(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍細胞成長を阻害し、腫瘍を治療するための方法・組成物、及び抗腫瘍化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】新規なポリペプチド、及びそれらをコードする核酸分子を見出し、該配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、結合抗体及びそれらを製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞成長を阻害するのに有用な物質の組成物であって、製薬的に許容される担体と混合されたＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストを含有する物質の組成物。
【請求項２】
ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストの成長阻害量を含有する請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項３】
ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストの細胞毒性量を含有する請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項４】
さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を更に含有する請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項５】
哺乳動物における腫瘍の治療に有用な物質の組成物であって、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストの治療的有効量を含有する物質の組成物。
【請求項６】
前記腫瘍が癌である請求項５に記載の物質の組成物。
【請求項７】
癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、骨髄腫及び白血病からなる群から選択される請求項６に記載の物質の組成物。
【請求項８】
腫瘍細胞の成長を阻害する方法において、前記腫瘍細胞をＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量に曝露することを含んでなる方法。
【請求項９】
前記アゴニストが、抗-ＰＲＯ２４０、抗-ＰＲＯ３８１、抗-ＰＲＯ５３４、抗-ＰＲＯ５４０、抗-ＰＲＯ６９８、抗-ＰＲＯ９８２、抗-ＰＲＯ１００５、抗-ＰＲＯ１００７、抗-ＰＲＯ１１３１、抗-ＰＲＯ１１５７、抗-ＰＲＯ１１９９、抗-ＰＲＯ１２６５、抗-ＰＲＯ１２８６、抗-ＰＲＯ１３１３、抗-ＰＲＯ１３３８、抗-ＰＲＯ１３７５、抗-ＰＲＯ１４１０、抗-ＰＲＯ１４８８、抗-ＰＲＯ３４３８、抗-ＰＲＯ４３０２、抗-ＰＲＯ５７２５、抗-ＰＲＯ１８３、抗-ＰＲＯ２０２、抗-ＰＲＯ５４２、抗-ＰＲＯ８６１、抗-ＰＲＯ１０９６又は抗-ＰＲＯ３５６２アゴニスト抗体である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アゴニストが、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記曝露工程がインビトロで行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記曝露工程がインビボで行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
容器；及び
当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物を具備し、前記組成物中の活性剤がＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチド、又はそのアゴニストである製造品。
【請求項１４】
前記組成物の腫瘍細胞成長阻害のための用途を記載した、前記容器に貼付されたラベル、又は前記容器内に封入される包装挿入物を更に具備する請求項１３に記載の製造物。
【請求項１５】
前記アゴニストが、抗-ＰＲＯ２４０、抗-ＰＲＯ３８１、抗-ＰＲＯ５３４、抗-ＰＲＯ５４０、抗-ＰＲＯ６９８、抗-ＰＲＯ９８２、抗-ＰＲＯ１００５、抗-ＰＲＯ１００７、抗-ＰＲＯ１１３１、抗-ＰＲＯ１１５７、抗-ＰＲＯ１１９９、抗-ＰＲＯ１２６５、抗-ＰＲＯ１２８６、抗-ＰＲＯ１３１３、抗-ＰＲＯ１３３８、抗-ＰＲＯ１３７５、抗-ＰＲＯ１４１０、抗-ＰＲＯ１４８８、抗-ＰＲＯ３４３８、抗-ＰＲＯ４３０２、抗-ＰＲＯ５７２５、抗-ＰＲＯ１８３、抗-ＰＲＯ２０２、抗-ＰＲＯ５４２、抗-ＰＲＯ８６１、抗-ＰＲＯ１０９６又は抗-ＰＲＯ３５６２アゴニスト抗体である請求項１３に記載の製造品。
【請求項１６】
前記アゴニストが、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である請求項１３に記載の製造品。
【請求項１７】
前記活性剤が哺乳動物における腫瘍の治療に有効な量で存在する請求項１３に記載の製造品。
【請求項１８】
前記組成物が、さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を更に含有する請求項１３に記載の製造品。
【請求項１９】
図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、及び図５６（配列番号：５６）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ単離された核酸。
【請求項２０】
図１（配列番号：１）、図３（配列番号：３）、図５（配列番号：５）、図７（配列番号：７）、図９（配列番号：９）、図１１（配列番号：１１）、図１３（配列番号：１３）、図１５（配列番号：１５）、図１７（配列番号：１７）、図１９（配列番号：１９）、図２１（配列番号：２１）、図２３（配列番号：２３）、図２５（配列番号：２５）、図２７（配列番号：２７）、図２９（配列番号：２９）、図３１（配列番号：３１）、図３３（配列番号：３３）、図３５（配列番号：３５）、図３７（配列番号：３７）、図３９（配列番号：３９）、図４３（配列番号：４３）、図４５（配列番号：４５）、図４７（配列番号：４７）、図４９（配列番号：４９）、図５１（配列番号：５１）、図５３（配列番号：５３）、及び図５５（配列番号：５５）に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ単離された核酸。
【請求項２１】
図１（配列番号：１）、図３（配列番号：３）、図５（配列番号：５）、図７（配列番号：７）、図９（配列番号：９）、図１１（配列番号：１１）、図１３（配列番号：１３）、図１５（配列番号：１５）、図１７（配列番号：１７）、図１９（配列番号：１９）、図２１（配列番号：２１）、図２３（配列番号：２３）、図２５（配列番号：２５）、図２７（配列番号：２７）、図２９（配列番号：２９）、図３１（配列番号：３１）、図３３（配列番号：３３）、図３５（配列番号：３５）、図３７（配列番号：３７）、図３９（配列番号：３９）、図４３（配列番号：４３）、図４５（配列番号：４５）、図４７（配列番号：４７）、図４９（配列番号：４９）、図５１（配列番号：５１）、図５３（配列番号：５３）、及び図５５（配列番号：５５）に示すヌクレオチド配列の全長コード化配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ単離された核酸。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ登録番号２０９２６０、２０９８０８、２０９７０１、２０９６９９、２０９９０４、２０３５８３、２０３０２１、２０９９５０、２０３１１１、２０３５４０、２０９８５６、２０３４５２、２０３２２３、２０３５７５、２０３２６７、２０３１１５、２０３２７７、２０３４６６、２０３６０３、２０３８３４、又はＰＴＡ-２５６の下で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ単離された核酸。
【請求項２３】
請求項１９から２２のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記細胞が大腸菌である請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記細胞が酵母菌細胞である請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記細胞がバキュウロウイルス感染昆虫細胞である請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチドの製造方法において、請求項２５に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で培養し、細胞培地から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項３１】
図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、及び図５６（配列番号：５６）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、及び図５６（配列番号：５６）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも８０％ポジティブのスコアをつけられる単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
ＡＴＣＣ登録番号２０９２６０、２０９８０８、２０９７０１、２０９６９９、２０９９０４、２０３５８３、２０３０２１、２０９９５０、２０３１１１、２０３５４０、２０９８５６、２０３４５２、２０３２２３、２０３５７５、２０３２６７、２０３１１５、２０３２７７、２０３４６６、２０３６０３、２０３８３４、又はＰＴＡ-２５６の下で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
異種アミノ酸配列に結合した請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項３５】
異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項３４に記載のキメラ分子。
【請求項３６】
異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項３４に記載のキメラ分子。
【請求項３７】
請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
（ａ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドであって付随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであってそれに付随するシグナルペプチドを持つものをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｃ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであってそれに付随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列；
と少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ単離された核酸。
【請求項４０】
（ａ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドであって付随するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｂ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであってそれに付随するシグナルペプチドを持つもの；又は
（ｃ）図２（配列番号：２）、図４（配列番号：４）、図６（配列番号：６）、図８（配列番号：８）、図１０（配列番号：１０）、図１２（配列番号：１２）、図１４（配列番号：１４）、図１６（配列番号：１６）、図１８（配列番号：１８）、図２０（配列番号：２０）、図２２（配列番号：２２）、図２４（配列番号：２４）、図２６（配列番号：２６）、図２８（配列番号：２８）、図３０（配列番号：３０）、図３２（配列番号：３２）、図３４（配列番号：３４）、図３６（配列番号：３６）、図３８（配列番号：３８）、図４０（配列番号：４０）、図４４（配列番号：４４）、図４６（配列番号：４６）、図４８（配列番号：４８）、図５０（配列番号：５０）、図５２（配列番号：５２）、図５４（配列番号：５４）、又は図５６（配列番号：５６）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであってそれに付随するシグナルペプチドを欠くもの；
と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するための方法及び組成物に関する。特に本発明は、腫瘍治療のための抗腫瘍組成物及び方法に関する。さらに本発明は、成長阻害性、例えば抗腫瘍化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993]）。
癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍実体を形成する異常な、又は腫瘍形成性の細胞数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節及び離間部位に拡散（転移）する悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
近年の癌治療の進歩にもかかわらず、腫瘍細胞成長を阻害することのできる新たな治療薬が大いに必要とされている。従って、本発明の目的は、癌細胞といった腫瘍細胞の成長を阻害することのできる化合物を同定することである。
【０００３】
（発明の概要）
１．  実施態様
本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するための方法及び組成物に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物患者、好ましくはヒトにおける乳癌、前立腺癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌及びＣＮＳ癌等の癌を含む腫瘍の治療のための方法及び組成物に関する。
一態様では、本発明は、製薬的に許容される担体と混合された、ここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量を含有する、腫瘍細胞成長を阻害するのに有用な物質の組成物に関する。好ましい実施態様では、物質の組成物は、ＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストの成長阻害量を含有する。他の好ましい実施態様では、組成物は、ＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストの細胞毒性量を含有する。
場合によっては、物質の組成物は、一又は複数のさらなる成長阻害及び／又は細胞毒性及び／又は他の化学治療薬を含有してもよい。
【０００４】
さらなる態様では、本発明は、ここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストの治療的有効量を含有する、哺乳動物における腫瘍の治療に有用な物質の組成物に関する。腫瘍は、好ましくは癌である。
他の態様では、本発明は腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関し、当該細胞をここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量に曝露することを含んでなる。特別な実施態様では、アゴニストは抗-ＰＲＯアゴニスト抗体である。他の実施態様では、アゴニストはＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である。
この方法は、インビトロ又はインビボで実施されうる。
【０００５】
またさらなる態様では、本発明は：
（１）容器；
（２）当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物であって、当該組成物は新生細胞成長、例えば腫瘍細胞成長の阻害に有効であり、該組成物中の活性剤はここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストである；及び
（３）前記ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの腫瘍細胞成長阻害のための用途を記載した、前記容器に貼付されたラベル、又は前記容器内に封入される包装挿入物；
を具備する製造品に関し、当該アゴニストはＰＲＯポリペプチドに結合する抗体であってよい。
【０００６】
特別な実施態様では、アゴニストは抗-ＰＲＯアゴニスト抗体である。他の実施態様では、アゴニストはＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である。ここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニストを腫瘍治療のための治療的有効量で含む類似の製造物も本発明の範囲内である。また、ここで定義されるＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニスト、並びにさらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を含む製造品も本発明の範囲内である。
【０００７】
２．  さらなる実施態様
本発明の他の実施態様では、当該発明は、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片のコード化配列を持つＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は（ａ）ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００１０】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失しているか又は膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここに開示される。従って、ここに記載されるＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００１１】
他の実施態様はＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードしてもよいＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約４００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約７００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約８００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約９００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片によってコードされるＰＲＯポリペプチド、好ましくは抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むＰＲＯポリペプチド断片も考慮される。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
或る態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドと比較したときに、少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８１％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８３％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８４％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８６％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８７％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８８％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８９％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９１％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９２％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９３％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９４％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９６％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９７％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９８％ポジティブ、そして、より好ましくは少なくとも約９９％ポジティブのスコアとされるアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１５】
特別な実施態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたＰＲＯを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性化された、単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
【００１６】
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニストは抗-ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することを含む。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
さらに他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯポリペプチドのアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
【００１７】
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアンタゴニスト又は抗-ＰＲＯ抗体に起因する状態の治療において有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、酵母、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
【００１８】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
またさらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字又は下線で示した。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
