(57)【要約】【課題】イオンビーム処理またはプラズマ処理を施すことによって得られる樹脂基板表面の親水性の向上効果を長期に亘って維持すること。【解決手段】疎水性高分子基材をプラズマ処理またはイオンビーム処理した後、該基材を水中または真空中に配置することを特徴とする、疎水性高分子基材表面の親水性維持方法、ならびにプラズマ処理またはイオンビーム処理された疎水性高分子基材を格納したパッケージであって、該基材が該パッケージ内で水中または真空中に保存されてなるパッケージ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性高分子基材をプラズマ処理またはイオンビーム処理した後、該基材を水中または真空中に配置することを特徴とする、疎水性高分子基材表面の親水性維持方法。
【請求項２】
前記プラズマ処理が不活性ガス下で行われるものであるか、またはイオンビーム処理がイオン化ガスとして不活性ガスを用いるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性高分子が、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンおよびポリ乳酸からなる群より選ばれたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性高分子基材が核酸マイクロアレイ用の基材である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プラズマ処理またはイオンビーム処理された疎水性高分子基材を格納したパッケージであって、該基材が該パッケージ内で水中または真空中に保存されてなるパッケージ。
【請求項６】
前記プラズマ処理が不活性ガス下で行われるものであるか、またはイオンビーム処理がイオン化ガスとして不活性ガスを用いるものである、請求項５に記載のパッケージ。
【請求項７】
前記疎水性高分子が、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンおよびポリ乳酸からなる群より選ばれたものである、請求項５または６に記載のパッケージ。
【請求項８】
前記疎水性高分子基材が核酸マイクロアレイ用の基材である、請求項５〜７のいずれか１項に記載のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性高分子基材表面の親水性を維持する方法に関する。より詳細には、本発明は、疎水性高分子基材をプラズマ処理またはイオンビーム処理することによって向上した基材表面の親水性を長期に亘って維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析プロジェクトの進展により、種々の生物ゲノムの全塩基配列が解読され、これらの塩基配列情報をもとにして、遺伝子の発現パターンや遺伝子産物の機能を全ゲノムレベルで調べるための新たなプロジェクトが進められている。ＤＮＡチップは、これらの機能解析プロジェクトを飛躍的に進展させるための手段として開発され、ヒト、マウス、酵母等の全遺伝子のジェノタイピングや遺伝子の発現解析にＤＮＡチップ技術が用いられている。
【０００３】
現在用いられているＤＮＡチップ（あるいはＤＮＡマイクロアレイ）を作製する方法は、大別してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社方式とスタンフォード方式とがある。前者の方法によるＤＮＡチップは、フォトリソグラフィーと光照射化学合成を組み合わせてガラス基板上で２０〜２５マー程度のオリゴヌクレオチドを高密度に合成することにより作製される（特許文献１〜３を参照）。後者の方法によるＤＮＡチップは、典型的には、予め調製されたＤＮＡ断片をスライドガラス上に高密度にスポットすることにより作製される（特許文献４および５を参照）。
【０００４】
一方、ガラス基板の代わりに、種々の樹脂を用いたバイオチップも検討されている（特許文献６を参照）が、未処理の樹脂はＤＮＡとの結合性が低いため、樹脂の表面に何らかの処理を加えることによって、ＤＮＡを吸着・固定しやすくするための研究が行われてきた。例えば、特許文献７では、そのような手法として、酸、アルカリ、過酸化物等の薬品による化学的処理や、物理的処理であるコロナ放電処理、低温プラズマ処理、電子線照射、ガンマ線照射が知られていることが記載されており、特許文献７に記載の発明ではイオンビーム処理が用いられている。
【０００５】
上記処理のうちでも、イオンビーム処理、プラズマ処理、コロナ放電処理を施すことによって、樹脂表面の親水性が向上することが知られている。
【特許文献１】米国特許第５４４５９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５７４４３０５号明細書
【特許文献３】米国特許第５７００６３７号明細書
【特許文献４】米国特許第５８０７５２２号明細書
【特許文献５】国際公開公報９８／１８９６１号パンフレット
【特許文献６】特開２００５−１０００４号公報
【特許文献７】特開平７−２０９３９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
