(57)【要約】【課題】  試料中の標的分子の特定部位を特異的に標識可能であり、使用する顕微鏡の空間分解能を損なわずに解析対象を標識及び解析することができ、該解析対象の局在、方向（向き）、形状（立体構造）、及び動態を、機能状態において解析可能とする顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブを用いた顕微鏡解析方法を提供する。【解決手段】  棒状構造を有し、該棒状構造が、顕微鏡解析対象の特定部位と接触可能な接触部を有することを特徴とする顕微鏡解析用プローブである。前記顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析方法である。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
棒状構造を有し、該棒状構造が、顕微鏡解析対象の特定部位と接触可能な接触部を有することを特徴とする顕微鏡解析用プローブ。
【請求項２】
接触部が、棒状構造の一端に配置され、前記棒状構造の他端には標識部が配置されてなる請求項１に記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項３】
少なくとも棒状構造が、タンパク質からなる請求項１から２のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項４】
棒状構造が、逆平行型コイルドコイル構造のタンパク質である請求項３に記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項５】
単一分子の組換え融合タンパク質からなる請求項３から４のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項６】
接触部が、顕微鏡解析対象の特定部位と相互作用可能な物質からなる請求項１から５のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項７】
相互作用が、抗原抗体反応である請求項６に記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項８】
接触部が、顕微鏡解析対象の特定部位と結合した状態で構成される請求項１から５のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項９】
顕微鏡解析対象と一体に発現されてなる請求項８に記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項１０】
急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、樹脂包埋切片法、及び氷包埋法から選択される少なくともいずれかによる顕微鏡解析用試料の調製に用いられる請求項１から９のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項１１】
蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び原子間力顕微鏡から選択される少なくともいずれかによる解析に用いられる請求項１から１０のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブ。
【請求項１２】
請求項３から１１のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブをコードする遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析用プローブ発現ベクター。
【請求項１３】
顕微鏡解析対象を発現する細胞に導入されて使用される請求項１２に記載の顕微鏡解析用プローブ発現ベクター。
【請求項１４】
請求項９から１１のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブを発現するベクターであって、顕微鏡解析対象の特定部位及び前記顕微鏡解析用プローブをコードする遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析用プローブ発現ベクター。
【請求項１５】
顕微鏡解析対象をコードする遺伝子が欠失したノックアウト細胞に導入されて使用される請求項１４に記載の顕微鏡解析用プローブ発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析方法。
【請求項１７】
（ベクター使用）
請求項１２から１５のいずれかに記載の顕微鏡解析用ベクターを発現させる工程と、該顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析方法。
【請求項１８】
顕微鏡解析用試料を、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、樹脂包埋切片法、及び氷包埋法から選択される少なくともいずれかにより作製する請求項１６から１７のいずれかに記載の顕微鏡解析方法。
【請求項１９】
顕微鏡解析が、蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び原子間力顕微鏡から選択される少なくともいずれかを用いて行われる請求項１６から１８のいずれかに記載の顕微鏡解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析に使用する顕微鏡の空間分解能を最高に保持可能な顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブを用いた顕微鏡解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の生体高分子の構造を解析する方法としては、例えば、Ｘ線結晶回折法や多次元ＮＭＲ法等を用いるのが一般的である。
しかしながら、前記Ｘ線結晶回折法は、構造解析の対象となる分子が結晶化していることが必要であるため、結晶化条件の探索をおこない、良質のタンパク質結晶を得る必要がある。また、前記多次元ＮＭＲ法は、構造解析の対象となる分子の分子量に制限があり、解析のために高純度で溶解度の高い可溶性試料を大量に得る必要がある。
さらに、これらの方法で決定される構造はいずれも、膨大な数の均一な分子の構造を時間的・空間的に平均化したものであるため、機能に伴いさまざまに変化する個々の分子の瞬時の構造や、複合体に組み込まれた際の構造等を解析することには適していない。
【０００３】
一方、個々の分子の実像を撮影する方法として、電子顕微鏡による直接観察法が知られている。例えば、タンパク質複合体を構造解析の対象とする場合、該タンパク質複合体を含む細胞や組織を、急速凍結と氷包埋した標本を電子顕微鏡で観察し、得られた画像を適切に組分け及び平均化した後、適当な方法で傾斜角度を推定し、画像を再構成する単粒子解析法が用いられている。
【０００４】
しかしながら、大部分が水と軽元素で構成される生体試料は、背景との間のコントラストが低く、標的分子の像を得るには焦点を外さざるを得ず、生体試料自体が電子線照射に対して極めて弱いため、標的分子を多数の方向から複数回撮影することは困難であるという問題がある。また、Ｓ／Ｎ比が低いため、多数の画像を平均化することが必須となるため、精製された均一な試料を用いた場合であっても、活性化状態等により個々の分子の構造が著しく相違する場合には、精密な構造解析が不可能となるという問題がある。
【０００５】
これらの問題に対し、ｉｎ  ｓｉｔｕの細胞内におけるタンパク質の構造解析方法として、急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法が提案されている。前記急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法は、急速凍結した生体試料の表面を軽く掻き取り、対象構造物周囲の水分子を昇華（エッチング）させた後、重金属による蒸着、及びカーボンによるコーティングを行い、前記生体試料部分を溶解させて得られたレプリカを電子顕微鏡により観察する方法である。
【０００６】
前記急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法においては、生体試料を急速凍結することにより、生命現象の現場において構造を変えて機能するタンパク質を１ミリ秒以内に物理固定することが可能である。また、試料のコントラストが高いため、個々のタンパク質分子の形状が明瞭に観察でき、その構造を直接解析できることに加え、得られる像の空間分解能も高い。さらに、試料が重金属及びカーボンのみからなるため、電子線照射にも強く、多数の傾斜画像を撮影し、適切な画像処理装置等を用いて画像処理を適用することにより（例えば、特許文献１〜３参照）、解析対象のタンパク質の３次元構造を正確に再構成することが可能である。
【０００７】
ところで、ｉｎ  ｓｉｔｕの細胞内におけるタンパク質の解析においては、溶液中の精製したタンパク質を観察対象の標的分子とする場合とは異なり、その局在位置や形状の推定が困難である。標的分子であるタンパク質の細胞内における局在位置を特定するためには、該分子を特異的に認識し相互作用可能な標識を用いて直接標識する手段が必要である。
従来の標識方法としては、例えば、抗体等を表面に吸着した球状の重金属コロイド粒子を用いる方法が知られている。このような標識を用いた場合、通常、重金属粒子径が標的分子よりも大きいため、標的分子と重金属粒子の画像とが重複し、前記標的分子の構造や詳細な局在を解析することができないという問題がある。使用する顕微鏡等の空間分解能を損なわずに解析するためには、粒子径を小さくする必要があるが、粒子径を小さくすることにより、検出が著しく困難となるという問題がある。
また、レプリカ試料においては、白金等の重金属を用いてコントラストを付与しているため、標識として用いた微小な重金属粒子を認識することは、極めて困難であるという問題がある。
【０００８】
このように、使用する顕微鏡の空間分解能を損なわずに解析対象を標識及び解析することができ、該解析対象の局在、方向（向き）、形状、及び動態を、機能状態において解析可能とする顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブを用いた顕微鏡解析方法は、未だ提供されていないのが現状である。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／４８９６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０２／０５６２５９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０２／０７５６５８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明は、使用する顕微鏡の空間分解能を損なわずに解析対象を標識及び解析することができ、該解析対象の局在、方向（向き）、形状（立体構造）、及び動態を、機能状態において解析可能とする顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブを用いた顕微鏡解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  棒状構造を有し、該棒状構造が、顕微鏡解析対象の特定部位と接触可能な接触部を有することを特徴とする顕微鏡解析用プローブである。該＜１＞に記載の顕微鏡解析用プローブにおいては、棒状構造を有し、該棒状構造が、顕微鏡解析対象の特定部位と接触可能な接触部を有してなるため、前記棒状構造を視認し、該棒状構造を辿るように追跡することにより、前記接触部を特定し、前記顕微鏡解析対象の特定部位を解析することができる。また、前記棒状構造の径を極めて細くすることにより、従来の金コロイド粒子等のマーカーとは異なり、前記顕微鏡解析対象を遮蔽することなく、すなわち前記顕微鏡の空間分解能を損なうことなく解析することができる。
