(57)【要約】【課題】エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する物質を見出し、当該物質を配合した皮膚化粧料、並びに当該物質を有効成分とする抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤、並びに当該物質を配合した皮膚化粧料を提供する。【解決手段】皮膚化粧料に、コロソリン酸を配合する。また、抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤に、コロソリン酸を有効成分として含有せしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロソリン酸を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項２】
コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項３】
コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項４】
コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
【請求項５】
コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞増殖促進剤。
【請求項６】
コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤及び皮膚化粧料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の真皮・表皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の真皮細胞外マトリックスによって構成されており、若い皮膚においてはこれらの皮膚組織が恒常性を維持することにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすることによって、真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチン、コラーゲン等の産生量が減少するとともに、変性や分解を引き起こす。その結果、角質は異常剥離を始め、肌は張りや艶を失い、肌荒れやシワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワの形成、張りの消失、弾力性の低下等には、エラスチン、コラーゲン等の真皮細胞外マトリックス成分の減少、変性が関与している。
【０００３】
エラスチンは、皮膚組織に弾力性を与える線維であり、加齢等に伴ってエラスチンが分解されると皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。エラスチンを分解する酵素であるエラスターゼは、紫外線の照射により活性化され、これによりエラスチンの分解が加速し、皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。そのため、エラスターゼの活性を阻害することによりエラスチンの分解が抑制され、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善できると考えられる。従来、エラスターゼ阻害作用を有する生薬として、スターフルーツ果実抽出物が知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックス系プロテアーゼの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。従来、ＭＭＰ−１阻害作用を有する生薬として、マツ科マツ属二葉松類の樹皮の抽出物が知られている（特許文献２参照）。
【０００５】
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、角質層に存在する大部分の細胞は、基底層から産まれた角化細胞である。通常、角化細胞は、基底層で産まれ、徐々に分化しながら上層に移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。
【０００６】
角質層は皮膚の最外殻に存在しており、絶えずターンオーバーを繰り返して一定の厚さと水分量を保持して、外界からの刺激に対するバリアーとしての役割を果たしている。皮膚では、このバリアー機能を維持させるため、角化細胞が基底層で産まれてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層は加齢等によって新陳代謝機能が衰えるため、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を呈することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、皮膚の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を予防・改善できるものと考えられる。
【０００７】
従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有する種々の生薬が知られており（非特許文献１参照）、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、ハス胚芽抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００８】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発で、皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００９】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖能が低下し、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少するとともに架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が始まるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ形成等の皮膚の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ形成、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、線維芽細胞の増殖能の低下が深く関与していると考えられる。
【００１０】
このような考えに基づき、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化を防止又は改善でき、安全性の高い天然物系の線維芽細胞増殖促進剤について種々の提案がなされている。例えば、五斂子の葉部からの抽出物（特許文献４参照）、ハス胚芽抽出物（特許文献５参照）、有色素米又は有色素米の糠からの抽出物（特許文献６参照）、月桃の葉及び／又は茎からの抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
【特許文献１】特開２００３−３００８９３号公報
【特許文献２】特開２００３−２７７２２３号公報
【特許文献３】特開２００２−６８９９３号公報
【特許文献４】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献５】特開２００２−２９９８０号公報
【特許文献６】特開２００２−３３９３号公報
【特許文献７】特開２００２−３３９０号公報
【非特許文献１】「和漢医薬学雑誌」，１９９８年，第１５巻，ｐ．４２６−４２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用及び線維芽細胞増殖促進作用を有する物質を見出し、当該物質を配合した皮膚化粧料、並びに当該物質を有効成分とする抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸を配合したことを特徴とし、また、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用及び線維芽細胞増殖促進作用を有する物質を見出し、当該物質を配合した皮膚化粧料、並びに当該物質を有効成分とする抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について説明する。
〔抗老化剤，エラスターゼ阻害剤，マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤，表皮角化細胞増殖促進剤，線維芽細胞増殖促進剤〕
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤及び線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸を有効成分として含有する。
【００１５】
コロソリン酸（corosolic acid）は、次式で表される化学構造を有するトリテルペノイド類化合物の一種である。
【００１６】
【化１】
2006265232.tif 000002
【００１７】
コロソリン酸は、コロソリン酸を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる（特開２００５−２９５７０号公報参照）。
【００１８】
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。コロソリン酸を含有する植物としては、例えば、ビワ（学名：Eriobotrya japonica）、バナバ（学名：Lagerstroemia speciosa）等が挙げられる。
【００１９】
ビワ（Eriobotrya japonica）は、バラ科の常緑高木であり、果実部は食用にされ、葉部は胃腸虚弱、神経痛、下痢等の治療等に用いられている。ビワは、日本、台湾、中国等に自生しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るビワの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。
