(57)【要約】【課題】  血液等の生物学的液体より分離対象物を選択的かつ効率的に分離するための装置を提供する。【解決手段】 生物学的液体中の分離対象物を分離するための装置であって、（Ａ）基材及び（Ｂ）分離対象物に対して選択的な高親和性を有する核酸リガンドを含み、該核酸リガンドが該基材の表面に固定化された装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的液体中の分離対象物を分離するための装置であって、（Ａ）基材及び（Ｂ）分離対象物に対して選択的な高親和性を有する核酸リガンドを含み、該核酸リガンドが該基材の表面に固定化された装置。
【請求項２】
該核酸リガンドを構成する核酸塩基が２’−アミノピリミジン、２’−フルオロピリミジン、及び２’−メトキシプリンからなる群から選ばれる核酸塩基の少なくとも１つを含有する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
生物学的液体が血液である請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
血液が体外循環中の血液である請求項３に記載の装置。
【請求項５】
分離対象物がＣＤ４陽性有核細胞である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
基材が不織布である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
カラムに充填された形態の請求項１ないし６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
自己免疫疾患の治療及び／又は予防のために用いる請求項１ないし７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置を用いて、生物学的液体から分離対象物を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の生物学的液体より分離対象物を選択的に除去するための分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ番号で分類される各種細胞表面分子を有する白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）、血小板などの血球やサイトカインなどの液性因子は免疫系において極めて重要な役割を果たしていることが知られている。ヒトＣＤ４は糖タンパク質で、モノマーとして細胞膜上に存在し、主としてＴリンパ球に発現している。ＣＤ４を発現しているＴリンパ球（ＣＤ４陽性Ｔリンパ球）はヘルパーＴリンパ球としての性質をもち、クラスIIＭＨＣ分子によって提示された抗原を認識する。また、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球はＨＩＶ(エイズウイルス)と結合し、感染の際に受容体として働くことも知られている。免疫系においてＴリンパ球は抗原に対して適切に応答するのに不可欠である。
【０００３】
健常人では自己免疫の障害を防ぐために、自己反応性抗原受容体を持ったリンパ球クローンの除去、それらの無反応性化、その働きの抑制といった様々な機構を用意している（免疫寛容）。自己免疫疾患の発生に関するメカニズムはまだ十分には解明されていないが、このような免疫寛容機構の異常が自己免疫疾患の原因となると考えられている。自己反応性抗原受容体を持ったリンパ球クローンはＣＤ４を発現しているＴリンパ球だけではないが、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の自己免疫疾患における重要性は認識されている。
【０００４】
一方、液性因子の代表であるサイトカインは、細胞シグナリング／細胞相互作用を誘発するタンパク質の多様なグループである。これらは、標的細胞の表面に発現されるその特異的な受容体を介して生物学的機能を発揮する。 サイトカインはイムノ／ヘマトポイエチン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)−関連分子、及びケモカインを包含する数グループに亜分類できる。代表的なイムノ／ヘマトポイエチンにはエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン−Ｍ（ＯＳＭ）、絨毛性神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０ 及びＩＬ−１２ がある。代表的なインターフェロン（ＩＦＮ）にはＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮγが包含される。代表的なＴＮＦファミリーメンバーにはＴＮＦα、インターフェロン（ＩＦＮ）β、ｇｐ３９（ＣＤ４０−Ｌ）、ＣＤ２７−Ｌ、ＣＤ３０−Ｌ，及び神経成長因子（ＮＧＦ）が包含される。代表的ケモカインは血小板因子（ＰＦ）４、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、ｇｒｏα、ＭＩＧ、ＥＮＡ−７８、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）１α、ＭＩＰ１β、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、Ｉ−３０９、ＨＣ１４、Ｃ１０、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、及びＩＬ−８である。
