(57)【要約】【課題】（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする光学活性アルコール類の効率的な製造方法を提供する。【解決手段】  オガタエア（Ogataea）属に属する微生物より単離された、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび該ポリペプチドを生産する形質転換体。並びに、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用して、２−ホルミルへキサン酸エチル等のカルボニル化合物を還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチル等の光学活性アルコールを製造する方法。【選択図】    なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、式(１)：
【化１】
2006280207.tif 000011
で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、式(２)：
【化２】
2006280207.tif 000012
で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡにコードされ、かつ、前記式(１)で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記式(１)で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３０）に含まれるプラスミドｐＮＴＯＦである請求項５記載のベクター。
【請求項７】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素である、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
宿主細胞が大腸菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３０）である、請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３１）である、請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項３又は４に記載のポリペプチド、又は、請求項９〜１２のいずれかに記載の形質転換体を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１４】
カルボニル基を有する化合物が、一般式(３)
【化３】
2006280207.tif 000013
（式中、Ｒ1は置換基を有していても良い炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ2は炭素数１〜１０の置換基を有していても良いアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体であり、光学活性アルコールが、一般式(４)
【化４】
2006280207.tif 000014
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同じ。）で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体である、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
カルボニル基を有する化合物が、式(１)
【化５】
2006280207.tif 000015
で表される２−ホルミルへキサン酸エチルであり、光学活性アルコールが、式(２)
【化６】
2006280207.tif 000016
で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルである、請求項１３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（１）：
【０００２】
【化７】
2006280207.tif 000002
で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、式(２)：
【０００３】
【化８】
2006280207.tif 000003
で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチド（カルボニル還元酵素）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【０００４】
本発明はまた、該ポリペプチド、又は、該形質転換体を用いた、光学活性アルコール類、とりわけ前記式(２)で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの製造法に関する。（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルは、医薬品の中間体として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００５】
（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルをはじめとする３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法としては、１）パン酵母を用いて２−ホルミルへキサン酸エチルなどの２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元することにより、目的物を得る方法（非特許文献１）、２）パン酵母から単離した還元酵素（Ｌ−１酵素）を用いて２−ホルミルへキサン酸エチルなどの２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元することにより、目的物を得る方法（非特許文献２）、３）２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元する能力を有する酵素源を用いて還元することにより、目的物を得る方法（特許文献１）等が知られている。
【０００６】
しかし、上記方法のうち、１）については、高い光学純度の生成物を得るためにはパン酵母を熱および添加物により処理する必要があり、操作が煩雑で、かつ、反応収率も低い。２）については、反応収率が低く、特に、２−ホルミルヘキサン酸エチルに対する反応性が極めて低い。３）についても、反応収率、および生成物の光学純度が共に高くなるような反応条件は見出されていない。またいずれの方法も、使用される酵素の基質特異性の点で、他の光学活性アルコールの生産に使用できる汎用性のある製造方法とはいえない。
【０００７】
このようにいずれの方法も効率的な製造方法とは言い難く、工業的製法としては大きな課題を有している。
【非特許文献１】Ｂｕｌｌ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.Ｊｐｎ.,６７,２２４４（１９９４）
【非特許文献２】Ｂｕｌｌ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.Ｊｐｎ.,６７,５２４（１９９４）
【特許文献１】ＷＯ ２００４/０５２８２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に鑑み、本発明は、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの製造において有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。
【０００９】
また、本発明は、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする種々の光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。さらに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、これを利用して、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を創製することに成功した。そして、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用することにより、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする種々の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドである。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡである。また、本発明は、該ＤＮＡを含むベクターである。また、本発明は、該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、該ポリペプチドまたは該形質転換体を用いた、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする光学活性アルコール類の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の実用的な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドであり、後述するようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有する微生物から単離することが出来る。当該活性を有する微生物は、例えば、各種の微生物の培養物、又はその処理物と２−ホルミルへキサン酸エチルを接触させ、生成した２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度を測定することにより見出すことが出来る。ここでいう「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体の破砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化したものであってもよい。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。また、上記反応において生成した、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて実施できる。
【００１６】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、上述した如く、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するものであれば特に限定されないが、例えばオガタエア（Ogataea）属に属する酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。
【００１９】
単離されたポリペプチドの２−ホルミルへキサン酸エチルを還元する活性は、例えば、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、１．０ｍＭの基質２−ホルミルへキサン酸エチル、２.０ｍＭの補酵素ＮＡＤＰＨ、および粗酵素を添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を１ｕｎｉｔと定義する。
【００２０】
本発明のＤＮＡは、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
【００２１】
単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
【００２２】
上述のようにして得られた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。
【００２３】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988) ）によりその全体の配列を決定することができる。
【００２４】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株由来のポリペプチドの情報を元にして配列が決定された配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
【００２５】
配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。
