(57)【要約】      （修正有）【課題】高ＧＣ含量で繰り返しのある配列を増幅できる長鎖ＰＣＲ法、および簡便で信頼性の高い顔面肩甲上腕筋ジストロフィ（ＦＳＨＤ）の診断法を提供する。【解決手段】高ＧＣ含量ＤＮＡ増幅用バッファーを使用し、ｄＮＴＰに、最適濃度に調整した７−デアザｄＧＴＰを加えたものを使用し、塩化マグネシウムの濃度を最も増幅効率のよい濃度に設定し、熱変性を短時間高温とし、アニーリング／伸長の温度を共通の温度とし反応時間を熱変性時間の１００倍以上とし、反応時間を１１サイクル以降はさらに延長することを特徴とする長鎖ＰＣＲ法。このＰＣＲ法により、第４染色体４ｑ３５に特異的なプライマーセットを使用して、高ＧＣ含量で繰り返しのあるＦＳＨＤに特徴的なゲノム領域を増幅し、その反復数を電気泳動により確認する診断法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ＧＣ含量かつ繰り返し配列を有するヒトＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅する方法であって、
耐熱性ホットスタート用ＤＮＡポリメラーゼを使用し、
ＰＣＲバッファーとして高ＧＣ含量ＤＮＡ増幅用バッファーを使用し、
ｄＮＴＰに最適濃度に調整した７−デアザｄＧＴＰを加えたものを使用し、
塩化マグネシウムの濃度を最も増幅効率のよい濃度に設定し、
熱変性を短時間高温とし、
アニーリング／伸長の温度を共通の温度とし、
反応時間を熱変性時間の１００倍以上とし、
反応時間を１１サイクル以降はさらに延長することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＣＲ反応液中の７−デアザｄＧＴＰ濃度が０．２７ｍＭ〜０．３３ｍＭであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲ反応液中の７−デアザｄＧＴＰ濃度が０．３ｍＭであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＲ反応液中の塩化マグネシウム濃度が２．６ｍＭ〜２．８ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲ反応液中の塩化マグネシウム濃度が２．７５ｍＭであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１１サイクル後の反応時間を１５〜２５秒延長することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１１サイクル後の反応時間を２０秒延長することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
アニーリング／伸長の温度を６３℃〜６８℃とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アニーリング／伸長の温度を６４℃とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ遺伝子診断方法であって、請求項１に記載の高ＧＣ含量ＤＮＡを鋳型とする長鎖ＰＣＲ法を用いて、プライマーの少なくとも一方が第４番染色体特異的であり、２つのプライマーがＤ４Ｚ４リピート領域を挟むことを特徴とするプライマーセット、およびヒトの組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いる、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ遺伝子診断方法。
【請求項１１】
ヒトの組織が血液であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第４番染色体特異的プライマーが配列番号１または２で表わされる一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ遺伝子型の同定に使用するプライマーセットであって、順方向プライマーが配列番号１の配列を有するものであることを特徴とする、プライマーセット
【請求項１４】
順方向プライマーが配列番号１であり、逆方向プライマーが配列番号２であることを特徴とする、請求項１３に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長鎖ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法、第４染色体特異的プライマーセット及びそれらを用いた顔面肩甲上腕型筋ジストロフィの迅速診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ（facioscapulohumeral muscular dystrophy; FSHD）は遺伝性神経筋疾患の中で、ドゥシェンヌ型筋ジストロフィ、筋緊張型ジストロフィについで３番目に頻度の高い疾患である。常染色体優性の遺伝形式をとり、罹病率は人口１０万人あたり２〜５人と言われている。発症年齢は０〜６５歳と幅広いが、思春期までに発症することが多い。筋萎縮は顔面頬部、肩、上腕部に強く、翼状肩甲が特徴的である。腰帯、下肢の筋力は早期には比較的保たれていることが多いが、進行すると障害が広がり、４０歳頃には車椅子が必要となることが多い。網膜症や神経性難聴の合併も約５０％に認められ、また若年発症例では、精神発達遅滞、痙攣など中枢神経症状もしばしば合併する。
