(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子を特異的かつ高感度で検出することができるプライマーセットを提供する。【解決手段】特定なる配列のプライマーセットの６またはそれ以上を含む、ＨＰＶを検出するためのキット、ならびに、試料から得られたＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写により調製したｃＤＮＡをテンプレートとして該キットを用いて、ポリマラーゼ連鎖反応を行い、試料におけるＨＰＶを特異的に検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２１および配列番号２２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３３および配列番号３４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１７からなる群より選択される６またはそれ以上のプライマーセットを含む、ＨＰＶを検出するためのキット。
【請求項２】
それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５からなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーセットを含む、請求項１記載のキット。
【請求項３】
それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５を含む、請求項１記載のキット。
【請求項４】
各々が配列番号１−３４に記載の塩基配列からなる３４種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１記載のキット。
【請求項５】
試料におけるＨＰＶの存在または発現を検出する方法であって、前記試料から得られたＤＮＡまたは前記試料から得られたｍＲＮＡから逆転写により調製したｃＤＮＡをテンプレートとして、請求項１−４のいずれかに記載のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして、増幅されたＨＰＶ遺伝子を検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＰＶ遺伝子を検出するための特異的プライマーセット、およびこれを用いるＨＰＶ遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、パポバウイルス科に属するＤＮＡウイルスであり、疣などの皮膚疾患や子宮頸部発癌と深く関与しており、実際子宮頸癌のほとんどからＨＰＶが検出されている。ＨＰＶは約８０００塩基対のゲノムＤＮＡを持ち、その塩基配列の違いから１００種類以上のサブタイプが報告されている。それらのサブタイプは、大きく皮膚病変に関与する皮膚型と、子宮頸部病変に関与している粘膜型に大別される。さらに、粘膜型と言われるＨＰＶサブタイプは、子宮頸部において前癌病変から癌へ移行する危険性からハイリスク型、中間型、ローリスク型の３つに分類される。
【０００３】
前癌病変の細胞診や組織診において、ＨＰＶに感染している細胞が、多核化・核異型・錯角化・大型化などとともに、異型核周囲に空胞（hollow）を伴った細胞コイロサイトーシスと呼ばれる異型細胞であることが古くから知られている。しかしながら、近年の遺伝子検査により、コイロサイトーシスの存在の有無に関わらずＨＰＶ ＤＮＡが検出され、異形成という子宮頸癌の前癌病変そのものがＨＰＶ感染によって発生することが言われている。したがって、細胞診検査によるコイロサイトーシスや異形成の検索よりも、ＨＰＶ遺伝子検査のほうが、より早い時期に確実に子宮頸部病変を捕らえることが可能である。
【０００４】
ＨＰＶ遺伝子検査の方法には、主にＰＣＲの増幅を伴う方法と増幅を経ないで直接検出する方法が存在する。
【０００５】
遺伝子増幅を伴わない方法の代表的なものはダイジーン社のハイブリッドキャプチャー法である。この方法は、ＨＰＶのＤＮＡにＲＮＡプローブをハイブリダイズさせた二本鎖をＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を認識する抗体を用いて検出する方法であるが、増幅を伴わないので、大量のサンプル細胞が必要であり、感度は高くない。さらに、非特異的な反応も出やすいため、さらによい方法が求められている。また、このキットはハイリスク・ローリスクの分類を行う目的で使用され、各型を同定することはできない。
【０００６】
ＰＣＲによる増幅を伴う方法としては、増幅の後、制限酵素で切断し電気泳動でバンドを検出するＰＣＲ−ＲＦＬＰ法と、プローブを搭載したＤＮＡアレイ（チップ）を用い、ラベルしたプローブをハイブリダイズさせシグナルを検出する方法に大別される。
【０００７】
