(57)【要約】【課題】従来解析対象とならなかった［Ｍ＋Ｈ＋２］＋や［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋などのイオンを有効に解析に役立てることができる、ＰＡ化糖鎖の構造解析方法を提供する。【解決手段】  アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、イオン（Ｂ）を、アミノピリジン標識糖鎖のマーカーとする、質量分析法。アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、イオン（Ｂ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定することによって、前記アミノピリジン標識糖鎖の構造解析を行う、糖鎖構造解析法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、前記アミノピリジン標識糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、前記イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、前記イオン（Ｂ）を、アミノピリジン標識糖鎖のマーカーとする、質量分析法。
【請求項２】
前記イオン（Ａ）は、前記アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したＸ付加イオンであり、前記Ｘ付加イオンを［Ｍ＋Ｘ］＋として、前記イオン（Ｂ）を［Ｍ＋Ｘ＋２］＋として得る、請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
前記Ｘ付加イオンが、プロトン付加イオン及び金属付加イオンから選ばれる、請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
前記金属付加イオンが、ナトリウム付加イオンである、請求項３に記載の質量分析法。
【請求項５】
還元性を有するマトリックスを用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項６】
ジヒドロキシ安息香酸及びジアミノナフタレンから選ばれるマトリックスを用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項７】
アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、前記アミノピリジン標識糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、前記イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、
前記イオン（Ｂ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定することによって、前記アミノピリジン標識糖鎖の構造解析を行う、糖鎖構造解析法。
【請求項８】
前記イオン（Ａ）は、前記アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したＸ付加イオンであり、前記Ｘ付加イオンを［Ｍ＋Ｘ］＋として、前記イオン（Ｂ）を［Ｍ＋Ｘ＋２］＋として得る、請求項７に記載の糖鎖構造解析法。
【請求項９】
前記イオン（Ａ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ａ）を得て、
別途、前記イオン（Ｂ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ｂ）を得て、
前記プロダクトイオン（ｂ）のうち、対応する前記プロダクトイオン（ａ）からみて質量数が２増加した特定のイオン（ｂ*）を、ピリジルアミノ化イオンの指標として解析を行う、請求項７又は８に記載の糖鎖構造解析法。
【請求項１０】
前記イオン（Ｂ）を前記イオン（Ａ）とともにプリカーサーイオンとしてまとめて選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ａ）及び複数のプロダクトイオン（ｂ）を得て、
前記プロダクトイオン（ｂ）のうち、対応する前記プロダクトイオン（ａ）からみて質量数が２増加した特定のイオン（ｂ*）を、ピリジルアミノ化イオンの指標として解析を行う、請求項７又は８に記載の糖鎖構造解析法。  
【請求項１１】
前記Ｘ付加イオンが、プロトン付加イオン及び金属付加イオンから選ばれる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項１２】
前記金属付加イオンが、ナトリウム付加イオンである、請求項１１に記載の質量分析法。
【請求項１３】
還元性を有するマトリックスを用いる、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項１４】
