(57)【要約】      （修正有）【課題】  本発明の目的は、生体由来試料中に微量に含まれるエストラジオール及びエストラジオール誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供することである。【解決手段】  生体由来試料に対してペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを反応させ、得られた反応混合物に含まれる生体内エストラジオール又は生体内エストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジルもしくはペンタハロゲン化ベンゾイル及び１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。【選択図】    図１
2006138786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体のＬＣ−ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
ｉ）生体由来試料に対して式：
【化１】
2006138786.tif 000012
（式中、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し；Ｌ及びＬ′は、それぞれ脱離基を表す）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを反応させる工程、及び
ii）前項ｉ）において調製した反応混合物に含まれる生体内エストラジオール又は生体内エストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジルもしくはペンタハロゲン化ベンゾイル及び１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する工程、
を含むことを特徴とする、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体の測定法。
【請求項２】
Ｌ又はＬ′が、ハロゲン原子を表す、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
生体由来試料が、血清、唾液、尿、糞、培養細胞又は臓器である、請求項１又は２に記載の測定法。
【請求項４】
ＬＣ−ＭＳ測定において、ＭＳのイオン化がＥＳＩにより行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定法。
【請求項５】
式：
【化２】
2006138786.tif 000013
（式中、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し；Ｌ及びＬ′は、それぞれ脱離基を表す）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物、及び１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを含むことを特徴とする、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体のＬＣ−ＭＳ測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来試料中に微量に含まれるエストラジオール及びエストラジオール誘導体を液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で測定する方法に関する。
より詳細には、生体由来試料中のエストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体に対し、そのフェノール性水酸基をペンタハロゲン化ベンジルもしくはペンタハロゲン化ベンゾイル基で置換した後、１７位水酸基に１−低級アルキル−２−ピリジル基を導入し、それをＬＣ−ＭＳで測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストラジオール及びその誘導体は、生体内において極微量で強力な生理作用を示す。これらエストロゲン類の生体内濃度を把握することは、臨床診断及び病態解析の上で極めて重要である。特に、更年期女性においては、血中エストラジオールの濃度が１０ｐｇ／ｍＬに低下していながら、逆にエストロゲン類が関与する疾患（乳癌、子宮体癌、子宮内膜症など）のリスクが高まる傾向にあることから、生体内の微量なエストロゲンの濃度を正確に把握することは重要である。
【０００３】
近年では、血中エストラジオールの濃度に加えて、生体内のエストロゲン活性をも把握する試みがなされるようになってきており、エストロゲン活性の指標として、例えば、血中バイオアベイラブルエストラジオール（J.Clin. Endocrinol. Metab.,86(1),192-199,2002）や唾液中エストラジオール（The Aging Male,2002(5),203-215）が注目されている。また、エストラジオールの代謝物である３−メトキシ−４−ヒドロキシエストラジオールが卵巣癌を誘発することから、この化合物の生体内濃度を測定し、それを卵巣癌の予防等に役立てる試みがなされている（Carcinogenesis,22(6),905-911,2001）。しかし、それらの指標や代謝物の生体内濃度は５ｐｇ／ｍＬときわめて微量であり、濃度を正確に把握するのは困難であるため、それらの指標等が臨床応用されるまでに至っていない。
【０００４】
通常の臨床検査においては、生体由来試料中のエストラジオール及び／又はその誘導体は、125Ｉ−又は3Ｈ−エストラジオールをリガンドとしたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫反応（ＥＩＡ）などの免疫法により定量されているが、免疫法の一般的な定量限界が１０ｐｇ／ｍＬであることに加えて、血液中にはエストラジオールの構造類似化合物や性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）蛋白質が共存しているので、使用する定量法により定量値が大きく変動する場合がある。最近になって、シー  アイ  エス  ダイアグノスティック社から、検出感度が１．４ｐｇ／ｍＬと極めて高感度のエストラジオールＲＩＡ測定キットが発売されたが、この測定キットはエストラジオール  １７−β  グルクロナイドとの交差性にあまり優れておらず、エストラジオール特異性に問題が残っている。
【０００５】
免疫法以外にも、例えば、ＬＣとエレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization：ＥＳＩ）−又は大気圧化学イオン化（atmospheric pressure chemical ionization：ＡＰＣＩ）−ＭＳを組み合わせる直接定量（宝バイオ社：ＡＰＩ  ４０００ＴＭ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ）が行われているが、この方法では生体内の夾雑物の干渉を受けるという欠点がある。
【０００６】
エストラジオールを誘導体化し、それをＬＣ−ＭＳで測定する試みも行われており、例えば、エストラジオールを蛍光試薬で標識したエストラジオール誘導体を蛍光検出器付ＬＣで測定する方法（J.Chromatogr.,616(2),317-322,1993）、エストラジオールを揮発性誘導体化した後にガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−ＭＳで測定する方法（J.Steroid Biochem.,28(2),203-213,1987）などが提案されている。しかし、これらの方法の測定限界は２０ｐｇ／ｍＬであり実用上十分な感度とはいえない。
