(57)【要約】【課題】複数の測定ポイントについて短時間で正確な解析を効率よく行うことができる光信号解析方法を提供する。【解決手段】試料に関して指定した測定ポイントから発せられる光を光検出器により検出するステップと、光検出器により出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割して、測定ポイント毎のデータとデータ数を抽出する時分割ステップと、異なる遅延時間に対して測定ポイント毎のデータ及びデータ数を再構成するステップと、再構成した各データを用いて統計計算を行うとともに、再構成した各データ数を用いて統計計算を行うステップと、２つの統計計算の結果を用いて試料の物理的性質を求める。【選択図】        図３
2006078377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に関して指定した測定ポイントから発せられる光を光検出器により検出するステップと、
前記光検出器により出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割して、測定ポイント毎のデータとデータ数を抽出する時分割ステップと、
異なる遅延時間に対して測定ポイント毎のデータ及びデータ数を再構成するステップと、
再構成した各データを用いて統計計算を行うとともに、再構成した各データ数を用いて統計計算を行うステップと、
前記２つの統計計算の結果を用いて試料の物理的性質を求めることを特徴とする光信号解析方法。
【請求項２】
前記試料に関する複数の測定ポイントを選択し、各測定ポイントから発せられる光を前記光検出器により検出し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎に分割して取り出し、前記分割した時系列信号毎に解析を行うことにより、前記試料の複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項１記載の光信号解析方法。
【請求項３】
前記光検出器から出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎にデータ分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行うことにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項２記載の光信号解析方法。
【請求項４】
前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行い、前記データ再構成によるデータ数に関する情報をウェイトとし、前記ウェイトと、複数の測定ポイント毎の分割再構成データとの組み合わせにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求めることを特徴とする請求項２記載の光信号解析方法。
【請求項５】
前記試料から発せられる光は、螢光、燐光、反射光または散乱光であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項６】
前記光信号の解析は、自己相関分析法または、フォトンカウンティングヒストグラム法を用いて行われることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項７】
前記光信号の解析は、相互相関分析法または、コインシデンス解析法を用いて行われることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項８】
前記再構成するステップは、
ａ）計測された各計測区間のデータおよびデータの数を一定時間記憶するステップと、
ｂ）隣接する複数の計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、
ｃ）演算結果を、演算に用いた隣接する計測区間の総和に等しい計測区間幅をもつ新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、
ｄ）新たに計測された計測区間のデータおよびデータの数を所定時間記憶するステップと、
ｅ）隣接する複数の新たな計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、
ｆ）演算結果を、演算に用いた新たな計測区間の時間の総和に等しい次の新たな計測区間幅をもつ次の新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、を具備し、
上記d)からｆ）のステップを所定の回数繰り返すことにより、試料の物理的性質を求めることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【請求項９】
前記試料に関する測定ポイントの物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１つに記載の光信号解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光信号解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光信号解析方法として以下の文献に示すような方法が提案されている。これらの光信号解析方法において、自己相関関数等を推定する場合には、１ヶ所のみの測定ポイントについて蛍光の強度の時系列信号を取得し、マルチプルτ方式の計算手法により自己相関関数を推定していた。また、複数の測定ポイントについては、それぞれ連続した蛍光強度の時系列信号を取得し、測定ポイント間は独立したシングルポイントマルチプルτ方式解析方法を用いていた。
【０００３】
標本内の複数の測定ポイントで一定時間間隔ごとに自己相関関数の推定を行おうとした場合、概して２つの方法が考えられる。第１の方法は、作業をすべての測定ポイントについて、順次行う方法である。すなわち、まず一つの測定ポイントで自己相関関数の推定を行い、次に他の測定ポイントに移動して、同様に自己相関関数を推定する。更にまた、別の測定ポイントに移動し、同様に自己相関関数を推定するという作業をすべての測定ポイントについて順次行う。
【０００４】
また、第２の方法として、複数の測定ポイントについて同時に測定を行い、同時に相関関数の推定を行う方法がある。
【非特許文献１】「New Concept in Correlator Design」, Klaus Sch-tzel, Inst. Phys. Conf. Ser.            No.77, P175, 1985.