【０００５】
上記ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球、血小板やサイトカインなどの液性因子は、自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチなどのシェーグレン症候群，若年性糖尿病，重症筋無力症，重症の炎症性腸疾患、多発性硬化症、ヒト全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、又はアトピー状態（アレルギー／喘息）などのほか、移植片体宿主病（ＧＶＨＤ）、敗血症、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、感染症、間質性肺炎、脳マラリア、ＡＩＤＳ、パーキンソン病、又は子宮内膜増多症などの疾患発症に大きな作用及び影響を及ぼすことが知られている。
【０００６】
自己免疫疾患や敗血症などの治療方法としては、その症状の程度に応じて副腎皮質ホルモン剤の投与，脾臓の摘出，又は免疫抑制剤の投与などが行なわれている。しかしながら、こうした薬物療法や摘脾手術を行っても効果的に回復しない症例も多く存在している。こうした患者に対して確実に有効な治療方法は未だ確立されていないのが現状であり、その方法の開発が急がれている。
【０００７】
自己免疫疾患や敗血症などの他の治療方法として、免疫吸着カラムを用いた血液の体外循環によるＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球やサイトカインの吸着除去も種々試みられている。例えば、ＣＤ４抗原と結合性を有する抗ＣＤ４抗体を担体に固定化したカラムの適用も検討されている。しかしながら、抗ＣＤ４抗体は極めて高価であり、また、高い安定性及び安全性が求められる医療用機器として上記カラムを利用するには種々の問題点が残されている。また、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球やサイトカインと親和性を有するポリペプチドを固定化したＣＤ４陽性細胞吸着材又はサイトカイン吸着材が検討されているが、リガンドに用いているポリペプチドの親和性及び特異性に問題があり、十分な選択的吸着能力を達成できていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、 血液等の生物学的液体から特定の分離対象物を選択的に分離することができる手段を提供することにある。より具体的には、血液などの生物学的液体から効率的かつ安全にＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球やサイトカインなどの分離対象物を分離するための装置を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記の課題を解決すべく、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球又は血小板やサイトカインなどの液性因子に対して高い選択性及び親和性を有し、かつ安価で、血液体外循環などの医療用途に用いても副作用などの問題を引き起こさない高度に安全なリガンドを提供するための研究を鋭意行なった。その結果、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）として知られる方法を適用することによって作成及び最適化した核酸リガンドが、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球及び血小板やサイトカインに対して強い親和性及び選択性を有しており、安価に調製可能なリガンドとして安全に体外循環などの医療用途に使用できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明により、生物学的液体中の分離対象物を分離するための装置であって、（Ａ）基材及び（Ｂ）分離対象物に対して選択的な高親和性を有する核酸リガンドを含み、該核酸リガンドが該基材の表面に固定化された装置が提供される。
この発明の好ましい態様により、該核酸リガンドを構成する核酸塩基が２’−アミノピリミジン、２’−フルオロピリミジン、及び２’−メトキシプリンからなる群から選ばれる核酸塩基の少なくとも１つを含有する上記の装置；生物学的液体が血液である上記の装置；血液が体外循環中の血液である上記の装置；分離対象物がＣＤ４陽性有核細胞である上記の装置；基材が不織布である上記の装置；カラムに充填された形態の上記の装置；自己免疫疾患の治療及び／又は予防のために用いる上記の装置；及び自己免疫疾患が慢性関節リウマチなどのシェーグレン症候群、若年性糖尿病、重症筋無力症、重症の炎症性腸疾患、多発性硬化症、ヒト全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、又はアトピー状態（アレルギー／喘息）である上記の装置が提供される。
