(57)【要約】【課題】    麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのための核酸を提供すること。【解決手段】  麹菌の同定方法は、麹菌のゲノムDNA中に、特定の領域若しくはその部分領域が存在すること該特定の領域とその隣接領域との分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む。また、上記方法を行なうための核酸は、上記特定の領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸である。【選択図】  図１
2006211936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌のゲノムDNA中に、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域若しくはその部分領域が存在すること及び／又は前記5416nt〜13160ntの領域とその隣接領域との分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む、麹菌の同定方法。
【請求項２】
前記部分領域が、１５塩基以上のサイズを有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域若しくはその部分領域にハイブリダイズする核酸プローブを用いる方法により行なう請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
サザンブロット法により行なう請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記5416nt〜13160ntの領域内の部分領域にハイブリダイズするプライマーを少なくとも１つ用いる核酸増幅法を行ない、増幅が起きるか否かに基づいて行なう請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅法は、前記5416nt〜13160ntの領域内の２個の異なる部分領域にハイブリダイズする１対のプライマーを用いたPCR、又は、前記5416nt〜13160ntの領域内の１つの部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１中の前記5416nt〜13160ntの領域以外の領域にハイブリダイズするプライマーとを用いたPCRにより行なう請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記5416nt〜13160ntの領域内の１つの部分領域にハイブリダイズするプライマーと、配列番号１の1nt〜5415ntの領域内の１つの部分領域にハイブリダイズするプライマーとを用いる請求項６記載の方法。
【請求項８】
用いる各プライマーのサイズが15bp以上である請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
PCRによる増幅断片のサイズが2000bp以下である請求項６ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２及び配列番号３にそれぞれ示される塩基配列を有する一対のプライマーを用いて行なう請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸。
【請求項１２】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１ないし９記載の方法に用いられる請求項１１又は１２記載の核酸。
【請求項１４】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域を含み、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntにハイブリダイズする、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌の同定用核酸。
【請求項１５】
配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る請求項１４記載の同定用核酸。
【請求項１６】
プローブ又はプライマーである請求項１４又は１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１４又は１５記載の核酸であるプライマーと、配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜5415ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域を含み、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の1nt〜5415ntにハイブリダイズする核酸であるプライマーとから成る、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌の同定するためのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）種の中からアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似のゲノム配列の一部を欠損した株を同定する方法及び該方法に用いることができる核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹菌（アスペルギルス・オリゼ）は古来より日本の醸造産業に利用されており、人間に対する安全性は、ＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe:米国ＦＤＡ）として認められている。一方、麹菌の類縁糸状菌であるアスペルギルス・フラブスには、強い発ガン性のあるアフラトキシンを生産する株が存在する。すでに、麹菌がアフラトキシンを生産しないことは種々の科学的方法で検証されている。しかしながら、アスペルギルス・フラブスが有するアフラトキシン生産に必要と推定される酵素など２５遺伝子を含む約７０Ｋｂに及ぶアフラトキシン生合成遺伝子クラスター（非特許文献１）と類似する領域を持つ麹菌の存在も報告されており（非特許文献２）、麹菌のアフラトキシン非生産性を遺伝子のゲノム構造から完全に証明するまでには到ってなかった。