【非特許文献２】「Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data」, Klaus Sch-tzel, SPIE             Vol.1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991.
【非特許文献３】「Photon Correlation Measurements at Large Lag Times」, Klaus Sch-tzel et            al., Journal of Modern Optics, Vol.35, No.4, P711, 1988.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した第１の方法では、推定全体に時間がかかると共に、作業も繁雑である。また、測定ポイントを逐次移動していくために、測定ポイント間の時間差は大きく、長時間を要する。
【０００６】
また、第２の方法をソフトウェアにより実現するには、メモリの制限、ＣＰＵの制限を受ける。また、光計測部分を複数セット要し、各セットの光測定条件（測定領域、照射強度、カウントレート等）を一致させることは難しく、誤差の原因となる。従って、上記した複数ポイントについて同時に測定を行って自己相関関数を推定することは非常に困難である。
【０００７】
すなわち、測定ポイントごとに測定時刻のずれ（時間遅れ）が生じ、測定条件の誤差が含まれるため、細胞内外で生じる速い反応、例えば、たんぱく質―たんぱく質相互作用、細胞内のシグナル伝達などをリアルタイムで測定することができなかった。
【０００８】
そこで、上記した欠点を克服するために、複数の測定ポイントについて短時間交替して測定し、測定の完了後、すべてのデータを用いたマルチポイントＦＣＳの一般的な解析方法が提案された。この方法では、複数ポイントの逐次測定法を用いて測定、計算と表示を順番に実現している。
【０００９】
しかし、すべてのデータの測定を完了した後に解析計算をスタートさせ、すべてのデータ位置を計算チャンネルとし、すべてのデータを扱って繰り返し相関計算を行うため、画像化に要する時間が長い。したがって、測定時間が長くなるほど、測定ポイントが増えるほど、測定、計算、画像化をリアルタイムで行うことは実用上現実的でなくなってしまう。
【００１０】
本発明はこのような課題に着目して行なわれたものであり、その目的とするところは、複数の測定ポイントについてリアルタイムで正確な解析を行うことができる光信号解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明の第１の態様は、光信号解析方法であって、試料に関して指定した測定ポイントから発せられる光を光検出器により検出するステップと、前記光検出器により出力される時系列信号を複数の時系列信号に時間分割して、測定ポイント毎のデータとデータ数を抽出する時分割ステップと、異なる遅延時間に対して測定ポイント毎のデータ及びデータ数を再構成するステップと、再構成した各データを用いて統計計算を行うとともに、再構成した各データ数を用いて統計計算を行うステップと、前記２つの統計計算の結果を用いて試料の物理的性質を求める。
【００１２】
また、本発明の第２の態様に係る光信号解析方法は、第１の態様において、前記試料に関する複数のポイントを選択し、各測定ポイントから発せられる光を前記光検出器により検出し、前記光検出器より出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎に分割して取り出し、前記分割した時系列信号毎に解析を行うことにより、前記試料の複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。
【００１３】
また、本発明の第３の態様に係る光信号解析方法は、第２の態様において、前記光検出器から出力される時系列信号を前記複数の測定ポイント毎にデータ分割して記憶し、必要に応じて前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行うことにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。
【００１４】
また、本発明の第４の態様は、第２の態様において、前記複数の測定ポイント毎の分割データを再構成して解析を行い、前記データ再構成によるデータ数に関する情報をウェイトとし、前記ウェイトと、複数の測定ポイント毎の分割再構成データとの組み合わせにより、前記複数の測定ポイント毎の物理的性質を求める。
【００１５】
また、本発明の第５の態様は、第１乃至第４の態様のいずれか１つにおいて、前記試料から発せられる光は、螢光、燐光、反射光または散乱光である。
【００１６】
