(57)【要約】【課題】真菌とレジオネラ属菌とが併存する場合であっても、真菌による影響を受けず、信頼性が高いレジオネラ属菌検査を可能とするレジオネラ検査用選択培地を提供する。【解決手段】レジオネラ属菌を培養可能な培地であって、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有するレジオネラ検査用選択培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジオネラ属菌を培養可能な培地であって、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有することを特徴とするレジオネラ検査用選択培地。
【請求項２】
ＧＶＰ培地に、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有させたことを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ検査用選択培地。
【請求項３】
上記シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールの含有量が、培地１Lあたりそれぞれ、４０ｍｇ以上４００ｍｇ以下、４０ｍｇ以上４００ｍｇ以下、及び、２０ｍｇ以上２００ｍｇ以下であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のレジオネラ検査用選択培地。
【請求項４】
レジオネラ属菌を培養可能な培地であって、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有する培地を用いて培養することを特徴とするレジオネラ属菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ検査用選択培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌はレジオネラ症の原因微生物として知られており、自然界や人工の水環境に広く生息しているグラム陰性の細菌である。レジオネラ属菌に汚染された冷却塔水や温泉水、循環風呂水などのエアロゾルを吸い込むことによって、レジオネラ属菌に感染し、レジオネラ症を引き起こす場合がある。そのため、「新版  レジオネラ症防止指針」（非特許文献１）が定められ、これらの環境水中のレジオネラ属菌のコントロールを行うことが求められている。
【０００３】
これら環境水からレジオネラ属菌を検出する方法にはさまざまな方法があるが、そのなかでも平板培養法はレジオネラ属菌検出の標準的方法として主要な方法である。ここで上記「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローの大略について図１に示す。
【０００４】
レジオネラ属菌を培養して検出する場合、レジオネラ属菌以外の微生物の影響を除くために試料の前処理を行なう。前処理方法としては検査対象水あるいは検査対象水の冷却遠心沈渣に滅菌水を加えたものに対し、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を加える酸処理を行って、レジオネラ属菌以外の菌を殺菌する方法が広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、このような酸処理によってもレジオネラ属菌以外の菌が残留することが多い。
【０００６】
これらレジオネラ属菌以外の菌（雑菌）は一般にレジオネラ属菌よりもコロニー形成及びその拡大が早いので、レジオネラ属菌コロニー計数の妨げとなり、また、それら雑菌によっては、近接するレジオネラ属菌コロニーの成長を妨げるなどの障害をもたらすため、レジオネラ属菌に対して障害を引き起こさず、かつ、レジオネラ属菌以外のこれら雑菌に対して有効な、抗菌剤を添加した培地を用いて、それらの繁殖を抑制する。
【０００７】
このような抗菌剤を添加した培地として、ＧＶＰ培地が挙げられる。ＧＶＰ培地はレジオネラ属菌を培養可能な培地であるＢＣＹＥα培地に対しレジオネラ属菌に対して選択性を付与するために、抗菌剤である、グリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢが添加されたものであり、雑菌の影響が排除されている。
【０００８】
しかし、ＧＶＰ培地は真菌に対しては対策が取られていないため、レジオネラ属菌がコロニーを形成するのに必要な５日程度の期間に培地に真菌が繁殖し、上記雑菌同様に、レジオネラ属菌の計数精度に大きな影響を及ぼす。
【０００９】
そのため、ＢＣＹＥα培地にグリシン、バンコマイシン、及び、ポリミキシンＢに加え抗真菌剤であるアニソマイシンを添加したＭＷＹ培地、または、ＢＣＹＥα培地にグリシン、バンコマイシン、及び、ポリミキシンＢに加え、抗真菌剤であるシクロヘキシミドを添加したＧＶＰＣ培地、あるいは、ＢＣＹＥα培地にグリシン、バンコマイシン、及び、ポリミキシンＢに加え抗真菌剤であるアンホテリシンＢを添加したＷＹＯ培地などが、真菌の影響をある程度排除できる選択培地として知られている（特開昭６０−１９９３９８号公報（特許文献１））。
【００１０】
しかしながら、真菌に対策が取られたこれら培地であっても、充分な効果が確実に得られるのではなく、これら抗真菌剤に対して耐性を有する糸状菌や酵母の繁殖により測定ができなくなったり、あるいは、レジオネラ属菌の計数精度に不安が生じるなどの問題が依然としてあった。
【特許文献１】特開昭６０−１９９３９８号公報
