(57)【要約】【目的】アルブミン凝集体及び/または不純蛋白質が低減された血清アルブミン製剤の製造方法を提供する。【構成】血清アルブミン含有水溶液を、好適には１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜で除去する工程に付すことからなる。これにより、アルブミン凝集体及び/または不純蛋白質が低減されたより安全性、安定性に優れたアルブミン製剤を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をウイルス除去膜に通液させることを特徴とする、アルブミン凝集体及び/または
不純物の除去方法。
【請求項２】
ウイルス除去膜が１０〜２０ｎｍの孔径を有するものである請求項１記載のアルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のアルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法を含んでなる、アルブミン製剤の製造方法。
【請求項４】
アルブミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をウイルス除去膜に通液させる工程が、ウイルス不活性化を目的とする溶液の加熱処理工程の後に実施されるものである、請求項３記載のアルブミン製剤の製造方法。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載のアルブミン製剤の製造方法によって製造される、アルブミン凝集体及び／または不純物が低減されたアルブミン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には、血漿分画製剤の一種である血清アルブミン製剤の製造方法及び当該方法で得られた製剤に関する。さらに詳細には、アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法、製造工程中に前記アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法を含んでなるアルブミン製剤の製造方法、並びに当該製造方法によって製造されるアルブミン製剤に関する。本願発明により工業的規模での高い収率を維持したアルブミン製剤の製造方法並びにアルブミン凝集体及び/または不純物が低減されたアルブミン製剤が提供される。
【０００２】
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】
アルブミンは分子量６.９万の蛋白質で、５８５個のアミノ酸からなる楕円状の分子である。血清アルブミンは全蛋白質中の約６割を占める血漿中に最も多く含まれる蛋白質であって、生体内では肝臓で合成される。そして、血液中で血漿膠質浸透圧の維持、毒物の中和や酸塩基平衡の維持に関与しており、また多くの薬物や化合物と非特異的に結合し、それらを運搬する役割を担う。
上記アルブミンを製剤化したアルブミン製剤は、火傷、ネフローゼ症候群等によるアルブミン喪失およびアルブミン合成能低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。
アルブミン製剤（加熱人血漿蛋白を含む）は、蛋白質濃度が４.４〜２５％（アルブミン含量が８０％以上もしくは９６％以上）という高濃度の蛋白質製剤である。また、製剤１本あたりの容量も２０〜２５０ｍＬと大量であり、その製造においては大量かつ大容量の蛋白質を処理することが求められる。
【０００３】
アルブミン製剤はその製造工程において、アルコール分画では高い濃度のアルコールに曝され、またウイルス不活化を目的とした６０℃１０時間の液状加熱が施された製剤であり、そのウイルスに対する安全性は５０年来の臨床使用により実証されている。一方、これらアルコール分画及び加熱処理を経ることで、アルブミン製剤中には、アルブミンの凝集体が形成される。アルブミン製剤中に存在するアルブミン凝集体形成の原因としては、▲１▼アルコール分画時のアルコールとの接触、▲２▼加熱処理によるアルブミン自身の凝集、▲３▼加熱処理におけるアルブミンと不純蛋白質との相互作用による凝集等が挙げられる。この凝集体が製剤の安全性に影響を及ぼす直接的な知見はないが、元来生体中に存在していない蛋白質の変性物であることから、製剤中に含有されていないことが望ましい。
【０００４】
従来の技術においては、一般に、ヒト血清アルブミンの精製方法としては、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等が用いられる。さらに製造工程の最終段階ではウイルス不活化を目的とした液状加熱処理が汎用されている。このような方法で製造される市販のアルブミン製剤は、製剤中にゲル濾過分析で全蛋白質中の２〜１０％の凝集体が存在することが知られている。また、アルブミン以外の不純蛋白質も全蛋白質中で１〜４％存在していることが知られている。
