(57)【要約】      （修正有）【課題】ゲノムのマッピングおよび配列決定に有用なハイブリッド制限酵素を得ることができる、ＤＮＡセグメントおよびこのＤＮＡセグメントを有するＤＮＡ構築物の提供。【解決手段】ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメント。これらのＤＮＡセグメントをベクターに対して動作可能に連結してＤＮＡ構築物を得る。前記認識ドメインは、Ｕｂｘのホメオドメインである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ構築物であって：
（ｉ）ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；
（ii）前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；
（iii）ベクターとを具備し、
前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているＤＮＡ構築物。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ構築物であって、前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼであるＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記認識ドメインが、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；ＰＯＵドメインモチーフ（真核転写レギュレータ）；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性ドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクからなる群から選択されるＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡ構築物であって、前記認識ドメインがＵｂｘのホメオドメインであるＤＮＡ構築物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
〔発明の背景〕
１．発明の技術分野
本発明はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ系に関する。特に、本発明はこの制限エンドヌクレアーゼ系の分離した機能ドメインをコードするＤＮＡセグメントに関する。
【０００２】
本発明はまた、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二種類の挿入変異体の構築に関する。
【０００３】
加えて、本発明は超双胸系(Ultrabithorax)ＵｂｘホメオドメインをＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）に連結することによって製造されるハイブリッド酵素（Ｕｂｘ−ＦＮ）に関する。
【０００４】
２．従来技術
ＩＩ型エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ(modification methylase)は、二本鎖ＤＮＡ中の特定の配列を認識するバクテリア酵素である。このエンドヌクレアーゼはＤＮＡを開裂するのに対し、該メチラーゼはアデニン残基またはシトシン残基をメチル化して宿主ゲノムを開裂から保護する［ＩＩ型制限酵素および修飾酵素；「ヌクレアーゼ」（Mordrich and Roberts編）；ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ社刊；第109〜154頁；1982年］。これらの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系は、この系がなければ細胞を破壊するようなファージおよびプラスミドによる感染から、細胞を保護するように機能する。
【０００５】
200以上の特異性を有する2500もの制限酵素が検出され、生成されている（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. 25:585-627, 1991）。これら殆どの酵素の認識部位は、４〜６塩基対の長さである。ファージゲノムは通常は小さく、またファージにはこれらの小さい認識部位が高頻度で存在するから、認識部位の大きさがこのように小さいことは有益である。
【０００６】
ＩＩＳ型のクラスに属する、35以上の特異性をもった80の異なるＲ−Ｍ系が同定されている。このクラスは、酵素の開裂部位が認識配列から離れている点において特徴的である。通常、認識部位と開裂部部位との間の距離は極めて正確である（Szybalski et al., Gene, 100:13-26, 1991）。これら全ての酵素のうち、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、最も良く特徴が調べられているＩＩＳ型クラスの酵素である。このＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（ＲＦｏｋＩ）は、二本鎖ＤＮＡにおける非対称なペンタヌクレオチド、即ち、一方の鎖の５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）および他方の鎖の３′−ＣＣＴＡＣ−５′（配列番号２）を認識し、該認識部位から離間した部位に千鳥状（段違い）の開裂を導入する（Sugisaki et al., Gene 16:73-78; 1981）。これとは対照的に、 ＦｏｋＩメチラーゼ（ＭＦｏｋＩ）はＤＮＡを修飾することにより、該ＤＮＡを、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼによる消化に対して耐性にする。このＦｏｋＩ制限遺伝子およびＦｏｋＩ修飾遺伝子はクローン化され、そのヌクレオチド配列が推定されている（Kita et al., J. of Biol. Chem., 264:575-5756, 1989）。にもかかわらず、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのドメイン構造は、３ドメイン構造が示唆されてはいるが（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. 25:585-627）、未だ未知のままである。
【０００７】
〔発明の概要〕
従って、本発明の一つの目的は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの単離されたドメインを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、ゲノムのマッピングおよび配列決定に有用なハイブリッド制限酵素を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、野生型酵素に比較して、認識部位から開裂部位までの距離が増大された、ＦｏｋＩの二つの挿入変異体を提供することである。この二つの変異体を構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が利用される。
【００１０】
本発明の他の種々の目的および利点は、添付の図面および以下の説明から明らかになるであろう。
【００１１】
一つの態様において、本発明は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメインをコードするＤＮＡセグメント；並びにＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡセグメントに関する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端または認識ドメインからなり、且つ前記エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有する単離されたタンパク；または実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端または触媒ドメインからなり、且つ前記エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を有する単離されたタンパクに関する。
【００１３】
更なる態様において、本発明はＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだＤＮＡ構築物に関する。この構築物において、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは動作可能にベクターに連結されて、ハイブリッド制限酵素を産生するようになる。上記の連結は共有結合を介して行われる。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含む原核細胞に関する。第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、動作可能に前記ベクターに連結される。第一のＤＮＡセグメントは、例えばＦｏｋＩの触媒ドメイン（ＦＮ）をコードしてもよく、また第二のＤＮＡセグメントは、例えばＵｂｘのホメオドメインをコードしてもよい。
【００１５】
他の態様において、本発明は、ハイブリッド制限酵素であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含んでおり、該触媒ドメインは、この触媒ドメインの取得源であるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ以外の酵素またはタンパクの認識ドメインに連結されているハイブリッド制限酵素に関する。
【００１６】
更に別の態様において、本発明はＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだＤＮＡ構築物に関する。好ましくは、前記第三のセグメントは４または７のコドンを含んでいる。
【００１７】
他の態様において、本発明は原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだ原核細胞に関する。
【００１８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの機能ドメインの同定および特徴付けに基づいている。本発明に至る実験において、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは２ドメイン系であり、その一つのドメインは配列特異的認識活性を有するのに対して、他方のドメインはヌクレアーゼ開裂活性を含んでいることが見出された。
【００１９】
このＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ中の非パリンドローム配列である５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）：５′−ＣＡＴＣＣ−３′（配列番号２）を認識し、該認識部位から９／１３ヌクレオチド下流を開裂させる。このＤＮＡヘリックスの１回転には１０塩基対を必要とするので、発明者は、該酵素は一点で結合することによってＤＮＡ面と相互作用し、該ヘリックスの次の回転の他点で切断するのあろうと仮定した。これは、離間した二つのタンパクドメイン（即ち、一つはＤＮＡの配列特異的認識のためのドメイン、他の一つはエンドヌクレアーゼ活性のためのドメイン）の存在を示唆している。この仮定された２ドメイン構造は、本発明に至る研究によって、 ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ系の正しい構造であることが示された。
【００２０】
従って、一態様において、本発明は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端（好ましくは、該タンパクの２／３に当たるＮ末端部分）をコードするＤＮＡセグメントに関する。このセグメントは、当該エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有するタンパクをコードする。即ち、このコードされたタンパクは、二本鎖ＤＮＡ中の非パリンドローム配列であるｄ−５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）：５′−ＣＡＴＣＣ−３′（配列番号２）を認識する。好ましくは、本発明のこのＤＮＡセグメントとは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸1-382をコードする。
