(57)【要約】【課題】  発作型不安神経症はパニック不安神経症ともいうが、激しい不安が理由もなく突発し、死の恐怖に圧倒されて、なすすべを失ってしまうタイプで、神経症の中では−番劇的なタイプのパニック発作、パニック病と呼ばれる、一般人にとっては理解しにくい症状を呈する病を検査する方法を提供する。【解決手段】  境界としてのD15S925(近位端)とD15S736(遠位端)とによって限定される15q24-25任意のゲノム配列の重複を使用すること、あるいは、ヒト染色体の重複領域である15q24-25内の任意のゲノム配列によってコードされる、又は15q24-25の重複の結果としてゲノムのその他の領域から発現されるポリペプチドの過剰発現されたタンパク質を使用することを特徴とする、家族性及び散発性に発症する場合を含む不安病及びその関連疾患、主に広場恐怖症、社会恐怖症、パニック発作およびパニック病の検査方法。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
境界としてのD15S925(近位端)とD15S736(遠位端)とによって限定される15q24-25任意のゲノム配列の重複を使用すること、あるいは、ヒト染色体の重複領域である15q24-25内の任意のゲノム配列によってコードされる、又は15q24-25の重複の結果としてゲノムのその他の領域から発現されるポリペプチドの過剰発現されたタンパク質を使用することを特徴とする、家族性及び散発性に発症する場合を含む不安病及びその関連疾患、主に広場恐怖症、社会恐怖症、パニック発作およびパニック病の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主としてパニック病、パニック発作の診断に関するもので、その遺伝学的検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある場面や場所や人や物が怖い、しかしそれさえ避けていればそれほど不安は感じなくてすむ。よくあるのは外出恐怖症、対人恐怖症その他、蛇だとか雷だとか飛行機だとか血をみるのが怖いといった特異な対象に限っての恐怖症である。「外出恐怖症」というのは群衆の中へ入ること、人の集まる街の広場（プラザ）へいくこと、−人旅、外国への旅などをしようと思うだけで、途方もない不安にかられ、逃げてしまう場合である。この不安には必ず身体の症状がともないます。動悸、頻脈、発汗、ふるえ、口渇、めまい、窒息感などなど。こういう人たちは自分の不安が（合理理的でないことをよく知っています。だから、なんとかしようとするのですが、それがなかなかできない。
【０００３】
「対人恐怖症」は、少人数の、顔見知りの人間関係の中に入っていくのに、さらにいえば彼らの面前で行動するのに、たいへん不安をおぼえる場合です。たいてい自分の赤面、顔のこわばり、声や手のふるえ、目のやり場などが気になり、それが相手に嫌な感じを与え、軽べつされないかと案じます。外出恐怖症の人とちがって、見知らぬ人の中へ入っていくことには不要を感じません。苦手な対人的場面さえはずして生活しておれば、不安をいだかずにすむ。しかし外出恐怖症といい対人恐怖症といい、ともに人間の社会生活にとって重要な社交がそのために制限されてしまう。とくに青年期という、人間関係を豊かにしていくための基礎の時代におきた場合、放っておくのはよくない。
【０００４】
発作型不安神経症はパニック不安神経症ともいう。その名前から想像できるように、激しい不安が理由もなく突発し、死の恐怖に圧倒されて、なすすべを失ってしまうタイプで、神経症の中では−番劇的なタイプである。神経症の人の悩みは第三者にわからないことが多いが、この場合は外からもよくわる。頻脈、ふるえ、口渇、胸苦しさ、呼吸因難、めまいなどをともないます。まもなくおさまりますが、発作は軽い場合でも週に一回の割合で、重い場合は週のうちに三、四回、くりかえされます。前項の恐怖（神経）症とちがうのは、特定の場面や物と関係しておこるのでないこと、不安の程度が激しいことである。  
【０００５】
パニック症がなおったあと、しばしば「また発作がやってこないか」という心配にとりつかれる。そのため自宅の周囲か、すぐ医師の門をたたける範囲内しか行動できない人がいる。先に述べた「外出恐怖症」になってしまうのである。パニック不安神経症とは正反対に、それほど強くない不安が広く浅くあるタイプがもう一つある。このタイプも症状は、不安は軽いが表現は多彩で、動悸、ほてり、ふるえ、口渇、胸痛、窒息感、めまい、喉頭のつかえなど、たくさんの身体の症状に加え、緊張感、いらいらなど、心の症状まである。こういう状態が少なくと六か月以上つづく。このタイプがパニック型に移行することはほとんどないといわれている。そのかわり、長く不安がつづくと心のエネルギーの備蓄がだんだんなくなってきて慢性的に「ゆううつ」や「おっくう」になってしまう。
【０００６】
このようなパニック症的症状を治療する薬はすでに、何種類か知られているのであるが、遺伝学的観点からの創薬については、あまり研究されてこなかった。パニック症とは、どういうものかという理解を助けるために図１に示す。
【０００７】
特開平５−２１３９６５号公報（特許文献１）には、治療的有効量のバージニアマイシンＭ1 化合物及び製薬的に許容される担体からなるパニック症状あるいは不安症の治療に有用な医薬組成物。治療的有効量の化合物及び製薬的に許容される担体からなるパニック症状あるいは不安症の治療に有用な医薬組成物。治療的有効量の化合物及び製薬的に許容される担体からなるパニック症状あるいは不安症の治療に有用な医薬組成物が開示されている。
【０００８】
特表２００３−５１２３６３号公報（特許文献２）には、一般式、（ここで、Ｚは硫黄原子又は酸素原子、Ｒ１とＲ２は相互に同じ又は異なるアルキル基又はアルケニル基、ＸはＣＯ、ＣＯ２、ＳＯ又はＳＯ２、Ｒはアルキル、アリル、アルケニル又はアラルキルのいずれかの基であり、Ｚが酸素原子、ＸがＳＯ２、Ｒがで表される基である場合には、Ｒ１とＲ２がともにメチル基ではない。）で表される化合物。神経障害として、癇癪、不安感、鬱症状、睡眠障害、パニック症状、筋肉収縮、疼痛、アルコール又はベンゾジアゼピン依存症もしくは精神病的な行動を対象とすることを特徴とするの使用が開示されている。
【０００９】
