(57)【要約】      （修正有）【課題】実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を提供する。【解決手段】実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）であって、ここでＨＧＶが、（ｉ）霊長類において伝染可能であり、（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）と血清学的に異なり、（ｉｉｉ）フラビウイルス科のメンバーであり、そして（ｉｖ）複数の特定の配列、またはそれらの相補体として示される配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする肝炎ウイルス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）で  あって、ここで該ＨＧＶが、
（ｉ）霊長類において伝染可能であり、
（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）と血清学的に異なり、
（ｉｉｉ）フラビウイルス科のメンバーであり、そして
（ｉｖ）配列番号３７、もしくは配列番号１９、またはそれらの相補体として示される配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する：
ことを特徴とする肝炎ウイルス。
【請求項２】
実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドであって、ここで該ＨＧＶが、
（ｉ）請求項１に記載のＨＧＶウイルスの特徴を有し、そして
（ｉｉ）配列番号３８の１９０アミノ酸配列、および配列番号２０の６７アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むことをさらに特徴とする、
ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応し、そして、該ポリペプチドはＨＧＶ陽性被験体由来の体液または組織サンプルと特異的に免疫反応する能力を有する、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載のＨＧＶポリペプチドおよび第二のポリペプチドからなる組換え融合ポリペプチドであって、ここで該第二のポリペプチドが、β−ガラクトシダーゼタンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質、および粒子形成タンパク質からなる群より選択される、融合ポリペプチド。
【請求項５】
ＨＧＶゲノム、そのｃＤＮＡまたはその相補体によりコードされる少なくとも１５個の連続するアミノ酸配列を含有し、ここで該アミノ酸配列が、
（ｉ）配列番号３８の１９０アミノ酸配列、またはそのフラグメント、および
（ｉｉ）配列番号２０の６７アミノ酸配列、またはそのフラグメント、
からなる群より選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対する特異的な抗体を含有する体液または組織サンプルのスクリーニングに使用するための診断キットであって、
請求項３に記載のポリペプチド、および
該ポリペプチドと該サンプル中の該抗体との特異的な免疫反応により形成される免疫学的複合体を検出するための手段、
を含む、診断キット。
【請求項７】
血清のスクリーニングにおいて使用するための、請求項６に記載の診断キット。
【請求項８】
非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）抗原を含有する体液または組織サンプルのスクリーニングに使用するための診断キットであって、
請求項３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドと特異的に免疫反応する実質的に単離された抗体、および
該抗体に対する該ポリペプチドの結合を検出するための手段、
を含む、診断キット。
【請求項９】
インビトロにおいて非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）感染を検出する方法であって、
試験被験体から得られた体液または組織サンプルと、請求項８に記載のキットの実質的に単離されたＨＧＶ特異的抗体とを反応させる工程、および
結合抗原の存在について抗体を試験する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドと特異的に免疫反応するポリクローナル抗体の実質的に単離された調製物。
【請求項１２】
請求項１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対して特異的な抗体を含有する体液または組織サンプルをスクリーニングする方法であって、
該サンプルと請求項３に記載のポリペプチドとを接触させる工程、および
該ポリペプチドと該サンプル中の抗体との特異的な免疫反応により形成される免疫学的複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対する抗体を生成するための組成物であって、
請求項３に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１４】
モザイク状ポリペプチドであって、請求項３に記載の少なくとも２つの異なるポリペプチドを含有し、ここで該モザイク状ポリペプチドは、天然のＨＧＶポリペプチドにおける該ポリペプチド間に通常、介在するアミノ酸を欠失する、ポリペプチド。
【請求項１５】
実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリヌクレオチドであって、ここで該ＨＧＶが請求項１に記載のＨＧＶの特徴を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号３７、もしくは配列番号１９、またはそれらの相補体として示される配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）のＰＣＲ検出に有用である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
インビトロにおいて非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）核酸を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：  
被験体から得られた核酸含有サンプルを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、請求項１５に記載のポリヌクレオチドからなるプローブと組み合わせる工程、および
ＨＧＶ核酸と該プローブとのハイブリダイゼーションにより形成される、ＨＧＶ核酸／プローブ複合体の存在を検出する工程。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記検出工程がＨＧＶ核酸特異的プローブを使用する工程、ここで２つの該プローブはＨＧＶ核酸の内部領域を規定し、そして各プローブは該領域の３’末端内側を含有する１つのストランドを有し、前記核酸／プローブハイブリダイゼーション複合体をプライマー伸長反応により２本鎖のプローブ含有フラグメントに転換する工程、
以下の工程を連続的に繰り返すことによりプローブ含有フラグメントの数を増幅する工程：（ｉ）２本鎖フラグメントを変性して１本鎖フラグメントを生成する工程、（ｉｉ）該１本鎖フラグメントを該プローブとハイブリダイズさせてストランド／プローブ複合体を形成させる工程、（ｉｉｉ）酵素および４つのすべてのデオキシリボヌクレオチドの存在下で、該ストランド／プローブ複合体から２本鎖フラグメントを作製する工程、および（ｉｖ）所望の増幅度が達成されるまで工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す工程、
該増幅産物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）由来のポリヌクレオチドの存在についてサンプルを分析するためのキットであって、
請求項１５に記載のＨＧＶポリヌクレオチドとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および
適切な容器、
を含有する、キット。
【請求項２１】
適切な条件下で、非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ゲノム由来のｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその相補体を発現し得るクローニングベクターであって、ここで該ウイルスが請求項１に記載の特徴を有し、そして該ＯＲＦが所望の宿主に適合し得る制御配列に作動可能に連結される、クローニングベクター。
【請求項２２】
非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドを生産する方法であって、前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列の発現をもたらす条件下で、請求項２１に記載のベクターで形質転換した細胞を培養する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非Ａ/非Ｂ/非Ｃ/非Ｄ/非Ｅ(N-(ABCDE))型肝炎関連ウイルス因子(HGV)に関連する核酸、ポリペプチド、抗原、エピトープ、ワクチンおよび抗体組成物に関する。本発明はまた、診断方法および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【化１】
2006115845.tif 000002
【０００４】
【化２】
2006115845.tif 000003
【０００５】
【化３】
2006115845.tif 000004
【０００６】
【化４】
2006115845.tif 000005
【０００７】
【化５】
2006115845.tif 000006
【０００８】
【化６】
2006115845.tif 000007
【０００９】
【化７】
2006115845.tif 000008
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）以外のウイルスから生じるウイルス肝炎は、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれている。ＮＡＮＢＨはさらに、個々のタイプの伝染の様式（例えば、腸対母体（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ））に基づいて規定される。
【００１０】
腸により伝染されるＮＡＮＢＨまたはＥＴ−ＮＡＮＢＨとして知られているＮＡＮＢＨの１つ形態は、食物および飲水が排泄物により汚染されている、衛生状態が悪い地域で広くかかわっている。Ｅ型肝炎ウイルスと呼ばれる、原因となる媒介物の分子クローニングが、最近記載されている（Ｒｅｙｅｓら，１９９０；  Ｔａｍら）。
【００１１】
母体により伝染されるＮＡＮＢＨ、またはＰＴ−ＮＡＮＢＨとして知られているＮＡＮＢの第二の形態は、母体経路により、代表的には血液または血液製品に曝されることにより伝染される。この肝炎の割合は、（ｉ）現場、（ｉｉ）ＡＬＴ試験を血液バンクで行ったかどうか、および（ｉｉｉ）ＡＩＤＳについて高リスクの患者の除外によって変化した。
【００１２】
輸血の約１０％はＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染を引き起こし、そしてそれらの約半分は慢性疾患状態に至った（Ｄｉｅｎｓｔａｇ）。抗ＨＣＶ試験の実施の後、１単位の輸血あたり、ＨＣＶの血清型変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は心臓外科患者において１％以下に低下した（Ａｌｔｅｒ）。
【００１３】
ヒトレシピエントにおいて輸血後ＮＡＮＢＨを産生することが確認されたヒト血漿サンプルを用いて、チンパンジーにＰＴ−ＮＡＮＢＨを感染させるのに成功した（Ｂｒａｄｌｅｙ）。感染したチンパンジー血漿から単離されたＲＮＡを使用して、慢性ＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染を有するヒト被験体からの血清を用いる免疫スクリーニングのための発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築した。この手順はＰＴ−ＮＡＮＢＨ特異的ｃＤＮＡクローンを同定し、そして続いて、ウイルス配列をプローブとして用いて、連続した７，３００塩基対のＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス因子を構成する１セットの重複フラグメントを同定した。配列決定したウイルス因子はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付けられた（例えば、ＨＣＶの配列は、１９８８年１１月１８日に出願されたＥＰＯ特許出願第８８３１０９２２．５号に示されている）。現在、ＨＣＶの全長配列（約９，５００ｎｔ）が入手可能である。
【００１４】
Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ；  Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ，１９７３−１９７５；  １９７８−１９８３）で行われた霊長類の伝染研究は、最初に、非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の複合因子の存在の実質的な証拠を提供した：ＮＡＮＢＨの症例の大部分と関連する第１の因子は、ＰＴ−ＮＡＮＢＨおよびＥＴ−ＮＡＮＢＨに関して、それぞれＨＣＶおよびＨＥＶ（上記を参照）であると現在確認されている。その後、ＣＤＣ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，１９８９年に提出）で抗ＨＣＶ抗体について研究（原型）および商業試験の両方を用いて行われた疫学研究は、全ての群集獲得型の（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）ＮＡＮＢＨの約２０％もまた、非Ｃ型であったことを示した。これらのサンプルのＨＥＶの存在についてのさらなる研究（Ｒｙｅｓら，ＷＯＡ９１１５６０３（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）１９９１年１０月１７日）は、群集獲得型の非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型肝炎のこれらの症例もまた非Ｅ型であることを示した。
【００１５】
センチネル郡（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｃｏｕｎｔｙ）の患者の肝臓生検の標本、血清および血漿（Ｍｉｒｉａｍ  Ａｌｔｅｒ博士およびＫｒｉｓ  Ｋｒａｗｃｚｙｎｓｋｉ博士の研究）もまた、多くのＮＡＮＢＨの真の症例も、（血清学的におよびＨＣＶ感染の全てのマーカーに対して陰性である逆転写酵素  ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；Ｋａｗａｓａｋｉら；Ｗａｎｇら、１９９０）により）結果として慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）の症状を有する慢性肝炎ま  たはウイルス感染と一致した慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）を発症した非Ｃ型肝炎であることを示した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、ポリペプチド抗原を開示する。該ポリペプチド抗原は、非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（本明細書中ではＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と称される）を有する個体の血清と免疫反応する。該抗原ポリペプチドのオープンリーディングフレーム配列をコードするポリヌクレオチドを含有する、対応するゲノムフラグメントクローンを教示する。該抗原は、試験被験体におけるＨＧＶの存在を検出するための診断方法において有用である。該抗原はまた、ワクチンおよび抗体の調製において有用である。さらに、２つのＨＧＶ単離物の全コード配列を開示する。サンプル中ＨＧＶの、核酸に基づく検出の方法を示す。そしてＨＧＶに対応するさらなるゲノム配列を単離するための方法もまた、示す。
【００１７】
本発明は、本明細書中でＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と名付けた、新たに発見した非Ａ／非Ｂ／非Ｃ／非Ｄ／非Ｅ（Ｎ−（ＡＢＣＤＥ））型肝炎関連ウイルス因子の特徴付けおよび単離に関する。本明細書には、ＨＧＶゲノム部分のｃＤＮＡレプリカの一族が開示される。さらなるＨＧＶ配列およびＨＧＶ変異体の配列の単離および特徴付けのための方法もまた開示される。
【００１８】
本発明は、ＨＧＶゲノムポリヌクレオチド、それに対するｃＤＮＡおよびそれらの相補体を包含する。ポリヌクレオチドに関して、本発明のいくつかの局面は以下を含む：精製されたＧ型肝炎ウイルスゲノムポリヌクレオチド；ＨＧＶ由来のＲＮＡおよびＤＮＡポリヌクレオチド；組換えＨＧＶポリヌクレオチド；ＨＧＶまたはＨＧＶ変異体ｃＤＮＡまたはそれらの相補体に由来する配列を構成する組換えポリヌクレオチド；ＨＧＶのエピトープをコードする組換えポリペプチド；上記組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えベクター、およびこれらのベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞。本発明の別の局面は、ＨＧＶおよび／またはその変異体のためのポリヌクレオチドプローブである。
【００１９】
配列情報を用いてＨＧＶを他のウイルス配列と比較する、ＨＧＶのゲノムの性質に対する現在の研究は、ＨＧＶがフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスのメンバーであることを示唆する。
【００２０】
ＨＧＶ由来のｃＤＮＡ配列部分は、天然に存在するウイルスの変異体を単離するため、またはサンプル中のウイルスの存在を測定するためのプローブとして有効である。これらのｃＤＮＡはまた、ＨＧＶ特異的ポリペプチド抗原を含む、ＨＧＶをコードしたポリペプチド配列の入手を可能にする。これらのコード配列は、診断試験の試薬および／またはワクチンの成分として、または標準品として有用であるポリペプチドの産生を可能にする。さらに、これらのｃＤＮＡ由来のプローブを利用してＨＧＶゲノムの他の部分を単離し、そして配列決定することが可能であり、それにより、予防、治療および診断の適用に有用である別のプローブおよびポリペプチドを与える。
【００２１】
本発明の他の局面は以下を含む：ＨＧＶ  ｃＤＮＡまたはその相補体由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を組み込む組換え発現系（この場合、ＯＲＦが、所望の宿主に適合性の制御配列に作動可能に結合されている）、この組換え発現系で形質転換された細胞、およびこの形質転換細胞により産生されたポリペプチド。
【００２２】
本発明のさらなる別の局面は、精製されたＨＧＶ粒子；精製されたＨＧＶからのポリペプチドの調製；精製されたＨＧＶポリペプチド；精製されたＨＧＶペプチド；およびＨＧＶまたはＨＧＶ変異体に含まれたエピトープで免疫学的に同定可能なエピトープを包含する精製されたポリペプチドである。
【００２３】
本発明に含まれる局面は、ＨＧＶポリペプチド；ＨＧＶゲノム、ＨＧＶ  ｃＤＮＡまたはその相補体由来の配列からなる組換えポリペプチド；ＨＧＶエピトープから作られる組換えポリペプチド、およびＨＧＶポリペプチドから構成される融合ポリペプチドである。
【００２４】
ポリペプチド配列内に含まれるＨＧＶエピトープに向けられるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方もまた、治療薬剤として、診断試験、ＨＧＶ因子（そこから、これらのｃＤＮＡが由来する）の単離、および抗ウイルス薬剤のスクリーニングに有用である。本発明はまた、ＨＧＶエピトープに向けられるポリクローナル抗体の精製された調製物；およびＨＧＶエピトープに向けられるモノクローナルを包含する。
【００２５】
キットに関する本発明のいくつかの局面は、以下のことを行うためのものである：適切な容器において、ＨＧＶ由来の約８個のまたはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを含むＨＧＶ由来のポリヌクレオチドの存在についてサンプルを調べること；適切な容器において、ＨＧＶ抗原に存在するＨＧＶエピトープを含有するポリペプチドを構成するＨＧＶ抗原に向けられる抗体の存在についてサンプルを分析すること；および適切な容器において、抗ＨＧＶ抗体を構成するＨＧＶ抗原の存在についてサンプルを分析すること。
【００２６】
本発明のさらに他の局面は、ＨＧＶエピトープから構成されるポリペプチド（これは固体基質に付着される）；およびＨＧＶエピトープに対する抗体（これは固体基質に付着される）である。
【００２７】
本発明の他の局面は、発現ベクターで形質転換された、ＨＧＶポリペプチドをコードする配列を含有する宿主細胞を、このポリペプチドの発現を可能にする条件下でインキュベートすることを含むＨＧＶポリペプチドの産生のための技術；およびこの方法により産生されたポリペプチド（例えば、ＨＧＶエピトープを含有する）である。
【００２８】
本発明はまた、サンプル中のＨＧＶ核酸を検出のための方法を包含し、この方法は、プローブおよびサンプルからのＨＧＶ核酸の間のポリヌクレオチド２本鎖の創出を可能にする条件下で、サンプルの核酸をＨＧＶポリヌクレオチドのプローブと反応させる工程、およびこのプローブを含有するポリヌクレオチド２本鎖を検出する工程を包含する。本発明は、以下のハイブリダイゼーションに基づく検出方法を包含する：レポーター標識；ポリメラーゼ連鎖反応；自己持続性配列複製；
リガーゼ連鎖反応；およびストランド置換増幅。さらに、検出方法は、シグナル増幅（例えば、分枝状ＤＮＡプローブおよびＱ−βレプリカーゼ法）を包含する。
【００２９】
本発明はまた、ＨＧＶを検出するための免疫アッセイを含む免疫アッセイを包含し、この免疫アッセイは、サンプル（これはＨＧＶで感染されたと疑われる）と抗原／ＨＧＶのエピトープ（抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で検出される）に向けられるプローブ抗体とをインキュベートする工程；およびプローブ抗体を含有する抗原−抗体複合体を検出する工程を包含する。ＨＧＶ抗原に向けられる抗体の検出のための免疫アッセイは、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、ＨＧＶを含有すると疑われているサンプルとＨＧＶのエピトープを含むプローブポリペプチドとをインキュベートする工程；およびプローブ抗原を含有する抗体−抗原複合体を区別する工程を包含する。
【００３０】
ＨＧＶ感染の処置および／または予防のためのＨＧＶワクチンもまた、本発明の一部を形成し、これには、ＨＧＶエピトープを含有する免疫原性ペプチド、またはＨＧＶの不活性化された調製物、またはＨＧＶの低減された調製物を包含する。
【００３１】
さらに別の局面において、本発明は、ＨＧＶに感染した、組織培養増殖細胞を含む。１つの実施態様において、組織培養増殖細胞は霊長類の肝細胞である。
【００３２】
本発明の別の局面は、ＨＧＶエピトープを含有する免疫原性ポリペプチドを免疫応答を引き出すのに適切な量で被験体に投与する工程を包含する、ＨＧＶ抗体を産生するための方法である。
【００３３】
本発明はまた、ＨＧＶモザイクポリペプチドを包含し、ここで、このモザイクポリペプチドは少なくとも２つのＨＧＶのエピトープを含有し、そして、このポリペプチドは、本来のＨＧＶコード配列中のエピトープの間に通常存在するアミノ酸を実質的に欠いている。このようなモザイクポリペプチドは、上述した適用および方法に有用である。
【００３４】
本発明はさらに、エピトープの提示の間で天然のＨＧＶの抗原性エピトープを模倣するランダムなペプチドエピトープ（ミミトープ）を包含する。このようなミミトープは、上述した適用症および方法に有用である。本発明はまた、ランダムなペプチドＨＧＶエピトープを同定するための方法を包含する。この方法では、ランダムなペプチドエピトープのライブラリーが生成されるか、または選択される。
【００３５】
このライブラリーは抗ＨＧＶ抗体と接触される。この抗体と特異的に免疫反応するミミトープが同定される。血清（抗ＨＧＶ抗体を含有する）または本発明の方法により産生される抗体は使用され得る。ランダムなペプチドライブラリーは、例えば、ファージで提示され得るか、または組み合わせライブラリーとして産生され得る。
【００３６】
別の局面では、本発明は、ＨＧＶ感染の予防および／または処置のための治療化合物および方法を包含する。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面とともに読むと、より充分に理解される。
【００３８】
本発明においては、以下が提供される。
１．実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）であって、ここで該ＨＧＶが、（ｉ）霊長類において伝染可能であり、（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）と血清学的に異なり、（ｉｉｉ）フラビウイルス科のメンバーであり、そして（ｉｖ）配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９、またはそれらの相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも５５％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含有する：ことを特徴とする肝炎ウイルス。
２．実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドであって、ここで該ＨＧＶが、（ｉ）項目１に記載のＨＧＶウイルスの特徴を有し、そして（ｉｉ）配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、配列番号３８の１９０アミノ酸配列、および配列番号２０の６７アミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列のポリペプチドであることをさらに特徴とする、ポリペプチド。
３．ＨＧＶ陽性被験体由来の体液または組織サンプルと特異的に免疫反応する抗原の能力により示されるような、少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応する抗原を含有する、項目２に記載のポリペプチド。
４．組換えＤＮＡ発現により調製され、配列番号１４により、または配列番号１４の相補体によりコードされるポリペプチド配列を含有する、項目２に記載のポリペプチド。
５．ＨＧＶポリペプチドおよび第二のポリペプチドからなる組換え融合ポリペプチドであって、ここで該第二のポリペプチドが、β−ガラクトシダーゼタンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質、および粒子形成タンパク質からなる群より選択される、項目２に記載のポリペプチド。
６．ＨＧＶゲノム、そのｃＤＮＡまたはその相補体によりコードされる少なくとも１５個の連続するアミノ酸配列を含有し、ここで該アミノ酸配列が、（ｉ）配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、またはそのフラグメント、（ｉｉ）配列番号３８の１９０アミノ酸配列、またはそのフラグメント、（ｉｉｉ）配列番号２０の６７アミノ酸配列、またはそのフラグメント、および（ｉｖ）ＰＮＦ２１６１ｃＤＮＡ供給源のλｇｔ１１ライブラリー内にコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される、項目２に記載のポリペプチド。
７．項目１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対する特異的な抗体を含有する体液または組織サンプルのスクリーニングに使用するための診断キットであって、項目３に記載のポリペプチド抗原、および該抗原と該サンプル中の該抗体との特異的な免疫反応により形成される免疫学的複合体を検出するための手段、を含む、診断キット。
８．血清のスクリーニングにおいて使用するための、項目７に記載の診断キット。
９．非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）抗原を含有する体液または組織サンプルのスクリーニングに使用するための診断キットであって、項目３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチド抗原と特異的に免疫反応する実質的に単離された抗体、および該抗体に対する該ポリペプチド抗原の結合を検出するための手段、を含む、診断キット。
１０．試験被験体における非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）感染を検出する方法であって、試験被験体由来の体液または組織サンプルと、項目９に記載のキットの実質的に単離されたＨＧＶ特異的抗体とを反応させる工程、および結合抗原の存在について抗体を試験する工程、を包含する、方法。
１１．項目３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）抗原と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
１２．項目３に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）抗原と特異的に免疫反応するポリクローナル抗体の実質的に単離された調製物。
１３．項目１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対して特異的な抗体を含有する体液または組織サンプルをスクリーニング方法であって、該サンプルと項目３に記載のポリペプチド抗原とを接触させる工程、および該抗原と該サンプル中の抗体との特異的な免疫反応により形成される免疫学的複合体を検出する工程、を包含する、方法。
１４．項目１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）に対する抗体を生成する方法であって、免疫応答を生じるに十分な量で少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応するエピトープを含有する抗原を含む、項目２に記載の実質的に単離されたＨＧＶポリペプチドを試験被験体に投与する工程、を包含する、方法。
１５．モザイク状ポリペプチドであって、項目３に記載の少なくとも２つの異なる抗原、ここで該モザイク状ポリペプチドは、天然のＨＧＶポリペプチドにおける該抗原間に通常、介在するアミノ酸を欠失する、ポリペプチド。
１６．非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ワクチン組成物であって、項目３に記載の実質的に単離されたＨＧＶポリペプチドを含有し、薬学的に受容可能なキャリア中で薬学的有効用量で存在する、組成物。
１７．実質的に単離された形態の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリヌクレオチドであって、ここで該ＨＧＶが項目１に記載のＨＧＶの特徴を有する、ポリヌクレオチド。
１８．配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９、またはそれらの相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも５５％の配列相同性を有する、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
１９．非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）のＰＣＲ検出に有用である、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
２０．試験被験体において非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）核酸を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：該被験体から核酸含有サンプルを得る工程、適切なハイブリダイゼーション条件下で、核酸を含有する該サンプルと項目１７に記載のポリヌクレオチドからなるプローブとを組み合わせる工程、およびＨＧＶ核酸の該プローブとのハイブリダイゼーションにより形成される、ＨＧＶ核酸／プローブ複合体の存在を検出する工程。
２１．項目２０に記載の方法であって、前記検出工程がＨＧＶ核酸特異的プローブを使用する工程、ここで２つの該プローブはＨＧＶ核酸の内部領域を規定し、そして各プローブは該領域の３’末端内側を含有する１つのストランドを有し、前記核酸／プローブハイブリダイゼーション複合体をプライマー伸長反応により２本鎖のプローブ含有フラグメントに転換する工程、以下の工程を連続的に繰り返すことによりプローブ含有フラグメントの数を増幅する工程：（ｉ）２本鎖フラグメントを変性して１本鎖フラグメントを生成する工程、（ｉｉ）該１本鎖フラグメントを該プローブとハイブリダイズさせてストランド／プローブ複合体を形成させる工程、（ｉｉｉ）酵素および４つのすべてのデオキシリボヌクレオチドの存在下で、該ストランド／プローブ複合体から２本鎖フラグメントを作製する工程、および（ｉｖ）所望の増幅度が達成されるまで工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す工程、該増幅産物を同定する工程、を包含する、方法。
２２．項目１に記載の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）由来のポリヌクレオチドの存在についてサンプルを分析するためのキットであって、項目１７に記載のＨＧＶポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および適切な容器、を含有する、キット。
２３．適切な条件下で、非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ゲノム由来のｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその相補体を発現し得るクローニングベクターであって、ここで該ウイルスが項目１に記載の特徴を有し、そして該ＯＲＦが所望の宿主に適合し得る制御配列に作動可能に連結される、クローニングベクター。
２４．非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリペプチドを生産する方法であって、前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列の発現をもたらす条件下で、項目２３に記載のベクターで形質転換した細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下で定義される用語は、本明細書中では以下の意味を有する：１．本明細書中で暫定的にＨＧＶと名付けた、「非Ａ／非Ｂ／非Ｃ／非Ｄ／非Ｅ型肝炎ウイルス因子｛Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）｝」は、（ｉ）マイスタックス（ｍｙｓｔａｘ）、チンパンジーまたはヒトを含むいくつかの霊長類で伝染可能であり、（ｉｉ）血清学的に、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）と異なり（しかし、ＨＧＶはこれらのウイルスと同時に被験体に感染し得る）、そして（ｉｉｉ）フラビウイルス科のウイルスのメンバーであるウイルス、ウイルス型、またはウイルスクラスを意味する。
【００４０】
２．「ＨＧＶ変異体」は、本明細書中に開示されているＨＧＶポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１４）に対して、少なくとも約４０％、好ましくは５５％または６５％、あるいはより好ましくは８０％の全配列相同性、すなわち、ウイルスゲノムポリヌクレオチド配列の長さの全体での配列同一性を有するウイルス単離体として定義される。
【００４１】
「配列相同性」は本質的に以下のように決定される。類似した長さ（好ましくはウイルスゲノム全体）の２つのポリヌクレオチド配列は、これらがＡＬＩＧＮプログラムを用いてアライメントされるときに、最も高い得点のアライメントにおける核酸の、４０％、好ましくは５５％または６５％、またはより好ましくは８０％より多くが、ｋｔｕｐを１とすること、省略時（ｄｅｆａｕｌｔ）のパラメーターおよび省略時のＰＡＭ行列を用いて同一的にアライメントされるならば、互いに相同と考えられる。
【００４２】
ＡＬＩＧＮプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７セットに見出される（Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０；  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎから入手可能なプログラム、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｘ  ４４０，Ｊｏｒｄａｎ  Ｈａｌｌ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）。
【００４３】
２つのウイルスが互いに「高度に相同的」であるかどうかを決定する際、１つのウイルスの全てのウイルスタンパク質（またはそのポリタンパク質）の完全な配列は、ｋｔｕｐを１とすること、省略時のパラメーターおよび省略時のＰＡＭ行列を用いて上記セットのＡＬＩＧＮプログラムを用いて、他のウイルスのウイルスタンパク質またはポリタンパク質と最適に、全体的にアライメントされる。非類似または類似の領域はこの分析から除外されない。２つの配列の間の長さの相違は、ミスマッチと考えられる。あるいは、ウイルスの構造タンパク質領域は、代表的に、ウイルス単離体間の関連性を決定するために使用される。高度に相同的ウイルスは、４０％、あるいは好ましくは５５％または６５％、あるいはより好ましくは８０％を越える完全なポリペプチド配列同一性を有する。
【００４４】
３．２つの核酸フラグメントが、以下の条件下で、これらが、ＨＧＶポリヌクレオチドまたはその変異体に特異的にハイブリダイズし得るか（例えば、ＨＧＶ核酸にハイブリダイズするが、フラビウイルス科のウイルスの他のメンバー由来のポリヌクレオチドにハイブリダイズしないプローブ）、またはポリメラーゼ連鎖反応を特異的に開始させ得る場合、ＨＧＶポリヌクレオチドに「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる：（ｉ）例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、３２０−３２８頁、および３８２−３８９頁に記載されているような代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、（ｉｉ）多くても約２５〜３０％塩基対のミスマッチを可能にする低いストリンジェンシー洗浄条件を用いること（例えば：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、３０分間ずつ；続いて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃で１回、３０分間；続いて、２×ＳＳＣ、室温で２回、１０分間ずつ）、または（ｉｉｉ）標準的条件下（例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋら）での代表的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のためのプライマー（これはＨＧＶまたはその変異体の配列の特異的増幅を生じる）を選択すること。
