(57)【要約】【課題】ポリペプチド内の位置特異的に、所望の分子を導入する方法であって、他の位置が修飾されることなく、ポリペプチドの分解や変性を防ぐことができる、修飾ポリペプチドの製造方法を提供する。【解決手段】炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、前記ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させ、前記非天然型アミノ酸に前記分子を付加することを特徴とする、修飾ポリペプチドの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、前記ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させ、前記非天然型アミノ酸に前記分子を付加することを特徴とする、修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
（１）炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸をポリペプチドに導入する、非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程と、
（２）得られた非天然型アミノ酸含有ポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、前記ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させる、ポリペプチド修飾工程
とを含むことを特徴とする、修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記クロスカップリング反応が共役結合を形成する反応であることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記炭素−炭素不飽和結合が、二重結合又は三重結合であり、前記官能基が芳香環に存在するヨードであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドの分解又は変性を防止する条件が、反応液中にラジカル捕捉剤を存在させるものであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記（１）非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程が、変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、前記変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で、前記非天然型アミノ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを含むものであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記（１）非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程が、ｐＨ８．０〜８．５、マグネシウム濃度４０〜１００ｍＭの条件下、非天然型アミノ酸でアミノアシル化させたｔＲＮＡを用いて、無細胞ポリペプチド合成系で行なうことを含むものであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法で製造し得る、修飾ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチド内の位置特異的に、所望の分子を導入することができる、修飾ポリペプチドの製造方法、及びこの方法により製造し得る修飾ポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、今までにない有用な性質をもつタンパク質をデザインし、生産するうえで、人為的に所望の分子をタンパク質に導入する修飾タンパク質が注目されている。このような方法としては、タンパク質生合成を利用した非天然型アミノ酸の導入、化学的修飾、de novo化学合成によって、タンパク質に天然にない化学的官能基を導入することが行なわれているが、それぞれに限界を有する。
【０００３】
まず、タンパク質生合成で非天然型アミノ酸を導入する方法としては、変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、前記変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で、前記非天然型アミノ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させる方法が知られており（例えば、非特許文献１〜１１）、その導入位置の特異性が高いという点で優れた方法である。ところがこれらの方法では、タンパク質合成に関わる生体分子の基質特異性の改変又は多様性に依存するので、導入できる非天然型アミノ酸の種類は、自ずから制約を受ける。したがって、これらの方法は、その基質特異性の改変又は多様性の限界を超えた構造を有する非天然型アミノ酸の場合は、導入することができない。また、仮に、本来のアミノ酸と比べて、性質・大きさが著しく異なった非天然型アミノ酸が導入できたとしても、この非天然型アミノ酸が存在することにより、翻訳後のタンパク質の正常なフォールディングを阻害する可能性も否定できない。
【０００４】
タンパク質を化学的修飾により修飾する方法も知られているが、化学的官能基を導入する位置を特定することができないという問題がある。例えば、タンパク質中のアミノ基の修飾を、化学的修飾法で行なうと、Ｎ末端とすべてのリジン残基が修飾を受けることになる。
【０００５】
さらに、de novo化学合成では、１００残基以上のポリペプチドの合成は難しく、同時にタンパク質が正しくフォールディングするという保証はない。
【０００６】
タンパク質生合成で非天然型アミノ酸を導入した後、化学的修飾を行なう方法（翻訳後修飾法）も試みられている。非特許文献１２には、アジドホモアラニンを含有するタンパク質と、ホスフィン試薬とStaudinger ligationを用いて反応させる方法が記載されているが、アジドが分解して生じたニトレンがタンパク質のＬｙｓのアミノ基と反応してしまう。同様に、タンパク質側にケト基を導入し、アミン又はヒドラジッドを含む機能性分子とを反応させる方法も知られているが（非特許文献１３及び１４）、やはり、ケト基は、タンパク質のＬｙｓのアミノ基と反応してしまう。
【０００７】
一方、特異性の高い炭素−炭素結合形成反応として、ヘック−ミゾロキ（Heck-Mizoroki）タイプ反応が広く知られている（例えば、非特許文献１５及び１６）。非特許文献１７には、ヘック−ミゾロキ（Heck-Mizoroki）タイプの反応をペプチド（９アミノ酸）であるブラジキニンの修飾反応に用いることが記載されているが、ポリペプチド又はタンパク質への応用は記載されていない。
【０００８】
【非特許文献１】
コイデ（Koide）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第８５巻、１９８８年、ｐ．６２３７−６２４１
【非特許文献２】
ノーレン（Noren）ら、サイエンス（Science）、 第２４４巻、１９８９年、ｐ．１８２−８
【非特許文献３】
ワング（Wang）ら、サイエンス（Science）、第２９２巻、２００１年、ｐ．４９８−５００
【非特許文献４】
チン（Chin）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２４巻、２００２年、ｐ．９０２６−９０２７
【非特許文献５】
チン（Chin）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第９９巻、２００２年、ｐ．１１０２０−１１０２４
【非特許文献６】
ファーター（Furter）、Protein Sci.第７巻、１９９８年、ｐ．４１９−４２６
【非特許文献７】
ワング（Wang）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２４巻、２００２年、ｐ．１８３６−１８３７
【非特許文献８】
サントロ（Santoro）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、第２０巻、２００２年、ｐ．１０４４−１０４８
【非特許文献９】
