(57)【要約】      （修正有）【課題】オーファンＧタンパク質共役受容体ＦＰＲＬ２用の天然リガンド及び使用方法、さらに、ＦＰＲＬ２に対して作成された抗体において、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの生物学的機能性を提供する。【解決手段】  サンプル中のホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド活性を検出するための、およびポリペプチド活性を調節する物質を同定するための、方法、試薬およびキットからなる。さらに、ＦＰＲＬ２に対して作成された抗体からなる。さらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を予防、処置および／または軽減するための物質からなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド活性を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドとヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの結合を許容する条件下で、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを含むサンプルをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドとインキュベートする段階、および
ｂ）  二次メッセンジャーを検出する段階。
【請求項２】
さらに以下の段階を含む、請求項１に記載の方法：
ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドとヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの結合を許容する条件下、ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの不存在下で、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを含む第二のサンプルをインキュベートする段階、および
ｂ）  二次メッセンジャーを検出する段階。
【請求項３】
サンプルが、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを発現している細胞を含む、請求項１または２のいずれか１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを保持している細胞膜を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーションを、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドポリペプチドを含有するウイルス誘発性の発芽膜中またはこの膜上で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
段階ａ）をＧα１６ポリペプチドの存在下でさらに行う、請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと結合する物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）  ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドとホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドの結合を許容する条件下、候補結合物質の存在または不存在下でホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドとヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの結合を測定する段階：この場合、候補結合物質不存在下での結合と比較して、候補結合物質の存在下で結合が減少すれば、当該候補結合物質をホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと結合する物質として同定する。
【請求項８】
当該物質がサンプル中に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大させる物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを物質と接触させる段階；
（ｂ）  当該物質の存在下でホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；および
（ｃ）  当該物質の存在下で測定された活性を、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと接触させる反応中で測定された活性と比較する段階：この場合、当該物質の存在下で測定された活性量がヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドによって誘発された量の少なくとも１０％であれば、当該物質をホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達を増大させるアゴニストとして同定する。
【請求項１０】
当該物質がサンプル中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を減少させる物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）  当該物質の存在または不存在下でホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのためのシグナル伝達活性を測定する段階；
（ｃ）  ホルミルペプチド様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドおよびヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドを含有し、当該物質を含まない反応中で測定された活性量を、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド、ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドおよび当該物質を含有する反応中で測定された活性量と比較する段階：この場合、当該物質不存在下での活性と比較して、この物質の存在下で活性が減少すれば、当該物質をホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのアンタゴニストまたは逆アゴニストとして同定する。
【請求項１２】
当該物質がサンプル中に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドが細胞によってその表面に発現されている、請求項７〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドが細胞膜中に存在する、請求項７〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１５】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドがウイルス誘発性の発芽膜中またはこの膜上に存在する、請求項７〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が以下の細胞からなる群から選択される、請求項３、４、１３または１４のいずれか１に記載の方法：ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞および１３２１Ｎ１星細胞腫細胞および他のセルライン。
【請求項１７】
さらにＧα１６ポリペプチドの存在下で行う、請求項７〜１６のいずれか１に記載の方法。
【請求項１８】
標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて測定または検出を行う、請求項１〜１７のいずれか１に記載の方法。
【請求項１９】
当該物質が、天然または合成ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合性断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子からなる群から選択される、請求項７〜１８のいずれか１に記載の方法。
【請求項２０】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性の検出または測定またはその結合の測定が、二次メッセンジャーのレベルの変化の検出を含む、請求項１〜１９のいずれか１に記載の方法。
【請求項２１】
シグナル伝達活性の検出またはシグナル伝達活性の測定または結合の測定段階が、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸濃度、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項１〜２０のいずれか１に記載の方法。
【請求項２２】
シグナル伝達活性の測定が、エクオリンに基づくアッセイの使用を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応する抗体であって、以下の事象を増大または減少させる抗体：
（ａ）ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドとホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドの結合、または
（ｂ）ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと結合したヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドのシグナル伝達活性。
【請求項２４】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害をインビトロで診断する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを含む組織サンプルをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと接触させる段階；
ｂ）  ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと組織サンプルの結合を検出する段階；および
ｃ）  段階（ｂ）で検出された結合を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した結合の差を、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【請求項２５】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害をインビトロで診断する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを含む組織サンプルをヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドと接触させる段階；
ｂ）  組織サンプル中のホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を検出する段階；および
ｃ）  段階（ｂ）で検出されたシグナル伝達活性を標準と比較する段階：この場合、標準と比較したシグナル伝達活性の差を、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【請求項２６】
マイクロアレイ上で比較を行う、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドとの結合、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと結合する物質またはホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を減少または増大させる物質を検出するためのキットであって、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドおよびヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチド、およびそれら用のパッケージ材料を含み、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドおよびヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドが個別にパッケージされているキット。
【請求項２８】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドがホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド発現細胞中に存在し、さらに、個別にパッケージされた、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドに特異的な抗体またはホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド特異的核酸プローブを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
細胞が以下の細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載のキット：ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞および１３２１Ｎ１星細胞腫細胞および他のセルライン。
【請求項３０】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドが、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドを保持する単離した細胞膜中に存在する、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
二次メッセンジャーアッセイの１つまたはそれ以上のコンポーネントをさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか１に記載のキット。
【請求項３２】
Ｇα１６ポリペプチドを含む、請求項２７〜３１のいずれか１に記載のキット。
【請求項３３】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる物質をスクリーニングするためのキットであって、以下のものを含むキット：
（ａ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドをエンコードする単離したポリヌクレオチド、ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドおよび、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料、または
（ｂ）  ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞、ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドおよび、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料。
【請求項３４】
当該物質が、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドに特異的な抗体またはホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド特異的核酸プローブを用いて検出される、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断用の、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
当該疾患または障害が、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドに特異的な抗体またはホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド特異的核酸プローブを用いて検出される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド発現セルラインにおいて、ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの存在下で測定されたホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド活性の標準をさらに含む、請求項２７〜３６のいずれか１に記載のキット。
【請求項３８】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の予防、処置および／または軽減用医薬組成物を製造するための、ＨＢＰポリペプチド、または請求項２３に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害が以下からなる群から選択される、請求項３８に記載の使用：
細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【請求項４０】
請求項２３に記載の抗体を製薬用担体と混合する段階を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項４１】
請求項２３に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項４２】
ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドが配列番号１８に記載の配列に対応する、先行する請求項のいずれか１に記載の方法、キット、使用または抗体。
【請求項４３】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドが配列番号２に記載の配列に対応する、先行する請求項のいずれか１に記載の方法、キット、使用または抗体。
【請求項４４】
配列番号１８に記載の配列に対応するヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号１８に記載の配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号１８に記載の配列に対応するヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチドの機能性断片であるポリペプチド。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれか１に記載のポリペプチドをエンコードする核酸。
【請求項４８】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応し、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる抗体。
【請求項４９】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのアゴニストである、請求項４８に記載の抗体。
【請求項５０】
モノクローナル抗体である、請求項４８または４９に記載の抗体。
【請求項５１】
ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰプラスミドコレクション、Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに、２００５年４月２８日付けで、ＢＣＣＭ受託番号：ＬＭＢＰ ６４０５ＣＢとして寄託されている、ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９と称するハイブリドーマセルラインが産生するＭａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１に対応する、請求項４８〜５０のいずれか１に記載の抗体。
【請求項５２】
ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰプラスミドコレクション、Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに、２００５年４月２８日付けで、ＢＣＣＭ受託番号：ＬＭＢＰ ６４０６ＣＢとして寄託されている、ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３と称するハイブリドーマセルラインが産生するＭａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０に対応する、請求項４８〜５０のいずれか１に記載の抗体。
【請求項５３】
ポリクローナル抗体である、請求項４８または４９に記載の抗体。
【請求項５４】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのアンタゴニストである、請求項４８〜５０または５３のいずれか１に記載の抗体。
【請求項５５】
ヒト化抗体である、請求項４８〜５４のいずれか１に記載の抗体。
【請求項５６】
請求項４８〜５５のいずれか１に記載の抗体の機能性断片。
【請求項５７】
抗原結合性断片を含む、請求項５６に記載の機能性断片。
【請求項５８】
請求項４８〜５７のいずれか１に記載の抗体または機能性断片のアミノ酸配列の、または当該抗体または機能性断片をエンコードするヌクレオチド配列の、相同配列。
【請求項５９】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を予防、処置および／または軽減するための、請求項４８〜５８のいずれか１に記載の抗体、機能性断片または相同配列。
【請求項６０】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害が、以下からなる群から選択される、請求項５９に記載の抗体、機能性断片または相同配列：
細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、オーファンＧタンパク質共役受容体ＦＰＲＬ２用の天然リガンドおよび使用方法に関する。本発明はさらに、ＦＰＲＬ２に対して作成された抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景および現行技術水準
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は細胞内のシグナル伝達を担うタンパク質である。ＧＰＣＲは通常、７つの貫膜ドメインを有する。リガンドがＧＰＣＲの細胞外部分または断片と結合すると、細胞の生物学的または生理学的性質または動態に変化が生じる細胞内でシグナル伝達される。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャネル）とともに、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力と連結するモジュール式シグナル伝達系のコンポーネントである。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は種々の生理学的プロセスを調節可能であり、疾患の潜在的な原因物質である。ＧＰＣＲは中枢神経系および末梢生理学的プロセスの両者に対して非常に重要であると考えられる。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは５つのファミリーで示される：ファミリーＩ，ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン作動性受容体によって代表され、現在２００を超える独特なメンバーで示される受容体；ファミリーＩＩ，副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー；ファミリーＩＩＩ，代謝調節型グルタミン酸塩受容体ファミリー；ファミリーＩＶ，ＣＡＭＰ受容体ファミリー、細胞性粘菌（D. discoideum）の走化性および発生に重要；およびファミリーＶ，真菌の接合フェロモン受容体、例えばＳＴＥ２。
【０００５】
Ｇタンパク質とは、グアニンヌクレオチドを結合する、α、βおよびγサブユニットから構成されるヘテロ三量体タンパク質のファミリーを表す。これらのタンパク質は通常、シグナル伝達用の細胞表面受容体（７つの貫膜ドメインを含有する受容体）と連結されている。実際、ＧＰＣＲにリガンドを結合すると、コンフォメーション変化がＧタンパク質に伝達され、これに起因してそのαサブユニットが、結合しているＧＤＰ分子をＧＴＰ分子と交換し、そしてβγ−サブユニットから解離する。
【０００６】
ＧＴＰ結合型のα、β、およびγ−サブユニットは典型的にエフェクター調節部分として機能し、二次メッセンジャー、例えば（例えばアデニルシクラーゼの活性化により）ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロールまたはイノシトール燐酸の生産を導く。
【０００７】
ヒトでは、２０を超える種々のタイプのα−サブユニットが既知である。これらのサブユニットは小プールのβおよびγサブユニットと関連している。哺乳類のＧタンパク質の例には、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが含まれる。Ｇタンパク質は、Lodish et al., Molecular Cell Biology（Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995；およびまたDownes and Gautam, 1999,「Ｇタンパク質サブユニット遺伝子ファミリー（The G-Protein Subunit Gene Families.）」Genomics 62:544-552）に詳細に記載されている。これらの両刊行物の内容は引用により本明細書中に包含される。
【０００８】
既知であるが、特徴付けされていないＧＰＣＲは現在、薬物作用および薬物開発のための主要な標的となっている。潜在的な予防および治療特性を有する新規アゴニストおよびアンタゴニストに関するスクリーニングに使用可能な新規Ｇタンパク質共役受容体を同定する取り組みが継続中である。
【０００９】
嗅覚受容体ファミリーを除いて、３００を超えるＧＰＣＲが今日までにクローニングされている。機構的には、臨床的に重要なすべての薬物のうち約５０〜６０％が諸ＧＰＣＲの機能を調節することによって作用する（Cudermann et al., J. Mol. Med., 73:51-63, 1995）。
【００１０】
ホルミルペプチド受容体様受容体２（formyl peptide receptor-like 2, ＦＰＲＬ２）（配列番号１：ヒトポリヌクレオチド配列、配列番号２：ヒトアミノ酸配列）はＦＰＲファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーはＧＰＣＲファミリーに属する。ヒトＦＰＲ（配列番号３：ヒトポリヌクレオチド配列、配列番号４：ヒトアミノ酸配列）はＦＲＰファミリーの第一のメンバーであり、これはプロトタイプのＮ−ホルミルペプチドであるホルミル−メチオニン−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＦ）のための好中球表面上の高親和性結合部位として１９７６年に生化学的に規定された。その後、この受容体は、１９９０年にBoulayらによって、分化型ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞ｃＤＮＡライブラリからクローニングされた［Boulay, F. et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168, 1103-1109；Boulay, F. et al. (1990) Biochemistry 29, 11123-11133］。トランスフェクトされたセルラインにおいて、ＦＰＲは高親和性（Ｋｄ＜１ｎＭ）でｆＭＬＦと結合し、また走化性およびカルシウムイオン（Ｃａ２＋）動態アッセイでは、ピコモル濃度〜低ナノモル濃度のｆＭＬＦによって活性化される。
【００１１】
その後、ＦＰＲＬ１（ＦＰＲ−様受容体１）（配列番号５：ヒトポリヌクレオチド配列；配列番号６：ヒトアミノ酸配列）およびＦＰＲＬ２（ＦＰＲ−様受容体２）と称されるさらに２つのヒト遺伝子が単離された。この単離は、ＦＰＲ ｃＤＮＡをプローブとして用いる低ストリジェントハイブリダイゼーションによって行われた［Ye, R.D. et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 184, 582-589；Bao, L. et al. (1992) Genomics 13, 437-440］。そしてこれらがヒト染色体１９ｑ１３．３上でＦＰＲとともにクラスターを形成していることが示された［Murphy, P.M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 7637-7643；Bao, L. et al. (1992) Genomics 13, 437-440］。ＦＰＲＬ１は低親和性ｆＭＬＦ受容体と規定されている。これは、この受容体がインビトロにおいて高濃度のＦｍｌｆ（μＭ領域）によってしか活性化されないことに基づく［Murphy, P.M. (1996)「化学誘引性リガンドおよびその受容体（Chemoattractant Ligands and their Receptors）(Horuk R, ed.), pp. 269-299, CRC Press, Inc., Boca Raton；Prossnitz, E.R. and Ye, R.D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102］。しかし、上記濃度のｆＭＬＦが細菌感染または組織損傷の部位で生成され得るかどうかは不明である。したがって、インビボにおいて真に機能する追加のｆＭＬＦ受容体としてのＦＰＲＬ１の役割は依然として決定されていない。ＦＰＲＬ２は、Ｎ−ホルミルペプチドと結合せず、これに応答しない［Durstin, M. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 174-179］が、その代わりに、ＦＰＲＬ１に関して同定されているいくつかの非ホルミル化走化性ペプチドを共有する［Christophe, T. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 21585-21593；Betten, A. et al. (2001) J. Clin. Invest. 108, 1221-1228］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１は食作用性の白血球において最初に検出されたが、他の細胞タイプもまた、これらの受容体を発現する。しかし、生物学的重要性は規定されていない。ＦＰＲＬ２の発現パターンに関しては、この受容体に関するｍＲＮＡが単球中に存在するが、好中球中に存在しないことを除き、情報がほとんど入手できない［Durstin, M. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 174-179］。機能性のＦＰＲＬ２はまた、成熟樹状細胞（ＤＣ）の中で発現される［Yang, D. et al.  J. Leukoc. Biol. Vol. 72: 598-607 (2002)］。成熟樹状細胞は低レベルのＦＰＲを発現するが、ＦＰＲＬ１を発現しないように見える［Yang, D. et al. (2001) J. Immunol. 166, 4092-4098；Braun, M.C. et al. (2001) Blood 97, 3531-3536］。
【００１３】
ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）（配列番号７）：ヒトポリヌクレオチド配列、配列番号８：ヒトアミノ酸配列；配列番号９：マウスポリヌクレオチド配列、配列番号１０：マウスアミノ酸配列）。ヒトおよびマウスＨＢＰのｃＤＮＡはそれぞれ５６７および５７０ｂｐ長であり、それぞれ１８９および１９０アミノ酸のタンパク質産物をエンコードする。このタンパク質は細胞の細胞質内に移される。ＨＰＢはヘムおよびポルフィリンをマイクロモル濃度のＫｄで結合する。ＨＢＰは、過剰生産されたポルフィリンならびにヘム用のバッファーとして機能する可能性がある。発現研究により、ＨＢＰをエンコードするマウスｍＲＮＡが肝臓、脾臓および腎臓の細胞で発現されていることが示された（Blackmon et al; 2002 Arch. of Bichem. and Biophysics 407, p196-201）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明の一実施態様は、サンプル中のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法である：
ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの結合を許容する条件下で、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含むサンプルをＨＢＰポリペプチドとインキュベートする段階、および
ｂ）  二次メッセンジャーを検出する段階。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、さらに以下の段階を含む上記方法である：
ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの結合を許容する条件下、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む第二のサンプルをＨＢＰポリペプチドの不存在下でインキュベートする段階、および
ｂ）  二次メッセンジャーを検出する段階。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、サンプルがＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現している細胞を含む上記方法である。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、サンプルがＦＰＲＬ２ポリペプチドを保持する細胞膜を含む上記方法である。
【００１８】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含有するウイルス誘発性の発芽膜（virus-induced budding membranes）中またはこの膜上でインキュベーションを行う上記方法である。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、段階ａ）をさらにＧα１６ポリペプチドの存在下で行う上記方法である。
【００２０】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドと結合する物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法である：
（ａ）  ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドの結合を許容する条件下、候補結合物質の存在または不存在下でＦＰＲＬ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの結合を測定する段階：この場合、候補結合物質不存在下での結合と比較して、候補結合物質の存在下で結合が減少すれば、当該候補結合物質をＦＰＲＬ２ポリペプチドと結合する物質として同定する。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、当該物質がサンプル中に存在する上記方法である。
【００２２】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大させる物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法である：
（ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドを物質と接触させる段階；
（ｂ）  当該物質の存在下でＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；および
（ｃ）  当該物質の存在下で測定された活性を、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる反応で測定された活性と比較する段階：この場合、当該物質の存在下で測定された活性量がＨＢＰポリペプチドによって誘発された量の少なくとも１０％であれば、当該物質をＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達を増大させるアゴニストとして同定する。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、当該物質がサンプル中に存在する上記方法である。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を減少させる物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法である：
（ａ）  当該物質の存在または不存在下でＦＰＲＬ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；
（ｃ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチドを含有するが、当該物質を含まない反応中で測定された活性量を、ＦＰＲＬ２ポリペプチド、ＨＢＰポリペプチドおよび当該物質を含有する反応中で測定された活性量と比較する段階：この場合、当該物質不存在下での活性と比較して、この物質の存在下で活性が減少すれば、当該物質をＦＰＲＬ２ポリペプチドのためのアンタゴニストまたは逆アゴニストとして同定する。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、当該物質がサンプル中に存在する上記方法である。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドが細胞によってその表面上に発現されている上記方法である。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドが細胞膜中に存在する上記方法である。
【００２８】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドがウイルス誘発性の発芽膜中またはその膜上に存在する上記方法である。
【００２９】
本発明の別の実施態様は、細胞が以下の細胞からなる群から選択される上記方法である：ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞および１３２１Ｎ１星細胞腫細胞および他のセルライン。
