(57)【要約】【課題】アポ化酵素を用いた電解質測定における測定感度を精度が下がらないレベルに維持し、かつ定量域を拡大すること【解決手段】アポ化酵素の阻害剤濃度を調整し、かつ該酵素の基質となりうる物質の濃度も併せて調整する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大することを特徴とする定量域拡大方法
【請求項２】
アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度を制御することを特徴とする請求項１記載の定量域拡大方法
【請求項３】
アポ化酵素が測定対象とする電解質により活性化されることを特徴とする請求項１乃至２記載の定量域拡大方法
【請求項４】
アポ化酵素を阻害する物質がキレート剤および、または該酵素の基質アナログである請求項１乃至３記載の定量域拡大方法
【請求項５】
アポ化酵素がα−アミラーゼである請求項１乃至４記載の定量域拡大方法
【請求項６】
測定対象とする電解質がカルシウムイオンであることを特徴とする請求項１乃至５記載の定量域拡大方法
【請求項７】
測定対象とする電解質が塩素イオンであることを特徴とする請求項１乃至５記載の定量域拡大方法
【請求項８】
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度が制御されていることを特徴とする、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大された電解質測定のための組成物
【請求項９】
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示されるα−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤を含有することを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、請求項８に記載の電解質測定のための組成物
【請求項１０】
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度が制御することを特徴とする、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大された電解質測定のための組成物を製造する方法
【請求項１１】
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、電解質測定系におけるα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値が一定に維持された、請求項１０に記載の電解質測定のための組成物を製造する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液、特に血液または尿中の電解質、例えばカルシウムイオン、塩素イオン等の電解質を測定する試薬の定量域を拡大する方法に関する。また、電解質を測定する試薬の定量域を拡大した組成物、更には、そのような定量域を拡大した組成物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の電解質の濃度は、通常厳密に代謝調節されていることから、体液中の電解質の測定は生体機能のバロメータとして生化学的臨床検査の中で最も一般的な分析であり、これらを測定することにより各種疾患の診断が行われる。例えば、血清中のカルシウムイオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパク質血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル病などの疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全などの疾患の診断に用いられる。また例えば、血清中の塩素イオンの測定は低クロール血症として、低張性脱水症、グルココルチコイド過剰症、呼吸性アシドーシスなどの疾患、高クロール結晶としては、高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性アルカローシスなどの疾患の診断に用いられる。
【０００３】
本発明者らは先にα−アミラーゼを用いた体液中のカルシウムの測定法を提案している。
（特許文献１参照）。この方法はカルシウムによりα−アミラーゼが活性化されることを利用し、糖基質を分解し、分解した生成物を測定することにより、体液中のカルシウムを定量するものである。α−アミラーゼは活性発現に必要なカルシウムをそれ自体に含むため、前記方法に使用されるα−アミラーゼは脱塩処理によりカルシウムが除去され不活化（アポ化）する必要がある。α−アミラーゼを用いたカルシウム測定は他の酵素法であるホスホリパーゼＤを利用する方法（特許文献２参照）、カルモジュリンを利用する方法（特許文献３参照）と比較して正確性かつ簡便性に優れているとして実際に臨床検査分野で用いられている。
【特許文献１】特公平６−８７７９８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１９５２９７号公報
【特許文献３】特開昭６２−３６１９９号公報
【０００４】
また、カルシウムを除去され、不活性化されたα−アミラーゼがカルシウムを取り込んで再度活性化されるためには、塩素イオンの存在が必須であり、その活性化の度合は塩素イオン濃度に比例することが知られている（非特許文献１、２参照）。この原理に基づきα−アミラーゼを用いて塩素イオン濃度を測定する方法（特許文献４、５参照）は、現在実際に臨床検査分野で用いられており、他の測定法と比較して正確性、簡便性、分析効率の点で優れている。
【非特許文献１】最新検査，６  （６）  ３６３，（１９８９）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｉｍｅｓ，２，３２（１９８９）
【特許文献４】特開平３−１７６０００号公報
【特許文献５】特開平４−９４６９８号公報
【０００５】
一方、近年臨床検査分野では正確性および安定性向上、またはコスト削減、作業の省力化等の要求により、液状化試薬が主流になっている。従来は酵素等液状状態で不安定なものは凍結乾燥状態で流通し、使用時に添付の溶解液で溶解し測定に使用していたが、最近の成分酵素等の耐熱化、またはｐＨ、バッファー条件の至適化などによる成分酵素の安定化により、液状状態での流通が可能となり、製造側としては凍結乾燥の手間が省け、また臨床検査現場においては溶解する手間が省け、臨床検査に関わる省力化に大きく貢献しているものである。
