(57)【要約】【課題】  種類の異なるレトロウイルスベクターで遺伝子導入された細胞においても、前記ベクターの染色体上の遺伝子組み込み部位を解析することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーの配列を提供すること。【解決手段】  配列番号１に示される塩基配列中の連続する１２塩基以上の配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。  前記オリゴヌクレオチドを使用することにより、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法では避けられなかった、使用されるレトロウイルスベクターごとのプライマー設計や条件設定が不要となる。また前記オリゴヌクレオチドを含有するキットを使用することにより、染色体上のレトロウイルスベクター組み込み部位の解析を簡便に、かつ高い再現性をもって実施することができる。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列中の連続する１２塩基以上の配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２または３に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
標識が付加されている請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含する、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法。
【請求項５】
下記工程を包含する請求項４記載の方法； 
（１）請求項１〜３いずれか記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応を行う工程、
（２）工程（１）で得られたプライマー伸長物を回収し、当該伸長物に相補的なＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを得る工程、
（３）工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する工程、および
（４）工程（３）で得られたオリゴヌクレオチド付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーと前記二本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーとを使用する核酸増幅反応を実施する工程。
【請求項６】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ塩基配列を決定するためのキットであって、下記の要素を包含するキット；
（ａ）請求項１〜３いずれか記載のオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる反応を実施するための緩衝液を含有する請求項６記載のキット。
【請求項８】
配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレトロウイルスベクターで遺伝子導入された細胞における、染色体上の遺伝子組み込み部位を解析する際に有用なオリゴヌクレオチドプライマーの配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する遺伝病やがんなどの難病について、正しい遺伝子情報の付加によってその細胞の機能を修正したり、細胞が本来持っていなかった新しい「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療または予防をしようとする治療法である。
【０００３】
遺伝子治療に使用される細胞への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する方法、リポソームのような遺伝子導入剤を使用する方法等が知られている。
【０００４】
ウイルスベクターは遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適している。一方、レトロウイルスベクターは宿主染色体に目的の遺伝子を安定に組み込む機能を有しているために、長期にわたり安定して遺伝子発現させることが可能であり、遺伝病の遺伝子治療への利用、トランスジェニック動物作製の分野に期待されているベクターである。しかし、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、目的遺伝子が宿主染色体上にランダムに組み込まれることから、組み込まれる部位によっては細胞ががん化するなどの可能性が指摘されている。そのため、このレトロウイルスベクターにより遺伝子が組み込まれている宿主染色体上の部位を解析すること、また被験細胞集団におけるクローン種（モノクローン、オリゴクローン、ポリクローン）の判定を感度良くモニタリングすることが重要となってくる。
【０００５】
一般的にウイルス、トランスポゾンやトランスジーンなどの染色体ＤＮＡ中への挿入、組み込み部位の解析方法としては、インバースＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）法（非特許文献１）やＬＭ  ＰＣＲ法（非特許文献２）、Ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ（ＬＡＭ  ＰＣＲ法）（特許文献１、非特許文献３）がある。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／２４９２９号パンフレット
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、第１９２４〜１９２８頁（１９８９）
【非特許文献２】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４６巻、第７８０〜７８６頁（１９８９）
