(57)【要約】  【課題】  酢酸菌において、セラミド高生産株を開発することにより、美肌効果などの生理作用が期待されている酢酸菌型セラミドを効率良く生産する方法を提供することに関する。  【解決手段】  セラミドアナログに、特に（±）−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）に対する耐性を獲得した酢酸菌を取得することによって、セラミド生産性が向上した酢酸菌を取得し、該酢酸菌体から酢酸菌型セラミドを回収することにより、酢酸菌型セラミドを効率良く生産することを可能とした。セラミドアナログ、特にＰＤＭＰに対する耐性度が５０μｇ／ｍｌ以上となるように育種された酢酸菌が好ましい。さらに好ましい酢酸菌として、グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１）が例示される。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミドアナログに対する耐性を向上させた酢酸菌。
【請求項２】
セラミドアナログに対する耐性が３０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは５０μｇ／ｍｌ以上であること、を特徴とする請求項１に記載の酢酸菌。
【請求項３】
セラミドアナログが（±）−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノールであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の酢酸菌。
【請求項４】
セラミドを高含有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の酢酸菌。
【請求項５】
セラミド含有量が乾燥菌体１ｇあたり７μｍｏｌよりも高く、好ましくは９μｍｏｌ以上、更に好ましくは１０μｍｏｌ以上であること、を特徴とする請求項４に記載の酢酸菌。
【請求項６】
酢酸菌がグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アサイア属（Ａｓａｉａ）、アシドモナス属（Ａｓｉｄｏｍｏｎａｓ）に属する少なくともひとつであること、を特徴とする請求項４又は請求項５に記載の酢酸菌。
【請求項７】
グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１）であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の酢酸菌。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の酢酸菌を培養して得られた菌体から、セラミドを抽出回収することを特徴とするセラミドの製造方法。
【請求項９】
選択培地としてセラミドアナログ含有培地を使用すること、を特徴とするセラミド高含有酢酸菌の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミドの含量を向上させた酢酸菌に関する。具体的には、セラミドの一種であるＮ−２’−ヒドロキシパルミトイル−スフィンガニン（以下、酢酸菌型セラミドと称する場合もある）の含量を向上させた酢酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは、長鎖塩基であるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸がアミド結合したものの総称であって、スフィンゴ脂質の一種であり、微生物や動植物に広く分布しており、ヒトにおいては特に皮膚器官の構成成分として特徴的に存在し、水分の損失及び皮膚の乾燥を防ぐなどの重要な役割を果たしている。
【０００３】
なお、小麦、米、大豆等の植物由来のセラミドを経口摂取することにより、保湿、肌荒れ防止改善、シワ防止改善等の美肌効果があることが知られているが（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）、植物由来のセラミドは、ヒトなどの動物由来のセラミドとは化学構造が異なり、美肌効果が弱いなどの問題があった。
【０００４】
一方、牛脳などの動物から抽出したセラミドは、ヒトのセラミド（以下、ヒト型セラミドと称する場合もある）と化学構造が似ており、美肌効果は強いのであるが、ＢＳＥ問題などにより、牛脳などの動物由来のセラミドを経口摂取などによってヒトが利用することは敬遠される傾向があった。
【０００５】
また、微生物由来のセラミドはその化学構造がヒト型セラミドに類似し、その高い効果が期待されているが、例えば、スフィンゴモナスなどの食経験のない微生物由来のセラミドは安全性に疑問が残り、経口摂取が敬遠されている。
【０００６】
一方、原核生物の一種である酢酸菌は、伝統的に食酢の製造に利用されている安全性の高い微生物であり、酢酸菌型セラミドを含有することが確認されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００７】
この酢酸菌型セラミドは、動物由来のセラミドのスフィンゴイド塩基部分のスフィンゴシンの前駆体であるスフィンガニンと脂肪酸がアミド結合した構造を有しており、ヒト型セラミドに共通する構造を持っており、ヒトの美肌効果などが強いことが期待されている。
【０００８】
以上のことから、伝統的に食酢の製造に利用されている安全性の高い酢酸菌を用い、高い付加価値を持った酢酸菌型セラミドを効率良く生産することが求められていた。
