(57)【要約】【課題】  レフルノミドが、Ａｋｔシグナル経路を抑制するという新しい知見に基づいて、レフルノミドの新規の用途を提供することを目的とする。【解決手段】  Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的として、また、Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害による、同経路の活性化した細胞に対する細胞増殖抑制及び、アポトーシス誘導を目的としてレフルノミドを使用する。更に、レフルノミドの有効量を含有することからなる、Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害に基づく疾患を予防及び治療するための医薬としてレフルノミドを使用する。【選択図】        図１
2006265117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的として使用するレフルノミド。
【請求項２】
Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害による、該経路の活性化した細胞に対する細胞増殖抑制及び、アポトーシス誘導を目的として使用するレフルノミド。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれか１項に記載のレフルノミドにおいて、癌の治療にも合わせて使用するレフルノミド。
【請求項４】
請求項１及び２のいずれか１項に記載のレフルノミドにおいて、マスト細胞が関与する病態の治療に使用するレフルノミド。
【請求項５】
レフルノミドの有効量を含有することからなる、Ａｋｔシグナル経路の活性化に基づく疾患を予防及び治療するためのレフルノミドの医薬としての使用。
【請求項６】
請求項５記載のレフルノミドの医薬としての使用において、前記活性化に基づく疾患は、癌及びマスト細胞が関与する疾患のいずれか１又は２であるレフルノミドの医薬としての使用。
【請求項７】
請求項６記載のレフルノミドの医薬としての使用において、レフルノミドを生理学的に許容し得る賦形剤と共に、又は、該賦形剤と、他の活性化合物、添加剤、及び補助物質のいずれか１又は２以上と共に、所定の製剤形態にすることからなるレフルノミドの医薬の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的としたレフルノミドの使用、及びＡｋｔシグナル経路が活性化した細胞へのアポトーシス誘導を目的としたレフルノミドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レフルノミド（ＨＷＡ−４８６）は、Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミドという名前をもつイソキサゾール誘導体である。投与すると、この化合物は、速やかにその活性開環型であるＮ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミド（Ａ７７１７２６）に変換され、その後速やかに、ケト−エノール互変異を受けて、下記のＮ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−シアノ−３−オキソ−ブチルアミドとなる。
【０００３】
【化１】
2006265117.tif 000003
【０００４】
（既知の用途と機序）
このレフルノミドは、抗炎症作用を有し関節リウマチの治療薬として使用されている。
その主な作用機序として、ピリミジンヌクレオチド三リン酸の生合成における要の酵素であるジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）に作用し核酸合成阻害をもたらし、細胞増殖抑制、細胞周期を停止させることが知られている。なお、レフルノミドに関する発明としては、インターロイキン１アルファを阻害するためのレフルノミドの使用（例えば、特許文献１参照）、腫瘍壊死因子アルファを阻害するためのレフルノミドの使用（例えば、特許文献２参照）、インターロイキン８を阻害するためのレフルノミドの使用（例えば、特許文献３参照）、インターロイキン１ベータを阻害するためのレフルノミドの使用（例えば、特許文献４参照）、レフルノミドの合成方法（例えば、特許文献５参照）、レフルノミド産物の抗ウイルス用途（例えば、特許文献６参照）、レフルノミドの新規な製法及び新しい結晶形態（例えば、特許文献７参照）等がある。
しかしながら、本申請の様な、細胞内シグナル伝達経路であるＡｋｔシグナル経路の活性化を抑制する作用は報告されていない。また、同経路の活性化を抑制することにより、同経路活性化細胞にアポトーシスをもたらす作用も知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平０６−２３４６３８号公報
