(57)【要約】【課題】  ヤマブシタケを有効成分とする脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤、ならびにその効果に優れたヤマブシタケ株を提供する。【解決手段】  ヤマブシタケ、特に寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８であるヤマブシタケ及び／又はその抽出物を有効成分として用いることにより、優れた脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤を得ることができる。ヤマブシタケは古くから食用に供されており、長期の連用によっても副作用を生じる可能性が低く安全性が高い。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８であるヤマブシタケ株。
【請求項２】
有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含む脳梗塞抑制剤。
【請求項３】
請求項２記載の脳梗塞抑制剤において、ヤマブシタケが寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８のヤマブシタケ株であることを特徴とする脳梗塞抑制剤。
【請求項４】
有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含む血小板凝集抑制剤。
【請求項５】
請求項３記載の血小板凝集抑制剤において、ヤマブシタケが寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８のヤマブシタケ株であることを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項６】
有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含むケモカイン遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
請求項５記載のケモカイン遺伝子発現抑制剤において、ヤマブシタケが寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８のヤマブシタケ株であることを特徴とするケモカイン遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヤマブシタケ株及びヤマブシタケを有効成分とする脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコ類は、古くから食用や薬用に用いられている。そのうち、ヤマブシタケは、その乾燥子実体を粉砕したものが中国の漢方において「猴頭」として処方され、胃潰瘍、胃炎、身体虚弱などに薬効があるとされている。
また、ヤマブシタケは、痴呆症の改善に作用する神経系の成長因子（ＮＧＦ）合成誘導物質を有することが報告され（特許文献１等）、注目されてきている。その他にも、ヤマブシタケに関しては、抗腫瘍作用（特許文献２）、血中脂質降下作用（特許文献３）、ＩＬ−１２産生促進作用（特許文献４）、ＩｇＥ産生抑制作用（特許文献５）なども報告されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平９−５９１７２号公報
【特許文献２】特開平５−１７３６６号公報
【特許文献３】特開平１１−１４３８号公報
【特許文献４】特開２００３−３２７５４１号公報
【特許文献５】特開２００３−２８１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、ヤマブシタケについては多くの薬理的効果が報告されているが、その全てが明らかにされたわけではなく、例えば、脳梗塞抑制作用、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用などはこれまで報告されていない。
また、キノコ類においては、例え同じ名称のものであっても生産方法や菌株などによってその効果に変動があることが考えられ、優れた効果を有する菌株を用いることが重要である。
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的はヤマブシタケを有効成分とする脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤、ならびにその効果に優れたヤマブシタケ株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明者らが鋭意検討を行った結果、ヤマブシタケ、特に寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８であるヤマブシタケ株に優れた脳梗塞抑制作用、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一の主題は、寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８であるヤマブシタケ株である。
