(57)【要約】【課題】新規メカニズムに基づくアレルギー性疾患等の免疫疾患の予防・治療薬等を提供すること。【解決手段】ＴＬＲリガンド等の樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなる、ＩＬ−２１産生誘導剤が提供される。本発明の剤は特にＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強力に誘導し、アレルギー性疾患等の免疫疾患の予防・治療に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなる、ＩＬ−２１産生誘導剤。
【請求項２】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が、ＴＬＲリガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ＴＬＲリガンドが、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、ザイモザン、リポペプチド、リポテイコ酸、ＲＳＶ  Ｆ  タンパク質、ファイブロネクチンＥＤＡドメイン、ＨＳＰ６０、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸、イミダゾキノリン系化合物、βグルカン、丸山ワクチン、マイコバクテリウムボビス、及びＯＫ−４３２からなる群から選択される、請求項２記載の剤。
【請求項４】
ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生誘導用である、請求項１記載の剤。
【請求項５】
免疫疾患の予防・治療剤である、請求項１記載の剤。
【請求項６】
該免疫疾患はアレルギー性疾患である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法であって、被験物質を樹状細胞に適用し、該樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を評価し、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導した物質を、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質として選択することを含む方法。
【請求項８】
免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、被験物質をＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生の誘導を評価し、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導した物質を、免疫疾患の予防・治療に有用な物質として選択することを含む方法。
【請求項９】
樹状細胞の存在下で、被験物質がＮＫＴ細胞に適用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定する方法であって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を被検者由来のＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することを含む方法。
【請求項１１】
樹状細胞の存在下で、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が被検者由来のＮＫＴ細胞に適用される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定するためのキットであって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質、ＮＫＴ細胞を調製するための試薬、及びＩＬ−２１産生を評価するための試薬を含むキット。
【請求項１３】
更に樹状細胞を調製するための試薬を含む、請求項１２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなるＩＬ−２１産生誘導剤及びその医薬用途、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法、アレルギー性疾患等の免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年以上に渡り、喘息、花粉症、及び湿疹のようなイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｅにより調節されたアレルギー性疾患の流行が、特に工業国において、劇的に増加した。例えば、喘息の発症率は、合衆国のみならず日本においても１９８０年からおよそ倍増し、今では５〜１０人に１人が冒されている。しかしながら、アレルギー性疾患の有意な増加の正確な理由や、ＩｇＥ抗体産生の制御のためのメカニズムは十分には決定されてこなかった。アレルギー性疾患の流行の有意な増加のための説明として、衛生仮説（Hygiene Hypothesis）がよく受け入れられてきた。この仮説は、工業国における改善された衛生と、感染の発生率を減少させる多くの抗生物質の使用が、ＩｇＥ産生を増強し得るＴヘルパー（Th）型反応の発生と、アレルギー性障害の増加した発生率とに関係していることを示唆している。逆に、この仮説を支持する幾つかの疫学的な研究が、感染性の物質への曝露がアレルギー性障害の発生率を減少させることを示してきている。後者の状況は、通常、Ｔｈ１型反応のような防御性免疫反応を駆動し、この反応はお互いにＴｈ２反応に対して抑制的である。従って、菌体産物による幾つかの治療戦略が、Ｔｈ２反応及びアレルギー反応の発生を抑制すると提唱されてきた。
Mycobacterium bovis bacillus Calmette Guerin (BCG)ワクチン接種とアレルギー性疾患の発生とが、特に出生直後に投与されたものでは、逆相関することが示唆されてきた（非特許文献１）。事実、ＢＣＧワクチン接種はＩｇＥ産生を抑制し、マウスモデル、及びヒト喘息において、アレルギー性疾患の発生を抑制することが報告されている（非特許文献１〜５）。ＢＣＧは生きた菌体であり、Ｔｈ１反応を誘導すると報告されていることから（非特許文献４）、これらの現象は上述の仮説にて主張された免疫反応によりたびたび説明されている。しかしながら、ＢＣＧ調節ＩｇＥ抑制のメカニズムに関して、ＢＣＧ投与後のＴｈ１シフトの所見については異論のあるところである（非特許文献３、６）。従って、ＩｇＥ抑制のための他のエフェクター細胞が考慮されるべきである。
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つであり、免疫系において制御的な役割を担っている。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識することを特徴とする（Science, 278, p.1626-1629, 1997; J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998; Science, 306, p.1786-1789, 2004）。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。過去の研究は、ＮＫＴ細胞は、自己免疫疾患発生からの保護、移植寛容の維持、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３等のサイトカイン産生を介した癌のための免疫学的監視等、多様な免疫反応において重要な役割を果たしていることを示した（非特許文献７）。ＩｇＥ産生の制御に関しては、α−ＧａｌＣｅｒ活性化ＮＫＴ細胞により産生された、ＩＬ−４ではなくＩＦＮ−γが、Ｔｈ２発生及びＩｇＥ産生を抑制することによって、Ｔｈ１細胞分化に対して優位な機能的効果を誘導した。しかしながら、多くの他の研究は、Ｔｈ２に偏った免疫反応やインビボにおけるＩｇＥ産生の増強におけるＮＫＴ細胞の役割が見出されている（非特許文献８〜１０）。従って、ＩｇＥ産生及びアレルギー性障害へのＮＫＴ細胞の寄与は、個々の状態において注意深く評価されるべきである。
幾つかの過去の報告がＢＣＧとＮＫＴ細胞との間の相関を示している。例えば、ＢＣＧに由来する脂質抗原がＮＫＴ細胞により認識され、グラニュローマ形成を誘導した（非特許文献１１）。更に、ＢＣＧ処理はＮＫＴ細胞の増殖（非特許文献１２）、及び抗炎症反応（非特許文献１３）を引き起こした。
ＢＣＧ等の菌体産物は、一般にＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれる一群の膜受容体により認識され、樹状細胞（ＤＣ）を刺激し、ＩＬ−１２等のサイトカインの産生や、共刺激分子の発現を増強し、免疫応答を誘導する。ＴＬＲは細胞外領域にロイシンに富む繰り返し構造を有し、また細胞質内領域にはＩＬ−１受容体とも共通する構造であるＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体相同性領域（Toll/IL-1 homologous domain, ＴＩＲドメイン）を有する。現在、ヒトのＴＬＲとして１０種類同定されている。ＴＬＲの多くはＴＩＲドメインを介して、細胞内に存在するアダプター分子であるＭｙＤ８８と会合する。この会合は最終的にはＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫカスケードの活性化に至るシグナル伝達経路を活性化する。
一方、ＩＬ−２１は最近既述されたサイトカインであり、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されることが知られている（非特許文献１４）。ＩＬ−２１はリンパ球系細胞機能を制御する幅広い能力を有している（非特許文献１５〜２０）。Ｂリンパ球による抗体産生に関しては、ＩＬ−２１はＩｇＥ産生の負のレギュレーターである（非特許文献２１、２２）。なぜなら、ＩＬ−２１は、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−４の両者により活性化されたＢ細胞のＩｇＥ産生を直接遮断し、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）欠損マウスは増強されたＩｇＥ産生を示すからである。従って、ＩＬ−２１はアレルギー反応を制御し得るサイトカインの一つであるが、どのような刺激がＩＬ−２１発現を効果的に誘導させるのか、またインビボにおいて真に機能的なＩＬ−２１産生細胞は何なのかについては、明らかでない点が多い。
