(57)【要約】【課題】金属ナノ粒子集合体の接合部に単一分子レベルのごく少数の分子が存在することを分光学的に確かめる方法を提供する。さらには、金属ナノ粒子集合体の接合部にごく少数の分子が存在するときに、そのSERS信号が巨大な増強を得ることを、実験的に確かめる方法を提供する。また、それを利用した単一分子のラマンスペクトル測定による状態分析の方法及びそれを利用したデバイスを提供する【解決手段】SERS信号と弾性散乱スペクトルの同時測定により、SERS信号のBlinkingから単一分子が吸着しており、白色光に対する散乱スペクトルからその分子が銀ナノ粒子接合部に存在していることが証明される。同時に、そのときのSERSスペクトルから目的化学種の存在状態を単一分子レベルで解析する【選択図】図１
2006106014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の単一分子から得られたラマン散乱スペクトルとバルク状態の分子から得られたラマン散乱スペクトルとの比較により単一分子レベルでの分子の構造のバルクとの違い、分子の配向性、周囲との相互作用その他の単一分子レベルでの分子の状態を分析する分子の状態分析方法
【請求項２】
カチオン性色素分子と塩化物イオンを還元法により形成した金属ナノ構造に吸着させて基板表面に固定してなることを特徴とするラマン散乱・弾性散乱観測用試料
【請求項３】
顕微鏡、CCD検出器つき分光器、前記顕微鏡に付設したCCDカメラ、ラマン励起光を除去するノッチフィルタとを備えることを特徴とするラマン散乱・弾性散乱観測用分光装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はナノスケールで特定の形状を有する金属表面に吸着した有機分子、無機分子およびそれらのイオン状態にあるものを、単一分子検出感度で検出し、かつそれらの化学種の存在状態を単一分子レベルで分析する原理と方法に関するものである。このような金属ナノ構造表面の特性を利用することによって生物・環境に関連する重要な物質、例えば高速DNA塩基配列解析、遺伝子診断、血液検査、有害ガス検知、環境ホルモン等を単一分子で測定し、定量、定性分析を行えるデバイスも含む。
【背景技術】
【０００２】
種々の固液界面に存在する化学種の高感度分析は、燃料電池などの触媒反応の制御や、DNA塩基配列、蛋白の高次構造と機能の解析などに関連して注目されている。In  situでの単一分子検出については、従来もっぱら蛍光法が適用されている。この方法は、例えばローダミン６Gのような強い蛍光を与える色素分子の単一分子感度での測定、あるいはそのような色素分子で標識した（DNAなどの目的箇所に蛍光分子を化学的に結合させ、蛍光測定により目的分子が存在することを検出できるようにすること）DNAなどの生体分子の特定部位の観察などで、幅広く利用されている。しかし、この方法では強い蛍光を発しない分子の検出が不可能であり、蛍光スペクトルで得られる情報が、ブロードなピーク波長などに限られていることから、あらかじめマーカとしてラベルされている場合を除き、未知物質の同定をはじめとする状態分析は困難である。これに対して、ラマン散乱を利用した場合、入射光が分子にあたるとその分子内または分子間の結合に基く固有の振動エネルギー状態を反映した光（散乱光のエネルギー＝入射光のエネルギー±振動エネルギー）が放射される。単純に言って結合の数だけ異なる振動が存在し、それによりラマン散乱スペクトルが与えられる。このラマン散乱スペクトルのピーク強度は、分子の固有の振動モード及びその配向が決まれば一義的に決まる。そのため、従来より知られているように、ラマンバンドピーク波数やピーク間の相対強度を分子が無秩序に配向したバルク溶液中や、規則的に配向した単結晶でのデータと比較することで、分子内の結合の強さや、分子の配向性のほか、立体構造や周囲の化学種との相互作用に関する情報が得られる。この意味で、化学種の定性、定量的な状態分析のために、ラマン分光は蛍光法よりも原理的に有用である。しかし、一般的にラマン散乱の信号光は蛍光に比べて圧倒的に弱いので（増強ないときのラマン信号強度/蛍光強度≒10-14）、単一分子での測定は不可能である。ところが、表面増強ラマン散乱を利用することによって、ラマン信号強度は単一分子に匹敵するくらい大きく増強される場合があることが、いくつかのグループ、たとえば、NieらによってScience誌  1997年第107巻pp1102-1106などに報告されている。
