(57)【要約】    【課題】検出時のＳ／Ｎ比が良好な選択結合物質が固定化された担体を提供すること。    【解決手段】担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が飽和環状ポリオレフィン系樹脂からなり、該担体には凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が飽和環状ポリオレフィン系樹脂からなり、該担体には凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
【請求項２】
該凹凸部の凸部上面が実質的に平坦であり、選択結合性物質が固定化された凸部上面の高さが、略同一である請求項１に記載に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項３】
該担体には平坦部が設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項４】
選択性結合物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部の高さと、最も低い凸部の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項５】
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項６】
少なくとも担体表面が黒色であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項７】
カーボンブラックを含有していることを特徴とする請求項６に記載の選択結合性物質固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」）を固定化した担体に関する。
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡマイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。
【０００４】
核酸を基板上に固定化するための技術としては、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。そして、ガラス以外の基板の材料としては、飽和環状ポリオレフィンなどのプラスチックも提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】２００３−１６１７３１号公報（特許請求の範囲および実施例）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、平坦なガラスやプラスチックの基板にオリゴＤＮＡを固定化した場合、以下のような問題点があった。すなわち、１）ハイブリダイゼーションを行った時、プローブＤＮＡを固定したスポット以外の部分にも非特異的に検体ＤＮＡが吸着し易く、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、この非特異的に吸着した検体をも検出し、ノイズが大きくなるため、結果的にＳ／Ｎ比が十分でないといった問題があった。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、上記のようなＳ／Ｎ比の悪化を防ぎ、検出感度の高い選択結合性物質が固定化された担体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が飽和環状ポリオレフィン系樹脂からなり、該担体には凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、非特異的な検体の吸着が少なく、かつ、ハイブリダイゼーション効率が良好であり、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合物質が固定化された担体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の選択結合性物質の固定化担体について説明する。本発明の選択結合性物質の固定化担体は、選択結合性物質を固定化するための担体表面が、飽和環状ポリオレフィンである必要がある。本発明で用いられる飽和環状ポリオレフィン系樹脂は、検出対象を蛍光標識で測定するときにバックグラウンド（自家蛍光）が低いこと、耐熱性耐溶剤性に優れた特性がある。具体的な分子構造としては、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体であり、好適には、一般式（１）で表されるノルボルネンの開環重合体の水素添加物等が挙げられる。
【００１０】
【化１】
2006078197.tif 000002
【００１１】
（ただし、上記式（１）中、Ｒ1およびＲ2は水素または炭素数１〜１０の炭化水素残基でそれぞれ同一または異なっていても良く、また、Ｒ1およびＲ2は互いに環を形成しても良い。）
一般式（１）で表せる構造単位を有する重合体は、モノマーとしてノルボルネン、及びそのアルキル又はアルキリデン置換体であり、具体的には、５−メチル−２−ノルボルネン、５，６−ジメチル−２−ノルボルネン、５−エチリデン−２−ノルボルネン等があり、これ以外にもジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロジシクロペンタジエン、及びこれらのメチル、エチル等のアルキル置換体を使用し、開環重合で得られる開環重合体を水素添加して製造される飽和重合体がある。
【００１２】
また、一般式（２）で示される環状オレフィン系モノマーの重合体、或いはエチレン、プロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等のα−オレフィンと一般式（２）で示される環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体を用いても良い。
【００１３】
【化２】
2006078197.tif 000003
【００１４】
（ただし、上記式（２）中、Ｒ1およびＲ8は水素及びハロゲン原子及び炭化水素残基よりなる群から選ばれ、Ｒ5〜Ｒ8は互いに環を形成しても良い。）
さらには、一般式（３）で示される環状オレフィン系モノマーの重合体、或いはエチレン、プロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等のα−オレフィンと一般式（３）で示される環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体を用いても良い。
【００１５】
【化３】
2006078197.tif 000004
【００１６】
（ただし、上記式（２）中、Ｒ1およびＲ12は水素及びハロゲン原子及び炭化水素残基よりなる群から選ばれ、Ｒ9〜Ｒ12は互いに環を形成しても良い。）
一般式（１）〜（３）記載の飽和したポリオレフィン系樹脂を原材料として生化学的活性物質の固定化の支持体となる基材を成形するが、基材の成形方法、形状には特に制限はない。成形性を考慮すると、押出成形、圧縮成形、射出成形等の方法が好適であり、この中でも射出成形が最も好ましい。
【００１７】
その他環状ポリオレフィン以外の樹脂材料としては、自家蛍光が少ないことからポリプロピレンも好ましく用いることができる。
【００１８】
一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーを有する担体に選択結合性物質を固定化するためには、これに前処理を施して、担体表面にカルボキシル基や水酸基を形成させることが好ましい。担体表面にカルボキシル基を生成する手段としては、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に担体を晒す方法などが挙げられるが、基板の損傷が少なくかつ表面のカルボキシル基の量を多くできることから、酸素プラズマでの処理が特に好ましく用いることができる。特に、低温酸素プラズマ処理が基板への損傷が少ないことから最も好ましく用いることができる。
【００１９】