【０００９】
しかし、例えば、食酢醸造に用いられる代表的な酢酸菌においては、セラミドの含有量は２〜４μｇ（３．５〜７μｍｏｌ）／ｇ乾燥菌体程度であり（例えば、非特許文献３及び非特許文献４参照）、決して満足できるものではなかった。
【００１０】
これまでに酢酸菌型セラミドの含有量を向上させた改良例は報告されておらず、より高い酢酸菌型セラミド含有量の酢酸菌を開発することが求められていた。
【非特許文献１】「フレグランス・ジャーナル（Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、２３巻、ｐ．８１〜８９、１９９５年
【非特許文献２】「バイオインダストリー（Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ）」、１９巻、ｐ．１６〜２６、２００２年
【非特許文献３】「帯大研報」、２３巻、ｐ．９１７〜９２５、１９７８年
【非特許文献４】「岩手大学大学院連合農学研究科博士論文」、後藤英嗣著、ｐ．１１〜４１、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のごとく、酢酸菌型セラミドの含有量を向上させた改良例は、いまだ報告されていない。本発明の目的は、酢酸菌において酢酸菌型セラミド含有量を向上させたセラミド高生産株を育種することにより、美肌効果などの生理作用が期待されている酢酸菌型セラミドを効率良く生産する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、酢酸菌型セラミドに類似する構造を有するセラミドアナログが酢酸菌に対する生育阻害活性を持つ場合、該セラミドアナログに対する耐性を獲得した酢酸菌はセラミドの含有量が向上していることが期待できるとの新規着想を得た。
【００１３】
上記の着想に基づき、種々の研究を行い、スフィンゴ脂質代謝化合物に近い構造をもつアナログが酢酸菌に対して生育阻害効果があることを見出し、該アナログに対する耐性が向上した新規酢酸菌を創製したところ、得られたアナログ耐性の酢酸菌が酢酸菌型セラミドを高含有することを確認し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、セラミドアナログに対する耐性を向上させた酢酸菌に関する。
また、請求項２に記載の本発明は、セラミドアナログに対する耐性が５０μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１に記載の酢酸菌に関する。
また、請求項３に記載の本発明は、セラミドアナログが（±）−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノールであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の酢酸菌に関する。
【００１５】
さらに、請求項４に記載の本発明は、セラミドを高含有すること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の酢酸菌に関し、請求項５に記載の本発明は、前項において、セラミドの含有量が乾燥菌体１ｇあたり７μｍｏｌよりも高く、好ましくは９μｍｏｌ以上、更に好ましくは１０μｍｏｌ以上であることを特徴とするものである。そして、請求項６に記載の本発明は、これらの請求項において、酢酸菌が、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アサイア属（Ａｓａｉａ）、アシドモナス属（Ａｓｉｄｏｍｏｎａｓ）の少なくともひとつであること、を特徴とするものである。
【００１６】
さらに、請求項７に記載の本発明は、グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１）であることを特徴とする請求項１〜請求項６に記載の酢酸菌に関する。
【００１７】
さらにまた、請求項８に記載の本発明は、請求項１〜請求項７に記載の酢酸菌を培養して得られた菌体から、セラミドを抽出回収することを特徴とするセラミドの製造方法に関する。
【００１８】
そして、請求項９に記載の本発明は、選択培地としてセラミドアナログ含有培地を使用すること、を特徴とするセラミド高含有酢酸菌の育種方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、高い生理活性が期待されている酢酸菌型セラミドを高濃度で含有する酢酸菌の育種株が提供され、さらにこの育種株を用いて酢酸菌型セラミドを従来以上に効率良く生産することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明のセラミドアナログ耐性株の創製に用いられる酢酸菌は、セラミドを生産する酢酸菌であれば特に限定はなく、例えば、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アサイア属（Ａｓａｉａ）またはアシドモナス属（Ａｓｉｄｏｍｏｎａｓ）に属する酢酸菌が例示される。
【００２２】
