(57)【要約】【課題】  高い光学純度のＬ−乳酸を、長期間にわたって連続的に、安定して容易に製造する方法を提供すること。【解決手段】  混合微生物集団が存在する原料を、５０〜６０℃及びｐＨ４．５以上の条件下で滞留時間を設定し、連続して培養することを特徴とする、高い光学純度を有するＬ−乳酸の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合微生物集団が存在する原料を、５０〜６０℃及びｐＨ４．５以上の条件下で滞留時間を設定し、連続して培養することを特徴とする、高い光学純度を有するＬ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
滞留時間に応じてＣＯＤ負荷を設定する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｌ−乳酸の光学純度が８０％以上である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
混合微生物集団が存在する原料が乳酸発酵する糖を含む原料である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
乳酸発酵する糖を含む原料が有機性廃棄物であり、滞留時間を２日間以上、ＣＯＤ負荷を５０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日以下に設定する、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
ｐＨ５．５以上及び７未満の条件下で培養する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｌ−乳酸の全糖に対する収率が７５％以上である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
培養開始時に高い光学純度のＬ−乳酸を生成している混合微生物集団を原料に添加して培養する、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−乳酸の製造方法に関する。さらに詳しくは、高い光学純度のＬ−乳酸を、長期間にわたって連続的に、安定して容易に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、例えば食品添加物や医薬品の他、近年話題の生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料など、その用途は多岐にわたり、需要量も急増している物質である。乳酸は分子内に不斉炭素を有し、その立体配置からＬ−乳酸及びＤ−乳酸の２種の光学異性体が存在するが、特に需要が見込まれるポリ乳酸を高品質で得ようとする場合、この２種の光学異性体のうちいずれか一方の乳酸のみを原料とすることが好ましい。したがって、いずれか一方の乳酸を選択的に製造する必要性は非常に高い。
【０００３】
乳酸の製造方法は、通常化学合成と発酵とに分類されるが、一方の光学異性体を選択的に製造することが容易であるという点から、発酵による製造方法が多用されている。
【０００４】
前記発酵により乳酸を製造する方法として、例えば、有機性廃棄物に、該廃棄物中の常在菌に対して有効な濃度比でＬ−乳酸を生産する乳酸菌を多量に添加する方法が提案されている（特許文献１参照）。かかる方法によれば、約９５％以上の高い光学純度を有するＬ−乳酸を生産することが可能である。なお、ここでの光学純度とは、以下の式：
光学純度（％）＝｛（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）｝×１００
（式中、ＬはＬ−乳酸の量、ＤはＤ−乳酸の量を示す）に基づいて算出されたものである。しかしながら、かかる方法では、Ｌ−乳酸を生産し得る特定の乳酸菌が多量に必要であり、しかもかかる特定の乳酸菌を、常在菌に対する濃度を調整して用いなければならず、また乳酸菌は栄養要求性が複雑で単純な基質では培養し難いことから、操作が複雑かつ煩雑であり、高い光学純度を有するＬ−乳酸を長期間にわたって、安定して容易に製造することが困難であるという問題がある。
【０００５】
