(57)【要約】【課題】  グリコサミノグリカン分解酵素の活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供すること。【解決手段】（Ａ）「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」と検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ、（Ｂ）前記作用後のグリコサミノグリカンを蛍光偏光分析法によって検出するステップ、及び（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性とを関連づけるステップを少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法。「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」を少なくとも含有するグリコサミノグリカン分解酵素の活性測定剤。フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとヒアルロン酸とが共有結合していることを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体又はその塩。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）の全てのステップを少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法。
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」と検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：前記作用後のグリコサミノグリカンを蛍光偏光分析法によって検出するステップ。
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性とを関連づけるステップ。
【請求項２】
グリコサミノグリカンが、カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項１に記載の活性測定方法。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸又はヘパリンであることを特徴とする、請求項２に記載の活性測定方法。
【請求項４】
「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」における蛍光物質が、グリコサミノグリカンのカルボキシル基部分に結合していることを特徴とする、請求項２又は３に記載の活性測定方法。
【請求項５】
蛍光物質が、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性測定方法。
【請求項６】
「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」における蛍光物質とグリコサミノグリカンとの結合が、共有結合であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の活性測定方法。
【請求項７】
「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」を少なくとも含有する、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定剤。
【請求項８】
グリコサミノグリカンが、カルボキシル基を有するグリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項７に記載の活性測定剤。
【請求項９】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸又はヘパリンであることを特徴とする、請求項８に記載の活性測定剤。
【請求項１０】
「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」における蛍光物質が、グリコサミノグリカンのカルボキシル基部分に結合していることを特徴とする、請求項８又は９に記載の活性測定剤。
【請求項１１】
蛍光物質が、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の活性測定剤。
【請求項１２】
「蛍光物質が結合したグリコサミノグリカン」における蛍光物質とグリコサミノグリカンとの結合が、共有結合であることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の活性測定剤。
【請求項１３】
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとヒアルロン酸とが共有結合していることを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体又はその塩。
【請求項１４】
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基とヒアルロン酸のカルボキシル基とがヒドラジド結合していることを特徴とする、請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法及び活性測定剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で使用する略号は以下の通りである。
ＡＢＥＥ：４−アミノ安息香酸エチルエステル（4-amino benzoic acid ethyl ester）
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide）
ＦＰ分析法：蛍光偏光分析法（fliorescence polarization assay method）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＨＡａｓｅ：ＨＡ分解酵素
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography）
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＭＢＴＨ：３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸（2-morpholinoethanesulfonic acid）
ＲＩ：示差屈折（Differential refractive index）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）
特許文献１には、ＧＡＧ分解酵素の活性を測定する方法として、第１の重合高分子イオン（ＧＡＧ）及びこれと逆の電荷を持つ蛍光標識された第２の重合高分子イオン（例えばポリリジン、ポリアルギニン、キチン等）とを相互作用させ、イオン結合させて、その複合体をＦＰ分析する方法が開示されている。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，６３０，２９５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＧＡＧ分解酵素の活性を、簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」とＦＰ分析法を採用することによって、ＧＡＧ分解酵素の活性を、簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の全てのステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性測定方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
【０００７】
