(57)【要約】【課題】  繊維性と機能性とが高水準で両立されたタンパク質及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  繊維性タンパク質をコードする遺伝子と機能性タンパク質をコードする遺伝子とを大腸菌プラスミドに組み込み、両遺伝子が所定のリンカーを介して連結した融合遺伝子を得る。この融合遺伝子をタンパク質発現ベクターに挿入し、更にタンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入して該大腸菌を培養し、繊維性タンパク質と機能性タンパク質とがリンカーを介して連結した融合タンパク質を発現させる。【選択図】  図３
2006052142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維性タンパク質と、
機能性タンパク質と、
所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有し、前記繊維性タンパク質と前記機能性タンパク質とを連結するリンカーと、
を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記繊維性タンパク質が、βシート構造を有する天然タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーが有する前記アミノ酸配列は、２〜１００個のアミノ酸残基で構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記リンカーが有する前記アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、５０ｍｏｌ％以上が親水性アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーが有する前記アミノ酸配列は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうちのいずれかのアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（ａ）親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基で構成され、疎水性アミノ酸残基を含まないアミノ酸配列
（ｂ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、１個の疎水性アミノ酸残基とで構成されるアミノ酸配列
（ｃ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、２個以上の疎水性アミノ酸残基とで構成され、疎水性アミノ酸残基それぞれのＮ末端及びＣ末端に親水性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基が結合しているアミノ酸配列。
【請求項６】
繊維性タンパク質をコードする第１の遺伝子と機能性タンパク質をコードする第２の遺伝子とを大腸菌プラスミドに組み込み、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子とが連結した融合遺伝子を得る第１のステップと、
前記融合遺伝子をタンパク質発現ベクターに挿入する第２のステップと、
前記融合遺伝子が挿入された前記タンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入して該大腸菌を培養し、前記繊維性タンパク質と前記機能性タンパク質とが前記リンカーを介して連結した融合タンパク質を発現させる第３のステップと、
を備えることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項７】
前記第１の遺伝子がＳｕｐ３５遺伝子であることを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項８】
前記第１の遺伝子が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、前記第２の遺伝子が配列表の配列番号２又は３に示す塩基配列を有し、前記リンカーが配列表の配列番号４〜１３に示される塩基配列のうちの何れかを有することを特徴とする、請求項６又は７に記載の融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子工学的手法又は化学合成により、繊維性を有するタンパク質を製造する技術が検討されている。例えば、非特許文献１には、天然タンパク質のアミノ酸配列を参考にしてＤＮＡをデザインし、そのＤＮＡを大腸菌で発現させてアミロイド様タンパク質を得る方法が開示されている。また、特許文献１には、化学合成により比較的短いペプチドを製造し、その人工ペプチドを繊維化する技術が開示されている。
【特許文献１】米国特許第５９５５３４３号明細書
【非特許文献１】Ｗｅｓｔ，  Ｍ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  １１２１１−１１２１６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、繊維性タンパク質に酵素活性等の機能を付与することは、医学又は工学的見地から非常に有用である。そこで、化学修飾により繊維性タンパク質の機能化が検討されており、繊維性タンパク質を酵素などの機能性分子と結合させる方法、あるいは人工ペプチドを繊維化する際に、予めペプチドに機能性官能基を導入する方法などが提案されている。
