(57)【要約】【課題】  細胞表面のオプソニン化剤、オプソニン化された細胞、ならびに各種抗原、特に腫瘍特異的抗原及び／又はウイルス感染細胞特異的抗原を提示した抗原提示細胞の調製方法の提供を目的とする。【解決手段】  一般式（１）【化１】2006025766.tif 000008（式中の各記号の定義は明細書中と同義である）で示される化合物を含む細胞表面オプソニン化剤、抗原提示細胞の貪食を高めたり活性化したりする物質が結合した細胞表面のオプソニン化剤、該オプソニン化剤でオプソニン化された細胞、特に腫瘍細胞及び／又はウイルス感染細胞、該オプソニン化された細胞を貪食して当該細胞特異的な抗原を組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で示される化合物を含む細胞表面オプソニン化剤
【化１】
2006025766.tif 000006
（式中、Ｚは２〜１０の水酸基を有する化合物の残基、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基とオキシアルキレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良く、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基、Ｒ２は炭素数１５〜２３の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基、Ｘは修飾対象物質を共有結合し得る反応性官能基を１個以上含有する基、ａは０あるいは１、ｍ１、ｍ２、ｍ３はオキシエチレン基の平均付加モル数、ｎ１、ｎ２、ｎ３は炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、かつ、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｋ１、ｋ２、ｋ３は下記の条件を満足する数である。
０≦ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３≦５００、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３≦５００でありかつ、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３≦５００、０．５≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１、０≦ｋ１≦８、１≦ｋ２≦４、１≦ｋ３≦４でありかつ、２≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦１０）。
【請求項２】
Ｒ２がオレイル基又は炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である請求項１記載の細胞表面オプソニン化剤。
【請求項３】
Ｒ２が一般式（２）で表される化合物の残基である請求項１記載の細胞表面オプソニン化剤
【化２】
2006025766.tif 000007
（Ｒ3及びＲ4は炭素数１５〜２３の不飽和炭化水素基、Ｒ5は炭素数２〜４の２価の炭化水素基であり、ｂは０あるいは１であり、ｃは０あるいは１である）。
【請求項４】
抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、あるいは抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部及び補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部の両方が結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞表面オプソニン化剤。
【請求項５】
該オプソニン化が、請求項１記載の細胞表面オプソニン化剤に結合させた抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、あるいは抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部及び補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部の両方を細胞表面に結合させることによって行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞表面オプソニン化剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞表面オプソニン化剤によってオプソニン化された細胞。
【請求項７】
腫瘍細胞である、請求項６記載のオプソニン化された細胞。
【請求項８】
請求項７記載のオプソニン化された腫瘍細胞を抗原提示細胞に貪食させることを含む、腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法。
【請求項９】
請求項８記載の腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法によって得られた腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞。
【請求項１０】
ウイルス感染細胞である、請求項６記載のオプソニン化された細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載のオプソニン化された細胞を抗原提示細胞に貪食させることを含む、ウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法によって得られたウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞。
【請求項１３】
樹状細胞又はマクロファージである、請求項９又は１２記載の抗原提示細胞。
【請求項１４】
請求項９、１２及び１３のいずれか１項に記載の抗原提示細胞を用いることを特徴とする細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種抗原、特に腫瘍特異的抗原あるいはウイルス感染細胞特異的抗原を提示した抗原提示細胞を効果的に得るための方法及び該方法に使用するオプソニン化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍の治療のために免疫細胞を利用したアプローチが多く報告されている。免疫細胞の中でもＣＤ８陽性Ｔ細胞が腫瘍細胞を傷害することが知られている。癌患者から得られたＴ細胞を体外で活性化させ、さらに増殖させてから患者体内に戻すＴ細胞養子免疫療法として発展してきた。
【０００３】
腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化させ増殖させるためには、腫瘍抗原提示した樹状細胞が効果的であることが知られている。樹状細胞は骨髄由来の免疫細胞であり、生体内に広く分布している。生体内では未成熟な樹状細胞は腫瘍由来のタンパク質等を貪食することで活性化し、所属リンパ節まで遊走し、成熟する。成熟した樹状細胞は貪食したタンパク質由来抗原ペプチドを組織適合性抗原クラスＩＩ分子と結合させて細胞表面に提示する。また同時に組織適合性抗原クラスＩ分子にも抗原ペプチドを結合させて提示することも知られている。抗原ペプチドを提示した樹状細胞によって、その抗原ペプチドを認識できるＣＤ８陽性又はＣＤ４陽性Ｔ細胞が効果的に誘導される（Ｂａｎｃｈｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２（１９９８）、Ｇｏｇｏｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉ．１６：２９９−３１７（２００３））。