【非特許文献３】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１００巻、第２７３７〜２７４３頁（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記の方法は、ＰＣＲ法あるいはプライマーエクステンション法とＰＣＲ法に基づいた遺伝子組み込み部位の解析方法である。現在使用されているレトロウイルスベクターはその塩基配列にいくつかのバリエーションがある。ＭＭＬＶベクター、ＰＣＭＶベクターのＬＴＲ領域の塩基配列を配列表の配列番号６、７にそれぞれ示すが、これらはそのサイズ（それぞれ約３４０ｂｐ、約２６０ｂｐ）においても相違している。このため、宿主染色体上のどの部位に遺伝子が組み込まれているのかを解析するためには、遺伝子導入に用いたそれぞれのレトロウイルスベクター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計する必要がある。また、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する場合には、被験細胞集団におけるクローン種の判定、細胞集団中の特定の細胞の存在割合を高感度に、高い再現性をもってモニタリングできるように配列を選択する必要がある。
【０００８】
本発明の目的は、種類の異なるレトロウイルスベクターで遺伝子導入された細胞においても、前記ベクターの染色体上の遺伝子組み込み部位を解析することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーの配列を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＭＭＬＶ、ＰＣＭＶあるいはこれらに類似した配列の３’−ＬＴＲ領域の塩基配列を有するレトロウイルスベクターを対象として、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、これらレトロウイルスベクターで遺伝子導入された細胞において、染色体上の遺伝子組み込み部位の解析を行う際に有用なオリゴヌクレオチドプライマー配列を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
上記プライマーを用いてＬＡＭ  ＰＣＲ法を行った場合には、より多くの組み込み部位由来のＤＮＡ断片を増幅させ、また、その集団に含まれる特定の増幅断片を感度よく検出できる。つまり、被験細胞集団におけるクローン種（モノクローン、オリゴクローン、ポリクローン）の判定、細胞集団中の特定の細胞の存在割合を高感度に、高い再現性をもってモニタリングすることが可能となる。また、例えば、これらのオリゴヌクレオチドプライマーについては、インバースＰＣＲ法やＬＭ  ＰＣＲ法にも有効に利用できる。
【００１１】
本発明の第１の発明は、配列番号１に示される塩基配列中の連続する１２塩基以上の配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００１２】
第１の発明のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２または３に示される塩基配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドが例示される。また、本発明のオリゴヌクレオチドは標識が付加されたものであってもよい。
【００１３】
本発明の第２の発明はレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法に関し、第１の発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含することを特徴とする。
【００１４】
第２の発明の方法としては、下記工程を包含する方法が例示される。
（１）第１の発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応を行う工程、
（２）工程（１）で得られたプライマー伸長物を回収し、当該伸長物に相補的なＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを得る工程、
（３）工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する工程、および
（４）工程（３）で得られたオリゴヌクレオチド付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーと前記二本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーとを使用する核酸増幅反応を実施する工程。
【００１５】
本発明の第３の発明はレトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ塩基配列を決定するためのキットであって、下記の要素を包含することを特徴とする。
（ａ）第１の発明のオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ。
【００１６】
第３の発明のキットとしては、さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる反応を実施するための緩衝液を含有するものが例示される。
【００１７】
本発明の第４の発明は配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００１８】
本発明の第５の発明は配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法では避けられなかった、使用されるレトロウイルスベクターごとのプライマー設計や条件設定が不要となる。特に、本発明のオリゴヌクレオチドを含有するキットを使用することにより、染色体上のレトロウイルスベクター組み込み部位の解析を簡便に、かつ高い再現性をもって実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
１．本発明のオリゴヌクレオチド