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップ。
【０００８】
ステップ（Ｂ）：前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップ。
【０００９】
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップ。
【００１０】
ここにいうＧＡＧは、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。またこのＧＡＧはＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ又はＨｅｐであることが好ましい。
【００１１】
また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましい。この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は、共有結合であることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する、ＧＡＧ分解酵素の活性測定剤（以下、「本発明測定剤」という。）を提供する。
【００１３】
ここにいうＧＡＧは、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。またこのＧＡＧはＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ又はＨｅｐであることが好ましい。
【００１４】
また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましい。この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は、共有結合であることが好ましい。
【００１５】
さらに本発明は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとが共有結合していることを特徴とする、ＨＡ誘導体又はその塩（以下、「本発明誘導体」という。）を提供する。この誘導体において、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基とＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合していることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明方法は、これを用いることにより、簡便、迅速、安価かつ高感度に、高い再現性と高い定量性をもって検体中のＧＡＧ分解酵素活性を測定することができ、極めて有用である。さらに本発明測定剤は、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施を可能にすることから非常に有用である。また本発明誘導体は、本発明方法や本発明測定剤の有効成分等として用いることができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の全てのステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性測定方法である。
ステップ（Ａ）：「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップ。
ステップ（Ｃ）：ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップ。
【００１８】
以下、ステップごとに説明する。
（１）ステップ（Ａ）
本ステップは、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素を作用させるステップである。
（１−１）蛍光物質が結合したＧＡＧ
ここにいう「蛍光物質」は、ＧＡＧに結合しうるものであり、かつＦＰ分析法によって検知しうるものである限りにおいて特に限定されず、種々のフルオレセイン誘導体、蛍光標識リガンド等が例示される。このようなものとしては、例えば、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、ローダミン、クマリン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、エオシン、ピレン等が例示される。なかでも、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合するものが好ましく、このようなものとしては、例えば、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドテキサスレッド ヒドラジド、１−アミノメチルピレン、カスケードブルーカダベリン等が例示される。なかでもフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが好ましい。
【００１９】
また、蛍光物質が結合されるＧＡＧも、活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素の基質となり得るＧＡＧである限りにおいて特に限定されない。このようなＧＡＧとしては、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、ＫＳ、ＨＳ、Ｈｅｐ等が例示されるが、カルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましい。カルボキシル基を有するＧＡＧとしては、ＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ、Ｈｅｐが例示されるが、なかでもＨＡ、ＣＨ、ＣＳ、ＨＳ及びＨｅｐからなる群から選ばれることが好ましい。そのなかでも、ＨＡ又はＣＨが好ましい。
【００２０】
またＧＡＧは塩であってもよい。塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。
【００２１】
蛍光物質が結合されるＧＡＧは、本発明方法における活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素の種類に応じて、当業者が適宜選択することができる。
例えばＨＡａｓｅを活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてＨＡを用いることができる。同様に、例えば、ヘパラン硫酸分解酵素を活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてヘパラン硫酸を用いることができる。
蛍光物質が結合されるＧＡＧのサイズも特に限定されない。例えば、ＨＡであれば重量平均分子量が１万〜３００万程度のものを例示することができる。なかでも重量平均分子量が２万〜２００万程度のものが好ましく、重量平均分子量４万〜１２０万のものがより好ましい。ＣＨとしては、例えば重量平均分子量１千〜５万程度のものを用いることができる。
【００２２】
このようなＧＡＧは、公知の方法で製造することができ、また市販のものを用いることもできる。
【００２３】
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における「蛍光物質」と「ＧＡＧ」との結合様式は、両者が何らかの形で結合するものである限りにおいて特に限定されないが、共有結合であることが好ましい。
【００２４】
すなわち本発明における「蛍光物質が結合したＧＡＧ」として特に好ましいのは、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨＡ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＣＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＤＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＫＳ、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨＳ及びフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが共有結合したＨｅｐである。
