(57)【要約】【課題】            ＲＴＸ（Repeats in the Structural Toxin）毒素の精製方法において、高い活性を保持しつつ高純度かつ高収量で精製する方法を提供する。【解決手段】        ＲＴＸ毒素ファミリーのうちActinobacillus pleuropneumoniaeの産生する毒素（以下、Apxと略）を、ホウ酸緩衝液存在下において、陽イオン交換クロマトグラフィー、またはシクロデキストリン結合アフィニティークロマトグラフィーにより精製することを特徴とするApxの精製方法。本精製方法により得られるApxを抗原として用いるワクチン。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウ酸緩衝液存在下で実施することを特徴とするＲＴＸ毒素の精製方法。
【請求項２】
クロマトグラフィー法による精製を行うことを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
ＲＴＸ毒素培養上清を、ホウ酸緩衝液で平衡化されたクロマトグラフィー用カラムにかけて、ＲＴＸ毒素を当該カラムに吸着させた後、吸着されたＲＴＸ毒素を溶出、回収することを特徴とする請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
当該ホウ酸緩衝液がpH５以上に調整されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
当該クロマトグラフィー法が陽イオン交換クロマトグラフィーである請求項１から４のいずれかに記載の精製方法。
【請求項６】
当該陽イオン交換クロマトグラフィーが、スルホプロピル（ＳＰ）基タイプのカラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーである請求項１から５のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
当該クロマトグラフィー法がアフィニティークロマトグラフィーである請求項１から４のいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
当該アフィニティークロマトグラフィーが、シクロデキストリン結合カラムを用いることを特徴とする請求項１から４または７のいずれかに記載の精製方法。
【請求項９】
当該シクロデキストリンが、α-シクロデキストリンである請求項１から４、７または８のいずれかに記載の精製方法。
【請求項１０】
当該ＲＴＸ毒素がActinobacillus pleuropneumoniaeの産生する毒素（以下、Apxと称する）である請求項１から９のいずれかに記載の精製方法。
【請求項１１】
当該ApxがApxのＩ型毒素（以下、ApxＩと称する）である請求項１から１０のいずれかに記載の精製方法。
【請求項１２】
請求項１から１１に記載の精製方法により得られるApx毒素を抗原として用いる豚胸膜肺炎ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＲＴＸ（Repeats in the Structural Toxin）毒素の精製方法において、高い活性を保持しつつ高純度かつ高収量で精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜に小孔を形成することにより細胞に障害を与える毒素を産生する種々のグラム陰性病原性細菌が知られている。このような孔形成毒素は、そのＣ末端部分にグリシンが多く含まれるカルシウムイオン結合性のモチーフが１０〜４０個も繰り返し並んでいる特徴的な構造（グリシンリッチな繰り返し領域）を有していることからＲＴＸ毒素と呼ばれるファミリーを形成している。
【０００３】
ＲＴＸ毒素ファミリーには、特異性は低いが種々の細胞に対して溶解活性を示す毒素（溶血素）と、特定の細胞に対して特異的に高い細胞毒性を示す毒素が含まれる。一つの毒素で溶血活性と細胞毒性の両方を示すものもある。
【０００４】
ＲＴＸ毒素ファミリーとしては、Escherichia coliのα-hemolysin (HlyA)、Bordetella pertussisのadenylate cyclase (CyaA)、Actinobacillus pleuropneumoniae（以下Aplと略）のApxI, ApxII、ApxIII、ApxIV、A. actinomycetemcomitansおよびMannheimia（Pasteurella）haemolyticaのleukotoxin lktA (lktA)などがある。
【０００５】