【非特許文献１】Science, 275巻, p.77-79, 1997年
【非特許文献２】J Allergy Clin Immunol, 102巻, p.867-874, 1998年
【非特許文献３】Immunology, 93巻, p.307-313, 1998年
【非特許文献４】J Exp Med, 187巻, p.561-569, 1998年
【非特許文献５】Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 128巻, p.1058-1060, 2002年
【非特許文献６】Am J Respir Cell Mol Biol, 27巻, 244-249, 2002年
【非特許文献７】Annu Rev Immunol, 21巻, p.483-513, 2003年
【非特許文献８】J Exp Med, 190巻, p.783-792, 1999年
【非特許文献９】J Exp Med, 197巻, p.997-1005, 2003年
【非特許文献１０】Curr Opin Immunol, 15巻, p.627-633, 2003年
【非特許文献１１】Proc Natl Acad Sci USA, 96巻, p.5141-5146, 1999年
【非特許文献１２】Eur J Immunol, 29巻, p.650-659, 1999年
【非特許文献１３】J Immunol, 171巻, p.1961-1968, 2003年
【非特許文献１４】Nature, 408巻, p.57-63, 2000年
【非特許文献１５】J Immunol, 171巻, p.608-615, 2003年
【非特許文献１６】J Immunol, 169巻, p.3600-3605, 2002年
【非特許文献１７】J Leukoc Biol, 72巻, p.856-863, 2002年
【非特許文献１８】J Allergy Clin Immunol, 112巻, p.1033-1045, 2003年
【非特許文献１９】Immunology, 112巻, p.177-182, 2004年
【非特許文献２０】Blood, 102巻, p.4090-4098, 2003年
【非特許文献２１】Blood, 100巻, p.4565-4573, 2002年
【非特許文献２２】Science, 298巻, p.1630-1634, 2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＢＣＧ等のＴＬＲのリガンドによるアレルギー性疾患の抑制メカニズムを詳細に解明し、当該メカニズムに基づくアレルギー性疾患等の免疫疾患の予防・治療薬や、アレルギー性疾患等の免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、Ｖα１４ＮＫＴ細胞欠損（ＮＫＴ  ＫＯ）マウスを用いて、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が、ＢＣＧにより誘導される抗原特異的ＩｇＥ産生の抑制に必要であることが見出された。驚くべきことに、それはＴｈ１／Ｔｈ２のインバランスにより調節されてはおらず、ＮＫＴ細胞がそのＩＬ−２１発現を通してＩｇＥ産生を抑制したことを示した。ＩＬ−２１が通常のＴ細胞よりもＶα１４ＮＫＴ細胞においてより多量に発現されており、ＮＫＴ細胞によるサイトカイン産生がＢＣＧワクチン接種により誘導されるＩｇＥ抑制のために機能的に必須であった。ＢＣＧによるＮＫＴ細胞の活性化は樹状細胞（ＤＣｓ）からのＩＬ−１２産生を必要とし、これは自然免疫シグナリング経路により調節されていた。以上のような知見に基づき、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に関する。
［１］樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなる、ＩＬ−２１産生誘導剤。
［２］樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が、ＴＬＲリガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される、上記［１］記載の剤。
［３］ＴＬＲリガンドが、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、ザイモザン、リポペプチド、リポテイコ酸、ＲＳＶ  Ｆ  タンパク質、ファイブロネクチンＥＤＡドメイン、ＨＳＰ６０、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸、イミダゾキノリン系化合物、βグルカン、丸山ワクチン、マイコバクテリウムボビス、及びＯＫ−４３２からなる群から選択される、上記［２］記載の剤。
［４］ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生誘導用である、上記［１］記載の剤。
［５］免疫疾患の予防・治療剤である、上記［１］記載の剤。
［６］該免疫疾患はアレルギー性疾患である、上記［５］記載の剤。
［７］ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法であって、被験物質を樹状細胞に適用し、該樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を評価し、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導した物質を、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質として選択することを含む方法。
［８］免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、被験物質をＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生の誘導を評価し、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導した物質を、免疫疾患の予防・治療に有用な物質として選択することを含む方法。
［９］樹状細胞の存在下で、被験物質がＮＫＴ細胞に適用される、上記［８］記載の方法。
［１０］樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定する方法であって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を被検者由来のＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することを含む方法。
［１１］樹状細胞の存在下で、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が被検者由来のＮＫＴ細胞に適用される、上記［１０］記載の方法。
［１２］樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定するためのキットであって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質、ＮＫＴ細胞を調製するための試薬、及びＩＬ−２１産生を評価するための試薬を含むキット。
［１３］更に樹状細胞を調製するための試薬を含む、上記［１１］記載のキット。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなり、特にＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強力に誘導し得る。また、本発明のＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法によれば、、特にＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強力に誘導し得る物質を獲得することができる。ＮＫＴ細胞はインビボにおける真に機能的なＩＬ−２１産生細胞であることから、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導し得る物質は、アレルギー性疾患や腫瘍等の免疫疾患の予防・治療に極めて有用である。また、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によるアレルギー性疾患等の免疫疾患の治療に際して、当該物質を被検者由来のＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することにより、当該治療に対する感受性を判定することが可能であることから、当該治療方法に対して感受性が高く、有効性がより期待出来る患者を選択することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（１．ＩＬ−２１産生誘導剤）
後述の実施例から明らかなように、ＢＣＧ等のＴＬＲリガンドや、可溶性ＣＤ４０リガンド等の樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質により、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が強力に誘導される。従って、本発明は樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなる、ＩＬ−２１産生誘導剤を提供するものである。
【０００７】
本発明において、樹状細胞は、任意の哺乳動物由来のものを用いることが出来る。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【０００８】
樹状細胞とは、リンパ系組織等に存在する抗原提示細胞であり、細胞表面上に発現されたＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ様分子（ＣＤ１等）、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ等を介して抗原を提示し、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞を活性化させる。樹状細胞は種々の刺激により活性化され、様々なサイトカインを産生する。特に、樹状細胞はインビボにおける主要なＩＬ−１２産生細胞であり、樹状細胞から放出されたＩＬ−１２は周囲の細胞に作用し、免疫反応を修飾し得る。
【０００９】
本明細書において、「ＩＬ−１２産生」、「ＩＬ−２１産生」とは、サイトカインポリペプチドの産生を意味する。また、「サイトカイン産生の誘導」は、サイトカインを産生していない状態にある対象を、該サイトカインを産生する状態へ変化させることのみならず、既にサイトカインを産生している対象における該サイトカインの産生量を増強させることをも含む概念である。
