(57)【要約】【課題】  ＢＫチャネル開口薬を探索するための効果的なアッセイ法を構築する。【解決手段】ヒト、ラットそれぞれのβ1サブユニットの細胞外領域のアミノ酸配列の違いに注目し、イベリオトキシンへの感受性の違いを担うアミノ酸を特定し、変異させた。本発明は、そのような変異を含むｈＳｌｏβ、それをコードするＤＮＡ、変異ｈＳｌｏβを含むＢＫチャネル変異体、該変異体を用いたＢＫチャネル作用性化合物を探索するためのスクリーニング方法も提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し；かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸配列において、細胞外領域においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されており、細胞外領域以外においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されていてもよい、アミノ酸配列を有し；かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチド。
【請求項３】
細胞外領域における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加が、配列番号：２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
細胞外領域における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加が、１若しくは複数のアミノ酸の電荷および／または極性の異なるアミノ酸への置換である、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
細胞外領域における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加が、配列番号：２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する位置での１若しくは複数のアミノ酸の配列番号：２の対応するアミノ酸への置換である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも６７位の置換を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＢＫチャネル特異的作用性化合物がイベリオトキシンである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦを有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦにおいて、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有し、かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のＤＮＡを含む、動物細胞形質転換用ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドとｈＳｌｏαとから形成される、ＢＫチャネル変異体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現している、動物細胞。
【請求項１３】
哺乳類細胞（好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞）である、請求項１２に記載の動物細胞。
【請求項１４】
請求項１１に記載のＢＫチャネル変異体を用いることを特徴とする、ＢＫチャネル作用性化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の動物細胞を用いて、
（ａ）試験化合物非存在下のＢＫチャネル電流を調べる工程；
（ｂ）試験化合物存在下のＢＫチャネル電流を調べる工程；および
（ｃ）ＢＫチャネル特異的作用性化合物（好ましくはＢＫチャネル特異的遮断薬、より好ましくはイベリオトキシン）存在下のＢＫチャネル電流を調べる工程；
を含むことを特徴とする、ＢＫチャネル作用性化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のスクリーニング方法に使用するための、キット。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載のスクリーニング方法によって得られた化合物。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載のスクリーニング方法により得られた化合物またはその誘導体を含む、ＢＫチャネルに関連した疾患または状態の処置をするための医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載のスクリーニング方法によって得られた化合物またはその誘導体を合成する工程を含む、化合物またはその誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＫチャネルに特異的に作用する物質への感受性を改良したＢＫチャネル変異体、およびその利用に関する。本発明は、高血圧、虚血性心疾患、排尿障害、気管支喘息、脳虚血障害、神経学的疾患等の治療薬の候補化合物を効率的に評価するのに有用である。また、作用点としてのＢＫチャネルの同定の効率化およびＢＫチャネルの機能制御のメカニズム解明にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面膜に存在するカリウム（Ｋ+）チャネルは、開口のメカニズムにより膜電位依存性、カルシウムイオン（Ｃａ2+）依存性、ＡＴＰ依存性に分かれる。そのうちＣａ2+依存性Ｋ+チャネルは細胞内Ｃａ2+濃度上昇により活性化され、単一チャネルの大中小のコンダクタンスの違いからＢＫ、ＩＫ、ＳＫに分類される。ＢＫチャネル（またはＭａｘｉ  Ｋ+チャネル）は、血管を含む平滑筋細胞に発現する大容量カルシウム依存性カリウムチャネル（large conductance Ca2+-dependent K+ channel）で、血圧の制御に重要な役割を担う膜タンパク質であることが明らかになっている。
【０００３】
平滑筋細胞は、刺激により興奮するとＣａ2+チャネルを通って細胞外から細胞内へＣａ2+が流入し、また細胞内のＣａ2+貯蔵部位からＣａ2+が放出されるため、細胞内Ｃａ2+濃度が上昇し、平滑筋の収縮が引き起こされる。一方、ＢＫチャネルは細胞内のＣａ2+濃度の上昇を感知して開口する。ＢＫチャネルが開口すると平滑筋細胞の膜電位が過分極するため、細胞の興奮性が減弱し平滑筋が拡張する。このようにＢＫチャネルは平滑筋の収縮に対してネガティヴ・フィードバック制御機構を担う生理的に重要な膜タンパク質である（非特許文献１）。
【０００４】
ＢＫチャネルは４分子のαサブユニットと４分子のβサブユニットから構成される（非特許文献２）。αサブユニットがＢＫチャネルの本体を構成し、βサブユニットがその機能を調節している。βサブユニットはαサブユニットの開口確率を高める、細胞内Ｃａ2+に対する感受性を高める等の修飾機能を担う。ＢＫチャネルαサブユニットには複数のスプライス・ヴァリアントが存在し、ＢＫチャネル機能の多様性と臓器特異性を決定する要因の一つとなっている。一方、ＢＫチャネルβサブユニットにはβ1〜β4まで４種類のサブタイプの存在が明らかになっており、それぞれ異なる臓器に発現してＢＫチャネル機能の多様性を担うことが明らかになっている。例えば、β1サブユニットは血管などの平滑筋に発現するのに対しβ4サブユニットは脳に発現している。
【０００５】
