(57)【要約】      （修正有）【課題】  新規な糖質加水分解酵素の提供。【解決手段】  特定のアミノ酸配列からなるイヌリン分解活性を有するタンパク質、そのタンパク質をコードする核酸、その核酸を挿入した組換えベクター及びその組換えベクターを導入した形質転換体。本タンパク質は新規な糖質加水分解酵素としてプロバイオティクスやシンバイオティクスの分野での活躍が期待される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号２２に示すアミノ酸配列において、１〜４０番目のアミノ酸及び８１１〜１２９６番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、イヌリン分解活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５に示すアミノ酸配列からなる請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号２１に示す塩基配列からなる核酸。
【請求項６】
請求項２に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項３に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸を挿入した組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌリン分解酵素及びその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
数多くの糖質加水分解酵素や糖転移酵素が、細菌、真菌、昆虫及び動植物など様々な生物において見つかっている（非特許文献１）。糖質加水分解酵素は、二糖、オリゴ糖及び多糖などの糖と複合多糖との間のグリコシド結合を切断して、糖と非糖部分（例えば、タンパク質や脂質）とを生成させる。糖質加水分解酵素とは逆に、糖転移酵素は活性化したドナーから特異的なアクセプターへの糖部分の転移を触媒し、二糖、オリゴ糖及び多糖を生成する。
【０００３】
現在、糖質加水分解酵素は９７のファミリーに分類されており（ＧＨ１からＧＨ９７まで）、carbohydrate-active enzymesのデータベースで確認することができる（ＣＡＺＹ，http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）。これらの中で、ＧＨ３２ファミリー（約４００の酵素）に、イベルターゼ、イヌリナーゼ、レバナーゼ、スクロース−６−リン酸加水分解酵素、フルクタノトランスフェラーゼ及びフルクトシルトランスフェラーゼが含まれる。
【０００４】
糖質加水分解酵素や糖転移酵素は、生物学的な重要性の他に、生化学分野、工業分野及び医学分野におよぶ新しいバイオテクノロジーにおいても関心を集めている。ある種の乳酸菌（L. acidphilus及びL. caseiなど）やイヌリン、レバン及びフルクトオリゴ糖などのオリゴ糖や多糖は、消化管の健康維持に効果的であると一般的に言われており、それぞれ、プロバイオティック及びプレバイオティックと言われている。
【０００５】
Lactobacillus（ラクトバチルス）菌株において、ＧＨ３２ファミリーに属する４つの推定タンパク質が存在することが、ゲノム配列決定プロジェクトから推定されている：L. acidphilus由来のフルクトシダーゼ（ＢｆｒＡ）及びスクロース加水分解酵素（ＳｃｒＢ）（非特許文献２）、L. johnsonii由来のスクロース−６−リン酸加水分解酵素（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＥ０１７１９８）及びL. plantarum由来のフルクトフラノシダーゼ（ＳａｃＡ）（ＮＣ＿００４５６７）。さらに、L. plantarum由来の推定されている５つのスクロース−６−リン酸加水分解酵素の部分配列も報告されている（Ｙ１７２４２，ＡＪ５７９５３８，ＡＪ５７９５３９，ＡＪ５７９５４０及びＡＪ５７９４１）。
【非特許文献１】Davies et al., Biochem. Soc. Trans., 30, 291-297, 2002
【非特許文献２】Barrangou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 8957-8962, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように糖質加水分解酵素は、様々な分野で注目を集めている。新規な糖質加水分解酵素は、プロバイオティクスやシンバイオティクスの分野での活用が期待されるほか、グライコーム解析への応用も期待できる。したがって、本発明の目的は、新規な糖質加水分解酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、L. casei IAM1045株がイヌリン又はフクルトオリゴ糖を含む培地中で増殖でき、イヌリンに依存してイヌリン分解酵素を産生して細胞培地中に放出していることを見出した。さらに、イヌリン分解酵素を部分精製し、当該酵素をコードする遺伝子を単離することに成功した。そこで、本発明者らは、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のタンパク質を提供する。
［１］  配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
