(57)【要約】【課題】本発明は神経生物学及びトランスジェニック動物に関する。【解決手段】具体的には、本発明はトランスジェニックマウスＦ０６６及びその自己プロモーターの制御下でヒトｓｃａ２遺伝子を発現することができるセルラインに関する。Ｆ０６６トランスジェニックマウスはＳＣＡ遺伝子病の特徴を産生する。従って、このトランスジェニックラインは、該病気を産生するメカニズムを研究するのに有用であり、また、該病気の患者の臨床症状を最少にするのに貢献する新たな治療を証明する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ０６６と名付けられ、アタキシン２−ポリペプチドの第１エキソン内に約７５個のＣＡＧのポリグルタミン領域を含む、配列表中で配列番号１として同定されるＤＮＡ配列をゲノム中に組み込まれた状態で含有し、前記配列が、ヒトの患者において観察される発現パターンを再現するＳＣＡ２ヒトプロモーターに作動的に連結されているトランスジェニックマウス。
【請求項２】
前記導入遺伝子についてホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記導入遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
親動物と同じ形態学的、生殖的及び行動的な特性を特徴とする、請求項１、２及び３に記載のトランスジェニックマウスの子孫。
【請求項５】
ＳＣＡ２遺伝子の第１エキソン内に７５個のＣＡＧの伸長部を有する、配列番号１として同定される配列をゲノムの一部として含有し、前記配列がＳＣＡ２ヒトプロモーターに作動的に連結されている細胞系を作製するための、請求項１、２、３及び４に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項６】
ＳＣＡ２遺伝子の第１エキソン内に７５個のＣＡＧの伸長部を有する、配列番号１として同定される配列をゲノムの一部として含有し、前記配列がＳＣＡ２ヒトプロモーターに作動的に連結されている、請求項５に記載の細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経生物学及びトランスジェニック動物に関し、さらに詳しくは、遺伝病である脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）を研究するための動物モデルを得ることと、これを使用するための方法とに関する。発明の本質は、１つのマウス系のゲノムが、ヒトアタキシン２の合成のために必要な情報を含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメントの導入を通じて変更されていることにある。特に本発明は、ヒトｓｃａ２遺伝子をその自己プロモーターの調節下で発現することができるトランスジェニックマウスＦ０６６とそれ自体に由来する細胞系とに関する。それらのＦ０６６と名付けられたトランスジェニックマウスは、ＳＣＡ２病の症状の幾つかを再現する。
【背景技術】
【０００２】
優性脊髄小脳失調症は、主に小脳のプルキンエニューロンに影響を与える神経変性疾患群である。脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）は、歩行失調、発語障害、反射異常行動及び緩慢で限定された眼球運動を特徴とする常染色体優性遺伝病である（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  Ｌ、Ｍｅｄｉｎａ  ＨＥ（１９９９年）、Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ  ２７（１６０）：９２１〜９２６頁）。
【０００３】
分子的には、上記疾患の症状の出現は、該病原対立遺伝子が３２個以上のＣＡＧ反復を呈する場合に発生し、このような反復を伸長部とみなしている（Ｓａｎｔｏｓら（１９９９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｕｂａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １６：２１９〜２２１頁）。該疾患症状の始まりは、上記伸長部の長さと逆の相関を持つ。この疾患は進行性であり、患者は症状開始後１５〜１８年で死亡する。より頻繁にある病原性反復は、３７個のＣＡＧ又はグルタミン反復である。グルタミン反復の数は、２０歳から６０歳の臨床症状開始時年齢に関連している（Ｓａｎｔｏｓら（１９９９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｕｂａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １６：２１９〜２２１頁）。
【０００４】
