(57)【要約】【課題】ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する有効な方法、およびＨＣＶ特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）の活性化のような、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する方法において使用され得る、ＨＣＶポリペプチドの別の領域に由来する、少なくとも１つの他のＨＣＶエピトープに融合された、変異ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むＨＣＶ融合タンパク質を提供すること。【解決手段】（ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３領域に少なくとも１つの、プロテアーゼ活性が阻害されるようなアミノ酸置換を含む改変されたＮＳ３ポリペプチドおよび（ｂ）ＮＳ３領域以外のＨＣＶポリタンパク質の領域に由来する、少なくとも１つのポリペプチドを含む、免疫原性融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３領域に少なくとも１つの、プロテアーゼ活性が阻害されるようなアミノ酸置換を含む改変されたＮＳ３ポリペプチドおよび
（ｂ）ＮＳ３領域以外のＨＣＶポリタンパク質の領域に由来する、少なくとも１つのポリペプチド
を含む免疫原性融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構築物に関する。より具体的には、本発明は、改変したＮＳ３ドメインを有するＨＣＶ融合タンパク質に関する。このタンパク質は、例えば、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を準備刺激するために、および／またはＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するために、細胞媒介性免疫応答を刺激し得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界の人口の約１％がこのウイルスに感染しており、重大な健康問題となっている。急性的に感染した個体のうち７５％以上は、最終的に慢性保菌者状態へと進行し、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌を生じ得る。非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶは、ＮＡＮＢＨの原因としてＨｏｕｇｈｔｏｎらによって最初に同定され、そして特徴付けられた。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は公知であり、この配列を得るための方法もまた公知である。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）である一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ウイルスのＦｌａｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。少なくとも６つの別個の、しかし関連するＨＣＶの遺伝子型が、系統学的分析に基づいて同定されている（非特許文献５）。このウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。このポリタンパク質は、翻訳と同時に、および翻訳後に構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質のいずれにもプロセスされる。
【０００４】
特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断生成物の順序および命名法は以下の通りである：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の最初の切断は、宿主プロテアーゼによって触媒され、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と称される）および２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１）としても公知））、ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質が遊離する。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と称される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する膜結合タンパク質であり、ＮＳ３と一緒に、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、次いでＮＳ３  Ｎ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性とＲＮＡヘリカーゼ活性との両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセスする役目を果たす。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒されるＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部での自己触媒的切断によって開始される。
【特許文献１】国際公開第８９／０４６６９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／１１０８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１４４３６号パンフレット
【非特許文献１】Ａｌｔｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９２年、３２７、ｐ．１８９９−１９０５
【非特許文献２】ＲｅｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ．、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１９９３年、１５３、ｐ．１６７２−１６７７
【非特許文献３】Ｓｅｅｆｆ、Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．、１９９５年、６、ｐ．２０−２７
【非特許文献４】Ｔｏｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９５年、３３２、ｐ．１４６３−１４６６
【非特許文献５】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年、７４、ｐ．２３９１−２３９９
【非特許文献６】Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４４、ｐ．３５９−３６２
【非特許文献７】Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、８８、ｐ．２４５１−２４５５
【非特許文献８】Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、８８、ｐ．１７１１−１７１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＩＶのような特定のウイルスに対する医薬の開発における広範な進歩にもかかわらず、急性ＨＣＶ感染および慢性ＨＣＶ感染の制御における成功は限られている（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅおよびｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：３４７−３５６）。特に、細胞性免疫応答（例えば、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）の生成は、ＨＣＶ感染の制御および根絶のために重要であると考えられる。従って、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する有効な方法について、当該分野における必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（項目１）
以下：
（ａ）ＨＣＶ  ＮＳ３領域に少なくとも１つの、プロテアーゼ活性が阻害されるようなアミノ酸置換を含む改変されたＮＳ３ポリペプチドおよび
（ｂ）ＮＳ３領域以外のＨＣＶポリタンパク質の領域に由来する、少なくとも１つのポリペプチド
を含む免疫原性融合タンパク質。
（項目２）
前記改変が、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記タンパク質が、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドお含む、項目１または２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記タンパク質が、ＮＳ５ｂポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記タンパク質が、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記タンパク質が、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目７）
前記タンパク質が、Ｅ２ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記タンパク質が、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記タンパク質が、Ｅ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記タンパク質が、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよび必要に応じてコアポリペプチドをさらに含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドが、同一のＨＣＶ単離体に由来する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記融合タンパク質に存在するポリペプチドの少なくとも１つが、改変ＮＳ３ポリペプチドである異なる、単離体に由来する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
アミノ末端からカルボキシ末端方向において、以下：
（ａ）改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｂ）改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｃ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｄ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｅ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｆ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｇ）Ｅ２ポリペプチドおよび改変されたＮＳ３ポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｈ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチドおよび改変されたＮＳ３ポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｉ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドおよび改変されたＮＳ３ポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；あるいは
（ｊ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドおよび改変されたＮＳ３ポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド
から本質的になる免疫原性融合タンパク質。
（項目１４）
アミノ末端からカルボキシ末端方向において、以下：
（ａ）改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｂ）改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｃ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｄ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｅ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｆ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｇ）Ｅ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｈ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；
（ｉ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド；あるいは
（ｊ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよびコアポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド
から本質的になる免疫原性融合タンパク質。
（項目１５）
改変されたＮＳ３ポリペプチドであって、該改変されたＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連して番号付けた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果、改変されたＮＳ３ポリペプチドがＨＣＶ融合タンパク質に存在する場合、プロテアーゼ活性が阻害される、ポリペプチド。
（項目１６）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質または項目１５に記載の改変されたＮＳ３ポリペプチドを、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合せて含む、組成物。
（項目１７）
脊椎動物の被験体における細胞性免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、治療有効量の項目１６に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１８）
脊椎動物の被験体における細胞性免疫応答を刺激する方法における、項目１５に記載の組成物の使用。
（項目１９）
脊椎動物の被験体における細胞性免疫応答を刺激するための医薬の製造における、項目１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質または項目１５に記載の改変されたＮＳ３ポリペプチドの使用。
（項目２０）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性融合タンパク質または項目１５に記載の改変されたＮＳ３ポリペプチドを、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合せて含む、組成物を製造する方法。
（項目２１）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質または項目１５に記載の改変されたＮＳ３ポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド。
（項目２２）
以下：
（ａ）項目２１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの制御要素、
を含む組換えベクターであって、それによって、該コード配列が、宿主細胞において転写および翻訳され得る、組換えベクター。
（項目２３）
項目２２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（項目２４）
免疫融合タンパク質または改変されたポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該タンパク質を産生するための条件下で、項目２３に記載の宿主細胞集団を培養する工程を包含する、方法。
【０００７】
（発明の要旨）
ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する（例えば、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を準備刺激する、および／または活性化する）ための試薬および方法を提供することが、本発明の目的である。本発明のこの目的および他の目的は、以下に記載される１以上の実施形態によって提供される。
【０００８】
本発明は、このような応答を刺激するために有用なＨＣＶ融合タンパク質を提供する。本発明の１つの実施形態は、プロテアーゼ活性を阻害し、その結果、融合の切断が阻害されるように改変されたＮＳ３ポリペプチドを含むＨＣＶ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、改変したＮＳ３ポリペプチドに加えて、以下に詳細に記載されるＨＣＶポリタンパク質の他の領域に由来する１以上のポリペプチド含む。これらのポリペプチドは、ＮＳ３ポリペプチドと同一のＨＣＶ単離体由来であるか、広範なＨＣＶ遺伝子型に対して増大した保護を提供するために、異なる株および単離体（任意の種々のＨＣＶ遺伝子型を有する単離体を含む）由来である。
【０００９】
特定の実施形態において、ＮＳ３の改変は、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む。
