(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素、及びそれをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又はそれに変異が導入されたアミノ酸配列であってゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それを含有する発現ベクター、その発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物からゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素やカロテノイド類を回収する方法等。【選択図】図１
2006280297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）からなることを特徴とするタンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子が導入されたことを特徴とする微生物。
【請求項５】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物からゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素を回収することを特徴とする、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の製造方法。
【請求項６】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物からカロテノイド類を回収することを特徴とする、カロテノイド類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を用いてゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素を製造する方法、および該遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を用いてアスタキサンチン等のカロテノイド類を製造する方法等に関するものである。なお、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性とは、ファルネシル２リン酸とイソペンテニル２リン酸との縮合反応によりゲラニルゲラニル２リン酸を合成する際の触媒作用をいう。
【背景技術】
【０００２】
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株はアスタキサンチン等のカロテノイドを生産する細菌として知られている（例えば非特許文献１参照）。アスタキサンチンは、動物（フラミンゴ、トキなどの鳥類、ならびにニジマスおよびサケのような魚類）、藻類および微生物等、広範な生物に存在が確認されている。また、アスタキサンチンは酸素ラジカルに対する強力な抗酸化活性を有することが知られており、癌のようないくつかの病気から、生細胞を守るための医療用途に応用することが期待されている。さらに、アスタキサンチンは動物を明瞭な赤燈色に染色し、染色飼料としての産業上の必要性が増加している。
【０００３】
アスタキサンチンの生合成は、イソプレノイド経路から重要な中間体であるファルネシル２リン酸にて分岐する。ファルネシル２リン酸およびイソペンテニル２リン酸はゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素（遺伝子ｃｒｔＥによってコードされるもの）によって縮合され、ゲラニルゲラニル２リン酸が合成される。次いでゲラニルゲラニル２リン酸はフィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンサイクラーゼの連続反応によってβ−カロテンに変換される。細菌においては、さらに、β−カロテンの酸化反応によりアスタキサンチンまで変換される（図１参照）（例えば非特許文献２参照）。
【０００４】
アスタキサンチン等のカロテノイド類は精力的な研究結果、化学合成によってその多くが提供されている。しかしながら、合成過程における副生成物、あるいは残存する有機溶媒の好ましくない副作用などの懸念から、発酵生産による天然物アスタキサンチンの要望が消費市場に広まっている。
【０００５】
発酵生産により天然物を生産するためには菌株の改良が第一に必要である。菌株改良は、一般に、ニトロソグアニジン等の化学処理剤によって行われ、古典的ではあるが多くの成功例がある。しかしながら、化学処理剤により対象とする微生物の遺伝子にランダムに変異を導入し、生産性の向上した菌株を単離することには多大な労力と時間を要する。
【０００６】
一方で、近年、ゲノム解析等による遺伝子情報の蓄積から遺伝子工学的技術による菌株改良も積極的に行われ生産性が向上した例が数多く報告されている。特に注目すべきは、ベリーらの遺伝子ｃｒｔＥを組換え、細菌を宿主としてカロテノイドの一つであるゼアキサンチンの生産性を向上させた例である（例えば特許文献１参照）。上述したように、カロテノイド類は複数の遺伝子によってコードされた各種合成酵素の働きにより合成される。複数の遺伝子をどの様に組換えるかは多数の組み合わせが存在し多大な労力を必要とする。肝心なことは生合成系の鍵となる酵素を特定し、該酵素をコードする遺伝子を集中的に組み換えることである。カロテノイドについては遺伝子ｃｒｔＥによってコードされているゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素が鍵酵素の一つであるとされている（例えば特許文献１参照）。
【０００７】
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株についてはアスタキサンチン合成系遺伝子の解明が行われ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢの各遺伝子配列が既知である（例えば非特許文献３参照）。しかしながら、鍵酵素の一つと想定される遺伝子ｃｒｔＥの配列が未知である。つまり、代謝工学、遺伝子組換え等の技術によりカロテノイド類を高度に生産する微生物を効率良く作製する際にはその知見を利用することができなかった。
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５２７２６５号公報
【非特許文献１】Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｉｚｕｍｉｄａ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｋｉ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ａｎｄ  ４−ｋｅｔｏｚｅａｘａｎｔｈｉｎ  ｂｙ  ｍａｒｉｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｍｅ．，  ５８：  １８４２−１８４４（１９９４）．
【非特許文献２】Ｐａｕｌ  Ｄ．  Ｆｒａｓｅｒ，  Ｙｕｔａｋａ  Ｍｉｕｒａ，  ａｎｄ  Ｎｏｒｉｈｉｋｏ  Ｍｉｓａｗａ，  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：  ６１２８−６１３５（１９９７）．
