(57)【要約】【課題】より簡易な構成によって環境要因および夾雑物質の影響を排除する。【解決手段】表面に測定抗原および参照抗原のそれぞれに対応する２種類の抗体が固定された金薄膜１と、金薄膜１の抗体が固定された表面に溶液を接触させた状態で金薄膜１の裏面に光を照射する光照射装置２０と、金薄膜１からの反射光を受光する受光装置３０と、受光装置３０の出力に基づき溶液中の抗原の濃度に応じた応答を検出する応答検出部と、標準溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第１の溶液および標準溶液に第２の濃度の参照抗原を添加した第２の溶液のそれぞれに対する応答のデータを記憶するデータ記憶部と、測定溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第３の溶液および測定溶液に測定抗原が含まれる第４の溶液のそれぞれに対する応答とデータ記憶部に記憶されているデータとに基づき、第４の溶液中の測定抗原の濃度を算出する濃度算出部とを備える。【選択図】  図１
2006078364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に測定抗原および参照抗原のそれぞれに対応する少なくとも２種類の抗体が固定された金属薄膜と、
この金属薄膜の前記抗体が固定された表面に溶液を接触させた状態で前記金属薄膜の裏面に光を照射する光照射手段と、
前記金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光する受光手段と、
この受光手段の出力に基づき前記溶液中の抗原の濃度に応じた応答を検出する応答検出手段と、
標準溶液に第１の濃度の前記参照抗原を添加した第１の溶液および前記標準溶液に第２の濃度の前記測定抗原を添加した第２の溶液をそれぞれ前記金属薄膜の表面に接触させて得られる第１および第２の応答のデータを記憶するデータ記憶手段と、
測定溶液に前記第１の濃度の前記参照抗原を添加した第３の溶液および前記測定溶液に前記測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液をそれぞれ前記金属薄膜の表面に接触させて得られる第３および第４の応答と、前記データ記憶手段に記憶されている前記データとに基づき、前記第４の溶液中の前記測定抗原の濃度を算出する濃度算出手段と
を備えることを特徴とする表面プラズモン測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の表面プラズモン測定装置において、
前記濃度算出手段は、前記第１の応答と前記第３の応答との比を用いて、前記第４の応答から前記第４の溶液と同じ濃度の前記測定抗原が前記標準溶液に含まれる溶液に対する応答を推定し、この推定結果および前記第２の応答に基づき前記濃度を算出することを特徴とする表面プラズモン測定装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の表面プラズモン測定装置において、
前記標準溶液は、夾雑物質が含まれない溶液であることを特徴とする表面プラズモン測定装置。
【請求項４】
測定抗原および参照抗原のそれぞれに対応する少なくとも２種類の抗体が固定された金属薄膜の表面に、標準溶液に第１の濃度の前記参照抗原を添加した第１の溶液を接触させ、前記金属薄膜の前記裏面に光を照射し、前記金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、前記第１の溶液中の前記参照抗原の濃度に応じた第１の応答を検出するステップと、
前記金属薄膜の前記表面に、前記標準溶液に第２の濃度の前記測定抗原を添加した第２の溶液を接触させた状態で前記金属薄膜の前記裏面に光を照射し、前記金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、前記第２の溶液中の前記測定抗原の濃度に応じた第２の応答を検出するステップと、
前記測定溶液に前記第１の濃度の前記参照抗原を添加した第３の溶液および前記測定溶液に前記測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液をそれぞれ前記金属薄膜の前記表面にを接触させ、前記金属薄膜の前記裏面に光を照射し、前記金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、前記第３および第４の溶液中の前記参照抗原および前記測定抗原の濃度に応じた第３および第４の応答を検出するステップと、
検出された前記第１、第２、第３および第４の応答に基づき前記第４の溶液中の前記測定抗原の濃度を算出するステップと
を備えることを特徴とする表面プラズモン測定方法。
【請求項５】
請求項４に記載の表面プラズモン測定方法において、
