(57)【要約】【課題】  空隙部を有するタンパク質多孔マトリックスを調製する方法を提供する。【解決手段】  加熱可能な棒状体をタンパク質含有液に挿入した後に凍結する工程、前記棒状体を加熱して凍結物と棒状体との接触部を融解し、前記棒状体を除去する工程、次いで、得られた凍結物を凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする。本発明によれば、組織破損の少ないタンパク質多孔マトリックスを簡便に調製することができる。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱可能な棒状体をタンパク質含有液に挿入した後に凍結する工程、前記棒状体を加熱して凍結物と棒状体との接触部を融解し、前記棒状体を除去する工程、次いで、得られた凍結物を凍結乾燥する工程を含む、タンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項２】
前記棒状体の加熱が、前記棒状体として熱伝導率が１０（ｋｃａｌ／ｍ・ｈ・ｄｅｇ）以上の部材を使用し、前記棒状体の一端を加熱して熱伝導により凍結物と棒状体との接触部を融解する方法、前記棒状体に通電して発熱させ加熱する方法、前記棒状体に中空構造を設け、この中空部に熱媒を流通させて加熱する方法のいずれかである、請求項１に記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項３】
前記棒状体を、前記タンパク質含有液を貫通するように挿入することを特徴とする、請求項１または２記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項４】
前記熱媒が水である、請求項２または３記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、コラーゲン、フィブリン、ケラチンおよびエラスチンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項６】
前記コラーゲンが、線維化アテロコラーゲンであることを特徴とする請求項５記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質含有液が、更に、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項８】
前記棒状体の断面積が、０．１８〜１９．０ｍｍ２である、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【請求項９】
前記棒状体の断面形状が真円、楕円、多角形、十字型およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかである、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質多孔マトリックスの製造方法に関し、より詳細には、棒状体を挿入したタンパク質含有溶液の凍結物を調製し、次いでこれを凍結乾燥することを特徴とする、細胞の進入性、増殖性などに優れるタンパク質多孔マトリックスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、形成外科の領域でも熱傷や外傷などによる真皮等の軟組織の欠損に、多孔性材料の一種であるコラーゲンスポンジを用いた治療が試みられている。コラーゲンスポンジなどの多孔性材料は、治癒が進行する間、構造的支持と増殖組織の枠組を提供し、充填後には細胞の進入や血管の進入が容易に起こり、創傷周辺の組織が再生するに従って徐々に吸収される。従って、これらの機能をより促進させるためには、多孔質構造であって、それぞれの孔の隔壁の一部が連通した形状となるように設計されることが好ましい。しかしながら孔と孔との連通は十分でなく、このため多孔質内部への細胞や血管の進入が早期に起こらない場合もある。そこで、多孔構造に加えて多孔質材料に人工的な空隙を有するものが検討されている。このような空隙を設けることで、多孔質材料の内部にも容易に細胞が浸潤して早期治癒が可能となり、または培養皮膚を適用した患部の浸出液の排出を円滑にして滞留を防止し、感染を防止することができる。
【０００３】
