(57)【要約】【課題】  レバン分解活性が低下した新規な納豆菌を提供すると共に、納豆粘物質中のレバン含量を高めた、腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善などの優れた健康機能を発揮する高付加価値の納豆を提供することを目的とする。【解決手段】  レバン分解活性が、親株の１／２以下であることを特徴とする納豆菌変異株；レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６１６）及びｓａｃＣｌｅｖＢ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３３）；前記納豆菌変異株を用いて製造されることを特徴とするレバン高含有納豆。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバン分解活性が、親株の１／２以下であることを特徴とする納豆菌変異株。
【請求項２】
レバン分解酵素活性が０．１Ｕ／ｍｇ以下である請求項１記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
親株のレバン分解酵素遺伝子が欠損されてなる請求項１又は２記載の納豆菌変異株。
【請求項４】
親株のレバン分解酵素遺伝子部分の欠損が、該遺伝子への薬剤耐性遺伝子の挿入によるものである請求項３記載の納豆菌変異株。
【請求項５】
レバン分解酵素遺伝子がｓａｃＣ遺伝子、または、ｓａｃＣ遺伝子およびｌｅｖＢ遺伝子である請求項３又は４記載の納豆菌変異株。
【請求項６】
親株のｓａｃＣ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６１６）。
【請求項７】
親株のｓａｃＣ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなると共に、親株のｌｅｖＢ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３３）。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の納豆菌変異株を用いて製造されることを特徴とするレバン高含有納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規レバン分解活性低下性納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造されたレバン高含有納豆に関し、さらに詳細には、レバン分解活性が低下した新規な納豆菌、及び該納豆菌を用いて得られ、納豆粘物質中にレバンを豊富に含み、優れた健康機能を発揮する高付加価値の納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
レバンは、多くの微生物や植物により生産され、自然界に広く存在するフルクトースの重合体である。
レバンに関し現在知られている機能としては、まず第一に、腸管内にてビフィズス菌の増殖促進作用があることが示されている。例えば、腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善などの優れた健康機能を有することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
第二に、微生物由来のレバンは、保湿力及び皮膚刺激緩和効能に優れ、安定性及び安全性に問題ない化粧品組成物としての利用法が報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００３】
レバンは、また、納豆粘物質の構成成分の一つでもあるが、その製造過程で分解制御を受けるため、納豆には少量しか含まれていない。すなわち、納豆菌による発酵開始から１０時間後でレバン量は頂点に達するが、その後、納豆菌により分解され減少する（例えば、非特許文献１参照）。
このため、納豆菌のレバン分解活性を制御できれば、納豆粘物質中のレバン含量を高めた、前記した腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善などの優れた健康機能を発揮する高付加価値の納豆を得ることができると考えられたが、納豆菌のレバン分解活性に関する情報は、現在のところ得られていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２３５４９２号公報
【特許文献２】特開２００３−２７７２２５号公報
【非特許文献１】「日本食品工業学会誌、２９巻、Ｐ．１０５〜１１０、１９８２年」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、レバン分解活性が低下した新規な納豆菌を提供すると共に、納豆粘物質中のレバン含量を高めた、腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善などの優れた健康機能を発揮する高付加価値の納豆を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み、本発明者らは鋭意検討を重ねる過程において、納豆菌のレバン分解酵素遺伝子を特定し、これを破壊することによりレバン分解能を低下させた納豆菌を開発できる可能性があることに着目した。
近縁種である枯草菌バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）については、近年完成した総ゲノム情報（例えば、ネイチャー（Nature）、３９０巻、ｐ．２４９−２５６、１９９７年）参照）において、ｓａｃＣ遺伝子がレバン分解酵素をコードすると推定されている。しかしながら、枯草菌においてｓａｃＣ遺伝子を破壊させても、レバンの生産量は増加しないことが報告されていた（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．），６６巻，７号，１５５５−１５５８，（２００２））。
