(57)【要約】【課題】血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる血管平滑筋細胞の増殖抑制剤、特に血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、血管内皮細胞の増殖阻害作用がない又はその作用が弱い、血管平滑筋細胞の増殖抑制剤の提供【解決手段】Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。【効果】血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項２】
ポリマーの数平均分子量が２〜１０００である請求項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
有効成分が数平均分子量２〜１０００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項４】
有効成分が数平均分子量６〜５００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項５】
有効成分が数平均分子量１０〜２００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項６】
有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．１〜３である請求項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項７】
有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．２５〜３である請求項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項８】
有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、１〜３である請求項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とし血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は心筋梗塞や脳梗塞の基礎病変であるが、この病変は動脈中膜の血管平滑筋細胞が内膜へと遊走し活発に増殖することで形成されるので、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することが、その防御及び予防に有効であることが知られている。血管平滑筋細胞の増殖阻害により動脈硬化を有効に抑制する物質について多くの研究者が研究をおこなっている（例えば、特許文献１）。しかし、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する物質の多くが内皮細胞の増殖を強く抑制し、動脈瘤の原因箇所となる障害を受けた内皮細胞の修復が遅れることにより、結果として動脈瘤の形成を促すことになり、未だに有用な動脈硬化を抑制するものは見出されていない。
【特許文献１】特開平７−１１２９３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明は、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することができる血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種が、血管平滑筋細胞の増殖を抑制すること、さらに前記硫酸エステルが内皮細胞の増殖を阻害しないか又は阻害しても弱いことを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は下記の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に係るものである。
項１．Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項２．ポリマーの数平均分子量が２〜１０００である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項３．有効成分が数平均分子量２〜１０００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項４．有効成分が数平均分子量６〜５００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項５．有効成分が数平均分子量１０〜２００のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー、これらの硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項６．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．１〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項７．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、０．２５〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
項８．有効成分がＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が、１〜３である項１〜５のいずれかに記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【０００６】
本発明において、有効成分はＮ−アセチルノイラミン酸（以下、NeuAcと表記することがある）、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー（以下、polyNeuAcと表記することがある）、これらの硫酸エステル（上記２種のアルファベット表記の最後に「-S」を付して表記することがある）及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である。
【０００７】
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーは下記式(I)で表されるポリマーを包含する。
【０００８】
【化１】
2006265210.tif 000002
【０００９】
〔式中、ｎは特に制限されないが、通常２〜１０００の整数、好ましくは６〜５００の整数、より好ましくは１０〜２００の整数を示す。〕
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーはｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、ｎの値が異なる他の化合物との混合物（例えばコロミン酸）であってもよい。コロミン酸は公知物質であり、特許第2620795号公報、アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry） 37, 2105-2110 (1973)などに記載の方法により製造できる。
【００１０】
また、本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸の硫酸エステル（NeuAc-S）はＮ−アセチルノイラミン酸の２，４，７，８及び９位にある少なくとも１種の水酸基が硫酸エステル化したものを包含する。そして、硫酸エステル化の程度は後述のポリマーの硫酸エステルの説明における硫酸エステル化の程度に準ずる。
