(57)【要約】      （修正有）【課題】神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子欠失に基づく、脊髄性筋萎縮症の診断方法を提供すること。【解決手段】常染色体性劣性神経変性異常である脊髄性筋萎縮症遺伝子が第５染色体の領域にマッピングされていたことを見出した。この遺伝子はウイルスのアポトーシス抑制タンパクと相同性を有するタンパクをコードすることから、このコードされたタンパクは、神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)と指定された。脊髄性筋萎縮症の患者にはＮＡＩＰ領域に欠失が認められ、正常者には、そのような欠失は認められなかった。【選択図】図１
2006025797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子であって、約5.5kbからなるエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１１までの制限酵素地図が図８に示したとおりであるヒト遺伝子。
【請求項２】
染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子であって、約5.5kb からなるエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１６までの制限控訴地図が図９に示したとおりであるヒト遺伝子。
【請求項３】
エクソン５から１６までが、配列番号２のアミノ酸配列と生物学的、機能的に同等なアミノ酸配列を有するＮＡＩＰタンパクをコードする請求項１または２のヒト遺伝子。
【請求項４】
エクソン５から１６までが、配列番号１のcＤＮＡ配列と生物学的、機能的に同等なcＤＮＡ配列を有する請求項１または２のヒト遺伝子。
【請求項５】
配列番号１のcＤＮＡ配列に対応するゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、mＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたは相同ＤＮＡを含む精製ヌクレオチド配列。
【請求項６】
配列番号１のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項７】
配列番号２を有するＮＡＩＰタンパクをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項８】
実質的に配列番号１のＤＮＡ配列からなる精製ＤＮＡ配列。
【請求項９】
実質的に配列番号２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列からなる精製ＤＮＡ配列。
【請求項１０】
配列番号１の少なくとも１８連続塩基を含む精製ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
請求項１０のＤＮＡ配列を含むＤＮＡプローブ。
【請求項１２】
請求項１０のＤＮＡ配列を含むＰＣＲプライマー。
【請求項１３】
請求項１０のＤＮＡ配列を含むＤＮＡハイブリダイゼーション分子。
【請求項１４】
ＤＮＡ配列が、表４のエクソン１から４および１７から選択される、請求項１０、１１、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。
【請求項１５】
ＤＮＡ配列が、表４のエクソン１から１６から選択される請求項１０、１１、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。
【請求項１６】
表４のエクソン配列１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７からなるＤＮＡ配列群から選択された請求項１０、１１、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。
【請求項１７】
ＤＮＡ配列が、エクソン４、５、６および７から選択される請求項１６の精製ＤＮＡ配列。
【請求項１８】
ＤＮＡ配列が、エクソン５および６から選択される請求項１６の精製ＤＮＡ配列。
【請求項１９】
クローニングベクターまたは発現ベクターの作成における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＤＮＡ配列の使用。
【請求項２０】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のＤＮＡ配列にコードされているＮＡＩＰタンパク。
【請求項２１】
請求項１０のＤＮＡ配列の連続４５塩基にコードされているＮＡＩＰタンパクの１５アミノ酸断片。
【請求項２２】
配列番号２のアミノ酸配列と生物学的に同等のアミノ酸配列を含むＮＡＩＰタンパク。
【請求項２３】
実質的に、配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＡＩＰタンパク。
【請求項２４】
配列番号２の少なくとも１５連続アミノ酸を含むＮＡＩＰタンパク断片。
【請求項２５】
エクソン５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれか一つにコードされたポリペプチド群から選択されたアミノ酸配列を含むＮＡＩＰタンパク断片。
【請求項２６】
選択されたポリペプチドが、エクソン５、６、７、８、９、１０、１１または１２にコードされたポリペプチドである請求項２５のＮＡＩＰタンパク断片。
【請求項２７】
選択されたポリペプチドが、エクソン５および６にコードされたポリペプチドである請求項２５のＮＡＩＰタンパク断片。
【請求項２８】
ハイブリドーマの作成における、請求項２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６のアミノ酸配列の使用。
【請求項２９】
生物標本を分析してＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の有無を診断する方法であって、
i)  ヒト染色体5q13のＳＭＡ関連領域から生物標本を単離し、
ii) 生物学的測定を行い
a)  配列番号１のＮＡＩＰコードＤＮＡ;および
b)  配列番号２のＮＡＩＰタンパク
からなる群より選択された少なくとも一方が上記生物標本に存在するか否かを決定する方法。
【請求項３０】
ステップii)において、a)群またはb)群の配列の突然変異が測定される請求項２９のヒトＭＡＳ発症リスク診断方法。
【請求項３１】
a)群のエクソン５および６の有無が測定される請求項３０の方法。
【請求項３２】
ＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の第５染色体における正常コピー数さらに決定する請求項３１の方法。
【請求項３３】
生物学的測定が、ＤＮＡハイブリダイゼーション、制限酵素分析、ＰＣＲ増幅、mＲＮＡ検出およびＤＮＡ配列決定からなる群より選択される測定である請求項２９、３０、３１または３２の方法。
【請求項３４】
生物学的測定が、エクソン５の5'領域およびエクソン６の3'領域から選択されたＰＣＲプライマーの使用によるエクソン領域５および６のＰＣＲ増幅である請求項２９、３０、３１または３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
神経細胞アポトーシスの抑制タンパク(ＮＡＩＰ)の遺伝子が、第５染色体のq13領域に同定された。この遺伝子の突然変異がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症患者に認められた。この発明は、この神経細胞アポトーシス抑制タンパクのアミノ酸配列を提供し、ウイルス性アポトーシスタンパクとの相同性を証明する。
【背景技術】
【０００２】
この発明に係る様々な態様を説明する際に、種々の刊行誌の論文を容易に参照できるように、明細書の最後に参考文献一覧表を付した。また、これらの参考文献はその最初の著者名および出版年を明細書中に明記した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
小児期の脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡs)は、常染色体性劣性神経変性疾患のグループに含まれ、発症および臨床的進行に基づいて３タイプに分類される(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz et al.，1991)。これら３タイプはすベて、近位随意筋の弱化および摩滅として顕在化する脊髄α運動ニューロンの変性によって特徴づけられる。Ｉ型ＳＭＡは最も重篤なタイプであり、胎児期(in utero)または生後数カ月で発症する。発症児は座位保持が不可能で、呼吸が不十分なために胸部感染症を再発し易いため、生後数年間を生き延びることは滅多にない(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz et al.，1991)。保因頻度が1/60から1/80のこの急性疾患は、最も頻度が高い致命的常染色体性変性疾患の1つである。II型ＳＭＡ発症児は歩行には介助を必要とし、予後はさまざまであるが、青年期に死亡する場合がある。III型発症児は自力歩行を続けられるが、３才から17才までの時期に弱化し始め、症状が緩やかに進行していく(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz.，1991)。
【０００４】
1990年には、ＳＭＡのこれら３つの小児期形態がすべて第５染色体長腕の5q11.2-13.3に遺伝学的にマッピングされた(Ｂrustowitcz et al.，1990;Ｇilliam et al.，1990; Ｍelki et al.，1990)。その後、多点連鎖分析と組換え現象の同定を行ったところ、その遺伝子欠損はＤ5Ｓ435/Ｄ5Ｓ629によってセントロメア側に位置する領域に局在化され(Ｓoares et al.，1993; Ｗirth et al.，1993，Ｃlermont et al.，1991)、ＭＡＰ1Ｂ/Ｄ5Ｓ112によってテロメア側に位置する領域に局在化された(Ｗirth et al.，1994，ＭacＫenzie et al.，1993; Ｌien et al.，1991)。この区間は、さらに最近の組換え現象の同定によって明確になり、ＳＭＡ遺伝子がＣＭＳ-１の遠位に存在し(Ｙaraghi et al.，Ｈuman Ｇeneticsに投稿; van der Ｓteege et al.，Ｈuman Ｇeneticsに投稿)、Ｄ5Ｓ557の近位に存在する(Ｆrancis et al,，1993)ことが明らかにされた。我々やその他の研究者等は、クローンおよび単純縦列反復の単離ならびに順序付けを阻害するＤ5Ｓ629/ＣＭＳ-Ｄ5Ｓ557領域に特に豊富な第５染色体の特異反復配列を検出した(Ｆrancis et al.，1993; Ｔhompson et al.，1993)。この区間内では、200kbのＣＭＳ-１領域(Ｋleyn et al.，1993)/ＣＡＴＴ-１領域(Ｂurghes et al.，1994，ＭcＬean et al.，印刷中)/Ｄ5Ｆ150領域/Ｄ5Ｆ149領域/Ｄ5Ｆ153領域(Ｍelki et al.，1994)に及ぶコスミドクローン系列が構成されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、5q13.1のＳＭＡ含有Ｄ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112区間を含むＹＡＣクローンの連続系列を構築した。その後、我々は、5q13.1のこの区間に存在し、神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子を発見した。さらに研究を行った結果、この遺伝子の欠失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症に認められることが確認された。
【０００６】
発明の要約
神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子がヒト染色体の5q13領域で見出された。この発明の一つの態様によれば、神経細胞アポトーシス抑制タンパクのcＤＮＡ配列表４に開示されたとおりに提供される。この発明の別の態様によれば、このcＤＮＡ配列から予測される神経細胞アポトーシス抑制タンパクのアミノ酸配列が提供される。
【０００７】
この発明の別の態様によれば、神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子の欠失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症患者に認められた。この神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子欠失の発見によって、脊髄性筋萎縮症の診断に使用する診断指示薬が提供される。
【０００８】
以下、図面を参照してこの発明の様々な態様をさらに詳細に説明する。また、図面の簡単な説明はこの発明の要約の次に記載する。
この発明のさらに別の態様によれば、染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子が提供される。このヒト遺伝子は約5.5kbのエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１１までの制限地図は図８に示したとおりである。
【０００９】
この発明のさらに他の態様によれば、エクソン１から１７までは、図９Ｄに示すように、エクソン２から１６までの制限地図を有している。
【００１０】
この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子の場合、エクソン５から１６は配列番号２のアミノ酸配列と生物学的、機能的に同等のアミノ酸配列を有するＮＡＩＰタンパクをコードする。
【００１１】
この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子は配列番号１のcＤＮＡ配列に生物学的、機能的に同等のcＤＮＡ配列を含むエクソン５から１６を有する遺伝子である。
【００１２】
この発明の別の態様によれば、精製ヌクレオチド配列は配列番号１のcＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、mＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたは相同ＤＮＡを含むヌクレオチド配列である。
【００１３】
この発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子の配列は配列番号２を有するＮＡＩＰタンパクをコードする配列である。
【００１４】
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号１のＤＮＡ配列からなる配列である。
【００１５】
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列からなる配列である。
【００１６】
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は配列番号１の少なくとも連続１８塩基を含む配列である。ＤＮＡプローブ、ＰＣＲプライマー、ＤＮＡハイブリダイゼーション分子などが、少なくとも１８連続塩基からなる精製ＤＮＡ配列を用いて提供することができる。
【００１７】
この発明の別の態様によれば、上記態様のＤＮＡ配列はクローニングベクターまたは発現ベクターの構築に使用される。
【００１８】
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは上記のＤＮＡ配列によってコードされるタンパクである。
【００１９】
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは配列番号２のアミノ酸配列と生物学的に同等なアミノ酸配列を含むタンパクである。
【００２０】
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは実質的に配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパクである。
【００２１】
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクのフラグメントは配列番号２の少なくとも１５連続アミノ酸を含むフラグメントである。
【００２２】
この発明の別の態様によれば、上記アミノ酸配列はハイブリドーマの製造に使用される。
