(57)【要約】【課題】  取り扱い易く、試料を注入したり抜き出しても、内圧が増減せず、培養環境が変化しないようにする。培養中は常に大気圧で試料の取り出しを行うことができ、外気が入り込む危険性が少なく、簡単に攪拌できるようにする。簡単に絶対嫌気状態での分注操作ができ、熟練が要求されず、そのため培養試験に手間と時間がかからないようにする。【解決手段】  フレキシブル培養バッグ１０は、内部に栄養源を含む液体を収容する袋状体１２と、それに装着された密封可能なコック付き注入スリーブ１４、及び液注入・吸引用の針状管を気密的に刺し込み・引き抜き可能なパッキン付き封止栓１６を備えている。フレキシブル培養バッグには、分注装置によって密閉容器内の液体を分注可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フレキシブル材料からなり内部に液体を収容する密閉構造の袋状体と、該袋状体に気密的に装着された密封可能なコック付き注入スリーブ、及び液注入・吸引用の針状管を気密的に刺し込み・引き抜き可能なパッキン付き封止栓を具備していることを特徴とするフレキシブル培養バッグ。
【請求項２】
袋状体が、アルミニウム箔が中間に位置するように樹脂フィルムを表裏にラミネートした複層材からなる請求項１記載のフレキシブル培養バッグ。
【請求項３】
袋状体が、外層として繊維質材料からなる布状シートを貼り付けて折り曲げ強度を補強した複層材からなる請求項２記載のフレキシブル培養バッグ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のフレキシブル培養バッグと、該フレキシブル培養バッグに嫌気状態を維持しつつ液体を注入する分注装置との組み合わせからなり、該分注装置は、内部に液体を収容する剛性構造の密閉容器と、該密閉容器に設けた閉止可能なバルブを備えた接続部と、該接続部から連続して密閉容器内の下部に達する移送管と、密閉容器への無酸素ガス供給系を有し、前記コック付き注入スリーブと接続部との間で気密的に接続・分離自在となっており、無酸素ガスによる加圧によって密閉容器内の液体をフレキシブル培養バッグに嫌気状態を維持したまま分注可能としたことを特徴とする嫌気培養試験装置。
【請求項５】
密閉容器は、上部に減圧口と無酸素ガス供給口を有し、減圧口に真空吸引用のポンプが接続され、無酸素ガス供給口に無酸素ガス供給系が接続されており、真空吸引と無酸素ガス供給を交互に行うことで密閉容器内の嫌気雰囲気化を可能にすると共に、密閉容器の底部に攪拌用のマグネットスターラが装備されている請求項４記載の嫌気培養試験装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性微生物の培養試験を行うためのフレキシブル培養バッグ、及び無酸素ガス供給によって嫌気状態を維持したまま液体をフレキシブル培養バッグに注入可能とした分注装置を備えた嫌気培養試験装置に関するものである。この装置は、特に限定されるものではないが、例えばバイオレメデーションによる浄化効果を評価するための室内実験などに有用である。
【背景技術】
【０００２】
有機塩素化合物（例えばトリクロロエチレンやテトラクロロエチレン、あるいは各種の有機溶剤など）による土壌・地下水汚染を浄化し、環境を修復する技術として、近年、バイオレメデーション促進技術が多用されつつある。これは、地中微生物の栄養源（例えば電子供与体など）を地中に注入して現地の嫌気性微生物（嫌気状態で繁殖する微生物）による自然浄化機能を活性化し、原位置にて汚染浄化を図る技術である。このようなバイオレメデーション促進技術において、浄化効果を高めるためには、汚染状況に応じて適切な種類の栄養源を選択し、適切な量を地盤に注入することが重要である。つまり、どの種類の微生物を活性化すればよいのか、そのためにはどのような種類の栄養源を、どの程度の割合（速度及び濃度）で注入すればよいのかを定量的に評価する必要がある。投入する栄養源とその量によっては、目的以外の微生物が繁殖し、目的とする微生物の繁殖が阻害されることも起こりうるからである。