ジヒドロキシ安息香酸及びジアミノナフタレンから選ばれるマトリックスを用いる、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス基礎研究分野に関し、より詳しくは、ＭＡＬＤＩをイオン源とする質量分析装置を用いた糖鎖の構造解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖の構造解析は、感度、解析時間の短縮化という点から、タンデム質量分析計を用いたＭＳ/ＭＳ解析手法が主流になりつつある。質量分析測定では試料の前処理が非常に重要であり、前処理が質量分析測定の可否を握っている。糖鎖の解析においては、前処理に相当する液体クロマトグラフィーによる分離精製功率を向上させるために、糖鎖を２−アミノピリジン（ＰＡ）や２−アミノベンズアミド（ＡＢ）などの蛍光物質で標識することが主流となっている。糖鎖のＰＡ化については、「High-performance liquid chromatography of pyridylaminated saccharides」, Sumihiro Hase, Methods in ENZYMOLOGY, vol. 230, p. 225-237, 1994などに記載されている。糖鎖のＡＢ化については、「Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid」, J. C. Bigge, T. P. Patel, J. A. Bruce, P. N. Goulding, S. M. Charles, R. B. Parekh, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 230, p. 229-238, 1995などに記載されている。
【０００３】
【非特許文献１】ハセ・スミヒロ（Sumihiro Hase）、「メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Methods in ENZYMOLOGY）」、１９９４年、第２３０巻、ｐ．２２５−２３７
【非特許文献２】Ｊ．Ｃ．ビッグ（J. C. Bigge）、Ｔ．Ｐ．パテル（T. P. Patel）、Ｊ．Ａ．ブルース（J. A. Bruce）、Ｐ．Ｎ．グールディング（P. N. Goulding）、Ｓ．Ｍ．チャールズ（S. M. Charles）、Ｒ．Ｂ．パレック（R. B. Parekh）、「アナリティカル・バイオケミストリー（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY）１９９５年、第２３０巻、ｐ．２２９−２３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＰＡ化糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定する場合は、汎用性の高さからＤＨＢ（ジヒドロキシ安息香酸）をマトリックスに使用するのが一般的である。そして、分子イオン（例えばポジティブモード測定で得られたプロトン付加イオンの場合、［Ｍ＋Ｈ］＋）に基づいてＭＳ/ＭＳによる構造解析が行われる。しかしながら、ＤＨＢを用いると、プロトン付加イオンの場合、［Ｍ＋Ｈ］＋の近傍に［Ｍ＋Ｈ＋２］＋が検出される。従って、従来、ＭＳ/ＭＳによる構造解析を行う場合、目的とするイオン［Ｍ＋Ｈ］＋のみをプリカーサーイオンとして選択し、解析に用いない［Ｍ＋Ｈ＋２］＋をＭＳ/ＭＳ測定対象から外す必要がある。しかしながら、プリカーサーイオン選択能が低い質量分析装置では［Ｍ＋Ｈ］＋だけでなく、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋も選択してしまうことが問題であった。反対に、プリカーサーイオン選択能が高い質量分析装置を用いたとしても、選択能を高くすることによってプリカーサーイオン選択量が低下し、その結果としてＭＳ/ＭＳの感度が低下するという問題点がある。
【０００５】
また、糖鎖は複雑な分枝構造を有するため、ＭＳ/ＭＳで得られたプロダクトイオンを帰属することが困難な場合が多い。
【０００６】
そこで本発明の目的は、質量分析測定によって、従来から解析に必要であった［Ｍ＋Ｈ］＋や［Ｍ＋Ｎａ］＋（ポジティブモード測定の場合）とともに、解析に用いられてこなかった［Ｍ＋Ｈ＋２］＋や［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋が発生する現象を逆に利用し、このような、従来解析対象とならなかった［Ｍ＋Ｈ＋２］＋や［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋などのイオンを有効に解析に役立てることができる、ＰＡ化糖鎖の構造解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、前記アミノピリジン標識糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、前記イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、前記イオン（Ｂ）を、アミノピリジン標識糖鎖のマーカーとする、質量分析法。
すなわち、（１）においては、質量分析装置によるポジティブモード測定又はネガティブモード測定を行うことができる。
なお、イオン（Ｂ）と称するものは、イオン（Ａ）より２大きい質量数を有するが、アミノピリジン標識糖鎖中のピリジルアミノ基において質量数が２増加する化学変化が起こることにより生成するイオンであって、イオン（Ａ）の同位体として生得的に生じるイオンとは異なる。
【０００８】
（２）前記イオン（Ａ）は、前記アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したＸ付加イオンであり、前記Ｘ付加イオンを［Ｍ＋Ｘ］＋として、前記イオン（Ｂ）を［Ｍ＋Ｘ＋２］＋として得る、（１）に記載の質量分析法。
すなわち、（２）は、質量分析装置によるポジティブモード測定を行う形態であり、Ｘは、糖鎖に付加することができるプラスチャージイオンである。
【０００９】
（３）前記Ｘ付加イオンが、プロトン付加イオン及び金属付加イオンから選ばれる、（２）に記載の質量分析法。
