(57)【要約】【課題】  シロイヌナズナのセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質を検出するための抗体を提供すること。【解決手段】  本発明者は、Ｒａｃｅ法を用いて、ＡｔＭｉｓ１２の遺伝子構造を決定した。この遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一部を用いた１５アミノ酸（CSKSLKIKGSDKQKS）を抗原として用いることにより作製されたＡｔＭｉｓ１２抗体は、シロイヌナズナのセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質を良好に検出するものであった。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に記載のＡｔＭｉｓ１２タンパク質を特異的に認識することを特徴とする抗体。
【請求項２】
抗体の認識部位が、配列番号６の第４４位〜第５７位のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのＣ末端側の部分ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記ポリクローナル抗体がウサギによって生産されたものであることを特徴とする請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が標識化されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を用いて、シロイヌナズナのＡｔＭｉｓ１２タンパク質を検出することを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質を検出する抗ＡｔＭｉｓ１２抗体等に関するものである。
【０００２】
本発明に係る抗ＡｔＭｉｓ１２抗体は、植物染色体のセントロメアの機能と構造を解明するための研究材料として有用であり、植物の細胞分裂に関する研究や植物の生長に関する研究のリサーチツールとしても利用可能である。さらに、これらの研究をベースに染色体機能を調節する技術を開発することで、作物の改良に利用したり、植物を原材料に使用する各種商品への利用も期待できる。
【背景技術】
【０００３】
染色体のセントロメア（動原体）領域は、染色体の分裂と移動に重要な役割をもつが、植物染色体のセントロメアに関する研究はまだまだ未解明の部分が多く、今後なお一層この分野での研究進展が望まれている。たとえば、セントロメアに結合し、その機能に深い関わりをもつ蛋白質の動態を調査し、その詳細な役割・機能を明らかにすることは重要である。
【０００４】
Ｍｉｓ１２は、分裂酵母のセントロメアタンパク質をコードしている遺伝子で（下記の非特許文献１参照）、そのホモログが最近、シロイヌナズナのデータベース上で同定された［At5g35520.1，第５染色体の35520.1座］（下記の非特許文献２参照）。しかし、実際にシロイヌナズナの染色体セントロメアに局在するかは確かめられていない。
【０００５】
【非特許文献１】Goshima et al. 1999；Genes Dev.13:1664-1677
【非特許文献２】Goshima et al. 2003; J. Cell Biol. 160:25-39
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、セントロメアに特異的に存在するタンパク質の動態およびその機能・役割を解明し、植物染色体のセントロメアの機能・活性をなお一層明らかにすることである。より具体的には、上記Ｍｉｓ１２のシロイヌナズナ・ホモログ（ＡｔＭｉｓ１２）に着目し、このＡｔＭｉｓ１２が実際に染色体セントロメアに局在するかどうか、また、局在するとすればセントロメアにおいてどのような役割を担っているか、等を調査研究する為の研究材料として、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質を特異的に認識・検出する抗ＡｔＭｉｓ１２抗体を作製・提供することを本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前出の文献に開示されている情報、即ちシロイヌナズナの遺伝子データベース上で同定されているＭｉｓ１２様の遺伝子に関して解析した。その結果、ＲＡＣＥ法により、このＡｔＭｉｓ１２遺伝子の構造を確定し、データベース上で推定されているものとは異なるｍＲＮＡが転写されていることを見出した。実際に翻訳されているＡｔＭｉｓ１２タンパク質の長さは、推定の２８５アミノ酸よりも短く、２３８アミノ酸であった。さらに、これらの知見に基づいて、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質を特異的に検出する抗体を作製し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
こうして、第１の発明に係る抗体（本明細書において、「抗ＡｔＭｉｓ１２タンパク質抗体」、或いは単に「ＡｔＭｉｓ１２抗体」とも称する）は、配列番号６に記載のＡｔＭｉｓ１２タンパク質を特異的に認識することを特徴とする。
【０００９】
配列番号６（図６に記載したアミノ酸配列に同じ）に記載したアミノ酸配列は、本発明者によって、実際にシロイヌナズナによって発現されていると同定されたＡｔＭｉｓ１２タンパク質のものである。
【００１０】
本発明において、抗体の認識部位は、配列番号６の第４４位〜第５７位のアミノ酸配列（つまり、配列番号７の第２位〜第１５位のアミノ酸配列）を有するポリペプチドまたはそのＣ末端側の部分ペプチドであることが好ましい。
【００１１】
