(57)【要約】【課題】  遺伝子の転写を抑制する際に、従来よりも簡便かつ広範囲に適用可能な遺伝子の転写を抑制するペプチドと、これをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用方法とを提供する。【解決手段】  本発明に係るペプチドは、α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ、α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ、又は、α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列からなる。但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２はＡｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。このペプチドを任意の転写因子と融合させることにより、上記転写因子を転写抑制因子に変換することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次に示す一般式（１）、（２）又は（３）
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ  ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド。
【請求項２】
上記一般式（１）乃至（３）におけるα１及びα２は、Ｃｙｓであることを特徴とする請求項１に記載の変換ペプチド。
【請求項３】
配列番号１乃至６の何れか１つで表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の変換ペプチドにおいて第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の変換ペプチドと、
任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部とを融合させてなることを特徴とする転写抑制因子。
【請求項６】
上記転写因子は、ＧＡＬ４タンパク質、ＥＲＦ１タンパク質、ＥＩＮ３タンパク質、ＣＵＣ１タンパク質、ＰＡＰ１タンパク質又はＡｔＭＹＢ２３タンパク質であることを特徴とする請求項５に記載の転写抑制因子。
【請求項７】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の変換ペプチドをコードすることを特徴とする変換オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の転写抑制因子をコードすることを特徴とする転写抑制因子ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７に記載の変換オリゴヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のベクターによって形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
単細胞生物であることを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
植物由来の細胞又は個体であることを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１４】
転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、
２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、請求項７に記載の変換オリゴヌクレオチド及び１個以上の制限酵素認識部位を備え、
前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、
さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記変換オリゴヌクレオチドと１個以上の制限酵素部位とが存在することを特徴とする発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１５】
転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、
２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター及び請求項８に記載の転写抑制因子ポリヌクレオチドを備え、
前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、
さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記転写抑制因子ポリヌクレオチドが存在することを特徴とする発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１６】
ｐＵＣ系プラスミドベクターであることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１７】
上記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター又はアクチン遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１４乃至１６の何れか１項に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１８】
上記ターミネーターは、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域であることを特徴とする請求項１４乃至１７の何れか１項に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１９】
請求項１４乃至１８に記載の発現ベクター構築用ベクターを用いることを特徴とする発現ベクターの構築方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターの構築方法により得られることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２１】
請求項７に記載の変換オリゴヌクレオチドと、
任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部をコードする転写因子ポリヌクレオチドと、
プロモーターとを含んでなる発現ベクターを宿主細胞に導入し、
転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含むことを特徴とする遺伝子の転写抑制方法。
【請求項２２】
さらに、上記発現ベクターを構築する工程を含むことを特徴とする請求項２１に記載の遺伝子の転写抑制方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、
転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと、転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子の一部とを融合させてなる転写抑制因子を発現させる工程を含むことを特徴とする遺伝子の転写抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の転写抑制機能を有する新規ペプチドとその代表的な利用に関するものであり、より具体的には、転写因子と融合させることによって転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチド、及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを利用した転写抑制方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体において、遺伝子の発現制御又は転写調節は、種々の遺伝子の機能を解析するために有用であるだけでなく、様々な産業にも応用が期待される。特に、転写の調節のうち転写の抑制については、応用分野として、例えば、癌遺伝子等の疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する等の医療産業や、植物の改良等のアグリビジネス産業等が挙げられる。
【０００３】
上記転写抑制の具体的な手段としては、アンチセンス法及びリボザイム法が一般に知られている。
【０００４】
アンチセンス法では、転写を抑制しようとする標的遺伝子や当該標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等の特異部位と結合させるため、当該特異部位と相補的な配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いる。
【０００５】
また、リボザイム法では、リボザイムすなわち酵素活性を有するＲＮＡ分子を用いる。
【０００６】
上記アンチセンス法及びリボザイム法は、転写を抑制する標的遺伝子の塩基配列に注目し、それを利用して転写抑制を行うものである。
【０００７】
一方、上記アンチセンス法及びリボザイム法とは別のアプローチによって遺伝子の転写を抑制する方法もある。
【０００８】
以前、本発明者らは、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７又はＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子と融合させたタンパク質が遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功している（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び特許文献４参照）。
【０００９】
さらに本発明者らは、Ｃｌａｓｓ  II  ＥＲＦ（ethylene responsive element binding factor）遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質をコードする遺伝子（特許文献６参照）、並びにＺｎフィンガータンパク（Zinc finger Protein）の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行い、遺伝子の転写を抑制することを見出している。
【００１０】
上記各遺伝子の塩基配列はまちまちであるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドには、７つのアミノ酸からなる共通のモチーフが存在することが明らかになっている（例えば非特許文献１、２参照）。
【００１１】
なお、このようなキメラ遺伝子を用いた遺伝子の転写抑制の技術は、上記と同様、幾つかの植物で報告されており（非特許文献３、４参照）、さらに動物でも報告されている（非特許文献５〜９）。
【００１２】
そして、本発明者らはこれらの知見を基にして、特許文献７に開示しているように、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドを得ることに成功している。この特許文献７には、最小１０アミノ酸残基からなり、転写因子に結合させることによって当該転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが記載されている。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２３日）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２３日）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）
【特許文献７】国際公開番号ＷＯ  ０３／０５５９０３  Ａ１公報（国際公開日：平成１５（２００３）年７月１０日）
【非特許文献１】Ohta. M., Matsui. K., Hiratsu, K., Shinshi, H., and Ohme-Takagi, M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
【非特許文献２】Hiratsu. K., Ohta. M., Matsui. K., and Ohme-Takagi, M., FEBS letter, Vol.514, 351-354, 2002
【非特許文献３】Guan, X., Stege, J., Kim, M., Dahmani, Z., Fan, N., Heifetz, P., Barbas, C.F. III. and Briggs, S.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.99, 13296-13301, 2002
