(57)【要約】【課題】  環境中に極微量に存在する内分泌攪乱化学物質を高感度で感受するモニタリング用植物、その生産に使用するＤＮＡ、発現ベクター等を提供すること。【解決手段】  本発明の形質転換植物は、プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列からなる第一構築物と、レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクターにより形質転換され、植物内に侵入した内分泌攪乱化学物質を感受してレポーター遺伝子を発現するため、内分泌攪乱化学物質のモニタリング用植物として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域の３つの領域を有する組換え転写因子をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域が、メダカ由来のエストロジェン受容体アルファのリガンド結合に関与する領域であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＤＮＡ結合領域が、大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合領域であり、転写活性化領域が、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質の遺伝子転写に関与する領域であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
組換え転写因子が、さらに核移行シグナルを有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項５】
プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列を含む第一構築物と、
レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクター。
【請求項６】
内分泌攪乱化学物質と第一構築物の翻訳産物との複合体によりＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子が発現され、当該遺伝子発現を介して、レポーター遺伝子の転写が細胞内で恒常的に行われるように構築されていることを特徴とする請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列からなる第一構築物と、レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクターにより形質転換され、植物内に侵入した内分泌攪乱化学物質を感受してレポーター遺伝子を発現する形質転換植物。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換植物の生産方法であって、上記発現ベクターでアグロバクテリウムを形質転換し、このアグロバクテリウムを植物細胞に感染させ、その後、植物体に再分化させる工程を含む生産方法。
【請求項９】
請求項７記載の形質転換植物を用いた、環境中の内分泌攪乱化学物質のモニタリング方法。
【請求項１０】
アルキルフェノール類化合物のモニタリングに使用することを特徴とする、請求項９記載のモニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ホルモンと呼ばれる内分泌攪乱化学物質（Endocrine disruptor：ＥＤ）を高感度で感受する形質転換植物、その生産に使用する組換え転写因子をコードするＤＮＡ、発現ベクター、同植物の生産方法、および、同植物を用いたモニタリング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
産業の発展と生活習慣の変化に伴い、さまざまな化学物質による環境の汚染が拡大している。これら化学物質の中でも、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌攪乱化学物質は、極低濃度で、生態系および人体の健康に影響を及ぼすことが心配されている。内分泌攪乱化学物質には、ダイオキシン類、工業化学品やある種の残留農薬などが含まれており、環境汚染のレベルは極低濃度である。
【０００３】
これら環境を汚染している内分泌攪乱化学物質のモニタリングは、従来、機器分析により行われてきた。確かに、機器分析は感度や精度に優れているが、高価な設備と熟練技術を必要とするため時間と経費がかかる。そこで、迅速かつ簡便に、汚染現場をモニタリングする方法の開発が求められている。
【０００４】
ところで、植物は発達した根系を利用して、広範囲から極低濃度の化学物質を吸収・蓄積することができる。また、植物は環境下での管理が容易で、環境安全性が高いという利点がある。さらに、生物機能に基づく新技術の開発はパブリックアクセプタンスを得やすい。
【０００５】
内分泌攪乱化学物質のうち、エストロジェン様作用を示す化合物は動物体内に取り込まれるとエストロジェン受容体（Estrogen Receptor：ＥＲ）と結合し、核内で遺伝子上流の標的配列に結合することによって標的遺伝子を誘導発現する。
【０００６】
これまでに、ヒトのエストロジェン受容体（ｈＥＲ）のリガンド結合領域と、大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合に関与する領域の一部であるＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域（ＬｅｘＡ）、および、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質の遺伝子転写に関与する領域の一部であるＶＰ１６転写活性化領域（ＶＰ１６）を組み合わせた組換え型転写因子をコードするＤＮＡが創製されている。そして、これと共にレポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をシロイヌナズナ植物に導入した組換え植物ＸＶＥが作出された（下記の非特許文献１）。この形質転換シロイヌナズナ植物ＸＶＥは、１７β−エストラジオール（Ｅ2）を根から吸収することにより、ＧＦＰ遺伝子の転写を誘導し、発現した。
