(57)【要約】【課題】簡易かつ安価で高効率なハイブリダイゼーション効果をもたらすハイブリダイゼーションの方法を提供することである。【解決手段】ＤＮＡプローブ１２が固定された基材１０上に検体用ＤＮＡが含まれたハイブリダイゼーション溶液１４を滴下し、その滴下されたハイブリダイゼーション溶液１４に透明性のカバー部材１６を被せ、その後インキュベート処理を行なうハイブリダイゼーションの方法であって、前記インキュベート処理は、前記カバー部材１６が被せられた基材１０を前記カバー部材１６が底面側に位置するように反転させた状態で行なうことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡプローブが固定された基材上に検体用ＤＮＡが含まれたハイブリダイゼーション溶液を滴下し、その滴下されたハイブリダイゼーション溶液にカバー部材を被せ、その後インキュベート処理を行なうハイブリダイゼーションの方法であって、
前記インキュベート処理は、前記カバー部材が被せられた基材を前記カバー部材が底面側に位置するように反転させた状態で行なうことを特徴とするハイブリダイゼーションの方法。
【請求項２】
前記反転処理の際に前記基材に振動を加えることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーションの方法。
【請求項３】
前記反転処理と、カバー部材が上方側に位置するように基材を再反転させる再反転処理と、を繰り返し複数回行なうことを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリダイゼーションの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学分野での遺伝子解析において検体から特定の配列を有するＤＮＡを検出するハイブリダイゼーションの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生物学、医学分野での遺伝子解析において検体から特定の配列を有するＤＮＡを検出する方法として、ハイブリダイゼーションの方法が用いられている。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ、ＲＮＡ自体、さらにはそれらを利用した検査に必須の過程である。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、ＤＮＡ（ＲＮＡ、 細胞、染色体等）プローブが固定されたスライドガラスなどの基材（ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレー）上に検体用ＤＮＡ（ＲＮＡ）が含まれたハイブリダイゼーション溶液を滴下し、その滴下されたハイブリダイゼーション溶液をカバーガラスで被い、湿箱中でインキュベートすることにより行なわれている（特許文献１参照）。このハイブリダイゼーションの効率は、核酸を利用した検査や研究の成否を左右する。従って、ハイブリダイゼーションの効率を高める方法の開発は、極めて重要となる。
【０００３】
現在、ハイブリダイゼーションの効率を高める種々の方法が提唱されているが、もっとも日常的に利用されているのは、単に長時間静置する方法である。インキュベーション時間は、目的によって異なるが、chromosomal comparative genomic hybridization (CGH)、 array CGH等では、長時間のハイブリダイゼーションを必要とするとともに、ＤＮＡプローブがスライドガラスの広い範囲に存在しているため、場所間においてハイブリダイゼーションに差がないことが要求される。このことは、精度の高い解析に特に要求される。
【０００４】
【特許文献１】特開平１５−１２５７５１号公報の段落［０００７］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述したような方法では、長時間のインキュベーションにも拘らず、ハイブリダイゼーションの効率は、高くなく、スライドガラス上での場所間格差も目立つことが多い。これらの問題を解決する方法として、強制的にハイブリダイゼーション液を撹拌させる装置が市販されているが、高価であるし、その効果についても必ずしも期待どおりのものではない。
【０００６】
そこで、本発明は、簡易かつ安価で高効率なハイブリダイゼーション効果をもたらすハイブリダイゼーションの方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上の目的を達成するため、本発明は、ＤＮＡプローブが固定された基材上に検体用ＤＮＡが含まれたハイブリダイゼーション溶液を滴下し、その滴下されたハイブリダイゼーション溶液にカバー部材を被せ、その後インキュベート処理を行なうハイブリダイゼーションの方法であって、前記インキュベート処理は、前記カバー部材が被せられた基材を前記カバー部材が底面側に位置するように反転させた状態で行なうことを特徴とする。
【０００８】
以上のように本発明に係るハイブリダイゼーションの方法においては、カバー部材が底面側に位置するように反転させた状態でインキュベート処理を行なうことによって、場所的格差を生じさせずにハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【０００９】