【０００３】
ＦＳＨＤの遺伝子座は第４染色体長腕４ｑ３５のサブテロメア領域に存在する。この部分には制限酵素KpnIで消化される３．３ｋｂの長さの繰り返し配列（Ｄ４Ｚ４）が、EcoRI切断部位に挟まれて存在し、正常ではこのリピート数が１０〜１００個程度であるのに対し、ＦＳＨＤ患者では７個以下と減少している（図１、図２）。ただしこの欠失領域内に原因遺伝子は見出されず、発症機序はいまだ不明である。
【０００４】
したがって遺伝子診断を行う際には、制限酵素EcoRIで消化したゲノムＤＮＡを用いたサザンブロット解析により、Ｄ４Ｚ４の繰り返し配列をその中に含む断片の長さを調べる必要がある。更に複雑なのはこのＤ４Ｚ４リピート配列と９８％以上の相同配列を有する３．３ｋｂKpnI繰り返し配列が第１０染色体サブテロメア領域１０ｑ２６にも存在し、サザンブロット解析で用いるプローブｐ１３Ｅ−１１に反応してしまうのである。したがって検出された断片が、第４、第１０染色体いずれに由来するかを判別するために、第１０染色体のＤ４Ｚ４配列のみを切断できる別の制限酵素（BlnI）によるEcoRI/BlnI二重切断断片を用いたサザンブロット解析も併用する必要がある。
【０００５】
D4Z4繰り返し配列を含むEcoRI切断断片の長さは正常では３００ｋｂ以上にもなる場合があるが、ＦＳＨＤでは２８ｋｂ以下である（図３）。また２９ｋｂ以上５０ｋｂ未満の間は、判定が報告者によって異なり、現在不確定領域と考えられている。したがってＦＳＨＤの診断には少なくとも５０ｋｂ以上の長さを保ったDNAを抽出する必要がある。このため、血液などのヒト組織からＤＮＡを抽出する際は、数日をかけて丁寧に行わなければならない。抽出したゲノムＤＮＡは、EcoRI、BlnIといった制限酵素で消化した後、０．３％というきわめて薄いアガロースゲルを用いて循環装置つき泳動槽で６８時間電気泳動した後、サザンブロット解析を行う。この際、ラジオアイソトープ標識をしたプローブを用いないと、検出は困難である。従って、この方法を用いた場合、制限酵素切断断片の長さを検出するまでには、早くても３週間から１ヶ月を要する。
【０００６】
またこの方法では、最低でも４０μgもの多量のゲノムＤＮＡを必要とするが、直接生検骨格筋などの少量の組織から多量のゲノムＤＮＡを調製するのは容易ではない。さらにKpnI切断断片（Ｄ４Ｚ４）はＧＣ含量が７３％以上ときわめて高く、また繰り返し配列であるため、ゲノムＤＮＡを用いてのＰＣＲ法での増幅は困難であった。
【０００７】
【非特許文献１】Yamanaka G, Goto K, Ishihara T, Oya Y, Miyajima T, Hoshika A, Hayashi YK, et al. FSHD-like patients without 4q35 deletion. J Neurol Sci 2004;219(1-2):89-93.
【非特許文献２】Goto K, Nishino I, Hayashi YK. Very low penetrance in 85 Japanese families with facioscapulohumeral muscular dystrophy 1A. J Med Genet 2004;41(1):E12.
【非特許文献３】Winokur ST, Chen YW, Masny PS, Martin JH, Ehmsen JT, Tapscott SJ, Hayashi YK, et al. Expression profiling of FSHD muscle supports a defect in specific stages of myogenic differentiation. Hum Mol Genet 2003;12(22):2895-2907.
【非特許文献４】Matsumura T, Goto K, Yamanaka G, Lee JH, Zhang C, Hayashi YK, et al. Chromosome 4q;10q translocations; comparison with different ethnic populations and FSHD patients. BMC Neurol 2002;2(1):7.
【非特許文献５】Yamanaka G, Goto K, Hayashi YK, Miyajima T, Hoshika A, Arahata K. [Clinical and genetical features of Japanese early-onset facioscapulohumeral muscular dystrophy]. No To Hattatsu 2002;34(4):318-324.
【非特許文献６】Yamanaka G, Goto K, Matsumura T, Funakoshi M, Komori T, Hayashi YK, et al. Tongue atrophy in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology 2001;57(4):733-735.
