(57)【要約】      （修正有）【課題】ラモプラニンの生合成に関与する遺伝子に関し、組換えＤＮＡ技術によってラモプラニンを作成するための組換え方法及び組換え物質を提供する。【解決手段】微生物中の抗生物質ラモプラニンの生合成に関与するモプラニン遺伝子クラスターを形成するタンパク質をコードするＯＲＦを含んでなる特定の隣接ＤＮＡ配列とそのタンパク質をコードする単離した遺伝子配列。かかる単離した生合成用遺伝子クラスターは、抗生物質構造体の生体工学用基質としての機能を果たす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ラモプラニンＯＲＦ１〜３３（配列番号２〜３４）のいずれかをコードする核酸、（ｂ）ラモプラニンＯＲＦ１〜３３（配列番号２〜３４）のいずれかにコードされるポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）ラモプラニンＯＲＦ１〜３３（配列番号２〜３４）のいずれかを増幅するプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される核酸からなる群より選択される核酸配列を含む単離した核酸。
【請求項２】
（ａ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかをコードする核酸、（ｂ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかにコードされるポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のポリペプチドに対して、少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される核酸配列を含む単離した核酸。
【請求項３】
核酸が、ＯＲＦ４〜３２（配列番号２〜３３）からなる群より選択される少なくとも２つのＯＲＦをコードすることを特徴とする請求項１又は２記載の単離した核酸。
【請求項４】
核酸が、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）からなる群より選択される少なくとも３つのＯＲＦをコードすることを特徴とする請求項１、２又は３記載の単離した核酸。
【請求項５】
ラモプラニン生合成遺伝子クラスターのＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、ラモプラニンの合成を誘導するための特異的なハイブリダイゼーションの対象であるＯＲＦを置換できる核酸を含む単離した核酸。
【請求項６】
ラモプラニン生合成遺伝子クラスターのＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、ラモプラニンの合成を誘導するための特異的なハイブリダイゼーションの対象であるＯＲＦを置換できる核酸を含む単離した核酸。
【請求項７】
単離した核酸が、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３、ＯＲＦ１４及びＯＲＦ１５（配列番号２〜１６）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項５又は６記載の単離した核酸。
【請求項８】
核酸が、ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＯＲＦ２０、ＯＲＦ２１、ＯＲＦ２２、ＯＲＦ２３、ＯＲＦ２４、ＯＲＦ２５、ＯＲＦ２６、ＯＲＦ２７、ＯＲＦ２８、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３０及びＯＲＦ３１（配列番号１７〜３２）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項５又は６記載の単離した核酸。
【請求項９】
単離した核酸が、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３、ＯＲＦ１４及びＯＲＦ１５（配列番号２〜１６）からなる群より選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項５、６又は７記載の単離した核酸。
【請求項１０】
単離した核酸が、ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＯＲＦ２０、ＯＲＦ２１、ＯＲＦ２２、ＯＲＦ２３、ＯＲＦ２４、ＯＲＦ２５、ＯＲＦ２６、ＯＲＦ２７、ＯＲＦ２８、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３０及びＯＲＦ３１（配列番号１７〜３２）からなる群より選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項５、６又は８記載の単離した核酸。
【請求項１１】
ラモプラニン又はラモプラニン類似体の合成を誘導するのに充分なポリペプチドをコードするＯＲＦを含む単離した遺伝子クラスター。
【請求項１２】
遺伝子クラスターが細菌中に存在することを特徴とする請求項１２記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項１３】
遺伝子クラスターが、アクセッション番号ＩＤＡＣ１９０９０１−１、１９０９０１−２及び１９０９０１−３の大腸菌ＤＨ１０Ｂ株中に存在することを特徴とする請求項１１又は１２記載の単離した遺伝子クラスター。
【請求項１４】
（ａ）ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）のいずれかのポリペプチド、及び（ｂ）ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）のいずれかのポリペプチドに対して、少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチド配列を含む単離したポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチド配列が、（ａ）ＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかのポリペプチド、及び（ｂ）ＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかに対して、少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする請求項１４記載の単離したポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）より選択される少なくとも２つのＯＲＦを含むことを特徴とする請求項１４又は１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）より選択される少なくとも３つのＯＲＦを含むことを特徴とする請求項１４、１５又は１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）より選択される少なくとも５つ以上のＯＲＦを含むことを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターで形質転換を行った宿主細胞。
【請求項２１】
細胞が、ラモプラニン又はラモプラニン類似体の組み立てを誘導するのに充分なポリペプチドをコードする遺伝子クラスターを含む外来性核酸で形質転換を行った細胞であることを特徴とする請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ラモプラニン生合成用遺伝子クラスターにコードされるポリペプチドの基質である生体分子の化学修飾方法であって、生体分子を請求項１４〜１７のいずれか記載のポリペプチドと接触させ、それにより該ポリペプチドが該生体分子を化学修飾することを特徴とする方法。
【請求項２３】
方法が、生体分子を、ラモプラニンＯＲＦ１〜３１（配列番号２〜３２）にコードされる少なくとも２つの異なるポリペプチドと接触させることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
方法が、生体分子を、ＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）にコードされる少なくとも２つの異なるポリペプチドと接触させることを特徴とする請求項２２又は２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許法第１１９条に基づく、２０００年１０月１３日に提出した米国特許出願番号第６０／２３９，９２４号の仮出願及び２００１年４月１２日に提出した米国特許出願番号第６０／２８３，２９６号の仮出願に関する利益、並びに米国特許法第１２０条に基づく、ここに参照として組み込んだ米国特許出願番号第９０／９１０，８１３号に関する利益について、そのすべてをあらゆる目的で要求するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗生物質分野に関し、より詳しくは、ラモプラニンの生合成に関与する遺伝子に関する。本発明は、組換えＤＮＡ技術によってラモプラニンを作製するための組換え方法及び組換え物質を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
ラモプラニンは、自然に発生するグリコシル化リポデプシペプチド抗生物質であり、グラム陽性好気性及び嫌気性細菌に対する活性をもつ。細菌細胞壁の構築に必要な酵素の１つを抑制することにより、ラモプラニンはグラム陽性菌を死滅させる。米国特許番号第４，３０３，６４６号に記載されているように、当初、ラモプラニンは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ３３０７６の発酵により産生される抗生物質Ａ／１６６８６として記載されていた。その後、関連性の高い３つの成分が抗生物質Ａ／１６６８６から単離可能であることが判明し、それらの成分は、抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ１、Ａ２及びＡ３と命名された（Ｃｉａｂａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）， Ｖｏｌ． ４２， Ｎｏ．２， ｐｐ． ２５４−２６７）。これらの物質については、その調製及び使用とともに米国特許番号第４，４２７，６５６号に記載されている。Ａ’１、Ａ’２、及びＡ’３と命名された３つの付加的な因子が発酵培地中に存在することがその後判明し、それらの因子はグリコシド基のマンノース単位が１つ欠如しており、元の複合体のそれぞれの親成分とは異なることがわかった（Ｇａｓｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． １１， Ｎｏ． １， ｐｐ． １３−１８）。
【０００４】
ラモプラニンは、ジマンノシルグリコシド基をもつ環状デプシペプチドコア構造を共有する３つの関連ポリペプチドの混合物で構成されている。ラモプラニンの３つの形態は、グリコシル化デプシペプチドコア構造を装飾する８−、９−又は１０−炭素脂肪酸から誘導された各種アシルアミド部分の存在によって区別される。
【０００５】
デプシペプチドは、環状又は分枝状のペプチドであり、そのカルボン酸基と末端ヒドロキシル基又は側鎖ヒドロキシル基との間に、エステル結合を含むものである。ラモプラニンのデプシペプチドコア構造には、１７個のアミノ酸が含まれている。Ｎ−末端からＣ−末端まで、下記の順序でアミノ酸が並んでいる。アミノ酸１：アスパラギン（Ａｓｎ）；アミノ酸２：β−ヒドロキシアスパラギン（ＨＡｓｎ）；アミノ酸３：４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）；アミノ酸４：オルニチン（Ｏｒｎ）；アミノ酸５：トレオニン（Ｔｈｒ）；アミノ酸６：ＨＰＧ；アミノ酸７：ＨＰＧ；アミノ酸８：Ｔｈｒ；アミノ酸９：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；アミノ酸１０：Ｏｒｎ；アミノ酸１１：ＨＰＧ；アミノ酸１２：Ｔｈｒ；アミノ酸１３：ＨＰＧ；アミノ酸１４：グリシン（Ｇｌｙ）；アミノ酸１５：ロイシン（Ｌｅｕ）；アミノ酸１６：アラニン（Ａｌａ）；アミノ酸１７：３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＣＨＰＧ）。かかるペプチドは、Ｃ−末端にあるＣＨＰＧのカルボン酸基とＨＡｓｎのヒドロキシル基との間にエステル結合が形成されることにより、環状化される。１位のＡｓｎのＮ−末端は、３つの異なる脂肪酸によりアシル化され、３つの異なる成分Ａ１−Ａ３となる。ヘミアセタール結合により、２つのＤ−マンノース糖類を１１位のＨＰＧに付着させる。
【０００６】
細菌が産生する多数の低分子量ペプチドは、ペプチド合成酵素と呼ばれる大型で多機能のタンパク質上で、リボソームとは無関係に合成される（Ｋｏｎｚ ＆ Ｍａｒａｈｉｅｌ， １９９９， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． Ｒ３９−Ｒ４８）。ペプチド合成酵素には繰り返し単位が含まれており、それぞれの繰返し単位は特定のアミノ酸を認識し、そのアミノ酸が段階的にペプチド鎖に入っていく際の触媒となる。ある特定の単位が認識するアミノ酸の同定は、その特異性がすでに判明している他の単位との比較により行われる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムに由来するミコバクチン生合成遺伝子クラスターの同定によって示されているように、多くのペプチド合成酵素には、ペプチド合成酵素中の繰返し単位の順序とそれぞれのアミノ酸がペプチド産物中に出現する順序との間に厳密な相互作用が存在し、既知の構造を有するペプチドとその合成をコードする推定遺伝子との相互作用を可能にしている（Ｑｕａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５， ｐｐ． ６３１−６４５）。
【０００７】
ペプチド合成酵素の繰返し単位は、ペプチド産物を形成するための認識、活性化、修飾、及びアミノ酸前駆体の結合においてそれぞれが特定の役割を果たしている、さらに小さな単位又は「ドメイン」で構成されている。ドメインの１つのタイプとしてアデニル化（Ａ）ドメインがあり、ペプチド合成酵素のある特定の単位によって組み込まれるアミノ酸を選択的に認識し活性化することに関与している。かかる活性化アミノ酸は、通常はＡドメインに隣接した位置を占めるチオール化（Ｔ）ドメインという他のタイプのドメインを通じてペプチド合成酵素と結合する。ペプチド合成酵素の連続単位に結合したアミノ酸は、その後、他のタイプのドメインである縮合（Ｃ）ドメインが触媒となるアミド結合の形成によって、相互に結合する。
【０００８】
ラモプラニンの構造は確認されたが、新しい活性やより増強された特性を有する新規構造を得る必要性は、依然として残っている。ラモプラニンの産生状況を改善する必要もある。よって、ラモプラニンの生合成に関する遺伝子情報が必要とされるのである。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、微生物におけるラモプラニン生合成経路のポリペプチドをコードする、単離精製を行ったポリヌクレオチド分子を提供するものである。本発明のある態様においては、ラモプラニン生合成経路の遺伝子座を全長にわたって示し、ラモプラニン遺伝子クラスターを形成するタンパク質をコードする３４のＯＲＦを含んでいる隣接ＤＮＡ配列（配列番号１）から、ポリヌクレオチド分子が選択される。かかるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２〜３４に示されている。３２個のＯＲＦについて、機能的及び構造的特徴づけを行っている。
【００１０】
したがって、１つの態様においては、本発明は、（ａ）ラモプラニンＯＲＦ１〜３３（配列番号２〜３４）のいずれかをコードする核酸、（ｂ）ラモプラニンＯＲＦ１〜３３（配列番号２〜３４）のいずれかによりコードされるポリペプチドをコードする核酸、及び（ｃ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のポリペプチドに対して、アミノ酸配列の相同性が少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上であるポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択される核酸配列を含む、単離した核酸を提供するものである。
【００１１】
本発明のある実施例は、ＯＲＦ１〜３２のうち、１つ以上のＯＲＦを特異的に除外している。最も顕著なのはＯＲＦ１、２、３、６、７、８、２０、２１、２７、２８、３１、及び３２（配列番号２、３、４、７、８、９、２１、２２、２８、２９、３２及び３３）であるが、他のＯＲＦも、本発明の範囲を逸脱することなく除外することができる。よって、本発明の別の実施例は、（ａ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかをコードする核酸、（ｂ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のいずれかによりコードされるポリペプチドをコードする核酸、及び（ｃ）ラモプラニンＯＲＦ４、５、９〜１９、２２〜２６、２９、３０及び３１（配列番号５、６、１０〜２０、２３〜２７、３０、３１及び３２）のポリペプチドに対して、アミノ酸配列の相同性が少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上であるポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択される核酸配列を含む、単離した核酸を提供するものである。
【００１２】
１つの実施形態においては、核酸は、ラモプラニン遺伝子座のＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択されるＯＲＦのうち、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ、さらに好ましくは４つ、最も好ましくはそれ以上のＯＲＦをコードしている。１つの実施形態においては、少なくともラモプラニンのデプシペプチドコア構造を形成するようなポリペプチドをコードするＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。別の実施形態においては、少なくともラモプラニンのデプシペプチドコア構造の脂肪酸側鎖を形成するようなポリペプチドをコードするＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。別の実施形態においては、ラモプラニンの４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）の合成に関与するポリペプチドをコードするＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。別の実施形態においては、少なくともβ−ヒドロキシアスパラギン残基を形成するポリペプチドをコードするＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。別の実施形態においては、ラモプラニンの生合成の制御に関与するＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。別の実施形態においては、ラモプラニン生合成機構の耐性及び細胞成分の局在に関与するポリペプチドをコードするＯＲＦの組み合わせをＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択して提供する。ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から単一のＯＲＦ又はＯＲＦの組み合わせを選択して提供し、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択したＯＲＦの発現レベルを変化させることによりラモプラニンの生成を増強する。別の実施形態においては、ＯＲＦ１〜３２（配列番号２〜３３）から選択したＯＲＦの発現レベルを変化させて、ある特定の形態のラモプラニンの収量を増加させる場合がある。
