(57)【要約】【課題】弧発性パーキンソン病及びＡＲ−ＪＰ（家族性パーキンソン病）は共に難病の特定疾患にランクされている重要疾病であるので、これ等両者のブリッジとなり得る共通の因子の解明、及びそこで得られた知見をこれ等の疾患の診断、治療及び予防に活用することは、全世界における急務の課題である。【解決手段】上記の共通因子として機能する、新規なパーキン結合タンパク質（ＰＢＰ）とその遺伝子並びに抗体を提供する。併せて、ＰＢＰ、その遺伝子、及び抗体を用いる、次の疾患の診断剤、治療薬及び予防剤が提供される：ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患としての弧発性パーキンソン病、ＡＲ−ＪＰ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病等。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２から配列番号１４に記載の合計１３種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
【請求項２】
配列番号１６から配列番号２０に記載の合計５種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
【請求項３】
配列番号２から配列番号１４に記載の合計１３種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を保有するタンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１６から配列番号２０に記載の合計５種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を保有するタンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質。
【請求項５】
請求項３及び請求項４にそれぞれ記載のタンパク質の混合物。
【請求項６】
薬効を奏する量の、請求項３又は４に記載のタンパク質、又は請求項５に記載のタンパク質の混合物を含有する、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患の治療薬。
【請求項７】
ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患が弧発性パーキンソン病、家族性パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、又は糖尿病である請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
診断用反応を呈する量の、請求項３又は４に記載のタンパク質、又は請求項５に記載のタンパク質の混合物を含有する、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患の診断剤。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はその断片。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡ又はその断片を用いることにより構築される遺伝子発現体により生産されるタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡ又はその断片を用いることにより構築される遺伝子治療剤。
【請求項１２】
請求項９に記載のＤＮＡ又はその断片の塩基配列に基づき設計される遺伝子診断剤。
【請求項１３】
請求項９に記載のＤＮＡ又はその断片の塩基配列に相補的なＲＮＡ塩基配列に基づき設計される遺伝子発現調節剤。
【請求項１４】
請求項３又は４に記載のタンパク質、又は請求項５に記載のタンパク質の混合物に対する抗体。
【請求項１５】
抗原抗体反応を呈する量の、請求項１４に記載の抗体を試薬として含有する診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、新規なパーキン結合タンパク質とその機能、並びにその用途としての弧発性及び家族性パーキンソン病、ミトコンドリア病、アルツハイマー病等々のミトコンドリア機能障害をきたす種々の変性疾患の診断剤、治療薬及び予防製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、静止時振戦、筋強剛、動作緩慢ないしは無動、及び姿勢反射障害を４主徴とする、神経変性疾患であり、世界での有病率は１０００人に約１例（ＷＨＯ年報２００３年）である。本邦での総患者数は、約１４万例であり、アルツハイマー病のそれ（約９万人）を超え、厚生労働省統計２００２年１０月現在、難病（特定疾患）にランクされている。この疾患は弧発性と家族性（遺伝性）に大別され、患者数は前者が主流である。尚、後者の家族性は、まれであり、現在、世界で数１０家系が発見されている程度ではあるが、欧米を中心に拡大しつつあり、疫学だけではなく、基礎及び臨床医学上、非常に重要な遺伝性疾患である。
【０００３】
弧発性パーキンソン病では、黒質緻密層のドーパミン産生細胞の選択的変性が、病態の基幹となっている。このドーパミン産生細胞の機能障害は、そこに存在するミトコンドリア遺伝子の欠失が加齢と共に増加するにつれ、進行することが知られている。そのため、ミトコンドリア機能は、この疾患の発症機転に重要な役割を担うと考えられている。
【０００４】
他方、家族性（遺伝性）の常染色体劣性若年性パーキンソニズム（以下「ＡＲ−ＪＰ」と略記する；また、「家族性パーキンソン病」と表記することがある）においては、その原因としてパーキン遺伝子が発見された（非特許文献１）。この遺伝子の発現産物であるパーキンはユビキチン・リガーゼ活性を有し（非特許文献２）、該遺伝子の変異がもたらす上記酵素活性の変調の結果、ある種の基質のユビキチン化が障害されることにより、ＡＲ−ＪＰが発症するという機序が報告されている（非特許文献３）。尚、かかる知見の利用に関しては、パーキン遺伝子を用いる診断や治療（特許文献１）、ユビキチン・リガーゼ
としてのパーキンの利用（特許文献２）、パーキンの基質としてのパエル受容体を用いる治療薬のスクリーニング（特許文献３）等の技術が既に公知である。
更に最近、パーキン結合タンパク質として、ＨＳＰ７０とそのコ・シャペロンＣＨＩＰが報告された（非特許文献３）。この報告によれば、これ等の両タンパク質は、パーキンと共同し、ＥＲストレス下で蓄積するパエル受容体をユビキチン化することにより、これを分解する。
【特許文献１】ＷＯ９９／０４０１９１
【特許文献２】特開２００１−３１６２９０
【特許文献３】特許文献３  特開２００３−１８９９２
【非特許文献１】Nature, 392(6676), 605-608, 1998April9.
