(57)【要約】要約書【課題】赤潮原因藻類に殺藻活性を有する大型DNAウイルスは光や水温によって容易に失活し、感染対象となる藻類への殺藻能力が低下する。従って、遮光および低温条件下で保存することで活性をある程度維持することが可能となるが、更に保存性を向上させるために抗生物質ならびに保護剤としてグリセリンを添加する方法を提供する。【解決手段】有害赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオの殺藻ウイルスであるHaVならびにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの殺藻ウイルスHcV懸濁液に硫酸ストレプトマイシン（５０から５０００ｐｐｍ）ならびにクロラムフェニコール（５−５００ｐｐｍ）およびグリセリン（１−２０％）を添加して該ウイルスの保存安定性を向上させる方法  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的赤潮防除剤として有用な赤潮殺藻ウイルスに抗生物質および保護剤を添加して保存安定性を向上させる方法
【請求項２】
有用な赤潮殺藻ウイルスがヘテロシグマ・アカシオの殺藻ウイルスであるはＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）およびヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの殺藻ウイルスであるＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)である請求項１に記載の方法
【請求項３】
添加する抗生物質が硫酸ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコールである請求項１に記載の方法
【請求項４】
添加する硫酸ストレプトマイシンの濃度が５０〜５０００ｐｐｍおよびクロラムフェニコールの濃度が５〜５００ｐｐｍである請求項３に記載の方法
【請求項５】
添加する硫酸ストレプトマイシンの濃度が１００〜１０００ｐｐｍおよびクロラムフェニコールの濃度が１０から１００ｐｐｍである請求項３に記載の方法
【請求項６】
添加する保護剤がグリセリンである請求項１に記載の方法
【請求項７】
添加するグリセリンの量が１〜２０％である請求項６に記載の方法
【請求項８】
添加するグリセリンの量が５〜１０％である請求項６に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオに対して強い殺藻活性を有するウイルスＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）ならびにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマに対して殺藻活性を有するウイルスＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)を生物学的赤潮防除剤として実用的に利用するために製剤化して保存する場合に活性を維持した状態で長期間保存するための方法において、抗生物質ならびに保護剤を添加して保存安定性を向上させる方法。
【背景技術】
【０００２】
有用赤潮殺藻ウイルスＨａＶ、ＨｃＶは直径約２００ｎｍの正二十面体の二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらの赤潮殺藻ウイルスは、養殖魚類に対する漁業被害の原因となる赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオあるいは二枚貝に甚大な漁業被害を及ぼすヘテロカプサ・サーキュラリスカーマが発生した天然の海域から分離された強い殺藻活性を有する天然海域に常在する赤潮殺藻ウイルスであり、有用な赤潮制御因子としての実用化に期待がもたれている（特許文献１、特許文献２）。
【０００３】
しかしながら、これらの大型DNAウイルスは、宿主細胞の非存在下において温度あるいは光がある条件下では、殺藻活性を容易に失活しやすい（非特許文献１）。そのため、これらの赤潮殺藻ウイルスを長期間保存するためには１０−２０％のジメチルスルホキシドなどの凍結保護剤を利用し液体窒素中で半永久的に保存する方法が開発されているものの（非特許文献２）、これらの赤潮殺藻ウイルスを商業的に利用するためには、液体窒素による保存では、使用者すなわち養殖漁業者への提供、保管には不向きである。