【００２０】
バナバ（Lagerstroemia speciosa）は、フィリピンやオーストラリア等の熱帯・亜熱帯地域に広く分布するミソハギ科の植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るバナバの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。
【００２１】
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２２】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２５】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２６】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２７】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からコロソリン酸を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、植物抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコール、アセトンの順で溶出させ、アルコール及びアセトンで溶出される画分として得ることができる。カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られた画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２８】
以上のようにして得られるコロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有しているため、それらの作用を利用して抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤として使用することができる。なお、抽出処理により得られた植物抽出物はコロソリン酸を含有しており、そのまま抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤の有効成分として使用し得るが、精製してコロソリン酸の純度を高めたものを使用することが好ましい。コロソリン酸の純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層使用効果に優れた抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を得ることができる。コロソリン酸を含有する植物抽出物には、コロソリン酸を含有する植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２９】
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物のみからなるものでもよいし、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物を製剤化したものでもよい。
【００３０】
コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物を製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤の形態としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等が挙げられる。
【００３１】
なお、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、必要に応じて、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する天然抽出物等を、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３２】
本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。また、本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。さらに、本発明の抗老化剤は、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の抗老化剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスターゼの活性を阻害することができる。これにより、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のエラスターゼ阻害剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３４】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性を阻害することができる。これにより、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、これらの用途以外にも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３５】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進することができ、これにより、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、表皮角化細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３６】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進することができ、これにより、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３７】
〔皮膚化粧料〕
本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸を配合したものである。
コロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有しており、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物をそのまま配合してもよいし、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物から製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を配合してもよい。コロソリン酸、コロソリン酸を含有する植物抽出物、コロソリン酸又はコロソリン酸を含有する植物抽出物から製剤化した抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤又は線維芽細胞増殖促進剤を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料にエラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を付与することができる。
【００３８】
コロソリン酸を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、リップ、入浴剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。
【００３９】
コロソリン酸を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して、約０．０００１〜１０質量％である。
【００４０】
本発明の皮膚化粧料は、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用、表皮角化細胞増殖促進作用又は線維芽細胞増殖促進作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。これらの助剤等を併用することで、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００４１】
本発明の皮膚化粧料によれば、コロソリン酸が有するエラスターゼ阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を通じて、コラーゲンの分解を抑制し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。また、本発明の皮膚化粧料によれば、コロソリン酸が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができるとともに、コロソリン酸が有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。
【００４２】
なお、本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤又は皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４４】
〔製造例１〕コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部３００ｇにエタノール３０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行い、熱時濾過した。得られた濾液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物８３ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を多孔性吸着樹脂（製品名：ダイヤイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）に付し、水５０００ｍＬ、５０質量％メタノール２０００ｍＬ、メタノール２０００ｍＬ、アセトン２０００ｍＬの順で溶出させた。これらの溶出部を薄層クロマトグラフィー（商品名：シリカゲルＦ６０，Ｍｅｒｃｋ社製）に付したところ、メタノール溶出部及びアセトン溶出部にコロソリン酸が含まれていることが確認されたため、これらの溶出部をあわせて（固形分２７．６ｇ）、シリカゲルカラム（移動相：クロロホルム：メタノール＝２０：１から３０：１，富士シリシア社製）を用いて分離・精製し、精製物１５２ｍｇを得た（試料１）。この精製物を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を以下に示す。