【００２５】
また、「蛍光物質」が結合しているＧＡＧ上の位置も特に限定されないが、ＧＡＧのカルボキシル基であることが好ましい。
【００２６】
また、「蛍光物質」としてフルオレセイン−５−チオセミカルバジドを用いる場合には、そのヒドラジノ基とＧＡＧのカルボキシル基とがヒドラジド結合しているものが好ましい。
【００２７】
すなわち、本発明における「蛍光物質が結合したＧＡＧ」として最も好ましいのは、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基と、ＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合しているＨＡである。
【００２８】
また、ＧＡＧに結合している蛍光物質の分子数も特に限定されないが、２分子以上であることが好ましい。
蛍光物質をＧＡＧに結合させる方法（「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の製造方法）は、蛍光物質とＧＡＧとを結合させることができる方法である限りにおいて特に限定されない。具体例については実施例を参照されたい。
（１−２）検体
本発明方法における「検体」は、活性測定の対象となるＧＡＧ分解酵素が含有されているか、又は含有されている可能性があるものである限りにおいて特に限定されない。また検体は、予め精製されている必要もない。すなわち、検体中に、活性測定の対象とするＧＡＧ分解酵素以外のＧＡＧ分解酵素やその他の蛋白質等が含有されていても、本発明方法では活性測定の対象とするＧＡＧ分解酵素を特異的に測定することができる。
【００２９】
検体として具体的には、ＧＡＧ分解酵素溶液、細胞培養上清、組織抽出物、体液（例えば血液、尿等）等が例示される。
（１−３）「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体との接触等
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させる方法は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体中のＧＡＧ分解酵素分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。なおこれらを接触させた後、酵素反応させるためにインキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、検体中のＧＡＧ分解酵素が「蛍光物質が結合したＧＡＧ」に作用してこれを分解する反応が惹起される条件である限りにおいて限定されない。具体例については実施例を参照されたい。
【００３０】
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」と検体を接触させることによって、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧ分解酵素が作用して、当該ＧＡＧが低分子化されることになる。
（２）ステップ（Ｂ）
ステップ（Ｂ）は、前記作用後のＧＡＧをＦＰ分析法によって検出するステップである。
【００３１】
ステップ（Ａ）において「蛍光物質が結合したＧＡＧ」がＧＡＧ分解酵素の作用によって低分子化されるが、その程度は検体中に存在するＧＡＧ分解酵素の活性に依存する。本ステップは、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度をＦＰ分析法で検出するステップである。したがって、「前記作用後のＧＡＧ」とは、ＧＡＧ分解酵素の作用を受けた後の「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を意味する。
【００３２】
ＦＰ分析法は、公知の方法で行うことができ、そのための各種装置も市販されており、いずれをも使用することができる。具体例は実施例を参照されたい。
【００３３】
前記作用後のＧＡＧを、このようなＦＰ分析法によって検出することにより、その検出結果が得られる。
（３）ステップ（Ｃ）
ステップ（Ｃ）は、ステップ（Ｂ）で得られた検出結果と、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけるステップである。
【００３４】
ステップ（Ｂ）において、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度が検出される。低分子化の程度は検体中に存在するＧＡＧ分解酵素の活性に依存することから、ステップ（Ｂ）で得られた検出結果（低分子化の程度の指標となる）と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性とを関連づけることにより、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性を測定することができる。
【００３５】
「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」は、ＦＰ分析法によって得られた生データ（例えば、ｍＰ値など。）であってもよく、当該生データから所定の数式等を用いて算出された値（例えば、分子量として算出された値など。）であってもよい。
【００３６】
検体中のＧＡＧ分解酵素の活性が高ければ、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の低分子化の程度が高くなるので、これを利用して、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性との関連づけを行うことができる。
【００３７】
例えば、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」として、ＧＡＧの低分子化の程度が高いほど高い値を示すもの（例えば、ｍＰ値など。）を用いる場合には、当該値が高いほど、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性は高いと関連づけることができる。
【００３８】
また、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」として、ＧＡＧの低分子化の程度が高いほど低い値を示すもの（例えば、分子量として算出された値など。）を用いる場合には、当該値が低いほど、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性は高いと関連づけることができる。
【００３９】
なお、本発明方法における「活性測定方法」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定（ＧＡＧ分解酵素の存否の検出）をも含む概念である。したがって、「ステップ（Ｂ）で得られた検出結果」と検体中のＧＡＧ分解酵素の活性との関連づけは、定量的なものであっても、定性的なもの（ＧＡＧ分解酵素活性の有無についての関連づけ）であってもよい。
【００４０】
定量的な関連づけは、活性のレベルが既知のＧＡＧ分解酵素を用いた結果をもとに予め検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって行うことができる。
【００４１】
このような関連づけを行うことにより、検体中のＧＡＧ分解酵素の活性を測定することができる。測定される「活性」は、純然たる「酵素の活性」のみならず、酵素の濃度、重量、分子数等として求めてもよい。
【００４２】
本発明測定方法は、このようなステップ（Ａ）〜（Ｃ）のステップを全て含んでいる限りにおいて、さらに他のステップが加わってもよい。
＜２＞本発明測定剤