【００２０】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００２１】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２２】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いても得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX （登録商標）V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２３】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２Ａと２Ｂは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記したようにしてALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較コンピュータプログラムNCBI-BLAST-2（Altschul等, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２４】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、ワード閾値（Ｔ）＝11、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２５】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００２６】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また図２Ａ-Ｐに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２７】
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表２Ｃ-Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝10、最小低複合長＝15/5、マルチパスｅ-値＝0.01、マルチパスの定数＝25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝25、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２８】
さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、ワード閾値（Ｔ）＝11、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチド-コード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチド-コード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチド-コード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチド-コード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチド-コード化核酸分子の核酸配列である。
【００２９】
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、添付の図面に示す全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
上記のように実施されるアミノ酸配列同一性比較の文脈における「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において同一であるアミノ酸残基ばかりでなく特性を有するものも含む。対象とするアミノ酸残基に対してポジティブ値をスコアされるアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の（下記の表６で特定するように）好ましい置換とされるものである。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。
【００３０】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、それに天然に付随する全ての成分を伴わない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
ＰＲＯポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子又は抗-ＰＲＯ抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、ＰＲＯコード化核酸の天然源又は抗-ＰＲＯコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、それに天然に付随する全ての成分を伴わない。単離されたＰＲＯコード化核酸分子又は抗-ＰＲＯコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯコード化核酸分子又は抗-ＰＲＯコード化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯポリペプチド又は抗-ＰＲＯ抗体をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する又は抗-ＰＲＯ抗体を発現する細胞に含まれるＰＲＯ核酸分子及び抗-ＰＲＯ核酸分子を含む。
【００３１】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯモノクローナル抗体(アゴニスト抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖の抗-ＰＲＯ抗体、及び抗-ＰＲＯ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００３２】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００３３】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３４】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生のＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性／特性を保持するＰＲＯポリペプチドの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生のＰＲＯポリペプチドによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生のＰＲＯポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生のＰＲＯポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
ここに開示されるスクリーニングアッセイによって同定できる抗体又は他のアンタゴニスト分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）の文脈における「生物学的活性」は、それらの分子が「治療的有効量」の定義に関してここに列挙する効果の一又は複数を誘起する能力を指す。好ましい生物学的活性は、標的腫瘍（例えば癌）細胞の成長の遅延及び完全な停止を含む阻害である。他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍（例えば癌）細胞の死をもたらす細胞毒性活性である。さらに他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍（例えば癌）細胞のアポトーシスの誘発である。
【００３５】
「免疫学的活性」という語は、ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性を意味する。
ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活性を持つＰＲＯポリペプチドの定性的生物学的活性を、周知の活性なＰＲＯポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを意味する。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジュバント中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜内又は皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反応性は好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子（例えば抗体）の対応するＰＲＯポリペプチドに対する結合親和性が、その分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対する結合親和性より有意に高い（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約４倍、さらにより好ましくは少なくとも約８倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍高い）ことを意味する。
【００３６】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００３７】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接的に腫瘍細胞の病理を低下させてもよいし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び／又は化学治療に対してより敏感にしてもよい。
癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
【００３８】
ここに開示されるポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」とは、腫瘍性細胞成長の阻害に関しては、標的細胞の成長を或る程度阻害できる量である。この用語は、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び／又は細胞毒性効果及び／又はアポトーシスを誘起することのできる量を含む。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、次の効果：（１）遅延化及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらしてもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う徴候の１つ又は複数の或る程度の軽減の１つ又は複数を誘起することのできる量を意味する。腫瘍の治療の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「治療的有効量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
【００３９】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、経験的に日常的手法で決定できる。ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
【００４０】
ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号参照）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ相でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ相以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ相停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
【００４１】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【００４２】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug delivery, Borchardt等（編）, pp.147--267, Human Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含み、限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞毒性薬の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００４３】
「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然のＰＲＯポリペプチドの生物学的活性に類似する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は特に、アゴニスト抗体又は抗体断片、天然のＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、腫瘍細胞を候補アゴニスト分子に暴露し、腫瘍細胞成長の阻害を測定することを含みうる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４４】
一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の自己形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４５】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＲｓ)と呼ばれる３つ又は４つののセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク(ＦＲ)領域と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、β-シート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、ＣＤＲにより連結されたβ-シート配置を主にとる４つ又５つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性活性への抗体の関与を示す。
【００４６】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異的抗体を含む。
【００４７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を持つ２つの同一な抗原結合断片、及び残りの「Ｆｃ」断片、その名称は容易に結晶化する能力を反映している、を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の二量体からなる。この配置では、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決定するために各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合する能力を持つが、結合部位全体よりは親和性が低い。
【００４８】
また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる１つ又は２つの明らかに異なる型に分類できる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられる。
【００４９】
ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在する自然に起こりうる突然変異以外は同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されない点において有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られ、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）により作成してもよい。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリから、例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いて単離してもよい。
【００５０】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望のお生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ枠残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるＣＤＲ又は枠配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. struct. Biol. 2: 593 -596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたPRIMATIZED(商品名)抗体を含む。
【００５１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ）に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、EP404097；WO93 /11161；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５２】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。また標識は、毒素のような非検出可能な物質でもよい。
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の粒子の不連続な固体相も含む。
【００５３】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はそれらに対する抗体など）の送達に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。
「小分子」は、ここで約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００５４】
以下に示すように、表１は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの完全なソースコードを与える。このソースコードは日常的にUNIX（登録商標）オペレーティングシステム上での使用委のためにコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを与える。
さらに、表２−５は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを使用して％アミノ酸同一性（表２-３）及び％核酸配列同一性（表４-５）を決定する後述の方法を使用するための仮説的例示を示し、「ＰＲＯ」とは対象とする仮のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を意味し、「比較タンパク質」とは対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドと比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を意味し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」とは、対象とする仮のＰＲＯ-コード化核酸配列を意味し、「比較ＤＮＡ」とは対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子と比較される核酸分子のヌクレオチド配列を意味し、「Ｘ」、「Ｙ」、及び「Ｚ」は各々異なる仮のアミノ酸配列、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮のヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００７６】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼称されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、ＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。
下記の実施例に開示するように、ｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００７７】
Ｂ．ＰＲＯ変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯ翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯポリペプチド又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯポリペプチドと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化する、ＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換による。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
【００７８】
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、天然のＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換と題して表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００７９】
2006025793.tif 000023
【００８０】
ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００８１】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &amp;amp; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００８２】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ-又はＣ-末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &amp;amp;amp; Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ-末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００８３】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯポリペプチドに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００８４】
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗-タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ-又はカルボキシル-末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗-タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-His-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００８５】