【０００４】
従って、これらの有用赤潮殺藻ウイルスを赤潮防除剤として供給するためには、養殖漁業者などの赤潮防除を必要とする使用者が赤潮防除（制御）製剤として、利用、普及しやすいような簡便かつ安価な長期保存技術が必要となる。
【０００５】
これらの有用赤潮殺藻ウイルスＨａＶ、ＨｃＶは、その殺藻活性喪失の主要な要因となる光、温度の影響に対し、遮光性の容器に封入し、凍結しない程度の低温すなわち冷蔵条件で保存することである程度、殺藻活性を維持することは可能である。
【０００６】
しかしながら、冷蔵条件での保存では、細菌や糸状菌など、他の雑菌が混在していると、環境の悪化あるいは赤潮殺藻ウイルスが混入雑菌によって産生される酵素などで分解され、殺藻活性の低下につながる可能性があり、これらの雑菌混入を抑止する方法が必要である。これまで慣例的に試験研究用の材料として赤潮殺藻ウイルスを保存する場合、アジ化ナトリウムを０．１％程度添加する方法がとられることがあったが、雑菌抑制効果はあるものの、殺藻活性の低下などの赤潮殺藻ウイルスに対する影響もあり、更に、人畜毒性が高いため安全性の面からも利用は難しいものと思われる。
【０００７】
一方、これらの有用赤潮殺藻ウイルスが、光などの影響によって殺藻活性を失う原因は現在のところ解明されていないが、赤潮殺藻ウイルスが宿主細胞に感染し、ゲノムを注入、宿主細胞内で増殖するという一連の感染機構から考えて、赤潮殺藻ウイルス粒子表層に宿主細胞に対して特異的な感染構造を有しているものと考えられる。失活の一要因としてこれらの赤潮殺藻ウイルス表層構造が光、温度などの要因によって、破壊されている可能性が考えられる。
【０００８】
従って、このような赤潮殺藻ウイルスの感染に関わる表層構造を外部要因から保護する効果がある有効な添加剤を見出すことで、更なる保存期間の延長が可能になると考えられる。
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−９８９７９
【特許文献２】特開２００１−２３１５５０
【非特許文献１】外丸裕司ら  ２００３（平成１５年）日本水産学会大会  講演要旨集
【非特許文献２】NAGASAKI  et al．，Cryopreservation of Virus(HaV) Infectinga  Halmful  Bloom  Causing  Microalga,  Heterosigma  akashiwo (Raphidophyceae). Vol.65 No.2319-320
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＨａＶ、ＨｃＶなどの有用赤潮殺藻ウイルスを赤潮防除剤として実用的に利用するために、これらの赤潮殺藻ウイルスを長期間安定的に保存する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、これらの赤潮殺藻ウイルスを遮光、低温条件で保存することに加えて、雑菌などによる腐敗を抑制し、更に、赤潮殺藻ウイルス粒子表層構造を保護する方法について鋭意検討を行った。その結果、赤潮殺藻ウイルスの殺藻活性に影響が無い濃度の複数の抗生物質を添加し、更に表層構造を保護するためにグリセリンを添加することが有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］  生物学的赤潮防除剤として有用な赤潮殺藻ウイルスに抗生物質および保護剤を添加して保存安定性を向上させる方法
［２］  有用な赤潮殺藻ウイルスがヘテロシグマ・アカシオの殺藻ウイルスであるＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）およびヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの殺藻ウイルスであるＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)である前記１に記載の方法
［３］  添加する抗生物質が硫酸ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコールである前記１に記載の方法
［４］  添加する硫酸ストレプトマイシンの濃度が５０〜５０００ｐｐｍおよびクロラムフェニコールの濃度が５〜５００ｐｐｍである前記３に記載の方法
［５］  好ましくは、添加する硫酸ストレプトマイシンの濃度が１００〜１０００ｐｐｍおよびクロラムフェニコールの濃度が１０から１００ｐｐｍである前記３に記載の方法
