(57)【要約】【課題】    抗アレルゲン抗体を用いることなく、簡便に環境中のアレルゲン量を測定することが可能なアレルゲンの測定方法を提供すること。【解決手段】  環境中の生物由来アレルゲンの測定方法では、該アレルゲンが有するプロテアーゼの基質として、酵素反応の結果目視可能な色の変化をもたらす基質を用い、該基質を含む溶液と、粘着シートを用いて採取した被測定物とを接触させ、該基質溶液の色の変化を指標として該被測定物中のプロテアーゼ活性を測定することにより前記生物由来のアレルゲンを測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境中の生物由来アレルゲンの測定方法において、該アレルゲンが有するプロテアーゼの基質として、酵素反応の結果目視可能な色の変化をもたらす基質を用い、該基質を含む溶液と、粘着シートを用いて採取した被測定物とを接触させ、該基質溶液の色の変化を指標として該被測定物中のプロテアーゼ活性を測定することにより前記生物由来のアレルゲンを測定することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
粘着シートを用いて採取した被測定物を、前記基質を含む溶液中に浸漬するか又は該溶液を含浸させた多孔性基材と接触させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基質が、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸がアミド結合した着色化合物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記着色色素がクレジルバイオレット、サフラニンＯ又はメチレンバイオレット3RAXである請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記着色色素がメチレンバイオレット3RAXである前記着色化合物を基質とし、前記溶液が該基質を５μＭないし２０μＭの濃度で含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記アレルゲンがダニ若しくはダニ由来物、又は花粉である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記花粉がスギ花粉である請求項７記載の方法。
【請求項９】
床、壁、窓、窓枠、敷物、寝具類、繊維製品、家具類、粉塵又はハウスダスト中のアレルゲンを測定する請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、アレルゲンの量に応じて色変化する、プロテアーゼの基質を含む溶液又は該溶液を含浸させた多孔性基材と、被測定物を捕集するためのテープを含む、簡易アレルゲン定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中のアレルゲンの測定方法及び簡易アレルゲン定量キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大気中に含まれる花粉や、カーペットや布団等に含まれるダニ等がアレルゲンとなって、花粉症、アトピー、喘息等のアレルギー疾患を引き起こすことは広く知られている。これらのアレルゲンに対してアレルギー体質の人は、これらのアレルゲンとの接触を避けることがアレルギーの発症を避ける上で重要である。
【０００３】
従来、アレルゲンの測定は、いずれも測定対象となるアレルゲンを対応抗原とする抗体を用いた免疫測定により行なわれていた（下記特許文献１〜５）。
【０００４】
しかしながら、抗体、とりわけ、測定精度を高めるために用いられるモノクローナル抗体は高価である。
【０００５】
一方、花粉、ダニ、カビ、昆虫由来物質等、環境中に存在するアレルゲンには、プロテアーゼ活性を有するものがあることが知られている。例えば、スギ花粉（非特許文献１）、ブタクサ花粉（非特許文献２）、メスキトー花粉（非特許文献３）、カビの一種であるAspegillus fumigatus（非特許文献４）、ワモンゴキブリのアレルゲン（非特許文献５）、ダニ（コナヒョウダニ（Dermatophagoides farinae）及びヤケヒョウダニ（Dermatophagoides pteronyssinus））（非特許文献６〜非特許文献１３）がプロテアーゼ活性を有することが知られている。しかしながら、これらの文献では、プロテアーゼ活性を利用してアレルゲンを測定することについては開示も示唆もなく、また、アレルゲン量との間に定量関係があることについても開示も示唆もない。また、これらの文献では、アレルゲンを抽出、濃縮及び／又は精製してプロテアーゼ活性を測定しており、環境中のアレルゲンをこれらの前処理なしにそのまま簡便に測定できる点については開示も示唆もない。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−８７２９８号公報
【特許文献２】特開平５−２０７８９２号公報
【特許文献３】特開平１１−１４５１１号公報
【特許文献４】特開２０００−３５４２８号公報
【特許文献５】特開平６−３４５１８号公報
【非特許文献１】J Agric Food Chem. 2002 Jun 5;50(12):3540-3. Isolation and characterization of aminopeptidase (Jc-peptidase) from Japanese cedar pollen (Cryptomeria japonica). Noguchi Y, Nagata H, Koganei H, Kodera Y, Hiroto M, Nishimura H, Inada Y, Matsushima A.
