(57)【要約】【課題】  ウイルス除去などに用いられる多孔性分離膜の性能を低下させることなく、高い洗浄効果を達成できる洗浄方法を提供する。【解決手段】  多孔性分離膜の洗浄方法であって、多孔性分離膜内に捕捉された蛋白質（例えばグロブリン及び／又はアルブミン）などの有機物を塩酸、クエン酸、又はスルファミン酸などの酸、及びパンクレアチン、パパイン、又はフィシンなどの酵素により洗浄する工程を含む方法。好ましくは酸洗浄工程及び酵素洗浄工程を同時に、又は別々に行なうことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性分離膜の洗浄方法であって、多孔性分離膜内に捕捉された有機物を酸及び酵素により洗浄する工程を含む方法。
【請求項２】
酸洗浄工程及び酵素洗浄工程を同時に、又は別々に行なう請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸洗浄工程に続いて酵素洗浄工程を行なう請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多孔性分離膜がウイルス除去膜である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多孔性分離膜がセルロースエステル類及び／又はエステル類により表面修飾された多孔性分離膜である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多孔性分離膜の平均孔径が１０〜１００ｎｍである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有機物が蛋白質である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質がグロブリン及び／又はアルブミンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酸が塩酸、クエン酸、及びスルファミン酸からなる群から選ばれる１以上の酸である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
酵素が少なくともパンクレアチン、パパイン、及びフィシンからなる群から選ばれるの１以上の酵素である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
完全性試験に先立って洗浄を行なう請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
完全性試験がフォワードフロー法、金コロイド法、バブルポイント法、又はディフュージョン法である請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔性分離膜の洗浄方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液製剤やバイオ製品を製造する場合、ＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶ等の危険度の高いウイルスを除去する工程は必須である。ウイルス除去方法として、多孔性分離膜が利用されている。それらを使用する際、濾過中の膜に変化がなかったことを確認するため、完全性試験（特許文献１や特許文献２）の実施が必要とされているが、完全性試験を行うためには、濾過前の膜の状態に戻すために、濾過中に多孔性分離膜内に捕捉又は吸着されたウイルス、細菌、蛋白質、又は脂質等の有機物を洗浄する必要がある。
【０００３】
多孔性分離膜の洗浄方法として種々の方法が検討されてきたが、従来の方法は物理的洗浄方法と化学的洗浄方法とに大別できる。物理的洗浄方法としては、スポンジボール又は高圧水流などにより強制的に付着物質をかき取る方法、水や透過液などの液体を濾液側から原液側へ透過させる液体逆洗法、加圧気体を濾液側から原液側へと透過させる気体逆洗法（例えば、特許文献３や特許文献４）、多孔性分離膜の原液側から気体が放出される圧力よりも小さい圧力の気体を濾液側から導入する加圧操作法、原液側に気泡を噴出させるバブリング法、超音波法、又は電気泳動法などのほか、多種多様の方法が提案されている。しかしながら、これらの洗浄方法は満足すべき洗浄効果を必ずしも達成できるものではなく、しかも多孔性分離膜の性能を変化させてしまうという問題も有していた。さらに、これらの洗浄方法は、高価で特殊な装置を必要とするという欠点もあった。