（４）前記金属付加イオンが、ナトリウム付加イオンである、（３）に記載の質量分析法。
【００１０】
（５）還元性を有するマトリックスを用いる、（１）〜（４）のいずれかに記載の質量分析法。
（６）ジヒドロキシ安息香酸及びジアミノナフタレンから選ばれるマトリックスを用いる、（１）〜（５）のいずれかに記載の質量分析法。
【００１１】
（７）アミノピリジン標識糖鎖を含む試料を、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ測定し、前記アミノピリジン標識糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、前記イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得て、
前記イオン（Ｂ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定することによって、前記アミノピリジン標識糖鎖の構造解析を行う、糖鎖構造解析法。
すなわち、（７）においては、質量分析装置によるポジティブモード測定又はネガティブモード測定を行うことができる。
なお、イオン（Ｂ）と称するものは、イオン（Ａ）より２大きい質量数を有するが、アミノピリジン標識糖鎖中のピリジルアミノ基において質量数が２増加する化学変化が起こることにより生成するイオンであって、イオン（Ａ）の同位体として生得的に生じるイオンとは異なる。
【００１２】
（８）前記イオン（Ａ）は、前記アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したＸ付加イオンであり、前記Ｘ付加イオンを［Ｍ＋Ｘ］＋として、前記イオン（Ｂ）を［Ｍ＋Ｘ＋２］＋として得る、（７）に記載の糖鎖構造解析法。
すなわち、（８）は、質量分析装置によるポジティブモード測定を行う形態であり、Ｘは、糖鎖に付加することができるプラスチャージイオンである。
【００１３】
（９）前記イオン（Ａ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ａ）を得て、
別途、前記イオン（Ｂ）をプリカーサーイオンとして選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ｂ）を得て、
前記プロダクトイオン（ｂ）のうち、対応する前記プロダクトイオン（ａ）からみて質量数が２増加した特定のイオン（ｂ*）を、ピリジルアミノ化イオンの指標として解析を行う、（７）又は（８）に記載の糖鎖構造解析法。
【００１４】
（１０）前記イオン（Ｂ）を前記イオン（Ａ）とともにプリカーサーイオンとしてまとめて選択し、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いてＭＳ/ＭＳ測定し、複数のプロダクトイオン（ａ）及び複数のプロダクトイオン（ｂ）を得て、
前記プロダクトイオン（ｂ）のうち、対応する前記プロダクトイオン（ａ）からみて質量数が２増加した特定のイオン（ｂ*）を、ピリジルアミノ化イオンの指標として解析を行う、（７）又は（８）に記載の糖鎖構造解析法。
【００１５】
上記（９）及び（１０）において、ピリジルアミノ化イオンとは、ピリジルアミノ基を有するイオンをいう。  
【００１６】
（１１）前記Ｘ付加イオンが、プロトン付加イオン及び金属付加イオンから選ばれる、（８）〜（１０）のいずれかに記載の質量分析法。
（１２）前記金属付加イオンが、ナトリウム付加イオンである、（１１）に記載の質量分析法。
【００１７】
（１３）還元性を有するマトリックスを用いる、（７）〜（１２）のいずれかに記載の質量分析法。
（１４）ジヒドロキシ安息香酸及びジアミノナフタレンから選ばれるマトリックスを用いる、（７）〜（１３）のいずれかに記載の質量分析法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、質量分析測定によって、従来から解析に必要であったイオン（ポジティブモード測定の場合、［Ｍ＋Ｈ］＋や［Ｍ＋Ｎａ］＋）とともに生じる、解析に用いられてこなかったイオン（［Ｍ＋Ｈ＋２］＋や［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋）における質量数２の増加が、ＰＡ化糖鎖のピリジルアミノ基で生じている変化に起因していることを見出すことによって、従来から解析に用いられてこなかった［Ｍ＋Ｈ＋２］＋や［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋が発生する現象を有効利用した、ＰＡ化糖鎖の構造解析方法を提供することができる。
【００１９】
また、本発明によると、質量分析測定によって生じたイオンの中からＰＡ化イオンを絞り込むことが可能になるため、従来から質量分析で得られたイオンを帰属することが困難であった糖鎖構造の解析を容易にかつ迅速に行うことができる方法を提供することができる。
【００２０】
さらに、本発明によると、プリカーサーイオン選択量の不足に起因するＭＳ/ＭＳの感度の低下を防ぐことができるため、ＰＡ化イオンの構造解析を感度良く行うことができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明では、ＭＡＬＤＩ質量分析測定による従来の糖鎖構造解析において解析の対象とされなかったイオンを利用する。具体的には、アミノピリジン標識糖鎖（以下、ＰＡ化（ピリジルアミノ化）糖鎖と表記する）を含む試料のＭＡＬＤＩ質量分析において、従来の糖鎖構造解析において解析の対象とされてきたイオンから質量数が２増加したイオンを利用する。そして、このようなイオンをＰＡ化糖鎖のマーカーとし、ＰＡ化糖鎖の識別や構造解析を行う。