イオンビーム処理またはプラズマ処理を施すことにより基板表面の親水性は向上するが、処理後の基板を空気中に放置すると、すぐに元の親水性へと戻ってしまうため、この向上された親水性を利用しようとした場合、イオンビーム処理またはプラズマ処理後すぐに次の処理工程を行なわなければならず、製造ラインの設立に膨大なコストを要するという問題があった。従って、本発明では、イオンビーム処理またはプラズマ処理を施すことによって得られる樹脂基板表面の親水性の向上効果を長期に亘って維持することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、樹脂基材のなかでも特に疎水性高分子基材の表面処理効果は、表面処理後の基材を特定の条件下で保存することによって、長期に亘って維持することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕  疎水性高分子基材をプラズマ処理またはイオンビーム処理した後、該基材を水中または真空中に配置することを特徴とする、疎水性高分子基材表面の親水性維持方法。
〔２〕  前記プラズマ処理が不活性ガス下で行われるものであるか、またはイオンビーム処理がイオン化ガスとして不活性ガスを用いるものである、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記疎水性高分子が、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンおよびポリ乳酸からなる群より選ばれたものである、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記疎水性高分子基材が核酸マイクロアレイ用の基材である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  プラズマ処理またはイオンビーム処理された疎水性高分子基材を格納したパッケージであって、該基材が該パッケージ内で水中または真空中に保存されてなるパッケージ。
〔６〕  前記プラズマ処理が不活性ガス下で行われるものであるか、またはイオンビーム処理がイオン化ガスとして不活性ガスを用いるものである、上記〔５〕に記載のパッケージ。
〔７〕  前記疎水性高分子が、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンおよびポリ乳酸からなる群より選ばれたものである、上記〔５〕または〔６〕に記載のパッケージ。
〔８〕  前記疎水性高分子基材が核酸マイクロアレイ用の基材である、上記〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載のパッケージ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、イオンビーム処理またはプラズマ処理によって向上した疎水性高分子基材の親水性を長期に亘って維持することができる。これにより、処理後、用時まで親水性が高い特性を有する疎水性高分子基材を保管することができ、処理後すぐに次の処理工程を行う必要がなく、製造ラインの設立に膨大なコストがかからない。また、該基材表面の親水性が維持されたまま保管することができ、ＤＮＡなどの核酸を容易に固定することができるので、該疎水性高分子基材は核酸マイクロアレイ作製用の基板としても好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、疎水性高分子基材をプラズマ処理またはイオンビーム処理することによって向上した親水性を維持する方法であって、該基材を水中または真空中に配置することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
本発明で使用される疎水性高分子基材の疎水性高分子は、水との接触角θが約６５°以上の疎水性高分子をいう。前記疎水性高分子としては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンおよびポリ乳酸から選ばれる少なくとも１種からなる高分子が挙げられる。安価で取り扱い易い点から、ＰＭＭＡ、ポリカーボネートおよびポリプロピレンが好ましい。また、蛍光検出に供する核酸マイクロアレイ用の基板として用いる場合には、ＰＭＭＡが好ましい。
【００１２】
前記疎水性高分子基材の形状は、その使用目的に応じて適宜決定すればよいため特に限定されないが、例えば、基板、容器、フィルムおよびチューブなどが挙げられる。なかでも取り扱いの容易性などを考慮すると、基板が好ましい。
【００１３】
前記基材は、公知方法に従い製造することができる。例えば、押出成形、射出成形、圧縮成形およびカレンダー成形等の製造方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。製造コストの観点から、押出成形および射出成形が好ましい。
【００１４】
前記基材製造時において、前記疎水性高分子に必要に応じて添加剤を加えることも好ましい。添加剤としては、イオンビーム処理またはプラズマ処理による基板表面の親水性の向上を阻害しないものである限り、高分子成形体の製造において一般的に用いられているその他の添加剤を含ませることができる。例えば、安定剤、可塑剤、滑剤、着色剤および結晶核剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。基材を核酸マイクロアレイ用の基板として使用する場合には、解析が容易となるような色を基板に発色させる着色剤を添加することが好ましい。
また、前記添加剤は、ミキサー、ヘンシェル、押出機、ニーダーおよびロール等によって高分子に混合・混練することができ、特に限定されるものではないが、製造コストの面から、押出機を用いることが好ましい。
【００１５】
