(57)【要約】【課題】サボテン、特にウチワサボテンの実から採った新規な乳酸菌菌株、これを用いたサボテンの乳酸菌発酵物の製造方法、及びこの方法により製造された乳酸菌発酵物を用いたヒラメの飼育方法を提供する。【解決手段】乳酸菌としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１（ＫＣＴＣ１８１０５Ｐ）によりサボテンを発酵させる段階を含むことを特徴とするサボテン乳酸菌発酵物の製造方法。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１（ＫＣＴＣ１８１０５Ｐ）によりサボテンを発酵させる段階を含むことを特徴とするサボテン乳酸菌発酵物の製造方法。
【請求項２】
サボテンの実を選別して水洗する段階と、
前記サボテンの実をミキサーにより磨砕して均質液を得る段階と、
前記均質液に糖蜜あるいは水あめなどの発酵促進剤と本発明に係る菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１とを混合する段階と、
室温において１分〜２週間、あるいはそれ以上の時間をかけて発酵を行い、発酵液を得る段階と、
前記発酵液を凍結乾燥して粉末状にする段階と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のサボテン乳酸菌発酵物の製造方法。
【請求項３】
前記サボテンがウチワサボテンであることを特徴とする請求項２に記載のサボテン乳酸菌発酵物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により調製したサボテンの乳酸菌発酵物。
【請求項５】
前記サボテンの乳酸菌発酵物がヒラメ飼料添加剤として用いられることを特徴とする請求項４に記載のサボテンの乳酸菌発酵物。
【請求項６】
ヒラメ飼料添加剤として、請求項１〜３のいずれかに記載の方法により調製したサボテン乳酸菌発酵物を含むヒラメ飼育用の飼料をヒラメに摂取させる段階を含むことを特徴とするヒラメの飼育方法。
【請求項７】
乳酸菌菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１（ＫＣＴＣ１８１０５Ｐ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサボテン、特に、ウチワサボテンの実から取った新規な乳酸菌菌株、これを用いたサボテンの乳酸菌発酵物の製造方法、並びに前記製造方法により製造された乳酸菌発酵物を用いたヒラメの飼育方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウチワサボテン（Opuntia ficus-indica）は韓国では百年草とも呼ばれるものであり、済州道の自生植物である。これは、比較的不毛な土壌でも良く成長する性質を有することから、開墾が困難な荒れ地に広く栽培され、農家における小規模な所得源として寄与している。
【０００３】
ウチワサボテンの代表的な効能としては、抗菌、抗ウィルスなどが知られており、近年、免疫機能の増大及び抗糖尿効果などについても報告されている。このような効能は、あくまでもウチワサボテンの実をそのまま摂取したり、あるいは、ウチワサボテンをそのまま加工したりすることにより得られるものである。また、ウチワサボテンは、有効成分が粘液質により被覆されているため、有効成分の効率よい摂取という面では不利なところがあると共に、普通の人間にとっては、摂取時にその独特な臭いと高い粘度が故に不愉快を招いている。これを解消するための方法として、ウチワサボテンの実及び茎からエキスを抽出し、ここに果糖などを加えた機能性飲料が開発されている。
【０００４】
しかしながら、エキスを抽出する場合、その高い粘度により、養殖飼料などの他の用途の機能性物質に添加剤として加えるときに万遍なく混ぜることが困難になるだけではなく、回収率が低く、しかも、繊維中に含まれている有効成分が失われるという欠点がある。
【０００５】
このような不具合を解決するために、ウチワサボテンの実を選別して水洗する段階と、前記サボテンの実をミキサーにより磨砕して均質液を得る段階と、前記均質液に糖蜜あるいは水あめなどの発酵促進剤と乳酸菌などの有効な微生物製剤を練り込む段階と、室温下で２週間以上をかけて発酵を行い、発酵液を得る段階と、前記発酵液を凍結乾燥して粉末状にする段階と、を含むサボテン発酵物の製造方法及びこれを用いたヒラメの養殖方法が提案されている（例えば、下記の特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、上記の技術において用いられる有効な微生物は、その発酵性能に優れておらず、その結果、当業界においては、さらに優れた発酵能を有する有効な微生物への要求が高まっていた。
【特許文献１】大韓民国特許第２００３−９４８７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、さらに、サボテン、特に、ウチワサボテンを発酵させる性能に優れており、得られたサボテンの発酵物を用いてヒラメを飼育するに当たって、ヒラメの成長を一層促進可能な新規な微生物を見出すために鋭意研究を行った。その結果、本発明者により、サボテンの実から採ったラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いてサボテン、特に、ウチワサボテンの発酵物を製造し、製造された発酵物を飼料添加剤として用いてヒラメを飼育すると、目を見張るほどに高いヒラメの成長が得られるということを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、サボテン、特に、ウチワサボテンの実から採った新規な乳酸菌菌株を提供するところにある。
【０００９】
さらに、本発明の他の目的は、前記新規な乳酸菌菌株を用いたサボテンの乳酸菌発酵物の製造方法を提供するところにある。
【００１０】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記新規な乳酸菌菌株を用いて製造された乳酸菌発酵物によるヒラメの飼育方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の諸目的を達成するために、本発明は、サボテン、特に、ウチワサボテンを発酵させる性能に優れている新規な微生物であって、サボテンの実から採ったラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１（ＫＣＴＣ１８１０５Ｐ）を提供する。
