(57)【要約】【課題】ABCトランスポーターの発現を抑制することによって抗癌剤耐性を克服する薬剤、当該薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞、及び抗癌剤耐性を獲得した癌に対しても有効な抗癌剤を提供すること。【解決手段】0.001〜100nMのステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物及びこれらの拮抗阻害剤から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.001〜100nMのステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物及びこれらの拮抗阻害剤から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項２】
ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物及びこれらの拮抗阻害剤から選ばれる１種又は２種以上が、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、ノルテストステロン、フラボノイド及びこれらの類縁化合物から選ばれる請求項１記載のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項３】
ABCトランスポーターを発現する細胞が、癌細胞である請求項１又は２記載のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項４】
癌細胞が、女性ホルモン受容体を発現する癌細胞である請求項３記載のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項５】
癌細胞が、乳癌細胞である請求項３記載のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤と、抗癌剤を含有する抗癌用組成物。
【請求項７】
抗癌剤が、カンプトテシン類、アンスラキノン類、スタウロスポリン類、アンスラサイクリン類、ビンカアルカロイド類、タキサン類、エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ及びイマニチブから選ばれる１種又は２種以上である請求項６記載の抗癌用組成物。
【請求項８】
癌が、乳癌である請求項６又は７記載の抗癌用組成物。
【請求項９】
BCRPを高発現する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌MCF-7細胞。
【請求項１０】
BCRPを高発現する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌T-47D細胞。
【請求項１１】
P-糖蛋白質を高発現するビンクリスチン耐性乳癌MCF-7細胞。
【請求項１２】
P-糖蛋白質を高発現するビンクリスチン耐性乳癌T-47D細胞。
【請求項１３】
請求項９〜１２記載の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌細胞又はビンクリスチン耐性乳癌細胞の、BCRP又はP-糖蛋白質の発現量を指標とするABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌剤耐性を獲得した癌に対して有効な抗癌剤及び当該抗癌剤の開発に有用な細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩酸イリノテカン等のカンプトテシン類、ミトキサントロン等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられているが、長期連用により抗癌効果が低下する場合のあることが指摘されている。癌細胞による、これらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては最近研究されており、ABCトランスポーターの一つであるBCRPが、これらの抗癌剤耐性獲得に関与していることが知られている（非特許文献１）。すなわち、抗癌剤が長期連用されると癌細胞内にBCRPが発現し、当該BCRPは抗癌剤を細胞外へ排出することにより抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。尚、MDR1遺伝子にコードされるP-糖蛋白質も抗癌剤耐性獲得に関与するABCトランスポーターとして知られている（非特許文献２）。P-糖蛋白質は２つのATP結合カセットを有し、BCRPとは基質特異性が異なる。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(26), 15665-15670(1998).
【非特許文献２】Methods in Enzymology,292:248-594(1998).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ABCトランスポーターの発現、あるいは発現の増大により抗癌剤耐性を獲得するに至った癌細胞系で、ABCトランスポーターの発現を抑制する低分子化合物は今までに見出されておらず、良好な実験系が存在しないことから、ABCトランスポーターの発現を抑制することにより抗癌剤耐性を克服するための手段の開発ができなかった。