【非特許文献２】Phytochemistry. 1998 Feb;47(4):593-8. Ragweed pollen proteolytic enzymes: possible roles in allergies and asthma.  Bagarozzi DA Jr, Travis J.
【非特許文献３】Am J Respir Cell Mol Biol. 1995 Apr;12(4):441-8. Isolation and properties of an angiotensin II-cleaving peptidase from mesquite pollen.  Matheson N, Schmidt J, Travis J.
【非特許文献４】J Investig Allergol Clin Immunol. 2002;12(4):257-62.  Serine proteinases with gelatinolytic activity in an Aspergillus fumigatus allergenic extract.  Iraneta SG, Duschak VG, Rodriguez SM, Alonso A.
【非特許文献５】J Investig Allergol Clin Immunol. 1999 Jul-Aug;9(4):235-40. Proteinase and gelatinolytic activities of house dust mite and cockroach extracts.  Iraneta SG, Duschak VG, Rodriguez SM, Seoane MA, Albonico JF, Alonso A.
【非特許文献６】Ando T, Ino Y, Haida M, Honma R, Maeda H, Yamakawa H, Iwaki M, Okudaira H. Isolation of cysteine protease in the crude mite extract, Dermatophagoides farinae.  Int Arch Allergy Appl Immunol. 1991;96(3):199-205.
【非特許文献７】Ando T, Homma R, Ino Y, Ito G, Miyahara A, Yamakawa H, Iwaki M, Okumura Y, Suko M, Haida M, et al.  Is a trypsin-like protease of mites a Der f III allergen?  Arerugi. 1992 Jun;41(6):704-7.
【非特許文献８】Ando T, Homma R, Ino Y, Ito G, Miyahara A, Yanagihara T, Kimura H, Ikeda S, Yamakawa H, Iwaki M, et al.  Trypsin-like protease of mites: purification and characterization of trypsin-like protease from mite faecal extract Dermatophagoides farinae. Relationship between trypsin-like protease and Der f III.  Clin Exp Allergy. 1993 Sep;23(9):777-84.
【非特許文献９】King C, Simpson RJ, Moritz RL, Reed GE, Thompson PJ, Stewart GA.  The isolation and characterization of a novel collagenolytic serine protease allergen (Der p 9) from the dust mite Dermatophagoides pteronyssinus.  J Allergy Clin Immunol. 1996 Oct;98(4):739-47.
【非特許文献１０】Schulz O, Sewell HF, Shakib F. Related Articles, Links A sensitive fluorescent assay for measuring the cysteine protease activity of Der p 1, a major allergen from the dust mite Dermatophagoides pteronyssinus.  Mol Pathol. 1998 Aug;51(4):222-4.
【非特許文献１１】Yasueda H, Mita H, Akiyama K, Shida T, Ando T, Sugiyama S, Yamakawa H. Allergens from Dermatophagoides mites with chymotryptic activity.  Clin Exp Allergy. 1993 May;23(5):384-90.
【非特許文献１２】Heymann PW, Chapman MD, Aalberse RC, Fox JW, Platts-Mills TA. Antigenic and structural analysis of group II allergens (Der f II and Der p II) from house dust mites (Dermatophagoides spp). J Allergy Clin Immunol. 1989 Jun;83(6):1055-67.