【非特許文献３】Ｎｏｒｉｈｉｋｏ  Ｍｉｓａｗａ，  Ｙｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｓａｔｏｍｉ，  Ｋｅｉｊｉ  Ｋｏｎｄｏ，  Ａｋｉｈｉｒｏ  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓｕｓｕｍｕ  Ｋａｊｉｗａｒａ，  Ｔｏｓｈｉｋｏ  Ｓａｉｔｏ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｏｈｔａｎｉ，  ａｎｄ  Ｗａｔａｒｕ  Ｍｉｋｉ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍａｒｉｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｌｅｖｅｌ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７７：  ６５７５−６５８４（１９９５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、カロテノイド類等の有用物質の生産、及び有用物質生産の実用化研究に役立つ新規なゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子を提供することにある。さらに、本発明は、遺伝子工学的手法により、該遺伝子によってコードされるゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素を生産する方法、及び組換えられた該遺伝子から構成される宿主生物を利用して有用物質を生産、提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株から単離された核酸断片が、新規なゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）からなることを特徴とするタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【００１２】
また本発明は、上述のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子である。さらに本発明は、上述の遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクターである。また本発明は、上述の遺伝子が導入されたことを特徴とする微生物である。さらに本発明は、上述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物からゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素を回収することを特徴とする、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の製造方法である。また本発明は、上述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物からカロテノイド類を回収することを特徴とする、カロテノイド類の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
１．ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素及びそれをコードする遺伝子
本発明によるゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素は、以下の（ａ）又は（ｂ）からなるタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【００１４】
（ａ）のタンパク質は、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株に存在するゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するタンパク質である。
【００１５】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を失わせない程度のアミノ酸が欠失、置換、又は付加された、即ち変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０，  ６４８７−６５００，  １９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内である。
【００１６】
上述の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の情報に基づき、一般的な工学的手法により製造することができる。例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型とし、配列番号１記載のアミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行うことにより、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子を得ることができる。またプライマーには、配列番号１２及び１３に記載された塩基配列の一部又は全部を用いることもできる。プライマーの長さは特に限定されないが、通常１０塩基以上であり、好ましくは１６〜５０塩基であり、更に好ましくは２０〜３０塩基である。
【００１７】
核酸増幅の手法についても、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子は、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株のＤＮＡ又はｍＲＮＡより作成されたＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから得ることもできる。ライブラリーの作製は、市販のライブラリー作製キット等を使用した一般的な方法により行うことができる。
【００１９】
ライブラリー作製にあたってはＰＣＲを利用したゲノムウォーキング法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８，  ｅ５５）が簡便であり、作製にあたっての労力を少なくすることができる。
【００２０】
ライブラリーから本発明の遺伝子を単離するためのスクリーニング方法は、特に限定されず、従来知られた公知の方法によって行うことができる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づいてプローブを作製し、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションを行うことによって、本発明の遺伝子を含有するクローンを選択することができる。また本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫化学的スクリーニングによっても、本発明の遺伝子を含有するクローンを選択することが可能である。本発明の遺伝子は、上記のスクリーニング法によって選択されたクローンからＤＮＡを抽出することによって得ることができる。
【００２１】