【００１１】
また、本発明においてＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステル（polyNeuAc-S）は下記式(II)で表されるポリマーを包含する。
【００１２】
【化２】
2006265210.tif 000003
【００１３】
〔式中、ｎは前記のとおり。Ｒは同一又は異なって水素原子又はＳＯ3Ｈ基を示す。但し、Ｒで表されるＳＯ3Ｈ基の数はＮ−アセチルノイラミン酸残基１モルに対し通常０．１〜３個、好ましくは０．２５〜３個、より好ましくは１〜３個である。〕
polyNeuAc-Sは、血管内皮細胞の増殖抑制作用が弱い又はその作用がない。本発明者らは、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数が増加するにともなって、その作用が弱まる傾向があることを示唆する実験結果を得ている。このため、血管内皮細胞の増殖抑制が問題となる場合には、polyNeuAc-SにおけるＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数は０．１〜３、好ましくは０．２５〜３、より好ましくは１〜３である。
【００１４】
polyNeuAc-Sはｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、ｎの値が異なる他の化合物との混合物（例えば硫酸化コロミン酸）であってもよい。また、polyNeuAc-Sの分子量は、プルラン、シアル酸オリゴマーなどを標準物質とし、ＨＰＬＣ等により測定することができる。
【００１５】
上述のNeuAc-S及びpolyNeuAc-Sは公知物質であり、例えば特許第３０６５９０６号に記載の方法で製造できる。例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー１重量部に対し、溶媒の存在下又は不存在下に触媒０．５〜２００重量部、硫酸化剤０．２〜３０重量部を反応させる。反応時間は０．２〜４８時間程度であり、反応温度は−４０〜９０℃程度である。触媒としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ、硫酸化剤としては、クロロスルホン酸、ピペリジン硫酸、サルファトリオキシド・トリメチルアミンなどが挙げられる。触媒としてピリジンなどを過剰量使用する場合には、溶媒を使用する必要はない。溶媒は、必ずしも使用する必要はないが、使用する場合には、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなどが挙げられる。硫酸化反応の終了後は、公知の方法、例えば濃縮、ゲル濾過、イオン交換などの各種クロマトグラフィー、再沈殿、透析などの後処理によってpolyNeuAc-Sを分離できる。
【００１６】
また、本発明において上述のNeuAc、NeuAc-S、polyNeuAc及びpolyNeuAc-Sの薬学的に許容される塩は、これらのナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩などを包含する。なお、硫酸エステルの薬学的に許容される塩の場合、硫酸基に塩が導入される。このため、薬学的に許容される塩において、上述のＮ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基数は、塩が導入されていない硫酸基及び前記塩が導入された硫酸基の総数に読み替えるものとする。
【００１７】
これらの塩は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩で中和することで製造することもでき、また、いったん遊離の酸として得た後、それを用いて塩の形態としてもよい。更に、イオン交換樹脂、イオン交換ゲル、イオン交換セルロースカラムを用いて塩の形態にしても良い。
【００１８】
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を注射剤として調製する場合、添加剤としては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などが挙げられ、これらを常法、例えば適当量配合することにより、注射剤用製剤とすることができる。該製剤は、静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内に投与される。また、本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤を経口剤として調製する場合の添加剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤）としては、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤などが挙げられ、これらを常法、例えば造粒、打錠、混合などの方法により、経口剤とすることができる。また、本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤をパップ剤、坐剤として調製する場合の添加剤としては、基剤、界面活性剤などが挙げられ、これらを常法により坐剤とすることができる。さらに、添加剤としては、上記に例示したものだけでなく、各々の製剤を調製する際に通常用いられている添加剤も適当量使用することができる。
【００１９】
上記の各種製剤中に配合される有効成分の量は、投与すべき患者の年齢、性別、体重、症状などにより変動するが、一般的には、ヒト成人に対する１投与単位当たり、経口剤では１〜１００ｍｇ程度、注射剤では０．１〜２０ｍｇ程度、坐剤では１〜５０ｍｇ程度であるのが好ましく、ヒト成人１日当たりの投与量としては、剤型によって異なるが、１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜２００ｍｇ程度である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤は、血管平滑筋細胞の増殖を有意に抑制する。また、硫酸エステルを有効成分とすることによって、内皮細胞の増殖を阻害しないか又は阻害しても弱い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を参考例及び試験例等を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００２２】
参考例１：polyNeuAc-S（硫酸化コロミン酸）の調製
ジメチルホルムアミド２０ｍｌにpolyNeuAc（コロミン酸）９０ｍｇ、サルファトリオキシド・ピリジン錯体４７７ｍｇ及びジメチルアミノピリジン３７ｍｇを加え、３０℃にて２４時間撹拌した。反応後、氷冷し、反応液を１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍｌに滴下し、中和した。中和後、濾過により固形物を分離し、透析チューブ（VISKASE SALES CORP.、孔の直径：24オングストローム）を用いて、透析を行った。透析後、ナトリウムイオン型のイオン交換樹脂（アンバーライトIR-120B、オルガノ株式会社製）カラムに通した。カラム流出液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥により、１２６ｍｇのpolyNeuAc-Sを得た。得られたpolyNeuAc-Sの平均分子量は22,000ダルトンで、硫酸基含量は１３．４4%（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ3Ｈ基の数は２．５）であった。
