(57)【要約】【課題】本発明は、リガンド-受容体追跡アッセイを提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、蛍光標識リガンドの内部化の測定に基づく、化合物をスクリーニングするイメージベースの方法を提供する。本発明は、少なくとも1つの細胞パラメーターが測定される、化合物の高含有量スクリーニングのための多重方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの標的受容体を発現する少なくとも1つの単一細胞、または細胞の少なくとも1つの亜集団、または異種細胞集団の少なくとも1つの細胞パラメーターを、化合物の存在下または非存在下で光学的に測定する、化合物の高含有量スクリーニングのための多重方法。
【請求項２】
少なくとも2つの細胞パラメーターを測定する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
少なくとも3つの細胞パラメーターを測定する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
異なる標的受容体を発現する少なくとも2つの単一細胞、または細胞の2つの亜集団を測定する、請求項2〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞パラメーターの少なくとも1つがリガンド-受容体複合体の追跡であり、該リガンド-受容体複合体は標識されたリガンドまたは標識された受容体の光学的検出によって追跡される、請求項1〜4のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項６】
細胞パラメーターの少なくとも1つがリガンド-受容体内部化の追跡であり、該リガンド-受容体内部化は標識されたリガンドまたは標識された受容体の光学的検出によって追跡される、請求項1〜5のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項７】
標識された受容体が、蛍光タンパク質が融合した受容体を含まない、請求項5または6のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項８】
標識されたリガンドが、ルミノフォアがグラフトされたリガンドである、請求項5〜7のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項９】
標識された受容体が特異的抗体によって結合される受容体であって、該抗体が光学的に検出することができる標識で標識される、請求項5〜8のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項１０】
異なる細胞または細胞の亜集団が、同一リガンドに結合することができる異なる標的受容体を独立して発現する、請求項2〜9のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項１１】
独立して検出することができる2つの異なる標識で標識された少なくとも2つの異なるリガンドの内部化を、化合物の存在下または非存在下で、少なくとも2つの異なる標的受容体を独立して発現する細胞の少なくとも2つの異なる亜集団において測定する、請求項6〜9のいずれか一項記載の多重方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの標的受容体がGPCRである、請求項1〜11のいずれか一項記載の多重スクリーニング方法。
【請求項１３】
少なくとも1つの標識がフルオロフォアである、請求項1〜12のいずれか一項記載の多重スクリーニング方法。
【請求項１４】
化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、受容体内部化を誘導するルミノフォア標識アゴニストの使用。
【請求項１５】
化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、ルミノフォア標識受容体の使用。
【請求項１６】
化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、GPCRに対するルミノフォア標識抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド-受容体追跡アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
高含有量スクリーニング（high content screening）は、薬物開発における高スループットスクリーニングに適合可能な新しいアプローチとして最近出現した。高含有量スクリーニングは、生細胞における遺伝子、タンパク質、および他の細胞構成要素の時間的および空間的活動を画定するように設計された技術プラットフォームである。
【０００３】
高含有量スクリーニング用の読み取り装置における中心的な構成成分の1つは、マイクロタイタープレートにおける試料のイメージ獲得に適合された顕微鏡である。読み取り装置には、自動イメージ獲得および分析を可能とするソフトウェアが備えられている。分析は、ルミネッセンスおよび/または明視野イメージに基づくことができる。
【０００４】
薬物スクリーニングに関して興味深い活性の1つは、リガンド-受容体複合体のアゴニスト誘導内部化である。PTH（副甲状腺ホルモン）-受容体について、緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合したPTH受容体のイメージングにより、アゴニスト誘導内部化および再利用が示されている（非特許文献１）。Schlag et al.は5HT2c-GFPの内部化について記載しており、内部化はArrayScan読み取り装置を用いて1つの細胞系で検出された。Ca2＋フラックスは異なるアッセイ、FLIPRによって別々に測定された（非特許文献２）。Gao et al.は、大規模なスクリーニング目的には適さないGFPタグ付きMC4受容体の内部化の手動定量を記載した（非特許文献３）。Giuliano et al.は、単一細胞の同一集団内でのマルチパラメーター高含有量スクリーニングを開示した。この文献は、1より多くのタイプの細胞でのリガンド追跡または多重化を開示していない（非特許文献４）。
【０００５】
【非特許文献１】Conway et al.,2001,J.Cell.Physiol.189,p.341-355
【非特許文献２】Schlag et al.,2004,J.Pharmacol.Exp.Ther.310,865-870
【非特許文献３】Gao et al.,2003,J.Pharmacol.Exp.Ther.307,870-877
【非特許文献４】Giuliano et al.,2003,Assay Drug Dev.Technol.1 (4),565-577
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リガンド-受容体追跡アッセイを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、化合物の高含有量スクリーニングのための多重方法を提供する。多重とは、1より多くの独立したパラメーターが測定値として獲得される方法を意味する。高含有量スクリーニングでは、イメージベースの分析により、ある測定された光学的シグナルを個々の同定された細胞に直接的に帰属させる。これにより、個々の細胞内の多数の事象、および異なる受容体を発現する多数の細胞における多数の事象の双方についての多重化が可能となる。1つの態様において、亜集団が異なる応答をする可能性があり、光学的手段によって区別することができる、異種細胞ミックスにおける多数の事象についての多重化が可能となる。もう1つの態様において、異なる応答をする可能性がある細胞の亜集団における多数の事象の多重化が可能となり、それにより亜集団は相互に区別することができる。
