(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱酵素を高生産する形質転換酵母株の提供。【解決手段】耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換し、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊したサッカロミセスセレビシエ。この遺伝子は、ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗの１又は２以上であり、この破壊酵母は耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。【選択図】図２
2006280253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、下記のタンパク質遺伝子の１つ又は２以上が破壊された酵母変異株。
タンパク質遺伝子：ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗ
【請求項２】
サッカロミセスセルビシエである請求項１記載の酵母変異株。
【請求項３】
耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した、酵母変異株。
【請求項４】
下記タンパク質遺伝子の１つ又は２以上が破壊された請求項１又は２記載の酵母変異株。
タンパク質遺伝子：ＡＬＧ３、ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＲＭＤ６，ＴＯＳ１，ＶＴＳ１，ＹＩＬＯ３９Ｗ
【請求項５】
バチルスリチエニホルミス由来のアミラーゼ生産ＤＮＡをコードした請求項１又は２記載の酵母変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性酵素を高生産できる、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、酵母変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性酵素とは、タンパク質の３次構造（立体構造）が高温でも壊れにくく、酵素活性を保持している酵素をいう。工業的に使用される酵素は、物理的に、化学的に、高い安定性が要求され、特に耐熱性酵素が好んで使用される。これは、酵素のかかわる多くの反応は、高温で行えるほうが好ましいからである。つまり、５５℃〜９５℃の如き高温下での処理が可能になり、基質の溶解度が増加し、溶媒粘度が減少し、触媒作用が加速され、さらに食品や医薬品の製造過程においては細菌混入のリスクが低下するからである。高温でのこれらのメリットを生かすため、種々の耐熱性酵素が求められている。
【０００３】
好熱菌の生体成分である酵素、核酸、膜、リボソームなどが熱安定性である。これらの菌から得られる耐熱性酵素は、医学・工学など広い分野で利用されている。たとえば、遺伝子DNAを試験管内で大量に増やす方法として近年、開発されたＰＣＲ法（Ｐｏ１ｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）では、使用する酵素を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼからサーマス菌のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ酵素）に切りかえたことにより、加熱を繰り返すたびに新たに酵素を加える必要がなくなり、自動化が可能になって、非常に広範な分野で用いられるようになった。
【０００４】
好熱性細菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，Ｃａ１ｄｏａｃｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）とは、通常５５℃以上で生育できる細菌の総称で、温泉や火山、あるいは海底の熱水の噴出口付近などから採取される。代表的なものにバチルス（Ｂａｃｉｌ１ｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属がある。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の酵素は高い耐熱性を示すことから、現在産業的にしようされる酵素の主流を占めている。
【０００５】
その一つ、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼは、バイオテクノロジーの反応で使用される天然の酵素の中でもっとも熱安定性が高いもののひとつであり、９０℃以上の温度で工業的にでんぷん加水分解を行うことも可能とされている（非特許文献１）。
【０００６】
これらの耐熱性酵素を産業上利用するためには多量に生産する手段が必要であり、好熱性菌を培養することが考えられる。しかしながら、これらの好熱細菌からの耐熱性酵素の取得には高温での微生物培養操作を要するため、さらには一般に好熱性菌の酵素生産速度が大きくないことなどから、工業的な酵素製造方法としては問題を有している。そこで常温程度の温度で生育でき、しかも高い酵素生産速度を示す宿主を用いた組換え体での生産が望まれる。
【０００７】
組換えＤＮＡ技術による酵素生産の宿主としては、一般にサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が広く用いられており、１９７８年以来これに内在するプラスミドやＤＮＡ複製開始点（ａｒｓ）や、誘導的あるいは恒常的高発現プロモーターなどを用いたベクターが開発されている。これにより酵母菌は、宿主にとって本質的に異種のタンパク質を遺伝子操作により、細胞培養培地中に分離する有用なタンパク質生産物として得ることができる（特許文献１）。
【０００８】
酵母の宿主−ベクター系は、酵母が真核生物であることにより、動物や植物の遺伝子の発現が大腸菌や枯草菌のような原核生物よりも効率がよい可能性がある。また、原核生物のように発熱性の毒素を持たないという利点もある。分泌に際してタンパク質をグリコシル化する能力もある。そして、古くから発酵工業に使われており、安全性の高いことが認められている。これまでにインターフェロン（αおよびγ）、B型肝炎ワクチン、キモシンなどのタンパク質の生産にも用いられている。また、遺伝子産物の生産量を上げるために、生産されたタンパク質を細胞外に分泌する分泌ベクターも開発され、ヒト・インスリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子やインターロイキン２などが分泌生産されるようになった。
