(57)【要約】      （修正有）【課題】諸機能を有しているＰＮＡオリゴマー誘導体化合物を提供する。【解決手段】アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有しているＰＮＡモノマー、またはＰＮＡオリゴマーと光透過性分子の誘導体、または膜透過性機能分子の誘導体、または臓器選択性機能分子の誘導体、または殺菌性機能分子の誘導体、または分子認識性機能分子の誘導体の少なくともいずれかを導入したモノマーまたはオリゴマーとを直接結合させるか、またはリンカーを介して間接的に結合させたことによる、ＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。【選択図】図１
2006158400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）
【化１】
2006158400.tif 000022
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なっている、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表され、機能性カルボン酸誘導体が、細胞膜透過性機能分子の誘導体、又は光活性機能分子の誘導体、又は臓器選択機能性分子の誘導体、又は殺菌機能性分子の誘導体、又は分子認識機能性分子の誘導体の何れかであることに基づくＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項２】
膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸であることを特徴とする請求項１記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項３】
水溶性アミノ酸が、アルギニン、リジン、セリンの何れかであることを特徴とする請求項２記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項４】
光活性機能分子が活性エステル型蛍光標識化合物であることを特徴とする請求項１記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項５】
活性エステル型蛍光標識化合物が、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌの何れかであることを特徴とする請求項４記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項６】
臓器選択機能性分子が、ラクトース、トリスエックスの何れかであることを特徴とする請求項１記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項７】
分子認識機能性分子が、ビオローゲンであることを特徴とする請求項１記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項８】
細胞膜透過性機能分子の誘導体、及び光活性機能分子の誘導体の双方を有していることを特徴とする請求項１記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項９】
Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、請求項８に記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項１０】
Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、請求項８、９に記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項１１】
ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【請求項１２】
Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれかに記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性ペプチド核酸モノマーの新規な製造方法、該製造方法によって製造された機能性ペプチド核酸オリゴマーおよびその中間体に関する。より詳細には、前駆体的PNAモノマーユニットをPNAオリゴマーに導入した後に１種または２種以上の機能性分子をポスト合成的に導入することを特徴とする、前記製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−(２−アミノエチル)グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ/ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
【０００３】
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
【０００４】
一方ＰＮＡは酵素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
【０００５】
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化１】
2006158400.tif 000003
によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
【０００６】
当初ＰＮＡには下記のようなｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化２】
2006158400.tif 000004
が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化３】
2006158400.tif 000005
が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、ｔＢｏｃ型の使用頻度は減少している。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないｔＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
【０００７】
これ以外にも、光機能性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（Peter E. Nielsen, GeraldHaaiman, Anne B. Eldrup PCT Int. Appl. (1998） WO 985295 A1 19981126, T. A. Tran, R.-H. Mattern, B. A. Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145,Jesper Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 503-509, Hans-georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen, et al. Pct Int. Appl. (1998) WO 9837232A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch, et al. (1998) Nucleic Acid Res., 26, 715-720）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化４】
2006158400.tif 000006
【化５】
2006158400.tif 000007
では効率良く合成できないと予想された。
【０００８】
したがって、一般に光機能性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合目的的な機能性PNAの合成方法、すなわち、（１）機能性PNAモノマーユニットの設計における、機能性分子のPNA背骨構造への効率的な導入、（２）コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および（３）遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化６】
2006158400.tif 000008
に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体6を用いて1のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体5と縮合してほぼ定量的に光機能性ＰＮＡモノマー4を合成する方法を見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体6の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
【００１１】
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってPNAプローブとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
【００１２】
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（Oliver Seitz; Tetrahedron Letters 1999, 40, 4161-4164.）。
【化７】
2006158400.tif 000009
【００１３】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
【００１４】
例えば、下図に示すように、市販されている光機能性分子のsuccinimideエステルを導入することはできず、導入するためにはFmoc-Gly等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化８】
2006158400.tif 000010
【００１５】
また、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでDNAオリゴマー・RNAオリゴマー・PNAオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているDNA/RNAオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
【００１６】
一方PNAオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、PNAオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
【００１７】
しかし、そのような処理を施してPNAオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞1個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの開発が有用であると考えられている。
【００１８】
なお、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブは既に存在する。例えば、（１）膜透過性機能を有するオリゴペプチドをPNAに結合させたもの、（２）膜透過性機能を有するリン脂質をPNAに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりPNA以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なPNAプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
【００１９】
【非特許文献１】Peter E. Nielsen, GeraldHaaiman, Anne B. Eldrup PCT Int. Appl. (1998） WO 985295 A1 19981126, T. A. Tran, R.-H. Mattern, B. A. Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145.