Ｄ．ＰＲＯポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯポリペプチド核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯポリペプチドを生産してもよい。
【００８６】
１．ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は既知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００８７】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００８８】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００８９】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E.coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００９０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ-コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００９１】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００９２】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００９３】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００９４】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００９５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００９６】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９７】
５．ＰＲＯポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯポリペプチドの性質に依存する。
【００９８】
Ｅ．抗体
本発明の組成物及び方法で使用する候補薬剤の幾つかは、ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する抗体及び抗体断片である。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９９】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には断片を含むＰＲＯポリペプチド、又はそのタンパク質又はその断片の融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１００】
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯポリペプチド対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１０２】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０３】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含んでよい。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１０４】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１０５】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１０６】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
国際公開WO 96/27011号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１０７】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成する別のメカニズムを提供した。フラグメントは、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは他のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１０８】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J. Immunol. 147:60(1991)。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるタンパク質上の２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ポリペプチドアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のタンパク質発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、特定のポリペプチドを発現する細胞に対する局所的細胞毒性薬として使用してもよい。これらの抗体は、ポリペプチド結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、ポリペプチドに結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１０９】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【０１１０】
６．エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【０１１１】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１１２】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１１３】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。      
【０１１４】
Ｆ．腫瘍性細胞成長又は増殖を阻害できるタンパク質の同定
本出願で開示したタンパク質を、国立癌学会（ＮＣＩ）の実験的、疾患指向性、インビトロ薬剤スクリーニングで現在使用されている６０腫瘍系のパネルで検定した。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する細胞毒性及び／又は細胞増殖抑制活性を有する分子を同定することである。ＮＣＩは毎年10,000を越える新たな分子をスクリーニングしている（Monks等, J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10): 1-12 [1989]）。この実験に使用された腫瘍細胞系は、上掲のMonks等に記載されている。本出願のタンパク質によって成長が有意に阻害された細胞系を実施例で特定した。
結果は、試験したタンパク質が種々の癌細胞系において細胞増殖抑制性、そして或る場合及び濃度では細胞毒性活性を示すことを明らかにした。
腫瘍（例えば癌）についての他の細胞ベースのアッセイ及び動物モデルも、ＮＣＩ癌スクリーニングの発見を裏付け、ここで同定したタンパク質と腫瘍精細胞成長の進行及び病因当量の関係をさらに理解するのに使用できる。例えば、（以下に記載するような）トランスジェニック動物における腫瘍から一次培地は、ここの細胞ベースのアッセイで使用できるが、安定な細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で公知である（例えば、Small等, Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 [1985]参照）。
【０１１５】
Ｇ．動物モデル
腫瘍の進行及び原因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例えば大腸組織に移植された大腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより作成される。（1997年9月18日に発行されたＰＣＴ公報WO 97/33551参照。）
癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。ハイポ／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異種移植の宿主として行動するという観察は、この目的のための広い用途を導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子系統に導入された。さらに、遺伝的な免疫不全を持つヌードマウス以外の広範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さらなる詳細については、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 及び B. Winograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照。
【０１１６】
これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌細胞系、例えば上記列挙した腫瘍細胞系、及び、例えばＢ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞：Ｃａｃｏ-２（ATCC HTB-37）、中程度に良く分化したグレードＩＩヒト大腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９（ATCC HTB-38）から、あるいは腫瘍及び癌から誘導することができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Karmali等, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983]）。
腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動物に、種々の手法によって導入できる。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー(trochar)を用いてニードル生検として、細胞懸濁物としてｓ．ｃ．移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植のために、適切な大きさの腫瘍組織断片がｓ．ｃ．空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は安定な腫瘍細胞系から新たに調製され、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下植え込みとして注射することもできる。この位置において、種菌が皮膚結合組織の下層とｓ．ｃ．組織との間に析出される。Boven及びWinograd (1991), 上掲。乳癌の動物モデルは、例えば、神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子が最初に単離される）、又はｎｅｕ形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより、基本的にはDrebin等, PNAS USA 83, 9129-9133 (1986)に記載されているように生成される。
【０１１７】
同様に、大腸癌の動物モデルは、大腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマウスにおけるヒト大腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wang等, Cancer Research 54, 4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に記載されている。このモデルは、いわゆるAntiCancer, Inc. (SanDiego, California)から市販の「METAMOUSE(商品名)」に基づく。
動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビトロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。このような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。
例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ-１６４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に導入され（DeLeo等, J. Exp. Med. 146, 720 [1977]）、それは、種々の抗原の抗-腫瘍活性の研究のための高度に制御可能なモデル系を提供する（Palladino等, J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987]）。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に注射する前に、細胞系は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。
【０１１８】
さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療における有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断片又は培地に残った細胞の注射に際して正常マウスに導入でき（Zupi等, Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980]）、証拠は、腫瘍がたった一つの細胞の注射から開始され、感染した腫瘍細胞の極めて高い集団が生存することを示している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986]を参照のこと。
移植された腫瘍の動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確である。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延としてより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利用可能である。しかし、腫瘍に続く壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期に腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、形態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
【０１１９】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック動物は、「導入遺伝子」又は動物自体又は動物の祖先に出生前段階（例えば胚段階）でゲノムに導入された遺伝物質を有するものである。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される。
【０１２０】
自発的な動物腫瘍の治療におけるここに同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の有効性も試験できる。このような研究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは高度に侵襲的な悪性腫瘍で、ネコに最も通常の口腔悪性腫瘍であり、この種に報告される口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、この転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているにすぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコの口腔の解剖学的形状による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない。研究に入る前に、各々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療がこの腫瘍を殺した後でも、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを長期に渡って繰り返し治療する。腫瘍の写真を治療期間中の毎日及び引き続く再チェックの時点で撮影した。治療の後、各ねこに再度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン及びラジオグラフは、その後８週間ごとに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上又は生存期間の延長を必要とする。
さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらのイヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの型の腫瘍の発生比率によって制限される。
【０１２１】
Ｈ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチドと結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。小分子とは、合成有機又は無機化合物を含むと考え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１２２】
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、その相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１２３】
Ｉ．製薬組成物
本発明のポリペプチド、ここに同定したタンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、癌を含む腫瘍の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が通常は好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる（例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]）。
また、ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬、又は成長阻害剤といったその機能を向上させる薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１２４】
ここで同定されるポリペプチド、又はそれらのアゴニストの治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）及び／又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１２５】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
治療的抗体組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバッグ又はバイアルに入れられる。
【０１２６】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１２７】
Ｊ．治療方法
本発明のポリペプチド及び抗体、ペプチド及び小分子アゴニストを含むそれらのアゴニストは、種々の腫瘍、例えば癌の治療に用いてもよい。治療される状態又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓(renal)、肝臓、腎臓(kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、胸腺、肝癌(hepatic carcinoma)；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部の腫瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状、視床下部及び腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔疾患などの疾患；及び炎症、脈管形成及び免疫学的疾患が含まれる。本発明の抗腫瘍剤（ここに開示したポリペプチド及びそれらの活性に類似したアゴニスト、例えば抗体、ペプチド及び有機小分子を含む）は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、又は筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、眼内、動脈内、病巣内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。
他の治療的養生法を本発明の抗癌剤の投与に組み合わせてもよい。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams &amp;amp;amp; Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。本発明の抗癌剤は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、これらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
【０１２８】
また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒＢ３、ＥｒＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。ときどきは、患者にサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗癌剤は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗癌剤を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
疾患の防止又は治療のための、ここでの抗腫瘍剤の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。薬剤は、患者に、一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼性のある指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti J.及びChappell. W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら編, Pergamon Press, New York 1989, 42-46に開示されているような原理に従い実施することができる。
【０１２９】
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍剤が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入により患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。特に用量及び送達方法に対する指針は文献にて提供されており；例えば米国特許第4,657,760号、同5,206,344号又は同5,255,212号を参照のこと。異なる調製物が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【０１３０】
