(57)【要約】    【課題】  長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、肝癌等の発癌自体を効果的に抑制し得る発癌抑制用経口投与剤の提供。    【解決手段】  クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる発癌抑制用経口投与剤。ＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌等の発癌、ＤＥＮをイニシエーターとする肝癌等の発癌、ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌等の発癌をそれぞれ抑制する、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる発癌抑制用経口投与剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる発癌抑制用経口投与剤。
【請求項２】
経口摂取する発癌物質による発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項３】
ヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項４】
N-ニトロソ化合物をイニシエーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項５】
N-ニトロソ化合物をイニシエーターとしヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項６】
ＭｅＩＱｘをプロモーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項７】
ＤＥＮをイニシエーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項８】
ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする発癌を抑制する請求項１記載の発癌抑制用経口投与剤。
【請求項９】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１０】
経口摂取する発癌物質による肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１１】
ヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１２】
N-ニトロソ化合物をイニシエーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１３】
N-ニトロソ化合物をイニシエーターとしヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１４】
ＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１５】
ＤＥＮをイニシエーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【請求項１６】
ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制する請求項９記載の肝発癌抑制用経口投与剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝癌等の発癌を抑制するための発癌抑制用経口投与剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許第２８２４９１７号公報（特許文献１）には、化学合成により高純度且つ大量に製造し得る物質であって、生体に投与しても毒性や副作用が少なく、高い抗腫瘍作用を発揮する生体応答調節物質として、特定のシアニン色素が開示されている。特許第２８２４９１７号公報記載の、長期に亙って安全且つ簡便に腫瘍治療に使用し得る抗腫瘍剤は、このシアニン色素を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。
【０００３】
特許第２８２４９１７号公報記載の抗腫瘍剤は、肝癌もその対象に含んでいる。日本人の肝癌の発生数は、各種癌の中でも上位にある。肝癌の罹患数は未だ増加傾向にあり、特に高齢者の割合が高まっている。肝癌についても早期発見・早期治療が重要であることは言うまでもないが、現状では、肝癌の早期発見を必ずしも確実には行い得ない。そのため、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、肝癌等の発癌自体を効果的に抑制し得る発癌抑制剤が望まれる。
【特許文献１】特許第２８２４９１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術に存した上記のような課題に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、肝癌等の発癌自体を効果的に抑制し得る発癌抑制用経口投与剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成する本発明の発癌抑制用経口投与剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる。
【０００６】
上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、経口摂取する発癌物質による発癌を抑制するものとすることができる。なお、本発明において、発癌物質というのは、イニシエーター作用及びプロモーターの何れか一方又は両方を有する物質を言う。
【０００７】
また上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、ヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【０００８】
また上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、N-ニトロソ化合物をイニシエーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【０００９】
また上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、N-ニトロソ化合物をイニシエーターとしヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【００１０】
更に、上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、ＭｅＩＱｘをプロモーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【００１１】
