(57)【要約】【課題】２種類以上の異なる配列を含む初期標的核酸から、初期標的核酸の存在比と比例した標的核酸を分取でき、信頼性が高く、再現性のある核酸検出または分析方法を提供すること。【解決手段】それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料から、該標的核酸の一部を分取し、分取された核酸試料を検出または分析する方法であって、初期標的核酸試料の核酸濃度から、初期標的核酸試料のコピー数を求める工程、及び上記初期標的核酸試料から所定数以上のコピー数の標的核酸を分取する工程を含む核酸検出または分析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料から、標的核酸の一部を分取し、分取された核酸試料を検出または分析する方法であって、
初期標的核酸試料の核酸濃度から、初期標的核酸のコピー数を求める工程、及び
上記初期標的核酸試料から所定数以上のコピー数の標的核酸を分取する工程、
を含む核酸検出または分析方法。
【請求項２】
更に、上記初期標的核酸試料から分取する標的核酸のコピー数が所定数を超えるときは、上記初期標的核酸試料を希釈し、該コピー数が所定数に満たないときは、上記初期標的核酸試料を濃縮する工程を含む、請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項３】
更に、分取する標的核酸コピー数が所定の範囲になるように調整できない核酸試料を、次工程に用いないか、用いてもその結果を用いないか、もしくは結果に警告を表記または記号を付加する工程を含む請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項４】
標的核酸の分取後、次工程として核酸増幅反応もしくは、分析反応を行う請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項５】
前記初期標的核酸試料がゲノムＤＮＡを含むものである請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項６】
分取された核酸試料を核酸分析反応し、所望の手段により標的核酸を検出する工程を含む請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項７】
標的核酸のコピー数から２項分布を用いた統計的手法または２項分布に近似した式により、分取すべき標的核酸のコピー数を決定する工程を含む請求項１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項８】
一塩基以上の異なる塩基配列部位が遺伝子多型であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出または分析方法。
【請求項９】
一塩基以上の異なる塩基配列部位が一塩基多型であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１０】
一塩基以上の異なる塩基配列部位がマイクロサテライト多型であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１１】
それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析する核酸検出または分析方法であって、
ａ）該標的核酸を含む増幅反応液を用いて核酸増幅を行う工程、
ｂ）核酸増幅量または核酸増幅の経過から増幅反応液中の標的核酸のコピー数および、初期標的核酸のコピー数を推定する工程、
ｃ）推定された初期標的核酸コピー数から、２項分布を用いた統計的手法または２項分布に近似した式により増幅反応液中に必要な標的核酸コピー数濃度を決定する工程、
ｄ）決定された必要なコピー数値と推定された増幅反応液中の標的核酸コピー数とを比較する工程、
を含むことを特徴とする核酸検出または分析方法。
【請求項１２】
２つの異なる核酸の増幅量を定量することにより検出または分析する方法として、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を用いることを特徴とする請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１３】
２種類以上の異なる標的核酸に、それぞれ２色の異なる蛍光を標識し、これらの蛍光の発光量の差から標的核酸の増幅量の違いを分析する方法として、２色蛍光核酸マイクロアレイを用いることを特徴とする請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１４】
上記標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、標準試料として分析した標的核酸と検査対象として分析した標的核酸の存在比率を比較して、予め設定された閾値を元にピーク比率の変化に差があるかないかを判定する工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１５】
２項分布を用いた統計的手法により、測定した該標的核酸の存在比率の信頼区間を算出する工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１６】
差があると判定する閾値と信頼区間の重なりを調べ、閾値と信頼区間が重なっていなければ差がある、又は差がないと判定し、閾値と信頼区間が重なっている場合は判定無効とする工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１７】
それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種塁以上のプライマーを用いて、含まれている標的核酸の中で比率の最も少ない標的核酸を増幅する工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１８】
初期標的核酸のコピー数からポアソン分布（Ｐｏｉｓｓｏｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を用いた統計的手法により増幅反応液中の標的核酸コピー数を決定する工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項１９】
増幅または分析反応液中の標的核酸コピー数が所定の値以上になるように、初期標的核酸試料を希釈・濃縮し、増幅または分析反応液を調整する工程、
増幅または分析反応液中の該標的核酸コピー数を上記所定の値以上に調整できない初期標的核酸試料を分析に用いない、もしくは分析してもデータとして用いない、もしくは分析データに警告を意味する表記または記号を付加する工程、
を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【請求項２０】
核酸検出または分析装置のコンピュータを、
ａ）それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて検出または分析する際に、初期核酸濃度からコピー数を決定するための標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
ｂ）初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
ｃ）算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、
として機能させるための核酸検出または分析プログラム。
【請求項２１】
