(57)【要約】  【課題】  特定の配列を有する目的遺伝子サンプルを高感度に検出できる遺伝子検出方法、及び、その際に用いる標識プローブを提供する。  【解決手段】  検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質を複数連鎖させた物質で標識された一本鎖の標識プローブと、一本鎖に変性された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて、標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する、固相に固定化された一本鎖の捕捉プローブと、前記標識化遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて、前記遺伝子サンプルを固相に捕捉する遺伝子サンプル捕捉工程と、前記固相に捕捉された前記標識化遺伝子サンプルの標識を電気化学的な測定により検出する検出工程とを含む。  【選択図】図１
2006345834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
電気化学的に活性である物質が複数連鎖されてなる標識剤で標識された、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製し、該一本鎖の標識プローブと前記一本鎖の遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程と、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、
前記固相に固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記固相に捕捉する遺伝子サンプル捕捉工程と、
前記固相に捕捉された前記標識化遺伝子サンプル中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記標識プローブは、下記一般式（１）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化１】
2006345834.tif 000023
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記標識プローブは、下記一般式（２）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化２】
2006345834.tif 000024
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記標識プローブは、下記一般式（３）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３】
2006345834.tif 000025
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記標識プローブは、下記一般式（４）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化４】
2006345834.tif 000026
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項６】
請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａ、前記Ｅ、前記Ｘの結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、あるいは抗体抗原結合のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｎは、２〜１００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａは、天然高分子または合成高分子である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルキル、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンのいずれか、あるいはこれらの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１０】
請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｅは、前記Ｌａに１〜１０個化学結合している、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１１】
請求項２ないし請求項５にいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｅは、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記検出工程は、前記固相に対して電圧を印加し、前記連鎖した電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１８】
特定の配列を有する遺伝子と特異的に結合され、該遺伝子を標識する標識プローブにおいて、
前記標識プローブは、連鎖した電気化学的に活性である物質が複数連鎖してなる標識剤で標識された、前記遺伝子の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブである、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の標識プローブにおいて、
当該標識プローブは、下記一般式（１）で表される、
ことを特徴とする標識プローブ。
【化５】
2006345834.tif 000027
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【請求項２０】
請求項１８に記載の標識プローブにおいて、
当該標識プローブは、下記一般式（２）で表される、
ことを特徴とする標識プローブ。
【化６】
2006345834.tif 000028
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【請求項２１】
請求項１８に記載の標識プローブにおいて、
当該標識プローブは、下記一般式（３）で表される、
ことを特徴とする標識プローブ。
【化７】
2006345834.tif 000029
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項２２】
請求項１８に記載の標識プローブにおいて、
当該標識プローブは、下記一般式（４）で表される、
ことを特徴とする標識プローブ。
【化８】
2006345834.tif 000030
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項２３】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記Ｌａ、前記Ｅ、前記Ｘの結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、あるいは抗体抗原結合のいずれかである、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２４】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記ｎは、２〜１００００の整数である、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２５】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記Ｌａは、天然高分子または合成高分子である、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２６】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記Ｌａは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルキル、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンのいずれか、あるいはこれらの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２７】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記Ｅは、前記Ｌａに１〜１０個化学結合している、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２８】