【０００７】
上記形質転換シロイヌナズナ植物ＸＶＥは、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ（ＸＶＥ）の順に融合した転写因子の遺伝子を恒常的に発現し、これにリガンドである内分泌攪乱化学物質が細胞内に取り込まれて結合するとレポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の上流部分の標的配列に結合し、一過的な遺伝子誘導発現を引き起こす（図９参照）。本形質転換シロイヌナズナ植物は、環境中およそ２ｐｐｂのＥ2の存在下でＧＦＰ遺伝子の転写を誘導し、ＧＦＰに基づく蛍光を発した。
【０００８】
一方、同様にＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｈＥＲ（ＸＶＥ）を恒常的に発現するが、リガンド存在下で特異的にＣｒｅ組換え酵素（Ｃｒｅレコンビナーゼ）遺伝子を誘導発現する形質転換シロイヌナズナ植物ＣＬＸが作出された（下記の非特許文献２）。本形質転換植物は、リガンド存在下でバクテリオファージＰ１由来の遺伝子組換え酵素Ｃｒｅを発現し、ｌｏｘＰ部位を特異的に切断することによってＧＦＰ遺伝子を恒常的に発現させる機能を有する（図１０参照）。その際、カナマイシン耐性遺伝子が特異的に切断されることから、誘導後、マーカーフリーの形質転換植物となる。
【０００９】
これまでにＥ2に関しては、蒸散が活発になると考えられる鉢上げ条件で組換え植物ＸＶＥおよび組換え植物ＣＬＸをＥ2を含むバーミキュライトで育成したところ、それぞれ０．００１ｐｐｂおよび０．１ｐｐｂのＥ2を検出し、従来の検出限界に比べて約２，０００倍の感度向上を達成した。
【００１０】
一方、環境中においては環境ホルモン類の一種である工業化学品の４‐ｔ‐オクチルフェノール（ＯＰ）や４‐ノニルフェノール（ＮＰ）といったアルキルフェノール類が頻繁に検出される（表１）。
【表１】
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【００１１】
したがって、上記アルキルフェノール類をモニタリングすることは非常に重要である。固形培地上で、４‐ｔ‐オクチルフェノールに対しては組換え植物ＸＶＥで１，０００ｐｐｂ、組換え植物ＣＬＸで１００ｐｐｂを検出し、４‐ノニルフェノールに対しては植物ＸＶＥで１，０００ｐｐｂ、植物ＣＬＸで１，０００ｐｐｂを検出できた。しかしながら、実際に環境中で検出されている濃度は、４‐ｔ‐オクチルフェノールで０．９２ｐｐｂ、４‐ノニルフェノールで８．４ｐｐｂとさらに低濃度であり、これらのアルキルフェノール類をモニターする為には検出感度を向上させる必要があった。
【００１２】
これまで用いたヒトＥＲ（ｈＥＲ）は、Ｅ2などの内分泌攪乱化学物質に対する結合親和性は高いものの、実際に環境下で高頻度に検出されるアルキルフェノール類に対しては親和性が低いという問題があった。
【００１３】
【非特許文献１】Zuo et al., The Plant Journal (2000) 24(2) 265-273.
【非特許文献２】Zuo et al., Nature Biotechnology (2000) 19 157-161.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、環境中に極微量に存在する内分泌攪乱化学物質を高感度で感受するモニタリング用植物、その生産に使用するＤＮＡ、発現ベクター等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、従来のヒト・エストロジェン受容体（ｈＥＲ）に比してより高感度の内分泌攪乱化学物質に対する受容体の探索を行った結果、魚類の内分泌攪乱化学物質に対する受容体遺伝子、特にメダカ由来のエストロジェン受容体（ｍＥＲ）遺伝子を組み込んだトランスジェニック植物は、内分泌攪乱化学物質に対して極めて高い感受性を有し、環境中に極微量に存在する内分泌攪乱化学物質を高感度で検出できること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｊ）の発明を包含するものである。
Ａ）  ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域の３つの領域を有する組換え転写因子をコードするＤＮＡ。本発明のＤＮＡは、組換え転写因子コード配列（組換え転写因子遺伝子）として、後述の第一構築物の要素となるものである。
【００１７】
Ｂ）  魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域が、メダカ由来のエストロジェン受容体アルファのリガンド結合に関与する領域であることを特徴とする上記Ａ）記載のＤＮＡ。メダカ由来のエストロジェン受容体（medaka Estrogen Receptor：以下、略して「ｍＥＲ」という場合がある。）は、アルキルフェノール類に対する結合親和性が高いので、本発明の組換え転写因子にｍＥＲのリガンド結合領域を用いることで、アルキルフェノール類などの内分泌攪乱化学物質を高感度でモニタリングすることができる。
【００１８】
Ｃ）  ＤＮＡ結合領域が、大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合領域であり、転写活性化領域が、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質の遺伝子転写に関与する領域であることを特徴とする上記Ａ）記載のＤＮＡ。
【００１９】