【特許文献２】特開平０６−２３４６３７号公報
【特許文献３】特開平０６−２３４６３６号公報
【特許文献４】特開平０６−２３４６３５号公報
【特許文献５】特表２００４−５００３８０号公報
【特許文献６】特表２００３−５２３３０９号公報
【特許文献７】特表２００３−５１７０１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（Ａｋｔシグナル経路活性化細胞における背景）
端的にはＡｋｔシグナル経路が異常に活性化した細胞は腫瘍化する。腫瘍細胞の異常増殖や不死化のメカニズムには、アポトーシス誘導シグナルの減少だけでなく、生存シグナルの増大が関与していることが知られている。細胞の最も重要な生存シグナルの一つとして知られるＰ１３Ｋ／ＰＤＫ／Ａｋｔ経路に関る分子は、多くの癌で遺伝子増幅や活性亢進が起きていることが明らかとなっている。活性化したＡｋｔは、シグナル下流のＧＳＫ３β、ＦＫＨＲ、ｐ２７Ｋｉｐｌ、Ｂａｄ、N Ｆ- ｋＢ、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｆａｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ、ＭＤＭ２等の分子群を介して細胞増殖、アポトーシス抵抗性に働くことが知られている。
サイトカイン及び増殖因子受容体変異による受容体の恒常的活性化は下流のＰ１３Ｋ／ＰＤＫ／Ａｋｔ経路を活性化させ、細胞の腫瘍化の要因となっていることが知られている。
一方、癌抑制遺伝子ＰＴＥＮ(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)がＡｋｔ活性化を阻害することにより腫瘍に対し抑制効果を示すことが知られているが、ＰＴＥＮの異常は癌化と密接な関係がある。実際、ＰＴＥＮは子宮内膜癌や前立腺癌等の多くの悪性腫瘍において変異が報告され、ＤＮＡメチル化などによりＰＴＥＮ機能不活化が癌化に関ることが報告されており、ＰＴＥＮが関与する癌はさらに多く存在するものと考えられる。さらに、ＰＴＥＮの先天性変異はＣｏｗｄｅｎ病やＬｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｃｌｏｓ病、Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ症候群など、多発性の過誤腫を伴い、高頻度に乳癌、甲状腺癌、卵巣癌などを好発する疾患を引き起こすことが知られている。
【０００７】
（Ａｋｔシグナル経路活性化阻害薬の抗腫瘍薬としての可能性）
恒常的なＡｋｔの異常賦活化を呈す、サイトカイン及び増殖因子受容体の変異、癌抑制遺伝子ＰＴＥＮの変異や欠如は、多くの腫瘍で認められる。また、多くの腫瘍でＰ１３キナーゼやＡｋｔ遺伝子増幅が報告されている。しかし、正常細胞においては、この経路はあまり働いていない。以上のことから、Ａｋｔ経路の活性化阻害は、抗腫瘍剤を始めとした医薬への応用が期待できる。
【０００８】
（マスト細胞における背景）
マスト細胞はＩ型アレルギーや各種アレルギー疾患、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、組織線維化などの病態形成に関与するとされる。マスト細胞は増殖因子ステムセルファクター（ＳＣＦ）がその受容体ＫＩＴを介し、Ａｋｔ経路を活性化させることにより長期生存し、炎症や疾患の慢性化に関与している。従って、Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害はマスト細胞の生存を制御する上で重要な経路である。
【０００９】
本発明者はレフルノミドがＡｋｔシグナル経路を抑制させ、同経路賦活癌細胞をアポトーシスに導くことを突き止めた。また、その機序として、Ａｋｔを活性化させる分子であるＰＤＫ１のリン酸化を抑制し、さらにＡｋｔのリン酸化を抑制することを明らかとし、以下に示す本発明を完成した。すなわち、レフルノミドが、Ａｋｔシグナル経路を抑制するという新しい知見に基づいて、レフルノミドの新規の用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の通りである。
（発明１）Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的として使用するレフルノミド。
（発明２）Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害による、同経路の活性化した細胞に対する細胞増殖抑制及び、アポトーシス誘導を目的として使用するレフルノミド。
