(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、血管新生抑制作用を効果的に発揮し得る物質を提供することである。【解決手段】  配列番号１乃至３で表されるペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤とする。このペプチドは、インテグリンβ３を活性化する作用を有する。この血管新生作用の確認には、傷つけアッセイや鶏胚漿尿膜法を用いることができる。【選択図】        図５
2006052161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤。
【請求項２】
配列番号１で表されるペプチドと該ペプチドに水溶性を付加する手段との組み合わせであることを特徴とする請求項１記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
配列番号２で表されるペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤。
【請求項４】
配列番号３で表されるペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制剤に関し、特に、生理活性ペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、血管内皮細胞の移動、増殖という過程を律速段階として含み、更に、いずれの段階も液性の血管新生誘引因子の作用に加えて、インテグリンを介した細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質との相互作用によって規定されている。
このような血管新生は、固形腫瘍、糖尿病性網膜症などの眼疾患、関節リウマチなどの炎症性疾患、尋常性乾癬、粥状動脈硬化などにおいても発生し、それぞれの病態の進展と密接に関連している。
【０００３】
このため、血管新生を阻害する物質は、これらの疾病の治療に利用することができると考えられており、例えば、メタロプロテアーゼであるＡＤＡＭ（A Disintegrin And Metalloprotease）ファミリーの新規ポリペプチド（特許文献１）などが開発されている。
また、特許文献２には、インテグリンの作用に着目して、αｖβ３インテグリンを選択的に阻害して、腫瘍血管網の血管形成による成長を抑制して、腫瘍退行の促進及び癌転移の防止することによって固形腫瘍を治療するプロパン酸誘導体が開示されている。
【０００４】
一方、インテグリンは細胞表面にたとえ充分量発現していても、定常状態ではリガンドと結合できず、何らかの細胞内シグナルにより細胞外立体構造の変化や多量体化することで活性化され、細胞接着能を有するようになることが知られている。
このため、細胞接着能の有無に基づく作用を効果的に発揮させるために、インテグリンを活性化又は不活性化する生理活性ペプチドも各種開発されている（例えば、特許文献３乃至５）。
【特許文献１】特開２００３−３８１８８号公報
【特許文献２】特表２００３−５３３５１１号公報
【特許文献３】特開２０００−２６４９００号公報
【特許文献４】国際公開第０１／０８６９８号パンフレット
【特許文献５】特開２００１−２１３８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、血管新生抑制作用を有する各種物質については血管新生を効果的に抑制しているとは言い難い。
従って、本発明の目的は、血管新生を効果的に抑制し得る物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の血管新生抑制剤は、配列番号１で表されるペプチドを有効成分とすることを特徴としている。
また本発明の他の血管新生抑制剤は、配列番号１で表されるペプチドと該ペプチドに水溶性を付加する手段とを組み合わせたものであることを特徴としている。
また更に本発明の他の血管新生抑制剤は、配列番号２で表されるペプチド又は配列番号３で表されるペプチドを有効成分とすることを特徴としている。
上記ペプチドはいずれも、インテグリンを活性化する作用を有し、このインテグリンを介した作用により、血管新生を抑制する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、配列番号１乃至３で表されるペプチドを有効成分とするので、血管新生を効果的に抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の血管新生抑制剤は、配列番号１乃至３で表されるペプチドを有効成分とするものである。このペプチドは、テネシン（ＴＮ）−Ｃ分子内に存在する配列を含むものであり、ヒト由来テネシンタンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１２３０〜１２３７に示されるアミノ酸配列（配列番号１）、特に、アミノ酸番号１２１７〜１２３７に示されるアミノ酸配列（配列番号２）を含むものである。テネシンは、発生、炎症、創傷治癒、再生過程などの際にその発現が強く誘導されるＥＣＭとして知られている。この配列番号１で表されるペプチドは、フィブロネクチン基質におけるインテグリンの細胞接着を強く促進、即ち、インテグリンを活性化することは知られているが、これに加えて血管新生抑制作用を有することが本発明において見出された。従って、少なくともアミノ酸番号１２３０〜１２３７の配列を含む配列番号１乃至３の少なくとも１つを有効成分とする本発明の薬剤を用いることによって、血管新生を効果的に抑制することができる。
【０００９】
