(57)【要約】【課題】ササ及び／又はタケの葉を原料にして優れた抗酸化活性を有する新規なフラボノイド化合物及びその製造方法、それを含む抗酸化剤を提供する。【解決手段】ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、クロロフィルを除去後、ジエチルエーテル等で液・液分配を行わせ、水層の液を取り出し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、上記ジエチルエーテル等による液・液分配後の水層又は上記酢酸エチル層から下記化学式で表される新規化合物のルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを得る。低級脂肪族アルコール抽出液又は分画液を加水分解することで収率を上げることができる。【化１】
2006265249.tif 000010
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ  Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（１）で表されるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドであることを特徴とする新規フラボノイド化合物。
【化１】
2006265249.tif 000009
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ  Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）
【請求項２】
ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過するか又は石油エーテルで液・液分配することによりクロロフィルを除去し、除去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを添加し液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、水層及び酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することを特徴とする新規フラボノイド化合物の製造方法。
【請求項３】
ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することを特徴とする新規フラボノイド化合物の製造方法。
【請求項４】
ササ抽出液又は分画後ピークの液を、さらに加水分解した後、加水分解後の液からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することを特徴とする請求項２又は請求項３記載の新規フラボノイド化合物の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の新規フラボノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗酸化活性を有する新規なフラボノイド化合物及びその製造方法、並びに、それを有効成分とする抗酸化剤に関するものである。さらに詳しくは、抗酸化活性を有する新規なフラボノイド化合物である特定のルテオリン配糖体、並びに、ササ及び／又はタケの葉を原料として該ルテオリン配糖体を低コストで製造する方法、そして、該ルテオリン配糖体を有効成分とする抗酸化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ある種のフラボノイド化合物が抗酸化活性を有することはよく知られている。例えば、特開平６−６５２７８号公報（特許文献１）、特開平６−１００５８４号公報（特許文献２）等には、ユーカリ属の樹木から採取したある種のフラボノイド配糖体が開示され、これらはすぐれた抗酸化作用を有し、飲食品、化粧品及び医薬品として有用であると記載されている。また、特開平６−２４８２６７号公報（特許文献３）には、タマネギ等の成分であるケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）及びケムフェロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、お茶等の成分であるカテチン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ），タキシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）等が抗酸化性を有するフラボノイド類として報告されている。
【特許文献１】      特開平６−６５２７８号公報
【特許文献２】      特開平６−１００５８４号公報
【特許文献３】      特開平６−２４８２６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  しかしながら、これらのフラボノイド化合物は、原料の入手が難しかったり、製造が煩雑であるばかりでなく、溶媒への溶解性等と関連し抗酸化活性も十分とは言えない。
そこで、本発明の目的は、卓越した抗酸化活性を有する新規フラボノイド化合物及びそれを工業的に製造する方法、並び該新規フラボノイド化合物を有効成分とする抗酸化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  一般に植物にはフラボノイド類が含まれており、抗酸化能が期待される。本発明者らは、前記の植物としてタケ類及びササ類に注目した。タケ・ササの仲間は、マダケ属、ナリヒラダケ属、トウチク属、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属、ヤダケ属、メダケ属、カンチク属、ホウライチク属の１０属から成っている。なかでもササ類は温帯や亜寒帯に広く分布する植物で、ササ属は日本を分布の中心とし、全国に種類、量ともに広く分布する。しかし、タケ・ササの仲間、特にササ属植物由来のフラボノイドに関する知見は少ない。本発明者らは、これらの葉に含まれているフラボノイド成分に着目し、抗酸化活性を有する新規な化合物を抽出精製することに成功し、本発明を完成したものである。【０００５】  すなわち、本発明によれば、新規なフラボノイド化合物として、下記の化学式（１）で表されるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドからなるルテオリン配糖体が提供される。
【化１】
2006265249.tif 000002
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ  Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）【０００６】  また、本発明によれば、ササ葉及び／又はタケ葉の低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数３以下のアルコールをいう、以下同じ）で抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層にさらに酢酸エチルを添加し液・液分配を行い、これらの操作を複数回繰り返し、水層及び酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することを特徴とする新規フラボノイド化合物の製造方法が提供される。
また、本発明によれば、別の方法として、ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することを特徴とする新規フラボノイド化合物の製造方法が提供される。
この際、ササ葉又はタケの葉の抽出液又は抽出液分画後ピークの液を、さらに加水分解した後、精製することにより、該加水分解後液から高い収率でルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取することができる。【０００７】  さらに、本発明によれば、ササ葉及び／又はタケの葉由来の新規なフラボノイド化合物であるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを有効成分として含む抗酸化性剤が提供される。【０００８】  本発明の新規フラボノイド化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド）は、下記の化学式（１）で表される構造を有するルテオリン配糖体であって、後述する実施例に示す測定データ等から明らかなごとく、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化物抑制活性に優れている。しかも、驚くべきことに、この新規化合物（ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド）は、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性が非常に大きい。【０００９】
