(57)【要約】      （修正有）【課題】  インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）と相互作用するインターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）のＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）又はＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）シグナル伝達経路を介するインターフェロンαの産生促進又は抑制する物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  ＩＲＡＫ−１ＩＲＦ７とを、被検物質が存在する細胞内で発現させ、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定したり、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を、被検物質の存在下にインビトロで測定したり、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスや該マウス由来の細胞に、被検物質とＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与又は刺激し、モデルマウスや由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量やＩＲＦ７の活性化の程度を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）とインターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）とを、被検物質が存在する細胞内で発現させ、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定し、被検物質の不存在下にＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させた場合のＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、ペプチドタグ標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、共免疫沈降法により測定することを特徴とする請求項１記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、倒立蛍光顕微鏡で視覚化することにより測定することを特徴とする請求項１記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、フローサイトメトリーを用いてＦＲＥＴを分析することにより測定することを特徴とする請求項１記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＩＲＦ７として、ＩＲＦ７のアミノ酸配列２３８と２８５の間の領域を少なくとも有するＩＲＦ７を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）によるインターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）のＣ末端のリン酸化の程度を、被検物質の存在下にインビトロで測定し、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を被検物質の不存在下にインビトロで測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を、ＧＳＴ−ＩＲＦ７を基質として用いたキナーゼ分析により測定することを特徴とする請求項６記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに、被検物質とＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与し、モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を投与することなく、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与した場合のモデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を、モデルマウスにおけるインターフェロンαのｍＲＮＡ量としてノーザンブロット分析により測定することを特徴とする請求項８記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を、細胞の培養上澄のＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−α濃度として測定することを特徴とする請求項１０記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を、抗ＩＲＦ７抗体を用いたイムノブロット分析により核タンパクを分析することにより測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシ核酸分子（ＣｐＧ ＯＤＮ）であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ＣｐＧオリゴデオキシ核酸分子（ＣｐＧ ＯＤＮ）がＤ３５又はＯＤＮ１６６８であることを特徴とする請求項１３記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ＴＬＲ７リガンドがＲ−８４８であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７の活性化に必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質
【請求項１７】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１９】
タンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする請求項１６に記載の使用方法。
【請求項２０】
ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７を活性化してインターフェロンαの産生を誘導する必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質
【請求項２１】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡにコードされることを特徴とする請求項２０に記載の使用方法。
【請求項２２】
タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする請求項２０に記載の使用方法。
【請求項２３】
タンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする請求項２０に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）と相互作用するインターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）のＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）又はＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）シグナル伝達経路を介するインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
また本発明は、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７の活性化に必須の制御因子としてのインターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）の使用方法や、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７を活性化してインターフェロンαの産生を誘導する必須の制御因子としてのインターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、異物を認識することで、活性化シグナルを伝え、樹状細胞成熟化を誘導する獲得免疫のリンクに重要なレセプター分子であり、哺乳動物における自然免疫応答に重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１及び２参照。）。これまでに、ＴＬＲファミリーとして１１種類の受容体が同定されている（例えば、非特許文献３）。これらの受容体のうち、ＴＬＲ７、８、９は、それぞれが密接な分子構造をもち、核酸リガンドを認識することにより同様の免疫応答を示すことが知られている（例えば、非特許文献４参照。）。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）や、イミダゾキノリンを認識し、ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡや、ＣｐＧオリゴデオキシ核酸分子（ＣｐＧ ＯＤＮ）を認識する（例えば、非特許文献５〜１０参照）。これら核酸リガンドとの結合時に、ＴＬＲ７やＴＬＲ９は、ＴＩＲドメインを含むアダプターＭｙＤ８８をリクルートする。さらに、ＭｙＤ８８は、デスドメイン間の同分子種間相互作用（homophilic interaction）を通じ、インターロイキン１受容体結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）ファミリーメンバーと会合する。ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）もＴＬＲ受容体複合体にリクルートされ、最終的にＮＦ−κＢとＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）が活性化される。これらのメカニズムにより、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２等の炎症性サイトカインが誘発される（例えば、非特許文献３参照）。これらは、ＭｙＤ８８依存性伝達経路と呼ばれるＴＬＲシグナルにおける既知の伝達経路である（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
ＩＲＡＫファミリーメンバーには、ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−２、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＩＲＡＫ−４を含む４つのファミリーメンバーが知られている（例えば、非特許文献１１〜１４参照）。これら４つのファミリーメンバーの中で、ＩＲＡＫ−１とＩＲＡＫ−４だけが内在性セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する（例えば、非特許文献１５参照）。ＩＲＡＫ−１は、インビトロにおいて、ＩＬ−１Ｒシグナルと関わりのあるキナーゼとして報告されていた（例えば、非特許文献１６及び１７参照）。Ｉｒａｋ−１−／−胚性繊維芽細胞（ＥＦｓ）では、ＩＬ−１を介するＩＬ−６の産生のみならず、ＭＡＰＫｓやＮＦ−κＢの活性化が減少した（例えば、非特許文献１４及び１８参照）。しかし、Ｉｒａｋ−１−／−マウスのマクロファージは、ＴＬＲリガンドの応答におけるＮＦ−κＢの活性化や、サイトカイン産生の部分的障害を示しただけであった（例えば、非特許文献１９）。対照的に、ＩＲＡＫ−４−／−では、ＩＬ−１や、ＩＬ−１８又はＴＬＲファミリーの各種リガンドに対する応答において、顕著な障害を示した（例えば、非特許文献２０参照）。ＩＲＡＫ−４-/-での表現型は、ＭｙＤ８８−／−マウスでの表現型と極めて類似している。このように、ＩＲＡＫ−４は、ＭｙＤ８８依存性経路において必須であると考えられていた。また、インビトロの実験では、ＩＲＡＫ−１は、ＩＲＡＫ−４によってリン酸化し活性化することが示されている（例えば、非特許文献１２及び２０参照）。しかし、ＩＲＡＫ−１とＩＲＡＫ−４との関係や、様々なシグナル伝達（発生）におけるＩＲＡＫｓのキナーゼ活性化に必要な条件は、明らかにされていない（例えば、非特許文献２１及び２２参照）。
【０００５】
炎症性サイトカインの産生に加えて、樹状細胞（ＤＣｓ）では、ＴＬＲ７、８、９リガンドによる受容体刺激は、I型インターフェロンの産生を誘発することが報告されている。さらに、樹状細胞（ＤＣｓ）の特殊なサブセットである形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）において、ＴＬＲ７、８、９リガンドによる受容体刺激は、インターフェロンαの産生を誘発することが報告されている。このＤＣｓの特殊なサブセットは、ウイルス感染によるＩ型インターフェロンの大量生産能を持つことが知られている（例えば、非特許文献２３〜２５参照）。これらＴＬＲリガンドに応答するインターフェロンαの誘導は、ＭｙＤ８８−／−ｐＤＣｓにおいて、完全に消滅されており（例えば、非特許文献２６参照）、ＴＬＲ７、８、９は、ｐＤＣｓでのＭｙＤ８８依存的に、インターフェロンαをコードする遺伝子を活性化する独特のメカニズムを持っていることを示唆している。ＴＬＲ受容体複合体において活性化されたＩＲＦ７は、細胞核に移行し、Ｉ型インターフェロン遺伝子の転写を誘発する。このようにＩＲＡＫ−１は、ＭｙＤ８８の下流で作用すると考えられてきたが、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したインターフェロンαの産生におけるＩＲＡＫ−１の役割は不明であった。
【０００６】
【非特許文献１】Cell 91:295-298. 1997.
