(57)【要約】【課題】  ４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン〔以下、ＨＤＭＦと略記する〕高生産乳酸菌、該乳酸菌を用いた培養醪、及びその培養醪を含有させた酒類又は食品の製造方法を提供する。【解決手段】  麹重量１に対して水を３倍重量加えた麹培地で培養したときに、ＨＤＭＦを２０ｍｇ／Ｌ以上生成することを特徴とするＨＤＭＦ高生産乳酸菌。当該ＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪。当該培養醪を含有させることを特徴とする酒類又は食品の製造方法。【効果】  当該乳酸菌を用いて、ＨＤＭＦを単独で高含有する培養醪を得ることができる。また、当該培養醪を含有させることにより、香味に優れた酒類又は食品を製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹重量１に対して水を３倍重量加えた麹培地で培養したときに、４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン〔以下、ＨＤＭＦと略記する〕を２０ｍｇ／Ｌ以上生成することを特徴とするＨＤＭＦ高生産乳酸菌。
【請求項２】
乳酸菌が、酒類又は食品のオフフレーバーを実質的に生成せず、かつ１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノール耐性を有することを特徴とする請求項１に記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２８である請求項１又は２に記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪。
【請求項５】
請求項４に記載の培養醪を含有させることを特徴とする酒類又は食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン〔以下、ＨＤＭＦと略記する〕高生産乳酸菌、ＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪、及びその培養醪を含有させた酒類又は食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸と糖を一緒に加熱又は長時間放置すると、メイラード反応又は非酵素的褐変反応といわれる現在でも完全には解明されていない複雑な反応によって、おびただしい数の有機化合物が生成する。その好ましい風味に大きく寄与する生成物の一つに、フラノン化合物であるＨＤＭＦがある。ＨＤＭＦは、カラメル様の甘い香りを呈し、官能閾値は水溶液中で１６０μｇ／Ｌと低く、その結果、ローストビーフやコーヒー、パンの皮など多くの食品で重要な香気成分とされている。更に、醤油や味噌、ビール、チーズからも見出されている（非特許文献１）。
【０００３】
この化合物は、フラネオール（ＦＵＲＡＮＥＯＬ、フィルメニッヒ社の登録商標）という名前で香料として販売されており、フラネオールを用いた、減少せしめられた糖を含有する製品の甘味を強化する方法が提案されている（特許文献１）。また、「香料の事典」（非特許文献２）によれば、パイナップル、ストロベリーに見出され、強いカラメル様香気を放ち、昇華して得た結晶の融点は７７〜７９℃であり、用途としては、食品の香味改良補強剤として使われるほか、ストロベリー、パイナップルフレーバーとしても重要視される、としている。この化合物は、上記天然物中での含有量が一般的に極めて少ないため、天然物から分離精製して利用することは極めて困難である。
【０００４】
林田らは、麦味噌における２種類のフラノン化合物である、ＨＤＭＦと醤油の特徴的な香気成分である４−ヒドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン〔以下、ＨＥＭＦと略記する〕の生成機構を解明するために、発酵温度の異なる麦味噌の製造試験、還元糖を加えて加熱した醤油麹の酵母の発酵試験、熟成した麦味噌の酵母の発酵試験を行った結果、この２種類のフラノン化合物の生成には、酵母による発酵と共にメイラード反応による着色が重要であり、麦味噌の着色原因物質である還元糖のうち、ヘキソースがＨＤＭＦの生成に、ペントースがＨＥＭＦの生成に関与していることを明らかにしている。また、熟成した麦味噌の発酵試験から、フラノンはメイラード反応の反応中間体が酵母によって変換されて生成すると推定している（非特許文献３）。