【０００３】
1970年代初めにFleishmannやVan  Duyneらにより発見された表面増強ラマン散乱(Surface  Enhanced  Raman  Scattering,  SERS)は,粗い金属表面に吸着した化学種のラマン散乱スペクトル信号が、局在金属表面プラズモン（Localized  Surface  Plasmon,  LSP）および金属表面と吸着種との間の電子移動に基づく化学増強メカニズムにより信号が増強されることである。しかし、実際に用いられる種々の金属表面でこれらの2つのメカニズムがどのように増強に寄与するかは、金属表面のナノスケールでの詳細な構造や、局所的な電子状態に依存することから、十分明らかになっていなかった。このため、SERSは、検出された信号強度が目的化学種の量だけでは決まらないため定量分析手法として用いることはできなかった。また、どのようなサイトに吸着しているのかを直接知ることはできなかった。
【０００４】
最近の走査型プローブ顕微鏡や高感度光検出器の発達により、個々の金属ナノ粒子の構造をナノスケールで測定し、同時に粒子間を十分大きくすることで、微量分子の吸着した特定の粒子のみからの分光信号を検出することが可能になってきた。SERSを用いたラマン散乱信号もそのひとつで、大きな増強度を与える（信号増強のために最適な形状を有する）金属ナノ粒子のみを観測することで、例えば、Journal  of  Physical  Chemistry  B2003年107巻9964-9972頁やAnalytical  Chemistry  2003年75巻6171-6176頁のように1010-1014の単一分子感度に匹敵する巨大な増強度も報告されている。しかし、これまでに報告されている巨大SERS増強度はすべて、クエン酸などの還元剤を用いて硝酸塩などの金属イオンから還元生成された種々の形状やサイズからなる金属ナノ粒子及びその集合体について得られたものである。その場合には、上記の多粒子・多分子系と同様に、巨大な増強を与えるメカニズムや関連して観測されるBlinking(SERS信号強度が、時間とともに突然かつ繰り返し示す強度変化。数回／秒の周波数でおきる)のオリジンは明らかになっていなかった。
【０００５】
この主な原因は以下の2つである。1）金属ナノ構造の形成方法に関連して、金属ナノ構造1個当たり1-10個程度の分子が吸着しているときに、それを実験的に直接確かめる方法がないために、検出されたSERS信号が1個の分子からのものであることを明言できない。２）そのために巨大増強を与えるメカニズムや、最適な形状を有する金属ナノ構造が、明確に解明されていないことによる。
【０００６】
そこで、われわれは、巨大なSERS増強度を与える金属ナノ構造を原子間力顕微鏡により直接観測し、またLSP吸収スペクトルと対応付けること、さらにその金属ナノ構造にSERS測定のためのレーザ光を照射したときにナノ構造表面に形成される局所電場強度を数値計算により求めることで、巨大増強度を与える金属ナノ構造を明らかにしてきた（Journal  of  Physical  Chemistry  B,  2003年107巻7607-7617ページ,  同2004年108巻673-678ページ）。この結果によると、（１）単一分子感度に匹敵する巨大な増強度は、孤立粒子ではなく、2粒子以上の集合体でのみ得られる。その場合、接合軸に平行な偏光を用いたとき、垂直な偏光に比べて著しく大きな増強度が得られる。これに対応して、集合体では個々のLSP吸収スペクトルが重なり合うために、用いた488nmの励起波長により効率的なLSP励起が行える。これによく対応して、局所電場計算では、(1)孤立した球状、楕円状、及び円筒状の金属ナノ粒子では、104-105のSERS増強しか得られない。(2)これに対して、これらの形状を有するナノ粒子の接合部では、粒子サイズによらず最適波長では1010以上の単一分子感度に匹敵する増強度が得られた。接合粒子の接合部から離れた一般的なサイトでは、孤立粒子と同様に104-105のSERS増強が得られた。このことから、単一分子感度の巨大増強度が金属ナノ粒子集合体、かつその接合部で得られることが明らかになった。また、（２）吸着色素分子を銀ナノ粒子1個当たり数分子−1分子以下にしたとき、SERS信号強度のBlinkingが観測された。これは、室温から７７Kまで冷却することにより抑制され、室温まで再加熱すると再開した。このことから、Blinkingは、吸着分子が銀ナノ粒子の接合部と他の一般的なサイトの間で熱拡散することによるものと推定される。