請求項１９ないし請求項２２のいずれかに記載の標識プローブにおいて、
前記Ｅは、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項２９】
請求項２８に記載の標識プローブにおいて、
前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項３０】
請求項２９に記載の標識プローブにおいて、
前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項３１】
請求項３０に記載の標識プローブにおいて、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項３２】
請求項３１に記載の標識プローブにおいて、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする標識プローブ。
【請求項３３】
請求項３２に記載の標識プローブにおいて、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである、
ことを特徴とする標識プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を検出する遺伝子検出方法に関し、特に、標識剤により電気化学的に遺伝子を検出する遺伝子検出方法、及び標識プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、前記標識剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
さらに、前述した標識剤には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があり、このような電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす挿入剤を用いれば、電気化学的変化の測定によって、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化の出力信号としては、酸化還元時に発生する電流や発光が挙げられる。
【０００５】
従って、このような従来の遺伝子検出方法においては、前記標識剤を二本鎖核酸にのみ特異的に結合させ、該二本鎖核酸に結合した標識剤の量を正確に検出することが重要となる。
【０００６】
しかし、前記標識剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した標識剤は、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００７】
これを解消する手法の１つとして、担体に固定した捕捉プローブと、電気化学的に活性である物質を標識した標識プローブと、遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、電圧を印加して、遺伝子サンプルに結合した標識プローブからの電気化学的な信号を検出することにより、目的とする遺伝子の存在を検出する手法がある（特許文献３参照）。
【０００８】
この手法は、いわゆるサンドイッチハイブリダイゼーションを用いた手法であり、前記捕捉プローブと、前記遺伝子サンプルと、前記標識プローブとが、各成分の特異的相互作用を介して複合体化されているため、特異性が高く、検出感度を向上させることが可能である。
【特許文献１】特許第２５７３４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【特許文献３】特許第３５０２８５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前述した特許文献３の方法では、１つの遺伝子サンプルにつき、１つの標識プローブがハイブリダイズするだけであり、さらに、該標識プローブは一本鎖核酸の末端部に電気化学的に活性な物質が１つ標識されているだけであるため、前述の特許文献１，２のような標識剤を用いた手法に比べ、電気化学的に活性な物質からの信号強度が低い。そのため、検出対象の遺伝子サンプルが低濃度の場合は、まずその遺伝子サンプルをＰＣＲなどで増幅させて高濃度にしなければならないという課題がある。
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するためにされたものであって、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる遺伝子検出方法、及びその際に用いる標識プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、電気化学的に活性である物質が複数連鎖されてなる標識剤で標識された、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製し、該一本鎖の標識プローブと前記一本鎖の遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、前記固相に固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記固相に捕捉する遺伝子サンプル捕捉工程と、前記固相に捕捉された前記標識化遺伝子サンプル中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【００１２】
これにより、前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記標識プローブは、下記一般式（１）で表されるものである。
【００１３】
【化１】
2006345834.tif 000003
【００１４】
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記標識プローブは、下記一般式（２）で表されるものである。
【００１６】
【化２】
2006345834.tif 000004
【００１７】
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記標識プローブは、下記一般式（３）で表されるものである。
【００１９】
【化３】
2006345834.tif 000005
【００２０】
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００２１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記標識プローブは、下記一般式（４）で表されるものである。
【００２２】
【化４】
2006345834.tif 000006
【００２３】
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００２４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａ、前記Ｅ、前記Ｘの結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、あるいは抗体抗原結合のいずれかであるものである。
【００２５】
これにより、前記標識プローブ中の、前記Ｌａ、前記Ｅ、及び前記Ｘを、強固に結合させることができる。
【００２６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｎは、２〜１００００の整数である。
これにより、前記標識プローブ中の、前記Ｌａに結合された前記Ｅが、当該標識プローブと前記遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えないようにすることができる。
【００２７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａは、天然高分子または合成高分子である。
これにより、標識プローブ中の前記Ｌａに、電気化学的に活性な物質を多く結合させることができる。
【００２８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルキル、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンのいずれか、あるいはこれらの組み合わせから構成されるものである。
【００２９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｅは、前記Ｌａに１〜１０個化学結合しているものである。
これにより、前記標識プローブ中の、前記Ｌａに結合された前記Ｅが、当該標識プローブと前記遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えないようにすることができる。
