(57)【要約】  【課題】  微生物に適した有機酸合成酵素をコードする遺伝子を選抜し、該微生物による効率的な有機酸の製造法を提供する。  【解決手段】  ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子を導入した微生物による有機酸の製造法であり、前記の有機酸は乳酸であり、前記の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であり、そして、前記の微生物は酵母であり、その酵母は好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母である。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物による有機酸の製造方法。
【請求項２】
有機酸が乳酸である請求項１記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
有機酸がＬ-乳酸である請求項１または２記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
有機酸合成酵素をコードする遺伝子が乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項１〜３いずれかに記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
有機酸合成酵素をコードする遺伝子がL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項１〜４いずれかに記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
微生物が酵母である請求項１〜５いずれかに記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母である請求項６記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
酵母がサッカロマイセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)である請求項６または７記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物により有機酸を製造する方法に関するものである。
【０００２】
本発明で用いられるヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子であり、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物は、好ましくは、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された酵母である。
【背景技術】
【０００３】
最近、資源循環型社会の構築に向け、植物を原料としたポリマーに注目が集まっている。その中でも、ポリ乳酸（以下、ＰＬＡと略すことがある。）が、植物原料のポリマーとして優れた性質を有することが明らかになってきている。
【０００４】
ＰＬＡの原料である乳酸は、従来、ラクトバチラス（Lactobacillus）属やラクトコッカス（Lactococcus）属に代表される、いわゆる乳酸菌と総称される微生物を培養することにより生産されている。これらの乳酸菌は、糖からの乳酸の収率には優れているものの酸に対する耐性が低いことから、酸性物質である乳酸を多量に蓄積させるためには、炭酸カルシウムや水酸化アンモニウム、あるいは水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和をしながら、培養を行わなければならない。
【０００５】
しかしながら、この手段ではアルカリによる中和操作により、乳酸ナトリウムや乳酸カルシウムなどの乳酸塩が生じるため、その後の精製工程において乳酸塩を乳酸に戻す操作が必要になり、その処理にコストがかかっている。
【０００６】
そこで、酸に耐性のある酵母に乳酸を生産させる試みが報告されている（特許文献1〜３および非特許文献1参照）。酵母に乳酸を生産させることができれば中和操作の軽減が期待でき、すなわち低コストで乳酸を生産できる可能性が考えられる。
【０００７】
酵母は、本来乳酸生産能を持たないことから、酵母による乳酸生産を可能にするためには、遺伝子組み換え技術によりＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を酵母に導入しなければならない。ここで、より効率的な乳酸発酵を目指す場合、原料糖（例えば、グルコース）から乳酸への変換効率（例えば、対原料収率）が高ければ高い方がより望ましい。
【０００８】
従来、酵母に導入するＬ−ｌｄｈ遺伝子としては、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が用いられている（特許文献２、特許文献３および非特許文献1参照）が、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子は、原核生物から高等真核生物まで広く存在していることが知られている。すなわち、多数あるＬ−ｌｄｈ遺伝子の中から、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子よりも酵母に適したＬ−ｌｄｈ遺伝子を選抜することができれば、酵母を用いた、より効率的な乳酸生産が可能になると考えられる。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号公報
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Danilo Porro et al : Biotechnol.Prog , 11 : 294-298 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の目的は、微生物に適した有機酸合成酵素をコードする遺伝子を選抜し、該微生物による効率的な有機酸の製造方法を提供することにある。
【００１０】
さらに、本発明において、前記の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物は、好ましくは、有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であり、さらに、有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子である。
【００１１】
好ましくは、本発明の目的は、前記の酵母に適したＬ−ｌｄｈ遺伝子を選抜し、該酵母による効率的な乳酸の製造方法を提供することであり、より好ましくは、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子よりも酵母に適したＬ−ｌｄｈ遺伝子を選抜し、該酵母による効率的な乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上述の課題を解決するために、由来の異なる複数のＬ−ｌｄｈ遺伝子をそれぞれ酵母に導入し、乳酸生産量を指標にＬ−ｌｄｈ遺伝子の選抜を行った。その結果、従来用いられているウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号４）を導入した酵母よりも、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号５）を導入した酵母の方が高い乳酸生産性を示し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の有機酸の製造方法は、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物による有機酸の製造方法である。
【００１４】