（発明３）マスト細胞腫瘍、子宮癌、前立腺癌、メラノーマ、膀胱癌、乳癌、肺癌、造血系腫瘍、神経膠芽腫、骨肉腫、ＰＴＥＮ (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) 変異又は欠損腫瘍や増殖因子受容体異常腫瘍等の各種癌の治療にも合わせて使用する発明１、発明２に記載のレフルノミド。
（発明４）マスト細胞が関与する病態（例えば、慢性炎症性疾患、アレルギー疾患や自己免疫疾患等）の治療に使用する発明１、発明２に記載のレフルノミド。
（発明５）レフルノミドの有効量を含有することからなる、Ａｋｔシグナル経路の活性化に基づく疾患を予防及び治療するための医薬としての使用。
（発明６）マスト細胞腫瘍、子宮癌、前立腺癌、メラノーマ、膀胱癌、乳癌、肺癌、造血系腫瘍、神経膠芽腫、骨肉腫、ＰＴＥＮ変異又は欠損腫瘍や増殖因子受容体異常腫瘍等の各種癌等の疾患、さらに、マスト細胞が関与する慢性炎症性疾患、アレルギー疾患や自己免疫疾患等の疾患を予防及び治療するための発明５に記載の医薬としての使用。
（発明７）発明６のレフルノミドの医薬としての使用において、レフルノミドを、生理学的に許容し得る賦形剤と共に、又は、該賦形剤と、他の活性化合物、添加剤、及び補助物質のいずれか１又は２と共に、適当な製剤形態にすることからなる医薬の製法。
ここで、他の活性化合物とは、例えば各種抗癌剤、アレルギー剤、免疫剤等の併用可能な薬剤等をいう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、レフルノミド産物が、Ａｋｔシグナル経路を抑制するという全く新しい知見に基づいて、同経路の活性化した細胞にアポトーシスを誘導させるという新規の用途を提供するものである。
レフルノミドは、既存の抗腫瘍薬や抗マスト細胞薬とは異なる方法で細胞増殖抑制、アポトーシス誘導を齎すことが発見されており、既知の抗腫瘍薬と併用する場合でも相乗効果が期待できる。この様なレフルノミドの新規作用機序はＡｋｔ経路が活性化した細胞に関る幅広い疾患の治療薬として、多大なる有用な医学的貢献が期待できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、リンパ球などの免疫担当細胞や白血病細胞などを使用して、サイトカインや増殖因子のレセプターとの結合を介するシグナル伝達機構を解明してきた。そして、一連の研究過程に於いて、マスト細胞の増殖因子ＳＣＦ（ステムセルファクター）とそのレセプターであるＫＩＴに着目した。ＫＩＴ受容体の活性化によりマスト細胞は長期生存を可能とするが、その恒常的活性化はマスト細胞を腫瘍化へ齎す。その代表的な腫瘍細胞株としてＨＭＣ−１（ヒトマスト細胞腫瘍株）が知られている。ＨＭＣ−１はＫＩＴ受容体の変異により恒常的にその下流のシグナルが活性化されている。ＫＩＴ受容体下流のシグナルの一つであるＰ１３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ経路（Ａｋｔシグナル経路）は細胞の生存維持に非常に重要なシグナル経路であるが、ＨＭＣ−１はこのＡｋｔ経路が恒常的に活性化した細胞であり、この細胞を用いてＡｋｔシグナル経路（以下、Ａｋｔ経路とも言う）に及ぼすレフルノミド影響に着目した。
【００１３】
つまり、細胞の生存維持に重要なＡｋｔシグナル経路の重要蛋白質であるＡｋｔと、Ａｋｔの上流でＡｋｔをリン酸化させる蛋白質であるＰＤＫ１に対する、レフルノミドの作用を検討した。Ａｋｔ及びＰＤＫ１の活性化を証明するには、同蛋白質のリン酸化を検出することで証明でき、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗リン酸化ＰＤＫ１抗体を用いたウエスタンブロット法（無数にある蛋白質の中から、ある特定のタンパク質だけを検出する方法であり、特定の蛋白質に対して抗体を反応させ、抗体の付いた特定の蛋白質をさらに発光する抗体と反応させ、発光の有る無し、強さを見ることにより、特定の蛋白質の存在及び量を調べる方法である。）を用いた。
【００１４】
また、Ａｋｔ経路の活性化した細胞に対するレフルノミドの細胞増殖抑制効果を見るために、ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒ  ｏｎｅを用いて細胞増殖を検証（ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒ  ｏｎｅを添加すると細胞増殖速度の違いにより細胞培養液の色が変化し、色の変化から細胞増殖速度の違いを吸光度測定器にて吸光度（ＯＤ）で検出する方法である）し、さらに、レフルノミドの作用機序が、従来主な作用機序であると言われてきた、ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害による核酸合成阻害であるかどうかをみるために、ＤＨＯＤＨ阻害による核酸合成阻害を回復する効果のあるウリジンを添加し、従来の主な作用機序とは異なる作用機序であるかを検証した。