【００２１】
更なる態様において、本発明はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこのＤＮＡセグメントによってコードされるタンパクは、 ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ開裂活性を有している。好ましくは、本発明のＤＮＡセグメントはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸383-578をコードする。本発明のＤＮＡセグメントは、当該技術において公知の方法、例えばゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはこれらの組合せを用いて、生物学的サンプルから容易に単離することができる。更に、本発明のＤＮＡセグメントは、当該技術において標準的な方法を用いて、化学的に合成することができる。
【００２２】
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントによってコードされるタンパクに関する。従って、他の態様において、本発明は実質的にＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＮ末端からなり、当該酵素の配列特異的認識活性を保持しているタンパクに関する。本発明のこのタンパクは、2-メルカプトエタノールの存在下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された約41キロドルトンの分子量を有している。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端（好ましくは該タンパクのＣ末端部分１／３）からなるタンパクに関する。2-メルカプトエタノールの存在下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したとき、このタンパクの分子量は約25キロドルトンである。
【００２４】
本発明のタンパクは、当該技術分野において周知の方法によって、生物学的サンプルから単離または精製することができる。例えば、このタンパクはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼを単離し、開裂することによって得ることができる。或いは、本発明のタンパクは化学的に合成し、または組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、精製することができる。
【００２５】
本発明のＤＮＡセグメントは、他のＤＮＡ結合性タンパクドメインをＦｏｋＩのヌクレアーゼ若しくは開裂ドメインと結合することにより、「ハイブリッド」タンパクを作製するために使用することができる。これは組換えＤＮＡ技術によると同様、化学的にも達成することができる。このようなキメラハイブリッド酵素は新規な配列特異性を有し、ヒト、マウスおよび植物のような様々な種におけるゲノムの生理的マッピングおよび配列決定のために有用である。例えば、このような酵素はヒトゲノムのマッピングにおける使用に適しているであろう。また、これらの加工されたハイブリッドエンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの取り扱いを容易にし、タンパク構造およびタンパク設計に関して価値のある情報を提供するであろう。
【００２６】
このようなキメラ酵素はまた、組換えＤＮＡ技術および分子生物学において価値のある研究手段である。現在のところ、４〜６塩基対のカッターおよび幾つかの８塩基対カッターが商業的に入手可能であるに過ぎない。（＞６塩基対を切断する商業的に入手可能な約１０種類のエンドヌクレアーゼが存在している。）  他のＤＮＡ結合性タンパクをＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインに結合させることによって、ＤＮＡ中の７塩基対以上を認識する新規な酵素を作製することができる。
【００２７】
従って、更なる態様においては、本発明はＤＮＡ構築物と、その中に暗号化されているハイブリッド制限酵素に関する。本発明のＤＮＡ構築物は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと、配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと、ベクターとを含んでいる。第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは、これらセグメントを発現してキメラ制限酵素を生じることができるように、動作可能にベクターに連結される。この構築物は、プロモータ（例えば、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｐおよびｌａｃ・ＵＶ５プロモータ）、転写ターミネータまたはレトロ調節因子類(retroregulators)（例えば、ステムループ(stem loop)）のような調節因子を含むことができる。ホスト細胞（E. coliのような原核細胞）は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換して、キメラ制限酵素の製造に用いることができる。
【００２８】
本発明のハイブリッド酵素は、他の酵素またはＤＮＡ結合性タンパク（例えば６塩基対を認識する、天然に存在するＤＮＡ結合性タンパク）に結合されたＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインから構成されている。適切な認識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフの認識ドメイン；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメイン（真核転写レギュレータ、例えば、Ｐｉｔ１、Ｏｃｔ２およびｕｎｃ８６）；ラムダリプレッサ、ｌａｃリプレッサ、ｃｒｏ、ｇａｌ４の他のＤＮＡ結合性タンパクドメイン；ｍｙｃ、ｊｕｎのような発癌遺伝子のＤＮＡ結合性タンパクドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のハイブリッド制限酵素は、当業者が公知の方法論を用いて製造することができる。例えば、該酵素は化学的に合成することができ、或いは当該技術において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。本発明のハイブリッド酵素は、本発明のＤＮＡ構築物を含むホスト細胞（ＨＢ１０１、ＲＲ１、ＲＢ７９１およびＭＭ２９４を培養し、当該タンパクを単離することによって製造することができる。更に、当該ハイブリッド酵素は、当該技術で公知の普通の連結技術、例えばＥＤＣ／ＮＨＳ、ＤＳＰ等のようなタンパク架橋剤を用いて、例えばＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインを認識ドメインに連結することによって、化学的に合成することができる。
【００３０】
本発明に従って作製することができ、従って本発明の一つの態様である特別なハイブリッド酵素は、Ｕｂｘ−ＦＮである。このキメラ制限エンドヌクレアーゼは、ＵｂｘホメオドメインをＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）に連結することによって製造することができる。精製に続いて、当該ハイブリッド酵素の特性を分析した。
【００３１】
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは以下の実験において研究された酵素であるが、他のタイプのＩＩＳエンドヌクレアーゼ類（例えば表２に掲載したもの）は、本発明に基づいて当業者が容易に測定できるであろう同様の２ドメイン構造を用いて機能するであろうことが期待される。
【００３２】
最近、ストレプトコッカス・サングイス(Streptococcus sanguis)から、ＳｔｓＩ、即ちＦｏｋＩのヘテロ分裂体(heteroschizomer)が単離された（Kita et al., Nucleic Acid Research 20 (3),618, 1992）。このＳｔｓＩは、ＦｏｋＩと同じ非パリンドロームのペンタデオキシリボヌクレオチド、即ち、５′−ＧＧＡＴＧ−３′：５′−ＣＡＴＣＣ−３′を認識するが、該認識部位の１０／１４ヌクレオチド下流を開裂する。このＳｔｓＩ・ＲＭ系はクローニングされ、配列決定されている（Kita et al., Nucleic Acid Research 20 (16) 4167-72, 1992）。二つのエンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩとＳｔｓＩの間に、顕著なアミノ酸配列の相同性（略３０％）が検出された。
【００３３】
本発明の他の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体の構築に関する。特に、この態様にはＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントとを含んだＤＮＡ構築物に関する。第三のＤＮＡセグメントは、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントの間に挿入される。この構築物はベクターをも含んでいる。上記のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼである。
【００３４】
適切な認識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメイン；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性メイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
上記で述べたように、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ末端に存在するのに対して、開裂ドメインは、おそらくは該分子のカルボキシ末端側１／３(the carboxyl terminal third of the molecule)に存在する。上記のドメインはリンカー領域によって結合され、これによってＤＮＡ基質の認識部位と開裂部位との間の距離が決定される。このＦｏｋＩのリンカー領域は、ＤＮＡ基質の存在下においてトリプシンにより開裂し、４１kDaのアミノ末端フラグメント（ＤＮＡ結合性ドメイン）および２５kDaのカルボキシ末端フラグメント（開裂ドメイン）を生じ易い。一次アミノ酸配列に基づくＦｏｋＩの二次構造予測はこの仮説を支持している（図１０参照）。この予測された構造は、認識ドメインと開裂ドメインとの連結部における、長く伸びたアルファヘリックス領域を明らかにしている。このヘリックスは多分、該酵素の二つのドメインを結合するリンカーを構成している。こうして、認識部位からのＦｏｋＩの開裂距離はこのスペーサ（アルファヘリックス）の長さを変化させることによって変更できるであろうことが教示された。アルファヘリックスの１回転(one turn)には3.6のアミノ酸が必要とされるから、この領域に４コドンまたは７コドンを挿入することによって、天然の酵素に存在しているヘリックスは夫々１回転または２回転だけ延長されるであろう。このヘリックス領域のアミノ酸配列を詳細に検査することによって、アミノ酸ＥＥＫで離間された二つのＫＳＥＬ反復の存在（図１０）が明らかになった（配列番号２１参照）。ＫＳＥＬセグメント（４コドン）（配列番号２２参照）およびＫＳＥＬＥＥＫ（７コドン）（配列番号２３参照）は、このヘリックスを夫々１回転および２回転だけ延長するためにヘリックス中に挿入するための良好な選択であると思われる。  （実施例ＸおよびＸＩを参照のこと）  こうして、変異体酵素を作製するために遺伝子工学が利用された。
【００３６】
特に、これらの変異体は１以上、好ましくは４または７のコドンをＦｏｋＩの認識ドメインと開裂ドメインとの間に挿入することによって得られる。より特定的には、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド1152に４コドンおよび７コドンが挿入される。この変異体は、野生型酵素と同様のＤＮＡ配列特異性を有している。しかしながら、野生型酵素と比較すると、これらは、ＤＮＡ基質の両鎖の認識部位から更に離間した一つのヌクレオチドを開裂する。
【００３７】
