(57)【要約】【課題】  骨格筋芽細胞または心筋細胞の好ましい心筋移植体、ならびにそれらの移植体を得るのに有用な細胞組成物および方法が記載される。【解決手段】  本発明の心筋移植体は安定であり、たとえば心臓に組換え蛋白質を直接に運搬するために使用しうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターの制御下にある選択可能なマーカー遺伝子を含む心筋細胞であって、前記プロモーターは心筋細胞中で選択的に活性である、前記心筋細胞。
【請求項２】
第一プロモーターの制御下にある第一の選択可能なマーカー遺伝子を有する第一の構築物、及び、第二プロモーターの制御下にある第二の選択可能なマーカー遺伝子を有する第二の構築物を含む、請求項１の心筋細胞。
【請求項３】
組換えタンパク質をコードする導入されたＤＮＡを発現する、請求項２の心筋細胞。
【請求項４】
胚性の心筋細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載の心筋細胞。
【請求項５】
第一の選択可能なマーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項１−４のいずれか１項に記載の心筋細胞。
【請求項６】
非ヒト動物における心筋移植体であって、前記非ヒト動物の心筋組織中に取り込まれた生存可能な骨格筋芽細胞の安定な移植体を含む、前記心筋移植体。
【請求項７】
非ヒト動物における心筋移植体であって、前記非ヒト動物の心筋組織中に取り込まれた生存可能な心筋細胞の安定な移植体を含む、前記心筋移植体。
【請求項８】
骨格筋芽細胞が、動物の骨格筋から単離される、請求項６に記載の心筋移植体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は一般的に心臓学の分野に関するものであり、より詳細には安定な心筋移植体ならびにその移植を達成するために有用な方法および細胞組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
さらに背景として、罹患した機能不全の組織と交換するために器官移植が広く採用されている。比較的最近になって、宿主の組織機能の欠陥を補うために細胞移植が有効な治療例として出現した。この方法の一例は、パーキンソン症候群を伴う個体においてよく知られている胎児組織の使用であり（（１）に概説、後記の参考文献リストを参照されたい）、この場合は移植された細胞からのドーパミン分泌が患者の欠陥を軽減する。他の研究においては、デュシェンヌ症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ）の患者において罹患していない同胞から移植された筋芽細胞が内在性筋管と融合した；重要なことは、移植した筋管が野生型ジストロフィンを発現したことである（２）。
【０００３】
これらの初期の研究は、他の領域においてそれらが適性を示すにもかかわらず、心臓に有効に適用しうる細胞移植技術については何ら述べていない。心臓において損傷を受けた心筋を交換することができれば、明らかに臨床適性があるであろう。さらに血管形成誘導因子およびイオノトロピックペプチドの長期発現を目標として心臓内移植体を使用すれば、それぞれ心筋虚血またはうっ血性心不全を伴う個体にとって治療上有用であろう。
【０００４】
この背景からみて、心臓における細胞移植技術の開発が要望されている。望ましくはそのような技術は、心臓における安定な移植体を提供するだけでなく、有用な組換え蛋白質または他の分子を心臓に直接に運搬することも可能にする。本発明はこれらの要望に対処するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明者らは、心筋において長期間生存しうる細胞移植体を確立した。心筋細胞および骨格筋芽細胞を同系動物の心筋内ヘ直接に移植した。移植後少なくとも半年は、生存可能な移植体が検出された（アッセイを行った最後の時点）。移植体の存在に伴って明瞭な不整脈が生じることはなく、大部分の移植体は宿主の心筋に直接に近接しており、被包されていなかった。こうして、心筋を細胞移植体のための安定な足場として使用しうることが見出された。これらの移植体は心臓へ組換え分子を局所運搬するために、および／または罹患組織に代わって心筋の機能を補足するために使用しうる。
【０００６】
従って本発明の好ましい１態様は、動物の心筋組織に取り込まれた骨格筋芽細胞および心筋細胞の安定な移植体を含む、動物における心筋移植体を提供する。
本発明の他の好ましい態様によれば、動物において安定な心筋移植体を形成する方法が提供される。本発明方法には、動物の心筋組織に骨格筋芽細胞または心筋細胞を導入し、これによって安定な心筋移植体を形成する工程が含まれる。細胞は常法により、たとえば注射により導入することができる。
【０００７】
本発明の他の好ましい態様によれば、動物の心筋組織に組換え分子を運搬する方法が提供される。この方法には、動物の心筋組織に取り込まれた骨格筋芽細胞または心筋細胞の安定な移植体を確立する工程が含まれ、その際筋芽細胞または心筋細胞は心筋組織に組換
え分子を運搬する。この態様においては、筋芽細胞または心筋細胞は組換え分子をコードするトランスジーンを保有するであろう。
【０００８】
本発明の他の好ましい態様によれば、不死化していない心筋細胞の実質的に均一な集団を含む細胞組成物が提供される。この、および他の細胞集団は、（ｉ）胚幹細胞をトランスフェクションして、幹細胞の分化により生じる１細胞系列を他の細胞系列から選択しうるマーカー遺伝子を導入し、（ｉｉｉ）幹細胞を分化させ、そして（ｉｖ）この１細胞系列をマーカー遺伝子に基づいて選択することを含む、好ましい本発明方法により得られる。これらの方法に使用される細胞およびこれらの方法により得られる細胞も本発明の一部を構成する。
【０００９】
本発明のさらに他の好ましい態様によれば、動物の心筋組織に取り込まれた骨格筋芽細胞および心筋細胞の安定な移植体を有する、非ヒト動物が提供される。
従って本発明は、心筋移植体、心筋移植体を形成するのに有用な方法および細胞組成物、ならびに心筋移植体を有する動物を提供する。移植体は、治療剤、たとえば組換え蛋白質および他の分子を運搬するためのベヒクルとして、かつ罹患組織に代わって心筋の機能を補足するための手段として有用であろう。本発明の細胞組成物は移植体を調製するために直接に用いることができ、かつ心筋細胞に対する薬物の作用をスクリーニングする際に、また組換え蛋白質を発現および採取するためにも有用であろう。移植した動物は、たとえば心臓に対する組換え分子の作用をスクリーニングするために利用しうる。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的は以下の記述から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
好ましい態様の説明
本発明の原理をより良く理解するために、その特定の態様について述べ、それを説明するために具体的な用語を使用するであろう。それにもかかわらず、これは本発明の範囲を限定することを意図したものでないことは理解されるであろう。本明細書に示す本発明の原理をさらに変更および応用することは、本発明に関連する技術分野の当業者が容易になしうるものと考えられる。
【００１２】
前記のように、本発明は骨格筋芽細胞および／または心筋細胞の安定な心筋移植体を提供する。これに関して本明細書において使用する用語“安定な心筋移植体”は、その細胞が少なくとも約２週間は生存可能である心筋移植体を意味するものとする。意外にもこのような安定な移植体は本発明によって容易に得られ、好ましい移植体は６カ月以上生存可能な細胞を有する。従って本発明の心筋移植体は組換え蛋白質もしくは他の分子を心臓に長期間運搬し、および／または心筋組織を長期間補足することができる。
【００１３】
