(57)【要約】【課題】  生体に対する安全性が高く、標的細胞への核酸のトランスフェクション能の向上した新しい技術を提供する。【解決手段】  細胞膜透過性官能基（例えば、ガラクトース、グルコースなど）と脂質膜撹乱性官能基（例えば、ポリエチレングリコール、シクロデキストリンなど）とを併有するβ−１，３−グルカン、または、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤またはアルカリ性溶剤に溶解した後、前記被導入核酸と水の存在下に混合することによって該核酸とβ−１，３−グルカンとから成る複合体を形成させ、この複合体を標的細胞に投与することを特徴とする方法。【選択図】  図１１
2006069913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に核酸を導入する方法であって、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカン、または、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤またはアルカリ性溶剤に溶解した後、前記被導入核酸と水の存在下に混合することによって該核酸とβ−１，３−グルカンとから成る複合体を形成させ、この複合体を標的細胞に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞膜透過性官能基として、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、グルコース、フコースおよびシアル酸より選ばれる単糖またはオリゴ糖の残基を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞膜透過性官能基として、ＲＧＤペプチド、コレステロール、トランスフェリン、または葉酸の残基を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項４】
細胞膜透過性官能基として、オリゴアルギニン、Ｔａｔペプチド、ＲｅｖペプチドまたはＡｎｔペプチドの残基を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項５】
脂質膜撹乱性官能基として、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、またはカルボン酸の残基を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンとして細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とが連結しているものを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコール残基に単糖またはオリゴ糖の残基が連結しているβ−１，３−グルカンを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シクロデキストリン残基に包接される疎水性ゲスト分子を介して該シクロデキストリン残基と単糖またはオリゴ糖の残基が連結しているβ−１，３−グルカンを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞膜透過性官能基および／または細胞撹乱性官能基を２種類以上有するβ−１，３−グルカンを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被導入核酸が、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＣｐＧ  ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンから選ばれたβ−１，３−グルカンを原料として用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
β−１，３−グルカンの２本鎖と被導入核酸の１本鎖とから成る複合体であって、β−１，３−グルカンの２本鎖のうちの１本が細胞膜透過性官能基を有し且つ他の１本が脂質膜撹乱性官能基を有するか、または、同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体から構成されることを特徴とする標的細胞に核酸を導入するための多糖系キャリアー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェクション能が高く、かつ生体に安全な、多糖系の新規なキャリアーを用いる核酸類の細胞への導入法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。この療法に基づき既に開発段階に入っている医薬品の候補は、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐の疾病に対するものとなっている。
【０００３】
アンチセンス療法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡを医薬として使用する場合、配列特異性の他にヌクレアーゼに耐性があること、無毒性で、製造コストが安価であること、標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること、細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること、高い特異性と透過性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること、そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなど多くの課題がある。
【０００４】
それらの課題の中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡの細胞内への導入効率を上げることは重要な課題であり、一般に、その解決のために遺伝子キャリアーが併用されている。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因として、これらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用は制限されている。
【非特許文献１】Mulligan, Science, 260,926-932（1993)
【非特許文献２】Miller, Nature, 357,455-460（1992）
【非特許文献３】Crystal, Science, 270,404-410（1995）
【非特許文献４】K. Nishikura, Cell (4), 107,415-418（2001）
【０００５】
近年、非ウイルス性の人工キャリアーとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＥＩと同様に窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリアー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、多数特許出願されている。
【０００６】
しかしながら、ＰＥＩのようなアミノ基を有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性も考えられる。事実、今まで検討されたカチオン性ポリマーは未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献５】医薬品添加物辞典