【００１３】
ラモプラニン生合成経路のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する本発明が、かかるペプチドに由来する断片をコードするポリヌクレオチドをも提供することは、当業者であればすぐにわかることである。また、本発明は、ここに記載するように、かかるポリペプチドの自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）に起因する変異体又は誘導体を提供するものであると理解される。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓの全遺伝子座のポリヌクレオチド配列を提供する本発明が、他の微生物、特にＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ科の微生物に由来するラモプラニン生合成遺伝子座の遺伝子の自然発生変異体又は相同体をも提供することは、当業者であればすぐにわかることである。
【００１４】
全遺伝子座のポリヌクレオチド配列及びコード配列を提供する本発明が、かかる生合成経路のポリペプチドの発現を制御するポリヌクレオチドをも提供することも、理解されている。そうした制御ポリヌクレオチドとしては、プロモーター及びエンハンサー配列、並びに前記配列のいずれかに対するアンチセンス配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アンチセンス分子は、それが由来する遺伝子の発現を抑制するために使用されるという点で、遺伝子発現を制御するものであるといえる。ここに記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット及びベクター、並びにそうしたカセットやベクターで形質転換又はトランスフェクションを行った細胞も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
１つの態様においては、本発明は、ラモプラニンのインビボ又はインビトロでの合成に使用するための、ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７（配列番号１０、１２〜１６、１８、２７及び２８）から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はかかるポリペプチドの自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７のいずれかにおける、非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。そうしたポリヌクレオチド及びポリペプチドもラモプラニン誘導体の作製に用いてもよい。１つの実施形態においては、ラモプラニンコア構造が変化するように、単一のＯＲＦ内部でモジュールが生じる順序を変化させる場合がある。別の実施形態においては、ラモプラニンコアの大きさが変化するように、１つ以上のＯＲＦの１つ以上のモジュールの削除又は挿入を行う場合がある。ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７に関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いて、かかるペプチドクラスの他の抗生物質の変異体を作製しても、又は作製を改善してもよい。１つの実施形態においては、ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７のいずれか１つ以上のＯＲＦに含まれるモジュールを使用して、別のペプチド抗生物質の合成に関与してペプチド抗生物質誘導体を作製するペプチド合成酵素中の既存のモジュールを置換してもよい。別の実施形態においては、別のペプチド抗生物質の合成に関与するペプチド合成酵素をコードする配列に、ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７のいずれか１つ以上のＯＲＦに含まれるモジュールを挿入し、より長いペプチドを備えたペプチド抗生物質誘導体を作製してもよい。別の実施形態においては、ＯＲＦ９、１１〜１５、１７、２６及び２７のいずれか１つ以上のＯＲＦに含まれるモジュールを本発明の配列と組み合わせて、又は他のペプチド合成酵素をコードする他の配列と組み合わせて用いて、ペプチド抗生物質を特別に設計してもよい。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、他のペプチド合成酵素モジュールとともにアデニル化ドメインとして使用し、ペプチド抗生物質前駆体へのＴｈｒの取りこみを可能にするための、ＯＲＦ１７（配列番号１８）をコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ１７の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ１７の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、ペプチド抗生物質前駆体のコア構造に脂肪酸を組み込むための、ＯＲＦ１１、１２又は２６（配列番号１２、１３及び２７）をコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ１１、１２又は２６の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ１１、１２又は２６の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体若しくは誘導体を提供する。１つの実施形態においては、脂肪酸構造を修飾するため、及び／又はペプチド抗生物質構造への脂肪酸の取りこみを増強するために、ＯＲＦ１６、２４若しくは２５、又はその変異体若しくは誘導体をＯＲＦ１１、１２又は２６とともに用いる。別の実施形態においては、ペプチド抗生物質構造への脂肪酸の組み込みをさらに増強するために、ＯＲＦ１、３、１９又は２９、又はその変異体若しくは誘導体をＯＲＦ１１、１２又は２６とともに用いる。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、ペプチド抗生物質前駆体のコア構造へＤアミノ酸を組み込むための、ＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール１、２、３及び５、並びにＯＲＦ１４（配列番号１５）のモジュール１、３及び７から選択されるモジュールのアデニル化及び／又は縮合ドメインをコードするポリヌクレオチド、かかるポリペプチドの自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール１、２、３及び５、並びにＯＲＦ１４（配列番号１５）のモジュール１、３及び７から選択されるモジュールのアデニル化ドメインの非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）の合成のための、ＯＲＦ４、６、７、２８及び３０（配列番号５、７、８、２９及び３１）のいずれかをコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ４、６、７、２８及び３０の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ４、６、７、２８及び３０の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。１つの実施形態においては、ＯＲＦ４、６、７、２８及び３０のいずれか、又はそれらの変異体若しくは誘導体を用いて、ＨＰＧ−含有ペプチド抗生物質の産生を増強する。かかる抗生物質としては、ノカルジシンＡ、バンコマイシン、アリジシン、クロロエレモマイシン、テイコプラニン及び関連するグリコペプチド抗生物質、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、ラモプラニン又はその変異体及び誘導体の分泌を増強するため、又はラモプラニン生合成用前駆体の取りこみを増強するための、ＯＲＦ２、３、８、１９、２３、２９及び３１（配列番号３、４、９、２０、２４、３０及び３２）のいずれかをコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ２、３、８、１９、２３、２９及び３１の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ２、３、８、１９、２３、２９及び３１の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。１つの実施形態においては、ＯＲＦ２、８、２３及び３１のいずれかを用いてラモプラニン又はその変異体及び誘導体に耐性を付与しても、又は生産レベルを向上させてもよい。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、ラモプラニン又はその変異体及び誘導体の生合成を調節するための、ＯＲＦ５、２１及び２２（配列番号６、２２及び２３）のいずれかをコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ５、２１及び２２の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ５、２１及び２２の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。１つの実施形態においては、ＯＲＦ５、２１及び２２のいずれかを用いてラモプラニン又はその変異体及び誘導体の産生を増強してもよい。別の実施形態においては、ＯＲＦ５、２１及び２２のいずれかを用いて、ラモプラニン又はその変異体及び誘導体の発現を環境シグナル又は細胞シグナルと連携させてもよい。
【００２２】
別の態様においては、本発明は、ペプチド抗生物質前駆体の芳香基のハロゲン化のための、ＯＲＦ２０（配列番号２１）のいずれかをコードするポリヌクレオチド、又はＯＲＦ２０の自然発生変異体若しくは誘導体及びそれらに由来する断片、例えば、ＯＲＦ２０の非必須アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換、又は必須アミノ酸の同類置換に起因する変異体又は誘導体を提供する。１つの実施形態においては、ＯＲＦ２０又はその変異体若しくは誘導体を用いて、ペプチド抗生物質前駆体のＨＰＧの塩素処理を行ってもよい。
（発明の詳細な説明）
【００２３】
ラモプラニンは、微生物のＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ３３０７６による天然の産物である。ラモプラニン産生株のＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ３３０７６（米国、ヴァーモント州、マナサス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）から単離したゲノムＤＮＡから、米国特許出願番号第０９／９１０，８１３号に記載の手順で、ラモプラニン産生のための生合成経路をコードする遺伝子座を単離し、クローン化した。この新しく発見された遺伝子座は、この生物によるラモプラニン生合成に関与する３２個の個別タンパク質をコードしている。３２個のタンパク質は、ＤＮＡが８８４２１個の塩基対（配列番号１）である隣接した配列に含まれるＯＲＦによってコードされている。
【００２４】
それぞれがラモプラニンの部分的生合成遺伝子座のコスミドクローンをもつ３つの寄託微生物、すなわち、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（００８ＣＨ）株、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（００８ＣＫ）株、及び大腸菌ＤＨ１０Ｂ（００８ＣＯ）株は、カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート  １０１５のカナダ国保険省微生物局、カナダ国際寄託局に、２００１年９月１９日に寄託された。配列番号１の塩基対５００６から４２９７４までの００８ＣＨクローンのアクセッション番号はＩＤＡＣ１９０９０１−３である。配列番号１の塩基対３４２９６から７０９３４までの００８ＣＫクローンのアクセッション番号はＩＤＡＣ１９０９０１−１である。配列番号１の塩基対５２１６３から８８３３３までの００８ＣＯクローンのアクセッション番号はＩＤＡＣ１９０９０１−２である。コスミドを含む大腸菌株として寄託したコスミドを、これより「寄託コスミド」と称する。
【００２５】
図１に示したように、寄託コスミドはラモプラニン生合成遺伝子座を含んでいる。本書類中の配列に関する記載との間で齟齬が生じた場合は、寄託コスミドに含まれるポリヌクレオチド配列及びそれらにコードされるあらゆるポリペプチドのアミノ酸配列が優先される（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）。
【００２６】
かかるコスミドの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて行われた。特許証が発行されると、寄託コスミドは最終的なものとして、無制限又は無条件で公開される。寄託コスミドは当業者の便宜のためだけに提供されるものであり、米国特許法第１１２条で要求されている実施可能要件を満たすために寄託が必要というわけではない。寄託コスミド及びそれに由来する化合物の作製、使用又は販売には許諾が必要となる場合があり、かかる許諾が寄託により与えられることはない。
【００２７】
本発明の各種試薬は、寄託株より単離可能である。本発明の各種サブクローンについてＤＮＡ配列分析を行い、それにより、ラモプラニン生合成遺伝子座の３２の個別タンパク質をコードするＯＲＦをはじめとする各種ラモプラニンＯＲＦの局在を確認するのが容易になった。
【００２８】
ラモプラニン生合成遺伝子座は、約８８，５００塩基対に及び、３２個のＯＲＦを含んでいる。配列番号１（８８４２１塩基対）の隣接ヌクレオチド配列には、配列番号２〜３４に挙げられた３３個の推定タンパク質が含まれている。ＯＲＦ１（配列番号２）は、配列番号１の残基２０７７〜３０７８（センス鎖）から推定した３３３個のアミノ酸である。ＯＲＦ２（配列番号３）は、配列番号１の残基３１１８〜４０３２（センス鎖）から推定した３０４個のアミノ酸である。ＯＲＦ３（配列番号４）は、配列番号１の残基４０３８〜５０４８（センス鎖）から推定した３３６個のアミノ酸である。ＯＲＦ４（配列番号５）は、配列番号１の残基６６６５〜５８１４（アンチセンス鎖）から推定した２８３個のアミノ酸である。ＯＲＦ５（配列番号６）は、配列番号１の残基７７０３〜６６９３（アンチセンス鎖）から推定した３３６個のアミノ酸である。ＯＲＦ６（配列番号７）は、配列番号１の残基９４６４〜８１３０（アンチセンス鎖）から推定した４４４個のアミノ酸である。ＯＲＦ７（配列番号８）は、配列番号１の残基９６９１〜１０７６１（センス鎖）から推定した３５６個のアミノ酸である。ＯＲＦ８（配列番号９）は、配列番号１の残基１２７５１〜１０８２９（アンチセンス鎖）から推定した６４０個のアミノ酸である。ＯＲＦ９（配列番号１０）は、配列番号１の残基１３６１７〜１２８０２（アンチセンス鎖）から推定した２７１個のアミノ酸である。ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、配列番号１の残基１５２０３〜１３６１４（アンチセンス鎖）から推定した５２９個のアミノ酸である。ＯＲＦ１１（配列番号１２）は、配列番号１の残基１５５９１〜１５８６３（センス鎖）から推定した９０個のアミノ酸である。ＯＲＦ１２（配列番号１３）は、配列番号１の残基１５８８０〜１９０３５（センス鎖）から推定した１０５１個のアミノ酸である。ＯＲＦ１３（配列番号１４）は、配列番号１の残基１９０３２〜３９７１３（センス鎖）から推定した６８９３個のアミノ酸である。ＯＲＦ１４（配列番号１５）は、配列番号１の残基３９７１３〜６５８００（センス鎖）から推定した８６９５個のアミノ酸である。ＯＲＦ１５（配列番号１６）は、配列番号１の残基６５８２６〜６６５３０（センス鎖）から推定した２３４個のアミノ酸である。ＯＲＦ１６（配列番号１７）は、配列番号１の残基６６５４６〜６７３７０（センス鎖）から推定した２７４個のアミノ酸である。ＯＲＦ１７（配列番号１８）は、配列番号１の残基６７３８４〜７００５９（センス鎖）から推定した８９１個のアミノ酸である。ＯＲＦ１８（配列番号１９）は、配列番号１の残基７００９９〜７０６６２（センス鎖）から推定した１８７個のアミノ酸である。ＯＲＦ１９（配列番号２０）は、配列番号１の残基７０６５９〜７１９０６（センス鎖）から推定した４１５個のアミノ酸である。ＯＲＦ２０（配列番号２１）は、配列番号１の残基７３４３９〜７１９６４（アンチセンス鎖）から推定した４９１個のアミノ酸である。ＯＲＦ２１（配列番号２２）は、配列番号１の残基７４２１６〜７３５６３（アンチセンス鎖）から推定した２１７個のアミノ酸である。ＯＲＦ２２（配列番号２３）は、配列番号１の残基７５４２４〜７４２１３（アンチセンス鎖）から推定した４０３個のアミノ酸である。ＯＲＦ２３（配列番号２４）は、配列番号１の残基７５５３５〜７６４６４（センス鎖）から推定した３０９個のアミノ酸である。ＯＲＦ２４（配列番号２５）は、配列番号１の残基７８１１０〜７６４４９（アンチセンス鎖）から推定した５５３個のアミノ酸である。ＯＲＦ２５（配列番号２６）は、配列番号１の残基７９８６４〜７８１０７（アンチセンス鎖）から推定した５８５個のアミノ酸である。ＯＲＦ２６（配列番号２７）は、配列番号１の残基８１６２４〜７９８６１（アンチセンス鎖）から推定した５８７個のアミノ酸である。ＯＲＦ２７（配列番号２８）は、配列番号１の残基８１９０９〜８１６８２（アンチセンス鎖）から推定した７５個のアミノ酸である。ＯＲＦ２８（配列番号２９）は、配列番号１の残基８２３４６〜８２０６２（アンチセンス鎖）から推定した９４個のアミノ酸である。ＯＲＦ２９（配列番号３０）は、配列番号１の残基８２５８７〜８４４４６（センス鎖）から推定した６１９個のアミノ酸である。ＯＲＦ３０（配列番号３１）は、配列番号１の残基８４４８１〜８５５４８（センス鎖）から推定した３５５個のアミノ酸である。ＯＲＦ３１（配列番号３２）は、配列番号１の残基８５５５６〜８６８４５（センス鎖）から推定した４２９個のアミノ酸である。ＯＲＦ３２（配列番号３３）は、配列番号１の残基８７３７２〜８６８０３（アンチセンス鎖）から推定した１８９個のアミノ酸である。ＯＲＦ３３（配列番号３４）は不完全であり、配列番号１の残基８７４９４〜８８４２０（センス鎖）から推定した３０９個のアミノ酸（Ｎ−末端のみ）である。
【００２９】
いくつかのＯＲＦ、すなわちＯＲＦ４、７、８、９、１２、１６、１７、１９、２０、２７、２８、２９、３０、３２、及び３３（配列番号５、８、９、１０、１３、１７、１８、２０、２１、２５、２８、２９、３０、３１、３３及び３４）は、標準的な開始コドンであるＡＴＧ（メチオニン）よりもむしろ非標準的な開始コドンであるＧＴＧ（バリン）で開始する。ＯＲＦにおける最初のコドンの特異性を示すため、すべてのＯＲＦをアミノ酸末端位置のアミノ酸であるメチオニン又はバリンとともに列挙しておく。しかし、あらゆる場合において生合成されたタンパク質がメチオニン残基、より詳しくはホルミルメチオニン残基をアミノ末端位置に含むことが予想されており、このことは、コードする遺伝子が非標準的開始コドンを指定した場合でも、細菌中でのタンパク質の合成はメチオニン（ホルミルメチオニン）によって始まるという広く受け入れられている原則と一致している（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９８， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ７５２−７５４を参照のこと）。