＜２＞  接触部が、棒状構造の一端に配置され、前記棒状構造の他端には標識部が配置されてなる前記＜１＞に記載の顕微鏡解析用プローブである。該＜２＞に記載の顕微鏡解析用プローブにおいては、前記接触部が、前記棒状構造の一端に配置され、前記棒状構造の他端には前記標識部が配置されてなるため、視認性が高められ、前記顕微鏡解析用プローブを容易に検出することができる。
＜３＞  棒状構造の端部が分岐し、接触部及び標識部の少なくともいずれかを２以上有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜４＞  棒状構造が、タンパク質、繊維状ファージ、金属、半導体、カーボンナノホーン、カーボンナノチューブ、及びアミロースから選択される少なくともいずれかからなる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜５＞  標識部が、蛍光物質、色素、重金属化合物、及び重金属コロイドから選択される少なくともいずれかからなる前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
【００１２】
＜６＞  少なくとも棒状構造が、タンパク質からなる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜７＞  棒状構造が、逆平行型コイルドコイル構造のタンパク質である前記＜６＞に記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜８＞  単一分子の組換え融合タンパク質からなる前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
【００１３】
＜９＞  接触部が、顕微鏡解析対象の特定部位と相互作用可能な物質からなる前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜１０＞  相互作用が、抗原抗体反応である前記＜９＞に記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜１１＞  接触部が、顕微鏡解析対象の特定部位と結合した状態で構成される前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜１２＞  顕微鏡解析対象と一体に発現されてなる前記＜１１＞に記載の顕微鏡解析用プローブである。
【００１４】
＜１３＞  急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、樹脂包埋切片法、及び氷包埋法から選択される少なくともいずれかによる顕微鏡解析用試料の調製に用いられる前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
＜１４＞  蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び原子間力顕微鏡から選択される少なくともいずれかによる解析に用いられる前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブである。
【００１５】
＜１５＞  前記＜６＞から＜１４＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブをコードする遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析用プローブ発現ベクターである。
＜１６＞  顕微鏡解析対象を発現する細胞に導入されて使用される前記＜１５＞に記載の顕微鏡解析用プローブ発現ベクターである。
＜１７＞  前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブを発現するベクターであって、顕微鏡解析対象の特定部位及び前記顕微鏡解析用プローブをコードする遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析用プローブ発現ベクターである。
＜１８＞  顕微鏡解析対象をコードする遺伝子が欠失したノックアウト細胞に導入されて使用される前記＜１８＞に記載の顕微鏡解析用プローブ発現ベクターである。
【００１６】
＜１９＞  前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析方法である。
＜２０＞  前記＜１５＞から＜１８＞のいずれかに記載の顕微鏡解析用ベクターを発現させる工程と、該顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする顕微鏡解析方法である。
＜２１＞  顕微鏡解析用試料を、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、及び氷包埋法から選択されるいずれかにより作製する前記＜１９＞から＜２０＞のいずれかに記載の顕微鏡解析方法。該＜２１＞に記載の顕微鏡解析方法においては、前記顕微鏡解析用試料が、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、樹脂包埋切片法、及び氷包埋法から選択される少なくともいずれかにより作製される。この結果、例えば、該顕微鏡解析用試料を用い、多数の傾斜画像を撮影し、適切な画像処理装置等を用いて画像処理を適用することによりタンパク質の３次元構造が正確に再構成される。
＜２２＞  顕微鏡解析が、蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び原子間力顕微鏡から選択される少なくともいずれかを用いて行われる前記＜１９＞から＜２１＞のいずれかに記載の顕微鏡解析方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、使用する顕微鏡の空間分解能を損なわずに解析対象を標識及び解析することができ、該解析対象の局在、方向（向き）、形状（立体構造）、及び動態を、機能状態において解析可能な顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブを用いた顕微鏡解析方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（顕微鏡解析用プローブ）
本発明の顕微鏡解析用プローブは、棒状構造を有し、該棒状構造が、顕微鏡解析対象の特定部位と接触可能な接触部を有してなり、更に必要に応じて、視認性をより向上させるための標識部等を有してなる。
前記棒状構造は、一般的なタンパク質分子や細胞内小器官の形状に対して奇異な形状であるため、顕微鏡解析対象が溶液中の精製分子や、細胞・組織などの生体試料のいずれであっても、該対象中において容易に視認され検出される。
【００１９】
前記顕微鏡解析用プローブの構造としては、少なくとも前記棒状構造を辿ることにより、前記接触部を特定可能な構造である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記接触部が前記棒状構造の端部にあることにより、前記接触部と前記棒状構造との接合領域の顕微鏡下における視認性が高められていることが好ましい。該視認性は、細い先端を有する限り、構造を構成する分子の長さや太さ、若しくは微細な形状を変える等の方法により高められてもよい。更に、前記接触部の径が前記棒状構造中において最も細いことがより好ましい。なお、前記棒状構造は、直線状、及び曲線状のいずれであってもよい。
【００２０】
また、前記棒状構造の一端に前記接触部を有し、他端に標識部を有する構造とすることが好ましい。このような構造であることにより、前記棒状構造がより容易に検出され、かつ確実に視認される。
さらに、前記顕微鏡解析用プローブは、前記棒状構造の端部が分岐し、前記接触部及び前記標識部の少なくともいずれかを２以上有する構造であることが好ましい。このような構造とすることにより、解析対象の標識及び検出がさらに容易となる。
【００２１】
前記顕微鏡解析対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質、及び半導体、金属等の無機材料が挙げられるが、これらの中でもタンパク質が好ましい。
前記解析対象のタンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞・組織などの生きた状態の組織中のタンパク質、精製した細胞内小器官分散液中のタンパク質、溶液中のタンパク質等が挙げられる。
【００２２】
前記顕微鏡解析対象の態様としては、（１）前記顕微鏡解析用プローブの接触部との相互作用により検出される外部の検出対象である第一の態様、及び（２）前記顕微鏡解析用プローブと一体である第二の態様が挙げられる。
【００２３】
前記顕微鏡としては、前記顕微鏡解析対象の特定部位における前記標的分子の解析が可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザ走査顕微鏡等の光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡等の走査型プローブ顕微鏡等が挙げられ、これらの中でも、蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、及び原子間力顕微鏡が好適に挙げられる。
【００２４】
−棒状構造−
前記棒状構造としては、解析に使用する顕微鏡の空間分解能を損なわない大きさであって、前記顕微鏡解析対象の局在位置や方向（向き）を指し示すことが可能な形状である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、その径がその長さよりも小さい構造であることが好ましい。
前記棒状構造の長さとしては、一般には例えば、１５ｎｍ以上であることが好ましく、２０ｎｍ以上であることが好ましい。長さが１５ｎｍ未満であると、棒状構造自体が視認されないことがある。ただし、顕微鏡解析対象がさらに微小な場合には、より小さな構造が適している。
また、前記棒状構造における前記接触部の径としては、例えば、５ｎｍ以下であることが好ましく、３ｎｍ以下であることが好ましい。径が５ｎｍを超えると、前記接合部を含む前記顕微鏡解析対象の特定部位を広く覆うこととなり、その局在、や方向（向き）を特定できないことがある。
【００２５】
