(57)【要約】      （修正有）【課題】染色体分配を制御するタンパク質の提供。【解決手段】セントロメア（動原体）に局在する、開示された５つのアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセントロメア構成タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性して染色体分配を制御するタンパク質。【効果】本タンパク質は制ガン薬剤のターゲットとして有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項２記載の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セントロメア構成タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、染色体分配を制御する新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。
【０００３】
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕まえて、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想されている（非特許文献３）。他のセントロメアタンパク質と同様に未同定のセントロメアタンパク質は、がん細胞で過剰に発現していることが予想される。したがって、未同定のセントロメアタンパク質は、制がん薬剤のターゲットになる可能性を秘めている。
【非特許文献１】Tomonaga et al., Cancer Res., 63, 3511-3516, 2003
【非特許文献２】Nishihashi et al., Dev. Cell, 2, 463-476, 2002
【非特許文献３】Fukagawa Exp. Cell Res., 296, 21-27, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、セントロメアに局在し、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合して染色体分配を制御しており、制がん薬剤のターゲットとして有用な新規タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質について研究を行い、特にＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに注目し、これに結合するタンパク質を探索してきた。その結果、今般、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、セントロメアへ局在し染色体分配を制御する機能を有する５種のタンパク質を見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のタンパク質は、セントロメアを構成するタンパク質であるＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する性質を有することから、染色体の分配に深く関与しているタンパク質である。このタンパク質の発現を制御すれば、がん細胞の増殖を制御でき、このタンパク質は制がん薬剤のターゲットとして有用である。すなわち、このタンパク質の過剰発現を抑制すれば、新たな作用機序による制がん剤が開発できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明タンパク質は、配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１〜５のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。
【０００９】
また、本発明の遺伝子は、前記タンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子としては、前記タンパク質をコードするものであれば制限されないが、例えば配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、又は０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。
【００１０】
配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列及び配列番号６〜１０から選ばれる塩基配列は、ニワトリ由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることはいうまでもない。
【００１１】
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。
【００１２】
本発明のタンパク質は、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、本発明の配列番号１〜５から選ばれるアミノ酸配列からなる５種類のタンパク質が得られる。
【００１３】
得られた本発明タンパク質は、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。
【００１４】
かくして得られた本発明のタンパク質及び遺伝子は、アミノ酸配列又は塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。
【００１５】
本発明タンパク質は、ＣＥＮＰ−Ｈ及びＣＥＮＰ−Ｉに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。本発明タンパク質が過剰に発現する細胞は、がん化している可能性が高く、本発明タンパク質又はこの遺伝子を検出すればがんの診断が可能である。また、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を指標にして、制がん剤の開発が可能である。すなわち、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を抑制する薬剤を探索すれば制がん剤がスクリーニングできる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１７】
（１）細胞内のＣＥＮＰ−Ｈ又はＣＥＮＰ−Ｉタンパク質の全てをタグ付き融合タンパク質に置換された細胞株の確立
ＣＥＮＰ−Ｈ遺伝子あるいはＣＥＮＰ−Ｉ遺伝子のゲノム領域と相同性のある約１０Kbのゲノム配列をプラスミドベクターｐＢＳへクローン化する。そのプラスミドへクローン化されたゲノム領域へ薬剤耐性遺伝子(ヒスチジノール耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子)を挿入したプラスミドを構築する (ノックアウトコンストラクト)。エレクトロポーレーション法(５５０Ｖ、２５マイクロＦ)を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで切断されたノックアウトコンストラクトをＤＴ４０細胞へ導入して、ノックコンストラクトとゲノム領域が置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株）を樹立する。相同組み換えの有無は、サザンハイブリダイゼーションで確認できる。平行して、ＣＭＶプローモーターの下流でＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現するプラスミドベクターを構築する(ＦＬＡＧタグ融合ベクター)。ＦＬＡＧタグ融合ベクターをエレクトロポーレーション法を用いて、ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉノックアウト株へ導入した。これらの細胞株では、野生型のＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がノックアウトされて、ＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質が発現しているため、細胞内の全てのＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質がＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＨあるいはＣＥＮＰ−Ｉタンパク質に置き換わっている。
【００１８】
（２）本発明タンパク質の分離
