(57)【要約】【課題】  免疫不全の個体において効率のよい適応免疫反応を誘導することができる人工リンパ節を提供すること。【解決手段】  抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造方法であって、以下の工程：（ａ）抗原で非ヒト動物を免疫する工程、および（ｂ）免疫した非ヒト動物に、サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植する工程を包含する方法、ならびに、ストローマ細胞、サイトカイン、抗体産生細胞、および高分子生体材料を含む、抗原特異的な抗体および抗原特異的Ｔ細胞を産生する人工リンパ節。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造方法：
（ａ）抗原で非ヒト動物を免疫する工程；および
（ｂ）免疫した非ヒト動物に、サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植する工程。
【請求項２】
以下の工程をさらに包含する、請求項１記載の方法：
（ｃ）前記サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植した非ヒト動物を、前記工程（ａ）の抗原でさらに免疫する工程。
【請求項３】
前記高分子生体材料が、前記工程（ａ）の抗原でパルスした活性化樹状細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ストローマ細胞が、ＴＥＬ−２細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記高分子材料が、コラーゲンスポンジである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記サイトカインが、リンホトキシンおよび／またはケモカインである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ＩｇＧタイプの抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ストローマ細胞、サイトカイン、抗体産生細胞、および高分子生体材料を含む、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節。
【請求項１０】
抗原でパルスした活性化樹状細胞をさらに含む、請求項９記載の人工リンパ節。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の人工リンパ節を含む、免疫賦活剤。
【請求項１２】
以下を含む、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造用キット：
（ａ）抗原；
（ｂ）サイトカイン発現ベクターおよびストローマ細胞、またはサイトカイン発現ベクターが導入されたストローマ細胞；および
（ｃ）高分子生体材料。
【請求項１３】
以下をさらに含む、請求項１２記載のキット：
（ｄ）活性化樹状細胞、または前記抗原でパルスした活性化樹状細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、免疫不全状態を伴う難治性感染症に対する治療としては、抗菌剤投与以外に、免疫グロブリン療法、白血球の補充、サイトカイン療法などが行われている。しかしながら、これらの療法は、免疫状態を一過性に高めるには有用であるが、必ずしも効果的であるとは言えない。また、癌に対する免疫療法も試みられているが、その効果については、未だ期待通りの結果が得られていない。
【０００３】
「適応免疫」とは、抗原特異的リンパ球による免疫応答であり、体内に侵入してくる病原微生物を排除するために必須の生体防御機構である。その一連の反応の正確さと効率は、高度に組織化された二次リンパ組織の存在によって、初めて実現されることが知られている。
【０００４】
過去１０年の間に、様々なサイトカイン遺伝子がクローニングされ、それらの遺伝子変異マウスを用いた研究から、二次リンパ組織の発生と組織構造の成熟について重要な役割を果たすサイトカイン（例えば、リンホトキシン、ケモカインなど）とストローマ細胞の存在が明らかになっている。
【０００５】
近年、組織工学技術と生体適合性を有する高分子材料を利用して、生体内微小環境を模倣した人工組織および／または臓器を構築し、それらを臨床適用するための様々な試みが行われている。しかしながら、リンパ組織の人工的な構築については、世界的にも殆ど報告がなく、胸腺再構築についていくつか報告がされているのみである。
【０００６】
例えば、Harvard大学のグループは、人工骨の材料として使用されているCell Foam内でマウス胸腺ストローマ細胞を試験管内培養して「胸腺オルガノイド（thymic organoid）」を作製し、この胸腺オルガノイドにヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞を加えることによって、成熟Ｔ細胞を分化させ得ることを報告している（非特許文献１を参照のこと）。
また、英国のEdinburgh大学のグループとオーストラリアのMonash大学のグループは、モノクローナル抗体で認識される糖タンパク質「ＭＴＳ２４」を発現するマウス胸腺上皮細胞を培養して再凝集させた後に、ヌードマウスの腎皮下膜に移植することによって、正常なＴ細胞分化を支持する機能的に完全な胸腺を再構築することに成功している（非特許文献２および非特許文献３を参照のこと）。
しかしながら、これらの文献は、再構築した胸腺によって正常な胸腺におけるＴ細胞分化を再現できるということが主な内容であり、この再構築した胸腺が、免疫反応においてどのような効果をもたらすのかについては記載していない。
【０００７】
一方で、適応免疫において重要な役割を果たしている二次リンパ組織を人工的に再構築した例は、本発明者ら以外に報告がない。
本発明者らは、ストローマ細胞、サイトカイン、および高分子生体材料を人工リンパ組織の構築に必須である三要素と仮定し、ストローマ細胞とサイトカインを高分子生体材料から構成される三次元構造に組み込み、これをマウスの腎皮膜下に移植することによって、移植の３週間後には、二次リンパ組織と構造的に類似した組織（人工リンパ節）を構築できること、さらに、この三要素の組み合わせに骨髄由来の活性化樹状細胞を加えることによって、人工リンパ節構築の効率を改善できる（移植組織の約６０〜８０％）ことを明らかにした（特許文献１を参照のこと）。
【特許文献１】特開２００４−２５５１１０号公報
【非特許文献１】Poznansky, MC.ら、Nature Biotechnol. 18:729-34, 2000
【非特許文献２】Bennett, AR.ら、Immunity 16:803-14, 2002
