(57)【要約】【課題】  形態異常誘導遺伝子を利用した又は植物の作成方法において、マーカーフリーの組織の作成効率を向上させる。【解決手段】  まず、目的遺伝子、サイトカイニン合成遺伝子以外の選抜マーカー遺伝子、及び、脱離部位を有し、上記選抜マーカー遺伝子が脱離部位に配されている目的遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入し、選抜マーカー遺伝子の発現を指標としてこの細胞を選抜する。次いで、この植物細胞に、形態異常誘導遺伝子、脱離酵素遺伝子、及び、脱離部位を有し、形態異常誘導遺伝子と脱離酵素遺伝子とが脱離部位に配されている選抜マーカー除去用ベクターを導入し、形態異常誘導遺伝子の発現によって生じる、培養組織の形態変化を指標として、マーカーフリーの遺伝子導入細胞又は組織を選抜する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞又は組織の作成方法であって、次の過程（Ａ）〜（Ｄ）を経ることを特徴とする方法。
（Ａ）目的遺伝子、サイトカイニン合成遺伝子以外の選抜マーカー遺伝子、及び、脱離部位を有し、上記選抜マーカー遺伝子が脱離部位に存在することを特徴とするベクターを、植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、上記選抜マーカー遺伝子の発現を指標として、目的遺伝子が導入された植物細胞を選抜する過程
（Ｃ）形態異常誘導遺伝子、脱離酵素遺伝子、及び、脱離部位を有し、形態異常誘導遺伝子と脱離酵素遺伝子とが、脱離部位に存在することを特徴とするベクターを、（Ｂ）で選抜された植物細胞に導入する過程
（Ｄ）（Ｃ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、その結果、該細胞が増殖して得られる組織より生じる、異常な形態をした組織を選抜する過程
（Ｅ）（Ｄ）で選抜された異常な形態をした組織を培養し、その結果生じる、正常な形態をした組織を選抜する過程
【請求項２】
脱離部位が、互いに同方向を向いた二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた領域であり、脱離酵素遺伝子が、上記二つの部位特異的組換え酵素認識配列を認識して作用する部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選抜マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
選抜マーカー遺伝子として、ＧＵＳ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子を用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
選抜マーカー遺伝子として、ｒｏｌ遺伝子を用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
形態異常誘導遺伝子として、サイトカイニン合成遺伝子を用いることを特徴とする、請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
サイトカイニン合成遺伝子として、ｉｐｔ（isopentenyltransferase）遺伝子を用いることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５又は６に記載の方法により選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞又は組織を作成した後、これを増殖させて、植物体を再分化させることを特徴とする、選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入植物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞、組織又は植物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物分野での遺伝子導入技術の進歩は目覚しく、遺伝子導入によって新規な形質を付与した組換え農作物が作出されるようになり、既に、野外で大規模に栽培されている。
【０００３】
植物への遺伝子導入では、このように所定の形質を付与するため植物細胞への導入が企図される遺伝子、即ち目的遺伝子は、選抜マーカー遺伝子と共に植物細胞に導入され、その植物細胞への選抜マーカー遺伝子の導入の有無、つまりはその植物細胞における選抜マーカー遺伝子の発現の有無が、目的遺伝子導入の指標として用いられるのが普通である。
【０００４】
しかし、遺伝子導入細胞の選抜に用いられた選抜マーカー遺伝子は、その細胞に存在し続け、更に、かかる細胞を起源として作成された遺伝子導入植物の細胞にも伝達されて存在し続けるため、様々な障害を与える。
【０００５】
例えば、遺伝子導入技術を利用した植物育種を行おうとする場合において、いったん、ある選抜マーカー遺伝子を用いて遺伝子導入を行い、遺伝子導入植物を作成してしまうと、この遺伝子導入植物に対しては、先に用いられた選抜マーカー遺伝子と同一の選抜マーカー遺伝子を用いて遺伝子導入を行うことは、二度とできない。すでに、その植物細胞には、この選抜マーカー遺伝子が存在しているため、再びこれと同一の選抜マーカー遺伝子を新たな目的遺伝子と共に導入しても、新たな目的遺伝子が導入されようがされまいが、その植物の細胞や組織ではこれが常に発現し、新たな目的遺伝子導入の指標とすることは、もはやできないからである。従って、このような遺伝子の多重導入は、各遺伝子の導入毎に異なる選抜マーカー遺伝子を用いなければならない。しかし、現在実用できる選抜マーカー遺伝子の種類はごく限られており、このことが、ある植物に遺伝子の多重導入を行うことのできる回数を制約して、より有用かつ実用的な形質をその植物に付与する試みを困難なものとしている。また、そもそも、遺伝子導入植物が選抜マーカー遺伝子を保持するものである限り、どのように遺伝子導入技術を駆使し、どのように画期的な形質を付与したとしても、これを食用等に供することについて、社会的な同意を得るのは、現状では非常に困難である。
【０００６】
従って、遺伝子導入細胞の選抜後、選抜に用いた選抜マーカー遺伝子を、それが存在し、機能する染色体等のＤＮＡから除去するなどして、その影響を、遺伝子導入細胞、組織、更には植物体から排除する技術は、遺伝子工学技術を用いた植物育種の新たな展開に必須のものであると言える。
【０００７】
このような技術として、本出願人は、先に、選抜マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を利用し、植物細胞への遺伝子導入に際し、この選抜マーカー遺伝子をトランスポゾンや部位特異的組換え系等と組合せて用いることにより、選抜マーカー遺伝子の影響を排除した、いわゆるマーカーフリーの遺伝子導入植物を作成する方法を提案した（例えば、特許文献１、特許文献２）。
【０００８】
この方法によれば、目的遺伝子と共に植物細胞の染色体ＤＮＡ等に導入された選抜マーカー遺伝子は、一定期間の経過後、トランスポゾンや部位特異的組換え系の働きにより、導入されたＤＮＡから除去され、しかも、そのＤＮＡへの導入及び除去が、遺伝子導入細胞に由来する組織の形状変化として、肉眼で容易に検出できる。つまり、この方法では、まず、遺伝子導入処理後の植物細胞を適当な条件下で培養し、この培養細胞が増殖して生じてくる組織の中から、形態異常を示す組織を選抜すれば、選抜マーカー遺伝子と目的遺伝子とが染色体ＤＮＡ等に導入された植物細胞及び組織を得ることができ、次いで、この形態異常を示す組織をやはり適当な条件下で培養し、その後、この組織から生じてくる、今度は正常な形態を示す組織を選抜すれば、そのＤＮＡから選抜マーカー遺伝子が除去されて目的遺伝子のみがこの染色体ＤＮＡ等に残留し続けている遺伝子導入細胞及び組織、換言すれば選抜マーカー遺伝子の影響が排除された、マーカーフリーの遺伝子導入細胞及び組織を得ることができ、更に、かかる細胞及び組織からマーカーフリーの遺伝子導入植物を得ることができる。
