(57)【要約】      （修正有）【課題】有害赤潮原因藻の有用殺藻ウイルスを人為的大量生産する場合に、高密度のウイルスを短期集中的に得るための方法を提供する。【解決手段】有害赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオの殺藻ウイルスであるＨａＶならびにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの殺藻ウイルスＨｃＶをそれぞれの宿主プランクトン培養液に接種するウイルスの量ならびにウイルス種により遮光管理の制御をすることによって、短期集中的に高密度のウイルスを得る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的赤潮防除剤として有用な赤潮殺藻ウイルスを宿主藻の培養液に接種し、容器内で生産する方法
【請求項２】
赤潮殺藻ウイルスを培養容器内で生産する場合に、培養器を遮光する請求項１に記載の方法
【請求項３】
培養容器の遮光を開始した後、完全遮光状態で、２日間静置培養する請求項２に記載の方法
【請求項４】
赤潮殺藻ウイルスがＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）の場合には、培養容器に対する遮光をＨａＶ接種１日後から開始し、赤潮殺藻ウイルスがＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)の場合には遮光をＨｃＶ接種２日後から開始する請求項３に記載の方法
【請求項５】
接種源となるＨａＶ、ＨｃＶ懸濁液に含まれる殺藻活性を有するＨａＶ、ＨｃＶ感染単位密度が１０5から１０6感染単位／ｍｌであるＨａＶ、ＨｃＶ懸濁液を宿主培養液の１０分の１量から２分の１量接種する請求項４に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオに対して強い殺藻活性を有するウイルスＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）ならびにヘテロカプサ・サーキュラリスカーマに対して殺藻活性を有するウイルスＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)を生物学的赤潮防除剤として実用的に利用するために人為的に大量生産する場合、短期集中的に高密度のウイルスを得るための方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
有用赤潮殺藻ウイルスＨａＶ、ＨｃＶは直径約２００ｎｍの正二十面体の二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらの赤潮殺藻ウイルスは、養殖魚類に対する漁業被害の原因となる赤潮原因藻ヘテロシグマ・アカシオあるいは二枚貝に甚大な漁業被害を及ぼすヘテロカプサ・サーキュラリスカーマが発生した天然の海域から分離された強い殺藻活性を有する天然海域に常在する赤潮殺藻ウイルスであり、有用な赤潮制御因子としての実用化に期待がもたれている（特許文献１、特許文献２）。
【０００３】
一般に、養殖産業における赤潮被害への対抗策は、公的機関による赤潮発生情報の早期広報を頼りに、経験的に知られている「餌止め」により養殖魚を絶食させ、斃死数を最小限に抑さえたり、養殖筏を赤潮が発生していない海域へ船舶で牽引移動させたりするという極めて消極的な回避方法が主流であった。しかも、赤潮発生域からの筏の移動は、逆に移動先へ赤潮原因藻を移植してしまう危険性もはらんでいる。
【０００４】
したがって、より積極的な防除技術の開発が期待されており、これまでに化学的防除方法（硫酸銅、過酸化水素水、オゾン、アクリノール、硫酸アルミニウムなどの直接散布）や物理的手法（多孔質粘土の散布、赤潮の海面回収、鉄粉吸収、海水循環、高分子凝集剤、ウォーターハンマー、超音波処理、高電圧パルス）が提案されてきているが、実場面での施用規模、コストの面で問題があるのはもちろん、自然海域への人為的異物投入による生態系への影響、安全性に対してそれ以上の懸念があったために、殆ど実用化には至っていない（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