【００１０】
ＩＬ−１２は、公知のサイトカインであり、ジスルフィド結合した約４０kDa（ｐ４０）と約３５kDa（ｐ３５）のサブユニットからなる約７５kDa のヘテロ二量体性サイトカインである。ＩＬ−１２のそれぞれのサブユニットのアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列も公知であり、例えばヒト（J. Immunol., vol.146, p.3074, 1991; Proc Natl Acad Sci USA, vol.88, p.4143, 1991）、マウス（J. Immunol., vol.148, p.3433, 1992）の配列が報告されている。ＩＬ−１２は樹状細胞、Ｂ細胞、貪食細胞等において産生されるが、特に樹状細胞は強力なＩＬ−１２産生細胞である。樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質としては、例えば、ＴＬＲリガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−α等を挙げることができる。
【００１１】
ＴＬＲリガンドとしては、哺乳動物のＴＬＲにより認識される物質であれば特に限定されない。哺乳動物には、複数種類のＴＬＲが存在することが知られており、例えばヒトにおいては１０種類（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０）のＴＬＲが知られているが、いずれのＴＬＲに対するリガンドも、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る限り、本発明に包含される。
【００１２】
具体的には、ＴＬＲリガンドとしては、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、ザイモザン、リポペプチド、リポテイコ酸、ＲＳＶ  Ｆ  タンパク質、ファイブロネクチンＥＤＡドメイン、ＨＳＰ６０、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸、イミダゾキノリン系化合物、βグルカン、丸山ワクチン、マイコバクテリウムボビス、ＯＫ−４３２等の物質を挙げることができる。
【００１３】
ＴＬＲリガンドの多くは、生物、ウイルス等に由来する物質であるので、ＴＬＲリガンドを含有する生物等から自体公知の方法で抽出を行うことによって単離・精製することが出来る。
【００１４】
また、ＴＬＲリガンドが、生物、ウイルス等に由来する物質である場合、ＴＬＲリガンドを含有する生物、ウイルス等や、それらの一部、あるいはそれらからの抽出物等もＴＬＲリガンドに含まれるものと解する。この場合、ＴＬＲリガンドを含有する生物の生死は特に限定されない。例えばＬＰＳ（リポ多糖）はグラム陰性菌に共通して存在し、グラム陰性菌の菌体外膜の主成分であるので、グラム陰性菌やその菌体外膜もＴＬＲリガンドに包含される。また、ペプチドグリカンはグラム陽性菌の外膜を構成するので、グラム陽性菌やその外膜もＴＬＲリガンドに包含される。同様に、結核菌等の抗酸菌やその細胞壁（これらはリポアラビノマンナンを含有する）、酵母やその細胞壁（これらはザイモザンを含有する）、種々のバクテリアやマイコプラズマ、あるいはそれらの細胞膜（これらはリポペプチドを含有する）、グラム陽性菌やその細胞壁（これらはリポテイコ酸を含有する）、呼吸器多核体ウイルス（これはＲＳＶ  Ｆ  タンパク質を含有する）、腸内細菌等の運動性細菌やその鞭毛繊維（これらはフラジェリンを含有する）、バクテリアやそのＤＮＡ（これらは非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡを含有する）、アガリクス、マイタケ、サルノコシカケなどの茸類（これらはβグルカンを含有する）、マイコバクテリウムボビス、溶連菌等もＴＬＲリガンドに包含される。
【００１５】
このうち、マイコバクテリウムボビス（ウシ型結核菌）に関しては、その菌株の種類は限定されないが、安全性等を考慮すると、弱毒菌であるカルメット−ゲラン（ＢＣＧ）菌株が好ましい。マイコバクテリウムボビスは生菌であっても死菌であってもよい。また、マイコバクテリウムボビスの菌体の一部（例えば細胞壁骨格（ＣＷＳ）、細胞壁（ＣＷ）等）も、本発明の範囲に包含される。マイコバクテリウムボビスのＣＷＳは公知文献（Cancer Res., 33, 2187-2195(1973); J. Natl. Cancer Inst., 48, 831-835(1972); J. Bacteriol., 94, 1736-1745(1967); Gann, 69, 619-626(1978); J. Bacteriol., 92, 869-879(1966); J. Natl. Cancer Inst., 52, 95-101(1974)等）に基づき単離・製造することが可能である。マイコバクテリウムボビスは、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ等のＴＬＲリガンド化合物を含有する。
【００１６】
ＴＬＲリガンドは、化学的に合成されたものであってもよい。例えば、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸等は市販の核酸合成装置により合成することが可能である。また、イミダゾキノリン系化合物は、自体公知の方法により製造することが可能である（Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 44(4), p.709-714, 1996）。ＲＳＶ  Ｆ  タンパク質、ファイブロネクチンＥＤＡドメイン、ＨＳＰ６０、フラジェリン等のポリペプチドは、公知のペプチド合成法（固相合成法、液相合成法等）に従って製造することもできる。
【００１７】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌと略記する場合がある）はＴＮＦファミリー分子の一員であるＩＩ型膜蛋白質（Ｎ−末端が細胞質にあり、Ｃ−末端が細胞外にある）である。ＣＤ４０Ｌは公知のタンパク質であり、ヒトＣＤ４０Ｌは、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（１９９２）および米国特許出願第０７／９６９，７０３号明細書に記載されたように、末梢血Ｔ細胞からクローン化され、マウスＣＤ４０Ｌのクローニングは、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０，１９９２に記載されている。可溶性ＣＤ４０ＬはＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインからなるか、或いはＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインと他の可溶性タンパク質（例えば抗体のＦｃ部分）との融合タンパク質等であり得る。可溶性ＣＤ４０Ｌは市販もされており、例えば可溶性マウスＣＤ４０ＬはＲ＆Ｄ社より入手可能である。
【００１８】
より効率的にＩＬ−２１産生を誘導するという観点からは、上述のＴＬＲリガンドのうち、特に非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、リポアラビノマンナン、マイコバクテリウムボビス等が好ましい。また、より効率的にＩＬ−２１産生を誘導するという観点から、マイコバクテリウムボビスとしては、ＢＣＧの生菌、ＢＣＧ−ＣＷ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧに含まれ得るリポアラビノマンナン等が好ましい。
【００１９】
ＩＬ−２１は、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列等も公知である（ＷＯ９９／６１６１７；ＷＯ２００２／０１０３９３；Nature, 408, p.57-63, 2000等）。ＩＬ−２１は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されることが知られていたが（Nature, 408, p.57-63, 2000）、後述の実施例から明らかなように、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と比較して、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生をより強力に誘導し得る。従って本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生誘導用であり得る。
【００２０】
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識する（Science, 278, p.1626-1629, 1997; J Exp Med, 188, p.1521-1528, 1998; Science, 306, p.1786-1789, 2004）。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。
【００２１】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、有効量の樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
【００２２】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、所望の効果を奏するような投与剤型にすることが好ましい。例えば、経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２４】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２５】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤の有効成分としてマイコバクテリウムボビス等の生菌を用いる場合には、これを凍結乾燥させた生ワクチン製剤とすることもまた好ましい。生ワクチン製剤は、適切な分散溶媒（例えば蒸留水、生理食塩水等）を用いて分散され、管針法にて接種される。更に、有効成分として菌体の一部（例えば細胞壁骨格、細胞壁、細胞膜、外膜等）を用いる場合には、エマルション製剤（例えば水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤等）の剤型をとることが好ましい。エマルション製剤の構成成分である油状物質としては鉱物油や動植物油等が挙げられる。エマルション製剤は必要に応じて界面活性剤、安定化剤、賦形剤等を含むことが出来る。また、エマルション製剤は凍結乾燥製剤の形とすることも可能である。その際、凍結乾燥製剤を分散するために使用される分散溶媒は、エマルション粒子の分散媒体となるものであり、蒸留水、生理食塩水等が挙げられるが、注射可能な分散溶媒であれば特に限定されない。
