(57)【要約】【課題】従来の化学療法だけでは長期的な治癒が期待できないので、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法としての免疫療法の確立が望まれる。進行性の肺癌等の固形癌の治療や再発防止に確固たる術のない現状を打開するため、安全・有効・均質な抗原を用いる癌の免疫療法の確立が期待される。【解決手段】ヒト骨髄腫ＨＭ１．２４タンパク質抗原に由来の免疫活性ドメインのアミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する抗体；該抗体によるＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）誘導作用に基づく癌の免疫療剤；該抗体を用いる癌の診断剤等。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する抗体を、薬効を奏する量、含有することを特徴とする癌の免疫療法剤。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の癌の免疫療法剤。
【請求項３】
癌が肺癌である請求項１又は２に記載の癌の免疫療法剤。
【請求項４】
アミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する抗体を、抗原抗体反応を呈する量、含有する肺癌の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、癌の治療及び再発防止に有効な免疫療法剤に関するものである。更に詳しくは、ヒト骨髄腫のＨＭ１．２４タンパク質抗原の免疫活性ドメインに対する抗体を、抗体依存性細胞障害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下「ＡＤＣＣ」と略記する）の作用物質あるいは有効成分として用いる癌、特に、肺癌の免疫療法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
上記のＨＭ１．２４抗原は、ＩＩ型の膜貫通・糖タンパク質であり、骨髄腫細胞で特異的に高発現されている抗原として１９９４年、小阪ら（徳島大学）により発見かつ報告された（非特許文献１）。その意義は、多発性骨髄腫やその他の癌に対する免疫療法の開発に有用かつ有望な手段あるいは標的を提示したことにある。爾後、この報告を契機として世界各地で、ＨＭ１．２４抗原とその遺伝子並びに抗体を用いる多発性骨髄腫及びその他の癌の診断、免疫療法等の研究及び技術開発が活発に展開されてきた。
既に開発された主な技術として、例えば、抗ＨＭ１．２４抗体による可溶性ＨＭ１．２４タンパク質抗原の測定（特許文献１）、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡとそのプローモーター領域並びにこれ等の用途（特許文献２）、発現ベクターによる可溶性ＨＭ１．２４抗原タンパク質の量産（特許文献３）、ＨＭ１．２４タンパク質によるパルス又は該遺伝子ＤＮＡの導入により作製された樹状細胞を有効成分として用いる癌ワクチン（特許文献４）、抗ＨＭ１．２４モノクローナル・ヒト化抗体を用いるＡＤＣＣによる骨髄腫の免疫療法（非特許文献２）等々が公知である。しかしながら、ＨＭ１．２４を用いる免疫療法の実用化は未だ知られていない。
【特許文献１】ＷＯ９９／４３７０３
【特許文献２】ＷＯ９９／４３８０３（特開２００３−２１９８９４）
【特許文献３】ＷＯ０１／７７３６２
【特許文献４】ＷＯ２００４／０３９３９８
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ、第８４巻（６号）、１９２２−１９３３、１９９４
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ、第９３巻（１１号）、３９２２−３９３０、１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述した従来技術（例えば、特許文献３及び４）によれば、ＨＭ１．２４タンパク質を構成する完全長アミノ酸配列（アミノ酸数１８０）やその断片（アミノ酸数１１５）等、１０ｋＤを超える高分子ペプチドを抗原として用いている。そのため、かかる抗原１分子上の多様なエピトープないしは免疫活性ドメインの存在は、その作用効果の確認と同定を複雑かつ困難にしている。更に、これ等の抗原は、発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し得られる形質転換体の培養により量産されているので、抗原の高度精製、細胞や培養培地等に由来の毒性迷入因子の否定等々に係る品質管理及び品質保証の確立には長年を要する。
換言すれば、量産されたＨＭ１．２４抗原の安全性と有効性並びに均質性の確定と保証が、従来技術の実用化を遅延かつ遅滞させていると思量される。
更に、例えば、多発性骨髄腫は抗癌剤に抵抗性を示す難治性の造血器腫瘍であり、従来の化学療法や自家造血幹細胞移植だけでは長期的な治癒が期待できず、従来の抗癌剤とは作用機序の異なる新しい治療方法の開発、例えば、免疫療法の確立が望まれているところである。
