(57)【要約】【課題】  本発明は、１００〜５０００ｎｍの巨大な細孔を有する担体の細孔に実質的な影響を及ぼすことなく、比較的容易な方法で担体の表面を改質しアルブミンのようなタンパク質の吸着を抑制した液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを課題とする。【解決手段】  極性基を有する担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後、水分を減圧下で除去し担体表面に該水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を前記水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面で水溶性高分子を架橋して得られる、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法及びその充填剤を用いた液体クロマトグラフィー用カラム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性基を有する担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後水分を除去し担体表面に該水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を前記水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面で水溶性高分子を架橋することにより得られる、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
水溶性高分子が分子内に水酸基を有する請求項１に記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
水溶性高分子が多糖である請求項１または２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである請求項３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
担体表面を被覆している水溶性高分子が架橋剤により架橋されている請求項１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである請求項５記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
担体が合成高分子系担体であり、分子内に極性基を有する請求項１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
担体が合成高分子系担体であり、分子内に有する極性基がスルホ基である請求項７記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項９】
担体がスルホン化ポリスチレンである請求項１、７または８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１０】
担体が直径１００〜５０００ｎｍの細孔を有する請求項１、７乃至９のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１１】
担体の質量平均粒子径が１０〜１００μｍである請求項１、７乃至１０のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後、水分を除去し担体表面に水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面の該水溶性高分子を架橋することを特徴とする表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１３】
表面改質に用いる水溶性高分子が分子内に水酸基を有するものである請求項１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１４】
表面改質に用いる水溶性高分子が多糖である請求項１２または１３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１５】
表面改質に用いる水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである請求項１４記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１６】
表面改質に用いる水溶性高分子を架橋剤により架橋する請求項１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１７】
架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである請求項１６記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１８】
表面改質される担体が分子内に極性基を有する合成高分子系担体である請求項１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１９】
分子内に極性基を有する合成高分子系担体の極性基がスルホ基である請求項１８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２０】
合成高分子系担体が分子内に有するスルホ基が修飾剤で修飾されている請求項１９記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２１】
