(57)【要約】【課題】  嫌気性微生物の均質な単一培養物を低コストかつ簡便に取得でき、それにより嫌気性微生物の産業利用のための大量培養技術の確立を可能にする嫌気性微生物の製造方法を提供する。更に、かかる製造方法により製造された嫌気性微生物用培地、及び、それを用いた嫌気性微生物の培養方法を提供する。【解決手段】  嫌気性微生物用培地の製造方法であって、前記培地の全容量を基準として２０〜２００ｍＭとなるように亜硫酸塩およびチオ硫酸塩の少なくとも１種を溶解させて、嫌気性微生物用培地を製造する培地の製造方法、および、かかる製造方法により製造される嫌気性微生物用培地およびそれを利用する嫌気性微生物の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物用培地の製造方法であって、
前記培地の全容量を基準として２０〜２００ｍＭとなるように亜硫酸塩およびチオ硫酸塩の少なくとも１種を溶解させて、嫌気性微生物用培地を製造する培地の製造方法。
【請求項２】
前記溶解後に、加熱加圧処理を施す請求項１に記載の培地の製造方法。
【請求項３】
更に、前記加熱加圧処理後に、炭酸塩を添加する請求項１又は２に記載の培地の製造方法。
【請求項４】
前記炭酸塩を、前記培地の全容量を基準として２０ｍＭ以上となるように添加する請求項３に記載の培地の製造方法。
【請求項５】
前記亜硫酸塩が、亜硫酸ナトリウムである請求項１〜４のいずれか一項に記載の培地の製造方法。
【請求項６】
前記嫌気性微生物が、硫酸還元菌である請求項１〜５のいずれか一項に記載の培地の製造方法。
【請求項７】
前記硫酸還元菌が、Desulfitobacterium sp. KBC1株（日本国独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）である請求項６に記載の培地の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の培地の製造方法により製造された嫌気性微生物用培地。
【請求項９】
請求項８に記載の培地を用いて嫌気性微生物を培養する嫌気性微生物の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性微生物の産業利用技術に関し、詳細には、嫌気性微生物の単一培養物の生産性を向上する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性微生物は、分子状酸素の非存在下で生育並びに増殖が可能な微生物である。例えば、硫酸塩類を最終電子受容体として有機物および水素を酸化してエネルギーを得る硫酸還元細菌は、偏性嫌気性の微生物である。そして、これら嫌気性微生物には環境汚染物質、例えば、塩素化芳香族化合物等の生分解に関与するものがあることが報告されており、環境修復等の産業利用のため嫌気性微生物の大量培養技術の構築が求められていた。一般に、微生物の均一な培養物を大量に取得するためには液体培地中で培養することが最も効率的であることが知られている。したがって、嫌気性微生物を大量に培養するためには液体培地を嫌気条件化することが必要となる。しかしながら、特に硫酸還元菌のような偏性嫌気性微生物の増殖に要求される厳密な嫌気性環境の形成は極めて困難であった。
【０００３】
従来、培地を嫌気条件化するための方法として、酸素を含まないガスにより培地をガス置換する方法、培地中に還元剤を添加する方法等が用いられてきた。詳細には、ガス置換する方法として、Ｎ２ガスや、Ｎ２ガスとＣＯ２ガスとの混合ガスの注入により培地中の溶存酸素を除去する方法が報告されていた（例えば、非特許文献１を参照のこと。）。更に、硫酸還元菌が発生する硫化水素を除去するためにＮ２ガス等の不活性ガスを通気する方法が報告されていた（例えば、特許文献１を参照のこと。）。還元剤を用いる方法としては、Ｎ２ガスとＣＯ２ガスとの混合ガスに加え硫化ナトリウムとＬ−システインを添加する方法（例えば、非特許文献２を参照のこと。）、アスコルビン酸を添加する方法（例えば、特許文献２を参照のこと。）等が報告されている。これらの方法は還元剤の還元作用により培地の溶存酸素を除去するものである。更に、還元剤の添加として、嫌気性微生物の培養を目的とするものではないが、亜硫酸ナトリウムの添加により溶存酸素を除去してビリルビンオキシダーゼ活性を安定維持する方法も報告されていた（例えば、特許文献３を参照のこと。）。