また、上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、ＤＥＮをイニシエーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【００１２】
また、上記本発明の発癌抑制用経口投与剤は、ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする発癌を抑制するものとすることができる。
【００１３】
本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなる。
【００１４】
上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、経口摂取する発癌物質による肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００１５】
また上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、ヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００１６】
また上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、N-ニトロソ化合物をイニシエーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００１７】
また上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、N-ニトロソ化合物をイニシエーターとしヘテロサイクリックアミンをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００１８】
更に、上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、ＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００１９】
また、上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、ＤＥＮをイニシエーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【００２０】
また、上記本発明の肝発癌抑制用経口投与剤は、ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌の発癌を抑制するものとすることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の発癌抑制用経口投与剤は、長期に亙って安全且つ簡便に投与し得、肝癌等の発癌自体を効果的に抑制し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００２３】
本発明の発癌抑制用経口投与剤におけるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００２４】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００２５】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
【００２６】
本発明の発癌抑制用経口投与剤の成人に対する投与量は、１日当り１乃至３５ｇ程度が適当である。
【００２７】
本発明の発癌抑制用経口投与剤における経口投与の形態に特に限定はないが、好ましくは、栄養食品、栄養補助食品、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、又は飲料用液体の形態である。
【００２８】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００２９】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００３０】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００３１】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００３２】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００３３】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００３４】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【００３５】
ＭｅＩＱｘ、すなわち2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxalineは、焼け焦げ中に存在するヘテロサイクリックアミンの一種で、肝癌等を発生させるプロモーター（発癌促進物質）である。
【００３６】
ＤＥＮ、すなわちN-nitrosodeethylaminediethylnitrosamineは、N-ニトロソ化合物で、イニシエーター（発癌起始物質）である。
【００３７】
なお、本発明における細胞膜破砕クロレラを経口投与することにより、肝癌等の発癌を抑制することができる。また、本発明における細胞膜破砕クロレラを経口投与することにより、ＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌等の発癌を抑制することができる。また、本発明における細胞膜破砕クロレラを経口投与することにより、ＤＥＮをイニシエーターとする肝癌等の発癌を抑制することができる。更に、本発明における細胞膜破砕クロレラを経口投与することにより、ＤＥＮをイニシエーターとしＭｅＩＱｘをプロモーターとする肝癌等の発癌を抑制することができる。
【実施例】
【００３８】
ＭｅＩＱｘにより誘発された前癌病変に対するクロレラの発癌抑制作用試験
【００３９】
被験物質であるクロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）乾燥粉末（以下、単に「クロレラ」とも言う。）の製造
【００４０】
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］  WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末（株式会社サン・クロレラ製の細胞壁破砕クロレラ粉末）が得られた。
【００４１】
発癌起始物質（イニシエーター）：N−nitrosodiethylamine（ＤＥＮ）〔東京化成工業株式会社製〕
【００４２】