このような空隙を有する多孔質材料の調製方法は公知であり、例えば、アテロコラーゲンの１％液から調製した厚さ１〜２ｍｍのコラーゲンスポンジに、窄設によって複数の空隙部を形成する方法がある（特許文献１）。
【０００４】
また、コラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートに、刃厚が極めて薄く、かつ刃先が鋭利な安全カミソリやメスのような刃物を用いて線状に切込みを入れ培養皮膚用基材を調製する方法もある（特許文献２）。該発明によって得られるコラーゲンスポンジやコラーゲンシートは、刃物によって設けた切り込みを開くように力を入れることで空隙を生じせしめることができる。
【０００５】
一方、多孔質材料は、皮膚欠損組織への充填材として使用されるばかりでなく、軟骨組織や骨などの硬組織の再生などにも応用される。例えば、多孔のセラミック顆粒を多孔質材料であるコラーゲンスポンジに混合し、硬組織用の修復材料として整形外科の領域で使用する場合もある。具体的には、未焼成のハイドロキシアパタイト単結晶を低抗原性化したコラーゲン繊維の一部に付着させてなる硬組織修復材料がある（特許文献３）。該公報では、使用される低抗原性化したコラーゲン線維はスポンジ状であってもよいとし、牛真皮より抽出されたＩ型コラーゲンのテロペプチドを除去したアテロコラーゲンに、中性域のｐＨのリン酸緩衝液を加えて、約３５〜４０℃、４時間以上処理して再線維化させ、その後凍結乾燥処理を行い、さらに真空下、１００〜１２０℃で、１〜８時間処理したものをコラーゲン線維として使用している。そして、未焼成のハイドロキシアパタイト単結晶をこのスポンジ状のコラーゲン線維と混合し、未焼成のハイドロキシアパタイト単結晶の吸着力によってコラーゲン線維表面に該単結晶を付着させ、硬組織修復材料を得ている。
【特許文献１】特開平４−３３２５６１号公報
【特許文献２】特開平９−４７５０３号公報
【特許文献３】特開平８−２７６００３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、多孔質に空隙部を形成するため、特許文献１のように調製後のコラーゲンスポンジに窄設によって複数の窄設孔を形成することは、手間が掛かるばかりか構造体の強度がもろい場合には窄設処理によって構造体自身が壊れる場合がある。このように、コラーゲンスポンジの調製後に空隙部を形成する不利益は、特許文献２でも同様である。
【０００７】
また、特許文献３のように、さらにセラミックスなどの粒子を多孔質に混合した多孔質材料でも空隙部を有することが好ましいが、硬度が高いセラミクスなどの粒子を混在させた多孔質材料に窄設処理を行うと、セラミクスが破壊されたり、セラミクスと多孔質材料との硬度が異なるため、窄設処理によって多孔質材料がより破壊されやすくなる。
【０００８】
このような現状のもと、本発明は、細胞の進入性、増殖性、血管の進入性に優れ、このため栄養成分や増殖因子の流入が効率的に行われ、かつ適用創面での浸出液の排出が容易に行われる、空隙部を有するタンパク質多孔マトリックスの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、コラーゲンスポンジの調製方法について詳細に検討した結果、コラーゲン含有液を凍結しこれを凍結乾燥してコラーゲンスポンジを調製する際に、コラーゲン含有液に棒状体を挿入して凍結させると凍結物に棒状の空隙部が形成され、該棒状体を加熱して凍結材料との界面をわずかに融解させて凍結材料から分離し、これを凍結乾燥させると簡便に空隙部を有するコラーゲンスポンジを調製できることを見出し、本発明を完成させた。また、該棒状体をタンパク質含有液を貫通するように挿入すれば、得られるコラーゲンスポンジに容易に貫通孔を形成することもできる。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（８）を提供するものである。
【００１１】
（１）  加熱可能な棒状体をタンパク質含有液に挿入した後に凍結する工程、前記棒状体を加熱して凍結物と棒状体との接触部を融解し、前記棒状体を除去する工程、次いで、得られた凍結物を凍結乾燥する工程を含む、タンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１２】