【００２６】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤における有効成分の含有量は、所望の薬理効果を奏することが出来る範囲で、有効成分の種類、剤型等を考慮し、適宜設定することが出来るが、通常、０．０００１〜１００重量％である。
【００２７】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に設定することは出来ないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。ＩＬ−２１は、Ｃε生殖系列転写（germline transcript）を阻害することによるＩｇＥ産生の遮断（Blood, 100, p.4565-4573, 2002）、ＩｇＥ産生Ｂ細胞に対するアポトーシスの誘導等の免疫を調節し得る作用を有するので、本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、種々の免疫疾患、例えば、アレルギー性疾患（特にアレルギー性喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等などのＩｇＥ調節アレルギー性疾患（Ｉ型アレルギー反応が関与する疾患））、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、多発性軟骨炎、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、ベーチェット病、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、グレーブス病、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、再生不良性貧血等）、乾癬、糸球体腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、橋本病、川崎病、膠原病）、移植による拒絶、炎症状態（関節及び筋肉における炎症及び疼痛（慢性関節リウマチ、リウマチ様骨髄炎、骨関節症、尿酸性関節炎等）、皮膚の炎症性状態（湿疹等）、眼の炎症性状（結膜炎等）、炎症を伴う肺の障害（喘息、気管支炎等）、炎症を伴う消化器の状態（アフタ性潰瘍、クローン病、萎縮性胃炎、いぼ状胃炎、潰瘍性大腸炎、脂肪便症、限局性回腸炎、過敏性腸症候群等）、歯肉炎、（手術又は障害後の炎症、疼痛、腫脹）、炎症に関連した発熱や疼痛、炎症性慢性腎状態（糸球体腎炎、ループス腎炎、膜性腎炎等）、ぶどう膜炎、接触皮膚炎等）、ショック（敗血性ショック、アナフィラキシー性ショック、成人型呼吸窮迫性症候群等）、癌（肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、ホジキン症等）、ウイルス疾患（肝炎等）等の予防・治療に有用である。
【００２９】
（２．ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質は、ＮＫＴ細胞等におけるＩＬ−２１産生を強力に誘導する。従って、本発明は、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法であって、被験物質を樹状細胞に適用し、該樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を評価し、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導した物質を、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質として選択することを含む方法を提供するものである。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法においては、まず被験物質及び樹状細胞が提供される。被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００３１】
樹状細胞は自体公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血等）から単離することが可能である。例えば、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカー（例えばＣＤ１１ｃ、ＣＤ８α、ＣＤ８５ｋ、ＦＤＬ−Ｍ１、ＤＥＣ−２０５等）に対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により樹状細胞を単離することができる。また、樹状細胞は、上述の哺乳動物の骨髄細胞等を適切な樹状細胞分化条件で培養することにより製造することも出来る。例えば、骨髄細胞はＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−４）の存在下で約６日間程度培養されることにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞：ＢＭＤＣ）へと分化する（Nature, 408, p.740-745, 2000）。
【００３２】
次に被験物質が樹状細胞に適用される。樹状細胞への被験物質の適用は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などをあげることが出来る。培養条件としては、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１〜約９６時間である。
【００３３】
次に、被験物質が適用された樹状細胞におけるＩＬ−１２産生が定量される。ＩＬ−１２産生は、ＩＬ−１２の転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の産生量は、種々の免疫学的手法により測定され得る。例えば、培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング法などにより測定することが出来る。また、細胞中の翻訳産物をフローサイトメトリー等により直接測定することも出来る。
【００３４】
そして、被験物質が適用された樹状細胞におけるＩＬ−１２産生量が、被験物質が適用されていない対照樹状細胞におけるＩＬ−１２産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を適用しない対照細胞におけるＩＬ−１２産生量は、被験物質を適用した細胞におけるＩＬ−１２産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００３５】
最後に、比較結果に基づいて、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導した物質が、ＩＬ−２１産生を誘導し得る物質として選択される。上述の様に、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と比較して、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生をより強力に誘導し得る。従って本発明の方法により得られるＩＬ−２１産生を誘導し得る物質は、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導し得る物質であり得る。本発明の方法により得られるＩＬ−２１産生を誘導し得る物質は、上述の種々の免疫疾患（例えばアレルギー性疾患）の予防・治療薬になり得る。従って、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を指標として、免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、被験物質を樹状細胞に到達し得るように動物へ投与することにより、被験物質を樹状細胞に適用し、該動物から単離された樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を評価することができる。動物を用いたスクリーニング方法は、インビボにおいて所望の効果を奏する物質を得ることが出来る点で優れている。
【００３７】
（３．免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法）
後述の実施例から明らかなように、ＢＣＧ投与により誘導されるＩＬ−２１産生の量は、通常のＴ細胞よりもＮＫＴ細胞の方が圧倒的に高いこと、またＮＫＴ  ＫＯマウスにおいてはＢＣＧ投与により誘導されるＩＬ−２１産生が激減すること等から、ＮＫＴ細胞がインビボにおいて真に機能的なＩＬ−２１産生細胞であることが理解される。従って、ＮＫＴ細胞においてＩＬ−２１産生を誘導し得る物質は、ＮＫＴ細胞からのＩＬ−２１産生を介して、アレルギー性疾患等の免疫疾患を予防・治療し得る。そこで、本発明は、免疫疾患の予防・治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、被験物質をＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生の誘導を評価し、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導した物質を、免疫疾患の予防・治療に有用な物質として選択することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法においては、まず被験物質及びＮＫＴ細胞が提供される。被検物質としては、上述のスクリーニング方法と同様のものを用いることが出来る。ＮＫＴ細胞は自体公知の方法によって、ＮＫＴ細胞を含有する上述の哺乳動物の組織（例えば、リンパ節、脾臓、末梢血、胸腺、肝臓、肺等）から、ＮＫＴ細胞の形質に基づいて単離することが可能である。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているので、これらの受容体に対する抗体を用いて、Ｔ細胞受容体とＮＫ受容体の二重陽性細胞をセルソーター、抗体磁気ビーズ法等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる。例えばマウスにおいては、ＮＫＴ細胞はＴＣＲβ＋ＮＫ１．１＋細胞、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋細胞であり得る。また、ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質を認識するので、当該糖脂質がロードされた可溶性のＣＤ１多量体（例えば四量体）が特異的に結合する細胞をセルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることができる（J Exp Med, 192, p.741-754, 2000; J Exp Med, 191, p.1895-1903, 2000）。更に、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られているので、ＮＫＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体のレパートリーを特異的に認識する抗体を用いて、セルソーター等により単離することで、ＮＫＴ細胞を得ることもできる。例えば、ヒトにおいては、ＮＫＴ細胞はＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞であり得る。
【００３９】
ＮＫＴ細胞は、生体中の組織から単離された後に、インビトロで増殖された細胞や、株化された細胞をも含む。ＮＫＴ細胞は、自体公知の方法によりインビトロで増殖させることが可能であり、例えば、α−ガラクトシルセラミドがパルスされた樹状細胞の存在下で培養されることにより、ＮＫＴ細胞は増殖する。また、ＮＫＴ細胞の株化は、自体公知の方法（J Exp Med, 191, p.105-114, 2000）を用いて行うことが可能である。
【００４０】
次に、被験物質がＮＫＴ細胞に適用される。樹状細胞への被験物質の適用は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などをあげることが出来る。培養条件としては、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１〜約９６時間である。
【００４１】
後述の実施例から明らかなように、ＢＣＧ刺激により誘導されるＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生には、樹状細胞の共存が重要であることが理解される。従って、被験物質は、樹状細胞の存在下でＮＫＴ細胞へ適用されることが好ましい。また、ＩＬ−１２に対する抗体や、ＣＤ１ｄに対する抗体の添加によって、ＢＣＧ刺激により誘導されるＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が阻害されることから、樹状細胞はＮＫＴ細胞へＣＤ１を介して接触し、かつ樹状細胞から産生されたＩＬ−１２がＮＫＴ細胞に作用し得るような態様で、樹状細胞は培養物中に存在することが好ましい。
【００４２】
次に、被験物質が適用されたＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が定量される。ＩＬ−２１産生は、ＩＬ−２１の転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の産生量は、種々の免疫学的手法により測定され得る。例えば、培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング法などにより測定することが出来る。また、細胞中の翻訳産物をフローサイトメトリー等により直接測定することも出来る。
【００４３】
そして、被験物質が適用されたＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生量が、被験物質が適用されていない対照ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を適用しない対照細胞におけるＩＬ−２１産生量は、被験物質を適用した細胞におけるＩＬ−２１産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
【００４４】
最後に、比較結果に基づいて、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導した物質が、免疫疾患（例えばアレルギー性疾患等）の予防・治療に有用な物質として選択される。このようにして得られた物質を用いれば、上述の本発明のＩＬ−２１産生誘導剤と同様にして、上述の免疫疾患（例えばアレルギー性疾患等）の予防・治療剤を製造することが出来る。従って、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を指標として、上述の種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【００４５】
（４．樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定する方法）
後述の実施例に示されるように、ＢＣＧ投与によるＩｇＥ抑制は、ＮＫＴ細胞において産生されたＩＬ−２１が重要な役割を果たしていることから、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質により刺激された被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することにより、当該物質による免疫疾患（例えばアレルギー性疾患等）の治療に対する感受性を判定することができる。従って、本発明は樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定する方法であって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を被検者由来のＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することを含む方法を提供する。
【００４６】
本発明の判定方法においては、通常、まず被検者よりＮＫＴ細胞が提供される。上述と同様に、ＮＫＴ細胞は、被検者（好ましくはヒト）のＮＫＴ細胞を含有する組織（例えば、リンパ節、脾臓、末梢血、胸腺、肝臓、肺等）から、ＮＫＴ細胞の形質に基づいて単離することが可能であるが、採取の容易性を考慮すれば、被検者の末梢血からＮＫＴ細胞を単離することが好ましい。末梢血中のＮＫＴ細胞の数は肝臓等と比較すると非常に少ないので、単離されたＮＫＴ細胞をインビトロで増殖させて用いてもよい。
【００４７】
次に、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質がＮＫＴ細胞に適用される。ＮＫＴ細胞への当該物質の適用は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などをあげることが出来る。培養条件としては、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１〜約９６時間である。
【００４８】
上述と同様に、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質は、樹状細胞の存在下でＮＫＴ細胞へ適用されることが好ましい。また、樹状細胞はＮＫＴ細胞へＣＤ１を介して接触し、かつ樹状細胞から産生されたＩＬ−１２がＮＫＴ細胞に作用し得るような態様で、用いられることがより好ましい。
【００４９】
次に、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が適用されたＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が定量される。ＩＬ−２１産生は、ＩＬ−２１の転写産物（mRNA等）又は翻訳産物（ポリペプチド、タンパク質等）を対象として自体公知の方法により定量できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の産生量は、種々の免疫学的手法により測定され得る。例えば、培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング法などにより測定することが出来る。また、細胞中の翻訳産物をフローサイトメトリー等により直接測定することも出来る。
【００５０】
そして、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質が適用されたＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生量が、該物質が適用されていない対照ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生量と比較される。産生量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。対照ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生量は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を適用した細胞におけるＩＬ−２１産生量の測定に対し、事前に測定した産生量であっても、同時に測定した産生量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。以上により、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質により刺激されたときの、被検者由来のＮＫＴ細胞のＩＬ−２１産生能力を評価することが可能となる。
【００５１】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による刺激時の、被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が、相対的に高い場合には、当該被検者は、当該物質による免疫疾患（例えばアレルギー性疾患等）の治療に対する感受性が高いと判定することが出来る。一方、被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が、相対的に低い場合には、当該被検者は、当該物質による免疫疾患（例えばアレルギー性疾患等）の治療に対する感受性が低いと判定することが出来る。
【００５２】
