(57)【要約】【課題】  酸化分解反応を含むポストカラム法を用いた測定において、アミノメチルりん酸とグリホサートを共に高感度に測定する。【解決手段】  移動相を送液する第１の送液ポンプと、移動相に試料を導入するインジェクタと、試料を分離する分離カラムと、第１の反応試薬を送液する第２の送液ポンプと、第２の反応試薬を送液する第３の送液ポンプと、前記分離カラムから溶出された試料に前記第１の反応試薬を混合する第１の混合部と、前記第１の混合部を経た溶液に前記第２の反応試薬を混合する第２の混合部と、当該第２の混合部を経た溶液を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、前記第２の送液ポンプは、少なくともアミノメチルりん酸が前記第１の混合部を通過した後に、前記第１の反応試薬を送液する。【効果】  アミノメチルりん酸とグリホサートを同時に高感度に検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相を送液する第１の送液ポンプと、移動相に試料を導入するインジェクタと、試料を分離する分離カラムと、第１の反応試薬を送液する第２の送液ポンプと、第２の反応試薬を送液する第３の送液ポンプと、前記分離カラムから溶出された試料に前記第１の反応試薬を混合する第１の混合部と、前記第１の混合部を経た溶液に前記第２の反応試薬を混合する第２の混合部と、当該第２の混合部を経た溶液を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、
前記第２の送液ポンプは、少なくともアミノメチルりん酸が前記第１の混合部を通過した後に、前記第１の反応試薬を送液することを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１の反応試薬は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含むアルカリ性緩衝液と次亜塩素酸ナトリウム溶液（ＮａＣｌＯ）の混合液であり、前記第２の反応試薬は、オルトフタルアルデヒドを含むホウ酸緩衝液であることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項３】
移動相を送液する第１の送液ポンプと、移動相に試料を導入するインジェクタと、試料を分離する分離カラムと、第１の反応試薬および第２の反応試薬を送液する第２の送液ポンプと、第３の反応試薬を送液する第３の送液ポンプと、前記分離カラムから溶出された試料に前記第１または第２の反応試薬を混合する第１の混合部と、前記第１の混合部を経た溶液に前記第３の反応試薬を混合する第２の混合部と、当該第２の混合部を経た溶液を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、
前記第２の送液ポンプは、少なくともアミノメチルりん酸が前記第１の混合部を通過した後に、前記第１の反応試薬から第２の反応試薬へ送液を切替えることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項４】
請求項３において、
前記第１の反応試薬は、次亜塩素酸ナトリウム溶液（ＮａＣｌＯ）を含まず、前記第２の反応試薬は、次亜塩素酸ナトリウム溶液（ＮａＣｌＯ）を含むものであることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリホサートおよびアミノメチルりん酸の測定に適した液体クロマトグラフに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水道水中の農薬の高感度分析の要求が高まっている。グリホサートは、除草剤として広く使用され、その分解物はアミノメチルりん酸として存在する。水質基準では、グリホサートとアミノメチルりん酸の合計値で判定し、μｇ／Ｌレベルの高感度分析が求められている。分析手法の一つとして、ポストカラム法を用いて液体クロマトグラフで測定する例がある。このような例としては、下記非特許文献１が挙げられる。
【０００３】
この装置においては、移動相に試料を注入して分離カラムで分離した後、反応試薬を混合して反応させ、その後検出器で検出を行う。
【０００４】
【非特許文献１】厚生労働省健康局水道課長通知，平成１５年１０月１０日  健水発第１０１０００１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
グリホサートを測定するためにポストカラム法を用いる液体クロマトグラフでは、複数の反応試薬を使用する。具体的には、試料に第１の反応試薬を混合し、酸化分解を行って２級アミンから１級アミンに分解し、その後第２の反応試薬を混合して、生成した１級アミンの蛍光誘導体化反応を行う。第１の反応試薬には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含むアルカリ性緩衝液と次亜塩素酸ナトリウム溶液（ＮａＣｌＯ）の混合液を用い、第２の反応試薬には、アミノ基（−ＮＨ2 ）を有する化合物と特異的に反応するオルトフタルアルデヒドを含むホウ酸緩衝液を用いるのが一般的である。
【０００６】
上記の手法では、グリホサートは感度良く測定されるものの、アミノメチルりん酸に関しては高感度に測定することができなかった。