【非特許文献６】日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社
【０００７】
一方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β-1,3-グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献７】Theresa M. McIntire and David A.Brant, J. Am. Chem. Soc., 120, 6909（1998）
【０００８】
この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約20年の使用実績がある。
【非特許文献８】清水、陳、荷見、増淵、Biotherapy, 4, 1390（1990)
【非特許文献９】長谷川、Oncology and Chemotherapy, 8, 225（1992）
【０００９】
このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲートを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲートを製造する方法が述ベられている。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４８００
【００１０】
また、最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカンまたはβ−１，３−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、アンチセンスヌクレオチドや免疫刺激性核酸（ＣｐＧ  ＤＮＡ）など各種の核酸と新しいタイプの複合体を形成することが見出された。そして、複合体の化学量論比を検討した際、核酸１分子に対してβ−１，３−グルカン２分子で複合体を構成していることが発見された。
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５
【特許文献３】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６７９３
【非特許文献１０】櫻井、新海、J. Am. Chem. Soc., 122,4520（2000）
【非特許文献１１】木村、甲元、櫻井、新海、Chem. Lett., 1242（2000）
【非特許文献１２】水、甲元、穴田、松本、沼田、新海、長 崎、櫻井、J. Am.Soc. Chem., 126, 8372 (2004)
【００１１】
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、水素結合および疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【非特許文献１３】櫻井和朗、井口律子、木村太郎、甲元一也、水雅美、新海征治、Polym.Preprints Jpn., 49, 4054（2000)
【００１２】
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、ケースによってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている。さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜との透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされた。
【特許文献４】ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８
【００１３】
さらに、細胞内へのトランスフェクション効率を高める手段として、最近は、標的細胞への特異的な透過性を活用する方法の研究が盛んである。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白にインテグリンがあり、そのインテグリン結合に有効と認められているペプチドとしてＲＧＤ配列が知られている。そして、ＲＧＤを含む配列のペプチドを、既知のカチオン性キャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、特許に例示されている。
【特許文献５】特表２００２−５０２２４３
【特許文献６】特願２００３−５２５０８
【００１４】
同様に、細胞の表面に存在する糖レセプターを特異的に認識することを活用するトランスフェクションの方法も研究されている。例えば、肝細胞に代表されるガラクトース受容体をもつ細胞に対して、特異的に透過性を有するガラクトースまたはガラクトースを構成成分として含むラクトースで修飾された脂質、ペプチド等の遺伝子キャリアーが、肝臓癌のアンチセンスＤＮＡ治療薬のキャリアーとして特許出願されている。また、本発明者らにより、ガラクトースを結合させたβ−１，３−グルカンを用いた肝細胞ターゲッティング製剤について特許出願している。ガラクトースおよびラクトース以外にも、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノ-ス、グルコース、フコースおよびシアル酸などが細胞表面の各種レセプターを認識する糖として知られている。
【特許文献７】特開平９−２３５２９２
【特許文献８】特開平１１−２９００７３
【特許文献９】特表２００２−５１５４１８
【特許文献１０】特表２００２−５３８１７４
【特許文献１１】特願２００３−３９６５８５
【００１５】
コレステロールも細胞表層に存在するレセプターを介して細胞内に取り込まれる化合物として知られており、ドラッグ・デリバリーの分野では比較的頻繁に利用されている。
また、トランスフェリンは鉄輸送タンパク質として、葉酸は核酸の塩基部位の合成に細胞に必要不可欠な分子として、細胞表層に存在するレセプターを介して細胞内に取り込まれる化合物として知られており、これらの化合物やその誘導体もドラッグ・デリバリーに応用されている。
【非特許文献１４】Bisgaier CL, Essenburg AD,Auerbach BJ, Pape ME, Sekerke CS, Gee A, Wolle S, Newton RS, J. Lipid Res, 38,2502-2515 (1997)
【非特許文献１５】Zhu ZB, Makhija SK, Lu B, WangM, Rivera AA, Preuss M, Zhou F, Siegal GP, Alvarez RD, Curiel DT, Virology, 325,116-128 (2004)
【非特許文献１６】Christopher P. Leamon, Scott R.Cooper, and Gregory E. Hardee  Bioconjugate Chem., 14, 738-747 (2003)
【００１６】
さらに、近年、Ｔａｔペプチドやオリゴアルギニンを遺伝子導入剤に応用する試みがなされてきた。Ｔａｔペプチドは、ウイルスが細胞内に侵入する際に細胞膜を貫通させるために用いる物質である。この一部が連続したアルギニン配列で構成されている。これらの持つ正電荷や構造が、そのメカニズムは明らかにされてはいないが、細胞膜透過性に深く関与していると明確に示されている。そのため、多くの研究者によって非ウイルス性ベクターにＴａｔペプチドやオリゴアルギニン、ならびに類似の作用が期待されるＲｅｖペプチドおよびＡｎｔペプチド等が用いられている。
【非特許文献１７】S. Futaki, Biochemistry, 41,7925-7930 (2002)