従って本発明の目的は、ABCトランスポーターの発現を抑制することによって抗癌剤耐性を克服する薬剤、ABCトランスポーターの発現を抑制することによって抗癌剤耐性を克服する薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞、及び抗癌剤耐性を獲得した癌に対しても有効な抗癌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、もともとABCトランスポーター、特にBCRPを高発現している癌細胞を用いて、BCRP発現を抑制する化合物を見出す目的で種々の物質についてスクリーニングしたところ、ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物又はこれらの拮抗阻害剤が、非常に低濃度で、女性ホルモン受容体を有するMCF-7細胞のBCRP発現を低下させることを見出した。
また、本発明者は、女性ホルモン受容体を有する乳癌細胞であるMCF-7、T-47D細胞等を用いてBCRP遺伝子の導入について検討したところ、外来性BCRP遺伝子を保有し、抗癌剤耐性を獲得した乳癌細胞の樹立に成功した。また、MCF-7、T-47D細胞等を用いてP-糖蛋白質遺伝子の導入について検討した結果、外来性P-糖蛋白質遺伝子を保有し、抗癌剤耐性を獲得した乳癌細胞の樹立に成功した。
更に、低濃度のステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物又はこれらの拮抗阻害剤が、当該乳癌細胞のBCRP又はP-糖蛋白質の発現を低下させ、その結果抗癌剤耐性を克服させる効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、0.001〜100nMのステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物、これらの類縁化合物及びこれらの拮抗阻害剤から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤を提供するものである。
また本発明は、上記ABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤と、抗癌剤を含有する抗癌用組成物を提供するものである。
また本発明は、BCRPを高発現する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌MCF-7細胞；BCRPを高発現する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌T-47D細胞；P-糖蛋白質を高発現するビンクリスチン耐性乳癌MCF-7細胞；及びP-糖蛋白質を高発現するビンクリスチン耐性乳癌T-47D細胞を提供するものである。
更に本発明は、上記7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)耐性乳癌細胞又はビンクリスチン耐性乳癌細胞の、BCRP又はP-糖蛋白質の発現量を指標とするABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ABCトランスポーター、特にBCRP又はP-糖蛋白質の発現により充分に薬効の発現できなくなった抗癌剤の効果を回復できることから、抗癌剤の投薬量の管理が容易となり、その結果副作用を抑制した癌化学療法が可能となる。
また、BCRP又はP-糖蛋白質の発現を抑制する化合物の検索、及びその作用機構を解明するための有用な薬剤開発系を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、代表的なABCトランスポーターであるBCRPを中心に説明する。
まず、もともとBCRPを高発現しているMCF-7（乳癌）、A549（肺腺癌）、JEG-3（胎盤絨毛性癌）の各細胞にステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物等を添加すると、後記実施例１に示すように、女性ホルモン受容体を発現しているMCF-7細胞のみにおいてBCRPの発現量が著明に減少した。
【０００８】
次に、外来性BCRP遺伝子を有する癌細胞について説明する。
癌細胞に導入すべきBCRP遺伝子は、DDBJのaccession number AB056867に登録されており、Doyle, L.A., Yang, W., Abruzzo, L. V., Krogmann, T., Gao, Y., Rishi, A.K. and Ross, D. D. Amultidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(26), 15665-15670(1998)などに記載されている。当該BCRP遺伝子としては、BCRPを発現し得るものであればよく、例えばレトロウイルスベクターに挿入したプラスミド、pHaBCRP、pHa-BCRP-IRES-DHFR等として用いることができる。より具体的には、Mycエピトープを付したBCRPをレトロウイルスベクターに挿入したプラスミドが特に好ましい。
【０００９】
癌としては、女性ホルモン受容体を発現していること、培養が容易であること、BCRPによって輸送される抗癌剤に感受性を示すことなどから、MCF-7、T-47D細胞等が好ましい。
【００１０】
癌細胞への外来性のBCRP遺伝子の導入手段としては、BCRP遺伝子を導入したレトロウイルス等を用いれば常法に従い容易に行うことができる。
かくして得られた外来性BCRP遺伝子を有する癌細胞は、BCRPを発現し、抗癌剤の細胞内への取り込みを低下させることにより、抗癌剤耐性を獲得しており、ABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤のスクリーニング用細胞として有用である。特にレトロウイルスを用いて遺伝子導入されたBCRP発現乳癌細胞では、親株と比べてMDR1、MRPなどの他の抗癌剤耐性遺伝子の変化がないこと、及び取り扱い性が良好であることから、BCRPによる抗癌剤耐性克服の研究に優れている。当該細胞は、直接in vitroでスクリーニングに用いてもよいが、マウス等の動物に移植することにより、in vivoのスクリーニングに用いることもできる。