【非特許文献３】Gill, J.ら、Nature Immunol. 3:635-42, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、人工的に再構築した二次リンパ組織を用いて、免疫不全症の個体において効率のよい適応免疫反応を誘導した例は未だない。従って、本発明は、免疫不全の個体において効率のよい適応免疫反応を誘導することができる人工リンパ節を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節を構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］  以下の工程を包含する、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造方法：
（ａ）抗原で非ヒト動物を免疫する工程；および
（ｂ）免疫した非ヒト動物に、サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植する工程。
［２］以下の工程をさらに包含する、［１］記載の方法：
（ｃ）前記サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植した非ヒト動物を、前記工程（ａ）の抗原でさらに免疫する工程。
［３］  前記高分子生体材料が、前記工程（ａ）の抗原でパルスした活性化樹状細胞をさらに含む、［１］記載の方法。
［４］  前記ストローマ細胞が、ＴＥＬ−２細胞である、［１］記載の方法。
［５］  前記高分子材料が、コラーゲンスポンジである、［１］記載の方法。
［６］  前記サイトカインが、リンホトキシンおよび／またはケモカインである、［１］記載の方法。
［７］  前記非ヒト動物が、非ヒト哺乳動物である、［１］記載の方法。
［８］  前記抗体が、ＩｇＧタイプの抗体である、［１］記載の方法。
［９］  ストローマ細胞、サイトカイン、抗体産生細胞、および高分子生体材料を含む、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節。
［１０］  抗原でパルスした活性化樹状細胞をさらに含む、［９］記載の人工リンパ節。
［１１］  ［９］または［１０］記載の人工リンパ節を含む、免疫賦活剤。
［１２］  以下を含む、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造用キット：
（ａ）抗原；
（ｂ）サイトカイン発現ベクターおよびストローマ細胞、またはサイトカイン発現ベクターが導入されたストローマ細胞；および
（ｃ）高分子生体材料。
［１３］  以下をさらに含む、［１２］記載のキット：
（ｄ）活性化樹状細胞、または前記抗原でパルスした活性化樹状細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節は、迅速かつ大量に抗原特異的な免疫反応を誘導し、有効な抗体を効率よく供給する強力な免疫賦活装置として、免疫不全状態または癌などの治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ａ）抗原で動物を免疫する工程；および
（ｂ）免疫した動物に、サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植する工程；
を包含する。
好ましくは、この方法は、以下の工程をさらに包含する：
（ｃ）前記サイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植した動物を、前記工程（ａ）の抗原でさらに免疫する工程。
【００１３】
本発明はまた、上記方法により作製される、ストローマ細胞、サイトカイン、抗体産生細胞、および高分子生体材料を含む、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節（以下、特異抗体産生人工リンパ節と略称する）を提供する。
好ましくは、この特異抗体産生人工リンパ節は、上記方法で動物の免疫に用いたのと同じ抗原でパルスした活性化樹状細胞をさらに含む。
【００１４】
（人工リンパ節の構成要素）
リンパ節とは、リンパ系組織（リンパ球が非リンパ系細胞と相互作用する組織）であって、リンパ球系の細胞の成熟や適応免疫応答に重要な役割を果たす組織器官である。リンパ系組織は一次リンパ組織と二次リンパ組織に分類することができる。一次リンパ組織はリンパ球産生の場所であり、骨髄と胸腺がこれに含まれる。また、二次リンパ組織は、抗原を補足するための特殊な構造をしており、適応免疫応答が開始される場所である。二次リンパ組織（末梢リンパ組織とも呼ばれる）には、脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ性組織（扁桃、気管関連リンパ性組織、腸管関連リンパ性組織、パイエル板（Peyer’s patches）（ＰＰ）、その他のリンパ球系細胞の凝集塊）が含まれる。
【００１５】
本発明の特異抗体産生人工リンパ節は、以下の三要素を組み合わせて、予め治療目的等に応じて選択された抗原で免疫した動物に移植することにより構築され得る：
（ａ） リンパ節の形成に重要であるストローマ細胞を代替する細胞；
（ｂ） リンパ節の形成に重要であるサイトカイン；および
（ｃ） 生体適合性高分子材料から構成される三次元構造骨格。
【００１６】
本発明の特異抗体産生人工リンパ節は、以下に挙げる、抗原特異的な免疫反応を起こす場として必須であると考えられるリンパ節の基本構造を備える。
【００１７】
［１］  明確に区別されるＴ細胞領域とＢ細胞領域を有する。
正常リンパ組織と同様、本発明の特異抗体産生人工リンパ節においてもＴ細胞とＢ細胞の領域は明確に分かれており、それぞれ「Ｔ細胞領域」、「Ｂ細胞領域」と呼ぶ。特にＢ細胞集団は「濾胞（follicle）」とも呼ばれる。
【００１８】
［２］  Ｔ細胞およびＢ細胞と共に、免疫反応において重要な役割を果たす樹状細胞が存在する。
【００１９】
［３］  中心部に濾胞樹状細胞のネットワークを含むＢ細胞領域が存在する。
濾胞樹状細胞（ＦＤＣ：follicular dendritic cell）は、「濾胞中心部に存在する樹状の突起を持つ特殊な細胞」を意味し、濾胞中心部でネットワークを形成している（ＦＤＣ  ｎｅｔｗｏｒｋという）。ＦＤＣは、樹状細胞（dendritic cell）とは別の種類の細胞である。
【００２０】
［４］  胚中心Ｂ細胞様のＰＮＡ（peanut agglutinin）強陽性Ｂ細胞が存在する。
抗原刺激による抗体産生に先立って、濾胞の中心部でＢ細胞の活発な増殖と形質細胞（抗体産生細胞）への分化が起きる。この部位を胚中心（ＧＣ：germinal center）と呼ぶが、この胚中心で活発に増殖するＢ細胞は、胚中心Ｂ細胞（germinal center B cell）と称する。胚中心Ｂ細胞 はＰＮＡとよく結合する性質を持つため、ＰＮＡで染色した時にＰＮＡ強陽性（ＰＮＡｈｉｇｈ＋）となることが知られている。
【００２１】
［５］  抗体産生細胞である形質細胞が存在する。
抗体産生細胞は、Ｂ細胞が最終段階まで分化した細胞であり、これを形質細胞と呼ぶ。
【００２２】
［６］  リンパ節へのリンパ球の侵入門戸となるＨＥＶ様の血管構造が存在する。
高内皮細静脈（ＨＥＶ）は、リンパ節、パイエル板などの二次リンパ組織に特異的に観察される特殊な血管構造であり、一般的な血管とは異なり、背の高い（壁が分厚い）内皮細胞を有する。このＨＥＶは、ある種の接着因子やケモカインを発現しており、リンパ球が血流からこれらの二次リンパ組織に遊走して入ってくる時の入り口となっている。
【００２３】
（サイトカイン）