Ｄ）  組換え転写因子が、さらに核移行シグナルを有することを特徴とする上記Ａ）記載のＤＮＡ。核移行シグナルは、本発明の組換え転写因子においてｍＥＲなど魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域のＮ末端側に配置されることが好ましい（図１参照）。
【００２０】
Ｅ）  プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列を含む第一構築物と、
レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクター。
【００２１】
Ｆ）  内分泌攪乱化学物質と第一構築物の翻訳産物との複合体によりＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子が発現され、当該遺伝子発現を介して、レポーター遺伝子の転写が細胞内で恒常的に行われるように構築されていることを特徴とする上記Ｅ）記載の発現ベクター。
【００２２】
Ｇ）  プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列からなる第一構築物と、レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクターにより形質転換され、植物内に侵入した内分泌攪乱化学物質を感受してレポーター遺伝子を発現する形質転換植物。したがって、本発明の形質転換植物（トランスジェニック植物・組換え植物）は、内分泌攪乱化学物質のモニタリング（用）植物として利用できる。
【００２３】
Ｈ）  上記Ｇ）記載の形質転換植物の生産方法であって、上記発現ベクターでアグロバクテリウムを形質転換し、このアグロバクテリウムを植物細胞に感染させ、その後、植物体に再分化させる工程を含む生産方法。
【００２４】
Ｉ）  上記Ｇ）記載の形質転換植物を用いた、環境中の内分泌攪乱化学物質のモニタリング方法。
【００２５】
Ｊ）  アルキルフェノール類化合物のモニタリングに使用することを特徴とする、上記Ｉ）記載のモニタリング方法。
【発明の効果】
【００２６】
上記のように、本発明の形質転換植物は、第一構築物と第二構築物を有する発現ベクターにより形質転換され、植物内に内分泌攪乱化学物質が侵入するとレポーター遺伝子の転写が開始されるので、当該遺伝子の転写・発現を任意の方法で検出することにより、環境中に存在するアルキルフェノール類などの内分泌攪乱化学物質を高感度でモニタリングすることができる。
【００２７】
また、上記モニタリング用植物の生産に使用されるＤＮＡ、発現ベクター、同植物の生産方法、および、同植物を用いたモニタリング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えば以下のとおりである。また、アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合、特に明示しなければＬ体を表すものとする。
【００２９】
アミノ酸については、ＧまたはＧｌｙ：グリシン、ＡまたはＡｌａ：アラニン、ＶまたはＶａｌ：バリン、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン、ＳまたはＳｅｒ：セリン、ＴまたはＴｈｒ：スレオニン、ＣまたはＣｙｓ：システイン、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸、ＫまたはＬｙｓ：リジン、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン、ＹまたはＴｙｒ：チロシン、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン、ＰまたはＰｒｏ：プロリン、ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン、ＱまたはＧｌｎ：グルタミンである。また、塩基については、Ａまたはａ：アデニン、Ｇまたはｇ：グアニン、Ｔまたはｔ：チミン、Ｃまたはｃ：シトシンである。
【００３０】
［１］本発明の形質転換植物の生産に使用するＤＮＡと発現ベクター
本発明は、上述のように、プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域からなる組換え転写因子コード配列、並びにターミネーター配列からなる第一構築物と、レポーター遺伝子配列を有し、細胞内で内分泌攪乱化学物質と上記第一構築物の翻訳産物（発現産物）との複合体によりレポーター遺伝子の転写が開始され、当該遺伝子を細胞内で発現させる第二構築物と、を備えた発現ベクターにより形質転換され、植物内に侵入した内分泌攪乱化学物質を感受してレポーター遺伝子を発現する、内分泌攪乱化学物質モニタリング用形質転換植物を提供する。以下ではまず、本発明の形質転換植物の生産に使用するＤＮＡと発現ベクターについて説明する。
【００３１】
本発明の形質転換植物に使用される発現ベクターは、第一構築物と第二構築物とを有し、第一構築物は、（１）プロモーター配列、（２）当該プロモーター配列の下流に配置された、本発明の組換え転写因子をコードするＤＮＡ（すなわち、ＤＮＡ結合領域、魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域、および転写活性化領域の３つの領域を有する組換え転写因子コード配列）、並びに、（３）ターミネーター配列を含むよう構築されている。
【００３２】
第一構築物において用いられるプロモーター配列としては、植物発現ベクターに通常用いられるプロモーターを用いることができ、特に制限はない。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの−９０領域とＧＣＣＡＣＧＴＧＣＣ配列を４つ結合した合成プロモーター（Ｇ10-90プロモーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターなどを用いることができる。
【００３３】
