(57)【要約】【課題】  安全性の高い糖質を有効成分とする、安価で新しい免疫賦活組成物、及び該免疫賦活組成物を含有する調整粉乳、乳飲料を提供する。【解決手段】  免疫賦活組成物の有効成分として、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、及びＡ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ（前記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）から選ばれた少なくとも１種を含有させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルラクトサミン及び下記式（１）、（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
Ａ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ  …（２）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）
【請求項２】
Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は下記式（１）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体を有効成分として含有する請求項１記載の免疫賦活組成物。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。）
【請求項３】
請求項１又は２記載の免疫賦活組成物を含有することを特徴とする乳製品。
【請求項４】
前記免疫賦活組成物を、Ｎ−アセチルラクトサミン、下記式（１）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体及び／又は下記式（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体換算で０．００００１〜１質量％含有する請求項３記載の乳製品。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
Ａ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ  …（２）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）
【請求項５】
前記乳製品は、乳飲料又は調整粉乳である請求項３又は４記載の乳製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又はＮ−アセチルラクトサミン誘導体を有効成分として含有する免疫賦活組成物、及び該免疫賦活組成物を含有する乳製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に加齢により免疫力は低下することが知られており、２０代をピークに減少し、５０歳代から急激に低下すると言われている。免疫力の低下は、感染症や悪性腫瘍等を引き起こすことが知られ、特に高齢者では命に関わる重要な問題である。また、最近では高脂血症や動脈硬化症のような生活習慣病にも影響を及ぼすことが分かってきている。
【０００３】
免疫力は、日々の運動や食生活、ストレスの軽減等により強化することができるが、より効果的な方法として、免疫賦活活性を有する薬剤や食品を摂取することが挙げられる。
【０００４】
従来、免疫力を向上させる薬剤として、インターロイキン、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＣＫ４３２、レンチナン、レバミゾール等が知られている。また、免疫力を向上させる健康機能食品として、アガリクス、β−グルカン等の多糖類、プロポリス、ラクトフェリン等が市販されている。
【０００５】
その他にも免疫賦活作用を示す糖質が知られており、例えば、下記特許文献１には、キチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖を含有する免疫賦活組成物が開示されており、これらの糖を併用することにより、免疫賦活作用が相乗的に増強され、少量でも十分な免疫賦活効果を有する組成物が得られることが記載されている。
【０００６】
下記特許文献２には、乳果オリゴ糖を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活組成物が開示されており、該免疫賦活組成物は、免疫賦活及びＩＦＮ−γ産生能亢進作用を発揮し、消化管における生体防御機構（免疫機能）を高めて、消化管感染等に対して顕著な予防及び治療効果を奏し得ることが記載されている。
【０００７】
下記特許文献３には、２−６糖のオリゴ糖であって、非還元末端にガラクトースを有し、ガラクトースと他の１−５糖との結合がα１−６結合であるオリゴ糖又はその誘導体を含む体液性免疫調節剤が開示されており、該体液性免疫調節剤がアトピー性皮膚炎やアレルギー疾患に有効であることが記載されている。
【０００８】
下記非特許文献１には、キトサンオリゴ糖の人への投与により、NK細胞活性が上昇することが記載されている。
【０００９】
下記非特許文献２には、イヌロオリゴ糖やマルトペンタオースやシクロデキストリン等１２種類のオリゴ糖が、マクロファージのＴＮＦ−α産生促進作用を有することが記載されている。
【００１０】
下記非特許文献３には、多糖であるアラビノガラクタンが、マクロファージのＴＮＦ−α、ＩＬ−１、インターフェロン−β２の産生を促進し、マクロファージを活性化させる作用を有することが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−９５９５４号公報
【特許文献２】特開２００１−６４１８１号公報
【特許文献３】特開２００３−４０７７９号公報
【非特許文献１】日本臨床栄養学会雑誌 21(1), pp41-47 (1999)
【非特許文献２】J. Vet. Med. Sci, 60(4):519-522,1998
【非特許文献３】Journal of the National Cancer Institute, vol.81, No.9, May3, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような薬剤は、活性は強いものの多量の摂取により人体に悪影響を及ぼすものもある。また、アガリクス、β−グルカン等の多糖類、プロポリス、ラクトフェリン等は高価なものであり、日常的に摂取するには問題があった。