【００３０】
本発明の別の実施態様は、さらにＧα１６ポリペプチドの存在下で行う上記方法である。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて測定または検出を行う上記方法である。
【００３２】
本発明の別の実施態様は、当該物質が、天然または合成ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合性断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子からなる群から選択される上記方法である。
【００３３】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性の検出または測定またはその結合の測定が、二次メッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む上記方法である。
【００３４】
本発明の別の実施態様は、シグナル伝達活性の検出またはシグナル伝達活性の測定または結合の測定段階が、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸（arachinoid acid）濃度、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポーター遺伝子発現の測定を含む上記方法である。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、シグナル伝達活性の測定がエクオリンに基づくアッセイの使用を含む上記方法である。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、本明細書中に開示するスクリーニング方法を用いて得られる物質である。
【００３７】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドと特異的に反応する抗体であって、以下の事象を増大または減少させる抗体である：
（ａ）  ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドの結合、または
（ｂ）  ＦＰＬＲＬ２ポリペプチドと結合したＨＢＰポリペプチドのシグナル伝達活性。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害をインビトロで診断する方法であって、以下の段階を含む方法である：
ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む組織サンプルをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；
ｂ）  ＨＢＰポリペプチドと組織サンプルの結合を検出する段階；および
ｃ）  段階（ｂ）で検出された結合を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した結合の差を、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【００３９】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害をインビトロで診断する方法であって、以下の段階を含む方法である：
ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む組織サンプルをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；
ｂ）  組織サンプル中のＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を検出する段階；および
ｃ）  段階（ｂ）で検出されたシグナル伝達活性を標準と比較する段階：この場合、標準と比較したシグナル伝達活性の差を、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【００４０】
本発明の別の実施態様は、上記の比較をマイクロアレイ上で行う上記方法である。
【００４１】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合、ＦＰＲＬ２ポリペプチドと結合する物質またはＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を減少または増大させる物質を検出するためのキットであって、ＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチド、およびそれら用のパッケージ材料を含み、この材料中、ＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチドが個別にパッケージされているキットである。
【００４２】
本発明の別の実施態様は、上記のＦＰＲＬ２ポリペプチドがＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞中に存在し、個別にパッケージされた上記のキットがＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体またはＦＰＲＬ２ポリペプチド特異的核酸プローブ（nucleic probe）をさらに含む上記キットである。
【００４３】
本発明の別の実施態様は、細胞が以下の細胞からなる群から選択される上記キットである：ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞および１３２１Ｎ１星細胞腫細胞および他のセルライン。
【００４４】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドが、単離されたＦＰＲＬ２ポリペプチド保持細胞膜中に存在する上記キットである。
【００４５】
本発明の別の実施態様は、二次メッセンジャーアッセイの１つまたはそれ以上のコンポーネントをさらに含む上記キットである。
【００４６】
本発明の別の実施態様は、Ｇα１６ポリペプチドをさらに含む上記キットである。
【００４７】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる物質のためのスクリーニング用のキットであって、以下の物質を含むキットである：
（ａ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードする単離したポリヌクレオチド、ＨＢＰポリペプチドおよび、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料、または
（ｂ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞、ＨＢＰポリペプチドおよび、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料。
【００４８】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体またはＦＰＲＬ２ポリペプチド特異的核酸プローブを用いて当該物質を検出する上記キットである。
【００４９】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断するための上記キットである。
【００５０】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体またはＦＰＲＬ２ポリペプチド特異的核酸プローブを用いて当該疾患または障害を検出する上記キットである。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現セルライン中、ＨＢＰポリペプチドの存在下で測定されたＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の標準をさらに含む上記キットである。
【００５２】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を予防、処置および／または軽減するための医薬組成物の製造に関する、ＨＢＰポリペプチド、または上記抗体の使用である。
【００５３】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害が以下からなる群から選択される上記使用である：細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【００５４】
本発明の別の実施態様は、医薬組成物を製造するための方法であって、上記抗体を製薬用担体と混合する段階を含む方法である。
【００５５】
本発明の別の実施態様は、上記抗体を含む医薬組成物である。
【００５６】
本発明の別の実施態様は、ＨＢＰポリペプチドが配列番号１８に記載の配列に相当する、上記方法、キット、使用または抗体である。
【００５７】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドが配列番号２に記載の配列に相当する、上記方法、キット、使用または抗体である。
【００５８】
本発明の別の実施態様は、配列番号１８に記載の配列に相当するＨＢＰポリペプチドである。
【００５９】
本発明の別の実施態様は、配列番号１８に記載の配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドである。
【００６０】
本発明の別の実施態様は、配列番号１８に記載の配列に相当するＨＢＰポリペプチドの機能性断片であるポリペプチドである。
【００６１】
本発明はまた、上に列挙したＨＢＰポリペプチドをエンコードする核酸に関する。
【００６２】
本発明の別の実施態様は、機能性抗体またはその抗原結合性断片であって、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応し、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる機能性抗体またはその抗原結合性断片である。
【００６３】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応し、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる抗体である。
【００６４】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応し、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達活性を増大または減少させる抗体であって、この抗体の存在下で測定される当該活性量がＨＢＰによって誘発される量の少なくとも１０％である場合の抗体である。
【００６５】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドと特異的に反応し、本明細書中に記載のスクリーニング方法を用いて得られる抗体である。
【００６６】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのアゴニストである、本明細書中に記載の抗体である。
【００６７】
本発明の別の実施態様は、モノクローナル抗体である、本明細書中に記載の抗体である。
【００６８】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９と称されるハイブリドーマセルラインが産生するＭａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１に相当する、本明細書中に記載の抗体である。このハイブリドーマは、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰプラスミドコレクション、Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに、２００５年４月２８日付けで、ＢＣＣＭ受託番号：ＬＭＢＰ ６４０５ＣＢとして寄託されている。
【００６９】
本発明の別の実施態様は、ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３と称されるハイブリドーマセルラインが産生するＭａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０に相当する、本明細書中に記載の抗体である。このハイブリドーマは、ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰプラスミドコレクション、Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに、２００５年４月２８日付けで、ＢＣＣＭ受託番号：ＬＭＢＰ ６４０６ＣＢとして寄託されている。
【００７０】
本発明の別の実施態様は、ポリクローナル抗体である、本明細書中に記載の抗体である。
【００７１】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのアンタゴニストである、本明細書中に記載の抗体である。
【００７２】
本発明の別の実施態様は、ヒト化抗体である、本明細書中に記載の抗体である。
【００７３】
本発明の別の実施態様は、本明細書中に記載の抗体の機能性断片である。
【００７４】
本発明の別の実施態様は、抗原結合性断片を含む、本明細書中に記載の機能性断片である。
【００７５】
本発明の別の実施態様は、上記抗体または機能性断片のアミノ酸配列の相同配列、または当該抗体または機能性断片をエンコードするヌクレオチド配列の相同配列である。
【００７６】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を予防、処置および／または軽減するための本明細書中に記載の抗体、機能性断片または相同配列である。
【００７７】
本発明の別の実施態様は、ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害が以下からなる群から選択される、本明細書中に記載の抗体、機能性断片または相同配列である：細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【発明の効果】
【００７８】
発明の詳細な記述
本発明は、ＨＢＰポリペプチドがオーファンＧタンパク質共役受容体ＦＰＲＬ２ポリペプチドの天然リガンドであるという発見に基づき、このリガンドと受容体の結合を薬物のスクリーニング方法において使用する方法に基づいている。既知のリガンドおよびその受容体ＦＰＲＬ２ポリペプチドとの相互作用はまた、受容体活性の調節不全が関与する症状の診断を提供する。本発明はまた、ＦＰＲＬ２ポリペプチドおよび相同配列、その対応するポリヌクレオチドおよび／または、このポリヌクレオチドを発現している組換え細胞を含むキットに関し、この受容体ポリペプチドおよび／またはその対応するポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよび調節化合物を同定するためのキットに関する。このようなキットは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性に関連する疾患および障害の診断、予防および／または処置に有用である。
【００７９】
本発明はまた、本発明の方法にしたがって同定される、受容体ポリペプチドおよびその対応するポリヌクレオチドの新規アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよび調節化合物に関する。
【００８０】
本明細書中で引用するすべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書中に包含される。
【００８１】
本発明は、ＨＢＰの断片（ＨＢＰポリペプチド）がオーファン受容体ＦＰＲＬ２（配列番号２）の天然リガンドであるという発見に基づく。したがって本発明は、ＨＢＰポリペプチドリガンド／受容体ペア、ならびにＨＢＰポリペプチドを同様に結合するこの受容体の機能性ホモログおよびＨＢＰポリペプチドリガンドとの組み合わせてこの受容体をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を含むベクターで形質転換された細胞に関する。本発明はまた、単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチドから本質的に構成される組成物、ならびにＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法に関する。本方法は、新規薬物の開発に有用なアゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニスト化合物の同定に有用である。ＦＰＲＬ２とＨＢＰポリペプチドの相互作用はまた、ＦＰＲＬ２活性に関連する疾患の診断法の開発に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
本発明は、ＦＰＬＲ２の機能を調節する物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）ＨＢＰポリペプチドとＦＰＬＲ２ポリペプチドとの結合を許容する条件下、候補調節物質の存在および不存在下で、ＦＰＬＲ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；およびｂ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの結合を測定する段階：この場合、候補調節物質不存在下での結合と比較して、候補調節物質の存在下で結合が減少すれば、この候補調節物質を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質として同定する。
【００８３】
本発明はさらに、サンプル中で、ＦＰＬＲ２の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）ＨＢＰポリペプチドとＦＰＬＲ２ポリペプチドの結合を許容する条件下、サンプルの存在および不存在下で、ＦＰＬＲ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；およびｂ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの結合を測定する段階：この場合、サンプル不存在下での結合と比較して、サンプルの存在下で結合が減少すれば、ＦＰＬＲ２の機能を調節する物質のサンプル中にその存在を示す。
【００８４】
先行するいずれかの方法の一実施態様では、測定は、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行う。
【００８５】
本発明はさらに、ＦＰＬＲ２の機能を調節する物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）候補調節物質の存在および不存在下でＦＰＬＲ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；およびｂ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階：この場合、候補調節物質不存在下での活性と比較して、候補調節物質の存在下で活性が変化すれば、この候補調節物質を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質として同定する。
【００８６】
本発明はさらに、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質を同定する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドを候補調節物質と接触させる段階；ｂ）候補調節物質の存在下でＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；およびｃ）候補調節物質の存在下で測定された活性を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドをＥＣ５０のＨＢＰポリペプチドと接触させたサンプル中で測定された活性と比較する段階：この場合、候補調節物質の存在下で測定された活性量が、ＥＣ５０で存在するＨＢＰポリペプチドによって誘発された量の少なくとも２０％であれば、この候補調節物質を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質として同定する。
【００８７】
本発明はさらに、サンプル中で、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質の存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）サンプルの存在および不存在下でＦＰＬＲ２ポリペプチドをＨＢＰポリペプチドと接触させる段階；ｂ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；およびｃ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチドを含有するがサンプルを伴わない反応中で測定された活性量を、ＦＰＬＲ２ポリペプチド、ＨＢＰポリペプチドおよびサンプルを含有する反応中で測定された活性量と比較する段階：この場合、サンプル不存在下での活性と比較して、サンプルの存在下で活性が変化すれば、サンプル中に、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質が存在することを示す。
【００８８】
本発明はさらに、サンプル中で、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質の存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）ＦＰＬＲ２ポリペプチドをサンプルと接触させる段階；ｂ）サンプルの存在下でＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階；およびｃ）サンプルの存在下で測定された活性を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドをＥＣ５０で存在するＨＢＰポリペプチドと接触させた反応中で測定された活性と比較する段階：この場合、サンプルの存在下で測定された活性量が、ＥＣ５０で存在するＨＢＰポリペプチドによって誘発された量の少なくとも２０％であれば、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの機能を調節する物質を検出する。
【００８９】
先行する各方法の一実施態様では、ＨＢＰポリペプチドは検出可能に標識されている。好ましい実施態様では、ＨＢＰポリペプチドは、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、および親和性タグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている。
【００９０】
先行する各方法の実施態様では、ＦＰＬＲ２ポリペプチド発現細胞中またはこの細胞上で接触を行う。
【００９１】
先行する各方法の実施態様では、合成リポソーム中またはこのリポソーム上で接触を行う。
【００９２】
先行する各方法の実施態様では、ＦＰＬＲ２ポリペプチドを含有するウイルス誘発性の発芽膜中またはこの膜上で接触を行う。
【００９３】
先行する各方法の実施態様では、ＦＰＬＲ２ポリペプチド発現細胞由来の膜フラクションを用いて接触を行う。
【００９４】
先行する各方法の実施態様では、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光からなる群から選択される方法を用いて測定を行う。
【００９５】
先行する各方法の実施態様では、物質は、天然または合成ペプチドまたはポリペプチド、抗体またはその抗原結合性断片、脂質、炭水化物、核酸、アンチセンスヌクレオチド、および有機小分子からなる群から選択される。
【００９６】
シグナル伝達活性を測定する方法の一実施態様では、ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階は、二次メッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む。
【００９７】
シグナル伝達活性を測定する方法の別の実施態様では、シグナル伝達活性を測定する段階は、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。
【００９８】
一実施態様では、シグナル伝達活性を測定する段階はエクオリンに基づくアッセイの使用を含む。
【００９９】
本発明はさらに、細胞中のＦＰＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する方法であって、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する物質を細胞にデリバリーし、これによりＦＰＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する段階を含む方法を含む。
【０１００】
本発明はさらに、ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）組織サンプルを、ＦＰＬＲ２ポリペプチドに特異的な抗体と接触させる段階；ｂ）抗体と組織サンプルの結合を検出する段階；およびｃ）段階（ｂ）で検出された結合を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した結合の差を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０１０１】
本発明はさらに、ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）組織サンプルから核酸を単離する段階；ｂ）核酸を鋳型として用いてＦＰＬＲ２ポリヌクレオチドを増幅する段階；およびｃ）段階（ｂ）で作成された増幅ＦＰＬＲ２ポリヌクレオチドの量を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した増幅ＦＰＬＲ２ポリヌクレオチドの量の差を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０１０２】
本発明はさらに、ＦＰＬＲ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって、以下の段階を含む方法を含む：ａ）組織サンプルから核酸を単離する段階；ｂ）核酸を鋳型として用いてＦＰＬＲ２ポリヌクレオチドを増幅する段階；およびｃ）段階（ｂ）で作成された増幅ＦＰＬＲ２ポリヌクレオチドの配列を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した配列の差を、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。一実施態様では、増幅段階はＲＴ／ＰＣＲを含む。別の実施態様では、標準は配列番号１である。別の実施態様では、配列を比較する段階はミニシークエンシングを含む。別の実施態様では、量を比較する段階はマイクロアレイを用いて行う。
【０１０３】
本発明はさらに、単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチドを含むか、あるいはそれらから本質的に構成される組成物を含む。単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチドは一緒になって、これらの相互作用を調節する物質の同定、ＦＰＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する物質の同定、およびＦＰＬＲ２ポリペプチドが媒介または関与する疾患または障害を患う個体の同定に有用な複合体を形成することができる。したがって、複合体型または非複合体型（すなわち結合型または未結合型）の単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチドは、本発明のアッセイおよび方法の本質的要素または基礎である。単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチド「から本質的に構成される」組成物は、追加の成分を含むことができるが、このような追加の成分は本発明の基礎である新規相互作用に本質的ではない。単離したＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび単離したＨＢＰポリペプチド「から本質的に構成される」組成物は、例えば細胞、組織または細胞もしくは組織抽出物中に存在する、ＦＰＬＲ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチド間の天然に存在する複合体と区別され、これを除外する。本発明の組成物はまた、組換えコンストラクトから発現されるＦＰＬＲ２ポリペプチドおよび天然に存在するＨＢＰポリペプチド間の複合体と区別され、これを除外する。
【０１０４】
本発明のキットは、例えばＦＰＬＲ２ポリペプチドの活性を調節する物質のスクリーニング、サンプル中におけるＦＰＬＲ２ポリペプチドを調節する物質の存在の同定、またはＦＰＬＲ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に有用である。本発明のキットはさらに、このようなキットに必要なパッケージ材料を含む。本発明のキットはさらに、標準を含むことができる。一実施態様では、標準はＦＰＬＲ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害に罹患していない個体由来のサンプルである。
【０１０５】
本明細書中で使用する用語「ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）ポリペプチド」とは、配列番号２と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、１００％同一性まで、および１００％同一性を含む、アミノ酸同一性を有し、かつＦＰＲＬ２活性を有するポリペプチドを表す。すなわち、ＦＰＲＬ２ポリペプチドはＨＢＰポリペプチドまたはその機能性断片を結合する。ＦＰＲＬ２ポリペプチドはまた、配列番号２の機能性断片、すなわち配列番号２の部分であって、依然としてＨＢＰポリペプチドまたはその機能性断片と結合能を有する部分であってよい。配列番号２の機能性断片は、配列番号２に記載の配列のアミノ酸の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％を含んでよい。
【０１０６】
好ましくは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドはまた、本明細書中で定義するＦＰＲＬ２シグナル伝達活性を有する。
【０１０７】
本明細書中で使用する「ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性」とは、本明細書中で定義するＨＢＰポリペプチドと特異的に結合すること、またはＨＢＰポリペプチドに応じてシグナルを伝達する（signalling by a HBP polypeptide）ことを表す。
【０１０８】
相同配列（他の哺乳類種または特定群のヒト集団に存在する可能性がある）とは、配列番号１の完全ヒトヌクレオチドまたは配列番号２の完全ヒトアミノ酸配列と高い配列同一性（８０％、８５％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性）を示す配列を意味する。この場合、ホモロジー（相同性）は配列同一性を指す。機能性ホモログは、本明細書中で定義するＨＢＰポリペプチドの結合能またはリガンド結合に応答したシグナルの開始または伝達能、またはその両者によって特徴付けられる。
【０１０９】
本発明に記載の配列の相同配列は、他の動物種（ラット、マウス、ネコ、イヌ、等）または特定のヒト集団群に存在する類似の受容体、同じ生化学的経路に含まれる類似の受容体をエンコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１１０】
このような相同配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの付加、欠失または置換を含んでいてもよく、これらは本発明の受容体の機能上の性質を実質的に変更しない。すなわち、ホモログは、ｗｔ完全長ヒトＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性の少なくとも９０％を有し、ＨＰＢポリペプチドを特異的に結合する。
【０１１１】
このような相同配列はまた、ストリジェントハイブリダイゼーション条件（例えば、SAMBROOK et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New Yorkに記載される条件）下、完全ヒトＦＰＲＬ２配列とハイブリッド形成可能な５０、１００、２００、３００、４００、６００、８００または１０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列であり得る。「ストリジェントハイブリダイゼーション条件」の典型例は以下の通りである：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート液、５０μｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸中４２℃でハイブリッド形成；および０．２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃（またはそれ以上、例えばプローブ配列の完全相補物のＴｍより２℃下まで）で洗浄。
【０１１２】
本明細書で使用する用語「ホルミルペプチド受容体様受容体２（ＦＰＲＬ２）のシグナル伝達活性（signalling activity）」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドによるシグナル伝達の開始または伝達を表す。ＦＰＲＬ２のシグナル伝達活性は、１つまたはそれ以上の以下の事象をアッセイして、シグナル伝達カスケード中の検出可能な段階を測定することによってモニターする：Ｇタンパク質上のＧＤＰとＧＴＰの交換の促進；アデニル酸シクラーゼ活性の変化；プロテインキナーゼＣ調節；ホスファチジルイノシトール分解（二次メッセンジャー、ジアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸が生成する）；細胞内カルシウム流動；ＭＡＰキナーゼの活性化；チロシンキナーゼの調節；または遺伝子もしくはレポーター遺伝子活性の調節。以下に記載する任意のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性アッセイに比較して、測定可能な活性がＨＢＰポリペプチドの実質的不存在下で確立されたベースラインの上または下に１０％またはそれ以上変化した場合には、シグナル伝達カスケード中の検出可能な段階が開始または媒介されたとみなす。測定可能な活性は、例えばｃＡＭＰまたはジアシルグリセロールレベルの測定のように、直接測定することができる。別法では、測定可能な活性は、例えばレポーター遺伝子のアッセイのように、間接的に測定することができる。
【０１１３】
用語「ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）ポリペプチド」とは、配列番号１８と少なくとも５０％またはそれ以上の同一性を有するポリペプチドを表し、この定義のポリペプチドは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドと特異的に結合し、そのシグナル伝達活性を活性化する。好ましくは、このポリペプチドは配列番号１８と少なくとも５５％、またはそれ以上の同一性である。好ましくは、このポリペプチドは配列番号１８と少なくとも６０％、または７０％、または８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％またはそれ以上の同一性である。
【０１１４】
ＨＢＰポリペプチドはまた配列番号１８の機能性断片、すなわち配列番号１８の部分であってもよく、これは依然としてＦＰＲＬ２ポリペプチドまたはその機能性断片と結合能を有する部分である。配列番号１８の機能性断片は、配列番号１８に記載の配列の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１、または上記数のうち任意の２つの間の範囲の数のアミノ酸を含む。
【０１１５】
用語「特異的に結合」とは、ＨＢＰポリペプチドが１００ｎＭまたはそれ以下のＥＣ５０、ＩＣ５０、またはＫｄを有することを意味する。「ＨＢＰポリペプチド」とはまた、先行する定義を満たすポリペプチドの断片を表し、この場合、この断片は配列番号１８の完全長ポリペプチドの結合活性およびシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも５０％を維持する。ＨＢＰポリペプチドはまた、配列番号１８のアナログ、変異体またはＣＯＯＨ末端および／またはＮＨ２末端由来のいずれかの短いポリペプチドを含む。ＨＢＰポリペプチドはまた配列番号１８に関して化学的および／またはアミノ酸付加、挿入、欠失または置換を含むことができる。このことは、得られたポリペプチドが配列番号１８に記載の完全長ポリペプチドの結合活性およびシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも５０％を維持する限りにおいてである。ＨＢＰポリペプチドは、例えばＨＢＰ融合タンパク質のように追加の配列を含むことができる。融合パートナーの非限定的な例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘまたはそれ以上のＨｉｓ）、またはエピトープタグ（例えば、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）を含む。ＨＢＰポリペプチドは、Ｎ末端にアセチル基を有する、あるいは有さない、配列番号１８に記載のポリペプチド配列であり得る。ＨＢＰポリペプチドは、標識、例えばビオチンまたは任意の他の色素（蛍光色素）を有するあるいは有さない、または放射性同位体を有する、配列番号１８に記載のポリペプチド配列であり得る。標識が存在する場合、これは例えばアセチル基を介してＨＢＰポリペプチドのＮ末端に結合していてよい。上記特徴の１つまたはそれ以上の組み合わせは本発明の範囲内である。
【０１１６】
本発明に記載の配列番号１８の相同配列は、他の動物種（ラット、マウス、ヒト、ネコ、イヌ等）または特定のヒト集団群に存在するが、同じ生化学的経路に関与する類似の配列をエンコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１１７】
このような相同配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの付加、欠失または置換を含んでも良く、これらは本発明のペプチドの機能上の性質を実質的に変更しない。すなわち、ホモログは配列番号１８に記載のアミノ酸配列の活性の少なくとも９０％を有し、ＦＰＲＬ２と特異的に結合し、またはこれを活性化する。
【０１１８】