【０００７】
また、カテコールタイプのエストロンの１７位ケトンのｐ−トルエンスルホンヒドラゾン化（非特許文献１参照）、ジヒドロテストステロンの１７位アルコール性水酸基のＮ−メチルピリジニウム化（特許文献１参照）などの誘導体化及びその誘導体のＬＣ−ＭＳ測定も試みられているが、これらの方法における測定限界は１００又は５０ｐｇ／ｍＬである。
【０００８】
非特許文献２には、種々の化合物をペンタフルオロベンジル化することにより、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳでの検出限界が、例えば、エストロンでは約４ｐｇ、２−メトキシエストロンでは約２ｐｇにまで高まることが記載されている。しかしながら、この文献には、エストラジオールの検出限界についての記載がない。また、特許文献２には、エストラジオール等におけるフェノール性水酸基をペンタフルオロベンゾイル化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する方法が記載されている。しかしながら、この文献には測定感度が記載されていない。
【０００９】
非特許文献３には、エストロン又はエストラジオールのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホン化）し、それをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定する方法により、エストラジオールの測定限界として６．３ｐｇ／ｍＬを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては、フェノール性又はアルコール性水酸基に対するダンシルクロライドの選択性があまりよくないうえ、ダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
【特許文献１】特開２００３−１６１７２６号公報
【特許文献２】特開２０００−８８８３４号公報
【非特許文献１】J.Chromatogr.,B,780,315-330,2002
【非特許文献２】Anal.Chem.,72,3007-3013,2000
【非特許文献３】Clin. Chem.,50(2),373-384,2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生体由来試料中に微量に含まれるエストラジオール及びエストラジオール誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体のＬＣ−ＭＳ測定用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、アルカリ条件下ではエストラジオール又はエストラジオール誘導体における水酸基のうち、フェノール性水酸基が選択的にペンタハロゲン化ベンジルエーテル化もしくはペンタハロゲン化ベンゾイルエステル化されること、続いてアルコール性水酸基を１−低級アルキル−２−ピリジニウム化すると、その誘導体がＬＣ−ＭＳ法において良好な測定感度を示すことを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体のＬＣ−ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
【００１３】
ｉ）生体由来試料に対して式：
【化３】
2006138786.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し；Ｌ及びＬ′は、それぞれ脱離基を表す）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを反応させる工程、及び
【００１５】
ii）前項ｉ）において調製した反応混合物に含まれる生体内エストラジオール又は生体内エストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジルもしくはペンタハロゲン化ベンゾイル及び１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する工程、
を含むことを特徴とする、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体の新規測定法に関する。
【００１６】
更に本発明は、式：
【化４】
2006138786.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し；Ｌ及びＬ′は、それぞれ脱離基を表す）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物、及び１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを含むことを特徴とする、生体内エストラジオール及び生体内エストラジオール誘導体のＬＣ−ＭＳ測定用キットに関する。
【発明の効果】
【００１８】
本願発明の測定法を用いることにより、生体内に微量に存在するエストラジオール及びエストラジオール誘導体を２ｐｇ／ｍＬ（定量下限値）のレベルで定量することができる。
【００１９】
なお、エストラジオール又はエストラジオール誘導体におけるすべての水酸基を、ペンタハロゲン化ベンジルエーテルもしくはペンタハロゲン化ベンゾイルエステルのみ、又は１−低級アルキル−２−ピリジニウムのみで誘導体化した場合、ＬＣ−ＭＳ測定時に２価のイオンが生成し、高感度の測定が困難となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書において、「生体内エストラジオール誘導体」とは、例えば、エストリオール、２−ヒドロキシ−３−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシ−３−メトキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール等の生体内に存在するエストラジオール化合物を挙げることができる。
【００２１】
また、本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、例えば、ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ及びＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳを挙げることができ、中でもＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳが好ましい。
【００２２】
さらに、本明細書において、「生体由来試料」としては、例えば、血清、唾液、尿、糞、培養細胞、臓器から得られる調製物等を挙げることができる。
【００２３】
本発明において使用することのできる、式：
【化５】
2006138786.tif 000005
【００２４】