さらに詳細には、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、グルコンアセトバクター・ハンゼニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、グルコンアセトバクター・インタメデイウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、グルコンアセトバクター・サッカリ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉ）、グルコンアセトバクター・ザイリナス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）、グルコンアセトバクター・ヨーロッパエウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、グルコンアセトバクター・オボエディエンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｂｏｅｄｉｅｎｓ）などが例示される。
【００２３】
また、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、グルコノバクター・フラトウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）などが例示される。
【００２４】
さらに、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、アセトバクター・トロピカリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・シジギイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、アセトバクター・シビノンゲンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｂｉｎｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・オルレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・ポモラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ）などが例示される。
【００２５】
さらに、アサイア属（Ａｓａｉａ）の酢酸菌としては、アサイア・ボゴレンシス（Ａｓａｉａ  ｂｏｇｏｒｅｎｓｉｓ）、アサイア・シアメンシス（Ａｓａｉａ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）などが例示される。
【００２６】
また、アシドモナス属（Ａｓｉｄｏｍｏｎａｓ）の酢酸菌としては、アシドモナス・メタノリカス（Ａｓｉｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）などが例示される。
【００２７】
さらに、酢酸菌としては、上記のほか、食酢製造に用いられている酢酸菌や、自然界より分離されたもの、また既存の微生物保存機関に保存されていて分譲可能な保存菌株などが適宜利用可能である。
【００２８】
中でも、グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、譲受可能な酢酸菌であり、その分類学的特徴は、形態はかん菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、酸素に対する態度は好気性、過酸化反応は陽性、エタノールからの酢酸生成は陽性、グルコン酸生成は陽性であり、さらに該酢酸菌は膜脂質としてセラミドやホパノイド化合物を他の酢酸菌よりも比較的多量に含むことが本発明において確認されており、本発明のセラミドアナログ耐性株の創製には好適である。
【００２９】
本発明においては、これらの酢酸菌に対して、突然変異を起こさせてセラミドアナログに対して耐性となった酢酸菌を取得するのである。
【００３０】
人工的に突然変異を起こす方法としては、物理的方法としては紫外線照射や放射線照射などがある。また、化学的方法としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴＧと称する場合もある）やエチルメタンスルホン酸などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる従来公知の方法が採用される。
【００３１】
例えば、ＮＴＧ等の変異剤を用いた化学的方法としては、「バイオファクターズ（Ｂｉｏ  Ｆａｃｔｏｒｓ）」、第１巻、ｐ．２９７−３０２、１９８８年等に記載されている方法が採用可能である。
【００３２】
また、酢酸菌は自然変異を起こしやすい微生物であることが知られていることから、自然界において自然に突然変異した酢酸菌の中から、セラミドアナログに対して耐性となった酢酸菌を選択分離することによっても取得可能である。
【００３３】
セラミドアナログ耐性の酢酸菌の選抜においては、選択培地にセラミドと似た構造をもつアナログ化合物であり、かつ酢酸菌の生育を阻害するなど表現型に何らかの変化が見られる化合物を添加する必要がある。
【００３４】
酢酸菌の生育阻害効果など表現型に変化が見られるセラミドアナログとしては、ミリオシン（ＩＳＰ−Ｉ）、フモニシンＢ１などの既知のものが使用可能である（例えば、「岩手大学大学院連合農学研究科博士論文」、後藤英嗣著、ｐ．６４〜７４、２００１年参照）。
【００３５】
さらに、特に、本発明において新たに酢酸菌の生育阻害効果を見出した（±）−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（以下、ＰＤＭＰと称する場合がある）がより適したセラミドアナログとして利用可能である。