キガら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第９９巻、２００２年、ｐ．９７１５−９７２３
【非特許文献１０】
サカモトら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第３０巻、２００２年、ｐ．４６９２−４６９９
【非特許文献１１】
Kirschenbaumら、ChemBioChem  ２００２、No.02-03、２３５−２３７
【非特許文献１２】
キック（Kiick）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、 ＵＳＡ、第９９巻、２００２年、ｐ．１９−２４
【非特許文献１３】
Dattaら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２４巻、２００２年、ｐ．５６５２−５６５３
【非特許文献１４】
Liuら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of American Chemical Society）、第１２５巻、２００３年、ｐ．１７０２−１７０３
【非特許文献１５】
オークロら、Tetrahedron Lett. vol.33,  １９９２年、p5363
【非特許文献１６】
Hundertmarkら、Organic Letters 第２巻、２０００年、ｐ．１７２９−１７３１
【非特許文献１７】
Dibouskiら、Angew.Chem.Int.Ed.第３７巻、1998年、ｐ．４７６−４７８
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ポリペプチド内の位置特異的に、所望の分子を導入する方法であって、他の位置が修飾されることなく、ポリペプチドの分解や変性を防ぐことができる、修飾ポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記の方法を提供する。
１．  炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、前記ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させ、前記非天然型アミノ酸に前記分子を付加することを特徴とする、修飾ポリペプチドの製造方法。
２．  （１）炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸をポリペプチドに導入する、非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程と、
（２）得られた非天然型アミノ酸含有ポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、前記ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させる、ポリペプチド修飾工程
とを含むことを特徴とする、修飾ポリペプチドの製造方法。
３．  前記クロスカップリング反応が共役結合を形成する反応であることを特徴とする、前記１又は２の方法。
４．  前記炭素−炭素不飽和結合が、二重結合又は三重結合であり、前記官能基が芳香環に存在するヨードであることを特徴とする前記３の方法。
５．  前記ポリペプチドの分解又は変性を防止する条件が、反応液中にラジカル捕捉剤を存在させるものであることを特徴とする、前記１乃至４のいずれかの方法。
６．  前記（１）非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程が、変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、前記変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で、前記非天然型アミノ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを含むものであることを特徴とする前記２乃至５の方法。
７．  前記（１）非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程が、ｐＨ８．０〜８．５、マグネシウム濃度４０〜１００ｍＭの条件下、非天然型アミノ酸でアミノアシル化させたｔＲＮＡを用いて、無細胞ポリペプチド合成系で行なうことを含むものであることを特徴とする、前記５の方法。
さらに、本発明は、前記１乃至７のいずれかの方法で製造し得る、修飾ポリペプチドも提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、ポリペプチドとは、一般的な定義に従い、１０以上のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するものをいい、分子量５０００以上のポリペプチドをタンパク質という（例えば、化学辞典、東京化学同人）。特に本明細書において、タンパク質とは、その翻訳後のフォールディングによって、独自の構造を有し、それにより主に生体内で何らかの機能・活性を示し得るポリペプチドをさすこともある。
【００１２】
ポリペプチドの分解又は変性とは、ポリペプチドが金属の存在によって、構造上の変化、特にペプチド結合の切断、多量体化、アミノ酸側鎖の酸化などを受けることをさす。そして、「ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件」とは、その条件が存在しない場合に受けることになる、ペプチド結合の切断、多量体化、アミノ酸側鎖の酸化を低減して、当該ポリペプチドの構造を保持して必要なレベルの所望の活性又は機能を維持することを意味する。タンパク質が切断・分解されていないことは、SDS-PAGEによる分離と、その後の当該タンパク質に特異的な抗体による検出によって確認することができる。
【００１３】
本発明の修飾ポリペプチドの製造方法は、修飾タンパク質の製造に好ましく用いられるので、以下修飾タンパク質を例にとって説明する。
本発明は、タンパク質のフォールディングを妨げないような、非天然型アミノ酸を導入し、タンパク質が正しくフォールディングした後で、タンパク質分子と望みの化学的官能基を持つ分子を、結合させる方法である。
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。以下の説明において、タンパク質に導入しようとしている分子の末端の、反応に寄与する部分をリンカー、タンパク質に導入されていて、リンカーと特異的に反応する部分をケミカルハンドルと称する。
【００１５】
本発明において、「炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の一方を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子」とを反応させるとは、炭素−炭素不飽和結合を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合とクロスカップリング反応可能な官能基を末端に有する分子とを反応させる場合、及び炭素−炭素不飽和結合とクロスカップリング反応可能な官能基を有する非天然型アミノ酸を含有するポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合を末端に有する分子とを反応させる場合のいずれでもよい。
クロスカップリング反応とは、タンパク質に導入した非天然型アミノ酸中のケミカルハンドルと、分子のリンカーとの間の反応により、炭素−炭素結合を生成する反応をいう。
【００１６】
すなわち、リンカーが炭素−炭素不飽和結合の場合、ケミカルハンドルは該結合とクロスカップリング反応可能な官能基からなるものが選ばれ、反対に、ケミカルハンドルが炭素−炭素不飽和結合の場合、リンカーは該結合とクロスカップリング反応可能な官能基からなるものが選ばれる。
炭素−炭素不飽和結合としては、二重結合又は三重結合を挙げることができる。
炭素−炭素不飽和結合とクロスカップリング反応可能な官能基としては、不飽和炭素に結合したハロゲンなどが挙げられ、例えば芳香族ヨウ化物、芳香族臭化物などの芳香族ハロゲン化物が挙げられ、特に、４−ヨードフェニルアラニン、３−ヨードチロシン、４−ブロモフェニルアラニン、４−アミノ-３-ヨードフェニルアラニン、４−アセチル-３-ヨードフェニルアラニン、２−ヨードトリプトファン、５−ヨードピリジン−２−イルアラニン、５−ヨードチオフェン−３−イルアラニン、５−ヨードフラン−３−イルアラニンなどが挙げられる。
【００１７】
次に、タンパク質にケミカルハンドルを導入する方法について説明する。
