(57)【要約】  【課題】  別個に測定された遺伝子発現量を比較・検証できるように規格化するための指標について、信頼性・精度の高い指標の取得方法を提示し、遺伝子発現量規格化の信頼性・精度を高めること。  【解決手段】  指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を用いて、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する方法であって、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量間の相関関係を相関関数から取得し、取得した相関関係を、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するための指標とする遺伝子発現量規格化方法を提供する。相関関数は、二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞３１から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量ｇｎについて、前記実験条件ごと（符号３４〜３８）の複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより得ることができる。  【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を用いて、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する方法であって、
指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量間の相関関係を取得し、
前記取得した相関関係を、遺伝子発現解析のために測定した遺伝子発現量を規格化するための指標とする遺伝子発現量規格化方法。
【請求項２】
前記相関関係は、
前記指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数から得られた値であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子発現量規格化方法。
【請求項３】
前記相関関数は、
二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、
前記各関数値が一定値に近似する組み合わせを選択することにより得られた相関関数であることを特徴とする請求項２記載の遺伝子発現量規格化方法。
【請求項４】
前記実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量は、二以上の細胞採取時刻を設定することにより得られたものであることを特徴とする請求項３記載の遺伝子発現量規格化方法。
【請求項５】
前記関数値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを、指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択することを特徴とする請求項３記載の遺伝子発現量規格化方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現量は、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションする標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度により測定した値であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子発現量規格化方法。
【請求項７】
指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を用いて、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するプログラムであって、
指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量の相関関係を取得し、
前記取得した相関関係を、測定された遺伝子発現量を規格化するための指標とするステップに係わる遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項８】
前記相関関係を、
前記指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数から得るステップに係わることを特徴とする請求項７記載の遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項９】
二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、
前記各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより、前記相関関数を得るステップに係わるプログラムを含むことを特徴とする請求項８記載の遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項１０】
二以上の細胞採取時刻を設定することにより得られた、複数の遺伝子発現量を用いることを特徴とする請求項９記載の遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項１１】
前記関数値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを、指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択するステップに係わることを特徴とする請求項９記載の遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項１２】