【０００４】
しかし、繊維性タンパク質の繊維化能は機能性分子又は機能性官能基のサイズや化学的特性の影響を受けやすいため、上記の化学修飾による方法では繊維性と機能性との両立が非常に困難である。より具体的には、前者の方法では機能性分子の結合後にタンパク質の繊維性が損なわれやすく、また、後者の方法の場合も、機能性官能基の導入後にペプチドの繊維化能が消失又は低下してしまう。
【０００５】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、繊維性と機能性とが高水準で両立されたタンパク質及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、繊維性タンパク質と、機能性タンパク質と、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有し、繊維性タンパク質と機能性タンパク質とを連結するリンカーと、を有することを特徴とする融合タンパク質を提供する。
【０００７】
このように、リンカーを介して繊維性タンパク質と機能性タンパク質とを連結することによって、機能性タンパク質のサイズや化学的特性などによる繊維性タンパク質の繊維化能の消失又は低下を十分に抑制することができる。したがって、本発明により、繊維性と機能性とが高水準で両立された融合タンパク質が実現可能となる。
【０００８】
本発明の融合タンパク質においては、繊維性タンパク質が、βシート構造を有する天然タンパク質であることが好ましい。かかる天然タンパク質を用いると、βシートの自己集合力により、融合タンパク質において一層高水準の繊維性を達成することができる。
【０００９】
また、リンカーが有するアミノ酸配列は、２〜１００個のアミノ酸残基で構成されていることが好ましい。リンカーのアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基数を上記範囲内とすることにより、融合タンパク質における繊維性と機能性との両立をより確実に達成することができる。
【００１０】
また、本発明の融合タンパク質においては、リンカーが有するアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、５０ｍｏｌ％以上が親水性アミノ酸残基であることが好ましい。これにより、リンカーの親水性を効果的に高めることができ、融合タンパク質における繊維性と機能性との両立をより確実に達成することができる。
【００１１】
また、リンカーが有するアミノ酸配列は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうちのいずれかのアミノ酸配列であることが好ましい。
（ａ）親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基で構成され、疎水性アミノ酸残基を含まないアミノ酸配列
（ｂ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、１個の疎水性アミノ酸残基とで構成されるアミノ酸配列
（ｃ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、２個以上の疎水性アミノ酸残基とで構成され、疎水性アミノ酸残基それぞれのＮ末端及びＣ末端に親水性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基が結合しているアミノ酸配列。
【００１２】
上記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はいずれも、２個以上の疎水性アミノ酸残基が連続して結合した構造を有さないものであり、疎水性アミノ酸残基を含む（ｂ）、（ｃ）においては、疎水性アミノ酸残基それぞれの両末端（Ｎ末端及びＣ末端）に親水性アミノ酸が結合した構造となっている。すなわち、アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はリンカーの親水性を効果的に高めるための好ましいアミノ酸配列である。そして、かかるアミノ酸配列を有するリンカーを採用することにより、融合タンパク質における繊維性と機能性との両立をより確実に達成することができる。
【００１３】
また、本発明は、繊維性タンパク質をコードする第１の遺伝子と機能性タンパク質をコードする第２の遺伝子とを大腸菌プラスミドに組み込み、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して第１の遺伝子と第２の遺伝子とが連結した融合遺伝子を得る第１のステップと、融合遺伝子をタンパク質発現ベクターに挿入する第２のステップと、融合遺伝子が挿入されたタンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入して該大腸菌を培養し、繊維性タンパク質と機能性タンパク質とがリンカーを介して連結した融合タンパク質を発現させる第３のステップと、を備えることを特徴とする融合タンパク質の製造方法を提供する。
【００１４】
このように、繊維性タンパク質又は機能性タンパク質それぞれをコードする遺伝子同士がリンカーを介して連結した融合遺伝子を作製し、その融合遺伝子が挿入されたタンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入して該大腸菌を培養することにより、繊維性と機能性とが高水準で両立された本発明の融合タンパク質を効率よく且つ確実に得ることができる。