100ｂｐフラグメントの開裂に基づくＦｏｋＩおよび変異体の切断部位の分析が、図１５に纏めてある。ＦｏｋＩの認識部位と開裂部位との間に４（または７）コドンを挿入すると、認識部位から開裂部位までの距離の増加が伴う。この情報は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ内に、二つの離間したタンパクドメイン（一つは配列特異的認識部位であり、他方はエンドヌクレアーゼ活性である）が存在することを更に支持する。この二つのドメインは、ＤＮＡ基質の認識部位と開裂部位との間の距離を決定するリンカー領域によって結合される。この酵素のモジュール構造は、他のＤＮＡ結合性タンパクをＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの開裂ドメインに連結することによって、異なった配列特異性のキメラエンドヌクレアーゼを構築することが容易であろうことを示唆している。
【００３８】
上述した情報の観点から、本発明の他の態様には、原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントとを含んだ原核細胞が含まれる。第三のＤＮＡセグメントは、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントの間に挿入される。また、この細胞はベクターをも含んでいる。加えて、前記第一のＤＮＡセグメント、前記第二のＤＮＡセグメントおよび前記第三のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように前記ベクターに対して動作可能に連結される。前記第三のセグメントは、実質的に４または７のコドンからなっていてもよい。
【００３９】
また、本発明には上記で述べた原核細胞によって産生されるタンパクが含まれる。特に、この単離されたタンパクは実質的に、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインと、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、前記第三のＤＮＡセグメントに存在するコドンによってコードされるアミノ酸とからなっている。
【００４０】
以下の制限的でない実施例は、本発明をより詳細に説明するために与えられるものである。
【００４１】
〔実施例〕
実施例Ｉ
ＦｏｋＩＲＭ系のクローニング
ＦｏｋＩ系を、変更表現型を選択する事によってクローンした。フラボバクテリウム・オケアノコイテス（Flavobacterium okeanokoites) 株ＤＮＡを、カゼルタら（Caserta et al., J. Biol. Chem., 262:4770-4777, 1987) によって記載された方法によって単離した。  数個のフラボバクテリウム・オケアノコイテスのゲノムライブラリーを、プラスミドｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３中に、クローニング酵素ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩを使用して構築した。プラスミド・ライブラリーＤＮＡ（１０μｇ）を、１００ユニットのＦｏｋＩエンドヌークレアーゼで消化し、ＦｏｋＩＭ＋表現型を発現するプラスミドを選択した。
【００４２】
生存プラスミドをＲＲＩ細胞にトランスフォーム（形質転換）し，形質転換物細胞を適切な抗生物質を含むプレート上で選択した。生化学的濃縮を二回行なった後、ｆｏｋＩＭ＋表現型を発現する数個のプラスミドをこれらのライブラリーから同定した。これらのクローン由来のプラスミドは、ＦｏｋＩによる消化に対して完全に抵抗性を示した。
【００４３】
Ｆ．オケアノコイテスのｐＢＲ３２２ ＰｓｔＩライブラリーから分析して得られた８つの形質転換物の内、二つは，ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらに由来するプラスミドは、５．５ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいた。Ｆ．オケアノコイテスのｐＢＲ３２２ ＢａｍＨＩライブラリーからピックアップされた８つの形質転換物の内、二つは，ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらに由来するプラスミドは、１８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を含んでいた。ｐＵＣ１３中のＦ．オケアノコイテスのゲノムＢｇｌＩＩライブラリーから分析された８つの形質転換物の内、６つが、ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらのクローンの内３つが、８ｋｂのＢｇｌＩＩ挿入物を担持し、残りは１６ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を担持していた。
【００４４】
これらのクローンについてのファージλのプレーテイング効率から、これらのクローンもまた、ｆｏｋＩＲ遺伝子を担時している事が示唆される。８ｋｂ のＢｇｌＩＩ挿入物を担持するクローンは、ファージ感染に一番抵抗性を示したようだ。更に，ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ活性が、ホスホセルロース・カラムで、部分精製を行った後のこのクローンの粗抽出物中で検出された。このクローン由来のプラスミド、ｐＵＣｆｏｋＩＲＭを選んで、更に特徴付けを行った。
【００４５】
５．５ｋｂ ＰｓｔＩ断片を、Ｍ１３ファージにトランスファーし、この挿入物の部分的ヌクレオチド配列を、サンガーのシークエンス法 (Sanger et al., PNAS USA, 74:5463-5467, 1977)を使用して決定した。ＦｏｋＩＲＭ系の完全なヌクレオチド配列は、別の研究室（Looney et al., Gene, 80:193-208, 1989; Kita et al., Nucleic Acid Res., 17:8741-8753, 1989; Kita et al., J. Biol. Chem. 264:5751-5756, 1989)によって公表されている。
【００４６】
実施例ＩＩ
ポリメラーゼ・チエイン・リアクションを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの効率的過剰生産者クローンの構築
ＰＣＲテクニックを使用してｆｏｋＩＲ遺伝子を囲む転写及び翻訳信号を変更し、大腸菌における過剰発現を遂行した（Skoglund et al., Gene, 88:1-5, 1990)。ｆｏｋＩＲ及びｆｏｋＩＭ遺伝子に先行するリボソーム結合部位を変更し、共通する大腸菌信号に適合させる。
【００４７】
ＰＣＲ反応において、ＢａｍＨＩで直線化されたプラスミドｐＵＣｆｏｋＩＲＭ ＤＮＡが、テンプレートとして使用された。ＰＣＲ反応物（１００μｌ）には、０．２５ ｎｍｏｌの各プライマー 、５０ μＭの各ｄＮＴＰ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．３、２５℃）、５０ ｍＭ ＫＣｌ, １．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２, ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１ ｎｇのテンプレートＤＮＡ、５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれていた。ｆｏｋＩＲ及びｆｏｋＩＭ遺伝子の増幅に使用されるオリゴプライマーを、図１に示す。反応混合物（４重に行なう）上に鉱物油を載置し、パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer-Cetus)熱サイクラーを使用して反応を実施した。
【００４８】
最初のテンプレート変性は２分間とプログラムされた。その後、サイクルプロフィルは、３７℃で２分（アニーリング）、７２℃で５分（伸張）、９４℃で１分（変性）というようにプログラムされた。このプロフィルを２５サイクル繰り返し、最後の７２℃伸張を１０分まで延長した。反応混合物の水層をプールし、１：１フェノール／クロロフォルムで一回、クロロフォルムで二回、抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、２０μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］で再懸濁した。次に、ＤＮＡを適切な制限酵素で切断して付着末端を生成し、ゲル精製を行なった。
【００４９】
過剰生産者クローンの構築は、二段階で行なわれた。はじめに、ｆｏｋＩＭ遺伝子を含むＰＣＲ産生ＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、ゲル精製を行った。次に、該ＤＮＡをＮｃｏＩ切断し、脱リン酸化されたｐＡＣＹＣ１８４に連結し、該組替ＤＮＡは、マニアチス（Maniatis et al., Molecular Cloning. A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). 等に記載の様に受容可能状態（コンピテント）にした大腸菌ＰＢ７９１ｉｇまたはＲＲＩ細胞にトランスフェクトされた。 Ｔｃ選択後、数個のクローンをピックアップし、プラスミドＤＮＡを制限分析にかけ、ｆｏｋＩＭ遺伝子断片がベクターのクロラムフェニコールのプロモーターに対して正しい方向で存在しているかどうかについて調べた（図２参照）。該プラスミドは、ＦｏｋＩメチラーゼを構成的に発現する。これは、ｆｏｋＩＲ遺伝子を、適合性プラスミドのホスト中に導入する際のホストの染色体切断を防ぐ。それ故、これらのクローン由来のプラスミドＤＮＡは、ＦｏＫＩ消化に対して、抵抗性がある。
【００５０】
次に、ＰＣＲで産生されたｆｏｋＩＲ断片は、ＢａｍＨＩに切断され、脱リン酸化された高発現ベクターｐＲＲＳまたはｐＣＢに連結された。ｐＲＲＳは、ｌａｃ ＵＶ５ プロモータ及び強ｔａｃプロモータを含むｐＣＢを担持している。加えて、これらのベクターは、挿入されたｆｏｋＩＲ遺伝子のバチルス・サーリンジェンシス（Bacillus Thuringiensis) 下流の結晶タンパク質をコードする遺伝子に由来する陽性レトロ調節ステップループ配列を含んでいる。
【００５１】
該組替ＤＮＡを受容可能な大腸菌ＲＢ７９１ｉｇ［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］または、ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトした。Ｔｃ及びＡｐ抗生物質選択をした後、数個のクローンをピックアップして、プラスミドＤＮＡを制限分析にかけ、ｆｏｋＩＲ遺伝子がベクター・プロモータからの発現について正しい配向にあるかどうかについて調べた。次に、これらの構築物の酵素産生について調べた。
【００５２】
酵素を産生するために、プラスミド含有ＲＢ７９１ｉｇまたは、ＲＲ１細胞を、３７℃で、２０μｇＴｃ／ｍｌ（ｐＵＣｆｏｋＩＲＭプラスミド以外）及び５０μｇ  Ａｐ／ｍｌを補給した２倍濃縮のＴＹ培地［１．６％トリプトン、１％酵素抽出物、０．５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）］中で、振盪しながら生育させた。細胞密度がＯ．Ｄ．６００＝０．８に達した時、ＩＰＴＧを濃度１ｍＭまで加えた。該細胞を、振盪しながら一晩（１２時間）インキュベートした。  図２に示すように、両構築物はＦｏｋＩを全細胞蛋白の５−８％のレベルまで産生した。
【００５３】
実施例III
ＦｏＫＩエンドヌクレアーゼの精製
シンプルな３段階精製法を使用して、電気泳動法的に均質なＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを得た。ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ、ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ］を、３７℃で、２０ μｇ Ｔｃ／ｍｌ及び５０ μｇ／Ａｐ ｍｌを含む２倍濃縮のＴＹ６ｌ中で、Ａ６００＝０．８まで生育させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで、一晩誘導した。遠心分離によって細胞を収穫し、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む２５０ｍｌの緩衝液Ａ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ燐酸（ｐＨ８．０）、７ ｍＭ ２ーメルカプトメタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール］中に再懸濁した。
【００５４】
