(57)【要約】【課題】  スーパー抗原融合蛋白及びその応用方法の提供。【解決手段】  一部のＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白質をエンコードするペプチドフラグメントと、蛋白質を細胞内にトランスポートしサイトゾル内で蛋白質をトランスロケートするためのペプチドフラグメントを具え、そのうち、一部のＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白質をエンコードするペプチドフラグメントはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、又はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を包含する。本発明はまた一部のＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白質をエンコードしＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、又はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を包含するＤＮＡ配列を提供し、このＤＮＡ配列は大腸桿菌表現システムでそれが対応する特異蛋白質を表現する。【選択図】        図１
2006025782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパー抗原融合蛋白において、
ＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白の少なくとも一部をエンコードするペプチドフラグメントと、
トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントと、
を具え、そのうち、ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、スーパー抗原融合蛋白。
【請求項２】
請求項１記載のスーパー抗原融合蛋白において、トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントは緑膿菌外毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）であることを特徴とする、スーパー抗原蛋白。
【請求項３】
核酸配列において、該核酸配列は大腸桿菌表現システム中において、特定性のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を表現し、それは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８
の配列を有することを特徴とする、核酸配列。
【請求項４】
請求項３記載の核酸配列において、該核酸配列がトランスロケート機能を有するペプチドフラグメントを具えたことを特徴とする、核酸配列。
【請求項５】
請求項４記載の核酸配列において、トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、核酸配列。
【請求項６】
Ｔ細胞に接合されるペプチドにおいて、少なくとも一部のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を含有し、該ペプチドは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、ペプチド。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドにおいて、これらペプチドは大腸桿菌表現システムにより発生したことを特徴とする、ペプチド。
【請求項８】
請求項６記載のペプチドにおいて、トランスロケート機能を具えたペプチドを包含することを特徴とする、ペプチド。
【請求項９】
請求項８記載のペプチドにおいて、トランスロケート機能を有するペプチドが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、ペプチド。
【請求項１０】
Ｔ細胞との接合に用いられるペプチドを含有する医薬組成物において、この医薬組成物は素ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白の少なくとも一部をエンコードするペプチドフラグメントを具え、
このペプチドフラグメントは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の医薬組成物において、トランスロケート機能を具えたペプチドを更に包含することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の医薬組成物において、トランスロケート機能を有するペプチドが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＡＲＳウイルス感染の治療に用いられることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１０記載の医薬組成物において、医薬上許容可能な担体を更に具えたことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２或いはその混合物のペプチドを包含し、受動免疫誘発のワクチンとして用いられることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４或いはその混合物のペプチドを包含し、ＳＡＲＳウイルスのワクチンの製造に用いられることを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一種のスーパー抗原融合蛋白及びその応用方法に係り、特に抗原に接合して細胞を現出可能で、有効に抗体を誘発し、ウイルス感染を抑制し、スーパー抗原反応を遮断する融合蛋白に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは微小で、独立繁殖不能であり、細胞内に寄生しなければ生存できず、ゆえに生物と非生物の中間に属する。コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ターゲット細胞上の受容体と結合した後、嚢泡を形成し、エンドサイトシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に進入し、更に細胞染色体中に嵌入し、転写により、ウイルスのＲＮＡがＤＮＡに転じ、更に細胞染色体中に嵌入し、宿主細胞を利用してウイルスが必要な蛋白及び遺伝物質を製造し、酵素の触媒作用により、蛋白と遺伝物質が組込まれた後、細胞内より釈放され、並びに宿主細胞を破壊する。
