(57)【要約】【課題】  ジャガイモそうか病原菌やせん虫菌等の有害菌におこされている堆肥や土壌を簡便の手段により無害化する病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法を提供する。【解決手段】  “超高温・好気発酵法”の高熱を利用したジャガイモ残渣に残存するジャガイモそうか病原菌の滅菌効果を新規遺伝子解折法である競合的ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ）−ＰＣＲ法を用いたジャガイモそうか病原菌（ｎｅｃｌ遺伝子）新規定量法と従来法の抗生物質添加したジャガイモそうか病原菌選択培地（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ用）を用いて調べた。その結果、発酵初期の堆肥化過程の発酵熱（８０℃〜９０℃）により、モデル系及び開放系の現場の実用化試験ともに、ジャガイモそうか病原菌が発酵初期に死滅し、ｎｅｃｌ遺伝子が分解されていた。従って、ジャガイモそうか病原菌に汚染された残渣が“超高温・好気発酵法”により、そうか病原菌フリーコンポストに変換できることが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャガイモそうか病原菌や線虫類等の有害菌（病原菌）を有する堆肥や土壌を前記有害菌（病原菌）のない堆肥や土壌にするための病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法であって、該方法は、ジャガイモ残渣を含む原料又はジャガイモ残渣と超高熱細菌含有種菌の混合原料を超高温・好気発酵法により製造することを特徴とする病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法。
【請求項２】
前記超高温・好気発酵体は堆肥や土壌を８０℃乃至９０℃の温度に保持されるものであることを特徴とする請求項１に記載の病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法。
【請求項３】
前記有害菌（病原菌）は競合的ＱＰ−ＰＣＲ法を用いた病原菌（ｎｅｃｌ遺伝子）新規定量法によりその死滅が確認されるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法。
【請求項４】
前記堆肥はその堆肥化槽において少なくとも２回乃至６回の堆肥切返しを行い熟成・完熟を４０日間前後行って超高温・好気発酵体を形成することを特徴とする請求項１乃至３に記載の病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモそうか病原菌や線虫類のような有害菌（以下、病原菌という）に汚染される堆肥や土壌から病原菌を除去し、有機物発酵法により公衆衛生的で無害な堆肥や土壌の形成し得る簡便な病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモそうか病は、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の数種の病原菌による土壌伝染性病害である。現在までに、膨大な研究報告がなされているが、未だに恒久的な防除対策が確立されていないまま、最も難防除な土壌病害の代表例とされている。しかしながら、防除対策の基礎となる本病原菌の土壌中における生態に関する知見は極めて乏しく、病原菌の同定・分類は混乱しており、定量法も未確立である。土壌改良材としては「特許文献１」や「特許文献２」があるが、これ等はあくまでも改良材であり、堆肥や土壌そのものの病原菌を特別の改良材を用いないで無害のものにする技術ではない。
【特許文献１】特開２００２−３３８９６２（全文）
【特許文献２】特開２００４−２３８３０８（全文）
【０００３】
従来行われているジャガイモそうか病原菌の除去方法としては抗生物質添加した病原菌分割基礎培地にジャガイモそうか病原菌を培養してその病原菌が除去されるか否かをテストする方法が採用されていた。このものは表１に示す病原菌分離のための基礎培地に表２に示す抗生物質を添加しここにジャガイモそうか病原菌を滴下してその除去を実験的に確認する方法である。
【０００４】
【表１】
2006256877.tif 000002
【０００５】
