(57)【要約】      （修正有）【課題】  高温において安定で高活性を示すキチナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】触媒活性ドメインが(1)特定の配列からなるアミノ酸配列、又は(2)特定の配列からなるアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。並びに、（3）特定の塩基配列からなるＤＮＡ、又は（4）特定の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなるＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒活性ドメインが(1)配列番号３に示すアミノ酸配列、又は(2)配列番号３に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。
【請求項２】
触媒活性ドメインに連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されている、請求項１に記載のキチナーゼ。
【請求項３】
キチン結合ドメインが、(3)配列番号４又は５に示すアミノ酸配列、又は(4)配列番号４又は５に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、請求項１又は２に記載のキチナーゼ。
【請求項４】
連結領域が、(5)配列番号６又は７に示すアミノ酸配列、又は(6)配列番号６又は７に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、請求項１乃至３のいずれかに記載のキチナーゼ。
【請求項５】
下記(7)又は(8)のアミノ酸配列からなる、請求項１乃至４のいずれかに記載キチナーゼ：
(7)配列番号８に示すアミノ酸配列、又は
(8)配列番号８に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されているアミノ酸配列。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のキチナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
触媒活性ドメインをコードするＤＮＡ領域が、
(9)配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は
(10)配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含む、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
キチン結合ドメインをコードするＤＮＡ領域が、(11)配列番号１０又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は(12)配列番号１０又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチンと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項６又は７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
以下の(13)又は(14)のＤＮＡである、請求項６乃至８のいずれかに記載のＤＮＡ：
（13）配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（14）配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなるＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項６乃至９のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することを特徴とする、キチナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温において安定で、結晶性キチンに対しても高いキチナーゼ活性を有するキチナーゼに関する。また、本発明は上記キチナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いて遺伝子工学的にキチナーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンはカニ、エビなどの甲殻類等に含まれる主成分で、Ｎ-アセチルグルコサミンが
β-1,4結合した多糖類である。近年、その脱アセチル化体であるキトサンとともに多様な分野で用途開発が進展している（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
キチンを部分加水分解することにより得られるキチンオリゴ糖は、さわやかな甘味を有し、乳酸菌増殖効果、ビフィズス菌増殖効果、免疫賦活効果などの新しい機能を持った食品新素材として、食品、医薬業界で大きな関心を集めている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、現在、キチンの処理は耐熱性の低いバクテリア由来の酵素を使用して行われており（例えば、非特許文献２参照）、高温下で処理できないために、キチンの処理効率は非常に低いという欠点がある（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【０００５】
一方、パイロコッカス属に属する超好熱性細菌が、耐熱性キチナーゼを産生することが報告されている。非特許文献４及びゲノムデータベースにおいて既に発表されているPyrococcus furiosusのキチナーゼの塩基配列には、２つの触媒活性ドメイン（以下、５’末
