(57)【要約】【課題】投影角度や次元数が制限されない信頼性のある自動化された投影スペクトロスコピを提案する。【解決手段】（ａ）一群のＮ次元実験からＮ次元ＮＭＲ実験を選択し、投影の次元（Ｄｉ）を選択し、ｊ組（ｊ≧２）の投影角度を制約なしに選択するステップと、  （ｂ）選択された投影角度でのｊ個の投影の離散的な組をＮ次元ＮＭＲ実験から記録するステップと、  （ｃ）ｊ個の投影スペクトルの各々についてピークを取り出しピークリストを作成するステップとを含むデータ記録を備えたＮ次元ＮＭＲ実験用の投影スペクトロスコピ方法であって、  （ｄ）Ｎ次元スペクトル（Ｎ≧３）での同一の共鳴から生ずる投影スペクトルに生じるピークをＮ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いて自動的に同定し、またＮ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いてＮ次元ピークリストを計算するステップを含むことを特徴とする。それにより、投影角度及び次元の制限がない信頼性のある自動投影スペクトロスコピ方法を実現する。【選択図】図４
2006343330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）一群のＮ次元実験からＮ次元ＮＭＲ実験を選択し、投影の次元（Ｄｉ）を選択し、ｊ組（ｊ≧２）の投影角度を制約なしに選択するステップと、
（ｂ）選択された投影角度でのｊ個の投影の離散的な組を、前記Ｎ次元ＮＭＲ実験から記録するステップと、
（ｃ）前記ｊ個の投影スペクトルの各々についてピークを取り出してピークリストを作成するステップと
を含むデータ記録を備えたＮ次元ＮＭＲ実験用の投影スペクトロスコピの方法であって、
（ｄ）Ｎ次元スペクトル（Ｎ≧３）での同一の共鳴から投影スペクトルに生ずるピークを、Ｎ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いて自動的に同定し、また、Ｎ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いてＮ次元ピークリストを計算するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｄ）が、
（ｉ）（ｃ）で作成されたｊ個のピークリストから選択されたｘ個（ｘは交点の存在を保証する最小の数）のピークリストにおけるピークから生ずる部分空間のＮ次元スペクトルにおける交点である候補点（Ｃ）を計算するステップと、
（ｉｉ）前記ｊ個のピークリスト全部を用いて、交差する部分空間の数Ｓを各候補点Ｃについて計算するステップと、
（ｉｉｉ）前記選択された候補点（Ｃ）に寄与するすべてのピークを同定することによりピーク・サブグループ・リストを作成するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）までをｋ−１回（ｋ≧１）反復するステップと、
（ｖ）ｋ個のピーク・サブグループ・リストを結合するステップと、
（ｖｉ）（ｖ）で得た結合されたリストにおけるピーク・サブグループ・リストのピーク・サブグループ（１，２，３）に基づいて前記Ｎ次元スペクトルにおけるピーク位置を計算するステップと
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともＳｍｉｎ個の交差する部分空間に対して寄与する候補点（Ｃ）のみを考慮することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉ）の後でサブグループ（１，２，３）のランク付けと削除を行うことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｖ）の後でサブグループ（１，２，３）のランク付けと削除を行うことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）を自動ピーク取り出しルーチンにより行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｖｉ）における該Ｎ次元スペクトルでのピーク位置が、対応するサブグループからのｘ個の選択されたピークから生ずるｗ個の部分空間の交差の算術平均であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）をステップ（ｂ）及び又はステップ（ｃ）と同時に行い、前記ステップ（ｄ）がデータ記録に影響を及ぼすと共にＮ次元ピークリストが決定されたときに測定を停止可能であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）で得たＮ次元ピークリストを、自動シーケンス固有の共鳴の帰属及び又は自動構造決定に用いることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ次元（Ｎ≧３）ＮＭＲ実験用の投影スペクトロスコピ方法に関し、この方法はデータ記録を備え、このデータ記録は、
（ａ）一群のＮ次元実験からＮ次元ＮＭＲ実験を選択し、投影の次元（Ｄｉ）を選択し、ｊ組（ｊ≧２）の投影角度を制約なしに選択するステップと、
（ｂ）選択された投影角度でのｊ個の投影の離散的な組をＮ次元ＮＭＲ実験から記録するステップと、
（ｃ）ｊ個の投影スペクトルの各々についてピークを取り出しピークリストを作成するステップとを含む。
【背景技術】
【０００２】
この種の方法は、非特許文献４０から公知である。
【０００３】
溶液中の生物学的巨大分子のＮＭＲ研究では（非特許文献１−４）、通常、ポピュレーテッド・スペクトル領域に合わせて調節された分解能でかつ等間隔で、すべての次元における時間ドメインをサンプリングすることにより多次元ＮＭＲデータを得ている（非特許文献５）。強い磁場強度及び又は極低温検出装置による近年の感度向上に伴って、従来法で時間ドメインの所要調査時間が感度の検討に必要な時間を通常大きく上回るので、実験継続時間は、間接次元における所望分解能により決まる。中小サイズの蛋白質についての３次元実験又はより高次の実験では「サンプリング限界」状況が通常生じるが（非特許文献６）、このようなサンプリング限界の状況下では、所望の化学シフト情報の収集は、時間ドメインの非一様サンプリング（非特許文献７，８）や２つ以上の間接次元の組み合わせ（非特許文献９，１０）などの「従来と異なる」実験方式で行われる。
【０００４】
そして、間接次元を結合するというコンセプトが、低次元化した実験（非特許文献９）やＧ−マトリックス・フーリエ変換（ＧＦＴ）ＮＭＲ（非特許文献１１−１２）の端緒となった。ＧＦＴ−ＮＭＲでは、多次元ＮＭＲ実験の展開時間を結合し、データをＧ−マトリックスを用いて処理し、その結果得たスペクトルの組を一緒に分析して同一のスピン系から生ずるピークを同定し、それらの共鳴周波数を計算する（非特許文献１１）。別のアプローチである投影−再構成（ＰＲ−）ＮＭＲ（非特許文献１３−１６）では、投影断面定理（非特許文献１７，１８）をイメージング技術からの再構成法と組み合わせる（非特許文献１９，２０）。特に、時間ドメインにおける傾斜面に沿った直角位相検出方式により、多次元実験の直交投影を任意の投影角度で直接記録することができることになる（非特許文献１５）。ＰＲ−ＮＭＲでは、多次元スペクトルデータの投影から完全多次元スペクトルが再構成される（非特許文献１３−１６）。
