兎の坐骨神経から精製されたＣＮＴＦは、末梢神経系に作用し、完全にＮＧＦと無関係のようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的はＮＧＦファミーに属する第４の神経栄養因子を同定すること、並びにそのような因子をコードする核酸を得ることである。
【０００９】
他の目的は、組換え細胞培養内で、そのような新規な因子を合成することである。
【００１０】
また、他の目的は、そのような新規な因子の変異体および改良形（修飾形）を与えることである。
【００１１】
さらに、他の目的は、抗体を惹起するための免疫原を製造すること、並びにそのような新規な因子、その変異体または改良形と結合し得る抗体を得ることである。
【００１２】
他の目的は、そのような新規な因子、その変異体または改良形を含有する、治療および診断のための組成物、および治療的処置法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１．本発明は、ＮＴ−４をコードする単離された核酸を提供する。
２．１つの実施形態において、本発明は、成熟ヒトＮＴ−４のための図１記載の核酸配列を有する上記単離された核酸を提供する。
３．本発明は、上記核酸を含有するベクターを提供する。
４．本発明は、上記核酸を含有する宿主細胞を提供する。
５．本発明は、動物種起源のＮＴ−４を含有し、該動物種の不純物ポリペプチドを含有しない組成物を提供する。
６．１つの実施形態において、本発明は、ＮＴ−４がヒト起源である上記組成物を提供する。
７．本発明は、ストリンジェント条件下でＮＴ−４をコードするＤＮＡとハイブリダイズする核酸を提供する、但しＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３をコードする核酸を除く。
８．１つの実施形態において、本発明は、ヒトＮＴ−４βのための図３記載の核酸を含有する上記核酸を提供する。
９．１つの実施形態において、本発明は、ヒトＮＴ−４γのための図４記載の核酸を含有する上記核酸を提供する。
１０．１つの実施形態において、本発明は、ヒトＮＴ−４△のための図５記載の核酸を含有する上記核酸を提供する。
１１．本発明は、免疫原ポリペプチドまたは非タンパク性ポリマーに結合したＮＴ−４を含有する組成物を提供する。
１２．本発明は、薬学的に許容し得る担体内に、有効量のＮＴ−４を含有する医薬組成物を提供する。
１３．１つの実施形態において、本発明は、さらに、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３をも含有する上記組成物を提供する。
１４．本発明は、ＮＴ−４と結合し得るが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３とは結合することができない抗体を提供する。
１５．本発明は、ＮＴ−４と結合し得るモノクローナル抗体を提供する。
１６．１つの実施形態において、本発明は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３とは交差反応しない上記モノクローナル抗体を提供する。
１７．本発明は、哺乳類に有効量のＮＴ−４を投与することを含む神経変性性疾患または損傷した神経細胞の治療方法を提供する。
１８．１つの実施形態において、本発明は、哺乳類がヒトである上記方法を提供する。
１９．１つの実施形態において、本発明は、有効量のＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３をも哺乳類に投与することを含む上記方法を提供する。
２０．１つの実施形態において、本発明は、神経変性性疾患がハンチントン病、アルツハイマー症、ＡＬＳまたはパーキンソン病であり、損傷した神経細胞が外傷によるものである上記方法を提供する。
２１．本発明は、上記抗体を用いてインビトロまたはインビボでＮＴ−４を検出する方法を提供する。
２２．本発明は、ＮＴ−４の混合物を上記抗体を結合させたカラムに通すことを含む、ＮＴ−４の精製法を提供する。
２３．本発明は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞培養物からＮＴ−４を回収することを含むＮＴ−４の製造法を提供する。
２４．１つの実施形態において、本発明は、ＮＴ−４を宿主細胞培養培地から回収する上記方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△はＮＴ−４の新規なアミノ酸配列変異体である。これら因子の各々は定まった神経細胞サブセットに単独で、または一緒に作用して中枢および末梢神経組織の両方における、正しい神経細胞連絡を達成すると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書中、「ＮＴ−４」は、図１に示すヒトＮＴ−４のためのアミノ酸配列を持ったポリペプチド、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列変異体、成熟ヒトＮＴ−４および
該アミノ酸配列変異体のペプチドフラグメント、ここに該ペプチドは少なくとも約５アミノ酸長さであって、対応するポリペプチドの免疫エピトープまたは他の生物学的に活性な部位を有する、および成熟ヒトＮＴ−４および該アミノ酸配列変異体およびペプチドフラグメントの改良形（ここにポリペプチドまたはペプチドは天然に存在するアミノ酸以外の部分による置換によって共有結合的に改良されている）を表す；但し、考慮下の特定のアミノ酸配列変異体、ペプチドフラグメント、またはその改良形は、新規であり、従来技術から自明でなく、かつどのような動物のＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３とも同一でなく、またそのようなＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３のいかなるフラグメントでもないことを条件とする。
【００１６】
ＮＴ−４核酸はＮＴ−４ポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡであるか、そのようなＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、結合状態で安定に維持される約１０塩基長以上の核酸である；但し、そのようなハイブリダイズする核酸は、新規であり、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３をコードする核酸またはその相補的な核酸をも含めて、従来技術の核酸と同一でないことを条件とする。ストリンジェント条件とは、（１）洗浄での低イオン強度と高温の使用、例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤＳＯ４、５０℃、あるいは（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド、例えば５０％ｖ／ｖホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  りん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）と７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムとを４２℃で用いる場合である。
【００１７】
ＮＴ−４をコードするＤＮＡは脳組織ｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムＤＮＡ、またはインビトロ合成で得ることができる。ハイブリダイズする核酸は通常、インビトロ合成で得られる。ＮＴ−４ＤＮＡの同定は、ヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを図１の配列から通常の基準、例えば、配列長さが十分であり疑似陽性を最小にするために非不明瞭さが十分であることなど、に従い選択される標識オリゴヌクレオチドを用いてプローブすることにより最も好都合に行うことができる。通常、約３０から５０塩基の３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドが適し、特に、メチオニンまたはトリプトファンをコードするコドンを１またはそれ以上含むオリゴヌクレオチドが好適である。単離された核酸とは、同定され、核酸の供給源に由来する他のポリペプチドをコードする不純物核酸から分離されたものであるだろう。核酸を診断目的で標識することもできる。
【００１８】
ＮＴ−４のアミノ酸配列変異体は、図１記載の配列内に１またはそれ以上のアミノ酸残基が挿入、欠失および／または置換されることによる、図１記載の成熟ヒトＮＴ−４と異なるアミノ酸配列を有するＮＴ−４ポリペプチドである。一般にアミノ酸配列変異体は、その配列内の各位置にあるアミノ酸の比較に基づいて、成熟ヒトＮＴ−４と、約７５％の相同性（そしてしばしば８５％以上の相同性）を有するであろう。
【００１９】
ＮＴ−４のアミノ酸配列変異体は、自然に生成するか、または、予め単離されたＮＴ−４ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、またはインビトロで所望の変異ポリペプチドを合成することにより、合成法で生成され得る。上記に示したように、そのような変異体は図１に示した成熟ヒトＮＴ−４のアミノ酸配列内に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有するであろう。変異体ＮＴ−４のアミノ酸配列を得るためには、生成する変異体ポリペプチドが所望の特性を有することを条件として、いかなる欠失、挿入、および置換の組み合わせを行ってもよい。アミノ酸の変化はまた、組換え宿主内での発現に際するＮＴ−４のさらなる修飾を与えるもの、例えば、グリコシル化部位の導入または移動、あるいはメンブランアンカー配列の導入（ＰＣＴＷＯ８９／０１０４１、１９８９年２月９日公開による）であってもよい。
【００２０】
好ましくは、例えば、天然に存在するアレル等の、自然に起きるＮＴ−４のアミノ酸配列変異体は、そのような自然発生的な変異体の配列をコードする、適当な宿主細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ内で発現されることにより組換え法で生成される。他のＮＴ−４のアミノ酸配列変異体は、先に単離しておいたＮＴ−４ＤＮＡに、予め決定した突然変異を起こすことにより生成される。そのような予定の突然変異を起こす上で考慮すべき可変的な基本事項が２つある：突然変異部位の位置と、突然変異の性質である。一般に、突然変異の位置と性質の選択は改変されるべきＮＴ−４特性による。例えば、候補ＮＴ−４アンタゴニストまたはスーパーアゴニストはまず、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４の問で同一または高度に保存されているアミノ酸残基を位置付けることで選択されるであろう。これらの残基を次いで、例えば、（１）達成される結果に応じて、まず保存性選択で、次いでよりラジカルな選択によって置換する、（２）標的残基を欠失させる、あるいは（３）位置する部位の隣と同じまたは異なる種類の残基を挿入するという順で、あるいはこれら（１）、（２）および（３）の任意の組み合わせにより修飾する。
【００２１】
１つの役立つ方法は「ａｌａスキャニング」と呼ばれる。この方法ではアミノ酸残基または標的残基群を同定しアラニンまたはポリアラニンで置換する。次いで、さらなるまたは異なる変異をアラニン置換部位にまたはアラニン置換部位の代わりに導入することにより、アラニン置換に機能的な感受性を示すドメインに一層磨きをかける。
【００２２】
明らかに、例えばＮＴ−４をＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３に変換するような変異、および当業界で新規性および進歩性を欠くようなＮＴ−４変異体またはポリペプチド配列のどのようなものも本発明範囲に含まない。このように、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されているが、突然変異の性質それ自体は予め決定されていなくともよい。例えば、特定の部位での突然変異の達成を最適にするために、標的コドンまたは標的領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現されたＮＴ−４変異体を所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングする。
【００２３】
アミノ酸配列の欠失は一般に約１−３０残基、好ましくは１−１０残基の範囲であって、典型的には隣接する。欠失はＮＴ−４の活性を改良するために、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４間で相同性の低い領域に導入される。実質的にＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＮＴ−３と相同な部位の領域からの欠失はＮＴ−４の生物活性をより大きく変化させるであろう。保存的な欠失の数は、影響を受けるドメインの３次構造、例えば、ベーター布状（プリーツシート）構造またはアルファヘリックス構造等を保存するように選択される。
【００２４】
アミノ酸配列の挿入には、単一または複数アミノ酸の配列内への挿入と同様、長さ１残基から、千またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドのアミノ−および／またはカルボキシ−末端への融合が含まれる。配列内挿入（即ち、成熟ＮＴ−４配列内への挿入）は通常、約１から１０残基、好ましくは１から５残基、最も好ましくは１から３残基の範囲である。末端挿入の例として、組換え宿主細胞からの成熟ＮＴ−４の分泌を容易ならしめるための、異質のＮ−末端シグナル配列のＮＴ−４分子のＮ−末端への融合が含まれる。そのようなシグナルは通常、意図する宿主細胞と同質であって、例えば、大腸菌のためのＳＴＩＩまたはｌｐｐ、酵母のためのアルファ因子、および哺乳類細胞のためのヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルがある。他の挿入には、細菌または酵母のタンパク質のような免疫原性ポリペプチドのＮＴ−４のＮ−またはｃ−末端への融合を含む。
【００２５】
第３の変異体は、ＮＴ−４内の少なくとも１個のアミノ酸残基、そして好ましくは唯一のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその部位に挿入されている変異体である。１つの例は、アルギニンおよびリジンを他のアミノ酸に置換し、ＮＴ−４をセリンプロテアーゼに対して抵抗性にし、そのことによりより安定なＮＴ−４の変異体を創製するものであ