【００１１】
別の観点からは、上記の装置を用いて、生物学的液体から分離対象物を分離する方法が本発明により提供される。さらに別の観点からは、自己免疫疾患、好ましくは慢性関節リウマチなどのシェーグレン症候群、若年性糖尿病、重症筋無力症、重症の炎症性腸疾患、多発性硬化症、ヒト全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、又はアトピー状態（アレルギー／喘息）の治療及び／又は予防方法であって、上記の装置により該疾患に関与する分離対象物を血液から分離する工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の装置は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球又は血小板やサイトカインなどの液性因子などの分離対象物に対して選択的な親和性を有しており、安価に製造でき、血液体外循環などの医療用途に用いた場合に副作用などの問題を引き起こさずに高度に安全に使用できるという特徴を有する。本発明の装置を用いて、例えば血液などの生物学的液体から自己免疫疾患治療、敗血症、又は癌など疾患の治療及び／又は予防を目的としてＴリンパ球などの細胞やサイトカインなどの液性因子を安全かつ効率的に除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において、「生物学的液体」とは、生物由来の物質、細胞、組織などの生物由来物を含有する液体のことを意味する。生物由来物としては、例えば、タンパク質、脂質、糖、又は核酸などの生体構成物質のほか、細胞、ウィルス、バクテリア、又は組織などを挙げることができる。生物学的液体には、上記の生物由来物のほか、有機物又は無機物が１種又は２種以上含まれていてもよい。生物学的液体を構成する溶媒は主として水であるが、生理学的に許容される範囲で少量のアルコール類などの有機溶剤を含んでいてもよい。より具体的には、生物学的液体として、例えば、血液、リンパ液、骨髄、臓器消化液、又は培養液などを挙げることができる。これらのうち、血液、リンパ液、骨髄液、又は臓器消化液は、従来利用されている各種の吸着剤による選択吸着を妨害する夾雑物が多く含まれており、分離対象物を選択的に除去することが困難であった。特に、血液は夾雑物が多量に含まれており、さらに抗体やポリペプチドなどの従来の吸着剤に対する分解酵素が多く含まれているため、分離対象物を安定かつ選択的に除去することは従来困難であった。一方、本発明の核酸リガンドは上記のような夾雑物の影響をほとんど受けないことから、血液、リンパ液、骨髄液、又は臓器消化液に含まれる分離対象物をきわめて効率的かつ選択的に除去することが可能になる。
【００１４】
本明細書において、「分離対象物」とは、生物学的液体に含まれる生物由来の物質、細胞、組織などの生物由来物のうち、除去対象となる特定の生物由来物のことを意味している。分離対象物としては、例えば、ＣＤ番号で分類される各種細胞表面分子を有する白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、又は単球）、血小板などの血球や、サイトカインなどの液性因子などを挙げることができる。また、分離対象物は、バクテリア、ウィルス、エンドトキシン、プリオンなどの外来由来の生物由来物であってもよい。
【００１５】
白血球としては、例えば、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性単球などのＣＤ４陽性有核細胞、ＣＤ１４陽性有核細胞などを挙げることができる。サイトカインは、イムノ／ヘマトポイエチン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)−関連分子、及びケモカインを包含する数グループに亜分類できる。代表的なイムノ／ヘマトポイエチンには、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン−Ｍ（ＯＳＭ）、絨毛性神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２が包含される。代表的なインターフェロン（ＩＦＮ）には、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγが包含される。代表的なＴＮＦファミリーメンバーには、例えば、ＴＮＦα、インターフェロン（ＩＦＮ）β、ｇｐ39（ＣＤ４０−Ｌ）、ＣＤ２７−Ｌ、ＣＤ３０−Ｌ、及び神経成長因子（ＮＧＦ）が包含される。