(57)【要約】      （修正有） 【課題】  優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有するＴＮＦ−α阻害剤を提供する。【解決手段】  白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物を主成分とすることを特徴とするＴＮＦ−α阻害剤。 【効果】   本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、優れたＴＮＦ−α阻害作用を示すため、ＴＮＦ−αの過剰な産生が引き起こす組織障害やさまざまな病気（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、悪液質、急性感染症、アレルギー、発熱、貧血、糖尿病、破骨細胞形成、緑内障など。）や疼痛の治療および予防効果が期待できる。さらに本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、高い安全性を有するため、長期連用しても人体に有害な作用を及ぼさない利益がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物を主成分とすることを特徴とするＴＮＦ−α阻害剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＮＦ−α阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ−α（Tumor Necrosis Factor-α：腫瘍壊死因子）は、炎症を通した生体防御・免疫機構に広く関わるサイトカインとして認識されている（例えば、特許文献１参照。）。そして、ＴＮＦ−αの過剰な産生が組織障害やさまざまな病気（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、悪液質、急性感染症、アレルギー、発熱、貧血、糖尿病など。）を引き起こす原因となることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、ＴＮＦ−αが自己免疫性疾患である慢性関節リウマチおよびクローン病の発症に重要な役割を果たしていることも知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００３】
このようなことから、ＴＮＦ−α阻害剤は、上記した疾患の治療に有効であると期待され、様々な化合物（例えば、６−フェニルテトラヒドロ−１，３−オキサジン−２−オン誘導体、側鎖に硫黄原子を有するウレア誘導体、ベンゾヘテロ環化合物、１，３−チアゾール化合物、メタロプロテアーゼ阻害剤、シクロスポリンＡなど。）についてのＴＮＦ−α阻害活性が研究されている（例えば、非特許文献１および２ならびに特許文献１〜７参照。）。
なお、ＴＮＦ−α阻害剤は、疼痛に対しても優れた予防・治療効果を発揮し、また、破骨細胞の活性化を抑制し、破骨細胞の形成を阻害することも知られている（例えば、特許文献６参照。）。また、ＴＮＦ−α阻害剤は、緑内障の治療にも使用できることが知られている（例えば、特許文献７参照。）。
【０００４】
白鶴霊芝（Rhinacanthus nasuta（L.）Kurz）は、インド南部デカン高原の原産とされるリナカンサス属きつねのまご科に属する常緑小低木であり、その全草（リナカンツス草）は駆虫、消炎、皮膚真菌に対する抗菌作用のあることが知られ（例えば、非特許文献３参照。）、主に中国、台湾等において、また最近では日本国においても漢方薬として用いられている。その他、本出願人による以前の出願で、白鶴霊芝に活性酸素消去能があること（特許文献８参照。）、排泄促進作用があること（特許文献９参照。）、抗アレルギー作用があること（特許文献１０参照。）および抗悪性腫瘍作用があること（特許文献１１参照。）が開示されている。しかしながら、この白鶴霊芝乃至白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物にＴＮＦ−α阻害作用があることは知られていない。 
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−５３５５５号
【特許文献２】特開２００３−３００８８４号
【特許文献３】特開２０００−４４５３３号
【特許文献４】特開２０００−１１９２４９号
【特許文献５】特開平８−７３４５３号
【特許文献６】特開２００３−６３９９３号
【特許文献７】特表平９−５０８１１５号
【特許文献８】特開平９−１４３０９１号
【特許文献９】特開平９−１６９６６２号
【特許文献１０】特開２００１−１０９６４号
【特許文献１１】特開２００２−５３４８１号
【非特許文献１】山崎、臨床免疫, 27および1270, 1995
【非特許文献２】Andreas Eigler et al., Immunology Today, 18, 487, 1997
【非特許文献３】原色牧野和漢薬草大図鑑、４９２頁、北隆館、１９８８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は、ＴＮＦ−α阻害作用を有する物質につき鋭意研究の結果、従来漢方薬などとして使用されている白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物が有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。 
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物を主成分とすることを特徴とするＴＮＦ−α阻害剤である。 
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明のＴＮＦ−α阻害剤を、発明を実施するための最良の形態に基づいてさらに詳細に説明する。
【０００９】