【０００３】
ウイルスは細胞表面上の受容体を認定し、例えばＨＩＶはＴ細胞表面のＣＤ４とＣＣＲ５抗原を認定した後でなければ細胞に進入できない。コロナウイルスは肺臓或いは腎臓等の細胞上のアミノペプチダーゼ（Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−Ｎ）即ちＣＤ１３受容体の構造を認定することで侵入できる。これによりバイオテクノロジーの発展を以てウイルスに対抗する重要な方向は、ウイルスと表面抗原の結合を阻止できる薬物を設計し、ウイルスの侵入を防止することである。ただし上述のウイルスはスーパー抗原（ｓｕｐｅｒ−ａｎｔｉｇｅｎ）を具備し、直接Ｔ細胞上の受容体と結合した後、Ｔ細胞の大量のインターロイキン或いはγ−インターフェロンの発生を誘発し、更にはそれと結合したＴ細胞を死亡経路に侵入させる（アポトーシス）。これにより、もしスーパー抗原と細胞の結合メカニズムを排除すれば、ウイルスの細胞受容体からの侵入を防止でき、即ち感染症状を防止或いは軽減できる。
【０００４】
免疫システム中、各Ｔ細胞の細胞膜には自己のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が表出し、ほぼ百万個の成熟したＴ細胞が我々の身体中を巡っており、ＴＣＲを通して身体内体細胞或いは抗原表出の細胞膜上に付帯する情報を検査できる。抗原表出細胞は外来蛋白質の認識に供される複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｒｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）の存在を有し、ＭＨＣはペプチドプラグメントと結合後に細胞膜表面に表出し、ＭＨＣとペプチドの形成する複合体は専門的に情報をＴＣＲに提供し、自己或いは非自己かの認識の媒介を行なう。しかし、科学者の努力、研究により、ＳＡＲＳウイルスが体内に侵入後、その外套膜のスパイク蛋白（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の一部がＴ細胞のＴＣＲと結合し、且つ抗原表出細胞のＭＨＣ分子の参加がなくとも、即刻正常細胞を外来侵入者と誤認する情報を釈放し、これによりＴ細胞の大量増殖或いは大量のインターロイキンの発生を誘発し、これにより自身の細胞の攻撃をもたらして免疫或いは発炎反応を引き起こすことがわかっている。以上の研究に基づき、ＳＡＲＳスパイク蛋白がスーパー抗原の特性を有していることが分かるが、このスーパー抗原がアミノ酸配列のどの部分であるかは、更に詳しく検討する必要があり、研究によるとこのスーパー抗原の位置は、ＳＡＲＳスパイク蛋白アミノ酸配列の第６８０から１０５０個の位置であると推測されているが、更なる実証が必要である。
【０００５】
ＳＡＲＳウイルス侵入時に引き起こされるセルフ免疫反応の防止は、ワクチンに類似のシステムにより達成されうる。ワクチン接種の鍵は、最終的に感染された寄主体内にもともと存在する抗体とウイルス記憶を保存するリンパ細胞の発生する作用にある。本発明者は、「融合蛋白が有効に抗体策略を誘発する」ことによって、「スーパー抗原区分免疫」を行ない、高力価抗体を誘発し、これにより健康者の体内の免疫細胞にＳＡＲＳウイルス超抗原エリアを認識できる抗体を発生させ、ＳＡＲＳウイルス感染時に、該抗体とＳＡＲＳウイルス超抗原エリアが結合し、過度にＴ細胞増殖を刺激する情況なくしてスーパー抗原或いは発炎反応を軽減することを発見した。本発明者は、また、「融合蛋白輸送システム」により、「細胞受容体ＣＤ１３結合エリアの抗体誘発」を進行し、こうして誘発した抗体はＳＡＲＳウイルスの細胞侵犯を遮断でき、ＳＡＲＳ予防の目的を達成できることを発見した。
【０００６】
ＳＡＲＳの研究を行なうための主要な条件は、先ずＳＡＲＳウイルスを取得することであるが、このウイルスは飛沫接触により伝染するため、この高い伝染性のウイルスを分離するには、設備が完備された実験室中でなければならない。即ち、科学者によりＳＡＲＳ野生ウイルス株の遺伝子特定プロセスを完成したものでなければならず、体外で大量のウイルスを剛性するには、特定の宿主システムに依存する必要があり、利用上の制限がある。本発明者はネットワークで公告されたＳＡＲＳ野生ウイルス株の遺伝子配列を、アミノ酸配列に翻訳し、更にアミノ酸配列を、一般の大腸桿菌宿主システムに依り、最も効率的な表現のコドン使用頻度で改質し、並びに連続ＰＣＲステップにより、遺伝子配列を自己合成し、更に大腸桿菌宿主システム中にあってＳＡＲＳ蛋白質を効率的に表現する。こうしてウイルス遺伝子実体サンプル不要で、ＳＡＲＳ抗原を獲得できるので、ＳＡＲＳウイルスの研究に有利である。
【０００７】
以下に本発明の明細書中で提示される参考文献１について記した。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７０５５，１６３号明細書
【特許文献２】台湾特許出願第０９２１２６６４４号明細書
【非特許文献１】Ｌｉａｏ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４３：４９８−５０７，１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は一種のスーパー抗原融合蛋白及びその応用方法を提供し、そのうち、スーパー抗原融合蛋白は一部のＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメント、及び一部のトランスロケート機能を有するペプチドフラグメントをエンコードし、また、高い伝染性のウイルスを取得しなくとも、体外でＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白を合成できるように、本発明は更にスーパー抗原融合蛋白をエンコードするアミノ酸配列を包含し、ウイルスからのスーパー抗原融合蛋白を大腸桿菌宿主システム中で表現できるようにする。
【００１０】
