(57)【要約】【課題】密度勾配遠心処理後の所望する層を回収する手段に使用される方法において、密度勾配層に対応して分離可能な方法を用いることで、従来の吸引にて回収するのではなく、分離膜を介して層を分離することで所望する層ごと回収し目的層回収率向上可能な方法を提供すること。【解決手段】密度勾配媒体を用いて、比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスと異物を含む検体を分離し濃縮後に回収する方法において、比重の異なった媒体を分離する手段である検体の微生物と異物を通過させることを可能とする孔を有する分離膜３を備えたことを特徴とするものである。【選択図】図１
2006280318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
密度勾配媒体を用いて、比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を分離し濃縮後、回収する方法において、比重の異なった媒体を分離する分離手段を備えたことを特徴とする分離回収方法。
【請求項２】
粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を通過させることを可能とする孔を有する形状で形成された仕切り板である分離膜を用いることを特徴とする請求項１記載の分離回収方法。
【請求項３】
前記分離膜を１枚以上用いることを特徴とする請求項１または２に記載の分離回収方法。
【請求項４】
密度勾配媒体の積層後の境界面より下方に前記分離膜を位置させることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項５】
密度勾配媒体で層を形成時に前記分離膜の下方に気泡を残さないようにすることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項６】
前記分離膜を境に密度勾配媒体を積層する方法として、前記分離膜上方に比重の高い媒体を注入し遠心処理を行いその遠心力により前記分離膜下方へ比重の高い媒体を移動させると同時に前記分離膜下方の気泡を除去し比重の高い媒体の上層へ目的の粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を積層することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項７】
粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離し、前記分離膜の上方もしくは下方に存在する粒子や細胞、微生物、ウィルスを回収することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項８】
粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離し、所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスが存在する境界層を境界層の下方に設置された前記分離膜と共に分離回収すること特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項９】
所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスと異物を分離し、所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスが最下層に存在する場合、前記分離膜上方に存在する不要層を前記分離膜ごと除去後、残された最下層ごと分離回収すること特徴とする請求項１乃至７いずれかに記載の分離回収方法。
【請求項１０】
分離膜上方に陰圧を生じさせることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項１１】
遠心処理後に容器を分離する手段として最上部の容器の開放口へ閉鎖手段に設けられた圧開放口より圧を抜きながら閉鎖手段を設置し容器を分離する時に前記圧開放口を密閉しながら容器を分離することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項１２】
密度勾配層を形成する媒体に粘性の高い媒体を用いることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の分離回収方法。
【請求項１３】
前記分離膜を通過不可能な大きさを持つ比重の大きい異物と比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体との混合液でも前記分離膜を用いることにより、比重に関係なく最上層の前記分離膜により除去することができることを特徴とする請求項１乃至１２いずれかに記載の分離回収手段。