【００１１】
当該細胞を用い、ステロイドホルモン、女性ホルモン作用を有する化合物等を、外来性BCRP遺伝子を有するMCF-7細胞又はT-47D細胞に添加した結果、後記実施例２に示すように、BCRPの発現量が著明に減少し、抗癌剤への感受性、すなわち抗癌剤による癌細胞増殖抑制効果が回復することが判明した。従って、これらの薬物は癌細胞のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤として有用である。
【００１２】
ここで、ステロイドホルモン、女性ホルモン、これらの類縁化合物及びこれらの拮抗阻害剤としては、女性ホルモン及びその類縁化合物が好ましい。具体的には、エストロン、エストラジオール、エストラジオールベンゾエート、エストラジオールジプロピオネート、エストラジオールバレレート、エチニルエストラジオール、エストリオール、エストリオールアセテートベンゾエート、エストリオールトリプロピオネート、結合型エストロゲン、メストラノール、ジエチルスチルベストロール、ジエチルスチルベストロールジプロピオネート、ホスフェストロル、リン酸エストラムスチンナトリウム等の卵胞ホルモンとその類縁体；プロゲステロン、プレグネロン、プレグナンジオール、ジドロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、クロルマジノンアセテート、アリルエストレノール、ゲストノロンカプロエート等の黄体ホルモンとその類縁体；ノルエチステロン、アリルステロール等のノルテストステロン類；ゲニスタイン、ナリンゲニン等のフラボノイドが挙げられる。
【００１３】
本発明のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤中の上記女性ホルモン及びその類縁化合物の含有量は、0.001〜100nMであり、0.01〜10nMが好ましい。
【００１４】
また、ABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤の対象となる抗癌剤としては、BCRP又はP-糖蛋白質により耐性を生じる抗癌剤であれば制限されないが、例えば、塩酸イリノテカン、トポテカン、トポテシン等のカンプトテシン類；ミトキサントロン等のアンスラキノン類；7-ヒドロキシスタウロスポリン等のスタウロスポリン類；塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン、アドリアマイシン等のアンスラサイクリン類；ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類；パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類；エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ、イマニチブが挙げられる。
【００１５】
また、本発明のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤の対象癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されないが、ホルモン受容体を発現する癌細胞、特に女性ホルモン受容体を発現する癌細胞が好ましい。
【００１６】
本発明の（Ａ）ABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物は新たな抗癌剤として有用である。
【００１７】
本発明のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤又は新たな抗癌剤は、これらの成分が従来用いられている製剤をそのまま併用することにより投与してもよいが、これらの成分を含む新たな製剤としてもよい。これらの製剤の形態としては、経口剤、注射剤（筋肉、皮下、静脈を含む）、坐剤、外用剤（パッチ剤、塗布剤）等が挙げられる。
【００１８】
本発明のABCトランスポーター蛋白質発現抑制剤の投与量は、投与法、症状等により異なるが、１日あたり0.1〜10mgが好ましい。また、（Ｂ）癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤の投与量は、通常の薬効量でよく、例えば、１mg〜１g、特に２〜300mgが好ましい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１（内因性BCRPの発現抑制）
もともとBCRPを高発現しているMCF-7、A549、JEG-3細胞のBCRP発現量に及ぼすステロイドホルモン、女性ホルモンの効果をウエスタンブロットで調べた。活性炭処理してステロイドを除いたウシ胎児血清を７％添加したフェノールレッドフリーのDMEM培地にエステロン又はエストラジオールを添加して４日間培養し、BCRP発現量を抗BCRP抗体を用いたウエスタンブロットで調べた。各レーンには各々30μgの蛋白質を電気泳動した。
エステロン又はエストラジオールの存在下でMCF-7細胞での内因性BCRP発現量はコントロールの10〜20％に減少したが、他の細胞では変化は見られなかった（図１）。
【００２１】
実施例２
（１）BCRP遺伝子
