(57)【要約】【課題】  患者から採取した間葉系幹細胞の初代培養において、間葉系幹細胞の培養容器底面への接着効率を向上し、早期に増殖を開始させることができ、大量の間葉系幹細胞を迅速に必要とする臨床治療に貢献する。【解決手段】  骨髄液を遠心分離して上澄み液を除去した細胞溶液中に含まれる間葉系幹細胞を所定の培地内で培養する際に、デキサメタゾンを添加する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄液を遠心分離して上澄み液を除去した細胞溶液中に含まれる間葉系幹細胞を所定の培地内で培養する際に、デキサメタゾンを添加する間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項２】
デキサメタゾンの添加濃度が、１〜１０００ｎＭである請求項１に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項３】
デキサメタゾンの添加濃度が、１０〜１００ｎＭである請求項２に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項４】
ビタミンＣと塩基性繊維芽細胞増殖因子を同時に添加する請求項１から請求項３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項５】
ビタミンＣの添加濃度が、２５〜４０００μｇ／ｍｌである請求項４に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項６】
ビタミンＣの添加濃度が、５０〜２００μｇ／ｍｌである請求項５に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項７】
塩基性繊維芽細胞増殖因子の添加濃度が１〜１００ｎｇ／ｍｌである請求項４から請求項６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項８】
塩基性繊維芽細胞増殖因子の添加濃度が１０〜５０ｎｇ／ｍｌである請求項７に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、間葉系幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪等に分化可能な多分化能を有しているため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めている。しかしながら、骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることが重要である。
【０００３】
従来、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている方法が知られている。
特許文献１には、任意の培地内に、塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic Fibloblast Growth Factor；以下、ｂＦＧＦという。）を０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して培養する間葉系幹細胞の培養方法が開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、任意の培地内に、ｂＦＧＦを０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、かつ、Ｌアスコルビン酸を７５〜１５００μｍ／ｍｌの濃度で添加して培養する細胞の培養方法が開示されている。
また、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導因子としてデキサメタゾンが知られている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／２２７８８Ａ１号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／４８１４７Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、患者から採取した骨髄液に含まれる間葉系幹細胞を培養する場合、骨髄液に大量に含まれる赤血球などの血球成分が、間葉系幹細胞よりも比重が重いために、培地内において間葉系幹細胞より速く沈降して培養容器の底面を覆い、間葉系幹細胞の培養容器の底面への接着を阻害する不都合がある。このため、特に、患者から採取した骨髄液に含まれる間葉系幹細胞を最初に培養する初代培養時において、間葉系幹細胞の接着効率が低くなり、早期に増殖を開始させることができない不都合がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取した間葉系幹細胞の初代培養において、間葉系幹細胞の培養容器底面への接着効率を向上し、早期に増殖を開始させることができ、大量の間葉系幹細胞を迅速に必要とする臨床治療に貢献し得る培地間葉系幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、骨髄液を遠心分離して上澄み液を除去した細胞溶液中に含まれる間葉系幹細胞を所定の培地内で培養する際に、デキサメタゾンを添加する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