【非特許文献４】Markel, H., Chandler, J. and Werr, W., Nuclelic Acids Res. Vol.30, 4709-4719. 2002
【非特許文献５】Badiani, P., Corbella, P., Kioussis, D., Marvel, J. and Weston, K., Genes Dev. Vol.8, 1994
【非特許文献６】Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. and Barbas, C.F. III., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95, 14628-14633, 1998
【非特許文献７】Beerli, R.R., Dreier, B. and Barbas, C.F. III., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol.97, 1495-1500, 2000
【非特許文献８】de Haan, G., Chusacultanachai, S., Mao, C., Katzenellenbogen, B.S. and Shapiro, D.J., J. Biol. Chem. Vol.275, 13493-13501, 2000
【非特許文献９】John, A., Smith, S.T. and Jaynes, J.B., Development Vol.121, 1801-1813, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上述のアンチセンス法及びリボザイム法は、以下のような問題点を有している。
【００１４】
まず、アンチセンス法では、調製されたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、上記標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制することには使用できない。それゆえ、他の標的遺伝子に対してはその配列に合わせて新たにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要がある。従って、アンチセンス法は、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという問題点を有している。
【００１５】
また、アンチセンス法と同様にリボザイム法においても、リボザイムは、特異部位と結合させるための相補的な配列を有する必要があり、さらには、所定の位置で特異部位を切断可能なようにリボザイムを設計する必要がある。従って、リボザイム法も、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという問題点を有している。
【００１６】
加えてリボザイム法では、リボザイムを実際にホスト細胞中に導入すると、転写されたリボザイムに余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われる場合がある。具体的には、例えば植物をホスト細胞とする場合、標的遺伝子を切断するように設計されたリボザイムを用いたとする。このとき、当該リボザイムをプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター等）及びターミネーター（転写終結配列）に連結してベクターを構築し、実際に植物細胞中に導入した際、上記のようなリボザイム活性が失われてしまうという現象が生じる場合がある。従って、リボザイム法では、条件によっては再現性が低いという問題点も有している。
【００１７】
また、上記アンチセンス法及びリボザイム法は、標的遺伝子の特定及び塩基配列の決定が不可欠となっており、特定の遺伝子群や塩基配列が未決定の遺伝子等に対しては転写を抑制することができないという問題点も有している。
【００１８】
以上のように、上記アンチセンス法又はリボザイム法等の転写制御方法は、汎用性に欠ける、条件によっては再現性が低い、塩基配列まで特定された遺伝子にしか利用できない等の課題を有している。そのため、その用途が限られるといった問題点がある。
【００１９】
これに対して、本発明者らによって見出された、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを用いる方法によれば、上記アンチセンス法やリボザイム法のもつ汎用性や再現性の問題を克服して遺伝子の転写を抑制することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記ペプチドに関してさらに鋭意検討した結果、６アミノ酸残基からなり、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換する新規なペプチドを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２１】
すなわち、本発明に係る変換ペプチドは、上記課題を解決するために、次に示す一般式（１）、（２）又は（３）
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ  ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る変換ペプチドにおいて、上記一般式（１）乃至（３）におけるα１及びα２は、Ｃｙｓであってもよい。
【００２３】
また、本発明に係る変換ペプチドは、配列番号１乃至６の何れか１つで表されるアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る変換ペプチドは、上記変換ペプチドにおいて第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、転写因子を転写抑制因子に変換するものであってもよい。
【００２５】
本発明に係る転写抑制因子は、上記課題を解決するために、上記変換ペプチドと、任意の転写因子又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部とを融合させてなることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る転写抑制因子において、上記転写因子は、ＧＡＬ４タンパク質、ＥＲＦ１タンパク質、ＥＩＮ３タンパク質、ＣＵＣ１タンパク質、ＰＡＰ１タンパク質又はＡｔＭＹＢ２３タンパク質であってもよい。
【００２７】
本発明に係る変換オリゴヌクレオチドは、上記課題を解決するために、上記変換ペプチドをコードすることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る転写抑制因子ポリヌクレオチドは、上記課題を解決するために、上記転写抑制因子をコードすることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係るベクターは、上記課題を解決するために、上記変換オリゴヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含むことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る別のベクターは、上記課題を解決するために、上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る形質転換体は、上記課題を解決するために、上記ベクターによって形質転換されたことを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る形質転換細体は、単細胞生物であってもよい。
【００３３】
また、本発明に係る形質転換細胞は、植物由来の細胞又は個体であってもよい。
【００３４】
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、上記課題を解決するために、２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、上記変換オリゴヌクレオチド及び１個以上の制限酵素認識部位を備え、前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記変換オリゴヌクレオチドと１個以上の制限酵素部位とが存在することを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る別の発現ベクター構築用ベクターは、転写抑制因子を植物細胞において発現させる発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、上記課題を解決するために、２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター及び上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを備え、前記２つのａｔｔ部位の間に、前記プロモーター及びターミネーターが存在し、さらに当該プロモーター及びターミネーターとの間に、前記転写抑制因子ポリヌクレオチドが存在することを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、ｐＵＣ系プラスミドベクターであることが好ましい。
【００３７】
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにおいて、上記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター又はアクチン遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにおいて、上記ターミネーターは、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域であることが好ましい。
【００３９】
本発明に係る発現ベクターの構築方法は、上記課題を解決するために、上記発現ベクター構築用ベクターを用いることを特徴としている。
【００４０】
本発明に係る発現ベクターは、上記課題を解決するために、上記発現ベクターの構築方法により得られたものであることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る遺伝子の転写抑制方法は、上記課題を解決するために、上記変換オリゴヌクレオチドと、任意の転写因子、又は少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む任意の転写因子の一部をコードする転写因子ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含んでなる発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換する変換ペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含んでいることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る遺伝子の転写抑制方法は、さらに、上記発現ベクターを構築する工程を含んでいてもよい。
【００４３】
また、本発明に係る別の遺伝子の転写抑制方法は、上記発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換する変換ペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４４】
本発明は上記の構成を備えているので、転写因子抑制変換ペプチドを任意の転写因子と融合させることによって上記転写因子を転写抑制因子に変換することができる。また、変換した転写抑制因子を用いれば、上記転写因子の標的となる特定の遺伝子の転写を抑制することができる。従って、塩基配列が未知の遺伝子であっても、或いは、単一遺伝子ではなく特定の遺伝子群であっても、任意の転写因子の標的となるものであれば、当該遺伝子又は遺伝子群の転写を再現性よく抑制することができる。以上のように、本発明によれば汎用的に、かつ、簡単な工程によって遺伝子の転写を抑制することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明の実施の一形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
