(57)【要約】  【課題】    組換えＤＮＡ技術によって発現させた目的タンパク質の精製を容易にする。  【解決手段】    保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、目的タンパク質の活性を有する活性型封入体を形成させる。該活性型封入体は、目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質の状態で保持する。該活性型封入体を可溶化することなく、融合タンパク質から正しく折り畳まれた目的タンパク質を切り出すことができる。保護ポリペプチドは、古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側の部分からなる分子量約１７０００のポリペプチドである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、前記保護ポリペプチドは古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側の部分からなる分子量約１７０００のポリペプチドであり、前記目的タンパク質の活性を有する活性型封入体。
【請求項２】
前記古細菌は、常温性古細菌であることを特徴とする請求項１に記載の活性型封入体。
【請求項３】
前記常温性古細菌は、メタン生産菌であることを特徴とする請求項２に記載の活性型封入体。
【請求項４】
前記メタン生産菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属古細菌であることを特徴とする請求項３に記載の活性型封入体。
【請求項５】
保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、前記保護ポリペプチドは配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、前記目的タンパク質の活性を有する活性型封入体。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、前記保護ポリペプチドと前記目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の活性型封入体。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項６に記載の活性型封入体。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の活性型封入体を形成している融合タンパク質に含まれる保護ポリペプチドをコードする単離された遺伝子。
【請求項９】
配列番号１で表される塩基配列からなる請求項８に記載の単離された遺伝子。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の単離された遺伝子からなる第１コード領域と、少なくとも１つの遺伝子挿入部位を有し、前記遺伝子挿入部位に目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクター。
【請求項１１】
前記遺伝子挿入部位は、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記第１コード領域と前記遺伝子挿入部位の間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記遺伝子挿入部位は、制限酵素サイトであることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項８又は９に記載の単離された遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を転写及び翻訳させ、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を合成し、該融合タンパク質からなる封入体を形成させ、前記封入体は前記目的タンパク質の活性を有することを特徴とする活性型封入体の製造方法。
【請求項１６】
前記融合遺伝子を含有する形質転換体を培養し、該培養物から活性型封入体を採取することを特徴とする請求項１５に記載の活性型封入体の製造方法。
【請求項１７】
請求項１乃至７のいずれかに記載の活性型封入体から目的タンパク質を単離する目的タンパク質の製造方法であって、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させ、該活性型封入体を可溶化することなく前記融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、前記保護ポリペプチドと前記目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする請求項１７に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含み、前記活性型封入体に該限定分解型プロテアーゼを接触させることにより前記限定分解型プロテアーゼ認識部位を切断し、目的タンパク質を切り出すことを特徴とする請求項１８に記載の目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型封入体及びその製造方法、単離された遺伝子、発現ベクター、並びに、目的タンパク質の製造方法に関し、さらに詳細には、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、封入体でありながら目的タンパク質の活性を有する活性型封入体及びその製造方法、該保護ポリペプチドをコードする単離された遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクター、並びに、該活性型封入体から目的タンパク質を単離する目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術によって異種タンパク質（目的タンパク質）を生産する技術は、バイオテクノロジー分野における基本技術の一つである。例えば、目的タンパク質の遺伝子を適宜の宿主細胞に導入し、宿主細胞内で該遺伝子を転写・翻訳させることにより、目的タンパク質を生産することができる。これにより、有用タンパク質の大量生産のほか、タンパク質の機能探索のため試料調製等が行われている。
【０００３】
しかし、組換えＤＮＡ技術によって目的タンパク質を生産する場合、目的タンパク質が正しく折り畳まれた正常型タンパク質としては得られず、変性した異常型タンパク質としてしか得られないことがしばしばある。このような異常型の目的タンパク質は本来の活性を失っており、もはや目的物たりえない。したがって、組換えＤＮＡ技術によって目的タンパク質を生産する場合は、その目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として得られることが必要である。
【０００４】
現在のところ、組換えＤＮＡ技術によって目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として得るためのアプローチは２つある。１つのアプローチは、目的タンパク質の遺伝子を発現させる際に、目的タンパク質が変性しないように、最初から正しく折り畳まれるように発現させる方法である。例えば、目的タンパク質が変性しないような宿主細胞、ベクター、プロモーター等を選択することにより、正常型の目的タンパク質を得ることが考えられる。また、タンパク質折り畳み因子と呼ばれるタンパク質の作用によって、目的タンパク質が変性しないようにすることもできる。タンパク質折り畳み因子は、非酵素的に働く「分子シャペロン」と酵素的に働く「フォルダーゼ」に分類されている。分子シャペロンの一種としては、シャペロニンが知られている。そして、特許文献１には、目的タンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質として発現させると、目的タンパク質が変性することを防ぐことができ、目的タンパク質が正常型タンパク質として得られた旨が記載されている。また、フォルダーゼの一種としては、ペプチジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と称する。）が知られている。ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）型及びパーブリン（Ｐａｒｖｕｌｉｎ）型の３種類に分類されている。このうちＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６が結合することにより活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログと定義されている。そして、特許文献２には、目的タンパク質を古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させることにより、目的タンパク質が正常型タンパク質として得られた旨が記載されている。これらの方法によれば、目的タンパク質を折り畳み直す工程が不用である。