【０００３】
しかし、麹菌の中には、上記アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している可能性のある株の存在も報告されている（非特許文献２）。これらの株は、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的である。従って、これらの株を食品産業に使うことは消費者に対して安心感を与えることができ、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域をほとんど有する麹菌株を使用することに比べてより望ましい。しかし、現在このアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している麹菌株を簡便に識別する方法は確立されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol. 70, 1253-1262(2004)
【非特許文献２】Curr.Genet.vol.37,p.104-111(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、麹菌のうち、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を欠損している菌株を簡便に識別する方法及びそのための核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌のグループが、他の麹菌のグループと異なる固有の塩基配列を有していることを見出し、該固有の塩基配列を指標として、アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠損している麹菌を同定することが可能であることに想到し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、麹菌のゲノムDNA中に、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域若しくはその部分領域が存在すること及び／又は前記5416nt〜13160ntの領域とその隣接領域との分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することを含む、麹菌の同定方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntの領域中の連続する１５塩基以上の領域又はそれらの１０％以下の塩基が置換した領域を含み、配列表の配列番号１に示す塩基配列中の5416nt〜13160ntにハイブリダイズする、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌の同定用核酸を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。従って、本発明の方法を適用して同定された、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を容易に食品産業に利用することができ、ひいては消費者に対して安心感を与えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本願発明者らは、独立行政法人酒類総合研究所の保存株であるアスペルギルス・オリゼRIB40株のゲノムDNA中のアフラトキシン生合成遺伝子群類似配列（以下、「AFクラスター」ということがある）の詳細を明らかにし、その塩基配列を公開している(DDBJ accession number: AB071288、AB076803、AB076804、AB182368)。RIB40株は、アスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスター全領域について、アスペルギルス・フラバスとほぼ同じ構造をしていることが明らかとなった。そこで、下記実施例において詳述するように、本願発明者らは、ＲＩＢ４０株のクラスター内に分散して存在する７遺伝子（aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs）を選択し、それぞれの塩基配列に基づき、麹菌ゲノム中の当該７遺伝子をＰＣＲ法により選択的に増幅、検出するためのプライマーセットを作成し、独立行政法人酒類総合研究所で保存している麹菌（アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）２１０株について、上記プライマーセットを用いて、上記７遺伝子のゲノム中の存在をＰＣＲ法にて調査した。その結果、そのうち１２２株については７遺伝子全てが増幅し、これら遺伝子の全てがゲノム上に存在することが確認された。これら１２２株をグループ１とした。一方、７５株についてはaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子の増幅が認められず、これら４遺伝子が欠損している可能性が見いだされた。これら７５株をグループ２とした。
【００１０】
グループ２中のRIB 62株についてAFクラスター周辺のゲノム構造（塩基配列）を解析したところ、AFクラスター中のver-1の上流部位でAFクラスター中が切断され、これに続いてRIB40株やNCBIデータベースに登録されている塩基配列のいずれとも相同性のない領域が約8kb続き、さらに染色体のテロメアに続いていることを明らかにした（図１参照）。
【００１１】