【非特許文献７】Goto K, Lee JH, Matsuda C, Hirabayashi K, Kojo T, Nakamura A, et al. DNA rearrangements in Japanese facioscapulohumeral muscular dystrophy patients: clinical correlations. Neuromuscul Disord 1995;5(3):201-208
【非特許文献８】Goto K, Song MD, Lee JH, Arahata K. [Genetic analysis of facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)]. Rinsho Shinkeigaku 1995;35(12):1416-1418.
【非特許文献９】Lee JH, Goto K, Sahashi K, Nonaka I, Matsuda C, Arahata K. Cloning and mapping of a very short (10-kb) EcoRI fragment associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). Muscle Nerve 1995;2:S27-31.
【非特許文献１０】Lee JH, Goto K, Matsuda C, Arahata K. Characterization of a tandemly repeated 3.3-kb KpnI unit in the facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) gene region on chromosome 4q35. Muscle Nerve 1995;2:S6-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記の煩雑で熟練した技術を要するＦＳＨＤの遺伝子解析法に代わりうる簡便で迅速かつ精度の高いＦＳＨＤ遺伝子診断法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の特徴はまず、ゲノムDNAを鋳型として、ＧＣ含有率が高く、かつ繰り返し配列を持った非常に長い領域をＰＣＲ法を用いて増幅することを可能にした点である。KpnI切断断片（Ｄ４Ｚ４）はＧＣ含量が７３％以上ときわめて高く、ゲノムＤＮＡを用いてのＰＣＲ法での増幅は困難とされていた。しかしながら今回我々の開発した方法は、このような増幅困難な繰り返し配列を１８．４ｋｂの長さのものまで増幅することを可能にしたものであり、今後同様の高ＧＣ含有ゲノム領域（たとえばハンチントンリピート）をＰＣＲ増幅する際に応用可能な方法といえる。
【００１０】
さらに本発明で画期的なのは、第４染色体のＤ４Ｚ４繰り返し配列のみを認識するようリピート部分を挟んで設計した特異性の高いプライマーセットである。このプライマーセットを使用することにより、他の染色体上の相同配列を増幅することなく、確実に第４染色体由来のＤ４Ｚ４繰り返し配列を同定することができる。
【００１１】
このプライマーセットと長鎖PCR法を組み合わせることによって、サザンブロット法で認識される２５ｋｂまでのEcoRI切断断片（Ｄ４Ｚ４繰り返し配列が５個以下に相当）に対応する断片を増幅して検出することが可能になった。これは４ｑ３５に欠失を有するＦＳＨＤの９５％以上を網羅しており（図２参照）、診断方法としてきわめて有用である。この方法を用いると、DNAを抽出してからの所要時間はわずか１５時間であり、必要とするゲノムＤＮＡは０．４μgと、従来の１００分の１の量で解析可能である。
【００１２】
表１に本発明の方法と従来法との対比を示す。
【表１】
2006129807.tif 000003
【発明の効果】
【００１３】
これまではサザンブロット法で得られるEcoRI切断断片の長さをもとに、D4Z4のリピート数を推定してきたが、本方法を用いることにより、確実なリピート数を同定でき、臨床経過、重症度等と、遺伝子欠失の大きさとの相関関係をより詳細に検討することが可能となり、病態機序の解明に大きな進歩をもたらすものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず本発明の高ＧＣ含量の鋳型を増幅できる長鎖ＰＣＲ法について述べる。
次に第４染色体特異的プライマーセットについて述べる。
最後に上記プライマーセットと長鎖ＰＣＲを用いた、ＦＳＨＤ患者の分析について述べる。
【００１５】
＜高ＧＣ含量ＤＮＡ用長鎖ＰＣＲ法＞