代表的ケモカインには、例えば、血小板因子（ＰＦ）４、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、ｇｒｏα、ＭＩＧ、ＥＮＡ−７８、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）１α、ＭＩＰ１β、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、Ｉ−３０９、ＨＣ１４、Ｃ１０、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、及びＩＬ−８が包含される。また、サイトカインなどの液性因子としては、例えば、アナンダマイド（ＡＮＡ）、２−ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（２−ＡＧ）、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｒｏｕｐ  １（ＨＭＧ−１）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥ）、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）などを挙げることができる。もっとも、本発明において分離対象物は上記に説明した特定のものに限定されることはない。なお、１つの核酸リガンドにより２種以上の分離対象物を除去することも可能である。
【００１６】
本明細書において、「核酸リガンド」とは、上記の分離対象物に対して選択的に高い親和性を有する核酸、又は該核酸の１種又は２種以上を部分構造として含む核酸、あるいはこれらの核酸の１種又は２種以上とその他の物質の１種又は２種以上とからなる複合体を意味している。一般的に、親和性は核酸リガンドと分離対象物との間の解離定数で表され、通常、解離定数は１０-2以下、好ましくは１０-4以下、さらに好ましくは１０-6以下、特に好ましくは１０-9以下である。より具体的には、該核酸は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミンなどの天然の核酸塩基、あるいは５−メチルシトシン、６−メチルアミノプリン、２’−アミノピリミジン、２’−フルオロピリミジン、又は２’−メトキシプリンなどの非天然型の核酸塩基により構成される核酸である。例えば、本発明の装置を血液体外循環装置などの血液に接触する用途に用いる場合には、核酸分解酵素に対する安定性を向上させるために、該核酸中に２’−アミノピリミジン、２’−フルオロピリミジン、及び２’−メトキシプリンからなる群から選ばれる非天然型の核酸塩基を少なくとも１つを含有することが好ましい。該核酸のサイズは特に限定されないが、通常は１０塩基以上で２００塩基以下、好ましくは１０塩基以上で１００塩基以下、さらに好ましくは、２０塩基以上で７０塩基以下である。
【００１７】
核酸リガンドに含まれる核酸は、分離対象物に対して十分に高い親和性を有し、かつ分離対象物に対して選択的に親和性を有するように設計することができる。上記核酸の設計には、例えば、セレックス法（ＳＥＬＥＸ法）を利用することができる。セレックス法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９６，２６７、２７５に記載されているＢ，Ｐｏｌｉｓｋｙらの方法、及びＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６０（１１），５２０９−５２１２に記載されているＷｉｌｌｉａｍ  Ｊａｍｅｓらの方法などを用いることができるが、これらに限定されることはない。
【００１８】
セレックス法は、典型的には下記の工程を含んでおり、分離対象物を標的として下記の工程を行なうことにより、分離対象物に対して選択的に高い親和性を有する核酸を得ることができる。もっとも、下記の工程は一例として挙げたものであり、当業者はこれらの工程に適宜の変更ないし修飾を加え、必要に応じて他の工程を採用することにより、所望の核酸を得ることができる。
（１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。一般に、候補混合物は固定された配列の領域及び無作為化された配列の領域を包含する。
（２）候補混合物を選択された標的と接触させる。この接触は、標的と候補混合物のメンバーとの間の結合に好都合な条件下に行なわれる。
（３）標的に対して比較的高い親和性を有する核酸を、標的に対する親和性がより低い核酸から分離する。
（４）上記工程（３）により分離された核酸（標的に対して比較的高い親和性を有する核酸）を増幅し、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸が濃縮された新たな候補混合物を創製する。
（５）上述の分離及び増幅工程を反復することにより、標的に対して最高の親和性を有する１種又は少数種の核酸を含有する候補混合物を得る。
【００１９】
