(57)【要約】  【課題】  試料等の測定対象物に接した薄膜層と誘電体ブロックとの界面で光ビームを全反射させてエバネッセント波を発生させ、それにより全反射した光ビームの強度に表れる変化を測定して試料の分析を行う測定方法および測定装置において、従来のリファレンス法により校正できなかった誤差を校正できるようにする。  【解決手段】  検出領域において予め本測定時に使用されるバッファーと水素イオン濃度指数等の性状が等しいバッファーに対する予備測定を行って、その結果を信号処理部２０内の図示しない記憶手段に記憶しておき、検出領域における本測定の結果を記憶手段に記憶されている予備測定の結果に基づいて校正することにより、測定装置の測定精度を向上させる。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、該薄膜層上に固定されたリガンド、および該リガンド上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段による検出結果に基づいて前記薄膜層上の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置により測定を行う測定方法において、
本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、
前記本測定を行い、
前記予備測定の結果に基づいて前記本測定の結果を校正することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層上に試料を保持する試料保持機構を備え、前記薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域および前記リガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、
光ビームを発生させる光源と、
前記薄膜層の前記検出領域と前記誘電体ブロックとの第1界面、および前記薄膜層の前記参照領域と前記誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で前記光ビームを入射させる入射光学系と、
前記第１界面および前記第２界面で全反射した光ビームの強度を各々独立して検出する光検出手段と、
該光検出手段による検出結果に基づいて前記薄膜層上の２つの領域の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置により測定を行う測定方法において、
前記検出領域において本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、
前記検出領域および前記参照領域において本測定を行い、
前記予備測定の結果に基づいて前記検出領域における前記本測定の結果を校正し、
前記参照領域における前記本測定の結果に基づいて校正後の前記検出領域における前記本測定の結果をさらに校正することを特徴とする測定方法。
【請求項３】
前記性状が、前記バッファーの水素イオン濃度指数であることを特徴とする請求項１または２記載の測定方法。
【請求項４】
前記性状が、前記バッファー中の界面活性剤の濃度であることを特徴とする請求項１または２記載の測定方法。
【請求項５】
前記性状が、前記バッファー中の両親媒性溶媒の濃度であることを特徴とする請求項１または２記載の測定方法。
【請求項６】
誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、該薄膜層上に固定されたリガンド、および該リガンド上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段による検出結果に基づいて前記薄膜層上の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置において、
本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定の結果を記憶する記憶手段と、
該記憶手段に記憶されている前記予備測定の結果に基づいて前記本測定の結果を校正する校正手段とを備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項７】
誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層上に試料を保持する試料保持機構を備え、前記薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域および前記リガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、
光ビームを発生させる光源と、
前記薄膜層の前記検出領域と前記誘電体ブロックとの第1界面、および前記薄膜層の前記参照領域と前記誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で前記光ビームを入射させる入射光学系と、
前記第１界面および前記第２界面で全反射した光ビームの強度を各々独立して検出する光検出手段と、
該光検出手段による検出結果に基づいて前記薄膜層上の２つの領域の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置において、
前記検出領域における本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定の結果を記憶する記憶手段と、
該記憶手段に記憶されている前記予備測定の結果に基づいて前記検出領域における前記本測定の結果を校正し、前記参照領域における前記本測定の結果に基づいて校正後の前記検出領域における前記本測定の結果をさらに校正する校正手段とを備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項８】
前記性状が、前記バッファーの水素イオン濃度指数であることを特徴とする請求項６または７記載の測定装置。
【請求項９】
前記性状が、前記バッファー中の界面活性剤の濃度であることを特徴とする請求項６または７記載の測定装置。
【請求項１０】
