(57)【要約】【課題】  シクラメンの花色合成に関わる酵素、特にカルコンシンターゼ及びジヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】  シクラメンから調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、逆転写ＰＣＲ法によってカルコンシンターゼ及びジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの一部をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡ断片をプローブに用いてシクラメンのｃＤＮＡライブラリーから配列番号２及び４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、シクラメンのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼのタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号３に記載の塩基番号３５〜１０６３を少なくとも含むＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号４に示されたアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号３に記載の塩基配列に対して相同性を示すＤＮＡであって、しかも、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質であるシクラメンのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ。
（Ｃ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクラメンの花色合成酵素のタンパク質をコードする新規な２つのDNAに関する。詳しく言えば、本発明は、シクラメンのカルコンシンターゼおよびジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有する新規なタンパクをコードする新規な２つのDNAに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、植物の花色における赤色、紫色、青色系色素として、フラボノイドの一種であるアントシアニンが広く知られている。植物の花弁中のアントシアニンの生合成経路においてカルコンシンターゼ（以下「CHS」と略す）はクマロイルCoAとマロニルCoAを縮合してテトラヒドロキシカルコンを生成する生合成系に関与することが知られている。
【０００３】
また、ジヒドロ−4−フラボノールレダクターゼ（以下「DFR」と略す）は、ジヒドロフラボノール、例えばジヒドロケンフェロール、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチンなどを還元し、対応するロイコアントシアニジンを生成する生合成系に関与することが知られている。
【０００４】
近年の遺伝子工学技術を利用した花卉植物の花色の改良研究において、これらの生合成系に関与するCHSおよびDFRは特に重要な役割を持っていると考えられている。
【０００５】
これまで花卉植物のCHSをコードする遺伝子の塩基配列については次のものが知られている。
【０００６】
（１）ペチュニア（Petunia hybrida）（Nucleic Acids Res．第１４巻、第５２２９頁−第５２３９頁、１９８６年）。
（２）ストック（Matthiola incana）（Plant Mol. Biol. 第１４巻、第１０６１頁−第１０６３頁、１９９０年）。
（３）ガーベラ（Gerbera hybrida）（Plant Mol. Biol. 第２８巻、第４７頁−第６０頁、１９９５年）。
（４）カーネーション（Dianthus caryophyllus）（GenBank accession Z67982（１９９５年））。
（５）リンドウ（Gentiana属）（特開平８−８９２５１（１９９６年））。
（６）アジサイ（Hydrangea macrophylla）（GenBank accession AB０１１４６７（１９９９年））。
また、これまで花卉植物のDFRをコードする遺伝子の塩基配列については次のものが知られている。
【０００７】
（１）ペチュニア（Petunia hybrida）（Plant Mol. Biol. １３巻、第４９１頁−第５０２頁（１９８９年））。
（２）ガーベラ（Gerbera hybrida）（Plant Mol. Biol. ２２巻、第１８３頁−第１９３頁（１９９３年））。
（３）カーネーション（Dianthus caryophyllus）（GenBank accession Z67983（１９９５年））。
（４）バラ（Rosa hybrida）（Plant Cell Physiol. 第３６巻、第１０２３頁−第１０３１頁（１９９５年））。
（５）リンドウ（Gentiana triflora）（Plant Cell Physiol. ３７巻、第７１１頁−第７１６頁（１９９６年））。
（６）レンギョウ（Forsythia intermedia）（Plant Mol. Biol. ３５巻、第３０３頁−第３１１頁（１９９７年））。
（７）アサガオ（Ipomoea purpurea）（GenBank accession U90432（１９９７年））。
（８）シンビジウム（Cymbidium hybrida）（GenBank accession AF017451（１９９８年））。
【特許文献１】特開平８−８９２５１（１９９６年）