上記の核酸リガンドを基材表面に固定化することにより、本発明の分離装置を製造することができる。基材としては、常温の生物学的液体中で固形状態にあるものであればその種類は特に限定されず、その形状も特に限定されることはない。形状としては、例えば、球状、立方状、平面状、チップ状、繊維状、平膜状、スポンジ状、又は中空糸状などの形状を挙げることができる。これらのうち、細密充填のしやすさ、核酸リガンドを比較的均質に表面に保持させやすい点、実有効面積を比較的多く確保できる点、及び生物学的液体の通過が容易である点などの観点から、球状、粒状、及び繊維状の形状が好ましい。さらに、繊維状の形状、特に繊維状の不職布は取り扱い及び血液などの生物学的液体の通過性の点で優れている。
【００２０】
基材の材質は、表面に核酸リガンドを保持できるものであれば、無機基材又は有機基材のいずれであってもよいが、細胞懸濁液などの生物学的液体との接触時に溶出物が少ないこと、及び形状の制御がより容易なことから有機高分子からなる基材が好ましい。有機高分子としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリレートエステル、ポリアクリレートエステル、ポリアクリル酸、若しくはポリビニルアルコール等のビニル系化合物又はその誘導体の重合体又は共重合体、ナイロン６又はナイロン６６等のポリアミド系化合物、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、あるいはセルロース等の植物由来の多糖類系化合物等が挙げられる。これらのうち、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、又はセルロース等の植物由来の多糖類系化合物は、血液などの生物学的液体と接触した場合に有害な不純物を溶出しないので好ましい。特に、ポリプロピレン又はポリエチレンテレフタレートは血液などの生物学的液体と接触した場合に血液を活性化しないなどの点で優れており、本発明に好ましく用いられる。
【００２１】
これらの基材と磁石とを組み合わせて、基材の回収を容易にすることもできる。基材を修飾し、表面に親水性を付与する手段を採用することも好ましい。アルブミン又はグロブリン等の生体由来タンパク質を固定化することや、適宜の親水性官能基を合成化学的に導入することによって、基材表面に親水性を付与することができる。親水性を付与するための親水性官能基としては、例えば、繰り返し単位が２から１５００のポリエチレングリコール鎖、水酸基、アミド基、エーテル基、又はエステル基などを挙げることができる。親水性を付与するためのポリエチレングリコール鎖を有するモノマーの例としては、例えば、メトキシジエチレングリコールメタクリレート、メトキシトリエチレングリコールメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールメタクリレート等の末端メトキシメタクリレート、メトキシジエチレングリコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレート、メトキシポリエチレングリコールアクリレート等の末端メトキシアクリレート、又はメチル基の代わりに水素が結合した末端水酸基を有するメタクリレート及びアクリレートなどを挙げることができる。親水性を与えるためのその他の置換基を有するモノマーとしては、例えば、ビニルピロリドン等が挙げられる。親水性置換基としては、例えば、ジメチルアミド基、ジエチルアミド基、ジイソプロピルアミド基等のアミド基などを用いてもよい。基材を構成する高分子鎖としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート鎖、ポリブチレンテレフタレート鎖等の芳香族ポリエステル鎖及び脂肪族ポリエステル鎖等のポリエステル鎖、メチレングリコール鎖、プロピレングリコール等のポリエーテル鎖、又はポリカーボネート鎖などを挙げることができ、これらの高分子鎖を形成可能なモノマーとして、親水性官能基有するビニルモノマーを挙げることができる。また、ビニルモノマー以外にアセチレンモノマー、ジエンモノマーなどを挙げることができる。繰り返し単位２〜１５００のポリエチレングリコール誘導体などをエポキシ基などの官能基を利用して直接基材に結合させることもできる。もっとも、親水性を付与するための手段は上記に例示したものに限定されることはない。
【００２２】
基材の表面を修飾し、その表面に親水性を付与する手段は特に限定されないが、例えば、共有結合、イオン結合、放射線やプラズマによるグラフト法、物理吸着、包埋、又は基材表面への沈澱不溶化など、当業者に利用可能な種々の手段を用いることもできる。例えば、高分子化合物やその単量体を放射線又はプラズマ等を用いてグラフト重合したり、共有結合するなどの公知の方法により表面改質を施す方法は本発明に好適に用いられる。基材表面に核酸リガンドを固定化する方法も特に限定されないが、例えば、放射線や電子線を用いて直接基材表面に核酸リガンドを共有結合する方法、又は化学的方法により基材表面の官能基を介して共有結合する方法などがある。
【００２３】