【００２３】
この発明の別の態様によれば、生物標本を分析してＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の有無を診断する方法が提供される。
【００２４】
この方法は、
i)  第５染色体のＳＭＡ含有領域q13由来の生物標本を単離し、
ii)  生物学的アッセイを行い、
a)  配列番号１のＮＡＩＰコードＤＮＡ;および
B)  配列番号２のＮＡＩＰタンパク
からなる群から選択された少なくとも一方が生物標本に存在するか否かを判定する方法である。
【００２５】
好ましい態様の詳細な説明
以下、別段の指示がない限り、本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方式＃２に基づいてエクソンを参照する。
【００２６】
明細書を通して、種々の略語を使用して様々な構成要素および技術を特定する。以下は、このような構成要素および技術の参照として付する語彙リストである。
ＣＴＲ        −    複合縦列反復
ＤＮＡ        −    デオキシリボ核酸
ＰＣＲ        −    ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＦＧＥ      −    パルスフィールドゲル電気泳動
ＰＡＣ        −    Ｐ１人工染色体
ＲＮＡ        −    リボ核酸
ＲＴ-ＰＣＲ   −    逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＴＲ        −    単純縦列反復
ＳＴＳ        −    配列標識部位
ＹＡＣ        −    酵母人工染色体
【００２７】
本発明は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子の同定、位置決定および配列特性に関するものである。我々は、この遺伝子の突然変異が上記Ｉ型、II型およびIII型脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)を引き起こすことを見出した。この遺伝子の突然変異は正常なＮＡＩＰタンパクの生成欠損を生じさせるが、このＮＡＩＰタンパクはヒト正常過程に生理学的に関与し、神経細胞を維持し、患者に共通する早期の神経細胞死を阻止していると考えられる。対象遺伝子は染色体5q13.1のＳＭＡ含有領域に特定される。別段の指示がない限り、本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方式＃２に基づてエクソンを参照する。この遺伝子は、約5.8kbのエクソン１から１７までを含み、図８に示すようなエクソン２から１１までの制限地図を有する。エクソン２から１６までの最新の制限地図を図９Ｄと図１１Ａに示した。図から解るように、この遺伝子はエクソン１から１７までの配列よりも相当長い。未だに配列が決定されていないエクソン間には、相当のイントロン情報が存在している。ＳＭＡを診断する観点からすると、エクソン１から１７までの配列が極めて貴重である。正常な配列は、表４に示す他、配列番号１として記載した。いかなる遺伝的突然変異、すなわちそのＤＮＡ配列の変化は、それが遺伝子の全体的な欠失、置換または多形化などに関わらず、疾患の原因であるか、または原因となり得る。最も共通的な突然変異は以下のとおりであると考えられる。
【００２８】
i)  遺伝子のエクソン５、６の欠失、または
ii)  残りの遺伝子に欠陥がある場合には、第５染色体のこの遺伝子のコピー不在もしくはコピー数の著しい減少が原因となり得る。
【００２９】
正常配列、または正常配列の突然変異の有無を判定することによってヒトのＳＭＡ感受性を診断するにはどのような生物学的アッセイを採用することもできる。このよう生物学的アッセイは、ＤＮＡプローブを使用するＤＮＡハイブリダイゼーション、制限酵素分析、ヒトの生体試料の第５染色体から単離されるような配列該当部のＰＣＲ増幅、配列当該部のメッセンジャーＲＮＡ検出およびＤＮＡ配列決定などである。これらの一般的な生物学的アッセイは様々な手続きで行うことができるが、その場合の好ましい方法は以下の通りである。
【００３０】
ＳＭＡの診断を２つの方法で実施する。第１は、危険性のあるヒトのゲノムについて、ＮＡＩＰのエクソン５および６が不在であるかを検定する。これらのエクソンは、母集団では0.05％の頻度で、Ｉ型ＳＭＡ集団では50％の頻度で不在であることが分かっている。第２の方法は、被検者のＮＡＩＰ遺伝子のコピー数を調べるものである。我々は、ＳＭＡ患者ではＮＡＩＰ遺伝子の欠失形態と正常形態とが共に概ね減少していることを見出している。濃度計を使用して遺伝子のコピー数を測定することによって、ＳＭＡの発症リスクを正確に評価する方法を確立することができる。最も高い相関は、エクソン２から４までとエクソン１３に観察される。
【００３１】
実際には、以上に概説した２つのステップは以下の方法で実施することができる。
(i) 被検者から得た等量のＤＮＡ(0.1マイクログラム)に対して２つの同時ＰＣＲを実施する。一方のプライマー対はエクソン５および６に対応するものとし(例えば、配列番号７のプライマー1863と配列番号８のプライマー1864)、他方のプライマー対はエクソン５および６以外の領域に相同なもの(例えば、配列番号５のプライマー1343と配列番号４のプライマー1258)とする。後者の反応を実施することで、ＰＣＲが作用していることを確認することができる。さらに２つのコントロールとして、(i)適切なプライマーを使用して、エクソン５およびエクソン６を含むことが知られるゲノムＤＮＡにＰＣＲを行い、この特定反応が作用していることを確認するものと、(ii)鋳型として水を使用し、混入物質の不在を確認する負のコントロールとがある。すべてのＰＣＲ産物はアガロースゲル内に移され、電気泳動によって分離され、視覚的に分析される。
【００３２】
(ii) ＳＭＡリスクの濃度計による判定は、蛍光色素で標識したＰＣＲプライマーを用いて行う。エクソン２から４、エクソン１３、エクソン５、６およびエクソン１１、１２に対するプライマーを使用して、被験者由来のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物はゲル上で電気泳動によって分離され、個々のバンドの輝度は蛍光光度法によって判定される。このような値を標準値と対比させ、ＳＭＡリスクを確認する。
【００３３】
ＮＡＩＰの一つの側面は、筋萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病等のその他の神経変性疾患に対するリスクと明らかに相関することである。従って、上記に説明した試験は、これらの疾患に対するリスクの予知としても役立つ。以下のＢaculoviral ＩＡＰsの節で詳細に述べるように、ＮＡＩＰタンパクは細胞アポトーシス抑制タンパクと高い相同性を有している。このため、神経細胞のアポトーシスを起因する神経変性疾患であれば、ＮＡＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列情報を用いて予知することもできる。このような神経細胞アポトーシスはＮＡＩＰ遺伝子の突然変異と最も結び付き易く、この変異は、ＳＭＡに関連した突然変異や神経アポトーシスを抑制するＮＡＩＰタンパクの生物活性に影響する他の遺伝子の突然変異と類似している。
【００３４】
mＲＮＡの検出については、我々は以下を提案する。
ＲＴ-ＰＣＲは複数の分子生物学的用途に必須であるＲＮＡ転写物を分析するめの迅速な方法である。この方法は従来のノーザンブロット法、ＲＮＡドット／スロットブロット法、in situハイブリダイゼイション法よりもはるかに感受性が高く、効率が良い。このような高い感受性によって、少量のＲＮＡ転写物や少量の細胞から単離したＲＮＡについて試験することができる。さらに、転写物のパネル全体を同時に分析することもできる。
【００３５】
プロトコルの概要:  最初に、ＲＮＡを組織または細胞から単離し、相補的ＤＮＡ(cＤＮＡ)への逆転写のための鋳型として使用する。逆転写(ＲＮＡ依存性のＤＮＡ合成)を逆転写酵素によって触媒する。次に、cＤＮＡを鋳型として、選択されたcＤＮＡ領域を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ後、生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。そのcＤＮＡのヌクレオチド配列情報から推定されるＰＣＲ産物のサイズによって増幅されたcＤＮＡを同定する。ＰＣＲ産物は、さらに制限切断、ハイブリダイゼーション、またはヌクレオチド配列決定によって確認することができる。
【００３６】
ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によるＲＮＡの酵素的増幅
この方法は、ＰＣＲを用いてＲＮＡを酵素的に増幅するために用いる。
【００３７】
プロトコルの詳細:  最初に、プライマーをＲＮＡにアニーリングする。ＲＮＡおよびcＤＮＡプライマーは、poly(Ａ)+ＲＮＡ、cＤＮＡおよび水を一緒に添加することによって共沈させる。酢酸ナトリウムとエタノールとを添加する。これを-20℃以上で一晩かけて沈降させる。ペレットをエタノールで洗浄する。次に、水、Ｔis-ＨＣlおよびＫＣlを添加し、その混合物を90℃に加熱した後、徐々に67℃まで冷却する。微少遠心分離し、３時間52℃でインキュベートする。この最終アニーリング温度は、プライマーの塩基組成に従って調整することができる。あるいは、プライマーをpoly(Ａ)+ＲＮＡ、cＤＮＡおよび水に混合することによってＲＮＡにアニーリングすることもできる。この混合物を65℃で３分から１５分間加熱する。冷却した混合物に逆転写酵素緩衝液を添加する。
【００３８】
次にcＤＮＡを合成する。逆転写酵素緩衝液とＡＭＶ逆転写酵素とを添加する。これを混合して１時間42℃でインキュベートする(プライマーとＲＮＡの塩基組成による)。Ｔris-Ｃl/ＥＤＴＡを添加した後、緩衝フェノールを混合し、撹拌する。微少遠心し、クロロホルムを水相に添加し、撹拌し、微少遠心する。酢酸ナトリウムとエタノールを水相に添加する。混合し、-20℃で一晩沈殿させ、微少遠心し、ペレットを乾燥させ、水に入れて再懸濁する。
【００３９】
次いでcＤＮＡをＰＣＲ増幅する。混合物は調製cＤＮＡ、増幅因子、dＮＴＰ混合物、増幅緩衝剤および水を含む。通常、増幅プライマーの一つはcＤＮＡプライマーと同一のものである。異なるプライマーを使用する場合、cＤＮＡプライマーはcＤＮＡ反応から除外されることが望ましい。反応混合物を２分間94℃に加熱し、微少遠心して凝縮物を回収する。Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼを添加し、混合し、遠心分離し、ミネラルオイルで皮膜して増幅サイクルを開始する。サイクル数は、ＲＮＡの量によって様々である。通常は４０サイクルで十分である。次に、反応産物をアガロースまたは非変性ポリアクリルアミドゲル内でゲル電気泳動によって分析する。cＤＮＡを増幅ステップに直接導入することもできる。
【００４０】
当然のことながら、遺伝子、そのcＤＮＡ配列、その他のＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列について言及する際に、何らかに特定化した配列は生物学的に同等の機能を有するもののいずれかまたは全てを包含するものである。同様に、記載したタンパク質配列についても、目的が関連している限りは、それらの呼び名は生物学的に同等の機能を有するもののいずれかまたは全てを包含する。上記の生物学的アッセイでは、当然のことながら、ＤＮＡ配列またはタンパク配列の全長または一部を使用することができる。一般に、そのＤＮＡの少なくとも連続１８個塩基がハイブリダイゼーション用プローブやＰＣＲプライマー等として有用である。同様に、タンパク質配列の場合にも、少なくとも１５個の連続アミノ酸配列がモノクローナル抗体などのタンパク質受容体を開発する際に有用である。このようなモノクロナール抗体は、タンパク質構造の特定の抗原決定因子に特異的なモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを作成するような標準的な方法で製造することができる。
【００４１】
表４について言えば、エクソン5、6、7、8、9、10、11および12がＩＡＰ領域と高い相同性を示すという観点からすれば、このような相同性は、これらのエクソンの欠失またはその他の突然変異が疾患に感受性があるキャリアに生じ得ることは当然である。例えば、このことは、ヒトにおける減少したコピー数においてエクソン５および６の欠失がこの疾患の原因となることによって証明される。このため、遺伝子のこの領域のいかなる配列情報も診断的観点からは重要であり、この領域に存在するいかなるＤＮＡの１８連続塩基または１５連続アミノ酸残基もＳＭＡの疑いがあるヒトの診断の根拠とすることができる。当然、この遺伝子のその他の領域における他の種類の欠失、突然変異、多形性なども疾患の原因であることが考えられ、疾患分析、予後、あるいは治療に関連するその他の目的に使用することもできる。
【００４２】
制限地図は被検者の遺伝子の特性を同定する際に有用であるが、エクソン１からエクソン１７までの特異的cＤＮＡ配列を配列番号１に記載した。コード配列は、エクソン５の396位塩基のＡＴＧコドンから始まり、エクソン１６の4092位塩基の停止コドンＴＡＡで終了する。エクソン１から４までは5'未翻訳領域に位置し、エクソン１７は3'未翻訳領域に位置する。いくつかの遺伝性疾患と同様に、未翻訳領域の突然変異または多形化がこの疾患の原因として当然と考えられるので、ＩＡＰが相当に類似した領域以外におけるプローブなどの配列部分もＳＭＡ診断に有効であると考えられる。配列番号１の配列情報は、適切なクローニングベクターを構築してその遺伝子のコピーを複製するために使用するこができ、あるいは組み換え技術によって発現ベクターを構築し、これを宿主にトランスフェクトしてＮＡＩＰを多量に製造するために使用することができる。クローニングベクターまたは発現ベクターの使用目的によって、配列情報のセクション、フラグメントまたは全長をそのようなベクターの構築に使用することができる。この理解を前提に、ＳＭＡ疾患遺伝子の同定、その特性、対応するタンパク質配列および診断時のそれらの使用法の詳細を説明する。
【００４３】
染色体5q.13に沿った脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)遺伝子領域のＹＡＣ連続系列を構築したが、これはＤ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112区間を含み、全体で４Mbであった。コスミド系列のＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位は、脊髄性筋萎縮症との有意な連鎖不平衡を示し、その遺伝子に隣接していることを示した。ただし、ＳＡＭ遺伝子を含む正確な領域の描写は、この情報だけでは不可能である。９個のクローンからなるＣＡＴＴ領域を含み約400kbに及ぶＰＡＣ連続系列が構築された。物理的マッピングデータと併用した遺伝学的分析の結果、ＣＭＳ対立遺伝子９と40Ｇ1 ＣＡＴＴ下位部位を含む154kbのＰＡＣクローン125Ｄ9(図７)が高い確率でＳＭＡを含んでいた。以下のようにさらに分析した結果、ＰＡＣ125Ｄ9は、神経アポトーシス抑制タンパクをコードする遺伝子を含むことが判明した。
【００４４】
pＹＡＣ(酵母人工染色体プラスミド)によって、400kb以下のＤＮＡ連続鎖を酵母に直接クローニングすることができる。環状pＹＡＣ(インサートなし)はＥ.coli.で複製させることができる。pＹＡＣのin vitro開列、外来性ＤＮＡとの連結、直鎖状分子(各末端にテロメアを含む)の酵母への直接形質転換によってライブラリが構築され、これは標準的な方法によってスクリーニングすることができる。
【００４５】
大型のＹＡＣ構築物は自然の染色体と同様に安定している。これらは、ヒトゲノムなどの複合ゲノムからライブラリを構成するための格好のベクターである。さらに、Ｅ.coli.コスミドおよびラムダベクターではクローニング不可能な配列も、ＹＡＣベクターでは十分にクローニング可能である。
【００４６】
ＹＡＣベクターは、通常は環状プラスミドとして細菌中で増殖する。制限酵素標的部位は、切断時に２つの腕を生じさせるように配置されており、その各々が異なる選別マーカーを含み、一方がテロメアで、他方が平滑末端で終結する。さらに、一方の腕はＡＲＳ要素を含む。この２つの腕は、連結フラグメントから分離精製され、平滑末端を分離するように断片化された供与ＤＮＡに連結される。連結反応混合溶液によって酵母細胞が形質転換されるが、この時の選別条件は、両腕の存在を確認することや、非組み換え体に認められる第３の選別マーカーがインサートによって妨害されることを確認すること等である。