本明細書中で使用する用語「検出可能な段階」とは、直接的に、例えば、二次メッセンジャーの測定、または修飾（例えばリン酸化）タンパク質の検出によって、あるいは間接的に、例えば、この段階の下流の作用のモニタリングによって測定することができる段階を表す。例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化はｃＡＭＰ生産を導く。アデニル酸シクラーゼの活性は、直接的に、例えばｃＡＭＰ生産をモニターするアッセイによって、あるいは間接的に、ｃＡＭＰの実際のレベルを測定することによって測定することができる。
【０１１９】
本発明の組換え細胞は、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクター、好ましくはバキュロウイルス、アデノウイルス、またはセムリキ森林熱ウイルスによって形質転換された組換え細胞であるのが好ましく、この細胞は、好ましくは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択される。
【０１２０】
本発明の好ましい実施態様では、細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞または１３２１Ｎ１星細胞腫細胞からなる群から選択される。しかし他のトランスフェクト可能なセルラインもまた有用である。好ましくは、ベクターは、本発明の受容体をエンコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結され、その発現を可能にする調節要素を含む。
【０１２１】
本発明の別の側面は、本配列の特定活性部分の使用に関する。本明細書中で使用する「活性部分」とは、正常または正常に近い薬理作用（例えば、受容体活性（本明細書中で定義ずみ）、アクチベーターまたはインヒビターに対する応答、またはリガンド結合が、野生型受容体が示す活性、応答、または結合のレベルの少なくとも９０％であること）を示すのに十分なサイズである配列の部分を表す。受容体をエンコードする配列を参照する場合の「部分」とは、１００％より少ない当該配列（すなわち、９９、９０、８０、７０、６０、５０％等...）を表す。活性部分は、完全ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分的欠失を含む受容体および特定リガンド、好ましくはＨＢＰポリペプチドとの結合およびそれとの相互作用に必要な活性部位（群）およびタンパク質ドメイン（群）を依然維持している受容体であることもできる。
【０１２２】
先行する任意の方法の別の実施態様では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含有する、合成リポソーム（Mirzabekov et al., 2000）中もしくはこのリポソーム上またはウイルス誘発性の発芽膜中もしくはこの膜上で接触を行う。（引用により本明細書中に包含される特許出願WO0102551、ウイルス様粒子、その調製および好ましくは医薬のスクリーニングおよび機能性ゲノミクスにおけるその使用（Virus-like particles, their Preparation and their Use preferably in Pharmaceutical Screening and Functional Genomics）（2001）を参照のこと）。
【０１２３】
本明細書中で使用する「リガンド」とは、受容体と結びつき、または結合することが可能な部分を意味する。本発明の方法では、リガンドおよび受容体は、受容体に対するリガンド結合の検出に適切なアッセイ方法（例えば、受容体に対するリガンド結合に応答する二次メッセンジャー生産の増大または減少を検出する二次メッセンジャーアッセイ、タンパク質−リガンド結合を測定する結合アッセイ、または抗体−抗原相互作用を測定する免疫アッセイ）によって結合の検出が可能であるほど十分に強い結合定数を有する。本発明のリガンドは受容体と結合する実際の分子を含み、あるいはリガンドは、受容体と結合可能な、任意のヌクレオチド、抗体、抗原、酵素、有機小分子、ペプチド、ポリペプチドまたは核酸であってよい。リガンドは好ましくは、ＨＢＰポリペプチド、ペプチドまたは核酸配列である。本発明の方法では、リガンドおよび受容体は互いに特異的に結合する（例えば、共有結合または水素結合を介して、または例えばタンパク質とリガンド、抗体と抗原またはタンパク質サブユニット間の相互作用を介して）。
【０１２４】
本発明の別の側面は、以下の段階を含む本発明の受容体の候補調節物質のスクリーニング、検出および回収方法に関する：ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合を許容する条件下で、候補調節物質の存在下で、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞をＨＢＰポリペプチドと接触させる段階、二次メッセンジャーアッセイを行う段階および候補調節物質の存在または不存在下で得られた二次メッセンジャーアッセイの結果を比較する段階。
【０１２５】
本発明の別の側面は、以下の段階を含む本発明の受容体の候補調節物質のスクリーニング、検出および可能な回収を行うための方法に関する：ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合を許容する条件下で、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞膜をＨＢＰポリペプチドと接触させる段階、二次メッセンジャーアッセイを行う段階および候補調節物質の存在または不存在下で得られた二次メッセンジャーアッセイの結果を比較する段階。
【０１２６】
別の実施態様では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階は二次メッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む。
【０１２７】
本発明のさらに別の側面は、本発明の方法によって同定されならびに／あるいは回収される未知のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト化合物ならびにこの（未知の）化合物を含む診断キット、または適切な製薬用担体および十分な量のこの（未知の）化合物を含む医薬組成物（ワクチンを含む）に関する。
【０１２８】
本発明のアンタゴニスト化合物は、本発明の受容体と結合可能で、天然化合物（ＨＢＰポリペプチド）の結合をブロック可能な分子または分子群を意味する。
【０１２９】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法を含み、以下の段階を含む方法である：ａ）組織サンプルを、ＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体およびＦＰＲＬ２リガンドに特異的な抗体と接触させる段階；ｂ）抗体群と組織サンプルの結合を検出する段階；およびｃ）段階（ｂ）で検出された結合を標準と比較する段階：この場合、標準と比較した、いずれかの抗体または両抗体の結合の差をＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０１３０】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法を含み、以下の段階を含む方法である：ａ）組織サンプルを単離する段階；ｂ）ＨＢＰポリペプチドの濃度を測定する段階；およびｃ）段階（ｂ）で測定されたリガンドの量を標準と比較する段階：この場合、標準と比較したＨＢＰポリペプチド量の差を、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０１３１】
本発明のさらに別の側面は、本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体をエンコードするポリヌクレオチド配列のホモ接合性無発現変異（ホモ接合性「ノックアウト」）を含む非ヒト哺乳類またはＦＰＲＬ２ポリペプチドを天然の発現レベルを超えて過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類に関する。本明細書中で使用する「天然の発現レベルを超える」とは、正常な天然状態での内因性受容体の発現レベルと比較して少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等）のレベルを表す。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳類は少なくとも１つの組織または細胞タイプ内で導入遺伝子を発現するが、すべての組織および細胞内でＦＰＲＬ２ポリペプチド導入遺伝子を発現し得る。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、当業者に周知の方法によって取得することができ、この方法では、例えば刊行物WO 98/20112に記載されるように、胚性幹細胞のトランスフェクションに基づく典型的技術を用いる。好ましくはCarmeliet et al.（Nature, Vol.380, p.435-439, 1996）に記載の方法にしたがって取得する。
【０１３２】
「遺伝子ターゲティング」とは、特定タイプの相同組換えであり、この組換えは、ゲノムＤＮＡ断片が哺乳類細胞に導入された場合に生じ、この断片は内因性相同配列を有して配置し、この配列と組み替える。これは米国特許第5,464,764号および米国特許第 5,777,195号に典型的に示される通りである。これらの特許文献の内容はこの引用によりその全体が本明細書中に包含される。本明細書中で使用する用語「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物を表し、その中でその１つまたはそれ以上の、好ましくは本質的にすべての、動物細胞が、人為的介入、例えば当技術分野で既知のトランスジェニック技術によって導入された導入遺伝子を含有する。導入遺伝子は、細胞の前駆体への導入によって、慎重な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクションによって、または組換えウイルスを用いる感染によって、直接または間接的に細胞内へ導入することができる。
【０１３３】
好ましくは、本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体をエンコードするポリヌクレオチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類は、受容体の過剰発現を可能にする誘導性プロモーターおよび、場合により、組織および細胞特異的な調節要素をも伴うＤＮＡコンストラクトに組み込まれたこのポリヌクレオチドを含む。
【０１３４】
一実施態様では、本発明のキットは、ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合を測定するための試薬を含む。別の実施態様では、キットはＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定するための試薬を含む。
【０１３５】
一実施態様では、本発明のスクリーニングキットまたは診断キットは、ＦＰＲＬ２受容体ポリペプチドまたはＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む細胞膜調製物および１つまたはそれ以上のＨＢＰポリペプチドを個別の容器の中に含む。このようなキットはさらに、本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体に対する（例えばＨＢＰポリペプチドの）特異的結合の検出を行うために必要なすべての手段および媒体を含むことができる。結合またはシグナル伝達活性は、本明細書中以下に記載する疾患の１つまたはそれ以上の症状をモニターする方法と関連付けることができる。
【０１３６】
したがって診断キットはさらに、特定の診断測定、または、例えば当業者に既知の高処理量のスクリーニング技術、例えばWO 00/02045に記載の技術を用いる結合化合物の測定に必要な要素を含むことができる。このようなキットは例えば、処置用のＦＰＲＬ２ポリペプチド調節物質の用量および有効性をモニターするために使用することができる。高処理量スクリーニングによる診断的用量決定およびモニタリングは、諸固形支持体、例えば当業者が選択するマイクロタイタープレートまたはバイオチップを用いて行うことができる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物中、適切な製薬用担体は固形、液状またはガス状担体であり、これは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を調節するために投与される化合物の投与のタイプおよびその副作用の可能性に応じて当業者が選択可能である。本発明の有用な製薬用担体は、組織培養用の培地または他の血清含有培地を含まない。製薬用担体と特定化合物の割合は、処置対象の患者、化合物の投与方法およびその副作用の可能性、ならびに処置または予防目的の対象である疾患障害のタイプに応じて当業者が選択可能である。
【０１３８】
この医薬組成物は、諸疾患または障害の処置および／または予防分野で有益に適用されるに至る。この諸疾患または障害は好ましくは以下からなる群から選択される：細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過���症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【０１３９】
上記疾患のうち、好ましい適用は、非限定的に以下を含む機能不全または疾患の予防、改善または治療の機能を果たすことができる７ＴＭ受容体を標的とする治療用物質に関するが、以下を含み、ただしこれらに限定されない。：細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2���、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【０１４０】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を調節する物質であって、上記の方法によって同定されるか、あるいは上記のようにサンプル中で検出される物質を含む。
【０１４１】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を調節するための当該物質の使用を含む。
【０１４２】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチド関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節用キットを製造するための、当該物質の使用を含む。
【０１４３】
本発明はさらに、適切な製薬用担体または希釈剤および十分な量の当該物質を含む医薬組成物を含む。
【０１４４】
本発明はさらに、投与対象である患者の免疫応答を調節可能なベシクルまたはアジュバントをさらに含む上記医薬組成物を含む。
【０１４５】
本発明はさらに、ＦＰＲＬ２ポリペプチド関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＦＰＲＬ２ポリペプチド調節用のキットを製造するための、上記医薬組成物の使用を含む。
【０１４６】
本発明はまた、インビボおよび／またはインビトロでＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を調節するためのＨＢＰポリペプチドの使用に関する。
【０１４７】
本発明はまた、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの部分的または全欠失を含む非ヒト哺乳類の検証中のＨＢＰポリペプチドの使用に関する。
【０１４８】
本発明はまた、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを過剰発現する非ヒト哺乳類の検証中のＨＢＰポリペプチドの使用に関する。
【０１４９】
本明細書中で使用する「アンタゴニスト」とは、受容体に対し、アゴニストと同一部位で競合的に結合するが、活性型受容体により開始される細胞内応答を活性化しないリガンドである。これによりアンタゴニストは、アゴニスト、例えばＨＢＰポリペプチドによって誘導される細胞内応答を、アゴニストの存在下で、かつアンタゴニストの不存在下での細胞内応答と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５−２５％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％阻害する。
【０１５０】
本明細書中で使用する「アゴニスト」とは、細胞内応答を誘導するＨＢＰポリペプチド濃度と等しいか、あるいはより低い濃度で受容体と結合した場合に、細胞内応答を活性化するリガンドを表す。本発明のアゴニストは、受容体によって媒介される細胞内応答を、アゴニスト不存在下の細胞内応答と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等...）増大させることができる。受容体の細胞表面発現を、アゴニスト不存在下の細胞表面上に存在する細胞表面受容体数と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等...）増大させるほどに、本発明のアゴニストは細胞表面受容体の内部移行（internalization）を促進する可能性がある。本発明の別の実施態様では、アゴニストは細胞表面受容体を安定化し、受容体の細胞表面発現を、アゴニスト不存在下で細胞表面上に存在する細胞表面受容体数と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等...）増大させる。
【０１５１】
本明細書中で使用する「逆アゴニスト」とは、受容体と結合した場合に細胞表面受容体の構成的活性を減少させるリガンドを表す。本発明の逆アゴニストは、受容体によって媒介される構成的細胞内応答を、逆アゴニスト不存在下の細胞内応答と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等...）減少させることができる。
【０１５２】
本発明の「インヒビター」化合物とは、受容体に指向する分子または受容体のための天然リガンドに指向する分子であって、これはＨＢＰポリペプチド存在下でのリガンドと受容体の結合を、ＨＢＰポリペプチド存在下で、かつインヒビター不存在下での結合と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５−２５％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％減少させる。本発明の「インヒビター」化合物は、アゴニスト、例えばＨＢＰポリペプチドによって誘導される細胞内応答を、少なくとも１０％、好ましくは１５−２５％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％減少させることができる。また「インヒビター」とは、本発明のインヒビター化合物をエンコードするヌクレオチド配列をも表す。本発明で有用なインヒビターは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを介するシグナル伝達に必要とされるＦＰＲＬ２ポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する抗体（例えばリガンド結合部位）、またはＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体と共役するシグナル伝達経路をブロックするか、あるいは（例えば少なくとも１０％）減少させることができる化学物質を含むが、これらに限定されない。このようなインヒビターは、致死量以下の用量の百日咳毒素、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；Sigma）、ジブチリルｃＡＭＰ（Boehringer Mannheim, Corp.）、およびＨ−８９（Ｎ−[２−((ｐ−ブロモシンナミル)アミノ)エチル]−５−イソキノリンスルホンアミド−ＨＣＬ；Calbiochem）を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
本明細書中で使用する「天然リガンド」とは、天然に見出される、天然に存在するリガンドであって、ＨＢＰポリペプチドと少なくとも等価の様式で受容体と結合するリガンドを表す。「天然リガンド」は、天然には見出されなく、受容体と結合するように操作されている改変リガンドを表さなく、これらは元々は、その結合様式が程度または種類において、結合するように操作されたものと異なっている。このような改変リガンドはもはや天然に存在しなく、「非天然」であり、天然に存在する分子の派生物である。
【０１５４】
本明細書中で使用する「調節物質（modulator）」とは、本発明の受容体の細胞表面発現を増大または減少させる化合物、リガンドと本発明の受容体との結合を増大または減少させる化合物、またはアゴニストの存在または不存在下で、かつ受容体のリガンド、例えばＨＢＰポリペプチドの存在下で、本発明の活性型受容体によって開始される細胞内応答を増大または減少させる任意の化合物を表す。調節物質は本明細書中で定義する、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターまたは逆アゴニストを含む。調節物質は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはその抗原結合性断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子であり得る。候補調節物質は天然または合成の化合物でありえて、これには、例えば、合成小分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物ならびにそのような細胞由来の条件培地中に含まれる化合物が含まれる。
【０１５５】
本明細書中で使用する「増大」および「減少」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体に対するリガンド結合および／またはＦＰＲＬ２ポリペプチドを介する細胞のシグナル伝達の少なくとも１０％の変化を表す。結合またはシグナル伝達における「増大」または「減少」は、候補調節物質の存在下でＦＰＲＬ２ポリペプチドをリガンドと接触させることに応じて測定するのが好ましく、この場合、結合またはシグナル伝達の変化は候補調節物質不存在下での結合またはシグナル伝達と比較する。
【０１５６】
本明細書中で使用する用語「小分子」とは、３０００ダルトンより小さい、好ましくは２０００または１５００ダルトンより小さい、さらにより好ましくは１０００ダルトンより小さい、そして最も好ましくは６００ダルトンより小さい分子質量を有する化合物を表す。「有機小分子」は炭素を含む小分子である。
【０１５７】
本明細書中で使用する用語「変化」、「差異」、「減少」または「増大」は、例えば結合またはシグナル伝達活性、またはある物質の量に適用される場合、結合、シグナル伝達活性、または例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドまたはリガンドのレベルが、既定アッセイでの標準との比較において少なくとも１０％増大または減少することを表す。
【０１５８】
本明細書中で使用する用語「調節不全」とは、以下のようなサンプル中のＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を表す：
ａ）  既定アッセイの測定で、１つまたはそれ以上のＦＰＲＬ２ポリペプチド、リガンドまたはｍＲＮＡレベルの量が、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少する場合、または；
ｂ）  ＦＰＲＬ２ポリペプチドのコード配列中、配列番号１と比較して、少なくとも１つの塩基対変化が検出され、パラグラフａ）、ｃ）またはｄ）で定義されるＦＰＲＬ２ポリペプチドのリガンド結合またはシグナル伝達活性の変化が生じる場合、または；
ｃ）  既定アッセイの測定で、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのリガンド結合活性の量が、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少する場合、または；
ｄ）  既定アッセイの測定で、本明細書中で定義される二次メッセンジャーが、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少する場合。
【０１５９】
本明細書中で使用する用語「ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合を許容する条件」とは、ＦＰＲＬ２がＦＰＲＬ２ポリペプチドを結合する際の、例えば、温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度等の条件を表す。正確な結合条件は、アッセイが生細胞を使用するのか、あるいは細胞の膜フラクションのみを使用するのか等のアッセイの性質に応じて変化する。しかしＦＰＲＬ２ポリペプチドは細胞表面タンパク質であるから、好適な条件は一般に、生理的塩（９０ｍＭ）およびｐＨ（約７．０〜８．０）を含む。結合のための温度は１５℃〜３７℃まで変化させることができるが、好ましくは室温〜約３０℃の範囲である。結合反応中のＨＢＰポリペプチドの濃度もまた変動するが、好ましくは約１０ｐＭ〜１０ｎＭ（例えば、放射性標識化トレーサーＨＢＰポリペプチドを用いる反応中）である。
【０１６０】
本明細書中で使用する用語「サンプル」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドとの結合またはＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を調節する物質または調節化合物の存在のための試験の対象である分子の供給源を表す。サンプルは、環境サンプル、動物、植物 酵母または細菌細胞または組織の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル、または組換え細胞または発酵プロセス由来の条件培地であり得る。用語「組織サンプル」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードする核酸、ＦＰＲＬ２リガンドまたは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのリガンド結合または活性を修飾する物質または化合物の存在、量、質または活性に関して試験を受ける対象の組織を表す。
【０１６１】
本明細書中で使用する「組織」は、生体内で特定機能を有する細胞の集合体である。本明細書中で使用する用語「組織」とは、特定の生理学的領域由来の細胞性物質を表す。特定組織中の細胞はいくつかの異なった細胞タイプを含み得る。その非限定的な例を挙げれば、脳組織であろう。その脳組織はさらに神経細胞およびグリア細胞ならびに毛細管内皮細胞および血球を含み、これらはすべて、既定の組織切片またはサンプル中に含まれる。また固形組織に加えて、用語「組織」は非固形組織、例えば血液を含むものとする。
【０１６２】
本明細書中で使用する用語「膜フラクション」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む細胞性脂質膜の調製物を表す。本明細書中で使用するように、「膜フラクション」は、非膜関連細胞構成物質が少なくとも部分的に（すなわち少なくとも１０％、好ましくはそれ以上）除去されている点において、細胞性ホモジネートと区別される。用語「膜関連」とは、脂質膜内に組み込まれているか、あるいは脂質膜内に組み込まれている成分と物理的に結合している細胞構成物質を表す。
【０１６３】
本明細書中で使用する「二次メッセンジャーアッセイ」は、好ましくは、以下の事象の測定を含む：グアニンヌクレオチドの結合または交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼ（群）またはチロシンキナーゼ（群）、プロテインキナーゼＣ活性、またはレポーター遺伝子発現またはエクオリンに基づくアッセイ。これらの測定は当技術分野で既知の、本明細書中で規定する方法にしたがって行う。
【０１６４】
本明細書中で使用する用語「二次メッセンジャー」とは、Ｇタンパク質共役受容体の活性化によって生産されるか、または濃度変化が引き起こされる分子であって、このＧＰＣＲ由来のシグナル伝達に関与する分子を表す。二次メッセンジャーの非限定的な例はｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、および細胞内カルシウムを含む。用語「二次メッセンジャーレベルの変化」とは、候補調節物質の不存在下で行われるアッセイで検出される量と比較して、既定の二次メッセンジャーの検出レベルが少なくとも１０％増大または減少することを表す。
【０１６５】
本明細書中で使用する用語「エクオリンに基づくアッセイ」とは、活性型ＧＰＣＲによって誘導される細胞内カルシウム流動を測定する、ＧＰＣＲ活性についてのアッセイを表し、この場合、細胞内カルシウム流動は、細胞中で発現されたエクオリンの発光によって測定する。
【０１６６】
本明細書中で使用する用語「結合」とは、リガンド（例えば、ＨＢＰポリペプチドのようなリガンド、または抗体）と受容体（例えばＦＰＲＬ２）の物理的結び付きを表す。本明細書中で使用するように、結合が１ｍＭより小さい、一般に１００ｎＭ〜１０ｐＭの範囲のＥＣ５０またはＫｄで生じる場合、この結合は「特異的」である。例えば、ＥＣ５０またはＫｄが１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭまたはそれ以下である場合、結合は特異的である。
【０１６７】
本明細書中で使用する用語「ＥＣ５０」とは、ＨＢＰポリペプチドまたは他のリガンドの結合および受容体ポリペプチドの機能的活性を含む既定の活性が、化合物不存在下で同一のアッセイを用いて測定可能な受容体活性に関する最大値の５０％である化合物の濃度を表す。言い換えれば、「ＥＣ５０」とは、さらにアゴニストを加えても増大しない活性量で１００％の活性化を設定する場合に、５０％の活性化を提供する化合物の濃度である。留意すべきは、ＨＢＰポリペプチドアナログの「ＥＣ５０」が、アッセイで使用されるアナログのアイデンティティーに応じて変動することである；例えば、ＨＢＰポリペプチドアナログはＨＢＰポリペプチドより高いか、より低いか、あるいは同一のＥＣ５０値を有し得る。したがって、ＨＢＰポリペプチドアナログがＨＢＰポリペプチドと異なる場合、当業者は従来の方法にしたがってそのアナログに関するＥＣ５０を決定することができる。既定のＨＢＰポリペプチドアナログのＥＣ５０の測定は、少なくともＦＰＲＬ２ポリペプチド応答が飽和するか、あるいは最大になるまで増大させる用量のＨＢＰポリペプチドアナログの存在下で、固定量のＦＰＲＬ２ポリペプチドポリペプチドの活性のためのアッセイを行い、その後、測定されたＦＰＲＬ２ポリペプチド活性をＨＢＰポリペプチドアナログ濃度に対してプロットすることによって行う。
【０１６８】
本明細書中で使用する用語「飽和」とは、リガンド濃度がさらに増大してもリガンドの結合またはＦＰＲＬ２ポリペプチド特異的シグナル伝達活性が増大しないＨＢＰポリペプチドまたは他のリガンドの濃度を表す。
【０１６９】
本明細書中で使用する用語「ＩＣ５０」は、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体の最大活性化を５０％減少させるアンタゴニストまたは逆アゴニストの濃度である。
【０１７０】
本明細書中で使用する用語「ＬＤ５０」とは、投与対象である被験者の５０％を死滅させるのに必要な特定物質の用量を表す。
【０１７１】
本明細書中で使用する用語「結合の減少」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドについての既知または推定の調節物質を用いる既定のアッセイにおいて、検出されるリガンド結合量が、その既知または推定の調節物質を欠いているアッセイで検出される結合と比較して少なくとも１０％減少することを表す。
【０１７２】
本明細書中で使用する用語「デリバリー」とは、薬物または物質に関して使用する場合、アッセイ混合物または培養細胞に薬物または物質を添加することを意味する。この用語はまた、動物への薬物または物質の投与を表す。このような投与は、例えば、（適切な担体、例えば滅菌食塩水または水中での）注射または吸入、または経口、経皮、直腸内、膣内、または他の一般的な薬物投与経路によって行うことができる。
【０１７３】
本明細書中で使用する用語「標準」とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節不全を特徴とする疾患または障害を患わない個体から採取されたサンプルを表す。「標準」は、ＦＰＲＬ２ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルおよび性質（すなわち変異型対野生型）の比較、ならびにＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の比較に関する基準として用いられる。「標準」はまた、参照配列、例えば配列番号１または配列番号２を含む。核酸配列またはそれらがエンコードするポリペプチド配列がこれらの参照配列と比較される。
【０１７４】
本明細書中で使用する用語「増幅」とは、核酸配列に適用される場合、鋳型の核酸から１つまたはそれ以上のコピーの核酸配列が生産されるプロセスを表す。好ましい「増幅」方法はＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲである。
【０１７５】
本明細書中で使用する用語「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」とは、７つのアルファヘリックス貫膜ドメインを有する膜関連ポリペプチドを表す。機能性ＧＰＣＲはリガンドまたはアゴニストと結合し、さらにＧタンパク質と結合して、これを活性化する。ＦＰＲＬ２ポリペプチドはＧＰＣＲである。
【０１７６】
本明細書中で使用する用語「抗体」は、通常の免疫グロブリン分子、ならびに対象ポリペプチドの１つと同様に特異的に反応するその断片である。抗体は従来の技術を用いて断片化することができる。この断片は、完全抗体に関して本明細書中以下に記載される方法と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理してＦ(ａｂ)２断片を作成することができる。得られたＦ(ａｂ)２断片のジスルフィド架橋を還元処理して、Ｆａｂ断片を作成することができる。本発明の抗体はさらに、二重特異性、単一鎖、およびキメラおよびヒト化分子であって、この抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与される、ポリペプチドに対する親和性を有する分子を含むものとする。好ましい実施態様では、抗体はさらに、自身に結合した検出可能な標識を含む（例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。抗体、モノクローナルまたはポリクローナルおよびその超可変部分（Ｆ(ａｂ)、Ｆ（ａｂ'）２、等）、ならびに抗体産生ハイブリドーマ細胞は、本発明のさらに別の側面である。この側面は、好ましくは本明細書中以下に記載されるような特定の疾患の診断およびモニタリング分野で具体的な産業上の応用を発見する。
【０１７７】
本発明のインヒビターおよび調節物質はモノクローナルまたはポリクローナル抗体または抗体の超可変部分を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
本明細書中で使用する用語「ヒト化免疫グロブリン」とは、異なった起源の免疫グロブリンの部分を含み、このうち少なくとも１部分がヒト起源である免疫グロブリンを表す。したがって、本発明は、ヒトＦＰＲＬ２を結合するヒト化免疫グロブリンであって、非ヒト起源（例えば、げっ歯類）の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも１部分（例えば、ヒトフレームワーク領域、ヒト定常領域またはそれらの部分）を含むヒト化免疫グロブリンに関する。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を有する非ヒト起源、例えば、マウスの免疫グロブリン由来の部分と、ヒト起源の免疫グロブリン配列由来の部分を含むことができ（例えばキメラ免疫グロブリン）、これらの部分は、慣用技術により（例えば合成により）化学的に連結され、あるいは遺伝子工学技術を用いて連続ポリペプチドとして調製される（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をエンコードするＤＮＡを発現させて、連続ポリペプチド鎖を生産することができる）。本発明のヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト起源のＣＤＲを含む１つまたはそれ以上の免疫グロブリン鎖（例えば、非ヒト起源の抗体由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲ）およびヒト起源の軽鎖および／または重鎖由来のフレームワーク領域を含有する免疫グロブリン（例えば、フレームワーク変化を伴うか、あるいは伴わないＣＤＲ移植型抗体）である。
【０１７９】
このようなヒト化免疫グロブリンは、合成および／または組換え核酸を用いて作成することができる。この合成および／または組換え核酸技術では、所望のヒト化鎖をエンコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を作成する。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列は、ＰＣＲ突然変異誘発法を用いて、ヒトまたはヒト化鎖をエンコードするＤＮＡ配列、例えば従来のヒト化可変領域由来のＤＮＡ鋳型を改変することによって構築することができる（例えば、Kamman, M., et al., Nucleic Acids Res., 17: 5404 (1989)；Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993)；Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991)；およびLewis, A.P. and J.S Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)を参照のこと）。これらの方法または他の適切な方法を用いて、変異体を容易に作成することができる。一実施態様では、クローニングされた可変領域を変異誘発することができ、所望の特異性を有する変異体をエンコードする配列を（例えば、ファージライブラリから）選択することができる（例えば、Krebber et al., 米国特許第5,514,548号；Hoogenboom et al., WO 93/06213, 1993年4月1日公開；Knappik et al., WO 97/08320, 1997年3月6日公開を参照のこと）。
【０１８０】