以下の説明では、説明の便宜上、適宜略称を用いることがある。同じく説明の便宜上、例えば配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、適宜「配列番号Ｘのペプチド」と表現することがある。塩基配列についても同様である。また、（Ｘ）式で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを、「（Ｘ）式のペプチド」と表現することがある。
【００４７】
また、本発明において、「ポリヌクレオチド」には、全てのＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニング及び／又は化学合成技術で得られるようなｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ等が含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。
【００４８】
［変換ペプチドの構造］
本発明者は、植物特異的なＥＲＦ転写因子群（非特許文献１参照）及びＴＦＩＩＩＡ−Ｔｙｐｅ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ転写（ＳＵＰＥＲＭＡＮを含む、非特許文献２参照）の中で、転写抑制因子として機能する因子のカルボキシル基末端に共通して存在するアミノ酸配列を見出した。このアミノ酸配列、すなわちＥＡＲ（ERF-associated Amphihilic Repression）モチーフは、７つのアミノ酸からなっている。本発明者は、以前、このＥＡＲモチーフを基に、最小で１０アミノ酸からなり、かつ、転写因子と融合させることによって転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを発明している（特許文献７を参照）。そして本発明者はさらに鋭意検討した結果、今回新たに６つのアミノ酸残基からなり、第２，４，６番目のアミノ酸は全てロイシンであり、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドを完成するに至った。
【００４９】
すなわち、本発明に係る変換ペプチドは、次に示す一般式（１）、（２）又は（３）
α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ  ・・・（１）
α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（２）
α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ  ・・・（３）
（ただし、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、β２は、Ａｓｎ又はＳｅｒを示し、γ1は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示す。）
によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００５０】
本発明に係る変換ペプチドでは、上記の一般式（１）、乃至（３）におけるα１及びα２は、Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５１】
本発明に係る変換ペプチドは、配列番号１乃至６の何れかで表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、配列番号１，２，５，６のペプチドは（１）式のペプチドに含まれ、配列番号３，４のペプチドは（３）式のペプチドに含まれる。
【００５２】
また、本発明に係る変換ペプチドは、上記変換ペプチドにおいて、第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ転写因子を転写抑制因子に変換するものであってもよい。ここで、「１若しくは数個」は、特に限定されないが、例えば１から３個を示し、好ましくは１又は２個を示し、より好ましくは１個を示す。
【００５３】
上述のように、本発明の変換ペプチドは、その構造として６つのアミノ酸残基からなると共に第２，４，６番目のアミノ酸が全てロイシンであり、上記の構造の何れかを持つ。そして、上記変換ペプチドは、当該ペプチドと融合した任意の転写因子を転写抑制因子に変換する。その結果、上記転写因子が標的とする遺伝子又は遺伝子群の転写を抑制することができる。従って、上記の構成によれば、上記変換ペプチドは、標的とする遺伝子又は遺伝子群の転写を再現性よく抑制することができるという効果を奏する。また、転写因子を変換した転写抑制因子を介して、標的となる遺伝子の転写を抑制するため、当該遺伝子の塩基配列が未知のものであっても抑制することができる。
【００５４】
本発明に係る変換ペプチドは、特許文献７に開示されている従来の変換ペプチドをさらに短くすることによって、以下に説明する利点を持っている。
【００５５】
上記変換ペプチドを用いて転写抑制因子を作製するためには、転写因子をコードする遺伝子（以下「転写因子遺伝子」という。）と上記変換ペプチドをコードする変換オリゴヌクレオチドとを連結する必要がある。この連結する工程において、本発明の変換ペプチドをコードする変換オリゴヌクレオチドは塩基数が１８塩基しかないことから、当該オリゴヌクレオチドと、鋳型になる転写因子遺伝子の末端配列に対して相補的な配列とを含む合成プライマーを作製し、当該プライマーを用いて転写因子遺伝子を鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことによって容易に転写抑制因子をコードするポリヌクレオチドを得ることができるようになった。
【００５６】
以上のように本発明の変換ペプチドは、その塩基数が少ないために転写因子と融合させる等するための後段の組換え作業を飛躍的に簡素化できるという利点を有している。
【００５７】
［変換オリゴヌクレオチドの構造］
変換オリゴヌクレオチドの具体的な構成は、遺伝暗号表に基づいて上記変換ペプチドをコードする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるか、或いは上記塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドでれば特に限定されるものではない。便宜上、以下の説明においては、上記の相補的な塩基配列も変換ペプチドをコードしていることとする。
【００５８】
上記変換オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７から１８のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００５９】
なお、配列番号７，８のオリゴヌクレオチドは配列番号１のペプチドをコードしており、配列番号９，１０のオリゴヌクレオチドは配列番号２のペプチドをコードしており、配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドは配列番号３のペプチドをコードしており、配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドは配列番号４のペプチドをコードしており、配列番号１５，１６のオリゴヌクレオチドは配列番号５のペプチドをコードしており、配列番号１７，１８のオリゴヌクレオチドは配列番号６のペプチドをコードしている。
【００６０】
また、上記変換オリゴヌクレオチドは、必要により、転写因子又はその一部をコードするポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。或いは、上記変換ペプチドをコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と転写因子又はその一部をコードする遺伝子のアミノ酸読み枠とが一致しないような場合には、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００６１】
例として、付加的な塩基配列を含んだ変換オリゴヌクレオチドとして配列番号１９から３０のオリゴヌクレオチドを挙げる。上記塩基配列には、酵母ＧＡＬ４タンパク質に含まれるＤＮＡ結合ドメインをコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と、変換オリゴヌクレオチドのアミノ酸読み枠とを一致させるために付加的な塩基配列を含んでいる。
【００６２】
なお、配列番号１９，２０のオリゴヌクレオチドは配列番号１のペプチドをコードしており、配列番号２１，２２のオリゴヌクレオチドは配列番号２のペプチドをコードしており、配列番号２３，２４のオリゴヌクレオチドは配列番号３のペプチドをコードしており、配列番号２５，２６のオリゴヌクレオチドは配列番号４のペプチドをコードしており、配列番号２７，２８のオリゴヌクレオチドは配列番号５のペプチドをコードしており、配列番号２９，３０のオリゴヌクレオチドは配列番号６のペプチドをコードしている。
【００６３】
［変換ペプチドおよび変換オリゴヌクレオチドの取得（生産）方法］
本発明に係る変換ペプチドの生産方法は特に限定されるものではない。例えば、上記の変換オリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、それによって発現する変換ペプチドを回収することによって取得してもよい。また、本発明に係る変換ペプチドは６つのアミノ酸残基のみからなっているので、シンセサイザーにより合成することでも容易に取得でできる。或いは、変換ペプチドを含むタンパク質から消化酵素等で切断等することによって取得してもよい。
【００６４】
同様に、本発明に係る変換オリゴヌクレオチドの取得方法及び生産方法も特に限定されるものではない。例えば、上述した配列番号に記載されている塩基配列等に基づいて、シンセサイザーにより合成して取得してもよい。また、変換ペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子を鋳型として、該当する変換オリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で増幅して取得してもよい。或いは、変換ペプチド含むタンパク質をコードする遺伝子から消化等することによって取得してもよい。また、変換オリゴヌクレオチドは、取得された変換オリゴヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ等により増幅することで大量に生産することができる。また、取得した上記オリゴヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌等を形質転換して、増幅したオリゴヌクレオチドを回収することによっても大量に生産することができる。
【００６５】
次に、上記の変換ペプチドにおいて、第１，３，５番目に存在するロイシン以外のアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ転写因子を転写抑制因子に変換することを特徴とする変換ペプチド（置換ペプチド）、及びこれをコードするオリゴヌクレオチド（置換オリゴヌクレオチド）の取得方法を説明する。上記置換ペプチド及び置換オリゴヌクレオチドの取得（生産）方法も特に制限されるものではない。
【００６６】
置換オリゴヌクレオチドは、例えば、上述の変換ペプチドを元に、第１，３，５番目のアミノ酸残基が１若しくは数個異なるアミノ酸配列をコードするように、遺伝暗号表に基づいて塩基配列を作製し、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドをシンセサイザーで合成する等することによって取得及び生産することができる。また、置換ポリペプチドは、取得された置換ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、当該ポリペプチドを発現させることによって生産することができる。
【００６７】
［転写抑制因子及びこれをコードする転写抑制因子ポリヌクレオチド］
本発明に係る転写抑制因子は、上述した変換ペプチドと転写因子とを融合させてなり、転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制することができる。ここで、転写因子として、例えば、ＧＡＬ４タンパク質やＬｅｘＡタンパク質、Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒタンパク質等の一般的な転写因子や、後述のＥＲＦ１タンパク質、ＥＩＮ３タンパク質、ＣＵＣ１タンパク質、ＰＡＰ１タンパク質、ＡｔＭＹＢ２３タンパク質や、ＴＣＰファミリーに属するタンパク質、ＷＲＫＹファミリーに属するタンパク質、Ｄｏｆファミリーに属するタンパク質、ＭＡＤＳボックス型転写因子、ホメオドメイン転写因子等の植物の転写因子、さらには、ＭＹＣタンパク質等の動物の転写因子を用いることができる。なお、上記転写因子は、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含んでいれば、転写因子の一部であってもよい。以下の説明においては、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子の一部も転写因子と称する。
