(57)【要約】【課題】  温和な条件下で生理活性物質を分離精製する方法として膜の拡散現象を利用し、工業的に適用可能なプロセスを提供すること。【解決方法】  多孔膜を利用した分離機において、平均孔径が２ｎｍ以上２ミクロン以下、空孔率４０％以上９０％以下で膜厚３０ミクロン以上１ｍｍ以下の平膜を用い、膜中の孔内部の拡散現象を利用した定常拡散法を適用する。また、平膜を封筒状にし、それを複数枚重ね両端を樹脂で充填後、両端を切断し、開放貫通なモジュールを作製する。平膜を封筒状に成型し、孔拡散法を用いることで従来濾過という面から問題であった支持体、目詰まりという構造上の問題が解決される。また、平膜では膜厚を厚く出来ることから力学的安定性、細菌・ウイルス除去製に優れ、これらを用いることにより生理活性物質を工業的規模で分離・精製することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性膜を利用した分離機において、該膜として平面状の膜（平膜と略称）を封筒状に用い、膜内部の孔が物質輸送の主たる通路でありかつ物質輸送方式として定常状態での拡散を利用した平膜孔拡散分離機。
【請求項２】
請求項１において平膜の孔特性として平均孔径２ｎｍ以上２ミクロンメートル以下、空孔率４０％以上９０％以下、膜厚３０ミクロンメート以上１ｍｍ以下であり、平膜を封筒状にしてそれを複数重ね、両端を樹脂で充填後、封筒の両端を切断して両端を開放貫通なモジュールとすることを特徴とする平膜孔拡散分離機。
【請求項３】
請求項１,２において、平膜孔拡散によって分離された物質を膜による濃縮工程を加えかつ平膜孔拡散分離機中の平膜がミクロ相分離法で作製されて多層構造を持っている平膜孔拡散分離機。
【請求項４】
請求項１〜３において、膜素材が再生セルロースである平膜孔拡散分離機。
【請求項５】
請求項１〜４において、封筒状膜を埋め込むための充填用樹脂として、ポリウレタンあるいはシリコン系の樹脂を用いた平膜孔拡散分離機。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温和な条件下で生理活性物質等を製造するのに際し分離精製工程で用いる物質分離方法に関する。詳しくは多孔性膜中の孔を介した物質の拡散現象を利用した物質分離精製方法を用いた分離機に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパクや糖タンパク等の生理活性物質あるいは熱や化学薬品に対して不安定で変性しやすい物質を分離精製する方法として超遠心分離、各種クロマトグラフィ、吸着、透析、エタノールや硫酸アンモニアを用いた沈降分離が採用されている。固液分離には精密濾過膜や限外濾過膜が利用されている。沈降分離以外の方法では大量処理が難しく、また、すべてバッチ処理であり連続的なプロセスとして製造ラインを組み込むのが難しい。各クロマトグラフィは分離精製方法としてはその性能の高さから多く採用されているが、適用される液体は清浄でその液体中に限られた物質種のみが混在した場合であり、一種のクロマトグラフィ用担体の汎用性は小さい。
【０００３】
一方、膜濾過法は固液分離に向いているが、膜は目詰まりを起こし、安定した濾過性能を維持するのは難しく、製造コストへの圧迫が大きいため、限られた溶液にのみ適用されている。（特許文献２、特許文献３）分離すべき分子の大きさが小さくなると、適用される限外濾過膜の平均孔径は小さくなり、それに伴って膜の有効濾過面積あたりの濾過量が小さくなる。また、平膜を介した拡散現象を利用した液中の物質分離精製法としては透析のみであり、大量に連続的な透析工程はほとんど実用化されていない。膜の拡散を利用した膜分離が利用されていない最大の理由は、分離速度が濾過の場合１／１０００以下という極端に小さな物質の移動速度にある。
