(57)【要約】      （修正有）【課題】  ヒト細胞、特に、未分化の状態の間葉系幹細胞の増殖を促進し、人体における骨組織をはじめとする生体組織の欠損部を迅速に修復することを可能とするヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体を提供する。【解決手段】  培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させてヒト細胞を培養するヒト細胞の培養方法を提供する。ヒト細胞は未分化の間葉系幹細胞でもよく、分化しつつある間葉系幹細胞でもよい。また、培地２に添加する代わりに、ヒト細胞を付着させて培養する内表面１ａに、陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有するコーティングを設けてなる培養容器１を用いてもよい。【選択図】    図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させてヒト細胞を培養するヒト細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ヒト細胞が間葉系細胞からなる請求項１に記載のヒト細胞の培養方法。
【請求項３】
ヒト細胞を付着させて培養する内表面に、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングしてなる培養容器。
【請求項４】
ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液とを混合してなる生体組織補填体。
【請求項５】
前記ヒト細胞が間葉系細胞からなる請求項４に記載の生体組織補填体。
【請求項６】
さらに生体親和性材料からなる生体組織補填材を混合してなる請求項４または請求項５に記載の生体組織補填体。
【請求項７】
生体組織補填材が粉状または顆粒状である請求項６に記載の生体組織補填体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ラット頭蓋冠由来骨芽細胞のＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性を促進するために硫酸化ヒアルロン酸を使用することが有効であることが知られている（例えば、非特許文献１）。この非特許文献１によれば、硫酸化ヒアルロン酸がラット頭蓋冠由来骨芽細胞の増殖や分化機能を制御できることが示されている。
【非特許文献１】「ラット頭蓋冠由来骨芽細胞のＡＬＰase活性を促進する硫酸化ヒアルロン酸の効果」、長幡  操  他４名、繊維学会誌
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
非特許文献１に記載された発明では、ラットの細胞において、硫酸化ヒアルロン酸が、低濃度の場合には増殖を促進し、高濃度の場合には分化を促進するという効果を奏することができることは示されている。しかしながら、ラットの細胞における効果がそのままヒト細胞への適応可能性を示唆するものではない。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、ヒト細胞、特に、未分化の状態の間葉系幹細胞の増殖を促進し、人体における骨組織をはじめとする生体組織の欠損部を迅速に修復することを可能とするヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させてヒト細胞を培養するヒト細胞の培養方法を提供する。
発明者らは、実験研究の結果、陰イオン修飾ヒアルロン酸を培地に添加した場合に、間葉系幹細胞の増殖促進効果があることを確認した。本発明によれば、培地内に含有される陰イオン修飾ヒアルロン酸、例えば、硫酸化ヒアルロン酸の作用により、ヒト細胞の増殖が促進され、ヒト細胞を迅速に必要細胞数まで培養することができる。なお、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を含有させる方法としては、培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加する方法の他に、陰イオン修飾ヒアルロン酸を内表面にコーティングした培養容器を用いて培養することが挙げられる。
【０００６】
上記発明においては、前記ヒト細胞が間葉系細胞からなることとしてもよい。
発明者らは、ヒト細胞が未分化の状態の間葉系細胞であっても、陰イオン修飾ヒアルロン酸によってその増殖が促進されることを確認した。本発明によれば、間葉系細胞の増殖を促進して、迅速に必要細胞数まで培養し、種々の生体組織における欠損部の修復に適用することが可能となる。
【０００７】
また、本発明は、ヒト細胞を付着させて培養する内表面に、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングしてなる培養容器を提供する。