また、本発明の第６の態様は、第１乃至第５の態様のいずれか１つにおいて、前記光信号の解析は、自己相関分析法または、フォトンカウンティングヒストグラム法を用いて行われる。
【００１７】
また、本発明の第７の態様は、第１乃至第５のいずれか１つにおいて、前記光信号の解析は、相互相関分析法または、コインシデンス解析法を用いて行われる。
【００１８】
また、本発明の第８の態様は、第１乃至第７の態様のいずれか１つにおいて、前記再構成するステップは、ａ）計測された各計測区間のデータおよびデータの数(ウェイト)を一定時間記憶するステップと、ｂ）隣接する複数の計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、ｃ）演算結果を、演算に用いた隣接する計測区間の総和に等しい計測区間幅をもつ新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、ｄ）新たに計測された計測区間のデータおよびデータの数を所定時間記憶するステップと、ｅ）隣接する複数の新たな計測区間のデータおよびデータの数を演算するステップと、ｆ）演算結果を、演算に用いた新たな計測区間の時間の総和に等しい次の新たな計測区間幅をもつ次の新たな計測区間のデータおよびデータの数として記憶するステップと、を具備し、上記d)からｆ）のステップを所定の回数繰り返すことにより、試料の物理的性質を求める。
【００１９】
また、本発明の第９の態様は、第１乃至第８のいずれか１つの態様において、前記試料に関する測定ポイントの物理的性質は分子、または粒子の並進拡散係数、回転拡散係数、あるいは前記測定領域内に存在する分子、または粒子の個数、あるいは蛍光寿命である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、複数の測定ポイントについて短時間で正確な解析を効率よく行うことができる。また、複数の測定ポイントの物理的性質の解析を同時に行い、複数の測定ポイントについての測定の順序を自由に組み合わせ、試料の反応、試料間の相互作用などを解析することができる。特に、本発明をマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳとして実現した場合は、マルチプルτ方式シングルポイントＦＣＳと比較して、同時に複数のポイント点を観察することができ、生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。
【００２１】
マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、大量のデータとそのチャンネル位置に対して計算を行う一般的なＦＣＳ計算方式より、計算時間が短く、効率的である。先にデータ計算のτ位置（チャンネル）を決め、すべてのデータを計算に扱いながら、限られた少ないチャンネル位置だけに諸計算処理を限定して行う。
【００２２】
また、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、平均値計算等の手法を用いて、特に大きいビンタイム領域において、計算用データの数を減らし、繰り返し数多いデータを処理することを避け、滑らか効果による誤差の低減を図っている。
【００２３】
マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、データ読込、計算処理に最小解析データ単位として1個のデータを扱うため、割込み手法により、表示等の命令を随時実行することが可能である。リアルタイム表示で、システムのハードウェア的な調整、測定データの異常発見、中止、サンプルの選定、調整が可能である。
【００２４】
なお、複数ポイントについて、一つの励起光源、測定装置を用いて解析、観察を行うため、ポイント間のハードウェア的な誤差がなく、同じ条件下で生体の細胞内外の多様な反応を捉えることができる。
【００２５】
更にまた、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの場合は、ポイント数の増加に伴うプログラミングの簡略化、効率化を目指すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
まず、本発明の概略を説明する。本発明では、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、複数の測定ポイントを時系列で繰り返し測定した測定信号をポイント毎に分割し、各ポイントについてデータテーブルとデータ数を意味する重み係数テーブルとを作成する。そして各測定ポイントにおけるテーブルのデータと重み係数だけを抽出して自己相関関数の計算を行う。ここで、抽出した各測定ポイントのデータと重み係数での計算結果により、同時に複数点の細胞反応を観察するだけではなく、細胞の異なる部位、相互作用等を観察することが可能である。