サンプル分注装置と、試料中の核酸濃度を測定する装置と、入出力装置と、核酸検出部と、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の初期標的核酸試料を検出する際に、コンピュータを、ａ）初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、ｃ）初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、ｂ）算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段として機能させるためのプログラムを格納した記憶装置と、該記憶装置のプログラムを読み出し、かつ検出または分析装置を制御するコンピュータと、少なくとも演算結果を表示する表示装置とを有する核酸または分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸中のＤＮＡ中に含まれる特定の配列の増幅、検出、および遺伝子の多型性の検出、一塩基多型分析等に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型を分析する方法としては、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，  ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：７７８−７８３（１９９３））、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）等がある。
【０００３】
Ｉｎｖａｄｅｒ法は、異なる２つの対立遺伝子に特異的な塩基配列を持つ核酸断片に異なる蛍光体を標識し、検査対象の対立遺伝子と完全に一致した核酸断片の蛍光標識を検出できる検出法である。非特許文献１では本方法において反応槽の微小化および、分析反応の微量化に成功し、反応に用いるゲノムＤＮＡ量を０．２ｎｇ（約４０コピー）としている。
【０００４】
ＳＳＣＰ法は、増幅した２本鎖の核酸断片を一本鎖にした後に変性させ、電気泳動を行うことで、一塩基の違いを高次構造の違いとして分離し、分析する方法である。また、ＳＳＣＰ法を用いて、遺伝子多型を含む対立遺伝子の量比を測定し、標準試料と検査対象の試料における２つの異なる対立遺伝子量比の測定結果を比較し、染色体の欠失（ＬＯＨ）を検出することもできる。
【０００５】
また、シングルセル分取システム（ＣＬＯＮＩＳ／ＯＬ）（オリンパス社）や、  Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  （ＬＣＭ）  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ビーエム機器株式会社製）を用いて、微量の癌細胞を分取し、この細胞から抽出した微量の核酸の遺伝子を増幅して分析することもできる。
【０００６】
また、非特許文献２に示される従来技術では、マイクロサテライト多型の対立遺伝子を分析する場合、核酸を分取したとき、確率的な現象により、分取したコピー数が少ないほど、分取によるバラツキの大きさが大きくなり、染色体増減の分析結果の再現性が低くなることを明示した。本従来技術では、この解決方法として、低コピーの核酸でも増幅可能なｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ  ＰＣＲを用いて、微量核酸の分取・分注を行わずに直接分析する方法を用いることを提案している。
【０００７】
【非特許文献１】第２６回日本分子生物学会年会  要旨集  ｐ７７８  ２ＰＣ−１０４
【非特許文献２】Ｓｌｅｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  （２００４）  ８４，  ６４９−６５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献２に示される従来技術を用いれば、確かに分取・分注による再現性低下の原因を抑えることが可能である。しかし、この方法では分取・分注ができないため、同じ検体に対して複数の遺伝子の分析が困難であることや同じ検体を用いた再分析が不可能であるといった課題がある。また、このような分取および分注による再現性の低下はマイクロサテライト多型のみではなく、あらゆる異なる２種類以上の核酸を含む溶液から、分取および分注して、分析する場合にも起こり得る問題であることを発明者は実験および統計論理式により明らかにした。したがって、本発明の課題は、複数の異なる核酸をそれぞれ信頼性が高く、再現性のある核酸検出方法または核酸分析方法ならびにそれらに有用なコンピュータプログラム及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の問題について、鋭意検討した結果、上記の課題を解決するためには、初期標的核酸試料から分取する標的核酸コピー数を統計学的に決定されたコピー数以上にすることで、必要な精度を満たす分析が可能であることを統計学的に証明し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の基本的な構成は、それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料から、該標的核酸の一部を分取し、分取された標的核酸試料を検出する方法であって、初期標的核酸試料の核酸濃度から、初期標的核酸試料のコピー数を求める工程、及び上記初期標的核酸試料から所定数以上のコピー数の標的核酸を分取する工程を含む核酸検出または分析方法にある。
【００１０】
本発明は更に、上記初期標的核酸試料から分取する標的核酸のコピー数が所定数を超えるときは、上記初期標的核酸試料を希釈し、該コピー数が所定数に満たないときは、上記初期標的核酸試料を濃縮する工程を含む核酸検出または分析方法を提供する。更に、上記核酸検出または分析方法は、分取する標的核酸コピー数が所定の範囲になるように調整できない核酸試料を、次工程に用いないか、用いてもその結果を用いないか、もしくは結果に警告を表記または記号を付加する工程を含むことができる。
【００１１】
標的核酸の分取後、次工程として核酸増幅反応もしくは、分析反応を行う核酸検出または分析方法が提供される。前記初期核酸試料がヒトゲノム又は植物ゲノムなどのゲノムＤＮＡを含むものであるときに本発明は特に有効である。
【００１２】
本発明において、初期標的核酸のコピー数から２項分布を用いた統計的手法により分取すべき標的核酸のコピー数を決定することが特に好ましい。しかし、２項分布を用いることは、しばしば複雑かつ膨大な準備と演算を必要とする場合があるので、２項分布に近似した計算式を用いてコピー数を決定することは実際的である。この計算式については追って説明する。
【００１３】
本発明はまた、それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸試料を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析する核酸検出または分析方法であって、
ａ）該標的核酸を含む増幅反応液を用いて核酸増幅を行う工程、
ｂ）核酸増幅量または核酸増幅の経過から増幅反応液中の標的核酸のコピー数および、初期標的核酸のコピー数を推定する工程、
ｃ）推定された初期標的核酸コピー数から、２項分布を用いた統計的手法によりまたは２項分布に近似した式により、増幅反応液中に必要な標的核酸コピー数濃度を決定する工程、
ｄ）決定された必要なコピー数値と推定された増幅反応液中の標的核酸コピー数とを比較する工程、
を含む核酸検出または分析方法を提供するものである。
【００１４】
上記方法において、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、標準試料として分析した標的核酸と検査対象として分析した標的核酸の存在比率を比較して、予め設定された閾値を元にピーク比率の変化に差があるかないかを判定する工程を含むことができる。上記方法において、初期標的核酸のコピー数からポアソン分布（Ｐｏｉｓｓｏｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を用いた統計的手法により増幅反応液中の標的核酸コピー数を決定することができる。
【００１５】
上記方法において、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）を用いることができる。また、２種類以上の異なる標的核酸に、それぞれ２色の異なる蛍光を標識し、これらの蛍光の発光量の差から標的核酸の増幅量の違いを分析する方法として、２色蛍光核酸マイクロアレイを用いることができる