【００１０】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、さらにＮＳ５ｂポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、このタンパク質は、さらにＥ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、さらにＥ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、さらにＥ２ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１５】
なおさらなる実施形態において、このタンパク質は、さらにＥ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、Ｅ２ポリペプチド、改変したＮＳ３ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１７】
さらなる実施形態において、このタンパク質は、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、改変したＮＳ３ポリペプチドを含み、そして必要に応じてコアポリペプチドを含む。
【００１８】
別の実施形態は、本質的に、ＨＣＶの改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、そして必要に応じてコアポリペプチドからなる融合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、ＮＳ５ｂポリペプチドもまた、存在する。
【００１９】
上記の実施形態において、融合タンパク質における種々の領域は、それらが天然のＨＣＶポリタンパク質中で天然に存在する順序である必要はない。従って、例えば、コアポリペプチドは、存在する場合には、この融合のＮ末端および／またはＣ末端であり得る。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、本質的に、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下：
（ａ）完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチド；
（ｂ）完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチド；
（ｃ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチド；
（ｄ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、およびＮＳ５ａポリペプチド；
（ｅ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチド；
（ｆ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチド；
（ｇ）Ｅ２ポリペプチド、および完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペ
プチド；
（ｈ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、および完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド；
（ｉ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、および完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド；あるいは
（ｊ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、および完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、
からなる免疫原性の融合タンパク質に関する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、本質的に、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下：
（ａ）完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、およびコアポリペプチド；
（ｂ）完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチド；
（ｃ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびコアポリペプチド；
（ｄ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドおよびコアポリペプチド；
（ｅ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチド；
（ｆ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、ＮＳ５ｂポリペプチドおよびコアポリペプチド；
（ｇ）Ｅ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、およびコアポリペプチド；
（ｈ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、およびコアポリペプチド；
（ｉ）Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、およびコアポリペプチド；あるいは
（ｊ）Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、ＮＳ２ポリペプチド、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果プロテアーゼ活性が阻害される改変したＮＳ３ポリペプチド、およびコアポリペプチド、
からなる免疫原性の融合タンパク質に関する。
【００２２】
なおさらなる実施形態において、本発明は、改変したＮＳ３ポリペプチドに関し、これは、完全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５、および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含み、その結果、この改変したＮＳ３ポリペプチドがＨＣＶ融合タンパク質内に存在する場合にプロテアーゼ活性が阻害される。
【００２３】
本発明のなお別の実施形態は、上記に詳述される任意のタンパク質をコードする単離したポリヌクレオチド、同一物を含む組換えベクター、このベクターで形質転換される宿主細胞、ならびに融合タンパク質を組換え生成する方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、任意のこれらの融合タンパク質、これらの融合をコードするポリヌクレオチド、またはこれらのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物を提供する。
【００２５】
本発明のなお別の実施形態は、本明細書中で記載されるような組成物を投与することによって脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を刺激する方法を提供する。特定の実施形態において、この組成物は、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を準備刺激および／または活性化する。Ｔ細胞は、改変したＮＳ３ポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるＨＣＶポリペプチドを含む融合タンパク質と接触される。活性化したＴ細胞の集団は、このＮＳ３ポリペプチドおよび／またはさらなるＨＣＶポリペプチドを認識する。
【００２６】
従って、本発明は、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する（例えば、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を準備刺激するおよび／または活性化する）ための方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬は、強力なＣＴＬ応答に関係するＨＣＶポリペプチドのエピトープを同定するために、およびＨＣＶに対して哺乳動物（ヒトを含む）を免疫するために、特に有利である。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示さない限り、複数の参照をも含むことが留意されなければならない。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の抗原の混合物を含む、など。
【００２９】
以下のアミノ酸の略語は、この明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）          アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）      アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）        グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）      グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）        イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）          リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）        フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）          セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）        トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）          バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００３０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして生成物の最小長に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義によって包含される。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブな配列に対する、改変（例えば、欠失、付加および置換（天然では、一般に保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように意図的であり得るか、または例えば、このタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するように偶発的なものであり得る。
【００３１】
ＨＣＶポリペプチドは、上記のように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はないが、合成的にまたは組換え的に生成され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株および単離物（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９に記載されるＨＣＶの６つの遺伝型を有する単離物を含む（例えば、１株、２株、３株、４株など））ならびに新しく同定された単離物およびこれらの単離物のサブタイプ（例えば、ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂなど）のいずれかに由来し得る。多くの保存領域および可変領域が、これらの株間で既知であり、そして一般に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合に、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きいアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ４」ポリペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来するネイティブなＮＳ４、ならびに以下にさらに定義されるようなＮＳ４アナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。
【００３２】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照分子の生物学的に活性な誘導体またはこのような誘導体のフラグメントをいい、これらは、以下に定義される細胞媒介性免疫応答を刺激する能力のような所望の活性を維持する。改変されたＮＳ３の場合において、「アナログ」または「ムテイン」は、そのネイティブなタンパク質分解活性を欠損するＮＳ３分子をいう。一般に、用語「アナログ」は、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブ分子に対して、１以上のアミノ酸付加、置換（一般に、天然では保存的、または改変されたＮＳ３の場合において、活性タンパク質分解活性部位で天然では非保存的）、および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいい、例えば、これらは、国際公開番号ＷＯ  ９１／０４２８２に記載される。好ましくは、このアナログまたはムテインは、ネイティブな分子として少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３３】
上に説明されるように、アナログは、一般に、天然では保存的である置換（すなわち、それらの側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で起こるこれらの置換）を含む。具体的に、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷で極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単独置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸の類似の保存的な置換は、生物学的活性に対して、主要な効果は有さないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、もしくは約１５〜２５までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知の、Ｈｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３４】
「改変されたＮＳ３」とは、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性が取り除かれるような改変を有するＮＳ３ポリペプチドを意味する。改変は、ネイティブな分子に対して１つ以上のアミノ酸の付加、置換（天然では一般に非保存的）および／または欠失を含み得、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は取り除かれている。プロテアーゼ活性を測定する方法は、以下にさらに議論される。
【００３５】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図される。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般に、全長分子の少なくとも約５〜１０の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０以上の連続するアミノ酸残基（これらは、エピトープを規定する）を含み、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続するアミノ酸残基を含むが、ただし、本明細書中に記載されるアッセイによって測定される場合、問題のフラグメントは、免疫原性活性を保持する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは約５〜１０または１５、および約１０００アミノ酸以下（またはこの間の任意の整数のアミノ酸）の配列をいい、これは、それ自体によって、またはより大きな配列の一部として、このような配列に応答して産生される抗体に結合する配列を規定する。フラグメントの長さに臨界的な上限は存在せず、このフラグメントは、ほぼ全長のタンパク質配列、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、これが由来する親タンパク質の一部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際に、ウイルスゲノムは、一定のフラックスの状態にあり、そして単離物間で比較的高い程度の変異性を示すいくつかの可変領域を含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブな配列に同一な配列、ならびにネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、天然では保存的））を包含する。
【００３７】
エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の、任意の数のエピトープマッピング技術を使用して、同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖エピトープは、例えば、多数のペプチド（これらのペプチドは、タンパク質分子の一部分に対応する）を固体支持体上で同時に合成し、そしてこれらのペプチドを固体支持体になおも付着させながら、これらのペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして以下に記載される：例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５。同様に、コンホメーションエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間的立体配座を決定することによって容易に決定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性および疎水性親水性指標プロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたもの）を使用して、同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）、および疎水性親水性指標プロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００３８】
