(57)【要約】【課題】核酸精製装置及び前記核酸精製装置を用いる核酸精製方法を提供する。【解決手段】試料導入口が形成されており、試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部、及び前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部を備える細胞またはウイルスの核酸精製装置、並びに前記核酸精製装置を用いる核酸精製方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料導入口が形成されており、前記試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部と、
前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、
を備えることを特徴とする、細胞またはウイルスの核酸精製装置。
【請求項２】
前記振動器は、超音波振動器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、機械式振動器、及び圧電物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記磁気力発生部が、レーザーの通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記細胞溶解毛細管と、弁により開閉される流路を通じて連結されているＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、
前記磁性ビーズを振動させるステップと、
前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、
前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、
前記磁性ビーズが除去された溶液を得るステップと、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸精製装置を用いて核酸を精製する方法。
【請求項６】
細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、
前記磁性ビーズを振動させるステップと、
前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、
前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、
前記磁性ビーズが除去された溶液を得た後、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通じて増幅チャンバに移送して増幅を行うステップと、
を含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法。
【請求項７】
前記レーザーが、パルスレーザーまたは連続波動レーザーを含むことを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記パルスレーザーが１ｍＪ／パルス以上の出力を有するか、または連続波動レーザーが１０ｍＷ以上の出力を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記パルスレーザーが１０ｍＪ／パルス以上の出力を有するか、または連続波動レーザーが１００ｍＷ以上の出力を有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レーザーが、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記レーザーが、７５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長帯で発生することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レーザーが、一つ以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記磁性ビーズの大きさは、５０ｎｍ〜１，０００μｍであることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記磁性ビーズの大きさは、１μｍ〜５０μｍであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁性ビーズは、二つ以上の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記毛細管状の容器は、直径と長さとの比率が１：２〜１：５０（直径：長さ）であることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記毛細管状の容器は、直径が１ｎｍ〜５ｍｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記毛細管状の容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属であるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びそれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含むことを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属でコーティングされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記磁性ビーズの表面は、負電荷を帯びていることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶解液は、唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザー及び磁性ビーズを用いた核酸精製装置、及び核酸精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞からＤＮＡの効率的な抽出は、多くの用途で必要であり、分子学的診断、特に病原菌同定及び定量化に必須である。分子学的診断は、一般的にＤＮＡ抽出ステップ後のＤＮＡ増幅により行われる。ＤＮＡ増幅反応には、重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸増幅、修復連鎖反応、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢ複製酵素増幅、及び転写活性化連結が含まれる。
