(57)【要約】【課題】  ＬＥＡＦＹ転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を生産する方法を提供する。【解決手段】  ＬＥＡＦＹ転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させた。供試した４６個体中１３個体において、ＬＥＡＦＹ遺伝子とＡＰ１遺伝子との二重変異体と同様の表現型を有する完全不稔性植物体を生産することができた。【選択図】  図４
2006280242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質である転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、植物体を完全不稔化することを特徴とする完全不稔性植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項３】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項４】
上記転写因子が、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性をするタンパク質であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項５】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項２または３に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号３６または３７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の完全不稔性植物体の生産方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、完全不稔性植物体。
【請求項１４】
上記完全不稔性植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１３に記載の完全不稔性植物体。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする完全不稔性植物体生産キット。
【請求項１６】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１５に記載の完全不稔性植物体生産キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全不稔性植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特に遺伝子の転写を抑制することによる完全不稔性植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、花はがく、花弁、雄しべ、雌しべの４つの器官からなり、花芽分裂組織を４つの同心円状領域、つまり、外側からｗｈｏｒｌ１〜４に分けた場合、ｗｈｏｒｌ１には４つのがく、ｗｈｏｒｌ２には４つの花弁、ｗｈｏｒｌ３には６つの雄しべ、ｗｈｏｒｌ４には２つの心皮が融合した雌しべが作られる。これらの器官の形質は、花のホメオティック遺伝子によって決定されることが知られている（非特許文献１）。花のホメオティック遺伝子は、転写因子をコードしており、これまでに植物の花器官の形成を制御する多数の転写因子が知られているが、その一つにＬＥＡＦＹおよびＡｐｅｔａｌａ１（以下「ＡＰ１」と称する）がある。
【０００３】
ＬＥＡＦＹ遺伝子は、最も重要な花芽分裂組織決定遺伝子であり、この遺伝子を強制発現させることで、本来は花序（側枝）に分化するはずの分裂組織を花芽に分化させることができる。すなわち、ＬＥＡＦＹ遺伝子は、植物が花を形成するために不可欠な遺伝子である。一方、ＡＰ１遺伝子は花芽形成に関与する遺伝子であるとともに、上記ＬＥＡＦＹ遺伝子のダイレクトターゲットであり、ＡＰ１遺伝子の発現はＬＥＡＦＹによって誘導されることが知られている（非特許文献４）。
【０００４】
このように、ＬＥＡＦＹ遺伝子およびＡＰ１遺伝子は花芽の分化に関与しているため、特に果実や花を利用しないような遺伝子改変植物においては、安全性や環境への影響等に鑑みると、ＬＥＡＦＹ遺伝子とＡＰ１遺伝子との発現を抑制して二重変異体と同様の表現型を有する完全不稔性植物体を作出し、屋外で栽培する際に花粉や種子の飛散が生じる可能性を低減することが好ましい。
【０００５】
遺伝子の発現を抑制する方法として、一般的な遺伝子破壊の他に近年よく用いられるようになったものにＲＮＡｉ法がある。ＲＮＡｉ法とは、２本鎖のＲＮＡを細胞の中に入れることにより、その配列に相同な細胞のｍＲＮＡを分解し、遺伝子発現を抑制する方法である。
【０００６】
ところで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献２、３参照）。このペプチドは、Ｃｌａｓｓ ＩＩ  ＥＲＦ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【０００７】
さらに、本発明者は、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することを試みている。そして、これにより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】酒井一著、「植物の形を決める分子機構」、秀潤社、１５０−１５５頁
【非特許文献２】Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｓｈｉｎｓｈｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１３，１９５９−１９６８，Ａｕｇｕｓｔ，２００１
【非特許文献３】Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１４（２００２）３５１−３５４
【非特許文献４】Ｄ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｓａｂｌｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｍ．Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，５８２−５８４，（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の完全不稔性植物体を作出するために、上記ＲＮＡｉ法によってＬＥＡＦＹ遺伝子の機能を抑制し、完全不稔性植物体を得ることも考えられる。しかしながら、ＲＮＡｉ法には、遺伝子の発現を抑制する場合にターゲットとする部位の決定が困難であり、試行錯誤が必要であること、コンストラクトの構築が難しいこと、ＲＮＡ干渉の効果が限定されること、ＲＮＡｉ法を適用する植物からＬＥＡＦＹ遺伝子をクローニングする必要があること等の種々の問題点がある。
【０００９】
また、シロイヌナズナ以外の植物ではＬＥＡＦＹ遺伝子と同等の機能を持つ遺伝子が複数存在する可能性があるため、ＲＮＡｉ法ではそれらの全てを抑制しなければ完全不稔性植物体を得ることはできない。
【００１０】
さらに、一般的に用いられるＲＮＡｉ法をＬＥＡＦＹに適用した場合、ＬＥＡＦＹ遺伝子の発現が抑制された結果、ＬＥＡＦＹのターゲットであるＡＰ１遺伝子の発現も多少は抑制されるが、例えばシロイヌナズナのＣＯタンパク質のように、ＬＥＡＦＹ以外にもＡＰ１遺伝子を活性化する転写因子が存在するため、ＡＰ１遺伝子とＬＥＡＦＹ遺伝子とを変異させた二重変異体（以下「ＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体」と称する）と同様の表現型を有する完全不稔性植物体を生産することはできない。
【００１１】
また、一般的な遺伝子破壊の方法では、相同遺伝子の組換え効率が低いため、高い確率で完全不稔性植物体を生産することはできない。
【００１２】
したがって、一般的な遺伝子破壊の方法やＲＮＡｉ法によって完全不稔性植物体を簡便に、かつ高い確率で得ることは非常に困難である。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＬＥＡＦＹ転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＬＥＡＦＹ転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させるだけで、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、簡便に、かつ高い確率で、ＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体と同様の表現型を有する完全不稔性植物体を生産することができることを初めて明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法は、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質である転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、植物体を完全不稔化することを特徴としている。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１６】
上記構成によれば、上記転写因子を転写抑制因子に転換することができ、植物体内では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。したがって、簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を生産することができる。
【００１７】
