(57)【要約】【課題】  優れた抗真菌活性を有する新規化合物、その製造方法、及び新規の抗真菌剤を提供する。【解決手段】  下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩、これらを有効成分として含有する医薬組成物、及び、ペニシリウム属に属し、式（Ｉ）で表される化合物を産生可能な菌を培養する工程、及び、前記化合物を培養物から採取する工程を含む、式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。【化１】2006182672.tif 000005【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１】
2006182672.tif 000004
【請求項２】
ペニシリウム属に属し、請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能な菌を培養する工程、及び、前記化合物を培養物から採取する工程を含む、式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
【請求項３】
前記ペニシリウム属に属し、請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能な菌が、ペニシリウム・インプリケイタムに属する菌であることを特徴とする請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
抗真菌剤である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ペニシリウム・インプリケイタムNCC00646株（ＣＧＭＣＣ No. 1079）又は請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能なその変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌活性を有する新規物質、その製造方法、及びそれを用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９５０年代以降の抗生物質に関する研究開発の急速な進歩およびその広範な普及により、各種感染性疾患に対する多くの治療薬が開発されてきた。その一方で、近年、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス等の真菌による深在性真菌症の増加と重篤化が見られるようになった。これには、白血病、悪性リンパ腫、ＨＩＶ感染等による免疫不全、抗がん剤の投与による免疫能の低下、或いは抗生物質の大量使用による菌交代現象等の問題が関与していると考えられる。
【０００３】
現在、深在性真菌症の治療には、ポリエンマクロライド系薬剤、アゾール系薬剤、フルシトシン等が使用されている。例えば、ポリエンマクロライド系薬剤のひとつであるアムホテリシンＢは、抗真菌活性の強さから重篤な疾患の治療に有効であるが、腎毒性等の副作用を生じることがあり、安全面での問題が指摘されている（非特許文献１）。フルシトシンについても、安全性の低さや耐性菌の存在が問題となっている。
【０００４】
一方、アゾール系薬剤は、一般に安全域が広く、副作用は比較的少ないと言われているが、抗菌域が狭く、作用が静菌的なため重篤な疾患に対する有効性が低い。また、耐性菌の増加も指摘されている（非特許文献２）。
また、近年では、ミカファンギンやカスポファンギン等のキャンディン系薬剤（非特許文献３）が開発され、深在性真菌症の治療に用いられている。
【非特許文献１】Ｇａｌｌｉｓら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２巻、３０９〜３２９頁、１９９０年
【非特許文献２】Ｒｅｘら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９巻、１〜８頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｄｅｎｎｉｎｇ、Ｌａｎｃｅｔ ３６２巻、９３３０号、１１４２〜１１５１頁、２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況で、疾病要因の変化、安全性の確保、耐性菌の増加に対応するためには、新しい抗真菌剤の開発が要望されている。
本発明の目的は、抗真菌活性を有する新規化合物、その製造方法、及び新規の抗真菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが新規抗真菌剤となりうる化合物を微生物産物中より探索した結果、ペニシリウム・インプリケイタム（Penicillium implicatum）に属する糸状菌の培養物中に抗真菌活性を有する化合物の存在を認めた。次いで、この培養物中の活性物質を同定するため、培養物を精製し、その構造を解析した結果、下記式（Ｉ）で表される新規化合物が抗真菌活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、抗真菌剤成分として有用な式（Ｉ）で表される新規化合物を提供する。また、本発明は、ペニシリウム属の糸状菌を培養し、その培養物から式（Ｉ）で表される化合物を採取することによって、式（Ｉ）で表される化合物の製造方法を提供するものである。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．  下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１】
