(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝子組換え法による多量生産に適したニワトリ型モノクローナル抗体を製造するための新規なプライマーを提供する。【解決手段】本発明は、ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーのひとつが、制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子増幅用のプライマー、及びそれを用いたニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を増幅させる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーのひととつが、制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子増幅用のプライマー。
【請求項２】
塩基数が１５〜３０である請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
塩基配列が、
３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｇｇｇｔｔｃ−５’
又はその相補鎖である請求項１又は２に記載のプライマー。
【請求項４】
他方のプライマーの塩基配列が、
５’−ｃｔｇａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｔｇａｃｇｔｔ−３’
又はその相補鎖である請求項１〜３のいずれかに記載のプライマー。
【請求項５】
他方のプライマーの塩基配列が、
５’−ｔｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｃｔｇａｃｔｃａｇｃｃ−３’
又はその相補鎖である請求項１〜３のいずれかに記載のプライマー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプライマーを用いて、ニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を増幅させる方法。
【請求項７】
可変領域がＶＬ領域である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プライマーが請求項５に記載のプライマーである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
可変領域がｓｃＦｖである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーが請求項４に記載のプライマーである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
塩基配列が、
３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｇｇｇｔｔｃ−５’
又はその相補鎖であるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を増幅させるためのプライマー、及び当該プライマーを用いた遺伝子の増幅方法に関する。また、本発明は組換えニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーとして使用される新規なオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、抗原の特定部分だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組換えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であり、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展している。
モノクローナル抗体については、マウス、ラット型など広く活用されているが、ニワトリ型については、発明者がすでに提案した例がある程度である。このニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作成困難な抗体が作成可能であるということである。
【０００３】
ニワトリは系統発生学的に哺乳動物より下等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ抗体が数多く作成されてきた。一方、ヒトをはじめとする哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗体が哺乳動物を用いて作成できない場合、ニワトリ抗体として作成可能であることも経験されてきた。そのため、ニワトリ抗体を大量調整するひとつの手段として、産卵鶏を特定の抗原で免疫し、その後、卵に移行した抗体を生成して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利用する方法が開発されているが、この方法によりモノクローナル抗体を製造することはできない。
【０００４】
マウスモノクローナル抗体は、極めて広範な基礎・応用領域に活用されているが、マウス型、ラット型以外のモノクローナル抗体については、応用にまで至っている成功例は少ない。マウス型、ラット型以外のモノクローナル抗体での応用の一例としては、本発明者らが開発した細胞融合法によるニワトリ型モノクローナル抗体がすでに報告されている。上述したとおり、ニワトリの大きな利点は、マウスあるいはラットを用いて作成困難な抗体がニワトリ抗体として得られやすいことであり、モノクローナル抗体としても作成可能なことである。
本発明者らによる細胞融合技術を用いたニワトリ型モノクローナル抗体の成功例としては、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を認識するニワトリ型モノクローナル抗体や哺乳動物に高度保存されたプリオンタンパク（ＰｒＰ）を認識するニワトリ型モノクローナル抗体などである。ＮｅｕＧｃは、ヒトのがんマーカーとなる抗原で、ヒトを除くほとんどの哺乳動物に存在しているため、マウス、ラットやウサギなど一般に広く免疫動物として用いる動物では抗体を作ることができない。また、ＰｒＰは、その異常型が狂牛病やヒトＣＪＤの病原体となることで知られているが、ＰｒＰは哺乳動物間でアミノ酸配列の相同性は９０％以上である。一方、哺乳動物とニワトリの間ではその相同性がわずか３０％台であるため、これまでに作成された哺乳動物ＰｒＰを認識するマウスモノクローナル抗体作成の成功例はわずかである。本発明者らは、すでにＮｅｕＧｃや哺乳動物ＰｒＰを認識できるニワトリ型ｍＡｂの作成に成功し、それらをヒトがんの診断や狂牛病・ヒトＣＪＤの研究に活用することができていた。
【０００５】
しかしながら、本発明者らが先に開発したニワトリ型モノクローナル抗体の最大の欠点は、その抗体を産生するハイブリドーマ（融合細胞）の抗体産生能力が低いことであった。
このように、ニワトリ型モノクローナル抗体は、他の哺乳動物では作成が困難であるモノクローナル抗体を作成することができるが、その抗体産生細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生能力がマウスやラットより低いことが大きな欠点であり、実用化にあたっての大きな障害となっていた。
【０００６】
一方、近年になり、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表面に発現させる技術が開発された。このファージディスプレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷｉｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（非特許文献１参照）、非免疫ヒト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的にＶＨ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃＦｖ（single chain Fragment of variable region）抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得た（非特許文献２参照）。この技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価された。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して実用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作製されている（非特許文献３参照）。
【０００７】
また、ニワトリを利用した例としては、以下に示す国内外の２つのグループからの報告が挙げられる。Daviesらは、非免疫状態のファブリキウス嚢由来抗体遺伝子と、発現ベクターｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ  １から３種の特異抗体を樹立し、哺乳動物以外でも同様にこの技術の適応が可能であり、しかも免疫を回避して作出できることを証明した（非特許文献４参照）。しかしながら、作出された抗体の反応性は極めて低く、また発現ベクターの構造からファージディスプレイ抗体しかできないという欠点があった。一方、山中らは、マウスアルブミン免疫脾細胞由来の抗体Ｖ領域遺伝子と、独自に開発した発現ベクターｐＰＤＳを利用して十分な反応性を示す特異的ファージディスプレイ抗体の構築を報告し、実用化抗体の作製には、免疫脾細胞由来抗体遺伝子ライブラリーの利用を強調した（非特許文献５参照）。ここで使用したｐＰＤＳは、マウス抗体発現用ベクターとして開発されたもの（非特許文献６参照）で、STRATA GENE社から市販されているクローニング用ファージミドベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIをベースとしている。
【０００８】
図１に発現ベクターｐＰＤＳの構成を示す。ｐＰＤＳは、そのラクトースオペロン（Ｌａｃ）プロモーターを利用し組み込んだｓｃＦｖ抗体ｃＤＮＡの発現を誘導するようになっている。プロモーターの下流には、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）およびＭ１３  ｇｅｎｅIIIのリーダー配列（ｇ３ｌ）を人工的に繋ぎ込み、ＥａｇＩとＢｓｓＨIIとからなるクローニングサイトで組み込まれた抗体遺伝子が大腸菌のペリプラズムを経て再構成ファージ体として発現できるよう設計されている。更にその下流にはＦａｂ抗体の発現に備えてマウスＣκ鎖遺伝子を繋ぎ、ｃｐ３の構造部位へとつながり終止コドンとなっている。このＣκ鎖は、融合タンパクの発現がうまく行われているかどうかを検証する上でも非常に有効なタグとなる。また、このｐＰＤＳベクターは、可溶型ｓｃＦｖもしくはＦａｂ抗体の発現にも対応できるように、Ｃκ鎖とｇｅｎｅIIIの間にはＴＡＧ（アンバー配列）ストップコドンを挿入しており、通常はｓｕｐＥの大腸菌株を用いることによりファージディスプレイ抗体として発現されるが、ノンサプレッサー株で培養すれば、培地中に可溶型抗体が分泌されるようになる。