本明細書中で使用する用語「トランスジェニック動物」とは、１つまたはそれ以上の細胞が人為的介入、例えば当技術分野で周知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を含有する、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類、魚類または両生類を表す。この核酸は、直接または間接的に、細胞前駆体への導入によって、慎重な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクションによって、または組換えウイルスを用いる感染によって細胞内に導入する。用語、遺伝子操作は典型的な交雑育種またはインビトロ受精を含まず、この用語は組換えＤＮＡ分子の導入に指向する。この分子は染色体内に組み込んでよく、あるいは染色体外複製ＤＮＡとしてもよい。本明細書中に記載の典型的なトランスジェニック動物では、導入遺伝子により細胞は１対象ポリペプチドの組換え型、例えばアゴニスト型またはアンタゴニスト型を発現する。しかし、例えば以下に記載のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性コンストラクトのように、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物もまた考慮する。さらにまた、「トランスジェニック動物」は組換え技術およびアンチセンス技術両者を含む人為的介入によって、１つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子破壊が生じている組換え動物を含む。
【０１８１】
配列
本発明は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）に関する（図１に示す）。本発明はまた、ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と相同な配列に関する。
【０１８２】
配列相同性（ホモロジー）の計算
本明細書中に記載の任意の配列に関する配列同一性は、いずれか１つまたはそれ以上の配列を別の配列と単純に「肉眼」によって比較（すなわち厳密に比較）し、この別の配列が当該配列（群）に対して、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有するかどうかを確かめることによって決定することができる。
【０１８３】
相対的配列同一性はまた、任意の適切な同一性測定用のアルゴリズムを用いて２つまたはそれ以上の配列間の％同一性を算出することができる市販のコンピュータプログラムによって決定することができる。この算出では、例えばデフォルトパラメータを用いる。このようなコンピュータプログラムの典型例はCLUSTALである。２配列間の同一性および類似性を測定する他のコンピュータプログラム法はGCGプログラムパッケージ（Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12: 387）およびFASTA（Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410）を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
％ホモロジーは連続する配列に対して計算してよい。すなわち、１配列が他の配列とアライメントされ、１配列中の各アミノ酸が他の配列中の対応するアミノ酸と１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップのない」アライメントと称される。典型的にこのようなギャップのないアライメントは比較的少数の残基に関してのみ行われる。
【０１８５】
この方法は非常に容易で堅実な方法であるが、この方法では、例えば別の箇所では同一対の配列中に１挿入または欠失があれば、それ以降のアミノ酸残基がアライメントから除外されるため、広範囲のアライメントを行う場合には、％ホモロジーが大きく減少する可能性があることが考慮されない。したがって、ほとんどの配列比較法は、存在し得る挿入および欠失を考慮する最適なアライメントを作成するように設計されていて、全体のホモロジースコアを不当に減点しない。これは、配列アライメント中に「ギャップ」を挿入して局所的なホモロジーの最大化を試みることにより達成される。
【０１８６】
ただし、より複雑なこれらの方法では、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当て、同数の同一アミノ酸に関して、可能な限り少ないギャップしか含まない配列アライメント−これは２比較配列間のより高い関連性を反映する−が多数のギャップを含むアライメントより高いスコアを達成するようにする。典型的には、ギャップの存在に関して相対的に高いコストを課し、このギャップ中の各連続残基に対してはより低いペナルティーを課する「アフィンギャップコスト（Affine gap costs）」を用いる。これが最も一般的に用いられるギャップスコア系である。高いギャップペナルティーにより当然ながら、より少ないギャップしか有さない最適化アライメントが生じる。ほとんどのアライメントプログラムではギャップペナルティーの修正が可能である。しかし、このようなソフトウェアを配列の比較に用いる場合には、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを用いる場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティーは、1ギャップに関しては−１２であり、各伸長に関しては−４である。
【０１８７】
したがって最大％ホモロジーの計算は、第一に、ギャップペナルティーを考慮する最適なアライメントの作成を必要とする。このようなアライメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al.,1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を実行可能な他のソフトウェアの例はBLASTパッケージ（Ausubel et al., 1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）およびGENEWORKS比較ツールパッケージを含むが、これらに限定されない。BLASTおよびFASTAはともにオフラインおよびオンライン検索によって利用可能である（Ausubel et al., 1999 上記, ページ7-58〜7-60）。
【０１８８】
最終％ホモロジーは同一性の観点から測定することができるが、アライメントプロセス自体は典型的に全か無かの対の比較に基づくものではない。その代わりに、尺度化された類似性スコアマトリクスを一般に使用する。このマトリクスでは、化学類似性または進化距離に基づく各対ごとの比較にスコアを割り当てる。一般に用いられるこのようなマトリクスの例は、BLOSUM62マトリクス−BLASTプログラムパッケージ用のデフォルトマトリクス−である。GCG Wisconsinプログラムでは一般に、公共のデフォルト値または、提供に応じてカスタムのシンボル比較テーブルが使用される。GCGパッケージについては公共のデフォルト値、また他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリクス、例えばBLOSUM62を使用するのが好ましい。
【０１８９】
BLASTアルゴリズムはパラメータをデフォルト値に設定して用いるのが有益である。BLASTアルゴリズムの詳細はhttp://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlに記載されている。このサイトは引用により本明細書中に包含される。検索パラメータは以下のように定義されており、これらは規定のデフォルトパラメータに設定するのが有益であり得る。
【０１９０】
有益には、「実質的同一性」は、BLASTによって評価される場合、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは１０またはそれ以上のEXPECT値と一致する配列に等しい。BLAST検索のEXPECTに関するデフォルトの閾値は通常１０である。
【０１９１】
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxが採用する発見的検索アルゴリズムである；これらのプログラムはKarlinおよびAltschulの統計的方法（Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68；Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlを参照のこと）を少し強化して使用した時の知見に意義を帰する。BLASTプログラムは配列類似性検索用に、例えばクエリ配列のホモログを同定するように調整されている。配列データベースの類似性検索における基本的問題点についての議論に関しては、Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129を参照のこと。
【０１９２】
http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能な５つのBLASTプログラムは、以下のタスクを実行する：blastp−アミノ酸クエリ配列をタンパク質配列データベースと比較する；blastn−ヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；blastx−ヌクレオチドクエリ配列（両鎖）の６フレーム概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する；tblastn−タンパク質クエリ配列を、全６リーディングフレーム（両鎖）で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する；tblastx−ヌクレオチドクエリ配列の６フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物と比較する。
【０１９３】
BLASTでは以下の検索パラメータを用いる：
【０１９４】
HISTOGRAM−各検索のスコアに関するヒストグラムを表示する；デフォルトはイエスである（BLASTマニュアルのパラメータＨを参照のこと）。
【０１９５】
DESCRIPTIONS−一致した報告対象の配列に関する短い記載の出力数を特定数に制限する；デフォルト制限値は記載１００である。（マニュアルページのパラメータＶを参照のこと）。
【０１９６】
EXPECT−データベース配列との一致の報告に関する統計的有意さの閾値；デフォルト値は１０であり、KarlinおよびAltschul（1990）の確率論的モデルによれば、一致１０は偶然によってはほとんど見出されないと予想される。ある一致の統計的有意さに関してEXPECT閾値より大きい場合、この一致は報告されない。EXPECT閾値が低いほど、より厳格であり、一致が報告される機会がより少なくなる。分数値も許容される。（BLASTマニュアルのパラメータＥを参照のこと）。
【０１９７】
CUTOFF−高スコアセグメント対の報告に関するカットオフスコア。デフォルト値は EXPECT値から算出される（上記を参照のこと）。データベース配列に関してHSPが報告されるのは、その統計的有意さの高さが、CUTOFF値と等しいスコアを有する単一のHSPに帰するであろう有意さと少なくとも等しい場合のみである。CUTOFF値が高いほど、より厳格であり、一致が報告される機会がより少なくなる。（BLASTマニュアルのパラメータＳを参照のこと）。典型的には、EXPECTを用いると、有意さの閾値をより感覚的に管理できる。
【０１９８】
ALIGNMENTS−高スコアセグメント対（HSP）報告の対象であるデータベース配列を特定数に制限する；デフォルト制限値は５０である。この値より多数のデータベース配列が報告に関する統計的有意さの閾値を満たす場合（本明細書中のEXPECTおよびCUTOFFを参照のこと）、高い統計的有意さを示す一致のみが報告される。（BLASTマニュアルのパラメータＢを参照のこと）。
【０１９９】
MATRIX−BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXのための代替のスコアリングマトリクスを指定する。デフォルトマトリクスはBLOSUM62である（Henikoff & Henikoff, 1992）。有効な代替マトリクスの選択は：PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYを含む。BLASTNについては利用可能な代替のスコアリングマトリクスがない；BLASTNリクエストにMATRIXコマンドを指定すると、エラー応答が帰ってくる。
【０２００】
STRAND−TBLASTN検索をデータベース配列のトップ鎖またはボトム鎖のみに制限する；またはBLASTN、BLASTXまたはTBLASTX検索をクエリ配列のトップ鎖またはボトム鎖上のリーディングフレームのみに制限する。
【０２０１】
FILTER−Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のSEGプログラムによって決定される、組成の複雑さが低いクエリ配列のセグメント、またはClaverie & States (1993) Computers and Chemistry 17:191-201のXNUプログラム、または、BLASTNに関して、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）によって決定される、短周期の内部反復からなるセグメントを隠す。フィルタリングは統計的に有意であるが、生物学的には意味のない報告（例えば、通常の酸性残基-、塩基性残基-またはプロリン-リッチ領域に対するヒット）をblast出力から排除し、データベース配列との特定の一致照合に利用可能な、クエリ配列の生物学的により意味のある領域を残すことができる。
【０２０２】
フィルタプログラムによって見出される対象である複雑さが低い配列は、ヌクレオチド配列中では、文字「N」を用いて置換され（例えば「NNNNNNNNNNNNN」）、タンパク質配列中では、文字「X」を用いて置換される（例えば「XXXXXXXXX」）。
【０２０３】
フィルタリングはクエリ配列（またはその翻訳産物）に適用されるのみであり、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTNに関しては DUSTであり、他のプログラムに関してはSEGである。
【０２０４】
SWISS-PROTにおいて配列に適用された場合、SEG、XNU、または両者によって何も隠されていないのは異常ではなく、つまりフィルタリングは常に効果を生じると予測すべきでないであろう。さらに、配列全体が隠されていることもあり、この場合は、フィルタされていないクエリ配列に対して報告される任意の一致について、その統計的有意さが疑わしいであろうことを示される。
【０２０５】
NCBI-gi−受入名および／または遺伝子座名に加えて、NCBI gi識別子を出力に表示させる。
【０２０６】
配列比較は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで提供されているシンプルBLAST検索アルゴリズムを用いて行うのが最も好ましい。本発明のいくつかの実施態様では、配列同一性の決定時にギャップペナルティーを使用しない。
【０２０７】
細胞
本発明に有用な細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
【０２０８】
本発明に有用な細胞は、本発明の受容体をエンコードする核酸配列が導入可能で、これによりこの受容体が、本明細書中で定義される、天然レベルで、あるいは天然レベル以上に発現される対象となる任意の細胞であり得る。細胞中で発現される本発明の受容体は、好ましくは、本明細書中で定義される、正常の、または正常に近い薬理作用を示す。最も好ましくは、細胞中で発現される本発明の受容体は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列または配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。細胞中で発現される本発明の受容体は、好ましくは、ＨＢＰポリペプチドを結合する。
【０２０９】
本発明の好ましい実施態様では、細胞は、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞または１３２１Ｎ１星細胞腫細胞、または他のトランスフェクション可能なセルラインからなる群から選択される。
【０２１０】
アッセイ
Ｉ．ＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を調節する物質の同定のためのアッセイ
ＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を調節する物質は、新規に発見されたこの受容体とＨＢＰポリペプチドの相互作用を利用する多数の方法によって同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上またはインビボでのＦＰＲＬ２ポリペプチド／ＨＢＰポリペプチドの結合の再構成能は、この結合を分裂させる物質の同定のための標的を提供する。結合の分裂に基づくアッセイでは、物質、例えば有機小分子をそのような分子のライブラリまたはコレクションから同定できる。別法では、このようなアッセイにより、天然起源由来のサンプルまたは抽出物中、例えば、植物、真菌または細菌抽出物中、またはヒト組織サンプル（例えば腫瘍組織）中でさえ、物質を同定できる。一側面では、抽出物は変異型核酸、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリを発現している細胞から作成することができる。その後、ＦＰＲＬ２ポリペプチド／ＨＢＰポリペプチドの結合の調節物質は、結合アッセイまたは、この受容体を介する下流のシグナル伝達を測定する機能アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２１１】
ＦＰＲＬ２ポリペプチド／ＨＢＰポリペプチドの相互作用を利用してＦＰＲＬ２ポリペプチドの機能を調節する物質をさらに直接的に同定する別のアプローチでは、候補物質または候補調節物質によって誘導されるＦＰＲＬ２ポリペプチドの下流のシグナル伝達の変化を測定する。これらの機能アッセイは単離した細胞膜フラクション中またはこの受容体を表面に発現している細胞上で行うことができる。
【０２１２】
ＨＢＰポリペプチドがＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体のリガンドであるという知見により、受容体活性のアゴニスト、アンタゴニストおよび逆アゴニストを同定するスクリーニングアッセイが可能になる。このスクリーニングアッセイは２つの一般的アプローチを有し、これらを以下に詳細に説明する。この段落では、典型的なリガンドとしてＨＢＰポリペプチド（配列番号１８）を用いる。しかし、記載のアッセイにおいて、本明細書中で定義する任意のＨＢＰポリペプチドを使用可能であることが理解されよう。
【０２１３】
１）リガンド結合アッセイ
このアッセイでは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞、このような細胞由来の膜抽出物、またはＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む固定の脂質膜を標識物質および候補化合物に曝露する。インキュベーション後、反応混合物において、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体に対する標識物質の特異的結合を測定する。標識物質の結合を妨げるか、あるいは標識物質を置換する化合物は、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストであり得る。以後の機能解析はポジティブ化合物に対して行い、この化合物がこれらのいずれのカテゴリーに属するかを決定することができる。
【０２１４】
２）機能アッセイ
このアッセイでは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する。
【０２１５】
ａ）アゴニストのスクリーニングでは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞またはこの細胞から調製した膜を候補化合物とインキュベートし、そしてＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する。受容体活性を調節する化合物によって誘導される活性を、天然リガンドであるＨＢＰポリペプチドによって誘導される活性と比較する。アゴニストまたは部分アゴニストは、１ｍＭまたはそれ以下のアゴニストまたは部分アゴニストが存在する場合に、ＨＢＰポリペプチドの最大活性の少なくとも１０％に相当する最大の生物学的活性を有する。このアゴニストまたは部分アゴニストはＨＢＰポリペプチドと少なくとも等しい効力を有するのが好ましい。
【０２１６】
ｂ）アンタゴニストまたは逆アゴニストのスクリーニングでは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞またはこの細胞から単離した膜を、ＨＢＰポリペプチドの存在下で、候補化合物の存在または不存在下でのシグナル伝達活性のためにアッセイする。アンタゴニストは、ＨＢＰポリペプチドが刺激する受容体活性のレベルを、ＨＢＰポリペプチド存在下のこのアンタゴニストを欠く反応と比較して少なくとも１０％減少させる。逆アゴニストは、この受容体の構成的活性を、この逆アゴニストを欠く反応と比較して少なくとも１０％減少させる。
【０２１７】
ｃ）逆アゴニストのスクリーニングでは、構成的にＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を発現している細胞またはこの細胞から単離した膜を、この受容体の活性を候補化合物の存在下で測定する機能アッセイにおいて使用する。逆アゴニストは、この受容体の構成的活性を少なくとも１０％減少させる化合物である。ＦＰＲＬ２ポリペプチドの過剰発現により、構成的な活性化を生じさせて構わない。ＦＰＲＬ２ポリペプチドは強力な構成的プロモーター、例えばＣＭＶ早期プロモーターの制御下に配置することによって過剰発現させることができる。別法では、ＧＰＣＲ保存アミノ酸またはアミノ酸ドメインの特定変異により構成的活性を生じさせる。例えば以下の刊行物を参照のこと：Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:1430；McWhinney et al., 2000. J. Biol. Chem. 275:2087；Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:16483；Samama et al., 1993, J.Biol.Chem 268:4625；Parma et al., 1993, Nature 365:649；Parma et al., 1998, J. Pharmacol. Exp.Ther. 286:85；およびParent et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:7949。
【０２１８】
リガンド結合および置換アッセイ：
上記（１）に記載されるように、ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドの結合を阻害する化合物をスクリーニングするために、細胞上で発現されているＦＰＲＬ２ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離した膜を、ＨＢＰポリペプチドとともに用いることが出来る。この段落では、典型的なリガンドとしてＨＢＰポリペプチド（配列番号１８）を用いる。しかし、記載のアッセイにおいて、本明細書中で定義する任意のＨＢＰポリペプチドを使用可能であることが理解されよう。
【０２１９】
置換実験では、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞（通常２５，０００細胞／アッセイ、または膜抽出物１〜１００μｇ）を、結合バッファー中、増加濃度の候補調節物質の存在または不存在下で、標識ＨＢＰポリペプチドとインキュベートする。アッセイを検証および較正するために、未標識ＨＢＰポリペプチドの増加濃度を用いるコントロール競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞を十分に洗浄し、既定の標識に応じて適切に（例えばシンチレーション計数、蛍光、等により）結合した標識ＨＢＰポリペプチドを測定する。候補調節物質の存在下で、結合した標識ＨＢＰポリペプチドの量が少なくとも１０％減少すれば、候補調節物質によって結合が置換されたことを示すことになる。このアッセイまたは本明細書中に記載の他のアッセイにおいて、候補調節物質が特異的に結合するとみなされるのは、この物質が１ｍMまたはそれ以下の濃度で標識ＨＢＰポリペプチド（飽和以下のＨＢＰポリペプチド用量）の５０％を置換する場合である。
【０２２０】
別法では、結合または結合の置換は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニターすることができる。表面プラスモン共鳴アッセイは、固定センサーに近接する質量の変化によって２分子間の結合を測定する定量的方法として用いることができ、この質量の変化は、水相由来のＨＢＰポリペプチドとセンサー上の膜中に固定されたＦＰＲＬ２ポリペプチドの結合または結合の喪失によって生じる。この質量の変化は、ＨＢＰポリペプチドまたは候補調節物質の注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定し、Biacore Biosensor（Biacore AB）を用いて測定する。ＦＰＲＬ２ポリペプチドは、Salamonらによって示される方法にしたがって、薄膜の脂質膜中のセンサーチップ（例えば、研究等級のCM5チップ； Biacore AB）上に固定することができる（Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294；Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567；Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219；これらの各刊行物は引用により本明細書中に包含される）。Sarrioらは、ＳＰＲを用いて、チップ上の脂質層に固定されているＧＰＣＲ Ａ(１) アデノシン受容体に対するリガンドの結合を検出できることを示した（Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174；この刊行物は引用により本明細書中に包含される）。ＳＰＲアッセイにおいてＨＢＰポリペプチドがＦＰＲＬ２ポリペプチドと結合する条件は、当業者がSarrioらによって報告されている条件を出発点として用いて微調整することができる。
【０２２１】
ＳＰＲでは、少なくとも２つの方法で、結合の調節物質に関してアッセイすることができる。第一に、ＨＢＰポリペプチドを、固定されたＦＰＲＬ２ポリペプチドポリペプチドにあらかじめ結合させることができ、次いで、０．１ｎM〜１μＭの範囲の濃度の候補調節物質を注入する。結合ＨＰＢポリペプチドの置換は定量可能であり、これにより調節物質の結合を検出することが可能になる。別法では、膜結合ＦＰＲＬ２ポリペプチドを、候補調節物質とプレインキュベートすることができ、これに対してＨＢＰポリペプチドでチャレンジさせる。調節物質にあらかじめ曝露されていないチップ上のＦＰＲＬ２ポリペプチドと比較して、調節物質に曝露されたＦＰＲＬ２ポリペプチドに対するＨＢＰポリペプチドの結合に差異があれば、調節物質の存在下でのＨＢＰポリペプチドの結合または置換が示される。いずれのアッセイでも、候補調節物質存在下の結合ＨＢＰポリペプチドの量が、候補調節物質不存在下の結合ＨＢＰポリペプチドの量と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチドの相互作用を阻害することを示すことになる。
【０２２２】
ＨＢＰポリペプチドとＦＰＲＬ２ポリペプチドの結合の阻害を検出する別の方法では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用する。ＦＲＥＴは、互いに近接している（通常、＜１００Ａの分離）蛍光ドナー（Ｄ）および蛍光アクセプター（Ａ）間で、Ｄの発光スペクトルがＡの励起スペクトルと重複する場合に生じる量子力学的現象である。試験対象分子、例えばＨＢＰポリペプチドおよびＦＰＲＬ２ポリペプチドは、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの相補対で標識する。ＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用によってともに近接して結合すると、ドナーフルオロフォアの励起により発光する蛍光は、ＨＢＰポリペプチドおよびＦＰＲＬ２ポリペプチドが結合していない場合の励起波長に応答して発光する蛍光と異なる波長を有し、したがって各波長の発光強度を測定することにより結合分子対未結合分子が定量できる。ＦＰＲＬ２ポリペプチドを標識するためのドナーフルオロフォアは当技術分野で周知である。特に興味深いのは、Cyan FP（ＣＦＰ、ドナー（Ｄ））およびYellow FP（ＹＦＰ、アクセプター（Ａ））として既知のA.victoria ＧＦＰの変異体である。例として、ＦＰＲＬ２ポリペプチドとの融合タンパク質としてＹＦＰ変異体を作成できる。融合物としてのＧＦＰ変異体を発現するためのベクター（Clontech）ならびにフルオロフォア標識されたＨＢＰポリペプチド化合物（Molecular Probes）は当技術分野で既知である。標識ＨＢＰポリペプチドおよびＹＦＰ−ＦＰＲＬ２タンパク質の混合物に候補調節物質を加えると、例えば、候補調節物質を含まないサンプルと比較してＹＦＰ蛍光が減少し、エネルギー転移の阻害が生じたことが証明される。ＦＲＥＴを用いてＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用を検出するアッセイでは、候補調節物質含有サンプル中のアクセプター波長での蛍光発光強度が、候補調節物質を含まないサンプルと比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用を阻害することを示すことになる。
【０２２３】
ＦＲＥＴのバリエーションでは、蛍光消光を用いて分子の相互作用をモニターする。相互作用ペアの一方の分子をフルオロフォアで標識し、他方を、このフルオロフォアと近接して付着するとその蛍光を消光する分子で標識することができる。励起時の蛍光変化は、フルオロフォア：消光剤ペアで標識された分子の結合の変化を示す。一般に、標識ＦＰＲＬ２ポリペプチドの蛍光が増大すれば、消光剤を保持するＨＢＰポリペプチド分子が置換されていることを示す。消光アッセイでは、候補調節物質含有サンプル中の蛍光発光強度が、候補調節物質を含まないサンプルと比較して１０％またはそれ以上増大すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用を阻害することを示すことになる。
【０２２４】
表面プラスモン共鳴およびＦＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定が結合の定量に有用である。蛍光標識された分子に関する蛍光偏光値は回転相関時間または反転速度に依存する。複合体、例えば蛍光標識ＨＢＰポリペプチドと結合したＦＰＲＬ２ポリペプチドによって形成される複合体は、複合体形成していない標識ＨＢＰポリペプチドより高い偏光値を有する。ＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用の候補インヒビターを含む事例で、候補インヒビターを含まない混合物と比較して蛍光偏光が減少するのは、この候補インヒビターがＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの相互作用を分裂させるか、あるいは阻害する場合である。蛍光偏光は、受容体：リガンド複合体の形成を分裂させる小分子の同定に非常に適している。候補調節物質含有サンプル中の蛍光偏光が、候補調節物質を欠くサンプル中の蛍光偏光と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用を阻害することを示すことになる。
【０２２５】
ＦＰＲＬ２ポリペプチド：ＨＢＰポリペプチド相互作用をモニターする別の代替法では、バイオセンサーアッセイを使用する。ＩＣＳバイオセンサーは当技術分野の刊行物に記載されている（Australian Membrane Biotechnology Research Institute；www.ambri.com.au/；Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, and Pace R.「イオンチャネルスイッチを用いるバイオセンサー（A biosensor that uses ion-channel switches）」Nature 1997, 387, 580）。この技術では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびそのリガンドの結合を、懸濁膜二重層中のグラマシジン（gramacidin）促進型イオンチャネルの閉鎖と共役させ、すなわちバイオセンサーのアドミッタンス（インピーダンス（impedence）と類似）の測定可能な変化と共役させる。このアプローチは６桁の振幅のアドミッタンス変化にわたって線形であり、小分子の組み合わせライブラリの大規模な高処理量スクリーニングに理想的に適している。候補調節物質含有サンプル中のアドミッタンスが、候補調節物質を欠くサンプルのアドミッタンスと比較して１０％またはそれ以上変化（増大または減少）すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチドおよびＨＢＰポリペプチドの相互作用を阻害することを示すことになる。ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの相互作用を試験するアッセイでは、相互作用の調節物質が、ＨＢＰポリペプチドと物理的に相互作用しているタンパク質のドメイン（群）と必ずしも直接相互作用しないかもしれない点に留意することが重要である。また調節物質は、相互作用部位から離れた位置で相互作用し、そして、例えば、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのコンフォメーション変化を生じさせることがあり得る。いずれにせよ、この様式で作用する調節物質（インヒビターまたはアゴニスト）はＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を調節する物質として興味深い。
【０２２６】
本明細書中に記載の任意の結合アッセイを、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの非ＨＢＰポリペプチドリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、等）を用いて実行可能であることが理解されよう。このリガンドは、例えば、本明細書中に記載のように同定される小分子またはＨＢＰポリペプチドアナログ、例えば非限定的に、任意のＨＢＰポリペプチドアナログ、天然または合成ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合性断片、脂質、炭水化物、および有機小分子を含むが、これらに限定されない。
【０２２７】
本明細書中に記載の任意の結合アッセイを用いて、サンプル、例えば組織サンプル中の、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体分子と結合する物質、またはＨＢＰポリペプチドとこの受容体との結合に影響する物質の存在を決定することができる。この場合、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを、サンプルの存在または不存在下でＨＢＰポリペプチドまたは別のリガンドと反応させ、そしてＨＢＰポリペプチドまたはリガンドの結合を、使用される結合アッセイに応じて適切に測定する。ＨＢＰポリペプチドまたは他のリガンドの結合が１０％またはそれ以上減少すれば、このサンプルが、受容体ポリペプチドに対するＨＢＰポリペプチドまたはリガンドとの結合を調節する物質を含有することを示すことになる。
【０２２８】
受容体活性の機能アッセイ
ｉ．ＧＴＰアーゼ／ＧＴＰ結合アッセイ：
ＧＰＣＲ、例えばＦＰＲＬ２ポリペプチドに関して、受容体活性の基準は受容体含有細胞膜によるＧＴＰの結合である。引用により本明細書中に包含されるTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854に記載の方法では、標識ＧＴＰの結合を検出することによって、膜と共役したＧタンパク質を本質的に測定する。ＧＴＰ結合アッセイでは、この受容体を発現する細胞から単離した膜を、以下の物質を含有するバッファー中でインキュベートする：20 mM HEPES、pH 7.4、100 mM NaCl、および10 mM MgCl2、80 pM 35S-GTPγSおよび3μM GDP。このアッセイ混合物を30℃で60分間インキュベートし、その後、未結合の標識ＧＴＰをGF/Bフィルタでろ過して除去する。結合した標識ＧＴＰを液体または固体（ＳＰＡ、以下を参照のこと）シンチレーション計数によって測定する。ＨＢＰポリペプチド誘導性ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節をアッセイするために、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞から調製した膜をＨＢＰポリペプチドと混合し、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の候補調節物質の存在および不存在下でＧＴＰ結合アッセイを行う。候補調節物質を含有するこの種のアッセイにおいて、シンチレーション計数によって測定される標識ＧＴＰの結合が、この調節物質を含まないアッセイと比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節物質がＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を阻害することを示すことになる。ＨＢＰポリペプチドを用いずに同様のＧＴＰ結合アッセイを行い、アゴニストとして作用する化合物を同定することができる。この場合、ＨＢＰポリペプチド刺激型ＧＴＰ結合を標準として用いる。化合物がアゴニストとしてみなされるのは、この化合物が１μＭまたはそれ以下で存在する場合に、ＨＢＰポリペプチドによって誘導されるＧＴＰ結合レベルの少なくとも５０、４０、３０、または好ましくは２０％を誘導する場合であり、ＨＢＰポリペプチドによって誘導されるレベルと等しいか、あるいはより高いレベルを誘導するのが好ましい。
