(57)【要約】【課題】  医療用、検査用、研究用として利用可能な蛍光マーカーナノ粒子の改良【解決手段】  チタン、シリコン、ゲルマニウム、ジルコニウムを原料とし、水溶液中で長期安定な、且つ抗体や薬剤結合が容易な表面修飾を行なった、ナノクラスター及びその製造法の開発。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チタン、ゲルマニウム、ジルコニウム、シリコンの混合組成、または単一組成からなる、蛍光発光特性を有するナノクラスター。
【請求項２】
請求項１記載のナノクラスターの製造方法。
【請求項３】
有機物質が、請求項１記載のナノクラスターと、直接化学結合していることを特徴とする、請求項１記載のナノクラスター。
【請求項４】
請求項３記載の有機物質は、直鎖、分岐あるいは２重結合、またはこれらを組み合わせたものの有無を問わない、炭素数が２以上２２以下のアルキル基であり、且つカルボキシル基又はシアノ基もしくはそれらを２以上有することを特徴とする、請求項３記載のナノクラスター。
【請求項５】
請求項４記載のナノクラスターの製造方法。
【請求項６】
請求項４記載のナノクラスターの、カルボキシル基をアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩にすることにより、親水性官能基に変換して、水中で凝集沈殿することなく、安定に分散して蛍光発光することを特徴とするナノクラスター。
【請求項７】
請求項６記載のナノクラスターの製造方法。
【請求項８】
請求項４記載のナノクラスターのシアノ基を、アミノ基に還元して、該アミノ基を、鉱酸、またはカルボン酸類の塩にすることにより、水中で凝集沈殿することなく、安定に分散して蛍光発光することを特徴とするナノクラスター。
【請求項９】
請求項８もしくは記載のナノクラスターの製造方法。
【請求項１０】
有機物質が、請求項６記載のナノクラスターのカルボキシル基、もしくはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、もしくは請求項８記載のナノクラスターのアミノ基、もしくはアミノ基の鉱酸類、またはカルボン酸類の塩に、直接もしくはリンカーを介して化学結合していることを特徴とする、請求項６または請求項８記載のナノクラスター。
【請求項１１】
請求項１０記載の有機物質は、生体分子であり、たんぱく質、核酸、ポリペプチド及び多糖、並びにチオール基またはスルフォニル基で修飾されたたんぱく質、核酸、ポリペプチド、多糖のうち１種以上を有することを特徴とする、請求項１０記載のナノクラスター。
【請求項１２】
請求項１０記載の有機物質は、生理活性物質であることを特徴とする、請求項１０記載のナノクラスター。
【請求項１３】
請求項１０記載のリンカーは、チオール基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルフェニル基、スルフィニル基、スルフォニル基、ジスルフィド基のうち１種以上の官能基を有する有機物質であることを特徴とする、請求項１０記載のナノクラスター。
【請求項１４】
請求項１０記載の有機物質は、請求項１１記載の生体分子、もしくは請求項１２記載の生理活性物質のうち、どちらか、もしくは両方の１種以上が、請求項８記載のナノクラスターと、化学結合もしくは請求項１１記載のリンカーを介して化学結合していることを特徴とする、請求項１０記載のナノクラスター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、医療用、生化学領域等の試験もしくは研究用に、蛍光マーカーとして利用可能なナノクラスターとその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  水中で蛍光マーカーとして使用しうるナノ粒子は、従来カドミウムを使用して合成しているものが報告されている（例えば特許文献１参照。）。【０００３】  特許文献１で報告されているナノ粒子は、水分散性を得るために、表面加工を、片方にチオール基を持ち、反対側先端にカルボキシル基等の水溶性置換基を持つアルキル鎖を、粒子表面の硫黄原子とアルキル鎖のチオール基との間の配位結合によって全体を覆うように設計されている。【０００４】  しかしこの方法で製造したナノ粒子の表面修飾基は、配位結合で結合していると考えられていて、結合力が弱く、しかも酸化や溶液のｐＨ変化によっても、配位子が外れる場合がある。【０００５】  また、該ナノ粒子を製造する際に於いては、カドミウム等の有害重金属を使用するため、製造従事者の健康面の問題が危惧されているばかりでなく、製造プロセスや廃棄プロセスに於いても、環境面への悪影響が懸念されている。【０００６】一方、非特許文献１や特許文献２、特許文献３、特許文献４に報告されている通り、シリコン、ゲルマニウムを構成成分とする有機溶媒可溶性の粒子もすでに合成例が報告されている。