【０００５】
複雑なＮＭＲスペクトルの分析には、人間の相互作用が関わるのが通常であり、巨大分子についてのＮＭＲスペクトロスコピの自動化は発展途上である。自動化する場合、真のピークをランダムノイズ及びスペクトル・アーチファクト並びにピークのオーバーラップから区別することが大きな問題になる（非特許文献２１−２３および４０）。
【非特許文献１】ビュートリッヒ，カー．（１９８６年）エヌエムアール  オブ  プロテインズ  アンド  ヌクレイック  エサッズ（ワイリー，ニューヨーク）
【非特許文献２】バックス，アーおよびグルツィーク，エス（１９９３年）アカウンツ  オブ  ケミカル  リサーチ，２６，１３１−１３８
【非特許文献３】ケイ，エル．イーおよびガードナー，ケイ．エイチ．（１９９７年）キャレント  オピオン  イン  ストラクチュラル  バイオロジ，７，７２２−７３１
【非特許文献４】ビュートリッヒ，カー．（２００３年）アンゲバンテ  ケミエ  インターナショナル  エディション，３３０−３３６３
【非特許文献５】エルンスト．エル．エル．ボーデンハウゼン．ゲーおよびボーカウエン，アー．（１９８７年）プリンシプルス  オブ  ニュークレア  マグネティック  リゾンナンス  イン  ワン  アンド  ツー  ディメンションズ  （オックスフォード  ユニバーシティ  プレス，オックスフォード）
【非特許文献６】シパルスキ，ティー．，イエー．デー．シー．，スクマラン，デー．ケイ．，モズレー，エイチ．エヌ．ビー．およびモンテリオーネ，ジー．ティー．（２００２年）ザ  プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミ  オブ  サイエンス  ユーエスエー，９９，８００９−８０１４
【非特許文献７】オレホフ，ブイ．ワイ．，イブラヒモフ．アイ．およびビレター，エム．（２００３年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２７，１６５−１７３
【非特許文献８】ロブニャック，デー．，フリュー，デー．ピー．，サストリー，エム．，サン，ゼット．ワイ．ジェー．，スターン，エー．エス．，ホハ，ヨット．ツー．およびワグナ．ゲー．（２００４年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，１７０，１５−２０
【非特許文献９】シパルスキ，ティー．，ウィルダー，ジー．，ブッシュウェラー，ジェイ．エイチおよびビュートリッヒ，カー．（１９９３年）ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ，１１５，９３０７−９３０８
【非特許文献１０】フリーマン，アール．およびクープス，イー．（２００４年）コンセプツ  イン  マグネティック  リゾナンス，２３Ａ，６３−７５
【非特許文献１１】キム，エス．およびシペルスキ，ティ．（２００３年）ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ，１２５，１３８５−１３９３
【非特許文献１２】コズミンスキ，ダブリュおよびツーコフ、アイ．（２００３年）  ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２６，１５７−１６６
【非特許文献１３】クープス，イー．およびフリーマン，アール．（２００３年）ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ，１２５，１３９５８−１３９５９
【非特許文献１４】クープス，イー．およびフリーマン，アール．（２００３年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２７，３８３−３８７
【非特許文献１５】クープス，イー．およびフリーマン，アール．（２００４年）  ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ，１２６，６４２９−６４４０
【非特許文献１６】クープス，イー．およびフリーマン，アール．（２００４年）コンセプツ  イン  マグネティック  リゾナンス，２２Ａ，４−１１
【非特許文献１７】ブレースウエル，アール．エウ．（１９５６年）オーストラリアン  ジャーナル  オブ  ザ  フィジックス，９，１９８
【非特許文献１８】ナガヤマ，ケイ．，バックマン，ペー，ビュートリッヒ，カー．およびエルンスト．エル．エル．（１９７８年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，３１，１３３−１４８
【非特許文献１９】メルゼレオ，エル．エム．およびオッペンハイム，アー，フォア．（１９７４年）プロシーディングス  アイトリプルイー，６２，１３１９−１３３８
【非特許文献２０】ラウテルビュ，ペー．ツェ．（１９７３年）ネイチャ，２４２，１９０−１９１
【非特許文献２１】コーラデ，エル．，ビルテル，エム．、エンゲリ，エム．，ギュンタ，ペー．およびビュートリッヒ，カー．（１９９８年）  ジャーナル  オブ  マグネッチク  リゾンナンス，１３５，２８８−２９７
【非特許文献２２】ヘルマン，エー．，ギュンテルト，ペー．およびビュートリッヒ，カー．（２００２年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２４，１７１−１８９
【非特許文献２３】バラン，エム．シー．，ファング，ワイ．ジェー．，モズレー，エイチ．エヌ．ビー．およびモンテリオーネ，ジー．ティー．（２００４年）ケミカル  レビュー，１０４，３５４１−３５５５
【非特許文献２４】グジェジーク，エス．およびバックス，エー．（１９９２年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，９６，４３２−４４０
【非特許文献２５】ヤング，デー．ダブリュ．およびケイ，エル．イー．（１９９９年）ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ，１２１，２５７１−２５７５
【非特許文献２６】ネリ，デー．，ビルター，エム．およびビュートリッヒ，カー．（１９９２年）ヤーナル  オブ  モレキュラ  バイオロジ，２２３，７４３−７６７
【非特許文献２７】エテザニィ−イスファジャニ，ティー．，ヘルマン，テー．，ペティ，ダブリュ．，クレック，エイチ．イー．，レズリー，エス．エー．およびビュートリッヒ，カー．（２００４年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２９，４０３−４０６
【非特許文献２８】ネリ，デー．，シパルスキ，ティー．，オッティング，ジー．，セン，エイチ．およびビュートリッヒ，カー．（１９８９年）バイオケミストリ，２８，７５１０−７５１６
【非特許文献２９】エテザニィ−イスファジャニ，ティー．，ペティ，ダブリュ．およびビュートリッヒ，カー．（２００３年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２５，１６７−１６８
【非特許文献３０】ディマルコ，エー．およびビュートリッヒ，カー．（１９７６年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，２４，２０１−２０４