培養容器内に所定の培地を貯留してヒト細胞を投入することにより、ヒト細胞が培養容器の底面等の内表面に付着して成長を開始する。この場合に、内表面に陰イオン修飾ヒアルロン酸がコーティングされていることによって、陰イオン修飾ヒアルロン酸による細胞増殖促進効果が発揮され、ヒト細胞を迅速に必要細胞数まで増殖させることができる。また、培地内に溶出した陰イオン修飾ヒアルロン酸によってもヒト細胞の増殖が促進されることになる。
【０００８】
また、本発明は、ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液とを混合してなる生体組織補填体を提供する。
陰イオン修飾ヒアルロン酸はヒト細胞の増殖効果を備えるので、これらを混合してなる本発明の生体組織補填体によれば、生体組織の欠損部に充填することにより、欠損部を迅速に修復することができる。特に、陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液は、ある程度の粘性を有するゲル状に形成されるので、本発明の生体組織補填体は、注射器等によって人体の表皮を貫通して、少ない侵襲で欠損部に注入することができる。また、陰イオン修飾ヒアルロン酸水溶液の粘性によって、欠損部に補填された状態でヒト細胞が周囲に分散しないように保持され、欠損部の修復効果を高めることができる。特に、ヒト細胞として軟骨細胞を採用した場合に、陰イオン修飾ヒアルロン酸の軟骨組織との高い親和性によって、生体組織補填体を軟骨組織に接着状態に保持することができる。これによっても、欠損部の修復効果を高めることができる。
【０００９】
上記発明においては、前記ヒト細胞が間葉系細胞からなることとしてもよい。
このように構成することで、修復すべき欠損部が存在する生体組織に合わせて、間葉系細胞をその生体組織へ分化誘導させることができる。したがって、任意の生体組織の欠損部に適用することができる。この場合において、陰イオン修飾ヒアルロン酸によって未分化の状態の間葉系細胞もその増殖を促進されるので、補填後、早期に必要細胞数まで増殖させ、生体組織細胞への分化により、迅速に欠損部を修復することが可能となる。
【００１０】
また、上記発明においては、さらに生体親和性材料からなる生体組織補填材を混合してなることとしてもよい。
このようにすることで、生体親和性材料、例えば、リン酸カルシウム多孔体からなる生体組織補填材を足場として、生体組織、例えば、骨組織や軟骨組織への分化を誘導し、生体組織に形成された欠損部を迅速に修復することができる。
【００１１】
さらに、上記発明においては、生体親和性材料からなる生体組織補填材が、粉状または顆粒状であることが好ましい。
このようにすることで、流動性を有する生体組織補填体を製造することができる。したがって、人体の表皮を大きく切開することなく、低侵襲で、骨組織の欠損部に注入することができる。この場合においても、粘性を有する陰イオン修飾ヒアルロン酸によって、生体組織補填材およびヒト細胞を一纏まりにするので、生体組織補填材が欠損部以外の部分に付着してしまうことを防止して、取扱性を向上することができる。また、粘性の高い陰イオン修飾ヒアルロン酸によって、ヒト細胞が欠損部から流出しないように保持し、欠損部の修復を効率的に行わせることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒト細胞、特に、未分化の状態の間葉系幹細胞の増殖を促進し、人体における骨組織をはじめとする生体組織の欠損部を迅速に修復することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一実施形態に係るヒト細胞の培養方法について、図１〜図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、培養容器内に貯留した所定の培地内に陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加して所定の培養条件に維持し、ヒト細胞を培養する方法である。
【００１４】
本実施形態に係る培養方法によれば、培養容器内に貯留された培地に投入されたヒト細胞が、培養容器底面に接着して成長する際に、培地内に添加されている陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、早期に十分な細胞数まで増殖することができる。特に、ヒト細胞が、未分化の状態の間葉系幹細胞である場合においても、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖を促進されるので、必要細胞数まで早期に増殖させることができる。
【００１５】
図１は、本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性を、ヒアルロン酸との対比において示したグラフである。図１のグラフは、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加しない場合を１００としたときの相対細胞数を陰イオン修飾ヒアルロン酸およびヒアルロン酸の濃度毎に示したものである。
【００１６】
ここでは、培地として、例えば、間葉系幹細胞用基本培地ＭＳＣＢＭに三光純薬のブレットキットＭＳＣＧＭ間葉系幹細胞用培地を添加して使用し、ヒト細胞として、例えば、ヒト間葉系幹細胞を使用し、それぞれ、５％ＣＯ２濃度、３７℃で、１週間にわたって培養した場合の相対細胞数を示している。
これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した培地中では、ヒト間葉系幹細胞は、陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高いほど細胞数が増えており、添加しない場合と比較して濃度５μｇ／ｍｌのときに、最大で約２５％増加していることがわかる。これに対して、ヒアルロン酸を添加した場合の細胞の増殖度は、最大で５％程度である。したがって、陰イオン修飾ヒアルロン酸が、未分化の状態の間葉系幹細胞に対して、増殖を促進する効果を有することがわかる。
【００１７】
図２は、本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性を、ヒアルロン酸との対比において示した図１と同様のグラフである。
ここでは、培地として、骨芽細胞分化誘導培地（ブレットキット骨芽細胞分化用培地（三光純薬社製））を用いた点を除き、図１の場合と同様の条件で培養している。
【００１８】
これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した骨芽細胞分化誘導培地中において、ヒト間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化しながら同時に増殖し、図１の場合と同様に、陰イオン修飾ヒアルロン酸の添加濃度が高いほど骨芽細胞の細胞数が増えていることがわかる。図２によれば、骨芽細胞は、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加していない場合と比較して、濃度５０μｇ／ｍｌのときに最大で約４０％増加していることがわかる。これに対してヒアルロン酸を添加した場合においては、その添加濃度に関わらず、骨芽細胞の増殖促進効果がほとんど認められない。
【００１９】
図３は、図２の各場合におけるヒト間葉系幹細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すグラフである。これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した骨芽細胞分化誘導培地中に投入されたヒト間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化し、陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高くなればなるほど高いアルカリフォスファターゼ活性を示していることがわかる。また、ヒアルロン酸を添加した場合、ヒト間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞は、添加しない場合よりも低いアルカリフォスファターゼ活性を示している。
【００２０】
さらに、図４は、図２の各場合におけるカルシウム沈着の検出結果である。陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した場合においては、多くのカルシウムが蓄積されている。
これら図１〜図４に示される本実施形態に係るヒト細胞の培養方法によれば、ヒト間葉系幹細胞の培養において、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、未分化の状態のヒト間葉系幹細胞の増殖を促進することができるとともに、骨芽細胞に分化させた後においても、分化後の骨芽細胞の増殖を促進することができる。本実施形態に係る培養方法によれば、ヒト間葉系幹細胞の増殖促進作用および分化後の骨芽細胞の増殖促進作用は、いずれも陰イオン修飾ヒアルロン酸の濃度が高いほど顕著に現れることがわかる。
【００２１】
次に、本発明の一実施形態に係る培養容器について、図５〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図５に示されるように、培地２を貯留するディッシュ状の容器であって、ヒト細胞３を接着させる底面１ａに陰イオン修飾ヒアルロン酸からなるコーティング４が施されたものである。
【００２２】
本実施形態に係る培養容器１によれば、培養容器１内に貯留された培地２に投入されたヒト細胞３が、培養容器底面１ａに接着して成長する際に、底面１ａにコーティングされている陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、早期に十分な細胞数まで増殖することができる。特に、ヒト細胞３が、未分化の状態の間葉系幹細胞である場合においても、コーティングされた陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって、その増殖が促進されるので、必要細胞数まで早期に増殖させることができる。
【００２３】