また、本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。
【００１８】
上記構成によれば、上記機能性ペプチドが付加されたカセットベクターに上記転写因子の遺伝子を組み込み、植物細胞に導入するだけで、上記キメラタンパク質を植物細胞内で発現させることができ、上記キメラタンパク質により転写因子の標的遺伝子の転写を容易に抑制することができる。したがって、簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を生産することができる。
【００１９】
また、本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含むことが好ましい。
【００２０】
また、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性をするタンパク質であることが好ましい。
【００２１】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）記載の遺伝子を用いることが好ましい。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするタンパク質をコードする遺伝子。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることが好ましい。
【００２４】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）または（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｆ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２６】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２７】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２８】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３６または３７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２９】
上記機能性ペプチドは、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、上記転写因子の標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産された完全不稔性植物体であることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００３１】
また、本発明にかかる完全不稔性植物体の生産キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記完全不稔性植物体の生産キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る完全不稔性植物体の生産方法は、以上のように、ＬＥＡＦＹ転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制することにより、完全不稔性植物体を生産するという構成を備えているので、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を生産することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。以下、本発明に係る完全不稔性植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用について詳述する。
（１）完全不稔性植物体の生産方法
本発明は、完全不稔性植物体を生産する技術であって、ＬＥＡＦＹ転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、完全不稔性植物体を生産するものである。
【００３４】
上記キメラタンパク質を生産させる方法では、上記転写因子は、上記機能性ペプチドにより転写抑制因子に転換される。そのため、上記キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、転写因子の標的遺伝子に結合すると、転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、ＬＥＡＦＹ遺伝子の機能が失われ、次世代植物のほぼ全ては雄しべ、雌しべ、花弁が形成されず、葉様の形態を示す完全不稔性植物体となる。すなわち、図４に示すように、花メリステムが二次花序メリステムに転換され、さらに花様器官では上述のｗｈｏｒｌ構造が失われ、外側に苞葉（場合によっては先端が柱頭化している）様の小葉が形成され、内側には顎ともめしべとも区別のつかないような器官が無数に形成される。
【００３５】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、ＬＥＡＦＹ転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。そこで、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００３６】
（Ｉ−１）転写因子
一実施形態において、本発明で用いられる転写因子は、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体である。配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記ＬＥＡＦＹ遺伝子がコードする転写因子であり、花芽の形成に関与する。
【００３７】
本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を有するＬＥＡＦＹ転写因子に限定されるものではない。具体的には、ＬＥＡＦＹ転写因子の変異体を挙げることができる。上記変異体としては、例えば、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、タンパク質における「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのタンパク質の活性にほとんど影響しない。
【００３８】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３９】
当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４０】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るタンパク質活性を変化させない。
【００４１】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４２】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００４３】
本実施形態に係る転写因子は、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００４４】
なお、上記の「（ｉ）記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」及び「配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４５】
また上記転写因子としては、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列に対して、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％または７０％以上の相同性を有するタンパク質も含まれる。なおここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。
【００４６】
なお、本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているタンパク質であればよいが、これに限定されるものではなく、タンパク質以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。本明細書中で使用される場合、「タンパク質以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００４７】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なタンパク質を含むものであってもよい。付加的なタンパク質としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識タンパク質が挙げられる。
【００４８】
ところで、ＬＥＡＦＹ遺伝子はシロイヌナズナやイネ、トウモロコシ、イチョウ、シダ、コケなどから単離されており、双子葉植物のみならず植物界全体にわたって相同性が高い。したがって、完全不稔性植物体の形成を行う個々の植物体において、ＬＥＡＦＹ転写因子やその遺伝子を必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において完全不稔性植物体を生産することができる。
【００４９】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）も好適に用いることができる。
【００５０】
上記転写因子をコードする遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【００５１】
上記転写因子をコードする遺伝子はさらに、ＬＥＡＦＹ転写因子をコードする遺伝子の変異体であってもよい。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００５２】
