(57)【要約】【課題】  容易に合成可能な標識ヌクレオシドを提供し、DNAチップ等を安価に作製できるようにする。【解決手段】  一般式（I）：X-NH-CO-NH-L-Y（式中、Xはアミノ基を有するヌクレオシドのアミノ基以外の部分を表し、Lはリンカーを表し、Yは標識基又は保護基を表す。）で表されるヌクレオシド誘導体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）：X-NH-CO-NH-L-Y（式中、Xはアミノ基を有するヌクレオシドのアミノ基以外の部分を表し、Lはリンカーを表し、Yは標識基又は保護基を表す。）で表されるヌクレオシド誘導体。
【請求項２】
一般式（I）におけるXが、シチジン又はデオキシシチジンのアミノ基以外の部分である請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
【請求項３】
一般式（I）におけるYが、ビオチン残基、蛍光基、又はトリフルオロアセチル基である請求項１又は２記載のヌクレオシド誘導体。
【請求項４】
アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含む請求項１乃至３のいずれか一項記載のヌクレオシド誘導体の製造方法。
【請求項５】
アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含むDNA又はRNAの標識方法。
【請求項６】
アミノ基を有する核酸塩基が、シトシンである請求項５記載のDNA又はRNAの標識方法。
【請求項７】
標識基又は保護基が、ビオチン残基、蛍光基、又はトリフルオロアセチル基である請求項５又は６記載のDNA又はRNAの標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識されたDNAやRNAの合成などに使用される新規なヌクレオシド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAチップを用いた遺伝子診断などにおいては、ビオチンや蛍光物質などで標識されたヌクレオチドが必要である。
【０００３】
従来、ビオチン等の標識物質は、シトシン塩基の５位に導入されることが多かった。例えば、ビオチンを-C2H-NH-を含む連結基を介してシトシンの５位に導入する方法（特許文献１）、標識物質をN-ヘキシルアクリルアミド骨格のスペーサーを介してシトシンの５位に導入する方法（非特許文献１）、シトシンの５位に3-（フタロイルイミド）プロバギル基を導入し、その後、標識物質を導入する方法（非特許文献２、非特許文献３）、N-トリフルオロ-6-アミノヘキシル基を導入し、その後、標識物質を導入する方法（特許文献２、非特許文献４）、N,N-ビス（N-トリフルオロ-2-アミノエチル）アミノエチル残基を導入し、その後、標識物質を導入する方法（特許文献３）などが知られている。
【０００４】
また、ヌクレオチドの塩基部分ではなく、リン酸基に標識物質を導入する方法も知られいている（特許文献４）。
【０００５】
一方、シトシンなどの核酸塩基は、その分子中にアミノ基を有しており、この基に標識物質を導入することも考えられる。しかし、このアミノ基に直接リンカー及び標識物質を結合させても、結合があまり強くないため、核酸合成時に保護基などと共に脱落してしまうことが多い。
【特許文献１】特公平3-75559号公報
【特許文献２】米国特許5596091号明細書
【特許文献３】特開平8-242862号公報
【特許文献４】特公平3-14319号公報
【非特許文献１】Glen Research Catalog, Product for DNA Research, p. 57 (2002)
【非特許文献２】K. J. Gibson, S. J. Benkovic, Nucleic Acids Res. 15, 6455-6467 (1087)
【非特許文献３】F. Seela, N. Ramzaeva, P. Leonard, Y. Chen, H. Debelak, E. Feiling, R. Kroschel, M. Zulauf, T. Wenzel, T. Frohlich, M. Kostrzewa, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20, 1421-1424 (2001)
【非特許文献４】H. Hashimoto, M. G. Nelson, C. Switzer, J. Am. Chem. Soc., 115, 7128-7134 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、標識物質は、シトシンの５位か、ヌクレオチドのリン酸基に導入されることが多い。しかし、このような標識ヌクレオチドはいずれも合成が難しく、高価なものになっている。このため、これらに代わる新規な標識ヌクレオチドが求められている。
【０００７】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、合成が容易な新たな標識ヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、シトシンのアミノ基と標識物質のリンカーとを結合させることにより、標識物質を安定的にヌクレオシドと結合させ得ることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供するものである。