【非特許文献１】Nucleic Acids Res．第１４巻、第５２２９頁−第５２３９頁、１９８６年
【非特許文献２】Plant Mol. Biol. 第１４巻、第１０６１頁−第１０６３頁、１９９０年
【非特許文献３】Plant Mol. Biol. 第２８巻、第４７頁−第６０頁、１９９５年
【非特許文献４】GenBank accession Z67982（１９９５年）
【非特許文献５】GenBank accession AB０１１４６７（１９９９年）
【非特許文献６】Plant Mol. Biol. １３巻、第４９１頁−第５０２頁（１９８９年）
【非特許文献７】Plant Mol. Biol. ２２巻、第１８３頁−第１９３頁（１９９３年）
【非特許文献８】GenBank accession Z67983（１９９５年）
【非特許文献９】Plant Cell Physiol. 第３６巻、第１０２３頁−第１０３１頁（１９９５年）
【非特許文献１０】Plant Cell Physiol. ３７巻、第７１１頁−第７１６頁（１９９６年）
【非特許文献１１】Plant Mol. Biol. ３５巻、第３０３頁−第３１１頁（１９９７年）
【非特許文献１２】GenBank accession U90432（１９９７年）
【非特許文献１３】GenBank accession AF017451（１９９８年）
【０００８】
しかしながら、シクラメン植物からのCHSおよびDFRをコードする遺伝子については知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第１の課題は、新規なシクラメンのCHSをコードするDNAをシクラメンから取得することにある。
【００１０】
また、本発明の第２の課題は、新規なシクラメンのDFRをコードするDNAをシクラメンから取得することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のDNAである。
【００１２】
（１）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、シクラメンのカルコンシンターゼのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基番号５７〜１２２３を少なくとも含むＤＮＡである（１）のＤＮＡ。
（３）配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号１に記載の塩基配列に対して相同性を示すＤＮＡであって、しかも、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズすることができ、かつ、カルコンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである（３）のＤＮＡ。
（５）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、シクラメンのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）配列表の配列番号３に記載の塩基番号３５〜１０６３を少なくとも含むＤＮＡである（５）のＤＮＡ。
（７）配列表の配列番号４に示されたアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）配列表の配列番号３に記載の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号３に記載の塩基配列に対して相同性を示すＤＮＡであって、しかも、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである（７）のＤＮＡ。
（９）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質であるシクラメンのカルコンシンターゼ。
（Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコンシンターゼの活性を有するタンパク質。
（１０）以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質であるシクラメンのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ。
（Ｃ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼの活性を有するタンパク質。
【００１３】
なお、本発明において「CHSの活性」とは、１分子のクマロイルCoAと３分子のマロニルCoAを縮合してテトラヒドロキシカルコンを生成する反応を触媒するタンパクの活性をいう。また、「DFRの活性」とは、ジヒドロフラボノール、例えばジヒドロケンフェロール、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチンなどを還元し、対応するロイコアントシアニジンを生合成するタンパクの活性をいう。
【００１４】
以下、CHSをコードするＤＮＡもしくはDFRをコードするDNA、又はこれらを総称して、「本発明のDNA」ということがある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により提供される、シクラメンのCHSおよびDFRをコードする遺伝子は、同種または異種の植物体に単独または組み合わせて導入することにより、該植物中でのアントシアニン合成に関与する酵素反応が調節することができ、植物の花色の多様性等、植物の育種開発に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のDNAはCHSおよびDFRのタンパク質をコードするDNAである。これらのDNAは、本発明を完成するに際しては、後に述べるようにして、シクラメンcDNAライブラリーから単離されたものであるが、その塩基配列が明らかにされたので、配列番号１または３に示す配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また、前記配列に基づいて作製した合成オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用い、公知の方法でDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）により取得することもできる。
