(57)【要約】【課題】  本発明は、虚血性心疾患における心臓の機能障害を改善する因子を提供することを目的とし、より詳しくは、虚血再灌流時における心筋細胞の細胞死を抑制する物質とその利用法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明者らは、嫌気的解糖系に働く酵素として知られている骨格筋型乳酸脱水素酵素（Ｍ−ＬＤＨ）が、これまでに知られていなかった「心筋細胞死の抑制効果」という新規な効果を有することを見出し、本発明に至った。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心疾患治療薬として新規活性を有する骨格筋型乳酸脱水素酵素及び骨格筋型乳酸脱水素酵素を利用した心疾患治療薬のスクリーニング方法並びに骨格筋型乳酸脱水素酵素の血中濃度を測定することを特徴とする心筋虚血の検査方法。
【請求項２】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項３】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項４】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であって、心筋の細胞死を伴うものであることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項５】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であって、心筋の細胞死を伴うものであり、労作狭心症、安静狭心症、前壁心筋梗塞、側壁心筋梗塞、下壁心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、虚血による重症の不整脈、のうち少なくとも１種類から選ばれることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項６】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項７】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項８】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とし、前記活性酸素の作用が、（ａ）心筋細胞内への過剰なカルシウムイオンの流入、（ｂ）心筋細胞膜における膜電位のオシレーション（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）、（ｃ）心拍出量の低下、のうち少なくとも１つから選ばれるものであることを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項９】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とし、前記活性酸素の作用が、（ａ）心筋細胞内への過剰なカルシウムイオンの流入、（ｂ）心筋細胞膜における膜電位のオシレーション（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）、（ｃ）心拍出量の低下、のうち少なくとも１つから選ばれるものであることを特徴とする、請求項３から請求項５のうちいずれか１項に記載の、薬剤組成物。
【請求項１０】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記成分が、骨格筋型乳酸脱水素酵素の全アミノ酸配列または一部が置換されたアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項１１】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記成分が、骨格筋型乳酸脱水素酵素の全アミノ酸配列または一部が置換されたアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３から請求項９のうちいずれか１項に記載の、薬剤組成物。
【請求項１２】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法
【請求項１３】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングのターゲットが心機能収縮改善効果または心筋細胞の生存維持の改善効果であることを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法
【請求項１４】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングのターゲットが心機能収縮改善効果または心筋細胞の生存維持の改善効果であって、骨格筋型乳酸脱水素酵素が刺激する細胞内情報伝達系を活性化する骨格筋型乳酸脱水素酵素以外の物質を探索することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法。