【非特許文献１８】J. Philippe, The journal ofbiological chemistry, 278, 585-590 (2003)
【００１７】
ドラッグ・デリバリーにおける細胞内への核酸の導入では、一般にエンドサイトーシスと呼ばれる経路で細胞膜を突破することが知られている。細胞内に導入後、エンドソームと呼ばれる脂質二分子膜に包摂され、リソソームへ移行して強力な分解酵素によって分解されるなどして代謝されてしまう。即ち、ドラッグ・デリバリーにおいてリソソームでの分解は大きな障壁であり、これを回避することによってデリバリー能の向上に大きく貢献できるものといえる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、400μg/ml以上の高濃度条件下において細胞膜融合を引き起こすことが知られており、その際に、脂質二分子膜を撹乱すると考えられる。その脂質二分子膜撹乱性により輸送小胞（エンドソーム）に包まれて細胞内に浸透した複合体が、局所的に脂質二分子膜の一種であるエンドソームに対するＰＥＧ濃度が増大し、エンドソームを突破し、脱出するものと考えられている。このまた、場合によっては細胞膜を直接撹乱することにより、エンドソームを経由せずに膜内に入って、リソソームでの分解を回避する可能性も考えられる。本発明者らにより、ＰＥＧを結合させたβ−１，３−グルカンを用いた核酸治療剤のデリバリーについて特許出願している。
【特許文献１２】特願２００４−６６６０６なお、本明細書において、単に脂質膜と記述した場合は、上記の脂質二分子膜のことを指称する。
【００１８】
シクロデキストリン（以下、ＣｙＤと表記することがある）にも同様に、脂質分子包接能により脂質二分子膜を撹乱する可能性を有することが知られている。そのため、ＣｙＤの遺伝子キャリアーとしての付加価値について、特に細胞内に導入された後のエンドソーム膜を突破し、ターゲットである核酸に向かって運搬できるものと考えられる。また、ＣｙＤは、脂質分子の他にアダマンタンなどの疎水性分子をゲストとして包接する作用を持ち、様々な分野に応用されている。
【非特許文献１９】Hidetoshi Arima, BioconjugateChem., 12, 476-484 (2001)
【非特許文献２０】Hiroshi Ikeda, J. Am. Chem. Soc.,118, 10980-10988, (1996)
【００１９】
しかしながら、上記のような、機能を有する官能基を、複数組み合わせてβ-1,3-グルカンに修飾し、核酸のキャリアーとして相乗効果と最適化を図る試みは見られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、生体に対する安全性が高く、かつ核酸と特異な複合体を形成する能力のある多糖であるβ−１，３−グルカンに、標的細胞への核酸のトランスフェクション能を一段と高めるための新しい技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に従えば、上記の目的を達成するものとして、標的細胞に核酸を導入する方法であって、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカン、または、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤またはアルカリ性溶剤に溶解した後、前記被導入核酸と水の存在下に混合することによって該核酸とβ−１，３−グルカンとから成る複合体を形成させ、この複合体を標的細胞に投与することを特徴とする方法が提供される。
【００２２】
さらに、本発明は、別の観点から、β−１，３−グルカンの２本鎖と導入核酸の１本鎖とから成る複合体であって、β−１，３−グルカンの２本鎖のうちの１本が細胞膜透過性官能基を有し且つ他の１本が脂質膜撹乱性官能基を有するか、または、同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体から構成されることを特徴とする標的細胞に核酸を導入するための多糖系キャリアーを提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に従えば、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併せ持つβ−１，３−グルカンを核酸と複合体化したハイブリッド多糖系キャリアーとして核酸を投与することにより、標的細胞への当該核酸の導入効率を高め、治療効果を向上させることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明において用いられる細胞膜透過性官能基とは、背景技術に関連して例示したように、細胞表層に存在する受容体を特異的に認識することができ、また、正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通することにより核酸の細胞内への浸透に効果のある官能基または原子団を指称する。細胞表層に存在する受容体を特異的に認識する細胞膜透過性官能基の好ましい例としては、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、グルコース、フコースおよびシアル酸より選ばれる単糖またはオリゴ糖の残基が挙げられる。この他、ＲＧＤペプチド、コレステロール、トランスフェリン、または葉酸の残基も本発明で使用可能な細胞表層に存在する受容体を特異的に認識する細胞膜透過性官能基の例である。正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通するタイプの細胞膜透過性官能基の好適な例は、オリゴアルギニン、Ｔａｔペプチド、ＲｅｖペプチドまたはＡｎｔペプチドの残基である。
【００２５】
本発明において用いられる脂質膜撹乱性官能基とは、背景技術に関連して例示したように、細胞膜または細胞内に導入された後の輸送小胞を突破・脱出する機能を有し細胞内でのリソソームにおける分解を回避する効果をもたらす官能基または原子団を指称する。本発明において好適に用いられる脂質膜撹乱性官能基の典型例は、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、またはカルボン酸の残基である。
【００２６】
本発明に従い標的細胞に核酸を導入するためには、先ず、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンを極性溶媒（非プロトン性極性溶剤、例えば、ＤＭＳＯ）に溶解する（以下、この態様を第1の態様と言うことがある）。または、別の態様として、細胞膜透過性官能基を有するβ−１，３−グルカンおよび脂質膜撹乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを非プロトン性極性溶剤に溶解する（以下、この態様を第2の態様と言うことがある）。この操作により、もともと天然もしくは水中で3重螺旋として存在していたβ−１，３−グルカンは1本鎖になる。なお、ＤＭＳＯのような非プロトン性極性溶媒の代わりに水酸化ナトリウム溶液のようなアルカリ性溶剤に溶解してもよい。
【００２７】
次に、このようにして得られたβ−１，３−グルカンを水の存在下に被導入核酸と混合する。すなわち、非プロトン性極性溶剤（またはアルカリ性溶剤）中に溶解しているβ−１，３−グルカンに核酸（1本鎖）を加え、溶媒を水に戻す。かくして、β−１，３−グルカンの2本鎖と核酸（標的細胞に導入されるべき核酸）の1本鎖とから成る複合体が形成される（非特許文献１３）。
【００２８】