【０００５】
更に、林田らは、工業的なチーズ製造に広く使用される乳酸菌であるラクトコッカス  ラクチス  サブスピシーズ  クレモリス〔Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ〕ＩＦＯ  ３４２７を用いて、糖としてガラクトース（ヘキソース）とリボース（ペントース）、アミノ酸としてグルタミン酸ナトリウムを用いた培地により、乳酸発酵によるフラノン化合物の生成を検討している。ＨＤＭＦは酵母の場合と同様に、乳酸菌によってもメイラード反応中間体から生成すると推定している。どの試料からもＨＥＭＦは検出されず、フラノン化合物としてはＨＤＭＦのみの生成であり、その生成量は最大でも１．１７ｍｇ／Ｌであった（非特許文献４）。
【０００６】
高価な出発原料や化学的合成方法を使用せず、飲食品に用いても安全な芳香性酵母又は芳香組成物の製造方法、並びにその組成物を用いた芳香性飲食品又は蒸留酒の製造方法が開示されている（特許文献２）。醸造工程から回収した酵母液は、一旦酒類、醤油、味噌などの発酵食品の製造に使用した後のものであればどのようなものでもよく、既知の方法により抽出すればよいとしており、その組成物には、エチル−９−デセノエイト、ＨＥＭＦ、ＨＤＭＦを高含有すると記載されているが、ＨＥＭＦやＨＤＭＦの具体的な含有量については記載されていない。
【０００７】
ＨＤＭＦ等のシュガー系フレーバー（砂糖様の甘い香気を有するフレーバー）を家畜用飼料添加剤して利用する試みがなされている。シュガー系フレーバーとして、ソトロン、シクロテン、フラネオール（ＨＤＭＦ）、ホモフラネオール、マルトール及びエチルマルトールからなる香料成分の１種又は２種以上の混合物を添加している（特許文献３）。
【０００８】
焼酎原料に乳酸菌を添加する焼酎の製造方法が開示されている（特許文献４）。乳酸菌はこれまで焼酎の製造において排除されていたが、乳酸菌を逆に利用するというものであるが、乳酸菌がどのような物質を生成するかについては何ら言及されていない。
【０００９】
このように、醸造食品における主要なフラノン化合物であるＨＤＭＦとＨＥＭＦの生成機構の研究がなされ、ＨＤＭＦは、酵母においても乳酸菌においても、ヘキソースからメイラード反応中間体を経由して生成すること明らかとなってきているが、甘い香りを有するＨＤＭＦを単独でより多量に生産する技術の開発はなされていないのが現状である。
【００１０】
【特許文献１】特開昭５０−１４０６５９号公報
【特許文献２】特開２００３−１８０３３９公報
【特許文献３】特開２００１−９５５０２公報
【特許文献４】特開２０００−６０５３１公報
【非特許文献１】日本醸造協会誌、第９８巻、第２号、第８９〜９５頁（２００３年）
【非特許文献２】「香料の事典」、第３９０頁、（株）朝倉書店、１９８０年８月２７日発行
【非特許文献３】日本醸造協会誌、第９３巻、第９号、第７３０〜７３８頁（１９９８年）
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．１，９７−９９（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、自然界に微量にしか存在しないフラノン化合物の１種であり、砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を有するＨＤＭＦを得ること、そして、酵母の場合のように、２種類のフラノン化合物、ＨＤＭＦとＨＥＭＦが共に生成している共存状態ではなく、ＨＤＭＦを単独でより高生産する乳酸菌を取得し、その乳酸菌により生成したＨＤＭＦを含む培養醪、及びその培養醪を含有させた酒類又は食品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、重量１に対して水を３倍重量加えた麹培地で培養したときに、ＨＤＭＦを２０ｍｇ／Ｌ以上生成するＨＤＭＦ高生産乳酸菌に関し、第２の発明は、乳酸菌が、酒類又は食品のオフフレーバーを実質的に生成せず、かつ１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノール耐性を有する第１の発明に記