端側にある触媒活性ドメインを「ＡＤ１」、３’末端側にある触媒活性ドメインを「ＡＤ２」と記す）と、２つのキチン結合ドメイン（以下、ＡＤ１の５’末端側にあるキチン結合ドメインを「ＣＢＤ１」、ＡＤ２の５’末端側にあるキチン結合ドメインを「ＣＢＤ２」と記す）がコードされていることが明らかにされている。この塩基配列から1004番目のアデニンを除いた塩基配列（配列番号１）を使用することにより、Ｎ末端側からＣＢＤ１、ＡＤ１、ＣＢＤ２及びＡＤ２を含むポリペプチド（分子量１１６ｋＤａ；以下、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼという）（配列番号２）が翻訳されることは既に報告さ
れている（非特許文献５）（図１参照）。
【０００６】
しかしながら、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼでは、キチナーゼ活性が不十分
であり、産業用酵素としての価値は低かった。また、非特許文献４には、ＣＢＤ１とＡＤ１を有するペプチド、及びＡＤ２を有するペプチドのキチナーゼ活性が報告されているが、これらのキチナーゼ活性はいずれも低く、産業用酵素として実用できるものではない。このように、配列番号１にコードされているキチナーゼの触媒活性ドメインであるＡＤ１やＡＤ２を利用した酵素で、実用レベルにあるキチナーゼ活性を示すものは、未だ取得されていないのが現状である。
【０００７】
また、Pyrococcus furiosusから得られる従来のキチナーゼの活性を向上させる技術に
ついては報告されておらず、まして、キチナーゼの触媒活性ドメインＡＤ２を如何なるアミノ酸配列と組み合わせれば、酵素のキチナーゼ活性を向上できるかについては一切知られていない。
【非特許文献１】ロバータス・ジェイエヌ（Robertus JN）及びハート・ジェイ（Hart J.）著、サドラー・ジェイエヌ（Saddler JN）及びペナー・エムエイチ（Penner MH）編集、スリー・ディメンショナル・ストラクチャー・オブ・アン・エンドキチナーゼ・フロム・バーレイ（Three-Dimensional Structure of an Endochitinase from Barley.）, エンザイマティック・ディグラデーション・オブ・インソルブル・カルボハイドレーツ（Enzymatic degradation of Insoluble Carbohydrates.）、「アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（American Chemical Society）」、ワシントン・ディー・シー（Washington, DC）、1995年、第5章（Chap.5）
【非特許文献２】ヤブキ・エム（Yabuki M）,ヤブキ・ワイ（Yabuki Y）,ヤナイ・イー（Yanai E）,アンドウ・エー（Ando A）,及びフジイ・ティー（Fujii T）著、アイソレーション・アンド・キャラクタライゼーション・オブ・キチノリティック・バクテリウム：アエロモナス・ハイドロフィラ（Isolation and characterization of chitinolytic bacterium: Aeromonas hydrophila）、日本、「テクニカル・ブレチン・オブ・ファカルティ・オブ・ホーティカルチャー，千葉大学（Technical Bulletin of Faculty of Horticulture, Chiba University）」、1983年、32巻、p.51
【非特許文献３】フランコフスキー・ジェイ（Frankowski J）,ロリト・エム（Lorito M）,スカラ・エフ（Scala F）,シュミット・アール（Schmid R）,バーグ・ジー（Berg G）,及びバール・エイチ（Bahl H）著、ピューリファイケーション・アンド・プロパティーズ・オブ・トゥー・キチノリティック・エンザイムズ・オブ・セラティア・プリムチカ・HRO-C48（Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48）、「アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジー（Archives of Microbiology）」、2001年、176巻、p.421-426
【非特許文献４】ガオ・ジェイ（Gao J.）,バウア・エム・ダブル（Bauer M. W.）,ショックリー・ケイ・アール（Shockley K. R.）,ピィズ・エム・エー（Pysz M. A.）,及びケリー・アール・エム（Kelly R.M.）著、グロウス・オブ・ハイパーサーモフィリック・アーカエオン・パイロコッカス・フリオサス・オン・キチン・インボルブズ・トゥー・ファミリー・１８キチナーゼズ（Growth of Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus on Chitin Involves Two Family 18 Chitinases）、「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）」、2003年、第69巻、p.3119-28
