(57)【要約】    【課題】本発明は、腎臓に発現し、腎臓の薬物排泄機能に関与する有機アニオントランスポーターを提供するものである。    【解決手段】  腎臓に特異的に発現し、腎臓からのアニオン性薬物の再吸収と排泄の役割に関与する新規な有機アニオントランスポーターを単離し、その動物細胞安定発現細胞株を構築したことにより、この細胞株を使えばこのトランスポーターを介した薬物の排泄経路をインビトロ（in-vitro）に検討でき、医薬品適性使用へ応用できるようにするものである。  また、ラットｏａｔｐ−Ｍ１を特異的に発現させたラットを用い、このトランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路などをインビボ（in-vivo）に検討できるようにするものである。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、甲状腺ホルモン及び／又はジゴキシンの輸送能を有する蛋白質を安定に発現する組み換え動物細胞株。
【請求項２】
動物細胞株がＭＤＣＫ細胞株である、請求項１に記載の組み換え動物細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞株に被検物質を接触させる工程及び被検物質の当該細胞への取り込みを測定する工程を含む、配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、甲状腺ホルモン及び／又はジゴキシンの輸送能を有する蛋白質によって輸送される物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
被検物質が標識化されている請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の細胞株に甲状腺ホルモン及び／又はジゴキシンと被検物質を接触させる工程、及び被検物質の当該細胞への取り込みを測定する工程を含む、配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号１若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、甲状腺ホルモン及び／又はジゴキシンの輸送能を有する蛋白質の甲状腺ホルモン及び／又はジゴキシンの輸送能を調節する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーター、より詳細には、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する、腎臓に発現し、腎臓の薬物の排泄と再吸収機能に関与する有機アニオントランスポーター、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を安定に発現する動物細胞株、それを用いた被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法、及びそれを用いた被検物質の腎臓における当該有機アニオントランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を検定する方法、特にインビトロで検定する方法、並びに当該遺伝子の１０〜１５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、その利用方法に関する。また、本発明は、当該有機アニオントランスポーターに対する抗体、及びその遺伝子を含有してなる医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は脂質二重層膜であり、一般に疎水性物質は比較的自由に通過することができるが、親水性物質は通過することができない構造になっている。親水性物質などの各種物質を細胞内外に移動させる機構としてチャネルとトランスポーターが細胞膜に存在している。イオンチャネルや水チャネルのようなチャネルは、その開閉によりイオンや水を細胞内外に流通させる。トランスポーターは細胞外から物質を細胞内に取り込むキャリアや、細胞内に流入した疎水性物質などを細胞外に排出するためのポンプなどがある。
【０００３】
腎臓は薬物排泄の主要臓器で、血液中の高濃度の薬物にさらされるため薬剤性害を起こしやすく、このため薬物の腎移行性や腎毒性発現の機構が生理学的に研究されてきているが、薬物の腎臓からの排泄と再吸収経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用をインビトロ（in-vitro）に検定する方法は見出されていなかった。
腎臓における薬物の取り込みは、トランスポーターによるものがあると考えられてきたが、未だ十分には解明されていなかった。腎臓におけるトランスポーターを解明することにより腎臓での薬物の腎臓からの再吸収と排泄経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用を解明することができる。
本発明者らは、各種のトランスポーターをクローニングしてきており、これらの知見に基づいて腎臓のトランスポーター、特に有機アニオントランスポーターを探索してきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、腎臓に発現している有機アニオントランスポーターを提供することを目的としている。また、本発明は、当該トランスポーターを安定に発現する動物細胞株を提供することを目的にしている。さらに、本発明は、当該トランスポーターを用いて、薬物の腎臓からの排泄と再吸収経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用をインビトロ（in-vitro）で検定する方法、及び当該トランスポーターを介して腎臓から再吸収し得る薬物を検出、同定する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、肝臓に少量発現している肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−２）をクローニングしてきた（Takaaki, Abe, et al., Gastroenterology, (2001), 120, 1689-1699）。