(57)【要約】      （修正有）【課題】  常温で酵素活性の高いアスパラギン酸脱水素酵素を提供すること。【解決手段】    下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。（Ｃ）特定のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項６】
下記（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
下記（Ｊ）、（Ｋ）又は（Ｌ）に示すタンパク質。
（Ｊ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｌ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項８】
下記（Ｊ）、（Ｋ）又は（Ｌ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｊ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｌ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項２、請求項４、請求項６又は請求項８に記載のDNAによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にアスパラギン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりアスパラギン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするアスパラギン酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にアラニン脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりアラニン脱水素酵素を採取することを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造方法。
【請求項１２】
原料として、ＤＬ−リンゴ酸およびアンモニウム塩を供給し、
触媒として、リンゴ酸脱水素酵素、並びに、請求項１，請求項３，請求項５，請求項７に記載のアスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、請求項９に記載の微生物、若しくは、請求項１０に記載の製造方法により製造されたアスパラギン酸脱水素酵素を加え、
さらに、補酵素としてＮＡＤ＋を添加し、
Ｌ−アスパラギン酸を得ることを特徴とするＬ−アスパラギン酸製造方法。
【請求項１３】
原料として、ＤＬ−リンゴ酸およびアンモニウム塩を供給し、
触媒として、リンゴ酸脱水素酵素、および、請求項１，請求項３，請求項５，請求項７に記載のアスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、請求項９に記載の微生物、若しくは、請求項１０に記載の製造方法により製造されたアスパラギン酸脱水素酵素を加え、
さらに、補酵素としてＮＡＤ＋を添加し、
Ｄ−リンゴ酸を得ることを特徴とするＤ−リンゴ酸製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、Ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、Ｄ−リンゴ酸製造方法に関し、特に、常温付近で酵素活性を有する新規なアスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、並びに、このアスパラギン酸脱水素酵素を用いたＬ−アスパラギン酸製造方法、および、Ｄ−リンゴ酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アスパラギン酸はタンパク質を構成するアミノ酸のうちの一つであり、生体内で極めて有用なアミノ酸である。実際に、アスパラギン酸を含めて、アミノ酸はアミノ酸輸液などの医薬としても広く用いられている。また、アスパラギン酸に関しては、人工甘味料アスパルテームの原料素材としても広く活用されている。
【０００３】
アスパラギン酸を初め各種のアミノ酸は、様々な方法で生産される。その一つとして、酵素を触媒としてケト酸とアンモニアを還元的アミノ化反応させアミノ酸を得る方法が知られている（式１）。
【数１】
2006254795.tif 000002
（式１では、NAD（P）を、NAD（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）とNADP（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸）をまとめた表現として用いている。これは、アミノ酸脱水素酵素の補酵素要求性の違いによるものである。）
【０００４】
しかしながら、自然界に知られるアミノ酸脱水素酵素は、アラニン脱水素酵素（AlaDH）、グルタミン酸脱水素酵素（GluDH）、ロイシン脱水素酵素（LeuDH）、バリン脱水素酵素（ValDH）、フェニルアラニン脱水素酵素（PheDH）の５種であり、式１を利用しては、アスパラギン酸を得ることはできなかった。
【０００５】
近年、アスパラギン酸脱水素酵素（AspDH）が発見され、この酵素によれば、ケト酸であるオキサロ酢酸を用いて、アスパラギン酸を得ることができる（式２）。
【数２】
2006254795.tif 000003
【０００６】