また前記の他にも、糖質やその他の栄養成分を含有するバイオマス原料にＬ−乳酸生産菌を植菌した後、４５℃以上でｐＨの中和一定制御を行う方法も提案されている（特許文献２参照）。かかる方法によれば、Ｌ−乳酸の光学純度が例えば９６％の発酵液を得ることができる。しかしながら、かかる方法は、特定の乳酸菌を添加して回分培養を行うことを前提とした方法であり、しかも特定のＬ−乳酸生産菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）は、前記したように、栄養要求性が複雑で単純な基質では培養し難い。したがって、このような特定の乳酸菌を実質一定量用い、所定条件下で植菌して発酵させなければならないこの方法は、やはり操作が複雑かつ煩雑であり、高い光学純度を有するＬ−乳酸を長期間にわたって連続的に、安定して容易に製造することが困難であるという問題がある。
【０００６】
そこで、特定の乳酸生産菌を植菌せずに乳酸を選択的に製造する方法として、粉砕して冷凍保存した台所廃棄物を用い、間欠的に中和しながら例えば３７℃といった中温域で保温して乳酸を選択的に蓄積させる方法が見出されている（非特許文献１参照）。しかしながら、かかる方法では、確かに特定の乳酸生産菌を植菌してはいないが、実質回分培養が行われており、連続的な培養は行われていない。また、３７℃といった中温域にて培養が行われていることから、この温域を至適温度とする菌群が多く、有機酸の中でも乳酸を選択的に産出させることが困難であり、有機酸全量に対して例えば９０％を超える選択性で乳酸を蓄積させるには、ｐＨを７に調整して中和する間隔を６時間以上に設定するなどの特定の工程が必要で煩雑である。しかも蓄積された乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸とが混在しており、かかる方法では、実際のところ、例えば９０％以上といった高い選択性でＬ−乳酸を長期間にわたって連続的に安定して製造することは非常に困難である。
【特許文献１】特開２０００−２４５４９１号公報
【特許文献２】特開２００５−７３５４９号公報
【非特許文献１】「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｏｐｅｎ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｉｔｃｈｅｎ  Ｒｅｆｕｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｐＨ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」Ｋｅｎｊｉ  Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６（２）、１４０−１４５、２０００（「セレクティブ  プロライフレーション  オブ  ラクティック  アシッド  バクテリア  アンド  アキュムレーション  オブ  ラクティック  アシッド  デュアリング  オープン  ファーメンテーション  オブ  キッチン  リヒューズ  ウィズ  インターミッテント  ｐＨ  アジャストメント」ケンジ  サカイら、フード  サイエンス  アンド  テクノロジー  リサーチ、第６巻第２号、１４０〜１４５頁、２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前記背景技術に鑑みてなされたものであり、高い光学純度のＬ−乳酸を、長期間にわたって連続的に、安定して容易に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、混合微生物集団が存在する原料を、５０〜６０℃及びｐＨ４．５以上の条件下で滞留時間を設定し、連続して培養することを特徴とする、高い光学純度を有するＬ−乳酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法によれば、８０％以上といった高い光学純度のＬ−乳酸を、長期間にわたって連続的に、安定して極めて容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（第１の実施形態）
本実施形態に係るＬ−乳酸の製造方法では、特定菌種の植菌を行わず、かつ原料に対して滅菌処理を行うこともなく、混合微生物集団が存在する原料を、５０〜６０℃及びｐＨ４．５以上の条件下で滞留時間を設定し、連続して培養する。以下に、本実施形態に用いられる原料及び該原料の培養条件などについて詳細に説明する。