かくして、本発明に従えば、β−１，３−グルカンの２本鎖と被導入核酸の１本鎖とから成る複合体であって、β−１，３−グルカンの２本鎖のうちの１本が細胞膜透過性官能基を有し且つ他の１本が脂質膜撹乱性官能基を有する複合体（第1の態様による場合）、または、同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体（第2の態様による場合）が形成され、この複合体の形態で核酸を標的細胞に導入する。図１１は、このような本発明のハイブリッド多糖系キャリアーを構成する複合体を概念的に示すものであり、図１１の（Ｂ）と（Ｃ）は同一のβ−１，３−グルカン鎖が細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基の両方を有している複合体を示し、図１１の（Ａ）は2本のβ−１，３−グルカン鎖の一方が細胞膜透過性官能基を有し他方が脂質膜撹乱性官能基を有する複合体を示している。
【００２９】
本発明は、β−１，３−グルカンに、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱能を有する官能基とを導入し、これらを導入しようとする核酸と複合体化して標的細胞に投与する方法である。そして、本発明で使用される核酸とは、疾病の治療等のために細胞内に導入されるべき遺伝子自体または該遺伝子を含む核酸、および類似の核酸類であり、上記のような官能基を有するβ−１，３−グルカンと複合体を形成するものであれば、どのような形態でも良い。すなわち、ＲＮＡ、オリゴＤＮＡ、１本鎖核酸、２本鎖核酸、プラスミドＤＮＡなどが本発明で用いられる核酸として包含されるが、実用的見地から特に好適な核酸物質はアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ  ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
β−１，３−グルカンと核酸が形成する複合体は、前述のように、β−１，３−グルカンの2本鎖と核酸の1本鎖、すなわち、核酸１分子に対しβ−１，３−グルカン２分子で構成される。細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を導入した一対のβ−１，３−グルカン（例えば、ガラクトースを導入したβ−１，３−グルカンとＰＥＧを導入したβ−１，３−グルカン：図１１のＡ）を複合化の際に混合することで、核酸１分子に異なる機能を付加した２種類のβ−１，３−グルカン各１本から成る新しい複合体が形成される。これは、例えば、ガラクトースによる肝細胞特異的なレセプターを介した細胞膜透過能とＰＥＧによるリソソームでの分解回避能を併せ持つハイブリッド機能性キャリアーとして利用可能となる。
【００３１】
また、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンを核酸との複合体化に供してもよく、このような細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンとしては、一般に、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とが連結しているものを用いる。例えば、ＰＥＧを側鎖に修飾したβ−１，３−グルカンのＰＥＧ末端に細胞膜透過性官能基（例えば、ガラクトース）を共有結合により連結させたβ−１，３−グルカンを核酸と複合体化する（図１１のＢ）ことにより、ＰＥＧを修飾したβ−１，３−グルカンの細胞内におけるリソソームでの分解回避能（特許文献１２）と細胞膜透過能（ガラクトースによる肝細胞特異的細胞膜透過能の付加）の２つの機能を併せ持つハイブリッド機能性キャリアーとして利用する。
【００３２】
如上の手段の他に、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基とを併有するβ−１，３−グルカンとして、シクロデキストリン（ＣｙＤ）残基に包接される疎水性ゲスト分子を介して該ＣｙＤ残基と単糖またはオリゴ糖の残基が連結しているβ−１，３−グルカンを用いることもできる。例えば、β−１，３−グルカンの側鎖にＣｙＤを修飾することで、β−１，３−グルカンに脂質膜撹乱能の付加価値が与えられるが、さらに、得られたＣｙＤ修飾β−１，３−グルカンをガラクトースで修飾したアダマンタン（疎水性ゲスト分子）と混合すると、ＣｙＤの疎水分子包接能によって、側鎖のＣｙＤにガラクトース修飾アダマンタンが包接される（図１１のＣ）。すなわち、細胞膜透過性官能基であるガラクトースとリソソーム分解回避能をもつＣｙＤとがアダマンタンを介してβ−１，３−グルカンの側鎖上で連結したことになる。このように生成した２官能性β−１，３−グルカンは、ハイブリッド遺伝子キャリアーとして利用することができる。
【００３３】
既述のように、本発明で使用する異なる官能基を修飾したβ−１，３−グルカンは、核酸との複合体化前に溶媒中で混合する。ＣｙＤを修飾したβ−１，３−グルカンと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストの場合もまた、核酸との複合化前に溶媒中で混合し結合させる。
【００３４】
本発明で用いられるβ−１，３−グルカンとは、よく知られているように、グルコースがβ１→３グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合の異なる各種のものが知られている。その中でも、後述するように細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基を導入する反応の容易性から、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのように主鎖に対して約３０％以上の側鎖のグルコース残基を有するβ−１，３−グルカンが好適である。
【００３５】
原料となるβ−１，３−グルカンに、所望の細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基を導入する方法としては、種々の反応が考えられるが、主鎖のグルコシド結合に影響を与えることなしに、側鎖に選択的に導入する方法として、β−１，３−グルカンに元々付いている側鎖のグルコースを利用し、過ヨウ素酸酸化／還元アミノ化を経由する方法が適当である。例えば、まず、側鎖のグルコースを過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化し、開環してカルボニルをつくる。それに導入する官能基のアミン誘導体と水素化ホウ素ナトリウムを反応させ、還元アミノ化することにより、アミド結合をリンカーとする、所望の官能基が導入された側鎖を有するβ−１，３−グルカンが得られる。例えば、β−１，３−グルカンに細胞膜透過性官能基としてグルコースを導入する場合には、アミン誘導体であるアミノエチルグルコシドと水素化ホウ素ナトリウムを反応させ、還元アミノ化することにより、側鎖にグルコースが導入できる（実施例２、図１参照）。
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
β−１，３−グルカン（シゾフィラン）の調製  原料となるβ−１，３−グルカンとして、３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手したSchizophyllum commune. Fries（ＡＴＣＣ  ４４２００）を、最小培地を用いて7日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量45万の3重螺旋シゾフィランを得た。以下、シゾフィランをＳＰＧと表記することがある。
【非特許文献２１】Gregory G. Martin, Michael F.Richardson, Gordon C. Cannon and Charles L. McCormick, Am. Chem. Soc. PolymerPrepr. 38 (1), 253-254（1997）