る。置換突然変異にとって最も興味深い部位は、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４に見い出されるアミノ酸が、側鎖の大きさ、電荷または疎水性において実質上異なるが、選択した部位が様々な動物種のＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＮＴ−３同族体間で（即ち、全動物のＮＧＦ、全動物のＮＴ−３およびＢＤＮＦの間で）高い相同性を有するような部位である。この分析により、栄養因子の活性の分化に関与し得る残基が強調され、それ故に、これらの部位における変異はそのような活性に影響するであろう。成熟ヒトＮＴ−４（Ｎ−末端から番号付け）におけるそのような部位は以下の通りである；挿入の例としてＮＴ−４（Ｇ７８−−＞Ｋ，Ｈ，ＯまたはＲ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ１３，１４，１５および１６）およびＮＴ−４（Ｒ８５−−＞Ｅ，Ｆ，Ｐ，ＹまたはＷ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ１７，１８，１９，２０および２１）。その他興味深い部位は全動物種のＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４間で同一残基の部位であり、このコンホメーションの程度は、４因子全部に共通の生物活性を達成するのに重要であることを示している。これらの部位、少なくとも他の３つで同一に保存されている部位の配列に含まれるものは比較的保存的な方法で置換される。そのような保存的置換は、衰１の好ましい置換という表示の下に記載されている。そのような置換が生物活性の変化をもたらすときには、さらに実質的な置換、表１で模範的な置換という表示の下に記載されている変化、または後述のアミノ酸クラスを引用して記載してなる置換を導入し、そして生成物をスクリーニングする。
【００２６】
【表１】
2006087434.tif 000002
保存的置換に特に好ましい部位は、成熟ヒトＮＴ−４のＮ−末端からの番号付けに従い、Ｒ１１、Ｇ１２、Ｅ１３、Ｖ１６、Ｄ１８、Ｗ２３、Ｖ２４、Ｄ２６、Ｖ４０、Ｌ４１、Ｑ５４、Ｙ５５、Ｆ５６、Ｅ５８、Ｔ５９、Ｇ７７、Ｒ７９、Ｇ８０、Ｈ８５、Ｗ８６、Ａ９９、Ｌ１００、Ｔ１０１、Ｗ１１０、Ｒ１１１、Ｗ１１２、Ｉ１１３、Ｒ１１４、Ｉ１１５、Ｄ１１６およびＡ１１８である。ＮＴ−４の適切な立体配座の維持に寄与していないシステイン残基も、分子の酸化安定性を向上し、異常な交差反応を防ぐために、一般にセリン残基で置換することができる。この節で述べた上記以外の部位も、既に一般的に述べた欠失または挿入研究に適している。
【００２７】
機能または免疫学的な同一性の実質的な改変は、（ａ）置換部位（エリア）におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えばシートまたはヘリカルコンホメーション、（ｂ）分子の標的部位の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ等、の維持に対する影響
において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は側鎖の性質の共通点に基づいて分類される。
（１）疎水性＝ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ（ノルロイシン）、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；そして
（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒおよびｐｈｅ。
【００２８】
非一保存的置換は、これらのクラスの１つに属する１メンバーを他のものに交換することで得られるであろう。そのような置換された残基はまた、前記の保存的置換部位、または好ましくはその残余の（非線存的）部位に導入され得る。
【００２９】
ＮＴ−４変異体には、ＮＴ−４（Ｅ６７−−＞ＳまたはＴ）（それぞれＳＥＱ
ＩＤＮＯ．２２および２３）（これはＮ−結合グリコシル化部位を付加する）；ＮＴ−４（Ｇ１−Ｃ６１）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．２５）（このような記載の変異体は、指摘した残基を含む断片である）；
【００３０】
【表２】
2006087434.tif 000003
（このような方法で記載した変異体は指摘した残基をも含めて、この範囲の欠失を含む）；ＮＴ−４（△Ｒ６０−△Ｄ８２）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．５６）ＮＴ−４（△Ｈ６０−△８８）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．５７）；ＮＴ−４（△Ｗ８６−△Ｔ１０１）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．５８）；ＮＴ−４（Ｒ５３−−＞Ｈ）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．５９）；ＮＴ−４（Ｋ９１−−＞Ｈ）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ，６０）ＮＴ−４（Ｖ１０８−−＞Ｆ）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．６１）；ＮＴ−４（Ｒ８４−−＞Ｑ，Ｈ，Ｎ，Ｔ，ＹまたはＷ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．６２、６３、６４、６５、６６および６７）；ＮＴ−４（Ｄ１１６−−＞Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｙ，ＳまたはＴ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．６８、６９、７０、７１、７２、７３）。
【００３１】
さらに、位置７０がＧ、Ｅ、ＤまたはＰ以外のアミノ酸残基で；位置７１がＡ、ＰまたはＭ以外のアミノ酸残基で置換されており、そして／または位置８３がＲ、Ｄ、ＳまたはＫ域外のアミノ酸残基で置換されているＮＴ−４、並びに、例えば以下の配列を含む環状ポリペプチドを初めとする環化ＮＴ−４フラグメントが含まれる。
【００３２】
【表３】
2006087434.tif 000004
また、本明細書記載のＮＴ−４変異体と類似の構造を有するＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＧＦアミノ酸配列変異体も本発明に包含される。例えば、ＮＴ−４の位置７０における突然変異と同様に、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦの類似の位置がそれぞれＤ、ＥまたはＰ以外の残基で置換されたものである。
【００３３】
ＮＴ−４のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは天然起源（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）から単離されるか、または先に調製された変異体または変異していないＮＴ−４バージョンをコードするＤＮＡに対する部位特異的突然変異誘発によって製造される。十分な数の隣接するヌクレオチドと同様、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチドを用いて、トラバースすべき欠失ジャンクションの両側と安定な２本鎖を形成するに十分なサイズと十分な配列の複雑さを有するプライマーを得ることにより、部位特異的突然変異によってＮＴ−４が生成される。一般に、変更すべき配列ジャンクションの両側に約５〜１０残基を持つ、約２０から２５ヌクレオチド長さのプライマーが好ましい。一般に、部位特異的突然変異誘発の方法は当業界でよく知られており、アデルマンら（Ａｄｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．）の文献（１９８３，ＤＮＡ  ２：１８３）に例示されている。
【００３４】
理解されるように、部位特異的突然変異誘発法には、通常、１本鎖および２本鎖の両方の形で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に用い得る代表的なベクターには、例えば、メッシングらの記載したＭ１３ファージベクターが含まれる（Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｈｉｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，（Ａ．ｗａｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｅｌｓｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００３５】
これらのファージは商業的に容易に入手可能であり、それらの使用は一般に当業者に既知である。また、１本鎖ファージ複製起点を有するプラスミドベクター［ヴェイラら（Ｖｅｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．），１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３］を１本鎖ＤＮＡの調製に用いることができる。あるいは、インビトロで適当なＤＮＡ断片を合成することによってヌクレオチド置換を導入し、それを当業者に自体既知のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて増幅する。
【００３６】
一般に、本発明に用いる部位特異的突然変異誘発は、まず、その配列内に関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する１本鎖ベクターを得る。所望の突然変異配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーを、通常、例えばクレアら［Ｃｒｅａ，１９７８，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：５７６５］の方法に従い合成的に調製する。このプライマーを次いで、１本鎖−タンパク質配列−含有−ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡポリメラーゼ酵素処理に付し、突然変異−担持鎖の合成を完成させる。このようにして１本の鎖は元の非突然変異配列を、他の第２の鎖は所望の突然変異を担持しているヘテロ２本鎖を得る。次いで、このヘテロ２本鎖ベクターを用いて、ＪＭ１０１のような適当な細胞を形質転換し突然変異した配列アレンジメントを担持する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【００３７】
そのようなクローンを選択した後、突然変異した領域を除去し、タンパク質の生産のための適当なベクター、一般に、適当な宿主の形質転換に通常用いられている発現ベクター内に配する。
【００３８】
特にＮＴ−４のアミノ酸の欠失および挿入、および置換の大多数はその特性を急激に変化させることを期待するものでなく、１つの置換ではＮＴ−４ポリペプチド内の少なくとも１つの免疫エピトープが保存される。
【００３９】
ＮＴ−４変異体を予め特性化することはしばしば困難であるため、所望の特性を有する変異体を同定するためにある種のスクリーニングが必要であることが理解されるであろう。促進された栄養活性、差別的な神経細胞型特異性、組換え細胞培養または血清における安定性（例えば、タンパク質分解的加水分解に対する）、アンタゴニスト作用の存在、酸化安定性、収率向上を伴う分泌される能力等に関し、スクリーニングすることができる。例えば、特定の抗体への親和性等の、ＮＴ−４の免疫学的特性の変化を競合型イムノアッセイで測定する。候補突然変異体の神経栄養活性の促進または抑制における変化を樹状突起の外への成長または体外移植組織細胞の生存率により測る。酸化還元または温度安定性、疎水性、プロテアーゼ分解の受け易さ、または担体との凝集またはマルチマーへの凝集のし易さ等のタンパク質の性質の改変を当業者既知の方法で分析する。
【００４０】
トリプシンまたは他のプロテアーゼ開裂部位をコードするアミノ酸配列を対の塩基性アミノ酸残基、例えば、隣接するアルギニルおよびリジル残基、に関して精査することで同定する。これらは、以下の方法でプロテアーゼに不活性化することができる；これら残基の１方を他の残基、好ましくはグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような疎水性残基で置換する；２個の塩基性残基の１つを欠失する；後方の塩基性残基の直後にプロリル残基を挿入する；あるいは２つの塩基性残基の間に他の残基を挿入する。
【００４１】
ＮＴ−４のアミノ酸配列変異体は一般に組換え法で製造することができる。即ち、変異体ＮＴ−４をコードする核酸を組換え細胞培養で発現させ、所望により、変異体ポリペプチドを細胞培養から、例えば変異体活性のバイオアッセイまたはウサギ抗ＮＴ−４ポリクローナル抗体（それは該変異体の少なくとも１個のエピトープであって天然のＮＴ−４にも存在するエピトープと結合する）を含有するイムノアフィニティーカラムヘの吸着により、精製する。４０残基またはそれ以下の小さいペプチドフラグメントはインビトロ法で好都合に作成することができる。
【００４２】
一度ＮＴ−４をコードするＤＮＡが得られれば、さらにクローニングまたは発現させるために、通常、それを複製可能なベクターに結合させる。ベクターは、受容能力のある宿主細胞と協力（宿主−ベクター系）して２つの機能を行うのに有用である。１つの機能はＮＴ−４をコードするＤＮＡのクローニングを容易にする、即ち、使用可能な量の核酸を製造する機能である。他はＮＴ−４の発現に向けられる。これら機能のいずれかまたは両者はベクター−宿主系によって達成される。ベクターは、クローニングまたは発現のために選択した宿主細胞と同様、それが達成すべき機能に応じて様々な成分を含有する。
【００４３】
各ベクターは上記のＮＴ−４をコードするＤＮＡを含有する。一般に、これはそのアミノ末端に分泌シグナルを結合している成熟形のＮＴ−４をコードするＤＮＡである。この分泌シグナルは好ましくは、インビボで正常にヒト細胞からのＮＴ−４の分泌を指令するＮＴ−４前配列である。しかしながら、他の動物ＮＴ−４由来のシグナル、ＮＧＦ、ＮＴ
−２またはＮＴ−３のシグナル、ウイルス性シグナルまたは同じまたは近縁種の分泌ポリペプチドからのシグナル等にも適当な分泌シグナルがある。
【００４４】