特表２００２−５０７８８４号公報（特許文献３）には、1. 血清サンプルからの患者の交感神経系機能の評価のためのドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ比活性の測定のためのin vitro診断方法であって、 a)血清サンプルを濾過して薬物及びドーパミン−β−ヒドロキシラーゼの内在性インヒビターを実質的に除去する工程、 b)工程a)の濾過されたサンプルを検出可能な化合物の変換のためにドーパミン−β−ヒドロキシラーゼの基質とともにインキュベートする工程、 c) 検出可能な化合物の量を測定してドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ活性を評価し、正常なサンプルと比較する工程、を含み、それにより正常なサンプルよりも低い量が、低下した交感神経系機能を示し、正常なサンプルよりも高い量が、増大した交感神経系機能を示すことを特徴とする、方法。交感神経系機能が低下する時が神経変性疾患、神経内分泌疾患、感情精神病
及び心血管疾患、バーンアウト、慢性疲労、ストレス並びにパニック症候群 を示す評価の方法が開示されている。
【００１０】
特表平８−５０２０２７号公報（特許文献４）には、
式： （式中、Ｒは、水素、ＣＨ3ＣＨ2−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−、（ＣＨ3）2ＣＨ−、である）で表される化合物又はそれらの医薬的に許容される塩。２．
該化合物が、６−（２−ブロモフェニル）−８−フルオロ−４Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−３−カルボキサミドである化合物。宿主のパニック病を処置する方法であって、式：（式中、Ｒは、水素、ＣＨ3ＣＨ2−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−、（ＣＨ3）2ＣＨ−、である）で表される化合物又はそれらの医薬的に許容される塩の抗パニックに有効な量を、その様な処置が必要である宿主に投与することを含む方法が開示されている。
【特許文献１】特開平５−２１３９６５号公報
【特許文献２】特表２００３−５１２３６３号公報
【特許文献３】特表２００２−５０７８８４号公報
【特許文献４】特表平８−５０２０２７号公報
【非特許文献１】Lesch, K.P., Bengel, D., Heil,s A., Sabol, S.Z., Greenberg, B.D.,Petri, S., Benjamin, J., Muller, C.R., Hamer, D.H., Murphy, D.L. Association ofanxiety-related traits with a polymorphism in the serotonin transporter generegulatory region. Science 1996 ; 274 : 1527-1530.
【非特許文献２】Bulbena, A., Duro, J.C., Mateo, A., Porta, M., Vallejo, J.Jointhypermobility syndrome and anxiety disorders. Lancet 1988 ; 2 : 694.
【非特許文献３】Bulbena, A.Duro JC, Porta M, Martin-Santos R, Mateo A, Molina LL. Anxietydisorders in the Joint hypermobility syndrome. Psychiatr Res 1993 ; 46 : 59-68.
【非特許文献４】Nadal, M., Moreno, S.,Pritchard, M., Preciado, M.A., Estivill, X., Ramos-Arroyo, M.A. Down syndrome :characterisation of a case with partial trisomy of chromosome 21 owing to apaternal balanced translocation (15 ; 21)(q26 ; q22.1) by FISH. J Med Genet1997 ; 34 : 50-54.
【非特許文献５】Celi, F.S., Cohen, M.M., Antonorakis, S.E., Wetheimer, E., Roth, J.,Shuldiner, A.R. Determination of gene dosage by quantitative adaptation of thepolimerase chain reaction (gd-PCR) : rapid detection of deletions andduplications of gene sequences. Genomics 1994 ; 21 : 304-310.
【非特許文献６】Lamballe, F., Klein, R., Barbacid, M.TrKC, a new member of the trkfamily of tyrosine protein kinases, is a receptor for neurotrophin-3. Cell 1991; 66 : 967-979.
【非特許文献７】Mcgregor, L.M., Baylin, S.B., Griffin, C.A., Hawkins, A.L., Nelkin,B.D. Molecular cloning of the cDNA for human TrKC (NTRK3), chromosomalassignment, and evidence for a splice variant. Genomics 1994 ; 22 : 267-272.
【非特許文献８】Kim, Y., Boyd, C.D., Csiszar, K.A highly polymorphic (CA) repeatsequence in the human lysyl oxidase-like gene. Clin Genet 1997 ; 51 : 131-132.
【非特許文献９】Cottingham, R.W., Idury, R.M., Schafer, A.A.Faster sequentialgenetic linkage computations. Am J Hum Genet 1993 ; 53 : 252-263.
