(57)【要約】【課題】  血管平滑筋細胞の増殖や肥大を引き起こす活性酸素を産生するNOX1の発現を、血管平滑筋特異的に制御できるポリヌクレオチド領域を提供する。【解決手段】  本発明のポリヌクレオチド又はその相補鎖からなる医薬組成物はNOX1ゲノムDNAの転写産物の非翻訳領域あるいはそのプロモーターに作用してNOX1の翻訳効率或いは転写活性を制御することにより、NOX1により構成されるNADPHオキシダーゼの活性を組織特異的に調節することができ、高血圧、動脈硬化症、糖尿病など生活習慣病に伴う循環器系疾患の予防及び治療に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1のゲノムDNAにおけるエキソンの塩基配列であって、配列表１〜６に示される塩基配列、その塩基配列の１又は２以上の塩基が欠損、付加及び／又は置換してなる塩基配列、又はその塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1のゲノムDNAにおけるイントロンの塩基配列であって、配列表８〜１０に示される塩基配列、その塩基配列の１又は２以上の塩基が欠損、付加及び／又は置換してなる塩基配列、又はその塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載されるポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
循環器系疾患治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチド及びその用途に関する。より詳細には、NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1の組織特異的転写産物の非翻訳領域、その塩基配列又はそれにハイブリダイズし得る塩基配列を有するポリヌクレオチド、血管平滑筋型NOX1と大腸に発現するNOX1転写産物の転写活性化領域及びそれらを有効成分とする循環器系疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
NADPHオキシダーゼ（NADHオキシダーゼを含む）は生体内における活性酸素産生酵素であり、非血球型NADPHオキシダーゼより産生される活性酸素種は細胞内情報伝達シグナルとして組織の増殖・肥大・分化に重要な役割を担っていることから、心血管系では虚血性心疾患、心肥大、高血圧、動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄など心血管組織リモデリングを伴う多様な病態への関わりが示唆されている。事実、糖尿病や高脂血症を有する患者症例の血管組織標本を用いた臨床研究において本酵素の活性が有意に亢進していることが報告されている。非血球型NADPHオキシダーゼは従って生活習慣病に伴う血管病変の発症・進展に広く関与しているものと考えられる。
【非特許文献１】血管医学 Vol.3 No.1 2002-2 p.49
【非特許文献２】医学のあゆみ Vol.197 No.9 2001.6.2 p.742
【非特許文献３】Nature Reviews (Immunology) Vol.4 March 2004 p.181
【０００３】
NOX1は生体内で活性酸素（スーパーオキシド）を産生するNADPHオキシダーゼの触媒サブユニットであり、主として大腸と血管平滑筋細胞に局在して細胞の増殖・肥大・分化に関与している。
NADPHオキシダーゼにより産生される活性酸素種は高血圧、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病における血管病変の形成に重要な役割を果たすことが提唱されている。活性酸素はそれ自身が毒性をもつのみならず、血管拡張因子である一酸化窒素（NO）と反応することによりNOの生理活性を減弱させ、血管の拡張性を低下させる。また一方で活性酸素そのものが細胞内で情報伝達分子としてはたらくことも示唆されている。
【０００４】
近年、NADPHオキシダーゼの遺伝子レベルでの解析が進み、その分子構造が明らかにされた。血管組織においてはNADPHオキシダーゼが主要な活性酸素供給源である。NADPHオキシダーゼは細胞膜に存在するNOXとp22phox、細胞質に存在するp47phox或いはp41nox、p67phox或いはp51nox、低分子量G蛋白質Racから構成され、複合体を形成する。触媒サブユニットであるNOXについては、現在までにNOX1からNOX5までの五種類と、DUOX1とDUOX2の計七種類が同定されており、一定の相同性を持つスーパーファミリーを構成している。
【０００５】