【０００３】
定量的な評価を実現するためには、現地の嫌気性微生物が生息する環境を室内に持ち込んで簡便に培養試験が行えるようにすることが望ましい。しかし、土壌や水中に生息する嫌気性微生物による試験を行う際には、酸素が育成を阻害するため、特殊な嫌気培養技術を用いなければならない。従来、嫌気性微生物の培養・検査を行う技術としては、ロールチューブ法やグローブボックス法などがある（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
ロールチューブ法は、ブチルゴム栓付きの試験管を用い、無酸素の混合ガス（水素：窒素：二酸化炭素など）を噴射させて、酸素を遮断しながら試験管などに分注し、検査する方法である。この方法は、無酸素混合ガスを吹き付けるために、試料中に揮発性の物質が含まれていて、その濃度変化を調べるような検査には不向きである。また、微生物の繁殖状況を確認するための試料の取り出しは、密閉容器であるために１回しかできない（試料の取り出しによって密閉容器内が減圧されてしまい、培養環境が変化してしまう）。そのため、このような目的に使用する場合には、予め数多くの試験管を準備する必要があり、時間と手間と熟練した技術が必要となる。
【０００５】
グローブボックス法は、無酸素ガスを満たした気密性のボックス内で、ボックス壁に装着されているゴム手袋を使って試料の分注や培養を行う方法である。ボックス内は、全体を無酸素状態にするために、真空ポンプによる真空吸引と無酸素混合ガスの注入を数回繰り返し、最終的に残存している微量の酸素を脱酸素触媒（パラジウム）により水素と反応させて嫌気状態を維持する。嫌気培養及び検査では、嫌気的に操作することと、嫌気状態を如何に維持するかが重要なポイントであり、そのため時間と手間と熟練した技術、大掛かりな設備などが必要となる。
【０００６】
ところで最近、嫌気性微生物の培養試験のために、培養容器に分注する必要がない培養器が開発されている。例えば、瓶体に培地を充填し、無菌的に注射針を刺入出し得るキャップにより密嵌した構造の無菌培地包装体がある（特許文献１参照）。これは、使用に際して、無菌培地包装体を開封し、無菌の雰囲気下で培地を取り出し、別の培養容器に分注する必要がないために、複雑で面倒な分注作業を無くすことができるとされている。
【０００７】
しかし、このような無菌培地包装体の場合、嫌気性微生物を含んだ地下水を瓶体内に注入しておくような使用方法には適用できない。加熱処理で培養対象である嫌気性微生物も死滅してしまうからである。この場合には、従来技術で説明したような複雑で面倒な無菌的分注操作が必要となる。
【０００８】
また、培地を瓶体に充填した後、加圧加熱滅菌処理する必要上、瓶体としては耐圧・耐熱性を有するバイアル瓶などを使用しなければならない。そのため、試験に際して多数の瓶体を用意すると、嵩張り、重く、取り扱い難い。また試験中、恒温槽など保存設備が大掛かりとなる。更に、注射器などで液状試料を注入したり、取り出したりすると、その分だけ液体量が変化するため瓶体の内圧が増減することになり、培養条件（培養環境）が変化してしまう問題もある。これを避けるには、キャップに注射針を突き刺して貫通させ、注射器のシリンダを押し出して試料を瓶体内に注入する際、シリンダを上下させて瓶体内のガスを抜きながら行うといった煩瑣な操作が必要となる。
【特許文献１】特開２００１−１１４３３９号公報