【非特許文献１】Zhiru Yang, et al,'Aspartate Dehydrogenase,a Novel Enzyme Identified from Structural and Functional Studies of TM1643',The Journal of Biological Chemistry,vol.278,No.10,pp.8804-8808(2003)
【特許文献１】特開２００４−２９００６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。上記非特許文献１に記載の酵素は、超好熱性菌であり常温程度では酵素活性が低く、アスパラギン酸を工業的に生産する場合には、反応効率が低いという問題点があった。特に、原料のオキサロ酢酸が高温では不安定であるため、反応系の温度を高めるには限界があるという原理的な問題点があった。
【０００８】
また、オキサロ酢酸自体も比較的高価であるため、アスパラギン酸を低廉に提供できないという問題点があった。
【０００９】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、常温で酵素活性の高いアスパラギン酸脱水素酵素を提供することを目的とする。
【００１０】
また、アスパラギン酸を安価に提供することを目的とする。
【００１１】
また、Ｄ−リンゴ酸を提供することを目的とする。
【００１２】
また、アラニン脱水素酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、部位特異的変異に基づく戦略を用い、野生型のBacillus subtilis（バチルス  ズブチルス：枯草菌）由来のグルタミン酸脱水素酵素(YWEB)の一部のアミノ酸残基を変異させることにより本発明を完成するに至った。なお、YWEBはROCG又はIPA-75Dとも表現されるが、本願においてはYWEBと表記することとする。
【００１４】
すなわち本発明は以下のとおりである。
１．：
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から８２番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号３の先頭から数えて８２番目に位置するリシンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このリシン残基の位置が８２番目からシフトしたとしてもこのリシン残基は残存させておくことを意味する。
【００１５】
２．： 
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から８２番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号３の先頭から数えて８２番目に位置するリシンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このリシン残基の位置が８２番目からシフトしたとしてもこのリシン残基は残存させておくことを意味する。
【００１６】
３．：
下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号４の先頭から数えて８２番目に位置するリシンと１４４番目に位置するアルギニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このリシン残基とアルギニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのリシン残基とアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１７】
４．：
下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から８２番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号４の先頭から数えて８２番目に位置するリシンと１４４番目に位置するアルギニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このリシン残基とアルギニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのリシン残基とアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１８】
５．：
下記（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から１０１番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号５の先頭から数えて１０１番目に位置するセリンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このセリン残基の位置が１０１番目からシフトしたとしてもこのセリン残基は残存させておくことを意味する。
【００１９】
６．：
下記（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から１０１番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号５の先頭から数えて１０１番目に位置するセリンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このセリン残基の位置が１０１番目からシフトしたとしてもこのセリン残基は残存させておくことを意味する。
【００２０】
７．：
下記（Ｊ）、（Ｋ）又は（Ｌ）に示すタンパク質。