複数のＳＣＡ２死亡患者における神経病理的研究は、貧弱な樹状突起分枝を伴うプルキンエ細胞数の著しい減少を示している。また、顆粒細胞、下オリーブニューロン及び橋小脳核からのニューロンの数が減少する。また、黒質からのニューロンの著しい減少、脊髄の脱髄及び運動ニューロンの数と大きさの減少が起こる（Ｅｓｔｒａｄａ  Ｒら（１９９９年）、Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ２（ＳＣＡ２）：ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｉｎ  １１  ａｕｔｏｐｓｉｅｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）９７（３）：３０６〜３１０頁）。
【０００５】
分子レベルの研究によって、正常なアタキシン２は、ヒト及びマウスの組織において広範に発現される１４０ｋＤａのタンパク質であることが実証されている。ヒトにおける該伝令ＲＮＡは、脳、心臓、胎盤、肝臓、筋肉及び膵臓に局在化されており、腎臓や肺ではほとんど発現されない。他のポリグルタミン疾患と異なり、核内凝集物の形成は発病機序と関連していない。（Ｐｕｌｓｔら（１９９６年）、Ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２６９〜２７６頁）。
【０００６】
ハンチントン及びＳＣＡ疾患の変性プロセスは、解明が非常に困難であるとともに、非常に活発である。これらの疾患における突然変異遺伝子の同定によって、基礎レベルでの病因の決定が可能になった。最近では、トランスジェニックマウス及び患者における研究により、ポリグルタミン疾患においてニューロンの機能障害及び壊死をもたらす分子的変化の幾つかを知ることが可能になった。同時に、神経学的な表現型を示す突然変異マウスの出現によって、イオン通路の変化又は神経伝達物質受容体機能の変化のような、他のタイプの二次的神経変性疾患を発見することが可能になった。（Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ．Ｚｏｇｈｂｉ  Ｙ（２０００年）、Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６２：７７９〜８０２頁）。
【０００７】
正常な及び罹患したヒトの脳における研究は、ポリグルタミン伸長部によって引き起こされる疾患の病因の知識に重要な側面をもたらすことができるが、幾つかの知見は本疾患の末期定常状態に限られている。トランスジェニックモデルはこの問題を回避できるが、その多くは、神経を変性させるために大きなポリグルタミン領域を持つ切断型構成物を用いて構成される。また、これらのモデルの多数は、ヒトのポリグルタミン疾患を規定する特徴である高いニューロン損失を示さない（Ｄａｖｉｅｓら（１９９９年）、Ｆｒｏｍ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｎｅｕｒｏｐａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｄ．２３４：９８１〜９８９頁）。
【０００８】
米国特許第６５１５１９７において、（Ｈｕｙｎｈら（２０００年）、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔａｘｉｎ−２  ｉｓ  ｎｏｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ＳＣＡ２  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｒ  ｈｕｍａｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：１〜７頁）によって開発されたトランスジェニックＳＣＡ２モデルが記述されている。これらの動物は、細胞質でのアタキシン２の蓄積と、ＳＣＡ２疾患の症状とを示すが、導入遺伝子発現と病原タンパク質産生がプルキンエ細胞のみで起きることが、制限要因となっている。また、これらトランスジェニックマウスからの病原対立遺伝子の比較的少数のＣＡＧ／ポリグルタミン反復（５８ＣＡＧ−５８Ｑ）が、このモデル由来の細胞系における該タンパク質の影響に関する研究において不備を発生させる。というのも、該細胞は、明確な表現型効果を示さないからである。
【０００９】
その結果、この分野では、ＳＣＡ２遺伝子の発現を自己プロモーターで調節することが必須である。この構成を持って産生されたトランスジェニック動物は、プルキンエ細胞内だけで異種性の遺伝子を発現させるのでなく、ヒトにおける場合と同様に他の細胞や組織においてもＳＣＡ２遺伝子の発現パターンを刺激するであろう。加えて、より大きな伸長部（７５ＣＡＧ−７５Ｑ）を用いることにより、明白な表現型効果を持つトランスジェニックマウスに由来する細胞系を得る可能性が増大される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝病である脊髄小脳失調症２型を研究するための有用なトランスジェニックマウスモデルを示し、該マウスは、自己プロモーターによって調節されるヒトＳＣＡ２遺伝子発現を特徴とし、ヒトの疾患の特徴の幾つかを再現することができる。該トランスジェニックマウスは、導入遺伝子についてホモ接合性でもヘテロ接合性でもよい。
【００１１】
本発明の全般的な目的は、ゲノムに組み込まれた７５個のＣＡＧ反復を伴うヒトＳＣＡ２遺伝子の１つ又は２つのコピーを含有するトランスジェニックマウス又はそれらに由来する細胞系を産生することにある。