【０００７】
本発明の目的は、上記課題を解決し、グリホサートおよびアミノメチルりん酸の同時分析において、何れの成分も高感度に測定することのできる液体クロマトグラフを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明の特徴は、アミノメチルりん酸が溶出するまでは、酸化分解を行うための反応試薬を送液しないか、次亜塩素酸ナトリウム溶液を含まない反応試薬を送液することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アミノメチルりん酸およびグリホサートをそれぞれ最適条件で高感度に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、図面に基づいて本発明の実施例を説明する。
【００１１】
従来はグリホサートとアミノメチルりん酸を同時に感度良く得ることはできていなかった。本発明者らが検討した結果、酸化分解を行うための反応試薬に加えられている次亜塩素酸ナトリウム試薬が、グリホサートおよびアミノメチルりん酸の感度に影響を与えていることが分かった。
【００１２】
図２に、反応試薬に含まれる次亜塩素酸ナトリウム溶液添加量とグリホサートおよびアミノメチルりん酸の得られるピーク強度の関係を示す。横軸が反応試薬に含まれる次亜塩素酸ナトリウム溶液添加量、縦軸がグリホサートおよびアミノメチルりん酸を蛍光検出器を用いて得た信号強度である。次亜塩素酸ナトリウム溶液添加量が０の場合、アミノメチルりん酸の感度は、良好であるが、グリホサートの感度は低くなる。逆に、グリホサートに最適な次亜塩素酸ナトリウム溶液添加量に設定すると、アミノメチルりん酸の感度が低下してしまうことが図２より分かる。即ち、次亜塩素酸ナトリウムは、グリホサートを検出するためには、必要な成分であるが、アミノメチルりん酸に対しては、酸化分解を起こし、得られる信号強度が減少しピーク強度が低くなるものであることが判明した。
【００１３】
図１は、上記検討結果に基づく第１の実施例の概略構成図である。
【００１４】
２５mmol／Ｌのりん酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）からなる移動相を０.８ｍＬ／
min の流量で送液ポンプ１によって送液し、送液された移動相に対してインジェクタ２から試料を注入する。試料は、カラムを加熱あるいは冷却して温度を制御するカラムオーブン３内に設置された分離カラム４で分離される。分離後の試料に対して、三方ジョイント５，１３において、２種類の反応試薬が混合される。
【００１５】
送液ポンプ７は、反応試薬１０を０.４ｍＬ／minの流量で送液する。反応試薬１０は、０.０１mol／Ｌの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、０.０１mol／Ｌのりん酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０.２mol／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が混合された水溶液に、次亜塩素酸ナトリウム液（５％）を０.２ｍＬ／Ｌ 加えたものである。送液ポンプ８は、反応試薬１１を０.５ｍＬ／minの流量で送液する。反応試薬１１は、０.０５mol／Ｌの四ほう酸ナトリウム（Ｎａ2Ｂ4Ｏ7） 水溶液に、オルトフタルアルデヒドメタノール溶液を０.２ｇ／２.５ｍＬ、及び２−メルカプトエタノール０.５ｍＬ を加え１Ｌに調製したものである。反応試薬１０が混合された試料は、反応コイル６を介してカラムオーブン３内で反応し、さらに三方ジョイント１３において反応試薬１１と混合し、反応コイル１４を介してカラムオーブン３で反応し、蛍光検出器などの検出器９へ導かれ、クロマトグラムを得る。
【００１６】
本実施例の特徴は、反応試薬１０の送液を制御するようにした事にある。具体的には、分離カラム４からアミノメチルりん酸が溶出し、少なくとも三方ジョイント５を通過するまで送液ポンプ７を停止し、アミノメチルりん酸が三方ジョイント１３を通過した後に送液を開始するようにする。より安全には、溶出したアミノメチルりん酸が、三方ジョイント１３を通過するまで送液ポンプ７を停止し、その後送液を開始するようにする。
【００１７】
上記の移動相流量の場合、通常、アミノメチルりん酸は分析開始から５〜６分程度で溶出され、グリホサートは分析開始から１５〜１６分程度で溶出される。したがって、分析開始から１０分までの間、送液ポンプ７の流量を０ｍＬ／min とし、反応試薬１０を流さないことでアミノメチルりん酸の酸化分解を防ぎ高いピーク強度を得ることができる。
１０.１分から送液ポンプ７の流量を０.４ｍＬ／min で送液すれば、試料に対して酸化分解が行われ、グリホサートも問題なく検出できる。また、反応試薬１０を途中から送液することで、流量が変化し、ベースラインは変動するが、目的成分の定量には影響はない。また、１０.１ 分から反応試薬１０の送液を開始する分析プログラムは、溶出したアミノメチルりん酸が、三方ジョイント１３を通過した後に反応試薬１０の送液が開始されることになる。このような分析プログラムでは、反応試薬１０の送液開始タイミングが、アミノメチルりん酸が反応コイル６を通過した後であるので、アミノメチルりん酸に反応試薬