RIB 62に見いだされたAFクラスターとテロメア間の特異的（ユニーク）部位の塩基配列の一部（図１中のRIB62の構造を示す図の上に書かれた灰色の箱の部分）をプローブにして、グループ２の７５株についてサザン解析をした結果、全ての菌株で同じサイズのバンドが検出された。一方RIB40と同じく、AFクラスターの全長を有すると思われる菌株（グループ１）ではバンドが検出されなかった。さらに、分断部位をふくむ領域（分断部位を挟んで上流から下流に到る配列）を増幅できるようなプライマーセットを設計し、このプライマーセットによるＰＣＲを行ったところ、全てのグループ２に属する菌株では同じサイズの増幅産物が得られ、グループ１では増幅産物は得られなかった。以上の結果から、グループ２に属する全ての菌株では、AFクラスターからテロメアにわたるゲノムの構造は同じ構造をとっていると結論づけた。
【００１２】
上記したように、グループ２に属する麹菌株はAFクラスターの半分以上を欠損しており、ゲノム構造上からアフラトキシンを生産する能力が失われていることが明白となった。すでに安全性が確立されている麹菌ではあるが、消費者への安心感を与えるためには、グループ２に属する麹菌を食品産業に用いることが極めて有効である。本願発明は、グループ２に属する麹菌を簡便に同定することができる麹菌の同定方法及びそのための核酸を提供するものである。
【００１３】
アスペルギルス・オリゼRIB40株及びRIB62株のAFクラスター内の一部領域の構造を図１に示す。図１中、白抜きの矢印は、遺伝子及び転写の方向を示す。斜線を引いた領域が、約8kbの新規な配列部分（以下、便宜的に「8kb特異領域」ということがある）であり、黒塗りの部分がアスペルギルス・オリゼのテロメア領域の繰返し配列である。図１に示されるように、グループ２のRIB62株では、アフラトキシンの合成に必須的なaflR等の遺伝子が欠失している。
【００１４】
RIB62株における、verAとavnAの間からテロメアに至る領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号１中の1654番目の塩基（以下、5'末端からＸ番目の塩基を「Ｘnt」のように表示する）から3184ntがverA遺伝子、4216nt〜5116ntがver-1遺伝子、5416nt〜13160ntが8kb特異領域、13161nt〜13267ntがテロメア領域である。
【００１５】
8kb特異領域は、アフラトキシン合成に必須的な、AFクラスターの一部を欠失している株に存在するので、配列番号１中の5416nt〜13160nt の領域である8kb特異領域若しくはその部分領域が存在すること又は前記5416nt〜13160ntの領域とその隣接領域との分断部位が存在することを指標として、アフラトキシン生合成遺伝子群類似配列の一部を欠損する麹菌を同定することが可能である。ここで、「部分領域」は、8kb特異領域が存在することを同定するのに足りるサイズを有する、8kb特異領域中の領域であり、好ましくは連続する１５塩基以上の領域である。なお、規則により配列表には２本鎖ＤＮＡの場合でも１本鎖のみを記載することになっているから、配列番号１には１本鎖のみが記載されているが、現実の8kb特異領域及びその隣接領域は、二本鎖であり、従って、その検出には配列番号１に示される１本鎖の相補鎖も用いることができる。すなわち、「配列番号１」は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、具体的に記載されている１本鎖及びその相補鎖並びに二本鎖を包含する意味で用いている。
【００１６】
8kb特異領域及びその隣接領域の塩基配列が明らかになっているので、8kb特異領域若しくはその部分領域の存在又は8kb特異領域とその分断部位の存在は、それ自体周知の種々の方法により調べることができる。
【００１７】
まず、核酸プローブを用いる方法を挙げることができる。8kb特異領域の全長又はその部分領域、好ましくは１５塩基以上の領域にハイブリダイズする核酸をプローブとして用い、該核酸プローブが試料となる麹菌のゲノムDNAとハイブリダイズするか否かを調べる。なお、ここで、「ハイブリダイズするか否か」は、サザンブロット等の常法において、核酸プローブがハイブリダイズするか否かに基づいて標的核酸の存否を判定するために採用されているストリンジェントな条件においてハイブリダイズするという意味である。このような条件は、当業者にとって周知であり、下記の実施例にも具体的に記載されている。核酸プローブは、8kb特異領域内の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、１０％以下の塩基が置換した配列を有する核酸プローブを用いても検出は可能である。核酸プローブのサイズの上限は、特に限定されるものではなく、8kb特異領域の全長以下である。核酸プローブは、また、8kb特異領域とその隣接領域（3'側及び5'側のいずれでもよい）に跨る領域にハイブリダイズするように設定したものであってもよい。ただし、この場合には、8kb特異領域が存在しない場合にはハイブリダイズが起きないように、8kb特異領域とハイブリダイズする部分が核酸プローブの半分以上を占めることが好ましい。なお、周知の通り、通常、核酸プローブは、ハプテン標識、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオチン標識等の周知の標識で標識される。
【００１８】
核酸プローブを用いる検出方法自体はこの分野において周知であり、例えば、サザンブロット法（下記実施例参照）を例示することができる。検出感度を高めるために、サザンブロット法に先立ち、試料DNAをPCR等の核酸増幅法により増幅してもよい（PCR−サザンブロット。増幅法は後述）。あるいは、核酸プローブを固相化し、試料DNAを標識して試料DNAが固相プローブにハイブリダイズするか否かを調べることによっても実施することができる。この場合も、検出感度を高めるために、固相プローブとのハイブリダイゼーションに先立ち、試料DNAをPCR等の遺伝子増幅法により増幅してもよく、この際に用いるヌクレオチドの一部として、蛍光標識や放射標識等で標識したヌクレオチドを用いることにより増幅DNAを標識することもできる。