【００１２】
本発明の一態様は、神経変性と関連した現象、例えば、運動の協調不能、アポトーシス及びポリグルタミン凝集物の形成、を調節することが可能な生物学的な又は化学的な種々の媒介物をスクリーニングするための方法であって、候補物質をトランスジェニックマウスと組み合わせるステップと、該モデルにおけるこの効果の評価とを含む方法を提供することにある。これらの物質は、上記疾患の臨床症状の予防、処置又は低減に有用な短い化学的分子或いは内在性又は外来性の生物学的な分子でもよい。もう１つの目的は、遺伝病である脊髄小脳失調症２型の進行及び関連する症状の研究、及び予防手段の同定を可能にする、該疾患の研究のネズミモデルを提供することである。
【００１３】
本発明のもう１つの態様において、トランスジェニックマウスは、例えば、ＩＧＦ−１、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのよう成長因子、Ｂｃｌ−２などのような抗アポトーシス遺伝子のような、治療効果を持ちうる他の遺伝子の発現を可能にするようにさらに操作されてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
トランスジェニック動物
本発明においては、上記外来性の遺伝子は、ヒトＳＣＡ２遺伝子の最小のプロモーター領域へ作動的に結合される（図１）。このプロモーターは、由来や種の異なる幾つかの細胞系において機能する（Ａｇｕｉａｒら（１９９９年）、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ２  ｇｅｎｅ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １６：１６５〜１６８頁、Ａｇｕｉａｒら（１９９９年）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｉｔｕａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  １  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｄａｔａ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｉｓｌａｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４：３１５〜３１８頁）。
【００１５】
上記導入遺伝子は、７５個のＣＡＧ反復という病的な伸長部を含有するが、これは、キューバ人患者で報告された最も長い伸長部の１つである。この患者は６歳で発症している。該遺伝子は、欠失、置換又は例えばＣＡＧ反復の数を増大するための挿入を導入する目的で操作されてもよい。そのプロモーター領域は、異常なＣＡＧ反復を伴うＳＣＡ２遺伝子発現のレベルを調節又は増大する目的で変更してもよい。本発明のトランスジェニックマウスは、例えば、内在性の遺伝子の機能を排除するための、他の変更を受けてもよい。
【００１６】
核酸組成
本発明におけるこの用途のための構成物は、ヒトにおいて見られるような種々の細胞や組織においてこの自己プロモーターの調節下で作動される７５個以上のＣＡＧ反復を含有するＳＣＡ２遺伝子又はこの遺伝子の断片を発現するトランスジェニック動物の産生のために適当ないかなる構成物をも含んでもよい。これらの構成物は、ｃＤＮＡ、ゲノム配列又はその両方を含んでもよい。
【００１７】
種々の源からの標的配列の単離とクローニングのための方法及びこの発現のための構成物は、本文献において報告されている。さらに、該構成物は、該発現の検出を容易にするためにヒトＳＣＡ２プロモーターの制御下に、ＬａｃＺのようなレポーター遺伝子を含んでもよい。組織又は細胞内領域における局在化の研究を行うことを可能にするタンパク質融合又は他の変更を施すことが可能である。構造機能の研究を行うために他の突然変異を用いてもよい。
【００１８】
他のヒト遺伝子
神経変性機序に関与する数多くのヒト遺伝子が存在する。本発明におけるトランスジェニック動物は、神経変性プロセス、ニューロン可塑性又は間接神経保護を促進する遺伝子をさらに有してもよい。
【００１９】
薬物スクリーニングアッセイ
ｓｃａ２遺伝子の病原性変異体を発現するトランスジェニック動物又はそれに由来する細胞系を用いて、神経変性プロセスに似たプロセスを引き起こすリガンド又は基質を同定することも可能である。そのような化合物は、アタキシン２に直接に作用してもよいし、疾患に関連する機序に作用してもよい。このように、これらトランスジェニック動物の研究に由来する、同定された治療の標的及び設計された薬物は、他のＣＮＳ病状のために有用であろう。というのも、それらは、不溶性凝集物の形成及びアポトーシス活性化を含む共通の神経変性機序を有しているからである。これは、毒性の低い薬物のスクリーニングの場合である。
【００２０】
このように数多くのアッセイ、例えば、運動行動の評価、免疫酵素的及び分子生物学的アッセイ、神経生理学的な評価、及び薬物の局在化、を用いることができる。マウス又はマウス由来の細胞は、アッセイによっては有用である。細胞は動物から抽出して無限に分裂させることができる。中枢神経系由来細胞、特にプルキンエ細胞は、特別な関心の対象である。また、例えば骨髄間質細胞のような他の細胞型も同様である。
