(57)【要約】【課題】  高額な解析機器を必要とすることなく簡便かつ短時間に、細胞内でゲノム上に結合している転写因子および／あるいは転写共役因子の標的遺伝子を、既知あるいは未知に関わらず、直接的かつ網羅的に同定する方法を提供すること。【解決手段】  細胞内の転写因子および／あるいは転写共役因子を検出可能な抗体を用いて、転写因子および／あるいは転写共役因子に結合したゲノム断片を抽出し、制限酵素処理によるゲノム断片の短小化を施し、他の制限酵素に対して感受性ある任意の塩基配列をもつリンカーDNAをゲノム断片の両端に付加し、リンカーDNAに対する制限酵素で消化し、ゲノム断片をライゲーションし、ベクター内に挿入し、ベクターを増やして回収し、挿入されたゲノム断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定する。【選択図】  図１
2006211979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子および／あるいは転写共役因子が結合する標的遺伝子を検出する方法であって、
細胞内の転写因子および／あるいは転写共役因子を検出可能な抗体を用いて、転写因子および／あるいは転写共役因子に結合したゲノム断片を抽出し、
制限酵素処理によるゲノム断片の短小化を施し、
他の制限酵素に対して感受性ある任意の塩基配列をもつリンカーDNAをゲノム断片の両端に付加し、
リンカーDNAに対する制限酵素で消化し、
ゲノム断片をライゲーションし、
ベクター内に挿入し、
ベクターを増やして回収し、
挿入されたゲノム断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定する
ことを特徴とする転写因子の標的遺伝子検出方法。
【請求項２】
転写因子および／あるいは転写共役因子が結合する標的遺伝子を検出する方法であって、
細胞内の転写因子および／あるいは転写共役因子を検出可能な抗体を用いて、転写因子および／あるいは転写共役因子に結合したゲノム断片を抽出し、
制限酵素処理によるゲノム断片の短小化を施し、
ゲノム断片の間を直接的に結合させ、
ゲノム断片をライゲーションし、
ベクター内に挿入し、
ベクターを増やして回収し、
挿入されたゲノム断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定する
ことを特徴とする転写因子の標的遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子が結合する標的遺伝子を、短時間で効率よく網羅的に決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物は一個の受精卵から発生し、細胞分裂を繰返すことで多細胞集団である成体を形成する。これらの細胞は、分裂過程において様々に特化した細胞表現型を獲得することで、組織・臓器を形成・構成する能力を備える。個々の細胞のゲノムに内在する遺伝情報すなわち遺伝子種は、生体内のどの細胞においても共通であり、細胞表現型の獲得には、必要な遺伝子のみを発現する転写制御システムが要求される。細胞表現型の実行プログラムは、複数の転写因子およびそれに付随する転写共役因子が、複雑に共役して標的遺伝子の発現を誘導することで履行される。また、多くの疾患において、特定の遺伝子の過剰発現や発現停止が病態の成立・進展に決定的な働きをすることから、遺伝子の転写制御機構、すなわち転写因子ならびに転写共役因子が結合する標的遺伝子を解明することは、発生生物学的および医学的に非常に重要な課題である。
【０００３】
従来の転写因子標的遺伝子解析法では、標的遺伝子を予め予想し、解析対象である転写因子との結合性等を一つ一つ検討しなければならず、得られる情報は限定的なものであり、ハイスループットな解析は不可能であった。また、現在頻用されているマイクロアレイ等の網羅的解析法は、遺伝子やタンパク質の発現レベルの違いに依存するため、発現レベルの高低や遺伝子が転写された後の様々な要素を反映する。従って、細胞内に発現している遺伝子やタンパク質の量比に立脚する技術的概念は、転写制御機構の解明に向けた直接的手段にはならない。
これらの解析手段では、通常、目的の転写因子を細胞内で過剰発現させる必要があり、細胞内の生理的状態を反映させることは困難である。また、遺伝子発現プロファイルから遺伝子間の相互作用、すなわち遺伝子ネットワークを解明しようとする試みが開始されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Loomis WF, Sternberg PW. Genetic network. Science 269: 649-650, 1995