【００４７】
ＹＡＣ連続系列の構築
Ｎational Ｃenters of Ｅxcellence(ＮＣＥ，Ｔoronto)、Ｉmperial Ｃancer Ｒesearch Ｆund(ＩＣＲＦ，Ｌondon)(Ｌain et al.，1991)およびＣentred'Ｅtude du Ｐolymorphism Ｈumaine(ＣＥＰＨ，Ｐaris)(Ａlertson et al.)で構築させた３つのライブラリからＹＡＣクローンを単離したが、これらは全てＹＡＣベクターpＹＡＣ４に連結したＤＮＡ全体の一部のＥcoＲＩ断片から調製されたものである。ＩＣＲＦ ＹＡＣクローンは、ライブラリフィルターを5q13.1プローブを用いて探査するこによって同定した。ＮＣＥライブラリから得られたＹＡＣＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリーニングし、電気泳動し、サザンブロットに固定し、放射標識したＳＴＳ産物にハイブリダイズし、ポジティブであることを確認した。多数のポジティブがプールしたプレートの第１回目ＰＣＲおよび目的のクローンを含むと考えられたプレートでの第２回目のＰＣＲ双方から繰り返し得られたが、その多くは偽のポジティブであった。偽ポジティブクローンはプライマー依存性と思われるが、その数はＰＣＲ産物を放射標識し、６％ポリアクリルアミドゲル上で分解させることによって減少した。その後、真のポジティブクローンのサイズを偽生成物からの干渉を受けずに正確に測定することができた。
【００４８】
5q13.1ＳＴＳに対してポジティブなＹＡＣを有する酵母菌株を選別プレート上で培養し、以下の方法で安定性を試験した。すなわち、４コロニーの各々をアガロースブロックで培養し調製し、酵母染色体ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動によって分離し、フィルターに転移し、放射標識した全ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせることによって各酵母コロニー内に含まれるＹＡＣクローンのサイズと数を決定した。ポジティブクローンは、オリジナルプローブとのハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅のいずれかによって確認した。ＹＡＣ24Ｄ6-2だけが１つ以上のＹＡＣを有する複数のコロニーを含んでいた。
【００４９】
ＹＡＣ末端クローンおよびインター-Ａluは、それぞれベクター-ＡluＰＣＲおよびインター-ＡluＰＣＲによって単離した。5q11−13におけるこれらの産物の位置は、第５染色体の全てを含む体細胞ハイブリッドＨＨＷ105(Ｄona et al.,1982)と、5q11.2-13.3が欠失した第５染色体を含む誘導体ＨＨＷ1064(Ｇilliam et al.,1989)のサザンフィルターにハイブリダイズさせて確認した。これらのプローブの多くは、5q11−13領域と第５染色体のどこかとに位置することを示すハイブリダイゼーションプロフィルを示した。ある場合には、各ＹＡＣ末端に特異的なプライマーは、ベクター-ＡluＰＣＲによって単離されたＹＡＣ末端クローンの配列から生成された。各々の新規ＳＴＳの5q11-13への配置は、体細胞ハイブリッドＨＨＷ105およびＨＨＷ1064由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅によって決定された。若干の場合には、ＨＨＷ105およびＨＨＥ1064から得られたＰＣＲ増幅産物がポジティブの場合は、プライマー対が第５染色体反復配列を含んでいた。新規のＳＴＳプライマーの形成によって、5q11-13領域に特異的な産物が増幅した。末端クローンハイブリダイゼーションおよびＳＴＳ分析をすべてのＹＡＣに実施し、各ＹＡＣの向きと位置を確認した。
【００５０】
ＳＭＡ区間を含むＹＡＣ連続系列の集合は、２つのマーカー、すなわち、ＳＭＡに隣接し、Ｄ5Ｓ435のセントロメア側に存在するマーカーＤ5Ｓ125(Ｍankoo et al.，1991)と、よりテロメア側に位置するマーカーＤ5Ｓ112(Ｌien et al.，1991)(図１参照)とから開始する。６つのＹＡＣは、セントロメアマーカーpＪＫ53(Ｄ5Ｓ112)によってＩＣＲＦライブラリに同定された。これらのＹＡＣの１つはＤ06100であるが、末端クローンＳＴＳ分析に基づきさらにセントロメア方向に延在することが示された。このＹＡＣのセントロメア末端によって、ＮＣＥライブラリから２つのＹＡＣすなわち1281と1284を同定した。Ｄ5Ｓ125またはＤ5Ｓ435マーカーにポジティブなＹＡＣは、ＩＣＲＦライブラリとＮＣＥライブラリには認められなかったため、ＣＥＰＨライブラリをスクリーニングすることによって、Ｄ5Ｓ435を含むクローンを単離した。ギャップの中心に位置するミクロサテライト多形性であるＣＡＴＴ-１を使用して、３つのＹＡＣすなわち24Ｄ6-2、27Ｈ5、33Ｈ10を検出した。これらのＹＡＣは、ＳＴＳ分析によって、セントロメア方向のＹＡＣおよびテロメア側のＹＡＣ(1281、1284)に連結することが示された。ＡluＰＣＲによる中間ＹＡＣ産物を使用して全てのＹＡＣを探査し、オーバーラップの程度を確立した。ＪＫ348とＤ5Ｓ112との間に位置するＳＴＳ配列(Ｋleyn et al.,1993)を使用し、オーバーラップの程度と連続系列におけるＹＡＣの配向を確認した。同時に5q13に沿って各ＳＴＳの順番も確認した。結果的に全部で１４ＹＡＣを同定し、遺伝マーカーＤ5s435、Ｄ5Ｓ629、ＣＭＳ-1、Ｄ5Ｆ153、Ｄ5Ｆ149、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｓ557およびＤ5Ｓ112によって固定した。
【００５１】
長距離制限地図および物理的距離の見積
重要なＳＭＡ領域の制限地図をＤ5Ｓ629に約100kb近位のＳＴＳ Ｙ116Ｕ(Kleyn et al.,1993)からＤ5Ｓ557に約500kb遠位のＳＴＳ Ｙ107Ｕまで作成した(図２参照)。我々のＹＡＣの欠失または転位についてあらゆる可能性を見い出すために、ＣＥＰＨライブラリ(Kleeyn et al.,1993)からさらにＹＡＣを単離し、この領域内にマッピングすることを分析に含めた。ＹＡＣの24Ｄ6、227Ｈ5、33Ｈ10、155ＳＨ11、76Ｃ1、235Ｂ7、184Ｍ2、428Ｃ5、81Ｂ11(Ｋleyn et al.,1993)を低頻度切断エンドヌクレアーゼＮotl、ＢssＨＩＩ、Ｓfil、Ｒsrlを用いて部分的に切断した。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）で分離した制限産物をサザンブロッティングし、ＹＡＣの左腕特異プローブおよび右腕特異プローブにハイブリダイズさせたところ、各ＹＡＣの両端からの開列部位の位置が明らかにされた。ＹＡＣの配向およびオーバーラップは、ＳＴＳ分析に基づいてすでに求められているので、オーバーラップしたＹＡＣ中の低頻度切断部位の位置を比較した。それらの共通する低頻度切断部位にオーバーラップしたＹＡＣを並べることによって、オーバーラップの程度をさらに正確に決定することかできた。異なる起源由来のオーバーラップＹＡＣの長距離制限地図は33Ｈ10および428Ｃ5を例外としてほとんど一致する。428Ｃ5は欠失を含むことが以前に立証さており(Ｋleyn et al.,1993)、そのＳＴＳ含有物の比較と、わずか300kbのサイズしかないことから、図２の配置よりもさらにセントロメア側に存在することが示唆される。ＳＴＳ分析に基づくＹＡＣ33Ｈ10は、内部欠失を含み、ＹＡＣ155Ｈ11はテロメア側がキメラであるので、地図のテロメア側の低頻度切断部位は確認することができず、含まれていなかった。この結果は、セントロメア境界であるＤ5Ｓ435からテロメア境界であるＤ5Ｓ557までの距離は1.4Mbであり、これは先に報告された400kb(Ｆrancis et al.,1993)とは著しく異なるが、別の見積結果(Ｗirth et al.,1993)とは一致した。さらに、Ｄ5Ｓ629-Ｄ5s557区間は1.1Mbであり、遺伝的に定義されたＣＭＳ1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間の距離は約550kbであると見積もられた。
【００５２】
第５染色体ライブラリからのコスミド連続アセンブリ
ＹＡＣ全体をプローブとして使用するコスミドの単離は、コスミド連続系列を構築する迅速な方法であると考えられたが、この場合、第５染色体に特異的な反復配列の存在によって、第５染色体の別の場所に位置するコスミドを単離し易いと思われた。目的のコスミドのウォーキング法は、こうして採用された。ＣＡＴＴ-１ ＳＴＲは、放射線ハイブリッド分析によって２つの接合標識Ｄ5Ｓ435とＤ5Ｓ351のほぼ中間に位置することがわかっているが、これを開始点として使用し、コスミドクローン系列を構築した。ゲノムＤＮＡに見られる複合増幅パターンは、１個体あたり２から８の対立遺伝子を含んでいるが(図３参照)、この領域のＣＡＴＴ-１配列のコピー数または部位が可変的であることを示すものであった。３０個のＣＡＴＴ-１にポジティブなコスミドを同定したところ、それらはＰＣＲ分析時に４個の異なる対立遺伝子の１つを含むことがわかった。コスミドライブラリはモノ染色体ソース由来であったので、これによってＣＡＴＴ ＳＴＲは少なくとも４つの位置に存在することが確認された。我々はこれらの４つの部位を下位部位(subloci)と命名した。これらの下位部位は、各々12、19、15、20のシトシンアデノシン(ＣＡ)ジヌクレオチドの対立遺伝子を含有することが確認された第１コスミド番地に基づいてＣＡＴＴ-40Ｇ1、ＣＡＴＴ-192Ｆ7、ＣＡＴＴ-58Ｇ12、ＣＡＴＴ25ＯＢ60と命名された。両方向ウォーキングを４つのコスミド下位部位から開始した。ポジティブなハイブリダイゼーションは、58Ｇ12を一端に有する250Ｂ6と他端に有する192Ｆ7に観察され、cen-192Ｆ7-58Ｇ12-250B6-telの順序であった(図４)。ＣＡＴＴ-192Ｆ7対立遺伝子を含む全てのコスミドは、それらのＣＡＴＴ-１対立遺伝子のサイズおよびそれらの制限酵素プロフィルに基づいて、この位置に配置された。図４に示すように、ＣＡＴＴ-192Ｆ7下位部位は、ＳＴＲ ＣＭＳ-１に対してテロメア側であり、それ自体がＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位のテロメア側である。
【００５３】
第５染色体特異反復配列の存在によって第５染色体の別の領域からコスミドを同定し、連続系列の一貫性を次の各ステップによって確認した。ベクター-Ａlu-ＰＣＲによって生成されたコスミド末端クローンを上記体細胞ハイブリッドパネルにハイブリダイズした。第５染色体領域に単独で位置する反復配列がハイブリッド細胞系ＨＨＷ1064では欠失しいてることが確認され、最終産物によって同定されるコスミドはＨＨＷ1064とハイブリダイズしないので、さらに分析した。オーバーラップは、末端クローンのハイブリダイゼーション、単コピープローブのハイブリダイゼーション、ＳＴＳ含量、制限酵素プロフィルの比較によって証明された。ＨＨＷ1064にハイブリダイズする末端クローンによって同定されたコスミドを除外し、同じ方法で確認した別のクローンからの異なるインター-Ａlu産物を用いてウォーキングを継続した。コスミドのサイズは、ＥcoＲＩ制限フラグメントの添加によって算出され、オーバーラップの存在はＥcoＲＩ制限フラグメントによって同様に求められた。
【００５４】
ＹＡＣ76Ｃ１コスミドのコスミド連続系列
コスミド連続系列の伸長は第５染色体に特異的な反復配列の存在によって妨げられるので、5ＸコスミドライブラリをＹＡＣ 76Ｃ1から作成した。ＹＡＣに沿って分布するＳＴＳのＣＡＴＴ-1、ＣＭＳ-1、Ｙ122Ｔ(Ｋleyn et at.,1993)、Ｙ97Ｔ(Ｋleyn et al.，1993)およびＹ98Ｔ(Ｋleyn et al.，1993)を用いてコスミドを同定し、連続系列を構築した。同様に、以前に開発されたマーカーpＺＹ8、pＬ7、pＧＡ-1、p15.1、p402.1、p2281.8および構築されたコスミド連続系列由来のβ-グルクロニダーゼ(Ｏshima et al.，1987)(表２、図２)がこのライブラリにハイブリダイズしたが、これはコスミドの順序付けに効果的な方法であった。不規則なハイブリダイゼーションパターンを示し、欠失および／または転位を含むと考えられるコスミドを除去した。
【００５５】
ＳＴＳ Ｙ98Ｔは、ＳＴＳ Ｙ98Ｔを含む第５染色体ライブラリクローン由来のプロー2281.8によって以前に同定されたコスミドを含む３つのコスミドを識別した。このコスミドの最終産物は、１０個のコスミドにハイブリダイズした。同時に、ＣＡＴＴ40Ｇ１下位部位の末端フラグメントは、これら１０コスミドの４つにハイブリダイズし、ＣＡＴＴ-40Ｇ１およびＣＭＳ-1をよりセントロメア寄りのＳＴＳ Ｙ98Ｔに連結した(図４)。我々は、ＹＡＣおよびＳＴＳ 97Ｔを含むいかなるクローンをも同定することができなかった。フィルターハイブリダイゼーションおよびＳＴＳマッピング実験の結果、別のＣＡＴＴ40Ｇ１下位部位がさらにセントロメア寄りであることを示した。この下位部位の重複は、我々のＳＭＡ血族遺伝子型データに一致した(ＭcＬＥan et al.，印刷中)。
【００５６】
この領域を測るのに必要な最小のコスミドセットを用いてＥcorＩ制限地図を作製した。連続系列の信頼性を確認するため、我々はそれを第５染色体特異的ライブラリからの連続構築物に組み込むことを試みた。連続系列の一致は、制限地図の比較、地図上のプローブおよびＳＴＳsの位置、およびＡlu-ＰＣＲフィンガプリンティングによって明白であった。この方法の場合、連続系列のサイズは210kbであると見積もられた。このため、直接的なウォーキング法によって、既知のセントロメア／テロメア配置を有する下位部位のＣＡＴＴ-１クラスターを含む１組のコスミド集合を作成した。
【００５７】
重複／欠失
幾つかの証拠は、我々のコスミド系列中にゲノム配列重複が存在することを示唆した。我々は、ＣＡＴＴ-40Ｇ1サブクローンの複製が単一の第５染色体由来のコスミドに存在することの証拠を提供する。ＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位として確立されたこの下位部位に対するセントロメアの位置は、複数のコスミドにおいてＳＴＳsのＹ122Ｔ、Ｙ88ＴおよびＣＭＳ-1に隣接していることが見出され、セントロメアのＹＡＣ428Ｓは、ＣＡＴＴ-40Ｇ1含有コスミドから単離されたプローブに対してポジティブであった。ＹＡＣ428Ｃ5は、ＰＣＲ増幅の際にはＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位を含まなかったが、これはＹＡＣが由来する染色体の無効対立遺伝子またはＹＡＣの欠失によって説明することができる。我々は、既に、離れたＣＡＴＴ-1下位部位で個々の無効対立遺伝子を観察している。ＣＡＴＴ40Ｇ1の別のよりテロメア寄りの位置を、いずれもテロメア側のＹＡＣ33Ｈ10である24Ｄ62に結合するプローブpＧＡ-1、pＬ-7およびpＺＹ8のＣＡＴＴ40Ｇ-1へのハイブリダイゼーションによって決定した。コスミド40Ｇ1由来のp402.1をコスミドの両方の位置にハイブリダイズしたところ、重複はＣＡＴＴ40-1下位部位に限定されず、より広い領域を含む傾向にあることが分かった。サザンブロットによって、２つの位置に対するコスミドの異なるプロフィルが明かになったが、Ａlu-ＰＣＲフィンガプリントによって共通のバンドが検出され、重複を裏付けた。
【００５８】
我々のＹＡＣ系列とコスミド系列との相関関係から、ＹＡＣの76Ｃ1、81Ｂ11、27Ｈ5は、5q13の150kbのＣＡＴＴ領域に及ぶことがわかった。それにも関わらず、これらのＹＡＣのＣＡＴＴ-1遺伝子型からは１つの対立遺伝子サイズが判明しただけで、これらのＹＡＣ(４つすべて)が由来する染色体が、それらの残りのＣＡＴＴ-1下位部位の無効対立遺伝子を含む確率が高くなった。ただし、我々の実験は、ＳＭＡ家系のＣＡＴＴ連鎖分析によって、遺伝子型を決定した約300人のうち誰も２つ以下の対立遺伝子を持っていないというようなシナリオはほとんど有り得ないことを示した。従って我々は、これらのＣＡＴＴ下位部位は不安定であり、ＹＡＣの構築および／または増殖中に欠失する傾向が強いと考える。
【００５９】
ＣＡＴＴ-1とＤ5Ｆ153プライマーの配列比較は、一方のプライマーが一致し、他方のプライマー配列が８ヌクレオチド重複しているので、これらの２つのＳＴＲは類似しており恐らくは同一であることを示した。ただし、セントロメア側のＹＡＣである428Ｃ5、232Ｆ12、235Ｂ7、184Ｈ2と、テロメア側ののＹＡＣである12Ｈ1、155Ｈ11、269Ａ6は、ＣＡＴＴ-1ネガティブであり、Ｄ5Ｆ153増幅産物を生成したことから、ＣＡＴＴ-1はＤ5Ｆ153の誘導体の可能性がでてきた。これらのデータは、３つのＤ5Ｆ153部位(図４)を含むコスミド系列のＤ5Ｆ153分析との比較によって、少なくとも５つのＤ5Ｆ153下位部位の存在を示した。