納豆菌は枯草菌の近縁種であることから、枯草菌のｓａｃＣ遺伝子が単にレバンの分解に関与するに過ぎないとすれば、通常は、納豆菌についてもそのまま当てはまるものと想定される。
このような状況下において、本発明者は、納豆菌のｓａｃＣ遺伝子を破壊させた変異株を作成したところ、驚くべきことに、該変異株は親株よりも多量のレバンを生産することを見出した。しかも、該変異株を用いて得られる納豆は、レバンを多量に含有し、しかも品質上全く問題のないものであることを見出した。
更に、上記文献において枯草菌のレバン分解酵素をコードすると推定されているｌｅｖＢにも着目し、納豆菌のｌｅｖＢ遺伝子と前記のｓａｃＣ遺伝子とを同時に破壊させた変異株を作成したところ、該変異株は、上記ｓａｃＣ遺伝子を単独で破壊させてなる変異株よりも多量のレバンを生産することを見出した。そして、該変異株を用いて得られる納豆は、レバンを安定して多量に含有し、しかも品質上全く問題のないものであることを見出した。
本発明は、係る知見に基き完成されたものである。
【０００７】
即ち、請求項１記載の本発明は、レバン分解活性が、親株の１／２以下であることを特徴とする納豆菌変異株を提供する。
請求項２記載の本発明は、レバン分解酵素活性が０．１Ｕ／ｍｇ以下である請求項１記載の納豆菌変異株を提供する。
請求項３記載の本発明は、親株のレバン分解酵素遺伝子が欠損されてなる請求項１又は２記載の納豆菌変異株を提供する。
請求項４記載の本発明は、親株のレバン分解酵素遺伝子部分の欠損が、該遺伝子への薬剤耐性遺伝子の挿入によるものである請求項３記載の納豆菌変異株を提供する。
請求項５記載の本発明は、レバン分解酵素遺伝子がｓａｃＣ遺伝子、または、ｓａｃＣ遺伝子およびｌｅｖＢ遺伝子である請求項３又は４記載の納豆菌変異株を提供する。
請求項６記載の本発明は、親株のｓａｃＣ遺伝子に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６１６）を提供する。
請求項７記載の本発明は、親株のｓａｃＣ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなると共に、親株のｌｅｖＢ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３３）を提供する。
請求項８記載の本発明は、請求項１〜７のいずれかに記載の納豆菌変異株を用いて製造されることを特徴とするレバン高含有納豆を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の納豆菌変異株によれば、発酵中に、納豆粘物質中のレバンをほとんど分解しないため、レバン高含量納豆の効率的な製造に用いることができる。
また、本発明のレバン高含有納豆は、腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善など、レバンの有する優れた健康機能を発揮することから、高付加価値の納豆として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の納豆菌変異株の親株、すなわち、育種改良に用いる元の納豆菌に関し、特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、及びさらに改良を重ねて得られる優れた納豆菌などを用いるのが望ましい。
納豆菌はその形態や遺伝子相同性から、枯草菌バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Bacillus natto）として分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subtilis var．natto或いはBacillus subtilis（natto）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。
【００１０】
納豆菌としては、Bacillus natto IFO3009株、Bacillus subtilis IFO3335株、同IFO3336株、同IFO3936株、同IFO13169株などがある他、各種の納豆菌が広く使用できる。
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるr22株（特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１１】
本発明の納豆菌変異株は、請求項１に記載するように、レバン分解活性が、前記した親株の１／２以下であることを特徴とする。
レバンとは、前述したように、多くの微生物や植物により生産され、自然界に広く存在するフルクトースの重合体である。
本発明の納豆菌変異株は、レバン分解活性が、親株の１／２以下、好ましくは１／３以下であることが好ましい。レバン分解活性が親株の１／２を超えると、親株と同程度にレバンを分解してしまい、レバン高含有納豆の製造に用いることができないので、好ましくない。
【００１２】
レバン分解活性は、親株及び納豆菌変異株のそれぞれを用いて得られる納豆のレバン量を比較することにより確認することができるが、納豆を得るまでもなく、レバン分解酵素活性を確認することによっても確認することができる。
すなわち、請求項２に記載するように、レバン分解酵素活性が０．１Ｕ／ｍｇ以下、好ましくは０．０８Ｕ／ｍｇ以下のものは、親株よりもはるかにレバン分解能が低く、レバン高含有納豆の製造に有用である。
ここで、レバン分解酵素とは、レバンを基質としてレバンの２，６−β−Ｄ−フルクトフラノシド結合を任意の部位で加水分解もしくは転移させ、レバンの重合度を低下させる酵素である。
レバン分解酵素活性が０．１Ｕ／ｍｇを超えると、親株と同程度にレバンを分解してしまい、レバン高含有納豆を得ることができないので、好ましくない。
【００１３】
このような本発明の納豆菌変異株は、レバン分解活性が親株の１／２以下となるように低下させた納豆菌を育種することにより得ることができる。また、レバン分解酵素活性が０．１Ｕ／ｍｇ以下となるように、親株を育種改良することによっても得ることができる。
