(57)【要約】      （修正有）【課題】移植の時点で、特異的細胞系列経路に分化するために試験管内で培養される間葉幹細胞を指導する組成物および方法の提供。特に、自己由来培養拡張骨髄誘導間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は、臨床的に著しい骨欠損を再生する。【解決手段】骨形成を増強する一つの組成物であって、分離間葉幹細胞と組み合わされた多孔セラミックを含み、多孔セラミックが、微粒子形態、構造的に安定した三次元移植片である組成物。また、骨形成を増強する１つの組成物であって、分離間葉幹細胞と組み合わされたゼラチン、セルロースおよびコラーゲンよりなるグループから選択される再吸収性バイオポリマーを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成を増強する一つの組成物であって、分離間葉幹細胞と組み合わされた多孔セラミックを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
多孔セラミックが、微粒子形態にあることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
多孔セラミックが、構造的に安定した三次元移植片であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
骨形成を増強する一つの組成物であって、分離間葉幹細胞と組み合わされたゼラチン、セルロースおよびコラーゲンよりなるグループから選択される再吸収性バイオポリマーを含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
再吸収性バイオポリマーが、微粒子形態であることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
再吸収性バイオポリマーが、スポンジ、条片、フィルム、ゲルあるいはウェブもしくは構造的に安定した三次元移植片であることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項７】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量で投与されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量で投与されることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項９】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量で投与されることを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項１０】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量投で与されることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項１１】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量で投与されることを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項１２】
骨形成増強を必要とする個体における骨形成を増強するために、前記個体に骨形成増強量投で与されることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この発明は１９９６年４月１９日受理されたアメリカ合衆国仮出願番号６０／０１６，２４５号および１９９６年１０月２８日受理されたアメリカ合衆国仮出願番号６０／０２９，８３８号の一部継続出願である。
【０００２】
自己由来培養拡張骨髄誘導間葉幹細胞（ＭＳＣＳ ）は今や臨床的に著しい骨欠損を再生することが示されてきている。ヒト間葉幹細胞を分離培養するための技術を使用して、単純な腸骨稜吸引により採取された患者自身の細胞の投与に基づく治療戦略を実行することが可能となるに違いない。この方法は自原性骨移植に対する選択肢を提供し、また内因性間葉幹細胞の数およびもしくは機能が減退する老化および骨粗鬆症などのような臨床環境では特に有用となるであろう。
【０００３】
骨幹骨における大きな分節欠損の修復は整形外科医が直面する重要な問題である。このような骨欠損は急性傷害の結果として発生することが多いが、これらの甚だしい欠損は先天性奇形、良性および悪性腫瘍、骨性感染、および骨折偽関節に続発して一般に存在する。新鮮な自己由来骨移植材料の使用が治療の歴史的標準として考察されてきたが、これは感染、奇形、疼痛、および機能損失を含む現実の罹患率と関連する（２７、１４９）。移植片採取から生じる合併症はその供給が制限されていることと重なり臨床的に重大な骨欠損修復のための代替的戦略の開発を活気づけた。この問題に対する主要なアプローチは有効な骨移植片材料の開発に焦点が合わせられた。
【０００４】
これらの調査努力から三つの骨移植片の一般的なクラスが出現し、これらのクラスは骨伝導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）あるいは直接骨形成として類別される。同種異系移植骨は多分もっともよく知られた型の骨伝導移植片である。長年にわたって広く使用されてはきたが、疾病伝達のリスク、宿主の拒絶反応、および骨誘導性の欠除はその望ましさを弱める（７６）。合成骨伝導性移植片は繊維金属チタン、およびヒドロキシアパタイトおよびもしくはリン酸トリカルシウム（脱フツリン鉱石）よりなるセラミックを含む。望ましい有孔性を持つこれらの移植片は骨内殖を促進するが、それらに骨誘導性能が欠除しているためにその有用性を限定する。各種の骨誘導性化合物も同じく、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むものとして知られる鉱物質除去骨基質（３４、４５）を含めて研究された。ユーリストのＢＭＰの最初の発見（１３８）以来、他の人達が大きな骨欠損の修復のために正常位部位で精製あるいは組換えＢＭＰを特徴付け、クローン化し、発現し、また移植を行った（４４、１２６、１４６、１４７）。このアプローチの成功はＢＭＰで提供される誘導シグナルに反応することのできる間葉細胞の存在にかかっていた（７４、１２９）。骨形成分化を受け手術部位で新しい骨を合成することに最終的に反応するものはこれらの間葉始原細胞である。
【０００５】
骨誘導アプローチに対する一つの選択肢は直接骨形成性である生体細胞の移植である。骨髄は骨形成能を所有する細胞の母集団を含むことを示してきたために、何人かの人は骨格修復の必要な部位に新鮮な自己由来あるいは同系骨髄の移植に基づいて実験的治療を考案した（２６、２７、４９、１０５、１１３、１４４、１４５）。原則的には堅実ではあったけれども、必要な数の骨始原細胞を持つ充分な骨髄を得る実用性は限定されている。
【０００６】
［発明の概要］
この発明はヒトおよび他の種において選択的手法あるいは病的条件の治療処置のための移植に先立ち、およびもしくは移植の時点で、特異的細胞系列経路に分化するために試験管内で培養される間葉幹細胞を指導する組成物および方法を提供する。自己由来および同種異系間葉幹細胞（ＭＳＣＳ ）がこの発明で考察される。
【０００７】
ここで報告される調査報告は、試験管内および生体内ＭＳＣＳ骨形成能を確証し、異所性皮下部位に移植された時にＭＳＣＳ の生体内骨形成能を論証し、また精製された培養拡張されたＭＳＣＳ がさもなければ臨床偽関節を生じるかもしれない分節骨欠損を再生できることを例証する。これらの実験は骨伝導、骨誘導あるいは他の適切な再吸収媒体に送達されたＭＳＣＳ の治癒性能を比較した。我々はまた望ましい融合、例えば脊椎固定あるいは関節固定の部位で骨の新規な形成を示す。
【０００８】
この発明は骨形成を創り出すのに十分な範囲で骨形成系列へのヒト間葉幹細胞の分化を支持する基質を持つ分離ヒト間葉幹細胞を投与することにより、それを必要とする個体において骨形成を増強する方法を提供する。基質は望ましくはセラミックおよび再吸収性バイオポリマーから選択される。セラミックは微粒子形態であることができ、あるいは構造的に安定な三次元移植片の形態であることもできる。構造的に安定な三次元移植片は立方体、円筒、ブロックあるいは適当な解剖学的形態であり得る。再吸収性バイオポリマーはゼラチン、コラーゲンあるいはセルロース基質であり、パウダーあるいはスポンジの形態でもあり得るし、また望ましくはウシ皮膚誘導ゼラチンである。
【０００９】
特にこの発明は、動物あるいはそれを必要とする個体に骨欠損の修復あるいは再生を実行するための方法を提供する。そのような欠損は、例えば分節骨欠損、偽関節、変形治癒あるいは癒合遅れ、嚢胞、腫瘍、壊死あるいは成長異常を含む。骨増強を必要とする他の条件、例えば関節再構築、美容術再構築あるいは脊椎固定もしくは関節固定などの骨融合は、例えば増強を必要とする骨の部位に新鮮健全骨髄およびもしくは分離ヒト間葉幹細胞もしくはその併用物をゼラチン、セルロースあるいはコラーゲンベース媒体内でそれから骨形成増強に十分な量を投与することにより個体で治療される。組成物は同じく新しい組織の形成に接近する速度で分離し、再吸収しあるいは改造する１個もしくはそれ以上の他の成分を含むことができる。
【００１０】
この発明は更に骨伝導あるいは骨誘導を達成できるように、細胞と共に他の細胞外基質成分の使用も考える。加えて前記生分解性基質での成分の比率を変えることにより、細胞バイオ基質移植材の手術用取扱い性質はスポンジあるいはフィルムなどの三次元安定基質からパウダーに到るまでの範囲で調節することができる。
【００１１】
前記の方法は更に間葉幹細胞の骨形成系列への分化を誘導しあるいは加速する少くとも１個の生物活性因子を個体に投与することを含む。ＭＳＣＳ は生体外で生物活性因子と接触され、望ましくはＭＳＣＳ が基質と接触している時に生物活性因子と接触され得る。例えば生物活性因子はデキサメタゾンなどの合成グルココルチコイドであり、あるいはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７などの骨形態形成タンパク質であり得る。骨形態形成タンパク質は筋肉内、静脈内、髄内あるいは関節内注射に適した液状あるいは半固体担体であり得る。
【００１２】
この発明は更に骨形成を増強する組成物を提供し、この組成物は少くとも１個の新鮮骨髄およびもしくは分離間葉幹細胞と併用される吸収性ゼラチン、セルロースおよびコラーゲンよりなるグループから選択される基質を含む。この組成物はスポンジ、条片、パウダー、ゲルあるいはウエブの形態で使用される。この発明はまたそれを必要とする個体に組成物の骨形成増強量を投与することにより個体で骨形成を増強する方法を提供する。
【００１３】
より詳細には、この発明はそれを必要とする個体の骨欠損部に多孔セラミック担体内で分離ヒト間葉幹細胞を投与し、それにより骨形成を生じるのに十分な量でそのような幹細胞の骨形成系列への分化を誘導することにより、それを必要とする個体にある分節骨欠損、偽関節、変形治癒、あるいは癒合遅れの修復に有効な方法を提供する。望ましくは、多孔セラミック担体はヒドロキシアパタイトを含み、またより望ましくは、多孔セラミック担体は更にリン酸βトリカルシウムを含む。多孔セラミック担体はまた新組織細胞外基質あるいは正常骨代謝回転に接近する速度で分解し、再吸収しあるいは改造する１個あるいはそれ以上の他の生分解担体成分を含むことができる。
【００１４】
この発明はまた正常な細胞外基質に類似した骨伝導あるいは骨誘導性を達成するために他の細胞外基質成分あるいは他の構成要素の使用を提供する。この組成物は骨髄およびもしくは分離間葉幹細胞と併用される吸収性ゼラチン、セルロースおよびもしくはコラーゲンベース基質である。組成物はスポンジ、条片、パウダー、ゲル、ウエブあるいは他の物理的形態で使用することができる。組成物は例えば欠損部に挿入され欠損の骨形成性治癒を生じる。
【００１５】
加えて、前記生分解性基質内での成分の比率を変更することにより、細胞−バイオ基質移植片の手術用操作性は多孔セラミックブロックあるいは成形能パテ状粘度のものから柔軟なゲルあるいはスラリまでの範囲に調節することができる。
【００１６】
より詳細には、この発明は大きな分節欠損、脊椎固定あるいは偽関節のための硬質細胞−基質移植片、ゲルあるいはスラリ細胞−基質移植片、もしくは安定した状態の骨折および他の分節骨欠損のための注入を含む。自己由来あるいは同種異系ＭＳＣＳ を含むオーダーメードの細胞−基質移植片は開放性あるいは関節鏡検査外科技術もしくは経皮挿入、例えば直接注射、カニューレ挿入あるいはカテーテル法を用いて投与することができる。
【００１７】
望ましい実施例において、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣＳ ）の組成物は健全な骨髄（あるいは出生前あるいは出生後の自己由来もしくは同種異系ｈＭＳＣＳ の他の源）から誘導される均質培養拡張調製物から、もしくはｈＭＳＣＳ の有効用量を含む富化あるいは異質性培養物から得られる。ＭＳＣ治療を用いる有効な臨床結果に対する手がかりは骨あるいは他の組織欠損を修復する多数の間葉幹細胞を患者に提供することである。これは「再生ＭＳＣ閾」すなわち組織欠損の直接修復を達成するために必要なＭＳＣＳ 濃度として引用される。再生ＭＳＣ閾は、１）組織の型（すなわち骨、軟骨、靭帯、腱、筋、骨髄間質、真皮および他の結合組織）、２）組織欠損のサイズあるいは範囲、３）薬剤担体での製剤形態、および４）患者の年齢により変化する。完全培地あるいは合成無血清培地において、分離培養拡張ｈＭＳＣＳ は骨形成を増強することが可能である。骨伝導性あるいは再吸収性バイオポリマーなど他の最適化培地において、骨髄のｍｌ当り約１０４  ＭＳＣＳ を含む新鮮な健全骨髄は同じく骨形成を増強することが可能である。これらの手法の組合せも検討される。
【００１８】
も一つの見地において、この発明は（ｉ）分離培養拡張ヒト間葉幹細胞、（ii）新鮮な吸引骨髄、あるいは（iii）それらと担体材料もしくは基質と組合せたものの送達を、基質のみと比較した時に改善された骨固定地域および融合塊を提供するために検討される。特に望ましいのは、改善された骨固定地域および融合塊を提供するために担体材料もしくは基質で送達される精製間葉幹細胞および新鮮な骨髄吸引液を含む組成物の送達である。
【００１９】
この発明の一つの組成物は骨修復、骨融合、あるいは骨の増強を実現するために移植された材料の組合せとして予見される。この移植材料の成分は、部分的には０．５mmから４mmの直径、望ましくは１．０から２．５mmの直径の大きさにわたる多孔粒状セラミックを含む。このセラミックの組成物はヒドロキシアパタイト１００％からリン酸トリカルシウム１００％にまでわたり、望ましい形態としてはヒドロキシアパタイトとリン酸トリカルシウムが０．６０／４０の混合物よりなる。セラミック材料は被覆されず、あるいは自己由来血清、精製フィブロネクチン、精製ラミニン、あるいは細胞粘着を支持する他の分子を含む各種材料で被覆される。粒状セラミック材料はセラミックcc当り１０，０００から３，０００万細胞、望ましくはcc当り３００万から１５００万細胞の間の濃度範囲にあるＭＳＣＳ と組合せることができる。細胞は生体外培養拡張なしで手術で得られた新鮮な骨髄の形態であることも予見される。
【００２０】
骨髄細胞は腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、助骨あるいは他の骨髄腔から得られる。ヒト間葉幹細胞の他の源は胚、卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年期の皮膚、ならびに血液を含む。細胞はセラミックと共に０乃至５時間、望ましくは３時間３７℃で保温される。移植の前に、細胞負荷粒子は日常的な吸引、もしくは他の生物学的補助剤により得られた新鮮末梢血、ヒトフィブリン、新鮮骨髄のいずれかと組合すことができる。これらの最終組合せは移植部位に材料をくっつけるのに役立つ柔らかな血液凝固を形成することを可能にする。移植あるいは送達方法は開放あるいは関節鏡手術および注入、例えば注射器あるいはカヌーレによる直接移植を含む。最後に、これらの移植片はそれ自身が内部あるいは外部に配置されかつ固定される固定装置の存在下もしくは不在下で使用することができる。
【００２１】
この組成物は更に骨誘導性因子などの追加の成分を含むことができる。このような骨誘導性因子は、例えばデキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、β−グリセロホスフェートおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰＳ ）などのＴＧＦ上科タンパク質を含む。組成物はまた抗生、抗真菌、抗炎症、免疫抑制および他の型の治療、保存ならびに賦形などの各薬剤を含むことができる。
【００２２】
｛図面の簡単な説明｝
図１Ａ―１Ｄ．  各成長段階でのラットＭＳＣ培養の位相差顕微鏡写真。
【００２３】
図１Ａ．  一次培養の７日でのＭＳＣコロニーは均一な紡錘形細胞で構成される。
【００２４】
図１Ｂ．  継代一匹のラットＭＳＣＳ が再平板培養４日後皿の表面に均一に分配される。
【００２５】
図１Ｃ．  ２８日間対照培地で成長したラットＭＳＣＳ が密集および多層となるが鉱化小節を形成しない。アルカリ性ホスファターゼ染色（ダークグレー）は正である細胞の分画を明らかにする。
【００２６】
図１Ｄ．  ２８日間骨形成補充材の存在下で成長したラットＭＳＣ培養物は鉱化小節を形成し、それはフォン・コッサ法で黒く染色される。細胞培養物は下記に記載の通りアルカリ性ホスファターゼおよびフォン・コッサ組織内検出法により染色された（非染色（ａ，ｂ）、アルカリ性ホスファターゼ組織化学およびフォン・コッサ法（ｃ，ｄ）、全部×４５）。