【００１１】
Ｌ−乳酸を製造するための培養の対象となる原料は、混合微生物集団が存在する原料である。すなわち本実施形態においては、ある特定の菌種（菌群）に限定されず、多種の微生物が存在する原料を制限なく用いることが可能である。
【００１２】
混合微生物集団が存在する原料としては、例えば食品工場廃棄物、飲食物製造場廃棄物、飲食店廃棄物、農産廃棄物などの有機性廃棄物；古米、カドミウム米、コーンスターチ、砂糖黍、廃糖蜜、キャッサバなどの農作物といった、例えば乳酸発酵する糖を含む原料があげられる。特に生ゴミなどの有機性廃棄物は、乳酸発酵に有利な糖の含有率が比較的高いにもかかわらず、実質堆肥以外の有効な再利用方法がないことから、産業上利用価値が高いポリ乳酸の原料となるＬ−乳酸を製造する際の原料として好ましい。
【００１３】
前記乳酸発酵する糖を含む原料を基質として用いる場合、乳酸発酵する糖を含む原料中の糖とは、必ずしも単糖、オリゴ糖といった発酵し易い程度にまで分解された糖でなくてもよく、本実施形態に係る製造方法によれば、発酵し易い程度にまで分解されていない糖を含む種々の原料を用い、高い光学純度を有するＬ−乳酸を製造することが可能である。
【００１４】
本実施形態では、前記のごとき原料を滅菌処理なしで用い、特定菌種の植菌を行わずに、所定の温度及びｐＨの条件下で滞留時間を設定し、連続して培養を行う。
【００１５】
原料を連続して培養する際の条件は、かかる混合微生物集団が存在する原料が発酵するのに適した範囲で設定しており、温度は５０〜６０℃、好ましくは５２〜５８℃、ｐＨは４．５以上、好ましくは４．８以上、７未満である。このように本実施形態に係る製造方法では温度及びｐＨの条件を一定の好適範囲内で組み合わせて培養を行うことから、乳酸の２種の光学異性体のうち、Ｌ−乳酸を、高い光学純度で長期間にわたって連続的に安定して製造することができる。またかかる条件下であれば、対象とする混合微生物集団が存在する原料の種類（構成成分）に応じて滞留時間を設定するだけでよく、乳酸を産出する特定菌種（乳酸菌）の植菌を行う必要がないので、例えば原料の滅菌や製造工程全体の密閉化が必要なく、簡素な装置で、原料中に含まれる培養に必須のビタミンなどの栄養素が失われることなしに、効率的に低コストにてＬ−乳酸を製造することができる。
【００１６】
しかもいわゆる乳酸菌は、自然発生的に増殖し得る菌群であり、一度増殖が始まれば他の菌を寄せ付けない性質を有するものの、このように自然発生的に増殖した乳酸菌は単一種ではないため、産出される乳酸が光学純度を保持することができないといった問題がある。しかしながら、本実施形態に係る製造方法では、かかる乳酸菌の植菌を必要とせず、対象とする混合微生物集団が存在する原料を５０〜６０℃及びｐＨ４．５以上の条件下で、かかる原料の種類に応じて滞留時間を設定し、連続して培養するだけで、Ｌ−乳酸を産出する菌群のみを効率的に集積させることができる。その結果、例えば８０％以上、さらには９０％以上といった高い光学純度を有するＬ−乳酸を長期間にわたって安定して製造することが可能である。
【００１７】
さらに特定菌種を植菌したことによる発酵が行われるのではないことから、菌群間の共存がもたらす相乗効果が発現され、前記したように、単糖、オリゴ糖といった発酵し易い程度にまで分解されていない糖を含む種々の原料であっても、高い光学純度を有するＬ−乳酸を製造することが可能であると考えられる。
【００１８】
なお、得られるＬ−乳酸の光学純度をより向上させ、このようなより高い光学純度を有するＬ−乳酸をさらに長期間にわたって安定して製造するには、適切な微生物生存条件を維持するために、設定した滞留時間に応じてＣＯＤ負荷を設定することが好ましい。
【００１９】
設定する滞留時間及びＣＯＤ負荷の範囲は、対象とする混合微生物集団が存在する原料の種類（構成成分）に応じて適切に変化させる。例えば混合微生物集団が存在する原料が乳酸発酵する糖を含む原料であり、特に有機性廃棄物である場合には、滞留時間は２日間以上、さらには３日間以上に設定することが好ましく、この際のＣＯＤ負荷は５０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日以下、さらには３５ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日以下に設定することが好ましい。