（２）  前記棒状体の加熱が、前記棒状体として熱伝導率が１０（ｋｃａｌ／ｍ・ｈ・ｄｅｇ）以上の部材を使用し、前記棒状体の一端を加熱して熱伝導により凍結物と棒状体との接触部を融解する方法、前記棒状体に通電して発熱させ加熱する方法、前記棒状体に中空構造を設け、この中空部に熱媒を流通させて加熱する方法のいずれかである、上記（１）に記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１３】
（３）  前記棒状体を、前記タンパク質含有液を貫通するように挿入することを特徴とする、前記（１）または（２）記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１４】
（４）  前記熱媒が水である、上記（２）または（３）記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１５】
（５）  前記タンパク質が、コラーゲン、フィブリンおよびエラスチンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１６】
（６）  前記コラーゲンが、線維化アテロコラーゲンであることを特徴とする上記（５）記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１７】
（７）  前記タンパク質含有液が、更に、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上を含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１８】
（８）  前記棒状体の断面積が、０．１８〜１９．０ｍｍ２である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【００１９】
（９）  前記棒状体の断面形状が真円、楕円、多角形、十字型およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかである、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質多孔マトリックスの製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、コラーゲンスポンジの調製時に同時に空隙部を形成することができるため、その後の空隙部形成工程が不要である。このため、刃物などによる窄設処理が不要であるため、コラーゲンスポンジの破損もなく、特に、セラミクスなどが混合されたコラーゲンスポンジであって空隙部を有するものの製造に好適である。
【００２１】
また、使用する棒状体のサイズや数を変更すれば、簡便に空隙状態の異なるコラーゲンスポンジを調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の第一は、加熱可能な棒状体をタンパク質含有液に挿入した後に凍結する工程、前記棒状体を加熱して凍結物と棒状体との接触部を融解し、前記棒状体を除去する工程、次いで、得られた凍結物を凍結乾燥する工程を含む、タンパク質多孔マトリックスの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明で使用する棒状体としては、棒状体自体が加熱可能な構造あり、加熱によってタンパク質含有液の凍結物から容易に引き抜けるものであれば、その素材は問わない。したがって、ＳＵＳ、アルミ、銅、種々の合金などの金属、アクリル樹脂、ポリカーボネート、フッ素樹脂どの高分子重合体、黒鉛、炭化ジルコニウムなどを好適に使用することができる。特に、凍結物との分離を容易にするため、例えば金属製の棒状体の、タンパク質含有液との接触面にテフロン（登録商標）などを被覆したものであってもよい。
【００２４】
棒状体の断面積は、得られるタンパク質多孔マトリックスの空隙部の形状およびサイズを決定する重要な要素であり、使用するタンパク質多孔マトリックスの用途によって適宜選択できるが、一般には、０．１８〜１９．０ｍｍ２であることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０．０ｍｍ２であり、特に好ましくは０．７５〜７．２ｍｍ２である。
