(57)【要約】【課題】  簡単な操作で造血幹細胞の分化抑制を行いうる手段を提供することにある。【解決手段】  アルギニンを含有しない培地で、造血幹細胞あるいはその分化途中の細胞を培養することにより、成熟血液細胞への分化を阻止する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞を培養するに際し、培地にアルギニンを実質的に含有させないことを特徴とする、上記細胞の分化抑制方法。
【請求項２】
アルギニンを実質的に含有しないことを特徴とする多能性幹細胞あるいはその分化過程にある細胞の分化抑制培地。
【請求項３】
トランスポーターの輸送物質を含有しない培地に多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞を培養し、これら細胞の分化の有無を指標として、該輸送物質の中から、分化に必要な物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
トランスポーターの輸送物質を含有しない培地からなることを特徴とする多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞の分化に必要な物質をスクリーニングするための培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞の分化抑制方法、そのために使用する分化抑制培地、並びに分化抑制物質のスクリーニング方法及びこれに使用する培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、血球細胞として、酸素運搬に関わる赤血球、感染防御に関わる顆粒球、単球、血液凝固に関わる血小板等が存在するが、これらは、多能性幹細胞からＣＦＵ−ＧＥＭＭ（Colony forming unit granulocyte eryhtrocyte monocyte macrophage）（多能性骨髄系幹細胞）に分化し、さらに、そこから各単能性幹細胞を経て分化したものである。
これらの分化過程においては、インターロイキン３、エリスロポエチン等の様々なサイトカインあるいは他の因子が関与しており、極めて複雑な分化制御系を構成している。
一方、近年、遺伝等に由来する造血系疾患を治療するため、造血幹細胞の移植について盛んに研究されており、これに伴い造血幹細胞を未分化のまま培養する手段として様々なものが提案されている。これらにおける分化抑制手段としては、例えば、サイトカインによる分化促進を抑制するために、サイトカインの受容体を使用するもの、造血幹細胞で分化抑制遺伝子を発現させるもの（特許文献１参照）、哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と接触可能な状態で造血幹細胞を培養するもの（特許文献２参照）等がある。しかし、これらの分化抑制手段はいずれも、煩雑な操作を必要とするほか、その分化抑制効果自体完全ではない。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１２７８５９号公報
【特許文献２】特開２００４−２４０８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消することにあり、簡単な操作で細胞の分化抑制を行いうる、全く新しい手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは多能性幹細胞の分化過程に関与するアミノ酸トランスポータに着目し、鋭意研究の結果、全く意外にも、単に多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞の培養培地においてアルギニンを含有させないだけで、極めて顕著に細胞の分化を抑制できるという驚くべき知見を得て、本発明を完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞を培養するに際し、培地にアルギニンを実質的に含有させないことを特徴とする、上記細胞の分化抑制方法。
（２）  アルギニンを実質的に含有しないことを特徴とする多能性幹細胞あるいはその分化過程にある細胞の分化抑制培地。
（３）  トランスポーターの輸送物質を含有しない培地に多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞を培養し、これら細胞の分化の有無を指標として、該輸送物質の中から、分化に必要な物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