【非特許文献２】Cell,102, 549-552, 2000.
【非特許文献３】Journal of Neurology, 250[Supplment 3], III/25-III/29, 2003.
【０００５】
換言すれば、従来、弧発性パーキンソン病と家族性パーキンソン病（ＡＲ−ＪＰ）とは全く異なった病態を呈すると考えられている。そして、他方では、上記両疾患の症状が同じであることを考慮し、ＡＲ−ＪＰの発症原因の解明が、弧発性パーキンソン病の発症機構の究明に極めて有用だと認識かつ期待されてはいる。しかしながら、これ等の両疾患のブリッジとなり得る共通の因子あるいは原因と発症機構については未だ知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した通り、弧発性パーキンソン病及びＡＲ−ＪＰは共に難病の特定疾患としてランクされている重要疾病であるので、かかる両者のブリッジとなり得る共通の因子あるいは原因と発症機構の解明、及びそこで得られた知見をこれ等の疾患の診断、治療及び予防に活用することは、全世界における急務の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、発明者らによる次の驚くべき発見、即ち、「全く新しい２つのパーキン結合タンパク質遺伝子と、これ等の各遺伝子がコードするアミノ酸配列」に基づく。尚、かかる発見は、発明者らが上記の課題を解決するため、前述した背景技術に新規な着想を加味し創意工夫をこらすと共に、試行錯誤と刻苦勉励を重ねた結果の成果である。本発明によれば、弧発性と家族性の両パーキンソン病をもたらす共通因子としての新規なパーキン結合タンパク質（Ｐａｒｋｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下「ＰＢＰ」と略記する）とＰＢＰ遺伝子並びにこれ等の用途としての治療薬や診断剤等が提供される。
【０００８】
先ず上記発見に至る過程が以下に説明され、次いで、この発明の具体的内容が後述される。ところで、この発明に係る新規なＰＢＰ発見に成功した鍵は、次（１）〜（６）に示す筆頭発明者が事前に蓄積した知見に基づく確実な推論、即ち、「ミトコンドリアへの移行シグナルを持たないと考えられるパーキンをミトコンドリアに運搬し、パーキンによるミトコンドリア機能の活性化を促進させる未知の蛋白としてＰＢＰが存在する」という卓抜した推論にある。この推論の確信を糧とし、ＰＢＰ遺伝子の探索が敢行かつ遂行された。
（１）蛍光抗体法や免疫電顕を用いた検討により、パーキンが増殖期の神経系・筋系細胞のミトコンドリアに局在していることが確認された；
（２）パーキンのミトコンドリアへの局在は、パーキンをＧＦＰベクターで導入した場合にも認められた；
（３）増殖期の細胞において、種々のミトコンドリア電子伝達系抑制剤及び細胞周期ブロッカーを添加した場合には、パーキンはミトコンドリアから遊離した。また、分化細胞では、パーキンはミトコンドリア外に局在していた。このことは、分化した細胞であるヒトや動物の中枢神経組織では、パーキンがミトコンドリアには存在しないという事実とも一致していた；
（４）パーキンを、神経芽細胞腫の細胞株でドーパミン産生細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙに過剰発現させた場合には、ミトコンドリアにコードされた遺伝子の転写・複製が増加した。しかし、核にコードされた遺伝子の転写・複製には変化が見られなかった。また、この細胞では、ｄｓＤＮＡプローブを用いた観察で、形態的にもミトコンドリアＤＮＡの増加があり、電顕ではミトコンドリアの増殖が認められた；
（５）上記（４）とは逆に、内因性パーキンの発現をｓｉＲＮＡで抑制した場合には、ミトコンドリアにコードされた遺伝子の転写・複製は選択的に減少していた。更に、これらの実験系でミトコンドリアの膜電位やアポトーシスを測定した結果、パーキンはミトコンドリアの転写を介して酸化的リン酸化などの機能を促進し、膜電位の形成・維持やアポトーシスの抑制を誘導することが明らかとなった；及び
（６）発明者らは、パーキンがミトコントリアでの遺伝子の転写と複製に関与しミトコンドリア機能を促進するという、パーキンの新しい機能を発見する共に、ミトコンドリアへの移行シグナルを持たないパーキンをミトコンドリアに運搬する未知のタンパク質としてＰＢＰの存在が推論された。
【０００９】
この発明によれば、上記課題を解決するための手段として、ＰＢＰ、その活性ドメインを含むＰＢＰ由来の断片、ポリペプチド及びペプチド、これ等をコードする遺伝子ＤＮＡやこれ等のＤＮＡ塩基配列に相補的なＲＮＡ、抗体等々、具体的には、次の（１）〜（１５）に記載の物質がそれぞれ提供される：
（１）配列番号２から配列番号１４に記載の合計１３種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
（２）配列番号１６から配列番号２０に記載の合計５種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