【００３６】
これらセラミドアナログの選択培地への添加濃度は、使用する酢酸菌の耐性度に応じて実施する必要があり、例えば、ＰＤＭＰの場合は１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２５〜２００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加しておくと良い。
【００３７】
変異を起こした酢酸菌を、その生育阻害限界濃度よりも高い濃度で添加したセラミドのアナログを含む固体培地に塗抹し、そこで生じた単コロニーから、セラミドアナログ耐性が向上した酢酸菌を選択することが可能となる。このようにして、高セラミド酢酸菌を育種することができる。
【００３８】
このようなセラミドアナログ耐性が向上した酢酸菌のセラミドの生産性を検証するには、以下の方法による。
【００３９】
まず、該酢酸菌を従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして、あるいは従来既知の培養方法にて、酢酸菌を培養する。
【００４０】
例えば、酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。例えば、炭素源としてはグルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。また、窒素源としてはペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。さらに、上記培地組成よりエタノールを除いた培地を用いて培養することも可能である。
【００４１】
培地のｐＨは通常ｐＨ２．５〜７の範囲であり、ｐＨ２．７〜６．５の範囲が好ましく、ｐＨは各種酸、各種塩基、緩衝液等を用いて調整することができる。
【００４２】
また、培養方法としては、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の従来から酢酸菌の培養に利用されている方法が採用可能であり、好気的条件下で酢酸菌を培養し、培養温度は通常３０℃前後で行なうのが良い。
【００４３】
酢酸菌型セラミドは公知の脂質抽出方法により得ることができる。例えば、上記培養によって得られた酢酸菌体を集菌し、その後、エタノール、アセトン等の極性溶媒を用いて酢酸菌セラミドを酢酸菌体から抽出し、有機溶媒中で再結晶させる方法などがある。
【００４４】
セラミドの定量方法としては、脂質抽出物をピリジン、塩化ベンゾイル存在下で反応させてベンゾイル基を導入し、高速液体クロマトグラフィーにて紫外線波長２３０ｎｍ下で検出する方法や脂質抽出物を高速液体クロマトグラフィーにて光散乱検出器を用いて検出する方法などが挙げられる。
【００４５】
このようにして育種したセラミド高含有酢酸菌は、セラミド含有量が高く、従来より食酢製造に用いられている代表的酢酸菌の場合は、乾燥菌体１ｇあたり、セラミド含有量が３〜７μｍｏｌ程度であるのに対して、７．５μｍｏｌ以上、好ましくは９μｍｏｌ以上、更に好ましくは１０μｍｏｌ以上であり、例えばセラミドアナログ耐性が更に高い菌株をスクリーニングすれば、１１〜１２μｍｏｌ以上の高セラミド含有酢酸菌を得ることも可能である。
【００４６】
このようにして調製された、酢酸菌型セラミドは、肌機能改善などの強い生理作用が期待できる組成物として利用可能である。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【００４８】
＜実施例１＞
以下に記載する方法で、本発明の酢酸菌型セラミドの高生産性の酢酸菌を創製した。
【００４９】
（１）変異処理
元株である酢酸菌グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株を、ＹＰＧ液体培地（グルコース３％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ｐＨ６．５）で、３０℃にて１６時間振とう培養した。
【００５０】
この培養液から酢酸菌体を集菌後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、２．５μｇＮＴＧ／ｍｌ（１０ｍＭリン酸緩衝液）中で、３０℃で３０分間、変異処理を行った。
【００５１】
変異処理後の菌体を集菌し、上記と同様にして洗浄し、次にＹＰＧ固体培地（グルコース３％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、寒天１．５％、ｐＨ６．５）で、３０℃で一晩培養し、生存率１３．１％の効率で、変異株を取得した。
【００５２】
（２）ＰＤＭＰ耐性株のスクリーニング
上記のように変異処理したグルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株を、５０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤＭＰを含むＹＰＧ固体培地上に塗抹し（約１万コロニー／プレート）、３０℃で１４日間培養して、その後出現したコロニー約５０株を得た。
【００５３】
得られたコロニー約５０株を、１〜２００μｇ／ｍｌの濃度でＰＤＭＰを含むＹＰＧ固体培地に再度レプリカ培養を行うことによりＰＤＭＰ耐性を確認し、５０μｇ／ｍｌ以上のＰＤＭＰ濃度で生育が確認された３株を得て、グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ１（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ１）株、同ＰＤＭＰＲ２株及び同ＰＤＭＰＲ３株と命名した。