本発明に用いられる骨格筋芽細胞および心筋細胞は、任意の適切な供給源から採取または単離することができる。たとえばＣ２Ｃ１２骨格筋芽細胞を含めた骨格筋芽細胞を公的寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションズ（ＡＴＣＣ）（マリーランド州ロックビル）から入手しうる。骨格筋芽細胞は骨格筋から、たとえば当技術分野および文献で周知の技術により単離することもできる。本発明に用いられる心筋細胞は文献（３）に記載の技術により、またはより詳細に後記実施例に記載した方法により得られる。簡潔に言えばこのような方法の１つは心臓組織を消化して心筋細胞を得ることによる。
【００１４】
他の方法は、適宜なマーカーを用いて、特定の細胞系列、たとえば心筋細胞を胚幹細胞（（２２）に記載される胚盤胞の内部細胞塊に由来する全能性細胞系）の分化により生じる他の細胞系列から選択することによる。好ましい方法は陽性選択方式によるものである
。たとえばマーカー遺伝子、たとえば抗生物質（たとえばネオマイシンまたはハイグロマイシン）耐性を付与する遺伝子を、遺伝子の発現が目的細胞系列においてのみ起こるような適宜な制御下で幹細胞に導入する。たとえば、マーカー遺伝子を目的細胞系列においてのみ活性であるプロモーターの制御下に置くことができる。次いで幹細胞が分化した時点で、マーカーに基づいて、たとえば分化した細胞の混合物を目的系列がそれに対する耐性を付与されている適宜な抗生物質と接触させることにより、目的系列を選択する。目的系列以外の細胞系はこうして死滅し、実質的に純粋かつ均一な目的系列の集団を回収することができる。より好ましい方法においては、２種類のマーカー、すなわちトランスフェクションした幹細胞を非トランスフェクション細胞から選択しうるマーカー、および目的細胞系列を他の系列から選択しうるマーカーを、母体である幹細胞に導入する。こうして各選択性マーカーが抗生物質耐性を付与する二重陽性選択方式を採用しうる。この選択法を用いると、後記実施例において証明されるように、約９０％、さらに約９５−１００％もの目的細胞系列を含む集団を得ることができる。
【００１５】
本発明の移植体を得るためには、骨格筋芽細胞または心筋細胞を生存動物、たとえば哺乳動物の心筋組織に導入する。細胞は任意の適切な方法で導入することができるが、導入様式は可能な限り非侵襲性であることが好ましい。たとえば細胞を注射、カテーテル導入、またはこれに類する手段で運搬することがより望ましいであろう。
【００１６】
得られた移植体保有動物は正常な洞調律を示し、これは移植体自体および移植体−宿主心筋の境界帯域が不整脈を誘発しないことを示している。これはヒトにおいて梗塞後にしばしば起こるリモデリングとは著しく対照的である；梗塞の境界帯域は輪回ループ（ｃｉｒｃｕｓ  ｌｏｏｐ）を形成し、その結果臨床的に重大な不整脈が起こる可能性がある（４，５）。
【００１７】
本発明の移植体は増殖性または非増殖性のいずれであってもよい。たとえば後記の具体例において確立されたＡＴ−１移植体は増殖性である。これに対し実施例において形成された骨格筋芽細胞由来の移植体は非増殖性であり、トリチウム化チミジン取り込みがないことは安定な心臓内移植体の形成が持続的な細胞増殖に依存するものでないことを示す。
【００１８】
好ましい移植体は、直接的な細胞内結合の存在、および宿主と移植細胞との間のギャップ結合の形成を特色とするであろう。さらにそれらの移植体は宿主において免疫反応を引き起こさず、移植細胞の最終分化および非腫瘍化性を示すであろう。
【００１９】
本発明の移植体は、治療用蛋白質などを移植細胞からの分泌により運搬し、罹患または損傷した組織に代わって心筋機能を補足するのに特に有用である。治療用蛋白質の運搬の例として、移植体は血管形成誘導因子（たとえば塩基性および酸性繊維芽細胞増殖因子；トランスフォーミング増殖因子−β、血管内皮増殖因子ならびに肝細胞増殖因子）を発現して新生血管形成を誘発しうる。同様に梗塞領域付近で神経栄養物質（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｇｅｎｔ）を発現する移植体を用いて、境界帯域に付随する不整脈惹起性を改善することができる。心臓を標的とする運搬についてのこれらおよび他の多数の候補物質は、当業者には自明であろう。
【実施例】
【００２０】
本発明ならびにその原理および利点の理解をいっそう促進するために、以下の具体例を提示する。これらの例は説明のためのものであって限定的な性質のものでないことは理解されるであろう。
【００２１】
実施例１  安定なＡＴ−１心筋細胞移植体の形成
Ａ．方法
ＡＴ−１細胞の培養および心筋移植プロトコル  ＡＴ−１心筋細胞を連続コラゲナーゼ消化により皮下腫瘍から分離し、１０％ウシ胎児血清を含有するＰＣ−１培地（ベントレックス、ミネソタ州クーン・ラピッズ）中で培養した：先に（６）に記載されたものに従う。注射位置の確認を容易にするために、細胞を１０μＭの８−クロロメチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザインデセン（ＢＯＤＩＰＹ，モレキュラー・プローブズ、オレゴン州ユージーン）で３７℃において３０分間標識した。注射直前にトリプシンおよびコラゲナーゼを用いて細胞を採取し、無血清ＰＣ−１培地で３回洗浄し、開胸手術した同系Ｂ６Ｄ２／Ｆ１マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ、メイン州バー・ハーバー）の心室心筋に直接に注射した：（７）の記載に従う。細胞（４−１０×１０4）は２−３μｌの容量で３０ゲージの注射針を備えたプ
ラスック注射器により注射された。
【００２２】
組織学的所見  頸部脱臼後に心臓を摘出し、３０％スクロース中で凍結保護し、包埋し、クリオマイクロトームで１０μｍの切片に切断した：（８）の記載に従う。ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）染色のために切片をアセトン：メタノール（１：１）中で後固定し、製造業者の説明書（シグマ・ダイアグノスティックス、ミズーリ州セントルイス）に従って染色した。免疫組織学的分析のために、固定していない切片をポリクローナルウサギ抗−Ｔ−Ａｇ抗体（１６１−Ｔ（（３）参照）または１６２−Ｔ）と反応させ、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ共役−ヤギ抗−ウサギ抗血清（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディアナポリス）と反応させ、ニッケル増強を伴うジアミノベンジジン反応により視覚化した：（９）の記載に従う。共通白血球抗原（ＣＤ４５；抗体Ｍ１／９．３ＨＬ、ベーリンガー・マンハイム）に対する、およびマクロファージＭａｃ−１抗原（ＣＤ１１ｂ；抗体Ｍ１／７０ＨＬ、ベーリンガー・マンハイム）に対するモノクローナル抗体を用いて、心臓内移植体拒絶を監視した。Ｍａｃ−１抗体はリンパ球と７５−９０％の交差反応性を有する。一次抗体で処理したのち、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ共役−ウサギ抗−ラット抗血清（ベーリンガー・マンハイム）と共にインキュベートし、ニッケル増強を伴うジアミノベンジジン反応により視覚化した。［3Ｈ］−
チミジン取り込みのために、マウスに同位体（２８Ｃｉ／ｍＭにおいて４００μＣｉ、アメルシャム、イリノイ州アーリントン・ハイツ）を１回ボーラス注射し、１８時間後に頸部脱臼により屠殺した。心臓を摘出し、３０％スクロース中で凍結保護し、包埋し、クリオマイクロトームで切断した。切片をメタノール：アセトン（１：１）中で後固定し、ＨおよびＥで染色し、蒸留水で１：１に希釈した写真乳剤（イルフォード（Ｉｌｆｏｒｄ）Ｌ．４、ポリサイエンシズ、ペンシルベニア州ウォーリントン）の薄層を付与した。切片を４℃で５−７日間露光し、コダックＤ−１９中で２０℃において４分間現像し、蒸留水で１分間洗浄し、３０％チオ硫酸ナトリウム中で１０分間固定し、蒸留水中で洗浄した。
【００２３】
電子顕微鏡検査（ＥＭ）  組織塊を０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２％グルタルアルデヒド中において固定し、２％五酸化オスミウム（スティーブンス・メタルルジカル・コーポレーション、ニューヨーク州ニューヨーク）中で後固定した。他のＥＭ化学薬品はすべてラッド・リサーチ・インダストリーズ・インコーポレーテッド（バーモント州バーリントン）から入手された。組織を塊のままｐＨ５．２マレイン酸緩衝液（０．０５Ｍ）中の２％酢酸ウラニルで染色し、脱水し、ラッドＬＸ−１１２に包埋した。トルイジンブルーで染色した１μｍの切片を用いて移植体の位置を調べた。トリミング後にブロックを薄く切断し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。検体をフィリップス４００透過型電子顕微鏡により検査した。
