(57)【要約】      （修正有）【課題】キンギョソウのトランスポゾンTam3の核移行に関与する物質について研究し、核移行タンパク質の核への移行を人為的に制御する手段を提供する。【解決手段】トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質およびそれをコードする遺伝子。核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法。前記核局在制御部位を有するタンパク質と共存するように、タンパク質T3IF5を発現させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(1)〜(3)の何れかのＤＮＡからなる遺伝子。
(1)配列番号1の塩基配列を有するＤＮＡ、
(2)配列番号1の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ、および
(3)配列番号１の塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、および
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
【請求項４】
核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法であって、前記核局在制御部位を有するタンパク質と共存するように、タンパク質T3IF5を発現させることを含む前記方法。
【請求項５】
前記核局在制御部位を有するタンパク質が、トランスポゾンTam3転移酵素である請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記核局在制御部位を有するタンパク質が、前記核局在制御部位を一部として含むタンパク質である請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記核局在制御部位を有するタンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列を有する請求項4〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質T3IF5をコードする遺伝子を、この遺伝子を常時発現させるプロモーターの支配下に置くことで、前記タンパク質T3IF5の発現を行う、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を常時発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい生物に導入する、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーターである請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質T3IF5をコードする遺伝子を、この遺伝子を、所定の条件下で発現させるプロモーターの支配下に置くことで、前記タンパク質T3IF5の発現の制御を行う、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を、所定の条件下で発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい生物に導入する、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーターが、Dex誘導性プロモーター、ユビキチンプロモーター、またはエタノール誘導性alcプロモーターである請求項10または11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核移行に対する阻害活性を有するタンパク質およびこれを用いたタンパク質の核移行制御方法に関する。特に、本発明は、キンギョソウから発見された、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5およびそれを用いたタンパク質の核移行制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核移行タンパク質は、タンパク質内にコードする核移行シグナルによって自動的に核に移行する。この核移行シグナルを有するタンパク質の細胞内局在性をコントロールする機構はこれまでに全く知られていなかった。
【０００３】
核移行タンパク質の例としてキンギョソウのトランスポゾンTam3が知られている。トランスポゾンTam3の転移は、低温（15℃）で著しく活性化し、高温（２5℃）では殆ど転移しない。この低温ストレスに応答し転移する性質は、Tam3に独特な性質である。(非特許文献1および２)しかるに、Tam3の温度応答性の転移の機構は明らかではない。
【０００４】
このTam3独特な性質である、低温ストレスに応答し転移する性質は、植物トランスポゾンに普遍的な制御機構メチル化と密接に関係していることが知られている(非特許文献２)。
【０００５】
トランスポゾンの転移抑制に働くとされるDNAのメチル化についての調査では、Tam3の末端領域のメチル化が低温では低く、高温では高いことが判明した。Tam3末端領域のメチル化は温度に合わせて、可逆的に変化し、それはこの領域に限定された変化であった。また、Tam3の転移酵素タンパク質はメチル化したDNAには結合しなかった。従って、Tam3末端領域の可逆的メチル化がTam3の温度感受性転移と深く関連することが示された。このような明確なメチル化の制御機構は、植物では殆ど知られていない。
【非特許文献１】Carpenter R., Martin C. and Coen E.C. (1987) Comparison of genetic behaviour of the transposable element Tam3 at two unlinked pigment loci in Antirrhinum majus.  Molecular General Genetics 207: 82-89
