(57)【要約】【課題】  三次元多孔性支持体全体の細胞の生存性を反映し、かつ簡便に測定する方法の提供。【解決手段】  下記工程を含むことを特徴とする、細胞の生存率を測定する方法。（ａ）細胞が内在化された三次元多孔性支持体を、培養媒体に浸漬する；（ｂ）該培養媒体中で、該三次元多孔性支持体をインキュベートする；（ｃ）特定の時点で、該培養媒体中の酵素活性を測定する；および（ｄ）（ｃ）の酵素活性を、コントロールの酵素活性と比較する；ここで、該コントロールの酵素活性は、（ａ）で得られる細胞が内在化された三次元多孔性支持体が浸漬された培養媒体を、細胞溶解剤により処理した後、該培養媒体の酵素活性を測定することによって測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むことを特徴とする、細胞の生存率を測定する方法；
（ａ）細胞が内在化された三次元多孔性支持体を、培養媒体に浸漬する；
（ｂ）該培養媒体中で、該三次元多孔性支持体をインキュベートする；
（ｃ）特定の時点で、該培養媒体中の酵素活性を測定する；および
（ｄ）（ｃ）の酵素活性を、コントロールの酵素活性と比較する；ここで、該コントロールの酵素活性は、（ａ）で得られる細胞が内在化された三次元多孔性支持体が浸漬された培養媒体を、細胞溶解剤により処理した後、該培養媒体の酵素活性を測定することによって測定する。
【請求項２】
該酵素が、乳酸脱水素酵素、および、ミトコンドリア内Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤ）から選ばれるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該三次元多孔性支持体の平均孔径が、５μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該三次元多孔性支持体が、グリコール酸と乳酸の重量比が９９：１以上１：９９以下の、グリコール酸と乳酸の共重合体を含んでなるものであり、且つ、縦長形状の孔が並列的に配置され、該孔の孔径が１０μｍ以上５００μｍ以下であり、該孔が孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞の生存率を測定する方法を用いることによる、細胞の生存率をモニターする方法。
【請求項６】
細胞を三次元多孔性支持体に内在化させること、および、請求項１〜４のいずれかに記載の方法で細胞の生存率を測定することを含むことを特徴とする、細胞の生存率が特定された、細胞が内在化した三次元多孔性支持体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
三次元多孔性支持体に播種した細胞の生存率を算出する場合において、支持体全体を酵素、特にＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の活性抽出処理し、測定することによって、細胞培養プロセスの最終段階の製品評価をより簡便に行うことを可能にする方法。
【背景技術】
【０００２】
再生医療ビジネスにおいて、患者から細胞を採取後、増殖させ、適当な三次元多孔性支持体に播種してしまうと、三次元多孔性支持体内部の細胞の生存性の確認は、浮遊細胞の場合と異なり、細胞単独の回収が困難で、数値化が難しい。一般に浮遊細胞の生存率測定の場合は、膜透過性を利用したトリパンブルー法（非特許文献１参照）、核を染色するヌクレオカウンター法（非特許文献２参照）、核酸蛍光染色剤を利用したもの（特許文献１、２参照）が近年よく用いられているが、三次元多孔性支持体の内部細胞の生存率は測定できない。また、三次元多孔性支持体内部の細胞の生死を判定するためには、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ法という細胞内エステラーゼ活性および核染色を利用する方法を用いることが可能である（非特許文献２参照）。しかし、この方法は、生存率を算出しようとした場合に、実際に染色細胞をカウントする必要があり、結果の信頼性に問題がある。
【特許文献１】ＷＯ９７／２４６１６
【特許文献２】特開平１０−９９０９６号公報
【非特許文献１】Ｋ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｓｅｎｆｔ，Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ−Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３３，７７（１９８５）