2006182672.tif 000002
２．  ペニシリウム属に属し、上記１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能な菌を培養する工程、及び、前記化合物を培養物から採取する工程を含む、式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
３．  前記ペニシリウム属に属し、上記１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能な菌が、ペニシリウム・インプリケイタムに属する菌であることを特徴とする上記２に記載の化合物の製造方法。
４．  上記１に記載の式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
５．  抗真菌剤である上記４に記載の医薬組成物。
６．  ペニシリウム・インプリケイタムNCC00646株（ＣＧＭＣＣ No. 1079）又は上記１に記載の式（Ｉ）で表される化合物を産生可能なその変異株。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、優れた抗真菌活性を有しており、真菌感染症の治療又は予防のための抗真菌剤等として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の前記式（Ｉ）で表される新規化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と略称する）は、下記の物理化学的性状を有する。
（１）色および性状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ４９Ｈ７９Ｎ７Ｏ１６
（３）マススペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）
実測値：ｍ／ｚ  １０２２．５６５８［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値：ｍ／ｚ  １０２２．５６６２［Ｃ４９Ｈ７９Ｎ７Ｏ１６＋Ｈ］＋
（４）比旋光度：［α]Ｄ＝−３６．２°（ｃ０．８，ＭｅＯＨ，２５℃）
（５）紫外線吸収スペクトル
λｍａｘ，ｎｍ（Ｅ１％１ｃｍ）：２２３（ｓｈ，１０８），２７６（１５），２８３（ｓｈ，１３）（ＭｅＯＨ）２４５（９２），２９１（１６）（０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ＋ＭｅＯＨ）
（６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）
νｍａｘ，ｃｍ−１：３３６０，２９２８，２８５５，１６２８，１５２０，１４５６，１２３２
【００１０】
（７）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）
δ（ｐｐｍ）：０．８５（３Ｈ，ｄ），０．８７（３Ｈ，ｔ），１．０４（３Ｈ，ｄ），１．２０（６Ｈ，ｄ），１．２５〜１．３５（１９Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｍ），１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０５（１Ｈ，ｍ），２．０８（１Ｈ，ｍ），２．２１（２Ｈ，ｔ），２．４１（１Ｈ，ｍ），２．５１（１Ｈ，ｍ），３．３７（１Ｈ，ｄｄ），３．７８（１Ｈ，ｄｄ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ），３．９１（１Ｈ，ｍ），３．９６（１Ｈ，ｄｄ），４．１４（１Ｈ，ｍ），４．１７（１Ｈ，ｄｄ），４．２１（１Ｈ，ｄｄ），４．２９（１Ｈ，ｄ），４．３０（１Ｈ，ｄ），４．３２（１Ｈ，ｄ），４．３８（１Ｈ，ｄｄ），４．５０（１Ｈ，ｄｄ），４．５４（１Ｈ，ｍ），４．５７（１Ｈ，ｄｄ），４．８３（１Ｈ，ｄ），４．９４（１Ｈ，ｄ），５．２２（１Ｈ，ｄ），６．７４（２Ｈ，ｄｄ），７．１３（２Ｈ，ｄｄ）
【００１１】
（８）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）
δ（ｐｐｍ）：１１．２，１１．７，１９．６（×２），２０．０，２７．０，２８．２，３０．３，３０．５，３０．５，３０．５，３０．６，３０．７，３０．８，３５．０，３５．７，３６．８，３７．７，３８．５，３９．０，５１．６，５２．９，５６．３，５６．８、５７．１，５８．５，６２．４，６８．３，６９．５，６９．７，７０．８，７１．２，７４．５，７５．５，７５．７，７６．９，１１６．１（×２），１２９．５（×２），１３３．０，１５８．４，１６９．９，１７２．５（×２），１７２．７，１７３．５，１７４．３，１７６．２
（９）溶解性：メタノール、クロロホルム、酢酸エチルおよびジメチルスルフォキシドに可溶、ヘキサン及び水に不溶である。
【００１２】
なお、化合物（Ｉ）と化学構造が類似する化合物として、エキノキャンディンＢ（Ｓａｎｄｏｚら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６巻、４１４７〜４１５０頁、１９７６年）及びムルンドキャンディン（Ｒｏｙら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４０巻、２７５〜２８９頁、１９８７年）が知られている。しかし、本発明の化合物（Ｉ）とこれらの化合物とは物理化学的性状が異なり、明確に区別される。