【非特許文献２】Hashida S.N., Kitamura K., Mikami T. and Kishima Y. (2003) Temperature shift coordinately changes the activity and the methylation state of transposon Tam3 in Antirrhinum majus. Plant Phisiology 132: 1207-1216
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、核移行タンパク質であるキンギョソウのトランスポゾンTam3の温度応答性の転移の機構は、依然として明らかにはされていない。一方、核移行タンパク質の核への移行を人為的に制御できれば、細胞に新たな機能を付加する有効な技術となり得る。例えば、核移行タンパク質の解析や新規細胞系統作出などが可能になる。
【０００７】
そこで本発明は、キンギョソウのトランスポゾンTam3の核移行に関与する物質について研究し、核移行タンパク質の核への移行を人為的に制御する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[請求項1]下記(1)〜(3)の何れかのＤＮＡからなる遺伝子。
(1)配列番号1の塩基配列を有するＤＮＡ、
(2)配列番号1の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ、および
(3)配列番号１の塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ。
[請求項2]下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、および
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
[請求項3]下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
[請求項4]核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法であって、前記核局在制御部位を有するタンパク質と共存するように、タンパク質T3IF5を発現させることを含む前記方法。
[請求項5]前記核局在制御部位を有するタンパク質が、トランスポゾンTam3転移酵素である請求項4に記載の方法。
[請求項6]前記核局在制御部位を有するタンパク質が、前記核局在制御部位を一部として含むタンパク質である請求項4に記載の方法。
[請求項7]前記核局在制御部位を有するタンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列を有する請求項4〜6のいずれか１項に記載の方法。
[請求項8]タンパク質T3IF5をコードする遺伝子を、この遺伝子を常時発現させるプロモーターの支配下に置くことで、前記タンパク質T3IF5の発現を行う、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
[請求項9]タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を常時発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい生物に導入する、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
[請求項10]前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーターである請求項8または9に記載の方法。
[請求項11]タンパク質T3IF5をコードする遺伝子を、この遺伝子を、所定の条件下で発現させるプロモーターの支配下に置くことで、前記タンパク質T3IF5の発現の制御を行う、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
[請求項12]タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を、所定の条件下で発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい生物に導入する、請求項4〜7のいずれか１項に記載の方法。
[請求項13]前記プロモーターが、Dex誘導性プロモーター、ユビキチンプロモーター、またはエタノール誘導性alcプロモーターである請求項10または11に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核移行タンパク質の核への移行を人為的に制御する手段を提供することができる。後述するように、本発明の核移行制御方法は、例えば、核移行タンパク質の解析と新規細胞系統作出に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
[タンパク質T3IF5をコードする塩基配列]
本発明は、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードする塩基配列に関する。
上記本発明の遺伝子は、下記(1)〜(3)の何れかのＤＮＡからなる遺伝子である。
(1)配列番号1の塩基配列を有するＤＮＡ、
(2)配列番号1の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ、および
(3)配列番号１の塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5をコードするＤＮＡ。
【００１１】
さらに本発明の遺伝子は、下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質をコードする遺伝子である。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、および
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
【００１２】
さらに本発明は、下記(1)〜(3)の何れかのタンパク質に関する。
(1)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2)配列番号2のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質、
