(57)【要約】【課題】  高密度プローブアレイを製造した場合に、プローブの位置情報であるアドレス（座標）と対応する既知の塩基配列の情報を正確に関連づけるためには大掛かりな画像処理システムを必要とした。【解決手段】  塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用い、液状の検体試料中に、前記オリゴヌクレオチドに対する結合能を有する対象成分が含有されるか否か、あるいは、その結合能の強弱を評価するため、前記オリゴヌクレオチドと対象成分との間で形成される複合体を検出する方法であって、検出用プローブとして用いる、前記塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを固定する固相基板いわゆるプローブ担体にその特異的な同一区画に異なる２種類以上のプローブを固定する第１のプローブ配置方法と、該プローブ担体の異なる２通り以上の特異的な別箇の区画に同一種のプローブを固定する第２のプローブ配置方法。【選択図】  図１
2006078387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用い、液状の検体試料中に、前記オリゴヌクレオチドに対する結合能を有する対象成分が含有されるか否か、あるいは、その結合能の強弱を評価するため、前記オリゴヌクレオチドと対象成分との間で形成される複合体を検出する方法であって、
検出用プローブとして用いる、前記塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを固定する固相基板いわゆるプローブ担体にその特異的な同一区画に異なる２種類以上のプローブを固定する第１のプローブ配置方法と、該プローブ担体の異なる２通り以上の特異的な別箇の区画に同一種のプローブを固定する第２のプローブ配置方法。
【請求項２】
前記請求項１による所定区画に結合している前記オリゴヌクレオチドの有する、既知の塩基配列の長さが2〜100塩基長であり、区画のサイズが10〜1000μmの径、もしくは、1辺10-1000μmのエリアであることを特徴とする請求項１、２に記載のプローブ担体とそのプローブ配置方法。
【請求項３】
前記請求項１〜２において、同一区画に固定されたプローブ群が異なるように配置されかつ重複しないように分布、構成された区画数分のブロックを担体上に割付けしたプローブの配置方法。
【請求項４】
前記請求項１〜３によるプローブ配置方法に従って製造されたプローブ担体。
【請求項５】
前記請求項１〜４に記載したプローブ担体において、
該プローブと相補的な複数の対象物が混在し、ハイブリダイゼーションを実行後に区画の反応パターンから対象物を絞り込む第1の検出手段と、反応パターンを定量することで対象物を最終的に特定する第２の検出手段を特徴とし、前記プローブ担体上反応プローブの複数のアドレスから対象物を決定する第１、第２のプローブ配置方法から反応の有り無し判定の精度を向上させる検出方法。
【請求項６】
前記請求項１〜５に記載したプローブ担体において、
該プローブ担体に結合した反応パターンが、その反応種を識別する表示形態をもつ表示手段をもつことにより対象物の識別方法。
【請求項７】
前記請求項１〜６に記載したプローブ担体において、
表示手段が、反応対象物の蛍光や発光によることを特徴とする、対象物の識別方法。
【請求項８】
前記請求項１〜７に記載したプローブ担体において、
表示形態が、文字（アルファベット、かな、漢字、数字）、記号、図形、2次元コードである、対象物の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを検出用プローブとして、この検出用プローブ用オリゴヌクレオチドとの間で、分子間結合により結合した複合体形成の有無を検出する方式により、検体試料中に、当該検出用プローブとの結合能を有する成分が含有されるか否かを検出する方法と、それを実現するプローブ担体に関し、より具体的には、複数の検体サンプルについて、例えば、それに特定の塩基配列を有する核酸分子が含有されるか否かについて、同時に検査を行う目的に利用されるプローブ・ハイブリダイゼーション法を用いた核酸分子の検出方法、ならびに前記の核酸分子の検出方法に専ら使用される、複数種のＤＮＡプローブを基板上にマトリクス状に固着したＤＮＡプローブ・マトリクスの構成およびその検出パターンに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子の塩基配列に含まれる部分配列の特定、生体に由来するサンプル中に含有される標的核酸の検出、あるいは、種々の細菌について、その遺伝子ＤＮＡの特徴に基づく属・種の同定においては、既知の塩基配列を有するプローブＤＮＡ複数種を用いて、各プローブＤＮＡと特異的な結合する、すなわち、各プローブＤＮＡとハイブリダイゼーションする核酸分子か否かを検出する手段が利用できる。