【非特許文献２】Ｎ．Ｋｏｔｏｂｕｋｉ，Ｍ．Ｈｉｒｏｓｅ，Ｙ．Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｈ．Ｏｈｇｕｓｈｉ，Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ａｕｔｏｌｏｇｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｈａｒｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ，２８  Ｉｓｓｕｅ  １  Ｐａｇｅ  ３３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一旦三次元多孔性支持体内部に播種された細胞の回収は、トリプシン、リコンビナントプロテアーゼやコラゲナーゼを用いても通常１０％から２０％しか回収できず、これらの操作で回収された細胞の生存率を測定しても、全体を反映しているとは言いがたい。
特に再生医療の分野で、細胞をＧＭＰ基準で培養し、最終サンプルを出荷する場合には、概算での生存率では不十分で、信頼できる数値が必要となる。
そのため、三次元多孔性支持体全体の細胞の生存性を反映し、かつ簡便に測定する方法を評価行程に導入することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討を進めた結果、三次元多孔性支持体を直接培地に入れ、保存した後、その培地中に細胞から出た酵素、特にＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の活性を測定することで、より簡便に且つ信頼性のある生存率を算出することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、下記工程を含むことを特徴とする、細胞の生存率を測定する方法に関する。
（ａ）細胞が内在化された三次元多孔性支持体を、培養媒体に浸漬する；
（ｂ）該培養媒体中で、該三次元多孔性支持体をインキュベートする；
（ｃ）特定の時点で、該培養媒体中の酵素活性を測定する；および
（ｄ）（ｃ）の酵素活性を、コントロールの酵素活性と比較する；ここで、該コントロールの酵素活性は、（ａ）で得られる細胞が内在化された三次元多孔性支持体が浸漬された培養媒体を、細胞溶解剤により処理した後、該培養媒体の酵素活性を測定することによって測定する。
【０００６】
また、本発明は、該酵素が、乳酸脱水素酵素、および、ミトコンドリア内Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤ）から選ばれるものである上記方法；
該三次元多孔性支持体の平均孔径が、５μｍ以上１０００μｍ以下である上記方法；
該三次元多孔性支持体が、グリコール酸と乳酸の重量比が９９：１以上１：９９以下の、グリコール酸と乳酸の共重合体を含んでなるものであり、且つ、縦長形状の孔が並列的に配置され、該孔の孔径が１０μｍ以上５００μｍ以下であり、該孔が孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有するものである上記方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、上記細胞の生存率を測定する方法を用いることによる、細胞の生存率をモニターする方法に関する。
さらに、本発明は、細胞を三次元多孔性支持体に内在化させること、および、上記方法で細胞の生存率を測定することを含むことを特徴とする、細胞の生存率が特定された、細胞が内在化した三次元多孔性支持体の製造方法に関する。
【０００８】
以下に、本発明の細胞の生存率を測定する方法について詳細に説明する。
まず、工程（ａ）では、細胞が内在化された三次元多孔性支持体を、培養媒体に浸漬する。
【０００９】
本発明における「細胞」としては、再生医療に供する可能性のある細胞、例えば骨髄細胞、心筋細胞、血球細胞等が含まれる。
【００１０】
本発明において「三次元多孔性支持体」とは、内部に、少なくとも１部に連通する多数の微細な孔または空隙を有する成形物を意味する。例えば、三次元多孔性支持体は、細胞を内部に内在化すると同時に、血清成分や栄養因子、また老廃物等の循環が円滑に行われるような構造を持つ、細胞培養のための支持体であってもよい。
【００１１】
三次元多孔性支持体の材料としては、特に限定されないが、例えば、活性炭、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機三次元多孔性支持体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋ポリアミド、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリアクリル酸エステル（ポリアクリル酸メチル等）、ポリメタクリル酸エステル（ポリメタクリル酸メチル等）等の合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリン等の多糖類からなる有機三次元多孔性支持体；セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス、さらにはこれらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機等の複合三次元多孔性支持体；ヒドロキシアパタイト、βＴＣＰ（β−三リン酸カルシウム）等のセラミック化合物からなる三次元多孔性支持体等が代表例として挙げられる。