【０００４】
樹状細胞に対象の腫瘍由来の抗原ペプチドを提示させる方法はいくつか知られている（非特許文献１参照）。腫瘍由来のペプチド抗原を樹状細胞に与え、樹状細胞の組織適合性抗原分子に結合させ、提示するペプチドパルス法が知られている。この方法には腫瘍由来のペプチドが必要となり、このペプチドを同定することが非常に困難である。このためこの方法を利用できる腫瘍は限られている（非特許文献２及び３参照）。
【０００５】
樹状細胞に腫瘍細胞そのものを貪食させて、腫瘍細胞由来ペプチドを樹状細胞に提示させる方法も報告されている（非特許文献４参照）。この方法では腫瘍細胞を壊死させたり、アポトーシス誘導したり処理をして用いているため、インタクトな腫瘍細胞に特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を得るために用いられる樹状細胞として適当なものか疑問である。
【０００６】
抗原ペプチドを提示させる別の方法として、樹状細胞と対象の腫瘍細胞とを細胞融合させる方法も知られている。この方法では適切な細胞融合の効率が低いことから、また樹状細胞の性質を大きく変えてしまうこと、さらに適切な抗原提示能が低いため、好ましい方法ではない（非特許文献５〜７参照）。
【０００７】
腫瘍細胞特異的抗体を結合させた腫瘍細胞を樹状細胞と混合培養し、樹状細胞に腫瘍細胞を貪食させ、樹状細胞に抗原ペプチド提示させる方法も報告されている（非特許文献８及び９参照）。この方法は樹状細胞がＦｃγレセプターを持つことを利用している。このように抗体結合させた（オプソニン化させた）細胞を貪食する性質を抗体依存的貪食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ；ＡＤＣＰ）と呼ぶ（非特許文献１０及び１１参照）。この方法では腫瘍特異的抗体が必要である。しかし対象の腫瘍に特異的な抗体を得ることも非常に困難であり、この方法も治療対象となる腫瘍は限られている。
【０００８】
腫瘍細胞に対する特異的抗体を得ることは困難であるが、任意の抗体を用いた腫瘍治療への試みがある。任意の抗原を細胞に発現又は化学修飾して、その抗原に対する抗体を腫瘍細胞に結合させることで樹状細胞へ貪食されやすくした例も報告されている（非特許文献１２参照）。この方法では腫瘍細胞膜表面に抗体を結合させるために、遺伝子を導入し、抗原を細胞表面に発現した腫瘍細胞を得る必要があり操作が煩雑であり調製に時間がかかる。さらに人為的に発現させたタンパク質は本来腫瘍細胞成分には含まれず、樹状細胞がこのタンパク質を提示することで誤った抗原提示を誘導する可能性が考えられる。また細胞表面タンパクに抗原を化学修飾した場合、腫瘍細胞のタンパク質が修飾されるため、これらのタンパク質が樹状細胞に提示できなくなる可能性が考えられる。
【０００９】
対象となる腫瘍細胞の治療に有効な特異抗原を同定することが難しく、そのため特異的抗体も調製が困難なことが、癌治療を難しくしている。しかし腫瘍特異抗体でなくとも、腫瘍細胞表面に抗体を結合し、抗体のＦｃドメインが腫瘍細胞表面に提示されていれば、樹状細胞に腫瘍細胞又はその成分を効果的に貪食させることができる。そして腫瘍由来抗原ペプチドを提示した樹状細胞を得ることができる。
【００１０】
樹状細胞はＦｃレセプターを介して貪食することにより、樹状細胞表面の組織適合性抗原分子の発現誘導、又はＴ細胞を活性化するために必須の共刺激分子であるＢ７分子の発現が誘導され、成熟型樹状細胞となることが知られている（Ｒｅｇｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：３７１−３８０（１９９９）、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：Ｆ１−Ｆ３（２００２）、Ａｌｅｘｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１６５３−１６５９（２００２）、Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１６４１−１６４８（２００３））。
【００１１】
体外で調製された癌患者から得られた腫瘍細胞由来抗原ペプチドを提示した患者由来の樹状細胞は、患者由来のＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞又はメモリーＴ細胞と体外で共培養することによって、腫瘍特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。この腫瘍特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を患者に移植することによって癌を治療することができる。
【００１２】
又は腫瘍細胞由来抗原ペプチドを提示した患者由来の樹状細胞を患者体内に移植することで、体内で腫瘍傷害性Ｔ細胞が誘導されることが期待される。また活性化した樹状細胞はインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を分泌し、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞を活性化、特に細胞免疫系を活性化調節するＴｈ１細胞を誘導する。またＩＬ−１２はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）細胞も活性化することが知られている。故に患者体内で腫瘍に対する免疫システムが大きく活性化されることが期待される（Ａｒｄａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１−９（２００３）、Ｃｏｍｐｏｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３６８８−３６９４（２００３））。
【００１３】
一方、本発明者らはこれまでに細胞膜表面にタンパク質を結合させるための、細胞修飾剤（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；ＢＡＭ）を開発している（特許文献１参照）。ＢＡＭは細胞膜に結合するための脂質鎖と、この脂質鎖を溶解するための水溶性あるいは両親媒性高分子鎖からなる化合物である。このＢＡＭの高分子鎖に任意の物質を結合させることができる。このように調製された組成物を細胞に添加すると、数分で細胞膜と非共有結合的に結合し、任意の物質を細胞表面に提示することが可能である。細胞膜表面にＢＡＭを用いてタンパク質を結合させる方法をタンパク質アンカーリング法と呼ぶ。タンパク質アンカーリング法は、傷害を生じることなく、プローブ（蛍光標識等）等の修飾対象物質で細胞膜を修飾することを目的としている。
【特許文献１】特開２００３−１１６５２９号公報
【非特許文献１】Ｓｖａｎｅら，ａｃｔａ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，  ｅｔ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（ＡＰＭＩＳ），デンマーク，２００３，１１１，ｐ．８１８−８３４
【非特許文献２】Ｎｅｓｔｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．），米国，１９９８，４，ｐ．３２８−３３２
【非特許文献３】Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ），米国，２００４，５，ｐ．７−１０
【非特許文献４】Ｔｈｕｍａｎｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ），オランダ，２００３年，２７７，ｐ．１−１６
【非特許文献５】Ｋｕｇｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．），米国，２０００年，６，ｐ．３３２−３３６
【非特許文献６】Ｔａｋｅｄａら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ），英国，３３，ｐ．８９７−９０４
【非特許文献７】Ｐｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．），米国，２００３，９，ｐ．１２１５−１２１９
【非特許文献８】Ｄｈｏｄａｐｋａｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ），米国，２００２，１９５，ｐ．１２５−１３３
【非特許文献９】Ｓｅｌｅｎｋｏら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，英国，２００１年，１５，ｐ．１６１９−１６２６
【非特許文献１０】Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．），オランダ，１９９９年，５３，ｐ．１９９−２０７
【非特許文献１１】Ａｋｅｗａｎｌｏｐら，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），米国，２００１，６１，ｐ．４０６１−４０６５
【非特許文献１２】Ｒｅｎｊｉｆｏら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．），米国，１９９８，１６１，ｐ．７０２−７０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、細胞表面のオプソニン化剤、特に腫瘍細胞やウイルス感染細胞のオプソニン化剤、オプソニン化されたそれらの細胞、ならびに腫瘍細胞由来ペプチドあるいはウイルス感染細胞由来ペプチドを提示した抗原提示細胞の調製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、細胞膜修飾剤ＢＡＭを用いたタンパク質アンカーリング技術により腫瘍細胞に対する特異抗体がなくても、腫瘍細胞表面に抗体又はＦｃドメインを含む抗体の一部を結合させ腫瘍細胞をオプソニン化することができ、そして抗体オプソニン化された腫瘍細胞が樹状細胞に効果的に貪食され、その腫瘍細胞特異的な抗原ペプチドを提示した活性化樹状細胞を得ることができることを見出して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
〔１〕一般式（１）で示される化合物を含む細胞表面オプソニン化剤
【００１６】
【化１】
2006025766.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｚは２〜１０の水酸基を有する化合物の残基、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基とオキシアルキレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良く、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基、Ｒ２は炭素数１５〜２３の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基、Ｘは修飾対象物質を共有結合し得る反応性官能基を１個以上含有する基、ａは０あるいは１、ｍ１、ｍ２、ｍ３はオキシエチレン基の平均付加モル数、ｎ１、ｎ２、ｎ３は炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、かつ、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｋ１、ｋ２、ｋ３は下記の条件を満足する数である。
０≦ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３≦５００、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３≦５００でありかつ、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３≦５００、０．５≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１、０≦ｋ１≦８、１≦ｋ２≦４、１≦ｋ３≦４でありかつ、２≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦１０）。
〔２〕Ｒ２がオレイル基又は炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である上記〔１〕記載の細胞表面オプソニン化剤。
〔３〕Ｒ２が一般式（２）で表される化合物の残基である上記〔１〕記載の細胞表面オプソニン化剤
【００１８】
【化２】
2006025766.tif 000003
【００１９】
（Ｒ3及びＲ4は炭素数１５〜２３の不飽和炭化水素基、Ｒ5は炭素数２〜４の２価の炭化水素基であり、ｂは０あるいは１であり、ｃは０あるいは１である）。
〔４〕抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、あるいは抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部及び補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部の両方が結合している、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の細胞表面オプソニン化剤。
〔５〕該オプソニン化が、上記〔１〕記載の細胞表面オプソニン化剤に結合させた抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、あるいは抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部及び補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部の両方を細胞表面に結合させることによって行われることを特徴とする、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の細胞表面オプソニン化剤。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の細胞表面オプソニン化剤によってオプソニン化された細胞。
〔７〕腫瘍細胞である、上記〔６〕記載のオプソニン化された細胞。
〔８〕上記〔７〕記載のオプソニン化された腫瘍細胞を抗原提示細胞に貪食させることを含む、腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法。
〔９〕上記〔８〕記載の腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法によって得られた腫瘍細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞。
〔１０〕ウイルス感染細胞である、上記〔６〕記載のオプソニン化された細胞。
〔１１〕上記〔１０〕記載のオプソニン化された細胞を抗原提示細胞に貪食させることを含む、ウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法。