本発明の有機酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の有機酸は乳酸であり、その乳酸は好ましくはＬ-乳酸である。
【００１５】
本発明の有機酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であり、その乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は好ましくはL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である。
【００１６】
本発明の有機酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物は酵母であり、その酵母は好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母であり、そのサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母は好ましくはサッカロマイセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、微生物にヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子を導入することにより効率的に有機酸を製造することができる。詳しくは、酵母にヒト由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することにより、効率的に乳酸等の有機酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１９】
［有機酸合成酵素をコードする遺伝子のクローニング］
本発明において、本発明で使用されるヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。本発明で用いられる有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子である。
【００２０】
有機酸合成酵素をコードする遺伝子をクローニングする方法としては、既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ (polymerase chain reaction) 法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、既知の遺伝子情報に基づき、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子、好ましくはＬ−ｌｄｈ遺伝子には、遺伝的多型性や変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。
【００２１】
遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものであり、また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット(Mutan-K(タカラバイオ社製))を用いる方法や、ランダム変異導入用キット(BD Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(CLONTECH社製))を用いる方法などがある。
【００２２】
［遺伝子導入ベクターの作製］
本発明で使用されるヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、通常、微生物で利用する発現ベクターに導入することにより、微生物で発現可能な形態をとることができる。好ましくは、前記のヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子である。
【００２３】
さらに、ヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物は、好ましくはヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された酵母である。
【００２４】
通常、酵母で利用する発現ベクターは、例えば、酵母の２μmプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）もしくはセントロメアの複製開始点と大腸菌のＣｏｌＥ１複製開始点の両方を有しており、また、例えば、薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ３およびＬＥＵ２等の酵母選択マーカー、および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することが好ましい。また、導入した遺伝子を発現させるために、その遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびＧＡＰＤＨターミネーターが挙げられる。しかしながら、発現ベクターはこれらに限定されるものではなく、例えば、染色体挿入型のベクターであってもかまわない。
【００２５】
［遺伝子の導入方法］
本発明で用いられるヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子が導入された微生物は、上記のヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子発現ベクターを微生物に導入することにより得られる。本発明において、前記のヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子は、好ましくはＬ−ｌｄｈ遺伝子である。さらに、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された微生物は、好ましくは、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母である。
【００２６】
遺伝子発現ベクターの微生物への導入方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションおよびエレクトロポレーション等の方法があり、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。得られた形質転換体の培養方法はすでに公知であり、例えば、「M.D. Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold SpringHarborLaboratoryPress (1990)」等に記載されている方法が挙げられる。
【００２７】
本発明で使用されるヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターを導入する酵母は、好ましくはサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母である。酵母は、より好ましくは、サッカロマイセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００２８】
Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターは、発現可能であればどのような形態で酵母内に導入されてもかまわない。例えば、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００２９】
ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターが導入された酵母は、例えば、ＵＲＡ３等の選択マーカーで選択することができる。
【００３０】
［有機酸の製造法］
本発明で用いられる有機酸生産培地としては、炭素源を好ましくは１〜２０％含有しており、かつ微生物の生育に適した栄養素を含有しているものであれば特に限定されない。使用する菌株にとって最適の栄養源の組成および配合割合は、簡単な小規模実験により容易に決定することができる。