【０００６】
α−アミラーゼを利用する電解質測定法は、簡便性、正確性などの点で優れていることは上述したとおりである。この方法において、α−アミラーゼは測定対象となるその活性発現に必要なカルシウムまたは塩素イオンを予め除去し、通常不活性型の状態で用いられる。また、この方法においては、ブランク反応を抑える、拮抗阻害剤として定量性を調節する、または測定対象外の類似共雑イオンをマスキングする等の目的で、測定試薬中にキレート剤が処方されている。
【０００７】
アポ化酵素を利用する電解質測定方法においては、キレート剤あるいは該酵素の基質アナログなどにより酵素活性を阻害する物質を測定試薬中に添加することにより定量域を確保しているが、測定に耐えうる定量域を確保するためには測定感度を下げる必要があった。
【０００８】
しかし、測定感度を必要以上に下げ過ぎるとわずかな吸光度変化により大きく測定値が変動してしまうため、測定の精度が下がってしまうという欠点がある。つまりアポ化酵素を用いた電解質測定では精度を保つために添加する阻害剤の濃度が制限されてしまい、それに伴い、確保できる定量域が規定される。例えばアポ化α−アミラーゼを用いたカルシウムイオン測定試薬では上記を考慮し、２０ｍｇ／ｄｌまでしか確保されていない。
【０００９】
体液、特に血清中カルシウムの正常値は８．７〜１１．０ｍｇ／ｄＬ（非特許文献３参照）であり、定量域が２０ｍｇ／ｄＬまでであっても試料を希釈することなく測定が可能であるが、尿検体の場合、正常値が３０〜２００ｍｇ／日（非特許文献４参照）であり、１日の尿量によってはカルシウムイオン濃度が２０ｍｇ／ｄＬ以上の検体も存在する可能性がある。そうした場合、定量域が〜２０ｍｇ／ｄＬまででは試料を希釈する、あるいは尿専用の測定パラメータを用いて測定する必要があり、測定作業が煩雑となる。
【非特許文献３】臨床病理  特集１７  ７１−８３（１９７０）
【非特許文献４】日本臨床  ４３巻  秋季臨時増刊号  ４５６−４５９（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は従来技術の課題を背景になされたもので、アポ化酵素を用いた電解質測定における測定感度を精度が下がらないレベルに維持し、かつ定量域を拡大することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するため、アポ化酵素を用いた電解質測定における測定感度を測定精度が保たれるレベルに維持したまま、定量域を拡大する方法を鋭意検討した結果、アポ化酵素の阻害剤濃度を上げることで該酵素が阻害され、定量域は拡大し、それに伴って測定感度が低下するが、同時に該酵素の基質濃度を上げてやることで拡大した定量域を保ったまま測定感度のみを上昇させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
［項１］
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大することを特徴とする定量域拡大方法
［項２］
アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度を制御することを特徴とする項１記載の定量域拡大方法
［項３］
アポ化酵素が測定対象とする電解質により活性化されることを特徴とする項１乃至２記載の定量域拡大方法
［項４］
アポ化酵素を阻害する物質がキレート剤および、または該酵素の基質アナログである項１乃至３記載の定量域拡大方法
［項５］
アポ化酵素がα−アミラーゼである項１乃至４記載の定量域拡大方法
［項６］
測定対象とする電解質がカルシウムイオンであることを特徴とする項１乃至５記載の定量域拡大方法
［項７］
測定対象とする電解質が塩素イオンであることを特徴とする項１乃至５記載の定量域拡大方法
［項８］
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度が制御されていることを特徴とする、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大された電解質測定のための組成物
［項９］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示されるα−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤を含有することを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、項８に記載の電解質測定のための組成物
［項１０］
アポ化酵素を使用する生体試料中の電解質測定試薬であって、該酵素に対し阻害活性を有する物質を作用させることで、測定項目および／または測定対象に応じた定量範囲を調節している電解質測定試薬において、アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度および該酵素が作用する基質の添加濃度が制御することを特徴とする、測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大された電解質測定のための組成物を製造する方法
［項１１］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、電解質測定系におけるα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値が一定に維持された、項１０に記載の電解質測定のための組成物を製造する方法
【発明の効果】
【００１３】
本発明はカルシウムなどの電解質測定方法等として臨床検査分野において用いることができる。本発明によれば、アポ化酵素を用いた電解質測定において、測定感度を測定精度が保たれるレベルに維持し、かつ、拡大した定量域を保つことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に用いるアポ化酵素としては、測定対象とする電解質量により活性化する酵素であり、当該酵素中の測定対象の電解質が測定に用いられる程度に除去されているものであればよく、このような酵素としては例えばカルシウムイオン測定に用いられる酵素としてα−アミラーゼ、ホスホリパーゼＤ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアアミドリアーゼ、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これら酵素は動物、植物、微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的で上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、これら酵素は、脱塩処理によってアポ化して用いるが、該脱塩処理は、例えば、透析、限外濾過、イオン交換、カラム除去、電気膜透析などの方法により行われるのが好ましい。このようなアポ化酵素の試薬組成中の濃度は、好ましくは反応液中に０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられる。これらの酵素は種々の市販のものを用いることが出来るし、また、当業者であれば種々の公知文献を参照して製造することも可能である。