【００１２】
この微生物を用いてサボテン、特に、ウチワサボテンを発酵してサボテン発酵物を製造し、これを用いて特にヒラメを飼育する場合、ヒラメの成長を一層促進できることから、ヒラメの成長のための飼料添加剤として用いることができる。
【００１３】
前記本発明者らにより見出された新規な微生物としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１は、大韓民国大田広域市儒城区魚隱洞５２番地に所在の韓国生命工学研究院の生物資源センターに２００４年１０月１４日付けで菌株を寄託し、その結果、ＫＣＴＣ１８１０５Ｐという菌株の寄託番号を与えられた。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る、サボテンの実から採ったラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を菌株として用い、サボテン、特にウチワサボテンの発酵物を製造し、製造された発酵物を用いてヒラメを飼育することにより、目を見張るほど大きなヒラメの成長が得られることから、本発明の菌株を用いたサボテン発酵エキスは、各種の動物の飼料添加剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を一層詳述する。
【００１６】
本発明者らにより開発された新規な微生物としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１は、当業界に周知のラクトバチルス用のＭＲＳ液体培地あるいは寒天培地において培養可能である。本発明に係る微生物を培養する条件及び方法などについては、ラクトバチルス・プランタルムを培養するために当業界に周知の培養条件及び方法を用いることができる。例えば、実施例１に記載の方法に基づき、本発明の微生物であるラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を培養することができる。
【００１７】
また、本発明に係る微生物であるラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１は、桿菌であり、グラム陽性により染色され、カタラーゼ陰性反応を示す。さらに、本発明の微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（ＡＴＣＣ１４９１７）と９９．９％の相同性を有する糖発酵性を示す。より具体的に、本発明に係る微生物ＣＮＵ００１としては、Ｌ−アラビノース、リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリチン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、Ｄ−ツラノースなどの糖源を用いることができる。
【００１８】
さらに、本発明に係る菌株は、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ２０２０５と１６ＳｒＲＮＡの配列において９９％の類似性を有する。
【００１９】
しかしながら、本発明に係る微生物ＣＮＵ００１は、ラクトバチルス・プランタルム系の種と比較してかなりの類似性を有するとしても、従来周知のラクトバチルス・プランタルム系の種、あるいは、多くの他の乳酸菌と比較して、サボテン、特に、ウチワサボテンの発酵性において極めて優れた性能を示し、また、製造されたサボテン発酵物を用いたヒラメの成長効果面からも、かなりの改善効果を示す。このような微生物の発酵能及びヒラメの成長向上の効果については、今までは当業界に報告されていない。
【００２０】
本発明に係る微生物ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いたサボテン、特に、ウチワサボテンの発酵物は、従来における乳酸菌を用いたサボテン、特にウチワサボテンの発酵物の製造方法とほとんど同じ方法、例えば、上記の特許文献１に記載の方法の方法と同様にして製造することができる。例えば、ウチワサボテンの実を選別して水洗する段階と、前記サボテンの実をミキサーにより磨砕して均質液を得る段階と、前記均質液に糖蜜あるいは水あめなどの発酵促進剤と本発明に係る菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を混合する段階と、室温下で１分〜２週間、あるいはそれ以上の時間をかけて発酵を行い、発酵液を得る段階と、前記発酵液を凍結乾燥して粉末状にする段階と、を含む方法が、サボテン発酵物の製造のために用いられる。前記製造に当たり、発酵のための菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１の使用量、使用可能な糖蜜あるいは水あめなどの発酵促進剤の使用量、発酵条件、凍結乾燥粉末の製造方法など、サボテン乳酸菌の発酵物を得るための諸条件については、上記の特許文献１から参照可能であるか、あるいは、通常の実験を通じて得られる。
【００２１】
一方、本発明によれば、サボテン、特にウチワサボテンを単に抽出して用いる場合に生じる問題点として、高い粘度による使用上あるいは保存上の不都合と、養殖飼料など他の用途の機能性物質への添加剤として用いられる場合における混合ムラと、サボテン内における活性成分の低い回収率と、サボテン内における有効成分の消失などが挙げられる。これらの問題点は、本発明に係る乳酸菌としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いることにより回避することが可能になる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、本発明に係る菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１は、生存性が極めて高く、腸内定着能に極めて優れていることから、これを用いてサボテン発酵物を製造する場合、本発明に係る菌株ＣＮＵ００１は生きている状態で発酵物内に存在することになる。また、このようなサボテン発酵物を摂取したヒラメにおいては、腸まで本発明に係る菌株ＣＮＵ００１が生きている状態で伝わって定着可能であり、定着された菌株は、高い生存力により腸内の細菌菌相を変化させる。その結果、それらの有益な効果によりヒラメの腸内の健康を増進することができ、これは、ヒラメの飼育効率にかなりの改善をもたらす。
【００２３】
一方、本発明に係る菌株を用いて製造されたサボテン発酵物は、通常、ヒラメの養殖のための飼料添加剤として用いることができる。