前記遺伝子発現量は、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションする標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度により測定した値であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子発現量規格化プログラム。
【請求項１３】
指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を用いて、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するシステムであって、
測定された遺伝子発現量を入力する入力手段と、
前記指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数を出力する出力手段と、
前記入力手段で入力された、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を、前記相関関数で演算処理することにより、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量の相関関係を取得する規格化指標取得手段と、
前記相関関係に基づき、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する遺伝子発現量規格化手段と、
を少なくとも備えたシステム。
【請求項１４】
二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、
前記各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより、前記相関関数を得る手段を備えることを特徴とする請求項１３記載のシステム。
【請求項１５】
二以上の細胞採取時刻を設定することにより得られた、複数の遺伝子発現量を用いることを特徴とする請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記関数値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを、指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択する手段を備えることを特徴とする請求項１４記載のシステム。
【請求項１７】
前記遺伝子発現量は、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションする標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度により測定した値であることを特徴とする請求項１３記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップなど遺伝子発現解析用基板を用いて得られた遺伝子発現量測定データの規格化又は標準化、解析、補正などに関わる技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」とする。）の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖を、検出用核酸として基板表面に集積して固定したものである。ＤＮＡチップを用いて、基板表面に固定された検出用核酸と細胞などから採取したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することにより、採取した細胞内における遺伝子発現を網羅的に解析することができる。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析におけるハイブリダイゼーション検出技術の向上に伴い、単に、遺伝子発現の有無を検出するだけでなく、遺伝子発現量の定量的な測定が可能になりつつある。例えば、ハイブリダイゼーション検出の際に蛍光強度を定量的に測定することにより、遺伝子発現量を示す定量的な数値を取得する技術は、一部実用化されている。
【０００４】
そこで、遺伝子発現量を示す定量的な数値を規格化する試みが進められている。ここで、「規格化」とは、他の遺伝子発現解析により得られた遺伝子発現量との比較が可能な数値に変換することをいう。遺伝子発現量を規格化する方法として、例えば、標準細胞の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法、定常的に発現している遺伝子の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法、ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析で測定された全遺伝子発現量の合計を規格化の指標とする方法、などが提案されている。
【０００５】
まず、標準細胞の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法について説明する。図９に示すように、標準細胞９１と遺伝子発現解析に供する細胞９２のそれぞれからサンプル核酸を取得し、それぞれのサンプル核酸に性質の異なる蛍光物質９３、９４を結合させた後、両サンプル核酸を混合して、ＤＮＡチップの基板表面に供給する。次に、ＤＮＡチップの基板表面９５に固定された検出用核酸９６と、標準細胞９１から取得したサンプル核酸９７とのハイブリダイゼーションを、蛍光物質９３の励起に基づく蛍光強度で測定し、標準細胞の遺伝子発現量を取得する。そして、標準細胞の遺伝子発現量を、遺伝子発現解析に供する細胞９２に係る遺伝子発現量（蛍光物質９４の励起に基づく蛍光強度）を規格化する際の指標とする。
【０００６】