【０００５】
目的タンパク質を正常型タンパク質として得るためのもう１つのアプローチは、目的タンパク質が変性することを許容し、後で目的タンパク質を正しく折り畳み直して再生する方法である。例えば、目的タンパク質を不溶性の封入体として発現させて、該封入体を塩酸グアニジン等の変性剤で可溶化した後、目的タンパク質を正しく折り畳み直すことにより、目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として取得することができる。例えば、特許文献３には、大腸菌β−ガラクトシダーゼと目的タンパク質との融合タンパク質からなる封入体を変性剤で可溶化した後、プロテアーゼを作用させ、目的タンパク質を切り出した旨が記載されている。この方法は、目的タンパク質の精製が容易という利点がある。すなわち、封入体が不溶性であることを利用して、遠心分離等の手法により封入体を可溶性画分から容易に分離することができる。その結果、可溶性画分を容易に除去でき、融合タンパク質の精製がきわめて容易となる。
【特許文献１】特開２００３−３３４０７３号公報
【特許文献２】国際公開２００４／００１０４１号パンフレット
【特許文献３】特開平８−１８７０９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、前者のアプローチによれば、可溶性画分から目的タンパク質を分離・精製する必要があるが、可溶性画分には他の不純タンパク質が多く含まれているので、精製が煩雑である。また、宿主細胞等を用いる場合でも、目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として発現できる宿主細胞等が必ず見つかる保証はない。また、後者のアプローチによれば、封入体となった融合タンパク質を正しく折り畳み直す必要がある。しかし、いったん封入体となった異常型タンパク質を正しく折り畳み直して正常型タンパク質に再生することは困難な作業であり、目的タンパク質の種類によっては成功しないことも多い。また、可溶化のために用いた変性剤を除去する工程が必要となる。さらに、いずれのアプローチでも折り畳み因子と目的タンパク質との融合タンパク質を使用する場合は、目的タンパク質を切り出す必要があるが、切り出し後の折り畳み因子そのものが主要な不純物となってしまい、精製が煩雑になる。以上より、正しく折り畳まれた正常型の目的タンパク質を高効率で得ることができ、かつ目的タンパク質を容易に精製することができる技術が求められている。
【０００７】
本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術によって目的タンパク質を生産する際に、正しく折り畳まれた正常型の目的タンパク質を高効率で得ることができ、かつ目的タンパク質を容易に精製することができる一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、目的タンパク質を古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの部分ポリペプチドとの融合タンパク質として発現させると、融合タンパク質全体としては封入体となるが、融合タンパク質の中の目的タンパク質部分は正しく折り畳まれた正常型タンパク質の状態で保持されることを見出した。そして、該封入体を可溶化することなく融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことができることを見出した。そして、切り出された目的タンパク質が正しく折り畳まれた正常型タンパク質として回収できることを見出し、本発明を完成した。上記した課題を解決するための本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、前記保護ポリペプチドは古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側の部分からなる分子量約１７０００のポリペプチドであり、前記目的タンパク質の活性を有する活性型封入体である。
【００１０】
一般に、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子量が１６０００〜１８０００程度の「ショートタイプ」と、分子量が２６０００〜３３０００程度の「ロングタイプ」に分類される。そして、本発明は該古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側の部分からなる分子量約１７０００のポリペプチドを保護ポリペプチドとし、該保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、目的タンパク質の活性を有する活性型封入体に係るものである。本発明の活性型封入体においては、目的タンパク質の部分がその活性を保持しており、変性していない。その結果、該封入体を可溶化することなく封入体から正常型の目的タンパク質を直接採取することができる。さらに、本発明の活性型封入体は遠心分離等の処理により可溶性画分と容易に分離できるので、本発明の活性型封入体を用いることにより目的タンパク質の精製が容易になる。
【００１１】
ここで「保護ポリペプチド」とは、目的タンパク質との融合タンパク質からなる封入体を形成させた場合に、融合タンパク質全体としては封入体となるが、目的タンパク質の部分が変性しないように保護する作用を有するポリペプチドと定義する。すなわち、目的タンパク質を保護ポリペプチドとの融合タンパク質にすると、封入体を形成しても目的タンパク質の部分は変性せず、活性を保持することができる。また、「目的タンパク質の活性を有する」とは、目的タンパク質が本来的に有している作用や機能を有することをいう。例えば、目的タンパク質が酵素であれば、活性型封入体がその酵素の活性を有することである。また、目的タンパク質が抗体であれば、活性型封入体が抗原との反応性を有することである。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、前記古細菌は、常温性古細菌であることを特徴とする請求項１に記載の活性型封入体である。
【００１３】
一般に、タンパク質は低温から常温域で取り扱うことが多いので、活性型封入体の形成も同様の温度域で行なわれることが好ましい。そして、本発明の活性型封入体においては、保護ポリペプチドの由来が常温性古細菌である。かかる構成により、保護ポリペプチドが常温域において効率的に目的タンパク質に作用し、活性型封入体が効率よく形成される。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、前記常温性古細菌は、メタン生産菌であることを特徴とする請求項２に記載の活性型封入体である。
【００１５】
常温性古細菌には、メタン生産菌と好塩菌が含まれる。このうち、好塩菌は高塩濃度で成育するので、好塩菌由来のタンパク質も好塩濃度の異常な条件下で高い活性を示すと考えられる。一方、常温性のメタン生産菌は通常の生化学的な条件下で生育できる。そして、本発明の活性型封入体は、保護ポリペプチドがメタン生産菌に属する常温性古細菌由来である。かかる構成により、通常の生化学的な条件下でも活性型封入体が効率よく形成される。
【００１６】
前記メタン生産菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属古細菌である構成も推奨される（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、前記保護ポリペプチドは配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、前記目的タンパク質の活性を有する活性型封入体である。
【００１８】