【非特許文献１】新編「土壌微生物実験法」  土壌微生物研究会編  株式会社養賢堂発行  １９９２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、従来技術では注射器で試料を注入したり取り出したりすると、その分だけ瓶体の内圧が増減し、培養条件（培養環境）が変化してしまう点、多数の瓶体を用意すると嵩張り重いため取り扱い難い点、また従来技術では簡単に絶対嫌気状態での分注作業ができず、熟練が要求され、そのため培養試験に手間と時間が多くかかる点、などである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、フレキシブル材料からなり内部に液体を収容する密閉構造の袋状体と、該袋状体に気密的に装着された密封可能なコック付き注入スリーブ、及び液注入・吸引用の針状管を気密的に刺し込み・引き抜き可能なパッキン付き封止栓を具備していることを特徴とするフレキシブル培養バッグである。
【００１１】
ここで袋状体は、例えばアルミニウム箔が中間に位置するように樹脂フィルムを表裏にラミネートした複層材で作製するのが好ましい。更に、外層として繊維質材料からなる布状シートを貼り付けて折り曲げ強度を補強した複層材を用いることも有効である。
【００１２】
また本発明は、上記のようなフレキシブル培養バッグと、該フレキシブル培養バッグに嫌気状態を維持しつつ液体を注入する分注装置との組み合わせからなり、該分注装置は、内部に液体を収容する剛性構造の密閉容器と、該密閉容器に設けた閉止可能なバルブを備えた接続部と、該接続部から連続して密閉容器内の下部に達する移送管と、密閉容器への無酸素ガス供給系を有し、前記コック付き注入スリーブと接続部との間で気密的に接続・分離自在となっており、無酸素ガスによる加圧によって密閉容器内の液体をフレキシブル培養バッグに嫌気状態を維持したまま分注可能としたことを特徴とする嫌気培養試験装置である。
【００１３】
ここで、密閉容器は、上部に減圧口と無酸素ガス供給口を有し、減圧口に真空吸引用のポンプが接続され、無酸素ガス供給口に無酸素ガス供給系が接続されており、真空吸引と無酸素ガス供給を交互に行うことで密閉容器内の嫌気雰囲気化を可能とするのがよい。また密閉容器の底部に攪拌用のマグネットスターラを装備するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るフレキシブル培養バッグは、袋状体がフレキシブル材料で構成されているために自由に変形でき、内部の液体の量が変化しても内圧は常に大気圧に一致するように自動的に調整される。従って、培養に先立って、あるいは培養中、溶液類などの液体を注入したり、培養中、定期的に液体を試料として引き抜いても、圧力条件（圧力環境）は全く変化せず、継続的に同じ条件で培養を続けることができる。このため、培養状態の経時的変化を調査したい場合でも、１つのフレキシブル培養バッグから定期的に順次液体試料を取り出せばよいため、経済的であり、使用する恒温槽などを小型化できる。更に、使用前においては、潰れた状態で保管できるために、コンパクトに保管でき、軽く取り扱い易い。
【００１５】
本発明に係る嫌気培養試験装置は、フレキシブル培養バッグと分注装置との組み合わせからなるが、分注装置では、簡単に手間と時間をかけずに、絶対嫌気状態を作ることができ、フレキシブル培養バッグは、分注装置に対して気密的に接続・分離自在なため、密閉容器内の溶液を嫌気状態を維持したまま、簡単に多数のフレキシブル培養バッグに分注（分取）することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るフレキシブル培養バッグの典型的な例を図１に示す。Ａに示すように、フレキシブル培養バッグ１０は、フレキシブル材料からなり、内部に栄養源を含む液体（液状培地）を収容できる密閉構造の袋状体１２と、該袋状体１２に気密的に装着された密封可能なコック付き注入スリーブ１４、及び液注入・吸引用の針状管（注射針など）を気密的に刺し込み・引き抜き可能なパッキン付き封止栓１６を具備している。
【００１７】