【非特許文献５】安藤進、東紀子、石川一彦、「Pyrococcus furiosus 由来の耐熱性キチナーゼ」、日本農芸化学会大会講演要旨集（2003年、横浜）、2A08a10, p26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。より詳細には、本発明は、高温において安定で高活性を示すキチナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供すること、該ＤＮＡを含むベクター及び該ベクターを含む形質転換体を提供すること、並びに該形質転換体を利用してキチナーゼを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、Pyrococcus furiosusのキチナーゼの塩基配列（配列番号１）にコードされ
ている２つの触媒活性ドメインＡＤ１及びＡＤ２の内、３’末端側にコードされている触媒活性ドメインＡＤ２を用いて、この触媒活性ドメインＡＤ２にキチン結合ドメインを連結してなるポリペプチドを調製することによって、キチナーゼ活性が顕著に向上されており、高温下で安定であるキチナーゼが得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる発明を提供するものである。
項１．  触媒活性ドメインが(1)配列番号３に示すアミノ酸配列、又は(2)配列番号３に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。
項２．  触媒活性ドメインに連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されている、項１に記載のキチナーゼ。
項３．  キチン結合ドメインが、(3)配列番号４又は５に示すアミノ酸配列、又は(4)配列番号４又は５に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、項１又は２に記載のキチナーゼ。
項４．  連結領域が、(5)配列番号６又は７に示すアミノ酸配列、又は(6)配列番号６又は７に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、項１乃至３のいずれかに記載のキチナーゼ。
項５．  下記(7)又は(8)のアミノ酸配列からなる、項１乃至４のいずれかに記載キチナーゼ：
(7)配列番号８に示すアミノ酸配列、又は
(8)配列番号８に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されているアミノ酸配列。
項６．  項１乃至５のいずれかに記載のキチナーゼをコードするＤＮＡ。
項７．  触媒活性ドメインをコードするＤＮＡ領域が、
(9)配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は
(10)配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含む、項６に記載のＤＮＡ。
項８．  キチン結合ドメインをコードするＤＮＡ領域が、(11)配列番号１０又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は(12)配列番号１０又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチンと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、項６又は７に記載のＤＮＡ。
項９．  以下の(13)又は(14)のＤＮＡである、項６乃至８のいずれかに記載のＤＮＡ：
（13）配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（14）配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなるＤＮＡ。
項１０．  項６乃至９のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
項１１．  項１０に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
項１２．  項１１に記載の形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することを特徴とする、キチナーゼの製造方法。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
キチナーゼ
キチナーゼとは、キチンのβ−１，４結合を加水分解してＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素である。本発明において、キチナーゼの活性測定は、以下の方法に従って行われる。
（キチナーゼ活性測定法）カニ由来の微粉末結晶性キチンを５ｍｇをチューブに入れ、これに活性測定対象のキチナーゼを適当量（例えば、０．０１〜１０μｇ）加え、緩衝液Ａ（25mM Tris-HCl [pH7.5], 1mM EDTA, 25mM NaCl）で全量を５００μlにする。これよく
懸濁した後、８５℃に加温し、１０分おきにサンプリングを行い、キチナーゼ反応によりキチンから遊離したＮ−アセチルグルコサミンの２量体を、モルガン−エルソン法によりＮ−アセチルグルコサミンにまで加水分解してＮ−アセチルグルコサミンを定量する。反応の初速から、キチナーゼ活性（測定対象のキチナーゼ１ｍｇ当たり、１分間にキチンから遊離するＮ-アセチルグルコサミン量；μmol/min.mg）を求める。
【００１２】
本発明のキチナーゼは、触媒活性ドメインが(1)配列番号３に示すアミノ酸配列、又は(2)配列番号３に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結
領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする。
【００１３】