Ｋ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は本発明の抗腫瘍剤である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１３１】
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
【０１３２】
実施例１
新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしあれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Dayhoff、GenBank）及び企業のデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
【０１３３】
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（常にではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１３４】
実施例２
アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを対象とするヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Fast Track 2）。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターpRK5DにおけるオリゴdTプライムしたcDNAの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAは1000bpを越えるサイズ分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dを、sp6転写開始部位、それに続くSfiI制限酵素部位、さらにXhiI/NotI cDNAクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
【０１３５】
２．ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5' 末端を好ましく表現するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6 RNAを（上記の）一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST-AMY.0におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロ値コールを用いたランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500-1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST-AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０１３６】
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌（Life Technoligies、20ml）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔た。次いで、SOC培地（Life Technplogies、1ml）を添加し、この号物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む20標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした（37℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl-勾配を用いてDNAを単離した。精製DNAは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／cDNA結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はHD56-5A（ATCC-90785）であった。この株は以下の遺伝子型：MATアルファ、ura3-52、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、MAL＋、SUC＋、GAL＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができるが、。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p、SSA1p-4p）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
【０１３７】
形質転換は、Gietzら, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からYEPD複合培地ブロス（100ml）に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なYEPDブロス（500ml）中におよそ2ｘ106細胞/ml（約OD600＝0.1）に希釈し、1ｘ10７細胞/ml（約OD600＝0.4-0.5）まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで5分間のSorval GS3 ローターのGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして50mlのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE（10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA  pH7.5, 100mMのLi2OOCCH3）で続けて洗浄し、LiAc/TE（2.5ml）中に再懸濁させた。
【０１３８】
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（100μl）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD）及び形質転換ＤＮＡ（1μg vol. ＜10μl）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE（600μl, 40%のポリエチレングリコール-4000, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi2OOCCH3, pH 7.5）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5）への再懸濁に次いで遠心分離した。
次いで、細胞をTE（1ml）中に希釈し、アリコート（200μl）を150mm成長プレート（VWR）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、しやくの量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（SCD-Ura）であった。形質転換体は30℃で2-3日成長させた。
【０１３９】
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Bielyら, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプンをSCD-Ura寒天プレートに最終濃度0.15%（w/v）で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した（最終濃度50-100mM）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（150mmプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD-Ura寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０１４０】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、96ウェルプレートにおいて無菌水（30μl）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（5μl）を、0.5μlのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; 4.0μlの10mM dNTP（Perkin Elmer-Cetus）; 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'（配列番号：57）
であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'（配列番号：58）
であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ．                  変性           92℃、  5分間
ｂ．次の３サイクル    変性           92℃、30秒間
アニール       59℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル    変性           92℃、30秒間
アニール       57℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル  変性           92℃、30秒間
アニール       55℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｅ．                  保持           4℃
【０１４１】
下線を施した領域は、各々ADHプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターpSST-AMY.0からの307bp領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの5'末端の最初の18ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は343bpであった。しかしながら、シグナル配列融合cDNAは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（5μl）を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ホウ酸塩-EDTA（TBE）緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。400bpより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム（Quagen Inc., Charsworth, CA）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０１４２】
実施例３
シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１４３】
実施例４
ヒトＰＲＯ２４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３０８７３と命名する。ＤＮＡ３０８７３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２４０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-TCAGCTCCAGACTCTGATACTGCC-3'（配列番号：５９）
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-TGCCTTTCTAGGAGGCAGAGCTCC-3'（配列番号：６０）
さらに、ＤＮＡ３０８７３コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-GGACCCAGAAATGTGTCCTGAGAATGGATCTTGTGTACCTGATGGTCCAG-3'（配列番号：６１）
【０１４４】
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２４０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２４０ポリペプチドについての全長ＤＮＡ配列（ここで、ＤＮＡ３４３８７−１１３８[図１、配列番号：１］）及びＰＲＯ２４０の誘導タンパク質配列が得られた。
上記で同定した全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２−１４に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置６９９−７０１に停止シグナルを持つ（図１、配列番号：１）。予測されるポリペプチド前駆体は２２９アミノ酸長であり図２（配列番号：２）に示す。図２（配列番号：２）に示した全長ＰＲＯ２４０配列の分析により、図２に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。全長ＰＲＯ２４０配列の分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸３０のシグナルペプチド及び約アミノ酸１９８〜アミノ酸２１２の膜貫通ドメイン。クローンＤＮＡ３４３８７−１１３８は1997年9月16日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２６０が付与された。
図２（配列番号：２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45、SwissProt 35）により、ＰＲＯ２４０アミノ酸配列と、Drosophilia melanogasterからの鋸歯状タンパク質前駆体及びGallus gallusからのＣ-鋸歯状-１タンパク質との間の配列同一性が明らかとなった（各々、３０％及び３５％）。
【０１４５】
実施例５
ヒトＰＲＯ３８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３９６５１と命名する。ＤＮＡ３９６５１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３８１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（３９６５１.ｆ１）：
5'-CTTTCCTTGCTTCAGCAACATGAGGC-3'（配列番号：６２）
逆方向ＰＣＲプライマー（３９６５１.ｒ１）：
5'-GCCCAGAGCAGGAGGAATGATGAGC-3'（配列番号：６３）
さらに、ＤＮＡ３９６５１コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ（３９６５１.ｐ１）：
5'-GTGGAACGCGGTCTTGACTCTGTTCGTCACTTCTTTGATTGGGGCTTTG-3'（配列番号：６４）
【０１４６】
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３８１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織（LIB227）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＤＮＡ４４１９４−１３１７[図３、配列番号：３］の全長DNA配列；及びＰＲＯ３８１の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４４１９４−１３１７の全コード化配列が図３（配列番号：３）に含まれる。クローンＤＮＡ４４１９４−１３１７は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７４−１７６に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置８０７−８０９に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は２１１アミノ酸長である。図４（配列番号：４）に示した全長ＰＲＯ３８１配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図４に示した全長ＰＲＯ３８１ポリペプチドの分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド；約アミノ酸１７６〜アミノ酸１８０の潜在的Ｎ-グリコシル化部位；約アミノ酸２０８〜約アミノ酸２１２の小胞体標的化配列；約アミノ酸７８〜約アミノ酸１１５、及び約アミノ酸１１８〜約アミノ酸１３２のＦＫＢＰ-型ペプチジル-プロリル・シス-トランスイソメラーゼ部位；約アミノ酸１４０〜約アミノ酸１６０、約アミノ酸１８４〜約アミノ酸２０４、及び約アミノ酸１９１〜約アミノ酸２０４のＥＦ-ハンドカルシウム結合ドメイン；及び約アミノ酸１８３〜約アミノ酸２０１のＳ-１００／ＩＣａＢｐ型カルシウム結合ドメイン。クローンＤＮＡ４４１９４−１３１７は1998年4月28日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０８が付与された。図４に示す全長ＰＲＯ３８１タンパク質は、約２４,１７２ダルトンの見積もり分子量と約５．９９のｐＩを有する。
全長ＰＲＯ３８１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＦＫＢＰイムノフィリンタンパク質に対して有意な配列類似性を持ち、よってＰＲＯ３８１が新規なＦＫＢＰイムノフィリン相同体であることを示唆した。より詳細には、図４（配列番号：４）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ３８１アミノ酸配列と以下に示すDayhoff配列との間に配列相同性が見いだされた：AF040252_1, I49669, P_R93551, S71238, CELC05C8_1, CEU27353_1, MIP_TRYCR, CEZC455_3, FKB4_HUMAN 及び I40718。
【０１４７】
実施例６
ヒトＰＲＯ５３４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４３０４８と命名する。ＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５３４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-CACAGAGCCAGAAGTGGCGGAATC-3'（配列番号：６５）
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-CCACATGTTCCTGCTCTTGTCCTGG-3'（配列番号：６６）
さらに、ＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CGGTAGTGACTGTACTCTAGTCCTGTTTTACACCCCGTGGTGCCG-3'（配列番号：６７）
【０１４８】
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５３４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織（LIB26）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＤＮＡ４８３３３−１３２１[図５、配列番号：５］の全長DNA配列；及びＰＲＯ５３４の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４８３３３−１３２１の全コード化配列を図５（配列番号：５）に示す。クローンＤＮＡ４８３３３−１３２１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８７−８９に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１１６７−１１６９に見かけの停止コドンを持つ（図５）。予測されるポリペプチド前駆体は３６０アミノ酸長である（図６）。図６に示した全長ＰＲＯ５３４タンパク質は、約３９,８８５ダルトンの見積もり分子量と約４．７９のｐＩを有する。クローンＤＮＡ４８３３３−１３２１は1998年3月26日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７００１が付与された。寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列決定技術に基づく代表的なものであると理解される。
全長ＰＲＯ５３４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して有意な配列類似性を持ち、よってＰＲＯ５３４が新規なジスルフィドイソメラーゼであることを示唆した。
ＰＲＯ５３４のアミノ酸配列をさらに分析すると、シグナルペプチドは配列番号：６の約アミノ酸１〜２５に存在する。膜貫通ドメインは配列番号：６の約アミノ酸３２１〜３４０に存在する。ジスルフィドイソメラーゼ相当領域は配列番号：６の約アミノ酸２１２〜３０２に存在する。チオレドキシンドメインは配列番号：６の約アミノ酸２１１〜２２８に存在する。Ｎ-グリコシル化部位は配列番号：６の約アミノ酸１６５〜１６９、１８１〜１８５、１８７〜１９１、１９４〜１９８、２０６〜２１０、２７８〜２８２、及び２９３〜２９７にある。Ｎ-ミリストイル化部位は配列番号：６の約アミノ酸３２〜３８、７０〜７６、１１１〜１１７、１１５〜１２１、１１８〜１２４、及び２０７〜２１３にある。アミド化部位は配列番号：６の約アミノ酸５〜９に存在する。対応するヌクレオチドは、ここに提供するアミノ酸配列から日常的に決定しうる。ＰＲＯ５３４は、他のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと同様に、ＥＲ保持ポリペプチドではなく膜貫通ドメインを有する。さらに、ＰＲＯ５３４は５プライム末端にイントロンを有しうる。
【０１４９】
実施例７
ヒトＰＲＯ５４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３９６３１と命名する。ＤＮＡ３９６３１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５４０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（３９６３１.ｆ１）：
5'-CTGGGGCTACACACGGGGTGAGG-3'（配列番号：６８）
逆方向ＰＣＲプライマー（３９６３１.ｒ１）：
5'-GGTGCCGCTGCAGAAAGTAGAGCG-3'（配列番号：６９）
ハイブリッド形成プローブ（３９６３１.ｐ１）：
5'-GCCCCAAATGAAAACGGGCCCTACTTCCTGGCCCTCCGCGAGATG-3'（配列番号：７０）
【０１５０】