【００２４】
心電図（ＥＣＧ）分析  表面ＥＣＧ記録のために、マウスを麻酔し（２．５％アベルチン、０．０１５ｍｌ／体重ｇ、腹腔内、フルカ・ケミカルズ、ニューヨーク州レーク・ロンコムコマ）、標準第Ｉ導出位置に表面電極を配置し、Ａ／Ｄ変換器（クールボーン・インスツルメンツ、ペンシルベニア州リーハイ・バレー）に連結したナルコ・バイオシステ
ムズ（テキサス州ヒューストン）高利得増幅器によりＥＣＧを記録した。
【００２５】
血漿酵素アッセイ（ＰＥＡ）  乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）イソ型アッセイのために、麻酔（２．５％アベルチン、０．０１５ｍｌ／体重ｇ、腹腔内）下での眼窩後洞採血により血漿を分離した。血漿を１％アガロースゲル上で分画し（ＣＫイソ酵素電気泳動システム、チバ−コーニング・ダイアグノスティックス、ニューヨーク州コーニング）、ＬＤＨイソ型をＴＮＢＴ−ホルマザン組織化学的アッセイ（ＬＤＨアッセイキット、シグマ・ダイアグノスティックス、ミズーリ州セントルイス）により視覚化した。
【００２６】
Ｂ．結果
これらの研究においては、ＡＴ−１心筋細胞（心臓内でＴ−Ａｇ癌蛋白質を発現するトランスジェニック動物に由来する）を同系マウスの心筋に直接に注射し、移植した材料の生存度を評価した。予備実験における注射部位の位置決定を容易にするために、ＡＴ−１心筋細胞を移植前に短期間、ＢＯＤＩＰＹと共にインキュベートした。ＢＯＤＩＰＹは生細胞の蛍光追跡を可能にする無毒性グルタチオン反応性染料である。移植部位はＦＩＴＣキューブ（ｃｕｂｅ）を用いる蛍光顕微鏡検査によって容易に視覚化された。以後の実験にはＢＯＤＩＰＹを用いなかった。
【００２７】
ＡＴ−１心筋細胞注射を受けた動物の５０％（１４／２８）が心臓内移植体を発達させた。大部分の場合、移植体は被包されておらず、また瘢痕を形成した心筋で囲まれてもいなかった。光学顕微鏡のレベルで、移植ＡＴ−１心筋細胞が宿主心筋細胞と直接に近接しているのが観察された。抗−Ｔ−Ａｇ一次抗体（１６２−Ｔ）を用い、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合した二次抗体を用いる免疫−ペルオキシダーゼアッセイにより、ＡＴ−１心筋細胞の同一性が確認された。抗−Ｔ−Ａｇ抗体の特異性は先に確立されている（１０，１１）。黒色沈着物が移植体の心筋細胞核上に見られたが、宿主心筋には見られず、移植体がＡＴ−１心筋細胞からなることが確認された。同様な結果が他の抗−Ｔ−Ａｇ抗体を用いて得られ、一次抗体の不在下ではシグナルが見られなかった。
【００２８】
生存ＡＴ−１心筋細胞が移植後少なくとも４カ月間は観察された。この期間中、ある程度の移植体増殖が起こった；3［Ｈ］−チミジン取り込み分析により移植細胞におけるＤ
ＮＡ合成が検出された。核への同位体取り込みにより証明されるように、１０％のＡＴ−１心筋細胞核がＤＮＡを合成していた。しかしその率は培養ＡＴ−１心筋細胞につき観察されたものよりかなり低く、この場合は同様な3［Ｈ］−チミジンパルス後に５０％の細
胞がＤＮＡを合成した。数例において、移植ＡＴ−１心筋細胞が心膜下腔内に位置していた。
【００２９】
心臓内移植体が慢性拒絶を受けるか否かを判定するために、免疫組織学的実験を採用した。１カ月より古い移植体はマウス白血球に特異的な抗体と反応しなかった；同一切片上に位置する血管において観察されたシグナルはその実験に対する陽性対照を与えた。同様にマウスのマクロファージおよびリンパ球を検知する抗体は心臓内移植体と反応しなかった；この場合も同一切片上に位置する血管において陽性シグナルが観察された。総括すると、これらの結果は同系宿主による慢性移植体拒絶がないことを示す。この結果は、サイクロスポリン処置（５０ｍｇ／体重ｋｇ、毎日腹腔内投与）が心臓内移植の成立頻度に有意に影響しなかったという所見により支持される（５０％の成功率、ｎ＝６）。宿主動物の性別も移植体形成率に有意に影響しないと思われた（雄においては４６％の成功率、ｎ＝１３；雌においては５３％の成功率、ｎ＝１５）。移植の成立頻度は初期の時点で検査した動物の場合（移植の１−４０日後、４７％、ｎ＝１５）は、より後の時点で検査した場合（移植の４０−１２０日後、５４％、ｎ＝１３）と比較して類似していた。最後に、細胞を左心室の遊離壁（ｆｒｅｅ  ｗａｌｌ）または心尖のいずれに運搬した場合でも、同様な成立頻度の心臓内移植が観察された。
【００３０】
ＡＴ−１心筋細胞移植体の電子顕微鏡分析により、被包のないことが確認された。高解像力の画像は、移植体内の隣接細胞間に結合複合体が良好に発達していることを明示した。移植心筋細胞は、インビボにおけるＡＴ−１腫瘍に典型的な多数のポリリボソームおよび脱分化した筋原繊維性の超微細構造（６）を含んでいた。心房由来の筋細胞に予想されるように、ＡＴ−１心筋細胞移植体内に高電子密度の分泌性顆粒も見られた。移植体周縁の宿主心筋細胞は、良好に形成されたサルコメアを伴う正常な超微細構造を示した。薄い基底膜のみがＡＴ−１心筋細胞と宿主心筋細胞を分離していたが、これら２細胞タイプ間には結合連結部は見られなかった。
【００３１】
ＡＴ−１心筋細胞移植体の存在が自己調律（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｈｙｔｈｍ）に影響を及ぼすか否かを判定するために、表面心電図測定を行った。虚偽動物からの記録と移植体を含む動物からのものとの間に認めうるほどの相異は見られなかった。それぞれの場合、被験動物は正常な洞調律を示し、麻酔心拍数は約４００回／分であった。正常なＰ−ＱＲＳ連結が維持され、これは移植ＡＴ−１心筋細胞が異所性ペースメーカーとして作用しなかったことを示す。この後者の結果は、ＡＴ−１心筋細胞がインビボ（１２）および培養（３）の双方において自発性電気的活性を示すという所見からみて重要である。明白な不整脈がないことも、移植体誘発性の心筋リモデリングに伴って有意の輪回リズムが発生しなかったことを示す。
【００３２】
表面ＥＣＧのほかに、ＡＴ−１心筋細胞移植体を保有するマウスにおいて血漿ＬＤＨ水準を評価した。循環中に心臓ＬＤＨイソ型が存在することは、十分に成立した心筋梗塞の特徴である。移植前にはマウス血漿中に心臓ＬＤＨ（イソ型−１）は見られなかった。ＡＴ−１心筋細胞の導入後に血漿中に心臓イソ型の一過性出現が生じたが、これは宿主心筋に対する損傷および損傷を受けたＡＴ−１心筋細胞を反映している可能性が最も高い。移植のための外科処置後に血漿骨格ＬＤＨイソ型の一過性増加も見られたが、これは恐らく経胸腔切開により生じた損傷を反映していると思われる。血漿ＬＤＨプロフィルは移植の７日後までには正常に戻った。その後は血漿ＬＤＨプロフィルは移植体の存在にもかかわらず正常に維持された。
【００３３】
実施例２  安定なＣ２Ｃ１２筋芽細胞移植体の形成
Ａ．方法
Ｃ２Ｃ１２細胞培養および心筋移植プロトコル  Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞はＡＴＣＣから得た。２０％ウシ胎児血清、１％ニワトリ胚エキス、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した高グルコースのダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で低密度において培養することにより、細胞を未分化状態に維持した。ある研究のために、２％ウマ血清および抗生物質を補充したＤＭＥＭ中で培養することにより、筋発生性の分化を誘発した。注射の直前に筋芽細胞をトリプシンで採取し、無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、開胸手術した同系Ｃ３Ｈｅｂ／ＦｅＪマウス成体（ジャクソン・ラボラトリーズ）の心室心筋内に直接に注射した：（７）の記載に従う。細胞（４−１０×１０4）は２−３μｌの容量で３０ゲージの注射針を備えたプラスック注射器により
