(57)【要約】【課題】本発明の目的は、５種以上の呼吸器疾患ウイルスのうち一つ以上を増幅させることができるプライマーセットを提供すること。【解決手段】配列番号１〜配列番号２６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから選択される５種以上の呼吸器疾患を引き起こすウイルスの標的配列を同時に増幅させることができる核酸プライマーセット、該増幅された産物を検出するためのプローブオリゴヌクレオチド、該プライマーセットおよび該プローブオリゴヌクレオチドを利用したウイルスの同時検出方法である。【選択図】図１
2006180878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上の核酸プライマーセット。
【請求項２】
配列番号１１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチド、または配列番号２５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のプライマーセットをさらに含む請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項３】
試料から核酸を得るステップと、
請求項１または２に記載の核酸プライマーセットを利用して前記核酸を増幅するステップと、
前記増幅産物を検出するステップとを含み、標的ウイルスに特異的な増幅産物が存在する場合に、前記標的ウイルスが存在することが決定されることを特徴とする、ウイルスの検出方法。
【請求項４】
前記試料から核酸を得るステップは、
試料からＲＮＡを分離するステップと、
分離されたＲＮＡからｃＤＮＡを得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅するステップは、ＰＣＲによって行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記検出するステップは、前記増幅産物をプローブとハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションの程度を検出するステップを含み、前記プローブは、配列番号２７〜配列番号５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブは、配列番号２７または２８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号２９または３０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３１または３２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３３または３４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３５または３６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３７または３８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３９または４０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４１または４２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドと、
配列番号４３または４４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４５または４６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４７または４８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４９または５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブは、配列番号２７〜配列番号５０のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブは、マイクロアレイの基板上に固定化されていることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２７〜配列番号５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ｃｏＶ）、ヘルペス・ゾスターウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ２）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ３）、インフルエンザウイルスＡ（ＩＶＡ）、インフルエンザウイルスＢ（ＩＶＢ）、呼吸器多核体ウイルスＡ（ＲＳＶＡ）および呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶＢ）のうち一つ以上を検出するためのプローブオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２７または２８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号２９または３０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３１または３２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３３または３４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３５または３６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３７または３８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号３９または４０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４１または４２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドと、