【０００７】
このような実験事実から、銀ナノ粒子接合部に色素などの分子1個が吸着しているとき、その分子のラマンスペクトルが観測され、その強度は銀ナノ構造表面の熱拡散のためにBlinkingするものとして解釈できる。しかしながら、種々の実験事実からこのように解釈できるものの、巨大なSERS増強度を与えるときに吸着した分子が実際に銀ナノ粒子接合部に存在するかどうかは、それを直接観測する分析方法がないために、明確にできなかった。
【０００８】
本発明の中で使用する用語について定義する。
【０００９】
本明細書内で使用する「表面増強ラマン散乱（SERS）」とはナノスケールの粗さを有する金属表面に吸着した化学種に、可視領域の波長を有するレーザ光を照射したとき、あらゆる方向に放射されるラマン散乱が、金属表面の局在表面プラズモン（LSP）や金属表面の電子状態と吸着種の電子状態の相互作用により、バルク状態に比べて104-105以上増強される現象をいう。ここで、ラマン散乱信号光は、入射光のエネルギーに比べて分子の振動エネルギー分だけ異なる散乱光で、分子内の結合の振動モードのエネルギーを与える。振動モードのうちラマンスペクトル測定で観測されるものは、分子の対称性に依存すること、およびそれらの相対強度は、分子の構造・対称性・電子状態など固有の特性を反映するので、このラマンスペクトルの解析により、分子の構造やその微小変化、分子の配向性や周辺化学種との相互作用に関する情報が得られる。
【００１０】
本明細書内で使用する「ナノ粒子」とはその半径(r)が1ナノメートル<  r  <  1000ナノメートル  (1ナノメートル＝10-9メートル)の球を示す。
【００１１】
本明細書内で使用する「Blinking」とは単一分子に由来する表面増強ラマン散乱信号の強度が、時間とともに数ヘルツの周期で繰り返し点滅することを示す。
【００１２】
本明細書内で使用する「LSP」（Localized  Surface  Plasmon）とは、金属ナノ粒子に局在する表面プラズモンで、可視領域の適切な波長の光照射により励起される。このとき、金属ナノ粒子表面に巨大な電場が形成され、それにより金属表面に吸着した化学種のラマン散乱信号が増強される。これはLSPによる表面増強ラマン散乱である。
【００１３】
in  situ分析法とは、非破壊の試料の本来存在する条件下、例えば電極触媒表面であれば、固液界面で電極の電位が制御された状態下で、生体分子であればそれが生体中で存在している状態のままで分析する方法。
【００１４】
【非特許文献１】Science誌 1997年第107巻pp1102-1106
【非特許文献２】Journal of Physical Chemistry B2003年107巻9964-9972頁
【非特許文献３】Analytical Chemistry 2003年75巻6171-6176頁
【非特許文献４】Journal of Physical Chemistry B, 2003年107巻7607-7617ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
金属ナノ粒子集合体の接合部に単一分子レベルのごく少数の分子が存在することを分光学的に確かめる方法を提供する。さらには、金属ナノ粒子集合体の接合部にごく少数の分子が存在するときに、そのSERS信号が巨大な増強を得ることを、実験的に確かめる方法を提供する。また、それを利用した単一分子のラマンスペクトル測定による状態分析の方法及びそれを利用したデバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
金属ナノ粒子集合体の接合部にごく少数の分子が存在するときに、そのSERS信号が単一分子感度を与えるように著しく増強される一方、吸着分子が接合部中心から熱拡散等で他のサイトに離れていったときにSERS信号強度が大きく低下する。このSERS信号強度の変化に対応して、われわれが見出した同じ試料について同時に観測した白色光を照射したときの弾性散乱スペクトルが明確な変化を示すことを利用する。より具体的には(1)巨大な増強度を与えるとき色素分子が接合部に存在し、それにより色素の吸収による付加的な弾性散乱ピークが観測されること、及び(2)SERS信号が増大されないとき、その弾性散乱ピークが消失することを利用する。これにより、単一分子レベルでの色素分子の位置の同定とそのときの分子の状態分析をSERSスペクトル解析により行える。また、このような巨大なSERS増強度を与える構造は、先に述べたように孤立した銀ナノ三角柱構造でも得られるので、全く同様の方法で、銀ナノ三角柱構造のエッジに吸着する分子の状態分析を単一分子感度で行うことができる。