【非特許文献２２】Kengo Tabata, Wataru Ito,Takemasa Kojima, Shozo Kawabata and Akira Misaki, Carbohydrate Research, 89, 121-135（1981）
【実施例２】
【００３７】
ＰＥＧ修飾シゾフィランの合成  ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。すなわち、実施例１で得られたシゾフィランの側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成したアルデヒドとアミン末端を持つＰＥＧ（ここでは分子量5,000）との還元アミノ化反応によりＰＥＧを導入した。但し、側鎖へ選択的にＰＥＧを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液にアミン末端を持つＰＥＧ100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することでPEG修飾シゾフィラン（以下、ＰＥＧ−ＳＰＧ）を得た。ＰＥＧのシゾフィランへの導入率は添加する過ヨウ素酸ナトリウムの当量数で制御することが可能であり、側鎖グルコース残基に対して1.0当量、5.0当量のものについても同様に合成を行った。
【実施例３】
【００３８】
ガラクトース修飾シゾフィランの合成  ガラクトース修飾シゾフィランは図１のスキームに従って合成した。例としてラクトノラクトンを用いた場合の合成法を示しているが、同様の合成法はすべての還元糖類（単糖、オリゴ糖、多糖）の導入に適用することができる。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、ラクトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ガラクトース修飾シゾフィラン（以下、Ｇａｌ−ＳＰＧ）を得た。
【実施例４】
【００３９】
グルコース修飾シゾフィランの合成  グルコース修飾シゾフィランの合成法は図１のスキームに従い合成し、ラクトノラクトンの代わりにここではマルトノラクトンを用いている。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、マルトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、グルコース修飾シゾフィラン（以下、Ｇｌｕ−ＳＰＧ）を得た。
【実施例５】
【００４０】
ＰＥＧの末端にガラクトースまたはグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランの合成  ＰＥＧの末端にガラクトースまたはグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。シゾフィラン側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成した両末端にアミンを持つＰＥＧ（ここでは分子量200、600、1000、6000）との還元アミノ化反応によるＰＥＧの導入法を示しているが、側鎖へ選択的にＰＥＧを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液に両末端にアミンを持つＰＥＧ100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することで末端にアミンを持つＰＥＧ修飾シゾフィランを得た。
調製された末端にアミンを有するシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、ラクトノラクトンまたはマルトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＰＥＧの末端にガラクトースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィラン（以下、Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧ）およびＰＥＧの末端にグルコースを結合させたＰＥＧ修飾シゾフィラン（以下、Ｇｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧ）を得た。今回、ＰＥＧの分子量が200であるＧａｌ−ＰＥＧ  200−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ  200−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が600であるＧａｌ−ＰＥＧ  600−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ  600−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が1000であるＧａｌ−ＰＥＧ  1K−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ  １Ｋ−ＳＰＧ、ＰＥＧの分子量が6000であるＧａｌ−ＰＥＧ  ６Ｋ−ＳＰＧとＧｌｕ−ＰＥＧ  ６Ｋ−ＳＰＧを得た。
【実施例６】
【００４１】
ＣｙＤ修飾シゾフィランの合成  ＣｙＤ（シクロデキストリン）修飾シゾフィランの合成は図１のスキームに従って合成した。シゾフィラン側鎖を過ヨウ素酸酸化し、生成したアミン末端を持つＣｙＤ（ここではβＣｙＤ）との還元アミノ化反応によるＣｙＤの導入法を示しているが、側鎖へ選択的にＣｙＤを導入できれば合成法は特に制限されない。
実施例１にて調製されたシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコース残基に対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、４℃で冷却攪拌しながら、先に調製したシゾフィラン溶液へゆっくりと加えた。２日後、反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析した。
得られた溶液にアミン末端を持つＣｙＤ（ここではβＣｙＤ）100mgを加え、溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥した。得られた白色固体を0.1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、一晩室温で攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析し、凍結乾燥することでアミン末端を持つＣｙＤ修飾シゾフィラン（以下、βＣｙＤ−ＳＰＧ）を得た。
【非特許文献２３】K. Hamasaki, H. Ikeda, A.Nakamura, A. Ueno, F. Toda, I Suzuki, T. Osa,J. Am. Chem. Soc., 115, 5035-5040(1993)
【実施例７】
【００４２】
ガラクトース修飾アダマンタンおよびグルコース修飾アダマンタンの合成  1-アミノエチルアダマンタン0.50g(3.0mmol)とラクトノラクトンまたはマルトノラクトン1.53g(4.5mmol)をメタノール中で一晩攪拌する。これを濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した（溶離剤：クロロホルム／メタノール３：２）。得られた黄色固体をｎ−ブタノール／ｎ−ヘキサンを用いて再結晶し、白色固体のガラクトース修飾アダマンタン（以下、Ｇａｌ−Ａｄｍ）およびグルコース修飾アダマンタン（Ｇｌｕ−Ａｄｍ）を得た。アダマンタンへ選択的に細胞膜透過性官能基を導入できれば合成法は特に制限されない。