配列番号４３または４４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４５または４６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４７または４８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号４９または５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１０に記載のプローブオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２７〜配列番号５０のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１０に記載のプローブオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のうちいずれか１項に記載のプローブオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５種以上のウイルス呼吸器疾患を引き起こすウイルスの標的配列のうち一つ以上を増幅させることができる核酸プライマーセット、前記増幅された産物を検出するためのプローブおよびそれらを利用したウイルスの検出方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器感染は、重要な感染疾患による死亡原因中の一つである。急性呼吸器疾患の７５％ほどはウイルスによって引き起こされる。人間に呼吸器疾患を引き起こす最も目につくウイルスには、はしかウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ｃｏＶ：ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペス・ゾスターウイルス（ＶＺＶ：ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１：ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ２）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ３）、インフルエンザウイルスＡ（ＩＶＡ：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）、インフルエンザウイルスＢ（ＩＶＢ）、呼吸器多核体ウイルスＡ（ＲＳＶＡ：ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）および呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶＢ）が含まれる。これらウイルスを迅速に特異的に検出することは、呼吸器疾患の診断、予防および治療に必須である。
【０００３】
特許文献１には、ＨＰＩＶ１配列を特異的に増幅できるプライマーを逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）に使用してＨＰＩＶ１を検出する方法が開示されている。また、特許文献２には、七種の呼吸器疾患関連ウイルス（ＨＰＩＶ１，２，３、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＲＳＶおよびアデノウイルス）を同時に検出できる方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許第５，７４４，２９９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１３０４９７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、以上のような従来発明によっても、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ｃｏＶおよびＶＺＶを検出できる方法は開示されていない。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、５種以上の呼吸器疾患ウイルスのうち一つ以上を増幅させることができるプライマーセットを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記プライマーセットを利用して５種以上の呼吸器疾患ウイルスのうち一つ以上を検出する方法を提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、１３種のウイルスのうち一つ以上を検出するのに使われるプローブセットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記本発明の課題を解決するために、本発明は、配列番号１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、から構成される群から選択される一つ以上の核酸プライマーセットを提供する。
【０００９】
前記本発明の他の課題を解決するために、本発明は、試料から核酸を得るステップと、前記記載の核酸プライマーセットを利用して前記核酸を増幅するステップと、前記増幅産物を検出するステップとを含み、標的ウイルスに特異的な増幅産物が存在する場合に、前記標的ウイルスが存在することが決定されることを特徴とする、ウイルスの検出方法を提供する。
【００１０】
前記本発明のさらに他の課題を解決するために、本発明は、配列番号２７〜配列番号５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ｃｏＶ）、ヘルペス・ゾスターウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ２）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ３）、インフルエンザウイルスＡ（ＩＶＡ）、インフルエンザウイルスＢ（ＩＶＢ）、呼吸器多核体ウイルスＡ（ＲＳＶＡ）および呼吸器多核体ウイルスＢ（ＲＳＶＢ）のうち一つ以上を検出するためのプローブオリゴヌクレオチドを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸プライマーセットによれば、５種以上の呼吸器疾患ウイルスのうち一つ以上を特異的に増幅させることができる。さらに、本発明の核酸プライマーセットによれば、５種以上の呼吸器疾患を引き起こすウイルスを一つの反応で増幅可能である。本発明の検出方法によれば、５種以上の呼吸器疾患を引き起こすウイルスを高い特異性で同時に検出可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の望ましい実施例を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、配列番号１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、から構成される群から選択される一つ以上の核酸プライマーセットを提供する。
【００１４】
本発明の核酸プライマーセットは、配列番号１１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号１９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチド、または配列番号２５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドと、から構成される群から選択される一つ以上のプライマーセットをさらに含む核酸プライマーセットである。
【００１５】