【００２２】
本発明では、質量分析装置を用いたＰＡ化糖鎖を含む試料のＭＳ測定によって、ＰＡ化糖鎖に由来する分子イオンとして、アミノピリジン標識糖鎖においてイオンＸが付加又は脱離したイオン（Ａ）と、前記イオン（Ａ）からみて質量数が２増加したイオン（Ｂ）とを得る。
【００２３】
ここで、ポジティブモード測定を行う場合は、前記イオン（Ａ）は、アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したイオン（Ｘ付加イオンと表記する。）である。このとき、Ｘは、糖鎖に付加することができるプラスチャージイオンである。例えば、プロトンや金属イオンなどが、糖鎖に付加しやすいイオンとして挙げられる。金属イオンとしては、ナトリウムイオンなどが挙げられる。そして、前記イオン（Ａ）は［Ｍ＋Ｘ］＋として、前記イオン（Ｂ）は［Ｍ＋Ｘ＋２］＋として得る。
【００２４】
ネガティブモード測定を行う場合は、前記イオン（Ａ）は、アミノピリジン標識糖鎖にイオンＸが付加したイオン（すなわちＸ付加イオン）、又は、アミノピリジン標識糖鎖からイオンＸが脱離したイオン（Ｘ脱離イオンと表記する。）である。このとき、Ｘ付加イオンを生成する場合は、Ｘは、糖鎖に付加することができるマイナスチャージイオンである。例えば、塩化物イオンなどが挙げられる。そして、前記イオン（Ａ）は［Ｍ＋Ｘ］-として、前記イオン（Ｂ）は［Ｍ＋Ｘ＋２］-として得る。Ｘ脱離イオンを生成する場合は、Ｘ脱離イオンは、通常、糖鎖におけるプロトン脱離反応により得られるものである。すなわち、前記イオン（Ａ）は［Ｍ−Ｈ］-として、前記イオン（Ｂ）は［Ｍ−Ｈ＋２］-として得る。
【００２５】
以下、ポジティブモードによる質量分析を行う場合を挙げて、本発明を説明する。ネガティブモードによる質量分析を行う場合も、以下と同様に説明することができる。
【００２６】
本発明では、イオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）に基づいてＰＡ化糖鎖の識別や構造解析を行う。イオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）は、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）より質量数が２大きい。しかしながら、イオン（Ａ）の同位体として生得的に生じるイオンとは異なるものである。イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とは、それらを構成する糖残基において同じである。イオン（Ｂ）における質量数２の増加は、ＰＡ化糖鎖におけるピリジルアミノ基において起こった化学変化に起因する。具体的には、ＰＡ化糖鎖のピリジルアミノ基が、マトリックスによって還元を受けた結果、質量数が２大きいイオン（Ｂ）が生成する。
【００２７】
イオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）は、還元性を有するマトリックスを用いることによって生成させることができる。このとき、イオン（Ｂ）は、用いるマトリックスの還元性が強いほど、強いイオン強度で検出され、用いるマトリックスの還元性が弱いほど、弱いイオン強度で検出される。一方で、ＰＡ化糖鎖が還元を受けることによって生じるイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）と同じ質量数を有するイオンが、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）の同位体として生得的に検出される。イオン（Ａ）より質量数が２大きいイオンに、還元を受けたＰＡ化糖鎖に由来するイオン（Ｂ）が含まれていることを確認するには、実測スペクトルと、対応するイオン（Ａ）の理論同位体分布と比較すれば簡単である。このとき、還元を受けたＰＡ化糖鎖に由来するイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）の存在は、実測スペクトルの、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）より２大きい質量数で検出されているイオンが、対応するイオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）の理論同位体分布の、質量数が２大きい同位体の分布比より強いイオン強度で検出されることで確認することができる。
【００２８】
一方、ＰＡ化糖鎖において認められるようなマトリックスによる還元を受けない物質、例えばＡＢ化糖鎖などを質量分析装置で測定すると、このような糖鎖からは、ＰＡ化糖鎖においてみとめられたような、還元を受けた糖鎖に由来するイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）は生じない。このため、マススペクトルにおける分子イオンのピークは、対応する理論同位体分布とほとんど同じ形状となる。すなわち、還元を受けない物質の分子イオンにおいて、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）より２大きい質量数で検出されているイオンは、イオン（Ａ）とともに生得的に生じる同位体イオンであるため、イオン（Ａ）の理論同位体分布における同位体分布比とほとんど同じイオン強度で検出される。
【００２９】