種々のＨＣＶエピトープの説明について、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、ペプチド構造または関連するハプテンに関するＴ細胞免疫を誘導し得るペプチド構造の特性をいう。Ｔ細胞エピトープは、一般に、ＭＨＣ分子のペプチド結合間隔内の拡大した立体配座を想定する直鎖ペプチド決定因子を含む（Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：５５１−５５７）。ポリペプチドのＭＨＣＩＩ型関連直鎖ペプチド決定因子（一般に５〜１４アミノ酸長）への変換とは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって実行される「抗原プロセシング」をいう。より詳細に、Ｔ細胞エピトープは、短鎖ペプチド構造の局所的な特性によって規定され、その結果、主なアミノ酸配列の性質は、電荷および疎水性、ならびに全体のポリペプチドの折り畳みに依存しない二次構造の特定の型（例えば、ヘリシティ）を含む
。さらに、ヘルパーＴ細胞によって認識され得る短鎖ペプチドは、一般に疎水性側（ＭＨＣ分子との相互作用について）および親水性側（Ｔ細胞レセプターとの相互作用について）を含む両親媒性構造であり（Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｅｄ．Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６）、そしてさらに、両親媒性構造はα螺旋立体配座を有する（例えば、Ｓｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３８：２０４−２１２；Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６：２４９８−２５０３を参照のこと）ことが考えられる。
【００４０】
それ故に、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質のセグメントは、多数のコンピュータプログラムを使用して容易に予測し得る（例えばＭａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｅｄ．Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら、（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６を参照のこと）。このようなプログラムは、一般的に、Ｔ細胞応答を誘導することが公知の配列とペプチドのアミノ酸配列を比較し、そしてＴ細胞エピトープを必要とすることが考えられるアミノ酸のパターンについて検索する。
【００４１】
ＨＣＶ抗原（ポリペプチドおよびインビボで発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含む）または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する被験体の体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して存在し、そして細胞表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方は、ＨＣＶ感染細胞を殺傷し得る。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する機能を刺激し、そしてこの細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、抗ウイルス性サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により産生される他のこのような分子（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられるがこれらに限定されない）の産生をいう。
【００４２】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近で指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的な保護を可能にするように生成され得る。
【００４３】
細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くのアッセイによって（例えば、リンパ球増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによって）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００４４】
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原もまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に対して特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する症状の保護または軽減を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００４５】
「等価な抗原決定基」とは、ＨＣＶの異なる亜種または株由来（例えば、ＨＣＶの１株、２株または３株など由来）の抗原決定基を意味し、抗原決定基は、配列のバリエーションに起因して等しく必要とされないが、問題のＨＣＶ配列における等価な位置に生じる。一般的に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、通常４０％より大きい、６０％より大きい、なお８０〜９０％より大きいアミノ酸配列相同性）を有する。
【００４６】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによって、そして３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。
【００４７】
「核酸」分子または「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物由来のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）由来のゲノムＤＮＡ配列または原核生物ＤＮＡ、特に合成ＤＮＡ配列をいうが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列も含む。
【００４８】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分が、それらの所望の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得（イントロンは転写され得る）、プロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４９】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、その起源または操作により、天然に付随するポリヌクレオチドのうちの全てまたは一部を付随しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載のように、クローン化され、次いで、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００５０】
「制御エレメント」とは、それが連結するコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、ならびに適切な場合、リーダー配列およびエンハンサー（これらは、集合的に、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する）を含む。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し得、それに作動可能に連結される下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５２】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、ｍＲＮＡにコード配列を転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指示し」、次いで、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００５３】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指向するように）作動可能に連結されるプロモーター）を含み、そしてしばしば、同様に、ポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの構成成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、１種以上の選択マーカー、このプラスミド構築物が単鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３の複製起点）、少なくとも１ヶ所のマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、複製のＳＶ４０起点またはアデノウイルス起点）を含み得る。
【００５４】
本明細書中で使用される「形質転換」とは、挿入のために使用される方法（例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換）に係わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入をいう。トランスフェクションの特定の方法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００５５】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換された細胞、または形質転換され得る細胞である。
【００５６】
「単離された」とは、ポリペプチドをいう場合、示された分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離され、そして別々であるか、または同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然においてそのポリヌクレオチドと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然で存在するが、その配列に関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「精製された」とは、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、より好ましくは、少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％の、同じ種類の生物学的高分子が存在することを意味する。
【００５８】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の同一性の割合をいう。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％またはそれ以上の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００５９】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の割合は、それらの配列を整列させ、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって割り、そして結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））は、分析を助けるために使用され得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラム（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する））は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、そして上に参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に使用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性の割合は、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００６０】
本発明の状況において同一性の割合を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性の割合または相同性の割合を計算するための他の適切なプログラムは、当該分野において一般的に公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）＝縮重なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００６１】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、単鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００６２】
「核酸免疫化」によって、インビボにおける免疫原（単数および複数）の発現のために、宿主細胞中に１つ以上の選択した抗原をコードする核酸分子を導入することを意味する。核酸分子は、例えば、注入投与、吸入投与、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエント被験体中に直接的に導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り出された細胞中に導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、被験体中で、核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答を開始し得る。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な除去または完全な除去、のいずれかをいう。処置は、予防的（感染前）であっても、治療的（感染後）であっても達成され得る。
【００６４】
「脊椎動物被験体」とは、以下を含むがこれらに限定されない、コルダータ（ｃｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバーを意味する：ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ）種およびサル（ｍｏｎｋｅｙ）種のような非ヒト霊長類を含む）；飼育場用家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭用家畜（例えば、イヌおよびネコ）；実験用動物（マウス、ラットおよびモルモットのような齧歯類を含む）；トリ（ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、アヒル、ガチョウなどのような家庭用、野生および狩猟用のトリを含む）。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体の個体および新生仔の個体の両方を網羅することが意図される。これら全ての脊椎動物の免疫系が同様に作動するので、本明細書中に記載される発明は、上記脊椎動物種のいずれにおける使用のためにも意図される。
【００６５】
（ＩＩ．発明を実施するための形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の処方物もプロセスのパラメーターも変動し得るので、特定の処方物にもプロセスのパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００６６】
本明細書中に記載された組成物および方法と類似するかまたは等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施で用いられ得、好ましい材料および方法が本明細書中に記載される。
【００６７】
本発明は、融合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関し、これは、改変されたＮＳ３ポリペプチドおよびＨＣＶポリタンパク質由来の少なくとも１つの他のＨＣＶポリペプチドを含む。本発明の融合タンパク質は、細胞免疫応答を刺激するため（例えば、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞（すなわち、これらのポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞）を活性化するため、および／またはヘルパーＴ細胞の産生を惹起するため、および／または抗ウイルスサイトカイン、ケモカインなどの産生を刺激するため）に使用され得る。このような融合タンパク質によるＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、（特に、応答と関連するＨＣＶポリペプチドエピトープを同定するための）ＨＣＶワクチンの開発のためのインビトロモデル系およびインビボモデル系の両方を提供する。融合タンパク質はまた、哺乳動物におけるＨＣＶに対する免疫応答（例えば、ＣＴＬ応答）を生成するため、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞をプライムして、治療目的または予防目的のいずれかのための抗ウイルス剤を作製するために使用され得る。