【非特許文献１】「新版レジオネラ症防止指針」  監修  厚生省生活衛生局企画課、発行者：（財団法人）ビル管理教育センター  平成１１年１１月  初版発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記した従来の問題点を改善する、すなわち、真菌とレジオネラ属菌とが併存する場合であっても、真菌による影響を受けずに信頼性が高いレジオネラ属菌検査を可能とするレジオネラ検査用選択培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のレジオネラ検査用選択培地は上記課題を解決するため、請求項１に記載の通り、レジオネラ属菌を培養可能な培地であって、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有することを特徴とするレジオネラ検査用選択培地である。
【００１３】
本発明のレジオネラ検査用選択培地は請求項２に記載の通り、請求項１に記載のレジオネラ検査用選択培地において、ＧＶＰ培地に、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有させたことを特徴とするレジオネラ検査用選択培地である。
【００１４】
本発明のレジオネラ属菌の培養方法は、請求項４に記載の通り、レジオネラ属菌を培養可能な培地であって、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを含有する培地を用いて培養するレジオネラ属菌の培養方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のレジオネラ検査用選択培地によれば、細菌の影響の排除は勿論、真菌による影響も極めて少なく、信頼性が高いレジオネラ属菌検査が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、レジオネラ属菌を培養可能な培地とは、レジオネラ属菌の培養に必要な成分を、レジオネラ属菌の培養に適した濃度で有し、かつ、その培地によりレジオネラ属菌のコロニーが形成可能な培地を云う。このようなレジオネラ属菌を培養可能な培地としては例えば、ＢＣＹＥα寒天培地が知られている。代表的な組成例（新版レジオネラ症防止指針記載のもの。必要により使用者により各成分の配合量は適宜変更される場合がある）を表１に示す。
【００１７】
【表１】
2006280219.tif 000002
【００１８】
しかし、ＢＣＹＥα寒天培地には選択性がないので、レジオネラ属菌と他の細菌（一般にレジオネラ属菌より増殖が早い。「雑菌」と云う）とが併存する場合には、レジオネラ属菌のコロニー計数時の妨げとなったり、あるいはレジオネラ属菌のコロニー形成が阻害される。このため、本発明ではこれら雑菌を抑制する抗菌剤を上記培地に配合することもできる。このような抗菌剤としてグリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢの３種の抗菌剤の組合せが適している。
【００１９】
ここで、グリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢが含有された、レジオネラ属菌を培養可能な培地として、ＧＶＰ培地が知られている。ＧＶＰ培地は表１に示した組成で代表されるようなＢＣＹＥα寒天培地にこれらグリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢを加えたものであり、その代表的な組成はＢＣＹＥα寒天培地の各成分にグリシン３ｇ、バンコマイシン５ｍｇ及びポリミキシンＢ１０００００ＩＵを添加して計１Ｌ（ｐＨ：６．９±０．１）となるようにしたものである（新版レジオネラ症防止指針記載のもの。必要により使用者により各成分の配合量は適宜変更される場合があるが、その場合も本発明におけるＧＶＰ培地に含まれる）。
【００２０】
本発明のレジオネラ検査用選択培地には、上記のレジオネラ属菌を培養可能な培地に、真菌（糸状菌や酵母）に対して有効な抗真菌剤としてシクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールを配合する必要がある。これら３成分の配合により、真菌による障害を極めて効果的に防止することができ、レジオネラ属菌の高精度で確実な検出が可能となる。
【００２１】
これら、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、及び、チアベンダゾールの含有量は、培地１Ｌあたりそれぞれ、４０ｍｇ以上４００ｍｇ以下、４０ｍｇ以上４００ｍｇ以下、及び、２０ｍｇ以上２００ｍｇ以下であるとレジオネラ属菌の培養を阻害せず、同時に、真菌による障害をより効果的に防止することができ、レジオネラ属菌のより高精度な検出が可能となる。より好ましいチアベンダゾールの添加量は２０〜８０ｍｇ／Ｌである。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明のレジオネラ検査用選択培地の実施例について具体的に説明する。
【００２３】
＜レジオネラ属菌に対する各抗真菌剤の最小発育阻止濃度の検討＞
抗真菌剤として、シクロヘキシミド（略号：ＣＨ）、アンホテリシンＢ（略号：ＡＭＰＨ）及び、チアベンダゾール（略号：ＴＢＺ）について、レジオネラ属菌に対する最小発育阻止濃度の検討を行った。
【００２４】
