(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドであるポリペプチドの提供。【解決手段】前記目的を達成するために、ポリペプチドは、ＷＴ１由来のポリペプチドであって、特定のアミノ酸配列からなるＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドである。ポリペプチドにより活性化されるＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、白血病細胞上のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合したポリペプチドを認識し、この白血病細胞に対し、直接、ＨＬＡクラスＩＩ拘束的に細胞傷害性を示す。ポリペプチドは、例えば、細胞免疫療法、ワクチン療法、遺伝子治療等の、白血病を含む悪性腫瘍に対する免疫療法の分野で有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１）配列番号１〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上であるポリペプチド。
（３）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することでＣＤ４+Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチド。
【請求項２】
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子のＨＬＡ遺伝子型が、ＨＬＡ−ＤＰ５である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
免疫療法に用いる医薬組成物であって、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載のベクター、又はこれらの誘導体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ＣＤ４+Ｔ細胞の製造方法であって、患者からリンパ球を採取する工程、及び、前記リンパ球と、抗原提示細胞と、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又はその誘導体とをインキュベーションする工程を含む製造方法。
【請求項７】
ＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法であって、患者からリンパ球を採取する工程、及び、前記リンパ球と、抗原提示細胞と、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又はその誘導体とをインキュベーションする工程を含む製造方法。
【請求項８】
樹状細胞の製造方法であって、患者から樹状細胞を採取する工程、及び、前記樹状細胞と、請求項１若しくは２に記載のポリペプチド又はその誘導体とをインキュベーションする工程を含む製造方法。
【請求項９】
樹状細胞の製造方法であって、患者から樹状細胞を採取する工程、及び、前記樹状細胞に、請求項４に記載のベクターを導入する工程を含む製造方法。
【請求項１０】
免疫療法に用いる医薬組成物であって、請求項６に記載の製造方法により製造されたＣＤ４+Ｔ細胞、請求項７に記載の製造方法により製造されたＣＤ８+Ｔ細胞、及び、請求項８又は９に記載の製造方法により製造された樹状細胞からなる群から選択される少なくとも１つ以上の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＤ４+Ｔ細胞株であって、請求項１又は２に記載のポリペプチドに特異的に反応して増殖するＣＤ４+Ｔ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１遺伝子は、ウイルムス（Wilms）腫瘍の患者の染色体１１ｐ１３における原因遺伝子として単離されたジンクフィンガー（zinc finger）型の転写因子であり（特許文献１参照）、その遺伝子産物であるＷＴ１タンパク質は、抑制領域（repression domain）、活性化領域（activation domain）およびジンクフィンガーからなる構造を有している。
【０００３】
ＷＴ１タンパク質は、正常細胞では、ほとんど発現せず、悪性腫瘍に特異的に発現することが知られている。その中でも、ＷＴ１タンパク質は、特に、ほとんどの白血病の場合に発現する。このような特徴に基づき、ＷＴ１遺伝子及びＷＴ１タンパク質は、白血病や固形がんを含むがんの検出方法や診断方法（特許文献２及び３参照）の他、がんの治療効果や予後の判定方法（特許文献４参照）にも、標的遺伝子・標的タンパク質として利用されている。
【０００４】
さらに、近年になり、ＷＴ１を悪性腫瘍の標的抗原として利用する免疫療法が注目されつつあり、複数のグループにより、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞が認識するＷＴ１由来の抗原ペプチド（エピトープ）が同定されている（例えば、特許文献５参照）。ＷＴ１抗原ペプチドによって体内外で誘導されるＷＴ１特異的ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞は、効率よく白血病細胞や固形腫瘍細胞を破壊することができる。このような知見に基づき、例えば、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドをワクチンとして用いるがんの免疫ワクチン療法や、前記ＷＴ１特異的抗原ペプチド利用して体外で製造したＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を患者の体内に戻す細胞免疫療法等の試みが始められている。
【０００５】