次に、定常的に発現している遺伝子の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法について説明する。図１０に示すように、予め、ＤＮＡチップの基板表面１０１に、定常的に発現する遺伝子とハイブリダイゼーションする検出用核酸１０２を固定しておく。そして、その検出用核酸１０２と遺伝子発現解析に供する細胞１０３から採取されたサンプル核酸１０４とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度などにより検出し、遺伝子発現解析に供する細胞１０４におけるその遺伝子の遺伝子発現量を取得して、規格化する際の指標とする。
【０００７】
次に、ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析で測定された全遺伝子発現量の合計を規格化の指標とする方法について説明する。この方法は、ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析で測定された全遺伝子発現量（蛍光強度）の合計が、ほぼ一定値になるという経験則に基づく方法で、ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析で測定された全遺伝子発現量の合計を、規格化する際の指標に用いる方法である。
【０００８】
その他、ＤＮＡチップなどによって得られた遺伝子発現量の解析方法、補正方法などに関する先行文献として、例えば、特許文献１〜３がある。非特許文献１は、本発明の一部と関連性がある遺伝的アルゴリズムに関する文献である。
【特許文献１】特開２００２−７１６８８号公報
【特許文献２】特表２００２−２６７６６８号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８６２号公報
【非特許文献１】北野宏明編「遺伝的アルゴリズム１〜４」、産業図書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
標準細胞の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法には、同一の標準細胞を用いて規格化を行った場合以外、それぞれの遺伝子発現量を比較できないという問題があった。即ち、例えば、ロットの異なる標準細胞を用いて規格化を行った場合、それぞれの遺伝子発現量を比較することはできなかった。また、標準細胞の遺伝子発現量の相対値という形でしか、遺伝子発現量を示すことができないという問題があった。
【００１０】
定常的に発現している遺伝子の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法には、定常的に一定の値で発現する遺伝子を探すことが難しく、実際には、細胞の採取時刻、細胞に加わった外部ストレスなどによって、遺伝子発現量が変動している場合が多いという問題があった。従って、規格化に用いる指標のばらつきが大きくなるため、定常的に発現している遺伝子の遺伝子発現量を規格化の指標として遺伝子発現量を規格化しても、信頼性の高い数値を取得することが難しかった。
【００１１】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析で測定された全遺伝子発現量の合計を規格化の指標とする方法は、理論的裏づけがなく、指標としての信頼性、精度に問題があった。
【００１２】
そこで、本発明は、別個に測定された遺伝子発現量を比較・検証できるように規格化するための指標について、信頼性・精度の高い指標の取得方法を提示し、遺伝子発現量規格化の信頼性・精度を高めることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を用いて、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する方法であって、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量間の相関関係を取得し、前記取得した相関関係を、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するための指標とする遺伝子発現量規格化方法を提供する。
【００１４】
前記相関関係は、前記指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数から得ることができる。相関関数は、例えば、二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、前記各関数値が一定値に近似する組み合わせを選択することにより得ることができる。前記実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量は、例えば、二以上の細胞採取時刻を設定することにより得ることができる。
【００１５】
また、前記相関関数を取得する際に、指標取得に用いる複数の検出用核酸を選択できる。その場合、前記関数値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを選択することが好ましい。
【００１６】
以上のように、本発明に係る遺伝子発現量規格化方法では、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量と相関関数から、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化することができる。指標取得のために用いる検出用核酸の選択と相関関数の取得は、遺伝子発現解析前に事前に行う必要がある。
【００１７】
なお、本発明に係る方法は、プログラムで記述することにより、自動化できる。
【００１８】