【００２６】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。
【００２７】
本発明のポリペプチドとして、具体的には、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株から単離された、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい例として挙げられる。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知の酵素（Ｌ−１）と比較して分子量が異なり、新規の酵素である（実施例２参照）。
【００２８】
また、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性を有し、かつ、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと機能的に同等であり、本発明に含まれる。
【００２９】
ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるポリペプチドを挙げることができる。
【００３０】
このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。
【００３１】
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００３２】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）が好適に使用できる。
【００３３】
ここで用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００３４】
ここで用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００３５】
本発明の発現ベクターの例としては、公知のプラスミドｐＵＣＮＴに、配列番号１に示すＤＮＡを導入した、ｐＮＴＯＦ（実施例５）を挙げることができる。
【００３６】
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００３７】
本発明の形質転換体の例としては、前述のプラスミドｐＮＴＯＦを導入したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）が挙げられる。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３０の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００３８】
本発明においては、本発明のポリペプチドを、カルボニル基を有する化合物と、ＮＡＤＰＨ等の補酵素の存在下、接触させて反応させることにより、当該カルボニル基を有する化合物を不斉的に還元し、光学活性アルコール類を製造することができる。この時、当該反応の進行に伴い、ＮＡＤＰＨ等の補酵素は酸化型に変換される。しかし、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。上記本発明のポリペプチド及び補酵素再生能を有するポリペプチドは、そのまま用いても良いし、公知の手段で固定化したものであってもよい。
【００３９】
また、本発明のポリペプチドのかわりに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。とりわけ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、光学活性アルコール類の製造をより効率良く行うことができる。
【００４０】
なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、菌体を含む培養液や培養菌体は言うまでもなく、その処理物としても光学活性アルコール類の製造に使用することができる。ここで言う「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。
【００４１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
【００４２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクターｐＮＴＯＦにバシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、ｐＮＴＯＦＧ１（実施例６）が挙げられる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）が挙げられる。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３１の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００４３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養や本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
【００４４】
形質転換体中の本発明のポリペプチドの還元活性は、前述の単離されたポリペプチドの活性測定方法と同様にして算出することが出来る。また、形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰまたはＮＡＤを、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨに還元する活性を１ｕｎｉｔと定義する。
【００４５】
本発明のポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体のいずれかを用いた光学活性アルコール類の製造は、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、及び、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を添加し、ｐＨ調整下、攪拌することにより実施できる。
【００４６】
一方、本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要はない。
【００４７】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
【００４８】
本発明の還元反応の基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、下記一般式（３）：
【００４９】
【化９】
2006280207.tif 000004
（式中、Ｒ1は置換基を有していても良い炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ2は置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体が挙げられる。さらに、好ましくは、上記２−ホルミル酢酸誘導体のうち、Ｒ1が置換基を有していても良い炭素数２〜１０のアルキル基であり、かつ、Ｒ2が置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基である２−ホルミル酢酸誘導体が挙げられ、より好ましくは、下記式（１）：
【００５０】
【化１０】
2006280207.tif 000005
で表される２−ホルミルへキサン酸エチルが挙げられるが、上述の反応条件において還元され、光学活性アルコールに変換されるものであれば、特に限定されない。
【００５１】
上述の反応条件において、前記一般式（３）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を基質とした場合、下記一般式（４）：
【００５２】
【化１１】
2006280207.tif 000006
（式中、Ｒ1およびＲ2は前記と同じ。）で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体が得られる。前記式（１）で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを基質とした場合、下記式（２）：
【００５３】
【化１２】
2006280207.tif 000007
で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルが得られる。
【００５４】
反応で生じた光学活性アルコール類は、常法により精製できる。例えば、反応で生じた光学活性アルコール類を含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製できる。
【００５５】
２−ホルミルへキサン酸エチル、および、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５(ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ５％ ＰＨＭＥ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ)（φ０．３２ｍｍ×３０ｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、カラム温度：１２０℃、キャリアガス：ヘリウム（１２５ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。さらに、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。
【００５６】
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の優れた製造法が提供される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
【００５８】
（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株より、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。
【００５９】
２−ホルミルへキサン酸エチルに対する還元活性は、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−ホルミルへキサン酸エチルを終濃度１．０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度２.０ｍＭとなるよう溶解し、さらに粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。
【００６０】
（微生物の培養）
５００ｍｌ容坂口フラスコに、グルコース５％、ペプトン１％、酵母エキス１％、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）１滴からなる液体培地３０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の培養液３００μｌを無菌的に接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
【００６１】
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養方法で得られた培養液１２００ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ  ｍｏｄｅｌ  １１０７９００（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＩＮＣ．製）で破砕した後、破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液８０ｍｌを得た。
【００６２】
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた無細胞抽出液８０ｍｌを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１夜透析し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（９５ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、終濃度が１．５Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
【００６３】