ＤＮＡ結合領域としては、第二構築物のプロモーター配列に結合する配列であればよく、例えば、大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合に関与する領域（ＬｅｘＡ）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域、アリルハイドロカーボンレセプターのＤＮＡ結合領域、エストロジェンレセプターのＤＮＡ結合領域などを用いることができる。
【００３４】
ＬｅｘＡのＤＮＡ結合に関与する領域としては、全長２０２アミノ酸からなるＬｅｘＡのうち８７アミノ酸（図７（ｂ）下線部）をＤＮＡ結合領域の最小単位として使用することができる。
【００３５】
魚類の内分泌攪乱化学物質受容体のリガンド結合領域（以下、単に「リガンド結合領域」という場合がある。）としては、魚類のアリルハイドロカーボン受容体のリガンド結合領域の使用なども考えられるが、特にメダカ由来のエストロジェン受容体のリガンド結合領域が、内分泌攪乱化学物質に対して極めて高い感受性を有し、環境中に極微量に存在する内分泌攪乱化学物質を高感度で検出でき好適である。
【００３６】
より具体的には、メダカ（Oryzias latipes）由来のエストロジェン受容体（ｍＥＲ）アルファのリガンド結合に関与する領域を用いることができる。ｍＥＲのリガンド結合領域としては、アミノ酸配列の第２８２番目から第６２０番目までの領域、あるいは、第３０１番目から第５８２番目までの領域を好適に使用することができる（図６参照）。ｍＥＲのリガンド結合領域を本発明の組換え転写因子に使用することで、環境汚染等で問題となる各種の内分泌攪乱化学物質、例えば、環境ホルモン類の一種である工業化学品の４‐ｔ‐オクチルフェノール（ＯＰ）や４‐ノニルフェノール（ＮＰ）等のアルキルフェノール類およびビスフェノールＡなどの内分泌攪乱化学物質を高感度でモニタリングすることができる。換言すれば、ｍＥＲに対して、リガンドとして高い親和性で結合する物質を高感度でモニタリングすることができる。
【００３７】
また、メダカのほかに、ゼブラフィッシュ、コイ、トーチなど、他の魚類のエストロジェン受容体のリガンド結合領域を使用した場合にも、内分泌攪乱化学物質を良好にモニタリングできると考えられる。
【００３８】
転写活性化領域としては、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質の遺伝子転写に関与する領域（ＶＰ１６）、アリルハイドロカーボンレセプターの転写活性化領域、エストロジェンレセプターの転写活性化領域などを用いることができる。例えば、ＶＰ１６は全長４９０アミノ酸からなるが、そのうち７８アミノ酸を転写活性化領域の最小単位として使用することができる（図８（ｂ）下線部）。
【００３９】
第一構築物では、プロモーターの下流に、５’側から、（１）ＤＮＡ結合領域、（２）リガンド結合領域、（３）転写活性化領域、の順番に各領域をコードするＤＮＡが配置され、あるいは、５’側から、（１）ＤＮＡ結合領域、（２）転写活性化領域、（３）リガンド結合領域、の順番に各領域をコードするＤＮＡが配置され、最後にターミネーターが配置される。このような第一構築物の配置上の相違に応じて、本発明の組換え転写因子の構造も互いに異なるものとなる（図１参照）。
【００４０】
ターミネーターとしては、植物用発現ベクターで使用される公知のもの、例えば、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ ｐｏｌｙＡ付加配列、エンドウｒｂｃＳ ３Ａ ｐｏｌｙＡ付加配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどを用いることができる。
【００４１】
また、第一構築物では、核移行シグナル（ＮＬＳ）コード配列、例えば、タンパク質を核内へ移行させるためのアミノ酸配列「ＰＫＫＫＲＫＶ」をコードする配列をリガンド結合領域の上流に、すなわち、ＤＮＡ結合領域、これに続いて核移行シグナル→リガンド結合領域→転写活性化領域（図１参照）、あるいは、転写活性化領域→核移行シグナル→リガンド結合領域の順番に、各領域をコードするＤＮＡを配置することが好ましい。
【００４２】
第二構築物は、リガンドとなる内分泌攪乱化学物質と、第一構築物の発現によって生産される転写因子との複合体によって、転写が開始されるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ配列である。具体的には、第一構築物の翻訳産物（発現産物）であるＤＮＡ結合領域と特異的に結合し、転写活性化領域によってその支配下にある遺伝子を転写させるプロモーター配列と、この下流に配置されたレポーター遺伝子とを含むＤＮＡ配列である。
【００４３】
上記プロモーター配列としては、ＤＮＡ結合領域と特異的に結合し、転写活性化領域によってその支配下にある遺伝子を転写させるプロモーターであれば特に制限はなく、当業者に知られた組み合わせを適宜選択して使用できる。例えば、ＤＮＡ結合領域がＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合領域の場合には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター−４６領域にＬｅｘＡオペレーター配列（ＣＴＧＴＡ及びＴＡＣＡＧを最小単位として）を８個連結したプロモーター配列（８×ＯLexA−４６）の組み合わせを用いることができる。また、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域とＧＡＬ４標的配列、アリルハイドロカーボン受容体のＤＮＡ結合領域と薬物応答エレメント（ＸＲＥ）、エストロジェン受容体のＤＮＡ結合領域とエストロジェン応答エレメント（ＥＲＥ）などの組み合わせを用いることができる。
【００４４】