該細胞を、ブランソン(Branson）超音波器で、最高強度、一時間４℃で破砕した。超音波破砕された細胞は１２、０００ｇ、２時間、４℃で、遠心分離された。上澄液を、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで、１Ｌまで希釈した。上澄液を、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで予め平衡化された１０ｍｌのホスホセルロース（Whatman)カラムに充填した。該カラムを、５０ｍｌのローデイグ緩衝液で洗浄し、蛋白を緩衝液中、０．０５Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの８０ｍｌ全勾配で抽出した。各画分は、Ａ２８０吸光でモニターされ、ＳＤＳ（０．１％）ポリアクリルアミド（１２％）ゲル(Laemmli, Nature 222,:680-685, 1970)上の電気泳動法で分析された。蛋白は、クマシー・ブルーで染色された。
【００５５】
各分画の制限エンドヌクレアーゼ活性を、ｐＴＺ１９Ｒを基質として使用して分析した。ＦｏｋＩを含む各分画はプールされ、燐酸アルミニウムで分画された。５０−７０％の硫酸アルミニウム分画は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを含有していた。沈澱物は、２５ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液５０ｍｌ中に再懸濁され、ＤＥＡＥカラムに充填された。多くの不純蛋白はＤＥＡＥに結合するのに対して、ＦｏｋＩ結合しない。流出液は燐酸セルロースカラムで濃縮した。ゲルろ過（ＡｃＡ４４）カラムを使用して精製が更になされた。ＦｏｋＩは、本方法を使用して、電気泳動的に均質になるまで、精製された。
【００５６】
各精製段階に存在する蛋白種のＳＤＳ（０．１％）ポリアクリルアミド（１２％）ゲル電気泳動プロフィルを、図３に示す。精製された酵素の最初の１０アミノ酸の配列が、蛋白のシークエンスにより決定された。決定された配列は、ヌクレオチド配列から推定されたものと同じであった。精製された酵素の結晶を、ＰＥＧ４０００を沈澱剤として使用して、成長させた。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは、ＡｃＡ４４ゲルろ過カラムを使用して、さらに精製された。
【００５７】
実施例ＩＶ
ＤＮＡ基質の存在下におけるトリプシン開裂によるＦｏｋＩＲエンドヌクレアーゼの分析
トリプシンはセリン・プロテアーゼであり、リジン及びアルギニン残基のＣ末端で開裂する。これは、蛋白及び酵素のドメイン構造を研究するのに大変有用な酵素である。ＦｏｋＩのトリプリン消化は、その基質、d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'(配列認識番号１０): 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'(配列認識番号１１)の存在下で、オリゴヌクレオチド二量体：ＦｏｋＩ分子比 ＝２．５：１で、実施された。ＦｏｋＩ（２００μｇ）をオリゴヌクレオチド二量体と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ％ グリセロール、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、を含む容積１８０μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（２０ μｌ、０．２ ｍｇ／ｍｌ）を、混合物中に添加した。反応混合物からアリコット（２８μｌ）を別々の時間間隔をおいてとり、過剰のトリプシン阻害剤、アンチパインでクエンチングした。該トリプシン断片を、逆相ＨＰＬＣで精製し、そのＮ末端配列を、Applied Biosystemの自動蛋白シークエンサーを使用して決定した。
【００５８】
２．５モル過剰オリゴヌクレオチド基質、１０ｍｇ ＭｇＣｌ２、存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化の時間経過が、図４に示される。２．５分時点で、完全なＦｏｋＩ以外、わずか二つの主要断片、４１ｋＤａ，２５ｋＤａ断片のみが存在していた。さらにトリプシンで消化すると、４１ｋＤａ断片は、３０ｋＤａ、１１ｋＤａ断片に分解される。この２５ｋＤａの断片は、更にこれ以上のトリプシン消化に対して抵抗性があるようだ。この断片は、もしＦｏｋＩーオリゴ複合体のトリプシン消化をＭｇＣｌ２非存在下で実施したとしたら、もっと不安定であっただろう。
【００５９】
１６０分時点では、わずか３つの主要断片（３０、２５、および１１ｋＤａ）が存在していた。これらの断片（４１、３０、２５、１１ｋＤａの各々は、逆相ＨＰＬＣで精製され、そのＮ末端のアミノ酸配列が決定された（表１）。これらのＮ末端配列を、ＦｏｋＩの推定配列と比較する事によって、４１ｋＤａ及び２５ｋＤａ断片は、それぞれＮ末端及びＣ末端の断片と同定された。加えて、３０ｋＤａは、Ｎ末端であると同定された。
【００６０】
実施例Ｖ
オリゴｄＴセルロース親和性カラムを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合トリプシン断片の単離
トリプシン断片のＤＮＡ結合性を、オリゴｄＴセルロース・カラムを使用して分析した。ＦｏｋＩ（１６０μｇ）を２．５モル過剰オリゴヌクレチド二量体[d-5'-CCTCTGGATGCTCTC(A)１５-3'(配列認識番号１４）：5'-GAGAGCATCCAGAGG(A)１５-3'( 配列認識番号１５）と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む容積９０ μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（１０ μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を該溶液に添加して消化を開始した。トリプシンとＦｏｋＩの割合は、重量で１：８０であった。消化を１０分間実施し、反応液中に４１ ｋＤａ Ｎ末端断片及び２５ ｋＤａ Ｃ末端断片を優占的に得た。反応物を大過剰のアンチパイン（１０μｇ）で、クエンチングし、ローデイング緩衝液［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、］で、最終容積が４００ μｌとなるまで希釈した。
【００６１】
該溶液を、オリゴｄＴセルロース・カラム（０．５ ｍｌ、Sigma, カタログ＃0-7751）に充填し、ローデイング緩衝液で前平衡化した。該ブレイクスルーを、オリゴｄＴセルロース・カラムに６回通した。該カラムを５ｍｌカラムローデイング緩衝液で洗浄し、次に、０．４ｍｌの １０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ｍｌ ＥＤＴＡで二回抽出した。これらの各分画は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質に結合しているトリプシン断片を含んでいた。オリゴｄＴセルロースカラムに結合しているトリプシン断片は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分析された。
【００６２】
別個の反応で、トリプシン消化を１６０分間実施し、反応混合物中に３０ｋＤa，２５ｋＤａ、および１１ｋＤａ断片を優占的に得た。
【００６３】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化１０分では、反応混合物中に、４１ｋＤａのＮ末端断片および２５ｋＤａのＣ末端断片が優先種として産生された（図５、レーン３）。該混合物をオリゴｄＴセルロースカラムに通し、４１ｋＤａＮ末端断片のみが該カラムに保持された。これは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合性が、該酵素のＮ末端２／３にある事を示唆している。２５ｋＤａ断片はオリゴｄＴセルロースカラムに保持されない。
【００６４】
ＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化１６０分では、３０、２５、１１ｋＤａの断片が優占的に産生された（図５、レーン５）。この反応混合物をオリゴｄＴセルロースカラムに通すと、 ３０および１１ｋＤａ断片のみがカラムに保持された。これらの種類は共に、ＤＮＡと結合しているようであり、４１ｋＤａ Ｎ末端断片を更に分解する事により生じる。２５ ｋＤａ断片は、オリゴｄＴセルロースカラムに保持されなかった。２５ ｋＤａもまたＤＥＡＥに結合しないので、ＤＥＡＥカラムを通過し、ブレイクスルー容液中で回収する事により精製され得る。
【００６５】
ＦｏｋＩ（３９０ μｇ）を２．５モル過剰オリゴヌクレオチド二量体 d-5'-CTCTGGATGCTCTC-3'（配列認識番号第１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）と一緒に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールを含む容積１７０ μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。４１ｋＤａＮ末端断片の生産が最大となるのは、ＭｇＣｌ２非存在下でのトリプシン（３μｌ；０．２ ｍｇ／ｍｌ)による消化では、室温で１０分であった。  反応物は、過剰のアンチパイン（２００μｌ）で、クエンチングした。 トリプシンの消化物は、ＤＥＡＥカラムを通した。２５ｋＤａのＣ末端断片を、ブレイクスルー中にて回収した。他の全トリプシン断片（４１ｋＤａ，３０ｋＤａおよび１１ｋＤａは、カラムに保持され、０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液（３ｘ２００μｌ）で抽出した。
【００６６】
別個の実験で、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、室温６０分で、ＦｏｋＩーオリゴ複合物のトリプシン消化を行なったところ、３０ｋＤａおよび１１ｋＤａ断片の産生が最高となった。この精製された断片は、非メチル化ＤＮＡ基質（ｐＴＺ１９Ｒ、図６）と、メチル化ＤＮＡ基質（ｐＡＣＹＣｆｏｒｋＩＭ）もともに、ＭｇＣｌ２存在下で非特異的に開裂した。これらの産生物は、小さく、開裂は比較的非特異的である事が示される。該生産物は、牛小腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化されるかまたはポリヌクレオチド・キナーゼおよび［γー３２Ｐ］ＡＴＰを使用して、再リン酸化された。３２Ｐ標識された産生物はＤＮａｓｅＩおよび蛇毒ホスホジエステラーゼを使用して消化されてモノヌクレオチドにされた。ＰＥＩセルロース・クロマトグラフィによるモノヌクレオチドの分析では、２５ｋＤａ断片が、優先的にホスホジエステルのボンド５’をＧ＞Ａ＞＞Ｔ−Ｃに開裂した事がわかる。このように、該２５ｋＤａのＣ末端の断片は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの開裂ドメインを構成している。４１ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合体は、アガロース・ゲル電気泳動によって精製された。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（２００μｇ）は、２．５モル過剰のオリゴヌクレオチド二量体 d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）と一緒に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールを含む容積１８０μｌ中で、室温にて１時間インキュベートされた。わずかな量の３２Ｐで標識されたオリゴヌクレオチド二量体が複合体中に組み入れられ、ゲル電気泳動中にそれをモニターした。４１ ｋＤａ Ｎ末端断片の産生を最高にする、トリプシン消化（２０μｌ；０．２ｍｇ／ｍｌ）は、室温１２分であった。反応物は、過剰のアンチパインでクエンチングされた。４１ ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合体は、アガロース・ゲル電気泳動で精製された。該複合体に対応するバンドが切り出され、透析バッグ（〜６００μｌ）中で、電気抽出によって回収された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる複合体の分析では、４１ｋＤａ Ｎ末端が主要構成物である事が解明された。３０ ｋＤａ Ｎ末端断片及び１１ ｋＤａ Ｃ末端断片は、副成分として存在していた。これらは一緒にＤＮＡに結合し、４１ ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合物とともに移動するようにみえる。
