(57)【要約】【課題】タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上した組換えバチルス属細菌、及びこれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法の提供。【解決手段】  枯草菌遺伝子spo0A及びabrB、又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子が共に欠失又は不活性化されたバチルス属細菌株に、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域並びに目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入してなる組換えバチルス属細菌、当該組換えバチルス属細菌を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌遺伝子spo0A及びabrB、又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子が共に欠失又は不活性化されたバチルス属細菌株に、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域並びに目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入してなる組換えバチルス属細菌。
【請求項２】
バチルス属細菌が枯草菌である請求項１記載の組換えバチルス属細菌。
【請求項３】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、Bacillus sp. KSM-64（FERM P-10482）又はBacillus sp. KSM-S237（FERM P-16067）の遺伝子由来のものである請求項１又は２記載の組換えバチルス属細菌。
【請求項４】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片である請求項１又は２記載の組換えバチルス属細菌。
【請求項５】
目的のタンパク質が、セルラーゼ又はアミラーゼである請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えバチルス属細菌。
【請求項６】
セルラーゼが配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と７０%以上の同一性を有し、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質であり、アミラーゼが配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、且つアルカリアミラーゼ活性を有するタンパク質である請求項５記載の組換えバチルス属細菌。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えバチルス属細菌を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換えバチルス属細菌、及びこれを用いたタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg  No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
また最近では、ある種の微生物について、胞子形成に関わる遺伝子（例えばsigE 、sigF等の遺伝子群）を削除又は不活性化した菌株が構築され、タンパク質やポリペプチドの生産性向上効果が得られることが報告され（特許文献１参照）、枯草菌の胞子形成開始の制御因子であるspo0A遺伝子とabrB遺伝子を不活性化させた菌株において、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの生産性が向上することも報告されている（非特許文献１）
【０００５】
一方、枯草菌等のバチルス属細菌については、その宿主ベクター系は適当な転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、分泌シグナル領域がない場合には、目的産物の正常な発現が行われなかったり、或いは目的産物が細胞内に留まったまま正常に分泌されなかったりすることが知られている。更に、枯草菌はタンパク質分解酵素を菌体の内外に生産することが知られており、分泌生産された目的のタンパク質が膜の上や菌体外で分解されるといった問題がある。
【特許文献１】特開２００３−４７４９０号公報
【非特許文献１】Xu,K. et al., J. Bacteriol. 178, 4319(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、目的のタンパク質又はポリペプチドの分泌生産性が向上した組換えバチルス属細菌、及びこれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、バチルス属細菌を用いたタンパク質の生産方法について種々検討したところ、枯草菌遺伝子spo0A及びabrB、又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子を共にゲノム上から欠失又は不活性化した後、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域並びに生産の目的であるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの分泌生産性が大幅に向上し、効率よく目的生産物が得られることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、枯草菌遺伝子spo0A及びabrB、又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子が共に欠失又は不活性化されたバチルス属細菌株に、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域並びに目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入してなる組換えバチルス属細菌に係るものである。
【０００９】
また本発明は、当該組換えバチルス属細菌を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法に係るものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組換えバチルス属細菌を用いることにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの分泌生産性向上を図ることができ、目的のタンパク質又はポリペプチドを効率よく且つ大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science,227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本発明において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００１３】
本発明の組換えバチルス属細菌に用いられる宿主バチルス属細菌株は、枯草菌のspo0A遺伝子（Nature, 390, 249-256, (1997)、及びJAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB、http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)に於ける遺伝子番号  BG10765）及びabrB遺伝子（Nature, 390, 249-256, (1997)、及びJAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB、http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)に於ける遺伝子番号  BG10100）、又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子が共に欠失又は不活性化されたものである。