この発明によれば、骨髄液を遠心分離して上澄み液を除去した細胞溶液中に含まれる間葉系幹細胞を所定の培地内で培養する際、すなわち、間葉系幹細胞の初代培養時にデキサメタゾンを培地に添加することにより、間葉系幹細胞の培養容器底面への接着効率を向上することができる。その結果、間葉系幹細胞は培養開始後早期に増殖を開始して、早期に多くの細胞数の間葉系幹細胞を回収することが可能となる。
【０００８】
また、デキサメタゾンによる間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導は、初代培養開始後所定の期間内には行われないことが判明した。したがって、初代培養においてデキサメタゾンを添加しても、骨芽細胞への分化を生ずることなく、多分化能を維持したままの間葉系幹細胞を増殖させることができる。
【０００９】
上記発明においては、デキサメタゾンの添加濃度が、１〜１０００ｎＭであることが好ましく、１０〜１００ｎＭであることがさらに好ましい。このように構成することで、デキサメタゾンを添加しない場合と比較して約１．７倍〜約４．１倍の多くの間葉系幹細胞を得ることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、ビタミンＣと塩基性繊維芽細胞増殖因子を同時に添加することが好ましく、その場合には、ビタミンＣの添加濃度が、２５〜４０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５０〜２００μｇ／ｍｌであり、塩基性繊維芽細胞増殖因子の添加濃度が１〜１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌであることとしてもよい。
高濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子とビタミンＣの相乗効果によって、ビタミンＣを含まない場合および低濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子による場合と比較して大幅に増殖促進効果を向上することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、初代培養において、間葉系幹細胞の培養容器底面への接着効率を大幅に向上して、培養開始後早期に増殖を開始させ、患者から採取した骨髄液等に含まれる微量の間葉系幹細胞から、短期に、かつ大量に間葉系幹細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、間葉系幹細胞のいわゆる初代培養における培養方法であって、通常使用される培地、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）に１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum ）および抗生物質を混合したものに、デキサメタゾンを添加して調整された培地に、骨髄液から遠心分離された間葉系幹細胞を含む細胞溶液を投入し、培養ディッシュ内において所定の培養条件（例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％）で培養する方法である。
【００１３】
本実施形態に係る培養方法によれば、デキサメタゾンを添加しない場合と比較して、間葉系幹細胞の培養ディッシュの底面への接着効率が向上され、培養開始後短期間の内に間葉系幹細胞を大幅に増殖させて多くの間葉系幹細胞を得ることができるという効果がある。しかも、デキサメタゾンによる間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を生じさせることなく、多分化能を維持したままの間葉系幹細胞を多量に得ることができるという効果がある。
デキサメタゾンの添加濃度は、１〜１０００ｎＭであることが好ましく、１０〜１００ｎＭであることがさらに好ましい。
【００１４】
なお、培地内に、適切な濃度（２５〜４０００μｇ／ｍｌ）のビタミンＣおよび適切な濃度（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）のｂＦＧＦを添加することにより、ビタミンＣを含まない場合および低濃度のｂＦＧＦによる場合と比較して、さらに大幅に増殖促進効果を向上することができる。
【実施例】
【００１５】
［第１の実施例］
上記実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第１の実施例を以下に説明する。
本実施例においては、培地に添加するデキサメタゾンの細胞増殖効果について説明する。