【００１３】
化合物（Ｉ）の「製薬学的に許容される塩」としては、製薬学的に許容される塩基との塩が挙げられる。塩基との塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属或いはカルシウム等のアルカリ土類金属等との塩が挙げられる。
【００１４】
上記の化合物（Ｉ）は、該化合物生産可能なペニシリウム属糸状菌を培養し、該培養物から該化合物を採取することによって製造することができる。化合物（Ｉ）を生産可能なペニシリウム属糸状菌としては、化合物（Ｉ）を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、一例として、ペニシリウム・インプリケイタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）に属する糸状菌であるペニシリウム・インプリケイタムＮＣＣ００６４６株（以下、単に「ＮＣＣ００６４６株」という。）が挙げられる。
【００１５】
ＮＣＣ００６４６株の菌学的性状は以下のとおりである。
化合物（Ｉ）の生産菌であるＮＣＣ００６４６株は、中国雲南省西双版納（Ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａ）で採集した土壌より分離された菌株である。
このＮＣＣ００６４６株を、ツァペック寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地にて、２６℃で培養すると、コロニーは青緑色から鈍緑色、ベルベット状、のちにわずかに縄状となり、密な菌糸層から形成される。可溶性色素は生成されない。裏面は茶色である。
また、分生子柄は基底菌糸より形成され、幅２〜２．５μｍ、長さは１００μｍ以下である。ペニシリは単輪生もしくはメトレ２本からなる複輪生、フィアライドは８〜１２本、輪生し、９〜１２×２〜２．５μｍである。分生子は、球形から亜球形、２．５〜３μｍ、わずかに粗面である。
【００１６】
以上の菌学的性状より、ＮＣＣ００６４６株は、ペニシリウム・インプリケイタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ）に属する糸状菌と同定されると考えられる。
なお、ＮＣＣ００６４６株は、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）に、２００３年１２月１８日、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１０７９として寄託されている。
【００１７】
また、本発明の化合物（Ｉ）の生産菌としては、ＮＣＣ００６４６株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性いずれでもよい）、形質接合体または遺伝子組換え体等の変異株を用いることもできる。ＮＣＣ００６４６株の突然変異株としては、自然界において生じた変異株であっても、人為的に変異させた変異株であってもよい。
【００１８】
化合物（Ｉ）の生産菌を培養するには、通常の微生物が利用し得る栄養源を含有する培地で培養することにより行うことができる。
栄養源としては、カビの培養に利用されている公知のものを使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、化合物（Ｉ）の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００１９】
化合物（Ｉ）の生産菌の培養は、好気的条件での培養法を用いるのが好ましく、静置培養、振とう培養、タンク培養等いずれで行ってもよいが、特に静置培養法が最も適している。培養温度及び培養時間は、化合物（Ｉ）の生産菌が生育可能で、化合物（Ｉ）の生産が行われる条件であれば特に限定されず、培地等によって適宜設定することができる。
前述のＮＣＣ００６４６株を用いる場合、培養温度は２５〜３０℃であることが好ましく、２６℃付近がより好ましい。また、培養時間は、通常２〜２１日間でその蓄積が最高に達する。培養物中の化合物（Ｉ）の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製することが望ましい。
【００２０】
微生物培養物からの化合物（Ｉ）の採取及び精製に当たっては、その性状を利用した通常の分離手段を用いて行うことができる。分離手段としては、例えば、例えば溶剤抽出法、吸着剤を用いた吸脱着法、各種樹脂を用いたクロマトグラフ法および沈殿法等が挙げられ、これらを適宜組み合わせてもよい。
具体的には、ＮＣＣ００６４６株の培養物から目的化合物を採取する場合、まず、培養物に６７％アセトン水溶液を加えて目的物質を抽出し、アセトン留去後酢酸エチルで抽出する。これをシリカゲル、ＬＨ−２０の各カラムにかけて順次精製をすすめ、最後にＨＰＬＣもしくはＴＬＣによる分画操作を行うことにより、化合物（Ｉ）を単離することができる。
【００２１】
本発明の化合物（Ｉ）又はその製薬学的に許容される塩は、抗真菌活性を有しており、これらのうち少なくともいずれかを有効成分として含有する医薬組成物は、ヒトを含む動物に医薬として投与することが有用である。具体的には真菌感染症の治療又は予防に効果があり、抗真菌剤として有用である。
