(57)【要約】【課題】  キャピラリープレートを温調して電気泳動を行なう際に、分離能を一層向上させる。【解決手段】  キャピラリー流路１２を備えたキャピラリープレート１０を用い、キャピラリー流路１２に分離媒体２２を充填した後、キャピラリー流路１２の一端のリザーバ１４ａから試料２８を注入し、その後そのリザーバ１４ａに溶液３２を注入した後、キャピラリー流路１２の両端間に電圧を印加して試料１１を電気泳動させる。このとき、キャピラリープレート１０を一定温度に保温しておき、溶液３２をキャピラリープレート１０の保温温度と実質的に同じ温度に保温した状態でリザーバ１４ａに注入する。【選択図】図４
2006250622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリー流路を備えたキャピラリープレートを用い、前記キャピラリー流路に分離媒体を充填した後、前記キャピラリー流路の一端のリザーバから試料を注入し、その後そのリザーバに溶液を注入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して前記試料を電気泳動させる電気泳動方法において、
前記キャピラリープレートを一定温度に保温しておき、
前記溶液をキャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度に保温した状態で前記リザーバに注入することを特徴とする電気泳動方法。
【請求項２】
前記キャピラリー流路への分離媒体充填後、試料注入前に前記リザーバに溶液を注入した後、前記キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して前処理を行なう工程を備えており、
前記前処理のために注入する前記溶液もキャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度に保温した状態で前記リザーバに注入する請求項１に記載の電気泳動方法。
【請求項３】
前記キャピラリープレートは複数のキャピラリー流路を備えたものであり、
前記リザーバは複数のキャピラリー流路の試料注入側に設けられた共通の大容量リザーバと、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路ごとに設けられた小容量リザーバとからなり、
試料は小容量リザーバに注入し、前記溶液は大容量リザーバに注入する請求項１又は２に記載の電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学、分子生物学、臨床などの分野において、極微量のタンパク質や核酸、薬物などの試料を分析するために、キャピラリー流路を備えたキャピラリープレートを用いて試料を電気泳動により分離して分析する電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。その代表的なものとしてキャピラリーチューブを用いたキャピラリー電気泳動装置がある。しかし、キャピラリーチューブを用いた装置は、その取扱いが煩雑である。そこで、取扱いを容易にするとともに、分析の高速化と装置の小型化を目的として、基板内部に複数のキャピラリー流路を形成したキャピラリープレートが提案され、使用されている（特許文献１，２参照。）。
【０００３】
キャピラリープレートはキャピラリー流路が電気泳動用の分離流路となり、両端部が基板表面に開口している。一端側の開口は試料注入用のサンプルリザーバとなっている。キャピラリープレートを用いた電気泳動（以下、キャピラリー電気泳動ともいう。）では、キャピラリー流路に分離媒体を充填した後、サンプルリザーバから試料を注入し、その後そのリザーバに溶液を注入した後、キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料を電気泳動させる。
また、キャピラリー流路への分離媒体充填後、試料注入前にリザーバに溶液を注入した後、キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して前処理を行なう工程を備えている場合もある。
【０００４】
キャピラリー電気泳動においては、その分離能の向上のためにキャピラリープレート自体を温度調節（温調という。）している。しかし、電気泳動の前処理時又は試料の電気泳動時にリザーバに注入される溶液は、注入前に特に温調されることなく、通常は室温（常温）の状態でリザーバに注入され、キャピラリープレート自体を温調することでサンプルリザーバ内の溶液を温調していた。
【特許文献１】特開２００２−３１０９９０号公報
【特許文献２】特開２００３−１６６９７５号公報
【非特許文献１】Anal. Chem., 2000, 72, 3129-3137
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
分離能の向上のためにキャピラリープレートを温調しているにも拘わらず、分離能の向上が充分に達成されない現象がある。
本発明は、キャピラリープレートを温調して電気泳動を行なう際に、分離能を一層向上させることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