【０００９】
【特許文献１】特開平９−１５４５８０
【特許文献２】特開平１０−３２７８６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記方法において、選抜マーカー遺伝子の染色体ＤＮＡ等への導入及び除去が、遺伝子導入細胞に由来する組織の形状変化をもたらすのは、この選抜マーカー遺伝子が形態異常誘導遺伝子であるため、目的遺伝子と共に植物の染色体ＤＮＡ等に導入され、発現することによって、その植物細胞の増殖・分化の方向を狂わせて、通常とは異なる、つまり異常な形態分化を引き起こすためである。
【００１１】
しかし、形態異常誘導遺伝子の一つである、サイトカイニン合成遺伝子を植物の染色体ＤＮＡに導入すると、その発現産物であるサイトカイニンが、隣接する非遺伝子導入細胞にも影響を及ぼし、その結果、遺伝子導入細胞のみならず、非遺伝子導入細胞までもが異常な形態分化を起こしてしまうことがある。このため、上記方法において、選抜マーカー遺伝子である形態異常誘導遺伝子としてサイトカイニン合成遺伝子を用いた場合には、遺伝子導入処理後の植物細胞より生じてくる形態異常を示す組織の中には、選抜マーカー遺伝子はもちろん、目的遺伝子も全く導入されていない非遺伝子導入細胞からなる組織や、遺伝子導入細胞とこのような非遺伝子導入細胞とが混在するキメラ組織が含まれる可能性も高く、結果的に、マーカーフリーの細胞・組織の作成効率が低下するという問題があった。
【００１２】
本発明は、かかる問題点に鑑み、形態異常誘導遺伝子を利用したマーカーフリーの遺伝子導入細胞、組織又は植物の作成方法において、マーカーフリーの組織の作成効率を向上させることを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明は、選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞又は組織の作成方法であって、次の過程（Ａ）〜（Ｄ）を経ることを特徴とする。
（Ａ）目的遺伝子、サイトカイニン合成遺伝子以外の選抜マーカー遺伝子、及び、脱離部位を有し、上記選抜マーカー遺伝子が脱離部位に存在することを特徴とするベクターを、植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、上記選抜マーカー遺伝子の発現を指標として、目的遺伝子が導入された植物細胞を選抜する過程
（Ｃ）形態異常誘導遺伝子、脱離酵素遺伝子、及び、脱離部位を有し、形態異常誘導遺伝子と脱離酵素遺伝子とが、脱離部位に存在することを特徴とするベクターを、（Ｂ）で選抜された植物細胞に導入する過程
（Ｄ）（Ｃ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、その結果、該細胞が増殖して得られる組織より生じる、異常な形態をした組織を選抜する過程
（Ｅ）（Ｄ）で選抜された異常な形態をした組織を培養し、その結果生じる、正常な形態をした組織を選抜する過程
【発明の効果】
【００１４】
本発明においては、まず、目的遺伝子、サイトカイニン合成遺伝子以外の選抜マーカー遺伝子、及び、脱離部位を有し、上記選抜マーカー遺伝子を脱離部位に配したベクター（以下、目的遺伝子導入用ベクターという。）を植物細胞に導入し、選抜マーカー遺伝子の発現を指標として、その染色体ＤＮＡ等に目的遺伝子が導入された植物細胞を選抜するので、遺伝子導入細胞を確実に選抜することができる。
【００１５】
さらに本発明は、上記のようにして選抜された遺伝子導入細胞に対し、形態異常誘導遺伝子、脱離酵素遺伝子、及び、脱離部位を有し、形態異常誘導遺伝子と脱離酵素遺伝子とを、脱離部位に配したベクター（以下、選抜マーカー除去用ベクターという）を導入するので、目的遺伝子と共に遺伝子導入細胞の染色体ＤＮＡ等に導入されていた選抜マーカー遺伝子は、その染色体ＤＮＡ等から除去される。
【００１６】
従って、本発明によれば、遺伝子導入処理後の植物細胞から、非遺伝子導入細胞からなる組織や、遺伝子導入細胞と非遺伝子導入細胞とが混在するキメラ組織が選抜する可能性を低減させ、その後の過程において、マーカーフリーの細胞及び組織の作成効率を向上させることができる。
【００１７】
しかも、選抜マーカー遺伝子の除去は、選抜マーカー除去用ベクターに配した形態異常誘導遺伝子の働きにより、遺伝子導入細胞に由来する組織の形状変化として、肉眼で容易に検出できるので、上記マーカーフリーの細胞及び組織の作成を容易に行うことができる。
【００１８】
また、本発明においては、選抜マーカー遺伝子の導入と除去とを２段階に分けて行う。つまり、まず、目的遺伝子導入用ベクターを用いて目的遺伝子と共に選抜マーカー遺伝子を導入し、次いで、選抜マーカー除去用ベクターを用いて選抜マーカー遺伝子を除去するので、選抜マーカー遺伝子を除去するタイミングを人為的に調節することができ、実用上、非常に便利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
まず、本発明において用いるベクターの構造について説明する。
【００２１】
本発明においては、目的遺伝子、サイトカイニン合成遺伝子以外の選抜マーカー遺伝子、及び、脱離部位を有し、上記選抜マーカー遺伝子を脱離部位に配した、目的遺伝子導入用ベクターと、形態異常誘導遺伝子、脱離酵素遺伝子、及び、脱離部位を有し、形態異常誘導遺伝子と脱離酵素遺伝子とを、脱離部位に配した、選抜マーカー除去用ベクターとを用いる。
【００２２】
目的遺伝子導入用ベクターに配される目的遺伝子の種類、つまり、本発明の方法により植物細胞に導入することができる目的遺伝子の種類に特に限定はない。例えば、高成長性を付与するC２C１A遺伝子（ペルオキシダーゼ遺伝子）、耐乾燥性を付与するｇｏｌｓ遺伝子、耐塩及び耐乾燥性を付与するｃｏｄＡ遺伝子、耐冷性を付与するデサチュラーゼ遺伝子など、農業的に優れた形質を付与できる遺伝子、農業的に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、目的に応じて種々選択することができる。さらに、厳密には遺伝子と言えないが、所定の構造を有し、所定の機能を細胞内で果たすＤＮＡ因子も、本発明でいう目的遺伝子として植物細胞に導入することができる。例えば、このような場合として、遺伝子の発現抑制を目的として、その遺伝子の転写調節因子をアンチセンス方向に配置した構造を導入する場合等が考えられる。
【００２３】
目的遺伝子導入用ベクターに用いる選抜マーカー遺伝子としては、目的遺伝子が植物細胞の染色体ＤＮＡ等に導入された場合の指標となって、かかる細胞の選抜を可能とするものであれば、何であれ用いることができる。このような選抜マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子、及び、ビアラホス（bialaphos）に対する耐性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(ｂａｒ遺伝子)等の除草剤耐性遺伝子のような、いわゆる薬剤耐性遺伝子を始め、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子等の視覚的選抜を可能とする遺伝子、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes：以下、Ａ．リゾジェネスと略す。）のＴ−ＤＮＡ上に存在するｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ及び／又はｒｏｌＣ等からなるｒｏｌ遺伝子など、汎用のものを使用することができる。また、これらの選抜マーカー遺伝子を２種類以上組合せて使用しても構わない。ただし、本発明の目的遺伝子導入用ベクターに用いる選抜マーカー遺伝子として、サイトカイニン合成遺伝子を使用することはできない。サイトカイニン合成遺伝子を選抜マーカー遺伝子として使用した場合には、遺伝子導入処理後の植物細胞から、非遺伝子導入細胞からなる組織や、遺伝子導入細胞と非遺伝子導入細胞とが混在するキメラ組織が選抜される可能性が高くなり、その後の過程において、マーカーフリーの細胞及び組織の作成効率が低下するからである。