サイトカインとは、各種の血球細胞の増殖と分化を制御するタンパク質性の生理活性物質の総称を意味し、さらには、非免疫系細胞を含む細胞の増殖因子および増殖抑制因子をいうこともある。作用の特性から、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、ケモカイン、リンホカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などに分類される。本発明において使用されるインターロイキンは、特に限定されず、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８の中から任意に選択することができる。コロニー刺激因子としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどが使用され得る。インターフェロン（ＩＦＮ）としては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどが使用され得る。ケモカインとしては、例えば、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ（secondary lymphoid tissue chemokine）ともいう）、ＣＸＣＬ１３（ＢＬＣ（B lymphocyte chemoattractant）ともいう）、ＣＣＬ１９（ＥＬＣ（Epstein-Barr virus-induced molecule 1 ligand chemokine）ともいう）などが使用され得る。ＴＮＦとしては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどが使用され得る。ＴＮＦ−βは、リンホトキシンα（ＬＴα）ともいわれる。ＬＴαは、リンパ節（ＬＮ）およびパイエル板（ＰＰ）の器官形成のために、ならびに正常な脾臓組織構造の形成のために必須であることが見出された最初の分子である。リンホトキシンには、ＬＴαの他に、ＬＴβが存在する。これらのリンホトキシンもまた、本発明に使用され得る。
本発明において使用されるサイトカインは、好ましくは、リンホトキシンおよび／またはケモカインであり、より好ましくは、ＬＴα、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、および／またはＣＣＬ１９である。
これらのサイトカインは市販されており、容易に入手することが可能である。
【００２４】
（ストローマ細胞）
ストローマ細胞とは、腺あるいは器官に特異的な固有の機能を持つ様々な細胞（実質細胞）を取り巻く微小環境を構成する細胞の総称であり、「支質細胞」ともいう。この「支質細胞」は、文字どおり実質の細胞を物理的に支持するとともに、細胞同士の相互作用により相手の細胞に何らかの作用を及ぼすという意味での支持機能も果たしていると考えられている。ストローマ細胞はまた、「支持細胞」あるいは「間質細胞」ともいう。
【００２５】
本発明において使用されるストローマ細胞としては、例えば、２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺から樹立されたＴＥＬ−２ストローマ細胞（Eur. J. Immunol 20: 47-53, 1990）が挙げられる。このＴＥＬ−２細胞は、１０％の非働化したＦＣＳおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養することによって、維持および継代することができる。例えば、培養している細胞を、３日毎に、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液で培養用ディッシュから収集し、１／１０〜１／２０に希釈して継代することができる。
【００２６】
（サイトカイン産生ストローマ細胞）
本発明に用いられる、サイトカインを産生するストローマ細胞は、サイトカインをコードする遺伝子を含む発現ベクター（サイトカイン発現ベクターともいう）を構築し、この発現ベクターを、公知の遺伝子導入技術によって、ストローマ細胞に導入することにより作製することができる。種々のサイトカインに関する遺伝子情報は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどの公に利用可能な遺伝子データベースから入手可能である。
【００２７】
例えば、ＴＥＬ−２ストローマ細胞において、上述のサイトカインまたはケモカインを産生させるには、それらをコードする遺伝子を含む発現ベクターをリポフェクション法などにより導入し、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を添加した選択培地で１０日から２週間培養して、薬剤耐性細胞株を得ることができる。導入遺伝子の発現は、細胞培養上清の生物活性を測定して確認することができる。生物活性の測定には、例えば、ケモカインの場合であれば、Ｔ細胞またはＢ細胞に対する遊走活性を測定するｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｓｓａｙを用いることができる。
【００２８】
（高分子生体材料）
本発明において使用される高分子生体材料としては、三次元構造骨格を有する生体適合性高分子材料が使用され得る。本発明において「三次元構造骨格」とは「ストローマ細胞と、リンパ球や樹状細胞などのリンパ節構成細胞とを、三次元的に組織化させるための足場（scaffold）」を意味する。また、「生体適合性高分子材料」とは、「生体に何らかの方法で適用した時、生体が異物としてそれを排除しようとする反応を極力低く抑えるようにされた、様々な高分子から構成される材料」のことを意味する。
【００２９】
このような高分子生体材料としては、例えば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸などが挙げられる。また、ナイロン、ポリエステル、ポリウレタンまたはエチレンビニルアセテートなどの非生体分解性の材料も、単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
【００３０】
コラーゲンスポンジは、生体の構成成分であり、炎症反応や免疫反応を低く抑えられる点で、高分子生体材料として好ましい。「コラーゲンスポンジ」とは、コラーゲンを含むスポンジ構造を有する多孔性材料を意味し、例えば、ウシアキレス腱の不溶性コラーゲンを凍結乾燥することにより、多孔性のスポンジ状にした、三次元組織培養用コラーゲンなどが本発明に利用可能である。
【００３１】
本発明で使用される高分子生体材料は、それが生体分解性であっても、非生体性分解性であってもよく、生体へ移植した際に、それ自身の抗原性による免疫反応および／または物理的刺激による炎症反応を起こしにくい素材である限り、任意の素材を用いることができる。ただし、ストローマ細胞と免疫担当細胞が三次元的に組織化され、人工リンパ節として機能するためには、例えば、多孔性の高分子材料であれば、人工リンパ節の構築に適した孔径（ポアサイズ）、または、移植する高分子材料全体の大きさを選択する必要がある。このような移植物の孔径および大きさは、当業者により適宜決定され得る。
【００３２】