【非特許文献２】Annu Rev Immunol. 21:335-376. 2003.
【非特許文献３】Nat Rev Immunol. 4:499-511. 2004.
【非特許文献４】Curr Mol Med 3:373-385. 2003.
【非特許文献５】Proc Natl Acad Sci U S A 101:11416-11421. 2004.
【非特許文献６】Blood 103:1433-1437. 2004.
【非特許文献７】J Exp Med 198:513-520. 2003.
【非特許文献８】Nature 408:740-745. 2000.
【非特許文献９】Nat Immunol. 3:196-200. 2002.
【非特許文献１０】Science 303:1526-1529. 2004.
【非特許文献１１】Science 278:1612-1615. 1997.
【非特許文献１２】Proc Natl Acad Sci U S A 99:5567-5572. 2002.
【非特許文献１３】Cell 110:191-202. 2002.
【非特許文献１４】J Exp Med 187:2073-2079. 1998.
【非特許文献１５】Mol Cell 11:293-302. 2003.
【非特許文献１６】Immunity 7:837-847. 1997.
【非特許文献１７】Eur J Immunol 28:3100-3109. 1998.
【非特許文献１８】J Immunol 163:978-984. 1999.
【非特許文献１９】J Immunol 164:4301-4306. 2000.
【非特許文献２０】Nature 416:750-756. 2002.
【非特許文献２１】J Biol Chem 279:40653-40658. 2004.
【非特許文献２２】J Biol Chem 279:26748-26753. 2004.
【非特許文献２３】Nat Immunol 2:1144-1150. 2001.
【非特許文献２４】J Exp Med 194:1171-1178. 2001.
【非特許文献２５】Blood 100:383-390. 2002.
【非特許文献２６】J Immunol. 170:3059-3064. 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）と相互作用するインターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）のＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）又はＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）シグナル伝達経路を介するインターフェロンαの産生促進又は抑制する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＩＲＡＫ−１は、当初ＩＬ−１処理後ＩＬ−１Ｒ複合体にリクルートされたキナーゼとして同定された（非特許文献１６，１７参照）。インビトロでの研究で、ＩＲＡＫ−１が、ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルのＮＦ−κＢ活性と関係があることが証明された（非特許文献１５参照）。Ｉｒａｋ−１−／−ＥＦｓを用いた研究で、ＩＲＡＫ−１が、ＭＡＰＫｓやＮＦ−κＢの活性化に関わり、ＩＬ−１を介したＩＬ−６の産生に必須であることが確認された（非特許文献１４，１８参照）。しかし、ＴＬＲ−４リンガンドＬＰＳに応答したＮＦ−ｋＢの活性化及びサイトカイン産生は、Ｉｒａｋ−１−／−マクロファージ（非特許文献１９参照）において部分的にのみ障害されており、ＴＬＲリガンドに対する応答におけるＩＲＡＫ−１の役割は細胞特異性があることが示唆された。本発明者らは、ＩＲＡＫ−１は、ｐＤＣｓにおけるＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路においてＩＲＦ７の活性化に必須の制御因子であるという、ＩＲＡＫ−１の新規な機能を見い出した。ＩＲＡＫ−１は、ｐＤＣｓにおけるＴＬＲ９を介した炎症性サイトカインの産生及びＮＦ−κＢやＭＡＰキナーゼの活性化に必須でなかった。ＩＲＡＫ−１は、ＩＦＮαの産生を誘導するＩＲＦ７経路の活性化への分岐点としての役割を果たすことを見い出した（図５Ｃ）。
【０００９】
ＩＬ−１Ｒのシグナル伝達経路における研究に基づき、ＩＲＡＫ−１活性化メカニズムを説明する精巧なモデルが構築された（非特許文献１５参照）。リガンド刺激により、ＩＲＡＫ−１はＩＬ−１Ｒへリクルートされ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ−４やＴＲＡＦ６と複合体を形成する。ＩＲＡＫ−４は、ＩＲＡＫ−１の上流に位置し、ＩＬ−１Ｒ複合体においてＩＲＡＫ−１をリン酸化することが示唆されている。このリン酸化が、ＩＲＡＫ−１自体のキナーゼ活性の誘発を引き起こし、結果として、ＩＲＡＫ−１は、複数のリン酸化を誘発し、ＴＲＡＦ６との親和性の向上をもたらす（Nat Cell Biol 2:346-351. 2000及びJ Exp Med 197:263-268. 2003参照）。ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性は、下流のＮＦ−κBの活性化に必須でないことが報告（Mol Cell Biol 19:4643-4652.1999参照）されたため、キナーゼ活性の正確な役割はまだ明らかにされていなかった。ｐＤＣＳにおけるＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路では、リガンド刺激により類似した受容体複合体が形成されると思われていた。遺伝学研究では、ＭｙＤ８８やＩＲＡＫ−４は、炎症性サイトカインとＩＦＮ−αの両方の誘導に必須であると示され（Proc Natl Acad Sci U S A 101:15416-15421.2004参照）、これらの分子は、シグナルの特異性を決定していないことを示している。さらに、ＩＲＡＫ−４は、ＩＲＦ７と直接的に結合せず、シグナルにおいて、ＩＲＡＫ−１の上流で作用することを示している。つまり、ＩＲＡＫ４は、ＩＲＡＫ−１のリン酸化を介してＩＲＦ７経路に参画する可能性がある。
【００１０】
ＩＲＦ７の活性化は、リン酸化によって調節されているとも考えられていた（Mol Cell Biol. 20:8803-8814.2000，EMBO J. 17:1087-1095.1998参照）。以前の研究で、２つのＩＫＫ関連キナーゼ、ＴＢＫ１（TANK binding kinase 1）や、誘導性ＩＫＫ（inducible IKK）がＩＲＦ３と同様に、ＩＲＦ７のリン酸化と関係がある（Science 300:1148-1151.2003，Nat Immunol. 4:491-496.2003参照）。ＴＢＫ−／−細胞は、ＴＬＲ３やＴＬＲ４刺激に応答してＩ型ＩＦＮを産生することができなかった（Nat Immunol. 4: 1144-1150. 2003，J Immunol. 169:6668-6672.2002，Science 301:640-643.2003，J Exp Med. 199:1641-1650.2004参照）。それにもかかわらず、本発明者らは、ＴＢＫ１やＩＫＫi欠失マウス由来のpＤＣsにおいて、ＣＰＧ ＯＤＮに応答するＩＦＮ−αの産生が、野生型細胞と比較して障害されていないことを見い出した。重複の可能性を排除するために、ＴＢＫ１及びＩＫＫiの両方が欠失するマウスを用いた更なる研究が必要であるが（J Exp Med199:1651-1658.2004参照）、他のキナーゼがＴＬＲ７やＴＬＲ９のシグナル伝達に関係していると信じるのが妥当である。他方、ＤＮＡに損傷を与える紫外線や化学療法薬（chemotherapeutic agent）に応答して、ＩＲＦ７がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）；ＭＫＫ４−ＪＮＫ経路（kinase 4 (MKK4)-c-Jun NH2-Terminal kinase (JNK)）によって活性化することが報告されている（Cancer Res 60:1153-1156.2000参照）。これらの観察結果から、ＩＲＦ７の活性化は、様々な刺激に応答するＭＡＰＫカスケードの下流で起きることが暗示された。しかし、ＴＬＲ９リガンドに応答するＭＡＰＫの活性化は、Ｉｒａｋ−１−／−ｐＤＣにおいて障害されず、ＩＲＦ７の活性化に関与する他の経路の存在が示唆されている。
【００１１】
本発明者らは、インビトロでＩＲＡＫ−１がＩＲＦ７をリン酸化することや、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ ネガティブ変異体（ＩＲＡＫ−１ ＫＮ）又はＩＲＡＫ−１ ＫＮの発現が、ＩＲＦ７やＭｙＤ８８との共発現によって誘因されるＩＦＮ−α４プロモータの活性化を抑制することを示した。これらのデータは、ＩＲＡＫ−１がＩＲＦ７のキナーゼとして役立つ可能性を示唆している。しかし、本発明者らは、ＩＲＡＫ−１によってＩＲＦ７の内因性リン酸化を示すことができなった。というのも、これらの実験は、ＩＲＦ７の発現（量）がわずかであることや、ＩＲＡＫ−１の刺激依存性退化（stimulus-dependent degradation）のために技術的に難しかった。
【００１２】
ＴＬＲファミリーメンバーのうち、ＴＬＲ７、８、９は形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）において、インターフェロンαの産生を誘発し、この誘発には、ＭｙＤ８８、ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）及びＩＲＦ７からなる複合体の形成が必要とされるが、本発明者らは、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したＩＲＦ７シグナル伝達経路におけるＩＲＡＫ−１の重要な役割を明らかにした。すなわち、ＩＲＡＫ−１はインビトロにおいてＩＲＦ７と直接的に結合しリン酸化すること、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性はＩＲＦ７の転写活性に必要であること、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したインターフェロンαの産生はＩＲＡＫ−１―／Ｙマウスにおいては完全に消滅したが、プロ炎症性サイトカインの産生は障害されなかったこと、ＮＦ−κＢやＭＡＰＫｓが正常に活性化されるにもかかわらず、ＩＲＡＫ−１―／ＹｐＤＣｓにおいて、ＩＲＦ７はＴＬＲ９リガンドによって活性化されなかったことを確認した。