前記棒状構造の材質としては、有機分子及び無機分子のいずれであってもよく、例えば、タンパク質、繊維状ファージ、金属、半導体、カーボンナノホーン、カーボンナノチューブ、アミロースなどが挙げられ、これらの中でもタンパク質、及び繊維状ファージが好ましく、タンパク質がより好ましい。
【００２６】
前記棒状構造の材質としてのタンパク質としては、いわゆる棒状タンパク質（繊維状タンパク質）が好ましく、具体的には、逆平行型コイルドコイル構造のタンパク質がより好ましい。
このようなタンパク質としては、例えば、モータータンパク質のダイニン（Ｄｙｎｅｉｎ）を構成するストーク（Ｓｔａｌｋ、又はＢ−ｌｉｎｋ）部位の逆平行コイルドコイル領域が特に好適に挙げられる。
【００２７】
前記棒状構造の材質としての繊維状ファージとしては、例えば、短くなるように遺伝子操作を加えたｆ１ファージ、ｆｄファージ、Ｍ１３ファージなどが挙げられ、これらの中でも、視認性及び識別性に優れた形状であるという観点から、遺伝子操作を加えたｆｄファージが好ましい。
【００２８】
−接触部−
前記接触部としては、前記顕微鏡解析対象の態様に応じ、適宜選択される。
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブの接触部との相互作用により検出される外部の検出対象である場合、前記接触部としては、前記顕微鏡解析対象の特定部位と相互作用可能な物質からなり、前記顕微鏡解析対象の前記特定部位との相互作用領域（接触領域）である第一の態様であることが好ましい。
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体である場合、前記接触部としては、前記顕微鏡解析対象の特定部位と結合した状態で構成され、前記顕微鏡解析対象の前記特定部位と結合した状態の結合端（接触端）である第二の態様であることが好ましい。
【００２９】
（１）第一の態様
前記接触部の第一の態様とは、前記顕微鏡解析対象の前記特定部位との相互作用領域（接触領域）の態様である。
本発明において、前記顕微鏡解析対象の前記特定部位と、前記接触部との「相互作用」とは、親和的かつ部位特異的な相互作用を表し、例えば、接着、結合、吸着、融合等が挙げられ、具体的には、抗原抗体反応が好ましい。
この場合、前記接触部としては、前記外部の検出対象と抗原抗体反応可能なタンパク質からなることが好ましい。なお、遺伝子工学的に合成してなるタンパク質を前記顕微鏡解析対象として、該顕微鏡解析対象と抗原抗体反応可能なタンパク質を探索し、これを前記接触部としてもよい。
【００３０】
前記接触部を構成する物質としては、例えば、前記顕微鏡解析対象の特定部位に対する抗原、抗体結合部位、レクチン、ビオチン、ヌクレオチド等の天然リガンド、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ、酵素、医薬組成物、試薬などが挙げられるが、これらの中でもリガンド、及びタグが好ましい。
【００３１】
前記抗原抗体反応可能なタンパク質の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、アレルゲン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、ホルモンレセプター、蛋白質、血液蛋白質、組織細胞、細胞破砕物、核物質、ウイルス、ウイルス粒子、各種代謝産物、神経伝達物質、ハプテン、薬物、核酸、微生物、寄生虫、細菌、ビオチン、アビジン、レクチン、糖、生理活性物質、生理活性物質受容体、環境物質、化学種又はこれらの誘導体等と、これらの分子のリガンドを認識する分子との組合せが挙げられ、具体的には、血漿蛋白、腫瘍マーカー、アポ蛋白、ウイルス抗原、自己抗体、凝固・線溶因子、ホルモン、血中薬物、及びＨＬＡ抗原等と、これらの分子のリガンドを認識する分子との組合せや、アクチンとミオシンのように、特異的相互作用が知られているタンパク質の組合せを選択することができる。
【００３２】
前記血漿蛋白としては、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、補体成分（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５，Ｃ１ｑ）、ＣＲＰ、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、β２−マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、及びフェリチンなどが挙げられる。
【００３３】
前記腫瘍マーカーとしては、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、γ−セミノプロテイン、ＴＰＡ、エラスターゼＩ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、及び免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）などが挙げられる。
【００３４】
前記アポ蛋白としては、例えば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＢ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、及びアポＥなどが挙げられる。
【００３５】
前記ウイルス抗原としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＶＣ）関連抗原、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、及び風疹ウイルスなどが挙げられる。
前記ＨＣＶ関連抗原としては、例えば、ＨＣＶｃ１００−３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原、及びｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原などが挙げられ、それらの混合物が好ましく使用できる。前記ＨＩＶ関連抗原としては、ウイルス表面抗原などが挙げられ、例えば、ＨＩＶ−Ｉ  ｅｎｖ．ｇｐ４１リコビナント抗原、ＨＩＶ−Ｉ
ｅｎｖ．ｇｐ１２０リコビナント抗原、ＨＩＶ−Ｉ  ｇａｇ．ｐ２４リコビナント抗原、及びＨＩＶ−ＩＩ  ｅｎｖ．ｐ３６リコビナント抗原などが挙げられる。
また、ウイルス以外の抗原としては、ＭＲＳＡ、ＡＳＯ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、及びＳＴＤなどが挙げられる。
【００３６】
前記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、及びミエリン抗体などが挙げられる。
【００３７】
前記凝固・線溶因子としては、例えば、フィブリノゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プラスミノゲン、α２−プラスミンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、第ＶＩＩＩ因子、プロテインＣ、及びプロテインＳなどが挙げられる。
【００３８】
前記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ、プロラクチン）、甲状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン）、及びその他（レニン、アンジオテンシンＩ，ＩＩ、エンケファリン、エリスロポエチン）などが挙げられる。
【００３９】
前記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質などが挙げられる。
【００４０】
前記抗原抗体反応可能なタンパク質としては、例えば、前記顕微鏡解析対象の特定部位に対する特異的一本鎖抗体、及び該抗体の一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｖ）等が好適に挙げられる。
前記顕微鏡解析対象を、予め任意の部位に外来ペプチド等（ＦＬＡＧタグ等）を挿入した組換えタンパク質とすることにより、前記接触部としては、該顕微鏡解析対象の外来ペプチドに対する抗タグ一本鎖抗体、及び該抗体の一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）等を用いることもできる。
前記ｓｃＦｖは、ファージディスプレイによるバイオパンニング法等の方法により作製することができる。
【００４１】
前記接触部の調製方法としては、例えば、前記接触部を構成する物質のみを調製した後、別途調製された前記棒状構造の端部に化学反応等により付加されてもよく、前記接触部及び前記棒状構造がともにタンパク質である場合、単一分子のタンパク質としてアミノ酸合成されてもよく、前記接触部及び前記棒状構造をコードする遺伝子配列からなるベクターを用いて、単一分子の組換え融合タンパク質として合成されてもよい。
なお、前記単一分子の組換え融合タンパク質として合成する方法については、後に詳しく説明する。
【００４２】
前記接触部を構成する物質のみを調製した後、別途調製された前記棒状構造の端部に化学反応等により付加する方法としては、例えば、ペプチド法、ジアゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリド法、生化学的特異結合法などが挙げられるが、共有結合などのより安定した結合には、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して方法が好ましく、化学的結合剤・架橋剤などを使用する方法がより好ましい。
【００４３】
このような化学的結合剤・架橋剤としては、例えば、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物、ピリジルジスルフィド化合物などが挙げられる。これらの中でも、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
【００４４】
（２）第二の態様
前記接触部の第二の態様とは、前記顕微鏡解析対象の前記特定部位と結合した状態の結合端（接触端）の態様である。
この場合、前記接触部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、タンパク質からなることが好ましく、前記顕微鏡解析対象と前記顕微鏡解析用プローブとの単一分子の組換え融合タンパク質の一部であることがより好ましい。
なお、前記単一分子の組換え融合タンパク質として合成する方法については、後に詳しく説明する。
【００４５】
−標識部−
前記標識部は、前記棒状構造の前記接触部を有する一の端部に対し、その他端にあることが好ましい。
【００４６】
前記標識部を構成する物質としては、顕微鏡で検出可能な物質からなる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質、色素、重金属化合物、重金属コロイド、酸化還元酵素などが挙げられる。
【００４７】
前記顕微鏡として実体顕微鏡、及び電子顕微鏡を用いる場合、前記標識部を構成する物質としては、蛍光物質が好ましく、蛍光タンパク質がより好ましい。また、前記標識部にビオチンを用い、さらに蛍光標識されたビオチンとアビジンとの複合体、及び蛍光標識されたストレプトアビジン、現像増感剤等を用いて前記顕微鏡解析用プローブの視認性を向上させてもよい。