【００１２】
したがって本発明の目的は、安全性の高い糖質を有効成分とする、安価で新しい免疫賦活組成物、及び該免疫賦活組成物を含有する乳製品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記目的を達成するため鋭意研究し、Ｎ−アセチルラクトサミン及びＮ−アセチルラクトサミン誘導体が免疫担当細胞であるマクロファージに作用して、細胞傷害活性因子である一酸化窒素や炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの産生を有意に促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の一つは、Ｎ−アセチルラクトサミン及び下記式（１）、（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活組成物を提供するものである。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
Ａ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ  …（２）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）
【００１５】
本発明の免疫賦活組成物においては、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は下記式（１）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体を有効成分として含有することが好ましい。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。）
【００１６】
上記発明によれば、免疫賦活組成物の有効成分として、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を含有させることにより、マクロファージを直接活性化して、細胞傷害活性因子である一酸化窒素や炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの産生を促進させ、免疫力を向上させることができる。また、上記オリゴ糖は、安全性が高く、容易に工業的規模で製造可能であり、安全かつ安価な免疫賦活組成物を提供することができる。
【００１７】
また、本発明のもう一つは、前記免疫賦活組成物を含有することを特徴とする乳製品を提供するものである。
【００１８】
本発明の乳製品は、前記免疫賦活組成物を、Ｎ−アセチルラクトサミン、下記式（１）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体及び／又は下記式（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体換算で０．００００１〜１質量％含有することが好ましい。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
Ａ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ  …（２）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）
また、前記乳製品は乳飲料又は調整粉乳であることが好ましい。
【００１９】
上記発明によれば、前記免疫賦活組成物の有効成分であるＮ−アセチルラクトサミンは、本来ウシ乳中に含まれている成分であり、これを乳製品に添加することにより自然かつ安全に免疫賦活作用を得ることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の免疫賦活組成物は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又はＮ−アセチルラクトサミン誘導体を有効成分として含有することにより、マクロファージを直接活性化して免疫力を向上させることができる。また、上記オリゴ糖は、安全性が高く、容易に工業的規模で製造可能であり、安全かつ安価な免疫賦活組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の免疫賦活組成物の有効成分であるＮ−アセチルラクトサミンは、ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンがβ１−４結合をしたオリゴ糖である。Ｎ−アセチルラクトサミンは、ウシ初乳中に遊離の状態で極微量発見されており、ウシの分娩から数日後の乳中には検出されなくなることから、初乳成分としての特別な機能が示唆されている。
【００２２】
また、下記式（１）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体は、Ｎ−アセチルラクトサミンの非還元末端側にガラクトースがβ１−４結合した、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（以下、ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンという）である。
Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ  …（１）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。）
【００２３】
また、下記式（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体は、Ｎ−アセチルラクトサミンの非還元末端側及び還元末端側が他の糖や官能基で修飾されたものである。
Ａ−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｂ  …（２）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。また、Ａは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、硫酸基又はリン酸基を表し、Ｂは１〜６個のガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、マンノース、メチル基、エチル基、プロピル基、フェニル基、ニトロフェニル基又はメチルウンベリフェリル基を表す。）
【００２４】