【０００３】
細胞からＤＮＡの分離方法は、ＤＮＡを結合する傾向を有する物質を利用して行われる。ＤＮＡの分離のための物質の例は、シリカ、ガラス繊維、陰イオン交換樹脂、及び磁性ビーズである（非特許文献１、非特許文献２参照）。手作業ステップを避け、作業者の誤りを取り除くために、いくつかの自動化機械が大量ＤＮＡ抽出のために開発されている。
【０００４】
細胞溶解は、一般的に機械的、化学的、熱的、電気的、超音波、及びマイクロウエーブ方法で行われる（非特許文献３参照）。
【０００５】
レーザーは、細胞の破壊に対して多くの長所を有し、ＬＯＣ（Ｌａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）によく適用される（非特許文献４参照）。
【０００６】
特許文献１には、レーザー誘導された細胞溶解システムが開示されている。レーザーのみを用いたとき、効果的な細胞溶解が起こらない。透明度の高い溶液内に入れた大腸菌を用いて実験した結果、レーザーのみを照射した場合、細胞溶解効率が低いということが確認されている。１５０秒間レーザーを照射した後のＤＮＡ濃度は３．７７ｎｇ／μｌであったが、これは、レーザーエネルギーが効果的に細胞に伝達されなかったためである。一般的な加熱方法によって９５℃で５分間沸騰させた後のＤＮＡ濃度は６．１５ｎｇ／μｌである。
【０００７】
特許文献２には、増加した組織修復のための、光を吸収するナノ粒子が記載されている。この特許は、一つ以上の波長で光を吸収する、直径が１〜１０００ｎｍであるナノ粒子を、組織に運んで連結させ、前記ナノ粒子を、ナノ粒子により吸収された一つ以上の波長の光に露出させることを含む、組織を連結する方法に関するものである。この方法は、レーザー及びナノ粒子を用いて細胞の機能のみを失わせる方法であり、細胞及び粒子を含む溶液を振動させて細胞を破壊する方法については記載されていない。
【０００８】
従来から、固相を用いた核酸の精製方法が知られている。例えば、特許文献３には、固相に結合した核酸を用いた核酸精製方法が開示されている。具体的には、前記方法は、出発物質、カオトロピック物質、及び固相に結合した核酸を混合するステップ、前記核酸を有する固相を液体から分離するステップ、並びに前記固相核酸複合体を洗浄するステップを含む。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／９６４２９Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６８５，７３０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【非特許文献１】Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ  ２２，５０６〜５１１（１９９７）
【非特許文献２】Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ  ２２、５５４〜５５７（１９９７）
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、４９２〜４９６（２００１）
【非特許文献４】Ｈｕａｉｎａ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、７３、４６２５〜４６３１（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、特許文献３に開示されている方法は、時間が長くかかり、複雑であり、それゆえＬＯＣに適さない。また、この方法は、カオトロピック物質の使用の問題を有する。すなわち、カオトロピック物質を使用しない場合には、固相に核酸が結合しない。また、カオトロピック物質は、人体に有害な物質であるので注意して扱わなければならない。さらに、カオトロピック物質は、ＰＣＲなどの後続の工程を妨害する物質として作用するので、核酸の精製中または精製後に、精製された核酸から除去しなければならない。
【００１０】
ＬＯＣの実施のためには、ＤＮＡ分離の全体のステップを可能な限り減らさなければならず、このためには、細胞溶解後直ちにＰＣＲを行うことが必要である。細胞溶解後直ちにＰＣＲを行うためには、細胞溶解後のＰＣＲ阻害剤の濃度を減少させなければならない。したがって、ＬＯＣの実施のための、細胞溶解の間のＰＣＲ阻害剤を除去する方法が必要とされている。よって、本発明の目的は、レーザー及び磁性ビーズを用いて核酸を効率的に精製する装置及び前記核酸精製装置を用いた核酸精製方法を提供することにある。
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、レーザー及びマイクロ磁性ビーズを共に使用して振動させて細胞またはウイルスを破壊した後、生成したＰＣＲ阻害剤を磁性ビーズに付着させ、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズを、毛細管状の容器の壁に装着した磁石で除去することによって、核酸を効率的に精製できるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的を達成するために、本発明の第一は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部、及び前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部を備える、細胞またはウイルスの核酸精製装置を提供する。
