(57)【要約】【課題】  非アルコール性脂肪肝においてMRP2が関与するような胆汁分泌機構の異常・変化に基づいて、非アルコール性脂肪肝治療のための候補薬物をスクリーニングする方法を提供する。【手段】  本発明は、非アルコール性脂肪肝の治療薬のスクリーニング方法であって、非ヒト動物の非アルコール性脂肪肝に被検物質を投与し、前記脂肪肝における胆汁排出能力について前記被検物質に起因する改善の程度を評価することを特徴とするスクリーニング方法に関する。本法では、例えば、胆汁排出量、排出胆汁中の胆汁酸濃度、リン脂質濃度、および／または、胆汁酸濃度／リン脂質濃度比を測定することが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝の治療薬のスクリーニング方法であって、非ヒト動物の非アルコール性脂肪肝に被検物質を投与し、前記脂肪肝における胆汁排出能力について前記被検物質に起因する改善の程度を評価することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
非ヒト動物からの摘出肝臓に前記被検薬物を含有する灌流液を用いて該被検物質を投与する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
肝臓における胆汁排出量、排出胆汁中の胆汁酸濃度、リン脂質濃度、および／または、胆汁酸濃度／リン脂質濃度比を測定することにより、胆汁排出能力の改善の程度を評価する、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
排出胆汁中のグルタチオン濃度を測定する、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
MRP2が関与する胆汁排出能力を測定することにより、胆汁排出能力の改善の程度を評価する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
肝臓の中心静脈領域における炎症細胞の接着、および／または毛細胆管膜上のMRP2分布を観測することにより、胆汁排出能力の改善の程度の評価することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝（NASH）を治療するための薬物のスクリーニングする方法に関し、より詳しくは、肝臓における胆汁流量、特にMRP2によるグルタチオン抱合物の排泄率などを指標とし、非アルコール性脂肪肝に治療的に有効な候補薬物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、成人の３割近くに脂肪肝の徴候がみられると言われており、脂肪肝は現代人特有の成人病として問題視されている。脂肪肝にはアルコール性のものと非アルコール性のものがある。アルコール性脂肪肝と同様に、非アルコール性脂肪肝も様々な合併症の引き金となるため、適切な治療が望まれている。しかしながら、非アルコール性脂肪肝の病理に関する機能的な解明はなされていない。
【０００３】
本発明者は、摘出肝臓の冷保存虚血再灌流に伴われる肝機能低下に、Multidrug Resistance Protein 2（MRP2）を介した輸送機構等が関与することを突き止めている（非特許文献１）
【非特許文献１】Atsushi Kudo et al, Hepatology, Vol.39, No.4, pp.1099-1109, April 2004; “Kupffer Cells Alter Organic Anion Transport Through Multidrug Resistance Protein 2 in the Post -Cold Ischemic Rat Liver”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、非アルコール性脂肪肝の病理学的側面、具体的にはMRP2が関与するような胆汁分泌機構の異常・変化に着目し、非アルコール性脂肪肝の治療のための候補薬物をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、胆汁分泌機構における一連の異常が非アルコール性脂肪肝化に関与することを見出し、この新規な知見に基づき本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、非アルコール性脂肪肝の治療薬のスクリーニング方法であって、非ヒト動物の非アルコール性脂肪肝に被検物質を投与し、前記脂肪肝における胆汁排出能力について前記被検物質に起因する改善の程度を評価することを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【０００７】
また本発明のスクリーニング方法では、非ヒト動物からの摘出肝臓に前記被検薬物を含有する灌流液を用いて該被検物質を投与することができる。