【００２４】
一方、選抜マーカー除去用ベクターに用いる形態異常誘導遺伝子としては、その発現によって、宿主細胞の増殖・分化の方向を狂わせて、通常とは異なる形態分化を引起こす遺伝子全般を用いることができる。かかる遺伝子として、代表的には、宿主植物に矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根頭癌腫、毛状根、葉の波打ち等を引起こす、植物ホルモン合成系遺伝子や植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子など、植物ホルモン関連遺伝子を例示することができる。
【００２５】
ここで、植物ホルモン合成系遺伝子とは、サイトカイニン合成遺伝子のように、植物ホルモンの合成に関与するタンパク等をコードする遺伝子を意味し、植物病原菌であるアグロバクテリウム等に存在するｉｐｔ（isopentenyltoransferase）遺伝子（A. C. Smigocki、L. D. Owens、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:5131、1988）、ｉａａＭ（tryptophan monooxygenase）遺伝子（H. J. Klee et al.、GENES & DEVELOPMENT、1:86、1987）、ｇｅｎｅ５遺伝子（H. kerber et al.、EMBO Journal、10:3983、1991）、ｇｅｎｅ６ｂ遺伝子（P. J. J. Hooyaas et al.、Plant Mol. Biol.、11:791、1988）、及びｒｏｌ遺伝子群（F. F. White et al.、J. Bacteriol.、164:33、1985）、シュードモナス・シリンガエの亜種（Pseudomonas syringae subsp. savastanoi）に存在するｉａａＬ（indoleacetic acid-lysine synthetase）遺伝子（A. Spena et al.、Mol. Gen. Genet.、227:205、1991）、更には、種々の植物のホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等が知られている。
【００２６】
植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子とは、ジベレリン、エチレン、オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンの存在を認識するセンサーや、そのセンサーからの情報を伝達していく、一連の情報伝達経路に関わるタンパクをコードする遺伝子を意味し、エチレン受容体遺伝子であるＥＴＲ１遺伝子（C. Chang et al.、Science、262:539、1993）、サイトカイニン受容体遺伝子であると考えられているＣＫＩ１遺伝子（T. Kakimoto、Science、274:982、1996）とその変異体（ex.ＣＫＩ２遺伝子）及びＧＣＲ１遺伝子（S. Plakidou-Dymock et al.、Current Biology、8:315、1998）の他、ＩＢＣ６遺伝子及びＩＢＣ７遺伝子（I. Brandstatter、J. J. Kieber、The Plant Cell、10:1009、1998）等が知られている。
【００２７】
本発明の選抜マーカー除去用ベクターにおいては、これら形態異常誘導遺伝子のいずれをも使用することができる、しかし、中でも特に、頂芽優勢の崩壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子は、特徴的な形態の異常を引き起こし、植物個体の再分化を妨げることから、植物に用いる形態異常誘導遺伝子として好ましい。
【００２８】
また、本発明の目的遺伝子導入用ベクター及び選抜マーカー除去用ベクターにおいて脱離部位とは、植物細胞のＤＮＡに組込まれた場合に、特定の脱離酵素の働きにより、そのＤＮＡから脱離する、ある範囲を有するＤＮＡ領域をいい、このような脱離部位及び脱離酵素遺伝子としては、例えば、部位特的組換え系に由来するものやトランスポゾン等を用いることができる。
【００２９】
部位特異的組換え系は、特徴的なＤＮＡ配列を有する組換え酵素認識配列、及び、組換え酵素認識配列を認識して、この認識配列が２以上存在したとき、その配列間の組換えを触媒する組換え酵素、という２つの要素からなっている。そして、この組換え酵素認識配列が同一ＤＮＡ分子上に、互いに同方向を向いてある一定の間隔で二つ存在している場合には、これに挟まれた領域がこのＤＮＡ分子から脱離する、という挙動を示すので、本発明では、部位特異的組換え系の互いに同方向を向いた二つの組換え酵素認識配列に挟まれた領域を脱離部位、このとき組換え酵素認識配列を認識して作用する組換え酵素を脱離酵素、該組換え酵素をコードする遺伝子を脱離酵素遺伝子として利用する。また、選抜マーカー遺伝子、又は、形態異常誘導遺伝子及び脱離酵素遺伝子を脱離部位に配するには、これらの遺伝子を、上記の互いに同方向を向いた二つの組換え酵素認識配列に挟まれた領域であって、その脱離に影響を及ぼさない位置に配すればよい。
【００３０】
なお、組換え酵素認識配列、及び、この認識配列を認識して作用する組換え酵素の組合せとしては、現在、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、ｃｅｒ系、ｆｉｍ系など、ファージ、細菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたもののみが知られており（総説として、N L. Craig、Annu. rev. genet.、22:17、1988）、高等生物ではまだその存在を知られていない。しかし、微生物から分離されたこれらの組換え酵素認識配列及び組換え酵素も、その由来する生物種と異なる生物種、即ち、植物や動物に導入された場合でも、そもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっており、本発明においても、こうした組換え酵素認識配列及び組換え酵素の組合せを自由に選択し、脱離部位を構成し、また、脱離酵素として利用することができる。中でも、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系は、動物、植物等で広く用いられており、組換え効率も高いので、こうした組合わせとして好ましい。もっとも、本発明において、組換え酵素認識配列は、上記野生型の認識配列だけではなく、そのＤＮＡ配列が一部改変された、変異型認識配列を用いることもできる。ただし、このとき、変異型認識配列は、脱離酵素として用いる、組換え酵素により認識され得るものであることを要する。
【００３１】
一方、本発明の脱離部位及び脱離酵素遺伝子としてトランスポゾンを用いる場合には、非自律性のトランスポゾンを用いる。このとき、トランスポゾン本体を脱離部位、その転移酵素を脱離酵素、該転移酵素遺伝子を脱離酵素遺伝子として利用することができる。選抜マーカー遺伝子、又は、形態異常誘導遺伝子及び脱離酵素遺伝子を脱離部位に配するには、これらの遺伝子を、トランスポゾン本体内部の、その脱離に影響を及ぼさない位置に配すればよい。この意味において、これらの遺伝子の位置は、トランスポゾン本体の内部であって、転移酵素が結合する末端領域よりは下流に配することが好ましい。なお、トランスポゾンは、通常、転移酵素の働きによりその存在するＤＮＡ上から脱離し、その後、ＤＮＡ上の新たな部位に転移するが、一定の確率で転移できぬままその機能を失い、消失等する場合も生ずるので、本発明ではこのようなトランスポゾンの転移ミスを利用する。