【実施例８】
【００４３】
化学修飾シゾフィランのキャラクタリゼーション  実施例２から実施例７にて得られた各化学修飾シゾフィランの細胞膜透過性官能基や脂質膜撹乱性官能基の導入率は、元素分析における窒素含有率から算出され、表１に示す導入率を得た。
【００４４】
【表１】
2006069913.tif 000003
【実施例９】
【００４５】
蛍光標識シゾフィランの合成  この実施例９および実施例１０は、後述の実施例１３で用いるサンプルを調製するためのものである。ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）中でシゾフィラン100mgとフルオロセインイソチオシアネート5mg（以下、ＦＩＴＣ）を混合し、遮光して３日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＦＩＴＣ標識シゾフィラン（以下、ＳＰＧ−ＦＩＴＣ）を得た。ＳＰＧに蛍光基を導入できれば合成法は特に制限されない。
【実施例１０】
【００４６】
蛍光標識アミノエタノール修飾シゾフィランの合成  アミノエタノール修飾シゾフィランは図１のスキームに従って合成した。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、２−アミノエタノール2ml（大過剰）を加え、一日後、水素化ホウ素ナトリウム200mg添加し、室温で３間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、アミノエタノール修飾シゾフィラン（以下、ＡＥ−ＳＰＧ）を得た。さらに、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）中でＡＥ−ＳＰＧ100mgとテトラメチルローダミンイソチオシアネート5mg（以下、ＴＲＩＴＣ）を混合し、遮光して３日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ＴＲＩＴＣ標識アミノエタノール修飾シゾフィラン（以下、ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ）を得た。側鎖へ選択的にアミノエタノールや蛍光基を導入できれば合成法は特に制限されない。
【実施例１１】
【００４７】
化学修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体化遺伝子治療剤の調製  実施例２から実施例７で合成された化学修飾シゾフィランをそれぞれジＤＭＳＯに溶解させ、濃度を20mg/mlに調整し、この溶液1μl、純水3μl、10mMのトリス緩衝液（pH7.8）1μlと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（1mg/ml）5μlを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌原遺伝子として文献に報告されているｃ−ｍｙｂ遺伝子のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列”５’−ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＧＧＣ−３’“を適用した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂに対する参照サンプルとしてアンチセンス効果を持たないアンチセンスシーケンスのスクランブルシーケンスである”５’−ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＧＣＧ−３’“を用いた。じっさいに使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、３’末端に40のｄＡをつけたシーケンスのｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、以下ＡＳ−ｃ−ｍｙｂと表記）、3’末端に40のｄＡをつけたｃ−ｍｙｂホスホロチオエートスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２、以下Ｓｃ−ｃ−ｍｙｂと表記）とした。
【非特許文献２４】Barbara Majello et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 83, 9636 （1986）
【非特許文献２５】Alan M. Gewirtz and BrunoCalabretta, Science, 242, 1303（1988）
【実施例１２】
【００４８】
化学修飾シゾフィランとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとの複合体形成の円偏光二色性分散計による確認  化学修飾シゾフィランとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を確認するために、既存の手法〔K. Sakurai, S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520 (2000)〕を用いて円偏光二色性スペクトル測定により複合体の融解温度を測定した。測定サンプルは、10mMのＴｒｉｓ緩衝溶液（pH7.8）1050μlと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（0.5mg/ml）30μlを調整し、0.5mg/mlの濃度に調整した化学修飾シゾフィランのＤＭＳＯ溶液120μlを混合した。溶液は透明で、均一であった。４℃で３日間熟成した溶液の円偏光二色性スペクトルを測定した。ここでは、一例として、ＰＥＧ  ５Ｋ（１０）−ＳＰＧとＡＳ−ｃ−ｍｙｂが形成した複合体の熱融解曲線を図２に例示した。また、合成した他の化学修飾シゾフィランやＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いても同様の結果が得られた。
図２より融解温度は50℃であり、生体温度においては安定な複合体を形成していることが示された。
【実施例１３】
【００４９】
蛍光エネルギー移動を用いた異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸の混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成の評価  異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成能の評価について、蛍光エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）を用いて行った。ここでは、一例として、ＦＩＴＣで標識したシゾフィラン（ＳＰＧ−ＦＩＴＣ）とＴＲＩＴＣで標識したアミノエタノール修飾シゾフィラン（ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ）とｐｏｌｙ（Ｃ）（アマシャムより入手）を利用して、ＦＩＴＣからＴＲＩＴＣへのＦＲＥＴを観測することで、ＳＰＧ−ＦＩＴＣとＡＥ−ＳＰＧ−ＦＩＴＣとｐｏｌｙ（Ｃ）を含むヘテロシゾフィランハイブリッド形成能を評価した。サンプルは、トリス緩衝液10mM、ｐｏｌｙ（Ｃ）0.5mg/ml、ＡＥ−ＳＰＧ−ＴＲＩＴＣ0.25mg/ml、ＳＰＧ−ＦＩＴＣ0〜0.25mg/mlを混合し、４℃で３日間静置して複合体を形成させて作成した。常温、FITCの励起波長である490nm（TRITCの励起波長は570nmであり、490nmではＴＲＩＴＣの蛍光はない）で、各サンプルの蛍光スペクトルを測定した。得られた各サンプルのFITCのピークである525nmとＴＲＩＴＣのピークである580nmの蛍光強度の比を取り、ＦＲＥＴの飽和点を100%としてＳＰＧ−ＦＩＴＣとＡＥ−ＳＰＧ−ＦＩＴＣとｐｏｌｙ（Ｃ）を含むヘテロシゾフィランハイブリッド形成率をプロットして図３を得た。図３から、異なる２種類の化学修飾シゾフィランと一本鎖核酸混合によるヘテロシゾフィランハイブリッド形成率は、異なる２種類の化学修飾シゾフィラン濃度の割合が１：１であるとき最も高いことが明らかとなった。