斯かる宿主バチルス属細菌株としては、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１４】
spo0A遺伝子は、胞子形成開始制御因子であるSpo0Aをコードする遺伝子である。リン酸化されたSpo0A（Spo0A〜P）は、abrB遺伝子の発現を抑制する他、胞子形成期特異的なシグマ因子をコードするsigF遺伝子やsigE遺伝子をはじめ、様々な遺伝子の発現調節に関与している。
【００１５】
abrB遺伝子は、リプレッサーAbrBをコードする遺伝子である。AbrBは、胞子形成期特異的なシグマ因子SigHをコードするsigH遺伝子の発現を抑制し、また主要な細胞外アルカリプロテアーゼをコードするaprE遺伝子をはじめ、様々な遺伝子の発現調節に関与している。
【００１６】
Spo0AやAbrB等の枯草菌転写制御因子に関する情報は、DBTBS: database of transcriptional regulation in Bacillus subtilis (DBTBS release3.4) でインターネット公開（http://dbtbs.hgc.jp/、2005年1月14日更新）されており、同データベースにおいて、Spo0A或いはAbrBに転写を制御される遺伝子が示されている（Makita Y, Nakao M, Ogasawara N, Nakai K., DBTBS: database of transcriptional regulation in Bacillus subtilis and its contribution to comparative genomics Nucleic Acids Res., 32,D75-77 (2004) (NAR online）。
【００１７】
これらの遺伝子に相当する遺伝子としては、例えば以下の（１）〜（２）に示す遺伝子が挙げられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
（１）上記枯草菌のspo0A遺伝子及びabrB遺伝子と同じ機能を有し、且つ各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子。
（２）上記枯草菌のspo0A遺伝子及びabrB遺伝子と同じ機能を有し、且つ各遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子。
なお、ここで、「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１８】
本発明の組換えバチルス属細菌においては、目的のタンパク質等の生産性向上に対してより大きな効果が期待できるものであれば、欠失又は不活性化する遺伝子には、上記枯草菌のspo0A遺伝子及びabrB遺伝子又は当該遺伝子に相当するそれぞれの遺伝子以外の遺伝子の欠失又は不活性化を組み合わせることも可能であり、更には当該遺伝子の欠失の他に、それ以外の遺伝子の発現強化及び機能強化を組み合わせることも可能である。
【００１９】
本発明における遺伝子の欠失又は不活性化には、標的遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは、当該遺伝子の転写・翻訳開始制御領域に変異を与える等の方法によって標的遺伝子を不活性化することが挙げられるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させるのがより望ましい。
【００２０】
斯かる遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、上記の標的遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２１】
標的とする遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法が挙げられ、既にいくつかの方法が報告されている（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等）。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親細菌細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって細菌ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化する方法や、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親細菌細胞内に取り込ませて親細菌ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換する方法が挙げられる。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００２２】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親細菌にγ線等を照射すること等によって実施可能である。
【００２３】
以下に、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２４】
本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.1-3.0kb、好ましくは約0.4-3.0kb断片と、同じく下流に隣接する約0.1-3.0kb、好ましくは約0.4-3.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２５】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２６】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示した中から選ばれるプライマーを表２の様なプライマーセットとして用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００２７】
かくして得られた欠失用DNA断片を、公知の方法によって細胞内に導入すると、欠失用DNA断片と親細菌ゲノムの欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域間において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失（不活性化）用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。具体的に導入用DNA断片を細胞内に導入する方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
【００２８】
本発明の組換えバチルス属細菌は、斯くして得られたバチルス属細菌株（バチルス属細菌変異株）に、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域並びに目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入することにより作製される。すなわち、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子には、その上流にバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を含むＤＮＡ断片が適正な形で結合されていることが必要である。
【００２９】
バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域としては、例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域が挙げられる。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加したした塩基配列からなるDNA断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加したした塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは複数個の塩基配列が付加されているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３０】