化合物（Ｉ）又はその製薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、種々の投与形態あるいは使用形態に合わせて、必要に応じて担体等とともに常法に従い製剤化することができる。
経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤等が挙げられる。また非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。製剤化に際しては、界面活性剤、賦形剤、安定化剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解補助剤、等張剤、緩衝剤、着色料、着香料等の医薬用添加剤を適宜使用する。
【００２２】
担体としては製薬学上許容されるものを用いることができ、その種類及び組成は投与経路や投与方法によって適宜決定することができる。例えば、液状担体として水、アルコール、大豆油、ゴマ油等を用いることができる。固体担体としてマルトース、スクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、シクロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩等を使用できる。注射剤として製剤化する場合には、液状担体は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース等の糖類溶液を用いることができる。
【００２３】
本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を医薬組成物として投与する場合、その投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路により異なり、動物試験の結果など種々の状況を勘案して総投与量が一定量を越えない範囲で決定できる。具体的には、ヒトに経口投与する場合には成人一人当たり一日に１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、静脈投与の場合には同じく０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与することができる。
【００２４】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではなく、ここに示さなかった変法あるいは修飾手段の全てを包括する。
【実施例】
【００２５】
１．ＮＣＣ００６４６株の培養
ＮＣＣ００６４６株（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１０７９）を、麦芽エキス寒天斜面培地（ＭＥＡスラント培地）で５日間２４℃で培養した。そして、ＭＥＡスラント培地に０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０水溶液１０ｍｌを加えて胞子を懸濁し、懸濁液０．５ｍｌを新鮮なＭＥＡ平面培地に接種した。ＭＥＡ平面培地で５日間培養後、胞子を白金耳で集めて滅菌蒸留水に懸濁し、この懸濁液をふすま１５ｋｇに植菌して７日間培養した。なお、ふすま培養には２００×８０×１７ｃｍの培養容器（ステンレス鋼製）を用いた。
【００２６】
２．活性化合物の精製
上記１で得られた培養物の一部（２ｋｇ）に、６７％アセトン２Ｌを加えて抽出し、そのろ液を減圧下でアセトンを留去した後、１．５Ｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮したところ粗抽出物６．８ｇが得られた。粗抽出物をメタノール１００ｍｌに溶解し、２０ｇのシリカゲル（ワコーゲルＣ３００、和光純薬）を加えて減圧下乾燥した。シリカゲルに吸着させた粗抽出物をグラスフィルター上のシリカゲル３０ｇに重層し、クロロホルム：メタノール＝９９：１（１００ｍＬ）、クロロホルム：メタノール＝９７：３（５００ｍＬ）、クロロホルム：メタノール＝９０：１０（３００ｍＬ）の各溶媒で順次洗浄した後、クロロホルム：メタノール＝５０：５０（５００ｍＬ）で活性成分を溶出し、減圧下乾燥して４２６ｍｇの固形物を得た。
この固形物を少量のメタノールに溶解後、メタノールに懸濁して充填したセファデックスＬＨ−２０（直径５ｃｍ×９０ｃｍ、ファルマシア社）に重層し、メタノールで溶出した。溶出量６００〜６５０ｍｌの画分を減圧下乾燥し、７９ｍｇの固形物を得た。さらに得られた固形物を少量のメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（カラム：コスモシールＡＲＩＩ、内径２ｃｍ×２５ｃｍ、ナカライテスク）に注入してアセトニトリル：蒸留水＝４０：３０で溶出した。移動相の流速を１０ｍＬ／分に設定し、１３．５分に溶出される成分を集めて減圧下乾燥し、化合物（Ｉ）６．２ｍｇを得た。
【００２７】
３．細胞増殖阻害活性の試験
上記２で得られた化合物（Ｉ）の抗真菌活性を、液体希釈法により下記の菌株に対する最小発育阻止濃度として測定した。培地にはＹＮＢＰ（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％ ｇｌｕｃｏｓｅ、ＤＩＦＣＯ社製）を用い、２８℃で４８時間培養した。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2006182672.tif 000003
【００２９】
表１に示すように、本発明の化合物（Ｉ）は、優れた抗真菌活性を有していることがわかる。