（１）非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの調製
ここで用いる非天然型アミノ酸は、ケミカルハンドルを含むものである。ケミカルハンドルは、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基のいずれかである。
【００１８】
非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの製造方法は、特に限定されず、例えば無細胞ポリペプチド合成系、真性細菌、真核細胞内でポリペプチドを合成する系などがいずれも適用可能である。これら非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの合成法において、位置特異的に分子を結合させるためには、用いる非天然型アミノ酸のアミノ酸導入位置を厳密に制御することが好ましい。すなわち、金属触媒を用いるクロスカップリング反応法に適した、非天然型アミノ酸をタンパク質の特定部位に導入する過程としては、タンパク質の生合成反応を利用することが好ましい。
そのような方法としては、非天然型アミノ酸含有ポリペプチド合成工程が、変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、前記変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で、前記非天然型アミノ酸と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡとを用いたポリペプチド合成系によって、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子を用いて、非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを含む方法が好ましい。このような方法としては、例えば、非特許文献１〜１１に記載された方法を用いることができる。
【００１９】
これらの方法において、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素としては、その基質特異性が非天然型アミノ酸に対しても向けられた野生型のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の他、本来のアミノ酸に対する特異性に比べて非天然型アミノ酸誘導体に対する特異性が高められた変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることができる。
具体的には、非特許文献１１に記載された方法に準じて、大腸菌フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Ａｌａ１９４→Ｇｌｙ）と大腸菌のサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅを用いることにより、タンパク質にｐ−ヨード、ｐ−ブロモ、ｐ−エチニルフェニルアラニンを導入して、これらをケミカルハンドルとして使用できる。同様に、非特許文献６に記載された方法に準じて、出芽酵母のフェニルアラニルtRNA合成酵素とtRNAPheを用いることにより、ｐ-フルオロフェニルアラニンを導入することができる。
【００２０】
また、非特許文献９に記載された方法に準じて、大腸菌チロシルｔＲＮＡ変異体（Ｖ３７Ｃ１９５）と大腸菌のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒを用いることにより、３−ヨードチロシンを導入して、これをケミカルハンドルとして使用することができる。同様に、非特許文献３に記載された方法に準じて、古細菌Methanococcus jannaschiiのTyrRSの変異体と、古細菌のtRNATyrを用いることにより、３−ヨードチロシンを導入して、これをケミカルハンドルとして使用することができる。
また、非特許文献１２に記載された方法に準じて、大腸菌メチオニルｔＲＮＡ合成酵素と大腸菌のサプレッサーｔＲＮＡＭｅｔを用いることにより、２−アミノ−５−ヘキシン酸をケミカルハンドルとして使用できる。
【００２１】
サプレッサーｔＲＮＡは、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はその変異体により、非天然型アミノ酸でアミノアシル化され、アンチコドンがストップコドンに対応するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは、その転写の鋳型となる配列を有する鋳型ＤＮＡを調製し、その転写反応により作製することができる。鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲによる増幅で行なうことが好ましい。この方法では、大量の鋳型を高い純度で作製することができる。
【００２２】
さらに、非天然型アミノ酸に対する特異性が高められる条件で、ｔＲＮＡのアミノアシル化反応を行なうことが好ましい。例えば、後述の実施例に記載したように、ポリペプチド合成に先立ち、ｐＨ８．０〜８．５、マグネシウム濃度４０〜１００ｍＭの条件下、変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、サプレッサーｔＲＮＡ、及び非天然型のアミノ酸を混合して、サプレッサーｔＲＮＡを非天然型アミノ酸でアミノアシル化しておくことが好ましい。更に好ましくは、マグネシウム濃度が約７０ｍＭ、約ｐＨ８．１の条件で、サプレッサーｔＲＮＡをアミノアシル化する。
【００２３】
ついで、この変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素で、前もって非天然アミノ 酸でアミノアシル化された、サプレッサーｔＲＮＡを用い、周知の無細胞ポリペプチ ド合成系で、所望の位置にアンバー変異が導入されたポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡから、ポリペプチドを合成する。
【００２４】
本発明において、「無細胞ポリペプチド合成系」は、細胞抽出液を用いて、インビトロでポリペプチドを合成する系を意味するものであり、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でポリペプチドを合成する無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含むものを包含する。
無細胞ポリペプチド合成系に必要なものとしては、
・任意の細胞抽出液、
・変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素で、前もって非天然アミノ酸でアミノアシル化された、サプレッサーｔＲＮＡ（上述）
・所望の位置にアンバー変異が導入されたポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ
が挙げられる。
【００２５】
前記無細胞系において、細胞抽出液は、リボゾーム、ｔＲＮＡ、ポリペプチド合成に必要な酵素などを含む真核および原核生物細胞の粗抽出液から調製されるものであって、高いポリペプチド合成活性の状態の大腸菌の細胞抽出液、特に大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を用いることができる。例えば、大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）から既知の方法（Ｚｕｂａｙら（１９７３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−２８７）で得ることができる。（Ｐｒｏｍｅｇａ社からも入手可能）
【００２６】
無細胞ポリペプチド合成系（すなわち、ポリペプチド合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含むことができる。その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
【００２７】
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−酢酸のような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はポリペプチドを構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
【００２８】