【０００７】  しかしこの方法で得られたナノ粒子は、有機溶媒可溶性であり、この表面修飾基を変換し、水中で長期安定な状態を保つことは困難であるため、医療用もしくは生化学領域で使用することは不可能である。【０００８】  特許文献５に記載されている通り、タキソールはその生理活性として、乳癌や進行性卵巣癌等の固形癌に対して優れた効果、即ち、抗癌活性があることが確認されている。【０００９】  ポリペプチド鎖から構成され、抗原と特異的に結合する抗体は、様々な合成例が報告されている。その一例として、非特許文献２に述べられている、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓからなるペプチドがあげられる。【００１０】
【特許文献１】ＵＳ６，２５１，３０３Ｂ１
【特許文献２】特開平１１−１４８４１
【特許文献３】特開平１１−１３０８６７
【特許文献４】特開平２００２−１０５２０７
【特許文献５】特開平２０００−４４５２３
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１９９９，１１，３３６６−３６７０
【非特許文献２】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２００２，９９，２０，１２６１７−１２６２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  本発明の目的は、蛍光マーカーとしてすでに市販されているナノ粒子の問題点である、カドミウム等の有害物質を使用することにより生じる、製造従事者のカドミウム等有害物質の暴露の危険性を排除し、且つ製造プロセスや使用後の廃棄プロセスにおいて発生する環境負荷を軽減することである。【００１２】  さらに水溶液中での安定な結合による表面処理を行なうことにより、生体物質、生理活性物質またはそれら２種類以上の有機物質を、ナノクラスターへ化学結合させることを容易にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  本発明は、生体に対する有害性が少なく、環境負荷の小さい材料とされるシリコン、チタン、ゲルマニウム、ジルコニウムまたはこれらの混合物を構成成分とする、蛍光発光特性を有するナノクラスターおよび、その簡易な製造方法である。【００１４】  先ず、テトラハロゲン化シリコン、テトラハロゲン化チタン、テトラハロゲン化ゲルマニウム、テトラハロゲン化ジルコニウムの１種類以上を有機溶媒中でアルカリ金属またはアルカリ土類金属によって還元し、ナノクラスターを製造する。【００１５】  この時、テトラハロゲン化シリコン、テトラハロゲン化チタン、テトラハロゲン化ゲルマニウム、テトラハロゲン化ジルコニムの一部をトリハロゲン化シリコン、トリハロゲン化チタン、トリハロゲン化ゲルマニウム、トリハロゲン化ジルコニムまたはジハロゲン化シリコン、ジハロゲン化チタン、ジハロゲン化ゲルマニウム、ジハロゲン化ジルコニウムを用いてもよい。【００１６】  ナノクラスターを製造する際に用いる有機溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、ノルマルヘキサンなどに代表される、非プロトン性溶媒が用いられるが、トリエチレングリコールジメチルエーテルなどの沸点の高い非プロトン性溶媒を使用することが好ましい。【００１７】  次に、ナノクラスターの表面を安定化させるために、エステル基またはシアノ基を有するアルキル亜鉛ハライドのみを加えて表面処理を行なうことにより、有機溶媒可溶性の安定なナノクラスターが得られる。【００１８】  この発明で云うエステル基またはシアノ基を有するアルキル亜鉛ハライドとは、二重結合および分岐側鎖の有無を問わない炭素数２以上２２以下のアルキル基に、エステル基またはシアノ基およびハロゲン基を有し、亜鉛を使用してハロゲン基の置換を行った、有機金属試薬のことを云う。【００１９】  この時、エステル基またはシアノ基を有するアルキル亜鉛ハライドの代わりに、トリアルキルハロゲン化シリコン、トリアルキルハロゲン化チタン、トリアルキルハロゲン化ゲルマニウム、ジアルキルハロゲン化シリコン、ジアルキルハロゲン化チタン、ジアルキルハロゲン化ゲルマニウム、モノアルキルハロゲン化シリコン、モノアルキルハロゲン化チタン、モノアルキルハロゲン化ゲルマニウムのいずれかもしくはそれら２種以上の任意の割合での組み合わせと、エステル基またはシアノ基を有するアルキル亜鉛ハライドの双方を任意の比率で混合したものを加えて表面処理を行っても、有機溶媒可溶性の安定なナノクラスターを得ることも出来る。【００２０】  エステル基を有するナノクラスターに、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物など、塩基の存在下において加水分解することにより、水分散性ナノクラスターが得られる。