【発明の効果】
【００１６】
上記の方法により、２種類以上の異なる配列を含む初期標的核酸試料から、初期標的核酸の存在比と比例した標的核酸を分取できる。また、初期標的核酸試料中に含まれる微量の核酸を確実に検出するための分析に用いる標的核酸のコピー数を決定できる。また、分析後の結果に対して、統計学的な信頼区間を求めることにより、より精度の高い分析結果の判定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参照して説明する。
【００１８】
まず、本発明の概略について説明する。図１は本発明の代表的な実施形態である。図１のフロー図に示すように、初期核酸濃度を測定し、その結果から初期核酸コピー数を算出もしくは推測し、分取すべき核酸コピー数を決定する。分取するコピー数が決まったら、初期核酸試料中のコピー数が所定の値よりも大きいときは希釈し、コピー数が所定の値よりも小さいときは濃縮して、分取に好都合な濃度に調整する。このように調整された試料から、所定のコピー数だけ分取する。これを反応液に添加し、反応液を調整して、増幅反応が必要なときは増幅反応を行い、必要でないときは、核酸検出のための反応を行う。反応の結果得られた試料を用いて核酸検出又は分析を行う。
【００１９】
図２は初期核酸試料中の核酸コピー数を算出する方法を示すもので、試料の二重鎖核酸の長さ（塩基数）、核酸濃度、核酸の総重量を求め、図２に示す要領で、初期核酸のコピー数を計算する。
【００２０】
また、分取１回あたりのコピー数を決める方法を図３に例示した。（４）式、（５）式、（８）式、（９）式は詳細な説明に示したものと同じで、これらの式を用いてコピー数が１００，０００未満の場合と、１００，０００以上の場合の計算方法を示した。また、より厳密な計算を求めるときは、２項分布である（１）式を用いた手法で計算する。以下に説明する（２）式〜（１４）式は本明細書においては、２項分布に近似した式として定義される。なお、基本的には２項分布の思想を利用すればよいわけで、必要ならば、（１）式〜（１４）式を変更、修正してもよいことは言うまでもない。
【００２１】
更に、図４においては、初期標的核酸のコピー数が、分取すべきコピー数との差が正か負か、あるいは差がないかで、試料の調整法をどうするかを示した。分取すべき標的核酸のコピー数と、初期核酸試料中のコピー数が、ほぼ同じであれば、そのまま分取を行い、反応液の調整を行う。初期核酸試料中のコピー数が、分取すべきコピー数よりも小さいときは、初期試料の濃縮を行う。また、初期標的核酸試料中のコピー数が、分取すべきコピー数よりも大きいときは、初期標的核酸試料の希釈を行う。
【００２２】
図５は本発明において用いられる核酸検出または分析装置の装置構成を示す線図であり、制御・解析部において、濃度測定部、サンプルアーム分注アーム部、遺伝子増幅部、及び検出部の制御を行い、その他サンプル及び試薬保持部を持つ。図６は、本発明の核酸検出または分析装置の制御・解析部、その他の機構との関係を示し、制御・解析部で濃度測定部により測定された初期標的核酸の測定値を受け、測定値を元に分取する標的核酸のコピー数を決定し、決定された値を分取するようにサンプル分注アーム部を操作する。その後の工程である、遺伝子増幅部、及び検出部の制御を行う。メモリはコンピュータにより読み出し可能な媒体であり、後述するプログラムが記憶され、コンピュータ（ＣＰＵ）によって一連の操作が制御実行される。また、入力部から操作者が必要な指令、条件を入力し、操作結果及び現状、警告等を表示部に表示する。それらの結果を元に、核酸を検出部により検出し、必要な情報を表示する。したがって、本発明は、サンプル分注装置と、試料中の核酸濃度を測定する装置と、入出力装置と、核酸検出部と、コンピュータを、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を検出する際に、ａ）初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、ｂ）初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、ｃ）算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段として機能させるプログラムを格納した記憶装置と、該記憶装置のプログラムを読み出し、かつ検出または分析装置を制御するコンピュータと、少なくとも演算結果を表示する表示装置とを有する核酸検出または分析装置を提供する。
【００２３】
本発明における、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の初期標的核酸試料を用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、初期標的核酸と同じ量比の増幅核酸量を得る方法は、面１に示される以下のステップで構成される。
１）該標的核酸の濃度を測定する。
２）初期標的核酸コピー数を決定する。
３）統計論理式を用いて初期標的核酸から分取し、増幅反応液中に投入する標的核酸コピー数を決定する。
４）該標的核酸を増幅する際の反応液中の該標的核酸コピー数が所定の値にできるように初期標的核酸を希釈または濃縮し、核酸増幅反応液を調整する。
５）核酸増幅を行う。
６）核酸を分析し、低コピー数の試料に警告を意味する表記または記号を付加する。
【００２４】
なお、本発明における初期標的核酸試料とは生物試料から抽出された核酸または生物試料から抽出された核酸の目的の領域を含む一部から複製された核酸または人工的に合成された核酸を意味する。生物試料とは、あらゆる生物の細胞、正常組織、血液や尿中の細胞、腫瘍組織自体も含む意味である。腫瘍組織は手術や生体検査などにより採取することもできる。
【００２５】
標的核酸の抽出方法は、特に限定されず、従来公知の方法である、フェノール・クロロフォルム抽出法またはＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）等を用いることができる。また、例えば、尿中に存在する細胞から核酸を抽出することもできるし、その他検査対象の組織から採取した細胞や尿中の細胞から核酸を抽出することもできる。検査対象から組織を採取した場合は、検査対象本人から採取した細胞由来の核酸を含む組織であれば如何なる組織でもよく、例えば、病理学検査に使用された、標本サンプルの一部を用いても良い。また、検査対象から尿を採取した場合には、尿中に脱落してきた本人の細胞由来の核酸を含むものであれば何でもよく、通常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び／又は癌細胞由来の核酸を、上記の種々の方法で効率よく抽出することができる。
【００２６】
核酸のコピー数を測定する装置としては、具体的には吸光波長測定装置、蛍光波長測定装置、ＵＶ波長測定装置等が挙げられるが、核酸コピー数の測定が可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような装置に限定されない。
【００２７】
核酸を増幅する装置としては、増幅方法にＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いる場合、具体的にはサーマルサイクラー、より具体的には核酸を増幅する装置であるＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、等が挙げられるが、ＰＣＲ法を用いた核酸増幅が可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような装置に限定されない。このようなＰＣＲ法を利用した核酸増幅装置の場合、核酸増幅用試薬調整液を満たした微小容器に対して加温と冷却を繰り返して、核酸を増幅する。また、定温で行う核酸増幅法を用いる場合、具体的にはサーモヒーター、インキュベーター等が挙げられるが、核酸増幅が可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような装置に限定されない。