〔１２〕上記〔１１〕記載のウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞の調製方法によって得られたウイルス感染細胞由来ペプチドを組織適合性抗原分子上に提示した抗原提示細胞。
〔１３〕樹状細胞又はマクロファージである、上記〔９〕又は〔１２〕記載の抗原提示細胞。
〔１４〕上記〔９〕、〔１２〕及び〔１３〕のいずれかに記載の抗原提示細胞を用いることを特徴とする細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、腫瘍細胞あるいはウイルス感染細胞に特異的結合する抗体が得られていない場合でも、任意の抗体又はＦｃドメインを含む抗体の一部等を細胞膜修飾剤ＢＡＭを用いて該細胞の表面又は該細胞由来の小胞の表面に結合させることができる。かかる結合により、特異抗原が同定されていない腫瘍や特異抗体が得られていない腫瘍を含む対象細胞の細胞表面を修飾することが可能となり、抗原提示細胞、特に樹状細胞がＡＤＣＰの様式によって、対象細胞を貪食することを促進させることができる。本発明の方法によって腫瘍やウイルス感染細胞特異的な抗原を提示し、活性化した抗原提示細胞を得ることができる。
本発明の細胞表面オプソニン化剤は、癌治療に対して汎用性が広く、試薬のコストが安価で、操作法が容易であり、また操作時間も比較的短時間であり、癌治療に大きな貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書中で引用した参考文献と本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書が優先される。
【００２２】
ここでいうオプソニン化とは、腫瘍細胞等貪食の対象となる細胞に、抗体等の抗原提示細胞の貪食を高めたり活性化を促したりする物質を結合させて抗原提示細胞に貪食されやすくする処理のことをいう。本発明の細胞表面オプソニン化剤は、任意の細胞膜にタンパク質を数分以内に結合させることができる細胞膜修飾剤ＢＡＭによって構成され、ＢＡＭと任意の抗体又はＦｃドメインを含む抗体の一部等を結合させて複合体を得、さらに当該複合体を腫瘍細胞等貪食の対象となる細胞に結合させることによって細胞をオプソニン化する。抗体等とＢＡＭとの結合は直接結合してもよいし、又は任意の抗原を結合させたＢＡＭにその抗原に対する抗体を結合させ、非共有結合的に間接的に抗体とＢＡＭとを結合させることもできる。ここでいう任意の抗原とはフルオレセイン、ビオチン等低分子化合物やペプチド又はタンパク質、糖や脂質が結合した修飾タンパク質等抗体と結合できる物質を指す。ただし、任意の抗原には腫瘍細胞の膜タンパク質と反応性を持ち、化学結合するような化合物は含まない。又は治療対象生物種が健常状態では通常多く持たないタンパク質、ペプチド、修飾タンパク質は任意の抗原として使用を避けたほうが好ましい。
【００２３】
ＢＡＭに結合させる抗体の代わりに以下の物質を用いることも効果的である。抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質、たとえば補体、レクチン、ＢＣＧやＬＰＳ等Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）等のサイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。またこれらの物質を単独で細胞表面に結合させるだけではなく、組み合わせることも有効である。
【００２４】
細胞表面オプソニン化剤、具体的には抗体等の抗原提示細胞の貪食を高めたり活性化を促したりする物質が結合した細胞表面オプソニン化剤を腫瘍細胞等貪食の対象となる細胞に添加し、一定時間放置し、必要があれば細胞を洗浄することでオプソニン化された細胞が得られる。ただしこの処理中、細胞はアルブミン無添加の培地又は緩衝等張液中に存在することが好ましいが、これに限定されず、もしアルブミン存在下でも細胞表面オプソニン化剤濃度や処理時間を調節することでオプソニン化することは可能である。
【００２５】
細胞表面のオプソニン化は血清添加培地中で２４時間程度持続するが、経時的に細胞膜から細胞表面オプソニン化剤が解離して減少するため、好ましくはオプソニン化処理後できるだけ早く抗原提示細胞と混合したほうがよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられる。
【００２６】
貪食対象となる細胞が腫瘍細胞である場合、混合培養することでオプソニン化された腫瘍細胞は抗原提示細胞に貪食され、貪食した細胞は成熟し活性化し、腫瘍細胞由来ペプチドを提示する。腫瘍由来ペプチドは、対象となる腫瘍細胞の種類によって適宜異なっていても良い。
【００２７】
貪食される細胞は腫瘍細胞だけに限られず、入手できればウイルス感染した細胞等も用いることができる。このことでウイルス感染した細胞由来のペプチドを提示した抗原提示細胞が得られ、ウイルス感染症の治療にも利用できる。
【００２８】
本発明においては、抗原提示細胞の貪食作用が促進される。故にその貪食の対象となる細胞は腫瘍やウイルス感染症のみに限られない。更に本発明の細胞表面オプソニン化剤は細胞のみならず、表面にリン脂質膜を持つ物質、たとえば、細菌、特にグラム陰性菌、ウイルス、リポソーム等、に結合できるため、これらを抗原提示細胞に貪食させることも可能である。リポソームの内部に任意の物質を封入することができれば、細胞表面オプソニン化剤を用いることによって、その任意の物質を貪食させることも可能である。
【００２９】
本発明で使用するＢＡＭとして、具体的には、式（１）で表される化合物を用いることができる。
【００３０】
【化３】
2006025766.tif 000004
【００３１】
（式中、Ｚは２〜１０の水酸基を有する化合物の残基、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基とオキシアルキレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良く、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基、Ｒ２は炭素数１５〜２３の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基、Ｘは修飾対象物質を共有結合し得る反応性官能基を１個以上含有する基、ａは０あるいは１、ｍ１、ｍ２、ｍ３はオキシエチレン基の平均付加モル数、ｎ１、ｎ２、ｎ３は炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、かつ、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｋ１、ｋ２、ｋ３は下記の条件を満足する数である。
０≦ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、ｎ３≦５００、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３≦５００でありかつ、３≦ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３≦５００、０．５≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１、０≦ｋ１≦８、１≦ｋ２≦４、１≦ｋ３≦４でありかつ、２≦ｋ１＋ｋ２＋ｋ３≦１０）。
【００３２】
細胞膜修飾剤ＢＡＭはモノアシル型とジアシル型が入手可能であるが、腫瘍細胞のオプソニン化時間を２時間以上持続させたい場合はジアシル型ＢＡＭを用いるほうが好ましい。