【００６０】
ＣＡＴＴ-1ＳＴＲとＤ5Ｆ153ＳＴＲの他に、ＣＭＳ-1ＳＴＲとＤ5Ｆ150ＳＴＲが第５染色体当たりの種々のコピー数で存在した。ＳＴＳ分析によって、ＣＭＳ-1はＹＡＣの423Ｃ5、76Ｃl、81Ｂ11、27Ｈ5に位置決定されたが、それぞれの対立遺伝子サイズは、5、4、4、3および４であった。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、１個体あたり４対立遺伝子までであることがわかり、染色体当たり２コピー多かった。Ｄ5Ｆ150はコスミド系列内の２つの位置に存在したが、１つの位置しかＹＡＣ系列には検出されなかった。Ｄ5Ｆ151は我々のコスミド系列には検出されなかったにもかかわらず、ＹＡＣ 428Ｃ5のポジティブな増幅に基づきそのコスミド系列に含まれたＹＡＣ33Ｈ10のセントロメア末端に配置された。Ｄ5Ｆ149の位置の一つは、我々のコスミドとＹＡＣクローンの両方で検出された。我々のデータは、ＣＡＴＴ-1については、無効対立遺伝子の存在および／またはＹＡＣのＣＭＳ-1、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｆ149配列の不安定性を示唆した。
【００６１】
欠失現象は、第５染色体の特異的コスミドライブラリから得られたコスミド234Ａ1を含むＣＡＴＴ-40Ｇ1から単一コピープローブとして単離された800bpのＥcoＲＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにおいて観察された。ＹＡＣＤＮＡの探査では、我々のＹＡＣのいずれにおいてもこのフラグメントを検出することができなかった。数人のゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションでは、欠失現象は一切同定されなかったので、この配列はＹＡＣの不安定性に起因するものと考えられた。このフラグメントの配列決定では、エクソンもコード領域も一切明かにならなかった。
【００６２】
ＳＭＡ領域の配列重複の別の証拠は、コスミド15Ｆ8(図４)から得られた1.2kbの内部Ａlu-ＰＣＲ産物(p151.2)を用いて確認された。プローブによって、ＹＡＣクローンの76Ｃ1、81Ｂ11、27Ｈ5(20kb、12k、3kb)の３つのＥcoＲＩフラグメントが同定されたが、33Ｈ10および24Ｄ6(20kb)と428Ｃ5では１つずつしか確認されなかった。内部ＥcoＲＩ部位は、このマーカーを500bpと700bpのプローブに分割した。大きい方のプローブによって、12kbおよび20kbのフラグメントを識別する一方で、小さい方のプローブによって3kbおよび20kbのフラグメントを識別した(図５)。我々は、ＹＡＣのこの配列の不安定性は、ライブラリが異なるために除外し、ハイブリダイゼーションパターンをそれらの物理的位置に反映させた。12kbおよび3kbのフラグメントはＥcoＲＩ制限地図上に配置されたが、我々は20kbのフラグメントを位置づけすることはできなかった。我々のコスミド連続系列の遠位にある20kbフラグメントはデータから推測することができる。複製はゲノムＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションによって確認され、３つ全てのフラグメントサイズが明らかになった。
【００６３】
ＹＡＣ系列とコスミド系列の特徴
我々は、Ｄ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112領域を組み込み4Mbを含むＳＭＡ疾患遺伝子領域のＹＡＣ系列を確立した。5q13に沿った系列の向きはＰＦＧＥ分析と組み合わせて７つの遺伝マーカーおよびＳＴＳｓを分析することによって確認した。長距離制限地図では、我々の系列に含まれるＹＡＣの主な欠失および転位は明かにならなかったので、この地図を用いて系列のサイズを詳細に見積もった。我々のＹＡＣ地図は、少数コピー反復配列と複数部位ＳＴＳsによって特徴づけられる1.1Mb領域に、マーカーＤ5Ｓ629、Ｄ5Ｆ153、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ149、ＣＭＳ-1、ＣＡＴＴ-1およびＤ5Ｓ557を物理的に連結させた。さらに、我々は、新しく遺伝的に規定されたＣＭＳ1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557が500kbであると見積もった。Ｄ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ557領域の物理的距離の評価値は400kb(Francis et al.，1993)から1.4Mb(Wirth et al.，1993)までであることが報告されている。このような研究とは対照的に、我々はＤ5Ｓ435-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557領域を1.4Mb、ＣＭＳ11-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557領域を550kbとする見積では、６個の染色体からなる３つの起源に由来するクローンを採用する。さらに、クローンサイズと低頻度切断部位の位置とを決定することによって、さらに詳細にＹＡＣのオーバーラップの程度と系列のサイズを決定することができるようになり、評価が信頼できるものになった。
【００６４】
我々は、第５染色体特異的ライブラリおよびＹＡＣ(76Ｃ1)特異的ライブラリ由来のコスミドクローンの単−連続系列を、210kbを含むＣＭＳ-1/ＣＡＴＴ-1/Ｄ5Ｆ153/Ｄ5Ｆ150/Ｄ5Ｆ149領域の制限地図に関連して構築した。第５染色体特異的ライブラリを使用した場合に、反復配列がコスミド配列の伸長を阻害したので、重要な領域についてコスミドライブラリＹＡＣ 76Ｃ1を構築しなければならなかった。連続コスミド系列は、制限酵素フラグメントのオーバーラップによって確立されたコスミドのオーバーラッブやＡluフィンガプリンティング、あるいはＳＴＳ、コスミド末端クローンおよび単コピープローブの分析を実証しながら直接的なウォーキング法によって構築された。
【００６５】
物理的マッピング分析および遺伝的マッピング分析は、重複と反復配列を含むゲノムＤＮＡの複合領域を明らかにした。この領域から得られた複合ＳＴＲを用いてゲノムＤＮＡの遺伝子型を決定することで、１個体当たり８個までの多形性バンドが存在することがわかった。これは、ＳＴＲのＣＡＴＴ-1、ＣＭＳ-1、Ｄ5Ｆ153、Ｄ5Ｆ150には複数のコピーまたは下位部位が存在することを示している。我々の物理的マッピングデータは、これらの複数の下位部位の存在を確認したが、Ｄ5Ｆ151およびＤ5Ｆ149の場合は例外であり、１つの位置しか明かにならなかった。４つのＣＡＴＴ-1下位部位は我々のコスミド系列の140kb領域に位置し、少なくともその一つである下位部位ＣＡＴＴ-40Ｇ1は重複化されている。Ｄ5Ｆ153とＣＱＴＴ-1は共通の祖先から分岐したと考えられるＳＲＳに関連していた。我々は、１つのＣＭＳ-1下位部位を我々のコスミド系列に位置づけたが、ＹＡＣ／コスミドライブラリが由来する染色体は無効対立遺伝子を残りの下位部位に含むか、または欠失が確認される場合が考えられるので、我々のデータからはこの200kb領域内の別の染色体上に他の下位部位が存在するか否かについて判定することができなかった。
【００６６】
ＣＡＴＴ-1、ＤＦ153、Ｄ5Ｆ150およびＤ5Ｆ149ＳＴＲは、母集団の染色体上に複数コピーが存在していたが、各々に対して単一の対立遺伝子ＰＣＲ産物によって明かなように、すべてのＹＡＣＳ上に下位部位マーカーとして確認され、これらの配列の不安定性と欠失とを示した。これは、第５染色体コスミドライブラリをベースとした連続系列由来の我々のＹＡＣにおいて800bｐのフラグメントが不在であることによって裏付けられる。複数の下位部位間に配置される別のユニークな配列プローブがＹＡＣに保持されているので、これらの配列の不安定性が大きな欠失を生じさせるとは思われない。
【００６７】
要するに、我々は、決定的なＳＭＡ領域に対する最初の高解像度物理地図を作成したのである。ただし、ＳＭＡ遺伝子を含んだ正確な領域の説明は、この情報だけでは不可能である。
【００６８】
我々は、遺伝的分析と同時に、ＹＡＣ連続系列を３つの異なるＹＡＣライブラリから得たクローン(Ｒoy et al.,1994)を用いて構築した。この系列からの最小表示は図９Ｂに示したとおりであり、これは拡張パルスフィールドゲル電気泳動(ＰＦＧＥ)分析と相関した。一般的なＣＡＴＴ-1 マーカーおよびＳＭＡの連鎖不平衡に関する初期の提案(Ｂurghes et al.,1994)に従い、伸長したＣＡＴＴ領域を組み込むコスミド連続系列の構築に着手した。5q13か第５染色体のどこかに位置する広範で多形性のゲノム反復要素の存在が、連続系列を直線的に構築することを妨害した。ただし、系列の一貫性は、制限酵素分析、Ａlu-ＰＣＲフィンガプリンティング、ＳＴＳ含量決定およびコスミド末端クローンやその他の単コピープローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって確保された。この結果、単一染色体に由来するフローソート第５染色体ゲノムライブラリ(Ｒoy et al.,1994)に含まれる５つのＣＡＴＴ下位部位を含んだ200kbを組み込んだ系列が作成された。さらに最近では、このＣＡＴＴ領域を含み、１０クローンから構成され、約550kbの長さを有するＰ１人工染色体(ＰＡＣ,loannou et al.，1994)連続系列が構築された(図９Ｃ)。
【００６９】
連鎖不平衡分析
ＳＭＡ領域に位置する５つの複合縦列反復および単純縦列反復を用いる連鎖不平衡分析を行った。この分析に使用された２つの多形性は、我々のコスミド系列にマッピングしたＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位およびＣＡＴＴ-192Ｆ7下位部位であった。２つの独立した下位部位の特異的増幅はＣＡ反復に隣接する領域の配列多形性で終了するプライマーを構築することによってなされた。ＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位では図６に示されるように、明確なピークが観察された。
【００７０】
ＰＡＣ連続系列
40Ｇ1 ＣＡＴＴ下位部位は連鎖不平衡を示したので、ＣＡＴＴ領域を含むＰＡＣ連続系列を構築した。このＰＡＣ連続系列は９個のクローンからなり、全長約400kbであった(図７)。物理的マッピングデータに組み合わせた我々の遺伝的分析は、ＳＭＡと最大の不平衡を示した40Ｇ1ＣＡＴＴ下位部位マーカーが重複しており、重要なＳＭＡ領域の極めてセントロメア寄りに局在していることを明らかにした。結果的に、10kbのセントロメア末端内にＣＭＳ対立遺伝子９を限定するＳＭＡ領域を含み、テロメア方向に延在して40Ｇ1 ＣＡＴＴ下位部位を組み込んだ154kbのＰＡＣクローン125Ｄ9をさらに別の試験用に選択した。
【００７１】
２つのゲノムライブラリは、ＰＡＣ125Ｄ9の全長およびＳsu3ＡＩで切断した部分的断片(平均インサートサイズ5kb)を用い、制限酵素産物をＢamＨ１で開列したＢluescriptプラスミドにクローン化することによって構築された。ゲノム配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクローンがＰＡＣの大部分をカバーするように(Ｃhen et al.，1993)、5kbの部分的インサートＳau3ＡＩライブラリから得られた２００クローンの両端について行った。これは、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の構造を説明するための手段を提供する。
【００７２】
ＰＡＣ125Ｄ9を30kbのセントロメア側フラグメントと125kbテロメア側フラグメントにＮotl部位で切除する(これは、アポトーシス抑制領域の開始部位であるＰＡＣ125Ｄ9のエクソン７を二分することが後に示された)。ＮotlＰＡＣフラグメントはＰＦＧＥによって単離され、胎児脳cＤＮＡライブラリのプローブとして別々に使用された。Ｎotl部位領域の物理的マッピングおよび配列決定も行い、迅速にコード配列を検出するためにＣpＧ ilandの存在を検定した。ＰＡＣ125Ｄ9はまたエクソン トラッピング システムにおける鋳型として使用し、神経アポトーシスよ抑制タンパク遺伝子に含まれるエクソンを同定した。
【００７３】
ＧＡ1やＬ7などのコスミド系列から得られたクローンを用いたハイブリダイゼーションによって既に同定された転写の存在に加え、多面的な方法を行って、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子に含まれる６つのcＤＮＡクローンを迅速に同定した。これらのクローンを可能な場合はオーバーラップ系列に配置した。キメラ現象は、ＰＡＣ125Ｄ9の部分的なＳau3ＡＩゲノムライブラリ由来のクローンから得られた配列を有するcＤＮＡクローンの共直線検出によって何度も除去した。
【００７４】
神経アポトーシス抑制タンパクのクリーニング
５つのＣＡＴＴ下位部位の１つを含むコスミド250Ｂ6の完全なゲノムcＤＮＡインサートを用いてヒト胎児脊髄cＤＮＡライブラリをプロービングしたした。この結果、2.2kbの転写ＧＡ1が検出されたが、この位置は図７に示した。胎児脳ライブラリを連続コスミドインサート(コスミド４０Ｇ1)の他、このようなコスミドから単離された単コピーサブクローンを用いてさらにプロービングした。複数の転写が確認され、中にはＬ7と呼ばれるものも含まれていた。コード領域はＬ7につては検出されなかったが、これは恐らくクローン実質部が未処理の異核ＲＮＡを含んでいた事実によると思われる。ただし、我々は、後にＬ7が神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の一部と考えられる領域を含むことを発見した。同様に、ＧＡ1転写は、神経アポトーシス抑制タンパクのエクソン１３であることが最終的に証明された。ＧＡ1は、発現遺伝子であることを示すエクソンを含むことがわかったので特に注目した。ＰＡＣクローン125Ｄ9内に含まれるＧＡ1転写は後にcＤＮＡライブラリを詳しくプロービングすることによって伸長された。
【００７５】
伸長ＧＡ1転写をその他の既知の配列と比較し、そのアミノ酸配列がＯrgyia ＰseudotsugataウイルスおよびＣydia Ｐomonellaウイルスのアポトーシス抑制ポリペプチドと高い相同性を有することが明らかにされた(表３)。この配列分析によって、エクソン５および６のアポトーシス抑制タンパクに相同性があることがわかった。
【００７６】
cＤＮＡの残りのギャップを補完して、２つの捕捉エクソンを用いて胎児脳ライブラリをプロービングすることによって最終的な３‘の伸長を行った。オーバーラップクローンを有するcＤＮＡの物理的地図を作成した。完全cＤＮＡ配列を表４に示したが、これには１６個のエクソンが含まれている。アミノ酸配列は、ヌクレオチドトリプレットＡＴＧに対応するメチオニンから開始する。図８は、ＳＭＡ遺伝子の構造を示す。
【００７７】
表４に示されるＮＡＩＰのcＤＮＡ配列は、当業者らによってこの遺伝子プライマー、プローブおよびタンパク産物に対する抗体から発展させることができる。表４のcＤＮＡ配列を組換ＤＮＡ技術に利用して適当な宿主で発現させ、神経アポトーシス抑制タンパクを製造することができる。これによって、神経アポトーシス抑制タンパク材料を提供することができる。ＮＡＩＰの配列およびそれに含まれるプローブとプライマーを供給すると、たとえば、脊髄性筋萎縮症などの疾患を検出することもできる。
【００７８】
ＮＡＩＰ構造
ＮＡＩＰ遺伝子は、少なくとも5.5kbからなる１７個のエクソンを含み、ゲノムＤＮＡの約80ｋｂに及んでいる。ＮＡＩＰコード領域は3698ヌクレオチドで、1233アミノ酸からなる遺伝子産物が推定される。ＮＡＩＰは２つの潜在的膜貫通領域と、ＧＴＰ結合部位に直接隣接する細胞内のアポトーシス抑制ドメインとを含んでいる。タンパク質ドメインプログラムの調査によって以下の結果が出た。
【００７９】
(i)  残基9-91：認識可能なモチーフが存在しないＮ-末端ドメイン
(ii) 残基94-118：疎水性膜spanningドメイン
(iii)残基：169-435：アポトーシス抑制タンパクと相同性を示し、次の疎水性ドメインであるＧＴＰ/ＡＴＰ結合部位の直前に位置するドメイン
(iv) 残基486-504：疎水性膜spanningドメイン