これは生理食塩水中において、凝集沈殿することなく１ヶ月以上安定に蛍光発光特性を有する。【００２１】  シアノ基を有するナノクラスターは、シアノ基を公知の技術によってアミノ基に還元し、鉱酸もしくはカルボン酸の塩にすることにより、水分散性ナノクラスターを得ることが出来る。このナノクラスターも生理食塩水中において、凝集沈殿することなく１ヶ月以上安定に蛍光発光特性を有する。【００２２】  上記記載の���法によって得られたナノクラスターは、アルキルカルボン酸もしくはアルキルアミンで表面修飾されており、このカルボン酸もしくはアルキルアミンは、直接またはリンカーを介して生体物質、生理活性物質またはそれらの２種以上を組み合わせて化学結合させることが可能である。【００２３】  この発明でいうリンカーとは、チオール基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルフェニル基、スルフィニル基、スルフォニル基、ジスルフィド基からなる群のうち少なくとも２以上の官能基を有する有機物質である。【００２４】  この発明でいう生体物質とは、たんぱく質、核酸、ポリペプチド、多糖、チオール基、スルフォニル基のいずれか、もしくは２種以上の組み合わせで修飾されたたんぱく質、核酸、ポリペプチド、多糖のいずれか、もしくは２以上を組み合わせた有機物質をいう。
【発明の効果】
【００２５】  本発明はテトラハロゲン化シリコン、テトラハロゲン化チタン、テトラハロゲン化ゲルマニウム、テトラハロゲン化ジルコニウム、もしくは、ジハロゲン化シリコン、ジハロゲン化チタン、ジハロゲン化ゲルマニウム、ジハロゲン化ジルコニウムを出発原料とする。そして実施例に示す通り、製造プロセスにおいても、環境負荷の大きい廃棄物の発生を極力抑制することが可能で、且つ製造したナノクラスターを使用後、廃棄する際にも環境に与える負荷を極力抑制することが可能であることを特徴とする。【００２６】  また、本発明により製造されたナノクラスターは、表面を安定な化学結合でアルキル基とエステル基もしくはシアノ基を有する有機物質で覆われている。【００２７】
【００２７】  このエステル基は、加水分解、アミド化、エステル化、還元など公知の方法によって、化学反応させることが可能である。【００２８】  また、このシアノ基は、公知の方法によって還元し、アミノ基に変換することが可能である。【００２９】  上記エステル基を有するナノクラスターに、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物などの塩基によって加水分解すると、アルキルカルボン酸塩を有するナノクラスターが得られる。【００３０】  また、上記アミノ基を有するナノクラスターに、塩酸などに代表される鉱酸又はカルボン酸類を加えるとアミン塩を有するナノクラスターが得られる。【００３１】  このナノクラスターのアルキルカルボン酸塩又はアルキルアミン塩類は、分散剤や界面活性剤をまったく加えない状態で、かつ窒素置換などの酸化防止処置を行なわずに生理食塩中、凝集沈殿せず、１ヶ月以上安定に蛍光発光する特性を有する。【００３２】  このナノクラスターのアルキルカルボン酸塩またはアルキルアミン塩類は、直接または必要に応じてリンカーを結合したものを介して、生体物質、生理活性物質またはそれらの２種類以上と組み合わせて化学結合させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】３−ブロモプロピオン酸メチル１７ｇをトリエチレングリコールジメチルエーテル５００ｍｌに溶解し亜鉛粉末７ｇを加えて１００℃で２時間加熱し、３−ジンクブロモプロピオン酸メチルを得た。
【実施例２】
【００３５】テトラクロロチタン１０ｇをトリエチレングリコールジメチルエーテル３００ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下で亜鉛粉末６ｇを加えて１７０℃で１００時間加熱攪拌してナノクラスターを得た。【００３６】００℃で１時間加熱した。２０℃まで冷却した後、トリメチルクロロシラン１５ｇを加えて２０℃で３０分、さらに６０℃に加熱して１時間攪拌した。得られた反応混合物を水に分散し、ノルマルヘキサンで抽出した。ノルマルヘキサンを減圧で除去し、微黄色の油状物０．３ｇを得た。このナノクラスタ−を島津製作所株式会社製蛍光分光光度計ＲＦ−５３００ＰＣで、励起波長３００ナノメートルで測定したところ、４４０ナノメートル付近に蛍光の発光極大が認められた。【００３７】  以下、蛍光発光分析は上記方法で行った。
【実施例４】
【００３８】実施例３で得た油状物０．３ｇを水酸化ナトリウム３０ｍｇをイオン交換水１００ｍｌ、エタノール１００ｍｌ混合溶媒中に溶解した溶液に加え５０℃で１時間攪拌した後、減圧で水及びエタノールを除いて微黄色固形物を０．４ｇを得た。
【実施例５】
【００３９】実施例４で得た微黄色固形物を重量比０．１％で生理食塩水に溶解した溶液は４４０ナノメートル付近に蛍光の発光極大が認められた。