従って、上記の理由、及び難治性の多発性骨髄腫や速進行性の肺癌等の治療や再発防止に確固たる術のない現状にあっては、安全かつ有効、しかも均質な物質の提供とこれを用いる癌の免疫療法の確立は、患者とその家族、そして担当臨床医のみならず、全人類にとって、解決されるべき待望の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上述した実情と課題解決の必要性を臨床面から深く体験かつ認識すると共に、前述ＨＭ１．２４抗原が発見された機関（徳島大学）にあって、該抗原の有用性とその活用に熱い視線を注ぎ、癌の免疫療法の観点から長年にわたり多種多様な創意工夫と研究を重ねた。
その結果、本発明者は、ヒトＨＭ１．２４抗原に由来する種々の免疫活性ドメインのうち、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体を用いることにより、次の（１）〜（３）に記載の驚くべき発見をした：
ＨＭ１．２４抗原が、多発性骨髄腫だけではなく、肺癌細胞においても高度に発
現されていること。換言すれば、該抗原は、血液、骨髄及びリンパ系以外の体組織の癌、即ち、固形癌においても高発現されていること。
（２）肺癌細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現頻度は、実験例３において後述する通り、４５％であり、多発性骨髄腫でのそれに比べ低値である。しかし、これまで肺癌において高頻度発現だとされている癌抗原、ＭＡＧＥ−３、ｐ５３、及びＳＡＲＴ−３の発現頻度は４０％台であるので、上記ＨＭ１．２４抗原の発現頻度は、これ等の癌抗原に匹敵する発現率である。従って、該抗原とこれに対する抗体は、肺癌診断のための新規な手段あるいはマーカーになり得ること；及び
（３）抗ＨＭ１．２４抗体は、多発性骨髄腫（前述の非特許文献２）だけではなく、固形癌である肺癌細胞に対してもＡＤＣＣ活性を発揮すること。しかも、該ＡＤＣＣ活性の強さは、上記（１）のＨＭ１．２４抗原の発現量に比例あるいは相関していること。
【０００５】
以上の知見に基づき、この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（３）が提供される：
（１）アミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する抗体を、薬効を奏する量、含有することを特徴とする癌の免疫療法剤；
（２）抗体がモノクローナル抗体である上記（１）に記載の癌の免疫療法剤；
癌が肺癌である前記（１）又は（２）に記載の癌の免疫療法剤；及び
（４）アミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する抗体を、抗原抗体反応を呈する量、含有する肺癌の診断剤。
【発明の効果】
【０００６】
この発明は、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療及び再発防止に優れて安全かつ有効そして均質な免疫療法剤を提供することにより、これ等の癌に対する免疫療法の確立を可能にする。換言すれば、この発明が人類の諸活動にもたらす精神的、物質的あるいは経済的効果は計り知れない。この発明は、世界の保健と医療行政に寄与するだけではなく、人類待望の癌の制圧に多大に貢献すると共に、長寿と延命という福音を全ての人類にもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
ヒトＨＭ１．２４抗原に対する抗体：
この発明に係る抗体は、ヒトＨＭ１．２４抗原に由来する種々の免疫活性ドメインのうち、配列番号１に記載のアミノ酸配列、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対する種々の抗体である。本発明によれば、これ等の抗体は、ＡＤＣＣの活性物質あるいは作用物質、ＡＤＣＣによる癌の免疫療法剤の有効成分、肺癌の診断剤等として用いることができる。尚、かかる抗体のヒトでの臨床使用では、その副作用の軽減あるいは安全性を考慮し、ヒトに対し異物（異種抗原）にならないよう留意選定する必要がある。この観点から、臨床使用では、例えば、ポリクローナル抗体に比べ、モノクローナル抗体が、また、マウスモノクローナル抗体に比べ、該モノクローナル抗体をヒト型に改造したマウス・ヒトキメラ抗体が望ましい。更に望ましくは、上記キメラ抗体を更に改造したＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：相補性決定領域）置換ヒト化抗体や、遺伝子工学により製造されるヒト型モノクローナル抗体を挙げることができる。
尚、前述した配列番号１に記載のアミノ酸配列は、該アミノ酸配列に対する抗体と同一機能の抗体の作成が可能な限り、少なくとも１個のアミノ酸残基を置換、付加、又は欠失させることができる。
【０００８】
（２）癌の免疫療法剤としての形態
この発明に係る抗体は、アンプルやバイアル瓶等に分注され、液状又は乾燥のかたちで密封された状態で提供される。尚、ＡＤＣＣによる癌の免疫療法における該抗体の投与量は、約１〜約５００μｇ／ドーズが望ましい。
【０００９】
以下、実験例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実験例及び実施例だけに限定されるわけではない。
（実験例１）
【００１０】
（１）肺癌細胞株：