【００４５】
好ましくは、高度に相同的な核酸鎖は、２０〜３０％未満の塩基対ミスマッチ、さらに好ましくは、５〜２０％未満の塩基対ミスマッチを含有する。これらの程度の相同性は、当該分野で周知のように、遺伝子ライブラリー（または他の供給源の遺伝子物質）由来のクローンの同定のための適切なストリンジェンシーの洗浄条件を用いることにより選択され得る。
【００４６】
４．本明細書中で使用されている「ＨＧＶポリヌクレオチド」は、以下のように定義される。約１００ヌクレオチドよりも大きいポリヌクレオチドについては、ＨＧＶポリヌクレオチドは、ＨＧＶ変異体および上記「２」で定義されているような相同的配列によりコードされるポリヌクレオチド配列を包含する。長さが約１００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドについては、ＨＧＶポリヌクレオチドは、ＨＧＶまたはその変異体の配列に選択的にハイブリダイズする配列を包含する。さらに、ＨＧＶポリヌクレオチドは、ＨＧＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する（以下を参照のこと）。
【００４７】
本明細書中で使用されている用語「ポリヌクレオチド」とは、代表的な核酸に水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー性分子を意味し、ここで、このポリマー骨格は、ポリマー性分子と代表的な核酸（例えば、１本鎖ＤＮＡ）との間で配列特異的な様式でこのような水素結合を可能にするように、塩基を提示する。このような塩基は、代表的に、イノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジンである。多くのポリヌクレオチドの改変は、当該分野で公知であり、例えば、標識、メチル化、および天然に存在する１つまたはそれ以上のヌクレオチドのアナログでの置換がある。
【００４８】
ポリマー性分子は、２本鎖および１本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、およびそれらの骨格修飾体（例えば、メチルホスホネート結合）を包含する。さらに、このようなポリマー性分子は、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ、１９７０ａ／ｂ）、モルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９２、１９９３）のような別のポリマー骨格構造を包含するが、これらに限定されない。種々の他の荷電または荷電していないポリヌクレオチドアナログが報告されている。多くの骨格修飾体は当該分野で公知であり、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、およびカルバメート）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）を包含するが、これらに限定されない。さらに、結合は、以下の代表的な修飾を含み得る：ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチドおよびポリ−Ｌ−リジンを含む）；インターカレーター（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素および酸化性金属）、アルキル化剤、および他の修飾された結合（例えば、αアノマー核酸）。
【００４９】
５．本明細書中の「ＨＧＶポリペプチド」は、ＨＧＶポリペプチドに相同的な任意のポリペプチドとして定義される。本明細書中で使用されている「相同性」は以下のように定義される。１つの実施態様では、ポリペプチドは、これがＨＧＶまたはその変異体の配列に選択的にハイブリダイズする核酸によりコードされる場合、ＨＧＶポリペプチドに相同的である。
【００５０】
別の実施態様では、ポリペプチドは、これがＨＧＶまたはその変異体によりコードされる場合、上記で定義されるように、ＨＧＶポリペプチドに相同的であり、このグループのポリペプチドは、代表的に、１５個、好ましくは２５個、またはより好ましくは３５個より大きい、連続するアミノ酸である。さらに、約６０アミノ酸より長いポリペプチドについては、「ポリペプチド相同性」を決定する目的のための配列比較は、局部のアライメントプログラムＬＡＬＩＧＮを用いて行われる。このポリペプチド配列は、ＨＧＶアミノ酸配列またはその任意の変異体に対して、上記で定義されたように、ｋｔｕｐを１とすること、省略時のパラメーターおよび省略時のＰＡＭでＬＡＬＩＧＮプログラムを用いて比較される。
【００５１】
６０アミノ酸より長い最適なアライメント、および６５％、好ましくは７０％、またはより好ましくは８０％より大きい同一的にアライメントされたアミノ酸を有する任意のポリペプチド（代表的には、ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応しないポリペプチド）は、「相同的ポリペプチド」であると考えられる。ＬＡＬＩＧＮプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７セットに見出される（Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎから入手可能なプログラム、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｘ  ４４０，Ｊｏｒｄａｎ  Ｈａｌｌ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）。
【００５２】
６．ポリヌクレオチドは、これが、ＨＧＶゲノムの領域、ＨＧＶのｃＤＮＡまたはその相補体と同じまたは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、あるいはこれが上記の「２」、「３」または「４」に記載のような相同性を提示する場合、ＨＧＶ「に由来する」。
【００５３】
ポリペプチドまたはポリペプチド「フラグメント」は、これが、（ｉ）ＨＧＶポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームによりコードされ、または（ｉｉ）上記の「２」および「５」に記載のようなＨＧＶポリペプチドに対して相同性を提示し、または（ｉｉｉ）ＨＧＶ陽性血清と特異的に免疫反応する場合、ＨＧＶ「に由来する」。
【００５４】
７．「実質的に単離された」および「精製された」は、いくつかの文脈で使用され、そして代表的には、関連のないまたは混入成分（例えば、血清細胞、タンパク質、非ＨＧＶポリヌクレオチドおよび非抗ＨＧＶ抗体）からのＨＧＶウイルス粒子、成分（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）、または関連化合物（例えば、抗ＨＧＶ抗体）の少なくとも部分的な精製を意味する。目的の化合物または成分の単離および精製のための方法および手順は、以下に記載される（例えば、融合タンパク質のアフィニティー精製およびＨＧＶポリペプチドの組換え産生）。
【００５５】
８．本発明の文脈で、用語「核酸配列」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする配列を示す場合、相同的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの配列、および開示された配列をコードする縮重核酸配列を包含することを意味する。
【００５６】
９．「エピトープ」は、抗原の特異的部分として定義される抗原性決定因子である。特異的抗体の抗原結合部分は、この特異的部分と相互作用する。
【００５７】
１０．抗原またはエピトープは、エピトープ／抗原がＨＧＶ感染血清に存在する抗体と結合するが、ＨＧＶに感染していないか、または感染したことがない個体からの血清の大部分（約９０％以上、好ましくは９５％以上）に存在する抗体と反応しない場合、ＨＧＶ陽性な血清と「特異的に免疫反応的」である。「特異的に免疫反応的」抗原またはエピトープはまた、特定のＨＧＶエピトープまたは抗原に対して産生されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と免疫反応的であり得る。
【００５８】
抗体または抗体組成物（例えば、ポリクローナル抗体）は、この抗体または抗体組成物がＨＧＶ抗原と免疫反応するが、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶまたはＨＥＶ抗原と免疫反応しない場合、ＨＧＶと「特異的に免疫反応性」である。さらに、「特異的な免疫反応性抗体」は、ＨＧＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶまたはＨＥＶに感染していないかまたは曝されていない被験体から得られた正常な血清に代表的に存在する抗原と免疫反応しない。
【００５９】
（ＩＩ．Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）血清）
抗ＨＣＶに対する血清学的試験の有用性およびＨＣＶ−ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発（Ｋａｗａｓａｋｉら；Ｗａｎｇら、１９９０）により、輸血後獲得型および地域獲得型の非ＨＣＶ肝炎の両方のいくつかの症例の同定を可能にした。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの支援による地域獲得型肝炎のＳｅｎｔｉｎｅｌ  Ｃｏｕｎｔｉｅｓ  Ｓｔｕｄｙを介して、ヒト肝炎の症例（ＰＮＦ２１６１）がＮＡＮＢ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）を有することが初めて確認された（Ａｌｔｅｒら、１９８９ｂ）。ＰＮＦ  ２１６１は、高齢のコーカサス人男性患者から得られたサンプルであり、この患者は輸血約８週後、急性肝炎を発症し、１１４１ＩＵの最高血清ＡＬＴ（正常レベル、≦４５ＩＵ）を示した。急性肝炎のエピソードの消散後、患者は変動があるものの、以後７年間にわたって高ＡＬＴレベルが持続し、慢性肝炎と一致したが、この診断の組織病理学的確証は得られなかった。
【００６０】
ＨＧＶのクローン化（本明細書中に記載）に使用した血漿試料は、急性肝炎のエピソードから約４年半後の１９８９年６月に得、そして冷凍保存した。患者のＰＮＦ２１６１は当初、ＨＣＶに感染したとは思われなかった。これは、第一世代の免疫アッセイ試験（Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）で一貫して陰性の結果であったことに基づく。しかし、第二世代のＨＣＶ免疫アッセイ（Ｏｒｔｈｏ）およびＨＣＶ５’非コード領域プライマーによるＰＣＲを用いるその後の試験では、患者がＨＣＶに感染したことが認められた。
【００６１】
（ＩＩＩ．ＨＧＶ関連配列の単離）
ＨＧＶ配列を含むクローンを同定するための１つのアプローチとして、発現ベクター、λｇｔ１１においてＨＧＶ感染血清からｃＤＮＡライブラリーを調製した（実施例１）。次いでポリヌクレオチド配列を、血清ＰＮＦ２１６１と免疫反応するペプチドの発現について選択した。ＰＮＦ２１６１血清（ファージライブラリーを作製するのに使用される）を用いて、一次スクリーニングを典型的に実施した。他のＮ−（ＡＢＣＤＥ）と疑われる血清でスクリーニングするのもまた可能である。
【００６２】
このアプローチによって同定される組換えタンパク質は、候補物に、診断検査において基質となり得るペプチドを提供する。さらに、このアプローチによって同定される核酸のコード配列は、さらなるＨＧＶコード配列の同定のための有用なハイブリダイゼーションプローブとして働く。
【００６３】
上記の血清を用いて、λｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブラリーを作製した（実施例１）。実施例１に例示した方法では、感染血清を、希釈せずに８％ＰＥＧ中で沈殿させ、そして得られたペレット化ウイルスからライブラリーを作製した。感染ヒト供給源由来の血清を、同様の様式で処理した。
【００６４】
ＰＥＧ沈殿に対する有利な代替法として、超遠心分離を用いて感染血清または他の生物学的試料から粒子因子をペレット化し得る。核酸を抽出し得るウイルス粒子を単離するために、血清（２ｍｌまでの範囲）をＰＢＳで約１０ｍｌに希釈し、３Ｋで１０分間スピンし、そして上清をＴｉ７０．１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）内で最低２時間、４０，０００ｒｐｍ（約１１０，０００×ｇ）、４℃で遠心分離する。次いで上清を吸引し、そして標準的な核酸抽出技術でペレットを抽出する。
【００６５】
出発物質としてペレット化した血清から抽出されるＲＮＡとの逆転写反応におけるランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られた分子を配列独立シングルプライマー増幅（ＳＩＳＰＡ；Ｒｅｙｅｓら、１９９１）リンカープライマーに連結し、そして非選択的方法で増幅し、次いでペプチド抗原の発現およびスクリーニングのために適切なベクター（例えば、λｇｔ１１）にクローン化した。あるいは、λｇｔ１０ベクターもまた、使用し得る。
【００６６】
λｇｔ１１は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終止コドンの５３塩基対上流に唯一のＥｃｏＲＩ挿入部位を含む、特に有用な発現ベクターである。それゆえ、挿入配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子産物のＮ末端部分を含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（ヘテロペプチド）および必要に応じてβ−ガラクトシダーゼペプチドのＣ末端領域を含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現される（ヘテロペプチドのコード配列が翻訳終止コドンを含まない場合は、Ｃ末端部分が発現される）。
【００６７】
このベクターはまた、許容温度（例えば、３２℃）でウイルスの溶原性を生じ、そして高温（例えば、４２℃）でウイルスによる溶原化に至る温度感受性リプレッサー（ｃＩ８５７）を生産する。このベクターの利点としては、（１）高い効率の組換えクローンの作製、（２）許容温度での宿主細胞増殖において溶原化宿主細胞を選択するが、非許容温度では選択しない能力、および（３）組換え融合タンパク質の生産が挙げられる。さらに、ヘテロの挿入物を含むファージは、不活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を生産することから、挿入物を含むファージは、β−ガラクトシダーゼを使用する発色基質変換反応を用いて典型的に同定される。
【００６８】
実施例１は、Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎血清ＰＮＦ２１６１に対するｃＤＮＡライブラリーの調製を記載している。ＰＮＦ２１６１を用いて、このライブラリーを免疫スクリーニングした（実施例３）。多くの免疫反応性のλｇｔ１１クローンを同定した。免疫陽性のクローンをプラーク精製し、そしてそれらの免疫反応性を再試験した。また、正常ヒト血清のクローンとの免疫反応性もまた、試験した。
【００６９】
これらのクローンをまた、クローン化挿入配列の「外因性の」性質について調べた。この基礎的試験から、クローン化フラグメントが、ヒトの一部または他の潜在的な混入核酸（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａおよびミトコンドリアの核酸）を示さないことが確認される。ポリメラーゼ連鎖反応増幅後、ＥｃｏＲＩ消化によってクローン挿入物を単離した。挿入物を精製し、次いで放射性標識し、そして膜結合正常ヒトＤＮＡ、正常マイスタックスＤＮＡ、および細菌ＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）に対するハイブリダイゼーションプローブとして使用した（実施例４Ａ）。
【００７０】
クローン４７０−２０−１（ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡ供給源）は、ＰＮＦ２１６１血清を用いる免疫スクリーニングにより単離されたクローンの１つであった。このクローンは、正常ヒト血清とは反応しなかった。このクローンは、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でλｇｔ１１ベクターのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を伴う大きなオープンリーディングフレーム（２０３塩基対；配列番号３）を有する。このクローンは、ヒト、酵母、およびＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを用いる、ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーション分析およびゲノムＰＣＲ分析により外因性である（実施例４Ｂ）。
【００７１】
この配列は、ＲＴ−ＰＣＲにより決定されるように、ＰＮＦ２１６１血清中に存在した（実施例４Ｃ）。系列希釈したＰＮＦ２１６１  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、１ｍｌあたり少なくとも約１０５コピーの４７０−２０−１特異的配列を示唆した。この配列はまた、ウイルス様粒子と関連して集まる配列と一致する密度で、ショ糖密度勾配画分中で検出された（実施例５）。
【００７２】
第２のクローンであるクローン４７０−ｅｘｐ１（配列番号３７）を発現するＥ．ｃｏｌｉの細菌溶解物はまた、クローン４７０−２０−１に相当するレベルでＰＮＦ２１６１血清と特異的に免疫反応することが示された。４７０−ｅｘｐ１のコード配列は、終止コドンに隣接し（配列番号１４との配列の比較に基づく、図１もまた参照のこと）、そして内部にメチオニンを有した。
【００７３】
さらに、配列番号１４に含まれる配列（クローン４７０−２０−１に隣接する）は、クローン４７０−２０−１由来のプライマーを用いるアンカーポリメラーゼ連鎖反応（Ａｎｃｈｏｒ  ＰＣＲ）によって得た（実施例６）。この場合、ＰＮＦ２１６１  ２−ｃＤＮＡ供給源ライブラリーをテンプレートとして用いた。この場合、ｃＤＮＡ／相補２本鎖ＤＮＡ生成物をλアームに連結したが、混合物はパッケージされなかった。
【００７４】
４７０−２０−１特異的プライマーは、テンプレートとしてＳＩＳＰＡ増幅ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡを用いる増幅反応に使用された（実施例４）。増幅ＤＮＡフラグメントの同一性を、（ｉ）大きさおよび（ｉｉ）４７０−２０−１特異的オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号  １６）とのハイブリダイゼーションにより確認した。ＳＩＳＰＡ増幅ＰＮＦ２１６１からのＰＣＲにより増幅されたｃＤＮＡに、４７０−２０−１特異的シグナルが検出され、供給原材料中に４７０−２０−１の配列が存在することが明らかにされた。
【００７５】
４７０−２０−１特異的プライマーはまた、基質として以下のＲＮＡ供給源を用いる増幅反応に使用された：正常マイスタックス肝臓ＲＮＡ、正常タマリン（Ｓａｎｇｕｉｎｓ  ｌａｂｏｒｉａｔｉｓ）肝臓ＲＮＡ、およびＭＹ１３１肝臓ＲＮＡ（実施例４）。これらの実験からの結果は、４７０−２０−１配列が、親血清サンプル（ＰＮＦ２１６１）中およびＰＮＦ２１６１を抗原投与した動物由来の肝臓ＲＮＡサンプル（ＭＹ１３１）中に存在することを示す。両方の正常コントロールＲＮＡは、４７０−２０−１配列の存在について陰性であった。
【００７６】
さらに、ＰＮＦ２１６１血清および他のクローニング供給源または関連の供給原材料を、選択されたクローン化配列由来のプライマーを用いるＰＣＲにより直接試験した。特異的オリゴヌクレオチドプローブ４７０−２０−１−１５２Ｆ（配列番号１６）に対するハイブリダイゼーションにより、特異的増幅産物を検出した。ＰＮＦ２１６１の多数の抽出物中で、４７０−２０−１特異的プライマーにより、特異的シグナルを再現的に検出した。
【００７７】
ＨＧＶと肝疾患との間の病的関連は、実施例４Ｆのデータによってさらに支持される。肝炎患者由来の血清および肝機能異常の血液ドナー由来の血清を、ＨＧＶ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲスクリーニングにより、ＨＧＶの存在について評価した。これらの血清サンプルのうち６／１５２に、ＨＧＶ特異的配列を検出した。コントロールサンプル間では、ＨＧＶ陽性は検出されなかった（ｎ＝１１）。
【００７８】
上記の結果は、肝臓のＮ−（ＡＢＣＤＥ）ウイルス感染（すなわち、肝炎）および／または他の組織および細胞タイプの感染（およびその結果生じる疾患）に関連するウイルス因子の単離を示す。
【００７９】
（ＩＶ．ＨＧＶ組換え抗原のさらなる特徴付け）
（Ａ．組換え体ライブラリーのスクリーニング）
さらなる候補ＨＧＶ抗原は、上記のスクリーニング方法を用いて本発明のライブラリーから入手し得る。上記のｃＤＮＡライブラリーは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２に寄託されており、そして以下の名称が割り当てられている：ＰＮＦ  ２１６１  ｃＤＮＡ供給源、ＡＴＣＣ  ７５２６８。
【００８０】
第１のＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡライブラリーについての記載と本質的に同様に、第２のＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ただし、第２のＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡ供給源ライブラリーをλｇｔ１１アームに連結したが、パッケージはしなかった。この非パッケージ化ライブラリーを用いて、以下に記載の拡張クローン（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｅ）を得た。この第２のライブラリーのパッケージ化バージョン（ＰＮＦ２１６１  ２−ｃＤＮＡ供給源ライブラリー）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２に寄託されており、そして以下の名称が割り当てられている：ＰＮＦ  ２１６１  ２−ｃＤＮＡ供給源、ＡＴＣＣ  ７５８３７。
【００８１】
上記で作製した組換えライブラリーに加えて、Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎血清由来の他の組換えライブラリーも同様に本明細書に記載のように作製され、そしてスクリーニングされ得る。
【００８２】
（Ｂ．エピトープマッピング、クロスハイブリダイゼーション、およびゲノム配列の単離）
抗原をコードするＤＮＡフラグメントは、（ｉ）上記の免疫スクリーニングまたは（ｉｉ）潜在的な抗原性領域を同定するためのアルゴリズム（例えば、「ＡＮＴＩＧＥＮ」，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いるコード配列（例えば、配列番号１４）のコンピュータ分析により同定され得る。抗原をコードするＤＮＡフラグメントは、サブクローン化され得る。次いで、サグクローン化挿入物は、ＤＮａｓｅＩによる部分消化によってフラグメント化されてランダムフラグメントを作製し得るか、または特異的制限エンドヌクレアーゼ消化によってフラグメント化されて特異的サブフラグメントを生成し得る。得られたＤＮＡフラグメントはλｇｔ１１ベクターに挿入され得、そしてクローン化挿入物のエピトープマップを提供するために免疫スクリーニングに供され得る。
【００８３】
さらに、ＤＮＡフラグメントをハイブリダイゼーション実験のプローブとして使用し、重複するＨＧＶ配列を同定し得、そしてこれらは順番にさらにプローブとして使用して一組の連続クローン（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ）を同定し得る。数組の連続クローンを作製すれば、ＨＧＶゲノムの配列の解明が可能になる。
【００８４】
上記のクローン配列（例えば、配列番号１４またはクローン４７０−２０−１由来）のいずれかを用いてｃＤＮＡおよびＤＮＡライブラリー（λｇｔ１０または「ＬＡＭＢＤＡ  ＺＡＰ  ＩＩ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなベクター内で作製される）をプローブ化し得る。公知の配列の特異的サブフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応により、またはこのような配列を保有するベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断後、単離され得る。得られるＤＮＡフラグメントは、任意の選択されたライブラリーに対する放射性標識プローブとして使用され得る。特に、クローン挿入物の５’および３’末端配列は、さらなるクローンを同定するためのプローブとして有用である。
【００８５】
さらに、クローン化挿入物の５’末端により提供される配列は、第１ストランドｃＤＮＡまたはＤＮＡ合成反応中の配列特異的プライマーとして有用である（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓｃｈａｒｆら）。例えば、特異的にプライム（ｐｒｉｍｅｄ）したＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡおよびＤＮＡライブラリーは、ＰＮＦ２１６１核酸上の配列番号１４由来の特異的プライマーをテンプレートとして用いることによって調製され得る。第２ストランドの新たなｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成される。上記の手順は、既知のクローン挿入配列に５’隣接する核酸領域に対応するＤＮＡ／ｃＤＮＡ分子を同定するか、または生成する。これらの新たに単離された配列を順次使用してさらに接する配列などを同定し、ＨＧＶの全ゲノムを含む配列を同定し得る。上記のように、新たなＨＧＶ配列の単離後、ポリヌクレオチドをクリーン化し、そして免疫スクリーニングして、特異的配列をコードするＨＧＶ抗原を同定し得る。
【００８６】
拡張クローンの配列（配列番号１４）（目的とするさらなる配列を含む）を、実施例６に記載の「アンカーＰＣＲ」法を用いてクローンＰＮＦ４７０−２０−１（配列番号３）について得た。簡単に説明すると、ストラテジーは、ＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ  ｃＤＮＡをλｇｔ１１アームに連結する工程、およびｇｔ１１特異的プライマーと２つの４７０−２０−１特異的プライマーのうち１つとで連結反応物を増幅する工程を包含する。
【００８７】
増幅産物を電気泳動的に分離し、フィルターに移し、そしてフィルターに結合したＤＮＡを４７０−２０−１特異的プローブでプローブした。ハイブリダイゼーション陽性バンドシグナルに対応するバンドをゲル精製し、クローン化し、そして配列決定した。
【００８８】
（Ｃ．抗原ポリペプチドおよび抗体の調製）
本発明の組換えペプチドは、標準的なタンパク質精製手順により精製され得る。この精製手順としては、分画沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００８９】
本発明の１つの実施態様において、本発明の抗原のポリヌクレオチド配列は、プラスミドｐ−ＧＥＸ（実施例７Ａ）またはその種々の誘導体（ｐＧＥＸ−ＧＬＩ）内でクローン化されている。プラスミドｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、１９８８）およびその誘導体は、タンパク質のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対してインフレームで融合したクローン化挿入物（ｓｊ２６）のポリペプチド配列を発現する。１つのベクター（プラスミドｐＧＥＸ−ｈｉｓＢ）の構築では、６個のヒスチジンのアミノ酸配列を融合タンパク質のカルボキシ末端で導入する。
【００９０】
種々の組換えｐＧＥＸプラスミドをＥ．ｃｏｌｉの適切な株に形質転換し得、そして実施例７Ａに記載のように、ＩＰＴＧ（イソプロピル−チオガラクトピラノシド）の添加によって、融合タンパク質の生産を誘導し得る。次いで、可溶化した組換え融合タンパク質を、グルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、誘導培養の細胞溶解物から精製し得る（実施例７Ａ）。
【００９１】
プラスミドｐＧＥＸ−ｈｉｓＢによって発現される不溶性の融合タンパク質は、６Ｍ尿素または６Ｍグアニジンイソチオシアネート（これらの両者とも、タンパク質の可溶化に有用である）を含有する緩衝液中での固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｏｒａｔｈ）により精製され得る。あるいは、ｐＧＥＸ−ＧＬＩまたはその誘導体において発現される不溶性タンパク質は、可溶性タンパク質を除去するための遠心分離に続いて不溶性タンパク質の可溶化と、標準的なクロマトグラフ方法（イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーなど）との組合せを用いて精製され得、そして他のこのような方法は、当該分野において既知である。
【００９２】
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（λｇｔ１１クローンによって生産されるような）の場合、融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって、細胞溶解材料を表面結合抗β−ガラクトシダーゼ抗体を有する固相支持体上に通過させることにより、容易に単離され得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる４７０−２０−１コード配列由来のβ−ガラクトシダーゼ／融合タンパク質の精製が、実施例７Ｂに記載されている。
【００９３】
ＨＧＶコード配列および適切な宿主内でのコード領域の発現を可能にする発現制御因子を含む、上記のλｇｔ１１またはｐＧＥＸベクターのような発現ベクターもまた、本発明に含まれる。制御因子は、一般にプロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳および転写終止配列、ならびに挿入物をベクターに導入するための挿入部位を含む。
【００９４】
所望の抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡは、多くの市販のベクターにクローニングされ得、適切な宿主系内でポリペプチドの発現をもたらす。これらの系には、限定はされないが、以下のものが含まれる：バキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙら；Ｂｅａｍｅｓら；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ワクシニア発現（Ｅａｒｌ、１９９１；Ｍｏｓｓら）、細菌における発現（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、酵母における発現  （Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ、１９９２；Ｒｏｍａｎｏｓ、１９９２；Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ）、哺乳動物細胞における発現  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ、１９８３、Ｌａｕ、１９８４、Ｋａｕｆｍａｎ、  １９９０））。これらの組換えポリペプチド抗原は、直接発現されるか、または融合タンパク質として発現され得る。多くの特徴を発現ベクターに取り入れることができる（例えば、発現された配列の培養培地への分泌を促進するリーダー配列）。
【００９５】
多くのこれらの系を用いる、大きなＨＧＶポリペプチドの発現については、実施例１６に記載している。
【００９６】
酵母系での発現は、商業的生産に有利である。ワクシニアおよびＣＨＯ細胞株による組換えタンパク質の生産は、哺乳動物発現系である点で有利である。さらに、ワクシニアウイルス発現は、以下を含むいくつかの利点を有する：（ｉ）広範な宿主範囲；（ｉｉ）組換えタンパク質の正確な転写後修飾、プロセッシング、折り畳み、分泌、および構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）；（ｉｉｉ）比較的可溶な組換えタンパク質の高レベルの発現；および（ｉｖ）外来ＤＮＡを収容する大きな能力。
【００９７】
組換え体から発現されるポリペプチドから生産されるＨＧＶポリペプチド抗原は、溶解した細胞または培養培地から典型的に単離される。精製は、当該分野におい公知の方法によって行われ得、これらには、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。免疫アフィニティークロマトグラフィーは、本発明の方法によって同定されるＨＧＶ抗原に基づいて作製される抗体を用いて、使用され得る。
【００９８】
ＨＧＶポリペプチド抗原もまた、ＨＧＶ粒子から単離され得る（下記を参照のこと）
。
【００９９】
ポリペプチドの連続抗原決定基は、一般に比較的小さく、代表的に６個から１０個のアミノ酸の長さである。より小さいフラグメントが、例えば、配座エピトープ内で抗原領域として同定されている。ＨＧＶポリペプチド抗原は、上記のように同定される。いずれかのストランドの得られるＤＮＡコード領域は、融合タンパク質または単離されたペプチドのいずれかとして組み換え的に発現され得る。さらに、アミノ酸配列は、市販の合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
または「ＰＩＮ」技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて簡便に化学的に合成され得る。
【０１００】
別の実施態様において、本発明は多数のエピトープを含有するモザイクタンパク質を包含する。ＨＧＶモザイクポリペプチドは、代表的に、ＨＧＶの少なくとも２つのエピトープを含有する。ここで、このポリペプチドは、通常、ネガティブなＨＧＶコード配列中のエピトープ間に介在するアミノ酸を実質的に欠く。多数のタンデムなエピトープをコードする合成遺伝子（Ｃｒｅａ；Ｙｏｓｈｉｏら；Ｅａｔｏｎら）が構築され得る。この合成遺伝子は、上記のポリペプチド発現ベクター／宿主系を用いる標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてモザイクタンパク質を産生する。
【０１０１】
さらに、多数の抗原ペプチドが、以前に記載された方法（Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，１９８８；Ｂｒｉａｎｄら）により化学的に合成され得る。例えば、α−アミノ基およびｅ−アミノ基を有するリジン残基の小さな免疫学的に不活性なコアマトリックスを用いて、目的のエピトープを提示する多コピーの同一または異なる合成ペプチド（代表的には６〜１５残基の長さ）をつなぎ止め得る。モザイクタンパク質または多数の抗原ペプチド抗原は、免疫アッセイにおいて多数のエピトープの分布により生じるシグナル増幅に起因するより高い感度および特異性を与える。
【０１０２】
これらの方法のいずれかにより得られる抗原は、抗原生成、診断試験、およびワクチン開発に用いられ得る。
【０１０３】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチド抗原に対する特異抗体を包含する。これらの方法のいずれかにより得られる抗原は、抗体の生成に直接用いられ得るか、またはこれらの抗体は適切なキャリア分子に結合され得る。このような多くのキャリアが当該分野で公知であり、そして市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）。代表的には、抗体を調製するために、宿主動物（例えば、ウサギ）が、精製抗原または融合タンパク質抗原で免疫される。ハイブリッドタンパク質または融合タンパク質は、他のタンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）に由来する種々のコード配列を用いて生成され得る。適切な時間間隔を置いた後に宿主の血清または血漿を収集し、そしてこの血清を抗原に対して特異的な抗体について試験する。実施例８は、ウサギ血清抗体の産生を記載する。この抗体は、ｓｊ２６／４７０−２０−１ハイブリッドタンパク質中の４７０−２０−１抗原に対して特異的である。これらの技術は、配列番号１４として示されるコード配列に由来する配列を包含するがこれに限定されない、ＨＧＶに由来する全ての免疫原性配列に平等に適用できる。
【０１０４】
免疫動物のγグロブリン画分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈澱またはＤＥＡＥセファデックスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはポリクローナル抗体を産生するための当業者に公知の他の技術の使用により得られ得る。
【０１０５】
あるいは、精製抗原または融合抗原タンパク質は、モノクローナル抗体を産生するために用いられ得る。ここで、免疫動物に由来する脾臓またはリンパ球が取り出され、そして不死化されるか、またはこれを用いて当業者に公知の方法によりハイブリドーマを調製する。ヒト由来のハイブリドーマを生成するために、ヒトリンパ球ドナーが選択される。ＨＧＶに感染したことが公知であるドナーは、適切なリンパ球ドナーとして供され得る。リンパ球は、末梢血サンプルから単離され得る。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）を用いてヒトリンパ球を不死化し得るか、または適切な融合パートナーを用いてヒト由来ハイブリドーマを生成し得る。ウイルス特異的ポリペプチドでの一次インビトロ感作はまた、ヒトモノクローナル抗体の生成に用いられ得る。
【０１０６】
不死化細胞により分泌される抗体は、所望の特異性の抗体を分泌するクローンを決定するために、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット法（実施例１０；Ａｕｓｕｂｅｌら）を用いることによりスクリーニングされる。
【０１０７】
ＨＧＶ陽性の血清または血漿、あるいは本発明の抗体を用いて、他の抗原性ペプチドおよびエピトープが単離され得る。例えば、多くのペプチドの同時合成のために多くの異なる方法が開発されている（Ｇｅｙｓｅｎら；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ；  Ｈｕｄｓｏｎ）。Ｇｅｙｓｅｎらにより開発された方法は、特に有用である。なぜなら、比較的簡単に多くの異なるペプチド配列が生成され、そして抗原性について試験され得るからである。Ｇｅｙｓｅｎ法（ＭＵＬＴＩ−ＰＩＮペプチド合成ともいう）においては、ペプチドは、マイクロタイタープレートに結合したポリアクリルアミド酸グラフト化ポリエチレンロッド上で合成される。ＭＵＬＴＩ−ＰＩＮストラテジーは、本発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、ならびに市販の試薬および装置を用いて免疫学的にスクリーニングされる多数の合成を可能にする（プレートあたり９６ペプチド）。
【０１０８】
報告によれば、６，０００オリゴペプチドまでは、２週間の期間で合成され得、従って単一のアミノ酸が決定するエピトープについてのウイルス抗原配列のスクリーニングを（特定の抗原の全ての可能な重複するアミノ酸配列を合成することにより）実施可能にする（Ｇｅｙｓｅｎら）。
【０１０９】