【００２０】
このように混合微生物集団が存在する原料を所定の温度及びｐＨの条件下で、その種類（構成成分）に応じた滞留時間、さらに好ましくはかかる滞留時間に応じたＣＯＤ負荷を設定し、連続して培養することにより、例えばその光学純度が８０％以上であるＬ−乳酸を長期間にわたって安定して得ることができる。さらに温度及びｐＨを前記のごとき好ましい範囲内、すなわち５２〜５８℃及びｐＨ４．８以上に調整することにより、例えばその光学純度が９０％以上と極めて高いＬ−乳酸を長期間にわたって安定して得ることができる。
【００２１】
さらに、原料中の糖から、得られる発酵液中の乳酸への転換率を上昇させて、すなわち乳酸の収率を向上させて、高い光学純度を有するＬ−乳酸の収率を向上させるには、原料を連続して培養する際の条件のうち、特にｐＨを５．５以上、７未満に調整することが好ましい。このように混合微生物集団が存在する原料を、５０〜６０℃及びｐＨ５．５以上、７未満の条件下で、原料の種類（構成成分）に応じた滞留時間で連続して培養することにより、例えば９０％以上といった高い光学純度を有するＬ−乳酸を、全糖に対して７５％以上といった高収率で長期間にわたって安定して得ることができる。温度、ｐＨ、滞留時間、ＣＯＤ負荷といった培養の条件を、対象とする原料の種類（構成成分）に最適に調整することにより、Ｌ−乳酸の光学純度をさらに高めるだけでなく、収率をさらに向上させることも可能である。
【００２２】
かくして培養を行い得られた発酵液中には、糖が転換した乳酸が含まれ、かかる乳酸には高い光学純度でＬ−乳酸が含まれている。なお本実施形態においては、かかる糖（全糖）の分析は後述するフェノール−硫酸法にて行い、発酵液中の乳酸の分析は後述する有機酸分析システムで、また乳酸中のＬ−乳酸の分析（光学異性体の定量）は高速液体クロマトグラフ（以下、ＨＰＬＣという）にて行う。
【００２３】
なお本実施形態において、混合微生物集団が存在する原料の培養には、例えば長期間にわたって酸発酵に供された汚泥を種汚泥として用いることもできるが、かかる種汚泥の性質によって目的とするＬ−乳酸の製造は何ら影響を受けることはなく、勿論、このような種汚泥なしで本発明の目的は達成され得る。
【００２４】
さらに、培養開始時に、例えばＬ−乳酸菌などを含む、高い光学純度のＬ−乳酸を生成している混合微生物集団を原料に添加することによって、Ｌ−乳酸の製造が立ち上がる馴致期間を短縮したり、反応系の安定性や反応効率をより向上させることも勿論可能である。
【００２５】
また原料を培養する際の温度調整やｐＨ調整の方法には特に限定がなく、例えば後述する実施例における方法などを採用することができる。さらに原料の培養に用いる装置は、所定の温度及びｐＨの条件下で滞留時間、好ましくはＣＯＤ負荷を設定することができる限り特に限定がなく、本実施形態においては特別に複雑な装置を必要としない。
【００２６】
次に本発明のＬ−乳酸の製造方法を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００２７】
（１）実施条件
（ａ）培養装置
図１の概略図に示す培養装置を用いた。図１において、１は容積１Ｌのガラス製の反応器、２は撹拌機、３は撹拌棒、４はサンプリング・排出口、給餌口、５はストップバルブ、６はガスパック、７はｐＨ制御器電極、８はｐＨ制御器計装線、９はｐＨ制御器、１０は送液ポンプ、１１は送液ポンプ動力線、１２はＮａＯＨサーバ、１３は逆止弁、１４は恒温水槽を示す。
【００２８】
前記培養装置において、液相部は完全混合型、気相部は密閉型であり、実験開始時にチッ素ガスに置換した。サンプリング・排出口、給餌口４からの原料の添加及び発酵液のサンプリング（含排出）は、ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ方式にて行った。また、ｐＨ制御器９にてｐＨを測定しながら、必要に応じてＮａＯＨサーバ１２から１０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を供給し、ｐＨを一定値に制御した。
【００２９】
なおガスパック６は、発酵液のサンプリングの際、減少した反応器１内の液容積をガスにて補うための設置であり、給餌時に液容積を回復させると共にガスパック６へガスが戻る。
【００３０】
