(57)【要約】【課題】  内因性組織モルフォゲン、特に骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）および近縁の遺伝子の発現を調節し得る化合物をスクリーニングするための組成物および方法を提供すること。【解決手段】  １つ以上のＯＰ−１特異的、非コードヌクレオチド配列および適切なリポーター遺伝子を用いて、組織形態形成タンパク質、特にＯＰ−１、ＯＰ−１ホモログおよび近縁のタンパク質の発現を調節するそれらの能力について、化合物をスクリーニングするための方法および組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）の特異的上流非コード配列の単一の核酸フラグメントであって、ここで、該核酸フラグメントは、配列番号１のヌクレオチド３１７０〜３３１７、３０２０〜３３１７、２７９０〜３３１７、２５４８〜３３１７、２３００〜３３１７、１３００〜３３１７、２５４８〜２７９０、１５４９〜２７９０、もしくは、１〜２７９０を含み、ここで、単離された核酸は、該ＯＰ−１上流配列の核酸フラグメントの１つより多くを含まない、単一の核酸フラグメント；あるいは
ｂ）（ｉ）骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）の特異的上流非コード配列の核酸フラグメントであって、ここで、該核酸フラグメントは、配列番号２のヌクレオチド２１５０〜２２９６、２０００〜２２９６、１７８８〜２２９６、１５４９〜２２９６、８００〜２２９６、１〜２２９６、１５４９〜１７８８、８００〜１７８８、もしくは、１〜１７８８を含む、核酸フラグメント；または
（ｉｉ）核酸フラグメント（ａ）の変異体であって、該変異体は核酸フラグメント（ａ）と同一の機能を有し、そして、該変異体は核酸フラグメント（ａ）に対して相補的な核酸と、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、および０．１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、その後の０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中での５０℃での洗浄の条件下でハイブリダイズする、変異体；
と作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むベクターであって、ここで、該核酸フラグメントは、エストロゲン応用性の様式で、該レポーター遺伝子の発現を制御するように作動する、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
【０００２】
【数１】
2006025796.tif 000002
【０００３】
（発明の分野）
【０００４】
【数２】
2006025796.tif 000003
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
【０００６】
【数３】
2006025796.tif 000004
【０００７】
【数４】
2006025796.tif 000005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
【数５】
2006025796.tif 000006
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
項目１．天然に存在する条件下で、ＯＰ１に隣接して存在する少なくとも１つのＯＰ１特異的な非コード配列に作動性に連結したリポーター遺伝子を規定するＤＮＡ配列を含むベクターであって、上記非コード配列は、上記ベクター上の上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼす能力がある、ベクター。
項目２．上記非コード配列は、核酸結合分子により機能し、それによって、上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、項目１に記載のベクター。
項目３．上記非コード配列は、塩基３１７０〜３３１７（配列番号１）；塩基３０２０〜３３１７（配列番号１）；塩基２７９０〜３３１７（配列番号１）；塩基２５４８〜３３１７（配列番号１）；塩基２１５０〜２２９６（配列番号２）；塩基２０００〜２２９６（配列番号２）；塩基１７８８〜２２９６（配列番号２）；塩基１５４９〜２２９６（配列番号２）により規定されるＤＮＡ配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）からなる群より選択される、項目１に記載のベクター。
項目４．上記非コード配列は、塩基２３００〜３３１７（配列番号１）；塩基１３００〜３３１７（配列番号１）；塩基１〜３３１７（配列番号１）；塩基２５４８〜２７９０（配列番号１）；塩基１５４９〜２７９０（配列番号１）；塩基１〜２７９０（配列番号１）；塩基８００〜２２９６（配列番号２）；塩基１〜２２９６（配列番号２）；塩基１５４９〜１７８８（配列番号２）；塩基８００〜１７８８（配列番号２）；塩基１〜１７８８（配列番号２）により規定されるＤＮＡ配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の群より選択される、項目１に記載のベクター。
項目５．上記非コード配列は、配列番号３（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の一部もしくは全体により規定される、項目１に記載のベクター。
項目６．上記非コード配列は、ＯＰ１イントロン配列の一部または全体を含む、項目１に記載のベクター。
項目７．ＯＰ１イントロンの一部もしくは全体を規定する上記配列は、配列番号１（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の塩基３７３６〜１０７００；塩基１０８９７〜１１０６３；塩基１１２１７〜１１４２４；塩基１１６２３〜１３３５８；塩基１３４４０〜１０５４８；塩基１５１６６〜１７２５０；全体からなる配列の群より選択される、項目６に記載のベクター。
項目８．上記ベクターは、少なくとも第２の上記非コード配列を含む、項目１に記載のベクター。
項目９．上記第２の非コード配列は、項目２、３、４、５または７に規定される配列の群より独立して選択される、項目８に記載のベクター。