【非特許文献２】Jesper Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 503-509.
【非特許文献３】Hans-georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen, et al. Pct Int. Appl. (1998) WO 9837232A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch, et al. (1998) Nucleic Acid Res., 26, 715-720.
【非特許文献４】Oliver Seitz; Tetrahedron Letters 1999, 40, 4161-4164.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法に着目し、当該方法によって製造することができる諸機能を有しているＰＮＡオリゴマー誘導体を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡ誘導体を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
即ち、本発明は、（１）下記一般式（I）
【化９】
2006158400.tif 000011
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なっている機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧１であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表され、機能性カルボン酸誘導体が、細胞膜透過性機能分子の誘導体、又は光活性機能分子の誘導体、又は臓器選択機能性分子の誘導体、又は殺菌機能性分子の誘導体、又は分子認識機能性分子の誘導体の何れかであることに基づくＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、（２）膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸であることを特徴とする前記（１）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２４】
さらに、本発明は、（３）水溶性アミノ酸が、アルギニン、リジン、セリンの何れかであることを特徴とする前記（２）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、（４）光活性機能分子が活性エステル型蛍光標識化合物であることを特徴とする前記（１）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、（５）活性エステル型蛍光標識化合物が、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌの何れかであることを特徴とする前記（４）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、（６）臓器選択機能性分子が、ラクトース、トリスエックスの何れかであることを特徴とする前記（１）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２８】
さらに、本発明は、（７）分子認識機能性分子が、ビオローゲンであることを特徴とする前記（１）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００２９】
さらに、本発明は、（８）細胞膜透過性機能分子の誘導体、及び光活性機能分子の誘導体の双方を有していることを特徴とする前記（１）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００３０】
さらに、本発明は、（９）Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、前記（８）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、（１０）Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、前記（８、９）のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、（１１）ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、前記（８〜１０）のいずれかに記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、（１２）Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記（８〜１１）のいずれかに記載のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に関する。
【発明の効果】
【００３４】
前記一般式（I）に基づく基本構成に立脚している本発明においては、Naphthalimide型、Flavin型、Dabcyl型、Biotin型、FAM型、Rhodamine型、TAMRA型、ROX型、HABA型、Pyrene型、Coumarine型等の光機能性モノマーユニット、膜透過機能性分子、臓器選択機能性分子、殺菌機能性分子および分子認識機能性分子のいずれかに対応した機能を発揮することができる。
【００３５】
尚、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖等を含むものも意味するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
ここで、本発明の実施形態について製造方法に即してさらに詳細に説明する。
【００３７】
本発明によるＰＮＡオリゴマー誘導体を合成するルートは、典型的には、下図に示すとおりである。
【化１０】
2006158400.tif 000012
【００３８】
前記工程について具体的に説明するに、最初に必要に応じて、下図
【化１１】
2006158400.tif 000013
に示すように、Fmoc−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノール（ＰｆｐＯＨ）とを反応させて得られるＦｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐ）とから、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを合成する。
以後の工程において用いる該Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐの溶液を得るには、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはアセトン等と水とを含む水溶性溶媒したものいずれも好適に用いることができる。前記水溶性溶媒を用いた場合には、精製等の後処理の面におけるメリットを有するものである。
【００３９】
前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とＰｆｐＯＨをＤＭＦ溶液中にてＤＣＣを加えて反応させることによって、例えば下記式（III）
【化１２】
2006158400.tif 000014
（式中、ｎは１〜１５の整数を表す）で表されるものが得られる。
【００４０】
次いで、これにＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのＤＭＦ溶液にジイソプロピルエチルアミンとともに添加し、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを得る。
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨは、ＰＮＡモノマーユニットの前駆体として機能するため、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと呼ぶことができる。
式（III）において、ｎとしては１〜１５までの整数を適宜選択できるが、ｎの値が大きい方が、ハイブリッド形成時の立体的反発（あるいは障害）を軽減する点において好ましい。