前記基材の大きさは、その使用目的に応じて適宜決定すればよいため特に限定されるものではない。また、最終的に必要とするサイズよりも大きなものを製造しておき、それを必要に応じて適切なサイズに裁断してもよい。例えば、基材を核酸マイクロアレイ用の基板とする場合は、ベッドサイドでの取り扱いの容易性の観点から、大きさは約１〜１０，０００ｍｍ２、好ましくは約１〜１，０００ｍｍ２が好適である。
【００１６】
前記プラズマ処理とは、不活性ガス雰囲気下で放電することにより、前記不活性ガスの電離作用によって生じるプラズマを固体表面に照射し、この表面をエッチング、濡れ性の向上および官能基の導入などの効果を付与する処理をいう。上記放電には、特に限定されるものではないが、コロナ放電（高圧低温プラズマ）、アーク放電（高圧高温プラズマ）およびグロー放電（低圧低温プラズマ）などが挙げられる。なかでも、表面処理の反応性の観点から、コロナ放電が好ましい。
【００１７】
前記プラズマ処理における不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガス、酸素ガス、ヘリウムガス、ネオンガスおよびキセノンガス等が挙げられるが、プラズマ処理後の核酸固定の効率を高める観点から窒素ガスおよびアルゴンガスが好ましい。リン酸骨格を有する（ポリアニオンである）ＤＮＡまたはＲＮＡを用いる場合は、前記プラスチック基材の表面にアミン基および／またはアミノ基を発生させ、当該表面の濡れ性の向上および当該表面のイオンチャージによって、より強固に固定することができる点で、窒素ガスがより好ましい。
【００１８】
前記プラズマ処理の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、コロナ放電を用いる場合、前記基材を密閉容器に入れ、約２５〜５０℃の窒素ガス雰囲気（約１０〜２０Ｐａ）下で、出力約１００〜５００Ｗで放電し、約１００〜１０００秒処理する方法などが挙げられる。使用する装置としては、例えばヤマト科学社製の小型高性能プラズマ表面処理装置（ＰＤＣ２００シリーズ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。かかる処理の回数は、所望の親水性を得る限りにおいては特に限定されないが、通常１〜１０回程度である。
【００１９】
前記イオンビーム処理とは、不活性ガスをイオン化し、電圧をかけて高速加速して得られるイオンビームを疎水性高分子基材表面に照射し、衝突させることによって発生したエネルギーにより、イオン注入、膜形成、エッチングおよび濡れ性の向上の効果を付与する表面処理方法をいう。
【００２０】
前記イオンビーム処理における不活性ガスとしては、基材を核酸マイクロアレイに用いる場合には、イオンビーム処理後の核酸固定の効率を高める観点から窒素ガスおよびアルゴンガスが好ましい。リン酸骨格を有する（ポリアニオンである）ＤＮＡまたはＲＮＡを用いる核酸マイクロアレイに基材を用いる場合には、疎水性高分子基材表面の親水性の向上および当該表面のイオンチャージによって、より強固に核酸を固定することができる点で、窒素ガスがより好ましい。
【００２１】
イオンビーム処理の方法は、特に限定されるものではないが、例えば、減圧下で、磁場中の電子のサイクロトロン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＥＣＲ）を利用したＥＣＲイオン銃を搭載した装置から得られたイオンビームを、約３００〜７００Ｖの加速エネルギーで、約１．０×１０２０ｉｏｎ／ｃｍ２のドーズ量で照射する方法が挙げられる。使用する装置としては、例えば、エリオニクス製の小型ＥＣＲイオンシャーワ装置（ＥＩＳ−２００ＥＲ）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。かかる処理の回数は、所望の親水性を得る限りにおいては特に限定されないが、親水性の長期維持の観点から、１回あたり０．２５〜２．０×１０２０ｉｏｎ／ｃｍ２のドーズ量を、少なくとも５回以上、好ましくは１０回以上照射することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２２】
前記プラズマ処理またはイオンビーム処理することにより、基板表面の親水性が上昇する。前記親水性は、疎水性高分子基材と水との接触角θを測定することにより決定することができる。処理後の水の接触角θは、前記疎水性高分子基材を核酸マイクロアレイ用の基材として用いる場合は、核酸の固定強度の観点から、６０°以下、好ましくは４０°以下、特に好ましくは２０°以下であるが、これに限定されるものはない。なお、処理前の基板の表面の水の接触角θは、通常、約６５°以上である。前記接触角θは、０．２５μＬの蒸留水を滴下し、光学顕微鏡で測定した値である。
【００２３】
本発明においては、プラズマ処理またはイオンビーム処理された基材を、水中または真空中に配置することを特徴とする。
【００２４】
前記水としては、水道水、蒸留水、逆浸透水およびイオン交換水などが挙げられ、電気抵抗度は１ＭΩ・ｃｍ以上であればよいが、基材表面へのコンタミネーションを防止する観点から、好ましくは１０ＭΩ・ｃｍ以上、さらに好ましくは１７ＭΩ・ｃｍ以上である。
【００２５】
一方、真空中とは、大気圧よりも減圧された状態であれば、特に限定されないが、包装時の安全性およびコストなどの観点から、約１０−３Ｐａ以下、好ましくは約１０−５Ｐａ以下である。
【００２６】
