(57)【要約】      （修正有）【課題】  医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野で有用な新規Ｎ−ジヒドロフェルロイルアミノ酸を提供するとともに、それらを含む抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。【解決手段】  L−α−アミノ酸又はその誘導体とジヒドロフェルラ酸を縮合させて得られる下記一般式（Ａ）で表わされる化合物である。さらに、一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤である。2006052152.tif 000020【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
L−α−アミノ酸又はその誘導体とジヒドロフェルラ酸を縮合させて得られる下記一般式（Ａ）で表わされる化合物。
【化１】
2006052152.tif 000019
【請求項２】
前記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項３】
前記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N−ジヒドロフェルロイルアミノ酸とその用途に関するものであり、当該化合物は、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野において抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として好適に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素やフリーラジカルが、様々な疾病を引き起こすことが明らかになってきている。元来活性酸素は生体の免疫機構の中で生成し、外部から侵入した病原菌などを攻撃する働きをもっている。しかし活性酸素が過剰に生成し残存してしまうと、生体内の構成成分、すなわち脂質、タンパク質、ＤＮＡなどと反応し悪影響を及ぼす。なかでも生体膜等の構成成分である不飽和脂肪酸は酸化され易く、フリーラジカル中間体を経て過酸化脂質を生成する。この過酸化脂質は、動脈硬化、高血圧症、肝機能障害などを誘起することが知られており、老化現象にも密接に関係しているとも言われている。最近では腋臭の原因としても不飽和脂肪酸の酸化分解物が挙げられている（例えば、非特許文献１参照）。また、酸化を受け易い不飽和脂肪酸を含む食品、医薬品、化粧品等は保存中の品質低下が起こり易いという問題もある。
【０００３】
かかる不飽和脂肪酸等の酸化を防止するためには、抗酸化剤を使用する必要がある。抗酸化剤としては多数の化合物が知られており、具体的にはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール類、アスコルビン酸及びその誘導体、ユビキノン及びその誘導体、フラボン誘導体、没食子酸誘導体、ポリフェノール類が挙げられる（例えば、非特許文献２および非特許文献３参照）。しかしながら、上記ＢＨＴやＢＨＡ等の合成化学物質は、人体への安全性に欠け用途的な制約があり、他の天然性の抗酸化物質は性能的に今一歩であったり、入手が困難であるという問題があった。
【０００４】
一方、しみ、そばかすは紫外線の暴露などに起因して表皮色素細胞内でメラニン色素が形成され、表皮に色素沈着することにより発生する。メラニン色素は、アミノ酸の一種であるＬ−チロシンが酸化酵素であるチロシナーゼの作用によりＬ−ドーパ、Ｌ−ドーパキノンへと代謝され、さらに各種の過程を経ることにより合成される（例えば非特許文献４および非特許文献５参照）。したがって、しみ、そばかすなどの色素沈着を防止するには、メラニン色素の合成に重要な役割を果たしているチロシナーゼの活性を阻害することが重要である。
【０００５】
従来、しみ、そばかすなどの予防・改善には、胎盤抽出物、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンなどの薬剤が使用されているが、必ずしも十分な効果は得られていない。また、欧米では、ハイドロキノンが色素斑の脱色を目的に用いられているが、安全性の点で問題があるために使用制限がなされている。さらに最近、コウジ酸にも発ガン性がある可能性が指摘され問題となっている。
【０００６】
大麦中に存在する化合物としてＮ−フェルロイルグリシンが知られており、この化合物の関連酵素であるＮ−フェルロイルグリシンアミドヒドロラーゼの研究において、Ｎ−フェルロイルアラニンが合成されている（非特許文献６参照）。また、Ｎ−ジヒドロフェルロイルアミノ酸に構造が類似した化合物であるカフェ酸アミド誘導体が抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することが知られている（特許文献１参照）。しかし、Ｎ−フェルロイルアラニンならびにカフェ酸アミド誘導体はいずれも、アミド基とフェニル基との間が炭素−炭素二重結合であり、アミド基とフェニル基との間が飽和炭化水素で結ばれているＮ−ジヒドロフェルロイルアミノ酸とは構造上の特徴が相違する。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１９２５２２号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】飯田悟、外７名、「体臭発生機構の解析と対処」、第５１回ＳＣＣＪ研究討論会講演要旨集、２００２年、ｐ．６４−６７
【非特許文献２】福沢健治、「フリーラジカル防御の薬理学と薬物開発の展望」、日本臨床、１９８８年１０月、４６巻、１０号、ｐ．２２６９−２２７６
【非特許文献３】Sies, H.、外２名、「Antioxidant Functions of Vitamins」、Annals New York Academy of Sciences、１９９２年、６６９巻、ｐ．７−２０