【００２１】
治療的な候補物質は、典型的には低分子量有機分子のような一群の化学化合物、及びペプチド、炭水化物、脂肪酸、ステロイド、脂質及びそれらの誘導体又は組合せのような生物分子を含む。候補物質は、多数の天然及び合成化合物を含有するライブラリーを含む種々の源から得られる。それらの化合物は、改良された薬理学的な特性を持つ構造類似薬を作るように変更してもよい。治療的媒介物には、骨髄間質性細胞があり、これは、トランスジェニック又は野生型のマウスに由来してもよい。これらの細胞は、遺伝子工学的に改変し、全身的に又は病変部位に直接定位的に投与することができる。スクリーニングは、周知の薬理活性化合物又はそれらの類似体若しくは誘導体に対して行うことができる。治療効果を得るために、候補物質は、製薬上適当な担体とともに製剤して投与することができる。
【００２２】
高処理量のインビボスクリーニングは、通常は、治療候補物質を異なる濃度で受けている多くの動物を用いることを含む。それはまた、同じ候補物質の種々の製剤形態を含む。これらの媒介物は、単一用量として投与することができ、共同効果を得ることが可能である場合に他の分子と組み合わせるだけである。効果のモニタリングは、従来の方法論で実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（実施例１）
ｓｃａ２−７５ＣＡＧヒト遺伝子を有するＦ０トランスジェニックマウスの獲得と分子特性の決定
遺伝的な構成は、５’−３’の順に並べた下記の要素からなる（図２）。
ａ）ヒトアタキシン−２遺伝子プロモーターをコードする０．８ｋｂｐ断片（Ａｇｕｉａｒら（１９９９年）、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ２  ｇｅｎｅ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １６：１６５〜１６８頁、Ａｇｕｉａｒら（１９９９年）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｉｔｕａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  １  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｄａｔａ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｉｓｌａｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４：３１５〜３１８頁）。
ｂ）７５個のＣＡＧ反復を持つｓｃａ２遺伝子の相補的ＤＮＡをコードする４．２１７ｋｂｐ断片。この断片は、ある患者の血液の全ＲＮＡ試料からＲＴ−ＰＣＲによって得た。
ｃ）ｐＧＬ３−Ｌｕｃベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミド内に存在する、ＳＶ４０ウイルスからの転写終結及びポリアデニル化のシグナルをコードする０．２６８ｋｂｐ断片。
【００２４】
図３は、トランスジェニックマウス系を産生するために用いられた遺伝的構成法を模式的に示す。ｓｃａ２遺伝子プロモーター領域を含有するＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を、ゲノムクローンから単離して、ｐＧＬ３−Ｌｕｃベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。７５個のＣＡＧ反復を持つｓｃａ２  ｃＤＮＡを、キューバ人患者からＲＴ−ＰＣＲによって単離した。この断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドにクローニングした。
【００２５】
転写終結及びポリアデニル化のシグナルを持つＳＶ４０ウイルスの遅発の発現遺伝子３’領域は、ｐＧＬ３−Ｌｕｃベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミドから得た。
【００２６】
最終的な遺伝的構成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記述された標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）にしたがって作成した。最終プラスミドは７７５として同定された。
【００２７】