スルホ基を修飾する修飾剤がグリシドールである請求項２０記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤及びその製造方法に関する。さらに詳しく言えば、試料中に共存するタンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質を充填剤表面に吸着することなく糖、脂質のような水溶性巨大分子量物質をゲルフィルトレーションクロマトグラフィーにより分離または測定するのに適した巨大細孔を有する表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、及びそれを用いた分析用カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性高分子の平均分子量測定には、従来、希薄高分子溶液の粘性測定から求める粘度平均分子量、光散乱、超遠心法から求める重量平均分子量が用いられてきた。一方、分子量分布測定にはその迅速さと簡便さからゲルフィルトレーションクロマトグラフィーが広く用いられている。
【０００３】
水溶性高分子の分子量分布測定に使用されるゲルフィルトレーションクロマトグラフィー用充填カラムとして、例えば、（メタ）アクリル酸エステル単量体を架橋重合した充填剤が充填されたカラムであるTSK-GEL PWXLシリーズ（東ソー（株）製）またはShodex OHpak SB-800 HQシリーズ（昭和電工（株）製）等がある。しかし、例えば粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような水溶性巨大高分子物質の分子量分布測定ではTSK-GEL PWXLシリーズの中でもっとも排除限界分子量の大きいTSK-GEL G6000PWXLカラムを用いても、排除限界に達していると推定されている（日本分析化学会第４９年会講演要旨集１５頁２Ａ１１「高分子ヒアルロン酸のＳＥＣ測定」（資生堂掛川工場）小野昭則等：非特許文献１）。一方、Shodex OHpak SB-800 HQシリーズの中でもっとも排除限界分子量の大きいShodex OHpak SB-806 HQでも粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸はその排除限界分子量に達している（第６回高分子分析討論会１０７〜１０８頁III−１０（昭光通商・Shodexサービスセンター）中村雅英等「水溶性超高分子用カラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析」：非特許文献２）。この様に（メタ）アクリル酸エステル単量体を架橋重合した充填剤が充填されたカラムでは、粘度平均分子量が３００万以上の巨大な分子量（分子量分布を考慮すると最大分子量は４００〜５００万に達する。）を有する試料を排除限界分子量に達することなく分析できるカラムが存在しないため正確な分子量分布測定は困難となっている。
【０００４】
こうした背景の中、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような巨大高分子物質の分子量分布をゲルフィルトレーションクロマトグラフィーにより迅速かつ簡便に測定できる充填剤が要望されていた。そこで、（メタ）アクリル酸エステル系以外の水溶性高分子用ゲルフィルトレーションクロマトグラフィー用充填カラムとして、Shodex SUGAR KSシリーズ（昭和電工（株）製）のようなポリスチレンをスルホン化し、親水化した充填剤を充填したカラムがある。そして、その中で最も排除限界分子量の大きいShodex SUGAR KS-807は、排除限界分子量に達することなく前記ヒアルロン酸を分析できることが報告されている（２００３年薬学会第１２３年会３７頁２８（Ｐ１）Ｉ−２７６（電気化学工業・昭光通商・昭和電工）大出桂等，「カラムスイッチングによる生体液中のヒアルロン酸分析」：非特許文献３）。
しかし、ポリスチレンをスルホン化し親水化した充填剤を充填したカラムは試料中に共存する、タンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質を充填剤表面に吸着するという欠点を有していた。
【０００５】
【非特許文献１】日本分析化学会第４９年会講演要旨集１５頁２Ａ１１「高分子ヒアルロン酸のＳＥＣ測定」（資生堂掛川工場）小野昭則等
【非特許文献２】第６回高分子分析討論会１０７〜１０８頁III−１０「水溶性超高分子用カラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析」（昭光通商・Ｓｈｏｄｅｘサービスセンター）中村雅英等
【非特許文献３】２００３年薬学会第１２３年会３７頁２８（Ｐ１）Ｉ−２７６「カラムスイッチングによる生体液中のヒアルロン酸分析」（電気化学工業・昭光通商・昭和電工）大出桂等
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような水溶性巨大分子試料の分子量及び分子量分布を排除限界分子量に達することなく分析でき、かつ、同一試料中にタンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質が存在していても当該水溶性巨大分子が充填剤表面に吸着されることのない充填剤及びそのような充填剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を続けた結果、特定の方法を用い担体表面を親水性高分子で被覆し、当該親水性高分子の表面を架橋することによって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、その充填剤を用いたカラムに関する。
１．極性基を有する担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後水分を除去し担体表面に該水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を前記水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面で水溶性高分子を架橋することにより得られる、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