（Ｊ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｌ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号６の先頭から数えて１０１番目に位置するセリンと１４４番目に位置するアルギニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このセリン残基とアルギニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのセリン残基とアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００２１】
８．：
下記（Ｊ）、（Ｋ）又は（Ｌ）に示すタンパク質をコードするDNA。
（Ｊ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｌ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アラニン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
ここで、先頭から１０１番目と１４４番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号６の先頭から数えて１０１番目に位置するセリンと１４４番目に位置するアルギニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このセリン残基とアルギニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのセリン残基とアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００２２】
９．：
上記２．、４．、６．又は８．に記載のDNAによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。なお、この微生物として大腸菌を挙げることができる。また、膜透過性を付与した大腸菌であってもよい。
【００２３】
１０．：
上記９．に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にアスパラギン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりアスパラギン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするアスパラギン酸脱水素酵素の製造方法。
【００２４】
１１．：
上記９．に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にアラニン脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりアラニン脱水素酵素を採取することを特徴とするアラニン脱水素酵素の製造方法。
１２．：
原料として、ＤＬ−リンゴ酸およびアンモニウム塩を供給し、触媒として、リンゴ酸脱水素酵素、並びに、請求項１，請求項３，請求項５，請求項７に記載のアスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、請求項９に記載の微生物、若しくは、請求項１０に記載の製造方法により製造されたアスパラギン酸脱水素酵素を加え、さらに、補酵素としてＮＡＤ＋を添加し、Ｌ−アスパラギン酸を得ることを特徴とするＬ−アスパラギン酸製造方法。
【００２５】
１３．：
原料として、ＤＬ−リンゴ酸およびアンモニウム塩を供給し、触媒として、リンゴ酸脱水素酵素、および、請求項１，請求項３，請求項５，請求項７に記載のアスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質、請求項９に記載の微生物、若しくは、請求項１０に記載の製造方法により製造されたアスパラギン酸脱水素酵素を加え、さらに、補酵素としてＮＡＤ＋を添加し、Ｄ−リンゴ酸を得ることを特徴とするＤ−リンゴ酸製造方法。
【００２６】
なお、以降において、上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質ないし酵素を、単にG82Kと適宜表記する。同様に、上記（D）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示されるタンパク質ないし酵素を、単にQ144R／G82Kと適宜表記する。同様に、上記（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）に示されるタンパク質ないし酵素を、単にM101Sと適宜表記する。同様に、上記（Ｊ）、（Ｋ）又は（Ｌ）に示されるタンパク質ないし酵素を、単にQ144R／M101Sと適宜表記する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、常温で酵素活性の高いアスパラギン酸脱水素酵素を提供することができる。また、また、Ｌ−アスパラギン酸を安価に提供することが可能となる。また、Ｄ−リンゴ酸を提供することが可能となる。また、アラニン脱水素酵素を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態を説明するが、本発明は記載した形態のみに限定されるものではなく、本明細書の記載および当分野で公知の技術に基づいて当業者が容易に修飾および改変し得る技術については本発明の範囲内に含まれるものである。
【００２９】
ここでは、まず、Bacillus subtilis由来GluDH遺伝子(yweB)のクローニング、yweBの耐熱化変異酵素Q144Rの作製、および、今回設計した変異酵素の作製について述べ、続いて、変異酵素の精製について言及する。その後、変異酵素の性質について述べる。なお、Q144Rの精製等は、本願発明者らの本願出願人による特許文献１にも記載している。
【００３０】