（樹状細胞）
樹状細胞とは、造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群の総称であり、リンパ系器官のみならず、リンパ系器官以外にも広く分布している。樹状細胞は、活性化の際に、Ｔ細胞およびＢ細胞の有効な刺激因子となり、免疫応答の開始に重要な役割を果たしている。
【００３３】
本発明に用いる樹状細胞は、その前駆細胞を培養することによって得ることができる。樹状細胞の前駆細胞は、骨髄、臍帯血、末梢血由来の造血幹細胞、末梢血由来の単球細胞などを起源とする。樹状細胞の前駆細胞は、採取した骨髄液、臍帯血、あるいは末梢血液などの懸濁液から必要に応じて分離精製することができる。
【００３４】
樹状細胞の前駆細胞を含む細胞群を増殖させ、さらに成熟／活性化樹状細胞へと分化誘導させるには、適切な誘導剤を使用する。誘導剤として、サイトカイン類を選択して使用することができる。サイトカインとしては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−αなどが挙げられ、これらを単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
例えば、樹状細胞を成熟／活性化させるには、５〜２０ｎｇ／ｍｌの上記サイトカインを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地、あるいはＭｃＣｏｙ’ｓ培地などを使用し、最終的に活性化させるためには、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）などの活性化因子を加えて培養すればよい。さらに、このＬＰＳと共に任意の抗原（例えば、治療目的等に応じて選択された抗原）を加えて培養することによって、樹状細胞を抗原パルスすることができる。
【００３５】
（抗原特異的な抗体産生能力を有する人工リンパ節の構築）
本発明の特異抗体産生人工リンパ節を構築するには、任意のサイトカインをコードする遺伝子を含む発現ベクターをストローマ細胞に導入して作製した、サイトカイン産生ストローマ細胞を高分子生体材料に付着させた後、この高分子生体材料を、治療目的等に応じて選択された抗原で免疫した動物の組織に移植すればよい。ストローマ細胞を高分子生体材料に付着させるには、高濃度に調製した細胞浮遊液に浸すか、あるいは、この細胞を、注射針（例えば、２６ゲージ）を装着した注射器を用いて、高分子生体材料に注入する。
【００３６】
好ましくは、この高分子生体材料には、サイトカイン産生ストローマ細胞の他に、樹状細胞が加えられ得る。より好ましくは、動物の免疫に用いたのと同じ抗原（すなわち、治療目的等に応じて選択された抗原）でパルスした活性化樹状細胞が加えられ得る。
【００３７】
ストローマ細胞（および活性化樹状細胞）を付着させた高分子生体材料の移植の対象となる動物は、ヒトおよび非ヒト動物であり、非ヒト動物は、好ましくは、非ヒト哺乳動物（例えば、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）である。
【００３８】
これらの動物は、高分子生体材料の移植の前に、治療目的等に応じて選択された抗原で免疫される（以下、一次免疫ともいう）。この一次免疫によって、動物の二次リンパ組織内等の免疫担当細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞など）は抗原刺激され、この抗原に特異的な抗体（好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＭ）を細胞表面等に発現する抗体産生細胞（Ｂ細胞）もしくは抗原特異的Ｔ細胞を生じる。
【００３９】
免疫に用いられる抗原としては、例えば、原虫、真菌、細菌、ウィルスなどの病原微生物が挙げられる。さらに、抗原としては、これらの病原微生物の他、癌、または特定の疾患に関係する、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質なども用いられ得る。
【００４０】
免疫の際、これらの抗原は、好ましくは、アジュバント（例えば、ａｌｕｍ、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントなど）と共に動物へ投与され得る。
一次免疫に用いる抗原の量は、使用する動物の種類、年齢、体重、投与の経路などによって異なるが、例えば、成体マウスの場合、ａｌｕｍ中に沈殿させた１０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは、１０〜１００μｇの抗原が、腹腔内投与され得る。
【００４１】
さらに、免疫担当細胞（例えば、Ｂ細胞）の抗原刺激を確実にするために、１〜２週間の間隔で、１または数回（例えば、１〜３回）、一次免疫を繰り返してもよい。一次免疫を繰り返す場合、抗原は、好ましくは、静脈（ｉ．ｖ．）投与され得る。
【００４２】
ストローマ細胞（および樹状細胞）を付着させた高分子生体材料は、一次免疫（一次免疫が複数回行われる場合には最後の免疫）から、好ましくは、一週間以降に動物の組織（例えば、腎皮膜下、皮下、腹腔内など）に移植される。
【００４３】
このような人工リンパ節における抗体産生細胞の誘導を確実にするために、一次免疫をした動物への高分子生体材料の移植の数週間（例えば、１〜３週間）後に、一次免疫に用いたのと同じ抗原で、二次免疫を行ってもよい。さらに、抗体産生細胞の誘導をより確実にするために、１〜２週間の間隔で、数回（例えば、１〜３回）、二次免疫を繰り返してもよい。このように、複数回、二次免疫を繰り返すことによって、人工リンパ節における抗体産生が著しく上昇する場合がある。
二次免疫に用いる抗原の量は、使用する動物の種類、年齢、体重、投与の経路などによって異なるが、例えば、成体マウスの場合、ａｌｕｍ中に沈殿させた１０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは、１０〜１００μｇの抗原が、ｉ．ｖ．投与され得る。
【００４４】
一次免疫によって抗原刺激されたＢリンパ球は、移植された人工リンパ節に集まり、その後、一次免疫に用いたのと同じ抗原に曝露されると、人工リンパ節においてクラススイッチを起こし、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＡを産生する抗体産生細胞を誘導する。本発明において、抗体産生細胞は、好ましくは、ＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の抗体を産生する細胞である。
【００４５】
高分子生体材料の移植から約３週間後には、動物の体内で本発明の特異抗体産生人工リンパ節が構築され得る。このようにして構築された特異抗体産生人工リンパ節は、生体から回収され、さらに別の動物に再移植して二次免疫されるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に供されるか、免疫不全症の個体に治療のために用いられるか、または、適切な保存剤（例えば、１０％ＤＭＳＯ）を添加した培養液中で−８０℃以下の低温にて保存して、使用前に調製して用いることができる。
【００４６】
