(57)【要約】      （修正有）【課題】  アネキシンＶを部分構造として含むテクネチウムで標識され、生体内のアポトーシスをイメージング可能な化合物であって、非標的組織への放射能集積が低減されており、かつ簡便な操作で容易に高い収率で製造可能な化合物を提供する。【解決手段】  4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドとアネキシンＶとがリンカーを介して結合した、例えば下記の式(I)：2006316004.tif 000007（ｍは１ないし８の整数、ｎは１ないし５の整数、Ｘは２価の連結基、丸で囲んだアネキシンＶに結合するアミノ基はアネキシンのアミノ酸残基に由来するアミノ基を示す）で表わされる化合物、及び該化合物にテクネチウムが配位した標識化合物、並びに該標識化合物を有効成分として含むイメージング剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドとアネキシンＶとがリンカーを介して結合した化合物。
【請求項２】
4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドの4'-アミノメチル基のアミノ基とアネキシンＶを構成するアミノ酸残基のアミノ基とがリンカーを介して結合した化合物。
【請求項３】
下記の式(I)：
【化１】
2006316004.tif 000005
（式中、ｍは１ないし８の整数を示し、ｎは１ないし５の整数を示し、Ｘは２価の連結基を示し、丸で囲んだアネキシンＶに結合するアミノ基はアネキシンのアミノ酸残基に由来するアミノ基を示す）で表わされる化合物。
【請求項４】
下記の式(II)：
【化２】
2006316004.tif 000006
（式中、ｍは１ないし８の整数を示し、ｎは１ないし５の整数を示し、丸で囲んだアネキシンＶに結合するアミノ基はアネキシンのアミノ酸残基に由来するアミノ基を示す）で表される化合物。
【請求項５】
ｍが５であり、ｎが３である請求項３又は４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物にテクネチウムが配位した標識化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の標識化合物を有効成分として含むアポトーシスのイメージング剤。
【請求項８】
ヒト若しくはヒト以外の哺乳類動物の疾患の診断に用いる請求項７に記載のイメージング剤。
【請求項９】
心筋梗塞の予後予測に用いる請求項８に記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ヒト若しくはヒト以外の哺乳類動物に投与した薬剤の効果予測のために用いる請求項８に記載のイメージング剤。
【請求項１１】
抗悪性腫瘍剤の効果予測又は虚血性心疾患に対する治療薬の効果予測のために用いる請求項８に記載のイメージング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内で生じるアポトーシスをインビボでイメージングすることが可能なイメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のアポトーシス研究により、アポトーシスは生体のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしており、癌をはじめとする種々の疾患に深く関与することが解明されている。従って、生体内で起きるアポトーシスを体外から非侵襲的に画像化することが可能であれば、これらの疾患の臨床診断や病態解明に非常に有用であり、将来的には、個々の患者の状態を正確に把握し、その状態に応じて適切な治療法を選択するといったいわゆるテーラーメイド治療の実現に大きく貢献する可能性も考えられる。
【０００３】
細胞がアポトーシスを起こすときの細胞破壊は、まず細胞膜の変性、核クロマチンの濃縮、DNAの断片化、及び細胞全体の収縮と断片化が起こり、アポトーシス小体となってマクロファージなどにより貪食されるという経過をたどる。この過程の初期段階である細胞膜変性時にフォスファチジルセリン(PS)の細胞膜表面への移送がおこる。アネキシンＶ (Annexin V)は分子量36 kDaの内因性のタンパクであり、PSに高い親和性を有する。正常な状態の細胞では、PSが細胞膜表面に存在しないため、アネキシンＶは、アポトーシスにより細胞膜表面に露出したPSの高感度のプローブとして使用することができる。従って、アネキシンＶを画像診断に適した物理的性質を有するラジオアイソトープ(RI)で標識すれば、RIを選択的にアポトーシス細胞に輸送することが可能であり、体内で起こっているアポトーシスを体外から非侵襲的に画像化することが可能である。このような観点から、アネキシンＶをRIで標識した化合物がいくつか提案されている。
【０００４】