【表２】
2006256877.tif 000003
【０００６】
抗生物質添加のジャガイモそうか病原菌の除去の具体的方法としては堆肥サンプルを２週間程、３０℃で前培養した後、定法に従って減菌水で希釈し、0.1ｍｌをそうか病原菌選択培地上に滴下し、コンラージ棒を用いて全面塗布した（表１）。菌数の比較のためにそうか病原菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ  ＩＥＯ  １３７６７）を同様に接種した。３０℃で約１０日間培養後に平板上に出現した放線菌のコロニーの中からそうか病原菌に類似するコロニーを肉眼で選択し、菌体を極少量掻き取り、減菌水を２０μｌ分注した１．５ｍｌマイクロチューブに菌体を懸濁し、９５℃で１０分間処理を行い、ＤＮＡを抽出した。ＱＰ−ＰＣＲ法を用いて菌体から抽出したＤＮＡについてｎｅｃｌ遺伝子の存在を確認したが病原菌が存在していることが確認された。従って、この病原菌除去方法は効果が低いことがわかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、供試された土壌（ジャガイモ残渣を含む）を原料に用いて堆肥化を行い、堆肥化中の発酵熱による温度上昇がジャガイモそうか病原菌に与える影響について調査した。菌数の評価は、新規遺伝子解折法である競合的ＱＰ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ）−ＰＣＲ法を用いたジャガイモそうか病原菌（ｎｅｃｌ遺伝子）の定量を求め、病原菌の除去を確認する方法が効果的であると考えその実験的実施を行うこととした。なお、ＱＰ−ＰＣＲ法とは、土壌を直接抽出したＤＮＡ（特定微生物の特異的な遺伝子の塩基配列）を鋳型にして特定微生物に特異な遺伝子を定量的なＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応させ、その増幅量から特定微生物の数を換算する。その結果、土壌中の特定微生物の同定とその存在量がわかる。
【０００８】
本発明は、以上の事情に鑑みて発明されたものであり、病原菌を超高温・好気発酵体により死滅化する病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成（バイオハザードフリーコンポスト）方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以上の目的を達成するために、請求項１の発明は、ジャガイモそうか病原菌や線虫類等の有害菌（病原菌）を有する堆肥や土壌を前記有害菌（病原菌）のない堆肥や土壌にするための病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法であって、該方法は、ジャガイモ残渣を含む原料又はジャガイモ残渣と超高熱細菌含有種菌の混合原料を超高温・好気発酵法により製造することを特徴とする。
【００１０】
また、請求項２の発明は、前記超高温・好気発酵体は堆肥や土壌を８０℃乃至９０℃の温度に保持されるものであることを特徴とする。
【００１１】
また、請求項３の発明は、前記有害菌（病原菌）は競合的ＱＰ−ＰＣＲ法を用いた病原菌（ｎｅｃｌ遺伝子）新規定量法によりその死滅が確認されるものであることを特徴とする。
【００１２】
また、請求項４の発明は、前記堆肥はその堆肥化槽において少なくとも２回乃至６回の堆肥切返しを行い熟成・完熟を４０日間前後行って超高温・好気発酵体を形成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の請求項１の「病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法」によれば、ジャガイモそうか病原菌や線虫類のような病原菌は、超高温・好気発酵法によりほぼ完全に死滅し、無害の堆肥や土壌を形成することができる。
【００１４】
また、本発明の請求項２の「病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法」によれば、病原菌を死滅させるための超高温・好気発酵体は堆肥や土壌を８０℃乃至９０℃の高温は加温されていることが必要であり、このようにして無害の堆肥や土壌を簡単に形成することができる。従来技術のように、各種の高価殺菌剤，殺虫剤，除草剤等を添加する必要がなく、低コストで、素早く病原菌を完全に死滅させることができる。