【００３０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｅは、酸化還元性を有する化合物であるものである。
これにより、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、遺伝子サンプルの検出が可能になる。
【００３１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物であるものである。
これにより、電気化学発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うことができる。
【００３２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかであるものである。
【００３３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。
【００３４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００３５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、オスニウムである。
【００３６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記検出工程は、前記固相に対して電圧を印加し、前記連鎖した電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである。
【００３７】
また、本発明の標識プローブは、特定の配列を有する遺伝子と特異的に結合され、該遺伝子を標識する標識プローブにおいて、前記標識プローブは、連鎖した電気化学的に活性である物質が複数連鎖してなる標識剤で標識された、前記遺伝子の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブであるものである。
【００３８】
これにより、検出すべき遺伝子サンプルの存在を高感度に検出可能な標識プローブを提供できる。
【００３９】
さらに、本発明の標識プローブは、下記一般式（１）で表されるものである。
【００４０】
【化５】
2006345834.tif 000007
【００４１】
（但し、式中、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００４２】
さらに、本発明の標識プローブは、下記一般式（２）で表されるものである。
【００４３】
【化６】
2006345834.tif 000008
【００４４】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００４５】
さらに、本発明の標識プローブは、下記一般式（３）で表されるものである。
【００４６】
【化７】
2006345834.tif 000009
【００４７】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００４８】
さらに、本発明の標識プローブは、下記一般式（４）で表されるものである。
【００４９】
【化８】
2006345834.tif 000010
【００５０】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００５１】
さらに、本発明の標識プローブは、前記Ｌａ、前記Ｅ、前記Ｘの結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体抗原結合であるものである。
【００５２】
これにより、前記標識プローブ中の、前記Ｌａ、前記Ｅ、前記Ｘを、強固に結合させることができる。
【００５３】
さらに、本発明の標識プローブは、前記ｎは、２〜１００００の整数であるものである。
これにより、前記Ｌａに結合された前記Ｅが、当該標識プローブと前記遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えない標識プローブを提供することができる。
【００５４】
さらに、本発明の標識プローブは、前記Ｌａは、天然高分子または合成高分子であるものである。
【００５５】
これにより、当該標識プローブ中の前記Ｌａに、電気化学的に活性な物質を多く結合させることができる。
【００５６】
さらに、本発明の標識プローブは、前記Ｌａは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルキル、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンのいずれか、あるいはこれらの組み合わせから構成されるものである。
【００５７】
さらに、本発明の標識プローブは、前記Ｅは、前記Ｌａに１〜１０個化学結合しているものである。
これにより、当該標識プローブ中の前記Ｌａに結合された前記Ｅが、当該標識プローブと前記遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えないようにすることができる。
【００５８】
さらに、本発明の標識プローブは、前記Ｅは、酸化還元性を有する化合物であるものである。
これにより、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、遺伝子サンプルの検出が可能になる。
【００５９】
さらに、本発明の標識プローブは、前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である。
これにより、電気化学発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うことができる。
【００６０】
さらに、本発明の標識プローブは、前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかであるものである。
【００６１】
さらに、本発明の標識プローブは、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。
【００６２】
さらに、本発明の標識プローブは、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００６３】
さらに、本発明の標識プローブは、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかであるものである。
【発明の効果】
【００６４】
本発明の遺伝子検出方法によれば、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質が複数連鎖してなる標識剤で標識された一本鎖の標識プローブを作製し、該一本鎖の標識プローブと前記一本鎖の遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、標識化遺伝子サンプルを形成し、該標識化遺伝子サンプルと、固相に固定化された一本鎖の捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、該固相に捕捉された前記標識化遺伝子サンプル中の前記連鎖した電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出するようにしたので、前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。
【００６５】
また、本発明の標識プローブによれば、連鎖した電気化学的に活性である物質が複数連鎖してなる標識剤で標識された、前記遺伝子の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いるようにしたので、当該標識プローブからの電気化学的な信号の強度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。
なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００６７】
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。
まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【００６８】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００６９】
次に、前記一本鎖の遺伝子サンプルに、後述する標識プローブを含む溶液を接触させる。これにより、前記標識プローブがもつ標識結合用プローブと、該標識結合用プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、標識化遺伝子サンプルが形成される。この標識プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００７０】