【００１７】
金属ナノ粒子集合体についてこの方法による解析は具体的には以下のとおりである。
(1)周知の還元法により形成した銀ナノ粒子にカチオン性色素分子と塩化物イオンを吸着させる。これをシリコン基板表面などに固定する。(2)この色素の吸着した銀ナノ粒子／基板試料の弾性散乱イメージ、及び弾性散乱スペクトル、ラマン散乱イメージ及びラマン散乱スペクトルを同一の顕微鏡と高感度CCD検出器付分光器により構成された分光装置により測定する。光学イメージ測定は、顕微鏡に付設のCCDカメラで、分光スペクトルは分光器に接続された高感度分光用CCD検出器により測定される。ラマンイメージ及びラマンスペクトル測定の際には、励起光を除去するためのノッチフィルタを用いる。顕微鏡でラマンイメージ、-スペクトル及び弾性散乱イメージが観測された個々の銀ナノ粒子は、AFMによりそのナノスケールでの形状が詳細に観察される。これは、基板上に描かれた縦横それぞれ30ミクロン間隔の格子を用いることではじめて可能になる。そのとき、個々の格子内部の銀ナノ粒子の数は、基板上に展開する銀ナノ粒子の粒子密度の制御で、また吸着色素分子の数密度（1銀ナノ粒子あたりの吸着分子の数）は、銀粒子に対する色素分子数の制御により調整される。
【００１８】
(3)このような方法で、1個1個の銀ナノ粒子のSERSスペクトル、弾性散乱スペクトル、LSP吸収スペクトル及びそれらのイメージ、さらにAFMによるナノスケールでの詳細な形状が解析される。この最適粒子探索により、まず1銀ナノ粒子あたり数10分子の色素吸着量のときに巨大なSERS増強を与える粒子を、SERSイメージ測定により明るいスポットとして見出す。(4)この巨大なSERS信号は、時間の経過とともに吸着分子が接合部からずっと遠い表面へ熱拡散することや完全な脱離のために、強弱を繰り返しながら、次第に強度低下し、およそ10-30分で完全に強度を消失する。その後再び信号を出すことはない。このSERS活性が変化する過程でSERS測定と同時に白色光による弾性散乱スペクトル測定を行うと、色素が吸着した銀ナノ粒子が巨大なSERS活性を与えるときのみ、銀のLSPピーク以外に付加的な散乱スペクトルピークが観測される。SERS活性が失われると、この付加的な散乱ピークは失われ、銀ナノ粒子のLSPピークのみが観測される。(5)この付加的な散乱ピークは、色素の吸収によるものである。銀ナノ粒子のLSPと電磁気学的カップリングをすることにより、色素のバルク状態での吸収波長よりも長波長側にシフトしている。このことは、後で述べるように銀ナノ粒子／色素系の白色光照射時の局所電場及び遠方電磁場をMaxwell方程式の数値計算により求めた結果で明瞭に確かめられた。重要なことは、ごくわずかな色素分子でも、接合部に存在している限り、色素が存在しないときに比べて、有意の散乱スペクトル変化を与える。これに対して、同じ量の色素分子が銀ナノ粒子表面に吸着していても、接合部以外の一般的なサイトに存在する場合には、そのような散乱スペクトル変化を与えない。より詳細には、接合部中心から7.5nm以上動いたとき、散乱スペクトルは色素が吸着していないときと全く同じものになる。従って、白色光による散乱スペクトル測定を用いれば色素分子が銀ナノ粒子集合体の接合部に存在すること、および色素分子が接合部からどの程度外れた位置に吸着しているかを明示することができる。
【００１９】
ここで用いた電磁気学数値計算についてまとめる。これは、試料系（ここでは色素の吸着した銀ナノ粒子）に光を照射したときに形成される電磁場を与える基本式であるMaxwell方程式が微分方程式であるために、対称な系や比較的簡単な幾何学的構造を有する試料系についてのみ解析解が得られることから、非対称なナノ構造体や複雑な試料系での電磁場計算に広く用いられている方法である。これは、簡略化したモデル計算ではなく、試料系のMaxwell式と境界条件をそのまま微分方程式から時間及び空間変数を含む差分方程式に変形して、数値計算により解を求める方法である。従って、十分細かい空間・時間の分割幅を用いる限り、計算精度の問題は抑えられ、原理的に常に正しい解を得ることができる。今回の試料系では、以下の実施形態に詳しく述べるように銀ナノ粒子表面の種々の位置にごくわずかな吸着分子（１銀ナノ粒子あたり数分子−数10分子）を配置したときの散乱スペクトル（入射光強度に対する試料遠方での電磁場の比）を計算して、色素の吸着による変化とそのときのSERS増強度を求めるものである。