【非特許文献３１】バルトルディ，イー．およびエルンスト．エル．エル．（１９７３年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，１１，９−１９
【非特許文献３２】ギュンタ，ペー．，デッシュ，フォア．，ワイダ，ジー．およびビュートリッヒ，カー．（１９９２年）ジャーナル  オブ  バイオモレキュラ  エヌエムアール，２，６１９−６２９
【非特許文献３３】バーテル．ツエー．，ギュンタ，ペー．およびビュートリッヒ，カー．（１９９５年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，Ａ１１７，３３０−３３３
【非特許文献３４】ブルム，ディ．ピー．およびエルンスト．エル．エル．（１９８０年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，３９，１６３−１６８
【非特許文献３５】ジーン，エイチ．およびフリーマン，アール．（１９９１年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，９３，９３−１４１
【非特許文献３６】ピオット，エム．，レピク，アール．ソーデック，ブイ．（１９９３年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，Ａ１０２，２４１−２４５
【非特許文献３７】マッコイ，エム．エー．およびミュラー，エル．（１９９２年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，９９，１８−３６
【非特許文献３８】シェーカ，エイ．ジェィ．，リー，シィ．，ジェィ．およびパイネス，エー．（１９８８年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，７７，２７４−２９３
【非特許文献３９】シェーカ，エイ．ジェィ．，ケラー．ジェィ．，フランキエル，ティ．およびフリーマン，．アール．（１９８３年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，５２，３３５−３３８
【非特許文献４０】モズレー，エイチ．エヌ．ビー．，リアツ，エヌ．，アラミニ，ジェィ．エム．，シペルスキ，ティ．，およびモンテリオーネ，ジー．ティー．（２００４年）ジャーナル  オブ  マグネティック  リゾナンス，１７０，２６３−２７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
公知の方法には、可能な投影角度の個数に制限がある、動作中に手動で相互作用する必要があるなどの不都合がある。さらに、現在の自動化方法はＮ＝３の場合に限られ、より高い次元への拡張は容易ではない。
【０００７】
本発明の目的は、上記の不都合を解決して、投影角度や次元が制限されず高信頼度の自動式投影スペクトロスコピ方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、
（ｄ）Ｎ次元スペクトル（Ｎ≧３）における同一の共鳴から投影スペクトルに生ずるピークを、Ｎ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いて自動的に同定し、また、Ｎ次元空間における投影の幾何的性質を利用するベクトル代数を用いてＮ次元ピークリストを計算するステップを含む方法によって達成される。
【０００９】
本発明は、自動式投影スペクトロスコピ（ＡＰＳＹ）方法を提供する。この方法は、Ｎ次元ＮＭＲ実験の投影スペクトルを自動分析するものであり、同一の共鳴からＮ次元スペクトルに生ずるピークを同定する。これはベクトル代数に基づいており、Ｎ次元空間における投影の幾何的性質を利用する。原理的には、自動分析ではスペクトルが高次元であることが利点になる。ピークがより広く分離し、ピークの重なりが実質的に減少するからである。ＡＰＳＹは、任意の次元Ｎ≧３で適用でき、また、投影角度や投影数に制限はない。
【００１０】
本発明の方法の好ましい変形例では、ステップ（ｄ）は、
（ｉ）（ｃ）で作成されたｊ個のピークリストから選択されたｘ個（ｘは交点の存在を保証する最小の数）のピークリストにおけるピークから生ずる部分空間のＮ次元スペクトルにおける交点である候補点を計算するステップと、
（ｉｉ）ｊ個のピークリスト全部を用いて、交差する部分空間の数Ｓを各候補点Ｃについて計算するステップと、
（ｉｉｉ）選択された候補点に寄与するすべてのピークを同定することによってピーク・サブグループ・リストを作成するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）までをｋ−１回（ｋ≧１）反復するステップと、
（ｖ）ｋ個のピーク・サブグループ・リストを結合するステップと、
（ｖｉ）（ｖ）で得た結合されたリストにおけるピーク・サブグループに基づいて該Ｎ次元スペクトルにおけるピーク位置を計算するステップとを含む。
【００１１】
この方法によれば、数が増大したピークを同定できる。通常、ｋは≧１０になるように選ばれ、好ましくは約１００以上である。
【００１２】
アーチファクトを減らすために、少なくともＳｍｉｎ個の交差する部分空間に対して寄与する候補点のみを考慮することが好ましい。
【００１３】
ステップ（ｉｉ）及び又はステップ（ｖ）の後でサブグループのランク付けと削除を行うことにより、アーチファクトをさらに減らすことができる。
【００１４】
ステップ（ｃ）を自動化されたピーク取り出しルーチンによって行うことが有利である。人間の相互作用は不要である。ピークリストが手動によるよりも迅速に得られ、精度が向上する。
【００１５】
好ましい変形例では、ステップ（ｖ）におけるＮ次元スペクトルでのピーク位置は、対応するサブグループからのｘ個の選択されたピークから生ずるｗ個の部分空間の交差の算術平均である（ただしｗ≧１）。これにより精度がさらに向上する。
【００１６】
ステップ（ｄ）をステップ（ｂ）及び又はステップ（ｃ）と同時に行い、ステップ（ｄ）がデータ記録に影響を及ぼすと共にＮ次元ピークリストが決定されたときに測定を停止可能にすることが有利である。精度を高めつつ時間を短縮することができる。
【００１７】
ステップ（ｄ）で得たＮ次元ピークリストを、自動シーケンス固有の共鳴の帰属に用いることができる。これは人的資源を排除して帰属の効率を高める応用である。
【００１８】
さらに、ステップ（ｄ）で得たＮ次元ピークリストを、自動構造決定に用いることができる。この応用は人間のバイアスを排除し、構造決定効率を高める。
【００１９】
詳細な説明と添付図面からその他の利点も明らかになる。上述した特徴及び以下で述べる特徴は、本発明に従って、単独で利用することも任意の組み合わせで利用することもできる。記述される実施の形態は、すべてを列挙したものではなく、本発明を説明するための例示的な性格のものであると理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、クープスおよびフリーマン（非特許文献１５）に記載の高次元ＮＭＲ実験の投影の記録技法とヘルマン外（非特許文献２２）の方式を用いた自動ピーク取り出しを、新しいアルゴリズムＧＡＰＲＯ（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）と組み合わたものである。幾何的考察に基づいて、ＧＡＰＲＯは、Ｎ次元周波数空間における同一の共鳴から生ずる投影のピークを同定し、次いで、高次元データセット自体を考慮することなしにＮ次元スペクトルにおける共鳴周波数を計算する。この投影スペクトルの自動分析ＡＰＳＹ（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）は、人間の相互作用なしに元の多次元実験のピークリストを与える。以下、ＡＰＳＹの基礎を紹介し、ＡＰＳＹの特性を説明する。ＡＰＳＹの２つの例は、６３残基の蛋白質４３４リプレッサ（１−６３）（非特許文献２６）を用いた４Ｄ  ＨＮＣＯＣＡ実験（非特許文献２４，２５）及び１１６残基の蛋白質ＴＭ１２９０（非特許文献２７）を用いた５Ｄ  ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験（非特許文献１１）である。