【００４８】
前記蛍光物質としては、蛍光を有する限り特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列などが挙げられ、具体的には、フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ジアシル(イソブチリル、アセチルまたはピバロイルなど)フルオレセイン−５及び／又は６−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル、６−(ジアシル−５及び／又は６−カルボキサミド−フルオレセイン)アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル、テキサス・レッド(Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．の商標)、テトラメチルローダミン−５(及び６)イソチオシアネート、エオシン−イソチオシアネート、エリトロシン−５−イソチオシアネート、４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール、４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール、３−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)メチルアミノプロピオニトリル、６−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)アミノヘキサン酸、スクシンイミジル１２−(Ｎ−メチル−Ｎ−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)アミノドデカノエート、７−ジエチルアミノ−３−(４'−イソチオシアナトフェニル)−４−メチルクマリン(ＣＰ)、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸、７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸、スクシンイミジル７−ジメチルアミノクマリン−４−アセテート、７−メトキシクマリン−４−酢酸、４-アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２,２'−ジスルホン酸(ＳＩＴＳ)、９−クロロアクリジン、スクシンイミジル３−(９−カルバゾール)プロピオネート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンノナノエート、p-ニトロフェニル１−ピレンブチレート、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジルアントラセン−９−プロピオネート、２−アントラセンスルホニルクロリド、などが挙げられる。
【００４９】
前記蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（Green  Fluorescence  Protein：ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（Enhanced  Green  Fluorescence  Protein：ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow  Fluorescence  Protein：ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan  Fluorescence  Protein：ＣＦＰ）強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue  Fluorescence  Protein：ＢＦＰ）、及び強化青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）などが挙げられ、これらの中でも強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が好ましい。
【００５０】
ここで、前記標識部が蛍光物質からなる場合、前記蛍光物質の励起波長又は発光波長と重複のある他の蛍光物質を付加した前記顕微鏡解析用プローブを用いることにより、前記検出対象の標識された分子間の蛍光エネルギー移動、及び距離の変化を測定することにより、前記その構造変化を解析することができ、また、蛍光顕微鏡を用いて蛍光の偏光を検出することにより、標識の向きを直接解析することができる。
【００５１】
一方、前記顕微鏡として原子間力顕微鏡を用いる場合、前記標識部を構成する物質としては、前記標的分子の位置を示すマーカーとして機能する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
前記標識部を前記棒状構造の端部に結合する方法としては、例えば、前記標識部を構成する物質のみを調製した後、別途調製された前記棒状構造の端部に化学反応等により付加する方法、前記標識部及び前記棒状構造がともにタンパク質である場合、単一分子のタンパク質としてアミノ酸合成する方法、前記標識部及び前記棒状構造をコードする遺伝子配列からなるベクターを用いて、単一分子の組換え融合タンパク質として合成する方法などが挙げられる。
前記標識部を構成する物質のみを調製した後、別途調製された前記棒状構造の端部に化学反応等により付加する方法としては、例えば、共有結合、イオン結合などの結合を形成できる反応性置換基を被蛍光物質の骨格内に導入し、これらの結合を利用して導入する方法、などが挙げられる。
なお、前記単一分子の組換え融合タンパク質として合成する方法については、後に詳しく説明する。
【００５３】
＜顕微鏡解析用プローブの使用方法＞
前記顕微鏡解析対象が、前記接触部との相互作用により検出される外部の検出対象である前記第一の態様である場合、前記顕微鏡解析用プローブの使用方法としては、前記解析対象に対して前記顕微鏡解析用プローブを投与し、前記特定部位中と相互作用させる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予め調製した前記顕微鏡解析用プローブを、前記顕微鏡解析対象を解析可能な形態に処理した試料に投与して使用する方法、予め調製した前記顕微鏡解析用プローブを、未処理の前記顕微鏡解析対象に投与して使用する方法、及び前記顕微鏡解析用プローブをコードする配列を含む発現ベクターを、前記顕微鏡解析対象を発現する細胞に導入し、該細胞において発現させた前記顕微鏡解析用プローブを使用する方法等が挙げられる。
【００５４】
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体である前記第二の態様である場合、前記顕微鏡解析用プローブの使用方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記顕微鏡解析用プローブと前記顕微鏡解析対象とが一体となった分子を懸濁した試料溶液とする方法、前記顕微鏡解析用プローブと前記顕微鏡解析対象とを発現するベクターを、前記顕微鏡解析対象をコードする遺伝子が欠失したノックアウト細胞に導入し、発現させて使用する方法等が挙げられる。
【００５５】
また、前記顕微鏡解析用プローブは、２種以上の前記解析対象を同時に解析することを目的として、例えば、異なる前記接触部を有する２種以上の前記顕微鏡解析用プローブ、及び、異なる前記接触部に応じて前記棒状構造の長さ若しくは形状の異なる２種以上の前記顕微鏡解析用プローブ等を同時に使用することができる。これにより、同一試料中において複数の解析を一度に行うことができ、その場合、改めて対照実験を行う必要もないため、有利である。
【００５６】
＜顕微鏡解析用プローブの調製方法＞
前記顕微鏡解析用プローブとしては、少なくとも前記棒状構造が、タンパク質からなることが好ましく、単一の組換え融合タンパク質分子であることがより好ましく、本発明の顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを用いて発現された単一分子の組換え融合タンパク質からなることが特に好ましい。
【００５７】
本発明の顕微鏡解析用プローブ発現ベクターは、前記単一分子の組換え融合タンパク質からなる前記顕微鏡解析用プローブの調製方法を通じて明らかにする。
【００５８】
前記顕微鏡解析対象が、前記接触部との相互作用により検出される外部の検出対象であり、前記接触部が第一の態様の相互作用領域（接触領域）である場合、前記顕微鏡解析用プローブとしては、例えば、ダイニンのストーク部位のコイルドコイル領域を前記棒状構造とし、前記接触部として、前記棒状構造のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかに前記接触部としての任意のタンパク質を融合し、さらに前記棒状構造の略中央部のコイルドコイルを形成しない領域に蛍光タンパク質を挿入してなるものが好適に挙げられる。
【００５９】
前記第一の態様における前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターとしては、これらのタンパク質をコードする遺伝子を連結してなる配列を含むものが好ましく、具体的には、ダイニンのストーク領域をコードする遺伝子と、前記接触部をコードする遺伝子と、蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなるものが好ましい。
【００６０】
前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターの構築方法としては、公知の方法から適宜選択することができるが、例えば、（１）ダイニンのストーク部位をコードするｃＤＮＡを調製し、これをプラスミドにサブクローニングし、（２）前記ストーク部位をコードするｃＤＮＡの略中央領域（コイルドコイルを形成しない領域）を除去し、ここに前記蛍光タンパク質をコードする配列を挿入し、（３）前記ストーク部位の端部（Ｎ末端及びＣ末端の少なくともいずれか）に、前記接触部としてのタンパク質をコードする配列を挿入する方法等が挙げられる。
【００６１】
前記接触部のタンパク質が、抗原抗体反応可能なタンパク質である場合、該タンパク質としては、抗体可変領域が好適に挙げられる。前記抗体可変領域としては、例えば、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）が挙げられる。前記ｓｃＦｖは、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるＶＨ及びＶＬから構成される可変領域を、フレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントである。前記ＶＨとＶＬとを連結させる順序、ペプチドリンカーの長さと配列、Ｖ領域のアミノ酸置換等によって、発現の容易さ、溶液中での安定性、及び形態等に差異が生じることが知られている。