レポーター遺伝子としては、その転写・発現を検出できるものであれば特に制限はなく、例えば、ＧＦＰ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、チトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７５ＡやＣＹＰ７５Ｂ遺伝子などを使用することができる。そして、レポーター遺伝子の発現による蛍光、染色、発光、花色などの変化の検出、あるいは、レポーター遺伝子のｍＲＮＡの定量、タンパク質の検出などによりレポーター遺伝子の転写・発現を評価することによって、対象とする内分泌攪乱化学物質をモニタリングすることができる。
【００４５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは前記第一構築物および第二構築物を同一ＤＮＡ分子内に含むものであるが、植物細胞内で第一構築物の翻訳産物が第二構築物と上述のように協働し、レポーター遺伝子を転写・発現させることができる限りにおいて、本発明の発現ベクターを独立した複数のベクターによって構成してもよい。
【００４６】
また、本発明の発現ベクターは、プロモーター配列とその下流に配置されて当該配列の支配下で転写される薬剤耐性遺伝子などの選抜マーカーの遺伝子を含む第三構築物を、前記第一構築物および／又は第二構築物と同一ＤＮＡ分子内に含むものであってもよい。例えば、選抜マーカー遺伝子としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流に抗生物質ハイグロマイシンに耐性を付与する遺伝子およびノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを持つＨＰＴ ｕｎｉｔ、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターの下流に抗生物質カナマイシンに耐性を付与する遺伝子およびノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを持つＮＰＴ II ｕｎｉｔなどを用いることができる（図２・３参照）。また、ビアラフォス耐性遺伝子、フォスフィノスリシンアセチル基転移酵素遺伝子などを用いることができる。
【００４７】
本発明の発現ベクターに、バクテリオファージＰ１由来の遺伝子組換え酵素Ｃｒｅ（Ｃｒｅレコンビナーゼ）遺伝子配列およびｌｏｘＰ配列を適切に配置し、リガンド存在下で遺伝子組換え酵素Ｃｒｅを発現させ、ｌｏｘＰ部位を特異的に認識して切断することによってレポーター遺伝子を恒常的に発現させるようにしてもよい（図１０参照）。その際、カナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が特異的に切断されるように各配列を配置すれば、誘導後、マーカーフリーの形質転換植物とすることができる（図２・３参照）。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡおよび発現ベクターの塩基配列について、常法に従って１個または数個の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加させ、改変蛋白を発現させるようにしてもよい。このような改変およびそれによって得られた物は、当然に本発明の技術的範囲に属するものと解釈されるべきである。
【００４９】
［２］本発明の形質転換植物の生産方法と同植物を用いたモニタリング方法
生産方法（形質転換方法）
本発明のモニタリング用植物は、上記発現ベクターにより形質転換することによって生産することができる。形質転換方法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法などを使用することができる。アグロバクテリウム法を使用する場合、例えば、土壌微生物であるアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に、エレクトロポレーション法により発現ベクター（発現プラスミド等）を導入する。導入の成否は、アガロースゲル電気泳動等により発現ベクターの一部を検出することで確認できる。次に、発現ベクターを保有するアグロバクテリウムを、植物体、植物片（葉、根、茎など）、カルス、もしくは、培養植物細胞などに感染させ、その後、抗生物質を添加した培地において、培養、選抜を経て植物体へ再分化させることにより、本発明の組換え植物を生産する。
【００５０】
対象植物
本発明の形質転換植物の種類に特に制限はなく、双子葉植物であっても、単子葉植物であってもよいが、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、ペチュニアなどの植物を好適に使用することができる。
【００５１】
なお、本発明における「植物」の範疇には、植物個体のほか、根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官、各種組織、植物細胞などが含まれ、さらにはプロトプラスト、誘導カルス、再生個体およびその子孫、なども含まれるものとする。
【００５２】
モニタリング方法
本発明のモニタリング用植物は、土壌中、廃水中など環境中における内分泌攪乱化学物質による汚染可能性がある地域に通常の栽培方法で例えば数週間栽培後、導入したレポーター遺伝子に応じて、蛍光、染色、発光、花色などの変化の検出、あるいは、レポーター遺伝子のｍＲＮＡの定量、タンパク質の検出などを行うことによってモニタリングする。本発明の組換え植物は、このように、環境中の内分泌攪乱化学物質による汚染の程度を検出するためのバイオセンサーとして利用可能である。
【００５３】
例えば、本発明の組換え植物は、環境を汚染しているアルキルフェノール類を汚染現場でモニタリングするために使用することができる。後述の実施例に示すように、本発明の実施例に係る組換え植物は０．０１ｐｐｂレベルのアルキルフェノール類を検出することができ、また、従来のヒトＥＲを用いた組換え植物では１００ｐｐｂが検出限界であったが、本発明の実施例に係るｍＥＲを用いた組換え植物は、約１０，０００倍の感度の向上を達成した。