このプローブＤＮＡ複数種に対するハイブリダイゼーション法による検定を、迅速に、また正確に行う上で有効な手法として、プローブＤＮＡ複数種を固相上に規則的に並べたプローブ担体を利用し、各プローブＤＮＡとの特異的な結合する核酸分子か否かを同時に検出する手段が提案されている。
【０００３】
このようなプローブ担体の一般的な製造方法としては、例えば、特許文献１にも記載されているように、固相上で所定の核酸プローブをアレイ状に合成していく方法や、予め合成した核酸プローブ複数を、固相上にアレイ状に供給する方法などが知られている。
【０００４】
前者の方法を開示している先行技術文献としては、例えば、米国特許第５４０５７８３号明細書（USP 5,405,783）（特許文献２）が挙げられる。また、後者の方法の一例として、例えば、米国特許第５６０１９８０号明細書（特許文献３）や「サイエンス（Science）」、第２７０巻、４６７頁、（１９９５）（非特許文献1)には、マイクロピペッテイングを用いて、固相上にｃＤＮＡをアレイ状に並べる方法が開示されている。
【０００５】
これらの方法で調製されるプローブ担体は、核酸プローブを固相上に１インチ角当たり１００００以上の高い密度で並べてあるアレイとすることができる。この高密度プローブ担体を検体溶液中に浸すことにより、一度に、多数種プローブとのハイブリダイゼーション反応を同時に行い、その際、ハイブリダイゼーションを起こした核酸プローブの塩基配列に基づき、対象遺伝子の塩基配列の解析がなされる。この方法は、プローブを小さな面積の基板に高密度に配置することで、少量のサンプルによる同時多項目検査を可能にし、被験者からのサンプル採取に伴う負担を少なくできるという利点がある。
【特許文献１】ヨーロッパ特許第３７３２０３号公報
【特許文献２】米国特許第５４０５７８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５６０１９８０号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５年第２７０巻４６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述したような従来のハイブリダイゼーション検出法において、高密度にプローブをアレイにした場合に、その位置情報であるアドレス（座標）と対応する既知の塩基配列の情報を正確に関連づけなければならないのと、アドレスを誤認識しないようなプローブの位置精度とその解析のための大掛かりな画像処理システムを必要とした。
【０００７】
また、同一アドレスに単一種プローブのみが固定されている構成であり、プローブ担体表面の品質と、固定するプローブの誤配置なしの保証を前提とするプローブ担体を製造することが不可欠であり、歩留まりが向上しないという問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために次の（１）〜（７）のように構成したプローブ担体とそのプローブ配置方法を提供するものである。
【０００９】
（１）オリゴヌクレオチド、ｃDNA、蛋白等、その一部をプローブとして固定したプローブ担体において、プローブの高密度固定領域を区画と定義すると、区画のサイズは10〜1000μm径もしくは1辺10-1000μmのエリアで、その形状と区画間隔に制限はない。単一区画に2種類以上のプローブ種が固定され、その含有比率は均等比が望ましく、また、同一プローブを複数の区画に固定し、そのパートナーとなるプローブが同一構成ではないことを特徴とする２つのプローブ配置方法。
【００１０】
（２）同一区画に固定されたプローブ群が異なるように配置されかつ重複しないよ
に分布、構成された区画数分のブロックを担体上に割付けしたプローブの配置方法。
【００１１】
ブロックの形状、間隔に制限はなく、内部のプローブ分布、構成はフリーであることを特徴とするプローブ及びブロックの配置方法。
【００１２】
（３）  （１）、（２）の配置方法に従って製造されたプローブ担体。
【００１３】