このような変異体としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５３】
上記転写因子をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記転写因子をコードする遺伝子または当該遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００５４】
一実施形態において、上記転写因子をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）記載のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするタンパク質をコードする遺伝子。
【００５５】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００５６】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００５８】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、公知の技術により、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法を用いることができる。例えば、上記転写因子をコードする遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記転写因子をコードする遺伝子の塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００５９】
あるいは、上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６０】
（Ｉ−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７、非特許文献２、３等参照）を挙げることができる。
【００６１】
本発明者は、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。また、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００６２】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００６３】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００６４】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６５】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６６】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６７】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１及びＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４１、４２に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列である。
【００６８】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６９】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７０】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７１】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１及びＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４３、４４に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４４に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４５に示す。
【００７２】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００７３】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７４】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
【００７５】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときに容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７６】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４６〜５４に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４６、４７または４８に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４９、５０または５１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５２、５３または５４に示すアミノ酸配列である。
【００７７】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、５５に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５５に示すアミノ酸配列である。
【００７８】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００７９】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００８０】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）または（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００８１】
上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００８２】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−ＫやＭｕｔａｎｔ−Ｇ（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００８３】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００８４】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８５】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。
【００８６】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）または（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。
【００８７】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２７、２８、３０、３２、３８，３９、または４０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２０、２３、３３、３４または３５のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２４、２５、２６、２９、または３１のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２１または２２のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８８】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３６または３７で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００８９】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００９０】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードするポリヌクレオチドとを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。
【００９１】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子をコードするポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子をコードするポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００９２】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、または１３２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、または１３３に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９０、９１に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号１〜４０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質には、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００９５】