【００２４】
本発明に係るサボテン発酵物を飼料添加剤として用いる場合、ヒラメの養殖に当たり、感染を避けるべき各種の微生物、例えば、連鎖球菌、エドワード菌、ビブリオ菌に対する高い抗菌効果を示す。このような効果により、本発明に係るサボテン発酵物を用いると、ヒラメの飼育環境を改善して高い飼育効果を得ることができる。
【００２５】
さらに、サボテン発酵物を飼料用の添加剤として用いる場合、サボテン発酵物はＥＨＶウィルス及び浸透性胃腸ウィルスの増殖抑制などの抗ウィルス作用を示す。
【００２６】
上記の長所により、新規な菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いて製造された本発明に係るサボテン発酵物は、ヒラメの飼料添加剤として有用である。
【００２７】
一方、本発明に係るサボテン発酵物を飼料用の添加剤として用いて飼料を製造する技術は、当業界における周知の添加剤を飼料に加えて飼料を製造する当業界における周知の技術の方法と同様にして製造することができる。
【００２８】
ヒラメの飼料添加剤として、本発明に係るサボテン発酵物を含有する飼料を用いてヒラメを養殖する場合、ヒラメは、稚魚段階及び成魚段階の両方においてかなりの成長効果を示す。
【００２９】
飼料に加えられるサボテン発酵物の量は、飼料の製造方式、飼育対象となる動物、その動物の健康状態などに応じて変わる。当業者であれば、適当な添加量については、実験を繰り返すなどして認識することができるであろう。
【００３０】
本発明に係るサボテン発酵物は、ヒラメの飼料用の添加剤として使用可能であるが、ヒラメの他に、犬、猫などのペット、各種の魚類などの水中動物、各種の爬虫類、各種の両生類、各種の昆虫などを含む各種の動物の飼料用の添加剤としても使用可能であり、これらも本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００３１】
以下、本発明を実施例を挙げて一層詳述するが、本発明がこれにより限定されないということは、言うまでもない。
【００３２】
下記の実施例において、サボテンとは、特に断りのない限り、ウチワサボテンを意味する。
【実施例】
【００３３】
実施例１．新規な乳酸菌の分離及び同定
１）菌の分離
自然に熟したサボテンの実を無菌的に均質化して搾汁したものを下記の滅菌された生理食塩水（０.９％のＮａＣｌ）により段階的に希釈し、０.５％のＣａＣＯ３を加えたＭＲＳ培地に塗抹した後、３０℃で３日間培養した。３日間の培養後、菌株の周りに透明な環が最も広く形成されている菌株を採った。このようにして採られた菌株を同じ培地において継代培養し、単一の菌株を得た。この菌株は、以降の実験を通じて、ラクトバチルス・プランタルム属のものであることが確認されるが、この菌株をラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１（以下、しばしば「ＣＮＵ００１」とも略される。）と名づけた。前記菌株は、大韓民国大田広域市儒城区魚隱洞５２番地に所在の韓国生命工学研究院の生物資源センターに２００４年１０月１４日付けで菌株を寄託し、その結果、ＫＣＴＣ１８１０５Ｐという菌株の寄託番号を与えられた。
【００３４】
２）ＣＮＵ００１菌株の培養
分離された菌株ＣＮＵ００１の培養には、ラクトバチルスＭＲＳ液体培地とラクトバチルスＭＲＳ寒天培地（Difco Laboratories, MD, USA）を用いた。液体培地の場合、５５ｇの培地を蒸留水１Ｌに入れ、２分間沸騰して全ての化合物を完全に溶かした後、１２１℃で１５分間滅菌を行った。なお、固体培地の場合、７０ｇの培地を蒸留水１Ｌに入れ、２分間沸騰して全ての化合物を完全に溶かした後、１２１℃で１５分間滅菌を行った。培養体の準備は、５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬずつ分取した液体培地に分離された菌株の単一コロニーを接種し、３０℃で１５０ｒｐｍにて２〜３日間振湯培養することにより行われた。
【００３５】
３）分離菌株ＣＮＵ００１の同定
−菌の形状的な特性
ラクトバチルスＭＲＳ液体培地を用い、３０℃で２〜３日間培養した液体培養体の一部を顕微鏡を用いて形状的な特性を調べてみたところ、桿菌であると明らかになった。また、グラム染色の結果、グラム陽性細菌であることが明らかになった。さらに、カタラーゼ生成の有無を調べてみた結果、カタラーゼ陰性反応が示された。
【００３６】
−菌の生理的な特性と炭素源の利用
菌株の生理学的な特性及び炭素源の利用性を調べるために、API 50 CHL（Biomerieux, France）システムを用い、メーカのガイドラインに従い糖発酵特性を調べてみた。分離菌株を３０℃で３日間培養した後、ラクトバチルス用のキットの基質に接種し、結果として得られた分離菌株の糖発酵特性を下記表１に示す。下記表１に示すように、ＣＮＵ００１菌株はラクトバチルス・プランタルムと９９.９％の相同性を有するということが分かった。表１中、ＡＴＣＣ１４９１７の種はラクトバチルス・プランタルム系の種である。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
−菌の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列分析
分離された菌株をラクトバチルスＭＲＳ液体培地（Difco, USA）に接種して３０℃で１８時間培養した後、１０,０００×ｇにて１０分間遠心分離して菌株を得た。その後、NucleoSpin Tissue Kit（ClonTech Lab., Inc.）を用い、メーカのガイドラインに従いゲノムＤＮＡを分離した。分離された全ＤＮＡから１６ＳｒＤＮＡを増幅するために２７ｆ（５'−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３'）と１５２２ｒ（５'−ＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＲＣＣＧＣＡ−３'）プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は下記の通りである。９５℃で５分間変性させた後、９５℃−１分、５５℃−１分、７２℃−１分の周期にて３３回循環させた後、最終的に７２℃で１０分間さらに反応させた。増幅されたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルにおける電気泳動により確認した。確認されたＰＣＲ産物はQIAEXR II Gel Extraction kitを用いて回収・精製してpGEM-T Easy Vector（Promega, Madison, WI）にライゲーションさせた後、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９への形質転換を行った。その後、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌとＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリン入りＬＢ寒天培地を用い、３７℃で１８時間培養した後、白いコロニーを選別した。続けて、ＳＰ６とＴ７プライマーを用いて遺伝子配列を分析した。分析された遺伝子配列の結果を、図９に示す。