［２］  配列番号２２に示すアミノ酸配列において、１〜４０番目のアミノ酸及び８１１〜１２９６番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、イヌリン分解活性を有するタンパク質。
［３］  配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５に示すアミノ酸配列からなる［２］に記載のタンパク質。
【０００９】
本発明は、また、以下の核酸を提供する。
［４］  ［１］に記載のタンパク質をコードする核酸。
［５］  配列番号２１に示す塩基配列からなる核酸。
［６］  ［２］に記載のタンパク質をコードする核酸。
［７］  ［３］に記載のタンパク質をコードする核酸。
【００１０】
本発明は、さらに、以下の組換えベクター及び形質転換体を提供する。
［８］  ［４］〜［７］のいずれか一項に記載の核酸を挿入した組換えベクター。
［９］  ［８］に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質は、新規なイヌリン分解酵素であり、イヌリンをはじめとする多糖やオリゴ糖を分解することができる。また、本発明の核酸は、イヌリン分解酵素をコードしており、イヌリン分解酵素の産生やイヌリン分解酵素を産生する形質転換体の生産に利用することができる。また、本発明の組換えベクターは本発明の形質転換体の生産に利用することができる。さらに、本発明の形質転換体は、イヌリン分解酵素を産生することができ、イヌリン分解酵素の生産に利用でき、また、体内に摂取することによりプロバイオティクスやシンバイオティクスとして利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（タンパク質）
本発明のタンパク質は、配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるイヌリン分解酵素である。１２９６のアミノ酸からなるが、Ｍｅｔ１からＡｌａ４０までの領域は細胞膜を通過するためのシグナルペプチドであり、成熟体はＡｌａ４１からＶａｌ１２９６までの１２５６のアミノ酸からなると考えられる（配列番号２３）。至適温度及びｐＨはそれぞれ５０℃及び５．５である。Ａｌａ４１からＡｒｇ８１０までの領域は酵素触媒ドメインであり、イヌリン分解活性にとって必須である。Ａｌａ８１１以降のＣ末端領域は、機能は必ずしも明確ではないがイヌリン分解活性には必須ではない。
【００１３】
したがって、本発明のタンパク質は、配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、イヌリン分解活性を有する限り、配列番号２２に示すアミノ酸において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をも包含する。これらの中でも、特に、配列番号２２に示すアミノ酸配列において、１〜４０番目のアミノ酸及び８１１〜１２９６番目のアミノ酸のうち、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、イヌリン分解活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜５であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１又は２であり、最も好ましくは１である。
【００１４】
より特定的には、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。ここで、配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、シグナルペプチドを欠いている。また、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ａｒｇ８１１以降のＣ末端領域を欠いている。配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、シグナルペプチド及びＡｒｇ８１１以降のＣ末端領域の両方を欠いている。
【００１５】
本発明のタンパク質は、当該タンパク質を産生する微生物を培養し、当該培養物から回収することができる。当該タンパク質を産生する微生物としては、例えば、L. casei IAM1045株及び当該タンパク質をコードする核酸を挿入した組換えベクターを導入した形質転換体が挙げられる。当該タンパク質が細胞外に放出される場合には、培養上清から回収することができ、細胞外に放出されない場合には、菌体から回収することができる。
【００１６】
培養上清及び／又は菌体からの本発明のタンパク質の精製は公知の方法により行うことができる。菌体から精製する場合には、超音波処理等により細胞を破砕し、遠心分離を行って上清を得る。このようして得られた上清及び／又は培養上清を、硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析；セファデックス等によるゲルろ過法；ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外ろ過法；アフィニティ・クロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法等で精製することにより、本発明のタンパク質が得られる。
【００１７】
（核酸）