【００４５】
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）＞
17.2（25-C），17.7（24-C），17.8（29-C），17.8（26-C），19.1（6-C），21.6（30-C），24.0（11-C），24.1（27-C），25.1（16-C），28.9（15-C），29.5（23-C），31.3（21-C），33.7（7-C），37.6（22-C），38.7（10-C），38.8（19-C），39.6（4-C），40.1（20-C），40.3（8-C），42.8（14-C），48.1（9-C），48.2（1-C），48.3（17-C），53.7（18-C），56.1（5-C），68.7（2-C），84.0（3-C），125.6（12-C），139.3（13-C），179.8（28-C）
【００４６】
以上の結果から、製造例１で得られた精製物が、コロソリン酸であることが確認された。
【００４７】
〔製造例２〕３％コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部１００ｇに８０質量％エタノール１０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行い、熱時濾過した。得られた抽出液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物１６ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した結果、当該抽出物にコロソリン酸が３質量％含まれていた（試料２）。
【００４８】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：６５％アセトニトリル
移動相流速：１．２ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
【００４９】
〔製造例３〕１０％コロソリン酸の製造
細切りにしたビワの葉部１００ｇに９０質量％エタノール１０００ｍＬを加え、９５℃にて２時間加熱還流抽出を行った後、活性炭（製品名：カルボラフィン，日本エンバイロケミカルズ社製）を用いて濾過した。得られた濾液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、５０質量％エタノールに懸濁させ、当該懸濁液を珪藻土で濾過した。残渣を９０質量％エタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレーターで濃縮・乾固させ、ビワ葉部抽出物１．８ｇを得た。得られたビワ葉部抽出物を、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した結果、当該抽出物中にコロソリン酸が１０質量％含まれていた（試料３）。
【００５０】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：６５％アセトニトリル
移動相流速：１．２ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
【００５１】
〔試験例１〕エラスターゼ阻害作用試験
製造例１〜３により得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、以下のようにしてエラスターゼ阻害作用を試験した。
【００５２】
９６ウェルプレートにて、０．２ｍｏｌ／Ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した試料溶液５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬのエラスターゼ・タイプIII溶液５０μＬを混合した。その後、上記緩衝液で調製した０．４５１４ｍｇ／ｍＬのN-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide１００μＬを添加して、２５℃で１５分反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、次式に基づき、エラスターゼ阻害率（％）を算出した。
【００５３】
エラスターゼ阻害率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表す。
【００５４】
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、エラスターゼの活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
上記試験の結果を表１に示す。
【００５５】
［表１］
試  料     ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
試料１            ４８．４
試料２        ＞４００
試料３        ＞４００
【００５６】
表１に示すように、コロソリン酸は、エラスターゼ阻害作用を有することが確認された。
【００５７】
〔試験例２〕マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）阻害作用試験
製造例１〜３により得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、以下のようにしてマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を試験した。
【００５８】
蓋付試験管にて、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）で調製した試料溶液５０μＬ、０．４ｍｏｌ／Ｌのマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１，シグマ社製）溶液（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１））５０μＬ、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのＰｚ−ペプチド（BACHEM Feinchemikalien AG社製）溶液（溶媒：２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１））４００μＬを混合し、３７℃にて３０分間反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え、反応を停止させた。
【００５９】
その後、酢酸エチル５ｍＬをさらに加えて、激しく振とうした。これを遠心分離し（１６００×ｇ，１０分間）、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様の方法により空試験を行った。得られた結果から、次式に基づき、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害率（％）を算出した。
【００６０】
ＭＭＰ−１阻害率(％)＝{１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加・酵素添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加・酵素無添加時の吸光度」を表し、Ｃは「試料添加・酵素添加時の吸光度」を表し、Ｄは「試料添加・酵素無添加時の吸光度」を表す。
【００６１】
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
上記試験の結果を表２に示す。
【００６２】
［表２］
試  料     ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
試料１            ４５．９
試料２            ６６．２
試料３          １１０．４
【００６３】
表２に示すように、コロソリン酸は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害作用を有することが確認された。
【００６４】
〔試験例３〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例１，２で得られたコロソリン酸（試料１，２）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００６５】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度にＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した各試料（試料１，２）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。
【００６６】
表皮角化細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記式に基づいて表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００６７】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
試験の結果を、表３に示す。
【００６８】
［表３］
試  料     試料濃度（μｇ／ｍＬ）   表皮角化細胞増殖促進率（％）
１            ３．１３                １２２．３±４．４