【００４１】
次に、下図
【化１３】
2006158400.tif 000015
に示すように、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いて、オリゴマーＩａを合成する。具体的には、Ｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
【００４２】
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めｔＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、ｔＢｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
【００４３】
次に、下図
【化１４】
2006158400.tif 000016
に示すように、ピペリジン処理によってFmoc基を選択的に脱保護してアミノ基とし、Ｉｂを得て、さらに、下図
【化１５】
2006158400.tif 000017
に示すように、該Ｉｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
【００４４】
また、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、２０〜４０分が好適であり、最も好適には３０分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
【００４５】
なお、機能性分子の導入は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく（第１法）、あるいは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい（第２法）。
【００４６】
最後に、下図
【化１６】
2006158400.tif 000018
に示すように、担体レジンからの切り出しとZ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマー誘導体化合物を得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、TFA/TFMSA/p-cresol/Thioanisole＝60/25/10/10のような一般的な条件において好適に行われる。
【００４７】
式（I）で表されるＰＮＡオリゴマー誘導体化合物として、例えば、Ｒがメチルレッドのカルボン酸誘導体を含むもの、さらにＸ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝９であり、Ｙ１＋Ｙ２＝１であるもの、またはＸ１＝３、Ｘ２＝６であり、Ｙ１＝１であるもの等が、特に好適に合成される。
【００４８】
式（I）で表されるＰＮＡオリゴマー誘導体化合物においては、例えば、Ｒが細胞膜透過性機能分子誘導体等であり、Ｒ１が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された構成を典型例として挙げることができる。前記典型例によるＰＮＡオリゴマー誘導体化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
【化１７】
2006158400.tif 000019
【００４９】
このようなＰＮＡオリゴマー誘導体化合物は、例えば前記一般式（II）において、Ｘ１＝Ｚ１＝Ｚ２＝１であり、かつＹ１≧２であるＰＮＡオリゴマー誘導体である。このようなＰＮＡオリゴマー誘導体化合物は合成のしやすさおよび合成コストの面等において好適である。
上記ＰＮＡオリゴマー誘導体化合物において、ａ、ｂおよびｆはそれぞれ０〜１０の整数であれば特に限定されないが、例えばａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であるものであっても、合成上および実用上のいずれにおいても支障はない。
【００５０】
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防ぐための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式（I）におけるｆ〜ｈを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
【００５１】
前記複数の機能性分子が導入されたＰＮＡオリゴマー誘導体化合物は、例えばKoch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. PeptideRes. 1997, 49, 80-88.を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
【００５２】
機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有するＰＮＡオリゴマー誘導体化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明のＰＮＡオリゴマー誘導体化合物に導入し得る膜透過性機能分子の典型例として、アルギニンが挙げられるが、リジンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
【００５４】
また、Fmocアミノ酸ユニットを利用することによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。その合成例は実施例２０および２１にも示した。しかしながら、上記２化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
【００５６】
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有するＰＮＡオリゴマー誘導体化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子等も、本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのようなＰＮＡオリゴマー誘導体化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）Fmoc-Gly-BocPNA-OHの合成（１）
Fmoc-Gly-OH (891 mg, 3.0 mmol) とPfpOH (754 mg, 4.5 mmol)のDMF溶液(12mL)にDCC (845 mg, 4.5 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をＢｏｃPNA-OH (436 mg, 2.0 mmol)のDMF溶液(16 mL)にdiisopropylethylamine (445 μL, 2.6 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-50% MeOH/CH２Cl２）により精製しFmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OH (121 mg, 12%)を得た。1H NMR (DMSO-d６)δ 7.88 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.62 (brt) and 7.56 (brt) (1 H), 7.41 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.85 (brt) and 6.79 (brt) (1 H), 4.35 - 4.15 (m, 3 H), 4.05 - 3.85 (m, 3 H), 3.77 (m, 1 H), 3.40 - 3.25 (m, 2 H), 3.10 (m) and 3.03 (s) (2 H), 1.37 (brs, 9 H); 13C NMR (DMSO-d６) δ172.2 (d), 169.10 (d), 156.34 (d), 155.58 (d), 143.83, 140.66, 127.58, 127.04, 125.24, 120.04, 77.77 (d), 65.71, 47.34 (d), 46.72, 46.65 (d), 29.23 (d), 28.14 (d); FABMS m/z 498 [(M+H)+].