また、育種方法の一つとして、レバン分解酵素の遺伝子情報を利用することもできる。すなわち、請求項３に記載するように、親株のレバン分解酵素遺伝子が欠損されてなるものとして本発明の納豆菌変異株を得ることもできる。
【００１４】
ここで、親株のレバン分解酵素遺伝子とは、前記したような納豆菌のレバン分解酵素をコードする遺伝子であり、具体的には、請求項５に記載するように、ｓａｃＣ遺伝子を挙げることができる。
このｓａｃＣ遺伝子は、既に述べたように、近縁種である枯草菌について、レバン分解酵素（exolevanase）をコードする遺伝子として推定されたものであるが、枯草菌において本遺伝子を欠損させたとしてもレバン生成量は実際には増加しない。しかしながら、納豆菌においては、ｓａｃＣ遺伝子を破壊すると、枯草菌の場合とは反対に、親株よりも多量のレバンを含む納豆を生産する変異株を得ることができる。
一方、請求項５に記載するように、親株のレバン分解酵素遺伝子としては、ｓａｃＣ遺伝子と共に用いることを前提として、ｌｅｖＢ遺伝子を挙げることもできる。
ｌｅｖＢ遺伝子は、既に述べたように、近縁種である枯草菌においてレバン分解酵素（endolevanase）をコードする遺伝子として推定されたものであるが、納豆菌のｌｅｖＢ遺伝子と前記のｓａｃＣ遺伝子とを同時に破壊すると、上記ｓａｃＣ遺伝子を単独で破壊させてなる変異株よりも多量のレバンを生産する変異株を得ることができる。
【００１５】
親株のレバン分解酵素遺伝子を欠損させるための手法としては、相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能である。本方法の利点は、狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができることである。
また、スタールらが枯草菌バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１５８巻、p．４１１−４１８、１９８４年」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
そして、請求項４に記載するように、薬剤耐性遺伝子の挿入による方法も利用可能である。薬剤耐性遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００１６】
更に、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、５６巻、p．２０９−２２１、１９７１年」参照）が利用可能である。
更にまた、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、１９９７年」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
【００１７】
本発明者らは、上記手法のうち、コンピテンス法を利用して、請求項６に記載するように、親株のレバン分解酵素遺伝子ｓａｃＣ部分に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣ１を得ることができた。このｓａｃＣ１株は、後述の実施例に示すように、レバン分解酵素活性が親株に比べて顕著に低いことが証明されている。この納豆菌変異株ｓａｃＣ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６１６である。
【００１８】
また、本発明者らは、上記納豆菌変異株ｓａｃＣ１のレバン分解酵素遺伝子ｌｅｖＢ部分に代えて、該遺伝子の一部にスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入することにより、請求項７に記載するように、親株のｓａｃＣ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなると共に、親株のｌｅｖＢ遺伝子部分に代えて、該遺伝子の一部にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなり、レバン高含有納豆の生産能を有する納豆菌変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１を得ることができた。このｓａｃＣｌｅｖＢ１株は、後述の実施例に示すように、レバン分解酵素活性がほとんどないことが証明されている。この納豆菌変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３３である。
【００１９】
なお、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、即ち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても、親株のレバン分解酵素遺伝子を欠損させてなる変異株の育種が可能である。
【００２０】
このような本発明の納豆菌変異株は、レバン分解活性が親株の１／２以下に低下しているので、請求項８に記載するように、レバン高含有納豆の製造に利用できる。
すなわち、本発明のレバン高含有納豆は、上記本発明の納豆菌変異株を用いて製造されることを特徴とする。
【００２１】
本発明のレバン高含有納豆は、上記本発明の納豆菌変異株を用いて製造されるのであれば、その製造条件及び製造工程について特に制限はなく、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２Ｋｇ／ｃｍ２・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
このような従来の納豆の製造方法において、本発明のレバン高含有納豆を得る場合は、発酵工程で用いる納豆菌を、本発明の納豆菌変異株に代えて使用することができる。
【００２２】