ＲＴＸ毒素は、グリシンリッチ領域以外にも疎水性領域、アシル化領域やＣ末端部分に局在している分泌シグナルなどの共通のドメイン構造を保持している（図１）。そのため菌種の異なるＲＴＸ毒素間においても、塩基配列及びアミノ酸配列でのホモロジーが比較的高い（非特許文献１）。
【０００６】
Aplは豚胸膜性肺炎の原因菌で、初発農場で致死率が高く、慢性化した農場では発育の遅延や飼料要求率が上昇するなど、経営上の被害が極めて大きい疾病である。
【０００７】
Aplはこれまでに１５種類の血清型が見つかっており、それぞれの血清型菌はＩ型〜IV型の４種類の毒素（以下、ApxＩ〜ApxIV）を単独あるいは複数産生する。このうち、ApxIVは全血清型により産生されるが、in vitroでは産生されず病原性因子としての役割などの詳細は不明である。各血清型菌は表１の通りApxIVを含めて２種ないし３種のＲＴＸ毒素を産生する。
【０００８】
【表１】
2006315998.tif 000002
【０００９】
Aplワクチンとしては従来から死菌ワクチンが使われてきたが、有効性の面で満足できるものではなかった。しかしながら、1990年前後にAplがＲＴＸ毒素に属する毒素を産生することが見出されて以来、本毒素のワクチン化研究が精力的に推進され、近年いくつかの製品が実用化されている。
【００１０】
しかし、ＲＴＸ毒素は極めて不安定で容易に失活し、また菌体成分や培地成分などと相互作用することから精製が極めて困難であった。そのため、不純物を多く含んだままの未精製のApx粗毒素がワクチンとして用いられてきたため、発熱、震顫や注射局所へのワクチンの残留など重篤な副作用が課題となっている。
【００１１】
これまで百日咳毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素および壊死毒など人体用・動物用を含めて種々のトキソイド化ワクチンが実用化されているが、高品質のワクチンを得るためには、高度に精製した活性のある毒素が好ましい。そのため、ワクチン抗原として注目されているＲＴＸ毒素ファミリーにおいても、幾つかの研究グループによって精製方法が検討されてきたが、毒素が極めて不安定で失活しやすく、また菌体由来物質や培地成分と親和性を示すため、通常のゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーによる精製が極めて困難であった。
【００１２】
そのためApxの精製に関する報告は少なく、特に活性を保持した状態での毒素の精製法はFrey and Nicolet（非特許文献２）およびMa and Inzana（非特許文献３)の報告のみであった。
【００１３】
Apl血清型１型菌を用いたFrey and Nicolet（非特許文献２）の方法は、培養上清→硫酸アンモニウム沈殿→Sephacryl S200→透析膜を用いた濃縮で、培養上清500mLから回収率が８％、精製度5.5倍で80μg（培養上清１Ｌに換算すると、0.16mg）のApx毒素タンパクを得ている。本法は調製工程が少ないにもかかわらず再現性に乏しく、また収量が少ないなど、必ずしも満足できるものではない。
【００１４】
一方、Ma and Inzana（非特許文献３）は、ApxIを認識するモノクローナル抗体を作製し、これを結合させた免疫アフィニティーでApxを調製する方法を報告した。Apl血清型１型菌および５型菌を用いた彼らの方法は、培養上清→限外ろ過濃縮→免疫アフィニティーカラムで、１型菌および５型菌の培養上清各35mLからそれぞれ回収率1.7％および46％でApx毒素タンパク37μgおよび48μg（培養上清１Ｌに換算すると、それぞれ1.1および1.4mg）を得ているが、精製の程度については触れられていない。
【００１５】
その他、毒素活性が消失してしまうが高純度標品を得る次のような方法がある。Ma and Inzana（非特許文献４）は、Apl血清型１〜７型菌を用いて培養上清→限外ろ過濃縮→調製用SDS-PAGE→凍結乾燥によってApxIを調製している。しかし、SDS-PAGEゲルから抽出することによる活性及び毒素タンパクの回収率などに難点があり、高純度ではあるが収量を考慮しない極めて微量の毒素の精製を目的とする方法である。
【００１６】
【非特許文献１】Frey et al., Infect. Immun., 59:3026-3032, 1991
【非特許文献２】Frey and Nicolet, FEMS Microbiol., Lett. 55:41-45, 1988
【非特許文献３】Ma and Inzana, Am. J. Vet. Res., 53: 59-62, 1992
【非特許文献４】Ma and Inzana, J. Clin. Microbiol., 28: 1356-1361, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ＲＴＸ毒素の高い活性を保持しつつ高純度かつ高収量でＲＴＸ毒素を精製する方法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