レジオネラの各菌株（表２参照）はあらかじめＢＹＥ液体培地（表３参照。ＢＣＹＥα寒天培地から、寒天、活性炭を除いたもの）を用い、３７℃の温度下で、２４時間培養した。各抗真菌剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させ、所定濃度まで２倍の希釈列を作製した。４８穴マイクロプレートに溶解・希釈した各抗真菌剤および陽性コントロールとしてＤＭＳＯをそれぞれ１０μＬずつ添加した。レジオネラの培養液を新しいＢＹＥ液体培地で１００倍に希釈し、上記４８穴マイクロプレートの各ウェルに９９０μＬずつ加えていく（このときＤＭＳＯの濃度は１％となりレジオネラの培養に影響がないものとなる）。次いで、３７℃のインキュベーター内に３日間静置して培養する。その後、各ウェルのレジオネラ属菌の増殖による濁度上昇が目視で認められない最小濃度を求めた。結果を表２に併せて示す（表中”＞４００”は４００μｇ／ｍＬの添加でも発育阻止が見られなかったことを示す）。
【００２５】
【表２】
2006280219.tif 000003
【００２６】
【表３】
2006280219.tif 000004
【００２７】
表２よりシクロヘキシミド、アンホテリシンＢは、４００ｍｇ／Ｌ以下の濃度で、チアベンダゾールは１００〜２００ｍｇ／Ｌ未満の濃度でレジオネラ属菌の生育に影響を与えないことが確認された。
【００２８】
＜各選択培地の抗真菌効果＞
それぞれ異なるビルの冷却塔水から採取したサンプル水を真菌培養用の一般的な培地であるＰＤＡ培地に接種したときに発育した糸状菌Ｍ−１〜Ｍ−４、それぞれ異なるビルの冷却塔水から採取したサンプル水をＧＶＰＣ培地（抗真菌剤としてシクロヘキシミドが配合された培地）に接種したときに発育した糸状菌Ｍ−５〜Ｍ−１０（これらはシクロヘキシミドに対して耐性を有する）を準備した。
【００２９】
また培地としては「新版レジオネラ症防止指針」に記載された培地、及び、それら培地にさらに成分を添加したいくつかの培地を準備した。
【００３０】
すなわち、
・ＧＶＰ培地：ＢＣＹＥα培地を基礎培地とし、これにグリシンを３ｍｇ／ｍＬ、バンコマイシンを５μｇ／ｍＬ、ポリミキシンＢを１００ＩＵ／ｍＬを添加した培地（表４に組成を示す）、
・ＧＶＰＣ培地：上記ＧＶＰ培地を基礎培地とし、シクロヘキシミドを８０μｇ／ｍＬ添加した培地、
・ＧＶＰＡ培地：上記ＧＶＰ培地を基礎培地とし、アンホテリシンＢを８０μｇ／ｍＬ添加した培地（ＷＹＯα培地）、
・ＧＶＰＣＡ培地：上記ＧＶＰ培地を基礎培地とし、シクロヘキシミドを８０μｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢを８０μｇ／ｍＬそれぞれ添加した培地、
・ＧＶＰＴ培地：上記ＧＶＰ培地を基礎培地とし、チアベンダゾールを４０μｇ／ｍＬ添加した培地、
・ＣＡＴ培地：上記ＧＶＰ培地を基礎培地とし、シクロヘキシミドを８０μｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢを８０μｇ／ｍＬ、チアベンダゾールを４０μｇ／ｍＬそれぞれ添加した培地（本発明実施例：培地１Ｌ当たりの組成を表５に示す。）、
の６種類の培地を準備した。
【００３１】
【表４】
2006280219.tif 000005
【００３２】
【表５】
2006280219.tif 000006
【００３３】
実験は次のように行った。上記Ｍ−１〜Ｍ−１０の糸状菌を滅菌脱イオン水に懸濁させ、これらそれぞれに、レジオネラ  ニューモフィラ（Legionella pneumophila）ＡＴＣＣ３３１５２株を別の滅菌脱イオン水に懸濁させた液を混合して、上記の選択培地に接種した。その後３７℃で５日間培養して、各培地の糸状菌の発育状況を観察した。抗真菌効果検討結果を表６に示す（表６中”＋＋＋”は糸状菌が培地に広く発育したことを、”＋＋”は”＋＋＋”よりは小さく発育したことを、”＋”は”＋＋”より小さく殆ど発育しなかったことを、”−”は発育が見られなかったことをそれぞれ示す）。
【００３４】
また同時に、各培地でのレジオネラ検出状況（レジオネラ  ニューモフィラのコロニー数）を調べた。このときブランクとしてレジオネラ属菌は添加したものの糸状菌を添加しなかった系についても併せて調べた。これら結果を表７に示す（表７中、”検出不能”は、糸状菌の生育によりレジオネラのコロニーが計数不能であったことを示す）。
【００３５】
【表６】
2006280219.tif 000007
【００３６】
【表７】
2006280219.tif 000008
【００３７】
表６及び表７より本発明に係るレジオネラ検査用選択培地によれば、糸状菌の生育を効果的にかつ、確実に防止することができ、そのとき、レジオネラ属菌生菌数を正確に調べることができることが判る。
【００３８】
なお、別途表５における本発明に係る培地と同様の組成で、ただし、培地１Ｌ当たり、チアベンダゾールの添加量を２００ｍｇとした培地（実施例）についても、別途、表５の組成の本発明の培地同様に検討を行ったが、そのときの結果ではレジオネラ属菌のコロニー形成に若干時間がかかったものの、表５の組成の培地での結果との間に有意差が認められなかった。このことからチアベンダゾールを２００ｍｇ／Ｌ添加した培地でも、レジオネラ検査用選択培地として使用可能であることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば真菌の生育を効果的にかつ、確実に防止することができ、その結果、真菌とレジオネラ属菌とが併存する場合であっても、レジオネラ属菌生菌数を正確に調べることができるため、再検査等が不要となり、例えば浴槽水など、レジオネラ属菌の有無が短期間で確実に検出される必要がある用途にも対応できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローチャート（抜粋）である。
【図１】
2006280219.tif 000009