【００２７】
図２．  皮下組織に異所的に配置されたＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片からの代表的な組織部分の光学顕微鏡写真。ＭＳＣＳ は負荷され試料は以下に記述の通り移植され、８週に採取され、石灰を除去され、顕微鏡検査のためにパラフィン処理された。ＨＡ／ＴＣＰセラミック（ｃ）の残部のみが残り、一方移植片の孔は骨（ｂ）、血管（ｖ）、および脂肪細胞を含む造血要素で充填される（トルイジンブルー−Ｏ、×７０）。
【００２８】
図３Ａ−３Ｈ．  ４週および８週での各種移植片を用いた分節欠損部の治癒を示す高解像度放射線写真。放射線写真は犠牲直後のファクシトロン映像システムで得られた。ポリエチレン固定板は各放射線写真で骨のトップにある。各グループで４週放射線写真は左側に、８週放射線写真は右側にある。ＨＡ／ＴＣＰ材料の放射線密度は各移植片の多孔性および中央管を明らかにする。
【００２９】
図３Ａおよび３Ｂ．  空に残された欠損部。
【００３０】
図３Ｃおよび３Ｄ．ＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部。
【００３１】
図３Ｅおよび３Ｆ．ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ担体で充填された欠損部。
【００３２】
図３Ｇおよび３Ｈ．骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰ担体で充填された欠損部。分節裂孔切除に続く空のままの欠損部は骨の切断端部で反応性骨形成を受け、この十分に確立したモデルで古典的な偽関節に導かれる。４週後、ＭＳＣ負荷試料は移植材料の孔の充填を開始した。偽関節は４週でいずれの移植型でも明らかである。８週までに、宿主−移植片インターフェイスの適度の癒合が担体（ｄ）および担体プラス骨髄グループ（ｈ）に生じたが、完全な組込みおよび骨架橋は担体プラスＭＳＣグループ（ｆ）で明らかである。ＭＳＣ負荷試料での多孔への骨の完全充填もまたパネルＦで明らかである（×１．５）。
【００３３】
図４Ａ−４Ｆ．４週および８週で各種の移植片を用いる分節欠損の代表的治癒を示す光学顕微鏡写真。無傷肢が採取され、固定され、脱水され、清浄化され、ポリメチルメタクリレートに包埋され、切断され、また染色の前に１００ミクロン厚に粉砕された。ある動物は血管系を視覚化するために墨汁の注射を受けたが、ここで黒染色としてパネルＢ，Ｃ，ＤおよびＥを提示する。ＨＡ／ＴＣＰ材料は非脱石灰処理の結果としてこれら顕微鏡写真で人為的に黒色で現れる。宿主皮質の切断端部はａおよびｂで矢印で示され、また類似の切開部もすべての他のパネルで提示される。
【００３４】
図４Ａおよび４Ｂ．  それぞれ４週および８週でＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部。
【００３５】
図４Ｃおよび４Ｄ．  それぞれ４週および８週でＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。
【００３６】
図４Ｅおよび４Ｆ．  それぞれ４週および８週で骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。新しい骨が孔内で現れ、あるいは宿主−移植片インターフェイスでこれらの標本内でブルーあるいはバイオレットに見える。重要なことはＭＳＣ負荷移植片を含む試料のみが欠損部を有効に治癒し、これはかなりの量の骨が移植片内でおよびパネルｃおよびｄの宿主とインターフェイスで現れる。詳細については本文を参照されたい（トルイジンブルー−Ｏ、×８）。
【００３７】
図５Ａ−５Ｂ．  ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片で充填された分節裂孔に８週で骨の再生を示す強力光学顕微鏡写真。パネルａは直接の付着で新しい骨を持つ宿主皮質の切断端部（矢印）を示す。この宿主−移植片インターフェイスでの新しい骨はＨＡ／ＴＣＰ担体の孔に形成された骨に隣接している。パネルｂはＨＡ／ＴＣＰ担体の孔を充填する薄層および網状骨（ブルー）を示す。担体は非脱石灰標本調製の人為的結果としてこれらの映像内で黒で現れる。骨芽細胞の分泌活性を調整する血管（ｖ）は孔内で明らかである（トルイジンブルー−Ｏ、×７５）。
【００３８】
図６．  試験管内ヒトＭＳＣＳ の骨形成分化。成長および骨形成条件下でのヒトＭＳＣ培養の位相顕微鏡写真（ａ，ｂ）。
【００３９】
図６Ａ．  第一継代ＭＳＣＳ は独特の紡錘形の形態を示し、再平板培養後に皿の表面を全体にわたり均一に分配される。
【００４０】
図６Ｂ．  ＯＳの存在下で１６日間成長したＭＳＣ培養物は鉱化小節粒団を形成し、それはアルカリ性ホスファターゼをグレーにまた鉱化基質を黒に染色する（非染色（ａ）×１８、アルカリ性ホスファターゼおよびフォン・コッサ組織化学（ｂ）×４５）。
【００４１】
図６Ｃ．  対照あるいはＯＳ培地で４，８，１２および１６日に成長したＭＳＣ培養におけるアルカリ性ホスファターゼ活性およびカルシウム沈着。試料は指定日に採取され、またアルカリ性ホスファターゼ活性、細胞数、およびカルシウム沈着は材料および方法に記載された通りに測定された。その結果は第一継代細胞からの３組の培養の平均値±標準偏差を表す。
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（対照と比較）
【００４２】
図７．  無胸腺ラットの皮下組織に異所的に配置されたヒトＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片からの代表的な組織切開部の光学顕微鏡写真。ＭＳＣＳ はセラミック内に負荷され、材料および方法に記載された通りに移植され、１２週に採取され、脱石灰され顕微鏡検査のためにパラフィンで処理された。ＨＡ／ＴＣＰセラミック（ｃ）の残部のみが残存し、一方移植片の孔は骨（ｂ）、血管（矢印）あるいは線維組織（ｆ）で充填される。立方骨の骨芽細胞が成長する骨の表面に線を描くのがみられる（トルイジンブルー−Ｏ、×７５）。
【００４３】
図８．  分節裂孔欠損部モデルおよび放射線撮影。（ａ）ポリエチレン固定板がこの代表的なラット大腿部の外側面に配置される。４個の二重皮質ねじと４本のセルクラージュ針金が板を定位置に固設するために使用される。８mmの骨の分節がその癒着骨膜に沿って除去され、細胞付きあるいは細胞無しのセラミック移植片は欠損部位に置かれる。上に重なる筋はその適した解剖位置に戻され、皮膚は再吸収性縫合糸で閉じられる。犠牲に続き直ちに得られた高解像度放射線写真は２個の移植片の型の１２週での分節欠損部の治癒の範囲を示す（ｂ，ｃ）。宿主−セラミックインターフェイスでの移植片の全組込みは担体プラスＭＳＣグループで明らかであるが（ｂ）、一方適度の癒合が無細胞移植片で観察される（ｃ）。ＭＳＣ負荷移植片の孔は裂孔全体を通じて骨に充填されるが、無細胞担体には殆ど骨がなくいくつかの亀裂を含む。
【００４４】
図９．  分節大腿欠損部での骨の再生の組織学的表示。抗体６Ｅ２を持つ免疫組織化学染色（ａ）はＭＳＣ負荷試料の移植４週を示し、担体の孔内の細胞はその表面で反応性であり従ってヒトからのものであり、一方セラミックの外側の細胞は免疫反応性ではない。位相差顕微鏡検査（ｂ）で、セラミックは黒であり、孔の細胞および移植片の外側を囲む細胞は明らかである。セラミック材料自身は蛍光二次抗体を吸着しグリーンに見える（ａ，ｂ．×７５）。光学顕微鏡写真はＨＡ／ＴＣＰ担体のみ（ｄ）、あるいは担体プラスＭＳＣＳ （ｃ，ｅ，ｆ）で移植後１２週の分節欠損部の代表的な治癒を示している。肢が採取され、固定され、脱水され、清浄化され、ポリメチルメタクリレートに包埋され、切断され、染色のため１００μｍ厚に粉砕された。セラミックは非脱石灰標本調製という人為構造のためこれらの顕微鏡写真では黒に見え、また孔内に存在しあるいは宿主−移植片インターフェイスに存在する骨はブルー−バイオレットに見える。ここで示されるＭＳＣ負荷標本は破壊的機械ねじり試験を受け、続いて２個の個別の片で組織学のため処理された。２個の片の整復顕微鏡写真は試験の前の大腿部の外観に接近する。実際の骨折面は移植片の上部および下部の二重矢印で示される。宿主皮質の切断端部はｃ，ｄ、およびｅの矢印で示される。ＭＳＣ負荷移植片を含む試料のみが欠損部を有効に治癒する。強力顕微鏡写真はかなりの量の骨が宿主−移植片インターフェイス（ｅ）および移植片本体内（ｆ）で存在することを示している（トルイジンブルー−Ｏ、（ｃ，ｄ）×７，（ｅ）×３１，（ｆ）×４５）。
【００４５】
図１０Ａ−１０Ｂ．  右手の法則で定義された３−１）整合システムはＸ軸を定義する対象となる水準での神経孔マーカーの間の線の中点に置かれるであろう。Ｚ方向は対象となる水準（すなわちオレンジ点の間）の上部および下部の神経孔の間の中点を通る線で定義される。正のＺ方向は頸部から腰椎までである。正のＹ方向は背側である。対象となる容積の基部はＸ−Ｚ面で定義される。融合塊の容量はＺ＝−７．５mmからＺ＝＋７．５mmの間のＸ−Ｙ面の正のＹ軸で全骨密度ボクセルの輪郭で定義される。完全な融合はＸ次元で２０−３０mmの幅でＹ次元で１０−１５mmの高さである。
【００４６】
図１１．  癒合スコアを割当てるための格子システムが小関節面関節の水準で概略断面図で示される。各ボックス域で半分の点が癒合にあてられる。
【００４７】
［発明の詳細な説明］
骨移植手順は急性骨折、骨折偽関節、骨欠損を処置するために、また治療関節固定術を実現するために広く使用されている。自原性海綿質は臨床骨移植にとって現在の「金本位」である。同時代の教義はこの有効性を以下に定義され得る三つの第一内在性質：骨伝導性、骨形成細胞および骨誘導性（７６，９６）に起因するものと考える。
【００４８】
骨伝導性−細胞の付着および移動、また従って移植量の全体にわたって骨治癒応答の分布を促進する移植された細胞外骨基質により提供される足場機能。この性質はコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオネクチン、オステオポンチン、オステオカルシン、プロテオグリカンおよびその他のような骨基質内の付着分子に依存するものと思われる。基質内の成長因子も役割を果すであろう。
【００４９】
骨形成細胞−移植で生存し増殖を続けおよびもしくは骨芽分化を受ける骨あるいは骨髄から誘導される自家移植の細胞。
【００５０】
骨誘導性−骨芽始原細胞の増殖およびもしくは分化を刺激する移植での成長因子あるいは他の要素の存在から誘導される自原性骨の生物活性。多くの成長因子が骨基質で確認されてきたが、それは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰＳ ）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などを含む。骨髄内の移植非骨形成細胞も同化因子であり、それは内皮細胞が特異的に密接に結び付く（１４１）骨治癒応答（１４０、４８）に貢献する。
【００５１】
骨髄あるいは分離間葉幹細胞は自己由来、同種異系、あるいは異種からの源であり得るし、また胚あるいは生後からの源であることもできる。骨髄細胞は腸骨稜、大腿部、頸骨、脊椎、助骨あるいは他の骨髄腔から得られる。ヒト間葉幹細胞の他の源は胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年期の皮膚ならびに血液を含む。間葉幹細胞を得るために、骨髄あるいは他のＭＳＣ源にある他の細胞から希有多能性間葉幹細胞を分離する必要がある。
【００５２】
この発明は健康な骨の急速な再生により骨欠損を修復する一つの組成物を提供する。この組成物は骨髄およびもしくは分離間葉幹細胞と併用される吸収性ゼラチン、セルロースおよびもしくはコラーゲンベース基質である。この組成物はスポンジ、条片、パウダー、ゲル、ウエブあるいは他の物理的形態で使用することができる。組成物は例えば欠損部に挿入され欠損部の骨形成治癒を生じる。
【００５３】
この組成物は骨誘導性因子などの追加の成分を含むことができる。このような骨誘導性因子は、例えばデキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、β−グリセロホスフェートおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰＳ ）などのＴＧＦ上科タンパク質を含む。この組成物は更に抗生、抗真菌、抗炎症、免疫抑制および他の型の治療、保存および賦形剤などの薬剤を含むことができる。
【００５４】
この発明はまた動物、とりわけ哺乳類および特にヒトにおいてさえそれを必要とする骨欠損を治療する方法を提供し、それは前記動物の骨欠損部に、この発明の組成物の骨欠損部再生量を投与することを含む。
【００５５】
ここで報告される調査報告書は基質のみあるいは他と併用した基質内で送達された新鮮な健全骨髄あるいはＭＳＣＳ の生体内治癒能を確認する。
【００５６】
この発明はまた、骨伝導性あるいは骨誘導性を達成するために細胞と共に他の細胞外基質の使用を考察する。加えて前記生分解性基質の成分の比率を変えることで、細胞−バイオ基質移植片の手術用操作性はスポンジ、あるいはフィルムなどの三次元安定基質から成形能パテ状粘度のもの、柔軟なゲルあるいはスラリからパウダーまでにわたる範囲で調節することができる。
【００５７】
骨髄あるいは分離間葉幹細胞は自己由来、同種異系あるいは異種からの源のものであり得るし、また胚あるいは生後からの源であることもできる。骨髄細胞は腸骨稜、大腿部、頸骨、脊椎、助骨あるいは他の骨髄腔から得られる。ヒト間葉幹細胞の他の源は胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年期の皮膚、および血液を含む。間葉幹細胞を得るために、骨髄あるいは他のＭＳＣ源にある他の細胞から希有多能性間葉幹細胞を分離する必要がある。
【００５８】
とりわけ望ましい実施例において、この発明の組成物は分節欠損部、脊椎固定術あるいは偽関節および他の骨欠損部の修復のために健全骨髄およびもしくは分離ＭＳＣＳ を含む吸収可能移植片よりなる。自己由来、同種異系あるいは異種骨髄およびもしくはＭＳＣＳ を含むオーダーメード細胞基質移植片は開放手術技法、関節鏡技法あるいは経皮注射を用いて投与することができる。
【００５９】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣＳ ）は健全骨髄（あるいは他の自己由来もしくは同種異系ｈＭＳＣＳ の生前あるいは生後の源）から、ｈＭＳＣ富化あるいは異質培養からあるいは少くとも組成物のミリリットル当り約１０３ ＭＳＣＳ 、望ましくは約１０４  ＭＳＣＳ の有効用量を含む新鮮健全骨髄（骨誘導性あるいは他の最適培地と結合された場合）のいずれかから誘導される均一培養拡張調製物として提供することができる。ＭＳＣ治療を用いるこの実施例で有効な臨床結果の手がかりは、多数の富化あるいは培養拡張間葉幹細胞を患者に提供し、あるいは欠損のそれと同等の健全骨髄の量でそれを越えて骨あるいは他の組織欠損を修復する最適培地のほぼ同じ数を提供することにある。これは「再生ＭＳＣ閾」すなわち組織欠損の直接修復を行うのに必要なＭＳＣＳ の濃度として引用される。再生ＭＳＣ閾は１）組織の型（つまり骨、軟骨、靭帯、腱、筋、骨髄間質、真皮および他の結合組織）、２）組織欠損のサイズと範囲、３）薬剤担体併用の際の製剤、および４）患者の年齢により変化する。
【００６０】
望ましい実施例において、この方法は更に少くとも１個の生物活性因子を投与することを含み、それは更にそのような間葉幹細胞の骨形成系列への分化を誘導しあるいは促進する。望ましくは細胞は一方では基質内では生体外で生物活性因子と接触され、あるいはこの発明の組成物の移植の際あるいは移植に続いて欠損部位に注射される。とりわけ望ましいのは、生物活性因子が各種の組織成長因子、とりわけ骨形態形成タンパク質、つまりＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４，ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７よりなるグループから選択された少くとも１個のものよりなるＴＧＦ−β上科の一員であることである。
【００６１】
ゼラチンベース基質を使用する実施例において、適切な吸収性ゼラチンスポンジ、パウダー、あるいはフィルムは架橋ゼラチン、例えばジェルフォームＲ  （ミシガン、カラマズー、アプジョン，インコーポレイテッド）であり、これは変性コラーゲンから形成される。吸収性ゼラチンベース基質は、吸収性ゼラチンスポンジを骨髄およびもしくはＭＳＣ細胞の細胞懸濁液に浸漬し、そこで懸濁液がそこに溶解した他の活性成分を持ち得ることにより、骨修復細胞および、選択肢として他の活性成分と組合せることができる。代替的に、予め決定された量の細胞懸濁液はゼラチンスポンジの上面に移すことができ、また細胞懸濁液を吸収できる。
【００６２】
セルロースベース基質を使用する実施例において、適切な吸収性セルロースは酸化セルロースシート材料を再生し、例えばサージセルＲ  （ニュージャージー、ニューブランズウィック、ジョンソン・アンド・ジョンソン）であり、これは各種サイズの条片の形態で利用され、あるいはオキシセルＲ  （ニュージャージー、フランクリン・レイクス、ベクトン・ディキンソン）であり、これは各種サイズのパッド、外科用綿撒糸および条片の形態で利用できる。吸収性セルロースベース基質は、吸収性セルロースベース基質を骨髄およびもしくはＭＳＣ細胞の細胞懸濁液に浸漬し、そこで懸濁液がそこに溶解した他の活性成分を持ち得ることにより、骨修復細胞および、選択肢として他の活性成分と組合せることができる。代替的に、予め決定された量の細胞懸濁液はセルロースベース基質の上面に移すことができ、また細胞懸濁液を吸収できる。
【００６３】