これまで述べてきたような状況に鑑み鋭意検討の結果、本発明者らは、高い活性を保持したＲＴＸ毒素の精製方法を完成するに至った。すなわち、ＲＴＸ毒素のクロマトグラフィーによる精製をホウ酸緩衝液存在下で実施することより、高い活性を保持しつつ高純度かつ高収量でＲＴＸ毒素を精製することが可能であることを見出した。本発明における精製方法の特徴として、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはシクロデキストリン結合カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより効果的な毒素の精製が可能となったことである。
【００１９】
すなわち、本発明は、高い活性を保持したＲＴＸ毒素の精製方法として、下記１）〜１２）の発明を含むものである。
【００２０】
１）ホウ酸緩衝液存在下で実施することを特徴とするＲＴＸ毒素の精製方法。
【００２１】
２）クロマトグラフィー法による精製を行うことを特徴とする上記１）に記載の精製方法。
【００２２】
３）ＲＴＸ毒素培養上清を、ホウ酸緩衝液で平衡化されたクロマトグラフィー用カラムにかけて、ＲＴＸ毒素を当該カラムに吸着させた後、吸着されたＲＴＸ毒素を溶出、回収することを特徴とする上記１）または２）に記載の精製方法。
【００２３】
４）当該ホウ酸緩衝液がpH５以上に調整されていることを特徴とする上記１）から３）のいずれかに記載の精製方法。
【００２４】
５）当該クロマトグラフィー法が陽イオン交換クロマトグラフィーである上記１）から４）のいずれかに記載の精製方法。
【００２５】
６）当該陽イオン交換クロマトグラフィーが、スルホプロピル（ＳＰ）基タイプのカラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーである上記１）から５）のいずれかに記載の精製方法。
【００２６】
７）当該クロマトグラフィー法がアフィニティークロマトグラフィーである上記１）から４）のいずれかに記載の精製方法。
【００２７】
８）当該アフィニティークロマトグラフィーが、シクロデキストリン結合カラムを用いることを特徴とする上記１）から４）または７）のいずれかに記載の精製方法。
【００２８】
９）当該シクロデキストリンが、α-シクロデキストリンである上記１）から４）、７）または８）のいずれかに記載の精製方法。
【００２９】
１０）当該ＲＴＸ毒素がApxである上記１）から９）のいずれかに記載の精製方法。
【００３０】
１１）当該ApxがApxＩである上記１）から１０）のいずれかに記載の精製方法。
【００３１】
１２）上記１）から１１）に記載の精製方法により得られるApx毒素を抗原として用いる豚胸膜性肺炎ワクチン。
【発明の効果】
【００３２】
Apl培養上清から、ホウ酸緩衝液存在下、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはシクロデキストリン結合カラムクロマトグラフィーによって、高い活性を保持した状態のＲＴＸ毒素、特に、Aplの産生する毒素を簡便に精製する方法を開発した。本発明の精製方法は、Apx毒素のみならず、Apx毒素とドメイン構造が類似している他のＲＴＸ毒素ファミリーの精製にも応用可能と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明において使用されるホウ酸緩衝液は、酢酸等を添加し、pHを適宜調製して使用される。ただし、pH５以下では溶血活性が急速に失活するため、pH５以上に調整する。
【００３４】
本発明において使用される陽イオン交換クロマトグラフィー用カラムとしては、ＳＰ基タイプの陽イオン交換体カラムが好ましい。
【００３５】
本発明において使用されるアフィニティークロマトグラフィー用カラムとしては、リガンドとして、シクロデキストリンが結合されたカラムが好ましい。さらに、シクロデキストリンとしては、α-シクロデキストリンが好ましい。
【００３６】
シクロデキストリン固定化カラムは、エポキシ活性化カラム担体にシクロデキストリンの水酸基を介して結合させることにより作製することが可能である。
【００３７】
本発明の精製方法により得られる精製ＲＴＸ毒素を抗原として用いることにより安全性及び有効性の高いワクチンの製造が可能となる。
【００３８】
例えば、精製Apx毒素をApxＩ単独もしくは他の毒素型であるApxII〜IVと適宜混合することにより、豚胸膜性肺炎に対する優れたワクチンの製造が可能となる。
【００３９】