このような状況下で、近年その実用化が期待されているのは、生物的防除技術である。自然界における赤潮の消滅過程においては、赤潮原因藻に対する殺藻細菌、赤潮殺藻ウイルス、捕食性生物、拮抗藻類の利用などが赤潮原因藻の密度推移に連動して高密度検出される事例が数多く報告されている。これらは自然海域にもともと生息するものであり、生物的防除素材として人為的に大量生産し、現場で施用、効果を発揮することができれば、環境への影響や安全性は極めて高い積極的赤潮防除剤としての期待は大きい。
【０００６】
特に、赤潮殺藻ウイルスは、宿主感染後の増殖性が極めて高いことから、複次感染により壊滅的殺藻効果が期待できるため、その他の微生物素材例えば殺藻細菌や、捕食性プランクトンなどに比べ、最も有望視されている生物素材の一つである（非特許文献３）。
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−９８９７９
【特許文献２】特開２００１−２３１５５０
【非特許文献１】代田昭彦  赤潮の対策研究と技術開発試験の経緯と展望  月刊海洋、２４、３−１６ (１９９２)
【非特許文献２】今井一郎  赤潮の生物学的防除の可能性  日本海水学会誌５２、２１６−２２７（１９９８）
【非特許文献３】今井一郎、吉永郁生  有害微生物の除去、「微生物利用の大展開」（今中忠行監修）、株式会社エヌ・ティー・エス、ｐ８８１−８８８（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの有用殺藻ウイルスを水産養殖漁業分野における積極的な赤潮防除手段として活用するためには、現場海域で養殖魚介類に対する被害がでないレベルに赤潮原因藻の発生を制御する必要があり、そのためには開放系である天然の海域に対し、大量の赤潮殺藻ウイルスを投入する必要がある。
【０００９】
そのためには、安価で、且つ簡便な装置で高密度の赤潮殺藻ウイルスを生産する必要があるが、本発明の素材となる赤潮殺藻ウイルスは、極めて宿主特異性が高く、これの大量生産のためには、まず、本来の宿主細胞を赤潮殺藻ウイルスに罹病しやすい状態で高密度集積培養しなければならない。
【００１０】
ＨａＶの宿主プランクトンであるヘテロシグマ・アカシオならびにＨｃＶの宿主プランクトンであるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマはいずれも植物プランクトンであり、その培養には、温度（２０〜３０℃）とともに、光強度４０−２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2ｓ-1（蛍光灯による照明）、明暗周期１２〜１６時間明期、８〜１２時間暗期の培養条件が必要であり、この条件下で２〜４日間程度培養するとウイルスに最も感受性が高いステージを迎える。更に、この感受性が高いステージの生きた細胞に感染させる必要があるため、宿主プランクトンの培養液に赤潮殺藻ウイルスを接種した後も、上述した光がある条件を維持する必要がある。
【００１１】
一方、ＨａＶ、ＨｃＶは光により、宿主細胞に対する感染力ならびに殺藻活性が失活する 。従って、培養容器内で宿主細胞に感染させ、新たに溶藻して宿主細胞体外へ放出された赤潮殺藻ウイルスも光がある条件下では、徐々に失活して最終的な培養収量は見込み量よりも低下することになる。本発明における課題は、この培養環境上の収量低下要因を制御し、最適な赤潮殺藻ウイルス生産条件を提供することにより、赤潮殺藻ウイルスの生産収量を最大限に引き上げる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＨａＶ、ＨｃＶを実場面における赤潮防除に利用することを目的として生産する際の宿主培養液の量、細胞密度に対する赤潮殺藻ウイルスの接種量および遮光管理に関わる条件について鋭意検討を行った結果、宿主プランクトンに感染させる時期を斉一化するためにウイルス接種量を最適化し、更に、赤潮殺藻後、宿主細胞内で赤潮殺藻ウイルスが複製を開始する段階から遮光を徹底することによって、最終的な赤潮殺藻ウイルスの生産収量が著しく向上し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）生物学的赤潮防除剤として有用な赤潮殺藻ウイルスを宿主藻の培養液に接種し、容器内で生産する方法。