分離能を向上させる方法について種々検討した。その結果、キャピラリープレートは温調されて高温状態となっている場合が多いので、流路内に分離媒体を充填した後、サンプルリザーバに室温の溶液を注入するとキャピラリープレートから熱を吸収してしまい、流路内の分離媒体が温度変化に伴って収縮又は膨張することがあった。これが分離能の低下の原因になっていることを見いだした。特に、試料注入後に分離媒体が収縮又は膨張した場合には分離能の低下が顕著であった。
【０００７】
そこで、本発明は、分離媒体が収縮又は膨張を防ぐことにより、分離能の低下を防ぐようにしたものである。
すなわち、本発明はキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートを用い、キャピラリー流路に分離媒体を充填した後、キャピラリー流路の一端のリザーバから試料を注入し、その後そのリザーバに溶液を注入した後、キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して試料を電気泳動させる電気泳動方法を対象とするものであり、キャピラリープレートを一定温度に保温しておき、前記溶液をキャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度に保温した状態でリザーバに注入する。
【０００８】
キャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度に保温した溶液をリザーバに注入することにより、キャピラリー流路内の分離媒体に生じる温度変化と分離媒体の収縮又は膨張が低減され、それにより分離能の低下が抑えられる。
したがって、「キャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度」とは、溶液の温度が、分離媒体に生じる温度変化と分離媒体の収縮又は膨張が低減される程度にキャピラリープレートの保温温度に近い温度であることを意味している。このような温度としては、溶液の温度をキャピラリープレートの保温温度に対して、好ましくは±５度、更に好ましくは±２．５度の温度とすることで、分離能の低下を抑えることが可能である。
【０００９】
本発明は、キャピラリー流路への分離媒体充填後、試料注入前にリザーバに溶液を注入した後、キャピラリー流路の両端間に電圧を印加して前処理を行なう工程を備えているものも対象にしている。その場合には、前処理のために注入する溶液もキャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度に保温した状態でリザーバに注入するのが好ましい。
【００１０】
用いるキャピラリープレートの一例は、複数のキャピラリー流路を備えたものであり、リザーバは複数のキャピラリー流路の試料注入側に設けられた共通の大容量リザーバと、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路ごとに設けられた小容量リザーバとからなるものである。その場合、試料は小容量リザーバに注入し、前記溶液は大容量リザーバに注入する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、試料の電気泳動時にリザーバに注入する溶液の温度をキャピラリープレートの保温温度と実質的に同じ温度にしたので、キャピラリー流路内の分離媒体に生じる温度変化を防ぎ、分離媒体の収縮又は膨張を低減することにより、分離能の低下を抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明をＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System：微小電気的・機械的システム）キャピラリープレートを電気泳動部材として用いた実施例を詳細に説明する。
図１において、（Ａ）はキャピラリープレートにおけるキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【００１３】
キャピラリープレートは一対の板材１０ａ，１０ｂが接合されたものである。一方の板材１０ａにはキャピラリー流路からなる分離流路１２が複数本、例えば３８４本形成されており、互いに交差しないように配列されている。
【００１４】
各分離流路１２の一端（カソード端）は基板表面に開口したそれぞれのサンプルリザーバである小容量リザーバ１４ａに接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４ａを含む大きさの大容量リザーバ１６ａが壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２の他端（アノード端）は基板表面に形成された共通のリザーバ１６ｂに接続されるように開口している。
【００１５】
分離流路１２の幅は１００〜１０００μｍ、好ましくは５０〜９０μｍであり、深さは１００〜１０００μｍ、好ましくは２０〜４０μｍである。他方の板材１０ｂには分離流路１２の両端に対応する位置に貫通穴が形成されている。小容量リザーバ１４ａのサイズは直径が１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜２ｍｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料を注入するのに適した大きさに設定されている。両板材１０ａと１０ｂは、分離流路１２が内側になるように張り合わされて、一体の板材となっている。
