(57)【要約】【課題】  腎疾患患者において腎硬化性病変の進行に関与する腎内RAS活性を知るための臨床的指標として、さらには、同疾患患者にAII阻害薬を投与する際にその至適投与量を知る臨床指標として有用なヒト尿中アンジオテンシノーゲンの測定剤の提供。【解決手段】ヒトレニンを含む、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン測定剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレニンを含む、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン測定剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規腎機能測定剤、より具体的には、ヒトレニンを含む、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン測定剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
わが国の慢性透析患者数は、増加の一途をたどっており、腎臓病の治療における重要な問題点の一つは、血液透析が必要となるような腎不全の進行に関与する腎硬化性病変の進行の抑制にある。近年、腎硬化性病変の進行には腎内のレニン・アンジオテンシン系（RAS）が重要な役割を果たしていることが明らかとなり、RASの最も重要な作用因子であるアンジオテンシンII（AII）を抑制するAII受容体拮抗薬やアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬が使用され、一定の腎保護効果を上げている。しかし、これらAII阻害薬による腎保護効果の発現には必要十分な量を投与する必要があるが、AII阻害薬は、腎保護効果を有すると同時に高カリウム血症、糸球体濾過低下、アシドーシスといった腎機能障害患者に投与するにあたっては多くの注意すべき作用を有しており、その至適投与量を知るための適切な臨床的指標は知られていなかった。
【０００３】
AII活性抑制薬の効果の指標としては、腎臓内AII濃度を測定するのが直接的であるが、臨床において患者の腎臓内AII濃度測定方法は確立していない。
【０００４】
また、AIIは、血中にも存在するが、血中AII濃度は、腎臓内AII濃度とは相関しないことから、腎機能障害患者に対するAII阻害薬の投与への臨床的指標としては、適切とはいえない。
【０００５】
RASには、循環血中に由来するRASに加えて、腎などでは組織内で発現する組織特有RASがある。腎内RASにおいては、アンジオテンシノーゲン（Ao）は、主に近位尿細管の上皮細胞によって尿細管に分泌されるが、一部は糸球体内皮細胞や直血管にも発現がみられる（非特許文献１）。また、レニンは傍糸球体装置に加え、糸球体上皮、尿細管上皮にも正常腎で発現している。さらに高血圧や腎疾患患者の腎では、メサンギウム細胞や上皮細胞にもAoやレニンが発現してくる（非特許文献２）。したがって、尿中には腎局所由来のAo、AIIが存在する（特許文献１）。
【０００６】
しかし、尿中Ao及びAIIの臨床的意義は、AIIに関連した高血圧症との関連が示唆されている（特許文献１、非特許文献３、４）のみで、腎機能との関連は、知られていない。
【特許文献１】特表２００２−５２４７２３号公報
【非特許文献１】Kobori H et al. J Am Soc Nephrol 2001,12:431-439
【非特許文献２】Lai KN et al. J Hypertens 1998,16:91-102
【非特許文献３】Kobori H et al. Kidney Int 2002, 61:579-585
【非特許文献４】Kobori H et al. Hypertension 2003, 41:42-49
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン（Ao）測定剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、予想外にも、尿中AII量と腎機能（糸球体濾過率：GFR）とは十分な相関がみられないこと、尿中Ao量は、GFRと負の相関があること、そして、アンジオテンシンII（AII）受容体拮抗薬であるロサルタン服用によって尿中Ao量が減少することを見出し完成された。
【０００９】
また、より簡易かつ迅速な測定のために、尿中Aoを、ヒトレニンを用いてアンジオテンシノーゲンＩ（AI）を生成させ、生成されたAIをラジオイムノアッセイを用いて測定することによって、尿中Aoを測定する方法を開発した。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒトレニンを含む、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン（Ao）測定剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
尿中Ao量は、慢性腎疾患の治療におけるAII阻害薬の投与についての臨床的指標として有用である。
さらに、尿中Ao量は、腎不全をきたす腎硬化性病変の進行に関与する腎内RAS活性を知る臨床的指標としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のヒトレニンは、鈴木らの方法に従い以下の方法で得られたものを用いた。すなわち、ヒトプロレニンｃＤＮＡを含むｐＳＶＤ発現ベクターをリン酸カルシウム法にてＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に導入してヒトプロレニンを産生させた。得られたプロレニンのレニンへの活性化は、プロレニンを５μg/mlのトリプシンで２５℃、１０分間インキュベーションし、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリドで反応を停止したものを用いた（Suzuki et al. Biochem Biophys Res Commun 2000, 267: 577-580）。
