(57)【要約】【課題】グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの複合体からなる結晶等を提供可能とすること。【解決手段】グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む斜方晶系の結晶であり、空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０プラスマイナス４．０オングストローム、ｂ＝１１６．５プラスマイナス４．０オングストローム、ｃ＝１６４．０プラスマイナス４．０オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とする結晶等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む斜方晶系の結晶であり、空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０プラスマイナス４．０オングストローム、ｂ＝１１６．５プラスマイナス４．０オングストローム、ｃ＝１６４．０プラスマイナス４．０オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とする結晶。
【請求項２】
単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とする請求項１記載の結晶。
【請求項３】
前記リガンドが、非ステロイド骨格を有するリガンドであることを特徴とする請求項１又は２記載の結晶。
【請求項４】
前記リガンドが、非ステロイド骨格を有し、かつ、アゴニスト活性を有するリガンドであることを特徴とする請求項１又は２記載の結晶。
【請求項５】
前記リガンドが、6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneであることを特徴とする請求項１記載の結晶。
【請求項６】
前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶。
【請求項７】
X線結晶構造解析により決定される分解能が、少なくとも2.8オングストロームであることを特徴とする前項１〜５のいずれかの前項記載の結晶
【請求項８】
前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、Met560、Leu563、Asn564、Leu566、Gly567、Gln570、Trp600、Met601、Met604、Ala605、Ala607,Leu608、Arg611、Phe623、Met639、Gln642、Met646、Leu732、Typ735、Cys736、Thr739、Phe749、Leu753を含むアミノ酸残基より構成されるリガンド結合ポケットを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶
【請求項９】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインを有するタンパク質であって、当該タンパク質のポリペプチド三次元構造状態がリガンドを結合し得るポリペプチド三次元構造状態にあり、かつ、前記ポリペプチド三次元構造状態にあるタンパク質の結晶の空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とするタンパク質。
【請求項１０】
前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標に係る情報を取得するための、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の使用。
【請求項１２】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標に基づいて当該複合体の三次元構造を誘導するための、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の使用。
【請求項１３】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと被験物質との化学的相互作用性を、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を基準として用いて評価するための、請求項１〜４のいずれかの請求項記載の結晶の使用。
【請求項１４】
前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１１、１２又は１３記載の結晶の使用。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を有するリガンド結合のためのポケットに被験物質を適用し、当該ポケットに適合する被験物質を選択する工程
を有することを特徴とするグルココルチコイド受容体の作動薬剤有効成分となり得る物質の探索方法。
【請求項１６】
グルココルチコイド受容体の作動薬剤有効成分となり得る物質の探索方法であって、
（１）請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標が第一記憶手段に入力される工程、
（２）被験物質の原子座標が第二記憶手段に入力される工程、
（３）入力された両者の原子座標に基づき、前記被験物質の原子団の特性と各原子団の距離との組み合わせにより特定される空間配置を安定的に最適化することによるリガンド結合ポケットに結合する被験物質の選択がコンピュータ処理手段により行われる工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするグルココルチコイド受容体の作動薬剤。
【請求項１８】
請求項１５又は１６により選択された物質又はその薬学的に許容される塩が有する前記化学的相互作用性の有無又はその程度に係るデ−タ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記デ−タ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核内受容体は、細胞質又は核内に局在し、リガンドの結合に応じて活性化するリガンド依存性転写因子のファミリ−として規定される（例えば、非特許文献１参照）。このファミリ−の一群であるステロイド受容体には、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びエストロゲン（ＥＲ）受容体等が含まれている。ステロイド受容体に対するリガンドには、エストラジオ−ル、プロゲステロン及びコルチゾ−ル等が知られている。これらのリガンドは細胞の周囲の流体中に存在するときに受動拡散によって外側の細胞膜を通り抜け、特定の核内受容体に結合して受容体／リガンド複合体を形成する。ついで、この複合体は細胞の核に移動し、そこで細胞ＤＮＡの特定の遺伝子に結合する。ＤＮＡに結合すると当該複合体は前記遺伝子によってコ−ドされるタンパク質の産生を調節する。この観点から、核内受容体に結合し天然のリガンドの作用を模倣する化合物は「アゴニスト」と呼ばれ、一方、天然のリガンドの作用を抑制する化合物は「アンタゴニスト」と呼ばれる。
グルココルチコイド受容体は、リガンドによる刺激のないときは、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ５６）との複合体を形成しており細胞質に存在する。グルココルチコイド受容体は、リガンドの結合によって熱ショックタンパク質から解離し、核内へ移行した後、ＤＮＡ及び／又はタンパク質と特異的に相互作用し、そして遺伝子発現を制御する。
グルココルチコイド受容体にアゴニストが結合すると、Ｉκ−Ｂが発現する。そして発現したＩκ−ＢとＮＦκ−Ｂとが相互作用することにより、抗炎症作用を示すと考えられている。グルココルチコイド受容体は、ＡＰ−１、ＮＦκ−Ｂ等の転写因子と相互作用することにより、抗炎症作用を示すと考えられている。
グルココルチコイド受容体のアゴニストとしては、例えば、コルチゾル、コルチコステロン等を挙げることができる。すでに多くの合成グルココルチコイド受容体アゴニストが存在し、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニシロン（ｐｒｅｄｎｉｓｉｌｏｎｅ）等が代表的なものである。グルココルチコイド受容体に作用するステロイドは、有効な抗炎症剤であることが示されたにも関わらず、類似したリガンド結合ドメインを有する鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びエストロゲン受容体（ＥＲ）等のステロイド受容体との交叉反応の結果、選択性、長期投与における副作用が知られているために、その使用には多くの制限等が存在している。
【０００３】
グルココルチコイド受容体の作動薬剤の研究にあたっては、１種又はそれ以上のステロイド受容体に対して特異性を有するが、他のステロイド受容体又は細胞内レセプタ−に対する交差反応性が減少しているか又は存在しない非ステロイド化合物の同定、検索、評価又は設計が、当分野において非常に価値がある。
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインのある種の原子座標についてはすでに明らかにされている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
また、現在すでに知られているグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標では、リガンドが、ステロイド骨格を有するデキサメタゾン、ＲＵ３８４８６又はフルチカゾンプロピオネイト(Fluticasone propionate)のいずれかのステロイド骨格を有するリガンドであり、限られた三次元構造についての情報だけが存在しているにすぎなかった。
【０００４】
【非特許文献１】Evans RM, Science, 240, 889 (1988)
【非特許文献２】Bledsoe RK等, Cell, 110, 93 (2002)：プロテイン・デ−タ・バンクの登録番号：1M2Z
【非特許文献３】Kauppi B等, J Biol Chem, 278, 22748 (2003)：プロテイン・デ−タ・バンクの登録番号：1P93、1NHZ
【特許文献１】国際公開第2003／015692号パンフレット
【特許文献２】欧州特許出願公開  第1375517号
【特許文献３】国際公開第2003／090666号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標は未だ知られておらず、当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造についての情報は何ら存在していかなった。従って、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの化学的相互作用性に係る情報を提供するための結晶を新規に見出し、当該結晶及びこれから得られる情報等を利用することは、グルココルチコイド受容体の変異体、作動薬剤又は拮抗薬剤等を同定、検索、評価又は設計するために非常に有益なことであり、切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、非ステロイド骨格リガンドとして6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneを用いて、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの複合体を含む結晶を新規に見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１． グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む斜方晶系の結晶であり、空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０プラスマイナス４．０オングストローム、ｂ＝１１６．５プラスマイナス４．０オングストローム、ｃ＝１６４．０プラスマイナス４．０オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とする結晶；