【請求項１６】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血初期に血液中に放出されるものであることを特徴とする、心筋虚血の検査方法。
【請求項１７】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血後初期に血液中に放出されるものであることを特徴とし、前記濃度が虚血後３０分からの急上昇と２４時間後以降の下降を伴うものであることを特徴とする、心筋虚血の検査方法。
【請求項１８】
骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法に利用される、検査用キットであって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血後初期に血液中に放出されるものであることを特徴とし、前記濃度が虚血後３０分からの急上昇と２４時間後以降の下降を伴うものであることを特徴とする、検査用キット。
【請求項１９】
骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が、ヒト由来の骨格筋型乳酸脱水素酵素である、請求項２から請求項１１のうちいずれか１項に記載の、薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患治療薬として新規活性を有する生理活性物質に関し、詳しくは、虚血性心疾患の治療薬として新規活性を有する骨格筋型乳酸脱水素酵素及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血再灌流は、心筋梗塞や心臓バイパス手術、心臓移植などで発生する主要な疾患の状態である。心臓冠動脈の虚血再灌流が発生した場合、心臓は肥大したり、虚血周囲で細胞死が観察されたり、また、心筋の繊維化が見られる。これらの現象はリモデリングと呼ばれており、これは虚血にさらされた心筋細胞ばかりでなく虚血周囲の組織においてもよく観察されている。このことは、虚血再灌流時に何らかのシグナルを伝達するための様々な因子が放出されていることを示唆している（非特許文献１，２）。
【０００３】
実際、心臓は全身に血液を送るポンプの役割ばかりでなく、ホルモン性因子を放出する内分泌系の組織として働いていることもよく知られている。一酸化窒素やプロスタグランジン、アデノシンといった低分子物質が心臓から放出され、心臓血管系の制御に関与している。これらの低分子に加え、炎症性サイトカインもまた心臓から虚血再灌流時に放出されている。例えば、腫瘍壊死因子は虚血心筋において産生され、リアナジン受容体阻害を介して心臓の収縮抑制に関与している。炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ‐１β）やインターロイキン６（ＩＬ‐６）も虚血後の心臓から放出されている。ＩＬ‐１βは心筋の直接的な阻害に加え、カルシウムを制御する遺伝子のダウンレギュレーションを介して心臓の収縮を抑制している。ＩＬ‐６は、Ｌ型タイプのカルシウムチャネルを阻害することによってカルシウムの細胞内流入や心臓収縮の抑制に働いている。これらの因子は、傷害を受けた心筋細胞の収縮を直接的に阻害するばかりでなく、無傷の心筋細胞の機能障害も導いている（非特許文献３−非特許文献１０）。
【０００４】
肝細胞増殖因子や血小板増殖因子、赤血球増殖因子といった様々な増殖因子も、虚血心筋から放出されて心臓に働きかけていることが知られている。しかしこれらの因子は、虚血心筋の細胞死を抑制することに加えて、血管新生や繊維芽細胞の増殖にも関与している（非特許文献１１−非特許文献１４）。
【０００５】
これまでに、心臓の様々な不整脈の発生を抑制するための薬剤が開発されてきた。しかしながらこれらの薬剤は副作用が極めて強く、重篤な心疾患以外に使用することは難しい。また一方、副作用の少ない生理的因子として増殖因子の遺伝子を用いた遺伝子治療の試みが現在なされているが、こうした増殖因子は繊維芽細胞や肝細胞リンパ球といった様々な細胞を増殖させる能力をもっており、この点が心疾患にとってはある種のリスクとなっている。心臓の機能障害を改善し、しかもリスクの少ない因子の発見が、多くの心疾患患者さんに恩恵をもたらすことが考えられるが、こうした因子はこれまでに発見されていない。
【特許文献１】特開昭６３‐９３７２６  虚血性心疾患治療薬
【特許文献２】特開平９‐１２４７５  虚血−再灌流障害の予防および治療薬
【特許文献３】特開平１１‐１３９９６９  医薬組成物
【特許文献４】特開２００１‐９７９７９  縮合複素環化合物、その製造法および用途
【特許文献５】特開２００３‐８８３８９  心疾患の予防・治療剤
【特許文献６】特表２００３‐５０６０９４  心臓における遺伝子発現を活性化するポリヌクレオチドおよび遺伝子治療におけるその使用
【特許文献７】特表２００４‐５２６４３５  心疾患の診断および治療の方法