【００３１】
生産する有機酸は、好ましくは、Ｌ−乳酸等の乳酸であり、また、用いられる微生物は、好ましくはヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子を導入した酵母である。
【００３２】
導入する発現ベクターを酵母内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。特に好ましい培地は、炭素源としてグルコースを１〜１０％、窒素源としてYeast Nitrogen Base without amino acid（DIFCO社製）を０．６７％含有し、適切なアミノ酸を添加した合成培地である。
【００３３】
乳酸の製造に際しては、まず、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が導入された酵母の前培養を行った後、例えば、培養液２％を新しい培地に移して本培養することにより、乳酸を製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、一般に好ましくは２０〜４０℃の範囲の温度であり、より好ましくは３０℃前後の温度が好適である。また、培養時間は、好ましくは１０〜５０時間であり、より好ましくは２０〜４０時間である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
【００３４】
上記のような条件で培養することにより、培地中に５〜２０％の乳酸を得ることができる。得られた乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法やＦ−キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
「Ｌ−乳酸脱水素酵素活性」
本発明において、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子の発現産物であるＬ−乳酸脱水素酵素（以下、Ｌ−ＬＤＨと略すことがある。）の活性とは、Ｌ−ＬＤＨがピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ＋に変換する活性を示す。また、限定されるわけではないが、各Ｌ−ＬＤＨ活性の比較は、実施例４で後述するように比活性を指標として比較することができる。すなわち、同条件で培養したＬ−ｌｄｈ遺伝子導入酵母からタンパク質を抽出し、その抽出液を用いてＮＡＤＨの減少に伴う３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室温において１分間当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）と定義することにより、Ｌ−ＬＤＨの比活性は、次式（１）で表すことができる。
【００３５】
【数１】
2006280368.tif 000002
【００３６】
（式中、Δ３４０：１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量
６．２２：光路長１ｃｍにおけるＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数）
上記測定を同条件下で行い、算出されたＬ−ＬＤＨの比活性によりＬ−ＬＤＨ活性を比較することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００３８】
（実施例１： Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの作製）
本発明では、乳酸菌由来としてラクトバチラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチラス・サケイ（Lactobacillus sakei）およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）を用い、また哺乳類由来としてウシおよびヒトからＬ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングし（以下、これらを順に配列番号１〜５とする。）、比較を行った。各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。ＰＣＲの鋳型とするＤＮＡの調製方法を、以下に示す。
【００３９】
（Ｉ）乳酸菌
各乳酸菌を培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。
【００４０】
（II）ウシ
ウシの骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より、付属のプロトコールに従いファージミドを調製した。得られたファージミドを続くＰＣＲの鋳型とした。
【００４１】
（III）ヒト
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを、続くＰＣＲの鋳型とした。
【００４２】
ＰＣＲ増幅反応には、Taq DNA Polymeraseの５０倍の正確性を持つとされるKOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のＤＮＡの調整方法（Ｉ）〜（III）で得られたゲノムＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、およびｃＤＮＡをそれぞれ５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、およびKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子増幅用プライマー（ラクトバチラス・プランタラム：配列番号６，７  ラクトバチラス・サケイ：配列番号８，９  ペディオコッカス・アシディラクティシ：配列番号１０，１１  ウシ：配列番号１２，１３  ヒト：配列番号１４，１５）には、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００４３】
各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。大腸菌DH５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドが得られた。この各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図１）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に導入した。以後、このようにして作製した各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターを、ｐＬ−ｌｄｈ１（ラクトバチラス・プランタラム由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）、ｐＬ−ｌｄｈ２（ラクトバチラス・サケイ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）、ｐＬ−ｌｄｈ３（ペディオコッカス・アシディラクティシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）、ｐＬ−ｌｄｈ４（ウシ由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）、ｐＬ−ｌｄｈ５（ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）とそれぞれ示す。
【００４４】
（実施例２：Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターの酵母への導入）