他方、ＣＤ４+Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識する。ＷＴ１等の腫瘍関連抗原に特異的なＣＤ４+Ｔ細胞は、悪性腫瘍や感染病に対する宿主の免疫応答を調節する中心的役割を担っていることが知られている。その重要性にもかかわらず、ＨＬＡクラスＩ拘束性の腫瘍関連抗原エピトープに比べ、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性の腫瘍関連抗原エピトープの同定は、ほとんど行われていない。このことは、ＷＴ１タンパク質についても当てはまる。
【特許文献１】米国特許第５，３５０，８４０号
【特許文献２】ＷＯ９７／３９３５４号パンフレット
【特許文献３】特開２０００−３０８５００号公報
【特許文献４】特開２００２−４８７９３号公報
【特許文献５】特表２００２−５２５０９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドであるポリペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のポリペプチドは、下記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドである。
（１）配列番号１〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上であるポリペプチド。
（３）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＨＬＡクラスＩＩ分子上と結合することでＣＤ４+Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者は、免疫療法におけるＣＤ４+Ｔ細胞の重要性を鑑み、鋭意研究を重ね、ＣＤ４+Ｔ細胞に認識されうるＷＴ１タンパク質に特異的なＨＬＡクラスＩＩ拘束性抗原ペプチド（ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチド）を同定し、このＷＴ１抗原ペプチドによれば、ＷＴ１特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進できること見出した。そして、さらに研究を重ねた結果、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞がＴH１サイトカインを産生できること、さらに、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞それ自体が、白血病細胞等に対してＨＬＡクラスＩＩ拘束性の細胞傷害性を示すこと見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明のポリペプチドによれば、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進できるから、本発明のポリペプチドは、例えば、白血病を含む悪性腫瘍に対するワクチン療法に利用できる。
【００１０】
本発明のポリペプチドを、例えば、患者から取り出したリンパ球及び抗原提示細胞と共培養することで、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を製造できる。前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、白血病細胞に対して、直接、細胞傷害性を示す。このＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞による白血病細胞に対する細胞傷害性機能は、本発明者が初めて見出した機能である。よって、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を患者の体内に戻すことにより、白血病を含む悪性腫瘍に対するより効果的な細胞免疫療法が可能となる。
【００１１】
また、樹状細胞等の抗原提示細胞表面上のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合した本発明のポリペプチドが、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞により認識されることで、前記抗原提示細胞自体が活性化され、より効率的にＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を製造できる。よって、例えば、本発明のポリペプチドを、患者から取り出したリンパ球及び抗原提示細胞と共培養することで、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を製造できる。前記ＷＴ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を患者の体内に戻すことにより、白血病を含む悪性腫瘍に対する細胞免疫療法が可能となる。
【００１２】
さらにまた、本発明のポリペプチドを、例えば、患者から取り出した樹状細胞と共培養することで、本発明のポリペプチドを抗原提示する樹状細胞を製造することができる。この樹状細胞によれば、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を活性化し、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化できる。そして、前記樹状細胞を患者の体内に戻すことにより、白血病を含む悪性腫瘍に対するより効果的な細胞免疫療法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のポリペプチドが提示されるＨＬＡクラスＩＩ分子のＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ−ＤＰ５であることが好ましい。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１５】