免疫優勢な（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｔｅ）ペプチドを精査するための別の方法は、従来の自動ペプチド合成を用いてＨＧＶ配列に対応するより長いペプチド（例えば、１０〜３０アミノ酸）を合成することである（Ｃａｒｔｅｒら，１９９４；Ｏｂｅｉｄら，１９９４；Ｃｏｍｍａｎｄａｅｕｒら，１９９４）。この方法は、より長いペプチドは構造的なエピトープを真似る形に折り畳まれ得るという利点を有する。
【０１１０】
また、ＨＧＶ抗体、特にモノクローナル抗体を用いて、それらのウイルスがコードする標的ポリペプチドを真似るランダムポリペプチドを同定し得る（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０；Ｓｍｉｔｈ，１９９１）。例えば、ファージで提示されるランダムペプチドライブラリー（ＲＰＬ）（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０）は、抗体生成またはワクチン開発のペプチドリガンド供給源として用いられ得る。ＲＰＬのアプローチにより、ファージ表面での融合タンパク質を含有するペプチドリガンドの発現、および抗体を用いるアフィニティー選択によりこれらのリガンドをコードするファージの富化が可能となる（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｐ．，１９９１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら；Ｓｃｏｔｔら，１９９２；Ｆｏｌｇｏｒｉら）。特異抗体により検出されるこれらのランダムペプチドエピトープは、エピトープ提示の間に、天然の抗原性エピトープを真似る（ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ））。ＨＧＶ抗原性模倣物（ミモトープ）は、ＲＰＬから単離され得る。ＲＰＬを発現するヘキサペプチドからデカペプチドファゴトープ（ｐｈａｇｏｔｏｐｅ）（ファージ上に提示されたミモトープ）は、公表された方法（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｐ．，１９９１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら；Ｓｃｏｔｔら；ＤｅＧｒａａｆら；Ｆｏｌｇｏｒｉら）により作成され得、そしてＨＧＶ関連ヒト血清または本発明の抗体によりスクリーニングされ得る。
【０１１１】
４７０−２０−１ミモトープの単離のためのＲＰＬの使用の１例は、以下の通りである。
【０１１２】
ランダムデカペプチド−ｐＩＩＩ融合ファージディスプレーライブラリーは、以前に記載された方法（ＤｅＧｒａａｆら，１９９３）に従って構築される。簡略に述べると、化学的に合成した１本鎖変性挿入物を、ＳｆｉＩ制限突出を生成するより短いオリゴヌクレオチドにアニールする。アニールしたＤＮＡを、ＳｆｉＩ切断ｆＵＳＥ−５ベクターＤＮＡ中に連結する。
【０１１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１を、連結したＤＮＡで形質転換する。ライブラリーを、２０ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを有するＬＢ培地中の約１０集団の倍加により増幅する。このライブラリーを、１つ以上の４７０−２０−１免疫反応性血清（または本発明の抗体）を用いてアフィニティー選択する。ポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｂａｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ．Ｉｌ）を、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中の硫酸アンモニウム分画の陽性血清（例えば、ＰＮＦ  ２１６１）で一晩、４℃にてコートする。抗体コートビーズを、ＰＢＳで完全に洗浄し、そしてＢＳＡでブロックする。
【０１１４】
これらの血清コートし、ブロックしたビーズを、過剰量のＭ１３Ｋ０７−ＵＶ死滅ファージで４℃にて４時間、プレインキュベートする。次いで、ライブラリーファージを上記のプレインキュベーション混合物に添加し、そして４℃にて１２時間インキュベートする。非結合のファージを除去し、そしてビーズを大量のＴＴＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％「ＴＷＥＥＮ  ２０」（ｖ／ｖ）、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）緩衝液で洗浄する。結合したファージを溶出緩衝液（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ２．２に調整した０．１Ｍ  ＨＣｌ）で溶出する。溶出した富化ファージを第２の陽性血清（例えば、Ｍｙｓ  １３６血清）でプラーク免疫スクリーニングによりスクリーニングする。
【０１１５】
選択されたファゴトープのさらなるスクリーニングを、陽性および陰性の血清、または特異的なＨＧＶモノクローナル抗体のより大きなパネルを用いて実施し得る。選択されたファゴトープは、直接ＥＬＩＳＡアッセイまたは抗体生成に用いれら得る。あるいは、ファゴトープをコードするヌクレオチドの配列は、従来のベクター／宿主系において決定および発現され得、そして抗原として使用され得る。
【０１１６】
上記のように同定された模倣ポリペプチドを、次に検出アッセイにおいて抗原として供され得るか、または抗原特異的抗体の生成に使用され得る。
【０１１７】
（Ｄ．ＥＬＩＳＡおよびタンパク質ブロットスクリーニング）
ＨＧＶ抗原が同定される場合、代表的には上記のプラーク免疫スクリーニングにより、抗原は発現され、そして精製され得る。次いで、抗原は、別の免疫アッセイ（例えば、単離された抗原ペプチドを用いるＥＬＩＳＡまたはタンパク質ブロットアッセイ（ウェスタンブロット））を用いて、多数の疑わしいＨＧＶ肝炎血清に対して迅速にスクリーニングされ得る。抗原ポリペプチド融合物は、通常、融合パートナー（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）に対するアフィニティークロマトグラフィーにより上記のように単離され得る。あるいは、抗原自体が、それに対して生成された抗体を用いて単離され得る（以下を参照のこと）。
【０１１８】
一般的なＥＬＩＳＡアッセイ形式は、実施例１０に示されている。Ｈａｒｌｏｗらは、免疫アッセイおよび抗体／抗原スクリーニングのための多数の有用な技術を記載する。
【０１１９】
精製抗原ポリペプチドまたは目的の抗原を含有する融合ポリペプチドを、固体支持体（例えば、マルチウェルポリスチレンプレート）に結合する。試験される血清を希釈し、そしてウェルに添加する。抗体が結合抗原に結合するのに十分な時間が経過した後、血清をウェルから洗い流す。標識レポーター抗体を適切な基質とともに各ウェルに添加する：精製抗原ポリペプチドまたは抗原を含有する融合ポリペプチドと結合した抗体を含有するウェルを、陽性シグナルにより検出する。
【０１２０】
本発明のポリペプチド抗原を用いるタンパク質ブロット分析の代表的な形式を実施例１０に示す。一般的なタンパク質ブロット法は、Ａｕｓｕｂｅｌらにより記載されている。実施例１０において、４７０−２０−１／ｓｊ２６融合タンパク質を用いて多数の血清サンプルをスクリーニングした。実施例１０に表す結果は、いくつかの異なる供給源のＮ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎血清がポリペプチド抗原と免疫応答することを示す。
【０１２１】
上に示す結果は、ＨＧＶの検出のために、本発明のポリペプチド抗原が、ＨＧＶ感染が疑われる血清サンプルのパネルに対してこれらの方法により迅速にスクリーニングされ得ることを示す。
【０１２２】
（Ｅ．  細胞培養系、動物モデル、およびＨＧＶの単離）
ＨＧＶ伝染性研究が、チンパンジー、カニクイザル、および４つのマイスタックス被験体において行われてきた（実施例４Ｈ）。これらの研究により、これらの動物モデルにおけるＨＧＶ伝染性についてのさらなる情報を得ている。本明細書で記載のＨＧＶは、タマリン、カニクイザル属のサル、およびチンパンジーに感染し得るという利点を有する。
【０１２３】
あるいは、感染動物（チンパンジー、ヒヒ、サル、またはヒト）から得た初代肝細胞を、インビトロで培養し得る。分化した霊長類肝細胞の長期維持を可能にする成長因子およびホルモンを添加した無血清培地が記載されている（Ｌａｎｆｏｒｄら；Ｊａｃｏｂら，１９８９，１９９０，１９９１）。初代肝細胞培養に加えて、感染細胞の不死化培養物もまた生成され得る。例えば、初代肝培養物は、（ＨｅｐＧ２のような）種々の細胞に融合されて、安定的な不死化細胞株を提供し得る。初代肝細胞の細胞培養物もまた、オンコジーンまたはトランスフォーム表現型を生じる遺伝子の導入により不死化され得る。このようなオンコジーンまたは遺伝子は、ＳＶ４０、ヒト細胞性オンコジーン、およびＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスを包含する当該分野で公知の多くの供給源に由来し得る。
【０１２４】
さらに、非感染肝細胞（例えば、初代肝細胞株または継続性肝細胞株）は、培養中の細胞を部分的に精製した粒子調製物（例えば、感染した血清から分別遠心分離および／または分子量ふるいにより調製される）としてか、または感染性血清中でＨＧＶに曝すことにより感染され得る。次いで、これらの感染細胞を増殖させ、そしてウイルスを当該分野で公知の方法で継代する。さらに、他の細胞タイプ（例えば、リンパ球様細胞株）は、ＨＧＶの増殖に有用であり得る。
【０１２５】
ＨＧＶのタンパク質相同性研究により、フラビウイルス科の他のウイルスに類似したアミノ酸領域が検出されている。この科のウイルスのメンバーは、種々の組織培養系中で増殖可能であることが公知である（ＡＴＣＣ−ウイルスカタログ，１９９０）。類推によれば、ＨＧＶは、１つ以上の以下の組織培養系において増殖され得るようである：Ｈｅｌａ細胞、初代ハムスター腎臓細胞、サル腎臓細胞、ｖｅｒｏ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２（アカゲザル腎臓細胞）、ＫＢ細胞（ヒト口部類表皮ガン細胞）、アヒル胚細胞、初代ヒツジ軟髄膜細胞、初代ヒツジ脈絡叢細胞、ブタ腎臓細胞、ウシ胚腎臓細胞、ウシ鼻甲介細胞、ヒヨコ胚細胞、初代ウサギ腎臓細胞、ＢＨＤ−２１細胞、またはＰＫ−１３細胞。
【０１２６】
ＨＧＶの発現に加えて、ＨＧＶポリヌクレオチド配列の領域、ｃＤＮＡ、またはインビトロ転写ＲＮＡは、組換え手段により組織培養細胞中に導入され得る。このような組換え操作により、ＨＧＶの個々の成分の別々の発現が可能となる。
【０１２７】
ＲＮＡサンプルは、感染組織、または特に感染細胞培養物から調製され得る。ＲＮＡサンプルは、ゲルで分画され、そしてクローン化されたＨＧＶ配列に由来するプローブを用いるハイブリダイゼーション分析のためにメンブレンに転写され得る。
【０１２８】
ＨＧＶ粒子は、感染血清、感染組織、上記の細胞培養培地、または培養した感染細胞から当該分野で公知の方法により単離され得る。このような方法は、サイズ分画に基づく技術（例えば、限外濾過、沈澱、沈降法）、陰イオンおよび／または陽イオン交換物質を用いる技術、密度、親水性を基礎とする分離、およびアフィニティークロマトグラフィーを包含する。単離手順の間、ＨＧＶは、（ｉ）本発明の抗ＨＧＶ肝炎会合試薬抗体を用いて、（ｉｉ）同定されたＨＧＶ核酸配列（例えば、実施例５）に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、または（ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲにより同定され得る。
【０１２９】
ＨＧＶに対する抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗら；Ｐｉｅｒｃｅ）によるＨＧＶ粒子の精製に使用され得る。ＨＧＶポリペプチドまたは融合ポリペプチド（例えば、４７０−２０−１）に対する抗体は、抗体がその免疫選択性を維持するような方法で固体支持体に固定される。固体支持体への抗体のこのような結合を達成するために、スペーサー基を含有する２官能性カップリング剤（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、しばしば抗体の抗原結合部位への接近し易さを保持するために用いられ得る。
【０１３０】
ＨＧＶ粒子は、免疫蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法、粒子を構成するタンパク質のウェスタンブロット分析、部分的に精製した粒子を用いる動物および／または細胞系における感染研究、および沈降特性を包含するが、これらに限定されない標準的な手順によりさらに特徴付けられ得る。実施例５に示す結果は、本発明のウイルス粒子が非エンベロープウイルス粒子よりも、エンベロープウイルス粒子に類似していることを示唆する。
【０１３１】
ＨＧＶ粒子を破砕してＨＧＶゲノムを得る。粒子の破砕は、例えば、キレート剤の存在下での界面活性剤処理により達成され得る。次いで、ゲノムの核酸は、さらに特徴付けられ得る。特徴付けは、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ感受性の分析を包含し得る。
【０１３２】
ゲノムの撚り性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）（実施例４１）および形態（例えば、環状）は、当該分野の技術により決定され得、これらは、電子顕微鏡での可視化および沈降特性を包含する。
【０１３３】
単離されたゲノムはまた、ゲノム全体の配列決定を可能にし、それがセグメント化されているか否か、およびそれがＲＮＡゲノムであるかＤＮＡゲノムであるか（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、染色体歩行技術、または近隣のクローン化配列由来のプライマーを利用するＰＣＲを用いて）を決定し得る。ＨＧＶの全配列の決定により、ゲノム構成研究ならびに公知のウイルス病原体のコード配列および調節配列とＨＧＶ配列との比較を可能にする。
【０１３４】
（Ｆ．抗ＨＧＶ肝炎活性を有する薬剤についてのスクリーニング）
ＨＧＶの増殖のための細胞培養および動物モデル系の使用は、感染性ＨＧＶの産生を阻害する抗肝炎剤：特に、ＨＧＶの複製を阻害する薬物についてスクリーニングする能力を提供する。細胞培養および動物モデルは、正常な細胞機能および生存性へのこのような抗肝炎薬物の効果の評価を可能にする。潜在的な抗ウイルス剤（天然の産物または合成化合物を包含する；例えば、低分子、真菌抽出物のような複雑な混合物、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、代表的に濃度範囲にわたる抗ウイルス活性についてスクリーニングされる。次いで、ＨＧＶ複製および／または抗原産生への効果が、代表的には、ウイルスの高分子の合成または高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）の蓄積をモニターすることにより評価される。この評価は、正常な細胞機能（ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、一般的なタンパク質翻訳など）への抗ウイルス剤の効果としばしば相関する。
【０１３５】
ＨＧＶの検出は、本明細書に記載の方法を包含する多くの方法により達成され得る。例えば、抗体は本発明の抗原に対して生成され得、そしてこれらの抗体は、細胞培養物中のＨＧＶ抗原を同定および定量するために抗体に基づくアッセイ（Ｈａｒｌｏｗら）に用いられた。ＨＧＶ抗原は、培養中に競合アッセイを用いて定量され得る：クローン化ＨＧＶ配列によりコードされるポリペプチドがこのようなアッセイに用いられ得る。代表的には、組換えにより産生されるＨＧＶ抗原ポリペプチドを生成し、そしてこれを用いてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生成する。組換えＨＧＶポリペプチドは、レポーター分子を用いて標識される。次いで、この標識ポリペプチドのその同族抗体への結合の阻害が、ＨＧＶ抗原を含有するサンプル（例えば、細胞培養培地または血清）の存在下で評価される。サンプル中のＨＧＶ抗原のレベルは、既知濃度の非標識組換えタンパク質を用いて作成した標準曲線に対する阻害レベルの比較により決定される。
【０１３６】
本発明のＨＧＶ配列は、細胞培養系で産生されるＨＧＶ核酸配列の量を定量するために用いられ得るポリヌクレオチドプローブ／プライマーの生成に特に有用である。このような定量は、種々の方法により達成され得る。例えば、レポーター分子で標識したプローブは、標準的なドットブロットハイブリダイゼーションまたは標識プローブと感染細胞の核酸との競合アッセイに用いられ得る。さらに、サンプル中の標的核酸レベルを定量するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いる種々の方法が存在する（Ｏｓｉｋｏｗｉｃｚら）。
【０１３７】
保護抗体はまた、上記の細胞培養および動物モデル系を用いて同定され得る。
【０１３８】
例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本発明の抗原に対して生成される。次いで、これらの抗体は、細胞培養または動物の感染前に感染性ＨＧＶ含有接種原（例えば、血清）を前処理するために用いられ得る。細胞培養物または動物を感染から保護する単一の抗体または抗体の混合物の能力が評価される。例えば、細胞培養および動物においては、ウイルス抗原および／または核酸産生が存在しないことが、スクリーニングとして供される。さらに動物においては、ＨＧＶ肝炎疾患症状（例えば、ＡＬＴ値の上昇）の不在はまた、保護抗体の存在の指標である。
【０１３９】
あるいは、回復期の血清が、保護抗体の存在についてスクリーニングされ得、次いで、これらの血清は抗体と結合するＨＧＶ肝炎関連病原体抗原を同定するために用いられる。次いで、同定されたＨＧＶ抗原は、組換えによりまたは合成により生成される。保護抗体を生成する抗原の能力が上記のように試験され得る。
【０１４０】
最初のスクリーニング後、保護抗体を生成し得ると同定された抗原（単数または複数）を、（単独または組み合わせてのいずれかで）ワクチンとして用いて試験動物を接種し得る。次いで、動物に感染性ＨＧＶで抗原投与する。感染からの保護は、それらを感染から保護する抗体を生成するための動物の能力を示す。さらに、動物モデルを用いることにより、細胞免疫を活性化する抗原の同定が可能となる。
【０１４１】
動物モデルでの研究において、ウイルス調製による抗原投与に応答した保護免疫応答（例えば、感染血清）は、（ｉ）動物を感染から保護するか、または（ｉｉ）疾患の発現を防ぐ。
【０１４２】
（Ｇ．ワクチンおよび防御免疫の発生）
ワクチンは、本発明の方法により同定された１つまたはそれより多いの免疫原性ポリペプチドから調製され得る。ＨＧＶから単離された配列と他の既知のウイルスタンパク質との間のゲノム構成類似性は、有効なワクチンの候補となるようなポリペプチドに関する情報を提供し得る。さらに、多くのコンピュータプログラムを、タンパク質抗原決定領域をコードする単離された配列の有望な領域を同定するために用い得る（例えば、Ｈｏｐｐら、；「ＡＮＴＩＧＥＮ」、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ）。
【０１４３】
活性成分として免疫原性ポリペプチドを含むワクチンは、代表的には溶液または懸濁液としてのいずれかで注入可能なように調製される。さらに、免疫原性ポリペプチドは、注入前の水性形態中への再懸濁に適する固体または凍結乾燥状態で調製され得る。免疫原性ポリペプチドはまた、乳化またはリポソーム中にカプセル化され得る。ポリペプチドはしばしばポリペプチドと適合可能な薬学的に受容可能な賦形剤と混合される。このような賦形剤は、以下のものおよび以下のものの組合せを含むがこれらに限定されない：生理食塩水、水、糖（例えば、デキストロースおよびソルビトール）、グリセロール、アルコール（例えば、エタノール［ＥｔＯＨ］）、および当該技術分野で公知の他の物。さらに、ワクチン調製物は、湿潤剤、乳化剤（例えば、界面活性剤）、およびｐＨ緩衝剤のような他の少量の補助物質を含み得る。さらに、多くのアジュバントが利用可能であり、ワクチン調製物の有効性を増強し得る。このようなアジュバントの例は以下のものを含むがこれらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミンおよびＮ−アセチル−ノル−ムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンを含む関連化合物の群、および水酸化アルミニウム。
【０１４４】
本発明のワクチンに用いられる免疫原性ポリペプチドは、組換え体であり得、合成物であり得、または例えば弱毒化されたＨＧＶ粒子から単離され得る。ポリペプチドは通常ワクチン中に中性または塩の形態で処方される。薬学的に受容可能な有機塩および無機塩が当該技術分野で周知である。
【０１４５】
ＨＧＶ肝炎関連因子ワクチンは、代表的には皮下または筋肉内注射により非経口投与される。他の可能な処方物は、経口処方物および坐剤処方物を含む。経口処方物は通常、賦形剤（例えば、医薬グレードの糖、サッカリン、セルロースなど）を用い、通常１０〜９８％内の免疫原性ポリペプチドを含む。経口組成物は、丸剤、カプセル剤、錠剤、溶液、懸濁液、粉剤などの形態をとり、徐放性または長期放出を可能にするように処方され得る。坐剤処方物は従来の結合剤およびキャリアを用い、代表的には０．１％と１０％との間の免疫原性ポリペプチドを含む。
【０１４６】
上記の情報を考慮すると、ＨＧＶ肝炎関連因子に対する多価ワクチンが生成され得、これは１つまたはそれより多い構造性または非構造性のウイルス因子ポリペプチドから構成される。これらのワクチンは、例えば、組換え発現ＨＧＶポリペプチド、ＨＧＶビリオンから単離されたポリペプチド、合成ポリペプチド、またはモザイクポリペプチドの形態でアセンブルしたエピトープを含み得る。さらに、不活性化ＨＧＶの使用を介してＨＧＶ肝炎感染に対する防御を与えるワクチンを調製することが可能であり得る。このような不活性化は、ウイルス溶解物の調製、次いで適切な有機溶媒、界面活性剤、またはホルマリンで溶解物を処理することにより達成され得る。
【０１４７】
ワクチンはまた、弱毒化したＨＧＶ株から調製され得る。このような弱毒化したＨＧＶは、上記の細胞培養物および／または動物モデル系を用いて得られ得る。代表的には、弱毒化された株がインビトロまたはインビボでの多回継代後単離される。
【０１４８】
弱毒化された株の検出は当該技術分野で公知の方法により達成される。弱毒化されたＨＧＶを検出する１つの方法は、ＨＧＶ抗原に対する抗体プローブ、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用、あるいは感染動物またはＨＧＶ感染したインビトロ培養物のアッセイについての配列特異的プライマーを用いる増幅である。
【０１４９】
あるいは、または上記方法の他に、弱毒化されたＨＧＶ株は、本明細書中に示された情報から得られ得るゲノム情報に基づいて構築され得る。代表的には、例えばウイルス発病学に関連するポリペプチドをコードする感染因子ゲノムの領域が欠失され得る。欠失はウイルス複製を妨害すべきではない。さらに、組換え弱毒化ＨＧＶ構築物は、ＨＧＶに対する防御免疫応答の惹起を与え得る１つあるいは複数のエピトープの発現を可能にする。所望の免疫応答は体液性免疫および細胞性免疫の両方を含み得る。次いで、弱毒化ＨＧＶのゲノムは細胞を形質転換するために用いられ、ウイルス複製を可能にする条件下で細胞が増殖される。このような弱毒化株は、ワクチンとしてのみならずウイルス抗原および／またはＨＧＶ粒子の産生ソースとしても有用である。
【０１５０】
ＨＧＶエピトープを含むハイブリッド粒子免疫原も生成され得る。ＨＧＶエピトープの免疫原性は、真核生物系（例えば、哺乳類系または酵母系）中にエピトープを発現することにより増強され得、ここでこのエピトープは公知の粒子形成タンパク質と融合またはアセンブルされる。このようなタンパク質の１つは、Ｂ型肝炎表面抗原である。ＨＧＶエピトープが粒子形成タンパク質のコード配列に直接連結される組換え構築物は、ＨＧＶエピトープおよび粒子形成タンパク質に関して免疫原性であるハイブリッドタンパク質を生成する。あるいは、粒子形成に関連しない粒子形成タンパク質コード配列の選択された部分が、ＨＧＶエピトープに対応するコード配列に置き換えられ得る。例えば、粒子形成タンパク質に対する特異的免疫反応性領域がＨＧＶエピトープ配列に置き換えられ得る。
【０１５１】
Ｂ型肝炎表面抗原は、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａ中および哺乳類細胞中で発現し、そしてアセンブルされて粒子となることが示された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９８２および１９８４；Ｍｉｃｈｅｌｌｅら）。これらの粒子は免疫反応性を増強したことが示された。ハイブリッドタンパク質（すなわち、異種のウイルス配列を有する組換え構築物）を用いるこれらの粒子の形成が以前に開示されていた（ヨーロッパ特許第１７５，２６１号、１９８６年３月２６日に公開）。ＨＧＶエピトープを含むこのようなハイブリッド粒子もワクチン適用に有用であり得る。
【０１５２】
本発明のワクチンは、処方方法に適合する用量でならびに予防処置または治療処置に薬理学的に有効であるような量で投与される。投与される免疫原の量は、処置される被験体、防御免疫応答の発生についての処置被験体の免疫系の能力、および所望の防御レベルに依存する。
【０１５３】
本発明のＨＧＶワクチンは単回または複数回の用量で投与され得る。用量レジメはまた、処置被験体の必要および耐性に関連して決定される。ＨＧＶ免疫原性ポリペプチドに加えて、ワクチン処方物は他の免疫調節剤と共に投与され得る。
【０１５４】
ＨＧＶワクチン接種へのさらなるアプローチでは、適切な調節制御下にＨＧＶタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、哺乳類組織にインビボで直接導入される。このような構築物の導入は「遺伝学的免疫」を生じる。同様のＤＮＡ構築物が細胞に取り込まれ、コードされたタンパク質が発現されることが示された（Ｗｏｌｆら；Ａｓｃａｄｉら）。注入されたＤＮＡは宿主細胞クロマチンへ組み込みまたは複製しないようである。この発現は、動物系におけるインビボでのウイルス抗原投与からの防御を含む、実質的な体液性および細胞性免疫応答を惹起する（Ｗａｎｇら、１９９３；Ｕｌｍｅｒら）。１つの実施態様では、局所麻酔（例えば等張性食塩水中メチルパラベンを含む塩酸ブピバカイン）での前処置に続いてＤＮＡ構築物を骨格筋に注入し、細胞のＤＮＡ取り込みを促進する。注入したＤＮＡ構築物が筋肉細胞に取り込まれ、コードされたタンパク質が発現される。
【０１５５】
可溶性ウイルスサブユニットタンパク質でのワクチン接種に比較して、遺伝学的免疫はウイルスタンパク質の確実なインビボ発現の有利性を有する。これらのウイルスタンパク質は、宿主細胞組織適合性抗原、および天然のウイルス感染で起こるような他のタンパク質と関連して発現される。このタイプの免疫は、多くの可溶性サブユニットタンパク質ワクチンに対比して、体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導し得る。従って、このタイプの免疫は、生弱毒化ワクチンの有利な特徴の多くを、ワクチン接種のための感染剤の使用および付随の安全性の心配なしで、維持する。
【０１５６】
所望のワクチン抗原をコードするプラスミドまたは他のＤＮＡ構築物のインビボでの組織中への直接注入は１つの送達手段である。ＤＮＡ構築物の他の送達手段が同様に用いられ得る。これらは種々の脂質ベースのアプローチを含み、ここでＤＮＡはリポソーム、カチオン性脂質試薬、またはサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）（例えばリポフェクチン）を用いてパッケージされる。これらのアプローチは、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ（１９９１）により要約されたようにインビボでの取り込みおよび発現を促進する。これらの基本のアプローチへの種々の改変は次を含む：（ｉ）特定の細胞の標的化、（ｉｉ）取り込みに続くＤＮＡ構築物の細胞内配置、または（ｉｉｉ）発現を促進することを促進するためのペプチドまたは他の部分の取り込み。あるいは、所望のワクチン抗原をコードする配列は適切なレトロウイルスベクターに挿入され得る。得られた組換えレトロウイルスベクターをワクチン抗原のインビボ発現のために被験体に接種した。次いで、抗原は免疫応答を誘導する。上記のように、このアプローチはウイルス抗原に対する体液性および細胞性免疫の両方を誘導することを示している（Ｉｒｗｉｎら）。
【０１５７】
さらに、本発明のＨＧＶワクチンは、他のワクチン剤、例えば他の肝炎ワクチンと組み合わせて投与され得る。
【０１５８】
（Ｈ．合成ペプチド）
ＨＧＶポリペプチドのコード配列を用いて、合成ペプチドがこれらのポリペプチドに対応して生成され得る。合成ペプチドは、商業的に合成され得るか、または当該技術分野における標準的な方法および装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を用いて調製され得る。
【０１５９】
あるいは、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成の標準的な方法により直接合成されるか、または、大きなコード配列の場合、コード配列に対応する複数のオリゴヌクレオチドフラグメントのタンデム配列（ａｒｒａｙ）を含む一連のクローニング工程により合成されるかのいずれかであり得る（Ｃｒｅａ；Ｙｏｓｈｉｏら；Ｅａｔｏｎら）。オリゴヌクレオチドコード配列は標準的組換え手順により発現され得る（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ａｕｓｕｂｅｌら）。
【０１６０】
（Ｖ．ウイルスゲノムの特徴付け）
実施例４に示すように、ＨＧＶゲノムはＲＮＡ分子であるようであり、ウイルスのフラビウイルス科のカテゴリーに分類されるウイルス配列に最も近い配列類似性を有する。この科はＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ属、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ属、および１つのメンバー（Ｃ型肝炎ウイルス）から構成される非分類属を含む。ＨＧＶウイルスは、フラビウイルス科の他の認められたメンバー（下記のタンパク質モチーフを除く）との著しく広範な（すなわち、ウイルスの長さを通して）配列同一性を有さない。
【０１６１】
一般的には、フラビウイルス科のメンバーは、１．１〜１．２３ｇ／ｍｌの間のショ糖濃度勾配密度を有する包膜ウイルスであり、熱、有機溶媒、および界面活性剤に感受性である。実施例５に示すように、ＨＧＶは包膜フラビウイルス科のウイルス（ＨＣＶ）に類似の密度特性を有する。無傷のＨＧＶビリオンも有機溶媒に感受性であるようである（実施例５）。
【０１６２】
フラビウイルス科のビリオンは直鎖状１本鎖（ｓｓ）ＲＮＡの単一分子を含み、これもまたウイルスタンパク質をコードする唯一のｍＲＮＡとして働く。ｓｓＲＮＡ分子は代表的には９キロベース長と１２キロベース長との間のサイズである。
【０１６３】
ウイルスタンパク質は、続いて成熟ウイルスタンパク質にプロセシングされる１つのポリタンパク質前駆体に由来する。フラビウイルス科のほとんどのメンバーは、その３’末端にポリ（Ａ）テイルを含まない。ビリオンは重量で約１５〜２０％脂質である。
【０１６４】
フラビウイルス科中のメンバーは、コアタンパク質および２つまたは３つの膜結合タンパク質を有する。３つの属のフラビウイルス科中のメンバーの類似の構造タンパク質は、配列レベルで互いにほとんど類似性を示さない。非構造タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）、ヘリカーゼ、およびセリンプロテアーゼについて保存されたモチーフを含む。これらの保存されたアミノ酸またはモチーフの短いブロックは、「ＭＡＣＡＷ」のように当該技術分野で公知のコンピュータアルゴリズムを用いて検出され得る（Ｓｃｈｕｌｅｒら）。これらのモチーフは、おそらくこれらのタンパク質によりプロセシングされた基質により課せられる束縛に関連する（ＫｏｏｎｉｎおよびＤｏｌｊａ）。これらのモチーフの順番は、フラビウイルス科の全メンバーにおいて保存される。ＨＧＶのゲノムは、フラビウイルス科のメンバーにおいて見られるタンパク質モチーフを含む；例えば、（ｉ）ヘリカーゼ遺伝子、（ｉｉ）セリン様プロテアーゼドメイン、および（ｉｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）（実施例５、「ＧＤＤ」配列を参照のこと）。
【０１６５】
配列情報は、ＨＧＶのいくつかの異なる株／単離物において本明細書中で開示される。この情報は、本明細書中に記載したような（例えば、開示されたＨＧＶ変異体配列に基づく縮重プライマーを用いる）ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、およびＲＴ−ＰＣＲの技法を用いて新規の株／単離物を単離するために、当業者により用いられ得る。
【０１６６】
この場合では、ＨＧＶは、フラビウイルス科のメンバーであると考えられる新規の単離物である。このウイルス科内で、ウイルスによりコードされる構造タンパク質の試験は、ウイルス単離物が別種のウイルスのメンバーであるかどうかの最も明確な決定を可能にする。非構造タンパク質は、ある科のウイルス種内の異なる種のウイルス間で最も保存される。これは例えば次のような酵素機能を保存する必要性の結果であると考えられる：ウイルスポリタンパク質のタンパク質分解的切断、ならびにウイルスヘリカーゼおよびウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡゲノムの複製。
【０１６７】
フラビウイルス科の任意の属（例えば、フラビウイルス属）内の数種の試験は、これらの保存された機能のための遺伝子が構造タンパク質よりも種間でより高度に保存されることを示す。従って、ウイルス単離物が既知の種の「変異体単離物」に対して新規の種を示すかどうかの主要な決定ファクターの１つは、既知のウイルス種と新規のウイルス単離物との間の構造タンパク質の全体的な相同性の決定である。
【０１６８】
非構造タンパク質中に見られる約２００アミノ酸またはそれより少ない領域内で見られた局所的相同性は、単離物が変異体または新規の種かどうかの不確定の指標である。代表的には、広範な構造タンパク質の約４０％またはそれより少ない相同性を有するウイルス単離物は、異なる種（ウイルス）または異なる属のいずれかとして分類される。各ＨＧＶの構造領域は、「ＧＥＮＢＡＮＫ」に記載されたあらゆるウイルスと比較して４０％より少ない相同性を有する（比較は当該技術分野の標準方法により行った）。従って、ＨＧＶは、ポジティブストランドＲＮＡウイルスの新規の種およびおそらく新規の属であると考えられる。
【０１６９】
ウイルス単離物の系統発生学的な位置の決定において試験される他の重要な領域は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。これらの領域はウイルス単離物の間で比較される。例えば、全メンバーのＨＣＶ（フラビウイルス科の非分類属）は、その属中の他の全メンバーと約９０％より多く保存された５’非翻訳領域を有する。さらに、ＨＣＶのメンバーは約２４ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間の３’非翻訳領域を共有する。
【０１７０】
５’非翻訳領域がＢＬＡＳＴＮ上のＦＡＳＴＡを用いる疑問の（ｑｕｅｒｙ）配列として用いられる場合、「ＧＥＮＢＡＮＫ」（Ｖｅｒ．８６）中のいかなるウイルスとも重要な配列は見られない。さらに、ＨＧＶは、あらゆる他の公知のウイルスに対する相同性もほとんど含まない少なくとも約２５０ヌクレオチド長である３’非翻訳領域を含む。
【０１７１】
フラビウイルス科のメンバーは、（ｉ）食血性節足動物ベクター（ダニおよび蚊）（ここでそれらは疾病を引き起こさない）から（ｉｉ）広範囲の脊椎動物宿主（ヒト、霊長類、他の哺乳類、有袋類、および鳥類）までの範囲にわたる広範囲の動物において複製することが知られている。フラビウイルス科の３０をこえるメンバーは、ヒトにおいて熱病または発疹から、出血熱、脳炎、または肝炎のような潜在的な致死疾患までの範囲にわたる疾患を引き起こす。フラビウイルス科の少なくとも１０のメンバーは、家畜において重篤なおよび経済的に重大な疾患を引き起こす。
【０１７２】
（ＶＩ．利用）
（Ａ．発明）
１つの局面では、本発明は実質的に単離された形態でのＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドに関する。１つの実施態様では、ＨＧＶポリヌクレオチドは、（ｉ）霊長類における伝搬、（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）から血清学的に区別し得ること、ならびに（ｉｉｉ）フラビウイルス科のメンバーであることにより特徴付けられる。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（あるいはそのアナログまたはその変異体）から構成され得、そして当該技術分野で公知の方法に従って、組換え産生され得、単離され得、または合成され得る。
【０１７３】
一般的には、本発明のＨＧＶポリヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド長である。別の実施態様では、ＨＧＶポリヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様では、ＨＧＶポリヌクレオチドは少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【０１７４】
より詳細な実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＧＶゲノムのｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ相補物を含む。より詳細な実施態様では、このようなｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ相補物は、配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９またはその相補物からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも４０％の配列相同性を有する。さらに他の実施態様では、このようなｃＤＮＡは、配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９、またはその相補物からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも５５％の配列相同性を示す。より詳細な実施態様では、本発明のｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ相補物ポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９、またはその相補物からなる群より選択される配列由来の配列を有する。
【０１７５】
他の一般的な実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＧＶに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである。さらに他の一般的な実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＧＶのエピトープをコードする。より詳細には、ポリヌクレオチドをコードするこのようなエピトープは、配列番号１４、配列番号１９、または配列番号３７由来の配列を含み得る。
【０１７６】