【０００４】
しかしながら、ガス置換する方法は、上述したＮ２ガスや混合ガス等はコストが高く、また、大量の培地をガス置換するためには長時間を要するのが現状であった。また、還元剤を用いる方法は、還元剤の多くは取り扱いが難しく、嫌気ボックス等の特殊な装置を必要とし操作が煩雑となるという問題点があった。例えば、硫化ナトリウムは取り扱いが非常に難しく、Ｌ−システイン、アスコルビン酸は還元力が弱いため所望の嫌気性環境の形成には至らず、いずれも硫酸還元菌等の嫌気性微生物の大量培養への適用には満足できるものではなかった。
【０００５】
そこで、ガス置換や還元剤を用いずに培地を嫌気条件化する方法として、好気性微生物と嫌気性微生物とを混合して培養を行う方法も報告されていた。つまり、かかる方法は、好気性微生物の増殖過程において溶存酸素を除去するものである（例えば、特許文献４、５を参照のこと。）。そして、好気性微生物の作用により培地が嫌気条件化した後に嫌気性微生物の増殖を促すものである（例えば、特許文献４を参照のこと。）。しかしながら、これらの方法は、操作は単純であるが、嫌気性微生物のみの単一培養物を得ることは不可能であった。そのため、産業利用、特には環境修復等の目的で微生物を用いる場合には、純粋な単一培養した菌体が必要となるが、上述した方法では、かかる産業利用の要請に応じることができないという問題点があった。
【０００６】
【特許文献１】特公平６−４０２０号公報
【特許文献２】特許第２６６６３２３号公報
【特許文献３】特開平１０−４２８６９号公報
【特許文献４】特開平７−２７４９４２号公報
【特許文献５】特開２００３−２２５６９１号公報
【非特許文献１】JAN GERRITSE他著、“Influence of Different Electron Donors and Acceptors on Dehalorespiration of Tetrachloroethene by Desulfitobacteriumfrappieri TCE1（Desulfitobacterium frappieri TCE1によるテトラクロロエチレンの脱ハロゲン呼吸における種々の電子供与体と受容体の影響）”APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、１９９９年１２月、第６５巻、第１２号、第５２１２〜５２２１頁
【非特許文献２】ATCC Cultures, Bacteria Collection Catalog,［online］. ATCC :The Global Bioresource Center,［平成１７年２月１８日検索］、インターネット＜URL: http://www.atcc.org/SearchCatalogs/longview.cfm?view=ba,9238975,700295&text=700295&max=20（URL:http://www.atcc.org/mediapdfs/2063.pdf）＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、嫌気性微生物の均質な単一培養物を効率的に低コストかつ簡便に取得でき、それにより嫌気性微生物の産業利用のための大量培養技術の確立を可能にする嫌気性微生物用培地の製造方法の提供を目的とする。更に、かかる製造方法により製造された嫌気性微生物用培地、及び、それを用いた嫌気性微生物の培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、従来の一般的な嫌気性微生物用培地を改良し、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度の最適化と、更に、加熱加圧処理との相乗効果により効率的に培地の嫌気条件化を達成でき、それにより、嫌気性微生物の生産性を向上できることを見出した。更に、加熱加圧処理後に炭酸塩を添加することにより培地の嫌気条件化を促進できることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、上記目的を達成するため、本発明において、嫌気性微生物用培地の製造方法であって、前記培地の全容量を基準として２０〜２００ｍＭとなるように亜硫酸塩およびチオ硫酸塩の少なくとも１種を溶解させて、嫌気性微生物用培地を製造する培地の製造方法が提供される。そして、好ましくは、前記溶解後に、加熱加圧処理を施す。また、好ましくは、上記培地の製造方法は、更に、前記加熱加圧処理後に、炭酸塩を添加するものであり、前記炭酸塩が前記培地の全容量を基準として２０ｍＭ以上となるように添加されることが好ましい。
