(57)【要約】  【課題】  酸性条件下でのタンパク質の凝集を効果的に防止可能なタンパク質凝集防止剤を提供する。  【解決手段】  酸性条件下のタンパク質の凝集を防止するためのタンパク質凝集防止剤として、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテルおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つの非イオン性界面活性剤を使用する。前記非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルが好ましい。図１のグラフに示すように、例えば、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルを使用すれば、強酸性条件下であっても、タンパク質の凝集を効果的に防止できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性条件下のタンパク質の凝集を防止するためのタンパク質凝集防止剤であって、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテルおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つの非イオン性界面活性剤を含むタンパク質凝集防止剤。
【請求項２】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルである請求項１記載のタンパク質凝集防止剤。
【請求項３】
前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの重合度が、４５〜８０の範囲である請求項１または２記載のタンパク質凝集防止剤。
【請求項４】
酸性条件下のタンパク質の凝集を防止するタンパク質凝集防止方法であって、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のタンパク質凝集防止剤を用いるタンパク質凝集防止方法。
【請求項５】
前記酸性条件下のタンパク質が、酸性液中のタンパク質であり、前記液中における前記タンパク質凝集防止剤の前記非イオン性界面活性剤の濃度が、０．１質量％（質量／体積％）以上である請求項４記載のタンパク質凝集防止方法。
【請求項６】
前記酸性液が、強酸性試薬が添加された血液試料である請求項５記載のタンパク質凝集防止方法。
【請求項７】
前記血液試料が、全血、血清および血漿からなる群から選択される少なくとも一つである請求項６記載のタンパク質凝集防止方法。
【請求項８】
基板の上に試薬が配置され、前記試薬にタンパク質含有試料を供給して反応させて前記試料中の成分を分析する検体分析用具であって、さらに、前記基板上に、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質凝集防止剤が配置され、前記タンパク質凝集防止剤によって前記試料中のタンパク質の凝集が防止される検体分析用具。
【請求項９】
前記試料が、血液試料である請求項８記載の検体分析用具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性条件下であってもタンパク質の凝集を防止可能なタンパク質凝集防止剤、それを用いたタンパク質凝集防止方法および検体分析用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、薬学、生物学、農学等のさまざまな分野において、試料中の成分分析が実施されている。生体由来試料には、タンパク質が含まれていることがあり、分析環境が酸性である場合、タンパク質が凝集して分析が妨害されることがある。特に、試料中の成分を分光分析等の光学的分析法により分析する場合は、タンパク質の凝集は重大な問題である。例えば、無希釈のヒト血清を、塩酸若しくは硫酸等の鉱酸や、スルホフタル酸、スルホサリチル酸等の強酸性有機酸、またはクエン酸、酢酸等の弱酸性有機酸からなるｐＨ１〜４の弱酸溶液と混合した場合、血清タンパク質（主に血清アルブミン）が凝集し、液は濁りを生じ、若しくは固化する。酸性条件下でのタンパク質の凝集は、タンパク質中のカルボキシル基、アミノ基、イミダゾール基、グアニジノ基等のイオン性官能基の乖離状態が変化し、陰イオンと陽イオンとのバランスが崩れ、イオン間の反発、イオン結合の破壊により、タンパク質が変性することに起因する。
【０００３】
酸性条件下でのタンパク質の凝集を防止するために、試料を希釈する方法や界面活性剤を使用する方法がある。例えば、体液中の無機リンを測定するにあたり、試料を希釈し、かつ界面活性剤を用いることが提案されている（特許文献１）。この方法において、無機リンの測定は、０．６７５〜１．２５Ｍ硫酸の強酸下で実施されるため、タンパク質の凝集を防止するために、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル若しくはポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルを用い、生体由来試料を３０〜１２５倍に希釈している。しかしながら、検体分析用具（試験片）では、上記の界面活性剤によるタンパク質凝集防止は達成されなかったため、他のタンパク質凝集防止技術の開発が強く望まれていた。
【特許文献１】特公平８−１２１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、酸性条件下でのタンパク質の凝集を効果的に防止可能なタンパク質凝集防止剤、それを用いたタンパク質凝集防止方法および検体分析用具の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質凝集防止剤は、酸性条件下のタンパク質の凝集を防止するためのタンパク質凝集防止剤であって、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテルおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つの非イオン性界面活性剤を含むタンパク質凝集防止剤である。なお、本発明において、酸性条件下とは、ｐＨ１未満の強酸性条件下ないしｐＨ１〜４の弱酸性条件下を意味する。
【０００６】
本発明のタンパク質凝集防止方法は、酸性条件下のタンパク質の凝集を防止するタンパク質凝集防止方法であって、前記本発明のタンパク質凝集防止剤を用いる方法である。
【０００７】