本発明の活性型封入体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、かつ目的タンパク質の活性を有する。また、本発明の活性型封入体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、換言すれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一視できるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体も含む。本発明の活性型封入体においては、目的タンパク質の部分がその活性を保持しており、変性していない。その結果、該封入体を可溶化することなく封入体から正常型の目的タンパク質を直接採取することができる。さらに、本発明の活性型封入体は遠心分離等の処理により可溶性画分と容易に分離できるので、本発明の活性型封入体を用いることにより目的タンパク質の精製が容易になる。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側部分に見られる。したがって、本発明の活性型封入体で用いる保護ポリペプチドは、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡから保護ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を発現させることにより得ることができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、前記融合タンパク質は、前記保護ポリペプチドと前記目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の活性型封入体である。
【００２０】
本発明の活性型封入体においては、融合タンパク質が保護ポリペプチドと目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されたものである。その結果、当該リンカーペプチドに所望の機能を有するものを選択することにより、活性型封入体に所望の機能を付加することができる。当該機能の例としては、目的タンパク質を切り出すための切断活性がある。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項６に記載の活性型封入体である。
【００２２】
かかる構成により、活性型封入体に対応の限定分解型プロテアーゼを直接作用させて、目的タンパク質を切り出すことができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、請求項１乃至７のいずれかに記載の活性型封入体を形成している融合タンパク質に含まれる保護ポリペプチドをコードする単離された遺伝子である。
【００２４】
本発明の単離された遺伝子は保護ポリペプチドをコードするものである。本発明の単離した遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とを連結することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製することができる。そして、当該融合遺伝子を転写及び翻訳することにより、前記融合タンパク質を合成すし、活性型封入体を製造することができる。
【００２５】
請求項９に記載の発明は、配列番号１で表される塩基配列からなる請求項８に記載の単離された遺伝子である。
【００２６】
配列番号１で表される塩基配列は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の５’末端側部分に見られる。したがって、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡから本発明の遺伝子を単離し、該遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とを連結することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製することができる。
【００２７】
請求項１０に記載の発明は、請求項８又は９に記載の単離された遺伝子からなる第１コード領域と、少なくとも１つの遺伝子挿入部位を有し、前記遺伝子挿入部位に目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターである。
【００２８】
また請求項１１に記載の発明は、前記遺伝子挿入部位は、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクターである。
【００２９】
本発明の発現ベクターは、保護ポリペプチドをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの遺伝子挿入部位を有する。そして、遺伝子挿入部位に目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。さらに、当該融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させることにより、目的タンパク質を簡便かつ高効率で生産することができる。
【００３０】
請求項１２に記載の発明は、前記第１コード領域と前記遺伝子挿入部位の間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の発現ベクターである。
【００３１】
本発明の発現ベクターは、第１コード領域と遺伝子挿入部位の間にペプチドリンカーをコードする塩基配列を有する。そして、当該リンカーペプチドに所望の機能を有するものを選択することにより、発現される融合タンパク質に所望の機能を付加することができる。当該機能の例としては、目的タンパク質を切り出すための切断活性がある。
【００３２】
請求項１３に記載の発明は、前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクターである。
【００３３】
かかる構成により、発現される融合タンパク質からなる活性型封入体に対応の限定分解型プロテアーゼを直接作用させて、目的タンパク質を切り出すことができる。
【００３４】
請求項１４に記載の発明は、前記遺伝子挿入部位は、制限酵素サイトであることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれかに記載の発現ベクターである。
【００３５】
かかる構成により、目的タンパク質をコードする第２コード領域を簡単に挿入することができる。
【００３６】
請求項１５に記載の発明は、請求項８又は９に記載の単離された遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を転写及び翻訳させ、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を合成し、該融合タンパク質からなる封入体を形成させ、前記封入体は前記目的タンパク質の活性を有することを特徴とする活性型封入体の製造方法である。
【００３７】
本発明の活性型封入体の製造方法においては、保護ポリペプチドをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を転写及び翻訳させ、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を合成する。そして、融合タンパク質からなり、かつ前記目的タンパク質の活性を有する封入体を形成させる。かかる構成により、目的タンパク質を高効率かつ簡便に製造する際に有用な活性型封入体を製造することができる。
【００３８】
請求項１６に記載の発明は、前記融合遺伝子を含有する形質転換体を培養し、該培養物から活性型封入体を採取することを特徴とする請求項１５に記載の活性型封入体の製造方法である。
【００３９】
かかる構成により、活性型封入体を簡便に製造することができる。
【００４０】
請求項１７に記載の発明は、請求項１乃至７のいずれかに記載の活性型封入体から目的タンパク質を単離する目的タンパク質の製造方法であって、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させ、該活性型封入体を可溶化することなく前記融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法である。