（３）配列番号２から配列番号１４に記載の合計１３種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を保有するタンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質。
尚、この明細書にいう「タンパク質」とは、ＰＢＰ、その活性ドメインそのもの、該ドメインをペプチド鎖全長の一部分として有する、ＰＢＰ由来の断片、ポリペプチド及びペプチドをも併せて意味する。また、「アミノ酸配列を保有のタンパク質」とは、該アミノ酸配列からなるタンパク質以外に、該アミノ酸配列をペプチド鎖全長の一部分として有するタンパク質をも併せて意味する。
（４）配列番号１６から配列番号２０に記載の合計５種のアミノ酸配列群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を保有するタンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質。
（５）前記（３）及び（４）にそれぞれ記載のタンパク質の混合物。
（６）薬効を奏する量の、前記（３）又は（４）に記載のタンパク質、又は上記（５）に記載のタンパク質の混合物を含有する、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患の治療薬。
（７）ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患が弧発性パーキンソンン病、家族性パーキンソンン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、又は糖尿病である上記（６）に記載の治療薬。
（８）診断用反応、例えば、抗原抗体反応、リガンドや受容体との吸着あるいは結合反応等を呈する量の、前記（３）又は（４）に記載のタンパク質、又は前記（５）に記載のタンパク質の混合物を含有する、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患の診断剤。
（９）前記（１）又は（２）に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はその断片。
（１０）上記（９）に記載のＤＮＡ又はその断片を用いることにより構築される遺伝子発現体、例えば、発現ベクター、ゲノムへの遺伝子導入ベクター等により生産されるタンパク質。
（１１）前記（９）に記載のＤＮＡ又はその断片を用いることにより構築される遺伝子治療剤、例えば、発現ベクター、ゲノムへの遺伝子導入ベクター等が有効成分として含有される。
（１２）前記（９）に記載のＤＮＡ又はその断片の塩基配列に基づき設計される遺伝子診断剤、例えば、ＰＣＲ用プライマー、マイクロアレイやＤＮＡチップ用プローブ等が有効成分として含有される。
（１３）前記（９）に記載のＤＮＡ又はその断片の塩基配列に相補的なＲＮＡ塩基配列に基づき設計される遺伝子発現調節剤、例えば、ＲＮＡｉ用のｓｉＲＮＡやｄｓＲＮＡ等が有効成分として含有される。
（１４）前記（３）又は（４）に記載のタンパク質、又は（５）に記載のタンパク質の混合物に対するポクローナル抗体及びモノクローナル抗体。例えば、Ｋｌｏｋｉｎ１及び２の各完全長ポリペプチド(全分子)、その断片（全分子のサブユニット）、後述される実施例２に記載の合成ペプチド、ＧＰＧＰＰＥＬＧＲＤＴＧＲＦＤＲＱ（Ｋｌｏｋｉｎ１に係る配列番号２に記載の第１９６番−第２１２番アミノ酸配）、ＣＰＰＶＥＬＰＷＡＰＲＲＧＨＲＬＳＰ（Ｋｌｏｋｉｎ２に係る配列番号１６に記載の第１９番−第３６番アミノ酸配列）等に対するポクローナル及びモノクローナル抗体。
（１５）抗原抗体反応を呈する量の、上記（１４）に記載の抗体を試薬として含有する診断剤。
【発明の効果】
【００１０】
この発明に係るＰＢＰは、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患としての弧発生パーキンソン病及び家族性ＡＲ−ＪＰの新規かつ極めて重要な共通因子であり、ミトコンドリアの機能障害という観点から上記疾病の基礎及び応用研究を飛躍的に発展させる。更に、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患、例えば、弧発性パーキンソン病、家族性パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病等々の診断、治療及び予防が達成され、世界の医療行政と難病患者に多大の貢献し福音をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（１）パーキン結合タンパク質（ＰＢＰ）：この発明に係るＰＢＰは、「Ｋｌｏｋｉｎ１」及び「Ｋｌｏｋｉｎ２」の２種類であり、これ等は、筆頭発明者により命名された。尚、この明細書にいう「ＰＢＰ」とは、ｋｏｌｋｉｎ１及び／又はｋｏｌｋｉｎ２、これ等のパーキン結合活性ドメインからなる断片、該ドメインをペプチド鎖の一部分として保有のタンパク質等を意味する。これ等のＰＢＰは、完全長アミノ酸配列及びこれ等の種々の断片を、単独又は２種以上組合せて用いることができる。また、完全長アミノ酸配列及びこれ等の種々の断片を保有のタンパク質のかたちで用いることができる。かかるアミノ酸配列の詳細を以下、Ａ群、Ｂ群及びＣ群にそれぞれ示す。