【００２１】
理論的背景
投影スペクトルの記録。ブレースウエル（非特許文献１７）による投影断面定理はナガヤマ外（非特許文献１８）によりＮＭＲに導入されたが、この定理によれば、Ｎ次元時間ドメインデータのｍ次元断面（ｍ＜Ｎ）ｃｍ（ｔ）は、ｍ次元フーリエ変換Ｆｔとその逆変換Ｆωにより、周波数ドメインにおけるＮ次元ＮＭＲスペクトルのｍ次元直交投影Ｐｍ（ω）に関連づけられる。Ｐｍ（ω）およびｃｍ（ｔ）は、それぞれに対応する座標系に関し同一角度方向に向く（図２）。これを基礎にして、クープスおよびフリーマンは、投影Ｐｍ（ω）に対応する時間ドメインデータｃｍ（ｔ）を直線（図２の破線）に沿ってサンプリングすることにより、投影Ｐｍ（ω）を記録することを提案した。その後の多次元フーリエ変換に係る正及び負の投影角度から、直角位相検出を得る（非特許文献１５）。
【００２２】
クロスピークの投影。ここではＮ次元スペクトル（Ｎ＞２）の２Ｄ投影Ｐ２（ω）を説明する。Ｐ２（ω）は２Ｄ平面におけるスペクトルデータを表し、Ｐ２（ω）は、
【外１】
【００２３】
2006343330.tif 000003
を単位ベクトルとする間接次元と
【外２】
【００２４】
2006343330.tif 000004
【００２５】
を単位ベクトルとする直接次元とで張られる。間接次元は、Ｎ−１個の間接次元の１Ｄ投影である。Ｎ個の時間ドメイン軸に関する２Ｄ時間ドメイン断面ｃ２（ｔ）をパラメータ化する同一の投影角度が、Ｎ個の周波数軸に関するＰ２（ω）の位置を定める（表１）。
【００２６】
表１は本発明の方法で用いられる単位ベクトル
【外３】
【００２７】
2006343330.tif 000005
の座標を示す。
【００２８】
【表１】
2006343330.tif 000006
【００２９】
例えばＮ＝５では、２つの単位ベクトル
【外４】
【００３０】
2006343330.tif 000007
および
【外５】
【００３１】
2006343330.tif 000008
はＮ次元周波数空間の座標系で次のように表される。
【００３２】
【数１】
2006343330.tif 000009
２Ｄ投影スペクトルＰ２（ω）の座標系において、投影されたクロスピークＱｉｆは位置ベクトル
【００３３】
【数２】
2006343330.tif 000010
【００３４】
を有し、ｖｉｆ，１とｖｉｆ，２は、それぞれ、投影された間接次元の方向の化学シフトおよび直接次元の方向の化学シフトである。Ｎ次元座標系および２Ｄ座標系の双方の原点が、すべての次元においてスペクトル範囲の中央にある場合、Ｎ次元周波数空間における位置ベクトル
【外６】
【００３５】
2006343330.tif 000011
は次のとおりである。
【００３６】
【数３】
2006343330.tif 000012
【００３７】
Ｎ次元クロスピークＱｉは、点Ｑｉｆにおいて投影平面と直交する（Ｎ−２）次元部分空間Ｌ内に位置する（図２参照）。ＡＰＳＹでは、ｊ個の投影の組が記録される。各Ｎ次元クロスピークＱｉから、投影されたピークＱｉｆ（ｆ＝１，・・，ｊ）がｊ個の投影の各々に現れる。同一のＮ次元ピークＱｉから生ずる投影ピークの組｛Ｑｉ１，・・，Ｑｉｊ｝は、Ｑｉのピーク・サブグループと定義される。このサブグループが既知であると共に十分な数のエレメントを含んでいれば、すべてのサブグループ・エレメントからの部分空間の交差から、Ｑｉの座標を計算することができる。２Ｄ投影の場合、少なくともＮ−１個のエレメントが必要である。
【００３８】
ＡＰＳＹ手順。この手順は図３に概略が示され、また図４に図示がある。オペレーターは、所望のＮ次元ＮＭＲ実験、投影スペクトルの次元およびｊ組の投影角度（ｊ≧Ｎ−１）を選択し、また、投影スペクトルを記録する。これらのスペクトルのピークは、プログラムＡＮＴＯＳ（非特許文献２２）を用いて自動的に取り出され、ｊ個のピークリストが得られる。これらのリストはピークＱｇｆを含み、ｇは各投影ｆ（ｆ＝１，・・・，ｊ）におけるピークの任意の数表現である。ＧＡＰＲＯは、これらのピークリストから任意にＮ−１個を選択し、これらの投影におけるピークＱｇｆに関連づけられた部分空間Ｌｇｆを生成する（図４ａ）。Ｎ次元空間における部分空間Ｌｇｆの交差すなわち共通部分は、Ｎ次元クロスピークの位置の候補である（図４ａでの白丸）。候補点Ｃの数は、スペクトルにおけるピークの数を上回るのが普通である。これらの候補点の各々につき、該点で交差するｊ個の投影全部から、サポートＳが部分空間の数として計算される。これにより、各投影から最大で１つの部分空間が考慮され（図４ｂ。下記参照）、よってＮ−１≦Ｓ≦ｊである。ある候補点Ｃのサポートに寄与する部分空間に関連するピークＱｉｆは「ピーク・サブグループ」を構成する。サブグループは高いＳ値に関してランク付けされ、上位のサブグループが選択される（縮退している場合、上位のサブグループの１つを任意に選択する）。このサブグループにおけるピークＱｉｆから生ずる部分空間を除去し、残りの候補点Ｃについての新しいＳ値が、残りの部分空間から計算される（図４ｃ）。残りのすべての候補点ＣについてのＳ値がユーザが定義する閾値Ｓｍｉｎ，１よりも小さくなるまでこの手順が反復され、その時点でピーク・サブグループのリストが生成される。サブグループの同定は、Ｎ−１個の投影からランダムに選択したｋ個の異なる組み合わせを用いて反復され（ユーザーが定義するパラメーターｋは、Ｎ−１個の投影の可能な組み合わせの総数よりも小さい）、そして、ｋ個のピーク・サブグループ・リストを得る（図３の灰色のボックス）。これらのリストは単一のリストに結合され、それが再び同種のランク付け手順にかけられ、Ｓ＜Ｓｍｉｎ，２であるサブグループ全てが除去されることになる。得られたサブグループの「最終」リストから、Ｎ次元空間におけるピーク位置が計算される（図４ｄ）。以下、図３の個々のステップで用いられる計算法について説明する。
【００３９】
部分空間の交差。数学的取扱いを簡単化するため、（Ｎ−ｌ）次元部分空間Ｌ（１＜ｌ＜Ｎ）を、この部分空間内の点ＱＬ及び部分空間Ｌに直交する１組の正規直交ベクトル
【外７】
【００４０】
2006343330.tif 000013
【００４１】
により記述する。例えば、５Ｄ周波数空間における４つの３Ｄ部分空間を交差させるには、３Ｄ部分空間のうちの２つを交差させて２Ｄ部分空間とし、この2Ｄ部分空間を残りの３Ｄ部分空間の１つと交差させて１Ｄ部分空間とし、この1Ｄ部分空間を４番目の３Ｄ部分空間と交差させて１つの点とすることができる。
【００４２】
ＬとＭは、（Ｎ−ｌ）次元および（Ｎ−ｍ）次元の２つの部分空間であり、（１＜ｌ＜Ｎ）及び（１＜ｍ＜Ｎ）である。Ｌは
【外８】
【００４３】