【０００９】
しかしながら、酵母に限らず、組換え体による異種タンパク質生産では必ずしも異種タンパク質の高生産が実現されているわけではない。例えば、同種の宿主−ベクター系を用いても、生産されるタンパク質量は大きく異なり（非特許文献２）、組換えタンパク質は宿主内で発現抑制を受けていると考えられる。
【００１０】
バチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来耐熱性アミラーゼと麹菌由来α−アミラーゼはそれらのｃＤＮＡが共にクローニングされている。これらをそれぞれ同じベクターに導入し酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させてアミラーゼ生産量を比較すると、酵母での耐熱性アミラーゼの生産量が非常に小さい（図１）。
【００１１】
その原因は異種たんぱく質の発現においては、異種細胞中での構造形成の困難な場合が多く、構造形成が不完全なこれらのタンパク質は宿主内で分解されることが知られており（非特許文献３）、高生産の妨げとなっていると考えられる。また、タンパク質の構造異常を管理している品質管理機構の働きにより、異種タンパク質の生産が抑制されている可能性があるが、この機構の詳細はほとんどわかっていない。従って、常温で効率よく耐熱性タンパク質を生産する技術が課題となっている。
【特許文献１】特開平６−１８１７７９号公報
【非特許文献１】Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｊｏｙｅｔ，ｅｔ  ａｌ，“Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ａｌｐｈａ‐Ａｍｙｌａｓｅ”ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ１０  ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９９２
【非特許文献２】Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，“Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ”，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｌ．Ｒｅｖ．２４，４５‐６６（２０００）
【非特許文献３】Ｈａｍｍｎｄ，Ｃ．ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．，“Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｅｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７，５２３‐５２９（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、耐熱性酵素を高生産できる、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、酵母変異株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、酵母における耐熱性酵素の分泌について、品質管理機構を調査するために、４７９２株の遺伝子破壊株に耐熱酵素の遺伝子を形質転換し、分泌活性を測定した。意外なことに、ある特定の遺伝子破壊株が、天然の酵母に比較して分泌活性が高かったことを見出し、この発見に基づいて本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、下記のタンパク質遺伝子の１つ又は２以上が破壊された、酵母、特にサッカロミセスセレビシエ、に関する。このタンパク質遺伝子とは、ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗの群れからなる遺伝子の１又は２以上、である。この破壊株は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００１５】
なかでも、ＶＴＳ１，ＡＬＧ８，ＤＩＥ２，ＥＣＭ３９，ＩＸＲ１，ＹＩＬＯ３９Ｗ，ＡＬＧ９，ＡＬＧ５，ＨＦＭ１，ＲＨＫ１及びＡＬＧ６よりなるタンパク質遺伝子群の中の少なくとも１種が破壊された酵母は、活性が高い特徴を有する。
【００１６】
また、本発明は、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、小胞体におけるタンパク質Ｎ結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した、酵母、に関する。この破壊酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。この遺伝子を破壊した酵母に使用できる酵母としては、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母も使用できる。サッカロミセスセレビシエ以外の酵母としてはシゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）がある。
【００１７】
サッカロミセスセレビシエなどの酵母には、約６０００個の遺伝子がある。そのうち生存にとって必須な遺伝子約１２００個を除いた４７９２個の遺伝子を１つ宛破壊した、４７９２種類の遺伝子破壊株（４７９２  ｙｅａｓｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎｓ）が販売されている。
【００１８】
バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼの変異体Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖは、熱安定性の高い耐熱性酵素として知られており、本明細書では耐熱性酵素の例としてこれを使用する場合を例として説明する。このα−アミラーゼの遺伝子ＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９ＶをベクターＰ３１６ＴＤＨｐＡＮに組換えた組換え体ｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを図２Ａに示す。
【００１９】
この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株を培養し、アミラーゼ活性を検出することにより、α−アミラーゼの変異体Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖの発現を確認した。この確認工程を図２Ｂに示す。
