(57)【要約】【課題】  β−フルクトフラノシダーゼを改良する際に有用な情報となる、β−フルクトフラノシダーゼの立体構造を知ることができるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶およびその製造方法の提供。【解決手段】  Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９４．３〜９７．３Å、ｂ＝６１．３〜６４．３Å、ｃ＝１１８．６〜１２１．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．０〜１１２．０°である、β−フルクトフラノシダーゼの結晶が提供され、この結晶は、β−フルクトフラノシダーゼから糖鎖を除去し、ポリエチレングリコール等の沈殿剤を用いて析出させて得ることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９４．３〜９７．３Å、ｂ＝６１．３〜６４．３Å、ｃ＝１１８．６〜１２１．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．０〜１１２．０°である、β−フルクトフラノシダーゼの結晶。
【請求項２】
β−フルクトフラノシダーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のものである、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
β−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもの、またはその相同体である、請求項１または２に記載の結晶。
【請求項４】
β−フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１または２に記載の結晶。
【請求項５】
Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、ａ＝９５．５Å、ｂ＝６２．９Å、ｃ＝１２０．７Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．６°である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項６】
β−フルクトフラノシダーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１または２に記載の結晶。
【請求項７】
Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、ａ＝９５．３Å、ｂ＝６２．３Å、ｃ＝１１９．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１１．０°である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項８】
β−フルクトフラノシダーゼが、１分子当たり少なくとも一以上の重金属原子を含んでなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項９】
前記重金属原子が、水銀、金、白金、またはジスプロシウムである、請求項８記載の結晶。
【請求項１０】
β−フルクトフラノシダーゼの結晶の製造方法であって、
β−フルクトフラノシダーゼの糖鎖を除去する工程と、
糖鎖の除去されたβ−フルクトフラノシダーゼと、沈殿剤とを接触させ、β−フルクトフラノシダーゼの結晶を析出させる工程と
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記沈殿剤が無機塩類、水溶性高分子、および有機溶媒からなる群より選択される少なくとも一つのものである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記沈殿剤がポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
析出したβ−フルクトフラノシダーゼの結晶を単離する工程をさらに含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記単離工程が蒸気拡散法より行われる、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、β−フルクトフラノシダーゼの結晶。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、β−フルクトフラノシダーゼの結晶およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、β−フルクトフラノシダーゼを改良する際に有用な情報となる、β−フルクトフラノシダーゼの立体構造を知ることができるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶およびその製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
一般にフラクトオリゴ糖は、ショ糖のフルクトースに１〜３分子のフルクトースがＣ１とＣ２の位置でβ結合しているオリゴ糖であり、難消化性の糖質で、腸内のビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質代謝改善作用、難う蝕性、ミネラル吸収促進作用などの優れた生理効果を有することが見出されている。
【０００３】
