(57)【要約】【課題】  スピロメトラ属条虫の幼虫が産生する新規な抗リウマチ因子の提供。【解決手段】  スピロメトラ属条虫、例えば、マンソン裂頭条虫の第３期幼虫（擬充尾虫）の虫体培養液上清を限外濾過濃縮し、アニオン交換樹脂カラム精製ついでレクチンカラム精製に付して得ることのできる、破骨細胞形成・分化抑制、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制および一酸化窒素合成抑制活性を有する分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白からなる抗リウマチ因子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピロメトラ（Spirometra）属条虫第３期幼虫（擬充尾虫）の虫体培養液の上清を限外濾過濃縮し、アニオン交換樹脂カラム精製ついでレクチンカラム精製に付して得ることのできる、破骨細胞形成・分化抑制、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制および一酸化窒素合成抑制活性を有する分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白。
【請求項２】
スピロメトラ属条虫がマンソン裂頭条虫（Spirometra erinaceieuropaei）である請求項１記載の糖蛋白。
【請求項３】
レクチンカラムがヒマ凝集素（Ricinus communis agglutinin（ＲＣＡ））−アガロースカラムと小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin（ＷＧＡ））−アガロースカラムの組み合わせである請求項１記載の糖蛋白。
【請求項４】
請求項１記載の糖蛋白からなる抗リュウマチ因子。
【請求項５】
スピロメトラ属条虫第３期幼虫の虫体培養液の上清を限外濾過濃縮し、アニオン交換樹脂カラム精製ついでレクチンカラム精製に付して精製して破骨細胞形成・分化抑制、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制および一酸化窒素合成抑制活性を有する分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白を含有する画分を得ることを特徴とする抗リウマチ因子の製造法。
【請求項６】
スピロメトラ属条虫がマンソン裂頭条虫である請求項５記載の製造法。
【請求項７】
レクチンカラムがＲＣＡ−アガロースカラムとＷＧＡ−アガロースカラムの組み合わせである請求項５記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スピロメトラ（Spirometra）属条虫の幼虫が産生する新規な抗リウマチ因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、スピロメトラ属条虫の第３期幼虫（plerocercoid；擬充尾虫）が産生する種々の生理活性物質が研究されている。例えば、我が国をはじめ、アジア、ヨーロッパ、オーストラリア大陸に広く分布するマンソン裂頭条虫（Spirometra erinaceieuropaei）の擬充尾虫について、それに感染したマウスの成長が促進されることから、非特許文献１では、擬充尾虫によるインスリン様活性と成長ホルモン様活性を有する物質の産生が示唆されている。また、非特許文献２では、擬充尾虫の産生する成長ホルモン様因子が精製され、分子サイズ２７ｋＤａの糖蛋白であることが報告されている。さらに、非特許文献３では、擬充尾虫によるマクロファージ抑制因子の産生が報告されている。
【非特許文献１】寄生虫学雑誌、第４２巻、第３号、１８５〜１９２頁（１９９３年）
【非特許文献２】米子医学雑誌、第５０巻、１３１〜１４２頁（１９９９年）
【非特許文献３】臨床免疫、第３９巻、第２号、１４１〜１４８頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、スピロメトラ属条虫の幼虫が産生する新規な抗リウマチ因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記したマンソン裂頭条虫の擬充尾虫のマクロファージ抑制因子についてさらに鋭意研究を重ねた。該因子は、トリプシンやプロテアーゼＫで処理すると、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制活性が消失し、また、加熱すると活性が消失することから蛋白性因子であると考えられた。また、他の寄生虫で糖蛋白がマクロファージの機能を抑制することが知られていることから、糖蛋白と推察された。そこで、擬充尾虫体の培養液から、成長ホルモン因子以外の糖蛋白を精製すべく検討した結果、分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白の精製に成功し、これが抗リウマチ因子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）スピロメトラ属条虫第３期幼虫（擬充尾虫）の虫体培養液の上清を限外濾過濃縮し、アニオン交換樹脂カラム精製ついでレクチンカラム精製に付して得ることのできる、破骨細胞形成・分化抑制、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制および一酸化窒素合成抑制活性を有する分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白、
（２）スピロメトラ属条虫がマンソン裂頭条虫である上記（１）記載の糖蛋白、
（３）レクチンカラムがヒマ凝集素（Ricinus communis agglutinin（ＲＣＡ））−アガロースカラムと小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin（ＷＧＡ））−アガロースカラムの組み合わせである上記（１）記載の糖蛋白、
（４）上記（１）記載の糖蛋白からなる抗リュウマチ因子、
（５）スピロメトラ属条虫第３期幼虫の虫体培養液の上清を限外濾過濃縮し、アニオン交換樹脂カラム精製ついでレクチンカラム精製に付して精製して破骨細胞形成・分化抑制、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現抑制および一酸化窒素合成抑制活性を有する分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白を含有する画分を得ることを特徴とする抗リウマチ因子の製造法、
（６）スピロメトラ属条虫がマンソン裂頭条虫である上記（５）記載の製造法、および
（７）レクチンカラムがＲＣＡ−アガロースカラムとＷＧＡ−アガロースカラムの組み合わせである上記（５）記載の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
得られた分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白は、破骨細胞形成・分化を抑制し、マクロファージ細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−１β等の炎症性サイトカインの遺伝子発現および一酸化窒素合成も抑制する。したがって、該蛋白は、リウマチ様関節炎を抑制する能力を有する抗リウマチ因子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明を実施するには、まず、適宜の宿主、例えば、ヘビ、マウス、ラット、ハムスター等に感染したスピロメトラ属条虫、例えば、マンソン裂頭条虫の擬充尾虫を回収して使用する。
【０００８】
本発明の抗リウマチ因子は、宿主から回収した擬充尾虫を培養し、その培養液の上清から所望の糖蛋白画分を精製することにより得られる。
擬充尾虫の培養は、適宜の液体培地、例えば、ＤＭＥＭ培地に１隻／ｍＬ入れて、通常、３０℃で２４時間行う。