配列番号１で表されるペプチドは、本発明の作用のために必須であるが、水溶性を付加するための手段と組み合わせることが好ましい。これにより、本ペプチドの水に対する溶解性が高められて種々の剤形として利用することが容易となる。
ここで用いられる水溶性を付加するための手段としては、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーや、硫酸基、水溶性アミノ酸などを挙げることができる。これらの水溶性付加手段は、配列番号１のペプチドと混合し、或いはこれに導入又は連結することによって組み合わせることができる。なお、これらの手段は組み合わせて使用してもよい。また、水溶性アミノ酸には、リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸や、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような酸性アミノ酸を挙げることができる。水溶性アミノ酸を用いる場合には、配列番号１のペプチドのＮ末端及びＣ末端の少なくとも一方に１つ以上を付加することができる。例えば、配列番号１のペプチドの両末端にリジンを複数個、付加したものが該当する。
【００１０】
本発明にかかるペプチドは、配列表の配列番号１乃至３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであれば、それ以外のアミノ酸配列は任意である。これらのペプチドも本発明にかかるペプチドに包含される。また、本発明の生理活性ペプチドの大きさは、合成の効率、取り扱い性、安定性その他の点より、アミノ酸数が３０残基以下であることが好ましく、さらに２５残基以下であることがより好ましい。
【００１１】
また、本発明にかかるペプチドは、その生理活性を損なわない限り、そのアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸を付加、欠失又は置換することが可能であり、そのようなペプチドも本発明に包含される。ここでアミノ酸の付加、欠失または置換は、部位特定変異誘発法（site-directed mutagenesis）等の周知の方法によって実施できる。
例えば、配列番号２で表される配列にシステインを付加した本発明にかかるペプチド（配列番号３）は、安定性の観点及びシステインを介した多量体を形成しやすいなどの観点から、好ましい。
配列番号１乃至３で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸を欠失又は置換する場合には、配列番号１乃至３で表されるペプチドとのアミノ酸レベルでの相同性は、９５％以上であることが特に好ましい。
【００１２】
また、配列番号１乃至３で表されたアミノ酸配列の整数倍繰り返し構造を有するペプチドは、さらに強い血管新生抑制作用を有することが期待される。そのようなペプチドも有効成分として本発明の血管新生抑制剤に含むことができる。
【００１３】
また、本発明にかかるペプチドは、配列表の配列番号１乃至３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドのみならず、これらの誘導体であっても同様の血管新生抑制作用を有することが期待でき、このようなペプチドも本発明に包含される。ペプチドの修飾方法としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子による修飾や直鎖状ペプチドの環状化（Saiki,I.,et al., Jpn. J. Cancer Res.,84,558,1993）等が考えられるが、特にこれらには限定されない。また、血管新生抑制作用を損なわない限り、該生理活性ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖を、例えばエステル結合、エーテル結合を利用して修飾することも可能である。さらに、該生理活性ペプチドの高次構造を模した化合物（ペプチドミメティックス）についても合成可能である。これらの修飾されたペプチド或いはペプチドミメティックスも本ペプチドの作用を損なわない限り、本発明に包含される。
【００１４】
さらに、本発明の生理活性ペプチドは、Ｌ体、Ｄ体、ＤＬ体等の光学異性体のうち、いずれのアミノ酸から構成されていても血管新生抑制作用が期待でき、このようなペプチドも本発明に包含される。また、テネシンのアミノ酸配列には種差があるが、本発明にかかるペプチドは、比較的ペプチド鎖長が短いので、種にかかわらず血管新生抑制作用を期待することができる。ただし、ペプチドを哺乳動物に投与するとき、免疫原性の観点から、同種由来のアミノ酸配列を持つペプチドの投与が好ましい。
【００１５】
本発明にかかるペプチドは、例えば、固相合成法等の化学的合成法や、配列番号１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をプラスミドベクターに挿入し、大腸菌等の微生物を形質転換する遺伝子組換え手法を用いた合成法等により合成することが可能である。化学的な合成は市販されているペプチド合成装置（ペプチドシンセサイザー）を用いて行なうのが最も一般的である。遺伝子組換え手法を用いた合成法では、本ペプチドをコードする遺伝子を、例えば、ＤＮＡ合成装置（ＤＮＡシンセサイザー）により合成し、公知のプラスミドベクターに該遺伝子を組み込み、得られた組み換えベクターを宿主となる微生物に導入し、形質転換体を作成することにより本ペプチドを生産することができる。ここで用いられるプラスミドベクターは、タンパク質生産用の発現ベクターであれば特に限定なく用いることができる。また、宿主は微生物に限定されることなく、ＣＯＳ細胞等の真核細胞を用いることができる。