アネキシンＶのRI標識化合物としては、当初、放射性ヨウ素で標識したアネキシンＶが用いられていたが、その後、テクネチウム(99mTc)で標識されたアネキシンＶが開発されており、現在ではテクネチウム標識化合物を利用するのが一般的である。例えば、N2S2型の四座配位子を標識部位として用いた99mTc-4,5-ビス(チオアセトアミド)ペンタノイル-アネキシンＶ (99mTc-BTAP-アネキシンＶ)が知られている(Circulation, 92, pp.3113-3121, 1995)。Narulaらは、このテクネチウム標識化合物を心臓移植を行った患者に投与したところ、拒絶反応を生じている患者では心臓に放射能集積が生じること、及び心筋生検サンプルのカスパーゼ-3染色によりこれらの患者の心臓ではアポトーシスが生じていることを報告している(Nat. Med., 7, pp.1347-1352, 2001)。
【０００５】
しかしながら、99mTc-BTAP-アネキシンＶは製造上の問題があり、この問題から汎用性が乏しいという問題がある。すなわち、この標識化合物に用いられるN2S2型配位子は遊離型チオールを含むため、中間段階でチオール基を保護することが必要となるが、99mTc標識を行なうに際して加熱などの過酷な条件でチオール保護基の脱保護を行なう必要がある。このため、アネキシンＶとN2S2型配位子とを結合させた後に標識を行うことができず、99mTc-グルコネートとN2S2配位子との反応により安定な99mTc-N2S2錯体を形成させた後、アネキシンＶと99mTc-N2S2錯体とを結合させ、目的物をゲルろ過で精製する多段階のステップが必要である。また、放射化学的収率が25-30%程度の低収率であることから、高放射能の99mTcを用いて反応を行なう必要があり、作業者の被曝も問題である。
【０００６】
このような問題を解決したテクネチウム標識化合物として、Blankenbergらはヒドラジノニコチンアミド(HYNIC)を配位子として用いる99mTc-HYNIC-アネキシンＶを報告している(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, pp.6349-6354, 1998)。HYNICは単座配位子であり、コリガンドとしてトリシン(tricine)を用いた場合、Tc:HYNIC:tricine=1:1:2の混合配位子錯体を形成する(Bioconjug. Chem., 6, pp.635-638, 1995)。この反応は穏やかな条件下で効率よく進行するため、予めHYNICとアネキシンＶとをconjugateしたHYNIC-アネキシンＶを作製してから99mTc標識することができ、１段階の反応で、しかもその後の精製を必要とせずに92-95%と高い放射化学的収率で99mTc-HYNIC-アネキシンＶの作製が可能である。また、この方法により198-265 GBq/μmolと高い比放射能の標識化合物を作製することが可能である。このように99mTc-HYNIC-アネキシンＶは簡便な操作で迅速に高い収率で作製可能であるため、より臨床利用に適した薬剤だと考えられる。
【０００７】
しかしながら、99mTc-HYNIC-アネキシンＶでは、コリガンドであるトリシンが非標的臓器において他のリガンドと置き換わってしまい、化学変化を生じた標識化合物が代謝臓器に滞留してしまうという問題があることが分かっている。特に、99mTc-HYNIC-アネキシンＶは非標的臓器、とりわけ腎臓への放射能集積が高いという問題を有している。Onoらは、Tc:HYNIC:tricine=1:1:2の混合配位子錯体を用いた99mTc標識タンパクを生体に投与した場合、放射性代謝物である[99mTc](HYNIC-lysine)(tricine)2のtricine 1分子とリソソーム内分子との配位子交換が代謝臓器への放射能集積に関与していること、及びtricine 1分子をピリジン誘導体1分子で置換することにより代謝臓器におけるクリアランスが促進されることを報告している(Bioconjug. Chem., 10, pp.386-394, 1999; Nucl. Med. Biol., 28, pp.155-164, 2001)。しかしながら、このピリジン誘導体との置換反応には加熱が必要であり、臨床利用を考慮した場合には現実的な解決方法ではない。
【０００８】
一方、テクネチウムのための配位子としてヒドロキサムアミド構造を有する[C3(BHam)2] (4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサムアミド)が提案されており(Bioconjugate Chemistry, 10(1), pp.9-17, 1999)、この配位子を用いて蛋白質やポリペプチドをテクネチウム標識できることも報告されている(Biomedical Research on Trace Elements, 14(1), pp.29-33, 2003)。しかしながら、この配位子及びテクネチウムを用いてアネキシンＶを標識した化合物は従来知られておらず、その性質も全く知られていない。
【非特許文献１】Circulation, 92, pp.3113-3121, 1995
【非特許文献２】Nat. Med., 7, pp.1347-1352, 2001
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, pp.6349-6354, 1998
【非特許文献４】Bioconjugate Chemistry, 10(1), pp.9-17, 1999