（４）前記、プローブ担体において、ハイブリダイゼーション後の区画の反応パターンから対象物を絞り込み第一の検出手段と、反応パターンを定量することで最終的に対象物を特定する第二の検出手段を有し、2つ以上のアドレスにある同一種プローブの反応から対象物の特定の精度を向上させることを特徴とする前記（１）記載のプローブ担体のプローブ配置方法。
【００１４】
（５）前記、プローブ担体において、対象物の反応パターンがそれを識別する情報をもった表示形態を有する表示手段を特徴とする前記（１）〜（２）記載のプローブ担体のプローブ配置方法。
【００１５】
（６）前記、プローブ担体において、表示手段が、蛍光、発光によるイメージング処理によることを特徴とする前記（３）記載のプローブ担体のプローブ配置方法。
【００１６】
（７）前記、プローブ担体において、表示形態が、文字（アルファベット、かな、漢字、数字）、記号、図形である対象物の識別法を特徴とする前記（３）記載のプローブ担体のプローブ配置方法。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したように本発明によれば、プローブ担体において、同一の特定領域に複数種のプローブ固定し、また、同一種のプローブを異なる領域に固定するプローブの配置方法を特徴とし、反応対象物を検出したときにプローブ担体上の反応パターン形状を確認することにより固定されているコンテンツを識別するため、プローブ担体上の特定領域に解析不能となる不良箇所がある場合にもその影響を最小限にくい止めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、プローブ担体において、同一種のプローブが、２つ以上のアドレスに固定され、同一アドレスに異なる２つ以上のプローブが固定されるように構成する。プローブ担体上へのプローブ割付け方法、固定方法、ハイブリダイゼーション結果の検出方法については限定しない。
【００１９】
以下に本発明の実施例について説明する。
【００２０】
（第１の実施例）
本発明の第１実施例を図１〜図２を用いて以下に説明する。
【００２１】
本発明は、プローブ担体上に複数のプローブをデザインすることに関する発明であるので、プローブの担体へのプローブの固定方法・結合様式、プローブの合成・スポッティング方法、および製造装置に関する説明は割愛する。また、ハイブリダイゼーションの検出方法も、蛍光法、RI法、電気・化学的法、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、その多岐にわたる手法を限定するものではなく、ここでは、便宜上一般的な蛍光検出法で実施形態を説明する。
【００２２】
図１は、プローブ担体に固定されたDNA等オリゴヌクレオチドの模式図であり、図２は、図１のM-M'を切り口とする断面図である。プローブは、規則的にアレイ状に区画配置され各区画には、２種のプローブが固定されている。
【００２３】
プローブP1とプローブP2とが半々に同一区画Aに固定されている場合、ハイブリダイゼーション時にP1の相補鎖だけが存在する場合、P2の相補鎖だけが存在する場合、P1・P2の両者の相補鎖が存在する場合に、この区画の蛍光強度の絶対値だけで３組を判別することになるが、特にP1のみの蛍光とP2のみの蛍光とを絶対値で識別することは現実的ではない。
【００２４】
そこで本発明では、例えば別箇の区画Bにある、例えば、プローブP2とプローブP3が半々に固定されていてかつ蛍光しない結果を示すと、前記の区画AにおいてプローブP1が2本鎖で、P2は1本鎖であることが確定する。表１は、5行5列の区画に2種類ずつプローブを固定したマトリックスの一例で、斜線で強調したセルが蛍光した箇所で、この場合、P1、P4が2本鎖を形成していると確定できる。
【００２５】
【表１】
2006078387.tif 000003
一方、表２のように斜線で強調したセルが蛍光しているとすると、この場合、P1、P3が2本鎖を形成していると確定できるが、P2においては不確定になる。P2の蛍光の有無によらず蛍光分布は変わらないからである。
【００２６】
【表２】
2006078387.tif 000004
区画Aの蛍光絶対強度をF(A)で表すと、
F(B)＞F(C)  ＆  F(Y)＜F(A)  
の場合には、プローブP2は2本鎖であり、
F(B)〜F(C)  ＆  F(Y)〜F(A)  
の場合には、プローブP2は1本鎖であると判定できるように、
||F(B)―F(C)||＜Const.
||F(Y)―F(A)||＜Const.  