本発明の核酸は、本発明のタンパク質をコードしている。具体的な塩基配列としては、配列番号２１に示す塩基配列などが挙げられる。本発明の核酸は、L. casei IAM1045株などの本発明のタンパク質を産生する微生物からゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号２１等に基づいて設計されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、常法により抽出・精製することにより調製することができる。また、本発明の核酸は、化学合成によって、又は、クローニングされたゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲによっても、調製することができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、配列番号２１に示す塩基配列以外の塩基配列を有する本発明の核酸を合成することもできる。核酸に変異を導入する方法として、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の方法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-KやMutan-Gなど；TAKARA）などを用いて、あるいは、LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（TAKARA）を用いて変異の導入が行われる。
【００１８】
本発明の核酸は、ベクター中にクローニングして組換えベクターを得るのに利用することができる。
【００１９】
（組換えベクター及び形質転換体）
本発明の組換えベクターは、本発明の核酸が挿入されている。この組換えベクターを利用して、本発明の形質転換体を得ることができる。
【００２０】
本発明の組換えベクターは、適切なベクター本発明の核酸を挿入（連結）することにより得られる。具体的には、本発明の核酸を適切な制限酵素で切断し、適切なベクターの制限酵素部位又はマルチスクリーニングサイトに挿入してベクターに連結する。
【００２１】
核酸を挿入するためのベクターは、遺伝子工学的に常用される宿主細胞（大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母等の真核細胞宿主）中で本発明の核酸にコードされているタンパク質が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコドンを導入することや、制限酵素部位を設けることも可能である。また、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列等、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプター等、さらには抗生物質耐性等を制御したり、代謝を制御したりし、菌体の選別等に有用な配列等を含ませることが可能である。プラスミドに含まれるプロモーターとしては、大腸菌を宿主とするプラスミドでは、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、λファージＰＬプロモーターが挙げられ、酵母を宿主とするプラスミドでは、例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーターが挙げられる。
【００２２】
また、大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔが挙げられる。
【００２３】
酵母を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクター及びｐＧＰＤ−２が挙げられる。
【００２４】
宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、大腸菌Ｋ１２株に由来するものが挙げられ、具体的には、ＮＭ５３３、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１及びＪＭ１０９等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明の形質転換体を食品等として使用する場合には、宿主細胞は乳酸菌であることが好ましく、ベクターは乳酸菌由来のプラスミド又は乳酸菌及び大腸菌の双方で複製可能なシャトルベクターであることが好ましい。乳酸菌由来のプラスミドは、アルカリＳＤＳ法などの公知の方法を用いて乳酸菌から調製することができる。また、シャトルベクターは、ｐＢＥ３１（特開平６−２５３８６１号公報）、ｐＨ４６１（特開平４−５８８９号公報）、ｐＵＣＹＩＴ３０６及びｐＵＣＹＩＴ３５６（特開２００３−２３５５６５号公報）並びにｐＣＡＴ１−１（特開２００４−１４１０６５号公報）などを使用することができる。
【００２６】
本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、イヌリン分解酵素を産生可能な本発明の形質転換体が得られる。形質転換の方法は特に制限されず、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したプロトプラスト化した細胞に、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール等の存在下でＤＮＡを接触させる方法や、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃により打ち込む方法が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
実施例１：L. casei IAM1045株の培養、イヌリン分解活性の測定及びＬｅｖＨ１の精製