１つの実施形態では、本発明はヒト型の特異抗体産生人工リンパ節を提供する。このようなヒト型の特異抗体産生人工リンパ節は、例えば、免疫不全動物（例えば、免疫不全マウス）にヒトリンパ球、ヒトリンパ球前駆体、骨髄細胞、および／または造血幹細胞などを導入して免疫不全動物の生体内にヒト免疫系を構築した後、このヒト免疫系を有する動物を、上記の方法に従って、治療目的等に応じて選択された抗原で一次免疫し、ストローマ細胞および／または樹状細胞を付着させた高分子生体材料を移植し、そして、必要に応じて、同じ抗原で二次免疫することによって構築できる。
【００４７】
（人工リンパ節の培養）
本発明の特異抗体産生人工リンパ節をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養するには、生体から回収した特異抗体産生人工リンパ節を、リンパ球や樹状細胞が生存、増殖を続けるためのサイトカインやその他の刺激因子を添加した培養液中に移して培養を行う。この培養系に、徐放性マテリアルを加えてもよい。特異抗体産生人工リンパ節をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する時には、新しい造血幹細胞、リンパ球または樹状細胞の前駆細胞、および、リンパ球、樹状細胞などを調製し、培養系に適宜補充しながら、培養を続ける。
【００４８】
（免疫賦活剤）
本発明の特異抗体産生人工リンパ節は、迅速かつ大量に抗原特異的な抗体を産生する強力な免疫賦活剤として、先天性免疫不全症候群および後天性免疫不全症候群を含む様々な免疫不全状態、悪性腫瘍または悪性腫瘍の放射線治療後の骨髄抑制による免疫不全状態などの治療に用いられ得る。
【００４９】
例えば、本発明の特異抗体産生人工リンパ節を、特定の病原微生物（例えば、原虫、真菌、細菌、ウイルスなど）に対して特異的な抗体または抗原特異的Ｔ細胞を産生するように設計／構築し、免疫不全状態の個体に移植することによって、この個体において、これらの病原微生物に対する適応免疫反応を惹起することができる。
【００５０】
また、本発明の特異抗体産生人工リンパ節は、免疫不全状態の個体の機能不全状態にある二次リンパ組織（例えば、脾臓、リンパ節など）に、抗体産生細胞、または抗原特異的Ｔ細胞を供給することで、該個体の免疫機能を賦活化することができる。
【００５１】
さらに、本発明の特異抗体産生人工リンパ節を、ワクチン接種に用いられるウイルス抗原に対して特異的な抗体、または抗原特異的Ｔ細胞を産生するように設計／構築して、ワクチン療法と組み合わせて使用すれば、ワクチン接種の効果を高めることができる。
【００５２】
本発明の特異抗体産生人工リンパ節を被験体に移植するときの量（大きさ）は、対象となる被験体により適宜設定することができる。例えば、成人に移植する場合は、本来のリンパ節と同等の大きさのもの、あるいは、本来のリンパ節よりも小さいが複数個を移植することができるものなどである。移植部位としては、皮下、腹腔内などが挙げられるが、侵襲の少なさ、移植手術手技の容易さから、皮下への移植が望ましい。
【００５３】
（キット）
本発明はまた、抗原特異的な抗体を産生する人工リンパ節の製造用キットを提供する。このキットは、ヒトまたは非ヒト動物において、本発明の特異抗体産生人工リンパ節を製造するために必要な、抗原、サイトカイン発現ベクターおよびストローマ細胞またはサイトカイン発現ベクターが導入されたストローマ細胞、ならびに高分子生体材料を含む。
好ましくは、このキットは、活性化樹状細胞をさらに含む。より好ましくは、このキットは、上記抗原でパルスした活性化樹状細胞を含む。
【００５４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００５５】
以下の製造例および実施例において使用した培養液、試薬および器具は以下の通りである。
ＲＰＭＩ−１６４０：ＧＩＢＣＯ社
２−メルカプトエタノール：Ｓｉｇｍａ社
ＦＣＳ（fetal calf serum；ウシ胎仔血清）： Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社
細胞培養液：１０％の非働化したＦＣＳおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０
Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液：ＧＩＢＣＯ社
Ｇ４１８（geneticin）：ＧＩＢＣＯ社
リコンビナントマウス ＧＭ−ＣＳＦ(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社
ＬＰＳ（lipopolysaccharide）：Ｓｉｇｍａ社
ＢＳＡ（bovine serum albumin）：Ｓｉｇｍａ社
培養ディッシュ、培養プレート、ペトリディッシュ；全て、ＦＡＬＣＯＮ社製
【００５６】
（製造例１）
（組換えストローマ細胞の調製）
ストローマ細胞として、２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺から樹立したＴＥＬ−２細胞（Nakashima M. et al., Eur J Immunol. 1990 Jan;20(1):47-53）を、１０％ウシ胎仔血清および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。マウスのリンホトキシンα（ＬＴα）またはケモカイン（ＣＣＬ２１、ＣＣＬ１９およびＣＸＣＬ１３）ｃＤＮＡを、マウス脾臓ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）によりクローニングした。各ｃＤＮＡを、ｐＣＸＮ２ベクター（Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-9）のＥｃｏＲＩ部位へと挿入した。このベクターは、ニワトリβアクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、およびウサギβグロビンスプライシングドナーを有する。得られた発現ベクターをＴＥＬ−２細胞へと導入し、そして安定なトランスフェクタント細胞株を、２週間のＧ４１８選択（５００μｇ／ｍｌ）後に得た。安定なトランスフェクタント細胞株を樹立させた後、全ての細胞株を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培養培地中で培養した。導入された遺伝子の発現を、ＬＴαについては蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析およびケモカインについては走化性アッセイにより確認した。
【００５７】
（製造例２）
（ストローマ細胞を吸着させたコラーゲンスポンジの調製）