【００１３】
以上の結果から、ＩＲＡＫ−１は、ｐＤＣｓにおけるＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したインターフェロンαに特異的な制御因子であることが示された。これらの結果は、ＩＲＡＫ−１がＩＦＮ−αの産生の特異的な調節に対する（興味深い）治療上のターゲットとなる可能性を与え、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療へ応用することができることを示している。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）とインターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）とを、被検物質が存在する細胞内で発現させ、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定し、被検物質の不存在下にＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させた場合のＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（２）ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、ペプチドタグ標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、共免疫沈降法により測定することを特徴とする前記（１）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（３）ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、倒立蛍光顕微鏡で視覚化することにより測定することを特徴とする前記（１）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（４）ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及びＩＲＦ７を細胞内で発現させ、フローサイトメトリーを用いてＦＲＥＴを分析することにより測定することを特徴とする前記（１）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（５）ＩＲＦ７として、ＩＲＦ７のアミノ酸配列２３８と２８５の間の領域を少なくとも有するＩＲＦ７を用いることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（６）インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）によるインターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）のＣ末端のリン酸化の程度を、被検物質の存在下にインビトロで測定し、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を被検物質の不存在下にインビトロで測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（７）ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を、ＧＳＴ−ＩＲＦ７を基質として用いたキナーゼ分析により測定することを特徴とする前記（６）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（８）インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに、被検物質とＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与し、モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を投与することなく、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与した場合のモデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（９）モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を、モデルマウスにおけるインターフェロンαのｍＲＮＡ量としてノーザンブロット分析により測定することを特徴とする前記（８）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１６】
さらに本発明は、（１０）インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１１）モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を、細胞の培養上澄のＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−α濃度として測定することを特徴とする前記（１０）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１２）インターロイキン１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を、抗ＩＲＦ７抗体を用いたイムノブロット分析により核タンパクを分析することにより測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１３）ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシ核酸分子（ＣｐＧ ＯＤＮ）であることを特徴とする前記（８）〜（１２）のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１４）ＣｐＧオリゴデオキシ核酸分子（ＣｐＧ ＯＤＮ）がＤ３５又はＯＤＮ１６６８であることを特徴とする前記（１３）記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（１５）ＴＬＲ７リガンドがＲ−８４８であることを特徴とする前記（８）〜（１２）のいずれか記載のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１７】
また本発明は、（１６）ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７の活性化に必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法や、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質（１７）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１６）に記載の使用方法や、（１８）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする前記（１６）に記載の使用方法や、（１９）タンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする前記（１６）に記載の使用方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、（２０）ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７を活性化してインターフェロンαの産生を誘導する必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法や、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質（２１）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（２０）に記載の使用方法や、（２２）タンパク質が、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする前記（２０）に記載の使用方法や、（２３）タンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有することを特徴とする前記（２０）に記載の使用方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
ＴＬＲによって誘導されるＩＦＮ−αは、抗ウイルス作用や抗癌作用を示すことが知られており、本発明のＩＲＦ７と結合するＩＲＡＫ−１のＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したＩＦＮ−αの産生（誘導）を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法を用いることで、自然免疫系に関わる種々の病気の病態解明や、自然免疫応答の調節による治療薬等として有用なＩＦＮ−αの産生（誘導）促進物質等の開発が期待できる。
【００２０】
さらに、本発明のＩＲＡＫ−１は、ＩＲＦ７と相互作用し、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したＩＦＮ−αの産生に関与する分子であることから、ＩＲＡＫ−１が、ＩＦＮ−αの産生の特異的な調節に対する治療上のターゲットとなる可能性を与え、ウイルス感染や自然免疫疾患への治療へ応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７とを、被検物質が存在する細胞内で発現させ、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定し、被検物質の不存在下にＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させた場合のＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度と比較・評価することを特徴とする本発明のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下「スクリーニング方法［１］」ということがある）において、細胞内に被検物質を導入する方法としては特に制限されないが、各種トランスポーター発現細胞を利用する方法や、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いる方法や、候補物質（被検物質）がペプチドの場合、該候補ペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターにインテグレートした組換えベクターとして、細胞内に導入することができる。細胞内への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等を例示することができる。