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１６】
本発明の第１の医薬組成物は、免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、又は、これらの誘導体を含む医薬組成物である。
【００１７】
本発明のＣＤ４+Ｔ細胞の製造方法は、患者からリンパ球を採取する工程、及び、前記リンパ球と、抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドとをインキュベーションする工程を含む製造方法である。
【００１８】
本発明のＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法は、患者からリンパ球を採取する工程、及び、前記リンパ球と、抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドとをインキュベーションする工程を含む製造方法である。
【００１９】
本発明の樹状細胞の製造方法は、患者から樹状細胞を採取する工程、及び、前記樹状細胞と、本発明のポリペプチドとをインキュベーションする工程を含む製造方法である。その他の態様として、本発明の樹状細胞の製造方法は、患者から樹状細胞を採取する工程、及び、前記樹状細胞に、本発明のベクターを導入する工程を含む製造方法である。
【００２０】
本発明の第２の医薬組成物は、免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のＣＤ４+Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＤ４+Ｔ細胞、本発明のＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＤ８+Ｔ細胞、及び、本発明の樹状細胞の製造方法により製造された樹状細胞の少なくとも１つを含む医薬組成物である。
【００２１】
本発明のＣＤ４+Ｔ細胞株は、本発明のポリペプチドに特異的に反応して増殖するＣＤ４+Ｔ細胞株である。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＰ５型のＨＬＡクラスＩＩ分子上に結合してＣＤ４+Ｔ細胞により特異的に認識されうるＷＴ１タンパク質の抗原ペプチドである。
【００２３】
本発明において、「抗原ペプチド」とは、抗原決定基（エピトープ）を構成するポリペプチドをいう。前記抗原ペプチドは、抗原決定基の最小単位である必要はなく、例えば、８〜２６個、９〜２４個、１０〜２２個又は１１〜２０個の範囲のアミノ酸により構成されるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
本発明において、「ＨＬＡクラスＩＩ分子上に結合してＣＤ４+Ｔ細胞により特異的に認識される」とは、例えば、あるポリペプチドが、樹状細胞等の抗原提示細胞表面のＨＬＡクラスＩＩ分子上に、適切な補助刺激因子とともに提示された場合、特異的にＣＤ４+Ｔ細胞を活性化しうること、又は、あるポリペプチドがマクロファージやＢ細胞の細胞表面上のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合した場合に、前記マクロファージやＢ細胞が、特異的なＣＤ４+Ｔ細胞によって活性化されうることをいう。
【００２５】
本発明のポリペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との結合は、特に制限されず、細胞内部で発現されたポリペプチド、又は、飲食作用により細胞内部に取り込まれたポリペプチドが、細胞内でＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する場合であってもよく、又は、既に細胞表面に存在するクラスＩＩ分子に、細胞外に存在するポリペプチドが直接結合する場合であってもよい。
【００２６】
本発明において、ＨＬＡクラスＩＩ分子とは、ヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子に対応する分子であり、ＨＬＡ−ＤＰ型とは、ＨＬＡクラスＩＩ分子が、ＨＬＡクラスＩＩ分子のアロ抗原型がＤＰ型であること、すなわち、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子の遺伝子産物であることをいい、ＨＬＡ−ＤＰ５型とは、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰ５（ＨＬＡ−ＤＰＢ１*０５０１）であることをいう。なお、日本人におけるＨＬＡ−ＤＰ５のＨＬＡ遺伝子頻度は、約５０％を占めるといわれる。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、配列番号１〜３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。配列番号１のアミノ酸配列は、ＷＴ１タンパク質（アクセッション番号ＡＡＯ６１０８８）の３３６番目〜３５５番目のアミノ酸配列に相当する。配列番号２〜１０のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側から１アミノ酸づつ欠失させていった配列に相当する。配列番号１１のアミノ酸配列は、ＷＴ１タンパク質の３３７番目〜３５５番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号１２〜２０のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列のＣ末端側から１アミノ酸づつ欠失させていった配列に相当する。