トランスジェネシス最終構成物をＣｌａＩで消化して、プロモーターと、７５個のＣＡＧ反復を伴うｃＤＮＡと、ＳＶ４０信号コード領域とを持つ断片を得た。トランスジェニック動物は、先に記述された方法によって得た（Ｃａｓｔｒｏ  ＦＯ、Ａｇｕｉｌａｒ  Ａ（１９８９年）、Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｉ−Ｏｂｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ６：６５〜７０頁、Ｃａｓｔｒｏ  ＦＯ、Ａｇｕｉｌａｒ  Ａ（１９８９年）、Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．ＩＩ−Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ（スペイン語）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ６：１７２〜１７４頁、Ｃａｓｔｒｏ  ＦＯ、Ａｇｕｉｌａｒ  Ａ（１９９２年）、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｏｒ  ｎｏｎ−ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｌｉｔｔｅｒ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  Ｂ６Ｄ２Ｆ１  ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３６：１０５頁）。用いたマウス系統は、我々の研究室で得られた雑種Ｂ６Ｄ２Ｆ１×ＯＦ１であった。親マウスの系統Ｂ６Ｄ２Ｆ１とＯＦ１は、キューバ国ハバナのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌから得た。
【００２８】
トランスジェニックマウスは、２ｎｇ毎マイクロリットルの線形ＤＮＡ断片を含有する緩衝液１〜２ピコリットルをマウスの単細胞胚前核の１つにマイクロインジェクションすることによって得た。胚を受容メスマウスに移し、出生後、導入遺伝子の存在を検出するために同腹仔をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら（１９８９年）、Ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７〜４９１頁）によって解析した。
【００２９】
全７１個の同腹仔のうち、１５個は導入遺伝子の存在について陽性であり（図４）、３個がオス、１２個がメスであった。ＤＮＡハイブリッド形成法によって、我々はＰＣＲの結果を確証し、トランスジェニックマウスのゲノムに統合されたコピーの数を決定することができた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ホモ接合性動物を交配によって得た。ＤＮＡハイブリッド形成法によって、ホモ接合性マウスの子孫が導入遺伝子の１又は２個のコピーを持ち、それがメンデルの遺伝法則にしたがって次世代へ受け継がれることが判定された。ヒトの導入遺伝子の発現は、ノーザンブロット（図６）及びウエスタンブロット（図７）の結果によれば、トランスジェニックマウスにおいて中枢神経系の内側及び外側において広範に行われる。
【００３０】
（実施例２）
ロータロッドによるトランスジェニックマウス系統Ｆ０６６の機能的試験
この実施例は、ロータロッドによるＳＣＡ２トランスジェニックマウス系の機能特性の決定を説明する。野生型、ホモ接合性及びヘテロ接合性マウスの運動協調能を、Ｂａｓｉｌｅロータロッドトレッドミルを用いて試験した。試験期間は、４つの個々のトライアルを伴う５日間であった。マウスを、３００秒間で回転速度が４から４０ｒｐｍまで加速するロッドに置き、その後、６００秒まで４０ｒｐｍの一定速度を保った。各試験の間に１５分の休憩時間を設けた。該試験でのマウスの成績の一例を図８に表す。該グラフは、５日間連続で毎日４回のトライアルにおけるロータロッド装置での平均成績を示す。トランスジェニックマウスは、野生型マウスよりも早くロータロッドから落ち、運動性欠陥を示した。８週のホモ接合性マウスと１６週のヘテロ接合性マウスについてかなりの差があった。ＳＣＡ２トランスジェニック動物における機能障害を調査するためにロータロッドを大いに活用した。まず、１５匹のＦ０のＰＣＲ陽性判定の動物を評価するために用い、それから、Ｆ１、Ｆ２及びホモ接合性の子孫を評価するために用いた。
【００３１】
（実施例３）
Ｆ０６６マウス由来のホモ接合性動物の評価
Ｆ０６６マウス由来のホモ接合性のマウスは、初代のＦ０６６マウスとトランスジェニックＦ１動物とを交配することによって得た。ホモ接合性の性質は、野生型との交配によって評価した。該交配に由来する子孫は、１００％ヘテロ接合性の動物であった。結果は、Ｆ３子孫のＰＣＲ解析によって実証された。ＰＣＲによるＤＮＡの解析によって、該動物の全てがＡＤＮｃ−ＳＣＡ２−７５ＣＡＧ導入遺伝子の存在に関して陽性であることがわかった。この運動性欠陥は、一方の親がホモ接合性である場合に由来する動物の全てにおいて実証された。４世代にわたる子孫は、親動物と同じ形態的、生殖性及び行動の表現型を保っている。
【００３２】
（実施例４）
トランスジェニック系統Ｆ０６６の足跡解析
マウスを、長さ３０ｃｍ、幅１０センチ、高さ６ｃｍの暗いトンネルを走り抜けさせた。一歩の長さを測定するために、両方の後ろ足に黒色の水性インクを塗った。足跡の方向も評価した。連続する２歩の間の角度差を計算した。該角度の絶対値は、角度差の合計を歩数で割って得られた値として表した。各動物から得られた合計の歩長の値は、各脚で与えられた全歩数に基づく歩長の平均である。足跡解析は、野生型マウスと比較して、トランスジェニック動物において、歩長が漸進的に減少することを示した。典型的な結果を図９に示す。