【化２】
2006265249.tif 000003
（ただし、上記式中、Ｈｅｑはｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｈを示し、Ｈａｘはａｘｉａｌ  Ｈを示す。糖の同じ炭素に付いたプロトンのどちらかを明記するために用いた記号）【００１０】  上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３’’−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５’’−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４’’−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５’’−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２’’−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１’’−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。【００１１】  以下、本発明のルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの製造方法及び単離精製方法、並びに、物質の同定方法に関し、順次詳述する。【００１２】（原料）
原料となるササは、クマイザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ、ミヤコザサ、ヤクシマダケ、スズタケ等その種類は問わない。また、タケも、モウソウチク、インヨウチク、マダケ、オオバヤダケ、メダケ、ホウライチク等が使用可能である。これらのササあるいはタケの葉の部分を、水洗した後、必要に応じて適当な大きさに細断し乾燥（水分除去）して使用する。ササ又はタケの葉は、粉末にしてもよく、枯れさせてもよい。【００１３】  この原料を用いて、図１に例示するようなフローで抽出及び液・液分配を行う。
各工程の具体例は、以下のとおりである。【００１４】（第１工程：アルコール抽出・蒸発乾固・粗抽出液の調製）
ササ葉１ｇに対して１０倍容の低級脂肪族アルコールで抽出する。抽出は暗所で２４時間放置し、２４時間後濾過する。この操作を４回繰り返し、得られた濾液をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、試料重量の２倍容の純水に溶解する。このようにして得られた溶液を粗抽出液とする。【００１５】（第２工程：石油エーテルによる液・液分配）
上記の粗抽出液に対して同量の石油エーテルを加え、分液ロートにて水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層と水層とを得る。石油エーテル層にはクロロフィルが含まれるので廃棄する。【００１６】（第３工程：ジエチルエーテルによる液・液分配）
次に、得られた水層に該水層と同量のジエチルエーテルを添加し、分液ロートにて水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層、水層を得た。ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで乾固する。【００１７】（第４工程：酢酸エチルによる液・液分配）
第３工程で得られた水層に、該水層と同量の酢酸エチルを加え、分液ロートにて，水・酢酸エチル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層、水層を得る。各層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、メタノールに置換する。【００１８】（組成物に含まれる有効成分）
上述のようにして得たジエチルエーテル層には、主にトリシンが含まれ、酢酸エチル層には、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシンが主に含まれる。一方、水層には、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドが主に含まれる。従って、酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを得ることができる。【００１９】  本発明者らの研究によれば、ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加して液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを採取する方法でも、ササ葉等を原料として目的化合物を製造し得ることが判った。
また、後述の実施例２、３で詳述するように、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド収量を上げる方法として、（１）ササ又はタケの葉の抽出液をさらに加水分解する方法、及び、（２）抽出液分画後ピークの液を加水分解する方法、の２つがあることが見出された。これらの加水分解は、酸を用いるほか、アミラーゼ等の糖鎖切断酵素によっても可能である。【００２０】（新規化合物の単離・精製及び同定）
酢酸エチル層に抗酸化成分として含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、それ自体、従来未知の新規化合物である。以下、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの単離・精製及び同定について詳細に説明する。【００２１】＜ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの単離・精製＞
メタノールに置換した上記の酢酸エチル層又は水層２ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライする。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画する。それぞれのフラクションについて波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮しフォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行う。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃【００２２】＜ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）の同定＞
本発明の新規化合物は、吸収スペクトル分析、質量分析及びＮＭＲ分析等により同定することが出来る。以下、本発明者らが実施した同定法について詳述する。
（ａ）吸収スペクトル法
精製物をメタノールに溶解し、４５０〜２３０ｎｍにおけるＵＶ・ＶＩＳ吸収スペクトルを測定する。すなわち、試料のメタノール溶液を測定した後、ナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）、１２％塩酸（１２％ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）の各種試薬を添加し吸収スペクトルを測定する。
その結果は、下記の表１に示すとおりである。なお、表１には、ルテオリン６−Ｃアラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のほか、参照例として、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）及びトリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）のデータも併記している。【００２３】
【表１】
2006265249.tif 000004
【００２４】測定結果からのルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの同定：
ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆される。また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより、４′位に遊離水酸基の存在することがわかる。
ＡｌＣｌ３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。ＡｌＣｌ３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基が存在する。そして、ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。ＮａＯＡｃ＋Ｈ３ＢＯ３添加によりＢｄ．Ｉから１２〜３６ｎｍの深色移動することより、３′，４′位に遊離水酸基が存在することがわかる。