得られた培養液を回収し、例えば、遠心分離等で不溶物を除去し、限外濾過により濃縮する。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、目的とする因子の分子サイズが９０ｋＤａ程度であることが判明しているので、少なくともこのサイズ付近の分子が濃縮できる限外濾過濃縮を行うことが好ましい。この際、培養液は適宜の緩衝液、例えば、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液に置き換える。
ついで、限外濾過濃縮した濃縮液をアニオン交換樹脂カラムで精製する。用いるアニオン交換樹脂としては、強アニオン交換樹脂、例えば、液体クロマトグラフィー用の単分散系親水性ポリマービーズをベースとした４級アミノ基を有する樹脂が挙げられ、濃縮液をカラムに吸着させた後、適宜の緩衝液、例えば、食塩の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液溶液で勾配溶離する。
溶出した画分を、糖蛋白の糖鎖と結合するレクチンカラムで精製し、レクチンと結合する糖鎖を含む画分を溶出させる。レクチンカラムとしては、ＲＣＡ−アガロースカラムとＷＧＡ−アガロースカラムの２種類を使用し、ＲＣＡと結合する糖鎖を有する画分を分離した後、この画分中のＷＧＡと結合する糖鎖を有する画分を分離することにより、所望の因子が精製できる。
【０００９】
本明細書における分子サイズ９０ｋＤａの糖蛋白とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が９０±１０ｋＤａの糖蛋白の画分をいう。
得られた糖蛋白画分は、以下のとおりの活性を有する抗リュウマチ因子である。
（１）マウス骨髄細胞をＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬにて共刺激すると、破骨細胞（酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性の多核細胞）に分化するが、例えば、該画分１０ｎｇ／ｍＬを添加すると破骨細胞への分化が抑制される。
（２）破骨細胞に特異的に発現する酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ遺伝子およびカルシトニン受容体遺伝子の発現を抑制する。
（３）マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）の遺伝子発現、および一酸化窒素合成を抑制する。
（４）トリプシン処理によりこれらの活性は消滅するため、活性中心は、糖鎖よりも蛋白分子にあると推察される。
かくして、本発明の抗リウマチ因子は、リウマチ様関節炎を抑制する能力を有し、医薬の有効成分として使用可能である。
以下に実施例を挙げて、本発明の抗リウマチ因子の精製についてさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１０】
既感染ハムスターから、マンソン裂頭条虫の擬充尾虫を回収し、１隻／ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に入れて、３０℃で２４時間培養した。培養液を回収し、１０，０００ｇで３０分遠心し不溶物を取り除いた。この培養液を限外濾過ユニット［Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (Nihon Millipore Ltd., Tokyo, Japan)］を用いて、この培養液を２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に置き換え、さらに濃縮して、２５０μｇ／ｍＬに調整した。
これを、同じ緩衝液で平衡化したアニオン交換樹カラム［MonoQ HR 5/5 anion-exchange column (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)］に適用し、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて勾配溶離した。
０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出された画分をＲＣＡ（ＲＣＡ１２０）−アガロースカラム［(Seikagaku Corp., Tokyo, Japan)］に適用し、０．２Ｍ乳糖を含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、ＲＣＡ１２０と結合する糖鎖を含む画分を溶出した。ついで、得られた画分をさらに、ＷＧＡ−アガロースカラム［(Seikagaku Corp., Tokyo, Japan)］に適用し、０．２Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、ＷＧＡと結合する糖鎖を含む画分を溶出し、所望の糖蛋白を得た。
ＷＧＡ−アガロースカラムより溶出された最終分画の純度を確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて展開し、ルビー染色により染色した。約８ｍＬの擬充尾虫培養液（蛋白量２ｍｇ）より、約２μｇの所望の糖蛋白が得られた。
【００１１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞を２０ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬと５０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦで５日間培養すると、破骨細胞（酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性の多核細胞）に分化するが（添付の図１参照）、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦで刺激後、４日目に上記で得られた糖蛋白を１０ｎｇ／ｍＬ添加すると、添付の図２に示すごとく、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性細胞の割合は減少し、多核に融合した細胞もほとんど見られなくなり、破骨細胞への分化が抑制された。
図１中、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ染色により濃く染色された大型の細胞が酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性多核細胞（破骨細胞）であり、図２中、濃く染色された粒状物が未分化の破骨細胞である。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
以上記載したごとく、本発明で得られる糖蛋白は、破骨細胞形成・分化を抑制し、マクロファージ細胞が産生する炎症性サイトカインの遺伝子発現を抑制し、また、一酸化窒素合成も抑制するので、抗リウマチ因子としての作用を発揮し、リウマチ様関節炎を抑制する能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウス骨髄細胞からＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの共刺激で分化した破骨細胞の酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ染色した１００倍の図面代用顕微鏡写真である。
【図２】図１の細胞に、本発明の糖蛋白を添加して培養した未分化破骨細胞の図面代用顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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