抗体とは、特異的な抗原を認識して結合するタンパク質のことを意味しており、その種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなど）、作製に利用した動物の由来（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ラクダなど）を問わない。また、抗体は、一価或いは多価のいずれでも良い。抗体には、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のいずれをも用いることができる。抗体がポリクローナル抗体である場合には、抗原を投与される動物としては、ウサギを使用することが好ましい。
【００１２】
本発明の抗体は、標識化することができる。標識化とは、その抗体の場所を同定するための標識物質を抗体に備えさせることを意味している。標識化には、例えば蛍光物質、放射能、酵素、その他のタンパク質（例えば、アビジン）などの利用が挙げられる。標識化された抗体を用いることにより、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質の定性的または定量的な検出を行うことができる。
【００１３】
なお、本発明の抗体を認識して結合する第２の抗体を用いることにより、本発明の抗体を標識化することなく、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質の定性的または定量的な検出を行うこともできる。ここで、第２の抗体とは、一般的には、本発明の抗体を作製するために用いた動物（またはモノクローナル抗体を作製するために用いた細胞が由来する動物）とは異なる動物由来の抗体であって、種特異的なエピトープを認識することで、本発明の抗体を特異的に認識する抗体を意味している。第２の抗体を標識化しておくことにより、本発明の抗体の位置または量（ひいては、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質の位置または量）を間接的に検出することができる。
【００１４】
第２の発明に係る検出方法は、第１の発明に係る抗体を用いて、シロイヌナズナのＡｔＭｉｓ１２タンパク質を検出することを特徴とする。
【００１５】
この検出方法は、例えば、（１）ゲル・メンブレン中のＡｔＭｉｓ１２タンパク質を定性的または定量的に検出するようなin vitroにおける使用、（２）シロイヌナズナの細胞中或いは細胞画分中のＡｔＭｉｓ１２タンパク質を定性的または定量的に検出するようなin situにおける使用等に用いることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る抗ＡｔＭｉｓ１２抗体は、シロイヌナズナのセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質の局在を調べるのに有効である。また、抗ＡｔＭｉｓ１２抗体を使って、セントロメアの活性などを調べることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
以下に、本発明の抗体を作製するために用いる抗原の調製方法、及び本発明の抗体の製造方法について説明する。
【００１８】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、(i) 配列番号６の全部または一部に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、または、(ii) 上記 (i)のペプチドのＮ末端或いはＣ末端に１個または２個以上の他のアミノ酸（例えば、Ｃｙｓ）を結合させたペプチド、を用いることができる（以下、これらの抗原を単に「本発明の抗原」と称することがある）。
【００１９】
本発明の抗原は、例えば（a）シロイヌナズナの組織または細胞から調整する、(b)ペプチドシンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成する、または（c）本発明の抗原をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する、ことによって製造することができる。
【００２０】
（a）シロイヌナズナの組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合は、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、得られた抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することにより調製できる。
【００２１】
（b）本発明の抗原を化学的に合成する場合は、例えば配列番号６に示されるＡｔＭｉｓ１２のアミノ酸配列から、エピトープ領域と推定される１０〜２０個程度のアミノ酸配列を決定し、ペプチドを合成することで調製できる。エピトープ領域は、例えばKite & Doolittleの方法により親水性の領域を予測すること等によって推定することができる。
【００２２】
（c）本発明の抗原をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合には、ＤＮＡは、公知のクローニング方法（例えば、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など）に従って作製することができる。例えば、（1）デザインしたＤＮＡプローブを用いて、シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡをクローニングする方法、または（2）デザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法によりＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡをクローニングする方法、などが挙げられる。
【００２３】
後述の実施例において、本発明のＡｔＭｉｓ１２抗体の作製に使用した抗原は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する合成ペプチドである。
【００２４】