ＬＳＴ−２は肝臓特異的なトランスポーターであるが、意外にもＬＳＴ−２が腎臓に発現する有機アニオントランスポーターと相同性を有していることを見出し、このＬＳＴ−２に基づいて腎臓に発現する有機アニオントランスポーターを単離できることを見出し本発明を完成した。本発明者らは、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとに分子生物学的な一連の操作を経て、ヒトおよびラットの腎臓に主に発現している新規な有機アニオントランスポータ（ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１及びラットｏａｔｐ−Ｍ１）を単離した。
【０００６】
即ち、本発明は、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーター、より詳細には、配列表の配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーターに関する。
また、本発明は、前記した有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子、より詳細には、配列表の配列番号３又は４に記載された塩基配列、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子に関する。本発明は、前記した遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列を有する１０〜１５０塩基、好ましくは１５〜１００、より好ましくは１５〜５０、さらには１５〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドにも関する。また、本発明は、前記遺伝子の発現を検出又は同定する方法、より詳細には、前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記遺伝子の発現を検出又は同定する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が導入され、前記した本発明の有機アニオントランスポーターを安定に発現し得る動物細胞株、より詳細には遺伝子が導入されたＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞株に関する本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定することからなる当該細胞への取り込み量の多い物質をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞、より詳細には前記した本発明の有機アニオントランスポーターを安定に発現し得る動物細胞株に、被検物質を接触させて、腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の排泄と再吸収経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を検定する方法に関する。
また、本発明は、前記した本発明の有機アニオントランスポーターに対する抗体にも関する。さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有するキャリアー、及び製薬上許容される担体を含有してなる薬物の代謝を促進するための医薬組成物、及び、これを患者に投与してヒト腎臓に特異的に本発明の有機アニオントランスポーターを発現させて、当該有機アニオントランスポーターを介して薬物の排泄を促進させる方法にも関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、腎臓に特異的に発現し、腎臓からのアニオン性薬物の排泄の役割に関与する新規な有機アニオントランスポーターを単離し、その動物細胞安定発現細胞株を構築したことにより、この細胞株を使えばこのトランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路をインビトロ（in-vitro）に検討でき、医薬品適性使用へ応用できるようになる。
また、ラットｏａｔｐ−Ｍ１を特異的に発現させたラットを用い、このトランスポーターを介した薬物の排泄経路などをインビボ（in-vivo）に検討できるようになる。
【０００９】
本発明者らは、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとに分子生物学的な一連の操作を経て、ヒト及びラットから新規な有機アニオントランスポータ（ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１およびラットｏａｔｐ−Ｍ１）を単離した。
