(57)【要約】【課題】温和な条件で人工赤血球が製造され、ヘモグロビンの変質も防止される人工赤血球の製造方法と、この方法によって製造された人工赤血球を提供する。【解決手段】エオシン化ゼラチン等の可視光架橋物質と、還元糖などのハイドロゲンドナーと、ヘモグロビンとを親油性液体に添加して分散させ、次いで可視光を照射して分散粒子を光架橋させてゲル化させ、このゲル化粒子よりなる人工赤血球を得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）の化合物と、ヘモグロビンとを親油性液体に添加して分散させ、次いで可視光を照射して分散粒子を光架橋させてゲル化させ、このゲル化粒子よりなる人工赤血球を得ることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
（Ａ）キサンテン系色素で修飾した、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ケラタン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、エラスチン、ヘパラン硫酸、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、オステオネクチン、エンタクチン、ガゼイン、ポリビニルアルコールヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体、ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種。
【請求項２】
請求項１において、さらにハイドロゲンドナーを前記親油性液体に添加することを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項３】
請求項２において、ハイドロゲンドナーがチオール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、キサンテン系色素がエオシンであることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、親油性液体が炭化水素、ハロゲン化炭化水素、又は天然油であることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、（Ａ）がゼラチンであることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、ゼラチンが１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項８】
請求項６において、ゼラチンが１分子中に２個〜６個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、製造された人工赤血球の直径が１０ｎｍ〜１０μｍであることを特徴とする人工赤血球の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかの製造方法により製造された人工赤血球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工赤血球の製造方法と、この方法により製造された人工赤血球に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工赤血球として、球状のカプセル中にヘモグロビン溶液を保持させた人工赤血球がある。
【０００３】
具体的には、
(i）  ヘモグロビン溶液を重合性の粉末へまぶした後に液体中に懸濁させ、放射線を照射して外周表面の重合性粉末を重合したもの；
(ii)  ホスファジルコリンなどの脂質をリポソーム化し、ここにヘモグロビン溶液を包埋担持させたもの
などがある。しかしながら、カプセル化の工程でヘモグロビンがメト化（酸化）されてしまう。
【０００４】
そこで、ヘモグロビン溶液へ還元剤や還元酵素を加える技術が検討されている。しかしながら、還元剤は塩酸ヒドロキシルアミンのような無機系のものでは生体へ有害であるためヘモグロビン溶液へは微量しか添加することができない。トコフェロール（ビタミンＥ）など生体への害が少ない有機系のものは、ヘモグロビン溶液の溶媒である水に溶解しにくく、紫外線などの光に弱い。還元酵素はヘモグロビン−メトヘモグロビンの可逆的酸化還元反応の際に、同時に、酸化型と還元型の間を可逆的に変化するので効果が持続する。しかしながら、酵素はカルセル化の工程での放射線照射や熱負荷により失活してしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、温和な条件で人工赤血球が製造され、ヘモグロビンの変質も防止される人工赤血球の製造方法と、この方法によって製造された人工赤血球を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明（請求項１）の人工赤血球の製造方法は、下記（Ａ）の化合物と、ヘモグロビンとを親油性液体に添加して分散させ、次いで可視光を照射して分散粒子を光架橋させてゲル化させ、このゲル化粒子よりなる人工赤血球を得ることを特徴とするものである。  
（Ａ）キサンテン系色素で修飾した、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ケラタン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、エラスチン、ヘパラン硫酸、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、オステオネクチン、エンタクチン、ガゼイン、ポリビニルアルコールヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体、ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種。