本発明の核酸プライマーセットは、呼吸器疾患を引き起こすとされている５種以上のウイルス種を増幅できるオリゴヌクレオチド対を含むものである。本発明の核酸プライマーセットは、１つの増幅反応で複数個の標的配列を増幅するのに使われうる。前記増幅反応は、多重ＰＣＲ反応になりうるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の核酸プライマーセットに含まれている各プライマー対は、次のような特性を有し、呼吸器疾患と関連した５種以上のウイルスを同時に検出するのに使われうる。
【００１７】
（１）配列番号１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、はしかウイルスに特異的なプライマー対であり、６１菌株のはしかウイルスのＦ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００１８】
（２）配列番号３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、エンテロウイルスに特異的なプライマー対であり、３菌株のエンテロウイルスの５’ＵＴＲ（ポリ蛋白質遺伝子）領域の保存領域から選択されたものである。
【００１９】
（３）配列番号５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ライノウイルスに特異的なプライマー対であり、６菌株のライノウイルスの５’ＵＴＲの保存領域から選択されたものである。
【００２０】
（４）配列番号７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ−ｃｏＶに特異的なプライマー対であり、７５菌株のＳＡＲＳ−ｃｏＶのＧＤ６９遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２１】
（５）配列番号９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＶＺＶに特異的なプライマー対であり、７菌株のＶＺＶのＯＲＦ５４遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２２】
（６）配列番号１１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、アデノウイルスに特異的なプライマー対であり、３１菌株のアデノウイルスのＨｅｘｏｎ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２３】
（７）配列番号１３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１に特異的なプライマー対であり、４３菌株のＨＰＩＶ１のＨＮ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２４】
（８）配列番号１５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ２に特異的なプライマー対であり、６菌株のＨＰＩＶ２のＨＮ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２５】
（９）配列番号１７の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ３に特異的なプライマー対であり、１４菌株のＨＰＩＶ３のＨＮ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２６】
（１０）配列番号１９の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＩＶＡに特異的なプライマー対であり、１８６菌株のＩＶＡのＭＰ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２７】
（１１）配列番号２１の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＩＶＢに特異的なプライマー対であり、３５菌株のＩＶＢのＮＰ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２８】
（１２）配列番号２３の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチド、または配列番号２５の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐであるオリゴヌクレオチドは、ＲＳＶＡおよびＲＳＶＢに特異的なプライマー対であり、２８菌株のＲＳＶＡおよびＲＳＶＢのＦ遺伝子の保存領域から選択されたものである。
【００２９】
本発明において、公知のデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）から得たウイルス配列を公知のプログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１５，米国）を利用して分析し、各ウイルスに特異的なプライマーセットを選択した。まず、さまざまなウイルスの菌株から保存領域を確認し、それら領域からプライマー対を選択した。対応する標的配列である標準ウイルス試料をテンプレートとして、選択したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、各ウイルスが特異的に増幅されるということを確認した。また、本発明で使われる各プライマー対を用いて、他のプライマー対の存在下でＰＣＲを行う場合、すなわち多重ＰＣＲを行うと、それぞれ対応するＰＣＲ産物を得ることができる。これは、本願発明のプライマーセットに含まれるプライマーは、分子内、または分子間の相互干渉によってＰＣＲ反応を阻害することなしに重合反応を介して鎖を延長できるということを表す。本発明の各プライマー対から増幅されるＰＣＲ産物は、互いに異なる長さであるために、増幅産物を電気泳動などの方法で容易に区別することができる。
【００３０】
本発明はまた、試料から核酸を得るステップと、前記核酸プライマーセットを利用して前記核酸を増幅するステップと、前記増幅産物を検出するステップとを含み、標的ウイルスに特異的な増幅産物が存在する場合に、前記標的ウイルスが存在することが決定されることを特徴とする、ウイルスの検出方法を提供する。
【００３１】
本発明において、前記試料から核酸を得るステップは、当業界に公知の任意の核酸抽出方法が使われうる。例えば、フェノールクロロホルム抽出法、核酸に結合する固相物質を利用した精製法（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号明細書）が使われうる。
【００３２】
本発明の一具現例として、前記試料から核酸を得るステップは、試料からＲＮＡを分離するステップと、分離されたＲＮＡからｃＤＮＡを得るステップとを含むものである。ｃＤＮＡを得るステップは、例えば、逆転写酵素を利用してなされうる。逆転写酵素を利用する逆転写酵素反応は、ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれるＰＣＲ反応を用いてもよい。