２． 単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とする請求項１記載の結晶；
３．前記リガンドが、非ステロイド骨格を有するリガンドであることを特徴とする請求項１又は２記載の結晶；
４．前記リガンドが、非ステロイド骨格を有し、かつ、アゴニスト活性を有するリガンドであることを特徴とする請求項１又は２記載の結晶；
５．前記リガンドが、6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneであることを特徴とする請求項１記載の結晶；
６．前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶；
７．X線結晶構造解析により決定される分解能が、少なくとも2.8オングストロームであることを特徴とする前項１〜５のいずれかの前項記載の結晶；
８．前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、Met560、Leu563、Asn564、Leu566、Gly567、Gln570、Trp600、Met601、Met604、Ala605、Ala607,Leu608、Arg611、Phe623、Met639、Gln642、Met646、Leu732、Typ735、Cys736、Thr739、Phe749、Leu753を含むアミノ酸残基より構成されるリガンド結合ポケットを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶；
９．グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインを有するタンパク質であって、当該タンパク質のポリペプチド三次元構造状態がリガンドを結合し得るポリペプチド三次元構造状態にあり、かつ、前記ポリペプチド三次元構造状態にあるタンパク質の結晶の空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°であることを特徴とするタンパク質；
１０．前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項９記載のタンパク質；
１１．グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標に係る情報を取得するための、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の使用；
１２．グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標に基づいて当該複合体の三次元構造を誘導するための、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の使用；
１３．グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと被験物質との化学的相互作用性を、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を基準として用いて評価するための、請求項１〜４のいずれかの請求項記載の結晶の使用；
１４．前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする請求項１１、１２又は１３記載の結晶の使用；
１５．請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を有するリガンド結合のためのポケットに被験物質を適用し、当該ポケットに適合する被験物質を選択する工程
を有することを特徴とするグルココルチコイド受容体の作動薬剤有効成分となり得る物質の探索方法；
１６．グルココルチコイド受容体の作動薬剤有効成分となり得る物質の探索方法であって、
（１）請求項１〜５のいずれかの請求項記載の結晶の原子座標が第一記憶手段に入力される工程、
（２）被験物質の原子座標が第二記憶手段に入力される工程、
（３）入力された両者の原子座標に基づき、前記被験物質の原子団の特性と各原子団の距離との組み合わせにより特定される空間配置を安定的に最適化することによるリガンド結合ポケットに結合する被験物質の選択がコンピュータ処理手段により行われる工程
を有することを特徴とする方法；
１７．請求項１５又は１６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするグルココルチコイド受容体の作動薬剤；
１８．請求項１５又は１６により選択された物質又はその薬学的に許容される塩が有する前記化学的相互作用性の有無又はその程度に係るデ−タ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記デ−タ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの複合体を含む結晶等が提供可能となる。さらに当該結晶及びこれから得られる情報等を利用することにより、グルココルチコイド受容体の変異体、作動薬剤又は拮抗薬剤等を同定、検索、評価又は設計するための方法も提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
【０００９】
Ａ又はＡｌａ：アラニン残基、      Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基、
Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基、  Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基、
Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基、      Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基、
Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基、  Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基、
Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基、      Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基、
Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基、  Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基、
Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基、    Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基、
Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基、        Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基、
Ｖ又はＶａｌ：バリン残基、        Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基、
Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基、      Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合には、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
【００１０】
本発明におけるグルココルチコイド受容体は、例えば、下記のいずれかのアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体であって、哺乳動物、好ましくはマウス、ヒト、特に好ましくはヒト由来のものである。
【００１１】
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であり、かつグルココルチコイド受容体としての機能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつグルココルチコイド受容体としての機能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつグルココルチコイド受容体としての機能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であり、かつグルココルチコイド受容体としての機能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【００１２】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、付加もしくは置換」や前記（ｃ）にある「８０％以上の配列同一性」及び（ｄ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、器官、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異（例えば、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって、天然の蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入し発現させることにより作出された蛋白質が有するアミノ酸配列中に存在するアミノ酸の変異）等が含まれる。
【００１３】
前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
【００１４】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個（ここで「数個」とは、２〜約１０個程度である。）、又はそれ以上である。かかる改変の数は、脂肪蓄積を促進する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
【００１５】
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００１６】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１７】
本発明における配列同一性は、例えば、アミノ酸配列基準の場合には８０％以上であることが好ましく、また塩基配列基準の場合には８０％以上であることが好ましい。もちろん上記条件を満たす限りにおいて、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、第１番目から第１６０番目までのアミノ酸配列における配列同一性が５０％以上であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち第１６１番目から第４１８番目、配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列のうち、第１番目から２５８番目における配列同一性が９０％以上であるような配列同一性であってもよい。
【００１８】
前記（ｅ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１９】
具体的には例えば、本発明におけるヒト由来のグルココルチコイド受容体は、例えば、アクセス番号Ｐ０４１５０（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６３５−４１（１９８５））等に記載されており、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものである。