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、当該ペプチドを構成し得る部分ペプチド、またはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、（i）M. Bodanszky & M.A. Ondetti、Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)、または（ii）Schroeder & Luebke、The Peptide, Academic Press, New York (1965)の方法を挙げることができる。
【００２５】
合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて、本発明の抗原を精製単離することができる。この方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することもできる。
【００２６】
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いて得ることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
【００２７】
保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、カルボジイミド類を用いることが好ましい。このようなカルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが例示される。各種活性化試薬による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか又は、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとして予め保護されたアミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
【００２８】
保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。そのような溶媒として、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適当な混合物などが例示される。反応温度はペプチド結合形成反応に使用されることが知られている範囲から適当に選択される。例えば、約−２０℃〜約５０℃の範囲から選択できる。
【００２９】
活性化されたアミノ酸誘導体は、通常約１.５倍〜約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００３０】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
【００３１】
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などが挙げられる。
【００３２】
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
【００３３】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００３４】
保護基の除去方法（脱離方法）としては、たとえばＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。
【００３５】
上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００３６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適当に選択できる。
【００３７】
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し、その後、アミノ基側にペプチド鎖を所定の鎖長まで延ばした後に、当該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記した混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所定の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所定のペプチドのアミド体を得ることができる。
【００３８】
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所定のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所定のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００３９】
本発明の抗原は、不溶化したものを直接免疫に用いることもできる。また、本発明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。担体（キャリアー）と本発明の抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、如何なるものを如何なる比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている高分子担体を重量比でハプテン１に対し０.１〜１００の割合で使用することができる。このような高分子担体としては、天然の高分子担体や合成の高分子担体が挙げられる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、ＫＨＬヘモシアニンなどが用いられる。
【００４０】
合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または各種ラテックスなどを用いることができる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。縮合剤としては、例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２,４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ,Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００４１】