本発明者等はＧＣ含量が７３％と高い領域を増幅するためのＰＣＲ法を詳細に検討した結果、耐熱性ホットスタート用ＤＮＡポリメラーゼを使用して熱変性を短時間高温とし、ＰＣＲバッファーとして高ＧＣ用バッファーを、さらにｄＮＴＰｓに７−デアザｄＧＴＰを加えたものを使用するとよいことを見出した。７−デアザｄＧＴＰならびに塩化マグネシウムの濃度が増幅に大きく影響することも見出した。さらにＰＣＲの条件を検討した結果、アニーリング／伸長の温度を共通の温度とし反応時間を熱変性時間の１００倍以上とし、１１サイクル以降は反応時間をさらに延長することで高ＧＣ含量かつ反復のある配列を効率よく増幅できることを見出した。具体的には反応液中の７−デアザｄＧＴＰ濃度は０．２７ｍＭ〜０．３３ｍＭが好ましい。ＭｇＣｌ２濃度は２．６ｍＭ〜２．８ｍＭが好ましい。アニーリング／伸長の温度は６３℃〜６８℃が好ましい。１１サイクル以降の反応時間は１５秒〜２５秒程度長くすることが好ましい。好ましい１例は、反応液中の７−デアザｄＧＴＰは０．３ｍＭ、ＭｇＣｌ２濃度は２．７５ｍＭ、アニーリング／伸長の温度は６４℃、１１サイクル以降の反応時間は２０秒程度長くするものである。
【００１６】
＜プライマーの設計＞
４ｑ３５領域にあるＤ４Ｚ４リピートを特異的に増幅し、１０ｑ２６にあるリピートは増幅しないプライマーセットを設計し、増幅効率のよいものを選択する。順方向プライマーの配列の１例はＧＧＣＣＡＧＡＧＴＴ  ＴＧＡＡＴＡＴＡＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＡＧ  （配列番号１）、逆方向プライマーの配列の１例はＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴ  ＴＧＴＧＡＣＡＴＡＴ  ＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣ  ＡＴＣ  （配列番号２）である。これは発明者等が６ヶ所を選んで作製したプライマーセットの中で、最も増幅効率が高かったものである。これらのプライマーの位置関係を図１に示す。この順方向プライマー１は従来のサザンブロットで使用されているプローブp13E-11（約800bpの断片）と一部重なっている。この領域は第４、第１０染色体の配列が極めて似ており、サザンブロット解析ではｐ１３Ｅ−１１は両染色体を認識する。しかし、このPCR用のプライマーは第１０染色体の配列と１塩基しか違わないが、第４染色体のみを選択的に増幅するものである。なお４ｑ３５領域にあるＤ４Ｚ４リピートを特異的に増幅できるプライマーであれば、上記のプライマーに限定されることはない。
【００１７】
＜プライマーの合成＞
プライマーは現在知られている方法のいずれで合成してもよい。脱塩精製して使用する。
【００１８】
ＤＮＡ標品は患者の血液から精製するのが好ましいが、組織から抽出することもできる。血液からＤＮＡを精製するには、ヘパリン加ヒト末梢血全血からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、１×ＴＥバッファーに溶解して０．２−０．３μｇ／μｌの濃度に調整する。高純度高分子量のゲノムＤＮＡを得るために、全工程を通して激しい攪拌を避け、丁寧に抽出する。
【００１９】
＜KpnIリピートの増幅と検出＞
上記のＤＮＡ標品を鋳型として合成プライマーセットを使用して、上記のＰＣＲ法で増幅を行うことにより、第４染色体のＤ４Ｚ４リピートを増幅することができる。得られた増幅産物をアガロース電気泳動にかけエチジウムブロマイド染色で検出する。得られる増幅産物は５．２〜１８．４ｋｂであるが、これらが実際に１−５個のＤ４Ｚ４であることは、増幅産物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に転写し、リピート内のプローブであるｐＭＡ１３を用いてサザンブロット解析することで確認できる。また精製ＤＮＡ標品について従来法（EcoRIで切断、電気泳動、ｐ１３Ｅ−１１プローブを用いてサザンブロット）でサイズを確認し、ＰＣＲ産物と比較することもできる。
【００２０】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
ＦＳＤＨ患者１０例（男６、女４、年齢７−６３歳）から末梢血液をとり、ヘパリンを加えて静かに混和し、以下の実験に使用した。
【００２２】
１．血液からのＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出を下記の手順に従って行った。
１日目
５０ｍｌ容遠沈管にヒトヘパリン加末梢全血１０ｍｌとＥＬバッファ（１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを加え、静かに混和。
↓
氷上に、５分毎にゆっくり混和しながら１５分置く。
↓
室温で２０００ｒｐｍ１０分間遠心する。
↓
上清を捨てる。ここまでの処理を、ペレットが白くなるまで、２−３回繰り返す。
↓
ＮＬバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，４００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．２）３ｍｌを加え、２１Ｇ針付き２．５ｍｌ注射器で、泡が立たないように静かに混和する。