もしもシグナル配列が他の神経栄養ポリペプチド由来であれば、それは図２の、ＮＴ−２、ＮＴ−３またはＮＧＦの開始メチオニン（Ｍ）残基から成熟タンパク質の直前のアルギニン（Ｒ）残基までの間の前駆体配列、あるいはこれら前駆体の相同性領域を考慮した、これら前駆体いずれか２つまたはそれ以上の配列からのコンセンサスまたはコンビネーション配列である。そのような前駆体領域のためのＤＮＡを成熟ＮＴ−４をコードするＤＮＡのリーディングフレームに結合させる。
【００４５】
発現およびクローニングベクターはベクターを１またはそれ以上の選択した宿主細胞内で複製させるヌクレオチド配列を含有する。一般に、クローニングベクター内で、この配列はベクターを宿主染色体と独立に複製させるものであり、複製起点または自律的な複製配列を有する。そのような配列は様々な細菌、酵母およびウイルスに関して周知である。周知のプラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は大多数のグラム陰性細菌に有用であり、酵母のための２μプラスミド複製起点および様々なウイルス複製起点（ＳＶ４０，ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞のためのクローニングベクターに有用である。哺乳類発現ベクターには複製起点は不要である（ＳＶ４０複製起源は、通常、ただ、それが早期プロモーターを有するという理由で用いられている）。大多数の発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ち、それらは少なくとも１種類の生物内で複製可能であるが、他の生物にも発現のためにトランスフェクションすることができるものである。例えば、あるベクターは大腸菌にクローンすることができ、それは宿主染色体と独立して複製することはできないが、発現のために酵母または哺乳類細胞を形質転換（トランスフェクション）することができる。
【００４６】
ＤＮＡは宿主ゲノムヘの挿入によってもクローニングすることができる。これは樟菌種で容易に行え、例えば、樟菌ゲノムＤＮＡに見いだされる配列に相補的なＤＮＡ配列をベクターに含有させることで行われる。細菌をこのベクターでトランスフェクションすると、ゲノムとの同種組換えとＮＴ−４ＤＮＡの挿入が起こる。しかしながら、ＮＴ−４をコードするゲノムＤＮＡを回収するには、制限酵素によるＮＴ−４ＤＮＡの切り出しが必要なので、遺伝子外で複製したベクターのＤＮＡの回収よりも複雑である。
【００４７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは選択遺伝子または選択可能マーカーを含有すべきである。一般に、これはベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在によって、ベクターを失った宿主細胞はすべて、確実に、形質転換された細胞を凌いで増殖または再生産するという利点を確実に得ることができない。代表的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサアートまたはテトラサイクリン等の抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）相補性栄養要求欠損、または（ｃ）樟菌のためのＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子等の、複合培地から得ることができない重要な栄養素の供給、等のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００４８】
酵母で用いるための適当な選択遺伝子は、酵母プラスミド（ＹＲｐ７）に存在するｔｒｐ１遺伝子である［スチンコムら（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．），１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；キングスマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９７９，Ｇｅｎｅ  ７：１４１；チェンパーら（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．），１９８０，Ｇｅｎｅ  １０：１５７］。ｔｒｐ１遺伝子はトリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異種、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）１９７７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２）に選択マーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１病巣が存在することは、トリプトファン不在下での培養による形質転換の検出に有効な状況を与える。同様にＬｅｕ２欠損酵母種（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）はＬｅｕ２遺伝子を担持する既知のプラスミドにより相補される。
【００４９】
哺乳類細胞にとって適当な選択マーカーの例は、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。そのようなマーカーはＮＴ−４核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にする。哺乳類細胞の形質転換体を、マーカーを取り込むことによってのみ形質転換体が生存し得るという、選択圧の下に置く。形質転換体を培地内の選択剤の濃度が連続的に変化する条件下に置くことにより、選択圧を課し、それにより選択遺伝子とＮＴ−４をコードするＤＮＡの両者を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産がより大きく損なわれた遺伝子が、連続的な組換細胞の世代の染色体内にタンデムに反復される過程を指す。増大量のＮＴ−４が増幅されたＤＮＡから産生される。
【００５０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的拮抗物質であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地で培養される。この場合、適当な宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞系であり、これはウラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャッシン（Ｃｈａｓｉｎ）［１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６］によって製造され、市販されている。特に有用なＤＨＦＲはＭｔｘに高度に抵抗性の突然変異ＤＨＦＲ（ＥＰ１１７，０６０Ａ）である。次いで、形質転換された細胞を漸増濃度のＭｔｘにさらす。このことでＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、ＮＴ−４をコードするＤＮＡのような他のＤＮＡを含有する発現ベクターの複数コピーが合成される。あるいは、ＮＴ−４、ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞をカナマイシンまたはネオマイシンまたはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質を含有する培地での細胞増殖により選択する。真核性細胞は通常、内因性ＡＰＨ活性を発現しないので、ＡＰＨタンパク質をコードする遺伝子（一般にｎｅｏ’遺伝子類と称する）は、ベクターで形質転換された宿主形質転換体を同定し得る、広範な真核性宿主細胞の選択可能マーカーとして優先的に用いられている。
【００５１】
ＮＴ−４の組換え脊椎動物細胞培養での製造に適した他の方法、ベクターおよび宿主細胞は［ゲッシングら（Ｇｅｔｈｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．），１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２０；マンテイら（Ｍａｎｔｅｉ，ｅｔ．ａｌ．），１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：４０；レビンソンら（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ．），ＥＰ１１７，０６０Ａ  ａｎｄ  １１７，Ｇ５８Ａ］に記載されている。ＮＴ−４の哺乳類細胞培養での発現に特に適したプラスミドはｐＲＫ５（欧州特許公開第３０７，２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０８２９１号、６／１３／９１公開）である。
【００５２】
発現ベクターはクローニングベクターと異なり、宿主生物によって認識され、ＮＴ−４核酸に機能的に結合したプロモーターを含有する必要がある。プロモーターは構造遺伝子の開始コドンから上流（一般に約１００から１０００ｂｐ）に位置する非翻訳配列であり、それらのコントロール下にある核酸の転写および翻訳をコントロールする。それらは一般に、誘導可能なものと構成的なものの、２種類に分類される。誘導可能なプロモーターは、培養条件のある変化（例えば栄養物質の存在または不在、あるいは温度変化）に応じてそれらのコントロール下にある核酸の転写および翻訳レベルの増大を開始するプロモーターである。現在では、様々な有能な宿主細胞が認識する多くのプロモーターが知られている。これらのプロモーターはそれらの起源の遺伝子から、制限消化によって除去した後、ＮＴ−４の開始コドンの５’に挿入することでＮＴ−４をコードするＤＮＡと操作可能に結合される。これはゲノムＮＴ−４プロモーターが使用不可能であることを意味するものではない。しかしながら、通常、異種のプロモーターの方がＮＴ−４の大きい転写と高収率を与えるであろう。
【００５３】
核酸はそれが他の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、それは機能的（操作可能）に結合していると言う。例えば、プレ配列または分泌リーダーはそれがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき暗号配列と機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響するとき暗号配列と機能的に結合しており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置するとき、暗号配列と機能的に結合していると言う。一般に機能的に結合しているということは、結合しているＤＮＡ配列が隣接していること、そして分泌リーダーの場合には、それが隣接しておりかつ読み取り相内にあることを意味する。結合は、好都合な制限部位に結合させることで達成される。もしそのような部位が存在しない場合には、従来の実施に従い合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【００５４】
原核性宿主細胞に用いるのに適したプロモーターには、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［チャンら（Ｃｈａｎｇ，）１９７８，Ｎａｔｕｒｅ
２７５：６１５；ゲッデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲッデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．），１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８：４０５７およびＥＰＯ出願公開第３６，７７６号］、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター系［ボアら（Ｈ．ｄｅ  Ｂｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ）．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ；，８０：２１］がある。しかしながら他の既知の細菌性プロモーターも適する。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより、必要な制限部位を供給する任意のリンカーまたはアダプターを用いて、当業者はそれらをＮＴ−４をコードするＤＮＡに機能的に結合させることができる［シーベンリストら（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．），１９８０，Ｃｅｌｌ  ２０：２６９］。細菌系で用いることができるプロモーターは、ＮＴ−４をコードするＤＮＡに機能的に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するだろう。
【００５５】
酵母宿主細胞に用いる適当なプロモーターの例には、３−ホスホグリセラートキナーゼのためのプロモーター［ヒッツマンら（Ｈｉｔｓｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９８０  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３］または他のグリコリティック（糖分解）酵素類［ヘスら（Ｈｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ，），１９６８，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ），１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００］であって、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルバートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グクコース−６−ホスファートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルバートキナーゼ、トリオセホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼがある。
【００５６】