またｐＨ制御器９は、設定ｐＨに対して外部動力出力が可能となっており、送液ポンプ１０はこのｐＨ制御器９からの動力出力により稼動する。このｐＨ制御器９と送液ポンプ１０との関係は、単純なＯＮ／ＯＦＦ制御であり、ｐＨ制御器９から直接動力出力するものを用いたが、勿論、ｐＨに伴って送液ポンプ１０を制御することが可能であればよく、本発明の製造方法はこのようなシステムの使用に限定されず、適宜変更が可能である。
【００３１】
（ｂ）原料及び給餌
以下の表１に示す成分を破砕して原料の人工生ゴミを調製し、これを蒸留水にて２倍に希釈して基質とした。かかる基質の全糖濃度は約６ｇ／Ｌ、溶解性糖濃度は約４ｇ／Ｌであった。
【００３２】
給餌間隔は平均２日に１回とし、１回の給餌量は後の表２に示すとおりである。また基質は滅菌処理を行わずに給餌した。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
（ｃ）種汚泥
実施例１及び比較例１のＲｕｎ１においては、約１年間酸発酵に供された汚泥を種汚泥として用いた。Ｒｕｎ２〜４では、その前のＲｕｎの汚泥をそのまま用いて続けて実施した。実施例２においては、かかる種汚泥を用いずに培養を行った。
【００３５】
（ｄ）乳酸分析
乳酸分析はＨＰＬＣ有機酸分析システム（（株）島津製作所製、ポストカラム（ｐＨ緩衝化電気伝導度検出法）、システムコントローラ（ＳＣＬ−１０ＡＶＰ）、送液ユニット（ＬＣ−１０ＡＤＶＰ×２）、脱気ユニット（ＤＧＵ−１４Ａ）、オートインジェクタ（ＳＩＬ−１０ＡＤＶＰ）、カラムオーブン（ＣＴＯ−１０ＡＣＶＰ）、電気伝導度検出器（ＣＤＤ−１０ＡＶＰ）、カラム（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ））にて定量した。また乳酸の光学異性体（Ｌ−乳酸）はＨＰＬＣ（（株）島津製作所製、システムコントローラ（ＳＣＬ−１０ＡＶＰ）、送液ユニット（ＬＣ−１０ＡＴＶＰ×２）、脱気ユニット（ＤＧＵ−１４Ａ）、カラムオーブン（ＣＴＯ−１０ＡＶＰ）、ＵＶ−ＶＩＳ検出器（ＳＰＤ−１０ＡＶＰ）、カラム（ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００））にて定量した。
【００３６】
（ｅ）全糖分析
全糖分析はフェノール−硫酸法にて行った。なお全糖濃度は、ヘキソースの吸光域である４９０ｎｍにてグルコースを検量線に取り、換算グルコース濃度にて求めた。かかるフェノール−硫酸法は、糖分析及び呈色過程が複雑で基本反応が不明であること、また濃度を示す吸光度のピーク位置に糖ごとに若干のズレが生じることから、求めた換算グルコース濃度と実全糖濃度との間には僅かな差異があると予想されるが、本実施形態においてはかかる換算グルコース濃度にて全糖−乳酸転換率（乳酸収率）を算出した。このような求めた換算グルコース濃度と実全糖濃度との間の僅かな差異が、後述するＲｕｎ３にて１００％の収率が算出された要因の１つであると考えられる。
【００３７】
（２）実施例及び比較例
実施例１（種汚泥を用いた培養）
（Ｒｕｎ１）
高温酸発酵槽より種汚泥を分種し、図１に示す培養装置にて以下の条件で基質に対して培養を開始し、所定期間の経過後に発酵液を得た。
条件：温度          ５５℃
ｐＨ          ５
滞留時間      ２０日
給餌量        １００ｍＬ／回
ＣＯＤ負荷    ５ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日
実施期間      開始〜９９日目（６０日目までの馴致期間を含む）
【００３８】
前記条件下での培養結果は以下のとおりである。
結果：基質中の平均全糖濃度                      約６４．８ｇ／Ｌ
発酵液中の平均乳酸濃度                    約２２．４ｇ／Ｌ
炭素換算での全糖−乳酸転換率（乳酸収率）  約３４．６％
発酵液中のＬ−乳酸光学純度                約９１．０％
（発酵液中の平均Ｌ−乳酸割合                約９５．５％）
【００３９】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度について、経日変化を図２（ａ）のグラフに示す。また発酵液中のＬ−乳酸の光学純度について、経日変化を図２（ｂ）のグラフに示す。
【００４０】