ＭＳ測定によって生じるイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）をＰＡ化糖鎖のマーカーとして用いる例としては、以下が挙げられる。例えば、ＰＡ化糖鎖とその他の物質との混合物を質量分析装置でＭＳ測定した場合、通常はＰＡ化糖鎖及びその他の物質に相当する複数の分子イオンが得られる。そして、それら分子イオンのスペクトルと、相当するイオンの理論同位体分布とをそれぞれ比較する。比較した結果、理論同位体分布と異なる形状で検出されているイオンが、ＰＡ化イオンすなわちＰＡ化糖鎖に由来するイオンであることが確認できる。具体的には、実測スペクトルの、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）より２大きい質量数を有するイオンが、イオン［Ｍ＋Ｘ］＋（Ａ）の理論同位体分布の、質量数が２大きい同位体の分布比よりも大きいイオン強度で検出されていれば、還元を受けたＰＡ化イオンが生じているということであり、したがって、その分子イオンがＰＡ化糖鎖に由来するものであることが確認できる。
【００３０】
このように、本発明の方法によると、複数の分子イオンからＰＡ化糖鎖に由来するイオンを容易に判別することができる。
【００３１】
本発明の方法によってＰＡ化糖鎖のＭＳ測定を行う場合は、測定試料に関する予備的情報量などに関する状況や、後述のＭＳ/ＭＳ測定による構造解析の必要性などに応じて、イオン（Ａ）及びイオン（Ｂ）の両方をある程度のイオン強度で得ても良いし、イオン（Ｂ）を優位に得ても良い。また、理論同位体分布を参照するまでもなく、一目瞭然にイオン（Ｂ）の生成を確認することができる場合もある。そのため、必ずしも理論同位体分布と実測スペクトルとを比較する必要はない。
【００３２】
本発明では、上記のようにＭＳ測定で得られた分子イオンのうち少なくともイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）をプリカーサーイオンとしてＭＳ/ＭＳ測定をし、複数のプロダクトイオン（ｂ）を得て、プロダクトイオン（ｂ）に基づいてＰＡ化糖鎖の構造解析を行う。
ここで、プロダクトイオン（ｂ）には、マトリックスによる還元を受けたピリジルアミノ基を有する還元末端糖残基を含むイオン（このイオンを特に（ｂ*）と記載する）と、マトリックスによる還元を受けたピリジルアミノ基を有する還元末端糖残基を含まないイオンとが含まれる。
【００３３】
本発明では、イオン（Ａ）をプリカーサーイオンとしたＭＳ/ＭＳ測定も行い、複数のプロダクトイオン（ａ）を得て、プロダクトイオン（ａ）と上記のプロダクトイオン（ｂ）とに基づいて、ＰＡ化糖鎖の構造解析を行うことが好ましい。
【００３４】
プロダクトイオン（ａ）とプロダクトイオン（ｂ）との両方に基づいてＰＡ化糖鎖の構造解析を行う場合、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とを別々にプリカーサーイオンとして選択し、各々のプリカーサーイオンについてＭＳ/ＭＳ測定を行っても良いし、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とを一緒にまとめてプリカーサーイオンとして選択し、ＭＳ/ＭＳ測定を行っても良い。
【００３５】
プリカーサーイオン（Ａ）とプリカーサーイオン（Ｂ）とは、ピリジルアミノ基部分が還元されているか否かということを除いては、糖残基の構成は同じである。従って、これらに基づいてＭＳ/ＭＳ測定を行うと、プロダクトイオン（ａ）とプロダクトイオン（ｂ）とは、互いに対応するものとして検出されるため、プロダクトイオン（ａ）を含むマススペクトルとプロダクトイオン（ｂ）を含むマススペクトルとは、互いに似た形となる。
【００３６】
プロダクトイオン（ａ）及びプロダクトイオン（ｂ）において互いに対応するイオンは、糖残基の構成において同じである。そして、プロダクトイオン（ｂ）のうち、（ｂ*）以外のイオン（すなわち還元されたピリジルアミノ基を持たないイオン）と、それに対応するプロダクトイオン（ａ）とは、質量数も同じである。すなわち、プロダクトイオンイオン（ｂ）のうち（ｂ*）以外のものとプロダクトイオン（ａ）とは、全く同じ構造のイオンである。一方、プロダクトイオン（ｂ）のうち、（ｂ*）のイオン（すなわち還元されたピリジルアミノ基を持つイオン）と、それに対応するプロダクトイオン（ａ）とは、イオン（ｂ*）の方が質量数が２大きい。
【００３７】
従って、プロダクトイオン（ｂ）のうち、プロダクトイオン（ａ）より質量数が２大きいイオン（ｂ*）を、ピリジルアミノ基を有するイオン（ピリジルアミノ化イオン）の指標とすることができる。
【００３８】
例えば、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とを別々にプリカーサーイオンとして選択し、ＭＳ/ＭＳ測定を行った場合は、それぞれのＭＳ/ＭＳスペクトルを比較する。なお、この場合、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とについては、それら両方を１回のＭＳ測定によって一度にある程度のイオン強度で得て、それぞれを個別に選択しても良いし、別々のＭＳ測定によって個別に得て（例えば、一方のＭＳ測定でイオン（Ａ）をより優位に得て、他方のＭＳ測定でイオン（Ｂ）をより優位に得るなど）、それぞれを個別に選択しても良い。そして、ＭＳ/ＭＳ測定の結果、互いに対応するプロダクトイオン（ａ）とプロダクトイオン（ｂ）とにおいて、プロダクトイオン（ｂ）の方が質量数が２大きい場合（すなわちプロダクトイオン（ｂ）がイオン（ｂ*）である場合）、それらイオンは、ピリジルアミノ基が関係するプロダクトイオンである。一方、対応するプロダクトイオン（ａ）とプロダクトイオン（ｂ）とにおいて、両者の質量数が同じものは、ピリジルアミノ基が関係しないプロダクトイオンであると判断できる。