加えて、本発明は、システム化が可能である。その場合、例えば、測定された遺伝子発現量を入力する入力手段と、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数を出力する出力手段と、前記入力手段で入力された、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を、前記相関関数で演算処理することにより、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量の相関関係を取得する規格化指標取得手段と、前記相関関係に基づき、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する遺伝子発現量規格化手段と、を少なくとも備えた構成にすることができる。
【００１９】
また、このシステムは、相関関数を、二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から、実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより得る手段を備えていてもよい。その他、関数値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを、指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択する手段を備えることも可能である。
【００２０】
以下、定義づけを行う。
【００２１】
「遺伝子発現量」は、特定の遺伝子の細胞内での発現量をいい、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションする標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度により測定した値（測定データ）、及び、その値に基づいて取得した遺伝子発現量の推定値なども包含する概念である。
【００２２】
「規格化」は、遺伝子発現解析などにより得られた蛍光強度などの数値を、他の遺伝子発現解析などにより得られた測定値全般との比較が可能な数値に変換することをいう。
【００２３】
「二以上の実験条件」は、いくつかの遺伝子について、遺伝子発現量を変動させる実験条件の変化をいう。例えば、サンプル細胞の採取時刻を複数設定する場合や、細胞に所定の外部刺激を加えることにより遺伝子発現量を変動させる場合などを含む。「細胞採取時刻」とは、サンプル細胞を取得した時刻を、遺伝子発現量の経時的変化が止まった時刻と推定して設定した概念であり、別途、遺伝子発現量の経時的変化が止まった時刻をある程度推定できる場合には、その時刻をいう。
【００２４】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える核酸間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２５】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２６】
「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸分子である。代表例は、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。「標的核酸」は、細胞から取得されたサンプル核酸のうち、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションする核酸である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、遺伝子発現量規格化の信頼性・精度を高めることができる。即ち、ＤＮＡチップを用いて遺伝子発現解析を行う際に、本発明を用いて遺伝子発現量を規格化することにより、別個に測定された遺伝子発現量を比較・検証できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、以下に記載する実施形態は、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と採取した細胞から取得したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度により取得した場合について例示したものであるが、本発明の範囲は、これによって狭く解釈されない。
【００２９】
はじめに、図１を用いて、遺伝子発現量規格化のフローを説明する。図１中、フローＡはＲＮＡ処理フローを、フローＢはゲノム処理フローを示している。なお、図１中、「Ｓ」はフローの始点（スタート）を、「Ｅ」はフローの終点（エンド）を示している（以下同じ）。
【００３０】
ＲＮＡ処理フローＡは、本フローで用いるＤＮＡチップを準備する段階（符号Ａ１、Ａ２）、採取した細胞からサンプル核酸を取得し調製する段階（符号Ａ３、Ａ４）、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と採取した細胞から取得したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度によって測定し、遺伝子発現量を取得する段階（符号Ａ５、Ａ６）、測定された遺伝子発現量を規格化するための指標を取得する段階（符号Ａ７）、から構成される。以下、順に説明する。
【００３１】
まず、ＤＮＡチップを準備する段階（図1中、符号Ａ１、Ａ２）について、ＲＮＡ処理フローＡで用いるＤＮＡチップの構成例を、図２を用いて説明する。ＲＮＡ処理フローＡで用いるＤＮＡチップには、指標取得に用いる複数の検出用核酸（図２中符号２１）と、遺伝子発現解析を行う検出用核酸（図２中符号２１以外の核酸、例えば符号２２）とを固定しておく。なお、指標取得に用いる複数の検出用核酸の固定位置は、図２に示した場所に限定されず、例えば、コントロールとする複数の検出用核酸を、基板表面の所定位置に集めて固定してもよい。指標取得に用いる複数の検出用核酸の選択方法は、後述する。
【００３２】
次に、再び図１を用いて、採取した細胞からサンプル核酸を取得し調製する段階（符号Ａ３、Ａ４）について、説明する。ＲＮＡ処理フローＡでは、公知の方法に従い、採取した細胞からＲＮＡを抽出後、そのＲＮＡと相補的な配列を持つｃＤＮＡを合成するなどして、サンプル核酸を取得する（符号Ａ３）。サンプル核酸は制限酵素で断片化してもよい（符号Ａ４）。