本発明に係るハイブリダイゼーションの方法において、前記反転処理の際に前記基材に振動を加えることが好ましく、また前記反転処理と、カバー部材が上方側に位置するように基材を再反転させる再反転処理と、を繰り返し複数回行なうことが好ましい。このような処理を行なうことによって、より場所的格差を生じさせずにハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【発明の効果】
【００１０】
以上のように、本発明によれば、カバー部材が底面側に位置するように反転させた状態でインキュベート処理を行なうという簡易な方法により、場所的格差を生じさせずにハイブリダイゼーションを行なうことができるので、簡易かつ安価で高効率なハイブリダイゼーション効果をもたらすハイブリダイゼーションの方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明に係るハイブリダイゼーションの方法の実施の態様について図面に基づいて説明する。図１は、本発明に係るハイブリダイゼーションの方法に使用されるスライドガラスの平面図である。このスライドガラス１０は、ＤＮＡ（ＲＮＡ、 細胞、染色体、組織等）プローブ１２が固定され、その上に検体用ＤＮＡ（ＲＮＡ）が含まれたハイブリダイゼーション溶液１４を滴下し、その滴下されたハイブリダイゼーション溶液１４をカバーガラス１６で被ったものである。本発明に係るハイブリダイゼーションの方法においては、図２に示すように、このスライドガラス１０を反転させて、カバーガラス１６を底面側に位置させる。この反転させた状態で、湿潤箱内に静置して、インキュベート処理を行なうことによって、ハイブリダイゼーションを実行する。本実施の態様において、湿潤箱内における静置は、スライドガラスの長手方向端部のみを２本の支持棒１８、１８によって支持することによって行なう。支えのないカバーガラス１６は、ハイブリダイゼーション溶液１４の表面張力によって保持される。なお、カバーガラス１６の一部をラバーセメントなどによって保持するように構成しても良い。
【００１２】
本実施例の態様に係るハイブリダイゼーションの方法を用いて、chromosomal CGHを行なった。本実施例においては、ＤＮＡとして胃腺癌desuを用いた。胃癌組織からmicrodissection（マイクロダイセクション）を用いて型通りに抽出したＤＮＡをニックトランスレーション法を利用してSpectrumGreen （Vysis社）にて標識する。一方、対照としてリンパ球から抽出したＤＮＡを同様にSpectrumOrange（Vysis社）にて標識する。それぞれ２００ｎｇを１０μｇのＣｏｔ−１に混合し、１０μlのハイブリダイゼーション溶液に溶解する。これについて分裂中期染色体とともにハイブリダイゼーションのインキュベート処理を７２時間行ない、その後、洗浄液にて型通りに洗い、ＤＮＡを０．１５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色する。蛍光染色体像はオリンパス社製の蛍光顕微鏡（ＢＸ６０）に搭載したＣＣＤカメラ（SenSys 1400）にて取り込み, 約２０個の染色体の蛍光強度をＶｙｓｉｓ社製のＣＧＨ解析ソフト（ＱＵＩＰＳ ＸＬ）を利用して解析を行った。また、比較として、スライドガラス１０を反転させないでハイブリダイゼーションを同様に行なった。これらの結果を図３及び４に示す。これらの図において、曲線ａ、ａ´がＤＮＡのコピー数の増減を表わしており、直線ｂ、ｂ´よりも右に出ると増、直線ｃ、ｃ´よりも左に出ると減となる。両者の中間の直線ｄ、ｄ´が基準線となる。曲線ａ、ａ´の左右にある点線ｅ１、ｅ２、ｅ´１、ｅ´２は、ＤＮＡの場所的分布を示す。これら点線ｅ１、ｅ２、ｅ´１、ｅ´２の幅が狭いほどスライドガラス上での場所間格差が大きいことを示す。図３及び４から明らかなように、本実施例の態様に係るハイブリダイゼーションの方法の方が、反転させなかったものに比し、スライドガラス上での場所間格差が小さいことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係るハイブリダイゼーションの方法に使用されるスライドガラスの平面図である。
【図２】（ａ）は、本発明に係るハイブリダイゼーションの方法に使用されるスライドガラスの反転させる前の側面図であり、（ｂ）は、その反転された状態の側面図である。
【図３】本実施例の態様に係るハイブリダイゼーションの方法を用いてchromosomal CGHを行なった結果を示す図である。
【図４】従来のハイブリダイゼーションの方法を用いてchromosomal CGHを行なった結果を示す図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０   スライドガラス
１２   ＤＮＡプローブ
１４   ハイブリダイゼーション溶液
１６   カバーガラス
１８   支持棒
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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