前記濃度を算出するステップは、前記第１の応答と前記第３の応答との比を用いて、前記第４の応答から前記第４の溶液と同じ濃度の前記測定抗原が前記標準溶液に含まれる溶液に対する応答を推定し、この推定結果および前記第２の応答に基づき前記濃度を算出することを特徴とする表面プラズモン測定方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の表面プラズモン測定方法において、
前記標準溶液は、夾雑物質が含まれない溶液であることを特徴とする表面プラズモン測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質に接した金属薄膜での表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance:ＳＰＲ）現象を利用して被測定物質の屈折率変化を検出する表面プラズモン測定装置および測定方法に関し、特に、表面に抗体を固定した金属薄膜を用いて溶液中の抗原濃度を測定する表面プラズモン測定装置および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
図１１は、従来の表面プラズモン測定装置の構成を示す図である。
従来の表面プラズモン測定装置は、被測定物質１０５に接する金属薄膜１０１が一表面に形成されたプリズム１０３と、Ｐ偏光光をプリズム１０３に入射させ入射角θで金属薄膜１０１に照射する光照射装置１２０と、金属薄膜１０１からの反射光を受光する受光装置１３０とを有する。
【０００３】
光照射装置１２０は更に、光源１２１と、光源１２１からの光のうちＰ偏光のみを通過させる偏光板１２２と、偏光板１２２を通過したＰ偏光光を集光するレンズ１２３とを有する。また、受光装置１３０は更に、金属薄膜１０１からの反射光を平行光にするレンズ１３１と、Ｐ偏光のみを通過させる偏光板１３２と、偏光板１３２を通過したＰ偏光光を受光する受光素子１３３とを有する。なお、金属薄膜１０１はプリズム１０３の一表面に直接蒸着されているのではなく、金属薄膜１０１を蒸着させたガラス基板（測定基板）をプリズム１０３の一表面に貼り付けたものが用いられる。
【０００４】
光照射装置１２０からプリズム１０３に入射された光は、プリズム１０３と金属薄膜１０１との界面でエバネッセント波を生起させる。エバネッセント波の波数ｋevは、式（１）により定義される。
ｋev＝ｋpｎpｓｉｎθ  …（１）
ここで、ｋpは入射光の波数、ｎpはプリズム１０３の屈折率、θは入射角である。
一方、金属薄膜１０１の表面では、表面プラズモン波が生じる。表面プラズモン波の波数ｋspは、式（２）により定義される。
ｋsp＝（ｃ／ω）｛εｎ2／（ε＋ｎ2）｝1/2  …（２）
ここで、ｃは光速、ωは角振動数、εは金属薄膜１０１の誘電率、ｎは被測定物質１０５の屈折率である。
【０００５】
エバネッセント波の波数ｋevと表面プラズモン波の波数ｋspとが一致する入射角θのときに、エバネッセント波のエネルギーが表面プラズモンの励起に使われ、反射光の強度が減少する。したがって、入射角θを変化させることにより、所定の角度θ0で極小をもつ入射角−反射強度曲線が得られる。
このＳＰＲ現象は、金属薄膜１０１に接する被測定物質１０５の屈折率ｎに依存する。このため、極小値をとる角度θ0から、被測定物質１０５の化学的濃度変化による屈折率変化等を測定することができる。
さらに、表面に抗体を固定した金属薄膜を用いて、溶液中の抗原と結合した抗体の屈折率変化を測定することにより、溶液中の抗原濃度を測定することもできる（例えば、特許文献１を参照）。
【０００６】
従来の表面プラズモン測定装置を用いた溶液中の抗原濃度測定は、温度変化や測定溶液の流速変化等の環境要因や、測定溶液（例えば血液等）中に存在する夾雑物質による抗体との非特異応答等に影響を受けやすい。
このうち、環境要因を排除するためには、従来の表面プラズモン測定装置は、光学系や測定溶液の温度を一定に制御する温度制御装置や、測定溶液の流速を一定に制御する微小流路制御装置を装備する必要がある。または、参照光と測定光を用いたマルチチャンネル化による環境要因に対する補正も可能である。なお、マルチチャンネル化を実現するには、参照光用および測定光用として、光照射装置１２０および受光装置１３０を２組設ける必要がある。
【０００７】
また、測定溶液中に存在する夾雑物質の影響を排除するためには、フィルター濾過、吸着、遠心分離作業による事前のサンプル調製等が必要である。加えて、表面プラズモン測定に用いる測定基板として、夾雑物質による抗体との非特異応答の少ない基板の作製が不可欠である。
【０００８】
なお、上述した従来技術のうち、環境要因や夾雑物質の影響を排除・補正する技術は、出願人が出願時点で知る限りにおいて文献公知ではない。
また、出願人は、本明細書に記載した先行技術文献情報で特定される先行技術文献以外には、本発明に関連する先行技術文献を出願時までに発見するには至らなかった。