↓
ペレットが溶けたら、１５ｍｌ容遠沈管に移す。
↓
プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）（和光純薬）５μｌを加える。
↓
２０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を１５０μｌ加える。
↓
静かに混和する。
↓
軽く遠心して、管壁に付着している液を落とす。
↓
遠沈管を３７℃の恒温水槽中で１６時間インキュベートする。
↓
２日目
インキュベート済みの遠沈管に５ＭのＮａＣｌを１ｍｌ加える。
↓
あまり激しくなく、白濁する程度に混和する。
↓
室温で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心する。
↓
上清を新しい１５ｍｌ容遠沈管に移す。
↓
フェノール:クロロホルム＝１：１の溶液を等量加える。
↓
ローテーターの上に置き、１５分間混和する。
↓
室温で２５００ｒｐｍで１０分間遠心する。
↓
上清を新しい１５ｍｌ容遠沈管に移す。
↓
クロロホルム溶液を等量加える。
↓
ローテーターの上に置き、１５分間混和する。
↓
室温で２５００ｒｐｍで１０分間遠心する。
↓
上清を新しい１５ｍｌ遠沈管に移す。
↓
１００％エタノール（−２０℃保存）を２倍量加える。
↓
−２０℃の冷凍冷蔵庫に１６時間置き、ＤＮＡを析出させる。
↓
３日目
ＤＮＡの析出している遠沈管を4℃で３０００ｒｐｍ、15分間遠心する。
↓
上清を捨てる。
↓
70%エタノール(４℃保存)でDNAを洗う。
↓
チューブを逆さに立てて、1〜2時間乾燥する。
↓
600μlの1ｘＴＥバッファー（１０ｍＭ Tris-ＨＣｌ(pH8.0),１ｍＭ ＥＤＴＡ(pH8.0)）を加え、４℃低温室内で回転式ローテーターを用い、一晩かけてよく溶かす。
↓
１．５ｍｌの遠沈管に移し、濃度を測定し、４℃で保管する。
【００２３】
２．プライマーの調製
順方向プライマーＧＧＣＣＡＧＡＧＴＴ  ＴＧＡＡＴＡＴＡＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＡＧ  （配列番号１）、逆方向プライマーＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴ  ＴＧＴＧＡＣＡＴＡＴ  ＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣ  ＡＴＣ  （配列番号２）は業者に合成を依頼し、脱塩精製を行った。
【００２４】
３．長鎖ＰＣＲ法
試験管あたりの反応用液の組成は以下のとおりである。
２×ＧＣバッファーＩ（ＴａＫａＲａ）（５ｍＭＭｇＣｌ２含有）      ２５μｌ
ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）(Applied BioSystems)                            ２.５μｌ
ｄＣＴＰ（１０ｍＭ）(Applied BioSystems)                            ２.５μｌ
ｄＴＴＰ（１０ｍＭ）(Applied BioSystems)                            ２.５μｌ
ｄＧＴＰ（１０ｍＭ）(Applied BioSystems)                            １.０μｌ
７−デアザｄＧＴＰ（１０ｍＭ）(Roche)                               １.５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２                                                 ０.５μｌ
ＬＡＴａｑＨＳ（５Ｕ／μｌ）（ＴａＫａＲａ）                        ０.５μｌ
順方向プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）                              １μｌ
逆方向プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）                              １μｌ
滅菌蒸留水                                                        １０μｌ    
計                                                                  ４８μｌ
（ここで順方向プライマー、逆方向プライマーは上記２）で調製したｓｓＤＮＡである。）
【００２５】
以下の手順でＰＣＲを行った。
８連の０．２ｍｌ容遠沈管それぞれに鋳型ＤＮＡ２μｌ（０.２−０.３μｇ／μｌ）を分注し、氷上に置く
