(57)【要約】  【課題】  ニトリル化合物やラクタム化合物などのニトリラーゼ誘導物質を使用せずに、かつ簡易な装置でニトリラーゼ活性の高い微生物を高濃度に得ることができる培養方法を提供すること。  【解決手段】  ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の流加培養方法であって、誘導物質を添加することなく、栄養源として植物油を使用することを特徴とする微生物培養方法。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の流加培養方法であって、誘導物質を添加することなく、栄養源として植物油を使用することを特徴とする微生物培養方法。
【請求項２】
植物油として大豆油を使用し、且つ培養液中の大豆油定常濃度が１０ｇ／Ｌ以上２５０ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１に記載の微生物培養方法。
【請求項３】
栄養源として０を越えて２０ｇ／Ｌ以下の酵母エキスを用いることを特徴とする請求項１〜２に記載の微生物培養方法。
【請求項４】
培養液中に０を超えて１０００ｐｐｍ以下の遷移金属イオンを存在させることを特徴とする請求項１〜３に記載の微生物培養方法。
【請求項５】
遷移金属イオンが鉄イオンであることを特徴とする請求項４に記載の微生物培養方法。
【請求項６】
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体がグラム陰性菌であることを特徴とする請求項１〜５に記載の微生物培養方法。
【請求項７】
ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属に属することを特徴とする請求項６に記載の微生物培養方法。
【請求項８】
ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６またはアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２７であることを特徴とする請求項７に記載の微生物培養方法。
【請求項９】
ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６であることを特徴とする請求項８に記載の微生物培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物菌体の培養法に関するものであり、より詳しくは、ニトリル化合物や環状アミド等の誘導物質を使用することなく行われるニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の流加培養法において、高いニトリラーゼ活性を有する菌体を高濃度で取得するための微生物培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリラーゼ生産能を有する微生物菌体としては、例えば、カゼオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属、アースロバクター属、ゴルドナ属、アシネトバクター属等に属する微生物が知られている。
【０００３】
しかしながら、これらの微生物におけるニトリラーゼ活性は一般的には低いので、そのニトリラーゼ活性を高めるために、ニトリラーゼ誘導物質を培地に添加して培養が行われている。ニトリラーゼ誘導物質を培地に添加することによりそのニトリラーゼ活性を高めるための方法として、例えば、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ベンゾニトリル、エチレンシアンヒドリンなどのニトリル化合物を添加して微生物を培養する方法（例えば、特許文献１〜４参照）、ε―カプロラクタムなどのラクタム化合物を添加してロドコッカス属の微生物を培養する方法（例えば、特許文献５参照）等があげられる。
【０００４】
また、ニトリラーゼ活性を高めるためのその他の微生物培養法として、ニトリルまたはニトリル前駆物を含有する炭素源を用いて炭素制限下に連続培養する方法（例えば、特許文献６）が開示されている。
【０００５】
さらにニトリラーゼ活性の高い微生物を高濃度で得るための別の方法として、対数増殖期が終了した後、炭素源のみを培養液中に添加する方法（例えば、特許文献７参照）や、微生物の生育終了後に培養液を低張液に交換する方法（例えば、特許文献８参照）が記載されている。
【特許文献１】特公昭６３−２５９６号公報
【特許文献２】特開平４−４０８９８号公報
【特許文献３】特開平８−１７３１５２号公報
【特許文献４】特開２００３−２７４９３３
【特許文献５】特許第３００９４２１号公報
【特許文献６】国際公開９７−６２４８号公報
【特許文献７】特開平１１−３４１９７９号公報
【特許文献８】特開２００１−２９２７６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これまでに知られている高いニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の培養方法のうち、ニトリル化合物を添加する方法では、ニトリル化合物は微生物菌体に対して炭素源であると同時に毒性もあるため培養初期から大量添加しておくことは困難である。また、一部のニトリル化合物は揮発性、引火性が強く、中には著しい悪臭を放つものもあり、工業的培養において用いることは困難である。