【００６７】
４１ ｋＤａ Ｎ末端断片の結合特異性は、ゲル・モビリテイシフト分析によって決定された。
【００６８】
実施例ＶＩ
ゲル・モビリテイ・シフト分析
特異的オリゴ（d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第１０）, 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）)は、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＤＴＴ、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（New England Biolabsより入手）、及び２０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２５ μｌの反応混合物中で３２Ｐ標識された。該混合物は、３７℃で、３０分インキュベートされた。キナーゼは、反応混合物を７０℃１５分加熱する事により失活させた。２００μｌの水を加えた後、溶液をセファデックスＧ−２５（Superfine) カラム（Phamacia)を通過させて未反応［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを除いた。標識された単鎖オリゴの最終濃度は２７μＭであった。
【００６９】
次に、単鎖をアニールして、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ中 に二量体を１２μＭの濃度まで形成した。 1 μｌの溶液は、オリゴ二量体を〜１２ピコモル及び〜５０ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。非特異的オリゴ類、即ちd-5'-TAATTGATTCTTAA-3'（配列認識番号１２）及びd-5'-ATTAAGAATCAATT-3'（配列認識番号１３）は、ここに記載したように［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された。単鎖オリゴはアニールされ、二量体を濃度１２μＭで産生した。該溶液は、オリゴ二量体を〜１２ピコモル及び〜２５ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。該非特異的オリゴ（d-5'-TAATTGATTCTTAA-3')（配列認識番号１２）及びd-5'-ATTAAGAATCAATT-3'（配列認識番号１３）は、ここに記載したように［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された。単鎖オリゴはアニールされ、二量体を濃度１２μＭで産生した。該溶液は、オリゴ二量体を〜４２ピコモル及び〜２５ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中に４１ｋＤａＮ末端断片ーオリゴ複合体（〜２ｐモル）を含む溶液１０μｌを、３２Ｐで標識した特異的なオリゴヌクレオチド二量体（または３２Ｐで標識した非特異的なオリゴヌクレオチド二量体）とともに３７℃で夫々３０分および１２０分インキュベートした。７５％のグリセロール５μｌを各サンプルに加え、８％の非変性ポリアクリル・アミド・ゲル上に充填した。電気泳動を、ブロモフェノールがゲルの頂部より６ｃｍ移動するまでＴＢＥ緩衝液中３００ボルトでおこなった。該ゲルを乾燥し、オートラジオグラフを行なった。ゲル・モビリテイ・シフト分析（図７）から理解できるように、複合体は、ＦｏｋＩ認識部位を含んだ、３２Ｐ標識された特異的オリゴヌクレオチド二量体と簡単に置き変わったが、ＦｏｋＩ認識部位を含まない、３２Ｐ標識された非特異的オリゴヌクレオチド二量体とは置き変わらなかった。これらの結果から、ＤＮＡの配列特異的認識に必要な全ての情報が,  ＦｏｋＩの４１ ｋＤａ Ｎ末端断片内にコードされている事がわかる。
【００７０】
実施例ＶＩＩ
ＤＮＡ基質の非存在下でのトリプシン開裂によるＦｏｋＩ分析
ＤＮＡ基質非存在下でのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシンの時間経過を図８に示す。はじめに、ＦｏｋＩが、５８ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片に切断された。該５８ｋＤａ断片はＤＮＡ基質に結合せず、オリゴｄＴセルロースカラムに保持されない。更に消化が進むと、５８ｋＤａ断片は、数個の中間トリプシン消化断片に分解される。 しかしトリプシン消化が完了すると２５ｋＤａ断片のみとなる（二つの重複バンドとして見える）。  これらの種（５８ｋＤａ，２５ｋＤａ、及び８ｋＤａ）は、逆相ＨＰＬＣで精製され、そのアミノ末端配列が決定された（表Ｉ）。Ｎ末端配列と推定されるＦｏｋＩ配列を比較すると、８ｋＤａ断片がＮ末端で、５８ｋＤａ断片がＣ末端である事がわかる。これは、さらにＦｏｋＩのＮ末端が認識ドメインに関与しているという結論を支持している。 ２５ｋＤａ断片のＮ末端をシークエンスすると、二つの異なる成分が存在している事がわかる。非特異的ＤＮＡ基質の存在下でのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化の時間経過では、非特異的ＤＮＡ基質の非存在下でＦｏｋＩのトリプシン消化で得られたプロフィルと類似していた。
【００７１】
実施例ＶＩＩＩ
ＦｏｋＩの２５ｋＤａＣ末端のトリプシン分解断片の開裂特異性
ＦｏｋＩの２５ｋＤａ Ｃ末端トリプシン断片は、ｐＴＺ１９Ｒを小さな産物に切断し、非特異的な開裂をしめす。分解産物は、牛小腸ホスファターゼによって脱リン酸化され、ポリヌクレオチド・キナーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによって３２Ｐ標識された。過剰の標識は、セファデックスＧ２５を使用して除去された。次に、標識された産物は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で、１ユニットの膵臓ＤＮａｓｅＩ（Boehringer-Mannheim)によって３７℃、１時間で消化された。次に、０．０２ユニットの蛇毒ホスホジエステラーゼを、反応混合物に添加し、３７℃、１時間で消化した。
【００７２】
実施例ＩＸ
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼにおける機能的ドメイン
トリプシンを使用したＦｏｋＩの機能的ドメインの分析（基質の存在下、非存在下における）を図９に要約した。ＦｏｋＩがＤＮＡ基質と結合すると、該酵素構造の変換が伴なった。この研究は、配列特異的認識用とエンドヌクレアーゼ活性用の二つの別個の蛋白ドメインが該酵素中に存在していることを裏付けている。この結果により、認識ドメインがＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＮ末端にあるのに対して、開裂ドメインが、該分子のＣ末端に存在しているであろうことが示される。
【００７３】
挿入変異物の構築に関する実施例（Ｘ−ＸＩＶ）
ＦｏｋＩ ＲＭ 系の完全なヌクレオチド配列は、多くの研究所によって公表されている（Looney et al., Gene 80: 193-208, 1989 & Kita et al., J. Biol. Chem. 264: 5751-56, 1989)。
例えば、ＰＣＲの実験プロトコールは、Skoglund et al., Gene 88:1-5, 1990  Bassing et al., Gene 113:83-88, 1992に、記載されている。細胞生育の方法及び変異酵素の精製は、野生型ＦｏｋＩ（Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4275-79, 1992)用に使用された物と同じである。さらに、セファデックスＧ−７５ゲルろ過およびヘパリンーセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーが変異酵素を均質になるまで精製するステップが必要であった。
【００７４】
実施例Ｘ
ｆｏｋＩＲ遺伝子内ヌクレオチド１６２におけるＳｐｅＩ部位の変異
ｆｏｋＩＲ遺伝子内のＳｐｅＩ部位８９のひとつを変位させるのに使用される二段階ＰＣＲ技法は、Landt et al., Gene 96:125-28, 1990)に記載されている。このプロトコール用の３つの合成プライマーは、１）ＳｐｅＩ部位内にひとつの不適性塩基を含む変異プライマー（5'- TCATAATAGCAACTAATTCTTTTTGGATCTT-3')（配列認識番号２４参照）、２）制限部位ＣｌａＩ部位（5'-CCATCGATATAGCCTTTTTTATT-3')(配列認識番号２５）及びＸｂａＩ部位（5'-GCTCTAGAGGATCCGGAGGT-3')(配列認識番号２６）でそれぞれフランキングされるプライマーである。第一段階では、ＸｂａＩプライマー及び変異プライマーを使用して中間断片が増幅された。次に、第２段階ＰＣＲで、ＣｌａＩプライマーが該中間物に添加された。０．３ ｋｂ ＰＣＲ最終産物をＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化し、付着末端を精製し、ゲル精製した。発現ベクター（ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ）は、ＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化された。次に、４．２ｋｂの大断片は、ゲル精製され、ＰＣＲ断片に連結された。組替ＤＮＡは、受容可能な大腸菌ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされた。テトラサイクリン及びアンピシリン抗生物質による選択の後、数個のクローンを取り上げ、そのプラスミドＤＮＡを、制限分析によって調べた。ＳｐｅＩ部位変異は、プラスミドＤＮＡをサンガーのシークエンシング法（Sanger et al. Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74:5463-67, 1977)使用したシークエンシングにより確認された。
【００７５】
実施例ＸＩ
４（または７）コドン挿入変異物の構築
４（または７）コドン挿入物を含むＰＣＲ産生ＤＮＡは、ＳｐｅＩ／ＸｍａＩで消化され、ゲル精製された。実施例Ｘで得られたプラスミドｐＲＲＳｆｏｋＩＲをＳｐｅＩ／ＸｍａＩで切断し、３、９ｋｂの大断片をゲル精製し、ＰＣＲ産生物に連結した。該組替ＤＮＡは、受容可能なＲＲＩ［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされ、所望のクローンが、実施例Ｘで記載されたように同定された。これらのクローン由来のプラスミドは単離されシークエンスされて、ｆｏｋＩＲ遺伝子の４（または７）コドン挿入物が確認された。
【００７６】
特に、変異物の構築は、下記の様になされた：
（１）ｆｏｋＩＲ遺伝子配列内には、ヌクレオチド１６２及び１１５２の夫々に２つのＳｐｅＩ部位がある。１１５２の部位は、ＦｏｋＩのトリプシン開裂部位近隣に位置し、認識ドメインと開裂ドメインを分離している。この領域の周囲に、４（または７）のコドンを挿入するために、もう一方の１６２のＳｐｅＩ部位を２段階ＰＣＲ法（Landt et al. Gene 96:125-28, 1990) を使用して変異させた。このＳｐｅＩ部位変異をｆｏｋＩＲ遺伝子へ導入しても、過剰生産者クローンの発現レベルに影響をあたえない。
【００７７】
（２）４（または７）のコドンの挿入は、ＰＣＲ法を使用して行われた。ＰＣＲ増殖で使用された変異プライマーは、図１１に示される。各プライマーは、ｆｏｋＩＲ遺伝子と相補的な２１ベースペア配列をもつ。これらのプライマーの５’末端は、ＳｐｅＩ部位でフランクされる。ＫＳＥＬ及びＫＳＥＬＥＥＫの繰り返しに対するコドンは、ＳｐｅＩ部位と２１相補ベースペアの間に取り込まれる。縮重コドンをこれらの繰り返し中に使用し、増幅中に起こり得る問題を回避した。
【００７８】
他のプライマーは、ｆｏｋＩＲ遺伝子の３’末端と相補的であり、ＸｍａＩ部位によってフランクされる。４（または７）コドン挿入物を含む０．６ｋｂＰＣＲ産生断片は、ＳｐｅＩ／ＸｍａＩによって消化され、ゲル精製された。これらの断片は、高発現ベクターｐＲＲＳｆｏｋＩＲに代替し、変異物を精製する。各変異物の数個のクローンが同定され、そのＤＮＡ配列がサンガーのジデオキシ・チェイン・ターミネーション法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74.5463-67 1977)によって確認された。