【０２２９】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）はホモジニアス（均一）スクリーニング技術であり、この技術は、適切な共役法を介して受容体を直接ＳＰＡビーズに固定することにより受容体結合アッセイに適用される。固定化後、受容体はビーズと十分に近接し、よって、適切に放射性標識されたリガンドがこの受容体と結合すれば、これはビーズを刺激して発光させるのに十分に近接して位置する。すべての未結合放射性リガンドはビーズから離れていて、エネルギーを転移できず、よって検出されない。したがってこのビーズは、受容体に結合しているリガンド分子集団のみを検出する。近接による結合の識別は、従来の方法のように結合リガンドと遊離のリガンドを分離することを必要としない。この方法は一般に、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］、［３５Ｓ］リガンドに適用可能である。抗体およびビオチン化を含むアプローチを可溶性受容体に関して使用することができる。
【０２３０】
ＧＴＰアーゼ活性は、ＦＰＲＬ２ポリペプチド含有膜をγ３２Ｐ−ＧＴＰとインキュベートすることによって測定する。活性なＧＴＰアーゼはこの標識を無機リン酸塩として放出し、これを検出する。この検出は、２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中の５％活性炭懸濁液中において遊離の無機リン酸塩を分離し、その後シンチレーション計数することによって行う。コントロールは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト）細胞から単離した膜を用いるアッセイを含む。その目的は、候補化合物の非特異的作用の可能性を排除することである。
【０２３１】
ＦＰＲＬ２ポリペプチド調節性ＧＴＰアーゼ活性に対する候補調節物質の作用をアッセイするために、この調節物質の存在および不存在下で膜サンプルをＨＢＰポリペプチドとインキュベートし、その後ＧＴＰアーゼアッセイを行う。ＧＴＰ結合またはＧＴＰアーゼ活性のレベルが、調節物質を含まないサンプルと比較して１０％またはそれ以上変化（増大または減少）すれば、ＦＰＲＬ２ポリペプチドが候補調節物質によって調節されることを示すことになる。
【０２３２】
ｉｉ．下流経路活性化アッセイ：
ａ．カルシウム流動−エクオリンに基づくアッセイ．
エクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアアポエクオリンの反応性を利用するものである（Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126；Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508；これらの両刊行物は引用により本明細書中に包含される）。簡単には、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現クローンをトランスフェクトして、ミトコンドリアアポエクオリンおよびＧα１６を同時発現させる。細胞を５μＭセレンテラジンＨ（Coelenterazine H）（Molecular Probes）と室温で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で洗浄し、濃度０．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。次いで細胞を試験アゴニスト分子と混合し、エクオリンによる発光を照度計で３０秒間記録する。結果は相対光単位（Relative Light Units（ＲＬＵ））として記載する。コントロールは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト）細胞から単離した膜を用いるアッセイを含む。その目的は候補化合物の非特異的作用の可能性を排除することである。
【０２３３】
エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルが「変化する」のは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現し、かつ候補調節物質で処理された細胞のサンプル中の光強度が、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現しているが、候補調節物質で処理されていない細胞のサンプルまたはＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト細胞）が、候補調節物質で処理された細胞のサンプルと比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０２３４】
ＨＢＰポリペプチドの不存在下で実施する場合いは、このアッセイをＦＰＲＬ２ポリペプチド活性のアゴニストを同定するために使用することが出来る。このアッセイをＨＢＰポリペプチドの存在下で実施する場合には、アンタゴニストのためにアッセイするためにこのアッセイを使用することが出来る。
【０２３５】
ｂ．アデニル酸シクラーゼ活性：
アデニル酸シクラーゼ活性に関するアッセイは、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591に記載され、これは引用により本明細書中に包含される。このアッセイは、引用により本明細書中に包含されるSolomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548に教示されているアッセイの修飾法である。簡単には、１００μＬ反応物は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭクレアチンリン酸（２ナトリウム塩）、１０単位（タンパク質７１μｇ）のクレアチンホスホキナーゼ、１ｍＭ α−３２Ｐ−ＡＴＰ（４ナトリウム塩、２μＣｉ）、０．５ｍＭサイクリックＡＭＰ、Ｇ−３Ｈ−標識サイクリックＡＭＰ（約１０，０００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％エタノール、および試験対象のタンパク質ホモジネート（すなわち、候補調節物質の存在または不存在下で、ＨＢＰポリペプチドで処理されているか、または処理されていない、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現しているか、または発現していない細胞由来のホモジネート）５０−２００μｇを含有する。反応混合物は一般に、３７℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、冷６％トリクロロ酢酸０．９ｍＬを加えて反応混合物から除タンパクする。試験管を１８００ｘｇで２０分間遠心分離し、各上澄液をDowex AG50W-X4カラムに加える。０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４ｍＬを用いてカラム由来のｃＡＭＰフラクションを計数用バイアル中へ溶出する。アッセイは望ましくは３回実施すべきであろう。またコントロール反応は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて実施されよう。
【０２３６】
本発明において、アデニル酸シクラーゼ活性が「変化する」のは、この活性が、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の候補調節物質で処理された細胞由来のサンプル中で、候補調節物質で処理されていない細胞の同様のサンプルまたはＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト細胞）が、候補調節物質で処理された細胞のサンプルと比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０２３７】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）またはｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定する。この測定は、当技術分野で公知の方法にしたがう。例えば、引用により本明細書中に包含されるHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105）はｃＡＭＰ用のＲＩＡを記載している。
【０２３８】
ｃＡＭＰ測定用の多数のキットが市販されている。例えば、LJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsにより市販されている高効率の蛍光偏光に基づくホモジニアスアッセイ（High Efficiency Fluorescence Polarization-based homogeneous assay）がある。コントロール反応は偽トランスフェクト細胞の抽出物を用いて行い、これにより候補調節物質の非特異的作用の可能性が排除されよう。
【０２３９】
ｃＡＭＰのレベルが「変化する」のは、上記Horton & Baxendale, 1995のＲＩＡに基づくアッセイを用いて、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現し、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の候補調節物質で処理された細胞（またはそのような細胞の抽出物）中で検出されるｃＡＭＰのレベルが、候補調節物質で処理されていない同様の細胞中のｃＡＭＰレベルと比較して少なくとも１０％増大または減少した場合である。
【０２４０】
ｄ．リン脂質分解、ＤＡＧ生産およびイノシトール三リン酸レベル：
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、およびその結果の二次メッセンジャーＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）生産をモニターすることによって、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの既知または推定の調節物質の活性を原因とする変化に関してモニターすることができる。これらについての各検出方法は、Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998編集のPhospholipid Signalling Protocolsに記載されている。この刊行物は引用により本明細書中に包含される。また引用により本明細書中に包含されるRudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831を参照のこと。この刊行物はホスファチジルイノシトール分解に関するアッセイを記載している。そのアッセイは候補調節物質の存在または不存在下で、ＨＢＰポリペプチドで処理されたか、または処理されていないＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞または細胞抽出物を用いて実施すべきです。候補調節物質の可能な非特異的作用を排除するために、コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはそれからの抽出物を用いて行う。
【０２４１】
本発明において、ホスファチジルイノシトール分解およびジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸レベルが「変化する」のは、これらのレベルが、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現する、候補調節物質で処理された細胞由来のサンプル中で、候補調節物質で処理されていないＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞由来のサンプル中で観察されるレベルと比較して、少なくとも１０％増大または減少した場合である。
【０２４２】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
成長因子受容体チロシンキナーゼはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化が関与する経路を介してシグナルを伝達することができる。このＰＫＣはリン脂質−およびカルシウム−活性化型プロテインキナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化は、最終的に、一連のプロトオンコジーン転写因子をコードする遺伝子、例えばｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎ、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、例えばＩ型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、および接着分子、例えば細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭＩ）の転写を生じさせる。アッセイは、ＰＫＣによって誘導される遺伝子産物の増加を検出するように設計し、このアッセイを使用して、ＰＫＣ活性化、すなわち受容体の活性をモニターすることができる。さらに、ＰＫＣを介してシグナルを伝達する受容体の活性は、レポーター遺伝子コンストラクトを使用してモニターすることができ、このコンストラクトは、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の調節配列によって駆動されるものである。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイについては、以下でより詳細に考察する。
【０２４３】
さらに直接的なＰＫＣ活性の測定では、引用により本明細書中に包含されるKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341の方法を用いることができる。このアッセイではＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定する。その後このリン酸化ペプチドをホスホセルロース紙と結合させて分離する。このＰＫＣアッセイ系を用いて、精製キナーゼの活性または粗製の細胞抽出物中の活性を測定することができる。プロテインキナーゼＣサンプルはアッセイの直前に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ ＤＴＴ中に希釈することができる。
【０２４４】
このアッセイの基質はミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（MARCKS）の誘導体ペプチドAc-FKKSFKL-NH2（配列番号１１）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。また、当技術分野で既知の他の塩基性のプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドをそれらのＫｍの少なくともの２−３倍の濃度で用いることができる。このアッセイに必要とされる補因子には、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールが含まれる。ユーザーの目的に応じて、アッセイの実施により、ＰＫＣ存在量（活性化条件）または活性なＰＫＣの存在量（非活性化条件）を測定することができる。本発明のほとんどの目的に関しては、非活性化条件を使用し、したがって、活性化し得るＰＫＣの測定ではなく、単離時のサンプル中で活性型であるＰＫＣを測定する。非活性化条件では、ＥＧＴＡによりカルシウムをアッセイから除去する。
【０２４５】
このアッセイは以下の物質を含有する混合物中で行う：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１−２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰ、〜１μＣｉ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍＬペプチド基質（〜１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜、および１００μＭカルシウム（または５００μＭ ＥＧＴＡ）。サンプル４８μＬを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＤＴＴ中に希釈し、これを最終反応容量８０μＬ中で用いる。反応は３０℃で５−１０分間行い、その後１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の溶液２５μＬを加えて反応を停止させる。
【０２４６】
反応の停止後、各反応物の一部（８５μＬ）をWhatman P81リン酸セルロースフィルタにスポットし、次いで０．４％リン酸５００ｍＬ中で４回洗浄し（５−１０分／洗浄）；９５％ＥｔＯＨ５００ｍＬ中で２−５分間最終洗浄する。シンチレーション計数により結合放射能を測定する。標識ＡＴＰの比活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、反応物のサンプルをP81紙にスポットし、洗浄せずにカウントすることによって測定する。トランスファーされたリン酸エステルまたは塩ｎｍｏｌ／分として定義されるＰＫＣ活性の単位は以下の通り算出する：
【０２４７】
単位（ｎｍｏｌ／分）で示される活性は
＝： （紙上ｃｐｍ）×（トータル１０５μＬ／スポットされた８５μＬ）
（アッセイ時間，分）（ＡＴＰの比活性ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）
【０２４８】
別のアッセイは、PanVera より販売されているプロテインキナーゼＣアッセイキット（Protein Kinase C Assay Kit（Cat. # P2747））を用いて実施することができる。
【０２４９】
アッセイは、候補調節物質の存在または不存在下で、ＨＢＰポリペプチドで処理されたか、または処理されていないＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞由来の抽出物に対して行う。候補調節物質の可能な非特異的作用を排除するために、コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはそれからの抽出物を用いて行う。
【０２５０】
本発明において、候補調節物質によりＰＫＣ活性が「変化する」のは、上記いずれかのアッセイによって測定されるＰＫＣの単位が、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現し、候補調節物質で処理された細胞由来の抽出物中で、候補調節物質で処理されていない細胞由来の同様のサンプルに対して行われた反応と比較して少なくとも１０％増大または減少する場合である。
【０２５１】
ｆ．キナーゼアッセイ：
ＭＡＰキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキットのいずれかを用いてアッセイすることができる。このようなキットは例えば、New England Biolabsにより販売されているp38 MAPキナーゼアッセイキット（Cat # 9820）またはPerkin-Elmer Life Sciencesにより販売されているFlashPlateTM MAPキナーゼアッセイである。
【０２５２】
ＭＡＰキナーゼ活性が「変化する」のは、この活性のレベルが、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現し、候補調節物質で処理された、細胞由来のサンプル中で、候補調節物質で処理されていない同様の細胞由来のサンプル中のＭＡＰキナーゼ活性と比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０２５３】
既知の合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸を用いるチロシンキナーゼ活性の直接アッセイは、他のタイプのキナーゼ（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）のために同様のアッセイとともに周知である。キナーゼアッセイは、候補調節物質の存在または不存在下で、ＦＲＬＰ２ポリペプチド発現する、ＨＢＰポリペプチドで処理されたか、または処理されていない、細胞から調製された精製キナーゼおよび粗製の抽出物の両者を用いて行うことができる。候補調節物質の可能な非特異的作用を排除するために、コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはそれからの抽出物を用いて行う。基質は完全長タンパク質またはこの基質を反映する合成ペプチドであり得る。Pinna & Ruzzene（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225；これは引用により本明細書中に包含される）にはキナーゼ活性の検出に有用な多数のリン酸化基質部位が列挙されている。多数のキナーゼ基質ペプチドが市販されている。特に有用な基質は、「Src関連ペプチド」RRLIEDAEYAARG（配列番号１２；Sigmaより# A7433として入手可能）であり、これは多数の受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。以下に記載のアッセイは、フィルタに対するペプチド基質の結合を必要とするため、このペプチド基質は、望ましくは、結合を促す正味の正電荷を有するべきである。一般に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離のアミノ末端を有するであろう。反応では一般に、０．７−１．５ｍＭのペプチド濃度を採用する。
【０２５４】
アッセイは一般に、以下の物質を含む２５μＬ容量中で行う：５μＬの５Ｘキナーゼバッファー（5ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２；アッセイ対象のキナーゼに的確に応じて、ＭｇＣｌ２の代わりに、あるいはそれに加えて、ＭｎＣｌ２を用いることができる）、５μＬの１．０ｍＭ ＡＴＰ（最終濃度０．２ｍＭ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、３μＬの１０ｍＭペプチド基質（最終濃度１．２ｍＭ）、試験対象のキナーゼを含有する細胞抽出物（キナーゼアッセイに使用する細胞抽出物はホスファターゼインヒビター（例えば、０．１−１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）を含有すべきである）、および２５μＬまでのＨ２Ｏ。反応は３０℃で行い、細胞抽出物を加えることによって開始させる。
【０２５５】
キナーゼ反応は３０秒〜約３０分間行い、その後、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μＬを加える。サンプルを微量遠心機中で２分間回転させ、上澄３５μＬをWhatman P81リン酸セルロースフィルタサークルにスポットする。このフィルタを冷０．５％リン酸５００ｍＬで３回洗浄し、その後、室温で５分間、アセトン２００ｍＬで１回洗浄する。フィルタを乾燥し、取り込まれた３２Ｐをシンチレーション計数によって測定する。キナーゼ反応物中のＡＴＰの（例えば、ｃｐｍ／ｐｍｏｌ単位の）比活性は、反応の小サンプル（２−５μＬ）をP81フィルタサークルにスポットし、洗浄せずに直接カウントすることによって決定する。次いで、このキナーゼ反応で得られたカウント／分（ブランクを除く（minus blank））を比活性で除算し、反応中の転移したリン酸基のモル数を決定する。
【０２５６】
チロシンキナーゼ活性が「変化する」のは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現する、候補調節物質で処理された、細胞由来のサンプル中のキナーゼ活性のレベルが、候補調節物質で処理されていない同様の細胞由来のサンプル中のキナーゼ活性と比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０２５７】
ｇ．下流経路活性化に関する転写レポーター：
受容体、例えばＦＰＲＬ２ポリペプチドに対するアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナル伝達は、細胞内イベントのカスケードを開始させ、最終的に１つまたはそれ以上の遺伝子の転写または翻訳の高速かつ検出可能な変化を生じさせる。したがってこの受容体の活性は、ＦＰＲＬ２活性化を担う調節配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターすることができる。
【０２５８】
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、遺伝子発現の受容体媒介性調節に必要な転写調節エレメントを表し、これには基本的プロモーターだけでなく、受容体によって制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位が含まれる。アゴニスト結合の結果生じる細胞内シグナルに応答するプロモーターを選択し、この選択プロモーターを、転写、翻訳または最終的活性が容易に検出可能で測定可能なレポーター遺伝子と作動可能に連結することによって、転写に基づくレポーターアッセイは、既定の受容体が活性化されているかどうかを迅速に示す指標を提供する。
【０２５９】
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子は、その産物の検出用アッセイとともに当技術分野で周知である。
【０２６０】
受容体活性のモニタリングに特によく適している遺伝子は「即時早期」遺伝子であり、これは通常、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドの接触後数分以内に高速に誘導される。即時早期遺伝子の転写誘導は新たな調節タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合に対する高速な応答性に加えて、レポーターコンストラクトの作成に有用な好ましい遺伝子の性質には以下のものが含まれる：静止状態細胞での、低い発現または検出不能な発現；一時的で、かつ新たなタンパク質合成と無関係な誘導；後の転写遮断が新たなタンパク質合成を必要とすること；およびこれらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡが短い半減期を有すること。転写調節エレメントが有用であるためには、これらのすべての性質を有するのが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。
【０２６１】
多数の諸刺激に応答する遺伝子の例はｃ−ｆｏｓプロトオンコジーンである。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化に特異的な物質、ストレス、および他の既知の細胞表面タンパク質に関する誘導物質によって、タンパク質合成と無関係な様式で活性化される。ｃ−ｆｏｓ発現の誘導は非常に高速で、受容体刺激後数分以内に生じることが多い。この性質により、受容体活性化のレポーターとしての使用にはｃ−ｆｏｓ調節領域は特に魅力的である。
【０２６２】
ｃ−ｆｏｓ調節エレメントには以下のものが含まれる（Verma et al., 1987, Cell 51: 513-514を参照のこと）：転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックス；基本転写用の２つの上流エレメント、およびエンハンサー、これは二回対称性を有するエレメントを含み、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ、およびＰＭＡによる誘導に必要とされる。
【０２６３】
ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡキャップ部位から上流の−３１７〜−２９８ｂｐ間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清飢餓ＮＩＨ ３Ｔ３細胞における血清誘導に必須である。２つの上流エレメントの一方は−６３〜−５７に位置し、これはｃＡＭＰ制御に関するコンセンサス配列に類似する。
【０２６４】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質）は、その名称が示すように、細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがってｃＡＭＰレベルの調節を介してシグナルを伝達する受容体の活性化は、この転写因子の結合を検出するか、あるいはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥ、またはｃＡＭＰ応答エレメントと称される）と連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターすることができる。ＣＲＥのＤＮＡ配列は、TGACGTCAである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーターコンストラクトは米国特許第5,919,649号に記載されている。
【０２６５】
ｃ−ｆｏｓエレメントおよびＣＲＥＢ応答性コンストラクトに加えて、他のプロモーターおよび転写調節エレメントには、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Fink et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6662-6666）；ソマトスタチン遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Montminy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 8.3:6682-6686）；プロエンケファリンプロモーター（ｃＡＭＰ、ニコチン性アゴニスト、およびホルボールエステル応答性；Comb et al., 1986, Nature 323:353-356）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Short et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:9721-9726）が含まれる。
【０２６６】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答する転写調節エレメントの別の例はＡＰ−１転写因子に応答するエレメントおよびＮＦ−κＢ活性に応答するエレメントを含むが、これらに限定されない。コンセンサスＡＰ−１結合部位はパリンドローム：TGA(C/G)TCAである（Lee et al., 1987, Nature 325: 368-372；Lee et al., 1987, Cell 49: 741-752）。このＡＰ−１部位はまた、腫瘍プロモーター、例えばホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−ベータ−アセテート（ＴＰＡ）による誘導の媒介を担い、したがってＴＰＡ応答エレメントとしてＴＲＥと称されることもある。ＡＰ−１は、成長刺激に対する細胞の早期応答に関与する多数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例はＦｏｓおよびＪｕｎ（これらのタンパク質自体がＡＰ−１活性を構成する）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼおよびアネキシンＩおよびＩＩに関する遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０２６７】
ＮＦ−κＢ結合エレメントはコンセンサス配列：GGGGACTTTCC（配列番号１３）を有する。多数の遺伝子がＮＦ−κＢ応答性として同定されており、それらの調節エレメントをレポーター遺伝子に連結して、ＧＰＣＲ活性をモニターすることができる。ＮＦ−κＢ応答性の遺伝子の小サンプルはＩＬ−１β（Hiscott et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 6231-6240）、ＴＮＦ−α（Shakhov et al., 1990, J. Exp. Med. 171: 35-47）、ＣＣＲ５（Liu et al., 1998, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 1509-1519）、Ｐ−セレクチン（P-selection）（Pan & McEver, 1995, J. Biol. Chem. 270: 23077-23083）、Ｆａｓリガンド（Matsui et al., 1998, J. Immunol. 161: 3469-3473）、ＧＭ−ＣＳＦ（Schreck & Baeuerle, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 1281-1286）およびＩκＢα（Haskill et al., 1991, Cell 65: 1281-1289）をエンコードする遺伝子を含む。これらの各参考文献は引用により本明細書中に包含される。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをエンコードするベクターもまた当技術分野で既知であり、あるいは当業者であれば、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いるか、またはＮＦ−κＢ制御の対象であることが既知の遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易に作成することができる。さらにＮＦ−κＢ応答性レポーターコンストラクトは、例えば CLONTECH から市販されている。
【０２６８】
作成したプロモーターコンストラクトは、望ましくは、このコンストラクトでトランスフェクトしたＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞をＨＢＰポリペプチドに曝露して試験すべきであろう。ＨＢＰポリペプチドに応答してレポーター発現が少なくとも２倍増大すれば、このレポーターがＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の指標であることを示すことになる。
【０２６９】
転写レポーターコンストラクトを用いてＦＰＲＬ２ポリペプチド活性をアッセイするため、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを安定に発現する細胞をこのレポーターコンストラクトで安定にトランスフェクトする。アゴニストに関するスクリーニングでは、細胞は未処理のままか、候補調節物質に曝露し、あるいはＨＢＰポリペプチドに曝露し、そしてレポーターの発現を測定する。ＨＢＰポリペプチドで処理された培養は、既知のアゴニストによって誘導される転写レベルの標準となる。候補調節物質の存在下でレポーター発現が少なくとも５０％増大すれば、この候補がＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節物質であることを示すことになる。アゴニストはＨＢＰポリペプチド単独と少なくとも同等、好ましくは同一量またはそれ以上のレポーター発現を誘導する。またこのアプローチを用いて、逆アゴニストに関するスクリーニングを行うことができる。この場合、細胞は、ＨＢＰポリペプチドまたは別のアゴニストの不存在下でレポーターの高い基準活性が存在するようなレベルでＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現している。候補調節物質存在下のレポーター活性が、その不存在下と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この化合物が逆アゴニストであることを示すことになる。
【０２７０】
アンタゴニストのためのスクリーニングするには、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現し、レポーターコンストラクトを保持している細胞を、候補調節物質の存在および不存在下でＨＢＰポリペプチド（または別のアゴニスト）に曝露する。候補調節物質存在下のレポーター発現が、候補調節物質の不存在下と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補がＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節物質であることを示すことになる。
【０２７１】
転写アッセイのためのコントロールは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現していないが、レポーターコンストラクトを保持している細胞、ならびにプロモーターを欠くレポーターコンストラクトを含む細胞を含む。ＦＰＲＬ２ポリペプチドが制御する転写の調節物質として同定する対象の化合物はまた、望ましくは、分析に付して、この化合物が他の制御配列および他の受容体によって駆動される転写に影響するかどうかを決定すべきであろう。その目的は、これらの化合物の活性について、その特異性および範囲を決定することである。
【０２７２】
転写レポーターアッセイ、およびほとんどの細胞に基づくアッセイは、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性を調節する物質に関して、タンパク質の発現ライブラリをスクリーニングするのに非常に適している。ライブラリは、例えば、天然起源、例えば、植物、動物、細菌、等由来のｃＤＮＡライブラリであり得、あるいは１つまたはそれ以上のポリペプチドをランダムにまたは体系的に変異誘発した変異体を発現するライブラリであり得る。またウイルスベクター中のゲノムライブラリを用いて、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのスクリーニングに使用する諸ライブラリ中の１細胞または組織のｍＲＮＡ内容物を発現させることができる。
【０２７３】
ｈ）イノシトールリン酸（ＩＰ）測定
本発明の細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ＦＣＳ、抗生物質、アンホテリシン、ピルビン酸ナトリウムおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有するイノシトールを含まないＤＭＥＭ中、１０μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］イノシトールを用いて２４時間標識する。この細胞を、以下の組成のクレブスリンガーＨｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー中で２時間インキュベートする（１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ：７．４）および８ｍＭグルコース）。次いでこの細胞に、ＨＢＰポリペプチドを３０分間チャレンジさせる。氷冷３％過塩素酸溶液を加えてインキュベーションを停止させる。以前（２５）に記載されている通り、ＩＰをDowexカラムで抽出分離する。
【０２７４】
ＦＰＲＬ２ポリペプチドアッセイ