【００１５】
本発明に用いる基質は、測定対象の電解質により活性化する酵素の基質特異性により設定される。また、本発明は、ｐ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニルなどの発色基を結合した合成基質に限らず、酵素の作用により生成した生成物にさらに追随酵素を作用させ過酸化水素を生成させ、酸化還元色素をペルオキシダーゼの存在下、発色に導く系に用いられうる基質にも適用される。また、本発明に用いる基質の具体例としては、カルシウムイオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用いる場合、例えばマルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた誘導体を基質とする方法として、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、２，４−ジクロロニトロフェニルマルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオシド等を基質として用い、活性化されたα−アミラーゼを作用させ、必要によりα−グルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて、これらの基質からアグリコンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することによりカルシウム等の電解質量を求める。これらの基質は種々の市販のものを用いることが出来るし、また、当業者であれば種々の公知文献を参照して製造することも可能である。
【００１６】
カルシウムイオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用いる場合、マルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコースの４位および６位のヒドロキシル基が何らかの手段で修飾された誘導体を基質とする方法は、基質として非還元末端グルコースがハロゲン、グルコピラノシル基等で修飾されたタイプの基質（例えば、特開昭６０−２３７９９８号公報）あるいは、４位および６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭６０−５４３９５号公報、特開平１−１５７９９６号公報）あるいは４位および６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラノシル基で置換したタイプの基質（例えば、特開平３−２６４５９６号公報、特開平６−３１５３９９号公報）を用いる方法がある。これらの基質は非還元末端が修飾されておりα-グルコシダーゼの影響がないことから原理的に優れている。
【００１７】
なかでも、２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを用いる方法は、追随酵素を必要としないことから低コストであり、しかも、α−アミラーゼの基質親和性が高いため好感度であるといったメリットがあり好適に用いられる。該基質の試薬組成物中での濃度は、反応液中に好ましくは０．０５〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜２ｍＭの範囲で用いられる。
【００１８】
塩素イオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用いる場合も、カルシウムの場合と事情は類似している。
【００１９】
本発明において阻害活性を有する物質とはいわゆる競合阻害剤であり、金属キレート剤、基質アナログが挙げられる。これらは各々単独で用いることもできるが、これらの競合阻害剤としての役割（ブランク反応を抑える、定量性を調節する等）は同じではあるが、その化学的な機序は異なるため組合わせて用いることも可能である。これらの競合阻害剤、金属キレート剤は種々の市販のものを用いることが出来るし、また、当業者であれば種々の公知文献を参照して製造することも可能である。
【００２０】
金属キレート剤としては、測定対象の電解質が特に金属イオンである場合は測定対象以外の金属イオンの試料に存在しうる濃度および当該金属イオンに対するキレート安定度定数を考慮して選択される。例えば、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、クエン酸、酒石酸等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。なかでも、α−アミラーゼを用いたカルシウムイオン測定に用いられる物質としては、α−アミラーゼの至適ｐＨが中性付近であり、本ｐＨ条件下で金属選択性を保持する、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸が好ましい。該金属キレート剤の試薬組成中濃度は反応液中濃度として、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲で用いられる。また、上記に示されるキレート剤を複数組合わせて用いることができる。
【００２１】
基質アナログとしては、例えばカルシウムイオン測定に用いる酵素としてα−アミラーゼを用い、基質として２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドを用いる場合は、マルトオリゴ糖、またはその非還元末端グルコースを修飾したマルトオリゴ糖、またはその還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖より選ばれる基質が好適に用いられる。また、カルシウムイオン測定に用いる酵素としてアポ化されたホスフォリパーゼを用いた場合、リン酸のアナログとしてモリブデン酸、ヒ酸、硫酸イオン等が挙げられるがこれらに限定するものではない。