特許文献１は、ウシおよびヒトＢＫチャネルのβサブユニットのｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡを含むベクター、該βサブユニットのアミノ酸配列、および該βサブユニットに対する抗体について記載する。また、αサブユニット単独からなるＣａ2+感受性Ｋ+チャネルと、αサブユニットおよびβサブユニットを共発現させたＣａ2+感受性Ｋ+チャネルとをアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた場合の電気生理学的特性の比較について記載する。特許文献２は、Ｃａ2+感受性Ｋ+チャネルの新規ヒトβ3サブユニットをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ配列を含むベクター、該新規ヒトβ3サブユニットの推定アミノ酸配列、および、αサブユニット単独からなるＣａ2+感受性Ｋ+チャネルと、αサブユニットおよび該新規β3サブユニットを共発現させたＣａ2+感受性Ｋ+チャネルとをツメガエル卵母細胞において発現させた場合の電気生理学的特性の比較について記載する。
【０００６】
近年、ＢＫチャネルがエストロジェンにより活性化され、そのターゲットがＢＫチャネルサブユニットであることが示された（非特許文献３）。この報告は、男性に比較して女性の高血圧発症率や虚血性心疾患発症率が低い理由を説明するものとして注目されている。即ち、血管平滑筋細胞のＢＫチャネルがエストロジェンにより開口し易くなると血管抵抗を軽減し、高血圧や動脈硬化を防ぐのではないかと推定されている。エストロジェン誘導体の中には、タモキシフェンのようにＢＫチャネル開口作用を有する化合物が見出されている。また、ＢＫチャネルβ1サブユニットのノックアウト・マウスが高血圧を発症すること、高血圧自然発症マウスの高血圧の発症に伴いβ1サブユニットの発現が低下すること、高血圧発症リスクとβ1サブユニットの変異の間に相関が見出されたことから、本態性高血圧とＢＫチャネルβ1サブユニットの関連が明らかになった（非特許文献４〜８）。
【０００７】
上記の通り、ＢＫチャネルαサブユニットおよびβサブユニットはどちらもＢＫチャネル開口薬のターゲットとなり得る。現在、血管平滑筋、膀胱平滑筋、気管支平滑筋に加えて神経細胞におけるＢＫチャネルの役割も解明されつつあり、ＢＫチャネルαサブユニットおよびβサブユニットを標的としたＢＫチャネル開口作用を有する化合物は高血圧、虚血性心疾患、排尿障害、気管支喘息、脳虚血障害、神経学的疾患等の治療薬の候補となる。
【０００８】
ヒトのＢＫチャネルに対するＢＫチャネル開口作用を発現系を用いてアッセイする方法は既に報告されている（非特許文献９）。しかしながら、これらのアッセイに汎用されるヒト由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）は内在性に電位依存性Ｋ+チャネルを発現しているため、ＢＫチャネルの薬理学的解析にはＢＫチャネル特異的遮断薬イベリオトキシン（iberiotoxin：ＩｂＴｘ）を用いてＢＫチャネル成分を分離する必要がある。ここで、ヒトＢＫチャネルはイベリオトキシンに対する感受性が低いという問題点があった。
【０００９】
これまでにヒトＢＫチャネルαサブユニット（ｈＳｌｏα）のみで構成されるＢＫチャネルに対してイベリオトキシンが高い感受性を示すのに対し、ｈＳｌｏαとヒトＢＫチャネルβ1サブユニット（ｈＳｌｏβ1）で構成されるＢＫチャネルはイベリオトキシンに対する感受性が１０倍以上低いことが報告されている（非特許文献９）。さらに、ｈＳｌｏαとヒトＢＫチャネルβ4サブユニット（ｈＳｌｏβ4）を共発現させるとイベリオトキシン感受性が完全に消失し、この効果にはβ4サブユニットの細胞外領域が関わることが報告されている（非特許文献１０）。
【特許文献１】特表平１０−５００３０３号公報
【特許文献２】特表２００３−５２２５２２号公報
【非特許文献１】Toro L, Marijic J, Nishimaru K, et al.: Aging, ion channel expression, and vascular function. Vascul. Pharmacol. 38:73-80 (2002).
【非特許文献２】Tanaka, Y., Koike, K., Alioua, A., et al.: β1-subunit of MaxiK channel in smooth muscle: a key molecule which tunes muscle mechanical activity. J. Pharmacol. Sci. 94: 339-347 (2004).
【非特許文献３】Valverde, M.A., Rojas, P., Amigo, J., et al.: Acute activation of Maxi-K channels (hSlo) by estradiol binding to the β subunit. Science 285:1929-1931 (1999).
【非特許文献４】Brenner, R., Perez, G.J., Bonev, A.D., et al.: Vasodilation by the β1 subunit of the calcium-activated potassium channel. Nature 407: 870-876 (2000).
【非特許文献５】Patterson, A.J., Henrie-Alson, J., Brenner, R.: Vasodilation at the molecular level: A role for the β1 subunit of the calcium-activated potassium (BK) channel. Trends. Cardiovasc. Med. 12; 78-82 (2002).
【非特許文献６】Amberg, G.C., Bonev, A.D., Rossow, C.F., Nelson, M.T., and Santana, L.F.: Modulation of the molecular composition of large conductance, Ca2+ activated K+ channels in vascular smooth muscle during hypertention. J. Clin. Invest. 112: 717-724 (2003).
【非特許文献７】Amberg, G.C. and Santana, L.F.: Downregulation of the BK channel β1 subunit in genetic hypertension. Circ. Res. 93 965-971(2003).
【非特許文献８】Fernandez-Fernandez. J.M., Tomas, M., Vasquez, E. et al.: Gain-of function mutation in the KCNMB1 potassium channel subunit is associated with low prevalence of diastolic hypertension. J. Clin. Invest., 113:1032-1039 (2004).
【非特許文献９】Lippiat, J.D., Standen, N.B., Harrow, I.D. et al.: Properties of BKCa channels formed by bicistronic expression of hSloa and b1-4 subunits in HEK293 cells. J. Membrane Biol. 192: 141-148 (2003).