【００３２】
非自律性トランスポゾンは、ＤｓやｄＳｐｍを始め（H. -P. D〓ring and P. Starlinger、Ann. Rev. Genet.、20:175、1986）、トウモロコシ、キンギョソウ、アサガオ等の多くの植物から単離されている（例えば、Y. Inagaki et al.、Plant Cell、6:375 、1994）。これらのトランスポゾンも、その由来する植物と、異なる種類の植物の染色体ＤＮＡ等に導入された場合にも、その能力を発揮して脱離し、転移することが多くの例で知られている（例えば、B. Baker et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83:4844 、1986）ので、本発明においても、こうした非自律性トランスポゾンを自由に選択して利用することができる。
【００３３】
次に、上記ベクターを用いて行う、本発明による選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞及び組織の作成方法について説明する。
【００３４】
この方法においては、まず、上記構造を有する目的遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入することにより、目的遺伝子及び選抜マーカー遺伝子を、その染色体ＤＮＡ等に導入する。植物細胞への導入法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等の物理的・化学的手法による直接的な導入法の他、植物に感染するウイルスや細菌を介して行う、間接的な導入法も使用することができる（I. Potrykus、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、42:205、1991）。この場合、ウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等が使用でき、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciense：以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、Ａ．リゾジェネス等が使用できる。
【００３５】
目的遺伝子導入用ベクターを導入した植物細胞は、適当な培地を用いて培養し、目的遺伝子と共に染色体ＤＮＡ等に導入された選抜マーカー遺伝子の発現を指標として選抜する。このとき培地としては、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ（T. Murashige and F. Skoog、Physiol. Plant.、15:473、1962））やガンボーグのＢ５等、植物の組織培養用培地として公知の基本培地又はこれを希釈したものに、必要に応じ、ショ糖等の炭素源、及び／もしくは、サイトカイニンやオーキシン等の植物ホルモンを添加した固体又は液体培地を用いることができる。ただし、使用する選抜マーカー遺伝子の種類によっては、その発現を検出するため、必要な成分を培地中に添加する必要がある。例えば、選抜マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を使用した場合には、対応する薬剤を培地中に添加して選抜マーカー遺伝子の発現を検出する必要があり、ＧＵＳ遺伝子を使用した場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドシクロヘキシルアンモニウム塩を、ルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合にはルシフェリンを培地中に添加して、選抜マーカー遺伝子の発現を検出する必要がある。なお、培養温度や湿度、光強度等の培養環境条件は、その植物細胞の培養に適した条件を適宜採用すればよい。
【００３６】
次いで、上記培養により選抜された植物細胞に、選抜マーカー除去用ベクターを導入し、この細胞を培養する。すると、その細胞は、選抜マーカー除去用ベクターに配した形態異常誘導遺伝子が染色体ＤＮＡ等に導入され、発現することにより、増殖・分化の方向が狂わされ、多芽体や発根能のない不定芽の分化、不定根の分化など、通常とは異なる形態の分化を起こす。そこで、このような形態異常を示す組織を選抜し、更に培養を続けると、やがて、この形態異常誘導遺伝子と共に、選抜マーカー除去用ベクターにより植物細胞に導入された脱離酵素遺伝子が働いて、脱離部位に存在する形態異常誘導遺伝子、そして、目的遺伝子導入用ベクターにより導入された選抜マーカー遺伝子が、これらが導入されていた染色体ＤＮＡ等から脱離して、その機能を失い、その結果、形態異常を示す組織から、今度は正常な形態を示す組織が生じるので、これを選抜する。こうして選抜される組織は、従来法と比べ、マーカーフリー組織である確率が大きく向上している。
【００３７】
選抜マーカー除去用ベクターの導入、及び、導入後の細胞の培養は、目的遺伝子導入用ベクターの導入と、その導入後の細胞の培養に準じて行うことができる。ただし、このとき培地中に、選抜マーカー遺伝子の発現を検出するための成分を添加する必要はない。マーカーフリーの植物は、上記のようにして得られたマーカーフリー組織を、定法によって増殖させ、再分化させることにより得ることができる。
【００３８】
なお、本発明において、適用できる植物種は特に限定されない。例えば、タバコ、キク、カーネーション、イネ等の草本植物や、ユーカリ、ポプラ、マツ、アカシア、サクラ、ヤマモモ、クヌギ、ブドウ、リンゴ、バラ、ツバキ、ウメ等の木本植物にも本願発明を適用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に従い、発明の詳細を述べる。もっとも、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作のうち分子生物学的手法についてはは、特に述べる場合を除き、Molecular Cloning（Sambrook et al.、1989）、又は製造業者の取り扱い説明書に従い行った。
【００４１】
［実施例１］
Ｉ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）の構築
プラスミドｐＩＧ２２１（Plant Cell Physio. 3(6)：805-813. 1990）を制限酵素Ｓｓｅ８３８７１（以下、ＳｓｅＩと略記する。）で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて処理した後、再連結することで、制限酵素ＳｓｅＩ部位が欠失したプラスミドｐＩＧ２２１ΔＳｓｅを構築した。このｐＩＧ２２１ΔＳｓｅの制限酵素ＳｍａＩ部位に二本鎖オリゴヌクレオチド（5'-cctgcagg-3'）を連結して、ＣＡＭＶ３５Sプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）とＧＵＳ構造遺伝子の間に制限酵素ＳｓｅＩ部位が導入されたプラスミドｐＩＧ２２１ｓｓｅΔｓｓｅを構築した後、このｐＩＧ２２１ｓｓｅΔｓｓｅより、３５Ｓ−Ｐとノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル（以下、ポリアデニル化シグナルは全てノパリンシンターゼ由来のものを用いた。）を連結したＧＵＳ遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにて切出し、これを、プラスミドｐＢＩ１２１（clontech社）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に配された、３５Ｓ−Ｐ、ＧＵＳ構造遺伝子及びポリアデニル化シグナルに置換して、プラスミドｐＢＩＧ２２１ｓｓｅ（図１）を構築した。