【００１７】
以下に、シクラメンのRNAから、RT-PCR（逆転写PCR）によって本発明のDNAの一部を取得し、さらにそれをプローブに用いたハイブリダイゼーションによって、本発明のDNAの全長を取得する方法を例示する。
【００１８】
（１）mRNAの調製およびcDNAライブラリーの構築
シクラメン（Cyclamen persicum）の花弁、茎葉、根、カルスなどの組織、好ましくは花弁から、常法により全RNAを抽出した後、タンパク質、多糖類、その他の夾雑物を取り除き、さらにオリゴdTセルロースを充填したカラムを用いてPoly(A)+ RNAを精製することによって、mRNAを得ることができる。
【００１９】
次に、mRNAからcDNAを合成し、これをファージベクター、例えばλgt11、λZAPIIなどに組み込み、組換えファージを得る。これらを宿主である大腸菌（エシェリヒア・コリ）に感染させ、プラークを多数得ることができる。これら一連の操作はcDNAクローニングキットが市販されているのでこれらを使用してもよい。
【００２０】
（２）クローニング用プローブの作製およびcDNAライブラリーのスクリーニング
cDNAライブラリーの中から目的とするシクラメンのCHSおよびDFRをコードするcDNAを単離するために、ペチュニア等の既知のCHSをコードする遺伝子およびDFRをコードする遺伝子で保存されている塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして上記で抽出したシクラメンRNAを鋳型とし、RT-PCR法によってシクラメンのCHSおよびDFRの一部をコードするプローブとなるcDNA断片を得る。CHS遺伝子の一部を増幅するためのプライマーの塩基配列としては、配列番号５及び６に示す塩基配列が、また、DFR遺伝子の一部を増幅するためのプライマーの塩基配列としては、配列番号７及び８に示す塩基配列が、それぞれ挙げられる。
【００２１】
次に、このプローブと（１）で作製したプラークとをハイブリダイズさせることによりcDNAライブラリーの中から、目的とするCHSをコードするcDNAおよびDFRをコードするcDNAを選抜することができる。
【００２２】
上記のハイブリダイゼーションで選抜されたプラークからファージを採取して、さらにその中からファージDNAを回収し、ジデオキシ法などにより、挿入DNA断片の塩基配列を決定することができる。その塩基配列中のタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム）から規定されるアミノ酸配列を既知のペチュニア等のアミノ酸配列と比較し相同性を確認することにより、目的とするシクラメンのCHSおよびDFRに対応するcDNA断片であることを特定することができる。
【００２３】
なお、一般に特定の機能や生理活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換された場合であっても、その機能や生理活性が維持される場合であることは当業者において広く認識されているところである。本発明には、このような修飾が加えられ、かつCHSおよびDFRの活性を有するタンパク質をコードするDNA断片も含まれる。すなわち、配列表の配列番号２および４において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつCHSおよびDFRの活性を有するタンパク質をコードするDNAも、本発明の範囲に含まれるものである。そのような改変されたDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように本発明のDNAの塩基配列を改変することによって得られる。
【００２４】
また、本発明のDNAまたはこれを有する細胞に変異処理を行い、これらのDNA若しくは細胞から、例えば配列表の配列番号１および３に記載の塩基配列を有するDNA又はそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを選択することによっても、
改変されたDNA断片を得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば９５％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００２５】
さらにシクラメン染色体から、本発明のDNAまたはその一部をプローブに用いた定法によるハイブリダイゼーションによって、CHSをコードするDNAおよびDFRをコードするDNAを取得し得るが、シクラメン染色体由来のCHS遺伝子およびDFR遺伝子はイントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているDNAも、CHSおよびDFRをコードする限り、本発明のDNAに含まれる。
【００２６】