配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第２３１４〜３１８０位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ
（配列番号２）の第７７２〜１０６０位に位置している３’末端側の触媒活性ドメインＡＤ２に相当する。
【００１４】
なお、ここで、欠失、置換若しくは付加の範囲としては、アミノ酸の上記変更によって、キチナーゼの触媒活性ドメインとしての作用を有する限り、特に制限されないが、相同性３０％以上が好ましく、４５％以上が更に好ましく、６０％以上が特に好ましい。なお、相同性はLipman-Pearson法(Science, 227, 1435(1985))により計算される。上記「キチナーゼの触媒活性ドメインとしての作用を有する」とは、当該触媒活性ドメインを構成するペプチドが単独でキチナーゼ活性を発揮することを意味し、具体的には、該ペプチドのキチナーゼ活性が、約０．０２μmol/min.mg以上、好ましくは約０．０５μmol/min.mg以上であることを意味する。
【００１５】
なお、本発明は、触媒活性ドメインが上記アミノ酸配列からなるものであり、ＡＤ１［配列番号１で示される塩基配列の第５３８〜１６１７位にコードされているアミノ酸配列、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（配列番号２）の第１８０〜５３９位に位置し
ている５’末端側の触媒活性ドメイン］を含まないものである。つまり、本発明のキチナーゼにおいて、触媒活性ドメインは上記アミノ酸配列単独から構成されるものであり、本発明のキチナーゼには、他のアミノ酸配列からなる触媒活性ドメインは含まない。
【００１６】
また、上記触媒活性ドメインに連結されているキチン結合ドメインは、キチンに対して結合可能であることを限度として、その由来やアミノ酸配列については特に制限されない。上記触媒活性ドメインが４０℃以上、好ましくは５０℃以上の高温下で作用するので、当該キチン結合ドメインについても触媒活性ドメインの上記作用温度条件下でキチンと結合可能であることが望ましい。高温条件下で作用するキチン結合ドメインとしては、例えば超高熱古細菌由来のもの、好ましくはPyrococcus furiosus由来のものが挙げられる。
【００１７】
当該キチン結合ドメインの具体例として、例えば、(3)配列番号４又は５に示されるア
ミノ酸配列、又は(4)配列番号４又は５に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列であって、キチンに対して結合可能であるアミノ酸配列、を含む配列からなるものが例示される。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１８６１〜２１０３位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（配列番号２）の第６２
１〜７０１位に位置しているキチン結合ドメインＣＢＤ２である。また、配列番号５に示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第２０８〜３９０位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（配列番号２）の
第７０〜１３０位に位置しているキチン結合ドメインＣＢＤ１である。
【００１８】
本発明のキチナーゼには、上記キチン結合ドメインが少なくとも１つ上記触媒活性ドメインに連結されていればよい。また、２つ以上の上記キチン結合ドメインが上記触媒活性ドメインに連結されていてもよい。
【００１９】
上記キチン結合ドメインは、上記触媒活性ドメインのＮ末端側又はＣ末端側のいずれの側に連結されていてもよい。また、２つ以上の上記キチン結合ドメインが連結されている場合には、該キチン結合ドメインは、上記触媒活性ドメインのＮ末端又はＣ末端の何れか一方の側に、或いはＮ末端とＣ末端の双方の側に連結されていてもよい。上記キチン結合ドメインは、少なくとも１つが上記触媒活性ドメインのＮ末端側に連結されていることが
望ましく、これによってキチナーゼ活性を一層効果的に向上させることができる。
【００２０】
本発明のキチナーゼは、上記活性ドメインが上記キチン結合ドメインに直接連結されていてもよく、また１以上のアミノ酸からなる連結領域を介して連結されていてもよい。キチナーゼ活性を一層向上させるという観点から、上記活性ドメインと上記キチン結合ドメインとの間に１以上のアミノ酸からなる連結領域が介在しているものが好ましい。当該連結領域を構成するアミノ酸の総数は、好ましくは５〜１００個、更に好ましくは１０〜８０個である。
【００２１】
また、上記連結領域は、耐熱性及び構造の柔軟性を備えるアミノ酸配列であることが望ましい。ここでいう耐熱性とは、例えば４０℃以上、好ましくは５０℃以上で安定であることを示す。また、柔軟性とはアミノ酸配列がタンパク質の立体構造を変化させ得ることを意味する。
【００２２】
このような耐熱性及び構造の柔軟性を備えるアミノ酸配列としては、例えば、主としてトレオニン、プロリン及びセリンから構成されているアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、配列番号６又は７に示すアミノ酸配列、及び配列番号６又は７に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列であって、耐熱性及び構造の柔軟性を備えるアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列が例示される。