【００４１】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を含む融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すものであり、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させ、該活性型封入体を可溶化することなく前記融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする。すなわち、本発明の目的タンパク質の製造方法においては、封入体から直接目的タンパク質を切り出す。本発明の目的タンパク質の製造方法は、封入体を可溶化する工程を要しないので、目的タンパク質の精製が容易である。さらに、本発明の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を折り畳み直す工程も要しないので、簡便かつ高効率で目的タンパク質を製造することができる。
【００４２】
請求項１８に記載の発明は、前記融合タンパク質は、前記保護ポリペプチドと前記目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする請求項１７に記載の目的タンパク質の製造方法である。
【００４３】
本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、ペプチドリンカーの部分を切断することにより目的タンパク質を切りだすことができる。
【００４４】
請求項１９に記載の発明は、前記ペプチドリンカーは、限定分解型プロテアーゼ認識部位を含み、前記活性型封入体に該限定分解型プロテアーゼを接触させることにより前記限定分解型プロテアーゼ認識部位を切断し、目的タンパク質を切り出すことを特徴とする請求項１８に記載の目的タンパク質の製造方法である。
【００４５】
本発明の目的タンパク質の製造方法においては、活性型封入体にプロテアーゼを接触させることにより、換言すれば、活性型封入体に直接プロテアーゼを作用させることによりプロテアーゼ認識部位を切断する。本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、封入体を可溶化することなくプロテアーゼを作用させるので、製造が簡便である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の活性型封入体によれば、目的タンパク質を高効率に製造することができ、目的タンパク質の精製も容易に行なえる。
【００４７】
本発明の単離された遺伝子によれば、目的タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を作製することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。その結果、目的タンパク質を含む活性型封入体を製造することができる。
【００４８】
本発明の発現ベクターによれば、目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。その結果、目的タンパク質を含む活性型封入体を製造することができる。
【００４９】
本発明の活性型封入体の製造方法によれば、より簡便に活性型封入体を製造することができる。
【００５０】
本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、目的タンパク質を高効率に製造することができ、目的タンパク質の精製も容易に行なえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。
【００５２】
本発明の活性型封入体の１つの様相は、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなり、前記保護ポリペプチドは古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側の部分からなる分子量約１７０００のポリペプチドであり、前記目的タンパク質の活性を有する活性型封入体である。本発明の活性型封入体を構成する保護ポリペプチドの由来となる古細菌の例としては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ａｅｒｏｐｕｒｕｍ属、Ｐｕｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する古細菌が挙げられる。
【００５３】
また、本発明の活性型封入体の好ましい実施形態は、保護ポリペプチドの由来が常温性古細菌である。「常温性古細菌」とは常温菌（中温菌ともいう）のうち古細菌に属する生物種を指し、Ｍａｄｉｇａｎらの分類法によると、一般に、至適生育温度が２０〜４５℃である古細菌を指す（Ｍａｄｉｇａｎ,  Ｍ.  Ｔ.  ｅｔ  ａｌ.,  １９９７,  “Ｂｌｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｚｍ”  ８ｔｈ  ｅｄ.,  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ,  Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ)。また、この場合の「至適生育温度」とは、その微生物の増殖速度が最も早められる温度を指す。本実施形態の活性型封入体を構成する保護ポリペプチドの由来となる常温性古細菌の例としては、上記した古細菌の例と同様の属で常温菌のものが挙げられる。
【００５４】
本発明の活性型封入体のさらに好ましい実施形態は、保護ポリペプチドの由来がメタン生成菌に属する常温性古細菌である。本実施形態の活性型封入体を構成する保護ポリペプチドの由来となるメタン生成菌に属する常温性古細菌としては、特に限定されず、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＭｅｔｈａｎｏｉｇｎｉｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ目等に属する古細菌が挙げられる。特に、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属に属する古細菌、とりわけ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの部分ポリペプチドが、保護ポリペプチドとして好適である。保護ポリペプチドとして好適なＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ２８．０）の部分ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるＭａＦＫＢＰ２８．０のアミノ酸配列のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜１５４（Ｇｌｕ）の部分に相当する。
【００５５】
本発明の活性型封入体を構成する保護ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列で、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドと同様の作用を有するものでもよい。当該アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、突然変異によって起こることがある。さらに、保護ポリペプチドをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込む際に、発現ベクター等由来のアミノ酸が付加されても、保護ポリペプチドとしての作用を有する限り本発明に含まれる。当該アミノ酸配列の例を配列番号６に示す。配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端のＭｅｔと２番目のＡｌａの間にＧｌｙが挿入されたものである。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドも保護ポリペプチドとして使用可能である。
【００５６】