【００３９】
また、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とを一緒にプリカーサーイオンとして選択し、ＭＳ/ＭＳ測定を行った場合は、得られたＭＳ/ＭＳスペクトルにおいて、互いに質量数が２異なる、対をなすピークを探す。この場合、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）との両方が、１回のＭＳ測定によって一度にある程度のイオン強度で得られているものであることが好ましい。そして、ＭＳ/ＭＳ測定の結果、質量数が互いに２異なるイオンの特徴的なピークである場合（すなわち、プロダクトイオン（ａ）とプロダクトイオン（ｂ*）との対である場合）、それらイオンは、ピリジルアミノ基が関係するプロダクトイオンであると判断することができる。
【００４０】
このように、本発明の方法によると、ＭＳ/ＭＳで得られる多数のプロダクトイオンから、ピリジルアミノ基が関係するプロダクトイオン及びピリジルアミノ基が関係しないプロダクトイオンを絞り込むことができるため、従来に比べてＭＳ/ＭＳ解析が大変迅速且つ容易になる。
【００４１】
本発明で用いるマトリックスは、ＭＳ測定でイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）を生成することができるものであれば特に限定されない。すなわち、本発明で用いるマトリックスは、ＰＡ化糖鎖のピリジルアミノ基に対する還元性を有しているものであれば特に限定されない。例えば、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）やジアミノナフタレン（ＤＡＮ）などが挙げられる。この中でも、ＤＨＢは比較的還元性が弱いマトリックスであり、ＤＡＮは、比較的還元性が強いマトリックスである。
【００４２】
すでに述べたように、本発明では、ＭＡＬＤＩ質量分析測定による従来の糖鎖構造解析において解析の対象とされなかったイオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）を利用する。すなわち本発明では、イオン［Ｍ＋Ｘ＋２］＋（Ｂ）を積極的に発生させるため、従来では用いられてこなかったマトリックスを用いることができる。ＤＡＮなどの還元性の強いマトリックスがそれに当る。なお、ＤＡＮには、ジアミノナフタレンの存在しうる全ての位置異性体が含まれる。本発明では、１，５−ジアミノナフタレンが好ましく用いられる。
【００４３】
これらマトリックスは、各々単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。マトリックスの使用形態（使用溶媒、マトリックス濃度、溶液の量など）は、通常の質量分析におけるマトリックスの使用という観点で、当業者が適宜決定することができる。マトリックスを組み合わせて用いる場合、その混合比は、各マトリックスが有する還元力やイオン化能力などを考慮し、測定形態に基づいて当業者が適宜決定することができる。ここでいう測定形態とは、すでに述べたように、ＭＳ測定でイオン（Ａ）及びイオン（Ｂ）のいずれか一方を優位に得る形態や、イオン（Ａ）及びイオン（Ｂ）の両方をある程度のイオン強度で得る形態などが挙げられる。
【００４４】
例えば、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）とをプリカーサーイオンとして選択し、ＭＳ/ＭＳスペクトルに基づいて構造解析を行う場合などは、イオン（Ａ）とイオン（Ｂ）との両方が、ＭＳ/ＭＳ解析が可能なイオン強度で検出される程度のプロダクトイオン（ａ）及び（ｂ）が生じ得る程度の、十分なイオン強度で検出されるように、マトリックスの還元力やイオン化能力などを考慮し、必要に応じてマトリックスを組み合わせれば良い。
【００４５】
本発明において用いる質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩをイオン源とするものであれば特に限定されない。本発明は、上に述べたように、従来から解析に用いられてこなかった［Ｍ＋Ｘ＋２］＋が、［Ｍ＋Ｘ］＋とともに発生する現象を有効利用することができる。このため、厳密に片方のイオンを選択することを要求されるような、プリカーサーイオン選択能の高い質量分析装置を必ずしも必要としない。したがって、質量分析装置のもつ選択能に関わらず、さまざまな機種のＭＡＬＤＩ質量分析装置を広く用いることができる。
【００４６】
このように、本発明では厳密に片方のイオンを選択することを要求しないため、選択能の高い質量分析装置を選定する必要性がないだけでなく、十分な量のプリカーサーイオンを選択することができ、したがって、プリカーサーイオン選択量の不足に起因するＭＳ/ＭＳの感度の低下を防ぐことができる。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１：ＰＡ化糖鎖の測定＞