L. casei IAM1045株（東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションから入手）を１％グルコース含有ＹＰ培地（イーストエキストラクト−ペプトン  ベース；Kodaira et al., Gene, 187, 45-53, 1997）で培養した後、ＴＶ培地（トリプトン−ビタミン  ベース；Burne et al., Infect. Immun., 60, 4621-4632, 1992）で培養した。濁度（ＯＤ６６０）の上昇が停止したら、炭素源を加えて培養を続けた。炭素源は、（１）０．５％グルコース、（２）０．５％イヌリン、（３）０．２５％グルコース及び０．２５％イヌリン、（４）０．１％グルコース及び０．４％イヌリンである。増殖曲線を図１に示す。L. casei  １０４５株は、いずれの条件下でも増殖し、グルコースはもちろんイヌリンを炭素源として利用できることが明らかとなった。グルコース及びイヌリンを含む培地中（図１の黒三角）で増殖した場合、L. casei 1045株は中程度増殖した後、約２０時間増殖が停止し、その後再び増殖した。ジオーキシー増殖の間のこの顕著に長い遅滞期（ｌａｇ−ｐｈａｓｅ）は、あまり好適でない炭素源（ラクトース、リボース及びマルトースなど）の存在下で増殖させたL. casei ATCC393株のそれと類似していた（Veyrat et al., Microbiol., 140, 1141-1149, 1994及びViana et al., Mol. Microbiol., 36, 570-584, 2000）。
【００２８】
L. casei IAM1045株及び01株（Christian Hansen GMBH、デンマークから入手）を１％のイヌリン（又はフルクトオリゴ糖）及び１％ＣａＣＯ３を含有するＹＰプレートで培養した。図２は、IAM1045株（左）及び01株（右）を、イヌリンを含有するＹＰプレートで培養した結果を表す図である。IAM1045株のコロニーは明瞭なハロを形成した。このことから、L. casei  IAM1045株が、イヌリン分解活性を有する細胞外タンパク質及び／又は細胞結合型タンパク質を産生していることが示唆された（ＬｅｖＨ１と命名した）。Ｄ−グルコース／Ｄ−フルクトースキット（ロシュ、ドイツ）を用い、添付の説明書にしたがって酵素活性を測定したところ（Wanker et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 1953-1958, 1995）、L. casei  IAM1045株を培養した、イヌリン又はフルクトオリゴ糖を含む細胞培養液中に酵素活性が認められた。
【００２９】
L. casei IAM1045株の細胞培養液の上清におけるＬｅｖＨ１を、ＤＥＡＥ−セルロースカラム及びバイオ−ゲル  Ｐ−１００カラムを用いたクロマトグラフィーで精製したが（Yokoi et al., Gene, 281, 115-122, 2001）、単一の均一なタンパク質は得られなかった。図３に部分精製したＬｅｖＨ１及びプロテアーゼで消化したＬｅｖＨ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を表す。部分精製したＬｅｖＨ１は、１６５ｋＤａ、１３６ｋＤａ及び１３０ｋＤａの３つの主要なバンドと１３０−３５ｋＤａの間にあるいくつかの微量のバンドとが認められた（図３、レーン３）。この部分精製されたＬｅｖＨ１は、イヌリン、フルクトオリゴ糖及びフルクトースに対して酵素活性を示し、その至適温度及びｐＨはそれぞれ５０℃及び５．５であった。
【００３０】
ＬｅｖＨ１をコードする遺伝子をクローニングするため、部分的に精製されたタンパク質をＶ８プロテアーゼ（０．１２５〜０．５ユニット）又はトリプシン（２μｇ〜１０μｇ）を用いて３７℃で２時間消化し、得られたポリペプチドをＮ末端アミノ酸配列決定分析に供した。そのような４つのポリペプチドの決定されたアミノ酸配列は次の通りである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３のレーン４〜１０に示した）。
Ｖ８消化で得られた６１ｋＤａのポリペプチド：ＱＶＱＳＳＶＧＱＳＱＴＤ
Ｖ８消化で得られた５９ｋＤａのポリペプチド：ＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰＹＲ
トリプシン消化で得られた５７ｋＤａのポリペプチド：ＴＴＬＰＴＳＮＥＱＶ
トリプシン消化で得られた５２ｋＤａのポリペプチド：ＡＶＴＳＤＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰ
５９ｋＤａのポリペプチド及び５２ｋＤａのポリペプチドは共通するデカペプチドＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰ配列を含んでいる。この配列に基づいて、クローニングのための縮重オリゴヌクレオチドプローブを構築した。例えば、ＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰのためのＴＰ１などである（表１を参照）。
【００３１】
【表１】
2006129729.tif 000002
実施例２：ｌｅｖＨ１遺伝子のクローニング
プラスミドベクターｐＵＣ１１８（又はｐＵＣ１１９）を用い、E. coli XL1-Blueを宿主として、L. casei IAM1045株のゲノムＤＮＡの制限ＨｈａＩ遺伝子ライブラリーを大腸菌の系で構築した（Yokoi et al., Gene, 281, 115-122, 2001を参照）。すなわち、常法に従い、L. casei IAM1045株のゲノムＤＮＡを抽出し、精製を行った。得られたゲノムＤＮＡをＨｈａＩで部分的に消化し、断片をｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。