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌であり、第３の発明は、乳酸菌が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２８である第１の発明又は第２の発明に記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌であり、第４の発明は、第１〜第３の発明のいずれかに記載のＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪であり、第５の発明は、第４の発明の培養醪を含有させる酒類又は食品の製造方法に関する。
【００１３】
本発明者らは、ＨＤＭＦの特徴である砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を酒類又は食品に広く利用すること考慮して、ＨＥＭＦの生成が検出されず、ＨＤＭＦを著量生成する微生物として、乳酸菌を中心に鋭意研究を行った結果、麹培地においてＨＤＭＦを高生産する乳酸菌を見出し、更に、麹培地における培養醪から、酒類又は食品のオフフレーバー、例えば、ダイアセチル、アセトアルデヒド、酢酸などが感じられず、かつ１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールに耐性を示す乳酸菌を選択することにより、ＨＤＭＦを高生産し、酒類又は食品の香味向上につながる乳酸菌が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１４】
麹培地を用いて選択することにより、砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を有するＨＤＭＦを高生産する乳酸菌を取得することができる。ＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いて、ＨＤＭＦを単独で高含有する培養醪を得ることができる。更には、ＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪を含有させることにより、砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を有するＨＤＭＦを含有する香味に優れた酒類又は食品を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における乳酸菌とは、乳酸発酵を行う微生物で、食の安全性の観点から安全が確認されているものであれば、特に限定されない。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、オネオコッカス（Ｏｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等が挙げられる。特にラクトバチルス属が好適に用いられる。
【００１６】
本発明における乳酸菌の選択の一例を示す。米麹（米を原料とした、清酒、焼酎、みりん等に使用する黄麹菌を用いた麹）の重量１に対して水を３倍重量加え、５５℃で２時間糖化し、オートクレーブにて１２１℃、３０分の滅菌を行い、乳酸菌を接種して３０℃、５日間の培養を行うことにより選択できる。このとき、１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールに耐性を示す乳酸菌であればより好ましい。
麹の原料としては、米に限定されるものではなく、麦等の穀類、イモ類、豆類や麦芽等であってもよい。また、麹に使用する麹菌としては、黄麹菌に限定されるものではなく、白麹菌、黒麹菌等であってもよいが、ＨＤＭＦを高生産させる上では黄麹菌が最も適している。
本発明でいう麹培地は、前記したように麹の原料や麹菌の種類を問わない広義の概念のものである。
【００１７】