【００１０】
更に、上記培地の製造方法は、前記亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００１１】
そして、前記嫌気性微生物が、硫酸還元菌であることが好ましく、更に、前記硫酸還元菌が、Desulfitobacterium sp. KBC1株（日本国独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７３）であることが特に好ましい。
【００１２】
また、上記目的を達成するため、本発明において、上記したいずれかの培地の製造方法により製造された嫌気性微生物用培地が提供される。
【００１３】
さらに、上記目的を達成するため、本発明において、上記した培地を用いて嫌気性微生物を培養する嫌気性微生物の培養方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、硫酸還元菌、特には、Desulfitobacterium sp. KBC1株等の嫌気性微生物の均質な単一菌体の大量培養物を効率的に低コストかつ簡便に得ることができる。したがって、嫌気性微生物を利用した土壌、水等の環境修復事業を実施する上で、大きなコストメリットを得ることができ、嫌気性微生物の産業利用に有用な技術である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、具体的な本発明の一実施形態に係る嫌気性微生物用培地の製造方法、嫌気性微生物用培地および嫌気性微生物の培養方法について説明する。ただし、あくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００１６】
本発明の実施形態に係る嫌気性微生物用培地の製造方法は、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度の最適化と、更に、好ましくは加熱加圧処理との組合わせにより、硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物の生育及び増殖に好適な嫌気性環境を形成するものである。これにより、嫌気性微生物の生産性を向上することができる。
【００１７】
ここで、本発明が適用される嫌気性微生物は、分子状酸素非存在下で生育する微生物であり、特にその種類について制限はない。そして、嫌気性微生物は、酸素が存在すると生育が阻害されるか或いは死滅する偏性嫌気性微生物と、酸素の有無にかかわらず生育できる通性嫌気性微生物に大別される。本発明の適用においては、いずれでも良いが、偏性嫌気性微生物が特に好ましい。具体的には、硫酸還元菌、メタン生成細菌、紅色硫黄細菌および緑色硫黄細菌のような光合成細菌、および、Bacteroidesのような発酵性細菌等が例示されるが、特に好ましくは、硫酸還元菌である。
【００１８】
硫酸還元細菌は、硫酸塩類を最終電子受容体として有機物および水素を酸化してエネルギーを得られる偏性嫌気性の微生物であり、なかでも亜硫酸還元菌が好ましい。詳細には、Desulfitobacterium属、Desulfovibrio属、Desulfuromonas属、Desulfotomaculum属、Desulfococcus属、Desulfobacter属、等に属する微生物が例示される。好ましくは、Desulfitobacterium属に属する微生物、特に好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３として日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託されたDesulfitobacterium sp. KBC1株に適用される。
【００１９】