【０００４】
それらの研究手段では、転写制御因子と標的遺伝子の関係のように、直接あるいは間接的に作用する因果連鎖の解明が問題となる。クラスター分析のように相関係数に基づく解析では、相関から因果を推論することは不可能であり、遺伝子破壊や過剰発現系実験データを大量に収集し、遺伝子間の因果連鎖を推論する必要がある。その場合、約30%にも及ぶとされる発現レベルにおける実験データ誤差の問題や、試料調整法の規格化等のいくつもの大きな課題を解決しなければならない。
従って、細胞が内・外部環境に応じて転写する遺伝子種を解明するためには、より直接的で網羅的に解析する技術の開発が不可欠である。
【０００５】
クロマチン免疫沈降法（以下、ChIPと略す）は、ゲノム上に結合している目的の転写因子あるいは転写共役因子を免疫沈降し、解析対象である特定の標的遺伝子との結合の有無をポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRと略す）により判定する方法である。
近年、多種類の標的候補遺伝子に対するPCRを繰返し行ったり（非特許文献２）、抽出したゲノムDNA断片をスライドガラス上にスポットしたマイクロアレイを用いて、目的の転写因子が結合する標的遺伝子の種類をより多く同定しようとする試みがなされている（非特許文献３）。
これらの方法は、従来法に比較して多くの標的遺伝子を同定することを可能にするが、高額で特殊な解析装置を必要としたり、非常に多大な労力と時間を要求する。
【非特許文献２】Fernandez P, Frank SR, Wang L, Schroeder M, Liu S, Green J, Cocito A, Amati B. Genomic targets of the human c-Myc protein. Genes Dev. 17: 1115-1129, 2003, Gerlilch D, Beaudouin J, Kalbfuss B, Daigle N, Eils R, Ellenberg J. Global chromosome positions are transmitted through mitosis in mammalian cells. Cell 115: 751-764, 2003
【非特許文献３】Weinmann AS, Yan PS, Oberley MJ, Huang THM, Farnham PJ. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. Genes Dev. 16: 235-244, 2002
【０００６】
また、関連する従来技術には、特許文献１〜３があるが、いずれも、転写因子および／あるいは転写共役因子の未知の標的遺伝子を網羅的に、さらに簡便かつ短時間に解析する方法は、産業上および学問上の重要性にもかかわらず、未だ開発されていない。
【特許文献１】特表2004-533804  「人工転写因子および使用の方法」
【特許文献２】再表02/29043  「転写因子の標的遺伝子の同定方法および単離方法」
【特許文献３】特開平11-187876  「転写因子の標的遺伝子を同定する方法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、高額な解析機器を必要とすることなく簡便かつ短時間に、細胞内でゲノム上に結合している転写因子および／あるいは転写共役因子の標的遺伝子を、既知あるいは未知に関わらず、直接的かつ網羅的に同定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の転写因子の標的遺伝子検出方法は、既存の転写因子標的遺伝子解析技術であるChIPを改変し、転写因子および／あるいは転写共役因子の標的遺伝子を簡便かつ短時間に同定することを基本とする（以下、仮にserial chromatin immunoprecipitation、すなわちSChIPと略す）。
【０００９】