即ち、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとにＥＳＴデータベース検索を行い、ＢＦ９００２２５という部分配列（４１１ｂｐ）を得、この配列をもとに作製したプライマーを用いて各種臓器のＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、腎臓に存在していることが明らかとなった。そこで腎臓より得られたｃＤＮＡを用いて５’及び３’ＲＡＣＥ法を行った。これにより得られた塩基配列はシークエンスの結果、５’側の配列が欠けていることが予想されたので、５’ＲＡＣＥ産物である１８８１ｂｐ（コーディング領域の８ｂｐから１８８０ｂｐにあたる配列）をプロープとしてヒト肝臓ライブラリーを７０万個スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは２５％ホルムアミド，４×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５×デンハード溶液を用いて４２℃、一晩行った。洗浄は２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間行った。その結果、３０個程のクローンが得られ、そのうち１３個のシークエンスを行ったところ、７２４アミノ酸からなる新規トランスポーターの単離に成功した。これをヒトＯＡＴＰ−Ｍ１と命名した。また、本発明のＯＡＴＰ−Ｍ１は、他のＯＡＴＰ(Organic anion trasporting polypeptide）ファミリーのトランスポーターと同様に１２回膜貫通型で、細胞内に５個のリン酸化部位、細胞外に４個の糖鎖結合を持つことが想定された。
相同性はヒトＯＡＴＰ−Ｅと最も高く４０．４％であった。さらに、上記フラグメントを用い、５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間洗浄し、ノザンプロット解析を行った。その結果図１に示すように主として腎臓に、わずかに気管に発現し、胎児では腎臓の他、肝臓、肺に発現することが明らかとなった。
【００１０】
また、上記ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングした同じフラグメントを用いて、ラットの腎臓ライブラリーを５０万個スクリーニングし、１８個ほどのクローンを得、ラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離に成功した。ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１との相同性は８５％であった。また、ラットｏａｔｐ−Ｍ１全長を用いて上記ヒトノザンと同様にハイブリダイズを行い、ノザンブロット解析したところ、図２に示すように、主として腎臓に発現していることが明らかとなった。
【００１１】
次に機能解析を行うため、ＯＡＴＰ−Ｍ１を強制発現させたＭＤＣＫ細胞を樹立するため、５’ＵＴＲを５ｂｐ，３’ＵＴＲを１３ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ２１７５ｂｐを含む２１９３ｂｐの配列を動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に入れた。これをＦｕＧＥＮＥ６を用いてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションした。遺伝子が入っている細胞のみがＧ４１８に耐性となるためＧ４１８を培地中に７５０μｇ／ｍＬの濃度で１０日間培養・選択を行い２４個のＧ４１８耐性株を得た。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出してノザンブロットを行った結果、３個のクローン（Ｃ５，１４，２３）がＭ１を発現していることがわかった。これらのクローンを用いて基質のスクリーニングを行った結果、図３内因性化合物として甲状腺ホルモンであるＴ３を最も運ぶのは、Ｃ１４であった（コントロールであるＧＦＰ発現細胞では５．５２±０．２０ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であるのに対し、１５．２１±０．５１ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。）。
その取り込みの作用機作を明らかとするために、ナトリウム非依存性試験を行った。即ち、まず、Ｎａ依存性をみるためにＮａＣｌをコリンＣｌに、ＮａＨＣＯ３をコリンｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅに置換したクレブス−ヘンセレイト緩衝液（142mM NaCl,23.8mM Na２O３,4.83mM KCl, 0.96mM KH２PO４,1.20mM MgSO４,12.5mM HEPPS,5.0mM glucose and 1.53mM CaCl２ adjusted to pH7.3）を用いて取り込み実験を行った。図４に示すように、取り込みはナトリウム非依存的であることを確認した。
また、上記クレブス−ヘンセレイト緩衝液を用いて３０分間前培養した後、ＲＩ化合物の入った緩衝液を加え３０分間取り込みをさせた。取り込みの停止は緩衝液の吸引後、Ｃｏｌｄ Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂａｆｆｅｒ＋１％ＢＳＡを加えることで行った。その後Ｃｏｌｄ Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂａｆｆｅｒで３回以上洗浄し、２５０μｌの１Ｎ−ＮａＯＨで一晩細胞を溶解後、２５０μｌの水を加えてそのうちの４００μｌをカウントした。残りは蛋白補正用として使用した。補正はＢｉｏ−Ｒａｄのｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（modified lowly method）を用いてＢＳＡを対照として行った。その結果、図５に示すように外因性化合物としてはジゴキシンにおいて取り込みが見られた。
【００１２】
以上から本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｍ１は主として腎臓に発現し、甲状腺ホルモンをはじめどする種々の化合物の輸送に関与する有機アニオントランスポーターであることが明らかとなった。
