(57)【要約】【課題】  本発明は、関節軟骨に作製した欠損が、正常組織へと修復されない非ヒト哺乳動物モデル、および該製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を有し、かつ該欠損部が該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布されている、哺乳動物を提供する。本発明はまた、軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物の生産方法であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を作製し、該欠損部に該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布することを特徴とする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を有し、かつ該欠損部が該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布されている、哺乳動物。
【請求項２】
該軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物が、ウサギまたはブタである請求項1記載の哺乳動物。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物の関節軟骨の欠損部に研磨装置を用いて軟骨下骨を研磨し、該欠損部に該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊を塗布することを特徴とする、軟骨の自然治癒を抑制する方法。
【請求項４】
軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物の生産方法であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を作製し、該欠損部に該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布することを特徴とする方法。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物がウサギおよびブタから選ばれる請求項4記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軟骨欠損モデル動物、該非ヒト哺乳動物の生産方法および軟骨の自然治癒を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、血管および神経のない組織であり、軟骨細胞が細胞外基質に埋め込まれたように散在するために、栄養補給が困難であり再生しにくい組織であると考えられている。損傷や変形などにより失われた関節軟骨を修復する手段として自己由来細胞移植が知られており、種々の研究が行われており、実用化されている(非特許文献1)。この治療法は患者自身の軟骨細胞や未分化間葉系幹細胞を生体外に取り出し、培養を行い、再度患者自身に細胞を戻す方法である。この際に細胞を三次元的および均一的に配向させることを目的とした基材が数多く報告されている。我々も以前、生分解性ポリマーのＰＬＧＡ（乳酸とグリコール酸の共重合体）で作製したユニークな構造を有する多孔質体を用いた基材について報告している（特許文献1）。
【０００３】
開発された基材はin vivoでは基材自身もしくは基材に細胞を配向させた状態で実験動物に移植して、生体適合性を確認することによって基材の有効性を証明する。すなわち、動物に電気ドリルなどを用いて健常軟骨部分に欠損を作製し、その欠損部分に細胞を配向させた基材を充填し、生体適合性が確認される。軟骨再生の研究に使う実験動物としてはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヤギ、馬、羊、犬などが使用されている。
【０００４】
しかしながら、従来の動物モデルは、非常に治癒力が高い故に、軟骨欠損を作製しても自然治癒が発生する為、評価系としては確立されていない（非特許文献２）。例えば、成熟ウサギにおいては3mm径の欠損では自然に軟骨再生が誘導されるが、5mm径の欠損では関節表面が軟骨で覆われることはないといわれている（非特許文献３）。しかし、実際には5mm径以上の欠損であっても軟骨再生がおきてしまうケースもある。この原因としては次のようなことが考えられる。
（１）骨の再生は動物によって個体差が生じやすいため自然治癒する個体も存在する。
（２）軟骨全層欠損作製の際に、軟骨下骨を傷つけることによって下骨から骨髄が滲みだしてきて、骨髄液中の幹細胞が遊走され軟骨の分化を促進するため、軟骨が再生される。
このような自然治癒は、最適な基材のスクリーニング法として障害になることから、自然治癒が起こらないモデル動物が必要とされている。
【特許文献１】特開2004-254655
【非特許文献１】Brittbergら  The New England Journal of Medicine Vol.331, Number 14, 889-95, 1995
【非特許文献２】第二回  医療機器フォーラム「医療機器・細胞組織医療機器の前臨床試験等について」ページ３１
【非特許文献３】Shapiroら  J.Bone Joint Surg  75A:532-553(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、関節軟骨に作製した欠損が、正常組織へと修復されない非ヒト哺乳動物モデル、および該製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、非ヒト哺乳動物の関節軟骨に作製した欠損を、該哺乳動物由来以外のフィブリン糊を塗布することにより、加えて研磨装置を用いて軟骨下骨を研磨することによって上記課題が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記（1）〜（５）に関する。
（１）
軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を有し、かつ該欠損部が該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布されている、哺乳動物。
（２）
該軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物が、ウサギまたはブタである（１）1記載の哺乳動物。
（３）