【非特許文献１０】Ott, J.Analysis of human Genetic Linkage. 2nd ed. Baltimore,   John Hopkins University Press, 1991. 11．Anastasis,J., LeBeau, M.M., Vardiman, J.W., Westbrook, C.A.Detection of numericalchromosomal abnormalities in neoplastic hematopoietic cells by in situhybridization with a chromosome-specific probe. Am J Pathol 1990 ; 136 :131-139
【００１１】
本発明者は、パニック病の家族性症例及び明白な散発性の症例から、パニック病、鬱病及び関節過剰運動症に罹った患者において、染色体15q24-25の介在性重複を検出した。15q24-25の重複は、一般集団の７％に存在している。この細胞遺伝変異は、一般的な不安病と複雑な不安病、並びに気分病の原因である。この重複領域には、少なくとも10個の遺伝子が存在し、その内NTRK3及びLOXL1が、各々不安病及び関節過剰運動症に関与している可能性がある。本発明者は、15q24-25の重複及びそれに関連する体細胞モザイク現象を検出するために、蛍光インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションに基づいた細胞学的及び細胞遺伝学的方法を開発した。本発明者は、重複領域15q24-25内の遺伝子(NTRK3及びLOXL1を含む)又はその他の核酸配列を定量するために、DNA又はRNA分析に基づいた分子的方法を開発した。
【００１２】
本発明者は、連鎖分析及び患者のみの分析(affected-only analysis)によって、染色体15q24-25の重複が、いくつかの家族性の不安病の症例に関与していることを明白に証明し、それらの病的変化の遺伝条件を確認し、そしてパニック病、広場恐怖症及び社会恐怖症のための共通の生物学的な背景を規定した。パニック病及び／又は広場恐怖症に罹った独立で無関係な患者の全てにおいても、前記重複が検出されるという事実から、この染色体変化が、不安病の表現型のための主要な感受性変異であるという考えが生じる。15q24-25の重複変異が関与する精神医学的臨床上の範囲は、未だに完全に規定されていないが、本発明者は、精神医学的臨床上のいくつかの分類群、例えば広場恐怖症、社会恐怖症及び単純恐怖症を伴う又は伴わないパニックにおいて、この変異が同時発生していることを示した。
【００１３】
この研究から明らかに、パニック病及び広場恐怖症などの純粋な疾患を主張することができないこと、むしろ遺伝的な観点からは、パニック病から広場恐怖症までの範囲のモデル、又は一般的な神経性症候群がより現実的であろうことが分かる。重複領域である15q24-25は、50個超の遺伝子を含んでいて、その内10個の遺伝子のみが正確に位置決定されている。本発明者は、15q24-25の重複を診断するための細胞学的、細胞遺伝学的及び分子的な方法を開発した。現在、NTRK3及びLOXL1が、本文に示した不安病及び関節過剰運動症候群を説明するための良好な候補遺伝子である。
【００１４】
パニック病及び／又は広場恐怖症の患者を有する家系を同定した。
DSM-III-R(American
Psychiatric Association, Diagnositic and Statistical Manual of Mental Disorders
(DSM-III-R), 3rd ed., revised, Washington DC, 1987)に基づいた構造的臨床面接法によって診断したところ、患者の19％はパニック病及び／又は広場恐怖症、22％は社会恐怖症、34％は単純恐怖症、そして18％は重症鬱病を有した。これらの発症頻度は、一般集団における各疾患の有病率に比べて有意に高く、このことは共通の遺伝的原因の存在を意味し、これらの疾患が、原因となる同一の分子的な変化が、臨床上異なって現れている可能性を示唆する。
【００１５】
Beightonスコア[3]が４以上である関節過剰運動症は、前記家系内の65人(44％)に検出された。パニック病及び／又は広場恐怖症は、64％の患者で関節過剰運動症候群と共に、59％の患者で社会恐怖症と共に、そして46％の患者で単純恐怖症と共に分離された。総合すると54％の患者において、これらの不安病のいずれかと関節過剰運動症候群とが共に分離された。
【００１６】
不安病が関節過剰運動症候群と共に分離されることから、これらが連続的な遺伝的症候群である可能性が示唆された。同時に本発明者は、関節過剰運動症候群の候補遺伝子(コラーゲン、フィブリリン、エラスチンなど)の近傍又はその中に存在する一組のマイクロサテライトマーカーとの分離分析、並びにこれらの候補遺伝子が存在する染色体を含んだ染色体の再編成を検出することに主に着目した細胞遺伝学的研究を行った。前記７家系内の10人の患者の試料において、15番染色体の長腕(15q24-25)上に推定上の細胞遺伝学的変化が認められ、続いてこれが介在性の重複であることが同定された。この領域に由来するいくつかのYACクローンを用いて、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)法により、前記の推定上の細胞遺伝学的異常を調べた。YAC 802-b-4, 929-c-7, 750-b-7, 891-e-7及び753-h-11から明らかに、患者における15q24-25の介在性重複(dup15q24-25と称する)が証明された。
【００１７】
この重複の程度を決定するために、15q24-25領域を網羅するYAC/PACのコンティグを作成した(図２)。地図の作成において、合計41個のYAC、３個のPAC及び２個のBACを用いた。前記YACクローンのキメラ現象及びSTSの内容に関する情報はCEPHに寄託されている。当重複領域は、ヒト15番染色体内のD15S739マーカー(近位)からD15S930マーカー(遠位)までの約10cMにわたる。当領域は、10個の既知の遺伝子(LOXL1, CRABP1, IREB1, NIC3A, NIC5A, NIC4B, FAH, IL16, NMB及びNTRK3)を含み、これらは、それらのSTSに基づいたPCRによって当重複領域内に位置することが決定された。当重複領域には、多数のESTが存在することが知られているが、それらは50〜200個の遺伝子を含む可能性がある。
【００１８】
当重複領域のセントロメア側の末端は、(欠失を有するYAC