【非特許文献４】「ファインケミカル誌」特集 美白剤の開発と製品展開、シーエムシー出版編集・発行、１９９９年３月１５日号
【非特許文献５】「フレグランス ジャーナル誌」特集 最近の美白剤の研究開発動向、フレグランスジャーナル社編集・発行、１９９７年９月号
【非特許文献６】Martens,M.外５名、Phytochemistry、２７巻、８号、ｐ．２４６５−２４７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、上述のような状況をふまえ、優れた抗酸化剤、あるいはチロシナーゼ活性阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは抗酸化剤及びチロシナーゼ活性阻害剤に関する研究を重ねた結果、Ｎ−ジヒドロフェルロイルアミノ酸が優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、Ｌ−α−アミノ酸又はその誘導体とジヒドロフェルラ酸を縮合させて得られる下記一般式（Ａ）で表わされる化合物である。
【００１０】
【化１】
2006052152.tif 000002
【００１１】
さらに、前記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤、及び前記一般式（Ａ）で表わされる化合物を含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のN−ジヒドロフェルロイルアミノ酸は、優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することから、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野において、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
○一般式（Ａ）で表わされる化合物
一般式（Ａ）におけるＲは、Ｌ−α−アミノ酸におけるアミノ基と結合した残基である。ジヒドロフェルラ酸と縮合するL−α−アミノ酸の誘導体としては、アミノ酸残基が塩で置換されたL−α−アミノ酸塩又はL−α−アミノ酸エステル等が含まれる。
本明細書で言うL−α−アミノ酸とは、カルボシキル基とアミノ基が同一炭素原子に結合したアミノ酸（α−アミノ酸）であり、その立体配置はＬ−型を有するものである。具体的には、Ｌ−α−アラニン、L−バリン、L−α−ロイシン、L−α−イソロイシン、L−α−セリン、L−α−スレオニン、L−α−フェニルアラニン、L−α−チロシン、L−α−トリプトファン、L−α−リジン、L−α−アルギニン、L−α−ヒスチジン、L−α−システイン、L−α−シスチン、L−α−メチオニン、L−プロリン、L−３−ヒドロキシプロリン、 L−４−ヒドロキシプロリン、L−α−アスパラギン酸、L−α−グルタミン酸、L−α−アスパラギン又はL−α−グルタミンなどが挙げられる。これらのL−α−アミノ酸は市販のものを使用することができる。
【００１４】
L−α−アミノ酸塩としては、アミノ酸残基中のカルボキシル基がナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等や、あるいは塩基性アミノ酸であるトリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンなどの塩基性残基が、塩酸、リン酸、硫酸、クエン酸、酢酸などの無機酸又は有機酸等の酸成分と塩を形成したものを示す。
【００１５】
L−α−アミノ酸エステルとは、アミノ酸残基中のカルボキシル基がアルコール類とエステル結合を形成したものであり、炭素数１〜１８の分子を有しても良いエステル基を有するものである。エステル基としては、メチルエステル基、エチルエステル基、ｎ−ブチルエステル基、ステアリルエステル基などの直鎖のエステル基、イソプロピルエステル基、２−エチルヘキシルエステル基などの分枝構造を有するエステル基、メタリルエステル基、ベンジルエステル基、ゲラニルエステル基、オレイルエステル基などの不飽和結合を有するエステル基が例示され、原料の入手容易なメチルエステル基、エチルエステル基、ｎ−プロピルエステル基、ｎ−ブチルエステル基、ベンジルエステル基が好適である。
【００１６】
なお、本明細書において、上記Ｌ−α−アミノ酸、Ｌ−α−アミノ酸塩及びＬ−α−アミノ酸エステルの表示で、「α−」表記を省略して表示することもある。
【００１７】
一般式（Ａ）で表わされる化合物は、たとえば、下記式（１）で表わされる化合物（以下、化合物１ともいう。その他の式で表わされる後記の化合物についても同様に略記する場合もある。）と、L−α−アミノ酸又はL−α−アミノ酸エステルとを縮合させることにより合成することができる。縮合反応は、脱水縮合剤を用いる方法、化合物１を活性エステル化合物に変換した後、L−α−アミノ酸またはL−α−アミノ酸エステルと反応させる方法など、常法に従って実施することができる。
【００１８】
【化２】
2006052152.tif 000003
【００１９】
一般式（Ａ）で表わされる化合物の合成法として、化合物１をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性エステル化合物（化合物２）に変換した後、L−アミノ酸エステルとの反応を行う方法を例に説明する。
【００２０】
【化３】
2006052152.tif 000004
【００２１】
化合物２は、有機溶媒中で化合物１とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを縮合剤を用いて反応させることにより、調製することができる。
本反応で使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドの量は、基本的には化合物１に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