尚、レバン分解活性が低下した本発明の納豆菌変異株の納豆菌の能力との相乗効果を期待して、原料である大豆中にスクロース（ショ糖）もしくはレバンを添加することにより、生産される納豆のレバン量をさらに増強させることも可能である。スクロース（ショ糖）の場合、その添加方法は特に限定されず、例えば、蒸煮後の大豆に適量のスクロース（ショ糖）溶液を添加したり、スクロース（ショ糖）を含有する大豆蒸煮の煮汁を蒸煮後の大豆に添加することができる。
また、発酵を低温で実施することで、レバン量をさらに増強させることもできる。
【００２３】
本発明のレバン高含有納豆は、納豆菌変異株を用いて製造されるものであるから、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆と比較すると、レバンを高い濃度で含有している。この点は、後述の実施例からも実際に証明されており、従って、本発明のレバン高含有納豆は、レバンの健康機能が期待できる優れた納豆であることが明らかである。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００２４】
以下の条件及び手順により、納豆菌のｓａｃＣ遺伝子を欠損させた納豆菌変異株を作製した。
【００２５】
（１）基本条件
育種対象である親株としては、納豆菌バシラス・サチラスｒ２２（Bacillus subtilis r22）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。
ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、以下のようにしてニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。
【００２６】
すなわち、Ｏ−２株を常法に準じＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３０℃、１時間、生存率７．３％）して、得られた変異菌５×１０６個を、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」に記載されているバシルス・サチリス（Bacillus subtilis）の方法に準じたプロトプラスト法により、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。形質転換後のプロトプラスト培地としてＮＰ再生培地（下記の表１参照）を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十株の形質転換株を得た。形質転換株のうち３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた胞子を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの保持の有無を調べ、得られた２１株のベクター除去株について、プロトプラストを形成し、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換能が向上しているもの１５株を選抜した。さらに、これら１５株について常法による納豆製造試験を行ない、発酵能や品質評価を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造できる４株のうち、品質の悪いものや糸引きが極端に悪くなったものを除いた１株をｒ２２株として得た。
【００２７】
【表１】
2006115815.tif 000002
【００２８】
また、他には大腸菌ＤＨ５α（Escherichia coli DH5α）株（タカラバイオ社製）を用いた。
プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）及びｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、２版（１９９２）、Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY」の記載に従った。
また、基本的な培養は以下の表２に示すＬＢ培地を用いて行った。
【００２９】
【表２】
2006115815.tif 000003
【００３０】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は、Ｔａｑポリメラーゼに添付のマニュアルに従った。
納豆菌の形質転換等は、以下の方法によった。
即ち、納豆菌の染色体ＤＮＡは、市販のキットを使用して調製し、形質転換は「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」の方法に従った。
納豆菌の胞子は、以下の表３及び表４にそれぞれ示すＮＢ培地及びSterlini-Madelstam置換培地を用いて調製した。
【００３１】
【表３】
2006115815.tif 000004
【００３２】
【表４】
2006115815.tif 000005
【００３３】
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１及び図２に示した。
即ち、ｒ２２株のｓａｃＣ遺伝子領域を含む約６Ｋｂｐの増幅にはプライマー１（primer 1：配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（primer 2：配列表の配列番号２に記載）を使用した。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー３（primer 3：配列表の配列番号３に記載）及びプライマー４（primer 4：配列表の配列番号４に記載）を用いた。
それぞれのプライマーは、枯草菌バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）のｓａｃＣ遺伝子の塩基配列（例えば、「ネイチャー（Nature）、３９０巻、ｐ．２４９−２５６、１９９７年」参照）を、またｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列（例えば、「プロシーシングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳＡ（Proceedings of National Academy of Science in U．S．A．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９−７０８３、１９８０年」参照）をもとにして設計し合成した。