【実施例】
【００５４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
なお、配列表の各配列番号は、以下の配列を表す。
［配列番号１］  ｍＥＲのリガンド結合領域（２８２−６２０番目のアミノ酸）を有する新規組換え転写因子ＸＶｍＥをコードする遺伝子（ＤＮＡ）構築のために使用したフォワードプライマー配列。
［配列番号２］  組換え転写因子ＸＶｍＥをコードする遺伝子（ＤＮＡ）構築のために使用したリバースプライマー配列。
［配列番号３］  ｍＥＲのリガンド結合領域（３０１−５８２番目のアミノ酸）を有する新規組換え転写因子ＸｍＥＶをコードする遺伝子（ＤＮＡ）構築のために使用したフォワードプライマー配列。
［配列番号４］  組換え転写因子ＸｍＥＶをコードする遺伝子（ＤＮＡ）構築のために使用したリバースプライマー配列。
［配列番号５］  ｍＥＲをコードするｃＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列。
［配列番号６］  ｍＥＲのアミノ酸配列。
［配列番号７］  組換え転写因子ＸｍＥＶが有する核移行シグナル（ＮＬＳ）のアミノ酸配列。
［配列番号８］  大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列。
［配列番号９］  大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のアミノ酸配列。
［配列番号１０］  ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列およびそのアミノ酸配列。
［配列番号１１］  ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質のアミノ酸配列。
［配列番号１２］  バクテリオファージＰ１由来のｌｏｘＰ配列。
［配列番号１３］  組換え転写因子ＸＶｍＥをコードする塩基配列およびそのアミノ酸配列。
［配列番号１４］  組換え転写因子ＸＶｍＥのアミノ酸配列。
［配列番号１５］  組換え転写因子ＸｍＥＶをコードする塩基配列およびそのアミノ酸配列。
［配列番号１６］  組換え転写因子ＸｍＥＶのアミノ酸配列。
【００５５】
〔実施例１：メダカＥＲ（ｍＥＲ）遺伝子のクローニング〕
ｍＥＲの発現を誘導するため、成熟したメスのメダカ（Oryzias latipes）を１ｐｐｍの１７β−エストラジオール（溶媒として０．１％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を使用）を含む水で１日間育てた。その後、採取したメダカを液体窒素により凍結し、磨砕後、セパゾール（ナカライテスク）を用いたＣＴＡＢ法により総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ処理後、ＲＴ−ＰＣＲに供することにより、ｍＥＲのリガンド結合領域をコードする２種類のｃＤＮＡを得た。
【００５６】
ＲＴ−ＰＣＲには、ThermoScript RT-PCR System（インビトロジェン）を使用した。ヒトＥＲのリガンド結合領域と対応する配列をクローニングするため、日本ＤＮＡデータバンクに登録されているメダカ属ＥＲ（ｍＥＲ）遺伝子の配列（アクセッション番号：Ｄ２８９５４）をもとに、以下のプライマーを設計した。
XVmE 5’：5’-GTCGACGGTCAGGAGCATAAAACGGT-3’（配列番号１）
XVmE 3’：5’-GTCGACCTAGTCTTGAAGGGCCGGGGTGC-3’（配列番号２）
XmEV 5’：5’-CTCGAGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG-3’（配列番号３）
XmEV 3’：5’-CTCGAGGGGAGCGATTCCACCCCCGC-3’（配列番号４）
【００５７】
プライマー「XVmE 5’」「XVmE 3’」は、組換え転写因子ＸＶｍＥに用いるｍＥＲリガンド結合領域（２８２−６２０番目のアミノ酸）をコードするＤＮＡ増幅用であり、プライマー「XmEV 5’」「XmEV 3’」は、組換え転写因子ＸｍＥＶに用いるｍＥＲリガンド結合領域（３０１−５８２番目のアミノ酸）をコードするＤＮＡ増幅用である。図４に示すように、各プライマーは、ｍＥＲリガンド結合領域のコード配列のほか、制限酵素切断部位の配列を含んでいる。さらにプライマー「XmEV 5’」は、核移行シグナル（ＮＬＳ）コード配列を含んでいる。
【００５８】
上記ＲＴ−ＰＣＲによって、長さの異なる２種類のＤＮＡ配列（１０２６ｂｐ、８７９ｂｐ）を増幅させ、それぞれpT7Blue Vector（ノバジェン）に挿入した。次に、ABI PRISMTM 310（アプライドバイオシステムズ）を用いて、得られたＤＮＡ配列の確認を行い、その配列が日本ＤＮＡデータバンクに登録されているｍＥＲ遺伝子の配列と一致することを確認した（図５・６参照）。なお、図５は、ｍＥＲの全ｃＤＮＡ配列を示し、下線部は、リガンド結合領域（２８２−６２０番目のアミノ酸）をコードする部分、斜字部は、リガンド結合領域（３０１−５８２番目のアミノ酸）をコードする部分である。図６は、ｍＥＲの全アミノ酸配列、転写因子ＸＶｍＥの有するアミノ酸配列（ｍＥＲリガンド結合領域（２８２−６２０番目のアミノ酸）を含む領域）、転写因子ＸｍＥＶの有するアミノ酸配列（ｍＥＲリガンド結合領域（３０１−５８２番目のアミノ酸）を含む領域）、を比較して示したものである。
【００５９】
〔実施例２：組換え転写因子をコードする遺伝子の調製と発現ベクターの構築〕