2006343330.tif 000014
および点ＱＬにより記述され、Ｍは
【外９】
【００４４】
2006343330.tif 000015
および点ＱＭにより記述される。ＬとＭの双方は直接次元と直交し、したがって、
【外１０】
【００４５】
2006343330.tif 000016
【外１１】
【００４６】
2006343330.tif 000017
【００４７】
の双方は、直接次元の単位ベクトルを含んでいる。下式（３）および式（４）が満たされるならば、部分空間ＬとＭは（Ｎ−ｋ）次元の部分空間Ｋで交差する。ここで、ｋ＝ｌ＋ｍ−１である。
【００４８】
【数４】
2006343330.tif 000018
【００４９】
【数５】
2006343330.tif 000019
【００５０】
ＱＬ（Ｎ）及びＱＭ（N）はそれぞれＱＬとＱＭのN番目の座標であり、Δｖｍｉｎはユーザーが定義する直接次元における交差許容幅であり、ｄｉｍは「の次元」を意味する。式（４）は、
【外１２】
【００５１】
2006343330.tif 000020
および
【外１３】
【００５２】
2006343330.tif 000021
が直接次元だけを共有することを示唆する。部分空間Ｋは直交基底
【外１４】
【００５３】
2006343330.tif 000022
【００５４】
および
下式（５）のｌ＋ｍ個のスカラー積によって与えられる座標１乃至Ｎ−１を有する点ＱＫにより記述される。
【００５５】
【数６】
2006343330.tif 000023
【００５６】
ＱＫのＮ番目の座標は、ＱＬのＮ番目の座標とＱＭのＮ番目の座標の算術平均である。
【００５７】
点と部分空間の間の距離。点Ｑと、点ＱＬ及びＬと直交する１組の正規直交ベクトル
【外１５】
【００５８】
2006343330.tif 000024
【００５９】
により記述される（Ｎ−ｌ）次元部分空間Ｌとの間の距離は、次式で与えられる
【００６０】
【数７】
2006343330.tif 000025
【００６１】
Ｎ次元空間におけるピーク位置。一般に、ピーク位置は実験データにより過剰に決定されるという事実があり、この事実がピーク座標を絞り込むために利用される。各サブグループからＮ−１個のエレメントが任意に選ばれ、関連する部分空間を交差させてＮ次元ピークの位置を得る（図４）。この手順がｗ回反復される。ｗはユーザーが定義するパラメーターである。個々の化学シフト測定精度が限られているので、同手順により、少しずつ異なるｗ個のピーク位置を得る。次に、これらのピーク位置を各次元で平均してＮ次元ピークのＱｉの最終位置を得る。
【００６２】
材料と方法
サンプル調製。非特許文献２６及び２８に公表されている手順に従って、［Ｕ−１３Ｃ，１５Ｎ］で標識付けした４３４−リプレッサ（１−６３）を生成した。ＮＭＲ測定のため、ｐＨ６．５の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中で０．９ｍＭサンプルを調製した。［Ｕ−１３Ｃ，１５Ｎ］で標識付けしたＴＭ１２９０を非特許文献２９の記載のように生成した。ｐＨ６．０の２０ｍＭリン酸バッファ中で３．２ｍＭ蛋白質濃度のＮＭＲサンプルを調製した。どちらのＮＭＲサンプルも９５％／５％のＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏと０．１％ＮａＮ３を含んでいた。
【００６３】
質量分析。使用したＮＭＲ実験方法を以下に説明する。４３４−リプレッサ（１−６３）につき３０°Ｃでの４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ実験を、ｚ−勾配三重共鳴プローブを備えたブルーカＤＲＸ７５０ＭＨｚスペクトロメーターを用いて記録した。Ｓｍｉｎ，１＝Ｓｍｉｎ，２＝３（図３）、ｋ＝１００（図３）、ｗ＝４００（図３）、Δｖｍｉｎ＝７．５Ｈｚ（式（３））、ＡＴＮＯＳピーク取り出しでの信号対雑音比Ｒｍｉｎ＝４．０（非特許文献２２）及び部分空間の交差の最小距離ｒｍｉｎ＝１００Ｈｚというパラメータの下で、ＧＡＰＲＯアルゴリズムを適用した。２．８ＧＨｚペンティアム(登録商標)４プロセッサーでリナックスを動かす標準的なパーソナルコンピュータの場合、ＧＡＰＲＯの計算時間は約１０分であった。
【００６４】
ＡＰＳＹ  ＮＭＲ用の実験方法の例
４Ｄ  ＴＲＯＳＹ＝ＨＮＣＯＣＡ（非特許文献２５）と同様、１３Ｃ’の展開時間を加えることにより、４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ実験用のパルスシーケンス（図６）を、３Ｄ  ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ用のパルスシーケンス（非特許文献２４）から導いた。７５０ＭＨｚの１Ｈ周波数において、３つの間接次元ω１（１５Ｎ）、ω２（１３Ｃ’）及びω３（１３Ｃα）を１６００Ｈｚ，１９００Ｈｚ及び５７００Ｈｚのスペクトル幅でそれぞれ記録し、２つの投影角度α，β（表１）を用いて１つの間接次元に投影した。インタースキャン遅延は１秒で、間接次元におけるデータ点あたり８つのトランジェントを蓄積した。スイープ幅１１．０ｐｐｍで直接次元において１０２４個の複素点を記録した。フーリエ変換の前に、ＦＩＤに７５°シフトしたサインベル（非特許文献３０）を乗じ、ゼロフィルして２０４８個の複素点にした。間接次元では、データに７５°シフトしたサインベルを乗じ、ゼロフィルして最も近い次の２の冪個の複素点にした後、フーリエ変換を行った（非特許文献３１）。ＰＲＯＳＡ（非特許文献３２）を用いてスペクトルを自動的に整相した。間接次元におけるＩＦＬＡＴ法（非特許文献３３）及び間接次元の多項式を用いて、ベースラインを補正した。ｊ＝２７個の投影を、以下の投影角度及び間接次元の複素点の個数ｎ（α，β，ｎ）＝（０°，０°，４２），（０°，９０°，４８），（９０°，０°，１６），（±３０°，０°，４０），（±６０°，０°，２４），（０°，±３０°，６４），（０°，±６０°，４８），（９０°，±３０°，４４），（９０，±６０°，５４），（±３０°，±６０°，５６），（±６０°，±６０°，５６），（±４５°，±３０°，６４）により記録した。
【００６５】
５Ｄ  ＡＰＳＹ＝ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験では、キムおよびシペルスキ（非特許文献１１）のパルスシーケンスを、グリシンＨαでスタートする磁化経路を抑制するように変形した（非特許文献３４）（図７）。（グリシンでスタートする磁化移動は５つの化学シフトのうち４つが同一で、Ｈαシフトだけが異なるピークを生ずる。このようなピーク対の間隔は多次元空間では非常に密である。原理的には、ＡＰＳＹは、投影角度の選択の調整やＧＡＰＲＯアルゴリズムの変更によりこのような状況に対処可能であると思われる）。５００ＭＨｚの１Ｈ周波数において、４つの間接次元ω１（１Ｈα）、ω２（１３Ｃα）、ω３（１３Ｃ’）及びω４（１５Ｎ）を２０００Ｈｚ，３６００Ｈｚ，１６００Ｈｚ及び１５５０Ｈｚのスペクトル幅でそれぞれ測定し、３つの投影角度α、β及びγを用いて１つの間接次元に投影した（表１）。
【００６６】
【表２】
2006343330.tif 000026
【００６７】
表２は、図９に示す２８個の２Ｄ投影ａ１ないしａ２８の記録に用いた次元ω１−４における投影角度とスペクトル幅ＳＷを示す。投影された間接次元におけるスペクトル幅ＳＷは、