なお、Ｂｄ．Ｉとは、波長３３０〜４２０ｎｍ付近の極大吸収を示し、Ｂｄ．ＩＩとは２３０〜２９０ｎｍ付近の極大吸収を示す。また、深色移動は長波長側、浅色移動は短波長側にシフトすることを示す。
以上の事実より、３′，４′，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、また、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。【００２５】（ｂ）質量分析
精製した試料について、パーセプティブ社製質量分析計Ｍａｒｉｎｅｒを用い、分子量を正イオンモード（ＰＯＳ）で測定する。条件は下記の表２に示すとおりである。（なお、表２にも、参照のため、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシンのデータを併記している。）
［質量分析条件］
内部標準：４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｐｈｅｎｏｌ（ｍ／ｚ１５２．０７），ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ（ｍ／ｚ６０９．２８）
インターフェイス：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）
温度：室温（２５℃）【００２６】
【表２】
2006265249.tif 000005
【００２７】  吸収スペクトルで糖の結合が示唆されるが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はペントース１つであることがわかる。また、イオン化の際に断片化を生じていないことから、糖との結合はＣ結合であることがわかる。【００２８】（ｃ）１Ｈ−ＮＭＲ分析
それぞれ、十分に乾燥したサンプルを２〜１０ｍｇ計量採取し、ＮＭＲ測定管に移して重メタノールもしくは重ジメチルスルホキシド０．７ｍｌに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲをＪｅｏｌＪＮＭ−Ａ４００（４００ＭＨｚ）にて測定する。（内部標準：ＣＤ３ＯＤ，３．３０，ＤＭＳＯ−ｄ６，２．４９）【００２９】１Ｈ−ＮＭＲ分析の詳細は、以下のとおりであり、１Ｈ−ＮＭＲ分析によっても、この化合物がルテオリン６−Ｃ−アラビノシドであることが判る。
δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，１Ｈ，３’’−Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５’’−Ｈｅｑ），３．９５（ｍ，１Ｈ，４’’−Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，５’’−Ｈａｘ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２’’−Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，１’’−Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．【００３０】１Ｈ−ＮＭＲ分析では、測定溶媒として重メタノールを用いる。芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ観測されるが、そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．５０（ｓ），６．５５（ｓ）は一重線であるが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると比較的よい一致を示すので、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されないので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され、上記吸収スペクトルの結果によく一致する。
次に、δ＝３．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．９５（ｍ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，１２．０Ｈｚ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ），４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１’’位）のプロトン４．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）の結合定数から、アノマー位の隣接プロトンとはアキシアル−アキシアルの関係にある。すなわち、糖部分はβ結合にてアグリコンに結合していると決定される。また、その化学シフトがＯ−グリコシドよりも高磁場シフトしていることから、糖部分はＣ−グリコシル化しているものと考えられ質量分析の結果に整合する。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はアラビノースのものとよい対応を示すことから糖部分はアラビノースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果をあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−アラビノシドであると決定される。
【発明の効果】
【００３１】  本発明によるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、抗酸化活性に優れた物質であり、従来のササエキス等に比べて、抗酸化活性に優れ、かつ耐熱性、耐光性も良好な組成物が得られる、という利点を有する。
さらに具体的に説明すると、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド又はそれを含む組成物は、ＤＰＰＨラジカル消去活性、スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）、脂質過酸化抑制効果等に優れており、しかも、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果が極めて大きいという利点を有する。
従って、本発明によるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを有効成分とする抗酸化性の組成物は、医薬品、化粧品、食品等の分野で有用である。
また、一般に、ルテオリン配糖体には、抗酸化の他に、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等が報告されており、上記のルテオリン６−Ｃ−アラビノシドにも、本発明者らが確認した抗酸化活性のほかに、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等を有することも期待される。【００３２】  さらに、本発明の製造方法によれば、日本各地に生育するササ又はタケの葉を原料とするため、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを低コストで製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】  以下に、本発明方法の実施例及び比較例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。なお、例中の％は特に断らない限り重量％を意味する。なお、例中に示す抗酸化活性の測定は次のように実施した。【００３４】１．ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。
なお、ラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ  Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０【００３５】２．スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の反応よるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。