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５４０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織（LIB227）から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここで、ＤＮＡ４４１８９−１３２２（配列番号：７）と命名されるＰＲＯ５４０ポリペプチドについての全長ＤＮＡ配列を得た。クローンＤＮＡ４４１８９−１３２２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１−２３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２５７−１２５９の停止コドンで終端する（図７）。予測されるコード化ポリペプチド前駆体は４１２アミノ酸長であり（図８、配列番号：８）。図８に示した全長ＰＲＯ５４０タンパク質は、約４６,６５８ダルトンの見積もり分子量と約６．６５のｐＩを有する。ＰＲＯ５４０のアミノ酸配列の重要な領域（およその位置を含む）は、シグナルペプチド（残基１−２８）、潜在的Ｎ-グリコシル化部位（残基９９−１０３、２７３−２７７、２８９−２９３、３９８−４０２）、潜在的脂質基質結合部位（残基１４７−１６４）、リパーゼ及びセリンタンパク質の典型的配列（残基１８９−２０２）、チロシンキナーゼリン酸化部位（残基１６５−１７４及び１７８−１８６）、ベータ伝達ファミリーＴｒｐ-Ａｓｐリピート（残基３５３−３６６）及びＮ-ミリストイル化部位（残基２００−２０６、２２７−２３３、２３２−２３８及び３１６−３２２）。クローンＤＮＡ４４１８９−１３２２は1998年3月26日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６９９が付与された。
【０１５１】
実施例８
ヒトＰＲＯ６９８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡを同定するために酵母スクリーニングアッセイを使用した。この酵母スクリーニングの使用により、ここでＤＮＡ３９９０６と命名される単一のｃＤＮＡが同定された。ＤＮＡ３９９０６配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６９８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-AGCTGTGGTCATGGTGGTGTGGTG-3'（配列番号：７１）
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-CTACCTTGGCCATAGGTGATCCGC-3'（配列番号：７２）
さらに、ＤＮＡ３９９０６配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CATCAGCAAACCGTCTGTGGTTCAGCTCAACTGGAGAGGGTT-3'（配列番号：７３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６９８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト骨髄組織（LIB255）から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１５２】
全長クローン（ここでＤＮＡ４８３２０−１４３３［配列番号：９］）が同定され、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４−１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５４４−１５４６に停止コドンが観られた。予測されるポリペプチド前駆体は５１０アミノ酸長であり、約５７,２８０ダルトンの算定分子量及び約５．６１の見積もりｐＩを有する。図１０（配列番号：１０）に示した全長ＰＲＯ６９８配列の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド；約アミノ酸７２〜アミノ酸７６、約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１４０、約アミノ酸１９３〜約アミノ酸１９７、約アミノ酸２５３〜約アミノ酸２５７、約アミノ酸３５２〜約アミノ酸３５６、約アミノ酸４１１〜約アミノ酸４１５のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸４４９〜約アミノ酸４５７のチロシンキナーゼリン酸化部位；約アミノ酸２０〜約アミノ酸４０の植物レクチンベータ鎖タンパク質に相同性を有するアミノ酸ブロック；約アミノ酸１６〜約アミノ酸２２、約アミノ酸３９〜約アミノ酸４５、約アミノ酸５３〜約アミノ酸５９、約アミノ酸６１〜約アミノ酸６７、約アミノ酸６３〜約アミノ酸６９、約アミノ酸８１〜約アミノ酸８７、約アミノ酸２４９〜約アミノ酸２５５、約アミノ酸３２６〜約アミノ酸３３２、約アミノ酸３２８〜約アミノ酸３３４及び約アミノ酸４３８〜約アミノ酸４４４のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸３３８〜約アミノ酸３６６のＨＢＧＦ／ＦＧＦファミリーに相同性を有するアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ４８３２０−１４３３は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０４が付与された。
全長ＰＲＯ６９８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがオルファクトメディン(olfactomedin)タンパク質に対して有意な配列類似性を持ち、よってＰＲＯ６９８が新規なオルファクトメディン相同体であることを示唆した。より詳細には、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ６９８アミノ酸配列と以下に示すDayhoff配列との間に配列相同性が見いだされた：OLFM_RANCA, I73637, AB006686S3_1, RNU78105_1, RNU72487_1, P_R98225, CELC48E7_4, CEF11C3_3, XLU85970_1 及び S42257。
【０１５３】
実施例９
ヒトＰＲＯ９８２をコードするｃＤＮＡの単離
上記の実施例３に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してＤＮＡ５７７００−１４０８を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでIncyteＥＳＴクラスター番号43715と命名されるＥＳＴクラスター配列のIncyteデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０９５と命名する。
ＤＮＡ５６０９５コンセンサス配列とMerckデータベースからのMerckＥＳＴ番号AA024389との間の観察された配列相同性に鑑みて、MerckＥＳＴ番号AA024389を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。ここで、ｃＤＮＡ挿入物が全長タンパク質をコードすることが見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１（配列番号：１１）に示し、ここでＤＮＡ５７７００−１４０８と命名する。
クローンＤＮＡ５７７００−１４０８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２６−２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４０１−４０３の停止コドンで終端する（図１１；配列番号：１１）。予測されるポリペプチド前駆体は１２５アミノ酸長であり（図１２）、約１４,１９８ダルトンの算定分子量及び約９．０１の見積もりｐＩを有する（図１２）。さらに図１２に示す全長ＰＲＯ９８２（配列番号：１２）の分析により、約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド；約アミノ酸３３〜アミノ酸３９及び約アミノ酸７０〜約アミノ酸７６のＮ-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０の潜在的アナフィラトキシンドメインが明らかとなった。クローンＤＮＡ５７７００−１４０８は1999年1月12日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５８３が付与された。
【０１５４】
実施例１０
ヒトＰＲＯ１００５をコードするｃＤＮＡの単離
上記の実施例３に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してＤＮＡ５７７０８−１４１１を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでIncyteＥＳＴクラスター番号49243と命名されるＥＳＴクラスター配列のIncyteデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０９５と命名する。
ＤＮＡ５６０９５コンセンサス配列とMerckデータベースからのMerckＥＳＴ番号AA256657との間の観察された配列相同性に鑑みて、MerckＥＳＴ番号AA256657を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。ここで、ｃＤＮＡ挿入物が全長タンパク質をコードすることが見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３（配列番号：１３）に示し、ここでＤＮＡ５７７０８−１４１１と命名する。
クローンＤＮＡ５７７０８−１４１１（図１３；配列番号：１３）は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３０−３２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８５−５８７の停止コドンで終端する（図１３；配列番号：１３）。予測されるポリペプチド前駆体は１８５アミノ酸長であり（図１４）、約２０,３３１ダルトンの見積もり分子量及び約５．８５のｐＩを有する（図１４）。図１４に示す全長ＰＲＯ１００５配列（配列番号：１４）の分析により、図１４に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図１４に示す全長ＰＲＯ１００５配列の分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド；約アミノ酸６７〜約アミノ酸７３、約アミノ酸１１８〜約アミノ酸１２４、及び約アミノ酸１６３〜約アミノ酸１６９のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸１５６〜約アミノ酸１７５のフラボドキシン相同体。クローンＤＮＡ５７７０８−１４１１は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０２１が付与された。
図１４（配列番号：１４）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１００５アミノ酸配列と以下に示すDayhoff配列との間に配列相同性が見いだされた：DDU07187_1, DDU87912_1, CELD1007_14, A42239, DDU42597_1, CYAG_DICDI, S50452, MRKC_KLEPN, P_R41998, 及び XYNA_RUMFL。
【０１５５】
実施例１１
ヒトＰＲＯ１００７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。上述のＥＣＤ相同性手法を使用し、ヒト肝臓組織(ライブラリ341からのクローン83012)から誘導され、Merck ＥＳＴ T70513と命名されるＥＳＴ配列を同定した。Merck ＥＳＴ T70513を入手し、更に検査して配列決定し、ここでＤＮＡ５７６９０−１３７４(図１５、配列番号：１５)と命名される全長ＤＮＡ配列及び誘導ＰＲＯ１００７天然配列ポリペプチド(図１６、配列番号：１６)を単離した。
クローンＤＮＡ５７６９０−１３７４は、下線で示すように、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６−１８に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置１０５４−１０５６の停止コドン(TGA)で終端する（図１５）。予測されるＰＲＯ１００７ポリペプチド前駆体は３４６アミノ酸長であり（図１６）、約３５，９１７ダルトンの見積もられた分子量及び約８．１７のｐＩを有する。ＤＮＡ５７６９０−１３７４を含むクローンは1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、
寄託番号２０９９５０が付与されている。
ＰＲＯ１００７ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６）の分析により、アミノ酸残基約１−３０の推定シグナルペプチド；アミノ酸残基約３２５−３４６の膜貫通ドメイン；アミノ酸残基約１１８−１２１、１２９−１３２、１３６−１６６、１７６−１７９、１８３−１８６及び２２７−１３０のＮ-グリコシル化部位；アミノ酸残基約１７−３６及び２０９−２２２のＬｙ-６／ｕ-Ｐａｒドメインタンパク質相同体；アミノ酸残基約２６−３２、４３−４９、５７−６３、６６−７２、８１−８７、１２８−１３４、１７１−１７１、２１８−２２４、２９８−３０４及び３１０−３１６のＮ-ミリストイル化部位；及びアミノ酸残基約２０５−２１６の原核生物膜リポタンパク脂質接着部位が明らかになった。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０１５６】
実施例１２
ヒトＰＲＯ１１３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２に記載したアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列をここでＤＮＡ４３５４６と命名する。ついで、該ＤＮＡ４３５４６配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ４５６２７と命名する。
ＤＮＡ４５６２７配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを産生し、上述の実施例２の第１段落に記載したヒトライブラリをスクリーニングするために使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり（pRK5BはSfiI部位を含まないｐRK5Dの前駆体である；Holmes等, Science 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）、切断されたｃＤＮＡサイズは２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び２つの逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-ATGCAGGCCAAGTACAGCAGCAC-3'（配列番号：７４）
逆方向ＰＣＲプライマー１：
5'-CATGCTGACGACTTCCTGCAAGC-3'（配列番号：７５）
逆方向ＰＣＲプライマー２：
5'-CCACACAGTCTCTGCTTCTTGGG-3'（配列番号：７６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列を持つＤＮＡ４５６２７配列から作成した：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-ATGCTGGATGATGATGGGGACACCACCATGAGCCTGCATT-3'（配列番号：７７）
【０１５７】
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１１３１遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
ヌクレオチド位置１４４−１４６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９８４−９８６に停止シグナルを有する単一の読み取り枠を含む全長クローンが同定された（図１７；配列番号：１７）。予測されたポリペプチド前駆体は２８０アミノ酸長であり、約３１,９６６ダルトンの算定分子量と約６．２６の推定ｐＩを有する。膜貫通ドメインは配列番号：１８のアミノ酸残基約４９−７４にあり；N-グリコシル化部位は配列番号：１８のアミノ酸残基約９５−９８及び１６９−１７２にあり；チロシンキナーゼリン酸化部位は配列番号：１８のアミノ酸残基約１４２−１５０及び１５６−１６４にある；Ｎ-ミリストイル化部位は配列番号：１８の１３０−１３６、２１４−２２０及び２４２−２４８にあり；ＬＤＬレセプターと配列同一性を有する領域は配列番号：１８の約５０−２６５にある。クローンＤＮＡ５９７７７−１４８０は1998年8月11日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１１が付されている。
図１８（配列番号：１８）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用してのDayhoffデータベース（バージョン35.45、SwissProt35）の解析により、ＰＲＯ１１３１アミノ酸配列と次のDayhoff配列、AB010710_1, I49053, I49115, RNU56863_1, LY4A_MOUSE, I55686, MMU56404_1, I49361, AF030313_1及びMMU09739_1の間のある配列同一性が証明された。
【０１５８】
実施例１３
ヒトＰＲＯ１１５７をコードするｃＤＮＡの単離
上記の実施例３に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してＤＮＡ６０２９２−１５０６を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでIncyteＥＳＴクラスター番号49243と命名されるＥＳＴクラスター配列のIncyteデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０９５と命名する。
ＤＮＡ５６０９５コンセンサス配列とMerckデータベースからのMerckＥＳＴ番号AA516481との間の観察された配列相同性に鑑みて、MerckＥＳＴ番号AA516481を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１９（配列番号：１９）に示し、ここでＤＮＡ６０２９２−１５０６と命名する。
【０１５９】
クローンＤＮＡ６０２９２−１５０６（図１９；配列番号：１９）は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５６−５８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３３２−３３４の停止コドンで終端する（図１９）。予測されるポリペプチド前駆体は９２アミノ酸長である（図２０；配列番号：２０）。図２０に示す全長ＰＲＯ１１５７タンパク質は、約９,３６０ダルトンの見積もり分子量及び約９．１７のｐＩを有する。図２０に示す全長ＰＲＯ１１５７配列（配列番号：２０）の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図２０に示す全長ＰＲＯ１１５７配列の分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド；約アミノ酸５１〜約アミノ酸７０の推定膜貫通ドメイン；約アミノ酸４０〜約アミノ酸４４のグリコサミノグリカン接着部位；約アミノ酸３４〜約アミノ酸４０、約アミノ酸３７〜約アミノ酸４３及び約アミノ酸５２〜約アミノ酸５８のＮ-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸２９〜約アミノ酸４０の原核生物膜リポタンパク脂質接着部位。クローンＤＮＡ６０２９２−１５０６は1998年12月15日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５４０が付与された。
図２０（配列番号：２０）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用してのDayhoffデータベース（バージョン35.45、SwissProt35）の解析により、ＰＲＯ１１５７アミノ酸配列と次のDayhoff配列：PTPN_HUMAN, B69251, I51419, AF019562_1, AF019563_1, C211_HUMAN, I37577, A39171, GAT5_MOUSE, ACR3_MOUSE, 5H6_RAT, P_W31512, and S58082との間のある配列同一性が証明された。
【０１６０】
実施例１４
ヒトＰＲＯ１１９９をコードするｃＤＮＡの単離
公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース(GenBank)を全長マウスｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡ(ＤＮＡ５３５１７)でサーチし、ｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡと相同性を示したＥＳＴ［ＡＡ３１１２２３と命名し、ＤＮＡ５３０２８と改名］を同定した。
ＥＳＴ配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するために、及び２）ＰＲＯ１１９９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０のヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物をもたらすように設計される。プローブ配列は、典型的には４０−５５ｂｐ長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology に従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り：
正方向ＰＣＲプライマー（ｈ-ＦＩＺＺ３.ｆ）：
5'-GGATTTGGTTAGCTGAGCCCACCGAGA-3'（配列番号：７８）
逆方向ＰＣＲプライマー（ｈ-ＦＩＺＺ３.ｒ）：
5'-GCACTGCGCGCGACCTCAGGGCTGCA-3'（配列番号：７９）
プローブ（ｈ-ＦＩＺＺ３.ｐ）：
5'-CTTATTGCCCTAAATATTAGGGAGCCGGCGACCTCCTGGATCCTCTCATT-3'（配列番号：８０）
【０１６１】
全長クローンの供給源に対して幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、上記において特定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。正のライブラリーをついで使用して、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一つを使用してＰＲＯ１１９９
遺伝子をコードしているクローンを単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
全長クローンＤＮＡ６５３５１−１３６６−１が同定され、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５−２７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３４９−３５１に停止コドンが観られた（図２１；配列番号：２１）。予測されるポリペプチド前駆体は１０８アミノ酸長であり、約１１,４１９ダルトンの算定分子量及び約７．０５の見積もりｐＩを有する。図２２（配列番号：２２）に示した全長ＰＲＯ１１９９配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図２２（配列番号：２２）に示した全長ＰＲＯ１１９９配列の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド；約アミノ酸５７〜アミノ酸６０の細胞接着配列モチーフ（ＲＧＤ）；約アミノ酸１３〜約アミノ酸１９、約アミノ酸７１〜約アミノ酸７７、約アミノ酸７５〜約アミノ酸８１、約アミノ酸９５〜約アミノ酸１０１、及び約アミノ酸１００〜約アミノ酸１０６のＮ-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ６５２５１−１３６６−１は1998年5月12日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８５６が付与された。