【００５８】
（実施例２) Fmoc-C7-OPfpの合成
Fmoc-C7-OH(381.9 mg，1.0 mmol)とPfpOH(349.7 mg、1.9 mmol)のDMF溶液(2.5mL)にDCC(392.0 mg，1.9 mmol)を氷冷下で加え、この反応液を0 ℃で30分次いで室温で一晩攪拌した。反応終了後DCUreaを濾別して濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法(CH2Cl2)により精製した後、Hexaneで再結晶し白色粉末としてFmoc-C7-OPfp (537.5 mg，98%)を得た。1H-NMR (CDCl3)δ7.76(d，J= 7.6 Hz, 2 H)，7.59 (d，J = 7.6 Hz, 2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.31 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，4.70 - 4.73 (brt，1 H)，4.47 - 4.40 (brd，2 H)，4.22 (t，J = 6.42 Hz, 1 H)，3.20 (q，J = 5.94 Hz, 2 H)，2.66 (t，J = 7.38 Hz, 2 H)，1.80 - 1.75 (m，2 H)，1.55 - 1.50 (m，2 H)，1.45 - 1.34 (m，6 H); 13C-NMR (CDCl3)δ 169.44, 156.43, 143.98, 141.96(m), 141.29, 140.23, 138.67(m), 136.99(m), 127.60, 126.96, 124.97, 119.91, 66.49, 55.73,47.29, 41.34(d), 34.89, 33.22, 29.85, 28.70, 26.42, 25.43, 24.60 ;HRMS(FAB+) calcd. for C29H27F5NO4 [(M+H)+] 547.5131 observed 548.1861.
【００５９】
(実施例３) Fmoc-Gly-BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(６.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-Gly-OPfp (240.9 mg，0.52 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で6時間攪拌した。氷冷した１ N塩酸で冷却した反応溶液をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)及びLH-20(MeOH)で精製した。この後、塩化メチレンに溶かし、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-Gly-BocPNA-OH (157.3 mg，80%)を得た。
【００６０】
（実施例４）Fmoc-β-Ala-ＢｏｃPNA-OHの合成（１）
Fmoc-β-Ala-OH (311 mg, 1.0 mmol)とPfpOH (334 mg, 1.75 mmol)のDMF溶液(2.5 mL)にDCC (288 mg, 1.4 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（CH２Cl２）により精製した。これをHexaneとCH２Cl２で再結晶し、白色粉末としてFmoc-β-Ala-OPfp (429 mg, 90%) を得た。Fmoc-β-Ala-OPfp(100 mg, 0.21 mmol)とＢｏｃPNA-OH (41 mg, 0.19 mmol)のDMF溶液(2 mL)にdiisopropylethylamine (36 μL, 0.21 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-10% MeOH/CH２Cl２）により精製しFmoc-β-Ala-ＢｏｃPNA-OH (41 mg, 42%)を得た。1H NMR (DMSO-d６)δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.41 (t, J= 7.3 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.18 (m, 2 H), 6.83 (brt) and6.72 (brt) (2 H), 4.3 - 4.2 (m, 4 H), 4.05 - 3.9 (m, 3 H), 3.33 (brt) and 3.29 (brt) (2 H), 3.19 (m, 2 H), 3.07 (brq) and 3.02 (brq) (2 H), 1.36 (brs, 9 H); 13C NMR (DMSO-d6) δ171.20 (d), 170.85 (d), 155.93, 155.56, 143.87, 140.69, 127.55, 127.01, 125.09, 120.05, 77.73 (d), 65.30 (d),59.69, 47.35 (d), 46.68, 46.49 (d), 37.99 (d), 36.72 (d), 28.14 (d).