なお、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株は、ＭＢＩＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｊｐ）より入手することができる。
【００２２】
上記のような方法によって得られたＤＮＡ断片は、公知の方法に従って塩基配列を決定し、本発明の遺伝子であることを確認する。塩基配列決定方法としては、例えば、チェーンターミネーター法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７４，  ５４６３−５４６７  （１９７７））、マキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５，  ４９９  （１９８０））等が挙げられるが、市販のシークエンスキットを利用すれば簡便に行うことができる。
【００２３】
２．ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の製造法
本発明のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素は、上述の（ａ）又は（ｂ）からなるタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培養することによって得ることができる。発現ベクターの作製及び宿主細胞への導入は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２４】
宿主細胞には、原核生物及び真核生物のいずれの細胞も用いることができる。例えば、原核生物の宿主細胞として一般的に用いられるものとしては、大腸菌や枯草菌等が挙げられる。また真核生物の細胞としては、例えば、酵母細胞等を挙げることができる。ただし、本発明に用いられる宿主細胞は、これらに限定されるものではない。
【００２５】
発現ベクターは、１．に記載のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子を含有するものであり、その上流に遺伝子の発現を制御する配列を有していることが望ましい。更には、宿主細胞での複製を可能にする複製開始点を含んでいることが望ましい。遺伝子の発現を制御する配列としては、原核生物の場合、プロモーター、ＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）等が挙げられる。プロモーターは、原核生物の細胞内で機能するものであれば、どんなものでもよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合には、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、たとえば、酵母を宿主細胞とする場合には、ＡＤＨ１プロモーター、ｈＣＭＶプロモーター等を挙げることができるが、宿主細胞内で機能するものであれば、どのようなものでも用いることができる。
【００２６】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、公知の方法で行うことができ、たとえば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、接合伝達法等が挙げられる。
【００２７】
ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の製造は、発現ベクターを導入した宿主細胞を、宿主細胞が生育可能でかつゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の誘導を可能とするような培地で培養することによって行う。この際、培養は液体培養で行うことが望ましい。この培養物からゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素を回収することができる。例えば培養した細胞を遠心分離等により回収し、細胞を破砕して粗抽出液を作製する。粗抽出液の作製には、超音波破砕、フレンチプレス等の物理的な方法によって細胞を破砕する方法の他、市販のタンパク質抽出試薬等も用いることができる。
【００２８】
粗抽出液からのゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の精製は、一般的なタンパク質精製法により、行うことができる。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法やこれらと塩析、限外ろ過、透析等を組み合わせた方法が挙げられる。このような精製法の例としては、次のようなものが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーでゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の活性画分を回収した後、限外ろ過処理によって活性画分を濃縮し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを行って活性画分を回収する。この方法により、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で単一のバンドとなるまで精製することができる。ただし、本発明の精製方法はこれに限定されるものではない。
【００２９】
なお、本発明のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の分子量は約３０ＫＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であり、精製されたタンパク質が本発明のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素であるかどうかは、分子量とゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性の有無によって確認することができる。ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の活性測定は、ゲラニルゲラニル２リン酸の代謝物を定量することにより行うことができる。
【００３０】
３．カロテノイド類の製造方法
本発明のカロテノイド類の製造に用いられる宿主細胞としては、カロテノイド類を産生しうる微生物であればそのまま用いることができるが、カロテノイド類を産生しない微生物の場合は、カロテノイド類を産生するのに必要な遺伝子を導入して用いればよい。一般に、イソプレノイド類は生命活動に必須であり、多くの微生物はイソプレノイド類を合成する酵素遺伝子を保有している。したがって、本発明のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子の他に、既知のカロテノイド類の合成酵素をコードする遺伝子を導入して用いればよい。複数の遺伝子を導入する際は、適当なプラスミドベクターを選択すれば良い。あるいは、同一のプラスミドベクターに各酵素をコードする領域を遺伝子工学技術によりそれぞれ発現するように組換えて用いても良い。カロテノイド類を産生しうる微生物においては、各種合成遺伝子が染色体にコードされているので、鍵酵素であるゲラニルゲラニル２リン合成酵素遺伝子が挿入された発現ベクターを導入するだけでカロテノイド類の合成活性が向上する。
