(57)【要約】【課題】  3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成を安定且つ良好に行い得る大豆煮汁の最適条件を見出すことで、産業排水として排水処理されている大豆煮汁を3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成に有効利用し得るとともに、排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減させ得る3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法を提供するものである。【解決手段】  大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中において乳酸菌を培養し、該乳酸菌により培養液中に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドを生成させる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中において乳酸菌を培養し、該乳酸菌により培養液中に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドを生成させることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【請求項２】
請求項１記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、前記乳酸菌として、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓを用いることで、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドとしてのグラム陽性細菌への殺菌作用を有するナイシンを生成することを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【請求項３】
請求項１，２いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、大豆煮汁は、洗浄した大豆に加水して蒸煮したものであることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、洗浄した大豆に加水する水は、該大豆の６倍重量以下であることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、大豆煮汁は、蒸煮後の前記大豆が秤に載せて指で押し潰した際、該秤の目盛が５００ｇ〜２５０ｇ程度となるような時間蒸煮したものであることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、培養は、３日〜１５日間行うことを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、大豆を加工し、醤油や味噌などを生産する工場では、大豆煮汁が大量に発生し、この大豆煮汁は産業排水として排水処理されている。
【０００３】
ところで、３％グルコースを添加した大豆煮汁中にて乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）を培養すると、グラム陽性細菌への殺菌作用を有する3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドを生成できる可能性が示唆されている。
【０００４】
そこで、工場から排出される大豆煮汁の排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減させるために、この大豆煮汁を3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成に有効利用することが検討されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、工場から排出される大豆煮汁の性状によっては、乳酸菌の良好な増殖が確認できるにも関わらず、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成が認められない場合があった。
【０００６】
本発明は、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成を安定且つ良好に行い得る大豆煮汁の最適条件を見出すことで、産業排水として排水処理されている大豆煮汁を3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成に有効利用し得るとともに、排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減させ得る3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨を説明する。
【０００８】
大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中において乳酸菌を培養し、該乳酸菌により培養液中に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドを生成させることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【０００９】
また、請求項１記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、前記乳酸菌として、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓを用いることで、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドとしてのグラム陽性細菌への殺菌作用を有するナイシンを生成することを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【００１０】
また、請求項１，２いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、大豆煮汁は、洗浄した大豆に加水して蒸煮したものであることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【００１１】
また、請求項１〜３いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、洗浄した大豆に加水する水は、該大豆の６倍重量以下であることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【００１２】
また、請求項１〜４いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、大豆煮汁は、蒸煮後の前記大豆が秤に載せて指で押し潰した際、該秤の目盛が５００ｇ〜２５０ｇ程度となるような時間蒸煮したものであることを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【００１３】