【実施例１】
【００１３】
Aoの定量は、サンプル中のAoを過量のヒトレニンによってアンジオテンシンＩ（AI）に変え、そのAIをラジオイムノアッセイ（SRL, Tokyo, Japan）によって定量し、尿サンプルについては尿中クレアチニン（Cre）１ｇ当たりのAI当量として算出した。
【００１４】
すなわち、血漿サンプルを０．２M PBS、１２５M EDTA、１mMカプトプリル及び５０mMフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む溶液を用いて２００倍に希釈し、また、尿サンプルを同様の溶液を用いて１０倍に希釈した。次いで、３５fMヒトレニンを加え３７℃で１８時間インキュベーションした。
【００１５】
生成されたAIをフロリジル３０mgに吸着させ、これを純水で洗浄後、０．５Ｎ  ＨＣｌを含むアセトンで抽出し、ラジオイムノアッセイにて定量した。このヒトレニンとの反応で生成されたAI量から元来サンプル中にあるAI量を差し引くことでサンプル中のAo量をAI当量として算出した。なお、尿サンプル内のAoから生成されるAIは、３５fMヒトレニンとの３７℃、１８時間以上のインキュベーションにて上限量での平衡に達することが確認されている。
【００１６】
結果１：尿中Ao量は、各種の慢性腎疾患における腎機能（糸球体濾過率：GFR）と負の相関を呈する。
AII抑制性の薬剤を服用していない慢性腎疾患患者５４例（GFR；４〜１１０ｍｌ／分）において、GFRと、血漿中と尿中のAo、アンジオテンシンII（AII）、アルドステロン（Ald）、血漿レニン活性、尿蛋白、尿中IV型コラーゲン（Col IV）、平均血圧との関連を調べたところ、GFRとの単相関は尿中Ao、尿中AII、尿中Col IV、尿蛋白、平均血圧でみられたが、尿中Aoが最もGFRと負の相関（r=-0.768）が強く、かつ、尿中Aoは、腎内の細胞外基質の発現との関連が報告されている尿中Col IV（非特許文献５）と強い正の相関（r=0.839）を認めた。GFRと相関する上記の変数の中で、尿中Aoと多重共線性が高い尿中Col IVを除いた尿中Ao、尿中AII、尿蛋白、平均血圧のうち、重回帰分析によりGRFと有意な関連性を呈するのは尿中Aoのみであった。(図１、表１、２)
一方、尿中Aoは血漿レニン活性、血漿Ao、血漿AII、血漿Aldとは相関は見られなかった。
【非特許文献５】Tomino Y et al. J Clin Lab Anal 2001, 15:188-192
【００１７】
ＡII抑制性の薬剤を服用していない慢性腎疾患患者５４例におけるGFRとの相関検定の結果を示す。
（表１）
変数                 相関係数r         p値
log(尿中Ao)           -0.768          <0.0001
log(尿中AII)          -0.437           0.0008
log(尿中Ald)           0.165           0.2336
log(尿蛋白)           -0.364           0.0077
log(尿中Col IV)       -0.743          <0.0001
log(血漿レニン活性)    0.147           0.2948
log(血漿Ao)            0.l99           0.1494
log(血漿AII)          -0.093           0.5041
log(血漿Ald)          -0.137           0.3245
尿中Ao                -0.519          <0.0001
尿中AII               -0.371           0.0054
尿中Ald                0.166           0.2303
尿蛋白                -0.308           0.0232
尿中Col IV            -0.437           0.0009
血漿レニン活性         0.098           0.4840
血漿Ao                 0.201           0.1465
血漿AII               -0.038           0.7840
血漿Ald               -0.180           0.1927
平均血圧              -0.418           0.0016
【００１８】
表１においてGFRと相関する変数の中で、尿中Aoと多重共線性が高い尿中Col IVを省いた尿中Ao、尿中AII、尿蛋白、平均血圧のうち、重回帰分析によりGRFと有意な関連性を呈するのは尿中Aoのみであることが明らかとなった。
（表２）
│R│=0.798、R2 = 0.636
回帰係数     標準誤差    標準回帰係数     t値        p値
log(尿中Ao)        -53.573      8.486       -0.885           -6.311     <0.0001