電気泳動的に検出するＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は検出感度がそれほど高くないが、技術的には簡便であり、特殊な機器を必要としないために、コストも安く抑えることができる。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法はＰＣＲ産物を複数のチューブに分注し、複数の制限酵素を用い電気泳動を行う方法である。従って、１検体あたり５〜８種類のチューブの操作が必要であるため作業が煩雑であり、また、サンプル中に複数のＨＰＶが存在する場合、予想される切断パターンとは異なるパターンが得られるために、ＨＰＶの型を同定することはできない。近年、ＨＰＶの複数の型による重複感染が日常的に起きていることが示されており、重複感染を解析したいという臨床現場のニーズは高まっているが、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による検査では、感染した型を同定する目的は完全には達成できない。
【０００８】
後者のハイブリダイゼーションを用いた方法は、検出感度が高く同定の特異性が高いが、ターゲットの調整やハイブリダイゼーション、洗浄、検出全ての工程において時間がかかる。また、プローブを搭載したＤＮＡアレイ（チップ）の作製にコストがかかり、特殊な機器を必要とするために、汎用性が低い。一般的な市中病院の検査室レベルで導入可能な機器は現在存在しない。
【０００９】
したがって、検査の現場においては、ＨＰＶの検出およびタイピングを迅速、簡便かつ低コストで行うことができる方法が求められている。
【００１０】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】特開２００４−１２１２４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、複数の型のＨＰＶ遺伝子を特異的かつ高感度で検出することができるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１７種類のＨＰＶを同時に特異的に検出することができるＰＣＲプライマーセットを含むキットを提供する。該キットは、下記の表１に示されるプライマーセット１−１７からなる群より選択される６またはそれ以上のプライマーセットを含む。
【００１３】
【表１】
2006345800.tif 000002
【００１４】
すなわち、本発明のキットは、それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２１および配列番号２２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３３および配列番号３４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１７からなる群より選択される６またはそれ以上のプライマーセットを含む。
【００１５】
本発明のキットに含まれる各プライマーセットは、これらのプライマーセットを一緒に混合して用いた場合にも、各ＨＰＶ遺伝子を特異的に増幅させることができ、かつＨＰＶの型により長さの異なる増幅産物を与えるよう選択されている。したがって、１つの試験管内でマルチプレックスＰＣＲを行い、１本のレーンで電気泳動を行って、増幅産物の長さを調べることにより、多数のＨＰＶについて同時にその存在または非存在を調べることができる。
【００１６】
下記の実施例に示されるように、表１に示される１７種類のプライマーセットおよび内部対照および外部対照プライマーをすべて混合して、１６種類のＨＰＶのゲノムの混合物をテンプレートとしてＰＣＲを行ったときに、すべての型のＨＰＶについて特異的な増幅産物が得られ、電気泳動で長さの異なるバンドとして確認された（図１）。このことは、表１に示される１７種類のプライマーセットのうち、検出すべきＨＰＶの型の数に応じて、任意の２組、３組、４組、ないしそれ以上の組のプライマーセットを選択して、マルチプレックスＰＣＲと増幅産物の電気泳動を行うことにより、サンプル中に存在するＨＰＶ遺伝子を同定することが可能であることを示す。
【００１７】
好ましくは本発明のキットは、上記の表１に示されるプライマーセット１−１７からなる群より選択される７またはそれ以上のプライマーセット、より好ましくは８またはそれ以上、さらに好ましくは９またはそれ以上、最も好ましくは１０またはそれ以上のプライマーセットを含む。
【００１８】
さらに好ましくは、本発明のキットは、子宮頸癌との関連性が示唆されているＨＰＶ１６、１８、３１、５１、５２、５６および５８の１つまたはそれ以上を検出しうるプライマーセットを含む。すなわち、本発明のキットは、以下のプライマーセットの少なくとも１つを含むことが好ましい：それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５。
【００１９】
さらにより好ましくは、本発明のキットは、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５を含む。
【００２０】