【００６８】
【数８】
2006343330.tif 000027
【００６９】
から計算される。ここで、
【外１６】
【００７０】
2006343330.tif 000028
は単位ベクトル
【外１７】
【００７１】
2006343330.tif 000029
【００７２】
の座標であり（式（１）），ＳＷｚは個々の４つの間接次元のスペクトル幅である。次元ω１−４は、投影角度α、β及びγで得た４つの間接次元，ω１（１Ｈα），ω２（１３Ｃα），ω３（１３Ｃ’）及びω４（１５Ｎ）の投影である（表１及び２）。
【００７３】
表２に示すパラメーターを用いて、全部で２８個の投影が１２８の複素点で間接次元において記録された。２８個の投影スペクトルを図９に示す。インタースキャン遅延は１秒で、間接次元におけるデータ点あたり４個のトランジェントが蓄積された。直接次元では、１０２４の複素点をスペクトル幅１２．０ｐｐｍで記録した。投影スペクトルを、４Ｄ−ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ実験に関して上述したように処理した。
【００７４】
ピーク取り出し。２Ｄ投影スペクトルの自動的ピーク取り出しを、ＡＴＮＯＳ（非特許文献２２）から導出したピーク取り出しルーチンにより行った。これはスペクトルのすべての局所極大を認識するものである。４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ実験では、グルタミンとアスパラギンの側鎖からのピークを、次のパラメーターをもつピークの対をすべて除くことにより除去した。６．５−８．２ｐｐｍの範囲のプロトン化学シフトであって、間接次元における化学シフトの差が１０Ｈｚ未満でかつ直接次元における化学シフトの差が４００から７００Ｈｚまでの間にあるもの。
【００７５】
結果
ＡＰＳＹ−ＮＭＲスペクトロスコピを、ここでは４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ及び５Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験によって例示する。４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡ実験は、６．９ｋＤ蛋白質４３４−リプレッサ（１−６３）で記録された。使用したパルス・シーケンス（図６）及びその他の実験の細部は「材料と方法」に示した。全スペクトロメータ時間４ｈにおいて、ｊ＝２７の２Ｄ投影を次の投影角度で記録した（表１）。（α，β）＝（０，０），（０，９０），（９０，０），（±３０，０），（±６０，０），（０，±３０），（０，±６０），（９０，±３０），（９０，±６０），（±３０，±６０），（±６０，±６０），（±４５，±３０）。投影スペクトルは、ＡＮＴＯＳ（非特許文献２２）によりピーク取り出しを行い、ＧＡＰＲＯへの入力を生成した。約１５分のＧＡＰＲＯ計算時間の後に得た４Ｄピークリストは５９個のピークを含んでいた。これに対して、分子の化学構造から予期されるピークは全部で６０個であった。各投影で平均して１８±９のノイズ・アーチファクトが取り出されたが、ＧＡＰＲＯアルゴリズムにより生成した最終４Ｄピークリストは５９個のクロスピークを含み、アーチファクトを１つも含まなかった（図８）。Ｎ−末端ジペプチドの残基と相関するピークだけが欠落していた。それは、すべての投影で信号強度がノイズ・レベルよりも小さかった。最終ＡＰＳＹピークリストにおける化学シフトの精度は、直接次元で１Ｈｚ、３つの間接次元の各々で８Ｈｚと推定された。
【００７６】
５Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験は、１２．４ｋＤａ蛋白質ＴＭ１２９０で記録された。使用したパルス・シーケンス（図７）を「補助材料」に記述し、その他の実験の細部を「材料と方法」に示した。この実験では、１１ｈで、２８個の２Ｄ投影が記録された。投影角度とスペクトル幅を表２に示し、２８個の２Ｄ投影を図９に示した。蛋白質ＴＭ１２９０について５Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験から生成された最終５Ｄピークリストは、分子の化学構造及び以前に公表されたＮＭＲ帰属（非特許文献２９）から予期されるすべてのピークを含み、最終ピークリストにはアーチファクトは含まれていなかった。
【００７７】
本発明の方法によれば、自動投影スペクトロスコピ（ＡＰＳＹ）の基礎が提示され、また、自動スペクトル解析用の新たなアルゴリズムＧＡＰＲＯの導入がなされた。そして、高次元異種核相関ＮＭＲ実験用のＡＰＳＹが蛋白質について実施された。２つの応用では、実験の最初のセットアップ後は人間が何ら介入することなく、４Ｄ及び５Ｄ三重共鳴スペクトルにつき高精度の化学シフトを含む完全なピークリストを得た。今後は、ＮＭＲによる蛋白質の構造決定の完全自動化されたプロセスにおいて、蛋白質の調製後、ＡＰＳＹが最初のステップになることが期待される。ＡＰＳＹは、既述のごとく自動ピーク取り出しと化学シフトリスト計算に加え、自動化されたシーケンス共鳴帰属をサポートすることが期待される。これらの考えられる目標に対して、ＡＰＳＹは同様の目的で最近導入されたＮＭＲ手法の有効な代替になる見込みがある。すなわち、ＰＲ−ＮＭＲ（非特許文献１３−１６）に比べ、ＡＰＳＹは、もっぱら実験の低次元投影スペクトルの解析に依拠するものであり、親の高次元スペクトルの再構成が不要であるという利点がある。また、ＧＦＴ−ＮＭＲ（非特許文献１１）に比べ、ＡＰＳＹは投影の数又は投影角度の組み合わせの選択に制限がないという点が異なる。しかし、ＡＰＳＹの最強の資産は、新しいアルゴリズムＧＡＰＲＯが実験的な投影スペクトルの完全自動化された解析を可能にするということである。主な結果として、完全なピーク取り出しと高精度の化学シフト・リストの計算が、人間の介入によって生ずる可能性があるバイアスなしで得られる。
【００７８】
ＡＰＳＹと蛋白質サイズ。これまで、ＡＰＳＹを６．９ｋＤａの蛋白質４３４−リプレッサ（１−６３）（図８）と１２．４ｋＤａの蛋白質ＴＭ１２９０（図９，表２）に適用した。大きな蛋白質にＡＰＳＹを適用する上でのスペクトル・オーバーラップによる制限の可能性を推定するため、ＢＭＲＢ化学シフト・デポジットからシミュレートしたｎ＝５０乃至３００残基のサイズの５４の蛋白質サンプルの４次元及び５次元三重共鳴スペクトルのピーク分離を解析した（表３）。
【００７９】
【表３】
2006343330.tif 000030
【００８０】
表３は、図５のプロットの生成に用いた蛋白質のデータベースである。これら５３の蛋白質の他、４３４−リプレッサ（１−６３）の化学シフト（ＢＭＲＢデータ２５３９及び未刊行データ）を用いた。
【００８１】
各ピークからその最近接近傍までの距離の平均ｄａｖと全スペクトル中で最も近い間隔の２つのピークの距離ｄｍｉｎを考察した。図５は、２つの実験である４Ｄ  ＨＮＣＯＣＡと５Ｄ  ＨＡＣＡＣＯＮＨに関するデータを示す。ｎとｄａｖ又はｄｍｉｎとの間に明らかな相関はなく、これは、ピークの密な接近が統計的に分布していること、また、蛋白質のサイズに関わりなく蛋白質の個々の性質に依存することを示している。図５では、ＡＰＳＹによっては解決できないおそれのあるピーク対に遭遇する統計的確率は、残基あたり１つのピークを含む４Ｄ及び５Ｄ三重共鳴データセットで代表的な、少なくとも３００残基までの蛋白質サイズについて１％未満である。したがって、スペクトルの密集よりも、信号検出の感度がＡＰＳＹの適用でより厳しい制約になることが予想される。これまでの経験からは、自動ピーク取り出し式のＡＰＳＹを効率的に利用するには、約３：１の信号対雑音比の投影スペクトルが必要である。