log(尿中AII)       -7.216       10.600      -0.070           -0.681     0.4994
log(尿蛋白)        18.252       9.244       0.244            1.975      0.0542
平均血圧           -0.073       0.249       -0.031           -0.295     0.7691
│R│=0.604、R2 = 0.365
回帰係数     標準誤差    標準回帰係数     t値        p値
尿中Ao             -0.727       0.277       -0.436           -2.628     0.0114
尿中AII            -0.273       0.150       -0.221           -1.814     0.0758
尿蛋白             0.002        0.004       0.069            0.434      0.6659
平均血圧           -0.447       0.308       -0.189           -1.450     0.1534
【００１９】
結果２：尿中AoはAII阻害薬ロサルタン服用後、有意に減少する。
AII抑制性の薬剤を服用していない慢性腎疾患患者２３例（GFR；６〜１１０ｍｌ／分）においてロサルタン２５mg服用開始前と服用２週間後での変化を調べたところ、血漿Ald、尿中AII、尿中Ald、尿中Col IVに有意な変化はなく、血漿レニン活性、血漿AIIは増加したにもかかわらず、尿中Aoは有意に減少した（表３）。
【００２０】
ＡII抑制性の薬剤を服用していない慢性腎疾患患者２３例におけるロサルタン２５mgを服用開始前と服用２週間後での血漿中・尿中ＲＡＳ関連因子の変化を示す。ロサルタン２５mgの２週間投与により尿中AII、尿中Ald、尿中Col IV、血漿Ald、平均血圧に有意な変化はなく、血漿レニン活性、血漿AIIは増加したにもかかわらず、尿中Ao、尿蛋白、血漿Aoは有意に減少した。
（表３）
投与前         投与２週間後     p値
尿中Ao（μg AI当量/g Cre）      7.2±2.6       4.8±1.6         0.0350
尿中AII（ng/g Cre）             31.5±6.0      42.0±10.3       0.1547
尿中Ald（μg/g Cre）            3.3±0.7       3.2±0.7         0.7420
尿蛋白（mg/day）                1597±326      830±182         0.0011
尿中Col IV（μg/g Cre）         10.3±3.0      7.3±2.3         0.1787
血漿レニン活性（ng/ml/hr）      1.6±0.4       3.9±0.9         0.0019
血漿Ao（ng/ml AI当量）          428.4±36.6    369.0±30.4      0.0170
血漿AII（pg/ml）                6.7±1.1       14.3±3.3        0.0141
血漿Ald（pg/ml）                66.0±12.3     69.9±16.0       0.7398
平均血圧（mmHg）                92±4          85±3            0.0677
値は平均値±標準誤差を示す
【００２１】
結論：各種の慢性腎疾患において、尿中Ao量は、血中RAS活性とは関連がなく、腎内RAS活性が亢進して腎硬化性病変が強くGFRが低下している患者ほど高値であり、ロサルタン服用にて減少することから、腎内RAS活性の指標となると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
尿中Ao量は、腎疾患患者において腎硬化性病変の進行に関与する腎内RAS活性を知るための臨床的指標として、さらには、同疾患患者にAII阻害薬を投与する際にその至適投与量を知る臨床的指標として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＡII抑制性の薬剤を服用していない慢性腎疾患患者５４例における、A〜Cは、RAS関連の尿中生理活性物質濃度とGFRとの値を示した散布図である。AはGFRと尿中Ao（r=-0.768、p<0.0001）、BはGFRと尿中AII（r=-0.437、p=0.0008）、CはGFRと尿中Ald（r=0.165、p=0.2336）である。尿中AoはGFRと強い負の相関が認められる。Dは、同患者における尿中Aoと尿中Col IVの値を示す。尿中Aoと尿中Col IVには強い正の相関（r=0.839、p<0.0001）が認められる。
【図１】
2006280320.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月9日(2005.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレニンを含む、ヒト尿中アンジオテンシノーゲン測定剤。
【請求項２】
ヒトレニンを用いてアンジオテンシノーゲンＩを生成させ、生成されたアンジオテンシノーゲンＩをラジオイムノアッセイを用いて測定することによって、ヒト尿中アンジオテンシノーゲンを測定する方法。
【請求項３】
ヒトレニンが、ヒトプロレニンをトリプシンを用いて活性化したものである、請求項２に記載の方法。