このような発現ベクターであるため、可溶型抗体においてはニワトリ抗体遺伝子由来であっても、検出にはマウスＣκ鎖に対する抗体を用いなければならず、サンドイッチＥＬＩＳＡ等におけるマウス抗体併用の場合、ニワトリ抗体の正確な測定が不可能であった。本発明者らは、山中博士よりｐＰＤＳの恵与を受け、抗体産生ニワトリハイブリドーマからファージディスプレイ抗体の作出に活用しようとしていることからも、この問題は解決すべき事項であった。
【０００９】
【非特許文献１】Winter, G., et al., Nature, 349, 293-299 (1991)
【非特許文献２】Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1991)
【非特許文献３】Williamson, R. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 7279-7282 (1996)
【非特許文献４】Davis, E. D., et al., J. Immunol. Methods, 186, 125-135 (1995)
【非特許文献５】Yamanaka, H. I., et al., J. Immunol., 157, 1156-1162 (1996)
【非特許文献６】Yamanaka, H. I., et al., J. Biochem., 117, 1218-1227 81995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝子組換え法による多量生産に適したニワトリ型モノクローナル抗体の製造方法を提供するものである。また、本発明は、そのための新規なプラスミドベクター及びそのための新規なプライマーを提供するものである。さらに本発明は、新規なニワトリ型モノクローナル抗体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、遺伝子組換え法によりニワトリ型モノクローナル抗体を製造する方法において、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入されている発現ベクターに、ニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを用いることを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体の新規な製造方法、及びその方法で製造されるニワトリ型モノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、前記方法で使用される新規な発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーのひととつが、制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子増幅用のプライマー、及び当該プライマーを使用してニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させる方法に関する。
また、本発明は、ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーとして有用な新規なオリゴヌクレオチドに関する。
【００１２】
より詳細には、本発明は、次の（１）〜（１１）の事項に関する。
（１）  ニワトリ型モノクローナル抗体のＶＬ又はｓｃＦｖをコードする遺伝子を増幅させるためのプライマーのひととつが、制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できる塩基配列を有することを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする遺伝子増幅用のプライマー。
（２）  塩基数が１５〜３０である前記（１）に記載のプライマー。
（３）  塩基配列が、
３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｇｇｇｔｔｃ−５’
又はその相補鎖である前記（１）又は（２）に記載のプライマー。
（４）  他方のプライマーの塩基配列が、
５’−ｃｔｇａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｔｇａｃｇｔｔ−３’
又はその相補鎖である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のプライマー。
（５）  他方のプライマーの塩基配列が、
５’−ｔｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｃｔｇａｃｔｃａｇｃｃ−３’
又はその相補鎖である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のプライマー。
（６）  前記（１）〜（５）のいずれかに記載のプライマーを用いて、ニワトリ型モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を増幅させる方法。
（７）  可変領域がＶＬ領域である前記（６）に記載の方法。
（８）  プライマーが前記（５）に記載のプライマーである前記（７）に記載の方法。
（９）  可変領域がｓｃＦｖである前記（６）に記載の方法。
（１０）  プライマーが前記（４）に記載のプライマーである前記（９）に記載の方法。
（１１）  塩基配列が、
３’−ｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｇｇｇｔｔｃ−５’
又はその相補鎖であるオリゴヌクレオチド。
【００１３】
本発明者らは、プリオン病の病態解析やプリオン変換機構解明へのツールとなりうるニワトリ型抗プリオンタンパク（ＰｒＰ）パネルモノクローナル抗体の作製とその安定的な利用を目的として、まず細胞融合法によって得られた哺乳動物プリオンタンパク（ＰｒＰ）２５−２９残基（ＲＰＫＰＧ）を認識する有効性の示されたＰｒＰ特異的ニワトリ型モノクローナル抗体ＨＵＣ２−１３を供試材料に、ｐＰＤＳ発現ベクターを用いたファージディスプレイ抗体技術によるリコンビナント化と大量調製の確立を行った。
【００１４】
本発明者らは、まず哺乳動物プリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１残基を認識するニワトリモノクローナル抗体を次のようにして調製した。
リコンビナントヒトプリオンタンパク（ＰｒＰ）２３−２３１（約１００μｇ）を４週齢の近交系ニワトリ白色レグホン種Ｈ−Ｂ１５ニワトリの腹腔内に免疫し、その脾臓を摘出し免疫脾細胞を調製した。これをＴＫ欠損・ウアバイン耐性のニワトリＢ細胞株であるＭｕＨ１とＰＥＧ法により融合して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
このようにして得られた抗体産生ハイブリドーマあるいは免疫ニワトリの脾臓リンパ球から調整した抗体遺伝子（ＶＨおよびＶＬ領域）をフレキシブルリンカーを介して１本鎖にしたｓｃＦｖ（single chain fragment of V region）を作成した。このｓｃＦｖを発現させるプラスミドベクターとしては、すでに山中（現ロート製薬）が構築したｐＰＤＳ（図１参照）があるが、ｐＰＤＳを用いると、ｓｃＦｖのＮ末端側にマウス免疫グロブリンＬ鎖のＣ領域（Ｃκ）が発現し、Ｖ領域がニワトリでＣ領域がマウスの組換え抗体となってしまう。
【００１５】
抗体の特異性（反応性）はＶ領域が規定することから、反応性には問題ないが、ＨＵＣ２−１３のようなバックグラウンド染色のない検出はｐＰＤＳベクターを使用した場合には得られなかった。リコンビナント抗体作出に使用した発現ベクターｐＰＤＳは，山中らによりマウス抗体発現用ベクターとして設計・構築されたものであり、発現するｓｃＦｖ抗体は，変異頻度の極めて高い抗体Ｖ領域で構成されており、安定的に検出することが困難であることから、検出用タグとしてマウスＣκ鎖が導入されている。したがって、ｐＰＤＳベクターを使用して作出したリコンビナント抗体は、抗原認識部位がニワトリ抗体由来でありながら検出には抗マウスκ鎖抗体を用いなければならず、その結果として、バックグラウンド染色が生じてきた。リコンビナント抗体において、マウスＣκ鎖を検出用タグとする限り、（１）高感度検出や定量実験に汎用されるサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した場合、キャプチャー抗体にマウス抗体を用いたとすると、その抗体をバックグラウンドとして検出してしまうこと、（２）モデル動物としてマウスを使用した免疫組織化学染色の場合、そのマウスの持つ免疫グロブリンを非特異的に検出してしまう、といった問題点が生じる。
【００１６】
そこで、本発明者らは、上述の問題点を解消するとともに、プリオン病解析さらにはより広範な研究にニワトリ型抗体が活用されることを目的として、抗ニワトリＩｇ抗体で検出できるよう、ｐＰＤＳ内のマウスＣκ鎖をニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）に置換した新規な発現ベクターの構築を試みた。さらに精製を簡便化する目的から、精製用タグ（ＦＬＡＧ）を導入した純ニワトリ型リコンビナント抗体発現用ベクターの構築をおこなった。
図２にニワトリリコンビナント抗体発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
まず、ニワトリＣλ鎖遺伝子をクローニングした。
正常ニワトリ脾細胞から合成したｃＤＮＡをもとにＰＣＲでニワトリＣλ鎖を増幅させたところ、Ｃλ鎖遺伝子と思われる約３４０ｂｐのバンドを得た（図３のＡ参照）。図３はこれらの結果を示す図面に代わる写真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４  ＨａｅIIIで消化を示す。
このバンドを制限酵素処理後ライゲーションし、形質転換を行った。翌日ランダムに６クローンをアルカリＳＤＳ法でプラスミド調製を行い、インサートの有無を確認したところ、全てにインサートが確認された。６クローンのうちの１クローン（クローン＃１）について塩基配列決定を行ったところ、１１４残基のアミノ酸をコードする既報のＣλ鎖と完全一致した（図４参照）。そこで、このクローンをベクター再構築用コンストラクト調製のためのテンプレートとした。
【００１７】
塩基配列を決定したクローニング済のニワトリＣλ鎖遺伝子をもとに、再構築コンストラクトに使用するニワトリＣλ鎖遺伝子をＰＣＲ法を用いて調製した。その結果、副生成物も多々みられたが、約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと思われるバンドが検出された（図３のＢ参照）。このバンドを精製し、ｇｅｎｅIII遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【００１８】