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、レトロウイルスベクターのＬＴＲ領域の塩基配列に相補的な配列を有し、前記領域を含む核酸を鋳型とした相補鎖合成反応においてプライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチドである。配列表の配列番号１には複数のレトロウイルスベクター、例えばＭＭＬＶベクターやＰＣＭＶベクターに共通して存在する塩基配列が記載されており、本発明のプライマーは該領域に相補的となるよう設計されたオリゴヌクレオチドであれば、その塩基配列、鎖長には特に限定はない。なお、プライマー伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとしての機能を発揮する観点からは前記領域の連続する１２塩基以上の配列に相補的な塩基配列を有するプライマーが本発明に使用することができ、例えば、連続する１２〜４０塩基の配列、好ましくは連続する１３〜３５塩基の配列、さらに好ましくは連続する１５〜３０塩基の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが使用できる。
【００２１】
本明細書に言う「相補的」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが鋳型となるべき核酸にアニーリング可能であることを指す。従って、配列番号１の塩基配列と完全に相補的ではないが、プライマー伸長反応の際のアニーリング工程の条件、例えば１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．２、２８ｍＭ  硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  塩化カリウム、５．０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ、０．５Ｍ  ベタイン（トリメチルグリシン）の組成の溶液中、５８℃において配列番号１の塩基配列を有する核酸にアニーリング可能なオリゴヌクレオチドであれば、前記配列に完全に相補的な配列を有するものでなくても本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。
【００２２】
本発明の特に好適な態様のひとつとして、特に本発明を限定するものではないが、配列番号２または３の塩基配列を有するプライマーが例示される。
なお、本発明のオリゴヌクレオチドは前記領域に相補的な塩基配列を有するものであれば、該配列に加えて前記領域とは無関係な塩基配列を、例えば当該プライマーの５’末端に付加されていてもよい。前記領域とは無関係な塩基配列としては、例えば制限酵素の認識配列や当該プライマーならびに該プライマーより伸長された伸長産物の回収に使用する塩基配列等が例示される。
【００２３】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、必要に応じて適当な修飾を施して使用することが可能である。ビオチンやジゴキシゲニンのようなリガンドや蛍光物質などを付したオリゴヌクレオチドは、伸長反応や増幅反応後の産物の検出を容易にするのみならず、前記産物の回収を可能とする。下記実施例に記載のように、ビオチン標識された本発明のオリゴヌクレオチドはレトロウイルスによる染色体上の遺伝子組み込み部位の解析に特に有用である。
【００２４】
また、本発明はＭＭＬＶベクターに類似した配列の３’−ＬＴＲ領域の塩基配列を有するレトロウイルスベクターについて、該ベクターによる遺伝子組込み部位の解析に有用なオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、ＭＭＬＶベクターに類似したベクターとして、配列番号８に示す塩基配列の３’−ＬＴＲを有するレトロウイルスベクターが存在する。当該ベクターに対しては、配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを遺伝子組み込み部位の解析のために使用することができる。
【００２５】
上記のオリゴヌクレオチドは、レトロウイルスによる遺伝子組込み部位の解析において、レトロウイルスベクターの組み込まれた部位に隣接する、被遺伝子導入細胞染色体由来のＤＮＡ断片を取得するためのプライマー伸長反応に有用である。
【００２６】
２．本発明の遺伝子組み込み部位の解析方法
本発明は、前記のオリゴヌクレオチドを使用した、レトロウイルスベクターにより染色体上に組み込まれた遺伝子の、染色体上の組込み部位を解析する方法を提供する。当該方法は、例えば特許文献１や非特許文献３に記載された手順に従って、あるいは下記の工程により実施することができる。
【００２７】
なお、本発明の方法を適用することができるレトロウイルスベクターには特に限定はなく、配列番号１に示される塩基配列、もしくは該配列に類似した塩基配列の領域を含有するＬＴＲを有するレトロウイルスベクターに適用できる。
【００２８】
本発明の遺伝子組み込み部位の解析方法を適用することができるレトロウイルスベクターとしては、特に本発明を限定するものではないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）に由来するベクター、あるいはＰＣＭＶ（ＰＣＣ４−ｃｅｌｌ  ｐａｓｓａｇｅｄ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）に由来するベクターが例示される。ＭＭＬＶ由来のレトロウイルスベクターとしては、例えばｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクターやこれらを改変したベクターが例示される。また、ＰＣＭＶ由来のレトロウイルスベクターとしては、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８４巻、第５２３２〜５２３６頁（１９９０）記載のレトロウイルスベクターや該ベクターを改変したベクターが例示される。
【００２９】
以下に本発明の遺伝子組み込み部位の解析方法について説明する。