前記性状が、前記バッファー中の両親媒性溶媒の濃度であることを特徴とする請求項６または７記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料等の測定対象物に接した薄膜層と誘電体ブロックとの界面で光ビームを全反射させてエバネッセント波を発生させ、それにより全反射した光ビームの強度に表れる変化を測定して試料の分析を行う測定方法および測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている。金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。表面プラズモンセンサーは、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料の特性を分析するものであり、種々のタイプのセンサーが提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサーによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサーによって検出することができる。
【０００５】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００６】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００７】
この光強度の低下が生じる全反射角以上の特定入射角θＳＰ（以後全反射減衰角θＳＰと記載）より表面プラズモンの波数が解ると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【数１】
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【０００８】
試料の誘電率εｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料の屈折率等が分かるので、結局、全反射減衰角θＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
また、エバネッセント波を利用した類似のセンサーとして、漏洩モードセンサーも知られている（例えば非特許文献１参照）。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【００１０】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰角θＳＰを知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１１】
また、上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のリガンドに結合するアナライトを見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にリガンドを固定し、該リガンド上に種々のアナライトを含有するバッファー（液体試料）を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θＳＰを測定している。バッファー中のアナライトが、リガンドと結合するものであれば、この結合によりリガンドの屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θＳＰを測定し、全反射減衰角θＳＰに変化が生じているか否か測定することにより、アナライトとリガンドの結合が行われているか否か、すなわちアナライトがリガンドと結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このようなアナライトとリガンドとの組み合わせとしては、例えば抗原と抗体あるいは抗体と抗体が挙げられ、そのようなものに関する具体的な測定としては、一例として、リガンドをウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とし、アナライトであるヒトＩｇＧ抗体との結合の有無検出とその定量分析を行う測定が挙げられる。
【００１２】
なお、バッファー中のアナライトとリガンドの結合状態を測定するためには、必ずしも全反射減衰角θＳＰの角度そのものを検出する必要はない。例えば最初にアナライトを含まないバッファーを用いて基準となるベースラインを測定した後、リガンド上にアナライトが含まれたバッファーを添加した際の全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。
【特許文献１】特開平6−167443号公報
【特許文献２】特開2000−065731号公報
【非特許文献１】「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ところで、上記のような表面プラズモンセンサー等の測定装置においては、バッファーによるバルク効果や、リガンドおよびバッファーの温度変化や、光源変動等の外乱による測定結果の誤差をなくすため、リファレンス法と呼ばれる方法を用いて測定精度を向上させる方法が用いられている。
【００１４】
このリファレンス法は、例えば、リガンドとアナライトの結合状態について測定を行う場合に、薄膜層上にリガンドを固定した検出系、および薄膜層上にリガンドを固定していない参照系の２つの系を用意し、例えば、検出系での測定結果から参照系の測定結果を引く等、参照系の測定結果に基づいて検出系の測定結果を校正することによって、上記のような外乱の影響を除外することができるものである。
【００１５】
このリファレンス法を行った場合、リガンドとアナライトの結合による信号の増加方向をプラスとすると、検出系および参照系においては上記のような外乱による共通の信号変動が生じ、さらに検出系においてはリガンドとアナライトの結合による信号増加が生じるため、検出系での測定結果から参照系の測定結果を引いた場合には通常プラスの値をとるはずであるが、測定の態様によってはマイナスの値をとることがあり、このような状態では正確に測定が行われていないことが確認された。すなわち、リファレンス法では校正しきれない誤差要因があることが判明した。