図２のグラフから明らかなように、発酵液中の乳酸濃度は、評価期間を通じてそれ程高くないものの、Ｌ−乳酸の光学純度は、培養開始時には１０％程度であったが、評価期間終了近くには約９０％にまで達した。またこのＬ−乳酸の光学純度は時間の経過とともに安定し、常に９０％以上が維持された。
【００４１】
（Ｒｕｎ２）
前記Ｒｕｎ１に引き続き、以下の条件で基質に対する培養を継続し、所定期間の経過後に発酵液を得た。
条件：温度          ５５℃
ｐＨ          ５
滞留時間      １０日
給餌量        ２００ｍＬ／回
ＣＯＤ負荷    １０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日
実施期間      １００〜１５９日目（１２９日目までの馴致期間を含む）
【００４２】
前記条件下での培養結果は以下のとおりである。
結果：基質中の平均全糖濃度                      約６４．８ｇ／Ｌ
発酵液中の平均乳酸濃度                    約１５．６ｇ／Ｌ
炭素換算での全糖−乳酸転換率（乳酸収率）  約２４．１％
発酵液中のＬ−乳酸光学純度                約９０．４％
（発酵液中の平均Ｌ−乳酸割合                約９５．２％）
【００４３】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度について、経日変化を図３（ａ）のグラフに示す。また発酵液中のＬ−乳酸の光学純度について、経日変化を図３（ｂ）のグラフに示す。
【００４４】
図３のグラフから明らかなように、発酵液中の乳酸濃度は、評価期間を通じてそれ程高くないものの、Ｌ−乳酸の光学純度は平均して約９０％が維持された。
【００４５】
（Ｒｕｎ３）
前記Ｒｕｎ２に引き続き、以下の条件で基質に対する培養を継続し、所定期間の経過後に発酵液を得た。なお前記Ｒｕｎ２とこのＲｕｎ３との間の１６０〜１６９日目は運転準備期間であり、引き続き１７０〜１９９日目を馴致期間とした。
条件：温度          ５５℃
ｐＨ          ６
滞留時間      １０日
給餌量        ２００ｍＬ／回
ＣＯＤ負荷    １０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日
実施期間      １７０〜２２２日目（１９９日目までの馴致期間を含む）
【００４６】
前記条件下での培養結果は以下のとおりである。
結果：基質中の平均全糖濃度                      約５１．６ｇ／Ｌ
発酵液中の平均乳酸濃度                    約５１．５ｇ／Ｌ
炭素換算での全糖−乳酸転換率（乳酸収率）  約１００％
発酵液中のＬ−乳酸光学純度                約９２．８％
（発酵液中の平均Ｌ−乳酸割合                約９６．４％）
【００４７】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度について、経日変化を図４（ａ）のグラフに示す。また発酵液中のＬ−乳酸の光学純度について、経日変化を図４（ｂ）のグラフに示す。
【００４８】
このＲｕｎ３では、前記したように、全糖−乳酸転換率（乳酸収率）が計算上１００％となったが、図４のグラフから明らかなように、発酵液中の乳酸濃度も平均して５０ｇ／Ｌを超えて高く、実施期間中高い割合で糖から乳酸へ転換したと考えられる。またＬ−乳酸の光学純度は安定して９０％を超える値が維持された。
【００４９】
（Ｒｕｎ４）
前記Ｒｕｎ３に引き続き、以下の条件で基質に対する培養を継続し、所定期間の経過後に発酵液を得た。
条件：温度          ５５℃
ｐＨ          ６
滞留時間      ５日
給餌量        ４００ｍＬ／回
ＣＯＤ負荷    ２０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日
実施期間      ２２３〜２８５日目（２３７日目までの馴致期間を含む）
【００５０】
前記条件下での培養結果は以下のとおりである。
結果：基質中の平均全糖濃度                      約４９．４ｇ／Ｌ
発酵液中の平均乳酸濃度                    約４０．８ｇ／Ｌ
炭素換算での全糖−乳酸転換率（乳酸収率）  約８２．４％
