(57)【要約】      （修正有）【課題】  ２種類以上の細胞を同時に培養する共培養を行うことなく、簡単な操作で効率良く細胞を増殖・分化させることができる方法を提供すること。【解決手段】  第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする、細胞の増殖又は分化の制御方法。特に、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する細胞の増殖または分化の制御方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする、細胞の増殖又は分化の制御方法。
【請求項２】
上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体上で、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上皮系の細胞として、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞、マラッセの上皮遺残細胞、口腔粘膜上皮細胞、上皮細胞又はこれらの前駆細胞を使用する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
間葉系細胞として、歯胚間葉系細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯乳頭細胞、歯嚢細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞、又は間葉系の幹細胞を使用する、請求項２から４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖又は分化方法に関する。より詳細には、本発明は、ある種の細胞の培養上清を用いて別の種の細胞の増殖又は分化を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞医療や再生医療を実現するためには、細胞の増殖・分化を効率よく制御するための技術を確立することが必要である。従来の細胞培養法において細胞を効率よく増殖・分化させるためには、Fibroblast growth factor (FGF)、Endothelial growth factor(EGF)などのサイトカイン、およびdexamethasoneなどの生理活性作用をもつ薬剤などを用いて培養を行っているが、単一の因子での細胞制御には限界があり、また人為的に合成した生理活性物質の使用には副作用の問題などが懸念される。従って、このような問題を解決するために、細胞に対して無理な負荷がかからず、かつ効率的に細胞の増殖・分化を制御する技術が求められている。
【０００３】
特許文献１には、培養上清を利用した細胞培養技術として、自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地に自己組織抽出液を添加してヒト細胞の培養を開始する手順と、細胞培養の過程で前記ヒト細胞から分泌された物質を含む培養上清を利用して細胞培養を継続する手順とを含むヒト細胞培養方法、該方法によって培養された細胞を自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地で分離継代する方法、及びこれらの方法で培養された細胞を凍結保存する方法が記載されている。特許文献１に記載の技術は、無血清培地の添加成分として培養上清を加えることで、無血清培地における細胞増殖能を改善するものであり、細胞の増殖・分化の制御を目的としたものではない。
【０００４】
また、非特許文献１には、上皮系および間葉系の細胞の混合培養により、細胞の石灰化および分化誘導を行うことが記載されている。さらに、非特許文献２には、ウサギ切歯由来の上皮細胞と共培養した歯髄細胞では象牙芽細胞への分化のマーカーであるアルカリホスファターゼの合成が増大することが記載されている。しかしながら、これらの方法では、単一容器中で、複数種の細胞を同時に制御する必要があるほか、臨床面で応用する場合に余計な細胞が混入する恐れがあるという問題がある。
【０００５】
【特許文献１】特開2004-173563号公報
【非特許文献１】Ishizeki,K., Acta Anat Nippon 71: 294-307 (1996)
【非特許文献２】Hideki Shiba et al., Cell Biology International 27 (2003) 815-823
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、２種類以上の細胞を同時に培養する共培養を行うことなく、簡単な操作で効率良く細胞を増殖・分化させることができる方法を提供すること解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ある種の上皮系細胞の培養上清の存在下で間葉系細胞を培養することにより、間葉系細胞の増殖や分化を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする、細胞の増殖又は分化の制御方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する。
好ましくは、担体上で、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する。
好ましくは、上皮系の細胞として、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞、マラッセの上皮遺残細胞、口腔粘膜上皮細胞、上皮細胞又はこれらの前駆細胞を使用する。