【非特許文献１】Ｓｕｔｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ，Ｎ．（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１，２９８１‐２９８８
【非特許文献２】Ｅｅｆｔｉｎｇ，（２００４）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．６１，４１４‐４２６
【非特許文献３】Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｍ．Ｊ．（２００４）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．６２，４８１‐４８８
【非特許文献４】Ｋａｔｗａ，Ｌ．Ｃ．（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５，Ｈ１１３２‐１１３９
【非特許文献５】Ｓｔａｎｇｌ，Ｖ．（２００２）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．５３，１２‐３０
【非特許文献６】Ｂｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．（２００１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．５１，１３‐２０
【非特許文献７】Ｗｅｂｂ，Ａ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１３６８３‐１３６８８
【非特許文献８】Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ａ．（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １４６，４１９‐４２８
【非特許文献９】Ｔｈａｉｋ，Ｃ．Ｍ，（１９９５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９６，１０９３‐１０９９
【非特許文献１０】Ｃｒａｉｇ，Ｒ．，（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５，２３８１４‐２３８２４
【非特許文献１１】Ｌｉ，Ｙ．，（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７，２４９９‐２５０６
【非特許文献１２】Ｘａｙｍａｒｄａｎ，Ｍ．，（２００４）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９４，Ｅ３９‐４５
【非特許文献１３】Ｐａｒｓａ，Ｃ．Ｊ．，（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９，２０６５５‐２０６６２
【非特許文献１４】Ｍｅｉｊ，Ｊ．Ｔ．，（２００２）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２，Ｈ５４７‐５５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この様な現状を踏まえ、本発明は、増殖因子以外で心臓の機能障害を改善する因子を提供することを目的とし、より詳しくは、虚血再灌流時における細胞死を抑制する物質とその利用法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的のため本発明者らは、虚血再灌流モデルを用いて、心臓から放出される様々な因子の生成同定を試みた。
【０００８】
すなわち本発明者らは、心筋由来の培養細胞を大量に培養し、これらの細胞に虚血再灌流刺激を行った。この培養上清を大量に回収し、タンパク質成分だけを硫酸アンモニウム沈殿法を用いて取り出した。この沈殿したタンパク質成分を透析した後、分泌因子だけを精製する特異的なカラムを用いて分離を行った。分離されたそれぞれのタンパク質を心筋細胞に添加し、細胞の生存活性を測定した。生存活性を示した分画を更にイオン交換カラムで分離し、それぞれの分画でも同様に生存活性を測定した。こうして分離精製されたタンパク質を、様々な条件下で心筋細胞に作用させ、心臓に対する生存活性を有する物質を探索した。
【０００９】
これらの解析によって、本発明者らは、嫌気的解糖系に働く酵素として知られている骨格筋型乳酸脱水素酵素（Ｍ‐ＬＤＨ）が、これまでに知られていなかった「心筋細胞死の抑制効果」という新規な効果を有することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の態様は、心疾患治療薬として新規活性を有する骨格筋型乳酸脱水素酵素及び骨格筋型乳酸脱水素酵素を利用した心疾患治療薬のスクリーニング方法並びに骨格筋型乳酸脱水素酵素の血中濃度を測定することを特徴とする心筋虚血の検査方法を提供する。
【００１１】