【請求項１４】
前記分離膜を境に密度勾配媒体を積層する方法として、前記分離膜下方に比重の高い媒体を前記分離膜下面に接触しない液量を入れた後に前記分離膜上方に同一の媒体を注入し遠心処理を行いその遠心力により前記分離膜下方へ同一の媒体を移動させた後に容器最上層へ比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスと異物を含む検体を積層することを特徴とする請求項１乃至１３いずれかに記載の分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、密度勾配遠心分離により比重の異なった粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離する方法及び回収する方法に関するもので、特に比重の近い物質が混在する検体から効率良く目的の粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離し回収する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の密度勾配遠心分離方法は、特表２００２−５０５８６６号公報に明記されたものが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
以下、その特表２００２−５０５８６６号公報について図５を参照しながら説明する。
図５は従来例の回収容器の断面を示す図である。図５に示すように、遠心チューブ１０１は上部をキャップ１０２により密閉され、キャップ上に配置された注入用チューブ１０３によって、上部より比重の異なる密度勾配溶液及び目的の粒子を含んだ溶液の液体試料を遠心チューブ１０１内に充填積層される。遠心分離後は、キャップ中心点より遠心チューブ１０１の中心軸上に沿って、遠心チューブ１０１内部に毛細管プローブ１０４を挿入し、目的の密度勾配溶液を吸引、回収するものである（特表２００２−５０５８６６号公報：特許文献１）。
【特許文献１】特表２００２−５０５８６６号公報（図８Ａ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような従来の密度勾配遠心を用いた分離回収方法では、目的の粒子を含んだ液層を回収するには、針・ピペット等を用い吸引にて回収を行う必要があり、吸引の為、所望する物質を回収する際に密度勾配液と液体試料に液流の乱れが生じ、所望する物質の回収率が低下し菌検査の精度が低下するという課題があり、積層した密度勾配層の乱れを防止し、効率良く所望する物質が含まれる液層を回収することが要求されている。
【０００５】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、従来の吸引回収ではなく、媒体を分離する手段により境界面を含む所望する層ごと回収し、積層した密度勾配層の乱れを防止し目的層回収率を向上させ菌検査の精度を向上させることができる方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の分離回収方法は上記の目的を達成するために、目的層及び不要液層の回収方法を針・ピペット等のように吸引を用いるのでは無く、媒体を分離することで目的層もしくは不要液層を含む媒体層を境界面を含む媒体ごと回収するものである。
【０００７】
この手段により吸引の場合よりも目的層回収率を向上することができ、また、菌検査の精度を向上できる分離回収方法が得られる。また他の手段は、針・ピペット等を用いずに境界面を含む所望する層ごと回収するものである。この方法により目的層回収時間を削減できる分離回収方法が得られる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、所望する粒子、細胞、微生物、ウィルスと、不要とされる異物が存在する層を分離することにより従来の吸引ではなく、境界面を含む所望する層ごと回収することで菌検査の精度を低下させることなく効率良く回収率を向上することができる効果のある方法を提供される。
【０００９】
他の効果は針・ピペット等を用いるのではなく、境界面を含む所望する層ごと回収することで目的層回収時間を削減できる効果のある方法を提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の請求項１記載の発明は、密度勾配媒体を用いて、比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を分離し濃縮後、回収する方法において、比重の異なった媒体を分離する手段を備えたことを特徴としたものであり、媒体を分離させることによって、従来の回収手段であるピペット等を用いた吸引回収では回収困難であった層と層の間の境界層および容器内壁付近の所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスを媒体ごと分離し回収することによって所望する菌や異物の回収が容易になるという作用を有する。