【非特許文献１３】Stewart GA, Ward LD, Simpson RJ, Thompson PJ.            Related Articles, Links  The group III allergen from the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus is a trypsin-like enzyme.  Immunology. 1992 Jan;75(1):29-35.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明の目的は、抗アレルゲン抗体を用いることなく、簡便に環境中のアレルゲン量を測定することが可能なアレルゲンの測定方法を提供すること、及びその方法を実施するための簡易アレルゲン定量キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ダニや花粉等の生物由来アレルゲンを粘着テープで採取し、該アレルゲンが有するプロテアーゼ活性を、酵素反応の結果として目視可能な色の変化をもたらす基質を用いて測定することにより、アレルゲンの抽出や濃縮等の前処理を行なわず且つ検出のための器具若しくは装置を使用せずに、環境中の生物由来アレルゲンを極めて簡便に測定できることを見出し、さらに該方法を実施するためのキットを開発し、本願発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本願発明は、環境中の生物由来アレルゲンの測定方法において、該アレルゲンが有するプロテアーゼの基質として、酵素反応の結果目視可能な色の変化をもたらす基質を用い、該基質を含む溶液と、粘着シートを用いて採取した被測定物とを接触させ、該基質溶液の色の変化を指標として該被測定物中のプロテアーゼ活性を測定することにより前記生物由来のアレルゲンを測定することを特徴とする測定方法を提供する。また、本願発明は、前記方法を実施するためのキットであって、アレルゲンの量に応じて色変化する、プロテアーゼの基質を含む溶液又は該溶液を含浸させた多孔性基材と、被測定物を捕集するためのテープを含む、簡易アレルゲン定量キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、抗アレルゲン抗体を用いることなく、環境中の生物由来アレルゲンを簡便に測定することが可能なアレルゲンの測定方法及びその方法を実施するための簡易アレルゲン測定キットが初めて提供された。本発明の方法は、抗アレルゲン抗体を用いないので安価に行なうことができる。また、本発明の方法及びキットは、アレルゲンの前処理を行なうことなく、市販の粘着テープ等の粘着シートで採取した被測定物をそのまま用いて実施可能であり、検出も特殊な器具又は装置を用いることなく色の変化を目視確認するだけでよいため、極めて簡便であり、熟練を要することなく行なうことができる。さらに、本発明のキットは、手軽に携帯できるため、各家庭や学校その他、アレルゲンを測定したいその場でアレルゲンの測定を簡便に行なうことができる。従って、本発明は、アトピーや花粉症のようなアレルギー疾患の発症予防に大いに貢献するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法の測定対象となるものは、環境中の生物由来アレルゲンである。ここで、「環境中」とは、大気中及び室内空気中並びに室内空気中へのアレルゲンの供給源となり得る、床、壁、窓、窓枠、敷物（カーペット、絨毯、たたみ、マット、ござ等）、寝具類（布団、毛布、枕、マットレス等）、衣類等の繊維製品、家具類（椅子、ソファー等）、粉塵、ハウスダスト等の内部及び外部を意味する。また、生物由来アレルゲンとは、花粉、ダニや昆虫等の虫体、糞、それらの死骸及び破片、カビ及びその胞子等の、生物自体及び生物が生産する物質であって、アレルギーの原因物質となるものである。
【００１２】
また、本発明の方法は、アレルゲンのプロテアーゼ活性を測定することによりアレルゲンを測定するものであるから、本発明の方法及び該方法を用いた簡易アレルゲン定量キットの測定対象となるものは、プロテアーゼ活性を有するアレルゲンである。好ましい例として、花粉、特にスギ花粉及びダニ（虫体、糞、死骸、破片）を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、カビ類等も対象になり得る。