以下、本発明に用いられる標識プローブについて説明する。
本標識プローブは、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質が複数連鎖されてなる標識剤で標識された一本鎖核酸である。
【００７１】
本発明の標識プローブは、例えば、下記一般式（１）、（２）、（３）、（４）で表すことができる。
【００７２】
【化９】
2006345834.tif 000011
【００７３】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００７４】
【化１０】
2006345834.tif 000012
【００７５】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。） 
【００７６】
【化１１】
2006345834.tif 000013
【００７７】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００７８】
【化１２】
2006345834.tif 000014
【００７９】
（但し、Ｘは検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸部位、Ｅは電気化学的に活性である電気化学活性部位、Ｌａは前記Ｘと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、水溶性スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｘ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００８０】
ここで、前述した一般式（１）〜（４）中に示される前記Ｌａは、アルキル、アミド、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成されるリンカー部である。そしてこのようなリンカー部である前記Ｌａは、天然高分子か、または合成高分子であることが好ましいが、単分子でも良い。これは、高分子の方が電気的に活性な物質を多く結合させることができるからである。そして、前記天然高分子、または合成高分子としては、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルキル、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン等の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００８１】
そして、前記一般式（１）〜（４）中の前記Ｅは、電気化学的に検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物である。そしてこのような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００８２】
なお、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、前記Ｅとしてこれらを用いた場合は、後述する検出工程にてその発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うこともできる。
【００８３】
また、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができ、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。
【００８４】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００８５】
また、前記一般式（１）〜（４）において、前記Ｌａと、前記Ｘ、前記Ｅは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などで結合している。
【００８６】
また、前述の一般式（１）〜（４）中に示される前記ｎの値は、前記Ｘの長さにより決定されるものであり、その値は、２〜１００００の整数であることが好ましく、特に２〜５００の整数が好ましい。なお、ｎが１００００以下の理由は、ｎが１００００より大きくなると、その部分が立体障害となり、本標識プローブと遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えるためである。さらに、前記式（１）〜（４）中に示される前記Ｌａに、前記Ｅが複数個化学結合させてもよい。例えば、前記一般式（１）の場合を例にあげると、下記に示す式（５）ようになる。
【００８７】
【化１３】
2006345834.tif 000015
【００８８】
このとき前記Ｌａに結合させる前記Ｅの数は、１〜１０個であることが望ましい。この理由は、Ｌａに結合するＥの数が１０個以上になると、電気化学的に活性である物質が立体障害となり、本標識プローブと遺伝子サンプルとのハイブリダイゼーションに悪影響を与えるためである。
【００８９】
また、前記Ｅ若しくは前記Ｘは、前記一般式（１）〜（４）に示すように、全てのＬａと連結しなければならないわけではなく、例えば下記式（６）に示すように、ｎが２〜３につき１個のＥ若しくはＸがＬａと連結しているというように、複数個のＬａそれぞれにＥ若しくはＸがそれぞれ１個連結しているものでもよい。
【００９０】
【化１４】
2006345834.tif 000016
【００９１】
さらに、前記Ｒ１あるいはＲ２がＥの場合は、ｎが１であってもよい。また前記ｎが１のときは、前記式中のＲ１及びＲ２は無くても良い。
【００９２】
以下、前述した標識プローブの具体例を下記式（７）〜（１０）に示す。なお、式（７）は一般式（１）の、また式（８）は一般式（２）の、式（９）は一般式（３）の、式（１０）は一般式（４）の具体例である。
【００９３】
【化１５】
2006345834.tif 000017
【００９４】
【化１６】
2006345834.tif 000018
【００９５】
【化１７】
2006345834.tif 000019
【００９６】
【化１８】
2006345834.tif 000020
【００９７】
なお、式（８），（１０）中のｎは２〜１００００の整数であり、式（９）中のｍ，ｏは、（ｍ＋ｏ）／２が２〜１００００の整数、且つｍ≧２，ｏ≧１である。
【００９８】
このように、前記標識プローブを、電気化学的に活性である物質を複数連鎖させてなる標識剤で標識された、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブとしたので、前記遺伝子サンプルと前記標識プローブとをハイブリダイズさせた際、該遺伝子サンプルに結合する電気化学的に活性である物質の量が増加し、後の電気化学的な検出工程において、前記遺伝子サンプルに結合する電気化学的に活性である物質からの電気化学的な出力信号が向上するため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。
【００９９】
そしてこの後、前述したようにして形成された標識化遺伝子サンプルを含む溶液を、固相に固定化された捕捉プローブに接触させる。これにより、前記捕捉プローブと、該捕捉プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、前記標識化遺伝子サンプルが固相に固定化される。この前記捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【０１００】
前記捕捉プローブとしては、化学合成で得た一本鎖の核酸、あるいは生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。なお、生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【０１０１】
また、前記捕捉プローブを固定化する固相としては、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が挙げられ、これらの物質は、後の電気化学的な検出工程において、電極として利用することができる。さらに、前述した固相を導電性高分子によって被覆しても良く、このように被覆することによって、より安定な固相を調製することができる。
【０１０２】