本発明の第二の主題は、有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含む脳梗塞抑制剤である。
また、本発明の第三の主題は、有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含む血小板凝集抑制剤である。
また、本発明の第三の主題は、有効成分としてヤマブシタケ及び／又はその抽出物を含むケモカイン遺伝子発現抑制剤である。
なお、本発明にかかる脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤において、ヤマブシタケが寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８のヤマブシタケ株であることが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ヤマブシタケ、特に寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８であるヤマブシタケ及び／又はその抽出物を有効成分として用いることにより、優れた脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤を得ることができる。ヤマブシタケは古くから食用に供されており、長期の連用によっても副作用を生じる可能性が低く安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ヤマブシタケ（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｍ（Ｂｕｌｌ．：Ｆｒ）Ｐｅｒｓ．）は、担子菌類に分類され、サンゴハリタケ科サンゴハリタケ属に属する。北半球の温帯地域（中国、日本、アメリカなど）に分布し、日本ではその子実体（キノコ）が山伏が衣の胸につける飾りに似ていることから「山伏茸」と命名された。
子実体の形状は針状、子実体内部は海綿状組織になっている。大きさは５〜１０ｃｍ程度で、色は白色から黄褐色である。
本発明においてヤマブシタケは、子実体、該子実体の抽出物、該抽出物の乾燥物でもよく、また、子実体は生のままあるいは乾燥したもののいずれでもよいが、取り扱い性、保存性及び抽出効率等の点から乾燥子実体が望ましく、有効量を効率的に摂取するためには、子実体の乾燥粉末あるいはその抽出物として用いることが好適である。
【０００８】
ヤマブシタケ抽出物を得るに先立ち、ヤマブシタケの組織を破壊処理することが好適である。これによって効率よく抽出することが出来る。ヤマブシタケの組織を破壊する手段としては、ビーズミル、ワーリングブレンダー、ホモジナイザー等の各種粉砕混合機による粉砕処理、爆砕機等による衝撃破砕処理、凍結処理、超音波処理等の物理的処理、水酸化ナトリウム等の水溶液によるアルカリ処理、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解作用のある酵素による処理、浸透圧処理等の化学的処理があり、これらを単独であるいは適宜に組み合わせて行なうことができる。これらの組織破壊処理のうち、ヤマブシタケの子実体を原料とした場合は粉砕処理または酵素処理が、また菌糸体を原料とした場合は酵素処理が好適である。
【０００９】
酵素処理では、公知の細胞壁分解酵素あるいは多糖分解酵素を利用でき、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、α−およびβ−グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、α−およびβ−グルカナーゼ等のうちの１種または２種以上を用いることができる。ヤマブシタケを酵素処理するには、適宜に細断あるいは粉砕処理を施したヤマブシタケに前記酵素を水溶液として加え、振とうあるいは撹拌すればよい。
本発明のヤマブシタケ抽出物を得るためには、前述のように組織を破壊処理したヤマブシタケに、抽出溶媒を加え適宜攪拌し、抽出処理すればよい。
抽出溶媒としては特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール等の一級アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素、エチルエーテル、アセトン等が挙げられ、これらを２種以上組み合わせて用いることもできる。好ましい抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混合溶媒が挙げられる。特に、ヤマブシタケ子実体乾燥粉末を熱水で抽出したものが好ましい。
【００１０】
また、抽出操作は常圧下、常温下で行っても良いが、１〜５気圧、６０〜１５０℃の加圧、加熱下で行なっても良い。具体的には、例えば、熱水等で抽出した後、遠心分離や減圧濾過により抽出液と残渣に分離することが好ましい。
なお、抽出残渣に対して前記と同様の条件下再抽出処理を行ない、この抽出操作を数回繰り返してもよい。
また、抽出物は、抽出液でもその乾燥物でもよい。乾燥物とする場合には、抽出液を減圧濃縮、殺菌、フリーズドライ、スプレードライ等の処理に供して抽出溶媒を除去する。