【００６１】
(実施例５）Fmoc-β-Ala-BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(1.25 mL)と水(1.25 mL)の混合溶液にNaHCO3(92.4 mg，1.1 mmol)を加え、Fmoc-β-Ala-OPfp (476.0 mg，1.0 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.55 mmol)を溶解し、室温で6時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、反応液に1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。この後、塩化メチレンに溶かし、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-β-Ala-BocPNA-OH (225.9 mg，80%)を得た。
【００６２】
（実施例６）Fmoc-GABA-ＢｏｃPNA-OHの合成（１）
Fmoc-GABA-OPfp (100 mg, 0.20 mmol)とＢｏｃPNA-OH (40 mg, 0.18 mmol)のDMF溶液(2 mL)にdiisopropylethylamine (34 μL, 0.20 mmol) を加え、室温で１５時間撹拌した。これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-20% MeOH/CH２Cl２）により精製しFmoc-GABA-ＢｏｃPNA-OH (43 mg, 45%)を得た。1H NMR (DMSO-d6)δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2 H),7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.29 (m, 1 H), 6.82 (brt) and 6.71 (brt) (1 H), 4.3 - 4.2 (m, 4 H), 4.05 - 3.9 (m, 3 H),3.35 - 3.25 (m, 2 H), 3.1 - 2.95 (m, 4 H), 1.36 (brs, 9 H); 13C NMR (DMSO-d６) δ172.2 (d), 171.5 (d), 156.03, 155.60 (d), 143.89, 140.68, 127.54, 127.00, 125.50, 120.04, 77.70 (d), 65.19, 54.84, 47.89 (d), 46.97 (d), 46.72, 38.20 (d), 29.23 (d), 28.14 (d), 24.98 (d).
【００６３】
（実施例７）Fmoc-GABA-OPfpの合成
Fmoc-GABA-OH (325 mg, 1.0 mmol)とPfpOH (221 mg, 1.2 mmol)のDMF溶液(2.5mL)にDCC (248 mg, 1.2 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（CH２Cl２）により精製し、白色粉末としてFmoc-GABA-OPfp (463mg, 94%) を得た。1H NMR (CDCl3)δ7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.59 (d, J =7.5 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.31 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 4.85 (brs, 1 H), 4.45 (d, J = 6.3 Hz, 2 H), 4.21 (t, J = 6.3 Hz, 2 H), 3.32(d, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 1.98 (t, J = 6.5 Hz, 2H); 13C NMR（CDCl3）δ169.02, 156.49, 143.83, 141.87 (m), 141.28, 140.23 (m), 138.61 (m), 136.94 (m), 127.62, 127.46, 124.89, 119.88, 66.52, 47.25, 39.92, 30.42, 25.03.
【００６４】
(実施例８) Fmoc-ＧＡＢＡ-BocPNA-OHの合成（２）
アセトン(5.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3 (67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-ＧＡＢＡ-OPfp (255.5 mg，0.52 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で8時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、反応液に1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-ＧＡＢＡ-BocPNA-OH (175.9 mg，84%)を得た。
【００６５】
(実施例９) Fmoc-C4-BocPNA-OHの合成
アセトン(４.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C4-OPfp (323.5 mg，0.64 mmol)とBocPNA-OH(87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で12時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮しアモルファスパウダーとしてFmoc-C4-BocPNA-OH (190.7 mg，88%)を得た。1H-NMR(CDCl3) δ7.76(d，J = 6.7 Hz, 2 H)，6.96 (mi) and 6.66 (ma) (brd, J = 6.7 Hz, 2 H), 7.41 - 7.37(m, 2 H), 7.32 ‐ 7.28(m，2 H), 7.14 (ma) and 6.68 (mi) (m, 1 H), 5.54 (ma) and 5.43 (mi) (brt, 1 H), 4.45(mi) and 4.37(ma) (m, 2 H), 4.24 - 4.21 (m, 1 H)，4.08 - 3.95 (m，2 H)，3.54 - 3.48 (m，2 H)，3.29 - 3.11 (m, 4 H)，2.43 - 2.25 (m, 2 H)，1.70 - 1.29 (m，13 H); 13C-NMR (CDCl3) δ 174.39，173.07，171.95，157.51，156.79(d)，156.11，144.06(d)，141.16，127.46(d)，126.90(d)，119.77(d), 81.42，79.67，66.39(d)，53.35，49.46(d)，49.17，48.60，47.15(d), 40.89，40.32(d)，38.68，31.87，31.41，29.59，29.11(d)，28.28，21.77(d); HRMS (FAB+) calcd. for C29H37N3O7 [(M+H)+] 539.2632 observed 540.2707.