本発明の別の目的は、Ｔ細胞に接合するスーパー抗原ペプチドエリア、特に、ＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白をターゲットとするペプチドを遮断し、抗体結合方式を利用し、予めＥ２スパイク蛋白スーパー抗原エリアと接合し、過度の免疫反応と過敏反応の誘発を防止することにある。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、Ｔ細胞上のＣＤ１３受容体に接合される接合ペプチドエリア、特にＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白をターゲットとするペプチドを遮断し、抗体結合方式により、ウイルスと免疫Ｔ細胞上のＣＤ１３受容体の接合を遮断し、予めＥ２スパイク蛋白スーパー抗原エリアと接合させ、ＳＡＲＳウイルスを免疫Ｔ細胞ＣＤ１３と接合後に寄主細胞を侵犯するのを防止することにある。
【００１２】
本発明はまたＳＡＲＳウイルスに感染したか否かの検査に使用可能で、それが誘発する抗体によりウイルスの寄主細胞への感染を防止でき、且つ免疫Ｔ細胞とＳＡＲＳウイルス接合後に誘発される過度免疫反応と過敏反応を減らせるため、本発明の融合蛋白はまた、ＳＡＲＳウイルスの感染症状を緩和或いは治療するのに用いられ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
請求項１の発明は、スーパー抗原融合蛋白において、
ＳＡＲＳ  Ｅ２スパイク蛋白の少なくとも一部をエンコードするペプチドフラグメントと、
トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントと、
を具え、そのうち、ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、スーパー抗原融合蛋白としている。
請求項２の発明は、請求項１記載のスーパー抗原融合蛋白において、トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントは緑膿菌外毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）であることを特徴とする、スーパー抗原蛋白としている。
請求項３の発明は、核酸配列において、該核酸配列は大腸桿菌表現システム中において、特定性のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を表現し、それは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８
の配列を有することを特徴とする、核酸配列としている。
請求項４の発明は、請求項３記載の核酸配列において、該核酸配列がトランスロケート機能を有するペプチドフラグメントを具えたことを特徴とする、核酸配列としている。
請求項５の発明は、請求項４記載の核酸配列において、トランスロケート機能を有するペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、核酸配列としている。
請求項６の発明は、Ｔ細胞に接合されるペプチドにおいて、少なくとも一部のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を含有し、該ペプチドは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、ペプチドとしている。
請求項７の発明は、請求項６記載のペプチドにおいて、これらペプチドは大腸桿菌表現システムにより発生したことを特徴とする、ペプチドとしている。
請求項８の発明は、請求項６記載のペプチドにおいて、トランスロケート機能を具えたペプチドを包含することを特徴とする、ペプチドとしている。
請求項９の発明は、請求項８記載のペプチドにおいて、トランスロケート機能を有するペプチドが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、ペプチドとしている。
請求項１０の発明は、Ｔ細胞との接合に用いられるペプチドを含有する医薬組成物において、この医薬組成物は素ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白の少なくとも一部をエンコードするペプチドフラグメントを具え、
このペプチドフラグメントは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、
或いは、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４、
を包含することを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１１の発明は、請求項１０記載の医薬組成物において、トランスロケート機能を具えたペプチドを更に包含することを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１２の発明は、請求項１１記載の医薬組成物において、トランスロケート機能を有するペプチドが緑膿菌外毒素であることを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１３の発明は、請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＡＲＳウイルス感染の治療に用いられることを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１４の発明は、請求項１０記載の医薬組成物において、医薬上許容可能な担体を更に具えたことを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１５の発明は、請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２或いはその混合物のペプチドを包含し、受動免疫誘発のワクチンとして用いられることを特徴とする、医薬組成物としている。