【００３９】
遺伝子配列の分析は、BigDye Cycle Sequencing kit（PE Applied Biosystems, Foster City, CA)とABI Prism 310 automatic sequencer（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）により行った。このとき、塩基配列の分析は、DNA starprogramとGene Bankのブラスト検索データベース（blast search database）を用いて行われた。塩基の系統学的な関係を明らかにするために、LasergeneのMegalign programを用いて分析を行った。このときに用いられた方法は、クラスト（Clustal）方法であった。１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の分析により同定を行った結果を図１に示す。図１に示すように、ＣＮＵ００１菌株は、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ２０２０５とは９９％の相同性を有するということが明らかになった。
【００４０】
実施例２．分離された乳酸菌ＣＮＵ００１の特性
１）分離菌株のサボテン発酵能の検証
サボテンの実のトゲを取った後、水洗した。次いで、トゲを取ったサボテンの実１０Ｋｇに蒸留水１Ｌ入れて９０℃で煮込んだ後、搾汁を行い、固形物を除去して発酵用の実汁を得た。
【００４１】
このようにして得られたサボテンの発酵用の実汁を、本発明の菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いて発酵させた。すなわち、滅菌したＭＲＳ液体培地１００ｍＬに菌株液を１ｍＬずつ接種して３０℃で２０時間培養した。この培養液をサボテンの実の搾汁液に０.２％ずつ接種して２Ｌの培養瓶に分取して封止した。次いで、２５℃、７日間培養しながら、発酵期間別にｐＨ、糖度、適正酸度、乳酸菌の数などを調べた。
【００４２】
−発酵期間別の糖度
得られた発酵液に対し、屈折糖度計（Hand refractometer, No. 507-1, NOW, Japan）を用いて発酵期間別の糖度を測定した。その結果を図２に示す。
【００４３】
図２に示すように、培養期間中の糖度は、４.０Ｂｒｉｘから３.２〜３.４Ｂｒｉｘへと僅かな変化を示すだけで、大した変化は見られなかった。
【００４４】
−発酵期間別の発酵液のｐＨ及び総酸度の測定
ｐＨは、試料の一定量をとり、ｐＨ測定計により測定した。なお、総酸度は、発酵液５ｍＬに滅菌水５ｍＬを加えた後、０.１ＮＮａＯＨによりｐＨ８.３まで滴下し、下記式に基づき計算した。その結果を図３に示す。
【００４５】
総酸度＝（０.１ＮＮａＯＨの消費量（ｍＬ）×Ｆ×０.００９／試料の体積）×１００
【００４６】
図３に示すように、発酵が進行中の場合、ｐＨは培養１日目から急激に減少し、発酵の終結時におけるｐＨは、ｐＨ３.５０であった。総酸度の変化は、発酵が進行するに伴い高速に酸を生成し、発酵の末期には酸度が０.８５％であった。
【００４７】
−乳酸菌数の測定
このようにして得られた発酵液０.５ｍＬを０.９％のＮａＣｌ溶液４.５ｍＬに懸濁し、これを１０倍単位に希釈した。その後、０.５％のＣａＣＯ３入りラクトバチルスＭＲＳ寒天培地を用いてポーアプレーティング（pour plating）方法により３０℃で３日間培養して、コロニーが鮮やかで且つ相対的に透明環（clear zone）を形成しているものの数を計測した。同じ実験を３回繰り返し行って平均値を算出し、その結果を図４に示す。
【００４８】
図４に示すように、ＣＮＵ００１菌株をサボテンの実の搾汁液に接種して２５℃において発酵させながら、乳酸菌数の変化を対数値により測定した。さらに、各接種量６.１〜６.９ＣＦＵ／ｍＬの条件下で、発酵期間による生育特性を調べてみたところ、培養１日で大幅に増加して８.４ＣＦＵ／ｍＬに達しており、２日目から発酵の末期まではほとんど類似したレベルを保っていた。
【００４９】
−発酵液の糖と有機酸の分析
このようにして得られた発酵液を遠心分離した後に上澄み液を採り、０.２μｍミリポア膜フィルタ（millipore membrane filter）に通した。ろ過液に対し、ＨＰＬＣを用いて発酵液の糖類を分析して定量した。このときの条件は、下記の通りである。
・ＨＰＬＣ：水−カーボハイドレイトカラム（Water carbohydrate column）
・検出器：ＥＬＳＤ２０００
・溶出液：アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（７５：２５）
・流速：１.０ｍＬ／分
・注入体積：１０μＬ
【００５０】
なお、発酵液の有機酸の分析は、Supelcogel TMC-610Hカラムを用いて行った。さらに、検出器はＵＶ（２１０ｎｍ）、溶出液は０.１％のリン酸、流速は０.５ｍＬ／分、注入体積は５μＬであった。その結果を図５及び図６に示す。
【００５１】
図５に示すように、発酵期間による糖の含量の変化を分析したところ、発酵３日目まではグルコースの含量が４.６ｍｇ／ｍＬから１.０ｍｇ／ｍＬへと急減したが、３日目からは緩やかに減っていた。フルクトースは、発酵が進むに伴い、徐々に減る傾向にあった。そして、スクロースの含量はほとんど変化がなかった。
【００５２】
さらに、図６に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１により発酵されたサボテンの実の搾汁液における有機酸の含量の変化によれば、主としてクエン酸、リンゴ酸、乳酸、酢酸などが分離された。クエン酸は、発酵前には約１.８ｍｇ／ｍＬであったが、発酵進行中にほとんど変化がなかった。乳酸の場合、発酵前には検出されなかったが、発酵が進むに伴い増えていった。特に、発酵の終結後、乳酸の含量は３.８７ｍｇ／ｍＬであった。