ガラクトース（Galactose）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）、マンノース（Mannose）及びフコース（Fucose）を構成糖とし、２−アミノピリジン（2-aminopyridine）に由来する(C5H4N)NH−基を有するＰＡ化糖鎖（図１）は、タカラバイオ株式会社より購入した。マトリックスは、５０％アセトニトリル/０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（v/v/v）に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ；１０ｍｇ/ｍｌ）と、５０％アセトニトリル/０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（v/v/v）に溶解した１，５−ジアミノナフタレン（１，５−ＤＡＮ（以下、単にＤＡＮと記載する）；１ｍｇ/ｍｌ）とをそれぞれ用いた。１ｐｍｏｌ/μｌの試料水溶液１μｌとマトリックス溶液０．５μｌとを、ＭＡＬＤＩサンプルプレート上で混合し、風乾した。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  plus；島津製作所製）を用い、正イオン・リフレクトロンモードでＭＳ測定した（図２）。そして、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ；島津製作所製）を用い、［Ｍ＋Ｈ］＋と［Ｍ＋Ｈ＋２］＋とをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し（図３）、アルゴンガスとの衝突によってＭＳ/ＭＳ測定を行った（図４）。
【００４８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって得られたスペクトルを図２の（２Ａ）及び（２Ｂ）に示す（横軸は質量/電荷（mass(m)/charge(z) ）、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。以下、全てのマススペクトルにおいて同じ）。（２Ａ）は、マトリックスにＤＨＢを使用した場合のＭＳスペクトルであり、（２Ｂ）は、マトリックスにＤＡＮを使用した場合のＭＳスペクトルである。（２Ｃ）は、［Ｍ＋Ｈ］＋及び［Ｍ＋Ｎａ］＋の理論同位体分布である。
【００４９】
図２の（２Ａ）及び（２Ｂ）が示すように、マトリックスとしてＤＨＢやＤＡＮを用いると、［Ｍ＋Ｈ］＋以外に、このイオンから質量数が２増加したイオン［Ｍ＋Ｈ＋２］＋も検出された。そして、この［Ｍ＋Ｈ＋２］＋が、ＤＨＢより還元性の強いＤＡＮをマトリックスに用いることによって優位に生成していることから、マトリックスの還元作用によって［Ｍ＋Ｈ］＋から生じていることが分かった。
【００５０】
また、図２の（２Ａ）及び（２Ｂ）が示すように、上記のプロトン付加イオンだけでなく、ナトリウム付加イオンも検出された。そして、マトリックスとしてＤＡＮを用いると、プロトン付加イオンの場合と同様に、［Ｍ＋Ｎａ］＋以外に、このイオンから質量数が２増加したイオン［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋も検出された。そして、この［Ｍ＋Ｎａ＋２］＋が、ＤＨＢより還元性の強いＤＡＮをマトリックスに用いることによって優位に生成していることから、マトリックスの還元作用によって［Ｍ＋Ｎａ］＋から生じていることが分かった。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳによって単一ピークのプリカーサーイオンとして選択された［Ｍ＋Ｈ］＋のスペクトルを図３の（３Ａ）に、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋のスペクトルを図３の（３Ｂ）に示す。そして、プリカーサーイオン［Ｍ＋Ｈ］＋に基づくＭＳ/ＭＳスペクトル及び構造解析結果を図４の（４Ａ）に、プリカーサーイオン［Ｍ＋Ｈ＋２］＋に基づくＭＳ/ＭＳスペクトル及び構造解析結果を図４の（４Ｂ）に示す。（４Ｂ）の＊印でマークしたイオンは、対応する（４Ａ）のイオンからみて質量数が２増加したイオンであることを示す。なお、図４中に示す各プロダクトイオンの構造において、（４Ａ）においてはピリジルアミノ基（ＰＡ）が還元されておらず、（４Ｂ）においてはピリジルアミノ基が還元されているが、両方のピリジルアミノ基を便宜上同じ記号を用いて表している。
【００５２】
図４の（４Ａ）及び（４Ｂ）が示すように、両者間で互いに対応するイオンが検出されており、極めて類似したＭＳ/ＭＳスペクトルが得られた。このことからも、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋が［Ｍ＋Ｈ］＋に由来していることが分かる。そして、両者間で互いに対応するピークの中に、質量数が２異なるものが認められた。より詳しくは、このようなイオンにおいては、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋から得られたプロダクトイオンの質量数が、［Ｍ＋Ｈ］＋から得られたプロダクトイオンの質量数より２大きいことが認められた。糖鎖の構造解析を行った結果、互いに対応するイオンのうち、上述の様に［Ｍ＋Ｈ＋２］＋から得られたプロダクトイオンの質量数の方が２大きいものは、全て、ピリジルアミノ基に関するイオン（すなわち還元されたピリジルアミノ基を有するイオン）であることが確認された。一方、互いに対応するイオンのうち、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋から得られたプロダクトイオンと［Ｍ＋Ｈ］＋から得られたプロダクトイオンとで質量数が変わらないもの（m/z５２８）は、ピリジルアミノ基を有しないイオンであることが確認された。
【００５３】
＜比較例１：ＡＢ化糖鎖の測定＞