【００２０】
４７９２個の各遺伝子を破壊した、４７９２株のサッカロミセスセレビシエに、酵素遺伝子発現ベクターｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを、図３Ａに示す方法で、形質転換した。
【００２１】
図３Ｂに示す方法で、アミラーゼ活性を測定することにより、アミラーゼ発現量を測定した。図４は、４７９２株全部の測定結果を図示するものであり、９６穴ミクロタイターウェルが５４枚示されている。その１穴が１株の試験に対応している。
【００２２】
このうち、アミラーゼ発現量が親株よりも高いものを図５に示す。図５には、形質転換破壊株を、破壊遺伝子名で示されている。アミラーゼ発現量は、親株の発現量を＋としたときの相対的な発現量＋＋、＋＋＋で示される。
【００２３】
図５に示されたように、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗの群れからなる遺伝子の１又は２以上のタンパク質遺伝子の１又は２以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００２４】
なかでも、ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＲＭＤ６，ＴＯＳ１，ＶＴＳ１，及びＹＩＬＯ３９Ｗの群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質遺伝子を破壊されたものは、著しく高い活性を有することが理解される。
【００２５】
図６は、小胞体でのＮ結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセスにおけるオリゴ糖の伸長・転移、および、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のこれらの反応にかかわる酵素をコードしている遺伝子を示している。
【００２６】
図５の高生産の株の破壊遺伝子のうち、ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＣＷＨ４１，ＯＳＴ５の１０個は、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子であり、この１０個のうち８個のＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＹＩＬ０３９Ｗは、著しく高生産（＋＋＋）である。このような結果は、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母でも、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した株は、耐熱性酵素を高生産する。
【００２７】
すなわち、本発明においては、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母としては、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）等が使用できる。
【発明の効果】
【００２８】
図５に示されたように、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗの群れからなる遺伝子の１又は２以上のタンパク質遺伝子の１又は２以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００２９】
また、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子破壊酵母に、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００３０】
本発明による酵母変異株は、種々の耐熱性酵素を生産することが可能であるが、とりわけ、耐熱性アミラーゼを効率よく生産し得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
【実施例】
【００３２】
組換え体ｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖの構築
図２Ａに示すように、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼＡｍｙＬ  Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを発現させるための、組換え体ｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを構築した。
【００３３】
ＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖ  ｃＤＮＡ断片は、両端にＡｓｃＩサイトとＮｏｔＩサイトを有し、ＰＣＲにより製造される。
【００３４】
ＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖ  ｃＤＮＡ断片は、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩにより消化され、同様に消化されたベクターｐ３１６ＴＤＨ３ｐＡＮにクローン化される。
ＡｍｙＬＨ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖの発現
この組換え体を使用して形質転換した、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株を培養し、アミラーゼ活性を検出することにより、α−アミラーゼの変異体Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖの発現を確認した（図２Ｂ参照）。
形質転換
サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）には、約６０００個の遺伝子がある。そのうち生存にとって必須な遺伝子約１２００個を除いた４７９２個の遺伝子を破壊した、４７９２株の遺伝子破壊株（４７９２  ｙｅａｓｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎｓ）が販売されている。
【００３５】
図３Ａに示すように、バチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ発現ベクターｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを４７９２破壊株に形質転換した。