で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物においては、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し；Ｌは、脱離基を表す。Ｘ1は、具体的には、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子を表す。また脱離基Ｌとしては、ハロゲン原子；トシルオキシ、メシルオキシ、もしくはトリフルオロメタンスルホニルオキシ基などの脱離基を挙げることができ、好適にはハロゲン原子を挙げることができる。このペンタハロゲン化ベンジル化合物としては、例えば、ペンタフルオロベンジルクロライド、ペンタフルオロベンジルブロマイド、ペンタブロモベンジルクロライド、ペンタブロモベンジルブロマイド等を挙げることができ、中でも、ペンタフルオロベンジルブロマイドが好適である。
【００２５】
また、本発明において使用することのできる式：
【化６】
2006138786.tif 000006
【００２６】
で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物においては、Ｘ1は、ハロゲン原子を表し、Ｌ′は、脱離基を表し、好適にはハロゲン原子を挙げることができる。このペンタハロゲン化ベンゾイル化合物としては、例えば、ペンタフルオロベンゾイルクロライド、ペンタフルオロベンゾイルブロマイド、ペンタブロモベンゾイルクロライド、ペンタブロモベンゾイルブロマイド等を挙げることができ、中でも、ペンタフルオロベンゾイルブロマイドが好適である。
【００２７】
これらのペンタハロゲン化ベンジル化合物及びペンタハロゲン化ベンゾイル化合物は、公知化合物であるか、又は公知化合物から公知の方法で合成することができる。
【００２８】
更に、本発明において使用することのできる「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」において、低級アルキルは、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。このような低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチルなどを挙げることができ、好適にはメチル、エチル、ｎ−プロピルを挙げることができる。また、「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」において、ハロゲンは、具体的には、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子を意味する。しかして、「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」としては、例えば、１−メチル−２−フルオロピリジン、１−エチル−２−フルオロピリジン、１−プロピル−２−フルオロピリジン、１−メチル−２−クロロピリジン、１−メチル−２−ブロモピリジン、１−エチル−２−クロロピリジン、１−エチル−２−ブロモピリジン等を挙げることができる。この中でも特に、１−メチル−２−フルオロピリジンが好ましい。この１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンも、公知化合物であるか、又は公知化合物から公知の方法で合成することができる。
【００２９】
本発明の測定法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
血清試料の調製方法については、後記実施例において詳述するが、簡易カラムクロマトグラフィーにより分離精製する一般的調製方法を適宜選択して用いることができる。
また、唾液、尿、糞、培養細胞、臓器から得られる調製物等の試料の調製方法も、血清の場合とほぼ同様な手法を用いることができる。
【００３０】
ペンタハロゲン化ベンジル誘導体もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体の調製
上記で調製した試料をアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解し、アルカリ条件下でペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物を反応させることにより、上記で調製した試料中のエストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体をペンタハロゲン化ベンジル誘導体もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に変換する（エストラジオールについての例を下記ステップ−１に示す）。
【００３１】
【化７】
2006138786.tif 000007
（式中、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し；Ｌ及びＬ′は、それぞれ脱離基を表す）
【００３２】
この反応は、−１０℃乃至６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５℃乃至４０℃の範囲内の温度が適している。また、ペンタハロゲン化ベンジル化合物もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、生体由来試料１ｍＬ又は１ｇに対して０．２ｍｇ乃至２０ｍｇとすることができ、好ましくは１ｍｇ乃至４ｍｇが適している。さらに、アルカリ条件下とは、反応液のｐＨを８〜１３、好ましくは９〜１１の範囲とすることを意味し、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基の中から、反応液を上記ｐＨの範囲にするのに十分な種類および量の塩基を適宜選択して用いることができる。ここで、本反応は、アルカリ条件下で行うことによって、エストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体における水酸基のうちフェノール性水酸基が選択的にペンタハロゲン化ベンジルエーテル化もしくはペンタハロゲン化ベンゾイルエステル化されるため、最終的に得られる１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳで高感度で測定することが可能となる。
【００３３】
上記ステップ−１と同様の方法により調製されるペンタハロゲン化ベンジル誘導体もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体としては、例えば、次のものを挙げることができる。
エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
エストラジオール−３−ペンタフルオロベンゾイルエステル、
２−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
３−メトキシエストラジオール−２−ペンタフルオロベンジルエーテル、
４−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、
３−メトキシ−４−ヒドロキシエストラジオール−４−ペンタフルオロベンジルエーテル等。
【００３４】
ピリジニウム誘導体の調製
上記ステップ−１の方法により調製したエストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジル誘導体もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体は、ジクロルメタン等の不活性溶媒に溶解した後、トリエチルアミン等の塩基性触媒の存在下で、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させることにより、ピリジニウム誘導体へと変換することができる（エストラジオールについての例を下記ステップ−２に示す）。