【００２７】
また、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、データと重み係数の計算用チャンネルはオクターブ方式（８チャンネル毎に初期ビンタイム値を２倍に増していく計算方法であり、後述するステップＳ１２で実施される）を用い、データと重み係数の計算を数少ない有限個のチャンネルの結果に制限し、同間隔の計算結果のプロットを実現する。
【００２８】
更にまた、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、先に異なるτ領域において、異なる遅延時間相当分のデータ平均値と重み係数平均値を計算する。相関計算は、平均した数少ないデータと重み係数だけを用いるため、計算に要する時間が短い。
【００２９】
なお、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのデータ解析において、相関関数の演算を行う際、抽出された測定ポイントのデータと重み係数による種々の処理は、1個のデータあるいは重み係数を計算最小単位とする。従って、計算は割り込み命令により、随時中断され、結果描画状態に移ることが可能で、計算と表示を同時進行させることで、リアルタイム的なマルチポイントＦＣＳの実現が可能である。
【００３０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。本実施形態では、試料の蛍光像観察を行うためにレーザ走査型共焦点光学顕微鏡に適用した場合について説明する。装置の基本的な構成として、レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10と、CCDカメラ11と、試料ステージ12と、試料ステージコントローラー13と、コンピュータ（PC）14と、TVモニタ15と、レーザ光源16とを備える。レーザ光源16の波長によって励起する螢光物質の種類が異なる。本実施形態では、螢光物質としてローダミン・グリーン(Rhodamine Green:RhG)等を用いるが、これを励起するのに適していると考えられる励起波長の一つとして波長488nmのアルゴンレーザを用いる。
【００３１】
レーザ光源16から発せられたレーザ光をレーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10に導き、試料ステージ12上の試料50に照射する。そして、CCDカメラ11で試料50からの螢光を受光し、TVモニタ15、あるいは顕微鏡接眼部を通して試料50の螢光顕微鏡観察を行なう。レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体10の試料ステージ12には2個のステッピングモータ20がそれぞれ90°方向に取り付けられており、それぞれのステッピングモータ20は試料ステージコントローラ13に接続されている。コンピュータ14からの指令により、2個のステッピングモータ20を駆動し、試料ステージ12をX方向、Y方向に移動させる。
【００３２】
次に走査系の構成について説明する。レーザ光源16より発せられたレーザ光をレンズ23‐1、23‐2から構成される拡大光学系(ビームエクスパンダ)に通してビーム直径を拡げてコリメート光とし、プレフォーカシングレンズ24を介してダイクロイックミラー25に導く。
【００３３】
ダイクロイックミラー25は波長488nm付近以下の波長の光を反射し、488nm付近以上の波長の光を透過させるように形成されている。ダイクロイックミラー25により反射されたレーザ光はXYスキャナ22に入射する。レーザ光はXYスキャナ22でX軸、Y軸方向に２次元走査されて対物レンズ21に導かれる。レーザ光はランダムに試料50内をスキャンされ、試料50内に存在する蛍光物質を励起することができる。
【００３４】
試料50内で微小な共焦点領域を形成させるためにここではNA(開口数)1.0の対物レンズ21を用いる。これにより得られる共焦点領域の大きさとして、直径0.6μm程度、長さ2μm程度の中央部がくびれた略円筒状となり、測定領域に存在する蛍光分子は平均して数個程度となる。試料50内の所望の蛍光物質から発せられた蛍光は励起光と同じ光路を通り、ダイクロイックミラー25により入射光路から分離された後、ピンホール26、ハーフミラー27を介して光検出器28により受光される。光検出器28としてはアバランシェフォトダイオード(APD)、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いれば良い。
【００３５】
光検出器28で受光した螢光出力信号を画像処理装置に導き、コントラスト向上、輪郭強調などの画像処理を行なった後、コンピュータ14を通してTVモニタ15上に試料50の2次元画像、あるいは3次元画像を得る。
【００３６】