また、従来平膜を用いたろ過法分離機としての構造には膜間差圧に平膜が耐えるための支持体が必要で、その構造が複雑になるという面から平膜を用いた分離機は実験室レベルで用いられる程度であり、工業的規模ではほとんど用いられていなかった。平膜を封筒状に用いることで支持体を無くし、孔拡散法を用いることと拡散を採用することで分離速度がろ過の場合の１／１０になることを発見して本発明に至った。従来は膜拡散により工業的展開は不可能と考えられていたが、孔拡散法によりその問題点が解消され、さらに膜濃縮法を組み合わせることにより拡散方式の欠点である目的物質の濃度が低下するという問題点がなくなる。
【０００４】
本発明中で多孔性膜とは、フィールドエミッション型走査型電子顕微鏡によって膜中に孔の存在が認められる膜で平均孔径２ｎｍ以上の膜で空孔率が４０％以上の膜を意味する。拡散とは濃度勾配を駆動力とした物質移動を意味し、孔拡散とは多孔膜中の孔を介した拡散が主である拡散を意味する。従来の膜中での物質の拡散は膜を構成する素材の基質部を介した拡散で溶解拡散と定義されている拡散である。孔拡散と溶解拡散との区別は拡散の見掛けの活性化エネルギーを測定すればよい。前者の拡散の場合、該エネルギーは０〜４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、後者は８〜５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの値を示す。定常孔拡散法とは膜中の孔を介した拡散において、膜表面と膜裏面との物質の濃度の差が時間的にほぼ一定に保たれる拡散を意味する。従来より透析等で利用される拡散ではこの濃度差の時間変化が起こり拡散速度は経時的に減少し定常状態は達成できない。該定常状態を実現するためには被拡散液と拡散液とが共に流動していることが必要である。
【０００５】
被拡散液とは定常孔拡散法を適用する前の液で、拡散液とは該拡散法によって得られた膜を介して拡散した後の溶液で、いわゆる膜透過した物質を含む溶液で、この溶液中の物質濃度は被拡散液中の物質濃度よりも低い。（非特許文献１）被拡散液の残液とは被拡散液に定常孔拡散法を適用した後、被拡散液側の膜表面での出口の溶液を意味する。
【０００６】
平膜とは平面状の膜であり、その平均孔径は（粘度・膜厚・濾過速度／膜間差圧・空孔率）の平方根で与えられる。ここで濾過速度は一平方メートル当りの純水の濾過速度でｍｌ／ｍｉｎの単位で測定され、膜厚はミクロン単位、粘度はセンチポイズ、膜間差圧はｍｍＨｇ単位で、空孔率は無次元単位である。この際の平均孔径はｎｍ単位となる。空孔率は次式で与えられる。
空孔率＝（１−膜の密度／素材高分子の密度）
膜の密度は（膜の重量／膜の面積＊膜の厚さ）で算出される。素材高分子の密度は空孔率０％の時の膜の密度で、これはすでに文献で与えられている。多層構造膜とは膜の断面方向から電子顕微鏡で観察すると１０〜１０００ｎｍの厚さの層が認められ、膜の表面からの観察では網目状または粒子間の隙間が孔として、また粒子相互は融着した様子が観察される膜である
【０００７】
【特許文献１】特開平０６−０９１１３０「選択分離用高圧促進膜及びその使用法」      多孔膜中の孔に溶媒中に溶解した担体を含む促進剤液体を埋め込むことにより気体中の特定成分を促進輸送する。
【特許文献２】特開平０６−０４４９５４「電池及びこの電池に使用される選択性透過膜」                    多孔性の透過膜により水蒸気の透過が阻止され酸素のみを効率よく透過させることにより優れた電池を与える。
【特許文献３】特開平１１−１９５４１０「リチウム２次電池」      ポリオレフィン微多孔膜を電池セパレータとして用いることにより電極群間の電解液の枯渇を防止する。