ここで袋状体１２は、長方形の２枚のシート１８を４辺で溶着した構造である。例えばＢに示すように、アルミニウム箔２０が中間に位置するように樹脂フィルム２２を表裏にラミネートした複層材で作製し、必要に応じて外層にガラス繊維質材料などからなる布状シート２４を貼り付けて折り曲げ強度を高めたシート１８を用いる。このようにアルミニウム箔２０を挟んで作製すると、有機塩素化合物などの透過を高効率で阻止できるため、特にバイオレメデーション促進技術での使用には最適である。また、遮光性が得られるため内部の変質を防止できる効果もある。本発明では、袋状体１２の内部に液体を収容するために、その重量によってアルミニウム箔が同じところで折れ曲がって損傷することも起こりうるが、上記のように布状シート２４を補強材として貼り付けることで、そのような不都合は解消できる。
【００１８】
袋状体の構成材料は、上記のような構成のみに限定されるものではなく、様々な材料の単層もしくは複層の透明あるいは不透明の樹脂シートなどで作製することもできる。透明樹脂シートで作製すると、培養した微生物の集落（コロニー）を外部から計数することも可能となる。
【００１９】
袋状体１２の任意の２箇所に、コック付き注入スリーブ１４とパッキン付き封止栓１６を気密的に設ける。コック付きスリーブ１４は、コック２６を手で回動することで流路を閉止・開放できる構造である。
【００２０】
パッキン付き封止栓１６は、例えばＣに示すように、円柱状パッキン２８を中空ジョイント３０と円筒状パッキン押さえ３２とで挟み、ネジ方式で締め付けた構造とする。ここでパッキン２８は、針状管（注射針など）を気密的に刺し入れ且つ抜き取ることができる材質からなり、例えばブチルゴムなどが好ましい。針状管を刺し込んだ後、抜き取ると、パッキンの柔軟性・弾力性により、刺し込み箇所が抜き取りとともに自然に縮小して閉塞される。また、液の注入や取り出しの際に、袋状体１２が変形して内圧は大気圧に常に一致する。これらによって、フレキシブル培養バッグの気密性が保たれる。
【００２１】
図２は本発明に係る嫌気培養試験装置の一例を示す概略図である。この嫌気培養試験装置は、上記のようなフレキシブル培養バッグ１０と、分注装置４０との組み合わせからなる。分注装置４０は、内部に液体を収容する剛性構造の密閉容器４２と、該密閉容器４２に設けた密閉可能なバルブ４４を備えた接続部４６と、該接続部４６から連続して密閉容器内の下部に達する移送管４８と、密閉容器４２への無酸素ガス供給系５０を有する。そして、フレキシブル培養バッグ１２のコック付き注入スリーブ１４と分注装置４０の接続部４６との間が気密的に接続・分離自在となっている。なお、「剛性」とは、フレキシブルではなく、内圧が変化しても大気圧では変形しないことを意味しており、例えばガラスやステンレス鋼などからなる。
【００２２】
密閉容器４２内を嫌気状態にする。無酸素ガス供給系５０から無酸素ガスを供給し液面を加圧することによって、密閉容器４２内の液体をフレキシブル培養バッグ１０に嫌気状態を維持したまま注入することができる。なお、嫌気状態か否かは、酸化還元指示薬（例えばレサズリン）を液体に添加しておき、色の変化を観察すればよい。フレキシブル培養バッグを次々に交換することで、簡単に多数のフレキシブル培養バッグに密閉容器内の液体を分注することができる。接続部に流量計を設けておけば、所定量の注入が簡単に行える。
【実施例】
【００２３】
本発明に係る嫌気培養試験装置の実施例を図３に示す。嫌気培養試験装置は、主としてフレキシブル培養バッグ１０と分注装置４０の組み合わせからなる。両者は互いに気密的に接続・分離可能になっている。
【００２４】
フレキシブル培養バッグ１０は、フレキシブルシートからなる袋状体１２と、該袋状体１２に気密的に装着された密封可能なコック付き注入スリーブ１４、及び液注入・吸引用の針状管を気密的に刺し込み・引き抜き可能なパッキン付き封止栓１６を備えた構造である。これは図１に示すものと同様のものである。
【００２５】
