(57)【要約】【課題】慢性肝炎は、治療薬の効果が認められない場合は、やがて肝硬変へと進展するが、肝硬変はほぼ確実に肝癌へと転帰する。したがって肝硬変は肝癌発症における病態のクリティカルステージであり、肝癌の前癌状態であると考えられる。そのため、慢性肝炎から肝硬変への病態の進展を的確に判別するためのマーカーならびにその判別法は、肝癌の早期診断マーカーならびに早期診断法として肝癌の発症阻止に向けた予防治療を施すことを可能にする。しかしながら現時点においてはそのようなマーカーならびに判別法は存在しない。【解決手段】慢性肝炎と肝硬変の患者で検出され、正常な人では検出されないマーカー、及び、正常な人と慢性肝炎患者で検出され、肝硬変の患者では検出されないマーカー、を二次元電気泳動法で検出することによって、肝疾患病態、特に慢性肝炎から肝硬変への病態の進展を判定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子を含む肝疾患病態判定用マーカー。
【請求項２】
α１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎ，Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ），Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎの少なくとも１種類を含む肝疾患病態判定用マーカー。
【請求項３】
慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料におけるＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子の有無を決定するステップとα１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ， Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎ，Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ），Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎの少なくとも１種類の有無を決定するステップとを有することを特徴とする肝疾患病態判定方法。
【請求項４】
慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＡ（等電点がｐＨ４．８を含み、分子量分布が５万を含む）の有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法。
【請求項５】
慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＢ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が５万５千を含む），スポットＣ（等電点がｐＨ６．１を含み、分子量分布が１万７千を含む），スポットＤ（等電点がｐＨ５．４を含み、分子量分布が１万４千を含む），スポットＥ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が４万２千を含む）の少なくとも１つの有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法。
【請求項６】
慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＡ（等電点がｐＨ４．８を含み、分子量分布が５万を含む）の有無、及び、スポットＢ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が５万５千を含む），スポットＣ（等電点がｐＨ６．１を含み、分子量分布が１万７千を含む），スポットＤ（等電点がｐＨ５．４を含み、分子量分布が１万４千を含む），スポットＥ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が４万２千を含む）の少なくとも１つの有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法。
【請求項７】
前記生体試料が血液であることを特徴とする請求項３，４，５又は６記載の肝疾患病態判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患の病態を判定するための新規マーカー及び該マーカーを利用する肝疾患病態判定方法に関する。詳しくは、慢性肝炎と肝硬変の判定を正確に判定するための新規マーカー及び該マーカーの1種類又は複数種類を利用する肝疾患病態判定方法に関する。さらに、上記マーカーのスポットを二次元電気泳動で検出する肝疾患病態判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、肝障害の判定には、血中に漏出するＧＯＴやＧＰＴ等を定量し、異常が認められた場合に、さらに障害原因を特定するために他の検査を行うという方法が一般的に採用されている。しかし、ＧＯＴやＧＰＴは肝障害がかなり進行した段階でなければ血中に漏出しないため、ＧＯＴやＧＰＴ診断による疾患の早期発見は困難であった。そこで、肝障害の早期発見を目的として、肝障害時に血中に漏出する肝クレアチンを定量する肝障害検査法が提案されている（特許文献１）。
【０００３】
また、肝細胞癌に関しては、肝細胞癌判定用マーカーが提案されている（例えば特許文献２）。
【特許文献１】特開２００３−２６２６４１