ヒト血清アルブミンの凝集体は、上記の液状加熱処理により共在する熱に不安定な不純蛋白質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられている（非特許文献１、非特許文献２を参照）。当該凝集体は、単量体が２分子或いはそれ以上結合して形成されるものであって、等電点や化学的性状が単量体と非常に似通っており、通常生産で行われる精製方法では、分離が困難である。そのため、従来の技術ではゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点分画処理、硫安分画処理、エタノール分画処理など数種類の精製方法を組み合わせて除去されてきた（特許文献１を参照)。不純蛋白質は、原料由来の蛋白質としてハプトグロビン、トランスフェリンやヘモペキシン等の他の蛋白質が夾雑蛋白質として含まれており、これら多くの精製工程を経てもなお、最終製剤中に数％残存し、不純蛋白質を極力低減することが製造上の重要な課題となっている。
精製方法を複数組み合わせると、回収率の低下と共に生産性の低下を招く場合が多い。工業的観点から、なるべく精製工程を少なくして凝集体及び不純蛋白質を効率的に除去し、かつアルブミンの単量体は高収率で回収できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】
特表平１１-５０９５２５（特許第２９２６７２２号）
【非特許文献１】
Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒａｐｉｅ，１６，１６０，１６０−１６４（１９８９）
【非特許文献２】
Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．６７，１２５−１３１（１９９４）
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の構成】
本願発明は、薬液中のウイルス等病原体の除去を目的として使用されているウイルス除去膜による濾過をアルブミン製剤の製造工程において行うことで、製剤中の凝集体含量を低減できることを見出し、完成したものである。即ち、本願発明はアルブミン製剤中の凝集体含量を低減させる方法及び凝集体含量の低いアルブミン製剤を提供することを目的とする。
アルコール分画及び加熱処理を経て得られたアルブミン製剤中の凝集体は、▲１▼アルコール分画において生じたアルブミンの凝集体、▲２▼加熱処理において生じたアルブミンの凝集体、及び▲３▼加熱処理においてアルブミンと不純蛋白とが相互作用して生じた凝集体に大別され、従って、アルブミン製剤の凝集体を低減・除去する方法としては、加熱処理前に▲１▼アルブミンの凝集体を低減・除去すること、▲２▼アルブミンと加熱中に相互作用して凝集体となる不純蛋白質を予め低減・除去すること、及び▲３▼加熱処理後に生じた全ての凝集体を低減・除去することが考察された。本願発明者らは、上記状況を鑑みて鋭意研究を進めた結果、凝集体及び不純蛋白質を含有するアルブミン水溶液をウイルス除去膜、好ましくは１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜を用いて濾過することで、アルブミンの凝集体及び/または分子量約７〜３０万以上の不純蛋白質の除去効果が得られることを見出し、本願発明を完成するに至った。
さらに、本願発明では対象物質の分子サイズの相違による除去という原理に基づいた濾過工程のみで凝集体と不純蛋白質の低減と除去が可能なことから、薬液の組成を変化させることなく、これまでより高収率でアルブミン単量体を得ることができ、これにより、より安全性・安定性に優れた製剤を提供することが可能となった。
【０００７】
上記の課題を解決すべくなされた、本願発明のアルブミン製剤は、製造方法において、ヒト血清アルブミン含有水溶液を、該水溶液中に含まれるアルブミン凝集体及び/または不純蛋白質をウイルス除去膜で除去する工程に付すことを特徴とする。
本願発明で用いられるアルブミン凝集体及不純蛋白質を除去するウイルス除去膜としては、１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜が好ましい。この用件を満たすウイルス除去膜であれば特段の制約はないが、例えば、プラノバ１５Ｎ（旭化成）、ウルチポアＶＦ-ＤＶ２０（ポール）、バイアソルブ（ミリポア）等の製品名で市販されている除去膜は好適な例として挙げられる。