上記した今回の設計とは、Clostridium symbiosum 由来のGluDH（以降、適宜CsGluDHと表記することとする）とYWEBとが立体構造が近似している点に鑑みてなしたものである。すなわち、CsGluDHが、基質γ−カルボキシル基と相互作用するリジン８９とセリン３８０および側鎖の結合ポケットを形成するアラニン１６３を、それぞれ、ロイシン、アラニン、グリシンに置換した変異酵素が、メチオニンとノルロイシンに対して良好な反応性を示すことが報告されていることに着目してなしたものである。
【００３１】
そこで、YWEBおよびQ144Rにおいて、基質２−オキソグルタル酸の結合ポケットを形成している二箇所のアミノ酸残基（グリシン８２（G82）、メチオニン１０１（M101））を、それぞれリシン（K）とセリン（S）へ置換したG82K、M101S、Q144R／G82K、Q144R／M101S変異酵素を作製することとした。
【００３２】
なお、遺伝子の単離およびこの遺伝子を含有する組み換えベクターの作成、組み換えベクターによる形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等に関しては公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（コールドスプリングハーバー出版社、1989年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ウィリー・インターサイエンス出版社、1989年）等に挙げられている方法を組み合わせて行うことができるので、その詳細な記載を省略する。
【００３３】
〔yweBのクローニング：染色体DNAの調製〕
まず、Bacillus subtilis由来GluDH遺伝子(yweB)をクローニングするため、Bacillus subtilis ATCC 23857をLB培地2 ml で37℃、18〜20 hr振とう培養を行い、遠心(15000rpm, 5分)にて集菌後、CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide）法（Nucleic Acids Research, 8, 4321-4325, 1980）を用いて染色体DNAの調製を行った。
【００３４】
〔yweBのクローニング：PCR によるGluDH 遺伝子の増幅〕
次に、目的遺伝子(yweB)の塩基配列情報 (EMBL Z99123, EMBL L47648)に基づきプライマーをデザインし、PCRを用いてyweB含むDNA断片の増幅を行った。YWEBは、上述したようにBacillus subtilis由来のGluDHである。なお、配列番号２にYWEBを示す。
【００３５】
〔yweBのクローニング：形質転換大腸菌の作製〕
CTAB法によるゲノムDNAの調製を行い、PCRにより増幅させたyweBを得た。得られたPCR増幅産物（約1.4kb）をアガロースゲル電気泳動で分離した後、そのバンドを切り出し、GENE CLEAN II（フナコシ社製）により精製した。これらのDNA断片は、それぞれpUC18ベクター(タカラ酒造社製)のBamHIおよびPstＩサイトにライゲーションし組み換えDNAを得た。得られた組み換えDNAを大腸菌(E. coli) MV1184コンピテントセル（日本ジーン社製）に導入し形質転換した。 形質転換株はLBプレート（アンピシリン、X-Gal、IPTG含有）上でホワイトコロニーを形成することで選択した。この形質転換株からアルカリ-SDS法によりプラスミドDNAを調製し、一部をBamHＩとPstＩで制限酵素処理し、電気泳動によりインサートDNAを確認した。これらの形質転換体の保持していたプラスミドをpYWEと命名した。
【００３６】
〔Q144R、G82K、および、M101Sの作製〕
野生型に対して変異導入するにあたり、プラスミドpYWEを制限酵素BamHＩとPstＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でyweBを分離した後、そのバンドを切り出し、GENE CLEAN II（フナコシ社製）により精製した。このDNA断片を、pKF18kベクター(タカラ社製)のBamHIおよびPstＩサイトにライゲーションし組み換えDNAを得た。この際の宿主はE.coli JM109を使用しカナマイシン含有培地を用いてブルー／ホワイト セレクションにより組み換え体を選択した。また、変異導入用合成オリゴヌクレオチド（Mutagenic oligonucleotide）はSelection Primerとは反対側の鎖にアニーリングさせなければならないので、lacZ 遺伝子の−鎖と相補的になるよう設計した。Q144R、G82KとM101Sの変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドを、それぞれ配列番号８、９、１０に示す。また、Q144R，G82K，M101Sの配列をそれぞれ、配列番号７，３，５に示す。
【００３７】
〔Q144R／G82K、Q144R／M101S変異酵素の作製〕
また、Q144Rからさらに変異導入するにあたり、上記と同様の手順に従った。すなわち、Q144R発現プラスミドpQ144Rを制限酵素BamHＩとPstＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でQ144Rを分離した後、そのバンドを切り出し、GENE CLEAN II（フナコシ社製）により精製した。このDNA断片を、pKF18kベクター(タカラ社製)のBamHIおよびPstＩサイトにライゲーションし組み換えDNAを得た。この際の宿主はE.coli JM109を使用しカナマイシン含有培地を用いてブルー／ホワイト セレクションにより組み換え体を選択した。また、変異導入用合成オリゴヌクレオチド（Mutagenic oligonucleotide）はSelection Primerとは反対側の鎖にアニーリングさせなければならないので、lacZ 遺伝子の−鎖と相補的になるよう設計した。Q144R／G82KとQ144R／M101Sの変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号９、１０である。また、Q144R／G82K，Q144R／M101Sの配列をそれぞれ、配列番号４，６に示す。