コラーゲンスポンジ（”Collagen Sponge” #CS-35, KOKEN, Tokyo, Japan）を、一定の形および大きさに小さく切り、４８ウェルプレートのウェルに１片ずつ入れた。製造例１に従って樹立したサイトカイン産生ＴＥＬ−２ストローマ細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を用いて収集し、培養液で１回洗浄して培養液に浮遊させ、さらに、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳでそれぞれ１回ずつ洗浄した後、１ｍｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加えて細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を遠心分離に供して細胞を沈澱させてペレットの状態にし、少量の１％  ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を浮遊させて、細胞濃度の非常に濃い、均一な細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液をコラーゲンスポンジの上に滴下し、スポンジを揉むようにして細胞をコラーゲンスポンジに吸着させた。少量の１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に細胞を浮遊させてコラーゲンスポンジに吸着させているので、乾燥させないように注意した。この細胞を吸着させたコラーゲンスポンジを入れた４８ウェルプレートを、マウスの腎皮膜下への移植まで氷上に置いた。
【００５８】
（製造例３）
（活性化樹状細胞の調製）
７週齢から１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウスの大腿骨と脛骨の骨髄腔内を、２６ゲージの注射針を装着した注射器を用いてＰＢＳで洗い出し、骨髄細胞液を得た。この骨髄細胞液をナイロンメッシュでろ過して大きな細胞塊等を除き、培養液で２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製して細胞浮遊液を作製した。なお、細胞浮遊液中には赤血球系の細胞がかなり含まれているが、赤血球系の細胞を無視して細胞の濃度を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと計算した。この細胞浮遊液を、直径１０ｃｍのプラスチック製ディッシュ（ペトリディッシュ）に、１ディッシュ当たり７ｍｌを移し、リコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦを最終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。３日又は４日毎に細胞上清を半分捨て、５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを加えた新しい培養液を加えた。培養８日目または９日目に浮遊細胞を集め、５ ｎｇ／ｍｌ のＧＭ−ＣＳＦを加えた新しい培養液で２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞浮遊液を作り、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（もしくはＴＮＦ−α）、および、抗原パルスを行う場合、高分子生体材料の移植前にマウスに接種される抗原と同じ抗原を加えて、細胞培養ディッシュで１７〜２０時間培養し、樹状細胞を成熟および活性化させた。
【００５９】
（製造例４）
（ストローマ細胞および樹状細胞を吸着させたコラーゲンスポンジの調製）
コラーゲンスポンジ（”Collagen Sponge” #CS-35, KOKEN, Tokyo, Japan）を、一定の形および大きさに小さく切り、４８ウェルプレートのウェルに１片ずつ入れた。製造例１に従って樹立したサイトカイン産生ＴＥＬ−２ストローマ細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を用いて収集し、培養液で１回洗浄して培養液に浮遊させ、細胞数を数えて氷上に置いた。製造例３に従って調製した活性化樹状細胞を、培養液で２回洗浄して培養液に浮遊させて細胞数を数え、氷上に置いた。その際、樹状細胞をＬＰＳで活性化した場合は、ＬＰＳが残らないように丁寧に洗浄した。その後、それぞれの細胞を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでそれぞれ１回ずつ洗浄した後、１ｍｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加えて細胞濃度のほぼ同じ均一な細胞浮遊液を作製した。これらの浮遊液を１対１の容量で混合し、遠心分離により細胞を沈澱させてペレットの状態にし、さらに少量の１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加えて、非常に細胞濃度の濃い均一な細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液をコラーゲンスポンジの上に滴下し、スポンジを揉むようにして細胞をコラーゲンスポンジに吸着させた。少量の１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に細胞を浮遊させてコラーゲンスポンジに吸着させているので、乾燥させないように注意した。この細胞を吸着させたコラーゲンスポンジを入れた４８ウェルプレートは、細胞を吸着させたコラーゲンスポンジをマウスの腎皮膜下に移植するまで氷上に保った。
【００６０】
（製造例５）
（コラーゲンスポンジのマウスへの移植）
８週齢から１４週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー社、ＳＰＦ環境のマウス飼育室で飼育）に麻酔をし、体表面を７０％エタノールで消毒して右側臥位にした。左季肋部の皮を約１ｃｍ切開し、その真下の筋層もほぼ同じ大きさに切開した。腎周辺の脂肪組織をピンセットでつまみ、腎臓を体外に引き出した。実体顕微鏡下で観察しながら、先の鋭利なピンセットを用いて、腎実質に傷をつけないように注意しながら、腎皮膜を開き、腎皮膜と腎臓の間にコラーゲンスポンジを挿入した。通常、片方の腎臓につき２ケ所（腎上極、下極付近）移植するため、左右の腎臓で一匹のマウスあたり計４つの、ストローマ細胞を付着させたコラーゲンスポンジを移植した。移植３週間後に移植組織（以下、人工リンパ節という）を回収した。
【００６１】
（実施例１）
（種々の条件で構築した人工リンパ節の抗原特異的な抗体産生能力の評価）
胸腺依存性抗原である４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−オバルブミン（ＮＰ−ＯＶＡ）を用いて、上記製造例に従って、以下に示す条件で構築した人工リンパ節における抗原特異的な抗体産生能力を試験した。図１に試験手順を示す。
条件（ａ）：ＬＴα産生ＴＥＬ−２（ＴＥＬ−２−ＬＴα）細胞、およびＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含むコラーゲンスポンジ（高分子生体材料）を、未感作の（ｎａｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、移植の３週間後に、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与した。