他の一般的な実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＧＶポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチドの隣接する配列を含む。このことについては、ＨＧＶは、次のアミノ酸配列の１つに少なくとも４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むゲノムとして特徴付けられる：配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、配列番号３８の１９０アミノ酸配列、または配列番号２０の６７アミノ酸配列。より詳細には、ポリヌクレオチドプローブはＨＧＶに特異的にハイブリダイズする。このようなポリヌクレオチドプローブは、検出用標識または他の改変を有し得るか、または固相支持体に固定され得る。
【０１７７】
上記のＤＮＡポリヌクレオチドはまた、ＨＧＶ特異的免疫反応性抗原決定基をコードし得る。このことについては、ＨＧＶは、アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むゲノム、ｃＤＮＡまたはその相補物を有するとして特徴付けられる。このような次のアミノ酸配列の１つに少なくとも４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列：配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、配列番号３８の１９０アミノ酸配列、または配列番号２０の６７アミノ酸配列。
【０１７８】
他の詳細な実施態様では、本発明に従ってＨＧＶ抗原決定基と特異的に反応性であるＨＧＶコードＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、または配列番号３８の１９０アミノ酸配列、または配列番号２０の６７アミノ酸配列に少なくとも５５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
さらに他の詳細な実施態様では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号３７、および配列番号１９、またはその相補物からなる群より選択されるポリヌクレオチドに少なくとも４０％の配列相同性を示し得る。
【０１８０】
さらなる実施態様では、本発明は、ＨＧＶ誘導ポリペプチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを包含する。より詳細には、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは、ＨＧＶゲノム、ｃＤＮＡまたはその相補物にコードされる少なくとも１５〜６０のアミノ酸の隣接する配列に５５％の配列相同性を有する少なくとも１５〜６０のアミノ酸の隣接する配列を含む。
【０１８１】
詳細な実施態様では、ＨＧＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡソースλｇｔ１１ライブラリー内にコードされ得る。さらに他の詳細な実施態様では、ＤＮＡポリヌクレオチドはＨＧＶのエピトープをコードし得る。さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドはＨＧＶと特異的にハイブリダイズするプローブであり得る。
【０１８２】
関連する局面では、本発明は、ＨＧＶポリペプチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換えベクターを包含する。他の関連する局面では、本発明は、このようなベクターで形質変換された細胞を包含する。
【０１８３】
さらに他の関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルスゲノム、ｃＤＮＡまたはその相補物に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを包含する。より詳細な実施態様では、ポリヌクレオチドプローブ配列は、配列番号１９、配列番号３７、または配列番号１４、あるいはその相補物由来の配列に少なくとも４０％の相同性を有する。他の詳細な実施態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１９、配列番号３７、または配列番号１４、あるいはその相補物由来である。
【０１８４】
他の関連する局面では、本発明は、被験体においてＨＧＶ肝炎ウイルス核酸を検出する方法を包含する。この方法に従って、核酸含有サンプルは被験体から得られる。次いでサンプルを、ＨＧＶ肝炎ウイルスゲノムと特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブと合わせる。次いで、ＨＧＶ核酸／プローブ複合体（ＨＧＶ核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより形成される）が検出される。このような検出は、少なくとも１つのリポーター部分を含むプローブのＨＧＶ核酸へのハイブリダイゼーションにより達成され得る。
【０１８５】
より詳細な実施態様では、上記の方法は、ＨＧＶ核酸特異的プローブの使用を包含する。ここで、２つのプローブ（プライマー）はＨＧＶ核酸の内部領域を定義する。この実施態様では、各プローブはＨＧＶ核酸内部領域への３’末端の内部を含む１本鎖を有する。次いで、核酸／プローブハイブリダイゼーション複合体は、プライマー伸長反応により２本鎖プローブ含有フラグメントに転換される。プローブ含有フラグメントは、（ｉ）１本鎖フラグメントを生成するために２本鎖フラグメントを変性させる工程、（ｉｉ）ストランド／プローブ複合体を形成するために１本鎖をプローブとハイブリダイズする工程、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの全デオキシリボヌクレオチドの存在下で、ストランド／プローブ複合体から２本鎖フラグメントを生成する工程、ならびに（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を所望の程度の増幅が達成されるまで繰り返す工程を、首尾良く繰り返すことにより増幅される。次いで、増幅産物は確立された手法に従って同定される。本発明の方法は、さらに上記の内部領域に選択的にハイブリダイズし得るが、増幅に用いられる特異的なプローブ／プライマー配列にはハイブリダイズしない第３のポリヌクレオチドプローブを包含し得る。
【０１８６】
他の詳細な実施態様では、ＨＧＶ核酸／プローブ複合体の検出は、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製、リガーゼ連鎖反応、または鎖置換増幅によるような標的増幅方法により達成される。さらに詳細な実施態様では、検出は分枝鎖ＤＮＡプローブ法またはＱ−βレプリカーゼ法のようなシグナル増幅技法を用いて達成される。
【０１８７】
さらに他の関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルス由来ポリヌクレオチドの存在についてサンプルを分析するキットを包含する。一般的な実施態様では、キットは、ＨＧＶポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブおよび適切な容器を含む。詳細な実施態様では、キットは、ＨＧＶポリヌクレオチドの内部領域を定義する２つのポリヌクレオチドプローブを含み、ここで各プローブは３’末端の内部側領域を含む１本鎖を有する。さらなる実施態様では、プローブはポリメラーゼ連鎖反応増幅用のプライマーとして有用であり得る。
【０１８８】
さらに関連する局面では、本発明は、実質的に単離された形態でのＨＧＶ肝炎ウイルス粒子を包含する。
【０１８９】
本発明はまた、実質的に単離された形態でのＨＧＶ肝炎ウイルス由来のポリペプチドまたはポリペプチド調製物を包含する。これについては、ＨＧＶウイルスは次のように特徴付けられる：（ｉ）霊長類において伝搬され得る；（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）とは血清学的に区別される；および（ｉｉｉ）フラビウイルス科のウイルスのメンバーである。ＨＧＶポリペプチド（上記で定義された）は、化学合成および組換えＤＮＡ発現を含む従来の手段により調製され得る。このようなポリペプチドはまた固相に固定され得る。
【０１９０】
詳細な実施態様では、ポリペプチドは少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応性である。さらに詳細な実施態様では、ポリペプチドはＨＧＶに特異的に免疫反応性である抗原決定基を含む。この文脈においては、ＨＧＶは、配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、または配列番号３８の１９０アミノ酸配列、または配列番号２０の６７アミノ酸配列に少なくとも４０％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するゲノムを有することにより特徴付けられる。より詳細な実施態様では、ＯＲＦは、前述のアミノ酸配列の１つに少なくとも５５％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする。さらなる実施態様では、ポリペプチド配列は、配列番号１５の２８７３アミノ酸配列またはそのフラグメント、配列番号３８の１９０アミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいは配列番号２０の６７アミノ酸配列またはそのフラグメント由来である。
【０１９１】
他の詳細な実施態様では、ＨＧＶ肝炎ウイルス由来のポリペプチドは、ＨＧＶゲノム、ｃＤＮＡ、またはその相補物によりコードされる少なくとも約６０のアミノ酸の隣接する配列を含む。より詳細には、このようなペプチド配列は、ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡソースλｇｔ１１ライブラリーによりコードされ得る。
【０１９２】
より詳細な実施態様では、組換え発現されるＨＧＶポリペプチドは、配列番号２０、配列番号３８、または配列番号１５由来のポリペプチド配列を含み得る。他の実施態様では、このようなポリペプチドは、配列番号１４由来、または配列番号１４の相補物由来の配列によりコードされ得る。
【０１９３】
さらに関連する実施態様では、本発明に従って、ＨＧＶ肝炎ウイルスポリペプチドは、ＨＧＶポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであり得る。より詳細には、このような融合ポリペプチドは、第二のポリペプチドシグナル配列として、β−ガラクトシダーゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質配列を含み得る。あるいは、第二のポリペプチドは粒子形成タンパク質を含有し得る。
【０１９４】
上記のポリペプチドは、構造または非構造ウイルスタンパク質由来であり得る。
【０１９５】
さらに関連する局面では、本発明は、適切な条件下で、ＨＧＶ肝炎ウイルスゲノム、ｃＤＮＡ、またはその相補物由来のｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現し得るクローニングベクターを包含する。本発明のこの局面では、ＯＲＦは、所望の宿主に適合可能な制御配列に作動可能に連結される。関連する局面では、本発明はこのようなベクターで形質転換された細胞を包含する。ベクターのより詳細な実施態様では、ＯＲＦは配列番号１４またはその相補物由来であり得る。さらに詳細な実施態様では、ＯＲＦは配列番号３７または配列番号１９由来であり得る。
【０１９６】
関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルスポリペプチドを産生する方法を包含する。この方法は、上記のベクターを含む細胞を、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列の発現を達成するに適切な条件下で培養することを包含する。より詳細な実施態様では、ＯＲＦ配列は、配列番号１５、配列番号３８、および配列番号２０からなるポリペプチド配列またはそのフラグメントの群より選択されるポリペプチド配列をコードする。さらに、ＯＲＦ配列は、ＨＧＶ  ｃＤＮＡ、またはその相補物由来であり得る。さらに他の詳細な実施態様では、ベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞中で発現されるλｇｔ１１ファージベクターである。
【０１９７】
さらに関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルス感染に対して特異的な抗体を含む血清のスクリーニングに使用する診断キットを包含する。このようなキットは、少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含有する実質的に単離されたＨＧＶポリペプチド抗原を含み得る。このようなキットはまた、抗原に対する前記抗体の結合を検出する手段を含む。このようなキットに関して、ＨＧＶは、アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するゲノム、ｃＤＮＡ、またはその相補物を有することにより特徴付けられる。このようなアミノ酸配列は、代表的には、配列番号１５の２８７３アミノ酸配列、または配列番号３８の１９０アミノ酸配列、または配列番号２０の６７アミノ酸配列に少なくとも４０％の配列相同性を有する。詳細な実施態様では、キットは、組換え産生されたまたは化学合成されたポリペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固相支持体に接着され得る。
【０１９８】
より詳細な実施態様では、上記キットの検出手段は、前記ポリペプチド抗原が接着される固相支持体を含む。このようなキットはまた、非接着リポーター標識抗ヒト抗体を含み得る。この実施態様では、抗体のＨＧＶポリペプチド抗原への結合は、リポーター標識抗体が抗体を結合することにより検出され得る。
【０１９９】
関連する局面では、本発明は、被験体でのＨＧＶ肝炎ウイルス感染を検出する方法を包含する。この検出方法は、ＨＧＶ被験体由来の血清を実質的に単離されたＨＧＶポリペプチド抗原と反応させる工程、および結合した抗体の存在について抗原を試験する工程を包含する。詳細な実施態様では、この方法は、固相支持体に接着されるポリペプチド抗原を含み、血清をその支持体と反応させる。続いて、支持体をリポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。次いで、固相支持体をリポーター標識抗体の存在について試験する。
【０２００】
さらなる局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルスワクチン組成物を包含する。
【０２０１】
この組成物は、実質的に単離されたＨＧＶポリペプチド抗原を含み、ここでこの抗原は少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む。ペプチド抗原は、組換え発現または化学合成を含む当該技術分野で公知の方法に従って産生され得る。このペプチド抗原は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア中に薬理学的に有効な用量で存在する。
【０２０２】
さらに関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ肝炎ウイルスエピトープと特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を包含する。他の関連する局面では、本発明は、ＨＧＶと特異的に免疫反応性のポリクローナル抗体の実質的に単離された調製物を包含する。より詳細な実施態様では、このようなポリクローナル抗体はアフィニティークロマトグラフィーにより調製される。
【０２０３】
関連する局面では、本発明は、ＨＧＶに対する抗体を産生するための方法を包含する。この方法は、実質的に単離されたＨＧＶポリペプチド抗原を被験体に投与することを包含し、ここでこの抗原は、少なくとも１つの抗ＨＧＶ抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む。抗原は被験体における免疫応答を生じるに十分な量で投与される。
【０２０４】
さらに他の関連する局面では、本発明は、ＨＧＶ抗原を含む血清をスクリーニングするのに用いるための診断キットを包含する。診断キットは、ＨＧＶポリペプチド抗原と特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体、およびポリペプチド抗原の抗体への結合を検出する手段を含む。１つの実施態様では、抗体は固相支持体に接着される。詳細な実施態様では、抗体はモノクローナル抗体であり得る。キットの検出手段は第二の標識モノクローナル抗体を含み得る。
【０２０５】
あるいは、またはさらに、検出手段は標識された競合抗原を含み得る。
【０２０６】
他の関連する局面では、本発明は、被験体におけるＨＧＶ感染を検出する方法を包含する。本発明のこの局面に従って、被験体由来の血清は、上記のキットの実質的に単離されたＨＧＶ特異抗体と反応する。次いでＨＧＶ特異抗体は結合した抗原の存在について試験される。
【０２０７】
さらに関連する局面では、本発明は、ＨＧＶで感染したインビトロで増殖した細胞を包含する。詳細な実施態様では、細胞は組織培養で増殖した肝細胞である。
【０２０８】
より詳細には、組織培養細胞は、不死化した肝細胞であり得るか、またはＨＧＶ感染した霊長類の肝臓由来の細胞株由来であり得る。
【０２０９】
関連する局面では、本発明は、ＨＧＶを増殖する方法を包含する。この方法は、上記のように、インビトロで増殖したＨＧＶ感染細胞をＨＧＶの増殖を促進するに有効な条件下で培養する工程を包含する。他の関連する局面では、本発明はこのような増殖方法により産生されるＨＧＶ粒子を包含する。
【０２１０】
さらなる局面では、本発明はモザイクポリペプチドを包含する。このようなポリペプチドはＨＧＶの少なくとも２つのエピトープを含み得、ここでポリペプチドは天然のＨＧＶコード配列中のエピトープ間に通常介在するアミノ酸を実質的に欠失する。より詳細な実施態様では、モザイクポリペプチドは固相支持体に接着される。さらに関連する局面では、本発明は上記のモザイクポリペプチドをコードする核酸を包含する。
【０２１１】
他の関連する局面では、本発明は、被験体におけるＨＧＶ感染を検出する方法を包含する。この方法は、上記のように、被験体由来の抗体含有サンプルをモザイクポリペプチドと接触させる工程、および結合した抗体の存在について抗原を試験する工程を包含する。
【０２１２】
さらに関連する局面では、本発明はＨＧＶワクチン組成物を包含する。ワクチン組成物は、１つより多いＨＧＶエピトープを含むモザイクポリペプチドを含む。モザイクポリペプチドは薬学的に受容可能なキャリア中に薬理学的に有効な用量で存在する。
【０２１３】
（Ｂ．ＨＧＶについてのイムノアッセイ）
本発明の方法により得られた抗原についての１つの有用性は、ＨＧＶ肝炎ウイルスに感染した被験体の血清中に存在する抗体の検出（それにより被験体における感染を示す）のための診断試薬としての利用である；例えば、４７０−２０−１抗原、配列番号１４またはその相補物によりコードされる抗原、および完全なウイルス配列のいずれかのストランドの部分によりコードされる抗原。本発明の抗原は、ＨＧＶを検出するために、単独でまたは互いに組み合わせて用いられ得る。本発明の抗原はまた、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＥＶのような他の肝炎因子についての診断アッセイと連結され得る。
【０２１４】
１つの診断形態（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）では、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原（例えば４７０−２０−１抗原）を有する固相試薬と反応する。試薬に抗ＨＧＶ抗体を結合し、洗浄により非結合血清成分を除去した後、試薬をリポーター標識した抗ヒト抗体と反応させ、固相支持体上の結合した抗ＨＧＶ抗体の量に比例してリポーターを試薬に結合させる。試薬を再び洗浄して非結合標識抗体を除去し、そして試薬に会合するリポーターの量を測定する。代表的には、リポーターは適切な蛍光基質または発色基質の存在下で固相をインキュベートすることにより検出される酵素である（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０２１５】
上記アッセイにおける固相表面試薬を、ポリマービーズ、ディップスティック、９６ウエルプレート、またはフィルター材料のような固相支持体材料にタンパク質材料を接着するための公知の技法により調製する。これらの接着法は、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または代表的には遊離アミノ基を介する活性化カルボキシル基、水酸基、またはアルデヒド基のような固相支持体上の化学反応性基へのタンパク質の共有接着を包含する。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが１つまたは複数のビオチン化抗原と組み合わせて用いられ得る。
【０２１６】
本発明の形成部分はまた、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットである。キットは一般的には、表面結合組換えＨＧＶ抗原（例えば、上記の４７０−２０−１抗原）を有する支持体、および表面結合抗ＨＧＶ抗原抗体を検出するためのリポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０２１７】
均一アッセイとして公知の第二の診断形態では、固相支持体に結合する抗体は、培地中で直接検出され得る反応培地中でいくつかの変化を生じる。本明細書中に提示した公知の一般的なタイプの均一アッセイは、（ａ）スピン標識されたリポーター（ここで抗原に結合する抗体は報告された移動度における変化（スピン分裂ピークの拡大）により検出される）、（ｂ）蛍光リポーター（ここで結合は蛍光収率または蛍光偏光における変化により検出される）、（ｃ）酵素リポーター（ここで抗体結合は酵素／基質相互作用を生じる）、および（ｄ）リポソーム結合リポーター（ここで結合はリポソーム溶解およびカプセル化されたリポーターの放出を引き起こす）を包含する。本発明のタンパク質抗原へのこれらの方法の適応は、均一アッセイ試薬の調製のための従来の方法に従う。
【０２１８】
上記各々のアッセイにおいて、アッセイ方法は、試験個体由来の血清をタンパク質抗原と反応させ、そして結合抗体の存在について抗原を試験することを包含する。試験は、第一の方法におけるように、標識抗ヒト抗体を（例えば、急性期、慢性期、または回復期からの）試験される抗体へ接着する工程、および固相支持体へ結合したリポーター量を測定する工程を含み得るか、または第二の方法におけるように均一アッセイ試薬における抗体結合の効果を観察する工程を包含し得る。
【０２１９】
第三の診断形態は、ＨＧＶ特異抗原を検出し得るＨＧＶ抗体の使用を包含する。ＨＧＶ抗原は、例えば抗原捕捉アッセイを用いて検出され得、ここで候補となる血清サンプルに存在するＨＧＶ抗原はＨＧＶ特異モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応する。抗体は固相基質へ結合し、次いで抗原は第二の異なる標識抗ＨＧＶ抗体により検出される。抗体は標準方法により本発明のペプチドを利用して調製され得る。さらに、実質的に単離された抗体を（反応性に影響し得る血清タンパク質を本質的に含まない）を生成し得る（例えば、アフィニティー精製（Ｈａｒｌｏｗら））。
【０２２０】
（Ｃ．ＨＧＶについてのハイブリダイゼーションアッセイ）
本発明の方法により得られる核酸配列についての１つの有用性は、血清中に存在するＨＧＶ配列（それにより個体における感染を示す）についての診断剤としての使用である。本発明のコード配列（特にクローン４７０−２０−１および配列番号１４）由来のプライマーおよび／またはプローブは、ＨＧＶを検出するために単独で、または互いに組み合わせて用いられ得る。
【０２２１】
１つの診断形態では、試験血清を、例えば４７０−２０−１配列由来のプライマーを用いるＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ条件下で反応させる。増幅反応で用いた血清におけるＨＧＶの存在は、プライマーにより標的された配列の特異的増幅により検出され得る。実施例４は、異なるソースの材料をスクリーニングするために、本発明のクローン由来のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖増幅反応の使用を記載する。これらの増幅反応の結果は、種々の異なるソースのテンプレートを用いる増幅反応により相同配列を検出するために、本発明のクローン（例えば、４７０−２０−１）由来のプライマーの能力を示す。実施例４における増幅反応は、テンプレート材料としての血清から直接得られる核酸の使用を含んでいた。
【０２２２】
あるいは、プローブは本発明のＨＧＶ配列由来であり得る。次いで、これらのプローブは標識され、そして試験血清または組織サンプルから得られる核酸に対するハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。プローブは、種々のリポーター分子を用いて標識され得、従って検出され得る：例えば、放射性アイソトープ標識および化学発光検出リポーター系（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）に。
【０２２３】
ポリメラーゼ連鎖反応、自己維持配列複製技法［「３ＳＲ」（Ｇｕａｔｅｌｌｉら；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、１９９０）、「ＮＡＳＢＡ」（ＶａｎＧｅｍｅｎら）としても公知である］、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ）、鎖置換増幅［「ＳＤＡ」（Ｗａｌｋｅｒ）］、および他の技法を包含する標的増幅法が、標的配列のコピー数を増加させる。シグナル増幅技法は、分枝鎖ＤＮＡプローブ（ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ；Ｕｒｄｅａ；Ｕｒｄｅａら）およびＱ−βレプリカーゼ法（Ｃａｈｉｌｌら；Ｌｏｍｅｌｌら）により例示され、まず特異的分子プローブを結合し、次いでこのプローブの全部または一部を複製するかまたはまたはいくつかの他の方法でプローブシグナルを増幅する。
【０２２４】
本発明で開示された特異的な核酸配列、あるいは同じまたは類似の（関連した）ウイルスゲノム中の隣接配列の検出について、増幅方法および検出方法は、ＰＣＲによる増幅の代替方法として用いられ得る。多くのこのような技法は、核酸診断の分野で公知である（Ｔｈｅ  １９９２  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（４）：７０５（１９９３））。
【０２２５】
（１．自己維持配列複製）
自己維持配列複製（３ＳＲ）技法は、等温であるが、ＰＣＲと類似の規模（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）までの増幅を生じる。温度サイクルで推し進められるＰＣＲよりむしろ、３ＳＲは、ａ）逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成、ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ鎖分解、およびｃ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の協同の３つの酵素反応として作用する。
【０２２６】
全部の反応配列は等温（代表的には４２℃）で生ずるので、高価な温度サイクル装置は必要ではない。加熱、有機溶媒、または他のメカニズムを経由する２本鎖の変性の不在下で、１本鎖テンプレートのみ（すなわち、主にＲＮＡ）が増幅される。
【０２２７】
３ＳＲ増幅における使用のための適切なプライマーは、当業者により本発明のウイルス配列から選択され得る。例えば、ウイルス配列の３ＳＲ技法による等温増幅のために、プライマー４７０−２０−１−７７Ｆ（配列番号９）がＴ７プロモーター配列およびオリゴヌクレオチドの５’末端に好適なＴ７転写開始部位の添加により改変される。この改変により適切な３ＳＲプライマーＴ７−４７０−２０−１−７７Ｆ（配列番号９）が得られる。プライマー４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）は、改変なしまたはＴ７プロモーターなしのいずれかでこれらの反応に用いられ得る。
【０２２８】
ＰＮＦ２１６１から抽出されたＲＮＡを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１（室温で）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  塩酸スペルミジン、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰ、７ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ、ならびに０．１５ｕＭの各プライマーを含む１００ｕｌの反応液中のＡＭＶ逆転写酵素（３０Ｕ）、ＲＮａｓｅＨ（３Ｕ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（１００Ｕ）とインキュベートする。増幅は４２℃で１−２時間のインキュベーションの間に行われる。
【０２２９】
最初に、プライマーＴ７−４７０−２０−１−７７Ｆは標的ＲＮＡにアニーリングし、そしてＡＭＶ逆転写酵素により伸長し、開始ＲＮＡ鎖に相補的なｃＤＮＡを形成する。ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ鎖の分解に次いで、逆転写酵素は第二鎖ＤＮＡの合成を触媒し、Ｔ７プロモーター配列（２本鎖）を含む２本鎖テンプレートを生じる。ＲＮＡ転写により、１本鎖ＲＮＡを生成する。次いでこのＲＮＡをさらなる増幅ラウンドのためのサイクルに再導入し、最終的に、高濃度のＲＮＡ産物のプールを得る。この産物は主に、かなり少量のｃＤＮＡとともにＴ７プロモーターを含むプライマー（Ｔ７−４７０−２０−１−７７Ｆ）と同じ鎖の１本鎖ＲＮＡである。
【０２３０】
あるいは、他のプライマー（４７０−２０−１−２１１Ｒ）はＴ７プロモーターを含み得るかまたは両プライマーがプロモーターを含み得、反応産物としてＲＮＡの両鎖を生成する。３ＳＲ反応の産物は、ＲＮＡ分析についての標準的技法（例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮＡスロットまたはドットブロット、ＲＮＡ染色色素を用いた直接ゲル電気泳動）により検出、特徴付け、または定量され得る。さらに、これらの産物はビオチン−アビジンアフィニティ相互作用または核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを使用する方法により検出され得る。
【０２３１】
３ＳＲ産物の迅速および特異的な分析のための１つの技法では、放射標識されたオリゴヌクレオチド４７０−２０−１−１５２Ｒ（配列番号２１）への産物の溶液ハイブリダイゼーションの後で、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。このアッセイ（ゲル移動度シフトタイプのアッセイ）により、ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドに対応するバンドより遅動性のバンドとして特異的プローブ産物ハイブリッドを検出する。
【０２３２】
（２．リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））
他の検出系の例として、ＨＧＶ配列はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）プライマーの設計の基礎を形成し得る。ＬＣＲは、ニックを閉鎖するＤＮＡリガーゼ活性を使用し、隣接する５’リン酸（「ドナー」オリゴ）および３’ヒドロキシル（「アクセプター」オリゴ）終末を有する２つのすぐ隣りのオリゴヌクレオチドを結合する。テンプレートに依存する方法で十分に相補的な末端部のみを結合するＤＮＡリガーゼの特性は、連結される末端が標的鎖に対する配列において完全にマッチしなければ連結が起こらない点で、高度の特異性をもたらす。
【０２３３】
プライマーと標的核酸との間の単一塩基のミスマッチの識別に対する特異性に関していくつかの利点とともにＰＣＲに代わる方法として、ＬＣＲが、ＨＧＶ配列に相同性を有するウイルスの「タイプ」株を検出するために用いられ得る。これらの技法は、このような塩基変化が薬剤耐性を与えることが知られている場合（例えば、ＬａｒｄｅｒおよびＫｅｍｐ；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、１９９１）、特異的な変異の存在を評価するために適切である。
【０２３４】
テンプレートに相補的なドナーおよびアクセプターオリゴヌクレオチドならびにドナーおよびアクセプターに相補的なオリゴヌクレオチドの存在下では、ＬＣＲによる指数関数的増幅が可能である。この実施態様では、連結の各ラウンドはサイクル反応における次のラウンドのための追加のテンプレートを生成する。
【０２３５】
例えば、プライマー４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）、隣接オリゴヌクレオチド（Ｂ、配列番号２２）、ならびに同種のオリゴ（２１１Ｒ’、配列番号２３、およびＢ’、配列番号２４）が、本発明の配列のＬＣＲ増幅を行うために用いられ得る。逆転写をまず標準方法により行い、ｃＤＮＡを生成し、ｃＤＮＡを、次いで、２５ｕｌ反応物中０．１−１μＭの４つの各ＬＣＲプライマー、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３（室温）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５ユニットのＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、または熱安定性ＤＮＡリガーゼの他の市販供給者）を含む反応物中で増幅する。
【０２３６】
熱サイクルを、９４℃で１分３０秒間；９４℃で１分間、６５℃で２分間、２５−４０サイクル繰り返して行う。生成物合成の特異性は、３’末端の位置でのプライマーテンプレートマッチに依存する。生成物はポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでエチジウムブロマイド染色により検出される；あるいは、アクセプターオリゴの１つ（２１１Ｒ’またはＢ）が、ゲル電気泳動に続くオートラジオグラフィによる可視化のために５’放射標識される。
【０２３７】
あるいは、ドナーオリゴは、特異的に結合し得る部分（例えば、ビオチン）で３’末端標識され、そしてアクセプターは、固相捕捉および検出のために特異的に検出可能な基（例えば、蛍光色素）で５’標識される。
【０２３８】
（３．増幅されたＤＮＡの分析のための方法）
（多くの技法が増幅されたＤＮＡの分析のために記載されている。いくつかのこのような技法、例えば高速および高分解能のＨＰＬＣ技法（ＫａｔｚおよびＤｏｎｇ）は、ゲル電気泳動が実施不可能である高処理量用途に有利である。しかし、一般に、感染性疾患生物について核酸プローブを用いてスクリーニングする方法は、病原体検出について必須の特異性を確実するために別個の増幅後ハイブリダイゼーション工程を含む。
【０２３９】
１つのこのような検出実施態様は、アフィニティに基づくハイブリッド捕捉技法（Ｈｏｌｏｄｎｉｙら）である。この実施態様では、ＰＣＲは１つのビオチン化プライマーを用いて行われる。増幅に続いて、２本鎖生成物を変性し、次いで取り込まれたビオチン化プライマーを有する鎖に相補的なペルオキシダーゼ標識されたプローブにハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズ生成物を、緩衝液中でインキュベートし、それはアビジン（またはストレプトアビジン）でコートされた表面（例えば、メンブランフィルター、マイクロウエル、ラテックス、またはパラマグネットビーズ）と接触する。
【０２４０】
この方法により分析されるべきＰＣＲ産物容量に接触するコートされた固相の量は、本質的に全ての遊離のビオチン化プライマーおよびかなり低濃度のビオチン化ＰＣＲ産物を捕捉するに十分なビオチン結合部位を含まなければならない。固相を３〜４回洗浄した後、結合したハイブリダイズ生成物を過酸化水素含有クエン酸緩衝液中のｏ−フェニレンジアミンとインキュベートすることにより検出する。
【０２４１】
あるいは、捕捉はプローブをコートした表面により媒介され得、次いでビオチン化プライマーおよびアビジンリポーター酵素結合体を介するアフィニティーに基づく検出を行い得る（Ｗｈｅｔｓｅｌｌら）。
【０２４２】
（４．追加の方法）
本発明のウイルス配列はまた、分枝鎖ＤＮＡプローブを用いる検出へのシグナル増幅アプローチの基礎を形成し得る。分枝鎖プローブ（ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ；Ｕｒｄｅａ）は、まれなＲＮＡおよびＤＮＡ配列の検出および定量について記載している（Ｕｒｄｅａら）。この方法では、オリゴヌクレオチドプローブ（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または核酸アナログ）が、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な配列を用いて合成される。このプローブはまた、特有の分枝配列または標的ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的ではない配列を含む。
【０２４３】
この特有の配列は、分枝した第２の検出プローブのハイブリダイゼーションのための標的を構成し、その各々は第３のプローブのための標的として提供される１つまたはそれ以上の他の特有の配列を含む。シグナル増幅経路における各分枝ポイントで、異なる特有の配列が第２、第３などの検出プローブのハイブリダイゼーションを指揮する。一連の最後のプローブは、代表的には、検出に有用な酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）に連結される。プライマーの連続的なハイブリダイゼーションは、結局、高度に分枝した構造を構築し、その腕（ａｒｍ）は酵素結合プローブで終結する。
【０２４４】
酵素的代謝回転は最終増幅を提供し、そして高感度化学発色基質の選択により、例えば、アルカリホスファターゼ標識のための基質として（ＬｕｍｉＰｈｏｓ、Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）は、アッセイあたり当初の標的配列の１０，０００分子またはそれより少ないオーダーで、鋭敏な感度を得る。このような検出方法では、増幅は酵素的メカニズムよりむしろ分子ハイブリダイゼーションにのみ依存し、従って、例えば、ＰＣＲより臨床標本中の阻害物質の作用を受けるおそれははるかに少ない。従って、この検出方法は、アッセイ前の大規模な精製なしで試験サンプル中の核酸遊離についての粗野な技法の使用を可能にする。
【０２４５】
本発明のウイルス配列の高感度検出のための増幅はまた、Ｑ−βレプリカーゼ技法により達成され得る（Ｃａｈｉｌｌら；Ｌｏｍｅｌｌら；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら）。この方法では、特異的プローブが、標的配列に相補的であるように設計される。次いでこのプローブは、標準的な分子クローニング技法によりＱ−βファージ由来の複製可能なＲＮＡの配列中に挿入され得る。レプリコンの特異的領域への挿入はＱ−βレプリカーゼによる複製を妨げない。
【０２４６】
分子ハイブリダイゼーション、および数サイクルの洗浄に続いて、レプリカーゼを添加し、そしてプローブＲＮＡの増幅を確実にする。「可逆的標的捕捉」は、ハイブリダイズしないプローブの複製由来の潜在的なバックグラウンドを減少するための１つの公知の技法である（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら）。増幅されたレプリコンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸アナログプローブを用いる標準的な分子ハイブリダイゼーション技法により検出可能である。