【特許文献２】特開平８−１８４５９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来から、肝細胞癌判定用マーカーは数多く提案され利用されている。たとえばアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）やＰＩＶＫＡＩＩが繁用されているが、これらは感度ならびに特異性ともに満足できるものではない。また、肝癌治療に不可欠な肝癌早期診断マーカーは現存しない。一方、慢性肝炎と肝硬変を正確に判別する適切な方法も知られていない。慢性肝炎は、治療薬の効果が認められない場合は、やがて肝硬変へと進展するが、肝硬変はほぼ確実に肝癌へと転帰する。したがって肝硬変は肝癌発症におけるクリティカルステージであり、肝癌の前癌状態であるとみなしてよい。そのため、慢性肝炎から肝硬変への病態の進展を的確に判別するためのマーカーならびにその判別法は、肝癌の早期診断マーカーならびに早期診断法として予防治療を可能にするものであり、それらを発見し確立することは肝癌発症を防ぐための適切な治療を施すために早急に解決すべき重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上述の問題点を解決するためになされたものであって、慢性肝炎と肝硬変の患者で検出され、正常な人で検出されないマーカー及び正常な人と慢性肝炎患者で検出され、肝硬変の患者で検出されないマーカーに関するものである。また、それらのマーカーを用いる肝疾患の病態判定方法、及び、それらのマーカーのスポットを二次元電気泳動で検出する肝疾患の病態判定方法に関する。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子を含む肝疾患の病態判定用マーカーである。
【０００７】
Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子は、慢性肝炎ならびに肝硬変患者由来血清すべてで検出されるタンパク質であり、肝疾患の病態判定に効果的に利用できるマーカーである。
【０００８】
また、本発明は、（２）α１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎ，Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ），Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎの少なくとも１種類を含む肝疾患の病態判定用マーカーである。
【０００９】
これらのタンパク質は、慢性肝炎患者の大部分で検出されたが、肝硬変患者では多くの試料で検出できなかった。マーカーとしての利用は、１種類の上記タンパク質であってもよいが、複数を組み合わせることによって、より正確な肝疾患の病態判定が可能になる。
【００１０】
また、本発明は、（３）慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための肝疾患病態判定方法であって、患者から得た生体試料におけるＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子の有無を決定するステップとα１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ， Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎ，Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ），Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎの少なくとも１種類の有無を決定するステップとを有することを特徴とする肝疾患病態判定方法である。
【００１１】
上述の各ステップの順序は任意でよく、どちらのステップを先に実行しても効果は同様である。上述のように肝疾患の病態を判定することにより、肝機能の正常な人、慢性肝炎患者、肝硬変患者を正確に判断することができる。
【００１２】
また、本発明は、（４）健常人と肝疾患患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＡ（等電点がｐＨ４．８を含み、分子量分布が５万を含む）の有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法、である。
【００１３】
また、本発明は、（５）慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＢ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が５万５千を含む），スポットＣ（等電点がｐＨ６．１を含み、分子量分布が１万７千を含む），スポットＤ（等電点がｐＨ５．４を含み、分子量分布が１万４千を含む），スポットＥ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が４万２千を含む）の少なくとも１つの有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法、である。
【００１４】
また、本発明は、（６）上記、慢性肝炎患者と肝硬変患者とを区別するための方法であって、患者から得た生体試料の二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットＡ（等電点がｐＨ４．８を含み、分子量分布が５万を含む）、又はスポットＢ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が５万５千を含む）又はスポットＣ（等電点がｐＨ６．１を含み、分子量分布が１万７千を含む）又はスポットＤ（等電点がｐＨ５．４を含み、分子量分布が１万４千を含む）又はスポットＥ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が４万２千を含む）の有無を検出することを特徴とする肝疾患病態判定方法、である。
【００１５】
上記スポットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅはいずれも広がりを持つものであり、等電点、分子量とも厳密に特定することはできないので、各スポットが上記等電点、分子量を含むスポットとして規定した。
【００１６】