条件（ｂ）：ＴＥＬ−２−ＬＴα細胞、およびＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含むコラーゲンスポンジを、ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、移植の３週間後に、ＰＢＳをｉ．ｖ．投与した。
条件（ｃ）：ＴＥＬ−２−ＬＴα細胞、およびＮＰ−ＯＶＡでのパルスをしていない樹状細胞を含むコラーゲンスポンジを、ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、移植の３週間後に、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与した。
条件（ｄ）：ＴＥＬ−２−ＬＴα細胞、およびＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含むコラーゲンスポンジを、ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、移植の３週間後に、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与した。
【００６２】
製造例１に従って、ＴＥＬ−２−ＬＴα細胞を作製した。活性化樹状細胞を、製造例３に従って、抗原パルスを行う場合、抗原としてＮＰ−ＯＶＡを用いて調製した。製造例４に従って、これらの細胞をコラーゲンスポンジに吸着させた。コラーゲンスポンジの移植のために、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウスを、日本チャールズリバー社から購入し、ＳＰＦ（Specific Pathogen Free）環境下のマウス飼育室で飼育した。
条件（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）については、各々のコラーゲンスポンジの移植前の７〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウスに、ａｌｕｍ中に沈殿させた１００μｇのＮＰ−ＯＶＡを腹腔内投与した。
製造例５に従って、コラーゲンスポンジをマウスへ移植した。
【００６３】
コラーゲンスポンジの移植の３週間後、条件（ａ）、（ｃ）および（ｄ）の場合はＮＰ−ＯＶＡ、条件（ｂ）の場合はＰＢＳを、マウスにｉ．ｖ．投与し、そして、投与の４日後に移植物および脾臓を収集し、ＮＰ特異的なＩｇＧ１抗体産生細胞（antibody forming cell；ＡＦＣ）の存在について、ＮＰ−ＢＳＡコーティングしたフィルタープレートを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴ（enzyme-linked immunospot）アッセイにより評価した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（MAIPS4510, Millipore, Billerica, MA）の疎水性ＰＶＤＦフィルターを、ＰＢＳ中の５０μｇ/ｍｌのＮＰ−ＢＳＡまたはＢＳＡを用いて、４℃で一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。脾臓細胞（１０５ cells／well）または人工リンパ節由来の細胞（０．２〜１×１０５ cells／well）を、９６ウェルプレート中のフィルター上で、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。ウェルを、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで１回、ＴＢＳ−Ｔで２回、そしてＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、フィルターを、アルカリホスファターゼ結合体化抗ＩｇＭ抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗ＩｇＧ１抗体（いずれも、Southern Biotechnology Associates,Inc., Birmingham, AL）と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼ活性およびＨＲＰ活性を、それぞれ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（CHEMICON International, Inc., Temecula, CA）およびＡＥＣ（BD Pharmingen, San Diego, CA）で可視化して評価した。
【００６４】
ＴＥＬ−２−ＬＴαおよびＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含むコラーゲンスポンジを、ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫したマウスに移植して構築した人工リンパ節（条件（ｄ））において、ＮＰ特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣが最も効果的に誘導された。
これに対して、移植したコラーゲンスポンジがＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含みかつＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与しても、移植前に一次免疫を行わなかった場合（条件（ａ））には、ＮＰ特定的ＩｇＧ１ＡＦＣは、脾臓においても、人工リンパ節においても検出されなかった。
また、マウスがＮＰ−ＯＶＡでの一次免疫を受けかつ移植したコラーゲンスポンジがＮＰ−ＯＶＡでパルスした活性化樹状細胞を含んでいても、移植後にＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与しなかった場合（条件（ｂ））にも、ＮＰ特定的ＩｇＧ１ＡＦＣは、脾臓においても、人工リンパ節においても検出されなかった。
ＥＬＩＳＰＯＴの結果を表１に示す。表１の括弧内は、試験したマウスの数を示す。
【００６５】
【表１】
2006129839.tif 000002
【００６６】
免疫染色は、一次免疫したマウスの人工リンパ節において、多くのＮＰ−結合Ｂ細胞が存在することを示した（データ示さず）。
【００６７】
これらの結果は、一次免疫されたリンパ球が人工リンパ節に浸潤し、二次免疫の後に、人工リンパ節においてＮＰ特異的ＩｇＧ１抗体を効果的に産生したことを示す。興味深いことに、免疫条件に依存して、構築された人工リンパ節のサイズの差異を見出した。ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣが最も効果的に誘導された人工リンパ節のサイズは、ＮＰ−特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣの誘導が少なかった人工リンパ節よりも明らかに大きかった。
【００６８】
（実施例２）
（人工リンパ節の再移植）