【００１５】
また、上記本発明の製造方法は、遺伝子工学的手法による低コスト・低汚染性のエネルギー変換系の実現を可能とするものであり、化学修飾により繊維性タンパク質を機能化する従来法と比較して、クリーンケミストリーの観点からも非常に有用である。
【００１６】
本発明の製造方法においては、第１の遺伝子がＳｕｐ３５遺伝子であることが好ましい。これにより、本発明の融合タンパク質をより効率よく且つ確実に得ることができる。
【００１７】
また、本発明の製造方法においては、第１の遺伝子が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、第２の遺伝子が配列表の配列番号２又は３に示す塩基配列を有し、リンカーが配列表の配列番号４〜１３に示される塩基配列のうちの何れかを有することが好ましい。第１の遺伝子、第２の遺伝子及びリンカーを上記の組合せとすることにより、得られる融合タンパク質における繊維性と機能性との両立をより有効に達成することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、繊維性と機能性とが高水準で両立された融合タンパク質が提供可能となる。また、本発明によれば、かかる融合タンパク質を効率よく且つ確実に得ることができる融合タンパク質の製造方法が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
図１は本発明の融合タンパク質の製造方法の好適な一実施形態を示すフロー図である。
【００２１】
図１に示した製造方法においては、先ず、繊維性タンパク質をコードする遺伝子Ａ、及び機能性タンパク質をコードする遺伝子Ｂを選定する（ステップ１０１）。
【００２２】
遺伝子Ａとしては、繊維性タンパク質をコードすることが可能であれば特に制限されないが、βシート構造の天然タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。遺伝子Ａの好ましい例としては、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｕｐ３５遺伝子又はその繊維形成ドメインであるＳｕｐ３５ＮＭドメインの遺伝子、昆虫類の絹糸成分であるフィブロインの遺伝子、クモ類のクモ糸成分の遺伝子、アミロイド性タンパク質の遺伝子、並びにこれらの相同遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
ここで、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｕｐ３５遺伝子（全長２．０  ｋｂ）よりその繊維形成ドメインであることが知られているＮＭドメイン（０．８  ｋｂ）をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ下記配列表の配列番号１及び配列番号１４に示す。
【００２４】
また、遺伝子Ｂは、目的の融合タンパク質に含まれる機能性タンパク質に対応して適宜選定される。より具体的には、本発明にかかる機能性タンパク質としては、グルコースセンサーとしてのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、呼吸商の定量に有用な細胞活性センサーとしてのカタラーゼ、無酸素呼吸の定量に有用な乳酸センサーとしての乳酸デヒドロゲナーゼ、活性酸素センサーとしてのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、硝酸呼吸（嫌気性細菌）感知センサーとしての硝酸レダクターゼ、酸素呼吸感知センサーとしてのペルオキシダーゼ、エタノールセンサーとしてのアルコールデヒドロゲナーゼ、一酸化炭素（ＣＯ）センサーとしてのシトクロームＰ−４５０、鉄結合タンパク質（ナノクラスター形成タンパク質）であるフェリチンなどが挙げられ、遺伝子Ｂはこれらの機能性タンパク質をコードする遺伝子である。
【００２５】
ここで、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｃａｔａｌａｓｅ  （ｋａｔＡ）遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ下記配列表の配列番号２及び配列番号１５に示す。また、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  （ｐｆｒ）遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ下記配列表の配列番号３及び配列番号１６に示す。
【００２６】
次に、ステップ１０２において、ステップ１０１で選定した遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂを大腸菌プラスミドに組み込み、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して、遺伝子Ａと遺伝子Ｂとが連結した融合遺伝子を作製する。
【００２７】
遺伝子Ａ、Ｂが組み込まれるプラスミドは、大腸菌の中で自律的に、且つ安定的に増殖するものであれば、いかなるものを使用してもよい。好ましいプラスミドとしては、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８などが挙げられる。
【００２８】