後述する実験例では合計３３株の肺癌細胞株を用いた。その内訳は、次の通りである：非小細胞肺癌に由来の合計２６細胞株（腺癌が１５細胞株、扁平上皮癌が５細胞株、及び大細胞癌が６細胞株）、及び小細胞肺癌に由来の合計７細胞株。
【００１１】
（２）抗ＨＭ１．２４抗体：
ヒトＨＭ１．２４抗原の免疫活性ドメインである配列番号１に記載のアミノ酸配列、即ち、Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕからなるペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を用いた。
【実施例１】
【００１２】
肺癌細胞株におけるＨＭ１．２４抗原の発現の測定：
実験例１（１）に記載の合計３３株の各肺癌細胞株におけるＨＭ１．２４抗原の発現を、実験例１（２）に記載のマウスモノクローナル抗ＨＭ１．２４抗体を用いたフローサイトメトリーによりそれぞれ測定し。即ち、５ｘ１０５細胞当たり１μｇの上記抗体を用いて染色した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂａｒによりフローサイトメトリーを行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅにて解析した。発現量はｍｅａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＳＦＩ）で定量化し、ＭＳＦＩ＞１０を高発現株とした。
その結果を表１に示す。全肺癌細胞株の４５％（１５／３３）においてＨＭ１．２４抗原の発現を認めた。更に、多発性骨髄腫株におけるＨＭ１．２４抗原の発現量に匹敵する高発現株の割合は、全体の２１％（７／３３）であった。
尚、肺癌細胞におけるＨＭ１．２４抗原の上記頻度（４５％）は、多発性骨髄腫での発現頻度に比較し低値であるが、肺癌細胞における癌抗原発現という観点からみると、これまでに肺癌で高率に発現されているとされるＭＡＧＥ−３、ｐ５３、及びＳＡＲＴ−３の癌抗原発現が４０％台であることから、ＨＭ１．２４抗原はこれらの癌抗原に匹敵する発現率であると判断される。                                          （以下余白）
【００１３】
【表１】
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【実施例２】
【００１４】
ＨＭ１．２４抗原の発現に及ぼすサイトカインの影響：
インターロイキンＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、インターフェロンＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）及びＩＦＮ−β（５００Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ添加混合した培養液を用い、実験例１（１）に記載の合計３３株の各肺癌細胞株を４８時間培養の後、ＨＭ１．２４抗原の発現量を実施例１の記載と同様にして測定した。
その結果、ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βの両者でＨＭ１．２４発現の増強が認められた。この増強効果は、全体的には、ＩＦＮ−βの方がＩＦＮ−γに比べ強い傾向にあった。但し、ＩＦＮ−γにだけ増強される細胞株も検出された。
【実施例３】
【００１５】
抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定：
抗ＨＭ１．２４抗体（２μｇ／ｍｌ）のＡＤＣＣ活性は、６時間の５１Ｃｒ遊離試験により測定した。尚、ターゲット細胞には実験例１（１）に記載の合計３３株の各５１Ｃｒ標識肺癌細胞株を、また、エフェクター細胞としてＳＣＩＤ（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ：重症複合免疫不全症）マウスの脾細胞を、そして比較対照には骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６をそれぞれ用いた。
その結果を図１に示す。各ターゲット細胞（肺癌細胞株）のＨＭ１．２４抗原の発現量に比例し、ＡＤＣＣ誘導効果が生じることが確認された。骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６におけるＡＤＣＣ活性は、肺癌細胞株ＳＢＣ−５細胞でのそれと同等であったことから、ＮＣＩ−Ｈ１９６細胞に対するＡＤＣＣ活性は、上記の骨髄腫細胞に対する活性に比べ、明らかに高いと判断された。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
この発明は、肺癌、乳癌等の固形癌等の治療及び再発防止のための免疫療法及び臨床検査において有用であり、医薬品、診断剤等の製造・販売の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＮＣＩ−Ｈ１９６、ＳＢＣ−５及びＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫの各肺癌細胞株に対する抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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