コラーゲンベースを使用する実施例において、適切な再吸収性コラーゲンは、ウシ真皮コラーゲンを精製し、例えばアビテンＲ  （マサチューセッツ、ウォーバーン、メドケム）であり、これは各種サイズの不織布ウエブおよび線維性フォームで利用でき、ヘリスタットＲ  （ミズーリ、カンサスシティ、マリオン・メレル・ダウ）であり、これは各種サイズのスポンジで利用され、あるいはヘモテンＲ  （マサチューセッツ、ウェストバラ、アストラ）であり、これはパウダーの形態で利用できる。
再吸収性コラーゲンベース基質は、再吸収性コラーゲンベース基質を骨髄およびもしくはＭＳＣ細胞の細胞懸濁液に浸漬し、そこで懸濁液がそこに溶解した他の活性成分を持ち得ることにより、骨修復細胞および、選択肢として他の活性成分と組合せることができる。代替的に、予め決定された量の細胞懸濁液はコラーゲンベース基質の上面に移すことができ、また細胞懸濁液を吸収できる。
【００６４】
前記ゼラチンベース、セルロースベースおよびコラーゲンベース基質は選択肢として止血性を持つ。
【００６５】
望ましい活性成分は骨、とりわけ組換えタンパク質の創傷治癒あるいは骨の再生を高めるこれらの生物作用薬である。これらの活性成分は創傷の治癒を高めるのに十分な量、すなわち創傷治癒有効量で存在する。活性成分の実際の量は付添い臨床医師により決定され、また創傷の発病度、患者の状態、患者の年齢および患者が持つ何らかの側副損傷あるいは医学上の病気に依存する。一般に活性成分の量は約１ｐｇ／cm２  から５ｍｇ／cm２  の範囲にある。
【実施例１】
【００６６】
ラット裂孔欠損修復
材料および方法
材料
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、β−グリセロホスフェートナトリウム（βＧＰ）、抗生ペニシリン／ストレプトマイシン、およびアルカリ性ホスファターゼ組織化学キット＃８５がシグマ・ケミカル・カンパニー（ミズーリ、セントルイス）から、ＤＭＥＭ−ＬＧ（ＤＭＥＭ）組織培養培地がジブコ・ラボラトリー（ニューヨーク、グランドアイランド）から、またＬ−アスコルビン酸−２−ホスフェート（ＡｓＡＰ）がワコーケミカル（日本、大阪）から購入された。胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）は広汎な試験および選抜実験記録の後ジブコから購入された（８０）。平均孔径２００−４５０μｍの多孔ヒドロキシアパタイト／β−トリカルシウムホスフェート（ＨＡ／ＴＣＰ）セラミックは寛大にもジンマー，インコーポレイテッド（インディアナ、ワルソー）により提供された。使用された他のすべての日常試薬は分析用グレードのものであった。
【００６７】
ＭＳＣ分離および培養
ＭＳＣ分離および培養拡張は前に公開された方法（３２）に従って行われた。要約すると、オス・フィッシャーＦ３４４ラット（２００−２７５ｇ）がペントバルビタールの過量投与により犠牲とされた。頸骨および大腿部が無菌状態での切開で回収され、骨の骨幹端部は切断され、また骨髄栓は骨の一端部に挿入された針を通じて食塩水を通して流された。プールされた骨髄凝塊はゆっくりピペットで移され分散され、続いてより小さな一連の針を通じる連続継代が単一細胞懸濁液を産出した。細胞は次いで１０分９００ｘｇで遠心分離され、１０％ＦＢＳ（対照培地）を含むＤＭＥＭで再懸濁された。５０００万有核細胞が７ｍｌの対照培地内でペトリ皿（６０cm２  ）に平板培養され５％炭酸ガスの存在下で３７℃で成長した。非着性細胞は平板培養４日後最初の培地交換の時点で除去され、細胞はその後週２回きまって供給された。これらの一次培養物は典型的には１３日目に密集に到達し、次いで１ミリモルのＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンに５分露出して解放され、１０４  細胞／cm２  の密度で継代培養された。移植用細胞は再平板培養１０日後のこれら第一継代培養から誘導され、この時点でそれは約８５％密集であった。
【００６８】
試験管内骨形成検定
第一継代の終りに、ＭＳＣＳ は対照培地で１０４  ／cm２  の密度で６ウエル平板に再平板培養された。次の日（０日）、新鮮対照培地が供給され、細胞は骨形成補足材（ＯＳ）（１００ナノモルＤｅｘ、０．０５ミリモルＡｓＡＰおよび１０ミリモルβ−ＧＰ）の不在下あるいは存在下で成長した（６４）。培地交換は週２度行われ、７日、１４日、２１日および２８日に培養物は従来記述された方法を利用して細胞数、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）組織化学および鉱石化基質生産を検定された。
【００６９】
移植片調製
ＨＡ／ＴＣＰ塊は約４mm径および８mm長の円筒に形作られた。概略１mm径の中央管が１８ゲージ皮下注射注射針を用いて全円筒を貫通して穴あけされた。円筒は超音波処理および蒸留水すすぎにより清浄化され、次いで２２０℃乾燥熱で５時間無菌化された。円筒は続けてヒト血漿フィブロネクチン（カリフォルニア、アービン、カル−バイオケム）を用いて１００マイクログラム／ｍｌ溶液に１６時間４℃で浸漬することにより被覆された。移植片は次いで室温で一晩無菌生物安全性キャビネットで空気乾燥され、４℃で貯蔵された。側面当り３mmで測定されるＨＡ／ＴＣＰ立方体が同様に調製され、異所性骨形成検定での使用のために前記の通りフィブロネクチンで被覆された。
【００７０】
立方体および円筒形態でのＨＡ／ＴＣＰ移植片は前に記載の方法を一部変形して使用してＭＳＣを負荷された（３２、８３）。要約すると、移植片は無血清ＤＭＥＭ内でのＭＳＣＳ 懸濁液（７．５×１０６  細胞／ｍｌ）内に配置された。負荷容器はキャップされ、移植片はＨＡ／ＴＣＰの孔内に存在する空気を除去し、また孔内への液の流れを容易にするためにそれぞれ５秒間３回のバーストで真空にされた。負荷容器はキャップをゆるめられ、組織培養恒温器に２時間置かれ、手術の時間まで３０分毎にゆっくり撹拌された。無細胞対照円筒が同じように処理されたが、著しい例外は無血清ＤＭＥＭには細胞が存在しなかったことであった。第三移植グループは新鮮骨髄吸引液の臨床関連対照に十分に接近するように設計された。移植の直前に、新鮮骨髄細胞懸濁液が前に記載の通り獲得され、１０分９００ｘｇで遠心分離され、大量の無血清ＤＭＥＭに再懸濁され、それは１個の完全な大腿部から誘導された多数の骨髄細胞、約５，０００万個で各円筒を被覆するであろう（１４４、１４５）。ＨＡ／ＴＣＰ移植片はそれを凝固骨髄懸濁液で横揺れさせることでこの新鮮骨髄を負荷された。
【００７１】
手術モデルおよび実験設計
ここで記述されるラット大腿部裂孔モデルは長骨修復の研究のために広範に使用されたものを変形したものである（３４、３７、６１、８３、１０５、１２６、１２９、１４４、１４５、１４７）。簡単に言えば、オスＦ３４４ラット（３００−３５０ｇ）の両大腿部は前外側アプローチにより露出された。軟組織および筋は持ち上げられ、一方骨膜は無傷のまま骨の表面に沿って留められた。ポリエチレン固定板（４×４×２３mm）（ニューヨーク、ニューヨーク、ホスピタル・フォア・スペシャル・サージェリー）が４本通されたキルシュナー鋼線および２本のセルクラージュ線（インディアナ、ワルソー、ジンマー）により各大腿部の前外側面に固定された。その付着骨膜に沿って中央骨幹の８mmの横分節が食塩水洗浄の下で回転骨切りバーで除去された。これらの安定分節欠損部は空のまま残されるか、あるいは無細胞ＨＡ／ＴＣＰ円筒、ＭＳＣ負荷円筒、あるいは新鮮骨髄細胞懸濁液を負荷された円筒のいずれかで置換された。移植片はセラミックおよび固定板の周りに２個の４−０ビクリル（ニュージャージー、サマビル、エチコン）縫合糸を置くことで固定された。筋は併置され筋膜および皮膚は日常の層化様式で閉じられた。ＭＳＣ負荷円筒を移植されたラットは更に異所性骨形成検定を正常位骨再生および試験管内同系ＭＳＣＳ 骨形成能と相関させるためにＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ立方体の皮下移植を受けた。骨髄負荷円筒を移植されたラットは同じように骨髄負荷立方体の皮下移植を受けた。動物は手術後檻の中で完全な運動を許された。動物はいずれも固定の失敗や他の術後合併症を経験することはなかった。少くとも６本の肢が左右の間で無作為に選択された移植グループのそれぞれに使用された。４週および８週での犠牲に際して、ある動物の血管系が墨汁で灌流され、全大腿部および周辺軟組織が注意深く切開された。標本は直ちに放射線写真で評価され、続いて非脱石灰組織学のため処理された。
【００７２】
放射線写真分析
標本は高解像度ファクシトロン映像システム（イリノイ、バッファローグローブ）を用いて３５ｋＶＰで３０秒放射線撮影された。放射線写真は著者の２人により個別に評価され、彼等には持続時間および移植片の型については伏せられた。骨形成は下記の範囲で半定量目盛りで得点を与えられた：遠位宿主−移植片癒合（０−２）；近位宿主−移植片癒合（０−２）；移植芯密度（０−４）。癒合得点および芯密度得点は加えられ各移植片に対し８の最高可能得点が与えられた。両試験管から得た結果は平均され最終得点が得られた。
【００７３】
組織構造および組織形態計測
１０％緩衝ホルマリンでの固定に続き、大腿部は脱水され、洗浄され、ポリメチルメタクリレートに包埋された。縦方向切片は水冷アイソメットのこぎり（ウィスコンシン、ビューラー）で切断され、各肢の中央切片は１００マイクロメートル厚に粉砕され、研磨され、トルイジンブルー−Ｏで染色された。ライカ・クオンティメット５００ＭＣ（英国、ケンブリッジ）映像分析ソフトウェアが各切片の骨幹欠損領域でのＨＡ／ＴＣＰ移植片、骨および軟組織の区域を決定するために使用された。データは一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ジャンデル・サイアンティフィック、シグマスタット）により分析された。更なる分析が事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験に従って行われた。皮下移植セラミック立方体は同じようにホルマリンで固定され、次いで脱灰され、脱水され、パラフィンに包埋され、連続切断され、トルイジンブルー−Ｏで染色された。
【００７４】
結果
試験管内ＭＳＣ培養および骨形成分化
ラットＭＳＣ培養は同系動物から確立され、また７日までに培養皿の表面に特徴あるコロニーを形成した（図１Ａ）。数百個のＭＳＣコロニーが各６０cm２  皿に播種された５０００万個の有核細胞から発生した。この観察にもとづき、ラットＭＳＣＳ はヒトＭＳＣＳ （１３、５４）と同じように１０５  有核骨髄細胞に約１個の頻度で存在するように見える。１４日継代培養された一次ＭＳＣ培養は新しい皿に均一に付着し、概略１０日あるいは皿が〜８５％密集になるまで分割を許された。継代細胞はまた特徴的な形態構造（図１Ｂ）を示し、かつ皿の上で均一に分割しその結果皿全体にわたりＭＳＣＳ の均一な分布を生じた。この第一継代から誘導された細胞は前記の通り移植片を調製するために使用され、アリコートがラットＭＳＣＳ の試験管内骨形成能を確認するために使用された。
【００７５】
骨形成検定のための再平板培養７日後、対照およびＯＳ処置培養双方は紡錘型細胞で構成され、その４０−５０％はアルカリ性ホスファターゼのため染色された。次の２１日間、対照細胞は線維芽のまま残り、その細胞表面アルカリ性ホスファターゼを増加させたが、鉱石化骨小節の成長に関連する形態構造変化を受けなかった（図１Ｃ）。これに反してＯＳ処置培養物はアルカリ性ホスファターゼで激しく染色された多角形および立方形細胞の集合体の形成を開始し、２１日までに培養物はフォン・コッサ染色鉱物沈着を含む特徴的な骨状小節を形成した。２８日を通じてそれらの小節の更なる鉱物化（図１Ｄ）はとりわけ小節間の領域内でアルカリ性ホスファターゼ染色の減少を伴った。
【００７６】
異所性ＨＡ／ＴＣＰ移植片でのＭＳＣ媒介骨形成
宿主ラットに移植されたＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ立方体のすべては４週で骨形成の十分な証拠を持っていた。８週の時点でかなりの量の骨および時々は軟骨が立方体の孔内に存在した。移植に続く８週に採取されたＭＳＣ負荷立方体からの代表的な切片が図２で示される。未染色粒状区域は標本調製の脱灰段階の間に除去されたセラミック材料の前の領域を反映している。顕微鏡写真で見られるように、骨形成は立方体の孔内で発生し、移植片を貫通する血管要素と関連する。このような血管形成は新骨形成には必須のものであり、というのは骨芽細胞の分泌活性が血管系により案内される指向現象であるためである。網状および薄層骨が移植の持続に依存して見ることができ、また正確な区域が検討された。大抵の孔は骨および造血要素の小さな島で充填され、残りは柔軟な結合組織で充填されていた。これらのＭＳＣ負荷試料とは反対に、新鮮な骨髄で負荷された立方体は４週でごく僅かの骨組織を含んでいたに過ぎず、また８週では同じように少しばかり増えただけであった。前に論証（３２、５４）されたように、ＭＳＣＳ あるいは骨髄なしで移植された立方体は骨はなくて線維組織および血管で充填された。
【００７７】
放射線写真評価
高解像度ファクシトロン放射線写真は移植片および周辺宿主骨内で生じる微妙な変化を識別するために十分な清澄さと詳細を提供する。図３は移植４週および８週で回収されたグループのそれぞれからの大腿部の代表的な放射線写真を示す。これらの放射線写真で示されるように、固定はすべての試料で無傷のままに留まり大腿部のいずれにも骨折はなかった。大腿部欠損が空で残された動物では、宿主大腿部の横切断端部での反応性骨形成が４週で観察された（図３Ａ）。８週までに少し多い骨が裂孔内に存在したが、この骨の大部分は骨膜と接触する固定板の端部に沿って形成されたように見えた（図３Ｂ）。空で残されたすべての標本は放射線写真偽関節の形成を生じた。グループに係わりなくいくつかの肢はまた通常固定板と対向する欠損部の外側にある偏心スピクラを含んでいた。
【００７８】
ＨＡ／ＴＣＰ円筒が移植されると、僅かばかりの反応性骨形成が大腿部の切断端部で生じた。移植材料（ＨＡ／ＴＣＰ）の鉱物量に帰因して、放射線写真評価に対する移植片自身の構造的詳細部分を認識することができる。中央管および孔の詳細は４週の放射線写真（図３Ｃ）ではっきりと見られ、他の放射線映像と比較して重要な基準線を提供するのに役立つ。孔マージンのぶれはこれらの無細胞移植片で８週（図３Ｄ）で認識することができる。重要なことは、移植片と宿主の間の癒合の欠除は４週で移植片自身とすべての動物の大腿部の切断端部の間の放射線透過性の透明な帯として表される。４週の担体だけのものとは逆に、ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ円筒を受けた動物は４週（図３Ｅ）で移植の孔内にかなりの量の新骨形成を示した。放射線密度の増加、および見かけ孔構造の閉塞は移植片の孔内での新骨形成の表示として使用された。移植片の組み込み、すなわち癒合は４週では観察されなかったが、その後の移植片と宿主の間の放射線密集骨架橋の形成はインターフェイスを完全に遮蔽した。８週までに、ＭＳＣ負荷移植片は切れ目がなくなり正常宿主骨に完全に組み込まれた（図３Ｆ）。新鮮骨髄で負荷されたＨＡ／ＴＣＰ移植片はいずれの時点でも孔にある放射線密集骨を生産するようには見えなかったが、それでも宿主骨の切断端部との限られた組み込みが８週で明らかになった（図３Ｇおよび３Ｈ）。
【００７９】
各移植片グループの各時点での放射線写真得点の平均が表１で提供される。
【００８０】
【表１】
2006158975.tif 000002
【００８１】
表１．各時点で各移植グループに対する放射線写真得点の平均。Ｃ＝担体、Ｍ＝骨髄。放射線写真は各移植片の同定のために条件等の伏せられた２人の個別の観察者により評価され得点が与えられた。癒合は０−２の目盛りで近位および遠位の両方で得点が与えられた。芯密度は０−４の目盛りで得点が与えられた。各時点での各グループに対しｎ＝３である。最高全得点は８である。独立変数として細胞負荷（無し、ＭＳＣＳ および骨髄）された異なった２時点での分散の一方向分析は８週でグループ間で著しい差異を示した（Ｆ＝１０．９、ｐ＝０．０１）が、４週では著しい差はなかった。＊＝対応する時点で他のグループよりも著しく大きい（ｐ＜０．０５）（事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験に基づく）。
【００８２】
ＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部の場合、低得点は孔内でのいずれの放射線密集材料の不在、および宿主骨で移植片の最小の癒合を示す。ＨＡ／ＴＣＰ移植片への新鮮骨髄の負荷は欠損部の治癒に改善をもたらさず、また低得点はこのグループの担体だけのそれとの類似性を反映する。しかしＨＡ／ＴＣＰＴ担体へのＭＳＣＳ の負荷は激しい骨形成応答を作り出す。４週においてすら孔充填が観察されたしこれら移植片のかなり高い得点に反映されている。興味深いのは、この場合においてもなお宿主−移植片の癒合は対照に比べてあまり大きくないものであった。８週時点までに、移植片の孔は新しい骨で充填され宿主−移植片の癒合は十分に確立された。
【００８３】
組織学および組織形態計測評価
試料の組織学評価は放射線検査による観察を立証した。空の欠損部において、反応性骨形成は宿主皮質および骨内膜の切断端部から生じるように見えた。８週においてさえ、欠損部を横切る架橋はなく、また線維偽関節が分節裂孔の中心で形成した。４週および８週で回収された移植グループの代表的な切片の顕微鏡写真が図４で示される。ＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部において、移植片の孔は線維組織で充填され（図４Ａ）、墨汁注射で測定されるように十分に血管を発達させていた。移植片の孔では骨を見ることができず、宿主での組み込みも限定されていた。８週においてもなお、大抵の孔はこの顕微鏡写真（図４Ｂ）で著しい血管発達があるにも拘らず骨を欠いていた。小量の新骨が宿主−移植片インターフェイスで存在したし、この代表的な移植片の一端部で、宿主誘導骨内膜骨は移植片の髄管の一端部に進みつつあるように見える。新鮮骨髄で負荷された試料における骨形成はＨＡ／ＴＣＰ担体のみのそれと非常に類似していた（図４ＥおよびＦ）。しかし限られた量の新骨を異所性移植の結果と相関して８週で移植片の孔内で見ることができた。これら移植片の癒合は無細胞移植片で観察されたものに類似し、反応性骨形成が移植片の端部で孔を僅かに貫通した。