【００３５】
ステップ−２
【化８】
2006138786.tif 000008
（式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、ハロゲン原子を表し、Ｒは、低級アルキル基を表す。）
【００３６】
この反応は、−１０℃乃至６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５℃乃至４０℃の範囲内の温度が適している。また、反応溶媒としては、一般的な不活性有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル等を使用することができる。
【００３７】
また、エストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジル誘導体もしくはペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に対する１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンの使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、生体由来試料１ｍＬ又は１ｇに対して０．２ｍｇ乃至２０ｍｇとすることができ、好ましくは１ｍｇ乃至４ｍｇが適している。
【００３８】
上記ステップ−２と同様の方法により調製されるピリジニウム誘導体としては、例えば、次のものを挙げることができる。
エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム、
２−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム、
３−メトキシエストラジオール−２−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム、
４−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム、
３−メトキシ−４−ヒドロキシエストラジオール−４−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム等。
【００３９】
また、本発明の測定方法におけるＬＣ−ＭＳ測定は、一般的な方法により行うことができる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１  ヒト血清中の生体内微量物質の測定
１−１  ヒト血清試料の調製
ヒト全血より得た血清試料１０００μＬにエーテル５ｍＬを加え、１０分間振とうし、遠心分離（４℃、１５００×Ｇ、５分間）した。これを凍結して上清を分取し、溶媒を留去した。
【００４１】
１−２  エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテルの調製
前項１−１で得た残留物をアセトニトリル５０μＬに溶解し、次いで、水酸化カリウムのエタノール溶液（１→１２５）５０μＬを加えて反応液のｐＨを約１０とし、次に５％ペンタフルオロベンジルブロマイド溶液５０μＬを加え、５０℃で１時間加温した。反応液を水で希釈後、エーテルで抽出し、溶媒を留去した。
【００４２】
１−３  エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウムの調製
前項１−２で得た残留物をジクロロメタン２０μＬに溶解し、これに１−メチル−２−フルオロピリジンのジクロロメタン溶液（１→５０）２００μＬ及びトリエチルアミンのジクロロメタン溶液（１→１０）３０μＬを加え、室温で９０分間反応した。次いで、溶媒を留去した後、薄めたメタノール（１→４）１．２５ｍＬに溶解し、あらかじめメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８カラムに負荷した。水１ｍＬ、０．３％アンモニア水３ｍＬ、メタノール２ｍＬ及び０．０１％ギ酸／メタノール混液（１：１）３ｍＬで洗浄した後、アセトニトリル／１０％ギ酸混液（４：１）３．５ｍＬで溶出した。溶出液を減圧下で留去した後、０．０５％ギ酸／アセトニトリル混液（１：３）１００μＬに溶解した。
【００４３】
１−４  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による測定
前項１−３で得た液のうちの２５μＬをＬＣ／ＭＳ測定に使用した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフィー装置（アジデントテクノロジー、ＨＰ１１００）に接続したマススペクトロメータ  Ｑｕａｔｔｒｏ−IIを用い、ＥＳＩ法で測定した。
【００４４】
ＬＣとＭＳの測定条件を、下記表１に示す。
【表１】
2006138786.tif 000009
【００４５】
ＭＳで測定した場合、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウムのマススペクトルは、ｍ/ｚ５４４．４に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ１１０．１に強い強度を示すスペクトルが得られた（図１）。
【００４６】
そこでｍ/ｚ５４４．４を前駆イオンとして、生成イオンｍ／ｚ１１０．１をＳＲＭ（selected reaction monitoring）クロマトグラム測定したところエストラジオール１ｐｇが検出できた（図２）。なお、内部標準物質には重水素で標識したエストラジオール（１６，１６，１７−ｄ３体）を用いた。この条件で得られた検量線の一例を示す（図３）。エストラジオール１〜１０００ｐｇの濃度範囲において相関係数０．９９８７と良好な直線を得た。
【００４７】
実施例２
実施例１と同様にして、種々の生体由来試料について、そのピリジニウム誘導体のピーク面積を測定し、それと内部標準物質とのピーク面積比を算出しエストラジオール濃度を求めた。その結果を下記表２に示す。
【００４８】
【表２】
2006138786.tif 000010
【００４９】
下記表３は、上記表２のデータをまとめたものである。
【表３】
2006138786.tif 000011
【００５０】
上記の結果より、本発明の方法を用いると、生体由来試料中のエストラジオール及びエストラジオール誘導体を１〜１０００ｐｇの濃度範囲で定量することができることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウムのマススペクトル（前駆イオンｍ/ｚ５４４.４、前駆イオンからの生成イオンｍ/ｚ１１０.１）である。
【図２】図２の上段と中段のグラフは、内部標準物質（エストラジオール１６、１６、１７ｄ３−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム）１ｐｇのＳＲＭクロマトグラムであって、上段は１１１．２のイオンピークを、中段は１１０．２のイオンピークをそれぞれ取り出したものである。また、図２の下段のグラフは、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル  １７−Ｏ−メチルピリジニウム１ｐｇのＳＲＭクロマトグラムである。
【図３】図３は、本発明の方法により測定されるエストラジオールについての、１〜１０００ｐｇでの検量線である。
【図１】
2006138786.tif 000014
【図２】
2006138786.tif 000015
【図３】
2006138786.tif 000016