【００１１】
また、粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を通過させることを可能とする孔を有する形状で形成された仕切り板である分離膜を用いることを特徴としたものであり、遠心処理時のみ分離膜は微生物と異物と溶媒を通過させることにより媒体分離時に媒体漏れを防止するという作用を有する。
【００１２】
また、前記分離膜を１枚以上用いることを特徴としたものであり、多段数の密度勾配遠心分離処理に対応するという作用を有する。
【００１３】
また、密度勾配媒体の積層後の境界面より下方に前記分離膜を位置させることを特徴としたものであり、微生物が境界面付近に存在する場合、境界面を前記分離膜で区切ることにより、上方と下方の媒体に微生物が存在することとなり未回収の微生物が発生するためこれを防止すると同時に、比重の高い下層液の方が粘性が高い場合がある為に液垂れ防止を行うという作用を有する。
【００１４】
また、密度勾配媒体で層を形成時に前記分離膜の下方に気泡を残さないようにすることを特徴としたものであり、気泡により境界面が崩れることを防止するという作用を有する。
【００１５】
また、前記分離膜を境に密度勾配媒体を積層する方法として、前記分離膜上方に比重の高い媒体を注入し遠心処理を行いその遠心力により前記分離膜下方へ比重の高い媒体を移動させると同時に前記分離膜下方の気泡を除去し比重の高い媒体の上層へ目的の粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を積層することを特徴としたものであり、遠心力を用い前記分離膜上方から前記分離膜下方へ密度勾配媒体を移動することにより前記分離膜下方に気泡の残留を低減させるという作用を有する。
【００１６】
また、粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離し、前記分離膜の上方もしくは下方に存在する所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスを回収することを特徴としたものであり、前記分離膜を用いて所望する回収層を不要層と分離でき回収を容易にするという作用を有する。
【００１７】
また、粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスを分離し、所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスが存在する境界層を境界層の下方に設置された前記分離膜と共に分離回収すること特徴としたものであり、層と層の間の境界面を回収することは非常に困難であるが、この方法を用いることで所望する層と境界層を回収時に不要層と分離でき回収を容易にするという作用を有する。
【００１８】
また、所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体を最上層として密度勾配層を形成後、遠心処理を行うことにより粒子や細胞、微生物、ウィルスと異物を分離し、所望する粒子や細胞、微生物、ウィルスが最下層に存在する場合、前記分離膜上方に存在する不要層を前記分離膜ごと除去後、残された最下層ごと分離回収すること特徴としたものであり、層と層の間の境界面を回収することは非常に困難であるが、この方法を用いることで所望する層と境界層を回収時に不要層と分離でき回収を容易にするという作用を有する。
【００１９】
また、分離膜上方に陰圧を生じさせることを特徴としたものであり、前記分離膜を境に媒体を分離する際に陰圧により前記分離膜下方からの媒体漏れを防止することができるという作用を有する。
【００２０】
また、遠心処理後に容器を分離する手段として最上部の容器の開放口へ閉鎖手段に設けられた圧開放口より圧を抜きながら閉鎖手段を設置し容器を分離する時に前記圧開放口を密閉しながら容器を分離することを特徴としたものであり、圧を抜くことにより前記閉鎖手段を設置し易くし、閉鎖手段設置時の陰圧により分離膜より上方の媒体が分離膜より下方に移動することを防止するという作用を有する。
【００２１】
また、密度勾配層を形成する媒体に粘性の高い媒体を用いることを特徴としたものであり、媒体分離時に分離膜より液漏れを防止することができる作用を有する。
【００２２】
また、前記分離膜を通過不可能な大きさを持つ比重の大きい異物と比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスを含む検体との混合液でも前記分離膜を用いることにより、比重に関係なく最上層の前記分離膜により除去することができることを特徴としたものであり、分離膜を通過不能な大きさを持つ異物が混在した検体でも前ろ過処理を加えることなく、密度勾配遠心を行うことができる作用を有する。