好ましくは、間葉系細胞として、歯胚間葉系細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯乳頭細胞、歯嚢細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞、又は間葉系の幹細胞を使用する。
【００１０】
本発明の一実施態様によれば、口腔粘膜上皮細胞の培養上清の存在下において間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の増殖促進方法が提供される。
本発明の別の実施態様によれば、歯胚上皮細胞の培養上清の存在下において歯胚間葉系細胞を培養することを含む、歯胚間葉系細胞の分化促進方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により得られる、増殖又は分化した細胞が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法により増殖又は分化した間葉系細胞を用いて、歯胚を再生する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、細胞培養の培地交換の際に得られる培養上清に含まれる生理活性物質の効果を利用して、この培養上清を別の細胞の培養に利用することにより、当該細胞の増殖・分化を促進させる技術である。以下に記載する本発明の実施例に示すとおり、培養上清の由来となる細胞と、上清を用いて培養する細胞との組み合わせを変えることにより、所望の細胞を増殖・分化させることができる。本発明は生体が本来もっている生理活性作用を応用した技術であることから、細胞に不自然な負担をかけずに、細胞を効率よく増殖・分化させることができる。また、移植医療や細胞療法、再生医療など、他家由来の因子などを使用しにくい場面においても、他の因子を用いることなく、患者由来の細胞の組み合わせにより、患者由来の組織・細胞のみで、自在に細胞の増殖・分化を制御できるような系を構築することができる。また、本発明における細胞培養は、単一の種類の細胞の培養であるため、細胞の制御が比較的簡便であり、さらに、臨床へ応用する際にも余計な細胞が混入する恐れがないという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による細胞の増殖又は分化の制御方法は、第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする方法である。好ましい態様によれば、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養することができる。本発明の別の態様によれば、間葉系細胞の培養上清の存在下において上皮系細胞を培養することもできる。
【００１４】
本発明は生体内の上皮・間葉相互作用に関連する因子が、細胞を培養する際に培養上清中に分泌されることを利用した技術である。生体において、上皮・間葉系細胞の相互作用は重要で、生体の器官および組織の発生、あるいはそれらの形態・機能の維持には、それぞれの部位における上皮および間葉系細胞から、増殖・分化の制御因子が放出され、器官・組織の発生・維持をおこなっている。
【００１５】
本発明は、このような生物学的特性を利用し、細胞培養の培地交換の際に出る培養上清に含まれる生理活性物質の効果を期待し、この培養上清を別の細胞の培養に利用することで、細胞の増殖・分化を促進させる技術である（図１）。
【００１６】
本発明では、培養上清を採取するための細胞として、例えば、上皮系細胞を使用することができる。本発明で用いる上皮系細胞としては、上皮系細胞であれば特にその種類は限定されないが、好ましくは、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞、マラッセの上皮遺残細胞、口腔粘膜上皮細胞、上皮細胞、表皮細胞又はこれらの前駆細胞が挙げられる。これらの細胞は、１種類の上皮系細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の上皮系細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。
【００１７】
本発明で増殖又は分化を促進するための細胞としては、例えば、間葉系細胞を使用することができる。間葉系細胞としては、間葉系細胞であれば特にその種類は限定されないが、好ましくは、歯胚間葉系細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯乳頭細胞、歯嚢細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞、又は間葉系の幹細胞等が挙げられる。これらの細胞は、１種類の間葉系細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の間葉系細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。
【００１８】
上皮系細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚等）の歯胚、歯根膜（マラッセの上皮遺残）、口腔粘膜、付着上皮、皮膚等から公知の方法により採取することができる。例えば、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞等の上皮系細胞の場合、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Hanks balanced salt solution（ＨＢＳＳ）溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、ＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼとディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。得られた細胞を、培地として、例えばＭＣＤＢ１５３（ｋｙｏｋｕｔｏ  Ｃｏ．）を用いて培養すると、歯胚中の間葉系細胞が失われ、上皮系細胞のみを得ることができる。