本発明で使用される亜硫酸塩およびチオ硫酸塩の種類は、培地中の溶存酸素を除去できる脱気作用を有する限り、特に制限はない。前記亜硫酸塩としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸マグネシウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム等が使用できる。これらの中でも、亜硫酸ナトリウムの使用が好ましい。また、チオ硫酸塩としては、例えば、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸マグネシウム、チオ硫酸アンモニウム等が使用できる。これらの１種又は必要に応じて２種以上を組合わせて培地中に溶解する。このとき、２種以上の組合わせとしては、亜硫酸塩、チオ硫酸塩の夫々の２種以上の組合わせの他、亜硫酸塩とチオ硫酸塩を組み合わせて使用することができる。
【００２０】
そして、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度は、培地の全容量を基準として２０〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲、特に好ましくは１００ｍＭである。上記範囲内の亜硫酸塩、チオ硫酸塩の存在により、その還元作用を充分に発揮できるようになる。それにより、培地中の溶存酸素が効率的に除去されて培地の脱気効果が高まる。そして、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度が上記範囲より低くなると嫌気性微生物の生育に好適な嫌気性環境を形成できず、また、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度が高すぎると、その毒性により嫌気性微生物の生育並びに増殖が阻害される。
【００２１】
本発明において使用される培地成分は、亜硫酸塩、チオ硫酸塩濃度以外は、嫌気性微生物用培地として公知の培地成分を利用することができ、天然培地若しくは合成培地のいずれでもよい。したがって、各種培地成分を適宜混合することにより製造してもよく、若しくは、市販されている培地を改変して利用することもできる。市販の培地を改変して使用する場合には、例えば、ATCC medium:2063（Desulfuromonas  medium）等を利用できる。
【００２２】
詳細には、炭素源、窒素源、無機塩類、微量元素、あるいは成長因子等の硫酸還元菌の増殖に必要な増殖基質を含むように構成される。これらの増殖基質は本発明が適用される嫌気性微生物の種類に応じて適宜選択して使用される。
【００２３】
炭素源としては、乳酸、ピルビン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、エタノール、メタノール等、嫌気性微生物が資化し得る公知の有機化合物を使用できる。これらの炭素源を単独で若しくは２種以上の混合物の形態として使用できる。なかでも、乳酸を主炭素源とすることが嫌気性微生物、特には硫酸還元菌の良好な増殖の観点から好ましい。このとき、添加される乳酸は、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸アンモニウム等の乳酸塩の形態で添加してもよい。
【００２４】
また、窒素源としては、無機窒素化合物若しくは有機窒素化合物のいずれをも使用でき、例えば、尿素、アンモニア、塩化アンモニウム等のアンモニア塩、酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、肉エキス等を使用できる。これらの窒素源を単独で若しくは２種以上の混合物の形態として使用できる。
【００２５】
また、無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウム等のリン酸塩、塩化物、酢酸塩等が例示される。また、成長因子としては、例えば、チアミン、葉酸、ピリドキシンおよびビオチン等のビタミン類を含むことができる。なお、塩類として炭酸塩を添加する場合には後述するように加熱加圧処理後に添加することが好ましい。
【００２６】
培地の形態は、液体培地若しくは固体培地のいずれでも良く使用目的に応じて適宜選択されるが、嫌気性微生物の均質な単一培養物の効率的な取得の観点から大量培養に適した液体培地とすることが好ましい。
【００２７】