培養条件により転写が制御されるという利点をも有する誘導可能な酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解可能な酵素、メ夕ロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関連する酵素類のプロモーター領域がある。酵母発現に用いられる適当なベクターおよびプロモーターはハイツマン（Ｒ．Ｈｉｔｚｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．）の欧州特許７３，６５７Ａに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモーターと用いると便利である。
【００５７】
哺乳類宿主細胞内でのＮＴ−４をコードするＤＮＡの転写はポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ−型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等、ウイルスゲノムから、あるいは、アクチンプロモーターのような、異種の哺乳類プロモーターから得られたプロモーターによってコントロールされる。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含む、ＳＶ４０制限断片として好都合に得ることができる［ファイアーら（Ｆｉｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．），１９７８，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３］。勿論、宿主細胞または近縁種からのプロモーターも本発明には使用可能である。
【００５８】
哺乳類宿主細胞内でのＮＴ−４をコードするＤＮＡの転写はエンハンサー配列を該ベクターに導入することで促進される。エンハンサーは通常、約１０−３００ｂｐのヌクレオチド配列であって、その相対的な方向性および位置とは無関係にプロモーターに作用してその転写を増大させる。今日、多くの哺乳類遺伝子由来のエンハンサー配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインシュリン）。しかしながら、真核性細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いるのが普通である。その例にはＳＶ４０の複製起点の後方部位にあるエンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイスルの早期プロモー夕ーエンハンサー、複製起点の後方部位にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。このエンハンサーはＮＴ−４をコードする配列の５’または３’位置内にスプライスすることができるが、プロモーターの５’側が好ましい。
【００５９】
真核性宿主細胞（酵母、カビ（真菌）、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多核性生物由来の有核細胞）内で用いる発現ベクターは転写の終結とｍＲＮＡの安定化のための配列をも含有する必要がある。そのような配列は通常、真核性またはウイルス性ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域はＮＴ−４をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内でポリアデニル化セグメントとして転写される領域を含む。３’非翻訳領域もまた転写終止部位を有する。
【００６０】
本明細書記載のベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は原核性細胞、酵母または上記の高等な真核性細胞である。適当な原核性細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌や棹菌がある。好ましいクローニングのための宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、他のグラム陰性またはグラム陽性原核性細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉＢ，Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、シュードモナス種またはＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓも適する。
【００６１】
原核性細胞に加えて、繊維状真菌、または酵母はＮＴ−４をコードするベクターに適する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通常のパン酵母が最も普通に用いられる下等真核性宿主微生物である。しかしながら多くの他の属、種および株も普通に手にいれ、本発明に用いることができる。
【００６２】
ＮＴ−４の発現に適した宿主細胞は多細胞生物から導かれる。そのような宿主細胞は複雑なプロセシングとグリコシル化活性を有する。基本的には、それが脊椎動物または無脊椎動物培養のいずれであろうと、高等真核細胞培養は有効であるが、ヒト等の哺乳類細胞が好ましい。培養されたそのような細胞の販売は自体既知である。［Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９７３，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。有用な哺乳類宿主細胞系はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｗ１３８，ＢＨＫ，ＣＯＳ−７，ＭＤＣＫ細胞系およびヒト胚腎細胞系２９３である。
【００６３】
宿主細胞は上記の発現またはクローニングベクターで形質転換されプロモーターの誘導
または増幅された遺伝子を含有する形質転換体の選択に適当な、通常の栄養培地内で培養する。温度、ｐＨ等の培養条件はクローニングまたは発現のために選択した宿主細胞に、従来用いられているものが適し、そしてそれらは、当業者に明らかであろう。
【００６４】
ＮＴ−４は、分泌シグナルなしに直接発現されたときは宿主細胞の溶解液（リゼート）から回収されるが、分泌タンパク質として培養培地から回収することが好ましい。ヒト起源でない組換え宿主細胞内でＮＴ−４が発現された場合、該ＮＴ−４は、ヒト起源のタンパク質を全く含んでいない。しかしながら、タンパク質として実質上、均一な製品を得るためにはＮＴ−４を組換え細胞タンパク質から精製する必要がある。第１工程として、培養培地またはリゼートを遠心して沈澱性の細胞屑を除去する。次いで、例えば、イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムによるフラクション処理；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱；またはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５等を用いるゲル電気泳動等によって共存する可溶性タンパク質からＮＴ−４を精製する。天然ＮＴ−４に対する残基の欠失、挿入または置換のある変異体は、変異による実質上の特性の変化を考慮し、天然ＮＴ−４と同様に回収される。例えば、他のタンパク質、例えば細菌またはウイルス抗原、とＮＴ−４との融合物の製造は該抗原に対する抗体を含有するアフィニティーカラムを用いて融合タンパク質を吸着させることができるので、精製を容易にする。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼインヒビターは、精製途中でのプロテアーゼによるタンパク質分解を阻害するので有用であり、偶然の汚染の増大を避けるために抗体を含有させてもよい。当業者は天然ＮＴ−４に適した精製法は、組換え細胞培養内でのＮＴ−４またはその変異体の特性の変化を考慮して、改良する必要があるということを理解するであろう。
【００６５】
ＮＴ−４および改良形ＮＴ−４のペプチドフラグメントも本発明の範囲に含まれる。約４０アミノ酸残基までのペプチドフラグメントをインビトロ合成によって常法通り製造することができる。
【００６６】
共有結合的な修飾はＮＴ−４ポリペプチドまたはペプチドフラグメントの標的アミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮ−またはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導化剤と反応させることによって行う。
【００６７】
システィル残基は、最も一般的には、クロル酢酸またはクロル酢酸アミドのようなα−ハロアセテート類（および対応するアミン類）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システィル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジル  ジスルフィド、メチル  ２−ピリジル  ジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール等との反応によっても誘導体化される。
【００６８】
ヒスチジル残基はｐＨ５．５−７．０で、該ヒスチジンの側鎖に比較的特異的な試薬であるジエチルピロカーボナートと反応させることで誘導体化される。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム中で行う。
【００６９】
リジルおよびアミノ末端残基はクエン酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化はリジン残基の電荷の逆転効果がある。α−アミノ含有残基の誘導体化に適する他の適当な試薬には、メチルピコリンイミダートのようなイミドエステル類；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；クロロボロハイドライド；トリニトロ
ベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオンおよびグリコキシラートによるトランスアミナーゼ−触媒反応である。
【００７０】
アルギニル残基は１または数個の常用の試薬との反応で修飾される。それらの試薬には、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが含まれる。グアニジン官能基の高いｐＫａ値の故に、アルギニンの誘導体化には、反応を塩基性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬をアルギニンイプシロン−アミノ基と同様、リジン基と反応させてもよい。
【００７１】
チロシル残基の特異的な修飾は、芳香性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応にり、チロシン残基へのスペクトルラベルを導入するという利益を伴って行い得る。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用い、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を得る。チロシル残基を１２５Ｉまたは１３１Ｉでヨウ素化するとラジオイムノアッセイに用いる標識タンパク質が得られるが、上記のクロラミンＴ法が適当である。
【００７２】
カルボキシル側鎖基（アスパラチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ−４−エチル）カーボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カーボジイミド等のカーボジイミド類（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応でアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００７３】
２機能性試薬による誘導体化は、抗ＮＴ−４抗体の精製のために、ＮＴ−４を水不溶性支持体マトリックスまたは表面にクロスリンキングさせる、またはその逆のために有用である。通常用いられるクロスリンキング剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルのようなＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステルを始めとするホモ２機能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような２機能性マレイミド類がある。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は光の存在下でクロスリンキングを形成し得る光活性な中間体を与える。あるいは、臭化シアン−活性化炭化水素のような反応性水不溶性マトリクスと文献（米国特許第３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；または４，３３０，４４０号）記載の反応性基質を用いてタンパク質の免疫原化を行うことができる。
【００７４】
グルタミニルおよびアルパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基をおだやかな酸性条件下で脱アミド化してもよい。これらの残基のいずれの形も本発明の範囲に含まれる。
【００７５】
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のりん酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［クレトン（Ｃｒｅｇｈｔｏｎ），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。ＮＴ−４はまた、非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類に、米国特許出願第０７／２７５，２９６；または米国特許第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６０，４１７；４，７９１，１９２；または４，１７９，３３７号に記載の方法で共有結合的に結合させる。
【００７６】
純化（精製）形のＮＴ−４、即ち、実質上他のポリペプチドまたはペプチドを伴わないＮＴ−４を、例えばコアセルベーション法または相間重合等（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル、コロイド状薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフォア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに入れることができる。そのような方法は文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０，（Ａ．Ｏｓｏｌ  Ｅｄ．））に記載されている。