【００１５】
さらに、細胞がアポトーシスに陥る前に生じる細胞内変化の一つとして現れる、断片化カスペース（断片化カスペースはカスペースの活性化の証拠であり、カスペースが活性化すると細胞はアポトーシスに陥る）の存在、及び量を調べることによりレフルノミドの効果を検証した。
【００１６】
最後に、レフルノミドによりアポトーシスが誘導されていることを、アネキシンＶ（ＰＩ−ａｎｎｅｘｉｎＶ）を用いたアポトーシス検出法を用いて証明した。同方法はアネキシンＶという早期アポトーシスに陥った細胞表面に出現するタンパク質を、それに対する抗体を使って検出する方法であり、アネキシンＶが陽性ということは、早期アポトーシスに陥っていることを意味する。
【００１７】
（方法）
（１）ＰＤＫ１のリン酸化抑制の検討 (ウエスタンブロット）
（２）Ａｋｔのリン酸化抑制の検討 (ウエスタンブロット）
（３）細胞増殖実験（ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒ  ｏｎｅ）
（４）断片化カスペース３誘導実験 (ウエスタンブロット）
（５）アポトーシス誘導実験 (アネキシンＶアポトーシス検出法）
ＨＭＣ−１（ヒトマスト細胞腫瘍株）に、レフルノミド（ＬＥＦ）を０、１０μＭ、１００μＭ、２００μＭ添加し、ウエスタンブロット法により、ＰＤＫ１及びリン酸化したＰＤＫ１のレフルノミド添加による変化を検証した（（１）の実験）。
同様に（２）、（４）の実験を行った。
さらに、ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒ  ｏｎｅを用いて（３）の実験、アネキシンＶアポトーシス検出法により、（５）の実験を行った。
【００１８】
以上の結果を図１〜図５に示す。
（１）レフルノミドは容量依存性にＰＤＫ１のリン酸化を抑制した (図１参照）。
抗リン酸化ＰＤＫ１抗体によるバンドが容量依存性に減弱している。抗ＰＤＫ１抗体のバンドの減弱はなく、レフルノミドによるリン酸化の減少が、ＰＤＫ１分子数そのものの減少に由来するのではないことが示されている。
（２）レフルノミドは容量依存性にＡｋｔのリン酸化を抑制した (図１参照）。
抗リン酸化Ａｋｔ抗体によるバンドが容量依存性に減弱している。抗Ａｋｔ抗体のバンドの減弱はなく、レフルノミドによるリン酸化の減少が、Ａｋｔ分子数そのものの減少に由来するのではないことが示されている。
（３）レフルノミドは容量依存性に細胞増殖を抑制し（図２参照）、１００μＭの濃度でウリジンの添加による回復を認めなかった（図３参照）。Ｐ＜０．０１は、統計学的に有意差ありを示す。
（４）レフルノミドは容量依存性にカスペース３を断片化させた（図４参照）。
３５ｋＤａ（キロダルトン）の分子量であるカスペース３が断片化され、３５ｋＤａのバンドの減弱と１７及び１９ｋＤａのバンドの増強を認める。断片化カスペース３を特異的に認識する抗体でもバンドの増強を認める。
（５）レフルノミドは容量依存性にアポトーシスを誘導した（図５参照）。
レフルノミドを各濃度で添加した結果を、それぞれが４分割されて示してあるが、右下の領域が早期アポトーシスに陥った細胞（アネキシン陽性、ＰＩ陰性）を示している。図では右下の領域のドットがレフルノミドを添加することにより増加していることがわかる。
【００１９】
（発明に至る実験結果の要約）
レフルノミドはＡｋｔ経路活性化腫瘍細胞のモデルであるＨＭＣ−１においてＰＤＫ１及びＡｋｔのリン酸化を抑制した。生存シグナルであるＡｋｔ経路が抑制された細胞にはアポトーシスが誘導された。この事象に関して特筆すべきは、ＨＭＣ−１のレフルノミドによる増殖抑制がウリジン添加により回復せず、従来からいわれているレフルノミドの作用機序であるジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ阻害による核酸合成阻害作用以外の、Ａｋｔシグナル経路抑制を介したアポトーシス誘導剤としての作用をレフルノミドが示したことである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】レフルノミドによるＰＤＫ１及びＡｋｔのリン酸化抑制を示す説明図である。
【図２】レフルノミドによる細胞増殖抑制作用を示す説明図である。
【図３】ウリジン添加による、レフルノミドの細胞増殖抑制作用の回復の有無を示すグラフである。
【図４】レフルノミドによるカスペース３の断面化を示す説明図である。
【図５】レフルノミドによるアポトーシスの誘導を示す説明図である。
【図２】
2006265117.tif 000004
【図３】
2006265117.tif 000005
【図５】
2006265117.tif 000006
【図１】
2006265117.tif 000007
【図４】
2006265117.tif 000008