【特許文献１】特開２００１−２５５２６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、環境要因を排除するために、従来のように温度制御装置や微小流路制御装置を装備するか、またはマルチチャンネル化を採用すると、装置が大型化し、高価になるという問題があった。温度制御装置や微小流路制御装置を装備する場合には更に、光学技術のみならず、温度制御、流速制御、微小流路形成等に関する高度の技術が要求され、また測定結果の解釈に専門知識が必要となるという問題があった。マルチチャンネル化を採用した場合には更に、参照光と測定光とで金属薄膜１０１への照射位置が異なることから、光学系の僅かなゆがみ等により環境要因に対する正確な補正が非常に困難になるという問題があった。
また、夾雑物質の影響を排除するために、事前のサンプル調製等が必要な従来の技術では、測定全体の工程数が増え、測定に長時間を要するという問題があった。
【００１０】
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、その目的は、表面プラズモン測定技術を用いた抗原濃度測定において、従来よりも簡易な構成によって環境要因および夾雑物質の影響を排除するとともに、測定時間を短縮することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的を達成するために、本発明に係る表面プラズモン測定装置は、表面に測定抗原および参照抗原のそれぞれに対応する少なくとも２種類の抗体が固定された金属薄膜と、この金属薄膜の抗体が固定された表面に溶液を接触させた状態で金属薄膜の裏面に光を照射する光照射手段と、金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光する受光手段と、この受光手段の出力に基づき溶液中の抗原の濃度に応じた応答を検出する応答検出手段と、標準溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第１の溶液および標準溶液に第２の濃度の測定抗原を添加した第２の溶液をそれぞれ金属薄膜の表面に接触させて得られる第１および第２の応答のデータを記憶するデータ記憶手段と、測定溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第３の溶液および測定溶液に測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液をそれぞれ金属薄膜の表面に接触させて得られる第３および第４の応答と、データ記憶手段に記憶されているデータとに基づき、第４の溶液中の測定抗原の濃度を算出する濃度算出手段とを備えることを特徴とする。なお、第２の濃度を様々に変えて得られる複数の第２の応答のデータをデータ記憶手段に記憶するようにしてもよい。
【００１２】
より具体的には、濃度算出手段は、第１の応答と第３の応答との比を用いて、第４の応答から第４の溶液と同じ濃度の測定抗原が標準溶液に含まれる溶液に対する応答を推定し、この推定結果および第２の応答に基づき濃度を算出するものであってもよい。
また、標準溶液は、夾雑物質が含まれない溶液であってもよい。
【００１３】
また、本発明に係る表面プラズモン測定方法は、測定抗原および参照抗原のそれぞれに対応する少なくとも２種類の抗体が固定された金属薄膜の表面に、標準溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第１の溶液を接触させ、金属薄膜の裏面に光を照射し、金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、第１の溶液中の参照抗原の濃度に応じた第１の応答を検出するステップと、金属薄膜の表面に、標準溶液に第２の濃度の測定抗原を添加した第２の溶液を接触させた状態で金属薄膜の裏面に光を照射し、金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、第２の溶液中の測定抗原の濃度に応じた第２の応答を検出するステップと、測定溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第３の溶液および測定溶液に測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液をそれぞれ金属薄膜の表面にを接触させ、金属薄膜の裏面に光を照射し、金属薄膜からの表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光を受光し、第３および第４の溶液中の参照抗原および測定抗原の濃度に応じた第３および第４の応答を検出するステップと、検出された第１、第２、第３および第４の応答に基づき第４の溶液中の測定抗原の濃度を算出するステップとを備えることを特徴とする。なお、第２の濃度を様々に変えて第２の応答を複数検出するようにしてもよい。