【００７９】
１ｍＭのイソプロピルβーＤ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、これらクローン中での変異酵素の発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥで測定したところ、３時間でもっとも顕著となった。これは、酵素活性についての分析によって、更に裏付けられた。これらのクローン中における変異酵素の発現レベルは、野生型ＦｏｋＩと比較してはるかに低かった。ＩＰＴＧでもっと長く誘導すると、より低い酵素レベルとなり、変異酵素が、これらのクローン中で積極的に分解される事が示唆された。これによって、ＦｏｋＩの認識ドメインと開裂ドメインの間の４（または７）のコドン挿入物が蛋白構造を不安定にし、細胞内における分解をし易くする事が示唆される。変異酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィルは、図１２に示される。
【００８０】
実施例ＸＩＩ
単一ＦｏｋＩ部位をもつＤＮＡ基質の調製
それぞれ単一ＦｏｋＩ認識部位をもつ２つの基質は、ｐＴＺ１９Ｒをテンプレートとして使用したＰＣＲによって調製された。オリゴヌクレオチド・プライマー：5'-CGCAGTGTTATCACTCAT-3' 及び 5'-CTTGGTTGAGTACTCACC-3'（夫々、配列認識番号２７及び２８）を使用して、１００ベースペア断片を合成した。プライマー：5'-ACCGAGCTCGAATTCACT-3'及び 5'-GATTTCGGCCTATTGGTT-3'（夫々、配列認識番号２９及び３０）を使用して２５６ベース断片を調製した。これらの基質内の個々のストランドは、対応する３２Ｐ標識されリン酸化されたプライマーを使用して、ＰＣＲ中に放射線標識された。産生物を、低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【００８１】
実施例ＸＩＩＩ
変異酵素の配列特異性の分析
図１３に、ｐＴＺ１９Ｒ ＤＮＡのＦｏｋＩおよび変異体酵素による開裂産生物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが示される。それらが非常に類似している事は、認識ドメイン及び開裂ドメインの間のリンカー領域における４（または７）コドン挿入物がそのＤＮＡ配列の特異性を変えない事を示唆している。この事は、更に、各々単一のＦｏｋＩ部位を含む３２Ｐ標識ＤＮＡ基質（１００ｂｐ及び２５６ｂｐ）を使用する事により確認された。３２Ｐで標識された個々のストランドを含む基質は、実施例ＸＩＩに記載された様に調製された。ＦｏｋＩは、２５６ベースペアの基質を二つの断片、１８０ｂｐ及び７２ｂｐにそれぞれ切断する（図１３Ｂ）。断片の長さは、各ストランドの３２Ｐで標識された５’末端から計算された。アガロース・ゲルのオートラジオグラフが、図１３Ｃに示される。基質中で３２Ｐ標識を担持するストランドに依存して、７２ｂｐ断片または１８０ｂｐ断片が、オートラジオグラフィーにバンドとして現われる。該変異酵素は、同一のアガロース・ゲル・プロフィル及びオートラジオグラフィーを現わす。それ故、認識ドメインと開裂ドメインの間の４（または７）コドン挿入物は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識機構を変えない。
【００８２】
実施例ＸＩＶ
変異酵素による認識部位からの開裂距離の分析
変異酵素による開裂の距離を決定するために、３２Ｐで標識された基質の開裂産物をＰＡＧＥで分析した（図１４）。消化物は、これらの基質を合成するためのＰＣＲで使用されたと同じプライマーで行われたｐＴＺ１９Ｒのシークエンシング反応に沿って分析された。１００ｂｐ断片のＦｏｋＩによる開裂パターンおよび変異物が、図１４Ａに示される。野生型酵素と比較すると、変異物の場合は、切断部位が基質の両ストランド上の認識部位からずれている。シークエンシング・ゲルおよび開裂産物の間の観測可能な小さなずれは、シークエンシング反応に使用される非リン酸化プライマーに起因する。
【００８３】
5'-GGATG-3'ストランド上で、両変異物は、ＤＮＡの認識部位から１０ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-CATCC-3'ストランド上では、１４のヌクレオチド離れて切断する。これらは両変異物にとって、主要な切断部位であると思われる。また、野生型酵素と同量の開裂が観察された。
【００８４】
２５６ｂｐ断片の開裂パターンは、図１４Ｂに示される。開裂パターンは、図１４Ｂに示される。開裂パターンは、１００ｂｐ断片と類似している。変異物の場合、5'-CATCC-3'ストランド上の認識部位から１５ヌクレオチド離れたところに、ある開裂が見られる。変異酵素の多数の切断部位は、これらの蛋白に異なる構造がある事に起因するのであろう。さもなければ、二つのドメイン間の空間領域の柔軟性が増加する事に起因する。ＤＮＡ基質に依存して、これらの部位における開裂の強さには、あるばらつきが見られた。これは、これらの切断部位の回りのヌクレオチド配列に起因するのかも知れない。多数の切断部位を持つ自然発生型ＩＩＳ酵素は、Szybalski et al., Gene 100: 13-26, 1991)に報告されている。
【００８５】
ハイブリッド酵素Ｕｂｘ−ＦＮ（ＸＶ−ＸＶＩＩ）の構築に関する実施例
上記に言及したように、ＦｏｋＩ制限ー変更システムの完全なヌクレオチド配列は、別の研究所から公表されている（Kita et al., J. Biol Chem. 264:5751-56 (1989); Looney et al., Gene 80: 193-208 (1989))。ＰＣＲの実験プロトコールは、いたるところに記載されている（Skoglund et al., Gene 88:1-5 (1990))。細胞生育およびＨｉｓｂｉｎｄＴｍ樹脂を使用した蛋白の精製は、ノバジェン（Novagen）ｐＥＴシステムマニュアルに、概説された通りである。さらに、ハイブリッド蛋白Ｕｂｘ−ＦＮをほぼ均質になるまで精製するためには、ホスホセルロースおよびＤＥＡＥカラム・クロマトグラフィーのステップを付加する事が必要である。ＳＤＳ／ＰＡＧＥのプロトコールは、Laemmli (Nature 222:680-685 (1970))によって記載された通りである。
【００８６】
ｐＵＣ１３派生基質の調製
ｐＵＣ１３派生ＤＮＡ基質は、ＳｍａＩ切断ｐＵＣ１３プラスミドの平滑末端と既知のＵｂｘ部位を含む１０倍過剰量の３０ｂｐ挿入物との連結によって調製された。数個のクローンを取り出し、そのプラスミドＤＮＡを、３０ｂｐ挿入物の有無について分析した。夫々、１、２、および３の挿入物を担持するｐＵＣ１３（１），ｐＵＣ１３（２）、ｐＵＣ１３（３）を含クローンが同定された。そのＤＮＡ配列は、サンガーのジデオキシシークエンシング法によって確認された（Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74: 5463-67 (1977))。
【００８７】
単一Ｕｂｘ部位を持つＤＮＡ基質の調製
単一の３０ｂｐ挿入物を保持するｐＵＣ１３（１）のポリリンカー領域をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して切り出し、ゲル精製した。この基質の各々のストランドは、３２Ｐ−ｄＡＴＰまたは３２Ｐ−ｄＣＴＰを使用して放射線標識され、クレノー酵素で該断片の付着末端を充填した。該産生物を低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させ、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【００８８】
実施例ＸＶ
ハイブリッド酵素Ｕｂｘ−ＦＮをＰＣＲを使用して産生するクローンの構築
ＵｂｘのホメオボックスによってコードされるＵｂｘのホメオ・ドメイン、６１アミノ酸蛋白配列は、細菌性ＤＮＡ結合蛋白中に見られるヘリックス・ターン・ヘリックスのモチーフに関係した構造を備えた配列特異的ＤＮＡ結合ドメインである。（Hayashi et al., Cell 63:883-94 (1992); Wolberger et al., Cell 67:517-28 (1991)。Ｕｂｘホメオ・ドメインは、９ｂｐのコンセンサスＤＮＡ部位、5'-TTAAT (G/T)(G/T) cc-3' (Ekker et al., The EMBO Journal 10:1179-86 (1991); Ekker et al., The EMBO Journal 11:4059-4702 (1992))を認識する。本発明者は、ＰＣＲ法を使用して、Ｕｂｘホメオ・ドメインとＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）を結合させ、また大腸菌中でＵｂｘ−ＦＮ酵素を発現させた。製作されたＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白の概略代表例を図１６に示す。ハイブリッド遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを図１７Ａに示す。
【００８９】
ハイブリッド蛋白を発現するクローンは下記の様に構築された。まず、ＰＣＲで産生されたＵｂｘホメオ・ドメインをＰｓｔＩ／ＳｐｅＩ消化し、ゲル精製した。次に、この断片をベクターｐＲＲＳｆｏｋＩＲ中に代替し、ＦｏｋＩＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡセグメントと置換し、よって、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド遺伝子を（図１７Ｂ）を作成した。
【００９０】
受容可能なＲＲ１細胞に結合用混合物をトランスフェクションした後、数個のクローンを制限分析によって同定し、そのＤＮＡ配列を、サンガー等のジデオキシ・チェイン・テーミネーション法により確認した（Proc. Natl. Acd. Sci. USA 74:5463-67 (1977))。次に、ハイブリッド遺伝子をＵｂｘ−ＦＮプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産生されたＤＮＡをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。次に、この断片をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ−１５ｂベクターに連結した。この構築物は、６つの連続したヒスチジン残基によって、ハイブリッド蛋白のそのＮ末端にタグを付ける事になる。これらは、ノバジェン（Novagen)のｈｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂を使用したメチル・キレーション・クロマトグラフィーによるこの蛋白の精製用の親和性タグとして働く。このＨｉｓタグは、その後、トロンビンによって除去できる。受容可能なＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、結合用混合物でトランスフォームされ、組替ＤＮＡ（図１７Ｂ）を含む数個のクローンが同定された。これらのコロニーは健全でなく、培地での生育も、ダブリング時間が４５分と、悪い。１ｍＭのイソプロピルーβーＤ−チアガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した後、ハイブリッド酵素をＨｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂、ホスホセルロース、及びゲル・クロマトグラフィーを使用して均質になるまで精製した。精製されたハイブリッド酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィルを、図１８に示す。ハイブリッド蛋白の同定は更に、ウエスタン・ブロットで、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに対して惹起されたラビットの抗血清によってプロービングする事により確認された（データ記載せず）。
【００９１】
実施例ＸＶＩ
Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド酵素のＤＮＡ配列選択性の分析
