(57)【要約】【課題】  ササ及び／又はタケの葉を原料にして優れた抗酸化活性を有するトリシンを製造する方法を提供する。【解決手段】  ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配を行わせ、水層の液を取り出し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、上記水層又は上記酢酸エチル層の液又はジエチルエーテル層の液よりトリシンを得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過するか又は石油エーテルで液・液分配することによりクロロフィルを除去した後、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られるジエチルエーテル層からトリシンを採取することを特徴とするトリシンの製造方法。
【請求項２】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液を濃縮し、水に置換又は加水し濾過するか又は石油エーテルで液・液分配することによりクロロフィルを除去した後、水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを加えて液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、酢酸エチル層からトリシンを採取することを特徴とするトリシンの製造方法。
【請求項３】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液を加水分解するか、又は分画液を加水分解することにより、トリシンの含量を増大させた液からトリシンを採取することを特徴とする請求項１又は請求項２記載のトリシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ササ及び／又はタケの葉を原料として、トリシンを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  フラボノイドの１種であるトリシンは、抗酸化活性を有する化合物として知られており、例えば、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｂａｒｎｙａｒｄ  ｍｉｌｌｅｔ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｕｔｉｌｉｓ）ｇｒａｉｎｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７，４５００−４５０５（１９９９）等には、トリシンがコムギの葉等や穀類のヒエの子実から単離されることが報告されている。【０００３】  しかしながら、コムギやヒエはいずれも貴重な食料資源であり、原料コストも無視できないため、他の安価な原料からトリシンを製造する方法が求められている。【０００４】
【非特許文献１】  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｂａｒｎｙａｒｄ  ｍｉｌｌｅｔ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｕｔｉｌｉｓ）ｇｒａｉｎｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７，４５００−４５０５（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、安価に入手できる野生のササ又はタケの葉を原料としてトリシンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、前記の植物としてタケ類及びササ類に注目した。タケ・ササの仲間は、マダケ属、ナリヒラダケ属、トウチク属、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属、ヤダケ属、メダケ属、カンチク属、ホウライチク属の１０属から成っている。中でもササ類は温帯や亜寒帯に広く分布する植物で、ササ属は日本を分布の中心とし、全国に種類、量ともに広く分布する。【０００７】  本発明者らは、これらの葉に含まれているフラボノイド成分に着目し、これを原料にしてトリシンを製造する本発明の方法を完成したものである。【０００８】  本発明によれば、ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数３以下のアルコールをいう、以下同じ）、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水し、濾過するか又は石油エーテルでの液・液分配を行った後、水層の液を取り出すことでクロロフィルを除去した後、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液並びに水層、ジエチルエーテル層を採取し、ジエチルエーテル層及び／又は酢酸エチル層からササ及び／又はタケの葉由来のトリシンを採取することを特徴とする方法が提供される。
かかる本発明方法では、ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液を加水分解するか、または分画液を加水分解することにより、トリシンの収量を増大させることができる。【０００９】  本発明方法の目的化合物は、下記の化学式で表されるトリシンである。【００１０】
【化１】
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【００１１】  上記トリシンの１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）である。【００１２】  上記トリシンは、後述の実施例に示すとおり、抗酸化活性のうちの１つである、脂質過酸化物抑制活性に特に優れている。【００１３】  以下、本発明の製造方法に関し、原料、各工程及び工程中で抗酸化性組成物、並びに、該組成物からトリシンの採取方法等について、以下に順次詳述する。【００１４】（原料）
原料となるササは、クマイザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ、ミヤコザサ、ヤクシマダケ、スズタケなどその種類は問わない。また、タケも、モウソウチク、インヨウチク、マダケ、オオバヤダケ、メダケ、ホウライチクなどが使用可能である、これらのササあるいはタケの葉の部分を、水洗した後、必要に応じて適当な大きさに細断し乾燥（水分除去）して使用する。ササ又はタケの葉は、粉末にしてもよく、枯れさせてもよい。【００１５】  この原料を用いて、図１に例示するようなフローで抽出及び液・液分配を行う。
各工程の具体例は、以下のとおりである。ここでは、ササ葉を使用する場合を例に説明するが、これに限定されるものではない。
（第１工程：アルコール抽出・蒸発乾固・粗抽出液の調製）