【０００８】
こうして、本方法は、多数の細胞集団における多数の細胞パラメーターに対するそれらの効果を測定することによって化合物のスクリーニングを可能とする。
【０００９】
本発明（１）は、少なくとも1つの標的受容体を発現する少なくとも1つの単一細胞、または細胞の少なくとも1つの亜集団、または異種細胞集団の少なくとも1つの細胞パラメーターを、化合物の存在下または非存在下で光学的に測定する、化合物の高含有量スクリーニングのための多重方法である。
本発明（２）は、少なくとも2つの細胞パラメーターを測定する、本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、少なくとも3つの細胞パラメーターを測定する、本発明(1)の方法である。
本発明（４）は、異なる標的受容体を発現する少なくとも2つの単一細胞、または細胞の2つの亜集団を測定する、本発明(2)〜(3)のいずれか一発明の方法である。
本発明（５）は、細胞パラメーターの少なくとも1つがリガンド-受容体複合体の追跡であり、該リガンド-受容体複合体は標識されたリガンドまたは標識された受容体の光学的検出によって追跡される、本発明(1)〜(4)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（６）は、細胞パラメーターの少なくとも1つがリガンド-受容体内部化の追跡であり、該リガンド-受容体内部化は標識されたリガンドまたは標識された受容体の光学的検出によって追跡される、本発明(1)〜(5)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（７）は、標識された受容体が、蛍光タンパク質が融合した受容体を含まない、本発明(5)または(6)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（８）は、標識されたリガンドが、ルミノフォアがグラフトされたリガンドである、本発明(5)〜(7)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（９）は、標識された受容体が特異的抗体によって結合される受容体であって、該抗体が光学的に検出することができる標識で標識される、本発明(5)〜(8)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（１０）は、異なる細胞または細胞の亜集団が、同一リガンドに結合することができる異なる標的受容体を独立して発現する、本発明(2)〜(9)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（１１）は、独立して検出することができる2つの異なる標識で標識された少なくとも2つの異なるリガンドの内部化を、化合物の存在下または非存在下で、少なくとも2つの異なる標的受容体を独立して発現する細胞の少なくとも2つの異なる亜集団において測定する、本発明(6)〜(9)のいずれか一発明の多重方法である。
本発明（１２）は、少なくとも1つの標的受容体がGPCRである、本発明(1)〜(11)のいずれか一発明の多重スクリーニング方法である。
本発明（１３）は、少なくとも1つの標識がフルオロフォアである、本発明(1)〜(12)のいずれか一発明の多重スクリーニング方法である。
本発明（１４）は、化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、受容体内部化を誘導するルミノフォア標識アゴニストの使用である。
本発明（１５）は、化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、ルミノフォア標識受容体の使用である。
本発明（１６）は、化合物の多重高含有量スクリーニングにおける受容体-リガンド追跡のための、GPCRに対するルミノフォア標識抗体の使用である。
本発明（１７）は、特に実施例を参照して、記載された方法および使用である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、リガンド-受容体追跡アッセイが提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の多重化方法において、少なくとも1つの標的受容体を発現する少なくとも1つの単一細胞、または少なくとも1つの細胞亜集団、または異種細胞集団の少なくとも1つの細胞パラメーターを、化合物の存在下または非存在下で光学的に測定する。この方法では、一つまたは複数の標的受容体を発現する細胞系、安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞、または初代細胞培養を用いることができる。好ましくは、少なくとも2つの細胞パラメーターを測定する。より好ましくは、少なくとも3つの細胞パラメーターを測定する。もう1つの好ましい態様においては、少なくとも4つの異なるパラメーターを測定する。
【００１２】
用語「光学的に測定」および「測定」は、光学的シグナルの定量的測定を意味すると理解される。
【００１３】
前記した方法については、前記パラメーターまたは複数パラメーターが、異なる標的受容体を発現する少なくとも2つの単一細胞、または異なる標的受容体を発現する細胞の少なくとも2つの異なる亜集団で測定されることが好ましい。また、前記パラメーターまたは複数パラメーターは、異なる標的受容体を発現する少なくとも3つの単一細胞、または異なる標的受容体を発現する細胞の少なくとも3つの異なる亜集団で測定することができる。
【００１４】
本明細書中に記載する方法の標的受容体はいずれも、アゴニストによる刺激に続いて内部化される任意のタイプの受容体であってよい。好ましくは、標的受容体はGタンパク質共役受容体（GPCR）である。より好ましくは、受容体はソマトスタチン受容体5（SSTR-5）（配列番号:1）、成長ホルモン分泌促進物質受容体1a（GHSR-1a）（配列番号:2）、バソプレッシン-1b受容体（配列番号:3）またはニューロキニン3受容体（NK3R）（配列番号:4）からなる群より選択される。本明細書に開示する方法で用いられる細胞は、標的受容体を天然で発現する細胞、または標的受容体で安定にまたは一過的にかのいずれかでトランスフェクトされた細胞でありうる。
【００１５】
もう1つの好ましい態様において、少なくとも2つの標的受容体のいずれか1つを発現する細胞の混合物を用いる。より好ましい態様においては、細胞の亜集団は多重方法によって分析される。細胞の亜集団は一つまたは複数の細胞からなりうる。もう1つの好ましい態様において、細胞の亜集団は、例えば、単一ウェル中のそれらの位置によって、あるいは異なる色素の発現または異なる色素での染色によって区別することができる。さらにより好ましい態様において、一過的にまたは最も好ましくは安定にトランスフェクトされた細胞を用いる。細胞の亜集団は、単一の細胞または1より多くの細胞からなる。
【００１６】
細胞パラメーターは、光学的に検出することができるいずれかの細胞パラメーターでありうる。非限定的例として、これらのパラメーターは以下の通りでありうる。
【００１７】