血管平滑筋細胞においては、NOX1、NOX4、NOX5の三種類の発現が現在までに報告されている。NOX1はヒト大腸や結腸癌細胞株Caco-2に高発現し、NOX1を強制発現させた繊維芽細胞では細胞増殖が亢進する。さらに血管平滑筋細胞を血小板由来増殖因子（以下、PDGFという）やアンギオテンシンIIで刺激するとNOX1の発現が増加する。
さらに分娩時の黄体退縮や子宮収縮を引き起こすとともに血管平滑筋細胞や心筋細胞を肥大させることが知られるプロスタグランジンF2αが強力なNOX1誘導因子であることが明らかとなった。
【非特許文献４】Katsuyama et al., J Biol Chem, 277, 13438, 2002
【０００６】
これらの所見はNOX1が癌細胞の増殖のみならず動脈硬化性病変に認められる血管平滑筋の肥厚にも関与することを強く示唆している。上に述べたような血管収縮と肥大作用を有する複数の生理活性物質により NOX1が誘導されることから、生活習慣病に伴う心血管系病変にNOX1が関与しているのではないかと考えた。
【０００７】
これを確かめるため、本願発明者らは、NOX1遺伝子欠損マウスを作製した。マウス NOX1遺伝子の第７エキソン近傍1.6 kbを標的部位としてneo耐性遺伝子に連結したターゲティングベクターを構築し、ES細胞相同組換え体を分離、集合キメラ法によりマウス初期胚に導入してキメラマウスを得た。C57BL/6マウスとの交配により生殖細胞系列への伝搬を確認し得られたNOX1ノックアウトマウスを用い、浸透圧ポンプによりアンギオテンシンIIの持続投与を行うことにより高血圧動物モデルを作製した。無処置下ではノックアウトマウスの血圧は収縮期圧、拡張期圧とも野生型マウスとの間に差が認められなかったが、アンギオテンシンII持続投与下ではノックアウトマウスでは野生型マウスに比し収縮期圧が著明に低値を示していた。この結果から、NOX1がレニン・アンギオテンシン系亢進による高血圧の発症に寄与していることが明らかとなった。
【０００８】
このように NADPHオキシダーゼの触媒サブユニットNOX1は特に臨床的な観点から、高血圧、動脈硬化症、心肥大など生活習慣病に随伴する心血管障害と密接な関係をもち、血管リモデリングを誘発する諸種の生理活性物質の下流に位置する情報ユニットとして重要な役割を有している。
【０００９】
本願発明者らは、前述のように、遺伝子改変動物を用いた解析にて、NOX1を触媒サブユニットとする血管平滑筋細胞NADPHオキシダーゼがレニン・アンギオテンシン系亢進による高血圧に関わっていることを示す明白なデータを得た。この所見はNOX1を標的としてその活性を阻害すれば、新しい作用機構の降圧薬として臨床応用出来ることを示している。
従って、血管組織特異的に発現するNOX1分子種を標的としてその活性を制御することができれば、現存の心血管作用薬とは全く異なる作用機構でこれらの疾患を治療することが可能となり、医学上大きな進歩が期待される。
【００１０】
現在用いられている降圧薬の現状：利尿薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、アンギオテンシンII受容体拮抗薬、カルシウム拮抗薬、アドレナリン受容体遮断薬などが存在し、複数の薬剤を併用使用することが一般的である。
利尿薬は古くより使用されている降圧薬であるが、副作用として低カリウム血症や代謝異常（血糖上昇）を生じ、特に高血圧を合併していることが多い糖尿病患者への投与について問題がある。カルシウム拮抗薬は強力な降圧作用を有するが血圧が動揺しやすく、薬物相互作用をおこしやすい欠点がある。アドレナリン受容体遮断薬、特にα受容体遮断薬は代謝への悪影響は少ないものの起立性低血圧などの強い副作用がある。
【００１１】
一方、アンギオテンシン変換酵素阻害薬及びアンギオテンシンII受容体拮抗薬は心肥大、虚血性心疾患、脳卒中、腎障害など臓器障害を伴う病態に保護効果を有するとされている。しかしながら高頻度の空咳の誘発や、有効降圧率がカルシウム拮抗薬より低いという欠点がある。
【００１２】
他方、NOX1はアンギオテンシンIIにより誘導され、NOX1により構成されるNADPHオキシダーゼを介して生成される活性酸素種が情報伝達シグナルとなって血管リモデリングに関わると考えられている。従って血管のNOX1分子種を標的としてNADPHオキシダーゼ活性を制御することにより、上記の心血管作用薬とは異なる作用点の新規の治療法を提供することが可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1の血管平滑筋と大腸における組織特異的転写産物の非翻訳領域及びその転写活性化領域に関し、血管組織に発現するNOX1の蛋白コード領域上流の非翻訳領域の配列及び転写調節（活性化）領域を明らかにするものである。組織特異的にNADPHオキシダーゼを制御することにより、細胞の増殖・肥大・分化が関わる組織リモデリングを制御することができる。従って、本発明は、各種循環器系疾患を治療するため、NOX1の翻訳効率及び転写活性の制御に基づいて、NOX1の発現・合成を制御し、心血管系疾患の治療に役立てるためのものである。