【００３１】
カロテノイド類を産生しうる微生物としては、例えばＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ属、Ｃｈｏｎｄｒａｍｙｃｅｓ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｒｃｉｎａ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等の真正細菌、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等の古細菌、他に各種真菌類等を挙げることができる。
【００３２】
発現ベクターとしては例えば大腸菌発現ベクター、枯草菌発現ベクター、酵母発現ベクター等を挙げることができる。さらには、ｐＢＢＲ、ｐＳＦＵ、ｐＲＫなどの広宿主域ベクターを用いることもできる。これらのプラスミドベクターにより形質転換された宿主細胞を用いて、適当な培養培地を使用することにより、各種カロテノイド類を細胞内に蓄積させることができる。このカロテノイド類を回収するためには、例えば培養液からカロテノイド類を蓄積した微生物を集菌し、適当な有機溶媒により抽出すればよい。有機溶媒はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。好適にはアセトンである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、ゲラニルゲラニル２リン酸の合成反応を触媒する新規なゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素および該酵素をコードする遺伝子配列が提供される。ゲラニルゲラニル２リン酸は様々な生理活性を有するカロテノイド類の原料等に利用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］カロテノイド合成酵素遺伝子断片のクローニング
カロテノイド産生細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株をＭＢＧ培地（３．７４％マリンブロス；Ｄｉｆｃｏ社製、１％グルコース）で２５℃、１８時間培養後、Ｐｕｒｅｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出、調製した。次いで、調製したＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩを用いて完全に消化した。反応液は４０μＬのＤＮＡ（約５０μｇ／ｍｌ）、８μＬの制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ、添付緩衝液６μＬ、水６μＬからなる。３７℃、１８時間反応後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液３０μＬに溶解した。このＤＮＡに対してゲノムウォーキング法を利用することにより、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡをクローニングした。具体的にはＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いた。まず、５μＬの消化ＤＮＡに対して、キット中のＳａｕ３ＡＩカセット（１０倍希釈）２．５μＬ、Ｓｏｌ  Ｉ溶液１５μＬ、Ｓｏｌ  ＩＩ溶液７．５μＬを添加し１６℃、２時間反応させた。反応後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液５μＬに溶解した。
【００３６】
この溶液を用いて第一段階のＰＣＲ反応を行った。反応は、まず、ＤＮＡ溶液１μＬに対して、１３．５μＬの水、２×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ社製）２５μＬを添加し、９４℃、１０分でＤＮＡを変性させた。この溶液に、２ｍＭ  ｄＮＴＰを８μＬ、ＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を０．５μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬの配列番号３のＧＷＰ１プライマー（カロテノイド合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＢにハイブリダイズするもの）を１μＬ、キット中の配列番号４のＰｒｉｍｅｒＣ１プライマーを１μＬを添加した。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４分を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。
【００３７】
次いで、第二段階のＰＣＲ反応をおこなった。第一段階と同様に、テンプレートＤＮＡである第一段階のＰＣＲ反応液１μＬに対して、水１３．５μＬ、２×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ社製）２５μＬを添加し、９４℃、１０分でＤＮＡを変性させた。この溶液に、２ｍＭ  ｄＮＴＰを８μＬ、ＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を０．５μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬの配列番号５のＧＷＰ２プライマー（カロテノイド合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＢにハイブリダイズするもの）を１μＬ、キット中の配列番号６のＰｒｉｍｅｒＣ２プライマーを１μＬ添加した。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４分を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。ＰＣＲ産物の増幅確認は０．９％のアガロース電気泳動により行い、約５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅されたことを確認した。
【００３８】
このＤＮＡフラグメントをＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いてアガロースから調整後、ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて増幅ＤＮＡフラグメントをｐＣＲ２．１ベクターに導入し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を３０℃で形質転換した。任意の形質転換株を数個選択し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地で培養後、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを調製し、上記の約５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントがインサートされたプラスミド（ｐＣＲＣＲＴＥ）を得た。これを次の配列解析に供した。
【００３９】