また、本発明の活性型封入体においては、保護ポリペプチドと目的タンパク質とがペプチドリンカーを介して連結されていることが好ましい。すなわち、ペプチドリンカーの所望の機能を持たせることにより、活性型封入体に新しい機能を付加することができる。新しい機能の例としては、目的タンパク質を切り出すための切断活性が代表的であり、限定分解型プロテアーゼ認識部位が特に好ましい。すなわち、本実施形態の活性型封入体に対応の限定分解型プロテアーゼを作用させることにより、活性型封入体から目的タンパク質を直接切り出すことができる。本実施形態における限定分解型プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ、エンテロキナーゼ等が挙げられる。
【００５７】
限定分解型プロテアーゼ認識部位以外の切断活性を有するアミノ酸配列としては、例えば、インテインの自己切断アミノ酸配列が挙げられる。すなわち、インティンの自己タンパク質スプライシング機能を利用して活性型封入体から目的タンパク質を切り出すことができる。なお、ペプチドリンカーをコードする塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。
【００５８】
本発明の単離された遺伝子は、保護ポリペプチドをコードするものである。遺伝子の採取源としては、例えば、上記した古細菌のゲノムＤＮＡを挙げることができる。例えば、該ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の遺伝子増幅法を行なうことにより、保護ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅することができる。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７と８で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行なうことにより、配列番号１で表される塩基配列からなる、保護ポリペプチドをコードする遺伝子を単離することができる。配列番号１で表される塩基配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドをコードする。また、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９と１０で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行なうことにより、配列番号５で表される塩基配列からなる、保護ポリペプチドをコードする遺伝子を単離することができる。配列番号５で表される塩基配列は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドをコードする。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、上記した保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現できるものである。すなわち、本発明の発現ベクターは、保護ポリペプチドをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの遺伝子挿入部位を有するものであり、該遺伝子挿入部位に目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することにより、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。そして、該融合タンパク質は活性型封入体を形成し、目的タンパク質の活性を有する。ここで、融合タンパク質を発現できるということは、換言すれば、遺伝子挿入部位は、第１コード領域と同じ解読枠内に位置しているということである。さらに換言すれば、該遺伝子挿入部位に第２コード領域を挿入したときに、第１コード領域と第２コード領域の解読枠が一致しており、かつ第１コード領域と第２コード領域の間に終止コドンが存在しないということである。なお、遺伝子挿入部位の位置は第１コード領域の上流でもよいし下流でもよい。遺伝子挿入部位が第１コード領域の下流にあるときは、第１コード領域はプロモーターに有効に連結していることが必要である。そのような発現ベクターによれば、該プロモーターによって第１コード領域から転写が開始され、Ｎ末端側が保護ポリペプチドでＣ末端側が目的タンパク質である融合タンパク質を発現することができる。そして、該融合タンパク質は、自発的に活性型封入体を形成する。上記した遺伝子挿入部位としては、制限酵素サイトが代表的である。
【００６０】
上記プロモーターとしては、用いる発現系に応じて適宜選択すればよく、宿主細胞内で発現させる場合は、その宿主細胞に適合したものを用いればよい。宿主細胞が大腸菌であれば、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーター等を用いることができる。ほ乳細胞系によって発現させる場合は、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターを用いることができる。
【００６１】
本発明の発現ベクターにおいては、さらに、第１コード領域と前記遺伝子挿入部位との間にペプチドリンカーとなる塩基配列を有してもよい。そのようなペプチドリンカーの代表例は、上述した切断活性を有するアミノ酸配列、特に限定分解型プロテアーゼ認識部位を含むものである。すなわち、本発明の発現ベクターにおいては、第１コード領域と前記遺伝子挿入部位との間に限定分解型プロテアーゼ認識部位をコードする塩基配列を有することが好ましい。該限定分解型プロテアーゼ認識部位をコードする塩基配列は、第１コード領域及び第２コード領域と同じ解読枠内で転写及び翻訳され、該限定分解型プロテアーゼ認識部位となる。すなわち、本実施形態の発現ベクターによれば、保護ポリペプチドと目的タンパク質とが限定分解型プロテアーゼ認識部位を介して連結された融合タンパク質を発現することができる。そして、該融合タンパク質は自発的に活性型封入体を形成する。その結果、該活性型封入体に対応の限定分解型プロテアーゼを作用させることにより、活性型封入体から目的タンパク質を直接切り出すことができる。
【００６２】
本発明の発現ベクターは、さらに、他の従来公知の塩基配列を含んでいてもよく、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列や、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等を含んでもよい。
【００６３】
本発明の活性型封入体の製造方法は、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子を転写及び翻訳させることにより、融合タンパク質を合成し、さらに、該融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させるものである。このとき、該融合タンパク質は特別の処理を施されることなく自発的に活性型封入体を形成する。前記融合遺伝子を転写及び翻訳させる系は、宿主細胞系と無細胞翻訳系の両方が使用可能である。宿主細胞系によって活性型封入体を製造する場合は、例えば、上記した融合遺伝子を含有する形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより融合遺伝子を転写及び翻訳させることができる。そして、該培養物から保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体を採取することができる。上記した融合遺伝子は、上記した本発明の発現ベクターの遺伝子挿入部位に目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、容易に構築することできる。この際に用いる宿主細胞は、用いる発現ベクターの特性と適合するものであれば特に制限はなく、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられる。ここで、宿主細胞が発現ベクターの特性と適合するとは、宿主細胞内においてその発現ベクターが複製可能であり、かつ第１コード領域と第２コード領域を転写及び翻訳できるということである。特に、転写が正常に行われるためには、発現ベクター上のプロモーターが正常に働く宿主細胞を選択することが必要である。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。
【００６４】