【００２８】
以下、図１に示すフローの中で重要な工程について詳しく説明する。
【００２９】
工程１）は初期標的核酸濃度を測定し、初期標的核酸の長さを元に初期標的核酸のコピー数を決定する。本工程について以下詳細に記述するが、本工程では、初期標的核酸コピー数が算出できればよく、後述の具体例に限定されない。
【００３０】
初期標的核酸の濃度は前述した核酸濃度測定装置を用いて測定する。この測定法としては、ＵＶ測定法、蛍光式測定法などが挙げられる。これらの例に限定されず、初期標的核酸の濃度が測定できれば如何なる方法を用いてもよい。
【００３１】
工程２）において、測定により得られた濃度からコピー数を算出する方法としては、初期標的核酸の塩基数を与えれば、例えば、バイオ実験イラストレイテッド３（ｐ２６−３３）に示される公知の方法で算出することができる。また、初期標的核酸のコピー数測定が困難な場合は、例えば、特開２００１−３１４１９４号公報に示されるような、公知の方法等を用いて核酸増幅の経過または、核酸増幅後の増幅核酸量から増幅前の増幅反応液中の標的核酸コピー数を推定することもできるが、初期標的核酸のコピー数を測定する方法としては、これらの例に限定されず、初期標的核酸のコピー数が測定できれば如何なる方法を用いてもよい。
【００３２】
工程３）は初期標的核酸のコピー数から統計論理式を用いて分析反応または増幅反応に必要な最低限のコピー数を決定する（分取すべきコピー数を決める）工程である。具体的には、初期標的核酸から測定する、または上述したような核酸増幅量または核酸増幅の経過から推定した、初期標的核酸コピー数を用いて、増幅または分析反応液に最低源必要な該標的核酸コピー数を統計論理式により決定できる。以下、統計論理式を用いた、増幅または分析反応液中の標的核酸コピー数の決定方法について詳細に述べる。
【００３３】
本発明の原理は、低コピー数において２種類以上の標的核酸を含む溶液を分取して増幅反応液を調整する場合、分取または希釈により、各標的核酸の存在比が変化する現象を回避するものである。従って、初期標的核酸中の核酸の総量を１とし、核酸分析に用いる核酸の存在比をｐとした場合、その他の核酸の比率は１−ｐで表すことができ、これは２項分布に従う。これより、ｎコピー分取したときに、分取液中にｂコピー含まれる確率Ｐ（ｂ）は、（１）式で表すことができる。
【００３４】
【数１】
2006087388.tif 000003
【００３５】
Ｐ（ｂ）：分取液中にｋコピー含まれる確率
ｐ：初期標的核酸中のある一種類の標的核酸の割合
ｎ：初期標的核酸から分取するコピー数
ｂ：分取液中に含まれる分析に用いる核酸のコピー数
また、分取する核酸のコピー数をｎとし、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たす時、これは近似的に平均ｐ、分散ｐ（１−ｐ）／ｎの正規分布従う。従って、以下のように分取すべき標的核酸コピー数値を統計学的に求めることができる。
【００３６】
初期標的核酸Ｎが十分大きいコピー数、好ましくはＮ＞１００，０００のコピー数を持つ複数の種類の標的核酸溶液がｐの割合で存在しているある一種類の標的核酸を含むとき、該標的核酸溶液からｎコピー分取する場合、分取した標的核酸中のある１種類の該標的遺伝子の割合Ｒは、統計学的にｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たすとき、ある信頼度の信頼区間において統計量Ｔを用いて、（２）式で表される範囲を取りうる。好ましくは信頼度９５％を用いて、統計量Ｔ＝１．９６を与えるのがよく、より好ましくは９９％の信頼度を用いて、統計量Ｔ＝２．５８を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Ｔを求めることもできる。
【００３７】
【数２】
2006087388.tif 000004
【００３８】
ｐ：初期標的核酸中のある一種類の標的核酸の割合
ｎ：初期標的核酸から分取するコピー数
Ｔ：ｎが正規分布を取る場合の統計量
Ｒ：ｐの信頼区間（取りうる値の範囲）
また、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たさない場合、Ｒの取りうる区間はｔ分布の統計量ｔｎ−１を用いて（３）式で表すことができるが、より好ましくは２項分布である（１）式を用いて算出するのがよい。
【００３９】
【数３】
2006087388.tif 000005
【００４０】
ｐ、ｎ、Ｒ：（２）式の定義と同じ
ｔｎ−１：ｎがｔ分布を取る場合の統計量
（２）及び（３）式より、初期標的核酸が十分大きい時、９５％の信頼度でコピー数によるＲの取りうる値を％に換算したとき、表１のように示すことができる。
【００４１】
【表１】
2006087388.tif 000006
【００４２】
表１は、９５％の信頼度において上限と下限に挟まれた区間では、統計学的に有意な差を見出すことが不可能なことを意味する。従って、この区間が狭いほど、統計学的に初期の標的核酸と同じ量比の増幅核酸を得る確率が高い。このことから、ある信頼度の信頼区間においてｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たすとき、常にｋの割合だけ信頼区間を許す時、所定の値ｎとは、統計量Ｔを用いると、（４）式で示すことができる。好ましくは信頼度９５％を用いて、統計量Ｔ＝１．９６を与えるのがよく、より好ましくは９９％の信頼度を用いて、統計量Ｔ＝２．５８を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Ｔを求めることもできる。
【００４３】
【数４】
2006087388.tif 000007
【００４４】
ｐ、ｎ、Ｔ：（２）式の定義と同じ
ｋ：分取液中に許される標的核酸比率の信頼区間
また、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たさないとき、ｔ分布の統計量ｔｎ−１を用いて好ましくは（５）式で示すことができるが、より好ましくは２項分布である（１）式を用いて算出するのがよい。
【００４５】
【数５】
2006087388.tif 000008
【００４６】
ｐ、ｎ：（２）式の定義と同じ
ｔｎ−１：（３）式の定義と同じ
ｋ：（４）式の定義と同じ
また、初期の標的核酸のコピー数が少ない場合、この初期の標的核酸のコピー数をＮとすると、（２）および（３）式に有限母集団修正項を乗じて（２）式は（６）式で、（３）式は（７）式で表すことができる。
【００４７】
【数６】
2006087388.tif 000009
【００４８】
ｐ、ｎ、Ｔ、Ｒ：（２）式の定義と同じ
ｔｎ−１：（３）式の定義と同じ
Ｎ：初期標的核酸のコピー数
従って、初期標的核酸のコピー数が統計学的に小さい、好ましくは１００、０００より小さいとき、初期標的核酸のコピー数をＮとすると、ある信頼度の信頼区間においてｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たすとき、本発明における所定の値ｎとは、（４）式で示した右辺をＸとすると、次に示す（８）式により表すことができる。好ましくは信頼度９５％を用いて、統計量Ｔ＝１．９６を与えるのがよく、より好ましくは９９％の信頼度を用いて、統計量Ｔ＝２．５８を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Ｔを求めることもできる。
【００４９】
【数７】
2006087388.tif 000010
【００５０】
Ｘ：（４）式右辺
Ｎ：（６）式、（７）式の定義と同じ
また、ある信頼度の信頼区間においてｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たさないとき、（５）式で示した右辺をＸｔとすると、次に示す（９）式により表すことができるが、より好ましくは２項分布である（１）式を用いて算出するのがよい。
【００５１】
【数８】
2006087388.tif 000011
【００５２】
Ｘｔ：（５）式右辺
Ｎ：（６）式、（７）式の定義と同じ