【０００７】
また、ラクタム化合物やエチレンシアンヒドリンは、系内におけるこれらの濃度が一定に保たれているため、ニトリラーゼの誘導効果は安定しているものの、資化されにくいために培養後もそのまま培養液中に残存し、培養廃液処理の問題がある。
【０００８】
その他、特許文献７に記載されているような、対数増殖期が終了した後、炭素源のみを培養液中に添加する方法では、一度発現したニトリラーゼ活性が培養後期に低下するという問題があり、その解決法として特許文献８に記載の微生物の生育終了後に培養液を低張液に交換するという方法が開発されたが、この方法では培養槽内を低張液に交換するためのろ過膜等の設備が必要であり、培養設備そのものが大掛かりなものになってしまう問題があった。
本発明は、こうした状況のもとに、ニトリル化合物やラクタム化合物などのニトリラーゼ誘導物質を使用せずに、かつ簡易な装置でニトリラーゼ活性の高い微生物を高濃度に得ることができる培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは植物油を添加し、培地組成をコントロールすることにより、ニトリル化合物等の誘導物質を添加することなく、高いニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を高濃度に培養する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）に示すニトリラーゼ活性を有する微生物培養方法である。
（１）ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の流加培養方法であって、誘導物質を添加することなく、栄養源として植物油を使用することを特徴とする微生物培養方法。
（２）植物油として大豆油を使用し、且つ培養液中の大豆油定常濃度が１０ｇ／Ｌ以上２５０ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする（１）に記載の微生物培養方法。
（３）栄養源として０を越えて２０ｇ／Ｌ以下の酵母エキスを用いることを特徴とする（１）〜（２）に記載の微生物培養方法。
（４）培養液中に０を超えて１０００ｐｐｍ以下の遷移金属イオンを存在させることを特徴とする（１）〜（３）に記載の微生物培養方法。
（５）遷移金属イオンが鉄イオンであることを特徴とする（４）に記載の微生物培養方法。
（６）ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体がグラム陰性菌であることを特徴とする（１）〜（５）に記載の微生物培養方法。
（７）ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属に属することを特徴とする（６）に記載の微生物培養方法。
（８）ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６またはアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２７であることを特徴とする（７）に記載の微生物培養方法。
（９）ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６であることを特徴とする（８）記載の微生物培養方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いることにより、ニトリラーゼ活性を有する微生物をニトリル化合物やラクタム化合物等の誘導物質を添加することなく、また、簡単な装置でニトリラーゼ活性の高い微生物を高濃度に得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明におけるニトリラーゼ活性を有する微生物菌体としては、例えば、カゼオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属、アースロバクター属、ゴルドナ属、アシネトバクター属等が挙げられる。
【００１３】
これらニトリラーゼ活性を有する微生物菌体のうち、グラム陰性菌としては例えば、アシネトバクター属、アルカリゲネス属等が挙げられるが、ニトリラーゼ産生能を有する微生物であればどのようなものでもよく特に限定されるものではない。
【００１４】
具体的には、特に好ましいものとして、アシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５９０）またはアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５９１）が挙げられる。これらの菌株は、特許文献１に記載されている。また、本発明における微生物は、天然あるいは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子が遺伝子工学的手法により組み込まれた微生物であってもかまわない。
【００１５】
本発明における流加培養法とは、培養液を抜き出すことなく培地を連続あるいは間欠的にフィードする培養方法であり、一般的に流加培養と呼ばれる方法と同様の方法である。本方法は、例えば、炭素源以外の栄養素を過剰に存在させ、そして微生物の増殖とともに炭素源を徐々に導入し、他の栄養素が消費されるまで炭素源の導入を継続することによって実施することができる。
【００１６】