細胞の亜集団の、または単一細胞の位置。それによって細胞は、蛍光タンパク質（例えば、GFP、または当技術分野において公知のその他のもの）でのトランスフェクション；細胞におけるCa2＋フラックス；1つの細胞区画からもう1つの細胞区画への標識されたタンパク質の移動（この標識は光学的に検出することができる）；タンパク質の分解；レポーター遺伝子を用いる遺伝子発現の検出；細胞アポトーシスの検出；細胞への内部化を誘導する受容体またはリガンドまたは小分子アゴニストの内部化を含む、蛍光または非蛍光色素で独立してマークすることができる。
【００１８】
本発明は、細胞に対する薬物スクリーニングに最適化された高含有量リガンド-受容体追跡方法を開示する。本方法は、標識されたリガンドおよび/または受容体の局所濃度および細胞内局所化のイメージベースの追跡に基づく。本発明は受容体-リガンド追跡を他の細胞パラメーターと関連付けることを可能とし、これは多重化によって達成される。好ましくは、リガンド-受容体内部化は本発明によって追跡されている。
【００１９】
受容体脱感作は、細胞が細胞外アゴニストによる刺激に対する応答を調節可能とするメカニズムである。脱感作は、細胞外刺激に対する細胞の感度の調節において重要である。それは誘導された受容体活性の迅速な減弱化を可能とし、同一の細胞シグナル経路を用いた同様なまたは異なるアゴニストによる引き続いての刺激のために細胞を準備させるからである。脱感作の第二の重要な機能は、アゴニストへの連続的暴露による感度の変調である。GPCRについては、シグナルの減弱化は、細胞内ドメインのリン酸化、引き続いての細胞表面からの受容体タンパク質の物理的除去を含む。受容体のこの内部化は、小胞ルーメンに位置する膜包埋リン酸化受容体およびリガンドを含む細胞外膜からの小胞の形成によって起こる。引き続いて、受容体はリソソーム中で分解され、あるいは再感作されて細胞表面に再利用される。
【００２０】
受容体内部化に影響する化合物をスクリーニングするアッセイは、古典的な競合結合アッセイにおいて競合体として作用する異なる薬理学的プロフィールを有する受容体リガンドを同定できるであろう。加えて、内部化メカニズムにおける他の工程を標的化することができる化合物もまた、リガンド-受容体追跡アッセイで検出することができる。
【００２１】
リガンドまたは受容体の内部化は、細胞内区画において光学的に測定でき、かつ平行して同一細胞において測定される他の細胞パラメーターと相関させることができる標識によって提供されるシグナルの内部化および蓄積の定量的イメージングによって追跡される。この方法は、Nouel et al.,1997,Endocrinology 138,296-306；またはRocheville et al.,2000,J.Biol.Chem.275,7862-7869に記載されているような先行技術におけるリガンド追跡方法よりも優れている。特に、リガンド-受容体追跡を含む多重薬物スクリーニングを行うのに十分な強いシグナルは、イメージベースの検出でしか得ることができない。標識されたアゴニストの場合、内部化されたアゴニストは結局は分解されるか、または受容体から解離されるが、内部化が誘導された場合に、細胞表面に存在する受容体の量について直接的比例尺度を与えるのに十分な時間の間、細胞内区画に濃縮されたままとなるであろう。
【００２２】
従って、本発明の好ましい態様において、測定された少なくとも2つの細胞パラメーターのうち少なくとも1つは受容体-リガンド内部化であり、このリガンド-受容体内部化は標識されたリガンドまたは標識された受容体の光学的検出によって追跡される。
【００２３】
本発明のこの態様において、標的受容体に対するアゴニストが提供され、これが受容体内部化を誘導する。受容体-リガンド内部化は、標識されたリガンド（アゴニスト）を追跡すること、または標識された標的受容体を追跡することのいずれかにより検出することができ、ここで標識は光学的に検出することができる。標識は共有結合または非共有結合のいずれかによりリガンドまたは標的受容体に付着させることができ、光学的検出は直接的でも間接的でもよい。好ましい態様において、標識はルミノフォアである。また、標識された受容体は、GFPのような蛍光タンパク質が融合されている受容体でないことも好ましい。
【００２４】
標識は、例えばGFPのようなリガンドに融合した蛍光タンパク質の、標的受容体またはリガンドに共有結合的にグラフトされるルミノフォア、好ましくはフルオロフォアを含みうる。または標識は、活性化を誘導することなく標的受容体に結合する抗体であってもよい。次いでその抗体をそれに付着される標識を介して追跡することができる。このような標識は、生きたまたは固定された細胞において直接的にかまたは間接的にかのいずれかで光学的に検出することができるいずれかの標識でありうる。Adie et al.は、pH感受性の光学的に検出可能なタグが結合した特異的抗体と結合することができる、タグが融合された内部化されたGPCRの追跡を開示した（Adie et al.,2003,Assay Drug Dev.Technol.1,251-259）。他の標識としては、ビオチン-ストレプトアビジン系、あるいはルミノフォア、より好ましくはフルオロフォアが、リガンドもしくはアゴニストもしくは受容体、またはそれらに融合もしくは連結したタグに非共有結合的に結合することができる物質に結合するいずれかの他のシステムが挙げられる。適した検出システムとしては、ランタニドキレート検出システムも挙げられる。本発明の好ましい態様において、フルオロフォアで標識されたリガンドが追跡される。次いで、このフルオロフォア標識リガンドは、化合物の存在下または非存在下で、標的受容体を発現する細胞と共にインキュベートされる。上記のように、細胞は、一つまたは複数の標的受容体を発現する細胞系または初代細胞培養でありうる。1つの好ましい態様において、少なくとも2つの標的受容体のいずれか1つを発現する細胞の混合物が用いられる。より好ましい態様においては、少なくとも1つの標的受容体を発現する細胞の亜集団が多重方法によって分析される。もう1つの好ましい態様において、細胞の亜集団は、例えば単一ウェル中のその位置によって区別することができる。最も好ましい態様において、単一細胞が本発明の多重方法によって分析される。
【００２５】
受容体アゴニストは、所与の標的受容体に対するアゴニストとして作用し、かつ受容体内部化を誘導するとして以前に同定された小分子、またはアゴニストとして作用し、受容体内部化を媒介することができる天然リガンド、好ましくはペプチドまたはタンパク質、またはその断片のいずれかでありうる。用語「アゴニスト」および「リガンド」は互換的に用いられ、双方は天然リガンド、そのようなリガンドの断片、受容体とリガンド/アゴニストとの内部化を刺激することができる抗体および小分子を含む。本発明のアゴニストとしては、受容体-アゴニスト複合体の内部化を誘導する標的受容体に対する標識された抗体も含まれる。好ましい態様は、ソマトスタチン、より好ましくはソマトスタチン-14（配列番号:5）；グレリン（ghrelin）（配列番号:6）、より好ましくはグレリンの切断型（配列番号:10）、バソプレッシン（配列番号:7）；またはニューロキニン3（配列番号:8）である。
【００２６】
フルオロフォアで標識されたアゴニストを、アゴニスト-受容体複合体の内部化を誘導する標的受容体を発現する細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を固定し、適当な蛍光イメージングハードウェアおよびソフトウェア、例えば受容体内部化アルゴリズムでArrayScan 4.0（Cellomics）を用いて蛍光強度を定量することによって、内部化されたアゴニストを測定した。以下に記載する実施例において、用いたソフトウェアは、核、例えばHoechst 33258のような特異的蛍光色素で染色した核、またはスポット、例えば蛍光アゴニストを含む小胞を表すスポットのような、より明るい物体の位置、サイズ、形状および強度を同定することができた。従って、蛍光アゴニストの強度は、染色された核によって測定される細胞数と相関させることができた。これは用量応答曲線の決定を可能とし、従って、蛍光的に標識されたアゴニストの内部化を阻害する化合物に関するIC50値の計算が可能であった。