（４）  トランスポーターの輸送物質を含有しない培地からなることを特徴とする多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞の分化に必要な物質をスクリーニングするための培地。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、単にアルギニンを含有しない培地に多能性幹細胞、あるいはその分化途中にある細胞を培養するという簡単な操作で、極めて効果的に細胞の分化を抑制できるという、驚くべき効果を有する。このような本発明による知見は、細胞の分化抑制に関する研究発展に多大な貢献をするとともに、多能性幹細胞その他の細胞の移植技術の開発等においても大いに寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の培地により培養する対象となる細胞は、多能性幹細胞、あるいはその分化途中にある細胞である。多能性幹細胞は、骨髄、臍帯血、末梢血等から得られる細胞であって、あらゆる、リンパ球、血球に分化する能力を有する細胞である。
【０００９】
図１は、この分化過程を示す模式図である。すなわち、これを、大略して示すと、多能性幹細胞はＣＦＵ−ＧＥＭＭとリンパ球系幹細胞とに分化し、リンパ球系幹細胞はリンパ球に分化するが、一方、ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、赤芽前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、顆粒球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｇ）、単球・マクロファージ系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｏ）、巨核球前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）等の単能性造血幹細胞に分化し、これら単能性造血幹細胞は、成熟血液細胞である、赤血球、顆粒球、単球、血小板等にそれぞれ分化するが、本発明のＬ−アルギニンを実質的に含有しない培地で多能性幹細胞あるいはその分化途中にある細胞を培養する場合、赤血球は形成されない。すなわち、分化は、ＣＦＵ−ＧＥＭＭから赤血球に至る赤血球系分化系列において、少なくとも赤血球が形成されるよりも前の段階でとどまる。
【００１０】
本発明者等は、臍帯血由来の各分化段階の血球細胞を各分化段階に特異的に発現するタンパク質を標的に分離し、各段階の血球細胞でのｈＣＡＴ−１の発現量をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果、ｈＣＡＴ−１の発現は赤血球系細胞に発現が高かいことを見いだした。ｈＣＡＴ−１は赤血球系細胞に発現が高く、赤血球系細胞への特異的な分化や増殖への関与が考えられる。
【００１１】
このＣＡＴ１遺伝子は、ネズミにおいてエコトロピックレトロウイルスのレセプター遺伝子あるいはアミノ酸トランスポータ遺伝子として知られており、このＣＡＴ１によりコードされるアミノ酸トランスポータは、アルギニン、ヒスチジン、リジン及びオルニチン等のカチオン性アミノ酸を輸送する機能を有する。
【００１２】
しかし、これらアミノ酸のうちアルギニンのみが分化に影響し、他のアミノ酸は影響しない。また、アルギニン不含培地において多能性幹細胞を培養する場合、サイトカイン等の分化誘導乃至促進する物質を培地中に加えても、赤血球は全く形成されない。すなわち、アルギニンは、少なくとも多能性幹細胞から赤血球への分化過程における必須物質といえる。
本明細書における、「実質的に含有しない」とは、アルギニンを全く含有しない場合の他、アルギニン濃度を低減させた場合も含む。
例えば、骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を用いた検討では４０μＭ含有されていれば分化は進む。しかしながら、通常、使用する培地にはアルギニンが４００μＭ含まれており、４０μＭの場合の分化率は４００μＭの約５０％に低下する。したがって、アルギニン濃度は、具体的には、通常培地中に含有されるアルギニン濃度の１０分の１以下、好ましくは１００分の１以下の濃度である。
【００１３】
本願発明において使用する培地は、多能性幹細胞の培養に通常使用される培地を基本培地として、該培地においてアルギニンを欠如させたものであり、基本培地としては、例えば、一般的に細胞の培養に用いられているDulbecco's Modified Eagle Medium （ＤＭＥＭ）を用いることができる。ＤＭＥＭ培地の組成は公開されており、アミノ酸、グルコース、無機酸等で構成されている。アルギニン欠如培地はＤＭＥＭ培地を作製する際にアルギニンのみ加えずに作製する。このほか、使用できる基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地等がある。
【００１４】
一方、上記したように、アミノ酸トランスポータはその遺伝子の発現量からみて多能性幹細胞の分化に何らかの関与をし、実際に、該トランスポータの輸送物質の中に、分化必須成分としてアルギニンが見いだされた。したがって、造血幹細胞の分化に関与する種々のトランスポータにおいて、その輸送物質の中には新たな分化必須成分が存在している可能性がある。