配列番号２１のアミノ酸配列は、ＷＴ１タンパク質の３３８番目〜３５５番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号２２〜３０のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２１のアミノ酸配列のＣ末端側から１アミノ酸づつ欠失させていった配列に相当する。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相同なポリペプチドを含む。ここで、アミノ酸配列が「相同」であるとは、その機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。例えば、アミノ酸配列に、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加による相違があるとしても、これらが本発明のポリペプチドの機能に影響を与えないならば、両者は相同であるといえる。また、相違するアミノ酸の残基数としては、例えば、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、２つ以上のアミノ酸配列において、例えば、８０％、８４％、８８％、９２％、９６％の同一性又は類似性を示す場合、これらは相同であるといえる。前記同一性及び類似性は、２以上の塩基配列又はアミノ酸配列間で、これらの配列を比較して決定される関係をいう。同一性が、アライメントされた場合の同一文字列の割合を示すのに対し、類似性は、同一文字に加え、同類置換された文字も含む。同一性及び類似性は、従来公知の様々なコンピュータープログラムにより、容易に決定できる。
【００２９】
本発明のポリペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成装置により製造してもよく、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の適当な宿主に導入して生物学的に製造してもよい。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３１の塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む。前記配列番号３１の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２〜３０のアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドの塩基配列は、前記配列番号３１の塩基配列を参照すれば、容易に決定できる。すなわち、欠失しているアミノ酸に対応する３つのヌクレオチドを配列番号３１の塩基配列から削除すればよい。
【００３１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜３０のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相同な塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの塩基配列が「相同」であるとは、前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが、本発明のポリペプチドとしての機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。例えば、塩基配列に、点変異、欠失又は付加による相違があるとしても、これらが前記遺伝子の機能に影響を与えないならば、両者は相同であるといえる。相違する塩基数としては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、２つ以上の配列において、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは約９９％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、２つのポリヌクレオチドの一方が、他方の相補配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。前記Ｔｍは、例えば、下記式により求められる。
Ｔｍ＝８１.５−１６.６(ｌｏｇ10[Ｎａ+]）＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−(６００/Ｎ）
上記式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成して製造してもよく、又は、公知のＷＴ１遺伝子に基づき設計したプライマーを使用して各種遺伝子増幅法により製造し、若しくは、適当なベクターにクローニングできる。
【００３３】
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、発現ベクターであることが好ましく、本発明のポリヌクレオチドが、本発明のベクターが導入される宿主細胞内で発現可能に連結されていることが好ましい。本発明のベクターの種類は、特に制限されず、例えば、ウイルスベクターであってよく、プラスミドベクターであってもよい。
【００３４】
本発明の第１の医薬組成物は、本発明のポリペプチド、その誘導体、又は、本発明のベクターそのものであってもよく、さらに、薬学的に許容できるアジュバンド、キャリア又は賦形剤を含んでもよい。また、本発明のポリペプチドの誘導体としては、特に制限されず、従来公知の修飾方法により修飾されたもの、例えば、塩、糖鎖修飾されたもの、脂質化されたもの等が含まれる。
【００３５】