【００２７】
アゴニストまたはリガンドの内部化、および第二の細胞パラメーター（非限定的例として、細胞または細胞の亜集団または複数の細胞の位置、Ca2＋フラックス、受容体遺伝子の発現、または第二のアゴニストの内部化などでありうる）が、化合物の存在下または非存在下でインキュベートした細胞または複数の細胞において測定される。
【００２８】
この設定は、好ましくは単一ウェルにおいて、カウンタースクリーニングを行って化合物の選択性を測定するのにも有用であり、ここで、細胞の少なくとも2つの異なる亜集団は、同一リガンドに結合することができる少なくとも2つの受容体を独立して発現する。そのようなアッセイの1つの可能な非限定的態様は、特異的リガンドに対する1つの標的受容体を発現する1つの細胞、同一リガンドに対する第二の受容体を発現する第二の細胞の使用であり、ここで、細胞の少なくとも1つは光学的に認識でき、例えば蛍光または非蛍光色素（例えば共発現GFP）で標識され、あるいは前記2つの細胞はそれらの位置に基づいて同定することができる。これは2つの細胞の弁別を可能とする。次いで、ルミノフォア、好ましくはフルオロフォアで標識されたリガンドまたは受容体の内部化を、2つの細胞において光学的に独立して検出することができる。次いで、少なくとも1つの受容体の内部化を妨げるアンタゴニストの2つの受容体についての選択性を測定し、定量することができる。例えば、Ca2＋フラックスのような他の細胞パラメーターを、本発明の多重方法における平行測定によって内部化に相関させることができる。
【００２９】
カウンタースクリーニングを行うのに有用なもう1つの可能な設定は、好ましくは単一ウェルにおいて化合物の選択性を測定することであり、ここで細胞の少なくとも2つの異なる亜集団は、異なるリガンドに結合することができる少なくとも2つの受容体を独立して発現する。そのようなアッセイの1つの可能な非限定的態様は、特異的リガンドに対する1つの標的受容体を発現する1つの細胞、第二のリガンドに対する第二の受容体を発現する第二の細胞の使用であり、ここで細胞は、例えば細胞亜集団間の異なる細胞サイズまたは他の光学的な差によって、またはルミネセントまたは非ルミネセント色素（例えば共発現GFP）で標識することによって光学的に区別することができ、あるいは2つの細胞はそれらの位置に基づいて同定することができる。これは2つの細胞の弁別を可能とする。次いで、ルミノフォア、好ましくはフルオロフォアで標識されたリガンドまたは受容体の内部化を、2つの細胞において光学的に独立して検出することができる。
【００３０】
本発明のもう1つの態様において、独立して検出することができる2つの異なる標識で標識された少なくとも2つの異なるリガンドの内部化を、化合物の存在下または非存在下にて、少なくとも2つの異なる標的受容体を独立して発現する細胞の少なくとも2つの異なる亜集団で測定する。
【００３１】
前記した方法の好ましい態様において、標的受容体はGPCRである。
【００３２】
前記した多重方法の好ましい態様において、少なくとも3つの細胞パラメーターを測定する。
【００３３】
本発明は、化合物の多重高含有量スクリーニングにおける、受容体-リガンド追跡のための受容体内部化を誘導するルミノフォア標識アゴニスト、ルミノフォア標識受容体、またはGPCRに対するルミノフォア標識抗体の使用を提供する。好ましくは、ルミノフォアはフルオロフォアである。1つの態様において、ルミノフォア標識受容体は、GFPのような蛍光タンパク質が融合された受容体ではない。
【実施例】
【００３４】
実施例1：アゴニスト内部化アッセイについての包括的な例
フルオロフォアに結合した少なくとも1つのアゴニストを用いた。核に対する染料、例えばHoechst 33258を加えて用いて、個々の細胞の同定を容易にすることができる。以下のプロトコルはHoechst 33258の使用を含むが、これはいずれかの他の細胞染料、蛍光または非蛍光で置き換えることができる。
【００３５】
アッセイに用いる細胞は、天然に標的受容体を発現する細胞、または標的受容体で一過的にまたは安定にトランスフェクトされた細胞であってよい。
【００３６】
プラスティックウェアおよび溶液
アッセイプレート  View plate（商標）96、黒色；Packardカタログ番号1104-02C、任意でポリ-Dリシン処理
10×HBSS  GIBCOカタログ番号14065-049
Hepes  1M溶液、GIBCOカタログ番号15630-056
BSA  ウシ血清アルブミン画分V、Sigma、カタログ番号A-3059
Hoechst 33258  Sigma、カタログ番号B-2261（ビスベンズイミド）、DMSO中10mMに溶解
ホルムアルデヒド  4％、PBS中の36.5％ストック（Fluka、カタログ番号47629）から希釈
【００３７】
試料調製
一日目：細胞を実験の24時間前に播種した。細胞をトリプシン/EDTAで剥がした。増殖培地を加え、10mlピペットに10〜20回通すことによって細胞を再懸濁させた。細胞濃度を測定し、細胞懸濁液を適当な濃度まで希釈した。96ウェルプレートで行う実験のために、細胞を200μl培地に15,000細胞/ウェルで播種した。細胞を細胞培養インキュベーター中で37℃にてインキュベートして、細胞をウェルに付着させた。
【００３８】
二日目：I-緩衝液を調製した（1×HBSS、20mM Hepes、0.1％BSA、3回蒸留水（tri-distilled water）で調製、pHは調整せず）。Hoechst 33258溶液を調製し、37℃にて平衡化させた。競合体溶液および蛍光リガンド溶液を調製し、37℃にて5分間で平衡化させた。続いての刺激の間、ウェル中37℃の温度を維持した。
【００３９】
細胞培養培地を穏やかに吸引した。各ウェルに、70μl 1.8×Hoechst溶液、1％DMSOを含む10μlのフルオロフォア-アゴニスト/緩衝液、および10μlの濃度漸増フルオロフォア-アゴニスト/緩衝液を競合のために、または緩衝液単独を対照ウェルに加えた。混合物を湿潤化インキュベーター中で37℃にて20〜40分間インキュベートした。
【００４０】
細胞を、37℃で予め平衡化させた100μl/ウェルのI-緩衝液で注意深く迅速に1回洗浄した。次いで、100μl/ウェルの4％ホルムアルデヒド（室温）を加え、ウェルを室温にて15分間インキュベートした。溶液を150μlのPBS/ウェルに交換した。
【００４１】
アゴニスト内部化の定量
アゴニスト内部化を、ArrayScan 4.0（Cellomics）をフィルター（Omega Optical,Vermont,USA）と共に用いて定量した。この装置は倒立蛍光顕微鏡を備えており、試料に対する自動焦点合わせ、および透明底部96ウェルプレート中に調製した試料からのイメージの獲得を可能とする。読み取り装置にはイメージ分析用のソフトウェアが組み込まれており、予め規定されたタイプの対象物の場所が同定される。
【００４２】