また本発明のスクリーニング方法では、肝臓における胆汁排出量、排出胆汁中の胆汁酸濃度、リン脂質濃度、および／または、胆汁酸濃度／リン脂質濃度比を測定することにより、胆汁排出能力の改善の程度を評価することができる。特に、排出胆汁中のグルタチオン濃度を測定するとよい。
【０００８】
また本発明のスクリーニング方法では、上記の測定と共にまたはそれとは別に、MRP2が関与する胆汁排出能力を測定することにより、胆汁排出能力の改善の程度を評価してもよい。また、肝臓の中心静脈領域における炎症細胞の接着、および／または毛細胆管膜上のMRP2分布を観測することにより、胆汁排出能力の改善の程度の評価することもできる。
【本発明の好ましい態様】
【０００９】
以下、本発明の具体的態様を明らかにし、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様は、非アルコール性脂肪肝を有する非ヒト動物モデルを使用し、その肝臓における胆汁流量およびMRP2によるグルタチオン抱合物の排泄率等を指標として、様々な被検物質から、非アルコール性脂肪肝に治療的に有効な候補薬物をスクリーニングする方法である。本発明は、さらなる前臨床または臨床試験の段階に進み得る候補薬剤を効率的に供給するであろう。
【００１０】
非アルコール性脂肪肝の非ヒト動物モデルには、下記実施例で示されるように、コリンーメチオニン欠乏食を3〜6週間、好ましくは6週間投与したラットを使用できる。
被検物質は、特に限定されるものではなく、本発明に従って非アルコール性脂肪肝に投与可能である公知または新規の物質が含まれる。また、本発明は、既に公知である医薬の第２の用途を検討するためにも使用され得る。したがって、被検物質には、公知の薬物または医薬組成物も含まれる。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、その実験系に非ヒト動物モデルから摘出された虚血肝臓を使用する。虚血肝臓を使用することにより、生体肝に近い条件で胆汁排出能力を直接的に観測することができる。具体的な評価指標としては、肝臓からの胆汁排出量；排出胆汁中の胆汁酸濃度、特にグルタチオン濃度；リン脂質濃度；および／または、胆汁酸濃度／リン脂質濃度比などを用いることができる。
【００１２】
従来、肝機能検査に用いられる指標にGPTやGOTなどが知られている。しかしながら、これらは肝細胞障害に起因する再構築に伴って血中にみられるものであり、細胞障害の度合いを事後的に観ているに過ぎない。本発明は、そのような従来の指標とは異なり、肝細胞機能自体を直接評価できる指標を利用するものである。すなわち、本発明は、肝細胞から毛細胆管レベルにおける胆汁排出異常に関する有力な指標を利用し、非アルコール脂肪肝化に関与し得る被検物質を直接的かつ効果的に検査することができる。
【００１３】
特にMRP2を介した排泄機構が非アルコール脂肪肝の病態生理にも深く関与することは本発明者により初めて見出されたことである。この見地から、本法に使用される評価指標としては、MRP2が関与するグルタチオン抱合物の排泄量が有用である。さらに、肝組織の形態に関する知見として、門脈領域および中心静脈領域における脂肪沈着や炎症細胞（つまり活性化単球系細胞の接着）、あるいは免疫組織染色により毛細胆管膜上のMRP2分布を視覚的に検査することも有用である。脂肪沈着についてはIntravital顕微鏡によるin vivo 観察が有用である。またそれらの解析にコンピューター上の画像処理を利用してもよい。
【００１４】
評価の手順は、使用される非ヒト動物モデルの正常肝（コントロール肝臓）について予め測定された胆汁排出量等の指標データを基準とし、被検物質が投与された肝臓の対応データを評価する。すなわち、被検物質の投与に起因して、正常肝データに近づくような有意な回復が観察される場合には、当該被検物質が非アルコール脂肪肝治療に有効な候補薬物であると判断される。
【００１５】
以下、実施例を参照しながら本発明をより具体的に説明するが、下記実施例は、本発明の実施可能性を示すものであり、特許請求の範囲に記載の発明を限定解釈するために参酌されるものではない。
【実施例】
【００１６】
非アルコール性脂肪肝モデルの作製
動物実験はすべて東京医科歯科大学のガイドラインに基づいて行った。本実験には、非アルコール性脂肪肝の動物モデルには、表１に示すコリンーメチオニン欠乏食（CDD）を6週間投与したラット（雄性Wistar Rats；250〜300g）を使用した。Intravital顕微鏡を用いて肝臓組織における中心静脈周辺の生体vivo観察（図示せず）を行ったところ、CDD肝臓（Steatotic Liver 6wks）では、顕著な脂肪化と中心静脈の炎症細胞接着が認められた。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
胆汁分泌能力の測定
マウスからコリンーメチオニン欠乏食により脂肪肝化した肝臓を摘出し、Krebs-Henseleitバッファーを使用し灌流温度37℃、 灌流速度2.65ml/分/g・Liverで１時間灌流した。この灌流液中のタウロコール酸ナトリウムの量は生理的なレベル（30mM）とした。