本発明のＴＮＦ−α阻害剤に使用する白鶴霊芝は、市販されている葉、全草、根もしくは茎、またはこれらの混合物を使用することができる。これらを天日乾燥および／またはドラム乾燥し、粉砕機にかけて１２メッシュ以上に粉砕して使用することも好ましい。白鶴霊芝は、必要により、天日乾燥および／またはドラム乾燥したものをさらに焙煎器により焙煎したものを使用することもできる。 
【００１０】
本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、このようにして得られた白鶴霊芝を水および／または有機溶媒で抽出して製造される。 
【００１１】
抽出に使用する溶媒としては、水および有機溶媒が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。水には冷却水、常温水および熱水が包含される。
【００１２】
抽出に使用する有機溶媒としては、エタノール、メタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ベンゼン等のフェノール類、ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類等が挙げられるが、エタノールおよびメタノールが特に好ましい。
【００１３】
抽出は、粉砕した白鶴霊芝に５倍量から５０倍量の水または有機溶媒を加えて、放置、振とう、撹拌または還流しつつ行う。抽出は、０℃から１３０℃の温度で行うことができるが、室温から１１０℃の温度で行うことが好ましい。抽出に要する時間は、抽出温度および白鶴霊芝の粉砕状態にもよるが、通常３０分から６時間程度である。
【００１４】
抽出後、デカンテーシヨン、遠心分離、減圧濾過等の慣用手段を用いて、無臭乃至僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた透明で緑褐色乃至黒褐色の液体が得られる。これをそのまままたはさらに濾過、遠沈、その他の方法で精製したものを本発明のＴＮＦ−α阻害剤として使用することができる。
また、これを適度に濃縮して得られる濃縮液を本発明のＴＮＦ−α阻害剤として使用することもできる。
また、この濃縮液をさらに凍結乾燥、減圧濃縮乾固、スプレードライ、蒸留乾固等の乾燥手段で処理して得られる微粉末を本発明のＴＮＦ−α阻害剤として使用することもできる。
【００１５】
本発明のＴＮＦ−α阻害剤においては、上記した白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物に加えて、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、食品、医薬部外品、医薬品等に一般に用いられる各種成分、すなわち水性成分、粉末成分、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、香料、色素等を配合することもできる。これにより、本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、食品、医薬部外品、医薬品等の広範な用途に用いることができるようになる。
【実施例】
【００１６】
実施例１
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝の根を粉砕機にて粉砕し、得られた粉砕物を篩にかけて１２メッシュで分級して白鶴霊芝根粉砕物を得た。この白鶴霊芝根粉砕物１ｋｇを９０％エタノール１０Ｌで３時間還流下に２回抽出し、得られた抽出液を５５℃〜６０℃で減圧下に約１０分の１量に濃縮後、加圧濾過した。濾液を９０℃〜９５℃で加熱滅菌後、減圧下に濃縮乾固し、微粉末状の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物８５．５ｇを得た。
【００１７】
実施例２
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝の葉を粉砕機にて粉砕し、焙煎器にて焙煎後、さらに粉砕し、得られた粉砕物を篩にかけて１２メッシュで分級して白鶴霊芝葉粉砕物を得た。この白鶴霊芝葉粉砕物１ｋｇを９０℃の熱水２５Ｌで２時間、２回抽出し、得られた抽出液を５５℃〜６０℃で減圧下に約１０分の１量に濃縮後、加圧濾過した。濾液を９０℃〜９５℃で加熱滅菌後、減圧下に濃縮乾固し、微粉末状の白鶴霊芝葉熱水抽出物３１０ｇを得た。
【００１８】
実施例３
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝の全草を粉砕機にて粉砕し、得られた粉砕物を篩にかけて１２メッシュで分級して白鶴霊芝全草粉砕物を得た。この白鶴霊芝全草粉砕物１ｋｇを９０℃の熱水２５Ｌで２時間、２回抽出し、得られた抽出液を５５℃〜６０℃で減圧下に約１０分の１量に濃縮後、加圧濾過した。濾液を９０℃〜９５℃で加熱滅菌後、減圧下に濃縮乾固し、微粉末状の白鶴霊芝全草熱水抽出物１８０ｇを得た。
【００１９】
実施例４
実施例１と同様にして得られた白鶴霊芝根粉砕物２．５ｇを９０％エタノール１００ｍｌに浸漬、濾過して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた黒褐色の液状の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物を得た。
【００２０】
実施例５
実施例２と同様にして得られた白鶴霊芝葉粉砕物２．５ｇを９０℃の熱水１００ｍｌに浸漬、濾過して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の液状の白鶴霊芝葉熱水抽出物を得た。
【００２１】
実施例６
実施例３と同様にして得られた白鶴霊芝全草粉砕物２．５ｇを９０℃の熱水１００ｍｌに浸漬、濾過して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の液状の白鶴霊芝全草熱水抽出物を得た。
【００２２】
試験例１
実施例１で得られた微粉末状の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物を用いてＴＮＦ−α阻害作用および毒性を評価した。