本明細書において実施例1〜4で用いた分析方法（アルゴリズム）は「Receptor Internalization（受容体内部化）」と呼ばれるものである。分析は、DNA特異的フルオロフォアおよび受容体特異的フルオロフォアで染色した試料の異なるフィルターセットで獲得された2つのイメージに基づくものであった。双方のイメージから対象物を同定した。DNA染色に対して特異的な第一のイメージから、核の数、位置、サイズおよび形状を決定した。第二のものから、濃縮された受容体特異的フルオロフォア（いわゆるERC）からなる対象物の位置、サイズ、形状および強度が同定された。双方のイメージの分析に関して、対象物の強度、サイズおよび形状についてのある一定の制限は、使用者によって調整できよう。これは、関心対象の対象物についての種々のパラメーターの選択的同定および定量を可能とした。
【００４３】
示した実施例で用いたフィルター設定についての詳細については、実験方法の最後のリストを参照されたい。
【００４４】
データの分析
IC50は、GraphPad Prism 3.02ソフトウェア（GraphPad Software, Inc.）を使用して、蛍光リガンドの受容体媒介内部化に対する非蛍光リガンドの阻害効果について測定した。
【００４５】
実施例2：Atto590-SST14でのhSSTR5の内部化
96ウェルフォーマットにおける固定した二重染色SSTR-5細胞集団の調製、および続いての高含有量スクリーニングを用いる内部化の定量に関するプロトコール。細胞染料:Hoechst 33258（核の染色用）およびAtto590-SST14。
【００４６】
このアッセイに用いた細胞系は、組換えヒトソマトスタチン受容体5を安定に発現するCHO細胞を含むものであった（Rocheville et al.,2000,J.Biol.Chem.275,7862-7869に従って作成された）。
【００４７】
蛍光アゴニストとして、N末端にフルオロフォアAtto590がグラフトされたソマトスタチンペプチドを用いた。
2006115843.tif 000002
＊はシステインブリッジの形成を示す。
【００４８】
N末端にグラフトされたフルオロフォアAtto590（Atto-tec）を有するソマトスタチン-14アナログ（Atto590-SS14）はBiosynthan,Berlinによってカスタム合成された。
【００４９】
ストック溶液
1.8×Hoechst溶液
9μM Hoechst 33258
I-緩衝液
9×競合体溶液
9×SST14（Bachemカタログ番号H-1490）希釈系列、I-緩衝液中に調製
I-緩衝液での希釈により新たに調製
9×蛍光リガンド溶液
900nm Atto590-SST14
I-緩衝液での希釈により新たに調製
PBS
【００５０】
試料は前記および実施例1に記載したように調製した。Atto590-SST14をフルオロフォア-アゴニストとして用いた。リガンド内部化は実施例1に記載したように定量した。
【００５１】
図1は、Atto590-SST14と共にインキュベートし、加えてDNA結合フルオロフォアHoechst染料で染色したSSTR-5発現細胞のイメージを示す。イメージはCellomics ArrayScan読み取り装置4.0を用いて獲得した。
【００５２】
パネルAは、Atto590蛍光に選択的なフィルター設定で獲得したAtto590-SST14と共にインキュベートした細胞を示す。パネルBは、細胞核の位置を規定するHoechst選択的フィルターを通して獲得した同一試料のイメージである。2つのイメージを重ねると、蛍光リガンドは、細胞の核の周りに密に位置したスポットとして見え、内質リサイクリング区画（endoplasmatic recycling compartment, ERC）に濃縮されているようであった。
【００５３】
過剰のSST14との共インキュベーション（パネルCおよびD）は蛍光ERCの形成をブロックすることから、Atto590-SST14のサイトゾル区画への移動はかなり受容体特異的であった。
【００５４】
ArrayScan4.0のような高含有量スクリーニング読み取り装置によって、スポットに濃縮された蛍光強度の差を定量することができた。本実施例においては、Receptor Internalization（Cellomics）用のアルゴリズムを適用した。このソフトウェアは、イメージ中の核およびスポットのような、より明るい対象物の位置、サイズ、形状および強度を同定することができた。各々Hoechstおよび蛍光リガンドに選択的な2つのイメージに基づき、前記アルゴリズムにより核の数を同定し、同定されたERCに局所化された蛍光強度を定量した。図2は、これを用いてどのように受容体に対する競合リガンドの存在を検出することができたかを示す。漸増濃度のSST14は、HCS読み取り装置によって検出された内部化Atto590-SST14の量を用量依存的に低下させた。
【００５５】
IC50値を計算した。3つの独立したアッセイにおいて、平均IC50は70mM＋/-20nM（n＝3）であると決定され、受容体薬理学的動態を再現性良く実験できることが示された。フィルターセットを表1に示す。
【００５６】
実施例3：Atto665-NKBでのhNK3Rの内部化
この実施例では、NK3受容体を安定に発現するCHO細胞を用いた（NK3受容体でのCHO細胞の安定なトランスフェクションは、Gether et al.,1992,FEBS Lett.296,241-244に記載されている）。
【００５７】
用いた細胞染料:Hoechst 33258（核の染色用）
試料の調製および測定は以下の修飾を施して実施例1のように行った。
【００５８】
蛍光リガンドとして、ニューロキニンB（NKB）アナログをフルオロフォアAtto655（sATTO-tec、カタログ番号AD655-4）で標識した。
【００５９】
蛍光NKBアナログは式:
【化１】
2006115843.tif 000003
を有した。
【００６０】
ニューロキニンBアナログにおいては、NKBのアミノ酸aa7をメチル-フェニルアラニンで置き換え、アミノ酸aa1はシステインで置換した。Atto655はシステイン側鎖にグラフトした。
【００６１】
ペプチドはBiosynthan,Berlinによってカスタム合成した。以下のプロトコルに従って、フルオロフォアAtto655（Atto-tec、カタログ番号AD655-4）をシステイン側鎖に共有結合させた。
【００６２】
チオール含有ペプチドを9:1 DMSO:50mMリン酸緩衝液pH6に1〜10mMの最終濃度で溶解させた。フルオロフォア試薬（10〜50mMの新たに調製した溶液、DMSO中）を段階的に加え、混合物を室温にて10分間反応させた。反応の進行は、RP-HPLCでの試料の分析によって追跡した。最後に、蛍光標識ペプチドをRP-HPLCによって単離した。
【００６３】
生成物は、試料の少量をHPLCへ再注入することにより＞90％純度であることが判明した。質量分析によって測定した分子量は1908.8Daであった。
【００６４】
蛍光試薬は650Daの分子量を有し、反応性基はマレイミドであった。フルオロフォアの正確な構造は知られていない。この情報に従って、Atto655-NKBの計算された分子質量は1909Daであった。
【００６５】
溶液
9×蛍光リガンド溶液
9nM Atto655-NKB
I-緩衝液中の希釈によって新たに調製
9×競合体溶液
9×希釈系列、I-緩衝液中に調製
I-緩衝液中の希釈によって新たに調製。
【００６６】
アッセイは実施例1に記載したように行った。Atto655-NKBをフルオロフォア-アゴニストとして用いた。アゴニスト内部化は実施例1に記載したように定量した。
【００６７】
リガンド内部化の定量には、以下のフィルター設定を用いた：Omegaフィルター、XF93 hoechstおよびXF110 Cy5。
【００６８】