【００５３】
実施例３．ＣＮＵ００１を用いたサボテン発酵物の製造
サボテンの実の搾汁液を発酵前にｐＨ６.６に調節して乳酸菌を接種した後、３〜４日間かけて発酵を行った。発酵液に麦芽糖を１０％の濃度になるようにして入れた後、均質化させた。次いで、発酵液に凍結保護剤として脱脂乳を１０％の濃度にて加えた後に、混合して均質化させた。続けて、−７０℃で３日間凍結し、凍結乾燥機において乾燥した。乾燥された試料は、粉砕して粉末状にした。
【００５４】
実施例４．ＣＮＵ００１を用いて得られたサボテン発酵物の成分分析
本発明の菌株の発酵効能を確かめるために、本発明に係る菌株ＣＮＵ００１を用いたサボテンの発酵前後の各種の成分の含量を分析した。
【００５５】
ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１菌株を発酵菌株として、発酵前と発酵後におけるサボテンの全成分、アミノ酸の成分及び脂質成分の含量分析を行い、その結果をそれぞれ下記表２、３及び４に示す。
【００５６】
下記表に示す結果から明らかなように、本発明の菌株を用いた発酵によれば、従来に問題視されていたサボテン中の繊維質などの粘液質成分の含量が大幅に減っていることが分かった。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
また、サボテンの発酵後、凍結乾燥工程を行った後に分析された、サボテンの全成分、アミノ酸の成分及び脂質成分の含量をそれぞれ下記表２−２、３−２及び４−２に示す。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
【表６】
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【００６３】
【表７】
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【００６４】
実施例５．ＣＮＵ００１菌株を用いて製造されたサボテンの実発酵液をヒラメに投与した投与群とそうでない対照群の腸内細菌相の分布
この実施例は、本発明の菌株としてのラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１を用いてサボテン発酵物を実施例３に従い製造し、製造された発酵物を１重量％の濃度にてＥＰ飼料（日清丸紅飼料、日本）に加えた後、これを約３ヶ月間ヒラメに摂取させる方式により、前記菌株をヒラメに投与したとき、ヒラメの腸内に本発明の菌株がどれほど定着されたかを確かめるために行われた。
【００６５】
その結果を図７に示す。すなわち、図７に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１菌株を用いて発酵させたサボテン発酵物をヒラメに連続して投与した後、ヒラメの腸内細菌相の変化を生菌数により測定したところ、対照群は通常の腸内細菌のみが主流をなしていたが、発酵物を投与した試験群の場合、腸内細菌数が対照群よりも約２３.６％程度減っており、投与区において乳酸菌が腸１ｇ当たり３.３Ｌｏｇ１０ＣＦＵの割合にて存在していた。
【００６６】
実施例６．本発明に係るサボテン発酵物の抗菌効果
この実施例においては、実施例３に従い製造されたサボテン発酵物をヒラメに摂取させる場合、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）に見られる抗菌効果について確かめるための実験を行った。抗菌効果の確認の対象となる菌として、ヒラメの養殖に際して滅菌が求められる連鎖球菌、エドワード菌及びビブリオ菌を用いた。
【００６７】
１）連鎖球菌
連鎖球菌の増殖に及ぼすサボテン発酵物の効果を調べるために、液体培地における菌の増殖率を比較分析した。先ず、実施例３に従い製造された凍結乾燥済みのサボテン発酵物をＢＨＩ（Brain Heat Infusion, Difco）に最終的な濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように浮遊させた後、室温下において３０分間混合し、その後、ｐＨを７.０に調整した。この混合物を氷箱に入れ、１５秒間の超音波処理および１５秒間の静置を８回繰り返した。超音波処理後、ろ紙により不溶性の物質を除去した後、注射器ろ過滅菌機（０.４５μｍの気孔径）に通し、その結果物を実験群として用いた。なお、サボテン発酵物が加えられていないＢＨＩを対照群として用いた。
【００６８】
実験群と対照群に予めＢＨＩにおいて１８時間培養しておいた連鎖球菌を１.２×１０４ＣＦＵ／ｍＬのレベルに接種した後、２２℃において静置しながら接種後、０、２、４、８、１２及び２４時間で連鎖球菌の菌数を測定した。菌数の測定は、実験群と対照群において、毎測定時期ごとに１００μＬの培養液を滅菌された生理食塩水に希釈した後、２％のＮａＣｌが加えられているＴＳＡ（Tryptic Soy agar, Difco）に塗抹接種して行われた。なお、各実験は２回繰り返し行われ、その結果を下記表５及び図８（Ａ）に示す。下記表５及び図８（Ａ）に示すように、対照群に比べて極めて高い細菌増殖の抑制効果が認められた。すなわち、サボテンが加えられていない対照群の場合、当初の４.１ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの菌数から、２４時間後に９.２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬまで増殖しているのに対し、サボテン発酵物が加えられている実験群においては、培養２４時間後に４.７ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの菌数を示し、菌の増殖は見られなかった。
【００６９】
【表８】
2006158396.tif 000010
【００７０】
また、連鎖球菌の病原性実験を下記のようにして行った。実験に用いられたヒラメは６ｃｍ級の大きさであり、済州道の海洋水産資源研究所に設けられたＦＲＰ丸水槽（φ７４ｃｍ×８０ｃｍ）において３ヶ月間サボテン発酵物１.０％入り飼料により飼育したものを用いた。飼育期間中における飼育水温は１７.４〜２１.６℃、塩分の濃度３３.０〜３５.４‰、ＤＯ５.８４〜７.１２ｍｇ／Ｌ、そして、ｐＨは７.５７〜８.０４の範囲であった。
【００７１】