33iF3の中で)重ならないYAC 753-h-11と875-a-3との間に位置し、そしてテロメア側の末端は、(欠失を有するYAC 964-f-8の中で)いずれも重ならないYAC 802-b-4と966-a-2との間に位置する。これらの間隙を埋めるYAC, PAC及びBACを得るために、いくつかの試みを行った。本発明者は、テロメア側末端のためにPAC 252-a-23と216-i-14を、そしてセントロメア側末端のためにPAC 251-c-23を獲得したが、いずれのクローンも前記間隙を埋めることはなかった。しかしこれらのPACクローンは15q24-25重複領域の末端に位置したので、本発明者は、当重複のFISH分析及び、前記家系における不安病の表現型との分離分析のために、コスミドプローブ(t216-1及びc251-3)を作成した。
【００１９】
前記家系内の患者に由来する別の試料の分析から、15q24-25重複の３形態が検出された。最も普通の形態を「テロメア型」と称し、79％の患者において見られた。このテロメア型重複は、FISHにより観察されるシグナルの相対距離に応じて、直列(縦列)型又は逆転型として観察された。最後に、「セントロメア型」重複は、起源位置からかなり離れて且つセントロメアの近くに位置するシグナルを有し、前記家系の21％の患者において検出された。当重複の前記の形態は、15q24-25の同一領域の再編成の違いに由来すると思われる。セントロメア型及びテロメア型における重複領域及びマーカーは同一であるが、当重複にセントロメア又はテロメアの付加的遺伝子座が関与すること、並びに、数kbの間隔内に切断点クラスターが存在することを排除することはできない。
【００２０】
当重複が前記患者に特異的な特徴であることを確かめるために、プローブt216-1及びc251-3を用いて、無関係な妊婦に由来する81個の匿名の羊水試料を調べたところ、５個の試料(6.2%)において当重複が検出された。更に、パニック病及び／又は広場恐怖症及び関節過剰運動症が認められない無関係な54人を調べたところ、その内５人(9.2%)において15q24-25の重複が検出された。全体として135個の無関係なコントロール試料から、テロメア型及びセントロメア型重複が、各々70及び20％の割合で見つかった。
【００２１】
15q24-25重複といくつかの不安病と関節過剰運動症候群との関連の強さを、前記の７家系において連鎖分析法によって分析した。不安の表現型を、以下の５個のモデルに基づいて調べた。1)パニック病及び／又は広場恐怖症、2)社会恐怖症、3)単純恐怖症、4)パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症、並びに5)パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症及び／又は単純恐怖症。関節過剰運動症候群(Beighton判定４以上)を加えた前記の５個のモデルをも調べ、またこの表現型を、唯一な形質としても検査した。
【００２２】
当重複の浸透率を78％として又はほぼ完全な浸透率の条件下で分析した場合の15q24-25重複と11個のモデルとの連鎖を考察した。４つの形質(パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症及び／又は関節過剰運動症候群)を含むモデルにおいて、組換え率０にて最高のロッドスコア4.94が得られた。単純恐怖症の場合(ロッドスコア2.33)を除いて、関節過剰運動症候群を含む残り全てのモデルにおいて有意な連鎖値が得られた。関節過剰運動症候群自体でのロッドスコアは、組換え率０の条件下で3.82であった。精神病の形質のみを有するモデルのロッドスコアは全て３を超えなかったが、３又は４つの不安表現型を有するモデルのロッドスコアは２を超えた。
【００２３】
前記の11個のモデルを、前記の２通りの浸透率の条件下で、15q24-25重複を患者のみの分析(affected-only analysis)により検査した。パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症により規定される表現型でのロッドスコアは3.36であり、４つの不安表現型でのロッドスコアは2.96であった。パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症のモデルに関節過剰運動症候群を追加した場合、ロッドスコアは3.66に増加した。パニック病及び／又は広場恐怖症の場合、並びに社会恐怖症の場合に、関節過剰運動症候群を追加すると、各々のロッドスコアは3.1及び3.28となった。その他のモデルにおいても正のロッドスコアが得られたが、有意なレベルには至らなかった。
【００２４】
前記の家系内の93人の患者の表現型の特徴、並びにそれらと15q24-25重複との関連を検討した。重複を有する前記家系内患者の割合(72%)は一般集団(7%)に比べて高い。注目すべきことに、社会恐怖症を有する全ての患者が当重複を有した。パニック病及び／又は広場恐怖症及び／又は社会恐怖症を有する45人の患者の内44人(98%)が15q24-25の重複を有した。同様に、関節過剰運動症候群を有する患者の87％が15q24-25の重複を有した。臨床判定により１又は数個の精神病形質と関節過剰運動症候群とが同時に存在した場合、その全ての患者が当重複を有した。最後に、重複を有する患者の内53人(79%)が、１又は数個の不安病を有すると診断され、重複を有さない患者の内ただ１人(2%)が、パニック病又は広場恐怖症を有すると診断された(広場恐怖症のみを有する患者)。前記の不安病及び関節過剰運動症候群のいずれも有さない前記家系構成員の内88％が、dup15q24-25変異に関して陰性であった。
【００２５】
別の一群の患者において当検査を繰り返すために、本発明者は、Anxiety Clinicに定期的に通院している患者の中から、パニック病及び／又は広場恐怖症を有する50人の無関係な患者を選んだ。当患者と前記村落患者との間の考え得る関係を排除した。驚くことに、50人全ての患者においてdup15q24-25が検出されたが、一般集団から選んだ135人の無関係な対照者では、その内10人だけに検出された(カイ２乗値(Yates補正あり)138.5；Fisherの直接検定によりP<0.0001；オッズ比1207.2)。
【００２６】
15q24-25重複のいくつかの起源とモザイク現象
６個のマイクロサテライトマーカー、すなわち15q24-25重複領域内に位置する４個(LOXL1, D15S154, D15S201, NTRK3-BP2)と当重複領域外にある２個(D15S1040とD14S158)のマーカーを用いて前記家系を分析したところ、前記の検査した全ての表現型モデルにおいて、連鎖なしか又は連鎖値１未満であった。これらのマーカーは、ヒト15番染色体の遺伝子地図上で20cMの領域に広がっている(重複領域内の４マーカーは約10cMにわたる)。興味深いことに、15q24-25重複を有する67人の前記家系患者においては、家系内の３世代にわたって重複が存在した場合でも、３つの対立遺伝子を検出することができなかった。変異ハプロタイプを確定することができた合計71の重複染色体から、前記の６マーカーに基づいて合計28個の異なるハプロタイプが生じた。各家系において、その家系の新しい構成員が有する重複を有するその他のハプロタイプの中から、創始者のdup15q24-25ハプロタイプが容易に同定された。