【００１２】
（Ａ群）次に示すＫｌｏｋｉｎ１の完全長アミノ酸配列とその部分配列（断片）を用いることができる。尚、配列番号１はＫｌｏｋｉｎ１遺伝子ＤＮＡのＣＤＲ（コーディング領域）の完全長塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列であり、配列番号２はＫｌｏｋｉｎ１の完全長アミノ酸配列である。また、以下の配列番号３から１４までは、配列番号２に示すＫｌｏｋｉｎ１の完全長アミノ酸配列（Ｎ末端を占める第１番メチオニン残基からＣ末端を占める第３１５番トレオニン残基まで、即ち、第１番〜第３５１番）の部分配列（アミノ酸残基の第ｎ番から第ｍ番までの序数、第ｎ番〜第ｍ番のかたちで表記）の例示である：配列番号３（アミノ酸残基の第７０番〜第８８番）、配列番号４（第１８９番〜第２００番）、配列番号５（第２３１番〜第２４５番）、配列番号６（第７番〜第７５番）、配列番号７（第１８番〜第１７４番）、配列番号８（第３９番〜第１１３番）、配列番号９（第５０番〜第９１番）、配列番号１０（第５３番〜第８８番）、配列番号１１（第１６６番〜第１８８番）、配列番号１２（第２０６番〜第２９５番）、配列番号１３（第２２５番〜第２５８番）、配列番号１４（第２２８番〜第２８４）等。
尚、この発明では、アミノ酸残基の置換・欠失・付加によりパーキン結合能が増強される場合には、上述の配列番号２〜１４に示す各アミノ酸配列における、少なくとも１アミノ酸残基と他種のアミノ酸残基との置換体、少なくとも１アミノ酸残基の欠失体、少なくとも１アミノ酸残基の付加体等を、それぞれ用いることができる。
【００１３】
（Ｂ群）次に示すＫｌｏｋｉｎ２の完全長アミノ酸配列とその部分配列（断片）を用いることができる。尚、配列番号１５はＫｌｏｋｉｎ２遺伝子ＤＮＡのＣＤＲの完全長塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列であり、配列番号１６はＫｌｏｋｉｎ２の完全長アミノ酸配列である。また、以下の配列番号１７から２０までは、配列番号１６に示すＫｌｏｋｉｎ２の完全長アミノ酸配列（Ｎ末端を占める第１番メチオニン残基からＣ末端を占める第１８４番グルタミン残基まで、即ち、第１番〜第１８４番）の部分配列（アミノ酸残基の第ｎ番から第ｍ番までの序数、第ｎ番〜第ｍ番のかたちで表記）の例示である：配列番号１７（アミノ酸残基の第５４番〜第１６８番）、配列番号１８（第１番〜第５３番）、配列番号１９（第５８番〜第１７０番）、配列番号２０（第１４６番〜第１５３番）等。
更に、この発明では、アミノ酸残基の置換・欠失・付加によりパーキン結合能が増強される場合には、上述の配列番号１６〜２０に示す各アミノ酸配列における、少なくとも１アミノ酸残基と他種のアミノ酸残基との置換体、少なくとも１アミノ酸残基の欠失体、少なくとも１アミノ酸残基の付加体等を、それぞれ用いることができる。
【００１４】
（Ｃ群）上記のＡ群及びＢ群にそれぞれ記載のアミノ酸配列の組合せあるいはこれ等のアミノ酸配列を保有のタンパク質の混合物。この発明では、これ等のアミノ酸配列の組合せやこれ等のアミノ酸配列を保有のタンパク質の混合物を用いることができる。
上記ＰＢＰの用途として、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患、例えば、弧発性パーキンソン病、家族性パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病等々の治療薬、診断剤、予防剤等を上げることができる。
【００１５】
（２）ＰＢＰ遺伝子ＤＮＡ：この発明では、上述したＡ群及びＢ群に記載の種々のＰＢＰアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いることができる。尚、これ等のアミノ酸配列からＤＮＡを設計する場合には、ＤＮＡの使用目的に合致するよう、コドンの縮重に基づき、ＰＢＰ遺伝子ＤＮＡの本来の塩基配列の一部を置換あるいは修飾することができる。
上記ＤＮＡの用途として、ＰＢＰの量産や遺伝子治療のためのＰＢＰ発現ベクター、遺伝子治療用のゲノムへのＰＢＰ遺伝子導入ベクター、診断用のプローブ、プライマー等を上げることができる。
【００１６】
（３）ＰＢＰ遺伝子ＤＮＡに相補的なＲＮＡ：この発明では、上述したＡ群及びＢ群に記載の種々のＰＢＰアミノ酸配列をコードするＤＮＡに相補的なＲＮＡを用いることができる。また、コドンの縮重に基づき、ＰＢＰ遺伝子ＤＮＡの本来の塩基配列の一部が置換あるいは修飾されたＤＮＡに相補的なＲＮＡも用いることができる。