培地としては、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳおよび抗生物質を混合したもの（培地Ａ）と、培地Ａに濃度５０μｇ／ｍｌのビタミンＣおよび濃度１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したもの（培地Ｂ）、培地Ｂにさらに濃度１００ｎＭ／ｍｌのデキサメタゾンを添加したもの（培地Ｃ）を用意した。
【００１６】
培養方法は以下の通りである。
（１）  患者から採取した骨髄液１０ｍｌを１５００ｒｐｍの回転数で５分間遠心し、分離された上澄み液を除去して、遠沈管内に沈降した間葉系幹細胞を含む細胞を回収した。
（２）  回収した細胞を３等分して、それぞれに培地Ａ〜Ｃを加えて３０ｍｌの細胞懸濁液を作成した。
（３）  各細胞懸濁液から１０ｍｌずつシャーレに分注し、ＣＯ２インキュベータ内において温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養した。
（４）  その後３〜４日ごとに、１回培地交換を行った。最初の培地交換は、古い培地を７ｍｌ除去し、新鮮な培地を７ｍｌ加え、２回目の培地交換は全量交換した。
（５）  培養１０〜１１日目に、細胞を回収して血球計算盤によって細胞数を計数した。
【００１７】
３種類の異なる検体Ｘ，Ｙ，Ｚに対して行った本実施例の培養結果を図１および表１に示す。
【表１】
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【００１８】
本実施例によれば、いずれの検体Ｘ，Ｙ，Ｚに対してもデキサメタゾンによる初代培養時における細胞増殖効果が確認できた。
すなわち、デキサメタゾンを添加した培地Ｃを用いた初代培養により、デキサメタゾンを添加しない培地Ａを用いた場合と比較して７．５〜１９倍、ビタミンＣおよびｂＦＧＦのみを添加し、デキサメタゾンを添加しない培地Ｂと比較して、１．７〜３．５倍もの間葉系幹細胞を回収することができた。したがって、デキサメタゾンを添加して初代培養を行うことにより、短時間で骨髄液から大量の間葉系幹細胞を得ることができ、培養期間および移植物の製造期間を大幅に短縮することができることがわかった。
【００１９】
［第２の実施例］
上記実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第２の実施例を以下に説明する。
本実施例においては、培地に添加するデキサメタゾンの細胞増殖効果の濃度依存性について説明する。
培地としては、上記培地Ｂ（デキサメタゾン０ｎＭ）と、これにデキサメタゾンを添加したもの（培地Ｄ〜培地Ｇ）とを用意した。デキサメタゾンの添加濃度は、１ｎＭ（培地Ｄ），１０ｎＭ（培地Ｅ），１００ｎＭ（培地Ｆ），１０００ｎＭ（培地Ｇ）の４種類とした。
【００２０】
培養方法は以下の通りである。
（１）  患者から採取した骨髄液１０ｍｌを１５００ｒｐｍの回転数で５分間遠心し、分離された上澄み液を除去して、遠沈管内に沈降した間葉系幹細胞を含む細胞を回収した。
（２）  回収した細胞を５等分して、それぞれに培地Ａ、Ｄ〜Ｇを加えて３０ｍｌの細胞懸濁液を作成した。
（３）  各細胞懸濁液から５ｍｌずつ培養ディッシュ（２５ｃｍ２フラスコ）に分注し、ＣＯ２インキュベータ内において温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養した。
（４）  その後３〜４日ごとに、１回培地交換を行った。最初の培地交換は、古い培地を３．５ｍｌ除去し、新鮮な培地を３．５ｍｌ加え、２回目の培地交換は全量交換した。
（５）  培養１０〜１１日目に、細胞を回収して血球計算盤によって細胞数を計数した。
【００２１】
本実施例の培養方法の結果を図２に示す。
本実施例によれば、デキサメタゾンを培地に添加して行われた初代培養と、デキサメタゾンを添加しない場合と比較して、デキサメタゾンの濃度が１ｎＭの場合は１．７倍、１０ｎＭの場合は４．１倍、１００ｎＭの場合は２．７倍、１０００ｎＭの場合は２．５倍とそれぞれ高い細胞増殖効果を示した。特に、デキサメタゾンの添加濃度が１０ｎＭの場合に最も高い細胞増殖効果が得られた。
【００２２】
［第３の実施例］
上記実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第３の実施例を以下に説明する。
本実施例においては、培地に添加するデキサメタゾンの細胞接着効率向上効果について説明する。
培地としては、上記培地Ａ〜培地Ｃを用意した。
【００２３】
本実施例においては、第１の実施例の場合と同様の方法で間葉系幹細胞を７日間培養した。培養後、以下のようにして、細胞接着効率向上効果を確認した。
（１）  培養７日目に、シャーレ内の上澄みを除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で２回洗浄した。
（２）  ０．５％濃度のクリスタルバイオレット溶液を１０ｍｌ添加し、３０分以上室温で放置した。
（３）  クリスタルバイオレット溶液を除去し、水道水で洗浄した。