また、請求項１〜５いずれか１項に記載の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法において、培養は、３日〜１５日間行うことを特徴とする3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法に係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成を安定且つ良好に行い得る大豆煮汁の最適条件を見出したから、産業排水として排水処理されている大豆煮汁を3.5ＫＤａ抗菌性ポリペプチドの生成に有効利用でき、排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減させ得る3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法を提供し得ることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明における3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法は、大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中において乳酸菌を培養することにより3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドを生成させる点に特徴がある。
【００１６】
従って、本発明は、産業排水として排水処理されている大豆煮汁を3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成に有効利用したから、排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減できる3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法となる。
【実施例】
【００１７】
本発明の実施例を説明する。
【００１８】
本実施例は、大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中にて乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）を培養し、該乳酸菌により前記培養液中に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの一種でありグラム陽性細菌への殺菌作用を有するナイシンを生成させる場合である。
【００１９】
本実施例の乳酸菌は、サンエイラクトＳＭＦ−ＬＬ１３１（サンエイ糖化株式会社製）として市販されているＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓを採用している。
【００２０】
このＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓは、通常、ＭＲＳ寒天培地で培養される。
【００２１】
本実施例は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓを大豆煮汁，糖類及び無機塩類を含む培養液中で培養することによりナイシンを生成させるものであり、以下に詳しく説明する。
【００２２】
本実施例の大豆煮汁とは、洗浄した大豆を水に一晩浸漬した後、この浸漬大豆に水を加水して蒸煮して得るものである。尚、蒸煮とは、少量の加水を行った上で、高圧釜等で高温（１１５℃程度）の蒸気で蒸したり、煮たりする処理方法である。具体的には本実施例は、浸漬した大豆を圧力釜を用いて高温の蒸気で蒸したり、あるいは、圧力をかけずに（無加圧で）煮ている。
【００２３】
加水量は、浸漬大豆重量の６倍重量以下であれば良い。加水量が浸漬大豆重量の６倍重量より多いとナイシンの生成が認められないことを確認している。
【００２４】
また、加水は、蒸煮前に所定量の水を全量加水する方法（以下、全量加水方法）若しくは所定量の水を蒸煮前と蒸煮後の二段階に分けて加水する方法（以下、二段階加水方法）により行う。全量加水方法でも二段階加水方法でも、最終的な加水量が浸漬大豆重量の６倍重量以下であれば良いことを確認している。二段階加水方法の場合、全量加水方法に比して蒸煮時間を短縮できるため、作業性が向上するとともにエネルギーの節約ができる。
【００２５】
また、加水後の大豆は、加圧条件下若しくは無加圧条件下で蒸煮を行う。尚、加圧時の圧力は０．５Ｋ程度とする。
【００２６】
蒸煮時間は、蒸煮後の大豆を秤に載せて指で押し潰した際の秤の目盛（１００粒平均値）が２５０ｇ〜５５０ｇとなる時間が良い。秤の目盛が上記以外となるような時間蒸煮した大豆煮汁にはナイシンの生成が認められないことを確認している。
【００２７】
即ち、本実施例の大豆煮汁は、大豆の硬度を指標として適切に蒸煮時間を設定して得られるものであるため、単純に大豆が柔らかくなるまで蒸煮して得られる大豆煮汁における乳酸発酵の場合と比して良好且つ確実に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドとしてのナイシンの生成を行うことができる。
【００２８】
本実施例の培養液は、上記大豆煮汁に糖類及び無機塩類を添加している。
【００２９】
糖類としては、グルコースを用いているが、糖類として本実施例のグルコース以外のものを適宜採用しても良い。また、本実施例のグルコースは、大豆煮汁中の濃度が３％（重量）程度となるように添加するのが良い。
【００３０】
無機塩類は、食塩を用いているが、無機塩類として本実施例の食塩以外のものを適宜採用しても良い。また、本実施例の食塩は、大豆煮汁中の濃度が２％（重量）程度となるように添加するのが良い。尚、食塩は、培地中に混入した雑菌の増殖を防止する効果があるから、培養液中に食塩を添加することにより目的の乳酸菌のみを優先的に増殖させることができる。
【００３１】
即ち、本実施例は、糖類や無機塩類を適切に添加することにより、何ら栄養素を添加せずに単に蒸煮処理のみで得られた大豆煮汁における乳酸発酵の場合と比して確実且つ良好に3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシンの生成を行うことができる。
【００３２】
次に、本実施例は、前記培養液中に５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ程度のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓが含まれるように植菌を行った後、３０℃で１５日間静置培養することで、この培養液中にナイシンを生成させる。
【００３３】
尚、培養液中におけるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓの培養期間は、３日より短いとナイシン生成が認められず、また、１５日より長いとナイシン生成が極めて微量となるため、３日〜１５日間とすることが良いことを確認している。
【００３４】
本実施例は、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシンの生成を安定且つ良好に行い得る大豆煮汁の適正条件を見出したから、産業排水として排水処理されている大豆煮汁をナイシンの生成に有効利用できることとなり、排水処理に関わるコストや環境への負荷を軽減できる3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法となる。更に、本実施例によれば、大豆煮汁を用いて検討された従来の方法に比し、確実且つ良好なナイシン生成が期待できる3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドの生成方法となる。
【００３５】
以下、本実施例の作用効果をより具体的に示す実験例について述べる。
【００３６】
[実験例１]