【００６８】
上記の構成において、変換ペプチドは、当該ペプチドと融合した上記転写因子の転写活性を転写抑制活性に変換する。従って、転写抑制因子は、上記転写因子の標的となる遺伝子又は遺伝子群の転写活性を抑制することができる。
【００６９】
上記転写抑制因子は公知の方法、例えば、下記の方法によって取得することができる。まず、変換オリゴヌクレオチドと転写因子をコードするポリヌクレオチド（転写因子ポリヌクレオチド）とを連結させてなる転写抑制因子ポリヌクレオチドを作製する。ここで、変換オリゴヌクレオチドと転写因子ポリヌクレオチドとを連結させる方法としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。まず、転写因子ポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲによって増幅させるプライマーとして、転写因子ポリヌクレオチドの末端配列と変換ヌクレオチドとを連結させたプライマーを合成する。このプライマーと、転写因子ポリヌクレオチドのもう一方の末端配列を有するプライマーとを用いて転写因子ポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲを行うことによって容易に転写抑制因子ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００７０】
次に、当該転写抑制因子ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入して、転写抑制因子発現ベクターを構築する。転写抑制因子は、当該発現ベクターを用いて適切な細胞を形質転換し、転写抑制因子を細胞内で発現させ、これを回収することにより取得することができる。
【００７１】
また、本発明に係る転写抑制因子を使用する際には、大腸菌、酵母、哺乳類細胞、又は植物細胞等から適宜選択された細胞内で、上記のように転写抑制因子を大量に発現させ、これを回収した後に対象となる生物に使用してもよいし、或いは、上記転写抑制因子発現ベクターを用いて使用の対象となる生物の細胞を形質転換し、上記生物の細胞内で直接転写抑制因子を発現させてもよい。
【００７２】
また、上記転写抑制因子には、付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｍｙｃ−Ｔａｇ、或いはＦｌａｇ等によって上記転写抑制因子がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００７３】
また、上記の形質転換の対象となる細胞は、大腸菌、枯草菌又は酵母等の単細胞生物であってもよいし、動物又は植物等を由来とする培養細胞でもよく、さらには、動物又は植物等の多細胞生物の生体に含まれる細胞であってもよい。
【００７４】
［変換オリゴヌクレオチドを含むベクター］
本発明に係るベクターは、上述した変換オリゴヌクレオチドと、当該変換オリゴヌクレオチドに隣接する領域に制限酵素認識部位とを有していれば特に限定されるものではない。上記ベクターには、例として、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター又はウイルスベクター等の任意のものを用いることができる。また、その用途はクローニング用、発現用等の何れであってもよい。
【００７５】
また、上記ベクターは、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位を含む代わりに、上記の転写抑制因子を発現する転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むベクターであってもよい。
【００７６】
また、上記ベクターは、上記変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチドを挟むようにして、任意のプロモーター及びターミネーターをさらに含んでいてもよい。ここで用いられるプロモーター及びターミネーターは、変換ペプチド又は転写抑制因子を発現させる生物の細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、所望の発現量を達成できるものを用いることができる。プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター、チキンβアクチン遺伝子のプロモーター、イネ等が有するアクチン遺伝子のプロモーター、及びイネ等が有するユビキチン遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターの例として、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域、及びＲｕｂｉｓｃｏ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子の転写終止領域等が挙げられる。
【００７７】
上記ベクターは、公知の遺伝子工学的手法を用いることによって容易に構築することができる。また、当該ベクターは、適切な細胞内に導入し、培養することによって容易に大量生産することができる。
【００７８】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、上述した変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換された細胞又は個体であればよい。
【００７９】
形質転換をする際のベクターの導入方法は特に限定されるものではなく、公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えばコンピテントセルの使用、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスによる感染、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いることができる。
【００８０】
上記形質転換体は大きく分けて２つの用途がある。１つ目は、上記ベクターを増殖させるための形質転換体（増殖用形質転換体）としての利用である。上記増殖用形質転換体としては、上記ベクターを複製することのできる細胞であればよい。当該細胞を培養し増殖させることによって、細胞に含まれる上記ベクターを任意に増殖させ、大量生産を行うことができる。上記の増殖用形質転換体の種類は特に限定されるものではないが、大腸菌、枯草菌又は酵母等の細菌類又は真菌類が好ましい。また、上記ベクターがウイルスベクターである場合は、当該ウイルスの宿主となる細胞を選択すればよく、当該細胞として、例えば、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞等を用いることができる。
【００８１】
上記形質転換細胞の２つ目の用途は、上記ベクターによって変換ペプチド又は転写抑制因子を発現させるための形質転換体（発現用形質転換体）としての利用である。ここで、「形質転換された」細胞とは、上記ベクターを有する細胞であってもよいし、或いは、導入された当該ベクターのうち、転写抑制因子ポリヌクレオチドを含む領域がゲノムＤＮＡ等に組み込まれ、当該ベクター自体は分解された細胞であってもよい。換言すれば、「形質転換された」細胞とは、上記ベクターが導入された結果として、上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを含んでいる細胞であればよい。例えば、培養細胞等に上記ベクターを導入した後、恒常的に転写抑制因子を発現する細胞を選別したり、或いは、トランスポゾンを利用したベクターやレトロウイルスベクター等を用いたりすることによって、ゲノムＤＮＡ等に上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを組み込んだ細胞等を挙げることができる。そのような細胞では、導入されたベクターは分解されていても、転写抑制因子ポリヌクレオチドは細胞内に残存し、それによって転写抑制因子を発現することができるので、形質転換された細胞と定義される。
【００８２】
上記発現用形質転換体の種類は特に限定されるものではない。実験に本発明を適用する場合には、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物；シロイヌナズナ等の植物；マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫等の動物；等に由来する細胞を用いることができる。また、農業分野に本発明を適用する場合は、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）を生産する植物、具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等を挙げることができる。さらに、医薬産業・医療産業分野では、ヒト又はヒト由来の培養細胞等を対象とすることもできる。また、上記の実験及び農業に適用される形質転換体は、培養細胞のみでなく、生体に含まれる細胞、臓器、器官あるいは個体をも含む。
【００８３】
［発現ベクター構築用ベクター］
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、植物を形質転換するための発現ベクター（植物用発現ベクター）を構築するために用いられるベクターであって、２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、当該プロモーター及びターミネーターに挟まれた変換オリゴヌクレオチドと、当該変換オリゴヌクレオチドに隣接した制限酵素認識部位とを有している。
【００８４】
これらのＤＮＡセグメントの配列は、一方のａｔｔ部位を基準とすれば、当該ａｔｔ部位、プロモーター、変換オリゴヌクレオチド、ターミネーター、他方のａｔｔ部位の順でこれら各ＤＮＡセグメントが並ぶ構成となっている。
【００８５】
また、前記ベクターは、制限酵素認識部位に上記の転写因子ポリヌクレオチドを有し、当該転写抑制ポリヌクレオチドと隣接する変換オリゴヌクレオチドとが転写抑制因子をコードしていてもよい。
【００８６】
上記の構成によれば、以下のような効果を奏することができる。標的となる遺伝子の転写を抑制する転写抑制因子の発現ベクターを容易に得ることができる。また、上記発現ベクター構築用ベクターは、プロモーター及びターミネーターを含むので、発現ベクターに組み込んで適切な細胞を形質転換することにより、転写抑制因子を発現させることができる。
【００８７】
さらに、上記発現ベクター構築用ベクターはａｔｔ部位を含んでいるため、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に形質転換用の発現ベクターと組換えることができる。それゆえ、簡便で効果的に遺伝子の転写を抑制できるとともに、発現ベクターへのクローニング効率、速度を飛躍的に高めることができる。
【００８８】
以下、元となるベクターと各ＤＮＡセグメントとについて詳細に説明する。
【００８９】
（ａ）ベースベクターの種類
本発明に係る上記構築用ベクターは、元となるベクター（以下の説明では、便宜上、ベースベクターと称する）に、上記２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、制限酵素認識部位等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記ベースベクターとしては、構築用ベクターで形質転換された形質転換体を特異的に検出できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知のプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を好適に用いることができる。
【００９０】
上記ベースベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２等の大腸菌由来のプラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＹＥＳ２等の酵母由来プラスミドベクター；λファージ等のバクテリオファージ由来のファージベクター；アデノウイルス、バキュロウイルス等のＤＮＡウイルスベクター；レンチウイルスなどのレトロウイルスベクター；等が挙げられる。
【００９１】