【００１６】
本発明の血管新生抑制剤を患者に投与する方法としては、直接目的とする臓器、組織に投与する方法の他、経口または非経口で投与する方法も用いられる。経口投与には舌下投与も含まれる。非経口投与には注射、例えば、皮下、筋肉、静脈、動脈注射、点滴、坐剤、塗布剤、貼付剤、更にはエレクトロポレーション、イオントフォレシスなどが含まれる。
【００１７】
また、投与量は、患者の年齢、投与経路、投与回数により異なり、適宜変えることができる。この場合、本ペプチドの有効量と、適切な希釈剤または薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与されるが、その有効量は１〜１００，０００μｇ／ｋｇ体重／日であり、前記の範囲内の投与量で連続的にあるいは１日１回から数回に分けて、または数日ごとに１回投与される。
【００１８】
本発明にかかるペプチドを経口投与する場合には、通常その組成物中に含有される結合剤、包含剤、賦形剤、崩壊剤等を含んだ錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等、または内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れの状態であってもよい。また、非経口投与の場合には、安定化剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等を含有し、通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器またはチューブの状態で投与用に提供される。
【００１９】
また本発明による血管新生抑制作用は、天然由来の血管内皮細胞などの細胞に対して効果的に発揮することができる。
このような血管新生抑制作用は、血管新生を検出又は測定することができる方法で確認することができ、このような方法には、実施例の項で示されるように、傷つけアッセイ法（J. Cell Biol., (1981), 91(31), 855-859; Cell (1985) 41(3), 1029-1038; Cell (1990) 60(5), 849-959）や、鶏胚漿尿膜法（Cancer Research, (1990) 50, 4131-4138；Anticancer Research (1990) 10, 311-316；Biochem. Biophys. Res. Commun., (1990) 171, 1264-1271；J. Dev. Biol., (1996) 40, 1189-1197）、コラーゲンゲル間サンドイッチ培養法（日本生化学会編、新生化学実験講座１０、「血管（内皮と平滑筋）」、東京化学同人、１９９３年）等を挙げることができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術範囲が限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２１】
［実施例１］
本発明における配列番号３のポリペプチド（以下、ＴＮIIIという）の血管新生抑制作用を評価するために、細胞傷つけアッセイを行った。ＴＮIIIは、サワディーテクノロジー社製から購入した。傷つけアッセイは、公知の方法に従って行った（J. Cell Biol., (1981), 91(31), 855-859; Cell (1985) 41(3), 1029-1038; Cell (1990) 60(5), 849-959）。簡単に説明すれば、以下の通りである。
５％ＦＢＳ（JRH Bioscience社製）、ＥＧＭ２−ＭＶ添加因子（三光純薬社製）を含むＭＣＤＢ １０５培地（ＳＩＧＭＡ社製）に懸濁したヒト微小血管内皮細胞（HＤＭＥＣ；三光純薬社製）（１．５×１０5／１ｍｌ／ウェル）を、接着基質としてフィブロネクチン（ＦＮ）をコートした１２穴マイクロプレート（旭テクノグラス社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて３時間培養した。細胞がコンフルエントになってからプレート上を１００μｌ用ピペットチップで線状に引っ掻いて細胞を除いた（５００μｍ幅）。次いで、上清を吸引して各濃度のペプチドを含む５％ＦＢＳ、ＥＧＭ２−ＭＶ添加因子を含む培地に交換した後、６時間細胞を培養した。細胞移動能は細胞移動距離から算出し、Migration Indexとして評価した（図１参照）。結果を図２及び図３に示す。
【００２２】
なお、細胞は、１５％ＦＢＳ、ＥＧＭ２−ＭＶを含むＭＣＤＢ １０５培地（０．１５％ＮａＨＣＯ3、２ｍＭのＬ−グルタミン、６０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンホテルシンを添加）中にて、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で培養したものを用いた。接着細胞の継代には０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡのＰＢＳ（−）溶液を用いて細胞を剥離することにより行った。ＨＤＭＥＣ培養の際にはゼラチンコートディッシュ（１００μｇ／ｍｌ in PBS（−）を１０ｍｌ／ｄｉｓｈ添加し、３７℃で１時間インキュベート）を用いた。
【００２３】
図２に示されるように、ＴＮIIIを添加していない対照では、細胞を取り除いた空間に細胞が移動しているのに対して、ＴＮIIIを添加すると、細胞の移動がわずかであった。また、図３に示されるように、細胞移動は、用量に依存して強く抑制し、５０μｇ／ｍｌのＴＮIIIではＨＤＭＥＣの移動を対照の３０％に抑制した。