【００３３】
ジアシル型ＢＡＭを構成する高分子鎖として、好ましくは生体適合性の高いポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）が利用される。また細胞膜修飾剤ＢＡＭとしての機能が損なわれない限り、そのＰＥＧ鎖の１本当たりの付加モル数は限定されないが、好ましくは１５モル以上であり、さらに好ましくは１５−１８０モル、より好ましくは８０モルである。
【００３４】
式（１）において、Ｚは２〜１０個の水酸基を有する化合物の残基であり、２〜１０個の水酸基を有する化合物としては、具体的には、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ペンタエリスリトール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン及びオクタグリセリン等を挙げることができる。Ｚとしては好ましくは２〜８の水酸基を有する化合物の残基を用いることができる。
【００３５】
式（１）において、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基等が挙げられる。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよく、あるいは２種以上が組み合わされていてもよい。２種以上が組み合わされる場合には、その組み合わせ方に制限はなく、ブロック状であってもランダム状であってもよい。
【００３６】
式（１）においてｎ１、ｎ２、ｎ３はオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、ｍ１、ｍ２、ｍ３はオキシエチレン基の平均付加モル数を示している。ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ０〜５００であり、オキシエチレン基とオキシアルキレン基の総和であるｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３は３〜５００の範囲であり、好ましくは１０〜３００、より好ましくは２０〜２００である。
また、オキシエチレン基の総和であるｍ１＋ｍ２＋ｍ３は３〜５００の範囲であり、好ましくは１０〜３００、特に好ましくは２０〜２００である。また、オキシエチレン基の総和であるｍ１＋ｍ２＋ｍ３とオキシアルキレン基の総和であるｎ１＋ｎ２＋ｎ３との比率は、０．５≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１を満足する必要がある。オキシエチレン基が少ないと水溶性が不足し十分な生体親和性が得られないことがある。オキシエチレン基の付加モル数は、例えばＲ１あるいはＲ２の疎水性基との親水性と疎水性のバランスによって決めることが可能である。好ましくは０．７５≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１、特に好ましくは０．９≦（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３）／（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）≦１である。
ｋ２が２以上であるか、あるいはＲ２がリン脂質化合物残基である場合には、疎水性を示す脂肪族炭化水素基が２鎖以上存在し、オキシエチレン基の平均付加モル数ｍ１＋ｍ２＋ｍ３が２０〜３００であることが好ましく、特に好ましくは３０〜２００であることがさらに好ましい。
前記式（１）において、ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値はＺの分岐数に対応しており、２〜１０、好ましくは２〜４の整数である。ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が２より小さい場合には、一末端に脂肪族炭化水素基である疎水性基、他の一末端に反応性官能基を有する化合物が得られないため、細胞と抗体等とを結合させることができなくなる。また、ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が１０より大きい場合には、分子の三次元的な広がりが大きく嵩高くなるために、立体障害により安定な結合を行うことができない場合がある。
【００３７】
前記式（１）において、ｋ１はポリアルキレンオキシドの分岐した末端の残基が水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である残基の合計数であり、０〜８の範囲の整数である。
前記式（１）において、ｋ２はポリアルキレンオキシドの末端の残基に炭素数１５〜２３の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基の合計数であり、１〜４の範囲の整数であり、好ましくは１〜３、特に好ましくは１〜２である。ｋ２が０の場合は細胞と可逆的に非共有結合で結合することができず、５以上の場合は、嵩高く、細胞膜に本発明のオプソニン化剤が結合されない場合がある。
【００３８】
前記式（１）においてａは０又は１であり、ａが０の場合には、Ｒ２で表される不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にエーテル結合していることを意味し、ａが１の場合はＲ２で表される不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にカルボニル基を介してエステル結合していることを意味している。
前記式（１）において、ｋ３はＸで示される反応性官能基を含有する基が末端残基に結合したポリアルキレンオキシド鎖の合計数であり、１〜４の範囲の整数であり、好ましくは１〜３である。ｋ３が２以上の場合は、Ｘに含有される反応性官能基は１種又は２種以上でもよい。２種以上の場合は同種あるいは異種の修飾対象物質と結合させ、細胞膜に導入することができる。
【００３９】
前記式（１）においてＲ１は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基であり、好ましくは水素原子又はメチル基である。ｋ２が１以上の場合には、Ｒ２の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基が式（１）の化合物の疎水性基として作用する。
前記式（１）において、Ｒ２は炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基である。好ましくはオレイル基、炭素数１７の不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、あるいは炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物の残基である。例えば下記一般式（２）で表される化合物の残基であることが好ましい。
【００４０】
【化４】
2006025766.tif 000005
【００４１】
Ｒ２の具体例としては、ａが０の場合、オレイル基、リノレイル基、アラキドニル基、エルカイル基等は不飽和の直鎖又は分枝の炭化水素基が挙げられる。別の具体例としては、炭素数１５〜２３の不飽和脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基、より好ましくは炭素数１７の不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基である。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン等が挙げられる。