無細胞翻訳系を用いて活性型封入体を製造する場合は、例えば、無細胞抽出液に上記した融合遺伝子を添加し、該融合遺伝子を転写及び翻訳させればよい。なお、無細胞抽出液には、さらに、ＲＮＡポリメラーゼ、各種ヌクレオチド３リン酸、各種アミノ酸、各種ｔＲＮＡ、リボゾームフラクション、各種リン酸化酵素等を含めてもよい。無細胞翻訳系は、目的タンパク質が宿主細胞に毒性を示すものである場合等に有効である。なぜなら、そのような目的タンパク質と保護ポリペプチドとの融合タンパク質からなる活性型封入体は目的タンパク質の活性を有し、宿主細胞に毒性を示すからである。
【００６５】
活性型封入体を培養物等から単離する方法としては、固液分離ができる方法であれば特に制限はなく、例えば、遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。
【００６６】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質からなる活性型封入体を形成させ、該活性型封入体を可溶化することなく該融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すものである。通常、封入体から目的タンパク質を回収する場合は、封入体を塩酸グアニジン等の変性剤でいったん可溶化する必要があるが、本発明の目的タンパク質の製造方法では、活性型封入体を可溶化する工程を要しない。すなわち、活性型封入体の中で目的タンパク質は正しく折り畳まれた正常型タンパク質の状態で保持されているので、活性型封入体を可溶化して目的タンパク質を折り畳み直す工程は必要ない。さらに、融合タンパク質から目的タンパク質を切り出す処理は活性型封入体に対して直接行えばよく、この点でも封入体を可溶化する必要がない。活性型封入体に対して目的タンパク質を切り出す処理を行なう方法としては、例えば、活性型封入体の懸濁液を調製し、該懸濁液中において所望の処理を行なえばよい。融合タンパク質が保護ポリペプチドと目的タンパク質との間にペプチドリンカーを有し、該ペプチドリンカーが限定分解型プロテアーゼ認識部位を含む場合は、活性型封入体の懸濁液に対応の限定分解型プロテアーゼを添加し、活性型封入体に直接作用させればよい。このようにすれば、活性型封入体を形成している融合タンパク質中の限定分解型プロテアーゼ認識部位が、対応の限定分解型プロテアーゼによって消化され、目的タンパク質が切り出される。
【００６７】
本発明の目的タンパク質の製造方法によって目的タンパク質を製造する手順の一例を示す。まず、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる保護ポリペプチドの遺伝子を適宜の方法で単離する。単離する方法としては、例えば、Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡからＰＣＲ等の方法によって単離することができる。次に、単離した遺伝子を適宜の発現ベクターに組み込み、さらに遺伝子導入部位を設けて、保護ポリペプチドとの融合用ベクターを構築する。この際、トロンビン等の限定分解型プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を、保護ポリペプチドの遺伝子と遺伝子導入部位との間に設けておく。次に、前記遺伝子導入部位に目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築する。次に、該発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、保護ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を生産することができる形質転換体を作製する。次に、該形質転換体を培養する。すると、宿主細胞内に該融合タンパク質からなる活性型封入体が蓄積される。次に、宿主細胞を破砕し、活性型封入体を遠心分離等の操作により単離する。次に、単離した活性型封入体を適宜の緩衝液に懸濁し、トロンビン等の限定分解型プロテアーゼを懸濁液に添加して、活性型封入体に限定分解型プロテアーゼを接触させる。これにより、融合タンパク質から目的タンパク質が切り出され、目的タンパク質は上清画分に放出される。最後に、該上清画分から目的タンパク質を採取する。
【００６８】
なお、切り出された目的タンパク質を精製する際に、添加した限定分解型プロテアーゼを効率よく除去する方法としては、タグ付きの限定分解型プロテアーゼを用いる方法が挙げられる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をタグとして有する限定分解型プロテアーゼ（例えば、プレシジョンプロテアーゼ）を添加した場合は、グルタチオンビーズに当該限定分解型プロテアーゼを結合させることにより、当該限定分解型プロテアーゼを目的タンパク質と分離することができる。その他の例としては、ビオチンをタグとして有する限定分解型プロテアーゼを添加した場合に、アビジンビーズを用いて当該限定分解型プロテアーゼ（例えば、トロンビン）を目的タンパク質から分離することができる。
【００６９】
本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、あたかも担体に固定化したタンパク質を精製するかのように、目的タンパク質を精製することができる。すなわち、保護ポリペプチドが担体の役割をしており、目的タンパク質が固定化された担体を遠心分離により回収し、その後、目的タンパク質を担体から切り出す操作と同様である。本発明の目的タンパク質の製造方法では、目的タンパク質を担体に固定化する代わりに、保護ポリペプチドとの融合タンパク質としている点が特徴である。
【００７０】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、あらゆる目的タンパク質の製造に適用可能である。目的タンパク質の例としては、各種の酵素、ホルモン、サイトカイン等が挙げられる。
【００７１】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
本実施例では、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ２８．０）の部分ポリペプチドである保護ポリペプチド（Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ）をコードする遺伝子の単離、及び該遺伝子を含有する発現ベクターの構築を行った。
【００７３】
常温性メタン菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ（ＤＳＭ２８３４）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、フェノール／クロロホルム処理、及び、エタノール沈殿法により、ゲノムＤＮＡを回収した。一方、配列番号３に示される公知のＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号９に示されるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｆ１プライマー及び配列番号１０に示されるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｆ１プライマー及びＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭａＦＫＢＰ２８．０のＮ末端側部分ポリペプチド（Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ）をコードする遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号５で表される塩基配列であった。これは、両末端部を除き、配列番号３で表されるＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子の１番〜４６２番の部分と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｆ１の５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−Ｒ１の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。すなわち、発現されるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅのアミノ酸配列は、配列番号６で表されるものとなった。