以上のように、本発明の免疫賦活組成物の有効成分である上記オリゴ糖は、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を有することが重要であり、その非還元末端側や還元末端側には他の官能基や糖が結合していてもよい。本発明においては、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又はガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンが好ましく用いられる。
【００２５】
Ｎ−アセチルラクトサミンは、天然糖蛋白糖鎖や糖脂質糖鎖、あるいはケラタン硫酸等から糖鎖の酵素的分解により得ることもできるが、極微量しか得ることができない。そこで、本発明においては、ラクトースとＮ−アセチルグルコサミンを溶解した溶液にβ−ガラクトシダーゼを作用させて糖転移反応を行う方法により製造することが好ましい。この方法によれば、Ｎ−アセチルラクトサミンを工業スケールで容易に製造できるだけでなく、副生成物としてガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンも製造することができる。
【００２６】
具体的には、特許第２８１９３１３号公報に記載されているように、ラクトースとＮ−アセチルグルコサミンを基質とし、β−ガラクトシダーゼを塩析剤存在下で作用させることことが好ましい。
【００２７】
上記β−ガラクトシダーゼとしては、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcusthermophilus、Aspergillus oryzae、Bacillus circulansを起源とするものが例示でき、これら市販されている酵素を使用することができる。中でも、Bacilluscirculansを起源とするものが、β１−４選択性が高いため、好ましく用いられる。
【００２８】
上記塩析剤としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が例示でき、これらのうち１種又は２種以上を用いることができる。塩析剤の濃度は５〜３０質量％が好ましい。
【００２９】
また、反応に用いるラクトースとＮ−アセチルグルコサミンの量は、モル比で１：１〜１：５とし、全基質濃度として２０〜７０質量％とすることが好ましい。β−ガラクトシダーゼは、反応系において０．０１〜５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、ｐＨ４〜９、温度５〜５０℃に保持して２〜５０時間作用させることが好ましい。
【００３０】
上記のようにして得られた反応液には、副生成物としてガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンがＮ−アセチルラクトサミンに対して２〜３％の割合で含まれている。
【００３１】
酵素反応液は、加熱して酵素を失活させた後、そのまま、あるいは必要に応じて活性炭カラムクロマトグラフィーや逆浸透膜により分離・精製、濃縮してから用いることができる。例えば、上記反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供してアルコールによるグラジエント溶出することにより、高純度のＮ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンを得ることができる。
【００３２】
また、上記式（２）に示されるＮ−アセチルラクトサミン誘導体は、碓氷らによって報告されている方法等により調製することができる。
【００３３】
例えば、上記式（２）において、Ａがなく、Ｂがラクトース（ガラクトースとグルコースの２糖）であるラクト−Ｎ−テトラオースやラクト−Ｎ−ネオテトラオースは、ラクトースとＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの存在下において、β１−３Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを作用させて得られた３糖に、ラクトースの存在下においてBacillus circulans由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトースを転移させることにより得ることができる。（Glycoconjugate J., 16, 189-195, 1999）
【００３４】
また、上記式（２）において、Ａがなく、Ｂがマンノース又はグルコースである３糖はＮ−アセチルラクトサミンのｐＮＰ誘導体と、マンノース又はグルコースの存在下でTrichoderma reesei由来のセルラーゼを作用させて、マンノース又はグルコースを転移させることにより得ることができる（Archives of Biochemistry and Biophysics, 385(1), Jan 1, 70-77, 2001）。
【００３５】
本発明においては、上記オリゴ糖をそのまま免疫賦活組成物として用いることもできるが、通常、上記オリゴ糖を１〜９９質量％含むことが好ましく、安価に量産が可能であるという点で５〜５０質量％含むことがより好ましい。
【００３６】
本発明の免疫賦活組成物の製剤形態は、液剤、散剤、錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、ゼリー、チュアブル、ペースト等が挙げられ、生理活性を損わない範囲で、賦形剤、糖類、甘味料、安定剤、増粘剤、着色料、香料、酸味料、その他添加剤等の他の成分を適宜含むことができる。
【００３７】
本発明の免疫賦活組成物は、各種飲食品や飼料に、添加・配合して摂取することもできる。Ｎ−アセチルラクトサミンや上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体はいずれも容易に水に溶解するので、飲食品等への添加・配合が容易である。また、飲食品等に添加・配合することにより、手軽に免疫賦活組成物を摂取することができ、継続摂取も容易となるので、より高い免疫賦活作用が期待できる。
【００３８】