【００２５】
また、棒状体の形状は、タンパク質多孔マトリックスの空隙部として好適な形状を有すれば特に制限なく使用することができる。したがって、上記断面積の範囲であれば、例えば図１に示すように、真円、楕円、多角形、十字型およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかであってもよい。特に、真円または楕円は、棒状体を凍結物より引き抜くことが容易であり好ましい。また、多角形は空隙部の表面積を大きくすることができる点で有利である。なお、棒状体は、タンパク質含有液が凍結した後に引き抜く必要があり、その全長に亘って断面が同一であることが好ましい。一方、棒状体の先端に向かって細くなっていれば、後記するように、棒状物の先端を弾性体で構成される容器に付き指すような場合に、好適に使用することができる。この様な棒状体を使用し、タンパク質含有液の少なくとも１の表面に挿入することにより、製造されるタンパク質多孔マトリックスにその表面に開口し、所定の深さまで連続してほぼ一様の断面積を有する空隙部を形成することができる。このような空隙部の存在により、使用時に細胞の進入が促進され、さらに血管組織の進入も期待できる。
【００２６】
タンパク質含有液に挿入する棒状体の数も制限はなく、製造されるタンパク質多孔マトリックスの用途などに応じて適宜選択すればよい。また、棒状体は、タンパク質含有液に挿入できればよく、その方向も問わない。したがって、該液の水面から垂直方向に挿入させてもよく、該液の水面に平行に挿入させてもよく、その他任意の方向から挿入することができる。また、その深さも問わず、タンパク質含有液の少なくとも一の表面に外部から棒状体を挿入して空隙部が形成されればよい。但し、棒状体をタンパク質含有液を貫通するように挿入すれば、貫通孔を有するタンパク質多孔マトリックスを製造することができる。
【００２７】
なお、本発明の方法は、タンパク質多孔マトリックスに空隙部を形成することを目的とするため、該液を仕込んだ容器と該液との接触面に上記棒状体が接触する必要がある。また、複数の棒状体をタンパク質含有液に挿入した場合、凍結後に棒状体を加熱して凍結物から抜き出す必要があり、この抜き出し操作を迅速かつ均一に行うために複数の棒状体は、同一の加熱部材や伝熱部材に連結されていることが好ましい。このような態様の棒状体として、例えば、図２に示すように、ヘッド１０に棒状体２０を多数配設した剣山様構造物がある。便宜のため、この剣山様構造物を使用してタンパク質多孔マトリックスを製造する方法を説明する。
【００２８】
本発明では、図３に示すように、タンパク質含有液を容器３０に仕込む。仕込む際の該液の深さに制限はなく、最終的に得られるタンパク質多孔マトリックスの厚さに応じて適宜選択すればよい。一般的には、１〜５００ｍｍ、好ましくは１〜１００ｍｍ、特に好ましくは１〜５０ｍｍの深さまで該液を仕込む。本発明の方法によれば、スポンジ構造を破壊しやすい窄設工程を行う必要がないため、深さ５００ｍｍの範囲で容器に仕込んだ場合であっても、破損が少なく、厚みのあるタンパク質多孔マトリックスを製造することができる。
【００２９】
次いで、例えば該液の水面から棒状体を挿入する。挿入の深さは得られるタンパク質多孔マトリックスの用途に応じて適宜選択することができる。容器としては、タンパク質含有液と反応せず、凍結させやすいものであればよく、ＳＵＳ、アルミなどの金属、アクリル樹脂、ポリカーボネートなどの高分子重合体、ガラスなどの素材からなる容器を使用することができる。
【００３０】
一方、本発明では、タンパク質含有液に棒状体を貫通させて貫通孔を形成することができる。例えば、タンパク質含有液の水面から底部に亘って棒状体を貫通させるには、前記容器３０の底部をタンパク質含有液と反応せず、しかも棒状体の先端部が突き刺してもタンパク質含有液の液漏れを防止できる程度の弾性材料で構成させ、この弾性材料に棒状体を突き刺すように挿入すると、該液の底部にも凍結乾燥工程で埋没しない程度の空隙部を形成することができる。なお、棒状体の先端部を尖らせておけば、弾性材料への突き刺しが容易となる。さらに、例えばタンパク質含有液を仕込む容器の側面、または、容器全体を弾性体で構成し、容器の一側面からタンパク質含有液に水平に棒状体を他の側面に接触するまで挿入してもよい。