項目１０．上記非コード配列は、少なくとも１つのＷｔ−１／Ｅｇｒコンセンサス結合エレメントを規定する、項目１に記載のベクター。
項目１１．上記非コード配列は、１〜６の間のＷｔ−１／Ｅｇｒ結合エレメントを規定する、項目１に記載のベクター。
項目１２．上記非コード配列は、ＦＴＺ結合エレメントの少なくとも一部を規定する、項目１に記載のベクター。
項目１３．上記非コード配列は、ステロイド結合エレメントを規定する、項目１に記載のベクター。
項目１４．項目１、３、４、５、６、１０、１１または１２のいずれかに記載のベクターを用いてトランスフェクトされた、細胞。
項目１５．上記ベクターのＤＮＡの少なくとも一部が、細胞のゲノム内に作動可能に組み込まれている、項目１４に記載のトランスフェクトされた細胞。
項目１６．上記細胞のゲノムが、ＯＰ−１遺伝子座を有し、かつ、上記トランスフェクトされたＤＮＡの少なくとも一部が、上記ＯＰ−１遺伝子座において上記ゲノム内に作動可能に組み込まれている、項目１５に記載のトランスフェクトされた細胞。
項目１７．上記細胞が、天然に存在する条件下で、ＯＰ１を発現する、項目１４に記載のトランスフェクトされた細胞。
項目１８．上記細胞が、上皮細胞である、項目１７に記載のトランスフェクトされた細胞。
項目１９．上記細胞が、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）細胞起源、腎臓（ｒｅｎａｌ）細胞起源、尿生殖器細胞起源、肝細胞起源、骨細胞起源、心臓細胞起源、肺細胞起源または神経細胞起源である、項目１７に記載のトランスフェクトされた細胞。
項目２０．トランスフェクトされたベクターを含む細胞であって、上記ベクターは、少なくとも２つのＤＮＡ配列と作動可能に連結したリポーター遺伝子を規定し、第１の上記配列は、塩基２５４８〜２７９０（配列番号１）；塩基２５４８〜３３１７（配列番号１）；塩基１５４９〜１７８８（配列番号２）；塩基１５４９〜２２９６（配列番号２）からなる群より選択される配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の一部または全体を含み、そして、第２の上記配列は、ＤＮＡ結合分子により機能し得るベクターであって、上記第１の配列および第２の配列は、上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼす能力がある配列を規定する、細胞。
項目２１．上記第２のＤＮＡ配列は、少なくとも１つのＷｔ−１／Ｅｇｒ−１コンセンサスエレメント（配列番号４）を含む、項目２０に記載の細胞。
項目２２．上記第２のＤＮＡ配列は、１〜６の間のＷｔ−１／Ｅｇｒ−１コンセンサスエレメント（配列番号４）を含む、項目２１に記載の細胞。
項目２３．上記第２のＤＮＡ配列は、少なくとも６のＷｔ−１／Ｅｇｒ−１コンセンサスエレメント（配列番号４）を含む、項目２１に記載の細胞。
項目２４．上記第２のＤＮＡ配列は、ＴＣＣエレメント、ＦＴＺ結合エレメントおよびステロイド結合エレメントからなる配列の群より選択される、項目２０に記載の細胞。
項目２５．上記リポーター遺伝子に作動可能に連結し、上記遺伝子の発現に影響を及ぼす能力がある第３のＤＮＡ配列をさらに含み、上記第３のＤＮＡ配列は、独立して、ＴＣＣエレメント、ＦＴＺ結合エレメントおよびステロイド結合エレメントからなる配列の群より選択される、項目２０に記載の細胞。
項目２６．上記リポーター遺伝子に作動可能に連結し、上記遺伝子の発現に影響を及ぼす能力がある第３のＤＮＡ配列をさらに含み、上記第３のＤＮＡ配列は、独立して、塩基３７３６〜１０７００（配列番号１）；塩基１０８９７〜１１０６３（配列番号１）；塩基１１２１７〜１１４２４（配列番号１）；塩基１１６２３〜１３３５８（配列番号１）；塩基１３４４０〜１０５４８（配列番号１）；塩基１５１６６〜１７２５０（配列番号１）からなる配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の群より選択される、項目２０に記載の細胞。
項目２７．ＯＰ−１の発現を調節する能力について、候補化合物をスクリーニングするための方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）上記候補化合物を、天然に存在する条件下で、ＯＰ１遺伝子に隣接して存在する、少なくとも１つのＯＰ１特異的な非コード配列と作動可能に連結したリポーター遺伝子を規定するＤＮＡ配列を含むベクターを用いてトランスフェクトされた細胞と共にインキュベートする工程であって、上記非コード配列は、上記ベクター上の上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼす能力がある、工程；
（ｂ）上記細胞において発現されるリポーター遺伝子のレベルを測定する工程；および
（ｃ）上記レベルを、上記候補化合物の非存在下で上記細胞において発現される上記リポーター遺伝子のレベルと比較する工程であって、ここで、リポーター遺伝子発現レベルの増加は、上記候補がインビボにおいてＯＰ−１発現を増加する能力の指標であり、そして、リポーター遺伝子発現レベルの減少は、上記候補がインビボにおいてＯＰ−１発現を阻害する能力の指標である、工程
を包含する、方法。
項目２８．上記非コード配列は、核酸結合分子により機能し得、それによって、上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、項目２７に記載の方法。
項目２９．上記非コード配列は、塩基３１７０〜３３１７（配列番号１）；塩基３０２０〜３３１７（配列番号１）；塩基２７９０〜３３１７（配列番号１）；塩基２５４８〜３３１７（配列番号１）；塩基２１５０〜２２９６（配列番号２）；塩基２０００〜２２９６（配列番号２）；塩基１７８８〜２２９６（配列番号２）；塩基１５４９〜２２９６（配列番号２）により規定されるＤＮＡ配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の群より選択される、項目２７に記載の方法。
項目３０．上記非コード配列は、塩基２３００〜３３１７（配列番号１）；塩基１３００〜３３１７（配列番号１）；塩基１〜３３１７（配列番号１）；塩基２５４８〜２７９０（配列番号１）；塩基１５４９〜２７９０（配列番号１），塩基１〜２７９０（配列番号１）；塩基８００〜２２９６（配列番号２）；塩基１〜２２９６（配列番号２）；塩基１５４９〜１７８８（配列番号２）；塩基８００〜１７８８（配列番号２）；塩基１〜１７８８（配列番号２）により規定されるＤＮＡ配列（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の群より選択される、項目２７に記載の方法。