【非特許文献１】藤岡留美子、吉田雅子、吉村知珠、山村知子、真鍋征一著「粒子間の液中拡散係数差を利用した新しい膜分離装置の試作と分離特性」福岡女子大学人間環境学部紀要、２９巻、１３項〜２０項、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では膜拡散現象を産業的に利用できるようにする。その際、この膜拡散が持つ特徴、すなわち（１）膜の目詰まりが起こりにくい，（２）拡散速度の差に基づき孔径より小さな物質の分離精製が可能，（３）孔内での体積流がないことによる分離処理中での力学的孔破壊がない，（４）膜濾過機構で中心となるふるい機構がほぼそのまま起こるという特徴を保持しつつ、膜拡散のもつ欠点すなわち物質移動速度が遅い、及び拡散液中の物質濃度が低い欠点を解消する方法を提案する。また、平膜を装置に組み込む際にろ過の際問題とされていた支持体の必要性と単位体積当りの膜面積が小さい問題を解決する。
【０００９】
本発明の特徴は物質分離の方法として定常孔拡散法を利用する点にある。従来から利用されている拡散は、膜の素材である高分子基質内に物質が溶解し、溶解後膜中を拡散するいわゆる溶解拡散機構での移動である。この機構での拡散係数は約１０−10ｃｍ 2／秒である。そのため産業的には利用しにくいほど遅い速度である。これに対して孔拡散では拡散係数は約１０−６ｃｍ
2／秒であり、濾過速度のほぼ１／１０であり、産業的に利用可能な値となる。定常拡散を用いるには膜を介した濃度勾配を一定にし、目詰まりが起こらなければ良い。従来において孔拡散が利用されなかった理由として（１）特に中空糸膜においては中空部に液体を流すのに必要な圧力によって濾過が起こる（２）孔拡散による物質分離データが皆無のため拡散係数の差が分離にどのように寄与するのか不明（３）孔拡散に利用される孔の特性が不明のために目的に沿う多孔性膜が入手できないことがあげられる。
【００１０】
また、実際に工業的に平膜を用いることの構造上の問題点として、従来、平膜状のモジュールでは装置の単位容積当たりに得られる膜面積が少なく、その構造が複雑な支持体を必要とするという問題があった。本発明ではこの問題点を克服するために平膜を封筒状に成型することと拡散を利用することによって支持体の問題をなくし、また封筒を複数枚重ねることで膜面積を大きくすることが可能であることを発見した。さらに従来は濾過という面からこれらの問題が特に顕著でありしかもろ過では孔内に目詰りが起こる問題もあったが、拡散現象を用いることでこれを解決できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の最大の特徴は特定の孔特性を持つ平膜状の多孔性膜を用い、平膜を封筒上にして孔拡散現象を利用して液中物質の分離精製法を用いた平膜孔拡散分離機にある。すなわち、平均孔径２ｎｍ以上２ミクロンメートル以下、空孔率４０％以上９０％以下、膜厚３０ミクロンメートル以上１ｎｍ以下である平膜を用い、多孔性膜の素材としては膜の再生の容易さと吸着機構による孔の目詰まりを防止するために親水性高分子である再生セルロース膜であることが望ましい。平均孔径が２ｎｍ未満であれば溶解・拡散機構による寄与が大きく、拡散係数が小さくなりすぎる。空孔率の上限は９０％以下であり、これを超えると膜の力学的性質の低下が著しく、ピンホールの発生確率も高くなる。膜厚は３０ミクロンメートル以上であり、膜厚を厚くすることで膜の強度、取り扱いやすさが増し、ピンホールの発生が減少する点から微生物除去にも効果的である。平膜を封筒状に用いることで孔拡散時に膜に圧力がかからないし、万一膜間差圧が生じても封筒が変形し該差圧を解消する方向に働く。そのため孔径、膜厚を広い範囲で設定できる。
【００１２】