【００３０】
セクション１：定義
ドメインとは、分子のある部分、例えば、タンパク質や核酸など、構造的及び／又は機能的にかかる分子の他の部分とは異なる部分を示す。
分子の誘導体又は類似体とは、かかる分子に由来する部分、又はかかる分子を修飾したものを示す。
【００３１】
本発明において単離した核酸分子とは、一本（コード又は非コード鎖）又は二本鎖であってもよい、ゲノムＤＮＡや相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）であってもよく、合成した一本鎖ポリヌクレオチドなどの合成ＤＮＡであってもよい。本発明の単離した核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）であってもよい。特定の実施形態においては、かかる核酸にはかかる遺伝子クラスターの全配列、ＯＲＦのいずれか１つの配列、ＯＲＦ及び関連するプロモーターをコードする配列、又はここに開示したＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ゲノムの断片中でコードされるペプチド、ポリペプチド、又は完全長タンパク質を発現させるのに有用な短い配列が含まれる。特定の実施形態においては、かかる核酸は天然、非天然若しくは修飾ヌクレオチド、又はヌクレオチド間結合、又はそれらの組み合わせを有している場合がある。
【００３２】
ポリヌクレオチドとは、ここに開示したＯＲＦの完全長または部分長配列を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）、又はそれらの修飾体、変異体、相同体若しくは断片でもよい。一本鎖の場合、そのポリヌクレオチドはコード鎖、「センス」鎖若しくは陽性鎖、又は相補鎖、「アンチセンス」鎖若しくは陰性鎖でもよい。アンチセンス鎖はタンパク質をコードするＲＮＡと相互作用するため、該タンパク質の調整物質として有益である。アンチセンス鎖は、特有の配列又は該タンパク質をコードするＲＮＡに対する特異性が高い配列を有する完全長鎖よりも短いものが好ましい。配列表に示す本発明のポリヌクレオチド配列は、（ａ）コード配列、（ｂ）（ａ）の転写に由来するリボヌクレオチド配列、（ｃ）遺伝子コードの冗長性又は変質を利用してかかるポリヌクレオチドをコードするコード配列、（ｄ）制御配列のいずれかとなっている。
【００３３】
ポリペプチド又はタンパク質とは、アミノ酸の鎖のことであり、長さや翻訳後修飾（例えば、タンパク質分解処理又はリン酸化）は考慮に入れない。本出願においては、この２つの語は交換可能である。当業者であれば、本発明のポリペプチドが天然の供給源、すなわちＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．から精製される場合があること、又は組換え技術を用いて作製される場合があることが、即座にわかるであろう。
【００３４】
ＯＲＦ、ラモプラニンオープンリーディングフレーム、及びラモプラニンＯＲＦとは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．より単離したラモプラニン生合成遺伝子クラスター中のオープンリーディングフレームを指す。この語は、ラモプラニンを合成する他の生物（例えば、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓの他の株及び／又は種など）に存在する同一のＯＲＦも含むものとする。この語は、対立遺伝子変異体及び単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）も含むものとする。ある例では、ラモプラニンＯＲＦという語は、ラモプラニンＯＲＦがコードするポリペプチドの同意語として使用され、かかるポリペプチド中の同類置換という意味も含む場合がある。特定の語法については、文脈から明らかになるであろう。
【００３５】
「相同的なアミノ酸配列」とは、臨界融解温度（Ｔｍ）から２５〜３５℃低い温度で配列表のコード領域核酸配列の部分とハイブリダイズする核酸配列により、全部又は一部をコードされるポリペプチドである。相同的アミノ酸配列とは、１つ以上のアミノ酸同類置換が、配列表のアミノ酸配列と異なっている配列を指す。そうした配列には、対立遺伝子変異体（後で定義する）及び欠失や挿入を含みながらもポリペプチドの機能的特性を保っている配列も含まれる。そうした配列は、少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、さらにまた好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の相同性を、配列表のアミノ酸配列に対して有している。
【００３６】
相同的アミノ酸配列には、配列表のアミノ酸配列と同一、又は本質的に同一の配列が含まれる。「本質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照先のアミノ酸配列との相同性が少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％のものであって、アミノ酸の同類置換の大半が、参照先のアミノ酸配列と異なっているものが好ましい。配列表のアミノ酸配列のいずれかと配列相同性をもつポリペプチドには、配列表のポリペプチドに固有の特性を保っている、自然発生対立遺伝子変異体、突然変異体、又はその他の非自然発生変異体が含まれており、本発明のこの態様と一致している。
【００３７】
ＷＩ５３７０５、マディソン、ユニヴァーシティーアヴェニュー１７１０のウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐなどの配列分析ソフトウェアを用いて、相同性を測定している。同一性が最大となるようにアミノ酸配列を並べている。最適アラインメントを得るため、間隔を人為的に配列に挿入する場合がある。最適アラインメントの設定後は、両方の配列で同じアミノ酸が存在する位置をすべて記録し、それをすべての位置の数と相対させて、相同性の程度を確認する。
【００３８】
相同的なポリヌクレオチド配列の定義も同様である。相同的配列は、配列表のコード配列のいずれかに対して、少なくとも４５％、好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％、最も好ましくは８５％の同一性をもっているのが好ましい。
【００３９】
「同類置換」という語は、タンパク質又はペプチドに関して使用され、分子の活性（特異性又は結合親和性）を本質的に変化させないアミノ酸置換のことを示す。典型的なアミノ酸同類置換には、あるアミノ酸と、同様の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸との置換が伴う。次に示す６つの群は、お互いに対して典型的な同類置換となっているアミノ酸をそれぞれ含んでいる。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパル酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４０】
「単離した」「精製した」「生物学的に純粋な」との語は、通常未加工の状態で付随している成分が本質的に又は基本的に存在しない物質を示す。核酸及び／又はポリペプチドに関しては、この語は、自然状態では通常隣接している配列に隣接していない核酸及び／又はポリペプチドを示す。そのような単離した核酸及び／又はポリヌクレオチドは、ベクター又は組成物の一部となる場合があるが、やはり単離したものとして定義される。これは、該ベクター又は組成物が該ポリヌクレオチドの自然環境の一部ではないためである。
【００４１】
「非相同（の）」という語は、コード配列及びコントロール配列などの核酸配列に関するものであり、通常は組換えコンストラクト領域と会合しない配列、及び／又は通常は特定の細胞と会合しない配列を示す。したがって、核酸コンストラクトの「非相同」領域とは、自然状態では他の分子と会合しない別の核酸分子内部の核酸又は該核酸分子に付着している核酸の同定可能なセグメントである。例えば、コンストラクトの非相同領域には、自然状態ではコード配列と会合しない配列が隣接しているコード配列が含まれることもある。非相同コード配列の別の例としては、コード配列そのものが自然状態では見られないコンストラクト（例えば、未変性遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）がある。同様に、通常は宿主細胞中に存在しないコンストラクトで形質転換を行った宿主細胞は、本発明の目的に鑑みて、非相同であると考えられる。
【００４２】
対立遺伝子変異体とは、１つ以上のアミノ酸に、ポリペプチドの生物学的機能を変化させない置換、欠失、又は付加が生じていることを特徴とする別形態のポリペプチドを指す。
【００４３】
「生物学的機能」とは、細胞中のポリペプチドの機能であって、自然に生じるものを指す。１つのポリペプチドが２つ以上の生物学的機能を有する場合もある。
【００４４】
セクション２：ラモプラニン核酸の単離、調製及び発現
ラモプラニン遺伝子クラスター由来の核酸を単離し、場合に応じて修飾し、宿主細胞に挿入して、代謝（生合成）経路を創り出すこと及び／又は修飾することは可能であり、これにより、かかる宿主細胞による各種代謝産物の合成及び／又は修飾が可能になる。他に、宿主細胞中で、また、化学試薬として、例えば、各種代謝産物の生体外合成及び／又は化学修飾に使用するために回収された、コードされたラモプラニンポリペプチド中で、ラモプラニン遺伝子クラスター核酸を発現させることができる。どちらの形で応用する場合も、適切な宿主細胞中の単離及び／又は修飾を行った１つ以上のラモプラニンＯＲＦをコードする１つ以上の核酸の挿入を伴うのが普通である。かかる核酸は、ラモプラニンポリペプチドの発現をもたらすのに適切な制御要素を含むコンストラクトである、発現ベクター中に通常は存在する。宿主細胞中に発現したラモプラニンポリペプチドは、その後代謝／生合成経路の構成要素として作用する（その場合、かかる経路の合成産物は回収されるのが普通である）か、又はラモプラニンポリペプチドそれ自体が回収される。ここに提供されている配列情報を利用すると、よく知られた通常の手段で、ラモプラニン核酸をクローン化し、発現させることができる。
【００４５】
Ａ．ラモプラニン核酸
ラモプラニン遺伝子クラスターを含む核酸を表２において同定し、ここに提供した配列表に列挙しておく。特に、表２はラモプラニン生合成遺伝子クラスターにおけるＯＲＦの遺伝子及び機能を同定するものである。ここに提供した配列情報を利用すると、当業者には周知の標準的な方法（例えば、Ｉｎｎｉｓ （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、などに記載の方法を使用；Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＳｕｉｔｅＴＭ， ＩｎｆｏｒＭａｘ、米国、メリーランド州ゲーサーズバーグ、などのコンピュータソフトを使用）により１つ以上のＯＲＦを増幅／単離するのに適切なプライマーを決定できる。
【００４６】
１つ以上のＯＲＦを増幅／単離するのに適切なプライマーは、配列表中で提供したヌクレオチド配列情報にしたがって、設計されている。その手順は下記のとおりである。１０〜４０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確実に起こすのに充分な割合、すなわち全ヌクレオチド量に対して少なくとも４０％、好ましくは５０％の割合で、Ｃ及びＧヌクレオチドを含むプライマーを選択すると有利である。通常、そうした増幅では、必要な遺伝子を含む生物（例えばＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）のＤＮＡ又はＲＮＡをテンプレートとして利用する。標準的なＰＣＲ反応は、１００μＬにつき０．５〜５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは同じ濃度の、それぞれ２０〜２００μＭのデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド全体濃度に対して０．５〜２．５ｍＭのマグネシウム、１０５〜１０６の標的分子、及び約２０ｐｍｏｌの各プライマーを含んでいるのが普通である。プライマーの本来のＴｍよりも１５℃〜５℃低いアニーリング温度で、約２５〜５０サイクルのＰＣＲを行う。アニーリング温度をさらに厳密なものにすると、不正確なアニーリングが行われたプライマーとの判別が容易になり、不正確なヌクレオチドがプライマーの３’末端へ組み込まれることは少なくなる。変性温度は、通常は９５℃〜９７℃であるが、Ｇ＋Ｃを多く含有する標的の変性には、より高い温度も適切とされる場合がある。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．由来のもののように、Ｇ＋Ｃを多く含有するテンプレートのＰＣＲ増幅には、ＤＭＳＯを最終濃度が５〜１０％となるように添加すると効果的である。行うサイクルの数は標的分子の初期濃度によって決まるが、非特異的なバックグラウンド産物が蓄積しやすいため、通常４０サイクル以上は行わないように推奨される。
【００４７】
相同的ポリペプチド又は対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを回収する別の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングである。ハイブリダイゼーションの手順は、当該分野では周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， １９９４）、Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａｌ．（Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８４）、及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８０）に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を最適化する重要なパラメーターは、この温度を越えると２つの相補ＤＮＡ鎖がお互いに分離し始める温度である、臨界融解温度を得るために使用する式に示されている（Ｃａｓｅｙ ＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． （１９７７） ４：１５３９）。約６００個及びそれ以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドについてのこうした式は以下のとおりである。Ｔｍ＝８１．５＋０．５×（％Ｇ＋Ｃ）＋１．６ｌｏｇ（陽イオン濃度）−０．６×（％ホルムアミド）。ストリンジェンシーが適切な条件下では、ハイブリダイゼーション温度（Ｔｈ）は、計算したＴｍよりも約２０〜４０℃、２０〜２５℃、又は好ましくは３０〜４０℃低くなっている。当業者であれば、最適温度及び塩条件はすぐに決められることがわかるであろう。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドに対しては、（ｉ）５０％のホルムアミドを含む６×ＳＳＣ中で、４２℃で４〜１６時間以内、又は（ｉｉ）６×ＳＳＣ水溶液（１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））中で、６５℃で４〜１６時間以内のプレハイブリダイジング及びハイブリダイジングインキュベーションの両方の場合についてストリンジェントな条件を整えた。
【００４９】
１つの実施形態においては、本発明は、ラモプラニンの組換え発現（例えば、ラモプラニン又はその類似体）用の核酸を提供する。かかる核酸としては、ラモプラニンの合成を誘導するには充分なポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、単離した遺伝子クラスターが挙げられる。本発明の他の実施形態においては、ＯＲＦが変化しない場合があるが、制御要素（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーなど）は修飾される場合がある。さらに他の実施形態においては、核酸が選択した構成要素（例えば、１つ以上のＯＲＦ又は修飾されたＯＲＦ）をコードする場合があり、及び／又は場合に応じて他の非相同生合成要素を含む場合がある。かかる要素には非リボソームポリペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）モジュール又は酵素ドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
かかる変異は、例えばラモプラニンの１つの置換基を他のものと置換するなど、ある特定の方法で既知の分子を修飾するために、故意に導入されることがある。それにより予測された構造を有するラモプラニン誘導体分子が作製される。その他に、例えば、生合成経路中の１つ以上のＯＲＦを体系的に又は場当たり的に置換して既知のラモプラニンの分子変異体ライブラリーを作製することにより、変異体をランダムに作製できる。
【００５１】
自然には発生しない有益な相同体及びその断片の設計には、アミノ酸配列の変化及び／又は欠損に耐性をもつとされるポリペプチドの領域を同定する既知の方法を用いる。一例として、異なる種に由来する相同的ポリペプチドを比較し、保存された配列を同定することが挙げられる。相違点の多い配列は、配列の変化に対する耐性を有する可能性が高い。配列間の相同性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７）のＢＬＡＳＴ相同性検索アルゴリズムを用いて分析してもよい。
【００５２】
その他に、配列番号２〜３４のアミノ酸配列を有する参照用ポリペプチドに対して作製された抗体との交差反応性をスクリーニングすることにより、ラモプラニン生合成経路において活性を有する本発明のポリヌクレオチドにコードされる相同的ポリペプチド又はポリペプチド誘導体を同定する場合がある。手順は次のとおりである。精製した参照用ポリペプチド、融合ポリペプチド（例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴ、又はＨｉｓタグ系の発現産物）、又は該参照用ポリペプチド由来の合成ペプチドに対する抗体を作製する。融合ポリペプチドに対する抗体を作製する場合は、異なる２つの融合系を用いる。下記のとおり、ウェスタンブロット（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９７９） ７６：４３５０）、ドットブロット及びＥＬＩＳＡなど多数の方法によって、特異的抗原性を測定できる。
【００５３】
ウェスタンブロット分析では、スクリーニングの対象となる産物は、精製した調製物又は全大腸菌抽出物のいずれかとして、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ （１９７０） ２２７：６８０）記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけられる。ニトロセルロース膜に移した後、約１：５から約１：５０００、好ましくは約１：１００から１：５００の稀釈範囲で稀釈した抗体を用いて、かかる物質をさらにインキュベーションする。かかる産物に対応するバンドが上記稀釈範囲内の稀釈物のいずれかに反応性を示した時点で、特異的抗原性が判明する。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ分析法では、スクリーニングの対象となる産物をコーティング抗原として使用するのが好ましい。精製した調製物が好ましいが、全細胞抽出物も使用可能である。すなわち、１ｍｌあたり約１０μｇのタンパク質を含む１００μｌの調製物を９６ウェルのポリカーボネート製ＥＬＩＳＡプレートに分注する。かかるプレートを３７℃で２時間インキュベーションし、その後４℃で一晩インキュベーションする。０．０５％のツイーン２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ツイーン緩衝液）で、かかるプレートを洗浄する。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２５０μｌのＰＢＳでウェルを満たし、非特異的な抗体結合を防止する。３７℃で１時間のインキュベーションを行った後、ＰＢＳ／ツイーン緩衝液でかかるプレートを洗浄する。０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ／ツイーン緩衝液で抗体を連続的に稀釈する。１ウェルあたり１００μｌの稀釈物を添加する。かかるプレートを３７℃で９０分間インキュベーションし、洗浄し、標準的な手順にしたがって評価する。例えば、ウサギの内部で特異抗体が作製された場合は、ヤギ抗ウサギ抗体とペルオキシダーゼとの共役物をウェルに添加する。３７℃で９０分間のインキュベーションを行い、かかるプレートを洗浄する。適切な基質で反応を展開させ、反応を比色分析（分光光度法による吸光度の測定）で測定する。上記実験条件下では、陽性反応は、非免疫性コントロール血清よりも高いＯＤ値で示されている。