【００３２】
このライブラリーを鋳型として用い、縮重プローブ（ＴＰ１などの表１に示したプローブ）及びｐＵＣシーケンシングプライマー（フォワード及びリバース；Kodaira et al., Gene, 187, 45-53, 1997）を組み合わせてＰＣＲでＤＮＡ断片を増幅し、ｐＵＣ１１８にクローニングした。  プローブＴＰ１を用いてこのように構築したクローンのＤＮＡ配列決定を行ったところ、約８８０ｂｐのインサートを有する組換えプラスミドｐＨＬ１は切断された遺伝子（ｌｅｖＨ１と命名した）を含んでいることが分かった。
【００３３】
比較分析を行った結果、ｌｅｖＨ１がコードする２８３の連続するアミノ酸配列は、レバナーゼ、イヌリナーゼ、フルクタナーゼ及びインベルターゼを含む他の推定されている糖質加水分解酵素の配列に対して顕著な類似性を示した。完全なｌｅｖＨ１遺伝子をカバーするため、表１に示した合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲで５’及び３’ゲノム領域をクローニングした。配列決定された６３５９ｂｐの領域には、２つの遺伝子ｌｅｖＨ１及びｌｅｖＨＸ１と、２つの切断型遺伝子ｌｅｖＨＤ及びｙｈｆＨとが含まれることが明らかとなった。それらの遺伝子の順序は、（ｌｅｖＨＤ）−ｌｅｖＨＸ１−ｌｅｖＨ１−（ｙｈｆＨ）であった。ｌｅｖＨＤ、ｌｅｖＨＸ１及びｌｅｖＨ１は一つの鎖に存在し、ｙｈｆＨは相補鎖に存在していた。ｌｅｖＨ１及びｌｅｖＨＸ１は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と考えられる５’−ＡＧＧＡＧＧ−３’に先行されており、ラクトバチルス遺伝子のそれとよく一致していた（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００４５６７）。図４にｌｅｖＨ１の物理的地図を示す。
【００３４】
実施例３：ｌｅｖＨ１の構造解析
ｌｅｖＨ１は、配列決定した６３５９ｂｐの核酸のうち、８０２番目（ＴＴＧ）から４９６３番目（ＴＡＡ）に位置し、分子量が１３８．８ｋＤａ、ｐＩが４．６６と計算される、１２９６アミノ酸残基のタンパク質（ＬｅｖＨ１）をコードしている。ｌｅｖＨ１の核酸配列を配列番号２１に、ＬｅｖＨ１のアミノ酸配列を配列番号２２に、それぞれ示す。Ｖ８プロテアーゼ又はトリプシンにより生成する４つのポリペプチドのＮ末端アミノ酸は、ＬｅｖＨ１の内部の配列と完全に一致していた。ＴＴＬＰＴＳＮＥＱＶ（１３７〜１４６番目のアミノ酸）、ＱＶＱＳＳＶＧＱＳＱＴＤ（１４５〜１５６番目）、ＡＶＴＳＤＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰ（１６８〜１８２番目）、ＶＳＱＮＤＱＹＮＥＰＹＲ（１７３〜１８４番目）。
【００３５】
全アミノ酸配列に関しては、ＬｅｖＨ１は他の既知タンパク質と高度にホモロジーはないが、中央部分の１８４〜７２４番目までの５４１残基は、他の糖質加水分解酵素や糖質転移酵素の推定されている酵素触媒活性部位を含む領域と実質的な類似性を示した（表２）。例えば、Bacillus subtilisのレバナーゼ（ＳａｃＣ）と３９％の同一性、Aspergillus foetidusのフルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴＦ）と３７％の同一性、Pseudomonas mucidolensのエキソイヌリナーゼ（Ｉｎｕ２）と３６％の同一性、などである。これらの比較分析から、ＬｅｖＨ１はおそらく糖質加水分解酵素ファミリーＧＨ３２（carbohydrate-active enzymesのデータベース：ＣＡＺＹ）に属していることが示唆された。
【００３６】
【表２】
2006129729.tif 000003
シグナルペプチドの切断部位を、SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）により予測した。また、タンパク質の二次構造の予測を、Ｊｎｅｔサーバー（http://www.aber.ac.uk/~phiwww/prof）により行った。このようなｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析の結果、ＬｅｖＨ１は３つのモジュール（モチーフ）から構成されることが分かった。一つは、４０アミノ酸のＮ末端領域であり、細胞膜を通過する移行のためのシグナル配列（シグナルペプチド）として作用する。一つは、およそ８００残基の中央領域であり、糖質加水分解活性を有する。一つは、およそ５００残基Ｃ末端領域であり、細胞壁の会合（又は認識／固着）のためのものである。
【００３７】
ＬｅｖＨ１の予測される成熟型（１２５６アミノ酸；Ａｌａ４０及びＡｌａ４１の間で切断されると推定される）は、１３４ｋＤａの分子量をもつと計算され、これはＳＤＳゲル上の部分精製されたＬｅｖＨ１ポリペプチドの分子量（１３６ｋＤａ及び／又は１３０ｋＤａ）とよく一致する（図３）。欠失変異を導入するドメインノックアウト分析を行ったところ、ＬｅｖＨ１の中央の７７０アミノ酸領域（Ａｌａ４１からＡｒｇ８１０まで）が酵素触媒ドメインを形成している可能性が最も高いことが示唆された（図４）。ＬｅｖＨ１の推定された触媒ドメインは、他のＧＨ３２（ＧＨ６８も含む）メンバーの等価体に相同的な７つの保存配列（モチーフ）Ｉ〜ＶＩＩを有していることが、比較分析の結果明らかとなった。ＬｅｖＨ１の構造と他の関連酵素の構造との比較を図５に示した。１４のタンパク質（表２に列挙されたＬｅｖＨ１からＬｆｔＡまで）を通じたモチーフのコンセンサス配列は以下の通りである。