基材表面に核酸リガンド固定化するための官能基を導入する方法としては、例えば、ハロゲン化シアン法、エピクロロヒドリン法、ビスエポキシド法、ブロモアセチルブロミド法、又はハロゲン化アセトアミド法等がある。より具体的には、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物、サクシニルイミド基、置換性ハロゲン基、アルデヒド基、エポキシ基、又はトレシル基などを導入することができる。核酸リガンド固定化のしやすさの観点から、例えば、ブロムシアン法、Ｎ−ヒドロサクシンイミド基法、又はハロゲン化アセトアミド法が好ましい。
【００２４】
官能基導入に用いるハロアセトアミノメチル化剤としては、Ｎ−ヒドロキシメチルクロロアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルフルオロアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルブロモアセトアミド、又はＮ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド等が好ましく用いられる。これらのうち、経済性及び安定性の観点から、より好ましくは、Ｎ−ヒドロキシメチルブロモアセトアミド、又はＮ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド等を用いることができる。基材に導入されたフルオロ基又はクロロ基は官能基導入後にヨウ化カリウム又は臭化カリウムの溶液で処理することで容易にヨウ素基又は臭素基に変換できる。これらの官能基を導入した基材の製造に用いられる酸触媒の種類は特に限定されず、強酸、特にプロトン酸であれば何れの酸を用いてもよい。例えば、トリフルオロメタン、メタン、ベンゼン、又はトルエン等のスルホン酸誘導体、あるいは硫酸、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、又は四塩化スズ等のフリーデル・クラフツ触媒等が好ましく用いられる。核酸リガンドを上記基材に固定する場合、通常は核酸リガンドを構成する核酸の５’末端又は３’末端、あるいはその鎖上にリンカーを導入することができる。リンカーとしては、下記の式（１）で表されるアミノ基、式（２）で表されるチオール基、又は式（３）で表されるビオチン基などが有用であるが、これらに限定されることはない。
【００２５】
【化１】
2006095139.tif 000002
【００２６】
【化２】
2006095139.tif 000003
【００２７】
【化３】
2006095139.tif 000004
【００２８】
核酸リガンドを基材に固定化する際に、核酸リガンドと基材との間に任意の長さの分子（スペーサー）を配置して、このスペーサーを介して核酸リガンドを基材に結合させることも好ましい。スペーサーの例として、例えば、ポリメチレン鎖又はポリエチレングリコール鎖等が挙げられる。スペーサーを介して基材に核酸リガンドを結合させる方法としては、例えば、基材としてアガロースを用いる場合にはアガロースの水酸基とスペーサーであるヘキサメチレンジイソシアナートの片側のイソシアナート基とを反応させて結合を形成させ、残ったイソシアナート基と核酸リガンドのアミノ基又はチオール基等とを反応させて結合を形成させる方法等が挙げられる。
【００２９】
本発明の分離装置を用いて、血液などの生物学的液体からＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球又は血小板などの血球やサイトカインなどの液性因子等の分離対象物を効率的かつ安全に分離することができる。例えば、体外において血液細胞懸濁液から、あるいは体外循環により血液から効率よく白血球などの血球やサイトカインなどの液性因子等の分離対象物を分離することが可能となる。また、白血球などの血球やサイトカインなどの液性因子を除去した細胞群を含む血液などの生物学的液体を種々の疾患の治療に用いることができる。あるいは、除去されたＣＤ４陽性Ｔリンパ球を回収して、該リンパ球を主たる成分として含む細胞懸濁液を調製することもできる。
【００３０】
分離対象物を分離する方法として、例えば、カラムによる分離又は磁気ビーズによる分離などの手段を採用できる。カラム法では、例えば、分離対象物である目的細胞上に存在する膜抗原に選択的に親和性を有する核酸リガンドを基材表面に固定化し、この基材をカラムに充填して血液などの生物学的液体を通過させることにより、分離対象物である細胞を簡便かつ効率的に分離することができる。磁気ビーズ法では、まず細胞混合液などの生物学的液体を核酸リガンドを結合させた磁気ビーズとともにインキュベートして分離対象物である目的細胞を磁気ビーズで標識し、その後、磁気装置を用いて標識されていない細胞から標識細胞を分離することができる。
【００３１】