【００３８】
変異導入はMutan-Super Express Km （ タカラ酒造社製 ） を用いて行った。このPCRについて図１に示した。これをE.coli MV118に形質転換し、カナマイシン含有培地を用いて変異組み換え体を選択した。選択したシングルコロニーからプラスミドDNA を調製してDNA塩基配列決定により変異の導入を確認した。
【００３９】
〔変異の確認〕
変異の確認には、ABI PRISM, Dye Terminator Cycle Sequencing Kit （ABI）を用いるABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer （ABI）を使用した。変異確認用Primerは、ベクタープラスミドに対するPrimer RV、および本酵素遺伝子の配列確認のために作製されたオリゴヌクレオチドより、G82KとQ144R／G82KにはM13 Primer RV（タカラ酒造社製）、M101SとQ144R／M101SにはYw 5（配列番号１１参照）、Q144R にはYw 2（配列番号１２参照）を選んで使用した。
【００４０】
変異確認ができたコロニーよりプラスミドを調製し、BamHＩとPstＩで制限酵素処理、発現ベクターpUC18 へライゲーションし、E.coli MV1184 を形質転換した。このときLB-プレート（アンピシリン、X-Gal、IPTG含有）でブルー／ホワイトセレクションにより選択する。生育してきたコロニーからプラスミドを調製し、アガロースゲル電気泳動により、サイズ確認を行った。得られた形質転換株についてSDS-PAGEを用いて発現確認を行ったところ、すべてに発現が確認され、AsｐDH活性も認められたので性質を調べた。
【００４１】
〔活性測定〕
還元型補酵素NADH は340nmに吸収極大をもつ。このことを利用して反応時の340nmにおけるNADH（分子吸光係数6.2 mmol-1・cm-1）の吸収の増減を追跡することにより活性測定を行った。活性（Activity）の表示は、1 分間に1 μmol のNAD+あるいはNADHの生成を触媒する酵素量を1 unit と定義し、比活性は1 mg protein 当たりのunit 数でunits/(mg protein) と表した。
【００４２】
活性の評価式を式３に示す。
【数３】
2006254795.tif 000004
また、アミノ化反応の概要を図２に、脱アミノ反応の概要を図３に示した。なお、タンパク量は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用い、牛血清アルブミンを標準タンパク質として検量線を作成し、そのタンパク量を求めた。
【００４３】
〔変異酵素の精製〕
精製にあたっては、E.coli MV1184/変異酵素クローン を、50 mg/ml Amp 3 μl を含むLB培地3 ml で37℃、18〜20 hr振とう培養を行い、次いで50 mg/ml Amp 750 μl、1 M IPTG 150 μl を含むLB 培地750 ml にスケールアップし、18〜20 hr、37℃で振とう培養し、遠心8,000 rpm 10 min で集菌した。最終的には、図４に示した方法（30〜40％飽和硫安沈殿工程、イオン交換（DEAE）カラム工程、疎水性（Butyl）カラム工程）で精製した。最終精製倍率は約40倍であり、SDS-PAGE の結果からもほぼ均一に精製されていることが確認された。
【００４４】
〔変異酵素の性質〕
次に、精製された変異酵素の酵素化学的性質を調べた。
【００４５】
〔変異酵素の性質：基質特異性〕
まず、変異酵素の基質特異性の評価を行った。図５は、YWEBのGluDH活性を１とした場合の、G82KとM101Sの相対活性を示した図である。また、図６は、Q144RのGluDH活性を１とした場合の、Q144RとQ144R／M101Sの相対活性を示した図である。
【００４６】
図示したように、G82K、Q144R／G82K、M101S、Q144R／M101Sは、いずれも、GluDH活性に比して高いAspDH活性とAlaDH活性があることが認められた。特に、野生型のオキサロ酢酸に対する相対活性が０．２％であるのに対して、G82Kは、相対活性が実に２８０倍、M101Sは、相対活性が４９５倍まで上昇していることは特筆すべきである。
【００４７】
〔変異酵素の性質：反応速度論的解析〕
次に、変異酵素について、Kinetic Parameter の解析を行った。具体的には、Kcatと Kmを求めた。また、Kcat 値は、酵素の代謝回転数（turn number)又は触媒定数と呼ばれ、酵素の活性部位が単位時間（通常１秒）ごとに触媒する反応回数（回転数）を表す。
【００４８】
Kcatと比活性と酵素の分子量の関係は式４で与えられる。
【数４】
2006254795.tif 000005
なお、Kcat / Km 値は見かけの二次反応速度定数であり、遊離の酸素と基質との間の反応性を示すため、酸素の触媒効率を表す指標となる。
【００４９】
Km 値は、アミノ化反応、脱アミノ反応の両反応でそれぞれの基質を様々な濃度で測定し、Lineweaver-Burk の逆数プロットから求めた。結果を図７に示す。Kcat値を見れば分かるように、YWEBやQ144Rのグルタミン酸脱水素酵素活性までには及ばないが、AspDHやAlaDHとして工業的にアスパラギン酸およびアラニンを生産可能な程度にまで活性度が上昇していることが分かる。