フラクトオリゴ糖は、天然では広く植物に分布しており、例えば、タマネギ、アスパラガス、キクイモ、蜂蜜などに含まれていることが知られている。最近では、微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼの転移反応を利用してショ糖から大量に製造する技術が確立され、工業的に生産されている。現在、フラクトオリゴ糖の工業的生産には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のβ−フルクトフラノシダーゼが利用されているが、さらなる高機能化が期待されている。例えば、アスペルギルス・ニガー由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、１−ケストース、ニストース、および１−フルクトシルニストースの混合物としてフラクトオリゴ糖を生成する。このβ−フルクトフラノシダーゼを改良し、単一成分として１−ケストースまたはニストースを選択的かつ効率的に生産することができれば、１−ケストースまたはニストースを高純度に精製し、結晶化させることによって、フラクトオリゴ糖の生理効果を保持し、かつ物性および加工上優れた特性を有する単一成分の結晶フラクトオリゴ糖を製造することが可能となる。
【０００４】
一方、本発明者らは、ショ糖を原料とした結晶１−ケストースの工業的製造法を提案している（特許文献１：国際公開第ＷＯ９７/２１７１８号公報）。すなわち、β−フルクトフラノシダーゼをショ糖に作用させて１-ケストースを生成させ、クロマト分離法により１−ケストースを純度８０％以上に精製した後、これを結晶化原液として純度９５％以上の結晶１−ケストースを得る方法である。この方法に用いられる酵素の特性として、ショ糖から１−ケストースへの変換率が高いこと、ニストースの生成量が低いことが求められる。このような性質を有する酵素を得るために、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の変異による酵素改良が試みられてきた。しかし、これまでの改良は、ランダム変異を用いたり、一次構造から得られた情報をもとにした部位指定変異を用いたものであった（特許文献２：国際公開第ＷＯ９７/３４００４号公報、特許文献３：特願２００４−０６０４２６号公報）。
【０００５】
一方、蛋白質の立体構造に基づいて分子設計を行う手法が知られている。しかしながら、フルクトース残基の転移作用を有する真核生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼに関しては、結晶および立体構造は知られていない。フラクトオリゴ糖を生成するβ−フルクトフラノシダーゼの立体構造を決定することができれば、立体構造に基づく合理的な分子設計手法を適用することが可能となり、ひいては工業的利用に有利な改変酵素を効率的に取得することも可能となる。
【０００６】
ショ糖の加水分解活性のみを有する細菌由来のインベルターゼの立体構造に関しての報告がなされている（非特許文献１：J．Biol．Chem., 279(18), 18903-18910, 2004）。しかしながら、この酵素は転移作用を有しないものであり、転移作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼとの配列類似性は著しく低い。配列類似性が３０％未満の場合、仮に類縁酵素の立体構造が決定されたとしても、転移作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼの立体構造モデルを十分な精度で作成することは困難である。
【０００７】
蛋白質の立体構造を決定する方法として、ＮＭＲ（核磁気共鳴）を利用することができる。ＮＭＲにおいては、測定する蛋白質を結晶化する必要はないが、立体構造を決定できる蛋白質は、一般的に分子量が１万以下の低分子の蛋白質に限定されている。したがって、β−フルクトフラノシダーゼを含む、分子量の大きい大部分の蛋白質は、ＮＭＲによって立体構造を特定することが困難である。
【０００８】
また、蛋白質の立体構造を決定するための他の手法として、Ｘ線構造解析が知られている。Ｘ線構造解析には蛋白質を結晶化することが必要であるが、一般的に蛋白質の結晶化は容易ではない。いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。また、通常、蛋白質の性質に応じて種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。また、沈殿剤の濃度、ｐＨ、塩の種類および濃度などのような添加剤の条件を最適化することも必要となる。さらに、Ｘ線構造解析においていかなる蛋白質の結晶も解析可能であるというわけではない。用いる装置によっても異なるが、蛋白質結晶は、一般的には単結晶で透明性が高く、明確な面と辺をもち、大きさが０．１から０．４ｍｍ程度であることなどが求められる。いずれにしても実際にＸ線を当てたときに、高分解能の回折強度データを与える結晶であることが必要である。したがって、フルクトース残基の転移作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼの立体構造を解析するため、β−フルクトフラノシダーゼの良質な結晶およびその製造方法を創出することが望まれる。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９７/２１７１８号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９７/３４００４号公報
【特許文献３】特願２００４−０６０４２６号公報
【非特許文献１】J．Biol．Chem., 279(18), 18903-18910, 2004
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、今般、β−フルクトフラノシダーゼが有する糖鎖の存在がその結晶化を妨げる大きな要因であり、この糖鎖を除去し、一定条件下にて処理することによりβ−フルクトフラノシダーゼの結晶を得ることができるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、β−フルクトフラノシダーゼの結晶およびその製造方法の提供をその目的としている。
【００１２】
そして、本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９４．３〜９７．３Å、ｂ＝６１．３〜６４．３Å、ｃ＝１１８．６〜１２１．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．０〜１１２．０°であるものである。
【００１３】
