(57)【要約】【課題】  被検体にダメージを与えず、Ｂ／Ｆ分離効率が高く、濾過抵抗が低く、かつ簡便にターゲット物質の分離が可能なバイオセパレーション用フィルターおよびバイオセパレーション用キットを提供する。【解決手段】  本発明のバイオセパレーション用フィルター１は、軸線がストレートな細孔３が、孔径が分布を有するように形成されたフィルター２と、該フィルター２と実質的に一体化されたリブ４と、を備えている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸線がストレートな細孔が、孔径が分布を有するように形成されたフィルターと、該フィルターと実質的に一体化されたリブと、を備えることを特徴とするバイオセパレーション用フィルター。
【請求項２】
前記フィルターの厚さが１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項３】
前記フィルターの開口率が１５〜６０％であることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項４】
前記フィルターの材質が、シリカ、チタニア、アルミナ、ニッケル、金、チタン、アルミニウム、またはステンレスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項５】
第１のフィルターが前記リブの一端側に設けられるとともに、該リブを挟んでその他端側に第２のフィルターが設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項６】
前記ウエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液が収容されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項７】
前記プローブ担持粒子の粒子径が実質的に均一であり、該粒子径ｄと、前記フィルターに形成された細孔の孔径ｈと、該細孔の孔間隔ｐとの関係が、ｄ＞ｈ＋ｐであることを特徴とする請求項６に記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項８】
前記フィルターを固定化担体として、プローブが結合されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセパレーション用フィルター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセパレーション用フィルターと、該バイオセパレーション用フィルターを収納する容器と、を備えることを特徴とするバイオセパレーション用キット。
【請求項１０】
前記容器に、前記バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対応して互いに独立した複数の独立空間が設けられていることを特徴とする請求項９に記載のバイオセパレーション用キット。
【請求項１１】
前記容器に、前記バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対して、前記フィルターを介して液の流通を共有する共有空間が設けられていることを特徴とする請求項９に記載のバイオセパレーション用キット。
【請求項１２】
前記容器における前記バイオセパレーション用フィルターを介した両側が、外部へ開放されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のバイオセパレーション用キット。
【請求項１３】
前記容器における前記バイオセパレーション用フィルターを収納する内部空間の内径もしくは内幅、または前記リブもしくは前記フィルターから上側に形成された前記容器の上部側内部空間の高さが５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載のバイオセパレーション用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、蛋白質、細胞などの生体成分をＢ／Ｆ分離により分離するバイオセパレーション用フィルターおよびそれを用いたバイオセパレーション用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、蛋白質、細胞などの生体成分を分離するバイオセパレーションは、医療、診断およびバイオテクノロジーの分野において不可欠な技術である。バイオセパレーションには各種の方法があるが、プローブあるいはリガンドを固定化した担体に被検体中のターゲット物質を捕捉させた後、担体に捕捉されない他の物質から担体を分離するいわゆるＢ／Ｆ（Bound form / Free form）分離、あるいはアフィニティー分離は、現在でも有力な方法として使用され、各種の方法が知られている。
【０００３】
例えば、遠心分離法は、ビーズなどのプローブ固定化担体と、この固定化担体に捕捉されない非捕捉物との比重差を利用して遠心分離により固定化担体を沈降させた後、上清を除去する方法であり、広く用いられている（非特許文献１）。この方法では、遠心力および遠心分離の時間を調整することで、固定化担体と非捕捉物との重力差がかなり小さい場合であっても分離できるが、過剰の遠心力を与えると、固定化担体の凝集、捕捉物質の破壊などを生じることがある。
【０００４】
また、プローブを固定したゲルを担体とし、アガロースゲルなどを充填したカラムを用いてターゲット物質を捕捉分離するアフィニティークロマトグラフも広く用いられている。この方法では、ゲルをカラムに充填する必要があり、充填操作が煩雑でコストを要し、また、カラムに流す液体の流速とカラム背圧は逆相関の関係にあるため、分離能力を上げるために流速を上げると被検体の濾過圧力が高くなり、その結果、ゲルの変形、カラムの破壊などが起き易くなるので流速が制限される。
【０００５】
また、ビーズなどのプローブ担持粒子をフィルターで分離する方法も広く用いられている（特許文献１）。分離用のフィルターとしては、ガラス繊維濾紙、メンブレンフィルター等が使用されており、これらのフィルターの厚さは通常１００μｍから数ｍｍである。これらのフィルターは、フィルターの孔が三次元的に入り組んだ構造をしており、孔の表面積が非常に大きいため、濾過抵抗が非常に大きく、通常は１００〜１０００ｈＰａ（０．１〜１気圧）の濾過抵抗を必要とする。このため、フィルターを収納する容器は、容器あるいは容器とフィルターとの接続部がこの濾過抵抗に耐え得るように、機械的強度を大きくする必要があり、微小な容器を用いることは困難である。また、フィルター内部の表面積が非常に大きいために、被検体を流通させた後のフィルター内部には非特異吸着物が多数存在しているが、濾過および洗浄は一方向への送液で行う必要がある。即ち、逆方向へ送液して洗浄を行うと、フィルター内部に付着した非特異吸着物が再びプローブ担持粒子に付着するため、洗浄は一方向からの送液で行う必要があり、正逆方向からの送液による充分な洗浄を行うことが難しい。
【０００６】
上記のようにフィルターの孔が三次元的に入り組んだ構造ではなく、ストレートな孔が形成されたフィルターとして、ポリエステル、ポリカーボネート等のフィルムに電子線で孔を形成したフィルター（商品名：サイクロポア  ワットマン株式会社製）が市販されている。しかしこのフィルターは材質がポリエステル、ポリカーボネート等であるため疎水性であり、バイオ溶媒である水系の溶液は透過し難く、また孔間隔が非常に広くランダムで開口率が非常に低いために濾過抵抗が高くなる。
【０００７】
また、アルミニウムを陽極酸化した孔径が２００μｍ以下のフィルター（商品名：アノポア  ワットマン株式会社製）も市販されている。しかし、このフィルターでは被検体の不純物などによりフィルター孔が目詰まりする可能性が高い。このフィルターを使用する際には、フィルターの機械的な強度が小さいので、樹脂容器の底面に設けられたメッシュ状支持体の上にフィルターを載せた状態で使用される。このため、支持体とフィルターとの間隙に被検体などが入り込む可能性がある。
【０００８】
上記のような現状において、バイオセパレーションでは、被検体にダメージを与えず、Ｂ／Ｆ分離効率が高く、濾過抵抗が低く、かつ簡便にターゲット物質の分離が可能な技術が求められている。