【００５０】
〔変異酵素の性質：耐熱性の検討〕
次に、変異酵素を各温度で20 分間熱処理した後、アミノ化反応における残存活性を熱未処理の活性を100 としたときの相対活性として示した。また各酵素を様々な温度で20 minの熱処理後、50 %の残存活性を示す温度をグラフから求めた。タンパク質濃度による保護効果の耐熱性への影響に考慮し、タンパク質濃度をほぼ等しくして実験を行った。図８に示したように、G82K、M101Sの５０％の失活温度は、野生型酵素と同程度であり、Q144R／G82K、Q144R／M101Sの５０％の失活温度は耐熱化酵素Q144Rと同程度であることが確認できた。なお、至適温度は、いずれの変異酵素についても４１℃〜４２℃であることを別途確認した。したがって、Kcat値を勘案すると、常温にて工業的な利用が可能であることが確認できた。
〔変異酵素の性質：最適pHの測定〕
それぞれの変異酵素の最適pH を、アミノ化、脱アミノ反応のそれぞれで活性測定を行うことにより決定した。Buffer は、pH 6.3〜7.6 でKP Buffer、pH 7.0〜8.8 でTris-HCl Buffer、pH 8.8〜9.6 でCarbonate Buffer を使用した。いずれの変異酵素においても、yweB同様に最適pH はアミノ化反応ではpH 7.3 付近、脱アミノ反応ではpH 7.7 付近であった。
【００５１】
〔アスパラギン酸の工業的生産方法〕
次に、工業的にアスパラギン酸を生産する方法について説明する。図９は、ＤＬ−リンゴ酸を原料としたＬ−アスパラギン酸の反応図である。図示したように、原料として、ＤＬ−リンゴ酸およびアンモニウム塩（例えば塩化アンモニウム）を供給し、触媒として、リンゴ酸脱水素酵素と上記説明したAspDH（G82K、Q144R／G82K、M101S、又は、Q144R／M101S）を加え、さらに、補酵素としてＮＡＤ＋を添加することにより、Ｌ−アスパラギン酸を生産可能となる。
【００５２】
なお、図９に示した生産方法は、比較的高価なオキサロ酢酸を用いる必要がなく、安価なＤＬ−リンゴ酸を用いればよく、また、高価な補酵素NADHを別途供給する必要がなくなるため、安価にアスパラギン酸を提供可能となる。
【００５３】
なお、AspDHは、純粋に精製したものでなく、使用の態様によっては例えば、大腸菌に導入したものを直接反応タンクの中に投入してもよい。同様に、リンゴ酸脱水素酵素も大腸菌に導入したものを反応タンクの中に投入しておいても良い。このとき、膜透過性付与大腸菌であることが好ましい。
【００５４】
なお、以上は、Ｌ−アスパラギン酸の生産という観点から反応を捉えた結果であるが、図９に示したようにこの反応ではＤ−リンゴ酸が残存する。Ｌ−アスパラギン酸とＤ−リンゴ酸は、分子内の電荷が異なるので、イオン交換クロマトグラフィーなどを利用して適宜分離できる。特にＤ−リンゴ酸は光学活性ジカルボン酸誘導体合成の中間体として反応させることができ、利用価値がある。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
AspDHをＬ-アスパラギン酸の定量用酵素として用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】変異導入PCRのプロトコルを示した図である。
【図２】アミノ化反応の概要を示した図である。
【図３】脱アミノ反応の概要を示した図である。
【図４】精製法の手順を示した図である。
【図５】YWEBのグルタミン酸脱水素酵素活性を１とした場合の、G82KとM101Sの相対活性を示した図表である。
【図６】Q144Rのグルタミン酸脱水素酵素活性を１とした場合の、Q144RとQ144R／M101Sの相対活性を示した図表である。
【図７】変異酵素の反応速度論的解析結果を示した図表である。
【図８】変異酵素の５０％失活温度を示した図表である
【図９】ＤＬ−リンゴ酸を原料としたＬ−アスパラギン酸の反応図である。
【図１】
2006254795.tif 000006
【図２】
2006254795.tif 000007
【図３】
2006254795.tif 000008
【図４】
2006254795.tif 000009
【図５】
2006254795.tif 000010
【図６】
2006254795.tif 000011
【図７−１】
2006254795.tif 000012
【図７−２】
2006254795.tif 000013
【図８】
2006254795.tif 000014
【図９】
2006254795.tif 000015
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月20日(2005.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【図１】変異導入PCRのプロトコルを示した図である。
【図２】アミノ化反応の概要を示した図である。
【図３】脱アミノ反応の概要を示した図である。
【図４】精製法の手順を示した図である。
【図５】YWEBのグルタミン酸脱水素酵素活性を１とした場合の、G82KとM101Sの相対活性を示した図表である。
【図６】Q144Rのグルタミン酸脱水素酵素活性を１とした場合の、Q144RとQ144R／M101Sの相対活性を示した図表である。
【図７−１】変異酵素の反応速度論的解析結果を示した図表である。
【図７−２】変異酵素の反応速度論的解析結果を示した図表である。
【図８】変異酵素の５０％失活温度を示した図表である
【図９】ＤＬ−リンゴ酸を原料としたＬ−アスパラギン酸の反応図である。