（１）一般式（I）：X-NH-CO-NH-L-Y（式中、Xはアミノ基を有するヌクレオシドのアミノ基以外の部分を表し、Lはリンカーを表し、Yは標識基又は保護基を表す。）で表されるヌクレオシド誘導体。
（２）一般式（I）におけるXが、シチジン又はデオキシシチジンのアミノ基以外の部分である（１）記載のヌクレオシド誘導体。
（３）一般式（I）におけるYが、ビオチン残基、蛍光基、又はトリフルオロアセチル基である（１）又は（２）記載のヌクレオシド誘導体。
（４）アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含む（１）乃至（３）のずれか記載のヌクレオシド誘導体の製造方法。
（５）アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含むDNA又はRNAの標識方法。
（６）アミノ基を有する核酸塩基が、シトシンである（５）記載のDNA又はRNAの標識方法。
（７）標識基又は保護基が、ビオチン残基、蛍光基、又はトリフルオロアセチル基である（５）又は（６）記載のDNA又はRNAの標識方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヌクレオシド誘導体は合成が容易であり、従って、これを利用することにより、DNAチップ等を安価に作製することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）ヌクレオシド誘導体
本発明のヌクレオシド誘導体は、一般式（I）：X-NH-CO-NH-L-Yで表される。
【００１２】
Xはアミノ基を有するヌクレオシドのアミノ基以外の部分を表す。アミノ基を有するヌクレオシドとしては、アデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、シチジン、デオキシシチジンなどを挙げることができる。これらのヌクレオシドの中でも、シチジン及びデオキシシチジンの誘導体は、標識基等が導入されていても塩基対を形成できるため、特に好適なヌクレオシドである。
【００１３】
ヌクレオシドには、保護基が導入されていてもよい。保護基としては、例えば、リボース及びデオキシリボースの５’位の水酸基に導入されるジメトキシトリチル基、アセチル基、ｔ-ブチルジメチルシリル基、リボース及びデオキシリボースの３’位の水酸基に導入されるジメトキシトリチル基、アセチル基、ｔ-ブチルジメチルシリル基、リボースの２’位の水酸基に導入されるジメトキシトリチル基、アセチル基、ｔ-ブチルジメチルシリル基などを例示できる。
【００１４】
Lはリンカーを表す。リンカーは標識基とヌクレオシド間の距離を確保でき、かつ標識基と結合できるものであればどのようなものでもよく、例えば、実施例で使用した-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH-などを使用することができるが、それ以外にも、例えば-(CH2)6NH-、-(CH2)6CONH-、-(CH2)2CONH(CH2)2NH-などを使用することもできる。
【００１５】
Yは標識基又は保護基を表す。標識基は特別なものを用いる必要はなく、DNA等の標識に利用されている一般的なものでよい。例えば、ビオチン残基、蛍光基（例えば、Cy3、Cy5、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、ピレンなどを含む基）、色素を含む基（ジメチルアミノアゾベンゼン、ナフトキノン、インジゴなどを含む基）、スピンをもつ基（例えば、テトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）を含む基）、電気化学的応答分子をもつ基（例えば、フェロセン、アントラキノンなどを含む基）などを標識基として使用することができる。保護基は、DNA合成時等においてリンカーの末端を保護できるものであればどのようなものでもよく、例えば、実施例で使用したトリフルオロアセチル基を一例として挙げることができるが、他にも、フルオレニルメトキシカルボニル基、トリメチルシリルエトキシカルボニル基、ｔ-ブトキシカルボニル基などを使用してもよい。
【００１６】
本発明のヌクレオシドは、後述する「（Ｂ）ヌクレオシド誘導体の製造方法」に記載した方法に従って製造することができる。
（Ｂ）ヌクレオシド誘導体の製造方法
本発明のヌクレオシド誘導体の製造方法は、アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含む。
【００１７】
この工程は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００１８】