【００３３】
次に、ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸と採取した細胞から取得したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度によって測定し、遺伝子発現量を取得する段階（符号Ａ５、Ａ６）について説明する。ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸にサンプル核酸を供給し、検出用核酸とサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度などを用いて測定する（符号Ａ５）。そして、その測定データに基づいて、遺伝子発現量（規格化前の推定量）を取得する（符号Ａ６）。
【００３４】
次に、測定された遺伝子発現量を規格化するための指標を取得する段階（符号Ａ７）について説明する。符号Ａ７の段階では、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量（符号Ａ６）間の相関関係を取得する。そして、取得した相関関係を、遺伝子解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するための指標にする。このステップは、プログラムで記述することにより自動化できる。ここで、相関関係とは、前記指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数から得られた値である。相関関数の取得方法については、後述する。
【００３５】
そして、符号Ａ７の段階で得られた指標を用いて（矢印Ａ８）、遺伝子発現解析を行う複数の検出用核酸とサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量（測定データ）に基づく遺伝子発現量（矢印Ａ９）を規格化する（符号Ｃ１）。このステップも、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００３６】
一方、ゲノム処理フローＢは、本フローで用いるＤＮＡチップを準備する段階（符号Ｂ１）、採取した細胞からサンプル核酸を取得し調製する段階（符号Ｂ３、Ｂ４）、細胞数取得のための検出用核酸と採取した細胞から取得したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度によって測定し、採取した細胞の細胞数を取得する段階（符号Ｂ５、Ｂ６）、から構成される。以下、順に説明する。
【００３７】
まず、ＤＮＡチップを準備する段階（符号Ｂ１）について説明する。ゲノム処理フローＢで用いるＤＮＡチップの基板表面には、細胞数取得のための検出用核酸を固定しておく。細胞数取得のための検出用核酸には、Ａｌｕ配列など、ゲノム中にほぼ一定の割合で存在する繰り返し配列又はその一部分と同じ配列を持つ核酸を固定する。
【００３８】
なお、細胞数取得のための検出用核酸は、ＤＮＡチップの基板表面のどの部位に固定してもよい。また、例えば、ＲＮＡ処理フローＡで用いるＤＮＡチップの基板表面に、細胞数取得のための検出用核酸を固定する領域を設けてもよいし、細胞数取得に用いるＤＮＡチップを別途用意してもよい。
【００３９】
次に、採取した細胞からサンプル核酸を取得し調製する段階（符号Ｂ３、Ｂ４）について説明する。ゲノム処理フローＢでは、公知の方法に従い、採取した細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、サンプル核酸を取得する（符号Ｂ３）。ゲノムＤＮＡから抽出したサンプル核酸は、制限酵素で断片化して用いる（符号Ｂ４）。
【００４０】
次に、細胞数取得のための検出用核酸と採取した細胞から取得したサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度によって測定し、採取した細胞の細胞数を取得する段階（符号Ｂ５、Ｂ６）について説明する。ＤＮＡチップの基板表面に固定された検出用核酸にサンプル核酸を供給し、検出用核酸とサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を、蛍光強度などを用いて測定する（符号Ｂ５）。そして、標的核酸中に存在する繰り返し配列を、蛍光強度などを用いて定量的に測定することにより、採取した細胞の細胞数の目安となる指標を取得する（符号Ｂ６）。
【００４１】
そして、遺伝子発現解析を行う複数の検出用核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション量（測定データ）に基づく遺伝子発現量（矢印Ａ９）を、採取した細胞の細胞数の目安となる指標を用いて単位細胞数当たりの値に換算することにより（矢印Ｂ８）、遺伝子発現量を規格化する（符号Ｃ１）。なお、このステップは、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００４２】
また、符号Ａ７の段階で取得した指標に基づいて規格化した遺伝子発現量と、符号Ｂ６の段階で取得した指標に基づいて規格化した遺伝子発現量と、を比較・検討することにより、測定データ検証を行うことができる（符号Ｃ１）。このステップも、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００４３】
続いて、図３から図５を用いて、本発明に係る相関関数の取得方法の一例について、説明する。なお、この方法は、指標取得に用いる複数の検出用核酸の選択方法も含む。
【００４４】
本発明では、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量と相関関数から、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するための指標を得ることができる。相関関数は、遺伝子発現量の測定前に、予め、取得しておく必要がある。