【００４２】
一方、プラスミド１２８−３５ＧＦＰより、互いに同方向を向いている部位特異的組換え系の組換え酵素認識配列（以下、単に認識配列ともいう。）ＲＳ二つに挟まれた、ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｎｏｓ−Ｐ）及びポリアデニル化シグナルを連結したＧＦＰ構造遺伝子を制限酵素ＳｓｅＩにて切出し、これをｐＢＩＧ２２１ｓｓｅの制限酵素ＳｓｅＩ部位に挿入して、本発明の目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＧＦＰ２１を構築した（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター宛てに３月２９日付けで寄託済み）。
【００４３】
ｐＩＧＦＰ２１の主な構造を図２に示す。このｐＩＧＦＰ２１は、目的遺伝子のモデルとしてＮＰＴＩＩ遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を有し、選抜マーカー遺伝子は、互いに同方向を向いた部位特異的組換え系の組換え酵素認識配列ＲＳ二つに挟まれた、脱離部位に位置するように配されている。なお、図中、四角形の枠で囲まれた黒三角形はＲＳ及びその配列の方向を、Ｔはポリアデニル化シグナルを示す（以下同じ。）。このベクターを植物細胞に導入した場合、Ｔ−ＤＮＡ領域、即ち、小さな黒三角形で示したＴ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）間が、染色体ＤＮＡ中に組込まれることとなる。
【００４４】
ＩＩ．選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の構築
プラスミド１２８−３５Ｒｒｕｂｉｐｔ（特願２００４−３８２３９４）より、互いに同方向を向いている二つの認識配列ＲＳで挟まれた、Rubiscoプロモーター（Ｒｕｂ−Ｐ）を連結したｉｐｔ遺伝子（プロモーターのみ、本来のプロモーターに換えてＲｕｂ−Ｐを使用。）、並びに、３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結した部位特異的組換え系の組換え酵素（以下、単に組換え酵素ともいう。）Ｒ構造遺伝子を制限酵素ＳｓｅＩにて切出し、これをプラスミドｐＴＳｓｐｓ（特願２００４−３８２３９４）の制限酵素ＳｓｅＩ部位に挿入して、選抜マーカー除去用ベクタープラスミドｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを構築した（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター宛てに３月２９日付けで寄託済み）。
【００４５】
ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒの主な構造を図３に示す。このｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒは、形態異常誘導遺伝子としてｉｐｔ遺伝子、脱離酵素遺伝子として部位特異的組換え系の組換え酵素Ｒの遺伝子を有し、これらの遺伝子は、互いに同方向を向いた部位特異的組換え系の組換え酵素認識配列ＲＳ二つに挟まれた、脱離部位に位置するように配されている。
【００４６】
ＩＩＩ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）及び選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）のアグロバクテリウムへの導入
Ａ．ツメファシエンス４４０４株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。この培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌し、次いで２００μlのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。
【００４７】
アグロバクテリウムへのベクターの導入には、エレクトロポレーション法を用いた。すなわち、０．５ｍｌチューブ内で、上記のようにして調製したプラスミド導入用菌液５０μｌと、３μｌのｐＩＧＦＰ２１を混合し、この混合液についてエレクトロポレーションを行った（ジーンパルサーＩＩシステム［ＢＩＯＲＡＤ社］）後、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて、これを２５℃で１時間振とうして培養し、得られた菌体を、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し、２８℃、２日間培養して菌コロニーを形成させた。アグロバクテリウムへのｐＩＧＦＰ２１の導入の確認は、この菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して培養した後、菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出し、定法にて行った。こうしてｐＩＧＦＰ２１が導入されたＡ．ツメファシエンス４４０４株を、ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧＦＰ２１）とした。
【００４８】
なお、ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒについても、同様にしてアグロバクテリウム４４０４株に導入し、これをＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）とした。
【００４９】
ＩＶ．タバコへの目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）の導入
培養容器内で無菌的に成育させたタバコ（Nicotiana tabacum SR1、特に記載する場合を除き、以下同じ。）の葉から、中脈を取り除いて約８ｍｍ角となるようにカットして得られた葉片３６片を、上記ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧＦＰ２１）の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調整。）に約１分間浸してこれに感染させ、滅菌した濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフリー）ＭＳ寒天培地（寒天０．８ｗ／ｖ％）に、葉の裏が上になるように置床して、２５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組織・植物体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養行った。
【００５０】
上記培養後の葉片を、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン２００ｍｇ／ｌを添加したＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不定芽１３個が再分化してきたので、この不定芽を分離し、更にカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシンン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養することにより発根させた。結局、１３個の不定芽にそれぞれ由来する、カナマイシン耐性組換え体１３系統を得ることができた。