本発明は、サンプル中の本発明の受容体活性を検出するためのアッセイを提供する。例えばＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現している細胞または細胞膜を含むサンプル中で測定することができる。上記のように、この段落ではＨＢＰポリペプチド（配列番号１８）を例として用いる。本明細書中で定義される任意のＨＢＰポリペプチドをこれらのアッセイにおいて使用可能であることを理解すべきである。このアッセイは、ＨＢＰポリペプチドの存在または不存在下でサンプルをインキュベートし、上記のような二次メッセンジャーアッセイを実施することによって行う。ＨＢＰポリペプチドの存在または不存在下で実施した二次メッセンジャーアッセイの結果を比較し、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体が活性であるかどうかを決定する。ＨＢＰポリペプチドの存在下において、本明細書中で定義される既定の二次メッセンジャーの検出レベルが、ＨＢＰポリペプチドの不存在下で実施したアッセイでの検出量と比較して１０％またはそれ以上増大すれば、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を示すことになる。
【０２７５】
任意の受容体活性のアッセイはＧＴＰ結合、ＧＴＰアーゼ、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出（以下を参照のこと）、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターアッセイを含むが、これらに限定されなく、サンプル、例えば組織サンプル中の、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体分子の活性に影響を与える物質の存在が決定できるように使用することが出来る。この場合、このサンプルまたはサンプルの抽出物の存在および不存在下で、ＦＰＲＬ２ポリペプチドを活性に関してアッセイする。このサンプルまたは抽出物存在下のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性が、このサンプルの不存在下と比較して増大すれば、このサンプルが受容体活性のアゴニストを含有することを示すことになる。ＨＢＰポリペプチドまたは別のアゴニストおよびサンプルの存在下での受容体活性が、ＨＢＰポリペプチドが単独で存在する条件下での受容体活性と比較して減少すれば、このサンプルがＦＰＲＬ２ポリペプチド活性のアンタゴニストを含有することを示すことになる。所望であれば、その後サンプルを分画し、さらに試験して、アゴニストまたはアンタゴニストを単離または精製することができる。サンプルが調節物質を含有することを示すために必要とされる活性測定値の増大または減少の量は、使用するアッセイのタイプに依存する。一般に、サンプルの不存在下で実施したアッセイと比較して１０％またはそれ以上変化（増大または減少）すれば、このサンプル中に調節物質が存在することを示すことになる。例外の１つは転写レポーターアッセイであり、このアッセイにおいて、サンプルが調節物質を含有することを示すためには、シグナルが少なくとも２倍増大するか、または１０％減少することが必要である。アゴニストは、ＨＢＰポリペプチドを単独で用いた場合と比較して、少なくとも５０％、好ましくは７５％または１００％またはそれ以上、例えば２倍、５倍、１０倍またはそれ以上の受容体の活性化を刺激するのが好ましい。
【０２７６】
他の機能アッセイには、例えば微視的生理計測（microphysiometer）またはバイオセンサーアッセイが含まれる（引用により本明細書中に包含されるHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149-158を参照のこと）。またアラキドン酸の細胞内レベルは、Gijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146-20156に記載の通りに測定することができる。
【０２７７】
ＩＩ．ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの相互作用に基づく診断アッセイ：
ＧＰＣＲを介するシグナル伝達は多数の疾患および障害の病理に関与する。リンパ球系列、脾臓、小腸、肺、心臓の細胞中で発現されるＦＰＲＬ２ポリペプチドは、免疫プロセス、癌および関連障害または疾患において役割を担うことが可能である。
【０２７８】
ＦＰＲＬ２ポリペプチドの発現パターンおよび、ＧＰＣＲが一般に媒介する障害に関する知見によれば、ＦＰＲＬ２ポリペプチドは以下の障害に関与し得る：
細胞遊走（cell migration）、癌（cancer）、腫瘍形成および腫瘍転移（development of tumours and tumour metastasis）、炎症性および新生物性過程（inflammatory and neoplastic processes）、傷害および骨治癒（wound and bone healing）および調節成長機能の機能不全（dysfunction of regulatory growth functions）、肥満症（obesity）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、急性心不全（acute heart failure）、低血圧症（hypotension）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、、再狭窄（restenosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）、自己免疫（autoimmune）および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患（diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation）、動脈瘤（aneurysms）、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患（diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation）、ストローク（stroke）、虚血（ischemia）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、前立腺肥大症（prostatic hypertrophy）、片頭痛（migraine）、嘔吐（vomiting）、精神病性および神経障害（psychotic and neurological disorders）、例えば不安（anxiety）、統合失調症（schizophrenia）、躁うつ病（manic depression）、うつ病（depression）、せん妄（delirium）、痴呆（dementia）および重度の精神発達障害（severe mental retardation）を含み、変性疾患（degenerative diseases）、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）、例えばアルツハイマー病（Alzheimer's disease）またはパーキンソン病（Parkinson's disease）、およびジスキネジア（dyskinasias）、例えばハンチントン病（Huntington's disease）またはジルドラトゥレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症（thrombosis）および他の心血管疾患（cardiovascular diseases）を含み、自己免疫（autoimmune）および炎症性疾患（inflammatory diseases）、例えば乾癬（psoriasis）、湿疹（Eczeme）、皮膚の炎症性および栄養性疾患（inflammatory and trophic diseases of skin）、リウマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）、強皮症（scleroderma）、ループス（lupus）、多発性筋炎（polymyositis）、皮膚筋炎（dermatomysitis）、クローン病（Crohn's disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）（ＩＢＤ）、過敏性腸管症候群（Irritable Bowel Syndrome）、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis）、喘息（Asthma）、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease）、アレルギー性鼻炎（Allergic Rhinitis）、線維症（Fibromyalgia）、移植臓器拒絶（Organ Transplant Rejection）、移植片対宿主病（Graft versus host disease）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、急性、虚血性発作（Acute, Ischemic Stroke）、感染症（Infectious diseases）、Ａ型肝炎（Hepatitis A）、Ｂ型肝炎（Hepatitis B）、Ｃ型肝炎（Hepatitis C）、敗血症（Sepsis）、敗血症性ショック（Septic shock）、慢性気管支炎（Chronic bronchitis）、感染（infections）、例えば細菌性（bacterial）、真菌性（fungal）、原虫性（protozoan）およびウイルス性感染（viral infections）、例えばＨＩＶ１およびＨＩＶ２による感染（infections caused by HIV1 and HIV2）、および痛み（pain）、癌（cancer）、摂食障害（anorexia）、過食症（bulimia）、喘息（asthma）、急性心不全（acute heart failure）、高血圧症（hypertension）、尿閉（urinary retention）、骨粗鬆症（osteoporosis）、狭心症（angina pectoris）、心筋梗塞（myocardial infarction）、潰瘍（ulcers）、アレルギー（allergies）、良性前立腺肥大症（benign prostatic hypertrophy）、および１型糖尿病（Type 1 Diabetes）、２型糖尿病（Type 2 Diabetes）、骨関節炎（Osteoarthritis）、糖尿病性網膜症（Diabetic Retinopathy）、糖尿病性腎障害（Diabetic Nephropathy）および受胎能機能不全（fertility dysfunctions）、胎児発育障害（foetal developmental disorders）。
【０２７９】
ＦＰＲＬ２ポリペプチドとＨＢＰポリペプチドの相互作用は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達が関与する疾患、障害またはプロセスの診断またはモニタリングのためのアッセイの基礎として用いることができる。ＦＰＲＬ２ポリペプチド関連疾患または障害に関する診断アッセイは、いくつかの諸形式を有し得る。第一に、診断アッセイでは、組織サンプル中のＦＰＲＬ２ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはリガンドの量を測定することができる。ＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡの量を測定するアッセイもこのカテゴリーに収まる。第二に、アッセイでは、この受容体またはリガンドの性質を評価することができる。例えば、個体が突然変異型または変異型のＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現しているかどうかを決定するアッセイを診断に使用することができる。第三に、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの１つまたはそれ以上の活性を測定するアッセイを診断に使用することができる。
【０２８０】
Ａ．ＦＰＲＬ２ポリペプチドの量を測定するアッセイ
ＦＰＲＬ２ポリペプチドのレベルを測定し、標準と比較することができる。その目的は、サンプル中に異常レベルの受容体またはそのリガンドが存在するかどうかを決定することである。これらの存在はいずれも、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達が調節不全である可能性を示すものである。ポリペプチドのレベルは、例えばこのポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫組織化学によって測定する。ＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性を特徴とする疾患または障害を患っていると疑われる個体から単離したサンプルを、ＦＰＲＬ２ポリペプチドに対する抗体と接触させ、当技術分野で既知の通りに（例えば二次抗体と共役した酵素の活性を測定することにより）抗体結合を測定する。
【０２８１】
ＦＰＲＬ２ポリペプチドのレベルを測定する別のアプローチは罹患組織由来の細胞のフローサイトメトリー分析を採用する。ＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体を蛍光標識することを含むフローサイトメトリーの方法は、当技術分野で周知である。他のアプローチは放射性免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡを含む。これらの各方法もまた当技術分野で周知である。
【０２８２】
検出される結合の量は、健康な個体由来、または罹患個体の罹患していない部位由来の同様組織サンプル中の結合と比較する。標準と比較して１０％またはそれ以上の増大があれば、この結果をＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０２８３】
ＦＰＲＬ２ポリペプチドの発現はまた、組織サンプル中のこのポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡの量を決定することによって測定可能である。ｍＲＮＡのレベルは、定量的または半定量的ＰＣＲによって測定可能である。「定量的」増幅の方法は当業者に周知であり、ＦＰＲＬ２核酸増幅用のプライマー配列は本明細書中に開示されているものである。定量的ＰＣＲの一般的方法は、同一プライマーを用いて、既知量のコントロール配列を同時に増幅することを含む。これは内部標準を提供し、この内部標準を用いて、ＰＣＲ反応を較正することができる。定量的ＰＣＲに関する詳細なプロトコルは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990) に記載されている。この刊行物は引用により本明細書中に包含される。サンプル中のＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡの量が、健康な個体由来の同様組織のサンプル中、または罹患個体の罹患していない位置由来の組織サンプル中で発現される量と比較して１０％またはそれ以上増大すれば、この結果をＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０２８４】
Ｂ．定性的アッセイ
ＦＰＲＬ２ポリペプチドまたはそれをエンコードするｍＲＮＡが野生型であるか否かを評価するアッセイを診断に使用することができる。ＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害をこの様式で診断するため、サンプルから単離したＲＮＡを、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのＰＣＲ増幅用の鋳型として用いる。増幅配列は次いで、標準的方法を用いて直接シークエンシングするか、あるいはまずベクター内にクローニングした後、シークエンシングする。野生型ＦＰＲＬ２ポリペプチドの配列と比較して１つまたはそれ以上のエンコード対象アミノ酸を変化させる配列の差異があれば、この結果をＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用することができる。コードする配列の変化がサンプル中で同定された場合に、この変異型受容体またはリガンドを発現させ、その活性を野生型ＦＰＲＬ２ポリペプチドの活性と比較することは有用であり得る。他の利点の中にはこのアプローチが常時活性型および無発現変異体を含む新規変異体を提供できる。
【０２８５】
標準的なシークエンシング法に加え、例えば、野生型配列と変異型配列を識別する分子ビーコンのハイブリダイゼーションを用いて、増幅配列を特定変異の存在のためにアッセイすることができる。１ヌクレオチド単位の変化に基づいて識別するハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で周知である。別法では、任意の回数の「ミニシークエンシング（minisequencing）」アッセイを実施することができる。このアッセイには、例えば、米国特許第5,888,819号、第6,004,744号および第6,013,431号（これらは引用により本明細書中に包含される）に記載のアッセイが含まれる。これらのアッセイおよび当技術分野で既知の他のアッセイは既定のサンプル中で、既知の多型性を有する核酸の存在を決定することができる。
【０２８６】
所望であれば、アレイまたはマイクロアレイに基づく方法をＦＰＲＬ２ポリペプチドの発現またはその配列中の変異の存在を解析するために使用することができる。ミニシークエンシングおよび核酸発現の定量のためのアレイに基づく方法は当技術分野で周知である。
【０２８７】
Ｃ．機能アッセイ．
ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断はまた、機能アッセイを用いて行うことができる。この場合、組織サンプルから調製した細胞膜または細胞抽出物を本明細書中に記載のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性のアッセイ中に使用する（このようなアッセイは例えば、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ結合アッセイ、ＧＴＰアーゼアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロールまたはイノシトール三リン酸アッセイ、ＰＫＣ活性化アッセイ、またはキナーゼアッセイである）。検出した活性は、健康な個体または罹患した個体の罹患していない部位から採取した標準サンプル中の活性と比較する。別法として、サンプルまたはサンプルの抽出物をＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞に適用し、その後ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を標準サンプルと比較して測定することができる。これらの任意のアッセイ中で測定される活性に関し、標準の活性と比較して１０％またはそれ以上の差異があれば、この結果をＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
【０２８８】
本発明による細胞中のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節
ＦＰＲＬ２ポリペプチドのリガンドであるＨＢＰポリペプチドの発見が細胞中のＦＰＲＬ２ポリペプチドポリペプチドの活性を調節する方法を提供する。細胞中のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性は、この細胞に対してＦＰＲＬ２ポリペプチドポリペプチドの機能を調節する物質をデリバリーすることによって調節する。この調節は、別の調節物質を同定するためのアッセイの部分として培養細胞中で、または、例えば、ヒトを含む動物中で実施することができる。その物質はＨＢＰポリペプチドおよび本明細書中で定義される他のリガンドならびに、本明細書中に記載のスクリーニング法を用いて同定される別の調節物質を含み、例えば、任意のＨＢＰポリペプチドアナログを含むが、これには限定されない。
【０２８９】
その物質は、培地に加えることによって細胞にデリバリーすることができる。デリバリーする量は、物質のアイデンティティーに応じて、およびデリバリーの目的に応じて変化する。例えば、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性のアンタゴニストを同定する培養アッセイでは、この受容体を最大半減的に活性化する（例えば、およそＥＣ５０に相当する）、例えば、ＨＢＰポリペプチドを加える。ただし好ましくは受容体の飽和に要する用量を越えない量である。ＨＢＰポリペプチドの更なる添加がＦＰＲＬ２ポリペプチド活性に追加の効果を持たないポイントを決定するために、この用量はＨＢＰポリペプチドの量を滴定によって求めることが出来る。
【０２９０】
ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節物質を疾患または障害の処置のために動物に投与する場合、当業者は所望の効果に基づいて投与量を調節することができる。処置の成功は、病理の１つまたはそれ以上の測定可能な症状（例えば、腫瘍細胞増殖、炎症性細胞の蓄積）が、処置前のその症状の値と比較して少なくとも１０％変化した場合に得られる。
【０２９１】
本発明において有用な候補調節物質
本発明は、本発明の受容体の調節物質である化合物を提供する。
【０２９２】
候補調節物質は、ＨＢＰポリペプチド（配列番号１８）、本明細書中で上に定義するＨＢＰポリペプチド、本明細書中で上に定義するリガンドまたは本発明によって同定される物質であるのが好ましい。
【０２９３】
候補化合物は、合成化合物、または化合物の混合物であり得て、あるいは天然産物（例えば植物抽出物または培養上澄）であってよい。本発明における候補化合物は合成可能な小分子、天然抽出物、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、抗体またはその抗原結合性断片、核酸、および有機小分子を含むが、これらに限定されない。
【０２９４】
候補調節化合物は、合成または天然化合物の大量ライブラリからスクリーニングすることができる。現在、糖類、ペプチド、および核酸に基づく化合物のランダム合成および指定の合成に関して、多数の方法が使用されている。合成化合物ライブラリは多数の企業から市販されており、このような企業には、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, NJ）、Brandon Associates（Merrimack, NH）、およびMicrosource（New Milford, CT）がある。希少な化学物質ライブラリはAldrich（Milwaukee, WI）から入手可能である。組み合わせライブラリは入手可能であり、また、調製可能である。また、細菌、真菌、植物および動物抽出物形態の天然化合物ライブラリは、例えば、Pan Laboratories（Bothell, WA）またはMycoSearch（NC）から入手可能であり、あるいは当技術分野で周知の方法によって容易に作成可能である。さらに、天然の、および合成的に作成されたライブラリおよび化合物は、通常の化学、物理、および生化学的方法を用いて容易に修飾することができる。
【０２９５】
有用な化合物は多数の化学物質の分類内で見出してもよい。有用な化合物は、有機化合物、または小さい有機化合物であってよい。小さい有機化合物は、５０ダルトンより大きいが、約２，５００ダルトンより小さい、好ましくは約７５０ダルトンより小さい、より好ましくは約３５０ダルトンより小さい分子量を有する。典型的な分類には、複素環類、ペプチド類、糖類、ステロイド類等が含まれる。この化合物は有効性、安定性、医薬品適合性等を強化するために修飾してもよい。その物質の構造上の同定を別の物質を同定、作成、またはスクリーニングのために使用してもよい。例えば、ペプチド物質が同定された場合、安定性を強化するために多数の方法で修飾してもよい。例えば、非天然のアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、特にＤ−アラニンを用いる修飾、アミノまたはカルボキシル末端を官能化、例えばアミノ基にはアシル化またはアルキル化、およびカルボキシル基にはエステル化またはアミディフィケーション（amidification）することによる修飾等である。
【０２９６】
一次スクリーニングでは、本発明の候補化合物の有用な濃度は約１０ｎＭ〜約１００μＭまたはそれ以上（すなわち１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、または１Ｍでさえある）であるが、１ｎＭおよびそれ以上、１ｐＭおよびそれ以上、または１ｆＭおよびそれ以上でもあり得る。一次スクリーニング濃度を上限として使用し、これに伴って９つの追加濃度を使用する。この場合、追加濃度は、二次スクリーニング用に、あるいは濃度曲線の作成用に、一次スクリーニング濃度を（例えば９つの追加濃度用に）半対数間隔で減少させて決定する。
【０２９７】
本発明において有用な抗体
本発明はＦＰＲＬ２ポリペプチドに対する抗体を提供する。抗体は当技術分野で既知の標準的プロトコルを用いて作成することができる（例えばAntibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照のこと）。哺乳類、例えばマウス、ハムスター、またはウサギを、このペプチドの免疫原型（例えば、ＦＰＲＬ２ポリペプチドまたは抗体応答の誘発能を有する抗原性断片、または本明細書中上記の融合タンパク質）で免疫することができる。抗体作成用の免疫原は、このポリペプチド（例えば、単離した組換えポリペプチドまたは合成ペプチド）をアジュバントと混合することによって調製する。別法では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドまたはペプチドを、より大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質として作成する。ポリペプチドはまた、他のより大きな免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと共有結合により連結可能である。別法では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドまたはこれらのタンパク質の断片をエンコードするプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、動物中でこのポリペプチドを発現させ、そして免疫応答を引き起こすことができる。これは引用により本明細書中に包含されるCostagliola et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:803-811に記載される通りである。抗体を作成する目的では、免疫原は典型的に、実験動物、例えばウサギ、ヒツジ、およびマウスに対して皮内、皮下、または筋肉内投与する。上記で考察した抗体に加えて、遺伝子改変された抗体誘導体、例えば単鎖抗体を作成することができる。
【０２９８】
免疫の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによってモニターすることができる。また、標準的ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーまたは他の免疫アッセイを用い、免疫原を抗原として、抗体のレベルを評価することができる。抗体調製物は単に免疫化動物由来の血清であり得、あるいは所望であれば、例えば、固定された免疫原を用いるアフィニティークロマトグラフィによってこの血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【０２９９】
モノクローナル抗体を生産するためには、免疫化動物から抗体産生脾細胞を採取し、そして標準的な体細胞融合手順により不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作成することができる。このような技術は当技術分野で周知であり、これには例えば、ハイブリドーマ技術（これはKohlerおよびMilsteinによって最初に開発された技術である；Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., (1985)「モノクローナル抗体および癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生のために免疫化学的にスクリーニングすることができ、そしてこのようなハイブリドーマ細胞を含む培地からモノクローナル抗体を単離することができる。
【０３００】
さらにまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化（primatized）抗体または単鎖抗体の断片を含む、抗体の機能性断片を作成することができる。前述の抗体の機能性断片は、その派生元の完全長抗体の、少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。好ましい機能性断片は、対応する完全長抗体の抗原結合機能を保持する（例えば、ヒトＦＰＲＬ２を結合する能力を保持する）。特に好ましい機能性断片は、ＦＰＲＬ２に特徴的な１つまたはそれ以上の機能、例えば結合活性、シグナル伝達活性、および／または細胞応答の促進を阻害または活性化する能力を保持する。例えば、一実施態様では、機能性断片はＦＰＲＬ２と１つまたはそれ以上のそのリガンドの相互作用を阻害または活性化することができるおよび／または１つまたはそれ以上の受容体媒介性の機能を阻害または活性化することができる。
【０３０１】
例えば、ヒトＦＰＲＬ２受容体またはその部分との結合能を有する抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２断片を含むが、これらに限定されなく、本発明に包含される。このような断片は、例えば酵素分解または組換え技術によって作成することができる。例えば、パパインまたはペプシン分解により、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を作成することができる。また、多数の切断型の抗体を作成することができる。この作成には、天然の終止コドンの上流に１つまたはそれ以上の終止コドン（codon）が導入されている抗体遺伝子を用いる。例えば、Ｆ（ａｂ'）２重鎖部分をエンコードするキメラ遺伝子は、この重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をエンコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
【０３０２】
スクリーニング法によって得られる抗体（例えばＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１、ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０）の配列は、（他の哺乳類種または特定群のヒト集団に存在する可能性がある）相同配列であり得て、この場合、ホモロジーは配列同一性を指し、この相同配列は、抗体またはその断片の完全ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と高い配列同一性（８０％、８５％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性）を示す配列を意味する。機能性ホモログは、本明細書中で定義するＦＰＲＬ２を結合する能力、またはＦＰＲＬ２における応答シグナルを阻害または刺激する能力、またはその両方を特徴とする。
【０３０３】
本発明における抗体配列の相同配列は、他の動物種（ラット、ヒト、ネコ、イヌ等）または特定のヒト集団群に存在し、同一の生化学的経路に関与する類似の配列をエンコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を含んでよい。
【０３０４】
このような相同配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの付加、欠失または置換であって、本発明における抗体またはその断片の機能的特徴を実質的に変更しない付加、欠失または置換を含んでよい。すなわち、ホモログは抗体またはその断片のアミノ酸配列の活性の少なくとも９０％を有し、そしてＦＰＲＬ２を特異的に結合し、刺激または阻害する。
【０３０５】
このような相同配列はまた、５０、１００、２００、３００、４００、６００、８００または１０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列であって、ストリジェントハイブリダイゼーション条件（例えばSAMBROOK et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New Yorkに記載されている条件）下でいずれかの抗体またはその断片のアミノ酸配列とハイブリッド形成可能な配列であり得る。「ストリジェントハイブリダイゼーション条件」の典型例は以下の条件である：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート液、５０μｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン中４２℃でハイブリッド形成；そして０．２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃（またはそれより高い温度、例えばプローブ配列の完全相補物のＴｍの２℃下まで）で洗浄。
【０３０６】
高処理量スクリーニングキット
本発明の高処理量スクリーニングキットは、好ましくは１ｎＭ〜１μＭの濃度範囲の、ＨＢＰポリペプチドの存在または不存在下で、本発明の受容体に対する調節化合物、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストまたはインヒビターの検出を実施するために必要なすべての手段および媒体を含む。このキットは以下の連続段階を実施するための材料を含む。ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体をエンコードするヌクレオチド配列を含み、これを発現している本発明の組換え細胞を、固形支持体、例えばマイクロタイタープレート、より好ましくは９６ウェルマイクロタイタープレート上で培養する。この培養は、当業者に周知の方法、特にWO 00/02045に記載の方法にしたがって行う。本発明の調節化合物を、約１ｎＭ〜１μＭまたはそれ以上の濃度で、適切な濃度（好ましくは１ｎＭ〜１μＭの範囲）のＨＢＰポリペプチドの存在または不存在下にある特定ウェルの培地に加える。
【０３０７】
本発明のキットはまた、高処理量スクリーニング解析に付することができる二次メッセンジャーアッセイに必要な材料を含むことができる。このような二次メッセンジャーアッセイには、ｃＡＭＰの細胞内レベル、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキノイド酸（arachinoid acid）濃度またはＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼ活性の測定（上記）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、サイクリックＡＭＰアッセイで測定されるＦＰＲＬ２ポリペプチド活性は、以前（２６）に記載される通り、放射性免疫アッセイによって定量する。結果は、ＨＢＰポリペプチドの存在下かつ添加調節化合物の不存在下で本発明の組換え細胞から得られるベースラインレベルのＦＰＲＬ２ポリペプチド活性と比較する。調節物質不存在下の活性のレベルと比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、さらに最も好ましくは１００倍またはそれ以上のＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の増大または減少を示すウェルをその後の解析用に選択する。
【０３０８】
本発明において有用な他のキット
本発明は、ＦＰＲＬ２ポリペプチド活性の調節物質に関するスクリーニングに有用なキット、ならびにＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットを提供する。本発明において有用なキットは単離したＦＰＲＬ２ポリペプチド（例えば、単離した膜上、ＦＰＲＬ２ポリペプチド発現細胞上、またはＳＰＲチップ上の、膜−または細胞−結合型ＦＰＲＬ２ポリペプチドを含む）を含むことができる。キットはＦＰＲＬ２ポリペプチドに特異的な抗体を含むこともできる。これとは別に、あるいはこれに加えて、キットはＦＰＲＬ２ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞を含有することができる。さらに別の実施態様では、本発明のキットはＦＰＲＬ２ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含有することができる。さらに別の実施態様は本発明のキットは以下に記載のＦＰＲＬ２ポリペプチドの増幅に有用な特異的プライマーを含んでよい。本発明のすべてのキットは、指定の品目または品目の組み合わせおよびそれらのためのパッケージ材料を含む。キットはまた使用のための指示書を含む。
【０３０９】
トランスジェニック動物
トランスジェニックマウスは、遺伝学的および発生生物学的研究のための、および新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。通常の遺伝子導入方法では、追加コピーの正常または修飾型遺伝子を接合体の雄性前核内に注入し、そしてこれが受容マウスのゲノムＤＮＡに組み込まれる。確立されたトランスジェニック系統において、導入遺伝子はメンデル様式で遺伝する。トランスジェニック動物の作成に有用なコンストラクトは、正常プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子、組織発現および制御パターンに関する解析対象のプロモーターの調節下にあるレポーター遺伝子、ならびに、特定の発生結果に関する研究対象である優性突然変異、変異プロモーター、および人工融合遺伝子を含有するコンストラクトを含む。典型的には、１０キロベースまたはそれ以下のオーダーのＤＮＡ断片を用いてトランスジェニック動物を構築する（Reeves, 1998, New. Anat., 253:19）。トランスジェニック動物は、本発明の１つまたはそれ以上の多型を含有する候補遺伝子を含むコンストラクトを用いて作成可能である。別法では、単一の多型を含有する候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、別の多型を含有する候補遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交雑することができ、子孫の動物において、この２つの多型の混合効果を研究することができる。
【０３１０】
他のトランスジェニック動物