被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が、相対的に高いか或いは低いかの判断は、例えば、予め統計学的解析に十分な数の被検者集団を用いて、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によるＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を測定し、その標準値（平均値）等に基づき判断することが出来る。例えば、被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が、標準値＋標準誤差の値よりも高い場合は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によるアレルギー性疾患等の免疫疾患の治療に対する感受性が高いと判断し、逆に、被検者由来のＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生が、標準値−標準誤差の値よりも低い場合は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によるアレルギー性疾患等の免疫疾患の治療に対する感受性が低いと判断することができる。
【００５３】
本発明の判定方法において、被検者由来のＮＫＴ細胞への樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質の適用は、インビトロのみならずインビボにおいて行われてもよい。例えば、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質をＮＫＴ細胞に到達し得るように被検者に投与することにより、該物質をＮＫＴ細胞に適用した後に、当該被検者から単離されたＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価してもよい。
【００５４】
本発明は、また、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する感受性を判定するためのキットであって、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質、ＮＫＴ細胞を調製するための試薬、及びＩＬ−２１産生を評価するための試薬を含むキットを提供する。本発明のキットを用いれば、上述の本発明の判定方法により容易に樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質による免疫疾患の治療に対する被検者の感受性を判定することが出来る。
【００５５】
樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質としては上述の物質（ＴＬＲリガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−α等）を挙げることが出来る。
【００５６】
ＮＫＴ細胞を調製するための試薬としては、例えば、Ｔ細胞受容体に対する抗体（抗ＴＣＲβ抗体、抗ＣＤ３抗体等）、ＮＫ受容体に対する抗体（抗ＮＫ１．１抗体）、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）やイソグロボトリヘキソシルセラミドなどの糖脂質がロードされた可溶性のＣＤ１多量体（例えば四量体）、ＮＫＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体のレパートリーを特異的に認識する抗体（例えば抗Ｖα２４抗体、抗Ｖβ１１抗体）等を挙げることが出来る。
【００５７】
ＩＬ−２１産生を評価するための試薬としては、抗ＩＬ−２１抗体、ＩＬ−２１遺伝子を特異的に認識し得る核酸プローブ、ＩＬ−２１遺伝子を特異的に増幅し得るプライマーセット等を挙げることが出来る。
【００５８】
本発明のキットは更に樹状細胞を調製するための試薬を含んでいてもよい。樹状細胞を調製するための試薬としては、例えば、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカー（例えばＣＤ１１ｃ、ＣＤ８α、ＣＤ８５ｋ、ＦＤＬ−Ｍ１、ＤＥＣ−２０５等）に対する抗体、骨髄細胞等から樹状細胞を誘導するための試薬（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４等）を挙げることが出来る。更に、本発明のキットは、本発明の判定方法のプロトコールが記載された指示書を含むこともできる。
【００５９】
本発明の上記判定方法及びキットは、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によりアレルギー性疾患等の免疫疾患に罹患した患者を治療するのに先立ち、当該治療の効果を予測したり、当該治療に対する感受性が高く、治療効果がより期待出来る患者を選別することが可能となり、臨床における治療方針決定の基礎となる情報を提供し得る。
【００６０】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
〔１〕実験方法
（マウス）
６〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスがJapan CREA Incから購入された。Ｊα２８１欠損マウスの作成は既述されている（Science, 278, p.1623-1626, 1997）。Ｊα２８１欠損マウスはＢＡＬＢ／ｃマウスへ１０回戻し交配された。ＩＲＡＫ−４  ＫＯマウスは既述されている（Nature, 416, p.750-756, 2002）。全てのマウスは特定病原不在条件下で、本願発明者らの動物実験施設にて維持され、オボアルブミン（ＯＶＡ）不含餌により飼育された。マウスはRIKEN RCAIの動物保護のガイドラインに従って処置された。
【００６２】
（アレルギー感作手順及びＢＣＧワクチン接種）
アレルギー皮上感作は、幾つかの変更が加えられ、既述の通り行われた（Int Arch Allergy Immunol, 124, p.461-469, 2001）。即ち、ＯＶＡ（grade V, Sigma-Aldrich）を含有する、或いは含有しない１００μｌのＰＢＳを染込ませた１ｃｍ２の無菌パッチが、剃毛された背中の皮膚の上に置かれ、生物閉塞性の包帯及び弾性包帯により固定された。パッチは４８時間に渡りそのまま置かれ、そして除去された。各感作過程が同一の皮膚部位において３〜４週間の全週繰り返された。ＢＣＧワクチン接種のために、臨床における幼児へのワクチン接種において通常用いられている、５００μｇの弱毒化されたＢＣＧ（strain Tokyo; Japan BCG Laboratory）が、マウスの腹腔内へ注入された。対照マウスは生理食塩水のみが投与された。
【００６３】
（フローサイトメトリー）
通常、１００万個の細胞がそれぞれの抗体により染色された。使用された抗体は、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１９、ＦＩＴＣ−抗ＴＣＲβ、ＰＥ−抗ＣＤ１１ｃ、及びＰｅｒＣＰ−抗ＩＬ−１２（BD PharMingen）である。ＰＥが結合され、α−ＧａｌＣｅｒがロードされたＣＤ１ｄ四量体（ＣＤ１ｄ−ｔｅｔ）は、既述のように調製された（J Exp Med, 191, p.1895-1903, 2000）。細胞内染色のために、ＤＣｓは固定され、BD Cytofix CytopermTMkit（BD PharMingen）により透過処理され、ＰｅｒＣＰ−抗ＩＬ−１２により染色された。染色された細胞はFACS Calibur（BD PharMingen）により解析された。
【００６４】
（細胞調製及び培養）
肝臓ＭＮＣｓは既述されたように調製された（J Exp Med, 191, p.105-114, 2000）。ＴＣＲβ陽性細胞は、肝臓ＭＮＣｓをＦＩＴＣ−抗ＴＣＲβにより染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）及びAuto MACSTM sorter（Miltenyi Biotec）を用いて精製することにより獲得された。回収精度は＞９８％であった。一部の試験においては、通常のＴ細胞（ＴＣＲβ＋ＣＤ１ｄ−ｔｅｔ−）及びＶα１４ＮＫＴ細胞（ＴＣＲβ＋ＣＤ１ｄ−ｔｅｔ＋）がMoFlo（Cytomation）によりソートされた。骨髄由来ＤＣｓは、ＧＭ−ＣＳＦ添加骨髄培養物から既述のように調製された（Nature, 408, p.740-745, 2000）。全ての細胞は、１０％胎仔ウシ血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で、ＢＣＧ（５〜５００μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下において、３７℃で７２時間培養された。ブロッキング試験においては、ＣＤ１ｄ又はＩＬ−１２に対する精製された抗体（BD PharMingen, クローンはそれぞれ1B1、C8.6である）又はアイソタイプコントロールが、Ｆｃブロッキングのための2.4G2抗体（BD PharMingen）の添加の後で、２０μｇ／ｍｌの濃度で添加された。
ＩｇＥ産生Ｂ細胞は、脾臓ＣＤ１９陽性細胞から、可溶性マウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ）及び組換え型ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ、Peprotec）を用いて、既述（J.Immunol., 155, p.5637, 1995）の様に生成された。Ｂ細胞は肝臓ＭＮＣｓと共に、あるいは肝臓ＭＮＣｓなしで、抗マウスＩＬ−２１中和抗体（２０μｇ／ｍｌ、クローンAF594、Ｒ＆Ｄ）の存在下又は不在下で、インキュベートされた。
【００６５】
（ＥＬＩＳＡ）
培養上清中及びヘパリン化血漿中のサイトカイン及びＩｇサブクラスはキット或いは抗体のセット（BD PharMingen）を用いて、製造者の指示書に従って測定された。特異的な抗ＯＶＡ−ＩｇＥ抗体は既述のように測定された（J Exp Med, 187, p.561-569, 1998）。
【００６６】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡがＴｒｉｚｏｌ（GIBCO）により抽出され、ｃＤＮＡがオリゴｄＴプライマーを用いて合成された。以下のプライマーセットがＲＴ−ＰＣＲのために用いられた：
（ＩＬ−２１）
5’ -CCCTTGTCTGTCTGGTAGTCATC-3’（配列番号１）
5’ -ATCACAGGAAGGGGCATTTAGC-3’（配列番号２）
（ＣＤ１９）
5’ -ACCAGTACGGGAATGTGCTC-3’（配列番号３）
5’ -TTCATAGGCCTCCCCTTCTT-3’（配列番号４）