【非特許文献１０】Meera, P., Wallner, M., and Toro, L.: A neuronal β subunit (KCNMB4) makes the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ channel resistant to charybdotoxin and iberiotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 5562-5567 (2000)。
【発明の開示】
【００１０】
従って、ＢＫチャネル開口薬を探索するための効果的なアッセイ法が望まれる。本発明者らは、ヒトの場合とは異なり、ラットＢＫチャネルαサブユニット（ｒＳｌｏα）とラットＢＫチャネルβ1サブユニット（ｒＳｌｏβ1）の共発現によるイベリオトキシン感受性の低下が、ｒＳｌｏαのみの発現時と比較してわずかに３倍程度に留まることを見出した。ｈＳｌｏβ1とｒＳｌｏβ1とはアミノ酸レベルで約８４％の相同性を有する。そこで、本発明者らは、両β1サブユニットの細胞外領域のアミノ酸配列の違いに注目し、イベリオトキシン感受性の違いを担うｈＳｌｏβ1中のアミノ酸を探索した。そして、ｈＳｌｏαと共発現させてもイベリオトキシン感受性の低下が少ないｈＳｌｏβ1の変異体（配列番号３のアミノ酸配列からなる）を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し；かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチド。
【００１２】
本発明は、また、配列番号：１のアミノ酸配列において、細胞外領域においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されており、細胞外領域以外においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されていてもよい、アミノ酸配列を有し；かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドを提供する。配列番号：１は、ヒトＢＫチャネルβ1サブユニットのアミノ酸配列である（GenBank #U25138）。配列番号：２は、ラットＢＫチャネルβ1サブユニットのアミノ酸配列である（GenBank #AF020712）。
【００１３】
本明細書において、ＢＫチャネルまたはその変異体のＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性に関して述べるときの「ＢＫチャネル特異的作用性化合物」とは、ＢＫチャネル成分のみを他の成分から分離して解析可能にすることができる化合物（物質ということもある。）をいう。例えば、試験化合物がヒトのＢＫチャネルに対する開口作用を有するか否かを解析するためのＨＥＫ２９３細胞の発現系を用いたアッセイにおいては、この細胞は内在性に電位依存性Ｋ+チャネルを発現しているが、ＢＫチャネル特異的遮断薬であるイベリオトキシンを用いることにより、試験化合物のＢＫチャネルに対する効果を分離して薬理学的解析をおこなうことができ、このようなアッセイ系においてはイベリオトキシンがＢＫチャネル特異的作用性化合物たり得る。
【００１４】
本明細書において、ＢＫチャネル変異体について特異的作用性化合物への感受性が「高い」というときは、変異を含まないＢＫチャネルと比較して、特定のＢＫチャネル特異的作用性化合物に対する感受性が改良されていることをいう。例えば、ＢＫチャネル特異的作用性化合物としてイベリオトキシンを用いる場合、対象となるＢＫチャネル変異体のイベリオトキシンへの感受性が「高い」とは：
（１）ＢＫチャネル変異体と変異のないＢＫチャネルのそれぞれを同じ濃度（例えば、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ）のイベリオトキシンに曝した場合に、変異のないＢＫチャネルの場合に比較して、ＢＫチャネル電流（Ｋ+チャネル電流でもよい）の遮断率が有意に高いとき、より具体的には、例えば、ＢＫチャネル変異体と変異のないＢＫチャネルのそれぞれを１０-7Ｍのイベリオトキシンに曝した場合に、変異のないＢＫチャネルのＫ+チャネル電流の遮断率が４０（全Ｋ+チャネル電流遮断率（ＴＥＡ感受性成分）を１００とする。）％であるのに対し、ＢＫチャネル変異体のそれが４０％（好ましくは約５０％、より好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％）より高いとき；および／または
（２）ＢＫチャネル電流（Ｋ+チャネル電流でもよい）を所望の率で遮断する（例えば、４０％遮断、５０％遮断、１００％遮断する）ために必要なイベリオトキシンの濃度が、変異のないＢＫチャネルの場合に比較して、有意に低いとき、より具体的には、例えば、Ｋ+チャネル電流を４０（全Ｋ+チャネル電流遮断率（ＴＥＡ感受性成分）を１００とする。）％遮断するために必要なイベリオトキシンの濃度が、変異のないＢＫチャネルの場合は１０-7Ｍであるのに対し、ＢＫチャネル変異体のそれが１０-7Ｍ（好ましくは約７．７ｘ１０-8Ｍ、より好ましくは５．５ｘ１０-8Ｍ、さらに好ましくは３．３ｘ１０-8Ｍ）より低いとき
をいう。
【００１５】
ＢＫチャネル成分を分離するのに必要なＢＫチャネル特異的作用性化合物の使用量がこの感受性に依存するという観点からは、感受性は高いほうが好ましい。
感受性は、特異的作用性化合物の特定濃度に曝した際のＢＫチャネル電流（化合物がＢＫチャネル特異的作用性化合物である場合、Ｋ+チャネル電流でもよい）の遮断効果、および／または特定の率の遮断効果（例えば、約４０％遮断、約５０％遮断、約１００％遮断）を発揮しうる特異的作用性化合物の濃度として表して、比較することができる。例えば、本明細書の実施例３では、Ｋ+チャネル電流の４０％遮断効果を得るために必要なイベリオトキシンの濃度は、天然体では１０-7Ｍ、変異体では３．２Ｘ１０-8Ｍであるので、このＢＫチャネル変異体の感受性は、変異のないＢＫチャネル変異体と比較して、高いということができる。
【００１６】
ある側面において、ＢＫチャネル変異体の感受性は、αサブユニットのみからなるＢＫチャネルの有する特異的作用性化合物への感受性との差異で説明されることがある。例えば、本明細書の実施例３で示されるように、Ｋ+チャネル電流を４０％遮断するために、αサブユニットのみからなるＢＫチャネルと比較して、αサブユニットと野生型のヒトβ1サブユニットとからなるＢＫチャネルは１０倍以上の濃度のイベリオトキシンを必要とするのに対し、ｈＳｌｏαとβサブユニット変異体とを共発現させたＢＫチャネル変異体の場合は、３倍程度のイベリオトキシンを必要とするに留まる場合、そのＢＫチャネル変異体の感受性は、変異のないＢＫチャネルと比較して、高いということができる。