また、ａが１の場合、Ｒ２は通常Ｒ２ＣＯとして脂肪酸に由来するアシル基を用いることができる。Ｒ２ＣＯの具体例としては、例えば、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エルカ酸等の不飽和の直鎖又は分枝の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
【００４２】
前記式（１）において、Ｘは修飾対象物質を共有結合し得る反応性官能基を１個以上含有する基である。好ましくは、Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、ｐ−ニトロフェニル基又はチオール基等の反応性官能基を含有する基である。ポリアルキレンオキシド残基の末端へのＸの結合様式については特に限定はなくＪＭＳ−ＲＥＶ．  ＭＡＣＲＯＭＯＬ．  ＣＨＥＭ．  ＰＨＹＳ．，  Ｃ２５（３），  ３２５−３７２（１９８５）等に報告されているような一般的な結合様式を用いることができるが、上記反応官能基を簡便に導入するためには２価の炭化水素基、エステルあるいはアミド結合を介して導入を行うことが好ましい。この目的に用いられる２価の炭化水素基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等の直鎖の２価の炭化水素基、ヘキシレン基、フェニレン基等の２価の環状炭化水素基が挙げられ、好ましくは炭素数１〜５の炭化水素基である。エステル結合としては、モノカルボン酸又はジカルボン酸由来のエステル結合でもよいが、ジカルボン酸としてはコハク酸、グルタル酸、及びマレイン酸等が挙げられ、アミド結合としてはエチルアミド及びプロピルアミド等由来のアミド結合が挙げられる。結合様式として、特に好ましいのはメチレン基、エチレン基、プロピレン基及びペンチレン基である。
【００４３】
Ｘにおける修飾対象物質とは、式（１）で表されるＢＡＭと結合して細胞をオプソニン化する、抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質（例えば任意の抗体分子、Ｆｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子、補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、レクチン、ＢＣＧやＬＰＳ等ＴＬＲのリガンド、ＴＮＦやＩＦＮ−γ等のサイトカイン等）、ならびにこれらの物質とＢＡＭとに結合し両者を結びつけることができる任意の抗原（フルオレセイン、ビオチン等の低分子化合物やペプチド又はタンパク質、糖や脂質が結合した修飾タンパク質等の抗体と結合できる物質）等である。すなわち、樹状細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質は、式（１）中のＸと結合することによって直接的に、あるいは式（１）中のＸと結合した任意の抗原と結合することによって間接的に、ＢＡＭと結合する。
【００４４】
前記式（２）は炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である。式（２）において、ｂは０又は1である。ｂが１の場合、式（２）は炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物の残基、すなわちホスファチジルエタノールアミン含有残基である。ｋ２の基数を増やさず、細胞膜と本発明のオプソニン化剤とを強く結合させる場合には、Ｒ２として式（２）で示される炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物残基を用いることが好ましい。
前記式（２）において、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に炭素数１５〜２３の不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、より好ましくは炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基である。Ｒ３及びＲ４は通常Ｒ３ＣＯ及びＲ４ＣＯとして脂肪酸に由来するアシル基を用いることができる。Ｒ３ＣＯ及びＲ４ＣＯの具体的なものとしては、例えば、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エルカ酸等の不飽和の直鎖又は分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、より好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
Ｒ３及びＲ４は同一であっても異なっていてもよい。Ｒ３及びＲ４の炭素数がそれぞれ２３を越える場合、疎水性が強く柔軟性が小さいため細胞膜への結合が困難になる場合があり、また炭素数が１５より少ない場合には、細胞膜への結合後、疎水性が弱いために細胞膜から抜け落ちる場合がある。Ｒ２が式（２）で示されるリン脂質含有化合物の残基の場合には、アシル基が２本あるために細胞膜の修飾後の安定性が一本鎖より高く、細胞膜にアンカーリングした状態で分子の脱落が生じにくい。
前記式（２）において、Ｒ５は炭素数２〜４の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれでもよい。具体的には−ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）３−、又は−（ＣＨ２）４−基等が挙げられる。
ｃは０又は１を示す。
【００４５】
本発明で用いるＢＡＭが１個以上の不斉炭素を有する場合には、任意の光学活性体又はジアステレオ異性体等の純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体等の任意の物質を用いることができる。また、オレフィン性の二重結合を含む場合には、純粋な形態のＥ体又はＺ体、あるいはそれらの混合物のいずれを用いてもよい。
【００４６】
ＢＡＭと抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部、等の修飾対象物質との結合は、具体的には下記の工程（１）修飾対象物質上の官能基と上記ＢＡＭを反応させる工程；及び工程（２）前記工程（１）で得られた反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させる工程により行うことができる。修飾対象物質として直接、抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質をＢＡＭに結合させる場合は上記の２工程で反応させることにより、修飾対象物質として抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質と結合する任意の抗原（上述）を用いる場合にはまず工程（１）で任意の抗原とＢＡＭとを結合させた複合体を作成した後得られた複合体と抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質とを結合させることによって行う。抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質と、ＢＡＭと修飾対象物質である任意の抗原とからなる複合体との結合は、複合体と細胞膜とを結合させる前であっても後であっても構わない。修飾対象物質である任意の抗原と抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質との結合は、その組み合わせに応じて適宜決定されるものであり、例えば抗原がフルオレセインであれば該物質としては抗フルオレセイン抗体を用いることができ、両者は抗原抗体反応によって結合し得る。