【００５５】
ドットブロット分析では、精製した調製物が好ましいが、全細胞抽出物も使用可能である。すなわち、かかる産物の溶液１００μｇ／ｍｌを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で連続して２倍に稀釈する。それぞれ１００μｌの稀釈液を、９６ウェルのドットブロット用装置（Ｂｉｏｒａｄ社製）にセットした０．４５μｍのニトロセルロース膜に塗布する。かかる系を真空状態にして、緩衝液を除去する。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加してウェルを洗浄し、かかる膜を空気乾燥させる。かかる膜にブロッキング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのスキムミルク）をたっぷりと含ませ、約１：５０から約１：５０００の範囲で、好ましくは約１：５００で稀釈した抗体で、かかる膜をインキュベーションする。標準的な手順により、反応を明らかにする。例えば、ウサギ抗体を使用する際に、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ共役物をウェルに添加する。３７℃で９０分のインキュベーションを行い、かかるブロットを洗浄する。適切な基質を用いて反応を展開させ、停止させる。着色したスポットの外観によって、例えば比色分析によって、反応を視覚的に測定する。上記の実験条件下では、着色したスポットと、少なくとも約１：５、好ましくは少なくとも約１：５００での稀釈処理との間に関連性があれば、陽性反応だとわかる。
【００５６】
ここに提供した情報を利用すれば、当業者であれば容易に目的の配列をクローニングする他の方法を思いつくであろう。例えば、目的のラモプラニン遺伝子及び／又は場合に応じてＮＲＰＳモジュール又は酵素的ドメインは、該遺伝子を発現する細胞に由来するｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニング、又は該遺伝子を含むことが知られているベクターからの該遺伝子の抽出などの組換え方法により、それらを発現する生物より入手可能である。その後、標準的技術を用いて、該遺伝子を単離して他の目的とする生合成要素と結合させることができる。問題の遺伝子がすでに適切な発現ベクター中に存在する場合は、要望に応じて例えば他のドメイン又はサブユニットとｉｎ ｓｉｔｕで結合させることができる。目的の遺伝子は、クローニングよりもむしろ合成によって作製できる。目的とする特定のアミノ酸配列用の適切なコドンを用いて、ヌクレオチド配列を設計することができる。かかる配列が発現する宿主に好適なコドンを選択するのが一般的である。標準的方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列を集めて、完全なコード配列へと組み立てることができる（Ｅｄｇｅ （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６； Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１２９９； Ｊａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：６３１１を参照のこと）。さらに、特注による遺伝子の合成が商業的に利用可能である（例えば、カリフォルニア州アラメダのＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社を参照のこと）ことも記されている。
【００５７】
Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８９） Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ カリフォルニア州サンディエゴのＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， （Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．） Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．との共同事業、米国特許第５，０１７，４７８号；及び欧州特許第０２４６８６４号には、そうした技術及び指示について、当業者の指針となるのに充分な例が、多数のクローニング実習によって示されている。
【００５８】
Ｂ．ラモプラニンＯＲＦの発現
原核生物の宿主から組換え発現系を選択するのが好ましい。細菌細胞は、当業者用の市販業者、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックヴィル）をはじめとする多数の異なる供給源から入手可能である。組換えタンパク質の発現に使用する細胞の市販業者は、かかる細胞の使用説明書も提供している。
【００５９】
発現したポリペプチドにとってどういった特徴が望ましいのかによって、どの発現系を選択するかが決まる。例えば、本発明のポリペプチドをある特定の脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）形態又は他の形態で作製するのが有用な場合がある。形質導入が可能なクローニングベクターであれば、本発明の核酸コンストラクト用のクローニングベクターとして使用できる。しかし、大型のクラスターを発現させる場合は、ファージミド、コスミド、Ｐ１、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ又は同様のクローニングベクターを用いてヌクレオチド配列を宿主細胞内にクローニングするのが好ましい。例えば、ファージミド、コスミド、及びＢＡＣは、それぞれＭ１３ファージ及びλファージよりも大型のＤＮＡを挿入して安定的に増殖させる能力により、有利なベクターとされている。この方法に使用されるファージミドには、一般に、プラスミドと繊維性ファージクローニングビヒクルとの混成物が含まれる。この方法に使用されるコスミドには、一般に、ｃｏｓ部位が挿入されたλファージを基礎とするベクターが含まれる。レシピエントプールクローニングベクターは、適切なプラスミドであればよい。突然変異体のプールが挿入されたクローニングベクターは、同一であってもよく、又は、異なる遺伝子マーカーを有し、発現するような構成であってもよい（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。こうした異なるマーカー遺伝子を有するベクターを用いるという効用を利用して、形質導入の首尾を容易に確認する場合もある。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態においては、ベクターを使用して、ラモプラニン生合成遺伝子又は遺伝子クラスターを宿主（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞に挿入する。しかし、下記のガイドラインによれば、不当な実験をすることも、本発明の範囲から逸脱することもなく、ベクター、発現コントロール配列及び宿主を選択することができる。当業者であれば、特定の宿主細胞に使用する多数のベクターについて充分な知識を有している。例えば、Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ， （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ， ３０９：４６２−４６４； Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５：５０９−５１２； Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：１１６−１６６は、すべて多様なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの宿主に使用するベクターについて記載している。ベクターの選択にあたっては、宿主内部での存続とできれば複製も可能なベクターと共存できるような、適切な宿主を選択しなくてはならない。ベクターのコピー数、抗生物質耐性など、他のタンパク質のコピー数及び発現をコントロールする能力について、考慮が重ねられている。１つの好ましい実施形態においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクターを使用しており、その内部には、かかるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクターの大腸菌内への導入及び大腸菌内での存続が可能となるような配列が含まれている。このようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ／大腸菌シャトルベクターは文献（例えば、Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７１：５８７２−５８８１； Ｇｕｉｌｆｏｉｌｅ ＆ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：８５５３−８５５７）に記載されている。
【００６１】
当業者に周知の方法によって、本発明の野生型及び／又は修飾されたＯＲＦを、１つ以上の発現ベクターに挿入することができる。発現ベクター（例えばプラスミド）は当業者に広く知られており、当業者であればすぐに利用できる。細菌ベクターについては、本発明のポリヌクレオチドを細菌のゲノムに挿入するか、又は、プラスミドの一部として遊離状態のままにしておく。発現ベクターで宿主細胞の形質転換を行う方法は、当該分野ではよく知られている。かかる発現ベクターには、操作可能な状態で目的のＯＲＦと結合したコントロール配列が含まれている。発現コントロール配列の選択にあたっては、多数の可変的特徴（ｖａｒｉａｂｌｅ）が考慮される。なかでも重要な可変的特徴は、配列の相対強度（例えば、各種条件下で発現を起こす能力）、配列の機能、及び発現するポリヌクレオチドとコントロール配列との適合性をコントロールする能力である（例えば、効率的な転写を妨害する場合があるヘアピン構造を回避するために、二次構造が考慮の対象となっている）。
【００６２】
本発明に使用する適切な発現系には、宿主である真核及び／又は原核細胞で機能する系が含まれる。しかし、上記の説明のとおり原核細胞系が好ましく、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．と適合する系が特別な興味を集めている。
【００６３】
どの発現カセットを選択するかは、発現したポリペプチド又は天然産物に望ましい特徴、及び選択した宿主系によって決まる。発現カセットとしては、選択した宿主系で機能できるプロモーターで、かつ構造プロモーター又は誘導プロモーターとなりうるもの、リボソーム結合部位、必要であれば開始コドン（ＡＴＧ）、場合によってはリーダーペプチドをコードする領域、本発明のＤＮＡ分子、終止コドン、及び場合によっては３’末端領域（翻訳及び／又は転写ターミネーター）が一般的に挙げられる。応用可能な場合、すなわち、分泌又は膜タンパク質である場合は、リーダーペプチドコード領域が本発明のポリヌクレオチドに近接しており、適切なリーディングフレームに配置されている。リーダーペプチドコード領域が存在する場合、その領域は、成熟したポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と相同又は非相同であり、発現に使用した宿主の分泌機構と適合する。本発明のＤＮＡ分子で構成されるＯＲＦは、単独で又はリーダーペプチドとともに、宿主系で転写と翻訳が生じるようにプロモーターの管理下で配置される。プロモーター及びリーダーペプチドコード領域は、当業者に広く知られており、当業者であれば利用できる。特に有用なプロモーターとしては、ラモプラニン及び／又はＮＲＰＳ遺伝子クラスターに由来するコントロール配列が挙げられる。他の細菌性プロモーター、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）及びマルトースなどの糖代謝酵素に由来するものが本件のコンストラクトに使用されている。他の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系、バクテリオファージλＰＬ、及びＴ５などの生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらに、自然状態では発生しない合成プロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）も、宿主細菌細胞中で機能する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいては、ＥｒｍＥ及びＴｃｍＧ（Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３０７２６−３０７３３）などの構造プロモーター、及びａｃｔＩ及びａｃｔＩＩＩ（Ｐｌｅｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ３７８：２６３−２６６； Ｐｉｅｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７：１１３７３−１１３７４； Ｗｉｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｃｈｅｍ． ＆ Ｂｉｏｌ． ２：５８３−５８９）などの制御可能なプロモーターを含めた、多数のプロモーターが記載されている。
【００６４】
他の制御配列についても、宿主細胞の成長に応じてＯＲＦの発現を制御できるものが望ましい。制御配列は当業者には知られており、その例としては、制御化合物の存在をはじめとする化学的又は物理的刺激によってスイッチのオン又はオフが生じる遺伝子の発現を引き起こすものがある。他のタイプの制御要素、例えばエンハンサー配列なども、ベクター中に存在する場合がある。
【００６５】
選択マーカーも組換え発現ベクターに含めることができる。形質転換した細胞株を選択するのに有用な多様なマーカーが知られているが、一般に、発現した場合に、適切な選択培地で成長し形質転換した細胞に選択可能な表現型を与えるような遺伝子で、そうしたマーカーは構成されている。該マーカーには、例えば、抗生物質に対する耐性又は感受性をプラスミドに与える遺伝子が含まれている。
【００６６】
別々のコントロール要素を用いて、又は、例えば単一のプロモーターのコントロール下で、目的とする各種ラモプラニンＯＲＦ、及び／又はＮＲＰＳクラスター若しくはサブユニットを、個別カセットとしての１つ以上の組換えベクターにクローンすることができる。かかるＯＲＦは、他のオープンリーディングフレームで欠失や挿入が発生しやすくなるように隣接制限部位を含んでいてもよく、それにより、混成合成経路の形成が可能になる。そのような独特の制限部位の設計は当業者には知られており、特定部位の突然変異誘発やＰＣＲなどの上述の技術により、そうした設計を行うことができる。
【００６７】
ＮＲＰＳコード遺伝子クラスターをはじめとする遺伝子クラスターなどの大型の核酸の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓをはじめとする細胞中でのクローニング方法及び発現方法は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ ａｎｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：３１３５−３１３９： Ｍｏｔａｍｅｄｉ ａｎｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：４４４５−４４４９； Ｇｒｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｅ， １５１：１−１０； Ｋａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５：５０９−５１２； Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５３：１１６−１６６を参照のこと）。ベクターを中心とする方法を用いて、原核細胞などの細胞に１００ｋｂを優に越える核酸を導入した例もいくつかある（例えば、Ｏｓｏｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ５２：１−８； Ｗｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ， Ｒｅｓ．， ２４：４２０２−４２０９を参照のこと）。
【００６８】
Ｃ．宿主細胞
ラモプラニン及び／又はラモプラニンシャント代謝物、及び／又はその後の単離用に修飾された他の代謝物、及び／又は１つ以上の望ましい生体分子（例えば、ラモプラニン及び／又はラモプラニン類似体など）の生合成用に修飾された他の代謝物の各種タンパク質成分を発現させるために、上記ベクターを用いることができる。ラモプラニン生合成遺伝子クラスターの１つ以上のタンパク質が、その後の単離及び／又は特徴決定で発現する（例えば、過剰発現する）場合は、タンパク質の発現に適したいかなる真核細胞又は原核細胞中でもかかるタンパク質が発現する。宿主の選択にあたっては、選択したベクターと適合し、発現産物が有しているかもしれないいかなる毒性作用にも耐性を示し、望ましい場合には発現産物を効率的に分泌でき、望ましいコンフォメーションでかかる産物を発現させることができ、計測が容易な単細胞宿主を選択する。その際には、最終産物の精製の容易さを考慮する。かかる最終産物は、発現したポリペプチド又はかかる発現したポリペプチドがその一部となっている生合成経路の産物である抗生物質などの天然産物であってもよい。１つの好ましい実施形態においては、かかるタンパク質は大腸菌中で発現する。
【００６９】
ラモプラニン、ラモプラニン代謝物、シャント代謝物などを組換えによって作製する際の宿主細胞は、組換えラモプラニン遺伝子クラスター及び／又はそのサブセットを保有できるのであれば、どの生物に由来していてもよい。したがって、本発明の宿主細胞は、真核生物又は原核生物のいずれに由来していてもよい。宿主細胞としては、自然状態でラモプラニンを発現する種又は株（例えば細菌株）の細胞が好ましい。適切な宿主細胞としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｔｅｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｒａなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい宿主細胞としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｍｉｃｒｏｓｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ． Ｃａｌｉｃｈｅｎｉｓｉｓ、Ａｃｔｉｏｎａｍａｄｕｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓｏｐｏｒａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｅｒｓｉｎａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