本発明における「リガンド結合ドメイン」とは、例えば、リガンド結合を招くステロイド受容体のＣ末端のリガンド結合部位を意味する。
本発明における、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、例えばヒト由来のグルココルチコイド受容体、（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６３５−４１（１９８５））等に記載されているアミノ酸配列において、Ｃ末端側のリガンド結合部位を意味する。
本発明における、ヒトグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、Ｎ末端側がアミノ酸配列において、例えば、第５００番目から第５３３番目からが挙げられる。好ましくは、第５１０番目から第５３１番目までである。より好ましくは第５２２番目からである。
本発明における、ヒトグルココルチコイド受容体のリガンド結合ドメインは、Ｃ末端側がアミノ酸配列において、例えば、第７７７番目までである。
本発明における、ヒトグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、より具体的に例えば、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、第５２２番目から第７７７番目を意味している。
他の哺乳動物由来のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの場合には、前記ヒト由来のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインに対応する領域を意味している。
但し、本発明におけるグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの開始部位及び終了部位は、必ずしも厳密なものではなく、その機能が保持されることを条件として、Ｎ末端及び／又はＣ末端に数残基いずれかの方向にずれたもの、或いは、Ｎ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。
尚、このような一次構造上の僅かな差異は当該グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの全体的な立体構造に対して大きな影響を与えず、通常、その機能は保たれると考えられる。
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、リガンド結合ポケットを含む。本発明の結晶に関して、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン中の残基は、結晶構造中のリガンドへのそれらの空間的な近接性により定義される。用語「リガンド結合ドメイン」はリガンド結合ドメインの相同体又はその一部をも含む。
本発明におけるリガンド結合ポケットは、Met560、Leu563、Asn564、Leu566、Gly567、Gln570、Trp600、Met601、Met604、Ala605、Ala607,Leu608、Arg611、Phe623、Met639、Gln642、Met646、Leu732、Typ735、Cys736、Thr739、Phe749、Leu753を含むアミノ酸残基より構成される又はその相同体である。
本発明における、リガンド結合ポケットは、リガンドを結合する、及びリガンド結合ドメインに位置する構造中の空間に関する。
本発明におけるグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインに用いている変異体は、例えば、野生型（配列番号３参照）、Ｆ６０２Ｓの１重変異体、Ｃ６３８Ｄの１重変異体、又は、Ｆ６０２Ｓ及びＣ６３８Ｄの２重変異体（配列番号２参照）等を挙げることができる。好ましくは、Ｆ６０２Ｓ及びＣ６３８Ｄの２重変異体等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において「リガンド」とは、受容体を活性化する化合物であれば、どのような化合物でもよいが、通常は、受容体のリガンド結合ドメインと相互作用する化合物を示している。しかしながら、リガンドは、結合することなしに、受容体を活性化する化合物も含む。
本発明におけるリガンドは、グルココルチコイド受容体との結合作用性を有するようなものであれば特に限定されるものではない。例えば、米国特許第3,683,091号、特公昭45−014056、特公平6−263688、国際公開第95／10266号パンフレット、特公昭45−36500、欧州特許出願公開第0 188 396号、C.F. Bigge等, J. Med. Chem., 36、 1977−1995 (1993)、 P.R.Kanjilal等, J. Org. Chem., 50、 857−863 (1985)、G. Sinha, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, (10), 2519−2528 (1983)、U. r. Ghatak、M. Sarkar及びS. K. Patra, Tetrahedron Letters No.32、 pp.2929−2931 (1978)、p. N. Chakrabortty等, Indian J. Chem., 12 (9), 948−55 (1974)、 E. Fujita等, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, (1)、 165−77 (1974)、H. Sdassi等, Synthetic Communications, 25 (17), 2569−2573 (1995)、 T. Ibuka等, Yakugaku Zasshi 87 (8), 1014−17 (1967)、日本特許第09052899号、米国特許第5,696,127号、米国特許第5,767,113号、欧州特許出願公開第0 683 172号、D. Bonnet−Delpon等, Tetrahedron, 52 (1), 59−70 (1996)、国際公開第98／26783号パンフレット、国際公開第98／27986号パンフレット、国際公開第98／31702号パンフレット、欧州特許出願公開第0 903 146号、J. A. Findlay等, Tetrahedron Letters, No.19、 pp.869−872 (1962)、ドイツ特許出願公開第19856475号、国際公開第99／41256号パンフレット、国際公開第99／41257号号パンフレット、国際公開第00／06137号号パンフレット、国際公開第99／33786号号パンフレット、国際公開第99／41257号パンフレット、国際公開第99／63976号パンフレット、国際公開第00／006137号パンフレット、国際公開第00／032584号パンフレット、国際公開第00／07972号パンフレット、国際出願第PCT／IB00／00366号又は国際公開第02／24702号パンフレット等に記載された化合物を挙げることができる。
より具体的には例えば、リガンドとしてステロイド骨格を有するリガンドである
（Ａ）デキサメタゾン
2006265173.tif 000002
（Ｂ）ＲＵ３８４８６
2006265173.tif 000003
（Ｃ）フルチカゾンプロピオネイト
2006265173.tif 000004
等を挙げることができ、またリガンドとして非ステロイド骨格を有するリガンドである6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one
2006265173.tif 000005
等が挙げられる。尚、当該化合物は、国際公開第02／10143号に記載される方法により製造することができる。
【００２１】
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体は、下記の取得方法（以下、本複合体取得方法と記すこともある。）によって取得することができる。
本複合体取得方法は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体の取得方法であり、
（１）（ａ）精製ドメインと（ｂ）グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの融合タンパク質を発現する遺伝子組み換え微生物又は細胞を、リガンド非存在下で培養する工程（第一工程）、
（２）前記工程により得られる前記微生物又は細胞を回収し、回収された前記微生物又は細胞を破砕する工程（第二工程）、
（３）前記工程により得られる菌体破砕物から前記融合タンパク質を、前記精製ドメインと精製用担体との結合性に基づき回収する工程（第三工程）、
（４）前記工程により得られる前記融合タンパク質から、当該タンパク質の精製ドメインに存在するプロテアーゼ切断性リンカーをプロテアーゼにより切断することにより、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を分離する工程（第四工程）、及び
（５）前記工程により得られる前記複合体を回収する工程（第五工程）
を有し、かつ、
（６）前記破砕工程、前記融合タンパク質の回収工程、又は、前記分離工程において前記融合タンパク質の精製ドメインに存在するプロテアーゼ切断性リンカーをプロテアーゼにより切断する前までの工程において、前記微生物又は細胞或いは前記融合タンパク質とリガンドとを接触させる工程（リガンド接触工程）
を含む。
【００２２】
本複合体取得方法の第一工程において、前記精製ドメインが、金属キレ−トペプチドが付加されてなるチオレドキシンとプロテア−ゼ切断性リンカ−とからなるポリペプチドであることが好ましい。また、前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることが好ましい。
【００２３】
精製ドメインは、（ａ１）本複合体取得方法の第三工程において融合タンパク質を精製するために、当該精製ドメインと精製用担体との結合性に基づき回収することが可能となるような部位と、（ａ２）本複合体取得方法の第四工程において融合タンパク質をプロテア−ゼにより切断することにより、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を分離することが可能となるような部位（即ち、当該タンパク質の精製ドメインに存在するプロテア−ゼ切断性リンカ−）と、必要に応じて、（ａ３）当該複合体を安定化させるためのポリペプチドとからなる。尚、前記の（ａ３）部位は前記の（ａ１）部位そのものである場合もある。
前記の（ａ１）部位としては、例えば、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュ−ルのような金属キレ−トペプチド若しくはヒスチジン−トリプトファンモジュ−ルのような金属キレ−トペプチド等が付加されてなるチオレドキシン、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト−プに対応する；Wilson,I.ら（１９８４）Cell 37:767）、マルト−ス結合性ポリペプチド、ＦＬＡＧＳ発現／アフィニティ−精製系で使用されるＦＬＡＧエピト−プ（Immunex Corp, Seattle, WA）及びＥ−エピト−プタグ（Ｅ−タグ）等を挙げることができる。好ましくは、ヒスチジン−トリプトファンモジュ−ルのような金属キレ−トペプチドが付加されてなるチオレドキシン、マルト−ス結合性ポリペプチドが挙げられ、より好ましくは、ヒスチジン−トリプトファンモジュ−ルのような金属キレ−トペプチドが付加されてなるチオレドキシンが挙げられる。ここで「ヒスチジン」における残基は、例えば、Porathら, Protein Expression and Purification, 3:263-281 (1992)等に記載されるような、固定化された金属イオンアフィニティ−クロマトグラフィ−（ＩＭＩＡＣ）に対する精製を容易にするものである。