【００１６】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、試料等の測定対象物に接した薄膜層と誘電体ブロックとの界面で光ビームを全反射させてエバネッセント波を発生させ、それにより全反射した光ビームの強度に表れる変化を測定して試料の分析を行う測定方法および測定装置において、上記問題を解消した測定方法および測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、リガンドとアナライトの結合状態について測定を行う際に、リファレンス法による校正を行うべく薄膜層上にリガンドを固定した検出系、および薄膜層上にリガンドを固定していない参照系の２つの系を用意し、検出系での測定結果から参照系の測定結果を引くことによって検出系の測定結果を校正した場合に、リガンドとアナライトの結合による信号の増加方向をプラスとすると通常校正後の値はプラスとなるはずであるが、測定の態様によってはマイナスの値となることがあり、このような状態では正確に測定が行われていないことを確認したため、この原因を探るべく検出系および参照系のそれぞれについてバッファーの水素イオン濃度指数（以後、ｐＨと記載）を５から１３まで変化させた際のＳＰＲ信号の出力の変化について調査した。なお、リガンドにはcytochrome cを用いており、バッファーにはアナライトは含有させず、また屈折率は各ｐＨで同じになるように調整した。その結果これらの間には図１２に示すような関係があることが分かった。図１２は、検出系（リガンド有）および参照系（リガンド無）における水素イオン濃度指数とＳＰＲ信号との関係を示したグラフである。なお、縦軸をＳＰＲ信号、横軸をバッファーの水素イオン濃度指数としている。
【００１８】
図中の□は検出系（リガンド有）の測定結果のグラフ、◇は参照系（リガンド無）の測定結果のグラフ、△は参照系の測定結果に基づいて検出系の測定結果を校正（検出系の測定結果−参照系の測定結果）した結果のグラフであるが、ｐＨが５から８までの間では検出系および参照系ともにＳＰＲ信号はほぼ０を示すのに対し、ｐＨが９以上になると参照系においてはＳＰＲ信号はほぼ０を示したままであるが、検出系においてはＳＰＲ信号はマイナスとなってしまっている。これはバッファーのｐＨ変化により薄膜層上に固定化されたリガンドの立体構造が変化（伸張）し、薄膜層近傍でのリガンドの密度が減少したためであると考えられる。
【００１９】
このようなバッファーの性状の変化によるリガンドの変形は、リガンドを固定した検出系のみで生じるため、上記のようなリファレンス法を用いて補正を行うと結果がマイナスとなる。また、このバッファーの性状の変化によるリガンドの変形は、バッファーの水素イオン濃度指数の変化によるものだけでなく、アナライトをバッファーに可溶化させるために使用される界面活性剤や両親媒性溶媒（DMSO）等のバッファー中の濃度の変化等、種々の場合が考えられる。
【００２０】
すなわち、本発明者は、リガンドが固定された系において本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、予備測定の結果に基づいて本測定の結果を校正することによって、上記のバッファーの性状に起因する測定誤差を補正できることを見出した。
【００２１】
本発明は上記の新たな知見に基づいてなされたものであり、本発明の第１の測定方法は、誘電体ブロック、誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、薄膜層上に固定されたリガンド、およびリガンド上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、光ビームを発生させる光源と、光ビームを誘電体ブロックに対して、誘電体ブロックと薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる入射光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、光検出手段による検出結果に基づいて薄膜層上の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置により測定を行う測定方法において、本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、本測定を行い、予備測定の結果に基づいて本測定の結果を校正することを特徴とする方法である。
【００２２】
また、本発明の第２の測定方法は、誘電体ブロック、誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および薄膜層上に試料を保持する試料保持機構を備え、薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域およびリガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、光ビームを発生させる光源と、薄膜層の検出領域と誘電体ブロックとの第1界面、および薄膜層の参照領域と誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で光ビームを入射させる入射光学系と、第１界面および第２界面で全反射した光ビームの強度を各々独立して検出する光検出手段と、光検出手段による検出結果に基づいて薄膜層上の２つの領域の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置により測定を行う測定方法において、検出領域において本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、検出領域および参照領域において本測定を行い、予備測定の結果に基づいて検出領域における本測定の結果を校正し、参照領域における本測定の結果に基づいて校正後の検出領域における本測定の結果をさらに校正することを特徴とする方法である。
【００２３】
上記第１および第２の測定方法において、予備測定は必ずしも本測定の前に行う必要はなく、本測定を行った後に予備測定を行ってもよい。
【００２４】
また、バッファーの性状とは、リガンドに変形を生じさせるようなバッファーの性質もしくは状態のことを意味し、予備測定時と本測定時とで等しくするバッファーの性状は、バッファーの水素イオン濃度指数であってもよいし、バッファー中の界面活性剤の濃度であってもよいし、バッファー中の両親媒性溶媒の濃度であってもよい。さらに、これらの複数の性状を等しくしてもよい。
【００２５】