【００７７】
ＮＴ−４には神経細胞の生存率を向上する薬剤または外方成長を刺激する薬剤としての用途が見つかった信じられる。従って、この物質は、アルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＬＳ、末梢ニューロパシー（神経障害）、およびその他の中枢、末梢または運動神経における神経細胞の壊死または喪失を特徴とする他の症状の治療に有用である。加えて、これは、例えば、火傷や怪我等の外傷条件により、糖尿病、腎不全、ガンやＡＩＤＳの化学療法の毒性作用で損傷された神経細胞等の、損傷神経細胞の治療にも有用である。それはまた、インビトロで神経細胞を培養する場合に培養培地に加える成分として有用である。最後に、ＮＴ−４製品は、放射性ヨウ素、酵素、発蛍光団、スピン標識等で標識すると、ＮＴ−４のアッセイおよび競合型受容体結合アッセイにおける標準として有用である。
【００７８】
治療のためのＮＴ−４製剤は所望の純度のＮＴ−４を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲）と混合し、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の剤形にして調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は用いられる用量および濃度において受容者に非毒性であり、それには、りん酸、クエン酸、および他の有機酸のバッファー；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸；単糖類；二糖類およびグルコース、マンノースおよびデキストリン等の他の炭化水素；マンニトールやソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成性カウンターイオン；および／またはＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓまたはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００７９】
インビボに用いられるＮＴ−４は滅菌されている必要がある。これは凍結乾燥の前または後で滅菌ろ過メンブランに通し、再構築することで容易に行われる。ＮＴ−４は通常、凍結乾燥形で保存される。
【００８０】
治療用のＮＴ−４組成物は通常、滅菌のための栓を有する容器、例えば、皮下注射針を突き刺すことができる静注溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【００８１】
所望により、ＮＴ−４をＮＧＦ、ＮＴ−３および／またはＢＤＮＦを含む他の神経栄養因子と混合するか、あるいは一緒に投与し、他の変性性神経疾患の治療法と共に用いる。
【００８２】
ＮＴ−４またはＮＴ−４抗体の投与経路は周知の方法により、例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内または病巣内経路への注射または注入、局所適用、または下記の徐放性システムである。ＮＴ−４はＣＮＳの液体貯蔵所への連続注入によって投与されるが、ボーラス注射も受容し得る。ＮＴ−４は脳小室へ投与するか、さもなくば、ＣＮ
Ｓまたは脊髄液に導入する。それはポンプのような連続投与手段を用い、インドゥエリング（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ）カテーテルによって投与するか、あるいは例えば徐放性ビヒクルの脳内移植のような移植によって投与すべきである。より詳しくは、ＮＴ−４は慢性的に移植されているカニューレを通して注射するか、浸透圧ミニポンプの助けを借りて慢性的に注入する。タンパク質を小さい管を通して脳小室に供給する皮下ポンプも利用可能である。高精度のポンプは皮膚を通して再充填され、その供給速度は外科的処置の介在なしにセットし得る。適当な投与プロトコルおよび皮下ポンプ装置または完全に移植された薬物供給システムを通しての連続的脳小室注入を始めとする供給システムの例は、アルツハイマー患者、および文献［ハルバウ（Ｈａｒｂａｕｇｈ），１９８７，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．２４：２７１；ＤｅＹｅｂｅｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．２：１４３］記載のパーキンソン病のための動物モデルヘのドパミンアゴニスト、コリンアゴニストの投与に用いられるものである。ＮＴ−４抗体も同様の方法、または血流またはりンパヘの投与によって投与される。
【００８３】
徐放性製剤の適当な例には、例えば、フィルム、マイクロカプセル等の形の成型された半透成型ポリマーマトリックスがある。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９，ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸ガンマエチルとのコポリマー（シドマンら（Ｓｉｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．），１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７；ランガー（Ｌａｎｇｅｒ），１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同）、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）がある。徐放性ＮＴ−４組成物にはリポソームにくるまれたＮＴ−４も含まれる。ＮＴ−４含有リポソームは自体既知の方法で調製される［エプスタインら（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：３６８８；ハワンら（Ｈｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．），１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；ＤＥ３，２１８，１２１Ａ；ＥＰ５２３２２Ａ；ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２６４１Ａ；日本特許出題第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４５４５号；およびＥＰ１０２，３２４Ａ］。通常、リポソームは脂質含量が約３０ｍｏｌ％コレステロールの小さい（約２００−８００オングストローム）単一層タイプであり、ＮＴ−４治療に最適な割合に調整したものが選択される。
【００８４】
治療に用いられるＮＴ−４の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態等に依存するであろう。従って、治療者は最適な治療効果を得るよう、用量を定量し、投与経路を改良することが必要である。典型的な１日あたりの用量は上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であろう。一般に、臨床医は、神経細胞機能を修復し、維持し、そして好適に、神経細胞機能を再確立するだけの量のＮＴ−４を投与するであろう。この治療の進行は従来からの分析により容易に改良し得る。
【００８５】
ＮＴ−４に対するポリクローナル抗体はＮＴ−４とアジュバントとを複数回、動物に皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することで惹起される。ＮＴ−４または、標的アミノ酸配列を免疫すべき種内で免疫原性を有するタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、２機能性試薬または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることが有用である。
【００８６】
動物に、免疫原性コンジュゲート１ｍｇまたは１μｇ（それぞれ兎またはマウスに対して）と、３容量のフロインド完全アジュバントを混合し、その溶液を複数の皮内部位に注射することで、動物を該コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１カ月後、元の、フロインドの完全アジュバント中コンジュゲートのの約１／５から１／１０量を動物の皮内の複数箇所にブースター注射する。７〜１０日後に動物から採血し、血清を抗ＮＴ−４力価に関して分析する。力価が一定になるまで動物にブースター注射を行う。好ましくは、動物を同じＮＴ−４ポリペプチドのコンジュゲートであるが、異なるタンパク質に結合しており、そして／またはそれが異なるクロスリンキング剤を介して結合しているコンジュゲートでブースター注射する。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養内で、融合タンパク質として製造され得る。また。免疫応答を高めるために、ミョウバンのような凝集剤を用いる。
【００８７】
モノクローナル抗体は免疫動物から脾臓細胞を回収し、例えば骨髄腫細胞との融合またはＥＶウイルス形質転換等の常法に従い、該細胞を不死化し、所望の抗体を発現しているクローンをスクリーニングすることで調製される。
【００８８】
ＮＴ−４抗体はＮＴ−４またはその抗体の診断分析に有用である。抗体を上記のＮＴ−４の標識と同様の方法で標識し、かつ／または不溶性マトリックスに固定化する。受容体結合分析の１態様では、全ＮＴ−４ファミリーを吸着させるために、全部のまたは選択したＮＴ−４ファミリーの複数のメンバーと結合する抗体組成物を不溶性マトリックスに固定化し、被検試料を固定化抗体組成物と接触させ、次いで、固定化ファミリーメンバーを各メンバーに特異的な複数の抗体であって、その各々は、別個の発蛍光団等の特有の標識により、それぞれが予め決まったファミリーメンバーに特異的なものとして同定することが可能な抗体と接触させる。各特有の標識の存在および／または各特有の標識の量を測定することで各ファミリーメンバーの相対的な比率および量を決定することができる。
【００８９】
ＮＴ−４抗体はまた、ＮＴ−４の組換え細胞培養または天然起源からのアフィニティー精製に有用である。検出可能な程度にはＮＧＦ、ＮＴ−３またはＢＤＮＦと交差反応しないＮＴ−４抗体は、これらの他のファミリーメンバーを含まない精製ＮＴ−４の取得に有用である。
【００９０】
ＮＴ−４およびその抗体の適当な診断分析は自体既知である。上記のバイオアッセイに加えて、競合法、サンドイッチ法および立体阻害アッセイが有用である。競合法およびサンドイッチ法は相分離工程部分を必要とするが、立体阻害アッセイは単一の反応混合物で行われる。分析される物質の分子量に応じて、ある方法が好ましいこともあるが、基本的には、ＮＴ−４およびＮＴ−４に結合する物質について同じ工程を用いる。従って、本明細書では、それが抗原または抗体のいずれの状態であるかを問わず、被検物質をアナライトと称し、アナライトと結合するタンパク質を、抗体、細胞表面受容体または抗原のいずれであろうと、結合パートナーと称する。
【００９１】
ＮＴ−４またはその抗体のための分析学的方法はすべて、以下の試薬の１つまたはそれ以上を用いる：標識アナライト類似体（アナローグ）、固定化アナライト類似体、標識結合パートナー、固定化結合パートナーおよび立体コンジュゲート。標識した試薬は「トレーサー」としても知られる。
【００９２】
用いる標識はアナライトとその結合パートナーとの結合を干渉しない検出可能な機能物質である。イムノアッセイに用いられる多くの標識が既知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、１４Ｃおよび１３１Ｉ等の放射性同位元素、希土類キレートやフルオレスセイン等の発蛍光団、安定なフリーラジカル等がある。これらの標識をタンパ
ク質またはポリペプチドに共有結合させるには、従来の方法を用いることができる。そのような結合法は、その全部がタンパク質性であるＮＴ−４またはその抗体に用いるのに適する。
【００９３】
ある分析法では試薬の固定化が必要である。固定化は結合パートナーと、溶液中に遊離して残存するなんらのアナライトとの分離を伴う。これは、従来、分析に先立って結合パートナーまたはアナライト類のいずれかを水不溶性のマトリックスまたは表面［ベニッヒら（Ｂｅｎｎｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７２０，７６０］に、共有結合的カップリング（例えば、グルタルアルデヒド交差結合を用い）でマトリックスまたは表面に吸着させるか、あるいは例えば免疫沈降により、後にパートナーまたは類似体を不溶化することで行われてきた。
【００９４】
その他、競合法またはサンドイッチ法として周知の分析法は十分に確立されており、商業的診断産業で広範に利用されている。
【００９５】
競合アッセイは、標識類似体（またはトレーサー）と被検試料アナライトとの、共通の結合パートナー上の限られた結合部位への結合能力によっている。通常、結合パートナーを競合の前または後に不溶化し、次いで、結合パートナーと結合したトレーサーおよびアナライトを結合しなかったトレーサーおよびアナライトから分離する。この分離はデカンテーション（競合反応前に結合パートナーを不溶化したとき）あるいは遠心（結合反応後に結合パートナーを沈降させたとき）で行う。被検試料アナライトの量はマーカー物質の量の測定価としての結合トレーサーの量と逆比例する。既知量のアナライトについての用量−応答曲線を作成し、試験結果と比較して被検試料中に存在するアナライトの量を定量的に決定する。これらのアッセイにおいて酵素を検出可能なマーカーとして用いた場合、ＥＬＩＳＡ系と称する。
【００９６】
他の競合分析である「ホモジーニアス」アッセイでは、相の分離を必要としない。ここでは、酵素とアナライトとのコンジュゲートを調製し、抗アナライトがアナライトに結合したとき、抗アナライトの存在が酵素活性を改変するように用いる。この場合、ＮＴ−４またはその免疫学的に活性な断片を２機能性の有機性ブリッジを介してペルオキシダーゼのような酵素にコンジュゲート結合させる。コンジュゲートは、抗ＮＴ−４の結合が標識の酵素活性を阻害または強化するよう、抗ＮＴ−４と共に使用するよう選択する。この方法はそれ自体、ＥＭＩＴという名称で広範に用いられている。
【００９７】
立体コンジュゲートはホモジーニアスアッセイにおける立体阻害法に用いられる。これらのコンジュゲートは、低分子量ハプテンを小さいアナライトに共有結合で結合させることにより合成されるが、この場合、ハプテンに対する抗体が、実質上、抗アナライトとして同時にコンジュゲートに結合することができないように合成される。この分析法では、被検試料に存在するアナライトが抗アナライトと結合し、それにより、抗ハプテンがコンジュゲートに結合することができ、その結果、コンジュゲートハプテンの性質、例えば、ハプテンが発蛍光団であるばあいには蛍光、を変化させる。