上記ＲＮＡの用途として、ＰＢＰ遺伝子調節用のｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を上げることができる。
【００１７】
以下、参考例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の参考例や実施例だけに限定されるわけではない。
（参考例１）
ＰＢＰの新規性：
ＧｅｎＢａｎｋデータベースの検索によれば、Ｋｌｏｋｉｎ１はアクセッション番号、Ａｃｃ．ＡＫ０２６３３１に、また、Ｋｌｏｋｉｎ２は、Ａｃｃ．ＢＣ００２８７３にそれぞれ相当する。但し、Ａｃｃ．ＡＫ０２６３３１の機能は不明である。また、Ａｃｃ．ＢＣ００２８７３にはヒト核タンパク質Ｅ３−３、ｔｒａｎｓｃｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ１の記載が見られるが、その機能は不明である。以上の結果に基づき、この発明に係るＫｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２のパーキン結合能はいずれも、新規な機能であり、逆に、これ等のタンパク質は、ＰＢＰとして新規物質であると判断された。
【００１８】
（参考例２）
ＰＢＰの機能と作用効果：
Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２は共に、ミトコンドリアへの移行シグナルを有し、細胞内で発現させると単独でミトコンドリアに移行して同部に局在する。さらに通常の増殖状態にある細胞では、パーキンと結合した後、パーキンＰＢＰ複合体の形でミトコンドリア内部まで移行する。パーキンはミトコンドリアの転写・複製ならびに電子伝達系の機能を促進するが、パーキン単独ではミトコンドリアに移行できないことから、パーキンのミトコンドリアにおける機能発現にはＫｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２が不可欠である。以上の知見に基づき、ＰＢＰ（Ｋｌｏｋｉｎ）による増殖期細胞内パーキンのミトコンドリアへの移行のモデルを図１に示す。
図１の説明：細胞増殖期においては、ＰＢＰ（Ｋｌｏｋｉｎ）が出現し、Ｋｌｏｋｉｎと結合したパーキンはミトコンドリアに移行の後、ミトコンドア内膜内に侵入し、ミトコンドリア機能を促進する。他方、Ｋｌｏｋｉｎと結合できなかったパーキンはミトコンドリアに移行できず、細胞内で分解されるか、あるいはゴルジ複合体に局在し、ユビキチンリガーゼとして機能すると考えられる。尚、細胞分化期には、Ｋｌｏｋｉｎの発現が少ないため、パーキンはほとんどがゴルジ複合体あるいは細胞質に存在する。
【００１９】
（参考例３）
ＰＢＰの パーキン非依存性の作用：
Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２は、これ等の遺伝子内にミトコンドリア移行シグナルを有し、細胞質で合成された後、単独でミトコンドリアに移行することができる。Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２は、ミトコンドリア内において、外膜、内膜を通過し、ミトコンドリアの転写調節や機能発現の調節に関与している。
【００２０】
（参考例４）
ＰＢＰと疾患の病態との関連
（ａ）遺伝性パーキンソン病との関連：前述した通り、パーキンは常染色体劣性若年性パーキンソン病（ＡＲ−ＪＰ）の責任遺伝子であり、パーキン遺伝子の異常によりＡＲ−ＪＰが発症することが知られている（非特許文献１）。一方、Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の両遺伝子に異常が起こった場合にも、パーキン遺伝子が変異する場合と同様に、パーキンソン病を発症することが考えられる。従って、Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の両遺伝子は遺伝性パーキンソン病の責任遺伝子となりうるもので、この異常の有無を患者検体からスクリーニングすることは、同病の診断の有力な手段となり得る。
（ｂ） 孤発性パーキンソン病との関連：パーキン遺伝子欠損症ではパーキン蛋白の発現は全ての組織で欠損しているが、孤発性パーキンソン病の組織においてパーキンの発現は正常組織と同様に保たれている。従ってパーキンは孤発性パーキンソン病の病態とは無関係である。孤発性パーキンソン病は黒質緻密層のドーパミン産生細胞のミトコンドリア機能障害をきたしていることが知られている。Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２は、ミトコンドリアの転写調節や機能発現の調節をおこなっていることから、黒質におけるＫｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の発現の異常により、孤発性パーキンソン病が発症し得ることになる。従って、Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の発現の異常につき、中枢神経系をはじめとする種々の臓器及び末梢血単核球で検討することは孤発性パーキンソン病の診断に有用な手段となる。