【００１４】
より具体的には、濃度を算出するステップは、第１の応答と第３の応答との比を用いて、第４の応答から第４の溶液と同じ濃度の測定抗原が標準溶液に含まれる溶液に対する応答を推定し、この推定結果および第２の応答に基づき濃度を算出するようにしてもよい。
また、標準溶液は、夾雑物質が含まれない溶液であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、金属薄膜の表面に測定抗原に対応する抗体とともに参照抗原に対応する抗体を固定し、標準溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第１の溶液および標準溶液に第２の濃度の測定抗原を添加した第２の溶液をそれぞれ金属薄膜の表面に接触させて得られる第１および第２の応答と、測定溶液に第１の濃度の参照抗原を添加した第３の溶液および測定溶液に測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液をそれぞれ金属薄膜の表面に接触させて得られる第３および第４の応答とを測定する。第３および第４の溶液に対する測定は同じ条件下で行われるので、第３および第４の応答には温度変化等の環境要因や測定溶液中に存在する夾雑物質の影響を同時に受ける。一方、同一濃度の参照抗原を測定溶液に添加した第３の溶液に対する第３の応答と標準溶液に添加した第１の溶液に対する第１の応答との間の関係は、測定溶液に同一濃度の測定抗原が含まれるもしくは添加された第４の溶液に対する第４の応答と標準溶液に添加された第１の溶液に対する第１の応答との間にも成立する。したがって、測定によって得られた４つの応答から、第２の溶液に対する測定と同じ条件下で第４の溶液に対する測定が行われた場合に得られる応答を推定することが可能となる。この推定結果に基づいて測定溶液中の測定抗原の濃度を算出することにより、測定結果から温度変化等の環境要因を排除することができる。さらに、標準溶液として夾雑物質が含まれない溶液を用いることにより、測定結果から夾雑物質の影響を排除することができる。
【００１６】
本発明では、測定抗原に対応する抗体とともに参照抗原に対応する抗体が固定された金属薄膜を用いることにより環境要因を排除でき、温度制御装置や微小流路制御装置を装備する必要がなく、またマルチチャンネル化を採用する必要もない。したがって、装置を小型化し、また装置自体の価格およびランニングコストを低減することができる。また、測定者に高度の技量や知識を要求することなく、正確な濃度測定が可能になる。
また、本発明では、参照抗原を含み夾雑物質が含まれない標準溶液に対する応答のデータを記憶しておくことにより、濃度測定の度にサンプル調整等を行う必要がなくなる。このため、測定全体の工程数を低減し、測定時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照し、本発明の一実施の形態について詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン測定装置の構成を示す図である。
この表面プラズモン測定装置は、プリズム３の一表面に形成された金薄膜１と、金薄膜１の表面に測定溶液を接触させるフローセル４と、Ｐ偏光光をプリズム３に入射させ入射角θで金薄膜１に照射する光照射装置２０と、金薄膜１からの反射光を受光する受光装置３０と、受光装置３０の出力を演算処理して測定溶液中における測定抗原の濃度を算出するコンピュータ４０とを有する。
【００１８】
ここで、光照射装置２０は、光源２１と、偏光板２２と、レンズ２３とを有する。光源２１としては、ＬＥＤまたは半導体レーザ等を用いることができる。光源２１からの光を、Ｐ偏光のみを通過させる偏光板２２に通し、偏光板２２を通過したＰ偏光光をレンズ２３によって集光してプリズム３に入射させ、入射角θで金薄膜３上に照射する。
また、受光装置３０は、レンズ３１と、偏光板３２と、受光素子３３とを有する。金薄膜１からの反射光をレンズ３１によって平行光にし、Ｐ偏光のみを通過させる偏光板３２に通して、受光素子３３で受光する。受光素子３３としては、ＣＣＤカメラ等を用いることができる。なお、偏光板２２，３２については、そのいずれか一方のみを用いるようにしてもよい。
【００１９】
光の入射角θを変え、その反射光を受光素子３３で受光できるように、光照射装置２０および受光装置３０は、図示しない位置制御機構を備えていてもよい。この位置制御機構により、入射角θを所定の角度範囲内（例えば６０°〜８０°）で連続的に変えることができる。ただし、レンズ２３で光を集光して金薄膜３上に照射することにより、ある程度の角度範囲内（例えば６５°〜７５°）の測定を一度に行えるので、この角度範囲内で測定を行う場合には、位置制御機構を用いなくてもよい。