最も好ましくは、本発明のキットは、各々が配列番号１−３４に記載の塩基配列を有する３４種類のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
別の観点においては、本発明は、試料におけるＨＰＶの存在を検出する方法を提供する。該方法は、前記試料から得られたＤＮＡをテンプレートとして、上述の本発明のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして、増幅されたＨＰＶ遺伝子を検出することを含む。試料におけるＨＰＶの発現を検出するためには、前記試料からｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した後、上述と同様にしてＨＰＶ遺伝子を増幅し、これを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のヒトパピローマ検出用キットは、上記の表１に示される６種類以上のプライマーセットを含む。本発明にしたがえば、各プライマーセットを混合物として用いた場合でも、特定の型のＨＰＶを特異的に検出することができる。後述の実施例に示されるように、本発明のプライマーセット１−１７は、それぞれの標的ＨＰＶに対する特異性が高いため、これらを混合して１つの試験管内でマルチプレックスＰＣＲ反応を行った場合に、試料中に存在する特定の型のＨＰＶ遺伝子を特異的に増幅することが可能である。また、各プライマーセットは異なる長さの増幅産物が得られるように設計されているため、ＰＣＲ反応生成物を１つのレーンで電気泳動で分離することにより、試料中に存在する特定の型のＨＰＶ遺伝子を特異的に検出することが可能である。本発明は多検体の検査を行う上で必要な、簡便性・迅速性・低コスト性の３要素を満たしている有用な方法である。
【００２３】
日常的に行われている婦人科細胞診検査は、ＨＰＶ遺伝子検査と併用することで、さらに効果的であることが最近報告されている。すなわち、細胞診検査は形態学的特徴で細胞の状態を判定する技術であるが、肉眼で判断するために、結果が主観的になる可能性がある。細胞診の主観的定量検査に対し、本発明によるＨＰＶ遺伝子検査は、ＨＰＶの有無のみならず、ＨＰＶの型の同定まで行うことができるため、客観的な定性検査を行うことが可能である。したがって、ＨＰＶ遺伝子検査は、細胞診検査の補助データとしても、単独のデータとしても非常に有効である。
【００２４】
マルチプレックスＰＣＲ法は、プライマーミックスを用いてＰＣＲを行う方法である。本発明にしたがう各プライマーセットは、複数のＰＣＲ産物の増幅が存在する場合でも、増幅産物が異なるサイズになるように設計されている。したがって、電気泳動でサイズを分画することで、特定の増幅産物の検出が可能である。さらに、複数の型のＨＰＶが存在する場合でも、それぞれの型について増幅産物を検出することができる。１サンプルに対し1本のチューブでＰＣＲを行い、１本のレーンで電気泳動を行うことにより、そのサンプル中に含まれるターゲット遺伝子が同定できるため、本発明の方法は多検体処理に向いている。しかも、ハイブリダイゼーション等の操作を必要としないため、コストを安く抑えることができ、検査時間も短い。また、検査の現場においても特別な訓練を必要とせず実施が可能である。
【００２５】
ＨＰＶ遺伝子検査は、臨床サンプルを用いた検査であるため、実験的な精度管理が非常に重要である。そのために、マルチプレックスＰＣＲの増幅ターゲットとして、内部標準、外部標準を設定することが好ましい。
【００２６】
内部標準としては、臨床検体中に存在するヒトゲノムＤＮＡに必ず含まれる遺伝子を選択する。ＨＰＶが存在しない場合でもヒトゲノムＤＮＡが存在すれば必ずバンドが検出されるはずであるので、ＤＮＡ抽出の陽性コントロールとして用いることができる。外部標準としては、任意のＤＮＡを、その内部領域を増幅するプライマーセットと共に、反応液に添加して用いる。これにより、外部標準の増幅は必ず起こるはずであるので、増幅反応の陽性コントロールとして用いることができる。
【００２７】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製  Model 394）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【００２８】
本発明のプライマーセットを用いて試料におけるＨＰＶ遺伝子の存在を検出するためには、試料からＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＨＰＶ遺伝子を増幅させる。試料としては、ＨＰＶに感染していると疑われる被験者から得られた組織試料、生検、スメア等を用いることができる。さらに、採取した細胞から密度勾配遠心操作により、通常ＨＰＶが感染する子宮頸部扁平上皮細胞を濃縮して用いることもできる。あるいは、培養細胞、例えばＨｅＬａ細胞等を用いてもよい。本発明にしたがってＨＰＶ遺伝子の存在を検出することが有用であると考えられる対象疾病には、いぼ、上皮内新生物、皮膚癌、口腔・口咽頭癌、性器新生物、子宮頸癌、コンジローム、乳頭腫が含まれる。