本発明の第１の測定装置は、誘電体ブロック、誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、薄膜層上に固定されたリガンド、およびリガンド上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定ユニットと、光ビームを発生させる光源と、光ビームを誘電体ブロックに対して、誘電体ブロックと薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる入射光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、光検出手段による検出結果に基づいて薄膜層上の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置において、本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定の結果を記憶する記憶手段と、記憶手段に記憶されている予備測定の結果に基づいて本測定の結果を校正する校正手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００２６】
また、本発明の第２の測定装置は、誘電体ブロック、誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および薄膜層上に試料を保持する試料保持機構を備え、薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域およびリガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、光ビームを発生させる光源と、薄膜層の検出領域と誘電体ブロックとの第1界面、および薄膜層の参照領域と誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で光ビームを入射させる入射光学系と、第１界面および第２界面で全反射した光ビームの強度を各々独立して検出する光検出手段と、光検出手段による検出結果に基づいて薄膜層上の２つの領域の状態の測定を行う測定手段とを備えてなる測定装置において、検出領域における本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定の結果を記憶する記憶手段と、記憶手段に記憶されている予備測定の結果に基づいて検出領域における本測定の結果を校正し、参照領域における本測定の結果に基づいて校正後の検出領域における本測定の結果をさらに校正する校正手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００２７】
上記第１および第２の測定装置において、バッファーの性状とは、リガンドに変形を生じさせるようなバッファーの性質もしくは状態のことを意味し、予備測定時と本測定時とで等しくするバッファーの性状は、バッファーの水素イオン濃度指数であってもよいし、バッファー中の界面活性剤の濃度であってもよいし、バッファー中の両親媒性溶媒の濃度であってもよい。さらに、これらの複数の性状を等しくしてもよい。
【００２８】
本発明の測定方法における測定装置および本発明の測定装置は、薄膜層を、金属膜からなるものとし、前述の表面プラズモン共鳴による効果を利用して測定を行う、所謂表面プラズモンセンサーとして構成されたものとすることができる。また、薄膜層を、誘電体ブロックの前記一面に形成されたクラッド層とクラッド層上に形成された光導波層からなるものとし、光導波層における導波モードの励起による効果を利用して測定を行う、所謂漏洩モードセンサーとして構成されたものとすることができる。
【００２９】
また、薄膜層上の状態の測定方法は、誘電体ブロックと薄膜層との界面に対して種々の入射角度で入射させた光ビームの該界面での反射光を検出して、全反射減衰角もしくはその角度変化を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよいし、また、D.V.Noort,K.johansen,C.-F.Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよい。
【００３０】
また、「本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファー」とは、完全に性状が等しいバッファーのみならず、本測定時のバッファーの性状に近いバッファーであってもよい。また、本測定時に使用されるバッファーの性状を含む広い範囲の性状のバッファーに対して予備測定を行って相関曲線を求めておき、本測定時のバッファーの性状に応じて校正を行ってもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の第１の測定方法および測定装置によれば、本測定時に使用されるバッファーと性状が等しいバッファーに対する予備測定を行い、予備測定の結果に基づいて本測定の結果を校正するようにしたことにより、従来のリファレンス法では校正しきれなかった、バッファーの性状の変化によるリガンドの変形に起因する誤差について校正することが可能となるため、測定装置の測定精度を向上させることができる。
【００３２】
また、本発明の第２の測定方法および測定装置によれば、上記第１の測定方法および測定装置における校正に加えてリファレンス法による校正をも行うため、測定装置の測定精度をより向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。本発明の第１の実施の形態の測定装置は、測定ユニットの複数の測定部に光ビームを並列的に入射させることにより複数の試料の分析を同時に行うことが可能な表面プラズモンセンサーであり、図１は本実施の形態の表面プラズモンセンサーの概略構成を示す平面図、図２はこの表面プラズモンセンサーの測定系の平面図、図３はこの表面プラズモンセンサーの測定系の側面図、図８は図２中のVIII−VIII線断面図である。
【００３４】
この表面プラズモンセンサー１は、図１に示すように、測定ユニット10に設けられた複数の測定部毎に光ビームを並列的に入射させることにより複数の試料の分析を同時に行うことが可能な表面プラズモンセンサーであり、同様の構成の複数の表面プラズモン測定系１Ａ、１Ｂ…により構成されている。各測定系の構成について、個別の要素を表す符号であるＡ、Ｂ…の符号は省略して説明する。