【００１７】
本明細書において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の細胞外領域とは、本発明のポリペプチドが細胞膜においてＢＫチャネルのβサブユニットとして機能可能な場合に、通常、細胞外に存在する部分をいい、例えば、β1サブユニットの推定膜貫通領域（２１位〜３９位および１５６位〜１７８位）に挟まれた部分である。すなわち、配列番号：１の４０〜１５５位（Ｎ末端から数えて４０番目のアミノ酸であるプロリンから１５５番目のグルタミンまでの１１６個のアミノ酸）からなる部分である。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸に関し「１若しくは複数が置換、欠失、挿入、および／または付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列が所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１〜９個、または１〜４個程度である。同一または性質の似たアミノ酸への置換等であれば、それより多くの数のアミノ酸が置換されていても、所望の機能を消失しないであろう。アミノ酸を置換、欠失、挿入、および／または付加する手法は、当業者によく知られており、例えば、アミノ酸をコードするＤＮＡ配列の１塩基置換によるアミノ酸置換が挙げられる。
【００１９】
配列番号：１のアミノ酸配列に由来するＢＫチャネルβサブユニット変異体の細胞外領域における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加（以下、「βサブユニットの細胞外領域における置換等」ということもある。）は、配列番号：２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する位置のいずれか（例えば５２位、６７位、１０８位、１２１位、１２６位、１２９位のいずれか一以上）における、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加であってもよい。
【００２０】
また、βサブユニットの細胞外領域における置換等は、βサブユニットと作用物質との相互作用、βサブユニットとαサブユニットとの相互作用、および／またはβサブユニットの三次元構造に静電的な変化を生ずる可能性のある置換等、例えば、電荷および／または極性の異なるアミノ酸への置換であってもよい。電荷の異なるアミノ酸への置換とは、例えば、生理的ｐＨ（７．０）付近で側鎖が電荷を有さないアミノ酸から生理的ｐＨ付近で側鎖が電荷を有するアミノ酸への置換、生理的ｐＨ付近で側鎖が電荷を有するアミノ酸から生理的ｐＨ付近で側鎖が電荷を有さないアミノ酸への置換、生理的ｐＨ付近で側鎖が負電荷を有するアミノ酸から生理的ｐＨ付近で側鎖が正電荷を有するアミノ酸への置換、および生理的ｐＨ付近で側鎖が正電荷を有するアミノ酸から生理的ｐＨ付近で側鎖が負電荷を有するアミノ酸への置換のいずれかをいう。極性の異なるアミノ酸への置換とは、例えば、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換、または非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換をいう。
【００２１】
また、βサブユニットの細胞外領域における置換等は、配列番号：２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する位置での、配列番号：２の対応するアミノ酸への置換であってもよい。
【００２２】
また、βサブユニットの細胞外領域における置換等は、少なくとも６７位のリシンの置換を含んでもよい。６７位のリシンを、リシンとは電荷および／または極性の異なるアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置換したものは、本発明の好ましい態様の一つである。
【００２３】
本発明はまた、ｈＳｌｏβの変異体である新規なポリペプチドをコードするＤＮＡ、すなわち、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを提供する：
（ａ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦを有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦにおいて、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有し、かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物（好ましくはＢＫチャネル特異的遮断薬、さらに好ましくはイベリオトキシン）への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物（好ましくはＢＫチャネル特異的遮断薬、さらに好ましくはイベリオトキシン）への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００２４】
本発明はまた、配列番号：１のアミノ酸配列において、細胞外領域においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されており、細胞外領域以外においてアミノ酸の１若しくは複数が置換、欠失、挿入および／または付加されていてもよい、アミノ酸配列を有し；かつｈＳｌｏβとして機能可能であり、ｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高い、ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
【００２５】
本発明のＤＮＡには天然物由来のＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれ、また本発明のＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
本明細書中において、塩基配列の「ＯＲＦ」とは、塩基配列中においてポリペプチドをコードする領域をいう。例えば、配列番号：１８の塩基配列のＯＲＦとは、配列番号：１８中の１６０〜７３５塩基を指し、終止コドンを含む。
【００２６】
本明細書において、ＤＮＡに関し「１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列」というときの置換等されるヌクレオチドの個数は、その塩基配列からなるＤＮＡが所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば、１〜９個または１〜４個程度である。同一または性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、より多くの数のヌクレオチドが置換等されていても、所望の機能を消失しないであろう。