即ち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｓａｃＣ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐを増幅するとともに制限酵素サイトＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片１（DNA fragment 1））（図１）。
【００３４】
さらに、ｐＣ１９４を鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を用いクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＳｐｈＩを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片２（DNA fragment 2））（図２）。
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いたベクターを、大腸菌ＤＨ５αを宿主として構築した。即ち、ＤＮＡ断片１を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで、ＤＮＡ断片２をＳｐｈＩで処理した。得られた断片をｐＢＲ３２２のマルチクローニングサイト上のＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩ間にＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片２の順に順次導入し、プラスミドｐＳＣＣ１を得た。プラスミドｐＳＣＣ１の構造の概略を図３に示す。
【００３５】
（３）形質転換
プラスミドｐＳＣＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｓａｃＣ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。その概略を図４に示す。
形質転換株の選択は、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｓａｃＣ１（Bacillus subtilis sacC1）株（以下、ｓａｃＣ１株と称する場合もある。ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６１６）のｓａｃＣ遺伝子は、塩基番号２４０−７７２の５３２塩基がクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることが、ＰＣＲ法による解析などによって確認された。
【００３６】
（４）レバン分解酵素活性の確認
（３）で得られたｓａｃＣ１株のレバン分解酵素活性を親株ｒ２２株のそれと比較した。
レバン分解酵素活性の分析は、以下の条件及び手順によった。すなわち、ｒ２２株とｓａｃＣ１株を、５ｍｌＬＢ液体培地にて３７℃、６時間培養し、培養液を遠心分離した。上清５００μｌと１％レバン溶液５００μｌを混合し、３７℃、４０分反応させた。反応液を遠心分離し、上清を採り、その内３００μｌについてブラッドフォード法にてタンパク量を測定した。残りの上清を、８０℃、１０分反応させて酵素を失活させ、Ｆ−キット（Ｒｏｃｈｅ製）にてフルクトース量を測定した。測定されたフルクトース１μｍｏｌを１分で遊離させる活性を１Ｕとして、レバン分解酵素活性の指標とした。
それぞれのレバン分解酵素活性の変化を表５に示した。
【００３７】
【表５】
2006115815.tif 000006
【００３８】
表５から明らかなように、ｓａｃＣ１株は、親株ｒ２２株に比べレバン分解酵素活性が大幅に低いことが確認された。この結果は、同時に、ｓａｃＣ遺伝子が納豆菌のレバン分解酵素をコードする遺伝子であることを証明するものである。
【実施例２】
【００３９】
以下の条件及び手順により、親株ｒ２２株及び変異株ｓａｃＣ１株をそれぞれ用いて納豆を試作すると共に、得られる納豆の品質評価を行った。
【００４０】
（１）納豆の試作
常法に従い、ｒ２２株、およびｓａｃＣ１株の胞子液を調製した。即ち、ｒ２２株またはｓａｃＣ１株を表３に示したＮＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表４に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。即ち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧１．８ＫＰａで１８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株またはｓａｃＣ１株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
【００４１】
その結果、ｓａｃＣ１株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、ｓａｃＣ欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００４２】
（２）納豆の品質評価
前記（１）で試作した納豆を、まず官能検査に供した。官能検査は、糸引きの強さ、菌膜の厚さ、豆の色、香り、及び熟度（発酵の進み具合）の各項目に関して、試作した納豆同士を比較して評価した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｓａｃＣ１株）とでいずれの項目においても違いが見られなかったことから、ｓａｃＣ１株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