請求項１６の発明は、請求項１０記載の医薬組成物において、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４或いはその混合物のペプチドを包含し、ＳＡＲＳウイルスのワクチンの製造に用いられることを特徴とする、医薬組成物としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は一種のスーパー抗原融合蛋白を提供し、それは少なくとも一部分のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白遺伝子と同じペプチドフラグメントと、細胞結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）とトランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）機能を有するペプチドフラグメントをエンコードし、そのうち、ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメントはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を包含する。
【００１５】
本発明はまた、一種のスーパー抗原融合蛋白をエンコードしたＤＮＡ配列を包含し、それは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８を包含する。そのうち、これらＤＮＡ配列は大腸桿菌表現システムを以てその対応する特定蛋白質が表現される。
【００１６】
本発明は更にＴ細胞に接合可能なペプチドを包含し、該ペプチドは少なくとも一部分のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を包含し、このペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を包含する。
【００１７】
本発明はまたＴ細胞に接合するのに用いられるペプチドの医薬組成物を提供し、それは少なくとも一部分のＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメントをエンコードし、そのうち、このＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３或いはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を包含する。
【００１８】
本発明のペプチドフラグメントは更にトランスロケーション機能を有するヌクレオチド或いはペプチドを包含し、このトランスロケーション配列の種類に制限は無く、主要な機能は、接続されたペプチドを細胞内部に導入し、好ましくは、緑膿菌外毒素Ａ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ）の第１及び２フラグメント機能部分がペプチドと接合されてトランスロケーションを行なう（特許文献１を参照されたい。）
【００１９】
本発明の医薬組成物はまた、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２或いはその混合物を含有するペプチドを包含し、それは受動免疫を誘発するワクチンとして用いられ得る。また、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４或いはその混合物を含有するペプチドを包含し、それは、ＳＡＲＳウイルスのワクチンを製造するのに用いられ得る。
【００２０】
本発明のスーパー抗原融合蛋白は四つの、ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白由来のフラグメントを包含し、そのアミノ酸配列と米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースより探し出されたＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白配列（ＮＰ ８２８８５１）と同じであるが、ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白を体外合成するため、本発明では、特許文献２に記載の方法で、ヌクレオチド配列を改変し、但しそのエンコードするアミノ酸配列を改変せずにＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白部分の配列の合成を行なう。改質後のＤＮＡ配列は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
〔実施例１〕ＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白部分ペプチドフラグメントの合成
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースよりＳＡＲＳウイルス  Ｅ２スパイク蛋白配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ ８２８８５１）を探し出し、配列上の第６８０−１０５０個のアミノ酸を四つのフラグメントに分け、ヌクレオチド改質とフラグメントの合成増幅を行ない、本発明の実施例の体外合成ターゲットとなす。
【００２２】
本実施例は特許文献２に提示された方法を利用し、ウイルススパイク蛋白の異源蛋白質を、大腸桿菌システムにより表現し、効率的に体外合成を行なう。改質の重点は、野生ウイルス株のヌクレオチドフラグメントに対して、もともと表現されるアミノ酸に影響を与えず、また有効に大腸桿菌宿主システム中で表現される情況下で、単一ヌクレオチドの変更を行なうことにある。
【００２３】
市販されている大腸桿菌ペプチドｐＥＴ２３０を利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅するフラグメント核酸のテンプレートとなす。本実施例で合成する４つのヌクレオチドフラグメントは、それぞれＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤペプチドに分けられ、合計２９対プライマーを利用してフラグメント増幅を行なう。全てのプライマー対の配列については表１、２を参照されたい。そのうち、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ；符号Ｆ１）は大腸桿菌プラスミドｐＥＴ２３０の部分配列と同源である。
【００２４】
【表１】
2006025782.tif 000003
【００２５】
【表２】
2006025782.tif 000004
【００２６】
四つのペプチドフラグメントは、同一のフォワードプライマー（ＳＡ−Ｆ１、ＳＢ−Ｆ１、ＳＣ−Ｆ１、ＳＤ−Ｆ１）に異なるリバースプライマー（ＳＡ−Ｒ１〜Ｒ６、ＳＢ−Ｒ１〜Ｒ８、ＳＣ−Ｒ１〜Ｒ７、ＳＤ−Ｒ１〜Ｒ８）を組み合わせて数回（ＳＡ６回、ＳＢ８回、ＳＣ７回、ＳＤ８回）のＰＣＲを行なう。それに採用する時間条件は、第１循環が摂氏９５度で５分間、第２循環が摂氏９４度で１分間、摂氏５５度で０．５分間、摂氏７２度で１分間で、２０回重複し、第３循環は摂氏７２度で１分間である。