（１）ＬＴＲに隣接する染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ（プライマー伸長物）の合成
材料となる細胞より染色体ＤＮＡを調製し、上記の本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してプライマー伸長物を合成する
前記の細胞には特に限定はなく、生体から採取された細胞、生体外で培養された細胞のいずれであってもよい。生体から採取された細胞としては、例えば造血幹細胞のような造血系の細胞が遺伝子導入の対照であった場合には、これらの細胞、もしくはこれらの細胞より分化した細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ等）やそれらの混合物を本発明の方法に使用する染色体ＤＮＡの調製材料とすることができる。
【００３０】
本発明に試料として使用される染色体ＤＮＡには特に限定はないが、通常はレトロウイルスベクターにより遺伝子導入された、もしくはその可能性のある細胞より調製された染色体ＤＮＡである。当該染色体ＤＮＡの調製材料となる細胞はモノクローン、オリゴクローン、ポリクローン由来のいずれのものでもよい。
【００３１】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡに上記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＤＮＡ伸長反応を行ってＬＴＲならびにそれに隣接する染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ鎖を合成する。この工程にはＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【００３２】
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成できるものであればよい。たとえば、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等）ならびにこれらの改変体を本発明に使用することができる。
【００３３】
さらに２以上のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用してもよい。例えば、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等）と当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、前記の３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失変異体等）とを混合して使用する方法が本発明に特に好適である。このようなＤＮＡポリメラーゼの混合物は、例えば米国特許第５４３６１４９号に開示されている。さらに、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（いずれもタカラバイオ社製）等が市販されている。
【００３４】
多くのプライマー伸長物を得る観点からは、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応を複数回繰り返すことが望まれる。この場合にはプライマー伸長物の合成をＰＣＲによって実施し、伸長物の鋳型ＤＮＡからの解離、新たなプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、プライマー伸長反応、の３工程を反復すればよい。
【００３５】
例えば、前記反応には二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物、たとえばベタイン（トリメチルグリシン等）、有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド）、テトラメチルアンモニウム塩［テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）、テトラメチルアンモニウムアセテート（ＴＭＡＡ）、テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）］等を含有させてもよい。前記化合物の添加により、より多くの分子種から構成されるプライマー伸長物が得られることが期待できる。その濃度は所望の効果を得られる範囲であれば特に限定はない。たとえばベタインの場合には終濃度０．１〜３Ｍ、好ましくは０．１〜１Ｍの範囲で、ジメチルスルフォキシドの場合には終濃度０．５〜１５％、好ましくは１〜１０％の範囲で、また、テトラメチルアンモニウム塩の場合には終濃度０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの範囲で、それぞれ本発明に使用することができる。
【００３６】
（２）プライマー伸長物の二本鎖への変換
以上に説明した工程において合成されたプライマー伸長物は、たとえばプライマーとしたオリゴヌクレオチドに付加された標識を利用して反応液から回収される。
オリゴヌクレオチドにリガンド標識が付されている場合には当該リガンドに結合するレセプター、また、ハプテン標識の場合には当該ハプテンを認識する抗体を使用することができる。このような標識物質に結合する物質を固定化した固層を利用すればプライマー伸長物を容易に反応液から回収することができる。たとえば、ビオチン標識を付加したプライマーを用いて得られたプライマー伸長物は、伸長反応液にアビジンを固定化したビーズを添加してビーズ上に伸長物を捕獲し、次いでこのビーズを洗浄した後に伸長物をビーズから脱着させることにより鋳型とされた染色体ＤＮＡから分離されたプライマー伸長物を得ることができる。
【００３７】
さらに、前記のプライマー伸長物の回収に先立って未反応のオリゴヌクレオチドを除去する操作を行ってもよい。このような操作は、例えば適当なポアサイズのフィルターを用いたろ過や長鎖の核酸のみが選択的に沈殿するような条件での分別沈殿法により実施することができる。
【００３８】