【００１３】
本発明の第二は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、前記磁性ビーズを振動させるステップと、前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、前記磁性ビーズが除去された溶液を得るステップを含む、前記核酸精製装置を用いて核酸を精製する方法である。
【００１４】
本発明の第三は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップと、前記磁性ビーズを振動させるステップと、前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップと、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部によって前記毛細管状の容器の壁に固定させるステップと、前記磁性ビーズが除去された溶液を得た後、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通じて増幅チャンバに移送して増幅を行うステップを含む、前記核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法である。
【００１５】
本発明の装置内の細胞溶解毛細管において、試料導入口を通じて投入された試料及び磁性ビーズが混合され、ここにレーザーを照射すれば細胞溶解が起こる。振動器は、細胞溶解毛細管内の試料及び磁性ビーズを混合する装置であって、振動を起こすいかなる装置でも可能である。レーザー発生部は、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給する装置であって、特定の一つの波長の光か、または二つ以上の波長の光を出すことができる。レーザーにより、磁性ビーズは沸騰する。
【００１６】
本発明の装置において、前記振動器は、超音波振動器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械式振動器、及び圧電物質を含むことができる。
【００１７】
本発明の装置において、前記磁気力発生部は、レーザーの通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることが望ましい。
【００１８】
本発明の装置は、前記細胞溶解毛細管と流路を通じて連結されているＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えてもよい。
【００１９】
本発明の装置において、前記細胞溶解毛細管は、毛細管状の容器に対応する。
【００２０】
本発明の方法において、前記レーザーは、パルスレーザーまたは連続波動（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｗａｖｅ：ＣＷ）レーザーを含むことができる。
【００２１】
本発明の方法において、前記パルスレーザーが１ｍＪ／パルス以上の出力を有し、ＣＷレーザーが１０ｍＷ以上の出力を有する。望ましくは、前記パルスレーザーが１０ｍＪ／パルス以上の出力を有し、前記ＣＷレーザーが１００ｍＷ以上の出力を有する。さらに望ましくは前記パルスレーザーが３２ｍＪ／パルス以上の出力を有し、前記ＣＷレーザーが１０Ｗ以上の出力を有する。
【００２２】
本発明の方法において、前記レーザーは、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することが望ましく、さらに望ましくは、前記レーザーは、７５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長帯で発生する。また、前記レーザーは、一つ以上の波長帯で発生してもよい。
【００２３】
本発明の方法において、前記磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ〜１，０００μｍであることが望ましく、さらに望ましくは１μｍ〜５０μｍである。また、前記磁性ビーズが二つ以上の大きさを有するビーズの混合物でありうる。
【００２４】
本発明の方法において、前記毛細管状の容器は、直径と長さとの比率が１：２〜１：５０（直径：長さ）であり、直径が１ｎｍ〜５ｍｍである。
【００２５】
本発明の方法において、前記毛細管状の容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されうる。
【００２６】
本発明の方法において、前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属であるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びそれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含むことが望ましい。
【００２７】
本発明の方法において、前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスでありうる。
【００２８】
本発明の方法において、前記磁性ビーズの表面は、負電荷を帯びていることが望ましい。
【００２９】
本発明の方法において、前記溶解液は、唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されうる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の方法によれば、毛細管における層分離によって容易にＰＣＲ阻害剤を除去できるため、ＰＣＲの収率を高めることができる。さらに電磁石の使用により、ＰＣＲ阻害剤の除去が確実になる。また、細胞溶解と同時にＤＮＡ精製を行えるので、ＬＯＣのステップを減らすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明をステップ別にさらに具体的に説明する。
【００３２】