【特許文献１】特開昭63-270000号公報
【非特許文献１】Nucleic Acid Research 第１４巻 p5037-5048(1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、被検体にダメージを与えず、Ｂ／Ｆ分離効率が高く、濾過抵抗が低く、かつ簡便にターゲット物質の分離が可能なバイオセパレーション用フィルターおよびバイオセパレーション用キットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のバイオセパレーション用フィルターは、軸線がストレートな細孔が、孔径が分布を有するように形成されたフィルターと、該フィルターと実質的に一体化されたリブと、を備えることを特徴とする。
【００１１】
前記フィルターの厚さは、１〜１００μｍであることが好ましい。
前記フィルターの開口率は、１５〜６０％であることが好ましい。
前記フィルターの材質は、シリカ、チタニア、アルミナ、ニッケル、金、チタン、アルミニウム、またはステンレスであることが好ましい。
【００１２】
上記の発明の好ましい態様では、第１のフィルターが前記リブの一端側に設けられるとともに、該リブを挟んでその他端側に第２のフィルターが設けられている。
上記の発明の好ましい態様では、前記ウエルに、プローブ担持粒子（リガンドを担持した粒子を含む）が分散された分散液が収容される。
【００１３】
前記ウエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液を収容する場合、前記プローブ担持粒子の粒子径が実質的に均一であり、該粒子径ｄと、前記フィルターに形成された細孔の孔径ｈと、該細孔の孔間隔ｐとの関係が、ｄ＞ｈ＋ｐであることが好ましい。
【００１４】
上記の発明の好ましい態様では、前記フィルターを固定化担体として、プローブが結合される。
本発明のバイオセパレーション用キットは、上記のバイオセパレーション用フィルターと、該バイオセパレーション用フィルターを収納する容器と、を備えることを特徴とする。
【００１５】
上記の発明の好ましい態様では、前記容器に、前記バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対応して互いに独立した複数の独立空間が設けられている。
上記の発明の好ましい態様では、前記容器に、前記バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対して、前記フィルターを介して液の流通を共有する共有空間が設けられている。
【００１６】
上記の発明の好ましい態様では、前記容器における前記バイオセパレーション用フィルターを介した両側が、外部へ開放されている。
前記容器における前記バイオセパレーション用フィルターを収納する内部空間の内径もしくは内幅、または前記リブもしくは前記フィルターから上側に形成された前記容器の上部側内部空間の高さは、５ｍｍ以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のバイオセパレーション用フィルターおよびバイオセパレーション用キットは、Ｂ／Ｆ分離時に被検体にダメージを与えず、Ｂ／Ｆ分離効率が高く、かつ濾過抵抗が低く、簡便にターゲット物質の分離が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。図１(ａ),（ｂ）は、
本発明の一実施形態におけるバイオセパレーション用フィルターの断面図である。図示したように、図１（ａ）のバイオセパレーション用フィルター１は、その上面にフィルター２が設けられ、フィルター２の下部側にフィルター２と実質的に一体となったリブ４が形成されている。フィルター２には、孔の軸線がストレートな細孔３が形成されている。
【００１９】
図１（ｂ）のバイオセパレーション用フィルター１は、その底部にフィルター２が設けられている。フィルター２には、図１（ａ）のバイオセパレーション用フィルターと同様に、孔の軸線がストレートな細孔３が形成されている。フィルター２の上面側には、フィルター２と実質的に一体化されたリブ４が設けられ、リブ４を側面とし、フィルター２を底面としてウエル５が構成されている。
【００２０】
リブ４は、ウエル５の側壁として機能し、またフィルター２を補強するための補強材の機能を担う。リブ４は任意の形状とすることができるが、フィルター２の強度を維持するためには、リブ４は、各ウエル５の側面を構成する周囲が閉ざされた孔部が形成された連続した壁であることが望ましい。即ち、リブ４が連続して一体に形成され、その中にフィルター２を底面としたウエル５が存在する構造が、機械的な強度の点で最も好ましい。このようなリブ４を実際に形成した例を図１８に示す。
【００２１】
バイオセパレーション用フィルターに設けられるウエルの数は任意であり、１つであっても多数であってもよい。図１（ａ）の実施形態ではフィルターを上面に有する構造を、図１（ｂ）ではフィルターを底面に有する構造を示しているが、フィルターを上面に有する構造および底面に有する構造のいずれであってもよい。
【００２２】
本明細書において「フィルターとリブが実質的に一体化された」とは、フィルターとリブが同一材料から一体に形成されることを意味している。フィルターとリブを一体に形成する方法としては、同一材料からフィルターとリブを、エッチング等のサブトラクティブ法で作製する方法、電鋳のアディティブ法、インプリント（ナノインプリント）法等で作製する方法が挙げられる。
【００２３】
また、シリコンウエハーなどの金属の表面に酸化膜を形成し、金属と酸化膜とのエッチングレートの差異を利用してフィルターとリブを作製することができ、この場合も金属と酸化膜が一体に形成されているので、フィルターとリブが実質的に一体化されたものとみなされる。
【００２４】
フィルターとリブを一体構造とすることで、フィルターの機械的な強度が増し、さらにフィルターとリブとの間に被検体などの不純物が入り込まず、Ｂ／Ｆ分離能力の高いフィ
ルターとすることができる。
【００２５】
本明細書において、フィルターに形成された「ストレート」な細孔とは、細孔が途中で分岐することなく形成され、孔の軸線（中心線）が直線状であることを意味する。例えば、一方のフィルター表面に形成された開口の中心から他方のフィルター表面への垂線と、他方のフィルター表面に形成された開口の中心から前記一方のフィルター表面への垂線とがずれていても、圧力損失という点ではそれほど遜色がないため、このような細孔であってもよい。貫通方向と垂直な細孔断面の形状は特に限定されず、孔の形状は円柱、四角錐、多角錐などいずれの形状であってもよいが、メニスカスを最小限にする点では細孔断面が鈍角形状あるいは円形であることが望ましい。
【００２６】
このようにストレートな細孔とすることにより、細孔の長さが最小となるため、流通液と細孔壁との接触面積が減少し、濾過に伴う圧送抵抗を最小限とすることができる。また、被検体中における非特異吸着物の細孔への付着を最小化することができ、非特異吸着物の洗浄除去が容易となる。例えば厚さ２μｍで孔径が４μｍのシリカ層フィルターの場合、１０〜５０ｇｆ／ｃｍ2の差圧で濾過することが可能であり、後述するバイオセパレー
ション用キットにおいて、バイオセパレーション用フィルターを収納する容器として機械的な耐圧強度を最小にした薄い容器壁構造にすることが可能であり、極めて微小な容器を使用できる。
【００２７】
本発明では、フィルターの細孔が孔径分布を有している。なお、本明細書において「フィルターの細孔が孔径分布を有している」とは、ランダムな孔径パターンを有する場合および所定の孔径パターンを有する場合の２つの場合を表している。これらのいずれの場合であっても、孔径のＣＶ(Coefficient of Variation)値は２０％よりも大きく、好ましくは３０〜３００％、より好ましくは５０〜２００％である。なお、このＣＶ値を算出する際に、他の多数の細孔に比べてその径が、意図しない程度に特に大きく形成された細孔は除外するものとする。
【００２８】
このようにフィルターの細孔径に分布を与えることで、濾過の際に、プローブ担持粒子が細孔を閉塞することによる濾過圧の上昇を有効に防止することができる。