当該目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片の宿主バチルス属細菌への導入は、斯かるDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の一般的な形質転換法によって宿主細胞に取り込ませること、或いは当該DNA断片に宿主枯草菌ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主細菌ゲノムに直接組み込むことによって行うことができる。宿主細菌ゲノムに直接組み込む方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
【００３１】
ここで、目的のタンパク質やポリペプチドは、特に限定されず、洗浄剤用、食品加工用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERMBP-7875）、または、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に具体的な例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該セルラーゼとアミノ酸配列において70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有し、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３２】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼが挙げられ、更に具体的な例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミラーゼとアミノ酸配列において70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有し、且つアルカリアミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３３】
本発明の組換えバチルス属細菌を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、目的のタンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３４】
以下に、組換え枯草菌株構築の実施例を中心に、本発明の組換えバチルス属細菌の構築方法及びこれを用いたアルカリセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００３６】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００３７】
また、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００３８】
培養上清中のセルラーゼ活性は、合成基質4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)の分解活性を測定することにより求めた。すなわち、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００３９】
培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００４０】
実施例１  spo0A遺伝子の欠失
表１に示したspo0A-260F及びSPO-1-RX、SPO-2-F及びSPO-2-RBの各プライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、spo0A遺伝子の上流を含む５’末端側の699 bp断片（Ａ）、及び３’末端側の348 bp断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。尚、それぞれのプライマーの５’末端側には、ApaI、XhoI、PstI、BamHIの各制限酵素認識配列が付加されている。得られた断片（Ａ）はApaIおよびXhoI、（Ｂ）はPstIおよびBamHI処理した。一方、プラスミドｐDG1727（Gene, 167, 335, (1995) ）のBamHIおよびXhoI制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出した（Ｃ）。次に、３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に、ｐBluescript II SK(+)（Stratagene）に（Ａ）はApaIおよびXhoI、（Ｃ）はXhoIおよびPstI、（Ｂ）はPstIおよびBamHI制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドＤＮＡを制限酵素ScaIで処理して直鎖状ＤＮＡにし、形質転換用の供与体ＤＮＡとした（図２参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（100μg/mL）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってspo0A遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。構築された菌株はΔspo0A株と命名した。
【００４１】
【表１】
2006345860.tif 000002
【００４２】
実施例２  abrB遺伝子の欠失
図１に示す方法と同様にして、枯草菌ゲノム上のabrB遺伝子の欠失を以下の様に行なった。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したabrB-FW及びabrB/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のabrB遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（Ｄ）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、abrB/Cm-F及びabrB-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のabrB遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（Ｅ）をPCRにより増幅した。
さらにプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.85kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。
次に、得られた（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したabrB-FW2とabrB-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行なうことによって、3断片を（Ｄ）（Ｆ）（Ｅ）の順になる様に結合させ、3断片が1.0kb断片（Ｄ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｆ）、1.0kb断片（Ｅ）の順に含まれる2.8kbのDNA断片（Ｇ）を得た。尚、（Ｄ）〜（Ｇ）のDNA断片の調製に使用したプライマーセットを表２に示した。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて実施例１にて構築したΔspo0A株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってabrB遺伝子が欠失し、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、spo0A遺伝子とabrB遺伝子が共に欠失したΔspo0A/abrB株を構築した。また、上記コンピテントセル形質転換にてΔspo0A株に替えて枯草菌168株を用いることにより、abrB遺伝子のみが欠失したΔabrB株を構築した。