また、本発明においては、子実体を用いることが好適であるが、その菌糸体にも効果が期待できる。菌糸体は炭素源および窒素源を含む培地で種菌を培養して得られる生あるいは乾燥菌糸体を利用できる。乾燥したものが簡便である。
【００１１】
ヤマブシタケの菌糸体の伸長は２５℃付近で最も良好で、子実体発生には１０〜１２℃の低温処理が適している。栽培期間は菌糸蔓延に２０〜２５日間、続いての子実体発生に２０日程度を要する。８００ｍＬのボトル栽培で１５０ｇ位の収穫が期待できる。培地基材のおが屑は大部分の広葉樹が適し、スギでも加水堆積したものは使用可能である。
【００１２】
本発明においては、市販のヤマブシタケを用いることもできるが、平成１６年８月１１日付で産業技術総合研究所に受託されており、識別のための表示をヤマブシタケ２００３１５４６である寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８のヤマブシタケ株が特に好適に使用できる。その科学的性質等は以下の通りである。
１．科学的性質…菌の特徴：炭素源と窒素源を含む栄養培地下において、白色のコロニーを形成する。また、光学顕微鏡下において、クランプコネクション（かすがい連結）が観察される。
２．分類学上の位置…担子菌
【００１３】
３．培養条件
（１）培地名…ＳＭＹＡ培地（S：サッカロース、M：マルトエキストラクト、Ｙ：イーストエキストラクト、Ａ：寒天）
Ｓ，Ａ→市販品  Ｍ，Ｙ→ディフコ社製（Ｄｉｆｃｏ）
（２）培地の組成…培地１０００ｍｌ当たり
１％      サッカロース          １０ｇ
１％      マルトエキストラクト  １０ｇ
０．４％  イーストエキストラクト  ４ｇ
２％      寒天                  ２０ｇ
（３）培地のｐＨ…５．０〜７．０（最適ｐＨ５．５）
（４）培地の殺菌条件…１２１℃  ２０分
（５）培地温度…２８℃
（６）培養期間…１０日間
（７）酸素要求性…好気性
【００１４】
４．保管条件
凍結法にて保管できる。
（１）凍結条件…−８０℃
（２）保護剤…１０〜２０％グリセリン水溶液（最適は２０％）
（３）凍結後の復元率…１年で１００％、３年で９９％
５．生存試験の条件
（１）微生物の復元…４０℃
（２）接種・培養・確認法…培養条件と同一条件による。
【００１５】
本発明においては、ヤマブシタケを使用して脳梗塞抑制剤を製造する。本発明の脳梗塞抑制剤は経口投与して、脳梗塞の予防のために適用することができる。脳梗塞抑制剤として用いる際の摂取量としては、個人差等により異なり特に限定されないが、成人１日当たりヤマブシタケ乾燥粉末に換算して１〜２０ｇ、特に５〜２０ｇ、最適には１６〜２０ｇを摂取すれば十分に効果が期待できる。
【００１６】
また、本発明においては、ヤマブシタケを使用して血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤を製造する。本発明の血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤は経口投与して、血栓形成の予防・改善、血流改善、炎症性あるいはアレルギー性疾患の予防・改善などのために適用することができる。血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤として用いる際の経口摂取量としては、症状等により異なり特に限定されないが、成人１日当たりヤマブシタケ乾燥粉末に換算して１〜２０ｇ、特に５〜２０ｇ、最適には１６〜２０ｇを摂取すれば十分に効果が期待できる。
また、本発明の血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤を皮膚外用剤として経皮的に投与すれば炎症性あるいはアレルギー性の皮膚疾患に対して予防・改善効果が期待できる。
【００１７】
本発明の脳梗塞抑制剤、血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤を内服薬とする場合には、常法により散剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、茶剤、懸濁化剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤等とすることができる。なお、製剤化の際には、通常の製剤化担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、賦香剤等を必要に応じて用いることができる。また、必要に応じて適当なコーティング剤等で剤皮を施すこともできる。
なお、これらは医薬用途に限らず、機能性飲食品、健康飲食品、サプリメントなどとしても摂取することができる。これらは例えば、ゼリー、キャンディー、グミ、クラッカー、ジュース、その他様々な形態で摂取される。
【００１８】