Ｄ．発現産物の回収
発現産物（例えば、ラモプラニン、ラモプラニン類似体、ラモプラニン生合成経路ポリペプチドなど）の回収は、当業者に周知の方法で行われる。例えば、ラモプラニン生合成遺伝子クラスタータンパク質を発現させ、単離する場合、単離（例えばＨｉｓ６）タグの作用を助長するのに便利なタグを用いて、かかるタンパク質を発現させることができる。他の標準的なタンパク質精製方法にも適切なものがあり、それらの方法は当業者によく知られている（例えば、（Ｑｕａｄｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１５８５−１５９５， Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３２：３１３−３２１などを参照のこと）。
【００７１】
本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体の精製は、ラモプラニン、又はかかるポリペプチドに結合する他のリポデプシペプチドに関連する抗体又は化合物のいずれかをリガンドとして用いて、アフィニティークロマトグラフィーで行ってもよい。かかる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかである。標準的方法によって、抗血清から精製ＩｇＧを調製する（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９４） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照のこと）。従来のクロマトグラフィーの裏付けについては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｄ． Ｌａｎｅ， Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ， Ｅｄｓ． （１９８８）に記載されている。
【００７２】
配列番号２〜３４のアミノ酸配列の部分配列であり、配列番号２〜３４のアミノ酸配列に相同的なポリペプチド配列の部分配列であり、内部欠損によって完全長ポリペプチドから由来したポリペプチドであり、融合タンパク質であるポリペプチド誘導体が提供されるが、これは、本発明のこの態様と一致している。
【００７３】
ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド及び大型の内部欠損を有しているポリペプチドを、標準的方法を用いて構築する（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， １９９４）。かかる方法としては、標準的ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、クローン化したＤＮＡ分子の制限酵素処理、又はＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８５） ８２：４４８）が挙げられる。これらの方法の構成要素及びその使用にあたっての説明書は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社などさまざまな市販業者から即座に入手できる。欠損突然変異体の構築後は、そうした変異体について、ここに記載のラモプラニン産生を向上させる能力又はリポデプシペプチドクラスの抗菌性産物若しくは天然産物の新規類似体を作製する能力のテストを行う。
【００７４】
融合ポリペプチドとは、Ｎ−末端又はＣ−末端で他のポリペプチドと融合している本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体（以下、ペプチドテールと称する）を含むもののことである。そうした融合ポリペプチドを得る簡単な方法に、ポリヌクレオチド配列のインフレーム融合、つまり混成遺伝子の翻訳がある。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに使用する発現ベクターに、融合ポリペプチドをコードする混成遺伝子を挿入する。他の方法としては、ペプチドテールをコードするポリヌクレオチドがすでにその内部に存在している発現ベクターに、ポリペプチド又はポリペプチド誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。そうしたベクター及びその使用にあたっての説明書は、例えば、ペプチドテールがマルトース結合タンパク質であるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のｐＭａｌ−ｃ２又はｐＭａｌ−ｐ２系、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ系、又はＮｏｖａｇｅｎ社から入手可能なＨｉｓ−Ｔａｇ系など、市販により入手可能である。これら及びその他の発現系により、本発明のポリペプチド及び誘導体をさらに精製する便利な手段が提供される。
【００７５】
配列番号２〜３４のヌクレオチド配列に相同的な配列の部分配列をコードする、３０〜６００個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを、概述したパラメーターを使用し、増幅する断片の５’及び３’末端の上流及び下流の配列と一致するプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅により回収する。そうした増幅用のテンプレートとなるポリヌクレオチドは、配列番号２〜３４のポリヌクレオチド配列に相同的な完全長ポリヌクレオチド又はＤＮＡ若しくはＲＮＡライブラリーなどポリヌクレオチド混合物に含まれるポリヌクレオチドのいずれかである。かかる部分配列を回収する別の方法として、Ｔｍ計算式を用いて上記条件下でスクリーニングハイブリダイゼーションを行う。３０〜６００個のヌクレオチドからなる断片を回収する場合は、減算（ポリヌクレオチドあたり塩基対にして６００個の大きさ）により計算したＴｍを訂正し、ハイブリダイゼーション温度をＴｍより５〜１０℃低い温度として、ストリンジェンシーの条件を定義する。２０〜３０個未満の塩基からなるオリゴヌクレオチドを得る場合には、Ｔｍ計算式は次のとおりである。Ｔｍ＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２×（Ａ＋Ｔ）。例えば、５０％のＧ＋Ｃの１８個のヌクレオチドからなる断片のＴｍは、約５４℃である。配列番号２〜３４のポリペプチド配列又はその相同配列の断片である短ペプチドは、化学合成によって直接入手可能である（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｈ． Ｊ． Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ， ４ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ； Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８１）， Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｋｉ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９８４））。
【００７６】
構成要素（例えば、ラモプラニンＯＲＦ）を使用して各種生体分子（例えば、ラモプラニン、ラモプラニン類似体、シャント代謝物、又はラモプラニンとは無関連の化合物、すなわち生体触媒）の合成及び／又は修飾を行う場合は、当業者に周知の標準的方法にしたがって望ましい産物及び／又はシャント代謝物を単離する（例えば、Ｃａｒｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｋｈｏｓｌａ （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：２０８４−２０８８， Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １８２： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ｅｄ．を参照のこと）。
【００７７】
Ｅ．プローブ
本出願中で提供されている配列情報により、推定リポデプシペプチド産生微生物の同定及び単離に用いる特異的ヌクレオチドプローブ及びプライマーの設計が可能となる。したがって、本発明のある態様は、配列表に示した配列中で見られる配列又は配列表に示した配列から遺伝子コードの変質によって取り出した配列を有するヌクレオチドプローブ又はプライマーを提供するものである。
【００７８】
本出願で使用する「プローブ」という語は、上記定義のとおりストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３４の核酸分子、配列番号１〜３４の配列と相同な配列、又はそれらの相補配列若しくはアンチセンス配列とハイブリダイズするＤＮＡ（好ましくは一本鎖）又はＲＮＡ分子（若しくは修飾体又はその組み合わせ）を指す。一般的に、プローブは完全長配列と比べてかなり短いものである。そうしたプローブには約５〜１００個、好ましくは約１０〜８０個のヌクレオチドが含まれている。特に、プローブは、配列番号１〜３４に開示した配列のある部分に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％の相同性を有している配列、又はそうした配列に相補的な配列を有している。プローブには、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、又はジアミノ−２，６−プリンなどの修飾された塩基が含まれていてもよい。糖及びリン酸残基は、修飾又は置換が行われていてもよい。例えば、デオキシリボース残基がポリアミドに置換されていてもよく（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５４：１４９７）、リン酸残基が２リン酸エステル、アルキルエステル、アリールホスホン酸エステル、及びホスホロチオエートエステルなどのエステル基に置換されていてもよい。さらに、そうした基をアルキル基として含有させることにより、リボヌクレオチド上の２’−ヒドロキシル基を修飾してもよい。
【００７９】
本発明のプローブは、捕獲又は検出プローブとして、リポデプシペプチドを産生するとされる微生物の同定及び単離に用いられる。従来よりかかる捕獲プローブは、共有結合手段又は受動吸着によって、固体支持体上で直接的又は間接的に不動化されている。検出プローブは、放射性同位元素、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、発色性、蛍光発光性又は発光性の基質を加水分解できる酵素、発色性、蛍光発光性又は発光性の化合物、ヌクレオチド塩基類似体、及びビオチンから選択される検出マーカーで標識されている。
【００８０】
本発明のプローブは、ドットブロット（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９７５） ９８：５０３）、ノーザンブロット（ＲＮＡが標的として使用される以外はサザンブロットと全く同一）、サンドウィッチ法（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９７７） １２：２３）など従来のハイブリダイゼーション法で使用される。後者の方法では、特異的な捕獲プローブ及び／又は特異的な検出プローブを、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列とともに用いている。
【００８１】
プライマーは通常、約１０〜４０個のヌクレオチドであり、増幅工程（例えば、ＰＣＲ）において、伸長工程において、又は逆転写法において、酵素によるＤＮＡの重合を開始させるのに使用する。ＰＣＲを伴う診断法で使用されるプライマーの標識は、当業者に周知の方法で行われる。プライマーをプローブとして使用することもできる。
【００８２】
ここに記載したように、本発明は、（ｉ）リポデプシペプチドを産生するとされる微生物の検出及び／又は単離用の本発明のプローブを含む試薬、（ｉｉ）リポデプシペプチドを産生するとされる微生物の検出及び／又は単離方法であって、ＤＮＡ又はＲＮＡをかかる微生物から抽出して変性させ、ハイブリダイゼーションが検出されるようにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、例えば、捕獲プローブ、検出プローブ又はその両方などの本発明のプローブに曝露させる方法、（ｉｉｉ）リポデプシペプチドを産生するとされる微生物の検出及び／又は単離方法であって、（ａ）サンプルを回収する又は微生物から取り出す、（ｂ）それらからＤＮＡを抽出する、（ｃ）抽出したＤＮＡを少なくとも１つ、好ましくは２つの本発明のプライマーで初回刺激し、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅させ、（ｄ）増幅したＤＮＡ断片を作製することを特徴とする方法を含むものである。
［実施例］
【００８３】
実施例：下記の実施例は例示のためのものであり、クレーム記載の本発明を限定するものではない。
実施例１：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＴＣＣ３３０７６における、ラモプラニン生合成遺伝子座の同定。
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＴＣＣ３３０７６が、生物学的に活性を有するリポデプシペプチドの１群であるラモプラニンを自然に産生することは、以前からわかっていた（米国特許第４，３０３，６４６号）。この化合物の産生に関与する遺伝子座については、以前はわかっていなかった。ヴァーモント州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）よりＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＡＴＣＣ３３０７６を入手し、標準的な微生物学的技法にしたがって培養した（Ｋｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｎｏｒｗｉｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ， Ｃｏｌｎｅｙ， Ｎｏｒｗｉｃｈ ＮＲ４ ７ＵＨ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ２０００）。オートミール寒天プレートの周密した菌糸を用いて、文献（上記Ｋｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）記載のとおりゲノムＤＮＡを抽出し、電界反転法（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｆｉｅｌｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で得られたＤＮＡの大きさの範囲を、アガロースゲル上で製造者（ＦＩＧＥ、ＢｉｏＲａｄ）による記載のとおりに査定した。かかるＤＮＡは、大型の断片クラスター同定ライブラリー、すなわち大型挿入物ライブラリーだけではなく、小型の断片ゲノムサンプリングライブラリー、すなわち小型挿入物ライブラリーの調製にも役に立つ。どちらのライブラリーもゲノムＤＮＡからランダムに作製されたＤＮＡ断片を含有しているため、それらはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．の全ゲノムを表しているといえる。
【００８４】
小型挿入物ライブラリーを構築するために、超音波処理によってゲノムＤＮＡをランダムに切断した。標準的な分子生物学的技法を用いて、１．５〜３ｋｂの大きさを有するＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分画し、単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）。供給者の記載のとおりにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、得られたＤＮＡ断片の末端を修復した。この酵素は、その後のクローニングにより適切なベクターへの導入が可能な、平滑末端を有するＤＮＡ断片を作製する。修復したＤＮＡ断片を、クローン化したＤＮＡの転写を不可能にするｐＢｌｕｒｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の誘導体にサブクローンする。Ｔ３、Ｔ７、ＳＫ及びＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などの一般的なシーケンシングプライマーに相当する配列に囲まれた便利なポリリンカー領域を含んでいるため、このベクターが選択された。平滑末端ＤＮＡ断片の挿入が可能になることから、かかるポリリンカー領域中で見られる独特のＥｃｏＲＶ制限部位を使用した。かかる挿入物の結合、宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂの形質転換を目的とした結合産物の使用、組換えクローンの選択、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．のゲノムＤＮＡ断片を有するプラスミドの単離は、周知の方法で行われた（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）。アガロースゲル上での電気泳動により、挿入物の大きさが１．５〜３ｋｂであることを確認した。この手順を用いて、小型ランダムゲノムＤＮＡ断片のライブラリーを構築した。かかるライブラリーは、研究した微生物の全ゲノムを表すものである。作製可能な個々のクローンの数は無限であるが、かかる微生物のゲノムのサンプルを抽出するためにさらに分析するクローンの数は、ほんの少数である。
【００８５】
大型挿入物ライブラリーを構築するため、高頻度切断（ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃｕｔｔｉｎｇ）制限酵素のＳａｕ３Ａ（Ｇ｜ＡＴＣ）で、高分子量のゲノムＤＮＡを部分的に分解した。この酵素は、初期の未分解時の大きさのＤＮＡから、その長さがゲノム中の酵素ＤＮＡ認識部位の頻度及びＤＮＡ分解範囲の広さによって決まる短い断片にいたるまで、ＤＮＡのランダムな断片を作製する。平均で４０ｋｂまでの長さをもつＤＮＡ断片を作製する際の条件を選択した（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）。Ｓａｕ３Ａで制限したＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＣｏｓ−１コスミドクローニングベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）のＢａｍＨＩ部位に結合させ、供給業者の指定どおりにファージ粒子（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ ＸＬ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を宿主として用いて、コスミドを有する８６４個の組換えクローンを選択して増殖させ、大型挿入物ライブラリーを構築した。ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓのゲノムの大きさが平均で８Ｍｂであり、大型挿入物ライブラリーにおけるコスミドあたりのゲノム挿入物の大きさが平均で３５ｋｂであることを考えると、８６４個のクローンからなるライブラリーは、かかる微生物の全ゲノムの３．７８倍の範囲をカバーしていることになる。その後、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．大型挿入物ライブラリーを製造業者の指定どおりに膜フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ社製）上に移した。