【００２２】
スクリーニング方法［１］において、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定する方法として、ペプチドタグ標識ＩＲＡＫ−１及びペプチドタグ標識ＩＲＦ７を細胞内で発現させ、抗Ｍｙｃ抗体や抗ＦＬＡＧ抗体等の抗ペプチドタグ抗体を用いる共免疫沈降法により測定する方法を挙げることができ、かかるペプチドタグとしては、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＨＡ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。また、ペプチドタグ標識に代えて、マーカータンパク質とＩＲＡＫ−１やＩＲＦ７との融合タンパク質として、共免疫沈降法により測定することもできる。かかるマーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができる。
【００２３】
また、スクリーニング方法［１］において、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定する方法として、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及び蛍光タンパク質標識ＩＲＦ７を細胞内で発現させ、ある蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象であるＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）を利用して生細胞内のＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との相互作用を倒立蛍光顕微鏡で視覚化することにより測定する方法を挙げることができ、かかる蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ（緑色）、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）、ＹＦＰ（黄色）、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（青色）、ＥＣＦＰ(enhanced CYAN fluorescent protein)、ＤｓＲｅｄ（赤色）を挙げることができる。
【００２４】
また、スクリーニング方法［１］において、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合の程度を測定する方法として、蛍光タンパク質標識ＩＲＡＫ−１及び蛍光タンパク質標識ＩＲＦ７を細胞内で発現させ、フローサイトメトリーを用いてＦＲＥＴを分析することにより測定する方法を挙げることができる。
【００２５】
上記ＩＲＡＫ−１としては、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性を有する限りにおいて、ＩＲＡＫ−１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよく、また、上記ＩＲＦ７及びその遺伝子としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものの他、アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＩＲＦ７活性を有するタンパク質や該タンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されないが、ＩＲＦ７のアミノ酸配列２３８と２８５の間の領域を少なくとも有するＩＲＦ７を用いることが好ましい。
【００２６】
ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させるには、１種類のＴＬＲ若しくはＴＬＲ関連遺伝子の発現に用いられるベクター、例えば市販の発現ベクターｐＵＮＯ−［ＴＬＲ ｇｅｎｅ］にＩＲＡＫ−１遺伝子とＩＲＦ７遺伝子をそれぞれ導入してコトランスフェクションにより細胞内に導入してＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させたり、２種類のＴＬＲ若しくはＴＬＲ関連遺伝子の発現に用いられるベクター、例えば市販の発現ベクターｐＵＮＯ−［ＴＬＲ ｇｅｎｅ１／ｇｅｎｅ２］にＩＲＡＫ−１遺伝子とＩＲＦ７遺伝子を導入してトランスフェクションにより細胞内に導入してＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７を細胞内で発現させることもできる。また、使用しうる宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＫＧ細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動物細胞の他、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞などを挙げることができる。
【００２７】
ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を、被検物質の存在下にインビトロで測定し、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を被検物質の不存在下にインビトロで測定した場合と比較・評価することを特徴とする本発明のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下「スクリーニング方法［２］」ということがある）において、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７のＣ末端のリン酸化の程度を測定する方法としては特に制限されないが、バクテリアにおいて発現したＧＳＴ−ＩＲＦ７を基質として用いたキナーゼ分析により測定する方法を好適に例示することができる。より具体的には、ＨＥＫ２９３細胞等にＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ−１遺伝子をトランジェントにトランスフェクションし、細胞のリゼートを抗ＦＬＡＧ抗体と免疫沈降し、ＧＳＴ−ＩＲＦ７及び[γ-３２Ｐ]ＡＴＰの存在下にキナーゼ分析する方法を挙げることができる。
【００２８】
ＩＲＡＫ−１をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＩＲＡＫ−１を発現することがない、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに、被検物質とＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを静脈注射等により投与し、モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を投与することなく、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドを投与した場合のモデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とする本発明のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下「スクリーニング方法［３］」ということがある）において、モデルマウスにおけるインターフェロンαの産生量の測定方法としては特に制限されず、例えば、抗インターフェロンαモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる方法や、モデルマウスにおけるインターフェロンαのｍＲＮＡ量としてノーザンブロット分析により測定する方法を好適に例示することができる。
【００２９】
ＩＲＡＫ−１をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＩＲＡＫ−１を発現することがない、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量を測定した場合と比較・評価することを特徴とする本発明のインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下「スクリーニング方法［４］」ということがある）において、モデルマウス由来の細胞におけるインターフェロンαの産生量の測定方法としては特に制限されないが、例えば、抗インターフェロンαモノクローナル抗体を用いて、細胞の培養上澄のＥＬＩＳＡにより測定する方法や、細胞におけるインターフェロンαのｍＲＮＡ量としてノーザンブロット分析により測定する方法を好適に例示することができる。また、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞としては、Ｆｌｔ３リガンドの存在下で培養して分化させた骨髄樹状細胞である該モデルマウスのＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）−骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）を好適に例示することができる。Ｆｌｔ３リガンドの存在下で培養して分化させることにより、形質細胞様樹状細胞を多く含んだ細胞群を誘導することができる。
【００３０】