本発明では、PCR法を用いてヒト胎盤mRNAより単離したヒトBCRP cDNAを用いた。このPCRでは、Clontech社のHuman placenta Marathon-ready cDNAを鋳型とし、プライマーとしてヒトBCRP  cDNAの５’側のプライマー1S（CCT GAG ATC CTG AGC CTT TGG TT）（配列番号１）及び３’側のプライマー5AS（GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号２）の２本のオリゴヌクレオチドを用いて、Clontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、94℃で１分の反応を１回行った後、94℃で30秒、68℃で３分の反応を35回繰り返し、最後に94℃で30秒、68℃で15分の反応を１回行い、約2150bpの増幅されたcDNAを得た。これをPCR2.1プラスミドにサブクローニングして、Applied Biosystems社のABI PRISM377 DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。独立な４クローンの塩基配列を決定し、PCRによる変異と推定される部分は除いて、本遺伝子のコード領域の塩基配列（配列番号３）とそれから予想されるアミノ酸配列（配列番号４）を推定した。本発明では、この配列を野生型BCRPの配列とする。本発明のBCRPの配列はDDBJ accession number AB056867として登録され、特開平2003-63989号公報に記載されている。
【００２２】
（２）BCRP発現プラスミドの作成
次に、このBCRP cDNAにMycエピトープを付けてレトロウイルスベクターに挿入するために、末端の修飾を目的とした２度目のPCRを行った。Mycエピトープタグを付加するためのPCRでは、上記のPCR反応で得られたヒトBCRP cDNAを鋳型とし、Mycエピトープタグを含む５’側のプライマー5Myc-204Ｓ（CCC CGC GGC ATG GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号５）及び３’側のプライマー8AS（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。PCRはClontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、94℃で１分の反応を１回行った後、94℃で30秒、68℃で３分の反応を20回繰り返し、最後に94℃で30秒、68℃で15分の反応を１回行い、約2200bpの増幅されたcDNAを得た。増幅されたcDNAをサブクローニングして塩基配列を決定し、PCRによる変異が起きていないことを確認した。HAエピトープタグを付加するためのPCRでは、上記のPCR反応で得られたヒトBCRP cDNAを鋳型とし、HAエピトープタグを含む５’側のプライマー5HA-204S（CCC CGC GGC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT ATG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号７）及び３’側のプライマー8AS（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。PCRはClontech社のAdvantage cDNA PCRキットを用いて、94℃で１分の反応を１回行った後、94℃で30秒、68℃で３分の反応を20回繰り返し、最後に94℃で30秒、68℃で15分の反応を1回行い、約2200bpの増幅されたcDNAを得た。増幅されたcDNAをサブクローニングして塩基配列を決定し、PCRによる変異が起きていないことを確認した。
これらのcDNAの両末端をSstIIとXhoIの２種の制限酵素で切断後、SstIIとXhoIで切断したpHaプラスミドベクターとT4 DNAリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をE.coli DH5alpHaに導入し、pHaプラスミドベクターのSstIIサイトとXhoIサイトの間にBCRP cDNAが挿入されたクローンpHaMycBCRP及びpHaHABCRPを得た。
【００２３】
（３）BCRPレトロウイルスの作成
最初に、マウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるPA317細胞にリン酸カルシウム法を用いてpHaMycBCRP及びpHaHABCRPを導入した。遺伝子導入後の細胞を１ng／mLのミトキサントロンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞の培養上清を集めて0.45μmのフィルターで濾過してレトロウイルス液とした。
【００２４】
（４）MCF-7／MycBCRP細胞の作成
MycBCRPレトロウイルス液をヒト乳癌MCF-7細胞の培養に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を20ng／mLのSN-38（7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン：塩酸イリノテカンの活性体）で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をMCF-7／MycBCRPと名付けた。MCF-7細胞及びMCF-7／MycBCRP細胞は７％のウシ胎児血清を添加したDMEM培地で培養した。MCF-7／MycBCRP細胞にBCRP蛋白が発現していることは、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した（図２）。各レーンには各々20μgの蛋白質を電気泳動した。MCF-7細胞はヒトの乳癌細胞であるが、もともと女性ホルモン受容体を発現していること、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのBCRPによって輸送される抗癌剤に感受性を示すことから、BCRP遺伝子導入細胞の親株として適している。また、MCF-7細胞及びMCF-7／MycBCRP細胞を免疫不全マウスに移植してBCRP阻害剤などの動物実験が可能である。