上記プラスミドベクターの具体的な種類は特に限定されるものではないが、大腸菌（E. coli）内でも増殖できるベクターが好ましく用いられ、さらには比較的サイズの小さいものがより好ましく用いられる。具体的には、例えば、ｐＵＣ型プラスミドを好ましく用いることができる。ｐＵＣ型プラスミドは、サイズが小さく（＜３ｋｂｐ）宿主大腸菌内でのコピー数が多いため、これを用いることにより、クローニング効率及びシーケンスの作業効率を高めることができる。
【００９２】
（ｂ）ａｔｔ部位
本発明の発現ベクター構築用ベクターに含まれる上記ａｔｔ部位とは、λファージ由来の公知の組換え部位であり、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識されるａｔｔ配列であればよい。このようなａｔｔ配列としては、例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ配列等を挙げることができる。
【００９３】
上記ａｔｔ配列を用いれば、λインテグラーゼによりＤＮＡ中のこれら組換え部位（ａｔｔ部位）の配列が認識され、これらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを転移させることが可能となる。
【００９４】
上記ａｔｔ部位は、野生型λファージ由来の組換え部位であってもよいし、野生型λファージ由来の組換え部位を操作した組換え部位であってもよい。ここでいう、操作した組換え部位とは、組換え反応の特異性や効率を増強するために公知の遺伝子工学的手法により操作された組換え部位を指し、市販のベクター等に含まれる組換え部位を用いてもよい。
【００９５】
（ｃ）プロモーター
上記プロモーターは、植物体内で発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター又はアクチン遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。
【００９６】
上述した各プロモーターを用いれば、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターにより構築される植物用発現ベクターに、上記プロモーターをそのまま組み込むことができる。そのため、得られた植物用発現ベクターを植物細胞内に導入することによって、転写抑制因子を強く発現させることが可能となる。
【００９７】
（ｄ）ターミネーター
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターに用いられるターミネーターは、植物細胞内で転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。中でも、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域を用いることが好ましい。
【００９８】
上述したターミネーターを用いれば、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがベクターのコピー数を減少させたりするような現象を防止することができる。なお、本発明におけるターミネーターの位置としては、後述するように、変換オリゴヌクレオチドの下流とすることが好ましい。
【００９９】
（ｅ）変換オリゴヌクレオチド、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチド
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、任意の転写因子を変換して、転写抑制因子を植物細胞内で発現させるために、上述のプロモーター及びターミネーターの間に変換オリゴヌクレオチドが配置されている。
【０１００】
また、転写抑制因子を発現させるためには、上記に加えて、上記変換オリゴヌクレオチドと転写因子ポリヌクレオチドとが連結される必要があるため、転写因子ポリヌクレオチドが挿入される部位に制限酵素認識部位が配置されている。この制限酵素認識部位は１種類以上配置されており、複数種類あることが好ましい。さらに、上記制限酵素認識部位は１種類あたり発現ベクター構築用ベクター内に１箇所しかなく、他の部位には存在しないことが好ましい。上記制限酵素認識部位を認識する制限酵素の種類は特に限定されるものではなく、転写因子ポリヌクレオチドを消化して単離する際に用いられる制限酵素が含まれていることが好ましい。
【０１０１】
例えば、後述する実施例では、SmaＩ、SalＩ等の制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含んでいる。上記制限酵素認識部位の具体的な作製方法は特に限定されるものではなく、例えば、用途に応じて公知の方法で合成した合成ポリヌクレオチドを用いてもよいし、市販のベクターに含まれているマルチクローニングサイトを単離して用いてもよい。
【０１０２】
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターに用いられる変換オリゴヌクレオチドとしては、上述した変換オリゴヌクレオチドのうち任意のものを用いることができる。また、プロモーターが存在する方向を上流としたときに、変換オリゴヌクレオチドが制限酵素認識部位又は転写因子ポリヌクレオチドの上流に来る場合は、変換オリゴヌクレオチドの先頭に翻訳開始メチオニンをコードするＡＴＧ塩基配列が付加されていることが好ましい。
【０１０３】
また、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、上述の構成のうち、上記制限酵素認識部位の代わりに上記転写因子ポリヌクレオチドを有し、当該転写因子ポリヌクレオチドとこれに隣接する変換オリゴヌクレオチドによって、転写抑制因子をコードしていてもよい。
【０１０４】
（ｆ）その他のＤＮＡセグメント
本発明に係る構築用ベクターは、上記のａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位以外に、他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。上記他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に配置させることによって、目的遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、本発明に係る発現ベクター構築用ベクターは、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含むことができる。
【０１０５】
［発現ベクター構築用ベクターの作製方法、並びに生産方法］
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記のベースベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、変換オリゴヌクレオチド及び制限酵素認識部位、或いは転写抑制因子ポリヌクレオチド等）を所定の順序となるように組換えればよい。
【０１０６】
上記各ＤＮＡセグメントを挿入する際に用いられる試薬、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。また、本発明に係る構築用ベクターを作製するための手順についても特に限定されるものではなく、上記各ＤＮＡセグメントを、所定の順序で効率的に配列させることができるようになっていればよい。また、上記組換えに用いられる生物も特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌又は酵母等を用いてもよい。
【０１０７】
本発明に係る発現ベクター構築用ベクターの生産方法、すなわち、上記作製方法で作製された発現ベクター構築用ベクターを増殖させる方法についても特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には、ベースベクターとして大腸菌内で複製できるベクターを用いた場合には、大腸菌を形質転換して当該大腸菌の細胞内で増殖させればよい。このときベースベクターや作製された構築用ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。また、大腸菌細胞から増殖した発現ベクター構築用ベクターを回収する方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。
【０１０８】
［植物における転写抑制の例］
本発明に係る転写抑制の一例としては、各種植物の転写因子を転写抑制因子に変換する例を挙げることができる。
【０１０９】
具体的な転写因子としては、例えば、ＥＩＮ３タンパク質（Chao. Q., Rothenberg. M., Solano. R., Roman. G., Terzaghi. W., Echer. J. R., Cell, Vol.89, 1133-1144, 1997参照）、ＣＵＣ１タンパク質（Takada. S., Hibara. K., Ishida. T., Tasaka. M., Development Vol.128, 1127-1135, 2001参照）・ＣＵＣ２タンパク質（Aida. M., Ishida. T., Fukaki. H., Fujisawa. H., Tasaka. M., Plant Cell, Vol.9, 841-857, 1997参照）、ＰＡＰ１タンパク質（Borevitz. J. O., Xia. Y., Blount. J., Dixon. R. A., Lamb. C., Plant Cell, Vol.12, 2383-2393, 2000参照）、ＡｔＭＹＢ２３タンパク質（Kirik. V., Schnittger. A., Radchuk. V., Alder. K., Hulskamp. M., Baumlein. H., Development Biology Vol.235, 366-377, 2001参照）等を挙げることができる。
【０１１０】
上記各転写因子の転写抑制因子への変換は、本発明に係る変換オリゴヌクレオチドと上述の転写因子をコードするポリヌクレオチド（転写因子ポリヌクレオチド）とを連結させて、最終的に融合タンパク質を作製することにより実現される。
【０１１１】
より具体的に説明すると、上記転写因子遺伝子のオープンリーディングフレームを、開始コドンＡＴＧを含むプライマーおよび終始コドンを除くように設計したプライマーを用いて増幅し、転写因子ポリヌクレオチドを得る。また、変換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し、２本鎖にして変換オリゴヌクレオチドを得る。次に上記転写因子ポリヌクレオチドと上記変換オリゴヌクレオチドとをライゲーションし、得られた転写抑制因子ポリヌクレオチドを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質遺伝子のプロモーター（３５Ｓ−ｐｒｏ）及びノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）を組み込んだ植物形質転換ベクターに挿入する。以上のようにして、転写抑制因子を発現するベクター（転写抑制因子発現ベクター）が構築される。そして、上記転写抑制因子発現ベクターを用いて、シロイヌナズナ等の植物の培養細胞又は生体内細胞を形質転換する。
【０１１２】
なお、上記の転写因子は、少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むものであれば転写因子の一部であってもよく、以下の例についても同様である。
【０１１３】
上記転写抑制因子を発現させた植物についての具体的な結果を以下に示す。なお、以下の説明では、便宜上、例えば、転写因子ＥＩＮ３タンパク質を変換した転写抑制因子をＥＩＮ３変換転写抑制因子と略す。他の転写因子も同様である。
【０１１４】
（ａ）ＥＩＮ３タンパク質の場合
植物ホルモンであるエチレン存在下で植物を生育させると、細胞伸張が抑制され、結果として矮性の植物となる。転写因子ＥＩＮ３タンパク質はエチレンのシグナル伝達を制御する機能を有している。それゆえ、ＥＩＮ３変換転写抑制因子を発現させた植物は、エチレンに対して感受性を持たない植物体となる。同時に、ＥＩＮ３タンパク質で制御されていた遺伝子の発現が抑制される。
【０１１５】
（ｂ）ＣＵＣ１タンパク質（ＣＵＣ２タンパク質も含む）の場合
ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質は、何れも転写因子として機能的に重複している。それゆえ、ＣＵＣ１変換転写抑制因子を発現した植物は、ＣＵＣ１タンパク質及びＣＵＣ２タンパク質が制御する遺伝子の発現を、これら内在性の転写因子に優先して抑制する。その結果、ＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子がともに不活性なＣＵＣ１／ＣＵＣ２二重変異体と同様な表現型が発現する。上記表現型は、子葉が融合したｃｕｐ  ｓｈａｐｅｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ型の表現型である。