一方、ｐＰＤＳからのｇｅｎｅIII遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行った。その結果、約６００ｂｐの位置にｇｅｎｅIII遺伝子と思われるバンドが検出された（図３のＣ参照）。このバンドを精製し、ＦＬＡＧ配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【００１９】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子のオーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そしてｇｅｎｅIII遺伝子の５’側に付加されたＦＬＡＧ配列を介して行った。その結果、約９５０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結したと思われるバンドが検出された（図３のＤ参照）。このバンドを精製し制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理されたｐＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転換した。
【００２０】
大腸菌への形質転換後、１５クローンをニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅でインサートチェックした。その結果、１２クローンで約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖の増幅が確認できた（図５参照）。図５はこの結果を示す図面に代わる写真である。図５の「Ｍ」はｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩで消化を示す。
これらのクローンはそれぞれｐＣＰＤＳ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２と命名した。これら１２クローンはｓｃＦｖ遺伝子を含まない状態でファージ体の調製を行い、発現タンパクの検討を行った。
この１２クローン由来のファージ体は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ならびに抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とし、ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体を検出用抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡでニワトリＣλ鎖およびファージ体の発現確認をした。なお、陽性対照としてｐＰＤＳから発現させたファージ体を用いた。その結果、ｐＣＰＤＳ８と１０を除いた残り１０クローンで抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）平均０．６の反応性であった（図６）。図６はこの結果を示すものであり、黒塗りはキャプチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。
これらのクローンは、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合には、平均０．１７と低値であり、さらにｐＰＤＳでの反応性に比べ明らかに低いことから構成されたベクターは再構築用コンストラクトを正確に発現する再構築ベクターであることがわかった。
【００２１】
得られた発現ベクターｐＣＰＤＳの構成を図７に示す。
上述した実験で、正確なニワトリＣλ鎖および再構成ファージの発現が確認された再構築ベクターｐＣＰＤＳ７を用い、図８〜図１３に示すニワトリ抗体をコードする遺伝子ＨＵＣ２−１３のファージディスプレイ抗体および可溶型抗体を調製した。調製したリコンビナント抗体は、ＨＵＣ２−１３とあわせてＨ２５ペプチドに対する反応性の確認を試みた。その結果、一次抗体を希釈なしで用いた場合、全ての抗体でＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）が１．５を越えた。希釈した場合、ＨＵＣ２−１３および菌体破壊から調製した可溶型抗体では２５倍希釈までほとんどＥＬＩＳＡ力価の低下はみられなかった。一方、ファージディスプレイ抗体および培養上清からの可溶型抗体では低下傾向にあり、１２５倍希釈では陽性ＥＬＩＳＡ力価が得られなかった。菌体破壊から調製した可溶型抗体は、１２５倍希釈からＨＵＣ２−１３のＥＬＩＳＡ力価を上回っていた（図１４参照）。
【００２２】
図１４はこの結果を示したグラフである。図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージディスプレイ抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型抗体（培養上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶型抗体（菌体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−１３（ネイティブ抗体）を示す。
【００２３】
以上の実験から、純粋なニワトリリコンビナント抗体作製のためのベクターの再構築ができたことがわかった。このベクターから得られた純粋なニワトリリコンビナント抗体は、マウス抗体によるノイズが少なく、検出のＳ／Ｎ比を高くすることができる。
本発明のベクターの構築に当たって、（１）機能的なＳｃＦｖ抗体が発現できる、（２）将来的にＦａｂ抗体も作製できるようなベクターにする、（３）簡便に精製できる、の３点に留意した。この３点を考慮し、マウスＣκ鎖の代わりにニワトリＣλ鎖を、精製用タグとしてＦＬＡＧ配列と呼ばれる人工配列を選択した。
【００２４】
また、再構築ベクターの作製にはｐＰＤＳベクターをベースとし、適当な制限酵素部位を利用してコンストラクトの入れ替えという形でできるようにした。ｐＰＤＳは、ｓｃＦｖ抗体クローニングサイト以降ｇｅｎｅIII終止コドンの直後のＥｃｏＲＩまで、位置的にも適当な制限酵素部位がないためＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間、もしくはＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ間でコンストラクトを置換せざるを得なかった。ニワトリＣλ鎖とＳｃＦｖ抗体遺伝子の連結部位は、自然なＶＬ−Ｃλアミノ酸配列に近似するよう注意しながら、高切断効率であり、かつベクターやＳｃＦｖ抗体遺伝子を切断しない制限酵素とその設置部位を選定した。この切断位置を検討するために、Ｖλ領域とＣλ領域の結合をまとめた。これを表１として示す。
【００２５】
【表１】
2006025799.tif 000002
【００２６】
表１の＊は置換可能なアミノ酸であり、イタリックは置換に問題があるアミノ酸を示す。１）で示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列はｐＰＤＳ用のプライマー配列であり、２）で示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列は本発明のニワトリ型抗体発現ベクター用のプライマー配列であることを示す。
この結果、ふたたびＢｓｓＨIIとなったが、ＢｓｓＨII−ＥｃｏＲＩ間でコンストラクトの置換を行うと、空ベクター発現時にフレームシフトが生じ正確にタンパク発現されないことから、ベクターの有効性を確認できないことが明らかとなった。そこで、新たなＥａｇＩ−ＢｓｓＨII間のスペーサーをつけ加えたＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間コンストラクトを導入することにした。
【００２７】
ニワトリＣλ鎖はニワトリ脾細胞から、ｇｅｎｅIIIはｐＰＤＳから遺伝子を準備した。一方、ＦＬＡＧ−アンバー配列はプライマーの一部に導入し、Ｃλ鎖増幅時に連結させることとしたが、煩雑な脾臓細胞由来ｃＤＮＡ群からＣλ鎖増幅時にこの５４塩基もあるプライマーを用いるのは危険であると判断し、いったんクローニングしたＣλ鎖をテンプレートとしてＦＬＡＧ−アンバー連結ＰＣＲを行うことにした。
ＥａｇＩ−ＢｓｓＨIIのｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイト−ニワトリＣλ鎖−ＦＬＡＧ−アンバー配列（ＴＡＧ）−ｇｅｎｅIIIまでの再構築用コンストラクトは全てＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法で作製した。ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＰＤＳにライゲーションし、最終的に１０クローンのニワトリＣλ鎖、再構成ファージ体を発現するベクターが得られた（図６参照）。
【００２８】
以上の実験に基づく本発明の純粋なニワトリリコンビナント抗体作製のための概要を図１５に示す。これを順に説明する。
（１）抗体Ｖ領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の調製
抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、下記の表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プライマーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用いて増幅する。
（２）ｓｃＦｖの構築
（１）の実験で得たＶＨおよびＶＬの増幅産物を精製した後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（scFv linker）（−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−）を用いて連結する（アッセンブリー反応）。
（３）ｓｃＦｖの再増幅と制限酵素処理
ｓｃＦｖの再増幅のための下記表２に示すプライマー・セット（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、（２）で構築したｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子断片（インサート）を調製する。
【００２９】
（４）インサート（ｓｃＦｖ）のｐＣＰＤＳへの挿入（ライゲーション）
ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（TAKARA））を用いてライゲーションを行う。
（５）大腸菌の形質転換
インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用いて、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を形質転換する。
（６）インサートを発現する形質転換大腸菌の選抜
増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニーを任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選抜する。
（７）ファージ発現抗体の作成