【００１２】
三次元多孔性支持体の材料としては、上記以外に生体適合性材料が好ましく挙げられる。生体適合性材料としては、例えば、コラーゲン、キチン、キトサン等の生体由来物質；αまたはβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマー、例えばＰＧＡ（グリコール酸重合体）、ＰＬＧＡ（乳酸−グリコール酸共重合体）、ＰＬＬＡ（Ｌ−乳酸重合体）等の人工物；あるいはそれらのうち２種以上の物質の複合体等が挙げられ、前述の構造（少なくとも１部に連通する多数の微細な孔または空隙を有する構造）を実現できる材料であれば特に限定されない。
好ましくは、グリコール酸と乳酸の共重合体（ＰＬＧＡ）であって、グリコール酸と乳酸の重量比が、好ましくは約９９：１〜１：９９、より好ましくは約７５：２５〜２５：７５である。
【００１３】
三次元多孔性支持体の平均孔径は、５μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
また、三次元多孔性支持体は、孔径が、好ましくは約１０μｍ以上５００μｍ以下、より好ましくは約１０μｍ以上３００μｍ以下で、孔長が、好ましくは約２０μｍ以上１ｃｍ以下、より好ましくは約５００μｍ以上１ｃｍ以下で、縦長形状の孔、例えば紡錘状等の孔が並列的に配置され、並置された各孔間が、孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有するものであることが、特に好ましい。
【００１４】
孔径約１０μｍ以下の小孔で連通した構造とは、上記縦長形状の孔の全個数の約５０％以上が、孔径約１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造を意味する。好ましくは、上記縦長形状の孔の全個数の約７０％以上が、孔径約１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造である。
【００１５】
三次元多孔性支持体は、その有孔率は約７０％以上であることが好ましいが、細胞密度確保の点から、約７０〜９５％のものがより好ましい。
ここで「有孔率」とは、支持体における縦長形状の孔と小孔との合計の割合をいい、単位体積あたりの支持体材料体積に対する空隙体積の合計体積から算出したものである。
また、上記孔径及び孔長は、電子顕微鏡観察による単位視野あたりに存在するすべての孔の内径、長さの測定を最低３視野について行い、このデータを統合することにより算出したものである。
【００１６】
さらに、この多孔性支持体の構造も、前述の構造を実現できるものであれば、スポンジ状のものであっても不織布であっても、あるいはそれ以外のものであってもよく、特に限定されるものではない。
【００１７】
三次元多孔性支持体の形状は、三次元であれば限定されないが、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状、直方体、立方体、平板状等、いずれも有効に用いられる。
三次元多孔性支持体が球状または粒状である場合、その平均粒径は、好ましくは約５μｍ以上１０００μｍ以下、より好ましくは約２０〜８００μｍ、さらに好ましくは約３０〜６００μｍである。
【００１８】
また、三次元多孔性支持体は、両方の面に孔径が約１０μｍの孔を有し、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板状形状を有し、一方または両方の面が開孔処理されているものであってもよい。
ここで、厚み方向とは、縦長孔の縦長方向を意味する。縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置とは、縦長孔を同じ方向に並置することを意味する。また、概平板状形状とは、完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものを全て含む。
【００１９】
さらに、開孔処理とは、孔径を拡大させることを意味し、公知の方法、例えばＷＯ２００４／０３５１０１に開示されるような方法によって処理し得る。簡単には、塩溶出法、または剥離法によって処理し得る。当該開孔処理によって、細胞が容易に通過できる、孔径が約５０〜８００μｍ、好ましくは約５０〜３００μｍ、より好ましくは５０〜１５０μｍの孔を確保できる。