【００１９】
また、口腔粘膜上皮細胞の場合、ヒトより採取した口腔粘膜をディスパーゼで処理した後、上皮部分を剥がし、トリプシン処理することにより得ることができる。
【００２０】
上皮系細胞の培養上清は、当業者に公知の常法により採取することができる。例えば、上皮系細胞の培養中における培地交換の際に培養上清を採取し、採取した培養上清に対してフィルターろ過を行って浮遊している細胞や不純物を除去してから用いることができる。
【００２１】
間葉系細胞は、哺乳類（例えば、ヒト、豚など）の歯胚、歯髄、歯槽骨、骨髄等から公知の方法により採取することができる。例えば、歯胚中の間葉系細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、ＰＢＳ溶液又はＨＢＳＳ溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、ＰＢＳ溶液又はＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼとディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。得られた細胞を、培地として、Dulbecco's Modified Eagle Mediumに１０％牛胎児血清と１％抗生剤を添加したものを用いて継代培養すると、歯胚中の上皮系細胞が失われ、間葉系の細胞のみを得ることができる。
【００２２】
また、歯牙からの歯髄の摘出は、例えばAbout I.,他Experimental cell research.258.33-41,2000に記載の方法に従って行うことができる。無菌的に採取した歯髄を、シャーレに移し、培地中で培養することにより、間葉系細胞を得ることができる。
更に、公知の方法に従い、腸骨等から骨髄穿刺を行って骨髄を採取し、培養することで間葉系の幹細胞を得ることができる。
【００２３】
本発明の方法に従って培養した細胞（例えば、間葉系細胞など）は、増殖又は分化が促進されていることから、細胞医療や再生医療に利用することができる。例えば、歯胚間葉系細胞を増殖・分化させることにより象牙芽細胞あるいは歯胚を形成させることが可能であり、これを歯科患者に移植することにより、該患者の治療のために用いられる。この場合、移植に伴う生体適合性などの観点から、培養に用いる間葉系細胞は、該患者に由来する自分の細胞を用いることが好ましいが、同種（他家）の細胞を使用することも可能である。
【００２４】
歯牙は、発生から成熟するまでに５つの段階を経て形成されることが知られている。第一期は、Initiation stageと呼ばれ、基底膜に上皮組織と間葉組織が誘導される。第二期は、Bud stageと呼ばれエナメル器が作られる。第三期はCap stageと呼ばれ、歯乳頭が形成され、歯胚が形成される。第四期はBell stageと呼ばれ、歯胚からエナメル質を形成する細胞への分化と歯乳頭から象牙質と歯髄を形成する細胞への分化が開始される。第五期はMaturation stageと呼ばれ、エナメル質と象牙質と歯髄などの歯牙を構成する組織へと分化する。本発明で用いる上皮系細胞及び間葉系細胞としては、これらのうちの好適な時期の細胞を採取して用いることができる。また、歯胚が存在していない症例では、歯根より歯髄を摘出して細胞を分離採取することができる。
【００２５】
上皮系細胞及び間葉系細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から３７℃の温度；５から１０％ＣＯ2 インキュベーター内など）の下で行なうことができる。また、上皮系細胞の培養には、無血清培地を使用して培養することも可能であるし、繊維芽細胞等のフィーダー細胞を共存させて培養することも可能である。
【００２６】
本発明において細胞の培養は担体上で行ってもよいし、担体なしで培養してもよい。担体の使用は、細胞から歯胚を形成するのに有用である。担体としては、歯胚の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。即ち、皮下、胃大網又は顎骨内などの生体内において適切な吸収速度と特性を有し、かつ細胞と高い親和性を有する材料から成る担体を使用することが好ましい。
【００２７】
担体の素材は、上記特性を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ポリグリコール酸（polyglycolic acid（ＰＧＡ））、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリカプロラクトンなどの合成高分子材料、またはコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの蛋白質材料、あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙質、サンゴなどの天然由来材料を使用することもできる。さらに、リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などの無機材料も使用することができる。
【００２８】