【００１５】
例えば、多能性幹細胞の分化過程において、ある特定のトランスポータ遺伝子の発現量が増大している場合においては、このトランスポータの輸送物質の中に、分化必須成分が存在している可能性があり、この輸送成分を各々除去した培地に多能性幹細胞あるいはその分化途中の細胞を培養し、その分化の有無を指標にして、分化が抑制されれば、その成分は多能性幹細胞あるいはその分化途中の細胞の分化に必要な成分であり、このようにして多能性幹細胞の分化過程に必要な成分をスクリーニングできる。
【００１６】
トランスポータ遺伝子の発現量は、例えば、上記した該遺伝子の発現に対応して生成するｍＲＮＡの量を上記したＲＴ−ＰＣＲ法により測定可能であり、また、多能性幹細胞或いはその分化途中の細胞の分化の有無は、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３３、Glycophorin A、ＣＤ４４、ＣＤ１４等の各分化段階に応じて細胞表面に特異的に出現する膜タンパク質（分化抗原表現系）をマーカーとして、該分化抗原と特異的に反応する標識抗体を用いて上記分化抗原を検出することにより行う。すなわち、分化段階において、特定の分化抗原が検出された場合には、少なくとも検出された分化抗原を有する細胞にまで分化が及んだことを示し、また、特定の分化マーカーを有する分化途中の細胞或いは成熟細胞が検出されない場合には、それ以前の段階で分化が阻害されていることを示す。本発明においては、トランスポータ輸送物質不含培地で多能性幹細胞或いはその分化途中にある細胞を培養し、分化途中で分化が終了している細胞の割合（例えば全細胞数に対する）を求め、一方、該輸送物質を除かない培地で同様に培養した場合における、分化途中で分化が終了した細胞の割合を比較すれば、該輸送物質を含有しないことによる分化阻害の有無およびその程度を測定することができ、分化に必要な物質を明らかにすることができる。
【００１７】
このようなスクリーニングに使用される細胞としては、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞の他に、骨髄性白血病細胞Ｋ５６２、ＨＬ−６０細胞等がある。骨髄性白血病細胞Ｋ５６２細胞は、ＣＦＵ−ＧＥＭＭに対応する細胞であり、脂肪酸であるブチレートにより赤血球細胞に分化することが報告されており、赤血球分化のモデル細胞として用いられる。また、細胞内リン酸化酵素を刺激する化合物により、顆粒球、単球に分化する。
例えば、12-O-tetradecanoyl phorbol-13 acetate （ＴＰＡ）はprotein kinase C をアクチベートし、Ｋ５６２細胞をマクロファージに誘導し、Staurosporine はprotein kinase C を抑制し、Ｋ５６２細胞を巨核細胞に誘導する。
また、骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞はレチノイン酸により顆粒球、単球に分化することが報告されている。
したがって、例えば、これらＫ５６２細胞或いはＨＬ−６０細胞を使用する場合、前者においてはブチレート或いはリン酸化酵素を刺激する化合物を含有する培地を使用し、トランスポータ輸送物質を含有しない条件下で培養し、分化の有無を検出し、また、後者においてはレチノイン酸の存在下でトランスポータ輸送物質を含有しない条件下で培養し、分化の有無を検出することにより、トランスポータ輸送物質の中から分化抑制乃至阻害物質をスクリーニングすることが可能となる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の実施例を示すが、これらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕
以下の組成の各培地成分を混合し、
【００１９】
【表１】
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さらに、ＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４にし、２００ｍＭ  L-Glutamineを最終濃度１０％になるように加えた。また、血清は、５５℃、３０ｍｉｎで不活化ＦＢＳを最終濃度１０％になるように加えるとともに、ＩＬ−３  １００ｎｇ／ｍｌ、ｒｈＳＣＦ  １００ｎｇ／ｍｌ、及びＥＰＯ  ４ｕｎｉｔ／ｍｌを加えて、Ｌ−アルギニン含有培地（Ａｒｇ（＋）培地）とした。
一方、培地の調製において、Ｌ−アルギニン塩酸塩を添加しない他は上記と同様に培地を調製し、該培地をＬ−アルギニン不含培地（Ａｒｇ（−））とした。これら培地を各ウエルに注下した。
次いで、臍帯血から常法により抗体を用いて回収したＣＤ３４細胞を、１ｘ１０４／５ｍｌ／ｗｅｌｌで、ウエル中のＬ−アルギニン含有培地及びＬ−アルギニン不含培地に対して、それぞれ播き、７日間及び１０日間培養した。７日間及び１０日間培養後の細胞数を図２に示す。