三次元多孔性支持体が概平板状形状である場合、その厚みは、好ましくは約０．５ｍｍ〜５．０ｍｍ、より好ましくは約１．０ｍｍ〜４．０ｍｍ、さらに好ましくは１．５ｍｍ〜３．５ｍｍである。
【００２０】
当該多孔性支持体の製造方法としては、前述の構造を実現できるものであれば特に限定されることはない。
当該多孔性支持体は、例えばＷＯ２００４／０３５１０１号公報に見出されるような公知の方法で製造できる。簡単には、多孔性支持体材料を有機溶媒に溶解し、調製した溶液を型枠に流し込んだ後、約３℃／分以上の冷却速度で凍結し、凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去することによって製造する。
【００２１】
次に、細胞を三次元多孔性支持体に播種する手法としては、細胞をそのまま、または液体、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、培養液、培地（例えばＭＥＭα培地、ＤＭＥＭ培地等の細胞培養用の培地）等に懸濁した懸濁液として、該支持体上に滴下またはシリンジ等により注入する事を含む。
このようにして、細胞が内在化された三次元多孔性支持体を得ることができる。
【００２２】
上記で得られた、細胞が内在化された三次元多孔性支持体を、培養媒体に浸漬する。
培養媒体としては、細胞を培養する際に使う培地であれば特に限定されないが、好ましくはＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地等が挙げられる。
また、上記培養媒体には、さらにＦＢＳ（ウシ胎仔血清）等の血清等を添加してもよい。
【００２３】
工程（ｂ）では、上記培養媒体中で、三次元多孔性支持体をインキュベートする。
インキュベートの方法は特に限定されるものではないが、例えば、ＣＯ２インキュベーター、恒温培養器等を用い、温度０〜４０℃で、０．５〜７２時間行うことが好ましい。
【００２４】
工程（ｃ）では、特定の時点で、該培養媒体中の酵素活性を測定する。
特定の時点とは、特に限定されるものではなく、測定を行いたい任意の時点のことをいう。
【００２５】
酵素としては、細胞内に内在する酵素、すなわち、細胞生存中では大多数が細胞内部に存在する酵素であり、細胞が死滅し、膜等の破壊が起こると細胞外に漏出する酵素を指す。例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）；ミトコンドリア内Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（コハク酸脱水素酵素、ＳＤ）等のミトコンドリア内酵素；ＡＴＰａｓｅ等が挙げられる。好ましくは、乳酸脱水素酵素、ミトコンドリア内Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤ）であり、より好ましくは、細胞外に出ても活性が安定な乳酸脱水素酵素である。
【００２６】
また、酵素活性の測定は、培養上清を取得し、遠心分離操作により細胞成分を除去したサンプルを、酵素活性測定用の基質と反応させ、約１０〜３０分後にその吸光度（４９０ｎｍ）を測定することにより、行うことができる。
【００２７】
工程（ｄ）では、上記（ｃ）の酵素活性を、コントロールの酵素活性と比較する。
該コントロールの酵素活性は、（ａ）で得られる細胞が内在化された三次元多孔性支持体が浸漬された培養媒体を、細胞溶解剤により処理した後、該培養媒体の酵素活性を測定することによって得られるものである。
また、当該コントロールの酵素活性も、上記と同様にして測定することができる。
【００２８】
細胞溶解剤としては、細胞の膜を破壊もしくは溶解して、内部の酵素を培養液中に放出しうるようなもので、かつ酵素活性測定を阻害しないものであれば特に限定されない。例えば、超音波処理等の物理的破壊でも良い。好ましくは、ＴｒｉｔｏｎＸ１００等の溶解剤が適している。
【００２９】
細胞の生存率は、上記で測定した（ｃ）の酵素活性をコントロールの酵素活性と比較することにより、求めることができる。
具体的には、（ｃ）の酵素活性の値をｘ、コントロールの酵素活性の値をｙとすると、細胞の生存率（％）は、１００×（ｙ−ｘ）／ｙにより算出することができる。
ここで、コントロールの酵素活性は、細胞溶解剤処理により細胞を全て死滅させた場合の酵素活性であり、これは、播種した細胞の総数が本来持っていた細胞内の酵素活性を示すものである。
【００３０】
また、本発明の細胞の生存率をモニターする方法は、上記細胞の生存率を測定する方法を用いてなるものである。
具体的には、上記方法により、細胞の生存率を経時的に何度か測定することにより、細胞の生存率をモニターすることができる。
【００３１】