【００８４】
新鮮骨髄のＨＡ／ＴＣＰへの追加から生じるまばらな骨形成とは逆に、ＭＳＣＳ を負荷された移植片の大抵の孔は４週でかなりの量の新骨を含んでいた（図４Ｃ）。再び未だに宿主骨の切断端部と移植片端部の間に明白な境界区分があった。８週ではＭＳＣＳ の負荷が次善のものであったある別個の区域を除いて、殆どすべての孔が新骨で充填された。興味深いことに、かなりの量の新骨形成が宿主と移植片の間のインターフェイスで生じ、欠損部の端から端までの骨の連続的広がりに導いた（図４Ｄ）。更に骨膜仮骨もまたＭＳＣＳ で負荷された試料に存在した（図４Ｄ）が、他の移植片の型には存在しなかった。孔内およびこれら移植片の端部で形成された骨は新規の骨形成を表し、高度に細胞性であり、図５でより大きい倍率の顕微鏡写真で提示される。新しい網状薄層骨は８週で宿主皮質の切断端部に密接接触して見ることができる（図５Ａ）。重要なことは、癒合のこの区域は移植片の孔全体にわたって形成された骨と直接隣接している。ＨＡ／ＴＣＰ内でより深い領域では、分化する骨芽細胞の分泌活性を指向する血管系と関連しているので、孔への新骨の充填は明らかである（図５Ｂ）。
【００８５】
前記定性的に記述された結果は表２で提示される組織形態計測データに反映される。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
表２．利用できる空隙の割合としてＨＡ／ＴＣＰ移植片への骨髄充填。組織形態計測測定値は移植材料自身および髄管を除き分節切除の領域内で形成された骨で得られた。値は３試料の平均値±標準偏差として報告される。独立変数として細胞負荷（無し、ＭＳＣＳ 、および骨髄）された２時点での分散の一方向分析は４週（Ｆ＝４３．３、ｐ＜０．００１）および８週（Ｆ＝２６．２、ｐ＜０．００２）でＭＳＣ負荷試料の間で著しい差異を示した。＊＝対応する時点で他のグループよりも著しく大きい（ｐ＜０．０１）（事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験に基づく。いずれの時点でも骨髄および担体のみの間では差異は観察されなかった（ｐ＞０．１））。
【００８８】
無細胞ＨＡ／ＴＣＰ移植片は４週および８週それぞれで僅か２．３％および１０．４％の骨分画を持った。重要なことは８週でのこの骨の分画がこれまでに公開された結果（１２６）と相関していることである。これらの分画は主として宿主皮質の切断端部からの骨内殖を表す。骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰ円筒は移植片の本体内部で多くない骨形成を示し、従って８週では１７．２％の僅かに高い値であった。重要なことは４週までにＭＳＣ負荷試料は他の２グループでは８週の値を上回った。４週時点での１９．３％という骨充填は十中八九ＭＳＣ媒介骨形成に起因する。移植片内の平均骨分画は時間と共に増加し、８週までに４３％に達した。スチューデント−ニューマン−キュールス試験に沿ったデータに基づき実行された一方向ＡＮＯＶＡは、４週および８週でＭＳＣ処理は担体のみあるいは骨髄負荷担体よりも著しく改善された（ｐ＜０．０１）。担体のみおよび骨髄負荷の移植片の間では著しい差異は検出されなかった。ＨＡ／ＴＣＰ担体の大量の分画は一定に留まり、組織形態計測システムの内部対照として役立った。８週までに空欠損部が３４％の骨充填であったとしても、欠損部の端から端までの架橋はなく、従って臨床偽関節として分類されるであろう。
【００８９】
論議
この研究において、精製培養拡張同系始原細胞が十分に樹立された動物モデルの臨床的に重要な骨欠損部の治癒を可能にすることを我々は論証した。これらの始原細胞は間葉幹細胞として引用され、というのはそれらは骨（１１、３２、５４、６４）だけでなく、軟骨（３２、６６、８０、１４２）、筋（１２１、１４３）、腱（２３）、および造血分化を支持する間質組織（８７）をも生じさせるからである。動物およびヒトＭＳＣＳ 両方の骨形成能は異所性検定での皮下移植を経て証明されてきたが、大きな分節骨欠損部を再生する培養拡張ＭＳＣＳ の能力を樹立する厳密で定量的な研究は我々の知る所では報告されていない。ＭＳＣＳ を多孔ＨＡ／ＴＣＰ移植片と組合せることが大きな分節骨欠損部を治癒する有効な戦略であることをこの研究が示している。現在の研究は更に新鮮な骨髄と比較してＭＳＣＳ が異所的にあるいは正常位部位に配置された時に著しくより多い骨を生産することを立証する。これらの結果を基礎にして、我々は我々の骨格欠損部の再生のための自己由来細胞治療へのアプローチを精緻化することを始める。
【００９０】
この研究で使用される細胞を更に特徴付けるために、我々はそれを試験管内で骨形成分化を誘導する培地の存在下および不在下で培養した。数多くの他の研究所で報告されているように（７７、８８、８９、１１８、１３５）、これらラット骨髄誘導細胞はデキサメタゾンに応答して骨形成系列に沿って成長し、最終的に皿の表面に骨状組織の鉱石化小節を形成する。このような分化は我々の顕微鏡写真（図１）で明らかであり、これらの移植片で使用される細胞がＭＳＣＳ の固有の性質の一つである骨を形成する能力を所有することを立証するのに役立つ。更に皮下に移植された立方体で形成される骨および軟骨はＭＳＣＳ の骨軟骨形成能を確証するだけでなく、これら組合せ細胞内で骨形成を支持できる環境をすべての宿主ラットが提供できることを証明する内部対照：すなわち基質移植片として作用する。これら細胞の多系列能を立証する追加の実験はこの研究の一部に含まれなかったが、その理由は従来の公開情報がそのような性能をより詳細に記述することに集中しているためである（３２、７９、８０、１２１、１４３）。ラットＭＳＣＳ の分離と選択手順はヒトＭＳＣＳ （３２、５４、８０）に使用されるものと類似し、図１Ａで示される特徴的な一次コロニーを形成する。これらの細胞は皿全体に一様に分配される形態構造的に均質母集団を産出するために有糸分裂拡張される。ヒトおよびラットＭＳＣＳ はいずれも多系列能を所有することが示されたしまたヒトＭＳＣＳ の試験管内骨形成分化の詳細が最近報告された（３３、６４）。系列進行のないヒトＭＳＣＳ の分離と培養拡張のための条件は最適化され（１３、５４、８０）、またヒトＭＳＣ成長のための無血清培地の開発は完成した（５８）。
【００９１】
この研究における放射線写真の結論はＭＳＣＳ を正常位置で受け入れる動物あるいはヒトでの骨再生の非侵襲性の証拠を獲得するための先例を確立する。ＨＡ／ＴＣＰ移植片の多孔性を与えられて、材質の間隙内で形成する新骨はＨＡ／ＴＣＰ材の固有の放射線密度にも拘らず４週までに放射線写真で容易に明らかとなる。８週までに明らかな放射線密度の進行性増加は処置肢の組織学的観察と十分相関する。興味深いことは、４週までに移植片の芯の中での新骨の存在にも拘らず、宿主−移植片インターフェイスでの組み込みは８週まで観察されなかった。３個の移植片グループの平均放射線写真得点は８週でＭＳＣＳ と骨髄負荷およびセラミック移植片のいずれかとの間で著しい（ｐ＜０．０５）差を立証し、一方いずれの時点でも骨髄負荷およびセラミック移植片の間では著しい差異は全然見られなかった。
【００９２】
組織学研究は、ＭＳＣＳ を負荷された異所性移植片でのこれまでの骨形成の観察（３２、４７、５４）とは矛盾せず、移植片の芯全体にわたりＨＡ／ＴＣＰの表面での付加骨成長を示している。ＭＳＣ負荷試料で４週および８週で形成される骨は多くの領域で織られた（網状化された）が、薄層骨も認識することができる（図５Ａおよび５Ｂ）。この骨欠損を再生する過程で骨形成は軟骨内配列によるよりも間葉細胞の骨芽細胞への直接変換により生じることに注目することが重要である。欠損部位で骨の再生が続くにつれて、セラミックの孔は著しく多い骨に充填され、それは移植片あるいは現存の骨の壁に横たわり、浸透する血管系により調整される。犠牲の直前に墨汁注入により視覚化されたこれらの血管は造血要素並びに宿主誘導ＭＳＣＳ を含む新しい骨髄島の登場と樹立のための正門を提供する。骨改造の過程が続いて起こり、最終的にはドナーの骨は宿主の骨に置換される（４７）。欠損部の端部で、移植片の組み込みは宿主皮質の切断端部と移植片の表面に形成された骨との間で直接連続性で達成される（図５Ａ）。骨髄負荷のあるいは無細胞のセラミックのいずれかで提供されたラットでは僅かの最小宿主−移植片癒合が生じるために、ＭＳＣ負荷セラミックで観察された進行組み込みは移植ＭＳＣＳ および宿主誘導細胞の組合せの貢献を反映したものと思われる。すべての試料での初期の癒合の欠除は、空で残された欠損部が皮質の切断端部でかなりの量の反応性骨形成を受けた事実を考慮に入れると驚くべきものがあった。欠損部位での移植片の存在は、空欠損部での反応性骨形成に貢献する周囲のゆるやかな間葉の移動およびもしくは脱出症を阻害することは可能である。更に移植円筒の微細動はインターフェイスでの安定した癒合を妨げるように思われる。
【００９３】
この実験モデルで大きな分節欠損部を再生するＭＳＣＳ の能力は脱灰骨基質、骨髄、精製あるいは組換えＢＭＰＳ 、同種異型移植片、セラミック、および線維金属などの移植片を試験する調査研究と比較して有利である（３４、３７、７４、８３、１０５、１２６、１２９、１４４、１４５、１４７）。組み換えＢＭＰの使用はかなりの注目を受ける一方、作用の正確なメカニズムはつい最近認識され始めたばかりである。これらの強力な誘導性分子は未分化間葉細胞に軟骨内カスケード（反応）を開始させるように作用し、最終的に骨の形成に帰着する。未分化ラット骨髄間質細胞の研究は、ＢＭＰ−２が骨芽成長を直接刺激するように作用し、またこの刺激がデキサメタゾンの追加により高められることを確証する（７７）。骨形成は新鮮骨髄のみが加えられる時は正常位部位で生じるが、治癒の速度と範囲は骨髄量とそこに存在する骨始原細胞数の関数である（２６、４９、１２９、１４４）。高木およびユーリストによる一連の重要な実験（１２９）は、髄質にアクセスし骨髄間質が妨げられかくしてＢＭＰ媒介骨修復で骨髄の細胞構成要素の絶対必要量を指示する時には、ＢＭＰの追加は分節欠損の治癒には有効でないことを論証する。これらの結果はラット分節裂孔モデルでＢＭＰと共に新鮮骨髄の移植が単独で移植されたどちらかの成分よりももっと有効であることを示す研究により支援された（７４）。骨髄誘導間葉始原細胞あるいはＭＳＣＳ は通常の骨治癒の間に放出されるＢＭＰＳ などの内因性骨誘導分の標的であることが前記のすべてから結論することも可能である。従って骨修復の通常の（あるいは外因性供給の）シグナルに応答するためにはＭＳＣＳ の適切な供給を持つ必要があり、さもなければ治癒は活力を失うということになる。
【００９４】
この研究で生成された組織形態計測データは他の調査研究との比較の基礎を提供する。大腿部１当量からの新鮮骨髄がＨＡ／ＴＣＰ移植片に負荷される時、細胞を受けない移植片と比較すると骨形成で著しい差異は観察されない。これは我々の研究の両時点で真実であり、適用される骨髄の量でＭＳＣＳ の不適当な数を反映しているように思われる。もし我々が移植片により多い骨髄を負荷させたとすれば、我々も他の者も骨欠損部のより大きな治癒が生じるであろうと予言するであろう（７４、１４４）。にも拘らず、一つの長骨から得られた全細胞母集団を適用することにより、適切な臨床関連制御に寛大にも接近することができ、何故なら病巣欠損の修復のため多重長骨からすべての骨髄を除去することは健全な臨床判断と矛盾するからである。多分もっとも重要なことは、ＭＳＣＳ が４週および８週でそれぞれ１９．３％と４３．２％の骨充填を生産したことである。精製ＢＭＰが同じ実験モデルで同一の担体に適用された時には、骨充填は４週で２１％で、８週では僅か２２％であった（１２６）。これらのＢＭＰ被覆ＨＡ／ＴＣＰ移植片は移植後１６週まで４３％の骨充填を達成しなかった。類似の量の骨が４週で両移植型から生じた一方、８週時点までにＭＳＣＳ はＢＭＰよりも２倍多く生産する。この処方ではＭＳＣ僅か８週で生産する同一量の骨を形成するのにＢＭＰは１６週を要した。この基礎の下でＢＭＰとＭＳＣＳ のいくつかの組合せが前に議論されたようにより早くより強力な骨修復を提供できるけれども、ＭＳＣＳ はＢＭＰのみの使用よりもかなりの利点を提供するように見える。
【００９５】
修復部位に存在する多数の始原細胞は重要な因子であるため、この点については如何にＭＳＣ負荷移植片を骨髄負荷移植片と比較するかを評価することは必須である。移植片に置かれた有核骨髄細胞の数は約５，０００万個であった。同数が一つの長骨から採取された。も一つの５，０００万個細胞が一つの移植片で細胞に最終的に提供されるＭＳＣ培養を開始するために使用された。これら５，０００万個の細胞から大ざっぱに５００個のＭＳＣコロニーが成長し、これらの細胞は最初の継代末期までに３００万個に有糸分裂拡張される。これはＭＳＣ数でも６，０００倍拡張されるが、それは約１２母集団の倍加に帰因する。これらの型は移植片に負荷する現在の技術を用いて、約１５万個の細胞がＭＳＣ懸濁液での保温に続き付着性になる（３２）。にも拘らず局所投与の１５万個の精製ＭＳＣは、５，０００万個の非分画骨髄細胞で通常存在する数の３００倍多い始原細胞の数を増加させるであろう。これらの計算を基礎にして、他の骨再生戦略に優るこの技術が提供する利点は、骨形成に必要とされる細胞機構の直接送達である。このアプローチは、老化、骨粗鬆症、あるいは各種の他の病的状態で生じるように多数の内因性始原細胞が縮少する環境では非常に大きな利点を持つであろう（３３、７２、８２、１１８、１２８、１３５）。他の研究者達は、骨髄を単に濃縮することにより、未精製品の分画および赤血球の除去により、あるいは試験管内間質細胞を培養することにより、より多くの始原細胞を送達することによるこの論理を追跡した（２６、８３、１０３、１０５、１４４）。骨形成能（１３）での損失なしで約１０億倍ほど多い培養での精製ヒトＭＳＣＳ の拡張を支持する技術および条件が確立されたために、ヒト骨欠損部を再生するための相似性臨床実験記録はそう遠くにはない。移植前に骨形成系列に入るため生体外培養拡張ＭＳＣＳ を指向しかくして移植および骨芽細胞としてのそれらの生物合成活性の間の原位置間隔を減少することにより治癒過程を更に促進することが可能となるであろう。いずれの型の欠損部に適合するよう形状化できる物質を含む手術により柔軟性を提供する細胞送達伝達体を開発することが進行中である。ＢＭＰなどの薬理的刺激剤とより優れた送達伝達体とを組合せることにより、これまで利用できなかった治療オプションを患者に提供することができるであろう。
【実施例２】
【００９６】
大型分節イヌ大腿部欠損が自己由来間葉幹細胞治療で治癒される
この研究は培養拡張自己由来間葉幹細胞が大型動物モデルにある臨床上重要な骨欠損部を再生できることを論証する。
【００９７】
最齧歯類の大型分節欠損部を修復する同系骨髄誘導間葉幹細胞（ＭＳＣＳ ）の能力が確定された（６８）。これらのＭＳＣＳ は骨髄あるいは骨膜から分離され、生体外で数を拡張され、また適当な担体伝達体で宿主に戻される。ＭＳＣの移植８週後に形成された骨の量が同じ担体で送達されたＢＭＰから生じたものの２倍であることをラットの研究は論証した（６８、１２６）。この技術の臨床実現可能性を論証するために、我々の目的は厳格な生物機械学試験に従いやすい大型動物での分節骨欠損部を再生することにあった。この目標を達成するために、我々はＭＳＣ負荷担体、担体のみおよび自家移植海綿骨の移植後の放射線写真、組織学および生物機械学データを比較するためのイヌ大腿部裂孔モデルを開発した。
【００９８】
材料および方法
ＭＳＣ培養および操作
ＩＡＣＵＣ認定実験記録に従って１５ｃｃ骨髄吸引液が各動物の腸骨稜から得られ、氷上で深夜便により細胞培養施設に送られた。イヌＭＳＣＳ の分離は、ヒトＭＳＣ分離のために開発されたもの（５４）に類似の手順を用いてパーコルクッション上で健全骨髄吸引液を遠心分離して行われた。組織培養フラスコ（１８５cm２  ）にクッションから分離された１０７  有核細胞が播種され、選択されたロットからの１０％胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭで培養された（８０）。細胞は８×１０３  細胞／cm２  で継代され、動物病院に戻されそこで移植の時まで保存された。細胞負荷移植片はＭＳＣＳ の７．５×１０６  細胞／ｍｌ懸濁液内で３時間３７℃でフィブロネクチン被覆多孔ヒドロキシアパタイト−リン酸トリカルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）円筒（ジンマー，インコーポレイテッド）を恒温培養して調製された。骨髄採取と移植の間の間隔は１６日であった。各調製物からの細胞のアリコートもまた骨芽分化の様相を定量化するために骨誘導条件の下で培養された。
【００９９】
イヌ大腿部裂孔モデル
一側性分節大腿部欠損モデルがＩＡＣＵＣ認定に続きこの研究のために開発された。全身麻酔の下で３６匹の骨格上十分に成長したメスの意図的に成育された猟犬（２０kg）がその中央骨幹から２１mm長の骨骨膜小節の切除を受けた。４．５mmシンテス●  ８穴延長板が骨の横面に輪郭され、二皮質スクリュで固設された。欠損部は３種の材質、１）無細胞ＨＡ／ＴＣＰ円筒、２）ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ円筒、あるいは３）腸骨稜から採取された海綿骨の一つで充填された。ＨＡ／ＴＣＰ移植片は移植片および板の周りに２本の縫合糸を据えることで固設された。動物は手術期抗生物質を受け、鎮痛薬が術後３日間投与された。