【００６６】
(実施例１０) Fmoc-C5-BocPNA-OHの合成
アセトン(7.5 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C5-OPfp (311.0 mg，0.6 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとして、Fmoc-C5-BocPNA-OH (198.0 mg，90%)を得た。1H-NMR (DMSO-d6)δ 7.88(d，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.68 (d, J =7.2 Hz，2 H)，7.41 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.32 (t，J = 7.4 Hz, 2 H)，7.22(brt，1 H)，6.81 (ma) and 6.67 (mi) (brt, 1 H)，4.33 (mi) and 4.29 (ma)(brd，2 H)，4.20 (t，J = 7.1 Hz, 1 H)，4.08 (mi) and 3.90 (ma) (brs，2H)，3.09 - 2.94 (m，4 H)，2.30 (ma) and2.14 (mi) (brt，2 H)，1.51 - 1.45(m，2 H)，1.41 - 1.31 (brs，11 H)，1.29-1.21 (m，8 H); 13C-NMR (CDCl3)δ175.1(d)，172.27(d)，157.20(t)，156.63，144.43(d)，141.69，128.07，127.45，125.40(d)，120.35，81.71，80.00，67.36(d)，50.42，49.81(d)，48.90(d)，47.82(d)，41.77，41.16，40.64，39.19，33.12，32.75，29.45(d)，28.81，26.59，24.97，24.70; HRMS (FAB+) calcd. for C30H39N3O7 [(M+H)+] 553.2788observed 554.2873.
【００６７】
(実施例１１) Fmoc-C6-BocPNA-OHの合成
アセトン(6.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C6-OPfp (331.9 mg，0.6 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C6-BocPNA-OH (197.0 mg，87%)を得た。1H-NMR (DMSO-d6)δ7.88 (d，J =7.7 Hz, 2 H)，7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd，J = 7.4 Hz，2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz，2 H), 7.32 (t, J =7.4 Hz，2 H), 7.22 (brt, 1 H), 6.79 (ma) and 6.66 (mi) (brt, 1 H), 4.39(mi) and 4.29 (ma) (brt, 2 H), 4.20 (t, J = 6.7 Hz，1 H) 4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs, 2 H), 3.10 - 2.97 (m， 4 H)，2.31 (ma) and 2.15 (mi) (brt，2 H)，1.50 - 1.47(m，2 H)，1.41 - 1.36(m，11 H)，1.28-1.24(brd，6 H);13C-NMR (CDCl3)δ175.23(d)，172.41(d)，157.11(d)，156.60，144.34(d)，141.69，128.07，127.45，125.40(d)，120.35，81.68，80.00(d)，67.72，67.50(d)，53.87，50.77，50.14(d)，48.90，47.82(d)，41.29(d)，41.36，40.69，39.18，33.19，32.96，30.00，29.11，28.81，26.75(d)，25.27(d)，24.80(d); HRMS(FAB+) calcd. for C29H41N3O7 [(M+H)+] 567.2945 observed 568.3027.
【００６８】
(実施例１２) Fmoc-C7-BocPNA-OHの合成
アセトン(7.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C7-OPfp (328.5 mg，0.6 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C7-BocPNA-OH (196.1 mg，84%)を得た。1H-NMR (DMSO-d6);δ7.88(d，J = 7.7 Hz，2 H)，7.68 (ma) and 7.63 (mi) (brd，J = 7.4 Hz，2 H)，7.40 (t，J = 7.4 Hz，2 H)，7.32 (t，J =7.4 Hz，2 H)，7.22 (brt，1 H)，6.79 (ma) and 6.79 (mi) (brt，1 H)，4.39(mi) and 4.29(ma) (brd，J = 6.9 Hz，2 H)，4.05 (t，J = 6.7 Hz，1 H)，4.08 (mi) and 3.91 (ma) (brs，2 H)，3.12 - 2.95 (m，4 H)，2.31 (mi) and 2.15 (ma) (brt，2 H)，1.50 - 1.47 (m，2 H)，1.42 - 1.34 (m，11 H)，1.25 (brd，2 H); 13C-NMR (CDCl3) δ 174.72，172.19，156.52，156.05，143.78(d)，141.14，127.51, 126.89, 124.86(d), 119.79, 79.43(d)，66.80(d)，53.33，50.19，49.20, 48.50，47.14(d)，41.18(d), 38.60，32.28(d)，29.60, 28.83，28.26, 26.27(d)，24.68(d)，21.77(d); HRMS (FAB+) calcd. for C32H43N3O7 [(M+H)+] 581.3101 observed 582.3171.