【００４７】
前記工程（１）の反応工程で用いる溶媒の種類は、反応に関与しない溶媒であれば特に制限されないが、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液あるいはその等張液、あるいは有機溶剤又は上記の水性媒体と有機溶剤との混合物等を用いることができ、これらは単独溶媒系でも混合溶媒系でもどちらでもよい。修飾対象物質が変性ないし失活することがないように、反応に関与しないアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶剤を使用することが好ましい。反応温度は、修飾対象物質が変性しない温度であれば特に限定されないが、例えば、０〜１００℃、さらに０〜４０℃が好ましい。反応時間は通常は１分〜４８時間程度であり、０．５〜３時間が好ましい。反応後は、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液等で洗浄、あるいは限外ろ過等により未反応のＢＡＭを除去して次の工程に進むことが好ましいが、反応生成物の精製を行わずに工程（２）に用いてもよい。
【００４８】
工程（２）においては、工程（１）で得られたＢＡＭを結合した修飾対象物質（抗体分子又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部、補体分子又は補体レセプターに結合するドメインを含む補体分子の一部等の抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質）に腫瘍細胞あるいはウイルス感染細胞をリン酸緩衝液あるいは無血清培地に分散させたものを添加、あるいは腫瘍細胞あるいはウイルス感染細胞の分散液にＢＡＭを結合した修飾対象物質を含浸させることによって抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質を細胞表面に固定化することができる。工程（１）で得られたＢＡＭを結合した修飾対象物質と腫瘍細胞あるいはウイルス感染細胞との結合は通常は０〜４０℃で行い、１秒間〜１２０分間、好ましくは２５〜３７℃で１０秒間〜８０分間行う。この工程において、工程（１）で得られた反応生成物以外の添加剤を添加してもよい。腫瘍細胞やウイルス感染細胞にＢＡＭを介して修飾対象物質を結合させた後、修飾対象物質が結合していない細胞を等張液を添加して洗浄することが好ましい。用いる等張液としては細胞に傷害を与えない溶媒であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液生理食塩水、細胞培養液等の等張液を用いることができる。
【００４９】
修飾対象物質として抗原提示細胞の貪食を高めたり、活性化を促したりする物質及びＢＡＭと結合し両者を結びつけることができる任意の抗原を用いた場合、任意の抗原は、工程（１）の後に添加しても工程（２）の後に添加してもよい。
【００５０】
本発明のＢＡＭを介して修飾対象物質を結合させた腫瘍細胞又はウイルス感染細胞は、アルブミン等のタンパク質水溶液を流すことによって修飾対象物質から除去することができる。タンパク質水溶液の濃度はタンパク質水溶液濃度が高ければ短時間で除去でき、タンパク質濃度が低ければ除去に時間がかかることになる。
【００５１】
本発明において用いるＢＡＭは修飾対象物質の表面の官能基に合わせて、穏和な条件で反応する反応性官能基を式（Ｉ）中のＸとして適宜選択することができる。
たとえば修飾対象物質の表面にアミノ基がある場合、反応性官能基はコハク酸イミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、ｐ−ニトロフェニル基等を含有する基が使用できる。これらは、対象となる物質の溶解性、安定性等の物性によって、適宜選択することができる。
修飾対象物質の表面にカルボキシル基がある場合、反応性官能基はアミノ基、チオール基等を含有する基を持つ固定化剤が使用できる。
修飾対象物質の表面にチオール基がある場合は反応性官能基としてマレイミド基、コハク酸イミド基を含有する基を持つ固定化剤が使用でき、逆に対象となる物質の表面にマレイミド基がある場合は反応性官能基としてチオール基を含有する基を持つ固定化剤を使用することができる。
修飾対象物質の表面の官能基とＢＡＭの反応性官能基との反応方法は、「蛋白質の化学修飾（上／下）」（大野素徳、学会出版センター、１９８１）等で示されている酵素等のタンパク質と反応性化合物との反応方法が適用できるほか、公知な方法を用いることができる。
【００５２】
また本発明のオプソニン化剤は、その表面に細胞膜と可逆的に非共有結合で反応する基をもつので、本発明のオプソニン化剤を腫瘍細胞又はウイルス感染細胞と単に混合するだけで随時密着固定化される。また本発明のオプソニン化剤は細胞膜表面に結合した後も、アルブミン等のタンパク質水溶液に含浸させるだけで除去できるので剥離時に細胞にダメージを与えることが無く有用である。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は本発明のある特別に好ましい様態をさらに例示することを意図しており、本発明の範囲を制限することを意図していない。
実施例１
本実施例において用いた、細胞表面オプソニン化剤を構成するＢＡＭは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とＰＥＧ鎖（８０モル）から構成されＰＥＧ鎖末端にＮヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）が修飾されているものを用いた（日本油脂株式会社より入手可能）。このＢＡＭをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍＭ溶液を調製した。５−（アミノメチル）−フルオレセイン（ＦＬ）（同人化学より入手可能）をＤＭＳＯに溶解し、３０ｍＭ溶液を調製した。ＢＡＭ溶液とＦＬ溶液を同量混和し、室温で２０分間放置した。この操作により得られた溶液を、ＢＡＭとＦＬが化学結合したＢＡＭ−ＦＬ溶液と呼ぶ。この調製により５ｍＭ  ＢＡＭ−ＦＬが得られた。ＢＡＭ−ＦＬは抗フルオレセイン抗体（抗ＦＬ抗体）と結合する。細胞表面オプソニン化剤の抗体又はＦｃドメインを含む抗体分子の一部との結合の様式の概念図を図１に示した。
【００５４】
腫瘍細胞としてマウスＴリンパ腫細胞株ＥＬ−４を用いた。ＥＬ−４細胞１×１０５個を０．１ｍｌの血清無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、これに５ｍＭ  ＢＡＭ−ＦＬを１１μｌ添加し、３７℃で６０分間加温した。リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で２回細胞を洗浄した。細胞を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＦＬ抗体（抗体クラスはＩｇＧ１型）を１０μｌ添加し、３７℃で３０分間加温した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。この操作で細胞は細胞表面オプソニン化剤でオプソニン化された。
【００５５】