（２）ポリクローナル抗体の作製
本発明の抗原は、それ自体単独であるいは担体・希釈剤と共に、各種動物の抗体産生が可能な部位に、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって投与することにより、ポリクローナル抗体を作製することができる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバント、又は不完全フロイントアジュバントを投与することもできる。
【００４２】
抗原の投与は、１回のみでも良いが、通常は２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体を作製する動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる。このうち、特に、モノクローナル抗体を作製するにはマウスが好ましく用いられる。
【００４３】
血清中の本発明の抗原に対する抗体価の測定は、液相法（例えば、標識化した本発明の抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定する方法）、或いは固相法（例えば、９６穴プレートの各ウエル内壁面に本発明の抗原を固着させておき、ここに血清を適当に希釈した溶液を添加し、抗体を抗原に結合させた後、ウエル中の溶液を洗浄することで余分な抗体を除去し、ウエル内壁面に結合した抗体量を測定する方法）によりなされる。
【００４４】
本発明のポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など）に従って行われる。
【００４５】
（３）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製に際しては、本発明の抗原を免疫された複数匹の動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、本発明の抗原のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。
【００４６】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature、256巻、495頁、1975年）に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４７】
本発明の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば本発明の抗原またはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した本発明のモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体 またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明の抗原を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
【００４８】
本発明のモノクローナル抗体のスクリーニング、培養は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の本発明の抗体の抗体価の測定と同様にして測定できる。本発明の抗原に対するモノクローナル抗体の分離精製は、上記したポリクローナル抗体の分離精製と同様に行われる。
【００４９】
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を動物の生体内または生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
【００５０】
上記のようにして調製された本発明の抗体（ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体）は、本発明の抗原を感度良く定量することができる。
【００５１】
次に、本発明の抗原の検出方法（免疫測定法）について詳細に説明する。
本発明の抗体を用いることにより、本発明の抗原の測定あるいは組織染色などによる検出を行うことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のF(ab')2、Fab'またはFab画分などを用いてもよい。
【００５２】
本発明の抗体を用いる検出方法は、特に制限されるものではなく、一般的に知られている免疫検出方法を用いることができる。
【００５３】
また、本発明の抗原量を測定するには、被測定物中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製し算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いることもできる。このような測定法としては、例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられる。
【００５４】
また、本発明の抗体を標識する場合には、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合には、ビオチン−アビジン系の化合物を用いることができる。
【００５５】
なお、個々の免疫学的測定法を本発明の検出方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の抗原の検出系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説などの文献を参照することができる。そのような文献としては、例えば、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００５６】
なお本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。なお、アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００５７】