【０００７】
請求項２の人工赤血球の製造方法は、請求項１において、さらにハイドロゲンドナーを前記親油性液体に添加することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の人工赤血球の製造方法は、請求項２において、ハイドロゲンドナーがチオール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の人工赤血球の製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、キサンテン系色素がエオシンであることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の人工赤血球の製造方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、親油性液体が炭化水素、ハロゲン化炭化水素、又は天然油であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の人工赤血球の製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、（Ａ）がゼラチンであることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の人工赤血球の製造方法は、請求項６において、ゼラチンが１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の人工赤血球の製造方法は、請求項６において、ゼラチンが１分子中に２個〜６個のキサンテン系色素分子を導入したものであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項９の人工赤血球の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、製造された人工赤血球の直径が１０ｎｍ〜１０μｍであることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１０の人工赤血球は、請求項１ないし９のいずれかの製造方法により製造されたものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の人工赤血球の製造方法にあっては、上記（Ａ）の物質を含有した液が、親油性液体中に分散された後、可視光照射により架橋し、ゲル化する。このように可視光によって架橋させるので、熱などエネルギー負荷に弱いヘモグロビン、ヘモグロビン還元酵素、有機系還元剤を失活させることなくゲル化させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明では、可視光の照射によりゲル化する物質として、前記（Ａ）の物質を用いる。
【００１９】
このキサンテン系色素としてはエオシンが好適であり、上記（Ａ）の物質としてはエオシン化ゼラチンが好適である。このエオシン化ゼラチンについては後に記述する。
【００２０】
ゼラチンをキサンテン系色素で修飾する場合、ゼラチン１分子に対するキサンテン系色素分子の導入数は１０個以下が好ましく、特に２〜６個であることが好ましい。この導入数が１０よりも多いと、ゲル粒子が硬くなってしまい、狭い血管を通過しにくくなったり、溶血（物理的破壊）が生じ易くなる。
【００２１】
本発明では、ヘモグロビンのメト化防止のために、ハイドロゲンドナーを用いるのが好ましい。このハイドロゲンドナーとしては、チオール、還元糖、ポリフェノール、１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物などが好適であり、特にグルコースが好適である。
【００２２】
ヘモグロビンは、終濃度１０〜３０％が好ましい。ヘモグロビン自体は、赤血球を溶血させたものを精製して分子量が１万程度の分画を使用するのが好ましい。赤血球の由来はヒトが好ましく、採血後５０日以内のものが好適である。ヘモグロビンにはリンゴ酸を含有させてもよい。
【００２３】
親油性液体中に前記（Ａ）、ハイドロゲンドナー、ヘモグロビンを添加する場合、ヘモグロビンを水溶液とすることが好ましく、特にこの水溶液中にハイドロゲンドナーを溶解させておくことが好ましい。
【００２４】
また、（Ａ）物質も水溶液としておくが、この（Ａ）の物質は上記ヘモグロビン水溶液中に溶解しておいてもよく、これとは別の水溶液としておき、ヘモグロビン水溶液（ヘモグロビンとハイドロゲンドナーとの水溶液であってもよい）とは個別に親油性液体中に添加してもよい。（Ａ）の物質の水溶液中の濃度は０．１〜５０重量％程度が好ましい。
【００２５】
親油性液体中に添加する場合の上記（Ａ）、ハイドロゲンドナー、ヘモグロビンの割合は、（Ａ）に対してハイドロゲンドナーを０．０１〜１５０重量部、（Ａ）に対してヘモグロビンを０．０１〜１５０重量部であることが好ましい。
【００２６】
親油性液体中に水溶液を添加する方法としては、キャピラリー等を使用して滴下するのが好ましい。滴下等によって添加するとき、又は添加した後に、親油性液体を攪拌し、水溶液をよく分散させることが好ましい。この場合、得られる人工赤血球の直径が１０ｎｍ〜１０μｍとなるように分散させるのが好ましい。
【００２７】
親油性液体としては、ヘキサン、シクロヘキサン、流動パラフィンなどの炭化水素；クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素；ヒマシ油、オリーブ油などの天然油；のいずれでもよい。
【００２８】
この親油性液体にポリオキシエチレンセシルエーテル、オキシエチレンオキシプロピレンコポリマー、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を添加してもよく、これにより粒子をより細かく分散させることができる。界面活性剤の親油性液体への添加量は０．１〜５０重量％程度が好適である。
【００２９】