(v)  残基505-1005：４つのＮ−末端結合グリコシル化部位と１つのリポタンパク質結合ドメインを含む受容体ドメイン
【００８０】
神経アポトーシス抑制タンパク
タンパク遺伝子突然変異の分析
cＤＮＡライブラリをスクリーニングするプローブとして完全ＰＡＣ125Ｄ9を用いてcＤＮＡ20.3プローブを得た。cＤＮＡプローブ20.3を用いたゲノムサザンのプロービングによって、III型の近親婚家族では9kbのＥcoＲＩバンドが欠損していることを明らかにした。この情報によって、ＮＡＩＰ遺伝子の欠失をエクソン５およびエクソン６に位置づけた。このため、欠失は低頻度Ｎotl制限部位とその直接下流を含むエクソンをカバーする。これらのエクソン内または周囲のプライマーを構築し、Ｉ型ＳＭＡ患者３人とIII型ＳＭＡ患者３人にこの領域の増幅がないことを明かにした。上記の欠失が原因で生成される接合(junction)フラグメントを増幅するプライマーを調製する目的で、ＰＡＣとエクソン４および５内および周囲のコスミドサブクローンからゲノムＤＮＡを単離し、配列を決定した。１つの接合フラグメントがIII型の患者に検出された。同様の産物が、近親婚の履歴がない別のフランス系カナダ人２例に観察された。３例のＩ型ＳＭＡおよび３例のIII型ＳＭＡ患者の染色体は、同一のＣＡＴＴ/ＣＭＳハプロタイプを有し、これが共通の軽度のＳＭＡ突然変異であり、フランス系カナダ人の母集団には比較的多いことを強く示唆した。このパターンの共分離が証明された。我々は、ＳＭＡ患者の１１０人の両親の分析を行ったが、同様の産物を発見することができなかった。この領域のゲノムＤＮＡの配列を決定したところ、約10kbの欠失があり、これがフレーム欠失を生じさせていることが確認された。この欠失は、イントロン領域とエクソン５および６に及んでいた。２世代のＳＭＡ家族にサザンブロット分析を行った。最初の８エクソンを含むcＤＮＡプローブを用いて、末梢血白血球由来ＤＮＡのＥcoＲＩ断片をブロービングした。ＳＭＡ患者は、エクソン５および６を含む10kbのＥcoＲＩバンドへのハイブリダイゼーションが存在しなかった。(図９)。
【００８１】
ＮＡＩＰ転写物は、最初に、コスミドライブラリに存在する５つのＣＡＴＴ下位部位の一つを含むコスミド250Ｂ6の完全な28kbのゲノムＤＮＡインサートを用いてヒト胎児脳cＤＮＡライブラリをプロービングすることによって単離した。これによって2.2kbの転写物を検出し、最終的にＮＡＩＰ遺伝子のエクソン１４であることを証明した。さらに、胎児脳ライブラリを連続隣接コスミド系列のインサート(コスミド40Ｇ1)と、このようなコスミドから単離された単コピーサブクローンを用いてプロービングすることによて、Ｌ7転写物を含む複数の転写物を同定し、最終的にＮＡＩＰ部位のエクソン１３を含むことを証明した。Ｌ7に対するコード領域は検出されなかったが、これは、クローン含有の未処理異核ＲＮＡがかなりの割合でその真の性質を妨害したことによると考えられる。
【００８２】
この段階では、完全な遺伝的分析および連鎖的不平衡分析とＰＡＣ連続系列の構築によって、ＰＡＣ125Ｄ9をＳＭＡ部位を含む可能性が高いものとして同定した。４つのＰＡＣ125Ｄ9ゲノムライブラリは、ＰＡＣインサートの全長およびＳau3ＡＩ、ＢamＨＩおよびＢamＨＩ/Ｎotlで切断した部分的断片（平均インサートサイズ５kb)をプラスミドベクターにクローニングすることによって作成した。High through putゲノム配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクローンがＰＡＣ125Ｄ9の大部分をカバーするように(Ｃhen et al.，1993)、5kbの部分的インサートＳau3ＡＩ切断ライブラリから得られた２００クローンの両端について行った。これは、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の構造を説明するための手段を提供する。
【００８３】
ＰＡＣ125Ｄ9は、24kbのセントロメア側フラグメントと130kbのテロメア側フラグメントにＮotl部位で分割され、アポトーシス抑制相同ドメインの上流に位置する最初の膜貫通ドメインの開始位置でＮＡＩＰのエクソン６を二分する(図１１および表４)。Ｎotl ＰＡＣフラグメントはＰＦＧＥによって単離され、胎児脳cＤＮＡライブラリのプローブとして別々に使用された。Ｎotl部位領域の物理的マッピングおよび配列決定も行い、迅速にコード配列を検出するためにＣpＧilandの存在を検定した。ＰＡＣ125Ｄ9はまたエクソン  トラッピングシステムにおける鋳型として使用し(Ｃhurch et al.，1994)、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン５、１２、１６、１７を同定した。
【００８４】
これらの多面的な方法によって、ＮＡＩＰ遺伝子(図１０)を網羅するcＤＮＡクローンを同定した。オーバーラップクローンを同定し、ＰＡＣ125Ｄ9の部分的Ｓau3Ｉ断片ゲノムライブラリのクローンから得られた配列を有するcＤＮＡ末端の共直線化を検出することによって、複数回cＤＮＡクローンのキメラ現象を除去した。この時点で、配列分析結果から、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン７から１３にコードされたタンパク配列は、バキュロウイルスの２つのアポトーシス抑制タンパク(ＩＡＰs)と類似することが明らかにされた。その後まもなく、cＤＮＡプローブを用いて近親婚のＳＭＡ家族から得たＤＮＡを含むサザンブロットをプロービングしたところ、欠失したバンドが明かになった。
どちらのＩＡＰもそのアミノ酸末端に80アミノ酸ＢＩＲ(バクロウイルスＩＡＰ反復)モチーフを含んでおり、約30残基の介在配列の後ろで、33％の一致率で重複していた(Ｃlem and Ｍiller，1993)。同じ現象はＮＡＩＰにも観察される。エクソン６、７、８にコードされたアミノ酸185-250は、エクソン１０、１１、１２にコードされたアミノ酸300-370と35％相同であった。最も長い相同性は、53アミノ酸配列領域全体に観察され、29のアミノ酸が一致していた。
【００８５】
さらに、ＩＡＰドメインのＮＨ2末端では、システインとヒスチジンが豊富な亜鉛フィンガー様モチーフがＣpＩＡＰとＯpＩＡＰの両方のカルボキシ末端に存在する。これらのモチーフはＤＮＡと相互作用することが知られている(Ｂirnbaum et al.，1994)が、ＮＡＩＰ(表４)では認められない。ＮＡＩＰはアポトーシス抑制ドメインと連続性ＧＴＰ結合部位を挟む２つの膜貫通領域を含んでいる。別のタンパク ドメイン プログラムの研究からは、以下のように、上記のタンパク ドメイン評価よりも特異的な結果が得られた。
【００８６】
１．残基 1-91：認識可能なモチーフがないＮ-末端ドメイン
２．残基 92-110：ＭＥＭＳＡＴプログラム(Ｊones et al.，1994)によって膜spanningドメインであることが予知された疎水性ドメイン
３．残基 163-47：バキュウロウイルスのアポトーシス抑制タンパクと相同性を示し、次の疎水性ドメインＧＴＰ／ＡＴＰ結合部位の直接上流に続くドメイン。
４．残基 479-496：ＭＥＭＳＡＴによって膜spanningドメインであると予知される疎水性ドメイン。
５．残基 493-1232：４つのＮ−末端連結グリコシル化部位および１つの原核脂質付
着部位を含む受容体部位。
【００８７】
我々は、少なくとも３つのエクソンは400bpの5'未翻訳領域(5'ＵＴＲ)を含んでおり、これ以外にも存在するであろうことを理解している。この領域の顕著な特徴は、エクソン２の前の5'ＵＴＲの90bp領域と、エクソン２とエクソン３を架橋する領域に完全重複領域が存在することである。さらに、エクソン１７を含む3'未翻訳領域は550bp区間を含み、そこにはニワトリ内在性膜タンパク質であるoccludin(Ｆuruse et al.，1993)との相同性が高く、ＧＲＡＩＬプログラムによって検出される潜在性コード領域が存在する。これがキメラ転写物を表わしている可能性がある。occuldin相同配列は４つの異なるcＤＮＡクローンと遺伝子の２つのアイソフォームに検出されている。推定上の３‘ＵＴＲを有するＮＡＩＰ遺伝子のコード化エクソンを表すocculdin配列が、実際には異核ＲＮＡであるという可能性は、3'ＵＴＲが観察されoccludin相同領域の上流に位置するフレーム内翻訳停止コドンが存在することからすると、ありえないことである。予備的なＲＴ−ＰＣＲ分析結果は、occludin系が転写されていることを示した。
【００８８】
組織発現
成人組織mＲＮＡを含有するノーザンブロットとエクソン１４プローブとのハイブリダイゼーションの結果、成人肝臓(約６kbと約７kbのバンド)と胎盤(７kbのバンド、図６)にのみバンドが検出された。成人ＣＮＳでの発現レベルは、ノーザン分析法では可視バンドを生成するためには不十分であったが、脊髄、繊維芽細胞、リンパ芽球ＲＮＡを用いてたＮＡＩＰ転写物の逆転転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)増幅は、このような組織の転写活性を示唆した。
【００８９】
ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型の検出
ＰＡＣ連続系の解析において、クローン２３８Ｄ１２および３０Ｂ２が、ＮＡＩＰのエクソン６に位置するＰＡＣ１２５Ｄ９と高い配列相同性を示したが、これらのクローンはＰＡＣ１２５Ｄ９のＮotl部位を含んでいなかった。このことは、ＮＡＩＰ遺伝子の重複コピーの可能性を示しており、そのため、さらに解析を進め、ＰＡＣＤＮＡを含むサザンブロットとＮＡＩＰエクソンプローブとのハイブリダイゼーションを行い、またＰＣＲ ＳＴＳに何が含まれているか評価を行った結果、ＮＡＩＰ遺伝子座の異常型２種が検出された。すなわち、一つは、エクソン２〜７が欠失したもの(ＰＡＣ ２３８Ｄ１２)で、他の一種は、エクソン６、７および１２〜１７が欠失したもの(ＰＡＣ ３０Ｂ２および２５０Ｉ７)である。サザン解析によってゲノムＤＮＡおよびＰＡＣＤＮＡに同じ大きさのバンドが存在することと、ＰＣＲの結果から、この欠失は、in vivoの状態よりもむしろin vitroでのＰＡＣアーチファクトを反映するものであるという可能性は排除された。従って、ゲノムＤＮＡサザンブロットをＮＡＩＰエクソンプローブとハイブリダズすると、現れたバンドの数は、ＮＡＩＰ遺伝子の単一コピーをプローブとした場合に予想されるより多かった。例えば、ＢamＨＩ制限切断ゲノムＤＮＡ含有ブロットをＮＡＩＰエクソン３−１１でプロービングすると、同一サイズの連続する14.5 kb ＢamＨＩフラグメントを含むバンドが正常なＮＡＩＰ部位に得られるはずである。(図１１)。ところが、さらに２つのバンドが9.4と23 kb(図１１)に現れた。これは、それぞれＰＡＣ238Ｄ12と30Ｂ2/25017で見られる断片である。9.4kb ＢamＨＩ断片はコスミドからサブクローン化されたもので、欠失のあるエクソン８−11を含んでいるが、この欠失は８番目のエクソンの直前にあるエクソン２から７を組み込んでいる（図１１）。23 kbのバンドはＢamＨi部位から6 kbが欠失して、２つの連続する14.5 kbのＢamＨＩ断片がエクソン２〜５、および８〜１１を含む23 kb ＢamＨＩ断片に置換し、その結果図１１に示したようにエクソン５および６が欠失する。この欠失の左側は、プライマー1933および1926での増幅では遺伝子産物ができるのに対し、1933および1923でのＰＣＲでは遺伝子産物が生成されない(データ示さず)という事実によってマッピングされた。プライマー1927および1933を用いてＰＣＲを行い、6 kbの欠失に及ぶ４．２kbの接合断片を増幅すると（図１１）、サイズおよび配列がゲノムＤＮＡおよびＰＡＣs30Ｂ2/25017において見られるような増幅産物が得られた。様々なヒトゲノムＤＮＡに見られる９．４および23kbバンドの用量が異なることから、ＮＡＩＰ遺伝子の２つの部分的欠失型は、一般母集団に複数かつ多形性で存在することを示している。
【００９０】
非ＳＭＡヒト胎児脳のcＤＮＡライブラリから、エクソン１１および１２（方式＃１）を欠失したクローンを同定し、そのうちの幾つかはさらにエクソン１５および１６（方式＃２）も欠失していたことから、複雑さがさらに高まった。こうしたエクソンの欠失はフレームシフトと非成熟タンパクの切断を生じさせるという事実はそれらが正常なスプライシングの変形であるよりはむしろ、一般母集団に存在する切断または欠失型ＮＡＩＰ遺伝子の転写結果である可能性の方が高いことがわかる（図１１）。以上を総合すると、ＮＡＩＰ遺伝子部位の内部欠失型および切断型は、幾つかは転写されるものであるが、これらの変異遺伝子の様々なコピー数を含む領域のプロフィールが我々の分析から明らかになった。
【００９１】
ＮＡＩＰのエクソン プローブを用いて、体細胞変異ハイブリッドＨＨＷ１０６４(Gillian et al.，1989)のＤＮＡ含有試料をプロービングすると、ＮＡＩＰ遺伝子の全ての形態が、この細胞系の第５染色体に含まれた５q１１−１３．３の３０Ｍｂ欠失領域に限定されることがわかる。以上の知見は、ＮＡＩＰエクソン１３をプローブに用いておこなったＦＩＳＨ検出によっても確認されている（未発表データ）。
【００９２】
ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異分析
ＰＣＲで増幅したＮＡＩＰエクソン３〜１０でゲノムサザンブロットをプローブすると、III型ＳＭＡ患者近親家系24561の発症者４例には、エクソン５および６を含む4.8kbのＥcoＲＩ/ＢamＨＩ断片が欠けていることが判明した（図１１および１４)。この家系についてＢamＨiで消化したＤＮＡを同様に検出すると、14.5kb バンドの欠失が認められ、前記のようにエクソン５および６の欠失に対応した（図１１および１４）。やはり近親関係にあると考えられる他のフランス系カナダ人家族２組にも、これと類似した結果が認められている。
【００９３】
このエクソン５および６の欠失を確認するため、このエクソンと相同のプライマーを作成した(図１１の矢印で示すプライマー1893、1864、1863、1910、1877)。家族24561と別のIII型ＳＭＡ近親家族のＤＮＡをエクソン５特異プライマー（プライマー1864および1863）を用いて、ＰＣＲで典型的な増幅を行うと同時に、エクソン１３配列を同時に反応させてＰＣＲが万が一エラーした場合にも対応できるようにした例を図１５に示す。エクソン５の増幅が存在しないことが、ＳＭＡの表現型と共分離していることが見いだせる。
【００９４】
ＮＡＩＰ遺伝子におけるエクソン５および６の欠失がＳＭＡの突然変異に起因するものかどうかを解析するため、サザン・ブロット解析をおこなった。エクソン５および６の6kb欠失の３‘末端直近にマップされる800bpのＥcoＲＶ単一コピーローブを使用した（図１１）。このマーカーをＥcoＲＩサザン・ブロットとハイブリダイズすると、完全なＮＡＩＰ遺伝子部位のエクソン５および６を含む9.4kbのＥcoＲＩ断片とエクソン５および６が欠失した３kbのＥcoＲＩバンドが検出された。ここで、われわれのＤＮＡ診断ライブラリで得られた筋緊張性ジストロフィー、ＡＤＰＫＯおよび嚢胞性繊維症の家族の９００種以上に及ぶ縁せき関係にない者のＤＮＡを含むＥcoＲＩのサザン解析試料について分析した。9.4kbのバンドは、全ての被検個体に認められたが、これは、約９００の被検者それぞれにエクソン５および６が少なくとも一以上存在する事実と一致する。さらに、被検者全てにこの３kbのバンドが認められたが、これは、一般母集団にエクソン５〜６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子が何らかの形でほぼ全面的に遍在していることを示している。さらに、３kbのバンドの容量にバラツキがあることから、エクソン５−６の欠失したＮＡＩＰ遺伝子のコピーの数は多型性であり、おそらく、ゲノム当たり４〜５コピーであろうと思われる。
【００９５】
次に、ＰＣＲ分析の範囲を拡大してエクソン５および６プライマーを用いて１１０のＳＭＡ家族に適用した。Ｉ型ＳＭＡ患者３８例中１７例名(４５％)、およびII型およびIII型ＳＭＡ患者７２例中１３例(１８％)に、このエクソンのホモ接合欠失が認められた。染色体がランダムに並んでいると仮定し、エクソン５〜６の欠失したホモ接合個体の実測頻度の平方をとると、Ｉ型ＳＭＡの６７％とII型／III型ＳＭＡの４２％について、エクソン５〜６の欠失した染色体が発現すると予想される頻度予測値が得られる。次に、増幅がうまくいかなかったＳＭＡ発症児の親１６８名についてＰＣＲ分析をおこなった結果、被検者３例においてエクソン５および６のホモ接合欠失が示唆された。この知見は、今回のアッセイには十分なＤＮＡによるサザン解析により、２例において確認された。この２名は、年齢２８歳と３５歳でともにＳＭＡ発症児の親で、電話でのインタビューで、体は健康で、ＳＭＡの発症はないと答えた。以上から結論として、単離されたＮＡＩＰのエクソン５〜６の欠失は、下記のようにＳＭＡ発症個体におけるより重度の欠失を表わしているものとも思われるが、臨床学的には無害であることから、極めて軽微なＳＭＡか正常な表現型に関係しているものと思われる。以上の個体について臨床学的評価が現在おこなわれている。