ササ葉１ｇに対して１０倍容の低級脂肪族アルコールで抽出する。抽出は暗所で２４時間放置し、２４時間後濾過する。この操作を４回繰り返し、得られた濾液をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、試料重量の２倍容の純水に溶解する。このようにして得られた溶液を粗抽出液とする。【００１６】（第２工程：石油エーテルによる液・液分配）
上記の粗抽出液に対して同量の石油エーテルを加え、分液ロートにて水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層と水層とを得る。石油エーテル層にはクロロフィルが含まれるので廃棄する。【００１７】（第３工程：ジエチルエーテルによる液・液分配）
次に、得られた水層に該水層と同量のジエチルエーテルを添加し、分液ロートにて水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層、水層を得た。ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで乾固する。【００１８】（第４工程：酢酸エチルによる液・液分配）
第３工程で得られた水層に、該水層と同量の酢酸エチルを加え、分液ロートにて，水・酢酸エチル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層、水層を得る。各層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、メタノールに置換する。【００１９】（組成物に含まれる有効成分）
上述のような液・液分配により得たジエチルエーテル層には主にトリシンが含まれる。また、酢酸エチル層には、トリシン、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン−６−Ｃ−グルコシドが主に含まれる。【００２０】（第５工程：トリシンの精製・採取）
したがって、ジエチルエーテル層からトリシンを採取するには、ジエチルエーテル層の液を小型のカラムクロマトグラフィー（セファデックス‘Ｓｅｐｈａｄｅｘ’ＬＨ−２０カラム：内径２ｃｍ×高さ１０ｃｍ）に供し、８０％〜１００％メタノール溶液にてトリシンを溶出させ、トリシンの画分を捕集するという方法が採用される。この層から純度９５％以上のトリシンを得ることができるが、必要に応じて、後述する分取ＨＰＬＣにより純度の高いトリシンを得ることができる。
酢酸エチル層からトリシンを採取するには、酢酸エチル層の液をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム：内径４ｃｍ×高さ８０ｃｍ）に供し、６０％メタノール溶液にて溶出させ、最も遅く溶出するトリシンアグリコンを捕集する方法が採用される。この方法により純度９９％以上のトリシンを得ることができる。さらに純度の高いものを得るには次項に示した分取ＨＰＬＣを行う。
また、酢酸エチル層からＬＨ−２０カラムによって分離されるトリシン配糖体からは後述する加水分解によってトリシンアグリコンを得ることができる。なお、カラムクロマトグラフィーでの溶離に際し、フラクションコレクターで分画する。それぞれの画分（フラクション）について波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮する。分取ＨＰＬＣにはフォトダイオードアレイ検出器を用い、ＨＰＬＣの適当な条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃
また、加水分解したササ葉抽出液をＸＡＤカラムに供することなく、ジエチルエーテルを加えて液・液分配分配し、回収したジエチルエーテル層のジエチルエーテルを蒸発させ、得られる粉末をメタノールで数回洗浄する方法によってトリシンを得ることが出来る。【００２１】（トリシンの精製及び同定）
採取されたトリシンは、以下の方法で精製し、同定することができる。
濃縮された該当ピークについて、フォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行う。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃【００２２】  なお、本発明者らの研究によれば、クマイザサ抽出液の加水分解による方法、あるいは分画後ピークの加水分解による方法、によって、液中のトリシンの含量を増大させることが出来、トリシンの収量が向上することを確認した。この加水分解は、酸のほかアミラーゼ等の糖鎖切断酵素によっても行うことができる。したがって、これを精製工程で加水分解物をＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸等を洗い流して精製することにより、収率よくトリシンを得ることが出来る。【００２３】＜吸収スペクトル法＞
精製物をメタノールに溶解し、４５０〜２３０ｎｍにおけるＵＶ・ＶＩＳ吸収スペクトルを測定した。すなわち、試料のメタノール溶液を測定した後、ナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）、１２％塩酸（１２％ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ），ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）の各種試薬を添加し、吸収スペクトルを測定する。
その結果は、下記の表１に示すとおりである。なお、表１にはトリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）のほか、参照例として、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ−６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）及びルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ−６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）のデータも併記している。【００２４】
【表１】
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【００２５】  吸収スペクトルによるトリシンを同定するには、以下のような手順が好ましい。すなわち、ＮａＯＭｅ添加によりＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することより、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）がわかる。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより、４’位に遊離水酸基が存在する。ＡｌＣｌ３添加によりＢｄ．Ｉが深色移動することから、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によりＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉと比較し浅色移動しないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在するが、Ｂ環中に隣接する遊離水酸基がないことがわかる。ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから、７位に遊離水酸基が存在する。ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３の添加によりメタノール溶液のＢｄ．Ｉと比べて深色移動がないことより、隣接する遊離水酸基ないことがわかる。