【００２２】
縮合剤としては、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミプロピル）カルボジイミド、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド、ジ−２−ピリジルカルボネート、ジ−２−ピリジルチオノカルボネートなどが例示され、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを好適に使用することができる。縮合剤の使用量は、基本的には化合物１に対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
【００２３】
本反応は有機溶媒中、なかでも、非プロトン性の溶媒中で行うことが好ましく、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピレンウレアおよびこれらの混合溶媒等を好適に使用することができる。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
本反応時間は条件により異なるが、通常、数時間である。
この反応終了後、化合物２を未精製のまま使用することもでき、また、再結晶等の公知の方法により、化合物２を単離精製することもできる。
【００２４】
上述のように調製した化合物２にＬ−アミノ酸エステルを反応させることにより、一般式（Ａ）で表される化合物を合成することができる。
本反応で使用する化合物２の量は、基本的にはL−アミノ酸エステルに対して１化学当量であり、０．７〜１．３化学当量であることが好ましく、さらに好ましくは、０．９〜１．１化学当量である。
本反応は、塩基性条件下で行うことが好ましく、好適には炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムをL−アミノ酸エステルに対して、０．７〜５．０化学当量、より好適には１．０〜３．０化学当量使用する。
【００２５】
本反応は、化合物２、L−アミノ酸エステル、及び炭酸水素ナトリウムなどの塩基性物質を溶解する溶媒中で実施することが好ましく、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピレンウレア、メタノール、エタノール、イソプロピリアルコール、トルエン、塩化メチレン、水、および、これらの混合溶媒が好適である。
上記反応の温度は、０〜５０℃が好ましく、より好ましくは、１０〜３０℃である。この反応温度が低すぎる場合は温度維持にコストがかかり、また、反応温度が高すぎる場合は副反応が進行する場合がある。
この反応時間は条件により異なるが、通常、数時間から数１０時間である。
この反応終了後は、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の方法により、一般式（Ａ）で表される化合物を単離精製することができる。
【００２６】
一般式（Ａ）で表わされる化合物は、抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有することから、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として、例えば、食品添加物や美白化粧料成分などに用いることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
＜合成例１＞
ジヒドロフェルラ酸（化合物１）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合反応を行い、化合物２を得た。
すなわち、ジヒドロフェルラ酸（２３．６ｇ，１２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１３．９ｇ，１２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２５０ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５．０ｇ，１２１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間攪拌後、蒸留水５ｍｌを加え、１６時間放置した。つぎに、生成した不溶物を濾別し、濾液を濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルとｎ−ヘキサンとの混合溶媒から再結晶し、無色結晶性の化合物（２５．０ｇ、収率７１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル分析（以下、特に記載しないかぎり、ＩＲスペクトルはＫＢｒペレット法による。）を行ない、得られた化合物が化合物２であることを確認した。
【００２９】
化合物２の融点は１４０−１４２℃であった。化合物２の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.80-2.92(6H,m), 2.96-3.02(2H,m), 3.89(3H,s), 5.57(1H,s), 6.70-6.75(2H,m), 6.85(1H,d,J=7.6Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3430, 2940, 1820, 1780, 1730, 1520, 1370, 1220, 1070, 820, 650であった。
【００３０】
＜合成例２＞
合成例１で用いたＮ−ヒドロキシスクシンイミドの代わりにＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて、化合物３を得た。
【００３１】
○化合物３の構造式
【００３２】
【化４】
2006052152.tif 000005