【００６８】
本発明のさらなる理解のために、さらに詳細な考察が、本発明の組成物において使用するための融合タンパク質、ならびにタンパク質の産生、それらを含む組成物およびタンパク質を使用する方法に関して、以下に提供される。
【００６９】
（融合タンパク質）
ＨＣＶ系統のゲノムは、約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質に転写される。図１および表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質は、切断の際に、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０個の異なる産物を産生する。このコアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた、１位〜１９１位に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムに関して、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドは、さらに、アミノ酸約１位〜約１７３位を含むＨＣＶポリペプチドを産生するように処理される。このエンベロープポリペプチド（Ｅ１およびＥ２）は、それぞれ、約１９２位〜約３８３位および約３８４位〜約７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、約７４７位〜約８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解性を有する完全な膜タンパク質であり、そしてこのポリタンパク質の約８１０位〜約１０２６位に見出される。ＮＳ２は、単独か、またはＮＳ３（約１０２７位〜約１６５７位に見出される）と組み合わせてかのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３単結合（ｓｉｓｓｌｅ  ｂｏｎｄ）を切断し、次に、ＮＳ３  Ｎ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。このＮＳ３プロテアーゼ（約１０２７位〜約１２０７位に見出される）は、残りのポリタンパク質を処理するのに役立つ。ヘリカーゼ活性は、約１１９３位〜約１６５７位に見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（約１６５８位〜約１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２個のタンパク質（約１７１２位〜約１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、および約１９７３位〜約２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１位〜約３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離する。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ結合の自己触媒による切断より開始される。
【００７０】
【表１】
2006265267.tif 000002
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けられている。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。
【００７１】
本発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ活性を阻害し、その結果、融合物のさらなる切断が、阻害されるように改変されたＮＳ３ポリペプチドを含む。ＮＳ３ポリペプチドが、ＮＳ３プロテアーゼドメインの全てまたは部分の欠失により改変され得る。あるいは、タンパク質分解活性が、プロテアーゼドメインの活性領域中のアミノ酸の置換により阻害され得る。最後に、触媒部位が改変されるような、アミノ酸のこのドメインの活性領域への付加がまた、タンパク質分解活性を阻害するのに役立つ。
【００７２】
上で説明されるように、このプロテアーゼ活性は、アミノ酸位置１０２７−１２０７の周りで見出され、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照のこと）に対して、図２（配列番号４）の位置２−１８２に番号づけられる。ＮＳ３プロテアーゼの構造および活性部位は、公知である。例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。従って、ネイティブ配列の欠失および改変は、代表的にこの分子の活性部位にて、またはこの近くで生じる。特に、図２（配列番号４）の位置１−１８２もしくは２−１８２、好ましくは１−１７０もしくは２−１７０または１−１５５もしくは２−１５５に存在する、１つ以上のアミノ酸に対して改変するかまたは欠失を作製することが、望ましい。好ましい改変は、プロテアーゼを不活性化するために、プロテアーゼの活性部位での触媒的三つ組、すなわち、Ｈ、Ｄおよび／またはＳ残基に対してである。これらの残基は、それぞれ、位置１０８３、１１０５および１１６５に存在し、全長ＨＣＶポリタンパク質に対して番号づけられる（図２（配列番号４）の位置５８、８０および１４０）。このような改変は、タンパク質分解性開裂を抑制する一方、Ｔ細胞エピトープを保持する。
【００７３】
当業者は、活性を妨害するために欠失すべきＮＳ３プロテアーゼの部分を、容易に決定し得る。活性の存在または非存在は、当業者に公知の方法を使用して決定され得る。
【００７４】
例えば、プロテアーゼ活性またはその欠失は、実施例の下部に記載される手順を使用して、ならびに当該分野で周知のアッセイを使用して、決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９８８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｐ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３−１５８；およびＫｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照のこと。
【００７５】
本発明の融合タンパク質は、改変されたＮＳ３ポリペプチドに加えて、ＨＣＶポリタンパク質の１つ以上のほかの領域由来の１つ以上のポリペプチドを含む。実際には、融合物は、ＨＣＶポリタンパク質の全ての部分を含み得る。これらのポリペプチドは、ＮＳ３ポリペプチドと同じＨＣＶ単離物からか、または異なる株または任意の種々のＨＣＶ遺伝子型を有する単離物を含む単離物から誘導され得、幅広い範囲のＨＣＶ遺伝型に対する保護を増加する。さらに、ポリペプチドは、特定の地理的な領域で特有の特定のウイルスクレード水腫に基づいて選択され得、ここで融合物を含むワクチン組成物が、使用される。本発明の融合物が、広範な文脈でＨＣＶ感染を処置する有効な手段を提供することが、容易に明らかである。
【００７６】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、改変されたＮＳ３（本明細書中でＮＳ３＊とも呼ばれる）、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、ＮＳ５ａならびに、必要に応じて、ＨＣＶのコアポリペプチド（ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＣｏｒｅ融合タンパク質、本明細書中で「ＮＳ３＊４５ａ」および「ＮＳ３＊４５ａＣｏｒｅ」とも呼ばれる）を含む。これらの領域は、ネイティブのＨＣＶポリタンパク質において天然に存在する順序である必要はない。従って、例えば、コアポリペプチドは、融合物のＮ末端および／またはＣ末端であり得る。
【００７７】
別の実施形態は、ＮＳ３＊、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂおよび必要に応じて、ＨＣＶのコアポリペプチド（ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂまたはＮＳ３＊ＮＳ４＊ＮＳ５ｂＣｏｒｅ融合タンパク質、本明細書中で「ＮＳ３＊４５ａｂ」および「ＮＳ３＊４５ａｂＣｏｒｅ」とも呼ばれる）を含む融合タンパク質を提供する。これらの領域は、これらがネイティブなＨＣＶポリタンパク質中で天然に存在する順番である必要はない。従って、例えば、コアポリペプチドが、融合物のＮ末端および／またはＣ末端であり得る。
【００７８】
なお別の実施形態は、ＮＳ２と組み合わされるＮＳ３＊、ＮＳ２、ｐ７およびＥ１と組み合わされるＮＳ３＊、ＮＳ２、ｐ７ならびにＥ１およびＥ２と組み合わされるＮＳ３＊、ＮＳ２、ｐ７およびＥ１と組み合わされるＮＳ３＊、Ｅ２と組み合わせられるＮＳ３＊、Ｅ１およびＥ２と組み合わせられるＮＳ３＊（これらの全てはコアポリペプチドを有していても有していなくてもよい）を含む融合タンパク質に関する。上記の融合物と同様に、これらの領域は、これらが天然に存在する順序である必要はない。さらに、これらの領域の各々は、同じＨＣＶ単離物または異なるＨＣＶ単離物から誘導され得る。
【００７９】
図３（配列番号５〜６）は、典型的な改変された融合タンパク質を示し、このタンパク質は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失されており、Ｃ末端上のコアのアミノ酸１〜１２１を含む。
【００８０】
上記の種々の融合物に存在する種々のＨＣＶポリペプチドは、全長ポリペプチドまたはその部分のいずれかであり得る。融合タンパク質を構成するＨＣＶポリペプチドの一部は、少なくとも１つのエピトープを含み、これは、活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターにより認識され、例えば、２１５２−ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０（配列番号１）および／または２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８（配列番号２）である。ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、およびＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂのエピトープは、種々の方法により、同定され得る。例えば、上の任意の組み合わせを含む個々のポリペプチドまたは融合タンパク質が、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用する免疫親和性精製により、単離され得る。次いで、単離されたタンパク質配列は、全タンパク質配列にわたる精製されたタンパク質のタンパク質分解性開裂により一連の短いペプチドを調製することによりスクリーニングされ得る。例えば、１００マーポリペプチドで開始することにより、各々のポリペプチドは、ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターにより認識されるエピトープの存在について試験され得、進歩的により小さく、重なるフラグメントは、次いで、同定された１００マーから試験されて目的のエピトープをマッピングし得る。
【００８１】
ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターにより認識されるエピトープは、例えば、５１Ｃｒリリースアッセイ（例えば、実施例４）により、またはリンパ増殖アッセイ（例えば、実施例６）により、同定され得る。５１Ｃｒリリースアッセイにおいて、標的細胞が、エピトープをコードするポリペプチドを発現ベクター中にクローニングすることにより、そしてこの発現ベクターを標的細胞中に形質転換することにより、目的のエピトープを表示する標的細胞が、構築され得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、例えば、融合物中で見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域から１つ以上のエピトープを表す標的細胞を溶解し、そしてこのようなエピトープを示さない細胞を溶解しない。リンパ増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、融合物中に見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域由来の１つ以上のエピトープと共に培養される場合、増殖するが、ＨＣＶエピトープ性ペプチドの非存在下では、増殖しない。
【００８２】
種々のＨＣＶポリペプチドは、融合タンパク質中に任意の順序で存在し得る。所望される場合、１つ以上のポリペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上が、融合タンパク質中に存在し得る。複数のＨＣＶのウイルス株が存在し、そして任意のこれらの株のＨＣＶポリペプチドが、融合タンパク質中で使用され得る。
【００８３】
多くのＨＣＶ株および単離物の核酸配列およびアミノ酸配列（コア、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂの遺伝子およびポリペプチドを含む、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域の核酸配列およびアミノ酸配列を含む）が、決定された。例えば、単離されたＨＣＶ  Ｊ１．１が、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０７２−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載されている。２つの独立した単離物、ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全コード配列が、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３にそれぞれ記載されている。
【００８４】
ＨＣＶ−１単離物を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離物ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離物ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０が、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載されている。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２が、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載されている。ＨＣＶ単離物Ａ、Ｃ、ＤおよびＥが、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４に記載されている。
【００８５】
融合タンパク質の各々の成分が、同じＨＣＶ株もしくは単離物または異なるＨＣＶ株もしくは単離物から得られ得る。例えばＮＳ３ポリペプチド由来の、ＨＣＶポリペプチドを含む、融合タンパク質は、ＨＣＶの第１の株から得られ得、そして存在している他のＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株から得られ得る。あるいは、１つ以上の他のＨＣＶポリペプチド（例えば、存在する場合、ＮＳ２、ＮＳ４、コア、ｐ７、Ｅ１および／またはＥ２）は、ＨＣＶの第１の株から得られ得、そして残るＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株から得られ得る。さらに、存在する各々のＨＣＶポリペプチドは、異なるＨＣＶ株から得られ得る。
【００８６】
上に説明するように、本発明の融合物中のＨＣＶポリタンパク質のコア領域から得られるポリペプチドを含むことが、望ましくあり得る。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号づけられる、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸位置１〜１９１に存在する。全長タンパク質、そのフラグメント（例えば、アミノ酸１〜１６０、例えば、アミノ酸１〜１５０、１〜１４０、１〜１３０、１〜１２０、例えば、アミノ酸１〜１２１、１〜１２２、１〜１２３．．．１〜１５１など）、またはこの全長タンパク質のエピトープを含むより小さなフラグメントのいずれか（例えば、アミノ酸１０〜５３、アミノ酸１０〜４５、アミノ酸６７〜８８、アミノ酸１２０〜１３０または例えばＨｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許番号５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；および米国特許番号６，２８０，９２７号および同６，１５０，０８７号で同定される任意のコアエピトープの間で見出される、エピトープ）が、本発明の融合物に使用され得る。さらに、ポリタンパク質のコア領域のフレームシフトから生じるタンパク質（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／６３９４１に記載されるような）が、使用され得る。
【００８７】
コアポリペプチドが存在する場合、これは、融合物のＮ末端、Ｃ末端および／または内部に存在し得る。特に好ましいのは、特定のアジュバンド（例えば、以下にさらに記載される、ＩＳＣＯＭ）との複合体の形成を可能にする、Ｃ末端上のコアポリペプチドである。
【００８８】
上に記載されるように、ＨＣＶ融合物中で有用なポリペプチドとしては、ポリタンパク質の任意の種々の領域から誘導されるＴ細胞エピトープが挙げられる。この点において、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７およびＮＳ２は、ヒト細胞エピトープ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）を含み、ワクチン効力を増加し、そして複数のＨＣＶ遺伝子型に対する保護レベルを増加するよう働く１つ以上のこれらのエピトープを含むことが、公知である。さらに、特異的な、保存されたＴ細胞エピトープの複数のコピーがまた、融合物（例えば、異なる遺伝子型由来のエピトープの複合物）中で使用され得る。