本発明の検体分析用具は、基板の上に試薬が配置され、前記試薬にタンパク質含有試料を供給して反応させて前記試料中の成分を分析する検体分析用具であって、さらに、前記基板上に、前記本発明のタンパク質凝集防止剤が配置され、前記タンパク質凝集防止剤によって前記試料中のタンパク質の凝集が防止される検体分析用具である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者等は、酸性条件下でのタンパク質の凝集を効果的に防止するために、界面活性剤の検討を中心に一連の研究を重ねた。その結果、前記３種類の非イオン性界面活性剤を使用すれば、強酸性条件下であり、かつタンパク質が高濃度であっても、タンパク質の凝集を効果的に防止することができることを見出し、本発明に到達した。本発明によれば、試料を希釈しなくても、酸性条件下でタンパク質の凝集を効果的に防止することができ、タンパク質の凝集に起因する試料中でのタンパク質の凝固および試料の濁りを効果的に防止できる。したがって、本発明によれば、例えば、タンパク質含有試料中の成分を無希釈で光学的手法により分析する場合であっても、高信頼性および高精度での分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のタンパク質凝集防止剤において、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであることが好ましい。前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであれば、さらに効果的にタンパク質の凝集を防止可能だからである。前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの重合度は、例えば、４５〜８０の範囲であり、好ましくは、平均重合度として６０〜６５の範囲である。前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルとしては、例えば、花王株式会社製の商品名エマルゲンＡ−５００がある。また、前記ポリオキシエチレンミリスチルエーテルの重合度は、５０〜５５が好ましい。前記ポリオキシエチレンミリスチルエーテルとしては、例えば、花王株式会社製の商品名エマルゲン４０８５がある。前記ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルの重合度は、４０前後であることが好ましい。前記ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルとしては、例えば、ナカライテスク株式会社製の商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５がある。なお、前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、前記ポリオキシエチレンミリスチルエーテルおよび前記ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルにおいて、前記重合度とは、ポリオキシエチレン鎖の長さ若しくは数を意味する。
【００１０】
つぎに、本発明のタンパク質凝集防止方法において、前記酸性条件下のタンパク質は、例えば、酸性液中のタンパク質である。この場合、前記酸性液中における前記タンパク質凝集防止剤の非イオン性界面活性剤の濃度は、例えば、酸の種類、濃度、ｐＨ等により適宜設定されるものであり、少なくとも、０．１質量％（質量／体積％：以下、同じ）以上であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜１０質量％の範囲で用いることである。また、本発明の場合では、例えば、酸が強酸の硫酸である場合、その濃度が０．５Ｍでは、少なくとも０．５質量％の前記非イオン性界面活性剤が必要であり、１９Ｍの場合では、５質量％以上の添加が好ましい。よって、硫酸の場合では、その濃度が０．５Ｍ〜１９Ｍの範囲で、０．５質量％〜５質量％の範囲で前記非イオン性界面活性剤の最低必要濃度と硫酸濃度とは比例関係にあるため、５質量％以上の添加で、どの濃度の硫酸であってもタンパク質凝集防止は達成される。また、スルホフタル酸の場合では、前記非イオン性界面活性剤の濃度は、１０質量％以上でどの酸濃度でもタンパク質凝集は達成されるが、好ましくは、５〜１０質量％の範囲である。
【００１１】
本発明において、その適用対象となる前記酸性液は、例えば、強酸性試薬が添加された生体由来試料がある。前記生体由来試料としては、例えば、血液試料、尿試料等がある。前記血液試料としては、例えば、全血、血清および血漿がある。前記強酸性試薬の種類は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、スルホフタル酸、スルホサリチル酸等の有機酸がある。
【００１２】
本発明のタンパク質凝集防止剤の使用方法は、特に制限されない。例えば、タンパク質を含む試料に酸性試薬を添加した後、前記タンパク質凝集防止剤を添加してもよいし、タンパク質を含む試料に、前記タンパク質凝集防止剤を添加してから、酸性試薬を添加してもよく、好ましくは、後者である。
【００１３】
前述のように、本発明の検体分析用具は、基板の上に試薬が配置され、前記試薬にタンパク質含有試料を供給して反応させて前記試料中の成分を分析する検体分析用具であって、さらに、前記基板上に、前記本発明のタンパク質凝集防止剤が配置され、前記タンパク質凝集防止剤によって前記試料中のタンパク質の凝集が防止される検体分析用具である。なお、本発明において、「検体分析用具」は、「試験片」と同義である。
【００１４】
本発明の検体分析用具において、前記試料は、特に制限されないが、例えば、血液試料、尿試料等の生体由来試料がある。前記血液試料としては、例えば、全血、血漿、血清がある。
【００１５】
本発明の検体分析用具の構成としては、例えば、基板の上に、試薬層が配置された構成がある。前記基板としては、例えば、キュベット状に加工されたプラスチック基板またはガラス基板がある。前記試薬層は、例えば、試薬類を、カルボキシメチルセルロースやポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンといった水溶性ポリマーを賦形剤として練ったものがある。前記試薬としては、検査対象の成分によって適宜選択され、例えば、血糖値であれば、グルコースオキシダーゼと発色試薬とがあげられる。また、前記試薬の一部構成として、酸性試薬を使用することもある。そして、前記試薬層には、本発明のタンパク質凝集防止剤を含有させてもよい。前記試薬層における試薬や本発明のタンパク質凝集防止剤の含有は、前記水溶性ポリマーと試薬溶液や本発明のタンパク質凝集防止剤溶液とを混合し、その混合液を基板上へ配置することで達成できる。混合液の基板上への配置手段としては、例えば、インクジェット印刷、滴下、噴霧など、試薬層がドット状に配置されるような手段を用いることができる。また、検査対象が、血漿または血清中の成分である場合は、全血検体中の血球成分を除去するために、前記試薬層の上に血球分離層を配置することが好ましい。前記血球分離層としては、例えば、ガラスフィルターが使用できる。もちろん、血漿または血清をあらかじめ得るために、遠心分離作業をマニュアルで行っておくこともできる。
【００１６】
基板の種類としては、先述のように、プラスチック基板やガラス基板が好ましく利用できるが、特に当該基板が光透過性であれば、試薬が検体と反応した後に「透過光測定」を行うことができる。透過光測定は、反射光測定に比べて凝集により受ける影響が大きいため、透過光測定においては、本発明であるタンパク質凝集防止剤の効果が最大限に発揮される。