【０１００】
放射線写真および組織学分析
標準放射線写真映像が手術前、手術直後、およびこの研究の終結まで４週の間隔で得られた。すべての試料は時間の変化および犬の間の変化を比較する基礎を提供するために放射線密度段階くさびを含んでいた。犠牲に際し、標本は高解像度ファキシトロン放射線撮影され、続いて生物機械学評価のために処理された。ねじり試験に続き非脱灰縦方向部分が定量組織形態計測のため処理されるであろう。
【０１０１】
生物機械学試験
移植の１６週後、動物は大腿部のねじり試験のために犠牲にされた。固定板、スクリュ、および付着軟組織が除去され、骨の骨幹端が包埋された。標本は特別注文ねじり試験装置で外側で回転されるであろうし、故障負荷および剛性は記録され、データは事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験に従って一方向ＡＮＯＶＡにより分析されるであろう。
【０１０２】
結果
すべての動物は感染出現率、移植片拒絶反応、あるいは固定栓なしで手術手順をうまく許容した。修復の二つのモードがＭＳＣ負荷試料で明らかとなった。まず最初はかなりの仮骨形成が宿主−移植片インターフェイスで生じた。また第二に移植片自身を取り巻くかなりの骨の環が成長した。無細胞移植片はこれらの特性のいずれも持たなかった。自家移植片試料は伝統的な圧密配列を受け、骨の大部分は裂孔欠損部の内側の面に横たわった。ＭＳＣ試料は宿主−移植片インターフェイスで完全に組み込まれるだけでなく、骨膜環は裂孔の切断端部を越えて近位および遠位に延びた。更に中央骨幹にある新骨の径は自家移植片あるいは無傷肢のいずれよりもＭＳＣ負荷移植片で大きかった。採取試料の生物機械学的分析は現在進行中である。各動物からの骨形成能ＭＳＣＳ の試験管内分析は著しい石灰化細胞外基質を沈着するアルカリ性ホスファターゼ正細胞の成長を論証する。
【０１０３】
ＭＳＣ負荷（ｎ＝２）および無細胞（ｎ＝１）ＨＡ／ＴＣＰ担体からの予備組織形態計測データは、利用できる空隙の割合としての骨充填がそれぞれ３９％と７％であることを示す。ＭＳＣ負荷試料の場合では、セラミック塊の領域での骨のかなりの量に加えて、更にかなり大きな石灰化骨膜仮骨が存在した。また骨髄の空隙は欠損部内で回復された。ところが無細胞ＨＡ／ＴＣＰ円筒では存在する骨の大部分は骨内膜空隙にあり一部移植片に貫入していた。
【０１０４】
試料（グループ当りｎ＝６）のねじり試験は、ＭＳＣ負荷試料が無細胞試料よりも約２倍強力であったが、自家移植対照と比べると約１／３の強さであった。
【０１０５】
議論
大型動物からのＭＳＣが培養拡張され、大型骨幹骨欠損部の成功する修復のために移植されることをこの発明は論証する。放射線写真および組織学の証拠はＭＳＣＳ が直接移植片内およびその周辺に骨を形成するだけでなく、その存在が追加の骨を形成するために宿主骨膜での応答を引き出すことを示している。このメカニズムは現在知られていないが、骨形成分化を経験しているＭＳＣが骨誘導性であるパラクリン因子を分泌する（６３）ということは我々の観察と一致する。無細胞移植片で仮骨形成および骨膜反応の目立った欠乏は予期しなかった発見であった。放射線写真の証拠はＭＳＣ媒介骨再生が研究期間全体にわたって自家移植片より早いことを示唆する。大型動物骨修復のための新しい標準化モデルを確立することに加え、この研究は研究室から外来診療所への自己由来幹細胞の転換の実行可能性を示す。
【実施例３】
【０１０６】
ヒト間葉幹細胞を使用する生体内骨形成
ラットＭＳＣＳ が構造的に能力のある骨を正常部位で合成する（６８）ことが示されてきたが、ヒトＭＳＣは試験管内（１２、６４）および免疫不全マウスの異所性移植部位で骨を形成する（５５）ことを示しただけであった。骨折治癒および骨修復は修復芽腫を形成するために欠損部位で十分な細胞を集める能力に依存するために、一つの治療戦略は修復を必要とする部位に前駆細胞を直接投与することである。このアプローチは、治癒が困難な骨折を持つ患者、あるいは年齢（７２、１１８）、骨粗鬆症（１２８）あるいは他の代謝障害の結果としてＭＳＣ貯蔵が減退している患者にとっては特に魅力的である。これを心に留め、この研究の目標は、精製され培養拡張されたヒトＭＳＣＳ が臨床的に重大な欠損部位で骨を再生できることを示すことであった。
【０１０７】
材料および方法
ヒトＭＳＣ培養および操作
インフォームドコンセントの後正常ボランティアから得られた骨髄吸引液からのヒトＭＳＣＳ の分離および培養拡張は前に記載の通り行われた（５４、５２）。選択されたロットからの１０％胎仔ウシ血清（バイオセル）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（シグマ）での最初の平板培養（８０）に続き、非付着細胞は最初の培地交換の時点である３日目に除去され、その後新鮮培地で週２回置換された。付着ＭＳＣＳ は当初平板培養された１０５  有核細胞の内約１に相当する。培養皿がほぼ密集となると、細胞は取り外され連続継代培養された。
【０１０８】
試験管内骨形成検定
ヒトＭＳＣＳ は３×１０３  細胞／cm２  の密度で６ウエル皿に再平板培養された。次の日（０日）、新鮮培地が供給され、細胞は骨補充材（ＯＳ）の不在あるいは存在下で成長した（１２、６４）。培地交換は週２回行われ、４、８、１２および１６日に培養はこれまでに記載された方法（６４）を利用して、細胞数、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）生化学および組織化学、ならびに石灰化基質生産を検定された。
【０１０９】
移植片調製
平均孔径２００−４５０μｍの多孔性ヒドロキシアパタイト／βリン酸トリカルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）セラミック塊（インディアナ、ワルソー、ジンマー，インコーポレイテッド）が、約４mm径および８mm長で１mm中央管を持つ円筒、あるいは各サイドが３mmの立方体に形作られた。ＭＳＣ負荷移植片は前に記載（６８）の通りヒトフィブロネクチン被覆ＨＡ／ＴＣＰ立方体および円筒を第一継代ＭＳＣＳ の７．５×１０６  細胞／ｍｌ懸濁液で２時間３７℃で保温培養して調製された。無細胞対照円筒は同じように調製された。
【０１１０】
無胸腺ラット大腿部裂孔モデル
ここで採用された大腿部裂孔手術モデルは長骨修復を研究する気分正常状態のラットで広範に使用されてきた（６８、１２９、３４、１４７）。手短に言えば、ハーランヌード（Ｈｓｄ：Ｒｈ−ｒｎｕ）ラット（３２５ｇ）の両大腿部が前外側到達法により露出された。ポリエチレン固定板が４本のキルシュナー鋼線で各大腿部に取り付けられ、その着生骨膜と共に中央骨幹の８mmの横断分節が食塩水灌水下で回転骨切りバーを用いて除去された。各動物は次いで無細胞ＨＡ／ＴＣＰ円筒を一つの大腿欠損部に、ヒトＭＳＣＳ を負荷された同一の円筒を対側性欠損部に、またＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ立方体の皮下埋め込みを背に沿って受けた。
【０１１１】
放射線撮影
各時点で犠牲の直後に、すべての標本は高解像度ファキシトロン映像システムを用いて３５ｋＶＰで３０秒の露出で側臥位で放射線撮影された。
【０１１２】
定量組織形態計測および免疫化学
４、８および１２週での犠牲に際し、各タイプの最低３標本が放射線撮影後非脱石灰化組織学で処理された。縦方向切片は切断され、トルイジンブルー−Ｏで染色され、骨形成の定量評価が前に記載（６８）の通りライカ・クオンティメット５００ＭＣ映像分析ソフトウェアを用いて行われた。データはスチューデントｔ−試験により分析された。皮下移植試料はホルマリンで固定され、脱石灰され、パラフィンに包埋され、連続して切開され、また同様に染色された。各時点での一匹の動物からの肢もまたヒト細胞をラット細胞から識別するモノクローナル抗体６Ｅ２により免疫染色のために調製された（５４）。非脱石灰寒冷切片は６Ｅ２上澄み、あるいは関係のない一次モノクローナル抗体対照（ＳＢ−１）（１０）で保温され、次いでリン酸緩衝食塩水で１：５００に希釈されたＦＩＴＣ−共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ジブコ）で保温された。
【０１１３】
生物機械学試験
移植１２週後、７匹の実験用動物および６匹の非手術対照動物が前に記載（８１）の通り大腿部のねじり試験のために犠牲にされた。固定板および付着軟組織は除去され骨の骨幹は包埋された。標本は注文製ねじり試験装置で外側で回転され、不全負荷および剛性は記録され、また、データは事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験で一方向ＡＮＯＶＡにより分析された。
【０１１４】
結果
ＭＳＣ培養および試験管内骨形成分化
ヒトＭＳＣ培養は確立され、７日までに培養皿の表面に特徴あるコロニーを形成した。１４日に継代培養された一次コロニーは新しい皿に一様に付着し、それが〜８５％密集になるまで追加の７日間分裂を許された。継代細胞はその特徴的な紡錘形形態を示し（図６Ａ）、また一様に分配されて平板全体にわたりＭＳＣの均一な分裂を生じた。この第一継代から誘導された細胞は前に述べた通り移植片調製のために使用され、アリコートがその試験管内骨形成能を確認するために使用された。
【０１１５】
これまでの研究（１２、６４、１３）で記載されているように、ＯＳで培養されたＭＳＣＳ は紡錘形から立方骨への細胞形態での劇的な変化を受け、それはアルカリ性ホスファターゼ活性および骨ヒドロキシアパタイトに富んだ細胞外基質の生産の増加を伴っていた（図６Ｂ）。アルカリ性ホスファターゼ活性の著しい増加がＯＳ処置の４日後に観察され、また最大の活性が８日に生じ、次いで１６日までに減退した（図６Ｃ）。このＯＳ培養のアルカリ性ホスファターゼ減少の遅れは鉱物質沈着の増加および骨細胞への細胞の末端分化と相関する。カルシウム沈着はフォン・コッサ染色あるいは対照培養における感受性比色分析定量カルシウム検定のいずれにも検出されなかったが、一方図６ＣはＯＳと共に成長したＭＳＣＳ がかなりの量のカルシウムを１２日（６０±５．１μｇ／皿）および１６日（９８±５．０μｇ／皿）までに沈着させた。
【０１１６】
異所性ＨＡ／ＴＣＰ移植片でのＭＳＣ媒介骨形成
無胸腺ラットの皮下空隙部に移植されたヒトＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ立方体は４週で骨形成の証拠を示したが、かなりより多い骨が８週および１２週で孔内に存在した。移植１２週後でのＭＳＣ負荷立方体からの代表的な切片は図７で示される。骨形成は立方体の孔内に生じ、移植片を貫通する血管要素と関連している。このような血管形成は新骨形成にとっては必須であり、何故なら骨芽細胞の分泌活性が血管系により案内される指向現象であるためである（２５）。前に論証（３２、５４）されたように、ＭＳＣＳ なしで移植された立方体は決して骨を含まず、線維組織および血管のみで充填されていた。
【０１１７】
骨切り術モデルおよび放射線撮影
図８Ａはこの研究で使用された分節欠損部モデルを示す。大腿部の上部にあるポリエチレン固定板は８mmの骨幹欠損部の創出に続く安定性を提供する。どの動物も研究課程全体にわたって固定の機能停止あるいは他の術後合併症を経験しなかった。これまでの研究は生物活性材と共に移植されない大腿部欠損が骨を欠いている線維性偽関節を生じさせることを立証した（６３、３４、１４７）。高解像度ファクシトロン放射線写真は移植片および周辺宿主骨内で生じる微妙な変化を認識するのに十分な清澄さと詳細を提供した。移植１２週後に回収された２グループからの大腿部の代表的な放射線写真は、ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ円筒（図８Ｂ）対無細胞円筒（図８Ｃ）を受けた動物に、かなりより多い骨があることを示している。放射線密度の増加および明白な孔構造の閉塞は移植片の孔内で新骨形成の目安として使用された。移植片の組み込み、すなわち癒合は４週では一般に観察されなかったけれども、８週で移植片と宿主の間の放射線密度骨架橋の続く形成はインターフェイスを完全に遮蔽した。８週までに、ＭＳＣ負荷移植片はかなりの骨を孔内に含み、移植片の末端で宿主骨を組み込まれた。１２週で癒合は完全となり、追加の骨が孔で明白となった。固定板に沿った仮骨形成がある試料で観察され、同様に大腿部の内側面に沿って通常存在する骨の不定期の偏心的骨片にも存在した。細胞を持ちおよび持たないある標本は移植片の芯内に亀裂を含んでいた。
【０１１８】
免疫細胞化学評価
抗体６Ｅ２での免疫細胞化学染色は、４週で移植片の孔内にある事実上すべての細胞がその表面で反応性であり、また従ってヒト発生源のものであったことを示している（図９Ａ）。移植片の直外縁に沿って、宿主ラット細胞はヒトドナー細胞と混ぜられ、しかし増加した細胞の表面から離れた距離にあるため、ドナー細胞の表示は急激に低下した。免疫染色されていないこれら周辺細胞の存在は同じく立証された抗体の負の対照として役立つ。位相差顕微鏡写真（図９Ｂ）で黒に見えるセラミック材料自身は高水準の自然蛍光を示す。６Ｅ２抗原の鋭敏な感受性、すなわち我々が使用するのが必要とされた抗体の相互作用は凍結切片を緩め、それは不幸にも免疫染色のためにこれら石灰化組織標本を処理する我々の能力を制限した。一方で我々は４週試料（ここで示される）の満足すべき凍結切片を得ることができたが、かなりより多い骨を含む後期の試料からの切片を調製することはできなかった。
【０１１９】
組織学評価
トルイジンブルー−Ｏ−染色試料の分析は放射線撮影により行われた観察を確認した。１２週で回収された移植片グループの代表的な切片の顕微鏡写真が図９で示される。ＭＳＣＳ 負荷された移植片の大抵の孔は８週までにかなり新しい骨を含んでおり、この骨再生の過程は１２週の評価期間を通して続けられた（図９Ｃ）。８週ではＭＳＣＳ の負荷が危うくされたかもしれなかったいくつかの分離した区域を除き殆どすべての孔は新骨を含んでいた。生物機械試験に続く肢評価は、骨折が横断あるいはらせん性のものであり、図９Ｃで見られるように軟骨あるいは適度の量の骨を含む中央領域を通じて一般に増殖した。再生過程の間、かなりの新骨形成が宿主と移植片の間のインターフェイスで生じ、連続した骨の範囲が欠損部を横断して存在した。新しい網状化で薄層化した骨は１２週で宿主の皮質の切断端部と密接に接触しているのを見ることができ（図９Ｅ）、またこの癒合の領域は移植片の孔全体にわたり形成された骨と隣接している。ＨＡ／ＴＣＰのより深い領域（図９Ｆ）では、孔への新骨および血管系の充填は明らかである。
【０１２０】
ＨＡ／ＴＣＰのみで供給された欠損部では、移植片の孔は１２週でも線維組織で主として充填されていた（図９Ｄ）。多くの試料は宿主−移植片インターフェイスで適度の組み込みの証拠を持ち、この代表的な移植片の一端部では（図９Ｄ）、宿主誘導骨内膜骨が骨伝導の結果として担体の髄管に進出しているのが見られる。無細胞セラミック担体はいずれも移植片の孔全体にわたり骨を含んでいなかった。
【０１２１】
組織形態計測評価
前記の定性的結果は表３で提出された組織形態計測データで示される。
【０１２２】
【表３】
2006158975.tif 000004
【０１２３】
表３、ヒトＭＳＣＳ あるいもしくは無しでセラミック担体を移植された無胸腺ラットの分節欠損部を貫通する縦方向切片が骨含有量を組織形態計測で評価された。結果は４週および８週での各グループの３実験肢、および１２週での各グループの８実験肢の平均値±標準偏差を表す。＊各時点での担体のみと比較したｐ＜０．０５。
【０１２４】
ＨＡ／ＴＣＰ移植片で存在する骨は主として宿主皮質の切断端部からの骨内殖を表す。４週およびそれ以上で、ＭＳＣ負荷試料は無細胞グループよりも著しく多い骨を含み、移植片内の平均骨分画は時間を追って増加し、それぞれ８週および１２週時点では２６．５％および４６．６％に到達した。この８週での骨分画増加は同時点で無細胞移植片で測定されたものよりも２．３倍高く、また１２週では４週のいずれの条件で観察されたものよりも２３倍以上高い。ＨＡ／ＴＣＰ担体の分画量は一定に留まり、組織形態計測のための内部対照として役立った。
【０１２５】
機械的検査
年齢および重量組合せ対照動物からの１２個の実験用大腿部および１１個の無傷大腿部が移植後１２週にねじり試験された。個の実験用肢は試験されなかったがそれはひどくもろかったためであった。治癒欠損部の概略の検査は大抵の標本で遠位内反回転変形を明らかにした。表４はねじり力、剛性、および吸収された全エネルギーによる機械的試験結果を要約したものである。
【０１２６】
【表４】
2006158975.tif 000005
【０１２７】
表４、未手術年齢組合せ対照（無傷対照）、あるいはその分節欠損部がＨＡ／ＴＣＰ担体のみ（担体のみ）もしくはＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ（担体＋ＭＳＣＳ ）で移植された動物からのラット大腿部試料の機械的試験データ。これらの結果は各実験移植片グループからの６肢、および対照動物からの１１肢の平均値±標準偏差を表す。移植１２週後各標本は採取され、骨端部は包埋され、試料は破損するまで縦軸に沿って６度／秒の外側回転で試験された。パラメータそれぞれの一方向ＡＮＯＶＡはｐ＜０．００１でグループの間に著しい差があることを示した。更に各グループは事後スチューデント−ニューマン−キュールス試験で測定された強度および剛性（ｐ＜０．０５）で他のものとは著しく異なっていた。
【０１２８】
これらの結果は無細胞担体試料と比較してＭＳＣ負荷試料では強度、剛性および吸収されるねじりエネルギーのそれぞれ１１５％、１４５％および１１２％の増加を示す。３グループすべては破損トルクおよび剛性で相互に統計的に異なることが発見された。
【０１２９】
議論