以上より、４’，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格を持つ色素であることがわかる。【００２６】＜質量分析＞
精製した試料（トリシン）について、パーセプティブ社製質量分析計Ｍａｒｉｎｅｒを用い、分子量を正イオンモード（ＰＯＳ）で測定する。条件は下記の表２に示すとおりである。（表２でも参照例として、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン６−Ｃアラビノシドのデータを併記している。）
［質量分析条件］
内部標準：４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｐｈｅｎｏｌ（ｍ／ｚ１５２．０７），ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ（ｍ／ｚ６０９．２８）
インターフェイス：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）
温度：室温（２５℃）【００２７】
【表２】
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【００２８】  吸収スペクトルからフラボン類であることがわかるが、質量分析によるｍ／ｚから結合糖は存在しないアグリコンであることがわかる。また、ｍ／ｚから構造の２カ所がメトキシル化されていることが推測される。【００２９】＜ＮＭＲ分析＞
それぞれ、十分に乾燥した試料を２〜１０ｍｇ計量採取し、ＮＭＲ測定管に移して重メタノールもしくは重ジメチルスルホキシド０．７ｍｌに溶解する。１Ｈ−ＮＭＲをＪｅｏｌＪＮＭ−Ａ４００（４００ＭＨｚ）にて測定する（内部標準：ＣＤ３ＯＤ，３．３０，ＤＭＳＯ−ｄ６，２．４９）。なお、１Ｈ−ＮＭＲ測定溶媒として重ジメチルスルホキシドを用いる。【００３０】  トリシンの１Ｈ−ＮＭＲによる測定値は、以下のとおりである。
δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，７，４’−Ｈ−Ｏ），３．８７（ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ−Ｏ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ−Ｏ）．
δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，６−Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，８−Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），７．３１（ｓ，２Ｈ，２’，６’−Ｈ）に４種の芳香族プロトンが観測される。
このうち、δ＝６．１７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）に相関が観測され、その結合定数よりこの二つのプロトンはメタの関係にあると推定される。また、δ＝７．３１（ｓ）のシグナルが積分比として２プロトン分あること、メトキシ基と考えられるδ＝３．８７（ｓ）のシグナルが積分比として６プロトン分あることから、対象性を有する４置換ベンゼンの存在が示唆され、また、δ＝３．１−３．６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）に水酸基由来のプロトンが２プロトン、及びδ＝１３．０（ｓ，１Ｈ）の低磁場に水素結合をしていると考えられる水酸基のプロトンが観測されることから、水酸基が３種あると推定される。
以上のデータと先の吸収スペクトル、質量分析結果をあわせた結果、この化合物はトリシンであると決定される。
【発明の効果】
【００３１】  本発明方法により得られるトリシンは、脂質過酸化抑制効果に優れている。また、トリシンには、抗腫瘍活性、抗白血病活性があること、脂質の過酸化を抑制することが知られている。さらに、防虫効果もある。したがって、本発明によるトリシンは、医薬品、化粧品、食品等を含む広い分野で有用である。
しかも、本発明方法によれば、日本国中に生育し、その多くは廃棄物となっているササやタケの葉を原料とするため、低コストでトリシンを製造することができるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】  以下に、本発明方法の実施例及び比較例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。なお、例中の％は特に断らない限り重量％を意味する。また、例中の抗酸化活性の測定は次のように実施した。【００３３】１．ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。なお、ラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ  Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０【００３４】２．スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の反応よるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ  Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ  Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ  Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔ  ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０【００３５】３．脂質過酸化抑制効果
４％−リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、試料１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。試料はササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールを試料の代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法にしたがい測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。
【実施例１】