更に、乳酸菌の選択についての詳細を示す。麹培地における乳酸菌の培養醪から、酒類又は食品のオフフレーバー、例えば、ダイアセチル、アセトアルデヒド、酢酸などが感じられないものを官能検査で一次選択し、次にＨＤＭＦを高生産する株を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で選択する。培養醪を酢酸メチルで溶媒抽出し、減圧遠心濃縮機ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＡＬ  ＶＡＰＯＲＩＺＥＲ  ＣＶＥ−１００Ｄ〔東京理化器械（株）製〕を用いて溶媒を除去し、乾固させたものをメタノールで再溶解し、これを分析に供する。ＨＰＬＣによる分析は、Ｍｏｄｅｌ  ２６９０〔日本ウォーターズ（株）製〕に、５０ｍＭリン酸溶液で平衡化したカラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ  ４．６×２５０ｍｍ〔ジーエルサイエンス（株）製〕を接続し、アセトニトリルで８−３５％の直線濃度勾配溶出を１０分かけて行った。溶出時間８．５分にＨＤＭＦのピークが検出され、そのピーク面積から乳酸菌の生成するＨＤＭＦ量を比較してＨＤＭＦ高生産株を選択する。
【００１８】
本発明におけるＨＤＭＦ高生産乳酸菌とは、麹重量１に対して水を３倍重量加えた麹培地で培養したときに、ＨＤＭＦを２０ｍｇ／Ｌ以上生成することを特徴とする。その際、ＨＥＭＦは、ＨＤＭＦを分析できるＨＰＬＣ条件では、不検出であることを確認している。
【００１９】
本発明のＨＤＭＦ高生産乳酸菌は、下記の菌学的性質を有し、ラクトバチルス属に属する乳酸菌であるが、通常のラクトバチルス属に属する乳酸菌よりも１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールに耐性を示し、かつＨＤＭＦの生産性が顕著に向上していることから、ラクトバチルス属の変異株であると認め、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．１９３（以下、１９３と略記する）と命名、表示し、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０４２８として寄託されている。
【００２０】
１９３の菌学的性質を下記に示す。
（菌学的性質）
１．形態的性状
形態的性状において、１９３は、通常のラクトバチルス属と相違はない。
２．生理的性質
（ａ）グラム染色：陽性
（ｂ）生育温度：１５〜３５℃
（ｃ）生育ｐＨ（初発ｐＨ）：３．５〜９．０
（ｄ）エタノール耐性：１２．５％（ｖ／ｖ）
（ｅ）ガス発生試験：−
（ｆ）糖資化性：アラビノース（−）、キシロース（−）、グルコース（＋）、マンノース（＋）、フラクトース（＋）、ガラクトース（＋）、マルトース（＋）、スクロース（＋）、ラクトース（＋）、トレハロース（＋）、ソルビトール（＋）、マンニトール（＋）、イノシトール（−）、グリセロール（−）、デンプン（−）
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールを生成している焼酎醪から分離された乳酸菌から、ラクトバチルス属に属するＨＤＭＦ高生産乳酸菌の選択を行った。まず、焼酎醪を滅菌した生理食塩水で希釈し、炭酸カルシウム及びシクロヘキシミドを含むＧＹＰ分離培地で混釈寒天平板培養を行った。生成した乳酸で炭酸カルシウムを溶解してクリアゾーンを形成したコロニーを釣り上げ、シングルコロニーとした乳酸菌を得た。米麹（黄麹菌使用）の重量１に対して水を３倍重量加え、５５℃で２時間糖化し、オートクレーブにて１２１℃、３０分の滅菌を行い、得られた乳酸菌を接種して、３０℃、５日間の培養を行い、ＨＤＭＦの生産性を検討し、ＨＤＭＦを２０ｍｇ／Ｌ以上生成するＨＤＭＦ高生産乳酸菌を複数株得た。
次に、ダイアセチル、アセトアルデヒド、酢酸などが感じられず、かつ１０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールに耐性を示す乳酸菌を選択し、ＨＤＭＦを５０ｍｇ／Ｌ以上生成するＨＤＭＦ高生産乳酸菌を３株得た。そのうち最もＨＤＭＦを高生産した１９３（ＨＤＭＦを５９ｍｇ／Ｌ生成）は、自動細菌検査装置Ｒｉｂｏ  Ｐｒｉｎｔｅｒ（Ｑｕａｌｉｃｏｎ社製）を用いて同定を行い、ラクトバチルス属に属する乳酸菌であると確認された。この株は、ＨＤＭＦを分析できるＨＰＬＣ条件では、ＨＥＭＦを生成していなかった。
なお、ＨＤＭＦを５０ｍｇ／Ｌ以上生成するＨＤＭＦ高生産乳酸菌の３株については、糖としてガラクトース（ヘキソース）とリボース（ペントース）、アミノ酸としてグルタミン酸ナトリウムを用いた培地により、ＨＤＭＦの生成を確認したところ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ＩＦＯ  ３４２７の５〜６倍量もの高いＨＤＭＦを生産していた。