また、リンカーのアミノ酸配列は、得られる融合タンパク質において繊維性タンパク質と機能性タンパク質との相互作用を抑制することができ、且つ、リンカー自体の立体構造により融合タンパク質の繊維性又は機能性を阻害しないものであることが好ましい。より具体的には、リンカーが有するアミノ酸配列のアミノ酸残基数は、好ましくは２〜１００個であり、より好ましくは５〜３０個であり、更に好ましくは５〜２０個である。
【００２９】
また、リンカーは、グルタミン酸残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基などの親水性アミノ酸残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、イソロイシン残基、バリン残基などの疎水性アミノ酸残基、あるいはグリシン残基などの中性アミノ酸残基のいずれを含んで構成されてもよいが、得られる融合タンパク質の繊維性と機能性とを両立する点から、親水性を有していることが好ましい。より具体的には、リンカーが有するアミノ酸配列に占める親水性アミノ酸残基の割合は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基の全量を基準として、好ましくは５０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは５５ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは６０ｍｏｌ％以上である。
【００３０】
更に、リンカーが有するアミノ酸配列は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうちのいずれかのアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３１】
また、リンカーが有するアミノ酸配列においては、２個以上の疎水性アミノ酸残基が連続して結合した構造を有さないことが好ましい。このようなアミノ酸配列の例としては、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が挙げられる。
（ａ）親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基で構成され、疎水性アミノ酸残基を含まないアミノ酸配列
（ｂ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、１個の疎水性アミノ酸残基とで構成されるアミノ酸配列
（ｃ）所定数の親水性アミノ酸残基及び／又は中性アミノ酸残基と、２個以上の疎水性アミノ酸残基とで構成され、疎水性アミノ酸残基それぞれのＮ末端及びＣ末端に親水性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基が結合しているアミノ酸配列。
【００３２】
本発明に係る好ましいリンカーの塩基配列を、下記配列表の配列番号４〜１３に示す。また、配列番号４〜１３に示す塩基配列に対応するアミノ酸配列を、それぞれ下記配列表の配列番号１７〜２６に示す。
【００３３】
次に、ステップ１０４において、ステップ１０３で作製した融合遺伝子をタンパク質発現ベクターに挿入する。タンパク質発現ベクターとしては特に制限されないが、具体的には、ｐＥＴ２２ｂ（＋）などが好適に使用される。
【００３４】
次に、ステップ１０５において、融合遺伝子が挿入されたタンパク質発現ベクターを大腸菌株の細胞内に導入し、その大腸菌株（形質変換体）を培養することにより、目的の融合タンパク質を得ることができる。タンパク質発現ベクターが導入される大腸菌株は、融合タンパク質を生産可能なものであれば特に制限されないが、具体的には、ＢＬ２１株などが好適に使用される。また、大腸菌株の培養は、例えばバクトリプトン、酵母エキス、食塩などを所定濃度含有する液体培地において行うことができる。またこのとき、図１に示したように、発現誘導を行うことが有効である。発現誘導とは、プロモーターを活性化してＲＮＡを生成させる手法であり、例えば数μＭのイソプロプル−β−チオガラクトピラノシド溶液（ＩＰＴＧ溶液）を大腸菌の培養液に添加し、振とう培養することによって、大腸菌株による目的の誘導タンパク質の分泌生産を効率よく実施することができる。培養温度は、大腸菌形質転換体が増殖できる温度であれば特に制限されないが、好ましくは２５〜３０℃である。
【００３５】
生産された融合タンパク質には所定の精製を施すことが好ましい（ステップ１０６）。精製方法としては、具体的には、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３６】
上記製造方法により得られる本発明の融合タンパク質は、ステップ１０２で形成されたリンカーに対応するリンカーを介して、繊維性タンパク質と機能性タンパク質とが連結した構造を有するものであり、均一環境下に保持するだけで、自発的、自己組織的に繊維状に組織化することができる。より具体的には、少量の有機溶媒を含有し又は含有しない水溶液の均一環境下に当該ペプチドを保持すればよい。かかる水溶液の溶媒としては、水又は中性水溶液が好ましく、あるいはエタノール−水混合溶媒であってもよい。また、水溶液中の融合タンパク質の濃度は０．５〜３μＭが好ましい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質を繊維状に組織化したときの繊維形状は、円二色性（ＣＤ）スペクトル等により確認することができる。また、繊維状に組織化された融合タンパク質は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などにより確認することができる。例えば、遺伝子Ａがβシート構造を与えるものである場合には、融合タンパク質において十分に規則正しく組織化されたβシート構造が形成される。