本願発明に係る製剤の主成分であるアルブミンの由来には、特に制限がなく具体的には哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウサギ等に由来するもの、また、遺伝子組換え技術に基づく培養細胞に由来するもの等が挙げられ、特にヒト由来のものは実用的であり、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分等が例示される。
本願発明のアルブミン製剤の製造方法は、上記アルブミンを含有する水溶液をウイルス除去膜に濾過し、アルブミン凝集体及不純蛋白質を除去する工程を含むものであれば、すべてを包含する。すなわち、どの段階で当該工程が含まれようとも本願発明の技術思想から外れるものではない。例えば、ウイルス不活化を目的とする加熱処理以前に本願の濾過工程を実施することにより、すでに形成されたアルブミン凝集体または加熱処理の工程中にアルブミンとの相互作用によりアルブミン凝集体を形成させる夾雑蛋白質を除去することができ、当該濾過工程を加熱処理後に行えば、加熱によって生じる全ての凝集体を低減・除去することが可能となる。
また、必要に応じてウイルス除去膜濾過前にアルブミンを含有する水溶液を陰イオン交換体や除去サイズが３５〜２００ｎｍのプレフィルターに供してアルブミンの凝集体及不純蛋白質の低減・除去を前処理として実施することも、本願発明の効果を助長する好ましい実施態様である。
【０００８】
【発明の効果】
本願発明の製造方法によれば、ウイルス除去膜により混入が危惧されるウイルスを除去すると共に加熱処理での凝集体形成因子である不純蛋白質を低減化することができるため、凝集体及び不純蛋白質含量の少ないアルブミン製剤を得ることができる。従って、本願発明により得られたアルブミン製剤は、加熱処理でウイルスが不活化されていると共にウイルス除去膜でウイルスが除去され、凝集体及不純蛋白質が低減化された、より安全性、安定性に優れた製剤である。
【０００９】
以下に、調製例、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
調製例
（アルブミン製剤の調製）
▲１▼アルブミン含有水溶液の調製
コーン氏のアルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペーストに、注射用水（日局）をペースト重量の２倍以上加え撹拌溶解し、限外濾過法により脱アルコールしたアルブミン画分を、ｐＨ４〜５（好ましくは４.４〜４.６）、ＥＣ５ｍＳ/ｃｍ以下（好ましくは１.５ｍＳ/ｃｍ以下）、蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは８〜１２ｗ/ｖ％）に調整した。
【００１１】
▲２▼イオン交換体による前処理の方法
ｐＨ４〜５（好ましくは４.４〜４.６）、ＥＣ５ｍＳ/ｃｍ以下（好ましくは１.５ｍＳ/ｃｍ以下）の酢酸バッファーで平衡化した陰イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ-セファロース（アマシャム・ファルマシア）、Ｑ-セファロース（アマシャム・ファルマシア）、ＤＥＡＥ-トヨパール（東ソー）、ＱＡＥ-トヨパール（東ソー））に、前記▲１▼で調製されたアルブミン含有水溶液を展開し、素通り画分を回収した。
【００１２】
▲３▼フィルターによる前処理の方法
３５〜２００ｎｍのサイズ排除が可能なフィルターを用いて、蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ/ｖ％）、ｐＨ６〜７.５（好ましくは６.６〜７.２）に調整されたアルブミン含有水溶液を濾過し、回収した。
【００１３】
▲４▼本願発明の処理：ウイルス除去膜への通液
プラノバ１５Ｎ（旭化成）に蛋白濃度５〜１５ｗ/ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ/ｖ％）、ｐＨ６〜７.５（好ましくは６.６〜７.２）に調整されたアルブミン含有水溶液を通液し、回収した。
【００１４】
▲５▼バルク調製
蛋白濃度を５〜３０ｗ/ｖ％（通常５または２０〜２５ｗ/ｖ％）になるように調整した。この際、蛋白の濃縮が必要な場合には限外濾過法を用いた。蛋白１ｇ当り、アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムをそれぞれ０.０８ｍｍｏｌとなるように加え、溶液ｐＨを６.９±０.５とし、これを孔径０.２２μｍ以下の濾過膜を用いて除菌濾過して最終バルクとした。
【００１５】
▲６▼加熱処理及び小分け分注
最終バルクを６０.０±０.５℃で１０時間以上加熱したものを、所定量ずつバイアルに無菌的に分注して、密栓した。
【００１６】
実施例１