【０２４７】
希薄なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の増幅および検出についてのさらなる方法が文献で公知であり、そして分子的診断学の分野におけるいくつかの用途のためのＰＣＲに好適である。これらの代替技法は、検出、特徴付け（例えば、本明細書中に記載された配列の複数の関連する株として存在する配列多様性、薬剤耐性の遺伝子型変化の特性）、または本発明に開示された配列の定量の基礎を形成し得る。
【０２４８】
また、本発明の一部分を形成するのは、直前に記載された増幅／ハイブリダイゼーションアッセイ法を行うためのアッセイ系またはキットである。このようなキットは一般に、増幅反応に用いられる特異的なプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブのいずれかを含む。
【０２４９】
（Ｄ．治療用途）
（上記のように、本発明のＨＧＶ抗原はワクチン調製において用いられ得る。）
さらに、本発明のポリペプチド抗原に対して生成された抗体は、受動免疫療法または受動免疫予防に用いられ得る。抗体は、抗体の他の治療投与に用いられる抗体に類似の量で投与され得る。例えば、プールしたγグロブリンを、０．０２〜０．１ｍｌ／ｌｂ体重で、狂犬病、麻疹、およびＢ型肝炎のような他のウイルス疾患の初期のインキュベーションの間、感染の確立を妨害するために投与される。従って、ＨＧＶ抗原に反応性の抗体は、感染を処理する宿主の能力を増強するために、単独でまたは他の抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＧＶに感染した宿主に受動的に投与され得る。
【０２５０】
本明細書に開示されたＨＧＶ配列は、ＨＧＶをフラビウイルス科のメンバーとして同定する（上記参照）。フラビウイルス科は３つの属、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）属、ペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属、Ｃ型肝炎ウイルス属に分類される（Ｆｒａｎｃｋｉら）。全てのフラビウイルス科は、３０００〜４０００アミノ酸の単一の長いポリペプチドをコードする９．０〜１２ｋｂ長のポジティブストランドＲＮＡゲノムを有する。このポリペプチドは、ウイルスキャプシドタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、および最小限５つの非構造タンパク質（ＮＳ）を含む、約１０のタンパク質にタンパク質分解的に切断される。非構造タンパク質は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ（ＮＳ３）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５）を含む。フラビウイルス科のＮＳ３タンパク質は、ウイルスポリペプチドのタンパク質分解的切断に必要である。ＮＳ５タンパク質はウイルスゲノムの複製に必要である（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０ａ）。
【０２５１】
さらに、いくつかの細胞タンパク質はフラビウイルス科の複製に関連すると同定されている。例えば、細胞性シグナルペプチダーゼ酵素は、いくつかの切断部位でウイルスポリペプチドを切断し、ウイルスプロテアーゼの発現を可能にするために必要であり得る（Ｈｉｊｉｋａｔａら）。
【０２５２】
これらのタンパク質がフラビウイルス複製に必要な機能を遂行することを妨害するインヒビターもまた、ＨＧＶの感染の処置に治療的価値を有し得る。最後に、サイトカインあるいは抗ウイルス活性を有するおよび／またはヒト免疫系を調節することが知られている他のポリペプチドが、ＨＧＶ感染の処置に有効であり得る。
【０２５３】
フラビウイルス科のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害することが知られている１つの化合物は、類推によりＨＧＶのＮＳ５タンパク質の活性を阻害すると予測され得、ヌクレオチドアナログ１−Ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１−２，４−トリアゾール、３−カルボキシアミドであり、またリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）として知られている（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら）。リバビリンの作用方法は、細胞内グアニンプールの枯渇およびウイルスＲＮＡのキャッピングの妨害を含むと考えられている（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら）。
【０２５４】
ＨＣＶで感染した個体において、ウイルス力価およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ・・・肝機能障害についての指標酵素）の血清レベルの有意な低減が、リバビリンが投与された間に観察された（Ｒｅｉｃｈａｒｄら；Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅら、１９９２）。リバビリンはフラビウイルス科感染を処置する広い効力を有するようであり、従って、有益な結果がＨＧＶ由来肝臓疾患を患う個体へのリバビリンの投与後に予測される。
【０２５５】
フラビウイルス科感染を処置するために有効であることが知られている他のクラスの化合物は、サイトカイン類、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ（Ｂａｒｏｎら；Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ）を含む。インターフェロンは、（ｉ）ウイルスＲＮＡの複製および翻訳を妨害する細胞タンパク質の発現を誘導すること、および（ｉｉ）ヒト細胞免疫系の成分の活性化の両方により抗ウイルス薬として作用すると考えられている（Ｂａｒｏｎら）。これらのインターフェロン類は、ＨＢＶ、ＨＤＶ、およびＨＣＶの感染を含むウイルス感染の治療に広範な用途を有する（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ；Ｆａｒｃｉら）。特に、複数の研究が、インターフェロン（単独または他の抗ウイルス療法と組み合わせてのいすれか）がＣ型肝炎ウイルスの感染を処置するために有効であることを示している（Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅら、１９８９；ＫａＫｕｍｕら）。ＨＧＶの明かな肝親和性の性質およびフラビウイルス科中のその分類の両方のため、ＨＧＶ感染は類似のインターフェロン療法に応答すると予測され得る。
【０２５６】
強力な抗ウイルス活性を有するさらに他のクラスの化合物は、ウイルスプロテアーゼのインヒビターである（Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈら）。全てのフラビウイルス科は、非構造領域における複数の部位でゲノムポリペプチドの複数の部位を切断するために必要であるキモトリプシン様セリンプロテアーゼをコードする。このプロテアーゼの触媒部位を構成するアミノ酸残基はよく記載されており、そしてヒスチジン、アスパラギン酸、およびセリン残基を含む（Ｇｒａｋｏｕｉら）。フラビウイルス（黄熱ウイルス）のさらなる研究は、活性部位のセリン残基の変異がウイルス複製を阻害することを示した（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０ｂ）。
【０２５７】
ＨＧＶ  ＮＳ３タンパク質のインヒビターは、酵素切断の遷移状態を模倣するように設計され得る。あるいは、このようなインヒビターは、先に合成された化合物の大量スクリーニングにより単離され得る。推定のＨＧＶ  ＮＳ３プロテアーゼインヒビターの活性は、フラビウイルス調査において広く用いられているインビトロ転写／翻訳系の使用により測定され得る（Ｈｉｊｉｋａｔａら；Ｇｒａｋｏｕｉら）。
【０２５８】
あるいは、ＨＧＶゲノムは、バキュロウイルスまたはワクシニアのような真核生物のタンパク質発現のための適切なベクター中にクローニングされ得、そしてこの化合物の効力は組織培養系で測定され得る（Ｇｒａｋｏｕｉら）。同様のアプローチが、ＨＩＶプロテアーゼの強力なインヒビターを得るために首尾良く用いられている（Ｖａｃｃａら；Ｒｏｂｅｒｔｓら）。
【０２５９】
ＨＧＶ感染により引き起こされた疾患を治療する他のアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＴｏｎｋｉｎｓｏｎおよびＳｔｅｉｎ）または本発明で開示されたＨＧＶの配列の一部分をコードするオリゴヌクレオチドアナログの合成による。全てのフラビウイルス科について真実であるように、ＨＧＶゲノムは９〜１２ｋｂサイズのポジティブストランドＲＮＡ分子であることが予測され得る。ウイルスゲノムの１本鎖の性質がアンチセンスオリゴヌクレオチドに対してＨＧＶを鋭敏な感受性にする。ウイルス複製を阻害するために用いられ得る可能な標的配列には、ＨＧＶの５’非翻訳領域、ＨＧＶのリボソーム結合部位、またはＨＧＶゲノムの翻訳を妨害し得る他の配列が含まれる。
【０２６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、市販の合成器を用いて合成され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ切断に耐える利点を有するホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）骨格を用いて合成される（Ｍａｒｓｈａｌｌ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）。さらに他のオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、非荷電またはアミド型骨格（Ｅｇｈｏｌｍら）を有するアナログ）が用いられ得る。これらのオリゴヌクレオチドは市販されており（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、そしてそれらの荷電の欠落が、代表的には荷電高分子の通過に抵抗する生物学的な膜をそれらが横断し得るという点で有利である。
【０２６１】
アンチセンス用途のためのオリゴヌクレオチド（またはそのアナログ）は、代表的には、ＨＧＶゲノム内の標的配列へのハイブリダイゼーションを促進するために８ヌクレオチド長より大きい。例えばＤＮＡオリゴマーのウイルスＲＮＡ標的配列へのハイブリダイゼーションに際し、ハイブリダイゼーション複合体はＲＮａｓｅＨのような細胞酵素により分解され得る。次いでＨＧＶテンプレートの減少がＨＧＶ関連疾患の重篤度を小さくする。
【０２６２】
上記の治療方法の有用性および効力は、インビトロで上記の細胞系を用いて、およびインビボで上記の動物モデル系を用いて評価され得る。
【０２６３】
以下の実施例は例示であり、いかなる方法においても本発明を制限する意図はない。
【０２６４】
（材料および方法）
合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーを市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器を用いて調製した。あるいは、注文設計された合成オリゴヌクレオチドが市販供給者から購入され得る。
【０２６５】
標準的な分子生物学およびクローニング技法は、本質的にはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＭａｎｉａｔｉｓらに以前に記載されたように行った。
【０２６６】
免疫反応性タンパク質抗原のスクリーニングおよび検出に抗血清および／または抗体を用いることに関連する通常の操作は、本質的には記載されたように行った（Ｈａｒｌｏｗら）。同様に、抗ウイルス抗体の検出のためのＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットアッセイを、それらの製造者（Ａｂｂｏｔｔ，Ｎ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に記載されたように、または当該技術分野で公知の標準的技法（Ｈａｒｌｏｗら）を用いてのいずれかで行った。
【実施例】
【０２６７】
（実施例１  ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡライブラリーの構築）
（Ａ．血清由来ＲＮＡの単離）
１ミリリットルの非希釈ＰＮＦ２１６１血清を、ＰＥＧ（分子量６，０００）を８％になるように添加することにより沈殿させ、そしてミクロ遠心器において４℃で１５分間１２Ｋで遠心分離した。本質的にＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉにより記載されるように得られた血清ペレットからＲＮＡを抽出した。
【０２６８】
ペレットを４Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、０．１８％２−メルカプトエタノール、および０．５％サルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）を含有する溶液で処理した。処理したペレットを酸性フェノールクロロホルムで数回抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈殿させた。この溶液を約１０分間−７０℃で保持し、次いで４℃で１０分間ミクロ遠心器で回転させた。得られたペレットを１００μｌのＤＥＰＣ処理（ジエチルピロカーボネート）水中に再懸濁させ、そしてこの溶液に１０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）、２容量の１００％エタノールおよび１容量の１００％イソプロパノールを添加した。
【０２６９】
この溶液を−７０℃で少なくとも１０分間保持した。５℃で１５分間、１２，０００×ｇでのミクロ遠心器における遠心分離によりＲＮＡペレットを回収した。このペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そして減圧下で乾燥した。
【０２７０】
（Ｂ．ｃＤＮＡの合成（ｉ）第１鎖の合成）
ｃＤＮＡ分子の合成を以下のように行った。Ｇｕｂｌｅｒらの方法に従い、ランダムヌクレオチドヘキサマープライマー（ｃＤＮＡ合成キット、ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮまたはＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて上記のＲＮＡ調製物をｃＤＮＡに転写した。
【０２７１】
第２鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを混合物に添加してｃＤＮＡ分子の平滑末端数を最大にした。反応混合物を室温で１０分間インキュベートした。この反応混合物をフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムイソアミルアルコールで抽出した。
【０２７２】
ｃＤＮＡを２容量の１００％エタノールの添加により沈殿させ、そして−７０℃で１５分間冷却した。遠心分離によりｃＤＮＡを採集し、７０％エタノールでペレットを洗浄し、そして減圧下で乾燥した。
【０２７３】
（Ｃ．２本鎖ｃＤＮＡ分子の増幅）
ｃＤＮＡペレットを１２μｌの蒸留水に再懸濁させた。再懸濁したｃＤＮＡ分子に以下の成分を添加した：５μｌのリン酸化リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ  ＡＢ、配列番号１および配列番号２からなる２本鎖リンカーであり、ここで配列番号２は、配列番号１に対して部分的に相補的な配列として、配列番号１に対して３’→５’方向にある）、２μｌの１０×ライゲーション緩衝液（０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ＝７．６、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）および１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．３〜０．６ワイス単位（Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔ））である。代表的には、ｃＤＮＡとリンカーとは１：１００の割合で混合した。反応物を１４℃で一晩インキュベートした。次の朝、反応物を７０℃  で３分間インキュベートして、リガーゼを不活性化した。
【０２７４】
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＫＣｌを含有する１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．３（緩衝液Ａ）に、約１μｌのリンカー連結−ｃＤＮＡ調製物、２μＭの配列番号１で示される配列を有するプライマー、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２．５ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を添加した。この反応混合物を変性のために９４℃で３０秒間加熱し、プライマーのアニーリングのために５０℃で３０秒間冷却し、次いでＴａｑポリメラーゼによるプライマー伸長を可能にするために７２℃で０．５〜３分間加熱した。連続的な加熱、冷却、およびポリメラーゼ反応を含む増幅反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ熱サイクラー（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら、；Ｒｅｙｅｓら、１９９１；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いてさらに２５回〜４０回反復した。
【０２７５】
増幅反応後、次いで溶液をフェノール／クロロホルム、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、そして２容量のエタノールで沈殿させた。得られた増幅ｃＤＮＡペレットを２０μｌのＴＥ（ｐＨ＝７．５）中に再懸濁させた。
【０２７６】
（Ｄ．ｃＤＮＡのλベクターへのクローニング）
ｃＤＮＡの構築に使用されたリンカーは、λｇｔ１１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）への増幅ｃＤＮＡの直接挿入を可能にするＥｃｏＲＩ部位を有していた。λベクターを製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入したが、これらは既にＥｃｏＲＩで消化され、そしてアルカリホスファターゼで処理されて５’リン酸が除去され、そしてベクターの自己ライゲーションが防止されていた。
【０２７７】
ＥｃｏＲＩ消化ｃＤＮＡ調製物をλｇｔ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。ライゲーション反応の条件は以下の通りである：１μｌのベクターＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、０．５ｍｇ／ｍｌ）；０．５μｌまたは３μｌのＰＣＲ増幅挿入ｃＤＮＡ；０．５μｌの１０×ライゲーション緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．８；０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２；０．２Ｍ  ＤＴＴ；１０ｍＭ  ＡＴＰ；０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（０．３〜０．６ワイス単位）であり、蒸留水で最終反応容量を５μＬにした。
【０２７８】
ライゲーション反応物を１４℃で一晩（１２〜１８時間）インキュベートした。連結されたｃＤＮＡをλＤＮＡパッケージングシステム（「ＧＩＧＡＰＡＫ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いる標準的な手順によりパッケージングし、次いで種々の希釈度でプレーティングして、力価を測定した。標準的なＸ−ｇａｌブルー／ホワイトアッセイを用いてライブラリーの組換え頻度を測定した（Ｍｉｌｌｅｒ；Ｍａｎｉａｔｉｓら）。
【０２７９】
各ライブラリーの組換えのパーセントはまた、以下のように測定した。多くのランダムなクローンを選択し、そして対応するファージＤＮＡを単離した。次いで、テンプレートとして単離したファージＤＮＡ、およびプライマーとしてｃＤＮＡ分子のＥｃｏＲＩ挿入部位に隣接するλ配列由来のλＤＮＡ配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら）を行った。挿入物の存在または非存在は、ポリメラーゼ連鎖反応生成物のゲル分析から明らかであった。
【０２８０】
血清サンプルＰＮＦ２１６１から作製したｃＤＮＡ挿入ファージライブラリーは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２に寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ  ７５２６８（ＰＮＦ  ２１６１  ｃＤＮＡ供給源）が与えられている。
【０２８１】
（実施例２  組換えライブラリーのイムノスクリーニング）
実施例１で作製したλｇｔ１１ライブラリーを、ライブラリーを作製したＰＮＦ２１６１血清により認識可能な抗原の産生についてイムノスクリーニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌プレーティング株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＭ３９２を用いてプラーク形成のためにファージをプレート化した。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０Ｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用し得る。
【０２８２】
λｇｔ１１クローンにより発現される融合タンパク質を、本質的にＡｕｓｕｂｅｌらにより記載される血清抗体を用いてスクリーニングした。
【０２８３】
各ライブラリーを、１５０ｍｍプレートあたり約２×１０４個  のファージでプレート化した。プレートをニトロセルロースフィルターで一晩覆った。このフィルターをＴＢＳ（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、ＡＩＢ（１％ゼラチンを有するＴＢＳ緩衝液）でブロックし、そしてＡＩＢ中で１００倍に希釈した一次抗体とインキュベートした。
【０２８４】
ＴＢＳを用いて洗浄した後、このフィルターを二次抗体であるアルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。反応性のプラークを、基質（例えば、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）を用いて、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム塩（Ｓｉｇｍａ））を用いて発色させた。一次スクリーニングの陽性な領域を再プレート化し、そして純粋なプラークが得られるまでイムノスクリーニングした。
【０２８５】
（実施例３  ＰＮＦ  ２１６１ライブラリーのスクリーニング）
λｇｔ１１中のＰＮＦ２１６１のｃＤＮＡライブラリーを、実施例２に記載されるように、ＰＮＦ２１６１血清を用いてスクリーニングした。スクリーニングの結果を表１に示す。
【０２８６】
【表１】
2006115845.tif 000009
上記のスクリーニングにより単離されたクローンの１つ（ＰＮＦ  ２１６１クローン４７０−２０−１、配列番号３；βガラクトシダーゼのインフレーム融合翻訳配列、配列番号４）を用いて実施例６に記載のように拡大クロー  ンを作製した。クローン４７０−２０−１の核酸配列は配列番号３として表される（タンパク質配列配列番号４）。ＳＩＳＰＡクローニングリンカーを用いずに  単離された核酸配列は配列番号１９として表される（タンパク質配列番号２０）。
【０２８７】
（実施例４  免疫反応性４７０−２０−１クローンの特徴付け）
（Ａ．  免疫反応性クローンのサザンブロット分析）
免疫反応性クローンの挿入物を、以下のコントロールＤＮＡ供給源にハイブリダイズするそれらの能力についてスクリーニングした：正常なヒト末梢血液リンパ球（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｃａｌｆｏｒｎｉａから購入）ＤＮＡ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＭ３９２ゲノムＤＮＡ（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。１０マイクログラムのヒトリンパ球ＤＮＡおよび２マイクログラムのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。制限消化産物を電気泳動によりアガロースゲルで分画し（Ａｕｓｕｂｅｌら）、そして製造業者の指示に従い、ナイロンまたはニトロセルロース膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に移した。
【０２８８】
免疫反応性クローン由来のプローブを以下の様に調製した。ｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩクローニング部位に隣接するλｇｔ１１配列に対応するプライマーを用いて各クローンを増幅した。各免疫反応性クローンをテンプレートとして用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅を行った。得られた増幅産物をＥｃｏＲＩで消化し、増幅フラグメントをゲル精製し、そしてゲルから溶出した（Ａｕｓｕｂｅｌら）。次いで、得られた免疫反応性クローン由来の増幅フラグメントを、３２Ｐ−ｄＮＴＰを用いる市販のキット（ＢＭＢ）を使用してランダムプライム標識した。
【０２８９】
次いで、ランダムプライムされたプローブを、上記で調製したナイロン膜にハイブリダイズさせて、挿入配列のコントロールＤＮＡに対するハイブリダイゼーションについて試験した。４７０−２０−１挿入物は、いずれのコントロールＤＮＡともハイブリダイズしなかった。
【０２９０】
陽性のハイブリダイゼーションコントロールとして、ヒトＣ−κ遺伝子フラグメント（Ｈｉｅｔｅｒ）由来のプローブをヒトＤＮＡに対する単一遺伝子コピーコントロールとして使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡに対しては、Ｅ．ｃｏｌｉのポリメラーゼ遺伝子フラグメントを同様に使用した。
【０２９１】
（Ｂ．ゲノムＰＣＲ）
ライブラリーの構築の間に偶然クローニングされ得るいくつかのゲノムＤＮＡに関する外因性を確認し、次いでクローニング供給源および関連の標本材料におけるクローニングされた配列の存在を試験するためにまずＰＣＲ検出を行った。ＳＩＳＰＡ増幅核酸および一次供給源から抽出された核酸、および関連の供給源材料から抽出した核酸（例えば、動物継代研究由来）を含む、いくつかの異なるタイプの標本を試験した。
【０２９２】
用語「ゲノムＰＣＲ」は、相当する生物由来のゲノムＤＮＡにおける特定の配列の存在について試験することをいう。例えば、マイスタックス由来クローンについてのゲノムＰＣＲは以下のようなゲノムＤＮＡを包含し得る：１．ヒトＤＮＡ（１μｇ／ｒｘｎ．）  ２．マイスタックスＤＮＡ（０．１〜１μｇ／ｒｘｎ．）  ３．Ｅ．ｃｏｌｉ（１０〜１００ｎｇ／ｒｘｎ．）  ４．酵母（１０〜１００ｎｇ／ｒｘｎ．）
ヒトＤＮＡおよびマイスタックスＤＮＡを、因子についての直接かつ究極の供給源として試験する。市販の酵素調製物の常習的な混入物として、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡが試験された。遍在動物として酵母もまた試験され、そのＤＮＡが試薬を汚染し得、そしてそれ故クローニングされる。
【０２９３】
さらに、陰性コントロール（すなわち緩衝液または水のみ）および約１０５細胞／ｒｘｎ．を有する陽性コントロールもまた増幅する。
【０２９４】
増幅条件は、個々の配列について決定され得るように変化するが、以下の標準的なＰＣＲプロトコルに厳密に従う：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｕＭ  の各プライマー、それぞれ２００ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、ならびに３００μＭ  ｄＵＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１００ｕｌの反応物あたり０．２ユニットのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含有する反応物中でＰＣＲを行った。サイクルは９４℃で少なくとも１分間、続いて変性（９２℃〜９４℃、１５秒間）、アニーリング（５５℃〜５６℃、３０秒間）、および伸長（７２℃、３０秒）を３０〜４０回反復した。増幅ＤＮＡの存在しないように維持された特別に指定された実験室でＰＣＲ試薬を合わせ、そして増幅反応物を構成した。
【０２９５】
増幅配列による汚染およびそれによる「偽陽性」による試験の弱体化に対するさらなる防御として、増幅配列を生化学的に天然ＤＮＡと区別可能にするために、ｄＵＴＰをＴＴＰと置き換えてＰＣＲを行った。任意の汚染ＰＣＲ産物を酵素的に増幅不可能にするために、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ酵素を全てのゲノムＰＣＲ反応に含ませた。熱サイクルの終わりに際して、反応物を７２℃に保持して、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの再性を防ぎ、かつ増幅Ｕ−含有配列の分解の可能性を防いだ。
【０２９６】
最大の感度および特異性のためには異なる増幅条件を理想的には必要とする種々の配列の増幅のために、上記の一般的なプロトコルをさらに強力にするめに、標準的な技法を用いて（「ＡＭＰＬＩＷＡＸ」Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；あるいは、手動技法を用いた）「ホットスタートＰＣＲ」を行った。
【０２９７】
２つのＰＣＲプライマー配列の内部に位置し、そしてプライマーとの重複を有さないかまたは最小限の重複を有する特定のオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションにより、増幅ＤＮＡの検出を行った。いくつかの場合では、臭化エチジウム蛍光を用いて電気泳動されたＰＣＲ産物の直接可視化を行うが、特異的な増幅産物と非特異的な増幅産物との間の識別を確実にするのを助けるために、各々の場合で、プローブハイブリダイゼーションを行った。溶液中の放射標識プローブへのハイブリダイゼーションに続いて、８〜１５％のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（増幅配列のサイズに対して適切なように）およびオートラジオグラフィーを行った。
【０２９８】
クローン４７０−２０−１を、ゲノムＰＣＲによりヒトＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ、および酵母ＤＮＡに対して試験した。陰性コントロール反応物および試験したいずれのゲノムＤＮＡにおいても特異的配列は検出されず、そして反応あたり１０５コピーのＤＮＡが容易に検出可能なシグナルを生じた。この感度（すなわち、１０５／反応）が１μｇの総ＤＮＡを含有する反応物における単一コピーヒト配列の検出に適切であり、約１．５×１０５細胞由来のＤＮＡであることを表す。
【０２９９】
（Ｃ．  直接血清ＰＣＲ）
血清または他のクローニング供給源または関連する供給源材料を、選択したクローンニング配列由来のプライマーを用いるＰＣＲにより直接試験した。これらの実験において、ＨＧＶウイルス粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて血清から直接沈殿させるか、またはＰＮＦおよび特定の他の血清の場合は、超遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡの精製のために、ペレット化した材料をグアニジニウムチオシアネートに溶解させ、そして酸性グアニジニウムフェノール技法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら）により抽出した。
【０３００】
あるいは、市販の試薬（例えば、「ＴＲＩＲＥＡＧＥＮＴ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）または「ＴＲＩＺＯＬ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の使用により実施および補充される本方法の改変、ならびに関連のプロトコルを用いてＲＮＡを単離した。さらに、「ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ」試薬およびプロトコル（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の使用により、血清またはウイルスを含有する他の液体から、予めウイルス粒子を濃縮またはペレット化することなく、ＰＣＲ分析に適切なＲＮＡを直接単離した。
【０３０１】
単離したＤＮＡをＰＣＲのためにテンプレートとして直接用いた。ＲＮＡを逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて逆転写し、次いでｃＤＮＡ産物を次のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。
【０３０２】
４７０−２０−１の場合、２０μｌ〜５０μｌのＰＮＦ血清由来の核酸を、各ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応中へのインプットテンプレートとして用いた。プライマーを以下のように４７０−２０−１配列に基づいて設計した：４７０−２０−１−７７Ｆ（配列番号９）および４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）。ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）およびランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、室温で約１０分間、４２℃で１５分間、そして９９℃で５分間インキュベートし、急速に４℃まで冷却することにより逆転写を行った。１００μｌの反応物あたり１．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２μＭ〜１μＭの各プライマー、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および２．５〜５．０ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（「ＡＭＰＬＩＴＡＱ」、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含有する反応物中のＰＣＲにより、精製することなく、合成ｃＤＮＡを直接増幅した。サイクルは、「ＧＥＮＥＡＭＰ  ＳＹＳＴＥＭ  ９６００」熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）において、９４℃で少なくとも１分間、続いて変性（１０サイクルについては９４℃で１５秒間；
続くサイクルについては９２℃または９４℃で１５秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、そして伸長（７２℃で３０秒間）の４０〜４５反復であるか、または他の熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）において相当するサイクル条件であった。
【０３０３】
陽性コントロールは、（ｉ）Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８蛍光アッセイを用いて推定された濃度を有する先に増幅したＰＣＲ産物、（ｉｉ）目的のＤＮＡ配列を有する精製プラスミドＤＮＡ、または（ｉｉｉ）Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６のようなファージＲＮＡプロモーターの転写制御下に置かれる目的のＤＮＡ配列を含むプラスミドクローン由来の精製  ＲＮＡ転写物、および市販のインビトロ転写キットの使用により調製されたＲＮＡから構成した。さらに、ＤＮＡ増幅反応物のインヒビターの存在についてのコントロールとして、約１０〜１００コピー／ｒｘｎ．に相当する陽性コントロールＤＮＡのアリコートをクローニング供給源標本から抽出した核酸を含有する反応物中に加え得る。それぞれ別々の抽出物を少なくとも１つの陽性コントロールを用いて試験した。
【０３０４】
特異性の確認のために、特異的産物を特異的なオリゴヌクレオチドプローブ４７０−２０−１−１５２Ｆ（配列番号１６）へのハイブリダイゼーションにより検出した。１０μｌのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを、約１×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識４７０−２０−１−１５２Ｆを含有する２０μｌの反応物中溶液で行った。特異的ハイブリッドを、ポリアクリルアミドゲルでハイブリダイズしなかったオリゴから電気泳動分離およびオートラジオグラフィーの後検出した。
【０３０５】
ＰＮＦに加えて、「血清ＰＣＲ」プロトコル配列を用いて、正常血清から抽出された核酸もまた逆転写し、そして増幅した。正常ヒト血清からはシグナルが検出されなかった。ＰＮＦ血清における特異的なシグナルを、４７０−２０−１特異的プライマーを用いて複数の抽出物中で再現可能に検出した。
【０３０６】
（Ｄ．  ＳＩＳＰＡ非クローニング核酸からの増幅）
ＳＩＳＰＡ（配列非依存単一プライマー増幅）増幅したｃＤＮＡをテンプレートとして使用した（実施例１）。選択されたクローニング配列から設計された配列特異的プライマーを用いてテンプレート由来の目的のＤＮＡフラグメントを増幅した。代表的には、テンプレートはクローニング操作において使用されるＳＩＳＰＡ増幅されたサンプルであった。例えば、増幅プライマーである４７０−２０−１−７７Ｆ（配列番号９）および４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）をクローン４７０−２０−１配列（配列番号３）から選択した。テンプレートとしてＳＩＳＰＡ−増幅ＰＮＦ２１６１  ｃＤＮＡを用いてこれらのプライマーを増幅反応に用いた。
【０３０７】
増幅されたＤＮＡフラグメントの同一性は、（ｉ）４７０−２０−１配列（配列番号３）に基づいて設計された特異的なオリゴヌクレオチドプローブ４７０−２０−１−１５２Ｆ（配列番号１６）とのハイブリダイゼーション、および／または（ｉｉ）サイズにより確認した。ＤＮＡブロット検出のために使用されるプローブを、製造業者（ＢＭＢ）の推奨に従い末端トランスフェラーゼを用いてジゴキシゲニンで標識した。次いで、増幅したＤＮＡへのハイブリダイゼーションを、サザンブロット分析または液体ハイブリダイゼーション（Ｋｕｍａｒら、１９８９）分析のいずれかを用いて行った。
【０３０８】
増幅反応において使用した陽性コントロールＤＮＡは、その濃度をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８蛍光アッセイにより推定した先に増幅したＰＣＲ産物、またはそれに代わってクローニングした目的の挿入物を含む精製プラスミドＤＮＡであった。