【００８９】
例えば、ＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２領域由来のポリペプチドが、本発明の融合物において使用され得る。Ｅ２は、複数の種（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）として存在し、そしてクリッピングおよびタンパク質分解が、Ｅ２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端で起こり得る。従って、本明細書中で使用のためのＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号づけられる、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸４０５〜６６１（例えば、４００、４０１、４０２．．．〜６６１）（例えば、３８３もしくは３
８４〜６６１、３８３もしくは３８４〜７１５、３８３もしくは３８４〜７４６、３８３もしくは３８４〜７４９または３８３もしくは３８４〜８０９あるいは３８３もしくは３８４から６６１〜８０９の間の任意のＣ末端）を含み得る。同様に、本明細書中で使用のためのＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、１９２〜３３０、１９２〜３３３、１９２〜３６０、１９２〜３６３、１９２〜３８３または１９２から３２６〜３８３の間の任意のＣ末端を含み得る。
【００９０】
エピトープを含むＥ１および／またはＥ２の免疫原性フラグメントは、本発明の融合物において使用され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドのフラグメントは、約５〜分子のほぼ全長（例えば、Ｅ１ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１８５またはそれ以上のアミノ酸）あるいは述べられた数の間の任意の整数を含み得る。同様に、Ｅ２ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０アミノ酸あるいは述べられた数の間の任意の整数を含み得る。
【００９１】
例えば、Ｅ２の超可変領域（アミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０にわたる領域のような）から得られるエピトープは、この融合物中に含まれ得る。Ｅ２ポリペプチド配列中に組み入れられる特に有効なＥ２エピトープは、この領域から得られるコンセンサス配列（例えば、ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列を表すコンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号７））を含むものである。さらなるエピトープＥ１およびＥ２は、公知であり、例えば、Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５に記載されている。
【００９２】
さらに、Ｅ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドは、ドメインに広がる膜の全てまたは一部を欠失し得る。Ｅ１について、アミノ酸位置約３７０以上（ＨＣＶ−１  Ｅ１の番号づけに基づく）で終結するほとんどのポリペプチドは、ＥＲにより保持され、従って増殖媒地中に分泌されない。Ｅ２について、アミノ酸位置７３１以上（これはまた、ＨＣＶ−１  Ｅ２配列の番号づけに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲにより保持され、そして分泌されない。（例えば、１９９６年２月１５日に公開された、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１を参照のこと）。これらのアミノ酸位置が決定的ではなく、ある程度変動し得ることが留意されるべきである。従って、本発明は、膜貫通結合ドメインならびに（アミノ酸位置約３６９以下で終結する）Ｅ１ポリペプチドおよび（アミノ酸位置７３０以下で終結する）Ｅ２ポリペプチドを含む膜貫通結合ドメインの全てまたは一部を欠くポリペプチドを保持するＥ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドの使用を企図する。さらに、Ｃ末端短縮は、Ｎ末端に向かうドメインにわたる膜を貫通して伸び得る。従って、例えば、例えば３６０より低い位置に存在するＥ１短縮および例えば７１５より低い位置に存在するＥ２短縮がまた、本発明に含まれる。必要な全ては、短縮したＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドが、その意図された目的のために機能性を保持することである。しかし、特に好ましい短縮されたＥ１構築物は、アミノ酸約３００を越えて伸びないものである。最も好ましいものは、位置３６０での終結である。好ましい短縮されたＥ２構築物は、アミノ酸位置約７１５を越えて伸びないＣ末端短縮を有するものである。特に好ましいＥ２短縮物は、任意のアミノ酸７１５〜７３０（例えば７２５）の後で短縮される分子である。
【００９３】
これらのＨＣＶ領域および他のＨＣＶ領域由来の種々のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；ならびに米国特許番号第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００９４】
好ましくは、上述の融合タンパク質およびこれらのタンパク質の個々の成分は、組換え的に産生される。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、発現ベクター内に導入され、これは、適切な発現系において発現され得る。種々の細菌、酵母、哺乳動物および昆虫の発現系が、当該分野で使用可能であり、そして任意のこのような発現系が使用され得る。必要に応じて、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、無細胞翻訳系において翻訳され得る。このような方法は、当該分野で周知である。このタンパク質はまた、固相タンパク質合成によって構築され得る。
【００９５】
所望の場合、融合タンパク質またはこれらのタンパク質の個々の成分はまた、他のアミノ酸配列（例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌性プロテインＡのようなタンパク質精製において有用なリガンド）を含み得る。
【００９６】
（融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
上述のように、ポリヌクレオチドは、完全に満たないＨＣＶゲノムを含むか、またはあるいは、変異ＮＳ３ドメインを有する完全なポリタンパク質の配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡで有り得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、他の成分（例えば、タンパク質および脂質）を含まないで単離される。ポリヌクレオチドは、上述の融合タンパク質をコードし、従って、ＮＳ３＊およびＨＣＶポリタンパク質の異なった領域由来の少なくとも１つの他のＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、コア（ｃｏｒｅ）などに由来するポリペプチド）をコードする配列を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、タンパク質精製において有用なリンカー、シグナル配列、またはリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、およびブドウ球菌性プロテインＡ）をコードする配列のような、他のヌクレオチド配列を含み得る。
【００９７】
発現収率を上げるため、ポリタンパク質を発現のためのフラグメントに分裂させることが望ましく有り得る。これらのフラグメントは、本明細書中で記載されるように組成物において組み合わせて使用され得る。あるいは、これらのフラグメントは、発現の後に結合し得る。従って、例えば、ＮＳ３＊ＮＳ４Ｃｏｒｅは、１つの構築物として発現され得、そしてＮＳ５ａＮＳ５ｂＣｏｒｅは、第２の構築物として発現され得る。同様に、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａは、１つの構築物として発現され得、そして例えば、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＣｏｒｅを有する第２の構築物が、第２の構築物として発現され得る。例えば、ＮＳ２ｐ７Ｅ２ＮＳ３＊ＮＳ４は、１つの構築物として発現され得、そしてＮＳ３（非修飾）ＮＳ４ＮＳ５ｂは、本発明の組成物における使用のためのさらなる構築物として発現され得る。上記の組み合わせは、代表例に過ぎず、任意の組み合わせの融合物が別々に発現され得ることが理解されるべきである。
【００９８】
種々のＨＣＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えば、ＨＣＶに感染した個体の血漿、血清、または肝臓ホモジネートに存在する核酸配列に由来するゲノムライブラリーから単離され得るか、または例えば、自動合成機を使用して実験室において合成され得る。ＰＣＲのような増幅方法を使用して、ＨＣＶゲノムＤＮＡまたはこれをコードするｃＤＮＡのどちらかからポリヌクレオチドを増幅し得る。
【００９９】
ポリヌクレオチドは、天然に存在するこれらのポリペプチドについてのコード配列かまたは天然に存在しない人工配列であり得るこれらのポリペプチドについてのコード配列を含み得る。これらのポリヌクレオチドを、標準的分子生物学技術を用いて連結させて、融
合タンパク質のコード配列を形成し得る。所望の場合、ポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローン化し、そして、例えば、細菌、酵母、または哺乳動物細胞内に形質転換し得、それにより、本発明の融合タンパク質が、細胞培養物において発現し得、これから単離され得る。
【０１００】
所望の融合物またはこれらの融合物の個々の成分を含む個々の発現構築物を含む、本発明の発現構築物を、核酸免疫化のために使用して、標準的遺伝子送達プロトコールを用いて細胞免疫応答を刺激し得る。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、直接脊椎動物被験体に送達され得るか、またはその代わり、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得、そしてこの細胞は、被験体に再移植され得る。例えば、この構築物は、例えば、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＣｏｌＥ１）内に含まれるプラスミドＤＮＡとして送達され得る。
【０１０１】
さらに、この発現構築物は、細胞内に送達される前に、リポソーム内に封入され得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸を安定的に結合するかまたは捕捉して維持し得る、リポソームを使用して達成される。凝集したＤＮＡ対脂質調製物の比率は変わり得るが、一般におよそ１：１である（ｍｇ  ＤＮＡ：高分子脂質）か、より脂質が多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【０１０２】
本発明での使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電）調製物、アニオン性（負に荷電）調製物、および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの登録商標で、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ．）から市販されている（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）もまた、参照のこと。他の市販の脂質としては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ  ９０／１１０９２を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を、参照のこと。
【０１０３】
ＤＮＡはまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載されるのと類似の渦巻き状（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）脂質組成物中で送達され得る。また、米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８も、参照のこと。
【０１０４】
多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞内への遺伝子伝達のために開発されている。例えば、レトロウイルス（例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）は、遺伝子送達系についての便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクター内に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子内に封入され得る。次いで、組換えウイルスは単離され得、次いで、インビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が、記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。簡潔には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルスを含む広範な種々のレトロウイルス、ならびにＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのようなスプーマウイルスおよびレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと）。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）のような寄託当局または収集局から得られ得るか、または一般に利用可能な技術を用いて、公知の供給源から単離され得る。
【０１０５】
アデノウイルス２型ベクターおよび５型ベクターのような、多くのアデノウイルスベクターもまた記載されている。宿主ゲノム内に組み込むレトロウイルスと違い、アデノウイルスは、染色体外に留まり、従って、挿入変異に関わる危険性を最小にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６））。
【０１０６】
Ｍｉｃｈａｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクターのような分子結合体ベクターもまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【０１０７】
シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス、ＶＥＥに由来するベクターのような（しかしこれらに限定されない）アルファウイルス属のメンバーもまた、目的の遺伝子の送達のためのウイルスベクターとしての使用を見出す。本発明の方法の実践のために有用なシンドビスウイルス由来ベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開番号ＷＯ  ９５／０７９９５およびＷＯ  ９６／１７０７２を参照のこと。
【０１０８】
他のベクターが使用され得、他のベクターとしては、シミアンウイルス４０およびサイトメガロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＢＣＧ株、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌ベクターが、使用され得る。ＭＣおよびＭＣ１のような小染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、バクテリオファージ、コスミド（λファージｃｏｓ部位が挿入されているプラスミド）およびレプリコン（細胞内において、それ自身の制御の下で複製を可能にする遺伝エレメント）もまた、使用され得る。
【０１０９】
発現構築物もまた、粒子キャリアにカプセル化され得、吸着され、または結合され得る。このようなキャリアは、免疫系に対し選択された分子の多くのコピーを提示し、局部リンパ節における分子の捕捉および維持を促進する。粒子はマクロファージによって補食され得、そしてサイトカイン放出を通して抗原提示を増大し得る。粒子キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来の粒子キャリア、ならびにポリ（ラクチド）由来の微粒子およびポリ（ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧとして公知である）由来の微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
【０１１０】
発現構築物を細胞に送達するために、広範な種々の他の方法が、使用され得る。このような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジン媒介性トランスフェクションもしくはポリオルニチン媒介性トランスフェクション、または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンが挙げられる）、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石など）を使用した沈殿が挙げられる。他の有用なトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、ソノボレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞を形質転換させるための技術の考察については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと；そして遺伝子移入に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポレーションを使用したＤＮＡの送達の特に効果的な方法が、国際公開番号ＷＯ／００４５８２３に記載される。