上述のように、マーカーの分子構造を同定する必要がないので、肝疾患の有無ならびにその病態の判定が二次元電気泳動装置を使用するだけで可能となる。また、特別な技能や知識を持たない人でも、肝疾患の判定が短時間で可能となる。
【００１７】
また、本発明は、（７）上記、（３），（４），（５）又は（６）において、前記生体試料が血液であることを特徴とする肝疾患病態判定方法、である。
【００１８】
少量の血液の採取だけで肝機能の正常な人、慢性肝炎患者、肝硬変患者を正確に判断することができるので、患者の負担を少なくすることができ、判定を短時間に行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の肝疾患病態判定用マーカー及び肝疾患病態判定方法によれば、慢性肝炎と肝硬変の判定を正確に判定することができる。したがって、本発明によって慢性肝炎患者の病態が肝硬変（前癌状態）へと進展したことを察知することが可能になり、肝癌発症阻止に向けた予防治療を早期に施すことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。図１は、正常人血清の二次元電気泳動パターンである。図２は、肝硬変患者血清の二次元電気泳動パターンである。
【００２１】
慢性肝炎患者と肝硬変患者から血液を採取し、血清タンパク質を得て、二次元電気泳動にて解析すると、健常人由来の血清タンパク質では検出されないスポットＡ（等電点がｐＨ４．８を含み、分子量分布が５万を含む）が検出される。
【００２２】
肝機能に異常のない人から血液を採取し、血清タンパク質を得て、二次元電気泳動にて解析すると、ほぼ全ての人からスポットＢ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が５万５千を含む）およびスポットＣ（等電点がｐＨ６．１を含み、分子量分布が１万７千を含む）およびスポットＤ（等電点がｐＨ５．４を含み、分子量分布が１万４千を含む）およびスポットＥ（等電点がｐＨ５．０を含み、分子量分布が４万２千を含む）が検出される。また、これらのスポットは大部分の慢性肝炎の患者からも検出される。しかし、肝硬変患者の多くからは検出されない。
【００２３】
以上のスポットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの検出により、肝機能に以上のない人、慢性肝炎患者、肝硬変患者の判定が高い確率で可能となる（下記００３０および００３２参照）。つまり、スポットＡが検出されず、スポットＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅの中の少なくとも１種類が検出されれば、肝機能に異常のない可能性が非常に高い。スポットＡが検出され、スポットＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅのうちの二つ以上が検出されなければ、肝硬変の可能性が非常に高い。また、スポットＡ及びスポットＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅの中の少なくとも三種類が検出されれば、慢性肝炎の可能性が非常に高い。
【００２４】
このようにして、肝疾患の病態を判定することができる。つまり、二次元電気泳動装置により、血清タンパク質のスポットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを検出すことにより、肝疾患の病態判定が短時間に可能である。
【００２５】
スポットＡはＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子であり、スポットＢはα１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎであり、スポットＣはＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎであり、スポットＤはＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ）であり、スポットＥはＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎである。
【００２６】
つまり、血清タンパク質にＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子の有無を決定するステップとα１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ， Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎ，Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ），Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎの少なくとも１種類の有無を決定するステップとを組み合わせることにより肝機能に異常のない人、慢性肝炎患者、肝硬変患者を判定することが高い精度で可能である。
【実施例１】
【００２７】
実施例として、二次元電気泳動による慢性肝炎と肝硬変の血清タンパク質の解析を説明する。
（１）方法
健常人１９例ならびに慢性肝炎患者２４例、肝硬変患者２０例のそれぞれから得た血清タンパク質１００μ g を以下のような二次元電気泳動にて解析した。
一次元目の等電点電気泳動は、血清タンパク質を、８M尿素２％の界面活性剤ＣＨＡＰＳを含む緩衝液に溶解し、１３ｃｍの固定化ｐＨ勾配（ｐＨ４〜７）ストリップ上で８０，０００volt
hours泳動した。泳動後ゲル中のタンパク質をそれぞれＤＴＴとヨードアセトアミドを入れた２％ＳＤＳ緩衝溶液で還元アルキル化した後に、二次元目のＳＤＳ電気泳動（ゲル濃度１５％、ゲル長１６ｃｍ）をおこない、ゲル中のタンパク質を銀染色
(Silver Staining kit， Amersham社)した。
【００２８】
（２）結果