【０３０９】
４７０−２０−１特異的シグナルが、ＳＩＳＰＡ−増幅ＰＮＦ２１６１からＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡで検出された。陰性コントロール反応物は非反応性であり、そして陽性コントロールＤＮＡテンプレートが検出された。
【０３１０】
（Ｅ．  肝臓ＲＮＡサンプルからの増幅）
肝臓生検材料から、Ｃａｔｈａｌらの方法に従ってＲＮＡを調製した。ここでは、組織を５Ｍのグアニジンチオシアネート中で抽出し、次いで４Ｍ  ＬｉＣｌによりＲＮＡを直接沈殿させた。ＲＮＡペレットを２Ｍ  ＬｉＣｌで洗浄した後、残留する混入タンパク質をフェノール：クロロホルム抽出により除去し、そしてＲＮＡをエタノール沈殿により回収した。
【０３１１】
基質として以下のＲＮＡ供給源を用いる増幅反応では４７０−２０−１特異的プライマーもまた使用した：正常なマイスタックス肝臓ＲＮＡ、正常なタマリン（Ｓａｎｇｕｉｎｕｓ  ｌａｂｉａｔｕｓ）の肝臓ＲＮＡ、およびＭＹ１３１肝臓ＲＮＡである。ＭＹ１３１は、１ｍｌのＰＮＦ２１６１血漿で静脈内に接種したマイスタックスである。肝臓酵素（ＳＣＩＤ）の明らかな増加および明白なウイルス感染の組織学的な証拠が存在した。組織学的相関は、肝臓がＳＣＩＤ活性がピーク時またはピーク時近くで得たＭＹ１３１の肝臓において最も明らかであった。マイスタックス１３１の肝臓ＲＮＡは、ＨＣＶの非コードプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いては増幅産物を生じなかった。
【０３１２】
増幅反応を２回の実験について重複して行った。これらの増幅反応の結果を表２に示す。
【０３１３】
【表２】
2006115845.tif 000010
これらの結果は、４７０−２０−１配列が親の血清サンプル（ＰＮＦ２１６１）およびＰＮＦ２１６１サンプルの継代動物由来の肝臓ＲＮＡサンプル（ＭＹ１３１）中に存在することを示す。しかし、コントロールＲＮＡは両方とも、４７０−２０−１配列の存在について陰性であった。
【０３１４】
（Ｆ．ＲＮＡテンプレートを用いたポリメラーゼ連鎖反応による、ＨＧＶ配列についての血清パネルのスクリーニング）
（１．高−ＡＬＴドナー）
ＨＧＶ特異的プライマーを用いる、肝炎患者由来の血清および肝機能異常の血液ドナー由来の血清のポリメラーゼ連鎖反応スクリーニングにより、ＨＧＶと肝臓疾患との間の疾患関連性を評価した。後者は、血清ＡＬＴレベルが１ｍｌ当たり４５国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔ）を超えるドナー血液由来の血清より構成された。
【０３１５】
総数１５２の血清よりなる血清パネルを選択した。以下の血清を血清パネルとして選択した：Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（ＳＵＢＢ）でスクリーニングしたドナー血液由来の１０４の高−ＡＬＴ血清；北カリフォルニア、エジプト、およびペルーからの３４のＮ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎血清；および肝臓疾患および／または肝炎ウイルス感染の疑いのある他のドナー由来の１４の血清である。パネルに対する陰性コントロールは以下の通りであった：ウイルス感染の危険因子の非存在が明らかである９名の高度にスクリーニングされた血液ドナー（ＳＵＢＢ）（例えば、Ｏ−陰性、Ｒｈ陰性；ＨＩＶ、既知の肝炎因子、およびＣＭＶに対して陰性；その複数の以前のドナー血液が疾患を引き起こすことなく輸血された「スーパーノーマル（ｓｕｐｅｒ  ｎｏｒｍａｌ）」血清）；および２名のランダムな血液ドナーである。これらの血清を、４７０−２０−１プライマー７７Ｆ（配列番号９）および２１１Ｒ（配列番号１０）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより、ＨＧＶ特異的配列の存在についてアッセイした。
【０３１６】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲを、プライマー４７０−２０−１−２１１Ｒの５’末端をビオチン化し、溶液中のハイブリダイゼーションを含む方法により、次いでストレプトアビジンでコートした常磁性ビーズを用いて、ハイブリダイズされたプローブの親和性捕捉により増幅産物の迅速なスクリーニングを促進した以外は、本質的に実施例４Ｃに記載されるように行った。親和性相互作用によりハイブリダイズした配列の捕捉を用いて特異的に標識したプローブへのハイブリダイゼーションによる核酸の分析方法は、核酸分析の技術分野で周知である。
【０３１７】
試験に利用可能な血清の量に応じて、３０μｌ〜５０μｌの血清由来のＲＮＡをＲＴ／ＰＣＲ反応に用いた。反応あたり１０コピー、１００コピーまたは１０００コピーのＲＮＡ転写物に相当する陽性コントロールおよび適切な陰性コントロール（緩衝液）を用いて各々の血清を重複して試験した。陰性コントロールは反応せず、そして反応あたり少なくとも１０コピーが各ＰＣＲ反応において検出可能であった。特異的なハイブリダイジングシグナルが２つの重複する反応物の１つのみに存在するとき、不確かな結果であると定義した。
【０３１８】
この血清パネルの増幅分析由来の産物の、効率的で高い感度の分析を、電気化学発光オリゴヌクレオチドプローブを用いる親和性に基づくハイブリッド捕捉のために特別に設計された器具（ＱＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０００ＴＭ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。ＱＰＣＲ  ５０００ＴＭを利用するアッセイは先に記載されている（ＤｉＣｅｓａｒｅら；Ｗａｇｅｓら）。
【０３１９】
各反応の産物を、プローブ４７０−２０−１−１５２Ｆ（電気化学発光ルテニウムキレートを用いて５’末端標識した）に対するハイブリダイゼーション、および「ＱＰＣＲ  ５０００」を用いる測定によりアッセイした。所定の増幅反応における陰性コントロールの平均値の合計および標準偏差の３倍のカットオフに基づいて、総数３４の陽性の可能性を有するサンプルを確認試験のために選択した。
【０３２０】
３４のサンプルを溶液ハイブリダイゼーションおよび電気泳動により分析した（実施例４Ｃ）。これら３４のサンプルのうち、６つの血清（すなわち、６／１５２）が重複反応で特異的にハイブリダイズする配列を有することが示された。これらの６個のサンプルのうち、３個は陽性コントロールとの比較により強く反応性であった：ＳＵＢＢからの１つの高−ＡＬＴ血清、およびエジプトからの２つのＮ−（ＡＢＣＤＥ）血清である。
【０３２１】
第２の血液サンプルを、最初のサンプルが採血されてから１年後の高度に陽性なＳＵＢＢ血清ドナーから得た。第２の血清サンプルは、上記のＰＣＲ法によりＨＧＶ陽性であることが確認された。この結果は、ヒトにおけるＨＧＶによる持続性感染を確証する。この血清を「ＪＣ．」と称した。さらに、この血清ドナーはＨＣＶ陰性であり（血清反応性試験およびＰＣＲにより測定された）、そしてＨＡＶおよびＨＢＶに対して抗体陰性であった。
【０３２２】
さらに、エジプトからの第３のＮ−（ＡＢＣＤＥ）血清、Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎の北カリフォルニア血液ドナー血清およびＮ−（ＡＢＣＤＥ）肝炎血清もまた、この方法により弱く陽性であることが示された。２つの他の血清は、２つの増幅反応物の１つにおける特異的配列の存在として定義される不確かな結果を与えた。
【０３２３】
これらのＨＧＶ陽性血清および不確かな血清由来の重複した血清のアリコートの後のＰＣＲ分析は、試験した８つの血清うち６つがＨＧＶ陽性の結果を与え、そして残りの２つの血清が不確かな結果を与えた。
【０３２４】
第２のプライマーセットをＨＧＶ陽性サンプルの確認のために使用した。診断増幅のためのこのプライマーセット（ＧＶ５７−４５１２ＭＦ、配列番号１２１、およびＧＶ５７−４６５７ＭＲ、配列番号１２２）を、推定のＮＳ５コード領域に由来するＨＧＶの保存領域から選択した。約２．２ｋｂのフラグメントを５つの別々のＨＧＶ単離物から増幅した。増幅反応に使用したプライマーは、４７０ＥＸＴ４−２１８９Ｒ（配列番号１１９）および４７０ＥＸＴ４−２９Ｆ（配列番号１２０）であった。増幅したＤＮＡフラグメントを配列決定し、そして配列を並べた。並びから高度に保存された領域が同定された。そして最適プライマー配列を、５つの配列にわたって相違したままであるような位置で、混合された塩基合成を取り込んで設計した。得られたＮＳ５プライマーは以下の通りであった：ＧＶ５７−４５１２ＭＦ、配列番号１２１、およびＧＶ５７−４６５７ＭＲ、配列番号１２２。これらのプライマーを用いて試験サンプルから１６５ｂｐの診断用フラグメントを増幅した。
【０３２５】
内部プローブ配列であるＧＶ２２ｄｃ−８９ＭＦ（配列番号１２３）は、特異的に増幅された産物の検出のために、他の高度に保存された領域に由来した。このプローブはまた、低いストリンジェンシー条件下で相違が最小限であるＨＧＶ配列の検出を可能にするに十分な長さである。
【０３２６】
診断用ＮＳ５配列の存在についての標本の分析は、４７０−２０−１プライマーについて記載されたような、サンプル調製、増幅、および液体ハイブリダイゼーションと同一条件（実施例４Ｃ）に従った。４７０−２０−１およびＮＳ５の両プライマー対を用いるＰＣＲにより分析した血清サンプルの結果の一致を表３に示す。
【０３２７】
【表３】
2006115845.tif 000011
ＨＧＶ陽性であると上で同定された８つの血清から得た別のアリコートのさらなるＰＣＲ分析を、４７０−２０−１プライマーセット（配列番号９および配列番号１０）およびＮＳ５プライマーセットを用いて行った。これらのアッセイにおいて、ＨＧＶ  ＰＣＲ分析は一致して８つの血清のうち５つにおいて陽性の結果を与えた。これらの結果を表４に表す。
【０３２８】
対照的に、２つのランダムドナー血清または９の高度にスクリーニングされた「スーパーノーマル」血清はどちらのセットのＰＣＲ分析においても陽性でなかった。
【０３２９】
これらの結果は、ＨＧＶと肝臓疾患との間の疾患関連性を強める。
【０３３０】
【表４】
2006115845.tif 000012
高−ＡＬＴドナー由来の血清のさらなる試験は以下の結果を与えた。上記の１０４の血清の最初のパネルに加えて、総数４９５の血清を試験した。これら４９５の標本のうち、６つはプライマー対４７０−２０−１−７７Ｆ（配列番号９）および４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）を用いてＨＧＶ陽性と同定された。これら６つの血清は以下のＨＣＶプロファイルを有する：Ｒ２５３４２、ＨＣＶ陰性；Ｒ１７７４９、ＨＣＶ陽性；Ｊ５３１７１、ＨＣＶ陽性、ＨＢＶ陽性；Ｊ５４４０６、ＨＣＶ陰性；Ｒ０８０７４、ＨＣＶ陰性；およびＸ３１０４９、ＨＣＶ陰性。陽性のスコアは、少なくとも２回の別の反応における繰り返された反応性を基準とする。Ｒ２５３４２を試験し、そしてＮＳ５プライマー対を用いるＰＣＲにより陽性であることが確認された。従って、約１．２％の検出率が観察された（試験した５９９のうち７）。
【０３３１】
ＰＣＲ（４７０−２０−１プライマー対）によるＨＧＶ  ＲＮＡについての試験のために、ＡＬＴが上昇した血液ドナー由来の新たに得た血漿サンプルをまた、ＳＵＢＢ、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、およびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から得た。試験した総数２１４のドナー血液のうち、総数５つ（約２．３％）がＨＧＶ  ＲＮＡ陽性であった。これらの５つの血清は以下のＨＣＶプロファイルを有する：Ｔ５５８０６、ＨＣＶ陽性；Ｔ５５８７５、ＨＣＶ陰性；Ｔ５６６３３、  ＨＣＶ陰性；Ｒ３８７３０、ＨＣＶ陰性；および３８３１７８１、ＨＣＶ陰性である。これらのドナーの２名（Ｔ５５８０６およびＴ５５８７５）からの後のド  ナー血液もまた、ＨＧＶ  ＲＮＡ陽性であった。Ｔ５５８０６、Ｔ５５８７５およびＴ５６６３３を試験し、そしてＮＳ５プライマー対を用いるＰＣＲにより陽性であることが確認された。
【０３３２】
（２．受託された血液ドナーのスクリーニング）
正常な血液ドナー集団におけるＨＧＶの流行を評価するために、ＳＵＢＢで輸血のためにスクリーニングされた血液ドナーから血清を採血した。総数９６８の標本（７６９名の個体ドナーを表す）をＨＧＶ  ＲＮＡについて試験した。サンプルを４７０−２０−１プライマー対を用いるＰＣＲによりスクリーニングした。
【０３３３】
総数１６の血清が検出可能なＨＧＶ  ＲＮＡを有すると同定された。これらのうち、６つは３名のドナー由来の重複した血清であり、試験された７６９名中総数１３名の個体ドナーがＲＮＡ  ＰＣＲによりＨＧＶ陽性であった。すべての陽性なサンプルを試験し、そしてＮＳ５プライマー対を用いるＰＣＲにより陽性であることが確認された。これらのドナーは、正常なＡＬＴレベル、ならびにそうでなければ通常の血清学により特徴付けられた。従って、正常な血液ドナー集団中で試験した血清の約１．７％がＨＧＶ陽性であった。従って、ＨＧＶの存在は受託された血液ドナーおよび拒否された血液ドナーの両方で検出された。
【０３３４】
（３．種々の地理的な場所からの標本）
地理的に広範な供給源からの肝炎患者の集団におけるＨＧＶ感染の存在をＰＣＲにより評価した。ＰＣＲ反応は、４７０−２０−１  ＰＣＲプライマー対を用いて本質的に実施例４Ｃに記載されるように行った。エジプト、ギリシャ、オーストラリア（実施例４Ｆ−４を参照のこと）、ペルー、イギリス、イタリア、ドイツ、韓国、アメリカ合衆国、および日本からの血清サンプルを試験した。試験した全ての集団のサブセットでＨＧＶ  ＲＮＡが検出可能であった。
【０３３５】
（４．輸血後関連ＨＧＶ感染および非経口伝染）
ＨＧＶ  ＲＮＡがいくつかの輸血後肝炎症例において検出された（実施例４Ｆ−３に含められた日本およびヨーロッパからの症例）。日本からの１つ、アメリカからの２つ、およびオーストラリアからの１つの総数４つの症例について、ＨＧＶ  ＲＮＡの存在について、複数の時点でアッセイした。これらの症例の３つについては、（ｉ）輸血前サンプルが利用可能であり患者の以前のＨＧＶの状態を確認し、そして（ｉｉ）これらの３つの症例に対する個々の血液ドナーからのサンプルが利用可能でありドナーのＨＧＶの状態を確認した。
【０３３６】
第１の症例は１９８０年１２月２日に輸血された日本人患者である。輸血後、この患者は非Ｂ型、非Ｃ型肝炎を発症した。この患者からの総数５つの血清を、４７０−２０−１プライマー対を用いるＰＣＲによりＨＧＶ  ＲＮＡについて試験した。ＨＧＶ  ＲＮＡは、輸血後約２週間から約８ヶ月検出可能であった。輸血後１年を超えて採取されたサンプルは不確か（すなわち、重複する反応の１つにおいてのみ陽性）であった。輸血前のサンプルは試験に利用可能でなかった。
【０３３７】
症例ＢＩＺおよびＳＴＯ（それぞれ、表５および表６）は、将来を見通して追跡したＮＩＨで行われた心臓手術研究（Ａｌｔｅｒら、１９８９）からの患者である。これらの患者の各々について、輸血後血清が利用可能であり、そして４７０−２０−１プライマー対を用いるＰＣＲによりＨＧＶ  ＲＮＡについて陰性であると測定された。ＢＩＺを試験すると、輸血後１日目から輸血後１９８週目までＨＧＶ  ＲＮＡについて陽性であった。ＢＩＺについては総数９名の血液ドナーのうち、試験した８名のうち２名がＨＧＶ陽性であることが見出された。ＳＴＯを試験すると、輸血後５週目から輸血後９２週目までＨＧＶ  ＲＮＡについて陽性であった。
【０３３８】
【表５】
2006115845.tif 000013
【０３３９】
【表６】
2006115845.tif 000014
４番目の症例はまた、オーストラリアのシドニーで行われた輸血後肝炎研究に参加した、将来を見込んで追跡された心臓手術患者であった。他の同定可能な危険因子を有さない患者（ＰＡ−１２４）に、手術の間に１４ユニット（４ユニットのパックされた赤血球細胞、１０ユニットの血漿板）の血液が輸血された。これらの１４ユニットのうち、１つはＨＧＶ陽性であり、他の１３はＨＧＶ陰性であった。１４名の血液ドナーのＨＢＶおよびＨＣＶ血清学分析は、反応性のＨＣＶ  ＥＩＡ（第１世代試験）を除いて陰性であった。他のＨＣＶ試験では陽性の知見は確認されなかった。
【０３４０】
患者ＰＡ−１２４（表７）では、手術後２週間目に採血されたサンプルから血清ＡＬＴが上昇し始め、そして１４週間の期間に少なくとも手術前の１０倍のレベルが観察された。ＰＡ−１２４由来の輸血前４週間目、および８週間目の血清において行われたＨＣＶについてのＰＣＲの結果は、全て陰性であった。この患者由来の血清を４７０−２０−１  ＰＣＲプライマーを用いてＨＧＶ  ＲＮＡについて試験した。輸血前サンプルはＨＧＶ  ＲＮＡについて陰性であった。輸血後に陽性の結果が示され、ＡＬＴの上昇に伴い、そしてそれに一致した。ＨＧＶ  ＲＮＡの存在は、輸血後１年まで検出された。これらのデータはＨＧＶは非経口的に伝染し得るという結論を支持する。
【０３４１】
【表７】
2006115845.tif 000015
将来を見込んで追跡した輸血後の症例に加えて、複数の輸血および静脈内薬剤使用（ＩＶＤＵ）により定義される危険グループにおいてさらなるＨＧＶ感染の症例が同定された（表８）。
【０３４２】
【表８】
2006115845.tif 000016
１００名の複数回輸血された鎌形細胞性貧血患者および地中海貧血患者中、１９名（１９％）が検出可能な血清ＨＧＶ  ＲＮＡを有することが見出された。同様に、４９名の血友病患者中９名（１８％）が、４７０−２０−１およびＮＳ５プライマーを用いるとＨＧＶ陽性であることが見い出された。重要なことに、５４名のＩＶＤＵ中１５名（２８％）がＨＧＶ  ＲＮＡについてＰＣＲ陽性であった。これらの非経口危険グループにおける感染率（１８％〜２８％）は、ＡＬＴの上昇した血液ドナーの感染率（１％〜２％）より高いようである。これらの結果は、ＨＧＶ伝染について非経口的経路の重要性を増援する。
【０３４３】
（５．  選択された肝炎疾患グループのＰＣＲスクリーニング）
急性および慢性肝炎、造血細胞ガン、ＨＢＶ感染またはＨＣＶ感染の患者由来の血清を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＨＧＶの存在について試験した（データを表８に示す）。肝臓疾患の患者由来の標本のセットの各々で、ＨＧＶ陽性の標本が示された（自己免疫性肝炎および原発性胆硬変を除く；両方の病態は感染因子と強く関連していないと考えられる）。
【０３４４】
輸血後の肝臓患者由来の血清のコレクションにおいて示されるように（実施例４Ｆ−４）、ＨＧＶ感染が急性肝炎の間に確認されているが、循環するウイルスＲＮＡは月単位から年単位で測定された期間について慢性感染の間継続して検出される。
【０３４５】
ＨＢＶ感染およびＨＣＶ感染患者において、約１０％〜２０％の同時感染率が観察された。従って、ＨＧＶ感染は、他の肝炎ウイルスとの同時感染を伴う肝炎または伴わない肝炎と関連することを示す。同時感染は、これらの肝炎ウイルスの伝染と類似の危険因子および経路を反映し得る。上記のように、血友病患者、ＩＶＤＵ患者、および複数回輸血された貧血患者のような非経口危険グループでは、（他の肝炎危険グループに比較して）ＨＧＶの罹患率がより高かった。
【０３４６】
（６．  ヒトにおけるＨＧＶによる持続性感染）
輸血後の肝炎症例であるＢＩＺ、ＳＴＯ、およびＰＡ−１２４は、輸血後および急性肝炎後、それぞれ３．８年、１．８年、および１．０年までＰＣＲで検出可能なウイルスＲＮＡを有することが示された。さらなる血清サンプルを、ドナーＪＣ（実施例４Ｆ−１）から、最初の陽性サンプルの後１年目および１．５年目に得た。これらの追跡血清サンプルもまたＨＧＶ陽性であった。他の高ＡＬＴドナー（Ｔ５５８０６、Ｔ５５８７５、Ｒ２５３４２）から、最初にＨＧＶ感染が検出された血清サンプルの数カ月後に得られたさらなる血清もまた、陽性であった。同様に、ＨＧＶ感染が実験霊長類（ＣＨ１３５６、実施例４Ｈ）において確認された場合、ＨＧＶ  ＲＮＡは接種後１．５年にわたって検出された。これらのデータは、ヒトおよび実験霊長類における持続性ＨＧＶウイルス血症を確立する。
【０３４７】
（Ｇ．  配列決定のための患者ＲＮＡ由来の長いフラグメントの増幅）
種々のＨＧＶ単離体の配列情報を得るために、ＰＣＲプライマーを設計してＨＧＶゲノムのいくつかの有益な領域を増幅した。当初の４７０−２０−１配列を含んでいた２．２ｋｂのフラグメントを増幅するためにプライマー４７０ＥＸＴ４−２１８９Ｒ（配列番号１１９）および４７０ＥＸＴ４−２９Ｆ（配列番号１２０）を設計した。サンプル由来のＲＮＡを「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ」逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡを、効率的な長範囲ＰＣＲのための試薬（「ＸＬ  ＰＣＲ  ＢＵＦＦＥＲＳ」および「ｒＴｔｈ−ＸＬ」、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて増幅した。
【０３４８】
アガロースゲル電気泳動で正しいサイズのバンドが検出される場合、増幅反応は陽性と考えられる。増幅産物の予備的ＤＮＡ配列決定によりサンプルを陽性として確認した。以下の血清サンプルを試験したところ、この増幅法によりＨＧＶ  ＲＮＡについて陽性であった：ＰＮＦ２１６１；Ｒ１０２９１（ＪＣ）；および北アメリカ人、エジプト人、および日本人グループのそれぞれ由来の標本。しかし、ペルー人の血清からは陽性サンプルは検出されなかった。
【０３４９】
種々のＨＧＶ陽性標本からの成功した増幅により、上記の４７０−２０−１プライマー対を用いるＰＣＲ増幅により得られた結果が確認された。しかし、増幅が得られないことは、乏しいＲＮＡ量または低コピー数、または選択されたプライマーセットが全般的に機能しないため単離体間の局部的な配列の差異を反映し得る。
【０３５０】
ＨＧＶゲノムの推定の５’非翻訳領域から配列情報を得るために、プライマーを設計して５’非翻訳領域由来のフラグメント（ＨＧＶ  ＰＮＦ２１６１変異体に基づく）を増幅した。２つのフラグメントを以下のプライマーセットにより規定した：ＦＶ９４−２２Ｆ（配列番号１２４）および  ＦＶ９４−７２４Ｒ（配列番号１２５）、７２８塩基対のフラグメントを生じる；およびＦＶ９４−９４Ｆ（配列番号１２６）およびＦＶ９４−９１２Ｒ（配列番号１２７）、８４７塩基対のフラグメントを生じる。
【０３５１】
効率的な長範囲ＰＣＲを促進するために記載された方法をそのまま使用した。試験したほとんどのサンプルから産物が得られ、サンプル中のＨＧＶ  ＲＮＡの存在のさらなる確認を提供した。
【０３５２】
（Ｈ．  霊長類におけるＨＧＶの感染力）
２匹のチンパンジー（ＣＨ１３２３およびＣＨ１３５６と称する）、６匹のカニクイザル（ＣＹ１４３、ＣＹ８９０４、ＣＹ８９０８、ＣＹ８９１２、ＣＹ８９１７、およびＣＨ８９１８）、および６匹のマイスタックス（ＭＹ２９、ＭＹ１３１、ＭＹ９８、ＭＹ１８７、ＭＹ２２９、ＭＹ２５４）被験体にＰＮＦ２１６１を接種した。接種前血清および接種後血清を、ＡＬＴおよびＨＧＶ  ＲＮＡ配列の存在（上記のＰＣＲスクリーニングにより決定される）についてモニターした。
【０３５３】
１匹のカニクイザル（ＣＹ８９０４）が総数１７の別々の採血血液から陽性のＲＮＡ  ＰＣＲ結果（接種後３９日）、および１つの不確かな結果を示した。ＣＨ１３５６と称する１匹のチンパンジーにおいて、持続性ウイルス血症がＲＴ−ＰＣＲにより観察された。表９に示されるように、有意なＡＬＴの上昇は観察されず、そして循環するウイルスは、接種のかなり後の時点でのみ検出された。ウイルス血症は接種後１１８日目およびそれ以後に観察された。最初の接種後時点（８日目）において示唆的な反応性もまた観察されたが、これは接種物の残留を示し得る。
【０３５４】
【表９】
2006115845.tif 000017
【０３５５】
（Ｉ．ウイルスゲノムの特徴付け）
ｃＤＮＡライブラリー（実施例１）からの４７０−２０−１の単離は、ＰＮＦ２１６１において検出されたウイルスゲノムがＲＮＡであったことを示す。ＨＧＶウイルスゲノムのＲＮＡとしての同一性を確認するさらなる実験は以下を包含する。
【０３５６】
最初のクローニング供給源におけるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの選択的な分解（例えば、ＤＮａｓｅフリーのＲＮａｓｅまたはＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅによる）に続くＨＧＶ特異的プライマーを用いる増幅、およびＲＮＡテンプレートをＤＮＡテンプレートと区別する役割をする増幅産物の検出。
【０３５７】
代替方法は、増幅反応物（テンプレートとして最初のクローニング供給源由来の核酸、およびＨＧＶ特異的プライマー）を利用する。この方法は、（ｉ）反応物中のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、逆転写酵素）の非存在下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）反応物中のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。この方法では、ＨＧＶゲノムがＤＮＡであるまたはＤＮＡ中間体を有する場合、増幅産物は両方のタイプの増幅反応物で検出される。ＨＧＶゲノムがＲＮＡのみである場合、増幅産物は逆転写酵素含有反応物のみにおいて検出される。
【０３５８】
実施例４Ｃに記載されるように、プロテイナーゼＫおよびＳＤＳに続いてフェノール抽出を用いてＰＮＦ２１６１から総核酸（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出した。この精製された核酸を、次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。ここで、（ｉ）ＰＣＲに先だって逆転写工程を行うか、または（ｉｉ）逆転写工程を省略した。ＰＣＲ反応に先だって逆転写を行った場合のみ増幅が再現性良く得られた。コントロールとして、ＤＮＡテンプレートが別の反応でうまく増幅された。これらの結果は、ＨＧＶウイルスゲノムの本質はＲＮＡであることを示す。
【０３５９】
本来ＰＮＦ２１６１に存在していたクローン化された鎖である２本鎖ＤＮＡ配列は、以下を含む種々の手段により推定され得る。感染した供給源血清由来の増幅されなかったゲノムＲＮＡのノーザンブロッティングまたはドットブロッティングに続いてクローン化配列の各鎖に対応するプローブに対する重複ブロットハイブリダイゼーションを行い得る。あるいは、感度を高めるために、Ｍ１３ベクター（Ｍｅｓｓｉｎｇ）から単離された１本鎖ｃＤＮＡプローブ、または複数の鎖に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する。供給源血清が１本ＲＮＡを含有する場合、１つのプローブのみ（すなわち４７０−２０−１クローンの１つの鎖由来の配列）が、適切な条件のハイブリダイゼーションストリンジェンシーの下でシグナルを生じる。供給源血清が２本鎖ＲＮＡを含有する場合、両鎖プローブがシグナルを生じる。
【０３６０】
逆転写を先に行い、１つまたは他の特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応は、ノーザンブロッティングよりもはるかに高い感度を示す。ＰＮＦ２１６１血清に存在する精製ビリオンから抽出したゲノムＲＮＡを、各ＲＴ／ＰＣＲにおいてインプットテンプレートとして用いる。ランダムヘキサマーを用いるｃＤＮＡ合成よりむしろ、ＨＧＶ配列特異的プライマーを用いた。１つのｃＤＮＡ合成反応を、クローン化配列の１つの鎖に相補的なプライマー（例えば、４７０−２０−１−７７Ｆ）を用いて行い；第２のｃＤＮＡ合成反応をさらに、対向する鎖に由来するプライマー（例えば、４７０−２０−１−２１１Ｒ）を用いて行った。
【０３６１】
得られた第１鎖ｃＤＮＡを、２つのＨＧＶ特異的プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲによる首尾良い増幅のためにコントロールを含めた（例えば、ＤＮＡコントロール）。
【０３６２】
記載される特異的プライマーを用いる場合、クローン化配列の各鎖のＲＮＡ転写物もまた、得られた逆転写効率についてのコントロールとして用いた。
【０３６３】
臭化エチジウム染色を用いて、アガロースゲル電気泳動により特異的産物を検出した。ＤＮＡコントロール（すなわち、ＰＣＲ増幅についての２本鎖ＤＮＡコントロール）は、逆転写に用いられるプライマーに関係なく首尾良く増幅された。１本鎖ＲＮＡ転写物（すなわち、逆転写効率および鎖特異性についてのコントロール）は、対向鎖プライマーがｃＤＮＡ合成に使用された場合にのみ増幅された。
【０３６４】
ＰＮＦ由来ＨＧＶポリヌクレオチドは、プライマー４７０−２０−１−２１１Ｒが逆転写に用いられた場合のみ特異的な増幅産物を生じた。従って、これは、血清に存在する当初のＨＧＶポリヌクレオチド配列は４７０−２０−１−２１１Ｒに相補的であり、そしておそらく１本鎖ＲＮＡであることを示す。
【０３６５】
（実施例５  ＰＮＦ  ２１６１のスクロース密度勾配分離）
（Ａ．  ＰＮＦ−２１６１因子のバンド化）
ＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の連続勾配の１０％〜６０％スクロース（「ＵＬＴＲＡＰＵＲＥ」、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）製の勾配メーカーを用いて調製した。−７０℃で保存し、３７℃で迅速に解凍させ、次いでＴＮＥで希釈した０．４ｍｌのＰＮＦ血  清を、約１２．５ｍｌの勾配に重層した。
【０３６６】
次いで、この勾配をＳＷ４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で、４℃で約１８時間、４０，０００ｒｐｍ（ｒａｖで約２００，０００×ｇ）で遠心分離した。容量約０．６ｍｌの画分をチューブの底から採集し、そして密度の算定のために、超遠心分離チューブ中で直接０．５ｍｌの重さを計量した。
【０３６７】
【表１０】
2006115845.tif 000018
次いで、推定ウイルス粒子を、Ｔｉ７０．１ローター中で、４℃で２時間、４０，０００ｒｐｍ（約１１０，０００×ｇ）で遠心分離することによりペレット化し、そして酸性グアニジニウムフェノール技法（「ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて抽出し、そして回収を改善するためのキャリアとしてグリコーゲンを用いてアルコール沈殿した。この精製核酸を、２ｍＭ  ＤＴＴおよび１Ｕ／μｌの組換えＲＮａｓｉｎを含有する緩衝液（ＲＮａｓｅを含まない）に溶解した。
【０３６８】
ＲＮＡ  ＰＣＲ（実施例４Ｃ）による勾配画分の分析は、１．１２６ｇ／ｍｌ〜１．０６８ｇ／ｍｌの範囲の密度の画分に局在化する４７０−２０−１特異的シグナルの明瞭なピークを示した（表１０）。従って、これらの条件下で、４７０−２０−１シグナルは、スクロース勾配におけるウイルス粒子の予想される挙動と一致する分離したバンドを形成することが示された。
【０３６９】
（Ｂ．ウイルス粒子相対密度）
ＰＮＦ２１６１はＨＣＶと同時感染することが示された（上記参照）。他の概知の肝炎ウイルス粒子に対する４７０−２０−１ウイルス粒子の性質を比較するために、血清ＰＮＦ２１６１および精製Ａ型肝炎ウイルスのサンプルを（上記のように）スクロース勾配上に載せた。画分（０．６ｍｌ）を採集し、ペレット化し、そしてＲＮＡを抽出した。各画分由来の単離したＲＮＡを、ＨＡＶ（配列番号５；配列番号６）、ＨＣＶ（配列番号７；配列番号８）および４７０−２０−１（配列番号９、配列番号１０）特異的プライマーを用いる増幅反応（ＰＣＲ）に供した。
【０３７０】
アガロースゲル上の増幅反応物の電気泳動的分離と後の臭化エチジウム染色により産物バンドを同定した。この分析の結果を表１１に示す。
【０３７１】
【表１１】
2006115845.tif 000019
これらの結果は、４７０−２０−１粒子がＨＡＶよりもＨＣＶ粒子に類似することを示唆する。
【０３７２】
さらに、血清ＰＮＦ２１６１およびＨＡＶ粒子をスクロース勾配遠心分離の前にクロロホルムで処理した。これらの実験の結果は、４７０−２０−１因子がエンベロープウイルスであり得ることを示唆する。なぜならそれは非エンベロープウイルス（ＨＡＶ）よりもエンベロープしたフラビウイルス科のメンバー（ＨＣＶ）に類似の性質を有するからである。
【０３７３】
（実施例６  ４７０−２０−１伸長クローンの作製）
（Ａ．  アンカーＰＣＲ）
実施例１に記載されるように、ＰＮＦ２１６１血清から直接ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを「ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ」１００ゲル濾過カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通過させて小分子量の不純物を除去した。ｃＤＮＡをＢＭＢ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて合成した。ｃＤＮＡ合成の後、ＰＮＦ  ｃＤＮＡを、５０倍〜１００倍過剰のＫＬ−１／ＫＬ−２  ＳＩＳＰＡリンカーまたはＪＭＬ−Ａ／ＪＭＬ−Ｂリンカー（それぞれ、配列番号１１／配列番号１２、および配列番号１７／配列番号１８）に連結し、そしてプライマーＫＬ−１またはプライマーＪＭＬ−Ａのいずれかを用いて３５サイクルの増幅を行った。
【０３７４】
ＥｃｏＲＩ消化（脱リン酸化）λｇｔ１１アーム（１μｇ）およびＥｃｏＲＩ消化ＰＮＦ  ｃＤＮＡ（０．２μｇ）を含有する１０μｌライゲーション反応物からの１μｌのアリコートのアンカーＰＣＲにより４７０の伸長クローンを作製した。ライゲーション反応物のＰＣＲ増幅（４０サイクル）を、４７０−２０−７７Ｆ（配列番号９）または４７０−２０−１−２１１Ｒ（配列番号１０）のいずれかと組み合わせたλｇｔ１１逆プライマー（配列番号１３）を用いて行った。ＰＣＲについて全てのプライマー濃度は０．２μＭであった。
【０３７５】
増幅産物（９μｌ／１００μｌ）を１．５％アガロースゲルで分離して、「ＮＹＴＲＡＮ」（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）にブロットし、そして４７０−２０−１に特異的なジゴキシゲニン標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてプローブした。ジゴキシゲニン標識はターミナルトランスフェラーゼ（ＢＭＢ）を用いて製造業者の推奨に従って行った。ハイブリダイズしたバンドをゲル精製し、「ＴＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＶＥＣＴＯＲ  ｐＣＲ  ＩＩ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。
【０３７６】
４７０−２０−１の５’側および３’側の両方の伸長部を有する多くのクローンが同定された。全ての配列は、少なくとも２つの独立した単離体の配列決定からのコンセンサス配列に基づく。このアンカーＰＣＲアプローチを同様の方法で反復してさらなる５’および３’伸長配列を得た。λｇｔ１１逆プライマー（配列番号１３）を先の伸長クローンから得た配列に由来するＨＧＶ特異的プライマーと組み合わせてこれらのＰＣＲ増幅反応を行った。これらの反応の基質は、パッケージされていないＰＮＦ２１６１  ２−ｃＤＮＡ供給源ＤＮＡであった。
【０３７７】
配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定システムを用いて製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の推奨に従って「ジデオキシターミネーターサイクル配列決定法」（Ｓａｎｇｅｒらの手順の改変法）により行った。配列データを配列表に示す。配列を、「ＧＥＮＢＡＮＫ」、ＥＭＢＬデータベースおよびｄｂＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の配列と核酸レベルおよびアミノ酸レベルの両方で比較した。サーチプログラムＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら）は、これらの配列が核酸およびアミノ酸配列の両方で新規であることを示した。
【０３７８】
選択されたプライマー対を用いて得た個々のクローンを並べてコンセンサス配列を得た。ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１変異体の配列を構築するために用いた１連のコンセンサス配列は以下の通りである：４Ｅ３、配列番号２６；３Ｅ３、配列番号２７；２Ｅ５、配列番号２８；１Ｅ５、配列番号２９；４Ｅ５、配列番号３０；３Ｅ５、配列番号３１；２Ｅ３、配列番号３２；１Ｅ３、配列番号３３、４Ｅ５−２０、配列番号３４；５Ｅ３、配列番号３９；６Ｅ３、配列番号４０；７Ｅ３、配列番号４２；５Ｅ５、配列番号４３、６Ｅ５（４４Ｆ）、配列番号４４；８Ｅ３、配列番号９８；９Ｅ３、配列番号１０９；１０Ｅ３、配列番号１１０；１１Ｅ３、配列番号１１６；１２Ｅ３、配列番号１１８；５’末端、配列番号１７５；および３’末端、配列番号１６７。
【０３７９】
個々のコンセンサス配列を並べ、重複する配列を同定し、そしてＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１変異体のコンセンサス配列を決定した。このコンセンサス配列を４つの他のＨＧＶ変異体：ＪＣ（配列番号１８２）、ＢＧ３４（配列番号１７６）、Ｔ５５８０６（配列番号１７８）、およびＥＢ２０−２（配列番号１８０）について得られた配列と比較した。
【０３８０】
ＨＧＶ−ＰＮＦ  ２１６１変異体のコンセンサス配列は配列番号１４に示される９３９１塩基対からなる。この配列は連続するオープンリーティングフレームを表す（配列番号１５）。
【０３８１】
ポリタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを図１１に示す。
【０３８２】
当初の４７０−２０−１クローンと伸長により得られた配列との間の関係を図１に概略的に示す。図に見られるように、このＤＮＡ鎖は長い連続するオープンリーディングフレームを含む４７０−２０−１のタンパク質コード配列とは反対の極性を有する。
【０３８３】
ＨＧＶのアミノ酸配列を、ＰＩＲデータベース（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のタンパク質配列中の全てのウイルス配列の配列に対して比較した。プログラムバージョン１．７（Ｐｅａｒｓｏｎら）の「ＦＡＳＴＡ」スーツ（ｓｕｉｔｅ）の「ＳＳＥＡＲＣＨ」プログラムを用いて比較を行った。ＨＧＶ配列と、フラビウイルス科ウイルスの２つのウイルスとの間に局部的に配列が類似する領域を見出した。類似性アラインメントを図５Ａおよび図５Ｂに示す。
【０３８４】
これらのアラインメントには、これらのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）のモチーフが存在する。保存されたＲＤＲＰアミノ酸モチーフを図５Ａおよび図５Ｂに星印および上付き太字で示す（ＫｏｏｎｉｎおよびＤｏｌｊａ）。これらのアラインメントは、ＨＧＶコード配列のこの部位がＲＤＲＰに対応することを示す。ＨＧＶのＲＮＡゲノムに関するデータと組み合わると、このアラインメントデータはフラビウイルス科のメンバーとしてのＨＧＶの位置づけを支持する。
【０３８５】
ＨＧＶポリタンパク質（配列番号１５）と、ＨｏＣＶ（ブタコレラウイルス）およびＨＣＶとの全体的なアミノ酸配列同一性は、それぞれ１７．１％および２５．５％である。このようなレベルの全体的な配列同一性は、ＨＧＶがＨｏＣＶおよびＨＣＶの両方とは別のウイルス実体であることを示す。例示すると、フラビウイルス科の２つのメンバーのウイルスであるＢＶＤＶ（ウシジフテリアウイルス）およびＨＣＶでは、１６．２％のアミノ酸がＨＧＶと全体的に並べられ得る。
【０３８６】
一般的に高い相同性を示す属内のメンバーは、全体的に並べられた場合、例えば、ＢＶＤＶとＨｏＣＶは７１．２％の同一性を示す。ＨＣＶがメンバーである命名されていない属の種々のメンバー（変異体）は、全体的に並べられた場合、６５％から１００％同一である。
【０３８７】
（Ｂ．ＲＡＣＥＰＣＲ：５’末端のクローニング）