【非特許文献５】Biomedical Research on Trace Elements, 14(1), pp.29-33, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、生体内のアポトーシスをイメージングするための化合物を提供することにある。より具体的には、アネキシンＶを部分構造として含むテクネチウムで標識された化合物であって、非標的組織への放射能集積が低減されており、かつ簡便な操作で容易に高い収率で製造可能な化合物を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、アネキシンＶとBHamとをリンカーで結合した化合物にテクネチウムを配位させた標識化合物がヒトを含む哺乳類動物の生体内でアポトーシスを極めて明瞭にイメージングできること、及び該標識化合物が簡便な操作により容易に製造でき、しかも非標的組織への放射能集積が低減されていることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【００１１】
すなわち、本発明により、テクネチウムの配位子である4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドとアネキシンＶとがリンカーを介して結合した化合物、より好ましくは、テクネチウムの配位子である4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドの4'-アミノメチル基のアミノ基とアネキシンＶを構成するアミノ酸残基のアミノ基とがリンカーを介して結合した化合物が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、下記の式(I)：
【化１】
2006316004.tif 000002
（式中、ｍは１ないし８の整数を示し、ｎは１ないし５の整数を示し、Ｘは２価の連結基を示し、丸で囲んだアネキシンＶに結合するアミノ基はアネキシンのアミノ酸残基に由来するアミノ基を示す）で表わされる化合物が提供され、さらに好ましい態様によれば、下記の式(II)：
【化２】
2006316004.tif 000003
（式中、ｍは１ないし８の整数を示し、ｎは１ないし５の整数を示し、丸で囲んだアネキシンＶに結合するアミノ基はアネキシンのアミノ酸残基に由来するアミノ基を示す）で表される化合物が提供される。さらに好ましい態様によれば、ｍが５であり、ｎが３である上記の各化合物が提供される。
【００１３】
別の観点からは、上記の化合物にテクネチウムが配位した標識化合物が提供される。また、本発明により、上記標識化合物を有効成分として含むアポトーシスのイメージング剤が提供される。このイメージング剤は、哺乳類動物の生体内で生じるアポトーシスをインビボでイメージングするために用いることができ、例えば、心筋梗塞の予後予測や抗悪性腫瘍剤の効果予測などの目的でイメージングを行なうことができる。より具体的には、本発明により、ヒト若しくはヒト以外の哺乳類動物の疾患の診断に用いる上記イメージング剤、心筋梗塞の予後予測に用いる上記イメージング剤、ヒト若しくはヒト以外の哺乳類動物に投与した薬剤の効果予測のために用いる上記イメージング剤、及び抗悪性腫瘍剤の効果予測又は虚血性心疾患に対する治療薬の効果予測のために用いる上記イメージング剤が提供される。
さらに別の観点からは、本発明により、上記の標識化合物を哺乳類動物に投与してアポトーシスをイメージングする方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、生体内のアポトーシスを明瞭にイメージングするための化合物が提供される。本発明の化合物は、テクネチウムで標識された従来の化合物に比べて非標的組織への放射能集積が低減されており、簡便な操作で容易に高い収率で製造可能である。本発明のイメージング剤は、心筋梗塞の予後予測や抗悪性腫瘍剤の効果予測など種々の医療用途に安全に用いることができ、明瞭なアポトーシスのイメージングを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明により提供される化合物は、テクネチウムの配位子である4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドとアネキシンＶとがリンカーを介して結合した化合物である。この化合物において、テクネチウムの配位子である4'-アミノメチル-N,N'-トリメチレンジベンゾヒドロキサミドの4'-アミノメチル基のアミノ基とアネキシンＶを構成するアミノ酸残基のアミノ基とがリンカーを介して結合した化合物が好ましく、さらに好ましい化合物は式(I)又は式(II)で表わされる化合物である。
【００１６】
上記式(I)において、ｍはとしては３ないし６の整数が好ましく、特に好ましいのはｍが５の化合物である。また、ｎとしては２ないし４の整数が好ましく、特に好ましいのはｎが３の化合物である。Ｘが示す２価の連結基の種類は特に限定されず、直鎖状、分枝鎖状、又は環状、あるいはそれらの組み合わせからなる連結基を用いることができ、連結基中には任意の個数の官能基及び／又は不飽和結合を含んでいてもよく、任意の個数の炭素原子及び／又はヘテロ原子（例えば酸素原子、窒素原子、又はイオウ原子など）を含んでいてもよい。