前記捕捉プローブを前記固相に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。一例をあげると、例えば前記固相が金である場合、固定する捕捉プローブの５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、金とイオウとの共有結合を介して、前記捕捉プローブが前記金に固定される。この捕捉プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，１８０５〜１８０８及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８５，ｖｏｌ．１３，４４８４）に記載されているものが挙げられる。
【０１０３】
即ち、前記方法によって得られたチオール基を有する捕捉プローブを、金に滴下し、低温下で数時間放置することにより、該捕捉プローブが金に固定され、捕捉プローブが作製される。
【０１０４】
また、前記捕捉プローブを固定化する固相の別の例として、担体粒子が挙げられる。前記担体粒子としては、例えば、ラテックス、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン等の高分子からなる粒子、活性炭等の炭素系材料、金属粒子、セラミック、マグネタイト、サマリウム−コバルト、フェライト等の磁性体粒子等が例に挙げられる。
【０１０５】
このような担体粒子を、前述したような固相上に展開して付着させることによって、前述した金などの電極として利用できる固相を用いた場合と同様、電気化学的な検出が可能である。前記担体粒子への核酸プローブの結合方法は、担体粒子にアビジンコーティングを施し、末端をビオチン修飾した核酸プローブと結合させるなどの公知の方法が用いることができる。
【０１０６】
なお、前述の説明では、まず遺伝子サンプルと標識プローブとをハイブリダイズさせて標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程の後、該標識化遺伝子サンプルと固相に固定化された捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、遺伝子サンプルを固相に固定化する遺伝子サンプル捕捉工程を行なうものとしたが、前記遺伝子サンプル捕捉工程と前記遺伝子サンプル標識化工程とを同時に行うものでもよい。この場合、遺伝子サンプルと、標識プローブと、固相に固定化した捕捉プローブとを同時に接触させて、標識された遺伝子サンプルを固相に固定化する。
【０１０７】
前述のようにして前記標識化遺伝子サンプルを固相に固定化後、該固相に固定化された前記標識化遺伝子サンプルの、電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を測定する。これにより、前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。
【０１０８】
そして、前記電気化学的に活性である物質として、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、該電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を、前記ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、前記電気化学的に活性である物質として、電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【実施例１】
【０１０９】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）固相表面への核酸プローブの固定化
固相には、金電極を使用した。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。さらに、電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で１分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
【０１１０】
捕捉プローブには、５’末端よりＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ  ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ  ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの配列を有する、５’末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【０１１１】
そして、該捕捉プローブを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１０μＭに調製した。
【０１１２】
この調製した捕捉プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で１２時間放置することで、チオール基と金とを結合させて、捕捉プローブを金電極に固定した。
【０１１３】
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ  ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ  ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ  ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ  ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ  ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ  ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【０１１４】
また、標識プローブには、５’末端からＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ  ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ  ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有し、５’末端のリン酸基を介して、下記式（１１）に示すような電気化学的に活性である物質を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【０１１５】
【化１９】
2006345834.tif 000021
【０１１６】
前記式（１１）で示される標識プローブは、以下のようにして得る。
まず、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。
【０１１７】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。
【０１１８】
塩化ルテニウム（III）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た（収率６８．２％）。
【０１１９】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｄ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、前記生成物Ｅ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。
【０１２０】
さらに、前記生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【０１２１】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た（収率７１．４％）。
【０１２２】
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【０１２３】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記式（１２）に示す電気化学的に活性である物質を得た（収率８７．５％）。
【０１２４】
【化２０】
2006345834.tif 000022
【０１２５】
表１は、前述のようにして得た式（１２）に示す物質の1Ｈ‐ＮＭＲ結果である。
【０１２６】
（表１）
1Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ  ｄ−６）
σ：
１．４６      （２Ｈ，ｍ）
１．６９      （４Ｈ，ｍ）
２．１０      （４Ｈ，ｍ）
２．５４      （３Ｈ，ｓ）
２．８１      （２Ｈ，ｔ）
３．０８      （２Ｈ，ｍ）
７．４１      （２Ｈ，ｔ）