また、標的核酸中における存在比率の小さい標的遺伝子を確実に増幅するための最低コピー数も算出することができる。例えば表１より、１００，０００以上のコピー数を持つ複数の種類の標的核酸中に１０％の割合で存在している、ある１種類の標的遺伝子を増幅する場合、統計学的に、９５％の信頼度において、コピー数が３５未満では検出できない可能性がある。従って、ある信頼度の信頼区間において、ｐの割合で含まれている標的核酸を確実に増幅するために分取すべき所定の値ｎとは、分取液中にｂコピー含まれる確率Ｐ（ｂ）としたときにＰｏｉｓｓｏｎ分布より与えられる（１０）式より導くのが望ましい。
【００５３】
【数９】
2006087388.tif 000012
【００５４】
Ｐ（ｂ）、ｐ、ｎ、ｂ：（１）式の定義と同じ
ｅ：自然対数の底
しかし、（１０）式は複雑かつ難解な式となるため、２項分布を正規分布に近似し、ある信頼度の信頼区間においてｐの割合で含まれている標的核酸を確実に増幅できる所定の値ｎとは、統計量Ｔを用いて（１１）式で示すことができる。好ましくは信頼度９５％を用いて、統計量Ｔ＝１．９６を与えるのがよく、より好ましくは９９％の信頼度を用いて、統計量Ｔ＝２．５８を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Ｔを求めることもできるが、より好ましくは、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を用いる。
【００５５】
【数１０】
2006087388.tif 000013
【００５６】
ｐ、ｎ、Ｔ：（２）式の定義と同じ
また、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たさないとき、ｔ分布の統計量ｔｎ−１を用いて好ましくは（１２）式で示すことができるが、より好ましくは、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を用いる。
【００５７】
【数１１】
2006087388.tif 000014
【００５８】
ｐ、ｎ、Ｔ：（２）式の定義と同じ
また、初期の標的核酸のコピー数が少ない場合、この初期の標的核酸のコピー数をＮとし、（１１）式で示した右辺をＹとすると、次に示す（１３）式により表すことができる。
【００５９】
【数１２】
2006087388.tif 000015
【００６０】
Ｙ：（１１）式右辺
Ｎ：（６）式、（７）式の定義と同じ
また、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たさないとき、（１２）式で示した右辺をＹｔとすると、次に示す（１４）式により表すことができるが、より好ましくは、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を用いる。
【００６１】
【数１３】
2006087388.tif 000016
【００６２】
Ｙｔ：（１２）式右辺
Ｎ：（６）式、（７）式の定義と同じ
好ましくは信頼度９５％を用いて、統計量Ｔ＝１．９６を与えるのがよく、より好ましくは９９％の信頼度を用いて、統計量Ｔ＝２．５８を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Ｔを求めることもできる。
【００６３】
以上の方法により、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列持つ２種類以上の標的核酸を、プライマーを用いて同時に増幅する際に、該標的核酸量と比例した増幅核酸量を得ることができる。また、本発明における（４）（５）（８）（９）式のｐの値およびｋの値は、本発明を適用する検出法または検出装置により異なるが、定量性の低い分析法および装置の場合は、ｋ値を高く設定し、定量性の高い分析法及び装置の場合、ｋ値を低く設定するのが好ましい。Ｐ値については検出したい標的核酸の存在比率で設定する。しかし、存在比率が分からない場合、ｐ値は好ましくは０．５を用い、より好ましくは推定できる存在比率に設定する。より詳細には、後述の工程５）において、本発明を適用する可能性のある検出法及び装置と、ｐ値及びｋ値の設定について記述する。
【００６４】
工程７）は増幅反応液または分析反応液中の標的核酸のコピー数を調整する工程である。増幅反応液または分析反応液における該標的核酸コピー数を上記方法により決定された値にする方法について、以下詳細に記述するが、本工程は増幅または分析反応液の該標的核酸コピー数が上記方法により決定された値となればよく、以下の詳細な記述に限定されない。
【００６５】
初期標的核酸のコピー数を測定した結果、初期標的核酸のコピー数が十分多い場合は、まず初期標的核酸を希釈する必要がある。希釈方法は初期標的核酸を一部分取し、溶媒に混ぜることにより可能となる。希釈に用いる溶媒としては、核酸断片が溶け、次工程の核酸増幅反応または核酸分析反応に影響を与えなければ如何なる溶媒を用いてもよい。また、初期標的核酸のコピー数が決定された標的核酸のコピー数以下の場合は、初期標的核酸をエタノール沈殿法等の公知の方法を用いて濃縮することができる。
【００６６】
次工程において核酸増幅を行う場合は初期標的核酸溶液の上記のように希釈または濃縮したコピー数調整液を一部分取し、核酸増幅試薬を調整し、その調整液に希釈または濃縮核酸を上述の方法により決定された値になるように投入する。また、初期標的核酸のコピー数を測定した結果、初期標的核酸コピー数が低く直接調整できる場合は該標的核酸を一部分取し、核酸増幅試薬とプライマーを調整した調整液に該標的核酸を上述の方法で決定された値になるように調整すればよい。初期標的核酸コピー数が所定の値に満たない際には、試料を追加するか、試料を濃縮するか、分析に用いない。もしくは、分析後に警告を意味する表記または記号を付加する。
【００６７】
核酸増幅を行わずに直接分析する場合は、初期標的核酸溶液を用いて上記のように希釈または濃縮したコピー数調整液を一部分取し、分析用の反応液に投入すればよい。また、初期標的核酸のコピー数を測定した結果、初期標的核酸コピー数が低く直接調整できる場合は該標的核酸を一部分取し、分析用反応液に該標的核酸を上述の方法で決定された値になるように調整すればよい。分析用反応液の組成については、初期標的核酸から直接目的とする分析が可能であれば如何なる組成を用いてもよい。
【００６８】
工程８）‘は核酸増幅を行う工程である。核酸増幅を行わずに直接分析反応を行う場合は本工程を行う必要はなく、工程９）に移る。核酸増幅を行う場合について、本工程の核酸増幅を詳細に説明するが、本工程は核酸増幅が可能であればよく、以下の詳細な例に限定されない。
【００６９】
核酸増幅の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＰＣＲ法、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法）、等温遺伝子増幅法（ＩＣＡＮ法）、ＬＡＭＰ法などがある。いずれの方法においても一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、プライマーを用いて同時に増幅が可能であればよいが、より好ましくはＰＣＲ法を用いる。核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、サイクル数を決定する必要がある。本発明におけるサイクル数は核酸断片の増幅が確認できれば如何なるサイクル数を用いても良いが、好ましくは２０〜４０サイクル前後がよい。
【００７０】