本発明の分離装置を用いて血液などの生物学的液体から上記ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球、血小板やサイトカインなどの液性因子を分離及び除去することにより、種々の疾患の治療及び／又は予防を行なうことができる。このような疾患として、例えば、慢性関節リウマチなどのシェーグレン症候群、若年性糖尿病、重症筋無力症、重症の炎症性腸疾患、多発性硬化症、ヒト全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、アトピー状態（アレルギー／喘息）などの自己免疫疾患を挙げることができる。また、上記ＣＤ４陽性Ｔリンパ球などの白血球又は血小板やサイトカインなどの液性因子は、上記自己免疫疾患以外の疾患、例えば、移植片体宿主病（ＧＶＨＤ）、敗血症、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、感染症、間質性肺炎、脳マラリア、ＡＩＤＳ、パーキンソン病、子宮内膜増多症などの疾患の発症に深く関与していることが知られている。さらに、上記ＣＤ４陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性単球などのＣＤ４陽性有核細胞、ＣＤ１４陽性有核細胞などの白血球又は血小板やサイトカインなどの液性因子が、癌などの疾患発症にも深く関与していることも知られている。従って、本発明の分離装置を用いて血液などの生物学的液体からこれらの白血球又は血小板やサイトカインなどの液性因子を分離及び除去することにより、これらの疾患を治療及び／又は予防することもできる。
【００３２】
本発明の好ましい態様の一例として提供される血液体外循環分離装置は、核酸リガンドを表面に固定化した基材を選択的吸着剤として充填したカラム、あるいは該選択的吸着剤を充填したフラスコ状ケースを備えており、血液の体外循環のための配管及びポンプなどを含む分離システムとして構成される。このような血液体外循環装置の構成は例えば人工透析装置などに準じて適宜選択可能であり、本発明の分離装置とともに適宜の構成を採用することにより、当業者は容易に血液体外循環分離装置を製造することができる。本分離装置を用いて血液体外循環治療を行なう場合の流速は、通常、３０〜３００ｍｌ／分、好ましくは５０〜２００ｍｌ／分、さらに好ましくは８０〜１２０ｍｌ／分である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
例１
（１）材料及び方法
Ａ．塩基
アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンなどの核酸塩基、２’−フルオロピリミジンなどの修飾核酸塩基は Ａｍｅｒｓｈａｍ社より購入した。
Ｂ．セレックス
セレックス操作はＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９６，２６７、２７５に記載されているＢ，Ｐｏｌｉｓｋｙらの方法、及び、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６０（１１），５２０９−５２１２に記載されているＷｉｌｌｉａｍ  Ｊａｍｅｓらの方法に準拠して行った。
上記方法で得られたＲＮＡ核酸ライブラリーはランダム領域の３６塩基は一方の片側５’位に２４塩基、他方の片側３’位に２３塩基を有している。
遺伝子組み換えＣＤ４抗原はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１３，７、及び、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６０，９７９に記載されているＡ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓらの方法に準拠して作成した。遺伝子組み替えＣＤ４抗原はＰｈａｒｍａｃｉａ社のＣＮＢｒ活性化セファロースビーズに固定された。
【００３４】
上記ＣＤ４抗原を固定化したセファロースビーズを上記ＲＮＡ核酸ライブラリーを含有するリン酸緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2）とともにインキュベートした後、ビーズをろ過分離し、ビーズを核酸を含有しない前記リン酸緩衝液で５回洗浄した。ビーズに結合した核酸を７Ｍの尿素水溶液で溶出した。回収された核酸を鋳型としてＰｈａｒｍａｃｉａ社のＡｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）の逆転写酵素を用いてＤＮＡに逆転写した。得られたＤＮＡをＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９６，２６７、２７５に記載されているＢ，Ｐｏｌｉｓｋｙらの方法によりＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）で増幅し、さらに転写酵素でＲＮＡに転写した。その後、同様な操作を１５回繰り返してＣＤ４抗原に対して選択的親和性を有するＲＮＡを得た。このＲＮＡを再度上記逆転写酵素でＤＮＡとし、ＰＣＲで増幅した後、両端にあるプライマー（プライマー１：ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ、プライマー２：ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ）を分解酵素で消化しｐＵＣ１９ベクターでＲＮＡ核酸リガンドのクローンを得た。得られたクローンはＷａｒｒｉｎｇｔｏｎ社Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３６０の自動シークエンサーにより配列を決定した。その結果、ＲＮＡ核酸リガンドは下記の配列を有していた。ＡＣＵＵＣＡＧＣＵＣＵＡＵ-ＵＡＡＣＡＧＣ-ＵＣＡＡＧＧＡＣＵＧ-ＧＣＡＣＡ