【００２９】
試料からＤＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出や、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる抽出により行うことができる。あるいは、カラムキット（GENERATION（登録商標） Capture Column Kit Gentra）による抽出を行ってもよい。
【００３０】
さらに、本発明のプライマーセットは、ＨＰＶ遺伝子のコーディング領域中の配列が増幅されるよう選択されているため、試料におけるＨＰＶ遺伝子の発現を検出するために用いることができる。ＨＰＶ遺伝子の発現を検出するためには、試料からＲＮＡを抽出して鋳型ｃＤＮＡを調製し、これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、試料中で発現されているＨＰＶ遺伝子を増幅させる。
【００３１】
試料からＲＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、グアニジン−イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出を用いることができる。あるいは市販のＲＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００３２】
ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法も当該技術分野においてよく知られている。プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することができる。逆転写酵素としては、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いることができる。
【００３３】
次に、このようにして調製したＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとして、本発明のプライマーセットの混合物をプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ポリメラーゼとしては例えばＥｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ）、Ｚ−Ｔａｑ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｍ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるポリメラーゼ等を用いることができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当該技術分野においてよく知られており、当業者は、プライマーの長さやＧＣ含量、目的とする特異性や感度、用いるポリメラーゼの特性等に基づいて、最適な条件を選択することができる。例えば、下記の実施例においては、９５℃で１５分間、次に９４℃で３０秒間、７０℃で１．５分間、７２℃で１分間を３５サイクル、次に７２℃で２分間でＰＣＲを実施した。また、所定の検出感度を達成し、かつ、ウイルスの型による検出感度のばらつきが少なくなるように、ＰＣＲ溶液中に含めるプライマーの量を適宜調節することができる。
【００３４】
次に、増幅産物を電気泳動で分離し、バンドの長さを判定することにより、試料中における各ＨＰＶの存在または非存在を検出することができる。
【００３５】
本発明のキットは、１７種類のＨＰＶに対応するプライマーセットを一緒に混合して用いて、各ＨＰＶ遺伝子を特異的に増幅させることができることを特徴とする。さらに、本発明のプライマーは、ＨＰＶの型により長さの異なる増幅産物をあたえるよう設計されている。すなわち、１つの試験管内でＰＣＲを行い、１本のレーンで電気泳動を行って、増幅産物の長さを調べることにより、１７種類のＨＰＶについて同時にその存在または非存在を調べることができる。このため、型特異的プライマーを用いて別々の試験管内でＰＣＲを行う従来技術の方法と比較して、アッセイが簡単であり、アッセイに要する時間、費用および試料が少なくてよいという利点を有する。また、多重感染の場合、すなわち試料中に複数種類のＨＰＶが存在する場合でも、これらを同時に検出することが可能である。
【００３６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
プライマーの設計
ＨＰＶをはじめとして、臨床検査における遺伝子検査は、大量のヒトゲノムＤＮＡやその他のウイルス・微生物などのＤＮＡが存在する中から目的のウイルスのＤＮＡの存在を検出する必要があり、そのためには、配列の特異性が高く設計されている必要がある。
【００３８】