１０が混合される可能性が無くなり、より確実にアミノメチルりん酸の検出を行うことができる。
【００１８】
ここで、送液ポンプ７の流量を、分析開始から最後まで０.４ｍＬ／minで測定した場合と、上記の本実施例のように途中から流量切替えを行った場合の測定結果を図４に示す。図４中の一番下のクロマトグラムが分析開始から最後まで送液ポンプ７の流量を変えない場合のクロマトグラム、一番上のクロマトグラムが本実施例のクロマトグラムである。本来、ベースラインは同程度の信号強度であるが、ここでは便宜上、高さを変えて記載している。図４において、５〜６分の間にあるピークがアミノメチルりん酸、１５〜１６分の間にあるピークがグリホサートである。図４のクロマトグラムによれば、本実施例を用いて分析を行った場合、アミノメチルりん酸のピーク強度は、従来行われていたように常に反応試薬１０を送液していた場合と比較し、約１５倍高い強度が得られ、グリホサートのピーク強度は、同等の感度が得られていることが分かる。
【００１９】
尚、上記の例において、反応試薬１０の送液開始時期は、アミノメチルりん酸とグリホサートの溶出時期の中間辺りとなるように、予めプログラムするものであるが、検出器９でアミノメチルりん酸のピークが検出された事を確認した後に、送液ポンプ７が反応試薬１０の送液を開始するように、フィードバック制御を行っても良い。
【００２０】
図３に、第２の実施例を示す。図１と基本的な構成は同じであるが、送液ポンプ７に、低圧グラジエントユニット機能を装備し、反応試薬１０と反応試薬１２の２つの反応試薬を切替えて送液するようにする。
【００２１】
反応試薬１０は、第１の実施例の反応試薬１０と同じ組成の試薬である。反応試薬１２は、０.０１mol／Ｌの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ），０.０１mol／Ｌのりん酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4），０.２mol／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を混合した水溶液である。即ち、反応試薬１０は次亜塩素酸ナトリウム液を含む試薬であり、反応試薬１２は次亜塩素酸ナトリウム液を含まない試薬である。
【００２２】
本実施例においては、分離カラム４からアミノメチルりん酸が溶出し、少なくとも三方ジョイント５を通過するまで送液ポンプ７は反応試薬１２を送液し、アミノメチルりん酸が三方ジョイント１３を通過した後に反応試薬１０に切替えて送液を続けるようにする。より安全には、溶出したアミノメチルりん酸が、三方ジョイント１３を通過するまで反応試薬１２を送液し、その後反応試薬１０の送液に切替えるようにする。
【００２３】
具体的には、分析開始から１０分までは、反応試薬１２を０.４ｍＬ／minで送液し、アミノメチルりん酸を検出し、１０.１分から反応試薬１０を０.４ｍＬ／min で送液しグリホサートを検出する。図４に、本実施例による測定結果を示す。中間にあるクロマトグラムが本実施例によるものである。本実施例においても、第１の実施例と同様にアミノメチルりん酸の強度は、従来のように反応試薬１０を常に送液している場合と比較し、約１５倍の高い強度が得られ、グリホサートのピーク強度は同等の強度を得られることが確認された。
【００２４】
また、１０.１ 分から反応試薬１０の送液を開始する分析プログラムは、本実施例においても、溶出したアミノメチルりん酸が、三方ジョイント１３を通過した後に反応試薬
１０の送液が開始されることになる。このような分析プログラムでは、反応試薬１０の送液開始タイミングが、アミノメチルりん酸が反応コイル６を通過した後であるので、アミノメチルりん酸に反応試薬１０が混合される可能性が無くなり、より確実にアミノメチルりん酸の検出を行うことができる。
【００２５】
尚、上記の例において、反応試薬１０と反応試薬１２の送液切替え時期は、アミノメチルりん酸とグリホサートの溶出時期の中間辺りとなるように、予めプログラムするものであるが、検出器９でアミノメチルりん酸のピークが検出された事を確認した後に、送液ポンプ７が反応試薬１２から反応試薬１０へ送液を切替えるように、フィードバック制御を行っても良い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１の実施例の概略構成図である。
【図２】反応試薬中の次亜塩素酸ナトリウム溶液の影響を示す図である。
【図３】第２の実施例概略構成図である。
【図４】従来方法，第１の実施例，第２の実施例で得られるクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００２７】
１，７，８…送液ポンプ、２…インジェクタ、３…カラムオーブン、４…分離カラム、５，１３…三方ジョイント、６，１４…反応コイル、９…検出器、１０，１１，１２…反応試薬。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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