具体的な実験方法を以下に述べる。すなわち、サボテン発酵物を加えた飼料（１重量％の濃度にてサボテン発酵物を含有するＥＰ飼料）を摂食したヒラメと、ＥＰ飼料を摂食したヒラメをそれぞれ５実験群と５対照群に分けて配置した。各群は４匹のヒラメよりなり、活性化した連鎖球菌をＢＨＩ液体培地に培養した後、１ｍＬ当たり９.８、９.８×１０２、９.８×１０４、９.８×１０６、９.８×１０８の連鎖球菌を腹腔に０.１ｍＬずつ接種した。接種後１４日間飼育しながら、斃死の有無及び外観の症状を毎日確認した。斃死魚と発現魚は解剖して病変を観察し、肝臓と腎臓において細菌を培養した。その結果を下記表６に示す。
【００７２】
【表９】
2006158396.tif 000011
【００７３】
上記表６に示すように、サボテン発酵物を加えた飼料を摂取しなかったヒラメの場合、１×１０９個の生存細胞（連鎖球菌）を接種した対照群は９日で７８％が斃死し、１×１０３個の生存細胞を接種した対照群は、１２日で５０％が斃死し、１×１０１個の生存細胞を腹腔注射した対照群は１０日で２５％が斃死した。また、１×１０７個の生存細胞を接種した対照群においては、１匹の斃死もなかったものの、腹水及び眼球突出が臨床症状として見られ、肝臓、腎臓などから接種菌などの原因菌が検出されていた。
【００７４】
しかしながら、サボテン発酵物入り飼料を摂食したヒラメの場合、１×１０９個の生存細胞を接種した実験群は８日で５０％が斃死し、１×１０７個の生存細胞を接種した実験群は１３日で２５％が斃死しただけであった。
【００７５】
これにより、本発明に係るサボテン発酵エキスは、球菌に対する抗菌効果があるということが明らかになった。
【００７６】
２）エドワード菌
エドワード菌の増殖に及ぼすサボテン発酵物の効果を調べるために、液体培地における菌の増殖率を比較分析した。先ず、実施例３の方法に従い製造された凍結乾燥済みサボテン発酵物をＢＨＩに最終濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように浮遊させた後、室温下において３０分間混合し、ｐＨを７.０に調整した。この混合物を氷箱に入れ、１５秒間の超音波処理および１５秒間の静置を８回繰り返した。超音波処理後、ろ紙により不溶性の物質を除去した後、注射器ろ過滅菌機（０.４５μｍの気孔径）に通し、その結果物を実験群として用いた。なお、サボテンが加えられていないＢＨＩを対照群として用いた。
【００７７】
実験群と対照群に予めＢＨＩにおいて１８時間培養しておいた連鎖球菌を１.２×１０４ＣＦＵ／ｍＬのレベルで接種した後、２２℃において静置し、接種後０、２、４、８、１２及び２４時間で連鎖球菌の菌数を測定した。菌数の測定は、実験群と対照群において毎測定時期ごとに１００μＬの培養液を滅菌された生理食塩水に希釈した後、２％のＮａＣｌが加えられたＢＨＩ寒天培地に塗抹接種して行われた。なお、各実験は２回繰り返し行われ、その結果を下記表７及び図８（Ｂ）に示す。
【００７８】
表７及び図８（Ｂ）に示すように、対照群の場合、培養１２時間後に８.４ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ、２４時間後に１１.０ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの菌数を示し、ウチワサボテンの実発酵粉末が加えられた実験群の場合、培養１２時間後に４.５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ、２４時間後に９.５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ菌数を示した。これより、エドワード菌の増殖抑制効果が１２時間まで続くことを確認した。
【００７９】
【表１０】
2006158396.tif 000012
【００８０】
また、エドワード菌の病原性の実験を下記のようにして行った。実験に供試されたヒラメは６ｃｍ級の大きさであり、済州道の海洋水産資源研究所に設けられたＦＲＰ丸水槽（φ７４ｃｍ×８０ｃｍ）において２０日間サボテン発酵物１.０％入り飼料により飼育したものを用いた。飼育期間中における飼育水温は１７.４〜２１.６℃、塩分の濃度３３.０〜３５.４‰、ＤＯ５.８４〜７.１２ｍｇ／Ｌ、そしてｐＨは７.５７〜８.０４の範囲であった。
【００８１】
具体的な実験方法として、サボテン発酵物を加えた飼料（１重量％の濃度にてサボテン発酵物を含有するＥＰ飼料）を摂食したヒラメと、ＥＰ飼料のみを摂食したヒラメをそれぞれ５実験群と５対照群に分けて配置した。各群は４匹のヒラメよりなり、活性化したエドワード菌をＢＨＩ液体培地に培養した後、成長した菌株を滅菌生理食塩水に浮遊させて１ｍＬあたり９.８、９.８×１０２、９.８×１０４、９.８×１０６、９.８×１０８のエドワード菌を腹腔に０.１ｍＬずつ接種した。接種後２０日間飼育しながら、斃死の有無及び外観の症状を毎日チェックした。斃死魚と発現魚は解剖して病変を観察し、肝臓と腎臓に細菌を培養した。その結果を下記表７−２に示す。
【００８２】
【表１１】
2006158396.tif 000013
【００８３】
表７−２に示すように、サボテン発酵物入り飼料を摂取しなかったヒラメの場合、１×１０９個の生存細胞を接種した対照群においては９日で１００％が斃死し、１×１０３〜１×１０７個の生存細胞を接種した対照群においては１６日で２５％が斃死し、そして１×１０１個の生存細胞を腹腔注射した対照群においては１２日で５０％が斃死した。これに対し、サボテン発酵物入り飼料を摂食したヒラメの場合には、１×１０９個の生存細胞を接種した粉末と液状の実験群の両方において８〜１４日間に１００％が斃死した。１×１０７個の生存細胞を接種した実験群と対照群においてほとんど同じ斃死率を示し、有意差が見られなかった。
【００８４】
一方、実験的に、エドワード菌に感染されたヒラメからは、その外観上、彩色の黒化、脱腸、眼球突出及び白濁、体表面の粘液などが主たる症状として見られた。解剖学的には、全般的な淡い粘液性の腹水が多量に満たされており、肝鬱血及び腎臓と脾臓の肥大を示し、自然感染魚と類似した症状を示していた。エドワード菌に感染されたヒラメの腎臓組織からは、尿細管上皮細胞の剥離及び壊死症状と、尿細管の顕著な減少が見られた。一部個体の肝臓からは、肝膵臓と隣り合う結合組織領域に壊死細胞とその細胞塊が認められた。
【００８５】
３）ビブリオ菌