【０１１１】
さらに、金およびタングステンのような粒子キャリアを使用する粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の発現構築物を送達するために特に有用である。この粒子は、送達されるべき構築物で被膜され、「遺伝子銃」から発射される銃粉末を用いて、一般に減圧の雰囲気下で、高速まで加速される。このような技術およびこれらに有用な装置の記載については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。
【０１１２】
（融合タンパク質または融合ポリヌクレオチドを含有する組成物）
本発明はまた、融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含有する組成物を提供する。この組成物は、１つ以上の融合物を含有し得、本明細書中で記載のような、この融合物の１つは、変異ＮＳ３ドメインを含む。本発明の組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。このキャリアは、それ自体が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導するべきではない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。このようなキャリアとしては、タンパク質、多糖類（例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）、アミノ酸コポリマー、および不活性型ウイルス粒子のような、大型のゆっくりと代謝される高分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
薬学的に受容可能な塩もまた、本発明の組成物中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような無機塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸の塩である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素、および当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、単独または組み合わせで、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなどのような液体または賦形剤、および湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤のような物質を含有する。本発明のタンパク質はまた、リポソームおよびＰＬＧのような粒子キャリアに吸着し得るか、これに捕捉され得るか、またはさもなければこれに結合し得る。リポソームおよび他の特定のキャリアは、上述される。
【０１１４】
所望の場合、Ｂ７−１もしくはＢ７−２、またはサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインのような、リンパ球に対する免疫提示を改善する同時刺激性分子が、組成物中に含有され得る。このケモカインとしては、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５からｓｅｒ１２５へ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、ＦＬＰ−３、リバビリンおよびＲＡＮＴＥＳのようなサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、アジュバントもまた、組成物中に含有され得る。使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）水中油乳剤処方物（ムラミルペプチド（下を参照）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を含有するかまたは含有しない）｛例えば：（ａ）（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１４８３７）（モデル１１０Ｙマイクロフルイタイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイタイザーを用いてミクロン未満の粒子に処方される）（ｂ）１０％スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記参照）含有のＳＡＦ（ミクロン未満の乳剤に微小流動されるか、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズの乳剤が作製される）、ならびに（ｃ）２％スクアレンと、０．２％  Ｔｗｅｅｎ
８０と、モノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））とを含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）｝；（３）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはこれから作製されるＩＳＣＯＭ（免疫刺激融合体）のような粒子であって、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を有さなくてもよい（例えば、国際公開番号ＷＯ  ００／０７６２１を参照のこと）；（４）Ｆｒｅｕｎｄｓ完全アジュバント（ＣＦＡ）およびＦｒｅｕｎｄｓ不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン｛例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２などのようなインターロイキン（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／４４６３６を参照のこと）、γインターフェロンのようなインターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など｝；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）のような細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、６３位の野生型アミノ酸がリジンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、７２位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここで、１０９位の野生型アミノ酸がセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここで、９位の野生型アミノ酸がリジンで、１２９位の野生型アミノ酸がグリシンで置換されている）（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９３／１３２０２およびＷＯ  ９２／１９２６５を参照のこと）；（７）必要に応じてミョウバンの実質的非存在下にあるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２２１；ＥＰＡ０６８９４５４を参照のこと）、（例えば、国際公開番号ＷＯ  ００／５６３５８を参照のこと）；（８）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油乳剤との組み合わせ（例えば、ＥＰＡ  ０８３５３１８；ＥＰＡ  ０７３５８９８；ＥＰＡ  ０７６１２３１を参照のこと）；（９）ポリエキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９９／５２５４９を参照のこと）；（１０）ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはサポニン＋ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、国際公開番号ＷＯ  ００／６２８００を参照のこと）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、国際公開番号ＷＯ  ００／２３１０５を参照のこと）；（１２）サポニンおよび油中水乳剤（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９９／１１２４１を参照のこと）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９８／５７６５９）；（１４）ＭＰＬ誘導体ＲＣ５２９；ならびに（１５）免疫刺激剤として作用し、組成物の有用性を高める他の基質。ミョウバンおよびＭＦ５９が、好ましい。
【０１１５】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７（ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる））、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
さらに、上記融合タンパク質は、ＩＳＣＯＭに吸着され得るか、またはＩＳＣＯＭ内に捕捉され得る。古典的ＩＳＣＯＭは、コレステロール、サポニン、ホスホリピド、および免疫原（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質）の組み合わせによって形成される。一般的には、免疫原（通常は、疎水性領域を有する）は、界面活性剤中にて可溶化され、そして反応混合物に添加され、それによって、ＩＳＣＯＭが、免疫原を中に組み込んで形成される。ＩＳＣＯＭマトリックス組成物は、同様に形成されるが、ウイルスタンパク質を含まない。高い正電荷を有するタンパク質は、このＩＳＣＯＭ粒子中に、疎水性の力を介してではなく、静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭ、ならびにＩＳＣＯＭを処方するための方法のより詳細な一般的考察について、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：２４７〜２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１１７】
本発明とともに使用するためのＩＳＣＯＭは、当該分野で周知の標準技術を使用して生成され、そして例えば、米国特許第４，９８１，６８４号、同第５，１７８，８６０号、同第５，６７９，３５４号および同第６，０２７，７３２号；欧州特許出願公開番号ＥＰＡ１０９，９４２；同１８０，５６４および同２３１，０３９；Ｃｏｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１２４３に記載される。代表的には、用語「ＩＳＣＯＭ」とは、グリコシド（例えば、トリテルペノイドサポニン（特にＱｕｉｌ  Ａ））と、疎水性領域を含む抗原との間に形成される、免疫原性複合体を指す。例えば、欧州特許出願公開番号ＥＰＡ  １０９，９４２および同１８０，５６４を参照のこと。この実施形態において、ＨＣＶ融合物（通常は、疎水性領域との融合物）は、界面活性剤中で可溶化され、反応混合物に添加され、それにより、ＩＳＣＯＭが、上記融合物を中に組み込んで形成される。ＨＣＶポリペプチドＩＳＣＯＭは、両親媒性特性を示すＨＣＶポリペプチドを用いて容易に生成される。しかし、望ましい疎水性特性を欠く、タンパク質およびペプチドが、疎水性アミノ酸、脂肪酸ラジカル、アルキルラジカルなどを有するペプチドと結合した後に、免疫原性複合体中に組み込まれ得る。
【０１１８】
欧州特許出願公開番号ＥＰＡ２３１，０３９に説明されるように、抗原の存在は、基本的ＩＳＣＯＭ構造（マトリックスまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと呼ばれる）を形成するためには必要ではない。この構造は、ステロール（例えば、コレステロール）、ホスホリピド（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）、およびグリコシド（例えば、Ｑｕｉｌ
Ａ）から形成され得る。従って、目的とするＨＣＶ融合物は、マトリックス中に組み込まれるのではなく、マトリックスの外側に存在し、例えば、静電的相互作用を介してマトリックスに吸着される。例えば、高い正電荷を有するＨＣＶ融合物は、疎水性の力を介するのではなく、ＩＳＣＯＭ粒子に静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭ、およびＩＳＣＯＭを処方する方法のより詳細な一般的考察について、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：２４７〜２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１１９】
ＩＳＣＯＭマトリックスは、例えば、可溶性ステロールと、グリコシドと、（必要に応じて）ホスホリピドとを、一緒に混合することによって、調製され得る。ホスホリピドが使用されない場合、２次元構造が形成される。例えば、欧州特許出願公開番号ＥＰＡ２３１，０３９を参照のこと。用語「ＩＳＣＯＭマトリックス」とは、３次元構造および２次元構造の両方を指すために使用される。使用されるべきグリコシドは、一般的には、両親媒性特性を示しかつその分子中に疎水性領域および親水性領域を含む、グリコシドである。好ましくは、サポアルビン（ｓａｐｏａｌｂｉｎ）（例えば、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａからのサポニン抽出物（ＭｏｌｉｎａおよびＱｕｉｌ  Ａ））が、使用される。他の好ましいサポニンは、Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ由来のエスチン（ａｅｓｃｉｎｅ）（Ｐａｔｔら（１９６０）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  １０：２７３〜２７５）、およびＧｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ由来のサポニン（Ｖｏｃｈｔｅｎら（１９６８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４２：２１３〜２２６）である。
【０１２０】
ＩＳＣＯＭを調製するために、グリコシドが、少なくとも臨界ミセル形成濃度において使用される。Ｑｕｉｌ  Ａの場合、この濃度は、約０．０３重量％である。ＩＳＣＯＭを生成するために使用されるステロールは、動物起源または植物起源の公知のステロール（例えば、コレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スティグマステロール、およびシトステロール）であり得る。適切なホスホリピドとしては、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。一般に、グリコシド（特に、Ｑｕｉｌ  Ａである場合）とステロール（特に、コレステロールである場合）とホスホリピドのモル比は、１：１：０〜１であり、各数字について±２０％（好ましくは±１０％以下）である。これは、Ｑｕｉｌ  Ａ：コレステロールについての重量比約５：１に等しい。
【０１２１】
可溶化剤もまた、存在し得、それは、例えば、界面活性剤であっても、尿素であっても、グアニジンであってもよい。一般に、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、または双性イオン性界面活性剤、またはコール酸ベースの界面活性剤（例えば、デゾキシコール酸ナトリウム、コール酸塩、およびＣＴＡＢ（セチルトリアンモニウムブロミド））が、この目的のために使用され得る。適切な界面活性剤の例としては、オクチルグルコシド、ノニルＮ−メチルグルカミド、またはデカノイルＮ−メチルグルカミド、アルキルフ
ェニルポリオキシエチレンエーテル（例えば、９〜１０個のオキシエチレン基を有するポリエチレングリコールｐ−イソオクチル−フェニルエーテル（商標名ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００ＲＴＭの下で販売される）アシルポリオキシエチレンエステル（例えば、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商標名ＴＷＥＥＮ  ２０ＴＭ、ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭなどの下で販売される））が挙げられるが、これらに限定されない。可溶化剤は、一般的には、例えば、限外濾過、透析、超遠心分離またはクロマトグラフィーによって、ＩＳＣＯＭの形成のために除去されるが、特定の方法においては、この工程は不必要である（例えば、米国特許第４，９８１，６８４号を参照のこと）。
【０１２２】
一般的には、グリコシド（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）とＨＣＶ融合物との重量比は、５：１から０．５：１の範囲にある。好ましくは、この重量比は、約３：１から１：１であり、より好ましくは、この比は、２：１である。
【０１２３】
一旦ＩＳＣＯＭが形成されると、そのＩＳＣＯＭは、本明細書中に記載されるように、組成物へと処方され得、動物に投与され得る。望ましい場合、得られる免疫原性複合体の溶液は、凍結乾燥され得、その後、使用前に再構成され得る。
【０１２４】
（ＨＣＶ特異的抗体を生成する方法）
ＨＣＶ融合タンパク質が、ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体を生成するために使用され得る。ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体は、ＨＣＶ抗原に特異的に結合する。ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマ）にこの融合タンパク質を投与することによって、生成され得る。免疫された動物由来の血清が収集され、それらの抗体は、例えば、硫酸アンモニウムを用いる沈殿、その後のクロマトグラフィー（好ましくは、アフィニティクロマトグラフィー）によって、血漿から精製される。ポリクローナル抗血清を生成および処理するための技術は、当該分野で公知である。