亜硫酸塩、チオ硫酸塩の培地への溶解後、好ましくは加熱加圧処理を施す。このとき、加熱加圧処理は亜硫酸塩、チオ硫酸塩による脱気効果が保持されている期間内に行なわれ、好ましくは、亜硫酸塩、チオ硫酸塩の溶解直後〜３０分以内に行われる。
【００２８】
加熱加圧処理は、公知のいずれの方法によっても行うことができるが、例えばオートクレーブを用いて行うことができる。オートクレーブは、所定の温度での飽和水蒸気圧の加圧状態に維持することにより微生物を殺滅処理する高圧蒸気滅菌装置である。
【００２９】
加熱加圧処理の条件は、特に制限されないが、好ましくは、微生物を殺滅するために必要な温度および圧力の水蒸気で一定時間加熱する。１２１℃の飽和水蒸気を得るためには、１ｋｇｆ／ｃｍ２の加圧が必要となり、微生物の殺滅のためには少なくとも１ｋｇｆ／ｃｍ２以上加圧する。したがって、１２１℃以上、１ｋｇｆ／ｃｍ２以上の加圧下で所定時間加熱加圧処理することが好ましい。通例、滅菌処理は、加熱水蒸気の温度が１２１℃の場合には１５分間、あるいは１２６℃の場合には１０分間行なわれるが、培地のスケール等に応じて適当な条件を設定することができ、加熱加圧処理時間は１０〜６０分間の範囲に設定することが好ましい。
【００３０】
加熱加圧処理により培地中の微生物は殺滅されると同時に培地中の気体は脱気される。そして、培地中に溶解させた亜硫酸塩、チオ硫酸塩の脱気作用との相乗効果により、培地中の溶存酸素濃度は極めて低くなり、嫌気性微生物の培養に好適な嫌気性環境が形成される。それにより、嫌気性微生物の増殖量が増大し生産性を向上できる。また、嫌気ボックスのような煩雑な手順や、その他の取り扱いの難しい還元剤を使用することなく、効率的に簡便かつ低コストに嫌気性微生物の培養に好適な嫌気性環境を形成できる。
【００３１】
更に、好ましくは、本発明の培地は炭酸塩が添加される。このとき、炭酸塩は加熱加圧処理後に添加される。炭酸塩の加熱加圧処理前の添加は、培地中に炭酸イオンが溶存していると半開放系容器で加熱加圧処理を行った場合に炭酸イオンがガス化することによりｐＨが大きく変動し菌体の増殖に著しく影響を与えるため好ましくない。
【００３２】
ここで、添加する炭酸塩の種類は、嫌気性微生物の生育並びに増殖を阻害するものでない限り特に制限はない。前記炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム 、炭酸マグネシウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムおよび炭酸トリス等が使用できる。これらの１種又は必要に応じて２種以上を組合わせて添加する。これらの中でも、炭酸水素ナトリウムの添加が好ましい。そして、炭酸塩の添加濃度は２０ｍＭ以上とすることが好ましく、特には４０ｍＭ以上とすることが好ましい。更には、経済的見地から２０〜１６０ｍＭ、更には４０〜１６０ｍＭ程度とすることが特に好ましい。
【００３３】
炭酸塩を添加することにより、培地の嫌気条件化を更に促進でき、嫌気性微生物の生育並びに増殖のための、より好適な嫌気性環境の形成が可能となる。これにより、嫌気性微生物の培養において対数増殖期への移行が早くなり、所望の菌体増殖量に到達までに要する期間を短縮でき、硫酸還元菌生産の更なる効率化を図ることができる。
【００３４】
上記の如くに製造された嫌気性微生物用培地も本発明の一実施形態をなす。本発明の実施形態の嫌気性微生物用培地は嫌気性微生物の培養に好適な嫌気性環境を提供することできる。かかる培地で嫌気性微生物を培養することより、菌体の増殖量が増大することから、嫌気性微生物の生産性が向上し効率的な培養が可能となる。したがって、嫌気性微生物の均質な大量の単一培養物を効率的に取得することが可能となる。
【００３５】
したがって、上記の如くに製造された嫌気性微生物用培地を用いた嫌気性微生物の培養方法も本発明の一実施の形態をなす。なお、温度、ｐＨ等の培養条件は、培養に供される嫌気性微生物の種類に応じて適宜設定することができる。また、培養形態に関しても特に制限はなく、静置培養等が例示されるが嫌気性微生物の種類、培養目的及び培養スケール等に応じて適宜設定することができる。本発明の培養方法によれば、嫌気ボックスのような煩雑な手順や、その他の高価かつ取り扱いの難しい還元剤を使用する必要がない。そのため、効率的に簡便かつ低コストに嫌気性微生物の培養に好適な嫌気性環境を形成できる。更には、本発明の培養方法によれば、効率的に嫌気性微生物を培養することができ、嫌気性微生物の生産性を向上できる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例および比較例との対比により本発明を具体的に説明する。ただし、以下の実施例および比較例により本発明が限定的に解釈されるものではない。