選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファージ発現抗体を作成する。
（８）特異的ファージ抗体の選抜のためのパニング
抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体を選抜する。
（９）可溶化抗体の作成
特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡあるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清および菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。
（１０）可溶化抗体の生成
抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体をアフィニティ精製する。
【００３０】
このようにして、本発明の発現ベクターｐＣＰＤＳを用いることにより純粋なニワトリリコンビナント抗体を製造することができる。この本発明のニワトリ型抗体を作成するためのｓｃＦｖの製造についてさらに詳細に説明する。
哺乳動物と鳥類では、抗体遺伝子の多様性獲得メカニズムが異なっており、哺乳動物抗体遺伝子では多数のＶ遺伝子のうちの１つが再構築するが、鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体遺伝子はただ１つであり、この機能的抗体遺伝子内に偽Ｖ遺伝子がランダムに挿入される。
図１６は哺乳動物（図１６上段）と鳥類（図１６下段）における抗体Ｈ鎖を模式的に示したものである。哺乳動物抗体遺伝子では多数のＶ遺伝子のうちの１つが再構築するために、５’側の塩基配列も変動し、抗体の種類によってプライマーを用意しなければならないのであるが、鳥類抗体遺伝子では、機能する抗体遺伝子はただ１つであり、この機能的抗体遺伝子内に抗体の種類に応じた偽Ｖ遺伝子がランダムに挿入されるために、どの種類の抗体であったも５’側の塩基配列も基本的に変動しない。
【００３１】
したがって、抗体遺伝子を抗体産生細胞からＰＣＲで増幅しようとする場合、哺乳動物Ｖ遺伝子は、多数のＶ遺伝子のどれが用いられているかわからないので、抗体の種類に応じて５’側（Ｖ遺伝子側）に多数のプライマーを合成し、準備しなければならない。
一方、鳥類Ｖ遺伝子は、ベースとなる機能的Ｖ遺伝子が１つであるので、あらかじめその塩基配列がわかっているので、５’側１つ、３’側１つの１ペアのプライマーで、全ての抗体産生細胞に対応できる点も、鳥類の抗体を用いる際の大きな特徴である。
本発明が開示する鳥類用のプライマーを次の表２に示す。
【００３２】
【表２】
2006025799.tif 000003
【００３３】
表２に示されるプライマーセットを使用することにより、基本的にはどのような抗体であっても、鳥類、好ましくはニワトリの抗体遺伝子を増幅させることが可能となる。この中で、ＣＬＦ１として示されるプライマーは、新規な塩基配列を有するものであり、その途中に制限酵素ＢｓｓＨIIで切断できるサイト（ｇｃｇｃｇｃ）を有していることを大きな特徴とするものである。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
図１７は、このプライマーＣＬＦ１の使用状況を模式的に示したものであり、図１７の上段の左側がＶＬ領域であり、そのすぐ右側がＣλ領域である。前記してきたように、発現ベクターｐＣＰＤＳにおいてはＶＬ領域とＣλ領域が制限酵素ＢｓｓＨIIで結合されるために、ＶＬ領域の３’末端とＣλ領域の５’末端の結合の様子を示している。図１７の丸２で示した塩基配列の四角枠で囲った部分が制限酵素ＢｓｓＨIIで切断可能な位置である。
そして、前述してきたように鳥類ではＶＬ領域の末端の塩基配列は抗体の種類により変動しなのであるから、このプライマーＣＬＦ１を用いることによりＶＬ領域及びＶＨ−リンカー−ＶＬからなるｓｃＦｖをも増幅可能となる。
【００３４】
以上のように、本発明は純粋なニワトリリコンビナント抗体を製造するための新規なプライマーセット、新規な発現ベクターｐＣＰＤＳ、及びそれを用いて製造される純粋なニワトリリコンビナント抗体を提供するものである。
【発明の効果】
【００３５】
本発明は、純粋な鳥類型リコンビナント抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供する。
ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では作成できないモノクローナル抗体を作成することができ、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパクなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生体系高分子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの展開が期待される。したがって、がん、プリオン病などの種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところが、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用するための必要量ができないことである。本発明は、実質上純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組み替え法で、初めて多量に作ることに成功した。即ち、本発明は、新規なプラスミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノクローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能にしたものであり、抗体、その製法、ベクター、プライマー・セット等を提供するものである。
また、鳥類の抗体遺伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固定化されており、本発明が提供するプライマーを用いて抗体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能であり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗体を遺伝子組換え手段により簡便に作成できる方法を提供するものである。
【００３６】
以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターの設計
ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターの設計は、ｐＰＤＳベクターをベースに行った。ｐＰＤＳにすでに挿入されているマウスＣκ鎖遺伝子をニワトリＣλ鎖遺伝子に置換し、その際ＶＬとＣλ連結の配列がgermlineのアミノ酸配列に近似し、使用遺伝子が切断されないようなクローニング用制限酵素部位を選択した（表１参照）。また、インサートのない状態（Ｍｏｃｋ）でもニワトリＣλ鎖の発現でベクター検定できるようＥａｇＩ以降のスペーサー配列も新たに設計し直した。ニワトリＣλ鎖の下流には精製用タグであるＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、さらにＦＬＡＧ配列とｇｅｎｅIIIの間には可溶型抗体として発現できるようＴＡＧ（ａｍｂｅｒ）ストップコドンを挿入した。ＥａｇＩ部位からｇｅｎｅIIIまで作製したコンストラクトは、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩ処理したｐＰＤＳにライゲーションし、ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターとした（図２参照）。
【実施例２】
【００３８】
ニワトリＣλ鎖遺伝子の単離
（１）  ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマーの設計と合成
ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマーは、既報のＣλ鎖塩基配列をもとにOLIGO 4.05 Primer Analysis Software（National Bioscinece）を用いて設計し、北海道システムサイエンスに委託して合成した。
（２）  ニワトリCλ鎖遺伝子の増幅とクローニング
ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅は、正常ニワトリ脾細胞から後記する方法に準じＲＴ−ＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  ２０μｌに再溶解した。その溶液に１６Ｕ／μｌのＢａｍＨＩと２０Ｕ／μｌのＨｉｎｄIIIをそれぞれ１μｌずつ添加し、３７℃  ２時間の制限酵素処理し、エタノール沈殿濃縮をした。濃縮後のサンプルは、ＤＷ  １０μｌに再溶解し、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、UltraCleanで精製し、ＤＷ  １０μｌに再溶解した。濃度測定後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ（−）とモル比がベクター：インサート＝１：３になるように混合し、TAKARA Ligation Kit ver.1で１６℃  ３時間ライゲーションした。ライゲーション終了後、その反応液５μｌをコンピテントセルに形質転換し、４０μｌをアンピシリン含有２×ＹＴプレートにプレーティングした。翌日、得られたコロニーを単離しアンピシリン含有２×ＹＴ培地で少量培養し、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを調製後、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、インサート有無の確認をした。
定法にしたがって、その塩基配列を決定した（図４参照）。
【実施例３】
【００３９】
連結反応用ニワトリＣλ鎖遺伝子の調製
（１）  ニワトリＣλ鎖遺伝子増幅用プライマーの設計と合成
再構築ベクターのコンストラクトとなるニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅用プライマーは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイトになるようＥａｇＩ、ＢｓｓＨIIを組み込み、さらに空ベクターでも発現できるようフレームシフトに留意したセンスプライマーと、ＦＬＡＧ−アンバー−ｇｅｎｅIII−５’末端配列を付加してｐＰＤＳから単離したｇｅｎｅIIIと連結できるようにしたアンチセンスプライマーを設計し、その合成した。
（２）  ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅
塩基配列決定後、データバンクと照会し完全一致したクローンは、塩化セシウム法で大量調製した。調製したサンプルをテンプレートとし、オーバーラップＰＣＲ用ニワトリＣλ鎖遺伝子を調製した。ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０μｌに再溶解した。この反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製、ＤＷ  １０μｌに再溶解し、ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIとのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
【実施例４】
【００４０】
連結反応用ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIの調製
（１）  ｇｅｎｅIII増幅用プライマーの設計と合成
ｐＰＤＳからのｇｅｎｅIII増幅には、ニワトリＣλ鎖とＦＬＡＧ−アンバー配列を介して連結できるようなセンスプライマーとｇｅｎｅIIIの終止コドン直後にＥｃｏＲＩを導入したアンチセンスプライマーを設計し、合成した。
（２）  ｇｅｎｅIIIの増幅
ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅIIIの調製は、ｐＰＤＳベクターからＰＣＲ法で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０μｌに再溶解した。この反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製、ＤＷ  １０μｌに再溶解し、ニワトリＣλ鎖とのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
【実施例５】
【００４１】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIIIとの連結反応
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIIIとの連結は、モル比１：１で混合したテンプレートをもとにアッセンブリー反応、再増幅反応で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０μｌに再溶解した。この反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製、ＤＷ  １０μｌに再溶解した。
【実施例６】
【００４２】
ｐＰＤＳベクターからのマウスＣκ鎖、ｇｅｎｅIIIの除去とニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅ３の挿入
ｐＰＤＳベクターにニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅIIIを挿入するため、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、さらに、分子内ライゲーションを防ぐためＢＡＰ処理を行った。ＢＡＰ処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ  １０μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。また、ニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅIIIも同様に制限酵素処理、精製して１０μｌの再構築用サンプルを準備した。調製した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比が１：３になるように混合し、TAKARA Ligation Kit ver.1で１６℃  ３時間ライゲーションし、その反応液５μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン含有２×ＹＴプレートに４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。
挿入遺伝子は，コロニーをテンプレートにニワトリＣλ鎖のＰＣＲ法による増幅で確認した。
【実施例７】
【００４３】
再構成ファージ体発現の確認
再構成ファージ体発現の確認は，サンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った．抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirkegaard and Perry Laboratories）と抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Kirkegaard and Perry Laboratories）を０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃  終夜固相化し、ブロッキングの後、挿入遺伝子の確認できたコロニーをもとにｓｃＦｖ抗体発現なしの再構成ファージ体を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃  １時間反応させた。反応後、３，５００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗Ｍ１３抗体を３７℃  １時間反応させｏ−フェニレンジアミンを基質として発色させた。１０分間の反応後、４９２ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダ  ＭＰＲ−Ａ４ｉで測定した。
【実施例８】
【００４４】
ＨＵＣ２−１３の作成
（１）  供試細胞株
チミジンキナーゼ欠損、ウアバイン耐性のニワトリＢ細胞株ＭｕＨ１を親株として、細胞融合で作成された哺乳動物プオリンタンパクＰｒＰの２５−２９残基を認識する抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体ＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマを使用した。なお、細胞は１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum）（SIGMA）含有ＩＭＤＭ（Iscove's modified Dullbecco's medium）（GIBCO BRL）を用い、３８．５℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養維持した。その培養上清は、抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体ＨＵＣ２−１３として利用した。
（２）  抗体Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
（２−１）  ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
供試細胞のＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Nippon Gene）を用い、添付のプロトコールに従い単離した。単離したＲＮＡは、ジエチルピロカーボネート処理蒸留水（diethylpyrocarbonate-distilled water、DEPC-DW）２０μｌに再溶解した。
１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成は、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー法を用いて行った。１〜５μｇの全ＲＮＡ溶液に５００μｇ／ｍｌ  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ１５プライマー（Boehringer Mammheim）を１．０μｌ加え、蒸留水（Ｄ．Ｗ）で１２μｌに調製した。この混合液を７０℃で１０分間インキュベートし、氷冷後、５×逆転写バッファー（GIBCO BRL）を４．０μｌ、０．１Ｍジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）（GIBCO BRL）を２．０μｌ、５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（GIBCO BRL）を２．０μｌ加え、４２℃で２分間インキュベートした。その後、２００Ｕ／μｌ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII  ＲＴ）（GIBCO BRL）を１．０μｌ加え、４２℃で５０分間、続いて７０℃で１５分間インキュベートした。合成したｃＤＮＡは−２０℃で保存した。
（２−２）  ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子ならびにリンカー遺伝子の増幅と精製
ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によるＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の増幅には、（２−１）で合成したｃＤＮＡを、リンカー遺伝子の増幅にはリンカー供給用に構築されたプラスミドｐＬＩＮＫをテンプレートとし、それぞれ１ペアのセンスプライマーおよびリバースプライマー、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO）、Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いた。また、陽性対照として、Yamanakaらが作製した抗マウスアルブミンモノクローナル抗体３Ｃ８（ニワトリリコンビナント抗体）を供試した。ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２μｌを加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、１．５％アガロースゲル（和光純薬）を用いて電気泳動した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ（MO BIO laboratories、 Inc.）で添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ  ２０μｌで溶出させた。リンカー遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の精製と同様に行った。ただし、電気泳動には３．０％アガロースゲルを用いた。
【００４５】
（２−３）  ｓｃＦｖ抗体遺伝子の増幅と精製
ｓｃＦｖ抗体遺伝子合成増幅のためのアッセンブリー反応ならびに再増幅反応は、精製したＶＨ、ＶＬ、およびリンカーをそれぞれモル比１：１：１で混合して行った。ｓｃＦｖ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２μｌ加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動した。得られたバンドは、Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎで添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ  ２０μｌで溶出させた。