腎臓は薬物排池の主要臓器であり豊富な血流を受けることから必然的に高濃度の薬物に曝され、薬剤性障害の発現しやすい状況にある。これまで、抗癌剤シスプラチン、アミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンや、グリコベプチド系抗生物質バンコマイシンなど、腎障害を誘発する薬物の腎移行特性や腎毒性発現のメカニズムについて生理学的に研究されてきた。今回、本発明者らは腎臓に特異的に発現しており腎臓からのアニオン性薬物の再吸収と排泄に重要な役割を担う多選択性有機アニオントランスポーターを単離しその動物細胞安定発現細胞株を構築した。そして、この系を用いることでトランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路の同定を動物実験をする前に予測することが可能となり、腎毒性の検討、腎臓における薬物相互作用のインビトロでの評価・予測系の開発を可能とするとともに医薬品適正使用に向けた応用が可能となる系と考えられた。
【００１３】
本発明は、腎臓に特異的に発現している新規な有機アニオントランスポーターを提供するものである。本発明の有機アニオントランスポーターは、甲状腺ホルモン（Ｔ３）やジゴキシン、メトトレキセートなどの薬物の取り込みの関与しており、腎臓における薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用に深く関与しているものであると考えられる。
本発明の好ましい有機アニオントランスポーターとしては、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、その一部が他のアミノ酸で置換され、若しくは他のアミノ酸が付加されてた、又はこれらの欠失、置換、付加が組み合わされてなるアミノ酸配列を有するものであって、腎臓に発現し、腎臓の薬物排泄機能に関与する有機アニオントランスポーターが挙げられる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト由来の本発明の有機アニオントランスポーターであり、配列番号２のアミノ酸配列は、ラット由来の本発明の有機アニオントランスポーターである。
【００１４】
本発明の遺伝子は、前記した本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子であり、本発明の遺伝子はｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はゲノムであってもよい。これらの遺伝子は本発明の有機アニオントランスポーターのアミノ酸配列をコードする翻訳領域のみから成っていてもよいし、これにさらにプロモーター領域やエンハンサー領域などの他の必要な領域を有するものであってもよい。本発明の遺伝子の好ましい例としては、配列表の配列番号３又は４に記載された塩基配列、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものが挙げられるがこれに限定されるものではない。なお、配列表の配列番号３の塩基配列は、ヒト由来の本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子のものであり、配列番号４の塩基配列は、ラット由来の本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子のものである。
また、本発明が開示した塩基配列を利用してゲノム中からＰＣＲ法などにより本発明の遺伝子をクローニングすることもできる。
【００１５】
本発明の有機アニオントランスポーターは、動物の腎臓細胞などの本発明の遺伝子が発現している細胞から得ることもできるが、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んで、通常の遺伝子工学の手法により形質転換した細胞、たとえば大腸菌やＣＨＯ細胞などで発現させて、これを精製し、単離することにより製造することもできる。
また、本発明の有機アニオントランスポーター、又はその一部のアミノ酸配列を抗原として用いて、マウスやウサギなどの動物に感作させた後、これを定法に従って細胞融合法などにより抗体を製造することができる。抗体としてはポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体としてもよい。また、必要により、キメラ抗体やヒト型抗体に加工することもできる。
【００１６】
本発明は、前記した本発明の遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列を有する１０〜１５０塩基からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドの長さとしては、特に制限はなく、前記した本発明の遺伝子の検出や同定や定量に利用できるのに充分な長さを有するものであればよい。好ましい長さとしては、１０〜１５０塩基、１０〜１００塩基、１０〜３０塩基、１５〜３０塩基程度が挙げられるがこれに限定されるものではない。本発明のオリゴヌクレオチドは、通常の放射性元素や蛍光物質や化学発光物質などを用いて標識化を行ってプローブとして利用することもできるし、てきとうな長さのものを使用してＰＣＲなどのプライマーとして利用することができる。
【００１７】
本発明は、前記した本発明の遺伝子の発現を検出又は同定する方法を提供するものである。本発明の遺伝子を検出、同定又は定量する方法としては、前記した本発明のオリゴヌクレオチドによるプローブを使用してもよいし、プライマーとしてＰＣＲ法などにより増幅して行うこともできる。またアンチセンス鎖を用いてＲＮＡのみを検出、同定することもできる。また、前記した本発明の有機アニオントランスポーターに対する抗体を用いて、蛋白質を検出、同定することもできる。
【００１８】
本発明は、本発明の有機アニオントランスポーターをコードするヒトの遺伝子で形質転換されたヒト以外の細胞を提供するものである。形質転換される細胞（宿主細胞）としては、大腸菌や酵母などの微生物細胞や、ＣＨＯやサルなどの動物細胞を使用することができる。また、永久細胞株（permanent cell line）としてＭＤＣＫを使用することもできる。