本発明の第２の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であって、心筋の細胞死を伴うものであることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記心疾患が、虚血性心疾患であって、心筋の細胞死を伴うものであり、労作狭心症、安静狭心症、前壁心筋梗塞、側壁心筋梗塞、下壁心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、虚血による重症の不整脈、のうち少なくとも１種類から選ばれることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１７】
本発明の第８の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とし、前記活性酸素の作用が、（ａ）心筋細胞内への過剰なカルシウムイオンの流入、（ｂ）心筋細胞膜における膜電位のオシレーション（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）、（ｃ）心拍出量の低下、のうち少なくとも１つから選ばれるものであることを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００１８】
本発明の第９の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であって、心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであることを特徴とし、前記活性酸素の作用が、（ａ）心筋細胞内への過剰なカルシウムイオンの流入、（ｂ）心筋細胞膜における膜電位のオシレーション（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）、（ｃ）心拍出量の低下、のうち少なくとも１つから選ばれるものであることを特徴とする、第３の態様から第５の態様のうちいずれか１つに記載の、薬剤組成物を提供する。
【００１９】
本発明の第１０の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記成分が、骨格筋型乳酸脱水素酵素の全アミノ酸配列または一部が置換されたアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする、薬剤組成物を提供する。
【００２０】
本発明の第１１の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記成分が、骨格筋型乳酸脱水素酵素の全アミノ酸配列または一部が置換されたアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする、第３の態様から第９の態様のいずれか１つにおいて記載の、薬剤組成物を提供する。
【００２１】
本発明の第１２の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１３の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングのターゲットが心機能収縮改善効果または心筋細胞の生存維持の改善効果であることを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１４の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングのターゲットが心機能収縮改善効果または心筋細胞の生存維持の改善効果であって、骨格筋型乳酸脱水素酵素が刺激する細胞内情報伝達系を活性化する骨格筋型乳酸脱水素酵素以外の物質を探索することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
本発明の第１５の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法を提供する。
【００２５】
本発明の第１６の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血初期に血液中に放出されるものであることを特徴とする、心筋虚血の検査方法を提供する。
【００２６】
本発明の第１７の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血後初期に血液中に放出されるものであることを特徴とし、前記濃度が虚血後３０分からの急上昇と２４時間後以降の下降を伴うものであることを特徴とする、心筋虚血の検査方法を提供する。
【００２７】
本発明の第１８の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素の血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法に利用される、検査用キットであって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が虚血後初期に血液中に放出されるものであることを特徴とし、前記濃度が虚血後３０分からの急上昇と２４時間後以降の下降を伴うものであることを特徴とする、検査用キットを提供する。