【００９６】
胎児脳のライブラリーとＰＴ−ＰＣＲ ＮＡＩＰ遺伝子産物から検出されたcＤＮＡのクローン(図２)から判断すると、ＮＡＩＰ遺伝子の多くの、そしておそらくは全ての切断されコピーは転写されているように思われる。ＳＭＡ患者でそのゲノムにエクソン４および５のコピーを持っていない者の親３名については、表面上ＳＭＡの影響を受けていないと思われる状態を考えると、ＮＡＩＰのエクソン５〜６の欠失型も翻訳されていると考えられる。このモデルによると、エクソン５および６が欠けると、フレーム内で欠失が生じ、上流の最も長いＮＡＩＰの読み取り枠が上流に伸びてヌクレオチド211位のエクソン３開始メチオニンにまで達する。
【００９７】
さらに、欠失したエクソン５および６のＩＡＰモチーフがコードするタンパク配列は、エクソン１０および１１でコードされたＩＡＰモチーフに約３５％相同である。このことは、エクソン５〜６が欠失した上記３例の個体において、識別可能な表現型が存在しないことの理由となるかもしれない。モデルとして一つ考えられるのは、各染色体上にエクソン５〜６が欠失したＮＡＩＰのコピーが一つだけあると、ＳＭＡの弱い表現型が生じ、一方、エクソン４−５が欠失したＮＡＩＰ遺伝子座のコピーを３ないし４以上もつ個体の場合は、臨床学的に影響を受けないということである。ＳＭＡ遺伝子が重複することがこの疾患の基本条件であるのではないか、という可能性が、ＤiＤonadoらによってこのほど提唱されている(１９９４年)。
【００９８】
ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅
ＳＭＡ患者と非ＳＭＡ患者のＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を図１６に示す。
ここで得た知見では、内部に欠失がみられ、かつ切断されたＮＡＩＰ遺伝子型は、少なくともその一部は転写されていた。機能的タンパクを産生する正常なＮＡＩＰ遺伝子の転写と、生成しないものの転写とを区別するため、できるだけ大きな転写体をＲＴ−ＰＣＲ増幅することを試みた。エクソン１４の大きさが2.2kbだとすると、これはエクソン２とエクソン１３の５’末端を含んだものであることがわかった。第１回目のＰＣＲ後の臭化エチジウム染色段階では遺伝子産物は検出されなかった。従って、先の図１６の説明のように二次の分枝増幅を行った。
【００９９】
ＲＴ-ＰＣＲ増幅実験の代表的な例を図１６に示す。すなわち、非ＳＭＡ組織のＲＮＡを鋳型に使い、エクソン１０または１３からの逆転写産物をＰＣＲ増幅すと、予想されたサイズの産物が一貫して増幅された。これとは対照的に、ＳＭＡ組織のＲＮＡを用いた同種のＲＴ−ＰＣＲ実験の結果、５例ではまったく増幅が認められなかったが、これは、この５例においては正常な転写が著しく制限されたか、あるいは転写が行われなかったことを示す（図１６Ａ９）。ＳＭＡ組織のＲＮＡは、死後わずか１２時間後に得られた。死後２４時間の正常な組織から完全なＮＡＩＰ転写を増幅するのは困難でないから、今回の増幅に伴う困難の原因はＲＮＡの劣化によるものだとは考えられない。また、増幅の困難性はＳＭＡ組織すべてについても見られるが、これは、ＮＡＩＰが運動ニューロンでのみ転写され、この運動ニューロンはＳＭＡではその細胞型を消失して居るために、脊髄組織でのＲＴ-ＰＣＲが成功しなかたったという可能性を否定するものである。
【０１００】
増幅が観察された事例では、ＲＴ-ＰＣＲ遺伝子産物の配列決定の結果、図１６Ａ，１６Ｂ，１６Ｃに示すように次の知見が得られた。
(i)  試料a９のエクソン５の３'末端からのコドン１５３および１９０の欠失。
(ii) 資料a２のエクソン５プライマー1864およびエクソン１３プライマー1974により増幅した産物において、７３番目ヌクレオチドにある終止コドンのエクソン７へのフレームシフトを生じさせるエクソン６の欠失。
(iii)試料a７のエクソン４のプライマー１８８６とエクソン１３のプライマー1974により増幅された遺伝子産物への約５０ヌクレオチドの挿入。
(iv) 試料a３のエクソン５のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974による増幅産物のエクソン１１および１２の欠失と合わせて、エクソン５のグルタミン酸コドン番号１５８の欠失。
(v)  試料a２、a３、a９、a１１においてエクソン９プライマー1844およびエクソン１３プライマー1974による増幅産物において、終止コドン１４ヌクレオチドのエクソン１３へのフレームシフトを生じさせるエクソン１１および１２の欠失。
【０１０１】
以上を要約すると、エクソン１３からの逆転写産物に対するＰＣＲを行った結果、１２例の非ＳＭＡ組織からは目的遺伝子産物がうまく増幅されたのに対し、１２例のＳＭＡ組織では増幅が成功したのは１例に過ぎなかった。後者の場合、すなわち、試料a１２においては、増幅が行われたのはエクソン１３から１４に限られ、その転写には、エクソン２〜３あるいはエクソン１４〜１７が含まれているどうかは不明である。以上のデータは、ＮＡＩＰがＳＭＡの原因遺伝子であるという強力な証拠であると考えられる。
【０１０２】
ＮＡＩＰ蛋白質の役割
神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子が第５染色体のＳＭＡ領域で発見されたことは、ＳＭＡの状態がアポトーシス抑制タンパクドメインにおける欠失の結果によるものであることを示している。運動ニューロンが長時間生き残るかどうかは、神経アポトーシス抑制タンパクアが生成されるかどうかにかかっている。このアポトーシス抑制タンパクドメインの欠失は、このタンパク活性を阻害する。我々は、ＳＭＡ患者全体の１７パーセント近くに、第５染色体のエクソン５および６の欠失が認められたことを実証した。
【０１０３】
５ｑ１３．１の同定領域にはＮＡＩＰ遺伝子の完全なコピーと一部欠失したものが不定数含まれている。５ｑ１３．１には別に遺伝子座があってその突然変異がＳＭＡ表現型の発現の原因となることは否定できないが、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異はＳＭＡの発症には必要かつ十分であると考えられる。ほとんどの常染色体性劣性遺伝病では、その原因となる突然変異が所与の遺伝子の単一コピーに認められるのが通常であるが、これとは対照的に、ＳＭＡ染色体は、重度のＳＭＡ突然変異の場合には、正常なＮＡＩＰ遺伝子のみならずエクソン３および４が欠失した変異型も不足しているか、あるいは全く存在していないことによって特徴づけられるということである。こうした染色体の出現に際しては、不均衡なクロスオーバーが関与し、上記遺伝子座に欠失が生じ、その結果、ＮＡＩＰ遺伝子産物が欠け、ＳＭＡが発症するように考えられる。
【０１０４】
ＳＭＡの診断
所与の個体におけるＳＭＡの遺伝子型を説明することは、５ｑ１３．１領域におけるＮＡＩＰ遺伝子の異常増幅によって複雑となる。ＮＡＩＰエクソン・プローブでゲノムＤＮＡ含有サザンブロットをプロービングすると、ＮＡＩＰ遺伝子の内部欠失型および切断型コピーから生じたバンドが見られる。従って、一般母集団においては、多様な形態のＮＡＩＰ遺伝子座が不定数存在するのが正常であり、それだけではＳＭＡ突然変異の判定要素とはならず、それ故に、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異分析は複雑となる。ＮＡＩＰ遺伝子座の変異体を含有したゲノムＤＮＡが検出されても、ＳＭＡ染色体の証拠とはならず、正常な遺伝子が欠損しているかどうかを探求しなければならない。しかし、ゲノム中にエクソン３−４のコピーがないにもかかわらず、臨床上は疾患の形跡がないという珍しい患者を我々は検出した。これは、我々がＮＡＩＰ遺伝子構造について理解していることと一致する知見である。従って、ＳＭＡ染色体の同定は、完全なＮＡＩＰと、エクソン３−４だけが欠失したＮＡＩＰ型の両方が不在であることに依存する。それが欠けているかどうかを検定する作業は複雑なものとなる。それは、ＮＡＩＰ遺伝子座でもう一つ、欠失のさらに進んだ形のものそれぞれに正常なＮＡＩＰ断片が存在するためにである。例えば、ＳＭＡ患者がそのゲノムにＰＡＣ ２３８Ｄ１２と３０Ｂ２、すなわち各々エクソン１−６およびエクソン５、６と１１−１４が欠失したＮＡＩＰの欠失型（図１０、１１）だけを持っている場合、ＰＣＲとサザン・ブロット解析ではＮＡＩＰのエクソン５−６だけが欠失した型を持っていることになり、従って、ＳＭＡ染色体は含んでいないように見られる。我々は、観察した多数のエクソン５−６の欠失したＳＭＡ患者の多く、おそらくはその大部分が、実際にこうした構造の染色体を持ち、欠失のないＮＡＩＰ遺伝子座もエクソン５−６だけが欠失したＮＡＩＰ型も含んでおらず、何か別の遺伝子座に重度な切断／欠失の認められる型を組み合わせたものを含有していて、その結果、欠失のないＮＡＩＰの翻訳ができないのだと考えている。こうした解釈の裏付けとなるのは、我々が、Ｉ型ＳＭＡ組織のＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを用いて、正常なＮＡＩＰ転写体を増幅させることができないという事実による。
【０１０５】
以上を総合して、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異またはその欠失がＳＭＡの原因となるという見解を支持する証拠をあげると次のようになる。
【０１０６】
(i)  ＮＡＩＰは、バキュロウイルスのＩＡＰと相同性があることを考えると、アポトーシスの抑制因子として作用する可能性が高いこと。この特性はＳＭＡの病理と完全に呼応するものである。ここで注目に値するのは、従来より、アポトーシスの調節遺伝子の変異がＳＭＡの原因ではないかと推測されていたことである(Ｏppenheim 1991，Sarnat，1992)。
【０１０７】
(ii) 組換えの範囲内でのＮＰＩＡ遺伝子座のマッピングは重大なＳＭＡ区間を規定すること、Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡状態にあることが判明している３種の多型マーカー、すなわち、ＣＡＴＴ−４０ＧＩ(Ｍclean et al.，1994)、Ｃ272(Ｍelki et al.，1994)およびＡＧ−１(ＤiＤonate et al.，1994)は全てＰＡＣ 125Ｄ9に位置し、ＮＡＩＰイントロン上に存在する(図９Ｃ)という事実。
【０１０８】
(iii)Ｉ型ＳＭＡの表現型と５ｑ１３．１マーカーの間に見られる連鎖不均衡の性質。我々は、非ＳＭＡ染色体でしばしば重複しているＣＴＴ-４０Ｇ１ ＣＴＲ下位部位(Ｒoy et al.，1994)の欠失が、非ＳＭＡ染色体では４５％(ＭcＬean et al.，1994)であるのに対して、Ｉ型ＳＭＡでは８０％であることを見出している。この知見は、ＳＭＡ染色体におけるＮＡＩＰ遺伝子数の欠失とよく一致する。同様に、Ｍelki et al.，1994は、Ｉ型ＳＭＡにおけるＣ272 ＣＴＲのバンド数の減少を伴う"ヘテロ接合体不全"を観察し、彼らはこれを、染色体欠失を反映するものであると提案している。ＤiＤonato et al.,(1994)もまた、非ＳＭＡ患者に比べて、Ｉ型ＳＭＡ患者ではＡＧ１ ＣＴＲ下位部位の数の著しい減少を見出している。Ｉ型ＳＭＡ染色体でのこれらＮＡＩＰ内マーカーの欠失に関する３つの研究グループの観察結果は、ＮＡＩＰ遺伝子の正常型とエクソン５−６欠失型双方の欠如または不在が疾患の原因となるというモデルと良く一致する。
【０１０９】
(iv) ＮＡＩＰエクソン５−６の欠失割合は、非ＳＭＡ染色体での検出(２-３％)に比べて、ＳＭＡ染色体で検出される割合が著しく高い(Ｉ型ＳＭＡ染色体で約６７％、II／III型ＳＭＡ染色体で４２％)。既に概観したように、この現象は、ＳＭＡ染色体において正常なＮＡＩＰ遺伝子とともにエクソン５から６のみが欠失したＮＡＩＰ変異型の双方が現象または不在であることを反映するものであり、ＮＡＩＰ遺伝子のより重度な内的欠失型および切断型が表出されていると思われる。
【０１１０】
(v)  １２名の非ＳＭＡ患者からのＲＮＡは全てＲＴ-ＰＣＲで増幅できたにも関わらず、１２名中１１名のＳＭＡ患者からのＲＮＡの転写物は一貫してＲＴ-ＰＣＲ増幅することはできなかった。さらに、Ｉ型ＳＭＡ材料から得ることのできたＰＣＲ産物の配列を決定したところ、様々な突然変異と欠失が明らかになった。
【０１１１】
(vi) ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型のコピーが不定数存在することは、常染色体優性多発性嚢胞腎臓病(ＡＤＰＫＤ，Ｅuropean Ｐolycystic Ｋidney Ｄisease Ｃonsortium，1994)で報告されている状況と類似している。このケースの場合には、原因遺伝子に対応するプロセスされていない偽遺伝子の位置が第１６染色体以外の場所にマッピングされることが見出されている。主な相違点は、ＮＡＩＰの遺伝子座では、その遺伝子の突然変異型が増幅されるという点である。
【０１１２】
この点に関して、５ｑ１３．１のＮＡＩＰ領域は、ステロイド２１−ハイドロキシラーゼをコードする遺伝子ＣＹＰ２１を含有する第６染色体の領域との類似性が高い(Ｗedell and Ｌuthman，1993)。ＣＹＰ２１は突然変異すると常染色体性劣性２１ハイドロキシラーゼ不全を引き起こすが、これは個体中のコピーが０−３個の時に観察されている。また、この領域にはＣＹＰ２１の不活性の偽遺伝子コピー(合わせて、ＣＹＰ２１Ｐという)が不定数存在する。ＣＹＰ２１の突然変異体の大多数は２１ハイドロキシラーゼ不全で観察されているだけでなく、ＣＹＰ21Ｐの幾つかの形態でも検出できることから、この偽遺伝子はＣＹＰ２１で見られる突然変異の発生源として作用すると考えられる。切断および内的欠失を有するＮＡＩＰ遺伝子が類似しているのはＣＹＰ21Ｐのみであり、ＣＹＰ21／ＣＹＰ21Ｐについて想定される遺伝子変換の代わりに、機能性タンパクをコードするＮＡＩＰ遺伝子形態を欠失させるような不均衡なクロスオーバーが染色体に生じる可能性がある。５ｑ１３．１上における変異ＮＡＩＰ遺伝子の多型性の存在は、上記のようにしてＳＭＡ染色体が発生する機序だと考えられる。
【０１１３】
バキュロウイルスＩＡＰ
ＮＡＩＰは、ＣpＩＡＰおよびＯpＩＡＰという昆虫細胞のアポトーシス抑制能をもつ二種のバキュロウイルスＩＡＰと高い相同性を示す(表４)。昆虫の細胞アポトーシスはバキュクロウイルス感染によって生じるが、これについては十分に実証されており、防衛メカニズムの一種と考えられている。感染した昆虫の細胞が早期に死亡する結果、ウイルスの複製が弱められる(Ｃlem and Ｍiller，1994a)。ＣpＩＡＰおよびＯpＩＡＰは、こうしたアポトーシスメカニズムに対するバキュロウイルス反応を表すものであると考えられる。両タンパクとも互いに関係なく作用し、宿主昆虫細胞アポトーシスを抑制することによってウイルスの増殖を増加させる(Ｃlem and Ｍiller，1994a，1994b)。これらのタンパクは相互にのみ強い類似性を有することが知られているが、最近までcrossphyla タンパクとの配列上の類似性は報告されていなかった。その作用形態は知られてはいないが、ＤＮＡとある程度相互作用することものと想定されている。
【０１１４】
ＮＡＩＰの働きおよび細胞局在性についてはまだ明らかにされていない。しかし、系統発生的にかなりかけ離れたＮＡＩＰ配列とバキュロウイルスＩＡＰ配列との強い類似性と、先に想定したようなＳＭＡの発生病理における異常なアポトーシスの役割とを考えあわせると、ＮＡＩＰは運動ニューロンにおいてアポトーシス抑制因子として作用する可能性が高い。ＮＡＩＰを用いて昆虫および哺乳類の神経細胞にトランスフェクション・アッセイをおこなえばこの点が明らかになるであろう。
【０１１５】
一つの可能性は、ＮＡＩＰのカルボキシル末端が特異なリガンドに結合してＧＴＰの結合部位を活性化させ、それがＩＡＰドメインを活性化させるということである。従って、運動ニューロンが生存できるかどうかは、リガンドが存在するかどうかで決まることになる。濃度が閾値以下に低下すると、ＩＡＰ領域は機能が停止し、その結果、細胞が死ぬ。これは胚形成過程で観察される運動ニューロンが自然選別されるメカニズムと考えられる。リガンドは筋肉細胞あるいはシュワン細胞のいずれかから発生すると考えられる。以上から、運動ニューロンの胚形成は細胞間における一種の競争と見ることができ、ＮＡＩＰの占有率を維持できるだけの接触をおこなう細胞だけが生き残ることができるのである。