注射された。
【００３４】
組織学的分析  実施例１の場合と同様に心臓を摘出し、凍結保護し、包埋し、切断した。ＨおよびＥ染色、ならびに［3Ｈ］−チミジン取り込みアッセイも実施例１の場合と同
様に実施した。免疫組織学的分析のために、メタノール固定した（−２０℃、１０分）切片をモノクローナル抗−骨格ミオシンＨ鎖抗体（ＭＹ−３２、シグマ・ケミカル・コーポレーション）と反応させ、次いでローダミン共役−ヒツジ抗−マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ'
）2フラグメント（ベーリンガー・マンハイム）と反応させ、エピフルオレッセンスによ
り視覚化した。
【００３５】
電子顕微鏡検査  ＥＭを実施例１の場合と同様に実施した。
心電図分析  ＥＣＧを実施例１の場合と同様に実施した。
血漿酵素アッセイ  ＰＥＡを実施例１の場合と同様に実施した。
【００３６】
Ｂ．結果
Ｃ２Ｃ１２に例示されるように、培養において分化して筋管となる能力をもつ数種類の筋芽細胞が知られている（１３）。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、Ｃ３Ｈマウスの損傷した大腿筋の体外培養物に由来する。富血清培地に維持した場合、筋芽細胞は急速に増殖し、未分化表現型を保持する。しかし貧血清培地で培養した場合、筋発生性分化が誘発される。Ｃ２Ｃ１２細胞は細胞周期から離れて融合し、これにより多核筋管を形成する。多数の筋特異性遺伝子産物の出現により証明されるように、筋発生性分化も誘発される。このようにこのモデルにおいては増殖と筋発生性分化は互いに排他的である（１４）。インビトロでの筋芽細胞の分化はインビボでの衛星細胞仲介による神経繊維再生に類似すると考えられる。
【００３７】
筋芽細胞を同系Ｃ３Ｈｅｂ／ＦｅＪマウスの心筋に直接に注射し、この移植材料の生存度を評価した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の心臓内移植を受けたマウスの１００％（１３／１３）が心臓内で移植体を発達させた。生存移植体が移植後６カ月間観察された（これがアッセイした最終時点であった）。すべての例において、移植された材料は被包されなかった。分化した状態の移植Ｃ２Ｃ１２細胞を、抗−ミオシンＨ鎖抗体（ＭＹ−３２）を用いる免疫組織学的アッセイにより測定した。この抗体は筋芽細胞とも心筋ミオシンＨ鎖とも反応しない。分化したＣ２Ｃ１２細胞は筋芽細胞注射を受けたすべての心臓において観察されたが、個々の細胞の移植効率は測定されなかった。追加の対照として、ＡＴ−１心臓内移植体を保有する心臓（実施例１参照）をＭＹ−３２抗体で検査した。染色が見られず、これによりＣ２Ｃ１２移植体において見られたシグナルは宿主心筋細胞における骨格ミオシンＨ鎖誘導によるものであるという可能性は除かれる。
【００３８】
前記の実施例１はＡＴ−１心筋細胞が同系心筋において安定な移植体を形成することを証明する。しかしこれらの細胞がインビボで増殖する能力を保持したという所見は、心臓内移植の成功には持続的な細胞分裂が必要であるかも知れないという可能性をもたらす。従ってＣ２Ｃ１２移植体の増殖状態を検査した。ＤＮＡ合成は実質的に観察されず（トリチウム化チミジンの取り込みにより評価）、これは移植したＣ２Ｃ１２細胞の大部分が実際に細胞周期からはずれたことを示す。連続切片の検査により、ＤＮＡ合成を行っているのは移植体内またはその付近の細胞の０．１％未満であることが示される。この結果はリモデリング過程での繊維芽細胞の増殖を反映している可能性が最も高い。ＡＴ−１移植体の場合と同様に、移植後２カ月の時点でＣ２Ｃ１２移植体の免疫組織学的分析によりマクロファージ、炎症性白血球またはリンパ球浸潤を検出することができず、これは同系宿主による慢性移植拒絶がないことを示す。
【００３９】
光学顕微鏡の水準でＣ２Ｃ１２心臓内移植体はＨおよびＥならびにＭＹ−３２免疫蛍光染色の双方により細胞不均一性を示した。Ｃ２Ｃ１２移植体の細胞構成をさらに解明するために、電子顕微鏡分析を採用した。トルイジン染色した１μｍの切片を１００μｍ間隔で探査して、ＥＭ分析用の移植体部位の位置を調べた。位置が確認されると、そのブロックから薄い切片を調製した。骨格筋細胞に典型的な形態をもつ細胞が移植体全体に観察された。良好に発達したサルコメア間に位置する豊富なミトコンドリアが容易に検出された。顕著なＺ膜ならびに太いフィラメントおよび細いフィラメントが観察された。場合により、伸長したｔ−管および波打った細胞膜が移植筋細胞中に観察された。良好に発達した筋細胞のほかに、より分化の低い第２の細胞タイプがＣ２Ｃ１２移植体中に観察された。最も注目すべきことは、これらの細胞は大きな核：細胞質比を示し、核周辺に顕著なヘテ
ロクロマチンの帯を伴うことであった。中心部に位置する中程度の量のヘテロクロマチンも検出された。これらの細胞には、限られた粗面小胞体およびわずかなミトコンドリアしか観察されなかった。類似の超微細構造特性がインビボおよび培養における衛星細胞の属性であると考えられている（１５，１６）。
【００４０】
宿主の心臓機能に対するＣ２Ｃ１２心臓内移植体の有害な作用を評価するために、２つの研究を開始した。第１の研究において、表面心電図分析は対照マウスと被験マウスから得た記録間に認めうるほどの相異を検出し得なかった。すべての被験動物が正常なＰ−ＱＲＳ連結を有し、麻酔心拍数約４００回／分を伴う正常な洞調律を示した。これらのデータは、心臓内筋芽細胞移植体が明白な不整脈を誘発しなかったことを示す。第２の研究においては、移植体を保有する動物において血漿ＬＤＨ水準を監視した。循環中に心臓ＬＤＨイソ型が存在することは、十分に成立した心筋梗塞の特徴である。移植前の血漿中には心臓特異性ＬＤＨイソ型（イソ型１，２および３）は観察されなかった。移植直後に血漿中に心臓イソ型の増加が観察されたが、これは宿主心筋に対する損傷を反映している可能性が最も高い。血漿骨格ＬＤＨイソ型（イソ型５）の一過性増加も見られたが、これは恐らく経胸腔切開により生じた損傷を反映していると思われる。血漿ＬＤＨプロフィルは移植の７日後までには正常に戻った。
【００４１】
実施例３  安定な胎児心筋移植体の形成
Ａ．方法
心筋細胞培養および心筋移植プロトコル  α−心臓ミオシンＨ鎖（ＭＨＣ）プロモーターおよび修飾したβガラクトシダーゼ（ｎＬＡＣ）リポーターを含む融合遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを形成した。ＭＨＣ−ｎＬＡＣトランスジェニックマウスを形成するために、ＭＨＣ−ｎＬＡＣ挿入ＤＮＡ（図１）をガラスビーズへの吸着により精製し、５μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、近交系Ｃ３Ｈ３Ｂ／ＦｅＪの胚の１細胞の核にマイクロインジェクションした：確立したプロトコルに従う（１７）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を用いて創始動物を同定し、トランスジーンの分離を監視した。センス鎖プライマー５’−ＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＣ−３’をＭＨＣプロモーターに配置し、アンチセンス鎖プライマー５’−ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ−３’をｎＬＡＣリポーターに配置した。ＰＣＲ分析は（１８）の記載に従った。ＭＨＣプロモーターは４．５ｋｂの５’側フランキング配列、およびエキソン１−３を包含する１ｋｂの遺伝子を含むが、開始コドンは含まなかった。ｎＬＡＣリポーターは真核細胞翻訳開始部位およびＳＶ４０核局在化シグナルの両方を保有するように修飾された（１９）。ｍＰ１配列はマウスプロタミン１遺伝子由来のイントロン、ならびに転写終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを保有していた。
【００４２】
βガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）活性およびＤＡＰＩエピフルオレッセンスの検査に用いる調製物を得るために、トランスジェニック動物をヘパリン処理（１０，０００Ｕ／ｋｇ、腹腔内）したのち頸部脱臼により屠殺した。通気した（９５％Ｏ2，５％ＣＯ2）ＫＨＢ緩衝液（１０５ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，３．８ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍ
Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4，０．０１ｍＭ  ＣａＣｌ2，１ｍＭマンニトール，１０ｍＭタウリン，１０ｍＭデキストロース，５ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ）のビーカーに心臓を入れた。次いで心臓を大動脈により懸垂し、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡを含有する通気したＫＨＢ（３７℃で０．５ｍｌ／分）で灌流したのち、ＫＨＢ中の０．１７％コラゲナーゼ（タイプＩ、ワースィントン・バイオケミカル、ニュージャージー州フリーホールド）で灌流した。心臓を弛緩するまで灌流し、心室をカミソリで刻み、パスツールピペットで摩砕処理することにより、分離した細胞を得た。少なくとも１時間のホルマリン固定後に懸濁液を濾過し、正に帯電したスライド（スーパーフロスト・プラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ）、フィッシャー、ペンシルベニア州ピッツバーグ）上に塗抹し、乾
燥させた。
【００４３】
注射用の単一細胞を分離するために、１５日目の胚（膣栓により妊娠の開始を判定）を有する雌を頸部脱臼により屠殺した。胚を摘出し、断頭し、心臓をＰＢＳ下に採取し、心室と心房を分離した。トランスジェニック心房（心臓βＧＡＬ活性により確認）をＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、シグマ）中の０．１％コラゲナーゼ（ワースィントン）中で４５分間消化し、１０％ＦＢＳを含むＰＣ−１培地（ベントレックス、ミネソタ州クーンズ・ラピッヅ）中においてパスツールピペットで摩砕処理して、単一細胞懸濁液を得た。
【００４４】
分離直後に胚性心筋細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、実施例１に従って開胸処置した同系マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ）の心室心筋内に直接に注射した。１−１０×１０4細胞を２−３μｌの容量で、３０ゲージの注射針を備えたプラスック注射器により注射
した。
【００４５】
組織学的分析  ＨおよびＥ、Ｘ−ＧＡＬ、免疫組織学的分析およびチミジン分析のために、実施例１の場合と同様に頸部脱臼後に心臓を摘出し、３０％スクロース中で凍結保護し、包埋し、クリオミクロトームにより１０μｍに切断した。ＨおよびＥ染色、心臓内移植体拒絶に関する監視、ならびに［3Ｈ］−チミジン取り込みアッセイも実施例１の場合
と同様に実施した。βＧＡＬ活性をアッセイするために、切片をＰＢＳ中で水和し、アセトン：メタノール（１：１）中で後固定し、次いで１ｍｇ／ｍｌのＸ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウムおよび２ｍＭ塩化マグネシウムをＰＢＳ中に含有する混合物を積層した。青色発色団の出現により陽性染色が指示される。一次抗体で処理したのち、アビジン−ビオチン（ＡＢＣ）キット（ベクター・ラボズ、カリフォルニア州バーリンゲーム）によりシグナルを視覚化した。心臓を前記により処理し、切片をメタノール：アセトン（１：１）中で後固定し、ＨおよびＥで染色し、蒸留水で１：１に希釈した写真乳剤（イルフォードＬ．４、ポリサイエンシズ）の薄い層で被覆した。実施例１の場合と同様に切片を露光、現像、洗浄、固定および洗浄した。単一細胞調製物のＸ−ＧＡＬ染色を実施例１の場合と同様に実施した。単一細胞調製物中の核の視覚化のために、スライドをＰＢＳ中のＤＡＰＩで染色し（０．２８μＭ、室温で３分、ベーリンガー・マンハイム）、ＰＢＳ中で３回洗浄し、グリセリンに溶解した２％没食子酸プロピル中で湿式マウントした。冠心臓切片を得るために、マウスを頸部脱臼により屠殺し、心臓を採取し、ランゲンドルフ装置により０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２％グルタルアルデヒドで灌流した。同緩衝液中で一夜浸漬固定したのち、ビブラトーム（カムデン、英国ロンドン）で２００μｍの冠心臓切片を作成した。移植体の位置を調べるために、切片をプールし、前記に従ってＸ−ＧＡＬによりβＧＡＬ活性用として染色した。
【００４６】
電子顕微鏡検査  ＭＨＣ−ｎＬＡＣ胚移植体の位置を前記に従って冠心臓切片中において調べた。トリミング後に組織を２％五酸化オスミウム（スティーブンス・メタルルジカル・コーポレーション、ニューヨーク州ニューヨーク）中で後固定した。次いで組織を脱水し、ラッドＬＸ−１１２（ラッド・リサーチ・インダストリーズ）に包埋した。移植領域をさらにトリミングし、薄く切断し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。検体を実施例１の場合と同様にフィリップス４００透過型電子顕微鏡により検査した。
【００４７】
心電図分析  ＥＣＧ分析を実施例１の場合と同様に実施した。
Ｂ．結果
前記に従って形成したトランスジェニックマウスは、ＭＨＣプロモーターおよびｎＬＡＣリポーターを含む融合遺伝子を保有していた。ｎＬＡＣはＳＶ４０核輸送シグナルを保有し、その結果βガラクトシダーゼ活性が標的細胞の核内に蓄積する。４つのトランスジ
ェニック系列が形成され、２つ（ＭＨＣ−ｎＬＡＣ−２およびＭＨＣ−ｎＬＡＣ−４）を以後の分析用として選択した。ＭＨＣ−ｎＬＡＣトランスジーンが適切な細胞系列マーカーを提供することを確認するために、トランスジェニック心筋細胞においてβガラクトシダーゼ活性（βＧＡＬ）を評価した。逆行（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ）コラゲナーゼ灌流により調製された単一細胞調製物をβＧＡＬ活性およびＤＡＰＩエピフルオレッセンスにつき同時に検査したところ、９９．０±０．４５％（ｎ＝４００）のトランスジェニック心筋細胞核がβＧＡＬを発現し、これに対し非心筋細胞中にはβＧＡＬ活性は検出されなかった。さらに非トランスジェニック対照心筋細胞中に核βＧＡＬ活性は検出されなかった。
【００４８】
胚１５日目のトランスジェニックマウスから心臓のコラゲナーゼ消化により単一細胞懸濁液を調製した。染料排除アッセイにより証明されるように、この方法で単離された心筋細胞の９５％以上が生存性であった。心筋細胞は同系非トランスジェニック動物の左心室自由壁へ運搬された。移植心筋細胞はＭＨＣ−ｎＬＡＣトランスジーンによりコードされる核βＧＡＬ活性によって容易に、かつ確実に同定された。移植心筋細胞は運搬地点から遠位にしばしば観察された；移植細胞のこの分散が心筋細胞の移動を反映するのか、または注射過程で切断平面に沿って生じる受動的拡散を反映するのかは、現在のところ明らかでない。胚心筋細胞の心臓内注射を受けた動物の約５０％（７／１３）が移植体を発達させた。この移植体形成の成功頻度は、細胞の調製および移植のプロトコルが最適化されるのに伴って高まると思われる。
【００４９】
βＧＡＬ活性用に処理されたＨおよびＥ染色切片の光学顕微鏡分析は、移植心筋細胞（青色の核）が宿主心筋細胞（紫色の核）と直接に近接していることを示した。他のＨおよびＥ分析によって有意の移植体被包を検出することはできなかった。この観察された移植心筋細胞と宿主心筋細胞の近接、および被包がないことは、２細胞タイプ間の連結が成功するための前提条件である。
【００５０】