【００３５】
Ｃ．ＲＮＡ核酸リガンドの５’末端へのリンカー導入
上記核酸リガンドを自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で［１−（ベンジルジチオ）ヘキシル］−６−オキシ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロプルアミノ−ホスホルアミダイトと反応させた後、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．５６，５９０７（１９６８）の高橋等の方法によりベンジルメルカプタン基を除去し、５’末端にリンカーとして５’−Ｃ６−チオール基を有するＲＮＡ核酸リガンドを合成した。
【００３６】
Ｄ．血液中のＣＤ４陽性細胞の分離
２−ヨードアセトアミド（東京化成社）５０ｇを蒸留水 １００ｍｌに懸濁し、３７％ホルムアルデヒド（和光純薬工業社）２０ｍｌを加え５０℃攪拌下で溶解した。炭酸カリウム２５．２ｇを徐々に加え、スターラーで１０分間攪拌後、室温にて２時間放置した。さらに４℃で一晩静置したのち、上清をデカンテーションにより捨て、蒸留水を４０ｍｌ加えたのち５０℃で沈殿を溶解し、室温にて２時間放置し、さらに４℃で一晩再び静置した。この操作をもう一度繰り返してから、生じた沈殿をＧ−３のガラスフィルター（フィルター径３０ｍｍ：日本理化学器械（株）社）に通過させることにより回収し、１時間アスピレーターにて吸引乾燥してから、２４時間凍結乾燥し、核酸リガンド固定化用活性基であるＮ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミドを調製した。
【００３７】
ガラス製のフラスコに硫酸５．７ｍｌ、ニトロベンゼン７．２ｍｌ及びパラホルムアルデヒド０．０３６３ｇを加え、攪拌下溶解後、Ｎ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド０．５８ｇを加え攪拌した。これにポリプロピレンからなる不織布（平均繊維直径３．３μｍ）０．３ｇを入れ室温にて一晩反応した。反応後不織布を取り出し、純水にて洗浄し、これを真空乾燥して、核酸リガンド固定化用活性基を導入した不織布を得た。この不織布を直径０．７ｃｍの円に切断し、それぞれ４枚ずつをＰＢＳに溶解したＲＮＡ核酸リガンド（５’末端にリンカーとして５’−Ｃ６−チオール基を有するＲＮＡ核酸リガンド）の溶液（１２μｇ／４００μｌ）に室温にて２．５時間浸し、ＲＮＡ核酸リガンドを固定した。２．５時間後、ＰＢＳで洗浄した。入口と出口を有する容量１ｍｌの容器にこの不織布を４枚充填したカラムを作成した。また比較対照として牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ピアス社アルブミンスタンダード）を核酸リガンドの代わりに同様に固定化したカラムも作成した。
【００３８】
健常人より末梢血１５ｍｌを採取し、ハンクスバランスド生理食塩水（ギブコ社）で３０ｍｌとし、フィコールパック（ファルマシア社）を１０ｍｌずつ分注した遠沈管２本に静かに１３ｍｌずつ重層し、 ８００回転／分、２０分の条件にて分離し、有核細胞層の細胞を回収した。ヒト健常人血液よりフィコールパック（ファルマシア社）を使った密度勾配遠心法により有核細胞層の細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、１．２×１０6個／ｍｌに調整した。この有核細胞浮遊液４ｍｌをシリンジポンプを用いて流速１ｍｌ／分で送液し、上記で作製したカラムの入口より流した。カラム出口より処理後の液を回収した。この時のＣＤ４陽性細胞の比率を、公知のフローサイトメトリー法（ＦＡＣＳ）で測定した。ＦＡＣＳ解析の際の細胞の染色はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ファーミンジェン社）を用い、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベックトン・ディッキンソン社）を用いて測定した。表１にカラム通過前後でのＣＤ４陽性有核細胞と他の有核細胞（ＣＤ４陰性有核細胞）の比率を示した。核酸リガンド固定化カラムを通過させることによりＣＤ４陽性有核細胞が効率的かつ選択的に除去されていた。
【００３９】
【表１】
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【配列表】
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