（ＩｇＥ）
5’ -AGGAACCCTCAGCTCTACCC-3’（配列番号５）
5’ -GCCAGCTGACAGAGACATCA-3’（配列番号６）
（ＩｇＭ）
5’ -TCCACTACGGAGGCAAAAAC-3’（配列番号７）
5’ -TGTGATCGGTTTTGGAGTGA-3’（配列番号８）
（ＩＬ−２１Ｒ）
5’ -TGTCAATGTGACGGACCAGT-3’（配列番号９）
5’ -CAGCATAGGGGTCTCTGAGG-3’（配列番号１０）
（γｃ）
5’ -GTCGACAGAGCAAGCACCATGTTGAAACTA-3’（配列番号１１）
5’ -GGATCCTGGGATCACAAGATTCTGTAGGTT-3’（配列番号１２）
（ＨＰＲＴ）
5’ -AGCGTCGTGATTAGCGATG-3’（配列番号１３）
5’ -CTTTTATGTCCCCCGTTGAC-3’（配列番号１４）
上述の転写物を検出するためのＰＣＲサイクルの数は以下の通りである。
ＩＬ−２１：３５サイクル
ＣＤ１９：３０サイクル
ＩｇＥ：３０サイクル
ＩｇＭ：３０サイクル
ＩＬ−２１Ｒ：３５サイクル
γｃ：３５サイクル
ＨＰＲＴ：３５サイクル
ＰＣＲ産物はエチジウムブロマイド染色により可視化され、確実性を確認するためにＤＮＡシークエンシングに供された。全ての試験において、ｃＤＮＡの量はハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴを、プライマー、Taqmanプローブ（Applied Biosystem）、及びPRISM7000TM real-time PCR system（Applied Biosystem）を用いて定量することにより標準化された。
【００６７】
（核抽出物の調製及びＥＭＳＡ）
ＤＣｓ（２×１０６個）が回収され、10ｍＭ HEPES-KOH, pH7.8, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, pH8.0, 0.1% NP-40中において、低浸透圧溶解により、氷上で破裂させた。核が、３０分間、４℃にて50ｍＭ HEPES-KOH, pH7.8, 420mM KCl, 0.1mM EDTA, pH8.0, 5mM MgCl2, 2% Glycerol中でローテーターによりゆっくりと攪拌しながらのインキュベーションにより抽出された。全ての緩衝液はプロテアーゼ阻害剤（1mM DTT, 0.5mM PMSF, 2μg/ml aprotinin, 2μg/ml pepstatin, 2μg/ml leupepsin）を含有した。抽出物は分注され、直ちに凍結され、−８０℃にて保存された。ＮＦ−κＢコンセンサス配列（5’ -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’：配列番号１５）からなるオリゴペプチドがPromegaより購入された。該オリゴヌクレオチドは［γ-32P］ATPにより、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識され、ＥＭＳＡアッセイがGel Shift Assay Systems（Promega）を用いて行われた。
【００６８】
〔２〕結果
（ＢＣＧワクチン接種はＶα１４ＮＫＴ細胞を活性化し、ＯＶＡパッチにより誘導されたＩｇＥ産生を、Ｖα１４ＮＫＴ細胞依存的な様式で抑制する）
本試験において、通常の蛋白質抗原パッチ感作プロトコールが、ＢＣＧワクチン接種と共に、或いはＢＣＧワクチン接種をせずに行われた。本願発明者らは、初めに、ＢＣＧワクチン接種が、このモデルにおいてＶα１４ＮＫＴ細胞を活性化し得るか調べた。５００μｇのＢＣＧが、１週間に１回、３週間にわたり、オボアルブミン（ＯＶＡ）感作と共に、或いはＯＶＡ感作なしで、野生型（ＷＴ）ＢＡＬＢ／ｃへ腹腔内投与され、最終投与の１週間後に、肝臓単核細胞（ＭＮＣｓ）が回収され、解析された。α−ＧａｌＣｅｒがロードされたＣＤ１ｄ四量体により検出されたＶα１４ＮＫＴ細胞は、ＢＣＧワクチン接種のない場合は、ＭＮＣｓの約８〜１２％に相当した（図１、左及び中央）。しかしながら、ＢＣＧワクチン接種はＶα１４ＮＫＴ細胞の集団を３０〜３５％にまで有意に増大させた（図１、右）。ＢＣＧワクチン接種後のＶα１４ＮＫＴ細胞の増大は、脾臓においても観察された（データ示さず）。これらの結果は、ＢＣＧワクチン接種がＶα１４ＮＫＴ細胞を活性化し、増殖させることを示唆する。
【００６９】
ＢＣＧ接種の相対的なＩｇＥ抑制能力を決定するために、最終感作の１週間後に血漿が採集され、全体の及び抗原特異的なＩｇＥの量が測定された。ＷＴマウスにおいては、ＯＶＡ感作（Sensitiz., OVA; BCG, -）は、非感作（Sensitiz., O; BCG, -）と比較して、効果的に全体の及びＯＶＡ特異的な血漿ＩｇＥを誘導した（図２）。しかしながら、ＢＣＧワクチン接種はＩｇＥ産生を有意に阻害した（図２）。ＩｇＥ産生の阻害へのＶα１４ＮＫＴ細胞の影響を決定するために、本願発明者らは、ＢＣＧワクチン接種の抑制効果を、ＷＴマウスとＶα１４ＮＫＴ欠損（ＮＫＴ  ＫＯ）マウスとの間で比較し、ＮＫＴ  ＫＯマウスにおいては、ＢＣＧワクチン接種は、ＷＴマウスにおけるように、血漿ＩｇＥ濃度を抑制することができないことを見出した（図２）。これらのデータは、Ｖα１４ＮＫＴ細胞はＢＣＧワクチン接種によるＩｇＥ抑制に決定的な役割を果たしていることを示す。
【００７０】
（ＢＣＧ投与によるＴｈ１／Ｔｈ２反応の変化）
Ｂ細胞のアイソタイプＩｇクラススイッチへの運命付けは、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスによって、厳格に制御されていることがよく知られている。例えば、ＩｇＥ及びＩｇＧ１反応は抗原特異的Ｔｈ２細胞により調節され、ＩｇＧ２ａ反応はＴｈ１細胞に依存する（Annu Rev Immunol, 21, p.579-628, 2003）。同様にＶα１４ＮＫＴ細胞はＴｈ細胞分化を制御する役割を有することが報告されている（J Exp Med, 190, p.783-792, 1999、J Exp Med, 197, p.997-1005, 2003、Curr Opin Immunol, 15, p.627-633, 2003）。従って、本願発明者らは、血清中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＭの濃度を評価し、このＢＣＧワクチン接種モデルにおけるＴｈ１及びＴｈ２細胞の寄与を調べた。驚くべきことに、ＢＣＧ投与は、ＷＴマウスにおいては、ＩｇＧ１産生（Ｔｈ２反応）を強く増強した（図３）。同様に、ＩｇＧ２ａレベル（Ｔｈ１反応）はＷＴマウスにおいてＢＣＧ処理により増加したが、ＩｇＭ産生における影響は観察されなかった（図３ｃ）。対照的に、ＮＫＴ  ＫＯマウスにおいては、これらのＩｇ産生に対するＢＣＧ投与の影響はほとんどなかった（図３）。本願発明者らは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により活性化された、感作されたマウスの脾細胞からのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生を試験した。驚くべきことに、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１タイプ）のみならずＩＬ−４（Ｔｈ２タイプ）産生もＢＣＧ処理により用量依存的に増強された（図４）。これらの結果は、ＢＣＧ処理によるＩｇＥ産生の阻害は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをコントロールすることを経ていないことを示唆する。むしろ、ＢＣＧワクチン接種は、ＩｇＥ抑制へ寄与するＶα１４ＮＫＴ細胞の機能的変化を生じさせ得る。
【００７１】
（ＩＲＡＫ−４調節シグナル経路を介した、ＢＣＧワクチン接種による樹状細胞（ＤＣｓ）の活性化）
ＢＣＧ誘導Ｖα１４ＮＫＴ細胞活性化のメカニズムに迫るため、本願発明者らは次に、ＢＣＧ処理後のＤＣｓからのＩＬ−１２産生を評価した。ＢＣＧ処理後に血漿中ＩＬ−１２の明らかな上昇が観察された（図５）。骨髄（ＢＭ）由来ＤＣｓ（ＢＭＤＣｓ）が、インビトロにおいて、５０μｇ／ｍｌのＢＣＧで刺激され、そのＩＬ−１２産生が、細胞内染色によって単一細胞レベルで試験された。ＢＣＧ刺激によって、多数のＣＤ１１ｃ＋細胞がＩＬ−１２を産生したが、ＣＤ１１ｃ−画分はそうではなかった（図６左）。更に、ＢＣＧ刺激は、ＣｐＧと同様にＤＣｓにおいて、ＩＬ−１２の発現を誘導するのに決定的な転写因子であるＮＦ−κＢの活性化を導き、これは電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により証明された（図６右）。これらの結果は、ＢＣＧは、ＮＦ−κＢ活性化と共に、ＤＣにおけるＩＬ−１２産生を直接誘導できることを示す。
【００７２】
次に、ＢＣＧ誘導ＩＬ−１２産生のために責任のある細胞内シグナリング経路が試験された。これに取り組むために、本願発明者らは、ＷＴマウス又はＩＲＡＫ−４  ＫＯマウスのＢＭに由来するＤＣｓを刺激し、ＩＬ−１２産生を試験した。ＢＣＧ又はＣｐＧへの反応において、ＩＲＡＫ−４  ＫＯマウスからのＢＭＤＣｓは、ＷＴマウスからのＢＭＤＣｓと比較して、極めて少ない量のＩＬ−１２しか産生しなかったが、ＴＮＦ−α刺激に対しては、同等レベルのＩＬ−１２を産生した（図７）。同様に、ＭｙＤ８８  ＫＯマウスからのＢＭＤＣはＢＣＧ刺激に対してほとんどＩＬ−１２を産生しなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＢＣＧにより誘導されるＤＣｓからのＩＬ−１２産生には、ＴＮＦ−α調節活性化のためには必ずしも必要ではない、ＩＲＡＫ−４及びＭｙＤ８８を経るシグナル経路が必要であることを示す。
【００７３】
（ＢＣＧにより誘導されたＶα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１の発現）