【発明の効果】
【００２０】
この発明はナノスケールで特定の形状を有する金属表面に吸着した有機分子、無機分子およびそれらのイオン状態にあるものを、単一分子検出感度で検出し、かつそれらの化学種の存在状態を単一分子レベルで分析する原理と方法に関するものである。このような金属ナノ構造表面の特性を利用することによって遺伝子診断、血液検査、有害ガス検知、環境ホルモン等、生体系及び環境汚染などに関連する重要な物質を単一分子感度で測定し、定量、定性分析を行うことができる。より具体的には以下のとおり。例えば、ボトムアップナノテクノロジーの利用により分子レベルのデバイスを構築するときに、構成要素である分子やイオンなど化学種の構造や、配向性・電子状態などの存在状態は、近傍化学種との相互作用などのために、孤立分子状態あるいはバルク状態とは大きく異なるものと考えられる。これらの点は、ナノデバイスの構造と機能を制御するために重要で、ナノデバイスの精密な制御のために明らかにする必要がある。最新の走査型プローブ顕微鏡などの進んだ分析法でも、構造についての情報はある程度得られるが、これらの点をin  situで解析することはできない。本発明によれば、最適金属ナノ構造をナノデバイスの基板あるいは電極として用いることで、任意の化学種の単一分子レベルでの存在位置の同定と、その状態分析が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の内容について発明の実施の形態の例について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態の例のみについて限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（１）SERS活性色素吸着した銀ナノ粒子試料の調製法：(1)室温で、既知の方法（J.  Physical  Chemistry  1982年86巻3391頁）により硝酸銀をクエン酸ナトリウムで還元して形成した銀ナノ粒子にカチオン性色素分子と塩化物イオンを吸着させる。これをシリコン基板表面などにアミノシランカップラーなどを用い固定する。このとき、銀表面の塩化物イオンによる負電荷と色素のカチオン、及びアミノ基の部分的負電荷の間の静電的相互作用により、色素分子の吸着した銀ナノ粒子は十分な機械的安定性を持って、基板表面に固定することができる。(2)この色素の吸着した銀ナノ粒子／基板試料の弾性散乱イメージ、及び弾性散乱スペクトル、ラマン散乱イメージ及びラマン散乱スペクトルを同一の顕微鏡（Olympus）とそれに光学的に結合された分光器（Renishaw）により構成された分光装置（図1）により測定する。図１はラマン散乱・弾性散乱観測用分光装置を示しており、このラマン散乱・弾性散乱観測用分光装置は白色光源１、CCDカメラ２、PC３、散乱光イメージ、ラマンイメージ４、ノッチフィルタ５、色素を吸着した銀ナノ粒子試料６、可動ミラー７、分光器８、干渉フィルタ９、アルゴンイオンレーザ（488nm）１０、CCD検出器１１、PC１２、ラマンスペクトル、散乱スペクトル１３、偏光子１４、顕微光学系１５を備えている。光学イメージ測定は、顕微鏡に付設のCCDカメラ（Sony,  DSC-50C）で、分光スペクトルは分光器に接続された高感度分光用CCD検出器により測定される。ラマンイメージ及びラマンスペクトル測定の際には、妨害となる励起光を除去するためのノッチフィルタ（Kaiser）を用いる。顕微鏡で観測された個々の銀ナノ粒子は、AFMによりそのナノスケールでの形状が詳細に観察される。これは、基板上に描かれた縦横それぞれ30ミクロン間隔の格子を用いることではじめて可能になった。また個々の格子内部の銀ナノ粒子の数は、基板上に展開する銀ナノ粒子の粒子密度の制御で、また吸着色素分子の数密度（1銀ナノ粒子あたりの吸着分子の数）は、銀粒子に対する色素分子数の制御により調整される。
【００２３】