Ｉ：ＷＭＮＤＰＮ（ＬｅｖＨ１の１９５〜２００残基）
ＩＩ：［Ｆ／Ｗ］ＳＧＳＡＶＶＤＸＸＮＴ（２９３〜３０４残基）
ＩＩＩ：ＦＲＤＰＫＶ（３８８〜３９２残基）
ＩＶ：ＥＣＰＤ（４４０〜４４３残基）
Ｖ：ＤＸＧＸＤ（５０２〜５０６残基）
ＶＩ：ＷＭ［Ｓ／Ｎ］ＮＷ（５２６〜５３０残基）
ＶＩＩ：ＶＤＸＸＸＶＥＶＦ（６８２〜６９０残基）
ＧＨ３２及びＧＨ６８ファミリーにおいて、３つの酸性残基Ａｓｐ（モチーフＩ）、Ａｓｐ（モチーフＩＩＩ）及びＧｌｕ（モチーフＩＶ）は、活性部位として酵素活性に必須であると考えられており（いわゆる触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ））、それぞれ、触媒性求核剤、遷移状態安定剤及び一般的な酸／塩基触媒（プロトンドナー）である。いくつかの酵素において、これらの酸性残基が酵素活性に必須であることが、変異性データ及び／又は結晶学的データから示されている。例えば、酵母インベルターゼにおけるＤ４２−Ｅ２２３（それぞれ、モチーフＩ及びＩＶ）（Reddy et al., J. Biol. Chem., 265, 10817-10820, 1990及びReddy et al., J. Biol. Chem., 271, 13953-13957, 1996）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼにおけるＤ８６−Ｄ２４７−Ｅ３４２（それぞれ、モチーフＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）（Meng et al., Nat. Struc. Biol., 10, 935-941, 2003）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉのレバンスクラーゼにおけるＤ２７２−Ｄ４２４−Ｅ５２３（それぞれ、モチーフＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）及びイヌロスクラーゼにおけるＤ２４９−Ｄ４０４−Ｅ５０３（それぞれ、モチーフＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）（Ozimek et al., FEBS Lett., 560, 131-133, 2004）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓのレバンスクラーゼにおけるＤ３０９（モチーフＩＩＩ）（Batista et al., Biochem. J., 337, 503-506, 1999）並びにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓのフルクトシルトランスフェラーゼにおけるＤ３９７（モチーフＩＩＩ）（Song et al., Biochem. J., 344, 259-264, 1999）。触媒３残基に加えて、酵母インベルターゼのモチーフＩＶにおけるＣｙｓ残基は、触媒における補助的な役割を果たしていると推測されている（Reddy et al., J. Biol. Chem., 271, 13953-13957, 1996）。しかし、他のモチーフＩＩ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩに関して、機能は未解明のままである。これらの結果から、ＬｅｖＨ１の約７７０の連続するアミノ酸配列（Ａ４１〜Ｒ８１０）はおそらく酵素触媒ドメインを形成し、Ｄ１９８−Ｄ３８９−Ｅ４４０の３残基は触媒性求核剤、遷移状態安定剤及び一般的な酸／塩基触媒として機能していることが示唆された。二次構造予測の結果によれば、予想されるＬｅｖＨ１の触媒ドメインは専ら二次βストランドからなり、ＧＨ３２ファミリーに属する他の糖質加水分解酵素と同様である。ノイラミニダーゼの構造と相同的な、ＧＨ３２ファミリーに共通する６枚羽根のβプロペラ折り畳み構造が提案されている（Pons et al., Proteins, 33, 383-395, 1998及びPons et al., Proteins, 54, 424-432, 2004）。
【００３８】
ＬｅｖＨ１の触媒ドメインの後に、８０アミノ酸からなるほぼ同一の５つのリピート配列が続く（８３〜９０％の同一性）。これらのリピート配列は、他の様々な仮定されている細胞表面タンパク質（例えば、Lactobacillus plantarum由来（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＬ９３５２５４−６１）、Lactobacillus lactis由来（ＡＥ００６３７６−２）、Listeria innocua由来（ＡＬ５９６１６６−１２７）及びListeria monocytogenes（ＡＥ０１７３２８−２３２）など）と実質的に類似しているが（およそ４５％のアミノ酸同一性）、その生物学的な機能は不明である。
【００３９】