７．５７      （６Ｈ，ｍ）
７．７７      （４Ｈ，ｍ）
８．１９      （１Ｈ，ｔ）
８．７９      （４Ｈ，ｔ）
８．８８      （６Ｈ，ｍ）
【０１２７】
アルミホイルで遮光した容器に、三量体リジン０．１ｍｇ（０．２５μｍｏｌ）と、蒸留水０．１ｍＬを入れて三量体リジンを溶解させた後、該三量体リジンの水溶液に、前記式（１２）に示す物質１．２ｍｇ（１．２４μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．４ｍｇ（１２．４μｍｏｌ）、ＷＳＣ７．１ｍｇ（３７．２μｍｏｌ）、及び０．１Ｍトリエチルアミン１２．４μＬ（１．２４μｍｏｌ）をそれぞれ添加し、３日間室温で反応させた。反応後、ＨＰＬＣで精製し、移動相の溶液を留去して四量体ルテニウム錯体を得た（収率６０．８％）。
【０１２８】
次に、標識プローブ７８６μｇ（８３．４ｐｍｏｌ）を蒸留水０．３ｍＬに溶解させ、該標識プローブの水溶液に、四量体ルテニウム錯体０．５ｍｇ（０．１２μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．５μｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４ｍｇ（７．５μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン２．５μＬ（０．２５μｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して式（１１）に示す標識プローブを得た（収率７４．１％）。
【０１２９】
前述の式（１１）に示す標識プローブ、及び遺伝子サンプルを、２ＸＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調製した。
【０１３０】
この調製した遺伝子サンプル及び標識プローブが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記捕捉プローブを固定した金電極上に滴下し、７０℃の恒温槽内で１時間反応させた。これにより、標識化遺伝子サンプルと捕捉プローブがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成された電極ｘを得た。
【０１３１】
さらに、本実施例１においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記核酸プローブと同様の処理を行い、標識化遺伝子サンプルと捕捉プローブがハイブリダイズせず、二本鎖核酸が形成されていない電極ｙを得た。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してチオール基を修飾したプローブを使用した。
【０１３２】
（３）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【０１３３】
図１は、本実施例１における、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。
【０１３４】
図１から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｘでの発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｙでの発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例１の標識プローブを用いれば、高感度に二本鎖核酸、すなわち目的遺伝子サンプルを検出できることがわかる。
【実施例２】
【０１３５】
（１）固相への捕捉プローブの固定化
実施例２では、固相に磁気ビーズを使用した。磁気ビーズは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。なお、捕捉プローブには実施例１と同様の配列を有し、５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
【０１３６】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：２Ｍ塩化リチウム：超純水＝２：１０：５：３の体積比になるよう調製）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの核酸プローブを５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【０１３７】
溶液をデカントし、残留した磁気ビーズを０．１５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、ＴＴバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：超純水＝１：２：１の体積比になるよう調製）で洗浄した。
【０１３８】
洗浄後、ＴＴＥバッファーに溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定な結合を除去した。これにより、捕捉プローブが固定化された磁気ビーズを得た。
【０１３９】
さらに、本実施例２においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記核酸プローブと同様の処理を行った。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してにビオチンを修飾したプローブを使用した。
【０１４０】
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプル、及び標識プローブは、前記実施例１と同様の物質を使用した。
前記捕捉プローブを固定した磁気ビーズに、２ＸＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した遺伝子サンプル及び標識プローブをそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、溶液をデカントし、４０℃に加温した２ＸＳＳＣで洗浄し、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズαを得た。
【０１４１】
なお、非相補的な捕捉プローブを固定した磁気ビーズについても、上記と同様の処理を行い、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβを得た。
【０１４２】
（３）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズα及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβをそれぞれ５μＬずつ電極に滴下した。電極の下には永久磁石のシートを取り付けており、作用極のみに磁気ビーズが集約するようにした。
【０１４３】
５分静置後、前記磁気ビーズα，βが集約した電極ｘα，ｙβそれぞれに、電解液を７５μＬ滴下した。その後、それぞれの磁気ビーズが集約した電極ｘα，ｙβに電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【０１４４】
図２は、本実施例２における、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズの電極ｘα、及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズの電極ｙβにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。
【０１４５】
図２から明らかなように、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズ電極ｘαでの発光量は、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズ電極ｙβでの発光量と比較して著しく高い値となっており、本発明の標識プローブを用いれば、高感度に二本鎖核酸、すなわち目的遺伝子サンプルを検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】本発明の実施例１における最大電気化学発光量を測定した図である。
【図２】本発明の実施例２における最大電気化学発光量を測定した図である。
【図１】
2006345834.tif 000031
【図２】
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【配列表】
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