実施例１のようにして得られたｐＬ−ｌｄｈ１〜５を酵母サッカロマイセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisiae）ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（CLONTECH社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＬ−ｌｄｈ１〜５の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＬ−ｌｄｈ１〜５の導入された形質転換体の選択が可能である。
【００４５】
このようにして得られた形質転換体へのＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰｒｅＭｉｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入されていることを確認した。
【００４６】
（実施例３：乳酸生産性の比較）
実施例２のようにして得られたｐＬ−ｌｄｈ１〜５が導入されたＮＢＲＣ１０５０５株（以下、それぞれＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ１〜５と示す。）を用いて乳酸生産テストを行い、各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子を比較した。
【００４７】
寒天培地上からＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ１〜５を少量とり、３mLのウラシル非添加の合成培地（２％グルコース、０．６７％ Yeast Nitrogen Base without amino acid(DIFCO社製)、１．９２ｇ／L dropout mixture without uracil(SIGMA社製)）に植菌し、３０℃の温度で一晩培養した（前培養）。以下、前記ウラシル非添加の合成培地培地をＳＣ−Ｕｒａと略す。前培養液を新しいＳＣ−Ｕｒａ（５%グルコース）１０mLに２％植菌し、３０℃の温度で培養を実施した。培養開始から４０時間後の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣにより乳酸量を測定した。
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）  移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）  反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）  検出方法：電気伝導度  温度：４５℃。
【００４８】
その結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
2006280368.tif 000003
【００５０】
Ｌ−ｌｄｈ遺伝子が導入されていないＮＢＲＣ１０５０５株では乳酸を全く生産していないのに対し、各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターを導入したＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ１〜５では乳酸の生産が確認できた。株による乳酸生産量の差は、導入した各Ｌ−ｌｄｈ遺伝子の違いに起因していると考えられる。
【００５１】
すなわち、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ５の乳酸生産量が最も多いことから、酵母に導入するＬ−ｌｄｈ遺伝子としてヒト由来のものが適していることがわかった。なお、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。  
【００５２】
（実施例４、比較例１：Ｌ−ＬＤＨ活性の比較）
実施例２で得られたＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ４およびｐＬ−ｌｄｈ５を用いて、ウシ由来Ｌ−ＬＤＨとヒト由来Ｌ−ＬＤＨの活性を比較した。
【００５３】
（ａ）菌体からのタンパク質抽出
寒天培地上からＮＢＲＣ１０５０５／ｐＬ−ｌｄｈ４とｐＬ−ｌｄｈ５をそれぞれ少量とり、３mLのＳＣ−Ｕｒａ液体培地に植菌し一晩培養した（前培養）。前培養液を新しいＳＣ−Ｕｒａ液体培地２０ｍＬに２％植菌し、１００ｍＬ容坂口フラスコを用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した（本培養）。本培養液１０ｍＬを遠心分離により集菌、１０ｍＬのリン酸バッファーで洗浄後、１ｍＬのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ（ＳＩＧＭＡ社製、直径０．６ｍｍ）を加え、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｕｂｅ  Ｍｉｘｅｒ（ＴＯＭＹ社製）を用い４℃で菌体を破砕した。このようにして菌体を破砕した後、遠心分離して得られる上清をＬ−ＬＤＨ酵素液とした。
【００５４】
（ｂ）Ｌ−ＬＤＨ活性測定
上記（ａ）で得られたＬ−ＬＤＨ酵素液の濃度を、ウシＩｇＧ（１．３８ｍｇ／ｍＬ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をスタンダードとして作製した検量線をもとにＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定し、それぞれのＬ−ＬＤＨ酵素液が０．５ｍｇ／ｍＬになるように滅菌水で希釈した。次に、表２に示した割合の２水準でＬ−ＬＤＨ酵素液およびＮＡＤＨを除いた混合液をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前にＬ−ＬＤＨ酵素液及びＮＡＤＨを加え混合した。
【００５５】
【表２】
2006280368.tif 000004
【００５６】
（表中、２ｘＢＲバッファー：０．０８Ｍ酢酸、リン酸、ホウ酸溶液を５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ調節した緩衝バッファー）
各Ｌ−ＬＤＨ酵素液の３４０ｎｍにおける吸光度の減少を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００Ｐｒｏ  アマシャム社製）で測定し、得られたΔ３４０の値を「Ｌ−乳酸脱水素酵素活性」の項に記した式（１）にあてはめ、ピルビン酸ナトリウム終濃度０．５ｍＭと１ｍＭについて、各Ｌ−ＬＤＨの比活性を算出した。その結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2006280368.tif 000005
【００５８】
この結果から、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がコードするＬ−ＬＤＨの比活性は、ウシ由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がコードするＬ−ＬＤＨの比活性よりも高いことを見いだした。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、微生物にヒト由来の有機酸合成酵素をコードする遺伝子を微生物に導入することにより効率的に有機酸を製造する方法であり、詳しくは、酵母にヒト由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を微生物に導入することにより、効率的に乳酸等の有機酸を製造することができるので、資源循環型社会の構築に向け、植物を原料としたポリマーの有効活用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明で用いられる酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【図１】
2006280368.tif 000006
【配列表】
2006280368000001.app