さらに、本発明の細胞が内在化した三次元多孔性支持体の製造方法は、上述のようにして細胞を三次元多孔性支持体に内在化させ、上記方法により細胞の生存率を測定することを含むものである。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、細胞が内在化された多孔性支持体を破壊することなく、かつ、測定される細胞の生存性に影響を与えることなく、細胞の生存率を簡便に定量的に測定することができ、またモニターし得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）ＬＤＨ活性とＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色の相関解析
Ｔ７５フラスコ（ファルコン製）に、正常ヒト間葉系細胞を５×１０５個／フラスコになるように播種し、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）で１０日間、細胞をコンフルエントまで培養した。５×１０６個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。次に、ＰＬＧＡ支持体（縦約６ｍｍ×横約６ｍｍ×厚さ約３．５ｍｍ、開孔処理されていない面の孔径約１０μｍ、開孔処理されている面の孔径約３００μｍ、紡錘状の縦長型の小孔径約１０〜３００μｍ）を用意し、これに細胞を１×１０７個／ｍＬになるように播種した。細胞播種した支持体（モジュール）を２４穴培養プレート（ファルコン社製）に入れ、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２時間静置培養した後に、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１％ＦＢＳを１ｍＬ入れた。
継続して３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２２時間培養し、培養液をその時点で全量回収したものと、その後４℃で４８時間保存した培養液を回収したものの２サンプル取得した（それぞれのサンプルは、同じ細胞播種密度で別々に準備した）。
培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を含まない上清を更に取得した。この上清について、ＬＤＨ測定キット（ＴＡＫＡＲＡ社製品）を用いてＬＤＨ活性を測定した。
この時、同じ細胞数を支持体に播種したモジュールを、細胞溶解剤である１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で処理し、播種した総細胞が全て死滅した場合のＬＤＨ活性を測定するための正コントロールサンプルとした。この正コントロールサンプルと、実際の実験サンプルのＬＤＨ活性の比を求め、細胞生存率を算出した（図１下）。
【００３５】
この時のモジュールについて、直ちにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色キットＬ−３２２４（モレキュラープローブ社製）を用いて、支持体全体を染色した。染色は、支持体を染色液５ｍｌ（ＬＩＶＥ液７μＬ、ＤＥＡＤ液１０μＬをＰＢＳに溶かしたもの）に入れ、３０分間反応させた。染色後、１０ｍｌのＰＢＳで支持体を洗浄し、支持体の細胞播種面に垂直に切断し、内部を蛍光顕微鏡（ＣＣＤカメラ（浜松フォトニクス  オルカ  ＥＲ  アクアライト）、顕微鏡（オリンパスＩＸ７０））で観察した（図１上）。
その結果、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色で観察された生存率と、ＬＤＨ活性測定で得られた生存率がほぼ等しいことがわかった。このことから、ＬＤＨ方法はモジュール内部の細胞生存率を反映していることが明らかになった。
【００３６】
（実施例２）ＬＤＨ活性を指標とした三次元多孔性支持体内部の細胞生存率の測定
実施例１に記載の方法によって、細胞を播種したモジュールを作製した。その後、モジュールを２４穴培養プレート（ファルコン社製）に入れ、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２時間静置培養した後に、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１％ＦＢＳを１ｍＬ入れた。
継続して３７℃、ＣＯ２インキュベーターで１９時間培養し、培養液を全量回収した。
培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を含まない上清を更に取得した。この上清中のＬＤＨ酵素活性は４℃で数週間変わらないので、４℃で測定まで保存した。次に、上記３７℃で２１時間培養したモジュールと同一のモジュールを複数作製しておき、室温（２１℃）および低温（８℃）で、更に２４時間、４８時間、１２０時間保存したものの培養上清を取得した。この際、各条件においてモジュールを３個ずつ用いて、それぞれのＬＤＨ活性を測定した。各保存時間で得られた上清について、ＬＤＨ測定キット（ＴＡＫＡＲＡ社製品）を用いてＬＤＨ活性を測定した。