本発明のポリペプチドを含む第１の医薬組成物は、ワクチンとして患者に有効量投与することを含む悪性腫瘍のワクチン療法に使用できる。前記ワクチンが投与された患者の体内において、本発明のポリペプチドが、例えば、樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれ、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合して前記抗原提示細胞上に抗原提示されると、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞が増殖刺激されて活性化される。一方、抗原提示細胞表面上のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合した本発明のポリペプチドが前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞に認識されることで、前記抗原提示細胞自体も活性化され、これにより、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞が増殖刺激されて活性化されることとなる。活性化された前記ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞は、前記患者の体内で、ＷＴ１を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。これにより、悪性腫瘍の治療が可能になる。
【００３６】
さらに、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞が、悪性腫瘍細胞に対してＨＬＡクラスＩＩ拘束性の細胞傷害を示しうることを、本発明者が初めて見出した。すなわち、本発明のポリペプチドを含む第１の医薬組成物を利用したワクチンによれば、ＷＴ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害性と、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞傷害性との相乗効果により、より効果的な悪性腫瘍の治療が可能となる。
【００３７】
本発明のポリペプチドを含む第１の医薬組成物をワクチンとして使用する場合、ＷＴ１特異的ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原ペプチド（ＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチド）を併用することが好ましい。該ペプチドは、樹状細胞等を含む抗原提示細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合して、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を増殖刺激し、活性化することができる。ＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドとしては、特に制限されず、例えば、従来公知のものを使用でき、例えば、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（Blood 95; 286-293, 2000、配列番号３２）やＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（Blood 95; 2198-2203, 2000、配列番号３３）等が挙げられる。
【００３８】
ワクチンとして使用する本発明のポリペプチドを含む第１の医薬組成物の調製方法は、従来公知の方法を使用できる。前記ワクチンは、例えば、注射剤として使用する溶液や懸濁液として、本発明のポリペプチドと、薬学的に許容できる賦形剤とから調製してもよい。また、前記ワクチンを、固体に調製してもよい。前記賦形剤としては、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また必要に応じて、ワクチンは少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝薬、又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含んでいてもよい。前記アジュバントとしては、特に制限されず、従来公知のものを使用でき、その中でも、患者の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞による本発明のポリペプチドの取込みを促進するものが好ましい。また、本発明のポリペプチドは、中性又は薬学的に許容できる塩として、ワクチンに製剤化されてもよい。
【００３９】
ワクチンは、通常、これらに制限されないが、例えば、表皮下、真皮内、真皮下又は筋肉内等の注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した製剤として、例えば、坐剤や、経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門及び頭蓋内製剤がある。ワクチンは、患者及び剤形に合わせて、治療的に有効量投与することが好ましい。
【００４０】
本発明において、治療対象となる悪性腫瘍は、ＷＴ１タンパク質を発現する悪性腫瘍であって、例えば、各種白血病や各種固形腫瘍等である。前記白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および小児期ＡＬＬ等があげられ、前記固形腫瘍としては、例えば、肺、乳房、甲状腺及び胃腸のがん、並びに黒色腫等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチド及びベクターを含む第１の医薬組成物は、患者の体内、好ましくは、筋肉細胞内に接種し、本発明のポリペプチドを発現させることで、ＷＴ１特異的免疫反応を誘導するＤＮＡ（ＲＮＡ）ワクチン療法に使用できる。ワクチンとしての調製方法は、特に制限されず、上述の本発明のポリペプチドを含むワクチンと同様に調製することができる。
【００４２】