０．７８                １２７．１±３．７
０．１９                １１５．８±３．４
２            ３．１３                １１８．０±２．５
０．７８                １１７．３±３．９
【００６９】
表３に示すように、コロソリン酸は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７０】
〔試験例４〕線維芽細胞増殖作用試験
製造例１〜３で得られたコロソリン酸（試料１〜３）について、線維芽細胞増殖作用を以下のようにしてＭＴＴ法（J. Immunol. Method 93，157，1986）に準拠して試験した。
【００７１】
２５ｃｍ２の培養フラスコに入れた１０％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）にヒト正常新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）１×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いでトリプシン処理し、遠心分離して細胞を回収した。沈殿として得られた細胞を５％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）に懸濁し、９６ウェルプレートの１穴につき７×１０３個ずつ分注した。
【００７２】
２４時間培養後、試料（試料１〜３）を溶解した５％ＦＢＳ含有培地を１穴につき１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で３日間培養した。培養後、培地を１穴につき１００μＬずつ除去し、ＭＴＴ試薬（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ(−)溶液）２０μＬを添加し、４．５時間インキュベーションした（増殖した細胞中のミトコンドリア由来の活性酸素がＭＴＴ試薬と反応し、黄色であった試薬の色が５７０ｎｍに吸収のピークを有する青黄色に変わる。）。その後、各穴に１０質量％ドデシル硫酸ナトリウム−０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を１００μＬずつ分注し、１８時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。別に、試料だけでもブランクをとり、同様の操作を行い吸光度の測定を行った。
【００７３】
また、各吸光度測定値は、同時に測定した６５０ｎｍの吸光度を差し引いて、増殖した細胞による濁度の影響を補正した。補正後の各吸光度より下記式に基づいて線維芽細胞増殖促進率（％）を求めた。
【００７４】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝{(Ａ−Ｃ)−(Ｂ−Ｄ)}／(Ｂ−Ｄ)×１００
式中、Ａは「試料添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の吸光度」を表し、Ｃは「試料添加、細胞無添加時の吸光度」を表し、Ｄは「試料無添加、細胞無添加時の吸光度」を表す。
結果を表４に示す。
【００７５】
［表４］
試  料     試料濃度（μｇ／ｍＬ）   線維芽細胞増殖促進率（％）
１              １００                  １５７．９±４．２
２              ４００                  ２０１．２±３．０
２００                  １６０．９±２．６
１００                  １３４．６±１．８
３              ４００                  １７４．９±６．９
２００                  １２４．３±４．４
【００７６】
表４に示すように、コロソリン酸は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７７】
〔配合例１〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１）                                  ０．００１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１ｇ
ローズマリー抽出物                                        ０．１ｇ
ハマメリス抽出物                                          ０．１ｇ
縮合リシノレイン酸ポリグリセリル                          ３．０ｇ
スクワラン                                                ８．０ｇ
マカダミアナッツ油                                        ３．０ｇ
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ５．０ｇ
メチルフェニルポリシロキサン                              ４．０ｇ
塩化ナトリウム                                            ０．５ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸プロピル）                      ０．１ｇ
香料                                                      適量
１，３−ブチレングリコール                                ５．０ｇ
グリセリン                                                ３．０ｇ
精製水                                  残部（全量を１００ｇとする）
【００７８】
〔配合例２〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１）                                  ０．００２ｇ
ニンジン抽出物                                            ０．１ｇ
油溶性甘草エキス                                          ０．１ｇ
ローヤルゼリー抽出物                                      ０．１ｇ
モモ葉抽出物                                              ０．１ｇ
酵母抽出物                                                ０．１ｇ
キサンタンガム                                            ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース                                ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー                                  ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール                                ４．０ｇ
グリセリン                                                ２．０ｇ
水酸化カリウム                                            ０．２５ｇ
香料                                                      適量
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル）                        ０．１５ｇ
エタノール                                                ２．０ｇ
精製水                                  残部（全量を１００ｇとする）
【００７９】
〔配合例３〕
下記組成のパックを常法により製造した。
コロソリン酸（製造例１）                                  ０．００１ｇ
ポリビニルアルコール                                    １５．０ｇ
カルボメキシメチルセルロース                              ５．０ｇ
グリセリン                                                ３．０ｇ
エタノール                                              １０．０ｇ
香料                                                      ０．５ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸ブチル）                        適量
酸化防止剤（酢酸トコフェロール）                          適量
精製水                                  残部（全量を１００ｇとする）
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の抗老化剤、エラスターゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤、表皮角化細胞増殖促進剤、線維芽細胞増殖促進剤及び皮膚化粧料は、シワの形成、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状の予防・改善に大きく貢献できる。