本発明は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を通じて試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解毛細管、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器、前記細胞溶解毛細管に装着され、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部、及び前記細胞溶解毛細管に装着され、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部を備える細胞またはウイルスの核酸精製装置に関する。
【００３３】
図１は、レーザー及びマイクロ磁性ビーズを用いて、細胞溶解後、磁性ビーズ層とＤＮＡ溶液層とを分離するために用いられるシステムの一実施形態を示す模式図である。試料及び磁性ビーズを、試料導入口を通じて細胞溶解毛細管に投入し、振動器によって投入された試料及び磁性ビーズを混合する。振動の間混合物にレーザーが照射されると、磁性ビーズは、レーザーを受けてレーザーアブレーション現象により光エネルギーを熱に変化させる。レーザーにより加熱された磁性ビーズは沸騰し、沸騰により変性した蛋白質及び細胞の残骸などのＰＣＲ阻害剤が磁性ビーズに付着する。ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズは、毛細管の壁に付着する。それゆえ、毛細管の下部に位置するＤＮＡが含まれた溶液と、毛細管の上部に位置する毛細管の壁に付着したほとんどの磁性ビーズとの間の層分離が起きる。毛細管の下部に分離したＤＮＡを含む溶液層は、ＰＣＲを実施するためにＰＣＲチャンバに移動される。前記移動は、電気的、機械的な力を用いたポンプなどにより行われる。
【００３４】
細胞溶解毛細管は、レーザーが十分に通過できる材質から構成されているか、または前記材質から構成されるウィンドウを有することができる。分離された磁性ビーズを含む層は、ガラス壁の表面に非特異的に結合するが、これは、制限的な直径を有する毛細管でさらに効率的に起きる。固定された電磁石または永久磁石は、分離された層をさらに確実に固定すると共に、固定化領域を指定するために使われうる。
【００３５】
本発明の一実施形態において、前記振動器は、超音波振動器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械式振動器、または圧電物質を含むことができる。振動器は、前記細胞溶解毛細管に装着されており、細胞及びマイクロ磁性ビーズの混合溶液を振動できるいかなる装置でも可能である。
【００３６】
本発明の一実施形態において、前記磁気力発生部は、レーザーの通路の上部に位置し、前記細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることが望ましい。図１に示すように、前記電磁石は、レーザーの通路の上部に位置させなければならないが、これは、レーザーの通路内に位置すれば、磁性ビーズがＰＣＲ阻害剤を吸着する前に電磁石に付着して、それによりＰＣＲ阻害剤の吸着の効果が低下するためである。また、細胞溶解毛細管内の磁性ビーズが沸騰するときに電源が入る電磁石であることが望ましい。磁性ビーズが沸騰する前に電源が入っていても、磁性ビーズ及び電磁石は空間的に離れていて磁気力が磁性ビーズに影響を及ぼさないので、磁性ビーズを付着できないためである。また、電磁石で除去するためには、ビーズは磁性を有していなければならない。
【００３７】
本発明の一実施形態において、前記細胞溶解毛細管と弁によって開閉される流路を通じて連結されているＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることができる。ＬＯＣの実施のためには、精製されたＤＮＡを増幅するシステムが必要である。精製されたＤＮＡは、分光光度計を用いる方法、マイクロ磁性ビーズを用いる方法、電気化学的方法、電気化学発光（ＥＣＬ）法、放射線及び蛍光標識を用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いて検出されうる。所望のＤＮＡを十分に増幅するためには、ＰＣＲ法が最も適している。その他のＤＮＡ増幅の方法も適用され、リアルタイムＰＣＲ法などを通じた直接検出も可能である。
【００３８】
本発明の一実施形態において、前記細胞溶解毛細管は、直径と長さとの比率が１：２〜１：５０（直径：長さ）であり、直径が１００ｎｍ〜５ｍｍであることが望ましい。
【００３９】
また本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップ、前記磁性ビーズを振動させるステップ、前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップ、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて毛細管状の容器の壁に固定させるステップ、及び前記磁性ビーズが除去された溶液を得るステップを含む、前記核酸精製装置を利用して核酸を精製する方法に関する。
【００４０】
前記方法において、磁性ビーズを含む溶液にレーザーを照射し、磁性ビーズがレーザーによりアブレーション現象を起こすことによって、衝撃波、蒸気圧、及び熱を細胞の表面に伝達する。このとき、物理的衝撃も細胞表面に加えられる。レーザーアブレーションとは、レーザービームが照射された物質に発生する一般的な現象を総称する。レーザーアブレーションにより、物質表面の温度は、数百から数千度まで急速に上昇する。物質表面の温度が蒸発点以上に上昇すれば、液層の物質の蒸発と共に、表面での飽和蒸気圧が急速に上昇する。
【００４１】
レーザーにより加熱された磁性ビーズは、溶液の温度を上げ、細胞を直接破壊する。溶液中の磁性ビーズは、単純な熱伝達体として存在するものではなく、熱的、機械的、及び物理的な衝撃を細胞の表面に与え、それにより細胞の表面を効果的に破壊する。
【００４２】