１９日令の心臓内移植体の連続切片をＨおよびＥ、βＧＡＬ活性、ならびにマクロファージおよび白血球免疫反応性に関して処理した。動物は免疫抑制されていないという事実にもかかわらず、移植体拒絶の徴候は見られなかった。免疫組織学的分析のための陽性対照として、不適合ＭＨＣハプロタイプの移植体を形成した；これらの心臓においては移植体拒絶が明瞭であった。トリチウム化チミジン取り込み分析により、非心筋細胞のＤＮＡ合成は明らかであるが、０．６％（ｎ＝１５６）のβＧＡＬ陽性核がＤＮＡを合成しているにすぎないことが示された。胚１５日目の供与体細胞は移植した時点ではなお有糸分裂活性を備えていた（標識指数約２９％）ので、移植後１９日目のβＧＡＬ陽性細胞において観察されたＤＮＡ合成水準が著しく低いことは、ＭＨＣ−ｎＬＡＣ胚心筋細胞が最終分化を行ったことを示唆する。
【００５１】
光学顕微鏡分析により観察された移植心筋細胞と宿主心筋細胞の近接は、これら２細胞タイプ間に細胞間直接連結を検出しうるか否かの判定を容易にした。Ｘ−ＧＡＬ反応生成物は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、１９参照）により検出しうる高電子密度沈殿である。グルタルアルデヒド灌流−固定心臓からのビブラトーム切片をβＧＡＬ活性用に染色し、こうして確認された移植領域をトリミングし、ＴＥＭ用に包埋した。βＧＡＬ陽性核は１μｍ切片の光学顕微鏡分析によって容易に観察された。Ｘ−ＧＡＬ反応生成物は、包埋過程でわずかな程度の核浸出が起こったため核周辺外観を示した。同群の心筋細胞を連続した薄い切片のＴＥＭ分析により同定した。核周辺βＧＡＬ活性が存在しないため光学顕微鏡においては容易に同定されなかった宿主心筋細胞が、電子顕微鏡により移植細胞と近接しているのが観察された。多数の結合複合体が宿主心筋細胞と移植心筋細胞の間に存在し、これは高度の細胞間連結を示している。宿主心筋細胞と移植体心筋細胞の間の細胞間連結の多数の例が、移植領域全体に観察された。重要なことは、細胞間連結は多数の宿主細
胞にわたるβＧＡＬ陽性心筋細胞から追跡することができ、従って移植心筋細胞が機能性融合細胞に関与している可能性が立証されることである。
【００５２】
ＴＥＭ分析は豊富な細胞間連結が移植心筋細胞と宿主心筋細胞の間に存在することを証明するほか、移植心筋細胞が高度に分化していることを解明した。完全なサルコメアを形成する筋原繊維、細胞間の多数の結合複合体、および豊富なネトコンドリアを含めて、成体心筋細胞の正常な特徴が観察された。事実、Ｘ−ＧＡＬ反応生成物の存在を別として、移植心筋細胞は宿主細胞と区別できなかった。さらに二核βＧＡＬ陽性細胞を心臓内移植体中に検出することができた。二核形成は成体げっ歯類の心筋細胞の特徴であるから、この所見は移植心筋細胞が最終分化を行ったことをさらに支持する。
【００５３】
結合した胚心筋細胞移植体の存在が宿主心臓の自動性に負の作用を及ぼすか否かを判定するために、表面ＥＣＧ記録を採用した。移植体保有動物から得たＥＣＧトレースは虚偽手術した対照と区別することができず、マウスに特徴的なＰおよびＱＲＳコンプレックスを示した。高度の細胞間連結が移植心筋細胞と宿主心筋細胞の間に存在するにもかかわらず、移植体保有動物に不整脈の徴候はなかった。
【００５４】
実施例４  実質的に純粋な心筋細胞培養物の調製
胚幹細胞を、不死化していない心筋細胞の実質的に均一な集団を生成しうるように遺伝的に修飾した。母体ＥＳ細胞系（Ｄ３）をｐＧＫ−ＨＹＧ（ハイグロマイシン）プラスミドおよびＭＨＣ−ｎｅｏr遺伝子を含むプラスミドで同時トランスフェクションした。ｐ
ＧＫ−ＨＹＧプラスミドはトランスフェクションしたＥＳ細胞に対する選択を与え、一方ｍＭＨＣ−ｎｅｏr遺伝子は分化した細胞に対する第２ラウンドの選択を容易にする：Ｇ
４１８の存在下でのインキュベーションにより非心筋細胞（すなわちＭＨＣプロモーターが活性でない細胞）が排除される。
【００５５】
ハイグロマイシンの存在下での培養によって、安定にトランスフェクションしたＥＳ細胞が選択された。プラスミドを線状にし、１１８０μＦ、２２０Ｖにおけるエレクトロポレーションにより幹細胞に導入した。トランスフェクションした細胞を、１０％の予備選択されたＦＢＳ、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ＰｅｎＳｔｒｅｐおよびＬＩＦを補充したＤＭＥＭ中において維持し、培地にハイグロマイシンを添加することにより形質転換体を選択した。次いで同時トランスフェクション体を両方のトランスジーンに特異的なＰＣＲ分析により同定した。このトランスフェクションにより両方のトランスジーンを保有する９Ａと表示される細胞系が形成された。
【００５６】
９Ａ  ＥＳ細胞において、２×１０6個の細胞をコーティングされていない１００ｍｍ
の細菌用ペトリ皿にＬＩＦの不在下で接種することにより、心臓発生を誘発した。培養の８日後に自発収縮活性を示す細胞（すなわち心筋細胞）のパッチが多数観察された。この時点で培地にＧ４１８を添加し、細胞をさらに９日間インキュベートした。この処理に際して、多数の非心筋細胞がＧ４１８により死滅するのが認められた。重要なことは、Ｇ４１８が心筋細胞には認めうるほどの影響を与えず、心筋細胞は実験期間中それらの自発拍動活性を維持したことである。
【００５７】
合計９日間のＧ４１８選択後に、生存細胞をコラゲナーゼおよびトリプシンで解離し、次いでフィブロネクチンコーティングした顕微鏡スライドガラスに再び接種した。細胞をさらに２４時間培養して、それらを継代培養から回復させ、次いで免疫細胞学的分析のために固定した。細胞をＭＦ２０、すなわちサルコメア性ミオシンを認識するモノクローナル抗体と反応させた。次いで細胞を個々に、心筋細胞に対するマーカーであるサルコメア性ミオシンの存否につき計数した。結果は以下のとおりであった：
計数した全細胞数：            ７９４
ＭＦ２０＋の細胞数：          ７９１
ＭＦ２０−の細胞数：              ３*
心筋細胞の割合：                ９９．６％
*  ＭＦ２０で染色されなかったこれら３細胞もやはり心筋細胞であった可能      
性はある。この抗体は単体ミオシンとは反応しないからである。
【００５８】
従って心臓特異性プロモーター下での薬物（ネオマイシン）耐性の発現により培養におけるＥＳ由来の心筋細胞の実質的に純粋な集団を選択しうることが証明された。このような集団を用いて、前記の各実施例において述べた方法で心筋移植体を形成することができる。
【００５９】
実施例５  移植体による蛋白質の運搬
Ａ．方法
Ｃ２Ｃ１２細胞培養およびトランスフェクション  Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ）を、２０％ウシ胎児血清、１％ニワトリ胚エキス、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した高グルコースのダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）1中で低密度において培養することにより、未分化状態に維持した。ある
研究のために、２％ウマ血清および抗生物質を補充したＤＭＥＭ中で培養することにより、筋発生性の分化を誘発した。
【００６０】
修飾したトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１）ｃＤＮＡを駆動するメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターを含む融合遺伝子をサミュエルら（２０）から得た。メタロチオネインプロモーターの転写活性は、細胞培養培地の重金属含量を調整することにより調節しうる。ＴＧＦ−β１  ｃＤＮＡは部位特異的突然変異を保有し、その結果Ｃｙｓ223およびＣｙｓ225がセリンに変換された。この修飾（（２１）に詳述される）の結果、二量体を形成し得ず、結果的に正常な転写後調節を受けないＴＧＦ−β１分子が作り出される。この修飾されたｃＤＮＡを発現する細胞は、プロセシングされた活性ＴＧＦ−β１を構成的に分泌する（２０）。ＭＴ−ＴＧＦ融合遺伝子をリン酸カルシウムトランスフェクションによりＣ２Ｃ１２筋芽細胞に導入し；安定なトランスフェクション体をＳＶ４０−ｎｅｏrトランスジーンとの同時トランスフェクションにより選択した。４