(3)このような方法で、1個1個の銀ナノ粒子のSERSスペクトル、弾性散乱スペクトル、LSP吸収スペクトル及びそれらのイメージ、さらにAFMによるナノスケールでの詳細な形状が解析される。その結果、まず1銀ナノ粒子あたり数10分子の色素吸着量のときに巨大なSERS増強を与える粒子を見出す。そしてその白色光による弾性散乱スペクトル測定を行う。(4)例えば図2cに示すようにこのような巨大なSERS増強度を与える銀ナノ粒子のAFMによるナノスケールでの形状は、予想通り集合体であり、このとき観測された1654,  1574,  1510,  1365,  1313,  1190  cm-1などのラマンバンドは、すべて用いた色素であるローダミン6G（R6G）によるバンドであることが、バルク状態のスペクトル（1647,  1568,  1534,  1504,  1365,  1308,  1195cm-1）との比較から確かめられた。このように単一分子から得られたスペクトルとバルク状態でのスペクトルとは１：１に対応づけられる。観測された有意のピーク波数のずれや相対強度の違いは、この分子が存在している局所的な環境を反映しているので、この様なスペクトル違いを、R6Gの単結晶や特定の方向に配向した試料のラマンスペクトルとの比較、及びラマンスペクトルの理論計算などにより解析することで、単一分子レベルでの状態分析（分子の構造のバルクとの違い、配向性、周囲との相互作用など）が可能になる。
このSERSスペクトルは、時間の経過とともに吸着分子が接合部からずっと遠い表面へ熱拡散することや完全な脱離のために、強弱を繰り返しながら、次第に強度低下し、およそ10-30分で完全に強度を消失する。例えば図2aに示すのは、巨大な増強度を与える銀ナノ粒子からのSERSスペクトルと、それが強度変化を繰り返しながら次第に低下し、約30分後に強度を消失したときのラマンスペクトルである。この後再び信号を出すことはない。この過程でSERS測定と同時に白色光による弾性散乱スペクトル測定を行うと、色素がごくわずかな量（数分子−数10分子）吸着した銀ナノ粒子が巨大なSERS活性を与えるときのみ、銀のLSPピーク(525nm,  730nm)以外に付加的な散乱ピークが630nm付近に観測される（図2b）。SERS活性が失われると、この付加的な散乱ピークは失われ、銀ナノ粒子のLSPピークのみが観測される（図2b,  c）。この付加的なピークの波長630nmは、色素のバルク固相での吸収ピーク波長560nmと比べるとより長波長側に観測されている。この付加的なバンドのピーク波長は、粒子ごとにわずかに異なるが、常に色素バルクの吸収ピーク波長よりも長波長側に観測される。(5)全く同様の変化が単一分子レベルの吸着量のときに観測された。図3aに示すように銀ナノ粒子あたり約3分子のR6Gが吸着している系で、blinkingする銀ナノ粒子を見出した。この粒子もやはり数個の粒子の集合体である。Blinkingを示すとき、475nm及び  630nmのLSP吸収によるピークのほかに、590nm付近に別の散乱ピークが観測された。SERS活性が失われると、LSPピークもわずかに強度及びピーク波長が変化するが、590nmの付加的なバンドは全く観測されなくなる。
【００２４】
(6)この付加的な散乱ピークは、色素の吸収によるものである。銀ナノ粒子のLSPピークと電磁気学的カップリングをすることにより、色素のバルク状態での吸収波長よりも長波長側にシフトし、かつ大きな強度を与えている。このことは、銀ナノ粒子／色素系の白色光照射時の局所電場及び遠方電磁場を上記数値計算法により求めた結果により確かめられた。まず孤立銀ナノ粒子系での計算結果では、粒子形状を80×80×40nmの回転楕円体として、単軸方向から光を入射（長軸に平行な直線偏光を使用）したとき、図4aに示すようにLSPの吸収波長は430nmである。この銀ナノ粒子表面にローダミン色素（吸収波長590nm）を異なる厚さ吸着させる。このとき、銀及び色素の誘電率としては、300-800nmの約25nm間隔の約20点の計算波長における文献値を用いた（銀の誘電率：Palik著「Handbook  of  Optical  Constants  of  Solids」(Academic  Press,  1985),  ローダミンの誘電率：Optics  Letters,  1981年6巻248-250））。色素分子は銀ナノ粒子表面を均一に覆っている。電磁場の散乱断面積は、先の入射光が照射されたときに、この粒子から遠方に放射される放射光エネルギー（入射光エネルギーで規格化されている）として数値計算により与えられる。