［６］  添加する保護剤がグリセリンである前記１に記載の方法
［７］  添加するグリセリンの量が１〜２０％である前記６に記載の方法
［８］  好ましくは添加するグリセリンの量が５〜１０％である前記６に記載の方法
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、本来容易にその有用な殺藻活性を失活しやすい赤潮殺藻ウイルスＨａＶ、ＨｃＶについて長期間安定的にその活性を維持することができるようになるため、これらの赤潮殺藻ウイルスを生物的赤潮防除剤として商業的に利用するための汎用性の向上に繋がる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明を実施するための好ましい例として、各工程を詳細に説明する。
ＨａＶ、ＨｃＶは、それぞれの宿主となる赤潮原因藻を一般的な藻類用海水培地(ＳＷＭ３培地、ＥＳＭ培地、Ｆ／２培地、ＡＳＰ系培地等)を用いて培養し、その対数増殖初期にそれぞれに感染する赤潮殺藻ウイルスを接種し、宿主がウイルス感染により溶藻した培養液を有用赤潮殺藻ウイルス懸濁液として作成する。得られた赤潮殺藻ウイルス懸濁液は、中空糸膜ろ過などの方法により、不要な培養液を除去することによって濃縮し、高密度の赤潮殺藻ウイルス懸濁液を調整する。これらの過程で雑菌類が赤潮殺藻ウイルス懸濁液中に混入しないよう、培養は宿主細胞と赤潮殺藻ウイルスだけの二者培養とし、更にろ過工程なども無菌条件下で実施するのが望ましい。このようにして得られた雑菌混入がない高密度赤潮殺藻ウイルス懸濁液に、二次的な混入雑菌の増殖抑止剤として、抗生物質硫酸ストレプトマイシンを５０（これ以下の濃度では全く雑菌抑制効果が期待できない）から５０００ｐｐｍ（これ以上の濃度では、赤潮殺藻ウイルスの殺藻活性に悪影響を及ぼす）好ましくは最も雑菌生育抑止の安定した効果が見られ、赤潮殺藻ウイルスに対する悪影響がない１００から１０００ｐｐｍ、クロラムフェニコールを５から５００ｐｐｍ（雑菌抑制効果が期待でき、赤潮殺藻ウイルスに悪影響を及ぼさない範囲）好ましくは最も安定した雑菌の生育抑制効果が得られ、赤潮殺藻ウイルスに対する悪影響もない１０から１００ｐｐｍ濃度となるように添加、溶解し、更に保護剤として、更に赤潮殺藻ウイルス粒子表層構造の保護の目的で、グリセリンを無添加の場合よりは保護効果が期待できるグリセリンを１から２０％、好ましくは保護効果による保存安定性向上に効果が認められる５から１０％添加して十分に混合した後、遮光性素材の容器に封入し、凍結しない冷蔵条件下で保存する。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
［実施例1］
１）硫酸ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコールの有効性
ＨｃＶの保存中の雑菌汚染を抑制するために有効な成分を明確にするために、幾つかの薬剤についてその効果とＨｃＶの殺藻活性に対する影響性を調査した。
ＨｃＶの感染宿主となるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは、２ｎＭのＮａ2ＳｅＯ3含有改変ＳＷＭ３培地（Ｃｈｅｎら，１９６９，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ  ５：２１１−２２０；Ｉｔｏｈ＆Ｉｍａｉ，１９８７，Ｓｈｕｗａ，Ｔｏｋｙｏ，ｐ．１２２−１３０）１０Ｌに初期密度６０００細胞／ｍｌとなるように接種し、１６時間明、８時間暗の明暗周期条件、温度２５±２℃、光強度１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2ｓ-1（蛍光灯による照明）の条件で３日間培養し、対数増殖初期の宿主細胞が１０5細胞／ｍｌ以上となっていることを確認した培養液を準備した。得られたヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養液を充填したウイルス生産槽にＦａｌｃｏｎ社製７５０ｍｌ容量通気孔付組織培養用角型フラスコを用いて培養したＨｃＶ懸濁液を１０００ｍｌ接種した。その後、4日間２３±２℃で静置培養して得られたＨｃＶ溶液を中空糸膜（旭化成ｍｉｃｒｏｚａ（登録商標）ＭＦモジュールＰＳＰ−１１３）でろ過することにより濃縮回収し、ＨｃＶ高密度濃縮懸濁液（９．７１×１０2感染単位／ｍｌ）を得た。