【００３５】
図２、図３および図８に示すように、各測定系は、１本の光ビーム13を発生させる半導体レーザ等からなる光源14（以下、レーザ光源14という）と、上記光ビーム13を測定ユニット10に通し、流路60（測定部）の下の誘電体ブロック50と金属膜55との２箇所の界面50ｄおよび50ｅに対して、種々の入射角が得られるように並列的に入射させる光学系15と、上記界面50ｄおよび50ｅで全反射した光ビーム13を各々平行光化する２つのコリメーターレンズ16と、この平行光化された光ビーム13を各々検出する２つのフォトダイオードアレイ17と、２つのフォトダイオードアレイ17に接続された差動アンプアレイ18と、ドライバ19と、コンピュータシステム等からなる信号処理部20と、この信号処理部20に接続された表示部21とを備えている。なお、信号処理部20は、後述する校正動作の際に使用される予備測定の結果のデータを記憶する図示しない記憶手段が内蔵されたものであり、また校正手段としても機能するものである。
【００３６】
まず、測定ユニット10について説明する。図４は測定ユニット10の斜視図、図５は上記測定ユニットの分解斜視図、図６は上記測定ユニットの上面図、図７は図６中のVII−VII線断面図である。
【００３７】
測定ユニット10は、光ビームに対して透明であり、平滑な上面50ａに薄膜層としての金属膜55が形成された誘電体ブロック50と、この誘電体ブロック50の金属膜55上に密接される流路部材51と、誘電体ブロック50と係合して、流路部材51を誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持する保持部材52とから構成される。
【００３８】
誘電体ブロック50は、例えば透明樹脂等からなるものであり、長手方向に直交する断面が上底よりも下底の方が短い台形状の本体を有し、この本体の長手方向の両端部に上面（もしくは下面）方向から見たときの幅が本体よりも薄く形成された保持部50ｂが形成されたもので、後述の測定装置の光源から出射された光ビームを誘電体ブロック50と金属膜55との界面に入射させるとともに、この界面で全反射した光ビームを測定装置の光検出手段に向けて出射させるプリズム部が一体的に形成されたものである。本体の長手方向の両側面には後述の保持部材52に形成された係合孔52ｃに係合させるための係合凸部50ｃと側面が垂直に形成された垂直凸部50ｄとが両側面で各々互いに対向するように形成されており、底面には長手方向に平行に延びる摺動溝50ｅが形成されている。
【００３９】
流路部材51は、入口61から測定部63に至る供給路62、および測定部63から出口65に至る排出路64から構成される流路60が、流路部材51の長手方向に渡って複数形成されており、この複数の流路60は直線状に配置されている。
【００４０】
図７に示すように、流路部材51の下部部分には、供給路62の出口と排出路64の入口が開口され、また流路部材51の下面に位置する金属膜55の表面と接する領域に、この供給路62の出口と排出路64の入口を囲むシール部51ａが形成されており、このシール部51ａの内側が測定部63となる。このため、流路部材51を誘電体ブロック50の金属膜55上に密接させた場合に、このシール部51ａ内の測定部63が流路として機能するようになる。なお、シール部51ａは、流路部材51の上部部分と一体形成されたものであってもよいし、上部部分とは異なる素材により形成され、後付されたものであってもよく、例えばＯリング等を流路部材51の下部部分に取り付けたものであってもよい。
【００４１】
本発明の測定ユニットを使用する表面プラズモンセンサー等の測定装置では、蛋白質を含む液体試料が使用されることが想定されるが、流路60内で液体試料中の蛋白質が固着してしまうと測定を正確に行うことが困難となってしまうため、流路部材51の材料としては蛋白質に対する非特異吸着性を有しないことが好ましく、具体的にはシリコン、ポリプロピレン等を用いるとよい。また、流路部材51をこのような弾性材料からなるものとすることにより、流路部材51を金属膜55上に確実に密接させることができるため、接触面からの液体試料の液漏れを防止することができる。
【００４２】
保持部材52は、ポリプロピレン等の弾性材料からなり、長手方向と直交する方向の断面が略冂字形状をしており、保持部材52の上板（保持板部）の流路部材51の入口61および出口65と対向する位置には流路部材51に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔52ａが形成されており、保持部材52の上面の各ピペット挿入孔52ａの中間、および両端のピペット挿入孔52ａのさらに外側には位置決め用のボス52ｂが形成されている。
【００４３】
また、この保持部材52の上面には、蒸発防止部材54が両面テープ（接着部材）53により貼付されている。図５に示すように、両面テープ53のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはピペット挿入用の孔53ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔53ｂが形成されており、同様に、蒸発防止部材54のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはスリット54ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔54ｂが形成されており、ボス52ｂに両面テープ53の孔53ｂおよび蒸発防止部材54の孔54ｂを挿通した状態で、蒸発防止部材54を保持部材52の上面に貼付することにより、蒸発防止部材54のスリット54ａと流路部材51の入口61および出口65とが対向するように構成される。この蒸発防止部材54は、スリット54ａからピペットを挿入できるように弾性を有する材料である必要があり、具体的にはシリコンまたはポリプロピレン等を用いるとよい。なお、上記の保持部材52と蒸発防止部材54とは一体的に形成してもよく、これに加えてさらに流路部材51も一体的に形成してもよい。
【００４４】