本発明のＣＤ４+Ｔ細胞の製造方法は、患者からリンパ球を採取し、前記リンパ球と、抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドとをインキュベーションすることで、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖及び活性化を誘導し、増殖・活性化した前記ＣＤ４+Ｔ細胞を回収することを含む。前記抗原提示細胞は、自己、同種同系、及び、ＨＬＡクラスＩＩについて前記患者と一致する同種異系の抗原提示細胞が使用できる。前記抗原提示細胞としては、本発明のポリペプチドをＣＤ４+Ｔ細胞に提示し、増殖刺激して活性化し得るＨＬＡクラスＩＩ分子及び補助刺激分子を発現するものが好ましく、例えば、樹状細胞である。
【００４３】
本発明のＣＤ４+Ｔ細胞の製造方法により製造されるＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、白血病細胞を含む悪性腫瘍細胞に対してＨＬＡクラスＩＩ拘束性の細胞傷害性を示すという特徴的機能を有する。さらに、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、本発明のポリペプチドを提示する抗原提示細胞を活性化するから、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞が増殖刺激されて活性化されることとなる。活性化された前記ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞は、前記患者の体内で、ＷＴ１を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。
【００４４】
本発明の第２の医薬組成物は、一つの態様として、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、この医薬組成物を患者に有効量投与することで、悪性腫瘍を治療する細胞免疫療法が可能となる。
【００４５】
本発明のＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法は、患者からリンパ球を採取し、前記リンパ球と抗原提示細胞と本発明のポリペプチドとをインキュベーションすることで、まず、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を活性化し、それにともない抗原提示細胞を活性化し、それにより、ＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化及び増殖刺激して、増殖・活性化した前記ＣＤ８+Ｔ細胞を回収することを含む製造方法である。より効率よく製造するために、前述のＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドを併用することが好ましい。前記抗原提示細胞は、自己及び同種同系の抗原提示細胞が使用できる。前記抗原提示細胞としては、本発明のポリペプチドをＣＤ４+Ｔ細胞に提示し、増殖刺激して活性化し得るＨＬＡクラスＩＩ分子及び補助刺激分子を発現し、かつ、ＣＤ８+Ｔ細胞を活性化し得るＨＬＡクラスＩ分子及び補助刺激分子を発現するものが好ましく、例えば、樹状細胞である。
【００４６】
本発明の第２の医薬組成物は、その他の態様として、本発明のＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法により製造されたＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬組成物である。この医薬組成物を患者に有効量投与することで、悪性腫瘍を治療する細胞免疫療法が可能となる。本発明の第２の医薬組成物は、さらに、前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞とＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞とをともに含んでいてもよい。これにより、両者の相乗効果により、より効果的な治療が可能となる。
【００４７】
本発明の樹状細胞の第１の製造方法は、患者から樹状細胞を採取する工程と、前記樹状細胞と、本発明のポリペプチドとをインキュベーションする工程とを含む製造方法である。前記樹状細胞を採取する工程として、例えば、２つの方法があげられる。１つ目の方法は、患者本人の血液から血液成分分離装置を用いて樹状細胞そのものを採取する方法であり、２つ目の方法は、患者の未成熟樹状細胞を採取し、それをサイトカインの１種であるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ等で樹状細胞に分化させる方法である。採取した樹状細胞を本発明のポリペプチドとインキュベーションすることで、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できる。さらに、前記インキュベーションにおいて、前述のＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドを併用すると、さらに、ＷＴ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できるため好ましい。
【００４８】
本発明の樹状細胞の第２の製造方法は、患者から樹状細胞を採取する工程と、前記樹状細胞に、本発明のベクターを導入する工程とを含む製造方法である。前記樹状細胞を採取する工程としては、例えば、上述の２つの方法があげられる。採取した樹状細胞に本発明のベクターを導入することで、細胞内で本発明のペプチドが発現し、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できる。さらに、前述のＨＬＡクラスＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを併せて導入すると、さらに、ＷＴ１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できるため好ましい。遺伝子導入方法としては、特に制限されず、例えば、ウイルスベクターを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００４９】