【００８６】
クローン化ゲノムＤＮＡ挿入物の配列決定によって、小型挿入物ライブラリーを分析した。フォワード（Ｆ）プライマーと称する一般的なプライマーのＫＳ又はＴ７を使用して標識ＤＮＡの重合を開始した。ＴＦ、ＢＤＴｖ２．０シーケンシングキットを供給業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の指定どおりに使用すると、通常は、プライミング部位から少なくとも７００ｂｐの伸長が可能である。３７００ＡＢＩキャピラリー電気泳動法ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、作製された断片（ゲノム配列タグ、ＧＳＴ）の配列分析を行った。かかるＤＮＡ配列の平均長は〜７００ｂｐであった。各種タンパク質配列データベースとの配列相同性を比較して、得られたＧＳＴをさらに分析した。得られたＧＳＴのＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、文献（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．）記載のアルゴリズムを用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース及び占有的なエコピア天然産物生合成遺伝子データベースであるＤｅｃｉｐｈｅｒＴＭと比較した。データベースに存在する機能が明らかな既知のタンパク質との配列類似性により、翻訳されたＧＳＴにコードされる部分タンパク質の機能を予測することが可能となる。
【００８７】
合計で８８２個のＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＧＳＴを、配列比較によって分析した。配列のアラインメントが少なくともｅ−５というＥ値を示すと、その配列は有意な相同性を有していると見なされ、さらに評価を加えるために保存された。かかるＥ値は、観察されたアラインメントスコアと少なくとも同等のアラインメントスコアをもつチャンスアラインメントの予想数を表すものである。Ｅ値が０．００であれば、完全な相同体であることを示す。Ｅ値の計算は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｏｃｔｏｂｅｒ ５； ２１５ （３） ４０３−１０に記載のとおりに行う。かかるＥ値は、相同だと推測するのが正当とされるほど充分な類似性を、２つの配列が示しているかどうかを確認する際に役に立つ。
【００８８】
目的の遺伝子との類似性を示すＧＳＴをこの時点で選択して、目的の遺伝子を含むゲノムＤＮＡのより大型のセグメントの同定に用いることができる。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．が産生するラモプラニンは、非リボソームポリペプチド抗生物質ファミリーに属する。非リボソームポリペプチドは、アミノ酸の一連の縮合及び修飾を行う非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）により合成される。この酵素クラスのメンバーの多くがタンパク質データベースで見つかっており、これによって、配列の類似性から未知のＮＲＰＳを同定することが可能になっている。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．ＧＳＴの分析により、ＭＣＢＩ非冗長タンパク質データベース内の既知のＮＲＰＳタンパク質との類似性を有する３つのＧＳＴの存在が明らかになった（表１）。これらのＧＳＴがＮＲＰＳ配列を部分的にコードすることが、得られたＥ値によって確認された。オリゴヌクレオチドプローブを作製するためにかかる３つのＮＲＰＳのＧＳＴを選択し、次いで特異的なＮＲＰＳ遺伝子を大型挿入物ライブラリーに有する遺伝子クラスターの同定に該プローブを使用した。
【００８９】
【表１】
2006180882.tif 000002
【００９０】
選択したＧＳＴのヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチドプローブを設計し、放射能標識を行い、標準的な分子生物学的技法（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ）を用いて大型挿入物ライブラリーとハイブリダイズさせた。陽性クローンを同定し、コスミドＤＮＡを抽出し（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、ショットガンシーケンシング法（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：４９６−５１２）を使用して全体のシーケンシングを行った。オリゴヌクレオチドプローブを作製するのに使用した元のＧＳＴを、得られたコスミドのＤＮＡ配列内部で同定することにより、これらのコスミドが実際に目的の遺伝子クラスターを有していることを確認した。
【００９１】
Ｐｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐアルゴリズム（米国、シアトル、ワシントン大学）を用いて、作製した配列を組み立てて、コスミド挿入物の全ＤＮＡ配列を再作製した。元のコスミドの末端に由来するプローブを用いて大型挿入物ライブラリーのハイブリダイゼーションを繰り返すと、元のコスミド配列の両端にある配列情報を無限に拡張することができ、最終的には、目的の遺伝子クラスターを完全な形で得ることができる。この方法をＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．に応用し、上記ＮＲＰＳのＧＳＴプローブを用いると、６個のコスミドが得られた。得られた遺伝子クラスターが実際にラモプラニンの産生に関与していることが、これらのコスミドの完全な配列及びこれらがコードするタンパク質の分析によって、はっきりと示された。その後、約８８．５キロの塩基対からなるラモプラニン生合成クラスター配列を調べたところ、小型挿入物ライブラリーのＧＳＴがさらに３つ存在していることが判明し、ラモプラニン遺伝子座のＧＳＴの数は全部で６となった。
【００９２】
実施例２：ラモプラニンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質
ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｖｏｌ． ２５， ｐｐ．３３８９−３４０２）を用いて、各タンパク質をタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋデータベース（米国、メリーランド州、バテシバ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に存在するタンパク質とコンピュータで比較して、３２個のラモプラニン生合成タンパク質の生物学的機能を評価した。各タンパク質について、ラモプラニン遺伝子座におけるアミノ酸配列の相同性が有意であると判明したものを表２に示す。
【００９３】
【表２】
2006180882.tif 000003
2006180882.tif 000004
2006180882.tif 000005
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2006180882.tif 000009
【００９４】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムからのミコバクチン生合成遺伝子クラスターの同定によって実証されたように、大半のペプチド合成酵素における繰り返し単位の順序と、それぞれのアミノ酸がかかるペプチド産物に出現する順序との間の相関関係により、既知の構造を有するペプチドとその合成をコードする推定遺伝子とを相関させることができる（Ｑｕａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５， ｐｐ． ６３１−６４５）。ここではこの原則を利用して、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに図示したように、本発明に記載されているラモプラニンペプチド合成酵素の各繰り返し単位に、生合成における役割を割り当ててきた。アミノ酸レベルにおける各ＯＲＦの繰り返し単位（モジュール）のドメインのおおよその境界線を、表３にまとめておく。表中、Ｃは縮合ドメインを、Ａはアデニル化ドメインを、Ｔはチオール化ドメインを、Ｔｅはチオエステラーゼドメインを表す。
【００９５】
【表３】
2006180882.tif 000010
【００９６】
Ａ．リポデプシペプチドコア構造の形成
ＯＲＦ９、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２６及び２７（配列番号１０、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２７及び２８）にコードされる９個のタンパク質は、ラモプラニンのリポデプシペプチドコア構造の形成に関与しているようである。ＯＲＦ１１、１２、１３、１４及び１７（配列番号１２、１３、１４、１５及び１８）は、ペプチド合成酵素又はペプチド合成酵素ドメインに対して有意な類似性を示している。これらのＯＲＦで見られるアデニル化ドメインの分析により、各単位により組み込まれたアミノ酸の同定が可能になる（図３Ａ及び３Ｂを参照のこと）。以下のアミノ酸の特異性は、これらを比較した結果と一致している。ＯＲＦ１２：アスパラギン（Ａｓｎ）；ＯＲＦ１３、モジュール１：４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）；ＯＲＦ１３、モジュール２：オルニチン（Ｏｒｎ）；ＯＲＦ１３、モジュール３：トレオニン（Ｔｈｒ）；ＯＲＦ１３、モジュール４：ＨＰＧ；ＯＲＦ１３、モジュール５：ＨＰＧ；ＯＲＦ１３、モジュール６はアデニル化ドメインを含まない；ＯＲＦ１３、モジュール７：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；ＯＲＦ１４、モジュール１：Ｏｒｎ；ＯＲＦ１４、モジュール２：ＨＰＧ；ＯＲＦ１４、モジュール３：Ｔｈｒ；ＯＲＦ１４、モジュール４：ＨＰＧ；ＯＲＦ１４、モジュール５：グリシン（Ｇｌｙ）；ＯＲＦ１４、モジュール６：ロイシン（Ｌｅｕ）；ＯＲＦ１４、モジュール７：未特定；ＯＲＦ１４、モジュール８：ＨＰＧ；ＯＲＦ１７、トレオニン（Ｔｈｒ）。かかるペプチド合成酵素繰り返し単位の数及び予想されたアミノ酸基質の特異性は、ラモプラニンペプチドコア構造と正確に一致しており、ここに記載した遺伝子座がラモプラニン生合成に関与している決定的な証拠となっている。
【００９７】
アデニル化ドメインのアミノ酸特異性は、突然変異誘発（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． ４９３−５０５； Ｃｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２０００， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２１１−２２４）又はペプチド合成酵素間でのドメイン交換（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ２６９， ｐｐ． ４８２−４８５； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｖｏｌ． ２５７， ｐｐ． ３０８−３１８； ｄｅ Ｆｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２７２， ｐｐ． ２５３０４−２５３０９）によって変化する場合があり、これによって天然ペプチド産物の誘導体が生じる。
【００９８】
ラモプラニンペプチド合成酵素中の繰り返し単位の特異性と順序を、ラモプラニン中のアミノ酸置換基の順序と比較することにより、ラモプラニンペプチドコア構造の生合成モデルを構築することができる（図２Ａ及び２Ｃに図示）。ＯＲＦ１２（配列番号１３）が含んでいるのはＡｓｎを特定するアデニル化ドメインのみであり、それゆえに、最初の２つ（Ａｓｎ）のアミノ酸残基をペプチド鎖に組み込む際の触媒となる場合がある。その後のアミノ酸は、隣接しているＯＲＦ１３及び１４（配列番号１４及び１５）中で各単位が生じる正確な順序にしたがって組み込まれていく。ペプチド合成酵素単位と、アミノ酸がラモプラニンに組み込まれる順序との間に共直線性が失われるのは、ＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール６だけである。このモジュールは、縮合ドメインとチオール化ドメインを含んでいるが、アデニル化ドメインを欠いている。ラモプラニンの構造から、Ｔｈｒはペプチド鎖のこの位置に組み込まれなくてはならないことがわかる。ＯＲＦ１７（配列番号１８）は、Ｔｈｒに特異的なアデニル化ドメインを有する、例外的なペプチド合成酵素単位をコードするが、従来の縮合ドメインを欠いている。図２Ａに示したモデルによると、ＯＲＦ１７（配列番号１８）タンパク質はＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール６と相互作用し、このモジュールに欠けているアデニル化ドメインを置換する。このようにして、成長中のラモプラニンペプチド前駆体の適切な位置にＴｈｒを組み込む際の触媒となるのである。ペプチド合成酵素単位間のかかるｔｒａｎｓ相互作用は、リポデプシペプチド抗生物質シリンゴマイシンの生合成に前例が見られる。シリンゴマイシン系においては、縮合ドメインを欠いているＳｙｒＢ１タンパク質のアデニル化ドメインが、縮合ドメインは含んでいるがアデニル化ドメインを欠いているＳｙｒＥ１ペプチド合成酵素単位の活性と相互作用し、かつかかる活性を補っているとされている（Ｇｕｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２７３， ｐｐ． ３２８５７−３２８６３）。
【００９９】
ＯＲＦ１２（配列番号１３）にコードされるペプチド合成酵素は、タンパク質のＮ−末端に縮合ドメインを有しており、出発単位としては例外的といえる。これまで記載されたペプチド合成酵素出発単位の大半は、ペプチド産物に組み込まれる第一アミノ酸（「出発」アミノ酸）の活性化に関与するアデニル化ドメインをＮ−末端に含んでいる。これに対して、ＯＲＦ１２（配列番号１３）にてコードされているラモプラニン出発単位は、タンパク質のＮ−末端に縮合ドメインを含んでおり、これは、ペプチド合成が例外的な方法で開始される可能性があることを示している。ラモプラニンペプチドのＮ−末端は、３つの候補脂肪酸基のうちの１つにより修飾されるが、このことは、ラモプラニンペプチドの構築が、アミノ酸よりもむしろ脂肪酸から始まることを示している。脂肪酸を出発基とする鎖開始機構の予想図を、図２Ｂに示す。このモデルによると、ＯＲＦ１２（配列番号１３）のＮ−末端の縮合ドメインは、モジュール１に結合しているアミノ酸１（Ａｓｎ）と、ＯＲＦ１１（配列番号１２）にコードされるアシル運搬体タンパク質に結合している脂肪酸とがアミド結合の生成によって結合する際に触媒作用を及ぼし、これによって、鎖をさらに伸長させるための「アシル−Ｎが付いた」アミノ酸中間産物が生じる。
【０１００】
ＯＲＦ１１及び２６（配列番号１２及び２７）は、脂肪酸前駆体の活性化及びＯＲＦ１２（配列番号１３）ペプチド合成酵素への輸送に関して、協調して作用するとされている。ＯＲＦ２６（配列番号２７）は、活性化したアデニル酸中間産物を介して脂肪酸の活性化に触媒作用を及ぼす酵素のアデニル酸形成スーパーファミリーのタンパク質である、アシル−ＣｏＡリガーゼに対する類似性を示している。ＯＲＦ１１（配列番号１２）は、活性化アデニル酸中間産物を受け取るペプチド合成酵素チオール化ドメイン及びアシル運搬体タンパク質に類似性を示している。図２Ｂに示したように、これら２つのＯＲＦの活性により、ラモプラニンリポペプチドコア構造合成用の開始基として作用する活性化脂肪酸チオエステルが生じる場合がある。他の脂肪酸を有するラモプラニン誘導体を作製するため、ＯＲＦ２６（配列番号２７）を単独で、又はＯＲＦ１２（配列番号１３）の縮合ドメインとともに、置換したり、突然変異させたりする場合がある。
【０１０１】
大半のペプチド合成酵素中の最終単位は、産物の放出に関与するとされる、特別なＣ−末端チオエステラーゼドメインを含んでいる。完全なペプチド産物をペプチド合成酵素から放出するには、一般にペプチド合成酵素のＣ−末端で見られるチオエステラーゼの機能が必要となる。ＯＲＦ１４（配列番号１５）はＣ−末端のチオエステラーゼドメインを含んでおり、Ｃ−末端ＨＰＧのカルボン酸基とＨＡｓｎのヒドロキシル基との間にエステル結合が形成される際に触媒となることで、ペプチド放出及び環化に関与することがあり、その結果、遊離環状デプシペプチド構造が生じる。ＯＲＦ１５（配列番号１６）も、ペプチド放出及び／又は環化に関与することがある。チオエステラーゼは、ペプチド合成酵素と頻繁に会合することがわかっており、ペプチド産物又は中間産物の放出に関与するとされており、かつ、ラモプラニンペプチドの放出及び／又は環化に関与することもあるが、ＯＲＦ１５（配列番号１６）は、そうしたチオエステラーゼに対して強い類似性を示す。ＯＲＦ９（配列番号１０）はα／β加水分解酵素折り畳みファミリーのエステラーゼと類似しており、ペプチド放出に関与する場合もある。
【０１０２】
ＯＲＦ２７（配列番号２８）は、ペプチド合成酵素遺伝子と頻繁に会合することがわかっているためペプチド生合成においてある役割を果たしていると思われている遺伝子によってコードされる、いくつかの小型保存タンパク質に対して強い類似性を示している。
【０１０３】
Ｂ．Ｌアミノ酸の、対応するＤアミノ酸へのエピマー化
ラモプラニンペプチド合成酵素の予想外の特徴は、繰り返し単位中にエピマー化ドメインが存在しないことである。エピマー化ドメインは、Ｌアミノ酸を対応するＤアミノ酸に変換する際の触媒となる。ラモプラニンには、Ｄアミノ酸単位が７つある。Ｄアミノ酸を組み込む細菌性ペプチド合成酵素の多くは、まず対応するＬアミノ酸を認識して組み込み、次いで、エピマー化ドメインの活性を通じてその立体配置をＤアミノ酸の形に変えることにより、Ｄアミノ酸の組み込みを行っている。最終的な天然産物中にＤアミノ酸が存在しているにもかかわらず、ラモプラニンペプチド合成酵素にエピマー化ドメインが欠如しているのは、ＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール１、２、３及び５、並びにＯＲＦ１４（配列番号１５）のモジュール１、３及び７で見られるアデニル化ドメインが、Ｄアミノ酸を特異的に認識するためかもしれない。ペプチド合成酵素によるＤアミノ酸の直接的な認識及び組み込みが想定されているのは、真核シクロスポリン及びＨＣトキシンペプチド合成酵素である（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ Ｖｏｌ． ２６， ｐｐ． １２０−１２５； Ｓｃｏｔｔ−Ｃｒａｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２６７， ｐｐ． ２６０４４−２６０４９）。
【０１０４】
他に、細胞アミノ酸エピメラーゼ／一次又は二次代謝物のエピメラーゼがエピマー化の触媒となる場合があるが、このことは、グラミシジン及びチロシジン系へのＤバリンの組み込みでも提起されている（Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ３４， ｐｐ． ７４５０−７４５９； Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ３４， ｐｐ． ４６３３−４６４２）。