ビブリオ菌の増殖に及ぼすサボテン発酵物の効果を調べるために、液体培地における菌の増殖率を比較分析した。先ず、実施例３の方法に従い製造された凍結乾燥されたサボテン発酵物をＢＨＩに最終濃度が２％（ｗ／ｖ）になるように浮遊させた後、室温下で３０分間混合し、ｐＨを７.０に調整した。この混合物を氷箱に入れ、１５秒間の超音波処理および１５秒間の静置を８回繰り返した。超音波処理後、ろ紙により不溶性の物質を除去した後、注射器ろ過滅菌機（０.４５μｍの気孔径）に通し、その結果物を実験群として用いた。サボテンが加えられていないＢＨＩを対照群として用いた。
【００８６】
実験群と対照群に予めＢＨＩにおいて１８時間培養しておいたビブリオ菌を１.２×１０４ＣＦＵ／ｍＬレベルに接種した後、２２℃において静置しながら、接種後０、２、４、８、１２及び２４時間におけるビブリオ菌の菌数を測定した。菌数の測定は、実験群と対照群において毎測定時期ごとに１００μＬの培養液を滅菌された生理食塩水に希釈した後、２％のＮａＣｌが加えられたＢＨＩ寒天培地に塗抹接種して行われた。なお、各実験は２回繰り返し行われ、その結果を図８（Ｃ）に示す。
【００８７】
図８（Ｃ）に示すように、対照群の場合、培養１２時間後に９.２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ、２４時間後に１１.１ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの菌数を示し、ウチワサボテンの実発酵粉末が加えられた実験群の場合、培養１２時間後に３.６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ、２４時間後に６.４ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ菌数を示した。これにより、ビブリオ菌の増殖抑制効果が２４時間まで続くことを確認した。
【００８８】
さらに、ビブリオ菌の病原性の実験を下記のようにして行った。実験に供試されたヒラメは６ｃｍ級の大きさであり、済州道の海洋水産資源研究所に設けられたＦＲＰ丸水槽（φ７４ｃｍ×８０ｃｍ）において１ヶ月間サボテン発酵物１.０％入り飼料により飼育したものを用いた。飼育期間中における飼育水温は１７.４〜２１.６℃、塩分濃度３３.０〜３５.４‰、ＤＯ５.８４〜７.１２ｍｇ／Ｌ、そしてｐＨは７.５７〜８.０４の範囲であった。
【００８９】
具体的な実験方法は、下記の通りである。すなわち、各群は４匹のヒラメよりなり、活性化したビブリオ菌をＢＨＩ液体培地に培養した後、成長した菌株を滅菌生理食塩水に浮遊させ、１ｍＬ当たり１×１０、１×１０３、１×１０５、１×１０７、１×１０９のビブリオ菌を腹腔に０.１ｍＬずつ接種した。接種後３１日間飼育しながら、斃死の有無及び外観の症状を毎日チェックした。斃死魚と発現魚は解剖して病変を観察し、肝臓と腎臓において細菌を培養した。その結果を下記表８に示す。
【００９０】
【表１２】
2006158396.tif 000014
【００９１】
その結果、表８に示すように、本発明の乳酸菌入り飼料を摂食しなかったヒラメにおいては、１×１０９個の生存細胞を接種した場合、１日で１００％が斃死し、１×１０７個の生存細胞を接種した場合、３日で７５％が斃死し、そして１×１０５個の生存細胞を接種した場合、８日で２５％が斃死した。
【００９２】
また、表８に示すように、サボテン発酵物入り飼料を摂食したヒラメにおいては、１×１０９個の生存細胞を接種した場合、１日で１００％が斃死し、１×１０７個の生存細胞を接種した場合、４日で５０％が斃死した。腹水及び眼球突出が臨床症状として見られ、肝臓、腎臓などからは接種菌などの原因菌が検出された。
【００９３】
一方、ビブリオ菌に感染されたヒラメからは、その外観上、彩色の黒化、脱腸、眼球突出及び白濁、体表面の粘液などが主たる症状として見られた。解剖学的には、全般的な淡い粘液性の腹水が多量に満たされており、肝鬱血及び腎臓と脾臓の肥大を示し、自然感染魚と類似した症状を示していた。ビブリオ菌に感染されたヒラメの腎臓組織からは、尿細管上皮細胞の剥離及び壞死症状と、尿細管の顕著な減少が見られた。一部個体の肝臓からは、肝膵臟と隣り合う結合組織領域に壞死細胞とその細胞塊が認められた。
【００９４】
実施例７．本発明に係るサボテン発酵物の抗ウィルス効果
１）ウマヘルペスウィルス（ＥＨＶ）に対するサボテン発酵物の増殖抑制効果
ウマヘルペスウィルス（Equine herpesvirus；ＥＨＶ）は、ヘルペスウィルス科に属するＤＮＡウィルスであり、これに感染されると、雌馬の初期感染時に一過性の発熱、鼻汁を主徴とする鼻肺炎であり、妊娠馬が妊娠中期以降に感染されると、胎子感染が起こり、その結果、流死産が引き起こされると知られている。この実験は、本発明に係るサボテン発酵物がＥＨＶに対して増殖抑制効果を有するかどうかを確かめるために行われた。
【００９５】
具体的な実験方法は下記の通りである。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Microtiterplate）にＭＤＢＫ細胞を単層に増殖させた。細胞培養液を除去後、各ウェルにＥＨＶウィルス５０ＰＦＵ／５０μＬを１時間感染させ、２倍段階に希釈させた実施例３に従い製造されたサボテン発酵物１００μＬを各ウェルに分取した。その後、ウィルスの増殖の有無を対照群ウェルに対する試験群のウェルのプラーク数の割合により観察した。各実験は４回行った後、平均値を算出した。
【００９６】
その結果、実施例３に従い製造されたサボテン発酵物を処理したプレートにおいてはウィルスが増殖されず、全くプラークが生成されなかったことから、１００％の抑制効果が現れることが確認された。
【００９７】
さらに、サボテン発酵物のＥＨＶウィルスに対する予防効果があるかどうかを確かめるために、下記の実験を行った。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレートにＭＤＢＫ細胞を単層に増殖させた。細胞培養液を除去後、２倍段階に希釈した実施例３に従い製造されたサボテン発酵物５０μＬを各ウェルに分取し、１時間培養させた。各ウェルに希釈されたサボテン発酵物を除去した後、各ウェルにＥＨＶウィルス５０ＰＦＵ／５０μＬを１時間感染させた。ウィルスの増殖の有無を、サボテンエキスが入っていない対照群ウェルのプラーク数に対する試験群のウェルのプラーク数の割合により観察した。各実験は、４回行った後、平均値を算出した。
【００９８】
その結果、実施例３に従い製造されたサボテン発酵物を処理したプレートにおいてはウィルスが増殖されず、プラークが全く生成されなかったことから、１００％の予防効果を示すことが確認された。
【００９９】
２）ウシヘルペスウィルス（ＢＨＶ）に対するサボテン発酵物の増殖抑制効果
