(57)【要約】【課題】  アミロイドβ蛋白質の定量法を提供し、さらには、アミロイドβ蛋白質の凝集を阻害し得る新規物質およびそのスクリーニング法を提供する。【解決手段】  β-アミロイドによりコートした直径５0 nm〜1000 nmの不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子を、溶液中のβ-アミロイドと自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、透過率を測定することにより溶液中のβ-アミロイド濃度を測定する方法及びこれを用いたアミロイドβ蛋白質の凝集を阻害し得る新規物質およびそのスクリーニング法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-アミロイドによりコートした直径５0 nm〜1000 nmの不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子を、溶液中のβ-アミロイドと自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、透過率を測定することにより溶液中のβ-アミロイド濃度を測定する方法。
【請求項２】
コートするβ-アミロイドがAmyloid-β-Protein(1-40), Amyloid-β-Protein(1-42), Biotin Amyloid-β-Protein(1-40), Biotin Amyloid-β-Protein(1-42)からなる群れより選ばれる1種である請求項１に記載した溶液中のβ-アミロイド濃度を測定する方法。
【請求項３】
β-アミロイドによりコートした直径50 nm〜1000 nmの不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子を、溶液中のβ-アミロイドと自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、透過率を測定した結果と、当該溶液中にアミロイドβ蛋白質及びアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補を添加し自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、透過率を再度測定した結果とを比較するアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中のβアミロイドの濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面に抗体を化学的・物理的に吸着させた微粒子に抗原となる物質を加えることにより架橋凝集させることによる透過率変化を測定し、抗原の濃度を測定する方法がある（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平８−１１４５９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、アミロイドβ蛋白質の定量法を提供し、さらには、アミロイドβ蛋白質の凝集を阻害し得る新規物質およびそのスクリーニング法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するために本発明は、第一に、微粒子表面にアミロイドβ蛋白質を固定化し、蛋白質間分子相互作用を利用した濁度変化による溶液内アミロイドβ蛋白質のインビトロ定量法を提供する。さらに、第二に本発明は、アミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補のスクリーニング方法を提供する。
すなわち、本発明は、β-アミロイドによりコートした直径５0 nm〜1000 nmの不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子を、溶液中のβ-アミロイドと自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、透過率を測定することにより溶液中のβ-アミロイド濃度を測定する方法である。
また、本発明は、コートするβ-アミロイドが、Amyloid-β-Protein(1-40), Amyloid-β-Protein(1-42)からなる群れより選ばれる1種とすることができる。
さらに、本発明は、β-アミロイドによりコートした直径５0 
nm〜1000 nmの不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子を、溶液中のβ-アミロイドと自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、上清の濁度を測定した結果と、溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補を添加し再度自己集合させることにより粒子を凝集沈降させ、上清の濁度を測定した結果とを比較するアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のβ-アミロイド濃度測定方法は、微粒子表面に着ける物質をアミロイドβ蛋白質にすることで、表面に抗体を付ける場合よりも高選択性であり、抗体を用いた場合より安価に、抗体を産生させる為の実験動物の犠牲を伴わないなどの利点がある。またＰＣＲや表面プラズモン共鳴などに比べて解析速度を向上させることができる。さらに、本発明のアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補のスクリーニング方法は、効率よくアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補をスクリーニングできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明で用いるポリスチレンの表面にコートするβ-アミロイドは、Biotin Amyloid-β-Protein(1-40), Biotin Amyloid-β-Protein(1-42)であり、ストレプトアビジンを介してポリスチレンの表面と結合させる。溶液中のβ-アミロイドはAmyloid-β-Protein(1-40),Amyloid-β-Protein(40-1), Amyloid-β-Protein(1-42), Amyloid-β-Protein(42-1)であり、また凝集阻害剤と共に用いるβ-アミロイドは Amyloid-β-Protein(1-40),Amyloid-β-Protein(1-42)を挙げることが出来る。
【０００７】
本発明で用いる不溶性担体粒子であるポリスチレン系微粒子は、直径５0 nm〜1000 nmの微粒子であり、とくに１００nm〜２５０nmが好ましく用いられる。このような微粒子は、スチレンを重合することにより得られる。
本研究で用いる透過率は、波長５００ nmで単位長（１ ｃｍ）における透過光を入射光で割ったものである。
本発明で用いるβ-アミロイドで修飾されたポリスチレン系微粒子を分散させる溶媒は、同時にβ-アミロイドを溶解するものであり、この性質を備えていればどのようなものでも良いが、水、食塩水、緩衝液等が挙げられ、特にPBS<phosphate buffer saline>が好ましく用いられる。
【実施例１】
【０００８】
（実施例２）
用いた試薬：
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Streptavidin Type II Wako
Amyloid-β-Protein(1-40)：BACHEM
Amyloid-β-Protein(1-40)：PEPTIDE Institute, Inc.