細胞表面に抗体が結合しているかどうか、即ち細胞がオプソニン化されているかどうかを以下の方法で確認した。上述の一連のオプソニン化処理を施したＥＬ−４細胞１×１０５個を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、０．２ｍｇ／ｍｌのＣｙ５蛍光標識抗マウスＩｇＧ１抗体を１０μｌ添加し、３７℃で３０分間加温した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞は１ｍｌの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、共焦点レーザー走査顕微鏡で細胞を観察した。その結果ＥＬ−４細胞の細胞膜にＣｙ５由来の赤色蛍光が観察され、細胞表面に抗体が結合し、オプソニン化されていることが示された。
【００５６】
実施例２
オプソニン化したＥＬ−４細胞に対するマウスマクロファージ細胞株ＷＥＨＩ−３の貪食を以下の順に操作し観察した。
（１）腫瘍細胞の蛍光染色：ＥＬ−４細胞８×１０５個を０．８ｍｌの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＤＭＳＯに溶解した１００μＭ  ５−又は６−（Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセイン（ＣＦＳＥ、同人化学より入手可能）溶液を４０μｌ添加し、３７℃で３０分間加温した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を０．８ｍｌの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、３７℃の５％炭酸ガス雰囲気下で２４時間培養した。
（２）腫瘍細胞のオプソニン化：細胞を３６０μｌのＰＢＳに懸濁し、１０ｍＭ  ＢＡＭ−ＦＬを４０μｌ添加し、３７℃で４０分間加温した。リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で２回細胞を洗浄した。細胞を３６０μｌのＰＢＳに懸濁し、０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＦＬ  抗体を４０μｌ添加し、３７℃で６０分間加温した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を３００μｌの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
（３）マクロファージ株の腫瘍細胞貪食：オプソニン化された腫瘍細胞ＥＬ−４  １×１０５個とマクロファージ株ＷＩＨＩ−３  １×１０５個を２００μｌの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で１時間共培養した。
（４）マクロファージ株の染色：共培養後細胞を直ちに４℃に冷やし、ＰＢＳ  １００μｌに懸濁し、フィコエリスリン（ＰＥ）蛍光標識された２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６／３２抗体を２μｌ添加し、４℃で６０分間放置した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのＰＢＳに懸濁した。フローサイトメトリーで細胞の蛍光を分析した。
（５）実施例２の分析結果：腫瘍細胞ＥＬ−４はＣＦＳＥで細胞内が緑色蛍光標識された。マクロファージ細胞株ＷＥＨＩ−３はその表面に存在するＦｃ受容体が赤色蛍光で免疫染色された。ＷＥＨＩ−３がＥＬ−４を貪食するとＷＥＨＩ−３が緑色蛍光も持つようになる（ダブルポジティブ細胞）。細胞表面オプソニン化剤により抗体を結合させたＥＬ−４は、細胞表面オプソニン化処理なしのＥＬ−４と比較して、赤色及び緑色蛍光ダブルポジティブ細胞（Ｒ２領域の細胞）の割合が２.１倍、緑色蛍光の弱いダブルポジティブ細胞（Ｒ３領域の細胞）の割合が４９.０倍増加した。緑色蛍光の弱いダブルポジティブ細胞はＷＥＨＩ−３がＥＬ−４由来成分の一部を貪食したものと思われる。
【００５７】
実施例３
マウスから摘出し、培養して得られた樹状細胞を使ってオプソニン化したＥＬ−４細胞に対する貪食を以下の通り観察した。ＣＦＳＥで蛍光染色され、細胞表面オプソニン化剤でオプソニン化された腫瘍細胞株ＥＬ−４の調製方法は実施例２と同様である。
（１）マウスからの樹状細胞の摘出：マウス（Ｃ５７ＢＬ／ｃ、雌、７週齢、日本チャールズリバーより入手）の頚動脈を切断し脱血後、７０％ＥｔＯＨに浸した。マウス腹部に切り込みを入れ、足先まで表皮を剥ぎ、大腿骨を取り出し、ハンクス溶液に浸した。大腿骨の両端を切断し、２．５ｍｌ（シリンジ）φ２５（注射針）を用いて、ハンクス溶液で骨髄細胞を洗い出し、注射器でピペッティングし、細胞をほぐしてから７０μｍセルストレイナーにかけ、５０ｍｌ遠沈管へいれ、１５００ｒｐｍで８分間，遠心した。上清を除去し、１ｍｌのＲｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社より入手）に懸濁し、２分後に無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で３０ｍｌに希釈し、１５００ｒｐｍで８分間遠心した。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＭ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌ添加）で５×１０５個／ｍｌとなるように懸濁後、２４穴プレートに１ｍｌずつ播種した。二日おきに培地交換（上清約７５０μｌを除去し、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＭ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌ添加）０．１ｍｌを添加）し、８日間培養した。
（２）樹状細胞の腫瘍細胞貪食：オプソニン化された腫瘍細胞ＥＬ−４  １×１０５個と樹状細胞１×１０５個を２００μｌの１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で１時間共培養した。
（３）樹状細胞の染色：共培養後細胞は直ちに４℃に冷やされ、ＰＢＳ１００μｌに懸濁し、フィコエリスリン（ＰＥ）蛍光標識された２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６／３２抗体を２μｌ添加し、４℃で６０分間放置した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのＰＢＳに懸濁した。フローサイトメトリーで細胞の蛍光を分析した。
（４）実施例３の分析結果：腫瘍細胞ＥＬ−４はＣＦＳＥで細胞内が緑色蛍光標識された。マウス樹状細胞はその表面に存在するＦｃ受容体が赤色蛍光で免疫染色された。樹状細胞がＥＬ−４を貪食すると樹状細胞が緑色蛍光も持つようになる（ダブルポジティブ細胞）。細胞表面オプソニン化剤により抗体を結合させたＥＬ−４は、オプソニン化処理なしのＥＬ−４と比較して、赤色及び緑色蛍光ダブルポジティブ細胞（Ｒ２領域の細胞）の割合が２．６倍、緑色蛍光の弱いダブルポジティブ細胞（Ｒ３領域の細胞）の割合が５．２倍増加した。緑色蛍光の弱いダブルポジティブ細胞は樹状細胞がＥＬ−４由来成分の一部を貪食したものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の細胞表面オプソニン化剤の構造を示す図である。（１）抗体を抗原を介して間接的に結合させた細胞表面オプソニン化剤の一般的な構造。（２）抗体を共有結合的に直接結合させた細胞表面オプソニン化剤の一般的な構造。（３）Ｆｃドメインを含む抗体の一部を共有結合的に直製結合させた細胞表面オプソニン化剤の一般的な構造。
【図１】
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