また、７日間培養を行った後、赤血球および白血球系細胞の分化マーカーとして各細胞におけるＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、Glycophorin Aをターゲットにし、以下の蛍光標識抗体を使用して、アルギニン不含培地（Ａｒｇ（−））とアルギニン含有培地（Ａｒｇ（＋））における、これら蛍光標識抗体に対して陽性を示す細胞数の割合をフローサイトメトリーで計測した。
〔蛍光標識抗体〕
ＣＤ３３抗体（BD Biosciences社製）  （phycoerythrin（ＰＥ）標識）
ＣＤ４５抗体（BD Biosciences社製）  （ＦＩＴＣ標識）
ＣＤ１４抗体（BD Biosciences社製）  （phycoerythrin（ＰＥ）標識）
Ｇｌｙ−Ａ（Glycophorin A）抗体(Immunotech社製)  (ＦＩＴＣ標識)
なお、ＣＤ３３陽性細胞はＣＤ３４（＋）細胞より若干分化が進んだ細胞集団、ＣＤ４５（＋）細胞は白血球系細胞の分化マーカーであり、顆粒球、単球、マクロファージを含んでいる。
ＣＤ１４（＋）は白血球系細胞のうち単球のマーカーとして、Glycophorin A は赤血球系細胞の赤芽球に対するマーカーとして知られている。
結果を図３に示す。図３中縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を表し、図３中の％は、全細胞に対する各蛍光標識抗体陽性細胞の割合を示す。
【００２０】
図３によれば、アルギニン含有培地（Ａｒｇ（＋））で計測されたグリコホリンＡ陽性細胞の細胞が、アルギニン不含培地（Ａｒｇ（−））では０であり、このことは、アルギニン不含培地（Ａｒｇ（−））では、造血幹細胞から赤血球への分化が完全に阻害されたことを示す。グリコホリンＡは、赤芽球に特異的な分化マーカーであり、この結果は少なくとも赤芽球よりも前の段階で分化がストップしたことを示す。
また、白血球系の分化系列においては、それほどの変化はなく、アルギニンによっては影響されないことを示す。
【００２１】
〔実施例２〕
実施例１の使用培地においてサイトカイン（ＩＬ−３、ｒｈＳＣＦ、ＥＰＯ）を添加しない他は同様にして、Ｌ−アルギニン不含培地（Ａｒｇ（−））とＬ−アルギニン含有培地（Ａｒｇ（＋））を調製した。ただし、これら培地それぞれに酪酸ナトリウム１ｍＭを添加し（Ｂｕｔｙ＋）、また添加しないで（Ｂｕｔｙ−）、４種類の培地を作成した（Ａｒｇ−Ｂｕｔｙ−、Ａｒｇ−Ｂｕｔｙ＋、Ａｒｇ＋Ｂｕｔｙ−、Ａｒｇ＋Ｂｕｔｙ＋）。
次いで、上記培地それぞれに、骨髄髄性白血病細胞Ｋ５６２細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播き、４日間培養した。４日後細胞を遠心（１０００ｒｐｍ、５分）し、回収した。次いで１ｘＰＢＳで細胞を洗浄し、１ｘＰＢＳを除去後１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞を懸濁した。該懸濁液をスライドガラスに塗布し、メタノールで細胞固定した。乾燥後ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine,tetrahydrochloride）溶液に１時間浸した。
１ｘＰＢＳで洗浄後、顕微鏡で細胞数により計測した。ベンチジン試薬は、ヘモグロビン検出に用いられ、ベンチジン陽性細胞は茶褐色に染色される。上記計測結果から、全細胞数に対するベンチジン陽性細胞を求めた。結果を図４に示す。
これによれば、臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞同様にＫ５６２細胞培養時アルギニンを欠如させた培地（Ａｒｇ−Ｂｕｔｙ＋）においてはブチレートで刺激を行ってもベンチジン陽性細胞の割合は低い。この結果は、アルギニンの欠如により、ヘモグロビン形成能を獲得する以前の細胞、すなわち少なくとも前赤芽球以前の段階で分化が抑制されたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】多能性幹細胞から成熟血液細胞及びリンパ系細胞に至る分化過程を示す図である。
【図２】臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞をアルギニン（＋）および（−）でそれぞれ７日、１０日間培養した時の細胞数を示すグラフである。
【図３】アルギニン不含倍地とアルギニン含有培地における、ＣＤ３４陽性細胞の分化への影響を、各分化マーカーに対する標識抗体を用いて調べた結果を示すグラフである。
【図４】Ｋ２５６細胞を使用して、アルギニンの分化への影響を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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