具体的には、まずこの蛋白非翻訳領域の配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド又はその相補鎖からなる組成物を用いることにより、血管リモデリングを伴う諸種の病態の治療・予防を可能とする治療剤を提供することができる。さらに転写活性化領域を用いることによってそれに結合する転写因子の探索を行い、転写因子と本転写活性化領域との相互作用を調節することにより、心血管系疾患の予防及び治療剤を提供するものである。
更に、生体内でNOX1は心血管系の他に大腸上皮に高発現していることが知られる。本発明者らはNOX1の遺伝子発現調節機構について解析を行った結果、血管と大腸上皮に発現する NOX1の蛋白コード領域上流の非翻訳領域配列が異なること、そしてそれぞれの遺伝子産物が異なる遺伝子領域上のプロモーターにより制御されることを見出した。この所見は血管に発現する NOX1分子種の転写活性を大腸型分子種の発現には影響無く、特異的に制御出来ることを意味するものであり、高血圧など広く心血管系疾患の治療への応用に重要な意義を有するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1のゲノムDNAにおけるエキソンの塩基配列であって、配列表１〜６に示される塩基配列、その塩基配列の１又は２以上の塩基が欠損、付加及び／又は置換してなる塩基配列、又はその塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるポリヌクレオチド、特にＤＮＡであり；
また、NADPHオキシダーゼ触媒サブユニットNOX1のゲノムDNAにおけるイントロンの塩基配列であって、配列表８〜１０に示される塩基配列、その塩基配列の１又は２以上の塩基が欠損、付加及び／又は置換してなる塩基配列、又はその塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるポリヌクレオチド、特にＤＮＡであり；
更に、上記のポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有することからなる医薬組成物、特に当該医薬組成物が循環器系疾患治療剤であることからなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は血管平滑筋細胞の増殖や肥大を引き起こす活性酸素を産生するNOX1の発現を、血管平滑筋特異的に制御できるポリヌクレオチド領域を提供するものである。本発明のポリヌクレオチド又はその相補鎖からなる医薬組成物はNOX1ゲノムDNAの転写産物の非翻訳領域あるいはそのプロモーターに作用してNOX1の翻訳効率或いは転写活性を制御することにより、NOX1により構成されるNADPHオキシダーゼの活性を組織特異的に調節することができる。
従って本発明は高血圧、動脈硬化症、糖尿病など生活習慣病に伴う循環器系疾患の予防及び治療に有用であり、例えば血管平滑筋特異的5'非翻訳領域に対するRNA医薬品などを動脈硬化症などの予防や治療に用いることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
まず本発明者らは、血管平滑筋細胞におけるNOX1の発現がプロスタグランジンF2α、アンギオテンシンII、PDGFといった増殖や肥大の刺激因子で誘導されることから、その転写調節機構を解明する目的で、NOX1遺伝子の5'非翻訳領域の構造を解析した。マウス血管平滑筋細胞株P53LMACO1細胞からPCR法（5'-RACE法）によりNOX1 mRNAの5'非翻訳領域を増幅し、二種類の産物を単離した（図１参照）。
マウスゲノム配列との照合の結果、二種類の産物のうち短く主要なPCR産物は、翻訳開始点を含むことが報告されているエキソン1（エキソン1aと命名：配列表１）の上流にさらに二つのエキソン（エキソン1b：配列表２、エキソン1c：配列表３）を含むものであった。長いPCR産物は、エキソン1aとエキソン1bに加え、さらに三つのエキソン（エキソン1d：配列表４、エキソン1e：配列表５、エキソン1f：配列表６）を含むものであった。
【００１７】