種類の独立したクローンを単離し、サザーンブロット分析によりトランスジーンの存在を確認した。まず種々のクローンの細胞系におけるＴＧＦ−β１発現の相対水準をノーザンブロット分析により評価し、Ｃ２（２８０）と表示される１つの系を以後の実験に用いた。
【００６１】
心筋移植プロトコル  移植プロトコルは実施例１に記載したものと同様である。手術の１４日後に、移植体を保有する動物に重金属を投与した（飲料水中に２５ｍＭのＺｎＳＯ4）。亜鉛処理を実験が終了するまで継続した（１−４週間）。
【００６２】
組織学的分析  パラフィン切片を得るために、１０％中性緩衝ホルマリン中で心臓を固定し、濃度勾配（ｇｒａｄｅｄ）アルコール類により脱水し、パラフィンで浸潤した。次いで組織塊を６μｍに切断した。切断直後に製造業者の説明書（シグマ・ダイアグノスティックス）に従ってＨおよびＥ染色を直接に実施した。
【００６３】
［3Ｈ］−チミジン取り込みのために、実施例１の場合と同様にマウスにボーラス投与
し、屠殺した。前記に従って心臓を摘出し、パラフィン包埋のために処理した。実施例１の場合と同様にオートラジオグラフィーを実施した。
【００６４】
Ｂ．結果
重金属誘導に応答した組換えＴＧＦ−β１の発現を、Ｃ２（２８０）筋芽細胞および筋
管において検査した。トランスジーン転写体（１．８ｋｂ）は、ノーザンブロット分析により内在性ＴＧＦ−β１遺伝子（２．５ｋｂ）と容易に区別された。培地に重金属を添加すると、Ｃ２（２８０）筋芽細胞および筋管において組換えＴＧＦ−β１転写体が顕著に増加した。前記に示したように、Ｃ２（２８０）細胞により発現する修飾ＴＧＦ−β１は構成性の生物学的活性をもつはずである。これを直接に試験するために、Ｃ２（２８０）筋芽細胞および筋管から得たならし培地を増殖阻害アッセイ法により検査した。
【００６５】
Ｃ２（２８０）筋芽細胞を用いて同系Ｃ３Ｈｅｂ／ＦｅＪマウスにおいて心臓内移植体を形成した。移植体の存在はＨおよびＥ染色切片において容易に検出された。Ｃ２（２８０）細胞の心臓内注射を受けた動物の１００％（ｎ＞５０）が移植体を発達させ続けた。興味深いことに、ＨおよびＥ分析はＣ２（２８０）移植体が非修飾Ｃ２Ｃ１２細胞により形成されたものと比較して分化が若干低いことを示した。この結果は、骨格ミオシンＨ鎖を認識するモノクローナル抗体を用いた免疫組織学的分析によって確認された。
【００６６】
Ｃ２（２８０）移植体トランスジーン発現を、抗−ＴＧＦ−β１抗体を用いた免疫組織学的分析によって評価した；ＴＧＦ−β１発現はＣ２（２８０）移植体において容易に検出された。陰性対照として、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞により形成される移植体においてＴＧＦ−β１発現を評価した。予想どおりＴＧＦ−β１発現の相対水準はＣ２（２８０）移植体と比較して著しく低かった。
【００６７】
ＴＧＦ−β１は周知の血管形成因子である。従って、ＭＴ−ＴＧＦトランスジーンを発現する移植体において血管形成応答の増大が起こるか否かを判定するために、血管内皮細胞において3Ｈ−チミジン取り込み分析を評価した。血管内皮細胞におけるＤＮＡ合成は
、3Ｈ−チミジン（Ｈ−ＴＨＹ）の一回ボーラス注射投与下のＣ２（２８０）移植体にお
いて直ちに認められた。これに対し非トランスフェクションＣ２Ｃ１２移植体においては血管内皮細胞のＤＮＡ合成は著しく低かった（表１）。血管形成応答が移植体材料のみによるものであるという可能性を除くために、同様な大きさおよび日令のＣ２Ｃ１２移植体とＣ２（２８０）移植体間で3Ｈ−チミジン取り込みを比較した（表１）。すべての分析
において、ＤＮＡを合成している血管内皮細胞の数が著しく増加した。最後に、チミジン取り込みにより、ある割合の移植筋芽細胞が増殖し続けていることも明らかになった。この所見はＴＧＦ−β１が筋分化に及ぼす既知の阻害作用と一致し、Ｃ２（２８０）移植体が分化していない外観をもつことに関与している可能性が極めて高い。
【００６８】
【表１】
2006180879.tif 000002
【００６９】
以上の記載において本発明を詳細に説明および記述したが、これらは説明のためのものであって限定的性質のものではないとみなすべきであり、好ましい態様を記載したにすぎず、本発明の精神に包含されるすべての変更が保護されるべきであると解される。
【００７０】
参考文献
以下の参考文献は、それらが方法の例示または本明細書に提示されるものを補足する他の詳細事項を提供する範囲で本明細書に参考として包含されるものとする。
【００７１】
１．  Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．  胎児移植体は将来性を示す．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：８６８−８７０，１９９２．
２．  Ｇｕｓｓｏｎｉ，Ｅ．，  Ｐａｖｌａｔｈ，Ｇ．Ｋ．，  Ｌａｎｃｔｏｔ，Ａ．Ｍ．，  Ｓｈａｒｍａ，Ｋ．Ｒ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｇ．，  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．  デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において筋芽細胞移植後に検出された正常なジストロフィン転写体．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４３５−４３８，１９９２．
３．  Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．，  Ｌａｎｓｏｎ，Ｎ．，  Ｄｒｅｓｄｎｅｒ，Ｋ．，  Ｄｅｌｃａｒｐｉｏ，Ｊ．Ｂ．，  Ｗｉｔ，Ａ．，  Ｃｌａｙｃｏｍｂ，Ｗ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．  トランスジェニックマウス由来の分化した成体
心房心筋細胞のインビボおよび培養における増殖．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２５９  （Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８）：Ｈ１８２６−Ｈ１８３４，１９９０．
４．  Ｊａｎｓｅ，Ｍ．Ｊ．，  Ｃｉｎｃａ，Ｊ．，  Ｍｏｒｅｎａ，Ｈ．，  Ｆｉｏｌｅｔ，Ｊ．Ｗ．，  Ｋｌｅｂｅｒ，Ａ．Ｇ．，  ｄｅＶｒｉｅｓ，Ｇ．Ｐ．，  Ｂｅｃｋｅｒ，Ａ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｄｕｒｒｅｒ，Ｄ．  心筋虚血における境界帯域．  ブタ心臓における電気物理学的、代謝的および組織化学的関係．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：５７６−５８８，１９７９．
５．  Ｓｐｅａｒ，Ｊ．Ｆ．，  Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｅ，Ｅ．Ｎ．  持続性心室頻拍性不整脈を生じやすいイヌにおける慢性梗塞性心筋の細胞の電気物理学的特性．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ４：１０９９−１１１０，１９８３．
６．  Ｄｅｌｃａｒｐｉｏ，Ｊ．Ｂ．，  Ｌａｎｓｏｎ，Ｎ．Ａ．Ｊｒ．，  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃｌａｙｃｏｍｂ，Ｗ．Ｃ．  トランスジェニックマウスの心房由来の移植可能な心臓腫瘍から単離された心筋細胞  （ＡＴ−１細胞）の形態学的特性解明．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９：１５９１−１６００，１９９１．