【００２５】
（５）T-47D／MycBCRP細胞の作成
MycBCRPレトロウイルス液をヒト乳癌T-47D細胞の培養に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を10ng／mLのSN-38で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をT-47D／MycBCRP細胞と名付けた。T-47D細胞及びT-47D／MycBCRP細胞は７％のウシ胎児血清を添加したDMEM培地で培養した。T-47D／MycBCRP細胞にBCRP蛋白が発現していることは、抗BCRP抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した（図２）。T-47D細胞はヒトの乳癌細胞であるが、もともとBCRPを発現していないこと、女性ホルモン受容体を発現していること、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのBCRPによって輸送される抗癌剤に感受性を示すことから、BCRP遺伝子導入細胞の親株として適している。
【００２６】
実施例３（外因性BCRPの発現抑制）
MCF-7／MycBCRP細胞、T-47D／MycBCRP細胞のBCRP発現量をウエスタンブロットで調べた。７％の活性炭処理してステロイドを除いたウシ胎児血清を添加したフェノールレッドフリーのDMEM培地にエストラジオールを添加して４日間培養し、BCRP発現量を抗Myc抗体を用いたウエスタンブロットで調べた（図２）。
エストラジオール存在下でMCF-7／MycBCRP細胞、T-47D／MycBCRP細胞での外因性BCRP発現量はコントロールの10〜20％に減少した（図２）。
【００２７】
実施例４（細胞増殖阻害試験）
MCF-7細胞とMCF-7／MycBCRP細胞のSN-38に対する感受性を細胞増殖阻害試験にて調べた。両細胞を12穴プレート（イワキ）に３万個／１mL／ウエルでまき、続いてmediumで各濃度に希釈した薬剤をウエルあたり１mL加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で37℃、５日間培養した。４日後、9.5mLのセルパック希釈液（東亞医用電子）を入れたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Sysmex CDA-500自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。図３では、各濃度の薬剤添加時における細胞数を薬剤無添加の細胞数で除し、（％of control）で表した。MCF-7／MycBCRP細胞はSN-38に約３〜４倍の耐性を示した（図３）。
【００２８】
実施例５（エストラジオールによるBCRPの耐性克服）
エストラジオールによるMCF-7細胞とMCF-7／MycBCRP細胞のSN-38及びビンクリスチンに対する感受性の変化を細胞増殖阻害試験にて調べた。両細胞を12穴プレート（イワキ）に３万個／１mL／ウエルでまき、続いてmediumで各濃度に希釈した薬剤をウエルあたり１mL加えた。エストラジオール最終濃度は0.03 nM又は3 nMとなるように調整した。このプレートを５％炭酸ガス培養器で37℃、４日間培養した。４日後、9.5mLのセルパック希釈液（東亞医用電子）を入れたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Sysmex CDA-500自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。図４では、各濃度の薬剤添加時における細胞数を薬剤無添加の細胞数で除し、（％of control）で表した。
MCF-7細胞は、エストラジオール濃度0.03 nMと3 nMとでSN-38とビンクリスチンの感受性にほとんど差がなかったが、MCF-7／MycBCRP細胞では、エストラジオール濃度3 nMで0.03 nMと比べてSN-38に約２倍の感受性増加を示した（図４）。表１に、エストラジオール添加によるSN-38又はビンクリスチンに対する感受性の変化を、細胞増殖を50％阻害する濃度で表した。
【００２９】
【表１】
2006069910.tif 000002
【００３０】
実施例６（外因性P-糖蛋白質の発現抑制）
（１）MDR1遺伝子
P-糖蛋白質は、抗癌剤耐性に関するABCトランスポーターとして最初に同定された。P-糖蛋白質の遺伝子であるMDR1遺伝子のヒトの全長cDNAの配列は米国の研究グループにより既に報告されている。
MDR1と名付けられた遺伝子はGenBankのaccession number M14758に登録されており、Chen, C., J., et al., Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells.Cell 47:381-389 (1986)などに発表されている。