【００３３】
本発明の方法において、前記増幅するステップは、ＰＣＲによって行われうる。
【００３４】
本発明の方法において、前記検出するステップは、前記増幅産物をプローブとハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションの程度を検出するステップを含み、前記プローブは、配列番号２７〜配列番号５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００３５】
本発明の方法において、前記プローブは、配列番号２７または２８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号２９または３０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号３１または３２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号３３または３４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号３５または３６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号３７または３８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号３９または４０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号４１または４２の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号４３または４４の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号４５または４６の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号４７または４８の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号４９または５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドとからなる群から選ばれる一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むものでありうる。
【００３６】
前記配列番号２７または２８；２９または３０；３１または３２；３３または３４；３５または３６；３７または３８；３９または４０；４１または４２；４３または４４；４５または４６；４７または４８；４９または５０；の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドのプローブ配列は、それぞれはしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ｃｏＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＲＳＶＡおよびＲＳＶＢに特異的なものであり、各オリゴヌクレオチドは本発明の核酸プライマーセットから増幅されたＰＣＲ産物に特異的に結合する。本発明のプローブ配列は、本発明の核酸プライマーセットによって増幅される標的配列のうち保存領域から選択されたものである。
【００３７】
本発明において、前記プローブセットは膜、ガラスまたはプラスチック重合体のような固体支持体の表面に固定化されたものでありうる。プローブを固体支持体の表面に固定化する過程は、当業界に公知の任意のプローブ固定化方法が使われうる。例えば、８０℃でのベーキングまたはＵＶ架橋化が使われうる。また、活性化された固体基板上でプローブ重合体がフォトリソグラフィによって合成される方法（例えば、ＷＯ９２／１０００９２明細書）またはすでに合成されたプローブを活性化された基板の表面に共有結合させる方法（スポッティング法）などが使われうる。本発明の方法の一具現例で、前記プローブは、マイクロアレイの基板上に固定化されているものでありうる。
【００３８】
本発明の標的増幅産物は、検出を促進するために標識されていてもよい。核酸を標識するのに使われる標識物質は、当業界に公知である。例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５のような蛍光を発する物質を使用することができる。その他、前記標識物質は、検出可能な信号を発生させることができるものならば、いかなるものでも可能である。例えば、放射能物質、または発色物質を生成させることができる酵素が含まれる。
【００３９】
本発明はまた、配列番号２７〜配列番号５０の配列に存在する１０個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが１０ｂｐ〜１００ｂｐである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ｃｏＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＲＳＶＡおよびＲＳＶＢのうち一つ以上を検出するためのプローブオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４０】
本発明のさらに他の具現例は、配列番号２７〜配列番号５０のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブである。
【００４１】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドプローブセットが固定化されているマイクロアレイを提供する。
【００４２】
本発明のプローブオリゴヌクレオチドおよびマイクロアレイについては、前記の本発明の方法で説明した通りである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：呼吸器疾患を引き起こす１３種のウイルスに特異的な標的配列を増幅するためのプライマーの選択
本実施例では、１３種のウイルス、すなわちはしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ｃｏＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＲＳＶＡおよびＲＳＶＢに特異的な標的配列を検出できるプライマーセットを設計した。
【００４５】
まず、Ｇｅｎｂａｎｋから呼吸器疾患を引き起こすウイルスの配列を入手してＤＮＡＳＴＡＲプログラムを利用し、それらからそれぞれ保存された領域を選択した。分析に使われた配列の数（菌株の数）および配列確認番号および保存された領域は、下記表１の通りである。
【００４６】
【表１−１】
2006180878.tif 000003
【００４７】
【表１−２】
2006180878.tif 000004
【００４８】