非天然型アミノ酸を組み込ませるポリペプチドの種類は、限定されるものではなく、発現可能ないかなるポリペプチドでもよく、異種の組換えポリペプチドでもよい。
本発明において非天然型アミノ酸を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）を導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。
【００２９】
ポリペプチドに部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)、Zoller, Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Kramer, Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。
【００３０】
本発明では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、真核または原核生物の細胞もしくは組織からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡとして周知の方法（フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心など）で得るか、あるいは、ｃＤＮＡクローニングで合成・単離することができる。あるいは、ポリペプチドのアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列が判明している場合には、ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成することもできる。
【００３１】
温度および攪拌速度などの反応条件は、ポリペプチドの種類に応じて任意の条件を使用できる。ポリペプチドの合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは約３２℃である。また、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のポリペプチドの生成を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
【００３２】
（２）タンパク質に導入する分子の調製
タンパク質に導入する分子としては、リンカーが末端に結合している分子を用いることができる。あるいは、所望の分子の末端に、リンカーを結合させることにより、本発明に用いることができる。
【００３３】
タンパク質に導入する分子としては、例えば、
・アミン（第１、第２、第３、第４）
・アルコール（第１、第２、第３）
・カルボニル
・カルボキシル
・チオール
・スルホキシド
・スルホン
・スルホン酸
・アリール
・アリル
・含硫黄ヘテロ環
・含窒素ヘテロ環
などの官能基又はその縮合物を含む機能性分子が挙げられる。また、周知の補酵素、糖鎖、脂肪鎖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、脂質、糖質およびそれらの誘導体、あるいは非天然分子を用いることができる。
さらには、周知の蛍光体、液晶を示す周知の分子（液晶分子）、又は基板などと結合することもできる。
【００３４】
例えば、下記の蛍光体（カスケードブルー）を用いることができる。
【化１】
2006180709.tif 000002
【００３５】
また、下記の液晶分子（ＭＢＢＡ）を用いることができる。
【化２】
2006180709.tif 000003
【００３６】
所望の分子の末端にリンカーを有していないときは、末端アルキン又は末端アルケンをリンカーとして、付加することができる。
リンカー付加法としては、例えば、
市販の、プロパルギルアミン（ＨＣ≡ＣＣＨ２ＮＨ２）
市販の、プロピオル酸（ＨＣ≡ＣＣＯＯＨ）
などを周知の方法で、下記のとおり、機能性分子と反応させる。
【００３７】
【化３】
2006180709.tif 000004
（Ｒは任意の機能性分子である）
【００３８】
【化４】
2006180709.tif 000005
（Ｒは任意の機能性分子である）
【００３９】
（３）翻訳後修飾反応について
得られた非天然型アミノ酸含有ポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子とを、金属触媒の存在下、ポリペプチドの分解又は変性を抑制する条件において反応させる、ポリペプチド修飾工程である。
【００４０】
金属触媒存在下で、得られた非天然型アミノ酸含有ポリペプチドと、炭素−炭素不飽和結合又は該結合とクロスカップリング反応可能な官能基の他方を末端に有する分子との反応としては、反応後に共役結合を形成する反応を用いることが好ましく、具体的にはヘック−ミゾロキタイプ反応、中でもソノガシラ反応を用いることが好ましい。
ここで、共役結合とは、多重結合と単結合が交互に連結した結合形態をいい、例えば、＝Ｃ−Ｃ＝、≡Ｃ−Ｃ≡などが挙げられる。
共役結合を形成する反応を用いると、
・修飾後に、さらなる環化反応により多様な分子構造を形成することができる
・     電子伝達性をもたせることができる
という利点を有する。
【００４１】
例えば、ヘック−ミゾロキ反応の場合は、Ｐｄ（ＯＡｃ）２などのパラジウム触媒、塩基の存在下、下記の共役結合が形成されるクロスカップリング反応である。
【００４２】
【化５】
2006180709.tif 000006
（Ｒは任意である）
【００４３】
この反応を利用した、本発明の態様の例を示すと、下記の通りである。
【化６】
2006180709.tif 000007
（Ｒは任意の分子である）
【００４４】
ソノガシラ反応は、Ｐｄ（Ｏ）などのパラジウム触媒、Ｃｕ（I）、塩基の存在下で、下記の共役結合が形成されるクロスカップリング反応である。
【化７】
2006180709.tif 000008
（Ｒは任意である）
【００４５】
この反応を利用した、本発明の態様の例を示すと、下記の通りである。
【化８】
2006180709.tif 000009
（Ｒは任意の分子である）
【００４６】
ソノガシラ反応は、安定なケミカルハンドルとリンカーを利用する点、クロスカップリングにより生じたＣ−Ｃ結合が安定である点、及び修飾反応の官能基特異性が高い点、室温付近で反応が進行する点で好ましいが、これらの方法をそのまま、タンパク質の修飾に応用すると、これらの反応で添加される金属触媒の存在によって、タンパク質がクロスカップリング反応中及び反応終了後に酸化的に分解又は変性することがわかった。
【００４７】
そこで、本発明は、このタンパク質（ポリペプチド）の分解又は変性を抑制する条件で行なうべく、検討した結果、特異性が高く安定な結合を作る反応を可能にする金属触媒存在下のクロスカップリング反応において、その金属触媒の存在に起因するタンパク質（ポリペプチド）の分解又は変性を抑制する条件を見出したものである。
【００４８】
具体的には、ラジカル捕捉剤を反応液中に添加することができる。
すなわち、液相に溶け込んだ酸素（溶存酸素）に由来するラジカルを取り除くためのラジカル捕捉剤を反応に加えることで、金属触媒によるクロスカップリング反応を妨げずに、タンパク質（ポリペプチド）の分解又は変性を抑制できることを見出したものである。
【００４９】
一般に、金属イオン存在下で、タンパク質は酸化修飾を受け、切断、多量体化、アミノ酸側鎖の酸化などが起こることが知られている。このような、酸化を防止するためには、一般に、還元剤を加えることが知られている。
ここで、還元剤とは：
酸化体と還元体の化学平衡
Ｏ  ＋  ｎｅ−  →    Ｒ
において、酸化還元対Ｏ／Ｒ系の標準電極電位が標準水素電極と比較して負であり、かつ反応系のなかでも最も標準電極電位Ｅ０が負である物質を意味する。要するに、還元剤とは、自発的に電子を供与する物質であり、かつ系中の物質から電子を受け取らないもの、ということができる。このような物質としては、例えば、ホスフィン化合物（ＴＣＥＰ塩酸塩）、チオール化合物（ＤＴＴ、２−メリカプトエタノール、システイン）などが挙げられる。
【００５０】
本発明者らは、前記クロスカップリング反応において、タンパク質、金属、還元剤が存在すると以下のサイクルがおこることを見出した。
まず、金属が酸化される（例えば、Ｃｕ（Ｉ）は酸化されて、Ｃｕ（II）になる）。同時に、溶存酸素が還元されて、活性酸素になる。活性酸素は、４種類存在するが、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が最も反応性が高い。生成した
・ＯＨは、タンパク質を酸化修飾する。Ｃｕ（II）は、還元剤により、Cu（I）に戻る。