【実施例２】
【００２３】
ＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いたＨＤＭＦを含有する培養醪を利用した例を示す。みりん麹（米を原料とした、みりんに使用する黄麹菌を用いた麹）の重量１に対して水を３倍重量加え、５５℃で２時間糖化し、オートクレーブにて１２１℃、３０分の滅菌を行い、ＨＤＭＦ高生産乳酸菌１９３を接種して、３０℃、５日間の培養を行い、ＨＤＭＦを含有する培養醪を得た。
表１及び表２に示す仕込配合により、比較例１のみりん及びその原料の一部に前記したＨＤＭＦを含有する培養醪を使用して調製した本発明１のみりんを、それぞれ糖化・熟成して醸造した。なお、本発明１のみりん中には、１．４ｍｇ／ＬのＨＤＭＦが含まれていた。
【００２４】
【表１】
2006280256.tif 000002
【００２５】
【表２】
2006280256.tif 000003
【００２６】
得られたそれぞれのみりんを８名のパネラーにより４点評価法（１：特に良好、２：良好、３：普通、４：不良）で官能評価を行った。結果を表３に示す。官能評価の評点は平均値で表した。
【００２７】
【表３】
2006280256.tif 000004
【００２８】
本発明によれば、ＨＤＭＦを含有する培養醪は通常のみりんの品質を向上させ、香ばしい、深みがある、熟成感がある、穀物臭が少ない、綿菓子の香り、菓子類に合うと描写される特性を有していた。
【実施例３】
【００２９】
みりんにおけるＨＤＭＦの効果的濃度について検討を行った。アルコール分１３．５％（ｖ／ｖ）以上１４．５％（ｖ／ｖ）未満のタカラ本みりん純米〔宝酒造（株）製〕にＨＤＭＦ〔東京化成工業（株）製〕を添加し、ＨＤＭＦの濃度が１６．２、３２．４、６４．８、１２９．６μｇ／Ｌとなるように調整したものと添加していないものとを呈示サンプルとして調製した。これらのサンプルを試料濃度が上昇系列となるようにパネラー１０名に呈示し、３点識別法により添加されたサンプルを判別させた。結果を表４に示す。
生の正答率Ｐ０を、次式（Ｐ０−ｐ）／（１−ｐ）を用いて補正したもの（ｐは偶然の正答率１／３を使用）を真の正答率Ｐｉとして、ＨＤＭＦ濃度と真の正答率をグラフにプロットし、最小二乗法で近似した直線において真の正答率が０．５となる濃度をＨＤＭＦの効果を示す閾値とした。
【００３０】
【表４】
2006280256.tif 000005
【００３１】
真の正答率が０．５となるとき、ＨＤＭＦの濃度は１２２．４μｇ／Ｌであった。この濃度が本みりんにおけるＨＤＭＦの効果が認識される閾値である。次に、ＨＤＭＦを添加した本みりんと添加しない本みりんについての比較を行った。すなわち、アルコール分１３．５％（ｖ／ｖ）以上１４．５％（ｖ／ｖ）未満のタカラ本みりん純米〔宝酒造（株）製〕にＨＤＭＦ〔東京化成工業（株）製〕を添加し、ＨＤＭＦの濃度が１２２．４μｇ／Ｌとなるように添加して調整したもの（本発明２）と添加しないもの（比較例２）を呈示サンプルとして調製し、１０名のパネラーにより５点評価法（１：よい、５：悪い）で官能評価を行った。結果を表５に示す。官能評価の評点は平均値で表した。
【００３２】
【表５】
2006280256.tif 000006
【００３３】
本発明によれば、ＨＤＭＦは、シュガー系フレーバーを付与するだけでなく、ＨＤＭＦを含有していない本みりんの品質を向上させ、アルコールの刺激が減少している、穀物臭が少ない、柿渋臭が少ない、甘い香り、メープルシロップ様、と描写される特性を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、自然界に微量しか存在しない、砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を有する天然のＨＤＭＦを高生産する乳酸菌を取得することができる。
本発明のＨＤＭＦ高生産乳酸菌を用いた培養醪を含有させることにより、醸造酒やみりんに砂糖様の甘さとフルーティーさとを併せ持った香気を向上させ、更に、香ばしい、深みがある、熟成感がある、穀物臭が少ない、綿菓子の香り、菓子類に合うなどの香味特性を付与することができる。
また、適切な抽出方法や濃縮方法を用いれば、広く酒類又は食品への利用が可能となる香味料を提供することができる。