【００３３】
化合物３の融点は１４７−１４９℃であった。化合物３の重クロロホルムと重メタノールの混合溶媒中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、3.11(2H,t,J=7.6Hz), 3.48(2H,t,J=7.6Hz), 3.88(3H,s), 6.726.85(3H,m), 7.66(1H,t,J=8.0Hz), 7.86(1H,t,J=8.0Hz), 8.03(1H,d,J=8.4Hz), 8.43(1H,d,J=8.4Hz)であった。
【００３４】
＜実施例１＞
合成例１で得た化合物２とＬ−α−アラニンエチルエステル塩酸塩との反応を行い、本発明の化合物４を合成した。
すなわち、Ｌ−α−アラニンエチルエステル塩酸塩（１．５４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（８５０ｍｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を蒸留水（１０ｍｌ）に溶解した。つぎに、化合物２（２．９４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した溶液を加え、室温で攪拌した。１８時間後、反応溶液に、２０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）、飽和食塩水（２０ｍｌ）および酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色液状の化合物（２．７４ｇ、収率９３％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析により、得られた化合物が化合物４であることを確認した。
【００３５】
○化合物４の構造式
【００３６】
【化５】
2006052152.tif 000006
【００３７】
化合物４の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.27(3H,t,J=7.2Hz), 1.35(3H,d,J=7.2Hz), 2.43-2.54(2H,m), 2.87-2.94(2H,m), 3.86(3H,s), 4.19(2H,q,J=7.2Hz), 4.56(1H,t,J=7.2Hz), 5.58(1H,br), 5.98(1H,br), 6.67−6.75(2H,m), 6.82(1H,d,J=8.0Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3350, 2980, 1740, 1650, 1520, 1450, 1280, 1210, 1160, 1120, 1060, 1030であった。
【００３８】
＜実施例２＞
実施例１で用いたＬ−α−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりに、Ｌ−セリンエチルエステル塩酸塩を用い、本発明の化合物５を合成した。
【００３９】
○化合物５の構造式
【００４０】
【化６】
2006052152.tif 000007
【００４１】
化合物５の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.28(3H,t,J=7.2Hz), 2.53(2H,t,J=7.6Hz), 2.77(1H,br), 2.91(2H,t,J=7.6Hz), 3.82-3.94(5H,m), 4.22(2H,q, J=7.2Hz), 4.60-4.66(1H,m), 5.72(1H,br), 6.46(1H,br), 6.69(1H,d,J=8.4Hz), 6.72(1H,s), 6.83(1H,d,J=8.4Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3370, 2940, 1740, 1660, 1520, 1450, 1380, 1280, 1210, 1160, 1030, 820であった。
【００４２】
＜実施例３＞
実施例１で用いたＬ−α−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりに、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩を用い、本発明の化合物６を合成した。
【００４３】
○化合物６の構造式
【００４４】
【化７】
2006052152.tif 000008
【００４５】
化合物６の融点は１１３−１１５℃であった。化合物６の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.38-2.53(2H,m), 2.83-2.92(2H,m), 3.06(2H,d,J=5.6Hz), 3.71(3H,s), 3.85(3H,s), 4.85-4.92(1H,m), 5.53(1H,br), 5.82(1H,br), 6.65-6.73(2H,m), 6.83(1H,d,J=8.0Hz), 6.90-6.96(2H,m), 7.20-7.25(3H,m)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3420, 3310, 3000, 2940, 1730, 1650,  1550, 1520, 1430, 1280, 1230, 1030, 700であった。
【００４６】
＜実施例４＞
実施例１で用いたＬ−α−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりに、Ｌ−メチオニンメチルエステル塩酸塩を用い、本発明の化合物７を合成した。
【００４７】
○化合物７の構造式
【００４８】
【化８】
2006052152.tif 000009
【００４９】