【００２７】
ハプロタイプ数のこの様な多さ(重複を有する染色体の42％は、異なったハプロタイプを有する)は、独立の起源の存在を意味し、そしてこの変異が容易に生じることを示唆する。前記家系内の少なくとも７夫婦では、その両者が重複を有した。このことは、重複に関して両者を分析した夫婦の44％に相当し、そして15q24-25変異に関連した表現型のために個体間でより高頻度に交配する傾向(assortative mating)があることを明らかに示す。前記家系において15q24-25重複の変則的な分離例がいくつか認められた。このことは、新たな形態の発生、重複染色体から非重複染色体への変換、そして重複の１形式から別の形式への変換を意味する。
【００２８】
15q24-25重複のモザイク現象は、プローブt216-1及びc251-3を用いたFISHによって、リンパ球の核分裂中期の染色体において始めて観察された。各個人の100個の間期核において、dup15q24-25のモザイク現象を評価したところ、重複を有する細胞(40.4-70.6%)の中央値が55％であることを検出した。重複を有さない対照者の間期核における前記プローブによるハイブリダイゼーション効率は85％であった。
【００２９】
本発明者は、重複を有さない対照者、及び重複がホモ接合である患者(重複のホモ接合15％、ヘテロ接合85％)から得た精子において、15q24-25の重複を調べた。予想通り本発明者は、前記患者の配偶子においてのみ重複を検出したが、その精子の40％のみが重複を有した。従ってこの結果は、生殖細胞に15q24-25の重複が存在することを示し、それがある世代から次の世代に伝播されることを意味する。
【００３０】
末梢リンパ球における15q24-25重複の細胞学的検出法 調製した末梢リンパ球において15q24-25の重複を検出するために、いくつかのDNAプローブを用いた。15q24-25重複領域の近位及び遠位に位置するプローブt216-1及びc251-3を用いて、従来の非特許文献４の通りに、間期細胞の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を行った。
【００３１】
末梢リンパ球における15q24-25重複の細胞遺伝学的検出法 核分裂中期のリンパ球細胞において15q24-25の重複を検出するために、いくつかのDNAプローブを用いた。プローブt216-1及びc251-3を用いて、従来の非特許文献の通りにFISHを行った。
【００３２】
末梢リンパ球における15q24-25重複の分子的検出法
不安病に関連する15q24-25変異を分子的に検出するために、15q24-25重複領域に由来するいくつかの遺伝子又は核酸配列を用いた。本文に記載した当該配列は、15q24-25重複を検出するために用い得る配列の単なる例示である。
【００３３】
RT-PCRによるIL16のRNAの定量
15q24-25重複領域内に存在する遺伝子の発現レベルを評価するために、血中リンパ球で十分に発現しているIL16を選択した。定量的PCRによってIL16の過剰発現を調べた。予想通り、ホモ接合の患者では、対照者に比べて、末梢血中リンパ球内のcDNA濃度は約２倍であった。当領域内の他の遺伝子の発現分析から、dup15q24-25変異を有する患者において重複した遺伝子が無発現化している可能性は排除される。患者及び対照者に由来する培養細胞から得た総RNAを、競合式PCR[5]によって増幅した。IL16遺伝子のcDNA配列(GenBank
G06653)内の326bp断片(STS WI-7689)に対応するプライマー(前方プライマー：5'-TCC CAT AAC CGC TGA TTC TC-3'及び後方プライマー：5'-AAT AAA TGT CAC TGT TTG GGG G-3')を用いて、内在性IL16
mRNAを増幅した。42ヌクレオチドのプライマー(この5'末端の20ヌクレオチドが76ヌクレオチド上流に対応する)を用いて、内部標準を作成した。これらのプライマーによって228bp産物を増幅し、これを更にpMOS Blue-Tベクター(Amersham)にサブクローン化し、そしてそれを内部標準として用いた。IL16 mRNAに相当するPCR産物が、残存するゲノムDNAによる場合もあり得るので、RNase Aによって事前処理してから各試料の対照PCR増幅を行った。
【００３４】
NYRK3遺伝子の定量的サザンブロット分析 
リシルオキシダーゼ類似体(LOXL1)及びニューロトロフィン３受容体(NTRK3)遺伝子は、15q24-25重複領域内に、物理的に反対の末端に位置し(図２)、しかも当患者に認められる表現型のための良い候補遺伝子であると考えられるので、前記遺伝子に対応するプローブを用いてサザンブロット分析を行った。患者及び正常者から得た５μgのゲノムDNAを、40単位のEcoRIで消化し、そしてそのDNAをナイロン膜(Hybond-N+, Amersham)に転写した。当重複領域外又は別の染色体に位置する対照遺伝子との比較により、当重複領域内の遺伝子の量は、正常者に比べてヘテロ接合の患者では1.5倍であり、ホモ接合患者では２倍であると期待された。
【００３５】
この目的のために、NTRK3遺伝子(GenBank
G913721)の5'cDNA部分を含んでいるプラスミドpNIJ3-SR0.4のEcoRI/SstI断片及び、２番染色体の対照マーカー(rBAT遺伝子のエキソン７)をα32P-dATPで標識した。アートラジオグラフ上のバンド密度の定量によって遺伝子量を評価した。NTRK3遺伝子を２番染色体上のrBAT遺伝子のバンド密度の定量、ピークの高さ、そして対照マーカーとの比較から、重複を有する個人ではバンド強度が増加していることが分かった。
【００３６】
NTRK3の定量的PCRによるDNA分析
ニューロトロフィン３受容体(NTRK3)遺伝子は、15q24-25重複領域内に位置し、そして不安表現型のための良い候補遺伝子であると考えられるので、２つの断片、すなわちNTRK3遺伝子の断片とPROC遺伝子(エキソン１)の対照断片、の同時PCR増幅を介して遺伝子量の分析評価を行った。NTRK3遺伝子の134bp断片に対応するプライマーは、5'末端を蛍光標識したTRK3U2': 5'-TAT GAA GAT GTT CGC