分注装置４０は、内部に液体を収容するステンレス鋼製の密閉容器４２を備えている。ここで密閉容器４２は、容器本体４２ａと蓋体４２ｂとからなり、それらがフランジ部４２ｃでシール材５２を介して衝合するように構成されて、留め具５４を締め付けることで内部が密閉可能な構造となっている。密閉容器４２には、蓋体４２ｂに減圧口６０と無酸素ガス供給口６２が設けられている。減圧口６０にはバルブ６１を設け、図示していないが真空吸引用のポンプを接続し、無酸素ガス供給口６２にもバルブ６３を設け、図示していないが無酸素ガス供給系を接続する。無酸素ガスとしては、例えば水素、窒素、二酸化炭素などのいずれかの単独ガス、あるいはそれら２種以上の混合ガスを用いる。また、閉止可能なバルブ４４を備えた接続部４６と、該接続部４６から連続して密閉容器４２内の下部に達する移送管４８を設ける。該移送管４８は、蓋体４２ｂを気密的に貫通するように設ける。密閉容器内の液体６６を攪拌・混合するために、マグネットスターラ６８を装備している。密閉容器４２内にマグネット攪拌子６８ａを入れておき、密閉容器４２をマグネットスターラ本体６８ｂの上に載置する。なお、減圧口６０には圧力ゲージ７０を設けておき、接続部４６には、図示するのを省略するが、流量計を組み込んでおくのが望ましい。
【００２６】
フレキシブル培養バッグ１０のコック付きスリーブ１４は、分注装置４０の接続部４６に対して相互に気密的に接続・分離自在となっているため、バルブ４４の閉止・開放操作によって、嫌気状態を維持しつつ別のフレキシブル培養バッグに順次交換することが可能であり、密閉容器４２内の液体６６を分注（分取）することができる。またコック付きスリーブ１４のコック２６を回すことで密封でき、そのまま分注装置４０から分離できる。その後、パッキン付き封止栓１６に、針状管（注射針など）を刺し込むことによって、嫌気状態を維持したまま、外部から注射器により薬品類や栄養源、微生物などを溶液の状態で注入したり、内部の溶液の一部を取り出すことを可能としている。
【００２７】
この嫌気培養試験装置は、例えばバイオレメデーション促進技術（土壌あるいは地下水の有機塩素化合物による汚染の微生物浄化）による濃度変化を調べる培養試験などに、特に有効である。その場合の操作方法の一例を以下に示す。
（１）地下水を嫌気状態で採水しておく。従って、採水中には嫌気性微生物が存在している。
（２）減圧・ガス注入の繰り返しにより、密閉容器４２の内部を嫌気状態にする。即ち、減圧口６０から真空吸引して密閉容器４２の内部を減圧し、次に無酸素ガス供給口６２から無酸素ガスを注入する。これらの操作を繰り返すことで、密閉容器４２の内部は無酸素状態（嫌気状態）になる。
（３）採水した地下水と各種栄養源を密閉容器内に入れる。これには接続部４６と移送管４８を使用すればよい。ここで、必要に応じて、マグネットスターラ６８を駆動し、密閉容器内の液体を攪拌混合する。嫌気状態であるか否かは、酸化還元指示薬を添加しておくことによって判定できる。例えば、レサズリンを用いた場合は、酸素が存在すれば赤色であるが、酸素が無ければ無色であるので、変色状態を目視により確認することで、嫌気状態になっていることを判定できる。
（４）フレキシブル培養バッグ１０と分注装置４０とをコック付きスリーブ１４と接続部４６を用いて接続する。また密閉容器内は２気圧程度に加圧しておく。
（５）フレキシブル培養バッグ１０につながっているバルブ４６を開放する。すると、密閉容器内が加圧されているので、密閉容器内で嫌気状態になっている液体６６が、移送管４８とコック付きスリーブ１４を通ってフレキシブル培養バッグ１０に注入される。流量計を設置しておけば、注入量を測定することもできる。
（６）バルブ４４を閉止し、コック２６も閉めてコック付きスリーブ１４を接続部４６から分離する。これによって、溶液注入後に、嫌気状態のまま、フレキシブル培養バッグ１０を分注装置４０から取り外すことができる。このように（５）〜（６）の操作を繰り返すことで、複数のフレキシブル培養バッグに密閉容器内の液体を分注（分取）することができる。
（７）フレキシブル培養バッグ１０にはパッキン付き封止栓１６が設けられているので、パッキンに刺し通した針状管（注射針など）を用いて溶液類（栄養源や有機塩素化合物など）を所定量追加注入できる。