このようにカルボキシル基を担体の表面に生成すれば、担体表面にアミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を共有結合により固定化することが可能となる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と担体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された担体を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボキシル基を活性化しておいても良い。
【００２０】
このような縮合剤を用い、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により担体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により担体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を担体に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００２１】
前述した方法により、ポリマー表面に選択結合性物質を固定化することにより、非特異的な検体の吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性物質を固定化でき、さらに、ガラスに比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体とのハイブリダイゼーション効率が高い担体を得ることができる。
【００２２】
ところで、一般式（１）で示されるような構造単位を含むポリマーで担体を作製する場合、ガラス、セラミック、金属などに比較し、射出成形方法やホットエンボス法などを用いることにより、微細な形状を設けた担体をより簡単に大量生産することが可能である。そこで、選択結合性物質が固定化される担体の形状について述べる。本発明の選択結合性物質が固定化される担体には凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化されていることが好ましい。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。そして、凹凸部の複数の凸部の高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいう。さらに本発明の担体には、平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１が平坦部であり、かつ、２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。そして、該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、５０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一である。ここで、平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。具体的に高さの差が略同一とは、凹凸部凸部上面の高さと、平坦部の高さとの差が１００μｍより小さいことをいう。
【００２３】
すなわち、一般にマイクロアレイは、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とを反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。この集光された光をマイクロアレイの表面に照射して、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、この条件のまま、対物レンズもしくは、マイクロアレイ自体を走査することによりマイクロアレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっている。
【００２４】
このような、スキャナーを用いて本発明の凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャンすると、凹凸部の凹部に非特異的に吸着した検体ＤＮＡの蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果を発揮する。この理由は、凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部ではレーザー光がデフォーカスされるからである。逆に言えば、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。なぜなら、凸部上面の高さにこれ以上のばらつきがあると、スキャナーの焦点深度の関係で正確な蛍光強度を測定できないことが起こりうるからである。
【００２５】
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であれば良いが、３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
【００２６】
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうのであって、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。
【００２７】
また、一般にスキャナーの焦点を調整する方法は、以下の通りである。すなわち、スキャナーがマイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、マイクロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、図３に示すように、治具にマイクロアレイを突き当て、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、その条件のまま、マイクロアレイ全体をスキャンする。したがって、本発明の担体には、特に凹凸部と平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１１が平坦部であり、かつ、１２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。このようにしておけば、選択結合性物質が固定化された担体をスキャンする場合は、いったん平坦部の上面で励起光の焦点を合わせたり、平坦部を治具に突き当てることが可能である。すなわち、スキャナーの焦点合わせが容易になる。このようにして、平坦部で励起光の焦点を合わせるので、選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、平坦であり、かつ、凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。
【００２８】
凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍより大きいと、以下のような問題点が生じることがある。すなわち、励起光の焦点は平坦部の上面で調整されているので、凸部の上面の高さが異なると、凸部上面での励起光の焦点がぼやけてしまい、最悪の場合、選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く検出されないことが起こりうる。同様なことは、凸部上面と高さが同じ平坦部が設けられていない場合でも起こりうる。
【００２９】
また、凸部の上面が平坦でない場合、凸部上面での励起光の焦点の大きさにばらつきが起き、結果的に１つの凸部上面内で検出された蛍光の強さにむらが発生する。こうなると、後の解析が困難となる。本願の場合は、上記のような問題は起きず、良好なシグナル（蛍光）を得ることが可能である。
【００３０】
なお、凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、５０μｍ以下であればよいが、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
【００３１】