７．  Ｒｏｃｋｍａｎ，Ｈ．Ａ．，  Ｒｏｓｓ，Ｒ．Ａ．，  Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｎ．，  Ｋｎｏｗｌｔｏｎ，Ｋ．Ｕ．，  Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．，  Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉｅｎ，Ｋ．Ｒ．  心臓肥大のインビボネズミモデルにおけるＡＮＦトランスジーンの心房特異性および誘導性発現の分離．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２７７−８２８１，１９９１．
８．  Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｕｓｚ，Ｐ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．ＩＩ中，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，１９８３．
９．  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．  心房ナトリウム排泄増加因子−ＳＶ４０  Ｔ抗原トランスジーンがマウスにおいて腫瘍および不整脈を生じる．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１０２９−１０３３，１９８８．
１０．  Ｋａｔｚ，Ｅ．，  Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．，  Ｄａｕｄ，Ａ．，
Ｄｅｌｃａｒｐｉｏ，Ｊ．Ｂ．，  Ｃｌａｙｃｏｍｂ，Ｗ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．  α−心臓ミオシンＨ鎖−ＳＶ４０  Ｔ抗原融合遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおける心室心筋細胞増殖．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６２  （Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３１）：Ｈ１８６７−Ｈ１８７６，１９９２．
１１．  Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．  “ＳＶ４０  ラージＴ抗原がトランスジェニックマウスにおける心筋細胞増殖を誘導する”
，  Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ中，  Ｊｏｈｎ  Ｏｂｅｒｐｒｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅａｎ  Ｏｂｅｒｐｒｉｌｌｅｒ編，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０．
１２．  Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．  トランスジェニックマウスにおける心臓腫瘍および律動異常．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １８：４６４−４６９，１９９０．
１３．  Ｙａｆｆｅ，Ｄ．  ａｎｄ  Ｏ．Ｓａｘｅｌ．  ジストロフィーマウスの筋肉から単離した筋原細胞の連続継代培養および分化．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７０：７２５−７２７，１９７７．
１４．  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ．Ｂ．  ＤＮＡ合成の不在下における筋原細胞系の寄託、融合および生化学的分化．  Ｃｅｌｌ  １５：８８５−８６４，１９７８．
１５．  Ｂｕｒｎｉ，Ｃ．  ニッケルサブスルフィドによるラブドミオサルコーマ誘導
の初期段階での筋肉衛星細胞の有糸分裂活性．  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ中，  Ａ．Ｍａｕｒｏ  編，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク，１９７９．
１６．  Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．，  Ｃ．Ｅ．Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｓｃｈｕｅｔｚｅ．  組織培養において単離された成体筋肉繊維の衛星細胞．  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ中，  Ａ．Ｍａｕｒｏ  編，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク，１９７９．
１７．  Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｌａｃｙ，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ中，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，１９８６．
１８．  Ｍ．Ｅ．Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ，  Ｋ．Ｌ．Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ｊ．Ｆｉｅｌｄ．  心房ナトリウム排泄増加因子融合遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおける高血圧．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ  １６：３０１−３０７，１９９０．
１９．  Ａ．Ｄ．Ｌｏｅｗｙ，  Ｐ．Ｃ．Ｂｒｉｄｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃ．Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５５：３４６，１９９１．
２０．  Ｓ．Ｋ．Ｓａｍｕｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  メタロチオネイン調節されたＴＧＦ−β１（Ｓｅｒ２２３，２２５）による腫瘍プロテアーゼ産生および侵襲の自己分泌誘導．  Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ［ＪＣ：ｅｍｂ］  １１（４）：１５９９−１６０５，１９９２．
２１．  Ａ．Ｍ．Ｂｒｕｎｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  トランスフォーミング増殖因子β１前駆物質のｐｒｏ領域におけるシステイン残基の部位特異性突然変異形成．  突然変異蛋白質の発現および特性解明．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４（２３）：１３６６０−１３６６４，１９８９．
２２．  Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ．  胚由来の幹細胞系．  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ中，  Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  編，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ワシントン  ＤＣ，１９８７．
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は後記の実施例３においてＭＨＣ−ｎＬＡＣトランスジェニックマウスを形成するために使用したＤＮＡを示す模式図である。
【図１】
2006180879.tif 000003
【配列表】
2006180879000001.app