（３）  発現ベクター（ｐＰＤＳ）の調製
ロート製薬（株）山中八郎博士より分与を受けたファージディスプレイ用発現ベクター（ｐＰＤＳ）（図１）を、Escherichia coli XL1-Blueへ塩化ルビジウム法による形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴプレートにプレーティング後、３７℃の終夜培養をした。得られたコロニーは選択採取し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地で大量振盪培養した。培養した大腸菌からのベクター精製は、塩化セシウム密度勾配平衡遠心法により行った。
（４）  制限酵素処理とＢＡＰ処理
精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２μｇとベクターｐＰＤＳ１０μｇは、ＤＮＡ１．０μｇに対して４．０ＵのＥａｇＩ（New England BioLabs, Inc.）を添加し、３７℃で終夜処理した。ＥａｇＩ処理後、同様の比率で反応液にＢｓｓＨII（New England BioLabs, Inc.）を添加し、５０℃で４時間処理した。ＢｓｓＨII処理後，６８℃、２０分間の酵素失活処理をし、反応液をＤＷで３００μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン  ２μｌを加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ  ３０μｌに再溶解した。
ベクターは、分子内ライゲーションを防ぐため大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（Bacterial alkaline phosphatase、ＢＡＰ）（TOYOBO）を用いて脱リン酸化処理した。ベクター３０μｌに５×ＢＡＰバッファー１０μｌ、アルカリフォスファターゼ（０．４Ｕ／μｌ）３μｌ、ＤＷ  ７μｌを加え、３７℃  ３時間の処理を行った。処理後の反応液は、ＤＷで３００μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２μｌ加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ  ３０μｌに再溶解した。
【００４６】
（５）  ベクターへのライゲーション
精製したｓｃＦｖ遺伝子断片とベクターｐＰＤＳのモル比が３：１になるように調製し、ＤＮＡ ligation kit ver.1（TAKARA）を用いてライゲーション反応を行った。なお、その方法は添付プロトコールに従った。
（６）  形質転換（塩化ルビジウム法）
形質転換は、−８５℃で保存したEscherichia coli XL1-Blueコンピテントセル溶液１００μｌを氷中で融解し、これにライゲーション溶液を１０μｌ加え、氷中３０分間静置した。次に４２℃、２分間熱処理し、すばやく氷中に移して２分間静置した。ＳＯＣ培地を１．０ｍｌ加え３７℃で１時間振盪培養し、１０μｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレーティング、３７℃で終夜培養した。
（７）  挿入ＤＮＡ断片の確認
挿入ＤＮＡであるｓｃＦｖ遺伝子の確認は、ｐＰＤＳベクター由来の配列であり挿入部位を完全に増幅できるように設計したＬａｃ  Ｚ上流配列のＭ１３−Ｒ、およびマウスＣκ鎖内配列のＳＬＰ−１の１ペアプライマーを用い、コロニーをテンプレートとしたＰＣＲ法で行った。
（８）  ファージディスプレイ抗体の調製
形質転換後、挿入ＤＮＡ断片の確認されたコロニーは、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＣ培地  ２ｍｌで３０℃、ゆっくりとした終夜振盪培養をした。翌日、培養液  ０．８ｍｌに、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地  ０．２ｍｌ、および２Ｍグルコース  ３７μｌを添加した。５０ｍｌチューブで３７℃、３時間振盪培養した後、５×１０９ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を加え穏やかに振盪しながら３０分間培養しファージを感染させた。さらに３０分間強めに振盪培養した後、室温で８００×ｇ  １０分間の遠心を行い上清を捨てた。沈殿物は、１ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地で再懸濁した後、同培地９ｍｌを加えて激しく振盪しながら終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ  １０分間の遠心で菌体を除き、０．４５μｍポアフィルター（関東化学）で上清を濾過し、その濾液をファージディスプレイ抗体浮遊液とした。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
得られたコロニーから１０コロニーをランダムに単離し、ＰＣＲでインサート（ｓｃＦｖ遺伝子断片）の有無を確認した。その結果、１０クローン中４クローン（クローン＃：１，３，５，および６）でインサートが確認され、これをもとにファージディスプレイ抗体を調製し、これら４種のファージディスプレイ抗体をそれぞれＨＵＣ２ｐ１，ＨＵＣ２ｐ３，ＨＵＣ２ｐ５およびＨＵＣ２ｐ６と命名した。
（９）  可溶型抗体の調製
可溶型抗体は、アンバー配列ノンサプレッサー株であるEscherichia coli XL1-Blue SOLR株（ＳＯＬＲ株）にファージディスプレイ抗体を感染させることにより作成した。ＳＯＬＲ株は２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＳＯＣ培地２ｍｌで終夜培養し、その培養液２００μｌにファージディスプレイ抗体５μｌを加えて３７℃で１時間感染させた。この培養液を２×ＹＴ培地で希釈し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴプレートにプレーティングし、３７℃で終夜培養した。得られたコロニーをテンプレートとしたＰＣＲでｓｃＦｖ抗体遺伝子断片が確認されたものを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地２ｍｌで培養した。その培養液５００μｌにＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地４．５ｍｌを加え、さらにアンピシリン、カナマイシンをそれぞれ終濃度１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌとなるように加え３７℃、２時間振盪培養した。その後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに４時間振盪培養した。培養液は氷冷後、室温で８００×ｇ  １０分間遠心し、その上清を回収した。上清はさらに０．４５μｍポアフィルターで濾過滅菌し、その濾液を可溶型抗体液（培養上清）、また、沈殿物は培養液同容量のＰＢＳ  ５ｍｌで撹拌後、Ｈａｎｄｙ  Ｓｏｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ＵＲ−２０Ｐ（トミー精工）で超音波処理しその濾液を可溶型抗体液（菌体破壊抽出物）として調製した。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
【実施例９】
【００４７】
ＨＵＣ２−１３  ＳｃＦｖ抗体の再構築ベクターを用いた発現
実施例８の（８）で構築したＨＵＣ２ｐ３からＳｃＦｖ抗体遺伝子を再構築ベクター用に設計したプライマーを用い、増幅させた。反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  ２０μｌに再溶解した。
塩化セシウム法を用いた大量調製後の再構築ベクターならびにＨＵＣ２ｐ３由来ＳｃＦｖ抗体遺伝子は、１０Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０Ｕ／μｌのＢｓｓＨIIで制限酵素処理した。さらに、ベクターは分子内ライゲーションを防ぐためＢＡＰ処理を行った。処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで精製後、ＤＷ  １０μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。調製した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比が１：３になるように混合し、TAKARA Ligation Kit ver.1で１６℃  ３時間ライゲーションし、その反応液５μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン含有２×ＹＴプレートに４０μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。インサートのチェックは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子増幅用のプライマーを用い、コロニーをテンプレートとするＰＣＲで行った。
インサートの確認できたコロニーは、実施例８に記載した方法に準じてファージディスプレイ抗体を調製した．
【実施例１０】
【００４８】
可溶型抗体の調製
可溶型抗体の調製は、実施例８に記載した方法に準じて行った。
【実施例１１】
【００４９】
ＥＬＩＳＡ
調製したニワトリ型ファージディスプレイ抗体ならびに可溶型抗体の反応性は、Ｈ２５ペプチドを抗原としてＥＬＩＳＡで解析した。一次抗体のリコンビナント抗体ならびにネイティブ抗体は１５，６２５倍までの５倍段階希釈液を用いた。二次抗体に２，０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Kirkegaard and Perry Laboratories）を用いたＥＬＩＳＡで解析した。
即ち、５μｇ／ｍｌ濃度のＨ２５ペプチドを９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ添加し、４℃、終夜固相化しこれを抗原プレートとした。抗原プレートはＢｌｏｃｋＡｃｅ（雪印乳業）をＰＢＳで２５％に希釈したものを４００μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃  １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で３回洗浄した。一次抗体反応は、リコンビナント抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、２時間静置して行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で５回洗浄後、二次抗体反応として１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅで３，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（Amersham Pharmacia biotech）を加え、３７℃  １時間静置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で８回洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン（ペルオキシダーゼ標識二次抗体使用時）（SIGMA）もしくはｐ−ニトロフェニルフォスフェート（アルカリフォスファターゼ標識二次抗体使用時）（Kirkegaard and Perry Laboratories）を用いて２０分間の発色を行い、４９２もしくは４０５ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダ  ＭＰＲ−Ａ４ｉ（ＴＯＳＯＨ）で測定した。