懸濁液中の微生物の乾燥重量は以下の方法により測定される。
[微生物乾燥重量の測定法]
まず、適当な濃度の微生物懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却、凍結させた後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し重量を測定する。この乾燥重量から、初めに量り取った懸濁液中の微生物濃度を算出する。既知濃度となった微生物懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、濁度計にて濁度を測定、濁度計の検量線を作成し、ファクターを得る。このファクターおよび該濁度計の濁度指示値から、任意の微生物懸濁液の微生物乾燥重量を算出する。
【００１７】
本発明における比活性とは、アクリロニトリルを基質として用いた場合に、１ｇの乾燥菌体が１時間に産生するアクリル酸アンモニウムの重量で表示される。
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の比活性は、以下の方法で求められる。
[ニトリラーゼ比活性の測定法]
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の懸濁液を３０ｍＭのアクリル酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝７）で洗浄、同水溶液に懸濁させた後、該懸濁液５ｍＬを３０℃に保持する。３０℃に保持された該懸濁液にアクリロニトリル１００μＬを素早く添加し、添加した時点を反応開始として、３０℃で２０分間振とう、反応させた。反応後の反応液あるいは上清中のアクリル酸アンモニウム濃度は、ホルマリン処理によりアンモニウムイオンをヘキサメチレンテトラミンとしてトラップした後、中和滴定にて定量した。この時、アクリロニトリルを添加しないサンプルも同時に作成し、アクリロニトリルを添加したサンプルと同様の処理を行い、その滴定値をブランク値（反応前のアクリル酸アンモニウム濃度）として、前記滴定値から差し引いた値をアクリル酸アンモニウム濃度とした。
【００１８】
本発明において、炭素源としては植物油であればどのようなものを用いてもよく、例えば、オリーブ油、コーン油、綿実油、大豆油などを用いることができるが、好ましくは大豆油を炭素源として使用する。本発明において大豆油を炭素源として使用する場合、培養液中の大豆油定常濃度は１０ｇ／Ｌ以上２５０ｇ／Ｌ以下であり、好ましくは、１０ｇ／以上１５０ｇ／Ｌ以下である。培養液内の大豆油定常濃度が１０ｇ／Ｌ未満である場合、系内の炭素源濃度が低くなりすぎる為、培養時間が長くなってしまう可能性がある。また、培養液内の大豆油定常濃度が２５０ｇ／Ｌを超える場合は、系内の炭素源濃度が高くなりすぎ、炭素源濃度が低くなりすぎる場合と同様、微生物の増殖速度が極端に低下し、培養時間が長くなってしまう可能性がある。
【００１９】
また、本発明における大豆油定常濃度とは微生物菌体の培養開始時から系内への大豆油フィード停止時までの培養液中の大豆油濃度のことである。
本発明における大豆油濃度は例えば、以下の方法で求められる。
[大豆油濃度の測定法]
界面活性剤で希釈したサンプル溶液１００μＬにリパーゼ溶液を適量加え、３７℃で１０分間反応させることにより脂肪酸を分解させる。該溶液２００μＬに、硫酸銅およびクロロホルム／ｎ−ヘプタンからなる抽出液を加え、１０分間振とうした後、遠心分離し、上清１ｍｌに発色液（クロロホルム４０ｍｌ／ｎ−ヘプタン６０ｍｌ／バソクプロイン０．０２ｇ／３（２）−ｔ−ブチル−４−ヒドロオキシアニソール２ｇ）１ｍｌを加えＯＤ４８０ｎｍで測定する。予めサンプル測定前に、既知濃度の大豆油を同様の操作により測定し、検量線を作成しておき、該検量線を用いてサンプル内の大豆油濃度を算出する。
【００２０】
本発明における窒素源としては一般に微生物培養に用いられるどのようなものを用いてもよく、例えば、アミン類、アミノ酸類、硝酸塩類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物等があげられるが、好ましくは酵母エキスである。
【００２１】
窒素源として酵母エキスを用いる場合、その使用濃度は０を超えて２０ｇ／Ｌ以下の範囲であり、好ましくは、０を超えて１５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下である。酵母エキスを２０ｇ／Ｌを超えて使用しても飛躍的な効果は期待できない。
【００２２】
また、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２３】
本発明で使用する遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン、コバルトイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン等が挙げられ、これらの遷移金属のうち少なくとも１つを使用することができるが、それらの中でも特に鉄イオンを使用するのが好ましい。該遷移金属の使用濃度は、０を越えて１０００ｐｐｍ以下であり、好ましくは２０ｐｐｍ以上３００ｐｐｍ以下である。遷移金属は１０００ｐｐｍを超えて使用しても特に飛躍的な効果は期待できない。
【００２４】