入射光波長を300nm-800nmで変えることで、散乱スペクトルが得られる。(7)その結果は、図４aに示すように、孤立粒子については色素膜厚が8nmとかなり厚くてもLSPバンドが強度を増加する以外は、色素による長波長側のピークは出現するものの無視できるくらい弱い。これは実測スペクトルの付加的なピーク強度と比較してもごく小さい。この付加的なバンドの強度は色素の吸収波長をLSP吸収波長に590nmから500nm,  450nmと近づけていくと、次第に増加し、450nmのときLSP吸収強度のおよそ1/4に増大する。この結果は、LSPと色素の吸収が近いほどLSPとのカップリングが大きくなり、お互いの強度やピーク波長が大きく変化することを示している。しかし、色素の吸収は実際には560nm付近にあるはずなので、このように吸収波長を変えるのは、あくまでもその寄与を調べるためであり、ここでR6G／銀粒子の試料についての実測値と対応付けられない。
(8)これに対して、銀ナノ粒子集合体（ここでは2粒子接合体）での計算結果は大きく異なっている。図5に示すように、ここでは、半径40nmの形状を有する円筒（無限長）2個が近接して置かれている系を試料とする。3次元計算を行わないでも、ここで示した２次元断面（円）内の偏光及び入射方向については、2次元計算で正しい解が得られること（Journal  of  Physical  Chemistry  B,  2003年107巻7607-7617ページ）を利用して、計算時間を節約するために、2次元で取り扱っている。この接合部及び他の一般的なサイト、例えば一方の粒子の接合部とは反対側端面などに、ごくわずかな色素分子（590nmに吸収を持つとして、2粒子間のギャップサイズ g (nm)をちょうど埋めるようにg×gnm2の面積）をおいた場合及びおかない場合の散乱スペクトルを計算する。結果は、図5aに示すように、ギャップサイズ8nmのとき左側の粒子の左端（接合部とは反対側）に色素分子（８×８nm2）をおいたとき、色素のない銀ナノ粒子のみの場合と全く同じ散乱スペクトルを与える（黒丸：色素のないとき、逆三角：左端に色素を置いたとき）。これに対して、2粒子の接合部に色素をおいたとき、散乱スペクトルはこれらとは全く異なる。この結果は、色素分子が接合部に満たされることで、左、右の銀ナノ粒子のLSPがまるでギャップがないかのように、極めて効率的にカップリングすることによる。実際にここで色素を接合部においたときに得られる散乱スペクトルは、全く同じ銀ナノ粒子をギャップなしに接触させたときのLSP散乱スペクトルと非常によく一致している（Journal  of  Physical  Chemistry  B,  2003年107巻7607-7617ページ）。この結果は、色素分子が銀ナノ粒子のLSP吸収波長と近い吸収ピークを有することによって保障されている。実際、もし色素の代わりに色素と同等の屈折率実部を有するガラスなどの材料をギャップにおいても、ここで得られたような大きなスペクトル変化は観測されず、ギャップに何も存在しないときと全く同じスペクトルが得られた。
(9)同様にギャップを4nm,  2nm,  1nmと小さくしたとき、色素をギャップに置いたときの散乱スペクトルの変化は、吸着した色素の量が4×4nm2,  2×2nm2,  1×1nm2と少なくなるためもあり、8nmのときに比べると小さいが、銀ナノ粒子の430nm付近のLSPピーク強度に比肩しうる色素の吸収による付加的なピークが、600-800nm付近に観測された。また、これらの場合でも色素分子を接合部以外の周縁領域においたとき、色素がないときと全く同じ散乱スペクトルが得られることが確かめられた。
(10)さらに、色素位置を詳細に変えたとき、重要な結果が得られた。まずギャップサイズ1nmのとき、色素分子1×1nm2≒1分子相当）をギャップ中央においたとき、660nmに付加的なバンドが観測される。これに対して、色素を接合部中央から上方（接合軸に垂直な方向）に5nm,  7.5nm,  10nmずらしたときの散乱スペクトルを計算したところ、10nm,  7.5nmでは色素が存在しないときとほぼ一致するスペクトルが得られた。すなわちこれらの場合、長波長側の色素の吸収による散乱ピークが観測されない。対照的に、5nmずらしたときには接合部中心においたときと、色素のないときのちょうど中間的なスペクトル変化が観測された。すなわちこのとき760nm付近に色素の吸収によるピークが接合部中央に置いたときの約1/2の強度で観測された。