（ｃ） その他の変性疾患との関連：ミトコンドリア機能障害は孤発性パーキンソン病のみならず、ミトコンドリア病、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病等、種々の変性疾患の病態に関連していることが知られている。これらの疾患においてもＫｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の発現の異常につき、種々の臓器ならびに末梢血単核球で検討することは、これ等の変性疾患の診断における極めて有用な情報となり得る。
【００２１】
（参考例５）
ＰＢＰと 疾患の治療との関連：
Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２は、パーキンと結合し、ミトコンドリアの転写調節や機能発現の調節をおこなっていることから、Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２の発見は、家族性および孤発性パーキンソン病、ミトコンドリア病、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病等、ミトコンドリア機能障害をきたす種々の変性疾患に係る治療の観点から、重要な意味をもたらす。即ち、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２とパーキンとの結合を増強する薬物、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２のミトコンドリアへの移行を促進する薬物、更に、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２の細胞内発現を促進する薬物はいずれも、上記の諸疾患の有力な治療薬となり得る。
【実施例１】
【００２２】
パーキン結合タンパク質（ＰＢＰ）遺伝子のクローニングとＰＢＰの同定とを次の通り行った。
ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム（ＢＤ  Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ＰＢＰ遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリーは、市販のヒト脳、骨格筋由来のもの及び神経芽細胞腫の細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にパーキンをトランスフェクションし、誘導された遺伝子ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを新たに作成したものを用いた。１次スクリーニンクで得られた１１８クローンについて、シークエンスを行い、ミトコンドリア移行シグナルの有無について検索した結果、このシグナルを有すると思われる１０クローンの遺伝子が得られた。
次に、これ等１０クローンの遺伝子をレポーター・ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｃ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入し、パーキン−Ｈｉｓ（使用ベクターはｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＷａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社製）のｓｔａｂｌｅ発現細胞であるＲＤ（ヒトｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ由来）に導入し、抗ＧＦＰ／Ｈｉｓ抗体による免疫沈降を行った。その結果を図２に示す。パーキンと結合する２つの新規なタンパク質、Ｋｌｏｋｉｎ１とＫｌｏｋｉｎ２が同定された。
図２の説明：Ｋｌｏｋｉｎ１及び２の各遺伝子を挿入のレポーター・ベクターを導入後、培養した上記ＲＤ細胞を、１重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で可溶化した。この可溶化細胞成分に抗Ｈｉｓ抗体（マウス・モノクローナル抗体）又は抗ＧＦＰ抗体（ラット・ポリクローナル抗体）を添加混合の後、プロテインＧ−アガロースで沈降させた。次いで、抗Ｈｉｓ抗体又は抗ＧＦＰ抗体を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。
（ａ）写真上段は、抗Ｈｉｓ抗体添加→プロテインＧ−アガロース沈降→抗ＧＦＰ抗体使用のウエスタン・ブロッティングの写真である。レーン１は抗Ｈｉｓ抗体添加、レーン２は正常マウス血清添加、及びレーン３は比較対照（免疫沈降なし）の可溶化細胞成分。レーン１と３に見られる分子量の同一性からパーキン−Ｈｉｓと共に、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２が沈降したことは明白である。