【００２０】
金薄膜１は、プリズム３と同じ材質のガラス基板（測定基板）２の一表面に金を蒸着したものである。ガラス基板２の裏面がプリズム３の一表面に貼り付けられている。
金薄膜１の表面には更に、２種類の互いに異なる抗体が固定されている。その状態を図２に概念的に示す。一方の抗体は、測定対象である測定抗原５３に対応する測定抗体５１であり、他方の抗体は、測定抗原５３とは異なる参照抗原５４に対応する参照抗体５２である。測定抗体５１は、測定抗原５３と特異的に反応し、参照抗体５２は、参照抗原５４と特異的に反応する。本実施の形態においては、測定抗体５１を抗成長ホルモン抗体（抗ＧＨ抗体）、測定抗原５３を成長ホルモン（ＧＨ）、参照抗体５２を抗牛血清アルブミン抗体（抗ＢＳＡ抗体）、参照抗原５４を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とする。
【００２１】
金薄膜１上への２種類の抗体５１，５２の固定方法を説明する。金薄膜１上に抗体５１，５２を安定に結合させるため、まず結合試薬として３−メルカプトプトプロピオン酸２００μｌを１５μｌ／ｍｉｎの流速で１００μｌずつ金薄膜１上に流す。次に、測定抗体（ＧＨ）５１および参照抗体（ＢＳＡ）５２を溶解させたＷＳＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochloride）溶液２００μｌを１００μｌずつ金薄膜１上に流し、メルカプトプトプロピオン酸と反応させ各抗体５１，５２を固定する。最後に、０．１％スキムミルク２００μｌを１００μｌずつ金薄膜１上に流し、未反応メルカプトプトプロピオン酸を反応させ、完成する。
【００２２】
なお、本実施の形態では、金薄膜１の表面に２種類の抗体５１，５２が固定される例を示したが、２種類以上の抗体が固定されたものであってもよい。この場合には、２種類以上の抗体の何れか１つは測定抗原５３に対応し、他の１つは参照抗原５４に対応するものである必要がある。また、本実施の形態では、金薄膜１を蒸着により作成しているが、スパッタ法によって作成してもよい。さらに、金薄膜１の代わりに、その他の金属からなる薄膜を用いてもよい。
【００２３】
図１に示すように、抗体５１，５２が固定された金薄膜１の表面には、フローセル４が取り付けられている。フローセル４の１つの面には、平面視方形の窪みが形成されている。この窪みが形成された面を金薄膜１に取り付けることにより、窪みと金薄膜１とからキャビティ５ができる。このキャビティ５に測定溶液を注入することにより、測定溶液を金基板１表面の抗体５１，５２に接触させることができる。キャビティ５の容量は、５〜１００ｎｌ程度であってもよい。フローセル４には更に流路６，７が形成されている。流路６を通してキャビティ５に測定溶液が注入され、流路７を通してキャビティ５から測定溶液が排出される。フローセル４は、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて作成することができる。ＰＤＭＳを用いることにより、フローセル４の成型が容易になる。
【００２４】
フローセル４の流路６は、配管８を介して、溶液供給装置１０に接続されている。溶液供給装置１０は、４つのシリンジポンプ１１〜１４と、切り換え器１５とから構成される。ここで、シリンジポンプ１１は、測定抗原５３および参照抗原５４を含まない標準溶液を注入するポンプである。シリンジポンプ１２は、参照抗原５４のみを含む測定溶液を注入するポンプである。測定溶液中の参照抗原濃度は既知である。シリンジポンプ１３は、測定抗原５３のみを含む測定溶液を注入するポンプである。シリンジポンプ１４は、抗原抗体解離溶液を注入するポンプである。切り換え器１５は、各シリンジポンプ１１〜１４からフローセル４へ注入される溶液を切り換える。なお、実際の濃度測定に先立って行われる本装置の設定データ取得の際には、シリンジポンプ１２，１３は、測定溶液に代えて、夾雑物質が除去された標準溶液を注入するものとする。
フローセル４の流路７は配管９に接続され、流路７から排出された測定溶液は廃棄される。
【００２５】
図３は、コンピュータ４０により実現される機能部を示すブロック図である。
コンピュータ４０は、溶液供給装置制御部４１と、ＳＰＲ角度算出部４２と、応答量算出部４３と、近似式算出部４４と、データ記憶部４５と、測定抗原濃度算出部４６とを実現する。
ここで、溶液供給装置制御部４１は、溶液供給装置１０を構成するシリンジポンプ１１〜１４に対する溶液注入のタイミングや流量の制御、切り換え器１５に対する注入溶液切り換えのタイミング制御等を行う。
【００２６】
ＳＰＲ角度算出部４２は、金属薄膜１への光の入射角θを最小から最大まで１回連続的に変えていったときに、受光素子３３から入力される反射光の強度が極小値をとる角度θ0を算出する。この角度θ0は、ＳＰＲ現象によるエネルギー吸収が最大となる角度であり、「ＳＰＲ角度」と呼ぶ。