本発明は、トランスジェニックのマウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ等を含むが、これらに限定されないトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニックブタの作成用プロトコルは、White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94；米国特許第5,523,226号；米国特許第5,573,933号；PCT出願WO93/25071；およびPCT出願WO95/04744に見出すことができる。トランスジェニックマウスの作成用プロトコルは、米国特許第5,530,177号に見出すことができる。トランスジェニックラットの作成用プロトコルは、Bader and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996に見出すことができる。トランスジェニックウシの作成用プロトコルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.に見出すことができる。トランスジェニックウサギの作成用プロトコルは、Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985およびTaylor and Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308, 1997に見出すことができる。
【０３１１】
ノックアウト動物
ｉ．標準
ノックアウト動物は、相同組換えを用いて遺伝子の欠失を創出する方法によって作成する。この技術は、胚性幹（ＥＳ）細胞の発生に基づく。ＥＳ細胞は、胚由来であり、培養中で維持される。そして、宿主胚盤胞内に導入された場合に、マウスのすべての組織発生に関与する能力を有する。ノックアウト動物の作成は、ＥＳ細胞中の特定の標的遺伝子への相同組換えを導き、これによりこの遺伝子の無効対立遺伝子を作成することによって行う。（ヘテロ接合性またはホモ接合性の子孫において）この無効対立遺伝子の潜在的表現型の結果を解析することができる（Reeves, 上記）。
【０３１２】
ｉｉ．Ｃｒｅ−ｌｏｘを用いるマウスのインビボ組織特異的ノックアウト．
標的化された相同組換えの方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的リコンビナーゼＣｒｅに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良されている。バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを、トランスジェニックマウスアッセイにおいて用いる。その目的は、指定の組織または発生段階に制限された遺伝子ノックアウトを作成することである。広範囲の遺伝子ノックアウトと対照的に、領域制限された遺伝子の欠失は、表現型が特定の細胞／組織に起因し得る点で有益である（Marth, 1996, Clin. Invest. 97: 1999）。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系では、一方のトランスジェニックマウス系統を操作して、ｌｏｘＰ部位が目的の遺伝子の１つまたはそれ以上のエキソンと隣接するようにする。このいわゆる「floxed遺伝子」に関するホモ接合体を第二のトランスジェニックマウスと交雑させる。この第二のトランスジェニックマウスは、特定細胞／組織タイプの転写プロモーターの調節下でＣｒｅ遺伝子を発現するものである。その後Ｃｒｅタンパク質はｌｏｘＰ認識配列間のＤＮＡを切除し、標的遺伝子の機能を効率的に除去する（Sauer, 1998, Methods, 14:381）。現在、この方法の多数のインビボ実施例が存在し、これには哺乳類組織特異的遺伝子の誘導性不活化（Wagner et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323）が含まれる。
【０３１３】
ｉｉｉ．ノックアウト表現型のＢａｃ救出（修復）
特定の遺伝子多型／突然変異がインビボの改変型タンパク質機能の原因であることを検証するために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することによって、この改変型タンパク質機能を「救出」（rescue）することができる。このような目的では、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンをトランスジェニックマウスにおいて発現させるインビボ補完を利用することができる。この方法はマウス概日Ｃｌｏｃｋ遺伝子の同定に利用されている（Antoch et al., 1997, Cell 89: 655）。
【０３１４】
材料
トリプシンはFlow Laboratories（Bioggio, Switzerland）から入手した。培地、G４１８、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、制限酵素、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼはStratageneから購入し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはEurogentec.（Liege, Belgium）から購入した。放射能製品であるミオ−Ｄ−［２−３Ｈ］イノシトール（１７．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はAmersham（Ghent, Belgium）から入手した。DowexAG1X8（ギ酸塩またはエステル型）はBio-Rad Laboratories（Richmond, Calif.）から入手した。ＡＴＰはSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した。フォルスコリンはCalbiochem（Bierges, Belgium）から購入した。ロリプラムはLaboratories Jacques Logeais（Trappes, France）から提供を受けた。ＰＣＤＮＡ３はInvitorgenから入手した発現ベクターである。
【０３１５】
投与の用量および様式
典型的には、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節物質（例えば、本発明の、ＦＰＲＬ２ポリペプチドに関するアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター）を投与することによって、患者を以下のように処置することができる。本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節物質は、摂取、注射、吸入または他の多数の方法により、好ましくは生物学的適合性溶液または製薬的に許容されるデリバリービヒクル中で患者に投与することができる。投与する用量は患者に応じて変化する；「治療的有効用量」は、例えば機能の向上レベル（例えば本明細書中に記載の二次メッセンジャーアッセイで決定されるレベル）によって決定することができる。また当業者は、ＨＢＰポリペプチドの結合をモニターすることによって、投与する用量を選択および調節することができる。本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチドの調節物質に関する用量は、毎日、毎週、毎月、毎年または担当医師が適切とみなすところにしたがって、くり返し投与してよい。
【０３１６】
一実施態様では、致死量以下の用量の、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を阻害または促進する物質を投与して患者を処置し、ＦＰＲＬ２ポリペプチド受容体のシグナル伝達活性を調節することができる。本発明の致死量以下の用量とは、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を阻害または刺激する、物質の用量であって、この特定物質のためのＬＤ５０であるか、あるいはそれ以下である用量を表す。一実施態様では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達活性を阻害する物質の用量は１ｆＭ〜１Ｍの範囲、好ましくは１ｐＭ〜１ｍＭの範囲、より好ましくは１ｎＭ〜１μＭの範囲である。一実施態様では、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節に有用な物質は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドのリガンド結合部位と特異的に結合する抗体であってよい。ＦＰＲＬ２ポリペプチドのシグナル伝達の調節に有用な用量を達成するのに必要な抗−ＦＰＲＬ２ポリペプチド抗体の量は、ＦＰＲＬ２ポリペプチドの発現レベル、受容体発現の局在性、および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するが、一般には、抗−ＦＰＲＬ２ポリペプチド抗体またはその結合性タンパク質０．０００５〜５．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり、より一般的には、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量である用量を使用する。
【０３１７】
医薬組成物
本発明は、生理学的適合性担体と混合した本発明のＦＰＲＬ２ポリペプチド調節物質を含む組成物を提供する。本明細書中で使用する「生理学的適合性担体」とは、生理学的に許容される希釈剤、例えば水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水を表し、さらにアジュバントを含んでよい。アジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンは当技術分野で周知の材料である。
【０３１８】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬的に使用可能な、適切な製薬的に許容される担体調製物を含んでよい。
【０３１９】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の製薬的に許容される担体を用いて経口投与に適した製剤として製剤化することができる。このような担体によって、医薬組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液状剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化することができる。
【０３２０】
経口用途の医薬調製物は、次のように得ることができる：活性化合物を固形賦形剤と混合し、場合により、得られた混合物を研磨し、そして、所望であれば適切な補助剤を加えた後に、顆粒の混合物を加工し、錠剤または糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば糖類、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；およびゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンである。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてよい。
【０３２１】
糖衣錠コアには、濃糖類溶液のような適切なコーティングを施す。コーティングは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。製品の同定用に、または活性化合物の量、すなわち用量を示すために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または顔料を加えてよい。
【０３２２】
経口使用が可能な医薬調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル剤、ならびにゼラチン製の密閉型軟カプセル剤およびコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールが含まれる。押し込み型カプセル剤は、充填剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、潤滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および、場合により、安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物は、安定化剤を含むか、あるいは含まない適切な液状物、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁してよい。
【０３２３】
非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射用には、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理学的適合性バッファー、例えばハンクス液、リンガー液、または生理緩衝食塩水中で製剤化してよい。注射用の水性懸濁液は、この懸濁液の粘性を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してよい。さらに、活性溶媒またはビヒクルの懸濁液には、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。場合により、懸濁液は、適切な安定化剤または、本化合物の可溶性を増大させて高濃度溶液の調製を可能にする物質を含有してもよい。
【０３２４】
鼻腔投与用には、浸透対象の特定障壁に適切な浸透剤を製剤中で使用する。このような浸透剤は当技術分野で一般に知られている。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で既知の様式、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣作成、浮揚（levitating）、乳化、カプセル化、包括（entrapping）または凍結乾燥プロセスによって製造してよい。
【０３２６】
医薬組成物は塩として提供してよい。このような塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等...を含むがこれらに限定されない多数の酸を用いて形成することができる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中では、非常に可溶性であり、その対応する遊離塩基形態で存在する。他の事例では、好ましい調製物は、１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトール、ｐＨ範囲４．５〜５．５中の凍結乾燥粉末であってよく、この粉末は使用前にバッファーと混合する。
【０３２７】
本発明の化合物を含む医薬組成物を、許容される担体中で製剤化して調製した後、これらを適切な容器に入れ、指定症状の処置用のラベルを付することができる。このラベルは、投与の量、頻度および方法を含む情報を示す。
【実施例１】
【０３２８】
実施例
実施例１：ヒトＦＰＲＬ２受容体のクローニング
ヒトＦＰＲＬ２を以下のようにクローニングした：ＦＰＲＬ２の配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドＡＳ−２０４は以下のフォワード配列を有するものであった：5'-ACCGGAATTCACCATGGAAACCAACTTCTCC-3'（配列番号１４）。これはＦＰＲＬ２の翻訳開始コドンに対してハイブリッド形成するものであった。オリゴヌクレオチドＡＳ−４１６は以下の配列を有するものであった：5'-ATCATCTAGAACGCAGGGTAGAAAGAGACAG-3'（配列番号１５）。これはＦＰＲＬ２の翻訳終止コドンの下流に位置する配列と相補的であった。ＰＣＲを実施した。この場合、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドＡＳ−２０４およびＡＳ−４１６をプライマーとして用いた。条件は以下の通りである：
ＰＣＲ酵素：Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）。
バッファーは、Stratageneによって酵素とともに供給されたものであり、これに２．５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを加えた。
サイクルは以下の通りであった：
【０３２９】
【表１】
2006025787.tif 000002
【０３３０】
予想サイズ（１．１ｋｂ）のＰＣＲ産物を得た。この産物を発現ベクター（ＰＣＤＮＡ３）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングした。この場合、ＡＳ−２０４オリゴヌクレオチドによって導入されたＥｃｏＲＩ部位、およびＡＳ−４１６オリゴヌクレオチドによって導入されたＸｂａＩ部位を使用した。そして両鎖に関してシークエンシングした（図１）。
【実施例２】
【０３３１】
実施例２：ＦＰＲＬ２の組織分布
ヒトＦＰＲＬ２の組織分布−逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を実施した。この場合、ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ（脊髄、胸腺、膵臓、子宮、胎盤、胃、肺、脾臓、精巣、脳、心臓、腎臓、骨格筋、胎児肝臓、胎児脳、副腎、骨髄）およびトータルＲＮＡ（下垂体、小腸、肝臓、卵巣、胎児大動脈、脂肪、単球、リンパ節、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＰＢＭＣ、ＰＭＮ、ＰＢＬ）のパネルを使用した。ＦＰＲＬ２プライマーは5'-CGCACAGTCAACACCATCTG-3'（フォワード）（配列番号１６）および5'-AGCTGTTAAAAAAGGCCAAG-3'（リバース）（配列番号１７）であり、予想される産物のサイズは７１７ｂｐであった（図２）。約５０ｎｇのポリ（Ａ）＋ ＲＮＡまたは５００ｎｇのトータルＲＮＡをSuperscript II（Invitrogen）で逆転写し、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼを用いて以下の条件下で実施した：９４℃で５分間変性；９４℃で１分間、５６℃で１分３０秒間、および７２℃で４５秒間の３０サイクル。ＰＣＲのアリコート（１０μＬ）を１％アガロースゲル電気泳動によって解析した。
【実施例３】
【０３３２】
実施例３：ＦＰＲＬ２の天然リガンドの精製およびＨＢＰの断片の同定
１．ホモジネート
ブタ脾臓３５０ｇから精製を実施した。新鮮な器官を購入し、液体窒素中で凍結した。次いで凍結した器官を２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液中で４℃にした。この場合、器官／液体の割合は１／４とした。この混合物を混合し、次いでUltraturaxで減量してホモジネートにした。
ホモジナイズ後、この混合物を１００００ｇで３０分間４℃で遠心した。
上澄を液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【０３３３】
２．第一段階
器官５０ｇに相当するアリコート２００ｍＬを水０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で４倍希釈し、５％ＡＣＮの濃度にした。次いで８００ｍＬを４．６ｘ１５０ｍｍのPorosカラムに５ｍＬ／分で積載した。このカラムに、５〜７０％のグラジエントのＡＣＮ（０．１％ＴＦＡを補充）を６％／分で適用した。フラクション１．２５ｍＬを回収し、エクオリンアッセイにおいて機能活性を試験した。ＨＰＬＣプロファイルに関して２つの活性領域を検出し、対応するフラクションを保存した。
【０３３４】
３．第二段階
２つの活性領域に対応するフラクションをプールした。このプールを水０．１％ＴＦＡ中で４倍希釈し、４．６ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラムに１ｍＬ／分で積載した。このカラムに、３０〜５０％の範囲のグラジエントのＡＣＮを、０．１％ＴＦＡの存在下、１％／分の割合で適用した。フラクション１ｍＬを回収し、機能活性のための試験した。２つの活性領域を検出した。この段階から、２つの領域を別個に処理した。
【０３３５】
４．第三段階
２回流出を行ったＣ１８由来の第二領域に対応するフラクション（アセトニトリルのパーセンテージが高い方）をプールし、speedvacで濃縮し、最終容量５０μＬにした。次いでこれを水／３０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡの混合物中で３倍希釈した。この最終容量を、サイズ排除カラムである７．５ｘ３００ｍｍのSuperdexペプチドPE（Pharmacia Biotech）に積載した。このカラムは希釈バッファーで平衡化したものであった。０．５ｍＬ／分で流出を行い、フラクション０．２５ｍＬを回収し、機能活性のために試験した。
【０３３６】
５．第四段階
１回の段階４由来の活性フラクションをプールし、水０．１％ＴＦＡ中で４倍希釈した。最終容量（２ｍＬ）を２．１ｘ２５０ｍｍのＣ４カラムに０．２ｍＬ／分で積載した。このカラムに、３０〜５０％の範囲のグラジエントのＡＣＮを、０．１％ＴＦＡの存在下、０．３％／分の割合で適用した。吸光度プロファイルにしたがって手動でフラクションを回収し、機能活性に関して試験した。この段階を３回繰り返した。最終活性フラクションのアリコートを１ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラムに積載して、その純度を調べた。次いでこのフラクションを乾燥し、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中に再懸濁し、煮沸し、トリプシン（５０ｎｇ）で一晩消化し、最後に、ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計で解析した。直接のモノアイソトピックマスフィンガープリンティングによって、以下のペプチドを同定することができた：アセチル-MLGMIKNSLFGSVETWPWQVL（配列番号１８）。これはブタＨＢＰの最初の２１アミノ酸に相当する（図３）。ヒトＨＢＰの最初の２１アミノ酸はブタＨＢＰの最初の２１アミノ酸と１００％同一である。
【実施例４】
【０３３７】
実施例４：ＦＰＲＬ２に関する機能アッセイ
ＦＰＲＬ２発現クローンは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションして、ミトコンドリアアポエクオリンおよびＧアルファ１６を同時発現させ、限界希釈し、ノーザンブロッティングによって選択することによって得ている。ポジティブクローンを使用して、上記の通り調製したブタ脾臓抽出物を用いるスクリーニングを行った。ミトコンドリアエクオリン細胞内Ｃａ２＋放出の発光に基づく機能アッセイ（Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126；この刊行物は引用により本明細書中に包含される）は、刊行物に記載の通り実施した（Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508；この刊行物は引用により本明細書中に包含される）。簡単には、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中のプレートから細胞を回収し、ペレットにし、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に５ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を５μＭセレンテラジンＨ（Molecular Probes）と室温で４時間インキュベートした。次いで細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で洗浄し、０．５ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。次いで細胞を試験アゴニストペプチドまたは組織抽出物含有プレートと混合し、Microlumat照度計（Perkin Elmer）を用いて発光を３０秒間記録した。結果は相対光単位（ＲＬＵ）で示す。
【実施例５】
【０３３８】
実施例５：ＨＢＰのＮ末端ペプチドによるＦＰＲＬ２発現細胞の活性化
ＨＢＰのＮ末端ドメインの潜在的効果を調査するために、発明者らは活性な脾臓フラクション由来の天然ペプチド（このペプチドは配列番号１８に示される配列を有する）を精製し、ＦＰＲＬ２受容体およびアポエクオリンを同時発現しているセルラインにおいて細胞内カルシウム放出を引き起こすその能力を試験した。発明者らは、Detheux et al.（2000 J. Exp. Med. 192, 1501-1508）に以前に記載されているエクオリンアッセイを使用している。図４に示す通り、ブタＨＢＰのＮ末端に相当する２１アミノ酸のペプチドは、ナノモル濃度でＦＰＲＬ２の活性化能を有した（平均ＥＣ５０は３．６ｎＭ）。
【０３３９】
配列番号１８に示されるペプチドのＮＨ２末端に位置するアセチル基がこのペプチドの活性を調節するか否かを調査するため、発明者らはこの２１アミノ酸のペプチドであって、そのＮＨ２末端にアセチル基を有するペプチドおよび有さないペプチドを合成した。図５に示す通り、このアセチル基はＦＰＲＬ２受容体に対するこのペプチドの活性を修飾しない（平均でアセチル化ペプチドのＥＣ５０は２１ｎＭであり、非アセチル化ペプチドのＥＣ５０は３６ｎＭである）。
【実施例６】
【０３４０】
実施例６：ＨＢＰのＮ末端ペプチドはＦＰＲＬ２受容体を特異的に活性化する
ＦＰＲＬ２受容体に対する上記ペプチドの特異性を調査するため、発明者らはＦＰＲファミリーの他の２つのメンバー：ＦＰＲ受容体およびＦＰＲＬ１受容体に対するこのペプチドの活性を試験した。図６に示す通り、この２１アミノ酸のペプチド（配列番号１８）は、ナノモル濃度でＦＰＲＬ２受容体の活性化能を有した（平均ＥＣ５０は８．８および８．２ｎＭ；注記：この実験では、２つの異なるＦＰＲＬ２発現クローンを試験した）が、ＦＰＲの活性化能を有さず、高濃度でしかＦＰＲＬ１を活性化しなかった（平均ＥＣ５０は５８４ｎＭ）。
【実施例７】
【０３４１】
実施例７：ＦＰＲＬ２はＧｉ共役受容体である
ＨＴＲＦキットを用いてｃＡＭＰ濃度を測定した。このキットは製造元の仕様書にしたがって使用した（HTRF kit, Cis bio International, cat n° 62AM2PEC）。抗生物質を含まない培地中でこの実験前に１８時間培養した対数期の中間部にある細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡで穏やかにフラッシングして剥離し、遠心して回収し、ＫＲＨ−ＩＢＭＸ（１ｍＭ）中に４．２ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。
【０３４２】
アゴニストアッセイでは、６μＬ／ウェルのフォルスコリン４Ｘ（最終濃度１０μＭ）および６μＬの増加量の被験アゴニスト（４Ｘ）（ペプチド２４７８：これは配列番号１８に開示されているペプチドに相当する）またはＦＫコントロール用のフォルスコリン４Ｘ（最終濃度１０μＭ）を９６ウェルプレート（Costar, cat n°: 3694）に分配する。１２μＬ／ウェルの細胞懸濁液（５０００細胞／ウェル）を各ウェル上に加え、室温で３０分間インキュベートする。
【０３４３】
１２μＬのｃＡＭＰ−ＸＬ６６５および１２μＬの抗−ｃＡＭＰクリプタート、Lysisバッファー中に希釈、を連続して加えて、反応を停止した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、Rubystar（BMG）で読み取った。６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比から結果を算出し、これをデルタＦ（％）で示す。デルタＦ％対ｃＡＭＰ濃度をプロットして検量線を得る。サンプルから得られたデルタＦ％を検量線に対して報告し、各サンプルによって生産された各ｃＡＭＰ濃度（ｎＭ）を推定することができる。
【０３４４】
配列番号１８による刺激に応じてＦＰＲＬ２によって活性化される天然の共役特性および細胞内シグナル伝達経路を、ヒト受容体およびエクオリンを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞において調査した。発明者らはまず、ＦＰＲＬ２受容体がフォルスコリンの存在下でアデニル酸シクラーゼと負に共役し（図７）、一方、フォルスコリン不存在下では、ｃＡＭＰの蓄積を促す能力を有さない（記載していない）ことを証明した。
【０３４５】
配列番号１８に示されるペプチドは、ＦＰＲＬ２受容体発現細胞において生産されるｃＡＭＰ量を用量依存様式で減少させる能力を有し、ＦＰＲＬ２に対するアゴニスト活性を示す。この場合、ＥＣ５０は６．５＋／−２．４ｎＭである。
【実施例８】
【０３４６】
実施例８：ヒトＦＰＲＬ２受容体およびリガンドの同定、合成、および特徴付け
Ａ）材料および方法
ヒトＦＰＲＬ２、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲの発現
ヒトゲノムＤＮＡからヒトコード配列（それぞれ、受け入れ番号AC005946、M84562およびM60626）をＰＣＲによって増幅し、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）およびｐＥＦＩＮ３（Euroscreen）ベクター内にクローニングし、シークエンシングした。ｐＥＦＩＮ３コンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１細胞内へＦｕｇｅｎｅ６を用いてトランスフェクトした。この細胞はＧα１６およびアポエクオリンを発現している細胞または発現していない細胞であった。ノーザンブロッティングにより、Ｇ４１８耐性クローンを受容体発現に関して特徴付けした。刊行物（４２）に記載の通り、ミトコンドリアエクオリンの発光に基づく機能アッセイを実施した。結果は、相対光単位（ＲＬＵ）で、または２０μＭ ＡＴＰに対する応答のパーセンテージで示した。
【０３４７】
生理活性ペプチドの精製
凍結されたブタ脾臓（３５０ｇ）を４容量の氷冷２０％ＣＨ３ＣＮ水溶液中でホモジナイズした。ホモジネートを１０，０００ｇで３０分間４℃で遠心し、液体窒素中で急速凍結した。上澄のアリコート２００ｍＬを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で４倍希釈し、４．６ｘ１５０ｍｍのPoros R2ビーズカラム（Applied Biosystems）に５ｍＬ／分で積載した。０．１％ＴＦＡ中の５−７０％のＣＨ３ＣＮグラジエント（６％／分）を適用した。フラクション１．２５ｍＬを回収し、エクオリンアッセイにおいて、ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する機能活性を試験した。ＨＰＬＣプロファイルに関して、２つの活性領域（Ａ１およびＡ２）を検出した。対応するフラクションをプールし、０．１％ＴＦＡ中で４倍希釈し、４．６ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラム（Vydac）に１ｍＬ／分で積載した。このカラムに、０．１％ＴＦＡ中の３０−５０％のＣＨ３ＣＮグラジエントを適用した。２つの活性領域を検出し、以後、別個に処理した。２回の流出から得た第一領域（Ａ１、低ＣＨ３ＣＮ濃度）および第二領域（Ａ２、高ＣＨ３ＣＮ濃度）に相当する１ｍＬフラクションを減圧濃縮して５０μＬにした。Ａ１およびＡ２をそれぞれ３０％ＣＨ３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡおよび３０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ中で３倍希釈し、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）（Ａ１：７．８ｘ３００ｍｍのＴＳＫ−ゲルAlpha-4000（Tosoh Biosep）；Ａ２：７．５ｘ３００ｍｍのSuperdexペプチドPE（Amersham Pharmacia Biotech））に積載した。これらのカラムには、流速０．５ｍＬ／分の希釈溶媒を適用した。１回のＳＥＣ由来の活性な０．２５ｍＬフラクションを０．１％ＴＦＡ中で４倍希釈し、２．１ｘ２５０ｍｍのＣ４カラム（Vydac）に０．２ｍＬ／分で積載し、このカラムに、０．１％ＴＦＡ中の２５−４５％（Ａ１）または３０−５０％（Ａ２）のＣＨ３ＣＮグラジエントを０．３％／分で適用した。吸光度プロファイルにしたがって手動でフラクションを回収した。Ａ１に関して、１回の流出から得た活性フラクションをプールし、０．１％ＴＦＡ中で５倍希釈し、１ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラム（Vydac）に０．０５ｍＬ／分で積載した。このカラムに、０．１％ＴＦＡ中の２３−５０％のＣＨ３ＣＮグラジエントを０．４５％／分で適用した。フラクションを手動で回収した。Ａ２に関して、アリコートを１ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラムに積載して、最終活性フラクションの純度を調べた。異なるプロトコルを用いて、精製を３回繰り返した（すなわちＳＥＣ段階を２．１ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラム上の逆相段階と置き換え、このカラムに、イオン対形成物質である０．１％Ｈ３ＰＯ４中のＣＨ３ＣＮグラジエントを適用した）。ＳＤＳ／ＰＡＧＥに付して活性フラクション中のタンパク質濃度を決定した。この決定は、銀染色後にアプロチニンおよびリゾチーム標準と比較して行った。
【０３４８】
質量分析による解析
活性フラクションを減圧乾燥し、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中に再懸濁し、５分間１００℃に加熱し、トリプシン（５０ｎｇ）で一晩消化するか、あるいは無傷のままにし、そして固相抽出（C18 ZipTip, Millipore）によって精製した。ペプチドを１．５μＬの７０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ中で金属ＭＡＬＤＩ標的上に溶出させ、乾燥し、次いで１．５μＬのマトリクス混合物（２ｍｇ／ｍＬ ２，５−ジヒドロキシ安息香酸および１０ｍｇ／ｍＬ α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、２ｍＭフコース、５ｍＭ酢酸アンモニウム）と混合した。ＭＡＬＤＩソースを備えたＱ−ＴＯＦ Ultima Global質量分光計（Micromass）で質量分析による解析を実施し、ウシ血清アルブミン由来トリプシンおよびキモトリプシンペプチドのモノアイソトピック質量を用いて較正した。窒素レーザ（３３７ｎｍビーム、１０Ｈｚ）を用いてイオン化を達成し、Ｖモードリフレクトロン位置で取得を実施した。親イオンの選択後、アルゴン誘発性の断片化によってマイクロシークエンシングを実施した。
【０３４９】
合成ペプチド
アセチル化または非アセチル化MLGMIKNSLFGSVETWPWQVL（ＨＢＰ［１−２１］、本実施例８におけるＦ２Ｌ）、NSLFGSVETWPWQVL（Ｆ２Ｌ［７−２１］）、ＷＫＹＭＶＭ、および
MLWRRKIGPQMTLSHAAG（ＣＣＬ２３のＮ末端由来のＳＨＡＡＧペプチド）は、固相Ｆｍｏｃストラテジー（４３）を用いて実験室で合成し、あるいはEurogentecのオーダーメイドであった。ＷＫＹＭＶＭおよびＷＫＹＭＶｍはPhoenix Pharmaceuticalsから購入し、ＦＭＬＰはNeosystemから購入した。すべてのペプチドのモノアイソトピック質量および配列は質量分析によって検証した。異なる起源のＦ２ＬおよびＷＫＹＭＶＭは同一の性質を示した。高濃度のＨＢＰ誘導体ペプチドをＤＭＳＯ中に溶解し、５０℃で１０分間加熱した。これはその高い疎水性のためである。５０％ＣＨ３ＣＮ中で中間希釈物を作成し、アッセイバッファー中でさらに４０倍希釈して作業用濃度にした。
【０３５０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
定量的ＰＣＲでは、市販の（Clontech）、または刊行物（４４）に記載の通り実験室で調製したヒト血球集団由来のｃＤＮＡ中、ＲＴ−ＰＣＲによってＦＰＲＬ２転写物を検出した。ＦＰＲＬ２用のフォワードプライマーは5'-CTGGCCACACCGTTCTGT-3'であり、リバースプライマーは5'-GGCCATGGTAATGAACACGTT-3'であった。ｃＤＮＡ品質のコントロールとしてＧＡＰＤＨ転写物の増幅を実施した（記載していない）。市販の（ClontechおよびAmbion）、または実験室で調製したヒト組織（ＤＣ）由来のトータルまたはポリＡ＋ ＲＮＡサンプルにおいて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan）を実施し、ＦＰＲＬ２転写物を検出した。ＦＰＲＬ２用のフォワードプライマーは5'-TTACCATGGCCAAGGTCTTTCT-3'であり、リバースプライマーは5'-GCAGACTGTGATGATGGACATAGG-3'であり、プローブは5'FAM-TCCTCCACTTCATTATTGGCTTCAGCGT-3'DABSYLであった。参照ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）用のフォーワードプライマーは5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'であり、リバースプライマーは5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'であり、プローブは5'FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'DABSYLであった。プライマーは９００ｎＭで使用し、プローブは２００ｎＭで使用した。この２つ遺伝子に関して体系的に標準曲線を作成し、各サンプルに関してＦＰＲＬ２の転写物コピー数をＧＡＰＤＨ転写物コピー数に対してノーマライズした。
【０３５１】
モノクローナル抗体およびフローサイトメトリー
ＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｇのｐｃＤＮＡ３−ＦＰＲＬ２を注射して抗体を作成した。この作成は刊行物（４５）に記載の通りである。ＣＨＯ−Ｋ１−ＦＰＲＬ２セルラインに関するＦＡＣＳによって血清を試験し、免疫マウスを用いて、標準ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を作成した。この作成では、ＮＳＯ骨髄腫セルラインを使用した。マウスｍＡｂアイソタイピングキット（IsoStrip, Boehringer Mannheim）を用いて、選択したハイブリドーマのＩｇクラスを決定した。フローサイトメトリーを用いて抗体を試験した。このフローサイトメトリーは、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム、および二次抗体であるＦＩＴＣ−コンジュゲート型γ鎖特異的ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Sigma）を含有するＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬ（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して）または５μｇ／ｍＬ（一次細胞に関して）の抗−ＦＰＲＬ２抗体またはコントロールＩｇＧ２ａを用いて実施した。FACScanフロー細胞蛍光測定計（Beckton Dickinson）を用いて１０，０００細胞の蛍光をアッセイした。Cytoperm/Cytowash（Becton Dickinson）を製造元の指示書にしたがって用いて、細胞質内染色を具体化した。