本発明では、細胞内の転写因子および／あるいは転写共役因子を検出可能な抗体を用いて、転写因子および／あるいは転写共役因子に結合したゲノム断片を抽出し、制限酵素処理によるゲノム断片の短小化後に、他の制限酵素に対して感受性ある任意の塩基配列をもつリンカーDNAをゲノム断片の両端に付加する。次いで、リンカーDNAに対する制限酵素で消化後、ゲノム断片をライゲーションし、プラスミドあるいはファージDNAなどのベクター内に挿入する。大腸菌等で増やしたベクターを回収し、挿入されたゲノム断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定する。
このように、制限酵素処理およびリンカーDNAを用いることによって、解析対象である転写因子および／あるいは転写共役因子が結合する標的遺伝子を、直接的かつ網羅的に同定することを可能にする。
【００１０】
解析対象とする転写因子は、解析に用いる細胞あるいは組織に内在あるいは遺伝子導入により過剰発現させた転写因子・転写共役因子およびその変異タンパク（例としてはアミノ酸配列の変異あるいはtag標識配列の付加）を含み、細胞種や生物種を限定しないので、実用性の高い発明である。
【００１１】
ゲノム断片の短小化およびリンカーDNAの消化に用いる制限酵素の種類と数および処理条件、およびゲノム断片のクローニングに用いるベクターの種類を限定せず、リンカーDNAの種類および塩基配列は変更可能である。
【００１２】
リンカーDNAを使用せず、ゲノム断片間を直接的に結合させて施行し、操作時間の短縮に寄与させてもよい。
【００１３】
転写因子および／あるいは転写共役因子あるいはその変異体をコードするcDNAあるいはゲノムDNAを、細胞あるいは組織内に導入する場合、導入に用いる手段は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法、レトロウィルス系を用いる方法や、アデノウィルス系を用いる方法、バキュロウィルス系を用いる方法等を任意に利用できる。
【００１４】
使用する試薬等の組成は、適宜変更可能であるので、操作性および反応性の向上を適宜行える。
【００１５】
また、調整後のゲノム断片をベクター内へ挿入せず、他の解析に供することも可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明による転写因子および／あるいは転写共役因子標的遺伝子の網羅的解析法は、従来の解析技術では解決不可能であった上記問題点を解消し、簡便かつ短時間に解析することを可能にする実用性の高いものである。
【００１７】
また、ゲノム断片を制限酵素で消化することで、それらのゲノム配列内での位置の特定に必要十分な断片長とすることが可能であり、転写因子および／あるいは転写共役因子が結合する塩基配列の解析に寄与する。
【００１８】
また、任意の塩基配列をもつリンカーDNAを用い、それを認識する制限酵素で切断した断片を繋いだものをベクターにクローニングすることで、１つの大腸菌コロニー等から複数の転写因子および／あるいは転写共役因子結合領域を特定でき、作業効率の大幅な向上が得られる。
【００１９】
また、使用する制限酵素、試薬、リンカーDNAの種類および組成等を制限しないので、発明技術の微細な改変を自在に行える。
【００２０】
また、解析に特殊および高額な装置を必要としないことから、より広い市場への導入が可能であり、高い汎用性が期待できる。
【００２１】
また、使用する抗体は、転写因子および／あるいは転写共役因子に特異的な抗体、あるいは人工的に付加したtag等に対する抗体を用いることで、解析対象とする転写因子および／あるいは転写共役因子は、細胞あるいは組織試料に内在性のものを対象とするのに加えて、遺伝子導入によって過剰発現させたものも対象にすることができる。そのため、試料内における解析対象の有無に関わらず、あるいは人為的に設計したタンパク質に対しても解析可能であり、広く応用できる。
【００２２】
また、使用する抗体は、転写因子および／あるいは転写共役因子に特異的な抗体あるいは人工的に付加したtag等に対する抗体を用いることで、解析対象とする転写因子および／あるいは転写共役因子の種類や生物種を限定せず、幅広い研究分野に応用できる。
【００２３】
また、高度な技術的要求もないことから、従来の方法では困難であった組織を試料とする解析等に対しても実用性および応用性を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。
なお、本発明は、あらゆる転写因子および／あるいは転写共役因子、および用いる細胞あるいは組織について実施可能であるが、以下では、好適実施例として、ヒト胎児腎臓由来の細胞株293Tに内在する転写因子であるGATA3（例A）、および293TにHis tag標識したGATA3 cDNAを遺伝子導入して行った（例B）2例を挙げて説述する。なお、本発明の構成は、その主旨から逸脱しない限り適宜設計変更可能なものである。以下の説述において、記載がない場合は、例Aと例Bは同一の操作を行うものとする。
