(57)【要約】【解決課題】  偽陽性判定の恐れが無い、タンパク質データの判定方法を提供する。【解決手段】  タンパク質試料の質量分析の実測値をメモリに記憶し、演算装置が前記実測値とデータベースとに基づいてタンパク質の同定を行うデータ処理方法において、前記演算装置は、前記実測値と理論値との検量線を試料の測定の都度作成し、この検量線に基づいて前記実測値から得られるピークリストを較正し、較正されたピークリストとデータベースとを照合して、前記タンパク質を同定する。【選択図】  図１
2006113034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質試料の質量分析の実測値をメモリに記憶し、演算装置が前記実測値とデータベースとに基づいてタンパク質の同定を行うデータ処理方法において、
前記演算装置は、前記実測値と理論値との検量線を試料の測定の都度作成し、この検量線に基づいて前記実測値から得られるピークリストを較正し、較正されたピークリストとデータベースとを照合して、前記タンパク質を同定するように構成されたタンパク質データの分析方法。
【請求項２】
前記演算装置は、ペプチドの実測値と、当該実測値と理論値との誤差とをプロットし、プロットしたポイントを最小二乗法により計算した直線を前記検量線として出力する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記演算装置は、前記誤差を計算してその標準偏差（σ値）を計算し、その標準偏差に基づいて不適なポイントを除外して残ったポイントで再度検量線を作成するようにした請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記演算装置は、前記検量線の作成を規定回数行うか、又は、残ったポイント数が設定したペプチド数になるまで行い、最後の結果を正規な検量線として出力するようにした請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記演算装置は、較正されたピークリストとデータベースを照合する際の、前記実測値と理論値との差に相当する許容値を小さく設定し、実測値と、推定されたペプチド又はアミノ酸の配列との理論値の差が、この許容値の範囲外にある実測値を除いた値からなる検索結果が得られるように構成された、請求項１−４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項７】
請求項６記載のプログラムが記憶された記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はタンパク質を質量分析し、この分析データを公知タンパク質のデータベースと照合して、タンパク質の同定を行う際のデータ処理方法及びそれをコンピュータに実行させるためのプログラムに関するものである。
【背景技術】  従来プロテオーム解析技術は、検出されたタンパク質をプロテアーゼ処理してペプチド混合物を得るまでの資料調整技術と、質量分析による解析技術、得られたデータを元にしてデータベース検索することでタンパク質を同定する技術とから構成されている。
タンパク質を同定する技術として、ペプチド・マス・フィンガープリンティング法が知られている。この方法は、特定のタンパク質をトリプシンなどのプロテアーゼで消化することによって得られる各ペプチドの質量の組み合わせが、個々のタンパク質に確率的に固有のものであることを利用し、この質量の組み合わせを情報としてデータベース検索してタンパク質を同定するものである。
あるタンパク質の混合液から、ＳＤＳ電気泳動法などを用いて個々のタンパク質に分離する。電気泳動後、目的とするタンパク質のバンド又はスポットが見つかり、これを同定するには、そのバンド又はスポットを切り出し、ゲル内でプロテアーゼ消化する。その後、生成ペプチドを回収して、質量分析するサンプルとして用いる。
質量分析データからピークリストファイルが作成される。これは、質量分析装置に付帯してある解析エンジンを利用して行われ、先ず、検出スペクトルをモノアイソトープピークだけにする。次いで、どの強度以上のピークを選択するかをスレッシュホールドで設定する。この結果、選んだピークのピークリストファイルが得られる。