【００２３】
また、請求項１乃至１３いずれかに記載の分離回収方法において、前記分離膜を境に密度勾配媒体を積層する方法として、前記分離膜下方に比重の高い媒体を前記分離膜下面に接触しない液量を入れた後に前記分離膜上方に同一の媒体を注入し遠心処理を行いその遠心力により前記分離膜下方へ同一の媒体を移動させた後に容器最上層へ比重の異なる粒子や細胞、微生物、ウィルスと異物を含む検体を積層することを特徴としたものであり、前記分離膜の下方に予め前記分離膜下面に接触しない量の媒体を注入しておくことで媒体を前記分離膜下方に全く注入せずに全て前記分離膜上方に媒体を注入し遠心力にて媒体を前記分離膜の下方に充填する時と比較して積層時間を削減できるという作用を有する。
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明するが、本発明の分離回収方法は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２５】
（実施の形態１）
分離膜の上方に比重の大きい媒体を注入し遠心処理を行う。遠心処理を行うことにより比重の大きい媒体が分離膜の下方に移動し、その際に発生した気泡が分離手段としての分離膜の下方に存在する場合は再度遠心処理を行い、気泡がなくなるまでこの作業を繰り返す。積層が２段の場合、気泡が無くなったことを確認後、分離膜の上方に検体を注入し、遠心処理を施し比重の大きい異物を分離膜の下方に移動させ、比重の大きい異物が移動完了後、分離膜の下方に存在する層を除去する。分離膜の下方に所望する菌の比重と近似の媒体を設置し遠心処理を行う。遠心処理後、分離膜より上方の所望する菌よりも比重の小さい異物の層を除去し分離膜の下方に存在する所望する菌が存在する層を回収することにより目的の菌を回収することができる分離回収方法。方法として例えば、図１に示すように、閉鎖手段１、上方に開放口２を備え下方に分離膜３を備えた上容器４、上方に開放口５を備え下方は閉鎖された下容器６にて各々の容器と閉鎖手段１が分割可能な着脱手段を用いることにより接続し構成された分離回収容器７は、閉鎖手段１を取り外すことにより、開放口２より密度勾配媒体及び微生物と比重の異なる異物を含み得る検体を注入することが可能である。作業の詳細は図２に示す分離回収方法。
【００２６】
なお上容器４に設置する閉鎖手段１は上容器４と下容器６の分離時に必要なもので遠心処理時については設置しなくてもよいがコンタミが予想される場合は遠心処理時も閉鎖手段１を設置しておく。
【００２７】
なお分離回収容器７に用いられる材料は滅菌処理であるオートクレーブ可能な材料を用いリユース可能な材料も含む。
【００２８】
また、材料として密度勾配を形成する媒体としては、シリカゲル系溶液、ショ糖溶液、グリセリン、塩化セシウム溶液、その他高分子材料を含むが、これに限定されるものではない。
【００２９】
また、材料として、分離膜３には孔径０．１μｍ以上を持つ金網、金属フィルタ、樹脂製フィルタ、プラスチック多孔質体、ナイロンネット、セラミック多孔質体を含むが、これに限定されるものではない。
【００３０】
また、材料として、上容器４と下容器６には、ポリカーボネート、アセタール、ポリサルフォン、シリコン、ステンレスなどであるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、閉鎖手段１としては、分離膜３上方の液を分離膜３下方に液漏れしないように密閉できれば良く例えばゴム栓を含むが、これに限定されるものではない。
【００３２】
また、材料として、閉鎖手段１には、ポリカーボネート、アセタール、ポリサルフォン、シリコン、ステンレス、天然ゴム・スチレンゴム・ブタジエンゴム・クロロプレンゴム・ブチルゴム・ニトリルゴム・ハイパロン・ウレタンゴム・フッ素ゴムを含むが、これに限定されるものではない。
【００３３】
また、上容器４と下容器６の色には透明、半透明を含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
また、遠心処理条件として、２０００Ｇ、３０ｍｉｎ、４℃を含むがこれに限定されるものではない。
【００３５】
また、オートクレーブの条件として１２１℃、１５ｍｉｎを含むがこれに限定されるものではない。
【００３６】
また、着脱手段には、ネジ構造、勘合を含むがこれに限定されるものではない。
【００３７】
また、ピペットもしくはシリンジもしくは針を備えたシリンジにて注入量を確定した上で注入したが、シリンジポンプのような自動で注入する装置を用いても問題はない。
【００３８】
また、上記構成において分離回収容器７に備えた下容器６に媒体移動時の遠心処理時間を削減する為に上容器４設置時に上容器４の下方に備えた分離膜３に接触しない媒体量をピペットもしくはシリンジもしくは針を備えたシリンジにて注入量を確定した上で予め注入しておいても問題は無い。