Amyloid-β-Protein(40-1)：BACHEM 
Amyloid-β-Protein(1-42)：BACHEM
Amyloid-β-Protein(42-1)：BACHEM
Biotin-Amyloid-β-Protein(1-40)：ANASPEC 
Biotin-Amyloid-β-Protein(1-42)：ANASPEC
Amyloid-β-Protein(1-16)：BACHEM
Amyloid-β-Protein(12-28)：BACHEM
Amyloid-β-Protein(29-40)：BACHEM
Gly-Amyloid-β-Protein(15-25)-Σ-aminocaproyl-(Lys)6：BACHEM
Bovine Albumin Fraction V protease free：Miles.Inc
Sodium Chloride(NaCl)：Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Potassium Chloride(KCl)：Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Na2HPO4・12H2O：Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
KH2PO4：Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
実験装置：
UV / VIS Spectrophotometer：JASCO V-550
【０００９】
実施方法：
（ビーズ調製）
まずPolystyrene Microspheres(D = 202 nm)（以下ポリビーズと略）500 μl(約13 μg相当)を超音波処理し分散させた後、遠心分離(15000 rpm, 15min)により沈降させ超純水で一回洗浄を行い、遠心分離(15000 rpm, 15min)をし、上清をPBSに置換した。その後遠心(15000rpm, 15min)し沈降したbeadsにStreptavidin Type II緩衝溶液(20 μg/１ml PBS)を加え、さらにbeads溶液を全量2 mlになるようにPBSで希釈した。低温雰囲気（4 ℃）（低温室）で一晩中攪拌する。（ポリビーズ表面にストレプトアビジンが物理吸着する。）一晩攪拌した後、遠心分離(12000 rpm,10 min, 4 ℃)をしてポリビーズを沈降させ、上清を取り除いた後PBSで2回洗浄を行った。その後、Biotin-Aβ(1-40) (5 μg/1 ml PBS)1ml をstreptavidin でcoatしたbeadsに加え、さらに全量が2 mlになるようにPBSで希釈後、3時間4 ℃で回転攪拌した。攪拌終了後遠心分離(12000 rpm,10 min 4 ℃)をして、ポリビーズを沈降させ上清を取り除きPBSで２回洗浄を行った。
【００１０】
（Aβの調製）
Amyloid-β-Protein(1-40) 約0.5 mgを1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)
(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)に溶解後、室温暗下で一晩静置した。続いて、窒素ガス気流によってHFIPを除去し、フィルター(0.22μm)でろ過したミリQ水5 mlに残留物を溶かした。最後にフィルター(0.22 μm)でろ過した２倍濃度のphosphate-buffered-saline (PBS, pH7.4)を5 ml添加した。
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【００１１】
（ビーズ凝集反応）
１mlのエッペンドルフチューブにAβ最終濃度(0 μM〜1 μM)になるように300 μlづつ調製し、そこに作製したポリビーズを10 μl(約0.09μg)加え30分間室温で攪拌することによりポリビーズを凝集させた。攪拌後、遠心分離（5000 rpm,5 min）によって、凝集したポリビーズを沈降させ、上清の透過率を測定した。
【００１２】
（測定結果について）
濁度測定結果
以下 Aβ(-)溶液ビーズ（代わりにPBS<phosphate buffer saline>を入れた）。にAβ（1 μM)溶液を加えたビーズそれぞれを30分間室温で回転攪拌させた後静置させた。凝集したものと凝集しないものは、目視により判断できた。
Aβ - coat beads（以下Aβ - beads）のみであると凝集しないので、Aβ - beadsが分散状態を保ち溶液は白濁していることがわかった。さらにAβ - beads同士がAβ(1-40)により架橋され大きな凝集体を形成する。その結果、Aβ - beadsは沈殿する。結果、溶液中に分散しているAβ - beadsの量が減少し、溶液は透明になることがわかった。
【００１３】
（Aβ (1-40)リン酸緩衝液によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (1-40)をPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-40) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30分間室温で攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）した後に上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図１に結果をしめす。