一般式（III）：X-NH2（式中、Xは前記と同意義を示す。）で表されるヌクレオシドと、一般式（IV）：Z-COO-R1（式中、Zはハロゲン原子、R1はフェニル基、トリブロモフェニル基、ペンタフルオロフェニル基などを表す。）で表される化合物とを、反応を阻害しない溶媒、例えば、塩化メチレン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド中で、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミンなど）の存在又は非存在下で、0〜50℃で0.5〜2時間反応させる。次に、反応後の溶液から溶媒を留去し、その残渣を、一般式（V）：NH2-L'（式中、L'は標識基との結合によってリンカーを形成する基）で表される物質、例えば、NH2(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH2と、反応を阻害しない溶媒、例えば、ピリジン、塩化メチレン、アセトニトリル中で、25〜50℃で1〜6時間反応させる。反応後の溶液をクロマトグラフィー等によって精製することにより、一般式（VI）：X-NH-CO-NH-L'で表される化合物が得られる。この一般式（VI）で表される化合物のL'の部分に、標識基等を、その基に適した方法によって導入する。これにより、一般式（I）：X-NH-CO-NH-L-Yで表されるヌクレオシド誘導体を製造することができる。
（Ｃ）DNA又はRNAの標識方法
本発明のDNA又はRNAの標識方法は、アミノ基を有する核酸塩基のアミノ基に、一般式（II）：-CO-NH-で表される構造を介して、標識基又は保護基を導入する工程を含む。この工程は、前述の「（Ｂ）ヌクレオシド誘導体の製造方法」の記載に従って行うことができる。この工程によって標識基を持つヌクレオシド又は保護基を持つヌクレオシドが得られる。標識基を持つヌクレオシドについては、これをモノマーの一部としてDNA等を合成することにより、標識されたDNA等を得ることができる。保護基を持つヌクレオシドについては、これをモノマーの一部としてDNA等を合成し、その後、保護基をはずし、標識基を導入することにより、標識されたDNA等を得ることができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕  リンカーが導入されたデオキシシチジン誘導体の合成
以下の合成スキームに従い、４位のアミノ基に-C(O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH-TFAが導入されたデオキシシチジン誘導体（化合物４）を合成した。
【００２０】
【化１】
2006052148.tif 000002
（１）化合物２の合成
2'-デオキシ-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）デオキシシチジン(4.3 g, 8.1 mmol)を無水アセトニトリル（50 mL）に懸濁し、ヘキサメチルジシラザン (3.4 mL, 16 mmol)を加え、60 ℃で30 分間攪拌した。室温に戻し溶媒を減圧下留去した後、残渣を無水ピリジンにより3回共沸し、無水塩化メチレン（80 mL）に溶解させた。無水ピリジン（981 μL, 12.2 mmol）、クロロギ酸フェニル（1.23 mL, 9.7 mmol）を加え、15分間攪拌した。その後、クロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を二度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。残渣にピリジン（40 mL）を加え、2,2’-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)（11.8 mL, 81 mmol）のピリジン溶液（40 mL）中に滴下した。１時間撹拌後、濃アンモニア水（80 mL）を加え、さらに２時間攪拌した。アンモニアおよび溶媒を減圧下留去し、残渣をクロロホルム（100 mL）に加え、重曹水で二度洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。溶出溶媒にピリジン（1%）を加えたNHシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し化合物２を得た（5.30 g, 93%）。
1H NMR (CDCl3) δ 2.04-2.10 (1H, m), 2.51-2.58 (1H, m), 2.74 (3H, t, J = 4.7 Hz), 3.24-3.58 (12H, m), 3.69 (6H, s), 4.05-4.11 (1H, m), 4.31-4.36(1H, m), 6.13 (1H, dd, J = 5.6 Hz, 5.6 Hz), 6.74 (4H, d, J = 8.6 Hz), 7.09-7.45 (10H, m), 7.96 (1H, d, J = 7.6 Hz), 9.02 (1H, br)
（２）化合物３の合成
化合物２（1.41 g, 2 mmol）をエタノール（20 mL）に溶解し、トリエチルアミン（839 mL, 6 mmol）、トリフルオロ酢酸エチル（717 mL, 6 mmol）を加えた。室温で２時間撹拌後、溶媒を減圧下留去した。残渣にクロロホルム（20 mL）を加え、重曹水で二度洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。溶出溶媒にピリジン（1%）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し化合物３を得た（1.47 g, 91%）。