【００２８】
本発明の第１９の態様は、骨格筋型乳酸脱水素酵素を有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記骨格筋型乳酸脱水素酵素が、ヒト由来の骨格筋型乳酸脱水素酵素である、第２の態様から第１１の態様のいずれか１つに記載の薬剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の提供する骨格筋型乳酸脱水素酵素は、心筋細胞の細胞死を抑制する。そのメカニズムは、活性酸素によって細胞内に過剰に流入するカルシウムイオンの抑制であり、また、活性酸素によって生じる不整脈の原因である膜電位のオシレーション（揺らぎ）も顕著に抑制された。更に、単離した心臓において活性酸素による心拍出量の低下を顕著に改善した。この様な効果は、心疾患において増悪因子といわれる活性酸素の作用を消去若しくは改善するものであり、不整脈をはじめとする種々の心疾患においても改善効果を有することが考えられる。
【００３０】
また心筋虚血において、本発明の提供する骨格筋型乳酸脱水素酵素がターゲットとする分子や細胞内情報伝達系を明らかにし、これらに作用する別の分子（化合物）を探索することによって、これまでに知られていない新規の心疾患治療薬をスクリーニングすることも可能となる。
【００３１】
更に、心臓虚血になった患者さんにおいて、骨格筋型乳酸脱水素酵素は、虚血初期に血液中への放出が観察され、虚血終了とともに急速に低下した。こうした結果から、骨格筋型乳酸脱水素酵素は、虚血性心疾患のマーカーとして検査に用いることができることを示しており、この方法に供するための検査キットもまた開発可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明者らは、骨格筋型乳酸脱水素酵素（以下「Ｍ‐ＬＤＨ」という）が細胞外から心臓に直接作用することによって、様々な心疾患を抑制することを見出した。以下において、本発明を実施するための最良の形態を記述する。
【００３３】
本発明の第１の態様では、心疾患治療薬として新規活性を有するＭ‐LＤＨ及びＭ−ＬＤＨを利用した心疾患治療薬のスクリーニング方法並びに骨格筋型乳酸脱水素酵素の血中濃度を測定することを特徴とする心筋虚血の検査方法が提示される。Ｍ−ＬＤＨは嫌気解糖系に働く酵素としては公知の酵素であるが、本発明は、Ｍ−ＬＤＨが心疾患の治療薬として新たな効果を持つことを発見したものであり、この効果を利用した心疾患治療薬及び心疾患治療薬のスクリーニング方法、並びに虚血心筋において血中Ｍ−ＬＤＨ濃度が短時間の間に急上昇する現象を利用した心筋虚血の検査方法が提示される。
【００３４】
本発明の第２の態様では、Ｍ−ＬＤＨを有効成分とし、心疾患に効果のあることを特徴とする薬剤組成物が提示される。本発明を利用した薬剤においては、その形態、Ｍ−ＬＤＨの濃度などは対象となる疾患に応じて調整すればよく、何ら本発明を限定するものではないが、濃度に関しては後に実施例で述べる通り、培養心筋細胞に対して２５ｎＭから２．５μＭの範囲内、好ましくは２５０ｎＭから２．５μＭの範囲内が１つの目安となるものである。また薬剤の投与の形態に関しては、虚血性心疾患が心臓手術中等に起こることに鑑み、例えば適当な緩衝液にＭ−ＬＤＨを溶解して注射薬等として用いることが考えられる。
【００３５】
本発明の第２の態様において、第３から第５の態様に述べられている通り、対象となる心疾患は虚血性心疾患、詳しくは、心筋の細胞死を伴うものが適しており、更に詳しくは、労作狭心症、安静狭心症、前壁心筋梗塞、側壁心筋梗塞、下壁心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、虚血による重症の不整脈、のうち少なくとも１種類から選ばれる疾患に対して有効であると考えられる。それぞれの疾患に対しては、Ｍ−ＬＤＨの濃度や投与形態を最適化することが望ましい。
【００３６】
本発明の第６の態様では、Ｍ−ＬＤＨを有効成分とし、心疾患に対して効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記効果が、心筋細胞の細胞死の抑制であることを特徴とする、薬剤組成物が提示される。心疾患の原因は様々であるが、本発明が提示する薬剤は特に、心筋細胞の細胞死を伴った心疾患に対して効果を持つことが提示される。
【００３７】
本発明の第６の態様における効果とは、第７から第９の態様に述べられている通り、詳しくは心筋に対する活性酸素の作用を除去するものであり、活性酸素の作用を更に詳しく述べれば、（ａ）心筋細胞内への過剰なカルシウムイオンの流入、（ｂ）心筋細胞膜における膜電位のオシレーション、（ｃ）心拍出量の低下、の３点である。本発明のＭ−ＬＤＨは上記作用のいずれも顕著に抑制したため、これらの症状を伴う疾患に本発明の提示する薬剤は有効であると考えられる。
【００３８】