【００１６】
板材１０ａへの分離流路１２の形成はリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング又はドライエッチング）により形成することができる。板材１０ｂへの貫通穴の形成はサンドブラストやレーザドリルなどの方法により形成することができる。
【００１７】
小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａによって領域全体を覆われており、その斜視図を示す（Ｃ）のように、全ての小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａ内に設けられ、リザーバ１６ａとつながっている。他端側のリザーバ１６ｂも全ての分離流路１２の他端側の開口が配置されている領域を覆っており、全ての分離流路１２の他端側の開口はリザーバ１６ｂとつながっている。
【００１８】
基板を構成する板材１０ａ，１０ｂの材質としては、石英ガラスやホウ珪酸系ガラス、樹脂などを用いることができ、泳動分離された成分を光学的に検出する場合には透明な材質を選択する。光以外の検出手段を使用する場合は、板材１０ａ，１０ｂの材質は透明なものに限定されるものではない。
【００１９】
小容量リザーバ１４ａの内壁を親水性、大容量リザーバ１６ａの底面又は底面から内壁面にかけて疎水性としてもよい。そのような親水性と疎水性の表面処理としては、種々の方法を挙げることができる。例えば、板材としてガラス板を使用した場合には、酸処理により親水性を持たせることができ、樹脂コーティング、フッ素樹脂加工又はシランカップリング剤処理などにより疎水性を持たせることができる。
【００２０】
図２に他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは板材１０ｂの表面側に凹部として形成され、その底部で分離流路１２とつながっている。複数の小容量リザーバ１４ａが大容量リザーバ１６ａに覆われて、大容量リザーバ１６ａの底面上に形成されている。
図３はさらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは分離流路１２と同程度の大きさの開口として形成されている。
【００２１】
これら図２又は図３に示されるキャピラリープレートにおいても、小容量リザーバ１４ａと、大容量リザーバ１６ａの底面のうち小容量リザーバ１４ａの開口部の狭い範囲の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理を施してもよい。これにより、注入された試料は親水性処理が施された部分に保持されることとなり、その親水性領域が小容量リザーバとなる。その親水性領域の大きさは、保持される試料量が数１０ｎＬ〜数μＬとなるのに適した大きさに設定される。
【００２２】
次に図１のキャピラリープレートにおける試料注入動作を、図４も参照して説明する。
（１）キャピラリープレート１０を５０℃の恒温状態に保つ。この恒温状態は試料の電気泳動が終了するまで維持する。
（２）図４（Ａ）に示されるように、カソード側の大容量リザーバ１６ａに純水２０、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を満たし、アノード側からシリンジで加圧して全ての分離流路１２に分離媒体であるゲル２２を充填する。
【００２３】
（３）分離流路１２から小容量リザーバ１４ａに流出したゲル２２は、大容量リザーバ１６ａの純水中に拡散するので、リザーバ１４ａ，１６ａ内の水２０及びゲル２２を吸引ノズルによって吸引し、リザーバ１４ａ，１６ａ内を洗浄する。
【００２４】
（４）その後、図４（Ｂ）に示されるように、カソード側リザーバ１６ａとアノード側リザーバ１６ｂに室温で保持されていたバッファ溶液２４を満たし、前処理として両リザーバ１６ａ，１６ｂのバッファ溶液に電極２６を挿入して電圧を印加する。この前処理によりゲル２２中の夾雑物イオンがアノード電極又はカソード電極に移動する。この前処理での印加電圧は、例えば１２５Ｖ／ｃｍで、印加時間は５分間が適当である。
【００２５】
（５）カソード側リザーバ１４ａ，１６ａのバッファ溶液を吸引し、リザーバ１４ａ，１６ａ内を洗浄した後、リザーバ１４ａ，１６ａ内を純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄する。
（６）その後、図４（Ｃ）に示されるように、各小容量リザーバ１４ａに試料２８を滴下する。
【００２６】
（７）次に各小容量リザーバ１４ａにそれぞれカソード電極３０を挿入し、アノード電極との間に電圧を印加して流路１２への試料注入を行なう。１１は注入された試料である。試料注入のための印加電圧は、例えば５０Ｖ／ｃｍで、印加時間は４０秒間が適当である。
（８）小容量リザーバ１４ａ内の残った試料を吸引して除去した後、図４（Ｄ）に示されるように、リザーバ１４ａ，１６ａ内をバッファ溶液３２で満たす。
【００２７】
（９）リザーバ１６ａにカソード電極３４を挿入し、リザーバ１６ｂのバッファ溶液に浸したアノード電極との間に泳動電圧を印加して試料の電気泳動分離と信号検出を行なう。電気泳動分離のための印加電圧は、７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、例えば１２５Ｖ／ｃｍである。