【００２７】
増幅完成したＰＣＲ産物を電気泳動して産物のサイズを確認した後、電気泳動上の産物を代表するバンドを切断し、産物の誘出（ｅｌｕｔｉｏｎ）を行なう。
【００２８】
〔実施例２〕プラスミド融合
実施例１で合成した４つのペプチドフラグメントＳＡ、ＳＢ、ＳＣ及びＳＤをプラスミドｐＥＴ−ＰＥ・・緑膿菌外毒素Ａバインディングドメイン（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）とトランスロケーションドメイン（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を付帯（非特許文献１を参照されたい。）と、保留の制限酵素位置を利用してアライメント結合させて、４種類の融合プラスミドを完成し、それぞれｐＥＴ−ＰＥ−ＳＡ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＢ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＣ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＤとなす（図１）。
【００２９】
〔実施例３〕蛋白質表現と純化
Ｓａｍｂｒｏｏｋの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）により、４つの合成完成したｐＥＴ−ＰＥ−ＳＡ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＢ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＣ、ｐＥＴ−ＰＥ−ＳＤ融合プラスミドをＩＰＴＧを利用して蛋白質の表現を誘導する。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹｓＳを選択して蛋白質（ペプチド）の表現を行なう。まず、菌種を２００ｕｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有する１００ｍｌ  ＬＢ培養液中で培養し、菌液濃度がＯＤ５５０の約０．３に到ると培養を停止する。続いて菌液中にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド（Ｐｒｏｍｅｇｅ，ＵＳＡ）１ｍＭを加え、続けて９０分間培養した後、生長した細胞を遠心収集する。冷凍解凍の反復操作方式で、ターゲット蛋白質を付帯する細胞の細胞膜構造をばらばらにし、この時、溶解液１０ｍｌ（０．９ｍｇ／ｍｌの溶菌酵素、１ｍｌのＰＭＳＦ及び０．０６４ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含有）を加え、室温下で１０分間置き、続いて更に１ｍｌの１０％トリトン  Ｘ−１００を加え、室温下で１０分間置き、その後、１２０００ｘｇで１０分間遠心分離して蛋白質を収集する。更にそれぞれ１Ｍと２Ｍの尿素で洗浄する。最後に、収集した蛋白質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を４ｍｌの８Ｍ尿素中に溶かす。
【００３０】
続いて市販されているｐＥＴ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ純化システム（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）で、実験説明書により以下の実験を行なう。即ち、収集した細胞ブロックを超音波振動の方法で、４ｍｌの冷たいバインディングバッファ（５ｍＭのイミダゾール−０．５ＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有、  ｐＨ７．９）に溶かし、ブロックを散開させる。続いて、摂氏４度で１２００ｘｇにより遠心分離を１５分間行ない、更に遠心分離後の上澄み液をカラム中に注ぎ（カラムはＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｎｉ2+）、最後にカラム中に粘着した蛋白質をバッファ液（５ｍＭのイミダゾール−０．５ＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有、  ｐＨ７．９）で収集する。
【００３１】
同様の方法で４種類の融合プラスミドが表現する４種類の融合蛋白−ＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤを完成する。
【００３２】
〔実施例３〕細胞免疫実験
Ａ．周辺血単核細胞の分離
健康な成年人の血液を取得後、１：１の比例でＨａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ溶液中（Ｈａｎｋｓ’ｂａｒａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と混合する。
Ｓａｃｅｒｄｏｔｅの方法（Ｓａｃｅｒｄｏｔｅ，１９９１＃１９７９）によりＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）で周辺血単核細胞を分離する。血液を混ぜたＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液を遠心分離し（６００ｘｇ，３０分間）、その後、単核細胞を付帯する溶液を別の遠心管に写し、Ｈａｎｋｓ’ｂａｒａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ溶液で２回洗浄した後、再度１２００ｘｇで１０分間遠心分離し、こうして周辺血単核細胞の分離を完成する。
【００３３】