このサイクルの繰り返しがおこる。そして、ラジカルは、次のような連鎖反応で、タンパク質を酸化する。
まず、ラジカルは非ラジカルから電子または水素（・Ｈ）を引きぬいて、自身は非ラジカルになる。新しく生成したラジカルは他の分子をラジカルに変えるか、酸素分子と反応して過酸化ラジカルになる。この連鎖反応の過程で、タンパク質が酸化変性する。
【００５１】
ラジカル捕捉剤は、タンパク質の酸化修飾を抑制する。本発明で用いられるラジカル捕捉剤は、ラジカル化しても化学的に安定なものである。安定なラジカルは新しいラジカルを生成しないので、ラジカルの連鎖反応を停止させることができる。こうして、ラジカル捕捉剤は、タンパク質の酸化反応を抑制することができる。
【００５２】
本発明において、ラジカル捕捉剤とは、活性酸素ラジカルの求電子攻撃を受け、結果的に電子または水素（・Ｈ）を供与するか、酸素または電子の励起エネルギーを受け取ることができる物質を意味する。すなわち、それ自体還元性がない（自発性に電子を供与することができない）物質でも、ラジカルに攻撃されれば、電子（水素）が引き抜かれたり、酸素分子を受け取ることができる。
【００５３】
本発明において、好ましく用いられるラジカル捕捉剤は、以下の特性を有する物質である。
１．タンパク質を変性させないラジカル捕捉剤
２．自身がラジカル化した後も化学的に安定であること、
３．ラジカル連鎖反応を加速しないこと
４．金属触媒に配位して、修飾反応を阻害しないこと
５．還元性が低いこと
６．アミノ酸残基と反応しないこと
さらに下記の性質を有することが好ましい。
７．低分子で除去が容易であること
８．水系溶媒への溶解度が高いこと
９．保存できること
【００５４】
これらの条件を満たすものであれば、特に制限されないが、具体的には下記のものが挙げられる。
・トリプトファン、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）（J Cell Biochem. 2001;81(3):507-13.）、メラトニン（Curr Top Med Chem. 2002 Feb;2(2):181-97. Review.）などのインドール類；
・硫黄含有化合物類、例えばＤＭＳＯ（Mutat Res. 1976 Nov;37(2-3):193-200.）、ヒポタウリン（Biochem Biophys Res Commun. 1999 Jan 27;254(3):661-5.）などのスルオキシド（Ｓ＝Ｏ）含有化合物類、２−（メチルチオ）エタノール（Biochemistry. 1995 May 2;34(17):5762-72.）、メチオニン（Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 5;72(5):523-9.）、チオアニソール（Prostaglandins. 1976 Apr;11(4):599-607）、メチオナール（Prostaglandins. 1976 Apr;11(4):599-607.）、Ｎ−アセチルシステイン（J Pharmacol Exp Ther. 1999 Jun;289(3):1634-40.）などのスルファニル（−Ｓ−）含有化合物類、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチオウレア（ＤＭＴＵ）（Diabetes Res Clin Pract. 1989 Apr 1;6(3):167-71.）などのチオ（＝Ｓ）含有化合物類、チオジプロピオン酸ジラウリル
・セレノメチオニン、Ｓｅ（IV）などのセレン含有化合物類
・トレハロース、マンニトール（Plant Physiol. 1997 Oct;115(2):527-532.）、グリセリン（Stroke. 1982 Jan-Feb;13(1):35-9.）、エタノール、グルコース（Kidney Int. 1992 Jun;41(6):1588-94.）などの１級アルコール類
・ギ酸ナトリウム（Ital J Biochem. 1991 Jul-Aug;40(4):223-8.）などのギ酸塩類
・オイゲノール（Mol Cell Biochem. 1994 Aug 17;137(1):1-8.）、クルクミン（Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jul 5;295(1):62-6.）などのアルキン類
・クレゾール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（Biochem J. 1990 Aug 15;270(1):241-3.）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（Biochem Med Metab Biol. 1994 Feb;51(1):74-9.）、ｐ−ヒドロキシアニソールなどのフェノール類
・３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸）（J Nat Prod. 2001 Apr;64(4):480-6.）、没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、サリチル酸ナトリウム（Brain Res. 2000 May 12;864(2):281-90.）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（バニリン酸）などの安息香酸誘導体類
・カテキン（Free Radic Biol Med. 1994 Jun;16(6):845-50.；Chem Pharm Bull (Tokyo). 1999 Feb;47(2):279-83.）、エピカテキン、ルチン（Free Radic Biol Med. 2000 Sep 15;29(6):507-14.）、エラグ酸、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸（カフェー酸）、レスベラトロール（Toxicol Lett. 2002 Sep 5;135(1-2):1-9.）、ＮＤＧＡ（nordihydroguaiaretic acid）（Agents Actions. 1987 Jun;21(1-2):191-4.）、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウムなどのポリフェノール類
・４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ（Clin Exp Pharmacol Physiol. 2002 Jan-Feb;29(1-2):26-31.）
【００５５】
中でも、特に好ましいラジカル捕捉剤は、硫黄含有化合物、ギ酸塩、安息香酸誘導体、ポリフェノール化合物、トレハロース、マンニトール、グリセリン、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシからなる群より選ばれる化合物である。
ラジカル捕捉剤の量は、反応の種類及びラジカル捕捉剤の種類に応じて、当業者によって適宜決定され得るが、一般的にはタンパク質とのモル比で10倍、好ましくは100倍以上である。
【００５６】
反応に用いられる金属触媒としては、遷移金属化合物が用いられることが好ましく、具体的には、鉄、ルテニウム等の鉄族、コバルト、ロジウム、イリジウム等のコバルト族、ニッケル、パラジウム等のニッケル族から選ばれる遷移金属の塩化物、臭化物、ヨウ化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩、チオシアン酸塩、アセチルアセトナート等を挙げることができる。これらの中では、特に、パラジウム化合物、例えば、塩化パラジウム（ＩＩ）、硝酸パラジウム（ＩＩ）、硫酸パラジウム（ＩＩ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）、パラジウム（ＩＩ）アセチルアセトナート等の二価パラジウム塩を好適に用いることができる。
しかしながら、本発明の方法において、用いる金属触媒の種類は、クロスカップリング反応に用いられることが周知（例えば非特許文献１５及び１６）の多くの触媒の中から目的とする反応に応じて、当業者によって決定され得るものである。
【００５７】
このような遷移金属化合物は、そのままでも用いることができる。しかし、遷移金属化合物は、これに配位子が配位した遷移金属錯体として用いる方がクロスカップリング反応が進行しやすい。即ち、遷移金属化合物と共に、上記遷移金属の配位子となり得る有機化合物を反応系に共存させるか、又は予め遷移金属化合物と上記配位子とから遷移金属錯体を調製して用いることが好ましい。