多孔性膜の製法として湿式または乾式法での製膜方法が採用できる。この方法では製膜過程でミクロ相分離が通常発生する。ミクロ相分離を膜厚方向に遂次発生させることで多層構造膜を作製できる。多層構造膜では微粒子の除去性が優れ、かつ拡散速度も同一の平均孔径と空孔率をもつ他の構造膜に比較して大きい。
【００１３】
本発明の特徴としては定常孔拡散法を採用している点にある。膜を介した液体の濃度差を一定に保つ（定常状態に保つための必要条件）のために膜の表面に沿って被拡散液を一定速度で流し、かつ拡散液を膜の裏面に沿って一定速度で流す。この際、濾過による物質移動を起こりにくくするために、流す方向は両者同一方向の設定することが望ましい。被拡散液の膜表面におけるひずみ速度は１／秒以上であれば膜表面における物質の堆積を防止できる。ひずみ速度の極端な増加は被拡散液中の生理活性物質の不活化をもたらすのでひずみ速度は被拡散液の組成に依存した最適値が存在する。
【００１４】
拡散液中の目的物質の濃度は被拡散液中の濃度の約１／１０になっている。拡散液中の物質濃度を高めるために拡散液を平行濾過により濃縮する工程を本発明に採用する。平行濾過による膜濃縮工程では濾過条件は温和であり相変化を伴わないので拡散液中の生理活性物質の変性はほとんど起こらない。平行濾過に用いる膜素材としては親水性膜モジュールが最適である。すなわち平均孔径２ｎｍ以下の再生セルロースあるいはポリスルホン製の中空糸膜などがある。拡散液は一般に清浄であるため、拡散液のひずみ速度は３／秒以上でかつ３００／秒以下であることにより濃縮用中空糸膜の目詰まりが防止できる。
【００１５】
本発明の特徴としては平膜を封筒状に成型する点にある。これらを複数枚重ね、両端を樹脂で充填後樹脂の両端を切断して両端を開放貫通なモジュールを作製する。封筒状に成型し、孔拡散法を用いることで膜間差圧を必要とせず、支持体を必要としないという利点が得られる。さらに封筒状平膜の内外部に不織布を挟むことで拡散液、被拡散液の流れのショートカットの生起を防ぐことが出来る。また、封筒状膜を埋め込むための充填剤としては切断時の硬さ、膜の再生時の化学的安定性からポリウレタンあるいはシリコン樹脂が有効である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明を採用することにより、生理活性物質等を分離精製することが可能となる。熱的、力学的、化学的に不安定な物質の分離精製には膜分離が最適であると考えられていたが、工業的には膜分離には前述のような多くの障害がある。膜分離の特徴が最も反映する膜拡散法ではほとんど工業的な展開が出来なかった。本発明では膜拡散の持つ最大の欠点であった分離速度の小さい点を改善し、孔拡散を利用することにより、広い分子量範囲（粒子径範囲）での分離回収が可能となる。また、膜を装置に組み込む際の形状を封筒状に成型することで支持体の問題解決でき、膜拡散を工業的に利用可能なレベルにまで改良した。さらに、平膜を用いることで膜の再生が容易であり、目詰まりがなく繰り返し使用できる利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用する平膜は新水性素材で製膜法として湿式または乾式のミクロ相分離法で作製される。例えば銅安法再生セルロース平膜は親水性素材として最適であるが膜厚を１００ミクロン以上にまた平均孔径を１００ｎｍ以上にするのが難しい。該膜の製法は特公昭６２−０４４０１９号及び特公昭６２−０４４０１７号と特公昭６２−０４４０１８号に与えられている。再生セルロース製の平膜の製法として多孔性アセテート膜を作成しこれを０．１規定の苛性ソーダでケン化処理することによって作製できる。アセテート膜の製法は上出健二，真鍋征一，松井敏彦，坂本富男，梶田修司，高分子論文集，３４巻３号２０５頁〜２１６頁（１９７７年）に与えられている。この方法により０．