また本発明では、平面状の担体に選択結合性物質を点着するのではなく、凹凸部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。したがって、凸部上面以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、凸部上面以外の部分では、励起光の焦点がぼやけてるため、望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光を検出することがない。このため、ノイズが小さくなり、結果的にＳ／Ｎが良くなるという効果を発揮する。
【００３２】
また、凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。このようにすることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００３３】
凸部の上面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、４ｍｍ２以下、１０μｍ２以上が好ましい。
【００３４】
凹凸部における凸部の高さとしては、０．０１ｍｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが１ｍｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。
【００３５】
また、少なくとも凸部の側面に導電性材料が設けられていることが好ましい。こうすると、例えば、対抗電極を設け、対抗電極とこの導電性材料の間に電流、電圧を印加することにより核酸の場合であるとハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。導電性材料がコートされる好ましい領域としては、凹部の全部、凸部の側面全部である。その例を図４に示す。
【００３６】
印加する電圧の範囲としては、電流が流れる場合は、０．０１Ｖ以上、２Ｖ以下の範囲が好ましい。特に好ましい範囲は、０．１Ｖ以上、１．５Ｖ以下である。これより、大きい電圧を印加すると水が電気分解をおこし、表面の選択結合性物質に悪影響を及ぼす場合がある。導電性材料の材質としては特に限定されないが、炭素、マグネシウム、アルミ、シリコン、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、錫、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、白金、金、ステンレスやこれらの混合物や導電性ポリマーが挙げられる。この中でも、白金、金、チタンが特に好ましく用いられる。これらの導電性材料の膜の作製方法としては、蒸着、スパッタ、ＣＶＤ、メッキなどが挙げられる。
【００３７】
上記のように凸部に導電性材料をコートした場合は、凸部の上面以外はさらに絶縁材料の層を設けることが好ましい。絶縁材料の層があると、電流を流した場合凸部の上面にのみ被検体を引き寄せることが可能である。絶縁材料の材料としては、金属の酸化物（例えば、Ａｌ−Ｏ、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＶＯ、ＳｎＯ、Ｃｒ−Ｏ、Ｚｎ−Ｏ、ＧｅＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2、Ｎｂ−Ｏ、Ｙ2Ｏ3など）、窒化物（Ａｌ−Ｎ、Ｓｉ3Ｎ4、ＴｉＮ、Ｔａ−Ｎ、Ｇｅ−Ｎ、Ｚｒ−Ｎ、ＮｂＮなど）、硫化物（ＺｎＳ、ＰｂＳ、ＳｎＳ、ＣｕＳ）、絶縁性のポリマーが挙げられる。
【００３８】
上述の方法により得られた選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。
【００３９】
また、選択結合性物質固定化担体は、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とをハイブリダイゼーション反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。しかし、担体表面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。これを防ぐため一般式（１）の構造単位を有するポリマーに黒色を呈し、またレーザー照射により発光を生じない物質を含有させて表面を黒色にすることにより、担体自身からの自家蛍光を低減させることができるので好ましい。このような担体を用いることにより、検出の際、担体からの自家蛍光を低減できるのでよりノイズが小さく、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。
【００４０】
ここで、担体が黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。
【００４１】
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２  条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
【００４２】
黒色にする手段としては、担体に黒色物質を含有させることにより達成しうるが、この黒色物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。
【００４３】
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラックを好ましく含有させることができ、ポリマーに一様に分散しやすいことから特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。
【００４４】
また、担体の形状としてガラス、金属などの熱変形をし難い材料からなる支持体層の上に、一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーからなる選択結合性物質固定化層を設けると、熱や外力による担体の形状変化を防げることから好ましい。この概念図を図５に示す。支持体層としては、ガラスや、鉄、クロム、ニッケル、チタン、ステンレスなどの金属が好ましい。また、この支持体層と選択結合性物質固定化層との密着性を良くするため、支持体層の表面を、アルゴン、酸素、窒素ガスでのプラズマ処理やシランカップリング剤での処理を施すことが好ましい。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。支持体層の上に選択結合性物質固定化層を設ける手段としては、ポリマーを有機溶媒に溶解し、スピンコートやディッピングなどの公知の手段を用いることができる。より簡単には、支持体層に接着剤で貼り付けることもできる。
【００４５】
ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。
【００４６】
本発明の担体を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【００４７】
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有する基板を射出成形した。なお、基板の材料としては、エチレンとジシクロペンタジエンのランダム共重合体の水素添加物を用いた。基板中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００５０】
基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部分を除き表面は平坦であった。基板の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
【００５１】
そして、この基板をリアクティブイオンエッチング装置（サムコ（株）製：ＲＩＥ−１０ＮＲ）の真空チャンバーにセットした。そして、１×１０−３Ｐａまで高真空排気した後、酸素流量５０ｓｃｃｍ、圧力１０Ｐａ、投入電力１００Ｗの条件にて、３０秒間酸素プラズマに基板をさらした。このようにして、基板表面にカルボキシル基を生成した。
【００５２】
（プローブＤＮＡの固定化）