【００４５】
前記相関関数は、二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、その各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより得ることができる。具体例を、以下詳述する。
【００４６】
なお、相関関数取得の際に用いる複数の遺伝子発現量は、オンラインデータベース（ＭＧＥＤ、ＢｏｄｙＭａｐなど）などで公開されている測定データを用いてもよいし、別途ハイブリダイゼーション測定を行って、測定データを取得してもよい。
【００４７】
図３は、本発明に係る相関関数の取得方法の一例を示す模式図である。
【００４８】
まず、設定した時刻ｔ（図３では五つの時刻）に細胞３１を採取し、それぞれの細胞３１からサンプル核酸を取得する。次に、ＤＮＡチップ３２の各ウエル３３にサンプル核酸を供給し、ＤＮＡチップ３２の基板表面に固定された検出用核酸とサンプル核酸中の標的核酸とのハイブリダイゼーション量を蛍光強度で測定する。
【００４９】
図３中のグラフの横軸は細胞採取時刻ｔを、縦軸は蛍光強度（遺伝子発現量）をそれぞれ示している。図３中のグラフでは、ＤＮＡチップ３２においてハイブリダイゼーションが検出された遺伝子（図３ではｇ１〜ｇ４）について、細胞採取時刻ｔごとに、蛍光強度（遺伝子発現量、ｇ(t)）をプロットしている。
【００５０】
相関関数は、以下のように取得する。まず、それぞれの細胞採取時刻ごとに、複数の遺伝子発現量ｇ(t)（図３ではｇ１〜ｇ４）を組み合わせ（例えば、図３では符号３４〜３８）、それぞれの関数値ｆ（ｇ(t)）を得る。そして、符号３４〜３８のそれぞれの関数値ｆ（ｇ(t)）が一定値に最も近似する遺伝子発現量ｇ(t)の組み合わせを選択し、その組み合わせとして選択された複数の検出用核酸を指標取得に用いるとともに、その組み合わせにより取得された関数を相関関数とする。なお、このステップは、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００５１】
前記のように、遺伝子解析のために測定された遺伝子発現量を規格化するための指標を得る際には、前記方法により選択された、指標取得に用いる複数の検出用核酸を、ＤＮＡチップの基板表面に、予め固定しておく必要がある。また、前記方法により取得した相関関数を用いる。
【００５２】
なお、図３では、五つの細胞採取時刻を設定することにより、相関関数を得ているが、本発明に係る相関関数は、二以上の実験条件下で、同一の遺伝子の遺伝子発現量が変動する場合は、適用可能である。例えば、二以上の細胞採取時刻を設定する場合のほか、細胞３１に外部刺激３９を与えることにより同一の遺伝子の遺伝子発現量を変動する場合にも、本発明に係る相関関数を得るための測定データとして用いることができる。
【００５３】
従って、指標取得に用いる複数の検出用核酸としては、実験条件の変化によって発現量が変動する遺伝子が好適である。例えば、二以上の細胞採取時刻を設定することにより実験条件を変化させる場合、時計遺伝子のように、細胞の採取時刻を変化させた場合に発現量が変動する遺伝子は、コントロールとする複数の検出用核酸として好適である。
【００５４】
図４は、複数の細胞採取時刻における遺伝子発現量をモデル曲線にフィッティングさせる方法の一例を示すグラフである。グラフの横軸は細胞採取時刻、縦軸は遺伝子発現量である。
【００５５】
例えば、複数の細胞採取時刻における遺伝子発現量をモデル曲線にフィッティングさせた場合、所定の範囲内における全ての時刻において、関数値ｆ（ｇ(t)）を得ることができる。
【００５６】
図４中のプロット４１は各細胞採取時刻ｔにおける遺伝子発現量を示す。そして、それらのプロット４１に基づき、モデル曲線４２をフィッティングさせる。
【００５７】
モデル曲線としては、例えば、Ｂ−スプライン曲線を採用できる。各プロット４１とモデル曲線４２の誤差４３が最小になるようにパラメータを調整し、モデル曲線４２を得る。モデル曲線４２を得る際には次元数の異なる複数のモデル曲線が得られるが、モデル曲線の次数を、ＡＩＣ（赤池情報基準）を用いて評価することにより、最適な曲線ｇ(t)を得ることができる。なお、このステップは、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００５８】
図５は、指標取得に用いる複数の検出用核酸の選択方法の一例を示す図である。なお、この方法は、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００５９】
相関関数を取得する際に、例えば、所定の範囲内における全ての時刻ｔにおいて、複数の遺伝子発現量ｇ(t)の組み合わせを行うと、組み合わせが膨大となる。そこで、図５に示すフローを用いて、指標取得に用いる複数の検出用核酸を選択する。
【００６０】
前述の通り、指標取得に用いる複数の検出用核酸は、次の方法で選択する。まず、複数の遺伝子発現量ｇ(t)を組み合わせ、それぞれの関数値ｆ（ｇ(t)）を得る。そして、それぞれの関数値ｆ（ｇ(t)）が一定値Ｅに最も近似する遺伝子発現量ｇ(t)の組み合わせを選択し、その組み合わせから相関関数ｆ（ｇ(t)）を求める（符号５１）。
【００６１】
その際に、重み値Ｗｎを用いて、関数値ｆ（ｇ(t)）を符号５２に示す加重平均を表す式に、一定値Ｅを符号５３に示す時間平均を表す式に、それぞれ設定し、最適解を求めることにより、相関関数ｆ（ｇ(t)）を得てもよい。なお、符号５２に示した式中、「ｇｉ(t)」は、複数の遺伝子ｎの遺伝子発現量ｇｎのうち、所定の遺伝子ｉの所定の時刻ｔにおける発現量を、「Ａ」は、誤差許容範囲を、それぞれ示している。
【００６２】
また、最適解を求めると、計算量が膨大になる場合は、遺伝的アルゴリズムを採用して、準最適解を求めることにより、相関関数ｆ（ｇ(t)）を得てもよい（符号５４）。なお、遺伝的アルゴリズムについては、例えば、非特許文献１に詳述されている。