アミノ酸については、Ｇ：グリシン、Ａ：アラニン、Ｖ：バリン、Ｌ：ロイシン、Ｉ：イソロイシン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｃ：システイン、Ｍ：メチオニン、Ｅ：グルタミン酸、Ｄ：アスパラギン酸、Ｋ：リジン、Ｒ：アルギニン、Ｈ：ヒスチジン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｙ：チロシン、Ｗ：トリプトファン、Ｐ：プロリン、Ｎ：アスパラギン、Ｑ：グルタミンである。また、塩基については、Ａまたはａ：アデニン、Ｇまたはｇ：グアニン、Ｔまたはｔ：チミン、Ｃまたはｃ：シトシンである。
【００５８】
また配列表の各配列番号は、以下の配列を表す。
［配列番号１］シロイヌナズナの遺伝子データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列。
［配列番号２］シロイヌナズナの遺伝子データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２の遺伝子配列（あわせて図２参照）。
［配列番号３］シロイヌナズナの遺伝子データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２タンパク質のアミノ酸配列。
［配列番号４］Ｒａｃｅ法によって決定された実際のＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列。
［配列番号５］クローン化されたｃＤＮＡから予測されるＡｔＭｉｓ１２の遺伝子配列（あわせて図５参照）。
［配列番号６］実際のＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列から推測されるＡｔＭｉｓ１２タンパク質のアミノ酸配列。
［配列番号７］ＡｔＭｉｓ１２抗体を作製する際に使用した抗原ペプチド（ＪＢ２２３）のアミノ酸配列。
［配列番号８］５’−Ｒａｃｅ法に用いたプライマーの塩基配列。
［配列番号９］３’−Ｒａｃｅ法に用いたプライマーの塩基配列。
【実施例】
【００５９】
次に、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例１：ＡｔＭｉｓ１２の遺伝子構造の決定〕
５’−Ｒａｃｅ法、及び３’−Ｒａｃｅ法を用いて、シロイヌナズナのデータベース上で同定されたＭｉｓ１２のホモログ（At5g35520.1）の遺伝子構造を確定した。５’−Ｒａｃｅ法には、配列番号８に示す塩基配列を持つプライマー（Ｍｉｓ１２−５ＲＣ）を使用し、３’−Ｒａｃｅ法には、配列番号９に示す塩基配列を持つプライマー（Ｍｉｓ１２−３ＲＣ）を用いた。また、両プライマーの位置は、図１中に下線を施して示した。
【００６０】
両Ｒａｃｅ法を実施した結果、いずれも単一のバンドが得られた。このプロダクトをＴ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、塩基配列を決定した。Ｒａｃｅ法には、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。
【００６１】
上記Ｒａｃｅ法により、遺伝子構造を確定し、データベース上で推定されているものとは異なるｍＲＮＡが転写されていることを見出した。実際に翻訳されているタンパク質の長さは、従来推定されていた２８５アミノ酸よりも短く、２３８アミノ酸であった（配列番号６及び図６参照）。
【００６２】
配列番号１及び図１には、データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列(GenBank/EMBL/DDBJ Accession no. NM122943)を示した。また、配列番号２及び図２には、データベース上で推定されていた遺伝子構造及びその塩基配列を、配列番号３及び図３には、それらから推定されたアミノ酸配列を示した(GenBank/EMBL/DDBJ Accession no. NM122943)。
【００６３】
これに対して、本実施例の結果として得られたｃＤＮＡ配列を配列番号４及び図４に示した。また、配列番号５及び図５には、解析の結果得られた遺伝子構造及びその塩基配列を、配列番号６及び図６には、それらから推定されたアミノ酸配列を示した。
【００６４】
このように、従来推定されていたＭｉｓ１２ホモログの構造と、本実施例の結果明らかにされたＭｉｓ１２ホモログ（ＡｔＭｉｓ１２）の構造とは、塩基配列及びアミノ酸配列において相違するものであった。
【００６５】
〔実施例２：抗ＡｔＭｉｓ１２タンパク質抗体（ＡｔＭｉｓ１２抗体）の作製〕
次に、図６に示したアミノ酸配列から、エピトープを推定し、このエピトープを認識する抗体を作製するためのペプチドを合成した。合成したペプチドのアミノ酸配列を配列番号７及び図７に示した。このペプチドは、図６に示したアミノ酸配列の第４４番目〜第５７番目の１４個のアミノ酸（下線を施した位置）のＮ末端にＣｙｓを付け加えた１５個のアミノ酸から構成されている。
【００６６】
この合成ペプチド（ＪＢ２２３）を定法に従って、２羽のウサギに注射（免疫）し、３９日目に採血した。すなわち、ＪＢ２２３をＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin)にＭＢＳ(m - maleimidobenzoyl- N - hydroxysuccinimide ester ) 法でコンジュゲートし、雌の家兎ニュージーランドホワイト２羽に対して、皮下注射により免疫した。なお、後の力価評価のため、免疫前のウサギの血清を採取した。初回免疫時にはアジュバントとしてＦＣＡ(Freund's complete adjuvant)を用い、２回目以降はＦＩＣＡ(Freund's incomplete adjuvant)を用いた。免疫は初回免疫から２週間おきに４回の追加免疫を行った。２回目の追加免疫から８日後に一次血清を採取し、３９日目にに二次血清を採取した。
【００６７】
