(57)【要約】      （修正有）【課題】  正常部よりも疾患部においてより高い薬理効果を発現する医薬品をスクリーニングするための、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法を提供する。【解決手段】  リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定する。これによりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定することにより、候補物質のスクリーニングを行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを含む、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法。
【請求項２】
リガンドと被験物質との相互作用を測定する環境が、温度、pH、塩濃度、金属イオン濃度、又は基質濃度を変化させた環境である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リガンドと被験物質との相互作用を非電気的方法で測定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
リガンドと被験物質との相互作用を表面プラズモン共鳴分析法で測定する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、前記流路系内の液体を被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換して表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって、リガンドと被験物質との相互作用を分析する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載の方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定する、候補物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも２種類以上の環境下で測定を行うリガンドと被験物質との相互作用の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は疾患部位で薬理効果を発現し、正常部ではできる限り不活性であること、つまり疾患部選択性が高いことが好ましい。一方、正常部と疾患部で様々な細胞内あるいは周辺の液物性が異なることが知られている。例えば、癌細胞ではpHが正常細胞に比較して著しく低い。また、癌細胞は代謝も激しいことから代謝産物も多い。
【０００３】
また、疾患部と正常部では同一の蛋白質が機能していることが多く、疾患部のみで医薬品の薬理効果を発現させるには、このような正常部と疾患部の溶液の性質や含有物の違いを利用する方法が知られている。具体的には、同一の蛋白質であっても溶液の性質や含有物の違いにより、化学物質の吸脱着性は変化する。例えば、等電点以下ではアニオン性の化合物は吸着しやすく、カチオン性の化合物は吸着し難いが、等電点以上では逆になる。
【０００４】
医薬品を開発するうえで、このような正常部と疾患部の溶液の性質や含有物の違いを活用することが、疾患部選択性を高めることにつながる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、正常部よりも疾患部においてより高い薬理効果を発現する医薬品をスクリーニングするための、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定し、当該２種類以上の環境下において相互作用の程度の相違が比較的大きい物質を選択することにより、疾患部に特異的に薬理効果を発現する可能性が高い物質をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを含む、リガンドと被験物質との相互作用の測定方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用を測定する環境は、温度、pH、塩濃度、金属イオン濃度、又は基質濃度を変化させた環境である。
【０００９】
好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用は非電気的方法で測定し、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析法で測定する。
【００１０】
好ましくは、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、前記流路系内の液体を被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換して表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって、リガンドと被験物質との相互作用を分析することができる。
【００１１】
好ましくは、流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定する、候補物質のスクリーニング方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、疾患部に特異的に薬理効果を発現する物質を多数の被験物質の中から速やかにスクリーニングことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によるリガンドと被験物質との相互作用の測定方法は、リガンドと被験物質との相互作用を少なくとも２種類以上の環境下で測定することを特徴とする。
【００１５】
本発明における環境とは、タンパクとの相互作用を測定する目的の化合物の濃度以外を全て含むものを言う。例えば、温度、pH、塩濃度（具体的にはCl-濃度、SO42-濃度、PO43-濃度など）、金属イオン濃度（具体的には、K+濃度、Na+濃度、Zn2+濃度、Ca2+濃度、Mg2+濃度など）、キレート剤濃度、基質（タンパクと相互作用して、別の物質に変換されることが知られているタンパク、化合物など）濃度などが挙げられる。
【００１６】
本発明においては、上記方法によりリガンドと被験物質との相互作用を測定し、異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質を候補物質として同定することにより、候補物質のスクリーニングを行うことができる。異なる環境下における相互作用の程度の差が大きい被験物質とは、例えば、第一の環境における相互作用の程度と、第二の環境における相互作用の程度との差が大きいことを言う。本発明においては、リガンドと被験物質との相互作用の程度は、結合定数（KD）などの数値として表すことができる。このように相互作用の程度を数値で表した場合、第一の環境下での測定値と、第二の環境下での測定値との比を求め、その比の値が大きいものを候補物質として同定することができる。
【００１７】
多数の被験物質と用いて上記のスクリーニングを行う場合には、第一の環境下での測定値と、第二の環境下での測定値との比を求め、その比の平均値よりも好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上高い比の値を示す物質を候補物質として同定することができる。
【００１８】
本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００１９】
本発明において好ましくは、リガンドと被験物質との相互作用を非電気的方法（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術など）で測定することができ、より好ましくは表面プラズモン共鳴分析法で測定することができる。
【００２０】
本発明の一実施態様においては、表面プラズモン共鳴測定装置の流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。このような測定により、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。
【００２１】
本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００２２】
また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)を、例えば、1以上100以下とすることができる。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０-5〜１×１０-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。
【００２３】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いることができる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。
【００２４】
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置の一例は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。
【００２５】
また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。
【００２６】
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００２７】
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。
【００２８】
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。
【００２９】
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００３０】
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。
【００３１】
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００３２】
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。
【００３３】
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。
【００３４】
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。
【００３５】
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。
【００３６】
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００３７】
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。
【００３８】
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００３９】
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。
【００４０】
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。
【００４１】
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。
【００４２】
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。
【００４３】
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。