【００３１】
なお、棒状体をタンパク質含有液の水面から底部に向けて挿入し、または該水面に平行に挿入する方法などの一方向に限定されず、水平方向と垂直方向とに同時に棒状体を挿入するなど、異なる角度から複数の棒状体を挿入することができる。このような場合にも上記したような剣山様構造物を使用することができ、例えば、該液の水面から底部に亘るように垂直に棒状体を挿入させ、さらに、該容器の側面から水平方向に剣山様構造物を挿入して、垂直方向および水平方向から空隙部を形成することもできる。なお、このように、容器の外部側面から棒状体を挿入させる場合には、棒状体が貫通してもタンパク質含有液の液漏れを防止できる程度の液密を確保できる弾性材料を使用すればよい。本発明において好適な弾性材料としては、シリコンラバー、パラフィルム（登録商標）、スチレン系エラストマーなど、特にシリコンラバー、パラフィルム（登録商標）が好適である。シリコンラバーは、液密性に優れるとともに、タンパク質含有液が凍結した後の剥離性にも優れるからである。
【００３２】
次いで、該液を冷却して凍結する。冷却温度は、対象とするタンパク質含有液の凝固点に基づいて適宜選択すればよく、一般には温度−１８０〜−１０℃、好ましくは−１５０〜−１５℃、特に好ましくは−８０〜−２０℃で凍結すると、棒状体が挿入された状態で凍結物が形成される。
【００３３】
次いで、剣山様構造物のヘッド１０を加熱する。例えば、該剣山様構造物の全体が金属製であり、ヘッド１０を加熱すると棒状体２０に伝熱されるような場合には、伝熱によって棒状体２０を加熱することができる。凍結後は、凍結物と棒状体とは硬く結合しているため、この状態で棒状体を引き抜こうとすれば凍結物が破損するが、このような伝熱によって棒状体２０を加熱し凍結物と棒状体との接触部を溶融させ、棒状体を容易に引き抜くことができる。
【００３４】
上記方法では、ヘッド１０からの伝熱によって棒状体２０を加熱するものであり、このような用途に使用する棒状体としては熱伝導率が１０（ｋｃａｌ／ｍ・ｈ・ｄｅｇ）以上の部材を使用することが好ましい。このような部材としては、ＳＵＳ、銅、アルミがある。上記範囲であれば伝熱性に優れるため、凍結物と棒状体との接触部の融解を迅速かつ均一に行うことができる。なお、棒状体の加熱方法としては、棒状体を通電可能な構造にして発熱によって加熱する方法であってもよい。例えば、各棒状体に電気を通し、発熱させて加熱させてもよい。このような用途に使用する部材としては、ニクロム線がある。
【００３５】
本発明において、棒状体の加熱温度に制限はなく、凍結物と棒状体との接触部分が溶融できればよい。一般には、接触部分の温度が−１０〜１０℃とすることができれば十分である。
【００３６】
このように、タンパク質含有液が凍結された状態であっても、棒状体を加熱して棒状体と凍結物との接触部の凍結部をわずかに溶融させると、棒状体の抜き取り時の摩擦力を低減でき、得られるタンパク質多孔マトリックスの多孔が破壊されることなく、マトリックス中に空隙部を形成することができる。しかも、棒状体を除去した後に再び材料を急冷および凍結乾燥しても、空隙部が融解して埋まることもない。このため、空隙部面が均一なタンパク質多孔マトリックスを製造することができる。
【００３７】
上記のように、棒状体を加熱した後に凍結物から引き抜くことで、棒状体２０に由来する空隙部が形成されたタンパク質含有液の凍結物が形成される。この凍結物を空隙部を維持したまま迅速に凍結乾燥するすると、マトリクスを貫通する孔を有するタンパク質多孔マトリックスを製造することができる。
【００３８】
一方、本発明の製造方法では、棒状体として、棒状体が中空物を使用することもでき、この中空部分に熱媒を流通させて棒状体を加熱してもよい。例えば、図４に示すように、剣山様構造物を構成する棒状体が中空構造であり、かつ該棒状体が外部からの水などの熱媒を導入できるように、ヘッドにも中空構造を有する場合には、水などの熱媒を棒状体に流すことで内部から棒状体を加熱することができる。この方法は、特にタンパク質多孔マトリックスに貫通孔を形成する場合に有効である。この方法では、棒状体の中空部分を流れる熱媒を棒状体の末端から排出させるため棒状体の末端が開口できる構造とし、したがって挿入時に棒状体の末端からタンパク質含有液が流入するのを防止するため予め密封しておくことが好ましい。密封材としては、タンパク質含有液と反応せず、かつ棒状体の末端を気密にしうる部材であればよく、たとえば、パラフィルム（登録商標）などがある。この方法でタンパク質含有液を仕込む容器も、例えば図４に示すように底部にパラフィルムなどのようにタンパク質含有液と反応せず、かつ棒状体が容易に貫通でき、しかもタンパク質含有液が遺漏しない部材で構成したものを使用することが好ましい。例えば、パラフィルムや、上記した弾性材料を好適に使用することができる。