【００６９】
(実施例１３) Fmoc-C10-BocPNA-OH
アセトン(7.0 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C10-OPfp (353.7 mg，0.6 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で24時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C10-BocPNA-OH (218.5 mg，88%)を得た。1H-NMR (CDCl3)δ9.60 (brs，1 H)，7.73 (d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.58 (d，J = 6.8 Hz，2 H)，7.37 (t，J = 6.8 Hz，2 H)，7.29 (t，J = 7.2Hz，2 H)，5.52 (ma) and 5.35 (mi) (brd，1 H)，5.00 (s，1 H)，4.45 (mi)and 4.40 (ma) (brd，J = 6.4 Hz，2 H)，4.23 - 4.22 (m，1 H)，4.09 (mi) and 4.04 (ma) (brs，2 H)，3.57 - 3.46 (m，2 H)，3.29 - 3.03 (m，4 H)，1.66- 1.58 (brs，2 H)，1.52 - 1.37 (m，11 H)，1.33 - 1.20 (brs，12 H); 13C-NMR (CDCl3)δ174.5(d)，172.43(d)，171.64(d)，157.83(d)，156.98，156.03，143.78(d)，141.17，127.52，126.90，124.86(d)，119.70(d)，81.08，79.43(d)，67.26，66.43，50.14，49.29，48.145(d)，47.17(t)，41.47，40.99，40.16，38.63，32.90，32.43(d)，29.55(d)，29.22(m)，28.28，26.56(d)，24.98，24.75; HRMS (FAB+) calcd. for C35H49N3O7[(M+H)+] 623.3571 observed 624.3643.
【００７０】
(実施例１４)Fmoc-C11-OPfpの合成
Fmoc-C11-OH (437.5 mg，2.0 mmol)とPfpOH(276.6 mg，3.0 mmol)のDMF溶液(2.5 mL)にDCC(309.5 mg，3.0 mmol)を氷冷下で加え、この反応液を0 ℃で30分次いで室温で18時間攪拌した。反応終了後DCUreaを濾別して濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法(CH2Cl2)により精製した後、Hexaneで再結晶し白色粉末としてFmoc-C11-OPfp (575.6 mg，96%)を得た。1H-NMR (CDCl3)δ7.79(d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.63 (d，J = 7.2 Hz, 2 H)，7.43 (t，J =7.6 Hz, 2 H)，7.34 (t，J = 7.2 Hz, 2 H)，4.86 (brt，1 H)，4.47 (mi) and 4.44 (ma)(brd，2 H)，4.25 (t，1 H)，3.22 (q，J = 6.1 Hz, 2 H)，2.68 (t，J = 7.2 Hz, 2 H)，1.80 (m，2 H)，1.56 - 1.52 (m，2 H)，1.47 - 1.42 (m，2 H)，1.39- 1.30 (m，12 H); HRMS (FAB+) calcd. for C33H34F5NO4 [(M+H)+]603.6194 observed 604.2490.
【００７１】
(実施例１５) Fmoc-C11-BocPNA-OH
アセトン(10 mL)と水(1.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(67.2 mg，0.8 mmol)を加え、Fmoc-C11-OPfp (362.2 mg，0.6 mmol)とBocPNA-OH (87.3 mg，0.4 mmol)を溶解し、室温で48時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。塩化メチレンに溶かした後、減圧濃縮し白色のアモルファスパウダーとしてFmoc-C11-BocPNA-OH (227.6 mg，89%)を得た。1H-NMR (CDCl3);δ9.62 (brs，1 H)，7.74 (d，J = 7.6 Hz，2 H)，7.57 (d，J = 7.5 Hz，2 H)，7.37 (t，J = 7.1 Hz，2 H)，7.28 (t，J = 6.8Hz，2 H)，5.53 (ma) and 5.35 (mi) (brs，H)，5.00 (brt，1 H)，4.43 (mi)and 4.37 (ma) (brd，J = 6.4 Hz，2 H)，4.22 - 4.19 (m，1 H)，4.06 (mi) and 4.01 (ma) (brs，2 H)，3.51 - 3.44 (m，2 H)，3.23 - 3.08 (m，4 H)，2.36(ma) and 2.21 (mi) (brt，J = 7.0 Hz，2 H)，1.69 - 1.58 (brs，2 H)，1.52- 1.40 (m，11 H)，1.29 - 1.25 (brd，14 H); 13C-NMR (CDCl3)δ175.45(d)，172.428(d)，157.91(d)，157.01，156.57，144.33(d)，141.72，128.05，127.43，125.40(d)，120.35，81.63，80.00(d)，67.77，66.97，50.67，49.84，49.20(d)，47.72(t)，42.10，41.53，40.70，39.18，33.51，33.07，30.032，29.83(m)，28.82，27.00(d)，25.44，25.35; HRMS (FAB+) calcd. for C36H51N3O7 [(M+H)+] 637.3727 observed 638.3794.