原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ  Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ  Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。下記条件のＥＳＲに供した。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−サンプル値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ  Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０【００３６】３．脂質過酸化抑制効果
４％−リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法に従って測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。
【実施例１】
【００３７】（１）組成物の調製
原料のササ葉として、北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ  ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉（採取地：網走市）を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。
まず、水洗・ササ葉１ｇに対して５倍容のメタノールを加え浸漬・抽出した。抽出は暗所で２４時間放置した後、濾過した。次いで、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ササ葉重量の２倍容の純水に溶解した。得られた水溶液を粗抽出液とした。
上記の粗抽出液に対して、等量の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
得られた各層を採取し、ササ葉重量に対して等倍の液量になるようにロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、これをメタノールに置換して抗酸化性組成物を得た。水層については、ＸＡＤカラムにより遊離の糖を取り除いて抗酸化性組成物を得た。【００３８】（２）ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの単離・精製
メタノールに置換した酢酸エチル層２ｍｌを、セファデックスＬＨ−２０をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライする。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画した。それぞれのフラクションについて波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮しフォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行った。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃【００３９】（３）ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの特性
下記の表３に、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの抗酸化活性を、他のルテオリン配糖体であるルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシンの酸化活性と対比して示す。この表から明らかなように、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、ＤＰＰＨ消去率及びＳＯＤ消去率において特にすぐれている。【００４０】
【表３】
2006265249.tif 000006
【００４１】＜油脂過酸化抑制率の測定＞
（１）試料油脂の調整
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、サンプル１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。サンプルはササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールをサンプルの代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
（２）ＰＯＶ検定
ＰＯＶ検定は、日本油脂学会による酸化油脂中の過酸化物価の測定法に従い、過酸化脂質（ヒドロペルオキシド）が酸性条件下で還元される反応に基づき、遊離されるヨウ素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法で行った。
重クロム酸カリウムを純水に溶解し、０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液を調製し、このとき、重クロム酸カリウム溶液のファクター（ｆ＝採取量／理論値）を求めておいた。ヨウ化カリウム１ｇを純水５ｍｌに溶解させ、そこに０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液２０ｍｌ、塩酸５ｍｌを加え、撹拌後栓をして５分間暗所に放置した。５分後、純水３００ｍｌを加え、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。褐色が消えかかったら、１％澱粉指示薬を加え、青色が完全に消失するまで滴定した。滴定値がＶｍｌのとき、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液のファクターは、Ｆ＝２０×ｆ／Ｖで求め、滴定を行った。
上述のように調製した試料油脂１ｇを採取し、クロロホルム氷酢酸混液（３：２）２５ｍｌ、飽和ヨウ化カリウム溶液１ｍｌ加え、すぐに撹拌し、１分間暗所に放置した。反応を止めるために純水７５ｍｌを加えた。２層に分かれる上層の赤紫色の消失を終点とし、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。空試験には純水１ｇを用いて行った。【００４２】
【数１】
2006265249.tif 000007
【実施例２】
【００４３】  次に、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドについて、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果を調べるため、一般に知られているＰＰＯ活性阻害剤、他のフラボノイド類との比較測定を行った。その測定方法は以下のとおりであり、測定結果は下掲の表４に示すとおりである。【００４４】＜ＰＰＯ（褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ）阻害活性の測定＞
０．０５Ｍクロロゲン酸を基質とし酵素液としてタマネギ鱗茎より抽出・部分精製を行った酵素液を用いた。すなわち、１．３ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭ濃度、２ｍＭ濃度、１０ｍＭ濃度に調製した阻害剤を０．１ｍｌ、酵素液を０．１ｍｌ添加し混合、３０℃に１０分間予備加温後、０．０５Ｍクロロゲン酸基質溶液を０．１ｍｌ加え混合し３０℃、３０分間加温後の波長４２０ｎｍにおける褐変度を求めた。阻害剤添加の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものをコントロールとし、活性を１００％として阻害効果を相対活性で示した。【００４５】  この結果、本発明に係るルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、一般のＰＰＯ活性阻害剤や他のフラボノイド類と比べて卓越したＰＰＯ阻害活性を有し、少量の使用でも褐変を防止できることがわかった。
従って、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドは、例えば、食品類の褐変防止剤としても有効に利用することができる。【００４６】
【表４】
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【実施例３】
【００４７】  本実施例では、クマイザサのササ葉抽出液を加水分解した場合について説明する。試料葉にはトリシンアグリコンを含まないもの（採取地：北海道津別町相生）を使用した。
すなわち、クマイザサ抽出液の酸加水分解とは、クマイザサ抽出液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加えた（抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにした）。混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。