ＩＲＡＫ−１をコードする遺伝子の一部若しくは全部が欠損し、ＩＲＡＫ−１を発現することがない、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９が認識するリガンドに対するインターフェロンα産生の応答性が特異的に障害されているＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞を、被検物質の存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激し、モデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を、抗ＩＲＦ７抗体を用いたイムノブロット分析により核タンパクを分析することにより測定し、被検物質を不存在下にＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドで刺激した場合のモデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を測定した場合と比較・評価することを特徴とするインターフェロンαの産生を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下「スクリーニング方法［５］」ということがある）において、モデルマウス由来の細胞におけるＩＲＦ７の活性化の程度を測定する方法としては特に制限されないが、例えば、核タンパク質を調製し、抗ＩＲＦ７抗体を用いて、核へトランスロケーション（移行）したＴＬＲ７量をイムノブロット分析法により測定する方法を好適に例示することができる。また、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスに由来する細胞としては、該モデルマウスのＦｌｔ３リガンド−骨髄樹状細胞を好適に例示することができる。
【００３１】
スクリーニング方法［３］〜［５］において用いられるＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンド不応答性のモデルマウスや、該マウスに由来する細胞は、常法によって調製することができる。ここで、不応答性とは、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性がほぼ失われていることを意味する。また、スクリーニング方法［３］〜［５］において用いられるＴＬＲ９リガンドとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、好ましくはＤ３５、ＯＤＮ１６６８を例示することができ、また、ＴＬＲ７リガンドとしては、市販のＲ−８４８（small antiviral molecule）を具体的に例示することができる。
【００３２】
スクリーニング方法［１］〜［５］により得られるインターフェロンαの産生促進物質は、インターフェロンαが必要とされる疾病、例えばウイルス感染症の予防・治療剤として期待できる。上記促進物質を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防・治療剤を用いる予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。スクリーニング方法［１］〜［５］により得られるインターフェロンαの産生抑制物質は、インターフェロンαの生体内における生合成のメカニズムを解明する上で有用であり、また、これらインターフェロンαの産生抑制物質は、樹状細胞からのインターフェロンαの過剰産生が病態と考えられているＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）の治療にも使える可能性がある。
【００３３】
本発明のＩＲＡＫ−１の使用方法としては、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７の活性化に必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法や、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路において、ＩＲＦ７を活性化してインターフェロンαの産生を誘導する必須の制御因子としての下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子の使用方法であれば特に制限されず、ＩＲＡＫ−１等の上記タンパク質は、前記［１］〜［５］に記載のスクリーニング方法におけるツールとして使用できるほか、ＩＲＡＫ−１がＩＲＦ７活性化やインターフェロンα産生に関与しているとする新たな知見から、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療への応用研究において使用することができる。また、上記ＩＲＡＫ−１等の遺伝子は、インターフェロンαが必要とされる疾病、例えば、ウイルス感染症の遺伝子治療に使用することができ、ＩＲＡＫ−１等の遺伝子のアンチセンス鎖は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンαの過剰産生が病態と考えられているＳＬＥ(全身性エリテマトーデス)の遺伝子治療に使用することができる。また、これらはＩＲＡＫ−１がＩＲＦ７活性化やインターフェロンα産生に関与しているとする新たな知見から、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療への遺伝子レベルでの研究において使用することができる。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＩＲＡＫ−１）
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＲＦ活性を有するタンパク質
【００３４】
本発明のＩＲＡＫ−１の使用方法に用いられるタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質のほか、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるタンパク質や、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質や、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつＩＲＦ７を活性化する機能を有するタンパク質を使用することも可能である。また、ここでいうストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７との会合）
ＩＲＡＫ−１やＩＲＡＫ−４は、ＭｙＤ８８と会合することが示されていたことから、ＩＲＡＫ−１やＩＲＡＫ−４がＩＲＦ７複合体と関わりがあるかどうかを調べた。まず、共免疫沈降法（coimmunoprecipitation）により、ＩＲＡＫ−１とＩＲＦ７又はＩＲＡＫ−４とＩＲＦ７との相互作用を分析した。ＦＬＡＧでタグしたＩＲＦ７をコードするプラスミドと、Ｍｙｃでタグ標識したＩＲＡＫ−１又はＩＲＡＫ−４とで、ヒト胎生期腎細胞（ＨＥＫ−２９３）をトランジェントにコトランスフェクションしたとき、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、Ｍｙｃ−ＩＲＡＫ−４ではなく、Ｍｙｃ−ＩＲＡＫ−１を発現する細胞で抗Ｍｙｃ抗体と共沈した（図１Ａ）。このことは、ＩＲＦ７と相互作用するのはＩＲＡＫ−４ではなく、ＩＲＡＫ−１であることを示している。
【００３７】
さらに、生細胞におけるＩＲＦ７やＩＲＡＫｓの物理学的相互作用を分析した。ＨＥＫ２９３細胞を、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）でラベルしたＩＲＦ７と、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）でラベルしたＩＲＡＫ−１又はＩＲＡＫ−４でコトランスフェクションし、倒立蛍光顕微鏡で視覚化した。ＩＲＦ７−ＹＦＰは、ＩＲＡＫ−４−ＣＦＰと共発現させた細胞質において広く発現した。反対に、ＩＲＡＫ−１−ＣＦＰと共発現させたとき、ＩＲＦ７−ＹＦＰは、細胞質において、ＩＲＡＫ−１−ＹＦＰと縮合した形として発現する（図１Ｂ）。これらの細胞での、ＩＲＦ７−ＹＦＰとＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ又はＩＲＦ７−ＹＦＰとＩＲＡＫ−４−ＣＦＰとの間の物理的相互作用について分析したところ、ＩＲＡＫ−１でマージした領域で、ＩＲＦ７から強いＦＲＥＴシグナルを検出したが、ＩＲＡＫ−４と合併した領域では検出しなかった（図１Ｂ）。
【００３８】
また、細胞をＩＲＦ７−ＣＦＰとＩＲＡＫ−１−ＹＦＰでコトランスフェクションしたときに、同一の共局在や物理学的相互作用を観察した。さらに、フローサイトメトリーを用いてＦＲＥＴを測定することで、この観察結果を確認した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＩＲＦ７−ＹＦＰとＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ又はＩＲＦ７−ＹＦＰとＩＲＡＫ−４−ＣＦＰでコトランスフェクションしたとき、ＩＲＡＫ−４ではなく、ＩＲＡＫ−１と共にＩＲＦ７を発現する細胞だけが、強いＦＲＥＴシグナルを示したことから、生細胞の細胞質において、ＩＲＦ７が、ＩＲＡＫ−４ではなくＩＲＡＫ−１と直接的に相互作用していることが示唆された（図１Ｂ）。ＩＲＦ７−ＣＦＰとＩＲＡＫ−１−ＹＦＰを交互に導入した細胞においても、同様の結果が観測された。
【００３９】
次に、ＩＲＦ７のどの部位がＩＲＡＫ−１と相互作用する原因となるのかを調べた。ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７とＭｙｃ−ＩＲＡＫ−１、又はアミノ酸配列の１〜２８５若しくは１〜２３７をコードするＦＬＡＧ−ＩＲＦ７の欠失変異体とＭｙｃ−ＩＲＡＫ−１で、トランジェントにトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞において発現したＦＬＡＧ−ＩＲＦ７や、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７  １−２８５を、抗Ｍｙｃ抗体と共沈し、ＩＲＦ７のアミノ酸配列２３８と２８５の間の領域が、ＩＲＡＫ−１と相互作用するのに必須部位であることが示された（図１Ｃ）。この領域のＩＲＦ７は、以前、ＭｙＤ８８とＴＲＡＦ６との両方の相互作用に必要であることが示されており、このことからＩＲＡＫ−１が、この部位との相互作用を通して複合体と、関与していることが示唆される。
【実施例２】
【００４０】
（ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性）
ＩＲＦ７は、ウイルス感染中に、Ｃ末端セリン残基のリン酸化により活性化して細胞質核に転座し、そこでインターフェロンαを含むターゲット遺伝子の発現を調節することが示されてきた（Immunity 13:539-548.2000参照）。そこで、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性が、ＩＲＦ７の活性化に必要か否かを調べた。
【００４１】