基材を水中または真空中に配置する方法としては、基材を水中または真空中に維持することができる方法であれば特に限定されないが、例えば、水を満たした容器および減圧された容器を用いて保存すればよい。前記容器としては、例えば、ガラス製の容器、樹脂製の容器、ラミネート包装体およびブリスター包装体などが挙げられるが、特にこれらに限定されない。搬送時における安全性の観点およびコストの観点から、樹脂製の容器およびラミネート包装体が好ましい。
【００２７】
本発明によれば、プラズマ処理またはイオンビーム処理により向上した親水性は、理論的には用時に水中または真空中から基材を取り出すまで維持することが可能であるためその維持期間は特に限定されるものではないが、基材を水中または真空中で保存開始後、少なくとも１時間〜１６８時間（一週間）維持するのが好ましく、少なくとも１時間〜７２時間（３日間）維持するのがより好ましい。
【００２８】
保存後の水の接触角θは、６０°以下であれば特に限定されないが、全く増大しないのが最も好ましい。
【００２９】
疎水性高分子基材を核酸マイクロアレイ用の基材として用いる場合、基材上に固定化される核酸（プローブともいう）とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体をいう。前記核酸（プローブ）は、天然由来であっても人工的に合成されたものであっても、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また、前記ＤＮＡは、天然もしくは合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、特に限定されるものではない。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｒＲＮＡ等、特に限定されるものではない。前記ＰＮＡは、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子をいう。前記誘導体とは、前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡを本発明の目的の範囲内で適宜修飾したものをいう。
【００３０】
上記ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの中では、製造コスト、種々の酵素が使用できる点および用途範囲が広い面で、一本鎖のＤＮＡが好ましいが、これに限定されるものではない。前記用途範囲とは、例えば、患者個人の薬剤感受性の予測、病原菌のもしくは耐性の判定ならびに個人の体質の判定などが挙げられ、一般的にはテーラーメイド医療と呼ばれる分野での用途を指すが、これに限定されるものではない。
核酸マイクロアレイは、核酸（プローブ）が一本鎖のＤＮＡである場合、一般にはＤＮＡチップとも呼ばれる。
【００３１】
本発明における核酸（プローブ）の長さは、ＵＶ照射によりプラスチック基板への固定が容易であり、測定対象の核酸とハイブリダイズすることができる長さであれば特に限定されないが、少なくとも５０塩基以上あるのがよい。なかでも、非特異吸着の頻度の観点から、５０〜５００塩基、好ましくは約２００〜４００塩基である。
【００３２】
固定化される核酸は、天然由来の核酸の場合、公知の方法により単離、精製し、必要に応じて酵素等で所定の長さに切断することにより調製したものを用いることができる。合成核酸の場合、核酸の種類に応じて公知の合成方法により調製したものを用いることができる。ＤＮＡの場合、逆転写反応やポリメラーゼ連鎖反応等により調製したものを好適に使用することができる。
【００３３】
しかしながら、検出に必要な塩基配列の長さは、約１０〜３０塩基程度であることが一般的である。このような場合、上記のようにして調整した核酸配列の末端に、検出に影響しないような配列を付加することにより、上記の５０塩基以上の長さを達成することができる。例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ、ポリｄＣおよびポリｄＧからなる群より選ばれるオリゴマーを付加することが挙げられ、吸着強度および非特異吸着の頻度の観点から、ポリｄＴオリゴマーを付加することがより好ましいが、これに限定されるものではない。前記ポリｄＴオリゴマーの付加は、ターミナルトランスフェラーゼなどにより容易に付加することが可能であるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
核酸を基板の表面に固定させる方法は、特に限定されず、公知方法に準じて行うことができる。例えば、まず、前記核酸（プローブ）を基板上にスポットし、次いで固定させる。核酸のスポッティングは特に限定されるものではないが、例えば、ディスペンサー（武蔵エンジニアリング社製のＳＭＰ−３など）が挙げられる。
【００３５】
また、前記ＵＶ照射には、通常約２５０〜３５０ｎｍの波長のＵＶを使用し、約５０００〜８０００μｗ/ｃｍ２で１〜１０分程度照射するが、これに限定されるものではない。
【００３６】
核酸（プローブ）の固定終了後、非特異吸着を低下させる観点で、洗浄またはブロッキング処理を行うことが好ましい。
【００３７】
本発明はまた、プラズマ処理またはイオンビーム処理された疎水性高分子基材を格納したパッケージであって、該基材が該パッケージ内で水中または真空中に保存されてなるパッケージも提供する。
【００３８】
パッケージの形態としては、疎水性高分子基材を格納可能な形状および大きさであれば特に限定されない。また、パッケージの材質はパッケージ内で疎水性高分子基材を水中または真空中に保存可能なものであれば特に限定されない。このようなパッケージとしては、例えば、ガラス製の容器、樹脂製の容器、ラミネート包装体およびブリスター包装体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。取り扱いの容易性からは、樹脂製の容器、ラミネート包装体が好ましい。