２．水溶性高分子が分子内に水酸基を有する前記１に記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
３．水溶性高分子が多糖である前記１または２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
４．水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである前記３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
５．担体表面を被覆している水溶性高分子が架橋剤により架橋されている前記１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
６．架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである前記５記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
７．担体が合成高分子系担体であり、分子内に極性基を有する前記１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
８．担体が合成高分子系担体であり、分子内に有する極性基がスルホ基である前記７記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
９．担体がスルホン化ポリスチレンである前記１、７または８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１０．担体が直径１００〜５０００ｎｍの細孔を有する前記１、７乃至９のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１１．担体の質量平均粒子径が１０〜１００μｍである前記１、７乃至１０のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１２．担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後、水分を除去し担体表面に水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面の該水溶性高分子を架橋することを特徴とする表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１３．表面改質に用いる水溶性高分子が分子内に水酸基を有するものである前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１４．表面改質に用いる水溶性高分子が多糖である前記１２または１３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１５．表面改質に用いる水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである前記１４記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１６．表面改質に用いる水溶性高分子を架橋剤により架橋する前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１７．架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである前記１６記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１８．表面改質される担体が分子内に極性基を有する合成高分子系担体である前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１９．分子内に極性基を有する合成高分子系担体の極性基がスルホ基である前記１８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２０．合成高分子系担体が分子内に有するスルホ基が修飾剤で修飾されている前記１９記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２１．スルホ基を修飾する修飾剤がグリシドールである前記２０記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２２．前記１乃至１１のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、比較的容易な方法を用いて表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤を製造することができ、この液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて、試料中に共存するアルブミンのようなタンパク質を吸着することなく、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような巨大高分子物質の分子量分布を排除限界分子量に達することなく分析できる。
【発明の実施の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明における表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤は、水溶性高分子を極性基を有する担体の表面に被覆させ表面が改質された充填剤である。
担体は極性基を持つものであれば特に限定されるものではない。例を挙げれば、合成高分子系担体、例えばポリビニルアルコール系ゲル、ポリ（メタ）アクリル酸系ゲル、ポリＮ−ビニルカルボン酸アミド系ゲル、スルホ基、四級アンモニウム基、三級アミノ基、二級アミノ基、一級アミノ基のようなイオン交換樹が導入されたポリスチレン系ゲルが用いられる。これらの中でも多孔性、強度の点でイオン交換基が導入されたポリスチレン系ゲルが好ましく、さらには入手のしやすさの点でスルホ基を導入されたスルホン化ポリスチレンゲルがより好ましい。