Ｇｏｎｇの方法（Ｇｏｎｇ，２０００＃１９７６）を利用し、未成熟の周辺血単核細胞で樹突状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；ＤＣｓ）を分化させる。先ず周辺血単核細胞を細胞培養液中に分散させ、並びに細胞を培養トレイ中に貼り付ける。摂氏３７度で２時間培養する。続いて、未付着の細胞を除去する。更に１％のヒト血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）培養液及びＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）とＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を利用し、付着した細胞を６日培養し、続いて第０日、第２日、第４日にそれぞれサイトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を加える。第６日に、未付着の細胞を収集し樹突状細胞の分子マーカーを有するか否かを分析する。
【００３４】
収集した樹突状細胞を、ＰＢＳ、０．２％のＦＢＳ及び０．５％のアジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳｃａｎバッファ液で洗浄する。続いてＦＩＴＣ−或いはＰＥ−結合の抗人類の抗体（ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加え、並びに氷上で３０分間作用させ、更にＦＡＣＳｃａｎバッファ液で洗浄する。フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及び「ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ」ソフトでデータの分析を行なう。
【００３５】
Ｂ．ＩＦＮ−γ酵素免疫吸着斑点法（ＥＬＩＳＰＯＴ  Ａｓｓａｙ）
Ｍｉｙａｈｉｒａ氏等（Ｍｉｙａｈｉｒａ，１９９５＃６７７）及びＭｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ氏等（Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，１９９８＃６９８）の文献に基づき、酵素免疫吸着斑点法実験の一部改修を行ない、抗原ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ及びＳＤに対する特定性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。
【００３６】
９６孔盤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上を一層の抗人類ＩＮＦ−γの抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含有するＰＢＳ（５０μｌ）で被覆する。摂氏４度で隔液を培養する。続いて培養孔を洗い、並びに１０％胎牛血清を含有する培養液で孔中を被覆する。このほか、異なる濃度の新鮮な或いは培養済の周辺血単核細胞を製造し、１０：１の比例で自体細胞より分化した樹突状細胞（実施例３Ａで述べるとおり）を、１×１０6 濃度で被覆後の培養孔中に加え、そのうち使用する樹突状細胞は４種類の融合蛋白−ＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤで２時間処理するか処理しない細胞とする。
【００３７】
培養後、培養孔を再度洗浄し、並びにビオチンが結合されたラット抗人類ＩＮＦ−γの抗体（５μｇ／ｍｌ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有するＰＢＳ（５０μｌ）を加えた後、摂氏４度で隔液を培養する。続いて孔盤を６回洗浄した後、１．２μｇ／ｍｌのアビジンアルカリホスファターゼ（ａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する５０μｌのＰＢＳを加え、並びに室温中で２時間培養する。続いて更に５０μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルー  テトラゾリウム溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を加え、室温下で２０分間培養した後、斑点の生成を観察する。その後、受質溶液を除去し、更に水道水で培養孔を洗浄し、反応を終了する。最後に培養トレイを乾燥して解剖顕微鏡で色斑数量を計算する。
【００３８】
酵素免疫吸着斑点法はＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤの四種類の融合蛋白が反応するＣＤ８+ Ｔ細胞の数量を測定する。図２は酵素免疫吸着斑点法の結果を示し、図２より異なるスケジュールの培養の反応結果を観察できる。斑点計数後の棒グラフは図３に示されるようであり、図３より明らかであるように、マウス免疫後第７日に、ＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤの四種類の融合蛋白を注射したマウスの血清中、ＩＮＦ−γの発生量は高くなり、マウス免疫後第１５日で、ＰＥ−ＳＣ融合蛋白は厳重な免疫反応を誘発し、マウス体内で高量のＩＮＦ−γを発生させた。
【００３９】
〔実施例４〕動物免疫
Ａ．動物の準備
生後６〜８週の雌のマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊを国立台湾大学（台北，台湾）より購入し、並びに国立台湾大学付属病院の動物センターで飼育した。
【００４０】
Ｂ．動物の免疫
実施例２で製造した４種類の融合蛋白ＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤをそれぞれ１００μｇマウスに注射し、免疫反応の試験を行ない、同時に一部のマウスに、緑膿菌外毒素Ａの蛋白質のみを注射し、コントロールグループとした。注射スケジュールは実験開始から第０日、第１４日、第２８日である。
【００４１】
Ｃ．特定性抗体の検出
Ｃｈｅｎｇの方法（Ｃｈｅｎｇ，２００１＃１４８６）を利用する。即ち酵素免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）で血清中のＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ特定性抗体の検出を行なう。
【００４２】