【００７２】
（実施例１６）PNA oligo 1（H2N-G-A-T-pMR-G-A-C-G-C-CONH2）の合成（第１法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。この間、Fmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OHを縮合した際には、次のチミジンPNAモノマーユニットと縮合する前に、まずピペリジン処理（20% piperidine in DMF 3 mL、室温３０分）してFmoc基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてp-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、チミジン、アデニン、グアニンのPNAモノマーユニットを逐次縮合したあと、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H2O) 303, 548 (nm)。
【００７３】
（実施例１７）PNA oligo 1の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてp-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H2O) 302, 550 (nm)。
【００７４】
（実施例１８）PNA oligo 2（H2N-G-A-T-mMR-G-A-C-G-C-CONH2）の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてm-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 2を得た。UVλmax (H2O) 308, 570 (nm)。
【００７５】
（実施例１９）PNA oligo 3（H2N-G-A-T-oMR-G-A-C-G-C-CONH2）の合成（第２法）
ｔＢｏｃ法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; φrum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、固相担体MBHA（50 mg）に各種PNAモノマーユニット（チミン7.7 mg、シトシン10.1 mg、アデニン10.6 mg、グアニン10.9 mg、Fmoc-Gly-ＢｏｃPNA-OH 10.0 mg；各20 mmol）と縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（7.0 μL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った。全てのモノマーユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３０分）してFmoc-Gly残基を脱保護して、次いで光機能性分子のカルボン酸誘導体としてo-Methyl Red-OH（10.8 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（13.9 μL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に導入した。その後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しとZ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするPNA oligo 1を得た。UV λmax (H2O) 302, 561 (nm)。
【００７６】
（実施例２０）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブ（１）の合成
【化１８】
2006158400.tif 000020
前記第２法を用いた。
標準的tBoc法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（50 mg）にチミンPNAモノマーユニット（7.7 mg、20 mmol）、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω‐アミノ酸Boc-7-aminoheptanoic Acid（5.2 mg、20 mmol）、Fmoc-Ahx-BocPNA-OH（10.0 mg、20 mmol）と再度Boc-7-aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてFmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
TFA処理（95% TFA/5% m-cresol）によりBoc基を脱保護した後、FITC（9.3 mg,25 mmol）をDIEA（17.4 mL, 100 mmol）存在下、室温で12時間振盪し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）して残るFmoc基を脱保護した後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI-TOF MS: calcd. 2096.26 (M + H+), found 2096.36.
【００７７】
（実施例２１）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブ（２）の合成
【化１９】
2006158400.tif 000021
標準的tBoc法（cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（50 mg）にチミンPNAモノマーユニット（7.7 mg、20 mmol）、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω‐アミノ酸Boc-7-aminoheptanoic Acid（5.2 mg、20 mmol）、Fmoc-Ahx-BocPNA-OH（10.0 mg、20 mmol）と再度Boc-7-aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU（7.6 mg、20 mmol）とDIEA（3.5 mL、20 mmol）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてFmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）してFmoc基を脱保護した後、再度Fmoc-Arg(Mts)-OH（23.1 mg、40 mmol）を縮合剤HBTU（15.2 mg、40 mmol）とDIEA（7.0 mL、40 mmol）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の追加導入）。
TFA処理（95% TFA/5% m-cresol）によりBoc基を脱保護した後、FITC（9.3 mg, 25 mmol）をDIEA（17.4 mL, 100 mmol）存在下、室温で12時間振盪し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（20% piperidine in DMF、室温３分）して残るFmoc基を脱保護した後、常法（TFA/TFMSA/p-cresol/thioanisol=60/25/10/10）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI-TOF MS: calcd. 2252.44 (M + H+), found 2252.33.
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ＰＮＡオリゴマー誘導体が有している機能性分子の誘導体の諸機能に基づいて、遺伝子治療などに利用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
【図２】２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
【図１】
2006158400.tif 000023
【図２】
2006158400.tif 000024