本方法において、およそ５００のタンパク質由来スポットが検出された。図１に健常人由来血清タンパク質の、図２に肝硬変患者由来血清タンパク質の電気泳動パターンの一例を示した。電気泳動パターン図中、赤丸で囲んだスポットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅが検出の可否が試料ごとに変動したものである。Ａは肝炎ならびに肝硬変患者由来血清すべてで検出された。一方、スポットＢ，Ｃ，Ｄ，は健常人のほぼすべて、慢性肝炎患者の大部分で検出されたが、肝硬変患者では多くの試料で検出できなかった。これらのスポットを切り抜き、ゲル中のタンパク質を一晩トリプシン（Promega社）で処理してペプチド断片にした後、C-18 Tip（Eppendorf社）を用いて脱塩をおこない、マトリックスとしてCHCA(α-cyano-hydroxy-cinnamic
acid)を加えて共結晶化した。これを質量分析機（AXIMA-CFR、島津製作所）にかけ、上記ペプチドの質量パターンを得て、それをタンパク質同定ソフトMascotにて解析した。その結果図1中に示すように、
スポットＡはＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎを一成分とした複合分子であり、スポットＢはα１Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎであり、スポットＣはＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  α２ｃｈａｉｎであり、スポットＤはＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ）であり、スポットＥはＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  βｃｈａｉｎであった。
【００２９】
（３）考察
本実験において、肝疾患の血清タンパク質マーカーに関し、以下の二点の発見があった。
１）本実験で検出された二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットAは慢性肝炎患者ならびに肝硬変患者と健常人とを区別する、肝疾患マーカータンパク質である。
２）本実験において健常人で検出された二次元電気泳動ゲルパターン上のスポットB， C， D， Eが、慢性肝炎患者の大部分で観察されたが、肝硬変患者では検出率が顕著に減少した。
【実施例２】
【００３０】
次に、単独マーカーによる肝硬変と慢性肝炎の判別の例を説明する。
上記実施例１の実験結果において、Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ各スポット単独を検出できない慢性肝炎患者ならびに肝硬変患者の割合は以下の通りであった。Ｂ；慢性肝炎４％、
肝硬変６０％、Ｃ；慢性肝炎１７％・肝硬変６０％、Ｄ；慢性肝炎１３％・肝硬変４０％、Ｅ；慢性肝炎４％・肝硬変７５％  。すなわち、Ｅスポットの消失をマーカー（指標）とすれば、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）７５％、特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）９６％
で肝硬変患者を慢性肝炎患者から判別できることになる。
【００３１】
上記感度とは、該マーカーによって該疾患患者が陽性（罹患）と判定される確率であり、特異性とは、該マーカーによって非該疾患患者が陰性（非罹患）と判定される確率である。つまり、感度と特異性が高ければ、より高い精度での判別が可能となる。
【実施例３】
【００３２】
次に、複数マーカーによる肝硬変と慢性肝炎の判別の例を説明する。
上記実施例１の実験結果において、スポットＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅのうち、２つ以上のスポットが検出されない例は、慢性肝炎患者で２４例中１例、肝硬変患者で２０例中１７例認められた。すなわち、スポットＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅのうち、２つ以上のスポットが検出されないことをマーカー（指標）にして、感度９０％、特異性９６％で肝硬変患者を慢性肝炎患者から判別できる。このうち、ＢまたはＥが検出されないことを指標にして、感度９０％、特異性９２％で、ＣまたはＥが検出されないことを指標にして、感度９５％、特異性８０％で、ＤまたはＥが検出されないことを指標にして、感度８５％、特異性８８％で、肝硬変を検出することができる。
【００３３】
以上のように、複数のマーカーを指標とすることにより、感度と特異性を高めることが可能となる。
【００３４】
以上、本発明の実施例を図面により説明したが、本発明の具体的構成はこの実施例に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計の変更等があっても本発明に含まれる。例えば、マーカーとなるタンパク質の検出は二次元電気泳動に限られるものではなく、他の方法を使うことも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
我が国における肝癌患者数は６万人を越えており、慢性肝炎の予後を判定するマーカーならびに肝癌の早期診断マーカーの社会的ニーズは高い。
本発明によれば、慢性肝炎から肝硬変への病態の進展を判別することができるので、肝癌発症阻止に向けた予防治療を早期に施すことが可能になる。したがって、本発明をさらに発展させ、肝機能測定あるいは肝癌早期診断のための体外診断薬（検査薬キット）ならびに医療用診断機器を製造販売することによって、本発明を事業化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】正常な人の血清の二次元電気泳動パターン
【図２】肝硬変患者の血清の二次元電気泳動パターン
【図１】
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【図２】
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