孔径分布を有する孔径パターンの一つの形態として、隣り合わせた細孔の孔径が異なると共に、１つおきに孔径が同一となるパターンが挙げられる。この場合、均一な粒子径を有するプローブ担持粒子を使用した際に、粒子が細孔を塞ぐ確率が低下するために、フィルターの濾過性が良好になる。この場合において、プローブを担持する粒子が実質的に均一な粒子径を有し、その粒子径ｄと、フィルターに形成された細孔の孔径ｈと、隣り合う２つの細孔３，３間の孔間隔ｐとの関係が、ｄ＞ｈ＋ｐであることが好ましい。なお、ここで細孔の孔径ｈおよび孔間隔ｐは、ウエルの上面もしくは下面を構成するフィルター部全体での平均値である。上記の関係を満たす場合、粒子がフィルター細孔を塞ぐ確率が著しく低下する。
【００２９】
また、孔径分布を有する孔径パターンの他の形態として、ウエル中心付近の細孔の孔径を大きくし、あるいは孔間隔を密にすることでこの領域の開口面積を大きくすると共に、ウエル周縁付近の細孔の孔径を小さくし、あるいは孔間隔を疎にすることでこの領域の開口面積を小さくしたパターンが挙げられる。この場合、フィルターの強度を高めることができる。
【００３０】
また、孔径分布を有する孔径パターンの他の形態として、ウエル中心付近の細孔の孔径を小さくし、あるいは孔間隔を疎にすることでこの領域の開口面積を小さくすると共に、ウエル周縁付近の細孔の孔径を大きくし、あるいは孔間隔を密にすることでこの領域の開口面積を大きくしたパターンが挙げられる。この場合、被検体が均一にフィルター細孔を
通過するためにフィルターの濾過性を向上することができる。
【００３１】
細孔の孔径は、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１μｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは３μｍ〜２０μｍである。孔径が１μｍ未満である場合、被検体が目詰りし易くなる。また、孔径が５０μｍを超えると、プローブをフィルター面に固定する場合には、フィルター細孔の表面積が小さくなり、またプローブを粒子に固定する場合には、大きな粒子を使用することになるので、いずれの場合もプローブ量が少なくなり、被検体からのターゲット物質の濾過性が低下する。
【００３２】
フィルターの孔間隔（隣接する各細孔の間における孔が開いていない部分の最短距離）は、特に制限は無いが、好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、孔間隔が均一である方がフィルター強度の点で好ましい。フィルターの孔間隔が１μｍ未満である場合、機械的な強度が不足することがあり、孔間隔が１０μｍを超えるとフィルターの開口率が低下し過ぎることがある。
【００３３】
フィルターの厚さは、好ましくは１μｍ〜１００μｍであり、より好ましくは１μｍ〜２０μｍ、さらに好ましくは２μｍ〜１０μｍである。厚さが１μｍ未満である場合、フィルターの強度が不足することがあり、厚さが１００μｍを超えると細孔の側面の面積が大きくなり濾過抵抗が過剰に大きくなることがある。
【００３４】
フィルター開口率は、好ましくは１５％〜６０％である。開口率が１５％未満である場合、濾過抵抗が過剰に大きくなることがあり、開口率が６０％を超えるとフィルターとしての機械的な強度が不足することがある。ここで開口率とは、フィルターに形成された各細孔の横断面における平均面積の総和に対する、これらの細孔が形成された領域におけるフィルター面の全面積の比の百分率である。開口率は、原則として１つのウエルの底面もしくは上面を構成するフィルター部分の全面についてのものであり、ウエルの側壁面積部分を除外した数字である。
【００３５】
フィルターの材質は、フィルターを形成できるものであれば特に限定されず、例えば金属、金属酸化物、有機材料などを使用することができるが、特に好ましいのは機械的強度が高い材料であり、具体的には、例えば液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド樹脂、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンなどのエンジニアリングプラスチック；鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、シリコン、チタン、タンタル、マグネシウム、モリブデン、タングステン、ロジウム、パラジウム、銀、金、白金、ステンレス、真鍮、黄銅、青銅、燐青銅、アルミ銅合金、アルミマグネシウム合金、アルミマグネシウムシリコン合金、アルミ亜鉛マグネシウム銅合金、鉄ニッケル合金などの金属；シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化タンタルなどの金属酸化物；ＳｉＮ、ＴｉＮ、ＴａＮなどの金属窒化物；ＳｉＣ、ＷＣなどの金属炭化物；ダイヤモンド、グラファイト、Diamond Like Carbon(ＤＬＣ)などの炭素材料；ソーダガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（登
録商標）、石英ガラスなどのガラスが挙げられる。
【００３６】
これらの中でも、シリカ、チタニア、アルミナ、ニッケル、金、チタン、またはステンレスが好ましい。これらは機械的な強度が高く、フィルターを薄い膜厚とすることができ、かつ比較的親水性であるので水系のバイオ溶液との親和性が高く、フィルター細孔へ容易に被検体を入れることができる。なお、これらを基材として使用し、その表面を酸化するか、あるいは別の材料により表面処理剤で表面処理してもよい。表面処理としてコロナ処理を施してもよい。表面処理剤としては、例えば、アルコール、親水化剤、疎水化剤、蛋白などのバイオ材料の非特異吸着防止剤などが挙げられる。
【００３７】
本発明のバイオセパレーション用フィルターは、フィルターなどを電気メッキにより積み上げる方法で製造することができる。この方法では、予め導電性を付与する処理がなされた基板を用意し、その上にフォトリソグラフィー法あるいはインプリント法等でパターニングを行い、電気メッキしない部分をレジストで保護して、基板とメッキ溶液との間に電流を流すことにより基板の所定部分にのみ金属材料を形成する。
【００３８】
先ず、導電性を付与する処理がなされた基板を用意し、その上にレジストを塗布して膜形成する。次に、フォトマスクを用意してＵＶ光で露光現像し、前記基板の上にフィルターの反転パターンであるレジストのポストを形成する。パターン限界はレジストの解像度に依存するが、例えばＴＨＢ−１１０Ｎ（商品名：ＪＳＲ株式会社製）を使用することで、パターンピッチが５μｍ、アスペクト比が２であるレジストポストを作製することができる。
【００３９】
次に、電気メッキ法により、これらのポストの間に金属を、交流もしくは直流の電流を流して電気的に充填する。電気メッキ法により充填される金属材料としては、例えば、金、ニッケル、銅、鉄、鉄ニッケル合金等が挙げられる。ニッケル電鋳のためのメッキ液としては、スルファミン酸ニッケル浴(スルファミン酸60%液700g/l、臭化ニッケル5g/l、硼酸35g/lの混合液、浴温50℃)などが用いられる。例えば、スルファミン酸ニッケル浴の場合、電圧６Ｖ、電流密度３Ａ/ｄｍ2で１０分〜２０分程度直流を流すことによって厚さ５μｍの電気メッキ物を得ることができる。
【００４０】
このようにしてフィルターを作製した後、リブを、フィルターの形成方法と同様に、さらに電気メッキ法により形成する。即ち、上記と同様にフィルターの上にレジスト膜を形成し、フォトエッチングによりパターンを形成し、次いで電気メッキ用材料の充填を行う。この場合、一般にリブの高さはフィルターの厚さ以上であるためにレジスト膜も厚くなり、このためレジストはドライフィルムレジストを積層して使用することが好ましい。一般に、線幅と厚さのアスペクト比が２を超えるメッキ物の形成は１回では困難であり、このような場合にはフォトエッチングと電気メッキ法によるメッキ物の形成を数回繰り返すことで所定の高さのリブとする。
【００４１】