破壊された細胞またはウイルスの溶解液は、ＰＣＲを妨害する化合物を含む。したがって、ＰＣＲを効率的に行うためには、前記溶解液からＰＣＲ阻害剤を除去する工程が必要であるが、これは、ＬＯＣを効率的に実施することに適していない。本発明の方法は、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて細胞溶解毛細管の壁に固定させ、ＰＣＲを容易にする。
【００４３】
具体的には、沸騰により変性された蛋白質及び細胞の残骸などのＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズはレーザーにより沸騰する。ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズは、容器の壁に付着する。それゆえ、容器の下部に、磁性ビーズを含まない、ＤＮＡを含む溶液が存在し、容器の上部には、ＰＣＲ阻害剤が付着したほとんどの磁性ビーズがガラス壁に付着するので、ＰＣＲ阻害剤が容易に除去される。この層分離は、制限的な直径を有する毛細管でさらに効率的に起こる。固定された電磁石または永久磁石は、分離された層をさらに確実に固定すると共に、固定化領域を指定するために使われうる。
【００４４】
また本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液を、磁性ビーズを含む毛細管状の容器に注入するステップ、前記磁性ビーズを振動させるステップ、前記磁性ビーズにレーザーを照射して細胞またはウイルスを破壊し、細胞またはウイルス溶解液中の化合物を前記磁性ビーズに結合させるステップ、前記細胞またはウイルス溶解液中の化合物が結合した磁性ビーズを、磁気力発生部を通じて毛細管状の容器の壁に固定させるステップ、並びに前記磁性ビーズが除去された溶液を得た後、前記溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通じて増幅チャンバに移送して増幅を行うステップを含む、前記核酸精製装置を用いて核酸の精製及び増幅を連続的に行う方法に関する。
【００４５】
ＬＯＣを実施するためには、核酸の分離、精製、及び増幅を連続して行う必要がある。したがって、磁性ビーズによって精製されたＤＮＡ溶液を、前記毛細管状の容器及び増幅チャンバを連結する流路を通じて増幅チャンバに直ちに移送して核酸を増幅すれば、前記目的は達成される。核酸の増幅チャンバへの移送は、電気的、機械的な力を用いたポンプなどにより行われうる。
【００４６】
本発明の一実施形態において、前記レーザーは、パルスレーザーまたはＣＷレーザーを含むことができる。
【００４７】
低すぎるレーザー出力では、効率的にレーザーアブレーション現象は起こらない。レーザー出力は、ＣＷレーザーの場合１０ｍＷ〜３００Ｗであり、パルスレーザーの場合１ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスである。望ましくは、ＣＷレーザーは１００ｍＷ〜３００Ｗの出力を有し、パルスレーザーは１０ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスの出力を有する。さらに望ましくは、ＣＷレーザーは１０Ｗ〜３００Ｗの出力を有し、パルスレーザーは３２ｍＪ／パルス〜１Ｊ／パルスの出力を有する。ＣＷの出力が１０ｍＷ未満であり、パルスレーザーの出力が１ｍＪ／パルス未満であれば、細胞を破壊するために十分なエネルギーが伝達されない。ＣＷの出力が３００Ｗ以上であり、パルスレーザーの出力が１Ｊ／パルス以上の場合、ＤＮＡが損傷する。
【００４８】
本発明の一実施形態において、前記レーザーは、磁性ビーズがレーザーを吸収する特定の波長帯で発生しなければならない。前記レーザーは、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することが望ましく、さらに望ましくは、７５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長帯である。これは、４００ｎｍ未満の波長では、ＤＮＡが変性または損傷されるためである。また、前記レーザーは、一つ以上の波長帯で発生しうる。すなわち、レーザーは、前記波長範囲内の一つの波長でもよく、相異なる二つ以上の波長でもよい。
【００４９】
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの大きさは５０ｎｍ〜１，０００μｍであることが望ましく、さらに望ましくは、１μｍ〜５０μｍである。磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満であれば、細胞溶解を引き起こすのに不十分である。１，０００μｍを超えれば、ＬＯＣに効果的でない。また、前記磁性ビーズは、二つ以上の大きさを有する磁性ビーズの混合物であってもよい。すなわち、前記磁性ビーズは、互いに同じ大きさでもよく、相異なる大きさの磁性ビーズの混合物でもよい。
【００５０】
本発明の一実施形態において、前記毛細管状の容器は、直径と長さとの比率が１：２〜１：５０（直径：長さ）であり、直径は１ｎｍ〜５ｍｍでありうる。磁性ビーズを含む層は、ガラス壁の表面に非特異的に結合するが、これは、制限的な直径を有する毛細管において効率的に起こる。したがって、直径が前記範囲を外れた容器の場合には、層分離が難しくなって精製効果が低下する。
【００５１】
本発明の一実施形態において、前記毛細管状の容器の材質は、重合体、有機物質、ケイ素、ガラス、及び金属からなる群より選択されうる。前記容器は、ビーズが固定化されうるいかなる材質でも可能である。
【００５２】
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは、磁性を有するいかなるものも可能である。特に、強磁性を有する金属であるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びそれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも一つの物質を含むことが望ましい。
【００５３】