【００５８】
このような配位子となり得る化合物としては、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセチルアセトン等の含酸素有機化合物、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アニリン、ジフェニルアミン、ピリジン、ピコリン、2,2'−ビピリジン、1,10−フェナントロリン等の含窒素有機化合物、トリエチルホスフィン、トリプロピルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィン、ビス（ジフェニルホスフィノ）メタン、1,２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、1,３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン、1,４−ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、トリエチルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリフェニルホスファイト、トリフェニルホスフィンオキサイド、トリス（３−ホスホフェニル）ホスフィン、トリフェニルホスフェート等の含リン有機化合物を挙げることができる。これらのなかでは、親水性のホスフィンを用いることが好ましい。例えば、トリス（３−スルホフェニル）ホスフィンの三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ）で行なうことができる。
【００５９】
また、予め遷移金属化合物に有機配位子を配位させた遷移金属錯体としては、例えば、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（II）ジクロリドなどを用いることができる。
【００６０】
本発明の方法において、用いる金属触媒の量は、目的とする反応に応じて、当業者によって決定され得るものである。通常、遷移金属化合物が、炭素−炭素不飽和結合に対して、0.００１〜５００００モル％、好ましくは、0.０１〜１モル％の範囲になるように用いられる。また、配位化合物は、遷移金属化合物に対して、通常、２０倍モル以下、好ましくは、0.１〜１０倍モル量の範囲で用いられる。
【００６１】
反応は、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、有機反応及び錯体合成で一般的な溶媒、例えば、ｎ−ペンタン、ｉ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−デカン、ベンゼン、トルエン、アセトン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｎ−ブチルメチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、シメチルスルホキシド、トリエチルアミン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の溶媒、またはこれらの混合物中で行なうことができる。温度は、４０℃以下、より好ましくは３０℃以下の室温で行なうことが好ましい。反応時間は、３０分〜１時間程度である。
【００６２】
例えば、ソノガシラタイプの反応を用いた本発明におけるクロスカップリング反応系の一例を挙げると下記の通りである。
1 ug/ml  〜  １０００ ug/ml、好ましくは約３０μｇ／ｍｌのポリペプチド
１mM  〜  20 mM、好ましくは約２０ｍＭの末端アルキン
50 mM  〜  400 mM、好ましくは約２００ｍＭのバッファー（ＴＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ）
0.1 mM  〜  5 mM、好ましくは約２ｍＭのＭｇＣｌ２、
50 mM  〜  500 mM、好ましくは約１００ｍＭのＮａＣｌ
1 mM  〜    500 mM、好ましくは約５０ｍＭのラジカル捕捉剤
0.01 mM  〜  2 mM、好ましくは約０．0２ｍＭのパラジウム触媒
0.04 mM  〜  8 mM、好ましくは約0.08ｍＭのＣｕＩ又はＣｕ（ＴＦＭＳＡ）
0 %  〜  1%、好ましくは約０．0５％の界面活性剤（triton又はグリコピラノシド）
試薬は、反応前に脱気し、反応は、窒素ガス存在下、室温にて２０分間行なう。
また、本発明の別の態様として、前記共役結合を形成するクロスカップリング反応の後に、MeGuireら（Ｊ. Org. Chem. 1994 Nov 4;59(22):6683-6.）に記載された下記の環化反応：
【００６３】
【化９】
2006180709.tif 000010
（Ｒ１及びＲ２は任意である）
を組み合わせて、下記のようにより複雑な構造をポリペプチドに導入することができる。
【００６４】
【化１０】
2006180709.tif 000011
（Ｒ及びＲ１は任意である）
このように、本発明は、周知の方法との組み合わせにより、多様な反応が可能となる。
【００６５】
（４）ポリペプチドの精製
生成物の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析でも検出することができる。
ポリペプチドの単離・精製としては、生産したポリペプチド特有の性質に基づき、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈澱、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行なうことができる。タンパク質が切断・分解されていないことは、SDS-PAGEによる分離と、その後の当該タンパク質に特異的な抗体による検出によって確認することができる。また、当該タンパク質の活性は、当該タンパク質について周知の方法によって確認することができる（活性が保持されていれば，正しい立体構造を保持しているとわかる）。また導入した分子の活性が保持されていることは、当該分子の活性を調べることで確認できる。例えば、ビオチンを結合した場合は、アビジンとの結合能、蛍光物質の場合は、蛍光観測などで確認することができる。
【００６６】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００６７】
［全般］
・一般遺伝子操作については，特に指定がなければ「Molecular Cloning 3rd Ed. Vol. 1-3, J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001」に準拠して行った。
・PCRは，特に指定がなければ，次の条件で行った。
ＫＯＤ DNA polymerase (東洋紡社から購入)，酵素に添付の反応用緩衝液を使用し，反応液の容量は50マイクロリットルとする．プライマーは25ピコモルずつ使用し，鋳型DNA を１００ナノグラム使用する。
反応の温度制御は次の通りとした。
98℃５分→（98℃10秒→50℃15秒→72℃ｙ秒）×ｚ回→72度５分
ｘ：x=1でDNAの増幅が認められないときは，xを10, および100としてPCRを行う。
ｙ：yは30以上で，PCRで生成するDNA断片の長さを500で割って60を掛けた値とする。
ｚ：z=25でDNAの増幅が認められないときは，30, および35としてPCRを行う。
【００６８】
（１）４−ヨードフェニルアラニン（４ＩＦ）組み込みタンパク質の調製
ａ．大腸菌フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンターゼ（Ａ２９４Ｇ）の調製
大腸菌PheRS(A294G) は、ハロゲン化フェニルアラニンを基質にすることが知られている（biochemistry (1994), vol.33, p7107-7112）。これを利用して、４−ヨードフェニルアラニンのポリペプチドへの導入のために、まず酵素の調製を行なった。
【００６９】
◇PheRS wt. 発現系の構築(pUC119-pheST)