【０１０５】
また、その他に、ＮＲＰＳ中の特定のドメインが２つの機能を働かせる能力を進化させたとも考えられる。そのような２の機能をもつ候補として傑出している１つのドメインは、縮合ドメインである。通常は、Ｄアミノ酸をペプチド産物内に導入する典型的なＮＲＰＳモジュール内にあり、チオール化（Ｔ）ドメインの後にエピマー化（Ｅ）ドメインが続いている。ＮＲＰＳ酵素上で線状ドメインを構成する場合には、縮合（Ｃ）ドメインとエピマー化（Ｅ）ドメインが同等の位置を占めると考えられる。すなわち、多数のモジュールを有し、Ｅドメインを欠いているＮＲＰＳにおいては、どのモジュールのＣドメインもその上流モジュールのチオール化（Ｔ）ドメインのすぐ隣に存在する。また、ＣドメインとＥドメインは、配列の相同性がかなり高い。よく保存されたコアモチーフのいくつかは、ＣドメインとＥドメインの間で共有されている。ＣドメインとＥドメインに共通する特に重要な１つのモチーフはヒスチジンモチーフＨＨＸＸＸＤＧであり、これは、活性化部位の一部を形成するための突然変異誘発によって示される（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８； ２７３：２２７７３−２２７８１）。したがって、ＯＲＦ１３（配列番号１４）のモジュール２、３、４及び６並びにＯＲＦ１４（配列番号１５）のモジュール２、４及び８のＣドメインは、アミド結合生成のみならずアミノ酸エピマー化も可能であり、ラモプラニンで見られる７−Ｄアミノ酸残基に関与しているのかもしれない。
【０１０６】
Ｃ．脂肪酸側鎖の形成
ラモプラニンデプシペプチドコア構造は、１位のＡｓｎのＮ−末端に付着する３つの異なる中鎖脂肪酸の１つを有する場合があり、その結果、３つの異なるラモプラニン構成要素Ａ１〜Ａ３が生じる。オクタ−２，４−ジエン酸（Ｃ８脂肪酸）、並びにその類似体である７−メチルオクタ−２，４−ジエン酸（Ｃ９）及び８−メチルオクタ−２，４−ジエン酸（Ｃ１０）という３つの不飽和脂肪酸前駆体が、何を起源として生合成されるのかについては、ほとんどわかっていない。これらの中鎖脂肪酸は、より長い鎖の脂肪酸からβ酸化的分解反応により生じるのかもしれない。オクタ−２，４−ジエン酸部分を有する構成要素Ａ２の産生は、産生する生物の発酵培地にアミノ酸ロイシンを添加することによって増量可能であることがわかっており、このことは、分岐鎖アミノ酸も、ラモプラニンの脂肪酸側鎖に対する生合成前駆体として役に立つ場合があることを示している（欧州特許第２５９７８０号）。ラモプラニン遺伝子座にコードされる３つのタンパク質、すなわちＯＲＦ１６、２４及び２５（配列番号１７、２５及び２６）は、脂肪酸代謝に関連する酵素に対して類似性を示しており、そのため、ラモプラニンのデプシペプチドコア構造に付着させるための脂肪酸側鎖の作製に関与している場合がある。ＯＲＦ２４及び２５（配列番号２５及び２６）は、お互いに対して、また、脂肪酸の分解及びロイシンの脂肪酸中間産物への分解に関与する酵素である、フラビン依存性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに対して、類似性が高い。これらのＯＲＦは、分岐鎖アミノ酸及び脂肪酸中間産物をラモプラニン生合成経路へ運ぶチャネルとなる場合がある。さらに、ＯＲＦ２４及び２５（配列番号２５及び２６）のデヒドロゲナーゼ活性は、ラモプラニンの不飽和脂肪酸基で見られる２つの二重結合の形成に関与している場合がある。ＯＲＦ１６（配列番号１７）もまた、同じく脂肪酸の分解に関与している一次代謝物のＮＡＤ依存性酵素である３−オキソアシル−アシル運搬体タンパク質レダクターゼに対して、強い類似性を示していることから、ラモプラニンの脂肪酸基の形成に関与しているのではないかと思われる。
【０１０７】
Ｄ．アミノ酸４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）合成
ラモプロニン遺伝子座がコードする５つのタンパク質、すなわち、ＯＲＦ４、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ２８及びＯＲＦ３０（配列番号５、７、８、２９及び３１）は、ラモプラニンのリポデプシペプチドコア構造への組み込みに関して基質として働く例外的なアミノ酸である４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）の合成に関与していると考えられる。二次代謝物においてＨＰＧが自然発生することは比較的少なく、最も著名な例としては、ノカルジシンＡ、バンコマイシン、アリジシン、クロロエレモマイシン、テイコプラニン及び関連するグリコペプチド抗生物質である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）、及びラモプラニンがある。生化学的研究により、抗生物質であるバンコマイシン、アリジシン、及びノカルジシンのＨＰＧ残基は、共通のアミノ酸であるチロシンに由来することがわかっており、チロシンからＨＰＧを合成する経路の存在が提起されている（Ｎｉｃａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， １９９７， ｐｐ． ３６３−３９２及び文中の参考文献； Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｖｏｌ． １９８６， ｐｐ． ６４２−６５１； Ｈｏｓｏｄａ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ４１， ｐｐ． １００７−１０１２； Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．）， Ｖｏｌ． １９８２， ｐｐ． ３４４−３４６）。しかし、図４に示すように、ラモプラニン生合成遺伝子座がコードするＯＲＦを分析したところ、別の経路の存在が実証されている。ＯＲＦ４、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ２８及びＯＲＦ３０（配列番号５、７、２９、及び３１）の活性を組み合わせると、チロシン代謝中間産物を例外的なアミノ酸であるＨＰＧに変換することができる。ＯＲＦ４、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７及びＯＲＦ３０（配列番号５、７、８及び３１）に対して類似性を示すタンパク質は、同じくＨＰＧ置換基を有する２つの天然産物であるＣＤＡ及びクロロエレモマイシンをコードする生合成遺伝子座で見られるが、それぞれの天然産物の生合成に関するこれらのタンパク質の役割については提案されていない（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ０３５６４０、ＡＬ０３５７０７及びＡＬ０３５６５４；ｖａｎ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５， ｐｐ． １５５−１６２）。
【０１０８】
Ｅ．耐性及び／又は局在タンパク質
ラモプラニン遺伝子座がコードする８つのタンパク質（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ８、ＯＲＦ１９、ＯＲＦ２３、ＯＲＦ２９及びＯＲＦ３１）は、ラモプラニン生合成機構の耐性及び／又は細胞内局在に関与する膜関連タンパク質であると思われる。ＯＲＦ２、８及び２３（配列番号３、９及び２４）は、標的特異的分泌に関与するＡＴＰ結合カセットトランスポートタンパク質のスーパーファミリーに対して類似性を示しており、ラモプラニン又は生合成前駆体の、細胞膜を越えてのトランスポートに関与していると考えられる。このことから、抗生物質の毒性作用に対する耐性又はラモプラニン産生量の増加に関する機構の存在が示唆される。ＯＲＦ３１（配列番号３２）は、各種ナトリウム／プロトン及び薬剤／プロトン交互輸送機構に対して類似性を示し、また、細胞膜を越えてラモプラニンをトランスポートする手段を提供する場合がある。ＯＲＦ１、３、１９及び２９（配列番号２、４及び２０）は、未知の機能を有する各種膜貫通タンパク質に対して類似性を示しており、脂質及び脂肪酸前駆体への進入路を提供するためにラモプラニン生合成機構を細胞膜に局在させることに関与している場合がある。
【０１０９】
Ｆ．ラモプラニン生合成制御に関与するタンパク質
ラモプラニン遺伝子座がコードする３つのタンパク質、すなわちＯＲＦ５、ＯＲＦ２１、ＯＲＦ２２は、ラモプラニン生合成の制御に関与すると思われる。ＯＲＦ５（配列番号６）は、抗生物質の生合成における多数の転写制御因子に対して類似性を示している。このタンパク質は、ラモプラニン遺伝子座の１つ以上の遺伝子の転写を制御しているようである。ＯＲＦ２１及びＯＲＦ２２（配列番号２２及び２３）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの抗生物質合成の全面的制御に関与しているＡｂｓＡ１／Ａ２系などの２成分シグナル伝達系に対して、相同性を示している。これらのＯＲＦは協調して作用し、環境シグナル又は細胞シグナルに応答したラモプラニン生合成遺伝子の発現やラモプラニンの生産を制御しているのかもしれない。
【０１１０】
Ｇ．末端ＨＰＧ残基の塩素化
ＯＲＦ２０（配列番号２１）は、ピロルニトリン生合成の芳香族前駆体の塩素化に関与するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＰｒｎＣハロゲナーゼをはじめとする、二次代謝物の塩素化に関与するハロゲナーゼ、及びクロロエレモマイシン中のチロシン残基の塩素化に関与するとされるハロゲナーゼに対して、類似性を示す。このタンパク質は、ラモプラニンペプチドコアに組み込まれた末端ＨＰＧ残基の塩素化の触媒となると考えられ、それにより３−クロロ−ＨＰＧという形態が生じる。
【０１１１】
Ｈ．β−ヒドロキシアスパラギン残基の形成
米国特許出願番号第６０／２８３，２９６号に開示されているように、ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、金属補助因子ヒドロキシラーゼ酵素の新しいファミリーの一員である。β−ヒドロキシアスパラギンの作製に必要なβ−ヒドロキシル化反応にはシトクロムＰ４５０酵素が関わっていると予想されていたため、これは驚くべき発見であった。
【０１１２】
アミノ酸残基をβ−ヒドロキシル化する新しい機構がラモプラニンの生合成で作動しているという可能性は、ＢＬＡＳＴＰ分析の結果、ラモプラニン生合成遺伝子座にコードされるＯＲＦで、既知のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに対して有意なアミノ酸配列の相同性を示すものが皆無であったという事実によって最初に示唆された。当初は、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１８及びＯＲＦ３２（配列番号１１、１９及び３３）に対してラモプラニン生合成における推定的な役割を割り当てることができず、それらはアスパラギンβ−ヒドロキシラーゼの候補と考えられていた。ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓのブレオマイシン生合成遺伝子座における未知の機能を有するタンパク質及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの推定クロラムフェニコール生合成遺伝子座で見られる未知の機能を有する部分タンパク質に対して相同性を示している。ブレオマイシンとクロラムフェニコールもβ−ヒドロキシル化アミノ酸残基を含んでいることに注目すべきである。ＯＲＦ１８（配列番号１９）が、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中のタンパク質に対して全く類似性を示していないのに対し、ＯＲＦ３２（配列番号３３）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中の未知の機能を有する仮想細菌性タンパク質に類似性を示している。ヒドロキシル化反応の触媒となる酵素は、金属補助酵素を利用する場合が多いため、ＯＲＦ１０、１８及び３２（配列番号１１、１９及び３３）をさらに分析して金属補助酵素の結合に関連するアミノ酸モチーフの有無を調べた。
【０１１３】
図５は、ＯＲＦ１１（配列番号１２）と各種金属リガンドモチーフとの配列相同性を示すクラスタルアラインメントを図示している。各クラスタルアラインメントにおいて、（ｉ）アラインメントの上の線は、保存性の高い位置を示すのに使用されている、（ｉｉ）アスタリスク「＊」は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示している、（ｉｉｉ）コロン「：」は、ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ及びＦＹＷという強い基のうちの１つが完全に保存されていることを示している、（ｉｖ）ピリオド「．」は、ＣＳＡ，ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ及びＨＦＹという弱い基のうちの１つが完全に保存されていることを示している。
【０１１４】
ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、金属補助因子を使用する酵素でよく見られる２つのアミノ酸配列モチーフを含んでいる。ＯＲＦ１０（配列番号１１）のＮ−末端領域は、いくつかの亜鉛結合性β−ラクタマーゼで見られる保存されたヒスチジンモチーフに対して有意な局所的配列相同性を示すヒスチジン残基のクラスター（Ｈｉｓモチーフ）を含んでいる。図５Ａは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）と、β−ラクタマーゼスーパーファミリーにおける２つの亜鉛分子の協調に関与している重要なモチーフとの間の局所的アミノ酸配列相同性を示している。かかるアラインメントは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）のアミノ酸２６３〜３１８、β−ラクタマーゼスーパーファミリーのメンバーのアミノ酸４２〜９９、結晶構造を確認したＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ由来のＬ１メタロ−β−ラクタマーゼ（１ＳＭＬ）（Ｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、及びｐｆａｍ００７５３のコンセンサス配列のアミノ酸１２〜６７、すなわちβ−ラクタマーゼスーパーファミリーモチーフについて示している（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。黒で強調したのは、亜鉛と協調することがＬ１メタロ−β−ラクタマーゼで示された残基及び他の２つの配列におけるその対応物である。Ｘ線による結晶構造分析で、この保存されたモチーフ中のヒスチジン残基が、亜鉛金属補助因子の結合に関与していることが示された（Ｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＯＲＦ１０（配列番号１１）のＨｉｓモチーフにおけるアミノ酸残基の正確なアラインメント及び保存された間隔を亜鉛結合β−ラクタマーゼと比較したところ、ＯＲＦ１０（配列番号１１）は金属補助因子を結合すると思われる。
【０１１５】
図５Ｂは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）と、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにおいて鉄分子の協調に関与している重要なモチーフとの間の局所的アミノ酸配列相同性を示している。かかるアラインメントは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）のアミノ酸４０５〜４５２、及び及びｐｆａｍ０００６７のコンセンサス配列のアミノ酸３７０〜４２１、すなわちシトクロムＰ４５０モチーフについて示している（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。強調してあるＯＲＦ１０（配列番号１１）の領域は、鉄の結合に必要なＰｒｏｓｉｔｅモチーフＰＳ０００８６（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）と比較的よく一致している：［ＦＷ］−［ＳＧＮＨ］−ｘ−［ＧＤ］−ｘ−［ＲＨＰＴ］−ｘ−Ｃ−［ＬＩＶＭＦＡＰ］−［ＧＡＤ］、式中、ｘはどのアミノ酸でもよく、括弧内のアミノ酸は、所定の位置における可変性を示す。特に、このモチーフにおいて最も可変性の少ない位置は、ＯＲＦ１０（配列番号１１）、すなわち、Ｐｈｅ残基４２３、Ｇｌｙ残基４２５、Ｃｙｓ残基４２８、及びＧｌｙ残基４３０にある。ＯＲＦ１０（配列番号１１）のＣ−末端領域には、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼでよく見られるモチーフ（Ｃｙｓモチーフ）に対して有意な局所的配列相同性を示しているアミノ酸残基のクラスターが含まれている。このモチーフは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ中によく保存され、かつ、触媒作用に必要な鉄金属補助因子の結合に関与していることがＸ線結晶構造分析によってわかっているシステイン残基を含んでいる。ＯＲＦ１０（配列番号１１）のＣｙｓモチーフは、金属補助因子の結合に寄与していると思われる。周知の特徴を有する金属結合酵素で見られる２つのアミノ酸配列モチーフの存在は、ＯＲＦ１０（配列番号１１）が金属結合酵素である可能性を示唆している。したがって、ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、ラモプラニン合成過程におけるβ−ヒドロキシアスパラギンの形成に関与していると考えられる。
【０１１６】
実施例３：発現分析
Ａ−アシル出発単位鎖開始
ラモプラニンＮＲＰＳ系の鎖開始に対するアシル出発単位鎖の関与について調べるため、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、及びＯＲＦ２６（配列番号１２〜１４）を個別にＰＣＲで増殖した。その際には、１０個の連続的ヒスチジンタグをＮ−末端に導入したのに加えて便利な制限酵素部位を各ＯＲＦの両端に導入したオリゴヌクレオチドプライマー対を使用した。これらの組換えＮ−末端ＨＩＳ１０標識ＯＲＦを、大腸菌発現ベクターにサブクローンし、結果として得られたプラスミドを大腸菌に導入し、その後、組換えＯＲＦが高レベルで発現するような条件下で増殖させた。細胞をペレット状にして分離させ、組換えＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、及びＯＲＦ２６（配列番号１２、１３及び２７）タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＯＲＦ１１及びＯＲＦ２６（配列番号１２及び２７）タンパク質は、可溶性タンパク質調製物として即座に得られるが、サイズが大きいためか、ＯＲＦ２６（配列番号２７）の可溶性は低い。
【０１１７】
配列の相同性に基づいて、ＯＲＦ１１（配列番号１２）はアシル又はアミノアシル運搬体タンパク質であると予測されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでの測定で、補助酵素Ａの４’−ホスホパンテテイン部分の添加分に相当する質量の増加が認められたことからわかるように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の精製Ｓｆｐ及び補助酵素Ａを利用して、精製組換えＯＲＦ１１（配列番号１２）タンパク質を初回刺激してインビトロでホロ型とすることができる。組換えＯＲＦ１１には不活性のアポ型から活性ホロ型へと変換するこのような翻訳後修飾が生じやすいという事実は、これが実際にアシル又はアミノアシル運搬体タンパク質であることを確認するものである。