【実施例１２】
【００５０】
抗体Ｖ領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の調整
抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡを元に、表２に示す合成プライマーセット（ＶＨ増幅用プライマーセット、ＶＬ増幅用プライマーセット）を用いて、ＶＨ及びＶＬ領域を増幅する。
（ＶＨ増幅条件）
１０ｘ  ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  １                    ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                  ３μｌ
２．０ｍＭ  ｄＮＴＰＳ                              ４μｌ
プライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊            ５μｌ
プライマーＣＨＳＦ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）＊          ５μｌ
ｃＤＮＡ                                            １μｌ
ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                        ０．５μｌ
ＤＷ                                              ２６．５μｌ
＊ＶＬ増幅条件はプライマーＣＬＳＢとＣＬＦ１を用いる。
以上のＰＣＲ混合物を作り、サーマルサイクラーにセットして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの増幅を行う。
（ＰＣＲサイクル条件）
・９８℃１０秒ｘ１回
・（９８℃１５秒、６０℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０回
・７４℃３０秒
・４℃
【実施例１３】
【００５１】
ｓｃＦｖの構築
実施例１２で得たＶＨおよびＶＬの増幅産物を精製した後、ＶＨおよびＶＬを、リンカ（ｓｃＦｖ  ｌｉｎｋｅｒ）を用いて連結する（アッセンブリー反応）。
（連結条件）
１０ｘ  ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  １                      ２．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                    ２．１μｌ
２．０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                １０μｌ
ＶＨ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ）                      １μｌ
ＶＬ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ）                      １μｌ
ｓｃＦｖ  ｌｉｎｋｅｒ（０．１２５ｐｍｏｌ／μｌ）    １μｌ
ＫＤＯ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                          ０．３μｌ
ＤＷ                                                  ７．１μｌ
以上のＰＣＲ  混合物を作り、サーマルサイクラーにセットして、以下のＰＣＲサイクル条件でＶＨとＶＬの連結を行う。
・９８℃１０秒ｘ１回
・（９８℃１５秒、６５℃３０秒）ｘ７回
・７４℃３０秒ｘ１回
・４℃
【実施例１４】
【００５２】
ｓｃＦｖの再増幅と制限酵素処理
ｓｃＦｖの再増幅のための表２に示すプライマー・セット（ＣＨＢとＣＬＦ１）を用いて、実施例１３で構築したｓｃＦｖの再増幅を行い、ｓｃＦｖを精製した後、プラスミドベクターｐＣＰＤＳに挿入するため、制限酵素（ＥａｇIとＢｓｓＨII）を用いてｓｃＦｖ挿入遺伝子断片（インサート）を調製する。
（再増幅反応）
１０ｘＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  １                        ２．５μｌ
２．０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                                ４μｌ
ｓｃＦｖプライマーＣＨＢ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）        ３μｌ
ｓｃＦｖプライマーＣＬＦ１（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）      ３μｌ
ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                          ０．３μｌ
ＤＷ                                                １２．２μｌ
（ＰＣＲ温度条件）
・９８℃１０秒ｘ１回
・（９８℃１５秒、６５℃７秒、７４℃２０秒）ｘ３０回
・７４℃３０秒ｘ１回
・４℃
（制限酵素処理）
・ｓｃＦｖの制限酵素処理
ｓｃＦｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ                          ２０μｌ
１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３                              ５μｌ
ＤＷで                                              ４８μｌ
ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ）            ３７℃で一晩処理
・ｐＣＰＤＳ  ｖｅｃｔｏｒの制限酵素処理
ｐＣＭＤＳ  ｖｅｃｔｏｒ（５μｇ）                    ｘμｌ
１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３                              ９μｌ
ＤＷで                                              ８８μｌ
ＥａｇI（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ）            ３７℃で一晩処理
・電気泳動でベクターの消化が完全に行われたことを確認した後、２μｌのＢｓｓII（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加え、５０℃３〜４時間消化する。
・６８℃２０分間処理し、酵素を失活させる。
・ｓｃＦｖの精製
・ｐＣＰＤＳはセルフライゲーションを防ぐためにＢＡＰ処理し、精製する。
【実施例１５】
【００５３】
インサート（ｓｃＦｖ）のｐＣＰＤＳへの挿入（ライゲーション）
ｐＣＰＤＳとインサートを１：１〜１０（モル比）に調整し、Ligation Kit ver.1（タカラ社製（ＴＡＫＡＲＡ））を用いてライゲーションを行う。
ベクター                                              Ｘμｌ
インサート                                            Ｙμｌ
５  ｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ                １μｌ
ＤＷで                                                ５μｌ
Ａ  ｂｕｆｆｅｒ                                    ２０μｌ
Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ                                      ５μｌ
１６℃で４〜終夜処理。
【実施例１６】
【００５４】
大腸菌の形質転換
インサートを挿入したｐＣＰＤＳ（１０μｌ）を用いて、大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ，１００μｌ）を、実施例８に記載の方法に準じて順形質転換する。
インサートを発現する形質転換大腸菌を、増殖させた大腸菌のコロニーから複数の大腸菌コロニーを任意に取り、プライマー・セットを用いてｓｃＦｖの増幅を行い、インサートを発現する形質転換大腸菌を選抜する。
【実施例１７】
【００５５】
ファージ発現抗体の作成
選抜済み大腸菌にヘルパーファージを感染させ、実施例８に記載の方法に準じてファージ発現抗体を作成する。
【実施例１８】
【００５６】
特異的ファージ抗体の選抜のためのパニング
抗原（プリオンタンパク）を固相化したプレートにファージ発現抗体を反応させた後、反応したファージ発現抗体のみを回収し、大腸菌に感染して特異的ファージ抗体を選抜する。