【００１９】
8kb特異領域若しくはその部分領域及び／又は8kb特異領域とその隣接領域の間の分断部位の検出は、プライマーを用いるPCR等の核酸増幅法を利用して行うこともできる。核酸増幅法に用いるプライマーの少なくとも一方として、8kb特異領域内にハイブリダイズするものを用いることにより、増幅が起きるか否かに基づいて8kb特異領域中の部分領域の存在を検出することができる。なお、ここで、「ハイブリダイズする」とは、塩基配列の相補性に基づき、通常のPCRのアニーリング工程における条件下でハイブリダイズするという意味である。プライマーは、8kb特異領域内の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸であることが好ましいが、通常、１０％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても増幅が起きる場合が多い。プライマーのサイズは、特に限定されないが、通常、１５塩基〜５０塩基程度、好ましくは１８塩基〜４０塩基程度である。増幅領域のサイズは特に限定されないが、余りに大きいと増幅に時間がかかり、用いる試薬の量も増えるので、増幅領域のサイズは2000bp以下が好ましく、さらに1000bp以下が好ましい。一方、増幅断片を電気泳動等で容易に検出することができるために、増幅領域は、好ましくは50bp以上のサイズを有する。なお、PCR等の核酸増幅法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらを用いて容易に実施することができる。また、増幅が起きたか否かは、常法により、増幅反応の生成物を電気泳動にかけ、バンドが検出されるか否か等により容易に調べることができる。
【００２０】
核酸増幅法に用いる一対のプライマーは、両方とも8kb特異領域内に設定してもよいが、一方のプライマーとして8kb領域内にハイブリダイズするものを用い、他方のプライマーを隣接領域にハイブリダイズするものを用いることにより、分断部位を跨ぐ領域を増幅することができる。この方法によれば、8kb特異領域の存在のみならず、分断部位の存在、すなわち、8kb特異領域が、本願発明により明らかにされた位置に存在しているのか否かも同時に知ることができるので、検出結果の精度がより高く、好ましい。隣接領域に設定するプライマーは、3'側、5'側のいずれの隣接領域に設定してもよいが、他の位置にも存在し得る、3'側隣接領域であるテロメア領域よりは、5'側の隣接領域に設定することが好ましい（下記実施例参照）。さらに、所望により、念のために増幅産物（好ましくは数十bpの短いもの）の塩基配列を直接決定して、分断部位の存在を確認してもよい。
【００２１】
8kb特異領域は、全く新規な配列であるので、本願発明は、該8kb特異領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸又はそれらの１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、8kb特異領域中の連続する１５塩基以上の領域から成る核酸をも提供する。このような核酸は、上記した本発明の方法に用いる核酸プローブやプライマーとして利用可能である。
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．  アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌
すでに本願発明者らは、独立行政法人酒類総合研究所の保存麹菌株ＲＩＢ ４０株のアスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域のＤＮＡ塩基配列を決定している（DDBJ accession number: AB071288、AB076803、AB076804、AB182368）。その結果、ＲＩＢ４０株は、アスペルギルス・フラバスに存在するアフラトキシン生合成遺伝子クラスター全領域について、アスペルギルス・フラバスとほぼ同じ構造をしていることが明らかとなった。そこでＲＩＢ４０株のクラスター内に分散して存在する７遺伝子（aflT, nor-1, aflR, norA, avnA, verb, vbs）を選択し、それぞれの塩基配列に基づき、麹菌ゲノム中の当該７遺伝子をＰＣＲ法により選択的に増幅、検出するためのプライマーセットを作成した。作成したプライマーセットの具体的な塩基配列は次の通りである。
aflT遺伝子用：フォワード側：5'-gcaccaaatgggtctttctcgt-3'
リバース側：5'-atccacggtgaagagggtaagg-3'
nor-1遺伝子用：フォワード側：5'-cggacgaggtctcattgaagcttt-3'
リバース側：5'-atcgatgatgaaggccgtga-3'
aflR遺伝子用：フォワード側：5'-ccggcgcataacacgtactc-3'
リバース側：5'-ggcgcttggccaataggttc-3'
norA遺伝子用：フォワード側：5'-ggctggaaaggggtaatggg-3'
リバース側：5'-tcttgcgaccctcacgagaa-3'
avnA遺伝子用：フォワード側：5'-aatcgcacccaatgagctgtct-3'
リバース側：5'-atggcccgggttctttagcaac-3'
verB遺伝子用：フォワード側：5'-gatgcaccatgacctcatgcgtta-3'
リバース側：5'-cacggcagcgttattgatcatctc-3'
vbs遺伝子用：フォワード側：5'-tgcgaatgctacggctctca-3'
リバース側：5'-caaccgccatctcctggtct-3'