【００３９】
この容器にタンパク質含有液を仕込み、例えば、棒状体を該液の水面から挿入しかつ該容器の底部から僅か突き出すように差し込む。このような中空の棒状体を使用する場合であっても、タンパク質含有液の水面から底部にかけて垂直に棒状体を挿入する場合に限られず、水面に平行に挿入してもよく、その他任意の方向から挿入することができる。
【００４０】
なお、このような中空の棒状体を使用し、内部に熱媒を流動する方法では、タンパク質含有液を凍結させる際に、中空部分に温度−３０〜４０℃の冷気や熱媒を導入することもでき、これによって凍結時間を短縮することもできる。
【００４１】
中空の棒状体の材質としては、金属であってもよいが、熱媒が棒状体の内部を常に流動するため、合成樹脂からなる棒状体なども好適に使用することができる。なお、中空の棒状体を使用する場合でも、棒状体の断面積や形状は上記した加熱方法の場合と同様であるが、棒状体の横断面は図５に示すように中空になる。
【００４２】
次いで、該液が凍結した後、温度−１０〜１００℃の熱媒を導入すれば、内部から棒状体を加熱して棒状体と凍結物との接触物を溶融することができる。棒状体が抜き出せる程度に溶融したことを確認した後、中空部分への熱媒の導入をやめ、棒状体を引く抜けば、空隙部を有する凍結物を形成することができる。また、これを凍結乾燥すれば、他の方法と同様に、組織の破損の少ないタンパク質多孔マトリックスを製造することができる。
【００４３】
本発明で使用するタンパク質含有液は、溶液中にタンパク質が溶解している場合に限定されず、タンパク質が含水してゲル状であっても、溶媒に不溶のタンパク質存在する懸濁液であってもよい。本発明で好適に使用できるタンパク質としては、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ケラチンなどがあり、これらの一種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。また、これらを化学的に修飾したものでもよい。用途に応じて適宜選択することができる。また、コラーゲンとしては、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ型などの重合して不溶性の線維構造を形成する線維性コラーゲンがあるが、本発明ではこれらの中でも線維化アテロコラーゲンを使用することが好ましい。抗原性が少ないため、得られるタンパク質多孔マトリックスを生体修復材料として使用する場合に、安全性が高いからである。
【００４４】
タンパク質含有液におけるこれらの濃度も用途に応じて適宜選択すればよい。一般には、０．５〜１０％Ｗ／Ｖ、より好ましくは１〜８％Ｗ／Ｖ、特に好ましくは２〜５％Ｗ／Ｖである。このようなタンパク質含有液を用いて、凍結乾燥によって気泡を含む多孔質を調製するには、例えば、特開平４−３３２５６１号公報などに記載される方法によって調整することができる。
【００４５】
本発明で使用するタンパク質含有液には、更に他の成分を含んでいてもよい。例えば、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などの多糖類やビタミン、ホルモン、骨形成因子などが例示できる。これらの配合量は用途によって適宜選択することができる。
【００４６】