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｍｙｃ−ＩＲＡＫ−１又はＩＲＡＫ−１のＭｙｃ−キナーゼ ネガティブ変異体（ＩＲＡＫ−１ ＫＮ）と共に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７でトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、ＩＲＡＫ−１やＩＲＡＫ−１ ＫＮの両方を発現する細胞において、抗Ｍｙｃ抗体と共沈した（図２Ａ）。ＩＲＡＫ−１ ＫＮを共発現した細胞中ではなく、ＩＲＡＫ−１を発現した細胞中で、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７の遅延した移動型（slow migrating form）を検出した。このことから、ＩＲＡＫ−１が、キナーゼ活性化を通じたＩＲＦ７のリン酸化を誘発することが示唆された。
【００４２】
ＩＲＡＫ−１が、ＩＲＦ７のＣ末端をリン酸化するかどうかを判断するために、インビトロで、バクテリアにおいて発現したＧＳＴ−ＩＲＦ７を基質として用いたキナーゼ分析を行った。ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−１ ＫＮ、ＩＲＡＫ−４、ＩＲＡＫ４ ＫＮは、ＨＥＫ２９３細胞で発現し、細胞のリゼートを、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。ＧＳＴ−ＩＲＦ７のリン酸化は、ＩＲＡＫ−４ではなく、ＩＲＡＫ−１の免疫沈降物において観察された（図２Ｂ）。これらの結果は、インビトロで、ＩＲＡＫ−４ではなく、ＩＲＡＫ−１が、ＩＲＦ７をリン酸化することを示している。
【００４３】
次に、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性がＩＲＦ７の転写活性に必要であるか否かを調べた。これまでの研究で、ＭｙＤ８８とＩＲＦ７の共発現によって、ＩＦＮ−αプロモーターが相乗的に活性化されることを示した。しかし、ＩＲＦ７とＩＲＡＫ−１や、ＩＲＦ７とＩＲＡＫ−４とを組み合わせた過剰発現は、いずれにおいても、ＨＥＫ２９３細胞で、ＩＦＮ−αプロモーターを相乗的に活性化しなかった。そこで、ＩＦＮ−α４プロモーターを保有するレポータープラスミドと一緒に、ＩＲＦ７、ＭｙＤ８８、様々な量のＩＲＡＫ−１  ＫＮとの組合せで、ＨＥＫ２９３細胞をトランジェントにトランスフェクトした。ＩＲＡＫ−１  ＫＮは、ＭｙＤ８８とＩＲＦ７との共発現によって誘導されたＩＦＮ−α４プロモーターの活性化を、用量依存的に阻害したが、ＩＲＡＫ−１  ＫＮは、ＭｙＤ８８によるＮＦ−ｋＢの活性化は阻害しなかった。ＩＲＡＫ−１  ＫＮの影響は、優性抑制型変異体（dominant negative mutant）として作用する、Ｃ末端のＴＲＡＦドメインのみを含むＴＲＡＦ６の切断した変異体（ＴＲＡＦ６ｃ）と明確な対照をなし、ＩＦＮ−α４及びＮＦ−κＢプロモーター両方の活性化を妨害した（図２Ｃ）。
【００４４】
以上の結果より、ＩＲＡＫ−１は、ＩＲＦ７をインビトロでリン酸化し、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性は、ＮＦ−κＢではなくＩＲＦ７の転写活性に対して必要であることが示している。
【実施例３】
【００４５】
（Ｉｒａｋ−１−／ＹｐＤＣにおけるＡ／ＤタイプＣｐＧ ＯＤＮへの応答）
ＴＬＲを介するＩＦＮ−αの産性におけるＩＲＡＫ−１のインビボでの役割を解明するために、ＣｐＧ  ＯＤＮにより誘導されたＩＦＮ−αの産生を、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）−骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）を用いて調べた。Ｉｒａｋ−１＋／ＹＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓからのＩＦＮ−αの大量産生は、Ａ／ＤタイプＣｐＧ ＯＤＮであるＤ３５に応答して観察された（J Leukoc Biol 71:813-820.2002参照）。しかし、ＩＦＮ−αの産生は、Ｉｒａｋ−１−/YＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓで著しく障害された。対照的に、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ及びＩｒａｋ−１−／ＹＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓでは、Ｄ３５に応答するＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０の産生は同程度であった（図３Ａ）。さらに、ノーザンブロット分析により、ＩＬ−６のmＲＮＡの誘導は、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ及びＩｒａｋ−１−／ＹＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓで同程度とみられるが、Ｄ３５によるＩＮＦ−α４のmＲＮＡの誘導は、Ｉｒａｋ−１−／ＹＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓにおいて障害されていることを示している（図３Ｂ）。
【００４６】
Ｆｌｔ３Ｌを伴った骨髄細胞の培養は、ｐＤＣｓ（Ｂ２２０＋）や、従来型ＤＣｓ（Ｂ２２０−）の両者を誘発した（J Exp Med 195:953-958.2002参照）。ｐＤＣｓは、ＩＦＮ−αの産生に重要な要素であるが、ＩＬ−１２のようなプロ炎症性サイトカインは、ＤＣｓサブセットによって産生される（非特許文献４参照）。プロ炎症性サイトカインの誘発が、ｐＤＣｓで障害されているか否かを見分けることは難しいため、さらにフローサイトメトリーにより、Ｂ２２０＋ｐＤＣｓからのＩＬ−１２やＩＦＮ−αの産生を分析した。Ｉｒａｋ−１＋／ＹやＩｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓをＤ３５により刺激し、ＩＦＮ−αやＩＬ−１２に対する抗体で染色し、ＣＤ１１ｃやＢ２２で共染色した。フローサイトメトリーによる分析は、Ｉｒａｋ−１−／ＹＢ２２０＋ｐＤＣＳからＤ３５を介したＩＦＮ−αの産生が、Ｉｒａｋ−１＋／ＹＢ２２０＋ｐＤＣｓと比較して著しく障害されていることを明らかにした。一方、Ｉｒａｋ−１＋／ＹＢ２２０＋ｐＤＣｓにおけるＩＬ−１２の産生は障害されていなかった（図３Ｃ）。
【００４７】
以上の結果より、ＴＬＲ９リガンドが誘導するＩＦＮ−αの産生が、Ｉｒａｋ−１−／ＹｐＤＣで特異的に障害されていることを示している。
【実施例４】
【００４８】
（他のＴＬＲリガンドに対するＩｒａｋ−１−／Ｙ細胞の応答）
Ｋタイプ若しくは従来のＣｐＧ ＯＤＮであるＯＤＮ１６６８は、最大限の誘導がＤ３５刺激ＤＣｓよりも低い濃度である、０．０１〜０１μＭの低い濃度でＩＦＮ−αを産生する（非特許文献２６参照）。Ａ／Ｄタイプ ＣｐＧＯＤＮによって観測された結果と同様、ＯＤＮ１６６８に応答するＩＦＮ−αの産生が、Ｉｒａｋ−１−／Ｙ  Ｆｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓで著しく障害された。しかし、他のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生は、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙや、Ｉｒａｋ−／Ｙ細胞で同程度であった（図４Ａ）。
【００４９】
また、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウスで、ＴＬＲ９リガンドを介したＩＦＮ−αの産生が消滅したので、Ｉｒａｋ−１−／ＹマウスでのＴＬＲ７を介したＩＦＮ−αの誘導を調べた。ＴＬＲ７リガンドであるＲ−８４８をＩｒａｋ−１＋／ＹやＩｒａｋ−１−／Ｙマウスに静脈注射し、ＩＦＮ−αの血清濃度を調べた。Ｒ−８４８の注射後、１時間以内に、Ｉｒａｋ−１＋／ＹマウスでのＩＦＮ−αの血清濃度が増加することが示されたが、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウスでは、ＩＦＮ−αの血清濃度レベルは増加しなかった。対照的に、Ｉｒａｋ−１＋／ＹマウスとＩｒａｋ−１−／Ｙマウスとでは、ＩＬ−１２ｐ４０の血清濃度に違いは表れなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、ＩＲＡＫ−１がＴＬＲ７を介したＩＦＮ−αの産生にも関与していることを示唆している。
【００５０】
また、Ｉｒａｋ−１−／−マウスにおけるＩＦＮ−α産生の本質的欠陥の可能性を除外するために、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙマウス由来のＦｌｔ３−ＢＭＤＣｓへ二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡであるポリ（Ｉ：Ｃ）をトランスフェクトし、ＩＦＮ−αの産生を測定した。Ｉｒａｋ−１＋／ＹやＩｒａｋ−１−／ＹのＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓはポリ（Ｉ：Ｃ）に応答し同レベルのＩＦＮ−αを産生し（図４Ｃ）、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウスが、ＩＦＮ−αを産生する能力を持つことを示している。
【００５１】
以上の結果より、ＩＲＡＫ−１は、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介したＩＦＮ−αの産生に特異的に関与していることを示している。
【実施例５】
【００５２】
（Ｉｒａｋ−１−／Ｙ細胞におけるＩＲＦ活性化の欠如）
ＴＬＲリガンドによってＩＲＦ７が活性化されるか否かをＩｒａｋ−１−／Ｙマウスで調べた。Ｉｒａｋ−１＋／ＹマウスやＩｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓをＤ３５で刺激し、抗ＩＲＦ７抗体又は、抗ＮＦ−κＢ抗体であるＲｅｌＡを用いたイムノブロット分析により、核タンパクを分析した。Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ細胞におけるＩＲＦ７は、Ｄ３５による刺激後、１時間で核に転座し、６時間で減少した。対照的に、Ｉｒａｋ−１−／Ｙ細胞においては、ＩＲＦ７は、Ｄ３５に応答して核に転座しなかった（図５Ａ）。Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ及びＩｒａｋ−１−／Ｙ細胞の両方で、ＲｅｌＡはＤ３５に応答して、核へトランスロケーション（転座）したが、より遅い時点ではＩｒａｋ−１−／Ｙでは、わずかな量のＲｅｌＡしか残らなかった（図５Ａ）。さらに、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーであるＥＲＫ１のＤ３５に応答した活性化をイムノブロット分析法により調べた。Ｉｒａｋ−１−／Ｙ細胞でのＥＲＫ１のチロシンリン酸化は、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ細胞よりいささか過渡的であったが、Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ及びＩｒａｋ−１−／Ｙ細胞の両方で誘導された（図５のＢ参照）。