【００５１】
Ｖ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）が導入されたタバコのサザン分析
ＩＶで得られたカナマイシン耐性組換え体１３系統（ｐＩＧＦＰ２１−１〜１３）より、ＣＴＡＢ法を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、これを制限酵素ＢａｍＨＩで切断して、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のアガロースゲルは、アルカリ・酸処理の後、その電気泳動面をナイロンメンブランに転写し、このナイロンメンブランについて、DIG PCR labeling kit（Boehringer Mannheim社より購入）にて予めラベリングしておいた、ＧＵＳ遺伝子と相同性を有するプローブＰ１を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、DIG Wash and Block Buffer（Boehringer Mannheim社より購入）により化学発光検出を行ったところ、サザン分析に供した２系統（ｐＩＧＦＰ２１−１０、１３）において、１コピーのｐＩＧＦＰ２１が導入されていることが確認された。
【００５２】
ＶＩ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）が導入されたタバコへの選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の導入
ＩＶと同様にして調製したｐＩＧＦＰ２１−１３の葉片を、前記ＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調整。）に約１分間浸してこれに感染させ、滅菌した濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを添加したホルモンフリーＭＳ寒天培地（寒天０．８ｗ／ｖ％）に、葉の裏が上になるように置床して、２５℃、全暗で２日間培養行った。
【００５３】
上記培養後の葉片を、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌを添加したホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不定芽６５個が再分化してきたので、これら不定芽を分離し、同組成の培地で引き続き培養した。この培養の間に、２９個の不定芽より多芽体が形成され、更に、その多芽体から正常な形態をした不定芽２８個が伸長した。こうして多芽体から生じた不定芽は、セフォタキシム１００ｍｇ／ｌを添加したホルモンフリーＭＳ寒天培地で培養することにより発根し、２８個の発根個体を得ることができた。これらの発根個体は継代培養を行って維持しつつ、以下の分析に供した。
【００５４】
ＶＩＩ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）、次いで選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析によるＧＦＰ遺伝子除去の確認
ＶＩにおいて作成した発根個体２８個の染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  ｋｉｔ  （ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ）により抽出し、この染色体ＤＮＡについて、３５Ｓ−Ｐに結合するプライマー３５ｓ６０と、ＧＵＳ構造遺伝子に結合するプライマーＥＸＧＵＳを用いて、ＰＣＲ分析を行った。この場合において、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたＧＦＰ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されると、９００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図４）。
【００５５】
ＰＣＲ反応は、上記のようにして抽出した染色体ＤＮＡ１μｇを、このプライマー０．２μＭを含む、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ社より購入）という組成を有する混合液５０μｌ中に溶解し、これを９４℃で１分３０秒間加温した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の加温サイクルを３０回繰り返して行った。得られた反応混合物はアガロースゲル電気泳動にて分析し、ＤＮＡ断片の増幅を検出した。
【００５６】
ＰＣＲ分析の結果、分析に供した２８個体中７個体において、９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた。よって、これら７個体は、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により、いったんは染色体ＤＮＡ中に導入された選抜マーカー遺伝子が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入された脱離酵素遺伝子の働きで、除去されたものと考えられる。
【００５７】
また、このとき、１個体において、上記９００ｂｐのＤＮＡ断片と共に、１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅も観察された。この１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ＧＦＰ遺伝子が、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により導入された状態のまま、染色体ＤＮＡ上に存在し続けている場合に増幅されるＤＮＡ断片の大きさに相当する。従って、この個体は、同一個体内に選抜マーカー遺伝子が除去された細胞と除去されていない細胞とが存在する、キメラ個体であると考えられる。
【００５８】
Ｂ．ＧＵＳ活性試験
目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）において、ＧＦＰ遺伝子は３５Ｓ−ＰとＧＵＳ構造遺伝子を分断する位置に配置されている。従って、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたＧＦＰ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されると、３５Ｓ−ＰとＧＵＳ構造遺伝子とが連結し、ＧＵＳ遺伝子が発現するようになる（図４）。
【００５９】
そこで、上記ＰＣＲ分析によってＧＦＰ遺伝子の除去が確認された７個体に由来する７系統について、植物体の一部を採取し、Jeffersonらの方法に準拠してＧＵＳ活性試験を行った。
【００６０】
その結果、上記７系統のＧＵＳ活性試験に供した個体の全てで、ＧＵＳによる染色が観察され、ＧＦＰ遺伝子が除去されていることが確認された。一方、前記ＩＶにて、目的遺伝子導入用ベクターの導入後に作成されたｐＩＧＦＰ２１−１３についても、同様にしてＧＵＳ活性試験を行ったが、この系統に由来する個体ではＧＵＳによる染色は観察されなかった。
【００６１】
Ｃ．サザン分析
ＰＣＲ分析によって選抜マーカー遺伝子の除去が確認された８個体（キメラ個体と考えられる個体も含む。）に由来する８系統の個体から、染色体ＤＮＡを抽出して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、前記Ｖと同様にしてサザン分析を行った。この場合において、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたＧＦＰ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されている場合には約７．０ｋｂｐ、一方、ＧＦＰ遺伝子が、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により導入された状態のまま、染色体ＤＮＡ上に存在し続けている場合には約２．７ｋｂｐのバンドが検出されることとなる。