また、本発明のバイオセパレーション用フィルターは、フィルター、リブの少なくともいずれかをエッチング法で作製することにより製造することができる。エッチングの対象物は、フィルターを形成できるものであれば、金属、金属酸化物、有機物など特に限定されないが、特に好ましいのは機械的強度が高い材料であり、具体的には、例えば液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド樹脂、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンなどのエンジニアリングプラスチック；鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、シリコン、チタン、タンタル、マグネシウム、モリブデン、タングステン、ロジウム、パラジウム、銀、金、白金、ステンレス、真鍮、黄銅、青銅、燐青銅、アルミ銅合金、アルミマグネシウム合金、アルミマグネシウムシリコン合金、アルミ亜鉛マグネシウム銅合金、鉄ニッケル合金などの金属；シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化タンタルなどの金属酸化物；ＳｉＮ、ＴｉＮ、ＴａＮなどの金属窒化物；ＳｉＣ、ＷＣなどの金属炭化物；ダイヤモンド、グラファイト、Diamond Like Carbon(ＤＬＣ)などの炭素材料；ソーダガラ
ス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（登録商標）、石英ガラスなどのガラスが挙げられる。
【００４２】
エッチングは通常の方法によって行うことができる。但し、アスペクト比が余りに大きいエッチングはその孔径や形状が不均一になる可能性があり、実質的には、通常の化学エッチングで得られるアスペクト比としては５以下、好ましくは３以下である。但し、このアスペクト比の範囲で積極的に逆テーパ形状を形成したフィルターを使用することで、濾
過性を向上させることもできる。
【００４３】
ウエル、リブあるいはこれらの両方をエッチングで作製する場合、そのアスペクト比が５以上であることが望ましいが、異方性エッチングによりアスペクト比が５以上のエッチングを行うことができる。例えば、シリコンなどの単結晶材料が、ＫＯＨ水溶液やエチレンジアミン・ピロカテコール(EDP)、４メチル水酸化アンモニウム(TMAH)などのエッチン
グ液に対して大きな結晶面依存性を示すことを利用する。シリコンの場合は（１１１）面のエッチング速度が他の結晶面に対して極端に遅く、（１１０）面を表面としたシリコンウエハーを用いて、マスク材の開口の辺を（１１１）面方向と揃えて化学的エッチングを行うことでアスペクト１００程度のエッチングを行うことができる。これらの方法は、精密工学会、編著：「ナノスケール加工技術」、日刊工業新聞社(1993)に記載されている。
【００４４】
また、必要に応じて、プラズマを用いた反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を行うことができる。例えば、ＳＦ6にフレオン系の塩素ガスを含むガスによって、基板に垂直な異
方性エッチングを行うことができる。これらの方法は、「’０２最新半導体プロセス技術」、プレスジャーナル社(2001)に記載されている。
【００４５】
エッチングによりフィルターとリブを作製する方法の中で特に好ましい方法は、組成の異なる複数の材質からなるプレート、例えばアルミ／アルミナ、金属シリコン／シリカ、あるいは金属チタン／チタニアなどについて、それぞれ両側からパターンエッチングを行うことによりフィルターとリブを形成する方法である。具体的には、片側組成層、例えばアルミナ、シリカ、チタニアなどの金属酸化物層を、酸化物層と金属層との境界までパターンエッチングしてフィルターを形成し、次いでアルミ、金属シリコン、金属チタンなどの金属層を、金属層と酸化物層との境界までパターンエッチングすることにより、リブとフィルターとを一体に形成することができる。
【００４６】
このように組成の異なる２層が一体化した材料としては、例えばアルミ板の表面を所定の厚さまで酸化してアルミナとしたアルミ／アルミナ板、金属チタンを同様に酸化した金属チタン／チタニア、酸化膜付きシリコンウエハー、あるいはＳＯＩ(Silicone On Insulator)ウエハーなどが使用できる。
【００４７】
また、本発明のバイオセパレーション用フィルターは、インプリント法により作製することができる。即ち、予めＭＥＭＳプロセスなどにより作製した２段の凸型金型を用いて、樹脂プレートをプレス成形することにより当該フィルターを作製できる。
【００４８】
なお、孔径分布を有する孔径パターンが形成されたフィルターの作製方法は、前記フォトレジスト用マスクまたはインプリント金型において、マスクパターンあるいは凸型金型を、孔径分布を有するように設計することで得ることができる。
【００４９】
図１（ｃ）は、本発明の他の実施形態におけるバイオセパレーション用フィルターを示した断面図である。図示したように、このバイオセパレーション用フィルター１には、第１のフィルター２ａが底部に設けられるとともに、リブ４を挟んで第１のフィルター２ａとは反対側に、第２のフィルター２ｂが設けられている。
【００５０】
図１（ｃ）のような構造とすることにより、複数の完全に独立したウエルが形成され、例えば異なるプローブを結合した各粒子を、それぞれのウエルに分割収納することが可能となる。また、ウエルの高さが均一であるために、被検体と、粒子に担持されたプローブとの反応空間が狭い範囲に制御され、反応速度を向上させることができる。
【００５１】
このバイオセパレーション用フィルターは、リブの片側にフィルターが設けられた一対
のバイオセパレーション用フィルターを、これらのリブを突き合わせて接合することにより作製することができる。例えば、プローブ担持粒子を片方のバイオセパレーション用フィルターのウエル内へ収納した後に、他方のバイオセパレーション用フィルターが取り付けられる。その取り付け方法としては、接着剤、磁力、機械的な嵌合、平滑部同士の面接合、機械的な加圧などが挙げられる。また、図１（ｃ）のバイオセパレーション用フィルターと、これを収納する容器とからなるバイオセパレーション用キットは、例えば、片側にフィルターが設けられた一対のバイオセパレーション用フィルターのうち一方を上容器に取り付け、他方を下容器に取り付けておき、上容器と下容器とを対向させて、粘着剤、磁石、クランプなどによる機械的な加圧などによってこれらを取り付けることで作製できる。
＜プローブ担持粒子分散液の収容＞
図１（ａ）〜（ｃ）に示したような本発明のバイオセパレーション用フィルターには、そのウエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液が収容される。各ウエルにプローブ担持粒子を収納する態様としては、同一のプローブが担持された粒子を各ウエルに収容する態様と、互いに異なるプローブが担持された粒子を各ウエルに収容する態様とを挙げることができる。
【００５２】
互いに異なるプローブが担持された粒子を各ウエルに収容する場合、図２に示したように、フィルター２を底部側にして各ウエル５毎に異なるプローブが担持された粒子２１ａ〜２１ｄを入れることができる。
【００５３】
また、同一のプローブが担持された粒子を各ウエルに収容する場合、図３（ａ）に示したように、フィルター２を底部側にして各ウエル５毎に同一のプローブが担持された粒子２１を入れるようにしてもよく、あるいは、図３（ｂ）に示したように、フィルター２を上部側にして、キットの容器１２の側壁とフィルター２とにより形成される空間をウエルとして粒子を入れるようにしてもよい。
【００５４】
また、図４（ａ）および図４（ｂ）に示したように、一対のフィルター２ａ，２ｂをリブ４を挟んで対向させた各空間（ウエル５）に、同一のプローブが担持された粒子２１（図４（ａ））または異なるプローブが担持された粒子２１ａ〜２１ｄ（図４（ｂ））を入れることができる。
【００５５】
粒子に担持するプローブあるいはリガンドとしては、例えば、核酸、分子量５００〜１００万のタンパク質、脂質、糖鎖、細胞、タンパク質発現細胞、アプタマー、ウイルス、酵素、薬理活性を有する分子量５０〜１００万のリード化合物、あるいは特定の生理活性作用を持つか、これを持つ可能性のある化学物質が挙げられる。
【００５６】