【００４３】
【表２】
2006345860.tif 000003
【００４４】
実施例３  枯草菌変異株のアルカリセルラーゼ分泌生産評価
実施例１及び２にて得られたΔspo0A/abrB株、及び対照として枯草菌168株、実施例１にて得られたΔspo0A株、並びに実施例２にて得られたΔabrB株それぞれに、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で振盪培養を行った。経時的に培養液を採取し、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、図３に示した様に、宿主としてΔspo0A/abrB株を用いた場合に、168株、或いはΔabrB株を宿主とした場合と比較して顕著に高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。またΔspo0A/abrB株では他の3株にて見られる培養20時間後付近以降のセルラーゼ活性蓄積の鈍化がないため酵素生産に必要な時間が短縮されており、培養後38時間の時点でほぼ最高活性に達した。この時点で168株、Δspo0A株、及びΔabrB株のセルラーゼ生産量がそれぞれ約3,100U/L、約3,100U/L、及び3,200U/Lであるのに対し、Δspo0A/abrB株の生産量は4,800U/Lであった。この様に、Δspo0A/abrB株では著量の酵素生産が短縮された時間で可能になっており、工業的にタンパク質を製造する上で非常に有利であることが示された。
【００４５】
実施例４  枯草菌変異株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例１及び２にて得られたΔspo0A/abrB株のアルカリアミラーゼ生産性評価を以下の様に行なった。
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行ない、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号５で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｇ）を増幅した。またバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行ない、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。次いで、得られた（Ｇ）（Ｈ）の2断片を混合して鋳型とし、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行なうことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片を得た。得られた2.2kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
【００４６】
実施例１及び２にて得られたΔspo0A/abrB株、及び対照として実施例１にて得られたΔspo0A株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行ない、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行なった。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表３に示した様に、宿主としてΔspo0A/abrB株を用いた場合に、Δspo0A株を宿主とした場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。
【００４７】
【表３】
2006345860.tif 000004
【００４８】
実施例５  枯草菌変異株の培養液濁度（OD600nm）評価
実施例３と同様に、プラスミドpHY-S237にて形質転換したΔspo0A/abrB株、枯草菌168株、Δspo0A株、ΔabrB株を培養した。その際の培養液の濁度（OD600nm）を経時的に測定したところ、図４に示す様に、Δspo0A株を宿主とした場合には培養約40時間後以降、著しい濁度の低下が見られた。一方、Δspo0A/abrB株ではその様な濁度低下は認められず、spo0A遺伝子欠失により引き起こされる濁度低下が、abrB遺伝子を併せて欠失することにより抑制されることが明らかとなった。Δspo0A株を宿主とした場合に見られる濁度低下は急激な菌体の溶解によるものと考えられ、その様な溶菌による菌体内タンパク質の培養液中への放出は目的のタンパク質の回収・精製に悪影響を及ぼすことが懸念された。Δspo0A/abrB株を宿主とした場合にはこの点が改善されており、当該変異株は、特に工業的にタンパク質を製造する上で有利であることが示された。
【００４９】
比較例  アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域を利用しない場合のアルカリセルラーゼ分泌生産評価
表４に示したS237FWsh及びS237RVのプライマーセットを用いて、組換えプラスミドpHY-S237を鋳型とし、転写開始制御領域を含まないアルカリセルラーゼ遺伝子断片（2.8kb）をPCRにより調製した。調製した2.8kb断片をシャトルベクターpHY300PLKのSmaI制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドpHY-S237shを構築した。尚、得られたプラスミドを鋳型として表４に示したTET4及びpreRVのプライマーセットを用いたPCRを行うことによりシャトルベクター由来のテトラサイクリン耐性遺伝子及びアルカリセルラーゼ遺伝子上流領域を含む1.9kb断片の増幅を確認した。すなわち、図５に示す様に組換えプラスミドpHY-S237sh上にてアルカリセルラーゼ遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子の下流に位置し、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写はテトラサイクリン耐性遺伝子の転写開始制御領域を利用して行われるものと考えられた。
構築した組換えプラスミドpHY-S237shを実施例３と同様に、Δspo0A/abrB株、枯草菌168株、及びΔspo0A株それぞれに導入して培養を行った。この結果、図６に示す様にΔspo0A株においては野生株である168株に比べて顕著な生産性の向上が認められたが、Δspo0A/abrB株においては実施例３で認められた様な大きな変化は見られなかった。すなわち、Δspo0A/abrB株は、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域を組み合わせて利用することでタンパク質又はポリペプチド生産性の向上に効果を発揮することが示された。
【００５０】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【図２】遺伝子破壊用プラスミドを用いた２重交差法による標的遺伝子の削除を模式的に示したものである。
【図３】アルカリセルラーゼの分泌生産量を示したグラフである。
【図４】培養液濁度（OD600nm）の経時変化を示したグラフである。
【図５】組換えプラスミドpHY-S237shの構築図である。
【図６】アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域を利用しない場合のアルカリセルラーゼ分泌生産量を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【配列表】
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