【００１２】
また、担体は多孔性であることが好ましく、その粒子をカラムに充填しテトラヒドロフランを溶離液に用いたとき分子量1610万の標準ポリスチレン（東洋曹達（株）製）が排除限界に達することなく溶出され、ポリスチレンによる推定排除限界分子量が約２億程度であることが望ましい。これらのポリスチレンの大きさ（直径）はIstvan Hal asz and Korn el Martin. Pore Sizes of Solids. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 17. 901-908 (1978)により定義された式で計算すれば分子量1610万の標準ポリスチレンは約1100ｎｍ、分子量が約２億程度は約4900ｎｍとなる。従って、本発明において使用される被表面改質充填剤は直径１００〜5000ｎｍの細孔を有する多孔性粒子がより好ましい。
担体の質量平均粒子径は１０〜１００μｍが好ましい。質量平均分子量はコールターカウンター（登録商標）で測定できる。
【００１３】
本発明で好ましく用いられるスルホ基を導入されたスルホン化ポリスチレンゲル担体は、その親水性を増大する目的でスルホ基を表面修飾剤で修飾してもよい。この時用いられる修飾剤はスルホ基と反応し親水性を増大するようなものであれば特に限定されないが、例えばソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリシドールを挙げることができ、さらに操作性さらに入手のしやすさの点で、グリシドールが好ましい。
【００１４】
親水性増大の目的で使用される修飾剤の使用量は、充填剤が持つ細孔径に影響を与えない範囲であれば特に制限されない。本発明においては、修飾剤は担体に対して0.5〜２質量倍、好ましくは１〜1.5質量倍使用される。
【００１５】
スルホ基を表面修飾剤で修飾する際、反応促進のため触媒を適時用いることができる。触媒としては、塩酸、硫酸のような無機酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ類、トリエチルベンジルアンモニウムクロライドやテトラメチルアンモニウムクロライドのような四級アンモニウム塩類、ベンジルジメチルアミンやトリブチルアミンのような三級アミン類、２−メチル−４−エチルイミダゾールや２−メチルイミダゾールのようなイミダゾール化合物さらには三フッ化ホウ素、ホウフッ化亜鉛、塩化スズのようなルイス酸を挙げることができ、反応効率の点からルイス酸が好ましく、反応の制御の点からホウフッ化亜鉛が特に好ましい。
【００１６】
担体の表面改質に使用される水溶性高分子は水に溶解する性質を持つものであれば特に限定されない。例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキサイドのような合成水溶性高分子、ゼラチン、カゼインのような動物性水溶性高分子、デキストラン、プルラン、セルロースのような多糖及びその誘導体が挙げられる。水溶性高分子はその親水性の強さから水酸基を持つものか好ましく、特に多糖からなるセルロース誘導体は誘導体の種類の多さから選択の範囲が広く好ましい、中でも、溶解性、入手のしやすさなどからヒドロキシエチルセルロースが特に好ましい。
【００１７】
表面改質のため担体の表面に水溶性高分子を被覆する方法は、特に制限されるものではない。水溶性高分子を溶解した溶液に担体を入れ、その表面に水溶性高分子を吸着させた後、ろ過等により水分を取り除く方法が考えられるが、操作が煩雑となりさらに再現性にも影響を与えることとなる。従って、担体を水溶性高分子溶液に懸濁させ、エバポレーターのような装置を用いて減圧下で水分を留去する方法が、簡便で再現性も高く好ましい。水分留去を速やかに行うためには３０〜２００ｈｐａの圧力が好ましく、留去時間の短縮と減圧による沸騰を勘案すると５０〜１００ｈｐａの圧力がより好ましい。減圧下での水分留去を速やかに行うために加温することが好ましいが、減圧下極端に高温にすると沸騰し担体が飛び散り収率が低下するので好ましくない。加温するとき温度は７０℃以下が好ましく、３０〜５０℃の範囲での加温がより好ましい。
【００１８】
表面改質のため被覆される水溶性高分子の量には特に制限はないが、担体の持つ多孔性に影響を与えることなく、表面が改質される量で決められる。好ましくは表面改質される担体に対し0.0005〜0.5質量倍、より好ましくは0.002〜0.2質量倍である。
【００１９】
本発明の充填剤において、担体を被覆した水溶性高分子を溶解しない溶媒中に分散させて架橋するのに使用される溶媒は、当該水溶性高分子を溶解するものでなければ特に限定されない。溶解性は使用する水溶性高分子の重合度、分子量分布によって変化するので、水溶性高分子を実質的に溶解しない溶媒を選択する。ここで水溶性高分子を実質的に溶解しない溶媒とは、水溶性高分子の被覆された担体を溶媒に浸した後の質量変化で水溶性高分子の溶媒への溶解度を測定したとき水溶性高分子の質量減少が浸漬前の５０％以下のもの、好ましくは質量減少が２５％以下のもの、より好ましくは５％以下のものが望ましい。具体例としては、トルエン、キシレン、エチルベンゼンのような芳香族化合物、ジオキサン、ジメチルホルムアミドのような極性有機溶媒を挙げることができる。これらの中でも、取り扱いの容易さの点から極性有機溶媒が好ましく、反応操作性からジオキサンがより好ましい。
【００２０】
担体を被覆した水溶性高分子を架橋するのに使用される架橋剤は当該水溶性高分子が有する官能基と反応する多官能性化合物であれば、特に限定されない。また、単に有機過酸化物のようなラジカル発生剤であってもよい。水溶性高分子が水酸基及び／またはスルホ基を有している場合には、これらの官能基と反応する多官能性化合物を用いることができる。例えば、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドのようなジアルデヒド類やエチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジグリシジルエーテルのようなジグリシジル類、さらにエピクロロヒドリンを挙げることができる。これらの中でも、反応の制御等の点からジグリシジル類が好ましく、入手のしやすさを考慮するとエチレングリコールジグリシジルエーテルが特に好ましい。