【００１５】
また、本発明の請求項３の「病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法」によれば、本発明の効果の確認のためには競合的ＱＰ−ＰＣＲ法を用いたｎｅｃｌ遺伝子の定量が検出法として適切であることがわかる。
【００１６】
また、本発明の請求項４の「病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法」によれば、堆肥は繰返し切返しされて超高温・好気発酵され、従来にない有機堆肥となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の病原菌フリー堆肥・土壌肥沃形成方法の実施の形態を以下に詳述する。
【００１８】
ａ）耐熱性ポリ容器を用いたモデル実験
堆肥化施設は、九州大学農学部附属農場の堆肥化施設を用いた。試料の採取方法は、そうか病原菌汚染ジャガイモ残渣を含む原料を耐熱性ポリ容器に詰め込み、堆肥中に埋設した。各切返し時に堆肥中からポリ容器を各３個取り出し、堆肥化は切返し５回目で終了した。九州大学堆肥化場における堆肥化過程における堆肥化過程におけるｎｅｃｌ遺伝子量は、表３に示した。ジャガイモそうか病原菌のｎｅｃｌ遺伝子は、原料でのみを確認できた。１回目の切返し以降、堆肥の中央部及び左右周辺部ともにｎｅｃｌ遺伝子を検出することは出来なかった。これらの結果は、発酵初期の堆肥化過程の発酵熱（８０℃〜９０℃）により、そうか病原菌が死滅しｎｅｃｌ遺伝子が分解されたことを明瞭に示している。従って、超高熱細菌を用いた“超高熱・好気発酵法”によるジャガイモそうか病原菌に汚染された残渣を機能性の高いそうか病原菌フリーの堆肥に変換することが明らかとなった。
【００１９】
【表３】
2006256877.tif 000004
【００２０】
ｂ）開放系の現場実験
堆肥化施設は、帯広山有の堆肥化施設を用いた。原料のそうか病原菌に汚したジャガイモ残渣と種菌を混合して発酵槽に堆積した開放系ジャガイモそうか病原菌の消長を調べた。供試試料は、各切返毎に発酵槽における堆積堆肥の内部及び外側から採取した。帯広山有における現場実用堆肥化実験の堆肥化過程のｎｅｃｌ遺伝子量は表４に示した。混合と切返１回目の外側の温度上昇が認められない部位では、ジャガイモそうか病原菌のｎｅｃｌ遺伝子がほぼ同量存在していた。１回目の切返し以降の内部及び外側ともに、ｎｅｃｌ遺伝子を検出されなかった。堆肥化過程の著しく高い発酵熱の殺菌作用により、そうか病原菌が死滅しｎｅｃｌ遺伝子が分解されていることが示された。以上の結果、開放系の現場対応実用化実験においても発酵初期の切返２回目でジャガイモそうか病原菌が死滅することが明らかになった。
【００２１】
【表４】
2006256877.tif 000005
【００２２】
ａ）堆肥サンプルからのＤＮＡ抽出
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて、堆肥サンプル０．５ｇからＤＮＡ抽出した。
【００２３】
競合的ＱＰ−ＰＣＲ法を用いたｎｅｃｌ遺伝子の定量
競合的ＱＰ−ＰＣＲ法は、定量値がＰＣＲ阻害物質の影響を受けにく、かつ迅速で簡便な遺伝子定量法である。生体内や環境中には、ＰＣＲにおいて遺伝子の増幅反応を阻害するような物質が数多く存在する。ＰＣＲを用いて遺伝子の定量を行う場合には、このＰＣＲ阻害物質の影響は大きな問題となる。競合的ＱＰ−ＰＣＲ法では、測定試料に既知量の内部標準遺伝子（標的遺伝子に人為的に数箇所変異を挿入したもの）を添加してＰＣＲを行い、標的遺伝子及び内部標準遺伝子の増幅の様子を同時に、２種類の蛍光消光プローブを用いてリアルタイムにモニタリングを行う。試料中にＰＣＲ阻害物質が含まれていた場合は産物の増幅が抑制されてしまうが、標的遺伝子と内部標準遺伝子は同程度に増幅が阻害され、初期添加量の比と指数関数的増幅領域の増幅産物比は一定に保たれ、標的遺伝子の初期存在量を算出できる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、ジャガイモそうか病原菌等の病原菌を有する堆肥や土壌を無害のものとするものであるが、堆肥や土壌に限らずこれ等及びその他の病原菌に犯されているすべての部位に適用され、その使用範囲は広い。