したがって、本実施例および比較例において、嫌気性微生物として硫酸還元菌を例示して説明するが、これに限定する意図はない。つまり、本発明により嫌気性微生物の生育並びに増殖に好適な培地の嫌気条件化が達成できることから、本発明は嫌気性微生物全般に適用されるものである。そして、特に制限がない限り硫酸還元菌として、亜硫酸還元菌Desulfitobacterium sp. KBC1株（以下、「ＫＢＣ１株」と略する場合がある。）を使用した。本ＫＢＣ１株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３として受託されたものである。
【００３７】
（実施例１）
最適化濃度の亜硫酸塩を溶解後に加熱加圧処理により滅菌し、滅菌後に炭酸塩を添加することにより製造した培地について、嫌気性微生物である硫酸還元菌の増殖を検討した。このとき、培地に添加される炭素源として乳酸を使用した。以下、かかる培地を「乳酸＋亜硫酸塩＋炭酸塩培地」と称する。
【００３８】
〔実験方法〕
（１）培地の組成
ここで製造した培地は上記背景技術の項で説明した非特許文献２に記載のATCC medium:2063（Desulfuromonas  medium）を改変したものである。培地の組成を以下の表１に示す。
【００３９】
【表１】
2006254790.tif 000002
【００４０】
ここで、使用したSL-10 Trace Elements Solution、および、Wolfes  Vitamin Solutionの組成を以下の表２、３にそれぞれ示す。
【００４１】
【表２】
2006254790.tif 000003
【００４２】
【表３】
2006254790.tif 000004
【００４３】
（２）培地の製造
（ａ）乳酸培地の溶解
Ａ培地を適量の蒸留水に溶解した。溶解後、蒸留水にて９５０ｍｌに定容し、容量１ｌのねじ口瓶に注入した。
（ｂ）亜硫酸塩の添加
亜硫酸塩であるＢ培地を、上記工程（ａ）で９５０ｍｌに定容した、ねじ口瓶中に添加し、約３分間スターラーで攪拌してＢ培地を溶解した。溶解後０〜３０分以内にオートクレーブにて１２１℃で２０分間加熱加圧滅菌し、冷却後、ねじ口瓶の蓋を閉めた。本実施例においては、亜硫酸塩として亜硫酸ナトリウム使用したが特に制限されるものではない。
（ｃ）炭酸塩の添加
予め、５０ｍｌの蒸留水に溶解した炭酸塩溶液であるＣ溶液を密栓した１００ｍｌバイアル瓶中でオートクレーブにて１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、滅菌後のＣ溶液を上記工程（ｂ）で製造した加熱加圧滅菌後の培地に添加した。添加後、ねじ口瓶の蓋を閉めた。本実施例においては、炭酸塩として、炭酸水素ナトリウムを使用したが、特に制限されるものではない。
【００４４】
（３）菌体の培養
ＫＢＣ１株を培地に接種した。この時、菌体の接種量は培地に対して０．０１〜５重量％とした。菌体の接種時期は、培地の製造後１週間程度の期間内であれば特に制限されるものではない。したがって、Ｃ溶液の添加の際に同時に接種してもよく、また、Ｃ溶液の接種後１週間程度の期間を空けて接種してもよい。菌体接種後、３０℃で暗所にて静置培養した。４〜６日間培養後、菌体増殖の指標として、培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００ｎｍ）を経時的に測定し、菌体の増殖を確認した。
【００４５】
（実施例２）
最適化濃度の亜硫酸塩を溶解後に加熱加圧処理により滅菌することにより製造した培地について、嫌気性微生物である硫酸還元菌の増殖を検討した。このとき、培地に添加される炭素源として乳酸を使用した。即ち、実施例２で製造した培地は実施例１で製造した培地と炭酸塩添加工程がない点で相違するのみである。以下、かかる培地を「乳酸＋亜硫酸塩培地」と称する。
【００４６】
〔実験方法〕
（１）培地の組成
炭酸塩溶液であるＣ溶液を含まないことを除いては実施例１と同一組成とした。