前記の（ａ２）部位としては、例えば、FactorXa Protease（血液凝固因子Xa）切断部位、PreScission Protease切断部位、スロンビン切断部位のような機能を有するもの等を挙げることができる。
前記の（ａ３）部位としては、例えば、当該複合体の水溶性を高めるためのポリペプチド、当該部位に続くグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体の三次元構造を再現良く導くことができるようなポリペプチド等を挙げることができる。好ましくは、チオレドキシン等を挙げることができる。
【００２４】
（ａ）精製ドメインと（ｂ）グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの融合タンパク質を発現する遺伝子組み換え微生物又は細胞は、宿主となる微生物において当該融合タンパク質を発現できる発現ベクターを通常の遺伝子工学的手法を用いて構築し、次いで構築された発現ベクターを通常の遺伝子工学的手法を用いて当該微生物又は細胞に導入することにより作製することができる。作製された遺伝子組み換え微生物又は細胞は、例えば、温度変化又は化学誘導等の適切な手段により、前記発現ベクターが有するプロモ−タ−の転写活性を促進しながら、非リガンド存在下の適切な培養条件で培養すればよい。尚、多数の微生物又は細胞（細菌、植物、動物（特に哺乳動物）及び古細菌起源の細胞を含む）の培養及び産生のために参考となる文献としては、例えば、Sambrook,Ausubel及びBerger(すべて前出)、並びに、Freshney, Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique、第3版 (1994)、Wiely−Liss, New York及びそこに引用された参考文献; Doyle and Griffiths, MAMMALIAN CELL CULTURE:ESSENTIAL TECHNIQUES (1997), John Wiley and Sons, NY; Humason, Animal Tissue Techniques, 第4版 (1979), W.H.Freeman and company; 並びに Ricciardelliら, In vitro Cell Dev.Biol.25:1016−1024 (1989); Payneら, Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (1992), John Wiley & Sons, Inc., New York ; Gamborg及びPhillips(編), Plant Cell,Tissue and Organ Culture ; Fundamental Methods Springer Lab Manual (1995),Springer−Verlag (Berlin Heidelberg New York) 及び Plant Molecular Biology, R.R.D.Croy編、Bios Scientific Publishers (1993), Oxford, U.K.ISBN0 12 198470 6; Atlas及びParks(編), The Handbook of Microbiological Media (1993), CRC Press,Boca Raton,FL.; Sigma−Aldrich,Inc (St.Louis,MO)からのLife Sience Research Cell Culture Catalogue (1998) (「Sigma−LSRCCC」); Sigma−Aldrich,Inc.(St.Louis,MO)からのThe Plant Culture Catalogue and supplement(1997)(「Sigma−PCCS」); TymmsIn vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology, 第37巻 (1995), Garland Publishing, NY.等を挙げることができる。
【００２５】
本複合体取得方法の第ニ工程において、前記微生物又は細胞を回収するための方法としては、遠心分離等が挙げられる。また、前記遺伝子組み換え微生物又は細胞を破砕するための方法としては、例えば、凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊処理又は細胞溶解剤処理等の通常の物理的又は化学的破壊処理等に基づく微生物工学的手法等を挙げることができる。
【００２６】
本複合体取得方法の第三工程において、前記菌体破砕物から前記融合タンパク質を回収するには、市販品であるタギングシステム等のようなアフィニティ−クロマトグラフィ−等を使用することにより、前記精製ドメインと精製用担体との結合性に基づき回収すればよい。必要に応じてさらに、硫酸アンモニウム若しくはエタノ−ル沈殿、酸性抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィ−、ホスホセルロ−スクロマトグラフィ−、疎水性相互作用クロマトグラフィ−、アフィニティ−クロマトグラフィ−、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ−又はレクチンクロマトグラフィ−等の各種のタンパク質精製方法と組み合わせて精製・回収してもよい。尚、多数の精製・回収のために参考となる文献としては、例えば、Sandana, Bioseparation of Preteins (1997), Academic Press,Inc.; Bollagら, Protein Methods 第2版 (1996), Wiley−Liss, NY; Walker, The Pretein Protocols Handbook (1996), Humana Press, NJ; Harris及びAngal, Protein Purification Applications: A Practical Approach (1990), IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris及びAngal, Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice 第3版 (1993), Springer Verlag, NY; Janson及びRyden, Protein : Principles, High Resolution Methods and Applycations, 第2版 Purification (1998), Wiley−VCH,NY; 又はWalker, Protein Protocols on CD−ROM (1998), Humana Press, NJ.等を挙げることができる。
【００２７】
本複合体取得方法の第四工程において、前記融合タンパク質を（ａ）精製ドメインと（ｂ）グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインに分離する。本複合体取得方法の第四工程において、プロテアーゼは、プロテアーゼは、例えば、FactorXa Protease (血液凝固因子Xa)、PreScission Protease、スロンビンのようなプロテアーゼ等を挙げることができる。プロテアーゼ切断の条件は、精製ドメインと前記複合体を分離できるものであれはよく、プロテアーゼの種類による。例えば、温度は４℃〜２０℃であり、好ましくは４℃である。プロテアーゼの切断に要する時間は、例えば６時間〜４８時間であり、好ましくは、１０時間〜２０時間である。しかしながら、加えるプロテアーゼの量により、融合タンパク質の切断される効率は変化するので、融合タンパク質が、精製ドメインとグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとに分離することができれば、切断に要する時間は厳密ではない。プロテアーゼを添加する溶液の融合タンパク質の濃度は、当該複合体が沈殿を引き起こさない濃度であれば、何ら問題はないが、例えば、0．001mg／ml〜10mg／mlであり、好ましくは0．1mg/ml〜2.0mg/mlである。より好ましくは、0．5mg／〜1．0mg／mlである。
【００２８】
本複合体取得方法の第五工程において、前記複合体を回収するには、例えば、硫酸アンモニウム若しくはエタノ−ル沈殿、酸性抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィ−、ホスホセルロ−スクロマトグラフィ−、疎水性相互作用クロマトグラフィ−、アフィニティ−クロマトグラフィ−、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ−又はレクチンクロマトグラフィ−等の各種のタンパク質精製方法と組み合わせて精製・回収してもよい。尚、多数の精製・回収のために参考となる文献としては、例えば、Sandana, Bioseparation of Preteins (1997), Academic Press,Inc.; Bollagら, Protein Methods 第2版 (1996), Wiley−Liss, NY; Walker, The Pretein Protocols Handbook (1996), Humana Press, NJ; Harris及びAngal, Protein Purification Applications: A Practical Approach (1990), IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris及びAngal, Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice 第3版 (1993), Springer Verlag, NY; Janson及びRyden, Protein : Principles, High Resolution Methods and Applycations, 第2版 Purification (1998), Wiley−VCH,NY; 又はWalker, Protein Protocols on CD−ROM (1998), Humana Press, NJ.等を挙げることができる。例えば、前記複合体を濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製してもよいし、陰イオン交換クロマトグラフィーを通過させた後、もしくは、吸着させてさらに精製してもよい。
本複合体取得方法の第五工程において、前記工程により融合タンパク質を切断した溶液について、溶液を置換する方法は、例えば、PD10カラム（アマシャムバイオサイエンス）や透析等を用いてもよい。溶液を置換した後に、市販品であるタギングシステム等のようなアフィニティ−クロマトグラフィ−等の通過物を得ることにより、前記工程で分離した複合体を回収することができる。例えば、陰イオン交換カラム、ゲルろ過クロマトグラフィー等により、更に複合体を精製してもよい。前記複合体を精製した後に、セントリプレップセントリコン、アミコン又はマイクロコン等の濃縮用の装置を用いて濃縮してもよい。
第五工程により得られる前記複合体を回収するには、前記複合体の含まれる溶液をピペットマン等を用いて保存容器内に回収してもよいし、−80℃に保存してもよい。第五工程の各段階において、精製したサンプルを回収して、結晶化処理を施してもよい。
【００２９】
本複合体取得方法は、上記工程のうちの特定な工程と関連しながらリガンド接触工程を含むことが重要であり、具体的には、前記破砕工程、前記融合タンパク質の回収工程（第二工程）、又は、前記分離工程において前記融合タンパク質の精製ドメインに存在するプロテアーゼ切断性リンカーをプロテアーゼにより切断する前までの工程において、前記微生物又は細胞或いは前記融合タンパク質とリガンドとを接触させる工程を含む。当該工程の存在により、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体の三次元構造がより安定に保持されることに繋がることになる。