【００３３】
（実施例５）
Ｆ０６６トランスジェニック系の握り合わせ評価
神経変性の表現型のマウスは、少なくとも１分間尾を持たれて吊されると後ろ脚を折り曲げる傾向を有する。握り合わせ試験では、１分間尾を持ってマウスを吊り下げた。図１０は、Ｆ０６６マウスに由来するトランスジェニック動物において観察された握り合わせを示す。握り合わせは、同じ齢の野生型動物においては全く観察されなかった。
【００３４】
（実施例６）
トランスジェニック系Ｆ０６６において観察された解剖学的な変化
この実施例は、ＳＣＡ２トランスジェニックマウス系統の形態特性の決定について説明する。同齢のトランスジェニック及びコントロール野生型マウスを犠牲にした。脳を取り出して、パラフィンに包埋した。組織切片をクレシルバイオレットで染色して、組織間の解剖学的な差異を評価した。トランスジェニックＦ０６６動物は、漸進的なプルキンエ細胞損失を示した（図１１、ＢとＣ）。プルキンエ細胞における形態学的変化を調べるために、ヘテロ接合性動物からの組織切片におけるカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性を、野生型マウスのそれと比較した。カルビンジン−２８Ｋは、小脳プルキンエ細胞の細胞質及び樹状突起のプロセスで特異的に発現されるタンパク質である。カルビンジン−２８Ｋ標識付けにおける変化は、若い動物において見られ、加齢とともにより明白になった。Ｆ０６６系からのトランスジェニックマウスにおいて、多くのプルキンエ細胞はカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性を喪失した。樹状突起の分岐の喪失も観察され、これに密接に続いてプルキンエ細胞数における損失が発生した（図１１，ＥとＦ）。これらの結果は、形態的な神経変性の表現型が、７５ポリグルタミン反復を持つヒトＳＣＡ２をヒトＳＣＡ２プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウスにおいて見られることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】７５個のＣＡＧ反復を持つｓｃａ２ヒト遺伝子に融合したｓｃａ２ヒトプロモーターの配列（全長は５．０１７ｋｂｐ）を示す図である。太字は、ＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）及びＳａｃＩ（ｇａｇｃｔｃ）の制限部位と、それらの側方のヒトｓｃａ２遺伝子プロモーター（０．８ｋｂｐ）（Ａｇｕｉａｒら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４：３１５〜３１８頁）を示す。ｓｃａ２ｃＤＮＡ配列（４．２１７ｋｂｐ）内に、キューバ人患者から単離された太字の７５個ＣＡＧ領域が存在する。
【図１−２】７５個のＣＡＧ反復を持つｓｃａ２ヒト遺伝子に融合したｓｃａ２ヒトプロモーターの配列（全長は５．０１７ｋｂｐ）を示す図である。太字は、ＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）及びＳａｃＩ（ｇａｇｃｔｃ）の制限部位と、それらの側方のヒトｓｃａ２遺伝子プロモーター（０．８ｋｂｐ）（Ａｇｕｉａｒら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４：３１５〜３１８頁）を示す。ｓｃａ２ｃＤＮＡ配列（４．２１７ｋｂｐ）内に、キューバ人患者から単離された太字の７５個ＣＡＧ領域が存在する。
【図２】マイクロインジェクション用のＤＮＡ断片（５．２８５ｋｂｐ）の模式図である：ヒトｓｃａ２遺伝子プロモーター（０．８ｋｂｐ）、７５個のＣＡＧ反復を持つヒトｓｃａ２ｃＤＮＡ（４．２１７ｋｂｐ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル（０．２６８ｋｂｐ）。
【図３】導入遺伝子構成図である。
【図４】染色体ＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応法を示す図である。（Ａ）１〜３：Ｆ０のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウス、４：野生型マウス、５：分子量マーカーＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ／ＨｐａＩＩ、６：２２個のＣＡＧ反復の対照プラスミド、７：７５個のＣＡＧ反復の対照プラスミド、８：陰性対照としての水。（Ｂ）１〜６：Ｆ２のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウス、７：野生型マウス、８：２２個及び４１個のＣＡＧ反復を有するキューバ人患者、９：７５個のＣＡＧ反復の対照プラスミド、１０：分子量マーカーＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ／ＨｐａＩＩ。