【００１９】
肝臓の灌流時における胆汁流量、胆汁組成としては胆汁酸、リン脂質、グルタチオン、胆汁酸／リン脂質比を測定した（図１および図２）。それらのデータから明らかなように、非アルコール性脂肪肝モデルのCDD肝臓では、正常肝に比べて、胆汁流量が半分近くに減少した（図２）。また排出された胆汁成分の組成をみると、胆汁酸濃度が約25%減少し（図２Ａ）、リン脂質濃度が約40%減少し（図２Ｂ）、グルタチオン濃度が約70%減少した（図２Ｄ）。特にグルタチオン濃度の減少は顕著である。胆汁酸濃度／リン脂質濃度比に上昇はなかった（図２Ｃ）。
【００２０】
次に、5-カルボキシフルオレセイン（CF）を門脈から投与し、胆汁からの排泄率を測定した（図３）。CFは、毛細胆管膜上のMRP2を介して肝細胞から排出されるものであり、その排出率はMRP2によるグルタチオン配合物の排出能力の指標となる。なお細胞レベルのローディングレベルの保持には、MRP2のポテントインヒビターであるプロベネシドを使用した。CDD肝臓では、正常肝に比べてCFの排泄率は明らかに減少していた。
【００２１】
薬剤投与による改善効果の確認
上記CDD肝臓にトロンボキサンA2（TXA2）合成のインヒビターの灌流投与を行った。TXA2インヒビターを投与した場合、CFの排泄率が上昇することが確認された（図３参照）。さらに、OKY-046（トロンボキサンA2（TXA2）合成のインヒビター）とPPARγのアゴニスト投与を行った場合のCF排出半減期を測定した（図４）。CDD肝臓でCF排泄率は低下するが、OKY-046投与、PPARγのアゴニスト投与およびそれらの同時投与のいずれによっても、CFの排泄率が改善した。なお、Kupffer cell 除去を引き起こすGdClの投与では改善が認められなかった。
【００２２】
脂肪肝組織の形態観察
肝組織のHE染色により脂肪沈着を観察した（図示せず）。早期の脂肪肝では、主として門脈領域でマクロ小胞（macrovesicular）、中心静脈領域でマクロ小胞沈着（macrovesicular deposit）がそれぞれ観察されたが、これらの変化は、OKY-046投与により改善した。
【００２３】
また、Intravital顕微鏡を用いてCDD肝臓の中心静脈領域の生体vivo観察を行い（図５）、中心静脈領域に接着した単位面積あたりの活性化単球系細胞の割合を調べた（図６）。図６の結果から明らかなように中心静脈領域への炎症細胞接着はPPARγのアゴニストの投与で完全に抑制されるが、OKY-046またはGdClの投与では抑制されない。したがって、OKY-046の投与は、中心静脈領域に接着した炎症細胞におけるTXA2合成を阻害し、その結果、MRP2障害を改善したといえる。すなわち、このことは、中心静脈領域の炎症細胞接着に起因して発生するTXA2がこの食事性肝炎（Dietary steatohepatitis）におけるMRP2障害の本体であることを示す。
【００２４】
また、MRP2の免疫組織染色（図７）によると、毛細胆管膜の嚢状拡張（saccular dilation）およびMRP2の下方制御（down regulation）あるいは肝細胞内局在の変化（Internalization）が観察されたが、これらの変化はOKY-046投与により改善した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】肝臓灌流時の胆汁流量を示すグラフである。
【図２】肝臓灌流時の排出胆汁中の胆汁組成を示すグラフであり、同図Ａは胆汁酸濃度、同図Ｂはリン脂質濃度、同図Ｃは胆汁酸／リン脂質の濃度比、同図Ｄはグルタチオン濃度を示す。白丸はコントロール肝臓の胆汁成分、黒丸はCDD肝臓の胆汁成分について示す。プロット値は３つの個別実験の平均値±SEであり、＊はコントロール肝臓との比較でP<0.05を示す。
【図３】胆汁内5-カルボキシフルオレセイン（CF）濃度を示すグラフである。白丸はコントロール肝臓、白角はTXA２投与のCDD肝臓、黒角はTXA２未投与のCDD肝臓を示す。T0はMRP2インヒビターであるプロベネシドの作用を取り除いた灌流開始時を示す。プロット値は少なくとも４つの個別実験の平均値±SEであり、＊はコントロール肝臓との比較でP<0.05を示す。
【図４】胆汁内CF排出半減期を示すグラフである。プロット値は少なくとも４つの個別実験の平均値±SEであり、＊はコントロール肝臓との比較でP<0.05を示す。
【図５】肝臓の中心静脈領域周辺のIntravital顕微鏡写真を示す写真代用図である。
【図６】肝臓の中心静脈領域に接着した単位面積あたりの活性化単球系細胞の割合を示すグラフである。
【図７】免疫組織染色された肝臓組織の顕微鏡写真を示す写真代用図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【図７】
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