また、本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶の製造方法は、β−フルクトフラノシダーゼの糖鎖を除去する工程と、糖鎖の除去されたβ−フルクトフラノシダーゼと、沈殿剤とを接触させ、β−フルクトフラノシダーゼの結晶を析出させる工程とを少なくとも含んでなるものである。
【００１４】
本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折実験において分解能約２．０ÅのＸ線回折強度データを得ることが可能な良質な結晶であり、従って、β−フルクトフラノシダーゼの立体構造の解析を可能とするものである。β−フルクトフラノシダーゼは、フラクトオリゴ糖の製造に用いられる非常に有用な酵素であり、その立体構造を明らかにすることによって効率的な酵素改良が可能となる。従って、立体構造解析を可能にする本発明による結晶が提供されることは、極めて意義がある。
【発明の具体的説明】
【００１５】
（１）本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶の製造方法
（ａ）結晶の素材としてのβ−フルクトフラノシダーゼおよびその発現・精製
本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶の素材としてのβ−フルクトフラノシダーゼは特に限定されないが、植物、カビなどの真核生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼが好ましい。具体的には、β−フルクトフラノシダーゼ活性を有するカビなどを培養して公知の方法により精製したもの、市販されている精製酵素、またはβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子または変異遺伝子を取得し、原核細胞、真核細胞、または無細胞系にて発現させて精製したものを用いることができる。
【００１６】
以下に、β−フルクトフラノシダーゼを得る方法の一つである、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の発現および精製について説明する。β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、真核生物由来のものであれば限定されず、例えば、植物またはカビ由来のものが挙げられるが、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のものである。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子は、例えば、国際公開第ＷＯ９７/３４００４号公報に記載の方法により得ることができる。
【００１７】
β−フルクトフラノシダーゼは、このβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を、宿主細胞内で複製可能かつ発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、とりわけＤＮＡ発現ベクター、の形態とし、これを用いて宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得ることができる。上記ＤＮＡ分子とりわけＤＮＡ発現ベクターは、ベクター分子にβ−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができるが、好ましくはプラスミドである。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００１８】
宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であるが、例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合、β−フルクトフラノシダーゼは不溶性の封入体となる。したがって、宿主細胞は、好ましくカビであり、より好ましくは酵母である。そして、宿主細胞の形質転換により得られる形質転換体を適当な条件にて培養し、得られる培養液から一般的な方法によってβ−フルクトフラノシダーゼの分取や精製を行うことにより、β−フルクトフラノシダーゼの精製品を得ることができる。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明による結晶の素材となるβ−フルクトフラノシダーゼは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもの、またはその相同体であるものが好ましい。ここで「その相同体」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、いくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくはその一方または両末端への付加がなされたものであって、かつそのβ−フルクトフラノシダーゼ作用を保持するものをいう。このような「相同体」は、配列番号１に示される配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造可能であることは明らかであり、その具体例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するβ−フルクトフラノシダーゼを挙げることができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、結晶の素材となるβ−フルクトフラノシダーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである。
【００２０】
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼの糖鎖除去