【００３９】
前記樹脂製の容器に用いる樹脂としては、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルペンテンおよびポリテトラフルオロエチレンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。防汚性などの観点からは、ポリテトラフルオロエチレン製が好ましい。
また、前記ラミネート包装体の原材料としては、ポリエステル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンコートポリエステル、ポリ塩化ビニルコートポリプロピレン、アルミ蒸着ポリエステル、シリカ蒸着ポリエステル、ポリビニルアルコールおよびポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。コストの観点からは、アルミ蒸着ポリエステルが好ましい。
【００４０】
また、１つのパッケージに格納される疎水性高分子基材の数は１個であってもよく、２個以上であってもよい。２個以上の場合は、各基材の表面がそれぞれ水と接触しているか真空中に保持されていればよい。
【実施例】
【００４１】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【００４２】
実施例１
基材として、押出成形されたポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）基板を用いた。
イオンビーム源は、小型ＥＣＲイオンシャーワ装置（エリオニクス製、ＥＩＳ−２００ＥＲ）を用いた。ＰＭＭＡ基板を基板ホルダに取り付け、真空チャンバー内を約５．０×１０−３〜３．０×１０−４Ｐａに排気した後、アルゴンを２．３８ｓｃｃｍでチャンバー内に導入した。そして、プラズマ源内で５０Ｗのマイクロ波を照射することによりアルゴンイオンを引き出し、６００ｅＶの電圧で加速することで、ＰＭＭＡ基板表面に照射した。
次に、上記イオンビーム処理されたＰＭＭＡ基板を、純水で満たしたガラス容器内に配置し、約２５℃で保管した。
【００４３】
実施例２
イオンビーム処理されたＰＭＭＡ基板を、約１．０×１０−４Ｐａ以下のステンレス製のチャンバー内に配置したこと以外は実施例１と同様に行った。
【００４４】
比較例１
実施例１と同様にしてイオンビーム処理されたＰＭＭＡ基板を、ポリスチレン製の容器内に配置することでコンタミネーションを防止し、約２５℃で大気中で保管した。
【００４５】
実験例１
実施例１、２および比較例１のＰＭＭＡ基板の接触角の経時変化を検討した。接触角は、ＰＭＭＡ基板表面に０．２５μＬの蒸留水を滴下し、光学顕微鏡で測定した。その結果を図１に示す。比較例１のＰＭＭＡ基板は１０時間程度で接触角が６０°以上になったが、実施例１および２のＰＭＭＡ基板はイオンビーム処理後約７２時間経過しても接触角はほとんど変化しなかった。
【００４６】
実施例１および比較例１のＰＭＭＡ基板にＤＮＡを固定し、核酸マイクロアレイを製造し、核酸を検出した。いずれの基板もイオンビーム処理後、約３日保管したものを用い、以下の態様で作製した。
【００４７】
ＤＮＡプローブ
ＤＮＡプローブとしては、配列番号１および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）を用いた。配列番号１のＤＮＡプローブは、第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内に存在するエストロゲン受容体対立遺伝子（Ｘｂａ  Ｉ多型）のうち、制限酵素Ｘｂａ  Ｉにより切断される配列（Ｘ型）を検出することができるものである。一方、配列番号２のＤＮＡプローブは、エストロゲン受容体対立遺伝子（Ｘｂａ  Ｉ多型）のうち、制限酵素Ｘｂａ  Ｉにより切断されない配列（ｘ型）を検出することができるものである。これらのＤＮＡプローブに３’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μＬ）を４μＬ、デオキシチミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ、配列番号１および２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μＬ、製品添付のＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４を５μＬ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μＬ含んだ精製水５０μＬを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０Ｘ  ＳＳＣ緩衝液５０μＬを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ（平均約４００ｂｐ長）２ｐｍｏｌ／μＬをそれぞれ得た。
【００４８】
Ｘ型検出用プローブ（配列番号１）：tctggagttg ggatga
ｘ型検出用プローブ（配列番号２）：gtggtctaga gttggg
【００４９】
ＤＮＡプローブの固定