【０１１６】
想定した通りにＮＡＩＰがアポトーシスを抑制するとしても、ＮＡＩＰがこれまでに特性化されていない哺乳動物のアポトーシス経路の成分であるのか、ヒトのアポトーシス抑制因子であるＢcl-2(Ｖaux et al.，1988; Ｈockenberry et la.，1990; Ｇarcia et al.，1992)に関わる経路の上流成分(と考えられるもの)であるのかは不明である。アポトーシス抑制因子の欠落したバキュロウイルス株を用いて検査した結果、Ｂcl-2はそのような欠落を補完はしないことが明らかとなった(Ｃlem and Ｍiller，1994b)。ＮＡＩＰがバキュロウイルスの機能的相似体であるとすれば、この観察からわかることは、従来特性化されていない真核細胞アポトーシスの経路においての何らかの役割が示唆される。可能性として一つ考えられるのは、ＮＡＩＰは、神経栄養性サイトカイン、繊毛の神経栄養性因子(ＣＮＴＦ，Ｒaff et al.，1993; Ｍeakin and Ｓhooter，1993)またはこの経路の下流成分の一種(Ｓtahl et al.，1994)を伴った新規なアポトーシスメカニズムとの交差を表わすということである。ＣＮＴＦナルマウスはＳＭＡと類似した病理学的態様を示し、ニューロンの正常な発達に続いて最初は徐々にアポトーシス的欠失状態が続く(Ｍasu et al.，1993)。さらに、正常な状態での神経栄養因子の剥奪は培養ニューロンにアポトーシスを生じさせるが、ＣＮＴＦだけではＢcl-1で救済されるようなアポトーシスを抑制することはできないということは注目すべきである。こうした知見に基づいて、その研究者等は第２の真核細胞アポトーシス経路の存在を示唆している(Allstopp et al.，1993)。このような別々の経路の存在は、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)およびＣＮＴＦ(Ｍitsumoto et al.，1994)で処理後に、Ｗobblerマウスの突然変異体における運動ニューロンの欠損が顕著に遅延することに見られる相乗効果を裏付けるものかもしれない。
【０１１７】
ＮＡＩＰの脂質付着部位の役割は知られていない。同種の部位は、通常はタンパクのアミノ末端にある原核タンパクのリーダー配列としての役割を果たすことが知られている。我々は、Ｓwiss-Ｐrotein Ｄatabase(release-２８)の２１８のヒト配列に共通パターンを検出した。これらの配列は多様な機能的背景に存在する。例えば、トランスメンブラン領域、シグナル配列、細胞外領域および細胞質領域などである。一つ考えられるのは、リポタンパク質付着部位は細胞外にあり、インテグリンと細胞外マトリックスとのアポトーシス抑制性相互作用について想定されているような方法でシュワン細胞のプロテオリピッドの成分を結合するということである(Ｍededith et al，1993; Ｆrish and Ｆrancis，1994)。さらに、この付着部位は我々がノーザンブロット解析で観察した肝細胞のＮＡＩＰにおいてはより積極的な役割を果たしているとも考えられる。また、ＳＭＡ発症児には血清脂肪酸異常が検出されたことは注目に値する(Ｋelley and Ｓladky，1986)。
【０１１８】
５ｑ１３．１の同定領域は、ＮＡＩＰ遺伝子の他に、ＮＡＩＰ遺伝子の内部欠失／切断型のコピーも不定数含んでいる。完全なＮＡＩＰ遺伝子と、特定個人のゲノムからエクソン５および６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子座の両方が欠損または不在であることがＳＭＡの原因でると我々は考えている。この点について、我々はＮＡＩＰを同定したことにより、ＳＭＡの正確な分子的診断法を整備することができるだけでなく、このような疾病状態に対する伝統的な治療法と遺伝的治療法とを公式化することがが可能となったのである。さらに、ＮＡＩＰ遺伝子座とＮＡＩＰと相互作用するタンパクとの相同性を示す遺伝子の同定により、哺乳類細胞におけるアポトーシスのメカニズムをさらに明らかとするための助けとなるかもしれない。
【０１１９】
実施例
Ｆamily Ｍaterial
ＭacＫenzie et al，(1993)に記載の方法で、所定の診断基準を満足する患者を対象に臨床的診断をおこなった。記載に従ってＤＮＡを抹消白血球から単離した(ＭacＫenzie et al.，1993)。
【０１２０】
遺伝的分析および連鎖不平衡分析
ミクロサテライト  マーカーによる遺伝子型の決定は、ＭacＫenzie et al．(1993)およびＭcＬean et al．(1994)に従って行った。既に述べたように、次の5q13.1部位を用いた。Ｄ5Ｓ112(Ｂrzusowitcz et al.，1990)、Ｄ5Ｓ351(Ｈudson et al.，1992)、Ｄ5Ｓ435(Ｓoares et al.，1993）、Ｄ5Ｓ557(Ｆrancis et al.，1993)、Ｄ5Ｓ629およびＤ5Ｓ637(Clermont et al.，1994）、Ｄ5Ｓ684(Ｂrahe et al.，1994)、Ｙ98Ｔ、Ｙ97Ｔ、Ｙ116Ｔ、Ｙ122ＴおよびＣＭＳ(Ｋleyn et al.，1993)、ＣＡＴ(Ｂurghes et al.，1994;ＭcＬean et al.，1994)およびＭＡＰＩＢ(Ｌien et al.，1991)。
【０１２１】
ミクロサテライトの繰返しで見られる複数対立遺伝子に対応できるパラメタを用いて連鎖不平衡分析をおこなった。不平衡分析は元来複雑なことを考え、複数の対立遺伝子に対応可能な計４種のパラメタを用いた。このパラメタとは、Ｈderick(1987)に規定されているＤij、Ｄij'およびＤ'ならびにｘ2検定である。うち２種、Dij，Dij'は筋緊張性ジストロフィーに関する以前の研究(Ｐodolsky et al.，1994)において後見的位置情報として最適であるとされている。患者とコントロール母集団はＭcＬean et al,(1994)のとおりである。
【０１２２】
コスミド、ＹＡＣ、ＰＡＣの系列化
コスミドとＹＡＣ連続系列についてはＲoy et al.,(1994)に概要が述べられている。ＰＡＣはloannou et al.,(1994)の記載に従って作製した。以上の方法を用いて合計175,000個のクローンからなるＰＡＣライブラリを３つ作製し、マイコロタイター皿に個別クローンとして増殖させた(lannou et al.，結果未公表)。３つのライブラリ(ＬＬＮＬ ＰＡＣ １、ＲＰＣＩ1、ＲＰＣＩ2と命名)を5q13.1ＳＴＳ'sでスクリーニングした。ポジティブなＰＡＣを配列して、互いに連続的にオーバーラップするように配置し、さらにＳＴＳを加えて解析するとともに、単一コピーのゲノムＤＮＡとcＤＮＡプローブを用いてＰＡＣ ＤＮＡを含有するサザンブロットをプロービングした。
【０１２３】
ＤＮＡ操作および分析
ＰＡＣゲノムＤＮＡインサートをＢamＨＩ，ＢamＨＩ/Ｎotl、全および部分的Ｓau3aＩ(5kbのインサートサイズに合わせて選択)で消化することにより、ＰＡＣ 125Ｄ9インサートを含む４種のゲノム・ライブラリーを作製し、これをＢlue scriptベクターにサブクローニングした。Ｃhen et al．(1994)の方法により、部分Ｓau３ＡＩ消化ライブラリーから得た５kbのクローン２００個について両末端の約400bpの配列を決定した。
【０１２４】
ＰＡＣのコード配列をＣhurch et al．(1994)に記載されたエクソン増幅法で単離した。ＰＡＣをＢamＨＩまたはＢamＨＩおよびＢgl IIIで消化させ、サブクローニングしてpＳＰＬ3を得た。各ＰＡＣのプールしたクローンをＣＯＳ−1細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、ＲＮＡ全体を抽出した。エクソンはpＡＭＰ10(Ｇibco，ＢＲＬ)にクローニングし、プライマーＳＤ２(ＡＴＧＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ）を用いて合成した。
【０１２５】
ＡＢＩ ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーによりＤＮＡの配列決定を行った。λgt(Ｓtratagene)およびλＺＡＰ(Ｃlontech)の市販ヒト胎児脳cＤＮＡライブラリーを用いて転写物の候補を単離した。ノーザンブロットは市販品を入手し(Ｃlontech)、標準的な方法で検出を行った。
【０１２６】
一般に、文献でＰＣＲ用に使用されるプライマーは６０℃のＴmＳに選択されたもので、９４℃、６０秒；６０℃、６０秒；７２℃、９０秒を３０サイクルという条件で使用される。ＰＣＲプライマーのマッピングは図面および本文に記載の通りである。
プライマーの配列は下記の通りである。
【０１２７】
2006025797.tif 000003
2006025797.tif 000004
【０１２８】
ＲＴ−ＰＣＲ
７μｇの完全なＲＮＡを用い、２０μｌの反応溶液でcＤＮＡを合成した。このＲＮＡを５分間９５℃で変性し、３７℃で冷却した。５μｌ５×の逆転写緩衝液、２μｌ0.1Ｍ ＤＴＴ、412.5mＭ dＮＴＰ、８単位 ＲＮＡsin、25ng cＤＮＡプライマー(1285)および４００単位 ＨＭＬＶ(Ｇibco，ＢＲＬ)を添加後、４２℃で１時間逆転写反応を行った。その後、５０μｌＰＣＲの反応では鋳型として１μｌのＤＮＡを用いた。この一次ＰＣＲ１μｌを鋳型に用いて二次ＰＣＲ増幅を行った。
【０１２９】
配列分析
一次ＤＮＡ配列データをＴＥＤプログラムで編集した(Ｇleeson and Ｈillier,1991)。部分Ｓau３ＡＩ消化ライブラリーの部分的にアミノ酸配列が決定されている5kbクローン２００のうちなるべく多数を、ＸＢＡＰ Stadenパッケージにより配列し、オーバーラップする列にした(Ｄear and Ｓtaden，1991)。また、ＧＣＧ Ｓequence analysis(Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup，1991)により配列データを組立て、分析した。Ｐrocite proteinデータベース(Ｂairoch and Ｂutcher，1993)を検索して蛋白質領域の相同性を検出した。ＭＥＭＳＴＡＴプログラムも使ってトランスメンブランドメイン領域の検索もおこなった(Ｊones e tal.，1994）。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
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図面の説明
【０１３５】
ＮＡＩＰ遺伝子のエクソンの番号は０から１６まで順次付けられている。これは、配列番号方式＃１として図面に記載した。ただし、従来のエクソン番号についてはエクソン１からエクソン１７までが好ましい。そこで、配列番号方式＃２として区別した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１はＳＭＡ遺伝子領域のＹＡＣ連続アッセイである。ＹＡＣは実線で示されている。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、白四角は単一コピープローブを示す。遺伝学的に定義されたＳＭＡ区間であるＣＭＳ-1-ＣＭＡ-Ｄ5Ｓ557および従来のＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間をＹＡＣ上方に示した。
【図２】図２はＳＭＡ領域の長距離制限地図である。低頻度切断(Rare Cutter)部位は実線上方に示した。マーカーの最小セットをpYMC4トリプトファンに対応する実線t下方または左端に示した。ｕはpＹＭＣ4ウラシルまたは右端に対応する。遺伝的に定義されたＣＭＳ-1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間およびＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間は、それぞれ550kbと1.1Mbであると推定される。
【図３】図３はCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。(Ａ)はＹＡＣの増幅であり、ＧはゲノムＤＮＡを示す。(Ｂ)は第５染色体移動選別ライブラリ由来のコスミドの増幅である。４つの異なる対立遺伝子をコスミド40G1(対立遺伝子15)、58G12(対立遺伝子12)、192F7(対立遺伝子10)および250B6(対立遺伝子7)によって示した。
【図４】図４は我々の連続系列からマッピングされたコスミドの代表例を示す。実線上方の垂直線はＥcoＲl部位である。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、黒四角は単一コピープローブを示し、白四角は転写配列を示す。Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡を示すＳＴＲｓは星印で示した。コスミドlＧ3とlＧ9はＹＡＣ 76 Ｃlコスミドライブラリから得られる。
【図５】図５はp151.2によって同定されるＳＭＡ領域の配列重複である。ＹＡＣのハイブリダイゼーションは、(Ａ)では700bpのフラグメント、(Ｃ)では500bpのフラグメントを用いた。ＹＡＣは、左から右に、セントロメアからテロメアまでが配列されている。コスミドのハイブリダイゼーションは、(Ｂ)では700bpのフラグメント、(Ｄ)では500bpのフラグメントを用いた。(Ｂ)では、12kbのフラグメントがコスミドに検出されたが、20kbのフラグメントは存在しない。2.5kbのフラグメントおよび600kbのフラグメントは、それぞれ3Ｂ3と、ＩＥＩに検出されたが、これらは末端フラグメントである。(Ｄ)では、３kbのフラグメントしかコスミドに検出されなかった。24Ｄ6の20kbバンドは(Ａ)では検出されていないが、(Ｃ)では存在することに留意されたい。700bpフラグメントは24Ｄ6に検出される場合もある。
【図６】図６はＩ型ＳＭＡと各種多形性5q13.1標識との間に観察される連鎖不平衡度が、40Ｇ1で不平衡ピークを示す図である。
【図７】図７は9クローンから構成されるＣＡＴＴ領域を含み、約400kbに及ぶＰＡＣ連続系列を示す。
【図８】図８はＳＭＡ遺伝子の構造を示す。エクソンを黒枠で示し、上方に番号を付けた。制限部位が図示されているが、ＢはＢamＨＩ、ＥはＥcoＲＩ、ＮはＮotlである。エクソン４およびエクソン５(方式＃１)または方式＃２のエクソン５および６は全てのタイプのＳＭＡでしばしば欠失している。
【図９】図９は図６、１、７、および８のそれぞれに開示された内容を単ページに配置した図である。図９(Ａ)は、病状表現型および物理地図を伴った６つの5q13.1標識について、Ｉ型ＳＭＡ家族に観察される連鎖不平衡度の相関を示す。本明細書記載の主要な組換えによって定義されるＳＭＡ含有区間が示されている。不均衡のピークが、組換え体によって規定されたＳＭＡ区間のセントロメア末端に隣接していることに留意されたい。
【図９Ｂ】図９(Ｂ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＹＡＣ連続系列である。ＹＡＣおよびＰＡＣの連続系列については、ＳＴＳsを黒三角で示し、多形性縦列反復の多形性を白三角で示し、単コピークローンを黒四角で示した。特に、以下の点を留意されたい。すなわち、我々の物理地図は、星印を付けた対立遺伝子９を含むＣＭＳ下位部位を他のＣＭＡ下位部位のテロメア側に配置しており、遺伝的組換えデータによれば逆転が観察されることから、我々は、5q13.1のこの領域に変異型が存在することを確信している。
【図９Ｃ】図９(Ｃ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＰＡＣ連続系列である。
【図９Ｄ】図９(Ｄ)は、図８に詳細に記載されたＮＡＩＰの遺伝子構造である。
【図１０】図１０は、ＰＡＣ、非ＳＭＡ個体由来の胎児脳cＤＮＡクローンおよびＳＭＡ患者由来のＲＴ-ＰＣＲクローンのエクソン内容である。Ｅ158はグルタミン酸残基の欠失を示している。ＲＴ-ＰＣＲは方式＃２のエクソン１３とエクソン４の間で行われたが、この領域の外側では未検出の欠失がさらに存在することが考えられる。
【図１１】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。図１１Ａでは、方式＃２に基づくエクソンを番号付けした黒枠として記した。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。図１１Ｂでは、明細書中で言及されている3kbおよび9.4kbのＥcoＲＩバンドを検出するＥcoＲＶクローンをＥＶと記した。図１４では欠失した4.8kbのＥcoＲＩ/ＢamＨＩバンドも記した。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域とこの欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｃおよび１１Ｄに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