ここで提示された結果は、精製培養拡張ヒトＭＳＣＳ が骨修復のために十分に確立されたモデルで臨床的に著しい骨欠損部を治癒できることを論証する。一方でヒトＭＳＣＳ の骨形成能が試験管内分離ＭＳＣＳ の研究（１２、６４）と同じく皮下移植片での新骨形成により証明（５４）されるが、これはヒトＭＳＣＳ が修復を必要とする正常部位で骨を形成できるということの最初の論証である。ＭＳＣＳ と多孔ＨＡ／ＴＣＰ担体の組合せは組織形態計測上および生物機械学的に担体のみよりも優れた再生能を持つ。この調査報告はヒトの整形外科欠損の治療のための自己由来ＭＳＣ治療の臨床利用への道を開く。
【０１３０】
８週で治癒骨の放射線密度の漸進的増加は処置肢の組織学的観察に対応する。４週でセラミックと結合した細胞はヒト発生源のものであり、移植片を取巻く細胞は宿主からのものであることを免疫細胞化学は証明する。８週およびそれ以上で、骨はドナーＭＳＣＳ により横たわり最終的には吸収され正常な改造配列（２４、４７）を通じて宿主細胞から誘導される骨により置換される。この骨欠損部を再生する過程において、骨形成が軟骨内カスケードによるよりもむしろ間葉細胞の骨芽細胞への直接転換により生ずることに注目することは重要である。この観察は動物あるいはヒトＭＳＣＳ を負荷された移植片での骨形成についてのこれまでの研究（３２、７０、５４、６８）と一致する。再生過程が続くにつれて、セラミックの孔は増加した量の骨で充填され、それは移植片の壁あるいは現存する骨に横たわり、また造血要素および宿主誘導ＭＳＣＳ を含む新骨髄島の参加および確立のための入口を提供する侵入血管系により指向される。
【０１３１】
骨再生の速度は同系ＭＳＣＳ を移植された気分正常ラットで観察されたものより低く（６８）、これは免疫無防備状態ラットがヒトＭＳＣＳ の骨形成能を評価するための理想的な宿主ではないことを示唆している。これは移植片の異種性および増加ナチュラルキラー細胞活性に帰因するものであり、それはその欠失Ｔ細胞媒介免疫（１２３）でうまく対処する動物の埋め合わせメカニズムである。にも拘らず著しく多い量の骨が担体のみを受ける肢と比較してＭＳＣＳ を受け入れた欠損部で形成された。宿主−移植片癒合の範囲はＭＳＣ負荷移植片でより大きく、これは移植ＭＳＣＳ および宿主誘導細胞の組み合わさった貢献を反映するものと考えられる。
【０１３２】
この実験モデルで骨を再生するヒトＭＳＣＳ の能力は、脱灰骨基質、骨髄、精製あるいは組換え骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、同種異系移植片、セラミック、線維金属および遺伝子活性化基質（１２９、３４、１４７）と比較して優れている。組織正常骨のかなりの量を形成することに加えて、生物機械学的データは、１２週でのねじり強さおよび剛性が無傷対照肢の〜４０％であったことを示し、それは無細胞担体で観察されたものの２倍以上であり、また霊長類長骨欠損モデルの新鮮自家移植片を用いる骨修復についての類似の研究（２９）で達成されたものの２倍であった。
【０１３３】
最近、組換えヒトＢＭＰなどの成長因子が骨修復を刺激するために実験用欠損モデルに移植された（１４７、７８、２９）。組換えＢＭＰＳ は軟骨内カスケードを異所性移植片に導入することができるけれども（１４６）、正常部位で直接骨形成を再生産する能力は適切な担体の設計および選択と関連する問題で妨げられてきた。ＭＳＣ負荷セラミックで著しい骨再生を示す機械的データとは逆に、同じＨＡ／ＴＣＰ担体に送達されたＢＭＰは担体のみ以上の移植片強度を増加させなかった（１２６）。このセラミックの壊れやすい性質はそのゆっくりした吸収および複雑な多孔構造と組み合わさり、著しい骨形成の存在にも拘らず機械的強度が無傷肢以下に留まる理由を説明するであろう。加えて負荷を帯びる固定板の結果として、新骨の応力保護はまた治癒欠損部の強度を制限する。前にも示唆（１６）したように、骨支持ＨＡ／ＴＣＰ円筒の使用は骨幹欠損部の置換のための理想的な基質ではないと我々は考える。ＭＳＣＳ 送達のための最適生物基質担体の設計での努力が調査研究の活性領域である。
【０１３４】
培養拡張自己由来ＭＳＣＳ の移植は、新骨合成の原因となる細胞構造を直接送達する利点を提供し、またさもなければゆっくりしたステップで骨修復に導くことを妨げる。多分内因性ＭＳＣＳ の低い力価の故（７２、１２８、１４４、１１）で結合組織を再生する能力の低い患者においてもなお、これらの希有ＭＳＣＳ は分離されその骨形成能（１３）を失うことなく１０億倍以上培養拡張され、従って組織欠損を治癒する患者の能力を回復し高める。ここで提出される研究はＭＳＣに基づく細胞治療がヒトにある各種の組織欠損部の再構築に有用であることを示唆している。
【実施例４】
【０１３５】
ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ立方体の骨形成応答についての被覆の効果
この実験は被覆されていないＨＡ／ＴＣＰ立方体がＭＳＣ媒介骨形成を支持するフィブロネクチンあるいは自己由来血清被覆ＨＡ／ＴＣＰ立方体と同等であることを立証する試みとして行われた。
【０１３６】
材料および方法
フィブロネクチン、１％自己由来血清、１０％自己由来血清で被覆され、あるいは未被覆で残された標準ＨＡ／ＴＣＰ立方体がＭＳＣＳ で負荷され無胸腺マウスに皮下移植された。立方体は移植６週後に回収され脱石灰組織学方法により骨形成水準を検査された。実験は多数のヒトおよびイヌドナーで行われ重複マウスで実行された。
【０１３７】
結果および結論
すべての処置グループからのＭＳＣ負荷立方体は６週で著しい量の骨形成を示した。フィブロネクチンあるいは血清のいずれかでＨＡ／ＴＣＰ立方体を被覆したものは立方体内でのＭＳＣ媒介骨形成水準に何らの効果も与えなかった。予期したように無細胞対照ＨＡ／ＴＣＰ立方体は骨形成を持たなかった。前記の結果に基づいて、未被覆ＨＡ／ＴＣＰは骨修復／増強を行うためのＭＳＣＳ 送達にとって実用的な担体であると我々は結論する。
【実施例５】
【０１３８】
イヌ脊椎固定モデルに使用される骨移植材料の比較
ここで報告されるデータは脊椎固定に利用のために現存する移植材料を改良する手段として、新鮮骨髄および培養拡張精製間葉幹細胞の価値に関して重要な情報を提供する。この技術は骨移植材料および手順の効力において著しい改善に帰着する。更に自原性骨移植の採取を必要としない骨移植手順の使用は骨移植手順の罹患率を著しく減少させるであろう。
【０１３９】
材料および方法
我々は小動物で有効性を証明された成長骨移植材料の特に評価と比較のためにイヌ後分節脊椎固定モデルを開発した。イヌ骨は齧歯類よりもヒト骨にとってより良いモデル（３５）であり、ここで議論された欠損モデルと関連する多くの制約を回避する。より大きな移植量および臨床移植手順の総合部位（脊椎）の使用は著しい利点である。各動物の３個の材料の試験は動物間の変異の制御を可能にし、必要とされる動物の数を減少させる。モデルは各融合部位が内部固定からの人為構造なしで機械的に試験される。不全部位での融合塊の断面区域の癒合得点は材料間で比較のための感受性手段となることを証明した。破壊試験の前の各融合部位の定量ＣＴ映像分析は最初の検査に応答して展開された。これは融合塊量、平均電子密度（無機質化）、および断面区域の定量分析を可能にする。
【０１４０】
このモデルを用いて、タイプＩウシ筋原繊維皮膚コラーゲンおよび０．５−１．０mm径顆粒の二相性リン酸カルシウムセラミック（ヒドロキシアパタイト６０％、リン酸トリカルシウム４０％）よりなるコラーゲン／セラミック（ＣＣ）複合材料が移植材料としては効力がないことを我々は示した。単独使用ではそれは非移植欠損部と同然である。骨基質タンパク質の抽出物の追加あるいは自原性骨の追加は効力を改良した（ｐ＜０．０１）が、その結果は純粋な自原性骨に劣っていた（ｐ＜０．０１）（５５）。我々は更にこのコラーゲン／セラミック複合材料の自原性骨への「骨移植拡張材」としての追加が自家移植効率を著しく減少させることを示した（ｐ＜０．０１）（５８）。興味深いことは、ＣＣ複合材料から生じる上首尾の融合は自家移植から生じる融合と類似の機械的性質を持ち、残存非吸収セラミック顆粒が融合塊の材料物性に何らの副作用ももたらさなかったことを示している。
【０１４１】
我々は精製基質タンパク質、骨誘導因子（ＯＩＦ）の送達システムとしてコラーゲン・コーポレイションのコラーゲン／セラミック複合材料を用いて、脊椎固定研究において移植性能を高める手段として骨髄処理を評価した。この基質は自原性海綿骨（ＡＢ）、新鮮吸引骨髄（ＡＢＭ）、あるいは遠心分離で１０倍濃縮された新鮮骨髄有核細胞のいずれかと軟膜分離物（ＢＭＣ）の５０：５０で混合された。不幸なことには、研究が完了して、ＯＩＦが活性サイトカインでなかったことが発見された。ＯＩＦの初期の調製物はＢＭＰＳ の汚染により誘導性であった。その結果全体の固定速度は低かった。しかし、ＡＢＭとＢＭＣが比較された時骨髄濃縮物から改良された結果の強い傾向が存在した（ｐ＝０．０６、集束データのためのロジスティック回帰モデル）。不幸なことに、この重要な質問に対する我々の解答能力は基質の貧弱な基線性能により制限された。これはこのプロジェクトにおける骨髄移植の評価のために有効で信頼すべき基質の選択の重要性を強調する。この実験における各材料に対する０から４までの固定得点の発生率は表５で提示される。
【０１４２】
【表５】
2006158975.tif 000006
【０１４３】
これらの研究は、後分節イヌ脊椎固定モデルが移植材料の比較のための感受性に富み信頼すべき工具であることを示す。非移植部位は治癒が劣り癒合得点も低い。自原性海綿骨移植は非常に有効ではあるがすべての移植部位を治癒しない。この自原性骨の性能のスペクトルは自原性海綿骨と同等あるいはそれ以上に実現する材料の評価を可能にする。癒合得点および機械的試験は材料を比較するのに有効に使用することができまたそうされてきた。高解像度ＣＴ映像分析は柔軟で定量および再生産できる重要な非破壊評価工具を加える。このモデルは骨移植材料の評価のための新しい標準を設定する。
【０１４４】
後分節イヌ脊椎固定モデル
このプロジェクトの特異的な目標は３種の移植材料：自原性間葉幹細胞を負荷した顆粒セラミック基質；新鮮骨髄を負荷した顆粒セラミック基質；および新鮮骨髄および自原性間葉幹細胞を負荷した顆粒セラミック基質である。
【０１４５】
１２匹のオスビーグル犬（生後１０−１４ケ月、１２−１４ｋｇ）が実験に使用された。局在化された融合が３ケ所の脊椎固定部位、Ｌ１−２、Ｌ３−４、およびＬ５−６で行われた。各部位は１個の可動分節で分離された隣接脊椎突起を固定する二重板を用いて内固定される。各動物は評価中の３種の材料の一つで移植される。手術の偏りの可能性を制限し３個の移植部位それぞれの材料分布を保証するために、１２枚のカード、３部位の３種の材料の６個の可能な組合せの２組が各実験の初めに用意され、封筒内に置かれた。部位割当ては次いで部位調製が完成する後で、盲くじ引きで手術時に行われる。内固定は脊椎突起のいずれかの側に置かれた板を用いて各分節に適用される。外固定は使用されない。すべての動物は１２週に安楽死され、各切除脊椎の術後側面ファクシトロン放射線写真は固定の完全性を評価するために撮影される。板の除去の後、高解像度ＣＴ映像が各脊椎でＬ１−Ｌ６からすべての分節で得られる。個々の融合分節は不全を機械的試験され癒合を物理的に評価される。材料間の比較は癒合得点、ＣＴデータの定量映像分析、および各融合で観察された機械的物性に基づいて行われる。
【０１４６】
脊椎固定３週前に各動物は短時間作用性ＩＶ鎮静薬の下で無菌技術を使用し左腸骨稜からの骨髄吸引を受ける。これらの試料は次いで間葉幹細胞を分離増殖するために輸送されるであろう。
【０１４７】
手術当日、研究下の各動物は３種の異なった水準で脊椎固定を受ける。間葉幹細胞は供給され、また新鮮骨髄が再び採取され、今回は右腸骨稜から採取される。各材料複合材は次いで手術時に調製される。手術床の準備および内固定の適用に続き、２ｃｃ量の各材料が各動物の１レベルで移植される。このように各動物は材料それぞれで１融合部位を持つ。材料は手術偏りを予防し部位による材料の均一な分布を保証するために無作為抽出実験記録に従って分配される。
【０１４８】
初期骨髄吸引およびＭＳＣ調製
無菌皮膚調製に続き、＃１１刃を使用して小さい（３mm）突き刺し切除部が作られる。リー−ロック骨髄吸引針（ミネソタ、ミネアポリス、リー−ロック・インコーポレイテッド）が骨腔に進入する。閉鎖膜は除去される。２ｃｃ量の骨髄が次いで速やかに１ｃｃのヘパリン化食塩水（１０００単位／ｍｌ）を含む１０ｃｃ注射器内に吸引される。注射器は取り外され混合を確実にするため数回逆にされる。続いて吸引液が同じ切開部および同じ皮膚孔を通じて同一の技術を用いて採取され、但し少くとも１cm離れた骨髄内部位に針尖を向けて行われる。止血を確実にするため圧を３−５分かける。包帯は必要でない。術後の固定あるいは制限は必要でない。
【０１４９】
ＭＳＣ分離および培養
腸骨稜骨髄吸引液（１０ｍｌ）がプロポフォル麻酔（ディプリバン１％、デラウェア、スチュアート・ファーマシューティカルズ）の下で１５−２５ｋｇの無作為源のイヌから得られた。骨髄は凝固を防ぐために７５００単位のヘパリン（ニュージャージー、チェリーヒル、エルキンズ−シム）を含む１０ｍｌ注射器に引き込まれた。いくつかのイヌでは、骨髄は氷上に置かれ細胞培養施設に一晩かけて送達された。骨髄は低グルコースＤＭＥＭ内で１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）よりなる完全培地二量で混合された。骨髄の有核細胞分画は１．０６３ｇ／ｃｃパーコルクッションで密度分離に基づきＭＳＣＳ を富化された。培地５ｍｌ内で２億個の有核細胞が２０ｍｌのパーコル（ミズーリ、セントルイス、シグマ）上に注意深く層にされた。分離は４００ｘｇ、２０分の遠心分離で達成された。培地−パーコルインターフェイスで収集された細胞は次いで洗浄され、完全培地７ｍｌ内で１．６×１０４  細胞／cm２  の１００mmペトリ皿で、あるいは完全培地３２ｍｌ内で５．４×１０４  細胞／cm２  のＴ−１８５培養フラスコで平板培養された。細胞は５％炭酸ガス環境下で３７℃で保温された。４日の培養で非付着細胞は培養培地と共に除去された。培養物は週２回供給され細胞を０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡに５分露出して放出することで１０−１３日の間で継代された。細胞は続くすべての継代のため８×１０３  細胞／cm２  で再平板培養された。いくつかの実験では、追加の継代は細胞が密集に到達した時、典型的には平板培養の５−７日に行われた。
【０１５０】
脊椎固定手術手順
全気管内麻酔の下で正中後縦方向切開がＴ１０からＬ７まで行われる。切断焼灼法が脊椎突起Ｌ１からＬ６までの尖端を際立たせるために使用されパラ脊椎筋の骨膜下隆起が行われる。棘間靭帯および層間組織は黄色靭帯を維持するためＬ１−２、Ｌ３−４、およびＬ５−６間空で切除される。歯科用バーが助軟骨下骨のレベルまで小関節面軟骨を切除するため、および連続食塩水灌注下で隣接層状面の表面の皮質除去を実行するために使用される。神経腔への進入は避ける。部位調製が完了すると、食塩水浸漬ガーゼが融合部位に置かれ、創傷は被覆され、また浄化されていない助手がその動物への材料／部位割当てを含むカードを手探りで選択する。
【０１５１】
ジンマー・インコーポレイテッドから６０／４０の組合せで提供された多孔性ヒドロキシアパタイト／リン酸トリカルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）は軽く粉砕され１．０から２．５mm径にわたる粒子サイズを選択するように篩にかけられる。顆粒の無菌化に続き、１５００万個のＭＳＣＳ が３時間３７°セルシウスで３０分毎に撹拌される１ｃｃセラミックで保温される。前に記したように、移植グループは１）自己由来ＭＳＣＳ と組み合わされたセラミック顆粒、２）自己由来ＭＳＣＳ と吸引で得られた新鮮骨髄と組み合わされたセラミック顆粒、および３）新鮮骨髄のみと組み合わされたセラミック顆粒よりなる。
【０１５２】
すべての移植材料の調製に続き、材料は注意深くその適切な部位に配置される。約１ｃｃの各移植片が切除された小関節面および層間腔の領域を充填するために使用される。各移植片の残りは隣接薄片の背側面に積み重ねられる。
【０１５３】
各部位での固定が次いで行われる。各部位で１mmバーが遠位脊椎突起の中央領域に穴を開けるために使用される。３１６ステンレススチール板（０．１２５″×０．４″×１．４″）が隣接脊椎突起のどちらかの側に配置され、ステンレススチールボルトおよびナット（サイズ２−５６、０．５″長）を用いて尾部脊椎突起に固定される。各板の４個の対称穴は個々の部位で脊椎間の距離の変化に適応するために３個の可能な固定長を許される（０．７５″、０．９０″、および１．０５″）。各レベルでの頭蓋脊椎突起への固定は脊椎突起に穴をあけるために板の適切な穴を貫通する穴あけにより、また第２ボルトおよびナットを通すことで達成される。２個のボルトは脊椎突起を砕くことなく固く締められる。第２固定ナットは次いで緩みを防ぐため各部位に適用される。脊椎創傷および自家移植片ドナー部位は次いで筋膜深くオー−デキソン・プラス縫合糸で閉じられ、２−０デキソン・プラスの皮下縫合糸を遮断され、次いでステープルで留められる。
【０１５４】
無菌皮膚調製に続き、小さい（３mm）突き刺し切開部が＃１１刃を用いて作られる。リー−ロック骨髄吸引針（ミネソタ、ミネアポリス、リー−ロック・インコーポレイテッド）が骨腔に進入する。閉鎖膜は除去される。骨髄は次いで１０ｃｃ注射器に速やかに吸引され、顆粒状セラミック基質と混合され凝固形成ができるように１０−１５分固められる。過剰の液は次いでガーゼスポンジで押し出され新鮮骨髄を含浸された２ｃｃ量の基質が移植される。
【０１５５】
動物の保護
研究動物は研究室保護の原理および研究室動物の保護および使用のためのガイド、国立保健研究所公報８５−２３、１９８５年に基づいて保護される。
【０１５６】
各動物は手術前ペニシリンＧ５０万単位ＩＭの予防抗生物質を受け、術後５日に１日当りアンピシリン２５０ｍｇ  ｐｏを受ける。アセプロマジンおよびタイレノールは手術中の疼痛のために使用される。外部の固定化は使用されない。動物は檻に術後３日収容され、次いで彼等が毎日運動する斜面に移動される。