非ヒト哺乳動物の関節軟骨の欠損部に研磨装置を用いて軟骨下骨を研磨し、該欠損部に該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊を塗布することを特徴とする、軟骨の自然治癒を抑制する方法。
（４）
軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物の生産方法であって、該非ヒト哺乳動物が関節軟骨に欠損部を作製し、該欠損部に該非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来フィブリン糊が塗布することを特徴とする方法。
（５）
非ヒト哺乳動物がウサギおよびブタから選ばれるである（４）記載の生産方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、非ヒト哺乳動物の関節軟骨に作製した欠損を、該哺乳動物由来以外のフィブリン糊を塗布すること、および研磨装置を用いて軟骨下骨を研磨することにより、正常組織へとは修復されない非ヒト哺乳動物モデルを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明における軟骨欠損モデル動物である非ヒト哺乳動物としては例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヤギ、馬、羊、犬などが挙げられるが、なかでも外科的処置を行うことが容易である適度な関節軟骨の大きさをもつウサギやブタが好ましい。
【００１０】
本明細書におけるフィブリン糊とは、フィブリノゲンとトロンビンを混合して糊状にしたものを意味しており、血液製剤として広く止血の補助や接着剤として外科、血管外科、心臓外科、脳外科で使用されている。フィブリン糊は、適用すべき非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来のフィブリン糊を使用することが必要である。フィブリン糊としては、適用すべき非ヒト哺乳動物とは異なる哺乳動物由来のフィブリン糊である限り、特に限定されないが、安定性、コスト、品質等に優れた市販のヒト由来フィブリン糊（バクスター社、ティシール（登録商標））が挙げられる。フィブリン糊はフィブリノゲンとトロンビンが混和されることにより硬化が始まるので、混和は動物に外科的処置を行う直前に行うのが望ましい。
【００１１】
次に、本発明に使用される、研磨装置は、関節軟骨に作製した欠損面を摩擦、研磨することが出来る限り、特に限定されない。例えば、金属ヤスリや歯科で用いられるダイアモンドドリルを転用して使用することが出来る。作業効率の観点から硬度な先端部位を有する研磨装置が好ましい。なお、金属ヤスリやダイアモンドドリルを使用する場合、術前にオートクレーブを行うことが好ましい。欠損を作製する際には、関節面に清潔な生理食塩水や蒸留水を施し、軟骨の摩耗粉を十分に洗い流すことがことが好ましい。また歯科用ドリルを使用する際には、摩擦によって軟骨面が熱を持つことがあり、過度に軟骨を損傷させてしまうおそれがあるので、ドリルの回転数を十分に落としたり、十分に時間をかけて処置を行う、もしくは適度に清潔な生理食塩水や蒸留水を施すことによって軟骨面が熱を持つことがないようにすることが望ましい。軟骨の欠損のサイズは自然に軟骨再生が誘導されることがない大きさで有れば欠損モデル系として妥当であるので、特にサイズは限定されない。欠損の深さとしては、自然に軟骨再生が誘導されない限り特に限定されないが、十分に軟骨層を取り除いた関節軟骨全層欠損が好ましい。また、軟骨下骨を傷つけることによって下骨から骨髄が滲みだしてきて、骨髄液中の幹細胞が遊走され軟骨の分化を促進するおそれがあるため、十分に研磨装置にて欠損面を研磨して、骨髄液の進入を防ぐ。また、一般的に動物の週齢が若ければ若いほど軟骨が自然再生されやすいので、使用する動物は成長期を過ぎ、十分成熟期に入った週齢のものを使うのが好ましい。上記のように、軟骨の自然治療が抑制された軟骨欠損モデル用の非ヒト哺乳動物が得られる。
【実施例】
【００１２】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１３】
（実施例１）
日本白色ウサギ（6ヶ月齢、オス4匹）を用いて軟骨欠損作製を行った。麻酔下にてウサギの大腿膝蓋溝滑車部に直径5mmの円形の軟骨全層欠損を作製した。また、修復度に動物の個体差が出ることを考慮して、同一個体内での比較を行った。欠損は同一個体の両膝に作製し、右足は欠損のみとし、左足は欠損にフィブリン糊（バクスター社、ティシールR）を添加した系にした。なお、両足ともに歯科用のダイアモンドドリルにて欠損部の研磨を行った。これにより、同一個体内での軟骨修復を比較検討した。ウサギは専用ケージ内で4週間自由歩行させた後、安楽死させ軟骨欠損部の組織学的解析を行った。
【００１４】
欠損作製4週間後に軟骨欠損部の組織を摘出し、脱灰操作を行った後、常法に従いパラフィン切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、光学顕微鏡にて観察した。また軟骨プロテオグリカンをアルシアンブルー染色、サフラニンＯ染色を行い、光学顕微鏡にて観察した（図1）。
いずれのウサギにおいても欠損のみの系は軟骨がほぼ再生されていたが、フィブリン糊を注入した系においては軟骨の再生が殆ど見られず、炎症性細胞の浸潤が確認された。これは、研磨装置およびヒト由来のフィブリンによって、欠損部への骨髄由来の幹細胞遊走を阻害し、さらに炎症反応惹起により生じたものと示唆される。
【００１５】
また、Tissue engineering  4(4)429-444,1998に従い、欠損作製を行った4羽のウサギを以下の5項目についてスコアリングして比較した。A.細胞形態（0〜4点）  B.細胞外マトリクス染色性（0〜3点）  C.軟骨表面の規則性（0〜3点）  D.軟骨の厚さ（0〜2点）  E.周辺組織との連続性（0〜2点）。A〜Eの5項目の合計点数は0〜14点であり、点数が小さいほど正常軟骨に近いことを示している（表１）。
表１  実施例1で示したスコアリング
【００１６】
【表１】
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いずれのウサギにおいても同一個体内で比較するとフィブリン糊を入れた軟骨欠損部の成績が悪くなり、軟骨の自然治癒が抑制されていることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例1で示したヘマトキシリン・エオジン染色像(HE)、アルシアンブルー染色像(AB)、サフラニンＯ染色像(SO)
【図１】
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