【０１１６】
（ｃ）ＰＡＰ１タンパク質の場合
ＰＡＰ１タンパク質は、フェニルプロパノイド合成関連遺伝子の発現を活性化させる転写因子である。フェニルプロパノイド合成関連遺伝子としては、例えば、ＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等が挙げられ、これら遺伝子の発現はストレス存在下で上昇する。ＰＡＰ１変換転写抑制因子を発現した植物は、野生型では見られる、ストレス存在下でのＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等の発現上昇が見られない。また、ＰＡＰ１変換転写抑制因子を発現した植物は、３％のショ糖存在下で生育させた場合に野生型植物で観察されるアントシアニンの蓄積も起こらない。
【０１１７】
（ｄ）ＡｔＭＹＢ２３タンパク質の場合
ＡｔＭＹＢ２３タンパク質は、葉の表面で発達するトリコームの発生に関連する転写因子であると考えられている。ＡｔＭＹＢ２３変換転写抑制因子を発現した植物は、野生型では見られるトリコームが無い植物体となる。また、トリコーム発生に関与している遺伝子の内、ＧＬ２遺伝子の発現抑制に関わっていることが明らかになった。
【０１１８】
［産業上の利用例］
このように、本発明は、これまでの技術では困難であった遺伝子又は遺伝子群の発現抑制を可能とする技術である。それゆえ、本発明を用いれば、遺伝子の発現を阻害することによって有用な効果をもたらす各種産業分野に利用することが可能となる。
【０１１９】
具体的には、植物を用いた産業分野としては、例えば、本発明を用いてエチレン非感受性植物、すなわち枯れにくい植物や切り花を創製する用途を挙げることができる。
【０１２０】
また、これまでにない色又は形を有する植物、或いは特定のタンパク質の含量を抑制した植物を創製することも可能となる。例えば、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、これまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創製することが可能になる。また、アレルゲンとなるタンパク質の発現を抑制することで、アレルゲンの少ない食物（例えば、低アレルゲン米）を創製することが可能になる。或いは、特定のタンパク質の発現を抑制することで、雑味の無い米（吟醸米等）を創製することも可能となる。さらに或いは、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、リグニン含量の少ない木を創製し、高品質のパルプを生産することも可能となる。
【０１２１】
また、本発明は有用物質等の効率的生産への応用が可能である。植物が産生する二次代謝物質には、医療分野、食糧分野並びに工業的応用に有用とされている物質が数多く存在する。例えば、フラボノイドおよびテルペノイドの一部は、健康を促進する食品として、またある種のアルカロイドは、薬理作用を持つことが知られ、医薬品として利用されている。
【０１２２】
植物の二次代謝産物の生合成経路を人為的に操作し、目的とする物質の収量を増加させる試みは、これまでにも多くなされている。しかし、多くの場合は、目的の物質生合成に関わる合成酵素を強発現させる等の方法であり、収量も十数パーセントの増加といったもので高効率の物質生産に結びつかないものが多い（Sato et al., PNAS, 98, 367-372 (2001)参照）。
【０１２３】
このような問題を解決し、目的とする植物の二次代謝産物をより効率的且つ簡便に生産する方法においても本発明を応用することが可能である。
【０１２４】
その手法の一例を図１に示した。図１はシロイヌナズナにおけるアントシアニン（Anthocyanins）、フラボノール（Flavonols）並びにプロアントシアニジン（Proanthocyanidins）といったフラボノイド生合成経路を示している（Plant Cell, 13, 2099-2114 (2001): Nesi et al. から引用）。
【０１２５】
例えば、フラボノールのみを選択的に大量に生産したい場合、アントシアニン及びプロアントシアニジンに分岐する経路に関わる酵素を制御する遺伝子を本発明により抑制する。つまり、ＴＴ２やＴＴ８といった転写因子を、本発明を用いて転写抑制因子に変換し、ジヒドロフラボノール（dihydroflavonols）をロイコアントシアニジン（leucoanthocyanidins）に変換する酵素であるＤＦＲ(dihydroflavonol-4-reductase)の発現を抑制する。上記によれば、フラボノイド生合成経路の中間産物であるジヒドロフラボノールは、アントシアニン及びプロアントシアニジン等の生合成に利用されず、図１の矢印で示すように、より選択的にフラボノールの生合成に利用される。
【０１２６】
つまり、本発明に係る転写抑制因子を用いて目的物質の生合成に不要な反応経路を阻害することによって、効率的および計画的に目的物質を得ることができる。
【０１２７】
上述した例では、主に、植物を用いた産業分野を挙げたが、本発明はもちろんこれに限定されるものではなく、動物を用いた産業分野にも好適に用いることができる。
【０１２８】
具体的には、例えば、医薬産業・医療産業分野の一例として、癌に対する抑制が挙げられる。動物における癌遺伝子の転写因子を同定し、それを変換した転写抑制因子を作製して動物細胞に作用させれば、より特異的な制ガン効果が期待できる。特に、本発明に係る変換ペプチドは植物由来であり動物には存在しないので、この特異性を利用すれば動物に内在する因子と競合せず、標的遺伝子あるいは細胞（癌等）に対する特異性を向上させることも可能となる。
【実施例】
【０１２９】
以下、本発明の実施例を図２から図９に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では以下のようにして、変換ペプチドが転写因子を転写抑制因子に変換できるかどうかを調べた。まず、合成した種々の変換オリゴヌクレオチドを、酵母の転写因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと連結して、転写抑制因子ポリヌクレオチドを作製した。次に、当該転写抑制因子ポリヌクレオチドを含むエフェクターベクターを構築し、その一方で、ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列とルシフェラーゼ遺伝子とを含むレポーターベクターを構築した。次に、これらエフェクターベクターとレポーターベクターを同時に、シロイヌナズナ葉にパーティクルガン法を用いて導入し、その後、レポーターとなるルシフェラーゼの活性を測定した。この測定した値を、レポーターベクターのみを導入したときのルシフェラーゼ活性と比較し、相対値を算出することによって転写抑制能を調査した。
【０１３０】
ここで、上記エフェクターベクターは本発明に係るベクターの一例に相当し、このベクターが導入されたシロイヌナズナ葉は、本発明に係る形質転換体の一例に相当する。
【０１３１】
（１−１）エフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤの作製
図２に示すように、クロンテック社製のプラスミドベクターｐＢＩ２２１（商品名）を制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化処理をした後、アガロースゲル電気泳動に供することによって、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーター（３５Ｓ−ｐｒｏ）及びノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓ−ｔｅｒ）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓ断片を得た。
【０１３２】
クロンテック社製のプラスミドベクターｐＡＳ２−１（商品名、クロンテック社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン(１−１４７アミノ酸残基)をコードする７４８ｂｐのＤＮＡ断片（ＧＡＬ４ＤＢＤ）をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化処理を行った。
【０１３３】
そして、平滑末端化処理を行ったＧＡＬ４ＤＢＤを、先ほど得られた３５Ｓ−Ｎｏｓ断片の、３５Ｓ−ｐｒｏとＮｏｓ−ｔｅｒとの間の平滑末端化した部位に挿入し、３５Ｓ−ｐｒｏに対してＧＡＬ４ＤＢＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が順方向に並んでいるものを選抜することによって、エフェクターベクターｐ３５Ｓ‐ＧＡＬ４ＤＢＤを構築した。
【０１３４】
ＧＡＬ４ＤＢＤのアミノ酸読み枠と、読み枠（フレーム）が一致するように設計した調査対象のペプチドをコードする両鎖のオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、以下に示す通り、ペプチド１をコードするオリゴヌクレオチドとして合成ＤＮＡ１，２を合成した。
【０１３５】
ペプチド１：Asp Leu Ser Leu Ser Leu（配列番号１）
合成ＤＮＡ１Ｆ：5’-AGATCTTAGCCTAAGCCTGTAAG-3’（配列番号１９）
合成ＤＮＡ１Ｒ：5’-TCGACTTACAGGCTTAGGCTAAGATCT-3’（配列番号２０）
さらに、このアミノ酸配列を基にして、第１，３，５番目に存在するアミノ酸のうち１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を作製し、それぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列を作製してオリゴヌクレオチドを合成した。作製したアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を以下に示す。
【０１３６】
以下はペプチド２及びそれをコードする合成ＤＮＡ２Ｆ，２Ｒである。
【０１３７】
ペプチド２：Asp Leu Ser Leu His Leu（配列番号２）
合成ＤＮＡ２Ｆ：5’-AGATCTTTCGCTACACCTGTAAG-3’（配列番号２１）
合成ＤＮＡ２Ｒ：5’-TCGACTTACAGGTGTAGCGAAAGATCT-3’（配列番号２２）
以下はペプチド３及びそれをコードする合成ＤＮＡ３Ｆ，３Ｒである。
【０１３８】
ペプチド３：Cys Leu Asp Leu Arg Leu（配列番号３）
合成ＤＮＡ３Ｆ：5’-ATGCCTGGACCTTCGTCTGTAAG-3’（配列番号２３）
合成ＤＮＡ３Ｒ：5’-TCGACTTACAGACGAAGGTCCAGGCAT-3’（配列番号２４）
以下はペプチド４及びそれをコードする合成ＤＮＡ４Ｆ，４Ｒである。
【０１３９】
ペプチド４：Ser Leu Asp Leu Arg Leu（配列番号４）
合成ＤＮＡ４Ｆ：5’-AAGCCTTGATTTAAGACTCTAAG-3’（配列番号２５）
合成ＤＮＡ４Ｒ：5’-TCGACTTAGAGTCTTAAATCAAGGCTT-3’（配列番号２６）
以下はペプチド５及びそれをコードする合成ＤＮＡ５Ｆ，５Ｒである。
【０１４０】
ペプチド５：Asn Leu Asn Leu Lys Leu（配列番号５）
合成ＤＮＡ５Ｆ：5’-GAATTTGAATCTCAAGTTGTGAG-3’（配列番号２７）
合成ＤＮＡ５Ｒ：5’-TCGACTCACAACTTGAGATTCAAATTC-3’（配列番号２８）
以下はペプチド６及びそれをコードする合成ＤＮＡ６Ｆ，６Ｒである。
【０１４１】
ペプチド６：Cys Leu Asp Leu Ser Leu（配列番号６）
合成ＤＮＡ６Ｆ：5’-ATGTTTGGATCTGAGTCTATGAG-3’（配列番号２９）
合成ＤＮＡ６Ｒ：5’-TCGACTCATAGACTCAGATCCAAACAT-3’（配列番号３０）
上記の各ペプチドをコードする１対の合成ＤＮＡを、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせた。そして、制限酵素ＳｍａＩ及びＳａｌＩで予め消化しておいたｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤにライゲーションした。以上のようにして、エフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤが得られた。