（凝集体の除去、低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認）
本願発明による凝集体の除去、低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認をするために、ｉ）調製例の▲１▼により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白濃度８ｗ/ｖ％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ/ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６.９８に調整したアルブミン溶液と、ii)このアルブミン溶液を本願発明のウイルス除去膜（プラノバ１５Ｎ、旭化成）に０.５ｋｇｆ/ｃｍ2の定圧濾過を実施した後のアルブミン溶液をそれぞれ単量体・重合体含量試験（日本薬局方、一般試験法、液体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析)により測定した。蛋白濃度を乗じて含量を求めた結果を表１に示す。表１から明らかなように、ウイルス除去膜によって凝集体の除去及び低減化効果が判明し、さらにアルブミン単量体の回収率も９９％以上で高効率に凝集体の除去効果が得られることが判明した。
【００１７】
【表１】
ウイルス除去膜濾過前後による凝集体の除去効果とアルブミン単量体の回収率
2006182649.tif 000002
【００１８】
実施例２
（除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果の確認）
本願発明のウイルス除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果を確認するために、ｉ）調製例の▲１▼により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白濃度８ｗ/ｖ％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ/ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６.９８に調整したアルブミン溶液と、ii)このアルブミン溶液を本願発明のウイルス除去膜（プラノバ１５Ｎ、旭化成）に０.５ｋｇｆ/ｃｍ2の定圧濾過を実施した後のアルブミン溶液を、それぞれゲル内沈降反応試験を実施した結果を表２に示す。表２から明らかなようにウイルス除去膜濾過によりセルロプラスミン、トランスフェリンの除去効果が判明した。さらに、ハプトグロビン、ヘモペキシンの低減化効果が判明した。
【００１９】
【表２】
ウイルス除去膜濾過による主な血漿蛋白質の除去及び低減化(ゲル内沈降反応試験)
2006182649.tif 000003
―：未検出
【００２０】
実施例３
（加熱処理後の製剤中の凝集体含量を低減する効果の確認）
ウイルス除去膜により凝集体及び不純蛋白質を除去及び低減化し、加熱処理後の製剤中の凝集体含量を低減する効果を確認するために、ｉ）本願発明の調製例▲１▼〜▲４▼により得られたアルブミン溶液を、分画分子量１０００〜３万の限外濾過法により脱塩し、蛋白濃度を２５ｗ/ｖ％に濃縮した。さらに、Ｎ-アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムをそれぞれ蛋白１ｇに対し０.０８ｍｍｏｌ加え、６０℃、１０時間以上加熱処理を行い、分注したアルブミン製剤（ウイルス除去膜処理実施）と、ii）比較例として調製例▲１▼〜▲３▼により得られたアルブミン溶液を分画分子量１０００〜３万の限外濾過法により脱塩し、蛋白濃度を２５ｗ/ｖ％に濃縮し、さらに、Ｎ-アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムをそれぞれ蛋白１ｇに対し０.０８ｍｍｏｌ加え、６０℃、１０時間以上加熱処理を行い、分注したアルブミン製剤（ウイルス除去膜処理未実施）をそれぞれ単量体・重合体含量試験(日本薬局方、一般試験法、液体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析)により測定した。その結果を表３に示す。表３から明らかなようにウイルス除去膜処理未実施の比較製剤に比べ、本願発明のウイルス除去膜濾過を行ったアルブミン製剤は二量体及び多量体の含量が低く、凝集体形成抑制効果があることが判明した。
【００２１】
【表３】
ウイルス除去膜濾過によるアルブミン製剤の凝集体の抑制効果
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