本発明の複合体取得方法は、上記工程において、例えば、前期微生物又は細胞或いは前記融合タンパク質を保持してなる溶液に、リガンドが溶解している溶液を添加することで、自然拡散により接触させることができる。その際のリガンドの終濃度は、例えば0.001pM〜500mMであり、好ましくは、１nM〜200mMであり、より好ましくは、1nM〜100mMである。実施例においては、前記工程における第二工程から第五工程において、前記融合タンパク質とリガンドを、例えば、10mMの濃度で接触させればよい。リガンドは、例えば、Dimethyl sulfoxide、メタノールやエタノール等の溶媒に溶解して保存していてもよい。
尚、上記リガンド接触工程を実施する限り、上記の特定な工程以降の次工程はリガンド存在下において実施しても構わない。
【００３０】
次に、本発明結晶は、下記の結晶取得方法（以下、本結晶取得方法と記すこともある。）によって取得することができる。
本結晶取得方法は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の取得方法であって、本複合体取得方法により得られた複合体に結晶化処理を施すことにより得られる結晶を回収する工程を有する。
【００３１】
本結晶取得方法において、前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることが好ましい。
【００３２】
本結晶取得方法における結晶化処理は、例えば、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加する操作又は溶媒量を蒸発等により減少させる操作等により、当該タンパク質が溶液状態から非溶解状態になる際に、結晶として析出する性質を利用している。また、結晶化させる条件として、当該タンパク質の種類、状態若しくは濃度、塩濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子が関与している。更には、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法としては、例えば、Blundell,T.L.及びJohnson,L.N.,PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY,第59−82頁,(1976)Academic Press,New York等に記載されるような、バッチ法、透析法、蒸気拡散法等の処理のための手法を挙げることができる。
蒸気拡散法には、例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法及びオイルバッチ法等があり、好ましくはオイルバッチ法である。当該オイルバッチ法において用いられるオイルとしては、例えば、シリコンオイル、パラフィンオイル、シリコンオイルとパラフィンオイルとを一定の混合比で混合したオイル（好ましくは、シリコンオイルとパラフィンオイルとを１：１の混合比で混合したオイル）等が挙げられる。通常、結晶化スクリ−ニングのプレ−トのWellに分注するオイルの種類及び分注量により、結晶化ドロップの蒸気拡散の速度を調節すればよい。具体的には例えば、オイルの分注量としては１０μｌ〜２００μｌ程度、好ましくは３０μｌ〜６０μｌ程度、さらに好ましくは４０μｌ程度を挙げることができる。
結晶化処理において使用される結晶化プレ−トとしては、７２Ｗｅｌｌ、９６Ｗｅｌｌ、３８４Ｗｅｌｌ及び１５３６Ｗｅｌｌ等のプレ−トを使用すればよいが、結晶化スクリ−ニングに使用できうるプレ−トであれば特にＷｅｌｌの数には制限はない。
【００３３】
本結晶取得方法において、本複合体取得方法により得られた複合体に結晶化処理を施す際に、必要に応じてグルココルチコイド受容体のコアクチベ−タ−ペプチドを存在下において結晶化処理を施してもよい。
共存させるコアクチベ−タ−ペプチドとしては、例えば、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチド等を挙げることができる。
ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチドとしては、ＮＲ  ＢＯＸ３であり、具体的には、例えば、ＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫ、ＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤ、ＰＶＳＰＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤＴ、ＱＥＰＶＳＰＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤＴＫＤのアミノ酸配列からなるＬＸＸＬＬモチ−フを有するアミノ配列からなるものを用いればよい。好ましくは、ＰＶＳＰＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤＴ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＬＸＸＬＬモチ−フを有するアミノ配列からなるものを挙げることができる。
【００３４】
本結晶取得方法の結晶化処理において準備される「目的のタンパク質溶液」は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体、必要に応じてさらに、グルココルチコイド受容体のコアクチベ−タ−ペプチド、を含有する溶液であり、当該溶液中のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体の濃度は、例えば、１ｍｇ／ｍｌ程度以上であればよく、さらに好ましくは２ｍｇ／ｍｌ程度以上である。
上記の結晶化処理において結晶を析出させるために用いられる水溶性物質としては、当該物質を溶液内に添加することにより、当該溶液中のタンパク質の溶解度を減少させ、しかもタンパク質を変性させることなく凝集させ、結晶として析出させることが可能であるような塩類、有機溶媒、高分子化合物等を挙げることができる。
上記の塩類の具体的な例としては、例えば、食塩、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類を挙げることができる。好ましくは、食塩、酢酸アンモニウム、イミダゾ−ル又は酒石酸アンモニウム等が挙げられる。より好ましくは、イミダゾ−ル又は酢酸アンモニウムを挙げることができる。
上記高分子化合物の具体的な例としては、例えば、ポリエチレングリコ−ル等を挙げることができる。好ましくは、平均分子量約１０００〜１５，０００程度のポリエチレングリコ−ルであり、より好ましくは約６０００〜８０００程度のポリエチレングリコ−ルであればよい。
このような水溶性物質の溶液内への添加濃度は、例えば、水溶性物質が塩類である場合には、終濃度約５〜７０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１０〜６０％（Ｗ／Ｗ）であればよい。水溶性物質が高分子化合物である場合には、終濃度約０．５〜５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは、約１.３％〜４．０％（Ｗ／Ｗ）であればよい。
また、前記「目的のタンパク質溶液」のｐＨは、通常、約２〜１０程度に保つことがよい。好ましくは約７〜９程度に保つことがよい。当該溶液の温度は、通常、約１〜４０℃程度に保つことがよい。好ましくは４〜２５℃程度に保つことがよく、より好ましくは４〜２０℃程度に保つことがよい。結晶化処理に要する時間は、約１分間〜２ケ月間程度であればよい。
このようにして結晶化処理を施すことにより得られる結晶を回収することにより取得された結晶は、必要に応じて、種結晶としてシ−ティング及び／又はマクロシ−ティングに用いることによって、Ｘ線結晶構造解析に適した大きさの結晶にさらに成長させることもできる。
【００３５】
本発明において、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標を決定するための手法として用いられる「Ｘ線結晶構造解析」の手法は、例えば、タンパク質の三次元構造を誘導し、明らかにするための解析手法として最も一般的に用いられるものである。具体的には例えば、Blundell,T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY,1−565頁,(1976) Academic Press, New York等に記載されているような手法であって、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線を照射することにより、得られるＸ線の回折像を元に、当該タンパク質の三次元構造を誘導し、明らかにしていくための解析手法である。
当該Ｘ線構造解析に適した他の条件や技術は、例えば、Glusker,J.,Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists,Wiley−VCH Press(1994)、International Tables for X−Ray Crystallography,第F巻,M.G.Rosssman及びE.Arnold編,Kluwer Academic Publishers(2001)等に記載されるようなものを適用してもよい。具体的には例えば、HKL2000〔Otwinowskiら,Methods Enzymol.276:307−326(1997)〕のSCALEPACKモジュ−ルを使用してデ−タを同型的に測定することもでき、或いは、d＊Trek(Rigaku MSC)若しくはSCALA(共同計算プロジェクト(COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT)No.4 「The CCP4 Suite：Programs for Protein Crystallography」〔Acta Cryst.D50,760-763(1994)〕を使用して測定することもできる。そして引き続き行われる全ての計算には、ＣＮＸパッケ−ジ（Accelrys, Inc.）を使用すればよい。或いは、ＣＣＰ４プログラム・パッケ−ジソフト若しくは当業者に周知のソフトウェア・パッケ−ジの組み合わせを用いて原子座標を同定することもできる。
このような解析手法を用いてグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む結晶の原子座標を決定し、決定された原子座標からタンパク質の三次元構造を誘導すればよい。
【００３６】
本発明結晶は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む斜方晶系の結晶であり、空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°である。尚、本発明における「グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を含む斜方晶系の結晶」の構成成分としては、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン及びリガンドの両構成成分以外に、グルココルチコイド受容体のコアクチベ−タ−ペプチドを構成成分として含有していてもよい。
また本発明結晶は、一般的なＸ線結晶構造解析の手法により、２．８オングストロームの分解能で解析することもできる。
【００３７】