親油性液体に、ポリエチレングリコール等の増粘剤を添加してもよく、これにより分散粒子径を均一にしたり、分散粒子径を小さくしたりすることができる。増粘剤の親油性液体への添加量は０．１〜２０重量％程度が好適である。
【００３０】
本発明では、上記（Ａ）、ハイドロゲンドナー、ヘモグロビンの他にグルタチオン、アスコルビン酸、トコフェロール、ポリフェノール、システインなど生体への害が低い還元剤を添加してもよい。これにより、ヘモグロビンのメト化現象（ヘモグロビン分子中のＦｅ（プロトヘム）の原子価が３価となってしまい、酸素分子との結合能がなくなってしまう現象）を抑制することができる。
【００３１】
このような還元剤を用いる代わりに、又は還元剤と共に、グルコースと、ＮＡＤ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸）、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸）及びアデノシン三リン酸からなる群から選択される１種以上とを添加してもよい。これにより、ヘモグロビンのメト化を酵素反応で抑制できる。添加量としては、アデノシン三リン酸類がヘモグロビンに対して０．０１〜１倍量（モル比）が好ましく、グルコースはヘモグロビンに対して１〜２０倍量（モル比）が好ましい。
【００３２】
次に、本発明において用いるのに好適なエオシン化ゼラチンについて説明する。
【００３３】
ここでゼラチンは、分子量５千〜１０万、アミノ基約１０〜１００個／１分子程度の通常のゼラチンで良い。
【００３４】
エオシン化ゼラチンは、下記反応に従ってゼラチンの側鎖にエオシンを導入することにより調製される。
【化１】
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【００３５】
ゼラチン分子へのエオシンの導入数は、例えば、エオシン化ゼラチンの水溶液の吸光度をエオシンの最大吸収波長５２３ｎｍにおいて測定し、エオシンのモル吸光係数（ε＝９４７５５）を基に算出可能であり、ゼラチン１分子に対して１〜１０個、特に２〜５個程度が好ましい。このエオシン等の感光基を有する化合物の導入数が少ないとゲル化率が低下し、また必要以上に多くてもゼラチン固有の柔軟性が損なわれる可能性がある。
【００３６】
このエオシン化ゼラチンは、粘稠性の液体状である。これを例えば濃度１〜１０重量％の水溶液とした場合には、３００〜３０，０００ｌｘ程度の可視光、特に生体に対する用途にあっては、３００〜１５，０００ｌｘ程度の比較的低照度で、生体に対して影響の低い可視光を０．１〜３０分程度照射してゲル状に硬化させることができる。
【実施例】
【００３７】
以下に、合成例及び実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００３８】
合成例１：エオシン化ゼラチンの合成
ゼラチン（分子量９５，０００、アミノ基量約３７個／分子）に、水溶性カルボジイミドであるＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）の存在下、下記反応でゼラチンの側鎖のアミノ基にエオシンを結合させることにより、ゼラチン１分子当たりエオシン約５個を導入してエオシン化ゼラチンを合成した。精製は透析で行い、ゼラチン鎖へのエオシンの導入率は５２２ｎｍの吸光度から算出した。
【００３９】
【化２】
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【００４０】
実施例１
合成例１で合成したエオシン化ゼラチン及びベンゼン溶媒のＡＩＢＮを開始剤としたラジカル重合で合成したポリ（Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）をそれぞれ終濃度１０重量％及び３重量％となるよう水へ溶解した。
【００４１】
ヒト濃厚赤血球製剤を生理食塩水で洗浄し、タンパクや血小板などの細胞成分を除去した。この洗浄赤血球へ超純水を加えて溶血させ、０．２μｍメンブランフィルターで赤血球膜成分を除去した。炭酸緩衝溶液にてｐＨ＝７．４へ調整した後、超純水で透析、濃縮してヘモグロビン濃度６０％溶液を得た。このヘモグロビン溶液２００ｍＬへ、ＡＴＰ−Ｎａ１００ｍｇ、グルコース３．６ｇ、りん酸２水素カリウム２５０ｍｇ、りん酸水素２ナトリウム３００ｍｇを加えて混合し、親水性ヘモグロビン溶液を得た。
【００４２】
上記エオシン化ゼラチン及びＮ，Ｎ-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド溶液とヘモグロビン溶液を混合し、ポリオキシエチレン（２０）セシルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｂｒｊｉ５８）をシクロヘキサン（関東化学、特級）へ溶解して０．５Ｍの親油性溶液を得た。
【００４３】
この親油性溶液１５０ｍＬを窒素パージ、攪拌しながら、キャピラリーを使用してヘモグロビン溶液５ｍＬを滴下した。光化学反応装置（ウシオ電機製）中でハロゲンランプ（トクヤマ社製）にて波長４００ｎｍ〜５２０ｎｍの可視光を２００ｍＷ／ｃｍ２に調整して２０分間照射し、ゼラチン溶液を架橋した。４℃で冷却し、沈殿物を濾過して回収し、シクロヘキサンで洗浄した後にデシケーター中で残留するシクロヘキサンを蒸発させ平均粒径約１μｍの人工赤血球を得た（図１参照）。この人工赤血球を生理食塩水中に懸濁させると、膨潤し、平均粒径は約１０μｍとなった（図２参照）。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１で製造した人口赤血球の顕微鏡写真である。
【図２】図１の人口赤血球を生理食塩水に懸濁させたときの顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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