【００１３】
本発明の方法では、上記した環境中の生物由来アレルゲンのプロテアーゼ活性を測定する。環境中の生物由来アレルゲンがプロテアーゼ活性を有すること自体は上記の通り公知であるが、下記参考例及び実施例において具体的に示されるように、プロテアーゼ活性とアレルゲン量の間に定量関係があり、プロテアーゼ活性を測定することによりアレルゲンを測定できることは知られていなかった。さらに、驚くべきことに、下記参考例及び実施例で具体的に記載するように、環境中の生物由来アレルゲンは、抽出や濃縮、精製等の前処理を何ら行なわなくてもそのままプロテアーゼ活性を測定可能なことが本願発明者らによって見出された。従って、本発明の好ましい態様では、環境中の生物由来アレルゲンを市販の粘着テープ等の粘着シートを用いて採取し、何らの前処理も行なわずにその粘着シートをそのまま測定に供するため、極めて簡便である。なお、「測定」には定量と検出の両者が包含される。
【００１４】
本発明の方法では、プロテアーゼ活性の測定は、プロテアーゼの基質として、酵素反応の結果、色の変化をもたらす基質を用いる。これによれば、測定に特殊な器具又は装置を用いる必要がなく、目視観察により容易に測定可能であり、極めて簡便である。このような基質の好ましい例は後述する。
【００１５】
なお、アレルゲンの種類により、プロテアーゼの基質特異性が異なるため、測定しようとするアレルゲンのプロテアーゼが反応する基質を選択して用いる。この選択は、単にルーチンな確認試験により行なうことができる。さらに、プロテアーゼ阻害剤も公知であり、特定のアレルゲンのプロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤を、測定に用いる基質と共存させることにより、当該特定のアレルゲンのプロテアーゼ活性を除外して、対象とするアレルゲンのプロテアーゼ活性を選択的に測定することもできる。プロテアーゼ阻害剤の例としては、p-メタクリ安息香酸、ジイソプロピルフルオロリン酸、シトルフェニルアラニルクロロメチルケトン、ズブチリシンインヒビター、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチン、エポキシコハク酸誘導体等を挙げることができる。このように、適切な基質を選択し、必要により、測定から除外したいアレルゲンのプロテアーゼに対する阻害剤を共存させることにより、測定されるアレルゲンの種類をかなり絞り込むことが可能になる。
【００１６】
さらに、本願発明者らは、プロテアーゼによる酵素反応により変色する色素を発明した。すなわち、本願発明者らは、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物にプロテアーゼが作用すると、上記アミド結合が切断され、変色することを見出した。ここで、「変色」とは、酵素反応の前後の両方において肉眼で色を見ることができ、かつ、その色が肉眼で見て変化することを意味する。変色は、励起光を必要とする蛍光よりも簡便に観察することができ、また、着色（無色のものに色がつく）に比べて微妙な変化でも判別しやすいので有利である。着色色素の好ましい例としては、クレジルバイオレット、サフラニンＯ及びメチレンバイオレット３RAX、ナイルブルーA、ダローレッド、アズレA、アズレC、ブリリアントクレジルブルー、ローダミン１２３、チオニンの様に共役系にアミノ基を有する色素を挙げることができ、特に好ましくは、下記化学構造を有するクレジルバイオレット、サフラニンＯ及びメチレンバイオレット3RAXを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１７】
【化１】
2006345801.tif 000002
【００１８】