また、プライマーをミックスして用いることから、プライマーダイマーを生じにくいように、プライマー間の特異性が高いプライマーを設計する必要がある。さらに、相同性の高いＨＰＶの複数のサブタイプを特異的に同定することができるプライマーを設計することは、非常に困難である。ＨＰＶの場合、普通にプライマー設計を行っただけでは、他のいずれかのタイプのＨＰＶの配列とおおよそ７割以上の割合でマッチしてしまうことがほとんどである。したがって、非特異的増幅が起きないように、注意深くプライマーを設計することが必要である。
【００３９】
本発明にしたがうＨＰＶのマルチプレックスＰＣＲ法による遺伝子検査では、バンドのサイズによってサブタイプの同定を行うため、あらかじめＰＣＲ産物のサイズを変えて設計しなければならない。電気泳動によるＰＣＲ産物の分離は、最低１０〜２０塩基は離れなければ十分なの分解能が得られないため、ターゲット数が増えれば増えるほど緻密な設計が求められる。つまり、プライマー特異性を極限まで上げるのと同時に、バンドのサイズを数塩基単位で調節する必要があり、同定するターゲットの数が増えれば増えるほど、困難さは相対的に増加していくことになる。
【００４０】
上記の要因を考慮しないで、ランダムにプライマーを設計しても、１６種の型のＨＰＶに対するプライマーをミックスした状態で、全く非特異的交差反応無しで、サンプル中に存在するＨＰＶをバンドで検出することはほぼ不可能である。上記のような特異性の高いプライマーを得るためには、インシリコ／インビトロの両者での特異的増幅のチェックを同時に行いながら、プライマーセットを最適化することが必須である。全く配列の異なる遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ法による同定において、数個のターゲットを増幅させた例は報告されているが、６個以上のターゲットを特異的に増幅確認できる系はほとんど知られていない。特に、ＨＰＶのように相互に相同性の高いウイルスについては、増幅産物の長さによって型を区別することができるマルチプレックスＰＣＲ系は知られていない。マルチプレックスＰＣＲ法においてターゲットの数を増やし難いもっとも大きな理由は、インシリコ／インビトロいずれにおいても非特異的な増幅を全てチェックするのに非常に手間がかかり、時間、コストを要するということである。
【００４１】
インシリコでのチェックでは、設計したプライマーに似た配列が他のサブタイプの配列に存在しないことをチェックする。このとき、領域を絞って設計しようとすると、プライマーとして利用可能な領域を限定することになり、プライマーの候補が見つからない場合も多くある。そこで、あるＨＰＶに対して設計したプライマーの配列を、他の全てのサブタイプのＨＰＶの配列に対して検索をかけ、ミスマッチ率（％）でプライマーの候補を選出した。上記の操作を数十回繰り返し、全ての候補プライマーを選出した。候補プライマーが得られない場合は条件設定を変更し、最終的に候補プライマーを選出した。
【００４２】
次に、これらの候補プライマーセットを用いて、１６種類のＨＰＶのそれぞれのゲノムをテンプレートとして含むサンプルおよびこれらのゲノムを混合したテンプレートミックスを含むサンプルを用いて、ＰＣＲを行い、予想されるサイズに特異的にバンドが見られることを確認した。非特異的増幅が見られた場合、そのプライマーセットは排除し、再びインシリコの検証を行い、プライマーを再設計した後、特異性を確認した。このインシリコとインビトロの検証サイクルを数十回繰り返し、最適化を行った結果、表１に示されるプライマーセットの組を選択した。
【００４３】
ＨＰＶ遺伝子検査は、臨床サンプルを用いた検査であるため、実験的な精度管理が非常に重要である。そのために、マルチプレックスＰＣＲの増幅ターゲットとして、内部標準、外部標準を設定した。内部標準としてはALAS1（aminolevulinate, delta-, synthase 1、NM＿000688）のゲノム領域を用いた。外部標準としては、Brevundimonas diminuta (syn. Pseudomonas diminuta)のゲノムＤＮＡをクローン化したプラスミドを、その内部領域を増幅するプライマーセットと共に、反応液当たり１０4コピーの量を添加して用いた。
【００４４】
これらの内部標準・外部標準を含め、合計１９種のターゲットを増幅できる、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーを設計することができた。これらの１９組のプライマーセットの混合物を用いて、１６種のＨＰＶの型のバンドサイズによる同定が可能になった（図１）。ＰＣＲ増幅産物は、クローニングとシーケンス解析を行い、目的の型のＨＰＶ遺伝子の塩基配列であることを確認した。
【００４５】
次に、市販の種々のポリメラーゼを用いて、ＰＣＲの温度条件を様々に変化させて、条件の最適化を行った。その結果、ＱＩＡＧＥＮのＭ−ＰＣＲキットを用いて、９５℃で１５分、次に、９４℃で３０秒、７０℃で１．５分、７２℃で１分を３５サイクル、７２℃で２分の条件でＰＣＲを行ったときに、反応液当たり１０2コピーの感度ですべての型のＨＰＶの存在がバンドとして確認できた（図２）。
【実施例２】
【００４６】
臨床サンプルにおけるＨＰＶの検出