【００２３】
Ａ．ＴＮＦ−α阻害作用の評価
１．肥満細胞の刺激
（１）抗原およびＩｇＥを用いた肥満細胞の刺激
ラットの肥満細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（細胞番号：ＪＣＲＢ００２３））(１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ) を、マウス抗ＤＮＰ特異的ＩｇＥモノクローナル抗体にて１８時間感作した。次に、遠心分離後、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓバッファー（０．０４％のＢＳＡおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。) により複数回洗浄した。次に、この細胞を９６ウェルプレートに入れ、表１に示す量のＤＮＰ−ＨＳＡ(human serum albumin)および微粉末状の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物を含む溶液を加えて２４時間刺激した。
【００２４】
【表１】
2006052145.tif 000002
【００２５】
（２）イオノマイシンを用いた肥満細胞の刺激
ラットの肥満細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３(１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ) ）を９６ウェルプレートに入れ、表２に示す量のイオノマイシンおよび微粉末状の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物を加えて２４時間刺激した。
【００２６】
【表２】
2006052145.tif 000003
【００２７】
２．ＴＮＦ−α阻害作用
（１）ＴＮＦ−α阻害作用の評価方法
ＴＮＦ−α阻害作用の評価は、上記１．の（１）および（２）のそれぞれについて、２４時間の刺激の後、上記した各９６ウェルプレートを遠心分離にかけ、上清を回収し、上清中のＴＮＦ−αの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定することにより行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定は、米国Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems Inc.）のキットを用いて、付属のプロトコルに従って行った。その概要は以下の通りである。
【００２８】
まず、あらかじめＴＮＦ−αに対するポリクローナル抗体でコートされたキット付属の９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、回収した上清を５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。
次に、各ウェルの中の液体を除去し、キット付属の洗浄液により各ウェルを５回洗浄した後、キット付属の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が付加された、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体を含む液を各ウェルに１００μｌ加え、室温で２時間反応させた。
【００２９】
次に、各ウェルの中の液体を除去し、キット付属の洗浄液により各ウェルを洗浄した後、キット付属の発色液を加えて室温で３０分間反応させ、その後、キット付属の反応停止液（hydrochloric acid）を加えて反応を停止させた。
得られた試料について、マイクロプレートリーダー（米国モレキュラーデバイス社（Molecular Device Corporation）製）を用いて、４５０ｎｍ（参照波長は５４０ｎｍ。）における吸光度を測定し、標準曲線からＴＮＦ−αの濃度を算出した。
【００３０】
（２）評価結果
評価結果を図１および図２に示す。図１は、上記１．の（１）（抗原およびＩｇＥを用いて肥満細胞を刺激した場合）における、肥満細胞からのＴＮＦ−αの放出量と白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物の添加量との関係を示す図である。図２は、上記１．の（２）（イオノマイシンを用いて肥満細胞を刺激した場合）における、肥満細胞からのＴＮＦ−αの放出量と白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物の添加量との関係を示す図である。
【００３１】
図１および図２に示すように、実施例１における白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物は、優れたＴＮＦ−α阻害作用を有することがわかった。
【００３２】
３．免疫抑制剤シクロスポリンＡとの比較
白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物のＴＮＦ−α阻害作用と、免疫抑制剤シクロスポリンＡのＴＮＦ−α阻害作用との比較を行った。比較は、表３に示す量のＤＮＰ−ＨＳＡ(human serum albumin)を用いた場合について行った。
【００３３】
【表３】
2006052145.tif 000004
【００３４】
図３は、白鶴霊芝のＴＮＦ−α阻害作用と免疫抑制剤シクロスポリンＡのＴＮＦ−α阻害作用との関係を示す図である。
図３に示すように、実施例１における白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物は、免疫抑制剤シクロスポリンＡと同様に優れたＴＮＦ−α阻害作用を有することがわかった。
【００３５】
Ｂ．毒性の評価