発酵液中のＬ−乳酸光学純度                約９３．５％
（発酵液中の平均Ｌ−乳酸割合                約９６．８％）
【００５１】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度について、経日変化を図５（ａ）のグラフに示す。また発酵液中のＬ−乳酸の光学純度について、経日変化を図５（ｂ）のグラフに示す。
【００５２】
図５のグラフから明らかなように、前記Ｒｕｎ３よりも僅かに低下したものの、発酵液中の乳酸濃度は平均して４０ｇ／Ｌを超えて高く、約８０％以上といった高い割合で糖から乳酸へ転換した。またＬ−乳酸の光学純度は安定して９０％を超える値が維持された。
【００５３】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度に関する経日変化、並びに発酵液中のＬ−乳酸の光学純度に関する経日変化について、前記Ｒｕｎ１〜４の結果をまとめて、それぞれ図６（ａ）及び図６（ｂ）に示す。またＲｕｎ１〜４の設定条件及び得られた結果を、以下の表２にまとめて示す。なお表２中の全糖に対するＬ−乳酸収率は乳酸収率と平均Ｌ−乳酸割合とから算出した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
図６及び表２から明らかなように、Ｌ−乳酸の光学純度は、各Ｒｕｎの馴致期間及びＲｕｎ２とＲｕｎ３との間の運転準備期間を除き、Ｒｕｎ１〜４を通じて９０％を超える高いものであった。このように、本発明の製造方法における所定の条件を満たした場合には、乳酸を産出し得る菌群が基質中に優先的に滞留して増殖し、また連続して培養することによってこのような所定の条件下では増殖が遅いその他の菌群が流出し、その結果、高い光学純度を有するＬ−乳酸が長期間にわたって安定して得られると考えられる。またＲｕｎ３〜４のように、さらにｐＨをより好適に設定すると、発酵液中の乳酸濃度が上昇し、Ｌ−乳酸収率も約８０％以上に向上することがわかる。
【００５６】
比較例１（中温培養）
Ｒｕｎ１〜４いずれにおいても培養温度を３７℃に変更し、Ｒｕｎ３の実施期間を１６０〜２２２日目（１９９日目までの馴致期間を含む）とした他は、実施例１と同様にして培養を行い、所定期間経過後に発酵液を得た。なお本比較例１では、培養中にガスの発生が度々観察された。
【００５７】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度に関する経日変化、並びに発酵液中の乳酸の光学純度に関する経日変化について、それぞれ図７（ａ）及び図７（ｂ）に示す。またＲｕｎ１〜４の実施条件及び得られた結果を、以下の表３にまとめて示す。なお表３中の全糖に対するＬ−乳酸収率は乳酸収率と平均Ｌ−乳酸割合とから算出した。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
図７及び表３から明らかなように、馴致期間を除く発酵液中の乳酸濃度は高くても２０ｇ／Ｌ程度にしか達せず、３０％程度しか糖から乳酸へ転換しなかった。これは、３７℃近辺の温度では至適菌群が数多く、乳酸を産出する菌群を優先的に滞留させて増殖させることかできず、乳酸が選択的に産出され得なかったためと考えられる。また乳酸の光学純度もＲｕｎ１〜４を通じて５％前後と低いものであった。したがって、培養温度が低く、本発明の製造方法の条件を満たさない場合には、乳酸の産出量そのものも少なく、しかもＬ−乳酸を高い選択性で得ることができないことがわかる。
【００６０】
実施例２（種汚泥を用いない培養）
種汚泥を用いずに、図１に示す培養装置にて以下の条件で基質に対して培養を開始し、所定期間の経過後に発酵液を得た。
条件：温度          ５５℃
ｐＨ          ６
滞留時間      １０日
給餌量        ２００ｍＬ／回
ＣＯＤ負荷    １０ｇＣＯＤ／Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ／日
実施期間      開始〜２７日目
【００６１】
前記条件下での培養結果は以下のとおりである。なお、基質中の平均全糖濃度については全期間の、それ以外については１滞留時間経過後の平均を示す。
結果：基質中の平均全糖濃度                      約５２．１ｇ／Ｌ