【００１７】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。なお、本発明は、下記の実施例および比較例により制限されない。
【実施例１】
【００１８】
血清（総タンパク質濃度：８．３ｇ／１００ｍＬ）中に、最終濃度が５．６質量％となるように、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（花王株式会社製、商品名エマルゲンＡ−５００）を溶解した界面活性剤含有血清１．６ｍＬに、０．８５質量％生理食塩水を０．２ｍＬ加えて試料液を調製した。分光分析用のセル（プラスチック製ディスポーザブルセル、セル長１ｃｍ）に、前記試料液１．６ｍＬおよび１８Ｍ硫酸液０．２ｍＬを入れて混合し、分光光度計（日本分光社製、商品名Ｖ５５０Ｄ）を用いて、各波長の光透過度を測定した。また、コントロールとして、前記試料液１．６ｍＬに蒸留水を０．２ｍＬ加えた液の各波長における光透過度も同様に測定した。これらの結果を図１のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロールの光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記試料液とを混合した場合の光透過度である。
【実施例２】
【００１９】
前記非イオン性界面活性剤として、前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルに代えて、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル（花王株式会社製、商品名エマルゲン４０８５）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、光透過度を測定した。その結果を図２のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロールの光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記試料液とを混合した場合の光透過度である。
【実施例３】
【００２０】
前記非イオン性界面活性剤として、前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルに代えて、前記ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社製、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、光透過度を測定した。その結果を図３のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロールの光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記試料液とを混合した場合の光透過度である。
【００２１】
（比較例１）
前記非イオン性界面活性剤として、前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルに代えて、前記ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（シグマ社製、商品名Ｂｒｉｊ３５）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、光透過度を測定した。その結果を図４のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロールの光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記試料液とを混合した場合の光透過度である。なお、前記非イオン性界面活性剤は、前記特許文献１に使用されているものである。
【００２２】
（比較例２）
前記非イオン性界面活性剤として、前記ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルに代えて、前記ポリオキシエチレン（２３）オレイルエーテル（シグマ社製、商品名Ｂｒｉｊ９８）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、光透過度を測定した。その結果を図５のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロールの光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記試料液とを混合した場合の光透過度である。なお、前記非イオン性界面活性剤は、前記特許文献１に使用されているものである。
【００２３】
（比較例３）
前記非イオン性界面活性剤を使用せず、前記血清１．６ｍＬと前記硫酸液０．２ｍＬとを混合して光透過度を測定した以外は、前記実施例１と同様にして、光透過度を測定した。その結果を図６のグラフに示す。同グラフにおいて、（１）が、コントロール（前記血清）の光透過度であり、（２）が、前記硫酸液と前記血清とを混合した場合の光透過度である。
【００２４】
図１、図２および図３の各グラフに示すように、実施例１、２および３では、高濃度の硫酸を加えても、効果的にタンパク質の凝集を防止できたといえる。特に、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルを使用した実施例１では、タンパク質の凝集が極めて効果的に防止され、試料液の濁りはまったく観察されなかった。これに対し、前記特許文献１に記載の前記非イオン性界面活性剤を使用した比較例１および比較例２では、タンパク質の凝集を防止することができなかった。また、非イオン性界面活性剤を使用しなかった比較例３では、タンパク質の強い凝集が起り、タンパク質の凝集塊が生成した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
以上のように、本発明によれば、酸性条件下でのタンパク質の凝集を効果的に抑制できる。したがって、本発明は、例えば、酸性条件下で高濃度のタンパク質含有試料を分析する全ての分野に適用可能であり、特に、血液および尿等の生体由来試料の成分の分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の一実施例のタンパク質凝集防止効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例のタンパク質凝集防止効果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例のタンパク質凝集防止効果を示すグラフである。
【図４】図４は、比較例のタンパク質凝集を示すグラフである。
【図５】図５は、その他の比較例のタンパク質凝集を示すグラフである。
【図６】図６は、さらにその他の比較例のタンパク質凝集を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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