［実施例２］カロテノイド合成酵素遺伝子断片の配列解析
実施例１で得られたｐＣＲＣＲＴＥベクターを用いて、カロテノイド合成酵素遺伝子断片のＤＮＡ塩基配列を決定した。塩基配列は、まず、配列番号７のプライマーおよび配列番号３のプライマーをそれぞれ使用し、テェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｉｔｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動シークエンサー  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより開始した。次いで、判明した配列を基にして、配列番号８のプライマー、配列番号９のプライマー、配列番号１０のプライマー、及び配列番号１１のプライマーを用いて順次解析した。
【００４０】
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３からクローニングしたゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４１】
［実施例３］ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素遺伝子の発現
実施例２で解析した配列を基にしてプライマーを設計し、ＰＣＲによりゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを増幅した。設計したプライマーは配列番号１２のＣＲＴＥＦ２および配列番号１３のＣＲＴＥＲ２である。それぞれ、５’側に制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの配列を有する。ＰＣＲは、まず、ＤＮＡ溶液１μＬ（実施例１で調製したＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＭＢＩＣ１１４３株のゲノムＤＮＡ）に対して、１３．５μＬの水、２×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ社製）２５μＬを添加し、９４℃、１０分でＤＮＡを変性させた。この溶液に、２ｍＭ  ｄＮＴＰを８μＬ、ＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を０．５μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬのＣＲＴＥＦ２プライマー（配列番号１２）およびＣＲＴＥＲ２プライマー（配列番号１３）をそれぞれ１μＬ添加した。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。終了後、反応液を０．９％アガロース電気泳動により確認したところ、設計通りのＤＮＡが増幅された。
【００４２】
得られたＰＣＲ産物をフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによる消化を行った。並行して、発現ベクターｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）も制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩにより消化した。得られた消化物をフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿によりそれぞれ精製し、ライゲーション反応を行った。ライゲーションはインサート側である消化ＰＣＲ産物１０μＬ、ベクター側の消化ｐＳＴＶ２８を１μＬ、次いでＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）１１μＬ添加し、反応させた（１６℃、２．０時間）。
【００４３】
この反応液を用いて、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含むＬＢ寒天培地で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。任意の形質転換株を選択し、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含むＬＢ培地で培養後、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが導入されたプラスミドベクター（ｐＳＣＲＴＥ）のコンストラクトを得た。その構造を図２に示す。
【００４４】
［実施例４］微生物によるアスタキサンチンの生産
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３株のｃｒｔＷ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢからなるカロテノイド合成遺伝子クラスターを三沢らの方法（非特許文献１）に従ってｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩサイトに挿入したコンストラクトを作製し、ｐＡＫ３２とした。このｐＡＫ３２と上記のｐＳＣＲＴＥを用いて、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含むＬＢ寒天培地を用いてヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換株を上記のＬＢ液体培地で３０℃、１８時間培養した。培養後、遠心操作により集菌し、さらに、アセトンによりカロテノイド類を抽出・定量した。
【００４５】
カロテノイドの定量は逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定し、以下の操作手順で行なった。すなわち培養液の一部を遠心分離して菌体を回収し、適量の純水を加えチューブミキサーにて１０分間懸濁させた。次いで純水に対して９倍量のアセトンを加えてチューブミキサーにて３０分間攪拌後、１４，０００回転５分間遠心分離を行ない上清を回収しＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣカラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０（東ソー社製）を使用し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、４７０ｎｍの検出波長で測定した。結果を図３に示す。図３の通り、ｐＳＣＲＴＥとｐＡＫ３２の組合わせにより形質転換された株はアスタキサンチンが有意に産生された。また、クローニングしたＤＮＡはゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素をコードすることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】カロテノイドの生合成経路を示す図である。
【図２】実施例３で得られたプラスミドベクターｐＳＣＲＴＥの構造を示す図である。
【図３】実施例４で得られた形質転換株抽出液のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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