ガラクトース（Galactose）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）、及びマンノース（Mannose）を構成糖とし、２−アミノベンズアミド（2-aminobenzamide）に由来するCONH2(C6H4)NH−基を有するＡＢ化糖鎖（図５）は、ＡＢ標識キット（コスモ・バイオ株式会社より購入）を用いて、相当する非標識糖鎖５００ｐｍｏｌから調製した。脱塩・精製し、乾固して得たＡＢ化糖鎖は、４μｌの水に溶解し、試料水溶液とした。マトリックスは、５０％アセトニトリル/０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（v/v/v）に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ；１０ｍｇ/ｍｌ）を用いた。試料溶液１μｌとマトリックス溶液０．５μｌとを、ＭＡＬＤＩサンプルプレート上で混合し、風乾した。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  plus；島津製作所製）を用い、正イオン・リフレクトロンモードでＭＳ測定した（図６）。
【００５４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより得られた［Ｍ＋Ｈ］＋の拡大スペクトルを図６の（６Ａ）に、［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布を図６の（６Ｂ）に示す。（６Ａ）のスペクトルは、（６Ｂ）の理論同位体分布とほぼ同じ形状であることから、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋が検出されていないことがわかった。
【００５５】
＜実施例２：ＰＡ化糖鎖とペプチドとの混合物の測定＞
５ｐｍｏｌのＰＡ化糖鎖、１ｐｍｏｌのＡＣＴＨ（Adrenocorticotrophic hormone）、及び５００ｆｍｏｌのAngiotensin IIの混合試料１μｌを、５０％アセトニトリル/０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（v/v/v）に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ；１０ｍｇ/ｍｌ）０．５μｌとＭＡＬＤＩサンプルプレート上で混合し、風乾した。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  plus；島津製作所製）を用い、正イオン・リフレクトロンモードでＭＳ測定した（図７）。
【００５６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって得られたＭＳスペクトルを図７の（７Ａ）に示す。図７の（７Ｂ）は、Angiotensin IIの［Ｍ＋Ｈ］＋の拡大スペクトルであり、図７の（７Ｃ）は、ＰＡ化糖鎖の［Ｍ＋Ｈ］＋の拡大スペクトルであり、図７の（７Ｄ）は、ＡＣＴＨの［Ｍ＋Ｈ］＋の拡大スペクトルである。また、図７の（７Ｅ）は、Angiotensin IIの［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布であり、図７の（７Ｆ）は、ＰＡ化糖鎖の［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布であり、図７の（７Ｇ）は、ＡＣＴＨの［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布である。
【００５７】
図７の（７Ａ）で検出された３つの［Ｍ＋Ｈ］＋それぞれの拡大スペクトルである図７の（７Ｂ）、（７Ｃ）及び（７Ｄ）を、対応する理論同位体分布（それぞれ図７の（７Ｅ）、（７Ｆ）及び（７Ｇ））と比較すると、m/z１８６５の拡大スペクトルのみ、理論同位体分布と異なる形状であり、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋が理論分布比よりも強いイオン強度で検出された。このことから、図７の（７Ａ）で検出された３つの［Ｍ＋Ｈ］＋のうち、m/z１８６５のイオンがＰＡ化糖鎖由来のものであることの判別を行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１で用いたＰＡ化糖鎖の構造式である。
【図２】実施例１において、マトリックスにＤＨＢを使用した場合のＭＳスペクトル（２Ａ）と、マトリックスにＤＡＮを使用した場合のＭＳスペクトル（２Ｂ）と、［Ｍ＋Ｈ］＋及び［Ｍ＋Ｎａ］＋の理論同位体分布（２Ｃ）である。
【図３】実施例１においてプリカーサーイオンとして選択された［Ｍ＋Ｈ］＋のスペクトル（３Ａ）、及び［Ｍ＋Ｈ＋２］＋のスペクトル（３Ｂ）である。
【図４】実施例１における、プリカーサーイオン［Ｍ＋Ｈ］＋に基づくＭＳ/ＭＳスペクトル及び構造解析結果（４Ａ）、及びプリカーサーイオン［Ｍ＋Ｈ＋２］＋に基づくＭＳ/ＭＳスペクトル及び構造解析結果（４Ｂ）である。
【図５】比較例１で用いたＡＢ化糖鎖の構造式である。
【図６】比較例１における、［Ｍ＋Ｈ］＋の拡大スペクトル（６Ａ）、及び［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布（６Ｂ）である。
【図７】実施例１におけるＭＳスペクトル（７Ａ）と、（７Ａ）で得られた３つの［Ｍ＋Ｈ］＋それぞれの拡大スペクトル（７Ｂ）、（７Ｃ）及び（７Ｄ）と、前記３つの［Ｍ＋Ｈ］＋の理論同位体分布（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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