J.MOL.BIOL. (1985), vol.184, p31-44には、大腸菌 pheS,T の発現制御領域を除くと、PheRS wt. の大量発現が可能になることが記載されている。また、大腸菌は、thrS、infC、rplT、pheS、pheT 及び himA 遺伝子群（GenBank ACCESSION#  V00291；配列番号１及び図１）がクラスターをなしていることが知られている。thrSはスレオニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子、infCは開始因子ＩＦ３遺伝子、rplTはリボソームタンパク質Ｌ２０、pheS（フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素βサブユニット；ＣＤＳは塩基番号３９５３〜４９４８）、pheT （フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素αサブユニット；ＣＤＳは塩基番号４９６３〜７３５０）及び himAは組込み宿主因子αサブユニット遺伝子である。
これらは、大腸菌染色体の３８分の位置にあり、Eco RI-Hind III断片としてプラスミドベクターｐＢＲ３２２にクローン化することができる（ｐＢＩ；Gene,11,33-42 (1980)）。
【００７０】
配列番号１の塩基番号３８７５から３８８０に存在するＳｍａＩ制限部位(cccggg)と、配列番号１の塩基番号７３９７−７４０２に存在するHindIII制限部位(AAGCTT)の間の断片をサブクローニングした。すなわち、pBIよりSmaI-BamHI 断片を切り出し、pUC119 にサブクローニングした。こうして、pUC119のlac プロモーター下流に大腸菌pheS,pheTのORFを繋いだ構造のプラスミドpUC119-pheSTを得た。
ついで、下記の方法で、PheRS(A294G)の発現系の構築を行なった。
【００７１】
第１のPCR
鋳型:    pUC119-pheST
プライマー：プライマー１（配列番号２）と プライマー２（配列番号３）
第２のPCR
鋳型:    pUC119-pheST
プライマー ；第１の PCR 産物と プライマー３（配列番号４）
第２のPCR産物を、SmaI と BamHI （BamHI制限部位ggatccは、配列番号１の塩基番号５６８７〜５６９２）で切断し、この SmaI-BamHI 断片を、pUC119-pheSTのSmaI-BamHI 断片（大）と連結した。こうして、PheRS(A294G)の発現系を構築した。
このプラスミドを有する大腸菌を、アンピシリンを含むLB培地で液体培養し、OD600 = 0.5前後で、IPTGを添加することにより、発現誘導した。菌体を破砕した後、陰イオン交換 (open colulmn) の後、疎水性カラム (FPLC)を用いて精製した。
ここで、カラム１：DEAE SEPHACEL (Pharmacia 製)を用い、KCl 濃度勾配50 mM → 500 mM で溶出した。ついで、カラム２：PHENYL-SUPEROSE 10/10    (Pharmacia 製）を用い、硫安濃度勾配 1.5 M  → 0 M で溶出した。
【００７２】
ｂ．UAG stop を含むras 遺伝子の調製
PCR鋳型に用いたplasmid pk7-rasHISwt（配列番号５）は、pk7-rasにggatccctggtgccacgcggtagtcaccaccaccaccaccac （配列番号５の塩基番号１８５９〜１９００に相当する）という配列を挿入した配列を有するものである。この配列を鋳型とし、各々、３２位と１７４位にアンバーコドンを有し、末端にＨｉｓタグが付与されたｒａｓの鋳型ＤＮＡ（各々、Ｙ３２−ＲａｓＨｉｓ、Ｙ１７４−ＲａｓＨｉｓと称する）を、それぞれ異なる鋳型を用いてPCRにより作製した。
【００７３】
2006180709.tif 000012
【００７４】
2006180709.tif 000013
こうして、Ｙ３２−ＲａｓＨｉｓ、Ｙ１７４−ＲａｓＨｉｓを調製した。
【００７５】
ｃ．ｔＲＮＡＰｈｅの調製
ｔＲＮＡＰｈｅの鋳型となるｔＤＮＡＰｈｅ（ＣＵＡ）（Ｃ３Ｇ）（配列番号１０）をＰＣＲで 調製した。
反応液  ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ
バッファー：ＫＯＤポリメラーゼに添付して生産者（Toyobo）から提供されるもの
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
プライマー８（配列番号１１）：０．１μM
プライマー９（配列番号１２）：１．３３μM
プライマー１０（配列番号１３）：１．３３μM
ＫＯＤポリメラーゼ（TOYOBO）：１２．５ｕ/ｍｌ
で９８℃  １５秒、６８℃３０秒を３５サイクル行ない、その後、74℃５分、４℃とした。
得られたｔＤＮＡＰｈｅ（ＣＵＡ）（Ｃ３Ｇ）（配列番号１０）を鋳型として転写を行なった。転写は、Uhlenbeckの方法（Methods Enzumol. 1989;180;51-62）に準じて行ない、目的とするｔＲＮＡを得た。
【００７６】
ｄ．４−ヨードフェニルアラニンの精製
反応の効率を上げるため、市販のＩ−Ｐｈｅ（fluka.sigma）に３％程度含まれるＢｒ−ＰｈｅをＨＰＬＣを用いて除いた。サンプルは８％ＡｃＯＨに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、カラムはコスモシール５Ｃ１８ＡＲII（粒径５μｍ、ポアサイズ１２ｎｍ）、溶媒系は、ＭＥＫ、アセトニトリルを用いた。
【００７７】
ｅ．プレチャージ（４―ヨードフェニルアラニンをサプレッサーｔＲＮＡに結合させる）
反応系の組成は、１０ｍＭ  ＡＴＰ、７０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２０％  ＤＭＳＯ、２．５ｍＭ  スペルミジン、０．２５％  Tween40、飽和４−ヨードフェニルアラニン、１ｎＭ  大腸菌フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンターゼ（Ａ２９４Ｇ）とした。これらを混合し、２５℃で２５〜３０分間インキュベートし、アミノアシル化反応を行なった後、フェノール／クロロホルム（１：１）の混合液を添加し、４℃で遠心分離し、上清をＰＤ−１０カラムと２５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ用いて精製し、最後にエタノール沈澱を行ない、４−ヨードフェニルアラニンをサプレッサーｔＲＮＡに結合させたものを得た。
この反応により、アミノアシル化率６０％で、４−ヨードフェニルアラニンをサプレッサーｔＲＮＡに結合することができた。
【００７８】
ｆ．無細胞系による４−ヨードフェニルアラニン組み込みポリペプチドの合成
反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ（Ｙ３２−ＲａｓＨｉｓ又はＹ１７４−ＲａｓＨｉｓ）  ４ｎｍ、プレチャージｔＲＮＡ０．１６９ｍｇ／ｍｌ、ＤＴＴ１．７７３ｍＭ、ＡＴＰ１．２２５ｍＭ、ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ各０．８７０ｍＭ、フォリン酸６８μＭ、ｃＡＭＰ０．６４５ｍＭ、ＮＨ４ＯＡｃ２７．６６１ｍＭ、クレアチンホスフェート８０．９２１ｍＭ、Mg(OＡc)2、１０．７ｍＭ、アミノ酸混合液１ｍＭ、クレアチンキナーゼ２．７８μＭ、大腸菌Ｓ３０抽出液、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．０７ｍｇ／ｍｌ、ヒスチジン６．６７ｍＭとした。これらを混合し、３０℃にて、２５分間反応させた。
精製は、RESOURCE Q、HiLoad 16/60 Superdex 75 pg、あるいはＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて、常法に従い行なった。こうして、３２位に４ヨードフェニルアラニンが導入されたｒａｓ−Ｈｉｓ（Ｉ−ｐｈｅ３２−ｒａｓＨｉｓ）及び１７４位に４ヨードフェニルアラニンが導入されたｒａｓ−Ｈｉｓ（Ｉ−ｐｈｅ１７４−ｒａｓＨｉｓ）を得た。
【００７９】
（２）プロパルギルビオチンの調製方法
ビオチンをポリペプチドへ導入するため、下記の方法で、ビオチンにリンカーを付加した。
ＤＭＦ  ２ｍｌ、  プロパルギルアミン塩酸塩  ５８．５ｍｇ、  Ｄ（＋）−ビオチン  １５２．４ｍｇ、  ＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）１２０ｍｇ、  ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を混合し、１０時間反応させた。DowEX(50w-X16)  ５０ｍｇに懸濁後、上清をカラムに通し、クロロホルム／ＭｅＯＨ（９．５／０．５）で溶出した。さらに、逆相ＨＰＬＣで精製を行なった。
【００８０】
（３）翻訳後修飾反応