このような２構成成分である結晶又は３構成成分である結晶を取得するために本複合体取得方法において用いられる代表的なリガンドは、非ステロイド骨格を有するリガンドであり、より代表的には、非ステロイド骨格を有し、かつ、アゴニスト活性を有するリガンドである。具体的な化合物としては、6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneである。また同様に本複合体取得方法において用いられる代表的なグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである。必要に応じて共存させる代表的なコアクチベ−タ−ペプチドは、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチド（より具体的には、ＰＶＳＰＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤＴ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＬＸＸＬＬモチ−フを有するアミノ配列からなるもの）である。
【００３８】
本発明結晶の原子座標は、グルココルチコイド受容体の変異体、作動薬剤又は拮抗薬剤を同定、検索、評価又は設計するために用いられる。また、本発明結晶の原子座標に基づいて三次元構造を誘導することにより、前記複合体の全体構造を明らかにすることもできる。
【００３９】
本発明には、（１）本発明原子座標の全部又は一部を格納しているコンピュ−タ用記憶媒体、（２）グルココルチコイド受容体の変異体、作動薬剤又は拮抗薬剤を同定、検索、評価又は設計するための、本発明原子座標の全部又は一部、或いは、前コンピュ−タ用記憶媒体の使用、（３）分子置換の手法を用いた結晶構造解析における、本発明原子座標の全部又は一部、或いは、前コンピュ−タ用記憶媒体の使用等も含まれている。
【００４０】
また本発明には、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと被験物質との化学的相互作用性を、本発明結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を基準として用いて評価するための、本発明結晶の使用も含まれている。前記グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインであることが好ましい。
本発明結晶から得られる原子座標を、タンパク質の三次元構造を表現するコンピュ−タ−・プログラムが動作するコンピュ−タ−又はそのコンピュ−タ−用記憶媒体に入力することにより、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの三次元空間的な化学的相互作用性に係る状態を詳細に表現することが可能になる。ここで、「化学的相互作用」とは、例えば、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと被験化合物分子の間の相互作用エネルギー等を意味するものである。ここで、「相互作用エネルギー」とは、例えば、水素結合、静電相互作用、及びファンデルワールス力等を意味するものである。
コンピュ−タ−用記憶媒体としては、本発明結晶から得られる原子座標に基づいて三次元構造を誘導可能であるコンピュ−タ−・プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリーと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フレキシブルディスク、ハ−ドディスク、光ディスク、光磁気ディスク又は磁気テ−プ等の半永久的な記憶媒体でもよい。
【００４１】
タンパク質の三次元構造を表現するコンピュ−タ−・プログラムとしては、例えば、タンパク質等の原子座標の入力手段、当該原子座標のコンピュ−タ−画面への視覚的表現、表現されたタンパク質等内における各原子間の距離や結合角等を測定する手段、当該原子座標の追加修正を行う手段等を提供できるように作成されたプログラムであれば特に制限されるものではないが、更に、タンパク質等の原子座標を元に当該分子の構造エネルギ−を計算する手段、水分子等の溶媒分子を考慮して自由エネルギ−を計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを好ましく挙げることができる。具体的には例えば、コンピュ−タ−・プログラムであるInsightII(Accelrys, Inc.)やQUANTA(Accelrys, Inc.)等を挙げることができる。
尚、このようなコンピュ−タ−・プログラムは、通常、シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社等から供給されているワ−クステ−ションと呼ばれるコンピュ−タ−に導入されて使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明作動薬剤は、下記のような探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。このような作動薬剤は、肥満、糖尿病、炎症、炎症性疾患、免疫及び自己免疫疾患等の後出の疾病の治療に特に有用である。
【００４３】
本発明は、グルココルチコイド受容体の作動薬剤有効成分となり得る物質の探索方法であって、本発明結晶の原子座標又は当該原子座標に基づいて誘導された三次元構造を有するリガンド結合のためのポケットに被験物質を適用し、当該ポケットに適合する被験物質を選択する工程を有することを特徴とする方法や、下記の
（１）本発明結晶の原子座標が第一記憶手段に入力される工程、
（２）被験物質の原子座標が第二記憶手段に入力される工程、
（３）入力された両者の原子座標に基づき、前記被験物質の原子団の特性と各原子団の距離との組み合わせにより特定される空間配置を安定的に最適化することによるリガンド結合ポケットに結合する被験物質の選択がコンピュ−タ処理手段により行われる工程
を有することを特徴とする方法も含まれている。
当業者は、当該目的に適当なプログラムが作動するように調整されているコンピュ−タ−を用いて、本発明結晶の原子座標を、当該コンピュ−タ−又はその記憶媒体に導入することによって、初めて三次元空間での各原子の配置まで表現された状態を理解することができる。これによって、リガンド結合のためのポケットに結合する被験物質を選択することが可能になるのである。その結果、本発明結晶の原子座標に基づきリード化合物の最適化を行うことができる。
【００４４】
リ−ド化合物を実験的に見い出す手法としては、例えば、コンビナトリアル・ライブラリ−として知られている一連の化合物、市販の化合物ライブラリ−、及び、微生物若しくは細胞等の培養物中から、ハイスル−プットスクリ−ニング等の技術により選抜してもよい。得られたリ−ド化合物とグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの化学的相互作用性に係る評価において、最適ではない化学的相互作用性を有する部位を見い出し、より最適化された化合物を設計すればよい。初期の段階では、正確にリ−ド化合物とグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの化学的相互作用性に係る情報の詳細を明らかにする方法としては、本結晶取得方法を用いて、前記リ−ド化合物とグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの複合体を含む結晶を取得し、上述のようなＸ線結晶構造解析技術の手法を用いて化学的相互作用性に係る情報の詳細を知ることが可能となる。同じ系統の化合物群においては、コンピュ−タ−による視覚的検討及び／又はエネルギ−計算を実施し、比較することにより、リ−ド化合物とグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの化学的相互作用性に係る情報を理解することもできる。
【００４５】
このコンピュ−タ−・プログラム及び同様のプログラムにより利用される一般法としては、例えば、下記３つの応用例を挙げることができる。これら技術の幾つかに関するより詳細な情報は、モレキュラ−・シミュレ−ションのユ−ザ−ガイド（１９９５）等に記載されている。
当該目的に用られる代表的なコンピュ−タ−・プログラムは、以下の工程からなる。
（ａ）タンパク質から既存の化合物を除く。
（ｂ）コンピュ−タ−・プログラム（DOCK等）を用いて、被験物質の三次元構造を活性部位にドッキングさせるか、又は、当該物質を化学的相互作用性が高まるように活性部位に移動させることにより、ドッキングさせる。
（ｃ）当該化合物と活性部位原子との間の空間を特徴付ける。
（ｄ）（ｉ）当該化合物と活性部位との間の空の空間に適合し、（ｉｉ）当該被験物質に結合し得る分子フラグメントをライブラリ−で探索する。
（ｅ）上で見い出されたフラグメントを当該被験物質に結合し、新たに修飾された化合物を評価する。
尚、工程（ｃ）では、活性部位の原子と当該被験物質との間に形成される幾何学的及び補足的相互作用を特徴付けることが重要である。好適な幾何学的適合は、有意な表面積が不適切な立体相互作用を形成せずに当該被験物質と活性部位原子との間で共有するときに達成される。尚、上記の工程（ｄ）及び（ｅ）を飛ばして、多くの化合物のデ−タベ−スをスクリ−ニングすることもできる。
【００４６】
多くの化合物をスクリ−ニングするコンピュータ・プログラムとしては、例えば
（１）GRID(P.J.Goodford,「A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromoecules」,J.Med.Chem.,28,849-857頁(1985))、（Oxford University,Oxford,UKから入手可能）；
（２）MCSS(A.Mirankerら、「Functionality Maps of Binding Sites:A Multiple Copy Simultaneous Search Method」、Proteins:Structure,Function and Genetics,11,29-34頁(1991))、（Accelrys, Inc.から入手可能）、；
（３）AUTODOCK(D.S.Goodsellら、「Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing」、Proteins:Structure,Function,and Genetics,8,195-202頁(1990))、（Scripps Research Institute,La Jolla,CAから入手可能）；
（４）DOCK(I.D.Kuntzら、「A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions」、J.Mol.Biol.,161,269-288頁(1982))、（University of California,San Francisco,CAから入手可能）；
（５）GOLD (Jones ET al.、 J. Mol. Biol 267:727-748 (1997))、（Cambridge Crystallographic Data Centre(UK)より入手可能）；
（６）GLIDE (Eldridge ET al.、 J. Comput. Aided Mol. Des. 11:425-445 (1997))、（Schrodinger(Portland OR) より入手可能）；
（７）FlexX(Tripos,Inc.)、（Tripos,Inc.より入手可能）；
（８）Flexidock(Tripos,Inc.)、（Tripos,Inc.より入手可能）；
（９）GRAMM(Ilya A.Vakser、RockefellerUniv.)、（RockefellerUniv.より入手可能）；
を挙げることができる。
【００４７】
また使用する被験物質のデ−タベ−スは、
（ａ）Elsevier MDL
（ｂ）Cambridge Crystallographic Data Centre
（ｃ）Chemical Abstracts Service
（ｃ）The Thomson Corporation
（ｄ）Maybridge
（ｅ）Sigma-Aldrich
等から入手可能である。
【００４８】
被験物質の２Ｄ構造から３Ｄ構造への立ち上げは、例えば
（１）CONCORD (Tripos,Inc)、
（２）Sketcher and Converter (Accelrys, Inc.)