この時、同じ細胞数を支持体に播種したモジュールを、細胞溶解剤である１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で処理し、播種した総細胞が全て死滅した場合のＬＤＨ活性を測定するための正コントロールサンプルとした。この正コントロールサンプルと、実際の実験サンプルのＬＤＨ活性の比を求め、細胞生存率を算出した（図２）。
なお、図２において、３７℃で２１時間培養した場合を「＃」で表し、例えば「＃＋２１℃２４ｈｒ」とは、３７℃で２１時間培養後、２１℃で２４時間培養したことを表す。
その結果、モジュール内部の細胞生存率が、ＬＤＨ方法を用いて、培養上清を取得する簡便な操作で、非侵襲的且つ経時的に追跡できることが明らかになった。
【００３７】
（実施例３）ＬＤＨ活性を指標としたモジュール内部に存在する骨分化細胞の生存率測定
実施例１に記載の方法により、５×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。次に、ハイドロキシアパタイト支持体（ペンタックス社製、直径約５ｍｍ×厚さ約２ｍｍの円柱状、有孔率約５０％、孔径約０．５〜５００μｍ）を１２穴培養プレート（ファルコン社製）に入れ、細胞を支持体あたりに約２×１０４個になるように播種した。細胞播種したモジュールを３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２４時間静置培養した後に、骨分化誘導剤（１０ｍＭβ−グリセロリン酸、７０μＭアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメサゾン、いずれも終濃度）を添加した培養液で、さらに９日間静置培養を行った。骨分化誘導したモジュールを４穴培養プレート（ＮＵＮＣ社製）に移し、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１％ＦＢＳを１ｍＬ入れた。
この培養プレートを３７℃、ＣＯ２インキュベーター、２５℃および４℃で２４時間培養し、各温度条件下における培養液を回収した（それぞれのサンプルは同じ細胞播種密度で別々に準備した）。
各培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を含まない上清を更に取得した。この上清について、ＬＤＨ測定キット（ＴＡＫＡＲＡ社製品）を用いてＬＤＨ活性を測定した。
この時、同じ細胞数を支持体に播種した骨分化誘導したモジュール（上記各温度（３７℃、２５℃、４℃）で２４時間培養する直前のもの）を、細胞溶解剤である１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で処理し、播種した総細胞が全て死滅した場合のＬＤＨ活性を測定するための正コントロールサンプルとした。この正コントロールサンプルと、実際の実験サンプルのＬＤＨ活性の比を求め、細胞生存率を算出した（図３上）。
【００３８】
上記と同様に調製した骨分化誘導したモジュールを用い、上記各温度（３７℃、２５℃、４℃）で２４時間培養したものについて、ＡＴＰ量測定キット（プロメガ社製）による測定を行った。０．５ｍＬの培養液（ＭＥＭ培地）に浸したモジュールに反応液（ＡＴＰ活性測定用溶液）を等量添加し、２分間混合、１０分間静置することにより、細胞の溶解とＡＴＰを利用した反応を行った。反応後の溶液を０．２ｍＬ採取し、マルチラベルカウンター（パーキンエルマー社製）により蛍光強度を測定した。正コントロールは、上記２４時間培養する直前のサンプルとし、細胞生存率を算出した（図３下）。
その結果、ＡＴＰ量測定キットにより算出された生存率と、ＬＤＨ測定キットにより算出された生存率はほぼ等しいことがわかった。このことから、ＬＤＨ方法によれば、モジュール内部の骨分化細胞の生存率を、培養上清の取得という簡便な操作で、且つ非侵襲的に測定可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、細胞が内在化された多孔性支持体を破壊することなく、かつ、測定される細胞の生存性に影響を与えることなく、細胞の生存率を簡便に定量的に測定することができ、またモニターし得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＬＤＨ活性とＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色の相関解析
【図２】ＬＤＨ活性を指標とした三次元多孔性支持体内部の細胞生存率の測定
【図３】ＬＤＨ活性を指標とした三次元多孔性支持体内部の骨分化細胞生存率の測定
【図１】
2006211950.tif 000002
【図２】
2006211950.tif 000003
【図３】
2006211950.tif 000004