【０００４】
化学的洗浄方法としては、アルカリ水溶液や洗浄剤等からなる洗浄液、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム／水酸化ナトリウム洗浄液等を使用する方法が一般的である。しかしながら、親水化高分子からなるウイルス除去膜がアルカリや界面活性剤によって影響を受け、膜の変質が生じるという問題があった。
【特許文献１】特開平７−１３２２１５号公報
【特許文献２】特開平１０−２３５１６９号公報
【特許文献３】特開昭５３−１０８８８２号公報
【特許文献４】特表平１−５００７３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、多孔性分離膜の洗浄方法を提供することにある。より具体的には、多孔性分離膜の性能を低下させることなく、高い洗浄効果を達成できる洗浄方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酸洗浄工程と酵素洗浄工程とを組み合わせた洗浄工程により、多孔性分離膜の性能を実質的に変化させることなく膜を完全に洗浄できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明により、多孔性分離膜の洗浄方法であって、多孔性分離膜内に捕捉された有機物を酸及び酵素により洗浄する工程を含む方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、酸洗浄工程及び酵素洗浄工程を同時に、又は別々に行なう上記の方法；酸洗浄工程に続いて酵素洗浄工程を行なう上記方法；多孔性分離膜がウイルス除去膜である上記の方法；多孔性分離膜がセルロースエステル類及び／又はエステル類により表面修飾された膜である上記の方法；多孔性分離膜の平均孔径が１０〜１００ｎｍである上記の方法が提供される。
【０００８】
また、さらに好ましい態様によれば、有機物が蛋白質である上記の方法；蛋白質がグロブリン及び／又はアルブミンである上記の方法；酸が塩酸、クエン酸、及びスルファミン酸からなる群から選ばれる１以上の酸である上記の方法；酵素が少なくともパンクレアチン、パパイン、及びフィシンからなる群から選ばれるの１以上の酵素である上記の方法；完全性試験に先立って洗浄を行なう上記の方法；及び完全性試験がフォワードフロー法、金コロイド法、バブルポイント法、又はディフュージョン法である上記の方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、多孔性分離膜の性能を実質的に低下させることなく、また膜の構造を破壊することなく、効率的かつ完全に膜の洗浄を行うことができる。その結果、高い信頼性をもった完全性試験を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の洗浄方法で用いられる多孔性分離膜の種類は特に限定されないが、例えば血液製剤やバイオ製品を製造する場合や血液透析などに用いられる多孔性分離膜を好ましい対象として例示することができる。例えば、ウイルスなどを除去するために用いられる多孔性分離膜が好ましい。より具体的には、例えば、精密濾過膜（ミクロフィルター、ＭＦ）、限外濾過膜（ＵＦ）、又はウイルス分離膜などを挙げることができる。
【００１１】
多孔性分離膜の材質は特に限定されないが、耐アルカリ性の低い材質の多孔性分離膜に対して本発明の方法は特に好適に適用できる。耐アルカリ性の低い材質として、例えば、ポリ酢酸ビニルからなる多孔性分離膜、あるいはセルローストリアセテート等のセルロースエステル類又はアクリル酸エステル若しくはメタクリル酸エステル等のエステル類をグラフト重合することにより表面修飾が施された多孔性分離膜を挙げることができる。多孔性分離膜の孔径は使用目的に応じて適宜選択されるが、例えば１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度である。当業者は、ウイルス等の除去対象物を捕捉することができ、かつ除去対象物以外の生体成分（タンパク質や脂質など）を通過させる孔径を適宜選択することができる。例えば、ＨＩＶやＨＢＶの除去を目的とする場合には、１０ｎｍ〜４０ｎｍ程度の孔径であることが好ましい。