本発明の第１０、第１１の態様では、Ｍ−ＬＤＨを有効成分とし、心疾患に効果のあることを特徴とする薬剤組成物であって、前記成分がＭ−ＬＤＨの全アミノ酸配列または一部が置換されたアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする薬剤組成物が提示される。本薬剤組成物におけるＭ−ＬＤＨは、その全アミノ酸配列を含むことが現時点では最も確実で望ましいが、嫌気解糖系酵素としてではなく心疾患治療薬として、そのアミノ酸の一部を置換したものもまた本発明の延長線上にあるものであり、更には心疾患治療薬として有効なアミノ酸配列をＭ−ＬＤＨの分解またはペプチド合成によって得たものもまた、本発明に含まれるべきものである。これらのペプチドの候補としては、Ｍ−ＬＤＨの酵素活性中心などが例として考えられる。
【００３９】
本発明の第１２から第１４の態様では、Ｍ−ＬＤＨの心疾患への効果を利用することを特徴とする、虚血性心疾患治療薬のスクリーニング方法が提示される。スクリーニングのターゲットとしては、心機能収縮改善効果または心筋細胞の生存維持の改善効果が挙げられ、好ましくは、Ｍ−ＬＤＨが刺激する心筋細胞の細胞内情報伝達系を見出し、これをＭ−ＬＤＨと同様に活性化する物質を探索するという方法が考えられる。現在は本発明者らによって、Ｍ−ＬＤＨの心疾患に対する効果が明らかになった段階であるが、その機構が明らかになれば、Ｍ−ＬＤＨと同様の機構によって心疾患の治療に効果を持つ物質をスクリーニングすることが可能になると考えられる。
【００４０】
本発明の第１５から第１８の態様では、Ｍ−ＬＤＨの血液中濃度を測定することを特徴とする、心筋虚血の検査方法が提示される。本発明者らによって、Ｍ−ＬＤＨは虚血初期において放出されその血液中濃度が急上昇し、その濃度は後に緩やかに下降することが明らかとなった。この上昇はおよそ虚血後３０分からはじまり、２４時間後以降に下降する。この濃度変化を測定する方法や、該方法に用いられるキットなどが提示され、例えば、患者さんから採取した血液に添加することで血中のＭ−ＬＤＨ濃度を可視化する試薬であって、Ｍ−ＬＤＨを特異的に認識する抗体などの分子を含むもの（発光、発色等）や、患者さんから採取した血液を滴下して、化学反応により血中のＭ−ＬＤＨ濃度を速やかに可視化する試験紙などの形態が考えられる。
【００４１】
本発明におけるＭ−ＬＤＨは、その由来を特に限定するものではないが、ヒト体内に直接作用させるという事情から、また、患者さんに対する心理的影響を考えても、ヒト由来のＭ−ＬＤＨであることが当面は望ましい。第１９の態様は、治療薬として提示された第２から第１１の態様のいずれかにおいて、Ｍ−ＬＤＨをヒト由来のＭ−ＬＤＨに限定したものである。
【実施例１】
【００４２】
以下に本発明の実施例を述べる。心筋由来の培養細胞を大量に培養し、これらの細胞に虚血再灌流刺激を行った。細胞培養上清２０リットルを乳酸アンモニウムで濃縮した後、ヘパリン及び陰イオン交換カラムで分離した。細胞生存活性は血清除去後、細胞に各分画の溶液を添加し、一定時間経過後の細胞数で測定した。また、タンパク質量を２８０ｎｍの吸光光度計で吸光測定した。心臓から放出された生存因子を精製するために、虚血再灌流にさらされた培養心筋細胞の上清をヘパリン硫酸カラムに適用した。図１Ａに示すように、ヘパリンアフィニティカラムに結合したタンパク質を、塩濃度上昇により放出させた。次にカラムから放出したタンパク質を虚血再灌流刺激後の細胞に与え、細胞数をモニターすることで生存活性を測定した。この結果、細胞死を阻害する生存活性が２つのピークから検出された。より強い生存活性を示したピークのタンパク質分画をイオン交換カラムにかけ、塩濃度上昇によりカラムから分離させた。分離したフラクションのうちピークＡ１分画が、生存活性とタンパク質溶出活性の両方で一致した。そこで、このタンパク質を電気泳動で分離した結果、３６ｋＤａの分子量があることがわかった（図１）。
【実施例２】
【００４３】
実施例１で得られた３６ｋＤａのタンパク質をトリプシンで消化し、カラムで精製した後、タンパク質フラグメントを飛行時間型質量分析計で解析し、そのデータをペプチドマスフィンガープリンティング検索で同定した。各フラグメントの質量数は、マウスＭ−ＬＤＨの計算上の質量と完全に一致した。更にＭ−ＬＤＨの計算上の分子量にある３６．３６７は電気泳動で分離した分子量とほぼ一致していた（表１）。また、Ｍ−ＬＤＨに対する抗体はこの３６ｋＤａタンパク質と強く反応した。この結果から、３６ｋＤａタンパク質はＭ−ＬＤＨであると結論づけた（図２）。また、ＮＣＢＩデータベースに登録されているヒトＬＤＨ（ＮＰ００５５５７：ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］）と本発明で得られた部分アミノ酸配列との比較を、配列１で示した。
【表１】
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【実施例３】
【００４４】