発酵液中の平均乳酸濃度                    約４０．９ｇ／Ｌ
炭素換算での全糖−乳酸転換率（乳酸収率）  約７８．５％
発酵液中のＬ−乳酸光学純度                約９４．１％
（発酵液中の平均Ｌ−乳酸割合                約９７．１％）
【００６２】
基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度について、経日変化を図８（ａ）のグラフに示す。また発酵液中のＬ−乳酸の光学純度について、経日変化を図８（ｂ）のグラフに示す。
【００６３】
図８のグラフから明らかなように、発酵液中の乳酸濃度は、開始当初はそれ程高くないものの、徐々に上昇して１１日目以降は３５ｇ／Ｌ以上に達した。またＬ−乳酸の光学純度は時間の経過とともに安定し、１１日目以降は９０％以上が維持された。したがって、本発明の製造方法における所定の条件を満たし、連続して培養した場合には、特定の菌群の植菌を行わなくても高い光学純度を有するＬ−乳酸が長期間にわたって安定して得られることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の製造方法によって高い光学純度で得られるＬ−乳酸は、食品、医薬品分野の他、生分解性プラスチックの原料としても有用である。また、その利用価値が低く、従来処分されるだけの廃棄物、特に食品廃棄物に代表される有機性廃棄物といったバイオマスの有効利用が可能であり、環境問題の解決にも繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の製造方法に用いられる培養装置の一例を示す概略図
【図２】実施例１のＲｕｎ１における結果を示すグラフで、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すグラフ、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図３】実施例１のＲｕｎ２における結果を示すグラフで、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すグラフ、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図４】実施例１のＲｕｎ３における結果を示すグラフで、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すグラフ、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図５】実施例１のＲｕｎ４における結果を示すグラフで、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すグラフ、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図６】実施例１のＲｕｎ１〜４における結果をまとめた図面で、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すプロット、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図７】比較例１のＲｕｎ１〜４における結果をまとめた図面で、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すプロット、（ｂ）は発酵液中の乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【図８】実施例２における結果を示すグラフで、（ａ）は基質中の全糖濃度及び発酵液中の乳酸濃度の経日変化を示すグラフ、（ｂ）は発酵液中のＬ−乳酸の光学純度の経日変化を示すグラフ
【符号の説明】
【００６６】
１  反応器
２  撹拌機
３  撹拌棒
４  サンプリング・排出口、給餌口
５  ストップバルブ
６  ガスパック
７  ｐＨ制御器電極
８  ｐＨ制御器計装線
９  ｐＨ制御器
１０  送液ポンプ
１１  送液ポンプ動力線
１２  ＮａＯＨサーバ
１３  逆止弁
１４  恒温水槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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