【００６２】
前記ｓｃＦｖのｃＤＮＡの調製方法としては、例えば、ファージディスプレイによるバイオパンニング法が挙げられる。具体的には、ｓｃＦｖを繊維状ファージの外殻タンパク質上に提示させてライブラリーを調製し、固相化した所望の抗原に対して結合させ、選択操作を行う方法である。
【００６３】
前記顕微鏡解析用プローブは、前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを用い、組換えタンパク質を産生させる公知の方法により調製することができ、例えば、前記顕微鏡解析用プローブを発現させる細胞等に前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養し、その培養液から前記顕微鏡解析用プローブを回収し、精製することにより調製することができる。
前記精製方法としては、例えば、ＧＳＴ融合タンパク発現用ベクターに、前記顕微鏡解析用プローブをコードするｃＤＮＡをサブクローニングし、得られたＧＳＴ融合タンパク質として合成された前記顕微鏡解析用プローブを、ＧＳＴカラムを用いて精製した後、ＧＳＴを除去する方法等が挙げられる。
【００６４】
前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを導入する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記顕微鏡解析対象が生体試料である場合、該解析対象である特定部位を構成する細胞であることが好ましい。
前記顕微鏡解析対象の特定部位を発現する細胞に、前記顕微鏡解析用プローブを発現させることにより、前記顕微鏡解析用プローブを加えて相互作用させる工程が不要となるため、例えば、前記生体試料を生きた状態で、さらには通常の生理条件下において、前記標的分子の局在、方向（向き）、構造、形状（立体構造）、及び動態等を解析することができる。
【００６５】
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体である前記第二の態様である場合、前記単一分子の組換え融合タンパク質からなる前記顕微鏡解析用プローブとしては、例えば、ダイニンのストーク部位のコイルドコイル領域を前記棒状構造とし、前記接触端としての棒状構造のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかに前記顕微鏡解析対象のタンパク質を融合し、さらに前記棒状構造の略中央部のコイルドコイルを形成しない領域に蛍光タンパク質を挿入してなるものが好適に挙げられる。
【００６６】
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体であり、前記接触部が前記顕微鏡解析対象の前記特定部位と結合した状態の結合端（接触端）である場合、前記顕微鏡解析用プローブとしては、例えば、ダイニンのストーク部位のコイルドコイル領域を前記棒状構造とし、前記接触部となる前記棒状構造のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかに前記顕微鏡解析対象としての任意のタンパク質を融合し、さらに必要に応じて前記棒状構造の略中央部のコイルドコイルを形成しない領域に蛍光タンパク質を挿入してなるものが好適に挙げられる。
【００６７】
前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターの構築方法としては、公知の方法から適宜選択することができるが、例えば、（１）ダイニンのストーク部位をコードするｃＤＮＡを調製し、これをプラスミドにサブクローニングし、（２）前記ストーク部位をコードするｃＤＮＡの略中央領域（コイルドコイルを形成しない領域）を除去し、ここに前記蛍光タンパク質をコードする配列を挿入し、（３）前記ストーク部位の端部（Ｎ末端及びＣ末端の少なくともいずれか）である前記接触部に連結して前記顕微鏡解析対象のタンパク質をコードする配列を挿入する方法等が挙げられる。
【００６８】
前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを導入する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記顕微鏡解析対象が生体試料である場合、前記顕微鏡解析対象をコードする遺伝子が欠失したノックアウト細胞であることが好ましい。
【００６９】
本発明の顕微鏡解析用プローブは、各種顕微鏡解析用試料の調製に好適に使用されるが例えば、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、樹脂包埋切片法、及び氷包埋法等による試料の調製においてより好適に使用され、これらの中でも、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法による試料の調製に特に好適に使用される。
前記急速凍結ディープエッチ・レプリカ法による試料調製において、前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを用い、前記顕微鏡解析対象の特定部位を発現する細胞中で前記顕微鏡解析用プローブを発現させて使用する方法を組み合わせることにより、生命現象の現場において機能遂行中に構造を変えるタンパク質を解析することが可能となる。
【００７０】
（顕微鏡解析方法）
本発明の顕微鏡解析方法は、顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含む方法である。
また、本発明の顕微鏡解析用プローブ発現用ベクターを用いる前記顕微鏡解析方法は、前記顕微鏡解析用ベクターを発現させる工程と、該顕微鏡解析用プローブを含む顕微鏡解析用試料を調製する工程と、該顕微鏡解析用試料中の前記顕微鏡解析用プローブを検出する工程とを少なくとも含む方法である。
【００７１】
解析に用いられる顕微鏡としては、前記顕微鏡解析対象の特定部位の解析が可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザ走査顕微鏡等の光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡等の走査型プローブ顕微鏡等が挙げられ、これらの中でも、蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、及び原子間力顕微鏡が好適に挙げられる。
【００７２】
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブの接触部との相互作用により検出される外部の検出対象である場合、前記顕微鏡解析用試料を作製する方法としては、前記顕微鏡解析用プローブを前記顕微鏡解析対象の特定部位と相互作用させる工程を含む。
前記相互作用させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予め調製した前記顕微鏡解析用プローブを、前記顕微鏡解析対象を解析可能な形態に処理した試料に投与する方法、予め調製した前記顕微鏡解析用プローブを、未処理の前記顕微鏡解析対象に投与する方法、及び前記顕微鏡解析用プローブをコードする配列を含む発現ベクターを、前記顕微鏡解析対象の特定部位を発現する細胞等に導入し、該細胞において発現させる方法等が挙げられる。
【００７３】
前記顕微鏡解析用プローブを投与する方法としては、例えば、前記顕微鏡解析用プローブと前記顕微鏡解析対象とを溶液中で混合する方法等が挙げられる。
また、前記顕微鏡解析用プローブ発現ベクターを細胞に導入する方法としては、例えば、キャリアペプチド、燐酸カルシウム、ポリエチレングリコール等による方法、並びに電気穿孔法等が挙げられる。
【００７４】
前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体である場合、前記顕微鏡解析用試料を作製する方法としては、前記顕微鏡解析用プローブを前記顕微鏡解析対象との単一融合タンパク質として調製し、これを前記顕微鏡解析用試料として調製することができる。
【００７５】
前記顕微鏡解析用試料としては、解析に使用する顕微鏡、及び前記顕微鏡解析対象の種類に応じて、公知の方法から適宜選択することができる。
前記顕微鏡が電子顕微鏡である場合、例えば、急速凍結ディープエッチ・レプリカ法、ネガティブ染色法、クライオ・ネガティブ染色法、氷包埋法等が挙げられ、これらの中でも急速凍結ディープエッチ・レプリカ法が好ましい。
【００７６】
前記急速凍結ディープエッチ・レプリカ法としては、例えば、前記顕微鏡解析用プローブと前記標的分子とを相互作用させた後、少なくとも前記顕微鏡解析対象の特定部位に対し、重金属（例えば、白金等）を蒸着し、さらにカーボンをコーティングし、生体試料を溶解除去する方法が挙げられる。
【００７７】
−解析方法−
前記顕微鏡解析対象の特定部位の解析方法としては、少なくとも前記顕微鏡解析用プローブの前記標識部及び前記棒状構造の少なくともいずれかを特定し、前記接触部を検出可能な方法であれば、特に制限はなく、その解析条件としては、顕微鏡の種類、前記顕微鏡解析用試料の種類、及び前記標識部を構成する物質等に応じて、適宜選択することができる。
例えば、蛍光物質からなる前記標識部を、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出することにより、前記検出対象の局在、方向（向き）を解析する方法、急速凍結法などにより作成された電子顕微鏡試料中で、前記顕微鏡解析対象の特定部位（検出対象）の局在、方向（向き）、及び形状を解析する方法、前記検出対象を含む溶液中の試料の動態を原子間力顕微鏡で解析する方法などが挙げられる。
【００７８】
前記顕微鏡として電子顕微鏡を使用する場合、解析方法としては、例えば、国際公開第ＷＯ０２／４８９６１号パンフレット、国際公開第ＷＯ０２／０５６２５９号パンフレット、国際公開第ＷＯ０２／０７５６５８号パンフレットに記載された方法等が好適に挙げられる。
【００７９】
本発明の顕微鏡解析用プローブは、視認性が高く、かつ顕微鏡の空間分解能を損なわないため、該顕微鏡解析用プローブを用いた本発明の顕微鏡解析方法は、例えば前記顕微鏡解析対象の特定部位の局在、方向（向き）、形状（立体構造）、及び動態等を、平均化することなく詳細に解析することができる。また、本発明の顕微鏡解析方法によれば、前記特定部位の生理条件下における経時的変化や、活性状態における構造等を解析することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００８１】
（実施例１）
前記顕微鏡解析対象として、合成ＦＬＡＧペプチドを用い、該ＦＬＡＧぺプチドを検出する前記顕微鏡解析用プローブ、及び該顕微鏡解析用プローブ発現用ベクターを、以下の方法により調製した。
なお、前記顕微鏡解析用プローブは、前記棒状構造として、ダイニン（Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｙｎｅｉｎ）のストーク部位のコイルドコイル領域、前記接触部（接触領域）として、前記ＦＬＡＧペプチドに抗原特異的結合能を持つｓｃＦｖ、及び前記標識部として、蛍光タンパク質ＥＧＦＰ（Ａ２０６Ｋ）からなる単一分子の組換え融合タンパク質として調製した。