また、皮膚外用剤とする場合には、公知の皮膚外用剤基剤にヤマブシタケ抽出物を配合すればよい。本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００１９】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、クエン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、亜硫酸ナトリウム、カフェイン、タンニン、パントテン酸およびその誘導体、ニコチン酸およびその誘導体、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、マロニエ、エスシン等の各種植物抽出物、ビタミンＥおよび酢酸トコフェロール等のビタミンＥ誘導体、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、胎盤抽出液、アスコルビン酸およびアスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド等のアスコルビン酸誘導体、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カミツレ油、４−ｎ−ブチルレゾルシノール等の美白剤、ビタミンＡおよびレチノール等のビタミンＡ誘導体、グルコース、フルクトース、キシリトール、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、ワセリン、グリセリン、尿素、ヘパリン等の保湿剤、セリン、アルギニン等の各種アミノ酸、セラミド、コレステロール等の脂質なども適宜配合することができる。
【００２０】
皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品として適用可能であり、その剤型は軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いられるものであれば特に制限されない。
以下、具体例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
血小板凝集抑制試験
種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患や肌荒れの発症には、アラキドン酸やその代謝物であるロイコトリエンやトロンボキサン、プロスタグランジンが関与していることが明らかにされつつある。例えば炎症性異常角化性疾患である乾癬では、その患部表皮において高いアラキドン酸代謝物の存在が認められており、アレルギー性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎、湿疹にもアラキドン酸代謝物の関与が示唆されている。また、プロスタグランジン類やトロンボキサン類は血小板を凝集させることから、アラキドン酸からプロスタグランジン類やトロンボキサン類への合成を抑制する化合物は、抗血栓効果、すなわち血流改善効果を有するものと考えられる。
【００２２】
そこで、ヤマブシタケについて、ＰＡＦ及びアラキドン酸ナトリウム惹起血小板凝集抑制効果を調べた。
（１）ヤマブシタケ抽出物の調製
ヤマブシタケの乾燥子実体を粉砕し、１６メッシュのふるいにかけて、粉末とした。また、比較例としてシイタケ、マイタケの乾燥子実体も同様に粉末とした。各粉末１０ｇをそれぞれ２００mlの熱水（９０℃）中で２時間抽出した。濾過後、濾液を減圧濃縮し、乾燥子実体の熱水抽出物を得た。
なお、ヤマブシタケとしてはＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株の他、市販ヤマブシタケ３種（国産Ａ、国産Ｂ、海外産）を用いた。
また、比較として、シイタケ、マイタケについても同様に行った。
【００２３】
（２）試験方法
ヒト血液を室温にて１１００ｒｐｍで２０分間遠心し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分取した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心して乏血小板血漿（ＰＰＰ）を分取した。ＰＲＰ  ２２３μＬを３７℃にて予備加温した後、上記メタノール抽出物の２％ＤＭＳＯ溶液、又は対照例としてイオン交換水をそれぞれ２μＬ添加し、さらに３分間３７℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるＰＡＦ水溶液（５００ｎＭ）を２５μＬ添加した。
惹起された凝集はアグリゴメーター（ＭＣＭヘマトレーサー  ＭＣＭメディカル株式会社製）を用いて測定し、被験試料の最大凝集率（ＰＰＰの値を１００として被験試料の凝集曲線より求められた最大値）を対照例の最大凝集率と比較することにより、被験物質のＰＡＦ惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した。
また、炎症やアレルギー等の発生の原因物質であるアラキドン酸に対する血小板凝集に対する抑制作用も、上記のＰＡＦ水溶液のかわりにアラキドン酸ナトリウム水溶液（５００μＭ）を用いることにより、同様に評価した。
【００２４】
（３）結果
図１はＰＡＦ惹起、図２はアラキドン酸惹起による血小板凝集に対する抑制効果を示している。図１〜２からわかるように、ヤマブシタケでは比較例のシイタケあるいはマイタケ抽出物に比べて血小板凝集抑制作用が高く、特にＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株に優れた血小板凝集抑制作用が認められた。