【００４３】
次に、（１）で試作した納豆中のレバン量を分析した。
即ち、１０ｇの納豆に２０ｍｌの２．５％トリクロロ酢酸を加え５０℃、１０分保温する。上清を５０ｍｌのメスフラスコに移した。残った納豆に更に２０ｍｌの２．５％トリクロロ酢酸を加え５０℃、１０分保温した後、ナイロンメッシュでろ過し、納豆を除いた。
ろ液を１回目の抽出時の上清とあわせた後５０ｍｌまでメスアップし、得られる抽出液を１２，０００ｒｐｍ、２０分、３０℃で遠心した。上清を２０ｍｌ採取し、ＮａＯＨでｐＨ７．０−７．２に調節して、４倍量のエタノールを加え氷上に１０分間置いた。１２，０００ｒｐｍ、１０分遠心して、沈殿を回収し自然乾燥させた。沈殿を２０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、粗抽出液とした。
【００４４】
粗抽出液０．６ｍｌに、レゾルシン−チオ尿素試薬（レゾルシン０．１ｇ、チオ尿素０．２５ｇ、酢酸１００ｍｌ）０．３ｍｌ、３０％塩酸０．２１ｍｌを加え、８０℃、１０分加熱した。急冷した後、Ａ５００を測定した。フラクトース溶液を用いて作成した検量線に、レバンの加水分解による増加分を考慮し０．９を乗じてレバン濃度を計算した。
以上の方法により、納豆中のレバン量を分析した結果を表６に示した。
【００４５】
【表６】
2006115815.tif 000007
【００４６】
表６から明らかなように、ｓａｃＣ１株では親株ｒ２２株に比べレバンの生成量が増加しており、ｓａｃＣ遺伝子欠損の効果が見られた。
【実施例３】
【００４７】
以下の条件及び手順により、納豆菌ｓａｃＣ１株のｌｅｖＢ遺伝子を欠損させた納豆菌変異株を作製した。
（１）基本条件
前記実施例１の（１）基本条件において、プラスミドベクターｐＢＲ３２２の代わりにｐＩＣ３３３（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテオロジー（Journal of Bacteriology）、１７８巻、p.１１７８−１１８６、（１９９６）参照」を用いた他は、同様の条件とした。
【００４８】
（２）ベクター構築
ｓａｃＣ１株のｌｅｖＢ遺伝子領域を含む約５．５Ｋｂｐの増幅にはプライマー５（primer 5：配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（primer 6：配列表の配列番号６に記載）を使用した。
ｐＩＣ３３３のスペクチノマイシン耐性遺伝子の増幅には、プライマー７（primer 7：配列表の配列番号７に記載）及びプライマー８（primer 8：配列表の配列番号８に記載）を用いた。
それぞれのプライマーは、枯草菌バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）のｌｅｖＢ遺伝子の塩基配列（例えば、「ネイチャー（Nature）、３９０巻、p．２４９−２５６、（１９９７）」参照）を、またｐＩＣ３３３のスペクチノマイシン耐性遺伝子の塩基配列（例えば、「遺伝子情報データベースＧｅｎｂａｎｋ−ｔｏｄａｙ（http：／／www．genome．ad．jp／dbget-bin／www_bfind？genbank−upd）に記載されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓトランスポゾンＴｎ５５４由来の塩基配列」をもとにして設計し合成した。
即ち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー５（配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を用いｌｅｖＢ遺伝子領域を含む約５．５Ｋｂｐを増幅するとともに修飾酵素Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（例えば、ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．製）で両端を平滑末端処理した（ＤＮＡ断片３（DNA fragment 3））。
さらに、ｐＩＣ３３３を鋳型にしプライマー７（配列表の配列番号７に記載）及びプライマー８（配列表の配列番号８に記載）を用いスペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＮｓｐＶを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片４（DNA fragment 4））。
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを構築した。即ち、ＤＮＡ断片４をＮｓｐＶで処理した。得られた断片をｐＢＲ３２２のマルチクローニングサイト上のＥｃｏＲＶ間にＤＮＡ断片３、ＤＮＡ断片４の順に順次導入し、プラスミドｐＬＢＳ１を得た（図５）。
【００４９】
（３）形質転換
プラスミドｐＬＢＳ１のプラスミドＤＮＡを鋳型にし、プライマー５（配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を用いｌｅｖＢ遺伝子領域及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む約５．５ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｓａｃＣ１株へ形質転換した。
形質転換株の選択は、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｓａｃＣｌｅｖＢ１（Bacillus subtilis ｓａｃＣｌｅｖＢ１）株（以下、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株と称する場合もある。ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３３）のｌｅｖＢ遺伝子は、塩基番号８９１−８９２の間にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが、ＰＣＲ法による解析などによって確認された。