上記飲食品としては、例えば、（１）乳製品、（２）清涼飲料、炭酸飲料、果実飲料、野菜ジュース、豆乳、ミネラルウォーター、茶系飲料、コーヒー飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、ゼリー飲料等の飲料類、（３）トマトピューレ、キノコ缶詰、乾燥野菜、漬物等の野菜加工品、（４）乾燥果実、ジャム、フルーツピューレ、果実缶詰等の果実加工品、（５）カレー粉、わさび、ショウガ、スパイスブレンド、シーズニング粉等の香辛料、（６）パスタ、うどん、そば、ラーメン、マカロニ等の麺類（生麺、乾燥麺含む）、（７）食パン、菓子パン、調理パン、ドーナツ等のパン類、（８）アルファー化米、オートミール、麩、バッター粉等、（９）焼菓子、ビスケット、米菓子、キャンデー、チョコレート、チューイングガム、スナック菓子、冷菓、砂糖漬け菓子、和生菓子、洋生菓子、半生菓子、プリン等の菓子類、（１０）小豆、豆腐、納豆、きな粉、湯葉、煮豆、ピーナッツ等の豆類製品、（１１）蜂蜜、ローヤルゼリー加工食品、（１２）ハム、ソーセージ、ベーコン等の肉製品、（１３）加工卵製品、（１４）干物、蒲鉾、ちくわ、魚肉ソーセージ等の加工魚や、乾燥わかめ、昆布、佃煮等の加工海藻や、タラコ、数の子、イクラ、からすみ等の加工魚卵、（１５）だしの素、醤油、酢、みりん、コンソメベース、中華ベース、濃縮出汁、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、味噌等の調味料や、サラダ油、ゴマ油、リノール油、ジアシルグリセロール、べにばな油等の食用油脂、（１６）スープ（粉末、液体含む）等の調理、半調理食品や、惣菜、レトルト食品、チルド食品、半調理食品（炊き込みご飯の素、カニ玉の素）等が挙げられ、中でも、乳製品に好ましく添加・配合することができる。本発明の免疫賦活組成物の有効成分であるＮ−アセチルラクトサミンは、本来ウシ乳中に含まれている成分であるため、乳製品に添加・配合することで、より自然かつ安全に免疫賦活作用を得ることができる。
【００３９】
なお、本発明における乳製品とは、厚生省の乳等省令に定められている乳製品に加えて、乳、及び乳又は乳製品を主要原料とする食品も含むものであり、例えば、牛乳、加工乳、脱脂乳、クリーム、バター、チーズ、濃縮ホエー、アイスクリーム類、濃縮乳類、れん乳類、粉乳類、調製粉乳、発酵乳、乳飲料、乳酸菌飲料等が挙げられる。また、上記乳飲料とは、乳固形分３％以上の種類別乳飲料に加えて、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料等の飲用の乳製品を含むものである。本発明においては、上記乳製品の中でも、乳飲料又は調製粉乳に特に好ましく添加・配合することができる。例えば、本発明の免疫賦活組成物を乳幼児向けの調製粉乳に配合することにより、本来は母乳より摂取されるべき免疫賦活成分を調製粉乳から摂取できる。
【００４０】
上記飲食品や飼料における本発明の免疫賦活組成物の配合量は、固形分当り、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体換算で０．００００１〜１質量％が好ましく、０．００１〜０．１質量％がより好ましい。上記範囲内であればウシの初乳に本来含まれている含量に近似するため、より自然かつ安全に免疫賦活作用を得ることができる。
【００４１】
なお、Ｎ−アセチルラクトサミンのラットにおける経口投与での急性毒性はＬＤ５０＞５ｇ／ｋｇ以上であり、その安全性が確認されている。
【００４２】
また、本発明の免疫賦活組成物は、医薬品、皮膚塗布用クリーム、化粧料等にも添加、配合することができる。
【００４３】
例えば、医薬品に配合する場合、医薬的に許容される担体や賦形剤、添加剤を用いて、注射剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等とすることができる。また、安定剤、増粘剤、着色剤等の補助的添加剤を使用することもできる。
【００４４】
本発明の免疫賦活組成物の有効摂取量は、人や状態、摂取方法等によっても異なるが、例えば、経口摂取する場合は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体換算で０．１〜５００ｍｇ／体重１ｋｇが好ましい。また、皮膚に塗布する場合は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体換算で１０〜２，０００ｍｇ／体重１ｋｇが好ましい。また、外粘膜へ塗布する場合は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体換算で１０〜２，０００ｍｇ／体重１ｋｇが好ましい。
【００４５】
また、化粧品に配合する場合、その配合量は、Ｎ−アセチルラクトサミン及び／又は上記Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体換算で０．０１〜４０質量％が好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞
（オリゴ糖の調製）
乳糖（和光純薬製）９０ｇとＮ−アセチルグルコサミン（焼津水産化学工業製）１１０ｇを５００ｍＬの水に溶解し、ビオラクタ（Bacillus circulans由来ラクターゼ、大和化成製）２００Ｕ（１Ｕは、ＯＮＰガラクトシドから１分間に１μｍｏｌのＯＮＰを遊離するのに必要な酵素量とする）を添加し、３０℃で２４時間酵素反応を行った。
【００４７】
酵素反応終了後、１００℃、１５分間加熱処理して酵素を失活させた後、活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、０〜１８％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコール溶液を用いてグラジエント溶出した。イソプロピルアルコール濃度８％（ｖ／ｖ）付近でＮ−アセチルラクトサミンが溶出し、イソプロピルアルコール濃度１２％（ｖ／ｖ）付近でガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンが溶出するので、それぞれの高純度画分を集めて、濃縮、凍結乾燥して、Ｎ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンを得た。
【００４８】
得られたＮ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンを用いて以下の試験を行った。
【００４９】
＜試験例１＞
使用細胞：マウス単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（大日本製薬製）
使用培地：ＤＭＥＭ＋１０％非動化ウシ胎児血清＋５０Ｕ／ｍＬペニシリン＋５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｐＨ７．４）
上記細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当り７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／８０μＬで播種した。そして、陽性対照ウェルには２０μＬの上記培地を、対照ウエル及び他のウェルには２０μＬのポリミキシンＢを終濃度１００Ｕ／ｍＬになるように添加した。