さらに、保持部材52の長手方向側板には、誘電体ブロック50に形成された係合凸部50ｃに係合させるための係合孔52ｃが形成されており、この係合孔52ｃを係合凸部50ｃに係合させて保持部材52と誘電体ブロック50とを係合させた状態で、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持され、流路部材51が誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持されるように構成されている。
【００４５】
図７に示すように、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持された状態では、流路部材51の入口61および出口65は、蒸発防止部材54のスリット54ａにより外気から遮断され、流路60内に注入された液体試料の蒸発を防止するように構成されている。
【００４６】
入射光学系15は、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビーム13を平行光化するコリメーターレンズ15ａと、該平行光化された光ビーム13を分光するハーフミラー15ｃと、ハーフミラー15ｃにより反射された光ビーム13を測定ユニット10方向に反射させるミラー15ｄと、ハーフミラー15ｃを透過した光ビーム13、およびミラー15ｄにより反射された光ビーム13を上記界面50ｄおよび50ｅ上で各々収束させる２つの集光レンズ15ｂとから構成されている。
【００４７】
光ビーム13は、上述のように集光されるので、界面50ｄおよび50ｅに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面50ｄおよび50ｅで全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。なお、上記光学系15は、光ビーム13を界面50ｄおよび50ｅにデフォーカス状態で入射させるように構成されてもよい。そのようにすれば、表面プラズモン共鳴の状態検出の誤差が平均化されて、測定精度が高められる。
【００４８】
なお光ビーム13は、界面50ｄおよび50ｅに対してｐ偏光で入射させる。そのようにするためには、予めレーザ光源14をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板で光ビーム13の偏光の向きを制御してもよい。
【００４９】
図８に示すように、本実施の形態において、測定ユニット10の各流路60の測定部63には２箇所の界面50ｄおよび50ｅに対して光ビーム13が並列的に入射されるが、このうち一方の界面50ｄ上の金属膜55上は何も固定していない参照領域とし、他方の界面50ｅ上の金属膜55上はリガンド73を固定した検出領域とし、後述のリファレンス法による測定結果の校正を行うことができるようにしている。
【００５０】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサー１による試料分析について説明する。測定に先立ち、恒温室２からチップ保持部11上の測定位置へ向けて測定ユニット10が移動される。チップ保持部11には誘電体ブロック50に形成された摺動溝50ｅと係合するレール11ａが形成されており、測定ユニット10を移動させる際に高い位置精度を確保することができるようになっている。さらに、測定ユニット10がチップ保持部11上に載置された後、誘電体ブロック50に形成された垂直凸部50ｄが不図示の固定機構により挟持されてチップ保持部11上の測定位置に固定される。その後、図８に示すように流路部材51の入口61に液体試料供給用ピペットチップ70を挿入し、出口65に液体試料吸入用ピペットチップ71を挿入し、液体試料供給用ピペットチップ70から液体試料としてアナライトを含有するバッファー72を流路60の測定部63に供給した後、測定を開始する。
【００５１】
図３に示す通り、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビーム13は、光学系15の作用により、測定部63の下の誘電体ブロック50と金属膜55との界面50ｄおよび50ｅ上で収束する。この際、光ビーム13は、界面50ｄおよび50ｅに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面50ｄおよび50ｅで全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００５２】
界面50ｄおよび50ｅで全反射した後、２つのコリメーターレンズ16によって各々平行光化された２本の光ビーム13は、２つのフォトダイオードアレイ17により各々検出される。本例におけるフォトダイオードアレイ17は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が１列に並設されてなり、図３の図示面内において、平行光化された光ビーム13の進行方向に対してフォトダイオード並設方向がほぼ直角となる向きに配設されている。したがって、上記界面50ｄおよび50ｅにおいて種々の反射角で全反射した光ビーム13の各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が受光することになる。
【００５３】
図９は、この表面プラズモンセンサーの電気的構成を示すブロック図である。図示の通り上記ドライバ19は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力をサンプルホールドするサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……、これらのサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……の各出力が入力されるマルチプレクサ23、このマルチプレクサ23の出力をデジタル化して信号処理部20に入力するＡ／Ｄ変換器24、マルチプレクサ23とサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……とを駆動する駆動回路25、および信号処理部20からの指示に基づいて駆動回路25の動作を制御するコントローラ26から構成されている。なお、差動アンプアレイ18、ドライバ19、信号処理部20は、２つのフォトダイオードアレイ17からの入力に対して、同様の処理を並列的に行うように構成されている。
【００５４】