(3)配列番号2のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質。
【００１３】
本発明者らは、タンパク質T3IF5を、トランスポゾンTam3転移酵素の解析の過程で、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行を阻害する物質として発見した。さらに、この阻害活性は、トランスポゾンTam3転移酵素のN末端部位に、核移行を阻害する部位があり、この部位とタンパク質T3IF5とが相互作用を生じることで、核移行を阻害することも見いだした。
【００１４】
トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性(阻害挙動)は、例えば、以下の方法により計測できる。
本計測はタンパク質T3IF5を有する細胞と同タンパク質の無い細胞において、トランスポゾンTam3転移酵素タンパク質の細胞内局在性を比較調査することによって実施される。詳細は以下のとおりである。
ハイグロマイシン抗生物質をマーカーにしたタンパク質T3IF5遺伝子を有するプラスミドをアグロバクテリウム法でゲノムに組込んだタバコBY2培養細胞を作成し、この培養細胞にグリーンフローレッセントタンパク質(GFP)遺伝子を融合したトランスポゾンTam3転移遺伝子をエレクトロポーレーション法によって導入する。一方、タンパク質T3IF5遺伝子を持たないタバコBY2培養細胞にGFP遺伝子を融合したトランスポゾンTam3転移酵素遺伝子を導入し、これをコントロールとして比較する。GFPの蛍光をもとにTam3転移酵素タンパク質の細胞内局在性を観察すると、タンパク質T3IF5遺伝子を発現しているタバコBY2細胞では、GFPは細胞質にのみ観察でき、タンパク質T3IF5遺伝子タンパク質のないタバコBY2細胞では核にもGFPの蛍光が観察される。詳細は、実施例においてさらに説明する。
【００１５】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１６】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１７】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１９】
本明細書で言う「配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。
【００２０】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１または2に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてキンギョソウのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００２１】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記したキンギョソウ由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２２】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２３】
また、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号1に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１および２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００２４】
例えば、配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
［核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法］
本発明は、核局在制御部位(NLI)を有するタンパク質と共存するように、タンパク質T3IF5を発現させることを含む核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法に関する。核局在制御部位は、タンパク質T3IF5と相互作用を起こし、タンパク質T3IF5は、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を阻害する。即ち、タンパク質T3IF5を発現させることで、核局在制御部位を有するタンパク質は、その核局在制御部位とタンパク質T3IF5との相互作用によって核移行が阻害される。
【００２６】
キンギョソウにおいて、Tam3トランスポゼースの核への移行阻害は、T3IF5とTam3トランスポゼースのN末端250アミノ酸残基(核局在抑制部位：nuclear localization inhibitory domain, NLI)が結合することによって起こる。T3IF5の発現は温度によって制御され、高温で発現が上昇し、低温で発現が抑えられる。すなわち、キンギョソウでのTam3トランスポゼースの核移行は高温時に抑えられることになる。そこで、T3IF5遺伝子のプロモーターを変えることで、遺伝子の発現をコントロールし、NLIを有するタンパク質の核移行をT3IF5の発現に合わせて制御することが可能となる。
【００２７】
核局在制御部位を有するタンパク質は、例えば、トランスポゾンTam3転移酵素であることができるが、それに限定されない。核局在制御部位を有するタンパク質は、核局在制御部位をその一部として含む任意のタンパク質(核局在制御部位を結合したタンパク質)であることができ、そのようなタンパク質としては、例えば、細胞核で機能するクロマチン結合性タンパク質や種々の遺伝子転写複製に関わるタンパク質等を挙げることができる。核局在制御部位を有するタンパク質は、天然のタンパク質であっても、人工的に作製したタンパク質であってもよい。
【００２８】