よって、ヤマブシタケあるいはその抽出物の摂取することにより、血小板凝集を抑制でき、炎症性・アレルギー性疾患の改善・予防や、抗血栓、血流改善などの効果が発揮されるものと考えられる。また、皮膚疾患に対しては、皮膚への適用も有効であると考えられる。
【実施例２】
【００２５】
ケモカイン遺伝子発現抑制試験
近年、種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患の発症に炎症性細胞の遊走・活性化を支配するケモカイン（Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が強く関与することが明らかにされつつある。ケモカインは分子量８〜１０ｋＤａのヘパリン結合性を有する塩基性蛋白の総称であり、生体において炎症に関わる様々な細胞の炎症部位への遊走・活性化に中心的に作用し、炎症の惹起に重要な役割を果たしているものと考えられている。
【００２６】
皮膚疾患においては、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの炎症部位に好中球や好酸球などの炎症細胞が遊走・活性化し、炎症の発生・増幅に関与していると考えられている。そして、この場合に皮膚の角化細胞、線維芽細胞などの細胞からインターロイキン−８（ＩＬ−８，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）等のケモカインが産生されることが知られている。また、炎症性異常角化性疾患である乾癬ではその皮膚患部にＩＬ−８が多量に存在していることが知られている。
従って、ＩＬ−８等のケモカインの発現を抑制することは、これらの炎症性あるいはアレルギー性の疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
そこで、ヤマブシタケにおけるケモカイン遺伝子発現抑制作用を調べた。
【００２７】
（１）ヤマブシタケ抽出物の調製
ヤマブシタケの乾燥子実体を粉砕し、１６メッシュのふるいにかけて、原粉末とした。原粉末１０ｇを２００ｍｌの熱水（９０℃）に加え、２時間抽出後、ろ過し、エバポレーターで濃縮後、残渣を減圧乾燥した。これを適量のＤＭＳＯに溶解し、以下の実験に使用した。
【００２８】
（２）ケモカイン遺伝子発現抑制作用の測定
ヒト皮膚線維芽細胞を直径６ｃｍの培養皿で、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地に被験試料として、ヤマブシタケ抽出液、あるいはハイドロコルチゾン（陽性対照）を添加した。ヤマブシタケ抽出物及びハイドロコルチゾンの終濃度はそれぞれ０．００２５〜０．０４％（乾燥質量）及び１０−７Ｍとした。
【００２９】
さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で６時間培養した。
次に常法に従って、細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成したのち、定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法）により、ＩＬ−８遺伝子の発現量を測定した。内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得られたデータを補正した。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として入手可能であり、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよいが、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地が特に好ましい。
【００３０】
（３）結果
図３は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株抽出物の各濃度におけるＩＬ−８の遺伝子発現量を示している。ＤＭＳＯのみの発現量は０．４７であった。ヤマブシタケ抽出物は、ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＩＬ−８の遺伝子発現を抑制した。その作用は、ヤマブシタケ抽出物濃度０．０２〜０．０３％までは濃度上昇に伴い抑制効果が高くなったが、それ以上になると濃度上昇とともに抑制効果は低下する傾向が認められた。
ハイドロコルチゾンは抑制効果が強いが、ステロイドホルモンであるため、炎症、組織障害、潰瘍形成等の副作用が引き起こされる可能性がある。これに対して、ヤマブシタケ抽出物では、その抑制効果はハイドロコルチゾンほどではなかったものの、副作用の心配がないので長期連用が可能である。
【実施例３】
【００３１】
脳梗塞抑制試験
脳組織に血液が充分供給されないと酸素の供給が低下する虚血状態となり、最終的には細胞死となり脳梗塞に至る。また脳梗塞状態となっている脳組織に需要量以上の過剰の血液が供給されると、大量の活性酸素の発生によって生と死の境界領域の梗塞周辺（ペヌンブラ領域）に重大な組織障害が起こることが解ってきた。これを細胞の枯死（アポトーシス）といって、脳梗塞に限らず、心筋梗塞やストレス潰瘍においても、極めて重要な臨床的現象として注目されている。