（１）で得た細胞を大量培養して間期の細胞を集めた。Dounceホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、遠心分離によって核を調製する。核を緩衝液Ａ（２０mM  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  pH８．０／１５０mM  ＫＣｌ／１mM  ＤＴＴ）に懸濁した後、超音波破砕し、遠心分離によってＤＮＡを含む画分を調製した。ＤＮＡを含む画分に最終濃度３mMのCaCl2を添加し、さらにマイクロコッカル・ヌクレアーゼを加えて４℃１時間反応させ、ＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに結合しているタンパク質を可溶化した。ＫＣｌ及びＮＰ−４０をそれぞれ最終濃度３００mM及び０．１％になるよう添加し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを添加して４℃３時間撹拌した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンを遠心分離によって回収し、緩衝液Ｂ（２０mM  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  pH８．０／３００mM  ＫＣｌ／１mM  ＤＴＴ／０．１％  ＮＰ−４０）を用いて洗浄した。抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジンに０．１Ｍ  Glycine  pH２．５溶液を添加して１分間静置した後、遠心分離によって溶液を回収した。溶液に等量の２０％トリクロロ酢酸及び５倍量のアセトンを添加し、−２０℃で２時間静置し、遠心分離によってタンパク質を回収した。
【００１９】
（３）タンパク質の同定
回収されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出し、ゲルを切り出して質量分析を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。各タンパク質の部分アミノ酸配列は、以下の通りである。
【００２０】
（ＣＥＮＰ−４０）Asp Gly Gly Gly Arg Met Pro Ala Ala Pro Leu Ala Gln Gly Lys Val Glu Arg 
【００２１】
（ＣＥＮＰ−３５）Lys Gln Trp Thr Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Tyr Lys Phe Ser Ser Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Met Leu Gly Val Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg 
【００２２】
（ＣＥＮＰ−３３）Lys Ala Glu Leu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Leu Ser Phe Leu Val Lys Phe Thr Gly Ile Gln Ile Thr Ser His Ser Lys Lys Thr Leu Glu Lys Thr Gly Asn Arg 
【００２３】
（ＣＥＮＰ−３０）Arg Asn Pro Glu Leu Ile Ser Thr Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys 
【００２４】
（ＣＥＮＰ−１７）Asn Val Gln Ala Ser Leu Ala Tyr Val Asp Val Arg Phe Phe Leu Gly Lys Val Cys Phe Leu Val Thr Gly Val Gly Arg Ala Asn Asn Cys Ser Val Glu Met 
【００２５】
ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞を大量培養し、クロマチン画分を調製した。抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてタンパク複合体を免疫沈降し、銀染色によってタンパクを検出した。得られた結果を図１に示す。コントロール実験として、野生型のＤＴ４０細胞 (wt)を大量培養し、クロマチン画分を調製して抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。ここで、検出されるタンパク質は、抗体の非特異的吸着により沈降されるタンパク質である。ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパクを発現する細胞で、特異的に沈降され、コントロール実験で沈降される5本のバンドに着目して、それらをＣＥＮＰ−Ｉ、ＣＥＮＰ−Ｈ、ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７と命名した。
ＣＥＮＰ−４０、ＣＥＮＰ−３５、ＣＥＮＰ−３３、ＣＥＮＰ−３０、ＣＥＮＰ−１７の各タンパクは、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと特異的に結合することから、これらが構成的にセントロメアに局在するタンパク複合体であると考えられた。ＣＥＮＰ−ＨをＣＥＮＰ−Ｈ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルとＣＥＮＰ−ＩをＣＥＮＰ−Ｉ−ＦＬＡＧに置き換えた細胞から調製したサンプルで共通に見られる５本のバンドを切り出して部分的アミノ酸配列を決定した。
【００２６】
（４）得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーングした。各種タンパク質に関して複数種類のｃＤＮＡクローンを得て、得られたすべてのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。その結果すべての  種類のタンパク質に関して開始コドンと予想されるＡＴＧが見いだされ、完全長のｃＤＮＡの塩基配列が決定できた。（ＣＥＮＰ−４０が配列番号１及び６、ＣＥＮＰ−３５が配列番号２及び７、ＣＥＮＰ−３３が配列番号３及び８、ＣＥＮＰ−３０が配列番号４及び９、ＣＥＮＰ−１７が配列番号５及び１０にそれぞれ対応する）。それらのｃＤＮＡを参考にプライマーを設計して、ＰＣＲ反応を行いストップコドンをとり除いたｃＤＮＡを得て、その断片をｐＥＧＦＰＮ１(クローンテック社)のＢａｍＨＩサイトへクローン化した。それぞれのプラスミドは、ストップコドンが取り除かれてＧＦＰのコード領域と融合している(ＧＦＰ融合発現プラスミド)。ＧＦＰ融合発現プラスミドをＤＴ４０野生型細胞あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−ＲＦＰ発現細胞(セントロメア領域が赤で標識されている細胞)へ導入して、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を安定に発現させた。それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の安定発現細胞を集めて、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン法によってスライドグラス上に貼付けた。スライドグラスを３％パラホルムアルデヒドに１５分間浸透させ、細胞を固定した。細胞をＰＢＳでリンスした後０．３マイクロg/mLのＤＡＰＩで細胞核及び染色体を染色した。作成したスライドグラスを蛍光顕微鏡へ供してＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を緑チャンネルで観察した。細胞形態によって、細胞分裂期の細胞と間期の細胞の区別が可能となる。５種類すべてのタンパク質がＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉと同様に細胞周期を通じて点状のドットとして観察された。ＣＥＮＰ−Ｈと局在をともにすることから、すべてのタンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることが確認できた（図２〜図６）。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＣＥＮＰ−Ｉ−ＧＦＰ、ＣＥＮＰ−Ｈ−ＧＦＰ、あるいはＣＥＮＰ−Ｈ−３×ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現する細胞から得られた抽出液を、抗ＧＦＰ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫複合体を免疫沈降させた結果を示す図である。図中、ＷＴは野生株細胞を示す。
【図２】ＣＥＮＰ−４０の細胞内局在を示す図である。ａ、ｂはＭ期、ｃは間期であり、ＣＥＮＰ−４０は緑、ＤＡＰＩは青に染色されており、細胞核及び染色体を示している。
【図３】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−３５及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図４】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)、ＣＥＮＰ−３３及びＣＥＮＰ−Ｈの細胞内局在を示す図である。
【図５】ＣＥＮＰ−３０の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−３０は緑、ＤＡＰＩ(細胞核)は青に染色されている。
【図６】融合タンパク質（merge）、ＤＡＰＩ(細胞核)及びＣＥＮＰ−１７の細胞内局在を示す図である。ＣＥＮＰ−１７は緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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