次に、ポリチミン付加された配列番号１または２の核酸プローブを、それぞれ１．０ｐｍｏｌ／μＬとなるように、製品添付の１０Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で希釈し、実施例１および比較例１の基板上にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、核酸マイクロアレイを製造した。
【００５０】
検体のゲノムＤＮＡの増幅
ｘｘ型の検体のゲノムＤＮＡを、配列番号３に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号４に示された塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法によりＸｂａ  Ｉ多型を含む塩基配列の増幅を行った。増幅反応は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒の１サイクルを３０サイクル行った。
【００５１】
フォワードプライマー（配列番号３）：gttccaaatg tcccagccgt
リバースプライマー（配列番号４）：cctgcaccag aatatgttac c
【００５２】
核酸の検出
増幅したＤＮＡ溶液２０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（２０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを1本鎖に変性させた。この変性ＤＮＡを含む溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）およびクエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）を含む溶液（１ｍＬ）を加え、実施例１または比較例１の基板から作製したマイクロアレイ１枚を浸潤させ、反応温度４５℃で３０分間振とうしてハイブリダイゼーションを行った。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸  ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を加えて、各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼによる発色反応を行った。つまり、核酸の検出が正確な場合は、配列番号１の配列を含むＤＮＡプローブは発色せず、配列番号２の配列を含むＤＮＡプローブは発色することになる。
【００５３】
発色した結果を図２に示す。実施例１のＰＭＭＡ基板から作製された核酸マイクロアレイは容易に目視で容易に判定できるのに対し、比較例１のＰＭＭＡ基板から作製された核酸マイクロアレイはほとんど発色しなかった。このことにより、イオンビーム照射後、基板を水中保存することにより基板表面の親水性を維持することができ、効率的に核酸の固定が可能であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
基板をポリカーボネート（ＰＣ）基板に置き換え、イオンビーム種を窒素に置き換えたこと以外は実施例１と同様に行った。
【００５５】
比較例２
基板をポリカーボネート（ＰＣ）基板に置き換え、イオンビーム種を窒素に置き換えたこと以外は比較例１と同様に行った。
【００５６】
実験例３
実施例３および比較例２のＰＣ基板にＤＮＡを固定し、核酸マイクロアレイを製造し、核酸を検出した。いずれの基板もイオンビーム処理後、約３日保管したものを用いた。マイクロアレイの製造および核酸の検出は、実験例２と同様におこなった。
【００５７】
発色した結果を図３に示す。実施例３のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイは目視で容易に判定できるのに対し、比較例２のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイはほとんど発色しなかった。
【００５８】
実施例４
基板をポリカーボネート（ＰＣ）基板に置き換えたこと以外は実施例１と同様に行った。
【００５９】
比較例３
基板をポリカーボネート（ＰＣ）基板に置き換えたこと以外は比較例１と同様に行った。
【００６０】
実験例４
実施例４および比較例３のＰＣ基板にＤＮＡを固定し、核酸マイクロアレイを製造し、核酸を検出した。いずれの基板もイオンビーム処理後、約３日保管したものを用いた。マイクロアレイの製造および核酸の検出は、実験例２と同様に行った。
【００６１】
発色した結果を図４に示す。実施例４のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイは目視で容易に判定できるのに対し、比較例３のＰＣ基板から作製された核酸マイクロアレイはほとんど発色しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】イオンビーム処理後の実施例１、２および比較例１のポリメタクリル酸メチル製基板表面の親水性の経時変化を示すグラフである。
【図２】実施例１および比較例１のポリメタクリル酸メチル製基板から作製されたマイクロアレイを用いた核酸検出の結果を示す図である。
【図３】実施例３および比較例２のポリカーボネート製基板から作製されたマイクロアレイを用いた核酸検出の結果を示す図である。
【図４】実施例４および比較例３のポリカーボネート製基板から作製されたマイクロアレイを用いた核酸検出の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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