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは、強磁性を有する金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスでありうる。
【００５４】
本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの表面は、ＤＮＡが付着しない負電荷を帯びていることが望ましい。前記負電荷は、ＣＯＯ−でありうる。ＤＮＡが負電荷を有しているため、反発力により、負電荷を帯びた磁性ビーズの表面にＤＮＡは付着しない。磁性ビーズの表面にＤＮＡが付着すれば、細胞が破壊された後で磁性ビーズからＤＮＡを分離することが難しくなり、ＤＮＡの精製がより難しくなる。
【００５５】
本発明の一実施形態において、前記溶解液が、唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されうる。前記溶解液は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、ウイルス、ファージなど核酸を有するいかなるものでも可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解釈されてはならない。
【００５７】
調製例１：細胞溶解システム
図１に示すように、下記のように調製されたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（６０μｌ）、血清（３０μｌ）、及びマイクロ磁性ビーズ（３０μｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸、ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）を毛細管内で混合した。毛細管をボルテキシングにより攪拌しながら、各実験で指定された時間内に細胞を破壊するために８０８ｎｍ、２１．１Ｗ（ＨＬＵ２５Ｆ１００−８０８、ドイツ、ＬＩＭＯ社製）の高出力レーザービームを照射した（図１参照）。
【００５８】
調製例２：ＨＢＶ、プライマー、及びＰＣＲ
細胞から放出されたＤＮＡは、下記の対のＰＣＲプライマーを使用して検出された：プライマーＴＭＰ５−Ｆ（配列番号１）、及びプライマーＴＭＰ５−Ｒ（配列番号２）。このプライマー対は、ＨＢＶゲノムの２，２６９〜２，３８７ヌクレオチドに該当する部位であった。ＰＣＲ増幅を、Ｔａｑ重合酵素（韓国、Ｔａｋａｒａ社製）を用いて４０サイクル（５０℃で１０分、９５℃で１分間予備変性、９５℃で５秒間変性、６２℃で１５秒間アニーリング及び伸長）行った。増幅されたＤＮＡを、市販のＤＮＡ５００アッセイサイジングの試薬セットを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（カリフォルニア州パロアルト、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で分析した。
【００５９】
実施例１：磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶液層の分離
容器の形態による磁性ビーズ層及びＤＮＡを含む溶液層の層分離の程度を調べるために、多様な種類の容器を用いて層分離の程度を観察した。図２は、内径が９．９５ｍｍであり、レーザー照射後の磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶液層が混合されている容器の写真である。図２に示すように、容器の内径が９．９５ｍｍである場合には、変性された蛋白質及び細胞の残骸などのＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズがガラス壁に付着せず、ＤＮＡを含む溶液に混合されて、磁性ビーズ層及びＤＮＡを含む溶液層が分離されないということが分かる。
【００６０】
図３は、内径が４．８８ｍｍであり、レーザー照射後の磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶液層が分離されている容器の写真である。Ａは、磁性ビーズ層及びＤＮＡを含む溶液層が分離されている容器を示し、Ｂは、Ａに示す容器の拡大写真である。図３に示すように、内径が４．８８ｍｍである毛細管の場合には、ＰＣＲ阻害剤が付着した磁性ビーズ層及びＤＮＡを含む溶液層が明確に分離されるということが分かる。すなわち、分離された層に含まれている磁性ビーズは、ガラス壁の表面に非特異的に結合し、これは、直径が５ｍｍ以下である毛細管でのみ起こる。
【００６１】
実施例２：磁性ビーズへのＰＣＲ阻害剤の結合
磁性ビーズにＰＣＲ阻害剤が結合されるか否かを確認するために、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を実施した。図４は、Ｐｕｒｅ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。Ｐｕｒｅ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸は、直径が２．８±０．２μｍであり、溶液内のビーズの濃度は６×１０７ビーズ／３０μｌであった。図４に示すように、純粋な磁性ビーズは、何も付着していなかった。また、ＤＮＡは負電荷を帯びているので、磁性ビーズに付着していなかった。図５は、レーザー処理による細胞溶解後、ガラス壁に付着したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。図５から明らかなように、多くの粒子が磁性ビーズに付着していた。前記粒子は、主に変性された蛋白質及び細胞の残骸であり、それらは、ＰＣＲを妨害する主要なＰＣＲ阻害剤であった。図６は、レーザー処理による細胞溶解後、ガラス容器の中央部から採取したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。図６から明らかなように、多くの粒子が磁性ビーズに付着していた。このことから、ＰＣＲ阻害剤として作用する変性された蛋白質及び細胞の残骸は、磁性ビーズを用いて容易に除去できる。