【０１１８】
可溶性組換えＯＲＦ２６と可溶性ホロ型ＯＲＦ１１（上記）とを併用できれば、短鎖脂肪酸をホロ型ＯＲＦ１１に移す際のＯＲＦ２６の役割を確認する手段が得られる。基質として１４Ｃ放射能標識長鎖脂肪酸パルミチン酸（ｐａｌｍｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を使用する実験では、結論が出なかった。こうした知見は、１６個の炭素原子を有するパルミチン酸などの長鎖飽和脂肪酸よりも、ラモプラニンで見られる８〜１０個の炭素原子を有する３つの不飽和脂肪酸などの短鎖脂肪酸に対して、ＯＲＦ２６が特異的であるという仮説と一致している。ラモプラニンペプチドのアミノ末端に自然に結合しているのが認められる脂肪アシル基を合成して、基質特異性をさらに調べている。
【０１１９】
Ｂ−β−ヒドロキシアスパラギン
β−ヒドロキシラーゼとしてのＯＲＦ１０（配列番号１１）の特徴及びβ位置でのアスパラギンのヒドロキシル化におけるＯＲＦ１０（配列番号１１）の役割を確認するため、ＯＲＦ１１、１２、及び２６（配列番号１２、１３及び２７）用に組換えＮ−末端Ｈｉｓ１０標識ＯＲＦ１０大腸菌発現系を上記のとおり設計した。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性の精製組換えＯＲＦ１０（配列番号１１）タンパク質を得た。精製組換えタンパク質がヘム含有酵素に特徴的な吸収スペクトルを示さないという事実は、ＯＲＦ１０（配列番号１１）がＰ４５０酵素ではないことを示している。したがって、上述したＯＲＦ１０（配列番号１１）金属結合モチーフは、非ヘム鉄又は鉄以外の金属と協調している。
【０１２０】
未変性ＯＲＦ１０（配列番号１１）の別の供給源として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ発現系を使用した。２つの特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマー配列（５’〜３’）Ｎ−オリゴ：ＣＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＴＣＧＣＧＣＴＴ、及びＣ−オリゴ：ＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＣＧを使用して、ＯＲＦ１０（配列番号１１）を高性能ＰＣＲで増幅した。このプライマー対は、ＯＲＦ１０遺伝子の両端に便利な制限酵素部位を導入するが、外来性のアミノ酸は導入しない。その後、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて、かかる増幅した遺伝子を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ／大腸菌発現シャトルベクターであるｐＥＣＯ１２０２にサブクローンした。クローニングを行った配列を確認したところ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２４がこのコンストラクトで形質転換されていた。個別の形質転換体を５つ選択し、さらに分析した。５ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ社製）を入れた容量２５ｍｌの三角フラスコを用いて、旋回する３０℃のインキュベーター中で、培養物を４８時間増殖させた。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの完全性及び濃度をアガロースゲル電気泳動でモニターした。その後、ベクター中でストップコドンのすぐ下流に位置するアンチセンスプライマー配列で初回刺激を行った全ＲＮＡ１ｕｇを用いて、逆転写を行った。続いて、各サンプル及び適切なコントロールの逆転写のため、本来のＯＲＦ特異的オリゴヌクレオチド、Ｎ−オリゴ及びＣ−オリゴを使用して、２０サイクルのＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析によると、５つの組換えＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓクローンは比較的高いレベルのＯＲＦ１０特異的ｍＲＮＡを発現しており、ＲＴ−ＰＣＲ産物の大きさは予想どおりであった。図６は、ラモプラニンＯＲＦ１０を発現している組換えＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓクローンのＲＴ−ＰＣＲ分析であり、図中、レーン１は１ｋｂのＤＮＡラダー；レーン２は形質転換を行っていないＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ；レーン３は空の発現ベクターで形質転換を行ったＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ；レーン４〜８は、ラモプラニンＯＲＦを発現している５つの異なるＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ組換えクローン；レーン９は関連性のない遺伝子を発現しているＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ組換えクローン；レーン１０は、ＲＮＡを用いずに処理を行ったネガティブコントロール；レーン１１は、ＲＴを用いずに処理を行ったネガティブコントロール；レーン１２はプラスミドＤＮＡを用いたＰＣＲのポジティブコントロールである。
【０１２１】
これらの組換え株が実際に予想されるＯＲＦ１０を生成しているのかを確認するため、タンパク質溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。すなわち、上記培養物の細胞ペレットを冷却抽出緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁し、氷上で２０秒間の超音波処理を１分間隔で４回行った。２０，０００×ｇで１０分間の遠心分離を行って、可溶性タンパク質を回収し、ブラッドフォード試薬（Ｂｉｏｒａｄ社製）で全タンパク質濃度を測定した。等量の全可溶性タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色して視覚化した。
【０１２２】
図７に示したように、検査した４つの組換え株は、見たところ、移動度が約６０キロダルトンのタンパク質を大量に含んでおり、これは、ＯＲＦ１０タンパク質の予想分子量である５８９１６．８０キロダルトンとも一致する。図７は、ラモプラニンＯＲＦ１０（配列番号１１）を発現している組換えＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。タンパク質溶解液の可溶性画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけ、クーマシーブルーで染色した。レーン１は分子量標準物で、大きさは左側にキロダルトンで示してある；レーン２は形質転換を行っていないＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ；レーン３は空の発現ベクターで形質転換を行ったＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ；レーン４〜７は、ラモプラニンＯＲＦ（配列番号１１）を発現している４つの異なるＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓ組換えクローンである。レーン４〜７では、右側に矢頭で記したとおり、約６０ｋＤａのＯＲＦ１０遺伝子産物がはっきりと認められる。
【０１２３】
ここに記載した実施形態は例示のみを目的とするものであること、及び、これらの実施形態を踏まえた各種修正や変更は、当業者であれば思いつくことであって、本出願の範囲及び後述のクレームの範囲に含まれるべきであることを理解すべきである。あらゆる刊行物、特許、特許出願、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びここで触れたその他のデータベースより引用した配列は、あらゆる目的に使用できるように完全な形でここに参照として組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
本発明の多様な実施形態を、添付の図面を参照して説明する。
【図１】図１はラモプラニン生合成遺伝子座の図式であり、ｋｂを単位とするスケール、３２個のＯＲＦの相対的位置及び配置、及び寄託したコスミドがカバーする範囲を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ラモプラニン生合成モデルである。ラモプラニンペプチド合成酵素の連続モジュールの共同活性を通じて、ラモプラニン鎖が段階的に組み立てられている。各モジュールのドメインは、図のように、円形及び楕円形の印で示されている。Ｒは、ラモプラニンペプチドに組み込まれた最初のアミノ酸（Ａｓｎ）のＮ−末端を覆う脂肪アシル基を示す（図２Ｂ参照）。ＯＲＦ１２がＡｓｎを認識し、ラモプラニンペプチドにあるＡｓｎ残基を両方とも組み込むとされていることに注意すべきである。２つ目のＡｓｎ残基のヒドロキシル基化は、かかるアミノ酸の認識及び活性化の前後に生じるのかもしれない。太い点線の矢印は、ＯＲＦ１７タンパク質がＯＲＦ１３産物のモジュール６と相互作用し、適切な位置へＴｈｒを組み込む際の触媒となることを示している。細い点線は、β−ヒドロキシアスパラギン残基の側鎖ヒドロキシル基が、ラモプラニン産物とＯＲＦ１４のモジュール８とを連結するチオエステル結合に求核攻撃を受け、その結果、かかるペプチド産物が環状化し、放出されることを示している。略語：ＨＡｓｎ、β−ヒドロキシアスパラギン。その他の略語は文中に示したとおりである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、脂肪酸開始基（ｓｔａｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）を用いたラモプラニンペプチド合成の開始モデルである。ＯＲＦ１１及びＯＲＦ１２は、開始単位として協調して作用を及ぼすとされており、脂肪酸基を用いて、ペプチド鎖組み立て部分を初回刺激する。印は図２Ａと同様である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ラモプラニンの構造を図示するものである。アミノ酸置換基の位置、及びアシルアミド部分が８炭素脂肪酸（Ｒ）に由来している実施形態が示されている。別の脂肪アシル鎖もこの位置に組み込まれている場合がある。
【図３Ａ】図３Ａは、ラモプラニン生合成酵素のアデニル化ドメインのクラスタル分析（ｃｌｕｓｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）である。グラミシジンＳ合成酵素ＧｒｓＡのアデニル化ドメインに相対的な、ラモプラニン遺伝子座で見られるあらゆるアデニル化ドメインのアミノ酸配列（１文字コード）のアラインメントを示している。マルチモジュール非リボソーム型ペプチド合成酵素であるＯＲＦ１３及びＯＲＦ１４のアデニル化ドメインは、それぞれ、対応するモジュールのＭ１−Ｍ７及びＭ１−Ｍ８に基づいて標識されている。ＯＲＦ１３がモジュール６中にアデニル化ドメインを含んでいないことに注目すべきである。アデニル化ドメインのよく保存されたコアモチーフＡ１−Ａ１０（Ｋｏｎｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． Ｒ３９−４８）を、ボックスで囲って強調している。各アデニル化ドメインの基質特異性を予想するうえで重要な残基を黒で強調している（図３Ｂを参照のこと）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、アデニル化ドメインの特異性を予想したものである。各アデニル化ドメインのアミノ酸特異性を指図すると予想される重要な残基を抽出するのに、Ｃｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．のモデル（Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０００， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２１１−２２４）を使用した（図３Ａ中で黒で強調されている）。ＧｒｓＡアミノ酸２３５、２３６、２３９、２７８、２９９、３０１、３２２及び３３０と並んでいる、対応する８つの残基は、既知の特異性をもつアデニル化ドメインということでグループ分けされている（データ提供：Ｊａｃｑｕｅｓ Ｒａｖｅｌ氏）。アクセッション番号、タンパク質名、モジュール番号及び既知のアミノ酸特異性については、後で述べる。略語：Ｃｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＣＤＡペプチド合成酵素；Ｃｅｐ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓのクロロエレモマイシンペプチド合成酵素；Ａｃｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓのアクチノマイシン合成酵素；Ｆｅｎ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのフェンギシン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ）ペプチド合成酵素；Ｂａｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのバシトラシンペプチド合成酵素；Ｆｘｂ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓのエキソケリン（ｅｘｏｃｈｅｌｉｎ）ペプチド合成酵素；Ｔｙｃ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのチロシジンペプチド合成酵素；ＧｒｓＡ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのグラミシジンペプチド合成酵素；ＤｈｂＦ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのシデロフォー２，３−ジヒドロキシベンゾエート合成酵素；Ｎｏｓ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．のノストペプトライドペプチド合成酵素；Ｃｓｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍのシクロスポリンペプチド合成酵素；ＨＰＧ、４−ヒドロキシフェニルグリシン；５ｈＯｒｎ、５−ヒドロキシオルニチン；Ｐｃｈ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのピオケリン。
【図３Ｃ】図３ＣはＯＲＦ２６とアシル−ＣｏＡリガーゼとの類似性を示している。ＯＲＦ２６と、Ｍｂ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ；Ｍｔ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｓｖ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ；Ｍｘ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ；Ｂｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどさまざまな種のアシル補助酵素Ａリガーゼとのクラスタル分析を示す。ボックスで囲って強調した部分は、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００に記載された、アシル−ＣｏＡリガーゼの保存性の高いコアモチーフＡＬ１〜ＡＬ８である。
【図４】図４は、例外的なアミノ酸４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）の生合成経路を推定した図である。コスミン酸（１）、プレフェン酸（２）及び４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（３）は、アミノ酸チロシン（４）の生合成の中間産物である。ＯＲＦ２８は、一次代謝のコスミン酸ムターゼとの類似性を示しており、それゆえ、（１）を（２）へと変換する際の触媒となる場合がある。ＯＲＦ４は、一次代謝のプレフェン酸デヒドロゲナーゼとアミノ酸類似性を示し、それゆえ、（２）を（３）へと変換する際の触媒となる場合がある。ＯＲＦ３０は、（３）をチロシン代謝の重要な中間産物であるホモゲンチシン酸（５）へと変換する４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼに対してアミノ酸類似性を示している。したがって、ＯＲＦ３０は、似たような酸化的脱炭酸反応の触媒となり、４−ヒドロキシマンデル酸（６）を作製する場合がある。ＯＲＦ７は、グリコール酸をグリオキサル酸へと変換する際の触媒となるグリコール酸オキシダーゼに対してアミノ酸類似性を示している。したがってＯＲＦ７は、（６）に見られるグリコール酸構造を対応するグリオキサル酸構造へと変換して４−ヒドロキシフェニルグリオキサル酸（７）を作製する場合がある。ＯＲＦ６は、多くのアミノトランスフェラーゼに対してアミノ酸類似性を示しており、（７）をＨＰＧ（８）へと変換する際の触媒となる場合がある。放射能標識をしたアミノ酸の生化学的研究により、抗生物質バンコマイシンのＨＰＧ残基がチロシン由来であることが確認され、構造６、７及び８はＨＰＧ生合成の候補中間産物とされた（Ｎｉｃａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， １９９７． ｐｐ． ３６３−３９２， 及びその中に記載された参考文献）。
【図５】図５は、２つのクラスタル配置を示している。図５Ａは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）と、β−ラクタマーゼスーパーファミリーの２つの亜鉛分子との協調に関与するｐｆａｍ００７５３で見られるある重要なモチーフとの局所的なアミノ酸配列の相同性を示している（ｐｆａｍファミリーデータベースに関する情報は、Ｂａｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ１を参照のこと）。１ＳＭＬは、亜鉛分子と強調した残基との間の密接な相互作用を示す結晶構造を利用できる、このスーパーファミリーの一員である（Ｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， １９９８ Ｎｏｖ ２０； ２８４ （１）： １２５−３６）。図５Ｂは、ＯＲＦ１０（配列番号１１）と、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの鉄分子との協調に関与するｐｆａｍ０００６７に存在するある重要なモチーフとの間の局所的なアミノ酸配列の相同性を示している。
【図６】図６は、ラモプラニンＯＲＦ１０（配列番号１１）を発現している組換えＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓクローンのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図７】図７は、ラモプラニンＯＲＦ１０（配列番号１１）を発現している組換えＳ． ｌｉｖｉｄａｎｓクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ａ−４】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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