本発明に用いる核酸増幅試薬は限定されるものではなく、核酸増幅が可能であれば如何なる試薬を用いてもよい。また、プライマーは検出したい核酸配列部位に対して特異的な遺伝子配列になるように設計する。プライマーは核酸増幅法による増幅が可能であれば如何なる設計でも良い。さらに、後述する増幅核酸断片の検出を容易にする目的等で、プライマーを標識することもできる。また、核酸増幅を実施する際に標識した塩基成分（例えば燐の放射性標識塩基）を用いる方法、又は、核酸増幅を実施した後に標識する方法により、核酸断片を標識することもできる。標識処理方法としては、検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）を用いた標識方法を挙げることができる。プライマーに対しては、例えば、プライマーの末端を予めＡ．Ｌ．Ｆ  ｒｅｄ（Ｃｙ５、登録商標）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社製）で蛍光標識したものを用いることもできる。また、蛍光ラベルとしてはアプライドバイオシステムズ社のＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ（以上、登録商標）なども使用できる。これらの場合、プライマーの５’末端または３’末端のどちらか一方を標識すればよく、好ましくはプライマーの５’末端を標識したものを用いる。
【００７１】
工程１０）は標的核酸を分析し、２つの異なる標的核酸の量比を測定する工程である。増幅または分析反応液中の２種類以上の異なる配列を持つ核酸を検出する方法として、具体的には、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）、２色蛍光ＤＮＡアレイ法、Ｍａｓｓ  Ａｒｒａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｂａｍｐｅｒ法等が挙げられる。しかし、本工程では、ＳＮＰｓや２つの異なる対立遺伝子、複数の異なる核酸が含まれた溶液中から目的の標的核酸を検出できればよく、これらの具体例に限定されない。
【００７２】
一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）とは標的核酸中の相同だが一塩基以上の異なる配列を含む部位を核酸増幅し、得られた増幅核酸を変性させ、塩基配列の違いを高次構造の違いとして分離し、電気泳動により異なる２本のピークの量比で検出する方法である。この分析法を用いる臨床的検査法としてはＬＯＨ法、ＭＳＩ法等が挙げられる。
【００７３】
このように異なる２本のピークの面積比や高さ比等を用いた量比で検出及び測定が可能な分析法の場合、検出および測定された量比は、初期核酸と一致率が高く、分析にも高い定量性が必要となる。このため、このような場合、一般的に信頼区間（上限と下限の差）１０％以内の定量性が求められ、このときｋ＝０．０５を与えることができる。
【００７４】
２色蛍光ＤＮＡアレイ法を用いた場合、蛍光色素の赤もしくは緑への変化からＤＮＡの違いを検出するため、原理的に高い定量性を要する検出は難しく、一般的に大まかな検出が可能であればよい。この分析法を用いる検査法としてはＣＧＨ法、各種ＳＮＰ検出法等が挙げられる。このような場合、一般的に信頼区間３０％程度の定量性が求められ、このときｋ＝０．１５を与えることができる。また、これらの分析法のような標的核酸がヘテロ接合体であることを分析する場合は、初期核酸中の２つの異なる標的核酸の割合１：１である。従って、ｐ＝０．５を与えることができる。
【００７５】
増幅した核酸を検出し、分析する装置には、具体的にはキャピラリー電気泳動装置、ゲル板電気泳動装置、質量分析装置、核酸マイクロアレイ等が挙げられる。より具体的には核酸の塩基配列を決定するジェネティックアナライザー（ＡＢＩ社製）、金属イオン、核酸、蛋白等の様々な物質を電気泳動により分析できるキャピラリー電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、キャピラリーと質量分析システムを結合させたＣＥ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ゲル板により核酸の配列を決定できるＢａｓｅＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）１００ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、遺伝子多型における塩基の違いを質量の違いとして分析可能なｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ社製）、検出したい遺伝子領域の塩基配列を合成されたプローブをチップ上に配列させ、検出したい核酸とチップを反応させる核酸マイクロアレイ等が挙げられるが、核酸を検出可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような分析装置に限定されない。
【００７６】
具体的な分析方法として１６本キャピラリー電気泳動装置用い、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を利用したヘテロ接合性の消失（以下ＬＯＨ）の測定法を述べるが、本発明では（４）、（５）、（８）、（９）式を用いて所定の値を決定し、該標的核酸の割合において目標とする信頼区間での増幅が確認できればよく、後述する測定法に限定されるものではない。該分析法を用いた場合、増幅核酸の電気泳動結果として１本または２本のピークを得ることができる。ＬＯＨの測定法においては、標準となる標的核酸と検査対象となる標的核酸をそれぞれ増幅し、それぞれの核酸に対して２本のピークの高さを測定し、その比率を算出し、一方のピークの減少率を算出し、標準となる標的核酸と検査対象となる標的核酸とのピーク比率の差を比較し、これらの差が小さければ陰性、差が大きければ陽性として判定する。また、これらの差が判定の閾値周辺の場合は、判定無効とすることもある。
【００７７】
以下、核酸増幅前に標的核酸コピー数を調べるか、もしくは、増幅経過または増幅後に標的核酸コピー数を調べ、低コピー数であっても分析を行う場合について詳細に記述するが、本工程では最終的な測定結果において、測定した標的核酸が低コピーであることが分かればよく以下の具体例に限定されない。
【００７８】
統計学的論理式より決定された値以下のコピー数の標的核酸を増幅し、ＬＯＨ検査を行った場合、測定した初期標的核酸コピー数と増幅反応液中標的核酸コピー数及び得られたピーク比率から、（２）、（３）、（６）、（７）式を用いて、得られたピークの信頼区間を求めることができる。得られた信頼区間が閾値を含む範囲に及んだ場合、この時の検査結果は陽性・陰性のどちらの判定も取りうるため、好ましくは、この検査の結果は低コピー数による解析のため警告を意味する表記または記号を付加する。より好ましくは、この検査の結果は低コピー数による解析のため判定保留、または判定無効として扱う。また、得られた信頼区間が判定閾値を含まない範囲の場合は、陽性または陰性の判定結果を表示する。より好ましくは、合わせて低コピー数で増幅・解析を行った警告を意味する表記または記号を付加する。上述したように低コピー数による信頼区間の広がりを測定結果に反映させることで、より精度の高い測定結果を得ることが可能となる。
【００７９】
また、本発明において、一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸検出に使用するプログラムが提供される。すなわち、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて、分析する際に、コンピュータを機能させるための以下の手段を含むものである。
ａ）初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
ｂ）初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
ｃ）算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、
ｄ）初期標的核酸コピー数と分析反応を行うために必要な標的核酸コピー数を比較し、分析反応液中の該標的核酸コピー数を決定した値以上に調整できない初期標的核酸を分析に用いない、もしくは分析してもデータとして用いない、もしくは分析データに警告を意味する表記または記号を付加する手段。
【００８０】
また、他のプログラムの例として、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて同時に増幅し、分析する際に、以下の手段を含むプログラムがある。