【００１２】
多孔性分離膜の形状及び構造は、濾過の目的に適したものであれば特に制限されないが、例えば、中空糸膜や平膜等を挙げることができる。本発明の方法で洗浄の対象となる有機物は特に制限されないが、例えば、例えば血液製剤やバイオ製品の製造や血液透析などにおける濾過の際に多孔性分離膜内に捕捉される有機物はいずれも洗浄の対象となる。洗浄の対象としては、濾過による除去対象物であるウイルスなどのほか、本来は濾過による除去対象ではないものの濾過後に多孔性分離膜内に捕捉されてしまうグロブリンやアルブミンなどのタンパク質なども含まれる。より具体的には、例えば、タンパク質、脂質、糖質、核酸、細胞、又はウイルス等を洗浄対象の有機物として挙げることができ、特に、蛋白質は好ましい洗浄対象である。蛋白質としては、例えば、酵素、抗体、血液凝固因子、インターロイキンやエリトロポエチン等のサイトカイン等などを挙げることができ、特に、グロブリンやアルブミン等のタンパク質は好ましい洗浄対象である。
【００１３】
本発明の方法は、多孔性分離膜内に捕捉された有機物を酸及び酵素により洗浄する工程を含むことを特徴としている。
酸は多孔性分離膜の性能に影響を与えないものであれば、その種類は特に制限されず、有機酸又は無機酸のいずれか、又は両方を使用することができる。有機酸としては、例えば、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、リンゴ酸、ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）、又はグルコン酸等を挙げることができる。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、又はスルファミン酸等が挙げられる。好ましくは塩酸、クエン酸、又はスルファミン酸である。これらの酸は２種類以上組み合わせて使用することもできる。酸は一般的には水溶液として用いることができるが、必要に応じて水性の有機溶媒（例えばグリセリンやエタノールなど）を適宜の割合で添加することもできる。水溶液中の酸の濃度は特に制限されないが、十分な洗浄効果を得る観点から０．０１Ｍ以上であることが好ましく、洗浄後の完全性試験への影響を排除するためには１Ｍ以下であることが好ましい。好ましくは０．０５〜０．１Ｍである。
【００１４】
酵素は有機物を分解でき、かつ多孔性分離膜の性能に影響を与えないものであれば、その種類は特に制限されない。例えば、パンクレアチン、パパイン、フィシン、ペクチナーゼ、トリプシン、又はペプシン等を挙げることができる。好ましくは、パンクレアチン、パパイン、又はフィシン等が挙げられる。これらの酵素は２種類以上を組み合わせて用いてもよい。酵素は一般的には水溶液として用いることができるが、必要に応じて水性の有機溶媒（例えばグリセリンやエチレングリコールなど）を適宜の割合で添加することもできる。酵素の濃度は有機物の分解効果を十分に達成できる濃度であれば特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｗｔ％程度の濃度で用いることができる。好ましくは０．１〜０．５ｗｔ％、さらに好ましくは０．２５〜０．５ｗｔ％程度である。非常に高濃度で酵素を使用すると膜の透過性能に影響を与える場合もあるが、そのような場合には濾紙で濾過してから使用することが好ましい。酵素を含む水溶液のｐＨは、酵素の活性を有効に発揮できる範囲であれば特に制限されないが、耐アルカリ性の低い多孔性分離膜の場合には１０未満であることが好ましい。
【００１５】