ＬｅｖＨ１のＣ末端領域（８６残基）は他の既知の配列とアミノ酸の類似性を示さないが、構造的には、細胞壁選別／タンパク質の固着のシグナルを含むと考えられているStreptococcus mutansのエキソ−β−Ｄ−フルクトシダーゼ（ＦｒｕＡ）と類似している。グラム陽性菌の他のよく知られた細胞壁に固着する表面タンパク質と同様に、ＬｅｖＨ１のＣ末端領域は固着のための四つの潜在的な部分からおそらく構成される（図６）：“Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｐｒｏ／Ｇｌｙに富んだ３７残基（４１％に達し、おそらく細胞壁の貫通のため）”−“５残基ＬＰＱＡＧ（細胞表面との結合のため）”−“２０残基（９０％は疎水的であり、膜固着のため）”−“正に荷電したセプトペプチドＫＲＲＶＫＲＶ（細胞膜との相互作用のため）”。５残基のＬＰＱＡＧは、いわゆるＬＰＸＴＧモチーフの等価体である。ＬＰＸＴＧモチーフは、すべての既知のグラム陽性菌の細胞壁に固着された表面タンパク質の選別シグナルで保存されている。ブドウ球菌の表面タンパク質Ａにおいて、ＬＰＸＴＧ中のＴｈｒをＡｌａに置換しても固着に影響を及ぼさないことが変異分析によって示されている。この比較結果から、ＬｅｖＨ１は細胞壁に固着する表面タンパク質ファミリーに属していると示唆された。
【００４０】
ｌｅｖＨ１の上流に、二つの推定遺伝子ｌｅｖＨＤ（切断型）及びｌｅｖＨＸ１（図２）があった。ｌｅｖＨＤがコードするＣ末端の７６アミノ酸は、Lactobacillus casei（ＧｅｎＢｎａｋ受入番号：ＣＡＦ３３３５１）、Enterococcus faecalis（ＡＡＯ８１５９６）及びLactobacillus johnsonii（ＡＡＳ０９４２６）のエンザイムＩＩＤ（ＥＩＩＤ）タンパク質のアミノ酸配列と、それぞれ１００、８６及び７４％の同一性を示した。ＥＩＩＤは、ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ輸送系（ＰＴＳ）におけるフルクトース／マンノース特異的パーミアーゼの構成成分と予想されている。
【００４１】
図６に示したように、ｌｅｖＨＸ１及びｌｅｖＨ１の間の２０５ｂｐの遺伝子間領域は、ｌｅｖＨ１のリボソーム結合部位はもちろん、５つの転写プロモーター様配列（−３５及び−１０コンセンサス）、１つの二次ヘアピンループ構造及び２つの不完全なリピート配列（ＴＧＸ５ＣＧＸ５ＣＡ）を含む。潜在的なプロモーターは以下に位置している：Ｐ１（６０４〜６３０番目の塩基）、Ｐ２（６１０〜６３０番目の塩基）、Ｐ３（６２０〜６４８番目）、Ｐ４（６３０〜６５７番目）及びＰ５（６６５〜６９３番目）。２つのリピートは、Ｈｕｅｃｋらにより提案されている炭素異化応答因子（ＣＲＥ）である（Ｔ／Ａ）ＧＮＡＡ（Ｃ／Ｇ）ＣＧＮ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）ＮＣＡのコンセンサスに類似している。グラム陽性菌において、パリンドロームのＣＲＥ配列は、異化制御タンパク質（ＣｃｐＡ）の標的部位として機能することが知られている。ＣｃｐＡは細菌の転写制御因子のＬａｃＩ−ＧａｌＲファミリーのメンバーであり、ラクトースなどの二次糖質源の異化を制御すると考えられている。
【００４２】
ｌｅｖＨ１及びｙｈｆＨの間の１１３１ｂｐの遺伝子間領域は、他の既知の配列と類似性を示さなかった。図４に示したように、この領域は不完全なリピート配列を含むが、それは約３０ｂｐの４つの短いリピート（ＲＳ）及び約２６０ｂｐの２つの長いリピート（ＲＬ）であり、その順番はＲＳ１−ＲＬ１−ＲＳ２−ＲＬ２−ＲＳ３−ＲＳ４である。２つの長いリピートＲＬ１及びＲＬ２は８３％のヌクレオチド同一性を示し、２つの潜在的な二次ヘアピンループを有している。ｙｈｆＨのすぐ下流に、別の可能性あるヘアピン構造が検出された。このヘアピン構造は、ｌｅｖＨ１及び／又はｙｈｆＨの転写終結に関連しているかもしれない。
【００４３】
実施例４：大腸菌におけるＬｅｖＨ１酵素触媒ドメインの過剰産生
ＬｅｖＨ１の酵素触媒ドメインを解明するため、ｌｅｖＨ１中の４つの領域をＰｌａｃ下にクローニングした。このようにして得られた４つの組換えプラスミド、ｐＫＮＬ１〜４を図４に示した。すべての組換えタンパク質はＮ末端にＬａｃＺ’の５残基ＭＴＭＩＴを含んでいた。これらのプラスミドがコードするアミノ酸配列を図７に示した。Ｓ３９からＲ８１０までの７７２残基を含有するｐＫＬ１、Ｓ３９からＧ７２４までの６８６残基を含むｐＫＬ２（触媒ドメインのＣ末端側の８６残基を欠く）、Ｖ８２からＲ８１０までの７２９残基を含むｐＫＮＬ３（触媒ドメインのＮ末端側４３残基を欠く）及びＶ８２からＧ７２４までの６４３残基を含むｐＫＮＬ４（触媒ドメインのＮ末端側４３残基及びＣ末端側８６残基を欠く）。構築したプラスミドを表３にまとめる。
【００４４】
【表３】
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プラスミドｐＫＮＬ１〜４を含有する大腸菌を１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）で誘導した。細胞をＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールで破壊し、１０％ＳＤＳゲルで電気泳動を行った。図８に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から分かるように、各組換え体は期待されるタンパク質を産生した。見かけ上の分子量は、８６ｋＤａ（ｐＫＬＮ１）、７８ｋＤａ（ｐＫＬＮ２）、６５ｋＤａ（ｐＫＬＮ３）及び５５ｋＤａ（ｐＫＬＮ４）であり、ＤＮＡから推測される分子量（それぞれ、８５．０、７５．３、７０．５及び６０．９ｋＤａ）とほぼ一致していた。
【００４５】