【００６２】
実施例３：ＤＮＡ精製方法によるＰＣＲ増幅効果
ＤＮＡ精製方法を変えたときのＰＣＲ増幅効果を研究するために、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ毛細管（内径：２．４２ｍｍ、高さ：３５．４０ｍｍ、内径：高さ＝１：１４．６３）内で細胞を溶解させ、得られた溶解液を用いてＰＣＲを行った。図７は、ＤＮＡ精製方法を変えたときのＰＣＲ産物の、電気泳動の結果を示す図である。矢印で表示されたバンドは、所望のＰＣＲ産物に該当する。レーン１、２は、磁性ビーズの不在下でレーザーをそれぞれ６０秒、及び９０秒照射した後ＰＣＲを行った結果であり、レーン３、４は、磁性ビーズの存在下でレーザーをそれぞれ５秒、及び１０秒照射した後ＰＣＲを行った結果であり、レーン５は、組み替えＨＢＶ（ｒＨＢＶ）の直接ＰＣＲの結果であり、レーン６は、ＰＣＲ陽性コントロールであって、Ｑｉａｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いてＤＮＡを精製した後でＰＣＲを行った結果であり、レーン７は、ＰＣＲ陰性コントロールであって、蒸留水のみを用いてＰＣＲを行った結果である。各試料の組成は、下記の表の通りであった。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
図７から明らかなように、磁性ビーズなしにレーザーの照射のみを行った場合（レーン１、２）には、ＰＣＲ産物が観察されず、また、ｒＨＢＶを直接ＰＣＲした場合（レーン５）にも、ＰＣＲ産物が観察されなかった。しかし、本発明の場合、すなわち磁性ビーズの存在下でレーザーを照射した場合（レーン３、４）には、所望の位置にＰＣＲ産物が観察された。また、Ｑｉａｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いてＤＮＡを精製した後でＰＣＲを行った場合（レーン６）にも、所望のＰＣＲ産物が観察された。これらの結果から、本発明の方法は、精製に多くの時間及びステップが必要とされる陽性コントロールであるＱｉａｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いてＤＮＡを精製した場合と、同様のＰＣＲ効率を表す。したがって、本発明の方法は、別途のＤＮＡ精製のステップなしに、ＰＣＲ効率よく行われるので、ＬＯＣに有効に適用されうる。
【００６５】
図８は、増幅されたＰＣＲ産物の濃度を示すグラフである。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ産物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を用いて定量化された。図８から明らかなように、本発明の方法を用いたＰＣＲの結果は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｅキットを用いた結果と同様であるか、または優れている。したがって、本発明の方法によれば、別途の精製工程なしで、ＤＮＡ分析のためのＰＣＲが容易に行われうる。
【００６６】
実施例４：レーザー照射時間による溶液中の蛋白質の量の比較
細胞溶解後、磁性ビーズにより吸収された蛋白質の量がどれほどかを研究するために、レーザー照射時間を変えたときの細胞溶解物中に存在する蛋白質の量を調べた。細胞溶解後に溶解物中に存在する蛋白質の量は、ＣＢＱＣＡ蛋白質定量キット（Ｃ−６６６７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製、調製マニュアルを参考にした）を用いて測定した。図９は、レーザー照射時間を変えたときの細胞溶解物中に存在する蛋白質の量を示すグラフである。図９に示すように、レーザー照射時間が１０秒、及び１５秒であるとき、溶解物中の蛋白質の量が顕著に減少した。レーザー照射時間が１０秒であるとき、溶解物中の蛋白質量の顕著な減少は、ＰＣＲ増幅が十分に行われるということを示しており、これは、前記図７及び図８の結果とも一致する。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、レーザー及び磁性ビーズを利用した核酸精製装置関連の技術分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】レーザー及びマイクロ磁性ビーズを用いて細胞溶解を行った後に、マイクロ磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶解液層が分離されている、システムの一実施形態を表す模式図である。
【図２】内径が９．９５ｍｍであり、レーザー照射後磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶液層が混合されている容器の写真である。
【図３】内径が４．８８ｍｍであり、レーザー照射後磁性ビーズ層及びＤＮＡ溶液層が分離されている容器の写真である。
【図４】Ｐｕｒｅ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。
【図５】レーザー照射による細胞溶解後、ガラス壁に付着したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。
【図６】レーザー照射による細胞溶解後、ガラス容器の中央部から採取したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０カルボン酸のＳＥＭ写真である。
【図７】ＤＮＡの精製方法を変えたときのＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図８】増幅されたＰＣＲ産物の濃度を示すグラフである。
【図９】レーザー照射時間を変えたときの細胞溶解物中の蛋白質の量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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