前記核局在制御部位を有するタンパク質の核局在制御部位は、Tam3転移酵素タンパク質のN末端1〜250番目のアミノ酸部位であり、配列表に配列番号３として記載したアミノ酸配列を有する。Tam3トランスポゼースのアミノ酸配列は公知であり、このアミノ酸配列のN末端250アミノ酸残基が、本発明における核局在制御部位である。
【００２９】
タンパク質T3IF5の発現は、タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を常時発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい宿主、例えば、植物内に導入することで行うことができる。この遺伝子を常時発現させるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーター等を挙げることができる。
【００３０】
例えば、植物でよく用いられる35Sプロモーター（恒常的に強く遺伝子の発現を誘導する）をT3IF5のプロモーター部位と交換し、これをタバコやイネなどのキンギョソウ以外の植物のゲノムに組み込むと、T3IF5タンパク質は常に産生され、NLIを有するタンパク質は核へは移行しない。遺伝子の導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やボンバードメント法等を挙げることができる。
【００３１】
NLIを結合させた任意の核移行タンパク質遺伝子を作成し、細胞内に導入すること（アグロバクテリウム法でゲノムに導入する方法や一過的に細胞に導入すること）で、そのタンパク質の核移行を、ゲノムに組み込んだ（アグロバクテリウム法等で）T3IF5遺伝子のタンパク質によって阻害することが出来る。
【００３２】
また、特定の条件でT3IF5の発現を誘導するプロモーターに置き換えることによって、NLIを有するタンパク質の核への移行をT3IF5タンパク質の産生に応じて調節することが出来る。
【００３３】
タンパク質T3IF5の発現は、タンパク質T3IF5をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を、所定の条件下で発現させるプロモーターを含むＤＮＡを、核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御したい宿主、例えば、植物に導入することでも行うことができる。そのような発現を誘導可能なプロモーターとしては、例えば、Dex誘導性プロモーター、コビキチンプロモーター、エタノール誘導性alcプロモーター等を挙げることができる。
【００３４】
T3IF5のコードするタンパク質は、以下のような操作により、人為的に操作することができる。(1)人為的に操作可能なプロモーターにT3IF5の核酸分子を結合させたものを、適宜Ｔｉプラスミド等の公知手段を用いて、植物に導入し、外的刺激をプロモーターに与え、これら遺伝子の発現をコントロールする。ここで使用できるプロモーターの例として以下のものが挙げられる。(1)35Sプロモーター（構成的に発現できる。）、(2)熱ショックプロモータ（温度依存的に発現できる。）、(3)Dex誘導性プロモーター（デキサメタゾンを投与することで発現をコントロールできる。）、(4)ペチュニアCHS-Aプロモーター（花弁の着色する性質の植物においては花弁特異的発現、シロイヌナズナなどでは花弁特異的発現をしないが、糖を投与することで、茎葉で発現できる。）等が挙げられるが、その他、植物の分野で公知の使用可能なプロモーターを用いてもよい。
【００３５】
本発明の核局在制御部位を有するタンパク質の核移行を制御する方法を利用することができる対象生物は、主に植物であり、植物としては、例えば、タバコ、イネ、ペチュニア、コムギ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、テンサイ、ナタネ、ダイコン、ホウレンソウ、アラビドプシス、トマト、オオムギ、ソバ等を挙げることができる。さらに、植物以外の生物であっても本発明の核移行を制御する方法を利用することはでき、例えば、酵母、動物、魚類、爬虫類等でも利用することができる。より具体的には、例えば、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、メダカ、ゼブラフィッシュ、アカパンカビ、アフリカツメガエル等でも利用することができる。
【００３６】
本発明の核移行制御方法は、例えば、核移行タンパク質の解析と新規細胞系統作出に利用することができる。
[核移行タンパク質の解析について]
本発明の核移行制御方法を適応し、TPaseの代わりに任意の核移行タンパク質に対して、T3IF5の結合するTPase内部の部位を付加し、T3IF5存在下で核への移行を阻害する。この技術を利用して行うことのできるタンパク質の機能解析は、そのタンパク質の核への移行を阻止した場合と阻止しない場合に起こる現象の比較を基礎とする。その際、該当するタンパク質の機能を欠損した株あるいは異種株を用いて実施されることが必要である。この方法では同時に、対象とするタンパク質の細胞内局在が未知の場合、T3IF5の存否応じて核移行するタンパク質量の差違を期待でき、それに基づいて調査したタンパク質が核移行するのか否かの判定にも利用できる。
【００３７】
[新規細胞系統作出について]
新規細胞系統作出においては、まず、核へ移行するタンパク質量が制御できるよう、人為的に発現調節が可能なT3IF5遺伝子を作成し、それを組み込んだ細胞株を育成する。そして、未知のタンパク質あるいは通常核に局在しないタンパク質に、核移行シグナルおよびT3IF5の結合部位を付加し、それらのタンパク質を上記細胞株で発現させ、T3IF5のコントロールのもと、核への移行量を調節することによって、核に新規の機能を付与することができる。核へ移行するタンパク質の量はこれまで人為的には調節できなかったので、その量的調節によって新規な核の機能をもつ細胞系統の開発が可能となると期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
トランスポゾンTam3転移酵素の核移行に対する阻害活性を有するタンパク質T3IF5の調製
材料および方法
【００３９】
１  供試材料