【００５４】
その後、上記５０μｇ／ｍｌ以上のＰＤＭＰ濃度で生育が確認された３株について、ＰＤＭＰへの耐性度を親株と比較し、同時にアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属ならびにグルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の代表的な標準菌株についても比較した。
【００５５】
すなわち、上記３株ならびアセトバクター・ポモラムＤＳＭ１１８２５（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ  ＤＳＭ１１８２５）株、アセトバクター・パスツリアヌスＤＳＭ３５０９（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ  ＤＳＭ３５０９）株およびグルコンアセトバクター属の標準菌株であるグルコンアセトバクター・ヨーロッパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＤＳＭ６１６０）株とグルコンアセトバクター・オボエディエンスＤＳＭ１１８２６（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｂｏｅｄｉｅｎｓ  ＤＳＭ１１８２６）株、及び元株として用いたグルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株を、ＰＤＭＰを１〜２００μｇ／ｍｌの間で段階的濃度で含有するＹＰＧ固体培地上で培養し、ＰＤＭＰに対する耐性濃度を確認した。
【００５６】
なお、上記アセトバクター・ポモラムＤＳＭ１１８２５（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｏｒｕｍ  ＤＳＭ１１８２５）株、アセトバクター・パスツリアヌスＤＳＭ３５０９（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ  ＤＳＭ３５０９）株、グルコンアセトバクター・ヨーロッパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＤＳＭ６１６０）株、及びグルコンアセトバクター・オボエディエンスＤＳＭ１１８２６（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｂｏｅｄｉｅｎｓ  ＤＳＭ１１８２６）株は、ドイツ微生物菌株保存機構ＤＭＳ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  ＧＥＲＭＡＮＹ）に保存されており、譲受可能な酢酸菌である。
【００５７】
以上の結果を表１に示した。なお、表１中、○は生育あり、また×は生育なし、を意味する記号である。
【００５８】
【表１】
2006345796.tif 000002
【００５９】
表１に示した通り、アセトバクター属の標準菌株やグルコンアセトバクターの標準菌株、並びに親株としたグルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７株（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株などのＰＤＭＰに対する耐性は、最高でも２５μｇ／ｍｌ程度であったのに対して、上記３株は５０μｇ／ｍｌ以上のＰＤＭＰ耐性を有することが確認でき、特にグルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株は２００μｇ／ｍｌの濃度のＰＤＭＰに対しても耐性を獲得していることが確認できた。
【００６０】
なお、グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年５月２日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１である。
【００６１】
（３）酢酸菌型セラミド含有量の評価
上記のように選抜されたＰＤＭＰ耐性株について、以下の方法で培養を行い、菌体あたりのセラミド含量を求めた。
【００６２】
すなわち前々培養として５ｍｌのＹＰＧ液体培地に菌株を植菌し、３０℃で４８時間、１２０ｒｐｍにて振とう培養を行い、さらに前培養として５ｍｌのＹＰＧ液体培地に前培養液を２％植菌し、３０℃で２４時間、１２０ｒｐｍにて振とう培養を行った。
【００６３】
前培養液を１００ｍｌのＹＰＧ液体培地と４％エタノールの入った３００ｍｌ容坂口フラスコに３％植菌し、３０℃で約７日間、１２０ｒｐｍにて培養した。
【００６４】
この培養液を集菌後、回収した菌体を凍結乾燥し、公知のブライ・デイヤー（Ｂｌｉｇｈ−ｄｙｅｒ）法に従い、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８の組成の有機溶媒にて全脂質の抽出を行った。
【００６５】
その後、有機溶媒を吸引して濃縮乾固して得られた全脂質に、０．４Ｎの水酸化カリウム溶液を加えて弱アルカリ分解を行い、回収したアルカリ安定脂質を無水ピリジン及び塩化ベンゾイル存在下にて７０℃で１０分反応させ、スフィンゴ脂質やホパノイド化合物を含んだベンゾイル誘導体を精製した。