【００９８】
サンドイッチ法は特にＮＴ−４またはＮＴ−４抗体の測定に有用である。連続サンドイッチ法では、固定化した結合パートナーを用いて被検試料中のアナライトを吸着させ、被検試料を洗浄等で除去し、結合したアナライトを用いて標識した結合パートナーを吸着させ、次いで結合した物質を残存トレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は被検試料アナライトに正比例する。「同時」サンドイッチ法では、標識した結合パートナーを加える前に被検試料を除去しない。１方の抗体として抗ＮＴ−４モノクローナル抗体を、他の抗体としてポリクローナル抗ＮＴ−４抗体を用いる連続サンドイッチ法はＮＴ−４活性を試験するための試料に有用である。
【００９９】
上記は、単にＮＴ−４および抗体の診断分析の例にすぎない。上記のバイオアッセイを初めとして、今日、または将来、これらアナライトのために開発される他の方法も本発明の範囲に包含される。
【０１００】
当業者に明らかなこれら、およびその他の本発明の目的は、まず、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３と関連した新規な神経−誘導因子（以下、神経栄養因子−４またはＮＴ−４と称する）をコードする配列の少なくとも一部を得ることで達成された。
【０１０１】
１側面では、本発明はＮＴ−４をコードする単離された核酸を提供する。他の側面では、本発明はこの核酸を含むベクターを提供する。第３の側面では、本発明はこの核酸を含有する組換え宿主細胞を提供する。さらに他の側面では、本発明は動物種起源のＮＴ−４を含有し、該動物種の不純物質（混在）ポリペプチドを含有しない組成物を提供する。
【０１０２】
ＮＴ−４をコードする核酸はまた、ＮＴ−４をコードする核酸と実質上配列相同性を有する核酸を同定、単離するためのハイブリダイゼーション分析に用いることができる。
【０１０３】
ＮＴ−４またはそのフラグメント（それらはインビトロの方法で合成することもできる）を（組換え発現、またはインビトロの共有結合的な方法で）免疫原性ポリペプチドと融合させ、次いで、この融合物を用いて動物を免疫し、ＮＴ−４エピトープに対する抗体を生産させる。抗ＮＴ−４抗体は免疫動物の血清から回収される。あるいは、免疫動物の細胞から、常法通り、モノクローナル抗体を調製する。通常のスクリーニングで同定された抗体はＮＴ−４と結合するが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３とは実質上、交差反応しないであろう。特に、固定化抗ＮＴ−４抗体は特にＮＴ−４の診断（インビトロまたはインビボ）またはＮＴ−４の精製に有用である。
【０１０４】
置換、欠失または挿入によるＮＴ−４の変異体をインビトロまたは組換え法で調製し、ＮＴ−４との免疫交差反応性に関し、またはＮＴ−４拮抗またはアゴニスト作用に関して、スクリーニングする。
【０１０５】
特にＮＴ−４またはその抗体の診断のために、またはＮＴ−４抗体のアフィニティー精製のために、固定化および標識化ＮＴ−４を得るために、インビトロでＮＴ−４の誘導体を調製する。
【０１０６】
ＮＴ−４、その変異体またはその改良形、あるいはその抗体を生理学的に許容される媒質、特に治療用の媒質を用いて製剤化する。そのような媒質には、徐放性製剤が含まれる。
【０１０７】
他の面では、本発明は、ＮＴ−４、またはその変異体または改良形を製造する方法であって、形質転換された宿主細胞を培養し、所望のポリペプチドを宿主細胞培養物から回収することからなる方法を提供する。
【０１０８】
ＮＴ−４は広範な組織分布を有し、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３と構造上、関連することが分かった。その脳および筋肉組織における存在は、それが神経変性性疾患および損傷神経細胞、例えば、外傷による神経損傷、の治療剤として有用であることを示唆している。
【０１０９】
従って、他の面では、本発明は、神経変性性疾患または損傷神経細胞を治療する方法であって、哺乳類に有効量のＮＴ−４、またはその変異体または改良形を投与することからなる方法を提供するものである。
【０１１０】
以下の実施例は例示のために示されたものであり、決して限定的なものではない。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１）
ヒトゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーから、ＮＧＦおよびＢＤＮＦプローブを用いてＮＴ−４をコードするＤＮＡを同定し単離する試みは失敗した。むしろＮＴ−４遺伝子の同定には、ヒトゲノムＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（ムリスら（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．），１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３）によって増幅する必要があった。活性型のＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３は単一のエクソンにコードされている（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（前掲）；Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（前掲））ので、上記のプライマーのための鋳型としてヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの、ゲノムＤＮＡライブラリーの調製の項を参考にして調製した）を用いた。ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３のアミノ酸配列を共通の相同性領域に関して精査した。これらの領域の多くが同定され、選択したＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３配列のプラスおよびマイナル鎖のＤＮＡのすべての可能な配列に相補的な、Ｓａｌ、ＸｂａおよびＥｃｏＲＩのための制限部位を有する１本鎖プライマープールを調製した。センス鎖のためのプライマープールは（成熟ヒトβＮＧＦ）ＮＧＦの５０−５８残基（ＮＧＸ−５４と命名）に相当していた。センスプライマーは以下のものから選択される配列を有する。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．９３，９４，９５，９６）。
【０１１２】
【表４】
2006087434.tif 000005
アンチセンス鎖のためのプライマープールはＮＧＦの残基１０２−１１０（ＡＲ１と命名）に相当しており、下記のものから選択される配列を有する。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．９７、９８、９９および１００）。
【０１１３】
【表５】
2006087434.tif 000006
各プライマー配列は増幅配列のクローニングを容易にするために、その５’末端に制限部位を持っていることに注意されたい。増幅条件の注意深い選択によって、これらのプールがより短いアミノ酸配列（３２から３２，０００倍の縮重）に対して従来用いられたプールよりもかなり大きいという事実にもかかわらず、ＮＴ−４配列を増幅することができた。（リーら（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．），１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１２８８；ストラスマンら（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：７７４０７；Ｌｅｉｂｒｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．前掲）。プライマーを用いて増幅されたＤＮＡを調製し、次いでこれを配列決定した。増幅の条件
は以下の通りである。
Ｉ．ヒト胎盤ゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ
最初は９５℃，５分の変性を１回
以後、以下を４４サイクル
変性：９５℃，１分
アニーリング：５５℃，１分
伸長：７２℃，１分
最後に伸長：７２℃、１５分
１０ｘバッファー（最終＝５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１０μｌ
ヒトゲノムＤＮＡ３μｌ（３μｇ）
７．５ｎｇ／μｌプライマー（３３ｍｅｒ約１μｇ＝約２．６μＭ、従って、１０３ｄｅｇｅｎ＝ｎＭ、１０６＝ｐＭ）
７．５ｎｇ／μｌプライマー
１０ｘｄＮＴＰ類１０μｌ（最終＝０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ）
Ｔａｑポリメラーゼ１μｌ
ｄＨ２Ｏ  ６１μｌ
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
合計      １００μｌ
ＩＩ．ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、所望の約２１０ｂｐの大きさの生成したフラグメントをゲル精製し、Ｍ１３に基づくベクター、Ｍ１３ｍｐ１８（ファルマシア）にサブクローニングする。
【０１１４】
ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３クローンをそれらの各々のｃＤＮＡ配列の唯一の領域から導かれたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって同定する。ハイブリダイゼーションしない挿入物を含有するプラスミドを配列決定し（スミス（Ｓｍｉｔｈ），１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：５６０）、それらから可能な翻訳生成物をＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３との相同性に関して分析した。
【０１１５】
この工程によって、約５００のＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３クローンと７８の無関係なクローンが存在することが判明した。さらに、新規なＮＧＦ関連因子の部分をコードする３つのＤＮＡ断片が同定され、これらをまとめてＮＴ−４と命名した。ＰＣＲによって生成したＮＴ−４クローンの豊富度が低いことは、ＤＮＡ配列とＰＣＲプライマーとの相同性の低さに起因していた。
【０１１６】
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ローゼンタールら（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，
ｅｔ  ａｌ．），１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３６４１）を、胎盤ゲノムクローンをプローブとしてスクリーニングすると、なんら陽性のクローンが得られなかった。完全なヒトＮＴ−４類似体を得るために、ヒトゲノムライブラリー（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），１９７８，Ｃｅｌｌ  １５：６８７）をもスクリーニングし、６ｋｂ断片を単離した。この断片はＮＴ−４成熟ポリペプチドを囲む１６８アミノ酸をコードする単一のオープンリーディングフレームを有することが分かった。
【０１１７】
ヒト成熟ＮＴ−４およびその前駆体の少なくとも一部の完全なヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を図１に示す。シグナル配列を含む完全な前駆体領域は、示した開始メチオニンと、成熟配列の開始前の開裂部位の最後のＡｒｇとの間に示されているかもしれない。もし、そうであれば、ＮＴ−４の前駆体領域は図２に示したＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３の前駆体領域よりもはるかに短い。ＮＴ−４のための開始コドンの帰属は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３の開始コドンの位置に基づいて行った。成熟ヒトＮＴ−４のアミノ酸配列は、図２記載の配列の比較に基づいて、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−
３と約４６％、５５％および５２％の配列相同性（同一性）を有する。
【０１１８】
ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３の活性な成熟形は、それらの約３０ｋＤの前駆体から生成される１３−１４ｋＤのホモダイマーである（Ｌｅｉｂｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．前掲；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．前掲；Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．前掲；グリーンおよびショーター（Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｓｈｏｏｔｅｒ），１９８０  Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：３５３）。ＮＴ−４前駆体タンパク質もまた成熟領域の開始位置前に潜在的な４塩基の開裂部位を示し、これはこのタンパク質ファミリーの４つのメンバー全部が同様のプロセッシングを受けることを示している。この部位でのプロセッシングは１３．１４ｋＤ（１３０アミノ酸）ポリペプチドを与える。
【０１１９】
ＮＴ−４の可能な機能を評価するために、ノーザンブロット法でその組織内の分布を調べた。ラットでは、ＮＴ−４ｍＲＮＡは心臓、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、腸、肺、および脊髄、並びに幾つかの脳の領域、小脳および皮質を含めて、調べた各組織に様々な濃度で存在していた。この、ＮＴ−４ｍＲＮＡの広範な器官での分布は、抹消神経系では、ＮＴ−４は交感、感覚、および／または運動神経細胞のための標的−誘導性の栄養因子であることを示唆していた。この理論を、組換えヒトＮＴ−４をコードするＤＮＡを発現させ、その様々な活性を分析することで試験した。
【０１２０】
（実施例２）