本発明者らの得た知見によれば、糖鎖の存在が、β−フルクトフラノシダーゼの結晶化を阻害する大きな要因であった。よって、β−フルクトフラノシダーゼの結晶化にあたり、糖鎖を除去することは、本発明による結晶の製造法において重要である。β−フルクトフラノシダーゼからの糖鎖の除去は、適切な反応条件下にて、糖鎖を分解除去する酵素を用いて行うことができる。この酵素は、β−フルクトフラノシダーゼの糖鎖を除去できる酵素であれば、特に限定されないが、例えば、市販品であるグリコペプチダーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）が挙げられる。ＥｎｄｏＨで処理する場合、β−フルクトフラノシダーゼの精製品１ｍｇに対して、約０．２５ＵのＥｎｄｏＨを添加し、ｐＨ５．５、３７℃の条件で反応を行うことが好ましい。β−フルクトフラノシダーゼの糖鎖除去が完了したことは、反応液を電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて処理し、分子量が低下した単一バンドが得られることにより確認することができる。
【００２１】
糖鎖の除去されたβ−フルクトフラノシダーゼは、特に精製することなく次の結晶化の工程に付されてもよいが、好ましくは精製される。この精製は、酵素精製の常法を用いて行うことができる。具体的には、ＵＦ濃縮、脱塩、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などの方法や、他の方法を適宜組合せることにより、高度に精製され、低分子化されたβ−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。        
【００２２】
（ｃ）β−フルクトフラノシダーゼの結晶化
本発明による製造方法にあっては、糖鎖の除去されたβ−フルクトフラノシダーゼを、次に結晶化する。結晶化は、所望により精製された、糖鎖の除去されたβ−フルクトフラノシダーゼと、沈殿剤とを接触させて行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、β−フルクトフラノシダーゼは、それを少なくとも含んでなる液媒体としてβ−フルクトフラノシダーゼに接触させることが好ましい。沈殿剤の作用によりβ−フルクトフラノシダーゼの結晶が析出する。
【００２３】
上記混合液中のβ−フルクトフラノシダーゼの濃度は、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であり、より好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
沈殿剤としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化リチウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノール、エタノールのような低級アルコール、１，６−ヘキサンジオール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの有機溶媒などが挙げられるが、好ましくはポリエチレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール１０００〜１００００である。さらに沈殿剤がそれを少なくとも含んでなる液媒体の形態で用いられる場合には、沈殿剤の他、塩類、緩衝液などの添加剤を適当量加えることが、安定な結晶化の観点から好ましい。ここで、塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。さらに緩衝液は特に限定されないが、好ましくはＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperadinyl]ethansulfonic acid）である。
【００２５】
本発明による製造方法は、好ましくは析出したβ−フルクトフラノシダーゼの結晶を単離する工程をさらに含んでなる。β−フルクトフラノシダーゼの結晶を単離する方法は、特に限定されないが、例えば、バッチ法、ハンギングドロップ法などの蒸気拡散法、マイクロ透析法、シーディング法などが挙げられ、好ましくは蒸気拡散法であり、より好ましくはハンギングドロップ法である。
【００２６】
（２）本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶
本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを与えるものである。Ｘ線回折強度データは、常法に従って処理することにより、結晶学的パラメータを特定することができる。本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９４．３〜９７．３Å、ｂ＝６１．３〜６４．３Å、ｃ＝１１８．６〜１２１．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．０〜１１２．０°であるものである。また、本発明の好ましい態様によれば、β−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、ａ＝９５．５Å、ｂ＝６２．９Å、ｃ＝１２０．７Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．６°であるものである。この態様において、β−フルクトフラノシダーゼは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである。また、本発明の別の好ましい態様によれば、β−フルクトフラノシダーゼの結晶は、Ｘ線回折において、空間群がＰ２１であり、ａ＝９５．３Å、ｂ＝６２．３Å、ｃ＝１１９．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１１．０°であるものである。この態様において、β−フルクトフラノシダーゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである。
【００２７】