【００３６】  原料のササ葉として、北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ  ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。
まず、水洗した・ササ葉１ｇをに対して５倍容のメタノール中に浸漬・抽出した。抽出は暗所で２４時間放置して抽出した後、濾過した。次いで、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ササ葉重量の２倍容の純水に溶解した。得られた水溶液を粗抽出液とした。
上記の粗抽出液に対して、等量等倍の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
置換した各層の液状組成物を用い、フェノール物質の定量及び抗酸化活性の測定を行った。原料のササ葉として、北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ  ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。【００３７】  上記の粗抽出液に対して、等倍の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
得られた各層を採取し、ササ葉重量に対して等倍の液量になるようにロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、これをメタノールに置換して抗酸化性組成物を得た。水層については、ＸＡＤカラムにより遊離の糖を取り除いて抗酸化性組成物を得た。【００３８】（２）トリシンの単離・精製
ジエチルエーテル層からトリシンを採取するため、ジエチルエーテル層の液を小型のカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム：内径２ｃｍ×高さ１０ｃｍ）に供し、９０％メタノール溶液にてトリシンを溶出させ、トリシンの画分を捕集した。
また、酢酸エチル層からトリシンを採取するため、酢酸エチル層の液をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム：内径４ｃｍ×高さ８０ｃｍ）に供し、６０％メタノール溶液にて溶出させ、最も遅く溶出するトリシンアグリコンを捕集した。カラムクロマトグラフィーでの溶離に際し、フラクションコレクターで分画した。それぞれの画分（フラクション）について波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮した。これによりジエチルエーテル層からは純度９５％以上のトリシンを、酢酸エチル層からは純度９９％以上のトリシンをそれぞれ得ることができた。
さらに純度の高いものを得る目的で分取ＨＰＬＣを行った。その結果純度９９％以上（ＮＭＲ分析可能グレード）のトリシンを得ることができた。
なお、この際の分取ＨＰＬＣにはフォトダイオードアレイ検出器を用い、ＨＰＬＣの条件は以下のとおりにした。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃【００３９】  下記の表３に、トリシンの精製品について抗酸化活性を測定した結果を、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド等の参照例と一緒にまとめて示す。【００４０】
【表３】
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【００４１】  なお、表３中の油脂過酸化抑制率の測定は次のように行った。
＜油脂過酸化抑制率の測定＞
（１）試料油脂の調整
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、試料１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。試料はササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールを試料の代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
（２）ＰＯＶ検定
ＰＯＶ検定は、日本油脂学会による酸化油脂中の過酸化物価の測定法に従い、過酸化脂質（ヒドロペルオキシド）が酸性条件下で還元される反応に基づき、遊離されるヨウ素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法で行った。
重クロム酸カリウムを純水に溶解し、０．０１Ｎ  重クロム酸カリウム溶液を作成する。このとき、重クロム酸カリウム溶液のファクター（ｆ＝採取量／理論値）を求めておく。ヨウ化カリウム１ｇを純水５ｍｌに溶解させる。そこに０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液２０ｍｌ、塩酸５ｍｌを加え、撹拌後栓をして５分間暗所に放置した。５分後、純水３００ｍｌを加え、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。褐色が消えかかったら、１％澱粉指示薬を加え、青色が完全に消失するまで滴定した。滴定値がＶｍｌのとき、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液のファクターは、Ｆ＝２０×ｆ／Ｖで求め、滴定を行った。
上述のように調製した試料油脂１ｇを採取し、クロロホルム氷酢酸混液（３：２）２５ｍｌ、飽和ヨウ化カリウム溶液１ｍｌ加え、すぐに撹拌し、１分間暗所に放置した。反応を止めるために純水７５ｍｌを加えた。２層に分かれる上層の赤紫色の消失を終点とし、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。空試験には純水１ｇを用いて行った。【００４２】
【数１】
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【００４３】  表３に示す結果から、本発明の方法により製造されるササ葉由来のトリシンは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性は見られないが、脂質過酸化物抑制活性に優れていることがわかった。
【実施例２】
【００４４】  本実施例では、クマイザサのササ葉抽出液を加水分解した場合について説明する。試料葉にはトリシンアグリコンを含まないもの（採取地：北海道津別町相生）を使用した。
すなわち、クマイザサ抽出液の酸加水分解とは、クマイザサ抽出液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加える（抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにする）。混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。