【００７４】
一方、配列番号１１で表される塩基配列からなるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖であるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２を合成した。なお、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２は、５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトを有し、内部には目的タンパク質の遺伝子を導入するためのＢａｍＨＩサイト及びＮｄｅＩサイトを有している。さらに、融合タンパク質から目的タンパク質をトロンビンにより切り出せるように、ＢａｍＨＩサイトの上流に、翻訳されてトロンビン認識部位となる塩基配列を有している（図１）。次に、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２とリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２をアニーリングさせ、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍを調製した。
【００７５】
Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ遺伝子−２本鎖リンカーの順になるよう挿入して、発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２を構築した。発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２の構成を図１に示す。すなわち、発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２は、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、ＢａｍＨＩサイト、及びＮｄｅＩサイトを有する。そして、ＢａｍＨＩサイト又はＮｄｅＩサイトに第２コード領域となる目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅと目的タンパク質の間にトロンビン認識部位を有する。なお、発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２は、第２コード領域を挿入しない状態では、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅを単独で発現することができる。
【実施例２】
【００７６】
本実施例では、オワンクラゲ由来天然型ＧＦＰ（以下、「ＧＦＰ」と略記する。）を目的タンパク質として使用し、活性型封入体を製造した。
【００７７】
ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号１２表されるＧＦＰ−Ｆ１プライマー及び配列番号１３で表されるＧＦＰ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、ＧＦＰ遺伝子を含む発現ベクターであるコントロールベクターＧＦＰ(ロシュダイアグノスティックス社製Ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍキットに含まれているもの)を鋳型とし、ＧＦＰ−Ｆ１プライマー及びＧＦＰ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＧＦＰ−Ｆ１の５’末端に由来するＢａｍＨＩサイト及びＧＦＰ−Ｒ１の３’末端に由来するＥｃｏＲＩサイトが導入された。増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングによりｐＴ７ブルーベクターに挿入し、塩基配列を確認したところ、データベースに登録されているＧＦＰ遺伝子の塩基配列と一致した。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理後、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでサイトに挿入して、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅとＧＦＰとの融合タンパク質（以下、「Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰ」と称する。）を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ遺伝子、トロンビン認識部位をコードする塩基配列、及び第２コード領域となるＧＦＰをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰを発現することができる。また、発現されるＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰは、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅとＧＦＰとの間にトロンビン認識部位を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。
【００７８】
２Ｌ容の三角フラスコに、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ  酵母エキス、２０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを仕込み、得られた形質転換体を白金耳で２〜３回接種し、３５℃、１１０ｒｐｍの条件で培養した。培養液のＯＤが０．４〜０．５になった時点でＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭとなるように添加し、その後、培養温度を１５〜２０℃に下げて、さらに一夜培養した。培養終了後、培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分）し、菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００７９】
凍結保存した菌体懸濁液を融解し、超音波処理をして菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。さらに沈殿画分を４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁して３０分間処理し、膜成分を可溶化した。懸濁液を遠心分離して、沈殿を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿を２０ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁して封入体画分を調製した。比較例の発現ベクターについても同様の操作を行なった。得られた可溶性画分と封入体画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）にてゲルを染色した。さらに、各画分についてＢｒａｄｆｏｒｄ法によってタンパク定量を行なった。さらに、各画分についてＧＦＰに起因する蛍光の強度を測定した。封入体画分の試料には、懸濁液を超音波処理して均一に分散させたものを用いた。そして、単位タンパク質当たりの蛍光強度（以下、「蛍光活性」と称する。）を算出した。すなわち、蛍光活性（／μＭ  ＧＦＰ）は、蛍光強度／（タンパク定量値（ｍｇ／ｍＬ）×Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰ比率（％）／Ｍａ２８ｔｒａｎｃａｔｅ−ＧＦＰの分子量×１０6）の式により算出した。
【００８０】
（比較例１）
実施例２で増幅したＧＦＰ遺伝子のみをｐＥＴ２１ｄプラスミドのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに導入し、ＧＦＰを単独で発現することができる発現ベクターを構築した。該発現ベクターを用いて、実施例２と同様にして、形質転換体の作製、培養、各画分の調製、及び各測定を行なった。蛍光活性（／μＭ  ＧＦＰ）は、蛍光強度／（タンパク定量値（ｍｇ／ｍＬ）×ＧＦＰ比率（％）／ＧＦＰの分子量×１０6）の式により算出した。
【００８１】