ＨＧＶゲノムの５’末端を代表するクローンを、改変したアンカーＰＣＲアプローチにより得た。このアプローチはＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）技法を利用した。ＲＡＣＥ法はＦｒｏｈｍａｎら（１９８８）およびＢｅｌｙａｕｓｋｙら（１９８９）により最初に記載された。簡単に述べれば、ＨＧＶの５’末端クローンを以下のように得た。
【０３８８】
第１鎖ｃＤＮＡ合成をランダムヘキサマーを用いてプライムし、そして「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ」または「ｒＴｔｈ」逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）のいずれかを用いて合成を行った。第１鎖の合成後、ＲＮＡテンプレートを塩基加水分解（ＮａＯＨ）により分解した。ｃＤＮＡサンプルを酢酸の添加により中和し、そしてガラスマトリックス支持体（「ＧＥＮＯ−ＢＩＮＤ」、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）への吸収により精製した。精製後、ｃＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、そして８０％エタノールで２回洗浄した。
【０３８９】
最初に記載されたＲＡＣＥ法を以下のように改変した。１本鎖オリゴヌクレオチドアンカー（配列番号１７４））（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、塩化コバルトの存在下てＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に連結した。オリゴヌクレオチドアンカーを製造業者から得、２回改変した：（ｉ）アンカーの３’末端をアミノ基で修飾し、コンカテマー形成を防ぐ、そして（ｉｉ）５’末端はリン酸基を有し、第１鎖ｃＤＮＡへのライゲーションを可能にする。
【０３９０】
アンカーのライゲーションの後、いくつかのＨＧＶ特異的プライマーをアンカー配列に相補的なプライマー（ＡＰプライマー、配列番号１３４）と組み合わせて用いるＰＣＲ増幅のテンプレートとして、ｃＤＮＡを用いた。得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、フィルターに移し、そしてネストしたＨＧＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。ＨＧＶプローブにハイブリダイズしたバンドを単離し、「ｐＣＲ−ＩＩ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化し、そして配列決定した。
【０３９１】
（Ｃ．ＨＧＶ  ３’末端のクローニング）
ＨＧＶゲノムの３’末端を代表するクローンを、改変したアンカーＲＴ−ＰＣＲ法により得た。簡単に述べると、ポリＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてｃＤＮＡ合成の前にＰＮＦ２１６１  ＲＮＡにポリ（Ａ）テール（ｔａｉｌ）の付加を触媒した。ポリ（Ａ）付加は製造業者の推奨に従って行った。ポリ（Ａ）修飾ＲＮＡの精製の後、「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ」（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いる逆転写をプライマーＧＶ−５４４６ＩＲＴ（配列番号１８４）を用いて行った。得られたｃＤＮＡを以下のプライマーセットを用いるＰＣＲにより増幅した：ＧＶ５９−５４４６Ｆ（配列番号１７１）およびＧＶ−５４４６ＩＲ（配列番号１７２）。
【０３９２】
増幅後、産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、フィルターに移し、そしてジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブ（Ｅ５−７−ＰＲＢ、配列番号１７３）とハイブリダイズさせた。オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした産物を単離し、精製し、「ｐＣＲ−ＩＩ」にクローン化して配列決定した。この方法により単離された２つのクローンはＭＰ３−３（配列番号１６８）およびＭＰ３−７（配列番号１６９）であった。
【０３９３】
（実施例７  ４７０−２０−１融合タンパク質の単離）
（Ａ．  ４７０−２０−１／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の発現および精製）
４７０−２０−１ペプチドを含有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｓｊ２６）融合タンパク質の発現を以下のように達成した。当初のλｇｔ１１  ４７０−２０−１クローンに対応する２３７塩基対挿入物（両側に１７ヌクレオチドのＳＩＳＰＡリンカーを有する）を、プライマーｇｔ１１  Ｆ（配列番号２５）およびｇｔ１１  Ｒ（配列番号１３）を用いるポリメラーゼ連鎖反応および続くＥｃｏＲＩ消化により当初のλｇｔ１１  ４７０−２０−１クローンから単離した。
【０３９４】
挿入物を改変ｐＧＥＸベクターであるｐＧＥＸ  ＭＯＶにクローン化した。ｐＧＥＸ  ＭＯＶはカルボキシ末端で６つのヒスチジンが融合したｓｊ２６タンパク質（ｓｊ２６ｈｉｓ）をコードする。この４７０−２０−１ポリペプチドコード配列を、ベクター中のｓｊ２６ｈｉｓコード配列の下流に位置するコード部位でベクターに導入した。従って、４７０−２０−１ポリペプチドは、ｓｊ２６ｈｉｓ／４７０−２０−１融合タンパク質として発現される。融合タンパク質のｓｊ２６タンパク質および６つのヒスチジン領域は、グルタチオン結合ビーズ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂら）および固定化金属イオンビーズ（Ｈｏｃｈｕｌａ；Ｐｏｒａｔｈ）を用いる２重クロマトグラフィー法による融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にする。
【０３９５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣカタログ番号２７３５２）をｐＧＥＸ  ＭＯＶおよび４７０−２０−１挿入物を含むｐＧＥＸ  ＭＯＶで形質転換した。ｓｊ２６ｈｉｓタンパク質および４７０−２０−１融合タンパク質は２ｍＭ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導される。従来のイオン交換クロマトグラフィーと組合わせた公開された方法（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂら；Ｐｏｒａｔｈ）に従って、融合タンパク質をグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーまたは固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のいずれかにより精製した。
【０３９６】
精製４７０−２０−１融合タンパク質はＰＮＦ  ２１６１と免疫反応性であった。しかし、精製ｓｊ２６ｈｉｓタンパク質はＰＮＦ  ２１６１と免疫反応性ではなった。これは４７０−２０−１ペプチドとＰＮＦ  ２１６１との間の特異的な免疫反応の存在を示す。
【０３９７】
（Ｂ．  ４７０−２０−１／Ｂ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の単離）
λファージｇｔ１１またはｇｔ１１／４７０−２０−１のいずれかで感染したＫＭ３９２溶原菌を、培養のＯＤが０．４に到達するまで３２℃でインキュベートする。次いで、培養を４３℃の水浴中で１５分間インキュベートしてｇｔ１１ペプチド合成を誘導し、そして３７℃で１時間インキュベートした。細菌細胞をペレット化し、そして細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．４、２％「ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００」および１％アプロチニン）中で溶解した。細菌溶解物を遠心分離（１０Ｋ、１０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＪＡ２０ローター）により清澄化し、そして清澄化溶解物を抗β−ガラクトシダーゼと結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とインキュベートする。
【０３９８】
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の結合および溶出を製造業者の指示に従って行う。代表的には、タンパク質の結合およびカラムの洗浄は細胞溶解緩衝液で行った。結合したタンパク質を０．１Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で溶出する。精製４７０−２０−１／ｂ−ガラクトシダーゼタンパク質はＰＮＦ２１６１および抗ｂ−ガラクトシダーゼ抗体の両方と免疫反応性である。しかし、ｇｔ１１溶原菌により発現され精製されたβ−ガラクトシダーゼはＰＮＦ２１６１とは免疫反応性でなく、抗β−ガラクトシダーゼ抗体とは免疫反応性である。
【０３９９】
（実施例８  ４７０−２０−１融合タンパク質の精製および抗４７０−２０−１抗体の調製）
（Ａ．  グルタチオンアフィニティー精製）
材料は、５０ｍｌのグルタチオンアフィニティーマトリックス還元型（Ｓｉｇｍａ）、ＸＫ２６／３０  Ｐｈａｒｍａｃｉａカラム、２．５×１０ｃｍ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ「ＥＣＯＮＯ−ＣＯＬＵＭＮ」（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）、Ｇｉｌｓｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＴ）ＨＰＬＣ、ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ）、尿素、および二塩基性リン酸ナトリウムを含んでいた。
【０４００】
融合タンパク質の精製には以下の溶液を用いた：緩衝液Ａ：リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、
および緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、８ｍＭグルタチオン（還元型グルタチオン）
ストリップ緩衝液：８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、１０ｍＭグルタチオン、１．５  ＮａＣｌ。
【０４０１】
４７０−２０−１挿入物を含むプラスミドｐＧＥＸ  ＭＯＶを有するＥ．ｃｏｌｉを発酵槽（２０リットル）中で増殖させた。細菌を採集し、そしてマイクロフリューダイザーを用いて２ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解した。他に示さない限り、以下の全ての手順は４℃で行われた。
【０４０２】
溶解細菌を「ＯＡＫＲＩＤＧＥ」チューブに入れそしてＢｅｃｋｍａｎモデルＪＡ−２０ローター中で２０Ｋｒｐｍ（４０ｋ×ｇ）で回転させることにより、充填のための粗溶解物を調製した。上清を０．４μｍのフィルター、次いで０．２μｍフィルターを通して濾過した。
【０４０３】
２．５×１０ｃｍの「ＥＣＯＮＯ−ＣＯＬＵＭＮ」に、室温で２時間ＰＢＳ中で膨潤させたグルタチオンアフィニティーマトリックスを詰めた。カラムを４ベッド量のＰＢＳで洗浄することにより平衡化した。
【０４０４】
このカラムを１分当たり８ｍｌの流速で粗細胞溶解物を充填した。続いて、カラムを５カラム容量のＰＢＳを用いて同じ流速で洗浄した。
【０４０５】
流速を０．７５〜１ｍｌ／分に設定して緩衝液Ｂを導入することによりカラムを溶出した。５カラム容量の緩衝液Ｂをカラムにポンプで送り、そして２分間毎の画分を採取した。例示の溶出プロファイルを図２に示す。画分に存在するタンパク質の含有量および純度を標準的なＳＤＳ  ＰＡＧＥで評価した（図３）。４７０−２０−１／ｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質を、その推定分子量およびＰＮＦ２１６１血清に対するその免疫反応性に基づいて同定した。さらなる操作のために、タンパク質を、融合タンパク質を含有する画分から、または融合タンパク質を含有するゲル領域の抽出によりゲルから単離し得る。
【０４０６】
（Ｂ．アニオン交換によるクローン４７０−２０−１融合タンパク質の精製）
溶液は以下を含む：緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、４Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ）；
緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、４Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ）；
およびストリップ緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、１０ｍＭグルタチオン、１．５  ＮａＣｌ）。
【０４０７】
粗溶解物（または上記からのプールした画分のような他のタンパク質供給源）を、「ＨＩＧＨ−Ｑ−５０」（Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）カラムに４．０ｍｌ／分の流速で充填した。
【０４０８】
次いで、カラムを４．０ｍｌ／分の流速で５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。
【０４０９】
これらの洗浄の後、グラジエントを開始し、そして１５カラム容量で緩衝液Ａから緩衝液Ｂへと移行した。次いで、グラジエントは１カラム容量の１００％緩衝液Ｂへと進んだ。例示のグラジエントを図４Ａに示す。画分を１０分ごとに採取した。４７０−２０−１／ｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質の純度を標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し（図４Ｂおよび図４Ｃ）、そして関連する画分をプールした（ほぼ画分３４〜３７、図４Ｃ）。
【０４１０】
（Ｃ．抗４７０−２０−１抗体の調製）
精製４７０−２０−１／ｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質をウサギにフロインドアジュバントで皮下注射した。０日目および２１日目に約１ｍｇの融合タンパク質を注射し、そしてウサギ血清を、代表的には６週目および８週目に採取した。
【０４１１】
第２のウサギを精製ｓｊ２６ｈｉｓタンパク質で同様に免疫化した。
【０４１２】
４７０−２０−１／ｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質、ｓｊ２６ｈｉｓタンパク質、およびβ−ガラクトシダーゼ／４７０−２０−１融合タンパク質を発現する細菌から小量の溶解物を調製した。
【０４１３】
この溶解物をゲルで分画し、そして膜に移した。２匹のウサギ由来の血清を用いて別々のウエスタンブロットを行う。
【０４１４】
４７０−２０−１誘導タンパク質で免疫化した動物由来の血清は、ｐＧＥＸ  ＭＯＶまたは４７０−２０−１挿入物含有ｐＧＥＸ  ＭＯＶのいずれかを用いて形質転換した、ＩＰＴＧ誘導Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の少量の溶解物中の全てのｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質と免疫反応性である。この血清はまた、４７０−２０−１λｇｔ１１構築物由来の少量の溶解物中の融合タンパク質と免疫反応性である。
【０４１５】
第２のウサギ血清は少量の溶解物中のｓｊ２６ｈｉｓおよび４７０−２０−１／ｓｊ２６ｈｉｓ融合タンパク質の両方と免疫反応性てある。この血清は、４７０−２０−１λｇｔ１１構築物由来の少量の溶解物中の４７０−２０−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質と免疫反応性であるとは予想されない。血清はいずれもβ−ガラクトシダーゼと免疫反応性であるとは予想されない。
【０４１６】
融合タンパク質で免疫化した動物由来の血清に存在する抗４７０−２０−１抗体を（４７０−２０−１リガンドを用いた）アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０４１７】
あるいは、融合タンパク質を切断してｓｊ２６タンパク質配列を含まない４７０−２０−１抗原を提供し得る。次いで、４７０−２０−１抗原を単独で用いて上記のように抗体を作製する。
【０４１８】
（実施例９  ウサギ抗ペプチド血清）
ＨＧＶ配列全体を含むように、特に非構造遺伝子および構造遺伝子中の各々の官能基を含むようにペプチドを設計した。ペプチドを従来の技術により商業的に合成させた。代表的なペプチドを表１２に示す。
【０４１９】
【表１２】
2006115845.tif 000020
ペプチドをＫＬＨに連結した。ウサギを宿主として用いて、結合ペプチドを複数の部位に皮下注射した。抗ペプチドウサギ血清を商業機関に作製させた。２週間の免疫化プロトコルを用い、採血を隔週に行った。
【０４２０】
ウサギ抗ペプチド血清はペプチド特異的であり、そして高い力価を有することが示された。ウサギ抗ペプチド血清はまた、Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスにおいて発現される対応する組換えタンパク質を認識する。抗体の終点力価は１：５０，０００希釈から１：６２５，０００希釈の範囲である。ウサギ抗ペプチド７（ＮＳ４ａ）は、わずか１：１，０００の低い終点力価を有していた。従って、例えば、バキュロウイルス系で発現されたＮＳ４ａタンパク質に対するウサギ抗血清は、より有用な試薬であり得る。
【０４２１】
ウサギ抗ペプチド血清は、例えばバキュロウイルスおよびワクシニアウイルスにおいて発現される対応するＨＧＶタンパク質の免疫沈降に有用である。ウサギ抗ペプチド血清はまた、ＨＧＶ抗原を検出するためのＥＩＡにおける捕捉抗体としても有用である。ウサギ抗ペプチド血清はさらに、ＨＧＶタンパク質の特徴付けに有用である。
【０４２２】
（実施例１０  血清学）
（Ａ．血清パネルのウエスタンブロット分析）
４７０−２０−１融合抗原（上記）を用いて血清パネルをスクリーニングした。多くのパネルは、肝炎を患う個体および非感染コントロールの両方に由来するヒト血清であった。
【０４２３】
アフィニティー精製した４７０−２０−１融合抗原（実施例８）を２μｇ／ｃｍで１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。ゲルを２００Ｖで２時間電気泳動した。抗原をゲルからニトロセルロースフィルターへ移した。
【０４２４】
次いで、１％のウシ血清アルブミン、３％の正常なヤギ血清、０．２５％のゼラチン、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％の脱脂粉ミルクの溶液を用いて２時間ブロックした。次いで膜を乾燥し、そして１ｍｍ〜２ｍｍの細片に切り出した；各細片は４７０−２０−１融合抗原を含んでいた。細片を、代表的には、ＴＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて再水和し、そして室温に保持して一晩パネル血清（１：１００）中でインキュベートした。
【０４２５】
細片を２回、各回ともＴＢＳプラス「ＴＷＥＥＮ  ２０」（０．０５％）中で５分間洗浄し、次いで２回（各回ともＴＢＳ中で）５分間洗浄した。次いで、細片を室温に保持して１時間二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ  抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ結合体、１：７５００）中でインキュベートした。次いで、細片を、ＴＢＳ＋「ＴＷＥＥＮ  ２０」中での細片５分間の洗浄を２回行い、次いでＴＢＳ中での５分間の洗浄を２回行った。
【０４２６】
ｐＨ９．５の緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中にＢＣＩＰ（実施例２）およびＮＢＴ（実施例２）を含有する基質溶液中で細片をインキュベートすることにより、結合した抗体を検出した。発色を約１５分間進行させ、その時点で蒸留Ｈ２Ｏ中で３回の洗浄により発色を停止させた。
【０４２７】
試験血清は以下のグループの個体に由来した：（ｉ）血液ドナー、ＨＢＶ  Ａｂ、表面Ａｇについて陰性、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１  Ａｂについて陰性；（ｉｉ）ＨＢＶ、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した個体由来の血清；（ｉｉｉ）ＨＣＶ、第２世代ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて反応性であるためＣ型肝炎ウイルスに感染した個体由来の血清；および（ｉｖ）ＨＸＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、またはＨＥＶについて血清学的に陰性な個体。
【０４２８】
これらのスクリーニングの結果を表１３に示す。
【０４２９】
【表１３】
2006115845.tif 000021
これらの結果は、多くの異なる血清サンプルにおける４７０−２０−１抗原の存在を示唆する。抗原は正常なヒト血清とは免疫反応性でない。
【０４３０】
（Ｂ．  抗体の検出のための一般的なＥＬＩＳＡプロトコル）
ポリスチレン９６ウェルプレート（「ＩＭＭＵＬＯＮ  ＩＩ」（ＰＧＣ））を、０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中の５μｇ／ｍｌ（１ウェル当たり１００μＬ）の抗原でコートする。プレートを「ＰＡＲＡＦＩＬＭ」でシールし、そして一晩４℃で保存する。
【０４３１】
プレートを吸引し、そして３００μＬの１０％の正常なヤギ血清でブロックし、そして３７℃で１時間インキュベートする。
【０４３２】
プレートをＰＢＳ  ０．５％「ＴＷＥＥＮ  ２０」で５回洗浄する。
【０４３３】
抗血清を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２で希釈する。１つまたは複数の抗血清（０．１ｍＬ）の所望の希釈液を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ  ０．５％「ＴＷＥＥＮ  ２０」で５回洗浄した。
【０４３４】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒト抗血清（Ｃａｐｐｅｌ）をＰＢＳで１／５，０００に希釈する。この溶液の０．１ｍＬを各ウェルに添加する。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで５回洗浄する。
【０４３５】
Ｓｉｇｍａ  ＡＢＴＳ（基質）をプレートへの添加の直前に調製する。
【０４３６】
試薬は、５０ｍｌ、０．０５Ｍのクエン酸（ｐＨ４．２）、０．０７８ｍｌ  ３０％の過酸化水素溶液および１５ｍｇのＡＢＴＳからなる。０．１ｍｌの基質を各ウェルに添加し、次いで室温で３０分間インキュベートする。０．０５０ｍＬの５％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の添加により反応を停止させる。相対吸光度を４１０ｎｍで測定する。
【０４３７】
（実施例１１  選択されたＨＧＶ抗原の発現）
ＨＧＶのコード配列全体を５０より多い別個の重複するｃＤＮＡフラグメントにサブクローン化した。ほとんどのｃＤＮＡフラグメントの長さは約２００ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲であった。ｃＤＮＡフラグメントを別々に発現ベクターｐＧＥＸ−ＨｉｓＢにクローン化した。
【０４３８】
このベクターは上記のｐＧＥＸ−ＭＯＶに類似する。
【０４３９】
ｐＧＥＸ−ｈｉｓＢは、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ａ０１４３８；市販の発現ベクター）を改変したものである。ベクターｐＧＥＸ−２Ｔは、トロンビン切断部位の下流に直接ＮｃｏＩを挿入することにより改変されている。この部位には、ＢａｍＨＩ部位が続き、それにポリヒスチジン（６つのヒスチジン）コード配列が続き、そこにｐＧＥＸ−２Ｔに見出されるＥｃｏＲＩ部位が続く。目的のコード配列は、代表的には、ＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入される。図６（配列番号１１５）において、挿入される配列はＧＥ３−２抗原をコードする。ベクター配列の残りはｐＧＥＸ−２Ｔと同一である。融合タンパク質の発現は本質的に他のｐＧＥＸ由来発現ベクターを用いた上記のように行う。
【０４４０】
全ての５０のフラグメントのクローニングを本質的に以下に記載するように行った。ここで、特異的プライマーは５０のコード領域の各々について選択した。ＰＮＦ２１６１または他のＨＧＶ（＋）血清から抽出したＲＮＡから、実施例４Ｃに記載されるように特異的なプライマーセットを用いて各ＨＧＶ挿入ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。代表的には、５’プライマーはＮｃｏＩ制限部位を含み、そして３’プライマーはＢａｍＨＩ制限部位を含んでいた。増幅フラグメント中のＮｃｏＩプライマーにより、発現ベクターｐＧＥＸ−ＨｉｓｂまたはｐＧＥＸ  ＭＯＶ中のＧＳＴ−ｓｊ２６コード配列に対する増幅コード配列のインフレーム融合が可能になった。
【０４４１】
増幅ＨＧＶ挿入ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化する。消化した挿入ＤＮＡをゲル精製し、そしてＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ消化したｐＧＥＸ  ｈｉｓＢまたはｐＧＥＸ  ＭＯＶと連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ＃２７３２５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をライゲーション産物で形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを選択した。挿入された分子に隣接するｐＧＥＸベクター配列に相同なプライマー（プライマーＧＬＩ  Ｆ（配列番号２３５）およびＧＬＩ  Ｒ（配列番号２３６）を用いてアンピシリン耐性コロニー由来の挿入物のＰＣＲ増幅により、挿入物の存在を確認した。
【０４４２】
ＰＣＲ増幅産物のサイズは挿入物のサイズ＋ベクター由来の約１６０ｂｐである。適切な挿入物による形質転換体を選択し、そして実施例７に記載されるようにＩＰＴＧによるタンパク質誘導に供した。発現された組換えタンパク質を、ウエスタンブロットにより、推定のＨＧＶ感染ヒト血清に対する特異的免疫反応性について分析した。
【０４４３】
ＧＥ３、ＧＥ９、ＧＥ１５、ＧＥ１７、ＧＥ４、ＥＸＰ３、ＧＥＩ−ＮおよびＧＥ−５７と称する８つのフラグメントが、推定のＨＧＶ感染ヒト血清と反応させたとき明らかな免疫原性反応を与える抗原をコードしていた。
【０４４４】
（Ａ．  ＧＥ３、ＧＥ９、ＧＥ１５、ＧＥ１７、ＧＥ４、ＥＸＰ３、ＧＥＩ−ＮおよびＧＥ５７のクローニング）
クローンＧＥ３、ＧＥ９、ＧＥ１５、ＧＥ１７、ＧＥ４、ＥＸＰ３、ＧＥＩ−ＮおよびＧＥ５７のコード配列挿入物を、ＰＮＦ２１６１またはＴ５５８０６から得たＳＩＳＰＡ増幅２本鎖ｃＤＮＡまたはＲＮＡから、各フラグメントに特異的なＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により作製した。以下の表１４に、各クローンの配列番号１４に対する位置および各クローン挿入物の作製に使用したプライマーセットを列挙する。
【０４４５】
【表１４】
2006115845.tif 000022
ＧＥ５７のアミノ酸配列を配列番号２４１として表されている。
【０４４６】
ＧＥ３−５’プライマー（ＧＥ−３Ｆ、配列番号４６）において、サイレント点変異を導入して、天然のＮｃｏＩ制限部位を修飾した。上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を作製した。増幅産物をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして再びゲル精製した。精製ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ  ＧＥ３、ＧＥ９、ＧＥ１５、ＧＥ１７、ＧＥ４、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７フラグメントを、脱リン酸化、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＧＥＸ−ＨｉｓＢベクターに独立に連結した。精製ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ  ＥＸＰ３フラグメントを、脱リン酸化、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＧＥＸ−ＭＯＶベクターに連結した。
【０４４７】
各ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株に形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを選択した。アンピシリン耐性コロニーをＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁し、そしてプライマーＧＬＩ  Ｆ（配列番号２３５）およびＧＬＩ  Ｒ（配列番号２３６）を用いるＰＣＲにより分析し、挿入配列の存在について確認した。８つの候補クローンをそれぞれ、ＧＥ３−２、ＧＥ９−２、ＧＥ１５−１、ＧＥ１７−２、ＧＥ４−８、ＥＸＰ３−７、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７と名付けた。
【０４４８】
（Ｂ．  ＧＥ３−２、ＧＥ９−２、ＧＥ１５−１、ＧＥ１７−２、ＧＥ４−８、ＥＸＰ３−７、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７融合タンパク質の発現）
ＧＥ３−２、ＧＥ９−２、ＧＥ１５−１、およびＧＥ１７−２、ＧＥ４−８、ＥＸＰ３−７、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７を含むベクターを有するアンピシリン耐性細菌のコロニーを、個々に、アンピシリンを含有するＬＢ培地に播種した。培養をＯＤが０．８〜０．９になるまで増殖させ、この時点でタンパク質発現を誘導するために、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を最終濃度が０．３ｍＭ〜１ｍＭになるように添加した。ＩＰＴＧの存在下でのインキュベーションを３〜４時間継続した。
【０４４９】
細菌細胞を遠心分離により回収し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液（０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％  グリセロール、５％  メルカプトエタノール、２．３％  ＳＤＳ）中に再懸濁した。再懸濁したペレットを５分間煮沸し、次いで、不可溶性細胞片を遠心分離により除去した。ＧＥ３−２、ＧＥ９−２、ＧＥ１５−１、ＧＥ１７−２、ＧＥ４−８、ＥＸＰ３−７、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７のＩＰＴＧ誘導培養物から得た上清液を、非誘導溶解物と共にＳＤＳ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。次いでこれらのゲルからタンパク質をニトロセルロースフィルターに移した（すなわち、ウエスタンブロットによる）。
【０４５０】
フィルターをまず、ＧＳＴタンパク質に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体（ＲＭ００１、Ｓｉｅｒｒａ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ製）とインキュベートして、適切なサイズのＧＳＴ融合タンパク質発現を検出した。上記クローンの予想されるタンパク質サイズは、それぞれ４０、３８、３９、３２、４２、６４、４２および３３ＫＤａである。融合タンパク質に対して適切な分子量のバンドとＲＭ００１の免疫反応性は、細菌細胞による上記クローンの融合タンパク質の成功した発現を示した。クローンタンパク質の発現はまた、クマシーブルー染色ゲル上のＩＰＴＧ誘導に際して適切なサイズの過剰発現タンパク質の出現によりモニターされる。
【０４５１】
（Ｃ．ＨＧＶタンパク質のウエスタンブロット分析）
一旦、ＨＧＶクローンタンパク質の発現を、抗ＧＳＴ抗体を用いるウエスタンブロット分析により確認されたなら、次に上記のように調製した第２のフィルターセットをいくつかのＨＧＶ（＋）およびＨＧＶ（−）ヒト血清に曝した。全細胞溶解物のウエスタンブロット分析のために使用されたヒト血清はλ−ｇｔ１１−ニトロセルロースフィルターに予め吸着させた。λ−ｇｔ１１−ニトロセルロースフィルターは以下のように調製した。簡単に述べると、ＫＭ３９２培養の一晩培養物をＬＢ中に調製した。この培養物を。０．２％マルトースを含有する新鮮なＬＢで１０倍希釈し、そして３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした。
【０４５２】
１時間後、培養物を等量のＭｇＣａ溶液（０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２および０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２）と混合した。この混合物に２×１０４ＰＦＵ／ｍｌの力価になるようにλｇｔ１１を添加し、そして振とうすることなく３０分間インキュベートした。３０分後、（このファージ／Ｅ．ｃｏｌｉ混合物の各ｍｌ当たり）１５ｍｌの溶解（５５℃）ＬＢ上層寒天（０．８％寒天を有するＬＢ）を加えた：この混合物の８ｍｌを、各１５ｃｍ  ＬＢ寒天プレート上に播いた。上層寒天が固化した後、プレートを３７℃で３〜５時間インキュベートした。
【０４５３】
プラークが生じた後、ニトロセルロースフィルターをプレート上に置き、そしてプレートをさらに一晩３７℃でインキュベートした。ニトロセルロースフィルターを除去し、そしてＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）プラス０．０５％の「ＴＷＥＥＮ  ２０」を用いて完全に洗浄した。洗浄したフィルターをＴＢＳ中の１％ゼラチンでブロックした。次いで、このフィルターをＴＢＳで３回洗浄した（各洗浄５  分）。
【０４５４】
ヒト血清の前吸着のために、各血清をブロック溶液（実施例１０に記載）に１００倍希釈した。次いで、１０ｍｌの希釈血清を、上記のように調製した２つのλｇｔ１１フィルターと一晩インキュベートした。λｇｔ１１フィルターを除去し、そして前吸着した血清をウエスタンブロット分析に用いた。
【０４５５】
ウエスタンブロット分析は、クローンＧＥ３−２、ＧＥ９−２、ＧＥ１５−１、ＧＥ１７−２、ＧＥ４−８、ＥＸＰ３−７、ＧＥ１−ＮおよびＧＥ５７がＨＧＶ（＋）血清に対して特異的な免疫反応性を示したことを明らかにした。ＧＥ−４−８タンパク質はＪ２１６８９血清と免疫反応性であった。Ｊ２１６８９はＨＧＶ  ＰＣＲ（実施例４）により測定されたようにＨＧＶ（＋）血清であり、そしてＨＣＶ  ＰＣＲおよび血清学的分析により測定されたようにＨＣＶ（＋）であった。ＥＸＰ３−７タンパク質はＪＣおよびＴ５５８０６と免疫反応性であった。ＪＣは、血液バンクにより高ＡＬＴであるため拒絶されている、実施例４Ｆにおいて同定されたＨＧＶ陽性血清である。最初の血清サンプルの１年後に採血された第２のＪＣサンプルもまた、ＰＣＲ分析によりＨＧＶ陽性であった。Ｔ５５８０６もまた、血液バンクにより高ＡＬＴであるため拒絶されている、実施例４Ｆにおいて同定されたＨＧＶ陽性血清てある。この血清はＨＣＶについても同時に陽性である。
【０４５６】
さらに、ＧＥ１５−１およびＧＥ−１７は、ＰＮＦ２１６１およびＴ５５８０６に対して弱いが、しかし特異的な免疫反応性を示した。ＧＥ１−ＮはＰＮＦ２１６１、ＪＣ、Ｔ５５８０６、Ｔ５６６３３、Ｔ２７０３４およびＲ０００１に対して免疫反応性であった。Ｔ５６６３３、Ｔ２７０３４およびＲ０００１は実施例４Ｆで同定されたＨＧＶ（＋）血清である。ＧＥ５７はＥ５７９６３およびＲ０００１と免疫反応性であった。Ｅ５７９６３はＨＧＶおよびＨＣＶについて同時に陽性の血清である。ＧＥ３−２およびＧＥ９−２もまた、ＨＧＶ血清と特異的に免疫反応性であった。しかし、８つの抗原はいずれも、ＨＧＶ陰性血清であるＴ４３６０８およびＲ０５０７２と免疫反応性でなかった。
【０４５７】
グルタチオン結合ビーズ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂら）および固定化金属イオンビーズ（Ｈｏｃｈｕｌｉら；Ｐｏｒａｔｈ）を使用する二重クロマトグラフィー法を用いて、本質的に実施例７のように細菌細胞溶解液からＧＥ３−２およびＧＥ９−２融合タンパク質を精製した。精製タンパク質を以下のようにウエスタンブロット分析に供した。
【０４５８】
種々の量の精製ＨＧＶタンパク質（例えば、ＧＥ３−２およびＧＥ９−２タンパク質）を１２％アクリルアミドゲルに充填した。ＰＡＧＥの後、標準的な手順を用いてタンパク質をゲルからニトロセルロース膜へ移した。個々の膜を、多くのヒト血清またはマウス血清のうちの１つとインキュベートした。過剰な血清は膜を洗浄することにより除去した。
【０４５９】
これらの膜を、スクリーニングに使用された血清に応じて、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒト抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。再び膜を洗浄して過剰なヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を除去し、そしてＮＢＴ／ＢＣＩＰに曝した。ＧＥ３融合タンパク質を有する染色された膜の例示の写真を図７Ａ〜図７Ｄに示す。
【０４６０】
これらの図は、以下の血清を用いる精製ＧＥ３−２タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す：Ｎ−（ＡＢＣＤＥ）ヒト（ＪＣ）血清（図７Ａ）、Ｎ−（ＡＢＤＥ）ヒト（ＰＮＦ２１６１）血清（図７Ｂ）、スーパーノーマル（ＳＮ２）血清（図７Ｃ）、およびＧＳＴ−ｓｊ２６タンパク質に対して惹起されたマウスモノクローナル抗体（ＲＭ００１）（図７Ｄ）。
【０４６１】
各図において、レーン１は予め染色した分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含み、そしてレーン２〜５はそれぞれ以下の量のＧＥ３−２融合タンパク質を含む：４μｇ、２μｇ、１μｇおよび０．５μｇ。数字は０．６ｃｍのゲル（ウェルサイズ）当たりのマイクログラム単位の充填量を表す。ヒトＪＣ、ＰＮＦ２１６１およびスーパーノーマル２血清の希釈は１：１００であった。抗ｓｊ２６希釈は１：１０００であった。ＪＣブロットにおいて約９７Ｋに見られたバンドは、ＧＥ３．２融合タンパク質調製物における少量の混入物に対して反応性である。タンパク質マーカーサイズは１４２．９ＫＤ、９７．２ＫＤ、５０ＫＤ、３５．１ＫＤ、２９．７ＫＤおよび２１．９ＫＤである。
【０４６２】
図７Ａ〜図７Ｄに示されるように、ＧＥ３−２はＪＣ血清と特異的な免疫反応性を示した。ＧＥ３−２は、ＰＮＦ２１６１血清とは弱く反応し、そして不確かまたは陰性としてスコアされ得る。
【０４６３】