キンギョソウHAM5系統を用い、以下の条件で育成してサンプリングを行った。まず実生より25℃で2ヶ月育てて開花に至った個体の葉（3cm〜4cm長）を採取した。その後、HAM5個体は15℃の人工気象室（16時間日長）に移し、4ヶ月後に葉を採取した。コントロール用の植物にはタバコSR1系統、シロイヌナズナCol-0株およびテンサイNK-219-O系統を用いた。GFP融合タンパク質の細胞内局在解析にはタマネギ鱗茎およびタバコBY-2培養細胞を用いた。タマネギは収穫後冷蔵保存されていない新鮮な毋球を購入した。
【００４０】
２  酵母ツーハイブリッドアッセイ用ベクターの構築
酵母ツーハイブリッドアッセイ用ベクターの構築にはGATEWAYシステムを用いた。BPクローニング法によって作成したエントリークローンpEnt-TPのTam3転移酵素断片を、GATEWAY対応酵母ツーハイブリッドアッセイ用デスティネーションベクターpDESTTM22（TRP1）およびpDESTTM32（LEU2, CYH2S）にLRクローニング法によって導入した。pDESTTM32由来のプラスミドをpDBTP、pDESTTM22由来のプラスミドをpADTPとした。
【００４１】
３  酵母ツーハイブリッドアッセイ
遺伝子型MATα, leu2-3,112, trp1-901, his3Δ200, ade2-101, gal4Δ, gal80Δ, SPAL10::URA3, GAL1::lacZ, HIS3UASGAL1::HIS3@LYS2, can1R, cyh2Rの酵母株Mav203 （Invitrogen）をホストとして用いた。URA3, lacZ, HIS3はGAL4誘導型レポーター遺伝子であり、これらの発現に基づき相互作用の検定を行った。酵母形質転換はコンピテントセル添付のプロトコールに従い、PEG/LiOAc法を用いた同時形質転換法によって行った。コントロールにはpPC97-CYH2S-dDPおよびp86-dE2Fを持つ酵母株MaV103株（MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3Δ200, ade2-101, gal4Δ, gal80Δ, SPAL10::URA3, GAL1::lacZ, HIS3UASGAL1::HIS3@LYS2, can1R, cyh2R）を用いた (Du et al., 1996)。形質転換酵母はSC-LeuTrp（Synthetic Complete lacking Leucine and Tryptophan）培地上で選抜し、２種類のプラスミドを有する株を選抜した。それぞれの株をYPAD培地中で30℃条件にてOD600となるまで回転培養を行い、1,000倍希釈液を相互作用検定培地上に10μLスポットしてコントロール株が十分増殖するまで30℃で培養した。相互作用検定培地にはSC-LeuTrpHis培地およびSC-LeuTrpUra培地を用いた。
【００４２】
４  X-Galアッセイ
YPAD固形培地に目的の酵母株をスポットあるいはストリークし、30℃で18〜48時間培養したプレートからコロニーリフティングを行い、酵母コロニーをメンブレンに転写した。メンブレン1枚あたりX-Gal 10mg、メルカプトエタノール 60μLをリン酸バッファー（pH7.0）に溶解して基質溶液を調製した。基質溶液を含ませた濾紙上にメンブレンを静置して37℃で24時間インキュベートして発現をモニターした。
【００４３】
５  β-Galアッセイ
2.5mLのSC-LeuTrp液体培地にピックアップしたシングルコロニーを懸濁して30℃で1晩培養した後、5mLのYPAD液体培地に1mLを移植し、OD600が1.0〜1.5程度になるまで30℃で培養した。1.5mLずつ分注し、酵母の沈殿をバッファー（2.38g HEPES, 0.9g NaCl, 65mg L-アスパラギン, 1.0g BSA, 50μL Tween 20/100mL, pH7.3）で洗浄した。100μLのバッファーと等量の酸洗浄0.5mmガラスビーズを加え、ボルテックスで酵母を破砕した。上清に900μLの2.23mM CPRG溶液を加えて良く混合し、溶液の色が黄色から赤茶色に変わった時に250μLの6mM ZnCl2を添加して反応を停止させて上清のOD574を測定した。β-Galの活性はCPRG溶液添加後から溶液色変化までの反応時間をt、アッセイに用いた培養液の容量をVとして、以下の計算式によって算出した。
β-Gal = 1,000 x OD574/(t x V x OD600)
【００４４】
６  mRNAの抽出
FastTrack 2.0（Invitrogen）を用いて、2gのキンギョソウ新展開葉からmRNAを抽出した。操作は添付のプロトコールに従った。核酸粗抽出液から21ゲージのニードルでDNAを除去した後、oligo（dT）セルロースを用いてmRNAを精製した。
【００４５】
７  cDNAプラスミドライブラリーの構築
cDNAライブラリーはSuperScript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning（Invitrogen）を用いて構築した。操作は添付のプロトコールに従い、逆転写酵素Superscript IIとNotI-primer-adapterを用いて1本鎖cDNAを合成した。次いでE.coli DNA Ligase、E. coli DNA PolymeraseおよびE. coli RNase Hを用いて2本鎖cDNAを合成し、T4 DNA Ligaseを用いてSalI adapterを付加した。NotI消化後、ゲル濾過法によって合成cDNAのサイズ分画を行い、6〜12番目のフラクションをバルク化してpEXP-AD502ベクターの制限酵素サイト（SalI、NotI）に導入した。反応液をMAX Efficiency DH5α（Invitrogen）に形質転換してオリジナルライブラリーとした。ライブラリーはセミソリッドカルチャー法で増幅して実験に用いた (Kriegler, 1990)。
【００４６】
８  酵母ツーハイブリッドスクリーニング
酵母ツーハイブリッドスクリーニングにはpEXP-AD502ベクターにクローニングした25℃育成キンギョソウHAM5系統の増幅cDNAライブラリーを用いた。プラスミドは20%グリセロール中の増幅ライブラリーストックから100μLを1Lの2xLB培地に植菌し、30℃で一晩増殖させた後に抽出した。酵母形質転換にはPEG/MgCl2で精製したプラスミドDNA10μgを用いた。