この電気泳動分離のための電極２６はリザーバ１６ａ，１６ｂにそれぞれ予め設けておいてもよい。また、試料注入側のカソード電極は小容量リザーバ１４ａごとに設けてもよい。
【００２８】
電気泳動分離のためにリザーバ１４ａ，１６ａに満たすバッファ溶液３２の温度として、３種類のものを使用し、それぞれについて電気泳動分離を行なってその結果を比較した。その３種類の温度は、サンプルプレートと同じ５０℃、室温に相当するものとしての２８℃、及びそれらよりも低い７℃とした。
【００２９】
測定した試料は単一塩基を接続した１塩基ラダーＤＮＡであり、サイクルシークエンシング用試薬キットBigDye v3.1（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して作成した。鋳型ＤＮＡは０．５μｇ／μＬのｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ（東洋紡社製）であり、プライマーは合成プライムを使用した。作成条件はキット取り扱い説明に従い、エタノール沈殿処理を行なった後、乾燥固化した標品を得た。その乾燥標品を０．４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．０４ｍＭのＥＤＴＡ１．５０％（ｗ／ｖ）エチレングリコールの各成分を含む試料調製液を用いて溶解して試料液を調製した。
【００３０】
以上の３種類のバッファ溶液温度条件で行なったＤＮＡの分離能の結果を図５に示す。
横軸はＤＮＡ鎖の長さを示す塩基対数、縦軸ＲＩは分離能を示すＲＩ値である。ＲＩ値は次の式により定義される（非特許文献１参照。）。
ＲＩ＝０.２５ＳＮ1/2
Ｓ＝２｜（ｔｍ１−ｔｍ２）／（ｔｍ１＋ｔｍ２）｜
Ｎ＝５.５（ｔｍ／Ｗw0.5）2
ここで、ｔｍ１，ｔｍ２，ｔｍ，Ｗw0.5はそれぞれ任意のＤＮＡ鎖の移動時間、それと異なるＤＮＡ鎖の移動時間、あるＤＮＡ鎖の移動時間とそのＤＮＡ鎖を検出した時のピークの半値幅である。
【００３１】
図５の結果によれば、従来のように室温（２８℃）でのバッファ溶液を注入した場合には外気温の影響を受け、そのバッファ溶液温度をさらに下げた（７℃）場合にはさらに分離能が低下している。それに対し、本発明によりバッファ溶液温度をサンプルプレートと同じ５０℃にした場合には、４００塩基以上の高分子ＤＮＡにおける分離能が改善されている。
【００３２】
実施例では前処理時に注入するバッファ溶液温度は室温のものとしているが、そのバッファ溶液温度もサンプルプレートと同じ温度のものを使用することにより、分離能をさらに向上させることができる。
【００３３】
実施例では試料注入を図４（Ｃ）に示されるようにリザーバ１４ａ，１６ａを空にした状態で行なっている。しかし、サンプルプレートが保温されていることから、試料の乾燥を防ぐ方策を講じることが好ましい。例えば、図６（Ａ）に示されるようにリザーバ１４ａ，１６ａを純水３６で満たし、試料を水よりも比重の大きい溶媒に溶解した状態のもの３８として、図６（Ｂ）に示されるようにピペット４０などで注入してもよい。試料を溶解するそのような比重の大きい溶媒としては、粘性が低く揮発しにくい液体が好ましく、例えば水を基本として構成され、多価アルコール、糖類及びその他の親水性高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含むことができる。多価アルコールとしては、２価アルコール、３価アルコール、例えば、エチレングリコール、グリセロール、ペンタエリスリトール、プロピレングリコール又はマンニトールなどが挙げられる。糖類としては、単糖類とこれが複数個縮合した少糖類、多糖類を含み、具体的にはグルコースやスクロース、デキストラン等が挙げられる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の試料注入方法は、生化学、分子生物学又は臨床などの分野において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明が適用されるキャピラリープレートの一例を示す図であり、（Ａ）はキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【図２】他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図３】さらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図４】一実施例の動作を示す工程断面図である。
【図５】電気泳動分離の結果の一例を示すグラフである。
【図６】他の実施例における試料注入過程を示す工程断面図である。
【符号の説明】
【００３６】
１０      キャピラリープレート
１０ａ、１０ｂ      板材
１２      分離流路
１４ａ    小容量リザーバ
１６ａ    大容量リザーバ
２２      ゲル
２４，３４      バッファ溶液
２６，３０，３４      電極
【図１】
2006250622.tif 000003
【図２】
2006250622.tif 000004
【図３】
2006250622.tif 000005
【図４】
2006250622.tif 000006
【図５】
2006250622.tif 000007
【図６】
2006250622.tif 000008