この場合のプロモーターとしては、ヒトゲノムからのプロモーターをそのまま使用することもできるが、他のプロモーターを使用することもできる。本発明の遺伝子は胎児期や癌化により発現すると考えられることから、本発明の他が常に発現している細胞を得ようとする場合には、ゲノムからのものではなく他の発現用のプロモーターを使用するほうが好ましい。
本発明は、このようにして形質転換され、安定に本発明の有機アニオントランスポーターを発現する動物細胞株を提供するものである。このような動物細胞としては、永久細胞株（permanent cell line）としてＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）を挙げることができる。
本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法を提供する。この方法における本発明の遺伝子が発現している細胞としてはヒト癌細胞などの動物の癌細胞を使用することができるが、前記した形質転換細胞を使用することもできる。この方法としては、取り込み量を測定できる方法であれば特に制限はないが、被検物質を放射性元素などで標識化し、標識化された被検物質を本発明の遺伝子が発現している細胞に接触させて、細胞内の被検物質の量を定量して行うことができる。
【００１９】
本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定することからなる当該細胞への取り込み量の多い物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は前記した検出、同定する方法と同様な手段で行うことができる。また、この場合の被検物質としては抗癌剤の候補物質であるのが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明の有機アニオントランスポーターは、腎臓細胞に特異的に発現しているものであることを特徴にしている。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターによってのみ特異的に取り込まれる物質をスクリーニングすることができれば、当該物質の腎臓での代謝過程を検討することができる。
また、前記した本発明の安定発現動物細胞株を用いることにより、被検物質の腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を、インビトロで検定することができ、薬物などの物質の腎臓での挙動を解明することが可能となる。本発明の有機アニオントランスポーターは、ヒト以外の動物にも発現していることから、ヒト以外の動物に当該動物の遺伝子を挿入して、本発明の有機アニオントランスポーターを強制的に発現させて、生体における被検物質の腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を、インビボで検定することも可能となる。
したがって、本発明は、このような実験動物を提供するものでもある。
【００２０】
また、本発明の有機アニオントランスポーターの遺伝子をヒトに導入して、ヒト腎臓に特異的に本発明の有機アニオントランスポーターを発現させて、当該有機アニオントランスポーターを介して薬物の再吸収や排泄を促進させることが可能となる。したがって、本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有するキャリアー、及び製薬上許容される担体を含有してなる薬物の代謝を促進するための医薬組成物を提供するものである。当該キャリアーとしては、遺伝子治療に通常使用されるウイルスやベクターなどが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、遺伝子を導入することにより、腎臓からの排泄を促進するものであり、過剰に投与された薬物の排泄のみならず、毒物の排泄を促進する解毒剤的な使用をすることもできる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１の単離）
ＬＳＴ−２の塩基配列をもとにＥＳＴデータベース検索を行い、ＢＦ９００２２５という部分配列（４１１ｂｐ）を得、この配列をもとに作製したプライマーを用いて各種臓器のＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、腎臓に存在していることが明らかとなったので腎臓より得られたｃＤＮＡを用いて５’及び３’ＲＡＣＥ法を行った。これにより得られた塩基配列はシークエンスの結果、５’側の配列が欠けていることが予想されたので、５’ＲＡＣＥ産物である１８８１ｂｐ（コーディング領域の８ｂｐから１８８０ｂｐにあたる配列）をプロープとしてヒト腎臓ライブラリーを７０万個スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは２５％ホルムアミド，４×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５×デンハルト溶液を用いて４２℃で一晩行った。洗浄は２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間行った。その結果、３０個程のクローンが得られ、そのうち１３個のシークエンスを行ったところ、７２４アミノ酸からなる新規トランスポーターの単離に成功した。
【００２３】
実施例２  （ラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離）
上記ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングした同じフラグメントを用いて、ラットの腎臓ライブラリーを５０万個スクリーニングし、１８個ほどのクローンを得、またラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離に成功した。
【００２４】