酸及び酵素による洗浄は同時に行なってもよいが、それぞれ独立した酸洗浄工程及び酵素洗浄工程として順次行なってもよい。あるいは、どちらかの工程又は両方の工程について適宜の回数の繰り返しを含めて、連続した３以上の工程として行なってもよい。一般的には、酸洗浄工程を先に行い、その工程に続いて酵素洗浄工程を行なうことが好ましい。酸及び酵素による洗浄を同時に行なう場合には、酸及び酵素を含む洗浄液を調製して洗浄を行なうことができる。
【００１６】
洗浄方法は特に限定されず、当業者が利用可能なものであれば任意の洗浄方法を採用することができる。２以上の洗浄方法を適宜組み合わせてもよく、任意の繰り返し工程を採用してもよい。例えば、洗浄液中で超音波洗浄する方法、洗浄液を浸漬する洗浄方法、洗浄液を順洗する洗浄方法、又は洗浄液を逆洗する洗浄方法等が挙げられる。順洗とは濾過方向と同方向に洗浄液を流す洗浄方法であり、逆洗とは濾過方向とは逆方向に洗浄液を流す洗浄方法である。多孔性分離膜の形状及び構造にもよるが、好ましくは順洗洗浄及び／又は逆洗洗浄を行うことが効果的である。洗浄温度は洗浄に用いる酸溶液又は酵素溶液、あるいは多孔性分離膜の性能に影響を与えない温度範囲を適宜選択できるが、通常は０℃〜４０℃程度の温度範囲である。
【００１７】
洗浄圧力は多孔性分離膜の構造に影響を与えない圧力であれば特に制限されないが、耐圧性の低いセルロース膜のような場合には、例えば１００ｋＰａ以下、耐圧性の高いポリフッ化ビニリデン膜やポリスルホン膜のような場合には、例えば３００ｋＰａ以下であることが好ましいが、できるだけ高い圧力を使用することが洗浄効果の観点から好ましい。洗浄量は、多いほど効果的であるが、例えば５Ｌ／ｍ2〜１０Ｌ／ｍ2が例示される。
【００１８】
洗浄効果の指標として、濾過及び洗浄前後の透水量から求められる透水量回復率を用いることができる。透水量回復率は、下式（１）により求めることができる。
ＷＦＲ（Ｒ）（％）＝ＷＦＲ（Ａ）／ＷＦＲ（Ｂ）×１００・・・（１）
ＷＦＲ（Ｒ）：透水量回復率、ＷＦＲ（Ａ）：濾過・洗浄後の透水量、ＷＦＲ（Ｂ）：濾過・洗浄前の透水量
透水量とは１分間、１ｍ2あたりに濾過される注射用蒸留水の量（ｍｌ／ｍｉｎ／ｍ2）のことである。洗浄効果の判断は、ＷＦＲ（Ｒ）≧９０％であれば十分な洗浄が達成できたと判断できる。
【００１９】
完全性試験方法は、多孔性分離膜の除去性能を確認できる方法であれば特に制限されないが、例えば粒子濾過法、バブルポイント法、プレシャーホールド法、フォーワードフロー法、又はディフュージョン法等を挙げることができる。好ましくは、粒子濾過法である金コロイド法あるいはフォーワードフロー法であるＬｉｑｕｉｄ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ（ＬＦＲ）法又はＧａｓ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ（ＧＦＲ）法を用いることができる。
【００２０】
金コロイド法とは、ウイルスと同程度の粒径である金コロイド粒子を利用し、膜が有する孔径分布の大きい孔の変化を測定する方法である。すなわち、金コロイド粒子をフィルターで濾過し、濾過前の溶液に存在する金コロイド量と濾液に存在する金コロイド量から、フィルターの金コロイド除去性能を測定する方法である。金コロイドの対数除去率は、下式（２）により求めることができる。
Φ＝Ｌｏｇ10（Ｇo ／Ｇf ）・・・（２）
Φ：金コロイドの対数除去率、Ｇo ：元液の金コロイド吸光度、Ｇf：濾液の金コロイド吸光度
【００２１】
金コロイド測定を行うことができるか否かについては、ブランクフィルターのΦ±０．０２であれば金コロイド測定が可能であると判断できる。金コロイド測定を行う時のフィルター内のｐＨは、金コロイド測定に影響しないｐＨであれば特に制限されないが、好ましくは、ｐＨ５〜ｐＨ１０程度である。洗浄効果の判断は、ＷＦＲ（Ｒ）、及び金コロイド測定値のいずれも判断基準を満たした場合に十分な洗浄が達成されたと判断できる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：多孔性分離膜の製造