臨床サンプルとしては、細胞診検査を行う検体の一部を材料として用い、密度勾配遠心分離により上皮細胞を濃縮した。細胞数が多い場合はカラムキット（GENERATION（登録商標） Capture Column Kit Gentra）を用いて、細胞数が少ない場合は、フェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行うことにより、ＤＮＡ抽出を行った。
【００４７】
フェノールクロロフォルム抽出を使用してＤＮＡ抽出を行った場合には、以下の組成のＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲマスターミックス  12.5
プライマーミックス      4 
テンプレート            1 
外部標準プラスミド      1 
DDW                  6.5      
計          25μｌ
【００４８】
カラム抽出キット（GENERATION（登録商標） Capture Column Kit  Gentra）を使用してＤＮＡ抽出を行った場合には、以下の組成のＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲマスターミックス  12.5
プライマーミックス      4 
テンプレート            5 
外部標準プラスミド      1 
DDW                  2.5      
計          25μｌ
【００４９】
ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮのＭ−ＰＣＲキットを用いて行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で１５分、次に、９４℃で３０秒、７０℃で１．５分、７２℃で１分を３５サイクル、７２℃で２分、最後に４℃とした。得られた増幅産物は、キャピラリ式電気泳動装置として、バイオアナライザ（アジレントテクノロジー社）を使用して解析した。
【００５０】
細胞診の日母分類による診断結果と、ＨＰＶ陽性率の関係を調べたところ、非常に高い相関が見られた（表２）。
【００５１】
【表２】
2006345800.tif 000003
【００５２】
細胞診陰性のクラスIではＨＰＶ陽性率4.2％であった。クラスIIで20.6％であったのに対し、クラスIIIは88.2％と顕著に増加傾向が見られた。さらにIIIｂでは85.7％、IV、Vでは100％と、細胞診結果と感染率の間には明確な関連が見られた。
【００５３】
さらに、米国の分類法であるベセスダシステムによる分類では、HSIL（クラスIIIaの中で中等度以上の核異型性と、クラスIV、Vをまとめた分類）の中では陽性率が96.9％（31/32）とほぼ100％に近い陽性率を示した（表３）。
【００５４】
【表３】
2006345800.tif 000004
【００５５】
クラスIIIは、形態学的に核の異形成を伴う細胞が含まれる場合に分類される。異形成とは、形態学的に捉えた場合、核の大きさ／細胞質の広さ（N/C）や、クロマチンの量に異常が見られることである。そもそも細胞診検査自体が、形態学を突き詰めていった学問であるので、細胞検査士によって判定が異なる場合もある。ＨＰＶ検査は人間の主観によらず、感染細胞の有無を定性的に調べることができるため非常に有益であることが示された。
【００５６】
注目すべきは、細胞診で陰性とされる、クラスI、IIにおいても10〜20％のＨＰＶ陽性率が見られたことである。このことは、細胞診の判定結果が陰性でも、ＨＰＶタイピングを行うことで、その後核異型成の進行をフォローすることで、少しでも早く子宮頸癌の発見が可能になり、治療法の選択などで有利になることを示唆するものである。
【００５７】
重複感染を同定した結果を示す（図３）。このように複数の型のＨＰＶが存在した場合に、１段階の方法でバンドサイズにより明確に型を同定することができた。
【００５８】
細胞診検体を多検体解析した結果、全陽性検体中の３割弱に複数の感染が確認された。中には、４種の型が同時感染している検体も確認された。これらのことは、ＨＰＶの重複感染は日常的に生じていることが示唆している。
【００５９】
以上の結果から、本発明のＨＰＶ検出キットを用いて、マルチプレックスＰＣＲにより、臨床サンプルからＨＰＶを特異的に検出しうることが示された。さらに重複感染も検出しうることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明のＨＰＶ検出キットを用いるＨＰＶ遺伝子増幅時における型特異性の検証の結果を示す。
【図２】図２は、本発明のＨＰＶ検出キットを用いる検出感度の検証の結果を示す。
【図３】図３は、本発明のＨＰＶ検出キットを用いる重複感染の検出の結果を示す。
【図１】
2006345800.tif 000005
【図２】
2006345800.tif 000006
【図３】
2006345800.tif 000007
【配列表】
2006345800000001.app