Ｕｂｘ−ＦＮの特性を調べるのに使用される、基質より派生し直線化したｐＵＣ１３を図１９に示す。既知のＵｂｘ認識配列5'- TTAATGGTT-3'を含む３０ｂｐ ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１３のＳｍａＩ部位に挿入する事によって誘導体が構築される。挿入されたＵｂｘ部位で切断されると、１．８ｋｂ及び０．９５ｋｂの断片が産物として生じる。Ｕｂｘ−ＦＮによる基質の部分消化物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが図１９に示される。これらの反応において、ＤＮＡのモル数は、蛋白のモル数に比較して著しく過剰である。反応条件を至適化して、基質分子あたり単一の二本鎖開裂を得るようにした。直線化したｐＵＣ１３ＤＮＡは、４つの断片に切断される。アガロース・ゲル電気泳動プロフィルに４つの異なったバンドが現れた事は、Ｕｂｘ−ＦＮが配列特異性をもってＤＮＡと結合した事、及び直線化したｐＵＣ１３中にハイブリッド蛋白に対する２つの結合部位があることを示している。このことは、単一のＵｂｘ部位を含む直線化されたｐＵＣ１３ＤＮＡ基質が６つの断片に切断されるという事実によって、更に裏付けられる。２つの付加的な断片（夫々、〜１．８ｋｂ及び〜０．９５ｋｂ）は、ｐＵＣ１３の新規に挿入されたＵｂｘ部位でハイブリッド蛋白の結合が行われた事及びこの部位付近で開裂が起きた結果であると説明できよう。予測されたように、バンドの強度は、ｐＵＣ１３中における３０ｂｐ挿入物の数に伴って増加する。ｐＵＣ１３の２つの推定ＵｂＸ結合部位、及び挿入されたＵｂｘ部位が下記表３に示される。これら全ての部位は、5'-TAAT - 3'をその核配列として担持し、それら好ましい部位はＵｂｘホメオ・ドメインに付いて報告された物と一致する。これら部位に対するＵｂｘホメオ・ドメインの親和性は、該核部位を囲むヌクレオチド塩基によって変更される。完全な消化が長期にわたって見られ、或いは蛋白濃度を増やす事によって見られるので、ハイブリッド蛋白はターンオーバー（代謝回転）するようだ（データ記載せず）。高温での開裂はより特異的である。
【００９２】
実施例ＸＶＩＩ
ハイブリッド酵素による認識部位からの開裂距離の分析
Ｕｂｘ−ＦＮによる認識部位からの開裂距離を決定するために、単一Ｕｂｘ部位を含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質の開裂産物が、ＰＡＧＥ（図２０）によって分析された。消化産物は、基質のマキサム・ギルバート（Ｇ＋Ａ）シークエンシング反応にそって分析された。予想されたように、切断部位は、認識部位からはずれた。5'-TAAT-3'ストランドでは、Ｕｂｘ−ＦＮは、ＤＮＡを認識部位から３ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-ATTA- 3'ストランドでは、認識部位から８、９、または１０ヌクレオチド離れて切断する。単一のＵｂｘ部位を含んだＤＮＡ基質の開裂に基づくＵｂｘ−ＦＮの切断部位の分析は、図２０に要約されている。この開裂によって５’からＴＡＡＴまでの配列が生じ、この開裂はＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白を作成した場合（図１６）と一致する。
【００９３】
【表１】
2006254921.tif 000002
【００９４】
【表２−１】
2006254921.tif 000003
【００９５】
【表２−２】
2006254921.tif 000004
【００９６】
【表２−３】
2006254921.tif 000005
【００９７】
【表２−４】
2006254921.tif 000006
【００９８】
【表２−５】
2006254921.tif 000007
【００９９】
【表２−６】
2006254921.tif 000008
【０１００】
【表３】
2006254921.tif 000009
【０１０１】
上記で述べた全ての刊行物は参照として本願明細書に組み込まれ、その一部をなす。
上記においては、明瞭な理解を助けるために幾らか詳細に説明してきたが、本発明の真実の範囲を逸脱することなく、形態およびその詳細において種々の変更をなし得ることが、当業者には容易に承認されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、ＰＣＲ増幅の際に、ｆｏｋＩＭおよびｆｏｋＩＲ遺伝子への新しい翻訳信号の導入のために用いられる、５′プライマーおよび３′プライマーの配列（配列番号３−９）を示している。ＳＤは、大腸菌（E. coli）のためのシャイン−ダルガノコンセンサス配列ＲＢＳを示しており、該ＲＢＳは７塩基対のスペーサによってＡＴＧ開始コドンから離間されている。ｆｏｋＩＭプライマーはＢａｍＨＩ部位に隣接している。開始コドンおよび停止コドンは太字で示されている。18塩基対の完全な配列は、ＭｆｏｋＩ遺伝子の停止コドンの直後に続く配列に対して相補的である。
【図２】図２は、プラスミドpACYCMfokIM、pRRSRfokIRおよびpCBfokIRの構造を示している。ＰＣＲ修飾されたｆｏｋＩＭ遺伝子がｐＲＲＳおよびｐＣＢのＢａｍＨＩ部位に挿入されて、それぞれpRRSRfokIRおよびpCBfokIRが形成された。ｐＲＲＳはｌａｃＵＶ５プロモータを有しており、またｐＣＢは強力なｔａｃプロモータを含んでいる。加えて、これらのベクター類は、挿入されたｆｏｋＩＲ遺伝子の下流に陽性レトロ調節配列を含んでいる。
【図３】図３は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを精製する際の各工程における、ＳＤＳ（0.1%）−ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動のプロファイルを示している。レーン１はタンパク標準；レーン２は非誘発細胞からの粗抽出物；レーン３は１mMのＩＰＴＧで誘発された細胞からの粗抽出物；レーン４はホスホセルロースのプール；レーン５は、50-70％の（ＮＨ４）２ＳＯ４分画プール；レーン６はＤＥＡＥプールである。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質、d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'（配列番号１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列番号１１）の存在下でＦｏｋＩエンドヌクレアーゼをトリプシン消化した際の、種々の時点におけるトリプシン分解フラグメントのＳＤＳ（0.1％）−ポリアクリルアミド（12％）ゲル電気泳動プロファイルを示している。レーン１はタンパク標準、レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであり、またレーン３は2.5分、レーン４は５分、レーン５は10分、レーン６は20分、レーン７は40分、レーン８は80分、レーン９は160分のトリプシン消化後のプロファイルを示している。レーン１０〜１３は、HPLC精製されたトリプシン分解フラグメントであり、レーン１０は41 kDaのフラグメント、レーン１１は30 kDaのフラグメント、レーン１２は11 kKaのフラグメント、レーン１３は25k Daのフラグメントである。
【図５】図５は、オリゴｄＴ-セルロースカラムを用いた、ＤＮＡ結合性トリプシン分解フラグメントの同定を示している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ；レーン３は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体の10分間のトリプシン分解混合物；レーン４は、オリゴｄＴ-セルロースカラムに結合したトリプシン分解フラグメント；レーン５は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体の160分間のトリプシン分解混合物；レーン６は、オリゴｄＴ-セルロースカラムに結合したトリプシン分解フラグメントである。
【図６】図６は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解フラグメントの開裂特性分析を示している。  （Ａ）トリプシン分解フラグメントの開裂特性を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、１mMのDTTおよび10mMのMgCl2の中の１μｇのpTZ19Rを、当該フラグメント（夫々トリプシン消化物、ブレークスルーおよび溶出物）と共に、37℃で１時間、10μｌの反応容量で消化した。レーン４〜６は、ＭｇＣｌ２の不存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応する。レーン７〜９は、ＭｇＣｌ２の存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応する。レーン１は１kbのラダー（梯子）；レーン２はpTZ19R；レーン３はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼで消化されたpTZ19R；レーン４および６は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化物の反応混合物；レーン５および７は、ブレークスルー容積中の25 kDaのＣ末端フラグメント；レーン６および９は、DEAEカラムに結合したＦｏｋＩのトリプシン分解フラグメントである。ゲル底部における強いバンドは、過剰のオリゴヌクレオチドに対応する。  （Ｂ）ＤＥＡＥカラムからのフラグメントのＳＤＳ（0.1%）−ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動のプロファイル。レーン３〜５は、ＭｇＣｌ２の不存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応している。レーン６〜８は、10mMのＭｇＣｌ２の存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ；レーン３および６はＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化物の反応混合物；レーン４および７はブレークスルー容積中の25kDaのＣ末端フラグメント;レーン５および８はＤＥＡＥカラムに結合したＦｏｋＩのトリプシン分解フラグメントである。
【図７】図７は、41kDaのＮ末端ＤＮＡによるＤＮＡの配列特異的結合の、ゲル移動度シフト試験を用いた分析を示している。交換反応のために、この複合体（10μｌ）を、10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mMのMgCl2を含む20μｌ容量において、１μｌの３２Ｐで標識された特異的（または非特異的）なオリゴヌクレオチド二本鎖と共に、時間を種々に変化させて37℃でインキュベートした。３２Ｐでラベルされた１μｌの特異的プローブ［d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'（配列番号１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列番号１１）］は、12ピコモルの二本鎖および略50×10３cpmを含んでいた。また、３２Ｐで標識された１μｌの特異的プローブ［d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'（配列番号１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列番号１１）］には、12ピコモルの二本鎖および略25×10３cpmが含まれていた。  （Ａ）レーン１は特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖；レーン２は41 kDaのＮ末端フラグメント−オリゴ複合体；レーン３および４は、当該複合体とともに夫々30分間および120分間インキュベートされた特異的プローブである。  （Ｂ）レーン１は非特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖；レーン２は41 kDaのＮ末端フラグメント−オリゴ複合体；レーン３および４は、当該複合体とともに夫々30分間および120分間インキュベートされた非特異的プローブである。