酵母株Mav203（Invitrogen）にpDBTP55-803を形質転換した酵母株をSC-Trp培地で十分に選抜した後、YPAD培地を用いてコンピテントセルを作製した。
1次スクリーニングはHIS3の発現を指標とした。SC-LeuTrpHis培地に終濃度50mMとなるよう3ATを添加したプレート（SC-LeuTrpHis+3AT）に形質転換酵母を塗布し、30℃暗条件で5日以内に形成されたコロニーを1次陽性クローンとした。
2次スクリーニングもHIS3の発現を指標とした。SC-LeuTrpHis+3ATプレートに1次陽性クローンを塗布し、30℃暗条件で2日以内増幅したクローンを2次陽性クローンとした。
3次スクリーニングは2次陽性クローンから偽陽性クローンを排除するため、プラスミドシャッフリングを行った。SC-Trp培地に終濃度10μg/mLとなるようシクロヘキシミドを添加したプレート（SC-Trp+Cyh）に2次陽性クローンを塗布し、30℃暗条件で3〜5日培養した。シングルコロニーを単離した後、YPAD固形培地上にスポットを行い、30℃暗条件で1日培養した。再度シングルコロニーを単離し、同様の操作を4回繰り返した後、YPAD液体培地でコンピテントセルを作製した。pDBTP55-803あるいはコントロールベクターpDB-LeuをPEG/LiOAc法によって形質転換した株をSC-LeuTrpHis+3ATプレートに塗布した。pDB-Leu形質転換株ではコロニーが生ぜず、pDBTP55-803形質転換株でのみコロニーが出現したクローンを3次陽性クローンとした。
4次スクリーニングには再形質転換法を用いた。3次陽性クローンからプラスミドを抽出し、酵母Mav203株へ再度pDBTP55-803と共に同時形質転換を行い、HIS3およびlacZの発現が検出されたクローンを相互作用クローンとした。
【００４７】
９  酵母からのプラスミド抽出
SC-LeuTrp液体培地1mLに、ピックアップしたシングルコロニーを懸濁して30℃で一晩培養した。増殖した酵母を沈降させ、100μLの酵母溶解液（3% SDS, 0.2N NaOH）を加えて室温で15分間転倒撹拌した後、500μLのTE液を添加してすばやく混合した。60μLの3M NaOAcと600μLのPCIを加え、上清を新たなチューブに移してタンパク質を除いた。この操作を7〜9反復し、氷冷した650μLのイソプロパノールでプラスミドを沈殿させた。70%エタノールでリンスした後、5μLのTE液に溶解して全量を大腸菌株DH5αに形質転換した。大腸菌を増幅した後に大腸菌からプラスミドを抽出してTE液に溶解した。
【００４８】
１０  MBP融合タンパク質発現ベクターの構築
GATEWAYシステムを用いてMBP融合タンパク質発現ベクターを構築した。MBP領域下流にインフレームでattR1およびattR2が挿入されるように、pMALベクターに存在するBamHIサイトを平滑化した後、GATEWAYコンバージョンシステム カセットRf.B（Invitrogen）をライゲーションした（pMAL, pM-Rf.B）。
【００４９】
１１  プルダウンアッセイ
MBPとアミロースレジンを用いて相互作用タンパク質を共沈させた。アミロースレジン（BioLabs）は10mg/L BSA溶液を用いてブロッキングした。所定のプライマーセットを用いてT3IFエントリークローンpEnt-T3IFを作製し、LRクロナーゼを用いてpM-Rf.Bへクローニングした。大腸菌で発現精製した融合タンパク質MBP-T3IF2、MBP-T3IF5およびMBP-T3IF6をそれぞれ約10μgずつブロッキング済みアミロースレジンに添加して全量200μLとし、室温で1時間緩やかに転倒撹拌した。50倍容のPBSで未結合MBP融合タンパク質を洗浄除去してMBP融合タンパク質結合アミロースレジンを調製した。0.5〜1μgのGST融合タンパク質（I）を添加して全量20μLとし、室温または4℃で1時間緩やかに転倒撹拌して反応を行った。チューブを4℃、10,000rpmでフラッシュして上清を新しいチューブにリザーブして上清画分（S）とした。沈殿を200μLのPBSで4回洗浄した後、20mLの溶出バッファーで複合体を溶出した（P）。I、SおよびPの画分をそれぞれSDS-PAGEで分画した後、Anti-pN1 AntibodyまたはAnti-GST Antibody HRP-conjugate（Amersham）でタンパク質を検出した。
【００５０】
１２  RFP融合タンパク質発現ベクターの構築
GATEWAYシステムを用いてRFP融合タンパク質発現ベクターを構築した。RFP発現ベクターpMtR中の制限酵素サイトSalIおよびNcoIを利用して、RFP領域上流のミトコンドリアシグナルペプチドを除去した（pMtR, pR）。RFP融合タンパク質発現用デスティネーションベクターは、RFP上流にインフレームでattR1およびattR2が挿入されるように、pR中に存在するSalIサイトを平滑化した後、GATEWAYコンバージョンシステム カセットRf.C.1（Invitrogen）をライゲーションした（pRf.C.1-R）。BPクローニング法によって作成したエントリークローンpEnt-T3IFのT3IF-CDS領域を、pRf.C.1-RにLRクローニング法によって導入した。
【００５１】
１３  形質転換用バイナリーベクターの構築
植物形質転換用バイナリーベクターの構築にはGATEWAYシステムを用いた。BPクローニング法によって作成したエントリークローンpEnt-T3IFのT3IF-CDS領域を、GATEWAY対応バイナリーデスティネーションベクターpGWB2およびpMDC32にLRクローニング法によって導入した (Curtis and Grossniklaus, 2003)。pGWB2由来のバイナリーベクターをpGWB2-T3IF、pMDC32由来のバイナリーベクターをpMDC32-T3IFとそれぞれ名付けた。
【００５２】
１４  タバコBY2細胞の形質転換
アグロバクテリウム法を用いてタバコBY2細胞に形質転換を行った。アグロバクテリウムEHA105株にバイナリーベクターをエレクトロポレーション法によって導入し、形質転換アグロバクテリウムを作製した。28℃でOD600が0.5〜1.0になるまで培養し、タバコBY2細胞の形質転換に用いた。