（２）赤潮殺藻ウイルスを培養容器内で生産する場合に、培養器を遮光する前記１に記載の方法。
（３）培養容器の遮光を開始した後、完全遮光状態で、２日間静置培養する前記２に記載の方法。
（４）赤潮殺藻ウイルスがＨａＶ（Heterosigma  akashiwo  virus）の場合には、培養容器に対する遮光をＨａＶ接種１日後から開始し、赤潮殺藻ウイルスがＨｃＶ(Heterocapsa  circularisquama  virus)の場合には遮光をＨｃＶ接種２日後から開始する前記３に記載の方法。
（５）接種源となるＨａＶ、ＨｃＶ懸濁液に含まれる殺藻活性を有するＨａＶ、ＨｃＶ感染単位密度が１０5から１０6感染単位／ｍｌであるＨａＶ、ＨｃＶ懸濁液を宿主培養液の１０分の１量から２分の１量接種する前記４に記載の方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ＨａＶ、ＨｃＶ等の赤潮の積極的な生物的防除素材として有用な赤潮殺藻ウイルスを人為的に大量生産する際に、短期集中的に高い生産収量を得ることができるようになるため、養殖漁業者等の赤潮防除剤の使用者への商業的生産、供給が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための好ましい例として、各工程を詳細に説明する。
ＨａＶ、ＨｃＶはそれぞれの宿主となるヘテロシグマ・アカシオ、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマを一般的な藻類用海水培地（ＳＷＭ３培地、ＥＳＭ培地、Ｆ／２培地、ＡＳＰ系培地等）を用いて培養し、対数増殖初期、すなわち、赤潮殺藻ウイルスの生産に適した条件の宿主プランクトン培養液を得た後、別途準備しておいた赤潮殺藻ウイルス懸濁液（１ｍｌ当りの宿主細胞密度と同等程度のウイルス懸濁液、すなわち、１０5から１０6感染単位／ｍｌ以上）を容積で宿主プランクトン培養液の１０分の１量から２分の１量となるように接種する。
【００１５】
その後、温度２５±２℃、光強度４０〜２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2  ｓ-1（蛍光灯による照明）の条件で無通気、静置培養し、ＨａＶの場合は感染殺藻が完了する１日後、ＨｃＶの場合は２日後に、赤潮殺藻ウイルスを接種した容器を完全に遮光し、更に同様の温度条件でＨａＶは２日間（ＨａＶ接種から３日間）、ＨｃＶは２日間（ＨｃＶ接種からのべ４日間）静置培養する。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例をあげて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１７】
［実施例１］ １）培養条件の違いによるＨｃＶ収量の推移
２０Ｌポリカーボネートタンクを用いたウイルス培養槽において、図１に示した各種条件下におけるＨｃＶの生産性を比較調査した。
ＨｃＶの感染宿主となるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは、２ｎＭのＮａ2ＳｅＯ3含有改変ＳＷＭ３培地（Ｃｈｅｎら，１９６９，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ  ５：２１１−２２０；Ｉｔｏｈ＆Ｉｍａｉ，１９８７，Ｓｈｕｗａ，Ｔｏｋｙｏ，ｐ．１２２−１３０）１０Ｌに初期密度６０００細胞／ｍｌとなるように接種し、１６時間明、８時間暗の明暗周期条件、温度２５±２℃、光強度１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2ｓ-1（蛍光灯による照明）の条件で３日間培養し、対数増殖初期の宿主細胞が１０5細胞／ｍｌ以上となっていることを確認した培養液を準備した。
得られたヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの培養液を充填したウイルス生産槽にＦａｌｃｏｎ社製７５０ｍｌ容量通気孔付組織培養用角型フラスコを用いて培養したＨｃＶ懸濁液を設定した以下の各条件（３００ｍｌ〜５０００ｍｌ）で接種した。ＨｃＶ接種後は、無通気、温度２３±２℃で静置培養条件とし、培養（ア）はＨｃＶ接種後４日間遮光なしの条件とし、培養（オ）はＨｃＶ接種直後からウイルス生産槽全体を黒色プラスチックで覆い4日間完全に遮光した。培養（イ）〜（エ）および培養（カ）、（キ）はＨｃＶ接種２日後に黒色プラスチックで覆い遮光条件での静置培養とした。
【００１８】
各培養条件下での培養終了後、上清と宿主細胞残渣溶液にわけ、中空糸膜（旭化成ｍｉｃｒｏｚａ（登録商標）ＭＦモジュールＰＳＰ−１１３）を用いて複製されたＨｃＶを濃縮回収した。
各培養条件で得られたＨｃＶ濃縮懸濁液について、殺藻活性を有するウイルス量を比較調査するために限界希釈法によって単位容量（１ｍｌ）当りのウイルス感染単位を算出し、更に各培養あたりの総ウイルス収量および培養原液（濃縮回収前）の単位容量あたりのウイルス感染単位を算出して、ＨｃＶの高収量化に最も適した条件を確認した。
【００１９】
その結果、ＨｃＶ接種後、遮光条件を設定しない場合（培養（ア））、１培養バッチ（１０Ｌ培地）当りの総力価ウイルス量は２．９×１０8感染単位であったのに対し、遮光条件以外は培養（ア）と同じ条件である培養（イ）では、総力価ウイルス量が１０倍に上昇し、溶藻期における遮光が極めて有効であることが確認された。これは、ウイルス接種後早期に複製されたＨｃＶが光によって失活することなく、効果的に集積されたものと思われた。更に、遮光条件は培養（イ）と同様の条件のままで、ＨｃＶ接種量を３００ｍｌから５００ｍｌに増やした培養（ウ）においては、総力価ウイルス量が１．１×１０11感染単位にまで増加し、適切な遮光管理、接種ウイルス量の制御がＨｃＶ生産量の向上に極めて有効であることが明らかとなった。
一方、培養（ウ）の条件で、遮光開始後の培養期間を１日に短縮した培養（エ）（ＨｃＶ接種後の全培養期間3日間）では、収量は著しく低下し（総力価ウイルス量１．４×１０4感染単位）、遮光条件としたのち、ＨｃＶが宿主細胞体内で充分に増殖する時間をとる必要があることがわかった。また、接種初期から完全遮光とした培養（オ）では、ＨｃＶの収量が培養（ア）と同程度（総力価ウイルス量６．１×１０8感染単位）にまで低下しており、高収量を得るためには、ＨｃＶ感染期における光が必須であることが明らかとなった。すなわち、培養（オ）に対して遮光条件のみが異なる培養（ウ）で１８０倍の生産性が見られたことから、ＨｃＶ接種２日後からの遮光が効果的であることが確認された。
ＨｃＶの接種量を１０００ｍｌに増やし、感染から殺藻、溶藻までのタイミングをより斉一にできる条件を設定した培養（カ）では、最高収量が得られ約９．３×１０12感染単位となった。これは、接種量が３００ｍｌである培養（ウ）の３２００倍、５００ｍｌの場合の８５倍という極めて高い収量である。また、培養原液に換算すると１０8感染単位／ｍｌ以上の収量であり、ＨｃＶ接種時のヘテロカプサ・サーキュラリスカーマの細胞密度は約１０5細胞／ｍｌなので、１細胞あたり１０3粒子以上のＨｃＶが生産されたことになる。これはＨｃＶの一細胞あたりの最大増殖数（１８００−２４４０感染単位／宿主１細胞）（Ｎａｇａｓａｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ｐ．２５８０−２５８６）に極めて近い密度である。
また、宿主培養液の２分の１量となる５０００ｍｌのＨｃＶ懸濁液を接種した培養（キ）でも、培養（カ）と同様に高い収量が得られ、総力価ウイルス量は約８．８×１０12粒子となった。すなわち、培養（キ）においても培養原液に換算するとその収量は８．８×１０8粒子／ｍｌ以上となり、ＨｃＶの最大増殖数に近い生産性が認められた。
すなわち、ＨｃＶを短期的に高い収量で生産するためには、高活性のＨｃＶを充分に含む新鮮な培養液を接種源として、宿主培養液の２分の１量から１０分の１容量のＨｃＶ懸濁液を接種するのが効果的であることが確認された。（図１）
【００２０】
［実施例２］
２）培養条件の違いによるＨａＶ生産性