【００２７】
本明細書中において、ＤＮＡのハイブリダイズに関し「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハルト液、５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳ中、６５℃でハイブリダイゼーションを行う条件、５ｘＳＳＰＥ、１０ｘデンハルト液、５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳ中、４２℃でハイブリダイゼーションを行う条件、若しくは５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト液、５０％ホルムアミド中、４２℃でハイブリダイゼーションを行う条件、またはこれらと同等の条件をいう。
【００２８】
変異塩基配列または変異アミノ酸配列に係るＤＮＡを調製するための手段は当業者に公知である。例えば、ＰＣＲを用いた合成オリゴヌクレオチドによる位置指定変異導入法、エキソヌクレア−ゼによる欠失法、亜硝酸による領域指定変異法がある。
【００２９】
例えば、本発明のＤＮＡが有する変異塩基配列の調製のためには、既知のｈＳｌｏβ1遺伝子の塩基配列を入手し、該塩基配列を組み込んだプラスミドに対して変異を導入した塩基配列の一部（例えば配列番号：４〜１５）をプライマーとして、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等のＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うことができる。プライマーの合成方法は、当業者によく知られている。また、当業者であれば、適切な長さのプライマーを設計しうる。例えば、９つのアミノ酸配列に対応する２７〜３１塩基のプライマーを、本発明のＤＮＡを得るために用いることができる。
【００３０】
本明細書中において、ｈＳｌｏβとして機能可能というときの「機能」とは、本明細書中の[背景技術]の項で述べたようなｈＳｌｏβの機能をいう。例えば、βサブユニットの、ＢＫチャネルの本体を構成するαサブユニットに対する、開口確率を高める等の調節機能、および／または細胞内Ｃａ2+に対する感受性を高める等の修飾機能をいう。得られた変異塩基配列または変異アミノ酸配列に係るポリペプチドがｈＳｌｏβとして機能可能であり、かつｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルのＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性が、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＳｌｏβがｈＳｌｏαと形成するＢＫチャネルと比較して、高いかどうかは、例えば変異塩基配列または変異アミノ酸配列に係るポリペプチドを動物細胞中においてｈＳｌｏαと共発現させ、形成されたＢＫチャネルについてＢＫチャネル特異的作用性化合物への感受性を調べることで同時に確認できる。
【００３１】
本発明はまた、上述した本発明のＤＮＡを挿入した組み換えベクターを提供する。ベクターは、宿主細胞内で所望の効果を発揮することができるものであれば特に制限はない。ベクターは、複製起点、選択用マーカー、特定の制限酵素による切断部位、プロモーター、エンハンサー等を有してもよい。本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターは、哺乳類動物細胞のトランスフェクションに好適なものとして、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられ、昆虫細胞のトランスフェクションに好適なものとして、ｐＢｌｕｅ  ＢａｃIIIが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＤＮＡの、適当なベクターへの組み込みは、当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えばＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの制限酵素ペアで処理して切り出した本発明のＤＮＡを、同制限酵素ペアにより処理したベクターに、ライゲーションにより組み込むことができる。
【００３２】
本発明のＤＮＡを含むプラスミドベクターを用いて当業者に公知の方法で大腸菌をトランスフォーメーションすることにより、大腸菌の増殖に伴って上記プラスミドを複製することができる。大腸菌をトランスフォーメーションする前に上記プラスミドベクターを制限酵素で処理することにより、所望のプラスミドベクターを選択することができる。例えば、ＰＣＲを行うことにより得たプラスミドを制限酵素Ｄｐｎ  Ｉで処理することにより、ＰＣＲ産物以外のプラスミドを切断することができる。さらに、トランスフォーメーションした大腸菌を選択培地上で培養することにより、所望のプラスミドを含む大腸菌を選択することができる。大腸菌内で複製したプラスミドの回収は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。例えば、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ法（ＱＩＡＧＥＮ社）により、プラスミドの回収を行うことができる。
【００３３】
回収したプラスミドが本発明のＤＮＡを目的部分に含むプラスミドであり、その他の変異等が含まれないことを確認するためには、例えばシークエンス解析等、当業者に公知の手法を用いることができる。
【００３４】
本発明はまた、上述したアミノ酸変異を含むｈＳｌｏβとｈＳｌｏαとから形成される、ＢＫチャネル変異体を提供する。本明細書において、単に「ＢＫチャネル（変異体）」というときは、特に示した場合を除き、αサブユニットとβサブユニットとから形成されるＢＫチャネルをいう。また、単に「βサブユニット（またはＳｌｏβ）」というときは、特に示した場合を除き、Ｓｌｏβ1、Ｓｌｏβ2、Ｓｌｏβ3、Ｓｌｏβ4のいずれかであり得る。Ｓｌｏβ1は、βサブユニットの特に好ましい態様の一つである。ＢＫチャネル変異体を形成するαサブユニットおよびβサブユニットは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、およびラット由来であってもよいが、ヒトのＢＫチャネルに関連した疾患または状態の処置をするための医薬の候補薬を得る場合は、ヒト由来であることが好ましい。