図１は、Aβ (1-40)の量が増加するとAβ(1-40) - coat beadsの凝集して沈殿することによって溶液の透過率が増加する（溶液中のAβ(1-40) - coat beadsの分散している量が減少し、濁度が減少する）ことを示している。
【００１４】
（Aβ (1-42)リン酸溶液によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (1-42)をPBSでそれぞれ300 μlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-40) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）した後に上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図２に結果をしめす。
図２の結果、グラフは平坦な挙動を示し、Aβ(1-42)はAβ(1-40) - coat beadsの凝集反応を起こさないことが判明した。
【００１５】
（BSA（牛血清アルブミン）によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集）
BSAをPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.92 mg/mlに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-40) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図３に結果をしめす。
図３の結果、グラフは平坦な挙動を示し、BSAはAβ(1-40) - coat beadsの凝集反応を起こさないことが判明した。
【００１６】
（Aβ (40-1)によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (40-1)をPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-40) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図４に結果をしめす。
図４の結果、グラフはほぼ平坦な挙動を示しているので、Aβ (40-1) はAβ(1-40) - coat beadsの凝集を起こさないことが判明した。
【実施例２】
【００１７】
（Aβの調製）において、Amyloid-β-Protein(1-40)をAmyloid-β-Protein (1-42)に代えた以外は実施例２と同様にして、β-アミロイドを調整し、同じ操作を繰り返した。
（Aβ (1-40)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (1-40)をPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-42)- coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図５に結果をしめす。
図５の結果、グラフはほぼ平坦な挙動を示しているので、Aβ (1-40) はAβ(1-42) - coat beadsの凝集を起こさないことが判明した。
【００１８】
（Aβ (1-42)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (1-42)をPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-42) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV /  VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図６に結果をしめす。
図６はAβ (1-42)の量が増加するとAβ(1-42) - coat beadsの凝集して沈殿することによって溶液の透過率が増加する（溶液中のAβ(1-42) - coat beadsの分散している量が減少し、濁度が減少する）ことを示している。よってAβ(1-42)はAβ(1-42)-coat beadsの凝集を起こすことが判明した。
【００１９】
（BSAによるAβ(1-42) - coat beadsの凝集）
BSAをPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.92 mg/mlに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-42) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図７に結果をしめす。
図７の結果、グラフは正の傾きを持つ直線を示し、BSAはAβ(1-42) - coat beadsに対して弱い凝集反応があることが判明した。
【００２０】
（Aβ (42-1)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集）
立体構造がrandom coilのAβ (42-1)をPBSでそれぞれ0.3 mlずつ0〜0.8 μMに希釈した。それぞれ希釈した溶液にAβ (1-42) - coat beadsをそれぞれ約0.09 μgずつ導入混合し、30 分間攪拌した。30分後、遠心分離（5000 rpm,5 min）し、上清をUV / VIS Spectrophotometerにより混合溶液の透過率を測定した。以下図８に結果をしめす。