このＴＮIIIによる細胞移動は、β１インテグリン不活性化作用を有するＦＮIII１４（配列番号２；Biochemistry, (2000) 39, 7138-7144; J.Biochem., (1997) 121, 189-192）によって完全に阻害することができた（データ提示なし）。
【００２４】
またＦＮは、間質内の主要な機能性ＥＣＭタンパク質であり、ＦＮ基質上で行った本実施例では、血管が腫瘍に向かって間質組織内で伸長する状況を想定したものである。ＦＮのみならず、基底膜を構成するラミニンＶ、プロテオグリカン、コラーゲンＩＶなどを多く含むマトリクスゲルを希釈してコート下場合でも、ＴＮIIIは、５０μｇ／ｍｌでＨＤＭＥＣの移動を３０％抑制していた（データ提示なし）。
このことから、本発明にかかるＴＮIIIには、内皮細胞の移動増殖を抑制する作用を有することが明らかであった。また、本発明にかかるＴＮIIIが、間質内の細胞移動のみならず、血管新生初期の基底膜上の移動においても同様に移動を阻害することが示唆された。
【００２５】
［実施例２］
次に、ＴＮIIIの血管内皮細胞に対する増殖抑制と細胞周期との関係について調べた。
各濃度のペプチドを含む５％ＦＢＳ、ＥＧＭ２−ＭＶ添加因子セットを含むＭＣＤＢ １０５培地に懸濁した各細胞（３×１０5／２ｍｌ／ウェル）を、接着基質としてＦＮ（０．１μｇ／ｍｌ）をコートした６穴マイクロプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて２日間培養した後、細胞を剥離して、ＢｒｄＵ、次いで７−ＡＡＤで処理（CycleTEST PLUS DNA Reagent kit又はBrdU Flow Kit；いずれもBecton Dickinson社製）し、ＦＡＣＳｃａｎにて蛍光強度を測定した。なお、細胞の剥離は、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌ  ＦＮIII１４（サワディーテクノロジー社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて５分間培養した後に行った。
結果を図４及び表１に示す。なお、Ｒ１はｓｕｂ−Ｇ１期、Ｒ２はＧ０／Ｇ１期、Ｒ３はＳ期、Ｒ４はＧ２／Ｍ期の細胞群を示す。
【００２６】
【表１】
2006052161.tif 000003
【００２７】
図４及び表１に示されるように、ＴＮIII（１０μｇ／ｍｌ）存在下ではＧｏ／Ｇ１期にある細胞群の比率が対照に比べて増加し（６９．１３％→７８．３％）、それに伴ってＳ期及びＧ２／Ｍ期にある細胞の比率が減少（２６．９５％→１５．３３％）していることが明らかとなった。また、ＴＮIIIによるＧｏ／Ｇ１期での細胞周期停止は高濃度ＴＮIII（４０μｇ／ｍｌ）存在下では更に顕著に観察されたが、同時にｓｕｂ−Ｇｏ期の細胞、すなわちアポトーシスの部分的な出現も認められた。ＴＮIIIによる細胞周期停止に対してもＦＮIII１４は用量に依存してブロックすることが示された（データ提示なし）。
このことから、ＴＮIIIはＨＤＭＥＣをＧｏ／Ｇ１増殖休止期に移行させることが明らかとなった。
【００２８】
［実施例３］
次にＴＮIIIの生体内における血管新生抑制効果を、鶏胚漿尿膜法によって確認した。
鶏胚漿尿膜法は、Ribatti等の方法（Ribatti, D., Vacc, A., Roncali, L. and Dammacco, F., J. Dev. Biol.,(1996) 40, 1189-1197）に若干の修正を加えて実施した。即ち、有精卵を３８〜３９℃の孵卵器でインキュベートし、４日後に卵に細孔を開けて卵白を約３ｍｌ吸引除去した後、再び孵卵器でインキュベートした。漿尿膜が２ｍｍ程度まで成長した卵を選別して室温に置き、漿尿膜上に滅菌シリコンリングを載せて、１０％メチルセルロール溶液（生理食塩水）に溶かした試験試料（５、１０、１５、２０μｇ／ｅｇｇのＴＮIII）をシリコンリング内に注入した。１濃度につき６個の卵を使用した。
腑卵器内で更に２日間インキュベートした後、卵殻を破壊して漿尿膜内にイントラリボスを３ｍｌ注入して、新生血管を観察した。
被検試料の血管新生阻害能（Angionenesis Index）は、次のように判定した。血管新生度を、顕著な血管新生が認められるもの＋＋＋（３点）、＋＋（２点）、＋（１点）、新生血管が認められないもの−（０点）の４段階に分けて数値化し、総合点を卵数で割った平均値を算出して、対照に対する百分率で表記した。結果を図５に示す。
図５に示されるように、ＴＮIIIは生体内においても用量依存的に血管の新生を阻害した。
【００２９】
従って、本発明にかかるペプチドを用いることによって、血管新生を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例にかかる傷つけアッセイを説明する概念図である。
【図２】本実施例にかかる傷つけアッセイの結果を示す写真である。
【図３】本実施例にかかる傷つけアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】本実施例にかかる細胞の細胞周期を示すＦＡＣＳ解析図である。
【図５】本実施例にかかる各被検試料の血管新生阻害能を示すグラフである。
【図１】
2006052161.tif 000004
【図３】
2006052161.tif 000005
【図４】
2006052161.tif 000006
【図５】
2006052161.tif 000007
【図２】
2006052161.tif 000008
【配列表】
2006052161000001.app