等のコンピュ−タ−・プログラムを挙げることができる。
【００４９】
グルココルチコイド受容体の作動薬剤の有効成分の構造ベ−ス設計及び同定は、アッセイスクリ−ニングとの連携で使用することができる。化合物についての大型コンピュ−タ−デ−タベ−ス（約１０，０００化合物）は時間の問題で検索できるので、コンピュ−タ−をベ−スとする方法は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの可能なモジュレ−タ−として細胞アッセイによりテストすべき化合物を狭めることができる。
【００５０】
グルココルチコイド受容体の作動薬剤の有効成分を同定するもう一つの方法として、化合物の既存モジュレ−タ−を修飾することである。例えば、モジュレ−タ−のコンピュ−タ−画像をグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインのコンピュ−タ−画像内で修飾することができる。
これらの方法は、例えば、
（１）LUDI (H.-J. Bohm、 J. Comp. Aid. Molec. Design 6:61-78 (1992)、Accelrys, Inc.より入手可能；
（２）LEGEND (Y. Nishibata ET al.、 Tetrahedron 47:8985 (1991)、Accelrys, Inc.より入手可能；
（３）LeapFrog、Tripos, Inc.より入手可能；
（４）SPROUT V. Gillet ET al、 J. Comput. Aided Mol. Design 7:127-153 (1993)、University of Leeds(UK)より入手可能
を挙げることができる。
モジュレ−タ−のコンピュ−タ−画像は、１個又は複数の置換基を削除するか、あるいは１個又は複数の置換基を付加することにより修飾する。化合物に対する各修飾により、修飾化合物及び活性部位の原子がコンホメ−ション内でシフトし、モジュラ−と活性部位原子との間の距離が２つの分子間に形成される補足的な相互作用性と共に評価される。評価は、好適な幾何学的適合及び好適な相互作用が得られるときに完了する。好適な評価を持つ化合物は、グルココルチコイド受容体の潜在的モジュレ−タ−である。
【００５１】
構造ベ−スモジュレ−タ−設計の他の方法は、モジュレ−タ−構築又はモジュレ−タ−検索コンピュ−タ−・プログラムにより設計された化合物をスクリ−ニングすることである。この型のコンピュ−タ−・プログラムとしては、例えば、Catalyst（Accelrys, Inc.）、ISIS/HOST（Elsevier MDL）、ISIS/BASE（Elsevier MDL）、ISIS/DRAW（Elsevier MDL）、UNITY (Tripos,Inc)等のコンピューター・プログラムを使用して行うことができる。これらのコンピュ−タ−・プログラムは、化合物とグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの複合体の三次元構造の活性部位から除去した化合物の構造に基づき操作する。そのような化合物につきプログラムを操作するのは、それが生物学的に活性なコンホメ−ションである故に好ましい。モジュレ−タ−構築コンピュ−タ−・プログラムは、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとの複合体中、置換基のコンピュ−タ−画像をコンピュ−タ−デ−タベ−スからの置換基と置換えるのに使用することが可能なコンピュ−タ−・プログラムである。モジュレ−タ−検索コンピュ−タ−・プログラムは、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインに結合した化合物と類似の三次元構造及び類似の置換基を有するコンピュ−タ−デ−タベ−スからの化合物のコンピュ−タ−画像を検索するのに用いることができるコンピュ−タ−プログラムである。
このようなコンピュ−タ−・プログラムは、以下の一般工程を用いて操作することができる。
（ａ）水素結合供与体又は受容体、疎水性／親油性、正にイオン化し得る部位、又は負にイオン化し得る部位により等、化学的特徴点により化合物をマップ化する。
（ｂ）幾何学的な拘束をマップ化した特徴点に加える。
（ｃ）（ｂ）で生成したモデルでデ−タベ−スを検索する。
【００５２】
コンピュ−タ−ベ−スのモジュレ−タ−設計及び同定の汎用性は、コンピュ−タ−・プログラムにより、スクリ−ニングした構造の多様性にある。コンピュ−タ−・プログラムは、２００，０００分子を含むデ−タベ−スを検索することが可能であり、多様な化学官能基を持つ酵素とすでに複合体を形成しているモジュレ−タ−を修飾することができる。この化学的多様性の重要性は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの機能の潜在的モジュレ−タ−が予測し得ない三次元構造状態を採る可能性があるということである。広範な一連の有機合成技術は、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインが有する機能の潜在的モジュレ−タ−を構築することの挑戦に適う技術にある。これら有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な文献類に詳細に記載されている。そのような文献の一例は、アドバンスド・オルガニック・ケミストリ−：反応、メカニズム及び構造、１９９４年３月、ニュ−ヨ−ク、マグロウヒル、である。このように、コンピュ−タ−ベ−ス法により同定されるグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインの潜在的モジュレ−タ−を合成するのに必要な技術は、有機化学合成の当業者に容易に利用可能である。
【００５３】
本発明には、被験物質について、本発明探索方法１又は本発明探索方法２により選択された当該被験物質が有する前記化学的相互作用性の有無又はその程度に係るデ−タ情報を入力・蓄積・管理する手段（以下、手段ａと記すこともある。）、前記デ−タ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段（以下、手段ｂと記すこともある。）、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段（以下、手段ｃと記すこともある。）を具備することを特徴とするシステムも含まれている。
【００５４】
まず、手段ａについて説明する。手段ａは、前記のとおり、本発明探索方法１又は本発明探索方法２により選択された当該被験物質が有する前記化学的相互作用性の有無又はその程度に係るデ−タ情報を入力した後、入力された当該情報を蓄積・管理する手段である。かかる情報は、入力手段１により入力され、通常記憶手段２に記憶される。入力手段としては、例えばキ−ボ−ド、マウス等の当該情報の入力可能なものが挙げられる。当該情報の入力及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｂに進む。尚、当該情報の蓄積・管理には、コンピュ−タ等のハ−ドウェアとＯＳ及びデ−タベ−ス管理等のソフトウエアとを用いて、デ−タ構造を有する情報を入力し、適当な記憶装置、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハ−ドディスク等のコンピュ−タ読取可能な記録媒体に蓄積することにより、大量のデ−タを効率良く蓄積し管理すればよい。
【００５５】
手段ｂについて説明する。手段ｂは、前記のとおり、手段ａにより蓄積・管理された前記デ−タ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段である。かかる情報は、入力手段１により照会・検索のための条件が入力され、通常記憶手段２に記憶された上記情報の中で当該条件に合致したものを選択すれば、次の手段ｃに進む。選択された結果は、通常、記憶手段２に記憶され、さらに表示・出力手段３により表示可能となっている。
【００５６】
手段ｃについて説明する。手段ｃは、前記のとおり、照会・検索された結果を表示・出力する手段である。表示・出力手段３としては、例えばディスプレイ、プリンタ等が挙げられ、当該結果をコンピュ−タのディスプレイ装置に表示するか、印刷等により紙上に出力するか等すればよい。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
実施例１  （発現ベクターの構築）
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインをクロ−ニングし、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン（５２２−７７７）を配列番号４及び５で示される塩基配列からなるプライマ−（配列番号４：GGTATTGAGGGTCGCCTGGTGCCACGCGGTTCTCCTGCAACGTTACCACAACT、配列番号５：AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTTTTGATGAAACAGAA）を用いてＰＣＲにより増幅した。次いで、得られた増幅ＤＮＡをｐＥＴ３２／ＸａＬＩＣベクタ−（Novagen）にクロ−ン化した。クロ−ン化されたヒト由来のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインを配列番号６及び７で示される塩基配列からなるプライマ−（配列番号６：ATCATCATCATTCTTCTGGTGGTATGAAAGAAACCGCTGC、配列番号７：GCAGCGGTTTCTTTCATACCACCAGAAGAATGATGATGAT）を用いてクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発(QuickChange Site directed mutagenesis)によりｐＥＴ３２／ＸａＬＩＣベクタ−(Novagen)上のスロンビン切断部位を削除した。Ｎ末端から順にチオレドキシンタグ、ポリヒスチジンタグ、スロンビン切断部位を含めるように発現ベクターを構築した。当該発現ベクターでＦ６０２のＳによる置換及びＣ６３８のＤによる置換をクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発(QuickChange Site-Direct Mutagenesis)キット(STRATAGENE)を用いて行った。このようにして得られた発現ベクターを大腸菌(E. coli)菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００５９】
実施例２  （タンパク質発現及び精製）
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインをｐＥＴ３２／ＸａＬＩＣベクタ−（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＴ７プロモ−タ−により駆動して融合タンパク質として発現させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドが添加された２ｘＹＴ培地（組成：１６ｇ, tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl／Ｌ  culture）を用いてリガンド非存在下で、１５℃で１６〜２０時間培養した後、遠心分離（７３３０g,  １２min,  ４℃）で大腸菌を回収することにより、菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを−８０℃で保存した。