【非特許文献２６】Y. Okamura, S. Kondo, I. Sase,T. Sga, K. Mise, I. Furusawa, S. Kawakami, Y. Watanabe, Nucleic Acids Research,28, e107 (2000)
【実施例１４】
【００５０】
および〔比較例１〕
異なる２種類の化学修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を用いた癌細胞増殖抑制  96穴プレートに100μlの10％仔牛胎児血清および1mM非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）に懸濁した2×103個のガラクトース受容体を有するＨｅｐ  Ｇ２を播種した。一晩、ＣＯ２インキュベーター内で37℃、5％ＣＯ２下で培養を行った後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例１１で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＰＥＧ  ５Ｋ（10）−ＳＰＧおよびＧａｌ（8.7）−ＳＰＧ〔またはＧｌｕ（4.2）−ＳＰＧ〕の複合体を限外ろ過膜（排除限界3000：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、37℃、5％ＣＯ２下で96時間培養後、細胞数をCell
Counting Kit-8（同仁化学研究所）を用いたWST法を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂの最終濃度は50μg/mlとし、すべてのＡＳ−ｃ−ｍｙｂが化学修飾シゾフィランと複合化するように調製した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率100％として細胞増殖を評価した。
その結果を図４に例示する。図４に示すように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＰＥＧ  ５Ｋ（10）−ＳＰＧおよびＧａｌ(8.7)−ＳＰＧの複合体である本発明に従う遺伝子治療剤の方が、細胞の生存率が低下するに至っている。また、この効果はＧａｌ(8.7)−ＳＰＧ／ＰＥＧ  ５Ｋ(10)−ＳＰＧの混合比（mol/mol；主鎖であるＳＰＧの割合）が0.5から0.75の投与区で特に顕著に現れた。この効果は、細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を組み合わせることにより得られたと考えられる。官能基の種類や修飾率、混合比を調整することで目的に合わせた高い効率のこれまでにない核酸キャリアーが得られていることが理解される。Ｈｅｐ  Ｇ２に受容体を持たないグルコースを用いたＧｌｕ(4.2)−ＳＰＧ／ＰＥＧ  ５Ｋ(10)−ＳＰＧの系では、ガラクトースを用いた場合と比較して癌細胞増殖抑制能が低下した。
【非特許文献２７】櫻井和朗、新海征治、J. Am. Chem. Soc.,122, 4520 (2000)
【非特許文献２８】水雅美、甲元一也、穴田貴久、狩長亮二、木村太郎、長崎健、新海征治、櫻井和朗、Bull. Chem. Soc. Jpn, 77, 1101-1110 (2004)
【実施例１５】
【００５１】
および〔比較例２〕
ＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を用いた癌細胞増殖抑制  実施例５で製造したＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランを実施例１４および比較例１と同様にＡＳ−ｃ−ｍｙｂと複合化させ、ガラクトース受容体を有するＨｅｐ  Ｇ２に添加し、ＷＳＴ法によって癌細胞増殖抑制試験を行い、アンチセンス能を評価した。図５に示したように、ガラクトースを有するＧａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧをＡＳ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして利用した場合、高い癌細胞増殖抑制効果が得られた。特に、ＰＥＧの分子量が6000であるＧａｌ−ＰＥＧ  ６Ｋ−ＳＰＧを用いた場合に顕著な効果が見られた。この結果においてもＰＥＧ修飾ＳＰＧやＧａｌ修飾ＳＰＧ単独をキャリアーとして用いた場合よりも高いアンチセンス効果を示した。実施例で用いた官能基以外の細胞膜透過性官能基と脂質膜撹乱性官能基を併せ持つ多機能型キャリアーを同様の手法で合成すれば、あらゆる状況に対応できるハイブリッド多糖系キャリアーライブラリーを作成することが可能である。Ｈｅｐ  Ｇ２に受容体を持たないグルコースを用いたＧｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧの系では、ガラクトースを用いた場合と比較して癌細胞増殖抑制能が低下した。
【００５２】
〔比較例３〕
ＰＥＧの末端に細胞膜透過性官能基を結合させたＰＥＧ修飾シゾフィランとスクランブルオリゴヌクレオチド複合体を用いた細胞生存率  実施例１５および比較例２と同様の実験系でＡＳ−ｃ−ｍｙｂの代わりにアンチセンス効果を持たないＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いて、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞生存率を検討した。図６に示したように細胞増殖率が大幅に変化することはなく、安全性の高いキャリアーであることが示された。
【実施例１６】
【００５３】
ＣｙＤ−ＳＰＧの疎水ゲスト包接能の保持  ＳＰＧにＣｙＤを化学修飾しても、ＣｙＤ−ＳＰＧに細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストが包接されることに支障がないことを示す必要がある。そこで、一例として、脂質膜やシクロデキストリンなどの高分子の疎水環境を調べる蛍光プローブとしてしばしば用いられるＡＮＳ−Ｎａ（1-Naphthalenesulfonic acid sodium salt）を利用し、βＣｙＤ−ＳＰＧがβＣｙＤそのものと同様にＡＮＳを包接することを示すことができると考えられる。一例として、βＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧ濃度1.34mM（βＣｙＤのみでは138μM、ＳＰＧの側鎖を含むグルコース4分子を1molとした、20mg/mlのβＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧ／ＤＭＳＯ  100μlをtotal
2mlに溶解した)、25℃、水の体積分率Ｖｗ=0.9、励起波長370nmで蛍光測定を行った。図７のように、βＣｙＤ(10.3)−ＳＰＧがβＣｙＤそのものと同様にＡＮＳを包接することが示された。