このＨｃＶ高密度濃縮懸濁液には、抗生物質による雑菌抑制効果を判別しやすいように、予め本溶液中で増殖可能な雑菌混入が確認されている溶液を添加した。調整した約５０ｍｌのＨｃＶ懸濁液を遮光アルミラミネートバッグに入れ、一晩冷蔵保管したのち、（ア）硫酸ストレプトマイシン１００ｐｐｍ、（イ）クロラムフェニコール１０ｐｐｍ、（ウ）硫酸ストレプトマイシン１０００ｐｐｍ＋クロラムフェニコール１００ｐｐｍ、（エ）硫酸ストレプトマイシン１００ｐｐｍ＋クロラムフェニコール１０ｐｐｍ、（オ）アジ化ナトリウム１０００ｐｐｍ、（カ）アジ化ナトリウム１００ｐｐｍ、（キ）ペニシリンＧカリウム１０００ｐｐｍ、（ク）非添加原液（薬剤等一切投入していないＨｃＶ高密度濃縮懸濁液）となるように各供試薬剤を添加し、ただちに、限界希釈法によって調整直後の各懸濁液のウイルス力価を調査した。残った試料は、遮光冷蔵保存し、一ヵ月後に同様の方法でウイルス力価を調査して活性赤潮殺藻ウイルスの劣化程度を調査した。
その結果、（ク）非添加原液および（オ）アジ化ナトリウム１０００ｐｐｍ添加区では、一ヶ月後に著しく力価が低下した（調整時６．８１×１０5感染単位／ｍｌ、１ヵ月後３．０１×１０2感染単位／ｍｌ）。すなわち、アジ化ナトリウムの高濃度添加では、赤潮殺藻ウイルスの殺藻活性に直接的なダメージがあることが分かった。また、（カ）アジ化ナトリウム１００ｐｐｍ添加区ならびに（キ）ペニシリンＧカリウム添加区では、一ヵ月後の調査でウイルス力価は比較的高く検出されたが（（カ）５．１５×１０5感染単位／ｍｌ、（キ）５．８２×１０4感染単位／ｍｌ）、雑菌も多く検出され、長期的な雑菌抑制によるＨｃＶの保存安定性向上の効果はないことが分かった。これに対し、硫酸ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコールの単用または混用処理区では雑菌の抑制とウイルス力価の劣化抑制が認められた（1ヵ月後（ア）１．３８×１０5感染単位／ｍｌ、（イ）７．１×１０5感染単位／ｍｌ、（ウ）９．３８×１０5感染単位／ｍｌおよび１．６１×１０6感染単位／ｍｌ）。特に、雑菌の抑制ならびにウイルス力価ともに混用した場合の方が効果が高かった。また、混用した場合は、低濃度での混合（硫酸ストレプトマイシン１００ｐｐｍ＋クロラムフェニコール１０ｐｐｍ）の方が薬剤のウイルス力価に対するダメージが少ないのと同時に混入雑菌に対する増殖抑制効果も十分にあり、本赤潮殺藻ウイルスの安定保存のために効果的であることが確認された。（図１）
【００１５】
［実施例２］
２）ＨｃＶに対する数種保護剤の評価
長期保存が困難なＨｃＶについて、保存安定性向上効果が期待できる数種保護剤について、その添加効果を調査した。供試した保護剤はポリエチレングリコール（＃６０００）１０％、グリセリン５０％および５％、蔗糖１２％、硫酸マグネシウム０．２％であり、最終的に保存状態とする際に上記濃度となるように調整した。
調整した直後に、各溶液から適当量をとり、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ  ＨＵ９４３３Ｐ株（高知県浦の内湾から分離された株）に対する限界希釈法により１ｍｌあたりのウイルス感染単位量を調査した。その後、アルミラミネートパックに各溶液を充填、遮光状態とし、５℃下に保存した。保存開始から１ヵ月後および２ヵ月後に同様の方法で赤潮殺藻ウイルスの殺藻活性を測定して各条件下における保存安定性を調査した。
その結果、グリセリン５０％、蔗糖１２％では、いずれも調整直後にＨｃＶ密度が１００感染単位／ｍｌ以下となり、殺藻活性の著しい低下（調整直後、グリセリン５０％では４９．１感染単位／ｍｌ、蔗糖１２％では４０．６感染単位／ｍｌしか検出されなかった）が認められた。更に、一ヶ月後にはいずれも検出限界（３．０１感染単位／ｍｌ）以下となった。このことからこれらの処理では保護剤としての機能を果たさないことが明らかとなった。一方、ポリエチレングリコールおよび硫酸マグネシウムの添加は、調整直後の劣化は認められないものの、１ヵ月後には無処理区（２５００感染単位／ｍｌ）と同等（硫酸マグネシウム０．２％添加区、２１８０感染単位／ｍｌ）かそれ以下（ポリエチレングリコール１０％添加区、５．１５感染単位／ｍｌ）に減少し、更に２ヵ月後には、硫酸マグネシウム０．２％添加区では１０３．２感染単位／ｍｌ、ポリエチレングリコール添加区では検出限界以下までに劣化が進行した。