図3は、Atto655-NKBおよびHoechst 33258染料とともにインキュベートしたNK3R発現細胞のイメージを示す。イメージは、Cellomics ArrayScan Reader 4.0を用いて獲得した。
【００６９】
パネルAは、Atto655蛍光に選択的なフィルター設定で獲得した、Atto655-NKBと共にインキュベートした細胞を示す。パネルBにおいては、同一試料の蛍光イメージを、細胞核の位置を規定するhoechst選択的フィルターを通して獲得した。重ねると、蛍光リガンドは、細胞の核の周りに密に位置したスポットとして明瞭に見え、内質リサイクリング区画（ERC）に濃縮されているようであった。
【００７０】
過剰のNK3R非ペプチドアンタゴニストSB222200との共インキュベーション（パネルCおよびD）が蛍光ERCの形成をブロックしたことから、Atto655-NKBのサイトゾル区画への移動はかなり受容体特異的であった。本実施例においては、受容体発現細胞は、全細胞集団に対して割合が小さい（20〜30％）ようであった。
【００７１】
実施例1に記載されたように、内部化リガンドの量は高含有量スクリーニング読み取り装置を用いて定量することができた。本実施例において、少数の細胞集団のみがNK3受容体を発現しているような細胞試料についても、この定量を行うことができたことが示された。図4は、どのように漸増濃度のSB222200が、HCS読み取り装置によって検出された内部化Atto655-NKBの量を用量依存的に低下させたかを示す。
【００７２】
2つの独立したアッセイにおいて、平均IC50は10nM＋/-8nM（N＝2）であると決定され、受容体薬理学的動態を再現性良く実験できることが示された。
【００７３】
実施例4：グレリン(1-19)-テキサスレッドでのGHSR-1aの内部化
本実施例においては、GHSR-1a受容体を安定に発現するヒト胎児性腎臓（HEK293）細胞を用いた。GHSR-1aを安定に発現する細胞は、当技術分野において周知のプロトコルに従って産生した（例えば、Lindemann et al.,2005,Genomics 85,372-385；J. Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989；Casademunt,et al.,EMBO J.18 (1999) 6050-6061を参照されたい）。
【００７４】
用いた細胞染料:Hoechst 33258（核の染色用）
試料の調製および測定は以下の修飾を施して実施例1のように行った。
【００７５】
蛍光リガンドとして、フルオロフォアテキサスレッド（Molecular Probes）で標識された切断型グレリンアナログを用いた。
【００７６】
蛍光グレリンアナログは式:
【化２】
2006115843.tif 000004
を有した。
【００７７】
グレリンアナログはアミノ酸aa19の後ろで切断し、アミノ酸aa19はシステインで置換した（配列番号:10を参照されたい）。すでに記載されたプロトコルに従って（EP 1524274を参照されたい）、ペプチドを合成し、テキサスレッドをシステイン側鎖にグラフトした。
【００７８】
競合体として、非ペプチドリガンドMK0677（WO94113696）を用いた。
【００７９】
溶液
9×蛍光リガンド溶液
90nMグレリン(1-19)テキサスレッド
I-緩衝液中の希釈によって新たに調製
9×競合体溶液
9×希釈系列、I-緩衝液中に調製
I-緩衝液中の希釈によって新たに調製
【００８０】
アッセイは実施例1に記載したように行った。グレリン(1-19)-テキサスレッドをフルオロフォア-アゴニストとして用いた。アゴニスト内部化は実施例1に記載したように定量した。
【００８１】
リガンド内部化の定量には、以下のフィルター設定を用いた：Omegaフィルター、XF53 hoechstおよびXF53 TxR。
【００８２】
図7は、グレリン(1-19)-テキサスレッドおよびHoechst 33258染料と共にインキュベートしたGHSR-1a発現細胞のイメージを示す。イメージは、Cellomics ArrayScan Reader 4.0を用いて獲得した。
【００８３】
パネルAは、テキサスレッド蛍光に選択的なフィルター設定で獲得された、グレリン(1-19)-テキサスレッドと共にインキュベートした細胞を示す。パネルBにおいては、同一試料の蛍光イメージを、細胞核の位置を規定するhoechst選択的フィルターを介して獲得した。重ね合わせると、蛍光リガンドは、細胞の核の周りに密に位置したスポットとして明らかに見え、内質リサイクリング区画（ERC）に濃縮されているようであった。
【００８４】
過剰のGHSR-1a非ペプチドアンタゴニストMK0677との共インキュベーション（パネルCおよびD）が蛍光ERCの形成をブロックしたことから、サイトゾル区画へのグレリン(1-19)-テキサスレッドの移動はかなり受容体特異的であった。
【００８５】
実施例1に記載したように、内部化リガンドの量は、高含有量スクリーニング読み取り装置を用いて定量することができた。本実施例において、少数の細胞集団のみがGHSR-1a受容体を発現するような細胞試料でも、この定量を行うことができたことが示された。図8は、どのように漸増濃度のMK0677が、HCS読み取り装置によって検出された内部化グレリン(1-19)-テキサスレッドの量を用量依存的に低下させたかを示す。
【００８６】
2つの独立したアッセイにおいて、平均IC50は11nM＋/-4nM（N＝4）であると決定され、受容体薬理学的動態が再現性良く実験できることが示された。
【００８７】
実施例5：BO-TMR-バソプレッシンでのhV1bRの内部化
本実施例では、V1b受容体を安定に発現するCHO細胞を用いた。V1bを安定に発現する細胞は、当技術分野において周知のプロトコルに従って生産された（例えば、Lindemann et al., 2005, Genomics 85,372-385；J.Sambrook, E.F. Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989；Casademunt, et al.,EMBO J.18 (1999) 6050-6061を参照されたい）。
【００８８】
用いた細胞染料:Hoechst 33258（核の染色用）
試料の調製および測定は以下の修飾を施して実施例1のように行った。
【００８９】
蛍光リガンドとして、フルオロフォアBODIPY-TMR（蛍光偏光キットFPA120の一部としてPerkin Elmerから購入した蛍光リガンド）で標識されたバソプレッシンアナログを用いた。
【００９０】
このペプチドについて、配列または構造は提供されていなかった。
【００９１】
競合体として、Arg-8-バソプレッシンを用いた（位置8にArgを有するバソプレッシン）。
【００９２】
バソプレッシンの配列を配列番号:7に示す。
【００９３】
溶液
9×蛍光リガンド溶液
5nM BO-TMR-バソプレッシン
I-緩衝液中の希釈により新たに調製
9×競合体溶液
9×希釈系列、I-緩衝液中に調製
I-緩衝液中の希釈により新たに調製
【００９４】
アッセイは実施例1に記載したように行った。BO-TMRバソプレッシンをフルオロフォア-アゴニストとして用いた。アゴニスト内部化は実施例1に記載したように定量した。
【００９５】
リガンド内部化の定量については、以下のフィルター設定を用いた：Omegaフィルター、XF93 hoechstおよびTRITC。
【００９６】
図9は、BO-TMR-バソプレッシンおよびHoechst 33258染料とともにインキュベートされたV1bR発現細胞のイメージを示す。イメージはCellomics ArrayScan Reader 4.0を用いて獲得した。