【０１２５】
その融合タンパク質中に存在するＨＣＶ特異的エピトープに対するモノクローナル抗体もまた、容易に生成され得る。ＨＣＶ融合タンパク質で免疫された哺乳動物（例えば、マウス）由来の正常Ｂ細胞が、例えば、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマが生成され得る。ＨＣＶ特異的抗体を生成するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを使用して同定され得、そして半固体寒天におけるクローニングによって、または限界希釈によって、単離され得る。ＨＣＶ特異的抗体を生成するクローンは、もう１回のスクリーニングによって、単離される。
【０１２６】
ＨＣＶエピトープに対する抗体（モノクローナルおよびポリクローナルのいずれか）は、サンプル中のＨＣＶまたはＨＣＶ抗原（例えば、ＨＣＶに感染したヒト由来の血清サンプル）の存在を検出するために、特に有用である。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、１つの抗体またはいくつかの抗体を利用し得る。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、例えば、ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのＨＣＶポリペプチドの複数のエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、種々のＨＣＶポリペプチドの複数のエピトープに対するモノクローナル抗体、同一のＨＣＶ抗原に対するポリクローナル抗体、種々のＨＣＶ抗原に対するポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用し得る。イムノアッセイプロトコルは、例えば、標識抗体を使用する、例えば、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。その標識は、例えば、蛍光標識、化学発光標識、または放射活性標識であり得る。
【０１２７】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫アフィニティーカラムによって、ＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原を単離するためにさらに使用され得る。この抗体は、例えば、吸着によって、または共有結合によって、固体支持体に固定され得、その結果、その抗体は、その免疫選択的活性を保持する。必要に応じて、スペーサー基が含まれ得、その結果、その抗体の抗原結合部位は、接近可能なままである。その後、固定された抗体が、生物学的サンプル（例えば、血液または血漿）由来のＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原に結合するために使用され得る。結合したＨＣＶ粒子または結合したＨＣＶ抗原は、例えば、ｐＨの変化によって、カラムマトリックスから回収される。
【０１２８】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞）
インビボまたはインビトロで発現される、上記の融合物（（コアポリペプチドを含むかまたは含まない）ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質、ならびに本明細書中に記載される他の種々の融合物を含む）によって活性化されるＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチド）のエピトープ（これらのペプチドのうちの１つ以上と、ＮＳ３＊との（コアポリペプチドを含むかまたは含まない）融合物のエピトープを含む）を認識する。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋であり得る。
【０１２９】
ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得、これは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体形成したこれらのエピトープのうちのいずれかを提示するＨＣＶ感染細胞を死滅させ得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイ（実施例４を参照のこと）によって検出され得る。５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、これらのエピトープのうちの１つ以上を提示する標的細胞を溶解する能力を測定する。抗ウイルス剤（例えば、ＩＦＮ−γ）を発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、本明細書中で企図され、これはまた、免疫学的方法によって、好ましくは、上記ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチドであるが、これらに限定されない）のうちの１つ以上でのインビトロ刺激の後、ＩＦＮ−γまたは同様のサイトカインについての細胞内染色によって、検出され得る（実施例５を参照のこと）。
【０１３０】
インビボまたはインビトロで発現される、上記の融合物（（コアポリペプチドを含むかまたは含まない）ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質であるが、これらに限定されない）によって活性化されるＨＣＶ特異的ＣＤ４＋細胞は、好ましくは、ＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチドであるが、これらに限定されない）のエピトープ（その融合物（例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質であるが、これらに限定されない）のエピトープを含む）を認識し、このＨＣＶポリペプチドのエピトープは、ＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合され、そして例えば、コアポリペプチドを用いてかまたは用いずに、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａペプチドまたはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂペプチドを刺激することに応じて増殖する。
【０１３１】
ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ増殖アッセイによって検出され得る（実施例６を参照のこと）。リンパ増殖アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、例えば、ＮＳ２エピトープ、ｐ７エピトープ、Ｅ１エピトープ、Ｅ２エピトープ、ＮＳ３エピトープ、ＮＳ４エピトープ、ＮＳ５ａエピトープ、および／またはＮＳ５ｂエピトープに応じて増殖する能力を測定する。
【０１３２】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する方法）
ＨＣＶ融合タンパク質またはポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボのいずれかでＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するために使用され得る。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、特に、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答を最適にするモデルシステムを提供するため、そしてＨＣＶ感染に対する予防処置または治療処置を提供するために、使用され得る。インビトロ活性化について、タンパク質は、上記のように、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を介して、好ましくはＴ細胞に供給される。
【０１３３】
Ｔ細胞のポリクローナル集団は、ＨＣＶに感染している哺乳動物の、血液から誘導され得、好ましくは、末梢リンパ器官（例えば、リンパ節）、脾臓、または胸腺から誘導され得る。好ましい哺乳動物としては、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが挙げられる。ＨＣＶは、哺乳動物中の活性化したＨＣＶ特異的Ｔ細胞の数を拡大するように作用する。その後、哺乳動物由来のＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、本明細書中に記載されるＨＣＶ融合タンパク質（例えば、コアポリペプチドを含むかまたは含まない、ＨＣＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープペプチドまたはＨＣＶ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドであるが、これらに限定されない）を、Ｔ細胞に添加することによって、インビトロで再刺激され得る。その後、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、特に、増殖、ＩＦＮ−γの生成、および例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞を溶解する能力について、インビトロで試験され得る。
【０１３４】
リンパ増殖アッセイ（実施例６を参照のこと）において、ＨＣＶ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ３エピトープペプチド、ＮＳ４エピトープペプチド、ＮＳ５ａエピトープペプチド、ＮＳ５ｂエピトープペプチド、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープペプチド、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドであるが、これらに限定されない）とともに培養された場合に増殖するが、エピトープペプチドの非存在下では増殖しない。従って、ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される特定のＨＣＶエピトープ（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、およびこれらのエピトープの融合物（例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープ）は、リンパ増殖アッセイを使用して同定され得る。
【０１３５】
同様に、上記の融合タンパク質を用いるインビトロ刺激の後にＨＣＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γを検出することは、例えば、ＩＦＮ−γを生成するようにＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する際に特に有効である、融合タンパク質エピトープ（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、およびこれらのエピトープの融合物（例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープであるが、これらに限定されない））を同定するために使用され得る。
【０１３６】
さらに、５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答のレベルを決定するために有用である。Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：４３９〜４４９を参照のこと。例えば、ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＨＣＶに感染した哺乳動物の肝臓から誘導され得る。これらのＴ細胞は、例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞に対する５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、試験され得る。異なるＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａエピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを発現するいくつかの標的細胞集団は、各標的細胞集団が、異なるエピトープＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂを提示するように、構築され得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋細胞は、これらの標的細胞集団の各々に対してアッセイされ得る。５１Ｃｒ放出アッセイの結果は、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂのうちのどちらが、ＨＣＶに対する最も強力なＣＴＬ応答を担うかを決定するために使用され得る。その後、最も強力なＣＴＬ応答を担うエピトープを含む、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａ融合タンパク質またはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂ融合タンパク質（コアポリペプチドを含むかまたは含まない）が、５１Ｃｒ放出アッセイから誘導された情報を使用して、構築され得る。
【０１３７】
上記のようなＨＣＶ融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞をインビボで活性化するために、哺乳動物（例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に投与され得る。投与は、上記のように、当該分野で公知の任意の手段（非経口投与、経鼻投与、筋肉内投与または皮下注射（生物学的微粒子銃（「遺伝子銃」）を使用する注入を含む）を含む）によってであり得る。
【０１３８】
好ましくは、ＨＣＶポリヌクレオチドの注射は、Ｔ細胞を活性化するために使用される。構築および改変を簡単にするという実用的利点に加えて、このポリヌクレオチドの注射は、宿主における融合タンパク質の合成を生じる。従って、これらの免疫原は、天然の翻訳後修飾、構造、および立体構造を有する宿主免疫系に提示される。このポリペプチドは、好ましくは、大きな哺乳動物（例えば、ヒト）に、１ｋｇ当たり、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇの用量で、筋肉内注射される。
【０１３９】
ＨＣＶ融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ、とりわけ、５１Ｃｒ遊離アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって測定されるかまたはＩＦＮ−γについての細胞内染色によって測定される場合に、活性なＨＣＶ特異的Ｔ細胞に対して有効な量で投与される。タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳動物にかＨＣＶ感染哺乳動物のいずれかに投与され得る。組成物中のポリヌクレオチドまたは融合タンパク質の特定の用量は、投与される哺乳動物の種、年齢、および全体的な状態、ならびに組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験のみを用いて容易に決定され得る。上記のインビトロおよびインビボモデルが、適切な用量を同定するのに用いられ得る。以下に記載の実施例において使用されるポリヌクレオチドの量は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいてＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するのに使用され得る全般的な手引きを提供する。概して、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５、または１０ｍｇのＨＣＶ融合タンパク質またはポリヌクレオチド（コアポリペプチドを含む場合も含まない場合もある）が、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトのような大きな動物に投与される。所望の場合、同時刺激分子またはアジュバントがまた、組成物の前、後、または同時に提供され得る。
【０１４０】
本発明の組成物の送達により生成される哺乳動物の免疫応答（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を含む）は、用量、投与経路、またはブーストレジメン（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）を変更することにより増強され得る。本発明の組成物は、単回用量スケジュール、または好ましくは多回用量スケジュールで与えられ得る。多回用量スケジュールにおいて、初回ワクチン接種は、１〜１０の別々の用量を含み、他の用量が、免疫応答を維持および／または強化するのに必要とされるその後の時間間隔（例えば、第２用量については１〜４月）で与えられ、および必要な場合、数ヶ月後にその後の用量が与えられる。
【実施例】
【０１４１】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。この実施例は、例示目的のみのために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、ひとたび本開示の教示が与えられれば、本発明が種々の方法で実施され得ることを容易に理解する。
【０１４２】
使用される数値（例えば、量、温度等）に関して、正確さを確保する努力をしているが、ある程度の実験誤差および偏差は、当然、許容されるべきである。
【０１４３】
（実施例１：ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコアポリヌクレオチドの生成）