独立行政法人酒類総合研究所で保存している麹菌２１０株について、上記プライマーセットを用いて、上記７遺伝子のゲノム中の存在をＰＣＲ法にて調査した結果、そのうち１２２株については７遺伝子全てが増幅し、これら遺伝子の全てがゲノム上に存在することが確認された。これら１２２株をグループ１とした。一方、７５株についてはaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子の増幅が認められず、これら４遺伝子が欠損している可能性が見いだされた。これら７５株をグループ２とした。
【００２４】
２．アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌のゲノムの特徴
次いで、グループ２に属するＲＩＢ６２株についてアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列が存在する周辺のゲノム塩基配列を詳細に調査した。その結果、グループ１に属するＲＩＢ４０株のゲノム配列と比べて、ＲＩＢ４０株に存在するaflT, nor-1, aflR, norAの４遺伝子を含むアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列中の約４０kbが欠落し、その延長上に約８Kbの配列が続き、さらに染色体のテロメア配列に続いていることが明らかになった。本発明者らは、これらの領域、すなわちＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列とそれに続く領域、さらに末端のテロメア領域までの塩基配列を全て解読した。解読した塩基配列の一部を上記の通り配列番号１に示す。アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌の当該部分のゲノム塩基配列の解読は世界ではじめてのことである。ＲＩＢ６２株のゲノム構造の解析結果から、ＲＩＢ６２株はグループ１のＲＩＢ４０株と共通に存在するver-1配列の上流で染色体の分断が生じ、その結果テロメア部分も含めた欠損を修復する過程で約８Kbの配列を含むテロメア配列が付加されたものと推定された。ＲＩＢ４０株とＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスター構造の模式図は上記の通り図１に示されている。
【００２５】
３．  グループ２におけるaflR 遺伝子の非存在の確認
グループ２では、aflR 遺伝子を特異的に増幅する上記プライマーを用いたＰＣＲ法によってaflR が検出されなかった。aflR は、アスペルギルス・フラブスにおいてアフラトキシンの生合成遺伝子を正に制御する重要な制御因子であり、本遺伝子の破壊によりアフラトキシンが生産されないことが確認されている。そこでグループ２についてaflR 内の配列をプローブとして常法によりサザン解析を行った。なお、用いたプローブの塩基配列を配列番号４に示す。その結果、グループ２に属する全ての菌株においてaflR 遺伝子が存在しないことが確認できた。従って、グループ２に属するアスペルギルス・オリゼ株はアフラトキシンの生産能力を全く有しないことが証明された。
【００２６】
４．  ＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスターにおける分断部位とテロメア配列間の約８ｋｂの配列の特異性
ＲＩＢ６２株のアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似するクラスターに存在する分断部位（配列番号１の5415ntと5416ntの間）からテロメア領域に続く約８Kbの配列について、ＮＣＢＩへの登録配列およびＲＩＢ４０株のゲノム配列に対して相同配列を検索をしたところ、いずれのデータベースにおいても相同する配列は見いだせなかった。ここに、ＲＩＢ６２株の約８KbについてはＲＩＢ６２株の特有の配列であることが明らかとなった。
【００２７】
５．  サザンブロット法によるグループ２株の同定
ＲＩＢ６２株が有するアフラトキシン生合成系遺伝子群に類似する配列、分断部位、それに続く特異的領域が他のグループ２にも存在するか否かを、ＲＩＢ６２株の8kb特異領域内の部分領域をプローブとしたサザン解析によって解析した。この方法をより具体的に説明する。プローブは、ＲＩＢ６２株のゲノムを鋳型とし、特異的配列を増幅できるプライマーセット(5'-agatgatcctgggatgcagaat-3'（配列番号５）と5'-aaattaagcgagcggttcagcg-3')（配列番号６）を用いたPCRにより増幅断片を得、市販のキット(PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche Diagnostics, GmbH Germany))を用いて増幅断片をハプテンの１種であるジゴキシゲニン(DIG)で標識することにより調製した。なお、このプローブがハイブリダイズする領域は、配列番号１の5887nt〜7141ntの領域であり、この領域は図１中の灰色のボックスで示されている。グループ２に属する７５株のゲノムDNA１５μgを、制限酵素SalIで３７℃、１晩分解した後に、１％アガロースゲル電気泳動した。なお、制限酵素SalI部位は図１に示されており、より詳細には、配列番号１中の3605nt〜3610nt、及び13052nt〜13057ntがSalI認識部位である。泳動ゲルを用い、Hybond-N+(Amersham Biosciences, Tokyo)にてサザンブロットとハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は、次の通りであった。メンブレンを1Mチャーチリン酸バッファー（pH7.2、ハイブリダイゼーションバッファー）中で68℃、30分以上プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを必要量（10ng/cm2）、1.5mlチューブに入れ5分間、軽い沸騰状態に保ち、その後氷水中で10分間急冷した。プローブをハイブリダイゼーションバッファーに加えた（メンブレンフィルター100cm2当たり3.5ml）。