【００２５】
図1は、本発明の概要を示す流れ図である。
例Bにおいては、ヒトGATA3 cDNAをpcDNA3.1-Hygro（Invitrogen）発現プラスミドに挿入して5'側にHis tagを付加したGATA3 cDNAを作製し、10 cm培養皿で培養した293Tにリン酸カルシウム法で導入する。導入後、十分な量のHis-GATA3タンパク質を発現させるために、48時間経過したものを解析試料とする。
10 cm培養皿上で培養した293Tの培養液中にホルムアルデヒドを加え（最終濃度1%）、15分間室温処理し、ゲノムDNAとそれに結合しているタンパク質をクロスリンクする。
リン酸緩衝生理食塩水（1 ml）中で細胞を回収する。
【００２６】
遠心分離により細胞を沈澱させ、150 μlの細胞溶解液（20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml leupeptin）中で293Tを溶解させる。
細胞溶解液を超音波処理し、ゲノムDNAを500 bp 〜 1 Kbpの長さに断片化する。
【００２７】
細胞溶解液に1350 μlの希釈溶液（16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml leupeptin ）を加え、50 μlのプロテインAセファロースと4℃30分間インキュベートし、プロテインAの非特異的結合による影響を防ぐ。下記の操作で加える抗体の種類により、プロテインGセファロースを用いることがある。
遠心分離後、上清画分に1 μgの抗GATA3抗体（例A）あるいは抗His抗体（例B）を加えて、4℃で12時間から一晩インキュベートし、解析対象であるタンパク質とその特異抗体を結合する。
プロテインAセファロース50 μlを添加後、4℃で1時間インキュベートする。
【００２８】
遠心分離後、上清画分を捨て、沈澱を500 μlの低塩濃度緩衝液（20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA）中で洗浄する。
遠心分離を行い、上清画分を廃棄した後、沈澱を500 μlの高塩濃度緩衝液（20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA）中で洗浄する。
遠心分離を行い、上清画分を捨て、沈澱を500 μlの塩化リチウム緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.25 M 塩化リチウム, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA）中で洗浄する。遠心分離を行い、上清を廃棄する。
【００２９】
沈澱を、500 μlのTE緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 mM EDTA）中で洗浄する。この操作をもう１度繰返す。
沈澱に、40 μlのイオン交換水、各2 μlの制限酵素（Alu IおよびHae III）および制限酵素に対する緩衝液（5 μl）を加えて、37℃で12時間から一晩インキュベートし、ゲノム断片を短小化する。
制限酵素を各1 μl追加し、37℃で1時間インキュベートする。この操作は省略可能である。
【００３０】
遠心分離による上清の廃棄後、GATA3と抗体の複合体に結合していない領域のゲノム断片を除去する。
沈澱を100 μlの溶出緩衝液（10 mM DTT, 1% SDS, 0.1% NaHCO3）に浮遊させ、15分間室温でインキュベートする。
溶液を新しいチューブに移し、4 μlの5 M NaClを加えて、65℃で6時間から一晩インキュベートし、ゲノム断片とGATA3-抗体-プロテインAセファロース複合体を解離する。
RNase A（1 μl）を加えて、37℃で1時間インキュベートし、試料中のRNAの混入を避ける。
プロテイナーゼKを1 μl加えて、45℃で1時間インキュベートし、試料中に含まれるタンパク質を消化する。
【００３１】
試料中に遊離しているゲノム断片を単離は、MinElute Reaction Cleanup Kit（Quiagen）を使用して行う。方法の詳細は製品のプロトコールに従って行う。同一の目的で、他社の製品を使用することも可能であり、フェノールクロロホルム抽出法などの製品を使用しないで行うことも可能である。