本発明では、さらにタンパク質含有液に、カルシウム含有無機化合物を含んでいてもよい。好ましくは、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム系化合物からなる群から選択される１種以上のカルシウム含有無機化合物を含んでいてもよい。なお、リン酸カルシウム系化合物としては、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウムヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸カルシウムガラス、バイオガラスおよび焼成骨、これらの混合物が挙げられる。これらは、良好な骨伝導性と骨結合性を有するため、これらを配合して得られたタンパク質多孔マトリックスを硬組織修復材料として骨組織に使用すると、破骨細胞による骨吸収とその後の骨芽細胞による骨添加が行われ自己骨組織を形成することができる。これらの配合量は、タンパク質多孔マトリックスの用途によって適宜選択できるが、硬組織修復材料用途に使用する場合には、タンパク質含有液に０〜５０％Ｗ／Ｖを配合することが好ましく、より好ましくは１〜３０％Ｗ／Ｖ、特に好ましくは２〜２０％Ｗ／Ｖである。
【００４７】
更に本発明では、タンパク質含有液を調製する際、タンパク質架橋剤（ソルビトールジグリシジルエーテルなど）を加えてもよいし、凍結乾燥後、加熱等によりタンパク質の架橋を行ってもよい。強度の調整ができ使用範囲が拡大させることができる。
【００４８】
本発明の方法で製造されるタンパク質多孔マトリックスは、本来の多孔に加えて、空隙部を有するが、棒状体の挿入数や挿入方向、深さ、棒状体の太さなどを適宜選択することで、空隙部の形状が異なり、かつ厚さのあるタンパク質多孔マトリックスを簡便に製造することができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００５０】
（実施例１）
図３に示すように、コラーゲンスポンジを成型する２５ｍｍ×２５ｍｍ×１０ｍｍの容器３０の底面に２４．８ｍｍ×２４．８ｍｍ×２ｍｍのシリコンラバー４０を敷いた。この容器３０に、図２に示す、３０ｍｍ×３０ｍｍ×５ｍｍのＳＵＳ製ヘッド１０に、先端を尖らせたＳＵＳ製の断面が円形の外径φ１ｍｍ、長さ１５ｍｍの棒状体２０を６４本、均等に配列した剣山様構造物を挿入し、棒状体２０の先端のテーパー部分がシリコンラバー４０に軽く突き刺さる様に圧迫した。
【００５１】
この容器３０に、線維化コラーゲン及び熱変性コラーゲンを含有するコラーゲン液（濃度３．０％Ｗ／Ｖ）６ｍｌを仕込み、この状態で−３０℃のフリーザーに保存してコラーゲン液を凍結させた。ついで、剣山様構造物のヘッド１０に２００℃に加熱したアイロンを数秒間、接触させることによりコラーゲン液の凍結塊と棒状体２０との界面部分をわずかに融解させた。ヘッド１０を持ち上げて棒状体２０をコラーゲンから抜き取った。その後、直ちにコラーゲンの凍結塊を−３０℃のフリーザーに保存した。この凍結塊を凍結乾燥してコラーゲンスポンジを調製した。得られたスポンジには表面に開口し連続したほぼ一様の断面形状を有する空隙部が形成されていた。
【００５２】
（実施例２）
実施例１と同様に、コラーゲンスポンジを成型する２５ｍｍ×２５ｍｍ×１０ｍｍの容器３０の底面に２４．８ｍｍ×２４．８ｍｍ×２ｍｍのシリコンラバー４０を敷き、この容器３０に、図２に示す、３０ｍｍ×３０ｍｍ×５ｍｍのＳＵＳ製ヘッド１０に、先端を尖らせた断面が円形のＳＵＳ製の外径φ１ｍｍ、長さ１５ｍｍの棒状体２０を６４本、均等に配列した剣山様構造物を挿入し、棒状体２０の先端のテーパー部分がシリコンラバー４０に軽く突き刺さる様に圧迫した。
【００５３】
この容器３０に、粒子径０．５〜１ｍｍのβ−ＴＣＰの顆粒０．９ｇをコラーゲン液（濃度２．５％Ｗ／Ｖ）６ｍｌに混合し、この状態で−３０℃のフリーザーに保存してコラーゲン液を凍結させた。剣山様構造物のヘッド１０に加熱したアイロンを接触させることにより、棒状体２０を温度２００℃に熱し、コラーゲン液の凍結塊と棒状体２０との界面部分をわずかに融解させた。ヘッド１０を持ち上げて棒状体２０をコラーゲンから抜き取った。その後、直ちにコラーゲンの凍結塊を−３０℃のフリーザーに保存した。この凍結塊を凍結乾燥してβ−ＴＣＰを含有するコラーゲンスポンジを調製した。得られたスポンジには表面に開口し連続したほぼ一様の断面形状を有する空隙部が形成されていた。
【００５４】
（実施例３）
図４に示すように、外部から水などの流体を貫通させることができる中空構造を有するＳＵＳ製ヘッドと、該中空構造に連結するステンレスパイプとを有する構造物であって、断面が円形のステンレスパイプの流体流出側の先端にパラフィルムをかぶせた。