【００６６】
このベンゾイル誘導体を高速液体クロマトグラフィーにて紫外吸光２３０ｎｍの波長を検出し、グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株から精製した、Ｎ−２’−ヒドロキシパルミトイル−スフィンガニン（酢酸菌型セラミド）精製品を用いた標準曲線から、菌体あたりの酢酸菌型セラミドの含有量を算出した。
【００６７】
高速液体クロマトグラフィーの移動相にはヘキサン：イソプロパノール＝１００：１の溶媒を用い、流速は１ｍｌ／分とした。
【００６８】
表２に、上記（２）ＰＤＭＰ耐性株のスクリーニングにおいて用いた各種標準菌株、及び親株であるグルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１６２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株とＰＤＭＰ耐性の３株について、乾燥菌体あたりの酢酸菌型セラミドの含有量を求めた結果を示した。
【００６９】
なお、表２には、上記（２）ＰＤＭＰ耐性株のスクリーニングにおいて求めた各菌株のＰＤＭＰ耐性についても記載した。
【００７０】
【表２】
2006345796.tif 000003
【００７１】
表２の結果から、野生型の標準菌株の中ではＰＤＭＰ耐性濃度が２５μｇ／ｍｌであるグルコンアセトバクター・ザイリナス１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株のセラミド含有量が最も高く、６．６６μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体であった。
【００７２】
これに対し、グルコンアセトバクター・ザイリナス１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株のＰＤＭＰ耐性となった３株においては、そのＰＤＭＰ耐性濃度が高くなるに従ってセラミド含有量が増加し、グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１）ではＰＤＭＰ耐性濃度が２００μｇ／ｍｌに増加したのに伴い、セラミド含有量が１０．６０μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体に増加したことが確認された。
【００７３】
以上の結果、ＰＤＭＰ耐性が３０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは５０μｇ／ｍｌを超える新規酢酸菌を創製し、酢酸菌型セラミドの高生産株を得ることが可能となった。この育種株を用いて従来以上に酢酸菌型セラミドを効率良く生産することが実現可能である。
【００７４】
（４）スフィンガニン及びホパノイド含有量の評価
グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株とその変異株グルコンアセトバクター・ザイリナスＰＤＭＰＲ３（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＰＤＭＰＲ３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３１）について、セラミドと同じスフィンゴ脂質の一種であるスフィンガニンとホパノイド化合物の含有量も調べた。
【００７５】
これらの脂質は酢酸菌に存在する特徴的な膜脂質の構成成分であり、セラミド同様いずれもアルカリに対して安定な脂質であり、定量は上記セラミドでの方法における誘導体化反応において同様に誘導体化されるため、同じ方法で同時に検出可能である。
【００７６】
市販のスフィンガニン標準品およびテトラヒドロキシバクテリオホパン、ホパノール、ホペンを含むホパノイド化合物をグルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１５２３７）株から精製した標準品を用いて標準曲線を作製し、菌体あたりの濃度を算出した。
【００７７】
スフィンガニンの含有量を表３に、ホパノイド化合物の含有量を表４に示した。なお、いずれの表においてもＰＭＤＰ耐性を併記し、また表４におけるホパノイド化合物の含有量はテトラヒドロキシバクテリオホパンとして換算した数値を示した。
【００７８】
【表３】
2006345796.tif 000004
【００７９】
表３の結果から、スフィンガニンについても、ＰＤＭＰ耐性株においては４．６５μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体から１３．５９μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体に増加したことが確認され、ＰＤＭＰ耐性を向上させることによりスフィンガニンの含有量も向上することが確認された。
【００８０】
【表４】
2006345796.tif 000005
【００８１】
また、表４の結果から、ホパノイド化合物の含有量についても、ＰＭＰＤ耐性株においては８．１８μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体から１１．７２μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体に増加しており、ＰＤＭＰ耐性を向上させることにより、ホパノイド化合物の含有量もあわせて増加することが確認された。