【００１７】
Ｘが示す２価の連結基中の原子の個数は特に限定されないが、例えば、２〜１０個程度であることが好ましい。また、Ｘが示す２価の連結基において、連結に関与する一方の原子ともう一方の原子とを結ぶ原子の数のうちの最小の数が３ないし５個程度であることが好ましい（本明細書においてこの原子数を「連結基構成最短原子数」という。例えば、1,3-プロペニレン基の場合には連結基構成最短原子数は３であり、1,2-プロペニレン基の場合には２であり、1,5-(4-ブトキン-3-ペンテニレン）基の場合には５である。また、1,3-フェニレン基の場合には３であり、1,2-フェニレン基の場合には２であり、2,4-キノリンジイル基の場合には３であり、1,5-ナフチレンの場合には４である。さらに、エチレンジオキシ基では４であり、マロニル基では３であり、フタロイル基では４である。）。本発明で特に好ましい連結基は下記の式で表される連結基であり、この連結基における連結基構成最短原子数は４である。この連結基を含む上記式(II)で表される化合物は、本発明において特に好ましい化合物である。
【化３】
2006316004.tif 000004
【００１８】
本発明の化合物は、一般的には、アネキシンＶを構成するアミノ酸残基に存在するアミノ基に対して反応性官能基を導入しておき、一方、[C3(BHam)2]を文献記載の方法、例えばBioconjug. Chem., 10, pp.9-17, 1999に記載された方法に従って製造して、反応性官能基を導入し、これらの２つの化合物の反応性官能基を反応させてリンカーとして結合させることにより製造することができる。本発明の化合物の典型的な製造方法が本明細書の実施例に具体的に示されているので、本明細書の実施例を参照することにより、当業者は本発明の化合物を容易に製造することが可能である。アネキシンＶを構成するアミノ酸残基に存在するアミノ基に反応性官能基を導入する方法は、例えば、背景技術に説明した非特許文献１ないし３などに説明されている。
【００１９】
本発明の上記化合物をテクネチウムと配位させることにより、本発明の標識化合物を製造することができる。テクネチウムとしては、一般的には核医学診断に広く用いられている99Moからミルキングで得られる99mTc（半減期6.01時間）を用いることができる。上記の化合物に対してテクネチウムを配位させる方法は特に限定されないが、例えば、背景技術に説明した非特許文献４又は５などを参照することにより行なうことが可能である。例えば、テクネチウムを含む99mTc-グルコヘプトナートを生成させ、この放射性化合物を上記の化合物と室温で数十分程度反応させることにより本発明の標識化合物を製造することができる。
【００２０】
上記の標識化合物を有効成分として含む本発明のイメージング剤をヒト又はヒト以外の哺乳類動物に投与することにより、アポトーシスをインビボでイメージングすることが可能である。本発明のイメージング剤は、インビボでイメージングを行うことにより、各種疾患の診断薬として、あるいは薬剤の有効性の判定などに用いることが可能である。例えば、本発明のイメージング剤を用いて心筋梗塞の患者の心臓におけるアポトーシスをイメージングすることにより、心筋梗塞の予後を判定することができる。また、抗悪性腫瘍剤を投与した患者において標的臓器におけるアポトーシスをイメージングすることによって、抗悪性腫瘍剤の効果を判定することもできる。
【００２１】
例えば、先に説明したように、従来、99mTc標識アネキシンＶを用いて、臓器におけるアポトーシス及び臓器移植の拒絶反応を調べることができることが知られている。また、心筋虚血再灌流傷害などにおいてアポトーシスのイメージング剤としての有用性が示されている(J. Nucl. Med., 45, pp.1536-1541, 2004)。さらに、Mochizukiらにより99mTc-HYNIC-アネキシンＶが抗癌剤の投与早期における治療効果判定予測に有用である可能性が示されており(J. Nucl. Med., 44, pp.92-97, 2003)。Doueらにより99mTc-HYNIC-アネキシンＶにより心筋虚血再灌流傷害によるアポトーシスをイメージングし、エリスロポイエチン(EPO)投与によるアポトーシス抑制効果が評価可能であると報告されている（Circulation, 110 suppl III, pp.435, 2004）。これらの刊行物を参照することにより、本発明のイメージング剤を上記用途に利用することが可能である。もっとも、本発明のイメージング剤の用途は上記に具体的に説明したものに限定されることはない。
【００２２】
本発明のイメージング剤の投与量は、核医学的見地からテクネチウムの放射能に応じて適宜決定できる。一般的には、イメージング剤を静脈内投与するか、あるいは局所投与した後、数分から１時間以内程度の短時間のうちにイメージングを行なうことが望ましい。イメージングは核医学の一般的手法であるSPECT撮像により容易に行なうことが可能であり、その手法は、例えば背景技術に記載した非特許文献１ないし３などに具体的に示されている。
【００２３】