ａ）初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
ｂ）初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
ｃ）算出した初期標的核酸コピー数から、増幅反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、及び
ｄ）初期標的核酸コピー数と増幅反応を行うために必要な標的核酸コピー数を比較する手段。
【００８１】
更にまた、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、標準試料として分析した標的核酸と検査対象として分析した標的核酸の存在比率を比較して、予め設定された閾値を元にピーク比率の変化に差があるかないかを判定する方法において、以下の手段としてコンピュータを機能させるプログラムが提供される。
ａ）初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として要求する手段、
ｂ）初期核酸濃度を核酸濃度測定装置を用いて測定、または増幅の経過及び核酸増幅量から推定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
ｃ）該標的核酸の存在比率を分析した結果から、２項分布またその近似式を用いて、この結果の信頼区間を算出する手段、及び
ｄ）差があると判定する閾値と信頼区間の重なりを調べ、閾値と信頼区間が重なっていなければ差がある、又は差がないと判定し、閾値と信頼区間が重なっている場合は判定無効とする手段。
【００８２】
更にまた、上記プログラムを記録し、コンピュータにより読み出し可能な記録媒体が提供される。
（実施例１）ＳＳＣＰ解析法を用いた低濃度核酸のヘテロ接合体対立遺伝子の存在比率
１．試料の調整と一塩基多型部位の増幅
血液より抽出したヒト由来核酸における対立遺伝子の存在比について、初期標的核酸中の対立遺伝子の相対比率と増幅後の異なる２つの対立遺伝子の相対比率について、Ａ）２％以内の精度を求める場合、Ｂ）５％以内の精度を求める場合、Ｃ）１５％以内の精度を求める場合、Ｄ）４０％以内の精度を求める場合、において必要なコピー数を表２に示した。それぞれのコピー数に分注した４種類の標的核酸増幅液それぞれに対して、表３に示す組成で調整した。すなわち、高い精度を期待する場合ほどコピー数が大きくなることが明らかである。これらの調整は８回の試行で行われた。
【００８３】
【表２】
2006087388.tif 000017
【００８４】
【表３】
2006087388.tif 000018
【００８５】
各調整液に対して、ヘテロ接合の対立遺伝子の一塩基多型部位を標的として、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で２分間の初回変性の後、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応を行う条件とした。
２．ＳＳＣＰ解析
上記の増幅反応後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて表４の組成により、温度３７℃で３０分間反応させ、末端平滑処理を行った。
【００８６】
【表４】
2006087388.tif 000019
【００８７】
末端平滑処理後の試料とＴＡＭＲＡ  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＡＢＩ社製）およびＦｏｒｍａｍｉｄ（ＡＢＩ社製）を用いて、ＳＳＣＰ解析用試薬を表５に示す組成に調整後、９２℃で２分間の熱変性後、表６に示す条件にてＳＳＣＰ解析を行った。
【００８８】
【表５】
2006087388.tif 000020
【００８９】
【表６】
2006087388.tif 000021
【００９０】
３．対立遺伝子の相対比率
ＳＳＣＰ解析では、ヘテロ接合体である対立遺伝子の増幅量をクロマトグラムにおいて２つの波形で検出できる。これら２つの波形の相対比率を求めることで、本来、等量含まれる対立遺伝子が核酸増幅後における変化を調べることができる。本実験においては８回の試行におけるピーク比率の変化の割合を調べた。この結果を表７に示す。
【００９１】
【表７】
2006087388.tif 000022
【００９２】
表７の結果では、試行回数が少ないため、バラツキの範囲は小さくなったが、確かにコピー数の減少により、バラツキの範囲が増大する傾向がある。この結果より、初期標的核酸から分取する核酸量を調節することで、要求する精度の範囲内における解析が可能あることがわかる。
（実施例２）ＳＳＣＰ解析を用いたＬＯＨ検査
１．測定条件の決定
ＬＯＨ検査とは、核酸中の２つの異なる対立遺伝子の量比を核酸中の一塩基の違いを利用して測定し、標準の所期標的核酸の該量比と比較して検査対象の該量比の変化を調べることである。従って、２つの異なる対立遺伝子の量比は、一般的には動物ゲノム核酸で１：１であり、２つの異なる対立遺伝子の一方を検出するとしたとき、この検出したい初期標的核酸の割合は５０％のため、ｐ＝０．５が与えられる。これに対して、対立遺伝子の量比に変化があるかどうか検査する検査対象の該量比は、解析するまで、分からないため、仮に、標準と同じｐ＝０．５を与え、解析後に補正する。また、本解析法は１０％以上の核酸を検出する必要があることから、９５％の信頼度において信頼区間を１０％（±５％）以内に抑える必要があるため、Ｔ＝１．９６、ｋ＝０．０５を与える。
【００９３】
本実施例では、患者の血液から抽出された核酸を標準の初期標的核酸、患者の癌組織や尿等から抽出された核酸を検査対象の初期標的核酸として、１０種類の遺伝子検査領域を増幅して検査を行う。
２．初期標的核酸のコピー数決定および、増幅反応液中のコピー数決定
ヒト由来血液より、フェノール・クロロフォルム抽出法により抽出した膀胱癌患者のヒト血液由来核酸を標準の初期標的核酸として用い、該患者の尿より上記方法で抽出したヒト尿由来核酸を検査対象の初期標的核酸として用いた。これらの初期標的核酸の濃度をＵＶ吸光測定装置を用いて測定し、細胞１個あたりのゲノムＤＮＡの長さを４．０×１０６ｋｂｐと仮定して換算したコピー数を表８に示した。
【００９４】
【表８】
2006087388.tif 000023
【００９５】
この時、増幅反応液中の標的核酸コピー数の計算式は、血液および組織由来ゲノムＤＮＡは１００，０００以上のコピー数を持つため、母集団は十分大きいとして（４）、（５）式を用いる。また、本実施例において尿由来ゲノムＤＮＡの初期コピー数が少かったため、初期コピー数Ｎ＝１５７５を与え（８）、（９）式より求める。以上の条件より、表８に示す増幅反応に必要なコピー数が与えられる。
【００９６】
【表９】
2006087388.tif 000024
【００９７】
本検査では１０種類の遺伝子検査領域を増幅する必要があるため、１０種類の反応液を準備する。従って、各反応液に増幅に必要なコピー数濃度の初期標的核酸を１μｌずつ分注する場合、最低でも１０μｌの初期標的核酸を容易する必要がある。しかし、ゲノムＤＮＡの全コピー数が非常に少なく、分析に必要量に満たない場合、信頼できる検査結果を得ることができないことが考えられる。この場合、本実施例では分析を行い、最終結果に判定に警告を意味する表記または記号を付加する。
３．核酸増幅反応液の調整と核酸増幅
反応液中の標的核酸のコピー数は、表９において決定された値以上の濃度（コピー数／μｌ）であればよく、初期標的核酸コピー数が十分存在する場合において、好ましくは１０，０００コピー程度に調整すると良い。従って、表１０のように血液および組織由来ゲノムＤＮＡを希釈し、１０，０００コピー／μｌの希釈液を調整し、尿由来ゲノムＤＮＡは少しでも濃度を高めるために、総量１５μｌの初期標的核酸溶液に対してエタノール沈殿法を用いて、総量を１０μｌに濃縮し、初期標的核酸濃度を１５７コピー数／μｌとした。
【００９８】
【表１０】
2006087388.tif 000025
【００９９】
そして、これらの本実施例では核酸増幅法としてＰＣＲ法を用い、核酸増幅試薬組成として表１１に示す組成と濃度で１０種類の増幅反応液を調整した。