【０３５２】
細胞内カスケードアッセイ
ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）キット（Cis Bio International）を用いてｃＡＭＰ濃度を測定した。簡単には、細胞を剥離し、１ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有するクレブスリンガーＨｅｐｅｓバッファー中に再懸濁し、１０μＭフォルスコリンを、単独で、または増加濃度のアゴニストとともに、室温で３０分間適用した。ｃＡＭＰ−ＸＬ６６５および抗−ｃＡＭＰクリプタート、溶解バッファー中で希釈、を連続して加えて反応を停止させた。プレートを室温で６０分間インキュベートし、Rubystar蛍光定量計（BMG）で読み取った。６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比から結果を算出し、これをデルタＦ（％）で示した。デルタＦ％対ｃＡＭＰ濃度をプロットして検量線を得た。ＥＲＫ１／２の活性化をウエスタンブロッティングによってアッセイした。このウエスタンブロッティングでは、抗−ホスホ−ｐ４２／４４モノクローナル抗体（E10, Cell Signaling Technology）を刊行物（４６）に記載の通り使用した。エクオリンに基づくアッセイを実施した。このアッセイは一晩の１００ｎｇ／ｍＬ百日咳毒素での前処理を施して、あるいは施さずに実施した。このような百日咳毒素での前処理はこれらの細胞においてＡＴＰに対する機能性応答を阻害しないことが示された。ＦＰＲＬ２多型解析では、ＨＥＫ細胞を空のｐｃｄｎａベクターおよび野生型またはＡｓｐ３３８ＨｉｓＦＰＲＬ２含有ｐｃｄｎａベクターで一時的にトランスフェクトした。このトランスフェクションはリン酸カルシウム法を用いて行った。４８時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳまたはｃＡＭＰ実験に使用した。
【０３５３】
結合アッセイ
カルボキシ末端にチロシンを有する修飾型Ｆ２Ｌペプチドは、エクオリンアッセイにおいて、野生型Ｆ２Ｌと同様の効力を示すことが証明された。ペプチド５μｇを２ｍＣｉの１２５Ｉで標識した。この標識には、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を使用した。未結合１２５Ｉを分離した後、得られたペプチドの比活性が９００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅであることを概算した。［１２５Ｉ］−ＷＫＹＭＶｍ（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はPerkin Elmer Life Sciencesから購入した。ＦＰＲＬ２、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を２４ウェルプレートに播種した（ＦＰＲＬ２に関してはウェル当たり２００，０００細胞、他の２受容体に関してはウェル当たり１００，０００細胞）。翌日、２８０ｍＭサッカロースおよび、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲに関しては、０．１％ＮａＮ３を含有するＫＲＨバッファーで細胞を２回洗浄した。飽和結合アッセイでは、細胞を種々の量のＦ２Ｌ−［１２５Ｉ］Ｔｙｒとインキュベートし、１μＭ Ｆ２Ｌを競合物質として用いて非特異的結合を決定した。競合結合アッセイでは、細胞を１００，０００ｃｐｍのＦ２Ｌ−［１２５Ｉ］Ｔｙｒまたは１０，０００ｃｐｍの［１２５Ｉ］−ＷＫＹＭＶｍおよび競合物質である種々の量のＦ２Ｌまたは他のペプチドとインキュベートした。このインキュベーションは、５％ＢＳＡを補充したＫＲＨバッファー中、室温で９０分間行った。細胞を氷冷バッファーで２回洗浄し、トータル放射能を１Ｍ ＮａＯＨで回収し、ガンマカウンターで２分間カウントした。
【０３５４】
一次細胞に関する走化性およびＣａ２＋動態アッセイ
５〜７日間、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩ１−４（５００Ｕ／ｍＬ）とともに培養したＰＢＭＣの接着性フラクションから、またはＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍＬ）とともに培養した単球のパーコール精製物から、単球由来ＤＣを作成した。Ｃａ２＋動態アッセイでは、単球単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec）を用いるネガティブ選択によって単球を得た。Ｆ２ＬおよびＦＭＬＰおよびコントロールとして使用したＭｉｐ１アルファに応答した細胞遊走を、刊行物（４８）に記載の４８ウェルのマイクロ走化性チャンバー技術を用いて評価した。Ｃａ２＋動態アッセイでは、単球由来ＤＣまたは単球（フェノールレッドを含まないが、０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭプロベネシド（Sigma）を含有するＨＢＳＳ中、５ｘ１０５細胞／ｍＬ）に４μＭ Ｆｌｕｏ４（Molecular Probes）を、暗所にて２０℃で１時間付加した。付加を受けた細胞を２回洗浄し、１〜２ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、５０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレート（Viewplate, Packard Bioscience）のウェルごとに分配した。Fluostar蛍光定量計（BMG）において２５℃で読み取りを実施した：５０μＬのリガンド含有培地を注入し、５２０ｎｍの蛍光を、１〜３分間、毎秒記録した。各条件を３回実施し、各時点での平均蛍光を算出し、注入前５測定の平均値を減算して曲線をノーマライズした。
【０３５５】
Ｂ）結果
ＦＰＲＬ２の内因性リガンドであるＦ２Ｌペプチド（配列番号１８）の単離および同定
発明者らは、スクリーニングアッセイとして、ヒトＦＰＲＬ２、アポエクオリンおよびＧアルファ１６を同時発現しているＣＨＯ−Ｋ１セルラインを開発した。これにより、ヒトリンパ器官抽出物、白血球集団の条件培地、および炎症性体液由来のフラクションを試験することが可能になった。ＦＰＲＬ２発現セルラインに特異的な生物学的活性を、ヒト脾臓由来抽出物の逆相ＨＰＬＣ分画から得たフラクション中で検出した（データは記載していない）。実際上の理由のために、発明者らは、同様の方法で調製したブタ脾臓由来のフラクションを試験し、ＦＰＲＬ２のために特異な活性を含有するプロファイルの２つの領域（活性領域Ａ１およびＡ２、図１３）を同定した。３５０ｇのブタ脾臓から出発し、これらの２活性領域を５回（Ａ１）または４回（Ａ２）の連続ＨＰＬＣ段階によって精製して均一にした。このＨＰＬＣ段階の最初の２回は共通であった（図１３）。両活性領域がプロテイナーゼＫに対して感受性であることから、ペプチド性であることが示唆された（記載していない）。活性化合物の分子量をサイズ排除クロマトグラフィによって概算したところ、活性領域Ａ１に関しては約６ｋＤであり、活性領域Ａ２に関しては３ｋＤであった。これらに関するピークの吸光度および生物学的活性から、ピークＡ１中に存在する化合物は、ピークＡ２の化合物より豊富であるが、より活性が低く表れた。この２フラクションをＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀染色によって解析した。その目的は、既知量のアプロチニンおよびリゾチームと比較することによって活性ペプチドを概算定量することであった（図１５）。エクオリンに基づくフラクションアッセイにおいて同フラクションに関する濃度作用曲線を作成したところ、Ａ２に関して２．３２±１．８４ｎＭ（ｎ＝２）、Ａ１に関して２００±５４ｎＭ（ｎ＝４）のＥＣ５０を概算することができた（それぞれ図１５）。両ペプチドを質量分析によって解析した。この解析は、Ａ２に関しては消化なしまたはトリプシン消化後に、Ａ１に関してはトリプシン消化後に行った（図１４）。Ａ２に関しては、未消化ペプチドの解析により、アミノ末端アセチル化を伴う、ヒト細胞内ヘム結合タンパク質（ＨＢＰ、受け入れ番号NM 015987）の最初の２１アミノ酸（ＭＷ：２４７８．２８ダルトン）と一致するマイクロシークエンス全体を同定することが可能であった（図１４）。Ａ１に関してもまた、６ペプチドがＨＢＰと一致した。この６ペプチドのうち４つは図１４のＢに示す２つの最長トリプシン断片の断片であった。このブタＨＢＰを、変性プライマーを用いる肝臓ｃＤＮＡからのＰＣＲによってクローニングした。これにより、発明者らはその同定、およびヒト配列との比較において、最初の２１アミノ酸の完全保存を確認することができた。この配列は追って、ブタＨＢＰ ＥＳＴが公共データベースに包含された後に確認した（受け入れ番号AY662687）。Ａ２由来の２トリプシンペプチドは、ブタＨＢＰの１９０アミノ酸長配列の、アミノ末端ドメイン中の５０アミノ酸をカバーするものであった（図１４）。発明者らは、証明はできていないが、Ａ１のアミノ末端はＡ２のアミノ末端と共通であると考える。また、Ａ１のカルボキシ末端は正確に決定されなかった。��の原因は、ＨＢＰのＡｒｇ５６より後に多数のトリプシン部位が存在するからであった。精製は別プロトコルを使って３回実施し、各事例において質量分析により同ペプチドを同定した。
【０３５６】
ホルミルペプチド受容体に関する比較薬理学および細胞内シグナル伝達
ヒトＦＭＬＰ受容体ファミリーの３メンバーの薬理学およびこれらによって活性化されるシグナル伝達経路をＣＨＯ−Ｋ１細胞において調査した。このＣＨＯ−Ｋ１細胞はこれらの受容体を、Ｇアルファ１６およびアポエクオリンともに、またはこれらを伴わずに発現している（図１６）。実施例８でＦ２Ｌ（ＦＰＲＬ２リガンドの意味で）と称するアセチル化２１アミノ酸ペプチドを合成し、エクオリンに基づくアッセイにおいて試験した。この試験は、これらの３つのセルラインに対して、ならびに野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して、およびChemerinRおよび他のＧＰＣＲを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して行った。合成Ｆ２Ｌペプチドは、脾臓から精製された未変性ペプチドと同様の効力でＦＰＲＬ２発現細胞を活性化し、ずっと低い効力で、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲを活性化する（以下参照）ことが示された。しかし、他のすべての被験セルラインに対しては完全に不活性であった（データは記載していない）。Ｆ２Ｌをまた、ｃＡＭＰ蓄積アッセイにおいて試験した。この試験は、ＦＰＲＬ２を発現しているが、Ｇアルファ１６を発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞について行った。この合成ペプチドは、フォルスコリンによって促進されたｃＡＭＰ蓄積を阻害することが見出されたが、単独ではｃＡＭＰ生産の刺激能を有さなかった。同細胞において、Ｆ２Ｌはまた、低ナノモル濃度で細胞内カルシウム放出を促進し（記載していない）、ピコモル濃度でＥＲＫ１／２ ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘発した（図１８）。ＭＡＰＫ活性化の速度論的研究では、１５分の時点で最大リン酸化が示された（図１８）。カルシウムシグナルは百日咳毒素での前処理によって完全に阻害された。これはＦＰＲＬ２受容体とＧｉファミリーのヘテロ三量体Ｇタンパク質の共役を証明するものであった（図１７）。
【０３５７】
次いでこれらの３つのホルミルペプチド受容体の比較薬理学をより詳細に研究した。この研究では、Ｆ２Ｌおよび、ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１の４つの参照アゴニスト（ＦＭＬＰ、ヘキサペプチドＷＫＹＭＶＭおよびＷＫＹＭＶｍ、およびＣＣＬ２３由来ＳＨＡＡＧペプチド）を使用した。濃度作用曲線および得られた機能パラメータを、エクオリンに基づくアッセイ、および１０μＭフォルスコリンによる刺激後のｃＡＭＰ蓄積アッセイの両アッセイにおいて立証した（図１６ＡおよびＢおよび表１）。被験ペプチドのうち、Ｆ２Ｌ（配列番号１８）は、ＦＰＲＬ２に対して特に高い効力を有し、ＥＣ５０はエクオリンアッセイにおいて１０ｎＭであり、ｃＡＭＰアッセイにおいて５ｎＭであった。
【０３５８】
Ｆ２Ｌはまた、ＦＰＲＬ１に対して、高い特異性を示し、弱い活性が得られた（エクオリンおよびｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０はそれぞれ５６７および２３４ｎＭ）が、一方、ＦＰＲに対しては、１μＭ Ｆ２ＬにおいてｃＡＭＰ蓄積の部分的阻害しか得られず、エクオリンアッセイにおいては５μＭまで活性が検出されなかった。他のペプチドに関し、ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１に対して得られたＥＣ５０値（表１）は本質的に文献記載の通りであった。しかし、２つのＷ−ヘキサペプチドをＦＰＲＬ２発現細胞に対して試験した場合に、公開されているデータと有意な差異が観察された。実際には、ＦＰＲＬ２を活性化するのに、マイクロモル濃度のこれらのペプチドが必要であった（一方、ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１に対しては低ナノモル濃度で活性であった）。報告されている通り、ＦＭＬＰおよびＳＨＡＡＧはＦＰＲＬ２に対して不活性であった。
【０３５９】
Ｆ２ＬがＦＰＲＬ２に対する特異的な高親和性リガンドであることをさらに確認するため、発明者らは結合実験を実施した。その結果が示す通り、ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して飽和結合アッセイを実施すると、１１．７±４．９ｎＭのＫＤが決定でき、また、およそ３０，０００受容体／細胞のＢｍａｘ（図１７Ｃ）が、カルボキシ末端にチロシンを有する修飾型Ｆ２Ｌペプチドについて得られた。Ｆ２Ｌを用いて競合結合アッセイを実施すると、３３．４±０．２ｎＭのＩＣ５０を示した（図１７Ｄおよび表１）。ヘキサペプチドＷＫＹＭＶＭおよびＷＫＹＭＶｍ、ＳＨＡＡＧおよびＦＭＬＰは、ＦＰＲＬ２結合に関して３μＭの濃度まで競合しなかった（データは記載していない）。発明者らは次に、Ｆ２ＬのＦＰＲＬ２に対する特異性を、ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する結合実験によって確認した。この実験では、［１２５Ｉ］−ＷＫＹＭＶｍをトレーサーとして使用した。ＷＫＹＭＶｍに関するＩＣ５０値は、ＦＰＲＬ１に対して２２．５±７．６ｎＭ（図１７Ｅ）であり、ＦＰＲに対して９８．４±３７．４ｎＭ（図１７Ｆ）であったが、Ｆ２Ｌとの競合は３μＭの濃度まで観察されなかった。
【０３６０】
ホルミルペプチドの類似性により、発明者らはＦ２Ｌのアミノ末端アセチル化の役割を調査した。非アセチル化ペプチドを合成したところ、アセチル化Ｆ２Ｌと同様のＦＰＲＬ２に関するＥＣ５０（２１．１±７．６ｎＭ、ｎ＝３）を示すことがわかった（図１７Ｈ）。発明者らはまた、最初の６アミノ酸を欠く切断型Ｆ２Ｌ変異体（Ｆ２Ｌ［７−２１］）を試験した。その理由は、元々、このＮ末端部分を欠くマウス細胞内ＨＢＰがエドマンシークエンシングによって報告されたからであった（４７）。この切断型ペプチドはエクオリン（図１７Ｈ）および結合アッセイ（記載していない）において完全に不活性であることが見出された。
【０３６１】
ヒトＦＰＲＬ２の分布
発明者らは、種々の白血球集団においてＲＴ−ＰＣＲによりＦＰＲＬ２転写物の存在を調査した（図１９Ａ）。以前（４１）に報告されている通り、ＦＰＲＬ２転写物は単球および未成熟または成熟型の単球由来ＤＣにおいて最も豊富であった。ＬＰＳ、ＬＰＳ＋ＩＦＮ−γまたはＣＤ４０ＬによってＤＣの成熟を３〜２４時間誘導したが、ＦＰＲＬ２転写物の発現レベルに検出可能な変化はなかった（図１９Ａおよび記載していない）。これらは、すべての他の被験細胞集団において、存在しないか、あるいは非常に低いレベルで存在した。多数の組織に対し、ＤＣを参照として用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ほとんどの組織で低レベルの転写物が観察され、高いレベルの転写物はリンパ節、小腸、肺および脂肪組織において観察された（図１９Ｂ）。
【０３６２】
また、遺伝子による免疫法によってヒトＦＰＲＬ２に対するモノクローナル抗体を作成し、ＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現しているＣＨＯ−Ｋ１セルラインに対するＦＡＣＳによって特徴付けした（図２０Ｃ）。その結果が示す通り、３つのモノクローナルのうちの１つ（１Ｃ４）はＦＰＲＬ２に対して本質的に特異的であり、弱いＦＰＲＬ１認識を示した。２つの他の抗体（１Ｄ２および１Ｅ１）は両受容体を等しく良好に認識した。しかし、ＦＰＲとは、いずれも有意な交差反応を示さなかった。発明者らは、ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＦ２Ｌのシグナル伝達をブロックする抗体の能力を調査した。しかし、これらの抗体のブロック特性は弱く表れており、高濃度（５０μｇ／ｍＬ）の１Ｃ４抗体を用いても、このシグナルの部分的阻害しか得られなかった（データは記載していない）。これらの抗体を用いて、ＤＣ表面における受容体の存在を確認した。この３つのモノクローナルにより、レベルの差はあるが、未成熟および成熟型の単球由来ＤＣに関してＦＰＲＬ２を検出することができた。２４ドナーのうち１６ドナーでＦＰＲＬ２発現を検出することができた。代表的な１ドナーに関する実験を図２０Ｄに示す。次いで発明者らは、ＤＣに関するＦＰＲＬ２の細胞質内および表面発現を比較した。この比較は、細胞を浸透化処理後に、ＦＡＣＳ分析を実施して行った。発明者らは、表面発現が非常に弱いか、あるいは検出できないドナーに関してさえも、ＦＰＲＬ２の有意な細胞内発現を見出した（図２０Ｅ）。さらに、ＤＣを１μＭ Ｆ２Ｌの存在下で４８時間培養した場合に、細胞表面ＦＰＲＬ２の下方制御が観察された（記載していない）。概してこれらのデータは、ドナー間の発現差が輸送パラメータ、例えば原形質中に存在するリガンドによる刺激後の受容体の内部移行に起因し得ることを示唆する。４被験ドナーに関して、ＬＰＳによってＤＣを成熟させると、ＦＰＲＬ２の表面発現のわずかな減少が誘発された（図２０Ｆ）。最後に発明者らは、現在までに報告されているＦＰＲＬ２の唯一の変異体であって、３３８位のアスパラギン酸がヒスチジンに置換されていることを特徴とする変異体（受け入れ番号AAA58482）を評価した。ＨＥＫ細胞に一時的に発現させて検出した発現または機能応答（ｃＡＭＰ阻害）に関し、最初に使用した型のＦＰＲＬ２と比較して差異は見られなかった（データは記載していない）。
【０３６３】
一次免疫細胞におけるＦ２Ｌの生物学的活性
白血球集団に対するＦ２Ｌの生物学的機能を調査した。化学誘引に関するＦＰＲおよびＦＰＲＬ１の役割との類似性および既定のＦＰＲＬ２分布によって、発明者らは単球および単球由来ＤＣに関するカルシウム動態および走化性の測定に重点を置いた。
【０３６４】
その結果が示す通り、Ｆ２Ｌは用量依存様式で未成熟ＤＣ（図２１Ａ）ならびに成熟ＤＣ（記載していない）の細胞内Ｃａ２＋流動を促進した。個体によって差はあるが、この応答の振り幅は、１０ｎＭ ＦＭＬＰによる刺激に起因する応答と同等であった（図２１Ｂ）。被験１２ドナーのうち、７例で強い応答が得られ、２例で弱い応答が得られ、３ドナーでは応答が得られなかった。これは、ＦＡＣＳ分析によって測定される通り、ＦＰＲＬ２の発現レベルの差に起因する。精製単球においても、１００ｎＭ Ｆ２Ｌに応答してカルシウム動態が観察されたが、そのシグナルの振り幅はＤＣを用いた場合より低かった（図２１Ｃ）。ヒトＦ２Ｌはまた、未成熟ＤＣおよび単球のエクスビボ遊走を促進した（図２１ＤおよびＥ）。Ｆ２Ｌに応答した細胞遊走は、ケモキネシスより走化性に主に起因した。これはチェッカーボード実験において評価された通りである（データは記載していない）。最大走化性応答は３００ｐＭ〜１ｎＭの濃度で得られた。他の機能アッセイから得たＥＣ５０より低い濃度に相当する最大値を有する、釣鐘状の走化性応答は、他の走化性因子、例えばケモカインに関して典型的に観察されるものである。
【０３６５】
この実施例では、受容体ＦＰＲＬ２の天然リガンドを同定している。脾臓から出発し、Ｆ２Ｌを単離し、ＦＰＲＬ２に対して高親和性かつ高選択性を示す第一の天然アゴニストとして特徴付けている。Ｆ２Ｌは、低ナノモル濃度域でＦＰＲＬ２と結合し、これを活性化する。一方、以前に報告されているこの受容体のリガンド（アネキシンＩ由来Ａｃ−１−２５、細菌Ｈｐ２−２０、および合成Ｗペプチド）は本質的にＦＰＲＬ１アゴニストであり、ＦＰＲＬ２に対しては弱い活性しか示さない。留意すべきは、合成ヘキサペプチドＷＫＹＭＶＭおよびＷＫＹＭＶｍがＦＰＲＬ２の高親和性アゴニストとして最初に報告されたことであり、これは精製白血球集団またはＦＰＲＬ２発現ＨＬ−６０細胞に対して行われた実験に基づくものである（４０、４１）。他のデータはこれらの観察結果と矛盾し、ＲＩＮｍ５Ｆ（４０）またはＨＥＫ２９３細胞（３９）で発現されたＦＰＲＬ２に対するマイクロモル濃度域のこれらのペプチドの活性を報告している。これらの２ペプチドは、実際に、ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞においてカルシウム流入を誘発するのにマイクロモル濃度を必要とした。一方、同系において発現されたＦＰＲおよびＦＰＲＬ１に対しては、これらは低ナノモル濃度で活性であった。
【０３６６】
【表２】
2006025787.tif 000003
【０３６７】
表１．Ｆ２Ｌ、ＦＭＬＰ、ＷＫＹＭＶｍ、ＷＫＹＭＶＭおよびＳＨＡＡＧによる、ＦＰＲＬ２、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞の結合および活性化を研究した。この研究では、結合アッセイ、エクオリンに基づくアッセイおよびｃＡＭＰ蓄積の阻害を測定するアッセイを使用した。用量反応曲線のＥＣ５０およびＩＣ５０パラメータは、Graphpad Prismソフトウェアを用いる非線形回帰によって決定した。結果は、少なくとも３回の独立した実験（ｎ）について平均のｐＥＣ５０またはｐＩＣ５０（Ｍｏｌ／Ｌで示されるＥＣ５０またはＩＣ５０の−Ｌｏｇ値）±ｓ.ｅ.ｍ.を表す。ＮＴ：試験せず。
【実施例９】
【０３６８】
実施例９：抗−ＦＰＲＬ２モノクローナル抗体はヒトＦＰＲＬ２の細胞内応答を調節する
エクオリンアッセイ
機能応答の分析は、ヒトＦＰＲＬ２およびＦＰＲＬ１発現細胞において、アゴニストまたは精製モノクローナル抗体を加えた後にエクオリンの発光を記録することによって行った。簡単には、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳでプレートから細胞を回収し、ペレットにし、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中に５ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、５μＭセレンテラジンＨ（molecular probes, Inc. Eugene, OR）と室温で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中、５ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で希釈した。次いで、細胞を９６ウェルプレート中でリガンドまたは精製モノクローナル抗体と混合した。microlumat Luminometer（EG&G Berthold, マイクロプレート照度計LB 96V）を使用して発光を６０秒間記録した。
【０３６９】
実験設計
アッセイにおいて使用する試薬、リガンドおよびモノクローナル抗体（調節物質）。
エクオリン培地（発現細胞のベースライン）。
２０μＭ ＡＴＰおよび０．１％トリトン（細胞における最大発光）。
Ｆ２Ｌペプチド（配列番号１８）：（Migeotte et al. (2005) J. Exp. Med, 201: 83-93）に記載のヒトＦＰＲＬ２受容体の特異的リガンド。２つの異なるバッチＦ２Ｌ（１）およびＦ２Ｌ（２）を使用している。
ヒューマニン（Humanin）（ＨＮ（Ｎ））ペプチド（Phoenix Pharmaceuticals, Inc.）：（Masataka et al. (2004) Biochemical and Biophysical Research Communications, 324:255-261）に記載されている。このペプチドはＦＰＲＬ２およびＦＰＲＬ１のリガンドとして開示されている。
精製モノクローナル抗体（Ｍａｂ）：
１．ＦＰＲＬ２ １４５Ｃ ４Ｆ２ １Ｃ４
２．ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１
３．ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０
４．ＦＰＲＬ２と結合しない非関連抗体（コントロールＭａｂ）
抗体はAmershamプロトコルにしたがってプロテインＡセファロース４Ｂビーズで精製した（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）。抗体FPRL2 145C 4F2 1C4、FPRL2 422F 2B9 1C11およびFPRL2 422F 2G3 1A10は、ブダペスト条約の下、BCCM/LMBPプラスミドコレクション, Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに寄託されている。これらは仮受託番号LMBP 6404CB（FPRL2 145C 4F2 1C4）、LMBP 6405CB（FPRL2 422F 2B9 1C11）、およびLMBP 6406CB（FPRL2 422F 2G3 1A10）を有する。寄託の日付は２００５年４月２１日（LMBP 6404CB / FPRL2 145C 4F2 1C4)、および２００５年４月２８日（LMBP 6405CB / FPRL2 422F 2B9 1C11、およびLMBP 6406CB / FPRL2 422F 2G3 1A10）である。
【０３７０】
試薬、ペプチド性リガンドおよびモノクローナル抗体は、アッセイにおいて諸濃度で使用されている。これは表２および３に記載する通りである。各データポイントは２通りである。Ｆ２Ｌおよびヒューマニンペプチドは２．５μＭ〜０．４ｎＭの濃度で使用し、Ｍａｂは５００ｕｇ／ｍＬ〜５ｕｇ／ｍＬの濃度で使用した。ヒトＦＰＲＬ１発現細胞はＭａｂに対するネガティブコントロールとして使用した。これらの細胞の機能性はヒューマニンでコントロールされている。
【０３７１】
【表３】
2006025787.tif 000004
【０３７２】
表２：ヒトＦＰＲＬ２発現細胞を用いるエクオリンアッセイの９６ウェルプレートの図表。M1 = mAb FPRL2 145C 4F2 1C4, M2 = mAb FPRL2 422F 2B9 1C11, M3 = mAb FPRL2 422F 2G3 1A10。
【０３７３】
【表４】
2006025787.tif 000005
【０３７４】
表３：ヒトＦＰＲＬ１発現細胞を用いるエクオリンアッセイの９６ウェルプレートの図表。M1 = mAb FPRL2 145C 4F2 1C4, M2 = mAb FPRL2 422F 2B9 1C11, M3 = mAb FPRL2 422F 2G3 1A10。
【０３７５】
結果
図２２および２３のグラフは、表２に記載の９６ウェルプレートに対応する結果をＲＬＵ表示で示す。
【０３７６】
観察結果
Ｆ２ＬペプチドはヒトＦＰＲＬ２発現細胞（Ｂ１−Ｄ６）を活性化し、ヒューマニンはヒトＦＰＲＬ１（データは記載していない）およびＦＰＲＬ２発現細胞（Ｅ１−Ｆ６）をいずれも活性化し、これは細胞の機能性を示す。Ｍａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１（Ｇ５−Ｇ８およびＨ５−Ｈ８）は、明らかに、用量依存様式でのヒトＦＰＲＬ２発現細胞の活性化能を有する。Ｍａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０（Ｇ９−Ｇ１２およびＨ９−Ｈ１２）もまた、これらの細胞の活性化能を有するが、その程度は低い。コントロールＭａｂ（Ｆ７−Ｆ１２）はＦＰＲＬ２発現細胞を活性化しない。試験用Ｍａｂパネルでは、ヒトＦＰＲＬ１発現細胞に関する活性化は観察されていない（データは記載していない）。
【０３７７】
上記観察結果は、Ｍａｂ ＦＰＲＬ２ ４２２Ｆ ２Ｂ９ １Ｃ１１およびＭａｂ ４２２Ｆ ２Ｇ３ １Ａ１０がＦＰＲＬ２機能応答の誘発能を有することを示す。これらの２つのモノクローナル抗体はＦＰＲＬ２受容体と結合し、（アゴニストとして）ＦＰＲＬ２を活性化する。
【０３７８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０３７９】
【図１】図１は、ヒトＦＰＲＬ２受容体の、ｐＣＤＮＡ３中にクローニングされたヌクレオチド配列（配列番号１）およびそのアミノ酸配列（配列番号２）を表す。開始および終止コドン（codon）は太字で記載し、クローニング用の制限部位（Ｅｃｏ ＲＩおよびＸｂａＩ）には下線を付する。
【図２】図２は、ヒトＦＰＲＬ２受容体の組織分布を示す。
【図３】図３は、Ｍａｌｄｉ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計における活性フラクションの質量スペクトルを示す。主要モノアイソトピック質量を矢印で示し、その配列を記載する。
【図４】図４は、ヒトＦＰＲＬ２受容体に対するブタＨＢＰのＮ末端に相当するアセチル化２１アミノ酸ペプチド（配列番号１８）の生物学的活性を示す。
【図５】図５は、ヒトＦＰＲＬ２受容体に対するアセチル化２１アミノ酸ペプチド（配列番号１８）および非アセチル化２１アミノ酸ペプチドの生物学的活性を示す。
【図６】図６は、ヒトＦＰＲ受容体ファミリーに対するアセチル化２１アミノ酸ペプチド（配列番号１８）の生物学的活性を示す。
【図７】図７は、ＦＰＲＬ２受容体がフォルスコリン存在下でアデニル酸シクラーゼと負の共役関係にあることを示す。
【図８】図８は、本発明に記載のアミノ酸および核酸配列を列挙している（配列表）。
【図９】図９は、本発明に記載のアミノ酸および核酸配列を列挙している（配列表）。
【図１０】図１０は、本発明に記載のアミノ酸および核酸配列を列挙している（配列表）。
【図１１】図１１は、本発明に記載のアミノ酸および核酸配列を列挙している（配列表）。
【図１２】図１２は、本発明に記載のアミノ酸および核酸配列を列挙している（配列表）。
【図１３】図１３．ブタ脾臓からのＦＰＲＬ２の天然リガンドの精製。まずブタ脾臓ホモジネートをＰｏｒｏｓカラム上でのＨＰＬＣによって分画した（段階１）。吸光度（ＡＵ）およびＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する生物学的活性を示す。エクオリンに基づくアッセイにおいて測定された発光（黒色棒グラフ）を２０μＭ ＡＴＰに関して得られた応答に対してノーマライズした。Ａ１（活性１）およびＡ２（活性２）はＨＰＬＣプロファイルに関する２つの活性領域を表す。これらをともにＣ１８カラム上でプロセスした（段階２）。その後、Ａ１およびＡ２を別々に、ＳＥＣカラム（段階３）、Ｃ４カラム（段階４）上で精製し、そしてＡ１に関しては、最後にＣ１８カラム上で精製した（段階５）。Ｘ軸は目的の領域に合わせて拡大してある。
【図１４】図１４．ＦＰＲＬ２の高親和性天然リガンドとしてＦ２Ｌの同定。Ａ．段階４から得られた未消化フラクションＡ２の質量分析による解析。Ｍａｌｄｉ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計を使用。Ｂ．トリプシン消化Ａ１（段階５）およびＡ２（段階４）フラクション、または未消化Ａ２の質量スペクトルの主要ピークに対応する配列。すべてのマイクロシークエンシングされたペプチドは、ブタヘム結合タンパク質（ＨＢＰ）由来であることがわかった。Ｆ２Ｌペプチド（Ａ２フラクション）はアミノ末端がアセチル化されている。Ａｃ：アセチル。Ｃ．ヒト、マウスおよびブタＨＢＰのアミノ酸配列アライメント。Ｆ２Ｌペプチドに相当する配列（太字で表す）はヒトおよびブタＨＢＰで同一である。フラクションＡ１から回収されたトリプシンペプチドを含有する領域をボックスで示す（ヒトＨＢＰ：ＮＭ ０１５９８７；マウスＨＢＰ：ＮＭ ０１３５４６）。
【図１５】図１５．ＦＰＲＬ２の高親和性天然リガンドとしてＦ２Ｌの同定。Ｄ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、標準のアプロチニン１０、５０および１００ｎｇとともにＡ１フラクション（段階５）を泳動した。ゲルを銀染色し、主要バンド（６ｋＤ）がペプチド約３００ｎｇを含有することを概算した。Ｅ．ヒトＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＡ１フラクションの生物学的活性。エクオリンに基づくアッセイを使用。Ｆ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、標準のアプロチニン１０および５０ｎｇとともにＡ２フラクション（段階４）を泳動した。ゲルを銀染色し、Ｆ２Ｌ（３ｋＤ）の量が４０ｎｇであることを概算した。Ｇ．ヒトＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＦ２Ｌ（Ａ２、段階４）の生物学的活性。エクオリンに基づくアッセイを使用。
【図１６】図１６．ホルミルペプチド受容体の薬理学。Ａ．ＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する、Ｆ２Ｌ（◇）、ＦＭＬＰ（■）、ＷＫＹＭＶｍ（▲）、ＷＫＹＭＶＭ（▼）およびＳＨＡＡＧ（●）ペプチドの濃度作用曲線。エクオリンに基づくアッセイを使用。結果は２０μＭ ＡＴＰによって誘発された応答の％として示す。Ｂ．３受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する、同ペプチドの濃度作用曲線。ｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用。結果は１０μＭ フォルスコリン存在下かつアゴニスト不存在下で得られたｃＡＭＰレベルの％として示す。ＦＳＫ：フォルスコリン。
【図１７】図１７．ホルミルペプチド受容体の薬理学。Ｃ．ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する飽和結合アッセイ（特異的結合）。カルボキシ末端に［１２５Ｉ］−Ｔｙｒを有するＦ２Ｌをトレーサーとして使用。Ｄ．ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する競合結合アッセイ。トレーサーとしてＦ２Ｌ−［１２５Ｉ］Ｔｙｒ、競合物としてＦ２Ｌを使用。Ｅ．およびＦ．ＦＰＲＬ１（Ｅ）およびＦＰＲ（Ｆ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する競合結合アッセイ。トレーサーとして［１２５Ｉ］−ＷＫＹＭＶｍ、競合物としてＷＫＹＭＶｍ（▲）またはＦ２Ｌ（◇）を使用。Ｇ．１００ｎｇ／ｍＬ百日咳毒素の不存在または存在下で培養されたＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＦ２Ｌによる刺激。エクオリンに基づくアッセイを使用。Ｈ．ＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する、アセチル化（◇）、非アセチル化（○）および［７−２１］Ｆ２Ｌ（□）ペプチドの濃度作用曲線。エクオリンアッセイを使用。
【図１８】図１８．ホルミルペプチド受容体の薬理学。Ｉ．Ｆ２Ｌで１０分間刺激した後のＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１／２の免疫検出。Ｊ．１００ｎＭ Ｆ２Ｌによって刺激した後のＥＲＫ１／２活性化の動態（Kinetics）。Ａ〜Ｉに示す各実験は少なくとも３回繰り返した。
【図１９】図１９．ヒトＦＰＲＬ２の発現プロファイル。Ａ．１セットのヒト白血球集団において、ＲＴ−ＰＣＲにより、ヒトＦＰＲＬ２をエンコードする転写物を増幅した。ａｃｔ．：活性化。Ｍｏｎｏｎｕｃｌ．：単核細胞。ｉＤＣ：未成熟樹状細胞。ｍＤＣ：成熟樹状細胞。Ｂ．１セットのヒト組織におけるＦＰＲＬ２の分布。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）を使用。データは、コントロールとして使用したＧＡＰＤＨの発現に関してノーマライズした。
【図２０】図２０．ヒトＦＰＲＬ２の発現プロファイル。Ｃ．ＦＰＲ、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＦＡＣＳによって、抗−ＦＰＲＬ２モノクローナル抗体を特徴付けした。１Ｃ４：太実線。１Ｄ２：点線。１Ｅ１：破線。コントロール標識（ＩｇＧ２ａ）：細実線。１Ｄ２および１Ｅ１のプロファイルは重ね合わせてあり、したがって区別できない。Ｄ．未成熟ＤＣに対するＦＡＣＳによってＦＰＲＬ２の発現を解析した。この解析では３つのモノクローナル抗体を使用した。抗−ＦＰＲＬ２ Ａｂｓ：太実線。コントロール標識（ＩｇＧ２ａ）：細実線。Ｅ．無傷および浸透化処理ＤＣ上のＦＰＲＬ２の発現。１Ｄ２を使用。１Ｄ２：太実線。コントロール標識（ＩｇＧ２ａ）：細実線。Ｆ．未成熟（太実線）および成熟（細実線）ＤＣ上のＦＰＲＬ２の発現。１Ｄ２を使用。コントロール標識（ＩｇＧ２ａ）：点線。
【図２１】図２１．一次免疫細胞に対するＦ２Ｌの生物学的活性。Ａ．およびＢ．諸濃度のＦ２Ｌ（Ａ）および１０ｎＭのＦＭＬＰ（Ｂ）に応答した、単球由来ＤＣにおけるＣａ２＋流動の記録。Ｃ．１００ｎＭおよび１μＭのＦ２Ｌに応答した、単球におけるＣａ２＋流動の記録。Ｄ．およびＥ．Ｆ２Ｌに応答した、単球由来ヒト未成熟ＤＣ（Ｄ）および末梢血単核細胞（Ｅ）の走化性。応答の表示は、被験５のうち、４ドナーの典型である。
【図２２】図２２．ヒトＦＰＲＬ２発現細胞に対するエクオリンアッセイのコントロール。（Ａ１−Ａ２：エクオリン培地、Ａ３−Ａ４：２０μＭ ＡＴＰ、Ａ５−Ａ６：０．１％トリトン）（スケール：１５０ ０００相対光単位（ＲＬＵ））。各応答グラフは、表２におけるＦＰＲＬ２の９６ウェルプレート上の指定位置に対応する。
【図２３】図２３．ヒトＦＰＲＬ２発現細胞に対するエクオリンアッセイでの、機能性モノクローナル抗体およびリガンド。スケール：５０ ０００ＲＬＵ。各応答グラフは、表２におけるＦＰＲＬ２の９６ウェルプレート上の指定位置に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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