【０１４２】
（１−２）レポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣの作製
図３に示すように、ｐＢＩ２２１プラスミド（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒを含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。
【０１４３】
上記のＮｏｓ−ｔｅｒ断片を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入した。
【０１４４】
次に、３５Ｓ−ｐｒｏのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡ）を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＴＡＴＡ５（配列番号３１）及びそれに相補的なＴＡＴＡ３（配列番号３２）を合成し、それらを９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせることによって２本鎖ＤＮＡを形成させた。
【０１４５】
次に、Ｎｏｓ−ｔｅｒを含むｐＵＣ１８を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。そして、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に上記のＴＡＴＡを有する２本鎖ＤＮＡを挿入することによって、ＴＡＴＡ及びＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドベクターを構築した。さらに、それを制限酵素ＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。
【０１４６】
ホタルのルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターｐＧＶ−ＣＳ２（商品名、東洋インキ社製）を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ＬＵＣを含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＬＵＣ断片を上記のＴＡＴＡとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドにライゲーションした。以上のようにして、ｐＴＡＴＡ‐ＬＵＣレポーター遺伝子を構築した。
【０１４７】
次に、図４に示すように、５コピーの酵母ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列（５×ＧＡＬ４）を持つプラスミドベクターｐＧ５ＣＡＴ（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、ＧＡＬ４ＢＳを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。続いて、ｐＴＡＴＡ‐ＬＵＣベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した上記の５×ＧＡＬ４断片を挿入し、得られたプラスミドのうち５×ＧＡＬ４が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子ｐＧＡＬ４‐ＬＵＣを構築した。
【０１４８】
プライマーとして３５Ｓ−ｐｒｏ−Ｆ（配列番号３３）及び３５Ｓ−ｐｒｏ−Ｒ（配列番号３４）を用いて、プラスミドｐＢＩ１２１を鋳型としてＰＣＲを行い、３５Ｓ−ｐｒｏの塩基配列のうち−８００〜−４６番目の領域を含むＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、３５Ｓ−ｐｒｏを含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。
【０１４９】
この３５Ｓ−ｐｒｏ断片を、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＧＡＬ４‐ＬＵＣに挿入し、３５Ｓ−ｐｒｏが順方向に向いているものを選別した。以上のようにして、レポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣが得られた。
【０１５０】
（１−３）リファレンスベクターｐＰＴＲＬの作製
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子（ＲＬ）をもつカセットベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌ（商品名、プロメガ社製）を制限酵素ＮｈｅＩとＸｂａＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でＲＬを含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＲＬ断片を、上記のエフェクターベクターを構築する際に用いたｐＢＩ２２１のＧＵＳを除いた部位に挿入した。そして、ＲＬが順方向に向いているものを選別した。以上のようにして、リファレンスベクターｐＰＴＲＬが得られた。
【０１５１】
（１−４）パーティクルガンによる遺伝子導入
上述のようにして構築したレポーターベクター及びエフェクターベクターを用いて、パーティクルガン法にてシロイヌナズナ葉の細胞を形質転換した。そして、形質転換した細胞内でレポーターの活性が抑制されているかどうかを測定することによって、エフェクターの効果を調べた。
【０１５２】
１．６μｇのレポーターベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣと、１．２μｇのエフェクターベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤと、０．３２μｇのリファレンスベクターｐＰＴＲＬとを５１０μｇの金粒（直径１μｍ、バイオラッド社製）にコーティングした。水で湿らせた濾紙を置いた９ｃｍシャーレに、生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉４〜７枚を並べ、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機（商品名、バイオラッド社製）を用いて上記各種ベクターをコーティングした金粒を打ち込んだ。
【０１５３】
なお、上記ボンバートメント機を用いたシロイヌナズナ葉へのＤＮＡの導入は、以下の条件でおこなった。金粒子を葉に導入するためのガス圧を調節するラプチャーディスクは、１１００ｐｓｉ用を用いた。金粒子を打ち込むシロイヌナズナ葉を並べたサンプル台は、ラプチャーディスクの位置より約２０ｃｍ下の位置にセットするため、器機の高さを調節する段の下から3段目に設置した。それ以外の条件は、機器の操作マニュアルに従った。
【０１５４】
（１−５）ルシフェラーゼ活性測定
金粒子を打ち込んだシロイヌナズナ葉は２２℃の明所で６時間静置した後、液体窒素中で粉砕し、Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、プロメガ社製）のキットに添付されているＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌに懸濁した。得られた懸濁液を遠心して上清を回収し、細胞抽出液２０μｌを上記キットに添付されている測定バッファー１００μｌと混合した。そして、ルミノメーター（TD20/20, Turener Design社製）を用いて上記混合液中のレポーター及びリファレンスのルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。ルシフェラーゼ活性の測定は１０秒間の発光を積分モードでカウントすることによって行い、その他の条件はキットの説明書に従った。さらに、得られたレポーターの活性測定値をリファレンスの活性測定値で割ることによって、導入効率も考慮に入れた活性値を求めた。
【０１５５】
上述した活性値の測定を、遺伝子導入の段階から個別に３回行って、３回分の活性値の平均値を算出する作業を各種エフェクターベクターごとに行った。そして、エフェクターベクターを導入しない場合のレポーターの活性を１００として、各種エフェクターの相対活性値をそれぞれ算出した。その結果を表１に示す。
【０１５６】
【表１】
2006055125.tif 000002
【０１５７】
上記のように、全てのエフェクターにおいて、相対活性値は１５．１％〜２５．０％となった。即ち、相対活性値は７５．０％〜８４．９％減少した。また、上記のエフェクターベクターから変換オリゴヌクレオチドを除いた、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤのみを有するベクターを用いてコントロール実験を行ったところ、レポーターの活性は抑制されなかった。従って、配列番号１から６のペプチドには転写因子を転写抑制因子に変換する能力があることが明らかとなった。
【０１５８】
〔実施例２〕
以下実施例２〜４において、発現ベクター構築用ベクター、及びこれを用いた発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターの例について説示する。また、実施例５において、上記発現ベクターを用いた遺伝子の転写抑制方法の一例について説示する。本実施例では、変換ペプチドの一例としてＳＲＤＸ（配列番号４５）を用いた。使用する変換ペプチドはこれに限られるものではなく、既述した本発明に係る変換ペプチド（配列番号１〜６）に置換しても同様の結果が得られることは言うまでもない。また、変換ペプチドの標的となる転写因子として、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号４１）を用いた。
【０１５９】
実施例２では、発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の一例として、ｐ３５ＳＲＤＸＧ及びその構築方法について以下に説明する。
【０１６０】
まず、図５に示すように、プラスミドベクターｐＥＮＴＲ（商品名、インビトロジェン社製）に含まれるａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号３５）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号３６）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号３７）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号３８）を用いてＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応として９４℃１分間、アニーリング反応として４７℃２分間、伸長反応として７４℃１分間を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下の実施例において、ＰＣＲ反応は全てこの条件で行った。得られたａｔｔＬ１断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｔｔＬ２断片はＥｃｏＲＩで消化し、それぞれ精製した。
【０１６１】
プラスミドベクターｐＢＩ２２１（商品名、クロンテック社製）を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳを除き、３５Ｓ−ｐｒｏとＮｏｓ−ｔｅｒを含む３５Ｓ−Ｎｏｓ断片を得た。
【０１６２】
配列番号３９，４０のＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングして２本鎖ＤＮＡを形成した。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓ断片のＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓを構築した。配列番号３９，４０の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩが含まれる。
【０１６３】
ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入した。以上のようにして、ｐ３５ＳＧを構築した。
【０１６４】