クレジルバイオレットのように、着色色素が複数のアミノ基を有している場合には、そのうちの少なくとも１個がアミド化されていればよい。また、アミド化に供するアミノ酸は、アミノ酸分子１個でもよいし、オリゴペプチド（好ましくはアミノ酸数２〜１０程度）でもよい。アミノ酸又はオリゴペプチドの種類は上記と同様、プロテアーゼの種類に応じて適宜選択される。例えば、ダニ抗原であるDermatophagoides farinae抽出物またはDermatophagoides pteronyssinus抽出物Pの測定には、ロイシン、メチオニン又はリジン分子１個をアミド結合したものが好ましく、特に、クレジルバイオレットの１個又は２個のアミノ基をロイシンとアミド結合したものが好ましい。なお、アミノ酸１分子がアミド結合したものを切断する活性は、エンドペプチダーゼ活性であるが、ダニ抗原等のアレルゲンがエンドペプチダーゼ活性を有することは本願発明者によって初めて見出されたことである。また、着色色素としてメチレンバイオレット3RAXを用い、そのアミノ基にBoc-Val-Leu-Lys（リジン側が着色色素に結合、Bocはt-ブチロキシカルボニル）を結合したものも特にダニ抗原の測定に好ましく用いることができる。
【００１９】
着色色素とアミノ酸のアミド結合は、例えば、着色色素分子とアミノ基をBocで保護したアミノ酸を、カルボニルジイミダゾールを縮合剤として用いて、室温で１日塩化メチレン又はDMF中で反応させ、アミド結合を形成させた後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することにより達成することができ、詳細な方法は下記参考例及び実施例に記載されている。オリゴペプチドも同様な方法によりアミド結合することができる。
【００２０】
上記した色の変化をもたらす基質は、溶液の状態で好ましく用いることができる。溶媒としては、水及び水系緩衝液を好ましく用いることができる。溶液中の基質濃度は、用いる基質の種類や、予測されるアレルゲンの量の範囲等に応じて適宜設定されるが、通常、1μＭ〜50ｍＭ程度、好ましくは5μＭ〜20μＭ程度である。ただし、これに限定されるものではない。
【００２１】
測定は、床、壁、窓、窓枠、敷物（カーペット、絨毯、たたみ、マット、ござ等）、寝具類（布団、毛布、枕、マットレス等）、衣類等の繊維製品、家具類（椅子、ソファー等）等に粘着シートを接触させ、その粘着シートを基質溶液を接触させ、基質溶液の蛍光や吸光度の変化を確認することにより、好ましくは、基質溶液の色の変化を肉眼で確認することにより行なうことができる。粘着シートと基質溶液との接触は、容器に収容した基質溶液に粘着シートを浸漬してもよいし、基質溶液を含浸させた多孔性基材に粘着シートを接触させてもよい。後者の場合、多孔性基材としては、スポンジ状のポリマーや、寒天ゲル、ゼラチンゲル、ポリアクリルアミドゲル等のゲルを利用することができる。
【００２２】
また、粘着シートは、市販の粘着テープ（ニチバン製セロハンテープ（登録商標））等を好ましく用いることができる。また、粘着シートとしては、採取した細塵の溶出を促進するために、粘着剤として水溶性の高いものを用いた粘着シートを好ましく用いることができる。このような水溶性の粘着剤としては、アクリル系ポリマーをベースポリマーとするものなどが用いられ、その例としては、イタコン酸、マレイン酸、アクリル酸、メタクリル酸もしくはこれらの誘導体等のカルボン酸、又はこのカルボン酸塩やエステルからなるポリマー、ポリアクリルアミド等のアクリル系ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、細塵のみを効率的に捕集しやすくするために、粘着面に凹凸加工を設けたものを用いてもよい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を参考例及び実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００２４】
参考例１
ハウスダスト中のダニ抗原の目視及び吸光度による定量
(1)  材料
ハウスダスト（掃除機回収粉塵）
プロテアーゼ基質（Bz-DL-Arg-pNA.HCl）（Bz:ベンゾイル、pNA:パラニトロアニリド、株式会社ペプチド研究所製）
【００２５】
(2)  方法及び結果
掃除機回収粉塵は10mg/mlにリン酸緩衝液に懸濁し孔径１μｍのろ紙で濾過を行なったろ液を用いた。ろ液は３倍ずつ６段階に希釈を行なった。180μＬに対し10mMにDMSOで溶解した基質20μＬと混合し、37℃で一晩培養した。発色したプレートを下方からスキャナーにて取込んだところ、試料濃度が高いウェルにおいて目視にて黄色い発色が観察された。また、プレートリーダーによる405 nmにおける吸光度測定を行なった。結果を図１に示す。この曲線は掃除機回収ゴミ量をxとし、吸光度をyとすると以下の様に近似することができる。
y=((A-D)/(1+(x/C)^B))+D