1H NMR (CDCl3) δ 1.20-1.38 (2H, m), 1.43-1.69 (4H, m), 2.05-2.19 (3H, m), 2.42-2.62 (2H, m), 2.66-2.81 (1H, m), 2.93-3.02 (1H, m), 3.21-3.60 (14H, m), 3.69 (6H, s), 4.00-4.09 (1H, m), 4.10-4.17 (1H, m), 4.25-4.31 (1H, m), 4.40-4.45 (1H, m), 4.49 (1H, br), 6.15 (1H, dd, J = 5.0 Hz, 5.6 Hz), 6.75 (4H, d, J = 8.6 Hz), 6.96 (1H, br), 7.09-7.45 (9H, m), 8.01 (1H, d, J = 7.6 Hz), 10.51 (1H, br)
（３）化合物４の合成
化合物３（240 mg, 0.3 mmol）を無水アセトニトリルにより3回共沸脱水したのち、無水塩化メチレン（3 ml）に溶解し、N,N-ジイソプロピルアミン（25.3 mL, 0.18 mmol）、および（2-シアノエトキシ）ビス（N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（114 mL, 0.36 mmol）を加え室温で６時間攪拌した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を二度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。溶出溶媒にトリエチルアミン（1%）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物４を得た（200 mg, 83%）。
1H NMR (CDCl3) δ 1.04-1.17 (12H, m), 2.17-2.28 (1H, m), 2.41-2.71 (3H, m,), 3.21-3.79 (24H, m), 4.13-4.19 (1H, m), 4.63-4.69 (1H, m), 6.19-6.26 (1H, m), 6.78-6.88 (4H, m), 7.18-7.40 (10H, m), 8.02-8.11 (1H), 9.12 (1H, br), 9.66 (1H, br), 10.81 (1H, br)
【００２１】
〔実施例２〕  蛍光標識されたオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
（１）リンカーが導入されたデオキシシチジン誘導体を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
化合物４を無水アセトニトリル-無水DMF（95:5, v/v）を用いて0.1 Mに調整し、DNA/RNA 自動合成機（ABI 392）に装着した。通常のプロトコール（1μmol）に従い、14量体d(C*CCCTAACCCTAAC)及び13量体d(C*CCTAACCCTAAC)を合成した後（C*は４位のアミノ基にC(O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH2が導入されたデオキシシチジン誘導体を表す。）、C18カートリッジを用いて精製した。収率は２８％であった（OD260＝３４から収量を算出）。精製した14量体及び13量体のオリゴデオキシリボヌクレオチドの陰イオン交換HPLCのチャートをそれぞれ図１及び図２に示す。また、これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドのMALDI-TOF-MASSによる分析結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2006052148.tif 000003
（２）蛍光標識オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
Cy3のN-ヒドロキシサクシネートエステル（0.1 μmol）をDMSO(50μl)に溶かし、0.1M炭酸緩衝液(pH8.5-9.00, 50 μl)に溶かしたd(C*CCCTAACCCTAAC) (0.04 μmol、OD260＝５から量を算出)を混ぜ、室温で、１時間撹拌したのち、ゲルろ過してCy3標識DNA14量体デオキシオリゴヌクレオチドを得た（定量的）。
【００２３】
〔実施例３〕  ビオチンで標識されたデオキシシチジン誘導体の合成
以下の合成スキームに従い、４位のアミノ基がビオチンで標識されたデオキシシチジン誘導体（化合物６）を合成した。
【００２４】
【化２】
2006052148.tif 000004
（１）化合物５の合成