そこで、ヤマブシタケについて、こうした血流障害に伴う脳梗塞の発現に及ぼす効果について、一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡ）による脳梗塞モデルを用いて調べた。
【００３２】
（１）ヤマブシタケ懸濁液の調製
ヤマブシタケの乾燥子実体を粉砕し、１６メッシュのふるいにかけて、原粉末とした。この原粉末を蒸留水に懸濁し、以下の実験に使用した。
【００３３】
（２）実験動物ならびに飼育方法
実験動物は体重２５−３０ｇのｄｄＹ系雄性マウス（紀和実験動物研究所、和歌山）を用いた。マウスは、プラスチックケージの中に、室温２３±２℃、湿度６０±２％および１２時間の明暗サイクル（７：００  ＡＭ点灯）の動物室で飼育した。なお、水および餌（ＣＥ−２；日本クレア株式会社、東京）は自由に摂取できるようにした。実験動物の取り扱いについては、福岡大学動物実験委員会（Experimental animal care and use committee）に準じた。
【００３４】
（３）ＭＣＡ閉塞マウスの作成手順
マウスを２％  ｈａｌｏｔｈａｎｅ吸入により麻酔を導入し、続いて１％  ｈａｌｏｔｈａｎｅ吸入によって麻酔を維持し手術台上に固定した。手術用顕微鏡（オリンパス  ＯＭＫ−１Ｆ）下で頸部の中央を切開し、左側総頸動脈と外頸動脈を結紮した。総頸動脈を切開し、塞栓子がＭＣＡの起始部に到達するように、内頸動脈と外頸動脈の分岐部から内頸動脈を経由して９ｍｍ挿入した。再潅流は、塞栓子を手前に引き抜くことによって行った。塞栓子は、長さ１１ｍｍの８−０ナイロンモノフィラメント（Ｅｔｈｉｌｏｎ；Ｅｔｈｉｃｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）の先端から４ｍｍをシリコン樹脂（Ｘａｎｔｏｐｒｅｎ；Ｂａｙｅｒ  Ｄｅｎｔａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングしたものを用いた。コーティング部分の直径は、体重により適切な太さを選択した。
【００３５】
（４）２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）染色
上記の操作により４時間閉塞を行った後、塞栓子を引き抜いて再潅流した。再潅流開始から２４時間後にマウスの頸椎を脱臼したのち、ただちに断頭した。取り出した脳を冷水でよく冷やし、大脳皮質を含む脳の前額断スライスを２ｍｍ間隔で作製した。切片を２％  ２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ）溶液中で３７℃、３０分間インキュベートした。そして、スライドガラス上に並べ、デジタルスチルカメラ（ＭＶＣ−ＦＤ９１，ＳＯＮＹ）で撮影した。
【００３６】
（５）梗塞巣体積の測定
ヤマブシタケ粉末は蒸留水１ｍｌあたりに３，１０又は３０ｍｇ、それぞれ懸濁し、マウス体重１０ｇに対して０．１ｍｌを経口投与した（０．３ｍｇ，１ｍｇ又は３ｍｇ・１０ＢＷ投与群）。コントロール群には、蒸留水を経口投与した。各群、マウスは６匹とした。
ヤマブシタケを１日１回１４日間連続経口投与し、翌日、ＭＣＡ閉塞を負荷した。次の日にＴＴＣ染色により梗塞巣の面積を求めた。
また、梗塞巣体積は、割面の写真から梗塞巣面積を画像解析ソフト（NIH Image 1.62）で測定し算出した。
【００３７】
（６）結果
図４（ａ）はコントロール群（ヤマブシタケ無投与群）のマウスの脳断面写真である。マウスの左側中大脳動脈の血流を一時的に停止させ、血流を再潅流させた２４時間後には、中大脳動脈が支配する左脳の側頭葉や頭頂葉の大部分に顕著な脳梗塞が起こった（写真の脳の左側白く見える部分）。
図４（ｂ）はヤマブシタケ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８）投与群のマウスの脳断面写真である。ヤマブシタケ水溶液を１４日間にわたり毎日服用させた場合には、再潅流させた２４時間後の脳梗塞程度はヤマブシタケの投与量に比例して脳梗塞巣の形成が抑制された。
【００３８】
中大脳動脈からの血液供給の影響が最も強い脳部位である側頭葉、頭頂葉及び線状体領域である４ｍｍ、６ｍｍおよび８ｍｍの位置の梗塞面積について、ヤマブシタケ投与群とコントロール群とを比較すると、ヤマブシタケ無投与群ではそれぞれ平均値で１４．０１ｍｍ２、２１．６３ｍｍ２および１５．９１ｍｍ２あったのに対し、ヤマブシタケ３ｍｇ／１０ｇ体重投与群ではそれぞれ平均値で７．７５ｍｍ２、１３．２５ｍｍ２および９．５４ｍｍ２であり、ヤマブシタケ投与により梗塞面積が顕著に減少していた。
【００３９】
図５は、ＮＨＩイメージ計測法による脳梗塞巣体積を示している。脳梗塞巣体積においても梗塞面積の場合と同様に、用量が高いほど抑制効果が顕著となり、３ｍｇ／１０ｇＢＷ投与群では統計的に有意な抑制効果が認められた（ｐ＜０．０５）。
また、図６は、ヤマブシタケ３ｍｇ／１０ｇＢＷ投与群の各マウスの梗塞面積ならびに梗塞体積を示しているが、被験マウス６例中２例の脳が梗塞負荷後もほぼ正常状態に維持されていた。
これらの結果から、ヤマブシタケが脳虚血から脳細胞を保護して脳梗塞を抑制する効果を有することが明らかとなった。脳梗塞を抑制することができれば、脳梗塞後遺症にみられる運動機能障害、記憶障害、情動障害などを予防することができる。なお、本試験ではマウスを用いているが、ヒトにおいてもこれらの効果は充分期待できる。