を満足すると、両者の区画での蛍光プローブは単一であるとする閾値定数Const.を決める。
【００２７】
一般化すると。単一プローブだけが蛍光する確定区画から、次の同様の確定区画までｎ区画あるとし初期区画の蛍光をF1、次の確定区画の蛍光をFnとすると、F2・・Fn-1まで全て蛍光している。
【００２８】
||Fi+1-Fi||＜Const.  （i=1,2,・・n-1）
を満足するとき、区画i+1は、区画iと蛍光プローブ種数が同じであると判定する。
【００２９】
また、同一区画に配置するプローブ種数は2種以上であれば制限はないが、蛍光強度定量性の性能に依存する部分である。プローブ種の配置は前記の例のように順番であることは本発明の制限するところではなく、ランダム配置にしてもかまわない。単一プローブを複数の区画に交差して固定することは、製造ミス、ハイブリダイゼーションのミス、解析時のエラーにともなう不良データのリカバリーとして有用である。反応対象物が少数である場合には、蛍光表示パターンの特徴を見るだけで判定結果を知ることも出来る。
【００３０】
（第２の実施例）
本発明の第２実施例を図３〜図５を用いて以下に説明する。
【００３１】
本発明は、プローブ担体上の同一区画にある複数種のプローブの検出反応パターンを見ることで、反応種を判別する第一の検出手段とプローブの組み合わせによって反応種を判別できない場合に蛍光強度を定量することで反応種を最終的に特定する第二の検出手段のうち、下記の工夫によって前者の手段だけで反応種を最大限検出できるように考えられたものである。
【００３２】
図３は、同一区画に２種プローブを固定しプローブ合計９種をペアで３×３のブロックに配置する構成を更に３×３の９ブロックに拡張したプローブ担体の構成図である。２種のプローブの組み合わせは、例えば、P１／P２、Ｐ２／Ｐ３、Ｐ３／Ｐ４、・・、Ｐ９／Ｐ１のようにループさせて、各区画にペアで固定する。右隣のブロックは、同様にＰ１〜Ｐ９のプローブをＰ１／Ｐ３、Ｐ２／Ｐ４、Ｐ３／Ｐ５、・・、Ｐ９／Ｐ２のように１プローブ分シフトさせてループする。同様に合計９ブロック分、順にプローブのペアを変えながら固定する。
【００３３】
すなわち、合計９種のプローブを２種ずつ全ての組み合わせのペアが９ブロックに分布するため、P1が反応プローブである場合のパターンは図４のようになる。P1、P2、P3が反応プローブである場合のパターンは図５のようになる。図４のように1種類のプローブP1だけの反応でも担体上で17箇所が蛍光するので、プローブの固定で不良部位があったとしてもリカバーすることが出来る。また、図５のように3種類のプローブP1、P2、P3の反応では、1ブロックだけでは、反応種を特定できないが、ブロック数を増やすことで、未確定プローブをなくすことが出来る。つまり、反応種数が増えても、蛍光強度の定量評価をすることなく、反応、未反応を判別することが出来る。また、図５ではプローブ担体上で45箇所が蛍光するので同様にプローブ固定において不良部位があったとしてもリカバーできる。
【００３４】
反応パターンをユニークにするために上記では、ブロック数を増やすことで対応してきたが、同一区画のプローブ数を２種ではなく3種以上にすることで対応することも本発明の範囲にあって、制限するものではない。また、プローブのペアリングは順番に構成することも本発明の本質ではなく制限するものではない。P1/P9、P5/P7、P3/P8、・・にようにランダムなペアリングを順不同で配置しても問題はない。
【００３５】
図３のようにプローブを配置する場合には、8種類が反応する場合と、P1-P9の全種が反応する場合とでは混合ブロックだけでは区別がつかないため、最終ブロックのP1・・P9の単一プローブで構成され区画されたブロックで最終判断ができる。本発明では、同一プローブをプローブ担体上に任意に分布し配置することで、特定プローブの反応の再現性を確認することにもなりその信頼性を向上させる。プローブ担体上の一部不良、劣化等による、未反応部分が存在しても統計学的に正確に判定できる利点がある。また、プローブ担体の製造方法として、予め混合したプローブをスポッティングしてもよいし、単一プローブを複数のリザーバに用意し、インクジェットヘッドを用いて、同一区画に複数プローブを重ねて吐出する手法であっても混合プローブで区画されたプローブ担体を製造可能であるため、本発明の制限するところではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の第１の実施例におけるプローブ担体の模式図。
【図２】図１のM―M'断面図。
【図３】本発明の第２の実施例におけるプローブ担体の模式図。
【図４】本発明の第２の実施例におけるプローブ担体のP1が蛍光反応を示した模式図。
【図５】本発明の第２の実施例におけるプローブ担体のP1、P2、P3が蛍光反応を示した模式図。
【符号の説明】
【００３７】
１  区画
２  区画A
３  区画B
P1  プローブ１
P2  プローブ２
P3  プローブ３
P4  プローブ４
P5  プローブ５
M,M'  断面の端点
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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