項目３１．上記非コード配列は、項目５、６または７により規定される配列からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
項目３２．ＯＰ−１の発現を調節する能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）項目２０、２１、２４または２５に記載の細胞と共に、上記候補化合物をインキュベートする工程；
（ｂ）上記細胞において発現されるリポーター遺伝子のレベルを測定する工程；および
（ｃ）上記レベルを、上記候補化合物の非存在下で上記細胞において発現される上記リポーター遺伝子のレベルと比較する工程であって、ここで、リポーター遺伝子発現レベルの増加は、上記候補がインビボにおいてＯＰ−１発現を増加する能力の指標であり、そして、リポーター遺伝子発現レベルの減少は、上記候補がインビボにおいてＯＰ−１発現を阻害する能力の指標である、工程
を包含する、方法。
項目３３．項目２７または３２に記載の方法により同定される、化合物。
項目３４．配列番号２（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の塩基１〜１８７１により規定されるＤＮＡ配列を含む、実質的に純粋な核酸。
項目３５．配列番号３（その対立遺伝子、種、および他の配列改変体を含む）の塩基１〜２９９７により規定されるＤＮＡ配列を含む、実質的に純粋な核酸。
項目３６．上記リポーター遺伝子に作動可能に連結されたＯＰ１プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部または全体をさらに含む、項目１、３、４、５または７に記載のベクター。
項目３７．上記ベクターが、上記リポーター遺伝子に作動可能に連結されたＯＰ１プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部または全体をさらに含む、項目２７に記載の方法。
項目３８．細胞においてＯＰ−１の発現を調節する能力を有する候補化合物を産生する方法であって、上記方法は、以下の工程：
（ａ）項目２７に記載の方法により、候補化合物を得る工程、および
（ｂ）上記候補化合物、または、上記候補と同一のＯＰ−１発現調節能力を実質的に有するその誘導体のいずれかを産生する工程
を包含する、方法。
項目３９．上記工程（ｂ）により産生された上記候補化合物、またはその誘導体が、組換えＤＮＡ技術、または非生物学的なペプチド合成によるものである、項目３８に記載の方法。
項目４０．細胞におけるＯＰ−１発現を調節し得る候補分子を同定するためのキットであって、このキットは、以下：
（ａ）サンプルを受容するために適合された容器であって、上記サンプルは、天然に存在する条件下で、ＯＰ−１遺伝子に隣接して存在する、少なくとも１つのＯＰ−１特異的な非コード配列と作動可能に連結したリポーター遺伝子を含むＤＮＡ配列をコードするベクターを含み、上記非コード配列は、上記リポーター遺伝子の発現に影響を及ぼす能力があり、ここで、上記ベクターは、細胞内に保有される、容器、および
（ｂ）上記候補化合物を上記サンプルに対して曝露した後に、上記リポーター遺伝子の発現を検出するための手段
を備える、キット。
項目４１．上記リポーター遺伝子が、ＯＰ−１  ＤＮＡ配列を含む、項目４０に記載のキット。
【００１０】
【数６】
2006025796.tif 000007
【００１１】
【数７】
2006025796.tif 000008
【００１２】
【数８】
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【００１３】
【数９】
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【００１４】
【数１０】
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【００１５】
【数１１】
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【００１６】
【数１２】
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【００１７】
【数１３】
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【００１８】
【数１４】
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【００１９】
【数１５】
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【００２０】
【数１６】
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【００２１】
【数１７】
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【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
【００２３】
【数１８】
2006025796.tif 000019
【００２４】
【数１９】
2006025796.tif 000020
【００２５】
【数２０】
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【００２６】
【数２１】
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【００２７】
【数２２】
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【００２８】
【数２３】
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【００２９】
【数２４】
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【００３０】
【数２５】
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【００３１】
【数２６】