【実施例４】
【００４０】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株の遺伝的特性
一般的に栽培品種の菌株（ストレイン）は、自然界から子実体の組織分離により二核菌糸を直接得たものか、あるいは胞子からの一核菌糸を交配する交雑育種により、人為的に作られたものである。それらは品種としての安定化の手順を経て使用されているが、菌糸からの継体培養を重ねるうちに劣化を招くことが多い。各々の栽培者は独自の菌株を保有しており、それぞれの栽培形態に適した菌床を用いて、培地基材や混合栄養剤を選択して子実体を得ている。
子実体の形質は、菌床成分、栽培環境など多くの因子によって影響されているが、その中で最も重要なのが菌株であり、菌株の違いによって、発生する子実体の形状が大きく異なり、含有される機能性成分にも反映される。
そこで、前記のように非常に高い機能を有するＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株の遺伝子特性について、分子生物学的手法により他品種と比較した。
【００４１】
＜対峙培養（帯線形成）試験＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株と、市販の栽培品種であるヤマブシタケＡ株、Ｂ株について、それぞれの菌株どうしで対峙培養を行った。この試験法では、両者の菌そう（コロニー）の接触面での帯線（ゾーンライン）の有無を観察することにより、両者の相同性を簡便に判定することができる。
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株と、市販Ａ株、Ｂ株とを対峙培養した結果、それぞれ帯線が形成された（図７）。
従って、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株は、市販Ａ株、Ｂ株何れとも相同性が低く、異なる品種であると言える。
【００４２】
＜ＲＡＰＤ解析＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株の遺伝的特性について、さらにＲＡＰＤ（Ｒａｎｄａｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法によりＤＮＡレベルでの解析を行った。
図８に、ＲＡＰＤ法の概念図を示す。まず、特定のプライマー（１０塩基程度）を用いゲノムＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＤＮＡを特異的に増幅する。増幅したＤＮＡを染色後、寒天ゲルで電気泳動してＤＮＡのバンドパターンを得る。ゲノムＤＮＡの塩基配列上に個体間差が存在する場合には、増幅されたＤＮＡ断片の種類や大きさに違いを生じ、異なるバンドパターンを示す。よって、バンドパターンを比較することにより、ＤＮＡレベルでの相同性を調べることができる。
【００４３】
１．試験方法
（１）ヤマブシタケ菌糸体を液体窒素で破砕した。
（２）２％サルコシルを含むクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５００μｌを加え、混合した。
（３）６５℃、３０分間Ｌｙｓｉｓ処理した。
（４）１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心後、上清を回収した。
（５）回収した上清と等量のフェノール−クロロホルム（１：１）を加え、ボルテックスにより混和した。
（６）１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、上層を回収した。
【００４４】
（７）５、６の操作を二回繰り返した後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．０〜２．５倍量の氷冷１００％エタノールを加え、攪拌した。
（８）−８０℃で２０分間冷却した。
（９）１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、上清を廃棄した。
（１０）７０％エタノールで沈殿を洗浄した。
（１１）２０分間風乾した。
（１２）５００μｌＴＥＳ溶液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に沈殿を溶解した。
１３）ＲＮａｓｅ（５ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ社）およびα−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）を１０μｌ加え、３７℃、１時間処理した。
【００４５】
（１４）再び、フェノール−クロロホルム抽出を行った。
（１５）エタノール沈殿および洗浄を行った。
（１６）風乾後、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）に溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度により測定した。ＤＮＡ溶液は−２０℃で保存した。