次に、回収されたプライマー伸長物（一本鎖ＤＮＡ）を二本鎖ＤＮＡに変換する。その手段には限定はなく、例えば、プライマー伸長物にランダムプライマーをアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてランダムプライマーから前記プライマー伸長物に相補的なＤＮＡを合成し、二本鎖核酸を得ることができる。
【００３９】
（３）リンカーカセットの付加
上記（２）の工程で二本鎖に変換されたプライマー伸長物を制限酵素消化し、生じた末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する。
本発明に使用される制限酵素には特に限定はないが、プライマー伸長物に含有されるＬＴＲ部分の塩基配列中に認識切断部位が存在するものは適当ではない。次の二本鎖オリゴヌクレオチドの付加を効率よく行う観点からは、付着末端を生じる制限酵素が本発明にはより好ましい。また、適切な鎖長のＤＮＡ断片を得るためには４塩基認識の制限酵素が好適であり、例えば、Ｔｓｐ５０９Ｉ（Ｓｓｅ９Ｉ）、ＭｂｏＩ（Ｓａｕ３ＡＩ）等を使用することができる。制限酵素消化は使用する制限酵素に応じた条件で実施すればよい。
【００４０】
制限酵素消化された二本鎖のプライマー伸長物の末端には二本鎖のオリゴヌクレオチド（リンカーカセット）が付加される。リンカーカセットは上記の制限酵素消化で生じる末端に対応する末端、好ましくは付着末端と、以降の核酸増幅工程において使用されるプライマーがアニーリングしうる配列とを有している。以上の条件を満たすものであればその配列、鎖長には特に限定はないが、通常、２０〜１００塩基対、好ましくは３０〜６０塩基対のリンカーカセットが本発明に使用される。プライマーがアニーリングしうる配列にも特に限定はなく、プライマーの設計に不適切な配列（ＧＣ含量が偏ったもの、分子内もしくは分子間で水素結合を形成しうるもの）を除く任意の配列が使用できる。
リンカーカセットの付加は公知のＤＮＡ結合方法（ライゲーション反応）によって実施することができ、例えば市販のキット等を使用してもよい。
【００４１】
（４）二本鎖ＤＮＡの増幅
こうして得られた二本鎖ＤＮＡは、一方の末端にＬＴＲ由来の塩基配列を、もう一方の末端にリンカーカセットの塩基配列を有している。このＤＮＡを鋳型とし、ＬＴＲ由来の塩基配列にアニーリングできるプライマー、リンカーカセットの塩基配列にアニーリングできるプライマーとを使用する核酸増幅反応を行うことにより、前記の二本鎖ＤＮＡを増幅することができる。
【００４２】
本発明の方法に使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法などが使用できる。
ＰＣＲ法を使用する場合には公知の方法に準じ、適切な条件（反応液組成、サイクル条件）を設定して実施すればよい。好ましくは上記（１）に記載された方法に準じて、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含有する反応液、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとの混合物が使用される。また、サイクル条件も上記（１）記載のものを使用できるが、サイクル数については上記条件よりも少なくすることができる。また、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法として知られている、２段階のＰＣＲ法を使用してもよい。
【００４３】
ＬＴＲ由来の塩基配列にアニーリングできるプライマーは、上記二本鎖ＤＮＡに含有されているＬＴＲ領域にアニーリングし、かつリンカーカセットの塩基配列にアニーリングできるプライマーと組み合わせて核酸増幅反応を実施できるものであれば特に限定はない。例えば、非特許文献３にＬＴＲ２、ＬＴＲ３として記載されているプライマーを使用することができる。さらに、下記実施例において使用された、前記のＬＴＲ２と類似した塩基配列（配列番号５）を有するプライマーはＭＭＬＶベクター、ＰＣＭＶベクターのどちらの遺伝子組込み部位解析にも有用であり、本発明の方法に好適である。また、リンカーカセットの塩基配列にアニーリングできるプライマーは、前記塩基配列に基づいて任意に設計、作製すればよい。
【００４４】
以上の（１）〜（４）に示した一連の工程によって、レトロウイルスベクターのＬＴＲ部分の塩基配列と、染色体上の当該ベクターが組み込まれた位置に隣接する（すなわち前記ＬＴＲに隣接する）領域の塩基配列とを含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００４５】
また、別法として、工程（１）において鋳型として使用される染色体ＤＮＡをあらかじめ適切な制限酵素、例えば上記（３）の項に記載された制限酵素であらかじめ消化しておき、これを使用してプライマー伸長反応を行うことができる。この場合には、得られた伸長産物を二本鎖ＤＮＡに変換した後、これを制限酵素消化することなくリンカーカセットの付加が実施される。この場合、リンカーカセットとしては平滑末端を有するものが使用される。
【００４６】
本発明の方法で得られた増幅ＤＮＡ断片は、例えばアガロースゲル電気泳動によって分析することにより、試料とされた細胞集団中にどの程度の種類の組み込み部位が存在するかを調べることができる。
【００４７】
さらに、上記の増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法によって決定することができる。増幅されたＤＮＡ断片は反応液より回収した後、適当なベクター（プラスミドベクター、ファージベクター等）に連結される。この組換えＤＮＡ分子で適当な宿主を形質転換して得られる形質転換体より組換えＤＮＡ分子を調製し、これを鋳型としてシークエンシング反応を行い、上記のＤＮＡ断片の塩基配列を解読することができる。ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ断片のクローニングには３’末端にＴ塩基が突出したベクター（Ｔ−ベクター）が好適であるが、これに限定されるものではない。また、増幅されたＤＮＡ断片の分子種が限られており、アガロースゲル電気泳動等によって単離可能である場合には、単離された増幅ＤＮＡ断片を鋳型としたダイレクトシークエンシングを行ってもよい。