【００５０】
（４）レバン分解酵素活性の確認
（３）で得られたｓａｃＣｌｅｖＢ１株のレバン分解酵素活性を親株ｒ２２及びｓａｃＣ１株のそれと比較した。
レバン分解酵素活性の分析は、前記実施例１の（４）レバン分解酵素活性の確認にて記載した方法に従った。
それぞれのレバン分解酵素活性の変化を表７に示した。
【００５１】
【表７】
2006115815.tif 000008
【００５２】
表７から明らかなように、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株はレバン分解活性が検出されなかった。このことから、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株は、レバンの安定性に優れていることが分かる。
【実施例４】
【００５３】
以下の条件及び手順により、親株ｒ２２株及び変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１株をそれぞれ用いて納豆を試作すると共に、得られる納豆の品質評価を行った。
（１）納豆の試作
前記実施例２の（１）と同様、常法に従い、ｒ２２株、ｓａｃＣ１株、およびｓａｃＣｌｅｖＢ１株の胞子液を調製し納豆を作製した。
その結果、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、ｓａｃＣとｌｅｖＢ遺伝子の同時欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００５４】
（２）納豆の品質評価
続いて前記（１）で試作した納豆を、まず、官能検査に供した。官能検査は、前記実施例２の（２）納豆の品質評価と同様の条件で行った。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｓａｃＣｌｅｖＢ１株）とで品質上に違いが見られず、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
【００５５】
次に、試作した納豆中のレバン量を分析した。レバン量の分析は、前記実施例２の（２）に記載した方法に従って行った。
納豆中のレバン量を分析した結果を、表８に示した。
【００５６】
【表８】
2006115815.tif 000009
【００５７】
表８から明らかなように、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株では、親株ｒ２２株に比べレバンの生成量が増加し、ｓａｃＣ１株と比べても高い生成量となっていた。このことから、ｓａｃＣ及びｌｅｖＢ遺伝子の同時欠損により、ｓａｃＣ遺伝子のみを欠損した場合よりもレバンの生産をより活性化させる効果が発揮されることが明らかとなった。
【００５８】
（３）納豆中のレバン安定性
さらに、前記（１）でｓａｃＣｌｅｖＢ１株を用いて試作した納豆の保存性試験を行った。
即ち、発酵終了後の納豆を１０℃の冷蔵庫に最大３週間まで保存し、１週間（７日経過）後及び３週間（２１日経過）後のレバン量の変化を（２）で記載したレバン分析法に従い、測定した。
納豆中のレバンの変遷を分析した結果を表９に示した。
【００５９】
【表９】
2006115815.tif 000010
【００６０】
表９から明らかなように、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株を用いて試作された納豆は、製造から３週間経過後もレバン量の減少が見られなかった。このことから、ｓａｃＣ及びｌｅｖＢ遺伝子欠損により、３週間経過後も安定して高濃度のレバンを含有する納豆を得られることが確認された。
【実施例５】
【００６１】
大豆中にスクロースを添加して納豆を試作すると共に、得られる納豆の品質評価を行った。
（１）納豆の試作
前記実施例２の（１）において、親株ｒ２２株及び変異株ｓａｃＣｌｅｖＢ１株の胞子液にスクロースを１ｇ加えたもの、あるいは加えないものを調製した他は同様にして、納豆を作製した。
【００６２】
（２）納豆の品質評価
試作した納豆中のレバン量を分析した。レバン量の分析は、前記実施例２の（２）に記載した方法に従って行った。
納豆中のレバン量を分析した結果を、表１０に示した。
【００６３】
【表１０】
2006115815.tif 000011
【００６４】
表１０から、スクロースを添加することにより、添加しない場合に比べ、レバンを高い濃度で含有する納豆が得られることが明らかとなった。特に、ｓａｃＣｌｅｖＢ１株を添加した場合には、レバン量を顕著に高い濃度で含有する納豆を得ることができることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の納豆菌変異株によれば、発酵中に、納豆粘物質中のレバンをほとんど分解しないため、レバン高含量納豆の効率的な製造に用いることができる。
また、本発明のレバン高含有納豆は、腸内菌叢の改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善など、レバンの有する優れた健康機能を発揮することから、高付加価値の納豆として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＤＮＡ断片１作製の概略を示した図である。
【図２】ＤＮＡ断片２作製の概略を示した図である。
【図３】プラスミドｐＳＣＣ１の構成の概略を示す図である。
【図４】ｓａｃＣ１遺伝子欠損工程の概略を示す図である。
【図５】プラスミドｐＬＢＳ１の構成の概略を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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