プローブを担持する粒子としては、有機粒子、無機粒子、有機無機複合粒子を挙げることができる。有機粒子としては、例えば、ブタジエン系、スチレン系、ジビニルベンゼン系、アクリロニトリル系、アクリレート系、メタクリレート系、アクリルアミド系、ベンゾグアナミン系、ナイロン系、ポリビニルアルコール系、またはフッ素系等のモノマーを、単独であるいは２種以上を組み合わせて用いたモノマー原料から、乳化重合あるいはサスペンション重合により得られた粒子が挙げられる。あるいは、均一孔を持つ多孔質プレートから樹脂を押し出して粒子を作製する膜乳化による方法で得られた粒子も使用できる。これらの粒子は必要に応じて分級機にて粒子径を揃えてもよい。
【００５７】
また、重合時にあるいは重合後にフェライト等の磁性体を添加して得られた粒子、あるいは特開平１０−８３９０２号などの方法にて粒子をフェライトメッキしたもの、あるいはセルロース、デンプン、アガロース、ガラクトース等の天然物架橋ゲル、アクリルアミド等の合成架橋ゲルも使用できる。
【００５８】
無機粒子としては、例えば、金属酸化物粒子、金属硫化物粒子、金属粒子が挙げられる。金属酸化物粒子として最も好ましいのはシリカ粒子であり、市販されている各種のシリカ粒子を使用できる。
【００５９】
上記粒子の表面を、アミノ基、カルボキシル基、カルボジイミド基、エポキシ基、トシル基、Ｎ−サクシイミド基、マレイミド基、チオール基、スルフィド基、ヒドロキシル基、トリメトキシシリル基、ニトリル三酢酸基、ベンゾスルホアミド基、ポリエチレンイミン基等の各種官能基、あるいはγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランなどにより表面修飾して、プローブ結合サイトとすることができる。
【００６０】
プローブを担持する粒子として有機粒子を使用する場合、その粒子径は１．５μｍ〜１２０μｍが好ましく、より好ましくは１．５μｍ〜３０μｍ、さらに好ましくは３μｍ〜１５μｍである。粒子径が小さい場合にはハンドリング性に難点が生じ、これらの粒子を捕捉するフィルターの作製が困難となり、またフィルター孔が小さいために被検体が目詰まりし易くなる。また粒子径が大きい場合には、ウエル単位容積当たりの粒子の表面積が相対的に小さくなり、プローブ量が減少したり、あるいは立体障害のために反応性が低下したりすることがある。
【００６１】
好ましくは、プローブを担持する粒子が実質的に均一な粒子径を有し、図５に示したように、その粒子径と、フィルター２に形成された細孔３の孔径と、隣り合う２つの細孔３，３間の孔間隔との関係が、ｄ＞ｈ＋ｐである。ここで、ｄはプローブ担持粒子２１の粒子径、ｈはフィルター２に形成された細孔３の孔径、ｐは隣接する細孔３，３間の孔間隔である。なお、ここで細孔３の孔径および細孔３，３間の孔間隔は、ウエルの上面もしくは下面を構成するフィルター部全体での平均値である。
【００６２】
上記の関係を満足させて、粒子数を細孔数よりも多くすることにより、粒子をフィルターに多段に積層して洗浄および濾過を行う際に、粒子が多くの細孔を閉塞することがないため、濾過性の低下を有効に防止することができる。
【００６３】
プローブ担持粒子を各ウエルへ収納する方法としては、各ウエルに対応した各種のプローブを粒子に予め固定化しておき、これをスポッター等により対応するウエル内に投入する方法が挙げられる。あるいは、プローブ結合サイトを表面に有する粒子をスポッター等により各ウエルに投入し、次いで、所定のウエルに対応した、種類の異なるプローブをスポッター等で対応するウエルに投入するようにしてもよい。
【００６４】
各ウエルへ収納するプローブ担持粒子の絶対数は、粒子分散液の投入時にフローサイトメーターで粒子を個別に制御し、ＣＣＤカメラなどで個々の粒子を実際にカウントしながら投入することにより制御することができる。あるいは、予め粒子分散液の粒子濃度を測定しておき、当該分散液の粒子濃度と粒子の比重から粒子数を計算して、この結果から逆算した粒子分散液の量をスポッター等で投入することで、近似の粒子数をウエルに投入することができる。また、複数回に分けて所定数の粒子をスポットし、スポットした粒子数をその都度カウントして不足量を算出し、不足量が近似的にゼロとなるまでスポットを行うようにしてもよい。ここで、各ウエルに収納される粒子数は、ある程度の近似的な同一性があればよいが、その誤差範囲はＣＶ値で２０％以内であることが好ましく、より好ましくは１０％以内である。
＜プローブのフィルターへの固定化＞
図６および図７は、本発明の他の実施形態におけるバイオセパレーション用フィルターを示した断面図である。図示したように、本実施形態ではバイオセパレーション用フィルター１におけるフィルター２を固定化担体として、その両面および細孔内表面にプローブ
２２を結合させている。
【００６５】
図６（ａ）では、各ウエル５の底部に設けられたフィルター２に、各ウエル５について同一のプローブ２２を固定化している。一方、図６（ｂ）では、各ウエル５の上部に設けられたフィルター２に、各ウエル５について同一のプローブ２２を固定化している。
【００６６】
図７（ａ）では、各ウエル５の底部に設けられたフィルター２に、各ウエル５について互いに異種のプローブ２２を固定化している。一方、図７（ｂ）では、各ウエル５の上部に設けられたフィルター２に、各ウエル５について互いに異種のプローブ２２を固定化している。
【００６７】
本実施形態では、ストレートな細孔が形成されたフィルターにプローブを固定化しているので、濾過抵抗が少なく、このため濾過時間を短くすることができ、さらにターゲット物質の損傷を最小限に留めることができる。また、従来のメンブレンフィルターを用いた場合に比較すると、プローブとターゲット物質との反応は非常に早く、濾過洗浄も容易である。
【００６８】
このようにフィルターへプローブを固定化する場合、フィルターの表面積を大きくするために、フィルターの膜厚を適度に厚くすることが好ましく、フィルターの膜厚は、好ましくは５μｍ〜１００μｍである。膜厚が５μｍ未満である場合、固定化担体としての表面積が小さ過ぎることがあり、１００μｍを超えると濾過抵抗が過剰に大きくなることがある。
【００６９】
このようにフィルターへプローブを固定化したバイオセパレーション用フィルターでは、フィルターの細孔径が分布をもつ形態の他、細孔径を均一とした形態であってもよい。
フィルターへのプローブまたはリガンドの固定化は、例えば次のようにして行うことができる。まず、フィルターに対して、プローブまたはリガンドのリンカーをスポッターなどで投入し、リンカーをフィルターに固定化させる。次に、未固定のリンカーを洗浄除去した後、プローブまたはリガンドを投入してリンカーと結合させ、最後に未結合のプローブまたはリガンドを洗浄除去する。
【００７０】
プローブがオリゴＤＮＡやペプチドの場合は、ホスホアミダイトやアミノ酸ＮＣＡモノマーをスポッターなどでウエルに投入し、所定条件下においてフィルターを固相として固相重合することにより、いわゆるＩｎ Ｓｉｔｕ重合でプローブを形成することも可能で
ある。具体的には、例えば特公平７−５３７４９号公報、特開昭６１−２０５２９８号公報などに記載の方法で、このようなプローブ形成を行うことができる。
【００７１】
投入するプローブあるいはプローブ前駆体を、ウエル毎に同一とするか、あるいは互いに異なるようにすることで、図６のように各ウエルに同一のプローブを形成したり、あるいは図７のように各ウエルに互いに異なるプローブを形成したりすることができる。
＜バイオセパレーション用キット＞
上述してきた本発明のバイオセパレーション用フィルターは、これを内部に収納する容器とともに分離用キットとして使用される。図８〜図１７は、このバイオセパレーション用キットの実施形態を示した断面図である。
【００７２】
バイオセパレーション用フィルターを収納する容器は、バイオセパレーション用フィルターを内部に収納する構造であれば各種の形状であってよい。例えば図８（ａ）では上面が全面開放された形状を有している。図８（ｂ）では、上面が部分的に開放された形状を有しており、即ち、フィルター径よりも小さい径を有する外部への開放部１３が容器上面に形成されている（なお、以下において、開放部１３は、バイオセパレーション用フィル