【００５５】
コラーゲンスポンジを成型する２５ｍｍ×２５ｍｍ×５０ｍｍの容器の底面に３０ｍｍ×３０ｍｍのパラフィルム（登録商標）６０を敷き、この容器に、図４に示すＳＵＳ製ヘッド１０に、先端を尖らせた断面が円形の外径φ１．３ｍｍ、内径φ１ｍｍ、長さ６０ｍｍのＳＵＳ製の棒状体を３６本、均等に配列した剣山様構造物を挿入し、棒状体の先端のパラフィルムが容器の底部に敷いたパラフィルム（登録商標）６０を貫通させた。
【００５６】
この容器に、線維化コラーゲン及び熱変性コラーゲンを含有するコラーゲン液（濃度２．５％Ｗ／Ｖ）を仕込み、この状態で−３０℃のフリーザーに保存し、コラーゲン液を凍結させた。図４に示すように、剣山様構造物のヘッドから水を注入し、ステンレスパイプの先端より温度２０℃の水を流出させて棒状体を熱し、コラーゲン液の凍結塊と棒状構造物との界面部分をわずかに融解させた。その後、剣山様構造物を容器から抜き取って分離し、直ちにコラーゲン液の凍結塊を−３０℃のフリーザーに保存した。この凍結塊を凍結乾燥してコラーゲンスポンジを調製した。得られたスポンジには表面に開口し連続したほぼ一様の断面形状を有する空隙部が形成されていた。
【００５７】
（実施例４）
実施例１においてコラーゲン液に代えて、フィブリン液を使用し、以下のようにフィブリンスポンジを調製した。
【００５８】
まず、図３に示すように、フィブリンスポンジを成型する２５ｍｍ×２５ｍｍ×１０ｍｍの容器３０の底面に２４．８ｍｍ×２４．８ｍｍ×２ｍｍのシリコンラバー４０を敷いた。この容器３０に、図２に示す、３０ｍｍ×３０ｍｍ×５ｍｍのＳＵＳ製ヘッド１０に、先端を尖らせたＳＵＳ製の断面が円形の外径φ１ｍｍ、長さ１５ｍｍの棒状体２０を６４本、均等に配列した剣山様構造物を挿入し、棒状体２０の先端のテーパー部分がシリコンラバー４０に軽く突き刺さる様に圧迫した。
【００５９】
一方、アプロチニン溶液３ｍｌ（３０００ＫＩＥ）にフィブリノーゲン末２４０ｍｇ及びヒト血液凝固第８因子（活性がヒト正常人血漿１ｍｌの１８０倍の活性を有する。）を加えて溶解して調製したフィブリノーゲン溶液と６．２Ｍ  ＣａＣｌ２３ｍｌにトロンビン末９００単位を加えて溶解して調製したトロンビン溶液を混合した。
【００６０】
該トロンビン溶液を前記した容器に仕込んだ。フィブリノーゲンはフィブリンに変化し、ゲル状となり、この状態で−４０℃のフリーザーに保存しフィブリンゲルを凍結させた。
【００６１】
ついで、剣山様構造物のヘッド１０に加熱したアイロンを接触させることにより、棒状体２０を熱し、フィブリンの凍結塊と棒状体２０との界面部分をわずかに融解させた。その後、ヘッド１０を持ち上げて棒状体２０をコラーゲンから抜き取った。その後、直ちにコラーゲンの凍結塊を−４０℃のフリーザーに保存した。この凍結塊を凍結乾燥してフィブリンスポンジを調製した。得られたスポンジには表面に開口し連続したほぼ一様の断面形状を有する空隙部が形成されていた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、簡便に空隙部を有するタンパク質多孔マトリックスを製造することができ、特に再生医療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明で使用する棒状体の横断面を示す図である。
【図２】本発明で使用する棒状体が剣山様構造物を構成する場合の図である。
【図３】タンパク質含有液を仕込んだ容器に剣山様構造物を挿入した状態を示す図である。
【図４】タンパク質含有液を仕込んだ容器に中空の棒状体からなる剣山様構造物を挿入した状態を示す図である。
【図５】本発明の棒状体が中空である場合の横断面を示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
１０・・・ヘッド、
２０・・・棒状体、
３０・・・容器、
４０・・・シリコンラバー、
５０・・・水、
６０・・・パラフィルム。
【図１】
2006280394.tif 000002
【図２】
2006280394.tif 000003
【図３】
2006280394.tif 000004
【図４】
2006280394.tif 000005
【図５】
2006280394.tif 000006