【００４８】
以上の工程により、多種類のレトロウイルスベクターについて個別のプライマー合成を行うことなく、レトロウイルスベクターの染色体組み込み部位の特定、組み込み頻度の高い配列または領域の推定、特定の遺伝子導入細胞の生体中での分布や割合のモニタリング等を実施することができる。さらに、同一のプライマーを使用するためにベクターごとに解析条件、特にプライマー伸長反応、遺伝子増幅反応の条件を至適化する必要がないことから、より簡便に、高い再現性で種々のレトロウイルスベクターの組込み部位の解析が可能となる。
【００４９】
３．本発明の遺伝子組み込み部位の解析方法に使用されるキット
本発明の、レトロウイルスベクターによる遺伝子組み込み部位の解析方法に使用されるキットは、コンポーネントとして（ａ）本発明のオリゴヌクレオチド、および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、を含有する。さらに、上記２．に記載された各工程に使用される試薬類を含有するものであってもよい。
【００５０】
２．−（１）に記載されたプライマー伸長反応をＰＣＲによって実施する場合、上記（ｂ）のＤＮＡポリメラーゼには耐熱性を有するものが選択される。このＤＮＡポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物であってもよい。
【００５１】
さらに、上記のキットは制限酵素、プライマー伸長物の二本鎖化のための試薬、リンカーカセット、ライゲーションや遺伝子増幅反応に使用される試薬、各工程の酵素反応を実施するための緩衝液等を含んでいてもよい。特に本発明を限定するものではないが、２．−（１）、２．−（４）に記載された工程に使用される緩衝液としては、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物、例えば２−（１）記載の化合物を含有する緩衝液が好適である。また、その組成は（ｂ）のＤＮＡポリメラーゼの使用に適したものであることが好ましい。また、その形態として、緩衝液中にプライマーやＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ添加されているもの、緩衝液とは別にｄＮＴＰやＭｇ塩が添付されているものなども本発明のキットに包含される。
【００５２】
また、（ａ）のオリゴヌクレオチドは伸長物の回収に適した標識、例えばビオチン等が付加されていてもよい。この場合には、当該標識に適した伸長産物の精製のためのコンポーネント、例えばアビジン固定化ビーズ等がさらに含まれているキットが好適である。
【００５３】
該キットを用いることで、レトロウイルスベクターの組み込まれた部位に隣接する、被遺伝子導入細胞染色体由来のＤＮＡ断片を取得することが容易となり、レトロウイルス組み込み部位解析を簡便に行なうことが可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
【００５５】
実施例１
（１）染色体ＤＮＡの調製
配列番号８に示す塩基配列の３’−ＬＴＲ領域を有するレトロウイルスベクターを用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）に遺伝子導入を行い、次いで前記ベクターが染色体に組み込まれた細胞を選択、クローニングすることによりクローン１６、２０を得た。これらクローンの−８０℃凍結細胞（それぞれ約２．０×１０６細胞相当）を５ｍｌの懸濁溶液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に懸濁し、１μｌのＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、５０μｌの１０％ＳＤＳ溶液、及び２５μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、タカラバイオ社製）を加えて転倒混和した。その後、５０℃で３時間加熱し、次いで等量のフェノール溶液を加えて１５分間転倒混和した。室温で遠心分離した後に上清を回収し、これに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液を加えて１５分間転倒混和した。遠心して上清を回収した後、全量の１／２５量になるように５Ｍ  塩化ナトリウムを加えて混合した。さらに全量の２．５倍量になるようにエタノールを添加し、室温で放置後、生じた沈殿物を回収した。沈殿物を７０％エタノールで洗浄して１０分間風乾した後、ここにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、２４時間低温室に放置して溶解させた。以上の操作を行うことによって、クローン１６、２０の染色体ＤＮＡのサンプルが回収された。
【００５６】
（２）遺伝子導入部位の解析
ＭＭＬＶ、ＰＣＭＶ、配列番号８に示す塩基配列の３’−ＬＴＲ領域を有するレトロウイルスベクターのＬＴＲ領域に共通に存在する塩基配列（配列番号１）からそれぞれ配列番号２、３の塩基配列を有し５’末端にビオチンが付加されたプライマー  ＬＴＲＩ−ＡおよびＬＴＲＩ−Ｂ、ならびに配列番号５の塩基配列を有するプライマー  ＬＴＲＩＩ−１を設計し合成した。また、非特許文献３に記載されたＬＴＲ３プライマーと同じ塩基配列（配列番号９）を有するＬＴＲＩＩＩプライマー、リンカーカセットＡ（配列表の配列番号１０、１１にそれぞれリンカーカセットＡを構成する二つのオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す）、リンカーカセットＡに相補的な配列を持つプライマー  ＬＣ１、ＬＣ２（配列番号１２、１３にそれぞれプライマー  ＬＣ１、ＬＣ２の塩基配列を示す）を作製した。上記プライマーを用いて、ＬＡＭ  ＰＣＲ法によりクローンゲノム中のレトロウイルスベクターの組み込み部位を含む領域が検出されるかを実施した。
【００５７】