ターが収納される容器の収納空間から分岐してその一端が容器外部または当該容器に設けられた別途の空間に開放された連通孔を意味している）。図９では上面がテーパ状に形成され、その頂部に外部への開放部１３が形成されている。この他、下面が閉鎖された形状、下面が全面もしくは部分的に開放された形状であってもよい。なお、ここで上面、下面という表現は便宜的なものであり、場合に応じて容器面を上下逆転して使用するようにしてもよい。また、図１０のようにフィルター面を縦方向にして、容器の開放面を左右に設けた形態であってもよい。
【００７３】
また、図１５〜図１７に示したように、バイオセパレーション用フィルター１を介した両側に、全面が開放された開口または部分的に外部へ開放された開放部１３を設けた形態であってもよい。図１５（ａ）では、その両面側に全面が開放された開口が設けられ、フィルター面と同等の内径を有し内部空間が容器の上面から下面へストレートに形成された容器１２を用いている。図１５（ｂ）では、一面側に全面が開放された開口が設けられ、他面側に、フィルター内径よりも小さい内径である、部分的に外部へ開放された開放部１３が設けられた容器１２を用いている。図１６では、バイオセパレーション用フィルター１を介した両側の側面部に、外部へ開放された開放部１３が設けられた容器１２を用いている。図１７では、バイオセパレーション用フィルター１を介した両側の上面部および底面部に、フィルター内径よりも小さい内径である、部分的に外部へ開放された開放部１３が設けられた容器１２を用いている。
【００７４】
このバイオセパレーション用キットでは、プローブ担持粒子をウエルに収納したバイオセパレーション用フィルター（あるいは図６および図７のようにフィルターにプローブを固定化したバイオセパレーション用フィルター）に被検体を投入して反応させ、次いでターゲット物質が捕捉されたプローブ担持粒子（図６および図７の場合ではターゲット物質が捕捉されたプローブ担持フィルター）に洗浄液を接触させて非捕捉物質を洗浄除去することによって、ターゲット物質を被検体中の他の物質から選択的に分離する。また、剥離液をウエルに投入して各ウエル内のターゲット物質をプローブ担持粒子から剥離し、容器に形成された所定の収容空間に取り出すことも可能である。
【００７５】
本発明のバイオセパレーション用キットは、以降に詳述するように、次のように使用される。例えば、容器に被検体、洗浄液、剥離液等の液を収容し、バイオセパレーション用フィルターと容器とを相対移動させ、これにより液の界面とフィルターとを接触させてウエル内にこれらの液を導入し、次いで、バイオセパレーション用フィルターと容器との相対移動（上下動）により、あるいは他の方法により、プローブ担持粒子とこれらの液とを攪拌する。あるいは、容器に設けた外部への開放部から差圧を作用させて被検体、洗浄液、剥離液等の液の界面を容器内で移動させ、これにより液の界面とフィルターとを接触させてウエル内にこれらの液を導入し、さらに差圧によって液を正逆方向に移動させることで、あるいは他の攪拌方法によってプローブ担持粒子とこれらの液とを攪拌する。
【００７６】
このように、容器に設けられた外部への開放部（バイオセパレーション用フィルターが収納される容器の収納空間から分岐してその一端が容器外部または当該容器に設けられた別途の空間に開放された連通孔）は、容器の上記収納空間への被検体、洗浄液、剥離液などの各液の導入および排出用の孔、差圧制御などの役割を果たす。
【００７７】
例えば、液を容器外へ排出させるために、この開放部の一端側に、液体を充填した排出液受け入れ容器を設置して、この排出液受け入れ容器内の液体と、キット容器の液排出孔として機能する上記の開放部とを接触させることにより容器内の液を排出することができる。
【００７８】
例えば容器の内径が１ｍｍ程度の狭い内径である場合、毛細管現象により液の排出が困
難であるが、例えば図１９に示したように、容器１２におけるバイオセパレーション用フィルター１を収納する収納空間の下方から、排出液を受け入れる下側の容器１２における各ウエル５に対応する隔離空間内のそれぞれに設けられた接触突起１８をフィルター２に接触させることで、ウエル内の液を瞬時に下側の容器１２に移動させることができる。
【００７９】
また、この開放部（液の入排出孔）または開放部の一端側に設置された入排出用容器に、差圧ポンプを連結することで差圧制御を行うことができる。この差圧ポンプにより、入排出用容器からキット容器に液を投入し、容器内で液を移動させ、容器から液を排出させることができる。
【００８０】
本発明のバイオセパレーション用キットにおける容器の形成材には、無機材料、有機材料、有機無機ハイブリッド材料を使用できる。無機材料としては、例えば、ニッケル、アルミニウム、シリコン、チタン、金、ステンレス等の金属；シリカ、アルミナ、チタニア等の金属酸化物、ソーダガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（登録商標）、石英ガラス等のガラスが挙げられる。
【００８１】
有機材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シクロオレフィン、ポリメチルペンテン、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンポリエチレンビニル、架橋ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸、ポリアミド、ポリイミド、セルロースアセテート、トリアセチルセルロース、硝酸セルロース、エポキシ、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリレートとの共重合体などの各種アクリレートの共重合体が挙げられる。
【００８２】
また、容器の形成材の表面に、プラズマ処理、コロナ処理、イオン処理などを施して、ヒドロキシル基、カルボキシル基などを形成してもよい。また、メッキなどにより表面に親水性の金属または金属酸化物を形成してもよく、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリレートとの共重合体、ポリエチレングリコール誘導体などの親水性材料をコーティングしてもよく、グリシジルメタクリレートを塗布した後にエポキシ基を開環してもよい。
【００８３】
容器は、例えば、プレス成形、射出成形、ブロー成形などの一般的な成形方法により作製することができ、またドリリング、レーザー、エッチングによる穴開けを適用してもよい。
【００８４】
本発明のバイオセパレーション用キットにおける一つの態様では、バイオセパレーション用フィルターが容器に固定される。この場合、例えば図１１（ａ）のように容器１２に段差部１４を設けて、この段差部１４にバイオセパレーション用フィルター１を嵌め合わせて接合することができる。あるいは、図１１（ｂ）のようにＯリング１５などのシール材を介して容器１２にバイオセパレーション用フィルター１を挟んでシールするようにしてもよい。
【００８５】
バイオセパレーション用フィルターを容器に接合して一体化する方法としては、容器とバイオセパレーション用フィルターとを接着剤で接着する方法、容器を成形する際にバイオセパレーション用フィルターと共にインサート成形する方法などが挙げられる。
【００８６】
本発明のバイオセパレーション用キットにおける一つの態様では、バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対して、フィルターを介して液の流通を共有する空間（以下、共有空間ともいう）が設けられている。このような共有空間が設けられたバ
イオセパレーション用キットを図１３および図１４に示した。
【００８７】
この共有空間１７は、フィルター２の下面側における容器１２の内部で構成される。バイオセパレーション用フィルター１が容器１２に固定されている場合には、これらが互いに固定された間の空間で共有空間１７が構成され、バイオセパレーション用フィルター１と容器１２とが互いに独立している場合には、バイオセパレーション用フィルター１を容器１２に収納することにより形成された空間で共有空間１７が構成される。
【００８８】
この共有空間１７には、図１４（ａ），（ｂ）に示したように、前述した開放部１３を容器１２の底面側もしくは側面側に設けてもよい。
このように共有空間１７を設けることによって、被検体などの各液を共有空間１７に収容し、バイオセパレーション用フィルター１と容器１２とを相対移動させるか、あるいは開放部１３から加減圧を行うことにより、フィルター２を介して複数のウエル５へ並列的に液を導入することができる。また、共有空間１７を介して各ウエル５の内外に液を出し入れして、各ウエル５に液を流通させることができる。