唯一、グリセリン５％添加区で、無処理区と比較して２ヵ月後までの保存安定性が向上する傾向が認められ、調整直後１．１９×１０5感染単位／ｍｌが1ヵ月後に７．０８×１０5感染単位／ｍｌ、2ヵ月後でも３．７３×１０4感染単位／ｍｌとなった。すなわち、５％のグリセリンの添加が本赤潮殺藻ウイルスの保存に効果的であることが明らかとなった（図２）。
【００１６】
［実施例３］
３）グリセリン濃度の最適化
保護剤として添加するグリセリンの最適濃度について、抗生物質(硫酸ストレプトマイシン、クロラムフェニコール)との併用による効果とともに評価を行った。
試験は、実施例１）と同様に、感染宿主となるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは、２ｎＭのＮａ2ＳｅＯ3含有改変ＳＷＭ３培地（Ｃｈｅｎら，１９６９，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ  ５：２１１−２２０；Ｉｔｏｈ＆Ｉｍａｉ，１９８７，Ｓｈｕｗａ，Ｔｏｋｙｏ，ｐ．１２２−１３０）１０Ｌに初期密度６０００細胞／ｍｌとなるように接種し、１６時間明、８時間暗の明暗周期条件、温度２５±２℃、光強度１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2ｓ-1（蛍光灯による照明）の条件で３日間培養し、対数増殖初期の宿主細胞が１０5細胞／ｍｌ以上となっていることを確認した培養液を準備した。得られたヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養液を充填したウイルス生産槽にＦａｌｃｏｎ社製７５０ｍｌ容量通気孔付組織培養用角型フラスコを用いて培養したＨｃＶ懸濁液を１０００ｍｌ接種した。その後、4日間２３±２℃で静置培養して得られた赤潮殺藻ウイルスＨｃＶ懸濁液を中空糸膜（旭化成ｍｉｃｒｏｚａ（登録商標）ＭＦモジュールＰＳＰ−１１３）でろ過することにより濃縮回収し、ＨｃＶ高密度濃縮懸濁液を得た。本試験では、雑菌混入がないことを確認したＨｃＶ懸濁液を使用し、以下の手順で、各成分を調整した。すなわち、準備したＨｃＶ懸濁液に対してグリセリンを２．５％、５．０％および１０．０％の添加濃度となるように添加し、対照としては２ｎＭのＮａ2ＳｅＯ3含有改変ＳＷＭ３培地で同様の希釈濃度となるように調整したＨｃＶ懸濁液（無処理区）を実験に用いた。また、雑菌制御による保存安定性向上に効果があると思われた抗生物質である硫酸ストレプトマイシン１００ｐｐｍならびにクロラムフェニコール１０ｐｐｍを共に添加した区を設け、併用した場合の保護効果についても評価を行った。なお、グリセリンの添加量により、実験に供試したＨｃＶ溶液が希釈される割合が変わるため、実験の精度をより高くするために、グリセリン添加区それぞれの濃度ごとにグリセリンならびに抗生物質溶液の代わりにＳＷＭ３培地添加による無処理区を設定した。
【００１７】
その結果、グリセリン２．５％比較区では、抗生物質を添加しない場合、１ヶ月後には、グリセリン非添加ならびに２．５％添加の場合でそれぞれ９．４×１０4感染単位／ｍｌならびに１．９９×１０5感染単位／ｍｌ、抗生物質を添加した場合でも、グリセリン非添加ならびに２．５％添加の場合でそれぞれ１．０３×１０5感染単位／ｍｌならびに３．３５×１０5感染単位／ｍｌとほとんど差はなく、グリセリン５．０％比較区では、抗生物質を添加しない場合、グリセリン非添加ならびに５．０％グリセリン添加の場合それぞれ４．４５×１０4感染単位／ｍｌならびに６．９８×１０5感染単位／ｍｌ、抗生物質を添加した場合は、グリセリン非添加ならびに５．０％添加の場合でそれぞれ１．１１×１０5感染単位／ｍｌならびに８．６７×１０5感染単位／ｍｌとなり、抗生物質ならびに５％グリセリン添加区でウイルス感染単位密度が高くなる傾向が認められた。一方、グリセリン１０．０％比較区では、この傾向がより顕著に現れ、抗生物質を添加しない場合、グリセリン非添加ならびに１０．０％グリセリン添加の場合でそれぞれ検出限界以下ならびに３．０１×１０3感染単位／ｍｌ、抗生物質を添加した場合は、グリセリン非添加ならびに１０．０％添加の場合でそれぞれ７．１８×１０3感染単位／ｍｌならびに９．８２×１０3感染単位／ｍｌとなった。グリセリン１０％比較区では、調整1日後のウイルス感染単位密度が他の試験区よりも低くなっているが、これは、試験に供試したＨｃＶ懸濁液の違いとともに、各調査用保存懸濁液の調整の際に希釈される割合が他の区より高かったことによる。
【００１８】