次に、変換ペプチドＳＲＤＸ（配列番号４５）をコードするオリゴヌクレオチド（配列番号４６，４７）を合成して、アニーリングを行い、２本鎖ＤＮＡにした。図６に示すように、ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記の変換ペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入した。以上のようにして、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧが得られた。
【０１６５】
〔実施例３〕
本実施例では、本発明に係る発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の別の例として、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧ及びその構築方法について以下に説明する。
【０１６６】
まず、上記のプラスミドベクターｐ３５ＳＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化し、電気泳動にて３５Ｓ−ｐｒｏ領域を除去するとともに、ａｔｔＬ１断片を回収した。
【０１６７】
東京大学より譲渡されたプラスミドベクターｐＡｃｔＦ１／ＴＡ（N.Sentoku, Y.Sato, M.Matsuoka, Develop.Biol.220,358-364(2000)）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化し、電気泳動にてアクチン遺伝子のプロモーター（Ａｃｔ−ｐｒｏ）を含むＤＮＡ断片を回収した。
【０１６８】
回収した上記ＤＮＡ断片を、ｐ３５ＳＧから３５Ｓ−ｐｒｏを除去した断片のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。これをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し、回収しておいたａｔｔＬ１断片を挿入した。以上のようにして、ｐＡｃｔＧを構築した。
【０１６９】
次に、変換ペプチドＳＲＤＸ（配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６，４７）を合成して、アニーリングを行い、２本鎖ＤＮＡにした。
【０１７０】
図８に示すように、ｐＡｃｔＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記変換ペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧを完成させた。
【０１７１】
〔実施例４〕
本実施例では、本発明に係る発現ベクター構築用ベクター及びその構築方法の別の例として、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧ及びその構築方法について説明する。
【０１７２】
また、本実施例では、発現ベクター構築用ベクターのａｔｔ部位を利用した発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターの一例として、ｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧのａｔｔ部位を利用した発現ベクターの構築方法、並びにそれによって得られた発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸについて以下に説明する。
【０１７３】
（４−１）発現用ベースベクターの作製
上記構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡセグメントを転移させるために、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨを以下のようにして作製した。
【０１７４】
図９に示すように、米国ミシガン州立大学より譲渡されたプラスミドベクターｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990）及びプラスミドベクターｐＢＩ１０１（商品名、クロンテック社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ＧＵＳ並びにＮｏｓ−ｔｅｒを電気泳動で除いた。
【０１７５】
インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ(登録商標)ベクターコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。
【０１７６】
回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記の消化したｐＢＩ１０１又はｐＢＩＧ断片に挿入した。以上のようにして、ｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨが得られた。なお、これらのベクターは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１７７】
（４−２）発現ベクター構築用ベクターへの転写因子ポリヌクレオチドの挿入
転写抑制因子を発現させるために、シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号４１）をコードする遺伝子（配列番号４２）を発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧに以下のようにして挿入した。
【０１７８】
シロイヌナズナ由来ＥＲＦ１遺伝子のＯＲＦのうち、終始コドンを除く領域をプライマーＥＲＦ１−Ｆ（配列番号４３）及びプライマーＥＲＦ１−Ｒ（配列番号４４）を用いてＰＣＲにて増幅を行った。
【０１７９】
増幅されたＥＲＦ１のＯＲＦのＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１８０】
得られたベクターの塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離した。以上のようにして、転写抑制因子ポリヌクレオチドを含む発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧが得られた。
【０１８１】
（４−３）植物を形質転換するための発現ベクターの作製
上記の発現ベクター構築用ベクター上にある３５Ｓ−ｐｒｏ、転写抑制因子ポリヌクレオチド、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに転移させることにより、植物を形質転換させるための発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下のように行った。
【０１８２】
まず、１．５μＬ（約３００ｎｇ）のｐ３５ＥＲＦ１ＳＲＤＸＧ及び４．０μＬ（約６００ｎｇ）のｐＢＩＧＣＫＨに、５倍希釈した４．０μＬのＬＲ  ｂｕｆｆｅｒ及び５．５μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えた。
【０１８３】
上記の溶液に４．０μＬのＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、２μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。その後、この溶液を１〜２μＬ用いて大腸菌（ＤＨ５α株等）を形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１８４】
以上の方法を用いることによって、発現ベクター構築用ベクターを組換えて発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを得ることができた。
【０１８５】
〔実施例５〕
本実施例では、上記の発現ベクターを宿主細胞に導入し、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させた転写抑制因子を発現させる工程を含む遺伝子の転写抑制方法の一例として、発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸをシロイヌナズナの細胞に導入した。なお、シロイヌナズナの形質転換は、Transfomation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。
【０１８６】
まず上記の発現ベクターｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell 1986)株）にエレクトロポレーション法にて導入した。そして、上記細菌を、抗生物質（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を含む１ＬのＹＥＰ培地中でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、以下の表２に示す１Ｌの感染用培地に懸濁した。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
この懸濁液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸漬し、上記細菌に感染させた後、再び育成し結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ，０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に７分間浸漬して滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、以下の表３に示す滅菌したハイグロマイシン選択培地に蒔種した。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
蒔種した約５０００粒の種子から平均して２０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物からＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いてＥＲＦ１ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１９１】
以上のようにして、本発明の変換オリゴヌクレオチドを含むベクターによって形質転換された植物個体が得られた。
【０１９２】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明に係る遺伝子の転写抑制機能を有する新規ペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用方法は、特定の遺伝子の転写を抑制することによって、研究用試薬や試料等の生産に関わる産業分野に好適に利用できるだけでなく、例えば、生物の品種改良、種苗産業、家畜水産業等にも利用でき、さらには医学的・薬学的な分野にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】本発明の実施形態を示すものであり、シロイヌナズナにおけるフラボノイド生合成経路の概要を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態を示すものであり、変換オリゴヌクレオチド及び転写因子ポリヌクレオチドを含むベクターｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ＲＤの構造及びその構築方法を示す図である。
【図３】本発明の実施形態を示すものであり、実施例１におけるレポーターベクターｐ３５Ｓ‐ＧＡＬ４‐ＬＵＣの構築方法の前半部を示す図である。
【図４】本発明の実施形態を示すものであり、実施例１におけるレポーターベクターｐ３５Ｓ‐ＧＡＬ４‐ＬＵＣの構築方法の後半部を示す図である。
【図５】本発明の実施形態を示すものであり、発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧの構築方法の前半部を示す図である。
【図６】本発明の実施形態を示すものであり、発現ベクター構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧの構造及びその構築方法の後半部を示す図である。
【図７】本発明の実施形態を示すものであり、発現ベクター構築用ベクターｐＡｃｔＳＲＤＸＧの構築方法の前半部を示す図である。
【図８】本発明の実施形態を示すものであり、発現ベクター構築用ベクターｐＡｃｔＳＲＤＸＧの構造及びその構築方法の後半部を示す図である。
【図９】本発明の実施形態を示すものであり、実施例４における発現用ベースベクターｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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