【００８９】
これにより、例えば異種のプローブ担持粒子を収納した各ウエル５に共有空間１７を介して被検体を流通させながら反応させることができる。共有空間１７と各ウエル５とは１層のフィルター２のみを介して隣接しているため、圧力損失は非常に小さく、また、各ウエル５への被検体の到達および各ウエル５におけるプローブ担持粒子との反応が並列で行われるため、プローブ担持粒子と被検体との接触および反応に要する時間が非常に短い。
【００９０】
なお、被検体、洗浄液等の各液を上記の共有空間に導入し、差圧により液面を移動させて反応、洗浄等を行うバイオセパレーション用キットでは、容器におけるバイオセパレーション用フィルターを収納する内部空間の、フィルター面方向もしくは容器の上下面の面方向と平行な面における内径ｄもしくは内幅ｄ、または、リブもしくはフィルターから上側に形成された容器の上部側内部空間の高さｈが、５ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは３ｍｍ以下、さらに好ましくは２ｍｍ以下である。なお、ここで「内径ｄ」とは、上記の平行面による容器の内部空間の断面形状が円である場合にはその直径を、楕円である場合には短軸の直径を表し、「内幅ｄ」とは、当該断面形状が正方形である場合にはその対向する両辺間の幅を、矩形である場合には対向する長辺間の幅を表し、当該断面形状がその他の場合であってもこれらと同様に規定される。内径ｄ（内幅ｄ）と高さｈの例を図２０（ａ）,（ｂ）に示した。図２０（ａ）では内径ｄ（内幅ｄ）および、リブ
４の上側に形成された容器１２の上部側内部空間の高さｈを、図２０（ｂ）ではフィルター２の上側に形成された容器１２の上部側内部空間の高さｈを示している。所定量の液を上記の共有空間に導入し、この共有空間の液面を上下方向に移動させる際に、容器の材質にもよるが、例えばガラスのような親水性材料の場合であっても上記の内径ｄ、内幅ｄおよび高さｈが５ｍｍを超える場合には、空気などの気体による差圧で液面を上昇させることが通常は困難である。
【００９１】
本発明のバイオセパレーション用キットを用いた被検体中のターゲット物質とプローブとの反応は、例えば次のように行われる。予め、バイオセパレーション用フィルターのウエルには所定のプローブ担持粒子を収納しておく。このバイオセパレーション用フィルターのウエル内に、被検体を投入して、被検体と、全てのウエル内のプローブ担持粒子とが接触可能な状態とする。この工程では、例えばウエルを容器内の被検体中で上下させるか、あるいは容器内の被検体の界面を差圧等により移動させることで、容器内の被検体とウエル内のプローブ担持粒子の分散液とを接触および一体化させ、被検体中のターゲット物質とプローブとの拡散（および反応）を行う。この際、底部のみにフィルターが設けられた図１（ｂ）のようなバイオセパレーション用フィルターを用いる場合には、ウエル内における液の界面高さは、リブの高さを超えないことが必要である。
【００９２】
ウエル内に所定の界面高さとなるまで被検体を投入する場合、バイオセパレーション用フィルターと容器とが独立したキットを用いて、予め容器に被検体を入れておき、そこにバイオセパレーション用フィルターを下に移動させて浸漬し、フィルターを介して各ウエル内に被検体を導入することができる。この際、フィルターの圧力損失がある場合には、バイオセパレーション用フィルターと容器とが相互に接する部分（例えば、バイオセパレーション用フィルターの外周部と容器の内周部）をシールして、フィルターに加圧力あるいは減圧力が負荷されるようにすることで、被検体を、フィルターを通過させて各ウエル内に導くことができる。
【００９３】
また、予め容器の底面とフィルターとの距離を一定とし、互いに固定したバイオセパレーション用キットを用いて、容器の低壁もしくは側壁に形成した開放部から、容器底部側とフィルター下面との間の共有空間（液収容室）を介してフィルター下面側から被検体を導入することができる。例えば、この共有空間に設けられた開放部から加圧空気を導入して容器内における被検体の界面を押し上げることによりウエル内に被検体を導入することができる。
【００９４】
また、被検体はウエル上面側の開口から投入してもよく、この場合には、スポッター等で各ウエル毎に均等量を投入することが好ましい。また、図１（ｃ）に示したような第１のフィルターおよび第２のフィルターでリブが挟まれたバイオセパレーション用フィルターを用いて、そのウエル内にプローブ担持粒子を収容する場合には、容器に設けた開放部から加圧して被検体をウエルへ送り込むか、あるいは上記の共有空間を減圧にして、バイオセパレーション用フィルターを介してこの共有空間とは反対側から被検体を送り込むようにしてもよい。
【００９５】
次に、バイオセパレーション用キットの容器に収容された被検体中でウエルを上下させるか、あるいは当該容器に収容された被検体の界面を上下させることにより、あるいは被検体を攪拌して各ウエル内の被検体を入れ替えることにより、被検体中のターゲット物質とプローブとの反応を進行させる。
【００９６】
被検体の攪拌方法としては、攪拌羽根の付いた攪拌機による攪拌、音波振動あるいは超音波振動による攪拌、空気や常磁性体の移動による攪拌など、既存の方法が使用できる。これらのうちで特に好ましいのは音波あるいは超音波による振動攪拌であり、例えば、容器またはバイオセパレーション用フィルターを振動させるか、あるいは振動子を被検体中に入れて振動させる。この場合、振動の適用周波数は、プローブや被検体の種類により適宜調節され、好ましくは１００Ｈｚ〜１ＧＨｚ、より好ましくは１〜１０ｋＨｚもしくは３００ｋＨｚ〜１ＧＨｚで振動させる。この範囲の周波数では、対象物の損傷を最小限に抑えることができる。
【００９７】
また、容器とバイオセパレーション用フィルターが独立している場合には、バイオセパレーション用フィルターを容器内の被検体から引き上げた後に、容器内の被検体を上述したいずれかの方法で攪拌し、次いでバイオセパレーション用フィルターを容器内の被検体に再度浸漬させるか、バイオセパレーション用フィルターを水平面で回転させるか、あるいは容器とバイオセパレーション用フィルターとを相対移動させることにより、各ウエル内の被検体を入れ替えることができる。前述したように、フィルターを介して被検体を上記の共有空間に導き、次にフィルターを介して他のウエル内に被検体を導くことにより、各ウエル間における被検体の入れ替えをすることができる。
【００９８】
このようにしてターゲット物質とプローブとを反応させた後、次のようにしてＢ／Ｆ分離を行う。まず、容器内の液の界面高さをフィルターの下面未満となるまで低下させ、プ
ローブ担持粒子に担持されたプローブと反応していない非捕捉物質（プローブに捕捉されたターゲット物質以外の物質）を含む液を各ウエル内から除去する。
【００９９】
次に、洗浄液をウエルに導入し、容器を介して洗浄液をウエルに循環させてウエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、次いで洗浄液をウエル外へ排出することにより、非捕捉物質を洗浄除去する。
【０１００】
ここで、液の界面高さをフィルターの下面未満にする方法としては、ウエル内の液を、フィルターを介してポンプあるいは加減圧等により開放部（排出孔）から容器外へ、あるいは上記の共有空間へ移動させる方法が挙げられる。また、容器とバイオセパレーション用フィルターとが独立している場合には、容器とバイオセパレーション用フィルターとを相対移動させて上下させることにより液の界面高さをフィルターの下面未満にすることができる。この場合、バイオセパレーション用フィルターを、隣接する容器、あるいは独立した別の容器に移してもよい。
【０１０１】
なお、図１（ｃ）に示したような第１のフィルターおよび第２のフィルターでリブが挟まれたバイオセパレーション用フィルターを用いて、そのウエル内にプローブ担持粒子を収納する場合には、ウエルからの粒子の漏れを懸念する必要が無いため、液面はウエルの高さを超えて任意に移動させることができる。
【０１０２】