一次免疫されたレシピエントマウスのＢ細胞が、人工リンパ節において、局所的に、ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣへとクラススイッチを受けたのか、あるいは、ＮＰ特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣが、レシピエントマウスの二次リンパ器官から人工リンパ節へと移動してきたのかを決定するために、本発明者らは、コラーゲンスポンジの移植前に一次免疫したマウスにおいて構築した人工リンパ節を、未感作（ｎａｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内へと移した（図２に示される、「再移植」と呼ばれる実験アプローチ）。次いで、再移植の数日（１〜３日）後に、ＮＰ−ＯＶＡを、レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．投与した。
ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣの存在を、実施例１と同様の手順でＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。その結果、ＮＰ特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣの存在を、ＮＰ−ＯＶＡ注射の４日以内に、レシピエントマウスの再移植した人工リンパ節において検出した。他方、この時点で、レシピエントマウスの脾臓では、ＮＰ−特異的ＩｇＧ１ではなく、ＩｇＭクラスが検出された（人工リンパ節中の１０５個の細胞あたり１４６０±９１１個のＮＰ−特異的ＩｇＧ１ＡＦＣ  対  レシピエントマウス脾臓中の１０５個の細胞あたり０±０．８個のＮＰ−特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣ（１２匹のマウスによるデータ））。この結果は、一次免疫されたＢ細胞のＮＰ特異的ＩｇＧ１ ＡＦＣへのクラススイッチが、人工リンパ節において生じたことを示唆した。
【００６９】
（実施例３）
（人工リンパ節の再移植を行ったＳＣＩＤマウスのＮＰ特異的ＩｇＧ１産生能力の評価）
本実施例のために、図２に示す手順に従って、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（C.B-17/IcrCrj-scid/scid）に対する再移植実験を４回繰り返した（６〜８匹のマウス／実験）。
人工リンパ節の再移植を行ったＳＣＩＤマウスの血清中のＮＰ特異的ＩｇＧ１の存在を、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により評価した。ＮＰ−ハプテンに対して特異的なＩｇＧ１アイソタイプ抗体を、ＥＬＩＳＡにより検出した。９６ウェルアッセイプレートを、ＰＢＳＮ（０．０５％  ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中の５０μｇ／ｍｌ  ＮＰ−ＢＳＡを用いて４℃にて一晩コーティングし、そしてＴＢＳ−Ｔ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした。連続希釈した血清を、各ウェルに添加し、そして４℃にて一晩、または３７℃にて１時間、インキュベートした。ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫し、そして、１回、二次免疫したマウスからプールした血清を、連続希釈の後、各プレートにコントロールとして加えた。ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄した後、プレートを、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１と共に室温で２時間インキュベートした。ＨＲＰ活性を、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（KPL, Gaithersburg, MD)を用いて発色させ、そして光学密度を４５０ｎｍで測定した。抗ＮＰ  ＩｇＧ１の濃度を、各プレートのポジティブコントロールとして用いた血清から作成した標準曲線と比較することにより評価した。
人工リンパ節の再移植の数日（１〜３日）後に、１回、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与したＳＣＩＤマウス（グループ１：図３の△）の血清において、ＮＰ−ＯＶＡ投与の４日後に、早くも、ＮＰ特異的ＩｇＧ１が検出可能であった。
人工リンパ節の再移植の数日（１〜３日）後に１回、２週間の間隔でさらに１回（合計２回）、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与したＳＣＩＤマウス（グループ２：図３の▲）の血清において、グループ１と比較して、約１００〜１０００倍のＮＰ−特異的ＩｇＧ１が検出された。
ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣおよびＮＰ特異的ＩｇＧ１抗体の存在は、ＳＣＩＤマウス間で、ある程度のレベルの差異はあったものの、全てのＳＣＩＤマウスの人工リンパ節または血清中で検出された。興味深いことに、ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣはまた、ＥＬＩＳＰＯＴおよび免疫染色の両方によって、移植されたＳＣＩＤマウスの脾臓においても検出された。このことは、人工リンパ節由来の細胞（ＮＰ特異的ＩｇＧ１ＡＦＣ）が、ＳＣＩＤマウスのリンパ組織を再構築することを示した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、実施例１に示す条件下での人工リンパ節の構築手順を示す。
【図２】図２は、実施例２および３に示す人工リンパ節の再移植実験の手順を示す。
【図３】図３は、再移植実験を行ったＳＣＩＤマウスの血清中のＮＰ特異的ＩｇＧ１の存在を示す。●は、ＮＰ−ＯＶＡで一次免疫し、そして同じ抗原で、１回、二次免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を示す（ポジティブコントロール）。この二次免疫したマウスの血清中のＮＰ−特異的ＩｇＧ１の量を１として、各マウスの血清中のＮＰ−特異的ＩｇＧ１の相対力価を算出した。○は、未感作（非免疫）ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を示す（ネガティブコントロール）。△は、人工リンパ節の再移植の数日（１〜３日）後に、１回、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与したＳＣＩＤマウス（グループ１）の血清を示す。▲は、人工リンパ節の再移植の数日（１〜３日）後に１回、２週間の間隔でさらに１回（合計２回）、ＮＰ−ＯＶＡをｉ．ｖ．投与したＳＣＩＤマウス（グループ２）の血清を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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