【００５３】
以上の結果から、ＩＲＡＫ−１が、ＩＲＦ７の活性化を調節し、ＣｐＧ ＯＤＮに応答するＩＦＮ−αの産生に関与することを示している。
【実施例６】
【００５４】
[試験及び材料]
（マウス）
Ｉｒａｋ１−／Ｙマウスは、Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ氏から提供された（テキサス大学  サウストン  メディカル  センター  ダラス）
【００５５】
（細胞及び試薬）
Ｆｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓは、上記非特許文献２６に記載の方法により調製した。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｄ３５や、ＯＤＮ１６６８）は、上記非特許文献２６に記載の方法により調製した。Ｒ−８４８は、生物薬学研究所、日本エネルギー株式会社から提供されたものを使用した。ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）は、Amersham社から購入したものを使用し、抗ＩＲＦ７や、抗ＥＲＫ抗体や抗リン酸化ＥＲＫ抗体はZymed社及びSanta Cruz社並びにNew England Biolab社から入手したものを使用した。
【００５６】
（プラスミド）
ＩＦＮ−α４プロモーターや、ＥＬＡＭプロモーターの構築は、文献（Nat Immunol 5:1061-1068. 2004.）に記載の方法によりおこなった。ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、ＩＲＦ７やＴＲＡＦ６ｃの欠失変異体の一種としてすでに記載されている。ＩＲＦ７−ＣＦ、ＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ、ＩＲＡＫ−４−ＣＦＰ、ＩＲＦ−ＹＦＰ、ＩＲＡＫ−１−ＹＦＰ、ＩＲＡＫ−４−ＹＦＰなどの変異タンパクをコードするプラスミドは、文献（Nat Immunol 5:1061-1068. 2004.）記載の方法により構築した。ＩＲＦ７のＣ末端は、ＰＣＲによって入手し、ｐＧＥＸ−５Ｘ１ベクター（Amersham社製）のＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位に結紮した。ＩＲＡＫ−１やＪＲＡＫ−４をコードする全長ＤＮＡフラグメントは、ヒト脾臓相補ＤＮＡライブラリー（Clontech社製）からＰＣＲにより増幅させ、適切な制限酵素で処理し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）や、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（Clontech社製）に挿入した。製造者の指示に従って、Quick Chage XL-Site Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いた部位特異的変異導入を行って、ヒトＩＲＡＫ−１（Ｋ２３９Ａ）や、ＩＲＡＫ−４（Ｋ２１３／２１４Ａ）のキナーゼネガティブ変異体を産出した。ＰＣＲによって入手したＤＮＡフラグメントの配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【００５７】
（トランスフェクション、免疫沈降、イムノブロット分析）
ＨＥＫ２９３細胞（１×１０６）を、１００ｍｍディッシュに蒔いた。１２時間後、細胞にLipofectamine 2000 (Invitrogen社製)を用いて、合計６．０μｇの様々なプラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。免疫沈降及びウエスタンブロット分析を、文献（Kawai, T., S. Sato, K.J. Ishii, C. Coban, H. Hemmi, M. Yamamoto, K. Terai, M. Matsuda, J. Inoue, S. Uematsu, O. Takeuchi, and S. Akira. 2004. Interferon-alpha induction through Toll-like receptors involves a direct interaction of IRF7 with MyD88 and TRAF6. Nat Immunol 5:1061-1068.）記載の通り行った。
【００５８】
（ＦＲＥＴ）
コラーゲンでコーティングしたグラスディッシュに載せたＨＥＫ２９３細胞を、文献記載の通り、撮像した。要約すると、細胞を、冷却ＣＣＤカメラを装備し、MetaMorph softwareにより制御された倒立顕微鏡で撮像した（Universal Imaging社製）。ＹＦＰ又はＣＦＰで融合した、一対のタンパク質が、ＨＥＫ−２９３細胞で発現した。以下のフィルターセットを用いて、細胞を撮像した：ＣＦＰ画像には、ＭＸ０４２０励起フィルター及びＢＰ４７０−４９０発光フィルター（オリンパス社製）；ＦＲＥＴ画像には、ＭＸ０４２０励起フィルター及び５３５ＤＦ３５発光フィルター（Omega Optical Inc社製）；ＹＦＰ画像には、５１０ＤＦ２３励起フィルター及び５６０ＤＦ１５発光フィルター（Omega Optical Inc社製）。ＸＦ２０５２二色性鏡（Omega Optical Inc社製）を実験を通して使用した。露出時間は、ＣＦＰ及びＦＲＥＴ画像には２００ｍｓｅｃで、ＹＦＰ画像には１００ｍｓｅｃであった。データを入手後、ＣＦＰ、ＦＲＥＴ及びＹＦＰの平均強度を測定し、ＦＲＥＴコンポーネント（“訂正”ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴＣ）からなるＦＲＥＴフィルターセットを通して蛍光を計算した。非ＦＲＥＴコンポーネントを、文献（Curr. Biol. 10, 1395-1398, 2000）記載の通り差し引いた。本研究者らの実験の条件として、次の方程式を使用した：ＦＲＥＴＣ＝ＦＲＥＴ−（０．３４×ＣＦＰ）−（０．０２×ＹＦＰ）。ＦＲＥＴのフローサイトメトリー分析用に、ＣＦＰ及び／又はＹＦＰ融合タンパク質と、上記記載の通りトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２９３発現培地（Invitrogen社製）に再懸濁し、ＦＡＣ  aria（ＢＤ）及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉＶａ softwareを用いて、ＹＦＰ（励起：４８８ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）、ＣＦＰ（励起：４０７ｎｍ；発光：５１０ｎｍ）、ＦＲＥＴ（励起：４０７ｎｍ；発光：５３５ｎｍ）を測定した。
【００５９】
（ルシフェラーゼレポータアッセイ）
２４ウェルプレートに蒔いたＨＥＫ２９３細胞（１×１０５細胞／ウェル）に、ルシフェラーゼレポータープラスミド１００ｎｇと、合計９００ｎｇの様々な発現ベクターとを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、Dual-luciferaseレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いて、全細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を測定した。Renilla-luciferaseレポーター遺伝子５０ｎｇを、同時にトランスフェクトし、内部コントロールとして用いた。
【００６０】
（ＥＬＩＳＡ）
Ｆｌｔ３−ＢＭＤＣｓ（１×１０細胞／ウェル）を、様々な濃度のＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５やＯＤＮ１６６８で２４時間刺激した。上澄みのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０やＩＦＮ−α濃度を、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡで測定した（PBL Bio. Lab.,社製）。
【００６１】
（インビトロキナーゼアッセイ）
２００万個のＨＥＫ２９３細胞を、直径６０ｍｍディッシュに蒔いた。２４時間後、細胞にLipofectamine ２０００(Invitrogen社製)を用いて、合計６．０μｇの空又は記載した量（２．０μｇのｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−１キナーゼ、又は、４．０μのｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−１キナーゼ）のプラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後に細胞を回収して溶解させ、１．０μｇの抗ＦＬＡＧＭ２ モノクローナル抗体（Sigma−Aldrich社製）と共にプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて１２時間遠心させ免疫沈降した。ビーズをリーシス緩衝液で４回洗浄し、更に、キナーゼアッセイ緩衝液(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ[ｐＨ７．５]、２０ｍＭのＭｇＣｌ２や、３ｍＭのＭｎＣｌ２や、１０ｍＭのβ-グリセロホスホレイト)で３回洗浄した。免疫沈殿物は、２．０μｇのＧＳＴ−ＩＲＦ７や、１０Ｃｉ[γ-３２Ｐ]ＡＴＰ（Amersham社製）を用い、３０℃で３０分間インキュベートした。キナーゼ反応を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液の付加により止め、４〜２０％ポリアクリルアミドグラジエントゲル上で分離した。ゲルを保持し、乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００６２】