０１〜数ミクロンの平均孔径を持つ多孔性膜が得られ、膜厚は２０〜数ｍｍまで可能である。かくして得られた多孔性再生セルロース膜を封筒状に成型する。この際、封筒の内部に再生セルロース不織布を封入する。設定された膜面積より封筒状平膜の数を決定し、封筒間に再生セルロース不織布をはさみ封筒の両端を接着剤で目止めする。目止めの後長方形のハウジングに封端部をポリウレタンで充填して両端部をハウジングごと切断し、箱型のモジュールを作製した。モジュールには封筒の内部のみに送液出来る出入口が２個ついたキャップを接着した。ハウジングには封筒の外部にのみ送液できる出入口２個がもうけられている。
該モジュールのキャップ側の入口部に拡散液の送液ポンプを、出口側に送液ポンプを設置し、両ポンプを連動させることにより入口部と出口部での液流速度を同一にした。封筒の外部には分離対象を含む被拡散液を流す回路を設置する。拡散液中の目的物質の濃度は被拡散液中のそれの約１／１０である。そのため濃縮する必要性がある場合には平均孔径１〜２ｎｍの銅安法再生セルロース中空糸膜を用いる。濃縮対象物質の分子量が３００以上であれば２０倍以上の濃縮が可能である。
【実施例１】
【００１８】
ミクロ相分離法によって平均孔径１０ｎｍ、空孔率６２％、膜厚７０ミクロンのアセテート膜（酢化度５４，２％）を作製し、これを30℃の０．１Ｎ苛性ソーダ水溶液に４８時間浸漬して再生セルロース多孔性膜を得た（平均孔径１７ｎｍ，空孔率６５％，膜厚１６０ミクロン）。この膜を用いて封筒状の２枚重ねの長方形膜を成型し、両端を接着剤（ウレタン樹脂）で封じた。その際、銅安法再生セルロース不織布（旭化成せんい（株）製、目付け１００ｇ／平方メートル）一枚を封入している。長さ５センチ，幅３センチ，深さ２センチのポリエステル製の箱にウレタンモノマーを注ぐ。封筒状膜３冊のそれぞれの間に不織布をはさみウレタンモノマー中に浸漬した状態で直立させる。３０℃、２４時間モノマーを重合し固めた。重合後端面を切断し、さらに切断面にキャップを接着して箱型モジュールを作製して連動ポンプにより非特許文献１に従って定常孔拡散が可能な装置を組み立てる。魚のたんぱく質に対して酵素プロテアーゼＥＣ３，４，２４，４を作用して得られた反応液を被拡散液として孔拡散を実施した。拡散液の流速は６．２５＊１０−２ｍｌ／秒，被拡散液の流速は３．１０＊１０−２ｍｌ／秒であった。反応生成物のペプチドの濃度をＵＶスペクトルでの２８０ｎｍでの吸光度で、７００ｎｍでの吸光度で酵素の濃度を決定した。その結果拡散液中のペプチドの濃度は被拡散液中のそれの１５％であった。被拡散液中のそれとほぼ同一であった。被拡散残液中の酵素濃度は拡散液を銅安法再生セルロース中空糸膜（平均孔径２ｎｍ、有効濾過面積１．３平方メートル）でタンデンシャル濾過（平行ろ過）で濃縮した。その結果ペプタイドの濃度は濃縮前の３０倍であった。本拡散を２４時間経過しても定常状態が確保され膜の目詰り現象は起こらなかった。
【実施例２】
【００１９】
実施例１と同様の装置を用いてケミカルポリシシングの廃液（ＰＨ，９．１２）を被拡散液とした。孔拡散の条件は実施例１と同様であった。拡散液のＰＨは８．０２被拡散残液
のＰＨは８．８０であった。拡散液は無色透明であった。一方,被拡散残液は白濁したままであった。廃液中の粒子成分は被拡散残液のみに残留した。２４時間拡散後、モジュールを分解し、回収した膜を水洗いした結果、膜中にはシリカ粒子の存在は認められなかった。                  
【産業上の利用可能性】
【００２０】
温和な条件下で分離、精製が求められる産業（例、製薬産業、食品産業）、特にタンパク質などの生理活性を持つ物質の分離、精製に本発明は利用できる。また、コロイド系を取り扱う工業においてコロイド粒子を含めて特定の微粒子を精製、分離する方法として工業的プロセスに組み込むことが出来る。