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【００３２】
【数２７】
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【００３３】
【数２８】
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【００３４】
【数２９】
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【００３５】
【数３０】
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【００３６】
【数３１】
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【００３７】
【数３２】
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【００３８】
【数３３】
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【００３９】
【数３４】
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【００４０】
【数３５】
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【００４１】
【数３６】
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【００４２】
【数３７】
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【００４３】
【数３８】
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【００４４】
【数３９】
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【００４５】
【数４０】
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【００４６】
【数４１】
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【００４７】
【数４２】
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【００４８】
【数４３】
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【００４９】
【数４４】
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【００５０】
【数４５】
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【００５１】
【数４６】
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【００５２】
【数４７】
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【００５３】
【数４８】
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【００５４】
【数４９】
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【００５５】
【数５０】
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【００５６】
【数５１】
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【００５７】
【数５２】
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【００５８】
【数５３】
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【００５９】
【数５４】
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【数５５】
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【００６１】
【数５６】
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【００６２】
【数５７】
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【００６３】
【数５８】
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【００６４】
【数５９】
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【数６０】
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【００６６】
【数６１】
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【００６７】
【数６２】
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【００６８】
【数６３】
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【００６９】
【数６４】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】。
【数６５】
2006025796.tif 000066
【図１Ｂ】。
【数６６】
2006025796.tif 000067
【図２】図２は、エストロゲンによるマウス子宮のＯＰ−１  ｍＲＮＡ調節の時間経過を示す。
【図３Ａ】。
【数６７】
2006025796.tif 000068
【図３Ｂ】。
【数６８】
2006025796.tif 000069
【図１Ａ】
2006025796.tif 000070
【図１Ｂ】
2006025796.tif 000071
【図２】
2006025796.tif 000072
【図３Ａ】
2006025796.tif 000073
【図３Ｂ】
2006025796.tif 000074