ＰＧＡは、例えばAlbany International Research Co.などから購入することができ、またＰＬＧＡはSigmaから購入することができる。ＰＧＡの場合、吸収速度が速いため、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）を表面にコートして吸収期間を遅らせることもできる。さらに、ＰＧＡ、ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着及び増殖性を高めるために、表面にコラーゲン溶液又はフィブロネクチン溶液等をコートして使用することもできる。
【００２９】
上記の担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態、不織布形態などが可能である。
【００３０】
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状の多孔体あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血管が進入しやすくなっているものが好ましい。
【００３１】
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。その後、レジンの型を取り出し、担体を構成する合成材料を流しこむことによって目的の形態を再現することができる。
【００３２】
本発明の方法では、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養した後に、該間葉系細胞を移植動物に移植し、該移植動物の体内で象牙質や歯胚を再生させてもよいし、該間葉系細胞を直接患者に移植してもよい。細胞の培養の際に用いた担体も細胞と一緒に、移植動物の体内に移植することができる。
【００３３】
移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ラット（ヘアレスラットなど）、ウサギ又はマウスなどのげっ歯類動物を使用することができる。移植の部位としては、骨の形成に必要な因子を供給しやすい部位が好ましく、具体的には、血流の豊富な部位が好ましく、例えば、腹腔内の胃大網などが特に好ましい。このような部位に移植することにより、細胞の成長を促進することができ、骨の形成を早めることが可能となる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：口腔粘膜上皮細胞の培養上清を用いた間葉系幹細胞の増殖
（方法）
ラット口腔粘膜上皮をメンテナンス培地にて培養し、コンフルエントに達した口腔粘膜上皮の培地を交換した。その後、3日おきに培地交換を行い、培地交換の際にでる培養上清を採取した。採取した培養上清に対してはフィルターろ過を行い、浮遊している細胞や不純物を完全に除去した。
【００３５】
上記の手法で採取した培養上清を、任意の量のDMEMで希釈し、この培養上清を培地として、間葉系幹細胞（MSC）の培養を行い、MSCの増殖能に対する培養上清の影響を検討した。
【００３６】
（結果）
6well Plateに初期数（１×104個）を播種し、DMEM培地，DMEM：メンテナンス培地＝１：１，DMEM：培養上清＝１：１，DMEM：培養上清＝３：１，DMEM＝培養上清＝７：１の培地を検討した結果、DMEM：培養上清＝７：１の混合比の培地で培養したMSCにおいて、高い細胞増殖能を示した（図２）。また、細胞の形態および増殖速度の低下は観察されなかったことから、この培養上清は、MSCに対して細胞増殖を起こさせる性質があることが示唆された。
【００３７】
実施例２：歯胚上皮細胞の培養上清を用いた歯胚間葉系細胞の分化
（方法）
ブタ歯胚よりディスパーゼを用いて分離したブタ歯胚上皮系細胞をKGM培地にて培養し、コンフルエントに達した歯胚上皮の培地を交換した。その後、3日おきに培地交換を行い、培地交換の際にでる培養上清を採取した。採取した培養上清に対してはフィルターろ過を行い、浮遊している細胞や不純物を完全に除去した。
【００３８】
上記の手法で採取した培養上清を、任意の量のDMEMで希釈し、この培養上清を培地として、歯胚間葉系細胞の培養を行い、培養上清の増殖能および分化能に対する培養上清の影響を検討した。
【００３９】
（結果）
12well Plateに初期数（１×104個）を播種し、DMEM培地，DMEM：KGM培地＝１：１，DMEM：KGM培地＝１：３，DMEM：KGM培地＝３：１，DMEM＝培養上清＝１：１，DMEM：培養上清＝１：３，DMEM：培養上清＝３：１，歯胚上皮上清の培地を検討した結果、歯胚上皮上清を用いた歯胚間葉系細胞においては、ほとんど細胞増殖を示さなかった一方で、非常に高いALP活性を示す結果となった（図３）。従って、培養上清を用いて培養した歯胚間葉系細胞において、細胞増殖がほとんど起こらなかったことと、一方で高いALP活性を示したことから、この培養上清は、歯胚間葉系細胞に対して細胞分化を起こさせる性質があることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明による培養上清を用いた細胞培養技術を示す。
【図２】図２は、口腔粘膜上皮細胞の培養上清による細胞増殖作用を示す。Ａは、口腔粘膜上皮細胞の培養上清により培養したＭＳＣの細胞数の変化を示す。Ｂは、初期細胞数を基準とした増加率を示す。
【図３】図３は、歯胚上皮細胞の培養上清による細胞分化作用を示す。Ａは、歯胚上皮細胞の培養上清により培養した歯胚間葉細胞の細胞数の変化を示す。Ｂは、歯胚上皮細胞により培養した歯胚間葉細胞のＡＬＰ活性の変化を示す。
【図１】
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【図２】
2006280234.tif 000004
【図３】
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