注射前及び３９日目の血清について、合成ペプチド（ＪＢ２２３）に対する力価を測定した。力価は、ウサギ血清を１／５００〜１／６４０００の８段階に希釈し、各希釈率でのペプチドに対する反応性を９６穴プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により求めた。
【００６８】
図８には、２羽のウサギから採取した血清の力価曲線を示した。両ウサギにおいて、Ｄ０（注射前）に比べると、Ｄ３９（３９日目）では、合成ペプチド（ＪＢ２２３）に対して、良好な力価が認められ、免疫活性の高い血清が得られた。
【００６９】
次に、注射から５３日目に、２羽のウサギから最終採血を行い、血清から抗ペプチド抗体を精製した。抗体の精製は、次の方法により行った。
【００７０】
（１）アフィニティカラムの調整
活性化されたセファローズビーズに合成ペプチド（ＪＢ２２３）をカップリングさせることによりアフィニティカラムを調製した。
【００７１】
（２）抗血清のアフィニティカラムへのロード
上記（１）で調製したアフィニティカラムに４ｍｌの抗血清をロードし、３７℃にて１時間静置した。
【００７２】
（３）抗体の溶出
抗血清をロードしたアフィニティカラムを洗浄し、０.０２％アジ化ナトリウム（Sodium azide）を含む溶媒で目的抗体を溶出させた。抗体を含む溶出液をプールし、ＵＶ分光高度計を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することで、抗体濃度を定量した。
【００７３】
（４）精製抗体の力価検定
９６穴マイクロプレート（Costar High Bindingを使用）の各ウエルにペプチド抗体（ＪＢ２２３）を吸着させておき、精製抗体を８ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの間で８段階に希釈し、力価を測定した。なお、コントロールとして、抗体精製前の血清を同じ系列で希釈したものを用いた。
【００７４】
精製抗体の力価曲線を図９に示した。図９（Ａ）は、抗体濃度（横軸）とＯＤ４５０ｎｍとの関係を示すグラフである。また、図９（Ｂ）は、抗体を精製する前後における希釈倍率（横軸）とＯＤ４５０ｎｍとの関係を示すグラフである。この結果より、ＡｔＭｉｓ１２抗体は、良好に精製されたことが分かった。
【００７５】
〔実施例３：ウエスタンブロット解析〕
実施例２で精製した抗体を使用して、ウエスタンブロット法によりＡｔＭｉｓ１２タンパク質の部位発現特異性を確認した。具体的には、12.5%ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、電気泳動後、セミドライブロッティング装置（ATTO）で、ＰＶＤＦメンブレンに転写した後、直ちに３％スキムミルクで３０分間ブロッキングした。ＴＴＢＳ緩衝液で５０００倍に希釈したアフィニティー精製済みの一次抗体（ＡｔＭｉｓ１２抗体）液中で室温1時間インキュベートし、洗浄後、ＴＴＢＳ緩衝液で２００００倍希釈した二次抗体（HRP結合抗ウサギIg, F(ab’)2 fragment、Amersham Bioscience社製）で１時間室温でインキュベートした。発色反応による検出にはECL plus Western Blotting Detection System (Amersham Bioscience)を用いた。
【００７６】
結果を図１０に示した。図より明らかなように、期待される約２７ｋＤａの位置に明瞭なバンドが検出された。４個のレーンのうち、特に懸濁培養からの細胞核（第４レーン）では、顕著なバンドが観察された。このことから、細胞核において、ＡｔＭｉｓ１２抗体に反応するタンパク質（つまり、ＡｔＭｉｓ１２タンパク質）が顕著に発現していることが分かった。
【００７７】
〔実施例４：間接免疫蛍光解析〕
次に、実施例２で精製した抗体を用い、間接免疫蛍光解析を行った。方法は以下のとおりである。
シロイヌナズナ培養細胞と酵素液（1%セルラーゼ、0.15%ペクトリアーゼ）を混合し20分間処理した。遠心して回収した細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した。固定した培養細胞をスライドガラスとカバーガラスではさみ押しつぶした後、冷凍してカバーガラスを剥がし標本を作製した。標本に3%BSA溶液をかけ30分ブロッキングした。Zenon antibody labeling kit（Molecular Probes）を用いてAlexa Fluor 488 で蛍光標識した抗AtMis12抗体をかけ4℃で一晩静置した。0.05%Tween 20 in PBSにいれ室温で10分間二回洗浄し、封入剤で封じた後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００７８】
結果を図１１に示した。なお、原図はカラーであり、図１１Ａ，Ｅ，Ｉは、ＡｔＭｉｓ１２抗体からのシグナルを緑で、図１１Ｂ，Ｆ，Ｊは、ＨＴＲ１２抗体からのシグナルを赤で、図１１Ｃ，Ｇ，Ｋは、ＡｔＭｉｓ１２抗体シグナル（緑）とＨＴＲ１２抗体シグナル（赤）とをマージさせたものである。また、上記９個の各図においては、ＤＡＰＩ（「4',6 - Diamidino - 2 -phenylindole, dihydrochloride」の略称。蛍光性色素で、蛍光顕微鏡下、染色体中のＤＮＡ検出に使用される）からのシグナル（青）によって染色されている。また、図１１Ｄ，Ｈ，Ｌは、ＡｔＭｉｓ１２抗体シグナル（緑）とＨＴＲ１２抗体シグナル（赤）と１８０−ｂｐ反復配列からのシグナル（青）とをマージさせたものである。
【００７９】
なお上記ＨＴＲ１２は、ヒトのCENP-Aホモログで、ヒストンH3のセントロメア特異的変異体である。また１８０−ｂｐ反復配列はシロイヌナズナのセントロメアに局在する配列である。
【００８０】
図１１Ａ，Ｅ，Ｉでは、細胞中の染色体部分が大きく青く染まり（但し、Ａ，Ｅでは、ほぼ連続した一つの領域が青く染まっている一方、Ｉでは、二つに分裂した上下二つの領域がそれぞれ青く染まっている）、その青く染まった領域中に緑色の多くの小さな点が点在している様子が観察された。