次にマウス盲腸からNOX1 mRNAの5'非翻訳領域を単離した。単離したPCR産物は血管平滑筋細胞由来のPCR産物とは異なり、エキソン1aの上流に、ゲノム上で隣接する配列をもつものであった（図１参照）。単離した最長の産物は、エキソン1aの上流にさらに48 bpを含んでいた（これらの配列を合わせてエキソン1a'と命名：配列表７）
【００１８】
マウスゲノムライブラリーからNOX1遺伝子のエキソン1a'の5'側に隣接する約1.9 kbの領域（up1a：配列表８）、エキソン1cの5'側に隣接する約2.9 kbの領域（up1c：配列表９）、エキソン1fの5'側に隣接する約1.5 kbの領域（up1f：配列表１０）をそれぞれ単離した。これらの領域を、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子とするベクターに組み込み、細胞に導入して転写活性を測定することにより、各5'上流領域がNOX1の組織特異的発現に寄与するかどうかについて調べた。
血管平滑筋特異的エキソンの5'上流域であるup1cとup1fはマウス血管平滑筋細胞株P53LMACO1細胞においては転写活性を示したが、マウス大腸上皮細胞株MCE301細胞においては転写活性を示さなかった。逆に大腸特異的転写開始点の上流域であるup1aはMCE301細胞においては転写活性を示したが、P53LMACO1細胞においては転写活性を示さなかった（図２及び実施例４参照）。
【００１９】
次にup1c及びup1fのどの領域が血管平滑筋細胞におけるNOX1の発現に必要なのかを調べた。各領域を様々な長さに切断したDNA断片をルシフェラーゼベクターに組み込んで転写活性を測定した。
その結果、up1cに関しては転写開始点の上流149塩基から168塩基の領域及び180塩基から199塩基の領域が、またup1fに関しては転写開始点の上流458塩基から686塩基の領域が重要であることがわかった（図３及び４並びに実施例５参照）。
【００２０】
次にup1aのどの領域が大腸上皮細胞におけるNOX1の発現に必要なのかを調べた。その結果、転写開始点の上流30塩基から364塩基の領域が重要であることがわかった（図５及び実施例６参照）。
【００２１】
上記の結果から、NOX1の発現を制御するには、二種の血管平滑筋型NOX1転写産物についてはゲノムDNAにおける各産物の転写開始点からそれぞれ上流149塩基〜168塩基の領域及び180塩基〜199塩基の領域、並びに458塩基〜686塩基の領域、また大腸型NOX1転写産物についてはその転写開始点から上流30塩基〜364塩基を含む領域が重要であることが明らかとなった。
【実施例】
【００２２】
次に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
マウス血管平滑筋細胞におけるNOX1遺伝子の5'非翻訳領域の単離
まず本発明者らは、血管平滑筋細胞におけるNOX1の発現がプロスタグランジンF2α、アンギオテンシンII、PDGFといった増殖や肥大の刺激因子で誘導されることから、その転写調節機構を解明する目的で、NOX1遺伝子の転写開始点の同定を行った。
マウス血管平滑筋細胞株P53LMACO1細胞の全RNAを鋳型とし、PCR法（5'-RACE法）によりNOX1 mRNAの5'非翻訳領域を増幅し、二種類の産物を単離した（図１参照）。マウスゲノム配列との照合の結果、短いPCR産物は、翻訳開始点を含むことが報告されているエキソン1（101 bp；エキソン1aと命名：配列表１）の上流に、ゲノム上ではX染色体の約3 kb上流に存在する97 bpの配列（エキソン1b：配列表２）と、さらにエキソン1bの約23 kb上流に存在する245 bpの配列（エキソン1c：配列表３）をもつものであった。
長いPCR産物は、エキソン1aとエキソン1bは含むがエキソン1cは含まず、代わりにX染色体上ではエキソン1cの約5.2 kb上流に存在する77 bpの配列（エキソン1d：配列表４）、エキソン1dの約42.4 kb上流に存在する181 bpの配列（エキソン1e：配列表５）、さらにエキソン1eの約36.3 kb上流に存在する134 bpの配列（エキソン1f：配列表６）をもつものであった。
【００２４】
実施例２
マウス盲腸におけるNOX1遺伝子の5'非翻訳領域の単離
次にマウス盲腸の全RNAを鋳型とし、5'-RACE法によりNOX1 mRNAの5' 非翻訳領域を増幅した。単離したPCR産物は血管平滑筋細胞由来のPCR産物とは異なり、エキソン1aの上流に、ゲノム上で隣接する配列（血管平滑筋細胞ではイントロンとして用いられていた配列）をもつものであった（図１参照）。単離した最長の産物は、エキソン1aの上流にさらに48 bpを含んでいた（これらの配列を合わせてエキソン1a'と命名した：配列表７）。
【００２５】
実施例３
マウスゲノムからのNOX1遺伝子プロモーター領域の単離