図６は、本実施形態に係るヒト細胞３の培養方法によるヒト細胞３の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。ここでは、培地２として、例えば、極東製薬のＫ−１１０ＴｙｐｅＩＩ培地、カルシウム濃度０．２０ｍＭを使用し、ヒト細胞３として、例えば、ヒト表皮角化細胞を使用し、培養容器１のコーティング４における陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度を変えて、５％ＣＯ２濃度、３７℃で６日間培養した場合の培養数を示している。これによれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度に依存して、密度が高くなればなるほど、ヒト表皮角化細胞３の増殖が低下していることがわかる。分化が促進されると、増殖は抑制されるので、この増殖度の低下はヒト表皮角化細胞３の分化を反映しているものと考えられる。
【００２４】
また、図７は、本実施形態に係るヒト細胞３の培養方法によるヒト細胞３の相対移行距離の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。培養条件は上記と同様である。ヒト表皮角化細胞３の細胞間連絡機構を解析した結果、陰イオン修飾ヒアルロン酸をコーティングした培養容器１で培養したヒト表皮角化細胞３は、その機能が亢進されていることが明らかである。そして、その機能の亢進は、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度の上昇とともに向上していることがわかる。細胞間連絡機構は、細胞の分化と密接に関わっているため、これによっても、陰イオン修飾ヒアルロン酸によって分化が促進されていることがわかる。
【００２５】
また、図８は、ヒト表皮角化細胞３の分化マーカーであるインボルクリンを定量ＰＣＲで検出した結果を示すグラフである。図８によれば、陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度が高くなるにつれて、インボルクリンの発現量が著しく増加していることがわかる。図９は、図８の各密度の場合における細胞の状態を示している。
【００２６】
本実施形態に係る培養容器１によれば、第１の実施形態における培養方法の場合と同様に、表面にコーティングされた陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、ヒト細胞３の増殖を促進することができる。また、ヒト表皮角化細胞３においては、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、分化を促進することができる。
さらに、培養容器１の内表面にコーティングする陰イオン修飾ヒアルロン酸の密度を調節することにより、ヒト細胞３の増殖やヒト表皮角化細胞３の分化を制御することができるという効果がある。
【００２７】
また、従来のヒト表皮角化細胞の分化促進には、マウス３Ｔ３細胞等の生体由来材料を直接フィーダーレイヤーとして前記角化細胞と接触させる方法が知られているが、生体由来材料であるために、感染する可能性が考えられていた。上記の陰イオン修飾ヒアルロン酸は半合成機能性ポリマー材料であり、上記感染の可能性を回避しながらヒト表皮角化細胞を分化促進することが可能となる。
【００２８】
次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体について説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体は、ヒト細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸とを混合したものである。ヒト細胞としては、例えば、ヒト間葉系幹細胞を使用し、陰イオン修飾ヒアルロン酸としては、例えば、分子量数万〜２００万の硫酸化ヒアルロン酸を使用する。
【００２９】
本実施形態に係る生体組織補填体によれば、上述したように陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用により、ヒト間葉系幹細胞の増殖が促進される。また、本実施形態に係る生体組織補填体によれば、流動性を有するので、注射器によって患部に注入することができる。したがって、人体の表皮を大きく切開することなく、注射針を刺すだけで患部に注入して欠損部を補填することができる。
【００３０】
また、特に、分子量の高い硫酸化ヒアルロン酸を使用することにより、生体組織補填体の粘性をある程度高く保持することができる。したがって、欠損部に補填された後に、含有しているヒト間葉系幹細胞が欠損部から外部に漏出しないように止めておくことができる。その結果、欠損部内に保持したヒト間葉系幹細胞の増殖を陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって促進し、また、生体内における分化誘導因子の作用により、ヒト間葉系幹細胞を欠損部の形成されている生体組織へ分化させて生体組織の形成作用を促進することができる。
【００３１】
特に、欠損部が軟骨組織に形成されている場合においては、陰イオン修飾ヒアルロン酸の作用によって生体組織補填体の軟骨組織への親和性を向上し、ヒト間葉系幹細胞を軟骨組織に接着状態に維持することができる。したがって、効率的に軟骨組織の再生を図ることができる。