次いで代表的な検索サイトにアクセスして、タンパク質の同定を行う。このような検索サイトとして、ＭＳ−Ｆｉｔがある。また、代表的な検索ソフトウエアとしては、Ｍａｓｃｏｔ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（いずれも商品名）が存在する。ＭＳ解析の測定値からのデータベース検索により、同定の確からしさ（スコア）とヒットしたタンパク質の数との関係を示す特性が得られる。
ペプチド・マス・フィンガープリンティング法では、試料の量が少ないと観測されるペプチドの本数が少なくなり同定精度が十分とは言えなくなる。そこで、ＭＳ／ＭＳ解析が知られている。この解析方法は、特定の質量（質量と電荷の比（ｍ／ｚ））を持つ分子だけを選び出し、アルゴンなどのガスと衝突させることでこれを断片化し、断片の質量を分析することで試料分子の構造情報を得る方法である。この分析では、アミノ酸残基間のペプチド結合部分がランダムに開裂するが、主として電荷を持つアミノ末端（αアミノ基）、或いはカルボキシル末端（リジン／アルギニン）を含む様々な長さの内部断片がスペクトルとして検出される。ピーク間隔に２０種類のアミノ酸のどれかを当てはめていくことにより順次アミノ酸配列を推定できる。検索ソフトウエアのエンジンでは候補ペプチドの理論値と実測値とを比較してこれが同一である可能性を判定する。このＭＳ／ＭＳ解析法では、液体クロマトグラフィーを用いて、タンパク質をプロテアーゼで消化した消化物を質量分析装置にオンラインで導入して、イオン化する事が行われている（特開２００４−５３５９３号公報）。
【特許文献１】  特開２００４−５３５９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  しかしながら、従来の方法では、ＭＳデータをデータベースと照合して、タンパク質の同定をする際、正しいタンパク質を誤って他のタンパク質と判定してしまう、偽陽性判定の問題があった。従来の検索エンジンでは、ペプチドやアミノ酸の質量の実測データに対して許容範囲を設定し、この許容範囲を超える実測データをタンパク質の同定の検索処理から排除することが行われていたが、この許容値を大きく取らざるを得ず、しかも許容値が固定的であったために、偽陽性判定の問題を避けることができなかった。
本発明はこのような問題を解消するために、前記偽陽性判定の恐れが無い、タンパク質データの判定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】  本発明は、タンパク質の質量分析データを検量線で較正することにより許容値を小さく設定することを可能にして、既述の問題を解決しようとしたものである。即ち本発明は、タンパク質試料の質量分析の実測値をメモリに記憶し、演算装置が前記実測値とデータベースとに基づいてタンパク質の同定を行うデータ処理方法において、前記演算装置は、前記実測値と理論値との検量線を試料の測定の都度作成し、この検量線に基づいて前記実測値から得られるピークリストを較正し、較正されたピークリストとデータベースとを照合して、前記タンパク質を同定するように構成されたことを特徴とするものである。
本発明に係わるタンパク質の質量分析は、ペプチド・マス・フィンガープリンティング法のほか、ＭＳ／ＭＳ分析法も対象となる。ＭＳ／ＭＳ分析の親マス及び／又は子マスの分析データが較正される。
検量線の例として、ペプチドの実測値と、当該実測値と理論値との誤差とをプロットし、プロットしたポイントを最小二乗法により計算した直線がある。前記演算装置は、前記誤差を計算してその標準偏差（σ値）を計算し、その標準偏差に基づいて不適なポイントを除外して残ったポイントで再度検量線を作成することが好適である。また、前記演算装置は、前記検量線の作成を規定回数行うか、又は、残ったポイント数が設定したペプチド数になるまで行い、最後の結果を正規な検量線として出力するようにした。またさらに、前記演算装置は、較正されたピークリストとデータベースを照合する際の、前記実測値と理論値との差に相当する許容値を小さく設定し、実測値と、推定されたペプチド及び／又はアミノ酸の配列との理論値の差が、この許容値の範囲外にある実測値を除いた値からなる検索結果が得られるように構成された。
本発明はさらに、既述の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであり、また、このプログラムが記憶された、ＣＤＲＯＭ、ＤＶＤＲＯＭ、ハードディスクなどの記憶媒体である。