配列番号６に示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１６１８〜１８６０位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナー
ゼ（配列番号２）の第５４０〜６２０位に位置している「ＡＤ１とＣＢＤ１とを連結している領域」のアミノ酸配列である。また、配列番号７に示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第２１０４〜２３１３位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（配列番号２）の第７０２〜７７１位に位置
している「ＡＤ２とＣＢＤ２とを連結している領域」のアミノ酸配列である。
【００２３】
また、本発明のキチナーゼにおいて、２以上のキチン結合ドメインが含まれ、キチン結合ドメイン同士が相互に連結された形態をとる場合、２以上のキチン結合ドメインは、相互に直接連結されていてもよく、また上記連結領域を介して連結されていてもよい。
【００２４】
また、本発明のキチナーゼには、上記の触媒活性ドメイン、キチン結合ドメイン及び連結領域の他に、本発明の効果を妨げないことを限度として、Ｎ末端側及びＣ末端側のいずれか又は双方にアミノ酸又はペプチドが付加されていてもよい。キチナーゼ活性に著しく悪影響を及ばさないためには、このように付加されるペプチドは、５０個以下、好ましくは２０個以下のアミノ酸からなるものが望ましい。
【００２５】
本発明のキチナーゼの好ましい一態様として、(7)配列番号８で示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチド、又は(8)配列番号８に示すアミノ酸配列の１若しくは２以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであってキチナーゼ活性を有するものが例示される。当該キチナーゼには、Ｎ末端側に、ＤＮＡの翻訳開始部分に相当する１又は複数のアミノ酸（例えば、ＭＡＳ等；Ｍ、Ａ、Ｓはアミノ酸の一文字表記を示す）を有しているものが包含される。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１８４６〜３２２５位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（配列番号２）の第６１６〜
１０７５位に位置しているアミノ酸配列に相当する。また、当該配列番号８で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端側から、配列番号４で示されるアミノ酸配列（キチン結合ドメインＣＢＤ２）、配列番号７で示されるアミノ酸配列（連結領域）、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列（触媒活性ドメイン）が結合されてなるポリペプチドである。即ち、当該
配列番号８のアミノ酸配列の第６〜８６位のアミノ酸配列、第８７〜１５６位のアミノ酸配列、及び第１５７〜４４５位のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列に相当する。
【００２６】
本発明のキチナーゼの作用温度は、通常３７〜１０５℃、好ましくは５０〜１００℃、更に好ましくは７５〜９５℃であり、至適温度は８５〜９０℃である。また、本発明のキチナーゼの作用ｐＨは、通常５．５〜８、好ましくは６〜７．５、更に好ましくは６．２〜７．２であり、至適ｐＨは６．５〜７である。
【００２７】
また、本発明のキチナーゼは、コロイダルキチン（キチンを塩酸等で処理してコロイド状態にしたもの）に対する加水分解作用を発揮するだけでなく、従来のキチナーゼでは分解不可能であった結晶性キチンに対しても加水分解作用を発揮できる。
【００２８】
本発明のキチナーゼは、化学的方法によって、触媒活性ドメイン、キチン結合ドメイン及び必要に応じて連結領域を結合することにより得られるが、簡便には、遺伝子組み換え技術により、触媒活性ドメインが必要に応じて連結領域を介してキチン結合ドメインに連結されているポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、これを適当な宿主で発現させることにより得ることができる。
【００２９】
以下、遺伝子組み換え技術を利用して、本発明のキチナーゼを製造する方法について説明する。
【００３０】
上記キチナーゼをコードするＤＮＡ
上記キチナーゼをコードしているＤＮＡは、通常の遺伝子工学的手法により、又はこれに化学合成による手法を組み合わせることにより、得ることができる。
【００３１】
上記キチナーゼをコードしているＤＮＡは、例えば、触媒活性ドメインコードするＤＮＡ、キチン結合ドメインをコードするＤＮＡ及び必要に応じて連結領域をコードするＤＮＡをそれぞれ調製し、これらのＤＮＡを翻訳可能であるように結合することにより得ることができる。ＤＮＡの結合は公知の方法（例えばT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）等を用い
る方法）により行なうことができる。
【００３２】
上記触媒活性ドメインをコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により得ることができる。Pyrococcus furiosusから、通常の方法によってゲノムＤＮＡを抽出する。得られ
たゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、例えば、触媒活性ドメインの部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、触媒活性ドメインに対する抗体を用いた免疫学的方法等によって、上記触媒活性ドメインをコードしている遺伝子を取得することができる。