【０１６２】
実施例１５
ヒトＰＲＯ１２６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してＤＮＡ６０７６４−１５３３を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteＥＳＴクラスター番号86995と命名されるLIFESEQ(商品名)データベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７１７と命名する。
ＤＮＡ５５７１７配列とIncyteＥＳＴ番号20965との間の配列相同性に鑑みて、IncyteＥＳＴ番号20965を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図７（配列番号：２３）に示し、ここでＤＮＡ６０７６４−１５３３と命名する。
【０１６３】
ＤＮＡ６０７６４−１５３３の全コード化配列が図２３（配列番号：２３）に含まれる。クローンＤＮＡ６０７６４−１５３３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７９−８１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１７８０−１７８２の停止コドンで終端する（図２３）。予測されるポリペプチド前駆体は５６７アミノ酸長である（図２４；配列番号：２４）。図２４に示す完全長ＰＲＯ１２６５ポリペプチドは、約６２，８８１の見積もり分子量及び約８．９７のｐＩを有する。図２４（配列番号：２４）に示した全長ＰＲＯ１２６５配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図２４に示した完全長ＰＲＯ１２６５配列の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド；約アミノ酸５４〜約アミノ酸５８、約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１３８、約アミノ酸２２０〜約アミノ酸２２４、及び約アミノ酸５５９〜約アミノ酸５６３のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸３５〜約アミノ酸４３及び約アミノ酸１６１〜約アミノ酸１６９のチロシンキナーゼリン酸化部位；約アミノ酸５２〜約アミノ酸５８、約アミノ酸６６〜約アミノ酸７４、約アミノ酸７１〜約アミノ酸７７、約アミノ酸１３０〜約アミノ酸１３６、約アミノ酸１３２〜約アミノ酸１３８、約アミノ酸１９８〜約アミノ酸２０４、及び約アミノ酸３７１〜約アミノ酸３７７のＮ-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸６１〜約アミノ酸８１のＤ-アミノ酸オキシダーゼタンパク質部位。クローンＤＮＡ６０７６４−１５３３は1998年11月10日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３４５２が付与された。
図２４（配列番号：２４）に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１２６５アミノ酸配列とDayhoff配列番号MMU70429_1との間の有意な配列同一性が明らかになった。配列相同性は、図２４（配列番号：２４）に示す全長配列と以下のDayhoff配列との間にも存在することが見いだされた：BC542A_1, E69899, S76290, MYV014_14, AOFB_HUMAN, ZMJ002204_1, S45812_1, DBRNAPD_1, 及びCRT1_SOYBN。
【０１６４】
実施例１６
ヒトＰＲＯ１２８６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載した独自に開発したシグナル配列アルゴリズムを使用することにより、DNA６４９０３−１５５３が同定された。上記のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＥＳＴクラスター番号86809と命名したLIFESEQ(商品名)データベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。アセンブリ中のＥＳＴは腫瘍、株化細胞、又は病変組織から同定されたものを含んでいた。ＥＳＴの一又は複数は病変大腸組織から単離されたＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリから得られた。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５８８２２と命名する。
ＤＮＡ５８８２２配列とIncyteのＥＳＴ番号1695434に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、ＥＳＴクローン番号1695434を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２５（配列番号：２５）に示し、ここでＤＮＡ６４９０３−１５５３と命名する。
【０１６５】
ＤＮＡ６４９０３−１５５３の全コード化配列が図２５（配列番号：２５）に含まれる。クローンＤＮＡ６４９０３−１５５３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９３−９５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３７２−３７４に見いだされる停止コドンで終端する（図２５）。予測されるポリペプチド前駆体は約９３アミノ酸長である（図２６；配列番号：２６）。図２６に示した全長ＰＲＯ１２８６タンパク質は、約１０，１１１ダルトンの分子量及び約９.７０のｐＩが見積もられた。図２６（配列番号：２６）に示した全長ＰＲＯ１２８６配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図２６に示した完全長ＰＲＯ１２８６配列の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド；約アミノ酸１５〜約アミノ酸２１、約アミノ酸１７〜約アミノ酸２３、約アミノ酸１９〜約アミノ酸２５、約アミノ酸８３〜約アミノ酸８９、及び約アミノ酸８６〜約アミノ酸９２のＮ-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ６４９０３−１５５３は1998年9月15日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２２３が付与された。
図２６（配列番号：２６）に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１２８６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：SR5C_ARATH, CELC17H12_11, MCPD_ENTAE, JQ2283, INVO_LEMCA, P_R07309, ADEVBCAGN_4, AF020947_1, CELT23H2_1, 及びMDH_STRARとの間のいくらかの相同性が明らかにされた。
【０１６６】
実施例１７
ヒトＰＲＯ１３１３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ６４８７６と命名する。ＤＮＡ６４８７６コンセンサス配列、及びＤＮＡ５７７１１と称されるジェネンテクが独自に開発したＥＳＴ配列との配列相同性の検索にに基づいて、Merck／ワシントン大学EST配列（R80613と称する）が、ＤＮＡ６４８７６及びＤＮＡ５７７１１と有意な相同性を持つことがわかった。従って、Merck／ワシントン大学ESTクローン番号R80613を購入し、その挿入物を得て配列決定することにより、図３１（配列番号：３１）に示すＤＮＡ６４９６６−１５７５配列、及びＰＲＯ１３１３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ６４９６６−１５７５の全コード化配列が図２７（配列番号：２７）に含まれる。クローンＤＮＡ６４９６６−１５７５は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１５−１１７に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１０３６−１０３８に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は３０７アミノ酸長であり、約３５,０９８ダルトンの見積もり分子量及び約８．１１のｐＩを持つ。図８８（配列番号：２１６）に示した全長ＰＲＯ１３１３配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図２８に示した全長ＰＲＯ１３１３ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１５のシグナル配列；約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１５７、約アミノ酸１６９〜約アミノ酸１８９、約アミノ酸２３０〜約アミノ酸２４８、約アミノ酸２７１〜約アミノ酸１８５の膜貫通ドメイン；約アミノ酸３４〜約アミノ酸３８、約アミノ酸１３５〜約アミノ酸１３９、及び約アミノ酸２０３〜約アミノ酸２０７のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸５９〜約アミノ酸６７のチロシンキナーゼリン酸化部位；約アミノ酸１６５〜アミノ酸１７１、約アミノ酸１９６〜約アミノ酸２０２、約アミノ酸２４０〜約アミノ酸２４６及び約アミノ酸２４７〜約アミノ酸２５３のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸５３〜約アミノ酸６１のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ(Ｐ-ｌｏｏｐ)。クローンＤＮＡ６４９６６−１５７５は1999年1月12日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７５が付与された。
図２８（配列番号：２８）に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３１３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった：CELT27A1_3, CEF09C06_7, U93688_9, H64896, YDCX_ECOLI, 及びRNU06101_1。
【０１６７】
実施例１８
ヒトＰＲＯ１３３８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
酵母菌スクリーニングを使用してＥＳＴ配列を得、ついで、ＥＣＤ相同性下で上述したもの（実施例１）と類似した方法で公的及び私的な種々のＥＳＴデータベースと比較し、胆嚢炎のある胆嚢組織から得られたＥＳＴであるIncyteＥＳＴ2615184を同定した。対応する全長配列の分析により、ＤＮＡ６６６６７(配列番号：２９、図２９)及び誘導ＰＲＯ１３３８天然配列タンパク質(配列番号：３０、図３０)を単離した。
図２９に示すＤＮＡ６６６６７(配列番号：２９)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド残基１１５−１１７に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２６３−２２６５の停止コドン(ＴＡＡ)で終端する、下線で示した。予測されるＰＲＯ１３３８ポリペプチド前駆体(配列番号：３０)は７１６アミノ酸長であり(図３０)、８０,７１６ダルトンの算定分子量と６．０６のｐＩを持つ。
図３０ＰＲＯ１３１３ポリペプチド(配列番号：３０)の分析により、およそアミノ酸残基１〜２５にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基６２９〜６４８に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基６９〜７３、９６〜１００、１０６〜１１０、１１７〜１２１、３８５〜３８９、５１７〜５２１、５８２〜５８６及び６１１〜６１５にＮ-グルコシル化部位、およそ残基５７３〜５８２にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基１６〜２２、２２４〜２３０、４６４〜４７０、６３７〜６４３及び６９８〜７０４にＮ-ミリストイル化部位があることが明らかになった。
ＤＮＡ６６６６７を含むｃＤＮＡは1998年9月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２６７が付与されている。
【０１６８】
実施例１９
ヒトＰＲＯ１３７５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Merck/Wash.U.データベースをサーチしてMerk ＥＳＴを同定した。ついで、この配列をSwiss-Prot公的データベース、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank、Merck/Wash. U.）と企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQ(商品名), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）からの他の配列とそれを整列化させるプログラムに入力した。サーチは、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質配列の比較としてコンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のBLASTスコアになったその比較物を集合化し、「phrap」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
phrapを使用して他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列が構築された。このコンセンサス配列はここで「ＤＮＡ６７００３」と命名する。
ＤＮＡ６７００３コンセンサス配列に基づいて、ヒト膵臓ライブラリにおいて核酸（配列番号：４１７）を同定した。クローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１３７５に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１３７５に対する誘導タンパク質配列が得られた。
【０１６９】
ＰＲＯ１３７５の全コード配列は図３１（配列番号：３１）に示される。クローンＤＮＡ６７００４−１６１４は、単一のオープンリーディングフレームを持ち、ヌクレオチド位置１０４−１０６に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置６９８−７００に見かけの停止コドンを有する。予測されたポリペプチド前駆体は１９８アミノ酸長であり、図３２（配列番号：３２）に示した。膜貫通ドメインはアミノ酸約１１−２８（ＩＩ型）及び１０３−１２５にあり；N-グリコシル化部位はアミノ酸約６０−６４にあり；チロシンキナーゼリン酸化部位はアミノ酸約７８−８６にあり；Ｎ-ミリストイル化部位はアミノ酸約１２−１８にある。クローンＤＮＡ６７００４−１６１４は、1998年8月11日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１５が付されている。図３２に示した全長ＰＲＯ１３７５タンパク質は約２２,５３１ダルトンの見積もり分子量と約８．４７のｐＩを有する。
図３２に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用してのDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt35）の解析により、ＰＲＯ１３７５アミノ酸配列と次のDayhoff配列：AF026198_5, CELR12C12_5, S73465, Y011_MYCPN, S64538_1, P_P8150, MUVSHPO10_1, VSH_MUMPL及びCVU59751_5の間の配列同一性が明らかにされた。
【０１７０】
実施例２０
ヒトＰＲＯ１４１０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載した独自開発のシグナル配列発見アルゴリズムを用いることによりＤＮＡ６８８７４−１６２２を同定した。上記のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となり、それをIncyteＥＳＴクラスター配列番号９８５０２と命名した。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４５１と命名する。
ＤＮＡ５６４５１配列とIncyteＥＳＴクローン番号1257046内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、IncyteＥＳＴクローン1257046を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図３３（配列番号：３３）に示し、ここでＤＮＡ６８８７４−１６２２と命名する。
【０１７１】
クローンＤＮＡ６８８７４−１６２２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５２−１５４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８６６−８６８の停止コドンで終端する（図３３）。予測されるポリペプチド前駆体は２３８アミノ酸長である（図３４；配列番号：３４）。図３４に示された全長ＰＲＯ１４１０タンパク質は約２５，２６２の見積分子量及び約６．４４のｐＩを有する。図３４に示す全長ＰＲＯ１４１０配列（配列番号：３４）の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図３４に示された全長ＰＲＯ１４１０配列の分析により次のものの存在が証明された：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド；約アミノ酸１９４〜約アミノ酸２２０の膜貫通ドメイン；約アミノ酸１３２〜約アミノ酸１３５の潜在的なＮ-グリコシル化部位；及び約アミノ酸１２１〜約アミノ酸１２７、約アミノ酸１４２〜約アミノ酸１４８、約アミノ酸１７１〜約アミノ酸１７７、約アミノ酸２０１〜約アミノ酸２０７及び約アミノ酸２０３〜約アミノ酸２０９のＮ-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ６８８７４−１６２２は1998年9月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２７７が付与された。
図３４（配列番号：３４）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１４１０のアミノ酸配列と以下のDayhoff配列：I48652, P_R76466, HSMHC3W36A_2, EPB4_HUMAN, P_R14256, EPA8_MOUSE, P_R77285, P_W13569, AF000560_1, 及びASF1_HELANとの間の有意な相同性が証明された。
【０１７２】
実施例２１
ヒトＰＲＯ１４８８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索してＥＳＴ番号3639112H1をＣＰＥ-Ｒと相同性を有するものとして同定した。ＥＳＴ番号3639112H1はここで「ＤＮＡ６９５６２」と命名される。ＥＳＴクローン3639112H1は、パトー症候群で死亡した２０週齢の胎児の肺組織ライブラリから取り出されたもので、購入され、ｃＤＮＡ挿入断片が得られ、その全体が配列決定された。ＰＲＯ１４８８の全ヌクレオチド配列は図１８９（配列番号：３２９）に含まれ、ここでＤＮＡ７３７３６−１６５７と命名された。ＤＮＡ７３７３６−１６５７は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６−８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６６６−６６８に見かけの停止コドンを持つ（図３５；配列番号：３５）。予測されるポリペプチド前駆体は２２０アミノ酸長である。
図３６に示す全長ＰＲＯ１４８８タンパク質は約２３，２９２ダルトンの推定分子量及び約８．４３のｐＩを有する。４つの膜貫通ドメインが約アミノ酸位置８−３０、８２−１０２、１２１−１４０、及び１６６−１８６に位置しているものと同定された。
図３６（配列番号：３６）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１４８８のアミノ酸配列とDayhoff配列AB000712_1の間の有意な相同性が明らかにされた。相同性はまたＰＲＯ１４８８アミノ酸配列と次のDayhoff配列：AB000714_1, AF007189_1, AF000959_1, P_W63697, MMU82758_1, AF072127_1, AF072128_1, HSU89916_1, AF068863_1, CEAF000418_1, 及びAF077739_1との間にも見いだされた。
クローンＤＮＡ７３７３６−１６５７は1998年11月17日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３４６６が付与された。
【０１７３】
実施例２２
ヒトＰＲＯ３４３８をコードするｃＤＮＡの単離
上記の実施例３に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してＤＮＡ８２３６４−２５３８を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでIncyteＥＳＴクラスター番号49243と命名されるＥＳＴクラスター配列のIncyteデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０９５と命名する。
ＤＮＡ５６０９５コンセンサス配列とMerckデータベースからのMerckＥＳＴ番号AA256657との間の観察された配列相同性に鑑みて、MerckＥＳＴ番号AA256657を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。ここで、ｃＤＮＡ挿入物が全長タンパク質をコードすることが見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３（配列番号：１３）に示し、ここでＤＮＡ８２３６４−２５３８と命名した。
【０１７４】