【発明の効果】  以上説明したように、本発明によれば、タンパク質の質量分析データを検量線で較正することにより、許容値を公知の検索エンジンよりも例えば１０分の１以下に小さく設定することができるために、試料タンパク質の同定に際して偽陽性判定の問題を無くした検索が可能になるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】  図１は、本発明に係わるデータ処理方法を実行するためのコンピュータシステムのブロック図である。このシステムは、処理プログラムや質量分析データを記憶するメモリ１０と、質量分析データに基づいて検量線を作成し、質量分析データを較正・補正するデータ処理部１２と、データ処理部での処理結果を出力するプリンタやモニタなどの出力部１４と、タンパク質の検索データベース（検索サイト）への接続を制御する接続部１６とから備えて構成されている。このシステムは、マイクロコンピュータによって実現される。
次に、データ処理部の動作を図２に示すフローチャートに基づいて説明する。データ処理部１２は、先ず、質量分析データを質量分析装置から得て、これをメモリ１０に一時記憶する（２００）。質量分析データには、ＭＳ値のほかＭＳ／ＭＳ値がある。
次いで、試料タンパク質の質量分析データ（ピークリスト）に含まれるペプチド（ＭＳ／ＭＳ法ではアミノ酸）のイオンスコアがスレッシュホールドより大きいか否かをチェックして、これ未満のデータを後述の検量線作成のためのポイントから除外する（２０２）。
次いで、検索サイトにアクセスして（２０４）、ペプチド（及び／又はアミノ酸）の実測値をｘ軸とし、推定されたペプチドの配列の配列と実測値との差であるＤｅｌｔａ（誤差）をｙ軸として全てのペプチドをプロットする（２０６）。
プロットしたポイントを最小二乗法により計算して直線の検量線を作成する。各実側値における検量線上のｙ値と、Ｄｅｌｔａ（誤差）値の差を計算してその標準偏差（σ値）を計算する。この差が２＊σ値より大きいポイントを除外して残ったポイントで再度検量線を作成する。この操作を設定した規定回数繰り返すか、ポイント数がプロテインの確認で設定したペプチド数になるまで行い、最後の結果を正規な検量線とする。
図３は検量線の一例を示すものであり、ペプチドごとに実測値と既述の誤差値とをプロットしたものであり、検量線としてｙ＝１．００２３（ａ）ｘ−０．０１８（ｂ）、（ａは傾き、ｂは切片）が得られる。
次に、得られた検量線で質量分析データを較正する。この較正は子ＭＳ及び又は親ＭＳのデータに対して行われる。子マスの較正は、較正値＝ＭＳＭＳ実測値−ｙ、のようにして行われる（２０８）。
親ＭＳデータの較正については、最初に実測値に変換する。即ち、実測値＝（ピークリストの親マス値−１．００７８）＊ｃｈａｒｇｅ。ｃｈａｒｇｅは、ピークリストで、ｃｈａｒｇｅ＝３＋のように設定されている。さらに、得られた実測値に、較正値＝ＭＳ値−ｙ、のように検量線の式を適用する。ＭＳＭＳ値はピークリストの値がそのまま実測値であるが、ＭＳ値の場合は上記の変換が必要である。最後に、ピークリストの親マス較正値＝（較正値÷ｃｈａｒｇｅ）＋１．００７８を行い、元のピークリストに戻す。
以上の処理により、質量分析データの実測値（ピークリスト）の較正が完了する。次いで、許容値が設定される（２１０）。この許容値としては、２＊σにするかなど適宜設定される。本発明では、タンパク質の質量分析データを検量線で較正しているために、許容値を公知の検索エンジンよりも例えば１０分の１以下に小さく設定することができる。
次いで、この許容値を超えるペプチド或いはアミノ酸の実測値（ピーク）を除いて、データベースで再度検索する（２１２）ことで、偽陽性の恐れが無いタンパク質の同定結果を得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のシステム構成図である。
【図２】  データ処理装置の動作フローチャートである。
【図３】  検量線の一例である。
【符号の説明】
１０  メモリ、１２  データ処理部、１４  出力部、１６  タンパク質の検索データベース（検索サイト）への接続を制御する接続部
【図１】
2006113034.tif 000003
【図２】
2006113034.tif 000004
【図３】
2006113034.tif 000005