【００２３】
試験例１：培養血管平滑筋細胞を用いたin vitroの実験
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を、ウシ大動脈からArteriosclerosis, 91, 207, 1991に記載の方法により単離し、１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ製薬社製）中にて３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下で培養した。４〜１０回継代した培養細胞を２％トリプシンと０．０２％エチレンジアミン−テトラ酢酸２ナトリウムの混合物で細胞をIWAKI培養ペトリ皿から取り出し、１００×ｇ、４℃で１０分遠心分離して集めた。このウシ大動脈血管平滑筋細胞を２４穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間上記と同じ条件で培養後、新鮮な同培地中でpolyNeuAc（平均分子量17,000）または参考例１で得られたのpolyNeuAc-S（０，２５，５０，１００ｍｇ／ｍｌ）存在下でさらに0〜72時間培養し、培養終了時の細胞数を粒子計測器（CDA-500）で測定した。培養４８時間後の細胞数を表１に示し、培養０，２４，４８，７２時間後の細胞数を表２に示した。
データはそれぞれ４回の試験結果の平均値±標準誤差で表し、結果についてはＡＮＯＶＡ検定による統計処理を行った。
【００２４】
【表１】
2006265210.tif 000004
【００２５】
血管平滑筋細胞数は、２５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのpolyNeuAc（平均分子量17,000）または参考例１で得られたpolyNeuAc-Sの添加後４８時間の培養で無添加群（０μｇ／ｍｌ）に比較して有意に減少し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用がみられた。また、その阻害作用は試料容量依存的であった。また、５０μｇ／ｍｌの阻害率は、polyNeuAcで約３５％、polyNeuAc-Sで約４４%であった。
【００２６】
【表２】
2006265210.tif 000005
【００２７】
５０μｇ／ｍｌのpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-Sの添加後２４時間から７２時間の培養により、血管平滑筋細胞数は、無添加群に比較して有意に減少し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用がみられた。また、その阻害作用は培養時間依存的であった。また、４８時間後の阻害率は、polyNeuAcまたはpolyNeuAc-S共に約３２%であった。
【００２８】
試験例２：血管平滑筋細胞における[3H]ラベルしたチミジンの取込み量の測定
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を６穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０%牛胎児血清含有ダルベッコ返法イーグル培地中で２４時間培養後、新鮮な同培地中でpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-S（０，２５，５０，１００ｍｇ／ｍｌ）存在下で更に７２時培養し、培養終了前６時間にＤＮＡの合成を調べるために２０ｋＢｑ／ｍｌの[3H]ラベルしたチミジン（NEN Life Science Products社製）を添加した。培養終了後、培地を捨て、細胞をカルシウム及びマグネシウム及び含有しないリン酸緩衝液で洗った。細胞を新鮮な同緩衝液存在下ゴムベラ（ラバーポリスマン）でかきとって回収後、超音波処理によって細胞を破砕した。この細胞破砕物について５%トリクロロ酢酸にて沈殿を形成させ、その不溶性画分への放射活性の取込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。別に細胞破砕液中のDNA量を蛍光分析法で測定した。結果を表３に示した。
【００２９】
【表３】
2006265210.tif 000006
【００３０】
血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成は、７２時間の培養で無添加群に比べて２５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのpolyNeuAcまたはpolyNeuAc-Sにおいて有意な抑制が認められ、細胞の増殖阻害作用は、平滑筋細胞のＤＮＡ合成阻害によるものであることが示唆された。
【００３１】
試験例３：培養血管内皮細胞を用いたin vitroの実験
ウシ大動脈血管内皮細胞を、In Vitro,19, 394, 1983に記載の方法により単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ製薬社製）中にて３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下で培養した。４〜１０回継代した培養細胞を２％トリプシンと０．０２％エチレンジアミン−テトラ酢酸２ナトリウムの混合物で細胞をＩＷＡＫＩ培養ペトリ皿から取り出し、１００×ｇ、４℃で１０分遠心分離して集めた。この血管内皮細胞を２４穴培養プレートに5,000 cells/cm2の密度で播種し、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間上記と同じ条件で培養後、新鮮な同培地中で参考例１で得られたpolyNeuAc-S（０，５０μｇ／ｍｌ）存在下でさらに４８時間培養し、培養終了時の細胞数を粒子計測器（CDA-500）で測定した。結果を表４に示した。
データはそれぞれ４回の試験結果の平均値±標準誤差で表し、結果についてはＡＮＯＶＡ検定による統計処理を行った。
【００３２】
【表４】
2006265210.tif 000007
【００３３】
polyNeuAc-Sは内皮細胞の増殖を抑制せず、むしろ増加傾向であった。平滑筋細胞の増殖抑制効果は、動脈硬化のリスク低減として好ましく、更には内皮筋細胞の増殖に影響を与えない、より好ましくは内皮筋細胞の増殖を促進する物質であり、polyNeuAc-Sはその物質に該当する。
【００３４】
試験例４：血管内皮細胞における[3H]ラベルしたチミジンの取込み量の測定
ウシ大動脈血管平滑筋細胞に代えてウシ大動脈血管内皮細胞を使用し、被験試料を参考例１で得られたpolyNeuAc-Sのみとし、被検試料濃度を５０μｇ／ｍｌとし、培養時間を４８時間とした以外は試験例２と同様にしてチミジン取り込み量を測定した。結果を表５に示した。
【００３５】
【表５】
2006265210.tif 000008
【００３６】
血管内皮細胞のDNA合成は、無添加群に比べて５０μｇ／ｍｌのpolyNeuAc-Sにおいて抑制が認められず増加傾向であり、試験例３と同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤は、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化の基礎病変に対して有用であると考えられる。