各XYスキャナ22は互いに直交する方向に走査できるように互いに垂直方向の向きに配置されており、コンピュータ14によって制御されたそれぞれのXYスキャナ駆動装置（不図示）により回動運動を精確に制御される。
【００３７】
XYスキャナ駆動装置にはXYスキャナ角度検出装置(図示しない)が装備されており、リアルタイムで走査角度が精度良く検知され、コンピュータ14にフィードバック制御される。本実施形態ではXYスキャナ22としてガルバノスキャナを用いている。なお、レーザ光をXY走査する手段、すなわちXYスキャナとしてガルバノスキャナに限らず、音響光学変調素子(AOM)やポリゴン鏡、ホログラムスキャナなどを用いても良い。
【００３８】
光検出器28に入射した光強度信号は電気信号に変換され、信号処理装置で波形整形され、on-offの2値化パルスに変換されて、コンピュータ14に導かれる。コンピュータ14は、入力された2値化パルス信号に対して相関演算を行なって自己相関関数を算出する。さらには得られた自己相関関数から、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域内に存在する蛍光分子の数の変化などが求められる。
【００３９】
光検出器28に入射する光強度信号が比較的大きい場合は、光検出器28から出力される電気信号はアナログの時系列信号となる。この場合は信号処理装置でA/D変換し、波形整形を行ない、先と同様に2値化パルス信号に変換する。
【００４０】
また対物レンズ21を光軸方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下させることができる。これにより、3次元画像をTVモニタ15上に生成させることができる。
【００４１】
なお、螢光物質についてはローダミン・グリーンに限ることなく、例えば、TMR(Tetrame-  hylrhodamine)、サイファイヴ(Cy5)、FITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO1、Acridine-Orange、Texas-Redなどを用いても良い。
【００４２】
図３は、重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。ここで、図３の重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの計算の流れは次のとおりである。
【００４３】
まず、ステップS０では、図１の構成を用いて試料50についての測定データとしての時系列測定信号を取得する。図４はこのとき得られる時系列測定信号を示している。縦軸はＩ（蛍光強度）であり、横軸はｔ（時間）である。次に、取得データが存在するか否かを判断し（ステップＳ１）、ＹＥＳの場合にはステップＳ２−1〜２−４に進んで、測定したポイント数とポイント番号を同時に判断する。測定信号のデータファイルあるいは信号にはポイント数とポイント番号の情報が含まれているが、この情報は後部のポイント毎のデータとデータ数情報の分割（分割テーブルの作成）に用いる。
【００４４】
例えば、上記のステップＳ１で測定ポイントが図２に示すような４つのポイントであり、１→２→３→４→１の順にデータ測定が行われた場合、時系列測定信号は、図５に示すように、P1、P2、P3とP4の４つのポイント信号が時系列で配列されたものになる。ここで、P0は、レーザ光をＸＹ操作する手段としてのXYスキャナ22の移動時のランダム測定データ範囲である。P1は、測定ポイント１の測定データ範囲である。P2は、測定ポイント2の測定データ範囲である。P3は、測定ポイント3の測定データ範囲である。P4は、測定ポイント4の測定データ範囲である。
【００４５】
ステップＳ２−1〜２−４で測定ポイントがＰ１であったならば、ステップＳ３以降ではポイント１の計算部分Ｓ１００で示されるステップＳ３〜Ｓ１９の処理を順次実行する。また、測定ポイントがＰ２であった場合にはポイント２の計算部分の処理（ステップＳ２００）、測定ポイントがＰ３であった場合にはポイント３の計算部分の処理（ステップＳ３００）、測定ポイントがＰ４であった場合にはポイント４の計算部分の処理（ステップＳ４００）を実行するが、各計算部分Ｓ２００、Ｓ３００、Ｓ４００では上記ステップＳ３〜Ｓ１９の処理と同様の処理を行う。
【００４６】
ポイント１の計算部分Ｓ１００において、まずステップＳ３では、測定ポイント１のデータ分割を行う。つまり、複数ポイントにおいて、マルチポイントＦＣＳの測定方法で測定した場合、複数ポイントの信号が混在している時系列測定信号（図５）が得られるが、この時系列測定信号を測定ポイントごとのデータに分割する。
【００４７】
ここでは図５に示す信号を図６のような具体的なデータテーブルに例えて測定ポイント毎のデータ分割を行う。図６において、Pointの値は、測定ポイントを示し、１は測定ポイント１、２は測定ポイント２、３は測定ポイント３、４は測定ポイント４である。また、Dataの値は、蛍光強度を示す。