９６孔トレイ上を一層のＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ（５μｇ）融合蛋白で被覆し、摂氏４度で隔液を培養する。更に２０％胎牛血清を含有するＰＢＳで培養孔中を被覆する。免疫１４日後のマウス中より血清を取得し、ＰＢＳを利用して連続希釈を行ない、続いて培養孔中に加え、摂氏３７度で２時間培養する。更に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで培養孔を洗浄後、１：２０００の過酸化酵素結合兎抗マウスＩｇＧ抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を培養孔内に加え、更に室温下で１時間培養する。その後、培養トレイを洗い、並びに１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えてカラー展開し、最後に１ＭのＨ2 ＳＯ4 で反応を終了する。ＥＬＩＳＡリーダーを利用し、４５０ｎｍの吸収スペクトル下で結果の判読を行なう。
【００４３】
図４は１：１００、１：５００、及び１：１０００で血清を連続希釈し、その特定性抗体力価の測定を行なった結果を示し、結果からＰＥ−ＳＣとＰＥ−ＳＤ融合蛋白を注射したマウスの血清は、発生したＣＤ８＋Ｔ細胞値がＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢ融合蛋白を注射したマウスの血清のものより非常に高かった（Ｐ＜０．０１，ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。この結果から、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ融合蛋白自身が動物に比較的高い抗体反応を誘発させることが分かり、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ融合蛋白を受け入れた者は、臨床上、発生する抗体作用を受け、受け入れた者を保護する効果を有することが分かる。
【００４４】
本発明の融合蛋白は動物の抗体生産の誘発に成功し、ＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ融合蛋白はＩＮＦ−γの大量発生を誘発し、本発明の実施例中、ＳＣとＳＤペプチドはＳＡＲＳウイルスのスーパー抗原位置である可能性が極めて高く、生命に危害を及ぼしうる。ただし、別の観点から述べると、抗体の大量生産は、将来的にはＰＥ−ＳＣ及びＰＥ−ＳＤ融合蛋白を動物に特定性抗体の生産を誘発させてワクチンの生産を行なうのに応用可能となり、更にＳＡＲＳウイルスの感染の治療に役立てることができる。
【００４５】
このほか、本発明のＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢの二種類の融合蛋白は動物の過度の免疫反応を誘発せず、このため、ＳＡＲＳウイルスに感染する可能性のある動物に受動免疫のメカニズムを形成させるための発展が可能で、即ち、ＰＥ−ＳＡ、ＰＥ−ＳＢの二種類の融合蛋白を注射するだけで、動物体内でＳＡＲＳウイルス分子のスパイク蛋白のＴ細胞上の受容体ＣＤ１３結合との結合の位置を遮断し、ＳＡＲＳウイルスの感染を予防しうる。
【００４６】
上述の実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明に基づきなしうる細部の修飾或いは改変は、いずれも本発明の請求範囲に属するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の実施例１のプラスミド表示図であり。そのうち、１ＡはｐＥＴ−ＰＥ−ＳＡ、１ＢはｐＥＴ−ＰＥ−ＳＢ、１ＣはｐＥＴ−ＰＥ−ＳＣ、１ＤはｐＥＴ−ＰＥ−ＳＤを示す。
【図２】本発明の実施例３の酵素免疫吸着斑点法の、異なるスケジュールの培養の反応結果図であり、Ａ１は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＡの反応の結果を、Ａ２は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＡの反応の７日後の結果を、Ａ３は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＡの反応の１４日後の結果を、Ｂ１は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＢの反応の結果を、Ｂ２は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＢの反応の７日後の結果を、Ｂ３は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＢの反応の１４日後の結果を、Ｃ１は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＣの反応の結果を、Ｃ２は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＣの反応の７日後の結果を、Ｃ３は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＣの反応の１４日後の結果を、Ｄ１は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＤの反応の結果を、Ｄ２は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＤの反応の７日後の結果を、Ｄ３は新鮮周辺血単核細胞とＰＥ−ＳＤの反応の１４日後の結果を示す。
【図３】本発明の実施例３の酵素免疫吸着斑点法の計数棒グラフであり、そのうち、ＰＥトランスロケーションペプチドとペプチドフラグメントＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤを含有する四種類の融合蛋白、及びＰＥトランスロケーションペプチドのみを有する蛋白に係る結果が示される。
【図４】本発明の実施例４の抗体力価の測定結果図であり、そのうち、上左、上右、下左、下右のグラフはそれぞれＰＥトランスロケーションペプチドと四つのペプチドフラグメントＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤを含有する融合蛋白に関するもので、実心棒は本発明の融合蛋白に関する結果で、白抜き棒はＰＥトランスロケーションペプチドのみを含有する蛋白に関する結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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