実施例１−（１）で調製したクローン１６ゲノムＤＮＡ  １００ｎｇ、１０ｎｇに２５μｌの×２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．２、２８ｍＭ  硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  塩化カリウム、５．０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ、０．５Ｍ  ベタイン（トリメチルグリシン）］、５μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、プライマー  ＬＴＲＩ−ＡまたはＬＴＲＩ−Ｂ  ０．１ｐｍｏｌ、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製）及び滅菌水を加えて最終容量５０μｌの反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間（変性）、５８℃、４５秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃、９０秒間（合成反応）を１サイクルとする５０サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した。
【００５８】
反応終了後、上記のＰＣＲ反応液に３００μｌのＴＥ溶液を加え、Ｓｕｐｒｅｃ０２（タカラバイオ社製）に添加し、５，０００ｒｐｍ、約７分間遠心した。さらに３５０μｌのＴＥ溶液を添加し、同様にして遠心し、フィルターを洗浄した。次いでフィルターに液量が４０μｌとなるようにＴＥ溶液を添加して、プライマーが除去されたＤＮＡ溶液を回収した。
【００５９】
回収された溶液にストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ（ＭＰＧ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、タカラバイオ社製）  ４０μｌ（２００μｇ相当）を加え、時折混和しながら室温で１時間放置した。反応液の入ったチューブを磁石スタンド（Ｍａｇｎｅｔｉｇｈｔ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄ、タカラバイオ社製）上で１分間静置した後、上清を廃棄し、ビーズの回収を行なった。このビーズに１００μｌのＢＷ緩衝液（５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０Ｍ  塩化ナトリウム）を添加して穏やかに混和し、磁石スタンド上で静置後、同様に上清を廃棄し、さらに１００μｌの滅菌水で同様の操作を行い、ビーズの回収を行なった（この操作をビーズ洗浄操作とする）。
【００６０】
洗浄したビーズを１４．１μｌの滅菌水に穏やかに懸濁し、×１０  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液（下記Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｌａｇｍｅｎｔに添付のもの）  ２μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）  ２．４μｌ、ランダムプライマー（ランダム６ｍｅｒ、１００ｐｍｏｌ／μｌ、タカラバイオ社製）  １μｌ、及びＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）  ０．５μｌを加えて全量を２０μｌとしたものを調製し、３７℃で時折混和させながら１時間反応させ、相補鎖の合成を行なった。反応後、ビーズ洗浄操作を行い、回収したビーズを１７．５μｌの滅菌水に懸濁し、そこに２μｌの×１０  ＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ１（下記Ｔｓｐ５０９Ｉに添付のもの）、０．５μｌの制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ（１０Ｕ／μｌ、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を加えて、時折混和させながら６５℃で１時間保温した。ビーズ洗浄操作を行い、そのビーズに５０ｐｍｏｌ／μｌ  リンカーカセットＡ  ２μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１、タカラバイオ社製）１６μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１、タカラバイオ社製）  ２μｌを添加し、時折混和しながら１６℃で１時間反応させた。
【００６１】
滅菌水でビーズの洗浄を１回行った後、ビーズを回収して５μｌの０．１Ｎ  水酸化ナトリウムに懸濁し、室温で１０分間放置した。磁石スタンド上で約５μｌの上清を回収し、このうち１μｌを用いて以下のＰＣＲ反応を行なった。１μｌの上記溶液に２５μｌの×２  ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．２、２８ｍＭ  硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  塩化カリウム、４．０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ、０．５Ｍ  ベタイン（トリメチルグリシン）］、５μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、プライマー  ＬＴＲＩＩ−１（２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びプライマー  ＬＣ１（２５ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌずつ、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ及び滅菌水を加えて５０μｌとした。この反応液をサーマルサイクラーにセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間（変性）、５８℃、４５秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃、９０秒間（合成反応）を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した（一回目）。その後、一回目のＰＣＲ反応液１μｌを鋳型として用いて、プライマー  ＬＴＲＩＩＩ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）、及びプライマー  ＬＣ２（２５ｐｍｏｌ／μｌ）で二回目のＰＣＲを行った。なお二回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲ条件に従った。