【００４８】
図５の測定信号から測定ポイント1のデータだけを抽出することを考えて、測定ポイント１以外のポイントに相当する位置にはデータ0を埋め込む。これによって、図7のような測定ポイント１の分割データテーブルが作成される。同様の方法によって、測定ポイント１〜４に対して、それぞれの異なる分割データテーブルを作成することができる。図８は、この４つの測定ポイントにおいて作成された４枚の分割データテーブル１０１〜１０４を示している。
【００４９】
同様にしてステップＳ４において、測定ポイント毎に重み係数の分割を行う。図５に示す複数ポイントの測定信号には、ステップＳ3で示したようなデータの大きさを表す情報の他にデータ数（データのポイント位置）を表す情報が含まれている。この情報もポイント毎に分割するが、マルチプルτ方式を用いるマルチポイントＦＣＳではこの情報を重み係数として計算に用いる。
【００５０】
以下に、上記したデータの分割と同様に、図９の具体的な重み係数テーブルを参照して重み係数の分割方法を説明する。図９は図６のテーブル内容に基づくもので、図９中のDataの値は、４つの測定ポイントに対して測定されたデータ数を示し、データ数1個（重み係数＝1）を表す。この部分は、マルチプルτ方式シングルポイントＦＣＳと比較したときの、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独特な解析方法で、解析アルゴリズム中では重み係数として表す。
【００５１】
以下に、重み係数の分割テーブルの作成方法を説明する。まず、図９の重み係数テーブルから測定ポイント1に対する重み係数だけを抽出するとともに、その他の測定ポイントに相当する位置には0という重み係数を埋め込む。これにより、図１０のような測定ポイント１の分割重み係数テーブルが作成される。同様の方法でP2、P3、P4に対して、それぞれの異なる分割重み係数テーブルを作成することができる。図１１は、この４つの測定ポイントにおいて作成された４枚の分割重み係数テーブル２０１〜２０４を示している。
【００５２】
次に、ステップＳ５において、最終的なＦＣＳのプロットに用いる横軸基準値（チャンネル）とその数および所属する段数を計算する。マルチプルτ方式では、読込んだデータ総数によりチャンネル数を決めるが、具体的な計算方法は図１２に示す通りである。つまり、ビンタイムτ0を基準値として0段の初期値とするが、各段の初期値は前段の初期値の2倍とする。各段のチャンネル数は、0段を16個とし、以降の各段は8個ずつとする。ビンタイムが２μSecの場合、チャンネルストラクチャーは図１３のようになる。
【００５３】
上記のチャンネル値を段ごとに記すと図１４、図１５に示す通りである。図１４は、ビンタイムτ0を基準値とする一般的なもので、図１５はビンタイムが２μSecの場合である。ここでわかるように、チャンネルの値はビンタイムによって決まるが、チャンネル数および段数は読込んだデータ総数によって決まる。何段目の何チャンネル目までデータの計算を行うかは読込んだデータの総数でチャンネル数、段数を計算することでわかる。例えば、ビンタイム２μSecで32秒間データを測定した場合、計算用の総チャンネル数は約176で、段数は21である。
【００５４】
次に、ステップＳ６において、段数判断、つまり、マルチプルτ方式でデータを処理する処理タイミングを算出する。マルチプルτ方式でデータと重み係数を計算する際、各段の計算は常にタイミングが一致するとは限らず、各段の計算タイミングはそれぞれ異なる場合もある。つまり、上段に二つの新しいデータがグレードアップされた時が下段のデータの移動、和計算、積和計算のタイミングである。例えば、0段の諸処理は、新しいデータが読み込まれる毎に行われるが、1段目の諸処理は、21=2個のデータが新しく読込まれた際に行われ、n段目の諸処理は、2n個のデータが新しく読込まれた際に行われる。図１６は各段の処理のタイミングを示している。
【００５５】
ステップＳ６での判断がＮＯの場合にはステップＳ１７に移行して読み込んだデータ総数をカウントする。カウント結果は段数ごとの相関値総合計算（自己相関関数あるいは相互相関関数の計算）（ステップＳ１６）の際に用いる。ステップＳ１７の後はステップＳ２−１〜２−４に戻る。
【００５６】
また、ステップＳ６での判断がＹＥＳの場合にはステップＳ７に進んで、４枚のデータテーブル上の各データを上列に移動させる処理を行う。つまり、新しいデータを読込む前に、各テーブルの値をアップグレードするものである。
【００５７】
各段のデータの移動はステップS6で示した処理タイミングに同期するもので、n段のデータは2n個のデータが新しく読込まれた際に移動処理が行われる。0段目と1段目のデータ移動は図１７と図１８に示す通りである。
【００５８】