【表１−３】
2006180878.tif 000005
【００４９】
【表１−４】
2006180878.tif 000006
【００５０】
これら保存領域から、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ｃｏＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＲＳＶＡおよびＲＳＶＢにそれぞれ特異的な配列番号１〜配列番号２６のプライマー対を選択した。
【００５１】
実施例２：１３種の呼吸器疾患と関連したウイルスのアガロースゲル上での検出
本実施例では、１３種の呼吸器疾患と関連したウイルスを培養し、それらからゲノムを分離した後、配列番号１〜配列番号２６のプライマーセットをプライマーとして使用した多重ＲＴ−ＰＣＲを行い、その産物をアガロースゲル上で確認した。
【００５２】
（１）ウイルス培養物の準備
各ウイルスＤＮＡゲノムは、５０μｌ培養溶液に５Ｎ  ＮａＯＨ５．５μｌを添加して最終濃度を０．５Ｎに調整した後、３７℃で１５分間変成させ、５Ｎ  ＨＣｌを５．５μｌ入れて中和させた後、Ｈ２Ｏで希釈した。ウイルスのＲＮＡゲノムは、約６００μｌのＴｒｉＺｏｌ−試薬を使用し、２００μｌの細胞上澄み液から分離した。エタノールで沈殿された最終沈殿物は、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）蒸溜水に再懸濁して−２０℃に保管するか、または直ちにＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００５３】
（２）逆転写およびＰＣＲ
前記得られた１３種のウイルス由来核酸試料をテンプレートとして、ヘキサマーやオリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成し、反応は５×バッファ３、０．５μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μｌ、ｄＮＴＰ  ３μｌ、ランダムヘキサマー、スーパースクリプトＩＩ  ＲＴａｓｅ（逆転写酵素）０．５μｌ、ＲＮＡ  ５μｌを使用し、最終体積をＤＥＰＣ処理蒸溜水を使用して１５μｌに調整し、３７℃で４０分、４２℃で９０分間反応させた後、９５℃で５分間酵素を不活性化にした。前記ｃＤＮＡ１０μｌ、ｄＮＴＰ４μｌ、配列番号１〜配列番号２６を含むプライマーをそれぞれ１μｌ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）ずつ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌを含むＰＣＲ反応混合液を９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７０℃で３０秒の熱サイクルを３０回行い、ウイルスゲノムから標的配列を増幅した。
【００５４】
（３）増幅産物の検出
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動によって確認した。図１は、配列番号１〜配列番号２６のプライマーセットを利用して多重ＰＣＲを介して標的核酸を増幅し、その増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を表す図面代替写真である。図１に表したように、１３個の標的配列を確認することができ、それは、多重ＰＣＲ中で配列番号１〜配列番号２６のプライマーセットは、相互標的配列特異性に影響を及ぼさないということを表す。図１で、各ＰＣＲ産物の長さは、下記表２に表した通りである。
【００５５】
【表２】
2006180878.tif 000007
【００５６】
実施例３：１３種の呼吸器疾患と関連したウイルスのマイクロアレイ上での検出
本実施例では、実施例２で増幅された増幅産物をマイクロアレイ上に固定化されているプローブとハイブリダイズさせ、そのハイブリダイゼーションの程度を検出することにより、特定のウイルス種から増幅された増幅産物の存否を確認した。
【００５７】
全てのフォワードプライマーには、５’末端がＣｙ３で標識された配列番号５１のオリゴヌクレオチドが連結されたプライマーを使用し、全てのリバースプライマーには、５’末端がＣｙ３に標識された配列番号５２のオリゴヌクレオチドが連結されたプライマーを使用したことを除いては、実施例２の試料準備およびＲＴ−ＰＣＲと同様の手法で実験を行った。増幅産物を下記のようにマイクロアレイ上で検出した。
【００５８】
（１）プローブの設計
ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを利用して各ウイルスゲノム増幅された領域からプローブを選択し、その配列は表３に表した通りである。
【００５９】
【表３】
2006180878.tif 000008
【００６０】
（２）前記プローブの固定化されたマイクロアレイの製造
本実施例に使われるマイクロアレイは、アミン化合物で活性化された基板上に配列番号２７〜配列番号５０のプローブオリゴヌクレオチドを添加し、５０℃で３０分間反応させることによって固定化した。得られたマイクロアレイに、前記のような１３種の各ウイルスから増幅された核酸が含まれている試料を前記ウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているスポットに添加し、１６℃で１２時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６１】
（３）検出
ハイブリダイゼーション反応後、洗浄バッファで洗浄した後、５４０ｎｍで蛍光を測定した。図２は、配列番号２７〜配列番号５０のプローブオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイに標的増幅産物をハイブリダイズさせた結果を表す図面代替写真である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の核酸プライマーセットおよびプローブオリゴヌクレオチド、それらを利用した呼吸器疾患ウイルスの検出方法は、例えば、ウイルス検出関連の技術分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】配列番号１〜配列番号２６のプライマーセットを利用して多重ＰＣＲを介して標的核酸を増幅し、その増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を表す図面代替写真である。
【図２】配列番号２７〜配列番号５０のプローブセットが固定化されているマイクロアレイに標的増幅産物をハイブリダイズさせた結果を表す図面代替写真である。
【図１】
2006180878.tif 000009
【図２】
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【配列表】
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