本発明の樹状細胞の製造方法により製造された樹状細胞は、下記医薬組成物として以外にも、例えば、本発明のＷＴ１特異的ＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞の製造方法の抗原提示細胞としても使用できる。
【００５０】
本発明の第２の医薬組成物は、さらにその他の態様として、本発明の樹状細胞の製造方法により製造された樹状細胞を含む医薬組成物である。本発明の第２の医薬組成物は、ＷＴ１特異的に免疫誘導力が向上した樹状細胞を含んでおり、悪性腫瘍の樹状細胞療法に利用できる。また、本発明の第２の医薬組成物は、前記樹状細胞に加え、上述の前記ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞及び／又はＷＴ１特異的ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞をさらに含んでいてもよい。
【００５１】
本発明のＣＤ４+Ｔ細胞株は、本発明のポリペプチドに特異的に反応して増殖するＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株である。本発明のＣＤ４+Ｔ細胞株の製造方法は、通常のＴ細胞クローンの製造方法と同様に、リンパ球と、抗原提示細胞と、本発明のポリペプチドとに、ＩＬ−２を添加して長期間培養することで製造できる。本発明のＣＤ４+Ｔ細胞株からＴ細胞レセプター遺伝子を単離し、その遺伝子を遺伝子導入に用いることで、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）を容易に作製できる。
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５３】
ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＷＴ１抗原ペプチドの同定と、ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株の樹立
ＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列に基づき、１０アミノ酸がオーバーラップする４３種類の２０アミノ酸からなるペプチドを包括的に合成し、これらのいずれかのポリペプチドに特異的に反応するＣＤ４+Ｔ細胞を、従来公知の技術によって単離した。すなわち、健常個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０μｇ/ｍＬの濃度の前記合成ポリペプチドで、３回刺激して、添加したＷＴ１ペプチドに対する増殖性応答及び生育細胞への細胞傷害性を調べた。ＷＴ１ペプチドに対する応答が陽性を示した細胞を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）含む培養培地中で、マイトマイシンＣ処理自己ＰＢＭＣ及びＷＴ１ペプチドを１〜２週に一度ウェルに加えながら、継続して培養した。
【００５４】
その結果、特定のＷＴ１ペプチド（ＷＴ１336-355  ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧＥＫＰＹＱＣ：配列番号１）に特異的に反応して増殖するＣＤ４+Ｔ細胞株ＮＩＫ−１を樹立した。
【００５５】
ＮＩＫ−１は、自己ＰＢＭＣ存在下で前記ＷＴ１ペプチドの刺激を受けると、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１２等のＴH１サイトカインを大量に産生した。また、ＮＩＫ−１は、前記ＷＴ１ペプチドを提示する自己Ｂ−ＬＣＬ（Ｂ細胞由来ＥＢウイルス形質転換株）に対して、強い細胞傷害性を示した。そこで、自己及び様々なアロジェニック（同種異系）ＬＣＬ細胞に対するＮＩＫ−１の細胞傷害性を、前記ＷＴ１ペプチドの添加をする場合、しない場合で測定した。細胞傷害性の測定は、従来公知のクロム５１放出細胞傷害アッセイ法を用いて行った。ＮＩＫ−１と標的細胞の割合は、１０：１、５：１及び２．５：１で行った。これらの結果を下記表１に示す。
【００５６】
【表１】
2006280324.tif 000002
【００５７】
上記表１に示すとおり、ＮＩＫ−１株は、ＨＬＡ−ＤＰ５を発現する自己ＬＣＬ及びアロジェニック（同種異系）細胞であって、ＷＴ１ペプチドが添加された場合のみ、細胞傷害性を示し、ＨＬＡ−ＤＰ５-アロジェニック細胞に対しては、ＷＴ１ペプチドの有無に関わらず、細胞傷害性を示さなかった。よって、ＮＩＫ−１の細胞傷害性は、ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性を示すことが示唆された。
【００５８】
そこで、前記ＷＴ１ペプチド及びＮＩＫ−１株のＨＬＡ−ＤＰ５拘束性を確認するため、標的細胞として、培養細胞のＬ細胞にＨＬＡ−ＤＰ５又はＨＬＡ−ＤＰ９を遺伝子導入した細胞を用いて、同様にＮＩＫ−１の細胞傷害性を調べた。エフェクターであるＮＩＫ−１細胞を標的細胞に添加する前に、必要に応じて、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（Ｌ２４３）、抗ＨＬＡ−ＤＱモノクローナル抗体（ＨＵ−１１）又は抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体（Ｂ７／２１）を最適な濃度で、標的細胞と３０分インキュベートした。その結果を下記表２に示す。
【００５９】
【表２】
2006280324.tif 000003