化合物２（703 mg, 1 mmol）、(+)-ビオチン（488 mg, 2 mmol）、3-(3-ジメチルアミノプロピル)-1-エチルカルボジイミド・塩酸塩（583 mg, 3 mmol）を無水DMFにより3回共沸脱水したのち、無水DMF(10 mL)に溶解した。60 ℃で3時間攪拌後、酢酸エチル（30 mL）を加え、飽和食塩水および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で二度ずつ洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。溶出溶媒にピリジン（1%）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。溶媒を減圧留去したのち、残渣にクロロホルム（30 mL）を加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で二度洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧流去し、化合物５を得た（857 mg, 92%）。
1H NMR (CDCl3) δ1.20-1.38 (2H, m), 1.43-1.69 (4H, m), 2.05-2.19 (3H, m), 2.42-2.62 (2H, m), 2.66-2.81 (1H, m), 2.93-3.02 (1H, m), 3.21-3.60 (14H, m), 3.69 (6H, s), 4.00-4.09 (1H, m), 4.10-4.17 (1H, m), 4.25-4.31 (1H, m), 4.40-4.45 (1H, m), 4.49 (1H, br), 6.15 (1H, dd, J = 5.0 Hz, 5.6 Hz), 6.75 (4H, d, J = 8.6 Hz), 6.96 (1H, br), 7.09-7.45 (9H, m), 8.01 (1H, d, J = 7.6 Hz), 10.51 (1H, br)
（２）化合物６の合成
化合物５（186 mg, 0.2 mmol）を無水アセトニトリルにより3回共沸脱水したのち、無水塩化メチレン（2 ml）に溶解し、N,N-ジイソプロピルアミン（22.5 μL, 0.16 mmol）、および（2-シアノエトキシ）ビス（N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（95 μL, 0.3 mmol）、1-H-テトラゾール（11.2 μg, 0.16 mmol）を加え室温で2時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を二度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。GS-310カラムを装着したリサイクル分取HPLCを用いて、溶出溶媒としてアセトニトリル、ついでクロロホルム-メタノール-トリエチルアミン（89:10:1, v/v）を流すことで精製し、化合物６を得た（215 mg, 95%）。
1H NMR (CDCl3) δ 1.00-1.05 (3H, m), 1.12-1.18 (9H, m), 1.35-1.46 (2H, m), 1.61-1.76 (4H, m), 2.16-2.24 (3H, m), 2.41 (1H, t, J = 6.2), 2.56-2.72 (3H, m), 2.85-2.91 (1H, m), 3.06-3.13 (1H, m), 3.29-3.37 (1H, m), 3.39-3.66 (16H, m), 3.78 (6H, s), 4.08-4.13 (1H, m), 4.21-4.28 (1H, m), 4.38-4.43 (1H, m), 4.51-4.67 (1H, m), 5.01 (1H, br), 5.93 (1H, br), 6.22 (1H, m), 6.69 (1H, m), 6.80-6.88 (4H, m), 7.21-7.40 (9H, m), 7.41 (1H, br), 8.09-8.19 (1H, m), 9.71 (1H, br), 10.70-10.78 (1H, 2br)
【００２５】
〔実施例４〕  ビオチンで標識されたオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
化合物６を無水アセトニトリル-無水DMF（95:5, v/v）を用いて0.1 Mに調整し、DNA/RNA 自動合成機（ABI 392）に装着した。通常のプロトコール（1μmol）に従い、14量体d(CbioGTTAGGGTTAGGG)を合成した後（Cbioは４位のアミノ基にC(O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH-Biotinが導入されたデオキシシチジン誘導体を表す。）、C18カートリッジを用いて精製した（58.5 OD260、42％）。このオリゴデオキシリボヌクレオチドの陰イオン交換HPLCのチャートを図３に示し、また、MALDI-TOF-MASSによる分析結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2006052148.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で合成した14量体のオリゴデオキシリボヌクレオチドの陰イオン交換HPLCのチャート。
【図２】実施例２で合成した13量体のオリゴデオキシリボヌクレオチドの陰イオン交換HPLCのチャート。
【図３】実施例４で合成したオリゴデオキシリボヌクレオチドの陰イオン交換HPLCのチャート。
【図１】
2006052148.tif 000006
【図２】
2006052148.tif 000007
【図３】
2006052148.tif 000008