【００３８】
上記構成を有する本発明の融合タンパク質は、繊維性と機能性とが高水準で両立されたものであるため、酵素等の機能を有する繊維として、ナノセンサーなどの様々な分野への応用が可能であり、医学又は工学用機能性材料として非常に有用である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
先ず、繊維性タンパク質をコードする遺伝子として、下記配列表の配列番号１に示す遺伝子（Ｓｕｐ３５  ＮＡドメイン遺伝子、０．８ｋｂ）を選定した。また、機能性タンパク質をコードする遺伝子として、下記配列表の配列番号２に示す遺伝子（ピロリ菌Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来の酸化還元酵素カタラーゼ（ｋａｔＡ）の遺伝子、１．５  ｋｂ）を選定した。
【００４０】
次に、Ｓｕｐ３５ＮＭドメイン遺伝子とｋａｔＡ遺伝子とを大腸菌プラスミドに挿入し、下記配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を介して両遺伝子が融合した融合遺伝子を作製した。本工程では、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを用いた。
【００４１】
次に、上記の融合遺伝子をタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に挿入し、更にそのタンパク質発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株の細胞内に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して振とう培養して、発現誘導による融合タンパク質の生産を行った。
【００４２】
実施例１において融合タンパク質を発現させた大腸菌の全タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、約９０ｋＤａに発現する特異的なバンドを得た。このバンドは、Ｓｕｐ３５ＮＭドメインとｋａｔＡとが配列番号１７に示すリンカーを介して連結した融合タンパク質の分子量に相当するものであり、この結果から、実施例１において目的の融合タンパク質が得られたことが示唆された。
【００４３】
更に、この全タンパク質についてアフィニティカラムによる精製を行ったところ、約９０ｋＤａの融合タンパク質を単離することができた。単離したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図２に示す（図２中のレーン２）。なお、図２のレーン１には、参考として、Ｓｕｐ３５ＮＭドメイン単体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを併せて示した。
【００４４】
次に、実施例１において単離した融合タンパク質及びＳｕｐ３５ＮＭドメインをそれぞれ１μＭの濃度でＰＢＳバッファー（ＮａＣｌ：０．１４Ｍ、ＫＣｌ：３ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４：１０ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４：２ｍＭ、ＰＨ７．４）に加え、室温下で３日間静置した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）よる観察を行った。実施例１の融合タンパク質のＴＥＭ写真を図３に、Ｓｕｐ３５ＮＭドメインのＴＥＭ写真を図４に、それぞれ示す。図示の通り、実施例１の融合タンパク質は、Ｓｕｐ３５ＮＭドメインと同様の繊維化能を有していることが確認された。
【００４５】
また、実施例１の融合タンパク質について、精製直後の状態と、上記操作により室温下で３日間静置した後の状態とを比較すべく、コンゴーレッド（Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ）試験を実施した。具体的には、タンパク質１μＭに対してコンゴーレッド溶液１０μＭを加えて反応させた後、４００〜６００ｎｍの波長領域における吸光度を測定した。図６は精製直後の融合タンパク質についてコンゴーレッド試験を行ったときの吸光スペクトルを示すグラフであり、図７は室温下で３日間静置した後の融合タンパク質についてコンゴーレッド試験を行ったときの吸光スペクトルを示すグラフである。図６と図７との比較からわかるように、室温下で３日間静置した後の融合タンパク質の吸光スペクトルにおいては、吸光度が増大しており、吸収極大を与える波長の長波長側へのシフト、及び、吸収極大を与える波長よりも長波長側でのショルダーの発現が観察された。この結果は、実施例１の融合タンパク質を繊維化することにより、βシート構造が形成されていることを示唆するものである。
［実施例２］
機能性タンパク質をコードする遺伝子を、下記配列表の配列番号３に示す遺伝子（ピロリ菌由来の鉄貯蔵タンパク質であるフェリチン（ｐｆｒ）の遺伝子、０．５ｋｂ）としたこと以外は、実施例１と同様にして、融合遺伝子の作製及び融合タンパク質の生産を行った。
【００４６】