化合物７の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.86-1.97(1H,m), 2.03-2.18(4H,m), 2.33-2.42(2H,m), 2.48-2.59(2H,m), 2.88-2.95(2H,m), 3.74(3H,s), 3.87(3H,s), 4.69-4.75(1H,m), 5.55(1H,br), 6.06(1H,br), 6.68-6.75(2H,m), 6.83(1H,d,J=8.0Hz)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3350, 2950, 1740, 1660, 1520, 1440, 1280, 1120, 1030, 820であった。
【００５０】
＜実施例５＞
合成例１で得た化合物２とＬ−ヒスチジンメチルエステル二塩酸塩との反応を行い、本発明の化合物８を合成した。
すなわち、Ｌ−ヒスチジンメチルエステル二塩酸塩（２．４３ｇ，１０ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．５２ｇ，３０．０ｍｍｏｌ）を蒸留水（１０ｍｌ）に溶解した。つぎに、化合物２（２．９４ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した溶液を加え、室温で攪拌した。１８時間後、反応溶液に、２０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）、飽和食塩水（２０ｍｌ）および酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色粉末状の化合物（３．０５ｇ、収率９７％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析により、得られた化合物が化合物８であることを確認した。
【００５１】
○化合物８の構造式
【００５２】
【化９】
2006052152.tif 000010
【００５３】
化合物８の重クロロホルムと重メタノールの混合溶媒中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.46-2.56(2H,m), 2.80-2.87(2H,m), 2.97-3.06(2H,m), 3.70(3H,s), 3.83(3H,s), 4.68(1H,t,J=7.2Hz), 6.60-6.67(2H,m), 6.71(1H,s), 6.75(1H,d,J=8.0Hz), 7.47(1H,s)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3290, 1740, 1660, 1520, 1440, 1370, 1280, 1130, 1030, 750であった。
【００５４】
＜実施例６＞
合成例２で得た化合物３とＬ−チロシンメチルエステルとの反応を行い、本発明の化合物９を合成した。
すなわち、Ｌ−チロシンメチルエステル（９８０ｍｇ，５．０２ｍｍｏｌ）および化合物３（１．５８ｇ，５．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、室温で攪拌した。１８時間攪拌後、５％炭酸ナトリウム水溶液（８０ｍｌ）、酢酸エチル（３０ｍｌ）を加えて分配した。有機層を回収し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、無色粉末状の化合物（９３５ｍｇ、収率５３％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析により、得られた化合物が化合物９であることを確認した。
【００５５】
○化合物９の構造式
【００５６】
【化１０】
2006052152.tif 000011
化合物９の重クロロホルム中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.40-2.55(2H,m), 2.79-3.03(4H,m), 3.71(3H,s), 3.81(3H,s), 4.81-4.89(1H,m), 5.72(1H,br), 5.98(1H,br), 6.62-6.85(8H,m)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3350, 2950, 1740, 1650, 1610, 1520, 1450, 1370, 1230, 1120, 1030, 820であった。
【００５７】
＜実施例７＞
実施例２で得た化合物５を加水分解することで、本発明の化合物１０を合成した。
すなわち、化合物５（１．５６ｇ，５．００ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（１５ｍｌ）に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて、室温で攪拌した。２４時間後、１N塩酸（５ｍｌ）を加えて、中和した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、無色結晶性の化合物（１．０１ｇ、収率７１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析により、得られた化合物が化合物１０であることを確認した。
【００５８】
○化合物１０の構造式
【００５９】
【化１１】
2006052152.tif 000012
【００６０】