（ｂ）写真下段は、抗ＧＦＰ抗体添加→プロテインＧ−アガロース沈降→抗Ｈｉｓ抗体使用のウエスタン・ブロッティングの写真である。レーン１は抗ＧＦＰ抗体添加、レーン２は正常ウサギ血清添加、及びレーン３は比較対照（免疫沈降なし）の可溶化細胞成分。レーン１と３に見られる分子量の同一性から、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２と共に、パーキン−Ｈｉｓが沈降したことは明白である。
更に、Ｋｌｏｋｉｎ−ＧＦＰを培養細胞（ＣＯＳ−１）に発現させた。その結果を図２に示す。発現された２つのタンパク質、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２は共に、細胞質に検出された。このＧＦＰシグナルはミトコンドリアに対する特異的プローブであるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（１００ｎＭ）添加のシグナルに一致していたことより、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２は共にミトコンドリアに選択的に局在することが明らかとなった。
図３の説明：写真上段はＫｌｏｋｉｎ１−ＧＦＰ、下段はＫｌｏｋｉｎ２−ＧＦＰの発現をそれぞれ示す。Ｋｌｏｋｉｎ−ＧＦＰとＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ両画像の重ね合わせ画像（Ｍｅｒｇｅ）に見られる通り、Ｋｌｏｋｉｎ−ＧＦＰシグナルはミトコンドリアの前記Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓシグナルに一致していた。
【実施例２】
【００２３】
パーキン結合タンパク質（ＰＢＰ）の細胞内局在性、及びミトコンドリアへの移行性を次の通り検定した。
＜材料と方法＞
（ａ）抗Ｋｌｏｋｉｎ１及び２各抗体の作成
Ｋｌｏｋｉｎ１及び２蛋白を構成する各完全長アミノ酸配列の部分配列、Ｋｌｏｋｉｎ１：ＧＰＧＰＰＥＬＧＲＤＴＧＲＦＤＲＱ（配列番号２に記載の第１９６番−第２１２番アミノ酸配列）；及びＫｌｏｋｉｎ２：ＣＰＰＶＥＬＰＷＡＰＲＲＧＨＲＬＳＰ（配列番号１６に記載の第１９番−第３６番アミノ酸配列）をそれぞれペプチド合成し、ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン：ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）コンジュゲートをＪａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ（白ウサギ）に免疫し、7回免疫の後、全採血を行った。得られた血清を、免疫原ペプチド結合ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いてアフィニティー精製し、抗体として使用した。
（ｂ）培養細胞、及びヒト末梢血における内因性蛋白の発現
イムノブロット：
健常者より採取した末梢単核球及び血漿、培養細胞であるＲＤ細胞の細胞画分を採取し、抗Ｋｌｏｋｉｎ１及び２各抗体を用いたイムノブロットを行った。
蛍光抗体法：
ＲＤ細胞、生検骨格筋細胞において、抗Ｋｌｏｋｉｎ１及び２各抗体、抗パーキン抗体、抗ミトコンドリア抗体を用いた免疫蛍光2重染色を行った。
（ｃ）ミトコンドリアへの移行性
Ｋｌｏｋｉｎ１及び２の各遺伝子並びにパーキン遺伝子をそれぞれ個別にｐＥＴ１５ｂベクターに導入し、大腸菌ＢＬ２１により大量培養した。大腸菌は６Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファーで可溶化した後、Ｎｉキレートカラム、及びＱ・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。また、ヒト横紋筋肉腫由来の培養細胞であるＲＤ細胞のミトコンドリア分画を採取し、上記で得られたＨｉｓタグを有するＫｌｏｋｉｎ１及び２、並びにパーキンを添加した。１ｍｇミトコンドリア分画に対し、１５−２５μｇのリコンビナント蛋白を添加し、２５℃で２０分間、放置した後、その一部をｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２ｍｇ／ｍｌ、１５分）で処理した。遠心（９，０００ｇ、１０分）した後、得られたペレットにつき抗Ｈｉｓ抗体を用いてイムノブロット解析を行った。
＜結果＞
（ａ）培養細胞及びヒト末梢血における内因性蛋白の発現
イムノブロット：
筋細胞系培養細胞ＲＤにおけるＫｌｏｋｉｎ１及び２の各発現は共に、ミトコンドリアで認められた（図４）。尚、核分画ではＫｌｏｋｉｎ２と共通のエピトープを有する別の複数の蛋白が検出された。末梢血単核球（ＰＭＢＣ）ではＫｌｏｋｉｎ１の発現は認められたが、Ｋｌｏｋｉｎ２の発現は見られなかった（図５）。また、血漿ではどちらの発現も認められなかった（図５）。