【００５０】
更に、陽性対照ウェルには１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（リポポリサッカライド）１００μＬ、対照ウェルには上記培地を１００μＬ、他のウェルには予め各濃度に調整したオリゴ糖サンプル（図１〜３参照）を１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２４時間培養した。
【００５１】
次に、ＮＯ（一酸化窒素）の量を測定するために、各ウェルから１００μＬをサンプリングし、別の９６ウェルプレートに移し、１００μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬を加え、１５分後に５４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、予め０、１２．５、２５、５０μＭの亜硝酸ナトリウムを含む培地を用いて測定した吸光度に基いて作成した標準曲線から、産生されたＮＯ（一酸化窒素）の量を算出した。得られたデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．で示し、ウェルチの二群比較による検定を行って有意差を判定した。有意水準は危険率５％以下とした。
【００５２】
図１に、Ｎ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響についての結果を示す。
【００５３】
図１から分かるように、Ｎ−アセチルラクトサミンを２０ｍＭ添加した場合は、対照に比べて危険率０．１％以下の有意差でＮＯ産生を促進した。
【００５４】
一方、還元末端の糖がグルコースであるラクトース（Ｇａｌ Ｇｌｃ）、還元末端の糖がグルコサミン塩酸塩であるラクトサミン塩酸塩（Ｇａｌ ＧｌｃＮ）を添加した場合は、同一濃度においてＮＯ産生促進作用が見受けられないか、あるいは極めて弱く、マクロファージのＮＯ産生促進には還元末端の糖がＮ−アセチルグルコサミン構造であることが重要であることが示唆された。
【００５５】
図２に、ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響についての結果を示す。
【００５６】
図２から分かるように、ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンを１０ｍＭ添加した場合は、対照に比べて危険率０．１％以下の有意差でＮＯ産生を促進した。図１の場合と同様、還元末端の糖がグルコースであるＧａｌ Ｇａｌ Ｇｌｃ（ガラクトシルラクトース）、還元末端の糖がグルコサミン塩酸塩であるＧａｌ Ｇａｌ ＧｌｃＮ（ガラクトシルラクトサミン塩酸塩）を添加した場合は、同一濃度においてＮＯ産生促進作用が見受けられないか、あるいは弱く、マクロファージのＮＯ産生促進には還元末端の糖がＮ−アセチルグルコサミン構造であることが重要であることが示唆された。
【００５７】
図３に、各濃度のＮ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響についての結果を示す。
【００５８】
図３から、Ｎ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンは、濃度依存的にＮＯ産生を促進することが分かる。特に、ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンはＮ−アセチルラクトサミンに比べて極めて強い活性を示しており、濃度２０ｍＭの場合においては、Ｎ−アセチルラクトサミンに比べて６．９倍もＮＯ産生を促進していることが分かる。
【００５９】
＜試験例２＞
試験例１と同条件で同細胞を培養し、その上清から産生されたＴＮＦ−α量を、商品名「マウスＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ」（Pierce Biotechnology Inc. 社製）を用いて測定した。
【００６０】
具体的には、０、５０、３５０、２４５０ｐｇ／ｍｌのマウスＴＮＦ−αを含む培地を用いて測定した４５０ｎｍ（対照５５０ｎｍ）の吸光度により標準曲線を作成し、それに基づいて算出した（キットのマニュアルに準拠した方法）。その結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2006182665.tif 000002
【００６２】
表１から、Ｎ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンを添加した系では、培地のみ添加した対照に比べてＴＮＦ−αの産生量が増大していることが分かる。Ｎ−アセチルラクトサミン２０ｍＭでは対照の２．０倍であったが、ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミン１０ｍＭでは、対照の２．６倍と、ガラクトースの数が大きいほうがＴＮＦ−α産生を促進することが示唆された。
【００６３】
以上の結果より、Ｎ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンは、免疫細胞であるマクロファージに直接作用することで、細胞障害活性因子であるＮＯ（一酸化窒素）及び炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの産生を効果的に促進させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の免疫賦活組成物は、マクロファージを活性化して免疫機能を増大させることができ、免疫低下による各種疾患の予防や治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】Ｎ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響について測定した結果を示す図である。
【図２】ガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響について測定した結果を示す図である。
【図３】各濃度のＮ−アセチルラクトサミン及びガラクトシルＮ−アセチルラクトサミンがマクロファージのＮＯ産生量に与える影響について測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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