【００８２】
少数の予期される狭い間隔のピーク対についてはＮ次元共鳴がすべての投影スペクトルで見出されることは不要であるので、ＡＰＳＹは問題を解決するのに良い位置にある。１つ又はいくつかの投影でオーバーラップしているピークは、通常、他の多くの投影では分解される（図４）。ＧＦＴ−ＮＭＲ（非特許文献１１）と同様、自動ピーク取り出しによるピーク位置がピークオーバーラップに起因して不正確になるおそれがあることに関し、ＡＰＳＹには十分な備えがある。最終のＮ次元ＡＰＳＹピークリストは多数の測定の平均として計算されるので（図３）、いくつかの投影におけるピーク位置の不正確さが全体の精度に及ぼす影響は小さい。
【００８３】
ＡＰＳＹとスペクトル・アーチファクト。ピーク・サブグループ（図３）に属するピークの位置はすべての投影スペクトルで相関するのに対し、ランダムノイズの位置は相関していない。この２種類のピークは最初の自動ピーク取り出しでは容易に区別できないが、両者の挙動がこのように異なることからアーチファクトは効率的に識別される。アーチファクトがランキングフィルタ（図３）を通過することは困難であり、最終ピークリストに現れるおそれは少ない。本研究で説明した２つのＡＰＳＹ適用では、最初のピーク取り出しルーチンは低い信号対雑音閾値Ｒｍｉｎで適用され、また、最初のピークリストに多数の偽の信号が含まれるが、最終ピークリストはアーチファクトを含まない。この結果は、今回使用したランキング規準（図３）の選択が良好であったことを裏付けている。
【００８４】
今後のＡＰＳＹ実施の見通し。ＡＰＳＹ実験の現在のセットアップ（図３）は、Ｎ次元実験、投影の数と次元および投影角度を選択する他に、オペレーターが７つのパラメータを定義する必要がある。パラメータは、ＡＴＮＯＳピーク取り出しに関する信号対雑音比の閾値Ｒｍｉｎ、２つのランキングフィルタの閾値Ｓｍｉｎ，１とＳｍｉｎ，２、サブグループ・リスト計算の回数ｋ、最終ピーク座標計算の回数ｗ、交差の最小距離ｒｍｉｎおよび直接次元における交差許容幅Δｖｍｉｎである。ＡＰＳＹを定期的に使用する場合、最適なパラメーターが出現する可能性があり、また、自由な変数のいくつかを新しい収束規準に変更する可能性がある。投影の最適数及び次元の選択ならびに与えられた実験状況での投影角度の最適な組み合わせの同定がさらに洗練される可能性がある。これは、関与する核の異なる緩和性質を考慮することを含み、最も急速に緩和するスピンに対して展開時間の短い投影角度を用いることが考えられる。今後の技術的な向上により、例えば、線形予測によるスペクトルの高分解能化が図られ、また、データ取得とデータ解析の同時進行によるスペクトロメータ時間の向上が図られ、最終ピークリストが収束したときに不要なデータ蓄積を停止するフィードバックが行われる。
【００８５】
本発明によれば、Ｎ次元（Ｎ≧３）ＮＭＲ実験からオペレーターが選択するｊ個の投影の離散的な組を記録し、相関クロスピークを自動的に同定するＡＰＳＹ法（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が提供される。ＡＰＳＹからの結果は、ｊ個の実験的に記録された低次元の投影の幾何的解析により、Ｎ次元ＮＭＲスペクトルの完全な又はほぼ完全なピークリストを完全に自動的に生成したものである。現在のＡＰＳＹの実施では、投影−再構成スペクトロスコピ（非特許文献１５）用に開発した方法を用いてＮ次元スペクトルの二次元投影が記録される。自動化されたルーチンＡＴＮＯＳ（非特許文献２２）により、すべての投影からピークを取り出すことができる。新しいアルゴリズムＧＡＰＲＯ（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）は、ベクトル代数を用いてＮ次元スペクトルでの同一共鳴から生ずる異なる投影におけるピークのサブグループを同定し、これらのサブグループからＮ次元周波数空間におけるピーク位置を計算する。こうして、Ｎ次元の少なくとも１つで他のピークがオーバーラップしていないすべてのクロスピークにつき、曖昧さなしに同定がなされる。多数の投影における対応するピークの位置の間には相関があるので、相関のないノイズが効率的に抑制され、ＡＰＳＹは、Ｎ次元スペクトル空間において本来ピーク密度が低い生物学的巨大分子の相関スペクトルにきわめて広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】蛋白質ＴＭ１２９０の多次元ＮＭＲスペクトルにおける最近接クロスピーク対の間の１０００Ｈｚまでの周波数差ｄの分布を、三重共鳴実験について示す図であり、（ａ）は３Ｄ  ＨＮＣＯに関し、（ｂ）は４Ｄ  ＨＮＣＯＣＡに関し、（ｃ）は５Ｄ  ＨＡＣＡＣＯＮＨに関する。Ｈは、ｄの値が予期される回数である。計算は、ＴＭ１２９０の公表されている化学シフト帰属に基づいており（ＢＭＲＢ入力５５６０）、また７５０ＭＨｚの磁場強度を仮定した。
【図２】２つの間接次元ｘ，ｙを有するＮ次元周波数空間の２Ｄ部分空間に関する投影断面定理（非特許文献１７−１９）の説明図である。時間ドメイン（ｔｘ，ｔｙ）における直線上の１次元信号ｃ１ｘｙ（ｔ）（左）は、１次元フーリエ変換Ｆｔと逆変換Ｆωにより周波数ドメイン（右）におけるスペクトル（ωｘ，ωｙ）の１次元直交投影Ｐ１ｘｙ（ω）に関連づけられる。ｃ１ｘｙ（ｔ）の傾きを記述する投影角度αはＰ１ｘｙ（ω）の傾きを定める。クロスピークＱｉは投影ｆの位置Ｑｉｆに現れる。さらに、周波数ドメインの２つの次元におけるスペクトル幅ＳＷｘ，ＳＷｙも示されている。
【図３】ＡＰＳＹのフローチャートである。四角のボックスはプロセスを示し，隅が丸められたボックスは中間結果又は最終結果を示す。灰色で強調されたステップはｋ回反復され、ｋ個のピーク・サブグループのリストを生成する。
【図４】（ａ）ないし（ｄ）は、Ｎ＝３，ｊ＝５，ｋ＝１及びＳｍｉｎ，１＝３に対するアルゴリズムＧＡＰＲＯを説明する図である（図３参照）。２つの間接次元は紙面内にあり、取得次元ω３は紙面と直交する。各パネルの中央部分は、３Ｄ−スペクトルの、周波数ω３０での２Ｄ（ω１，ω２）断面を示す。この２Ｄ断面は、投影角度α＝０°，９０°，４５°，−２５°及び−６０°での３Ｄスペクトルに係る５つの実験的な２Ｄ投影の、ω３０での５つの１Ｄ断面により囲まれている。図４ａにおいて、灰色のドットは、２Ｄ投影の自動ピーク取り出しの断面に関する結果を示す（図３）。アルゴリズムは、α＝０°及びα＝−６０°で、第１ラウンドのスペクトル分析のため、ｊ個の投影のうちＮ−１＝２個を任意に選択する（図３）。これら２つの投影におけるピークに対応する部分空間の交差は、３Ｄスペクトルでの８つの候補点Ｃ（白丸）を同定する。５つの投影全部からの部分空間を用いて、各候補点についてサポートＳ（交差する部分空間の数）が計算される。明るい色のドットと黒い四角は、Ｓ＝２及びＳ＝５をそれぞれ示す（図４ｂ）。図４ｃにおいて、最も高いサポート（Ｓ＝５）の３つの候補点の１つが任意に選択される。選択された候補点Ｃに寄与する投影のすべてのピークがピーク・サブグループとして同定される（投影において番号１が付されたドット）。このサブグループからの部分空間が除去され（灰色の破線）、残りの候補点ＣのサポートＳが再計算される（Ｓ＝５の点が１つ残り、Ｓ＝４の別の１点が残る）。図４ｃに示す手順をさらに２ラウンドした後、新たに２つのサブグループが同定され、番号２及び３がそれぞれ付される（図４ｄ）。この３つのサブグループから、３Ｄスペクトルにおける３つのピークの位置が計算される（図４ｄの黒いドット）。