【００４４】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。
【００４５】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。
【００４６】
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。
【００４７】
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。
【００４８】
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
【００４９】
本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。
【００５０】
金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００５１】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００５２】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００５３】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５４】
金属膜は、最表面に生理活性物質（即ち、被験物質に対するリガンド）を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。
【００５５】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００５６】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。
【００５７】
上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００５８】
本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質（即ち、リガンド）としては、測定対象物である被験物質と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００５９】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６０】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６１】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６２】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６３】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００６４】
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（１）結合量の測定
リガンド固定（アミンカップリング）は以下の通り行った。測定装置としては、Biacore3000（Biacore社製）を使用した。リガンドとしては、ヒト血清アルブミン（以下HSAと略す）（シグマ社製）5mgをリン酸緩衝液10mM（pH7.4）（以下PBS7.4と略す）1mlに溶解したものを準備した。測定温度は25℃とした。使用チップは、CM5（カルボキシメチルデキストランセンサー）（Biacore社製）である。ランニングバッファーとして、PBS7.4を使用した。流速は10μl/minとした。活性化液として、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との等量混合液を使用した。活性化時間は15分である。固定化液としては、HSA 5mg/ml(PBS7.4)を酢酸バッファーpH5.0（Biacore社製）で10倍希釈したものを使用した。固定化時間は15分である。不活性化液としては、1Mエタノールアミン溶液（pH8.5）（biacore社製）を使用した。不活性化時間は15分である。
【００６６】
薬剤結合の測定は以下の通り行った。測定装置としては、Biacore3000（Biacore社製）を使用した。ランニングバッファーとしては、5重量％DMSO含有リン酸緩衝液10mM  pH7.4（以下5%DMSO/PBS7.4と略す）を使用した。薬剤濃度は0.05mMである。溶解処方は、薬剤10mMDMSO溶液  2.5μl、PBS7.4  47.5μl、5%DMSO/PBS7.4  450μlとした。使用した薬剤は、以下の化合物１及び化合物２である。
【００６７】
【化１】
2006078195.tif 000002
【００６８】
さらに、上記方法と同様に、リン酸緩衝液のpHのみを6.8に変更して、測定環境pH6.8で測定を実施した。Biacore3000付属のソフトにて、結合定数（KD）を求め、その比を計算した結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
2006078195.tif 000003
【００７０】
本発明では、pH変化に対するKD値の変化がより大きい化合物を候補物質として選択することができる。上記実施例の場合は、化合物２を選択することができる。
【００７１】
（実施例２）
以下に記載の方法で結合定数（KD）を求めた。なお以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。
【００７２】
図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。
【００７３】
なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。
【００７４】
またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。
【００７５】
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。
【００７６】
図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。
【００７７】
この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。
【００７８】
（１）デキストラン測定チップの作製
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）中11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
【００７９】
次に、11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールで被覆した表面を10重量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。
【００８０】
次に、25重量％のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。
【００８１】
（２）リガンド固定チップの作成
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのPBS7.4（実施例1.と同義）で3回洗浄した。PBS7.4を100μl入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、チップ内をヒト血清アルブミン（以下HSAと略す）シグマ社製5mgをPBS7.4  1mlに溶解したものをさらにAcetate5.0バッファーで10倍に希釈した溶液100μlに入れ替え30分間放置し、HSAを固定した。チップ内を1M エタノールアミン溶液（pH8.5）（biacore社製）に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのPBS7.4で10回洗浄した。
【００８２】
（３）参照チップの作成：
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDCと50mM NHSの混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのPBS7.4で3回洗浄した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのPBS7.4で10回洗浄した。
【００８３】
（４）流路系の作成
本発明のHSA固定チップに対し、誘電体ブロックをシリコンゴムでふたをすることで、内容積１５μlのセルを作成した。また、ふたのシリコンゴムに２箇所、1mm径の穴をあけ、内径0.5mm、外径1mmのテフロンチューブを通し、流路を作成した。同様に参照チップにもふた、流路を作成し、２つのチップを直列につなぎ、流路系を作成した。この流路系の２つのチップをそれぞれ、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置した。
【００８４】
（５）被験物質の結合性能評価
流路系内を5重量％のDMSOを含有するリン酸緩衝液10mM（pH7.4）（以下5％DMSO/PBS7.4と略す）で満たした。液交換前を基準とした信号変化を0.5秒間隔で測定した。流路系内を20μl/secの速度で、被験化合物（実施例１で使用したものと同じ５０種類の化合物を10μg/mlになるよう5％DMSO/PBS7.4に溶解したもの）に置き換えた。置き換えに要した時間は５秒であった。
【００８５】
液交換開始５秒後以降は、液の流れを停止させた。液置換５秒後から２分後までのデータを使用し、被検物質の結合定数（KD）を求めた。
結合定数は、以下の方法で算出した。
【００８６】
即ち、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、KD＝kd／ka表される式により解離定数（KD）を算出した。
【００８７】
ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃs×（１−θ）−kd×θ      （１）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃsは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂2ｃ／∂ｘ2                  （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃsとなる。）
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ                              （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）
【００８８】
実施例２は、実施例１と同様な結果を得られると共に、液使用量低減、ベースラインノイズ低減の効果が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、実施例で用いた表面プラズモン共鳴測定装置を示す。
【図２】図２は、実施例で用いた誘電体ブロックを示す。
【符号の説明】
【００９０】
１０  測定ユニット
１１  誘電体ブロック
１２  金属膜
１３  試料保持枠
１４  センシング物質
３０  光ビーム
３１  レーザ光源
３２  集光レンズ
４０  光検出器
Ｓ４０  出力信号
４００  ガイドロッド
４０１  スライドブロック
４０２  精密ねじ
４０３  パルスモータ
４０４  モータコントローラ
４１０  ユニット連結体
４１１  連結部材
【図１】
2006078195.tif 000004
【図２】
2006078195.tif 000005