以下の実施例において、ＮＳ３＊は、改変されたＮＳ３分子を表す。ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ（ＨＣＶ−１に対する番号でいうと、アミノ酸約１０２７〜２３９９）（本明細書中では、ＮＳ３４５ａとも言う）をコードするポリヌクレオチドを、ＨＣＶから単離する。この分子のＮＳ３部分を、プロテアーゼ活性部位で見出されるＨｉｓ、Ａｓｐ、およびＳｅｒ残基についてのコード配列を変異させることにより変異誘発する。その結果、得られた分子は、これらの部分ではＨｉｓ、Ａｓｐ、およびＳｅｒ以外のアミノ酸をコードし、ＮＳ３プロテアーゼ活性を欠く。この構築物を、全長ポリペプチドのアミノ酸１〜１２２を含むコアポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合する。コアをコードするポリヌクレオチド配列を、この構築物のＮＳ５ａコード部分から下流に融合し、その結果、得られた融合タンパク質は、そのＣ末端にコアポリペプチドを含む。この構築物を、プラスミド、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスベクター中にクローニングする。さらに、この構築物を、組み換え発現ベクター中に挿入し、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコア融合タンパク質を産生する宿主細胞を形質転換するのに使用する。
【０１４４】
プロテアーゼ酵素活性は、以下のようにして決定する。ＮＳ４Ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ）（配列番号８）およびその融合タンパク質を、９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  グリセロール、０．０５  ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、５ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈し、室温で３０分間混合する。この混合物９０μｌをマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に添加し、ＨＣＶ基質１０μｌ（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を添加する。このプレートを混合し、Ｆｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで読み取る。結果を、１分当たりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表す。
【０１４５】
（実施例２：ワクチン接種動物におけるＨＣＶ特異的ＣＴＬのプライミング）
上記のようにして生成したＨＣＶ融合タンパク質ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコアを以下のように使用して、ＨＣＶ融合体−ＩＳＣＯＭを生成する。この融合体−ＩＳＣＯＭ処方物は、融合タンパク質と、予め形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（空のＩＳＣＯＭ）をイオン性相互作用を利用して混合し、抗原とアジュバントとの間の会合を最大にすることにより調製する。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは、本質的に、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１２４３に記載されるようにして調製する。
【０１４６】
アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を、麻酔下で免疫する。動物を、２つのグループに分割する。第１グループに、２×１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）（経皮的に１×１０８、乱切（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって１×１０８）のｒＶＶＣ／Ｅ１を感染させる（第０月）。このグループを、ＣＴＬプライミングについてのポジティブコントロールとして利用する。第２グループの動物を、上述のような、ＩＳＣＯＭに吸着させた２５〜１００μｇのＨＣＶ融合ポリペプチドを用いて、左大腿四頭筋における筋内（ＩＭ）注射によって免疫する（第０、１、２、および６月）。細胞障害活性を、Ｐａｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １６：２７３に記載されるような、標準的な５１Ｃｒ遊離アッセイにおいてアッセイする。
【０１４７】
（実施例３：ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコアポリヌクレオチドによる免疫）
１つの免疫プロトコルにおいて、動物を、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコア融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ５０〜２５０μｇを用いて、前脛骨筋への筋内注射により免疫する。ワクシニアウイルス（ＶＶ）−ＮＳ５ａ  １０７ｐｆｕ（腹腔内）またはプラスミドコントロール５０〜２５０μｇ（筋内）のブースター注射を、６週間後に提供する。
【０１４８】
別の免疫プロトコルにおいて、動物の前脛骨筋に、ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコア融合タンパク質をコードするアデノウイルス粒子１０１０を、筋内注射する。ＶＶ−ＮＳ５ａ  １０７ｐｆｕの腹腔内ブースター注射またはＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ａコアをコードするアデノウイルス１０１０の筋内ブースター注射を、６週間後に提供する。
【０１４９】
（実施例４：ＨＣＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化）
（５１Ｃｒ遊離アッセイ）５１Ｃｒ遊離アッセイを用いて、ＮＳ５ａエピトープを提示する標的細胞を溶解するＨＣＶ特異的Ｔ細胞の能力を測定する。脾臓細胞を、免疫した動物からプールする。これらの細胞を、ＩＬ−２の存在下で、ＨＣＶ  ＮＳ５ａ由来のＣＴＬエピトープペプチドｐ２１４Ｋ９（２１５２−ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０；配列番号１）を用いて、６日間インビトロで再刺激する。次いで、この脾臓細胞を、Ｗｅｉｓｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：９９１２−９９１７に記載のように、標準的な５１Ｃｒ遊離アッセイにおいて、クラスＩ  ＭＨＣ分子を発現するがクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現しないペプチド感作標的細胞（Ｌ９２９）に対する細胞障害活性についてアッセイする。６０：１、２０：１、および７：１のエフェクター（Ｔ細胞）  対  標的（Ｂ細胞）の比を試験する。パーセント特異的溶解を、各エフェクター  対  標的の比について算出する。
【０１５０】
（実施例５：ＩＦＮ−γを発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化）
（インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）に対する細胞内染色）  ＩＦＮ−γの細胞内染色を用いて、ＮＳ５ａエピトープｐ２１４Ｋ９によるインビトロ刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞を同定する。個々の免疫した動物の脾臓細胞を、ＩＬ−２およびモネンシンの存在下で、ｐ２１４Ｋ９または非特異的ペプチドのいずれかを用いて、６〜１２時間、インビトロで再刺激する。次いで、この細胞を、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γについて染色し、フローサイトメトリにより分析する。次いで、ＩＦＮ−γについて陽性でもあるＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセントを算出する。
【０１５１】
（実施例６：ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖）
（リンパ球増殖アッセイ）  プールした免疫動物からの脾臓細胞を、磁気ビーズを用いてＣＤ８＋  Ｔ細胞を枯渇させ、ｐ２２２Ｄ、ＨＣＶ−ＮＳ５ａ由来のＮＳ５ａ−エピトープペプチド（２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８；配列番号２）、または培地のみのいずれかと共に培養する（三連）。７２時間後、細胞を、１μｌ  Ｃｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでパルスし、６〜８時間後に収集する。放射活性の取り込みを、収集後に測定する。平均ｃｐｍを算出する。
【０１５２】
（実施例７：ＮＳ３＊４５ａコアコードＤＮＡワクチン処方物のＣＴＬプライム能力）
動物を、実施例３に記載されるようなＮＳ３＊４５ａコア融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ  １０〜２５０μｇ、ＮＳ３＊４５ａコアををコードするＰＬＧ連結ＤＮＡ（以下を参照のこと）、またはＮＳ３＊４５ａコアをコードするＤＮＡのいずれかを用いて、エレクトロポレーションを通じて送達することによって免疫する（この送達技術については、例えば、国際公報番号ＷＯ／００４５８２３を参照のこと）。この免疫に続いて、ＮＳ３＊４５ａコアをコードするプラスミドＤＮＡの６週後にブースター注射を行う。
【０１５３】
（ＰＬＧにより送達されるＤＮＡ）  ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマーを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手する。ＰＬＧポリマーは、５０／５０のコポリマー比および６５ｋＤａの分子量を有するＲＧ５０５である（製造元データ）。ＤＮＡの吸着したカチオン性微粒子を、本質的に、Ｓｉｎｇｈ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：８１１−８１６に記載されるような、改良した溶媒蒸発プロセスを用いて調製する。簡単に言うと、微粒子を、塩化メチレン中５％ｗ／ｖポリマー溶液１０ｍｌと、１ｍｌのＰＢＳとを、ＩＫＡホモゲナイザーを用いて高速で乳化することにより調製する。次いで、このプライマリーエマルジョンを、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を含有する（０．５％ｗ／ｖ）蒸留水５０ｍｌに添加する。これにより、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンの処方物が得られ、これを、室温にて１２時間、６０００ｒｐｍで攪拌して、塩化メチレンを蒸発させる。得られた微粒子を、１０，０００ｇで遠心分離することによって、蒸留水で２度洗浄し、そして凍結乾燥する。調製、洗浄、および回収後、１００ｍｇのカチオン性微粒子を、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液中、４℃で６時間、インキュベートすることによって、ＤＮＡを微粒子に吸着させる。次いで、微粒子を、遠心分離によって分離し、ペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、そしてこの微粒子を凍結乾燥する。
【０１５４】
ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γ発現を、上記実施例において記載されたような５１Ｃｒ遊離アッセイまたは細胞内染色によって測定する。
【０１５５】
（実施例８：免疫経路およびＮＳ３＊４５ａコアをコードするレプリコン粒子ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物に、ＮＳ３＊４５ａコアをコードするＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子５×１０６ＩＵを、実施例３に記載されるように筋内（ＩＭ）注射するか、もしくは尾の基部（ＢｏＴ）および足パッド（ＦＰ）において皮下（Ｓ／Ｃ）注射するか、または２／３のＤＮＡをＩＭ投与を通じて送達し、１／３のＤＮＡをＢｏＴ経路を通じて送達する組み合わせを用いる。この免疫に続いて、実施例３に記載されるように、ＮＳ５ａをコードするワクシニアウイルスをブースター注射する。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５に記載されるように、細胞内染色によって測定する。
【０１５６】
（実施例９：アルファウイルスレプリコンのプライミング、その後の種々のブーストレジメン）
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物を、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）、ＮＳ３４５ａコアをコードするレプリコン粒子１．５×１０６ＩＵを、前脛骨筋に筋内注射することによってプライムし、その後、ＮＳ５ａをコードするプラスミドＤＮＡ  １０〜１００μｇ、ＮＳ３＊４５ａコアをコードする１０１０のアデノウイルス粒子、ＮＳ３＊４５ａコアをコードするＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子１．５×１０６ＩＵ、またはＮＳ５ａをコードするワクシニアウイルス１０７ｐｆｕのいずれかのブースターを第６週に用いる。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５に記載されるように、細胞内染色によって測定する。
【０１５７】
（実施例１０：ＮＳ３＊４５ａコアを発現するアルファウイルス）
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩＮＣＲ（ＬＰ））を、Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物を、ＮＳ３＊４５ａコアをコードするＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン  １×１０２〜１×１０６ＩＵを用いて、送達経路の組み合わせ（２／３をＩＭで、１／３をＳ／Ｃで）を通じて、およびＳ／Ｃ単独によって免疫するか、またはＮＳ３＊４５ａコアをコードするＳＩＮＣＲ（
ＬＰ）レプリコン  １×１０２〜１×１０６ＩＵを用いて、送達経路の組み合わせ（２／３をＩＭで、１／３をＳ／Ｃで）を通じて、およびＳ／Ｃ単独によって免疫する。この免疫に続いて、ＮＳ５ａをコードするワクシニアウイルス１０７ｐｆｕのブースター注射を第６週に行う。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５に記載されるように、細胞内染色によって測定する。
【０１５８】
このように、細胞媒介免疫応答を刺激するためのＨＣＶ融合ポリペプチドを開示する。本発明の好ましい実施形態がある程度詳細に記載されているが、本明細書中で定義される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、明らかな変更がなされることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノムのダイアグラム表示であり、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図２】図２は、代表的な天然の改変していないＮＳ３プロテアーゼドメインのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号３〜４）を示す。
【図３Ａ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｂ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｃ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｄ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｅ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｆ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｇ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｈ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｉ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図３Ｊ】図３は、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失されかつＣ末端上にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な改変した融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。
【図１】
2006265267.tif 000003
【図２】
2006265267.tif 000004
【図３Ａ】
2006265267.tif 000005
【図３Ｂ】
2006265267.tif 000006
【図３Ｃ】
2006265267.tif 000007
【図３Ｄ】
2006265267.tif 000008
【図３Ｅ】
2006265267.tif 000009
【図３Ｆ】
2006265267.tif 000010
【図３Ｇ】
2006265267.tif 000011
【図３Ｈ】
2006265267.tif 000012
【図３Ｉ】
2006265267.tif 000013
【図３Ｊ】
2006265267.tif 000014
【配列表】
2006265267000001.app