【００２２】
本発明で言う電解質とは、水その他の溶媒に溶解して溶液がイオン電導を行うような物質をいうものであり、具体的には、カルシウムイオン、塩素イオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等を指す。
【００２３】
本発明の「電解質測定のための組成物」は、液体状、固体状など種々の形態をとることが出来る。また、いくつかのパーツに分割されていて構成されていても良い。例えば液体状の場合は、市販の自動分析機に適用できるよう、あるいは、試薬の安定性を確保する観点から、２以上に分割された構成をとることが好ましい。また、固体状では、粉末、凍結乾燥状態や、例えばドライケミストリーの形態としてチップ等上に塗布された形態などが例示できる。
【００２４】
本発明には、さらに、Ｋｍ値維持剤を含有させることもできる。例えば、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いる電解質測定のための組成物には、化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示されるα−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤を含有させることができる。
【００２５】
本発明において、「測定の感度を一定あるいは高水準に維持したまま定量範囲を拡大する」とは、最低限必要な測定感度と定量範囲の両方を維持することを意味する。適切な測定感度の確保は測定精度の維持に寄与する。
【００２６】
例えば本発明においてカルシウム測定用組成物を想定した場合、測定感度は５から１００ｍＡＢＳ／ｍｉｎ（好ましくは１０から５０ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）であり、このときの測定精度は測定値変動幅として１．２ｍｇ／ｄＬ以下（好ましくは０．８ｍｇ／ｄＬ以下）である。また、定量範囲は測定上限として測定試料が血清である場合１５ｍｇ／ｄＬ（好ましくは２０ｍｇ／ｄＬ）である。
このような性能は、アポ化酵素に対して阻害活性を有する物質の添加濃度を例えばアポ化α−アミラーゼの場合０．１ｍＭ以上（好ましくは０．１５ｍＭ以上）、および、該酵素が作用する基質の添加濃度を０．０１〜１．０ｍＭ（好ましくは０．０３〜０．５ｍＭ）にすることによって達成することが出来る。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
下記のカルシウム測定試薬の第一試薬に１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸を表１に示した濃度になるように添加した３試薬を調整した。カルシウム測定の感度は１０ｍｇ／ｄＬカルシウム水溶液を測定した時の単位時間あたりの吸光度変化率（ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）で評価をした。定量域測定の試料は３０ｍｇ／ｄＬカルシウム溶液を２０段階希釈して調整し、調整した試薬を用いて測定を実施した。定量域は回収率が１００±５％の範囲内に収まっているかどうかで判断した。回収率は理論値に対する割合として算出した。
【００２９】
第一試薬
グッド緩衝液（ｐＨ７．１）  ５０ｍＭ
界面活性剤  ０．１％（Ｗ／Ｖ）
ガラクトシルマルトース  １５０ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド  ０．２ｇ／Ｌ
第二試薬
グッド緩衝液（ｐＨ６．４）  ３００ｍＭ
界面活性剤  ０．１％（Ｗ／Ｖ）
ＮａＣｌ  ２００ｍＭ
マルトース一水和物  １５０ｍＭ
不活性型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来）  ２６ＩＵ／ｍＬ
【００３０】
日立７１７０型自動分析機を用いた。試料量５．２μＬに第一試薬１８０μｌを加え、５分間予備加温した後、さらに第二試薬６０μｌを加えて反応を開始させ、該酵素試液添加後２分後からの３分間における１分当たりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム１０ｍｇ／ｄＬ標準液での２点検量線に基づき資料中のカルシウム量を求めた。測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施した。
【００３１】
【表１】
2006180742.tif 000002
【００３２】
結果  表１に示す。１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸添加量が上昇するにしたがって感度は低下し、回収率が１００±５％範囲に収まる濃度範囲は広くなった。
【００３３】
（実施例２）
下記のカルシウム測定試薬の第一試薬に２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを表２に示した濃度になるように添加した４試薬を調整した。カルシウム測定の感度は１０ｍｇ／ｄＬカルシウム水溶液を測定した時の単位時間あたりの吸光度変化率（ｍＡＢＳ／ｍｉｎ）で評価をした。定量域測定の試料は４８ｍｇ／ｄＬカルシウム溶液を１６段階希釈して調整し、調整した試薬を用いて測定を実施した。
【００３４】
第一試薬
グッド緩衝液（ｐＨ７．１）  ５０ｍＭ
界面活性剤  ０．１％（Ｗ／Ｖ）
ガラクトシルマルトース  １５０ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸  ０．３０ｇ／Ｌ
第二試薬
グッド緩衝液（ｐＨ６．４）  ３００ｍＭ
界面活性剤  ０．１％（Ｗ／Ｖ）
ＮａＣｌ  ２００ｍＭ
マルトース一水和物  １５０ｍＭ
不活性型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来）  ２６ＩＵ／ｍＬ
【００３５】
【表２】
2006180742.tif 000003
【００３６】
結果  表２に示す。２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド添加量が上昇するにしたがって感度は上昇するが、回収率が１００±５％範囲に収まる濃度範囲は変動しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明はカルシウムなどの電解質測定方法等として臨床検査分野において用いることができ、産業界に寄与するところが大である。