【００３５】
本発明はまた、そのようなＢＫチャネル変異体を発現（好ましくは機能可能に発現）している動物細胞を提供する。本発明の動物細胞は、遺伝子導入および発現解析に適したものであればよく、由来する動物の種類、組織は特に限定されない。例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ由来の細胞）、昆虫細胞、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル卵母細胞）を用いることができる。ヒト細胞であり、さらに好ましくはＨＥＫ２９３細胞は、本発明の動物細胞の好ましい一例である。これらの細胞は、その使用の目的により使い分けることができる。例えば、ヒトのＢＫチャネルに関連した疾患または状態の処置をするための医薬の候補化合物のスクリーニングに用いる場合には、ヒト細胞を用いることができる。
【００３６】
また、例えばＢＫチャネルまたはβサブユニットの大量調整を行う場合等、目的によっては、これらの細胞はＢＫチャネル変異体を発現してさえいればよい。
本発明のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現している動物細胞を、本発明のＤＮＡまたはそれを含む組み換えベクターで形質転換することにより得る際には、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。ＢＫチャネル変異体が機能可能に発現しているか否かは、当業者であれば公知の種々の方法を用いて確認することができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明のＢＫチャネル変異体を用いることを特徴とする、ＢＫチャネル作用性化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、本発明のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現した本発明の動物細胞を用いて、（ａ）試験化合物非存在下のＢＫチャネル電流を調べる工程；（ｂ）試験化合物存在下のＢＫチャネル電流を調べる工程；および（ｃ）ＢＫチャネル特異的作用性化合物（好ましくはＢＫチャネル特異的遮断薬、より好ましくはイベリオトキシン）投与後のＢＫチャネル電流を調べる工程；を含むことを特徴とする、ＢＫチャネル作用性化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、該スクリーニング方法に使用するためのキット、該スクリーニング方法によって得られた化合物、該スクリーニング方法により得られた化合物またはその誘導体を含む、ＢＫチャネルに関連した疾患または状態の処置をするための医薬組成物、およびスクリーニング方法によって得られた化合物またはその誘導体を合成する工程を含む、化合物またはその誘導体の製造方法を提供する。
【００３９】
本明細書において「ＢＫチャネル作用性化合物」とは、ＢＫチャネルに対して作用可能な化合物（物質）をいい、これにはＢＫチャネルの開口作用を有する化合物、ＢＫチャネルの閉口作用を有する化合物とが含まれ、ＢＫチャネルに対して選択的または特異的に作用するものが含まれる。ＢＫチャネルの開口作用を有する化合物は、ＢＫチャネル開口薬の候補となり得る。公知のＢＫチャネル作用性化合物としては、ピメリン酸、デヒドロアビエチン酸、ジクロロデヒドロアビエチン酸、タモキシフェン、ピマル酸、ＮＳ−１６１９、およびＢＭＳ−２０４３５２、イベリオトキシン、キャリブドトキシン（ｃｈａｒｉｂｄｏｔｏｘｉｎ）、パキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎｅ）およびペニトレムＡ（ｐｅｎｉｔｒｅｍ  Ａ）がある。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法を、ＢＫチャネル開口薬の候補を得ることを目的として実施する場合は、ＢＫチャネル変異体は、動物細胞、好ましくはヒト由来細胞に機能可能に発現した状態で用いることができ、スクリーニングのためのある工程において、ＢＫチャネル特異的作用性化合物（好ましくはＢＫチャネル特異的遮断薬、より好ましくはイベリオトキシン）を用いることができる。本発明のスクリーニング方法のためのキットは、それらを含むことができる。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法において、「動物細胞を用いて」とは、本発明のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現した本発明の動物細胞の全体または一部を用いることをいい、ホールセルで用いること、および該細胞の一部を用いること（例えば動物細胞からＢＫチャネルを含むパッチを作成して使用すること）を共に含む。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法に供される試験化合物がＢＫチャネルに対して作用可能であるか否かは、試験化合物のＢＫチャネルに対する効果（例えば、電流の変化、電位の変化、イオンフラックス、イオン濃度の変化、結合性）を測定することにより、判定することができる。測定は、直接的に、または標識化合物を用いて間接的に行うことができる。
【００４３】
本明細書中のＢＫチャネル電流は、本発明の細胞から当業者に公知の手法を用いて、ホールセルパッチクランプ法により測定できる。
例えば、本発明のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現したＨＥＫ２９３細胞を用いてＢＫチャネル開口薬の候補となるＢＫチャネル作用性化合物を得ることを目的としてスクリーニングを実施する場合、保持電位（−６０ｍＶ）から４０ｍＶへのテストパルスに応じて活性化したＢＫチャネル電流の電流値を、（ａ）コントロールとして試験化合物非存在下で、および、（ｂ）試験化合物存在下で、測定する。次いで、細胞外溶液を用いて細胞を洗い（ｗａｓｈ）試験化合物を洗ったことによるＢＫチャネル電流の回復傾向を観察したのち、（ｃ）ＢＫチャネル特異的遮断薬の充分量の存在下（例えば、イベリオトキシン１０-7Ｍの投与後）のＢＫチャネル電流値を測定する。その後、非特異的Ｋ+遮断薬の充分量の存在下（例えばテトラエチルアンモニウム１０-2Ｍの投与後）残った電流成分が完全になくなることを確認する。各測定は、ＢＫチャネル電流が安定するまで適宜時間を置いてから行うことが好ましい。上記方法により試験化合物がＢＫチャネル電流に対してどのような効果を持つか検討することができる。また、その後のＢＫチャネル電流に対するイベリオトキシンの効果を検討することにより、化合物によるＢＫチャネル電流の変化がＢＫチャネル依存性か否かの判断が可能となる。
【００４４】