上記フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の各出力は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……に入力される。この際、互いに隣接する２つのフォトダイオードの出力が、共通の差動アンプに入力される。したがって各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が出力する光検出信号を、それらの並設方向に関して微分したものと考えることができる。
【００５５】
各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、それぞれサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……により所定のタイミングでサンプルホールドされ、マルチプレクサ23に入力される。マルチプレクサ23は、サンプルホールドされた各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力を、所定の順序に従ってＡ／Ｄ変換器24に入力する。Ａ／Ｄ変換器24はこれらの出力をデジタル化して信号処理部20に入力する。
【００５６】
図１０は、界面50ｄ（または50ｅ）で全反射した光ビーム13の入射角θ毎の光強度と、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力との関係を説明するものである。ここで、光ビーム13の界面50ｄ（または50ｅ）への入射角θと上記光強度Ｉとの関係は、同図（１）のグラフに示すようなものであるとする。
【００５７】
界面50ｄ（または50ｅ）にある特定の入射角θＳＰで入射した光は、金属膜55とバッファー72との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθＳＰが全反射減衰角であり、この角度θＳＰにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。この反射光強度Ｉの低下は、図３にＤで示すように、反射光中の暗線として観察される。
【００５８】
また図１０の（２）は、フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向を示しており、先に説明した通り、これらのフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置は上記入射角θと一義的に対応している。
【００５９】
そしてフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置、つまりは入射角θと、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力Ｉ´（反射光強度Ｉの微分値）との関係は、同図（３）に示すようなものとなる。
【００６０】
信号処理部20は、Ａ／Ｄ変換器24から入力された微分値Ｉ´の値に基づいて、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の中から、全反射減衰角θＳＰに対応する微分値Ｉ´＝０に最も近い出力が得られているもの（図１０の例では差動アンプ18ｄとなる）を選択し、それが出力する微分値Ｉ´に所定の補正処理を施してから、その値を表示部21に表示させる。なお、場合によっては微分値Ｉ´＝０を出力している差動アンプが存在することもあり、そのときは当然その差動アンプが選択される。
【００６１】
以後、所定時間が経過する毎に上記のように選択された差動アンプのいずれかが出力する微分値Ｉ´が、所定の補正処理を受けてから表示部21に表示される。この微分値Ｉ´は、測定チップの金属膜55に接している物質の誘電率つまりは屈折率が変化し、全反射減衰角θＳＰが変化して、図１０（１）に示す曲線が左右方向に移動する形で変化すると、それに応じて上下する。したがって、この微分値Ｉ´を時間の経過とともに測定し続けることにより、金属膜55に接しているバッファー72（またはリガンド73）の屈折率変化を調べることができる。
【００６２】
特に本実施形態では検出領域において、バッファー72に含まれるアナライトがリガンド73と結合する特定物質であれば、リガンド73とアナライトとの結合状態に応じてリガンド73の屈折率が変化するので、上記微分値Ｉ´を測定し続けることにより、アナライトがリガンド73と結合する特定物質であるか否かを検出することができる。
【００６３】
ところで、上記装置の検出領域において測定された全反射解消角θＳＰの角度変化は、厳密にはリガンド73とアナライトとの結合状態の変化に応じて生じた屈折率の変化を正確に反映したものではなく、上述したようにバッファー72の性状に基づいてリガンド73が変形することにより生じた屈折率の変化を含むため、測定結果にはこれによる誤差が含まれてしまっている。しかしながら、リファレンス法による校正を行うための参照領域においてはリガンド73を固定していないため、従来のリファレンス法では上記のリガンド73の変形により生じた誤差を校正することができない。
【００６４】
そのため、本発明の測定装置においては、検出領域において予め本測定時に使用されるバッファー72と性状が等しいバッファーに対する予備測定を行って、その結果を信号処理部２０内の図示しない記憶手段に記憶しておき、検出領域における本測定の結果を記憶手段に記憶されている予備測定の結果に基づいて校正することにより、測定装置の測定精度を向上させることができる。なお、予備測定の結果に基づいて本測定の結果を校正する方法としては、２つの測定結果の差を求める方法があるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００６５】
ここで、予備測定に用いるバッファーは、バッファーの水素イオン濃度指数、バッファー中の界面活性剤の濃度、バッファー中の両親媒性溶媒の濃度等について、可能な限り本測定時に使用するバッファーと性状が等しいバッファーを使用することが好ましいが、例えばバッファーの水素イオン濃度指数のみを等しくする等、上記の性状のうちいずれか１つもしくは２つのみ性状が等しいバッファーを使用してもよい。
【００６６】