（ＩＩ）本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体に導入し、完全不稔性植物体を生産する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００９６】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードするポリヌクレオチドと、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００９７】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００９８】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００９９】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【０１００】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【０１０１】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【０１０２】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【０１０３】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１０４】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１０５】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードするポリヌクレオチドと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーター（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０６】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１０７】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１０８】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１０９】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｂｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）を用いることができる。
【０１１０】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１１１】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１１２】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１１３】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１１４】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのものの花様器官の形態から選抜してもよい。例えば、花様器官の形態から選抜する例としては、形質転換体の花様器官の形態を、形質転換していない植物体の花様器官の形態と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に花様器官の形態は、単に比較するだけでも選抜が可能になるとともに、完全不稔性植物体の生産という本発明の効果そのものも確認することができる。
【０１１５】
また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１６】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１１７】
（２）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる完全不稔性植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、完全不稔性植物体を得ることができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１１８】
（２−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる完全不稔性植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、完全不稔性植物体とすることによりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。
【０１１９】
（２−２）本発明の有用性
本発明によれば、完全不稔性植物体を生産することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、完全不稔性植物体の生産により効果がある分野であればよい。かかる分野としては、新規な園芸品種の創出への応用等を挙げることができる。
【０１２０】
まず、新規な園芸品種の創出への応用例について説明すると、本発明に係る植物体の生産方法を用いることにより、上記機能性ペプチドが付加されたカセットベクターにＬＥＡＦＹ転写因子の遺伝子を組み込み、植物細胞に導入するだけで、上記キメラタンパク質を植物細胞内で発現させることができ、ＬＥＡＦＹ転写因子の標的遺伝子の転写を容易に抑制することができる。したがって、簡便に、かつ高い確率で完全不稔性植物体を作出することができる。得られる植物体は、高い確率で雄しべ、雌しべ、花弁が形成されず、葉様の形態を示す完全不稔性植物体となるため、新規な形態の観葉植物等として園芸上の利用価値が高いといえる。
【０１２１】
また、近年、遺伝子組み換え技術の急速な進歩とともに、種々の有用形質を付与した遺伝子組み換え作物が多く作出されるようになってきているが、環境への影響や安全性に鑑みると、遺伝子改変植物体の花粉や種子の自然界への望ましくない拡散を防止する必要がある。一例を挙げると、パルプの原料であるユーカリでは、遺伝子操作により、耐塩性や耐寒性に優れ、樹木が巨大化するなどの、より優れた形質を導入された遺伝子改変植物体が創出され、野外環境下における導入形質の検証実験が行われている。
【０１２２】
しかし、このような遺伝子改変植物体を野外環境下で育てると、風や昆虫等を媒体とした花粉の拡散を通じて、遺伝子改変植物体が自然界へ広く拡散していき、自然環境が改変される恐れがある。そのため、かかる問題に対処するために、遺伝子改変植物の検証実験を、外界から完全に隔離された特殊な環境下で行う必要がある。
【０１２３】
本発明によれば、完全不稔性植物体を生産することができるので、果実や花を利用しないような植物（例えば木や芋、葉もの野菜など）、シバ、樹木の接ぎ木など、栄養繁殖できる植物において、遺伝子組み換え作物を野外で栽培する際に花粉や種子が飛散しないようにすることができる。したがって、遺伝子組み換え植物の環境への拡散を防ぐことができ、非常に安全である。
【０１２４】
さらに、本発明によれば、植物体の老化が抑制された新規園芸種の作製が可能となる。一般に、花が咲いた後は結実するが、生長しつつある種子は物質の吸収力が非常に強く、通常古い葉の成分、特に窒素やリンの化合物は分解されて種子に運ばれるため、順次葉は枯死してゆくことが知られている。すなわち、種子を成熟させるために、葉そして最終的には根や茎も、構成成分の急速な分解つまり老化により枯死してしまう。しかしながら、本発明によれば、完全不稔性植物体が得られる確率が高く、種子が形成される確率が低いため、上述のような植物体の老化を抑制することができる。したがって、本発明によれば、老化が抑制された新規園芸種の作製が可能となり、非常に有用である。
【０１２５】
また、後述する実施例に示すように、本発明に係る完全不稔性植物体の生産方法によって作出した完全不稔性植物体の表現型は、花メリステムが二次花序メリステムに転換され、さらに花様器官では上述のｗｈｏｒｌ構造が失われるとともに、外側に苞葉（場合によっては先端が柱頭化している）様の小葉が形成され、内側には顎ともめしべとも区別のつかないような器官が無数に形成されるというものであり、これはＬＥＡＦＹ遺伝子単独の全欠失突然変異の表現型というよりは、それが増強されたＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体（ＡＰ１遺伝子とＬＥＡＦＹ遺伝子の双方とも全欠失）の表現型と同様のものである。
【０１２６】
本発明によれば、ＬＥＡＦＹと上記機能性ペプチドとのキメラ遺伝子を単独で発現させただけでＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体と同様の表現型を示す植物体を得ることができる。一方、上述のように、ＲＮＡｉ法には種々の問題点があるため、ＬＥＡＦＹにＲＮＡｉ法を適用しただけではＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体同様の表現型を有する植物体を生産することは不可能である。
【０１２７】
本発明ではＬＥＡＦＹと機能性ペプチドとのキメラタンパク質がＡＰ１の発現を他の転写因子に対して優勢的に抑制するので、上記キメラタンパク質を発現させるだけでＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体と同様の表現型を有する植物体を生産することができる。したがって、本発明は、ＲＮＡｉ法では生産不可能な表現型を有する完全不稔性植物体を簡便かつ高い確率で生産可能であるという点でも非常に有用であるということができる。