応答量算出部４３は、入射角θを最小から最大まで変えていく制御を複数回繰り返すことによって得られる複数個のＳＰＲ角度θ0のデータから、溶液中の抗原５３，５４の濃度に応じたＳＰＲ角度θ0の変化量を算出する。このＳＰＲ角度θ0の変化量を「応答量」と呼ぶ。なお、応答量算出部４３に、溶液供給装置制御部４１から注入溶液切り換えのタイミング信号を入力することにより、注入溶液切り換えに合わせた応答量の算出が可能となる。
【００２７】
近似式算出部４４は、標準溶液中の測定抗原５３の濃度（第２の濃度）と応答量との関係を近似する近似式を算出する。
データ記憶部４５は、本装置の設定データを記憶する。具体的には、近似式算出部４４で算出された近似式と、所定濃度（第１の濃度）の参照抗原５４を含む標準溶液に対する応答量を記憶する。なお、シリンジポンプ１２によって注入される測定溶液中の参照抗原５４の濃度は、データ記憶部４５に記憶されている応答量を得た標準溶液中の参照抗原５４の濃度と同じ値に設定される。
【００２８】
測定抗原濃度算出部４６は、シリンジポンプ１２によって既知濃度の参照抗原５４を含む測定溶液をフローセル４へ注入したときに得られる応答量と、シリンジポンプ１３によって測定抗原５３を含む測定溶液をフローセル４へ注入したときに得られる応答量と、データ記憶部４５に記憶されている設定データとに基づいて、測定溶液中の測定抗原５３の濃度を算出する。
【００２９】
次に、本装置の設定データの取得方法について説明する。
まず、図４を参照し、標準溶液中の測定抗原５３の濃度と応答量との関係を近似する近似式の取得方法について説明する。
【００３０】
本実施の形態では、標準溶液としてリン酸緩衝溶液を用いる。なお、このリン酸緩衝溶液には、夾雑物質は含まれない。
標準溶液に測定抗原５３を添加し、濃度Ｃ1の測定抗原標準溶液を作成する。この測定抗原標準溶液を基準条件の下、シリンジポンプ１３からフローセル４のキャビティ５へ注入する（ステップＳ１，Ｓ２）。本実施の形態では、基準条件として、溶液の温度を２５℃、ｐＨを７．４、流速を１５μｌ／ｍｉｍに設定した。
測定抗原標準溶液がキャビティ５に注入されると、測定抗原５３と金薄膜１に固定された測定抗体５１とが結合し、測定抗体５１の屈折率が測定抗原５３の濃度Ｃ1に応じて変化する。
【００３１】
この状態で、光照射装置２０から金薄膜１への光の入射角θを連続的に変えていき、金薄膜１からの反射光を受光装置３０で受光する（ステップＳ３）。このときの反射光の強度変化を基に、ＳＰＲ現象によるエネルギー吸収が最大となる入射角であるＳＰＲ角度θ0をＳＰＲ角度算出部４２において算出する（ステップＳ４）。濃度Ｃ1の測定抗原標準溶液に対し、ステップＳ３，Ｓ４によるＳＰＲ角度θ0の算出を所定のサイクルで複数回繰り返す（ステップＳ５，ＮＯ）。
濃度Ｃ1でのＳＰＲ角度θ0の算出が終了すると（ステップＳ５，ＹＥＳ）、応答量算出部４３において、ＳＰＲ角度θ0の時間変化を示すデータシートを作成する（ステップＳ６）。このデータシートを基に、標準溶液中の測定抗原５３の濃度Ｃ1に応じたＳＰＲ角度θ0の変化量、すなわち濃度Ｃ1に応じた応答量を算出する（ステップＳ７）。
【００３２】
このような応答量の算出処理を、複数の測定抗原濃度に対して繰り返し行う（ステップＳ８，ＮＯ、ステップＳ９）。これにより、測定抗原濃度と応答量のデータが複数得られる（図５中の■）。
これらのデータを基に、近似式算出部４４において、標準溶液中の測定抗原５３の濃度と応答量との関係を近似する近似式を算出する（ステップＳ１０）。この近似式を仮に式（３）のように表す。
Ｙ＝ａＸ  …（３）
ここで、Ｘは濃度、Ｙは応答量である。
この近似式をデータ記憶部４５に記録し（ステップＳ１１）、一連の処理を終了する。
【００３３】
次に、図６を参照し、所定濃度の参照抗原５４を含む標準溶液に対する応答量の取得方法について説明する。
本実施の形態では、標準溶液としてリン酸緩衝溶液を用いる。標準溶液に参照抗原５４を添加し、濃度Ｃの参照抗原標準溶液を作成する。この参照抗原標準溶液を上述した基準条件の下、シリンジポンプ１２からフローセル４のキャビティ５へ注入する（ステップＳ２１）。これにより、標準溶液中の参照抗原５４と金薄膜１に固定された参照抗体５２とが結合し、参照抗体５２の屈折率が参照抗原５４の濃度Ｃに応じて変化する。
【００３４】
その後、図４のステップＳ３〜Ｓ７と同様の処理を行い、標準溶液中の参照抗原５４の濃度Ｃに対するＳＰＲ角度θ0の変化量、すなわち濃度Ｃに対する応答量を算出する（ステップＳ２２〜Ｓ２６）。この応答量を「Ａ0」とする。
応答量Ａ0をデータ記憶部４５に記録し（ステップＳ２７）、一連の処理を終了する。
なお、図４のステップＳ１〜Ｓ１１と同様にして、標準溶液中の参照抗原５４の濃度と応答量との関係を近似する近似式の取得し、この近似式をデータ記憶部４５に記録するとともに、この近似式から濃度Ｃに対する応答量Ａ0を算出するようにしてもよい。