A=0.061, B=1.398, C=5.059, D=0.575
この曲線から、本実施例の方法により、少なくとも、ハウスダスト濃度が約1mg/mlないし10 mg/mlの範囲でハウスダスト中のダニ抗原の定量が可能であることがわかる。
参考例２
(1)   酵素切断により変色する着色化合物の合成
酵素切断により色変わりを起こす基質を合成した。クレジルバイオレット、サフラニンO、メチレンバイオレット3RAXのアミノ基に、以下の方法により、ロイシン、またはメチオニンをアミド結合により結合させた。すなわち、色素分子（終濃度０．１M）とアミノ基をBocで保護したアミノ酸（終濃度０．２M）を、カルボニルジイミダゾール（終濃度０．１M）を縮合剤として用いて、室温で１日塩化メチレン又はDMF中で反応させ、アミド結合を形成させた。反応後トリフルオロ酢酸（５０％）/塩化メチレン（５０％）を用いて脱保護した。
【００２６】
クレジルバイオレットはアミノ基を２つ有するところ、上記合成より２つのアミノ基のうち両方がアミノ酸とのアミド結合に寄与しているもの（黄色、最大吸収波長：440 nm）またはそのうちの片方のみがアミド結合に寄与しているもの（オレンジ色、490 nm）が単離された。吸収波長はそれぞれプレートリーダー（SPECTRA Max）を用いて測定した。
【００２７】
さらに、これらのロイシンとクレジルバイオレットのアミド結合化合物にアミノペプチダーゼMを加え、アミド結合を切断する実験を行なった。すなわちN末端にアミド結合により結合しているアミノ酸を切断する酵素である、アミノペプチダーゼMを適宜PBSで希釈したものを50マイクロリットルと約10 mMにエタノールに溶解した基質を5マイクロリットル加え、３０分放置し、96穴プレートでこれの吸収スペクトルを測定した。その結果一方のアミノ基のみがアミド結合に寄与していた基質は酵素消化により、オレンジ（最大吸収波長：490 nm）から紫（最大吸収波長：590 nm）に吸収スペクトルが変化し、両方のアミノ基がアミド結合に寄与していた化合物は、黄（最大吸収波長：450 nm）から緑、青を経て、紫（最大吸収波長：590 nm）を呈することが示された。質量分析の結果このうち青色を示す物質はクレジルバイオレットにロイシンがひとつ結合したものであることが確認された。また酵素消化により最終的に呈する紫色の吸光スペクトルはクレジルバイオレットそのものの吸光スペクトルと完全に一致し、薄相クロマトグラフィーの結果からも、クレジルバイオレットそのものであることが確認された。クレジルバイオレットにロイシンがひとつ結合した場合に青またはオレンジの２種類の色調を示すのはクレジルバイオレットの分子構造が対称構造ではなく、いずれのアミノ基が関与するかで吸収スペクトルが異なるためである。それぞれの吸光スペクトルを図２に示す。アミノ酸として、ロイシン以外にメチオニン、又はリジンを用いても同様の色調変化がおこることを確認した。
【００２８】
メチレンバイオレット3RAXは、アミノ基を１個有しこれがアミノ酸とのアミド結合に寄与している場合は薄い紫色（最大吸収波長：550 nm及び590 nm）を呈し、これをアミノペプチダーゼMで消化すると、鮮やかな桃色（最大吸収波長：550 nm）を呈した。消化後の吸光スペクトルはメチレンバイオレット3RAXの吸光スペクトルと完全に一致する。メチレンバイオレット3RAXとロイシンのアミド結合体がアミノペプチダーゼMによりスペクトル変化する様子を図３に示す。なお、図３及び後述する図４において、「Apase」はアミノペプチダーゼＭを意味する。
【００２９】
サフラニン-Oとロイシンのアミド結合体はアミノ基を２個有し、これらとロイシンの結合体は赤色を示した。アミノペプチダーゼMで消化することによりオレンジ色の色調を呈した。消化後の吸光スペクトルはサフラニン-Oの吸光スペクトルと完全に一致する。サフラニンＯとロイシンのアミド結合体がアミノペプチダーゼMによりスペクトル変化する様子を図４に示す。
【００３０】
(2)  合成した着色化合物によるダニ抗原の定量
実際にクレジルバイオレットとロイシンのアミド結合物(CV-Leu)がハウスダスト中のダニ抗原量に応じて色変化することを確認した。すなわち、表１に示すa-gの試料について、室内アレルゲン測定用の市販のELISAキットを用い、添付のプロトコールにしたがって、Fダニ抗原量を定量した（表１）。これらのa-gの試料に上述のCV-Leuを加え、一晩おいたところ、a, bのサンプルについて、紫色の呈色が観察され、ダニ抗原の量が多いことが示された。この結果はELISAの結果と相互している。よって、CV-Leuを基質として用い、その変色によりダニ抗原を測定できることが明らかになった。