【非特許文献２９】T. Hirasawa, Y. Maeda, H.Kitano, Macromolecules, 31, 4480-4485 (1998)
【実施例１７】
【００５４】
ＣｙＤと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストのホスト−ゲスト作用の保持  疎水ゲストに細胞膜透過性官能基を化学修飾しても、ＣｙＤ−ＳＰＧに細胞膜透過性官能基を修飾した疎水ゲストが包接されることに支障がないことを示す必要がある。そこで、一例として、核酸やシクロデキストリンの蛍光プローブとしてよく用いられるdansyl(５−dimethylamino−１−naphthalenesulfonyl)基を導入したβＣｙＤ（以下、βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ）を利用し、βＣｙＤとＧａｌ−Ａｄｍがホスト−ゲスト会合体を形成するかどうか検討した。βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ／Ｇａｌ−Ａｄｍの系では、βＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌ濃度2μM、25℃、水の体積分率Ｖｗ=0.9、励起波長375nmで蛍光測定を行った。図８のように、βＣｙＤとＧａｌ−Ａｄｍがホスト−ゲスト会合体を形成することが示された。この結果と実施例１７の結果から、βＣｙＤ−ＳＰＧとＧａｌ−Ａｄｍがホスト-ゲスト会合体を形成することが示唆される。
【非特許文献３０】H. Ikeda, M. Nakamura, N. Ise,N. Oguma, A. Nakamura, T. Ikeda, F. Toda, A. Ueno, J. Am. Chem. Soc., 118,10980-10988 (1996)
【実施例１８】
【００５５】
および〔比較例４〕
ＣｙＤ−ＳＰＧと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水性ゲストをアンチセンスオリゴヌクレオチドキャリアーとして利用した癌細胞増殖抑制  一例として、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｃ−Ａｄｍ、βＣｙＤ−ＳＰＧ会合体を用いて、ガラクトースを特異的に認識するアシアロ糖レセプターを持つ肝臓癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）に対する癌細胞増殖抑制効果の向上を目的としたアンチセンス効果をＷＳＴ法によって検討した。サンプルや測定法については、実施例１４で述べたものと同様である。Ｇａｌ−Ａｄｍは、サンプル調製時に100μg/ml、つまり、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−Ａｄｍが半分程度会合体を形成している状態で添加した。図９に示した癌細胞増殖抑制試験の結果から、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−Ａｄｍ会合体を用いることで、Ｈｅｐ  Ｇ２への高い細胞認識能とアンチセンス効果の上昇が見られた。
【００５６】
〔比較例５〕
ＣｙＤ−ＳＰＧと細胞膜透過性官能基を修飾した疎水性ゲストをスクランブルオリゴヌクレオチドキャリアーとして利用した癌細胞生存率  一例として、癌原遺伝子ｃ−ｍｙｂのアンチセンス鎖であるＡＳ−ｃ−ｍｙｂのスクランブル配列であるＳｃ−ｃ−ｍｙｂを用いて、βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｃ−Ａｄｍ、βＣｙＤ−ＳＰＧと複合化させ、ＷＳＴ試験を行った。サンプルや測定法については、実施例１８および比較例４で述べたものと同様である。いずれのキャリアーを用いた場合でも図１０に示したように細胞増殖率が大幅に変化することはなく、安全性の高いキャリアーであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、トランスフェクション能が高く生体に安全な核酸の標的細胞への導入技術として、標的指向性が高く、治療効果に優れた、かつ生体に安全な遺伝子治療の分野での利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】化学修飾シゾフィランの合成スキーム（実施例２〜６および実施例１０）
【図２】ＰＥＧ  ５Ｋ（１０）−ＳＰＧとＡＳ−ｃ−ｍｙｂの複合体の円二色性偏向スペクトル測定から得られた熱融解曲線（実施例１２）
【図３】ＦＲＥＴによるＳＰＧ−ＦＩＴＣとＡＥ−ＳＰＧ−ＦＩＴＣとｐｏｌｙ（Ｃ）を含むヘテロシゾフィランハイブリッド形成能の評価（実施例１３）
【図４】ＰＥＧ  ５Ｋ（１０）−ＳＰＧとＧａｌ（8.7）−ＳＰＧ、あるいはＰＥＧ  ５Ｋ（10）−ＳＰＧとＧｌｕ（4.2）−ＳＰＧから成る混合系ＡＳ−ｃ−ｍｙｂキャリアーによる肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２に対する細胞増殖抑制試験（実施例１４および比較例１）
【図５】Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧおよびＧｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧをＡＳ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして用いた肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２に対する細胞増殖抑制試験（実施例１５および比較例２）
【図６】Ｇａｌ−ＰＥＧ−ＳＰＧおよびＧｌｕ−ＰＥＧ−ＳＰＧをＳｃ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして用いた肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２の生存率（比較例３）
【図７】蛍光測定によるＡＮＳ濃度に伴うβＣｙＤ（10.3）−ＳＰＧに包接されるＡＮＳの飽和濃度（実施例１６）
【図８】蛍光測定によるＧａｌ−Ａｄｍ濃度に伴うβＣｙＤ−ｄａｎｓｙｌに包接されるＧａｌ−Ａｄｍの飽和濃度（実施例１７）
【図９】βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｕ−ＡｄｍをＡＳ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして利用した肝臓癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）増殖抑制試験（実施例１８および比較例４）
【図１０】βＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇａｌ−ＡｄｍあるいはβＣｙＤ−ＳＰＧ／Ｇｌｕ−ＡｄｍをＳｃ−ｃ−ｍｙｂキャリアーとして利用した肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２の生存率およびＧａｌ−Ａｄｍ、Ｇｌｕ−Ａｄｍを投与したときの肝臓癌細胞Ｈｅｐ  Ｇ２の生存率（比較例５）
【図１１】ハイブリッド多糖系核酸キャリアーの概念図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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