以下のＮＴ−４ＤＮＡの発現および生成したＮＴ−４の精製のプロトコルは、分析目的に十分なＮＴ−４を与えると予測されるものであった。この実施例では精製ＮＴ−４を試験してＮＧＦと比較するのに用いることができると考えられるアッセイをも提供する。
【０１２１】
発現ベクターとして、サイトメガロウイルスに基づく発現ベクターｐＲＫ５［ゴーマンら（Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．），１９９０，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２：１およびＥＰ公開Ｎｏ．３０７，２４７，１９８９年３月１５日発行，］を用いる。ＮＴ−４ゲノムＤＮＡをそれがクローンされていたファージから切断する。次いで、ＤＮＡ断片を、予め、ＤＮＡに適応させるように適当な制限酵素で切断しておいたｐＲＫ５に標準的な結合法で結合させる［マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。得られたベクターをｐＲＫ−５ｈＮＴ−４と称する。
【０１２２】
ヒト胚性腎臓２９３細胞系（グラハムら（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）を全面成長まで増殖させる。ＮＴ−４プラスミドＤＮＡ（ｐＲＫ−５ｈＮＴ−４）１０μｇをＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［タイマッパヤら（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ  ｅｔ  ａｌ．），１９８２，Ｃｅｌｌ，３１：５４３］１μｇと混合し、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ２５００μｌに溶解する。これに５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ４５００μｌをボルテックスしながら滴下して加え、２５℃で１０分間沈澱を折出させる。懸濁した沈澱を細胞（１００ｍＭ  プレート中）に加え、インキュベーター内で４時間静置する。次いで培地を吸引除去し、りん酸緩衝化食塩水中２０％グリセロール２ｍｌを３０秒加える。細胞を血清不含培地５ｍｌで２回洗浄した後、新鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベーションする。
【０１２３】
２９３細胞をｐＲＫ５単独で同様に形質転換（トランスフェクション）する。
【０１２４】
形質転換（トランスフェクション）の２４時間後、培地を交換し、細胞を２００μＣｉ／ｍｌ３６Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌ３６Ｓ−メチオニンの存在下で１２時間インキュベーションする。次いで調整培地を採取し、凍結乾燥して５倍濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填し、次いで、高め、乾燥し、２時間、フィルムに露出する。これらのデータは、ほぼ予測される大きさ（１４−１５ｋＤ）のポリペプチドの存在を示すと思われる。
【０１２５】
ＮＴ−４の大規模発現は、硫酸デキストラン法［ソンペイラックおよびダナ（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ  ａｎｄ  Ｄａｎｎａ），１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２：７５７５］でｐＲＫ−５ｈＮＴ−４  ７００μｇを３リッターのＢｅｌｃｏ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｓｐｉｎｎｅｒフラスコ内で最大密度（１．５リッター）に増殖させたヒト胚腎臓２９３細胞系に一時的に導入することで行う。細胞をまず遠心してｓｐｉｎｎｅｒフラスコから濃縮し、りん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＤＮＡ−デキストラン沈澱を細胞ペレット上で４時間インキュベーションする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地（５０：５０）等の培地で洗浄し、上記の培地＋５μｇ／ｍｌウシインシュリンおよび０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含有する３リッターのｓｐｉｎｎｅｒフラスコに再度導入する。上記のプロトコルを３個の別個の３リッター培養に関して行う。
【０１２６】
４日後、上記の大規模発現から得た約５リッターの調整培地を遠心し、濾過して細胞と屑を除去し、１００倍濃縮する。バッファー、塩、および他の小さい分子を２５ｍＭのほう酸ナトリウム、ｐＨ９．０および４Ｍ尿素内に透折することで交換し、５ｃｍ  ｘ  ５ｃｍＤＥＡＥセファロース高速−イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に適用する。カラム溶離液（４９５ｍｌ）を２５０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファー０．１容量を最終組成が２５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０および４Ｍ尿素となるように加えて中和（ｐＨ７．０）する。この試料を２．５ｃｍ  ｘ  ２．５ｃｍのＳ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に適用し、洗浄し、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、４Ｍ尿素、および０．５Ｍ
ＮａＣｌ（４０ｍｌ）で溶離する。
【０１２７】
以下の２つの異なるアッセイは組換えヒトＮＴ−４がＳ−セファロース塩溶離液（１３０ｎｇ／ｍｌ、合計５μｇ）にあることを示している：１）３種の型の雛胚末梢神経節細胞における４８時間神経細胞生存および軸索の外への成長：それらは、脊椎傍交感神経鎖神経節細胞、後根神経節（腰仙領域）の脊髄感覚神経細胞、および結節性神経性細胞である、および２）ＮＴ−４でなく、βＮＧＦを免疫原として用い、上記の発明の詳細な説明の項で述べたごとくにして生成することができるヒトβＮＧＦに対するポリクローナル抗体を利用するＥＬＩＳＡアッセイ（ルーカスら（Ｌｕｃａｓ，ｅｔ  ａｌ．），１９８９，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２０；４４９）での免疫交差反応性。Ｓ−セファロース溶離液を１Ｍ酢酸と４Ｍ尿素に透折し、１０倍に濃縮し、Ｓ−３００セファクリルゲルろ過カラム（１．５ｃｍ  ｘ  ４４ｃｍ）に適用し、同じバッファーでクロマトグラフする。
【０１２８】
採取した各１ｍｌ画分から２００μｌをとり、１Ｍ酢酸に透折し、凍結乾燥し、３０μｌのレムリＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ
２２７：６８０）に再溶解する。ヒトβＮＧＦも同様にして得られる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて銀染色したゲルは、単一の優先的に染色される約１５ｋＤポリペプチドを示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析領域に対応するＳ−３００カラム溶離画分の３ｍｌプール作り、１ｍｌ（０．５ｎｍｏｌｅ）をプロトタイプ自動アミノ酸シーケンサー（コール（Ｋｏｈｒ），ＥＰ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２５７，７３５）によるエドマン分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定に付す。Ｎ−末端アミノ酸配列決定はアルギニンで終わる４塩基
の開裂配列で推測され、プレプロＮＧＦから成熟βＮＧＦのプロセッシングによって推測される、グリシンから始まる単一の配列を与える。
【０１２９】
最初の配列決定サイクルは３−カラム工程からの精製ヒトＮＴ−４の回収量を示すために定量される。精製組換えヒトＮＴ−４を０．１％酢酸に透折し、最終濃度３．２５μｇ／ｍｌとする。このストック物質を、種々のバイオアッセイのために、４〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で神経細胞培地（１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ高グルコース）で希釈してもよい。
【０１３０】
ＮＴ−４の大規模生産のための好ましいベクターは上記のごとく、ＳＶ４０から導いたベクター、例えばｐＳＶ１６Ｂであり、好ましい宿主細胞はチャイニーズハムスターの卵巣細胞であり、好ましい培地は生成物の収率を最適にするようグルコース濃度を高めたＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地または米国特許４，７６７，７０４記載の血清不含培地である。
【０１３１】
精製ＮＴ−４の神経栄養活性を、デーヴィス（Ｄａｖｉｅｓ，ｉｎ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１９８９（Ｒ．Ａ．Ｒｕｓｈ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ）ｐｐ．９５−１０９）が記載したように、幾つかの型の１次胚性１０日雛神経細胞に関して分析する。即ち、脊椎傍交感神経鎖神経節細胞（ＳＧ）、後根神経節（腰仙領域）（ＤＲＧ）、および結節性神経性細胞（ＮＧ）を１０日雛胚から得る。トリプシンまたパンクレアチン（ＧＩＢＣＯ）を用いて神経細胞を神経節から分離し２回プレプレートして非神経細胞の数を減少する。細胞を計数し、ポリオルニチン（５００μｇ／ｍｌ）とラミニン（１０μｇ／ｍｌ）［リンドセーら（Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ  ａｌ．），１９８５，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１１２：３１９）で前処理した９６ウエルの組織培養プレートに撒く。細胞のは種数はＳＧ、ＤＲＧ、４０００細胞／ウエル；ＮＧ、２０００細胞／ウエルである。
【０１３２】
アッセイに用いた精製マウス下顎神経節βＮＧＦはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得、０．１％酢酸に濃度１０μｇ／ｍｌで溶解する。最終濃度３．２５μｇ／ｍｌに０．１％酢酸に対して透折した精製組換えヒトＮＴ−４を用いる。細胞を因子類の存在下または非存在下に４８時間インキュベーションし、長さが細胞体の５倍（５ｘ）に達した軸索を有する輝相（ブライトフェーズ）の細胞体の数を数える。ＤＲＧおよびＮＧ神経細胞の培養内では個々の神経細胞形質を数えることができる。しかしながら、ＳＧ神経細胞は凝集するので、細胞凝集体を数える。最大応答に際して生存する細胞はＤＲＧおよびＮＧ神経細胞に関して約２０〜４０％であるが、ＳＧ神経細胞に関しては、凝集体が数えられているのでより高いであろう。ＮＧＦおよびＮＴ−４の各々を用いて４回の実験を行う。
【０１３３】
ＮＴ−４は末梢神経細胞に対し、最も活性であると思われる。脊椎動物では、末梢神経細胞は２つの区別される胚起源から導かれる：神経堤と神経プラコードである［ルデュアリンおよびスミス（ＬｅＤｏｕａｒｉｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ），１９８８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：３７５］。神経堤誘導細胞は神経細胞、および末梢神経系の支持細胞を生起し、プラコード誘導細胞は幾つかの感覚神経細胞と頭部神経細胞を生起する。
【０１３４】
神経堤誘導後根感覚神経節（ＤＲＧ）細胞はＣＮＳおよび末梢組織にプロジェクト（企画）されており、それらの両ターゲットから導かれる栄養因子に依存する。（リンセィら（Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ  ａｌ．）１９８５，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１１２：３１９）。この２重依存性は、すべての適当な連絡（コネクション）を形成する神経節のみの生存を確かにすることを可能ならしめる機構である。プラコード誘導感覚神経神経節（ＮＧ）、こ
れもまた２重連絡性であって、ＢＤＮＦのＣＮＳ因子に応答するが、は末梢誘導栄養因子（ＮＧＦ）に応答しない。即ち、ＮＧ神経細胞の末梢標的神経支配は、他の機構を介し、または他の因子によって確かにされると思われる。
【０１３５】
脳および末梢におけるＮＴ−４の存在は、他の機能を示唆し、脳の神経細胞損傷によって引き起こされるアルツハイマー、パーキンソン、ハンチントン病等の疾患の治療における価値、および／または外傷により損なわれた神経の治療または末梢神経細胞の損傷の予防における価値の可能性を示唆する。ＮＴ−４を、例えばヘフティ（前掲）の確立された疾患動物モデル、または高齢ラットまたはサルを用いて、中枢神経系機能に関して試験することができる。
【０１３６】
（実施例ＩＩＩ）
ＮＴ−４の天然に存在するアミノ酸配列変異体を同定するために、上記の成熟ヒトＮＴ−４の暗号配列を含有するゲノムＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションプローブとして用い、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー［ローゼンタールら（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３６４１］およびヒトリンパ細胞ゲノムＤＮＡライブラリー［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ］における相同なＤＮＡ類のスクリーニングを行った。
【０１３７】
ライブラリーＤＮＡを含有するフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は高ストリンジェンシー条件下で行った：放射標識したＮＴ−４プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１ｘ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  りん酸ナトリウムｐＨ６．８、２ｘＤｅｎｈａｒｄｔ（デンハート）の溶液（１ｘ＝０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）、１０％硫酸デキストラン中、４２℃で２０時間行う。フィルターの洗浄は０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で行う。