約８０ｇの菌体ペレットを３００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  β −ｍｅｒｃｈａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２Ｍ  ＵＲＥＡに懸濁した後、これに6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneを１０μＭの濃度となるように添加した。得られた菌混合物をDigital Sonifer S-450D(BRANSON)を用いて超音波処理（レベル５の強度、氷上、２０分間）に施すことにより、菌体破砕物を得た。菌体破砕液を、遠心分離（38900g, 30min, 4℃）で遠心後、上清を回収した。
次に、得られた上清をニッケルキレ−ト化樹脂上でのクロマトグラフィ−に供した後、０．０４−０．５Ｍイミダゾ−ルの勾配溶出により、前記融合タンパク質（約９０％純度）を全部で１０〜３０ｍｇ回収した。得られた融合タンパク質（即ち、チオレドキシン及びポリヒスチジンと融合されてなるヒト由来のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。尚、配列番号１における第157番目から第162番目までのアミノ酸領域がスロンビン切断部位である。
【００６０】
得られた融合タンパク質をＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス）に供した後に得られた溶液の溶媒を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  β −ｍｅｒｃｈａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０μＭ  6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅのリガンド含有緩衝液に置換した。置換後の前記溶液に、スロンビン（アマシャムバイオサイエンス）を５００Ｕ添加した後一晩、４℃で置くことにより、前記融合タンパク質中のスロンビン切断部位を開裂させた。得られた開裂物の溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２５ｍｌで平衡化された、予めＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス）５ｍｌが充填された１６／２０カラム（アマシャムバイオサイエンス）に供することにより、図２に示すグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとの複合体を回収した。
回収された前記複合体を２５ｍｌの５０ｍM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．０、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴで平衡化されたＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  ５ｍｌ(アマシャムバイオサイエンス)カラムを通過させた後に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ１０（アミコン）を用いて１４ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
濃縮後のグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインを５０ｍM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．０、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭ  6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one、５００ｍＭ  酢酸アンモニウム、１００μＭ  ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチド（配列番号８）からなる溶液を用いて１０倍量の体積に希釈した後、当該希釈物をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ１０（アミコン）を用いて濃縮・回収することにより、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンドとからなる複合体であって、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチドを含有する複合体の精製物を得た。
【００６１】
実施例３  （結晶化）
実施例２で得られた複合体の精製物をマイクロバッチ法に基づいた下記操作により、結晶化させた。
プレ−トは９６穴プレ−ト（コ−ニング）を使用し、４０μｌのオイルを添加した。オイルはシリコンオイル(HAMPTON RESERCH)とパラフィンオイル(HAMPTON RESERCH)とを１：１で混合したものを用いた。
オイル下で、０．４μｌの各種の沈殿剤と２．０μｌの実施例２で得られた複合体の精製物とを混合し、これを結晶化サンプルとした。
４℃で約１か月後に、沈殿剤が下記の組成である場合における１つの結晶化ドロップの中から、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンド（6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one）とからなる複合体であって、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチドを含有する複合体を含む結晶（即ち、本発明結晶）が複数個得られた。
【００６２】
＜沈殿剤の組成＞
組成１．８％(Ｗ／Ｖ)  ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ  酢酸アンモニウム、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）
組成２．１Ｍ  イミダゾ−ル（ｐＨ７．０）
【００６３】
このようにして調製された本発明結晶と、上記と同様な組成を有する沈殿剤とを１：１で混合してなる結晶化ドロップを、４０μｌの上記と同様な組成を有するオイル内で調製することにより、新たな結晶化ドロップを２０℃で作製した。
作製された結晶化ドロップに、上記ですでに調製された本発明結晶の複数個を、種結晶として添加した。結晶は経時的に大きくなり、７〜１０日間後には測定可能な大きさまで成長した。
成長した本発明結晶の一例を図２（沈殿剤の組成が組成１である場合）及び図３（沈殿剤の組成が組成２である場合）に示す。
【００６４】
実施例４  （デ−タ測定）
実施例３で調製された本発明結晶をレ−ヨン製ル−プ（HAMPTON RESERCH）で掬い、クライオプロテクタントとして２０％グリセロ−ルが添加されたリザ−バ−溶液に１〜３秒間浸透させた後、液体窒素により急速冷凍した。急速冷凍後の本発明結晶を液体窒素中で保存した。保存後の本発明結晶を１００Ｋ窒素気流下でＸ線回折強度を、振動法により収集した。デ−タ測定は波長１．５４１８オングストロームのＸ線を用いて行った。検出器はR-AXIS IV++(リガク)であり、読み取り装置部は、直径３００×３００ｍｍのイメ−ジングプレ−トを用いた。カメラ長は２００ｍｍであり、露光時間を１５分間とした。振動角は１度とした。またデ−タ処理及び分析のために、Crystal Clear 1.3 (リガク)を使用した。本発明結晶から得られたX線回折写真を図１に示す。
測定されたデ−タを解析した結果、本発明結晶は、空間群がI２１２１２１に属し、単位格子がａ＝４８．０４オングストローム、ｂ＝１１６．５４オングストローム、ｃ＝１６４．０３オングストローム、α＝β＝γ＝９０°である結晶であることが判明した。
【００６５】
2006265173.tif 000006
【００６６】
実施例５  （三次元構造の精密化）
プロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン等を用いて分子モデルを構築し、分子置換プログラム（AMORE等((CCP4(Collaborative Computational Project,Number4.Acta Crystallogr. D50, 670−673(1994))の一つ)により、初期構造を決定する。三次元構造の精密化は、QUANTA2000バージョン00.1110（Accelrys, Inc.）とCNX（Brunger,a.ｔ.et  al.,  1998）等により行う。
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合部位に、6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneに係る電子密度マップが確認できる。6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-oneを電子密度マップに適合させる。
【００６７】
QUANTA2000バージョン00.1110（Accelrys, Inc.）とCNX（Brunger,a.ｔ.et  al.,  1998）等を用いてさらに三次元構造の精密化を実施し、本発明結晶の原子座標を決定する。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインと非ステロイド骨格を有するリガンドとの複合体を含む結晶等が提供可能となる。さらに当該結晶及びこれから得られる情報等を利用することにより、グルココルチコイド受容体の変異体、作動薬剤又は拮抗薬剤等を同定、検索、評価又は設計するための方法も提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本発明結晶から得られたＸ線回折写真である。
【図２】図２は、沈殿剤の組成が組成１（８％(Ｗ／Ｖ)  ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ  酢酸アンモニウム、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））である場合において調製された、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンド（6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one）とからなる複合体であって、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチドを含有する複合体を含む結晶（本発明結晶）を示す図（写真）である。
【図３】図３は、沈殿剤の組成が組成２（１Ｍ  イミダゾ−ル（ｐＨ７．０））である場合において調製された、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインとリガンド（6-[[3-[1-(2-Chloro-5-fluorophenyl)cyclobutyl]-2-hydroxy-2-trifluoromethylpropionyl]amino]-4-methyl-2,3-benzoxazin-1-one）とからなる複合体であって、ＴＩＦ２コアクチベ−タ−ペプチドを含有する複合体を含む結晶（本発明結晶）を示す図（写真）である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−
【図１】
2006265173.tif 000007
【図２】
2006265173.tif 000008
【図３】
2006265173.tif 000009
【配列表】
2006265173000001.app