【図１２】図１２は、ＮＡＩＰ遺伝子のイントロン／エクソンスのスプライス配列である。
【図１３】図１３は、ＮＡＩＰ部位のエクソン１３(方式＃２)をプローブとした成人組織のノーザンブロットである。組織は標識化され、フィルターは50℃、0.2×ＳＳＣで洗浄され、４日間露呈させた。バンドは、肝臓および胎盤に6-7kbの範囲で観察することかができる。
【図１４】図１４は、近親婚のフランス系カナダ人のIII型ＳＭＡ家族の家系分析結果およびサザンブロット結果である。上のパネルは、ＢamＨＩ/ＥcoＲＩで切断したゲノムＤＮＡを、ＮＡＩＰのエクソン２から９(方式＃２)までを含むcＤＮＡプローブで探索した結果、エクソン５および６(方式＃２)を含む4.8kbのフラグメントが全患者で損失し、フレーム内欠失が生じていることを示している。その他全員は、ホモの正常な姉弟を除き、このバンドの用量は半分であった。下のパネルは、同じ家族のＢamＨＩ断片を示す。患者では、2つの重なった14.5kbの連続フラグメントがＢamＨＩ部位を含む6kb配列を欠失しており、その結果23kbのバンドが生成されている(図１１参照)。家系のすべての個体の23kbのＢamＨＩバンドの存在は、母集団全体のばらつきと一致することに留意されたい。同様に、ＰＡＣ238Ｄ12に含まれ、かつ図１１に示される方式＃２のエクソン１から６までの欠失を示す9.6kbのＢamＨＩバンドが、非ＳＭＡキャリアーを含む個体すべてに確認することができる。
【図１５】図１５は、エクソン５(方式＃２)を増幅するプライマー1864および1863を用いてIII型家系21470および24561をＰＣＲ増幅した結果である。この反応は、エクソン１３(方式＃２)のプライマー1258および1343を用いて多数回行い、結果を曖昧にするＰＣＲの不良を除外した。増幅不良は、エクソン５(方式＃２)のホモ接合の不在に一致し、病状表現型と共分離することがわかる。
【図１６】図１６は、ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織から得られたＲＴ-ＰＣＲ増幅の結果である。文字ｎは、非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡを指し、aはＳＭＡ疾患組織由来のＲＮＡを指す。組織源は、各パネルの上に示した。lymはリンパ芽球を指し、fibは繊維芽細胞を指す。a５を除くすべての試料はＩ型ＳＭＡ患者から得られ、a５は図１５に示す近親婚のIII型ＳＭＡ家系24561から得られた。ＲＮＡは、エクソン１３(方式＃２)から逆転写された。パネルＡおよびパネルＢに示される一次ＰＣＲ産物には、エクソン１のプライマー1884とエクソン１３のプライマー1285または1974を使用し、パネルＣに示される一次ＰＣＲ産物にはエクソン６のプライマー1919とエクソン１３のプライマーとを使用した。パネルＡの二次ＰＣＲには、エクソン４のプライマー1886とエクソン１３のプライマー1974とを使用し、パネルＢの二次ＰＣＲには、エクソン５のプライマー1864とエクソン１１のプライマー1979とを使用し、パネルＣの二次ＰＣＲには、エクソン９のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974とを使用した。生成産物の不良または増幅は、パネルＡの脊髄組織およびリンパ芽球組織の試料a２、a３、a４、a５、a６およびa７から確認することができる。パネルＢは、a２およびa３においてサイズが減少したバンドが増幅されたことを示し、a７においては挿入断片と一致して大型産物が増幅されたことを示している。パネルＣは、a２、a３、a９およびa１１においてエクソン１１および１２(方式＃２)の欠失と一致してバンドサイズが低減することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月20日(2005.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に配列番号：１に示される塩基配列を含むDNA、または、前記DNAにハイブリダイズし、かつ、神経細胞アポトーシス抑制タンパクをコードするDNA。
【請求項２】
実質的に配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
【請求項３】
表４のエクソン１から１６の少なくとも１に対応するcDNA、mRNAまたはそのアンチセンス鎖である精製ヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のDNAまたはヌクレオチド配列にハイブリダイズする、少なくとも１８連続ヌクレオチドを有する精製ヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項記載のDNAまたはヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１８連続ヌクレオチドを有する精製ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
DNAまたはRNAである、請求項６のヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
請求項５のヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー。
【請求項９】
配列番号：３から２０より選択されるヌクレオチド配列からなる請求項８のＰＣＲプライマー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項記載のDNAまたはヌクレオチド配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月14日(2005.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【図１】図１はＳＭＡ遺伝子領域のＹＡＣ連続アッセイである。ＹＡＣは実線で示されている。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、白四角は単一コピープローブを示す。遺伝学的に定義されたＳＭＡ区間であるＣＭＳ-1-ＣＭＡ-Ｄ5Ｓ557および従来のＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間をＹＡＣ上方に示した。
【図２】図２はＳＭＡ領域の長距離制限地図である。低頻度切断(Rare Cutter)部位は実線上方に示した。マーカーの最小セットをpYMC4トリプトファンに対応する実線t下方または左端に示した。ｕはpＹＭＣ4ウラシルまたは右端に対応する。遺伝的に定義されたＣＭＳ-1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間およびＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間は、それぞれ550kbと1.1Mbであると推定される。
【図３Ａ】図３ＡはCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。(Ａ)はＹＡＣの増幅であり、ＧはゲノムＤＮＡを示す。
【図３Ｂ】図３ＢはCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。(Ｂ)は第５染色体移動選別ライブラリ由来のコスミドの増幅である。４つの異なる対立遺伝子をコスミド40G1(対立遺伝子15)、58G12(対立遺伝子12)、192F7(対立遺伝子10)および250B6(対立遺伝子7)によって示した。
【図４】図４は我々の連続系列からマッピングされたコスミドの代表例を示す。実線上方の垂直線はＥcoＲl部位である。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、黒四角は単一コピープローブを示し、白四角は転写配列を示す。Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡を示すＳＴＲｓは星印で示した。コスミドlＧ3とlＧ9はＹＡＣ 76 Ｃlコスミドライブラリから得られる。
【図５】図５はp151.2によって同定されるＳＭＡ領域の配列重複である。ＹＡＣのハイブリダイゼーションは、(Ａ)では700bpのフラグメント、(Ｃ)では500bpのフラグメントを用いた。ＹＡＣは、左から右に、セントロメアからテロメアまでが配列されている。コスミドのハイブリダイゼーションは、(Ｂ)では700bpのフラグメント、(Ｄ)では500bpのフラグメントを用いた。(Ｂ)では、12kbのフラグメントがコスミドに検出されたが、20kbのフラグメントは存在しない。2.5kbのフラグメントおよび600kbのフラグメントは、それぞれ3Ｂ3と、ＩＥＩに検出されたが、これらは末端フラグメントである。(Ｄ)では、３kbのフラグメントしかコスミドに検出されなかった。24Ｄ6の20kbバンドは(Ａ)では検出されていないが、(Ｃ)では存在することに留意されたい。700bpフラグメントは24Ｄ6に検出される場合もある。
【図６】図６はＩ型ＳＭＡと各種多形性5q13.1標識との間に観察される連鎖不平衡度が、40Ｇ1で不平衡ピークを示す図である。
【図７】図７は9クローンから構成されるＣＡＴＴ領域を含み、約400kbに及ぶＰＡＣ連続系列を示す。
【図８】図８はＳＭＡ遺伝子の構造を示す。エクソンを黒枠で示し、上方に番号を付けた。制限部位が図示されているが、ＢはＢamＨＩ、ＥはＥcoＲＩ、ＮはＮotlである。エクソン４およびエクソン５(方式＃１)または方式＃２のエクソン５および６は全てのタイプのＳＭＡでしばしば欠失している。
【図９Ａ】図９は図６、１、７、および８のそれぞれに開示された内容を単ページに配置した図である。図９(Ａ)は、病状表現型および物理地図を伴った６つの5q13.1標識について、Ｉ型ＳＭＡ家族に観察される連鎖不平衡度の相関を示す。本明細書記載の主要な組換えによって定義されるＳＭＡ含有区間が示されている。不均衡のピークが、組換え体によって規定されたＳＭＡ区間のセントロメア末端に隣接していることに留意されたい。
【図９Ｂ】図９(Ｂ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＹＡＣ連続系列である。ＹＡＣおよびＰＡＣの連続系列については、ＳＴＳsを黒三角で示し、多形性縦列反復の多形性を白三角で示し、単コピークローンを黒四角で示した。特に、以下の点を留意されたい。すなわち、我々の物理地図は、星印を付けた対立遺伝子９を含むＣＭＳ下位部位を他のＣＭＡ下位部位のテロメア側に配置しており、遺伝的組換えデータによれば逆転が観察されることから、我々は、5q13.1のこの領域に変異型が存在することを確信している。
【図９Ｃ】図９(Ｃ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＰＡＣ連続系列である。
【図９Ｄ】図９(Ｄ)は、図８に詳細に記載されたＮＡＩＰの遺伝子構造である。
【図１０】図１０は、ＰＡＣ、非ＳＭＡ個体由来の胎児脳cＤＮＡクローンおよびＳＭＡ患者由来のＲＴ-ＰＣＲクローンのエクソン内容である。Ｅ158はグルタミン酸残基の欠失を示している。ＲＴ-ＰＣＲは方式＃２のエクソン１３とエクソン４の間で行われたが、この領域の外側では未検出の欠失がさらに存在することが考えられる。
【図１１Ａ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。図１１Ａでは、方式＃２に基づくエクソンを番号付けした黒枠として記した。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。図１１Ｂでは、明細書中で言及されている3kbおよび9.4kbのＥcoＲＩバンドを検出するＥcoＲＶクローンをＥＶと記した。図１４では欠失した4.8kbのＥcoＲＩ/ＢamＨＩバンドも記した。
【図１１Ｃ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域とこの欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｃに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
【図１１Ｄ】図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示す。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域とこの欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｄに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
【図１２】図１２は、ＮＡＩＰ遺伝子のイントロン／エクソンスのスプライス配列である。
【図１３】図１３は、ＮＡＩＰ部位のエクソン１３(方式＃２)をプローブとした成人組織のノーザンブロットである。組織は標識化され、フィルターは50℃、0.2×ＳＳＣで洗浄され、４日間露呈させた。バンドは、肝臓および胎盤に6-7kbの範囲で観察することかができる。
【図１４】図１４は、近親婚のフランス系カナダ人のIII型ＳＭＡ家族の家系分析結果およびサザンブロット結果である。上のパネルは、ＢamＨＩ/ＥcoＲＩで切断したゲノムＤＮＡを、ＮＡＩＰのエクソン２から９(方式＃２)までを含むcＤＮＡプローブで探索した結果、エクソン５および６(方式＃２)を含む4.8kbのフラグメントが全患者で損失し、フレーム内欠失が生じていることを示している。その他全員は、ホモの正常な姉弟を除き、このバンドの用量は半分であった。下のパネルは、同じ家族のＢamＨＩ断片を示す。患者では、2つの重なった14.5kbの連続フラグメントがＢamＨＩ部位を含む6kb配列を欠失しており、その結果23kbのバンドが生成されている(図１１参照)。家系のすべての個体の23kbのＢamＨＩバンドの存在は、母集団全体のばらつきと一致することに留意されたい。同様に、ＰＡＣ238Ｄ12に含まれ、かつ図１１に示される方式＃２のエクソン１から６までの欠失を示す9.6kbのＢamＨＩバンドが、非ＳＭＡキャリアーを含む個体すべてに確認することができる。
【図１５】図１５は、エクソン５(方式＃２)を増幅するプライマー1864および1863を用いてIII型家系21470および24561をＰＣＲ増幅した結果である。この反応は、エクソン１３(方式＃２)のプライマー1258および1343を用いて多数回行い、結果を曖昧にするＰＣＲの不良を除外した。増幅不良は、エクソン５(方式＃２)のホモ接合の不在に一致し、病状表現型と共分離することがわかる。
【図１６】図１６は、ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織から得られたＲＴ-ＰＣＲ増幅の結果である。文字ｎは、非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡを指し、aはＳＭＡ疾患組織由来のＲＮＡを指す。組織源は、各パネルの上に示した。lymはリンパ芽球を指し、fibは繊維芽細胞を指す。a５を除くすべての試料はＩ型ＳＭＡ患者から得られ、a５は図１５に示す近親婚のIII型ＳＭＡ家系24561から得られた。ＲＮＡは、エクソン１３(方式＃２)から逆転写された。パネルＡおよびパネルＢに示される一次ＰＣＲ産物には、エクソン１のプライマー1884とエクソン１３のプライマー1285または1974を使用し、パネルＣに示される一次ＰＣＲ産物にはエクソン６のプライマー1919とエクソン１３のプライマーとを使用した。パネルＡの二次ＰＣＲには、エクソン４のプライマー1886とエクソン１３のプライマー1974とを使用し、パネルＢの二次ＰＣＲには、エクソン５のプライマー1864とエクソン１１のプライマー1979とを使用し、パネルＣの二次ＰＣＲには、エクソン９のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974とを使用した。生成産物の不良または増幅は、パネルＡの脊髄組織およびリンパ芽球組織の試料a２、a３、a４、a５、a６およびa７から確認することができる。パネルＢは、a２およびa３においてサイズが減少したバンドが増幅されたことを示し、a７においては挿入断片と一致して大型産物が増幅されたことを示している。パネルＣは、a２、a３、a９およびa１１においてエクソン１１および１２(方式＃２)の欠失と一致してバンドサイズが低減することを示している。