化合物１０の融点は１３７−１３９℃であった。化合物１０の重ジメチルスルフィド中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.42(2H,t,J=7.6Hz), 2.68(2H,t,J=7.6Hz), 3.55-3.80(6H,m), 4.23-4.36(1H,m), 6.58(1H,d,J=7.6Hz), 6.65(1H,d,J=7.6Hz), 6.77(1H,s), 8.00(1H,br), 8.65(1H,br)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3520, 3310, 2940, 1750, 1710, 1650, 1540, 1520, 1280, 1270, 1220, 1030, 860, 820, 800であった。
【００６１】
＜実施例８＞
実施例４で得た化合物７を加水分解することで、本発明の化合物１１を合成した。
すなわち、化合物６（１．７１ｇ，５．００ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（１５ｍｌ）に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を加えて、室温で攪拌した。２４時間後、反応混合物を減圧濃縮し、残渣をメタノールから再結晶することにより、淡黄色結晶性の化合物（４５０ｍｇ、収率４３％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトル分析により、得られた化合物が化合物１１であることを確認した。
【００６２】
○化合物１１の構造式
【００６３】
【化１２】
2006052152.tif 000013
【００６４】
化合物１１の融点は２２１−２２２℃であった。化合物１１の重ジメチルスルフィドと重メタノールの混合溶媒中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、1.73-1.85(1H,m), 1.91-2.07(4H,m), 2.29-2.50(4H,m), 2.73-2.81(2H,m), 3.79(3H,s), 4.07-4.14(1H,m), 6.62(1H,d,J=8.0Hz), 6.68(1H,d,J=8.0Hz), 6.81(1H,s)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3370, 2930, 1650, 1650, 1600, 1520, 1400, 1280, 1260, 1230, 1130, 1040, 820であった。
【００６５】
＜比較例１＞
合成例１で用いたジヒドロフェルラ酸（化合物１）の代わりにtrans−フェルラ酸を用いて活性エステル化合物を調製し、得られた活性エステル化合物とＬ−ヒスチジンメチルエステル二塩酸塩との反応を実施例５と同様の手順で行ない、化合物１２を得た。
【００６６】
○化合物１２の構造式
【００６７】
【化１３】
2006052152.tif 000014
【００６８】
化合物１２の重クロロホルムと重メタノールの混合溶媒中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、3.08(2H,m), 3.74(3H,s), 3.90(3H,s), 4.80-4.90(1H,m), 6.44(1H,d,J=16.0Hz), 6.81-6.90(2H,m), 7.01-7.12(2H,m), 7.50(1H,s), 7.56(1H,s)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3300, 1740, 1660, 1590, 1510, 1280, 1210, 1130, 980, 820であった。
【００６９】
＜比較例２＞
実施例５で用いた化合物２の代わりに、3−(p−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(和光純薬工業製)を用い、化合物１３を得た。
【００７０】
○化合物１３の構造式
【００７１】
【化１４】
2006052152.tif 000015
【００７２】
化合物１３の重ジメチルスルフィド中で測定した1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、2.32(2H,t,J=8.0Hz), 2.64(2H,t,J=8.0Hz), 2.79-2.95(2H,m), 3.58(3H,s), 4.42-4.53(1H,m), 6.64(2H,d,J=8.8Hz), 6.77(1H,br), 6.95(2H,d,J=8.8Hz), 7.52(1H,br), 8.21(1H,br), 9.12(1H,br), 11.80(1H,br)であった。
また、ＩＲスペクトルで吸収のあった波数（ｃｍ-1）は、3290, 1740, 1660, 1520, 1440, 1370, 1250, 990, 830, 620であった。
【００７３】
＜実施例９＞
抗酸化活性を確認するための試験として、常法である１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨと略記）ラジカルの消去試験を行った。すなわち、上述の実施例で得られた化合物４〜化合物１１、ならびに比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）、化合物１２、化合物１３及びL−ヒスチジンを用いて、ＤＰＰＨラジカルの消去試験を行った。
具体的な試験手順は以下のとおりである。
【００７４】
９６穴プレートの各ウェルに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（８０μｌ）と被験試料（最終濃度５０μg／ｍｌ）のエタノール溶液（２０μｌ）を分注し混合した。ここに８００μＭのＤＰＰＨエタノール溶液（１００μｌ，最終４００μＭ）を添加し良く攪拌した。これを室温、暗所にて２０分間静置した後、５４０ｎｍの吸光度を測定した（試料溶液の吸光度）。
対照として１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（８０μｌ）、エタノール（２０μｌ）及び８００μＭのＤＰＰＨエタノール溶液（１００μｌ）を用いて上記と同様に操作し、吸光度を測定した（対照溶液の吸光度）。