さらに、本発明の別の態様によれば、β−フルクトフラノシダーゼの重原子置換結晶が提供される。重原子置換結晶は、類縁蛋白質の立体構造が未知であり、分子置換法による構造解析が不可能な新規蛋白質の立体構造解析において有用である。特にフラクトオリゴ糖を生成する酵素蛋白質の立体構造は未知であり、重原子置換結晶は、重原子同型置換法および多波長異常分散法のような立体構造解析において特に有用である。重原子置換結晶は、ソーキング法および共結晶化法等の公知の方法により得ることができる。例えば、ソーキング法によれば、重金属原子を含む溶液にβ−フルクトフラノシダーゼの結晶をソーキングさせ、重金属原子を結合させることにより重原子置換結晶を得ることができる。また、共結晶化法によれば、重金属原子を含む溶液中においてβ−フルクトフラノシダーゼを結晶化（共結晶化）させることにより重原子置換結晶を得ることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、β−フルクトフラノシダーゼの結晶は、β−フルクトフラノシダーゼが、１分子当たり少なくとも一以上の重金属原子を含んでなるものである。本発明に用いる重金属原子としては、特に限定されないが、好ましくは水銀、金、白金、およびジスプロシウムである。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
β−フルクトフラノシダーゼの結晶化
国際公開第ＷＯ９７／３４００４号公報の実施例Ａに記載された方法に準じて、アスペルギルス・ニガーＡＣＥ−２−１（ＡＴＣＣ２０６０１１）由来の、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するβ−フルクトフラノシダーゼを、酵母を宿主として生産した。次に、得られた培養上清１２Ｌを、０．４５μｍフィルターを用いてろ過し、さらにＵＦ濃縮（ペリコン−２、ミリポア社）した後、Ｑ−セファロースを用いてイオン交換クロマトグラフィーにて分画し、活性画分を得た。この活性画分に対して、０．２５Ｕ／ｍｇ蛋白質となるようにＥｎｄｏＨ（シグマ社）を加え、ｐＨ５．５、かつ３７℃にて１８時間反応させた。この反応液をＱ−セファロースを用いてイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、活性画分を得た。この活性画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量約７０ｋＤａの単一バンドを得た。この活性画分をβ−フルクトフラノシダーゼの精製標品とした。次に、この精製標品を用いて蛋白質濃度１０ｍｇ／ｍLの溶液に調製し、ハンギングドロップ法を用いて、以下のようにβ−フルクトフラノシダーゼの結晶化を行った。
まず、リザーバー液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール３４００、０．２２５Ｍ塩化ナトリウム）を調製した。このリザーバー液を、組織培養用の２４穴リンブロ・プレート（ＩＣＮバイオメディカル社）のウェルに０．５ｍLずつ入れた。次に、１８ｍｍシリコナイズド・ガラスプレート（ハンプトンリサーチ社）上に、１μLの上記精製標品の溶液を加え、さらに１μＬのリザーバー液を加えて混合した後、上記プレートを反転させて上記ウェルに乗せ、グリースを用いて密閉した。２０℃で４〜７日静置した後、β−フルクトフラノシダーゼの結晶を得た。
【００３０】
実施例２
β−フルクトフラノシダーゼ変異体の結晶化
実施例１と同様の方法により、アスペルギルス・ニガーＡＣＥ−２−１（ＡＴＣＣ２０６０１１）由来の、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するβ−フルクトフラノシダーゼを発現させ、それを精製して、β−フルクトフラノシダーゼの精製標品を得た。そして、実施例１と同様に調製した１μＬの精製標品の溶液と、１μＬのリザーバー液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール３４００、０．２２５Ｍ塩化ナトリウム）とを混合し、実施例１と同様にハンギングドロップ法を用い、２０℃で４〜７日静置したところ、β−フルクトフラノシダーゼの結晶を得た。
【００３１】
実施例３
Ｘ線回折強度データの収集
実施例１にて得られたβ−フルクトフラノシダーゼの結晶を、抗凍結剤（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、３０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール３４００、０．２２５Ｍ塩化ナトリウム）を用いて処理し、−１７０℃にて瞬間凍結した。こうして得られたサンプルを用いて、Ｘ線回折測定を行った。検出器としては、Ｒ-ＡＸＩＳＶＩＩ（リガク社製）を使用し、カメラ長を２００ｍｍとし、さらにイメージングプレートを用いた。Ｘ線回折強度データの処理については、クリスタル・クリア（リガク社製）を用いた。Ｘ線回折強度データの処理により、実施例１にて得られたβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９５．５Å、ｂ＝６２．９Å、ｃ＝１２０．７Å、α＝γ＝９０°、β＝１１０．６°、分解能２．３Åを示した。
【００３２】
実施例４
Ｘ線回折強度データの収集
実施例２にて得られたβ−フルクトフラノシダーゼの結晶を、抗凍結剤（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、３０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール３４００、０．２２５Ｍ塩化ナトリウム）を用いて処理し、−１７０℃にて瞬間凍結した。こうして得られたサンプルを用いて、Ｘ線回折測定を行った。検出器としては、Ｒ-ＡＸＩＳＶＩＩ（リガク社製）を使用し、カメラ長を２００ｍｍとし、さらにイメージングプレートを用いた。Ｘ線回折強度データの処理については、クリスタル・クリア（リガク社製）を用いた。Ｘ線回折強度データの処理により、実施例２にて得られたβ−フルクトフラノシダーゼの結晶は、空間群がＰ２１であり、格子定数がａ＝９５．３Å、ｂ＝６２．３Å、ｃ＝１１９．６Å、α＝γ＝９０°、β＝１１１．０°、分解能２．０Åを示した。
【配列表】
2006025707000001.app