TTC AG-3'と、TRK3U2F: 5'-TCT ACC TGG ACA TTC TTG GCT-3'であった。PROC遺伝子の222bpに対応するプライマーは、5'末端を蛍光標識したPC111: 5'-GTG CTA GTG CCA CTG TTT
GT-3'とPC112: 5'-ATC ACC ACC TAG CTC TCT TC-3'であった。試料をABI PRISM 373 DNAシークエンサーにかけ、その結果をプログラムGENESCAN及びGENOTYPERaによって処理した。NTRK3断片とPROC遺伝子の対照断片との同時PCR増幅により、15q24-25重複を原因とするDNA量の差が明確となった。
【００３７】
個人の血中リンパ球における重複を有する細胞の割合(間期核のFISHにより、重複と正常の割合を測定することにより評価する)が、ピーク間の明確且つ再現性ある差異を得るために十分に高い場合にのみ、サザンブロット分析及びPCR分析は有用であった。実際、モザイク現象の存在は、サザン分析又はPCR分析による重複の評価をかなり面倒にした。
【００３８】
本発明を実行するための方法患者の臨床評価 DSM-III-Rに基づいた構造的な臨床面接法によって、広場恐怖症、社会恐怖症、単純恐怖症及び重度鬱病を伴う又は伴わないパニック病に関して、全ての患者を評価した。
【００３９】
細胞遺伝学的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析
標準的な方法によって、72時間の羊膜細胞の培養及び、患者の末梢血リンパ球の培養の後に、核分裂中期の染色体スライド標本を準備した。全ての例でGTLバンド法を行った。900個のGバンドレベルの高分解性染色体を得るために、メトトレキセートを用いて末梢血液培養細胞を同調させた。未染色スライドを、ハイブリダイゼーションまで-20℃で保存した。ハイブリダイゼーションの前に、スライドを55℃で30分間焼いた。スライドを、0.5mg/mlのヨウ化プロピジウム又は150ng/mlのDAPIを含有する退色防止溶液(Vector Laboratories)40μlで被った。
【００４０】
非特許文献４のプライマーA33及びA44を用いてインターAlu-PCRを行って、YAC, BAC及びPACクローンからプローブを作成した。このPCR産物をエタノール沈殿させ、標識前に蒸留水40μl中に再縣濁した。FISH(cDNA、コスミド、YAC及びPAC)に用いる全てのプローブ(各２mg)を、ビオチン-16dUTP又はジゴキシゲニン-11dUTP(Boehringer-Mannheim)によって標準的なニックトランスレーション法に従って標識し、そしてゲル濾過した。次に各プローブ400ngを、1mgのcot1-DNA(GIBCO-BRL)及び1mgのサーモン精子DNA(Sigma)と共にエタノール沈殿し、そして50％ホルムアミド及び50％の12x
SSC及び硫酸デキストランを含有するハイブリダイゼーション混合液中に再縣濁した。
【００４１】
非特許文献４の記載通りにFISHを行った。要約すると、各プローブ70ng(ハイブリダイゼーション混合液7ml)を各スライドに加え、ラバーセメントによって密封した(１回に２個以上のプローブを用いてハイブリダイゼーションする場合、各プローブ5mlを用いた)。スライドを80℃で８分間加熱することによって変性を行った後、それらを保湿チャンバー内で37℃で一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼーション後の洗浄を、50％ホルムアミドと50％の2x SSCとの混合液によって３回、その後2x SSCによって３回、全て42℃で行った。次にこのスライドを、ブロッキング溶液(Boehringer Mannheim)中で10分間インキュベーションした。このスライドを、保湿チャンバー内で37℃で20分間、アビジン-FITC(ビオチン標識プローブのため)又は抗ジゴキシゲニン-TRITC(ジゴキシゲニン標識プローブのため)とインキュベーションし、それから4x SSC/0.1%Tween-20によって２回洗浄する。
【００４２】
cDNAプローブ及びコスミドプローブを検出する場合、ビオチンシグナルを一度増幅した。そのためにスライドをビオチン化抗アビジン(Vector Laboratories)と20分間インキュベーションし、前記通りに洗浄し、そして再度アビジン-FITCと更に20分間インキュベーションし、そして再度洗浄した。スライドを、0.1mg/mlのDAPI(Vectashield, Vector
Laboratories)を含有する退色防止溶液で被った。適当なフィルターを装着した蛍光顕微鏡(VANOX,
Olympus)を用いてスライドを観察した。Cytovisionシステム(Applied Imaging Ltd., UK)によって顕微鏡像を解析した。ハイブリダイゼーション毎に、少なくとも20個の分裂中期核を調べた。
【００４３】
間期核の分析 
既知の二倍体の対照を用いて当技術方法の効率を考慮に入れて、FISHによるモザイク現象の検出を行った。３つのハイブリダイゼーションシグナルを示す核の割合が、対照試料における偽の三染色体性のシグナルの平均(30%)の２つの標準偏差を超えた場合、その患者が重複を有すると考えられた。対照試料及び検査試料で各々100個の核を分析した。
【００４４】
精子のFISH 
採取した精子を最初にPBSで３回洗浄した。その縣濁液を清潔なスライドに２滴添加し、そして空気乾燥した。FISH分析するまで、スライドを−20℃で保存した。ハイブリダイゼーションの前に、スライドを2x SSCで３分間すすぐことによって精子の頭部を脱凝縮させ、連続エタノール処理(70, 80, 95%)により脱水化し、そしてDTT 5mM中で最大10分間37℃でインキュベーションした。次にスライドを2x SSC中で３分間すすぎ、再び連続エタノール処理により脱水化した。そして前記通りにFISHを行った。
【００４５】
サザンブロット分析及びPCRによるDNA定量評価
塩析によって末梢血液から高分子DNAを単離した。患者及び正常人のゲノムDNA５mgを40単位のEcoRIで切断し、そして１％アガロースゲル中で0.5x TBE緩衝液により12時間電気泳動した。DNAを20x SSC中でナイロン膜(Hybond-N+,
Amersham)に転写した。ランダムヘキサマープライマー法により、NTRK3(GenBank
G913721)の5'側の400bp cDNAを有するプラスミドpNIJ3-SR0.4のEcoRI/SstI断片と、２番染色体由来の対照マーカー(rBAT遺伝子断片)(GenBank G349705)とを、α32P-dATPによって高比活性(5x 10-9cpm)に標識した。65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェント条件0.1x SSC,