【００８２】
＜顕微鏡解析用プローブ発現ベクターの調製＞
（１）ストーク部位のｃＤＮＡのプラスミドへのサブクローニング
−ストーク部位のｃＤＮＡの調製−
Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｙｎｅｉｎのストーク部位に相当するｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００２３２３として報告されているＤＮＡ配列の９３５０〜１０３６９番目の塩基配列部分：１０１９塩基）を、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ヒト神経芽細胞腫由来細胞株）のＴｏｔａｌ  ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法により調製した。
前記ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のＴｏｔａｌ  ＲＮＡは、１×１０７個の細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて抽出した。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  II  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を逆転写酵素として用い、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして用い、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。
【００８３】
前記Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートとし、耐熱性ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号１：５´−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣ−３´）、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号２：５´−ＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣ−３´）をそれぞれ用いてＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物が、ストーク部位に相当するｃＤＮＡであることを確認するため、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて配列を解析したところ、得られたｃＤＮＡは、前記Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００２３２３のＤＮＡ配列と完全一致していることが確認された。
【００８４】
−プラスミドへのサブクローニング−
前記顕微鏡解析用プローブは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）のＣ末端に融合させて発現させるために、ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム社製）のＧＳＴのｃＤＮＡの下流に存在するマルチクローニングサイト内に、ＧＳＴのｃＤＮＡと前記顕微鏡解析用プローブのｃＤＮＡの読み枠が合致するように構築するため、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１の前記マルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に、前記ストーク部位に相当するｃＤＮＡを挿入した。
【００８５】
（２）蛍光タンパク質ＥＧＦＰのｃＤＮＡの挿入
前記ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にサブクローニングした前記ストーク部位に相当するｃＤＮＡから、逆平行コイルドコイル領域にはさまれた微小管結合部位を除去し、ここに蛍光タンパク質ＥＧＦＰのｃＤＮＡを下記の方法により挿入した。
【００８６】
前記ストーク部位に相当するｃＤＮＡの、前記Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００２３２３の配列において９７０７から９７１２番目に相当する配列と、１００７０から１００７５番目に相当する配列をＡｏｒ１３ＨＩサイトとなるようにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて部位特異的遺伝子変異を行った。変異導入に用いたプライマーの配列を以下に示す。
（配列番号３）
５´−ＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＡＣＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧ−３´
（配列番号４）
５´−ＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＧＴＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＧ−３´
【００８７】
両端にＡｏｒ１３ＨＩサイトを持つＥＧＦＰのｃＤＮＡは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして用い、耐熱性ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号５：５´−ＧＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３´）、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号６：５´−ＣＡＧＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ−３´）を用い、ＰＣＲ法により合成した。得られた両端にＡｏｒ１３ＨＩサイトを持つＥＧＦＰのｃＤＮＡを、前記ストーク部位の除去した領域に、読み枠が合致するように挿入した。
【００８８】
さらに、前記ＥＧＦＰの２量体化（Ｚａｃｈａｒｉａｓ  ＤＡ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６：９１３−９１６）を防ぐために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、プライマー（配列番号７：５´−ＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣ−３´、及び配列番号８：５´−ＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧ−３´）を用いてＡ２０６Ｋ変異を導入した。
【００８９】
（３）ＳｃＦｖのｃＤＮＡの挿入
−パニング法によるＳｃＦｖ発現ファージのクローニング−
（ｉ）抗原作成
合成ＦＬＡＧペプチド（配列番号９：ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＣ、ＭＷ：１１７４．１８、Ｓｉｇｍａ社製）と、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）とを、架橋剤ＭＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてコンジュゲートを作成した。
【００９０】
（ii）マウス免疫
前記（ｉ）で調製した抗原（ＦＬＡＧ−ＢＳＡ）溶液２ｍｇ／ｍＬと、Ｆｒｅｕｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔとを１：１で混合したものをマウス腹腔内に投与し、２週間後、前記抗原溶液２ｍｇ／ｍＬとＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔとを１：１で混合したものを同様に投与した。さらに１週間後、マウスから採血しＦＬＡＧ−ＢＳＡを抗原としてＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定した。
【００９１】
（iii）免疫マウスからのｍＲＮＡの抽出
前記（ii）の結果、抗体価の上昇が見られたマウスから脾臓を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、摘出した脾臓からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０−ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）を用いてｍＲＮＡを抽出した。
【００９２】
（iv）抗体ｃＤＮＡの合成
前記（iii）で得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをテンプレートとし、ＰＣＲ法により抗体重鎖ｃＤＮＡ、及び抗体軽鎖ｃＤＮＡを得た。
なお、ＳｃＦｖの合成は、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム社製、以下「ＲＰＡＳ」と表す）を用いて行った。プライマーとしては、Ｈｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒ１＆２、及びＬｉｇｈｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを用い、耐熱性ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００９３】
（ｖ）リンカーの挿入（ＳｃＦｖのｃＤＮＡ合成）
前記（iv）で得られた抗体重鎖ｃＤＮＡ、及び抗体軽鎖ｃＤＮＡを、前記ＲＰＡＳのＬｉｎｋｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを用いて混合し、ＡｍｐｌｉＴａｑを使用して７サイクルのみＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、前記ＲＰＡＳのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ  Ｓｐｕｎ−Ｃｏｌｕｍｎを使用して精製し、ＳｃＦｖのｃＤＮＡを得た。
【００９４】
（vi）ＳｃＦｖのｃＤＮＡへのＳｆｉＩサイト及びＮｏｔＩサイト付加
前記（ｖ）で得られたＳｃＦｖを、前記ＲＰＡＳのＲＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘをプライマーとして、ＡｍｐｌｉＴａｑを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩ、及びＮｏｔＩで切断した後、前記ＲＰＡＳのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ  Ｓｐｉｎ−Ｃｏｌｕｍｎを使用して精製した。
【００９５】