【００６２】
その結果、分析に供した上記８系統の個体全てで約７．０ｋｂｐのバンドが観察され、ＧＦＰ遺伝子が除去されていることが確認された。また、ＰＣＲ分析の結果、キメラ性が示唆された１系統の個体については、この約７．０ｋｂｐのバンドと併せ、約２．７ｋｂｐのバンドも検出され、この系統がキメラ個体の系統であることが確認された。一方、前記ＩＶにて、目的遺伝子導入用ベクターの導入後に作成されたｐＩＧＦＰ２１−１３に由来する系統の個体では、約２．７ｋｂｐのバンドしか検出されなかった。
【００６３】
ＶＩＩＩ．次世代マーカーフリータバコの分析
上記ＰＣＲ分析、ＧＵＳ活性試験及びサザン分析の結果、染色体ＤＮＡからのＧＦＰ遺伝子の除去が確認された７系統は、ＩＶでカナマイシン耐性も確認されていることから、染色体ＤＮＡに目的遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）が導入され、かつ、その染色体ＤＮＡから選抜マーカー遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）が除去されている、マーカーフリー細胞からなるマーカーフリー個体の系統であると考えられる。
【００６４】
そこで、これらの系統について、その次世代の分析を行うべく、自家受粉により得られた種子から幼植物体を生育させ、上記ＶＩＩ−Ａ及び−Ｂと同様にして、ＰＣＲ分析及びＧＵＳ活性試験を行った。
【００６５】
その結果、ここで分析に供した次世代の全ての幼植物体において、親世代と同様に、ＰＣＲ分析による９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅、及び、ＧＵＳ活性試験によるＧＵＳ染色が観察された。従って、これらの系統について、親世代の形質はその次世代にも確実に伝達されており、しかも、これらの親世代７系統は、マーカーフリー細胞のみから構成される個体の系統であって、キメラ性を全く有していないと考えられる。
【００６６】
[実施例２] 
Ｉ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）の構築
ｒｏｌ遺伝子が、互いに同方向を向いた部位特異的組換え系の認識配列ＲＳ二つの間に挟まれている構造を有するプラスミド１２８−ｒｏｌを構築し、次いで、この認識配列ＲＳ間に挟まれたｒｏｌ遺伝子を、制限酵素ＳｓｅＩにて１２８−ｒｏｌより切出し、これを、実施例１−Ｉで構築したプラスミドｐＢＩＧ２２１ｓｓｅの制限酵素ＳｓｅＩ部位に挿入して、本発明の目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＲｏｌ２１を構築した（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター宛てに３月２９日付けで寄託済み）。
【００６７】
ｐＩＲｏｌ２１の主な構造を図５に示す。このｐＩＲｏｌ２１は、選抜マーカー遺伝子としてｒｏｌ遺伝子を有する他は、実施例１で用いた目的遺伝子導入用ベクターｐＩＧＦＰ２１と同様の構造をしている。
【００６８】
ＩＩ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）のアグロバクテリウムへの導入
実施例１−ＩＩＩと同様にして、ｐＩＲｏｌ２１をＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐＩＲｏｌ２１）とした。
【００６９】
ＩＩＩ．タバコへの目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）の導入
上記ＬＢＡ４４０４（ｐＩＲｏｌ２１）を、実施例１−ＩＶと同様にして、タバコに感染させた。
【００７０】
感染処理後のタバコ葉片１０５片は、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン２００ｍｇ／ｌを添加したＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不定芽１１個が再分化してきたので、この不定芽を分離し、更にカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシンン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養することにより発根させた。結局、１１個の不定芽にそれぞれ由来する、カナマイシン耐性組換え体１１系統を得ることができた。
【００７１】
ＩＶ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）が導入されたタバコのサザン分析
ＩＩＩで得られたカナマイシン耐性組換え体１１系統（ｐＩＲｏｌ２１−１〜１１）について、実施例１−Ｖと同様にしてサザン分析を行ったところ、そのうち２系統（ｐＩＲｏｌ２１−７、１１）に、１コピーのｐＩＲｏｌ２１が導入されていることが確認された。
【００７２】
Ｖ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）が導入されたタバコへの選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）の導入
実施例１−ＶＩと同様にして、ＩＶで１コピーのｐＩＲｏｌ２１の導入を確認したｐＩＲｏｌ２１−１１に、前記ＬＢＡ４４０４（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）を感染させ、感染後の葉片を培養して不定芽８４個を再分化させ、更に、この不定芽から多芽体を経由して、１０９個の発根個体を得た。これらの発根個体は継代培養を行って維持しつつ、以下の分析に供した。
【００７３】
ＶＩ．目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）、次いで選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析によるｒｏｌ遺伝子の除去の確認
Ｖにおいて作成した発根個体１０９個の染色体ＤＮＡについて、プライマー３５ｓ６０とＥＸＧＵＳ、及び、ｒｏｌ遺伝子に結合し、その一部を増幅するように設計したプライマーｒｏｌｃ１とｒｏｌｃ２とを用い、実施例１−ＶＩＩＡと同様にしてＰＣＲ分析を行った。この場合において、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたｒｏｌ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されると、９００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅され、また、ｒｏｌ遺伝子が、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により導入された状態のまま、染色体ＤＮＡ上に存在し続けていると、１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅されることとなる（図６）。
【００７４】
ＰＣＲ分析の結果、分析に供した１０９個体中１７個体において、９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた。よって、これら１７個体は、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により、いったんは染色体ＤＮＡ中に導入された選抜マーカー遺伝子が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入された脱離酵素遺伝子の働きで、除去されたものと考えられる。