さらに、本実施の形態においては、リファレンス法を行うべく検出領域と参照領域の２つの領域を有し、この２つの領域の測定を同時に行っているため、リガンド73の変形により生じた誤差を校正した結果に対して、さらにリファレンス法によりバッファー73の温度変化や、光源変動等の外乱による誤差を校正することができるため、測定装置の測定精度をより向上させることができる。なお、予備測定の結果に基づく校正後の結果をさらにリファレンス法で校正する方法としては、本測定時の２つの領域における測定値の差を求め、さらにこの測定値と予備測定の結果に基づく校正後の測定値との差を求める方法があるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００６７】
なお、本実施の形態において金属膜55上の参照領域には何も固定していないが、参照領域はバッファー72中のアナライトと結合しない機能を有している方が好ましい。そのような態様とするためには、例えばアルキルチオール、アミノアルコールまたはアミノエーテル等を金属膜55上に固定すればよい。
【００６８】
また、測定装置については、複数の表面プラズモン測定系により測定ユニットに設けられた全ての流路に対して同時に測定を行う態様に限定されるものではなく、一つの表面プラズモン測定系のみを備え、測定ユニットの位置を測定系に対して相対的に移動させることによって測定ユニットに設けられた複数の流路の測定を順次行う態様としてもよい。
【００６９】
次に、図１１を参照して本発明の第２の実施の形態について説明する。なおこの図１１において、図３中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。この第２の実施の形態の測定ユニットは漏洩モードセンサーに対応したものであり、測定系は第１の実施の形態の表面プラズモンセンサーと同じ構成である。
【００７０】
この測定ユニット10´の誘電体ブロック50の一面（図中の上面）には薄膜層としてのクラッド層56および光導波層57が順に積層されている。誘電体ブロック50は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層56は、誘電体ブロック50よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層57は、クラッド層56よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層56の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層57の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００７１】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源14から出射した光ビーム13を誘電体ブロック50を通してクラッド層56に対して全反射角以上の入射角で入射させると、光ビーム13が誘電体ブロック50とクラッド層56との界面50ｄおよび50ｅで全反射するが、クラッド層56を透過して光導波層57に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層57を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層57に取り込まれるので、上記界面50ｄおよび50ｅで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７２】
光導波層57における導波光の波数は、該光導波層57の上のバッファー72もしくはリガンド73の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、バッファー72もしくはリガンド73の屈折率を知ることができる。また、差動アンプアレイ18の各差動アンプが出力する微分値Ｉ´に基づいてリガンド73とバッファー72の中の被検体との結合状態の変化の様子を調べることができる。
【００７３】
上記第２の実施の形態においても第１の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の第１の実施の形態による表面プラズモンセンサーの概略構成を示す平面図
【図２】上記表面プラズモンセンサーの測定系の平面図
【図３】上記表面プラズモンセンサーの測定系の側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーの測定ユニットの斜視図
【図５】上記測定ユニットの分解斜視図
【図６】上記測定ユニットの上面図
【図７】図６中のVII−VII線断面図
【図８】図２中のVIII−VIII線断面図
【図９】上記表面プラズモンセンサーの測定系の電気的構成を示すブロック図
【図１０】上記表面プラズモンセンサーの測定系における光ビーム入射角と検出光強度との関係、並びに光ビーム入射角と光強度検出信号の微分値との関係を示す概略図
【図１１】本発明の第２の実施の形態による漏洩モードセンサーの測定系の側面図
【図１２】検出系（リガンド有）および参照系（リガンド無）における水素イオン濃度指数とＳＰＲ信号との関係を示したグラフ
【符号の説明】
【００７５】
10    測定ユニット
13    光ビーム
14    レーザ光源
15    光学系
16    コリメーターレンズ
17    フォトダイオードアレイ
17ａ、17ｂ、17ｃ……    フォトダイオード
18    差動アンプアレイ
18ａ、18ｂ、18ｃ……    差動アンプ
19    ドライバ
20    信号処理部
21    表示部
22ａ、22ｂ、22ｃ……    サンプルホールド回路
23    マルチプレクサ
24    Ａ／Ｄ変換器
25    駆動回路
26    コントローラ
50    誘電体ブロック
51    流路部材
52    保持部材
53    両面テープ
54    蒸発防止部材
55   金属膜
56   クラッド層
57   光動波層
60   流路
61   入口
62   供給路
63   測定部
64   排出路
65   出口
70、71   ピペット
72    液体試料
73   リガンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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