プレハイブリダイゼーション溶液からメンブレンを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液に移し、68℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。なお、ハイブリダイゼーション溶液はあらかじめ68℃まで加温した状態で用いた。ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件は次の通りであった。一晩ハイブリダイゼーション後のメンブレンを2×SSC（NaCl:17.53g, Sodium Citrate・2H2O:8.82g/L）に0.1%SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)を加えた溶液において、室温で、５分間以上、２回洗浄を行った。その後、68℃に加温しておいた0.5×SSCに0.1%SDSを加えた溶液において、68℃で10分以上、２回洗浄を行った。シグナル検出はDIG市販発光検出キット(Roche Diagnostics, GmbH Germany)の方法に従って行った。
【００２８】
その結果、RIB ４０株ではバンドが検出されないが、グループ２に属する７５株の麹菌株では全て約9.4Kbの位置に明確なバンドが検出された。この結果は、グループ２に属する全ての菌株が、ＲＩＢ６２と相同の特異的領域を有することを示している。
【００２９】
また、上記方法により、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している麹菌に共通して存在する特異的配列をサザン解析により検出することによりアフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損している全ての麹菌を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。
【００３０】
６．  ＰＣＲによるグループ２株の同定
グループ２に属するＲＩＢ６２株のver-1配列に続く分断部位を越えてテロメアに続く一連の領域はグループ１には存在しないゲノム構造（塩基配列）となっていた。そこで、ＲＩＢ６２株のver-1配列及び分断部分に続く約８Kbの配列の分断部位に近い配列に基づいて、ＲＩＢ６２株の分断部分構造を含む領域を特異的にＰＣＲ法にて増幅するためのプライマーを設計した（配列a：配列番号２、配列b：配列番号３）。なお、配列番号２の配列は、配列番号１のセンス鎖の5253nt〜5279ntと同一の配列であり、配列番号３の配列は、配列番号１の6222nt〜6199ntのアンチセンス鎖と同一の配列である。従って、このプライマーセットを用いて配列番号１の配列を鋳型としてPCRを行なうと、これらのプライマーに挟まれる970bpの領域が増幅される。このプライマーセットを用いて全てのグループ２に分類された麹菌のゲノムを鋳型にしてＰＣＲを行った。PCRは、具体的に次のようにして行なった。ＰＣＲにはグループ２に属する７５株のそれぞれのゲノムＤＮＡ、プライマー(a)、プライマー(b)、１３μLのInsert Check-Ready-Mix(Code No.:PIK-251, TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan) を含む１５μＬの反応液を用いた。ＰＣＲ反応は、GeneAmp PCR sysytems9700(Applied Biosystems)を使用し、９４℃で４分保持後、変性反応（９４℃、２０秒）、アニーリング（６０℃、５秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）で２５サイクル行った。ＰＣＲ反応終了液３μLを、１×Tris-Acetate-EDTA（TAE）バッファーを用い１％アガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで２０分処理しゲルを紫外線照射してＰＣＲ産物を検出した。
【００３１】
その結果、グループ１ではＰＣＲ反応生成物は検出されず、グループ２に属する７５株全てにおいてＲＩＢ６２株の配列から予想されるサイズと同じサイズのＰＣＲ増幅産物が検出された。増幅産物のサイズが全て同じであることから、グループ２の７５株は、ＲＩＢ６２株に特異的なアフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の欠損を生じた染色体の分断部位近傍のゲノム構造と同じゲノム構造を有している可能性が極めて高いことが明らかとなった。
【００３２】
また、プライマー(a)、(b)を用いたＰＣＲ反応ではグループ２でしか反応生成物ができないことから、本プライマーを用いたＰＣＲ反応によって、アフラトキシンの生合成系遺伝子群に類似する配列の一部を欠損しているグループ２の菌株を特異的にかつ簡便に同定分類できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の方法により、遺伝子（ゲノム）構造からアフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を簡便に同定することができる。本発明の方法を用いて同定された、アフラトキシンを生合成する能力が全くないことが確定的な麹菌を食品産業等において用いることにより、消費者に対して安心感を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】アフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域を有するアスペルギルス・オリゼRIB40株の該領域の一部分の構造及びアフラトキシン生合成遺伝子クラスターと類似する領域の一部を欠失した同RIB62株の一部分の構造を示す図である。
【図１】
2006211936.tif 000003
【配列表】
2006211936000001.app