【００７５】
また、このとき、９個体において、上記９００ｂｐのＤＮＡ断片と共に、１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅も観察された。従って、この個体は、同一個体内に選抜マーカー遺伝子が除去された細胞と除去されていない細胞とが存在する、キメラ個体であると考えられる。
【００７６】
Ｂ．サザン分析
ＰＣＲ分析によって選抜マーカー遺伝子の除去が確認された２６個体（キメラ個体と考えられる個体も含む。）に由来する２６系統の個体から染色体ＤＮＡを抽出して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、実施例１−Ｖと同様にしてサザン分析を行った。この場合において、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたｒｏｌ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されている場合には約７．０ｋｂｐ又は約２０．０ｋｂｐ、一方、ｒｏｌ遺伝子が、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により導入された状態のまま、染色体ＤＮＡ上に存在し続けている場合には約２．７ｋｂｐのバンドが検出されることとなる。
【００７７】
その結果、分析に供した上記２６系統の個体のうち、ＰＣＲ分析によりキメラ性が示唆された系統の個体を除く１７系統の個体全てで、約７．０ｋｂｐ又約２０．０ｋｂｐのバンドが観察され、ｒｏｌ遺伝子が除去されていることが確認された。また、ＰＣＲ分析によりキメラ性が示唆された９系統の個体については、その全てで、約２０．０ｋｂｐのバンドと約２．７ｋｂｐのバンドとが検出され、この系統がキメラ個体の系統であることが確認された。一方、前記ＩＩＩにて、目的遺伝子導入用ベクターの導入後に作成されたｐＩＲｏｌ２１−１１では、約２．７ｋｂｐのバンドしか検出されなかった。
【００７８】
ＶＩＩ．次世代マーカーフリー個体及びキメラ個体の分析
上記ＰＣＲ分析及びサザン分析の結果、染色体ＤＮＡからのｒｏｌ遺伝子の除去が確認された２６系統（キメラ個体の系統も含む。）の個体について、自家受粉を行い、得られた種子から幼植物体を生育させて以下の実験を行った。
【００７９】
Ａ．ＰＣＲ分析
上記２６系統の個体を親世代とする幼植物体について、実施例１−ＶＩＩＡと同様にしてＰＣＲ分析を行ったところ、ここで分析に供した全ての幼植物体で、選抜マーカー遺伝子（ｒｏｌ遺伝子）の除去を示す９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が観察された。つまり、この次世代分析では、親世代において、９００ｂｐのＤＮＡ断片と共に１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅も観察された、キメラ個体の系統から得られた幼植物体においても、９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅しか観察されず、この個体及び系統のキメラ性が消失していることが判明した。
【００８０】
このように、本発明の方法にて得られたキメラ個体が、全て、その次世代においてキメラ性を消失させる、という共通の結果を示したことは、これらのキメラ性が不規則なものではなく、一定の規則性を有していることを示唆し、非常に興味深いことである。この理由は明らかではないが、植物体を形成する組織は、大きくＬ１（表皮などに発達する）層、Ｌ２（生殖器官に発達する）層及びＬ３（骨格構造に発達する）層の３つに分けることができるので、上記キメラ個体においては、Ｌ２層の細胞においてのみ、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により染色体ＤＮＡ中に導入されたｒｏｌ遺伝子が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子の働きでそのＤＮＡ上から除去され、Ｌ１及びＬ３層の細胞では、このｒｏｌ遺伝子が、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）により導入された状態のまま、染色体ＤＮＡ上に存在し続けている、とも考えられる。
【００８１】
Ｂ．ＧＵＳ活性試験
この実施例で用いた目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＲｏｌ２１）においても、ｒｏｌ遺伝子は、３５Ｓ−ＰとＧＵＳ構造遺伝子を分断する位置に配置されており、目的遺伝子導入用ベクター（ｐＩＧＦＰ２１）により、タバコの染色体ＤＮＡ中にＮＰＴＩＩ遺伝子（目的遺伝子）と共に導入されたｒｏｌ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）が、選抜マーカー除去用ベクター（ｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ）により導入されたＲ遺伝子（脱離酵素遺伝子）の働きで脱離して、そのＤＮＡ上から除去されると、３５Ｓ−ＰとＧＵＳ構造遺伝子とが連結し、ＧＵＳ遺伝子が発現するようになる（図６）。
【００８２】
そこで、ここでは、上記ＰＣＲ分析及びサザン分析の結果、染色体ＤＮＡからのｒｏｌ遺伝子の除去が確認された２６系統のうち、キメラ性が示唆された系統を除く１７系統を親世代とする幼植物体について、実施例１−ＶＩＩＢと同様にしてＧＵＳ活性試験を行った。その結果、ここで分析に供した全ての幼植物体において、ＧＵＳによる染色が観察され、ｒｏｌ遺伝子が除去されていることが確認された。従って、これらの系統についても親世代の形質はその次世代に確実に伝達されており、これらの親世代１７系統は、マーカーフリー細胞のみから構成される個体の系統であって、キメラ性を全く有していないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＧＦＰ２１の作成スキムのうち、プラスミドｐＩＧ２２１からプラスミドｐＢＩＧ２２１ｓｓｅの構築までを示す図である。
【図２】目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＧＦＰ２１の作成スキムのうち、プラスミドｐＢＩＧ２２１ｓｓｅからｐＩＧＦＰ２１の構築までを示す図である。
【図３】選抜マーカー除去用ベクタープラスミドｐＴＳｓｐｓＭＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒの作成スキムを示す図である。
【図４】目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＧＦＰ２１により、そのＴ−ＤＮＡ領域が組込まれた染色体ＤＮＡの構造、及び、この染色体ＤＮＡからＧＦＰ遺伝子が除去された後の構造を示す、説明図である。
【図５】目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＲｏｌ２１の作成スキムを示す図である。
【図６】目的遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＩＲｏｌ２１により、そのＴ−ＤＮＡ領域が組込まれた染色体ＤＮＡの構造、及び、この染色体ＤＮＡからｒｏｌ遺伝子が除去された後の構造を示す、説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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