組換えプラスミドを含有するE. coli XL1-BlueをＬＢ培地（１００ｍＬ）中３７℃で培養した。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）で３時間誘導した後、細胞を超音波で破壊し、細胞抽出液（２ｍＬ中の１０μＬ）を３％のイヌリンを含有する１．５％の寒天プレート（ｐＨ５．５）にスポットした。プレートを５０℃で２４時間インキュベートした。このハロアッセイの結果を図９に示す。図９に示したように、ｐＮＫＬ１はイヌリン分解活性を生じたが（図９ｆ）、他のプラスミドｐＫＮＬ２、３及び４は活性が低いか、活性を示さなかった（図９ｄ、ｅ及びｇ）。このことは、ＬｅｖＨ１の酵素活性ドメインは約７７０残基から構成され、Ｃ末端側の半分である約５００残基は酵素活性には必須ではないことを示唆している。ｐＫＮＬ２及びｐＫＮＬ３がコードする切断型のタンパク質は、触媒的な折り畳みにとって重要かもしれない潜在的なβストランドを欠損している（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のタンパク質（イヌリン分解酵素）はオリゴ糖を分解することができるため、グライコバイオロジー、特にグライコーム解析に有用である。また、本発明の核酸は、形質転換体の生産及び本発明のタンパク質の産生に利用することができる。さらに、かかる形質転換体は、プロバイオティクス及びシンバイオティクスに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】様々な炭素源の存在下におけるL. casei IAM1045株の増殖曲線を表す図である。矢印で示した時点で、様々な炭素源を加えた。
【図２】IAM1045株（左）及び01株（右）を、イヌリンを含有するＹＰプレートで培養した結果を表す図である。
【図３】部分精製したＬｅｖＨ１及びプロテアーゼで消化したＬｅｖＨ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す図である。レーン３：部分精製ＬｅｖＨ１、レーン４〜７：プロテアーゼＶ８の消化物（順に０、０．１２５、０．２５及び０．５ユニット）、レーン８〜１０：トリプシン消化物（順に２、４及び１０μｇ）。白抜き印はプロテアーゼを表す。１０％ゲル（レーン１〜７）及び１２％（レーン８〜１０）ゲルで電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
【図４】ｌｅｖＨ１の物理的地図並びにＬｅｖＨ１及び構築したプラスミドの構造を示す図である。太い棒は配列決定した６３５９ｂｐのL. casei IAM1045株のゲノムを表す。ボックスは遺伝子ｌｅｖＨ１及びｌｅｖＨＸ１を表す。閉じていないボックスは切断された遺伝子ｌｅｖＨＤ及びｙｈｆＨを表す。棒のついた白丸は二次ヘアピンループ構造を表す。制限酵素部位を一番上に示す。不完全なリピート配列をゲノムの上に示す。ゲノムの下にＬｅｖＨ１の機能ドメインを示す（ＳＰはシグナルペプチドを表す）。ＬｅｖＨ１の下に構築したプラスミド及びイヌリン分解活性を示す（＋＋＋は強、＋は非常に弱、−は検出されなかったことを表す）。
【図５】ＬｅｖＨ１の構造と他のＧＨ３２メンバーの構造とを比較した図である。ＳＰはシグナル配列を表し、Ｉ〜ＶＩＩはモチーフを表す。
【図６】ｌｅｖＨ１のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を表す図である。配列決定したＤＮＡのうち、５６５〜４７３８番目の核酸を示す。破線はｌｅｖＨ１の省略した塩基を表す。Ｒ．Ｂ．はリボソーム結合部位を表す。アステリスクは終止コドンを表す。転写プロモーター様配列を塩基配列の上に棒で示す。矢印はステムループの二次構造を表す。ループとＲ．Ｂ．の間の２つの不完全なリピートは以下のように表される：同一塩基は影付き、ＣＲＥ様配列はボックス。シグナルペプチドはボックスで表され、切断箇所は破線の矢印で表される。グラム陽性菌の表面タンパク質のＣ末端共通モチーフは、以下のように表される：Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｐｒｏ／Ｇｌｙ−リッチ領域は波下線、ＬＰＸＴＧモチーフはボックス、疎水性膜アンカー領域は二重線のボックス、正に荷電した領域は下線。ｒ５及びＲＳ−１は不完全なリピート配列を表す。
【図７】構築した組換えプラスミドがコードするアミノ酸配列を表す図である。ＬｅｖＨ１のＳ３９からＲ８１０までのアミノ酸配列を示す。ＧＨ３２メンバーの保存配列（ＩからＶＩＩ）を示し、同一塩基は影付きで表す。Ｄ１９８−Ｄ３８９−Ｅ４４０の３残基はアステリスクで表す。二次βストランドは棒で表す。構築した４つの欠失変異体をイヌリン分解活性と共に示す。
【図８】ｌｅｖＨ１触媒ドメインを発現させた大腸菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す図である。レーン１：マーカー、レーン２：ｐＵＣ１１８（０時間）、レーン３：ｐＵＣ（２時間）、レーン４：ｐＫＮＬ１（０時間）、レーン５：ｐＫＮＬ１（２時間）、レーン６：ｐＫＮＬ２（０時間）、レーン７：ｐＫＮＬ２（２時間）、レーン８：ｐＫＮＬ３（０時間）、レーン９：ｐＫＮＬ３（２時間）、レーン１０：ｐＫＮＬ４（０時間）、レーン１１：ｐＫＮＬ４（２時間）。過剰産生されたタンパク質を矢印で示した。
【図９】ｌｅｖＨ１触媒ドメインを発現させた大腸菌のハロアッセイの結果を表す図である。（ａ）エンドイヌリナーゼ（０．５ユニット）、（ｂ）エキソイヌリナーゼ（６ユニット）、（ｃ）ｐＵＣ１１８、（ｄ）ｐＫＮＬ２、（ｅ）ｐＫＮＬ４、（ｆ）ｐＫＮＬ１、（ｇ）ｐＫＮＬ３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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