次に、ステップＳ８において、上記のステップＳ７のデータ移動と同様に、４枚の重み係数テーブルの各値を上列に移動させる処理を行う。つまり、新しい重み係数データを読込む前に、各重み係数テーブル値をアップグレードするものである。
【００５９】
各段の重み係数データの動きはステップＳ６で示した処理タイミングに同期するもので、n段のデータは2n個の重み係数が新しく読込まれた際に移動処理が行われる。0段目と1段目の重み係数の移動は図１７及び図１８と同様に考えることができるので、ここでは説明を省略する。
【００６０】
次に、ステップＳ９において、新規データの読込みを行う。つまり、0段0列目に1個の新しいデータを読込む。ステップＳ７の移動に続いて0段0列目に1個の新しいデータが読込まれる。新しく読込まれたデータは、データのポイント情報により４枚のデータテーブルに分割される。測定ポイント毎のデータテーブルへの分割方法はステップＳ３で示した通りである。
【００６１】
次に、ステップＳ１０において、新規の重み係数の読込みを行う。つまり、ステップＳ９の0段0列目に新しい1個のデータが読込まれる動作に伴い、重み係数の読み込みと分割を行う。また、測定ポイント毎の重み係数テーブルに新しく読込んだ重み係数を分割代入するが、分割方法はステップＳ４で示した通りである。
【００６２】
次に、ステップＳ１１において、各段0列目のデータを計算する。これは、マルチプルτ方式でデータを計算する重要な部分の一つである。チャンネル16以降の遅延時間τは、8チャンネルごとに初期ビンタイム値を2倍に増しているため（ステップＳ５を参照のこと）、各段のデータは上段の二つのデータ和からなる。具体的なデータの変化は図１９の通りである。また、ここでのデータの和計算タイミングは、上記のステップＳ６で示した各段の処理タイミングに同期しなければならない。
【００６３】
複数の測定ポイント１〜４において、和計算の処理を行うと、データ分割テーブルは図２０のように次々と下位段のデータが形成され、新しいデータ形態を有することになる。
【００６４】
次にステップＳ１２において、各段0列目の重み係数を計算する。これは、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の重要な部分の一つである。ステップＳ１１と同様に、チャンネル16以降の遅延時間τは、8チャンネルごとに初期ビンタイム値を2倍に増しているため（ステップＳ５を参照のこと）、各段の重み係数は各段のデータ計算方法と同様に上段の二つの重み係数和からなる。具体的な重み係数の変化は図２１に示すとおりである。また、ここでの重み係数の和計算タイミングも、上記のステップＳ６で示した各段の処理タイミングに同期しなければならない。
【００６５】
測定データにおける処理と同様に、複数の測定ポイント１〜４において、重み係数の和計算処理を行うと、重み係数分割テーブルは図２２のように次々と下位段の重み係数が形成され、新しい重み係数形態テーブルを有することになる。
【００６６】
次のステップＳ１３は、マルチプルτ方式の計算方法にも含まれている部分であるが、ここでは、あるデータとτ遅延後のデータとの積和を計算する。計算は、同じ測定ポイントのデータテーブルを用いる。つまり、各段0列目のデータと同段各チャンネルのデータの掛け算（図２３）をする。掛け算計算の和は同段のデータが新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。
【００６７】
次に、ステップＳ１４は、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独特な計算方法で、重み係数間の積和を計算する。計算は、ステップＳ１３と同じ測定ポイントの重み係数テーブルを用いる。つまり、ステップＳ１３の計算方法と同様に、各段0列目の重み係数と同段各チャンネルの重み係数の掛け算をする。掛け算計算の和は同段の重み係数が新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。
【００６８】
次に、ステップＳ１５においてデータと重み係数の積和を計算する。これはマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳの独自の手法であり、同じ測定ポイントのデータテーブルと重み係数テーブルを用いる。つまり、各段0列目のデータと同段各チャンネルの重み係数との掛け算（図２４）を行う。あるいは、各段0列目の重み係数と同段各チャンネルのデータとの掛け算(図２５)を行う。
【００６９】
掛け算計算の和は同段のデータと重み係数が新しい値に更新される時に行われるが、各段の計算タイミングは上記のステップＳ６に同期しなければならない。
【００７０】