また、上記操作の前後において、必要に応じて、各種の洗浄剤や各種の緩衝液、あるいは二次抗体などの薬液をウエルへ投入してもよい。これらの投入は、被検体の投入と同様の方法で行うことができる。
【０１０３】
このようにしてターゲット物質を被検体から分離した後、剥離剤をウエルに投入してプローブ担持粒子からターゲット物質を剥離し、ターゲット物質を容器に取り出すことができる。このための容器を用いたバイオセパレーション用キットを図１２（ａ），（ｂ）に示す。なお、プローブ担持粒子からターゲット物質を剥離するために同図に示したような容器を用い、プローブと被検体との反応または洗浄用には、これとは別途の容器を用いてもよい。
【０１０４】
図示した容器１２には、バイオセパレーション用フィルター１における複数のウエル５に対応した複数の独立空間１６ａ〜１６ｄが設けられている。これらの独立空間１６ａ〜１６ｄは、プローブ担持粒子から剥離したターゲット物質を受け入れる収容室（ウエル）を構成しており、所定のウエル５の直下に配置される。例えば、バイオセパレーション用フィルター１の下面と、容器１２の上面に、凸状の嵌合部と凹状の被嵌合部とを形成しておき、これらを嵌め合わせることで、所定のウエルの下方に所定の独立空間を位置させることができる。
【０１０５】
プローブ担持粒子からターゲット物質を剥離して容器の独立空間に取り出す場合、例えば、バイオセパレーション用フィルターのウエル上面の開口から、スポッター等を用いて各ウエルへ個別にあるいは各ウエルへ一度に剥離液を投入した後、独立空間内に収容した別途の液とフィルター面で接触させるか、あるいは独立空間の底部に設けた外部への開放部から減圧を作用させてウエル内の溶液を独立空間に移動させる。
【０１０６】
容器１２に設けられた各独立空間の底面は、図１２（ａ）のように閉鎖されていてもよく、あるいは図１２（ｂ）のように、底面から外部へ貫通する孔形状の開放部１３を形成してもよい。底面にこのような開放部１３を設ける場合、底面からの液体の漏出を防ぐために、その孔の内径が３ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１ｍｍである。例えば、この開放部１３を介して、差圧ポンプ等により減圧力を作用させることにより、
各独立空間内に収容されたターゲット物質を含む液（あるいはターゲット物質を含むか否かを検出するための液）を一括してフローダウン移動させて独立空間へ取り出すことができる。
【０１０７】
このようにして得られた分離液は、例えば、質量分析計、ラマン分析計、表面プラズモン分析計、Ｘ線分析計、電気化学検出装置、水晶発信子マイクロバランス検出装置などの各検出装置により解析・同定される。あるいは、得られた分離液内のターゲット物質は、次の反応工程の出発物質、アッセイのための精製体として使用される。
【０１０８】
なお、図１２（ａ），（ｂ）に示した、独立空間を設けた容器は、プローブ担持粒子を収納したバイオセパレーション用フィルターのウエルに被検体を投入してこれらを接触、反応させるために用いることもできる。即ち、例えば各独立空間１６ａ〜１６ｄに互いに異なる被検体を収容しておき、この容器１２に、各ウエル５に同一または異種のプローブが担持された粒子の分散液を収容したバイオセパレーション用フィルター１を収納して、各被検体と、対応する各粒子分散液とをフィルター面を介して接触させることにより、これらを接触および反応させることができる。
【０１０９】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１（ａ）は、本発明の一実施形態におけるバイオセパレーション用フィルターの断面図、図１（ｂ）は、本発明の他の実施形態におけるバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図２】図２は、ウエルにプローブ担持粒子の分散液を収容したバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図３】図３は、ウエルにプローブ担持粒子の分散液を収容したバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図４】図４は、ウエルにプローブ担持粒子の分散液を収容したバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図５】図５は、プローブを担持する粒子の粒子径と、フィルター上の隣り合う２つの細孔の孔径と、孔間隔との関係を説明する断面図である。
【図６】図６は、同一のプローブを各ウエルの底部もしくは上部のフィルターに固定化したバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図７】図７は、互いに異なるプローブを各ウエルの底部もしくは上部のフィルターに固定化したバイオセパレーション用フィルターの断面図である。
【図８】図８は、容器上面を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図９】図９は、容器上面をテーパ形状として、その頂部を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１０】図１０は、バイオセパレーション用フィルターのフィルター面を上下方向に配置し、容器の左右両側を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１１】図１１は、バイオセパレーション用フィルターを容器に固定したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１２】図１２は、バイオセパレーション用フィルターの各ウエルに対応する独立空間を容器に設けたバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１３】図１３は、バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対して、フィルターを介して液の流通を共有する空間を容器に設けたバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１４】図１４は、バイオセパレーション用フィルターにおける複数のウエルに対して、フィルターを介して液の流通を共有する空間を設けたバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１５】図１５は、容器の両面側を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１６】図１６は、容器の両面側を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１７】図１７は、容器の両面側を開放したバイオセパレーション用キットの断面図である。
【図１８】図１８は、リブを連続して一体に形成し、その中にフィルターを底面としたウエルが存在する構造としたバイオセパレーション用フィルターの電子顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、容器の両側面を開放したバイオセパレーション用キットと、フィルターと接触させてウエル内の液を排出するための接触突起を設けた排出液受け入れ容器の断面図である。
【図２０】図２０は、容器におけるバイオセパレーション用フィルターを収納する内部空間の内径ｄもしくは内幅ｄおよび、フィルターもしくはリブから上側に形成された容器の上部側内部空間の高さｈを説明する断面図である。
【符号の説明】
【０１１１】
１  バイオセパレーション用フィルター
２  フィルター
２ａ  第１のフィルター
２ｂ  第２のフィルター
３  細孔
４  リブ
５  ウエル
１１  バイオセパレーション用キット
１２  容器
１３  開放部
１４  段差部
１５  Ｏリング
１６ａ〜１６ｂ  独立空間
１７  共有空間
１８  接触突起
２１  プローブ担持粒子
２１ａ〜２１ｄ  プローブ担持粒子
２２  プローブ
２２ａ〜２２ｄ  プローブ
２３  分散液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１８】
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