（４）  シャーレを風乾し、コロニー数を計数した。
【００２４】
２種類の異なる検体Ｘ，Ｚに対して行った本実施例の培養結果を図３および図４に示す。
本実施例によれば、いずれの検体Ｘ，Ｚに対してもデキサメタゾンによる初代培養時における細胞接着効率向上効果が確認できた。
【００２５】
すなわち、デキサメタゾンを添加した培地Ｃを用いた初代培養により、デキサメタゾンを添加しない培地Ａを用いた場合と比較して２．４倍、ビタミンＣおよびｂＦＧＦのみを添加し、デキサメタゾンを添加しない培地Ｂと比較して、１．６倍ものコロニー数が確認された。したがって、デキサメタゾンを添加して初代培養を行うことにより、間葉系幹細胞のシャーレ底面への接着が促進され、培養開始後早期に間葉系幹細胞の増殖を開始させることができることがわかった。
【００２６】
［第４の実施例］
上記実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第４の実施例を以下に説明する。
本実施例においては、デキサメタゾンを添加して初代培養で得た間葉系幹細胞が多分化能を維持していることについて説明する。
本実施例においては、第１の実施例の場合と同様の方法で、培地Ｂ（デキサメタゾンなし）と培地Ｃ（デキサメタゾンあり）を使用して、検体Ｚの間葉系幹細胞を１１日間、初代培養した。初代培養後、培地Ｂおよび培地Ｃで得た細胞を用いて、以下のようにして、間葉系幹細胞の多分化能について２つの方法で確認した。
【００２７】
第１に、上記の培地Ｂおよび培地Ｃで初代培養によって得られた間葉系幹細胞を回収し、デキサメタゾンの存在下において、間葉系幹細胞の骨分化誘導の比較を行った。
図５に、間葉系幹細胞の骨分化の度合いを示すアルカリフォスタファーゼ活性（以下、ＡＬＰ活性という。）を観察するために、骨分化誘導３日目と７日目におけるＡＬＰ染色結果を示す。図５（ａ）によれば、骨分化誘導３日目においては、培地Ｂ，Ｃで初代培養した細胞はいずれもＡＬＰ活性が極めて少ない。このことから、骨分化誘導前の初代培養中には、添加したデキサメタゾンによっては間葉系幹細胞の骨分化がほとんど行われていなかったことがわかる。
【００２８】
また、図５（ｂ）によれば、骨分化誘導７日目においては、培地Ｂ，Ｃで初代培養した細胞はいずれも同等のＡＬＰ活性を示している。
さらに、図６に、骨分化誘導１７日目までのＡＬＰ活性の時間変化を示す。図６によれば、デキサメタゾンを添加した培地Ｃで初代培養した細胞は、１０日目〜１３日目で、添加していない培地Ｂで初代培養した細胞よりも高いＡＬＰ活性を示しているが、いずれの場合も略同等の傾向でＡＬＰ活性の増加が見られる。このことから、デキサメタゾンを添加して初代培養して得られた間葉系幹細胞は、デキサメタゾンを添加しないものと同様のＡＬＰ活性を示し、初代培養時におけるデキサメタゾンの添加は、間葉系幹細胞の骨分化にはほとんど影響しないことが確認された。
【００２９】
第２に、上記培地Ｂおよび培地Ｃでの初代培養によって得られた間葉系幹細胞を回収し、デキサメタゾン、インドメタシンおよびＩＢＭＸの存在下において、間葉系幹細胞の脂肪分化誘導を行った。
図７は、脂肪分化誘導６日目の細胞の様子を示している。デキサメタゾンを添加した培地Ｃで初代培養して得られた細胞（図７（ａ））は、デキサメタゾンを添加していない培地Ｂ（図７（ｂ））と同様に、脂肪細胞に分化されたのが確認された。
【００３０】
これらの結果から、デキサメタゾンで初代培養した間葉系幹細胞は、その後の分化誘導によって、骨芽細胞、脂肪細胞のいずれにも分化する能力を有すること、すなわち、多分化能を維持していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第１の実施例によるデキサメタゾンの細胞増殖効果を説明するグラフである。
【図２】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第２の実施例によるデキサメタゾンの細胞増殖効果の濃度依存性を説明するグラフである。
【図３】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第３の実施例によるデキサメタゾンの細胞接着効率向上効果を説明するグラフである。
【図４】図３の細胞接着効率向上効果を示す写真である。
【図５】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第４の実施例において、デキサメタゾンを含む培地で初代培養して得られた間葉系幹細胞の骨分化誘導を説明する写真である。
【図６】図５の骨分化の時間変化を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の第４の実施例において、デキサメタゾンを含む培地で初代培養して得られた間葉系幹細胞の脂肪分化誘導を説明する写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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