ポリフッ化ビニリデン樹脂（ＳＯＬＶＡＹ社製、型番ＳＯＬＥＦ１０１２、結晶融点１７３℃）５０ｗｔ％、フタル酸ジシクロヘキシル（大阪有機化学工業株式会社社製  工業品）５０ｗｔ％からなる組成物を、ヘンシェルミキサーを用いて７０℃で撹拌混合した後、冷却して粉体状としたものをホッパーより投入し、二軸押出機（東洋精機株式会社製  商品名ラボプラストミル  ＭＯＤＥＬ  ５０Ｃ  １５０）を用いて２１０℃で溶融混合し均一溶解した。続いて、温度が１３０℃のフタル酸ジブチル（三建化工株式会社製）を中空内部に８ｍｌ／ｍｉｎの速度で流しつつ、内直径０．８ｍｍ、外直径１．１ｍｍの環状オリフィスからなる紡口より吐出速度１７ｍ／ｍｉｎで中空糸状に押し出し、４０℃に調節された水浴中で冷却固化させて、６０ｍ／ｍｉｎの速度でカセに巻き取った。その後、９９％メタノール変性エタノール（今津薬品工業株式会社製  工業品）でフタル酸ジシクロヘキシル及びフタル酸ジブチルを抽出除去し、付着したエタノールを水で置換した後、高圧蒸気滅菌装置（平山製作所株式会社製、型番ＨＶ−８５）を用いて１２５℃の熱処理を１時間施した。その後、付着した水をエタノールで置換した後、オーブン中で６０℃の温度で乾燥することにより中空糸状の多孔性分離膜を得た。抽出から乾燥にかけての工程では、収縮を防止するために膜を定長状態に固定して処理を行った。
【００２３】
続いて、上記の多孔性分離膜に対し、グラフト法による親水化処理を行った。反応液は、ヒドロキシプロピルアクリレート（東京化成株式会社製、試薬グレード）を８ｖｏｌ％となるように、３−ブタノール（純正科学株式会社製、試薬特級）の２５ｖｏｌ％水溶液に溶解させ、４０℃に保持した状態で、窒素バブリングを２０分間行ったものを用いた。まず、窒素雰囲気下において該多孔性分離膜をドライアイスで−６０℃に冷却しながら、Ｃｏ６０を線源としてγ線を１００ｋＧｙ照射した。照射後の膜は、１３．４Ｐａ以下の減圧下に１５分間静置した後、上記反応液と該膜を４０℃で接触させ、１時間静置した。その後、膜をエタノールで洗浄し、６０℃真空乾燥を４時間行い、多孔性分離膜を得た。得られた膜は水に接触させた時に自発的に細孔内に水が浸透することを確認した。得られた膜の平均孔径は１６．２ｎｍ、グラフトによる重量増加率は１３．４％であった。最後に、該膜を用いて膜面積０．００１ｍ2のフィルターを成型した。
【００２４】
例２
６．０ｍＭの塩化金酸（和光製．試薬特級）の水溶液８０ｇおよび蒸留水３２０ｇを反応容器にとり、攪拌しながら７０℃に昇温後、４．０％クエン酸ナトリウム水溶液を１８．０ｇ添加し６０分反応を行った。この時の溶液中の金濃度は、５００ｐｐｍであった。反応終了後、東京化成社製ＰＶＰ（Ｋ−１５）（分子量１００００）３０％水溶液を３７．５ｇ添加し、さらに、４０ｗｔ％のポリアクリル酸ナトリウム溶液（日本純薬製  ＡＣ−１０３）９．０ｇをすることによって濃厚で赤色の金コロイド溶液を得た。濃厚の金コロイド溶液１０ｇを取り、注射用蒸留水８８．２ｇに４０ｗｔ％のポリアクリル酸ナトリウム（日本純薬製  ＡＣ−１０３）１．８ｇを添加した水溶液で希釈し、赤色の金コロイド溶液を得た。分光光度計により吸収スペクトルを測定したところ、金プラズモン吸収に由来する５２７ｎｍに最大吸収が見られた。この金コロイド溶液をコロジオン膜張り付きメッシュ上で乾固した後、透過型電子顕微鏡により観察した。金微粒子の分散状態は良好で、平均粒子径は２０ｎｍであった。
【００２５】
例３
使用する注射用蒸留水（大塚製薬株式会社製）及び３ｗｔ％のウシ血清γグロブリン（インビトロジェン株式会社製）（ＩｇＧ）、洗浄液はあらかじめ２５℃にした。３ｗｔ％ ＩｇＧは、プラノバ３５Ｎ（旭化成ファーマ株式会社製）を用いてプレフィルトレーションを行った。また、洗浄操作は全て２５℃の恒温室で行った。例１で得られたフィルターを用いて、初めに注射用蒸留水を濾過圧力１９５ｋＰａで濾過し、透水量を求めた。次に、３ｗｔ％のＩｇＧを濾過圧力２９３ｋＰａで初期濾過速度の１／５になるまで濾過した後、濾過圧力１９５ｋＰａで０．１Ｍのクエン酸（和光純薬工業株式会社製）水溶液を５分間逆洗濾過した。続いて、濾過圧力１９５ｋＰａで、０．０５ｗｔ％のパンクレアチン（和光純薬工業株式会社製）／生理食塩水（大塚製薬株式会社製）溶液をさらに５分間逆洗濾過し、最後に、濾過圧力１９５ｋＰａで注射用蒸留水（大塚製薬株式会社製）を５分間逆洗濾過してフィルター内部の洗浄液を除去した後に、濾過圧力１９５ｋＰａで透水量を求めた。その結果、フィルターのＷＦＲ（Ｒ）は９４．１％であり、洗浄効果を確認できた。