【図５】ピーク間隔（Ｈｅｒｔｚで示す）を蛋白質サイズに対してプロットしたものである（ｎは残基の数）。ｄａｖは最も近いピークへの平均距離であり、ｄｍｉｎは最近接ピーク対の間の距離である。（ａ）及び（ｂ）は４Ｄ  ＨＮＣＯＣＡに関し、（ｃ）及び（ｄ）は５Ｄ  ＨＡＣＡＣＯＮＨに関する。計算は、５４の蛋白質のＢＭＲＢ化学シフト・デポジットに基づいており（表３参照）、１Ｈ周波数７５０ＭＨｚを仮定した。Ｇｌｙ残基は、（ａ）及び（ｂ）のみに含まれている。
【図６】４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡに用いられるパルスシーケンスを示す図である。ラジオ周波数パルスを、１５Ｎには１１８．０ｐｐｍで、１３Ｃ’には１７４．０ｐｐｍで、１３Ｃαには５６．０ｐｐｍで、そして１Ｈには４．７ｐｐｍで加えた。炭素チャンネルのキャリア周波数は、１３Ｃ’と１３Ｃαのキャリア位置の間で２つの垂直矢印で示されたところで切り換えられた。狭いバーと広いバーはそれぞれ９０°及び１８０°パルスを表す。大文字でマークしたパルスは成形パルスとして加えた。ＡはＧａｕｓｓｉａｎ形状かつ持続時間１００μｓのパルス、ＢはＧａｕｓｓｉａｎ形状かつ１２０μｓのパルス、ＣはＩ−ｂｕｒｐ  （９）かつ２００μｓのパルス、ＤはＧａｕｓｓｉａｎ形状かつ８０μｓのパルス、ＥはＲＥ−ｂｕｒｐ（９）かつ３５０μｓのパルスである（持続時間はスペクトロメータ周波数（ここでは７５０ＭＨｚ）に依存する）。他のすべてのパルスは高出力で印加される矩形パルスとした。最後の６つの１Ｈパルスは、３−９−１９ＷＡＴＥＲＧＡＴＥエレメント（１０）を表す。灰色の１３Ｃαパルスは、選択パルス（１１）の非共鳴効果を補償するために加えた。１Ｈに対してＤＩＰＳＩ−２（１２）、１５Ｎに対してＷＡＬＴＺ−１６（１３）を用いたデカップリングを矩形で示す。ｔ４は取得時間である。ＰＦＧのマークを付した線の上において、カーブした形は、ｚ−軸方向に加えたサインベル形パルス磁場勾配を示し、持続時間と強度は次の通りである。Ｇ１は７００μｓかつ１３Ｇ／ｃｍ、Ｇ２は１０００μｓかつ３５Ｇ／ｃｍ、Ｇ３は１０００μｓかつ３５Ｇ／ｃｍ、Ｇ４は８００μｓかつ１６Ｇ／ｃｍ、Ｇ５は８００μｓかつ１３Ｇ／ｃｍ、Ｇ６は８００μｓかつ１８Ｇ／ｃｍ、Ｇ７は１０００μｓかつ２８Ｇ／ｃｍ、Ｇ８は１０００μｓかつ２８Ｇ／ｃｍである。位相サイクリングはφ１＝｛ｙ，−ｙ｝，φ２＝｛ｘ，ｘ，−ｘ，−ｘ｝，φ３＝｛４ｘ，４−ｘ｝，φ４＝｛ｘ，−ｘ，−ｘ，ｘ，−ｘ，ｘ，ｘ，−ｘ｝であり、他のすべてのパルス＝ｘである。次の遅延を用いた。τ＝２．７ｍｓ，δ＝１３．７５ｍｓ，η＝４．５ｍｓ，λ＝５０μｓ。間接展開時間ｔ１−ｔ３の増分は投影角度αとβに合わせた（明細書及び表１参照）。間接次元の直角位相検出は、投影に対して多次元フーリエ変換法（１４）を位相Y１〜Y３で用いて実現した。
【図７】５Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＡＣＡＣＯＮＨ実験に用いたパルス・シーケンスを示す図である。ラジオ周波数パルスを、１Ｈには４．７ｐｐｍで、１５Ｎには１１６．０ｐｐｍで、１３Ｃ’には１７３．５ｐｐｍで、１３Ｃαには５２．５ｐｐｍで加えた。狭いバーと広いバーはそれぞれ９０°及び１８０°パルスを表す。「Ａ」のマークを付したパルスは、５００ＭＨｚの１Ｈ周波数で持続時間１２０μｓのＧａｕｓｓｉａｎ波形として加えた。１３Ｃαと１３Ｃ’への他のすべてのパルスは矩形形状であり、９０°及び１８０°パルスに対し、それぞれ、／（Δω（Ｃα，Ｃ’）・２）及び／（Δω（Ｃα，Ｃ’）・４）の持続時間であった。１Ｈと１５Ｎへのパルスは矩形形状であり高出力で加えた。最後の６つの１Ｈパルスは、３−９−１９ＷＡＴＥＲＧＡＴＥエレメント（１０）を表す。灰色の１３Ｃ’と１３Ｃαへのパルスは、選択パルス（１１）の非共鳴効果を補償するために加えた。１Ｈに対してＤＩＰＳＩ−２（１２）、１５Ｎに対してＷＡＬＴＺ−１６（１３）をそれぞれ用いたデカップリングを矩形で示す。ｔ５は取得時間である。ＰＦＧのマークを付した線の上において、カーブした形は、ｚ軸方向に加えたサインベル形パルス磁場勾配を示し、持続時間と強度は次の通りである。Ｇ１は８００μｓかつ１８Ｇ／ｃｍ、Ｇ２は８００μｓかつ２６Ｇ／ｃｍ、Ｇ３は８００μｓかつ１３Ｇ／ｃｍ、Ｇ４は８００μｓかつ２３Ｇ／ｃｍ、Ｇ５は８００μｓかつ２６Ｇ／ｃｍ、Ｇ６は８００μｓかつ２３Ｇ／ｃｍである。位相サイクリングはφ１＝｛ｘ，ｘ，−ｘ，−ｘ｝，φ２＝｛ｘ，−ｘ｝，φ３＝｛ｘ，−ｘ，−ｘ，ｘ｝，ψ１＝ｙであり、他のすべてのパルス＝ｘである。以下の初期遅延を用いた。ｔ１ａ＝ｔ１ｃ＝１．９ｍｓ，ｔ１ｂ＝０ｍｓ，ｔ２ａ＝４．７ｍｓ，ｔ２ｂ＝８．８ｍｓ，ｔ２ｃ＝１３．５ｍｓ，ｔ３ａ＝ｔ３ｃ＝１１．０ｍｓ，ｔ３ｂ＝０ｍｓ，ｔ４ａ＝ｔ４ｃ＝１１．０ｍｓ，ｔ４ｂ＝０ｍｓ。遅延τ＝２．７ｍｓとη＝３．６ｍｓは固定し、遅延δとεは、実験中、δ＝（ｔ４ａ＋ｔ４ｂ−ｔ４ｃ）／２及びε＝４．７ｍｓ＋（ｔ３ａ＋ｔ３ｂ−ｔ３ｃ）／２に調整した。４つの間接次元では、選択した投影角度α、β及びγに起因する次元の増分に応じて、一定時間又は半一定時間の展開時間を用いた（表２）。間接次元に関する直角位相検出は、投影に対して多次元フーリエ変換法（１４）を位相Y１、Y２、Y３及びY４で用いて実現した（Y１、Y２及びY３を９０°ステップで増加させ、Y４を９０°ステップで減少させた）。
【図８】図６に示した実験方法によって測定した４３４−リプレッサ（１−６３）の４Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＮＣＯＣＡスペクトルの領域を示す図である。投影は、角度α＝０°及びβ＝９０°で記録した。これは、（ＨＮ（ｊ），Ｃα（ｊ−１））に対応する。図示したスペクトル領域は２４の共鳴を含み、すべてＡＰＳＹにより４Ｄ空間で正しく同定された。黒いドットは最終の４Ｄ  ＡＰＳＹピークリストからのピーク座標を示す。共鳴の帰属は、１文字のアミノ酸コードとアミド・プロトンのシーケンス番号により与えられる。
【図９】ｚ勾配三重共鳴極低温プローブヘッドを備えた５００ＭＨｚスペクトロメータで、蛋白質ＴＭ１２９０につき図７の方法を用いて測定した５Ｄ  ＡＰＳＹ−ＨＡＣＡＣＯＮＨの２８の２Ｄ投影ａ１乃至ａ２８を示す図である。次元ω１−４は、投影角度α、β及びγで得た４つの間接次元ω１（１Ｈα），ω２（１３Ｃα），ω３（１３Ｃ’）及びω４（１５Ｎ）の投影である（表１及び表２）。１５Ｎではキャリア周波数１１８．０ｐｐｍに、１３Ｃ’では１７３．０ｐｐｍ、１３Ｃαでは５４．０ｐｐｍ、１Ｈでは４．７ｐｐｍにスケールの中心を合わせた。投影された間接次元における投影角度及びスペクトル幅を表２に示す。すべての投影を同一の輪郭パラメーターでプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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