【００３３】
上記触媒活性ドメインをコードするＤＮＡの具体例として、配列番号９に示す塩基配列、又は配列番号９に示す配列番号からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼの触媒活性ドメインとしての作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが例示される。配列番号９に示す塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１８４６〜３２２８位に存する塩基配列である。
【００３４】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％ホルムアミドを含むハイブリ
ダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
【００３５】
また、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により得ることができる。遺伝資源として、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域をコードするＤＮＡを有する微生物、好ましくは該遺伝子を有する超好熱性古細菌（例えば、Pyrococcus furiosus）を使用して、通常の方法によってゲノムＤＮＡを抽出す
る。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、例えば、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域の部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域に対する抗体を用いた免疫学的方法、キチンに対する結合能を測定する方法等によって、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域をコードしているＤＮＡを取得することができる。
【００３６】
上記キチン結合ドメインをコードするＤＮＡの具体例として、配列番号１０又は１１に示す塩基配列、又は配列番号１０又は１１に示す配列番号からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチンと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡが例示される。配列番号１０に示す塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１８６１〜２１０３位に存する塩基配列であり、配列番号４に示すアミノ酸配列（ＣＢＤ２）をコードしているものである。また、配列番号１１に示す塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列の第２０８〜３９０位に存する塩基配列であり、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＣＢＤ１）をコードしているものである。
【００３７】
上記連結領域をコードするＤＮＡの具体例として、配列番号１２又は１３に示す塩基配列、又は配列番号１２又は１３に示す配列番号からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、連結領域を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡが例示される。配列番号１２に示す塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列の第１６１８〜１８６０位に存する塩基配列であり、配列番号６に示すアミノ酸配列（連結領域）をコードしているものである。また、配列番号１３に示す塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列の第２１０４〜２３１３位に存する塩基配列であり、配列番号７に示すアミノ酸配列（連結領域）をコードしているものである。
【００３８】
また、上記キチナーゼの内、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるキチナーゼをコードしているＤＮＡについては、簡便には、Pyrococcus furiosusのゲノムＤＮＡから
直接得ることもできる。具体的には、Pyrococcus furiosusのゲノムＤＮＡを適当な制限
酵素（例えば、NheI及びXhoI）で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、例えば、上記キチナーゼの部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、上記キチナーゼに対する抗体を用いた免疫学的方法等によって、上記キチナーゼをコードしているＤＮＡを取得することができる。
【００３９】
本発明のキチナーゼをコードするＤＮＡの具体例として、配列番号１４に示す塩基配列、又は配列番号１４に示す配列番号からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが例示される。配列番号１４に示す塩基配列は、Pyrococcus furiosusのキチナーゼの塩
基配列（配列番号１）の第１８４６〜３２２８位に存する塩基配列であり、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードしているものである。当該ＤＮＡには、５’末端にＤＮＡ翻訳