【００３９】
また、下容器６に予め注入する上容器４の下方に備えた分離膜３に接触しない媒体量は上容器４設置時に上容器４の下方に備えた分離膜３からの距離１ｍｍを含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
（実施の形態２）
図３の分離膜３の上方に比重の大きい媒体を注入し遠心処理を行う。遠心処理を行うことにより比重の大きい媒体が分離膜３の下方に移動し、その際に発生した気泡が分離膜３の下方に存在する場合は再度遠心処理を行い、気泡がなくなるまでこの作業を繰り返す。積層が３段以上の場合、気泡が無くなったことを確認後、分離膜ａの上方に分離膜３の下方に存在する媒体よりも比重の小さい媒体を注入し、遠心処理を行い分離膜ａを通過させることで分離膜３と分離膜ａの間を媒体で満たす。分離膜３と分離膜ａの間に気泡が存在する場合は再度遠心処理を行い気泡がなくなるまで遠心処理を繰り返す。気泡存在しないことを確認後、この作業を繰り返すことにより積層段数を増加させていくことができる分離回収方法。方法として例えば、図４に示すように、閉鎖手段１、上方に開放口２を備え下方に分離膜３を備えた上容器４、上方に開放口８を備え下方に分離膜３を備えた中容器９、上方に開放口５を備え下方は閉鎖された下容器６にて各々の容器と閉鎖手段１が分割可能な着脱手段を用いることにより接続し構成された分離回収容器１０は、閉鎖手段１を取り外すことにより、開放口２より密度勾配媒体及び微生物と比重の異なる異物を含み得る検体を注入することが可能である。作業の詳細は図３に示す分離回収方法。
【００４１】
なお、中容器の個数を増加させることにより4層以上の密度勾配層を処理してもよい。
【００４２】
また、中容器９に用いられる材料は滅菌処理であるオートクレーブ可能な材料を用いリユース可能な材料も含む。
【００４３】
また、材料として、中容器９には、ポリカーボネート、アセタール、ポリサルフォン、シリコン、ステンレスなどであるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
また、中容器９の色には透明、半透明を含むが、これに限定されるものではない。
【００４５】
また、中容器９の着脱手段には、ネジ構造、勘合を含むがこれに限定されるものではない。
【００４６】
また、ピペットもしくはシリンジもしくは針を備えたシリンジにて注入量を確定した上で注入したが、シリンジポンプのような自動で注入する装置を用いても問題はない。
【００４７】
また、上記構成において下容器６に媒体移動時の遠心処理時間を削減する為に中容器９設置時に中容器９の下方に備えた分離膜３に接触しない媒体量をピペットもしくはシリンジもしくは針を備えたシリンジにて注入量を確定した上で予め注入しておいても問題はない。
【００４８】
また、下容器６に予め注入する中容器９の下方に備えた分離膜３に接触しない媒体量は中容器９設置時に中容器９の下方に備えた分離膜３からの距離１ｍｍを含むが、これに限定されるものではない。
【００４９】
また、中容器９に予め注入する上容器４の下方に備えた分離膜３に接触しない媒体量は上容器４設置時に上容器４の下方に備えた分離膜３からの距離１ｍｍを含むが、これに限定されるものではない。
【００５０】
また、分離膜３を２枚以上用いる時、各々は重ならないようにするためにその距離1ｍｍを含むが、これに限定されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
食品、化粧品や飲料水中の微生物のみを分離回収することにより、微生物以外の異物を除くことで、蛍光発光試薬や発光試薬染色や抗体試薬での検出が、従来に比べ精度良く検出することができ、食品分野、医薬品分野、化成品分野における微生物の検査において適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の実施の形態１の分離回収方法の一態様の概略図
【図２】本発明の実施の形態１、２の分離回収方法のフローチャート
【図３】本発明の実施の形態１、２の分離膜構成の概略図
【図４】本発明の実施の形態２の分離回収方法の一態様の概略図
【図５】従来の密度勾配溶液を注入する容器を示す断面図
【符号の説明】
【００５３】
１    閉鎖手段
２    開放口
３    分離膜
４    上容器
５    開放口
６    下容器
７    分離回収容器
８    開放口
９    中容器
１０  分離回収容器
ａ    分離膜
ｂ    分離膜  
【図１】
2006280318.tif 000003
【図２】
2006280318.tif 000004
【図３】
2006280318.tif 000005
【図４】
2006280318.tif 000006
【図５】
2006280318.tif 000007