上記各工程で測定したＢＫチャネル電流から、コントロール時とＢＫチャネル閉口時とのＢＫチャネル電流の差（工程（ａ）と工程（ｃ）とから得られたＢＫチャネル電流の差）と、試験化合物存在時とＢＫチャネル閉口時とのＢＫチャネル電流の差（工程（ｂ）と工程（ｃ）とから得られたＢＫチャネル電流の差）とを求め、両者を比較した場合に、後者の方が値が大きいとき、該試験化合物をＢＫチャネル開口作用化合物として選択できる。一方ここで、前者の方が値が大きいとき、該試験化合物をＢＫチャネル閉口作用化合物として選択できる。
【００４５】
また、得られたＢＫチャネル閉口作用化合物が、特にＢＫチャネルに対して選択的または特異的に作用するか否かを調べる場合においては、例えば以下の工程を追加してもよい。
【００４６】
すなわち、ＢＫチャネル変異体を機能可能に発現しないＨＥＫ２９３細胞に対して上述の（ａ）〜（ｃ）の工程を行うことで、ＢＫチャネル以外のＫチャネルに対する作用を調べることができる。このとき、上述の本発明のＢＫチャネル変異体を機能可能に発現したＨＥＫ２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＢＫチャネル変異体をＨＥＫ２９３細胞に発現させるためにベクターを用いた場合、同様のベクターであってＢＫチャネル変異体をコードするＤＮＡを含まない、空のベクターを導入した細胞を用いることが好ましい。各工程の結果と、ＢＫチャネル変異体を機能可能に発現したＨＥＫ２９３細胞に対する各工程の結果とから、ＢＫチャネルに対して選択的または特異的に作用するＢＫチャネル作用性化合物を選択することができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法においては、ＢＫチャネル特異的作用性化合物（例えばイベリオトキシン）への感受性が高いＢＫチャネルを発現する本発明の動物細胞を用いるため、使用するＢＫチャネル特異的作用性化合物（例えばイベリオトキシン）の量が少なくてすむという利点がある。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法は、ＢＫチャネルに関連した疾患または状態の処置をするための医薬自体、または医薬の候補を得るために有用である。ＢＫチャネルに関連した状態または疾患とは，例えば高血圧、虚血性心疾患、排尿障害、気管支喘息、脳虚血障害および神経学的疾患をいう。
【００４９】
本発明はまた、上記のスクリーニング方法によって得られた化合物またはその誘導体を合成する工程を含む、化合物またはその誘導体の製造方法をも提供する。製造方法は、当業者であれば、適切な出発物質を用い、公知の工程を組み合わせて実施することができる。得られる最終物質が、本発明のスクリーニング方法を利用して得られた化合物または得られた化合物を基にして創製された化合物と同一である限り、そのような化合物またはその誘導体を得るための製造方法は、本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
実施例：
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
ｈＳｌｏβ変異導入部位を含むプラスミドの作製：
図１に示した箇所についてアミノ酸変異を導入した変異体βサブユニットの作製をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って行った。ｈＳｌｏβ1（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｕ２５１３８、Ｔｏｒｏ，  Ｌ博士（ＵＣＬＡ）より御分与頂いた。）の塩基配列を含むｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対し、変異導入部位を含むプライマー（配列番号４〜１５）をセットで用いてＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用しＰＣＲを行った。
【００５２】
使用したプライマーセットは下記の通りである。
K52T変異体:
K52T-for:5'-AGGAATCCACGTGCCACCTGATTGAGACC-3'(配列番号：４)
K52T-rev:5'-TCAATCAGGTGGCACGTGGATTCCTGGGTC-3'(配列番号：５)
K67E変異体:
K67E-for:5'-CAGGAGGAGCTGGAGGGCAAGAAGGTG-3'(配列番号：６)
K67E-rev:5'-CCTTCTTGCCCTCCAGCTCCTCCTGGTCCC-3' (配列番号：７)
G108R変異体:
G108R-for:5'-CTACATCCCACGCAGCGTGGACAATTACC-3' (配列番号：８)
G108R-rev:5'-GTAATTGTCCACGCTGCGTGGGATGTAGG-3' (配列番号：９)
E121K変異体:
E121K-for:5'-GCCCGGGCCGACGTGAAGAAGGTCAGAGC-3' (配列番号：１０)
E121K-rev:5'-GCTCTGACCTTCTTCACGTCGGCCCGGG-3' (配列番号：１１)
E129K変異体:
E129K-for:5'-GAGCCAAATTCCAAAAGCAGCAGGTCTTC-3' (配列番号：１２)
E129K-rev:5'-GAAGACCTGCTGCTTTTGGAATTTGGCTC-3' (配列番号：１３)
K126N変異体:
K126N-for:5'-GGTCAGAGCCAACTTCCAAGAGCAGCAGG-3' (配列番号：１４)
K126N-rev:5'-ACCTGCTGCTCTTGGAAGTTGGCTCTGACC-3' (配列番号：１５)
これらの産物を制限酵素Ｄｐｎ  Ｉで処理した後、大腸菌ＤＨ５にトランスフォーメーションした。アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ法（ＱＩＡＧＥＮ）によりプラスミドを回収した。このプラスミドに含まれるｈＳｌｏβ1の塩基配列のうち目的部分に変異が導入されていることおよびその他の配列に変異が含まれないことをシークエンスにより確認した。
【００５３】
得られたプラスミドをＥｃｏＲ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉで処理して変異の導入されたβ１サブユニットを切り出し、同じくＥｃｏＲ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉで処理したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（組み込まれた遺伝子とバイシストロニックにＧＦＰを発現する）にライゲーションにより組込んだ。これを大腸菌ＤＨ５にトランスフォーメーションし、プラスミドを回収した。回収したプラスミドが所望のＤＮＡを目的部分に含むプラスミドであり、その他の変異等が含まれないことをシークエンス解析により確認した。