【図５】サザンブロットの図である。（Ａ）ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片ハイブリッド形成法。１、２：Ｆ０のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウス、３：野生型マウス、４：ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩで消化された、７５個のＣＡＧ反復のための０．１ｎｇの対照プラスミド。（Ｂ）ＫｐｎＩ断片ハイブリッド形成法。１：ＫｐｎＩで消化された、７５個のＣＡＧ反復のための０．０１ｎｇの対照プラスミド、２：野生型マウス、３〜７：Ｆ２のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウス。
【図６】ノーザンブロットによるトランスジェニックマウスの種々の組織における導入遺伝子の発現解析を示す図である。陰性対照として齢の対応する野生型動物を使用した。ヒトｓｃａ２−７５ＣＡＧ導入遺伝子の分子量（４ｋｂｐ）を矢印で示す。（Ａ）小脳：１−−ｓｃａ２−７５ＣＡＧヒト遺伝子についてホモ接合性のＦ２トランスジェニックマウス、２−−ｓｃａ２−７５ＣＡＧヒト遺伝子についてヘテロ接合性のＦ１トランスジェニックマウス、３−−野生型マウス。（Ｂ）１、３、５−−野生型マウスからの脳、肝臓及び骨格筋。２、４、６、７、８−−ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスからの脳、肝臓、骨格筋、肺及び腎臓。
【図７】ウエスタンブロットによるトランスジェニックマウスの種々の組織における導入遺伝子の発現解析を示す図である。陰性対照として齢の対応する野生型動物を使用した。ＡＴＧと２２個のＣＡＧ反復領域とを含むヒトアタキシン２タンパク質のＮ末端断片に対して作製したモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った。矢印は、野生型アタキシン２タンパク質（１４０ＫＤ）を指す。分子量のより大きいタンパク質は、７５個のＣＡＧ反復を持つ伸長アタキシン２タンパク質、又は異なるタンパク質に凝集したアタキシン２タンパク質であるかもしれない。トランスジェニックマウスに対応する試料において、強く染色される比較的低分子量のタンパク質が存在するが、これは、７５個のＣＡＧ反復を持つ伸長アタキシン２の分解断片であるかもしれない。（Ａ）１−−分子量マーカーとしてのモノクローナル抗体（１５０ＫＤ）。２−−野生型マウスからの小脳。３−−ヘテロ接合性のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウスからの小脳。（Ｂ）１−−野生型マウスからの小脳。２−−分子量マーカーとしてのモノクローナル抗体（１５０ＫＤ）。３〜９−−ヘテロ接合性のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウスからの小脳、脳、肝臓、心臓、骨格筋、腎臓及び肺。
【図８】２匹のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウスと１匹の齢の対応する野生型マウスでのロータロッド試験結果を示す図である。該グラフは、連続５日間、毎日４回のトライアルにおけるロータロッド装置での平均成績を示す。（Ａ）６週齢についての図である。ホモ接合性のマウスは、野生型に比べて運動障害の明白な症状を示す。（Ｂ）１２週齢についての図である。ホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニックマウスは両方とも、野生型マウスに比べて運動障害を示す。
【図９】野生型マウス（Ａ）及びヘテロ接合性のＦ０トランスジェニックマウス（Ｂ）の足跡パターンを示す図と、歩長（Ｃ）及び直進性（Ｄ）の定量的な比較を示す図である。
【図１０】握り合わせ姿勢を示す図である。野生型マウスは、自身を安定させるために標準的な姿勢である後ろ脚をひろげた形になる（Ａ）。ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスは、尾を掴んで持ち上げると、両方の後ろ脚を絡ませ、足を握り合わせた姿勢を示す（Ｂ）。
【図１１】解剖学的な変化の評価を示す図である。（Ａ、Ｂ、Ｃ）クレシルバイオレット染色。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）抗カルビンジン２８Ｋ免疫組織化学。（Ａ、Ｄ）１歳の野生型マウスからの小脳。（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）１歳のヘテロ接合性のｓｃａ２−７５ＣＡＧトランスジェニックマウスからの小脳。
【図１−２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１−１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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