0.1% SDSで15分間洗浄した。このナイロン膜をＸ線フィルム(Curix, Agfa)に、−80℃で一晩露出した。密度計(Phoretix)を用いて、オートラジオグラフ上のバンド強度とピークの高さを各バンド毎に定量し、そして対照マーカーと比較することによってDNA量を評価した。
【００４６】
あるいは、２つの断片、すなわちNTRK3遺伝子(GenBank
G913721)の3'側cDNA断片とPROC遺伝子の対照断片(エキソン１)とを、同一反応チューブ内でPCR増幅することによって定量分析した。10ngゲノムDNA、0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2のPCR用緩衝液, 0.1単位Taqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)、並びに0.8μMのNTRK3プライマー対及び1.2μMのPROCプライマー対を含有する10mlの反応液中でPCRを行った。PCRの条件を、94℃３分間の変性、それに続く94℃30秒間、56℃50秒間及び74℃30秒間から成る反応22サイクルとした。反応試料を添加用緩衝液と混合し、94℃で５分間加熱し、そしてABI PRISM 373 DNAシークエンサー(Perkin-Elmer)にかけた。この結果をGENESCANプログラムで処理し、GENOTYPEaプログラムを用いて、対立遺伝子の指定、その面積及びピークの高さの決定を行った。
【００４７】
培養細胞におけるmRNAの定量分析
患者及び対照者から得た培養細胞から、塩化グアニジウム法及び塩化セシウム勾配法によって総RNAを調製した。Celiの非特許文献５に従って、競合的PCRを行った。総RNA 5μgを用いて、Superscript及びランダムプライマー(Gibco, BRL)によってRT-PCRを行った。標的及び内部標準を、以下の通りに同時に増幅した。逆転写産物１μlを、0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2のPCR用緩衝液、0.1単位Taqポリメラーゼ、並びに0.5μMの標的配列プライマー対及び種々の濃度の内部標準１μlを含有する混合液に加えた。PCRの条件を、94℃４分間の変性、それに続く94℃30秒間、56℃30秒間及び74℃30秒間から成る反応30サイクルとした。
【００４８】
地図の作成 
Whitehead
Institute for Biomedical Research/MIT Center for Genome Researchから得た15番染色体のYACコンティグ及びSTS情報に基づいて
(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/phys
map)、15q24-25重複領域の末端を狭めた。YACクローンを、Fondation Jean
Dausset-CEPH(www.cephb.fr)から入手して、FISH分析によって染色体15q24-25上にマッピングし、更にSTSのPCR増幅によって精密にマッピングした。またCEPHのヒト(メガ)YACを、LOXL1遺伝子の断片のPCR増幅によってスクリーニングしたが、陽性クローンは得られなかった。ICIのヒトYACライブラリー(HGMP-Resource Center, UK, www.hgmp.mrc.ac.uk.によってそのフィルターが供給されている)を、LOXL1遺伝子(GenBank
G307145)のエキソン７に対するプライマーをプローブとしてスクリーニングしたところ、LOXL1を含有する陽性YACクローン(33i-F3)が検出された。
【００４９】
種々のプローブを用いて、HGMP-Resource
Center(UK)(www.hgmp.mrc.ac.uk)から入手したヒトPACライブラリーフィルター、及びResearch Genetics, Inc. (Huntsville, USA)から入手したヒトBACライブラリーフィルターをスクリーニングすることによって、間隙を埋め、コンティグを延長し、そして当重複の末端を正確に決定した。PAC, BAC及びYACクローンを配置するために合計57個のSTSを用いた。それらのプライマーを、Genset(フランス)から入手するか、392DNA/RNAシンセサイザー(Applied Biosystems)を用いて合成した。
【００５０】
100ngの鋳型DNA、0.5μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2のPCR用緩衝液、及び0.1単位Taqポリメラーゼを含有する25μl反応液中でPCR増幅を行った。反応条件は、94℃５分間の変性反応、それに続く94℃30秒間、50〜65℃30秒間(プライマーによる)及び74℃４秒間から成る反応35サイクル、最後に72℃５分間の伸長反応であった。
【００５１】
以前にクローン化され、そして当重複領域内に配置された遺伝子の位置を、当遺伝子を含むSTSのPCR増幅によって決定した。あるいは、連鎖分析、体細胞ハイブリッド分析、又は細胞遺伝学的研究から当領域内に位置すると思われる遺伝子のために、それらのcDNAの3'領域に対するプライマーを合成し、その領域を含むYACからPCR増幅することによって当遺伝子の位置を決定した。
【００５２】
前記家系内の分離パターンを調べるために、下記の異なった15qのマイクロサテライトマーカーを増幅した：LOXL1遺伝子[8]のイントロン１内に存在するジヌクレオチド反復、D15S154, D15S201, D15S158, D15S1040及びNTRK3-BP2。最後のものは、PAC252 A23の1.5kbのBamHI断片の配列から同定された新規なマイクロサテライトマーカー(NTRK3遺伝子の3'末端プローブを用いてHGMP-Resource Center(UK)のヒトPACライブラリーから単離されたもの)である。前記の反復配列は(CA)24であり、このマーカーを増幅するために用いたプライマーは、BP2F: 5'-TTG CTT GAA GGG CAC CTG-3'及びBP2R:
5'-AAC ATC CTG GGT ACA TGC-3'であった。
【００５３】