【０１５７】
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【０１５８】
標本採取
１２週に動物はペントバルビタール過量投与により安楽死され腰脊椎が無傷で採取される。側面ファクシトロン放射線写真が固定の完全性を立証するために得られる。板除去の後、個々の分節は軟組織を綿密に洗浄され、融合塊を損うことなくまた標本の乾燥を防ぐために細心の注意が払われる。分節は次いで歯科矯正用レジン（オハイオ、クリーブランド、ミーア・デンタル・サプライ）に入れられ、二重シールプラスチック袋で−２０℃で凍結される。
【０１５９】
融合部位の定量ＣＴ映像分析
融合塊の定量評価はヘリカルＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および自動化三次元映像処理技術を用いて行われた。
【０１６０】
各融合部位での定量計測は１）融合塊量、２）中央ディスク横断面で測定された区域、および、３）融合塊の無機質化密度を含む。
【０１６１】
走査はソマトーム・プラス４０ＣＴスキャナ（シーメンス・メディカル・システムズ）で行われる。標本はテーブル行程の方向に垂直の頭蓋尾部軸で配置される。この位置付けにおいて、脊椎骨間空間は走査面に垂直に位置付けられる。これは軸横断面で起こる偽関節の特性を見失う機会を減らし脊椎骨間空間の正中線をより正確に確認することを可能にする。走査は１２０ｋＶｐ、２１０ｍＡ、１秒ヘリカルモード、２mm視準、およびテーブル速度２mm／秒、３０秒で行われるであろう。これは２mm切片厚および１mm２  ピクセル区域の映像を生じる。映像は次いで骨アルゴリズムおよび１ｍｎのイメージ対イメージオーバーラップを用いて再構築される。これは（すなわち１mm３  のボクセルサイズ）で利用できる最高の可能な空間解像度を提供する。シーメンス骨無機質密度幻像は骨無機質化密度の定量のための参考例を提供するために各標本の下に置かれる。
【０１６２】
骨および軟組織ＣＴ値はたやすく区別できる（ＣＴ骨−１５０〜１０００、ＣＴ軟組織−０〜２０）。従って再構築量データセットの三次元分節化は各二次元薄片の基本的自動化閾値アルゴリズム、次いで薄片間の接続性アルゴリズムを用いて行われる。一度三次元データセットが分節されると、融合塊の量は対象となる特異的な領域で測定され、解剖学基準標識で定義される。使用者は対象となるレベル、および対象となる部位の上および下のレベルで左および右の神経孔の背側最高点を定義する２点を選択する。使用者はまた、椎間円板の中点を確認する。三次元データセットを操作し視覚化する双方向装置はジーエル・ライブラリーおよびシリコングラフィクスワークステーションで利用できるアイリス・インベンター・トゥールキットを用いて展開される。
【０１６３】
融合塊の量は対象となる特定領域内の分節ボクセル（骨）を合計し、この合計量を適切なボクセル量（１mm３  ）で乗じて計算される。融合塊の領域は中央融合薄片にある分節ピクセル（骨）の量を合計し、この合計量を適切なピクセル区域（１mm２  ）で乗じて中央融合横断面で測定されるであろう。平均無機質化密度は全融合塊で計算され幻像密度に対して参照される。中央円板横断面での骨無機質密度の二次元地勢図が提供される。各分節の対象となる領域からの骨および骨横断面図の最初の量は隣接正常分節にある同一領域を測定することで推定できる。これは各融合分節からのデータを標準化するために使用される。
【０１６４】
この定量分析のためのソフトウェアは４個のモジュール、すなわち三次元分節性、横断面を調べ基準点に印をつけるための動画化、対象となる長方形領域の計算および骨融合の定量測定、ならびに三次元での再構築データを調べるための双方向表示モジュール、を必要とする。
【０１６５】
機械的試験
試験の前に、各標本は室温で２４時間解凍される。試験は注文製４点曲げ装置を用いるＭＴＳテスター・バイオニクス・システムで行われる。３回の正弦ならしサイクルの後、負荷置換データが屈曲−延伸および左右曲げで非破壊的に収集される。次いで破壊試験が８mm／秒で傾斜機能を用いて右曲げで行われる。曲げが破壊モードとして選択されてきたがそれは曲げ剛性がこれまでの研究（９４）で癒合状態ともっとも密接に相関することが発見されたためであった。負荷置換曲線は剛性、最大負荷、破壊への置換、および破壊までの全エネルギーを誘導するために使用される。
【０１６６】
癒合得点
機械的試験の直後に、骨折標本の表面は金属プローブを用いて検査される。骨折表面の両側面を比較することにより、癒合の度合は領域格子システム（図１１）に基づいて０から４まで得点を与えられる。４の得点は小関節面および全薄片両方が完全に融合しているものと定義される。１．５点が各小関節の半分あるいは隣接薄片面の４個の四分円のいずれかに加えられる。従って０、１、２、３および４の得点はそれぞれ重合量の横断区域のおおよそ０、２５、７５および１００％の癒合を表す。得点付けは標本を一緒に検討する２人の観察者の同意によるものであり、彼等は各部位で移植される材料に関して伏せられたまま行われる。
【０１６７】
脊椎固定癒合得点およびＣＴデータの統計分析
癒合得点およびＣＴ創出データは部位およびもしくは材料効果に帰因して結果が統計的に異なるかどうかを決定するために分析される。このデータは「不完全」と考えられる、というのは動物内の各部位でたった一つの材料のみを試験できるからである。従って、部位および材料は欠けている観察を除いて繰返される因子である。実験設計の欠けているデータプロファイルおよび同一動物内での観察の可能な相関に適応するために繰返された計測データの退化モデルが使用される。このモデル化戦略はジーガー他（１５０）およびオウ他（１０８）により記述された一般化推定方程式（ＧＥＥ）アプローチを使用する。一定のイヌに対する癒合得点は潜在的に相互に独立してはいないため、独立性の作用共分散構造および強固な共分散推定値がモデルを適合するのに使用される。共分散構造は部位および材料効果のための退化係数に影響を与えることなしで無視することはできない。強固な共分散推定値を使用するスチューデントＴ検定がペイク（１１２）により記述された材料および部位の間の特異的な比較のために使用される。癒合得点は主要な結果のパラメータで残るが、ＣＴデータの分配性能は結局統計モデル化戦略を指示する。
【０１６８】
脊椎固定機械試験データの統計分析
機械パラメータは癒合得点により強く影響される。従って機械試験は第一には異なった材料で誘導される完全な固定（大きな断面区域−癒合得点３．５から４．０）で形成される骨の材料物性と比較する手段として、第二には結果のパラメータとしてこのモデルで使用される。完全な癒合の選択は類似の慣性モーメントを持つ固定の比較を可能にする。部分固定における骨幾何学（構造）の複雑性および移植部位での非結合軟組織の品質での広い局部変化は部分癒合の有用な分析を妨げる。この戦略の選択は、癒合得点が高い場合を除いて、一定の移植材料より形成される骨の材料物性が臨床的には重要でないという我々の実践的な信念を反映する。スチューデントｔ検定は最初の順位比較に使用された。対分析はもっとも適しているが比較される２種の材料の癒合比率が高くない限りそれは不可能である。
【０１６９】
大型イヌでの脊椎固定研究の中間報告
この出願に記載されているＭＳＣ負荷セラミック顆粒を創り出す技術を用いて顆粒セラミック１ｃｃ当り１５００万個のＭＳＣを保温する時、提供されるＭＳＣＳ の９５％以上が３７°セルシウスで３時間保温期間の後セラミック材料に付着する。ＭＳＣ−セラミック材料は術後１２週まで移植材料の何らの移行の証拠もなく創り出された手術用欠損部位にうまく適合する。移植の時点で新鮮骨髄と組み合わされたＭＳＣＳ ありもしくはなしのいずれかの試料は柔らかな凝固を形成し、それは緩やかにセラミックを被覆した。いずれの試料の調製あるいは移植でも技術的問題に直面しなかった。各動物から誘導された細胞の分析は試験管内骨形成能および標準生体内異所性移植検定で著しい骨形成を実証した。
【０１７０】
すべての動物は術後１２週で殺された。平面フィルム放射線写真はＭＳＣＳ 移植片を受け入れた殆どすべての動物で骨癒合の存在を示している。手術部位を通じて１mmの間隔で得られた２mm厚ＣＴ走査からの三次元再構築は新鮮骨髄のみを含む移植片と比較するとＭＳＣＳ を伴う移植片を含む領域でより大きな融合塊があることを示している。ＭＳＣＳ を含む試料の融合得点も新鮮骨髄のみを含むものよりも高かった。更にこれらの融合得点はまた組み換えヒトＢＭＰ−２を含む類似の様式で調製された試料を使用する従来の研究で達成されたものよりも高かった。
【実施例６】
【０１７１】
吸収可能コラーゲン含有スポンジで骨髄を使用する骨欠損修復
この研究の目的は確立された動物モデルで臨床的に著しい骨欠損部を治癒する骨髄およびもしくは間葉幹細胞（ＭＳＣＳ ）の効力を示すことであった。
【０１７２】
材料および方法
研究では重さ約３２５グラムのフィッシャー３４４ラット（マサチューセッツ、ウィルミントン、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ）が使用された。８mm長の左右相称大腿部裂孔が各大腿部に創り出された。内固定板が４本のキルシュナー鋼線で適用された。比較のためのグループは下記の一つで個別に処理された。
【０１７３】
（１）ジェルフォームＲ  無菌スポンジ（ミシガン、カラマズー、アプジョン）；
（２）ジェルフォームＲ 無菌パウダー；
（３）末梢血血餅；
（４）末梢血血餅プラス四本骨から誘導された骨髄；
（５）四本骨から誘導された骨髄を含むジェルフォームＲ  スポンジ；
（６）血餅を提供する新鮮末梢血の存在および不在下でジェルフォームＲ プラス１本骨から１本骨の半分までの変化する量の骨髄。
【０１７４】
この動物系では、４本の骨からの新鮮骨髄は約１億５，０００万個の細胞を産出し、一方１本の骨の半分からの新鮮骨髄は約２，０００万個の有核細胞を産出する。各グループは最小で３匹の動物よりなり、そのすべては望ましい終点を得るために術後６週で犠牲とされた。何匹かの動物は移植３週の中間点で高解像度ファクシトロン放射線撮影を受けた。すべての動物が犠牲とされた６週時点で、肢は除去され、放射線撮影され、非脱石灰組織学評価のために調製された。
【０１７５】
新鮮末梢血血餅の存在あるいは不在下で新鮮骨髄と組み合わされたジェルフォームＲ スポンジの取扱いは望ましくまた殆ど同等であった。
【０１７６】
結果
６週で動物の犠牲に続く放射線写真の評価は、ジェルフォームＲスポンジの移植された動物あるいは新鮮骨髄および末梢血餅で移植された動物のいずれでも欠損領域で骨が存在しないことを明らかにした。欠損部の切断端部で新骨の最小骨内膜固定が移植片だけでは存在しなかった歴史的対照の場合と同じく観察された。それとは逆に、末梢血餅の不在あるいは存在下でジェルフォームＲ スポンジプラス４本骨あるいは１本骨からの骨髄を受けた動物は移植の領域で強力な骨形成治癒応答を示した。末梢血餅の存在下でジェルフォームＲ スポンジおよび、１本の半分骨からの骨髄で移植された動物はほんの限られた量の骨形成を示した。最後に末梢血餅の存在下でジェルフォームＲ スポンジおよび１本の半分の骨からの骨髄を移植された動物は欠損領域で骨のないことを示した。すべての標本の組織学分析は高解像度放射線写真に基づいて行われた観察を確認する。骨髄細胞で負荷されたジェルフォームＲ スポンジの試料における新皮質の形成は感動的であった。組織学的評価は更に手術６週後に移植部位で残存ジェルフォームＲ 材料が保持されなかったことを示している。１本骨からの骨髄で負荷されたジェルフォームＲ スポンジの試料は髄管内の成長する造血要素の島を立証した。宿主−移植片インターフェイスは無傷であるように見える。
【０１７７】
要するに、ジェルフォームＲ スポンジで移植された受容体ラットのそれぞれで同系骨髄の著しい骨形成応答は著しい骨欠損部の修復にこの細胞および基質組合せが適していることを示している。
【０１７８】
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【０２２６】
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８２．リアン、Ｃ．Ｔ．；バーンズ、Ｊ．；シーダー、Ｊ．Ｇ．；カルタッキオ、Ｈ．Ａ．；ボランダー、Ｍ．Ｉ．；ジェフリー、Ｊ．Ｊ．；およびローダン、Ｇ．Ａ．：年老いたラットにおける損傷骨活性：細胞および分子レベルでの変化。骨１３：４３５−４４１、１９９２。
【０２６０】
８３．リーバーゴール、Ｍ．；ヤング、Ｒ．Ｇ．；小沢、Ｎ．；リース、Ｊ．；デービー、Ｄ．Ｔ．；ゴールドバーグ、Ｖ．Ｍ；およびキャプラン、Ａ．Ｉ．：複合骨移植片における細胞操作およびＴＧＦ−§の作用。骨形成および修復。ブライトン、Ｃ．，フリードランダー、Ｇ．，およびレーン、Ｊ．（編）、整形外科手術アメリカン・アカデミー、ローズモント、イリノイ、３６７−３７８、１９９４所収。
【０２６１】
８４．リンドホーム  ＴＳ、ラーニ  Ｐ、およびリンドホーム  ＴＣ．：ラビットの実験的脊椎固定における骨髄間葉細胞の脱無機質皮質骨基質に対する応答。臨床整形外科および関連研究１５０：２９６−３０２、１９８８。
【０２６２】
８５．リンドホーム  ＴＳ、およびユーリスト  ＭＲ．：骨髄および骨基質の複合移植片への導入による新骨形成の定量分析。臨床整形外科および関連研究１５０：２８８−３００、１９８０。
【０２６３】
８６．ローベル  ＴＰ、ドーソン  ＥＧ、ニルソン  ＯＳ、およびユーリスト  ＭＲ．：イヌにおける骨形態形成タンパク質での脊椎固定の増強。臨床整形外科および関連関連研究２４３：２６６−２７４、１９８９。
【０２６４】
８７．マジャンダー、Ｍ．Ｋ．；ヘインズワース、Ｓ．Ｅ．；ティード、Ｍ．Ａ．；マーシャク、Ｄ．Ｒ．；キャプラン、Ａ．Ｉ．；およびガーソン、Ｓ．Ｌ．：培養拡張ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣＳ ）はサイトカインを発現し試験管内造血を支持する。血液８６（１０）：４９４ａ（１９９５）。
【０２６５】
８８．マラバル．Ｌ．；モドロウスキ、Ｄ．；アシュワニ、Ｇ．；およびオーバン、Ｊ．Ｅ．：ラット骨髄間質細胞培養での試験管内骨形成中の骨関連タンパク質の細胞発現。細胞生理学ジャーナル１５８：５５５−５７２、１９９４。
【０２６６】
８９．マニアトポーラス、Ｃ．；ソデック、Ｊ．；およびメルヒャー、Ａ．Ｈ．：若い成長ラットの骨髄から得られた間質細胞による試験管内骨形成。細胞組織研究２５４：３１７−３３０、１９８８。
【０２６７】
９０．マイデービッド  ＰＴ、ブーン、Ｍ２、カフローイ  ＡＨ、およびミッチェル  ＤＦ：セラミックに対する反応に対する自原性骨髄およびカルシトニンの作用。歯科研究ジャーナル５８：１４７８８３、１９７９。
【０２６８】
９１．ムーア  ＤＣ、チャップマン  ＭＷ、およびマンスク  Ｄ．：腸骨骨幹欠損部移植に使用される二相性リン酸カルシウムセラミックの評価。整形外科研究ジャーナル５：３５６−６５、１９８７。
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【０２７０】
９３．マリケン  ＪＢ、カバン  ＬＢ、および  グロバッキ  Ｊ．：誘導骨形成−生物学的原理および臨床的適用。手術研究ジャーナル３７：４８７−９６。１９８４。
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【０２７２】
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【０２７５】
９８．マスコロ  ＤＬ、カレッティ  Ｅ、シャジョウィッツ  Ｆ、アロージョ  ＥＳ、および牧野  Ａ．：凍結骨のヒト大量同種移植における組織型別。骨および関節手術アメリカンジャーナル６９：５８３−９５、１９８７。
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【０２７９】
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【０２９１】
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【０２９２】
１１５．ペレイラ、Ｒ．Ｆ．；ハルフォード、Ｋ．Ｗ．；オハラ、Ｍ．Ｄ．；リーパー、Ｄ．Ｂ．；ソコロフ、Ｂ．Ｐ．；ポラード、Ｍ．Ｄ．；バガスラ、Ｏ；およびプロコップ、Ｄ．Ｊ．：骨髄からの培養付着細胞は照射マウスの骨、軟骨、および肺への効果持続前駆細胞として役立ち得る。全米科学アカデミー紀要、９２：４８５７−４８６１、１９８８。
【０２９３】
１１６．ピッテンジャー、Ｍ．Ｆ．，マッケイ、Ａ．Ｍ．およびベック、Ｓ．Ｃ．（１９９６）分子生物学  細胞・７、５８２ａ。
【０２９４】
１１７．プライファ  ＣＡ、マウスの移植骨髄からの骨の成長。解剖学記録１０２：２２５、１９４８。
【０２９５】
１１８．クアルト、Ｒ．；トーマス、Ｄ．；およびリアン、Ｔ．：骨始原細胞欠乏および骨修復能力の年齢に関連する減退。石灰化組織インターナショナル５６：１２３−１２９、１９９５。
【０２９６】
１１９．ラーニ  Ｐ、リンドホーム  ＴＳ、およびリンドホーム  ＴＣ．：自原性骨髄と組合せた同種異系移植脱無機質骨基質で誘導される胸および腰部脊椎内の脊椎椎体固定力学。ラビットでの実験研究。整形外科および外傷学イタリアンジャーナル１３：２４１−５１、１９８７。
【０２９７】
１２０．レジダ  ＢＶ、ピーレン  ＪＧ、およびドゥ  ＧＫ、：骨代替物としてのリン酸トリカルシウム。生物工学ジャーナル１：９３−７、１９７７。
【０２９８】
１２１．斉藤、Ｔ．；デニス、Ｊ．Ｅ．；レノン、Ｄ．Ｐ．；ヤング、Ｒ．Ｇ．；およびキャプラン、Ａ．Ｉ．：試験管内および生体内ｍｄｘマウスの筋管内で間葉幹細胞の筋原性発現。組織工学１（４）：３２７−３４３、１９９５。