しかしながら、このMDR1 cDNAの配列は突然変異剤ethylmethane sulfonateで処理したコルヒチン耐性癌細胞より得られたものであり、日本人に最も多いタイプのMDR1遺伝子（いわゆる野生型）と比べて、C540T、G554T、A555T、T1236Cの違いがある。なお、この場合、野生型MDR1遺伝子の塩基配列が数字の左側に記載されている。これらの塩基配列の違いのうち、C540Tは180番目のセリンをコードするコドンにあり、多型によるアミノ酸の変化を生じない遺伝子多型である。また、T1236Cは412番目のグリシンをコードするコドンにあり、多型によるアミノ酸の変化を生じない遺伝子多型である。G554TとA555Tは野生型のMDR1遺伝子の185番目のグリシンをコードするCCAがGTTとなり、バリンに変異する。これはこの癌細胞が突然変異剤で処理された後に起きた変異であり、人為的な突然変異と考えられている。
本発明でヒト野生型MDR1 cDNAと呼ぶ遺伝子は、ヒトの副腎のcDNAライブラリーより単離されたものである。Kioka, N., et al. P-glycoprotein gene (MDR1) cDNA from humanadrenal: Normal P-glycoprotein carries Gly185 with an altered pattern of multidrug resistance. Biochem Biophys Res Commun 162: 224-231(1989)に記載されている。
【００３１】
（２）MDR1発現プラスミド
本発明に用いた野性型MDR1発現レトロウイルスベクタープラスミドpHaMDRは、Sigimoto,Y., Aksentijevich,I., Gottesman,M.M., and Pastan,I. Efficient expression of drug-selectable genes in retroviral vectors under control of an internal ribosome entry site. Nature Biotechnology 12: 694-698(1994)に記載されている。
【００３２】
（３）MDR1レトロウイルスの作成
本発明に用いた野性型MDR1発現レトロウイルスHaMDRのレトロウイルス液は、pHaMDRプラスミドをマウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるPA317細胞にリン酸カルシウム法を用いて導入したのちに35ng/mlのビンクリスチンで選択し、さらに得られたビンクリスチン耐性細胞を限界希釈法でクローニングすることによって得られたレトロウイルス産生細胞3P26の培養上清を用いた。3P26細胞については、Suzuki,M., Sigimoto,Y., Tsukahara,S., Okuchi,E., Gottesman.M.M., and Tsuruo,T. Retroviral co-expression of two different types of drug-resistant genes for the chemoprotection of normal cells from combinaton chemotherapy., Clin.Cancer Res.,3: 947-954(1997)に記載されている。
3P26細胞の培養上清を集めて、これを0.45マイクロメーターのフィルターでろ過してレトロウイルス液とした。
【００３３】
（４）MCF-7／MDR1細胞の作成
HaMDRレトロウイルス液をヒト乳癌細胞MCF-7の培養に加えることにより遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を６ng/mlのビンクリスチンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をMCF-7/MDR1と名付けた。
【００３４】
（５）外因性P-糖蛋白質の発現抑制
MCF-7/MDR1細胞における外因性P-糖蛋白質の発現と、エストラジオールが発現に及ぼす効果をウエスタンブロットで調べた。MCF-7細胞及びMCF-7/MDR1細胞を７％の活性炭処理してステロイドを除いたウシ胎児血清を添加したフェノールレッドフリーのDMEM培地にそれぞれディッシュ２枚培養し、そのうちそれぞれ１枚のディッシュには最終濃度が３nMとなるようにエストラジオールを添加して４日間培養した。それぞれの細胞のP-糖蛋白質発現量を抗P-糖蛋白質抗体C219を用いて調べた（図５）。MCF-7細胞はP-糖蛋白質を発現していなかったが、MCF-7/MDR1細胞は外因性のP-糖蛋白質を強く発現していた。エストラジオールの存在下でMCF-7／MDR1細胞の外因性P-糖蛋白質発現量はコントロールの約20％に減少した（図５）。
【００３５】
以上より、これらのステロイドホルモン、女性ホルモン又は抗ホルモン剤は、非常に低濃度でBCRP又はP-糖蛋白質の発現を低下させ、BCRP又はP-糖蛋白質による抗癌剤耐性を克服することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エストロン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロールによる内因性BCRP発現の抑制を示す図である。
【図２】エストラジオールによる外因性BCRP発現の抑制を示す図である。
【図３】MCF-7細胞、MCF-7／MycBCRP細胞のSN-38による細胞増殖阻害試験の結果を示す図である。
【図４】MCF-7細胞、MCF-7／MycBCRP細胞のエストラジオール存在下でのSN-38、ビンクリスチンによる細胞増殖阻害試験の結果を示す。
【図５】エストラジオールによるP-糖蛋白質発現の抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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