（vii）ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅへのサブクローニング（ＳｃＦｖ発現ライブラリーの作成）
前記（vi）で得られたＳｆｉＩサイト及びＮｏｔＩサイトを持つＳｃＦｖのｃＤＮＡを、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５ＥのＳｆｉＩサイト及びＮｏｔＩサイトにサブクローニングした。
得られたｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ−ＳｃＦｖベクターを用い、大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、ＬＢプレート上で培養した後、プラスミドを回収し、ＳｃＦｖ発現ライブラリーとした。
【００９６】
（viii）ＳｃＦｖ発現ファージライブラリーの作製
前記（vii）で得られたＳｃＦｖ発現ライブラリーを用い、大腸菌（ＴＧ−１）を形質転換した。該大腸菌にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させ、ファージ粒子１×１０１１個のＳｃＦｖ発現ファージライブラリーを得た。
【００９７】
（ix）パニング法による抗原特異的ＳｃＦｖ発現ファージのクローニング
３ｃｍ径のプラスティックディッシュに、２０ｇの抗原（ＦＬＡＧ−ＢＳＡ）を吸着固定し、ＢＳＡ（又はカゼイン）でブロッキング操作を行った後、前記（viii）で得たＳｃＦｖ発現ファージライブラリーを加えて反応させた。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄した後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ディッシュに結合したファージを溶出した。ファージ溶出後は、速やかに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を用いて中和した。
回収されたファージを大腸菌（ＴＧ−１）に感染させ、該大腸菌を増殖させた後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させ、再度ＳｃＦｖ発現ファージを回収し、これを二次ライブラリーとした。得られた二次ライブラリーを用い、上記の操作（パニング操作）をさらに２回繰り返して行い、抗原特異的ＳｃＦｖ発現ファージを濃縮した。
濃縮された抗原特異的ＳｃＦｖ発現ファージを大腸菌（ＴＧ−１）に感染させてクローン化したファージを得た。得られたファージクローンは、ＥＬＩＳＡ法によって抗体価を確認した。
【００９８】
別途、前記パニング法を用いてＳｃＦｖ発現ファージライブラリーから抗原特異性を持つＳｃＦｖ発現ファージクローンをクローニングしておき、該抗原特異的ＳｃＦｖ発現ファージクローンからＳｃＦｖ発現用ベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ）をレスキューした。
得られた前記ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅをテンプレートとし、耐熱性ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号１０：５´−ＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣ−３´）、及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号１１：５´−ＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧ−３´）を用いてＰＣＲを行い、両端にＮｏｔＩサイトを持つＳｃＦｖのｃＤＮＡを合成した。
得られたＳｃＦｖのｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ＭＣＳ内のＮｏｔＩサイトにＣ末端に順向きに読み枠が合致するように挿入し、前記顕微鏡解析用プローブ発現用ベクター（ｐＧＥＸ−ＳＭＰ）を得た。模式図を図１に示す。
【００９９】
＜顕微鏡解析用プローブの調製＞
（１）ｐＧＥＸ−ＳＭＰの導入
前記顕微鏡解析用プローブの発現用細胞として、大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬを用い、前記顕微鏡解析用プローブ発現用ベクター（ｐＧＥＸ−ＳＭＰ）で形質転換した。ＬＢＧ−ａｍｐ（２％グルコースを含む）プレート上から数クローンを拾って１５ｍｌ程度の培地で培養し、得られた大腸菌からタンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、ＩＰＴＧによる発現誘導が正常に確認できるクローンを選択し、形質転換体とした。
【０１００】
（２）形質転換体の大量培養
前記（１）で得た形質転換体の大腸菌培養液１０ｍＬを、１０００ｍＬの２×ＹＴＧ（２％グルコースを含む）に接種し、２５℃で２時間培養した後、発現誘導を行うために最終濃度０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、さらに１時間培養した後に、４℃、７７００×Ｇで遠心し、大腸菌を回収した。
【０１０１】
（３）細胞抽出液の調製
前記（２）で回収された大腸菌のペレットに、５０ｍＬの氷冷１×ＰＢＳ（プロテアーゼ阻害剤として、ロシュ社製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ＥＤＴＡ  Ｆｒｅｅ  ｔａｂｌｅｔを含む）を加え、ピペッティングにより前記ペレットを完全に懸濁した後、超音波処理装置により細胞を破壊して、細胞抽出液を得た。なお、超音波処理は、熱の発生を抑えるために氷上で数回に分けて行った。４℃、１２０００×Ｇで遠心し、上清（細胞抽出液）を新しい容器に移した。
【０１０２】
（４）顕微鏡解析用プローブの精製
ＧＳＴｒａｐＦＦ  １ｍＬカラムを高速液体クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０Ｓ、アマシャム・バイオサイエンス社製）に接続し、５ｍＬの結合緩衝液（１×ＰＢＳ）で前記カラムを平衡化した後、前記（３）で得た細胞抽出液５０ｍＬを前記カラムに添加し、１０ｍＬの前記結合緩衝液で前記カラムの洗浄を行った。
続いて、１０ｍＬのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）で前記カラムの洗浄を行った。
８０μＬのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅと、９２０μＬのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断緩衝液との混合液を調製し、前記カラムに添加した後、該カラムを密閉して１２時間静置した。
【０１０３】
前記カラムの終端にさらにもう一つの平衡化済みＧＳＴｒａｐＦＦ  １ｍＬカラムを接続し、切断されたＧＳＴタグ、及び未消化のＧＳＴ融合タンパク質（顕微鏡解析用プローブ）を吸着除去するフィルターとした。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ消化処理後、１５ｍＬのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断緩衝液でＧＳＴタグが切断されたタンパク質（顕微鏡解析用プローブ）を溶出させた。溶出液は０．５ｍＬずつの画分として分取し、ＯＤ２８０が最も高い値を示した３つの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、単一タンパク質分子が、単一のバンドとして検出されることを確認し、本発明の顕微鏡解析用プローブを得た。得られた前記顕微鏡解析用プローブの概略図を、図２に示す。
【０１０４】
実施例１から、単一分子からなる前記顕微鏡解析用プローブを効率よく調製できることがわかった。
なお、前記標的分子として他の抗原を選択した場合においても、上記の方法により、所望の前記顕微鏡解析用プローブを作製することができる。
【０１０５】
（実施例２）
前記顕微鏡解析対象としてミオシンを選択し、ミオシン中の特定領域を解析可能な前記ミオシンと一体の前記顕微鏡解析用プローブ、及びこれを得るための前記顕微鏡解析用プローブ発現用ベクターを調製した。
なお、実施例２の前記顕微鏡解析用プローブは、前記接触端となる領域と連結してミオシンのｃＤＮＡを挿入してなる前記顕微鏡解析用プローブ発現用ベクターを調製し、該ベクターを、ミオシン重鎖遺伝子ノックアウト株（細胞性粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）に導入して発現した以外は、実施例１と同様にして調製した。
【０１０６】
（１）ミオシンｃＤＮＡの挿入
前記顕微鏡解析用プローブの前記棒状構造及び前記標識部のｃＤＮＡを含むプラスミドをテンプレートとして、プライマー（配列番号１２：５´-ＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧ−３´、及び配列番号１３：５´−ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ−３´）を用い、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行い、端部にそれぞれＢｓｐＨＩサイトとＮｃｏＩサイトとを付加し、これをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター(Ｐｒｏｍｅｇａ社製)に挿入した。配列を、シークエンサー（ＡＢＩ３２００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製）により確認した後、前記棒状構造及び前記標識部のｃＤＮＡを含む配列をＢｓｐＨＩとＮｃｏＩとで切り出した。
【０１０７】
一方、ｐＴＩＫＬＭｙＤ△Ｂを、ＢｓｐＨＩ及びアルカリフォスファターゼで処理し、前記棒状構造及び前記標識部のｃＤＮＡを含む配列を挿入した。なお、前記ｐＴＩＫＬＭｙＤ△Ｂは、ｐＴＩＫＬＭｙＤ（Liu  et  al.,  1998））中の３つのＢｓｐＨＩ部位のうち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来するベクターバックボーンにある２つを、部位特異的変異処理により取り除き、ミオシン重鎖遺伝子の５´付近にあるＢｓｐＨＩ部位がユニークとなったものである。
挿入したｃＤＮＡは両方向に挿入され得るが、ＢｓｐＨＩサイトが５´側で、ＮｃｏＩサイトが３´側に挿入されたものを、制限酵素切断パターンにより選択した。この結果、ミオシン重鎖のＮ末端（アミノ酸配列「ＭＮＰＩＨＤＲＴ…」の「ＨＤ」の部位）に、前記ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（ｐＴＩＫＬｐｒｏｂｅＭｙｏ）を得た。
【０１０８】
（２）顕微鏡解析用プローブの精製