２０Ｌポリカーボネートタンクを用いたウイルス培養槽において、ＨｃＶでの結果をもとに図２に示した４種条件下におけるＨａＶの生産性を比較調査した。
ＨａＶの感染宿主となるヘテロシグマ・アカシオは、２ｎＭのＮａ2ＳｅＯ3含有改変ＳＷＭ３培地（Ｃｈｅｎら，１９６９，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ  ５：２１１−２２０；Ｉｔｏｈ＆Ｉｍａｉ，１９８７，Ｓｈｕｗａ，Ｔｏｋｙｏ，ｐ．１２２−１３０）１０Ｌに初期密度１００００細胞／ｍｌとなるように接種し、１６時間明、８時間暗の明暗周期条件、温度２３±２℃、光強度６０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ-2ｓ-1（蛍光灯による照明）の条件で３日間培養し、対数増殖初期の宿主細胞が１０6細胞／ｍｌ以上となっていることを確認した培養液を準備した。
【００２１】
得られたヘテロシグマ・アカシオの培養液を充填したウイルス生産槽にＦａｌｃｏｎ社製７５０ｍｌ容量通気孔付組織培養用角型フラスコを用いて培養したＨａＶ懸濁液を適宜接種した。ＨａＶ接種後は、無通気、温度２３±２℃で静置培養条件とし、培養（ク）はＨａＶ接種後３日間遮光なしの条件とし、培養（ケ）はＨａＶ接種直後からウイルス生産槽全体を黒色プラスチックで覆い３日間完全に遮光した。培養（コ）はＨａＶ接種１日後に黒色プラスチックでウイルス生産槽全体を覆い遮光条件下の静置培養とした。
各培養条件下での培養終了後、上清と宿主細胞残渣溶液にわけ、中空糸膜（旭化成ｍｉｃｒｏｚａ（登録商標）ＭＦモジュールＰＳＰ−１１３）を用いて増殖したＨａＶを濃縮回収した。
各培養条件で得られたＨａＶ濃縮懸濁液について、殺藻活性を有するウイルス数を比較調査するために限界希釈法によって単位容量（１ｍｌ）当りのウイルス感染単位を算出し、更に各培養あたりの総ウイルス収量および培養原液（濃縮回収前）の単位容量あたりのウイルス感染単位を算出して、ＨａＶの高収量化に最も適した条件を確認した。
その結果、ＨｃＶ同様、ＨａＶにおいても充分な接種源と殺藻直後の適切な遮光管理によって、本来このＨａＶが有する潜在的増殖能（７７０感染単位／１宿主細胞）（Ｔａｒｕｒａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，  ２０００  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｐ．４９１６−４９２０）。に極めて近い高い生産収量があげられることが明らかとなった。
【００２２】
すなわち、図２に示したように、遮光せず、接種量が３００ｍｌと少ない培養（ク）、接種量を１０００ｍｌに増やし、ＨａＶ接種直後から３日間完全に遮光した培養（ケ）においては、総力価ウイルス量が４．１×１０8感染単位ならびに８．７×１０8感染単位であったのに対し、接種量を１０００ｍｌとし、ＨａＶ接種１日後から遮光を開始した培養（コ）においては、３．６×１０12感染単位の総力価ウイルス量が得られた。これは、ヘテロシグマ・アカシオ１細胞あたり約７２３感染単位のＨａＶが生産されたことになり、潜在的増殖能（７７０感染単位／１宿主細胞）（Ｔａｒｕｒａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，  ２０００  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｐ．４９１６−４９２０）に極めて近い値であった。また、同様に接種量を５０００ｍｌとした培養（サ）でも総力価ウイルス量は約３．３×１０12感染単位、ヘテロシグマ・アカシオ１細胞あたりのＨａＶ増殖数は約６６３感染単位となり、培養（コ）同様高い増殖性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】培養条件の違いによるＨｃＶ収量の推移を示した説明図である。（実施例１）
【図２】培養条件の違いによるＨａＶ収量の推移を示した説明図である。（実施例２）
【図１】
2006025652.tif 000002
【図２】
2006025652.tif 000003