図８の結果、グラフはほぼ平坦な挙動を示しているので、Aβ (42-1) はAβ(1-42) - coat beadsを凝集しないことが判明した。
【００２１】
以上の結果を表1に示す。この結果は凝集能があれば○、無ければ×とし、判別できないものを△で表示した。
【表１】
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【実施例３】
【００２２】
本発明について実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（アミロイドβ蛋白質を表面に着けた微粒子の調製）
Polystyrene Microspheres(D = 202 nm)約13 μg相当を超音波処理し水中に分散させた後、遠心(15000 rpm, 15min)により沈降させた後、超純水で一回洗浄し遠心(15000 rpm, 15min)し、上清をPBS<phosphate buffer saline>に置換した。その後遠心(15000 rpm, 15min)し沈殿させた微粒子にStreptavidin Type II溶液(20 μg/１ml PBS)を加え、さらにbeads溶液を全量2 mlになるようにPBSで希釈した。低温雰囲気（4 ℃）で一晩中旋回攪拌した。旋回攪拌後、遠心分離(12000 rpm,10 min, 4 ℃)をして微粒子を沈降させた。上清を取り除いた後、微粒子をPBSで2回洗浄を行った。その後、Biotin-Aβ(1-40) (5 μg/1 ml PBS)1ml を streptavidinを表面に吸着させた微粒子に加え、さらに全量が2 mlになるようにPBSで希釈した。その後3時間4 ℃で旋回攪拌した。攪拌終了後遠心分離(12000 rpm,
10 min 4 ℃)をして、微粒子を沈降させ上清を取り除きPBSで２回洗浄を行った。
【００２３】
本発明で用いるβ-アミロイド阻害剤候補化合物は、Amyloid-β-Protein(1-16), Amyloid-β-Protein(12-28), Amyloid-β-Protein(29-40),Gly-Aβ(15-25)-Gly-e-amoinocaproyl-(Lys)6 を挙げることが出来る。
【００２４】
（ アミロイドβ蛋白質凝集の阻害薬のスクリーニング方法）
１mlのエッペンドルフチューブにアミロイドβ蛋白質（Aβ(1-40)）(1 μM)と凝集阻害剤候補物質(10 μM）の混合溶液を300 μlづつ調製し、そこに調整した微粒子を約0.09 μg加え30分間室温で攪拌することにより微粒子を架橋凝集させた。攪拌後、遠心分離（5000 rpm,5 min）によって、凝集したポリビーズを沈降させることで取り除き上清の濁度を測定した。結果を以下図９に示す。図９のpositive controlはAb(1-40)だけを入れたもの、Ab(1-16)はAmyloid-β-Protein(1-16)を添加したもの、Ab(12-28)はAmyloid-β-Protein(12-28)を添加したもの、Ab(29-40)はAmyloid-β-Protein(29-40)を添加したもの、Gly-Ab(15-25)はGly-Amyloid-β-Protein(15-25)-e-aminocaproyl-(Lys)6を添加したものである。図９の結果、Gly-Ab(15-25)だけ透過率が減少しているので、このGly-Aβ(15-25)-e-aminocaproyl-(L ys)6という凝集阻害剤候補物質がβーアミロイドの凝集について高い阻害活性を持つことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明のβ-アミロイド濃度測定方法及びアミロイドβ蛋白質の凝集阻害薬剤候補のスクリーニング方法は、アルツハイマーの治療薬、予防薬の開発に光明をもたらすものであり、産業上の利用可能性が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Aβ (1-40)リン酸緩衝液によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集
【図２】Aβ (1-42)リン酸溶液によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集
【図３】BSA（牛血清アルブミン）によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集
【図４】Aβ (40-1)によるAβ(1-40) - coat beadsの凝集
【図５】Aβ(1-40)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集
【図６】Aβ (1-42)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集
【図７】BSAによるAβ(1-42) - coat beadsの凝集
【図８】Aβ (42-1)によるAβ(1-42) - coat beadsの凝集
【図９】Aβ (1-40) 凝集の阻害剤スクリーニング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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