タバコBY2細胞はBY2液体培地（MS mix salt, 200mg KH2PO4, 100mg myo-inositol, 1mg thiamine HCl, 0.2mg 2,4-D, pH5.8）で28℃、100rpm、暗条件で旋回培養を行い、植え継ぎ後３日目の培養液とアグロバクテリウムを共存培養させた。28℃48時間静置した後、15mLコーニングチューブに細胞を移してアグロバクテリウムの除菌洗浄を行った。洗浄後、カルベニシリン（500μg/mL）とカナマイシン（200μg/mL）またはハイグロマイシン（200μg/mL）を添加したBY2固形培地（0.4%ゲランガム）で形質転換細胞を選抜した。2週間後、3mm程度に成長したカルス塊を集め、抗生物質を添加したBY2液体培地で旋回培養を行った。植え継ぎ毎に抗生物質濃度を1/2に減少させ、最終的に抗生物質フリーのBY2培地で細胞を維持した。
【００５３】
結果
１  Tam3転移酵素間相互作用
Tam3転移酵素のNLIを介した核移行を制御する因子は転移酵素それ自身か宿主因子である。本発明者らはNLIを介した制御にはタンパク質間の結合が重要と考え、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによってNLIに結合するタンパク質の単離を試みた。まず、アッセイを行うための転移酵素タンパク質の条件を設定した。
アッセイ用コンストラクトとしてGAL4-DNA結合ドメインC末端にTam3転移酵素タンパク質全長を融合したプラスミドpDBTPと、PolII活性化ドメインC末端にTam3転移酵素タンパク質全長を融合したプラスミドpADTPを作製した。酵母ツーハイブリッドアッセイに先立って、pADTPを単独で酵母に形質転換した場合、GAL4レポーター遺伝子の発現は全くみられなかったのに対し、pDBTPを単独で酵母に形質転換した場合は全て検出された。従って完全長の転移酵素遺伝子を含むpDBTPは単独でレポーター遺伝子を転写させるため、酵母ツーハイブリッドアッセイには不向きであると判断した。Tam3転移酵素タンパク質アミノ酸配列のN末端54残基あるいはC末端226残基を欠失したプラスミドpDBTP55-803、pDBTP1-577ではレポーター遺伝子は発現しなかったので、pDBTP55-803とpADTPを酵母ツーハイブリッドアッセイに使用することにした。
pDBTP55-803とpADTPを同時に酵母へ形質転換した。URA3、HIS3およびlacZの3種類のレポーター遺伝子発現のモニターからTam3転移酵素タンパク質間の相互作用が検出された。Essersら(2000)は、Tam3転移酵素タンパク質633-720残基のhATCドメインを介してダイマーを形成すると予想した。しかし、N側230残基（NLIドメイン）を欠失したクローンやC側452残基を欠失した場合、pADTPとの相互作用を示さなかったことから、Tam3転移酵素タンパク質のダイマー形成にはNLIを含むN側（最大230残基）とhATCを含むC側（最大452残基）が必要であることが明らかとなった。
【００５４】
２  Tam3転移酵素相互作用因子（T3IF）のスクリーニング
Tam3転移酵素のNLIドメインを介した相互作用の結果、核移行が阻害されるとすれば、それは高温で特異的に存在する転移酵素の派生タンパク質あるいは類似のタンパク質との相互作用（ヘテロ多量体形成）が原因かもしれない。
Tam3転移酵素タンパク質との相互作用タンパク質を単離するため、キンギョソウHAM5系統のcDNAライブラリーを用いて酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。プレイライブラリーにはキンギョソウcDNAをpEXP-AD502ベクターに一方向でクローニングしたプラスミドライブラリーを用いた。25℃ライブラリーはサイズ5 x104cfu（colony formation unit）、平均インサート長1083bpで、15℃ライブラリーはサイズ4 x104cfu、平均インサート長は1250bpである。ベイトタンパク質にはpDBTP55-803を用いた。
10,000,000以上の酵母クローンからスクリーニングした結果、ベイトタンパク質と相互作用する候補として独立の11株を単離した。単離した全ての形質転換酵母株からプラスミドを抽出してシークエンスを決定した結果、10個の独立なcDNA配列が得られ、それらをTam3-TPase Interacting Factor（T3IF）１〜１０と命名した。その中にTam3転移酵素遺伝子と相同性のある配列は存在しなかった。単離したcDNAクローンについては、RACE法によって転写開始点から5'UTR、CDS、3'UTRおよびポリAまでを含む完全長cDNA配列を同定した。T3IF5の塩基配列は配列表の配列番号１に示し、T3IF5のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示す。
【００５５】
３  T3IF遺伝子の発現解析
本実験ではノーザンブロット解析によってT3IF遺伝子の発現と温度依存性との関連性を調査した。実験に先立って、サザン解析によりそれぞれのT3IF領域が反復配列を形成していない事を確認した。従って、ノーザンブロット解析で得られるバンドはそれぞれに固有の転写産物を表すことになる。転写のパターンからT3IF1、T3IF3、T3IF4、T3IF6、T3IF8、T3IF9およびT3IF10は高温と低温の両条件間で発現に差がなかったが、T3IF5は高温で特異的に発現していた（図１A）。以降の解析はT3IF2、T3IF5およびT3IF6の3遺伝子に絞って実験を進めた。
得られた3つのT3IF遺伝子の類似遺伝子はデータベースを通じてシロイヌナズナやタバコでも見出される。ストリンジェンシーを下げたノーザンブロット解析によってTam3の宿主でない植物での遺伝子発現を調査した結果、シロイヌナズナ、タバコおよびテンサイでは転写産物が検出されなかった（図２）。従って、３つのT3IFはキンギョソウで特異的に発現していると判断した。事実、高温育成下におけるTam3転移酵素の核移行阻害はキンギョソウに特異的であり、このことからもT3IFはキンギョソウ特異的に発現する遺伝子である事が支持された。