【図８】図８は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解の種々の時点における、トリプシン分解物のＳＤＳ（0.1%）−ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動プロファイルを示している。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mMのMgCl2を含む最終容量200μｌ中の酵素（200μｇ）を、室温においてトリプシンで消化した。 ＦｏｋＩに対するトリプシンの比率は、重量比で１：５０であった。一部分（28μｌ）を異なった時間間隔で反応混合物から取り出し、過剰のアンチペイン(antipain)で急冷した。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。また、それぞれレーン３は2.5分；レーン４は5.0分；レーン５は10分；レーン６は20分；レーン７は40分；レーン８は80分；レーン９は160分のトリプシン消化である。
【図９】図９は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解地図を示している。（Ａ）オリゴヌクレオチド基質の不存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの断片形成パターン。（Ｂ）オリゴヌクレオチド基質の存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの断片形成パターン。
【図１０】図１０は、PREDICTプログラムを用いた一次配列決定（配列番号３１）に基づく、ＦｏｋＩの推定二次構造を示している。ＤＮＡ基質の存在下におけるＦｏｋＩのトリプシン開裂部位が矢印で示されている。KSELEEKKSEL配列が強調されている。図中の記号は次の通りである：ｈはヘリックス；ｓはシート；黒丸はランダムコイル。
【図１１】図１１は、ＦｏｋＩの挿入変異体の構築に用いた５′および３′オリゴヌクレオチドプライマーの配列（それぞれ配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９）を示している。４コドン挿入物および７コドン挿入物が太字で示されている。アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に示されている。両挿入変異体のＰＣＲ増幅において、同一の３′プライマーが用いられた。
【図１２】図１２は、均一に精製された変異体酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロファイルを示している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩ；レーン３は４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン４は７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩである。
【図１３】図１３は、上記変異体酵素におけるＤＮＡ配列特異性の分析を示している。ＤＮＡ基質を、37℃で２時間、10mMトリスHCl pH8.0／50mM NaCl／1mM DTT／10mM MgCl2の中で消化した。  （Ａ）１％アガロースゲル電気泳動による、pTZ19RＤＮＡ基質の開裂パターン。夫々の反応において、２μｇのpTZ19RＤＮＡを用いた。レーン１は、１キロ塩基（ｋｂ）のラダー；レーン２はpTZ19R；レーン３は、ＦｏｋＩで消化したpTZ19R；レーン４は、４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩで消化したpTZ19R；レーン５は、７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩで消化したpTZ19Rである。  （Ｂ）1.5％アガロースゲル電気泳動によって分析された、単一のＦｏｋＩ部位を含む256ｋｂのＤＮＡ基質の開裂パターン。１μｇの放射能ラベルした基質（ここの鎖に３２Ｐラベルを施した）を、上記のようにして消化した。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光で可視化した。レーン２〜６は、５′−ＣＡＴＣＣ−３′鎖が３２Ｐでラベルされた３２Ｐラベル基質に対応する。レーン７〜１１は、５′−ＧＧＡＴＧ−３′鎖が３２Ｐでラベルされた３２Ｐラベル基質に対応する。レーン１は、１キロ塩基（ｋｂ）のラダー；レーン２および７は、３２Ｐでラベルした250ｋｂのＤＮＡ基質；レーン３および８は、ＦｏｋＩで開裂された３２Ｐラベル化基質；レーン４および９は、精製された実験室的野生型(laboratory wild-type)のＦｏｋＩ；レーン５および１０は、４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン６および１１は、７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩである。  （Ｃ）上記で得たアガロースゲルのオートラジオグラフ。レーン２〜１１は、上記の（Ｂ）と同じである。
【図１４】図１４は、ＦｏｋＩおよび上記変異体酵素による認識部位から開裂部位までの距離の分析を示している。pTZ19RをテンプレートとしたＤＮＡ配列決定のために、非燐酸化オリゴヌクレオチドが用いられた。そのシーケンシング生成物（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）を７Ｍ尿素を含む６％アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、該ゲルを乾燥させた。次いで、その生成物をＸ線フィルムに２時間露光させた。100ｂｐおよび256ｂｐのＤＮＡ基質からの開裂生成物が、ＡおよびＢにそれぞれ示されている。Ｉは、５′−ＧＧＡＴＧ−３′鎖における３２Ｐラベルを含む基質に対応している。また、ＩＩは５′−ＣＡＴＣＣ−３′鎖における３２Ｐでラベルを含む基質に対応している。レーン１はＦｏｋＩ；レーン２はＦｏｋＩ；レーン３は４コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン４は７コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩである。
【図１５】図１５は、単一のＦｏｋＩ部位を含む100ｂｐのＤＮＡ基質に基づく、 ＦｏｋＩおよび変異体酵素の開裂部位の地図を示している。（Ａ）は野生型ＦｏｋＩ；（Ｂ）は４コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ；（Ｃ）は７コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ（配列番号４０参照）である。開裂部位は矢印で示されている。主要な開裂部位は大きな矢印で示してある。
【図１６】図１６は、ＤＮＡ基質に関連させた、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（ＦＮ）に対するＵｂｘホメオドメインの向きを示す図を表している。尖った波形に縁取りされた(engrailed)ホメオドメイン−ＤＮＡ複合体の結晶構造が、Kissinger et al. (Cell 63:579-90 (1990))によって報告されている。
【図１７】図１７は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド酵素の発現ベクターの構築を示している。  （Ａ）ハイブリッド遺伝子のＵｂｘ−ＦＮの構築に用いた５′プライマーおよび３′プライマーの配列。このＵｂｘプライマーは、ＰｓｔＩおよびＳｐｅＩに隣接している（配列番号４１および配列番号４２を参照のこと）。Ｕｂｘ−ＦＮプライマーは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に隣接している（配列番号４３および配列番号４４を参照のこと）。開始コドンおよび終止コドンは太字で示されている。  （Ｂ）プラスミドｐＲＲＳ・Ｕｂｘ−ＦＮおよびｐＥＴ−１５ｂ・Ｕｂｘ−ＦＮの構造。ｐＲＲＳｆｏｋＩＲのＰｓｔＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、ＰＣＲ修飾されたＵｂｘホメオボックスで置換して、ｐＲＲＳ・Ｕｂｘ−ＦＮを作製した。Ｕｂｘ−ＦＮプライマーを用いたＰＣＲで作製されたフラグメントをｐＥＴ−１５ｂのＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ部位に挿入して、ｐＥＴ−１５ｂ・Ｕｂｘ−ＦＮを形成した。
【図１８】図１８は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド酵素の精製における各工程でのＳＤＳ／ＰＡＧＥプロファイルを表している。レーン１はタンパク標準；レーン２は誘発された細胞からの粗抽出物；レーン３はＨｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂プール；レーン４はホスホセルロースのプール；レーン５はＤＥＡＥプールである。
【図１９】図１９は、Ｕｂｘ部位を含む線形化したｐＵＣ１３・ＤＮＡ基質を用いた、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッドタンパクの特徴付けを示している。  （Ａ）ｐＵＣ由来のＤＮＡ基質。□は、Ｕｂｘ部位、即ち５′−ＴＴＡＡＴＧＧＴＴ−３′を含む30ｂｐの挿入物である。これらの基質における30ｂｐ挿入物のタンデムリピート(tandem repeats)の数が、括弧内に示されている。Ｕｂｘ部位の向きは矢印で示されている。  （Ｂ）20mM Tris.HCl (pH7.6), 75mM KCl, 1mM DTT, 50μｇ／ml tRNAおよび2mM MgCl2を含む緩衝溶液中において、31℃で４〜５時間、上記のＤＮＡ基質（１μｇ）を部分的に消化した。生成物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。基質は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッドタンパクに比較して大過剰（略100：１）で存在した。反応条件は、基質分子当たり一つの二本鎖開裂を生じるように最適化された。この反応は酵素濃度を増大させて進行させるか、或いは31℃で一晩消化することによって完結される（データは示していない）。新たに挿入されたｐＵＣ１３のＵｂｘ部位でのハイブリッド酵素の結合と、該部位の近傍での開裂によって生じた二つのフラグメント、即ち略1.8ｋｂおよび略0.95ｋｂのフラグメントが矢印で示されている。
【図２０】図２０は、Ｕｂｘ−ＦＮによる認識部位から開裂部位までの距離の分析を示している。（Ｇ＋Ａ）マクサム−ギルバートの配列決定反応(Maxam-Gilbert sequencing reaction)に従った、単一のＵｂｘ部位を含む３２ＰでラベルされたＤＮＡ基質のＵｂｘ−ＦＮによる開裂生成物を、６Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、乾燥し、Ｘ線フィルムに対して６時間露光させた。  （Ａ）は、５′−ＴＡＡＴ−３′鎖（配列番号４５を参照のこと）での３２Ｐラベルを含む基質からの開裂生成物に対応している。レーン１は（Ｇ＋Ａ）配列決定反応；レーン２はＵｂｘ−ＦＮである。  （Ｂ）は相補鎖、即ち５′−ＡＴＴＡ−３′（配列番号４６を参照のこと）での３２Ｐラベルを含む基質に対応している。レーン１は（Ｇ＋Ａ）配列決定反応であり；レーン２はＵｂｘ−ＦＮである。  （Ｃ）は、単一のＵｂｘ部位を含むＤＮＡ基質に基づく、Ｕｂｘ−ＦＮ開裂部位の地図である。認識部位は白抜き文字によって示されている。プリン残基は黒星印によって示されている（配列番号４７および配列番号４８を参照のこと）。
【図１】
2006254921.tif 000010
【図２】
2006254921.tif 000011
【図３】
2006254921.tif 000012
【図４】
2006254921.tif 000013
【図５】
2006254921.tif 000014
【図６】
2006254921.tif 000015
【図７】
2006254921.tif 000016
【図８】
2006254921.tif 000017
【図９】
2006254921.tif 000018
【図１０】
2006254921.tif 000019
【図１１】
2006254921.tif 000020
【図１２】
2006254921.tif 000021
【図１３】
2006254921.tif 000022
【図１４】
2006254921.tif 000023
【図１５】
2006254921.tif 000024
【図１６】
2006254921.tif 000025
【図１７】
2006254921.tif 000026
【図１８】
2006254921.tif 000027
【図１９】
2006254921.tif 000028
【図２０】
2006254921.tif 000029
【配列表】
2006254921000001.xml