実施例１において、虚血再灌流中に培養心筋細胞から放出された成分が、Ｍ−ＬＤＨであることを確認するため、細胞の培養上清をＭ−ＬＤＨに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。Ｍ−ＬＤＨは虚血２時間後、再灌流２４時間で細胞外に顕著に放出されていた。しかし、Ｍ−ＬＤＨと同様に細胞質に存在しているグルコース３リン酸脱水素酵素やピルビン酸フルクトースキナーゼは、虚血再灌流によっても細胞外に放出されなかった。これらの結果は、Ｍ−ＬＤＨが虚血再灌流によって、特異的に細胞外に放出されることを示唆している。Ｍ−ＬＤＨは、血清除去によって誘導された細胞死を、濃度依存的に阻害した。
【００４５】
一方、心筋虚血再灌流中には、過酸化水素などの活性酸素が発生する。これらの活性酸素は心筋細胞に対する増悪因子となっている。そこで、Ｍ−ＬＤＨ存在／非存在下における、心筋細胞に対する過酸化水素の影響を検討した。その結果、Ｍ−ＬＤＨ非存在条件下では、４０μＭ過酸化水素の添加により、２０分後には心筋細胞が正常な棒状から球形へと変形した。このとき心筋細胞は、電気刺激に対する収縮能力を完全に消失していた。この球形に変形した心筋細胞は、刺激６０分後には細胞死のマーカーであるアネキシンとの反応性が観察された。しかしながら、Ｍ−ＬＤＨで前処理を行った細胞では、過酸化水素添加後における細胞の球形化が明らかに少なく、多くの細胞で電気刺激に対する収縮性が観察された。この結果は、Ｍ−ＬＤＨが酸化ストレスから心筋細胞を保護していることを示している（図３）。
【実施例４】
【００４６】
Ｍ‐ＬＤＨの生存活性メカニズムを検討するため、心筋細胞における細胞内カルシウム濃度の応答を検討した。心臓は収縮のため、細胞内のカルシウム濃度が定期的に上昇している。しかし、活性酸素などによる酸化ストレスは心筋細胞に過剰なカルシウム流入を引き起こし、これに応答して過剰な収縮がおこる。この過剰な収縮が、心臓に悪影響を及ぼしていると考えられている。活性酸素にさらされた培養胎児心筋細胞では、刺激後４分以内に急速な細胞内カルシウム濃度の上昇が認められ、その後４０分までの間緩やかなカルシウム濃度上昇が観察された。Ｍ−ＬＤＨで培養心筋細胞を前処理しておくと、処理後２０分までの間、過酸化水素による細胞内カルシウム濃度の上昇はほぼ抑制された（図４）。
【００４７】
次に、成人心筋細胞におけるＭ−ＬＤＨのカルシウム濃度応答について検討した。コントロール条件下では、０．５Ｈｚの電気刺激に応答して、一定周期のカルシウム濃度上昇が検出され、正常な収縮と弛緩を示した。４０μＭ過酸化水素による刺激により、２０分後に不規則なカルシウム濃度上昇が認められ、細胞の形は球形に変化した。処理後３０分で、典型的な細胞死の形態を示した。一方、Ｍ−ＬＤＨで前処理を行った細胞は、刺激後２０分においても規則正しいカルシウム濃度上昇を示し、同時に収縮弛緩が観察された。これらの結果は、Ｍ−ＬＤＨが成人の心筋細胞に対して、活性酸素による心筋細胞の機能障害を減少させる「細胞保護因子」であることを強く示唆している（図５）。
【実施例５】
【００４８】
細胞内カルシウム濃度の過剰な上昇は、Ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅを引き起こし、心臓瀕脈や不整脈の原因となる細胞膜のオシレーションに関与していると考えられている。そこで、Ｍ−ＬＤＨ存在／非存在下で、過酸化水素処理を行った心筋細胞の膜電位を観察した。Ｍ−ＬＤＨ非存在下において、過酸化水素は刺激後６分以内に心筋細胞の膜オシレーションを誘導した。オシレーションの頻度と強さはそれぞれ刺激後１０分まで増加した。一方Ｍ−ＬＤＨの存在は過酸化水素による膜オシレーションの発生を明らかに抑制した（図６）。過酸化水素は心筋細胞の膜電位の時間を延長させるが、Ｍ−ＬＤＨは膜電位の延長には影響を及ぼさなかった。Ｍ−ＬＤＨによる膜電位オシレーション抑制能力は、濃度に応じて若干減少する傾向にあった（図７）。
【００４９】
この現象におけるＭ−ＬＤＨの作用機序を検討するため、細胞内のチロシンリン酸化を観察した。Ｍ−ＬＤＨ添加後、５分以内に４５ｋＤａタンパク質のリン酸化が観察された。刺激後１５分の時点で、高分子の１５０ｋＤａ及び８０ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化が認められた。これらの結果は、Ｍ−ＬＤＨがチロシンリン酸化を介して細胞内シグナル伝達経路を活性化していることを示唆している。細胞生存因子としてこれまでに報告されているＥＲＫやＡｋｔは、少なくとも１５分の時点でのリン酸化は認められなかった（図８）。
【実施例６】
【００５０】
次に、単離した心臓を用いてＭ−ＬＤＨの影響を検討した。単離心臓では、過酸化水素は心拍数を変化させることなく心臓の拍出量を顕著に減少させた。Ｍ−ＬＤＨは、この心拍出量の減少を有意に抑制し、心臓の機能を回復させることが明らかになった。過酸化水素処理を行った心臓でも、Ｍ−ＬＤＨの存在下ではコントロールとほぼ同等の心拍出量が観察された（図９）。
【実施例７】
【００５１】