【００４７】
（２）培地の製造
炭酸塩添加工程である工程（ｃ）を含まないことを除いては、実施例１と同様に製造した。
【００４８】
（３）菌体の培養
実施例１と同様にＫＢＣ１株を培養して菌体の増殖を確認した。
【００４９】
（比較例１）
比較例として、既知の嫌気性微生物用培地についての嫌気性微生物である硫酸還元菌の増殖を確認した。以下、かかる培地を「既知培地」と称する。
【００５０】
（１）培地の組成
既知の嫌気性微生物用培地としては、上記背景技術の項で説明した非特許文献２に記載のATCC medium:2063（Desulfuromonas  medium）を用いた。かかる培地は、実施例１、２の「乳酸＋亜硫酸塩＋炭酸塩培地」、及び、「乳酸＋亜硫酸塩培地」の改変の基礎とした培地である。炭素源として乳酸の代わりフマル酸を、還元剤として亜硫酸塩の代わりにＬ−システイン並びに硫化ナトリウムを含有して構成された以外は、実施例１と同一組成により構成されている。培地の組成を以下の表４に示す。
【００５１】
【表４】
2006254790.tif 000005
【００５２】
（２）培地の製造
培地成分を適量の蒸留水８８０ｍｌに溶解した後、オートクレーブにて加圧滅菌した。滅菌後、８０％Ｎ２ガスと２０％のＣＯ２ガスの雰囲気下で冷却した。続いて、予め所定量の蒸留水に溶解したＡ、Ｂ、ＣおよびＤ溶液をオートクレーブにて滅菌した。このとき、Ａ溶液はＣＯ２ガスの雰囲気下で、Ｂ〜Ｄ溶液はＮ２ガスの雰囲気下で滅菌処理に供した。滅菌後、Ａ〜Ｄ溶液を上記で製造した培地に添加した。なお、その他の詳細な実験条件は、実施例１、２の培地の製造方法に準拠して行った。
【００５３】
（３）菌体の培養
培地にＫＢＣ１株を接種後、Ｎ２ガスおよびＣＯ２ガスの混合ガスの雰囲気下で菌体を培養した以外は、実施例１と同様に培養して菌体の増殖を確認した。
【００５４】
〔結果〕
実施例１の「乳酸＋亜硫酸塩＋炭酸塩培地」、実施例２の「乳酸＋亜硫酸塩培地」、比較例１の「既知培地」の各培地におけるＫＢＣ１株の増殖を経時的に確認した増殖曲線を図１に示す。「乳酸＋亜硫酸塩＋炭酸塩培地」および「乳酸＋亜硫酸塩培地」の菌体の増殖量は約１×１０９細胞数／ｍｌに達し、「既知培地」が約６．７×１０８細胞数／ｍｌであったのに対し、約１．５倍の硫酸還元菌の増殖量を達成できることが確認された。また、「乳酸＋亜硫酸塩＋炭酸塩培地」は、「乳酸＋亜硫酸塩培地」と比較して、菌体増殖の対数増殖期に至るまでの期間を短縮でき、効率的に硫酸還元菌を培養できることも確認された。
【００５５】
したがって、亜硫酸塩濃度の最適化と加熱加圧滅菌を組合せることにより、硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物の培養に非常に適した培地の嫌気性環境が得られ嫌気性微生物の生産性が向上することが判明した。また、加熱加圧滅菌後の炭酸塩の添加により、培地の嫌気条件化が促進され、更に嫌気性微生物の生産の効率化を図れることも判明した。以上の結果より、嫌気ボックスのような煩雑な手順や、その他の高価かつ取り扱いの難しい硫化ナトリウム等の強力な還元剤を使用することなく、効率的に硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物の生産性を向上できることが判明した。また、亜硫酸塩と同等の脱気効果を有することが知られているチオ硫酸塩の使用によっても同様の効果が得られることが導かれる。
【００５６】
（実施例３）
嫌気性微生物の培養に用いる培地の嫌気性環境を形成するために、亜硫酸塩濃度が嫌気性微生物である硫酸還元菌の増殖に与える影響を検討した。
【００５７】
亜硫酸塩として亜硫酸ナトリウムを１０、２０、５０、１００、２００、４００ｍＭとなるようにそれぞれ添加した以外は、培地の組成、製造並びに培養方法は、実施例１と同様に行った。８日間培養して実施例１と同様にＫＢＣ１株の増殖を確認した。結果を図２に示す。
【００５８】
亜硫酸ナトリウムを２０〜２００ｍＭ添加することで、ＫＢＣ１株はいずれの場合も良く生育並びに増殖し、菌体数が増加することが確認された。５０〜２００ｍＭ、特には、１００ｍＭの添加により、菌体の対数増殖期への移行が早くなり培養期間を短縮できることが確認できた。一方、４００ｍＭの亜硫酸ナトリウムの添加により菌体の増殖が抑制されることも判明した。