実施例２においてタンパク質を発現させた大腸菌の全タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、約５０ｋＤａに発現する特異的なバンドを得た。このバンドは、Ｓｕｐ３５ＮＭドメインとフェリチンとが配列番号１７に示すリンカーを介して結合した融合タンパク質の分子量に相当するものであり、この結果から、実施例２において目的の融合タンパク質が得られたことが示唆された。
【００４７】
更に、この全タンパク質についてアフィニティカラムによる精製を行ったところ、約５０ｋＤａの融合タンパク質を単離することができた。単離した融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図２に示す（図２中のレーン３）。
【００４８】
次に、実施例２において単離した融合タンパク質を１μＭの濃度でＰＢＳバッファー（ＮａＣｌ：０．１４Ｍ、ＫＣｌ：３ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４：１０ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４：２ｍＭ、ＰＨ７．４）に加え、室温下で３日間静置した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）よる観察を行った。実施例２の融合タンパク質のＴＥＭ写真を図５に示す。図示の通り、実施例２で得られた融合タンパク質は、Ｓｕｐ３５ＮＭドメインと同様の繊維形状に組織化していることが確認された。
【００４９】
また、実施例２の融合タンパク質について、実施例１と同様にしてコンゴーレッド試験を実施した。図８は室温下で３日間静置した後の融合タンパク質についてコンゴーレッド試験を行ったときの吸光スペクトルを示すグラフである。室温下で３日間静置した後の融合タンパク質の吸光スペクトルにおいては、実施例１の場合と同様に、吸光度が増大しており、吸収極大を与える波長の長波長側へのシフト、及び、吸収極大を与える波長よりも長波長側でのショルダーの発現が観察された。この結果は、実施例１の融合タンパク質を繊維化することにより、βシート構造が形成されていることを示唆するものである。
【００５０】
更に、実施例２において単離した融合タンパク質を用い、鉄取り込み実験を実施した。具体的には、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｐＨ７．０）０．１Ｍ、ＮａＣｌ０．２Ｍ、及びＦｅ２（ＳＯ４）３２ｍＭを含む水溶液に、実施例２のタンパク質１μＭを懸濁した。この懸濁液を室温下で４８時間静置した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図９に示す（図９中のレーン２）。なお、図９中のレーン１は実施例２の融合タンパク質単独のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンであり、また、レーン３は実施例２においてタンパク質を発現させた大腸菌の全タンパク質の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンである。図９中のレーン１とレーン２との比較からわかるように、鉄取り込み試験における懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおいては、高分子量側に大きくシフトしたバンドが認められた。このレーン２のバンドは、この結果は、実施例２の融合タンパク質のフェリチン部分に鉄が取り込まれ、融合タンパク質と鉄との複合体が形成されたことによるものと考えられ、この結果から、実施例２の融合タンパク質のフェリチンに由来する鉄取り込み能を有していることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の繊維状タンパク質の製造方法の好適な一実施形態を示すフロー図である。
【図２】実施例で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す電気泳動図であり、レーン１〜３はそれぞれＳｕｐ３５ＮＭドメイン、実施例１の融合タンパク質、及び実施例２の融合タンパク質のパターンを示している。
【図３】繊維化した実施例１の融合タンパク質を示すＴＥＭ写真である。
【図４】繊維化した実施例２の融合タンパク質を示すＴＥＭ写真である。
【図５】繊維化したＳｕｐ３５ＮＭドメインを示すＴＥＭ写真である。
【図６】精製直後の実施例１の融合タンパク質の吸光スペクトルを示すグラフである。
【図７】繊維化した実施例１の融合タンパク質の吸光スペクトルを示すグラフである。
【図８】繊維化した実施例２の融合タンパク質の吸光スペクトルを示すグラフである。
【図９】鉄取り込み試験により得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す電気泳動図であり、レーン１は実施例２の融合タンパク質単独のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターン、レーン２は鉄を作用させた後の実施例２の融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターン、レーン３は実施例２においてタンパク質を発現させた大腸菌の全タンパク質の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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