ヒトにおける心臓手術中に、人工心肺を用いることで虚血にさらされた患者さんの、血液中へのＭ−ＬＤＨ放出を観察した。血清中には、乳酸脱水素酵素（以下「ＬＤＨ」という）のトータルの活性は手術後３０分の時点で観察され、この酵素活性は７２時間持続した（図１０）。次にＬＤＨの２つのアイソフォームであるＭ−ＬＤＨと心筋型乳酸脱水素酵素（以下「Ｈ‐ＬＤＨ」という）のそれぞれの酵素活性を検討した。人工心肺を用いずに心臓手術を行った患者さんでは、Ｍ−ＬＤＨは手術後どの時点においてもほとんど検出されなかった。しかし、Ｈ‐ＬＤＨは手術後３０分の時点で酵素活性の上昇が観察され、この活性は７２時間持続した。一方、人工心肺を用いることによって虚血にさらされた心臓では、Ｍ−ＬＤＨが顕著な上昇を示し、虚血終了後、その活性は急速に低下した。反対にＨ‐ＬＤＨは、虚血によって血清中に放出され、虚血終了後も放出は持続した（図１１）。これらの結果は、Ｍ−ＬＤＨが虚血に特異的に応答し、心筋細胞に対して何らかの重要な役割を果たしていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、心臓虚血後に発生する不整脈をはじめとする心疾患に、心臓（心筋細胞）自身から放出されるＭ−ＬＤＨが虚血性心疾患の発生を抑制する効果があることが明らかとなった。また、Ｍ−ＬＤＨの血液中における酵素活性を測定することで、心筋虚血の把握も可能となった。更に、Ｍ−ＬＤＨの放出量が少ない患者さんにおいてＭ−ＬＤＨを補充投与することは、心筋虚血後の不整脈を抑制することを可能とする。加えて、Ｍ−ＬＤＨのアミノ酸配列の全部または一部を用い、不整脈を抑制することが可能となるかもしれない。また、Ｍ−ＬＤＨが刺激する細胞内情報伝達系を活性化する、高分子（タンパク質、多糖など）或いは低分子の物質は、不整脈をはじめとする心疾患の治療薬として期待されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】心筋培養細胞に虚血再灌流刺激を与え、その培養上清を回収しカラムクロマトグラフィーによって分離を行った。
【図２】心筋培養細胞に虚血再灌流刺激を与え、その培養上清に放出された骨格筋型乳酸脱水素酵素の量をウェスタンブロット法で定量した。
【図３】成人型心筋細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果、引き起こされた形態学的変化を示す。骨格筋型乳酸脱水素酵素は、成人型心筋細胞が酸化ストレスによって球状に変形するのを抑制した。
【図４】心筋培養細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果、引き起こされた過剰な細胞外カルシウムの流入を示す。骨格筋型乳酸脱水素酵素は、この過剰な細胞外カルシウムの流入を顕著に抑制した。
【図５】成人型心筋細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果、引き起こされる不規則なカルシウムの流入を示す。骨格筋型乳酸脱水素酵素は、この酸化ストレスを与えた後も規則正しいカルシウムの流入を維持した。
【図６】成人型心筋細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果、引き起こされる膜電位の異常なオシレーションを示す。骨格筋型脱水素酵素は酸化ストレスを与えた後に発生する膜電位の異常なオシレーションも顕著に抑制した。
【図７】成人型心筋細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果、引き起こされる膜電位の異常なオシレーションを測定した。ここでは骨格筋型乳酸脱水素酵素の濃度依存性を測定した。骨格筋型乳酸脱水素酵素の量は、一定量以上増加すると膜電位を増悪する効果を持つことも示す。
【図８】心筋培養細胞に骨格筋型乳酸脱水素酵素を投与した際の、細胞内の情報伝達経路を検討した。骨格筋型乳酸脱水素酵素を投与すると細胞内でチロシンリン酸化酵素が活性化され、分子量１５０ｋＤａと１１０ｋＤａのタンパク質及び低分子のタンパク質のチロシンリン酸化が引き起こされた。
【図９】マウスから単離した心臓に過酸化水素による酸化ストレスを与えた結果引き起こされる心臓の拍出量の変化を測定した。過酸化水素により心臓の拍出量は顕著に低下するが、骨格筋型乳酸脱水素酵素はこの拍出量の低下を抑制した。
【図１０】心臓手術中に人工心肺によって心筋虚血になった患者と人工心肺を用いない手術を受けた患者を比較した。人工心肺を用いた心筋虚血の患者ではすべて、トータルの乳酸脱水素酵素活性が上昇している。
【図１１】心臓手術中に人工心肺によって心筋虚血になった患者と、人工心肺を用いない手術の結果を比較した。この際、血液中に放出された乳酸脱水素酵素の各アイソザイムの酵素活性を測定している。骨格筋型乳酸脱水素酵素は心筋虚血になると急速に血液中に放出され、虚血終了後急速に減少している。一方、心筋方乳酸脱水素酵素は虚血時に増加しているが、虚血終了後もこの上昇は持続している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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