【００５６】
４  T3IFの結合特異性
T3IF2、T3IF5およびT3IF6のTam3転移酵素タンパク質NLI部位との結合特異性を確認するため、再度、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った。これら3クローンそれぞれをGAL4-DNA結合ドメインC末端に融合したpDBT3IFと、PolII活性化ドメインC末端に融合したpADT3IFを作製し、pADTP55-803株およびpDBTP55-803株へ形質転換した。lacZレポーター遺伝子の発現をβ-Galアッセイによってモニターした結果、いずれのT3IFもTP55-803タンパク質と相互作用する事が明らかとなった（図３）。
次いで、これら３つのT3IFタンパク質がTam3転移酵素NLIドメインと特異的に相互作用するか否かを調査するため、in vitroでのプルダウンアッセイを行った。アッセイにはT3IF2、T3IF5、T3IF6それぞれをMBP（マルトース結合タンパク質）のC末端に融合した組換えタンパク質として調製し（図４）、Tam3転移酵素タンパク質のNLIドメインにはGST-TP1-250融合タンパク質を用いた。MBP融合T3IFタンパク質と相互作用するGST融合Tam3転移酵素タンパク質をアミロースレジンによって共沈させた。MBP-T3IFを固定化したプルダウンアッセイの結果、いずれの組換えT3IFタンパク質でもGST-TP1-250との結合を示すバンドが検出された（図５）。MBPタグやGSTタグのみを固定化した場合はバンドが検出されないことから、T3IFタンパク質とGST-TP1-250が直接相互作用したと判断できる。次いでGST-TP231-577を同様にアッセイに用いた時にはMBP-T3IF6でのみ共沈した。
以上の結果から、T3IF2およびT3IF5はNLIドメインと特異的に結合する事が明らかとなった。T3IF6に関してはTP1-250およびTP231-577の両方との結合が検出されたので、オーバーラップしている領域（231-250）と結合する可能性もある。
【００５７】
５  T3IFを介したTam3転移酵素タンパク質の核移行阻害
T3IFの細胞内局在を調査した。SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）による機能ドメイン探索およびPSORT（http://www.psort.org/）による細胞内局在予測を行った。T3IF5ではER：小胞体膜（0.820）、原形質膜（0.190）、ペルオキシソーム（0.163）、ER：ルーメン（0.100）の順で局在性が示された。実際の細胞内局在を調査するため、RFP（赤色蛍光タンパク質）との融合タンパク質としてそれぞれのT3IFをタバコBY2細胞で発現させた。T3IF5の蛍光はPSORTの予測通りER（小胞体膜あるいはルーメン）あるいは細胞質で検出された。この結果から、T3IF5によって核移行が阻害されるとすれば、Tam3転移酵素タンパク質はERあるいは細胞質に局在化すると考えられた。
さらにT3IFを恒常的に発現するタバコBY2細胞にpTPE（Tam3転移酵素GFP融合タンパク質発現ベクター）を導入した結果、コントロールでは核に局在化した。それに対して、T3IF5を形質転換したBY2細胞ではER（小胞体膜あるいはルーメン）、細胞質および核膜にTam3転移酵素の局在化が検出され、核への局在はほとんど検出されなかった。
以上の結果から、T3IF5を発現する植物細胞中ではTam3転移酵素タンパク質の核移行が阻害され、この遺伝子が温度感受性に関与することを示唆した。
【００５８】
６  T3IF遺伝子発現の生育温度応答
ノーザンブロット解析によってT3IF遺伝子発現と温度感受性との関係を調査した。高温育成したキンギョソウHAM5系統を用い、低温育成用グロスチャンバーに移して24時間低温で育成した後に再度高温で育成した。まず、低温に移した後、0、1、6、12、24時間後の葉をサンプリングしそれぞれRNAを抽出した。さらに再度高温に移してから24、48時間後に葉をサンプリングしRNAを抽出した。図６Aに示すように、T3IF5の発現が低温育成時間を増すにつれて段階的に低下し、24時間後では転写産物を検出できなかった。低温で低下した転写産物の蓄積は再度24時間高温で育成する事によって回復した。
次いで、低温育成したキンギョソウHAM5系統を用い、高温育成用グロスチャンバーに移して24時間高温で育成した。これらの植物からも、図６Bに示すように高温に移してから0、6、12、24時間後に分けて葉をサンプリングし、それぞれRNAを抽出した。T3IF5発現は高温育成時間を増すにつれて段階的に上昇し、24時間後にはっきりと転写産物が検出された。
以上の結果からT3IF5の転写パターンとTam3転移酵素の核局在性の低温応答との間に強い相関が見られた。したがって、キンギョソウでの核局在性調節は主としてT3IF5によって担われていると結論した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の核移行制御方法は、例えば、核移行タンパク質の解析と新規細胞系統作出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ノーザンブロット解析によってT3IF遺伝子の発現と温度依存性との関連性を調査した結果。
【図２】ノーザンブロット解析によってTam3の宿主でない植物での遺伝子発現を調査した結果。
【図３】lacZレポーター遺伝子の発現をβ-Galアッセイによってモニターした結果。
【図４】３つのT3IFタンパク質がTam3転移酵素NLIドメインと特異的に相互作用するか否かを調査するため、in vitroでのプルダウンアッセイを行った結果。
【図５】MBP-T3IFを固定化したプルダウンアッセイの結果。
【図６】ノーザンブロット解析によってT3IF遺伝子発現と温度感受性との関係の調査結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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