【００６０】
上記表２に示すとおり、ＮＩＫ−１は、ＷＴ１ペプチドを提示するＨＬＡ−ＤＰ５+Ｌ細胞に対して細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−ＤＰ９+Ｌ細胞には細胞傷害性を示さなかった。さらに、ＮＩＫ−１の細胞傷害性は、抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体を添加することで阻害された。これらの結果から、ＮＩＫ−１株は、ＷＴ１特異的ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞株であることが確認された。
【００６１】
次に、前記ＷＴ１ペプチド（配列番号１）の欠失ポリペプチドを作成し、自己ＬＣＬ細胞上に配置させた場合のＮＩＫ−１の細胞傷害性を測定することで、ＮＩＫ−１に認識されうるより短い抗原エピトープを同定していった。その一例を下記表３に示す。その結果、５０％以上の細胞傷害性を示す最小のアミノ酸配列は、ＷＴ１337-347  ＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号１９）であった。
【００６２】
【表３】
2006280324.tif 000004
【実施例２】
【００６３】
ＮＩＫ−１細胞株の白血病細胞に対するＨＬＡ−ＤＰ５拘束性細胞傷害
標的細胞として、さまざまな白血病細胞株、リンパ腫細胞株、及び、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は急性リンパ腫白血病（ＡＬＬ）患者から新たに単離した白血病細胞を用いて、ＮＩＫ−１の細胞傷害性を測定した。なお、ほとんどの白血病細胞株では、ＨＬＡ−ＤＰ５は陰性であり、ほとんどのタイプの白血病細胞では、ＨＬＡクラスＩＩ分子の発現が陽性であった。その結果を下記表４に示す。
【００６４】
【表４】
2006280324.tif 000005
【００６５】
上記表４に示すとおり、ＮＩＫ−１は、ＷＴ１を発現するＨＬＡ−ＤＰ５陽性白血病細胞株に強い細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−ＤＰ５陰性白血病細胞株、並びに、ＷＴ１を発現していないＨＬＡ−ＤＰ５陽性及び陰性リンパ腫細胞株には、細胞傷害性を示さなかった。また、ＮＩＫ−１は、新たに単離したＨＬＡ−ＤＰ５陽性白血病細胞を効率的に破壊したが、ＨＬＡ−ＤＰ５陰性白血病細胞は破壊しなかった。よって、ＮＩＫ−１の白血病細胞に対するＷＴ１特異的細胞傷害性は、ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性を示すことが示唆された。
【００６６】
そこで、ＮＩＫ−１のＨＬＡ−ＤＰ５拘束性を確認するため、エフェクターであるＮＩＫ−１を標的細胞に添加する前に、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（Ｌ２４３）、抗ＨＬＡ−ＤＱモノクローナル抗体（ＨＵ−１１）又は抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体（Ｂ７／２１）を最適な濃度で、標的細胞と３０分インキュベートして、ＮＩＫ−１の細胞傷害性を測定した。その結果を下記表５に示す。なお、同表における標的細胞は、上記表４の標的細胞と同じものである。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
上記表５に示すとおり、ＮＩＫ−１の白血病細胞株及び白血病細胞に対する細胞傷害性は、抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体によって阻害された。このことは、ＮＩＫ−１の白血病細胞に対するＷＴ１特異的細胞傷害性が、ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性であることを示す。
【００６９】
ＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株であるＮＩＫ−１の白血病細胞に対する細胞傷害経路が、パーフォリンであることを確認した。コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）は、溶解性顆粒のｐＨを上昇させてパーフォリンの分解を加速することにより、パーフォリン型細胞傷害性を阻害する空胞型Ｈ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤であり、それゆえ、ＣＭＡは、パーフォリン媒介細胞傷害性を測定する有効なツールである。そこで、エフェクター細胞であるＮＩＫ−１を、標的細胞とインキュベートする前に、１００ｎｍｏｌのＣＭＡ（和光純薬社製）で２時間前処理し、ＣＭＡ存在下で、標的細胞とインキュベートして、ＮＩＫ−１の細胞傷害性を測定した。その結果を下記表６に示す。なお、同表における標的細胞は、上記表４の標的細胞と同じものである。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
上記表６に示すとおり、ＮＩＫ−１をＣＭＡ処理すると、白血病細胞に対する細胞傷害性の低下が認められた。よって、白血病細胞に対するＷＴ１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞傷害の主な経路が、パーフォリン依存性顆粒のエキソサイトーシスであることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
以上、説明したとおり、本発明は、例えば、白血病を含む悪性腫瘍の医療分野、特に、細胞免疫療法、ワクチン療法、遺伝子治療等を含む免疫療法の分野で有用である。
【配列表】
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