【００３５】
次に、図７および図８を参照し、本装置による測定溶液中における測定抗原５３の濃度測定方法について説明する。
本実施の形態では、測定溶液として様々な体液を想定している。測定溶液に対しては夾雑物質の除去処理を行わないので、測定溶液中には夾雑物質が存在している。
まず、測定抗原５３および参照抗原５４を含まないリン酸緩衝溶液を、シリンジポンプ１１からからフローセル４のキャビティ５へ注入する（図７のステップＳ３１、図８の「イi」）。この測定では、測定溶液の流速を１５μｌ／ｍｉｍに設定した。
【００３６】
ＳＰＲ角度の変化が十分に安定したところで、既知濃度Ｃの参照抗原５４を含む測定溶液１００μｌを、シリンジポンプ１２からフローセル４のキャビティ５へ注入する（図７のステップＳ３２、図８の「ロ」）。この既知濃度Ｃは、データ記憶部４５に記憶されている応答量を取得したときの標準溶液中の参照抗原５４の濃度と同じ値である。
参照抗原５４を含む測定溶液がキャビティ５に注入されると、参照抗原５４と金薄膜１に固定された参照抗体５２とが結合し、参照抗体５２の屈折率が参照抗原５４の濃度Ｃに応じて変化する。
ここで、図４のステップＳ３〜Ｓ７と同様の処理を行い、測定溶液中の参照抗原５４の濃度Ｃに対するＳＰＲ角度θ0の変化量、すなわち濃度Ｃに対する応答量を算出する（図７のステップＳ３３〜Ｓ３７）。この応答量を「Ａ」とする。
【００３７】
再びＳＰＲ角度の変化が十分に安定したところで、続いて、測定抗原５３を含む測定溶液１００μｌを、シリンジポンプ１３からフローセル４のキャビティ５へ注入する（図７のステップＳ３８、図８の「ハ」）。これにより、測定溶液中の測定抗原５３と金薄膜１に固定された測定抗体５１とが結合し、測定抗体５１の屈折率が測定抗原５３の濃度に応じて変化する。
ここで、図４のステップＳ３〜Ｓ７と同様の処理を行い、測定溶液中の測定抗原５３の濃度に対するＳＰＲ角度θ0の変化量、すなわち濃度に対する応答量を算出する（図７のステップＳ３９〜Ｓ４３）。この応答量を「Ｂ」とする。
【００３８】
つぎに、データ記憶部４５から、図６のステップＳ２７で記録された応答量、すなわち標準溶液中における参照抗原５４の濃度Ｃに対する応答量Ａ0を読み出す（図７のステップＳ４４）。
図７のステップＳ３２〜Ｓ３７で測定された応答量Ａは、応答量Ａ0に対し、溶液の温度変化等の環境要因や、溶液中に存在する夾雑物質の影響を受けたものである。これらの影響は、同一の測定系であれば、抗原および抗体が異なる場合であっても、同様に観察される。したがって、図７のステップＳ３８で注入した測定溶液と同じ測定抗原濃度の標準溶液に対し、上述した基準条件の下で応答を測定したときの応答量を仮に「Ｂ0」とすると、応答量Ａ，Ａ0，Ｂ，Ｂ0の間には式（４）に示す関係が成立する。
Ａ／Ａ0＝Ｂ／Ｂ0  …（４）
【００３９】
式（４）を変形すると、式（５）が得られる。
Ｂ0＝Ａ0×Ｂ／Ａ  …（５）
式（５）より、環境要因や夾雑物質の影響が排除された測定抗原５３に対する応答量Ｂ0を推定することができる。
【００４０】
続いて、データ記憶部４５から、図４のステップＳ１１で記録された近似式、すなわち標準溶液中の測定抗原５３の濃度と応答量との関係を近似する式（３）を読み出す（図７のステップＳ４４）。
この式（３）の「Ｙ」に応答量Ｂ0を代入することにより、測定溶液中における測定抗原５３の濃度Ｘが導き出される。
Ｘ＝（Ａ0×Ｂ）÷（Ａ×ａ）  …（６）
これにより、環境要因や夾雑物質の影響が排除された正確な濃度を測定することができる（図７のステップＳ４５）。
【００４１】
再びＳＰＲ角度の変化が十分に安定したところで、最後に、抗原抗体解離溶液１００μｌを、シリンジポンプ１４からフローセル４のキャビティ５へ注入する（図７のステップＳ４６、図８の「ニ」）。こうして、結合した抗原５３，５４と抗体５１，５２とを解離させ、一連の濃度測定を終了する。
なお、引き続き濃度測定を行う場合には、図７のステップＳ３１〜Ｓ４６の処理を繰り返し行えばよい（図８の「イii」）。
【００４２】
次に、実験結果を示す。
図９は、参照抗原５４を含む標準溶液および測定抗原５３を含む標準溶液を連続してフローセル４のキャビティ５へ注入したときのＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。
ここでは、標準溶液として夾雑物質のないリン酸緩衝溶液を用いた。
まず、標準溶液を注入した。標準溶液の基底状態（図９の「イ」）において、参照抗原５４を添加した標準溶液を注入すると（図９の「ロ」）、参照抗原抗体反応による応答が得られた（図９の「Ａ0」）。続いて、測定抗原５３を添加した標準溶液を注入すると（図９の「ハ」）、測定抗原抗体反応による応答が得られた（図９の「Ｂ0」）。この結果より、２種類の抗体５１，５２を固定した金薄膜１を用い、同一測定系において、異なる２種類の抗原の濃度測定を連続して実施できることが分かる。