本発明測定剤は、「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する、ＧＡＧ分解酵素の活性測定剤である。
【００４３】
「蛍光物質が結合したＧＡＧ」の説明は、本発明測定方法における説明と同じである。
【００４４】
したがって、ＧＡＧはカルボキシル基を有するＧＡＧであることが好ましく、このＧＡＧはＨＡであることが好ましい。また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質は、ＧＡＧのカルボキシル基部分に結合していることが好ましく、この蛍光物質は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドであることが好ましく、また「蛍光物質が結合したＧＡＧ」における蛍光物質とＧＡＧとの結合は共有結合であることが好ましい。
本発明測定剤は、このような「蛍光物質が結合したＧＡＧ」を少なくとも含有する限りにおいて特に限定されず、さらに医薬的又は試薬的に許容される担体（例えば、緩衝剤や安定化剤など。）が含まれていてもよい。また、ＧＡＧ分解酵素の活性測定に使用する「蛍光物質が結合したＧＡＧ」以外のコンポーネント（例えば、ＰＢＳ、ＧＡＧ分解酵素の標準品など。）とセットにしたキットの形態であってもよい。
【００４５】
本発明測定剤は、前記の本発明測定方法に従って使用することができる。
＜３＞本発明誘導体
本発明誘導体は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとが共有結合していることを特徴とする、ＨＡ誘導体又はその塩である。
【００４６】
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドとＨＡとを共有結合させる方法としては、
ＥＤＣのような水溶性カルボジイミドの存在下で、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドに存在するアミノ基やヒドラジノ基を、ＨＡ上のカルボキシル基に結合させる方法が例示される。
【００４７】
なかでも、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基とＨＡのカルボキシル基とがヒドラジド結合していることが好ましい。
【００４８】
「塩」としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
ＭＥＳ溶液：２．１ ｇのＭＥＳ（同仁化学製）を１００ ｍｌの蒸留水に溶解し、５ Ｍの水酸化カリウムでｐＨ ５．５に調整し、これを０．２２ μｍ 孔径のフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。
ＥＤＣ溶液：ＥＤＣ（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液に溶解し、１００ ｍｇ/ｍｌに調製した。
ＨＡ：以下の３種類のＨＡを用いた。
【００５０】
ブタ皮由来の重量平均分子量４万〜６万のＨＡ（生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｌ」という。）。
【００５１】
鶏冠由来の重量平均分子量約９０万のＨＡ（生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｈ１」という。）。
【００５２】
鶏冠由来の重量平均分子量約９０万のＨＡ製剤（商品名：アルツ、生化学工業株式会社製。以下、「ＨＡ−Ｈ２」という。）
ＣＨ：サメ軟骨由来のＣＨ（生化学工業株式会社製）。
＜２＞方法と結果
１．本発明誘導体の調製
ＧＡＧ（ＨＡ−Ｌ、ＨＡ−Ｈ１、ＨＡ−Ｈ２及びＣＨ）を、それぞれ終濃度が１０ ｍｇ/ｍｌになるように０．１ Ｍ ＭＥＳに溶解し、ＧＡＧ溶液を調製した。このＧＡＧ溶液 １ ｍｌに、５０ ｍＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製） １００ μｌ、１００ ｍｇ/ｍｌ ＥＤＣ ５０ μｌを加え、混合溶液を調製した。この混合溶液を室温で一晩インキュベートした後、１４０００ ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し、少量の沈殿を得た。上清を新しいチューブに移した後、室温で１〜２日間ＰＢＳに対して透析し（時折ＰＢＳを交換する）、遊離のフルオレセイン−５−チオセミカルバジドを除き、本発明誘導体（フルオレセイン−５−チオセミカルバジドのヒドラジノ基がＨＡのカルボキシル基にヒドラジド結合しているＨＡ）を得た。
【００５３】
この本発明誘導体を蒸留水に希釈し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した結果、ＧＡＧにフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが結合していることが確認された。
２．蛍光偏光装置を用いたＨＡａｓｅの活性測定
蛍光標識されたＧＡＧ（ＨＡ−Ｈ１又はＣＨ）各２０ μl、５Ｍ ＮａＣｌ ３μl（終濃度１５０ｍＭ）、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５〜ｐＨ ６）１．７μl（終濃度５０ｍＭ）、及び、種々のレベルの活性を有するＨＡａｓｅ溶液を混合し、１００ μlの混合溶液を調製した。この混合溶液を３７℃で４時間インキュベートして酵素反応させた。
【００５４】
反応後の溶液を、ＰＢＳで１００〜５００倍に希釈して十分に撹拌した。撹拌後、この溶液を蛍光偏光システム（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ社製）に付し、ｍＰ値を測定した。
【００５５】
ＨＡａｓｅの活性と検出されたｍＰ値との関係を図１及び図２に示す。図中の丸印は蛍光標識されたＨＡ−Ｈ１を用いた結果を、四角印は蛍光標識されたＣＨを用いた結果を示す。その結果、ＨＡ−Ｈ１とＣＨのいずれを用いた場合においても、ＨＡａｓｅの活性と検出されたｍＰ値との間には高い相関性が見られた。特にＨＡａｓｅの活性が０〜１００単位の範囲では、直線的な相関（相関係数：０．９５〜０．９８）が見られた。
【００５６】
したがって本発明方法によって、ＧＡＧ分解酵素の活性を測定できることが示された。また、図１及び図２は、そのまま検量線として用いることができる。
【００５７】
また、０〜１００単位のＨＡａｓｅを用いてこの測定を３回行った結果を、標準誤差とともに図３に示す。図中の斜線の棒グラフはＨＡ−Ｈ１の結果を、白抜きの棒グラフはＣＨの結果をそれぞれ示す。０．１単位のＨＡａｓｅを用いたＣＨの結果と、１００単位のＨＡａｓｅを用いたＨＡ−Ｈ１の結果については、実施していないため表示していない。図３より、本発明方法は、再現性及び正確性が高い方法であることが示された。
【００５８】
また、蛍光標識されたＨＡとして、蛍光標識されたＨＡ−Ｌ及びＨＡ−Ｈ２を用いて同様に測定した結果、いずれも蛍光標識されたＨＡ−Ｈ１を用いた場合と同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明方法は、簡便、迅速、安価かつ高感度なＧＡＧ分解酵素活性の測定に利用することができる。また本発明測定剤は、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施に利用することができる。また本発明誘導体は、本発明方法や本発明測定剤の有効成分等として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＨＡａｓｅの活性（０〜１０００単位）と、ｍＰ値との関係を示す図である。
【図２】ＨＡａｓｅの活性（０〜１００単位）と、ｍＰ値との関係を示す図である。
【図３】ＨＡａｓｅの活性（０〜１００単位）と、ｍＰ値との関係の再現性を示す図である。
【図１】
2006025625.tif 000002
【図２】
2006025625.tif 000003
【図３】
2006025625.tif 000004