クローンＤＮＡ８２３６４−２５３８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５０−５２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６４７−６４９の停止コドンで終端する（図３７）。予測されるポリペプチド前駆体は１９９アミノ酸長である（図３８；配列番号：３８）。図３８に示した全長ＰＲＯ３４３８タンパク質は、約２１,３２３ダルトンの見積もり分子量及び約５．０５のｐＩを有する。図３８に示す全長ＰＲＯ３４３８配列（配列番号：３８）の分析により、図３８に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図３８に示す全長ＰＲＯ３４３８配列の分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１５のシグナルペプチド；約アミノ酸１６１〜約アミノ酸１８１の膜貫通ドメイン；約アミノ酸１７〜約アミノ酸２３及び約アミノ酸１７２〜約アミノ酸１７８のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸７３〜約アミノ酸７９のアミド化部位。クローンＤＮＡ８２３６４−２５３８は1999年1月20日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６０３が付与された。
図３８（配列番号：３８）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ３４３８アミノ酸配列と以下に示すDayhoff配列との間に配列相同性が見いだされた：S48841, P_W03179, P_W03178, PIGR_HUMAN, HGS_A215, AB001489_1, HGS_B471, P_W61380, P_R15068 and MML1L_1。
【０１７５】
実施例２３
ヒトＰＲＯ４３０２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト組織から単離した組織について上記の実施例２に記載したアミラーゼスクリーニング手法を使用してＥＳＴ配列を得、ついでこれを種々のＥＳＴデータベースと比較し、アミラーゼスクリーニング手順及び／又はＥＣＤ相同性手法下で、上述の方法によりコンセンサス配列を作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ７８８７５と命名する。ＤＮＡ７８８７５コンセンサス配列とIncyte ＥＳＴ番号2408081H1との間の相同性に基づいてIncyte ＥＳＴ番号2408081H1を購入し、その挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図３９（配列番号：３９）に示し、ここでＤＮＡ９２２１８−２５５４と命名し、ＰＲＯ４３０２全長天然配列タンパク質（配列番号：４０）を誘導した。
太字の下線で示したように、図３９に示す全長クローンＤＮＡ９２２１８−２５５４(配列番号：３９)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７４-１７６に見かけの翻訳開始部位と、ヌクレオチド位置７６８-７７０に停止シグナル(ＴＡＧ)を有する。予測されるＰＲＯ４３０２ポリペプチド前駆体は１９８アミノ酸長であり、約２２,２８５ダルトンの算定分子量と約９．３５の見積ｐＩを持つ。図４０（配列番号：４０）に示した全長ＰＲＯ４３０２ポリペプチド配列の分析により、およそアミノ酸残基約１から２３にシグナルペプチド；アミノ酸残基約１１１から１３０に膜貫通ドメイン；アミノ酸残基約２６−３０にｃＡＭＰ-及びｃＧＭＰ-依存性プロテインキナーゼリン酸化部位；アミノ酸残基約３６−４３にチロシンキナーゼリン酸化部位；及びアミノ酸残基約１２４−１３０、１４４−１５０及び１８９−１９５にＮ-ミリストイル化部位があることが明らかになった。
ＤＮＡ９２２１８−２５５４を含むｃＤＮＡクローンは1999年3月9日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０３８３４が付与されている。
【０１７６】
実施例２４
ヒトＰＲＯ４４００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）及びジェネンテクが独自に開発したＥＳＴを含んでいた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ７７６３４と命名する。ＤＮＡ７７６３４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ４４００の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）の対を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-GCTGCTGCCGTCCATGCTGATG-3'（配列番号：８１）
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-CTCGGGGAATGTGACATCGTCGC-3'（配列番号：８２）
さらに、ＤＮＡ７７６３４コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-GCTGCCGTCCATGCTGATGTTTGCGGTGATCGTGG-3'（配列番号：８３）
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１７７】
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ４４００ポリペプチドについての全長ＤＮＡ配列（ここで、ＤＮＡ８７９７４−２６０９[図４１、配列番号：４１］）及びＰＲＯ４４００ポリペプチドの誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ８７９７４−２６０９の全長コード化配列が図４１（配列番号：４１）に含まれる。クローンＤＮＡ８７９７４−２６０９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７−２９に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１０２６−１０２８に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は３３３アミノ酸長であり、約３８,６１８の見積分子量及び約９．２７のｐＩを有する。図４２（配列番号：４２）に示した全長ＰＲＯ４４００配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。全長ＰＲＯ４４００配列の分析により以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド；約アミノ酸６７〜約アミノ酸７１及び約アミノ酸３２５〜約アミノ酸３２９のＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸１５２〜約アミノ酸１５９及び約アミノ酸１８３のチロシンキナーゼリン酸化部位；及び約アミノ酸８９〜約アミノ酸９５及び約アミノ酸１２８〜約アミノ酸１３４のＮ-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ８７９７４−２６０９は1999年4月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３９６３が付与された。
図４２（配列番号：４２）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45、SwissProt 35）により、ＰＲＯ４４００アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の配列同一性が明らかとなった：
AF033827_1, AF070594_1, AF022729_1, CEC34F6_4, SYFB_THETH, G70405, SD_DROME, S64023, ALK1_YEAST and VG04_HSVII。
【０１７８】
実施例２５
ヒトＰＲＯ５７２５をコードするｃＤＮＡの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索し、ニューリチン(Neuritin)と相同性を持つＥＳＴを同定した。IncyteＥＳＴクローン番号3705684をLIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAから購入し、ここでＤＮＡ９２２６５−２６６９と命名するそのクローンのｃＤＮＡ挿入物を得て全体を配列決定した［図４３；配列番号：４３］。
全長クローンＤＮＡ９２２６５−２６６９（配列番号：４３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７−２９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５２２−５２４に見かけの停止シグナルを持つ（図４３；配列番号：４３）。予測されるポリペプチド前駆体は１６５アミノ酸長であり、約１７,７８６の算定分子量及び約８．４３のｐＩを有する。図４４（配列番号：４４）に示した全長ＰＲＯ５７２５配列の分析により、図４４に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。図４４に示した全長ＰＲＯ５７２５配列の分析により、以下の存在が明らかになった：約アミノ酸１〜約アミノ酸３５のシグナルペプチド；約アミノ酸１４１〜約アミノ酸１５７の膜貫通ドメイン；約アミノ酸１２７〜約アミノ酸１３３のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸７７〜約アミノ酸８８の原核生物膜リポタンパク脂質結合部位。クローンＤＮＡ９２２６５−２６６９は1999年6月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-２５６が付与された。
図４４（配列番号：４４）に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ５７２５アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の相同性が明らかになった：RNU88958_1, P_W37859, P_W37858, JC6305, HGS_RE778, HGS_RE777, P_W27652, P_W44088, HGS_RE776, 及びHGS_RE425。
【０１７９】
実施例２６
インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定ｍＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。［３３-Ｐ］ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2(商品名)核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１８０】
３３Ｐ-リボプローブ合成
6.0μl（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加した：
2.0μlの5ｘ転写バッファー
1.0μlのＤＴＴ（100mM）
2.0μlのＮＴＰ混合物（2.5mM: 10μl; 10mMのGTP, CTP及びATP+10μlのH2O）
1.0μlのＵＴＰ（50μM）
1.0μlのＲＮＡｓｉｎ
1.0μlのＤＮＡテンプレート（1μg）
1.0μlのＨ２Ｏ
1.0μlのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。90μlのＴＥ（10mMトリスpH7.6／1mMのＥＤＴＡpH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（6分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（3分間）。最終回収スピンの後、100μlのＴＥを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBiofluor IIで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのＲＮＡ ＭｒｋＩＩＩを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１８１】
３３Ｐ-ハイブリッド形成
Ａ．凍結切片の前処理：  スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、0.5ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O）。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（250mlの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の10mg/mlストック12.5μl）、切片を0.5ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：  スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、2ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼＫ（250ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（250mlのＲＮａｓｅバッファー中100μl、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド化：  スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘＳＳＣ及び9mlのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で1-4時間インキュベートした。
【０１８２】
Ｄ．ハイブリッド形成：  スライド当たり1.0ｘ10６cpmのプローブ及び1.0μlのｔＲＮＡ（50mg/mlストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄：  洗浄は、2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（400mlの20ｘSSC＋16mlの0.25M EDTA、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（250mlＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ＝20μg/ml）。スライドを2ｘ10分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、0.1ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０１８３】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
インサイツハイブリッド形成は、ここに開示したＤＮＡのうち６つについて実施した。これらの分析に使用したオリゴヌクレオチドは以下の通り：
（１）ＤＮＡ３４３８７-１１３８（ＰＲＯ２４０）（鋸歯状／ＥＧＦ相同体）
オリゴＢ-２３１Ｗ４８mer：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCGAGATATGCACCCAATGTC-3' （配列番号：８４）
オリゴＢ-２３１Ｗ４７mer：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCCCAGAATCCCGAAGAACA-3' （配列番号：８５）
（２）ＤＮＡ５７７０８-１４１１（ＰＲＯ１００５）（新規な分泌ＣＡ関連タンパク質）
６７８．ｐ１：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCTCTGTCCACTGCTTTCGTG-3' （配列番号：８６）
６７８．ｐ２：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTTCTCCACCGTGTCTCCACA-3' （配列番号：８７）
（３）ＤＮＡ６０７６４-１５３３（ＰＲＯ１２６５）（Ｆｉｇ-１相同体）
DNA６０７６４-ｐ１：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCGCTGTCCTGCTGTCACCA-3' （配列番号：８８）
DNA６０７６４-ｐ２：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTTCCCCTCCCCGAGAAGATA-3' （配列番号：８９）
（４）ＤＮＡ２８４９８（ＰＲＯ１８３）（ＦＨＦ-２）
ＤＮＡ２８４９８-ｐ１：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCAGCAAAAGAAGCGGTGGTG-3' （配列番号：９０）
ＤＮＡ２８４９８-ｐ１：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATTCAGCACGCCAGAGACACTT-3' （配列番号：９１）
【０１８４】
Ｇ．結果
インサイツ分析をここに開示する上記の４つのＤＮＡに対して実施した。これらの分析からの結果は以下の通りである：
（１）ＤＮＡ３４３８７-１１３８（ＰＲＯ２４０）（鋸歯状／ＥＧＦ相同体）
ヒト成人及び胎児組織における発現パターン
増大したシグナルが以下の部位で観察された：
胎児組織：甲状腺上皮、小腸上皮、生殖腺、膵臓上皮、腎臓及び尿細管における肝実質細胞；発現は、発育中の血管組織でも見られた。
成人組織：胎盤細胞栄養芽層、尿細管、膀胱上皮、副甲状腺及び上皮性腫瘍における中程度のシグナル。
肺腺癌及び扁平上皮癌における発現
発現は、８つ全ての扁平上皮癌及び８つの腺癌のうち６つで観察された。発現は、インサイツ及び浸潤成分において見られた。発現レベルは腺癌において低から中程度であった。一般に、発現は、扁平上皮癌においてより高く、これらの２つにおいて発現は強かった。腫瘍間質、肺胞及び正常呼吸器上皮において発現は見られなかった。リンパ節では低レベルの発現の可能性があった。
（２）ＤＮＡ５７７０８-１４１１（ＰＲＯ１００５）（新規な分泌ＣＡ関連タンパク質）
極めて強い発現が、胃腸襞の粘液頚部細胞（チンパンジー）及び洞（ヒト）粘膜全体に見られた。これらの細胞は、増殖及び胃の粘膜再生において重要である。硬化性小結節の辺縁における胎児肝実質細胞及び成人肝実質細胞の全体でも見られた。胎児の外眼筋及び下肢の骨格筋全体で可能な発現が現れた。試験した１６の一次肺癌（８つの扁平上皮癌及び８つの腺癌）のいずれにおいても有意な発現は観察されなかった。
【０１８５】
（３）ＤＮＡ６０７６４-１５３３（ＰＲＯ１２６５）（Ｆｉｇ-１相同体）
試験した１６肺腫瘍のうち１５が分析に適していた（８つの腺癌及び７つの扁平上皮癌）。殆どの腫瘍がＤＮＡ６０７６４の発現を幾分示した。発現は、浸潤腫瘍に隣接する単核細胞に大いに限局されていた。一つの扁平上皮癌では、発現は悪性上皮に見られた。
また発現は、不明な組織形成の胎児胸腺髄質の細胞全体に見られた。発現は、損傷腎臓間質の単核細胞及び腎細胞癌の内膜細胞の全体で見られた。また発現は、胚中心の細胞全体で見られ、殆どのＦｉｇ-１陽性細胞が発生においておそらく炎症性であるという事実に符合する。
（４）ＤＮＡ２８４９８（ＰＲＯ１８３）（ＦＨＦ-２）
胎児網膜の内面全体で発現が観察された。強い発現が、脊髄神経節全体及びヒト胎児の脊髄の前角におけるニューロン全体で見られた。ヒト胎児の脳では有意な発現は観察されなかったが、海馬ニューロンを含むアカゲザル脳のニューロン全体で高い発現が見られた。また、発現はラット胚の脊髄及び発育中の後脳でも見られた。
【０１８６】
実施例２７
ＰＲＯのハイブリッド形成プローブとしての使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。
ここに開示されるような全長又は成熟ＰＲＯ又はその断片のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ（ＰＲＯの天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリを含むフィルターの洗浄は、以下の高い緊縮性条件下で実施される。ＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子から誘導された放射性標識プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xＳＳｃ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施した。
全長天然配列ＰＲＯをコードするＤＮＡと所望の同一性を持つＤＮＡは、次いでこの分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０１８７】
実施例２８
大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のＰＲＯの調製を例示する。
ＰＲＯをコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
【０１８８】
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＰＲＯタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１８９】
ＰＲＯは、以下の手法を用いて、大腸菌においてポリ-Ｈｉｓタグ形態で発現させた。ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら3-5のＯ.Ｄ.６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%（w/v）のグルコース及び7mMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に50-100倍希釈し、３０℃で振盪させながら約20-30時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
【０１９０】
0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の3-5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni2+-NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【０１９１】
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、５ｍＭのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールデｌイング溶液を４℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度0.4%（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨＥＰＥＳ、pH6.8に調製した。
【０１９２】
実施例２９
哺乳動物細胞におけるＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現によるグリコシル化形態のＰＲＯの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯＤＮＡを約1μgのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMのＥＤＴＡ、0.227MのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMのＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mmのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１９３】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/mlの３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-ＰＲＯＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μｇ/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