【０２９９】
１２２．サラマ  Ｒ、およびバイスマン  ＳＬ、：骨および自己由来赤色骨髄の組合せ異種移植片の臨床利用。予備報告。骨および関節手術ブリティッシュジャーナル６０：１１１−５、１９７８。
【０３００】
１２３．シャールマン、Ｈ．Ｊ．、フーゲン、Ｈ．Ｐ．、およびバン・ローバレン、Ｈ．（１９９２）ＩＬＡＲジャーナル３４（１−２）、３−１２。
【０３０１】
１２４．シモンズ  ＤＪ、エルサッサー  ＪＣ、カミンズ    Ｈ、およびレスカーＰ：ラビットでの複合骨同種異系移植片−骨髄自家移植片の骨誘導能。臨床整形外科および関連研究９７：２３７−４７、１９７３。
【０３０２】
１２５．ステイブラー  ＣＬ、アイスモント  ＦＪ、ブラウン  ＭＤ、グリーン  ＢＡ、およびマリーニン、Ｔｉ：子供の死体骨移植片を用いる後頸部融合不全。骨および関節手術アメリカンジャーナル６７：３７１−５、１９８５。
【０３０３】
１２６．スティーブンソン、Ｓ．；カニンガム、Ｍ．；トス、Ｊ．；ディビー、Ｄ；およびレッディ、Ａ．Ｈ．：ラットの正常位分節欠損部の骨形成に関するオステオジェニン（骨形態形成タンパク質）の作用。骨および関節手術ジャーナル７６（１１）：１６７６−１６８７、１９９４。
【０３０４】
１２７．スティーブンソン  Ｓ、ホーン  ＲＢ、およびテンプルトン  ＪＷ、：イヌの新鮮海綿骨同種異系移植片の治癒に関する組織抗原組合せの作用。獣医学研究４４：２０１−６、１９８３。
【０３０５】
１２８．田渕、Ｃ；シモン、Ｄ．Ｊ．；ファウスト、Ａ．；ラッセル、Ｊ．；ビンダーマン、Ｉ．；およびアビオリ、Ｌ．：卵巣摘出ラットにおける骨欠損部。臨床調査ジャーナル７８：６３７−６４２、１９８６。
【０３０６】
１２９．高木、Ｋ．；およびユーリスト、Ｍ．Ｒ．：大腿部広範囲骨幹欠損部の骨形態形成タンパク質誘導修復における骨髄の役割。臨床整形外科および関連研究１７１：２２４−２３１、１９８２。
【０３０７】
１３０．トーマス  ＥＤ、およびストーブ  Ｒ、：ヒト骨髄移植の技術。血液３６：５０７−１５、１９７０。
【０３０８】
１３１．トーマス  Ｉ、カーケィディ  ＷＷ、シン  Ｓ、およびペイン  ＫＷ、：モルモットおよびイヌの実験脊椎固定：固定の作用。臨床整形外科および関連研究１１２：３６３−３７５、１９７５。
【０３０９】
１３２．ティードマン、Ｊ．Ｊ．；コナリー、Ｊ．Ｆ．；ストレーツ、Ｂ．Ｓ．；およびリッピエロ、Ｌ．：骨髄および脱無機質骨基質の経皮注射による偽関節の処置。臨床整形外科および関連研究２６８：２９４−３０２、１９９１。
【０３１０】
１３３．ティードマン、Ｊ．Ｊ．；フアマン、Ｗ．Ｗ．；コナリー、Ｊ．Ｆ．；およびストレーツ、Ｂ．Ｓ．：骨基質および骨髄で移植後大型非骨形成線維腫の治癒。臨床整形外科および関連研究２６５：３０２−３０５、１９９１。
【０３１１】
１３４．トムフォード  ＷＷ、スタークウエザー  ＲＪ、およびゴールドマン  ＭＨ、：貯蔵同種異系移植骨の使用における感染臨床発生率の研究。骨および関節手術アメリカンジャーナル６３：２４４−８、１９８１。
【０３１２】
１３５．辻、Ｔ．；ヒューズ、Ｆ．Ｊ．；マカロック、Ｃ．Ａ．；およびメルヒャー、Ａ．Ｈ．：試験管内ラット骨髄の骨形成細胞についてのドナー年齢の作用。老化成長のメカニズム５１：１２１−１３２、１９９０。
【０３１３】
１３６．ツーリ  ＳＭ、およびシン  ＡＤ、：脱石灰化骨基質の骨誘導性。実験研究、骨および関節手術ブリティッシュジャーナル６０：１１６−２３、１９７８。
【０３１４】
１３７．タークセン  Ｋ、およびオーバン  ＪＥ、：２クラスの骨始原細胞の富化に対する正および負の免疫的選択。細胞生物学ジャーナル１１４：３７３８４、１９９１。
【０３１５】
１３８．ユーリスト、Ｍ．Ｒ．：骨：自家誘導による形成。サイエンス１５０：８９３−８９９、１９６５。
【０３１６】
１３９．ユーリスト  ＭＲおよびドーソン  Ｅ、：化学不妊化自己分解抗原抽出同種異系（ＡＡＡ）骨の助けによる横空間突起融合。臨床整形外科および関連研究１５４：９７−１１３、１９８１。
【０３１７】
１４０．ユーリスト  ＭＲ、デランジュ  ＲＪ、およびファイナーマン  ＧＡ、：骨細胞分化および成長因子。サイエンス２２０：６８０−６、１９８３。
【０３１８】
１４１．ビラヌーバ  ＪＥ、およびニムニ  ＭＥ、：内皮細胞による頭蓋冠骨形成の促進。骨および無機質研究ジャーナル５：７３３−９、１９９０。
【０３１９】
１４２．脇谷、Ｓ．；ゴット、Ｔ．；ピネダ、Ｓ．Ｊ．；ヤング、Ｒ．Ｇ．；マンスーア、Ｊ．Ｍ．；キャプラン、Ａ．Ｉ．；およびゴールドバーグ、Ｖ．Ｍ．：関節軟骨の大型全層欠損部の間葉細胞ベース修復。骨関節手術ジャーナル７６Ａ：５７９−５９２、１９９４。
【０３２０】
１４３．脇谷、Ｓ．；斉藤、Ｔ．；およびキャプラン、Ａ．Ｉ．：５−アザシチジンに露出されたラット骨髄間葉幹細胞から誘導される筋原細胞。筋および神経１８：１４１７−１４２６、１９９５。
【０３２１】
１４４．バーンツ、Ｊ．Ｒ．；レーン、Ｊ．Ｍ．；バースタイン、Ａ．Ｈ、；ジャスティン、Ｒ．；クライン、Ｒ．；およびトミン、Ｅ．：骨髄による正常位骨再生の定性および定量分析。整形外科研究ジャーナル１４：８５−９３、１９９６。
【０３２２】
１４５．ヴォルフ、Ｄ．；ゴールドバーグ、Ｖ．Ｍ．；およびスティーブンソン、Ｓ．：セラミックおよびチタン繊維金属移植片を用いる分節骨幹欠損部の修復の組織形態計測分析：骨髄の作用。整形外科研究１２：４３９−４４６。１９９４。
【０３２３】
１４６．ヴォズニー、Ｊ．Ｍ．；ローゼン、Ｖ．；セレスト、Ａ．Ｊ．；ミツォック、Ｌ．Ｍ．；ホウィッタース、Ｍ．Ｊ．；クリズ、Ｒ．Ｗ．；ヒューウィック、Ｒ．Ｍ．；およびワン、Ｅ．Ａ．：骨形成の新規な調整者：分子クローンおよび活性。サイエンス２４２：１５２８−１５３４、１９８８。
【０３２４】
１４７．ヤスコ、Ａ．Ｗ．；レーン、Ｊ．Ｍ．；フェリンジャー、Ｅ．Ｊ．；ローゼン、Ｖ．；ヴォズニー、Ｊ．Ｍ．；およびワン、Ｅ．Ａ．：組換えヒト骨形態形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ−２）で誘導される分節骨欠損部の治癒。骨関節手術ジャーナル７４（５）：６５９−６７１、１９９２。
【０３２５】
１４８．ヤング、Ｒ．Ｇ．；バトラーＤ．Ｌ．；ウェーバー、Ｗ．；ゴードン、Ｓ．Ｌ．；およびフィンク、Ｄ．Ｊ．（１９９７）移植整形外科研究学会２２、２４９。
【０３２６】
１４９．ヤンガー、Ｅ．Ｍ；およびチャップマン、Ｍ．Ｗ．：骨移植ドナー部位での罹患率。整形外科および外傷学ジャーナル３：１９２−１９５、１９８９。
【０３２７】
１５０．ジーガー  ＳＬ、リアン  ＫＹ、およびアルバート  ＰＳ、：縦方向データのモデル：一般化推定方程式アプローチ「公開正誤表は生物測定法１９８９、３月；４５（１）：３４７で現れる」。生物測定法４４：１０４９−６０、１９８８。
【０３２８】
１５１．ツァーベック  ＪＥ、クーロッシュ  Ｓ．、シャインバーグ  Ｒ、他：脊椎固定骨移植代替物としての繊維性コラーゲン−二相性リン酸カルシウム複合材。整形外科研究ジャーナル１０：５６２−７２、１９９２。
【図面の簡単な説明】
【０３２９】
【図１】各成長段階でのラットＭＳＣ培養の位相差顕微鏡写真。図１Ａ．一次培養の７日でのＭＳＣコロニーは均一な紡錘形細胞で構成される。図１Ｂ．継代一匹のラットＭＳＣＳ が再平板培養４日後皿の表面に均一に分配される。図１Ｃ．２８日間対照培地で成長したラットＭＳＣＳ が密集および多層となるが鉱化小節を形成しない。アルカリ性ホスファターゼ染色（ダークグレー）は正である細胞の分画を明らかにする。図１Ｄ．２８日間骨形成補充材の存在下で成長したラットＭＳＣ培養物は鉱化小節を形成し、それはフォン・コッサ法で黒く染色される。細胞培養物は下記に記載の通りアルカリ性ホスファターゼおよびフォン・コッサ組織内検出法により染色された（非染色（ａ，ｂ）、アルカリ性ホスファターゼ組織化学およびフォン・コッサ法（ｃ，ｄ）、全部×４５）。
【図２】皮下組織に異所的に配置されたＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片からの代表的な組織部分の光学顕微鏡写真。ＭＳＣＳ は負荷され試料は以下に記述の通り移植され、８週に採取され、石灰を除去され、顕微鏡検査のためにパラフィン処理された。ＨＡ／ＴＣＰセラミック（ｃ）の残部のみが残り、一方移植片の孔は骨（ｂ）、血管（ｖ）、および脂肪細胞を含む造血要素で充填される（トルイジンブルー−Ｏ、×７０）。
【図３】図３Ａ−３Ｈ．４週および８週での各種移植片を用いた分節欠損部の治癒を示す高解像度放射線写真。放射線写真は犠牲直後のファクシトロン映像システムで得られた。ポリエチレン固定板は各放射線写真で骨のトップにある。各グループで４週放射線写真は左側に、８週放射線写真は右側にある。ＨＡ／ＴＣＰ材料の放射線密度は各移植片の多孔性および中央管を明らかにする。図３Ａおよび３Ｂ．空に残された欠損部。図３Ｃおよび３Ｄ．ＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部。図３Ｅおよび３Ｆ．ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ担体で充填された欠損部。図３Ｇおよび３Ｈ．骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰ担体で充填された欠損部。分節裂孔切除に続く空のままの欠損部は骨の切断端部で反応性骨形成を受け、この十分に確立したモデルで古典的な偽関節に導かれる。４週後、ＭＳＣ負荷試料は移植材料の孔の充填を開始した。偽関節は４週でいずれの移植型でも明らかである。８週までに、宿主−移植片インターフェイスの適度の癒合が担体（ｄ）および担体プラス骨髄グループ（ｈ）に生じたが、完全な組込みおよび骨架橋は担体プラスＭＳＣグループ（ｆ）で明らかである。ＭＳＣ負荷試料での多孔への骨の完全充填もまたパネルＦで明らかである（×１．５）。
【図４】図４Ａ．４週および８週でＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部。図４Ｂ．４週および８週でＨＡ／ＴＣＰ担体のみで充填された欠損部。図４Ｃ．４週および８週でＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。図４Ｄ．４週および８週でＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。図４Ｅ．それぞれ４週および８週で骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。新しい骨が孔内で現れ、あるいは宿主−移植片インターフェイスでこれらの標本内でブルーあるいはバイオレットに見える。重要なことはＭＳＣ負荷移植片を含む試料のみが欠損部を有効に治癒し、これはかなりの量の骨が移植片内でおよびパネルｃおよびｄの宿主とインターフェイスで現れる。詳細については本文を参照されたい（トルイジンブルー−Ｏ、×８）。図４Ｆ．それぞれ４週および８週で骨髄負荷ＨＡ／ＴＣＰで充填された欠損部。新しい骨が孔内で現れ、あるいは宿主−移植片インターフェイスでこれらの標本内でブルーあるいはバイオレットに見える。重要なことはＭＳＣ負荷移植片を含む試料のみが欠損部を有効に治癒し、これはかなりの量の骨が移植片内でおよびパネルｃおよびｄの宿主とインターフェイスで現れる。詳細については本文を参照されたい（トルイジンブルー−Ｏ、×８）。
【図５】図５Ａ．ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片で充填された分節裂孔に８週で骨の再生を示す強力光学顕微鏡写真。パネルａは直接の付着で新しい骨を持つ宿主皮質の切断端部（矢印）を示す。この宿主−移植片インターフェイスでの新しい骨はＨＡ／ＴＣＰ担体の孔に形成された骨に隣接している。パネルｂはＨＡ／ＴＣＰ担体の孔を充填する薄層および網状骨（ブルー）を示す。担体は非脱石灰標本調製の人為的結果としてこれらの映像内で黒で現れる。骨芽細胞の分泌活性を調整する血管（ｖ）は孔内で明らかである（トルイジンブルー−Ｏ、×７５）。図５Ｂ．ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片で充填された分節裂孔に８週で骨の再生を示す強力光学顕微鏡写真。パネルａは直接の付着で新しい骨を持つ宿主皮質の切断端部（矢印）を示す。この宿主−移植片インターフェイスでの新しい骨はＨＡ／ＴＣＰ担体の孔に形成された骨に隣接している。パネルｂはＨＡ／ＴＣＰ担体の孔を充填する薄層および網状骨（ブルー）を示す。担体は非脱石灰標本調製の人為的結果としてこれらの映像内で黒で現れる。骨芽細胞の分泌活性を調整する血管（ｖ）は孔内で明らかである（トルイジンブルー−Ｏ、×７５）。
【図６】試験管内ヒトＭＳＣＳ の骨形成分化。成長および骨形成条件下でのヒトＭＳＣ培養の位相顕微鏡写真（ａ，ｂ）。図６Ａ．第一継代ＭＳＣＳ は独特の紡錘形の形態を示し、再平板培養後に皿の表面を全体にわたり均一に分配される。図６Ｂ．ＯＳの存在下で１６日間成長したＭＳＣ培養物は鉱化小節粒団を形成し、それはアルカリ性ホスファターゼをグレーにまた鉱化基質を黒に染色する（非染色（ａ）×１８、アルカリ性ホスファターゼおよびフォン・コッサ組織化学（ｂ）×４５）。図６Ｃ．対照あるいはＯＳ培地で４，８，１２および１６日に成長したＭＳＣ培養におけるアルカリ性ホスファターゼ活性およびカルシウム沈着。試料は指定日に採取され、またアルカリ性ホスファターゼ活性、細胞数、およびカルシウム沈着は材料および方法に記載された通りに測定された。その結果は第一継代細胞からの３組の培養の平均値±標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（対照と比較）
【図７】無胸腺ラットの皮下組織に異所的に配置されたヒトＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ移植片からの代表的な組織切開部の光学顕微鏡写真。ＭＳＣＳ はセラミック内に負荷され、材料および方法に記載された通りに移植され、１２週に採取され、脱石灰され顕微鏡検査のためにパラフィンで処理された。ＨＡ／ＴＣＰセラミック（ｃ）の残部のみが残存し、一方移植片の孔は骨（ｂ）、血管（矢印）あるいは線維組織（ｆ）で充填される。立方骨の骨芽細胞が成長する骨の表面に線を描くのがみられる（トルイジンブルー−Ｏ、×７５）。
【図８】分節裂孔欠損部モデルおよび放射線撮影。（ａ）ポリエチレン固定板がこの代表的なラット大腿部の外側面に配置される。４個の二重皮質ねじと４本のセルクラージュ針金が板を定位置に固設するために使用される。８mmの骨の分節がその癒着骨膜に沿って除去され、細胞付きあるいは細胞無しのセラミック移植片は欠損部位に置かれる。上に重なる筋はその適した解剖位置に戻され、皮膚は再吸収性縫合糸で閉じられる。犠牲に続き直ちに得られた高解像度放射線写真は２個の移植片の型の１２週での分節欠損部の治癒の範囲を示す（ｂ，ｃ）。宿主−セラミックインターフェイスでの移植片の全組込みは担体プラスＭＳＣグループで明らかであるが（ｂ）、一方適度の癒合が無細胞移植片で観察される（ｃ）。ＭＳＣ負荷移植片の孔は裂孔全体を通じて骨に充填されるが、無細胞担体には殆ど骨がなくいくつかの亀裂を含む。
【図９】分節大腿欠損部での骨の再生の組織学的表示。抗体６Ｅ２を持つ免疫組織化学染色（ａ）はＭＳＣ負荷試料の移植４週を示し、担体の孔内の細胞はその表面で反応性であり従ってヒトからのものであり、一方セラミックの外側の細胞は免疫反応性ではない。位相差顕微鏡検査（ｂ）で、セラミックは黒であり、孔の細胞および移植片の外側を囲む細胞は明らかである。セラミック材料自身は蛍光二次抗体を吸着しグリーンに見える（ａ，ｂ．×７５）。光学顕微鏡写真はＨＡ／ＴＣＰ担体のみ（ｄ）、あるいは担体プラスＭＳＣＳ （ｃ，ｅ，ｆ）で移植後１２週の分節欠損部の代表的な治癒を示している。肢が採取され、固定され、脱水され、清浄化され、ポリメチルメタクリレートに包埋され、切断され、染色のため１００μｍ厚に粉砕された。セラミックは非脱石灰標本調製という人為構造のためこれらの顕微鏡写真では黒に見え、また孔内に存在しあるいは宿主−移植片インターフェイスに存在する骨はブルー−バイオレットに見える。ここで示されるＭＳＣ負荷標本は破壊的機械ねじり試験を受け、続いて２個の個別の片で組織学のため処理された。２個の片の整復顕微鏡写真は試験の前の大腿部の外観に接近する。実際の骨折面は移植片の上部および下部の二重矢印で示される。宿主皮質の切断端部はｃ，ｄ、およびｅの矢印で示される。ＭＳＣ負荷移植片を含む試料のみが欠損部を有効に治癒する。強力顕微鏡写真はかなりの量の骨が宿主−移植片インターフェイス（ｅ）および移植片本体内（ｆ）で存在することを示している（トルイジンブルー−Ｏ、（ｃ，ｄ）×７，（ｅ）×３１，（ｆ）×４５）。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂ．右手の法則で定義された３−１）整合システムはＸ軸を定義する対象となる水準での神経孔マーカーの間の線の中点に置かれるであろう。Ｚ方向は対象となる水準（すなわちオレンジ点の間）の上部および下部の神経孔の間の中点を通る線で定義される。正のＺ方向は頸部から腰椎までである。正のＹ方向は背側である。対象となる容積の基部はＸ−Ｚ面で定義される。融合塊の容量はＺ＝−７．５mmからＺ＝＋７．５mmの間のＸ−Ｙ面の正のＹ軸で全骨密度ボクセルの輪郭で定義される。完全な融合はＸ次元で２０−３０mmの幅でＹ次元で１０−１５mmの高さである。
【図１１】癒合スコアを割当てるための格子システムが小関節面関節の水準で概略断面図で示される。各ボックス域で半分の点が癒合にあてられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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