３ヶ月後の調査では、グリセリン２．５％比較区では、抗生物質非添加系で、グリセリン非添加ならびに２．５％添加の場合でそれぞれ３．０１感染単位／ｍｌならびに１８感染単位／ｍｌ、抗生物質添加系でも、グリセリン非添加ならびに２．５％添加の場合でそれぞれ３０．１感染単位／ｍｌならびに７０．２感染単位／ｍｌとなり、抗生物質とグリセリンを同時に添加した場合に赤潮殺藻ウイルス感染単位密度が最も高くなった。この傾向は、グリセリン５．０％比較区でもみられ、抗生物質非添加系で、グリセリン非添加ならびに５．０％グリセリン添加の場合でそれぞれ３．８５感染単位／ｍｌならびに９．８９×１０2感染単位／ｍｌ、抗生物質添加系で、グリセリン非添加ならびに５．０％グリセリン添加の場合でそれぞれ３０．１感染単位／ｍｌならびに２．３２×１０4感染単位／ｍｌであった。グリセリン１０．０％比較区では、更にこの傾向が顕著になり、抗生物質非添加系で、グリセリン非添加ならびに１０．０％グリセリン添加の場合でそれぞれ９．８２感染単位／ｍｌならびに４４．５感染単位／ｍｌ、抗生物質添加系で、グリセリン非添加ならびに１０．０％添加の場合でそれぞれ３０．１感染単位／ｍｌならびに１．３９×１０2感染単位／ｍｌとなった。試験開始直後の活性赤潮殺藻ウイルス密度が、グリセリン５％添加区の１０分の１から１００分の１と低かったにも関わらず、3ヶ月後の活性赤潮殺藻ウイルス密度がほぼ等しかったことから、グリセリン１０％での保護効果が高いことが明らかとなった。（図３）。
【００１９】
［実施例４］
４）硫酸ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、グリセリン各至適濃度での保存安定性
硫酸ストレプトマイシン、クロラムフェニコールならびにグリセリンの至適濃度における長期保存性を調査した。
２０Ｌのウイルス生産用培養容器を用いて生産した赤潮殺藻ウイルスＨｃＶ懸濁液を中空糸膜ろ過することで濃縮回収し、ＨｃＶ高密度濃縮懸濁液（感染ウイルス粒子数約１．８×１０10感染単位／ｍｌ）を得た。
得られたＨｃＶ高密度濃縮懸濁液に硫酸ストレプトマイシン１００ｐｐｍ、クロラムフェニコール１０ｐｐｍ（以下抗生物質混液と略す）並びにグリセリン１０％を添加し、遮光性アルミラミネート袋に１００ｍｌ充填し冷蔵（５℃）保存した。また、比較対照として、ＨｃＶ高密度濃縮懸濁液に抗生物質混液のみ添加した試験区、グリセリン１０％のみ添加した試験区、そして無添加の無処理区を設け、それぞれ１００ｍｌずつ作製して実験に供試した。保存開始直後、調整１日後、２週間後、１ヵ月後、３ヵ月後および６ヵ月後のウイルス感染単位密度を限界希釈法で測定し、長期的なウイルス保存安定性を確認した。
【００２０】
ＨｃＶ濃縮懸濁液原液のみを冷蔵、遮光保存した場合、１ヵ月後にはウイルス感染単位密度の著しい減少がみられ（６．４５×１０6感染単位／ｍｌ）、６ヵ月後には検出限界以下（０感染単位／ｍｌ）となった。これに対し、抗生物質混液ならびにグリセリン１０％を加用した区では、保存開始後１ヶ月目までは、殆ど劣化が認められず（調整時１．８２×１０10感染単位／ｍｌ、１ヶ月後１．７７×１０10感染単位／ｍｌ）、その後、３ヵ月後ならびに６ヶ月後にはそれぞれ１．０９×１０9感染単位／ｍｌ、１．８２×１０3感染単位／ｍｌとなった。一方、抗生物質混液を単独で添加した試験区では3ヵ月後ならびに6ヵ月後にそれぞれ３．０５×１０7感染単位／ｍｌ、１６．３感染単位／ｍｌとなり、また、グリセリンを単独で添加した試験区では3ヵ月後ならびに6ヵ月後にそれぞれ１．０７×１０7感染単位／ｍｌ、８．８感染単位／ｍｌまで減少していた（図４）。
以上の結果から、抗生物質混液の添加によって、保存開始後の雑菌汚染を制御するとともに、グリセリン１０％を加用しＨｃＶ粒子に対する保護効果を加味することによって、ＨｃＶの保存安定性が向上することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】硫酸ストレプトマイシンとクラムフェニコールの効果を示した説明図である。（実施例１）
【図２】保護剤の有効性を示した説明図である。（実施例２）
【図３】抗生物質と併用した場合のグリセリンの保護効果を示した説明図である。（実施例３）
【図４】抗生物質ならびにグリセリンの最適添加濃度における長期保存安定性を示した説明図である。（実施例４）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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