（比較例２）
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号１４で表されるＭａ２８−Ｆ１プライマー及び配列番号１５で表されるＭａ２８−Ｒ１プライマーを用いる以外は全て実施例１と同様の操作を行うことにより、ＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子を単離し、次いで、発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２を構築した。さらに、実施例２で増幅したＧＦＰ遺伝子を発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２に導入し、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＧＦＰとの融合タンパク質（以下、「ＭａＦＫＢＰ２８．０−ＧＦＰ」と称する。）を発現することができる発現ベクターを構築した。該発現ベクターを用いて、実施例２にして、形質転換体の作製、培養、各画分の調製、及び各測定を行なった。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢの結果を図２に示す。図２（ａ）は実施例２、図２（ｂ）は比較例１、図２（ｃ）は比較例２の結果である。図中、ＳＵＰは可溶性画分、ＰＰＴは封入体画分を表す（以下同じ）。すなわち、実施例２においては、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰに相当するバンドは封入体画分（レーン２）のみ検出された。しかも、当該バンドはほとんど単一であり、その純度は高かった。
一方、比較例１においては、可溶性画分（レーン１）と封入体画分（レーン２）の両方にＧＦＰに相当するバンドが検出された。このとき、封入体画分における当該バンドはほとんど単一であったが、可溶性画分には他のバンドも多く検出され、その純度はあまり高くなかった。
さらに、比較例２においては、ＭａＦＫＢＰ２８．０−ＧＦＰに相当するバンドは可溶性画分（レーン１）にのみ検出された。ただし、可溶性画分には他のバンドも多く検出され、その純度はあまり高くなかった。
以上より、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰは封入体画分に、ＧＦＰ単体は可溶性画分と封入体画分の両方に、ＭａＦＫＢＰ２８．０−ＧＦＰは可溶性画分に存在していた。
【００８３】
蛍光活性を測定した結果、実施例２においては、可溶性画分の蛍光活性が５．７（／μＭ  ＧＦＰ）であったのに対し、封入体画分の蛍光活性が１１０（／μＭ  ＧＦＰ）と高く、封入体でありながら含まれているＧＦＰが活性を保持していることが分かった。一方、比較例１においては、可溶性画分の蛍光活性が１５６（／μＭ  ＧＦＰ）であったのに対し、封入体画分の蛍光活性は０．４（／μＭ  ＧＦＰ）とバックグラウンドと有意差がなく、封入体に含まれているＧＦＰは失活しているものと考えられた。以上より、実施例２で調製した封入体は、目的タンパク質が正しく折り畳まれた正常型タンパク質として保持されている活性型封入体であった。なお、比較例１の可溶性画分には蛍光活性が検出され、ＧＦＰは失活していなかったが、純度が低いので精製が煩雑であると予想された。
【実施例３】
【００８４】
本実施例では、活性型封入体から目的タンパク質（ＧＦＰ）を切り出すことにより、目的タンパク質を製造した。
【００８５】
実施例２で調製した封入体画分（沈殿懸濁液）に、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰ１ｍｇ当たりに１Ｕの割合となるようにトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理した。処理後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分）を行い、上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）とに分離した。各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ及び蛍光強度の測定を行なった。図３にＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢの結果を示す。図３において、レーン１はトロンビン処理前の沈殿懸濁液、レーン２はトロンビン処理後の可溶性画分、レーン３はトロンビン処理後の封入体画分である。まず、トロンビン処理後においては、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰのバンドは可溶性画分と封入体画分のいずれにも検出されず、これに代わってＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅに相当するバンド（レーン３）とＧＦＰに相当するバンド（レーン２及び３）が検出された。これより、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰのトロンビン認識部位がトロンビンによって切断されたことが確認された。また、可溶性画分には、ＧＦＰに相当するバンドが検出されたが、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅに相当するバンドは検出されなかった（レーン２）。一方、沈殿画分にはＧＦＰに相当するバンドとＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅに相当するバンドの両方が検出された（レーン３）。以上より、封入体にトロンビンを直接作用させてもＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰからＧＦＰが切り出されることが分かった。
蛍光活性を測定した結果、トロンビン処理前の封入体懸濁液の蛍光活性が１１０（／μＭ  ＧＦＰ）であったのに対し、トロンビン処理後の可溶性画分の蛍光活性が２２０（／μＭ  ＧＦＰ）、沈殿画分の蛍光活性が２．６（／μＭ  ＧＦＰ）であった。以上より、可溶性画分にＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅ−ＧＦＰから切り出された活性型のＧＦＰが検出され、さらにその可溶性画分にはＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅが含まれず、ＧＦＰの純度が高かった。一方、封入体画分にはもはや活性型のＧＦＰは含まれていなかった。
【００８６】
なお、参考として、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２を単独で大腸菌に導入し、実施例２と同様にして培養し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢを行なった。結果を図４に示す。すなわち、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅは封入体画分に検出された（レーン２）。これより、Ｍａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅは単独で発現した場合、封入体を形成することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅＦ２の構成を表す模式図である。
【図２】図２（ａ）は実施例２で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真であり、図２（ｂ）は比較例１で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真であり、図２（ｃ）は比較例２で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３】実施例３で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図４】保護ポリペプチドＭａ２８ｔｒｕｎｃａｔｅを単独で発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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