以下に、実施例を示し、更に詳しく本発明について説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【実施例１】
【００４０】
《実施例１：Apx溶血素の調製およびその活性測定》
（１）使用菌株およびApx毒素の調製
菌株はApl血清型10型菌D-13039株（独立行政法人 農業・生物系特定産業技術研究機構 動物衛生研究所より分与を受けた）を使用した。これは10型菌が他の血清型とは異なり、ApxＩ毒素（強い溶血活性を持つ）を単独で産生するためである（ApxIVはin vitroでは産生されない）。
クロマトグラフィーには、ヘペス緩衝液化ブレインハートインフュージョン培地（表２）で培養した10型菌培養上清液を供試し溶血素ApxIの精製を行った。溶血活性の糖類による阻害反応には、10型菌培養上清の硫安濃縮液を使用した。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
（２）溶血活性の測定
溶血活性は、10mM ヘペス緩衝液-150mM 塩化ナトリウム-１mM 塩化カルシウム,pH7.5で洗浄した羊赤血球（１％v/v）150μLと培養菌液遠心上清の硫安濃縮液またはクロマトグラフィーの溶出液100μLとを混合し、37℃で１時間静置反応後、反応液遠心上清の吸光度を540 nmで測定し、小数点を除くため1,000倍した値を溶血活性とした。相対的な値として比較するために、溶血活性は測定した吸光度値から液体培地のみの対照値を差引いた値で表した。
【００４３】
《実施例２：ＳＰセファローズを用いたイオン交換クロマトグラフィーによるApxＩの精製方法》
溶血素ApxIの精製条件を検討するために、イオン交換体あるいはゲルろ過クロマトグラフィーの各種担体を検討したが、多くの場合溶血素のカラムからの回収率が著しく低かった。そこで、緩衝液の種類、pH、イオン強度、溶出の条件などについて種々検討したところ、クロマトグラフィー用緩衝液にホウ酸イオンを添加することにより、回収率の増加がみられた。
【００４４】
10mM ホウ酸ナトリウム-酢酸-2.5mM 塩化カルシウム, pH6.0緩衝液で平衡化したＳＰセファローズカラム（Amersham Biosciense Corp.）でクロマトグラフィーを行った。吸着したタンパクは、同緩衝液中で0.4M 塩化ナトリウムにより溶出した。
【００４５】
図２に、SPセファローズによる溶血素のクロマトグラフィーパターンを示した。また、表３に精製のまとめを、図３に得られた溶血素のSDS-PAGEを示した。電気泳動のパターンから、ＳＰセファローズを使用した精製方法によって得られた溶血素タンパクは、90％以上の純度を示した。イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の精製は、担体が既に市販されているためスケールアップも容易であることから、ワクチン調製のための溶血素の大量精製に適している。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
《実施例３：各種シクロデキストリン誘導体による溶血活性の阻害》
環状グルコース誘導体であるシクロデキストリンについて溶血素ApxＩの活性阻害を検討した。
【００４８】
10mM ヘペス緩衝液-150mM 塩化ナトリウム-2.5 mM塩化カルシウム, pH7.5に溶解した各種糖溶液の２段階希釈液50μLと同緩衝液に、血清型10型菌培養液を硫安塩析濃縮後、透析した菌溶血素50μLとを混合し、さらに150μLの羊赤血球浮遊液を加えて37℃で60分間反応後、遠心上清の吸光度を測定し、溶血素のみの反応液の溶血活性に対する％から阻害活性を算出した。
【００４９】
図４に６種類のシクロデキストリン誘導体による溶血活性の阻害効果を示した。いずれの誘導体も著しく高い阻害活性を示した。最も高い阻害活性を示したのは、モノメチル-β-シクロデキストリンで50％阻害活性濃度（50％ＨＤ）は10.5μMであった。
【００５０】
シクロデキストリン誘導体による阻害活性の強さの順序は、モノメチル-β-シクロデキストリン＝ジメチル-β-シクロデキストリン＞β-シクロデキストリン＞α-シクロデキストリン＞トリメチル-β-シクロデキストリン＞γ-シクロデキストリンの順であった。
【００５１】
これらの結果より、溶血活性阻害能の高いこれらのシクロデキストリン誘導体をリガンドとすれば、ＲＴＸ毒素のアフィニティー精製用カラムの開発も可能になると思われた。
【００５２】
《実施例４：RTX毒素精製用アフィニティーカラムの作製》