【０１２８】
（２−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち完全不稔性植物体生産キットを挙げることができる。
【０１２９】
この完全不稔性植物体生産キットの具体例としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドと上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例及び図１ないし図５に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
〔実施例１〕
以下の実施例１においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチドをＬＥＡＦＹ遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１３２】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１３３】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３６）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３７）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１３９）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１３４】
（２）クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１３５】
（３）以下の配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
５’−ｃｔａｇａｇｇａｔｃｃａｃａａｔｔａｃｃａａｃａａｃａａｃａａａｃａａｃａａａｃａａｃａｔｔａｃａａｔｔａｃａｇａｔｃｃｃｇｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃｔｃ−３’（配列番号１４０）
５’−ｃｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｇｔａａｔｔｇｔａａｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｔａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔ−３’（配列番号１４１）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１３６】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１３７】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
５’−ｇｇｇｃｔｔｇａｔｃｔｇｇａｔｃｔａｇａａｃｔｃｃｇｔｔｔｇｇｇｔｔｔｃｇｃｔｔａａｇ−３’（配列番号１４２）
５’−ｔｃｇａｃｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｃａａａｃｇｇａｇｔｔｃｔａｇａｔｃｃａｇａｔｃａａｇｃｃｃ−３’（配列番号１４３）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１３８】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１３９】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：２０３，１９９０）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１４０】
（２）インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ(登録商標)ベクターコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。
【０１４１】
（３）回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１４２】
＜構築用ベクターへのＬＥＡＦＹコード領域の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＬＥＡＦＹタンパク質をコードするＤＮＡ配列または遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１４３】
（１）シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡ ｐｄａ０１６７３を鋳型として、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くＬＥＡＦＹポリヌクレオチド（Ａｔ５ｇ６１８５０）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１  ５’−ｇａｔｇｇａｔｃｃｔｇａａｇｇｔｔｔｃａｃｇａｇｔｇｇｃｔｔ−３’（配列番号１４４）
プライマー２  ５’−ｇａａａｃｇｃａａｇｔｃｇｔｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｔｃｃａｃｃ−３’（配列番号１４５）
ＬＥＡＦＹポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列およびＬＥＡＦＹポリヌクレオチドのｃＤＮＡをそれぞれ配列番号１３４および１３５に示す。
【０１４４】
（２）得られたＬＥＡＦＹコード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１４５】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１４６】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１４７】
（１）まず、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５．５μＬを加えた。
【０１４８】
（２）この溶液にＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１４９】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１５０】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１５１】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）(ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓａｈｅｌｌ  １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、下表２）に懸濁した。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１５６】
次に、ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで形質転換した植物体について、図４および図５に基づいて説明する。図４は、ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナの花様器官を示し、図５は、当該花様器官の拡大図である。図４および図５に示すように、ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナでは、花メリステムが二次花序メリステムに転換され、さらに花様器官ではｗｈｏｒｌ構造が失われ、外側に苞葉（場合によっては先端が柱頭化している）様の小葉が形成され、内側には顎ともめしべとも区別のつかないような器官が無数に形成された。これは、ＡＰ１・ＬＦＹ二重変異体の表現型と同様の形質であった。
【０１５７】
供試した４６個体のうち１３個体において、図４および図５に示すように、雄しべ、雌しべ、花弁が形成されず、花様器官が葉様の形態を示す完全不稔性植物体が形成された。また、供試４６個体のうち８個体で、種子をつけたさやが１個から１０個の範囲にとどまっており、その他もほとんどの個体で著しく稔性が低下していた。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
このように、本発明では、ＬＥＡＦＹ転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制することによって完全不稔性植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業、園芸業、造園業、アグリビジネス等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＬＥＡＦＹ遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナの花様器官を示す図である。
【図５】ｐＢＩＧ−ＬＥＡＦＹ−ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナの花様器官の拡大図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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