プラークハイブリダイゼーション法及びPCR法により、マウスゲノムライブラリー（STRATAGENE社より購入）からNOX1遺伝子のエキソン1a'の5'側に隣接する約1.9 kbの領域（up1a：配列表８）、エキソン1cの5'側に隣接する約2.9 kbの領域（up1c：配列表９）、エキソン1fの5'側に隣接する約1.5 kbの領域（up1f：配列表１０）をそれぞれ単離した。
【００２６】
実施例４
NOX1遺伝子の5'上流領域を用いた転写活性の測定；組織特異的な発現の解析
NOX1遺伝子の5'上流領域up1a、up1c、up1fをそれぞれ、レポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターpGL3-basic（Promega社より購入）のルシフェラーゼ遺伝子の上流部分に連結した。また実験対象群間の遺伝子導入効率を補正するため、βガラクトシダーゼ遺伝子をレポーターとして、SV40ウイルスラージT抗原のプロモーターの下流につないだベクター pSV-βGal（Promega社より購入）を同時に細胞に導入した。細胞への遺伝子の導入はリポフェクション法（ロシュ社のFuGENE6を使用）により行った。
血管平滑筋細胞のモデルとしてP53LMACO1細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を、大腸上皮細胞のモデルとしてMCE301細胞（富山医科薬科大学田渕圭章氏より分与）を使用した。遺伝子導入後24時間又は48時間の細胞抽出液を用いてルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼ活性を測定した。βガラクトシダーゼ活性を一定にすることにより導入効率の補正を行った。ルシフェラーゼの活性測定にはPromega社のルシフェラーゼアッセイシステムを用い、ルミノメーターで発光を測定して活性とした。βガラクトシダーゼ活性の測定にはPromega社のキットを用い、420nmの吸光度を測定して活性とした。結果を図２に示す。
図２に示されるように、血管平滑筋特異的エキソンの5'上流域であるup1cとup1fはマウス血管平滑筋細胞株P53LMACO1細胞においては転写活性を示したが、マウス大腸上皮細胞株MCE301細胞においては転写活性を示さなかった。逆に大腸特異的転写開始点の上流域であるup1aはMCE301細胞においては転写活性を示したが、P53LMACO1細胞においては転写活性を示さなかった。
【００２７】
実施例５
血管平滑筋型NOX1 mRNAの5'上流領域を用いた転写活性の測定；血管平滑筋特異的な発現に寄与する部位の同定
NOX1遺伝子の5'上流領域up1c及びup1fを種々の長さに切断した断片を、前記ルシフェラーゼベクターに組み込み、P53LMACO1細胞を用いて実施例４と同様の方法により転写活性を測定した。up1cの結果を図３に、up1fの結果を図４に示す。
図３及び４に示されるように、up1cに関しては転写開始点の上流149塩基から168塩基の領域及び180塩基から199塩基の領域が、またup1fに関しては転写開始点の上流458塩基から686塩基の領域が重要であることがわかった。
【００２８】
実施例６
大腸型NOX1 mRNAの5'上流領域を用いた転写活性の測定；大腸上皮特異的な発現に寄与する部位の同定
NOX1遺伝子の5'上流領域up1aを種々の長さに切断した断片を、前記ルシフェラーゼベクターに組み込み、MCE301細胞を用いて実施例４と同様の方法により転写活性を測定した。結果を図５に示す。
図５に示されるように、大腸上皮細胞におけるNOX1の発現には、転写開始点の上流30塩基から364塩基の領域が重要であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はマウスNOX1 mRNAの5'非翻訳領域と遺伝子の構造を模式的に示したものである。
【図２】図２はマウスNOX1の三種類の5'上流領域と血管平滑筋及び大腸上皮特異的転写との関係を示したルシフェラーゼアッセイの結果である。
【図３】図３はマウスNOX1の5'上流領域up1cの血管平滑筋特異的転写に関与する部位を示したルシフェラーゼアッセイの結果である。
【図４】図４はマウスNOX1の5'上流領域up1fの血管平滑筋特異的転写に関与する部位を示したルシフェラーゼアッセイの結果である。
【図５】図５はマウスNOX1の5'上流領域up1aの大腸上皮特異的転写に関与する部位を示したルシフェラーゼアッセイの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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