（１７）ＤＮＡ５ｎｇをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件、ＰＣＲ反応液組成ならびにプライマー塩基配列は次の通り。
【００４６】
（ＰＣＲ条件）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
９４℃                    ３０ｓｅｃ
９４℃（変性）            ３０ｓｅｃ
４２℃（アニーリング）    ２ｍｉｎ      ４５ｃｙｃｌｅｓ
７２℃（伸長反応）        ３ｍｉｎ
７２℃                    ７ｍｉｎ
４℃                    ∞
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００４７】
（ＰＣＲ反応液組成）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
１０×ＰＣＲ−ｂｕｆｆｅｒ        １      （μｌ）
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ              ０．８
Ｐｒｉｍｅｒ  １０μＭ            ０．５
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ５ｎｇ          １
Ｔａｑ                            ０．０５
（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ｖｉｒｓｉｏｎ）
Ｗａｔｅｒ                        ６．６５
――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｔｏｔａｌ                        １０
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００４８】
（プライマー配列）
プライマーＡ０１：ｔｇｃａｃｔａｃａａｃａ
プライマーＡ１２：ｔｔｃｇｇａｃｇａａｔａ
【００４９】
２．結果
図９（ａ）及び（ｂ）は、それぞれプライマーとしてプライマーＡ０１及びＡ１２を用い、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株ならびに市販のヤマブシタケＡ〜Ｃ株についてＲＡＰＤ解析を行った結果である。ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株と、市販Ａ〜Ｃ株とは何れも異なるバンドパターンを示していることがわかる。
このように、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株は市販株とはＤＮＡレベルで異なり、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株の有する高い機能性はこのような遺伝的特異性に関連するものであると推察された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヤマブシタケのＰＡＦ惹起血小板凝集に対する抑制効果を示す図である。
【図２】ヤマブシタケのアラキドン酸惹起血小板凝集に対する抑制効果を示す図である。
【図３】ヤマブシタケ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８）のケモカイン遺伝子発現抑制効果を示す図である。
【図４】（ａ）コントロール群（ヤマブシタケ無投与）、ならびに（ｂ）ヤマブシタケ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８）投与群の、マウス脳梗塞脳断面写真である。
【図５】ヤマブシタケ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８）投与量によるマウス脳梗塞巣体積の変化を示す図である。
【００５１】
【図６】ヤマブシタケ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８）３ｍｇ／１０ＢＷ投与群の各マウスにおける脳梗塞巣面積及び脳梗塞巣体積を示す図である。
【図７】ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８株と、市販Ａ株、Ｂ株との対峙試験結果（帯線形成）を示す図である。
【図８】ＲＡＰＤ法の原理を示す概念図である。
【図９】ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１５８ヤマブシタケ株ならびに市販ヤマブシタケＡ〜Ｃ株について、プライマーとして（ａ）プライマーＡ０１又は（ｂ）プライマーＡ１２を用い、ＲＡＰＤ法でＤＮＡ解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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