なお、後記実施例で得られたシクラメンのCHSのcDNAはｐBluescriptSK(-)プラスミドベクターにサブクローニングされ、これを導入した大腸菌はEscherichia coli SOLR（CPCHS-1）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年６月２９日に、寄託番号FERM P-17440で寄託されている。またDFRのcDNAは、pUC119プラスミドベクターにサブクローニングされ、これを導入した大腸菌はEscherichia coli JM109(CPDFR-1）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年６月２９日に、寄託番号FERM P-17439で寄託されている。
【００２７】
本発明のCHSをコードするDNAを適当な宿主で発現させることにより、CHSを製造することができる。また、本発明のDFRをコードするDNAを適当な宿主で発現させることにより、DFRを製造することができる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。これらの宿主細胞に、その宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結した本発明のCHS又はDFRをコードするDNAを導入する。これらのDNAの導入に際しては、これらのDNAをプラスミドに挿入して組換えプラスミドを構築し、得られた組換えプラスミドで宿主を形質転換するか、あるいは相同組換え等によって前記DNAを染色体DNAに組み込むことによって形質転換する。得られる形質転換細胞を、発現調節配列が機能する条件で培養することによって、CHS又はDFRが産生される。
【００２８】
また、本発明のCHS又はDFRをコードするDNAは、シクラメンまたは他の植物体に、単独または組み合わせて導入することにより、それらの植物中でのアントシアニン合成に関与する酵素反応が調節することができる。植物に本発明のDNAを導入するには、アグロバクテリウム法（Ｄｒａｐｅｒ，Ｊら編集、「Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、６９〜１６０頁、１９８８年）、ウイスカ法（米国特許第５３０２５２３号明細書、米国特許第７４７２５３８号明細書、特開平１０−１７９１７４号公報、Ｋａｅｐｐｅｒ，Ｈ．Ｆ．ら、１９９２年、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第８４巻、５６０〜５６６頁、Ａｓａｎｏ,Ｙ.ら、１９９１年、「Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第７９巻、２４７〜２５２頁）、植物細胞に超音波を照射して、細胞を部分的に損傷させ、損傷箇所を通して遺伝子を導入する方法（Ｊｏｅｒｓｂｏ，Ｍ．ら、１９９０年、「Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ」、第９巻、２０７〜２１０頁、Ｊｏｅｒｓｂｏ，Ｍ．ら、１９９２年、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ」、第８５巻、２３０〜２３４頁）等が挙げられる。
【実施例】
【００２９】
以下に、本発明の実施例を例示してより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに
限定されるものではない。
【００３０】
以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「Molecular Cloning第２版」（J. Sambrookら、Cold Spring Habor Laboratory press, 1989年）に記載されている方法に従った。
【００３１】
（１）シクラメンmRNAの調製
シクラメン（品種：フレグランスミニ）の開花中の花弁３ｇを液体窒素存在下で凍結後、乳棒乳鉢を用いて粉砕した。この粉砕物に２×CTAB溶液（2%臭化セチルトリメチルアンモニウム，0.1M Tris（pH9.5）、20mM EDTA、1.4M NaCl、4% β−メルカプトエタノール）30mlを加え、撹拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。次にクロロフォルム抽出を２回行い、イソプロパノール沈殿を行い、核酸を沈殿させた。その核酸をTE緩衝液（10mM Tris（pH8.0）、１mM EDTA）3mlに溶解し、10M 塩化リチウム溶液７５０μｌを加え、氷上に２時間置いた後、１９０００g、４℃で１０分間遠心分離を行い、ＲＮＡを沈殿させた。そのＲＮＡを蒸留水に溶解し、さらにフェノール抽出、エタノール沈殿により精製し、0.6mgの精製全RNAを得た。さらに、上記で得られた全RNAから、mRNAの単離をmRNA精製キット（PerSeptive Biosystems社製、BioMag mRNA purification Kit）を用いて行い、シクラメンのmRNAを約１０μｇ得た。
【００３２】
（２）cDNAライブラリーの作製
上記（１）で得られたmRNAからcDNA合成キット（アマシャム  ライフサイエンス社製、cDNA synthesis module）を用いて二本鎖cDNAを得た。これらのcDNAにアダプター（宝酒造（株）社製  EcoRI-NotI-BamHI Adaptor）を連結し、さらにアダプターのリン酸化処理を行った。これらのcDNAをλZAPIIファージベクター（STRATAGENE社製、Lambda ZAP Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit）に連結後、イン・ビトロパッケージングキット（STRATAGENE社製、GigapackIII Gold Packaging Kit）を用いてラムダファージにパッケージングを行った。このファージを大腸菌XL1-Blue MRF'に感染させて組換えファージを多数得て、これらをシクラメンのcDNAライブラリーとした。