実験例１は、洗浄して１晩浸漬した大豆を、表１に示すような種々の条件１〜９（加水の有無，加圧の有無及び蒸煮時間の長短）で処理し、得られる大豆煮汁が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（以下、乳酸菌）の増殖や、この乳酸菌により生成されるナイシンの濃度（ｐｐｍ）にどのような影響を及ぼすのかを確認したものである。
【００３７】
大豆煮汁の処理方法について具体的に述べる。
【００３８】
洗浄して１晩浸漬して水切りした大豆に対する加水量は、条件１〜条件８において大豆の４倍重量とし、条件９において無加水とした。
【００３９】
大豆の蒸煮は、条件１〜条件７において無加圧蒸煮とし、条件８，９において加圧（０．５Ｋ）蒸煮とした。
【００４０】
蒸煮時間は、条件により変化させて２５分〜９００分とし、各条件における蒸煮後の大豆煮汁中の大豆の硬度を、大豆を秤に載せて指で押し潰した際の秤の目盛（１００粒平均値）により求めた（表１）。
【００４１】
上記処理方法により得られた条件１〜条件９の大豆煮汁に３％（重量）グルコースを加え、３０℃に冷却したものを培養液とし、各培養液中に乳酸菌が５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ程度となるように植菌後、静置で３０℃，１５日間培養した。
【００４２】
１５日間の培養期間中、乳酸菌の菌数を経時的に測定するとともに（図１）、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシン濃度（ｐｐｍ）も抗菌活性試験により経時的に評価した（図２）。また、培養液中のｐＨも経時的に評価した（図３）。
【００４３】
抗菌活性試験は、ディスク拡散法により行った。具体的には実験例１は、グラム陽性菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓをナイシン活性測定の指標菌として用い、寒天培地上の培養液含有ディスクの周囲の前記指標菌の発育阻止帯の大きさを測定することにより、抗菌活性を評価した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
表１に示すとおり、大豆煮汁中の大豆の硬度は、条件１で１０９９ｇ，条件２で６５３ｇ，条件３で５５０ｇ，条件４で４９３ｇ，条件５で3.5０ｇ，条件６で２５０ｇ，条件７で１５０ｇ，条件８で４５５ｇ及び条件９で４３０ｇであった。
【００４６】
また、図１に示すとおり、乳酸菌の増殖は、全条件において乳酸菌のmaximum  growthとされる１０８オーダーに達したことが認められた。
【００４７】
また、図２に示すとおり、ナイシンの生成は、条件４，５，６，８及び９においてのみ認められた。即ち、条件１，２，３及び７においては、乳酸菌の増殖を確認できたにもかかわらずナイシンの生成は認められなかった。
【００４８】
また、図２に示すとおり、培養液中のナイシンは経日的な消長を示し、培養液中にナイシンが認められる期間は、条件４及び条件８で３日〜１５日（実験終了時）の間，条件５で４日〜１５日の間，条件６で９日〜１５日の間及び条件９で３日〜７日の間であった。
【００４９】
特に、条件４及び条件８では早い段階から実験終了時まで長期間に渡りナイシンの生成が認められた。尚、培地中に最大量のナイシンが生成される期間と濃度は、条件４及び条件８で５日〜７日目（最大濃度１０ｐｐｍ）、条件５で９日〜１１日目（最大濃度１０ｐｐｍ）、条件６で９日〜１５日目（最大濃度５ｐｐｍ）、及び条件９で５日目（最大濃度１０ｐｐｍ）であった。
【００５０】
また、培養液中のｐＨの経時的変化は、図３に示すとおりとなった。
【００５１】
上記図１〜図３によれば、乳酸菌の菌数とナイシン濃度が増大する期間においてはｐＨ値が低く保たれる一方、乳酸菌の菌数とナイシン濃度が減少する期間においてはｐＨ値が高くなる傾向が見られるため、ナイシン生成のメドは、ｐＨが最低値から上昇した時期とすることができる。
【００５２】
以上、上記実験例１によれば、加圧，加水の有無に関わらず、大豆煮汁中の大豆の硬度が４９３ｇ〜１５０ｇであると、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシンを良好に生成できるといえる。また、加圧の有無に関わらず、加水を行うものは、無加水の場合と比較して、培養液中にナイシンが認められる期間が長く、長期間安定してナイシンが得られるといえる。
【００５３】
[実験例２]
実験例２は、洗浄して１晩浸漬した大豆に対し、表２に示すように、この浸漬大豆の重量の１倍重量〜２０倍重量の加水を行い加圧蒸煮する方法（以下、全量加水方法）で得られる大豆煮汁、及び洗浄して１晩浸漬した大豆に対し、あらかじめ浸漬大豆の重量の４倍重量の加水を行い加圧蒸煮した後、更に表３に示す希釈倍率での加水を行う方法（以下、二段階加水方法）で得られる大豆煮汁が、乳酸菌の増殖や、この乳酸菌により生成されるナイシンの量にどのような影響を及ぼすのかを確認したものである。
【００５４】
尚、加圧は０．５Ｋとし、大豆煮汁中の大豆の硬度が４５０ｇ〜４９０ｇとなるように蒸煮し、得られた大豆煮汁に３％グルコースを加え、３０℃に冷却したものを培養液とし、続いて、この培養液に実験例１と同様に乳酸菌を植菌し、３０℃で６日間培養した後、培養液中の3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシン濃度を測定した（図４，図５）。
【００５５】
尚、実験例１から、大豆の硬度が４９０ｇ程度の大豆煮汁を用いる場合、６日間程度の培養期間で培養液中に最大量のナイシンが含有されることが明らかであるため、培養期間を６日間とした。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
2006280246.tif 000004
【００５８】
図４に示すとおり、６日間培養後の培養液中には、全量加水方法における加水量が浸漬大豆の重量の６倍重量以下の場合に１０ｐｐｍのナイシンが生成された。一方、加水量が６倍重量より多い場合にはナイシンが生成されなかった。
【００５９】
また、図５に示すとおり、６日間培養後の培養液中には、二段階加水方法における総加水量が６倍重量以下の場合に１０ｐｐｍのナイシンが生成された。一方、総加水量が６倍重量より多い場合にはナイシンが生成されなかった。
【００６０】
以上、上記実験例２によれば、加水量は、該浸漬大豆の６倍重量以下とすると、3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチドであるナイシンを良好に生成できるといえる。特に、蒸煮前の加水量の少ない二段階加水方法は、蒸煮前の加水量の多い全量加水方法に比し、蒸煮時間を短縮できるため、作業性が向上するとともに、エネルギーの節約ができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本実施例の実験例１における乳酸菌の菌数を経時的に測定したグラフである。
【図２】本実施例の実験例１における3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチド濃度を経時的に測定したグラフである。
【図３】本実施例の実験例１における培養液中のｐＨを経時的に測定したグラフである。
【図４】本実施例の実験例２における3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチド濃度を経時的に測定したグラフである。
【図５】本実施例の実験例２における3.5ｋＤａ抗菌性ポリペプチド濃度を経時的に測定したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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