【００８１】
図１１Ｂ，Ｆ，Ｊでは、図１１Ａ，Ｅ，Ｉと同じ部分が大きく青く染まり、その青く染まった領域中に赤色の多くの小さな点が点在している様子が観察された。
【００８２】
図１１Ｃ，Ｇ，Ｋでは、赤色の点と緑色の点との重なりが観察され、すなわちＡｔＭｉｓ１２抗体シグナルと、セントロメアタンパク質ＨＴＲ１２抗体シグナルとの間に重なり合いが観察された。
【００８３】
図１１Ｄ，Ｈ，Ｌでは、さらに青色の点と緑色の点との重なりが観察され、すなわちＡｔＭｉｓ１２抗体シグナルと、１８０−ｂｐ反復配列検出シグナルとの間に重なり合いが観察された。
【００８４】
このように本実験結果から、染色体のセントロメア領域にＡｔＭｉｓ１２のシグナルが観察された（図１１Ｅ）。また、ＡｔＭｉｓ１２のシグナルは、染色体に必須なもう一つのタンパク質であるＨＴＲ１２セントロメアタンパク質のシグナルとも重なった（図１１Ｃ，Ｇ，Ｋ）。さらに、これらのシグナルは、シロイヌナズナのセントロメアに局在する１８０−ｂｐ反復配列のＦＩＳＨ（蛍光 in situ ハイブリダイゼイション）シグナルとも重なった（図１１Ｄ，Ｈ，Ｌ）。
【００８５】
以上のことから、本発明の抗ＡｔＭｉｓ１２抗体は、シロイヌナズナのセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質の局在を調べるのに非常に有効であることが分かった。Ｍｉｓ１２は、活性のあるセントロメアに局在するタンパク質であるので、抗ＡｔＭｉｓ１２抗体を使って、セントロメアの活性を調べることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、以上のように、シロイヌナズナのセントロメアに特異的に存在するＡｔＭｉｓ１２タンパク質検出用抗体に関するものであり、植物染色体のセントロメアの機能と構造を解明するための研究材料として有用であり、植物の細胞分裂に関する研究や植物の生長に関する研究のリサーチツールとしても利用可能である。さらに、これらの研究をベースに染色体機能を調節する技術を開発することで、作物の改良に利用したり、植物を原材料に使用する各種商品への利用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列（GenBank/EMBL/DDBJ Accession no. NM122943）を示す図である。５’末端部の囲み部分（ＡＴＧ）は開始コドンとして推定されている位置を、３’末端部の囲み部分（ＴＡＡ）はストップコドンとして推定されている位置を示す。また、下線を施した二ヶ所の部分は、３’−Ｒａｃｅ法、及び５’−Ｒａｃｅ法を実施するために用いたプライマーの位置を示す。
【図２】データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２の遺伝子構造を示す図である。図中、大文字はエクソンを、小文字はイントロンを示す。囲み部分（ＡＴＧ）は、開始コドンとして推定されている位置を示す。
【図３】データベース上で推定されているＡｔＭｉｓ１２のアミノ酸配列（285アミノ酸）(GenBank/EMBL/DDBJ Accession no. NM122943)を示す図である。
【図４】ＲＡＣＥ法によって決定された実際のＡｔＭｉｓ１２のｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。５’末端部の囲み部分（ＡＴＧ）は開始コドンとして推定されている位置を、３’末端部の囲み部分（ＴＡＡ）はストップコドンとして推定されている位置を示す。
【図５】クローン化されたｃＤＮＡから予測されるＡｔＭｉｓ１２の遺伝子構造を示す図である。図中、大文字はエクソンを、小文字はイントロンを示す。また、囲み部分は、開始コドン（ＡＴＧ）とストップコドン（ＴＧＡ）を示す。符号「/」は、ポリＡテールの付加位置を示す。
【図６】図４に示すｃＤＮＡから推測されるアミノ酸配列を示す図である。下線部は、ＪＢ２２３を合成するために用いたエピトープ部位を示す。
【図７】抗ＡｔＭｉｓ１２タンパク質抗体作製用合成ペプチド（ＪＢ２２３）のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ＪＢ２２３を免疫した２羽のウサギの抗体価を示すグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は、異なるウサギ個体の抗体結果を示している。なお、グラフの記号中、菱形はＤ０（注射前）の血清を用い、四角はＤ３９（３９日目）の血清を用いたときの結果を示している。
【図９】精製抗体の力価曲線を示すグラフである。（Ａ）は抗体濃度（横軸）とＯＤ４５０ｎｍとの関係を、（Ｂ）は抗体を精製する前後における希釈倍率（横軸）とＯＤ４５０ｎｍとの関係をそれぞれ示している。
【図１０】ＡｔＭｉｓ１２抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。レーンの左から、１．シロイヌナズナの葉からのタンパク質抽出物、２．シロイヌナズナの葉から核を単離したもの、３．シロイヌナズナの懸抱濁培養細胞からのタンパク質抽出物、４．シロイヌナズナの懸抱濁培養細胞から核を単離したものを示す。
【図１１】シロイヌナズナ懸濁培養細胞におけるＡｔＭｉｓ１２抗体を用いた間接蛍光免疫抗体染色法を実施したときの顕微鏡図である。図中、A-D:間期、E-H:中期、I-L:終期を示す。また、A, E, I: AtMis12抗体からのシグナル（緑）、B, F, J: HTR12抗体からのシグナル（赤）、C, G, K: AtMis12抗体（緑）とHTR12抗体（赤）とをマージさせたもの（DAPI［青］によって染色されている）、D, H, L: AtMis12抗体（緑）とHTR12抗体（赤）と180-bp反復配列からのシグナル（青）とをマージさせたものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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