（８）試験する地下水や有機塩素化合物などの内容物が異なる多くの種類のフレキシブル培養バッグを、例えば２０℃の恒温室に静置し、微生物の培養を行う。なお、内容物を攪拌する必要がある場合には、フレキシブル培養バッグを曲げるなど変形させたり、揺り動かせば簡単に行える。
（９）バイオレメデレーション促進試験の場合には、定期的に（例えば数週間にわたって１日に１回程度ずつ）フレキシブル培養バッグから内容物の一部を試料として抜き出し、溶液中の有機塩素化合物の物質収支（分解物質の状況）を測定し記録する。試料を抜き出したフレキシブル培養バッグは、再び２０℃の恒温槽に戻して次の試料抜き出しまで静置する。これによって、浄化効果を定量的に判定することができる。
【００２８】
他の操作方法の例を以下に示す。これは嫌気性の液体培地を分注する場合である。
（１）各種栄養源と滅菌した水を密閉容器内に充填する。また酸化還元指示薬も添加しておく。
（２）減圧・ガス注入の繰り返しにより、密閉容器の内部を嫌気状態にする。即ち、減圧口から真空吸引して密閉容器の内部を減圧し、次に無酸素ガス供給口から無酸素ガスを注入する。これらの操作を繰り返すことで、密閉容器の内部は無酸素状態（嫌気状態）になる。
（３）嫌気状態であるか否かは、酸化還元指示薬によって判定する。レサズリンを用いた場合は、酸素が多く存在すれば青色、酸素量が少なくなれば赤色（ピンク色）に変わり、酸素が無ければ無色になるので、変色状態を目視により確認することで、嫌気状態になっていることが判定できる。
（４）フレキシブル培養バッグと分注装置とをコック付きスリーブと接続部で接続する。また密閉容器内を無酸素ガスで２気圧程度に加圧しておく。
（５）フレキシブル培養バッグにつながっているバルブを開放する。すると、密閉容器内で嫌気状態になっている溶液が、移送管とコック付きスリーブを通ってフレキシブル培養バッグに注入される。流量計を設置しておけば、注入量を測定することもできる。
（６）バルブを閉止し、コックも閉じ、スリーブを接続部から分離する。これによって、溶液注入後に、嫌気状態のまま、フレキシブル培養バッグを密閉容器から取り外すことができる。このように（４）〜（５）の操作を繰り返すことで、複数のフレキシブル培養バッグに密閉容器内の液体を分注（分取）することができる。
（７）フレキシブル培養バッグには、パッキン付き封止栓が備えられているので、注射針などを備えた器具によって該パッキンから溶液類（試験する微生物などを含む液体）を注入できる。また、培養の途中で栄養源などを追加することもできる。
（８）試験する嫌気性微生物などが異なる多くのフレキシブル培養バッグを、例えば２０℃の恒温室に静置し、微生物の培養を行う。内容物を攪拌する必要がある場合には、フレキシブル培養バッグを曲げるなど変形させたり、揺り動かせば簡単に行える。溶液類の注入あるいは取り出しを行ってバッグ内容物の量が変化しても、周囲はフレキシブルで変形自在なので内圧は大気圧と常に一致し、気密状態の維持と内圧変動防止が担保される。
【００２９】
このように、本発明に係る嫌気培養試験装置は、培養試験の目的に応じて様々な使用方法、使用形態が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係るフレキシブル培養バッグの典型的な例を示す説明図。
【図２】本発明に係る嫌気培養試験装置の一例を示す概略図。
【図３】本発明に係る嫌気培養試験装置の実施例を示す説明図。
【符号の説明】
【００３１】
１０  フレキシブル培養バッグ
１２  袋状体
１４  コック付きスリーブ
１６  パッキン付き封止栓
１８  複層材
２０  アルミニウム箔
２８  パッキン
４０  分注装置
４２  密閉容器
４４  バルブ
４６  接続部
４８  移送管
【図１】
2006025617.tif 000003
【図２】
2006025617.tif 000004
【図３】
2006025617.tif 000005