それぞれ化合物について４回同様の測定を行い、その平均値を以下の式に代入し、ＤＰＰＨラジカル消去率を算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝［1−（ａ／ｂ）］×１００
ａ＝試料溶液の吸光度
ｂ＝対照溶液の吸光度
【００７５】
【表１】
2006052152.tif 000016
【００７６】
構造類似の化合物８と化合物１２および化合物１３とを比較した場合、アミド基とフェニル基との間が炭素−炭素二重結合である化合物１２に対して、アミド基とフェニル基との間が飽和炭化水素で結ばれている本発明の化合物８の方が、ラジカル消去率が高いことが分かった。また、フェニル基上にメトキシ基が存在しない化合物１３に比べ、フェニル基上にメトキシ基が存在する本発明の化合物８の方が、ラジカル消去率が高いことが分かった。また、本発明の化合物は、ｄｌ−α−トコフェロールと同等以上のラジカル消去活性を有することがわかった。したがって、本発明の化合物は活性酸素、特にヒドロキシラジカルの消去剤として使用できると考えられる。
【００７７】
＜実施例１０＞
上述の合成例で得られた化合物４〜化合物１１、ならびに比較対照としてｄｌ−α−トコフェロール（東京化成工業製）およびL−ヒスチジン（和光純薬工業製）を用いて、リノール酸における過酸化脂質生成抑制試験を行った。
【００７８】
具体的な試験手順は以下のとおりである。
１）スクリューバイアル（容量５０ｍｌ）に取ったリノール酸（０．２ｇ、東京化成工業
製）、化合物４（０．０１ｇ）、および界面活性剤ニッサンＯＴ−２２１（０．４ｇ、
日本油脂（株）製）にエタノール（２．０ｇ）を添加して溶解させた後、蒸留水
（１７．３９ｇ）を加え攪拌し、密栓をして４０℃の恒温槽に放置した。これを２個調
製した。
化合物５〜化合物１１、ｄｌ−α―トコフェロール、L−ヒスチジンおよび検体無
添加（ブランク）についても同様に行った。
２）試験開始から１０日後、２０日後および３０日後のリノール酸残量をＨＰＬＣにより
定量した。
ＨＰＬＣの分析条件は、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：ｐＨ２．６に調整したＭ
ｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液とメタノールとの混合溶液（１０：９０）、流速：１ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６φｍｍ×１５０ｍｍ）、カラム温度４０℃の
条件にて実施した。
３）ＨＰＬＣでの定量はそれぞれの試料について１回ずつ行い、計２回の測定値の平均値
からリノール酸残存率を算出した。この結果を表２に示した。
【００７９】
【表２】
2006052152.tif 000017
【００８０】
試験の結果、本発明の化合物は、L−ヒスチジンならびに既存の過酸化脂質生成抑制剤であるｄｌ−α−トコフェロール以上の効果を有することがわかった。
【００８１】
＜実施例１１＞
上述で得られた化合物４〜化合物１０、ならびに比較対照としてアルブチン（東京化成工業製）及びL−ヒスチジン（和光純薬工業製）を用いて、Ｌ−ドーパを基質としたチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
【００８２】
具体的な試験手順は以下のとおりである。
はじめに以下の［１］〜［４］溶液をそれぞれ調製した。
［１］リン酸二水素ナトリウム（１．０００ｇ）及びリン酸水素二ナトリウム
（１．１８６ｇ）を蒸留水（５００ｍｌ）に溶解し、リン酸緩衝液を調製した。
［２］L−ＤＯＰＡ（３２．７ｍｇ）を蒸留水（２００ｍｌ）に溶解し、基質溶液を調
製した。
［３］検体のジメチルスルホキシド溶液を、リン酸緩衝液で１０倍に希釈し、試験溶液
を調製した。
［４］マッシュルームチロシナーゼ（３．０ｍｇ，２４００ｕｎｉｔ）を蒸留水
（７．０ｍｌ）に溶解した後、さらにリン酸緩衝液で5倍に希釈しチロシナーゼ溶
液を調製した。
【００８３】
次に、下記の１）及び２）の手順で試験を行った。
１）９６穴プレートの各ウェルにL−ＤＯＰＡ溶液（８０μｌ）および被検試料溶液
（８０μｌ）を分注し混合した。ここにチロシナーゼ溶液（８０μｌ）を加えて、１５
秒間攪拌した。得られた溶液を２５℃で保持し、１分４５秒後および２分４５秒間後の
４９０ nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
２）上記１）の試験操作をそれぞれの検体およびブランク試験（ジメチルスルホキシドの
み）について各４回行い、得られた数値を下記計算式に代入して、その平均値をチロシ
ナーゼ活性阻害率（％）とした。
チロシナーゼ活性阻害率（％）＝［（Ｔ１−Ｔ２）／Ｔ１］×１００
Ｔ１＝ブランク溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
Ｔ２＝試験溶液の２分４５秒間後と１分４５秒後の吸光度の差
【００８４】
本発明の化合物４〜化合物１０、ならびにアルブチン及びL−ヒスチジンをそれぞれ、酵素反応液中に２．００ｍｇ／ｍｌ用いた場合の結果を表３に示した。
【００８５】
【表３】
2006052152.tif 000018
【００８６】
試験の結果、本発明の化合物は、L−ヒスチジンとは異なり、既存のチロシナーゼ活性阻害剤であるアルブチンと同様に、チロシナーゼ阻害活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の一般式（Ａ）で表わされる化合物は、優れた抗酸化活性及びチロシナーゼ阻害活性を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等の分野で、抗酸化剤あるいはチロシナーゼ活性阻害剤として使用することができる。