各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸を洗い流し、メタノールに溶媒置換後、ＬＨ−２０カラムに供し、精製後、ＨＰＬＣで定量分析した。【００４５】  まず、図２にササ葉抽出液の非加水分解物のＬＨ−２０溶出パターンを示す。そして、ササ葉抽出液を０．２Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間、加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図３に、０．７Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図４に示す。
図２のＢＩＩはルテオリン６−Ｃグルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ  ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｃ）の溶出ピーク、ＢＩＩＩはルテオリン６−Ｃアラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ  ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のピークであり、トリシンアグリコンは図３では２ＨＩＩＩ、図４では７ＨＩＩＩのピークである。なお、ＨＰＬＣやＸＡＤカラム、ＬＨ−２０カラムの条件は既に述べた条件と同じである。
図２、図３、図４より、加水分解によって図２（加水分解前）のＢＩピークが減少し、図３の２ＨＩＩＩ及び図４の７ＨＩＩＩが新たに検出することが確認できる。新たに検出された２ＨＩＩ１や７ＨＩＩＩのピークはトリシンアグリコンを含んでいない試料でも、加水分解によってトリシンが生成されることを示している。【００４６】  すなわち、図５に示すように、酸加水分解処理を行うことで、トリシンアグリコンを含んでいない試料でも、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでトリシンを得ることが出来ることがわかった。
【実施例３】
【００４７】  本実施例では、ササ葉抽出液をＬＨ−２０カラムで分画し、配糖体を含むフラクションを加水分解してトリシンを取得する場合について説明する。
クマイザサのメタノール抽出液のＬＨ−２０カラム分画液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加えて（分画液と塩酸の比率は１：１になるようにする）混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ加水分解物から酸を洗い流しメタノールに溶媒置換し、ＨＰＬＣ分析した。【００４８】  図６に、上記図２の無処理ササ葉抽出液のＬＨ−２０カラム分画分で、配糖体が含まれていると考えられるフラクション（ＢＩ）を加水分解して得られたトリシン量の定量結果を示す。この図から明らかなように、クマイザサ抽出液をセファデックスＬＨ−２０カラムで分画した後でも、酸加水分解処理を行うことにより、トリシンアグリコンを含まない検体からトリシンを得ることが出来ることが確認された。【００４９】  以上より、トリシンの収量を上げる方法として、（１）クマイザサ抽出液の酸加水分解による方法、及び（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが確認された。【００５０】  また、加水分解したササ葉のメタノール抽出液をＸＡＤカラムに供することなく、ジエチルエーテルを加え液・液分配し、回収したジエチルエーテル層のジエチルエーテルを蒸発させて、得られる粉末をメタノールで数回洗浄する方法でも、トリシンが得られることもわかった。【００５１】  さらに、図７に示すように、トリシンアグリコンを含むササ葉検体（採取地：北海道興部町）を試料とし、実施例１と同様にメタノール抽出液をジエチルエーテルによる液・液分配して得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムで分画した場合も、波長３５０ｎｍにおいて、トリシンを含む画分が見られ、これからトリシンを採取できることもわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】  本発明の方法の工程概略図
【図２】  クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、ＢＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．６６〜９４、ＢＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９５〜１１５、ＢＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１６〜１４３に分画）
【図３】  クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、２ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９１〜１１２、２ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１３〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１９９〜２２０に分画）
【図４】  クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．７Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、７ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．８８〜１０８、７ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１０９〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１８９〜２１２に分画）
【図５】  トリシン（アグリコン）の含量を示すグラフであって、図３の２ＨＩＩＩピーク及び図４の７ＨＩＩＩピークを使用したときのデータ（クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムの溶出結果からトリシンのピークが検出されなかったため、未処理は０として算出し，２ＨＩＩＩピークを０．２ＮＨＣｌ処理、７ＨＩＩＩピークを０．７ＮＨＣｌ処理とそれぞれＸ軸表記）
【図６】  ＢＩピークの酸加水分解（水解）によるトリシン（アグリコン）含量の変化を示すグラフであって、図２のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行ったときのデータ（酸加水分解前のものを水解前、酸加水分解処理したものを水解後とそれぞれＸ軸に表記）
【図７】  ジエチルエーテルによる分配で得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムの分画チャート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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