【００６２】
こうして得られた反応液５０μｌの内、５μｌを３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動し、反応液中の増幅産物の確認を行った。その結果、プライマー  ＬＴＲＩ−Ａ、ＬＴＲＩ−Ｂのどちらを用いてプライマー伸長物を作成した場合でも１０ｎｇの鋳型濃度で増幅バンドが確認された。このことから、今回新たに設計したプライマー  ＬＴＲＩ−Ａ、ＬＴＲＩ−ＢおよびＬＴＲＩＩ−１を用い、ＬＡＭ  ＰＣＲで良好な感度が得られることが明らかとなった。
【００６３】
実施例２  プライマー  ＬＴＲＩ−Ｃを用いたＬＡＭ  ＰＣＲ
（１）モノクローン由来染色体ＤＮＡを鋳型とした場合の増幅
配列番号８のＬＴＲ領域の塩基配列から配列番号表の配列番号４の塩基配列を有し、５’末端にビオチンが付加されたプライマー  ＬＴＲＩ−Ｃを作製した。実施例１（１）で調製したクローン１６及びクローン２０の染色体ＤＮＡをそれぞれ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇを鋳型とし、プライマー  ＬＴＲＩ−ＡまたはＬＴＲＩ−Ｂの代わりに、ＬＴＲＩ−Ｃを用いて実施例１（２）と同様の操作を行うことによってクローンゲノム中のレトロウイルスベクターの組み込まれた部位が検出されるか実施した。最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１６、２０ともに１ｎｇの染色体ＤＮＡまでクローン由来の増幅断片が確認された。これにより、今回新たに設計したプライマー  ＬＴＲＩ−Ｃ、ＬＴＲＩＩ−１を用いることで、ＬＡＭ  ＰＣＲにより特定のクローン由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
【００６４】
（２）２種類のクローン由来染色体ＤＮＡの混合物を鋳型とした場合
実施例１（１）で調製したクローン１６、クローン２０の染色体ＤＮＡを重量比（クローン１：クローン２、ｗ：ｗ）で１：０、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、０：１となるように混合し、全量を１００ｎｇとしたものを調製した。これらを鋳型として実施例２（１）と同様の操作を行った場合に、各比率で混合したクローン１、２の由来の増幅断片が検出されるか実施した。
【００６５】
上記の操作で得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１６、クローン２０の何れの混合比の鋳型を用いた場合にも、各クローン由来の増幅断片が得られることが確認された。これにより、今回新たに設計したプライマー  ＬＴＲＩ−Ｃ、ＬＴＲＩＩ−１を用いることで、２種のクローンが混在した場合にも感度よく検出されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、レトロウイルスベクターによって遺伝子が導入された染色体における、前記遺伝子の組み込み部位を簡便に、かつ高い再現性をもって解析することができる。従って、本発明は遺伝子導入技術の開発、遺伝子治療における治療効果のモニタリング等に非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
SEQ ID NO:1; A portion of LTR sequence of MMLV retroviral vector.
SEQ ID NO:2; PCR primer LTRI-A to amplify a DNA fragment having LTR sequence.
SEQ ID NO:3; PCR primer LTRI-B to amplify a DNA fragment having LTR sequence.
SEQ ID NO:4; PCR primer LTRI-C to amplify a DNA fragment having LTR sequence.
SEQ ID NO:5; PCR primer LTRII-1 to amplify a DNA fragment having LTR sequence.
SEQ ID NO:6; LTR sequence of MMLV retroviral vector.
SEQ ID NO:7; LTR sequence of PCMV retroviral vector.
SEQ ID NO:8; LTR sequence of a certain retroviral vector.
SEQ ID NO:9; PCR primer LTRIII to amplify a DNA fragment having LTR sequence.
SEQ ID NO:10; Oligonucleotide constituting linker-cassette A.
SEQ ID NO:11; Oligonucleotide constituting linker-cassette A.
SEQ ID NO:12; PCR primer LC1 to amplify a DNA fragment having linker-cassette A.
SEQ ID NO:13; PCR primer LC2 to amplify a DNA fragment having linker-cassette A.
【配列表】
2006280333000001.app