【００６３】
その場合、閾値以上の重み値Ｗｉに対応する複数の遺伝子を、指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択する（符号５５）。
【００６４】
続いて、ＤＮＡチップ内における遺伝子発現量の揺らぎを補正する方法について、図６を用いて説明する。なお、この方法は、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００６５】
まず、前述の方法により選択された、指標取得に用いる複数の検出用核酸を、ＤＮＡチップの基板表面の複数の領域６１に固定する。図５のＤＮＡチップでは、五つの領域にそれぞれ固定されている。
【００６６】
次に、ハイブリダイゼーション量を測定する際に、各領域６１のそれぞれについて、前記方法により得られた指標を取得し（図６中、Ｃ１〜Ｃ５）、各指標Ｃ１〜Ｃ５をモデル曲面にフィッティングさせ、補正用曲面６３を得る。なお、図６中段の３次元グラフは、ＤＮＡチップ上の各ウエル６２の位置をａ−ｂ平面で表し、各ウエル６２におけるハイブリダイゼーション量（蛍光値）を高さで表したグラフである。
【００６７】
前記モデル曲面には、例えば、Ｂ−スプライン曲面を採用できる。また、モデル曲面６３を得る際には、モデル曲面の次数を、ＡＩＣ（赤池情報基準）を用いて評価することにより、最適な曲面を得ることができる。
【００６８】
次に、各ウエル６２のそれぞれにおける遺伝子発現量（蛍光値）ｇａ，ｂを、補正用曲面６３上の該当する位置における指標Ｃａ，ｂを用いて、規格化する。
【００６９】
その他、各領域６１のそれぞれについて得られた指標の平均を、規格化の指標にして、データ検証に用いてもよい。
【００７０】
続いて、前記方法により得られた指標を用いて、データ検証を行う方法の一例について、図７を用いて説明する。なお、この方法は、プログラムで記述することにより自動化できる。
【００７１】
ハイブリダイゼーション測定を複数回行った場合、それぞれの測定で得られた指標（図７では、Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃ）を用いて、各測定のデータの信頼性を検証できる。
【００７２】
例えば、図７中段のグラフのように、それぞれの測定で得られた指標の値を小さい順に並べた場合に、シグモイド形状になっているときは、指標の値の分布がガウス分布に従っていることを示し、各測定のデータの信頼性が高いことを検証できる。
【００７３】
また、図７下段のグラフのように、それぞれの測定で得られた指標の値を小さい順に並べた場合に、多峰形状になっているときは、各測定のデータの信頼性が低い可能性があり、そのデータを棄却するなどの判断をすることができる。
【００７４】
続いて、図８を用いて、本発明に係る遺伝子発現量を規格化するシステムの一例について、説明する。
【００７５】
図８では、本発明に係るシステムは、測定された遺伝子発現量を入力する入力手段８１と、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量をパラメータとする相関関数を出力する出力手段８２と、入力手段８１で入力された、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量を、前記相関関数で演算処理することにより、指標取得のために測定された複数の遺伝子発現量の相関関係を取得する規格化指標取得手段８３と、相関関係に基づき、遺伝子発現解析のために測定された遺伝子発現量を規格化する遺伝子発現量規格化手段８４、ＣＰＵ８５、ＲＡＭ８６、ＲＯＭ８７、及び、前記各モジュールをつなぐバス８８を備えた構成である。
【００７６】
本発明に係るシステムは、上記に加えて、例えば、二以上の実験条件下でそれぞれ採取された細胞から実験条件ごとに取得された複数の遺伝子発現量について、前記実験条件ごとの複数の遺伝子発現量間の相関関係を関数値とし、各関数値が一定値に近似する関数値の組み合わせを選択することにより相関関数を得る手段（図示せず）、相関値に対する寄与の度合いが大きい前記複数の遺伝子発現量の組み合わせを指標取得に用いる複数の検出用核酸として選択する手段（図示せず）、などを備えていてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、遺伝子発現解析用基板を用いた遺伝子発現解析における、ハイブリダイゼーションの定量的な測定を、規格化、高精度化することができる。また、ハイブリダイゼーション測定値を規格化できるため、遺伝子発現解析ごとの測定値を、高精度に比較・検証することができる。
【００７８】
本発明に係る方法、プログラム、及び、システムは、ＤＮＡチップなどを用いた測定装置に容易に組み込むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】遺伝子発現量規格化のフローを示す図。
【図２】本発明に係るＤＮＡチップの構成例を示す図。
【図３】本発明に係る相関関数の取得方法の一例を示す模式図。
【図４】複数の細胞採取時刻における遺伝子発現量をモデル曲線にフィッティングさせたグラフ。
【図５】指標取得に用いる複数の検出用核酸の選択方法の一例を示す図。
【図６】ＤＮＡチップ内における遺伝子発現量の揺らぎを補正する方法を示す図。
【図７】データ検証を行う方法の一例を示す図。
【図８】本発明に係る遺伝子発現量を規格化するシステムの一例を示す図。
【図９】従来技術を説明するための図であって、標準細胞の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法を示す図。
【図１０】従来技術を説明するための図であって、定常的に発現している遺伝子の遺伝子発現量を規格化の指標とする方法を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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