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４５ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．５Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
【００６４】
（２’，５’−ＡＤＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した２’，５’−ＡＤＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（２０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、ポリペプチドの精製標品を得た。
（実施例２）ポリペプチドの諸性質
実施例１で調製した精製ポリペプチドの酵素化学的性質について調べた。
【００６５】
（１）作用
ＮＡＤＰＨを補酵素として、２−ホルミルへキサン酸エチルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルへ還元した。
【００６６】
（２）分子量
溶離液として２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）による精製ポリペプチドのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した分子量は約３６，０００であった。
【００６７】
（３）至適温度
作用至適温度を調べるため、２０〜７０℃における２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性を実施例１に記載した方法で測定した。その結果、至適温度は４５℃付近であった。
【００６８】
（４）至適ｐＨ
作用至適ｐＨを調べるため、ｐＨ３．５〜９.０における２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性を実施例１に記載した方法で測定した。緩衝液として１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜５．５）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜７．５）、及び１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）を用いて、ｐＨ３．５〜９.０の範囲で活性を測定した。その結果、至適ｐＨは６．０であった。
【００６９】
（実施例３）精製ポリペプチドを用いた（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの合成
実施例１で調製した精製ポリペプチド溶液に、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１００Ｕ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤＰ１．０ｍｇ、各種２−ホルミルアルカン酸エチル誘導体２ｍｇを添加し、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、反応の進行をＴＬＣで確認した後、生成物の光学純度を測定した。その結果を表２に示した。
【００７０】
２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。なお、得られた２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルは全てＲ体であった。
【００７１】
【表１】
2006280207.tif 000008
（実施例４）遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５’−tayytnatgcaytggccngt−３’（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５’−tcytcnggrtcrttrtanac−３’（配列表の配列番号４）を合成した。
【００７２】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。
【００７３】
（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌIIで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988) ）により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１に示した。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００７４】
（実施例５）発現ベクターの構築
プライマー３：５’−gggaattccatatgctttctatttgcac−３’（配列表の配列番号６）と、プライマー４：５’−atcgagctcttatcaagcctgaataatc−３’（配列表の配列番号７）を用い、実施例３で得たオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号1に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＳａｃＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＯＦを構築した。
【００７５】
（実施例６）グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー５：５’−atcgagctctaaggaggttaacaatgtataaagatttagaagg−３’（配列表の配列番号８）と、プライマー６：５’−gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga−３’（配列表の配列番号９）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＳａｃＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＰｓｔＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＰｓｔＩで消化した。これを上記の組換えベクターｐＮＴＯＦのＳａｃＩ認識部位とＰｓｔＩ認識部位の間に挿入して、組み換えプラスミドｐＮＴＯＦＧ１を構築した。ｐＮＴＯＦＧ１の作製法および構造を図１に示す。
【００７６】
（実施例７）形質転換体の作製
実施例４で構築した組換えベクターｐＮＴＯＦを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）を得た。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３０の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００７７】
また、同様に、実施例５で構築した組換えベクターｐＮＴＯＦＧ１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）を得た。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２３１の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００７８】
（実施例８）形質転換体における遺伝子の発現
実施例７で得た２種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮＴを含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）６０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、６０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性、および、ＧＤＨ活性を測定したものを、表２に示した。実施例５で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性は、実施例１に記載の方法で測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【００７９】
【表２】
2006280207.tif 000009
（実施例９）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの合成
実施例８と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）の無細胞抽出液１ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１００Ｕ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤＰ１．０ｍｇ、２−ホルミルへキサン酸エチル１０ｍｇを添加し、３０℃で２０時間振とうした。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、抽出物を分析した。その結果、収率９９％で光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルが得られた。
【００８０】
２−ホルミルへキサン酸エチル、および、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５(ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ５％ ＰＨＭＥ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ)（φ０．３２ｍｍ×３０ｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、カラム温度：１２０℃、キャリアガス：ヘリウム（１２５ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。さらに、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、実施例３と同様の方法で行った。
【００８１】
（実施例１０）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの合成
実施例８と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）の培養液１００ｍｌに、５５％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８５ｍｌ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、２−ホルミルへキサン酸エチル３０ｇを添加し、１０Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で３５時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、抽出物を実施例９と同様の方法で分析した。その結果、収率９６％で光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルが得られた。
【００８２】
（実施例１１）ポリペプチドの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１.０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度２.０ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例１で調製した精製ポリペプチドを適当量添加し、３０℃で１分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これを２−ホルミルへキサン酸エチルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表３に示した。表３から明らかなように本発明のポリペプチドは、広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。
【００８３】
【表３】
2006280207.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】組換えベクターｐＮＴＯＦ及びｐＮＴＯＦＧ１の作製法および構造を示す
【図１】
2006280207.tif 000017
【配列表】
2006280207000001.app