【００３６】
具体的には、遺伝子破壊株を２５μＬの培地を分注した９６穴ミクロタイターウェルで２８℃、２４時間静置培養した。培養液に発現ベクターを含む２５μＬの遺伝子導入液と混合し、４２℃で２時間処理をした。これを選択培地にまき４８から７２時間培養して形質転換体を得た。
【００３７】
アミラーゼ活性試験
図３Ｂは、アミラーゼ活性試験を図示している。
【００３８】
得られた形質転換体を、２８℃、ｐＨ６．０で、ウラシルを含まない合成培地で培養し、培養液を１％デンプンを含む選択培地（ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃、２４時間静置培養後、ヨウ素デンプン反応により生じたハロによりアミラーゼ活性を検出した。
【００３９】
アミラーゼ活性試験結果
図４は、４７９２株の酵母破壊株のバチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ活性試験を示している。図４には、９６穴ミクロタイターウェルが５４枚示されている。その１穴が１株のアミラーゼ活性試験に対応している。
【００４０】
高分泌生産株
このアミラーゼ活性試験の結果、バチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼを高分泌生産する、４５の破壊株をえた。破壊遺伝子名と、それぞれの破壊株と親株のアミラーゼ活性試験の結果を図５に示す。
【００４１】
図５に示されたように、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、ＡＤＥ６，ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＡＳＥ１，ＢＯＰ１，ＣＡＰ１，ＣＬＢ４，ＣＳＮ９，ＣＷＨ４１，ＦＬＯ１，ＧＤＳ１，ＧＰＡ２，ＨＡＰ２，ＨＦＭ１，ＨＵＢ１，ＩＶＹ１，ＩＸＲ１，ＫＥＸ１，ＭＥＴ１２，ＯＳＴ５，ＰＭＰ３，ＲＭＤ６，ＲＶＳ１６７，ＳＥＴ７，ＳＮＴ３０９，ＳＲＦ６，ＳＹＣ１，ＴＯＳ１，ＴＲＭ１，ＵＢＲ２，ＶＩＫ１，ＶＴＳ１，ＹＢＬ０８１Ｗ，ＹＧＬ２４２Ｃ，ＹＧＲ０４２Ｗ，ＹＧＲ０５４Ｗ，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＹＪＬ００７Ｃ，ＹＬＲ２３２Ｗ，ＹＬＲ４０７Ｗの群れからなる遺伝子の１又は２以上のタンパク質遺伝子の１又は２以上を破壊した、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００４２】
これらの遺伝子のうち、ＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＹＩＬ０３９Ｗ，ＣＷＨ４１，ＯＳＴ５の１０個は、小胞体におけるタンパク質Ｎ結合型糖鎖付加に関わる遺伝子であり（図６、表１、参照）、この１０個のうち８個のＡＬＧ３，ＡＬＧ５，ＡＬＧ６，ＡＬＧ８，ＡＬＧ９，ＡＬＧ１０，ＡＬＧ１２，ＹＩＬ０３９Ｗは、著しく高生産（＋＋＋）である。このような結果から、サッカロミセスセレビシエ以外の酵母でも、小胞体におけるタンパク質N結合型糖鎖付加に関わる遺伝子を破壊した株は、耐熱性酵素を高生産することが期待できる。
【００４３】
表１は、ＡｍｙＬ高活性の破壊株の破壊遺伝子のタンパク質の一般名、系統的名称、その分子機能、生物学的作用、及び、その細胞内の局在を示す。
【００４４】
また、表１に示されるように、耐熱性酵素をコードするＤＮＡを形質転換した、小胞体Ｎ型糖鎖付加関連タンパク質の遺伝子を破壊した酵母は、耐熱酵素を特に強力に高分泌生産する。
【００４５】
【表１】
2006280253.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はＴＤＨ３プロモーター下流にそれぞれ挿入した麹菌由来α−アミラーゼ遺伝子ＴＡＡとバチルスィチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来耐熱性α−アミラーゼ遺伝子ＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを持つ発現ベクターをサッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に軽質転換した組換え酵母のアミラーゼ発現を示している。ヨウ素デンプン反応を起こしていない白い部分（ハロ）がアミラーゼ活性の大きさを示している。
【図２】図２Ａは、バチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖの遺伝子をベクターｐ３１６ＴＤＨ３ｐＡＮに組換えた組換え体ｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを図示している。また、図２Ｂはｐ３１６ＴＤＨＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖによって形質転換された、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３における、ＡｍｙＬＨ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖにコードされるアミラーゼの発現を示している。
【図３】図３Ａは、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）４７９２破壊株に酵素遺伝子を形質転換すること（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を図示している。
【００４７】
図３Ｂは、アミラーゼ活性検出試験を図示している。
【図４】図４は、４７９２株のサッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）破壊株のバチルスリチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ活性試験。
【図５】図５はスクリーニングで得た耐熱性酵素ＡｍｙＬ‐Ｈ１３３Ｉ−Ａ２０９Ｖを高分泌生産できる遺伝子破壊株のアミラーゼ活性試験の結果を示している。
【図６】図６は、小胞体（ＥＲ）でのＮ結合型糖鎖付加タンパク質のグリコシル化プロセスにおけるオリゴ糖の伸長・転移、および、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のこれらの反応にかかわる酵素をコードしている遺伝子を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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