【００３３】
（３）クローニング用プローブ作製
CHSおよびDFRのcDNA断片クローニング用のプローブをRT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)を用いて作製するために、まずプライマーの設計を行った。
【００３４】
ａ）CHS用プローブの作製
下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを、プライマーNo.1、No.2として化学合成により作製した。
【００３５】
（プライマーNo.1：配列番号５）
5'-GAGAARTTYMAGCGCATGTG-3'
（プライマーNo.2：配列番号６）
5'-ACRCAMGCRCTYGACATGTT-3'
【００３６】
なお、上記の２種類のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成装置（Model 391、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその合成品をイオン交換HPLCで精製することにより行った。
【００３７】
次に上記（１）で得た全RNA１μgをテンプレートとして、逆転転写反応液（10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、5mM MgCl2、1mMのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合物、2.5μM オリゴ(dT)（Oligo(dT)12-18 primer、ライフテックオリエンタル（株）製）、RNA阻害剤（RNase Inhibitor、宝酒造（株）製）20単位および逆転写酵素（AMV Reverse Tra
nscriptase XL、宝酒造（株）製）５単位）２０μlを調製し、逆転写反応を行った。逆転写反応は３０℃  １０分間、５０℃  ３０分間、９９℃  ５分間、４℃、５分間インキュベートする条件で行った。
【００３８】
更にプライマーNo.1、No.2、各0.1μMをプライマーとし、上記で得られた逆転写反応液を含むPCR法用の増幅反応液を調製し、DNAの増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、PCRキット（宝酒造（株）社製、LA PCR Kit Ver.2.1）により調製した。
【００３９】
PCR法によるDNAの上記の増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Control
System PC-700）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（Extention）を７２℃、１分間行う、３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００４０】
上記のようにして増幅されたCHSのcDNAの一部を、プローブDNAとしてcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。
【００４１】
ｂ）DFR用プローブの作製
下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーNo.3、No.4として化学合成し、（３）−a）と同様の方法により増幅されたDFRのcDNAの一部をプローブDNAとしてcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。
【００４２】
（プライマーNo.3：配列番号７）
5'-GGSTTYRTCGGCTCATGGCTSGT-3'
（プライマーNo.4：配列番号８）
5'-AARTACATCCAWSCRGTCAT-3'
【００４３】
（４）cDNAライブラリーのクローニング
ａ）CHSのcDNAのスクリーニング
上記（２）で作製したシクラメンのcDNAから、上記（３）−ａ）で作製したプローブDNAを用いたプラークハイブリダイゼーション法により、シクラメンのCHSのcDNAのスクリーニングを行った。プラークハイブリダイゼーション法は以下の通りに行った。
【００４４】
上記（３）−ａ）で得られたプローブDNAを、DNAラベリングキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、DIG-ELISA DNA Labeling & Detection Kit）を用いて、ジゴキシゲニン（DIG）でラベルして標識プローブDNAを得た。
次に上記（２）で得られたシクラメンcDNAライブラリーである組換えラムダファージのプラークを、1.5％寒天培地上に形成させた。それらファージプラークをナイロン膜（Dupont社製）Gene Screenに転写した。ファージプラークの転写されたナイロン膜をアルカリ変性液（1.5M NaCl、0.5M NaOH）および中和液（1M Tris−HCl(pH7.5)）２×SSC（0.3M NaCl、30mM sodium citrate）でそれぞれ１０分間処理し、風乾後、８０℃、２時間ベーキングを行うことにより、ファージのプラークに含まれているファージDNAをナイロン膜上に固定した。
【００４５】
このファージDNAが固定されたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（500mM NaPiバッファー（pH7.2）、7% SDS、1mM EDTA）に浸し、６５℃、２時間の浸漬処理を行った。次に前記のDIGラベルした標識プローブDNA（10ng/ml）を１００℃、５分間インキュベートし、ディネイチャー後、ハイブリダイゼーション溶液に加え、６５℃で１５時間浸漬処理することによって、標識プローブDNAとナイロン膜上に固定された目的とするファージDNAの間にDNA−DNAハイブリッドを形成させた。