【０１３８】
成熟ヒトＮＴ−４をコードするＤＮＡと有意な配列相同性を有する３つのＤＮＡが同定された。これら相同性ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を、それらがコードするポリペプチド（それぞれ、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γ、およびＮＴ−４△と命名）の推定のアミノ酸配列と共に、図３、４、５に示す。図３に示すヒトＮＴ−４βをコードするＤＮＡはヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから単離された。図３に記載のヌクレオチド配列はヒトＮＴ−４βの一部をコードするようである。全ヒトＮＴ−４βをコードする完全長さのｃＤＮＡは、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを図３に開示されたｃＤＮＡを用いてプローブすることで容易に得ることができる。ヒトＮＴ−４γをコードするＤＮＡは図４に示す配列を有し、ヒトリンパ細胞ゲノムＤＮＡライブラリーから単離された。図５に示す配列を有するヒトＮＴ−４△もヒトリンパ細胞ゲノムＤＮＡライブラリーから単離された。
【０１３９】
図６はヒトＮＴ−４、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△のアミノ酸配列間の相同性を示す。ヒトＮＴ−４のアミノ酸配列は、図６に記載のアミノ酸配列の比較に基づき、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△の各々と約７５％のアミノ酸相同性（同一性）を有する。本明細書で定義したように、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△は明らかにヒトＮＴ−４のアミノ酸配列変異体であり、様々なアミノ酸の挿入および置換によってヒトＮＴ−４と異なっている。
【０１４０】
ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△はヒトＮＴ−４の天然に存在するアミノ酸配列変異体であるから、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△はヒトＮＴ−４と同様に脊椎動物の神経組織の正常な成長および／または発達の調節に役割を有すると予測される。ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△は、上記のごとく、これらのポリペプチドを
コードするＤＮＡを含む発現ベクターによって形質転換された適当な宿主細胞内での発現による組換え法によって容易に得ることができる。ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△の神経栄養作用を、上記のＮＴ−４に関する記載と同様に分析する。
【０１４１】
要約すると、ＮＴ−４は広範な組織分布の新規な栄養因子である。それはある末梢神経細胞の栄養因子であるＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３を補足するものである。ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△はＮＴ−４の新規なアミノ酸配列変異体である。これら因子の各々は定まった神経細胞サブセットに単独で、または一緒に作用して中枢および末梢神経組織の両方における、正しい神経細胞連絡を達成すると思われる。
【０１４２】
（配列表）
【０１４３】
【表６】
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【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
【表８】
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【０１４６】
【表９】
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【０１４７】
【表１０】
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【０１４８】
【表１１】
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【０１４９】
【表１２】
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【０１５０】
【表１３】
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【０１５１】
【表１４】
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【０１５２】
【表１５】
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【０１５３】
【表１６】
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【０１５４】
【表１７】
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【０１５５】
【表１８】
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【０１５６】
【表１９】
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【０１５７】
【表２０】
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【０１５８】
【表２１】
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【０１５９】
【表２２】
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【０１６０】
【表２３】
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【０１６１】
【表２４】
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【０１６２】
【表２５】
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【０１６３】
【表２６】
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【０１６４】
【表２７】
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【０１６５】
【表２８】
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【０１６６】
【表２９】
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【０１６７】
【表３０】
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【０１６８】
【表３１】
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【０１６９】
【表３２】
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【０１７０】
【表３３】
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【０１７１】
【表３４】
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【０１７２】
【表３５】
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【０１７３】
【表３６】
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【０１７４】
【表３７】
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【０１７５】
【表３８】
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【０１７６】
【表３９】
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【０１７７】
【表４０】
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【０１７８】
【表４１】
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【０１７９】
【表４２】
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【０１８０】
【表４３】
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【０１８１】
【表４４】
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【０１８２】
【表４５】
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【０１８３】
【表４６】
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【０１８４】
【表４７】
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【０１８５】
【表４８】
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【０１８６】
【表４９】
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【０１８７】
【表５０】
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【０１８８】
【表５１】
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【０１８９】
【表５２】
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【０１９０】
【表５３】
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【０１９１】
【表５４】
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【０１９２】
【表５５】
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【０１９３】
【表５６】
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【０１９４】
【表５７】
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【０１９５】
【表５８】
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【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、成熟ヒトＮＴ−４の全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をも含めて、ヒトＮＴ−４遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１）の部分ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．２）を示す。矢印は成熟配列の開始位置を、アストリスクは神経栄養因子ファミリーの他のメンバーとの相同性の算定の始まる位置を示し、終止コドンは円で囲まれている。アミノ酸は成熟領域のＮ−末端から番号付けされている。
【図２】図２は、ヒトＮＴ−２（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．３）、ＮＴ−３（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．４）およびＮＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．５）、およびＮＴ−４の成熟および部分前駆体部分（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．６）の問のアミノ酸配列の相同性を示す。配列上のセンス（ＮＧＸ−５４）およびアンチセンス（ＡＲ１）プライマーの位置は太い縦の矢印で、成熟領域の開始位置は矢印で示されている。
【図３】図３は、ヒトＮＴ−４β（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．７）の一部をコードするｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．７）のヌクレオチド配列、ＮＴ−４βのこの部分の推定のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．８）を示す。
【図４】図４は、ヒトＮＴ−４γをコードするゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．９）および推定のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１０）である。最初のインフレームＭｅｔ残基はヌクレオチド位置３５６−３５８に位置し、ヒトＮＴ−４γの開始コドンと推定される。
【図５】図５は、ヒトＮＴ−４△をコードするゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１１）、およびヒトＮＴ−４△のこの部分の推定のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１２）である。
【図６】図６は、ヒトＮＴ−４、ＮＴ−４β、ＮＴ−４γおよびＮＴ−４△のアミノ酸配列相互の相同性を示す。矢印は成熟ヒトＮＴ−４配列の開始位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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