これまでに得られたＢＣＧワクチン接種によるＩｇＥ抑制の結果は、Ｖα１４ＮＫＴ細胞及びＤＣｓの両方の寄与を示している。最近、Ｔ細胞から産生された、コモンγ鎖（γｃ）依存的サイトカインファミリーのメンバーの一つであるＩＬ−２１が、Ｔｈ２細胞分化に影響を与えずに、Ｂ細胞のＩｇＥ産生を抑制するが、ＩｇＧ１は抑制しないことが示された（Blood, 100, p.4565-4573, 2002）。そこで、本願発明者らは、活性化されたＶα１４ＮＫＴ細胞により誘導されたＩＬ−２１がＢＣＧワクチン接種によるＩｇＥ抑制のための鍵となり得る分子であるか、試験した。これを確認するために、本願発明者らは、まず、インビボでのＢＣＧによる処理後のＴ細胞受容体発現細胞（通常のＴ細胞及びＶα１４ＮＫＴ細胞の両方を含んでいる）におけるＩＬ−２１発現を評価した（図８）。ＢＣＧがＷＴ及びＮＫＴ  ＫＯマウスの腹腔内に投与され、示した時点において、肝臓ＭＮＣｓが調製され、ＴＣＲβ＋細胞が単離された。これらの細胞におけるＩＬ−２１転写が、ＨＰＲＴ発現による厳密なｃＤＮＡの標準化の後で、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出された。ＩＬ−２１転写は、ＷＴマウスの肝臓ＴＣＲβ＋細胞において、ＢＣＧ注入後６時間以内に検出された（図８ａ）。対照的に、ＮＫＴ  ＫＯマウスからのこれらの細胞においてはＩＬ−２１の転写は検出されず（図８ａ）、ＢＣＧ投与に反応して、Ｖα１４ＮＫＴ細胞がＩＬ−２１を産生したことが強く示唆された。これと一致して、Ｖα１４ＮＫＴ細胞のための特異的活性化剤である、α−ＧａｌＣｅｒの投与は、実質的にＩＬ−２１転写を誘導した（図８ａ）。Ｖα１４ＮＫＴ細胞における優位なＩＬ−２１の産生を確認するために、本願発明者らは、ＴＣＲβ＋画分からこれらの細胞をソートした。期待された通り、ＢＣＧ注入後の全ての時点において、通常のＴ細胞よりもＶα１４ＮＫＴ細胞においてより容易にＩＬ−２１転写が検出された（図８ｂ）。これらの結果は、ＢＣＧは特にＶα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強力に誘導するを意味する。
【００７４】
（ＢＣＧ投与によるＩｇＥ抑制のためのＩＬ−２１の必要性）
ＩＬ−２１を産生しているＮＫＴ細胞が実際にＢ細胞のＩｇＥ産生を抑制するかを試験するために、本願発明者らは共培養アッセイを行った。ＷＴマウスから獲得された、ナイーブな精製された脾臓Ｂ細胞が、インビトロでＩｇＥ産生形質細胞にするために、ＩＬ−４の存在下で可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激された。ＢＣＧ又はビヒクル処理されたマウスからの、Ｖα１４ＮＫＴ細胞が支配的である肝臓ＭＮＣｓがＢ細胞の培養物に添加され、ＩｇＥ産生が評価された。ＢＣＧ処理されたマウスからの肝臓ＭＮＣｓの添加は、ＩｇＥ産生を有意に阻害したが、ビヒクル処理されたマウスからの該細胞はそのような効果を示さなかった（図９左）。この阻害はＩＬ−２１依存的であった。なぜなら、抗ＩＬ−２１中和ｍＡｂ抗体の添加によりこの阻害が完全に取り消されたからである（図９左）。肝臓ＭＮＣｓの源としてＮＫＴ  ＫＯマウスを用いたときは、ＢＣＧ処理によってさえ、ＩｇＥ産生の抑制は誘導されず（図９右）、ＩｇＥ抑制においてＶα１４ＮＫＴ細胞は必須の役割を果たしており、これはＩＬ−２１により調節されていることが示された。
【００７５】
ＩＬ−２１はＩｇＥへのクラススイッチを阻害することにより、ＩｇＥ産生を遮断することが報告されている（Blood, 100, p.4565-4573, 2002）。そこで、本願発明者らは、Ｖα１４ＮＫＴ細胞の添加によるＩＬ−２１抑制のタイミングを試験した。ｓＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−４により処理されたＢ細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析において、処理に伴ってＩｇＥ及びＩＬ−２１Ｒ発現の有意な増大が検出されたが、コモンγのそれは有意には変化しなかった（図１０ａ）。これは、少なくともクラススイッチ誘導の３日後では、Ｂ細胞の幾つかはＩｇＥ産生形質細胞へなることを示す。そこで、本願発明者らは、Ｂ細胞培養物へのＮＫＴ細胞を含む肝臓ＭＮＣｓの添加のタイミングを変化させた。驚くべきことに、ＢＣＧ処理されたマウスからのＶα１４ＮＫＴ細胞の遅延した添加によって、培養の始めからそれらを添加したとき（図１０ｂ、前）と同様に、ＩｇＥ産生は強力に阻害された（図１０ｂ、後）。Ｖα１４ＮＫＴ細胞の遅延した添加によって見られたこの阻害は、依然ＩＬ−２１依存的であった。なぜなら、抗ＩＬ−２１ｍＡｂにより完全に該阻害がキャンセルされてしまうからである（図１０ｂ）。ＩＬ−２１と培養されたＢ細胞の生存率を評価すると、最近報告されたとおり、アポトーシスの頻度の増大が検出された（データ示さず）。これらの結果は、Ｖα１４ＮＫＴ細胞から産生されたＩＬ−２１は、ナイーブＢ細胞のみならず、既にクラススイッチをしたＢ細胞のＩｇＥ産生を抑制し、該抑制は、少なくとも一部は、アポトーシス誘導の結果であることを示す。
【００７６】
（ＢＣＧにより誘導されるＶα１４ＮＫＴ細胞でのＩＬ−２１発現におけるＤＣの関与）
ＢＣＧにより活性化されたＤＣがＶα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１発現を誘導するか、試験を行った。本願発明者らは、ＢＣＧの存在下で、Ｖα１４ＮＫＴ細胞を含有する肝臓ＴＣＲβ＋細胞及びＢＭＤＣｓを培養し、ＩＬ−２１発現を半定量的ＰＣＲにより解析した。この培養は、実質的にＩＬ−２１発現を誘導したが（図１１ａ）、一方、ＢＭＤＣｓの不在下では、ＩＬ−２１の発現は誘導されなかった（データ示さず）。従って、ＢＣＧ刺激におけるＩＬ−２１の誘導にはＤＣｓが必要である。ＢＣＧによるＶα１４ＮＫＴ細胞の活性化におけるＤＣｓの必要性の基礎となる分子メカニズムに迫るため、本願発明者らは共培養系におけるＩＬ−１２及びＣＤ１ｄ分子の関与を試験した。ＩＬ−２１発現は抗ＩＬ−１２ｍＡｂ或いは抗ＣＤ１ｄｍＡｂの添加により阻害されたが、アイソタイプｍＡｂは効果がなかった（図１１ｂ）。従って、細菌感染時のヒトＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γ産生を支配するメカニズムと同様に（Nat Immunol, 4, p.1230-1237, 2003）、ＤＣのＩＬ−１２及びＣＤ１ｄが、Ｖα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１発現に重要である。これは、ＢＣＧはＤＣｓにおけるＩＬ−１２産生を誘導し得ることを示したデータと一致している（図６、７）。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明のＩＬ−２１産生誘導剤は、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質を有効成分として含有してなり、特にＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強く誘導し得る。また、本発明のＩＬ−２１産生を誘導し得る物質のスクリーニング方法によれば、、特にＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を強く誘導し得る物質を獲得することができる。ＮＫＴ細胞はインビボにおける主要なＩＬ−２１産生細胞であることから、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を誘導し得る物質は、アレルギー性疾患や腫瘍等の免疫疾患の予防・治療に極めて有用である。また、樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得る物質によるアレルギー性疾患等の免疫疾患の治療に際して、当該物質を被検者由来のＮＫＴ細胞に適用し、該ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１産生を評価することにより、当該治療に対する感受性を判定することが可能であることから、当該治療方法に対して感受性が高く、有効性がより期待出来る患者を選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＢＣＧワクチン接種によるＶα１４ＮＫＴ細胞数の増加を示す図である。
【図２】ＢＣＧワクチン接種によるＩｇＥ抑制においてＶα１４ＮＫＴ細胞が重要であることを示す図である。左グラフは血漿中の抗ＯＶＡ  ＩｇＥ濃度（unit）を、右グラフは血漿中の全ＩｇＥ濃度（ng/ml）を示す。
【図３】ＢＣＧワクチン接種によるＴｈ１／Ｔｈ２反応の変化を、血清中の各アイソタイプ抗体の濃度を指標に示した図である。左グラフは血清中ＩｇＧ１濃度（μｇ／ｍｌ）を、中央グラフは血清中ＩｇＧ２ａ濃度（μｇ／ｍｌ）を、右グラフは血清中ＩｇＭ濃度（μｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
【図４】ＢＣＧワクチン接種の脾臓細胞サイトカイン産生への影響を示す図である。
【図５】ＢＣＧワクチン接種による血漿中ＩＬ−１２濃度上昇を示す図である。
【図６】ＢＣＧ刺激による樹状細胞におけるＩＬ−１２産生誘導を示す図である。左図はフローサイトメトリーによる解析結果を示し、右図はＥＭＳＡ解析の結果を示す。矢印はＮＦ−κＢのバンドを示す。
【図７】野生型マウス又はＩＲＡＫ４  ＫＯマウスから樹立された樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を示す図である。左図はＢＣＧ又はＣｐＧ刺激によるＩＬ−１２  ｐ４０産生量（ng/ml）を、右図はＴＮＦ−α刺激によるＩＬ−１２  ｐ４０産生量（ng/ml）をそれぞれ示す。
【図８】半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＢＣＧ刺激によるＩＬ−２１発現誘導を解析した結果を示す図である。ａは野生型マウス（ＷＴ）又はＮＫＴ  ＫＯマウスのＴ細胞受容体発現細胞におけるＩＬ−２１発現を、ｂはＶαＮＫＴ細胞又はＴ細胞におけるＩＬ−２１発現を示す。
【図９】野生型マウス（左グラフ）又はＮＫＴ  ＫＯマウス（右グラフ）の血漿中全ＩｇＥ濃度（ng/ml）を示した図である。
【図１０】Ｂ細胞におけるＩｇＥ産生に対する、肝臓単核球の影響を示す図である。ａは半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりインビトロにおけるＢ細胞のクラススイッチ誘導を解析した結果を示す図である。ｂは肝臓単核球の添加前後における培養上清中のＩｇＥ濃度（ng/ml）を示すグラフである。
【図１１】ＢＣＧ刺激によるＶα１４ＮＫＴ細胞におけるＩＬ−２１発現誘導を示す図である。ａはＢＣＧ刺激による肝臓ＴＣＲβ＋細胞におけるＩＬ−２１発現誘導を示す図である。ｂはＢＣＧ刺激により誘導された肝臓ＴＣＲβ＋細胞におけるＩＬ−２１発現に対する、抗ＩＬ−１２抗体又は抗ＣＤ１ｄ抗体の効果を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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