【００３２】
抽出したGATA3結合ゲノム断片に制限酵素（BamH I）で切断されうるリンカーDNAを1 ngとDNAリガーゼ加えて、16℃で12時間から一晩インキュベートし、ゲノム断片の両端にリンカーDNAを結合する。
BamH I（2 μl）、BamH I緩衝液（3 μl）およびイオン交換水を加えて計30 μlとし、30℃で12時間から一晩インキュベートし、リンカーDNAおよび／あるいはゲノム断片中に内在するBamH I感受性配列を切断する。
60℃で1時間インキュベートしBamH Iを不活性化する。
【００３３】
MinElute Reaction Cleanup Kitを用いてBamH I切断々片を抽出し、DNAリガーゼを加えて16℃で12時間から一晩インキュベートを行い、断片間をライゲーションする。BamH I切断々片抽出法の詳細は製品のプロトコールに従って行う。同一の目的で、他社の製品を使用することも可能であり、フェノールクロロホルム抽出法などの製品を使用しないで行うことも可能である。
BamH Iで切断し脱リン酸化処理した0.5 μgのpBlueScript IIプラスミドとDNAリガーゼを添加後、16℃で2時間から一晩インキュベートし、BamH I切断部位で繋がったゲノム断片をpBlueScript IIにクローニングする。ベクターの脱リン酸化処理の有無は問わない。
【００３４】
大腸菌に形質転換後、アンピシリン、X-galおよびIPTG含有寒天培地に播種し、独立した大腸菌コロニーが得られるまで、37℃で培養する。寒天培地に添加する抗生剤および化学物質の種類および有無は問わない。
寒天培地上で得られた白色コロニーを鋳型として、pBlueScript IIに対するプライマーを用いたPCRを行い、クローニングされたGATA3結合ゲノム断片の有無および長さを確認する（図2）。
【００３５】
ゲノム断片の存在が確認された大腸菌コロニーに関して、プラスミドを単離精製し、挿入されているゲノム断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定する。
BamH I切断部位に挟まれた塩基配列を一つのGATA3結合配列とし、ゲノムデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html等）等で染色体内におけるGATA3結合領域を同定する。
内在性のGATA3に対して158個のコロニーを検索し、175個のGATA3結合ゲノム領域を同定した（例A）。His tagを付加したGATA3 cDNAを導入した細胞から得られた70個のコロニーを検索し、91個のGATA3結合ゲノム領域を同定した（例B）（図3）。
【００３６】
図4に、例Aで同定された領域に内在あるいは近接する遺伝子を列記する。
図5に、例Bで同定された領域に内在あるいは近接する遺伝子を列記する。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によると、細胞内でゲノム上に結合している転写因子および／あるいは転写共役因子の標的遺伝子を、高額な解析機器を必要とすることなく簡便かつ短時間に同定することができ、遺伝子の転写調節機構に関連する研究に限らず、疾患の診断・治療薬開発に向けたデータの収集等に活用でき、用途が広く産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明によるSChIP法の概要を示す流れ図
【図２】SChIP法によりpBlueScript IIにクローニングしたGATA3結合ゲノム断片長を、PCRにより確認したことを示す写真図（例A）。ここで、左端はDNAの分子量マーカー（1 kbラダー）を示す。
【図３】例Aおよび例Bで得られた大腸菌コロニー数、同定ゲノム領域および平均ゲノム断片長を示す表。
【図４】例Aにより同定されたGATA3結合ゲノム部位に近接する遺伝子あるいはクローン番号を示す表。代表例として30例を示す。
【図５】例Bにより同定されたGATA3結合ゲノム部位に近接する遺伝子あるいはクローン番号を示す表。代表例として30例を示す。
【図１】
2006211979.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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