発癌促進物質（ブロモーター）：2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline（ＭｅＩＱｘ）〔株式会社ナード研究所製〕
【００４３】
供試動物：F３４４／DuCrj系雄ラット（SPF動物）を日本チャールス・リバー株式会社より５週齢で入手した。４日間検疫し、全例に異常のないことを確認の上、本試験に用いた。
【００４４】
基礎飼料
【００４５】
オリエンタル酵母工業株式会社製γ線照射（６.０kGy）粉末飼料MFを用いた。
【００４６】
投与飼料・溶液の調製及び投与経路
【００４７】
発癌起始物質（ＤＥＮ）：ＤＥＮ４.０gを量り取り、局方生理食塩液（株式会社大塚製薬工場製）１００mLに溶解させた（４０mg／mL溶液）。ＤＥＮの投与は、この溶液の腹腔内投与を１回行なうことにより行った。
【００４８】
発癌促進物質（ＭｅＩＱｘ）：ＭｅＩＱｘを必要量秤量し、乳鉢で少量の粉末飼料と混合後、約１／３量の基礎飼料とコーンオイル（日本食品加工株式会社製）と共にミキサーで約１０分間混合した。更に残りの飼料を追加して約３０分間混合し投与飼料とした。なお、コーンオイルは飼料の紛立ち防止のため２重量％の割合で添加した。これを経口投与法により投与した。
【００４９】
被験物質（クロレラ）及び発癌促進物質（ＭｅＩＱｘ）：クロレラ及びＭｅＩＱｘをそれぞれ必要量秤量し、ＭｅＩＱｘは乳鉢で少量の粉末飼料と混合後、約１／３量の基礎飼料とコーンオイル（日本食品加工株式会社製）と共にミキサーで約１０分間混合した。更に残りの飼料を追加して約３０分間混合し投与飼料とした。なお、コーンオイルは飼料の紛立ち防止のため２重量％の割合で添加した。これを、ヒトが被験物質を摂取する通常の経路である経口投与法により投与した。
【００５０】
群構成及び使用動物数
９０匹の動物を体重別層化法により、表１に示すように各群１５匹からなる６群に群分けした。実験開始時におけるラットの体重範囲は９４乃至１０８gであった。群分け時の群間の平均体重には統計学的な有意差がないことを確認した。
【００５１】
【表１】
2006069994.tif 000002
【００５２】
試験方法
(１) 第１−３群の動物に対し、前記DEN投与液をＤＥＮ２００mg／kg体重の用量で単回腹腔内投与（投与容量：５ml／kg）した。
【００５３】
第４−６群の動物には、DEN投与液に用いた溶媒である生理食塩液のみ５ml／kgを同様に腹腔内投与した。
(２) 第３及び６群の動物には、前記のように調製した被験物質含有飼料をDEN投与３目前よりDEN投与後第２週まで投与し、それ以降は前記のように調製した被験物質（クロレラ）及び発癌促進物質（ＭｅＩＱｘ）含有飼料を第８週まで投与した。
【００５４】
第１及び４群の動物には、DEN投与日から第８週まで基礎飼料のみを投与した。
【００５５】
第２及び５群の動物には、DEN投与日から第２週までは基礎飼料のみを、それ以降は前記のように調製した発癌促進物質（ＭｅＩＱｘ）含有飼料を第８週まで投与した。
(３) DEN投与後３週経過時には、全動物についてエーテル麻酔下で肝臓の左葉及び中間葉を切除する２／３肝部分切除術（左葉及び中間葉の基部を結紮後、剪刀で切除）を施行した。
【００５６】
検査
【００５７】
投与期間終了後、全動物を解剖前日より絶食させ、エーテル麻酔下に開腹し、腹部大動脈より採血し、放血致死させた後、肝臓を摘出し、次のように免疫組織化学的検査に供した。
【００５８】
肝臓の右葉（頭部）、右葉（尾状部）及び尾状葉（尾状部）から各１片の計３片を約５mm厚に切り出し、１０％緩衝ホルマリン液にて固定した。
【００５９】
次いで、パラフィンブロックを作製し、薄切後、ABC法にて胎盤型Glutathione S−transferase（GST−P）を免疫組織化学的に染色した。
【００６０】
肝臓切片の面積及び直径０．２mm以上のGST−P陽性細胞巣の個数及び面積を、病理標本画像解析装置IPAP−WIN（住化テクノサービス株式会社製）を用いて計測した後、肝臓切片１ｃｍ２当りの個数及び面積を算出し、定量的解析を行った。
【００６１】
さらに、DEN無処置群については、顕微鏡下でGST−P陽性細胞巣を構成する細胞を個数毎に検索し、同様に肝臓切片１ｃｍ２当りの個数も算出した。
【００６２】
試験結果
［DEN処置群］
【００６３】
直径２００μm以上のGST−P陽性細胞巣を画像解析装置を用いて解析した結果、MeIQx単独投与群（第２群）では、GST−P陽性細胞巣の単位面積当たりの個数及び面積の平均値は何れも対照群（第１群）と比較して統計学的に有意な高値認めた。
【００６４】
クロレラ・MeIQx併用投与群（第３群）では、対照群（第１群）と比較した場合にはGST−P陽性細胞巣の単位面積当たりの個数のみ有意な高値を示した。
【００６５】
単位面積あたりのGST−P陽性紬胞巣の発生個数及び面積に基づくクロレラの抑制率を次式により算出した結果、個数では６７．６％、面積では７４．２％であった。
抑制率＝［{（第２群−第１群）−（第３群−第１群）}／（第２群−第１群）］×１００
［DEN無処置群］
【００６６】
光学顕微鏡下で、直径２００μm以下のGST−P陽性細胞巣を構成する細胞の個数毎にカウントし、単位面積当たりの個数を算出したところ、MeIQx単独投与群（第５群）では何れの個数毎の分布（single cell, ２−４ cell,   ５−１０ cell，〉１１ cell及びTotal）においても対照群（第４群）と比較して有意な高値を示した。
【００６７】
またクロレラ・MeIQx併用投与群（第６群）においても何れの個数毎の分布においても対照群（第４群）と比較して有意な高値を示したが、MeIQx単独投与群（第５群）と比較すると１１個以上で構成された陽性細胞巣を除いて何れも有意な低値を示した。
【００６８】
単位面積あたりのGST−P陽性紬胞巣（２個以上の細胞で構成される陽性細胞巣）の発生個数に基づくクロレラの抑制率を次式により算出した結果、５２．０％であった。なお、Single cellは必ずしもGST−P陽性細胞巣として増殖していくものとは言えないことから、抑制率の計算から削除した。
抑制率＝［{（第５群−第４群）−（第６群−第４群）}／（第５群−第４群）］×１００
【００６９】
結論
【００７０】
免疫組織化学的検査では、DEN処置群においてMeIQx投与によりGST−P陽性細胞巣の単位面積あたりの個数及び面積とも有意な高値を示し、さらにクロレラを併用投与することにより、その発生は有意に減少した。また、DEN無処置群で見られたGST−P陽性細胞巣の発生もMeIQx投与により明らかに増加し、クロレラの併用投与によりその発生は抑制された。
【００７１】
クロレラはMeIQxの肝発癌を抑制することが明らかであり、その抑制率はDEN処置条件下におけるGST−P陽性細胞巣の個数で６７.６％、面積で７４.２％、またDEN無処置条件下での個数では５２.０％であった。