反応系としては、下記の組成を用いた。
３０μｇ／ｍｌタンパク質（Ｉ−ｐｈｅ３２−ｒａｓＨｉｓ又はＩ−ｐｈｅ１７４−ｒａｓＨｉｓ）
２０ｍＭ  末端アルキン（プロパルギルビオチン）
２００ｍＭ  バッファー（ＴＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ）
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ
５０ｍＭラジカル捕捉剤
０．２ｍＭ  パラジウム触媒
０．０５％界面活性剤（triton又はグリコピラノシド）
これらの試薬は、反応前に脱気し、反応は窒素ガス存在下、室温にて２０分間インキュベートした。
【００８１】
さらに、反応液に１００ｍM（＋）カテキンを添加することにより、抗酸化活性を上げられることを見出した。
すなわち、３０μｇ／ｍｌのＩ−ｐｈｅ３２−ＲａｓＨＩＳ又はＩ−ｐｈｅ１７４−ｒａｓを、２００ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ８．３）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ２- メルカプトエタノール、５％グリセリン、８０ｍＭカテキン、０．１％デシル−β−Ｄ−グリコピラノシド、２ｍＭ  Ｃｕ（ＴＦＭＳＡ）［（ＣＦ３ＳＯ３Ｃｕ）２Ｃ６Ｈ６；Aldrich］、２．５ｍＭ  トリス（３−スルホフェニル）ホスフィン三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ）及び０．５ｍＭ  Ｐｄ（ＯＡｃ）２（ナカライ）を含む水溶液中で、２０ｍＭのプロパルギルビオチンと反応させた。触媒溶液は、アセトニトリル中０．１MのCuIの代わりに、DMSO中２０ｍMのCu（TFMSA）を用いた以外はDibouwskiに記載された方法によって調製した。プロパルギルビオチンは、DMSO中に、１００ｍMストックで保存した。Iphe32-RasHISは、１００ｍM  HSPES/KOH（ｐH7.5）、１００ｍM  NaCl、１ｍM  ２−メルカプトエタノール及び５０％グリセリンを含む０．３μｇ／μｌストックとして、−２０℃で保存した。
【００８２】
（＋）カテキンは、酸素ラジカルに水素原子（・Ｈ）を供給することにより、タンパク質に対するフリーラジカル攻撃を防止するものと考えられる。このプロセスの間、酸素ラジカルは、有害でない形態に転換され、ラジカル捕捉剤は、より安定なラジカル形態又は非ラジカルに転換される。反応系のフリーラジカル捕捉活性を高めた後、単一の２０ｋＤａのバンドは、反応系のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出された。
【００８３】
反応系には、タンパク質保存のための還元剤２−メルカプトエタノールも含まれていた。還元剤は、Cu(II)をCu(I)へ戻すことによりラジカル生成反応を持続させるために、銅媒介ラジカル生成を増大させた。反応中の０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールは、５ｍＭＤＴＴに比べると、分解を誘導する効果は低い。
【００８４】
・生成物の検出
生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析で検出した。生成物がSDSポリアクリルアミドゲル上で単一の２０ｋＤａのバンドを生成することから，酸化的分解を受けていないことがわかる．さらに，このバンドはビオチンに対する周知の検出法で検出しても，また抗Ｒａｓ抗体で検出してもポジティブなシグナルを与えることから，Ｒａｓタンパク質にビオチンがカップリングした産物であると結論された。
【００８５】
比較例（１）タンパク質の酸化的分解
３０μｇ／mlのＩ−ｐｈｅ３２−ＲａｓＨＩＳを、ＴＡＰＳ（ｐＨ８．３）、２ｍＭの Cu(TFMSA)、０．５ｍＭのPd(OAc)2、を含む水溶液中において、２０ｍＭのプロパルギルビオチンと反応させた。触媒を含まない反応の前混合物と、Ｉ−ｐｈｅ３２−Ｒａｓを完全に、乾燥させ、脱気した精製水に新たに溶解した。Ｉ−ｐｈｅ３２−Ｒａｓ−ＨＩＳを、グローブバック中の嫌気性条件下で触媒に添加し、反応液を２０分間１０℃でインキュベートした。得られた産物を直ちにゲルろ過で脱塩し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロット分析を行なった。しかしながら、クロスカップリングは進行したと推測されるが、タンパク質が酸化分解したため反応産物を検出できなかった．
【００８６】
（酸化的分解を生じたメカニズム）
これは、金属イオンを介したタンパク質の酸化分解のためであった。１０℃における酸素溶解度は、約１２ｐｐｍである。1/10 vol. の脱気していないタンパク質溶液を加えたとすると、反応液は約１．２ｐｐｍの溶存酸素を含むことになる。金属イオンが存在すると、酸素は、種々の有害な反応種となり得、これがタンパク質の酸化的修飾を起こし得る。例えば、溶存酸素は、還元されて、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）となり、これと同時にCu(I)は、Cu(II)に酸化される。スーパーオキシドは、さらに Cu(I) によりペルオキシドアニオン
（Ｏ２２−）に還元され、最後に高い反応性のヒドロキシラジカル（・ＯＨ）に還元される（フェントンタイプ反応）。これらの酸素ラジカルは、近傍に存在するアミノ酸残基を攻撃して、不可逆的なダメージをタンパク質に与えることができる。この有害な効果は、チロシン同士の架橋によるタンパク質二量体の形成、あるいはＨｉｓのオキソ化、Ｐｈｅのヒドロキシル化、Ｍｅｔのスルホキシド化・スルホン化を含む。さらにヒドロキシルラジカルの水素分子引き抜きによって生じたα炭素ラジカルへの酸化的付加の結果、タンパク質の断片化が生じる。
【００８７】
【発明の効果】
本発明は、組換えタンパクのインビトロの翻訳後修飾における制御を可能にする。インビボの修飾は、酵素反応に基づいて行なうので制御するのが困難である。新しい修飾によりタンパク質の機能的特性を広げることは、将来、機能的プロテオミクス及びナノテクノロジーを初めとする多くの分野に寄与するものである。非天然型アミノ酸を含有する組換えタンパク質のハイスループット又は大量生産系は、デザイン化された修飾タンパク質の生産を可能にするであろう。
【００８８】
例えば下記のような応用例が考えられる。
（１）標識タンパク質
蛍光分子（フルオレセイン等）をリンカーを介して結合することにより得られるタンパク質は、タンパク質の挙動の解析に好ましく用いられる。これまでにも、このような蛍光分子を標識とするタンパク質、例えはＧＦＰなどが知られていたが、本発明の方法は、位置特異的に蛍光分子を導入することができるため、タンパク質の活性に影響を与えない箇所に選択的に導入することができるので、より正確な解析が可能となる。ビオチンなどの分子を導入したタンパク質も、タンパク質の挙動の解析に好ましく用いられる。
【００８９】
（２）  機能未知タンパク質の相互作用の対象を検出
本発明の方法によって、機能未知タンパク質に蛍光基を導入し標識タンパク質とする。これをｃＤＮＡライブラリーと共に、細胞に存在させ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を測定する。ここで、蛍光特性の変化を検出した細胞では、ライブラリーから発現したタンパク質又はそのエフェクタータンパク質が標識タンパク質と相互作用している可能性を示す。
【００９０】
（３）液晶分子を結合させる
液晶分子を導入したタンパク質は、その液晶分子の作用により高磁場で配向する。これを利用して、ＮＭＲでの構造解析が容易となり、構造解析のハイスループット化が可能となる。
【００９１】
（４）同種のタンパク質同士の多量体化
タンパク質同士を架橋し、多量体化すると、結晶化が促進され、Ｘ線結晶解析が容易となる。ここで架橋分子に重原子を入れると、さらに構造解析が容易となる。
【００９２】
（５）タンパク質をチップ上に固定
タンパク質をチップ上に固定すると、生体内の系をチップ上に再構成することができる。本発明の方法によれば、チップへの固定の箇所を部位特異的に行なうことができ、タンパク質の配向を制御することができる。このようなポリペプチドチップは、リガンドの探索に有用である。
【００９３】
（６）薬剤送達システム
病原部位に局在している物質と結合するタンパク質と、薬剤とを、本発明の方法により結合する。
【００９４】
【配列表】
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