【００２１】
上記ジグリシジル化合物を用い架橋する際、反応促進のため触媒を適時用いることができる。触媒としては、塩酸、硫酸のような無機酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ類、トリエチルベンジルアンモニウムクロライドやテトラメチルアンモニウムクロライドのような四級アンモニウム塩類、ベンジルジメチルアミンやトリブチルアミンのような三級アミン類、２−メチル−４−エチルイミダゾールや２−メチルイミダゾールのようなイミダゾール化合物さらには三フッ化ホウ素、ホウフッ化亜鉛、塩化スズのようなルイス酸を挙げることができるが、反応効率の点からルイス酸が好ましく、中でも反応の制御の点からホウフッ化亜鉛が特に好ましい。
【００２２】
担体の表面改質において、水溶性高分子に対する架橋剤の使用量は通常実際に担体表面を被覆している水溶性高分子の架橋に必要な量より過剰に加えられるが、担体に対しては0.1〜２質量倍、好ましくは0.25〜1.5質量倍使用される。
【００２３】
本発明における表面が改質された充填剤は、分子内に極性基を有する充填剤の表面が水溶性高分子で被覆されることで改質された液体クロマトグラフィー用充填剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１：
スルホン化ポリスチレンゲルで、その対イオンを水素型にした粒子（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）KS-807ゲル）５ｇを２５ｇのジオキサン中に分散し、次いで、室温中グリシドール５ｇを添加し、３０分撹拌した。その後ホウフッ化亜鉛１ｇを添加し温度を８０℃へ昇温し４時間反応を行った。冷却後、グリシドールで表面処理された粒子をNo.101のろ紙によりろ別した後、脱イオン水１００ｍＬ、さらに、アセトン１００ｍＬで洗浄し、ステンレス製バット上に広げ風乾した。
グリシドールで表面処理されたスルホン化粒子５ｇを２００ｍＬなす形フラスコに入れ、さらに0.05質量％ヒドロキシエチルセルロース水溶液２５ｍＬを入れ分散させた後ロータリーエバポレータを用い水分を留去し、粒子表面にヒドロキシエチルセルロース皮膜を形成した。
この表面にヒドロキシエチルセルロース皮膜が形成された粒子が入ったなす形フラスコに５０ｇにジオキサンを入れ、粒子をよく分散させた後エチレングリコールジグリシジルエーテル2.5ｇを入れ１０分間撹拌を続けた後ホウフッ化亜鉛2.5ｇを入れ８０℃で３時間反応させ表面のヒドロキシエチルセルロース皮膜を架橋した。
こうして得られた表面がヒドロキシエチルセルロースで改質された粒子を、パッカーと高圧ポンプを用いて内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
【００２６】
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を溶離液に0.03質量％になるように溶解した試料１００マイクロリットルを注入し分子量を測定した。なお、検出器には示差屈折計（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）ＲＩ−７１）を用いた。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
さらに、このカラムを別の高速液体クロマトグラフ装置に接続し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を溶離液として1.0ｍＬ毎分の流速で流し、試料としてウシ血清アルブミン（SIGMA-ALDRICH社製）の0.03質量％溶離液１０マイクロリットルを注入し、紫外分光検出器（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）ＵＶ−４１）を用いて検出波長２８０ｎｍでクロマトグラムを得、その面積値を測定した。続いてカラムを高速液体クロマトグラフ装置から取り外し、代わりに内径0.5ｍｍ、長さ１０ｍのポリテトラフルオロエチレンチューブをウシ血清アルブミンを吸着しない参照カラムとして接続し、同様に0.03質量％ウシ血清アルブミン溶離液溶液１０マイクロリットル注入してクロマトグラムを得、その面積値を測定した。
表面改質充填剤充填カラムから得られたクロマトグラム面積値を参照カラム（ポリテトラフルオロエチレンチューブ）から得られる面積値で除した値として定義したウシ血清アルブミンの回収率は７８％であった。
【００２７】
比較例１：
実施例１と同様のスルホン基の導入されたポリスチレンゲル粒子を実施例１と同様にパッカーと高圧ポンプを用い、内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を実施例１と同様に測定した。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
さらに、このカラムを実施例１と同様の条件で試料として0.03質量％ウシ血清アルブミン１０マイクロリットル注入したが、ウシ血清アルブミンが充填剤に吸着され、ほとんど流出してこなかったため正確なクロマトグラムを得ることはできなかった。
【００２８】
比較例２：
実施例１のグリシドールで表面処理された段階のスルホン化ポリスチレン粒子を実施例１と同様パッカーと高圧ポンプを用い、内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を実施例１と同様に測定した。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
【００２９】
さらに、このカラムを実施例１と同様の方法でウシ血清アルブミンの回収率を測定したところ、回収率は４２％であった。