各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸を洗い流し、メタノールに溶媒置換後，ＬＨ−２０カラムに供し、精製後ＨＰＬＣで定量分析した。【００４８】  まず、図２にササ葉抽出液の非加水分解物のＬＨ−２０溶出パターンを示す。そして、ササ葉抽出液を０．２Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間、加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図３に、０．７Ｎ塩酸中、１００℃、３０分間加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図４に示す。
図２のＢＩＩはルテオリン６−Ｃグルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の溶出ピーク、ＢＩＩＩはルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のピークであり、トリシンアグリコンは図２では見られない（図３の２ＨＩＩＩのピークである）。それぞれの処理によって得られるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの結果を、それぞれ図５に示す。なお、ＨＰＬＣやＸＡＤカラム、ＬＨ−２０カラムの条件は既に述べた条件と同じである。【００４９】  図２、図３及び図４より、上記図２のＢＩピークが減少し、図３の２ＨＩＩＩピーク及び図４の７ＨＩＩＩピークが新たに検出されることが確認できる。図２におけるＢＩＩＩピーク、図３の２ＨＩＩピーク及び図４の７ＨＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。これらのピークは、以前に同定したルテオリン６−Ｃ−アラビノシドである。【００５０】  また、図５より酸加水分解処理を行うことで、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量が約３．３倍多くなったことがわかる。従って、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの収量を大幅に上げることが出来る。
【実施例４】
【００５１】  本実施例では、クマイザサのササ葉抽出液をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム）で分画し、分画液を加水分解した場合について説明する。
クマイザサのササ葉のメタノール抽出液をＬＨ−２０カラムで分画し、配糖体を含むフラクションを加水分解し、各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ加水分解物から酸を洗い流しメタノールに溶媒置換し、ＨＰＬＣ分析した。すなわち、クマイザサ抽出液のＬＨ−２０カラム分画液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加えて（分画液と塩酸の比率は１：１になるようにする）、混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。【００５２】  図６には、上記図２の無処理ササ葉抽出液のＬＨ−２０カラム分画分で、配糖体が含まれていると考えられるフラクション（ＢＩ）を加水分解して得られるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの定量結果を示す。この図から明らかなように、クマイザサ抽出液を分画した後でも、酸加水分解処理を行うことにより、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを高い収率で得られることが確認された。【００５３】  以上より、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの収量を上げる方法として、（１）クマイザサ抽出液の酸加水分解による方法、及び（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、の２つの方法があることが確認された。
【実施例５】
【００５４】  本実施例では、クマイザサの葉（採取地：北海道津別町相生）約２００ｇを切り刻み、メタノールに一晩浸し、これを２回繰り返した後、粗抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮し、水に置換した。これに等量の石油エーテルを加えて液・液分配し、残存するクロロフィルを石油エーテル層に移行させ除去した。残った水層に等量のジエチルエーテルを加え、液・液分配し、得られた水層をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム）に供することにより、図７に示すルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの画分を得た。この画分のルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの純度は約９０％を示し、不純物としてルテオリン７−Ｏ−グルコシドを含んでいた。この画分を先に述べた分取ＨＰＬＣを１回実施することで、純度９９％以上のルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】  本発明方法の工程概略図
【図２】  クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、ＢＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．６６〜９４、ＢＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９５〜１１５、ＢＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１６〜１４３に分画）
【図３】  クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、２ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９１〜１１２．２ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１３〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１９９〜２２０に分画）
【図４】  クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．７Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、７ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．８８〜１０８．７ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１０９〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１８９〜２１２に分画）
【図５】  ルテオリン６−Ｃ−アラビノシドの含量を示すグラフであって、サンプルには図２のＢＩＩＩピーク、図３の２ＨＩＩピーク及び図４の７ＨＩＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−アラビノシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩＩピークを「未処理」、２ＨＩＩピークを「０．２Ｎ塩酸処理」、７ＨＩＩピークを「０．７Ｎ塩酸処理」としてそれぞれＸ軸表記）
【図６】  分画したＢＩピークの酸加水分解（水解）によるルテオリン６−Ｃ−アラビノシド含量の変化を示すグラフであって、図２のＢＩピークを最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱処理を行った場合のデータ（酸加水分解処理前のものを「水解前」、酸加水分解処理したものを「水解後」とＸ軸に表記）
【図７】  ジエチルエーテルによる液・液分配で得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２Ｉ．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ）（試料採取地：北海道津別町相生）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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