【００３１】
【表１】
2006345801.tif 000003
【００３２】
実施例１
キットの試作
(1)  着色化合物の合成
ペプチド研究所にて以下の通りに作製した。まずメチレンバイオレット3RAXにBoc-Lys(Z)-OHを活性エステル法により縮合し、Boc-Lys(Z)-3RAXとした。次にTFAにより脱Boc後、Boc-Leu-OHをカルボジイミド・添加剤法により縮合しBoc-Leu-Lys(Z)-3RAXを得た。さらにTFAにより脱Boc後、Boc-Val-OHをカルボジイミド・添加剤法により縮合しBoc-Val-Leu-Lys(Z)-3RAXを得た。最後に、接触還元によりZ基を除去し、逆相HPLCで精製を行ない、Boc-Val-Leu-Lys-3RAXを得た。
【００３３】
(2)  方法及び結果
ハウスダストは１〜６番までの家庭から掃除機で採取したもののうち、髪の毛などを除いた細塵部分を用いた。これを1.5 cm x 1.5 cmの粘着シート（ニチバン製セロハンテープ）を用いて採取した。また、ネガティブコントロールとして、ハウスダストを採取しないシートも設けた（Blk）。各試料に含まれるダニ抗原の量はIndoorのELISAにて測定したDer1f, Der2f, Derpの総量として以下に示す。
【００３４】
【表２】
2006345801.tif 000004
【００３５】
基質として上記のBoc-Val-Leu-Lys-3RAXを用いた。基質は10μMとなるように、1%CHAPS（商品名、株式会社同仁化学研究所製両性界面活性剤）を加えたPBSに溶解し、これを透明のプラスチックケースに2ml加え、ハウスダストを採取した粘着シートを中にいれ、５分間室温にて放置し、色変化を観察した。その結果、２については、濃いピンク色に、１については、中程度のピンク色に、３、５、６については若干ピンクがかった紫色を呈した。ブランクおよび４の試料については、基質の紫色のまま、変化は観察されなかった。
【００３６】
参考例３
着色化合物Boc-Val-Leu-Lys-3RAXの吸光スペクトルの変化
実施例１のハウスダストを5 mg/ml（1% CHAPS PBS）として、その上澄み50μlを採取し、上記基質の100μM溶液と混合した。図５に混合５分間後の吸光スペクトルを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の方法及びキットは、ダニや花粉等の環境中のアレルゲンを簡便に測定することを可能にするものであり、各種アレルギーの予防等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の参考例において測定した、掃除機回収粉塵濃度と吸光度との関係を示す図である。
【図２】クレジルバイオレットとロイシンのアミド結合体にアミドペプチダーゼMを作用させた場合の、酵素反応の前後及び中途における、出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図３】メチレンバイオレットとロイシンのアミド結合体にアミノペプチダーゼMを作用させた場合の、酵素反応の前後における、出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図４】サフラニン-Oとロイシンのアミド結合体にアミノペプチダーゼMを作用させた場合の、酵素反応の前後における出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図５】本発明の実施例において作製した着色化合物Boc-Val-Leu-Lys-3RAXにハウスダスト希釈液を作用させた場合の、反応混合物の吸光スペクトルである。
【図１】
2006345801.tif 000005
【図２】
2006345801.tif 000006
【図３】
2006345801.tif 000007
【図４】
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【図５】
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