【００５９】
以上の結果により、亜硫酸塩を２０〜２００ｍＭ添加することにより硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物の増殖が促進されて菌体の生産性を向上できることが判明した。また同時に、５０〜２００ｍＭ、特には、１００ｍＭの添加により硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物生産の更なる効率化が図れることも判明した。
【００６０】
（実施例４）
嫌気性微生物の培養に用いる培地の嫌気性環境を形成するために、炭酸塩濃度が嫌気性微生物である硫酸還元菌の増殖に与える影響を検討した。
【００６１】
炭酸塩として炭酸水素ナトリウムを１０、２０、４０、８０、１２０、１６０ｍＭとなるようにそれぞれ添加した以外は、培地の組成、製造並びに培養方法は、実施例１と同様に行った。更に、コントロールとして炭酸塩を添加しない培地を製造して菌体を培養した。６日間培養して実施例１と同様にＫＢＣ１株の増殖を確認した。結果を図３に示す。
【００６２】
いずれの場合においても、ＫＢＣ１株は良く増殖したが、炭酸水素ナトリウム濃度を２０ｍＭ以上とすると、対数増殖期への移行が早くなり培養期間を短縮できることが確認できた。特に、４０ｍＭ以上となると、対数増殖期への移行が更に早くなることが確認できた。
【００６３】
以上の結果により、炭酸塩を２０ｍＭ以上添加することにより硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物生産の効率化が図れることが判明した。また、炭酸塩を４０ｍＭ以上とすることで更なる生産性の効率化が図れることが判明した。これは、加圧加熱滅菌後の炭酸塩の添加により培地の嫌気条件化が促進され、嫌気性微生物が培地にスムーズに適応しているものと推定される。
【００６４】
（比較例２）
嫌気性微生物の培養に適した培地の嫌気性環境を形成することが可能か否か、還元剤を添加した場合について検討した。
【００６５】
まず、特許第２６６６３２３号公報に記載の方法において嫌気性環境の形成のための還元剤として用いられているアスコルビン酸について検討した。上記特許第２６６６３２３号公報に記載の方法に従い、アスコルビン酸を還元剤として添加した溶液を製造した。まず、１８℃の蒸留水１００ｍｌを１００ｍｌ容量のメジューム瓶に注入し、アスコルビン酸を１ｇ／１００ｍｌ、５ｇ／１００ｍｌとなるように添加した。続いて、これらの溶液をスターラーで攪拌してアスコルビン酸を完全に溶解させた。溶解後、ＯＲＰ計を用いて各溶液の酸化還元電位を測定した。さらに、コントロールとして、アスコルビン酸を添加しない溶液を製造して同様に酸化還元電位を測定した。結果を表５に示す
【００６６】
【表５】
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【００６７】
アスコルビン酸を添加することで溶液中の酸化還元電位が低下することが確認されたが、嫌気性微生物である硫酸還元菌を培養するために好適な酸化還元電位０〜−２００ｍＶには至らなかった。なお、アスコルビン酸の添加量は最大で５重量％となっており、その還元力を発揮するための充分量が添加されているものと推定される。したがって、特許第２６６６３２３号に記載のアスコルビン酸では、硫酸還元菌をはじめとする嫌気性微生物の培養に必要な嫌気性環境が確保できないことが判明した。
【００６８】
したがって、アスコルビン酸等のような亜硫酸塩およびチオ硫酸塩以外の還元剤では、上記実施例で示したような嫌気性微生物の生産性の増大に関して良好な結果を得られないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１、実施例２および比較例１の、亜硫酸塩濃度の最適化と加熱加圧滅菌、および、加熱加圧滅菌後の炭酸塩の添加が嫌気性微生物の増殖に対する効果を示す図。
【図２】実施例３の亜硫酸塩濃度が嫌気性微生物の増殖に及ぼす影響を示す図
【図３】実施例４の炭酸塩濃度が嫌気性微生物の増殖に及ぼす影響を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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