次に、ステップＳ１８においてイメージング判断を行う。このステップでは、途中計算結果ステップＳ１１〜Ｓ１５を用いて最終自己相関総合計算を行い、イメージングステップ（ステップＳ１９：計算結果の表示）に移行するか否かを判断する。ここでＮＯの場合にはステップＳ２−１〜２−４に戻る。また、ＹＥＳの場合にはステップＳ１６に移行して、マルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳのアルゴリズムにより最終的な相関計算を行う。具体的には、上記ステップＳ１３〜Ｓ１５での計算結果を以下の解析式
【数１】
2006078377.tif 000003
に代入して自己相関値を計算する。
【００７１】
ステップＳ１６の後は、ステップＳ１９に移行してイメージングを実行する。ここでは、計算結果としてＦＣＳカーブをプロットする。ここでのプロットは1個の読込みデータを単位とするため、今までの一般的なＦＣＳ計算方式のような大量データの計算完了を待つ必要がなく、随時データの読込み、計算を中止させ、リアルタイムにプロットすることが可能である。その後、本フローの処理を終了する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明が適用される光信号解析装置の構成を示す図である。
【図２】測定ポイントと測定順番を示す図である。
【図３】重み係数を用いたマルチプルτ方式マルチポイントＦＣＳ演算の手順を説明するためのフローチャートである。
【図４】時系列測定信号を示す図である。
【図５】複数のポイントの時分割表示測定信号を示す図である。
【図６】複数のポイントの測定データの大きさを示す図である。
【図７】測定ポイント１の分割データを示す図である。
【図８】測定ポイント毎に分割したデータテーブルを示す図である。
【図９】複数ポイントの重み係数情報を示す図である。
【図１０】測定ポイント１の分割重み係数を示す図である。
【図１１】ポイント毎に分割した重み係数テーブルを示す図である。
【図１２】マルチプルτ方式のチャンネル構造を示す図である。
【図１３】２μSecビンタイムのチャンネル構造を示す図である。
【図１４】各段のチャンネル値を示す図である。
【図１５】ビンタイム２μSec時の各段のチャンネル値を示す図である。
【図１６】段数と処理タイミングを示す図である。
【図１７】０段目のデータ移動について説明するための図である。
【図１８】１段目のデータ移動を示す図である。
【図１９】０列目のデータ構成を示す図である。
【図２０】各段のデータを有する分割データテーブルを示す図である。
【図２１】０列目の重み係数の構成を示す図である。
【図２２】各段の重み係数を有する分割重み係数テーブルを示す図である。
【図２３】データ間の積和計算を示す図である。
【図２４】データと重み係数との積和計算を示す図である。
【図２５】重み係数とデータとの積和計算を示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
１０…レーザ走査型共焦点光学顕微鏡本体、１１…CCDカメラ、１２…試料ステージ、１３…試料ステージコントローラ、１４…コンピュータ、１５…TVモニタ、１６…レーザ光源、２０…ステッピングモータ、２１…対物レンズ、２２…XYスキャナ、２３…ビームエクスパンダー、２４…プレフォーカシングレンズ、２５…ダイクロイックミラー、２６…ピンホール、２７…ハーフミラー、２８…光検出器、５０…試料。
【図１】
2006078377.tif 000004
【図２】
2006078377.tif 000005
【図３】
2006078377.tif 000006
【図４】
2006078377.tif 000007
【図５】
2006078377.tif 000008
【図６】
2006078377.tif 000009
【図７】
2006078377.tif 000010
【図８】
2006078377.tif 000011
【図９】
2006078377.tif 000012
【図１０】
2006078377.tif 000013
【図１１】
2006078377.tif 000014
【図１２】
2006078377.tif 000015
【図１３】
2006078377.tif 000016
【図１４】
2006078377.tif 000017
【図１５】
2006078377.tif 000018
【図１６】
2006078377.tif 000019
【図１７】
2006078377.tif 000020
【図１８】
2006078377.tif 000021
【図１９】
2006078377.tif 000022
【図２０】
2006078377.tif 000023
【図２１】
2006078377.tif 000024
【図２２】
2006078377.tif 000025
【図２３】
2006078377.tif 000026
【図２４】
2006078377.tif 000027
【図２５】
2006078377.tif 000028