本発明における微生物菌体の培養においては、培養液のｐＨは５以上１０以下であり、好ましくは６以上８．５以下である。また培養温度は２０℃以上４０℃以下、好ましくは２５℃以上３５℃以下で行うのがよい。
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
酢酸１重量％、酵母エキス０．３重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１５重量％、リン酸水素二カリウム０．２重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．２重量％、塩化マンガン０．０２重量％、塩化カルシウム０．０１重量％、大豆油２重量％、酵母エキス０．０５重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、酢酸０．８重量％を含む液体培地２００ｍＬを三角フラスコに入れ、ｐＨが７になるよう水酸化ナトリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、これにアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６を接種して３０℃で振套培養をした。培養開始１８時間後に酢酸及硫酸アンモニウムを追添しさらに２４時間、３０℃で振套培養した（前培養）。
一方、塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１５重量％、リン酸水素二カリウム０．２重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．２重量％、硫酸第一鉄七水和物０．００３重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、塩化マンガン０．０２重量％、硫酸銅五水和物０．００２重量％、硫酸亜鉛七水和物０．００２重量％、酵母エキス０．０５重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、大豆油２重量％を含む液体培地３Ｌをジャーファーメンターに入れ、ｐＨが７になるよう水酸化ナトリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、前記の前培養液をジャーファーメンターに接種した。培養開始８時間後から大豆油を流加した。ｐＨは７になるようリン酸およびアンモニア水でコントロールした。培養終終了後、微生物の乾燥菌体最終濃度を測定したところ６９ｇ／Ｌ、アクリロニトリルを基質とした場合の比活性は１１０ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間であった。
【００２６】
実施例２
実施例１においてｐＨ調整用に用いたリン酸の代わりに酢酸を使用する以外は同様の操作を行った。培養終終了後、微生物の乾燥菌体最終濃度を測定したところ５５ｇ／Ｌ、アクリロニトリルを基質とした場合の比活性は１２７ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間であった。
【００２７】
比較例１
塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５重量％、硫酸第一鉄七水和物０．００５重量％、硫酸アンモニウム０．１重量％、硝酸カリウム０．１重量％、硫酸マンガン五水和物０．００５重量％を含む培養液２５０ｍＬを三角フラスコに入れｐＨが７になるように水酸化カリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、アセトニトリル２．５重量％を添加した。これにアシネトバクター  ＳＰ．  ＡＫ２２６を接種して３０℃で振套培養をした。培養終終了後、微生物の乾燥菌体最終濃度を測定したところ０．８ｇ／Ｌ、アクリロニトリルを基質とした場合の比活性は１１０ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間であった。
【００２８】
比較例２
比較例１に記載の培地と同組成の培養液３Ｌをジャーファーメンターに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した後、比較例１記載の培養液を接種し３０℃で通気攪拌培養を行った。培養開始２時間後から酢酸をフィードした。ｐＨ７になるようにリン酸およびアンモニア水でコントロールした。培養終終了後、微生物の乾燥菌体最終濃度を測定したところ７ｇ／Ｌ、アクリロニトリルを基質とした場合の比活性は７４ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間であった。
【００２９】
比較例３
比較例２において、通気攪拌培養時にフィードする酢酸の代わりに酢酸アンモニウムを使用する以外は同様の操作を行った。培養終終了後、微生物の乾燥菌体最終濃度を測定したところ２０ｇ／Ｌ、アクリロニトリルを基質とした場合の比活性は６２ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間であった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明を用いることにより、簡単な装置でニトリル化合物やラクタム化合物等の誘導物質を添加することなく、ニトリラーゼ活性の高い微生物を高濃度に得ることが可能である。