【００９７】
パネルAは、BO-TMR蛍光に選択的なフィルター設定で獲得された、BO-TMR-バソプレッシンと共にインキュベートされた細胞を示す。パネルBにおいては、同一試料の蛍光イメージが、細胞核の位置を規定するhoechst選択的フィルターを介して獲得された。重ねると、蛍光リガンドは、細胞の核の周りに密に位置したスポットとして明らかに見え、内質リサイクリング区画（ERC）に濃縮されているようであった。
【００９８】
過剰のV1bRペプチドアゴニストArg-8-バソプレッシンとの共インキュベーション（パネルCおよびD）が、ほとんどの細胞において蛍光ERCの形成をブロックしたことから、サイトゾル区画へのAtto655-NKBの移動は、かなり受容体選択的であった。
【００９９】
実施例1に記載したように、内部化リガンドの量を、高含有量スクリーニング読み取り装置を用いて定量することができた。本実施例においては、少数の細胞集団のみがV1b受容体を発現するような細胞試料でも、この定量を行うことができたことが示された。図10は、どのように漸増濃度のArg-8-バソプレッシンが、HCS読み取り装置によって検出された内部化BO-TMR-バソプレッシンの量を用量依存的に低下させたかを示す。
【０１００】
2つの独立したアッセイにおいて、平均IC50は、実験の2つの独立したセットにおいて、各々5nMおよび15nMであると決定され、受容体薬理学的動態が再現性良く実験できることが示された。
【０１０１】
実施例6：NK3およびSSTR5発現細胞系における内部化の多重化
多重化とは、1より多くの独立したパラメーターが測定値として獲得されるアッセイを意味する。高含有量スクリーニングにより、イメージベースの分析は、ある測定された光学シグナルを個々の同定された細胞に直接的に帰属させる。これは、個々の細胞内の多数事象、または亜集団が異なる応答をする可能性がある異種細胞ミックスにおける事象の双方についての多重化を可能とする。
【０１０２】
本実施例では、同一ウェルにおいて異なるGPCRについての2つの内部化アッセイを合わせることによって、高含有量スクリーニングが多重化を可能とすることが示された。本明細書において適用されたアプローチは、個々のリガンドの各々に選択的なイメージの獲得を可能とする蛍光スペクトルを有する受容体特異的蛍光リガンドを用いることであった。
【０１０３】
NK3RおよびSSTR-5についての多重化アッセイは、同一ウェルにおける2つの細胞系の共播種、および1より多くの蛍光リガンドとの同時インキュベーションを除いて、実施例1〜3に従って行った。この分析には、2つではなく3つの、同一視野のイメージの獲得が必要であった：1つは細胞核のHoechst染色、2つ目はAtto590蛍光に特異的なもの、および3つ目はAtto655蛍光に特異的なもの。
【０１０４】
多重化のために、実施例2および3に記載された2つの細胞系を、前記したように96ウェルプレート中に24時間共播種した。個々の受容体の内部化用のものと同一濃度のストック溶液を用い、容量を調整して、さらなる競合体および蛍光リガンド溶液を補った。
【０１０５】
ArrayScan 4.0（Omega Optical, Vermont, USA）でのリガンド内部化の定量には、Omegaフィルターを用いた。同一試料について2つのスキャンを行った：
スキャン1:「XF93 hoechst」および「XF93 Cy5」（内部化Atto655-NKBの検出）、
スキャン2:「XF53 hoechst」および「XF53 TxR」（内部化Atto590-NKBの検出）。
【０１０６】
図5は、Atto590-SSTR14、Atto655-NKBおよびHoechst染料と共にインキュベートしたSSTR-5細胞と混合されたNK3R発現細胞のイメージを示す。イメージはCellomics ArrayScan Reader 4.0を用いて獲得した。
【０１０７】
図5におけるイメージの各列は、個々のフルオロフォアHoechst（C、F、IおよびL）、Atto590（B、E、HおよびK）およびAtto655（A、D、GおよびJ）の実質的に選択的な検出を可能とする3つの異なるフィルター設定で得られた、試料内の同一視野につき獲得された。第一の試料においては（イメージA、BおよびC）、NK3RおよびSSTR5発現細胞はともに、内部化リガンドAtto655-NKB（A）およびAtto590-SST14（B）でそれぞれ染色された。予期されたように、2つの染色の間に有意な重なりは観察されなかった。個々の細胞が受容体の1つを発現したに過ぎなかったからである。第二および第三の列における2つの次の試料のイメージセットにおいては、どのように蛍光リガンドの受容体媒介内部化が、受容体特異的非蛍光競合体によって選択的にブロックできたかが示された。このように、過剰のNK3RアンタゴニストSB222200はSSTR-5の内部化に対して影響せず（E）、他方、蛍光リガンドのNK3R媒介内部化はブロックされた（D）。また、SSTR-5内部化は、過剰のSST14が加えられた場合に選択的に阻害できた（G、H）。最後の列においては（J、KおよびL）、2つの競合体のミックスでのNK3RおよびSSTR-5内部化の同時ブロッキングが示されている。
【０１０８】
図6において、イメージの定量は、蛍光リガンドのうちの1つの実質的に選択的な検出を可能とした前記で示したフィルターを介して同一試料から採取して示されている。パネルAにおいては、漸増量のSB222200は、ERCに局所化されたAtto655-NKBの蛍光強度を低下させ、他方、内部化Atto590-SST14の量は影響されなかった。Atto655-NKB内部化の阻害についてのIC50は21nMと決定され、これは実施例2で示された個々のNK3リガンド追跡システムで見出されたIC50とよく対応する。Bにおいては逆の状況であり、Atto590-SST14のERC強度はSST14によって低下し、他方、ERCにおけるAtto655-NKBの強度は変わらなかった。Atto590-SST14内部化の阻害についての36nMにおけるIC50は、実施例2に示されたSSTR-5システムで見出された値と良好な相関があった。
【０１０９】
【表１】
2006115843.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】96ウェルプレートで調製された固定細胞試料のイメージは、Cellomics ArrayScan 4.0高含有量スクリーニング読み取り装置で獲得された。対物レンズ10倍。フィルター設定1:XF53-TxR、2秒の露出時間（パネルAおよびC）。フィルター設定2:XF53-hoechst、0.1秒の露出時間（パネルBおよびD）。  A:37℃にて30分間、100nM Atto590-SST14とともにインキュベートされたSSTR-5発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。パネルB:Aと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。C:1μM SST14および100nM Atto590-SST14と共にインキュベートされたSSTR-5発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。D:Cと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。