細胞性粘菌  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのミオシン重鎖遺伝子ノックアウト株ＨＳ１（Ruppel  et  al.,  1994）を、電気穿孔法（Egelhoff  et  al.,  1991）により前記ｐＴＩＫＬｐｒｏｂｅＭｙｏを導入して形質転換し、１２μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＢＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）と、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＨＬ５培地（Sussman,  1987）で培養し、形質転換体を選択した。得られた形質転換体を３０ｃｍ角のプラスチックシャーレ１２枚を用い、２１℃で培養した。
【０１０９】
前記形質転換細胞からのミオシンの精製は、Ruppelらの方法（Ruppel  et  al.,  1994）の変法により行い、すべての操作は０〜５℃の温度条件下で行った。
前記形質転換体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）中に回収し、低速遠心(２０００ｒｐｍ、２分間)により集菌した。これを同じ前記Ｔｒｉｓバッファーに再度懸濁し、再度遠心を２回行い、培地を除去した。
得られた菌体１ｇに対し、４ｍＬの溶菌バッファー(２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ)を加えて懸濁した。さらに１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びタンパク質分解酵素阻害剤(ＰＭＳＦ、ＴＰＣＫ、ＴＬＣＫ、ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、及びｌｅｕｐｅｐｔｉｎ)を含む溶菌バッファーを、菌体１ｇあたり５ｍＬ加え、氷上で５分間静置した。
これを１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心して上澄を捨て、得られた菌体を１ｇあたり２ｍＬのバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁した。
これを１８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄を捨て、得られた菌体を１ｇあたり２ｍＬのバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁した後、直ちに５５，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。
得られた上澄に、５μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａを加え、バッファー（１０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ  ｐＨ６．８、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して一晩透析した。生成した沈殿を１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心して回収し、これをバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中にホモジェナイズした。直ちに５５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して不溶性分画を取り除き、顕微鏡解析用プローブ分画とした。
得られた分画の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検定した結果、約９０％であった。
前記顕微鏡解析用プローブの濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製)により測定したところ、〜１０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１０】
（３）運動アッセイ
前記（２）で得たミオシンと一体の前記顕微鏡解析用プローブを、１ｍｇ／ｍＬ  Ｆ−アクチン、４ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ(ｐＨ７．４)、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴを用いて１／５に希釈した後、直ちに６８，０００ｒｐｍで６分間遠心し、ＡＴＰ存在下でもＦ−アクチンと解離しない分子を除去した後、アクチン滑り運動型の運動アッセイに供した。
前記運動アッセイは、Ｕｙｅｄａらの方法（Uyeda  et  al.,  1996）に従って行った。前記運動アッセイは、０．１ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、０．０２ｍｇ／ｍＬカタラーゼ、３ｍｇ／ｍＬグルコースを含む１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ(ｐＨ７．４)、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液を用い、２５度の温度条件下で行った。
【０１１１】
前記運動アッセイにおいては、前記顕微鏡解析用プローブと一体に発現してなるミオシンを敷いたカバーガラス上のＦ−アクチンは、野生型のミオシンを用いた場合と大きく異ならない速度で正常な滑り運動を起こした。このことから、前記棒状構造を付加したことにより、解析対象であるミオシンの機能への影響は小さく、本発明の顕微鏡解析用プローブは、機能状態のタンパク質の解析に好適であることが明らかになった。
【０１１２】
（実施例３）
実施例２で調製した前記顕微鏡解析用プローブ付きのミオシンを、以下の方法により、透過型電子顕微鏡により観察した。
前記顕微鏡解析用プローブ付きのミオシン１０ｍｇ／ｍｌを、０．４Ｍ酢酸アンモニウム、４０％グリセロール溶液に添加して十分に混合し、１５μｇ／ｍＬの希釈液を調製した。得られた希釈液５μＬをプラスチックピペットチップに吸引し、そのまま噴霧式ペイントブラシ（スプレイ・ガン）の先端に開けた小孔に挿入した。
前記ペイントブラシの前方３０ｃｍに、標的とするスライドグラスを置き、その中央に、劈開した新鮮な面を前に向けて両面テープでマイカ小片を貼りつけたものを用意し、ここに前記ペイントブラシのチューブを窒素ボンベに連結し、前記顕微鏡解析用プローブ付きのミオシン希釈液を一気に噴霧した。
【０１１３】
前記スライドガラスを、マイカ表面の微小な水滴の分布を実体顕微鏡で確認した後、フリーズ・エッチング装置（Ｂａｌｚｅｒｓ  ３００型）に挿入し、真空度が上昇するのを待った。１〜２時間後、１０度の高さから白金／カーボンの回転シャドウィングを施し、さらにその上から純カーボンでコーティングを行った。水面の表面張力を利用してマイカ表面のカーボン膜を剥がし、水面に膜を浮かべた。
【０１１４】
前記カーボン膜を、電子顕微鏡用銅グリッド(＃１５０ｍｅｓｈ)で小分けにしてすくい取り、透過型電子顕微鏡(ＪＥＭ−２０００ＥＳ)に挿入し、加速電圧８０ｋＶにて観察、撮影した。結果を図３に示す。
【０１１５】
図３に示したとおり、ミオシン頭部の球状部分が一体となった実施例２の顕微鏡解析用プローブは、該球状部分を２個有するミオシン分子の発現形態に伴い、２個ずつ発現されている。図３で明らかなとおり、本発明の顕微鏡解析用プローブは、十分に細く、またいずれもミオシン頭部の中位付近から生えており、当該顕微鏡解析用プローブが極めて視認性に優れた、そして電子顕微鏡の高分解能を保持できることが明らかとなった。
なお、前記顕微鏡解析用プローブ用発現ベクターの構築において、挿入した前記ミオシン分子のＮ末端に前記棒状構造のｃＤＮＡを連結したため、発現した前記顕微鏡解析用プローブにおける前記棒状構造の端部は、前記ミオシン分子のＮ末端との接触部を構成し、顕微鏡下において該接触部が視認可能であり、立体構造中における前記ミオシン分子のＮ末端の位置とその向きが明確に解析できることが明らかになった。また、前記ミオシン分子のＮ末端の位置は、原子モデル中の当該部位の局在位置とも合致することも確認された。
【０１１６】
（実施例４）
実施例２で作製した前記顕微鏡解析用プローブを、アッセイ溶液（２５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）で４μｇ／ｍＬ希釈したものを顕微鏡解析用試料とし、原子間力顕微鏡（型番：ＮＶＢ５００、（株）オリンパス製）を用いて、前記ミオシン分子の挙動を解析した。結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の顕微鏡解析用プローブは、使用する顕微鏡の空間分解能を損なわずに解析対象を標識及び解析することができ、該解析対象の局在、方向（向き）、形状（立体構造）、及び動態を、機能状態において解析可能とするため、各種顕微鏡解析用試料の標識として好適であり、該顕微鏡解析用プローブを用いた本発明の顕微鏡解析方法は、従来の構造解析法の対象とは成り難い生体試料の解析や、経時的な構造変化を伴う試料の解析等に好適である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、実施例１で構築した本発明の顕微鏡解析用プローブ発現用ベクター（ｐＧＥＸ−ＳＭＰ）を示す概略図である。
【図２】図２（Ａ）は、前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブの接触部との相互作用により検出される外部の検出対象である第一の態様である場合に好適な顕微鏡解析用プローブの模式図（実施例１の顕微鏡解析用プローブ）であり、図２（Ｂ）は、前記顕微鏡解析対象が、前記顕微鏡解析用プローブと一体である第二の態様である場合に好適な顕微鏡解析用プローブ（実施例２の顕微鏡解析用プローブ）の模式図である。
【図３】図３は、実施例２で調製した本発明の顕微鏡解析用プローブを、実施例３で観察して得た電子顕微鏡像を示す。左に透過型電子顕微鏡写真を示し、右に左の写真中における顕微鏡解析用プローブの位置を説明する概略図を、その下にミオシン頭部の原子モデル中における当該Ｎ末端部位の位置を示した。標識はその位置を正確に指示している。
【図４】図４は、実施例２で調製した本発明の顕微鏡解析用プローブの挙動を、原子間力顕微鏡で解析し、約８０ミリ秒毎に撮影した動画像から抽出した静止画を時系列で並べた図である。
【符号の説明】
【０１１９】
１０                  顕微鏡解析用プローブ
２０                  棒状構造
２１                  接触部（接触領域）
２２                  接触部（接触端）
３０                  顕微鏡解析対象
４０                  標識部
【図２】
2006343207.tif 000003
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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