上記方法によりクローニングしたｍＥＲリガンド結合領域のｃＤＮＡ配列を使用して、２種類の組換え転写因子（ＸＶｍＥ・ＸｍＥＶ）をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を調製した。図１に示すように、ＸＶｍＥは、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｍＥＲをこの順番に連結したもの、ＸｍＥＶは、ＬｅｘＡ−ｍＥＲ−ＶＰ１６をこの順番に連結したものである。ＸｍＥＶにおいては、核内により移行しやすくなるように、核移行シグナル（ＮＬＳ）をＬｅｘＡとｍＥＲとの間に連結している。ＮＬＳのアミノ酸配列は「ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）」とした。図１において、「ｍＥＲ」は、上記のように、ｍＥＲリガンド結合領域を表す。また、「ＬｅｘＡ」は、大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合領域（図７（ｂ）下線部）を表し、「ＶＰ１６」は、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のＶＰ１６タンパク質の転写活性化領域（図８（ｂ）下線部）を表す。以下、特に断りのない限り、同じ意味でこれらの語を使用する。
【００６０】
図１の各数字は、それぞれのタンパク質のアミノ酸番号を示し、図中のアルファベットはアミノ酸を１文字表記したものである。
【００６１】
図２・３には、これら２種類の組換え転写因子（ＸＶｍＥ・ＸｍＥＶ）をそれぞれコードする遺伝子発現ベクター（プラスミド）の調製方法、および、これらのプラスミドを使用して、本発明に係る４種類の発現ベクター（ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ、ｐＸ６−ＸＶｍＥ、ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ、ｐＸ６−ＸｍＥＶの４種類の植物発現用プラスミド）を構築する方法の概略が示される。
【００６２】
なお、図２・３において使用される各略語の意味は以下のとおりである（但し、既に説明した略語は除く）。
ＲＢ：ライトボーダー
ＬＢ：レフトボーダー
Ｐ：プロモーター配列
Ｔ１・Ｔ２・Ｔ３：ターミネーター配列
ｌｏｘ：ｌｏｘＰ配列「ATAACTTCGTATAGCATACATATACGAAGTTAT（配列番号１２）」
Pac I・Sal I・Xho I・Asc I：各制限酵素の切断部位
pXV・pXVasc・pSmES・pXVmE・pXVA・pXmEX・pmEV・pPLS・pPLSasc・pXmEV：各プラスミドの名称
ｐＥＲ８ＰＡＳ：ＧＦＰレポーター遺伝子を保有する発現ベクター。前記の非特許文献１参照。一過的な遺伝子誘導発現を引き起こす。
ｐＸ６ＰＡＳ：ＧＦＰレポーター遺伝子を保有する発現ベクター。前記の非特許文献２参照。恒常的な遺伝子誘導発現を引き起こす。
【００６３】
上記４種類の発現ベクターは、図２・３に示すように、各制限酵素の切断部位における切断・連結、およびリンカーの挿入などの各処理を経て構築した。こうして得られた４種類の発現ベクターのうち、「ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ」「ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ」は、図９に示すように、植物細胞内で一過的な遺伝子誘導発現を引き起こす。また、「ｐＸ６−ＸＶｍＥ」「ｐＸ６−ＸｍＥＶ」は、図１０に示すように、植物細胞内で恒常的な遺伝子誘導発現を引き起こす。（図９・１０においては、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６−ｍＥＲの順に連結された転写因子ＸＶｍＥを模式的に示す。図中、「ＥＤｓ」は内分泌撹乱化学物質、「ｈｓｐ９０」は熱ショックタンパク質９０を表す。）
【００６４】
〔実施例３：形質転換植物の生産〕
上記４種類の発現ベクターをそれぞれアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404）に導入し、その後、各発現ベクターを保有するアグロバクテリウムを、減圧浸潤法によりシロイヌナズナのコロンビア株（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Columbia）に感染させた。感染一ヶ月後、Ｔ1種子を収穫した。
【００６５】
植物の培養にはＭＳ培地を用い、播種後２日間、暗所において低温処理（４℃）を行った後、明所（２３℃）にて密閉環境下で培養を行った。「ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ」および「ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ」の各ベクターを用いた植物にはハイグロマイシンを４０μｇ／ｍＬ添加し、「ｐＸ６−ＸＶｍＥ」および「ｐＸ６−ＸｍＥＶ」の各ベクターを用いた植物にはカナマイシンを５０μｇ／ｍＬ、ＭＳ培地に添加した。
【００６６】
抗生物質耐性を示したＴ1植物を鉢上げし、Ｔ2種子を得た。抗生物質耐性の分離比が３：１を示す個体についてさらに鉢上げを行い、Ｔ3種子を得た。１００％の抗生物質耐性を示したＴ3植物をホモ個体とした。選抜結果を下記表２に示す。
【表２】
2006129733.tif 000004
【００６７】
表２中、形質転換植物「ＥＲ８−ＸＶｍＥ」、「ＥＲ８−ＸｍＥＶ」、「Ｘ６−ＸＶｍＥ」および「Ｘ６−ＸｍＥＶ」は、それぞれ、発現ベクター「ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ」、「ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ」、「ｐＸ６−ＸＶｍＥ」および「ｐＸ６−ＸｍＥＶ」によって形質転換されたシロイヌナズナである。
【００６８】
〔実施例４：形質転換シロイヌナズナの評価〕
上記形質転換シロイヌナズナが環境中の内分泌撹乱化学物質に応答し、そのモニタリング用植物として適しているかどうかを評価するため、次の実験を行った。
【００６９】