【００２６】
例４
例３で使用したフィルターを用いて、金コロイド測定を行った。例２で得られた金コロイド溶液を、該フィルターに９８ｋＰａの圧力で濾過した。５ｍｌを流してフィルターに充填されていた水を置換した後、次の５ｍｌを分取した。その濾液の５２７ｎｍの吸光度を吸光度計（島津製作所製  型番ＵＶ−１７００）にて測定し、金コロイドの対数除去率（Φ）を算出した。同じ方法でブランクフィルターの吸光度も測定をした。その結果、フィルターのΦは１．６３、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、完全性試験を行えるレベルの洗浄効果があることを確認できた。
【００２７】
例５
例３の逆洗を順洗に変えた以外、例３及び４と同様の方法で実験を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は９６．３％、Φは１．６２、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、洗浄効果が確認できた。
例６
例３とは逆に、０．０５ｗｔ％のパンクレアチン／生理食塩水溶液で逆洗を行った後、０．１Ｍのクエン酸で逆洗洗浄を行い、最後に例４と同様の測定を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は９０．２％、Φは１．６３、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、洗浄効果が確認できた。
例７
例３の濾過する蛋白質を含有する液体をＩｇＧからウシ血清アルブミン（生化学工業株式会社製）に変えた以外、例３及び４と同様の方法で実験を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は９２．９％、Φは１．６２、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、洗浄効果が確認できた。
【００２８】
例８（比較例）
注射用蒸留水で洗浄する工程を行うのみとした以外は例３及び４と同様の実験を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は６７．８％、Φは１．９１、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、透水回復率、金コロイド測定値、いずれにおいても洗浄効果は不十分であった。
例９（比較例）
０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）を、０．１Ｍのクエン酸水溶液及び０．０５ｗｔ％のパンクレアチン／生理食塩水溶液の代わりに用いて例３および例４と同様の洗浄を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は２２．０％となり、膜の表面の親水化層が破壊（加水分解）された。
例１０（比較例）
０．１Ｍのクエン酸水溶液のみで洗浄した以外は、例３及び４と同様の実験を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は９２．６％、Φは１．８１、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、透水回復率は洗浄条件を満たしたものの、金コロイドの値がブランクフィルターと一致せず、洗浄効果は確認できなかった。
【００２９】
例１１（比較例）
０．０５ｗｔ％のパンクレアチン／生理食塩水溶液のみで洗浄した以外は、例３及び４と同様の実験を行った。その結果、ＷＦＲ（Ｒ）は８６．８％、Φは１．６４、ブランクフィルターのΦは１．６３であり、金コロイドの値は洗浄条件を満たしたものの、透水回復率が低く、洗浄効果が確認できなかった。