【実施例２】
【００５４】
変異ｈＳｌｏβ1等の発現：
実施例１で得られたｈＳｌｏβ１サブユニットを含むｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクターと、ｈＳｌｏα（Ｔｏｒｏ，  Ｌ博士（ＵＣＬＡ）より御分与頂いた。）の塩基配列を含むｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とで、ＨＥＫ２９３細胞を共トランスフェクションした。ＧＦＰの発現をマーカーとしてｈＳｌｏβ1を発現する細胞を選別した。また、ＢＫチャネル電流を有する細胞を選択することにより、ｈＳｌｏαを発現する細胞を選別した。
【実施例３】
【００５５】
イベリオトキシン感受性の評価：
発現したＢＫチャネルを介するＢＫチャネル電流をホールセルパッチクランプ法により測定した。全Ｋ+チャネル電流遮断率（ＴＥＡ感受性成分）を１００（％）としたときのイベリオトキシンによる相対的ＢＫチャネル電流遮断作用について用量作用曲線を作成し、イベリオトキシン感受性を評価した（図２）。
【００５６】
ａ．αサブユニットのみからなるＢＫチャネルのイベリオトキシン感受性の評価：
ヒトＢＫチャネルαサブユニット（ｈＳｌｏα）のみからなるＢＫチャネル、またはラットＢＫチャネルαサブユニットのみからなるＢＫチャネルに対してイベリオトキシンが同等に高い感受性を示した。Ｋ+チャネル電流を４０％遮断するのに必要なイベリオトキシンの濃度は、ヒトβ1サブユニットを共発現させたものは１０-7Ｍであったのに対し、ラットβ1サブユニットを共発現させたものは、３．２ｘ１０-8Ｍであり、３倍以上高くなっていることを見出した（図２）。
【００５７】
ｂ．ｈＳｌｏβ1変異体とｈＳｌｏαの共発現によるイベリオトキシン感受性の評価：
実施例２で得られた変異β1サブユニットとｈＳｌｏαとを共発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、発現したＢＫチャネルの開口に応じて流れるＢＫチャネル電流を測定した。
【００５８】
ＢＫチャネル電流を測定しながらイベリオトキシンを適用し、ＢＫチャネル電流遮断作用を評価することによりイベリオトキシン感受性を検討した。
その結果、Ｋ６７Ｅ変異体はラットと同等のイベリオトキシン感受性を示すことを見出した。このようなイベリオトキシン感受性の増強はＫ５２Ｔ変異体、Ｇ１０８Ｒ変異体、Ｅ１２１Ｋ変異体では見られなかった。例えば、Ｇ１０８Ｒ変異体のイベリオトキシン感受性は野生型ヒトβ1サブユニット（ｈＳｌｏβ1）と同等であった（図２）。
【００５９】
ｃ．考察：
ヒトのＢＫチャネル開口作用を発現系を用いてアッセイする方法では、これらのアッセイに汎用されるヒト由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）が内在性する他の電位依存性Ｋ+チャネルを発現しているため、ＢＫチャネルの薬理学的解析には例えばＢＫチャネル特異的遮断薬であるイベリオトキシンを用いてＢＫチャネル成分を分離する必要がある。しかしながら、ヒトＢＫチャネルはイベリオトキシンに対する感受性が低いという問題点があった。今回の発明による新規β1サブユニットを含むＢＫチャネルは、既知のｈＳｌｏαおよびｈＳｌｏβから形成されるＢＫチャネルと比較してイベリオトキシンに対する感受性が飛躍的に高まった。そのため、ＢＫチャネル成分を分離したＢＫチャネルの薬理学的解析が可能になり、ＢＫチャネル開口薬の探索が容易になった。また、本発明による新規β1サブユニットを含むＢＫチャネルを用いたスクリーニング方法により高血圧、虚血性心疾患、排尿障害、気管支喘息、脳虚血障害、神経学的疾患等の治療薬の候補となる化合物のＨＴＳが可能になると考えられる。
【実施例４】
【００６０】
イベリオトキシンを用いたＢＫチャネル開口作用化合物のスクリーニング：
実施例２で選別した、ｈＳｌｏαおよび変異ｈＳｌｏβ1を共発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いた。ＢＫチャネル電流は、実施例３と同様の手法を用いて測定し、保持電位（−６０ｍＶ）から４０ｍＶへのテストパルスに応じて活性化したＢＫチャネル電流を記録した。試験化合物としては、ＮＳ−１６１９を用いた。
【００６１】
（ａ）最初に、コントロールとして試験化合物投与前の定常状態のＢＫチャネル電流を測定した。（ｂ）次に、ＮＳ−１６１９（１０-5Ｍ）を投与し、徐々に増大したＢＫチャネル電流が安定するまで、約１０分間ＢＫチャネル電流を測定した。細胞外溶液を用いて細胞を洗い、ＮＳ−１６１９を洗ったことによるＢＫチャネル電流の回復傾向を観察した後、（ｃ）イベリオトキシン（１０-7Ｍ）を投与し、約５分間、ＢＫチャネル電流の減少が止まるまでＢＫチャネル電流を測定した。最後にＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）（１０-2Ｍ）を投与し、残った電流成分が完全になくなることを確認した。
【００６２】
保持電位（−６０ｍＶ）から４０ｍＶへのテストパルスに応じて活性化したＢＫチャネル電流の電流値を縦軸に取り、横軸に時間経過（ｍｉｎ）をとりプロットして図３Ａを作成した。
【００６３】
各工程で測定したＢＫチャネル電流の波形を重ね書きして図３Ｂを作成した。横軸は時間（ｍｓ）である。「ｃｏｎｔｒｏｌ」は工程（ａ）、「ＮＳ１６１９」は工程（ｂ）、「ｗａｓｈ」はＮＳ−１６１９を洗った後、「ＩｂＴｘ」は工程（ｃ）、「ＴＥＡ」はＴＥＡ投与後に測定した、ＢＫチャネル電流を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ヒトＢＫチャネルのβ1サブユニットのアミノ酸配列、変異導入部位、膜貫通領域を示す図である。
【図２】サブユニットの構成を変化させた場合の、様々な濃度のイベリオトキシンに対するＢＫチャネル電流の遮断度合を示す、グラフである。
【図３】実施例４のアッセイにおいて、時間経過に対するＢＫチャネル電流値の変化を示すグラフ（図３Ａ）および、各工程におけるＢＫチャネル電流を重ねて示すグラフ（図３Ｂ）である。
【図３】
2006288248.tif 000003
【図１】
2006288248.tif 000004
【図２】
2006288248.tif 000005
【配列表】
2006288248000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月8日(2005.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2006288248.tif 000006