実験には、上記「Ｘ６−ＸｍＥＶ」形質転換植物のＴ2世代（X6-XmEV-2 plant）を使用した。すなわち、Ｔ2種子をカナマイシン含有ＭＳ培地に播種したのち１０日後に３：１検定を行い、１コピーの抗生物質耐性遺伝子を保有すると考えられる個体を４‐ｔ‐オクチルフェノール（ＯＰ）を含むＭＳ培地上に移植した。ＯＰ濃度は「０．００１」、「０．０１」、「０．１」、「１」、「１０」、「１００」、「１０００」ｐｐｂとし、溶媒としてＤＭＳＯ（終濃度０．１％）を用いた。移植後７日目に植物体を液体窒素により凍結し、磨砕後、Plant Total RNA Mini（バイオジーン）を用いて総ＲＮＡを抽出した。
【００７０】
総ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理後、ThermoScript RT-PCR Systemを用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲに用いた。ＰＣＲにおいて、レポーターであるＧＦＰおよび内部標準としてチューブリンの各遺伝子増幅を行い、ＯＰ濃度に応じて形質転換シロイヌナズナ（X6-XmEV-2 plant）におけるレポーター（ＧＦＰ）遺伝子の転写量がどのように変化するかを評価した。その結果を図１１（ａ）に示す。図中、各数字はＯＰ濃度（ｐｐｂ）を表す。「Ｄ」は培地にＯＰを含まない場合である。
【００７１】
１０００ｐｐｂの４‐ｔ‐オクチルフェノールを含むＭＳ培地上に移植した個体は数日で全て枯死したが、それ以下の濃度の場合は、図１１（ａ）に示すように、４‐ｔ−オクチルフェノールの濃度が増加するにしたがって、レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の転写量も増加した。
【００７２】
このように、本発明の形質転換植物は、４‐ｔ‐オクチルフェノール濃度依存的にレポーター遺伝子（ＧＦＰ）が転写誘導され、０．０１ｐｐｂを検出できた。これらの検出感度は、水系を汚染している４‐ｔ‐オクチルフェノールなどのアルキルフェノール類を汚染現場でモニタリングするのに十分であると考えられる。
【００７３】
対照として、非特許文献２記載のヒトＥＲを用いた形質転換植物（CLX plant with hER）についても同様の実験を行った。その結果を図１１（ｂ）に示す。このＣＬＸ植物では１００ｐｐｂが検出限界であったことから、本発明の形質転換植物は、従来のものと比較して、約１０，０００倍の感度の向上を達成した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上のように、本発明は、環境中に存在するアルキルフェノール類などの内分泌攪乱化学物質を高感度でモニタリングすることができる形質転換植物、その生産に使用するＤＮＡ、発現ベクター等を提供するものであり、例えば、水質調査、土壌汚染調査といった各種環境調査などに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係る２種類の組換え転写因子の構造を模式的に示す図である。
【図２】本発明に係る発現ベクター（ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ、ｐＸ６−ＸＶｍＥ）の構築手順を説明する図である。
【図３】本発明に係る発現ベクター（ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ、ｐＸ６−ＸｍＥＶ）の構築手順を説明する図である。
【図４】ｍＥＲリガンド結合領域をコードする遺伝子増幅用に使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す図である。
【図５】ｍＥＲの全長ｃＤＮＡ配列を示す図である。数字は塩基番号を示す。
【図６】ｍＥＲの全アミノ酸配列、転写因子ＸＶｍＥの有するｍＥＲリガンド結合領域のアミノ酸配列、転写因子ＸｍＥＶの有するｍＥＲリガンド結合領域のアミノ酸配列、を比較して示す図である。数字はアミノ酸番号を示す。
【図７】（ａ）はＬｅｘＡの全長ｃＤＮＡ配列を、（ｂ）はそのアミノ酸配列を示す図であり、下線部はＸＶｍＥおよびＸｍＥＶで用いた領域である。数字は塩基番号またはアミノ酸番号である。
【図８】（ａ）はＶＰ１６の全長ｃＤＮＡ配列を、（ｂ）はそのアミノ酸配列を示す図であり、下線部はＸＶｍＥおよびＸｍＥＶで用いた領域である。数字は塩基番号またはアミノ酸番号である。
【図９】本発明の発現ベクター（ｐＥＲ８−ＸＶｍＥ、ｐＥＲ８−ＸｍＥＶ）により形質転換された植物細胞内で、内分泌攪乱化学物質により一過的にレポーター遺伝子の転写・発現が誘導されることを説明する図である。
【図１０】本発明の発現ベクター（ｐＸ６−ＸＶｍＥ、ｐＸ６−ＸｍＥＶ）により形質転換された植物細胞内で、内分泌攪乱化学物質により恒常的にレポーター遺伝子の転写・発現が誘導されることを説明する図である。
【図１１】（ａ）は、４−ｔ−オクチルフェノール処理した形質転換シロイヌナズナ（Ｘ６−ＸｍＥＶ系統のＴ2植物）のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図であり、（ｂ）は、比較のため行った、ヒトＥＲを用いた形質転換シロイヌナズナＣＬＸの結果を示す図である。
【図１】
2006129733.tif 000005
【図２】
2006129733.tif 000006
【図３】
2006129733.tif 000007
【図４】
2006129733.tif 000008
【図５】
2006129733.tif 000009
【図６】
2006129733.tif 000010
【図７】
2006129733.tif 000011
【図８】
2006129733.tif 000012
【図９】
2006129733.tif 000013
【図１０】
2006129733.tif 000014
【図１１】
2006129733.tif 000015
【配列表】
2006129733000001.app