【００４３】
図１０は、参照抗原５４を含む測定溶液および測定抗原５３を含む測定溶液を連続してフローセル４のキャビティ５へ注入したときのＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。
ここでは、測定溶液として夾雑物質を混入したリン酸緩衝溶液を用いた。
まず、標準溶液を注入した。標準溶液の基底状態（図１０の「イ」）において、参照抗原５４を添加した測定溶液を注入すると（図１０の「ロ」）、参照抗原抗体反応による応答が得られた（図１０の「Ａ」）。続いて、測定抗原５３を添加した測定溶液を注入すると（図１０の「ハ」）、測定抗原抗体反応による応答が得られた（図１０の「Ｂ」）。
【００４４】
標準溶液中での測定と比較して、來雑物質の影響により、測定抗原５３および参照抗原５４ともに応答量が低下した。その理由は、測定抗原５３および参照抗原５４ともに、溶液中の夾雑物質の影響を等しく受けるためである。したがって、上述したように、夾雑物質の有無による参照抗原５４の応答量の変化から、測定抗原５３の濃度を正確に測定することが可能となる。
さらに、この濃度測定方法によれば、測定温度、測定ｐＨ、流速、固定化タンパクの固定化量、固定化タンパクの劣化、測定基板の基板調製誤差等の環境要因の影響を同時に排除することができる。
【００４５】
なお、本実施の形態では、測定溶液中の測定抗原濃度測定の際に、参照抗原５４を含む測定溶液を注入してから測定溶液５３を含む測定溶液を注入する例を示したが、これとは逆に、測定抗原５３を含む測定溶液を注入してから参照溶液５４を含む測定溶液を注入するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明による表面プラズモン測定装置は、微量サンプルを直接、リアルタイムに測定可能であるから、医療、工業等の一般分野で広く利用可能である。
また、従来の表面プラズモン測定装置は、大型かつ高価であり、可搬性、機動性に欠けていたため、主に研究用途に用いられていた。しかし、本発明により表面プラズモン測定装置の小型化、低価格化が可能になるので、フィールドにおける各種環境計測、品質、衛生管理、診断等、場所、場面に左右されることなく利用することが可能となる。具体的には、ウイルス検出や、特定タンパクのリアルタイム測定などによる診断への応用、救急医療における即時診断、ベットサイドにおける測定、それに伴う患者のＱＯＬ（Quality of Life）向上（在宅自己診断）等に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン測定装置の構成を示す図である。
【図２】２種類の抗体が固定された金薄膜の表面の状態を示す概念図である。
【図３】コンピュータにより実現される機能部を示すブロック図である。
【図４】標準溶液中の測定抗原の濃度と応答量との関係を近似する近似式の取得方法を説明するフローチャートである。
【図５】抗原濃度と表面プラズモン測定の応答量（角度変化量）の関係を示すグラフである。■は測定抗原、○は参照抗原である。
【図６】所定濃度の参照抗原を含む標準溶液に対する応答量の取得方法を説明するフローチャートである。
【図７】測定溶液中における測定抗原の濃度測定方法を説明するフローチャートである。
【図８】測定抗原の濃度測定時におけるＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。
【図９】参照抗原を含む標準溶液および測定抗原を含む標準溶液を連続して注入したときのＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。
【図１０】参照抗原を含む測定溶液および測定抗原を含む測定溶液を連続して注入したときのＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。
【図１１】従来の表面プラズモン測定装置の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１…金薄膜、２…ガラス基板、３…プリズム、４…フローセル、５…キャビティ、６，７…流路、８，９…配管、１０…溶液供給装置、１１〜１４…シリンジポンプ、１５…切り換え器、２０…光照射装置、２１…光源、２２，３２…偏光板、２３，３１…レンズ、３０…受光装置、３３…受光素子、４０…コンピュータ、４１…溶液供給装置制御部、４２…ＳＰＲ角度算出部、４３…応答量算出部、４４…近似式算出部、４５…データ記憶部、４６…測定抗原濃度算出部、５１…測定抗体、５２…参照抗体、５３…測定抗原、５４…参照抗原。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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