【実施例６】
【００４０】実施例５で得られた溶液を３５℃、空気雰囲気下で１ヶ月安定性テストを行なったが蛍光強度及び蛍光波長に変化は認められず、凝集沈殿も起こらなかった。
【実施例７】
【００４１】実施例４で得た微黄色固形物５ｍｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解し、ヒドロキシコハク酸イミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えて１０℃以下で２時間攪拌し、活性エステル化した。この水溶液にＬ−シスチンを加えて１０℃以下で１２時間攪拌した。同温度でさらにジチオスレイトールを加えて還元した後、限外ろ過膜を用いて低分子試薬を除去し、凍結乾燥すると、粒子表面にＮ−プロピオニルシステインを結合した水分散性ナノクラスター４ｍｇが得られた。
【実施例８】
【００４２】実施例４で得た微黄色固形物５ｍｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解し、ヒドロキシコハク酸イミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えて１０℃以下２時間攪拌し活性エステル化した。この水溶液にＬ−セリンを加えて１０℃以下で１２時間攪拌した。反応液から限外ろ過膜を用いて低分子試薬を除去し、凍結乾燥すると粒子表面にＮ−プロピオニルセリンを結合した水分散性ナノクラスター４ｍｇが得られた。
【実施例９】
【００４３】実施例２及び実施例３と同様の方法でテトラクロロチタンをテトラクロロシランに代えて実施した場合も蛍光発光特性を有するナノクラスターが得られた。
【実施例１０】
【００４４】実施例２及び実施例３と同様の方法でテトラクロロチタンをテトラクロロゲルマニウムに代えて実施した場合も蛍光発光特性を有するナノクラスターが得られた。
【実施例１１】
【００４５】実施例２及び実施例３と同様の方法でテトラクロロチタンをテトラクロロジルコニウムに代えて実施した場合も蛍光発光特性を有するナノクラスターが得られた。
【実施例１２】
【００４６】実施例２及び実施例３と同様の方法でテトラクロロチタンをテトラクロロゲルマニウムに代えて実施した場合も蛍光発光特性を有するナノクラスターが得られた。
【実施例１３】
【００４７】実施例４で得た微黄色固形物１０ｍｇをＤＭＦ１００ｍｌに溶解し、タキソール０．１ｍｇを加えた後（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えて１０℃以下１２時間攪拌しエステル化した。ＤＭＦを減圧濃縮した後、０．０１ｍｏｌ濃度の水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌに溶解し、限外ろ過で低分子を除去した後、凍結乾燥して８ｍｇの生成物を得た。得られた生成物は１Ｈ−ＮＭＲ分析でタキソール骨格由来のスペクトルが認められた。
【実施例１４】
【００４８】実施例１３で得られた生成物を５０％含水ＤＭＦ１００ｍｌに溶解し、実施例８と同様に活性エステル化した後、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓからなるペプチドを加えて、ペプチド鎖を結合した。ＤＭＦ及び水を減圧濃縮した後、０．０１ｍｏｌ濃度の水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌに溶解し、限外ろ過で低分子を除去した後、凍結乾燥して７ｍｇの生成物を得た。得られた生成物は、アミノ酸分析により上記アミノ酸の成分が確認された。
【実施例１５】
【００４９】実施例１と同様の方法で３−ブロモプロピオン酸メチルを
【実施例１５】
【００４９】実施例１と同様の方法で３−ブロモプロピオン酸メチルを３−ブロモプロピオニトリルに代えて、３−ジンクブロモプロピオニトルを得た。
【実施例１６】
【００５０】実施例１５で得られた３−ジンクブロモプロピオニトリルを実施例２及び実施例３と同様に反応することにより表面にシアノエチル基を結合した有機溶媒可溶性ナノクラスターが得られた。
【実施例１７】
【００５１】実施例１６で得られたナノクラスターはテトラヒドロフラン中で水素化リチウムアルミニウムで還元することにより、アミノプロピル基へ変換されたナノクラスターが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】  シリコン、チタン、ゲルマニウム、ジルコニウムもしくは２以上の原料を  使用したことにより、医療用として直接体内へ導入することに対する安全性が飛躍的に向上することが期待できる。【００５３】  また安定な表面状態を確立でき、かつ生理活性物質や生体物質をナノクラスターに化学結合することを可能にしたため、医療用だけでなく、生化学領域にも利用することが可能である。