【０１９４】
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてよい。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＰＲＯは、一過性発現手法によってＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、又は他の安定発現手法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【０１９５】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０１９６】
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3ｘ10７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地（0.2μm濾過ＰＳ２０、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3ｘ10５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行の米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ10６細胞/mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の30mLとした。生産を通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
【０１９７】
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi２＋-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示するＰＲＯの多くが、上記のように成功裏に発現された。
【０１９８】
実施例３０
酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが、上記のように成功裏に発現された。
【０１９９】
実施例３１
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載する。
ＰＲＯのコード化配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯあるいはＰＲＯのコード化配列の所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０２００】
次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯは、例えば、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mlのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mMのＥＤＴＡ；10%のグリセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMＮａＣｌ、10%のグリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調製し、25mlの水で洗浄し、25mlの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mlでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMのイミダゾール勾配で展開した。1mlの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが、上記のように成功裏に発現された。
【０２０１】
実施例３２
ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ又はＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０２０２】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＰＲＯの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＰＲＯに対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０２０３】
実施例３３
特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０２０４】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０２０５】
実施例３４
薬剤スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
しかして、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０２０６】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０２０７】
実施例３５
合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら, J.Biochem.,113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０２０８】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【０２０９】
実施例３６
インビトロ抗腫瘍アッセイ
ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ５３４、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ６９８、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ１００５、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１１５７、ＰＲＯ１１９９、ＰＲＯ１２６５、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１３１３、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１３７５、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１４８８、ＰＲＯ３４３８、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４００、ＰＲＯ５７２５、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ５４２、ＰＲＯ８６１、ＰＲＯ１０９６又はＰＲＯ３５６２ポリペプチドの抗増殖活性を、Skehan等, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112(1990)により本質的に記載されているようなスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染色結合アッセイを使用して、国立ガン研究所（ＮＣＩ）の治験疾患指向インビトロ抗ガン薬発見アッセイにおいて決定した。この研究で使用した６０の腫瘍細胞株（「ＮＣＩパネル」）並びにインビトロでの維持と培養の条件はMonks等, J. Natl. Cancer Inst., 83:757-766 (1991)によって記載されている。このスクリーニングの目的は異なったタイプの腫瘍に対して試験化合物の細胞障害及び／又は細胞分裂停止活性を最初に評価することである（上掲のMonks等；Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10):1-12[1989]）。
【０２１０】
およそ６０のヒト腫瘍細胞株由来の細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco）で収集し、一度洗浄し、ＩＭＥＭに再懸濁させ、その生存度を決定した。細胞懸濁物をピペット（１００μｌ容量）で別個の96ウェルのマイクロタイタープレートに加えた。過成長を防ぐため、6日のインキュべーションに対する細胞密度は2日のインキュべーションのものより少なかった。安定化のために37℃での24時間のプレインキュベーション時間で播種が可能になった。意図した試験濃度の２倍希釈物が、時間ゼロの時点で100μlの分割量でマイクロタイタープレートウェルに加えられた（1：2の希釈）。試験化合物を5倍半の対数希釈で評価した（1000から100,000倍）。インキュベーションは5％のＣＯ２雰囲気及び100％湿度で2日間及び6日間行われた。
【０２１１】
インキュべーション後、培地を取り除き、細胞を40℃で0.1mlの10％トリクロロ酢酸中に固定した。プレートを脱イオン水で5回洗浄し、乾燥させ、1％酢酸中に0.1ml入った0.4％スルホローダミンＢ染料（Sigma）で30分間染色し、1％酢酸で4回洗い流して、未結合染料を取り除き、乾燥させ、0.1mlの10mMトリス塩基[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]、ｐＨ10.5で5分間染色物を抽出した。429nmでのスルホローダミンＢの吸光度（ＯＤ）をコンピュータに接続した96ウェルのマクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は一回又は複数の濃度で少なくとも40％の成長阻害効果を示すとポジティブと考えられる。結果を次の表７に示すが、そこでは腫瘍細胞型の略号は次の通りである：
ＮＳＣＬ＝非小細胞肺癌；ＣＮＳ＝中枢神経系
【０２１２】
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【０２１３】
2006025793.tif 000025
【０２１４】
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【０２１５】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
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【０２２０】
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【０２２１】
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【０２２２】
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【０２２３】
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【０２２４】
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【０２２５】
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【０２２６】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１  ユニバーシティ  ブルバード  マナッサス、ヴァージニア、２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
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【０２２７】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０２２８】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】天然配列ＰＲＯ２４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図であり、配列番号：１はここでＤＮＡ３４３８７−１１３８と命名されるクローンである。
【図２】図１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図３】天然配列ＰＲＯ３８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図であり、配列番号：３はここでＤＮＡ４４１９４−１３１７と命名されるクローンである。
【図４】図３に示した配列番号：３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。
【図５】天然配列ＰＲＯ５３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す図であり、配列番号：５はここでＤＮＡ４８３３３−１３２１と命名されるクローンである。
【図６】図５に示した配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。
【図７】天然配列ＰＲＯ５４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す図であり、配列番号：７はここでＤＮＡ４４１８９−１３２２と命名されるクローンである。
【図８】図７に示した配列番号：７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。
【図９】天然配列ＰＲＯ６９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す図であり、配列番号：９はここでＤＮＡ４８３２０−１４３３と命名されるクローンである。
【図１０】図９に示した配列番号：９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す図である。
【図１１】天然配列ＰＲＯ９８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す図であり、配列番号：１１はここでＤＮＡ５７７００−１４０８と命名されるクローンである。
【図１２】図１１に示した配列番号：１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す図である。
【図１３】天然配列ＰＲＯ１００５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す図であり、配列番号：１３はここでＤＮＡ５７７０８−１４１１と命名されるクローンである。
【図１４】図１３に示した配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す図である。
【図１５】天然配列ＰＲＯ１００７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示す図であり、配列番号：１５はここでＤＮＡ５７６９０−１３７４と命名されるクローンである。
【図１６】図１５に示した配列番号：１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す図である。
【図１７】天然配列ＰＲＯ１１３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す図であり、配列番号：１７はここでＤＮＡ５９７７７−１４８０と命名されるクローンである。
【図１８】図１７に示した配列番号：１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。
【図１９】天然配列ＰＲＯ１１５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す図であり、配列番号：１９はここでＤＮＡ６０２９２−１５０６と命名されるクローンである。
【図２０】図１９に示した配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す図である。
【図２１】天然配列ＰＲＯ１１９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示す図であり、配列番号：２１はここでＤＮＡ６５３５１−１３６６−１と命名されるクローンである。
【図２２】図２１に示した配列番号：２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す図である。
【図２３】天然配列ＰＲＯ１２６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示す図であり、配列番号：２３はここでＤＮＡ６０７６４−１５３３と命名されるクローンである。
【図２４】図２３に示した配列番号：２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す図である。
【図２５】天然配列ＰＲＯ１２８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５）を示す図であり、配列番号：２５はここでＤＮＡ６４９０３−１５５３と命名されるクローンである。
【図２６】図２５に示した配列番号：２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す図である。
【図２７】天然配列ＰＲＯ１３１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示す図であり、配列番号：２７はここでＤＮＡ６４９６６−１５７５と命名されるクローンである。
【図２８】図２７に示した配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す図である。
【図２９】天然配列ＰＲＯ１３３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示す図であり、配列番号：２９はここでＤＮＡ６６６６７と命名されるクローンである。
【図３０】図２９に示した配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す図である。
【図３１】天然配列ＰＲＯ１３７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示す図であり、配列番号：３１はここでＤＮＡ６７００４−１６１４と命名されるクローンである。
【図３２】図３１に示した配列番号：３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す図である。
【図３３】天然配列ＰＲＯ１４１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３）を示す図であり、配列番号：３３はここでＤＮＡ６８８７４−１６２２と命名されるクローンである。
【図３４】図３３に示した配列番号：３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す図である。
【図３５】天然配列ＰＲＯ１４８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す図であり、配列番号：３５はここでＤＮＡ７３７３６−１６５７と命名されるクローンである。
【図３６】図３５に示した配列番号：３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す図である。
【図３７】天然配列ＰＲＯ３４３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す図であり、配列番号：３７はここでＤＮＡ８２３６４−２５３８と命名されるクローンである。
【図３８】図３７に示した配列番号：３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す図である。
【図３９】天然配列ＰＲＯ４３０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示す図であり、配列番号：３９はここでＤＮＡ９２２１８−２５５４と命名されるクローンである。
【図４０】図３９に示した配列番号：３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す図である。
【図４１】天然配列ＰＲＯ４４００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示す図であり、配列番号：４１はここでＤＮＡ８７９７４−２６０９と命名されるクローンである。
【図４２】図４１に示した配列番号：４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す図である。
【図４３】天然配列ＰＲＯ５７２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３）を示す図であり、配列番号：４３はここでＤＮＡ９２２６５−２６６９と命名されるクローンである。
【図４４】図４３に示した配列番号：４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す図である。
【図４５】天然配列ＰＲＯ１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５）を示す図であり、配列番号：４５はここでＤＮＡ２８４９８と命名されるクローンである。
【図４６】図４５に示した配列番号：４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す図である。
【図４７】天然配列ＰＲＯ２０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７）を示す図であり、配列番号：４７はここでＤＮＡ３０８６９と命名されるクローンである。
【図４８】図４７に示した配列番号：４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す図である。
【図４９】天然配列ＰＲＯ５４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示す図であり、配列番号：４９はここでＤＮＡ５６５０５と命名されるクローンである。
【図５０】図４９に示した配列番号：４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す図である。
【図５１】天然配列ＰＲＯ８６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示す図であり、配列番号：５１はここでＤＮＡ５０７９８と命名されるクローンである。
【図５２】図５１に示した配列番号：５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す図である。
【図５３】天然配列ＰＲＯ１０９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３）を示す図であり、配列番号：５３はここでＤＮＡ６１８７０と命名されるクローンである。
【図５４】図５３に示した配列番号：５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す図である。
【図５５】天然配列ＰＲＯ３５６２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５）を示す図であり、配列番号：５５はここでＤＮＡ９６７９１と命名されるクローンである。
【図５６】図５５に示した配列番号：５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
2006025793.tif 000090
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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