（フローサイトメトリー）
細胞内でＩＬ−１２ｐ４０やＩＦＮ−αを染色するために、Ｆｔｌ３Ｌ−ＤＣｓを３μＭのＤ３５で処理し、５時間培養した。Golgi stop（BD PharMingen社製）を、さらに３時間加え、細胞をパラホルムアルデヒドに固定して回収した。ＩＦＮ−αを、ラット抗マウスＩＦＮ−α（ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＦＮ−α）の混合体（clone F18，Hycult Biotechnology b.V. and clone RMMA-1，PBL Biomedical Laboratories社製）を用い、サポニンを含む緩衝液中で染色し、次に、ビオチン化したマウス抗ラットＩｇＧ抗体（ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ-ｒａｔ ＩｇＧ）（Jackson Immuno Research社製）や、スプレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰＣ）（Pharmingen社製）を用い染色した。ＩＬ−１２を、抗−ＩＬ−１２−ＰＥ抗体（PharMingen社製）を用い、サポニンを含む緩衝液中で蛍光した。その後、細胞を抗−ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ抗体（clone HL3）や抗−Ｂ２２０−ｃｙｃｈｒｏｍｅ抗体（clone RA3-6B2）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Bioscience社製）で分析した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＩＲＡＫ−４ではなく、ＩＲＡＫ−１が、ＩＲＦ７と結合することを示す図である。（Ａ）細胞溶解物（cell lystates）を抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体を用いて、イムノブロット分析を行った。ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７のslow migrated formをアスタリスクで示した。（Ｂ）上パネル：ＨＥＫ２９３細胞を、ＩＲＦ７−ＹＦＰ（黄色）や、ＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ又は、ＩＲＡＫ−４−ＣＦＰ（青色）でトランスフェクトし、ＦＲＥＴ（pseudocolor）を用いて決定されたこれら２つの分子の物理的相互作用を視覚化した。下パネル：ＨＥＫ２９３細胞は、ＩＲＦ７−ＹＦＰ，ＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ又はＩＲＡＫ−４−ＣＦＰとトランスフェクトした。左側に、単一細胞（水平軸）のＣＦＰ励起によるＣＦＰ放射の蛍光発光強度や、単一細胞（垂直方向）のＣＦＰ励起によるＹＦＰ放射の蛍光発光強度を示した。ＣＦＰ励起によって、ＹＦＰやＣＦＰのいずれに対してもポジティブである細胞を、ＦＲＥＴとして囲んで示した。右側に、ＩＲＡＫ−１−ＣＦＰ又はＩＲＡＫ−４−ＣＦＰや、ＩＲＦ７−ＹＦＰのＦＲＥＴの計算値を示した。（Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞から調製された細胞分解産物可溶化液を、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７欠失変異体とＭｙｃ−ＩＲＡＫ−１との結合体でトランジェントにトランスフェクトし、抗Ｍｙｃ抗体又は、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、図に記載の通りの組合せによる、抗Ｍｙｃ抗体又は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットによる分析を行った。
【図２】図２は、ＩＲＡＫ−１によるＩＲＦ７の活性化の結果を示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞から調製された細胞分解産物可溶化液を、Ｍｙｃ−ＩＲＡＫ１又は、Ｍｙｃ−ＩＲＡＫ１ ＫＮと共にＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をトランジェントにトランスフェクトし、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、図に記載の通りの組合せによる、抗Ｍｙｃ抗体又は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットによる分析を行った。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ−１、ＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ−１ ＫＮ、ＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ−４又はＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ−４ ＫＮとトランジェントにトランスフェクションした。細胞溶解液を抗ＦＬＡＧ抗体と免疫沈降し、ＧＳＴ−ＩＲＦ７の存在下、インビトロでのキナーゼ反応を行った。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、続いてオートラジオグラフィによって視覚化した。(Ｃ)ＨＥＫ２９３細胞を、ＩＦＮ−α４プロモーターを運搬するレポータープラスミドと共に、ＩＲＦ７、ＭｙＤ８８や、１、１０、５０ｎｇのＩＲＡＫ−１キナーゼネガティブ変異体（ＩＲＡＫ−１ＫＮ）とを組み合わせてトランジェントにトランスフェクトした（左側）。さらにＨＥＫ２９３細胞を、ＥＬＡＭプロモーターを運搬するレポータープラスミドと共に、ＭｙＤ８８と、１、１０、５０ｎｇのＩＲＡＫ−１ＫＮとを組み合わせてトランジェントにトランスフェクトした（右側）。トランフェクションから３６時間後に、細胞をレポータージーンアッセイによって、ＩＦＮ−α４又は、ＥＬＡＭに依存するプロモーター活性について分析した。
【図３】図３は、ＩＲＡＫ−１−／ＹマウスのＤ３５によるＩＦＮ−α誘導の障害についての結果を示す図である。（Ａ）ＩＲＡＫ−１＋／Ｙ、ＩＲＡＫ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ−３Ｌ−ＢＭＤＣｓを、図に示した濃度のＤ３５で２４時間刺激した。培養上澄のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。データは平均値±ＳＤとして示した。（Ｂ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓを、１ＭのＤ３５で図に示した時間刺激した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析を行った。（Ｃ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙや、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３−ＢＭＤＣｓにおける蛍光した細胞内ＩＦＮ−αやＩＬ−１２染色を３μＭのＣｐＧＤＮＡ（Ｄ３５）で刺激した。Ｆｌｔ３−ＢＭＤＣｓのＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋個体数をｐＤＣとして、それぞれ分析した。
【図４】図４は、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウスでの他のＴＬＲリガンドによるＩＦＮ−αの誘導の結果を示す図である。（Ａ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓを図に示したＯＤＮ１６６８の濃度で２４時間刺激した。培養上澄のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。データは平均値±ＳＤとして示した。（Ｂ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウスに５０ｎｍｏｌのＲ−８４８を静脈注射した。血清サンプルを取りだし、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓを１０μｇ／ｍｌのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）で２４時間トランスフェクトした。培養上澄のＩＦＮ−αの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。データは平均値±ＳＤとして示した。（Ｎ．Ｄ．は検出していないことを示す。）
【図５】図５は、Ｉｒａｋ−１−／Ｙ細胞でのＤ３５に応答するＩＲＦ７の核転座を障害することを示す図である。（Ａ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓをＤ３５で、１時間、２時間、６時間刺激した。核タンパク質を調製し、抗ＩＲＦ７抗体や、抗ＲｅｌＡ抗体を用いてイムノブロット分析を行った。アスタリスクはＩＲＦ７タンパク質を示す。（Ｂ）Ｉｒａｋ−１＋／Ｙ、Ｉｒａｋ−１−／Ｙマウス由来のＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣｓをＤ３５で、１０分、３０分、６０分間刺激した。全細胞可溶化液を抗phospho特異的ＥＲＫ１抗体を用いてイムノブロット分析を行った。（Ｃ）ＴＬＲ７や、ＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路の概略図である。ＩＲＦ７はＭｙＤ８８と相互作用することで複合体を形成し、ＩＦＮ−αの誘導の基礎として働く。ＩＲＡＫ−１はＩＲＦ７と直接結合し、複合体を形成する。ＩＲＡＫ−１は、ＮＦ−κＢの活性化に必要でないが、ＩＲＦ７の活性化を介してＩＦＮ−αの誘導を調節する。ＩＲＡＫ−４は、ＩＲＡＫ−１の上流に位置し、ＩＲＡＫ−１の活性化に関係する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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