実施例３  （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のノーザンブロット解析）
上記フラグメントを用い、５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃で６０分間洗浄し、ノザンプロット解析を行った。その結果、主として腎臓、胎児では腎臓の他、肝臓、肺に発現することが明らかとなった。
この結果を図１に図面に代わる写真で示す。図中のβーアクチンは，ブロットを確認するためのコントロールであり、左側の数字は分子量（ｋｂ）を示す。
【００２５】
実施例４  （ラットｏａｔｐ−Ｍ１のノーザンブロット解析）
ラットｏａｔｐ−Ｍ１の全長を用いて上記ヒトノザンと同様にハイブリダイズを行い、ノザンブロット解析したところ、主として腎臓に発現していることが明らかとなった。
この結果を図２に図面に代わる写真で示す。図中のβーアクチンは，ブロットを確認するためのコントロールであり、左側の数字は分子量（ｋｂ）を示す。
【００２６】
実施例５  （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１を安定に発現する細胞株の構築）
ＯＡＴＰ−Ｍ１を強制発現させたＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞を樹立するため、５’ＵＴＲを５ｂｐ，３’ＵＴＲを１３ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ２１７５ｂｐを含む２１９３ｂｐの配列を動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に入れた。これをＦｕＧＥＮＥ６を用いてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションした。遺伝子が入っている細胞のみがＧ４１８に耐性となるためＧ４１８を培地中に７５０μｇ／ｍＬの濃度で１０日間飼育および選択を行い２４個のＧ４１８耐性株を得た。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出してノザンブロットを行った結果、３個のクローン（Ｃ５，１４，２３）がＭ１を発現していることがわかった。また、これらのクローンで基質のスクリーニングを行い、Ｔ３を最も運ぶのはクローンＣ１４であった。
この結果を図３に示す。図３の横軸は濃度（μＭ）を示し、縦軸は甲状腺ホルモン（Ｔ３）の取り込み量（ｐmol/mgタンパク質）を示す。黒丸部印は各測定点における平均値を示す。
【００２７】
実施例６  （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のナトリウム非依存性試験）
取り込みの作用機作を明らかとするために、ナトリウム非依存性試験を行った。即ち、まず、Ｎａ依存性をみるためにＮａＣｌをコリンＣｌに、ＮａＨＣＯ３を炭酸コリンに置換したクレブス−ヘンセレイト緩衝液（142mM NaCl,23.8mM Na２O３,4.83mM KCl, 0.96mM KH２PO４,1.20mM MgSO４,12.5mM HEPPS,5.0mM glucose, 1.53mM CaCl２, pH7.3）を用いて取り込み実験を行った。その結果、取り込みはナトリウム非依存的であることを確認した。
この結果を図４に示す。図４のＫＨはクレブス−ヘンセレイト緩衝液の場合を示し、Ｎａ（−）はコリンＣｌの場合を示し、Ｃｌ（−）は炭酸コリンの場合を示す。縦軸は取り込み量（Ｆmol/mgタンパク質）を示す。
【００２８】
実施例７  （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１による薬物の取り込み試験）
クレブス−ヘンセレイト緩衝液を用いて３０分間前培養した後、ＲＩ化合物の入った緩衝液を加え３０分間取り込みをさせた。取り込みの停止は緩衝液の吸引後、冷コリン緩衝液＋１％ＢＳＡをことで行った。冷コリン緩衝液で３回以上洗浄し、２５０μｌの１Ｎ−ＮａＯＨで一晩細胞を溶解後、２５０μｌの水を加えそのうちの４００μｌでカウントした。残りは蛋白補正用として使用した。補正はバイオ−ラッドのプロテインアッセイキットを用いてＢＳＡを対照として行った。その結果、外因性化合物としてはジゴキシンにおいて取り込みが見られた。
ジゴキシンの取り込み結果を図５に示す。図５の横軸は濃度（μＭ）を示し、縦軸はジゴキシンの取り込み量（ｐmol/mgタンパク質）を示す。黒丸部印は各測定点における平均値を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のノーザンブロット解析結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明のラットｏａｔｐ−Ｍ１のノーザンブロット解析結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】図３は、本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｍ１による甲状腺ホルモン（Ｔ３）の取り込み試験結果を示すものである。
【図４】図４は、ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のナトリウム非依存性試験結果を示すものである。
【図５】図５は、ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１による薬物の取り込み試験結果を示すものである。
【図３】
2006345871.tif 000002
【図５】
2006345871.tif 000003
【図１】
2006345871.tif 000004
【図２】
2006345871.tif 000005
【図４】
2006345871.tif 000006
【配列表】
2006345871000001.app