PCR増幅のために、LOXL1, D15S154, D15S201及びD15S158の場合、(GT)n配列を挟むGT鎖オリゴヌクレオチドプライマーをポリヌクレオチドキナーゼによって末端標識した。標準的な条件下で、100ngのゲノムDNA、１μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2のPCR用緩衝液、及び0.1単位Taqポリメラーゼを含有する25μl反応液中でPCRを行った。この増幅条件は、最初に94℃５分間の変性反応、それに続く94℃30秒間、58〜65℃30秒間(プライマーによる)及び74℃40秒間から成る反応30サイクル、最後に72℃５分間の伸長反応であった。反応産物(２μl)を２μlのホルムアミド停止溶液と混合し、６％ポリアクリルアミドDNA配列決定用ゲル中で40Wで3.5〜4時間電気泳動した。ゲルを乾燥し、それをＸ線フィルム(Curix, Agfa)に−80℃で４〜12時間露出してオートラジオグラフを得た。マーカーD15S822, D15S1040及びNTRK3-BP2を前記と同様の条件で増幅した。ただし逆方向プライマーを末端標識しなかった。その代わりに、２μlの反応産物を２μlのホルムアミド停止溶液と混合し、５％ポリアクリルアミドDNA配列決定用ゲル中で40Wで４〜５時間電気泳動し、そしてそのゲルを銀染色して乾燥した。
【００５４】
連鎖と関連に関する研究
精神病の形質と関節過剰運動症候群の形質のために、不完全な浸透率を有する常染色体遺伝パターンを考えた。異なる遺伝子型による当該遺伝子座の形質の最終浸透率(P)は、Ottの文献(Ott,
1991)に従って、P = fc + (1-f)(1-c)の関係式（ただしｆは所定の遺伝子型における浸透率であり、ｃは正しい診断の確率(羅患対非羅患)である）により、精神病の誤診断(c)を考慮している。従って前記浸透率は、遺伝子型+/+の場合、表現型模写又は誤診断を考慮してP=0.05であり、遺伝子型+/Dの場合P=0.736であり、そして遺伝子型D/Dの場合P=0.9であった。ただし＋は野生型対立遺伝子を、そしてDは有害対立遺伝子を意味する。
【００５５】
15q24-25重複を、羅患性又は二分性(dichotomous)の遺伝子座型として分析した。この細胞遺伝学的現象による全ての観察された形質を含ませるために、各親から遺伝し、且つ真の遺伝子型として当接合個体に存在する遺伝子型、すなわちDUP/DUP, DUP/+又は+/+を考慮した。ただしDUPは、15q24-25変異を保持する「重複を有する有害な対立遺伝子」であり、＋は、重複を持たない野生型の対立遺伝子である。観察された表現型は、この接合体遺伝子型に由来し、その遺伝子型はモザイク現象を含み、そしてFISHによって観察される。この遺伝子座の形質の浸透率は、最終表現型を付与する当接合体の元々の遺伝子型がFISHによって観察される確率である。更にプローブ効率又は誤った解釈に基づく細胞遺伝学的な診断の誤り(c)の確率を考慮した。
【００５６】
この様にして、本発明者は３つの責任(liability)分類を考えた。LC1は、未羅患又は非重複の症例のために設定されたもので、連鎖家系図の標準的な形式において「1 1」と表示された。LC1における浸透率(1-P)は、0.9 (+/+)、0.05
(+/DUP)及び0.01 (DUP/DUP)であった。LC2は「ヘテロ型での重複」のために設定されたもので、連鎖家系図の形式において「2 2」と入力された。LC2における浸透率(P)は、0.05 (+/+)、0.90
(+/DUP)及び0.05 (DUP/DUP)であった。LC3は「ホモ型での重複」のために設定されたもので、「2 3」と入力された。この場合の浸透率は、0.01 (+/+)、0.05 (+/DUP)及び0.90 (DUP/DUP)であった。
【００５７】
更に本発明者は「ほぼ完全な浸透率」を有するモデルを考えた。この場合には、LC1での浸透率(1-P)は、0.99 (+/+)、0.01
(+/DUP)及び0.001 (DUP/DUP)であり、LC2での浸透率(P)は、0.001 (+/+)、0.99
(+/DUP)及び0.01 (DUP/DUP)であり、LC3での浸透率(P)は、0.001 (+/+)、0.01
(+/DUP)及び0.99 (DUP/DUP)であった。
【００５８】
本発明者は、両方の形質遺伝子座(D又はDUP)において、疾患対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の頻度(q)が同一であると仮定し、そしてそれらの値は、一般集団における精神病表現型の発生又は当重複の検出に従って計算され、同様な値：q≒0.075が得られた。これによる影響は、本発明者の分析においてわずかであった。なぜなら家系図内の大部分の構成員が診断(タイピング)され、従ってそれらの遺伝子型をこの様に推定することが可能であったからである。
【００５９】
本発明者は、FASTLINK V2.2プログラム内の機能性MLINKを用いて、２つの当該遺伝子座形質間の２点連鎖分析を行った。前記の考察に従ってデータを入力した。結果の章で指摘したとおり、精神病及び関節過剰運動症候群の表現型に基づいた11個のモデルを検査した。更に、浸透率及び診断判定基準の影響を調べるために、前記の11個のモデルに関して患者のみの検査(affected-only analysis)を行った。
【００６０】
更に本発明者は、15q24-25重複領域内に位置する４つのマーカー(LOXL1, D15S154, D15S201及びNTRK3-BP2)及び当重複外の２つのマーカー(D15S1040及びD14S158)を考慮した。それらの地図上の位置及びマーカー間の遺伝的距離は公開されている(http://www.cephb.fr)。各分析において、各マーカー遺伝子座毎に同じ対立遺伝子頻度を考慮した。本発明者は、前記マーカーと当遺伝子座形質との間の２点間計算を行った。更にマーカー間の遺伝的距離を再計算した。この様にして本発明者は、15q24-25重複の影響にために生じる組換えの違いを求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】パニック病の説明図。
【図２】不安病及び関節過剰運動症候群を有する患者において重複が存在する15q24-25領域の物理的地図。マーカーの順序は、公開情報(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/phys map)に基づく。各マーカー及びクローンの位置を検査した。当領域に広がる57個のSTSを、当染色体領域を意味する横棒の上に示す。矢印はセントロメア側(CEN)とテロメア側(TEL)の両端を示す。マーカーは等間隔で表示した。地図の下側に示した遺伝的距離は、前記の公開データに基づく。YAC 33iF3をICIから入手し、その他全てのYACクローンをCEPHから入手した。PAC及びBACは、その番号の前に各々P又はBを付記した。YAC, PAC及びBACにおける黒丸は、そのクローン内のSTSを表し、そして白丸は、そのクローンに存在しないSTSを表す。縦矢印と横棒との組合せは、YAC, PAC又はBACクローン内に存在する遺伝子の位置を示す。RBP1のみが15q24-25領域の外に位置する。
【図１】
2006025744.tif 000002
【図２】
2006025744.tif 000003