開始部分（例えば、ＡＴＧＧＣＴＡＧＣ等）が付与されたものも包含する。
【００４０】
組換えベクター
上記キチナーゼをコードする遺伝子を適当なベクターに連結することによって、該遺伝子を含有する組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主においてキチナーゼを発現させ得るものであれば、特に制限されない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等のベクターを用いることができる。具体的には、大腸菌ベクターのpBR322、pUC19、pKK233-2、pET11a等、バチルス属細菌ベクターのpUB110
、pC194、pE194、pTHT15、pBD16等、酵母用ベクターYip5、Yrp17、Yep24等、動物細胞用
ベクターのpcDNA、pBAC等を例示できる。
【００４１】
上記組換えベクターには、形質転換された細胞の選択を可能とするために、マーカー遺伝子が含まれていることが望ましい。当該マーカー遺伝子としては、例えば、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、又は薬剤に対する抵抗遺伝子等を挙げることができる。また、上記組換えベクターには、宿主で上記遺伝子の発現を可能にするためのプロモーターやその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）が含まれていることが好ましい。当該プロモーターとして、具体的にはSV40、CMV、ie1、T7、lac、trp、tac等のプロモーターを例示できる。
【００４２】
形質転換体
上記組換えベクターを用いて、宿主を形質転換することによって、該組換えベクターを含む形質転換体を得ることができる。宿主としては、上記キチナーゼを生産可能なものであれば、真核生物及び原核生物のいずれを用いることもできる。例えば、大腸菌等の細菌、酵母、糸状菌、動物細胞等を挙げることができる。形質転換は、宿主の種類に応じて、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主として細菌を使用する場合であれば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いることができる。
【００４３】
キチナーゼの製造
上記形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することによって、上記キチナーゼを取得することができる。
【００４４】
上記形質転換体の培養は、宿主の種類に応じた通常の方法を採用すればよい。具体的には、炭素源、窒素源、その他微量栄養物を含む培地で培養を行う方法を挙げることができる。培養は、液体培養であっても、また固体培養であってもよい。
【００４５】
上記培養物からのキチナーゼの採取は、培養物を、例えば硫安分画、各種のクロマトグラフィー等の工程に供して単離、精製することにより行われる。なお、キチナーゼが菌体内又は表面に蓄積されている場合には、菌体を回収し、これを破砕又は溶菌して菌体抽出物を得、これを用いて単離、精製すればよい。
【発明の効果】
【００４６】
本発明のキチナーゼは、高温で高い酵素活性を示すので、高温下で、微生物による汚染を抑えつつ、高効率でキチンを加水分解できるため、産業用酵素として実用的価値がある。
【００４７】
また、本発明のキチナーゼは、コロイダルキチンを分解するだけでなく、結晶性キチンに対する分解作用をも有しているので、該キチナーゼによれば、基質となる結晶性キチンをコロイド状態になるように前処理することなく、キチンの分解が可能になる。また、本発明のキチナーゼによって結晶性キチンを分解した後の産物は主に、N−アセチルグルコ
サミンの２量体として存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明について、実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１  キチナーゼの製造
＜Pyrpcoccus furiosusの培養＞
13.5gの食塩、4gのNa2SO4、0.7gのKCl、0.2gのNaHCO3、0.1gのKBr、30mgのH3BO3、10g
のMgCl2・6H2O、1.5gのCaCl2、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを1Lの超純水に溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し、
加圧殺菌することにより培地を作成した。
【００４９】
次いで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2%となるように培地に加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、パイロコッカス・フリオサス（JCM8422）を植菌した。培地が
嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で2〜4日培養し、その後、遠心分離により集菌した。
【００５０】
＜Pyrpcoccus furiosusのゲノムＤＮＡの調製＞
培養終了後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌し、菌体を10mM Tris（pH 7.5）-1mM EDTA溶液で2回洗浄した後、InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入した