ウシヘルペスウィルス（ＢＨＶ）は、ヘルペスウィルス科に属するＤＮＡウィルスの感染により引き起こされ、牛の呼吸器型と生殖器型の伝染病である。高熱と呼吸器系統の急性炎症壞死と流産、そして伝染性の膿疱性外陰膣炎及び亀頭包皮炎を引き起こし、子牛においては時々脳炎を引き起こすと知られている。この実験は、本発明に係るサボテン発酵物がＢＨＶに対して増殖抑制効果を有するかどうかを確かめるために行われた。
【０１００】
具体的な実験方法は、下記の通りである。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレートにＭＤＢＫ細胞を単層に増殖させた。細胞培養液を除去後、各ウェルにＢＨＶウィルス５０ＰＦＵ／５０μＬを１時間感染させ、２倍段階に希釈させた実施例３に従い製造されたサボテン発酵物１００μＬを各ウェルに分取した。その後、ウィルスの増殖の有無を対照群のウェルのプラーク数に対する試験群のウェルのプラーク数の割合により観察した。各実験は、４回行った後、平均値を算出した。
【０１０１】
その結果、実施例３に従い製造されたサボテン発酵物を処理したプレートにおいてはウィルスが増殖されず、プラークが全く生成されなかったことから、１００％の抑制効果が得られることが確認された。
【０１０２】
さらに、サボテン発酵物がＢＨＶウィルスに対して予防効果があるかどうかを確かめるために、下記の実験を行った。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレートにＭＤＢＫ細胞を単層に増殖させた。細胞培養液を除去後、２倍段階に希釈した実施例３に従い製造されたサボテン発酵物５０μＬを各ウェルに分取し、１時間培養した。各ウェルから希釈されたサボテン発酵物を除去した後、各ウェルにＥＨＶウィルス５０ＰＦＵ／５０μＬを１時間感染させた。ウィルスの増殖の有無を、サボテンエキスが入っていない対照群のウェルのプラーク数に対する試験群のウェルのプラーク数の割合により観察した。各実験は４回行った後、平均値を算出した。
【０１０３】
その結果、実施例３に従い製造されたサボテン発酵物を処理したプレートにおいてはウィルスが増殖されず、プラークが全く生成されなかったことから、１００％の予防効果が得られることが確認された。
【０１０４】
実施例８．本発明に係るサボテン発酵物を用いたヒラメの飼育
この実施例においては、本発明に係るサボテン発酵物は飼料添加剤として用いられると飼育されたヒラメに優れた成長効果をもたらすことを確かめるために行われた。
【０１０５】
ヒラメの稚魚時期においては、ＰＰ小水槽（１トン）を用い、サボテン発酵液１重量％をＥＰ飼料（日清丸紅飼料、日本）に飼料重量に対して吸着させ、１日につき２回ずつ実験魚が摂餌活動をしなくなるまで十分に供給した。これを３ヶ月間続けた。実験前後におけるヒラメの体長、体重及び生存率を調べ、その結果を下記表９に示す。
【０１０６】
【表１３】
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【０１０７】
一方、ヒラメ成魚に対しては、ＰＰ小水槽（１トン）を用い、凍結乾燥されたサボテン発酵粉末をＭＰ飼料（発明者により製造された飼料であり、マアジ９０％、魚粉１０％を混合して製造されたものである）の重量比を基準に０.０２〜０.１６重量％の各種の濃度にて吸着して、１日につき２回ずつ実験魚が摂餌活動をしなくなるまで十分供給した。これを８ヶ月間続けた。実験前後におけるヒラメの体長、体重及び生存率を調べ、その結果を下記表１０に示す。
【０１０８】
【表１４】
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【０１０９】
実施例９．本発明に係る飼料添加剤と、他の微生物を用いて製造されたサボテン発酵エキスを含む飼料添加剤と、を比較したヒラメの飼育効果
サボテンの発酵に用いる発酵菌株として、ＥＭ（有用複合微生物）、光合成細菌、乳酸菌の５種類を選び、それぞれの発酵液がヒラメの成長に及ぼす効果を調べてみた。次いで、実施例８の方法と同様にして、それぞれの飼料添加剤を用いて飼育したヒラメの成長効果を比較し、その結果を下記表１１に示す。
【０１１０】
下記表１１に示すように、飼育効果は、ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１の場合に最大となることが分かった。
【０１１１】
【表１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の分析により得られた結果であり、サボテンの実から採った新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株がどの系統に属するかを示す図である。
【図２】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株を用いてサボテンを発酵する場合における、発酵期間別の糖度の変化を示す図である。
【図３】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株を用いてサボテンを発酵する場合における、発酵期間別の酸度の変化を示す図である。
【図４】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株をサボテンの実のエキスに接種し、２５℃において発酵した時に得られる発酵期間別の乳酸菌数の変化を示す図である。
【図５】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株を発酵する場合に得られる発酵期間別の糖の含量分析の結果を示す図である。
【図６】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株により発酵されたサボテンの実のエキスにおける有機酸の含量の変化を示す図である。
【図７】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株をヒラメに投与したとき、ヒラメの腸内に本発明の菌株がどれほど定着されたかを示す図である。
【図８】本発明に係る新規な乳酸菌ＣＮＵ００１菌株の抗菌効果を示す図である。（Ａ）は連鎖球菌に対する効果、（Ｂ）はエドワード菌に対する効果、（Ｃ）はビブリオ菌に対する効果。
【図９】ラクトバチルス・プランタルムＣＮＵ００１の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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