【０１００】
【表１１】
2006087388.tif 000026
【０１０１】
これらの調整液に希釈または濃縮した初期標的核酸を１．０μｌ分注し、尿由来標的核酸以外は増幅反応液中の標的核酸中のコピー数を表２に示された値以上にして、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で２分間の初回変性の後、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応を行う条件とした。
４．ＳＳＣＰ解析法を用いたピーク比率測定
分析用サンプルの調整では次に示す順に試薬とサンプルを添加したが、添加する順序はこの例に限定されない。分析用の微量容器にＤＮＡの変性剤であるＦｏｒｍａｍｉｄ  ３６μｌにサイズ標準マーカとなる４ｎＭ  ＴＡＭＲＡ  ｓｉｚｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＡＢＩ社）を１．０μｌ添加し、ＤＮＡ増幅産物の原液を３．０μｌ加え、総量４０μｌに調整した。調整サンプルに対してサンプル導入条件として電圧２０ｋＶ時間５秒、泳動条件として電圧１５ｋＶ、時間７０分間でＳＳＣＰ電気泳動を行った。この時、増幅したＡ〜Ｊの１０種類の遺伝子検査領域に対して得られた２本のピークから、２つの異なる対立遺伝子のうち検出したい標的核酸の存在比率を測定した結果を表１２に示す。
【０１０２】
【表１２】
2006087388.tif 000027
【０１０３】
５．ピーク比率からの信頼区間の再検定とＬＯＨ判定
表１２の結果および（２）、（６）式から、各遺伝子検査領域の持つ判定の閾値と、それぞれの遺伝子検査領域における組織および尿の比率の推定できる上限値と下限値示した、そしてこれらを考慮した判定を行う。この場合、判定の判断方法としては、比率上限が判定閾値よりも下であれば陽性、比率下限が判定閾値よりも上であれば陰性、上限と下限の間に判定閾値が入っている場合は判定無効と判断できる。これらの結果を表１３に示す。
【０１０４】
【表１３】
2006087388.tif 000028
【０１０５】
このように、検査によって測定された比率をもとに、（２）、（３）、（６）、（７）式を用いて、再検定を行うことにより、統計学的に９５％の信頼度を持った検査結果を得ることが可能となる。本実施例は統計学的に９５％の信頼度を元に結果を判定したが、より好ましくは９９％を用いる。
（実施例３）血液中のウイルス核酸の検出
１．測定条件の決定
血液中に微量に含まれるウイルス核酸を検出する方法として、患者の血液から抽出した初期核酸に対してウイルスの持つ遺伝子配列に特異的なプライマーを用い、遺伝子増幅を行うことでウイルス核酸を検出できる。本実施例では、遺伝子増幅を行う際に、この初期核酸から一部核酸を分取して増幅試薬中に投入する場合、初期核酸中に０．０１％以上存在するウイルス核酸を９９％の信頼度で分取できる核酸コピー数を決定する実施例について以下に述べる。このとき、０．０１％以上のウイルス核酸を検出したいため、ｐ＝０．０００１が与えられ、９９％の信頼度における統計量Ｔ＝２．５８を与えることができる。
初期標的核酸のコピー数決定および増幅反応液中のコピー数決定
ヒト由来血液より、フェノール・クロロフォルム抽出法により抽出した患者のヒト血液由来核酸を標準の初期標的核酸として用い、初期標的核酸の濃度をＵＶ吸光測定装置を用いて測定し、細胞１個あたりのゲノムＤＮＡの長さを４．０×１０６ｋｂｐと仮定して換算したコピー数を表１４に示した。ただし、ウイルス核酸のコピー数は不明のため、ゲノム核酸のコピー数から決定することとする。
【０１０６】
【表１４】
2006087388.tif 000029
【０１０７】
この時、増幅反応液中の標的核酸コピー数の計算式は、血液由来ゲノム核酸は１００，０００以上のコピー数を持つため、母集団は十分大きいとして（１１）式を用いる。以上の条件より、表１５に示す増幅反応に必要な核酸量またはコピー数が与えられる。
【０１０８】
【表１５】
2006087388.tif 000030
【０１０９】
この結果、患者Ａについては、初期核酸を一部希釈し、分取することで、検査を行うことができる。しかし、患者Ｂの場合はゲノム核酸の全コピー数が少なく、分析に必要な量に達しないため、信頼できる検査結果を得ることができないことが考えられる。この場合、分析に用いないか、分析後の最終結果の判定に警告を意味する表記または記号を付加する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明の核酸検出または分析方法の主要部を示すフロー図。
【図２】初期核酸のコピー数を算出方法を示すフロー図。
【図３】標的核酸から分取するコピー数を決定する方法を示すフロー図。
【図４】初期核酸のコピー数調整方法を示すフロー図。
【図５】本発明が適用される核酸検出または分析装置の構成を示す概略図。
【図６】本発明が適用される核酸検出または分析装置の制御・解析部及びその他の機構を示す概略図。
【符号の説明】
【０１１１】
１…サンプル分注アーム部、２…アーム可動部、３…濃度測定部、４…遺伝子増幅部、５…原液サンプル保持部、６…調整試薬保持部、７…分析用サンプル保持部、９…検出部、１０…制御及び解析部。
【図１】
2006087388.tif 000031
【図２】
2006087388.tif 000032
【図３】
2006087388.tif 000033
【図４】
2006087388.tif 000034
【図５】
2006087388.tif 000035
【図６】
2006087388.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ２種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な２種類以上のプライマーを用いて、含まれている標的核酸の中で比率の最も少ない標的核酸を増幅する工程を含む請求項１１記載の核酸検出または分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明における、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ２種類以上の初期標的核酸試料を用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、初期標的核酸と同じ量比の増幅核酸量を得る方法は、図１に示される以下のステップで構成される。
１）該標的核酸の濃度を測定する。
２）初期標的核酸コピー数を決定する。
３）統計論理式を用いて初期標的核酸から分取し、増幅反応液中に投入する標的核酸コピー数を決定する。
４）該標的核酸を増幅する際の反応液中の該標的核酸コピー数が所定の値にできるように初期標的核酸を希釈または濃縮し、核酸増幅反応液を調整する。
５）核酸増幅を行う。
６）核酸を分析し、低コピー数の試料に警告を意味する表記または記号を付加する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【数１】
2006087388.tif 000037
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
Ｐ（ｂ）：分取液中にｂコピー含まれる確率
ｐ：初期標的核酸中のある一種類の標的核酸の割合
ｎ：初期標的核酸から分取するコピー数
ｂ：分取液中に含まれる分析に用いる核酸のコピー数
また、分取する核酸のコピー数をｎとし、ｎｐ＞５かつｎ（１−ｐ）＞５を満たす時、これは近似的に平均ｐ、分散ｐ（１−ｐ）／ｎの正規分布に従う。従って、以下のように分取すべき標的核酸コピー数値を統計学的に求めることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
工程８）は核酸増幅を行う工程である。核酸増幅を行わずに直接分析反応を行う場合は本工程を行う必要はなく、工程９）に移る。核酸増幅を行う場合について、本工程の核酸増幅を詳細に説明するが、本工程は核酸増幅が可能であればよく、以下の詳細な例に限定されない。