【図２】用量応答曲線  100nM Atto590-SST14および様々な量のSST14とともにインキュベートされたSSTR-5細胞の試料から測定された、細胞当たりのERC（内質リサイクリング区画）強度（試料調製については、プロトコルを参照されたい）。分析されたイメージは、図1の説明に記載されたものと同一の光学設定で獲得された。核の数およびERCにおける強度は、ウェル当たり4つのイメージから受容体内部化アルゴリズム（Cellomics）を使用して測定した。
【図３】96ウェルプレートで調製された固定細胞試料のイメージは、Cellomics ArrayScan 4.0高含有量スクリーニング読み取り装置で獲得された。対物レンズ20倍。フィルター設定1:XF110-Cy5、10秒の露出時間（パネルAおよびC）。フィルター設定2:XF53-hoechst、0.1秒の露出時間（パネルBおよびD）。  パネルA:37℃にて30分間、1nM Atto655-NKBと共にインキュベートされたNK3R発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。B:Aと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。C:1μM SB222200および1nM Atto655-NKBと共にインキュベートされたNK3R発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。D:Cと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。
【図４】用量応答曲線  SB222200の変化量の関数としての、1nM Atto655-NKBと共にインキュベートされたNK3R細胞の試料から測定された、細胞当たりのERC強度（試料調製については、プロトコルを参照されたい）。分析されたイメージは、図3の説明に記載されたものと同一の光学設定で獲得され、ウェル当たり4つのイメージセットから受容体内部化アルゴリズム（Cellomics）を使用して分析した。
【図５】1nM Atto655-NKBおよび100nM Atto590-SST14および異なる組合せの非蛍光リガンドと共に37℃にて30分間インキュベートしたNK3R発現細胞およびSSTR5発現細胞の混合集団。A、B、C:非蛍光リガンド無し；D、E、F:1μM SST14；G、H、I:1μM SB222200；J、K、L:1μM SST14および1μM SB222200。  94プレートで調製した固定細胞試料、Cellomics ArrayScan 4.0高含有量スクリーニング読み取り装置において異なるフィルター設定で獲得された3つのイメージを重ねたもの。対物レンズ10倍。フィルター設定:XF53-TxR、0.8秒の露出時間（A、D、G、J）、XF93-Cy5、10秒の露出時間（B、E、H、K）およびXF53-hoechst、0.1秒の露出時間（C、F、I、L）。
【図６】用量応答曲線  1nM Atto655-NKBおよび100nM Atto590-SST14とともにインキュベートされた混合NK3R細胞およびSSTR5細胞の試料のイメージから測定された、細胞当たりのERC強度。左側Y軸、塗り潰された丸:XF53 hoechst/XF53-TxRフィルター設定で獲得されたイメージ対についてのERC強度/細胞。右側Y軸、白抜きの丸:XF93-hoechst/XF93-Cy5フィルター設定で獲得された同一試料のイメージ対についてのERC強度/細胞。上方パネル:SB222200の変化量の関数としてのERC強度、下方パネル SST14の変化量の関数としてのERC強度。イメージセットは、ウェル当たり4つのイメージから受容体内部化アルゴリズム（Cellomics）を使用して分析した。  図6は、この設定がどのようにGPCR内部化についての2つの独立した測定値の同一試料における同時定量を可能とするかを示す。
【図７】96ウェルプレートで調製された固定細胞試料のイメージは、Cellomics ArrayScan 4.0高含有量スクリーニング読み取り装置で獲得された。対物レンズ20倍。フィルター設定1:XF53-TxR、2秒の露出時間（パネルAおよびC）。フィルター設定2:XF53-hoechst、0.1秒の露出時間（パネルBおよびD）。  パネルA:37℃にて30分間、10nMグレリン(1-19)-テキサスレッドと共にインキュベートしたGHSR-1a発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。B:Aと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。C:1μM MK0677および10nMグレリン(1-19)-テキサスレッドと共にインキュベートされたGHSR-1a発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。D:Cと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。
【図８】用量応答曲線  MK0677の変化量の関数としての、10nMグレリン(1-19)-テキサスレッドと共にインキュベートされたGHSR-1a細胞の試料から測定された、細胞当たりのERC強度（試料調製については、プロトコルを参照されたい）。分析されたイメージは、図7の説明に記載されたものと同一の光学設定で獲得され、ウェル当たり4つのイメージセットから受容体内部化アルゴリズム（Cellomics）を使用して分析した。
【図９】96ウェルプレートで調製された固定細胞試料のイメージは、Cellomics ArrayScan 4.0高含有量スクリーニング読み取り装置で獲得された。対物レンズ20倍。フィルター設定1:XF93-TRITC、2秒の露出時間（パネルAおよびC）。フィルター設定2:XF93-hoechst、0.1秒の露出時間（パネルBおよびD）。  パネルA:37℃にて30分間、5nM BO-TMR-バソプレッシンと共にインキュベートされたV1bR発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。B:Aと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。C:100nM Arg-8-バソプレッシンおよびBO-TMR-バソプレッシンと共にインキュベートされたV1bR発現細胞、フィルター設定1を介して獲得されたイメージ。D:Cと同一試料、フィルター設定2を介して獲得されたイメージ。
【図１０】用量応答曲線  Arg-8-バソプレッシンの変化量の関数としての、5nM BO-TMR-バソプレッシンと共にインキュベートされたV1bR細胞の試料から測定された、細胞当たりのERC強度（試料調製については、プロトコルを参照されたい）。分析されたイメージは、図8の説明に記載したものと同一の光学設定で獲得され、ウェル当たり4つのイメージセットから受容体内部化アルゴリズム（Cellomics）を使用して分析した。
【図１】
2006115843.tif 000006
【図２】
2006115843.tif 000007
【図３】
2006115843.tif 000008
【図４】
2006115843.tif 000009
【図５】
2006115843.tif 000010
【図６】
2006115843.tif 000011
【図７】
2006115843.tif 000012
【図８】
2006115843.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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