【００４６】
その反応終了後に、６５℃に保温した洗浄液（40mM NaPiバッファー（pH7.2）、1% SDS）で前記のナイロン膜を２０分ずつ３回洗浄した。その後、上記のDIG-ELISA Labeling &
Detection Kitを用いて、シクラメンのCHSをコードするDNAを含有した目的の組換えファージの検出を行った。
【００４７】
その結果、４万５千個のファージプラークから５個、CHSのcDNAが組み込まれていると思われるファージが単離選抜できた。
【００４８】
ｂ）DFRのcDNAのスクリーニング
上記（２）で作製したシクラメンのcDNAから上記（３）−ｂ）で作製したプローブDNAを用い、（４）−ａ）と同様の方法によりプラークハイブリダイゼーション法を行い、シクラメンのDFRのcDNAのスクリーニングを行った。
【００４９】
その結果、約１０万個のファージプラークから６個、DFRのcDNAが組み込まれていると思われるファージが単離選抜できた。
【００５０】
（５）cDNAのサブクローニング
ａ）CHSのcDNAのサブクローニング
前記（４）−ａ）で単離したファージに含まれるcDNAを、前記のLambda ZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kitを用いてpBluescript SK(-)プラスミドベクター（STRATAGENE社製）にサブクローニングし、大腸菌SOLR細胞を形質転換した。各々のプラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出し、これらのDNAの各々１μlを、１０μlのHバッファー中で制限酵素EcoRI ５単位で別々に消化した。得られた消化反応液をアガロースゲル電気泳動により分析した結果、DNAの電気泳動パターンにより２種類のDNAが存在することが確認された。
【００５１】
ｂ）DFRのcDNAのサブクローニング
前記（４）−ｂ）で単離したファージに含まれるcDNAを、（５）−ａ）と同様の方法によりサブクローニングおよびDNAの分析を行った結果、これらは何れも同一のDNAを含んでいることが確認された。
【００５２】
（６）cDNAのシークエンシング
ａ）CHSのcDNAのシークエンシング
上記（５）−ａ）でサブクローニングしたそれぞれ２種類のcDNA断片のうち、大きい断片のものを選抜し、塩基配列解析を行った。塩基配列の解析は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））および塩基配列決定キット（TaKaRa Taq Cycle Sequensing Core Kit（宝酒造（株）社製））を用い、自動DNAシーケンサー（PE-ABI model377 Sequencer（PE−ABI社製））で行った。その結果、１４４６塩基のcDNAが決定された。このcDNAは１１７０塩基の単一のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。このORFはそれぞれ５６塩基の５’非翻訳領域およびポリ（Ａ）テールを含む２２０塩基の３’非翻訳領域に挟まれている。
【００５３】
ｂ）DFRのcDNAのシークエンシング
上記（５）−ｂ）でサブクローニングしたcDNA断片をpUC119にサブクローニングし、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換後、（６）−ａ）と同様の方法により塩基配列解析を行った。その結果、配列番号３記載の１２２０塩基のcDNAが決定された。このcDNAは配列番号３に記載の１０３２塩基の単一のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。このORFは３４塩基の５’非翻訳領域とポリ（Ａ）テールを含む１５４塩基の３’非翻訳領域に挟まれている。
【００５４】
よって、本発明によるシクラメンのCHSおよびDFRをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１および配列番号３に記載の単一のオープンリーディングフレームのそれぞれ、１４４６塩基、１２２０塩基からなる。また本発明によるシクラメンのCHSおよびDFRをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ３８９アミノ酸残基および３４３アミノ酸残基からなるタンパクをコードしている。この配列番号２のアミノ酸配列を、これまで明らかにされているペチュニアのCHS（Nucleic Acids Res. 14(13), 5229-5239 (1986)）と比較すると９０％の相同性が認められるが、他の領域ではペチュニアのCHSと明らかに異なり、シクラメン特有の配列である。また、配列番号４のアミノ酸配列を、これまで明らかにされているペチュニアのDFRのアミノ酸配列（Plant Mol. Biol. 13(5), 491-502 (1989)） と比較すると７２％の相同性が認められるが、他の領域ではペチュニアのDFRと明らかに異なり、シクラメン特有の配列である。
【００５５】
尚、本発明のCHSをコードするＤＮＡとペチュニアのCHS遺伝子との相同性は７５％、本発明のDFRをコードするＤＮＡとペチュニアのDFR遺伝子との相同性は ７３％であった。
【配列表】
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