実施例３で述べたようにApl産生溶血素ApxＩの活性は、グルコースの環状構造誘導体であるシクロデキストリンによって高い阻害活性が見られた。このことはApxＩと環状構造のシクロデキストリン誘導体との間に高い結合親和性があることを示している。そこで、溶血素の持つこの性質を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによる溶血素の精製を試みるため、シクロデキストリン結合カラムを調製した。
【００５３】
糖をクロマトグラフィー担体に結合させる方法はいくつか報告されているが、種々検討した結果、Epoxy-activated Sepharose 6B（Amersham Biosciense Corp., Piscataway, NJ USA）に糖の水酸基を介して結合する方法が効率的であることが分かり、シクロデキストリンを結合させたSepharose（製品名）を調製し、アフィニティークロマトグラフィーを試行した。シクロデキストリンとの結合方法は製品の説明書に従った。
【００５４】
《実施例５：シクロデキストリン結合カラムによるApxI溶血素のアフィニティークロマトグラフィー精製》
実施例４で作製されたシクロデキストリン結合カラムによる溶血素の精製試料として、実施例１のApl血清型10型菌培養上清を使用した。
【００５５】
10型菌を表２に示した液体培地中で一晩培養し、その２mLを20mLの同培地に継代し３時間振盪培養（100rpm）した。さらにその20mLを250mLの同培地に再度継代し、３時間振盪培養（100rpm）した上清120mLを、15mM 塩化ナトリウム-10mM ホウ酸ナトリウム-酢酸-2.5mM 塩化カルシウム, pH7.5で平衡化したα-シクロデキストリン-Sepharoseによりクロマトグラフィーを行った。吸着したタンパクは0.5mM α-シクロデキストリンで溶出した。その結果を図５に示した。溶血素のほとんどがカラムに結合し、溶出された溶血活性のピーク付近の分画のタンパク濃度は検出限界以下であった。この方法によれば、クロマトグラフィーの一段階工程だけで溶血毒ApxIの精製が可能であることを示している。
【００５６】
次いで、検討したApxIの溶血活性阻害能についてシクロデキストリン誘導体のうちα-シクロデキストリンより高い阻害活性を示したモノメチル-β-シクロデキストリンを結合させたカラムによるクロマトグラフィーを試みたが、大部分の溶血素は結合せず、未吸着分画に溶出され、溶血素の精製には不適であることが示された。これは、溶液中で阻害活性が高いモノメチル-β-シクロデキストリンが、Sepharoseに結合することによって立体構造の制限を受け、活性阻害能（溶血素との親和性）を失ったことによるものと思われる。
【００５７】
表４にα-シクロデキストリン結合カラムによる精製のまとめを示した。タンパクおよび溶血活性の回収率はそれぞれ6.6％および9.0％で、120mLの培養上清から約12μgの精製溶血素が得られた。図６には、精製した溶血素のSDS-PAGEの結果を示した。
【００５８】
【表４】
2006315998.tif 000005
【００５９】
以上の結果は、はじめに目的としたAplの産生する溶血素を効率的に、簡便かつ大量に精製する方法が、α-シクロデキストリン結合カラムによるアフィニティークロマトグラフィーによって可能であることを示している。表５に従来法との比較をまとめたが、α-シクロデキストリン結合カラム法によれば、先述したFrey and Nicolet（非特許文献２）の方法に較べて精製度が約40倍高い毒素を、わずか一段階工程で得ることができる。
【００６０】
【表５】
2006315998.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＲＴＸ毒素に共通のドメイン構造を示す図。
【図２】ＳＰセファローズを用いたイオン交換クロマトグラフィーによるApxＩのクロマトグラフィーパターンを示す図。
【図３】ＳＰセファローズカラムクロマトグラフィーにより精製したApxＩのSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図４】６種類のシクロデキストリン誘導体による溶血活性の阻害効果を示す図。
【図５】Apl産生溶血素のα-シクロデキストリン結合カラムによる分画。
【図６】α-シクロデキストリン結合カラムにより精製した溶血素のSDS-PAGEの結果を示す写真。１．活性化分画の濃縮液。２．溶出分画の活性のピーク。３．溶出された活性部分を集めた分画（濃縮前）。４．培養上清液。定法に従い、SDS-PAGEを行い、銀染色によりタンパクを検出した。
【図１】
2006315998.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006315998.tif 000011
【図６】
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