毒性の評価は、ラットの肥満細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３)に表４に示す濃度の白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物を添加して２４時間の培養を行った後、ＭＴＳ試薬を加えさらに２時間の培養を行い、その後、マイクロプレートリーダー（テカン ジャパン社製）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。
【００３６】
【表４】
2006052145.tif 000005
【００３７】
その結果、試料Ｎｏ．１乃至試料Ｎｏ．５におけるＭＴＳ結果から、白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物は、肥満細胞に対する毒性が極めて低いことがわかった。
【００３８】
Ｃ．試験例１のまとめ
以上より、白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物は、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有する、優れたＴＮＦ−α阻害剤であることがわかった。
【００３９】
試験例２
実施例１で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に代えて、実施例２で得られた白鶴霊芝葉熱水抽出物を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、ＴＮＦ−α阻害作用および毒性を評価した。
その結果、実施例２で得られた白鶴霊芝葉熱水抽出物は、実施例１の場合と同様に、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有することがわかった。
【００４０】
試験例３
実施例１で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に代えて、実施例３で得られた白鶴霊芝全草熱水抽出物を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、ＴＮＦ−α阻害作用および毒性を評価した。
その結果、実施例３で得られた白鶴霊芝全草熱水抽出物は、実施例１の場合と同様に、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有することがわかった。
【００４１】
試験例４
実施例１で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に代えて、実施例４で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出液を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、ＴＮＦ−α阻害作用および毒性を評価した。
その結果、実施例４で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出液は、実施例１の場合と同様に、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有することがわかった。
【００４２】
試験例５
実施例１で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に代えて、実施例５で得られた白鶴霊芝葉熱水抽出液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ＴＮＦ−α阻害作用および毒性を評価した。
その結果、実施例５で得られた白鶴霊芝葉熱水抽出液は、実施例１の場合と同様に、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有することがわかった。
【００４３】
試験例６
実施例１で得られた白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に代えて、実施例６で得られた白鶴霊芝全草熱水抽出液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ＴＮＦ−α阻害作用を評価した。
その結果、実施例６で得られた白鶴霊芝全草熱水抽出液は、実施例１の場合と同様に、優れたＴＮＦ−α阻害作用および高い安全性を有することがわかった。
【００４４】
以上説明したように、本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、優れたＴＮＦ−α阻害作用を有するため、ＴＮＦ−αの過剰な産生が引き起こす組織障害やさまざまな病気（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、悪液質、急性感染症、アレルギー、発熱、貧血、糖尿病など。）の治療および予防効果が期待できる。また、本発明のＴＮＦ−α阻害剤は、高い安全性を有するため、長期連用しても人体に有害な作用を及ぼさない利益がある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】抗原およびＩｇＥを用いて肥満細胞を刺激した場合の、肥満細胞からのＴＮＦ−α放出量と白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に含まれる白鶴霊芝濃度との関係を示す図である。
【図２】イオノマイシンを用いて肥満細胞を刺激した場合の、肥満細胞からのＴＮＦ−α放出量と白鶴霊芝根９０％エタノール抽出物に含まれる白鶴霊芝濃度との関係を示す図である。
【図３】抗原およびＩｇＥを用いて肥満細胞を刺激した場合の、白鶴霊芝のＴＮＦ−α阻害作用と免疫抑制剤シクロスポリンのＴＮＦ−α阻害作用との関係を示す図である。
【図１】
2006052145.tif 000006
【図２】
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【図３】
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