本発明のイメージング剤は、一般的には溶液の形態で提供されるが、必要に応じて、診断薬などの製造に一般的に用いられる製剤用添加物を１種又は２種以上添加してもよい。例えば、緩衝剤、pH調節剤、無痛化剤、防腐剤、等張化剤などを添加することが可能である。また、標識前の前駆体はkitとして作製、長期保存が可能であるが、テクネチウム標識後は速やかに使用されるべきであり、長期保存には適しないが、必要に応じて溶液状態のまま、あるいは凍結乾燥状態などで一時的に保存することも可能である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
C3(BHam)2をXuらの方法(Bioconjug. Chem., 10, pp.9-17, 1999)に従って合成した。アネキシンＶは興和株式会社から供与されたものを用いた。アネキシンＶ 2 mgを0.16 M ホウ酸緩衝液(pH 8.0, 2 mM EDTA) 800μLに溶解した。2-iminotholane (2-IT) 80 μgを0.16 M ホウ酸緩衝液(pH 8.0, 2 mM EDTA) 40μLに溶解し、上記のアネキシンＶ溶液に加えて室温で1時間攪拌した。その後、生成物をPD-10 カラム (Amersham Biosciences)により精製した。
C3(BHam)2 1 mgをN,N-ジメチルホルムアミド(DMF) 36μLに溶解した。N-スクシイミジル-6-マレイミドヘキサノエート 454μgをDMF 36 μLに溶解して上記のC3(BHam)2溶液に加えた。PD-10で精製後のアネキシンＶ反応溶液1.5 mLにNaH2PO4を192 μL加えた後、C3(BHam)2反応溶液16 μl加えて室温で2時間攪拌した。その後、ヨードアセトアミド 1 mgを水100μLに溶解して加え、室温で10分攪拌した。その後、PD-10 カラムを用いて反応溶液を精製してC3(BHam)2-アネキシンＶ（上記一般式(II)において、mが5であり、nが3である化合物）を得た。
【００２５】
Yamamuraらの方法(Bioconjug. Chem., 10, pp.489-95, 1999)によって作製したSn-グルコヘプトナート・キット 2 mgに99mTcO4- 1 ml(370 MBq)を加えて室温で15分間反応させることにより99mTc-グルコヘプトナートを得た。C3(BHam)2-アネキシンＶ 21 μL (334 μg/mL)と99mTc-グルコペプトナート 4 μLを室温で１時間反応させ、放射化学的収率97%で99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶを得た。上記方法にてアネキシンＶと99mTc-グルコペトナートとを反応させたところ、タンパク画分には放射能が観察されなかったことから、99mTcは特異的にC3(BHam)2に配位しているものと考えられた。比較のため、Bioconjug. Chem., 10, pp.386-94, 1999に記載された方法に従ってHYNIC-アネキシンＶを製造し、Eur. J. Nucl. Med., 26, pp.1251-1258, 1999に記載された方法に従ってHYNIC-アネキシンＶの99mTc標識を行なった。
【００２６】
例２：血球結合実験
作製した化合物の生理活性を調べるためにTaitらの方法(Bioconjug. Chem., 11, pp.918-925, 2000)に従って細胞結合アッセイを行った。その結果、99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶ と99mTc-HYNIC-アネキシンＶでそれぞれ78.92±0.63及び78.64±3.44であった。99mTc-HYNIC-アネキシンＶの文献値（上記Taitらの文献）が83.9±2.5であることから、アネキシンＶの活性は両者でほぼ保たれていると考えられた。
【００２７】
例３：体内動態実験
1群5匹のddY雄性マウス(27-30 g)に99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶ 及び99mTc-HYNIC-アネキシンＶ 100μL (37 kBq)を静脈内投与後、動物を経時的(10, 60, 180分後)に屠殺して臓器を摘出し、それぞれの重量と放射能を測定した。その結果、99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶは99mTc-HYNIC-アネキシンＶに比べて腎臓の放射能集積が大幅に低減されていた。また、肝臓及び腎臓の放射能が99mTc-HYNIC-アネキシンＶにおいては滞留しているのに対して、99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶでは３時間において減少していた（図１）。以上の結果より、99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶは、アポトーシスイメージング薬剤として優れた性質を有していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】99mTc-C3(BHam)2-アネキシンＶ 及び99mTc-HYNIC-アネキシンＶをマウスに投与した後の肝臓及び腎臓における放射能集積を測定した結果を示した図である。
【図１】
2006316004.tif 000008