蛍光抗体法：
ＧＦＰ−Ｋｌｏｋｉｎ１及び２をそれぞれ個別に導入したＣＯＳ−１細胞を、抗Ｋｌｏｋｉｎ１及び２各抗体で染色した結果、ＧＦＰ−Ｋｌｏｋｉｎ１及び２の各シグナルと、抗Ｋｌｏｋｉｎ１及び２各抗体で検出されたシグナルは完全に一致した（図６）、これより、これ等の抗体はＫｌｏｋｉｎ１及び２にそれぞれ特異的に反応したものと考えられた。
また、作成した抗体で検出された内因性Ｋｌｏｋｉｎ１及び２の各シグナルは、ミトコンドリア電子伝達系複合体３のシグナルとほぼ同じ部位で検出された（図７）、これより、内因性Ｋｌｏｋｉｎ１及び２がそれぞれミトコンドリアに局在することが示唆された。
（ｂ）ミトコンドリアへの移行性（図８）
ミトコンドリア存在下あるいは非存在下でｂｕｆｆｅｒにＨｉｓタグを付加したパーキン及びＫｌｏｋｉｎ１と２をそれぞれ添加した後、遠心し、ペレットを抗Ｈｉｓ抗体でイムノブロットした結果は、次の通りであった：ミトコンドリア非存在下（ｌａｎｅｓ７−１２）ではｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理によりパーキン及びＫｌｏｋｉｎ１と２は完全に分解された（ｌａｎｅｓ８−１０）。ミトコンドリア存在下では、パーキン及びＫｌｏｋｉｎ１と２は、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理にも拘わらず、バンドが検出されたことより（ｌａｎｅｓ１−３）、これらの蛋白がミトコンドリア内に移行したことが示唆された。パーキンのミトコンドリアへの移行性はＫｌｏｋｉｎ１及び２の各存在で著明に増加した（ｌａｎｅｓ４−６）。
＜結論＞
以上の結果に基づき以下（ａ）〜（ｅ）が明確になった。
（ａ）作成した抗体はそれぞれ特異的にＫｌｏｋｉｎ１及び２と反応する；
（ｂ）内因性Ｋｌｏｋｉｎはミトコンドリアに局在している；
（ｃ）末梢血リンパ球でもＫｌｏｋｉｎは発現している；
（ｄ）Ｋｌｏｋｉｎ１及び２はミトコンドリアへ良好な移行性を示す；
（ｅ）パーキンは単独でもミトコンドリア内に移行するが、Ｋｌｏｋｉｎ１又は２の存在下ではさらに移行性が増強する。
換言すれば、パーキンは常染色体劣性若年性パーキンソン病の（ＡＲ−Ｊ）責任遺伝子であり、パーキン遺伝子の異常によりＡＲ−ＪＤが発症することが知られている。一方、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２各遺伝子に異常が起こった場合にも、パーキン遺伝子が変異する場合と同様に、パーキンソン病を発症することが考えられる。従って、Ｋｌｏｋｉｎ１及びＫｌｏｋｉｎ２各遺伝子は遺伝性パーキンソン病の責任遺伝子となりうるものある。また、孤発性パーキンソン病においてもＫｌｏｋｉｎ１及び２各蛋白の発現異常が病態に関連している可能性があるので、上記の抗体を用い、この異常の有無を患者検体からスクリーニングすることば、同病の診断の有力な手段となり得るものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
この発明に係るＰＢＰに由来のタンパク質、ペプチド、抗原、抗体、パーキン結合活性ドメイン、ＰＢＰ遺伝子ＤＮＡに由来のプローブ、プライマー、パーキン結合活性ドメインをコードする遺伝子ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等々は、ミトコンドリア機能障害をきたす変性疾患、例えば、弧発性パーキンソン病、家族性パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病等の基礎及び応用研究用試薬、診断剤、治療薬、予防剤等に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＰＢＰの機能とパーキンとの関係を示す模式図である。
【図２】ウエスタン・ブロッティングによるＰＢＰの同定を示す写真である。
【図３】ＰＢＰのミトコンドリアにおける局在を示す顕微鏡写真である。
【図４】遺伝子導入ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのＰＢＰの発現を示す顕微鏡写真。
【図５】末梢血におけるＰＢＰの発現を示す写真。
【図６】遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞でのＰＢＰの発現を示す顕微鏡写真。
【図７】遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞内でのＰＢＰの局在を示す顕微鏡写真。
【図８】ＰＢＰのミトコントリアへの移行性を示す写真と図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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