↓
各チューブに、上記の反応液４８μｌを静かに加える（混和してはいけない）。
↓
Gene Amp PCR System 9700(PE Applied BioSystems)にセットし、下記の条件でＰＣＲ増幅を行う。
ＰＣＲ条件
９４℃１分
↓
９８℃１０秒→６４℃２０分、１０サイクル
↓
９８℃１０秒→６４℃２０分＋２０秒／サイクル、２３サイクル
↓
７２℃１０分
↓
４℃保存
【００２６】
４．電気泳動
１１×１４ｃｍの大きさの０．４％アガロースゲル(SEAKEN HGT AGAROSE FMC)を１×ＴＡＥバッファーで作製した。ＰＣＲ産物３０μｌを電気泳動装置（商品名HORIZON11.14(GIBCO BRL)を用い、４．２Ｖ／ｃｍで３時間泳動した。泳動が済んだアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した後、ＵＶ（ＶＩＬＢＥＲＬＯＵＲＭＡＴ）照射下インスタントフィルム(POLAROID MD-4)を用い写真撮影をした。図４にその写真を示す。
【００２７】
５．サザンブロット
写真撮影後、常法どおりアガロースゲルからハイボンドＮ＋膜(Amersham Bioscience)への転写を行い、３２Ｐ放射性同位体標識したプローブｐＭＡ−１３を用いてサザンブロットを行った。すでに述べたようにｐＭＡ−１３はＤ４Ｚ４内にある１．３ｋｂの制限酵素StuI切断断片を含むものである。５．２ｋｂから１８．４ｋｂのＤ４Ｚ４リピートの存在が確認された。
【００２８】
６．確認
別途、増幅ＰＣＲ産物を制限酵素BlnIを用いて消化しても、増幅産物の大きさに変化のないことを確認した。これは増幅されたＰＣＲ産物が第１０染色体上の３．３ｋｂ KpnIリピート（BlnI切断部位を有する）ではないことを示すものである。これにより上記５．２ｋｂから１８．４ｋｂのＰＣＲ増幅産物が第４染色体上のＤ４Ｚ４リピート１−５個に相当することが確認された。
また従来法と比較するために上記１０例の患者のDNA標品について従来法での検定（EcoRI切断、電気泳動、ｐ１３Ｅ−１１をプローブとするサザンブロット）を行った結果を図５に示す。ここで＊を付したバンドはＹ染色体上の相同配列が認識されたものである。
【実施例２】
【００２９】
表２に患者６７例について実施例１と同様にして本発明のＰＣＲ法を行った結果と従来のサザンブロット法による結果の対比を示す。これからも本発明の信頼性は明らかである。
【表２】
2006129807.tif 000004
【００３０】
ＰＣＲ法ではＤ４Ｚ４リピート数１〜５個に相当するバンド（従来のサザンブロット法での１０〜２５ｋｂのEcoRI断片長に相当）が増幅される。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上の結果から、本発明の長鎖ＰＣＲ法を用いることにより、ＧＣ含量のきわめて高くかつ繰り返し配列を有する領域も容易に増幅することができることが明らかになった。さらに第４染色体特異的に設計されたプライマーを用いることにより、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ（ＦＳＨＤ）の遺伝子欠失を、従来のＥｃｏＲＩ断片のサザンブロット法による大まかなサイズ変化として捉えるのではなく、実際のＤ４Ｚ４リピートの数を１〜５個まで正確に数えることによって確認することが可能になった。また本方法は従来法に比べ、使用するＤＮＡ量は１００分の１、所要時間も約５分の１と簡便かつ迅速に遺伝子解析をおこなうことができるので、ＦＳＨＤ患者の９５％以上を占める、Ｄ４Ｚ４の繰り返しが６個以下の患者をスクリーニングするのにきわめて有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】第４染色体上のＦＨＳＤ患者と正常者とのＤ４Ｚ４繰り返し数の違いおよびプライマーの相当部位、制限酵素切断部位およびプローブの位置関係を示す模式図である。
【図２】２１４例のＦＳＨＤ患者について従来法のＥｃｏＲＩ断片−サザンブロットを行った、ＥｃｏＲＩ断片長の分布を示すグラフである。
【図３】ＦＨＳＤ患者と正常者のＥｃｏＲＩ断片の長さの違いを示す、従来法によるサザンブロットの結果である。□は父親、●はＦＳＨＤの母親、■はＦＳＨＤの息子を示す。
【図４】１０例の患者のＤＮＡ標品を本発明の方法でＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動しエチジウムブロマイドで染色した結果である。
【図５】図４と同じ１０例の患者のＤＮＡ標品について従来法でサザンブロットを行った結果である。
【図１】
2006129807.tif 000005
【図２】
2006129807.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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