そして、配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。このＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし、ｐＨ調整用の塩酸を加えて、１ｌにメスアップしたものにたもの。ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をガラス製のキャピラリーに取り、顕微鏡下でこのプローブＤＮＡを基板の凸部上の４箇所に点着した。次いで、この基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、その後純水で洗浄した。
【００５３】
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号２のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。
【００５４】
配列番号３と配列番号４のＤＮＡを合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号３および配列番号４のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００５５】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号３の溶液を２μｌ、配列番号４の溶液を２μｌ、 テンプレート（配列番号５）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号２（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００５６】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液にに２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号２（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００５７】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１％（ｗ／ｖ）サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
【００５８】
（ハイブリダイゼーション）
前述の（検体ＤＮＡの調整）で調整したＤＮＡ溶液を１０μｌ取りだし、これに３０μｌの、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）サケ精子ＤＮＡの溶液を加え、トータルで４０μｌとした。そして、これを前述したＤＮＡが固定化された担体の凹凸部分に滴下して、注意深くカバーガラスをかぶせた。そして、カバーガラスの周りをペーパボンドでシーリングして、ハイブリダイゼーション溶液が乾かないようにした。すなわち、検体ＤＮＡの分子量を実施例１や比較例１と同じにした。これをプラスチック容器に入れて、湿度１００％、温度４５℃の状態で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離して、洗浄・乾燥した。
【００５９】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000B）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、ノイズとはスポット周り（ＤＮＡが点着されていない部分）の蛍光強度の平均値とした。その結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2006078197.tif 000005
【００６１】
比較例１
平板状のエチレンとジシクロペンタジエンのランダム共重合体の水素添加物からなる基板を射出成形した。この基板は平坦であること以外は、実施例１と同様のものである。実施例１と同様に、カルボキシル基の生成、プローブＤＮＡの固定化、検体の調整、ハイブリダイゼーション、測定を行った。その結果を表１に示す。これから分かるように、２つの基板の間でシグナル強度はほとんど変化ないが、凹凸形状にすることによりノイズが低下し、結果的にＳ／Ｎの向上ができていることが分かる。
【００６２】
実施例２
次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。実施例１で用いた射出成形品の凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面（基準となる凸部）よりも、３０μｍ低い凸部（４箇所）がある担体（担体ア）、他の凸部上面よりも、５０μｍ低い凸部（４箇所）がある担体（担体イ）をそれぞれ作製した。なお、これら担体の低い部分以外の凸部（基準となる凸部）上面の高さと、平坦部分の高さの差は３μｍ以下であった。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調整を行った。ついで、基準となる凸部上面に４箇所、低い凸部上面に４箇所にプローブＤＮＡ溶液の点着を実施例１と同様に行った。さらに、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を実施例１と同様に行い、測定も実施例１と同様に行った。基準となる凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平均値、高さが低い凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平均値を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2006078197.tif 000006
【００６４】
このように、凸部の高さにばらつき（５０μｍ以下）があっても、比較例と比べると十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
実施例３
さらに、凸部上面と平坦部の差がある場合について検討した。実施例１で用いた射出成形品の平坦部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と凸部上面の高さの差が３０μｍ（担体ウ）、５０μｍ（担体エ）の２種類の担体を作製した。すなわち、担体ウは凸部の高さが平坦部の高さより３０μｍ高いことになる。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調整、凸部上面へのプローブＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用ＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、実施例１と同様に測定を行った。なお、上面にＤＮＡ溶液をスポットした凸部はそれぞれの基板について４カ所である。そして、ＤＮＡを点着したスポット（４カ所）の蛍光強度と、その周りのノイズ（４カ所）の平均値を求めた。その結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
このように、平坦部上面と凸部上面との高さに差（５０μｍ以下）があっても、比較例と比較するれば十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の担体の模式図
【図２】本発明の担体の断面模式図
【図３】マイクロアレイ突き当て用治具の例
【図４】電極を形成した場合の担体凹凸部の断面図
【図５】支持体層と選択結合性物質固定化層を有する担体の概念図
【符号の説明】
【００６８】
３      支持体層（ガラス）
４      選択結合性物質固定化層
１１    平坦部
１２    凹凸部
１３    マイクロアレイ
１４    対物レンズ
１５    励起光
１６    マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
２１  凸部上面
２２  導電性膜
２３  絶縁膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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