【００３２】
なお、未分化のヒト間葉系幹細胞を採用することにより、分化誘導因子の選択によって任意のヒト細胞に分化させることができるので、あらゆる生体組織の欠損部に補填することができる。ヒト間葉系幹細胞の代わりに、所定のヒト細胞、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等を直接用いて生体組織補填体を構成することにしてもよい。これらの場合には、それぞれの生体組織に特化して欠損部の修復を図ることができる。
【００３３】
また、本実施形態においては、ヒト間葉系幹細胞と陰イオン修飾ヒアルロン酸とを混合してなる生体組織補填体を例示して説明したが、これに、βリン酸三カルシウムのようなリン酸カルシウム多孔体の粉体または顆粒体を混合してもよい。このように構成することにより、リン酸カルシウム多孔体を足場としてヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させ、骨組織の形成作用を促進して骨欠損部を迅速に修復することができる。
【００３４】
特に、粉体状または顆粒体状のリン酸カルシウム多孔体を使用することにより、ある程度流動性を有する生体組織補填体が構成されている。そして、粘性を有する陰イオン修飾ヒアルロン酸の水溶液によってリン酸カルシウム多孔体が、一纏まりに保持されるので、骨欠損部への補填時に周囲に付着して炎症を起こす等の不都合の発生を防止することができる。
【００３５】
次に、陰イオン修飾ヒアルロン酸を軟骨分化用培地に添加して、軟骨分化マーカの発現を検討した実施例について、以下に説明する。
軟骨分化用培地としては、ブレットキット軟骨細胞分化用培地（三光純薬社製）を用い、ヒト細胞としてヒト間葉系幹細胞を用い、陰イオン修飾ヒアルロン酸として、濃度０．００５％（５０μｇ／ｍｌ）の硫酸化ヒアルロン酸を添加した。そして、５％ＣＯ２濃度、３７℃で培養し、７日、１４日、２１日経過した場合のアグリカンおよびコラーゲンタイプ２を軟骨分化マーカとしてそれぞれ測定した。比較例として、陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加しない場合、および、ヒアルロン酸を添加した場合について併せて示す。
【００３６】
その結果、ヒト間葉系幹細胞から軟骨分化させたとき、陰イオン修飾ヒアルロン酸が存在すると、軟骨に分化したときに発生する物質であるアグリカンが、培養１４日、２１日目において、また、コラーゲンタイプ２が、培養２１日目において有意に高く産生されていることがわかった。したがって、陰イオン修飾ヒアルロン酸は軟骨再生用材料としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施形態に係るヒト細胞の培養方法によるヒト間葉系幹細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。
【図２】骨芽細胞に分化しつつあるヒト間葉系幹細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示す図１と同様のグラフである。
【図３】図２の骨芽細胞の相対アルカリフォスファターゼ活性の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。
【図４】図２の骨芽細胞によるカルシウム沈着の陰イオン修飾ヒアルロン酸濃度依存性をヒアルロン酸濃度依存性との対比において示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態に係る培養容器を説明する模式的な縦断面図である。
【図６】図５の培養容器によるヒト表皮角化細胞の増殖度の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。
【図７】図６のヒト表皮角化細胞の細胞間連絡機能の亢進の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。
【図８】図５の培養容器によるヒト表皮角化細胞の分化促進の陰イオン修飾ヒアルロン酸密度依存性を示すグラフである。
【図９】図８の各密度における細胞の形態を顕微鏡写真で示す図である。
【図１０】本発明の一実施例に係るヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化において陰イオン修飾ヒアルロン酸を添加した場合の軟骨分化マーカの発現結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３８】
１  培養容器
１ａ  底面（内表面）
２  培地
３  ヒト表皮角化細胞（ヒト細胞）
４  コーティング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006211920.tif 000009
【図８】
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【図９】
2006211920.tif 000011
【図１０】
2006211920.tif 000012