【００２５】
(11)これらの結果から、数分子とごくわずかな色素分子(1nm×1nm≒1分子相当)でも接合部にある限り、色素が存在しないときに比べて、有意の散乱スペクトル変化（600-800nmの付加的なバンド）を与える。これに対して、同じ量の色素分子が銀ナノ粒子表面に吸着していても、接合部以外の一般的なサイトに存在する場合には、そのような散乱スペクトル変化を与えない。より詳細には、接合部中心から7.5nm以上動いたとき、散乱スペクトルは色素が吸着していないときと全く同じものになる。従って散乱スペクトル変化から、色素分子の吸着サイトが接合部中央に存在していること、あるいは接合部からどれくらいの距離離れているかを明示することができる。
(12)先に示した実験事実、すなわち銀ナノ粒子接合体が巨大なSERS増強度を与えるとき、弾性散乱スペクトルが長波長側に付加的なバンドを与え、SERS増強度が時間とともに消失したとき、この付加的な散乱ピークも消失することと複合して考えると以下のことが結論づけられる。巨大なSERS活性を与える銀ナノ粒子集合体が、白色光入射に対する弾性散乱スペクトルで長波長側に付加的な散乱ピークを与えるのは、色素分子が銀ナノ粒子接合部に存在するからである。吸着分子が時間とともに接合部から次第に遠ざかったり、あるいは完全に脱離すると、銀ナノ粒子間は有意のギャップが開くので、ここのLSPのカップリングが消失し、それとともに長波長側の散乱ピークが失われる。
(13)この結果を用いると、SERS信号と弾性散乱スペクトルの同時測定により、SERS信号のBlinkingから単一分子が吸着しており、白色光に対する散乱スペクトルからその分子が銀ナノ粒子接合部に存在していることが証明される。同時に、そのときのSERSスペクトルから目的化学種の存在状態を単一分子レベルで解析することができる。さらにこの結果を利用すると、還元法により形成した金属ナノ粒子集合体に限らず、ナノ粒子リソグラフィ法（関連特許、特願2004-32098）により形成された金属ナノ構造のエッジ部分に、目的化学種が吸着していることを単一分子感度で検出し、かつそのラマンスペクトル測定から分子構造のバルク状態からの微小な変化、配向性、周辺化学種との相互作用など状態分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】SERSイメージ、SERSスペクトル、散乱スペクトル、AFM測定用装置構成図
【図２】実施の形態における方法により形成・測定された巨大なSERS増強度を持つ銀ナノ粒子のラマンスペクトル(a)、散乱スペクトル(b),(d)及びAFMイメージ(c).SERS増強度の失われる前後のデータ。色素吸着量は30分子/銀ナノ粒子
【図３】実施の形態における方法により形成・測定された巨大なSERS増強度を持つ銀ナノ粒子のラマンスペクトル(a)、散乱スペクトル(b),(d)及びAFMイメージ(c).SERS増強度の失われる前後のデータ。色素吸着量は3分子/銀ナノ粒子
【図４】実施の形態における方法により計算された孤立銀ナノ粒子（80×80×40nm3）への白色光入射時の散乱スペクトル：a)色素吸収波長590nmで色素膜厚を変えた、b)色素膜厚8nmで吸収波長を変えたときの結果
【図５】実施の形態における方法により計算された銀ナノ粒子接合体（半径40nmの無限長円柱）への白色光入射時の散乱スペクトル：a)ギャップサイズ8nm,b)  ギャップサイズ4nm,  c)ギャップサイズ2nm,  d)ギャップサイズ1nm.さらに色素位置を接合部および左の粒子の左端、上側などにずらしたときの結果
【符号の説明】
【００２７】
１    白色光源
２    CCDカメラ
３    PC
４    散乱光イメージ、ラマンイメージ
５    ノッチフィルタ
６    色素を吸着した銀ナノ粒子試料
７    可動ミラー
８    分光器
９    干渉フィルタ
１０  アルゴンイオンレーザ（488nm）
１１  CCD検出器
１２  PC
１３  ラマンスペクトル、散乱スペクトル
１４  偏光子
１５  顕微光学系
【図１】
2006106014.tif 000003
【図２】
2006106014.tif 000004
【図３】
2006106014.tif 000005
【図４】
2006106014.tif 000006
【図５】
2006106014.tif 000007