。このブロックを1%N-lauroylsarcosine-1mg/ml プロテアーゼK溶液中で処理することに
より、ゲノムＤＮＡがAgaroseブロック中に分離調製された。
【００５１】
＜キチナーゼをコードするＤＮＡの増幅＞
Pyrpcoccus furiosusのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーGG GCT AGC ACT ACC CCT GTC CCA GTC TCA GG及びプライマーGG CTC GAG TTA TGT TGG AAC ACT AGC TTC GCを使
用して、ＰＣＲ反応により配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ反応後、ＤＮＡを制限酵素NdeI及びXhoIで完全分解（３７℃で２時間）した。
【００５２】
＜キチナーゼをコードするＤＮＡを含有するベクター、及びそれを用いた形質転換体の構築＞
発現ベクターのpET21d（Novagen社製）を制限酵素NdeI及びXhoIで切断し、精製した。
次いで、上記のキチナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を用
いて１６℃で、１６時間反応させることにより上記発現ベクターに連結した。得られたベクターを用いて、大腸菌(E. coli JM109株)（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換
体は、（0.05 mg/ml アンピシリン）を含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標
に選択した。得られた形質転換体からキチナーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドをアルカリ法で抽出した。
【００５３】
＜キチナーゼ酵素の発現及び精製＞
本キチナーゼをコードするＤＮＡが組み込まれたプラスミドを保持している大腸菌をＬＢ培地（１Ｌ中にポリペプトン１０ｇ、酵母エキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇを含む）を用いて３７℃で振とう培養し、対数増殖期中（６００ｎｍにおける光学密度０．２〜０．４）にイソプロピルβチオガラクトピラノシド（IPTG）を培地中の最終濃度が０．２ｍＭになるように添加した。そのまま培養を一晩継続し、その後遠心分離（６０００×ｇで７分間）によって大腸菌の細胞を回収した。
【００５４】
培養液１Ｌから回収した大腸菌を２０ｍＬの緩衝液Ａ（25mM Tris-HCl [pH7.5], 1mM EDTA, 25mM NaCl）に懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後、高速遠心（１３０００×ｇで１５分間）によって抽出液を得た。抽出液は８５℃で３０分間加熱し、再び高速遠心（１
３０００×ｇで１５分間）によって上清を回収した。
【００５５】
回収した上清を陰イオン交換カラムHiTrapQ（アマシャム社製、5ml）に添加した。カラムへの添加および溶出はAKTA prime（アマシャム社製）を用いた。溶出は緩衝液Ａに含まれる塩（NaCl）の濃度勾配（２５ｍＭ〜１Ｍ）によって行った。目的のキチナーゼタンパク質が溶出した画分を回収し、硫酸アンモニウム８０％飽和の条件において４℃で一晩沈殿させた。高速遠心（１３０００×ｇで１５分間）で沈殿を回収し緩衝液Ａで再溶解を行った。溶解後のサンプルは緩衝液Ａで平衡化を行ったゲル濾過カラムHiLoad 26/60 Superdex-200pg（アマシャム社製）に添加し、混入している低分子量のタンパク質および残留
硫酸アンモニウムを除去した。キチナーゼタンパク質が溶出した画分を回収し、CentriPrep YM-10（アミコン社製）で濃縮した。得られた画分には、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれており、均一標品は、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＮ末端側にMet-Ala-Serが付与されているポリペプチドからな
るキチナーゼであった。
【００５６】
試験例１  キチナーゼ活性の評価
上記実施例で得られたキチナーゼの他、下記キチナーゼをそれぞれ常法に従って調製し、これらのキチナーゼについて結晶性キチン及びコロイダルキチンに対するキチナーゼ活性を前記方法に従って測定した。
【００５７】
【表１】
2006025701.tif 000002
得られた結果を表２に示す。ＣＢＤ１、ＡＤ１、ＣＢＤ２及びＡＤ２からなるPyrococcus furiosusの全長キチナーゼ（比較例１）、ＣＢＤ１及びＡＤ１からなるキチナーゼ（
比較例２）、ＡＤ１単独からなるキチナーゼ（比較例３）、及びＡＤ２単独からなるキチナーゼ（比較例４）では、結晶性キチン及びコロイダルキチンに対する分解作用が低かったが、ＡＤ２にキチン結合ドメインを連結させてなる本発明のキチナーゼは、結晶性キチン及びコロイダルキチンに対する優れた加水分解作用を示した。この結果から、ＡＤ２にキチン結合ドメインを連結させることにより、ＡＤ２のキチナーゼ触媒活性を顕著に向上させることができることが明らかとなった。
【００５８】
【表２】
2006025701.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼにおけるキチン結合ドメイン（ＣＢＤ１、ＣＢＤ２）；触媒活性ドメイン（ＡＤ１、ＡＤ２）；及び連結領域の位置を示す図である。
【図１】
2006025701.tif 000004
【配列表】
2006025701000001.app