パニングは、抗原抗体反応を利用した高親和性抗体選抜法である。例えば、次のようにして行う。５μｇ／ｍｌ濃度のマルトース結合タンパク融合リコンビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（ＭＢＰ−ＨｕＰｒＰ）を９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ（０．２５μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、終夜固相化しこれを抗原コートプレートとした。抗原コートプレート１６ウェルに２５％ＢｌｏｃｋＡｃｅ  ４００μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃  １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で３回洗浄した。洗浄後、ファージディスプレイ抗体浮遊液  １．６ｍｌ、ＢｌｏｃｋＡｃｅ  ７０４μｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ９６μｌで混合したものを１５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃  ２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で１５回洗浄した。洗浄後のウェルには、溶出液５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間  室温の反応後、２Ｍ  トリス３μｌ／ｗｅｌｌで中和した。中和後、反応液を回収しＯＤ６００＝０．５〜１．０に培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ２ｍｌに３７℃  １時間感染させた。感染後の溶液の一部は力価測定のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳＯＢＡＧプレートにプレーティングし、溶出ファージ力価を測定した。さらにＰＣＲによるインサートチェック後、そのインサート率を溶出ファージ力価に積し陽性溶出ファージ力価を求めた。残りの感染溶液には５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  ４００μｌと２Ｍ  グルコース３７μｌ加え、３７℃  ２時間の培養後、５×１０９ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）を１時間感染させた。感染後、８００×ｇ  １０分間遠心して上清を除き、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  １０ｍｌで終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ  １０分間の遠心で菌体を除き、０．４５μｍポアフィルターで上清を濾過し、その濾液を一次パニング済ファージディスプレイ抗体浮遊液とし、次回のパニングサンプルとした。
【実施例１９】
【００５７】
可溶化抗体の作成
実施例８に記載の方法に準じて、特異的ファージ抗体をノンプレッサー大腸菌（ＳＯＬＡあるいはＨＢ２１５１）に感染させる。感染２４時間後に、大腸菌培養上清および培養菌体を回収し、上清および菌体破壊抽出物を可溶化抗体とする。
抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースゲルを用いて可溶化抗体をアフィニティ精製する。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、純粋な鳥類型リコンビナント抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を製造するためのプライマー・セット等を提供するものである。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では作成できないモノクローナル抗体を作成することができ、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパクなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生体系高分子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの展開が期待される。したがって、がん、プリオン病などの種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。ところが、ニワトリ型の大きな欠点は、一般にモノクローナル抗体を産生させる融合細胞の手法では、実際に実用するための必要量ができないことである。本発明は、実質上純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組み替え法で、初めて多量に作ることに成功し、本発明は、新規なプラスミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノクローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能にしたものであり、本発明はそのためのプライマー・セット等を提供するものである。
したがって、本発明は、がん、プリオン病などの種々の診断薬、治療薬等のためのニワトリ型モノクローナル抗体のために有用なプライマー・セット等を提供するものであり、産業上の利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、公知の発現ベクターｐＰＤＳの構成を示すものである。
【図２】図２は、本発明のニワトリリコンビナント抗体発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
【図３】図３は、ニワトリＣλ鎖遺伝子と思われる約３４０ｂｐのバンド（図３のＡ）、約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと思われるバンド（図３のＢ）、約６００ｂｐの位置のｇｅｎｅIII遺伝子と思われるバンド（図３のＣ）、約９５０ｂｐの位置のニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅIII遺伝子が連結したと思われるバンド（図３のＤ）が検出されたことを示す、図面に代わる写真である。図３中の「Ｍ１」はｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩで消化を、「Ｍ２」はφｘ１７４  ＨａｅIIIで消化を示す。
【図４】図４は、１１４残基のアミノ酸をコードするニワトリＣλ鎖遺伝子の塩基配列と、本発明の方法で得られたＣλ鎖の塩基配列を比較したものである。
【図５】図５は、インサートして得られた１２クローンで約３６０ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖の増幅が確認できたことを示す、図面に代わる写真である。図５の「Ｍ」はｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩで消化を示す。
【図６】図６は、本発明の方法で得られた１２クローンのリコンビナント抗体について、抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合、及び抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をキャプチャー抗体とした場合のＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）を示すものである。黒塗りはキャプチャー抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示し、白抜きはキャプチャー抗体として抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用した場合を示す。
【図７】図７は、本発明の発現ベクターｐＣＰＤＳの構成を示す。
【図８】図８は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。図８のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を示す。
【図９】図９は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。図９のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を示す。
【図１０】図１０は、ニワトリ抗体のＶ領域重鎖の塩基配列、及びＶ領域軽鎖のアミノ酸配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。図１０のＮはＤセグメントの塩基配列を示し、：は欠失を示す。
【図１１】図１１は、ニワトリ抗体のＶ領域軽鎖の塩基配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。図１１の：は欠失を示す。
【図１２】図１２は、ニワトリ抗体のＶ領域軽鎖の塩基配列を、ＨＵＣ２−１３と共に比較して示したものである。図１２の：は欠失を示す。
【図１３】図１３は、ＨＵＣ２−１３Ｌ鎖における多様性獲得機構をＨＵＣ２ＶＬと共に比較して示したものである。図１３の？は突然変異を示し、：は欠失を示し、ＰＶは偽遺伝子を示す。
【図１４】図１４は、本発明の方法により調製されたリコンビナント抗体のＨ２５ペプチドに対する反応性の確認を試みたＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４９２）の結果を示すものである。図１４中の黒四角印はニワトリ型ファージディスプレイ抗体を示し、灰色菱形印はニワトリ型可溶型抗体（培養上清）を示し、灰色丸形印はニワトリ型可溶型抗体（菌体破壊）を示し、灰色三角形印はＨＵＣ２−１３（ネイティブ抗体）を示す。
【図１５】図１５は、本発明の純粋なニワトリリコンビナント抗体作製のための概要を示したものである。
【図１６】図１６は、哺乳動物（図１６上段）と鳥類（図１６下段）における抗体Ｈ鎖遺伝子の構成を模式的に示したものである。
【図１７】図１７は、本発明のプライマーＣＬＦ１の使用状況を模式的に示したものであり、図１７の上段の左側がＶＬ領域であり、そのすぐ右側がＣλ領域である。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
本発明のプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2006025799.tif 000004
【図２】
2006025799.tif 000005
【図３】
2006025799.tif 000006
【図４】
2006025799.tif 000007
【図５】
2006025799.tif 000008
【図６】
2006025799.tif 000009
【図７】
2006025799.tif 000010
【図８】
2006025799.tif 000011
【図９】
2006025799.tif 000012
【図１０】
2006025799.tif 000013
【図１１】
2006025799.tif 000014
【図１２】
2006025799.tif 000015
【図１３】
2006025799.tif 000016
【図１４】
2006025799.tif 000017
【図１５】
2006025799.tif 000018
【図１６】
2006025799.tif 000019
【図１７】
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【配列表】
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