平行実験において、ＧＥ９−２は、ＰＮＦ２１６１血清に対して弱いがしかし特異的な免疫反応性を示した。
【０４６４】
（実施例１２  例示のエピトープライブラリーの構築）
（Ａ．  Ｙ５ライブラリー）
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡから３つの重複するＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡを、ＪＭＬ−Ａ／Ｂリンカー（配列番号５４および配列番号５５）を用いて調製した。１μｌのこの物質を、１μＭのＪＭＬ−Ａプライマーを用いて、３０サイクル（９４℃で１分、５５℃で１．５分および７２℃で２分）で再増幅した。総反応容量は１００μｌであった。３つのこれらの増幅からの産物を合わせ、そして製造者の指示に従って、「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）に１回通すことにより過剰のＰＣＲプ  ライマーから分離した。「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」はシリカベースの樹脂であり、高イオン強度緩衝液中でＤＮＡを結合し、そして低イオン強度緩衝液中でＤＮＡを遊離する。増幅したＤＮＡを、１００μｌの蒸留水でカラムから溶出した。
【０４６５】
溶出したＤＮＡを１．５％アガロースＴＢＥゲルで分画し（Ｍａｎｉａｔｉｓら）、エチジウムブロミド染色後にＵＶ光で可視化した。強い不鮮明な（ｓｍｅａｒ）なＤＮＡフラグメントが、１５０〜１０００ｂｐの間で観測された。１μｌの再増幅ｃＤＮＡを、表１５に示す各プライマー対によるＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用した。
【０４６６】
【表１５】
2006115845.tif 000023
プライマーを、表１５に示すサイズのＨＧＶ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅が生じるように設計した。増幅反応において、プライマー対を１μＭの濃度で使用した。
【０４６７】
増幅は、９４℃で１分、５４℃で１．５分および７２℃で３分の３０サイクルで、１００μｌの総反応容量であった。３つの異なるプライマー対のＰＣＲ反応のそれぞれは、予測されるサイズを有する産物の特異的増幅を生じた。各プライマー対の反応について、３つの独立したＰＣＲ反応からの増幅産物を合わせ、そして上記の「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」を用いて精製した。精製産物を５０μｌのｄＨ２Ｏで溶出した。
【０４６８】
各精製産物からのサンプル（１４μｌ、約１〜２μｇの各プライマー対の増幅ＤＮＡフラグメントを含む）を合わせた。３つの異なる増幅フラグメントのすべてを合わせたサンプルを、５μｌの１０×ＤＮＡｓｅ消化緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＰＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２）および２μｌのｄＨ２Ｏに添加した。この消化混合物から、１０μｌのサンプルを取り出し、そして５μｌのストップ溶液（１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を含むチューブ内に置いた。このサンプルを、０「分消化」の時点とした。残りの消化反応物を、２５℃に置いた。消化反応物に、１／２５希釈のＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
の１μｌを添加した。種々の時点で１０μｌのアリコートを取り出し、そして５μｌのストップ溶液と混合した。ＤＮＡｓｅＩ消化ＤＮＡ産物を、１．５％アガロースＴＢＥゲルで分析した。
【０４６９】
いくつかの消化実験の結果は、４０分の消化により１００〜３００ｂｐの範囲のサイズのＤＮＡフラグメントの良好な分布が得られることを示した。次いで、ＤＮＡｓｅＩ消化を繰り返し、室温で４０分間放置して完全に消化した。消化を１８μｌのストップ緩衝液の添加により停止し、そして消化ＤＮＡ産物を「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」を用いて精製した。「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」を５０μｌのｄＨ２Ｏで溶出し、そして溶出ＤＮＡを以下の反応混合物に添加した：７μｌの制限酵素緩衝液Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  １ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．９）、１×濃度）；１１μｌの１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ；および２μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｉｅｍ）。この反応混合物を３７℃で３０分間保った。その時点で、７０μｌのｐＨ  ８．０のフェノール／ＣＨＣｌ３を添加し、そして混合した。フェノール／ＣＨＣｌ３を除き、そして１回抽出して、ＤＮＡサンプルを含む１５０μｌの水性の総容量を得た。ＤＮＡを、２容量の無水エタノールおよび０．５容量の７．５Ｍ酢酸ＮＨ４を用いてエタノール沈澱した。ＤＮＡを、「ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ  ＭＩＣＲＯＦＵＧＥ」で、１５分間、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、４２℃で５分間乾燥し、そして２５μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【０４７０】
ＤＮＡを、５’リン酸化したＳＩＳＰＡリンカ−ＫＬ１（配列番号６２）およびＫＬ２（配列番号６３）に連結した。いくつかの異なる濃度のＳＩＳＰＡリンカーおよびＤＮＡを試験した。
【０４７１】
最も高い連結度（下記の通りの評価した）が、以下の連結反応条件下で生じた：１０μｌの総反応容量において、６μｌのＤＮＡ、２μｌの５．０×１０−１２Ｍ  ＫＬ１／ＫＬ２リンカー、１μｌの１０×連結緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、および１μｌの４００ユニット／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）。連結を、１６℃で一晩行った。
【０４７２】
２つの反応を、以下のように並行して行った。２μｌの連結物質を、１００μｌの総反応容量においてＫＬ１  ＳＩＳＰＡプライマーを用いて増幅した。（９４℃で１分、５５℃で１．５分および７２℃で２分の２５サイクル）。連結度を、１．５％アガロースＴＢＥゲルを用いる電気泳動によって、１／５のＰＣＲ反応増幅産物を分離することにより評価した。ゲルをエチジウムブロミドで染色し、そしてバンドをＵＶ光で可視化した。
【０４７３】
２連反応からの増幅産物を「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  ＣＯＬＵＭＮ」を用いて精製し、そして精製ＤＮＡを５０μｌのｄＨ２Ｏで溶出した。２５μｌアリコートのＰＣＲ  ＫＬ１／ＫＬ２増幅ＤＮＡを、３０μｌの総容量中３６ユニットのＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。反応を、３７℃で一晩行った。消化ＤＮＡを「セファデックスＧ２５」スピンカラムを用いて精製した。
【０４７４】
ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを、一晩の反応でλｇｔ１１アームに連結した。λｇｔ１１アームは、ＥｃｏＲＩで予め消化し、そしてウシ小腸アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で処理した。連結混合物を、製造者の指示に従って、「ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＧＯＬＤ  ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ  ＥＸＴＲＡＣＴ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージした。得られた組換えファージの力価量の測定を、ＫＭ−３９２のローン（ｌａｗｎ）上に、１／１０希釈のパッケージされたファージをプレート化することにより行った。この場合、プレートは、１００ｍｇ／ｍｌ溶液のｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；Ｓｉｇｍａ）の２０μｌおよび０．１Ｍ溶液のＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド；Ｓｉｇｍａ）の２０μｌを含有した。７５％を超える組換えファージを含有する、１．２×１０６ファージ／ｍｌの力価を得た。
【０４７５】
組換えプラークの割合を、プライマー１１Ｆ（配列番号２５）および１１Ｒ（配列番号
１３）を用いて、８個の無作為に選んだプラークのＰＣＲ分析により確認した。増幅ＤＮＡ（Ｆ１／Ｒ１、Ｆ２／Ｒ３、およびＦ４／Ｒ４）の消化物由来のＤＮＡフラグメントを含有するこのパッケージされたライブラリーはＤＮＡを増幅し、そしてＹ５ライブラリーと称した。
【０４７６】
（Ｂ．ＥＮＶライブラリー）
発現ライブラリー（ＥＮＶライブラリーと称する）を、以下のように作製した。
【０４７７】
１μｌのＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ増幅ＤＮＡを、以下のプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖増幅反応におけるテンプレートとして用いた：ＧＥＰ−Ｆ１５（配列番号１２８）およびＧＥＰ−Ｒ１５（配列番号１２９）、これらは５２５ヌクレオチドのＨＧＶフラグメントを生成する；ならびにＧＥＰ−Ｆ１７（配列番号１３０）およびＧＥＰ−Ｒ１６（配列番号１３１）、これらは７６５ヌクレオチドのＨＧＶフラグメントを生成する。
【０４７８】
ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、５２℃で１．５分間、そして７２℃で３分間の３５サイクルであった。増幅産物を精製し、そしてＤＮＡｓｅＩで消化した。ＫＬ１およびＫＬ２リンカーのｃＤＮＡへの連結、ＤＮＡフラグメントの増幅およびλｇｔ１１におけるライブラリーの構築は、実質的に実施例１２Ａに記載の通りに行った。ライブラリーの組換え頻度は、７０％を超えた。λｇｔ１１のフランキング領域由来のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による挿入物の分析によって、組換え頻度を確認し、そして挿入物のサイズ範囲が１５０〜５００ヌクレオチドであることが示された。
【０４７９】
（Ｃ．  ＮＳ３ライブラリー）
ＮＳ３と称する発現ライブラリーを、以下のように構築した。第一のフラグメントを、プライマー４７０ｅｐ−Ｆ９（配列番号１３２）および４７０ｅｐ−Ｒ９（配列番号１３３）ならびに（テンプレートとして）ＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ増幅核酸を用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。この増幅反応の予測される産物は７７７塩基対であった。増幅フラグメントを、ＴＡＥゲルでの分離によりゲル精製した。フラグメントを、「ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ」（Ｂｉｏ  １０１、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてさらに精製した。
【０４８０】
フラグメントＦ９／Ｒ９もまた、供給源物質として伸長クローンＧＥ３Ｌ−１１（配列番号４１）を用いて増幅した。増幅反応において、約２５ｎｇのＧＥ３Ｌ−１１を、テンプレートとして、Ｆ９およびＲ９プライマーをともに用いた。
【０４８１】
両方のＦ９／Ｒ９増幅は、９４℃で１分間、５２℃で２分間、および７２℃で３分間の３０サイクルで、「ＴＡＱＳＴＡＲＴ」（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌａ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いた。両反応からの増幅産物を合わせた。産物をＤＮＡｓｅＩで消化した（１０μｌのＧＥ３Ｌ産物および２５μｌのＰＮＦ  ＳＩＳＰＡ産物）。ＧＥ３Ｌに基づく増幅産物は、大多数の増幅産物出発物質を表した。ＫＬ１およびＫＬ２リンカーのｃＤＮＡへの連結、ＤＮＡフラグメントの増幅およびλｇｔ１１におけるライブラリーの構築は、本質的に実施例１２Ａに記載の通りに行った。
【０４８２】
得られた力価は２．５×１０６ファージ／ｍｌであった。そして組換えファージの割合は、９９％を超えると測定された。挿入物のサイズのポリメラーゼ連鎖反応分析によって、組換え頻度を確認し、そして挿入物のサイズ範囲が１５０〜５５０ヌクレオチドであることが示された。
【０４８３】
さらに、第二のフラグメントもまた、ＧＥＰ−Ｆ１０／ＧＥＰ−Ｒ１０プライマー（それぞれ、配列番号１３５および配列番号１３６）を用いて増幅した。１μｌのＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ増幅核酸をテンプレートとして使用した。５７０ヌクレオチドの予測されるフラグメントサイズが得られた。得られた増幅産物を、Ｆ９／Ｒ９増幅についての記載の通り操作した。このフラグメントについて得られた力価は、λｇｔ１１に挿入された場合、１．４７×１０６ファージ／ｍｌであり、組換え頻度は９０％であった。
【０４８４】
（Ｄ．  ＮＳ２ライブラリー）
ＮＳ２エピトープライブラリーを、実施例１２Ａに記載の方法論を用いて構築した。ＨＧＶタンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、およびＮＳ５ｂ）のすべてまたは一部を含有する４つのＤＮＡフラグメントを、１μｌのＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ  ＤＮＡ（本質的に、実施例１２Ａに記載の通りに調製した）から増幅した。ライブラリーを表１６に示されるプライマー、およびテンプレートとしてＳＩＳＰＡ増幅ＰＮＦ２１６２  ＤＮＡを用いて作製した。
【０４８５】
【表１６】
2006115845.tif 000024
すべての増幅は、９４℃／１分間、４８℃／２分間、および７３℃／３分間の３５サイクルであった。すべての増幅により、予測されるサイズのフラグメントが少なくとも得られた。増幅産物を混合して、約１：１：１：１の比にし、そして部分的にＤＮＡｓｅＩで消化した。上記のように、消化産物をＫＬ１  ＳＩＳＰＡリンカーに連結し、増幅し、そしてＥｃｏＲＩ消化した。消化フラグメントをλｇｔ１１内に連結した。連結産物をパッケージした。
【０４８６】
パッケージされた連結産物をプレート化した。得られたライブラリーを測定したところ、ライブラリーは約７０％の組換えファージを含有し、１５０〜５００ｂｐの挿入サイズが観測された。
【０４８７】
（Ｅ．ＶＮＳ５Ａライブラリー）
プライマー４７０ＥＸＴ４−２１８９Ｒ（配列番号１１９）および４７０ＥＸＴ４−２９Ｆ（配列番号１２０）を用いて、２．１ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントは、ＨＧＶタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ、ならびにＮＳ４ａの３’末端およびＮＳ５ｂの５’末端）の全コード配列を含有した。これらのプライマーを用いるＰＣＲ増幅を、実施例４Ｇに記載の通りに行った。以下のものを含む複数のＨＧＶ感染血清を用いて、首尾良い増幅が観察された：Ｔ５６６３３は、カットオフ値を超えるＡＬＴ値のために献血が拒否された献血者由来であった；サンプルＥ２１−ＡおよびＥ２０は、肝炎を患っているエジプト人個体由来であった；そして、サンプルＡＨ０５９１は、劇症肝炎を発症したオーストラリア人由来である。
【０４８８】
Ｅ２１−ＡおよびＥ２０の増幅産物を、本質的には実施例６に記載の通り、ベクターＴ／Ａ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡから入手した）のＴ突出部位にクローン化した。
【０４８９】
次いで、これらの２つのプラスミドからの２．１ｋｂ  ＨＧＶ挿入物を、約１５０ユニットの制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で、約２０μｇのプラスミドＤＮＡを消化することにより単離した。３７℃で一晩のインキュベーション後、消化産物を、ＴＡＥアガロースゲル電気泳動により分離した。産物を、目的のフラグメントを含有するアガロースゲルの切片から切り出した。アガロースを溶かし、そして遊離したＤＮＡの抽出を、製造者の指示に従って「ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ」キット（Ｂｉｏ  １０１、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。
【０４９０】
Ｅ２１−ＡおよびＥ２０のサンプルに由来する精製した２．１ｋｂフラグメント、ならびにサンプルＴ５６６３３およびＡＨ０５９１のＰＣＲ増幅から得られたＤＮＡフラグメントを、実施例１２Ａに記載の通りに、ＤＮＡｓｅＩで別個に消化した。４つのすべてのサンプルについて、消化条件を決定し、その結果、サイズが１００〜１０００ｎｔの間のフラグメントを単離した。精製およびトリミング（ｔｒｉｍｍｉｎｇ）（実施例１２Ａ）の後、４つのＨＧＶ感染サンプルのそれぞれに由来するフラグメントを、異なる組のＳＩＳＰＡリンカーに別個に連結した。連結後、ＤＮＡをＳＩＳＰＡ増幅した。
【０４９１】
増幅ＤＮＡを、約１００ユニットのＥｃｏＲＩで３７℃で一晩、別個に消化した。次いで、消化ＤＮＡを、Ｇ２５樹脂（５’３’Ｉｎｃ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を用いてスピンカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｔ５６６３３、ＡＨ０５９１、およびＥ２１−Ａのサンプル由来の消化ＤＮＡを１：１：１の比で合わせ、そしてＤＮＡ混合物を、実施例１２Ａに記載の通りに、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位に連結した。「ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩＩ  ＸＬ」抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてパッケージした後、得られたライブラリーをＩＰＴＧおよびＸＧＡＬの存在下でプレート化し、そして約１．０×１０６ファージ／ｍｌの力価および約７０％の組換え頻度であることが測定された。
【０４９２】
（実施例１３  エピトープライブラリーの免疫スクリーニング）
（Ａ．免疫反応性Ｙ５クローンの単離）
２つのＨＧＶ陽性血清（ＰＮＦ２１６１およびＪＣ）を、本質的には実施例２に記載の通りに、Ｙ５ライブラリーの免疫スクリーニングのために使用した。Ｙ５ファージライブラリーを、１プレート当たり、約１５、０００ファージで２０個のプレートにプレート化した。プレートを約５時間インキュベーションし、そしてニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）で一晩覆った。フィルターを、約６時間、ＡＩＢ（１％ゼラチン＋０．０２％アジ化Ｎａ）中でのインキュベーションによりブロック処理した。ブロックしたフィルターをＴＢＳで一回洗浄した。
【０４９３】
１０枚のＹ５ライブラリーフィルターを、攪拌しながら、ＰＮＦ２１６１血清とともに一晩インキュベーションした。そして１０枚のＹ５ライブラリーフィルターを、攪拌しながら、ＪＣ血清とともに一晩インキュベーションした。両血清は、ＡＩＢで１：１０に希釈した。非特異的な抗体結合を減少させるために、希釈した血清を、野生型λｇｔ１１を吸着させたニトロセルロースフィルターと一晩インキュベーションすることにより前処理した。
【０４９４】
フィルターを血清から取り出し、ＴＢＳで３回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトアルカリホスファターゼ結合２次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ；ＡＩＢで１／７５００に希釈した）で１時間インキュベーションした。フィルターを４回ＴＢＳで洗浄した。結合した２次抗体を、ＮＢＴおよびＢＣＩＰを含有するＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ９．５）中でフィルターをインキュベーションすることにより検出した。
【０４９５】
１次スクリーニングで陽性と判定されたプラークを拾い、そして５００μｌのＰＤＢ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、０．０２％ゼラチン）中に溶出した。免疫反応性のファージを、１００ｍｍプレート当たり１００〜５００プラークの総密度で溶出ファージを再プレート化することにより精製した。プレートを、本質的には上記の通りに、適切なＨＧＶ陽性血清で再度、免疫スクリーニングした。発色後、いくつかの単離された陽性プラークを拾い、そして５００μｌのＰＤＢ中に入れた。
【０４９６】
１  時間のインキュベーション後、２μｌの再精製ファージＰＤＢ溶液を、１１Ｆ（配列番号２５）および１１Ｒ（配列番号１３）ＰＣＲプライマーを含有するＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。これらのプライマーは、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位の７０ヌクレオチド（ｎｔ）の５’および９０ｎｔの３’に位置する配列に対して相同的である。ＰＣＲ反応物は、９４℃で１分間、５５℃で１．５分間および７２℃で２分間の３０サイクルにより増幅された。
【０４９７】
ＰＣＲ増幅反応物をアガロースゲルでサイズ分画した。精製プラークのＰＣＲ増幅により、単一プラーク増幅反応のそれぞれについて単一のバンドが得られた。この場合、増幅フラグメントは、ＤＮＡ挿入物＋１４０ｂｐの５’および３’のファージのフランキング配列を含有した。単一のバンドを生じるＰＣＲ反応物由来の増幅産物を、製造者の指示に従って「Ｓ−３００  ＨＲ」スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。ＤＮＡを定量し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化シーケンサー３７３Ａおよび適切なプロトコルを用いてＤＮＡ配列決定をした。
【０４９８】
ＪＣ血清によるＹ５ライブラリーの上記のスクリーニングの結果、表１７に示すポジティブストランドのクローンを精製し、そしてＤＮＡ配列決定をした。ポジティブストランドクローンは、配列番号１４に示すＨＧＶ配列−−ポリタンパク質リーディングフレームの５’から３’への翻訳物に対応する。
【０４９９】
【表１７】
2006115845.tif 000025
これらのクローンは、ＨＧＶの推定ＮＳ５タンパク質内の２つの免疫原性領域を示した。これらの２つの領域は、配列番号１４として示される配列に関連し、６６３６〜６８２１位および７２７８〜７３８５位である。
【０５００】
さらに、ＰＮＦ２１６１血清によるＹ５ライブラリーのスクリーニングの結果、表１８に示す以下のネガティブストランドクローンを精製し、そしてＤＮＡ配列決定をした。ネガティブストランドクローンは、配列番号１４に示すＨＧＶ配列に相補的な配列の５’から３’への翻訳物に対応する。
【０５０１】
【表１８】
2006115845.tif 000026
すべてのこれらの配列は、ＰＮＦ２１６１血清を用いて単離された元のＨＧＶクローン４７０−２０−１の部分を含有する。
【０５０２】
Ｙ５ライブラリー由来のさらなるエピトープクローンを、以下のように単離した。Ｙ５ライブラリーを、実施例１３に記載の方法を用いて、ＨＧＶ感染血清Ｊ２１６８９およびＴ５６６３３でスクリーニングした。４００を超える陽性プラークを得た。このことは、これらのＨＧＶ感染血清の両者により認識される強い免疫原性配列の存在を示す。これらの陽性プラークの１０個を精製し、そしてＤＮＡ配列決定をした。ＤＮＡ配列決定から得られた結果を、表１９に示す。
【０５０３】
【表１９】
2006115845.tif 000027
これらの配列の結果とこのライブラリーのスクリーニングから以前に得られた結果との比較により、これらのクローンは、すべて同一のエピトープを含有することを示した。このエピトープは、以前に単離されたエピトープクローンＹ５−１０内に含まれる。２つのクローン（Ｙ５−１１４−２ＢおよびＹ５−１２１−１９Ａ）は、それらの５’末端が、Ｙ５−１０、Ｙ５−１２、およびＹ５−２６の以前に観察された開始より、ＮＳ５ａのカルボキシ末端の方に１４アミノ酸近い所に位置するという事実により区別される。上記クローンのいずれも、クローンＹ５−１０で観察されたエピトープに対してその３’末端を内部に有しない。従って、このエピトープの最小配列は、アミノ酸配列（配列番号２７２）内に含有される。
【０５０４】
（Ｂ．ＥＮＶライブラリー由来の抗原性クローン）
ＥＮＶライブラリーをＨＧＶ血清Ｊ２１０９４てスクリーニングした。この血清（Ｊ２１０９４）は、第１世代（ｃ−１００）ＨＣＶ試験に基づき、ＨＣＶ陽性と同定された。ＰＣＲおよび他のＨＣＶ抗原を用いて、最初のＪ２１０９４血清サンプル、およびその後得られたＪ２１０９４サンプルのその後の試験は、血清供給源の個体はＨＣＶ感染していたことを確認した。ＨＧＶ核酸の存在についての証拠が、４７０−２０−１とＮＳ５とのプライマーの組を用いるＰＣＲ分析により得られた。
【０５０５】
多数のファージクローンが、Ｊ２１０９４血清と免疫反応性であると同定された。ファージをプラーク精製し、そして配列決定した。７個のクローン（Ｑ７−１２−１、Ｑ７−１６−２−２、Ｑ７−１５−２、Ｑ７−１７−２−１、Ｑ７−１９−１、およびＱ−７−１９−２−１）は、同一の挿入物を含有した。Ｑ７−１２−１のヌクレオチド配列を、配列番号１４３（ポリペプチド配列、配列番号１４４）として示す。
【０５０６】
さらに１個のクローン（Ｑ７−１６−１）を上記の方法により得た。これは、Ｑ７−１２−１と同じ５’末端を有するが、３’末端で２６アミノ酸短い。
【０５０７】
（Ｃ．  ＮＳ３ライブラリー由来の抗原性クローン）
Ｆ９／Ｒ９ファージおよびＦ１０／Ｒ１０ファージの１：１混合物を、以下の血清を用いてスクリーニングした：ＰＮＦ２１６１、Ｊ２１６８９およびＥ５７９６３。Ｊ２１６８９およびＥ５７９６３の両者は、（複数のプライマーを使用する）ＰＣＲによりＨＣＶおよびＨＧＶについて共に陽性と判定される血清である。それぞれの免疫スクリーニングは、１０個のプレートすなわち約１５０、０００個のファージからであった。これらのスクリーニングにおいて同定された免疫陽性クローンのいくつかは、以下の通りである。
【０５０８】
クローンＹ１２−１０−３（ポリヌクレオチド配列、配列番号１４５；ポリペプチド配列、配列番号１４６）を、Ｊ２１６８９血清との免疫反応性により同定した。このクローンは、ＨＧＶ  ＮＳ３由来の８８アミノ酸挿入物を発現する。
【０５０９】
クローンＹ１２−１５−１（ポリヌクレオチド配列、配列番号１４７；ポリペプチド配列、配列番号１４８）を、Ｅ５７９６３血清との免疫反応性により同定した。このクローンは、ＨＧＶのＮＳ３タンパク質由来の６４アミノ酸挿入物を発現する。この配列は、クローンＹ１２−１０−３に対して約７０アミノ酸の５’側に位置する。
【０５１０】
（Ｄ．  ＮＳ２ライブラリー由来の抗原性クローン）
複数の陽性プラークを、ＨＧＶ陽性血清Ｔ５６６３３でＮＳ２ライブラリーをスクリーニングすることにより単離した。１１個のこれらのプラークを引き続き精製し、そしてＤＮＡ配列決定をした。これらのプラーク内に含有される挿入物の位置（配列番号１４と比較して）を、表２０に示す。
【０５１１】
【表２０】
2006115845.tif 000028
すべての免疫クローンは、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分を発現する。このリーディングフレームは、ポリタンパク質をコードする配列に相補性であるＨＧＶポリヌクレオチドストランドによりコードされる。このＯＲＦは、配列番号１４に相補的な配列のｎｔ６３２２とｎｔ６８６５との間に広がる。相補ストランドのｎｔ６３８８に位置する翻訳開始部位として作用し得るメチオニンが存在し、このメチオニンは、１５９個のアミノ酸タンパク質の産生を可能にする。
【０５１２】
１１個の配列決定したすべてのクローンに共通な最小のアミノ酸配列は、（配列番号１４の相補ストランドと関連して）ｎｔ６３４２からｎｔ６６０６の間に位置している。ＨＧＶ−ＰＮＦ  ２１６１のネガティブストランドのこの領域によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号２７３として示す。
【０５１３】
免疫反応性ネガティブストランド領域のサブクローニングおよびその後のウェスタンブロット分析を、以下に記載する。
【０５１４】
（Ｅ．ＶＮＳ５Ａライブラリー由来の抗原性クローン）
ＶＮＳ５ａライブラリー由来の約１．５×１０５ファージをプレート化し、そして引き続いて実施例１３に記載の手順を用いてＨＧＶ陽性血清Ｊ２９３７４でスクリーニングした。ＶＮＳ５ａライブラリーのＪ２９３７４による免疫スクリーニングの結果、複数の陽性プラークを単離した。これらのプラークの６個を精製し、そして引き続いてＤＮＡ配列決定をした。得られたＤＮＡ配列の元の株を、いずれのＳＩＳＰＡリンカー配列がクローンの５’および３’末端に存在するかによって決定し得た。（配列番号１４と関連して）
得られたクローンの開始および終了の位置ならびにそれらの供給源の血清を、表２１に要約する。
【０５１５】
【表２１】
2006115845.tif 000029
これらのすべてのクローンは、共通してクローンＱ１１−２２−１の配列（配列番号２７４）を含有する。このアミノ酸配列は、Ｙ５−１０エピトープの最小配列に対してすぐ５’側に位置する。従って、このアミノ酸配列は、ＨＧＶＮＳ５ａのもう１つの独特なエピトープを（Ｙ５−１０およびＹ５−５とともに）定義する。これらの３つのＨＧＶ変異体の観察されたアミノ酸配列とＰＮＦ−２１６１単離物およびＪＣ単離物のアミノ酸配列との比較では、アミノ酸置換はほとんど見られない。
【０５１６】
（実施例１４  免疫反応性クローンのさらなる特徴付け）
（Ａ．  サブクローニング）
（１．Ｙ５クローン）
Ｙ５−１０、Ｙ５−１６、およびＹ５−５クローンを選択し、発現ベクターｐＧＥＸ−ＨｉｓＢにサブクローニングした。これらのクローンの末端での無関係のリンカー配列を除いたＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーはまた、（ｉ）各挿入物の（コード配列に対して）５’末端でのＮｃｏＩ部位、および（ｉｉ）各挿入物の３’でのＢａｍＨＩ部位が導入された。これらのプライマー（表２２を参照のこと）を用いて、ＤＮＡフラグメントを２μｌの純粋なプラークストックから増幅した。
【０５１７】
【表２２】
2006115845.tif 000030
増幅を、以下の通りに行った：９４℃で１分間、５０℃で１．５分間、および７２℃での２分間の３０サイクル。増幅後、得られたＤＮＡを、「ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ」、スピンカラムを用いて精製し、サンプルを５０μｌで溶出し、そしてＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで一晩消化した。３０ユニットの各酵素の最少量を、制限エンドヌクレアーゼ消化において使用した（ＮｃｏＩ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；ＢａｍＨＩ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０５１８】
消化したＰＣＲフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＧＥＸ−ＨｉｓＢに一晩連結した。各セットの連結したプラスミドを別個に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を熱ショックプロトコル（Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｍａｎｉａｔｉｓら）を用いて形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上で選択し、そして耐性クローンを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢの２ｍｌに接種した。非組換えｓｊ２６／ｈｉｓタンパク質を発現する培養物もまた、調製した。
【０５１９】
３７℃で一晩インキュベーション後、培養物を２ｍｌの新鮮なＬＢ＋アンピシリン中に１／１０に希釈し、そして３７℃でさらに１時間増殖させた。ＩＰＴＧを、０．２ｍＭの最終濃度に加え、そして培養物を３７℃でさらに３時間増殖させた。細菌を遠心分離によりペレット化し、そして細菌ペレットを１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ペレットに、１００μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０％グリシン、５％β−メルカプトエタノール、２．３％  ＳＤＳ）を加えた。得られた溶解物をボルテックスし、そして５分間１００℃に加熱した。各溶解物のアリコート（１５μｌ）を１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せた。
【０５２０】
発現したタンパク質を、電気泳動によりサイズ分画した。分離したタンパク質を、標準的技術（Ｈａｒｌｏｗら）を用いてゲルからニトロセルロースフィルターに移した。発現タンパク質を含有するもう１つのゲルを、クマシーブルータンパク質染色を用いて染色した。
【０５２１】
Ｙ５−１０、Ｙ５−５およびＹ５−１６のプラスミドを有する形質転換体は、著量の正しいサイズの組換え融合タンパク質を発現した。組換え融合体の同一性を、ｓｊ２６と特異的に免疫反応するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）を用いてウェスタンブロット（上記のように調製した）のインキュベーションにより確認した。
【０５２２】
拾ったコロニーが適切な挿入物を含有することを、以下の通りにしてさらに確認した。各コロニーのファージ溶液を、組換えクローンが接種されて発現が予想される細菌の少量を含有する爪楊枝で４０μｌのＴＥ溶液に接種することにより調製した。５μｌのサンプルを各溶液から取り出し、そして別個にＰＣＲ増幅した。
【０５２３】
増幅には、適切な正方向プライマー（例えば、Ｙ５−１０の発現が予想されるコロニーについてのＹ５−１０Ｆ）およびプラスミドｐＧＥＸ−ＨｉｓＢのクローニング部位の３’に位置する配列に相同的な逆方向プライマー（配列番号１０４）を用いた。ＰＣＲ増幅は、以下の２５サイクルであった：９４℃で１分間、５０℃で１．５分間および７２℃で２分間。
【０５２４】
さらに分析するために選択したすべてのコロニーは、これらの条件下で他の明らかなバンドは全くなく、正しいサイズのＤＮＡバンドを与えた。
【０５２５】
Ｙ５−１０、Ｙ５−１６、およびＹ５−５の挿入物から発現した抗原（ｓｊ２６−ｈｉｓ融合タンパク質として発現した）の免疫反応性を、以下のように測定した。上記のように調製した各粗溶解物のアリコート（１５μｌ）を、１２％アクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルター上にエレクトブロットした（「ＮＯＶＥＸ  ＭＩＮＩＣＥＬＬ  ＭＩＮＩＢＬＯＴ  ＩＩ」、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０５２６】
次いで、フィルターを、以下の血清の１つで、個別にインキュベーションした：ＪＣ、ＰＮＦ２１６１、および陰性コントロールとしてスーパーノーマル血清４（ＳＮ４）（ＲＯ５０７２）。さらに、１枚のフィルターを抗ｓｊ２６モノクロナール抗体（ＲＭ００１；Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）とインキュベーションした。
【０５２７】
予想されるように、Ｙ５−１０、Ｙ５−５、およびＹ５−１６の挿入物によりコードされる抗原を発現する細菌により産生される組換えタンパク質はすべて、ＪＣ血清と反応した。ＰＮＦ２１６１血清またはＳＮ４血清のいずれによっても反応性は観測されなかった。
【０５２８】
すべてのタンパク質は、抗ｓｊ２６モノクローナル抗体に対するそれらの反応性により測定されるように、同じようなレベルで発現されるようであった。Ｙ５−５およびＹ５−１０によってコードされるタンパク質を選択し、そしてさらに精製した。
【０５２９】
Ｙ５−５およびＹ５−１０含有ｐＧＥＸ−ＨｉｓＢベクターを保有するＥ．ｃｏｌｉを培養し、そして融合タンパク質の発現を上記のように誘導した。細胞を、フレンチプレスを用いて１５００ｐｓｉで、ＰＢＳ（２ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する）中で溶解した。粗溶解物をスピンし、細胞破砕物を除いた。上清を、高流速でグルタチオンアフィニティーカラムに載せ、そしてカラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。Ｙ５−５およびＹ５−１０融合タンパク質を、１０ｍＭグルタチオンを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．８）で溶出した。
【０５３０】
それぞれの融合タンパク質サンプルを緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．８、８Ｍ尿素を含有する）で１／１０に希釈し、そしてニッケルキレート化「ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ」ファーストフロー（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）カラムに載せた。それぞれのカラムを、夾雑物がそれ以上溶出されなくなるまで、緩衝液Ａで繰り返し洗浄した。融合タンパク質を、緩衝液Ａ中においてイミダゾールのグラジェントを用いて溶出した。イミダゾールグラジェントは、２０カラム容量において０〜０．５Ｍイミダゾールで行った。画分を集めた。
【０５３１】
分画のそれぞれのセットを、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いる標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｙ５−５およびＹ５−１０融合タンパク質含有画分を、別々にプールした。
【０５３２】
図８Ａ〜図８Ｄに、以下のサンプル（μｇ／レーン）のウェスタンブロット分析の結果を示す：レーン１、Ｙ５−１０抗原１．６μｇ；レーン２、Ｙ５−１０抗原０．８μｇ；レーン３、Ｙ５−１０抗原０．４μｇ；およびレーン４、Ｙ５−１０抗原０．２μｇ。ヒト血清ＪＣ（図８Ａ）およびスーパーノーマル２血清（図８Ｂ）を１：１００に希釈した。抗ＧＳＴマウスモノクロナール抗体ＲＭ００１（図８Ｃ）を１：１０００に希釈した。図８Ｄに、Ｙ５−１０抗原を示す。
【０５３３】
これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロースメンブレン上に移され、そしてポンソーＳタンパク質染色で染色される（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ；Ｓｉｇｍａ）。矢印は、Ｙ５．１０抗原の位置を示す。これらの結果は、Ｙ５−１０がＮ−（ＡＢＣＤＥ）ヒト血清ＪＣと特異的に免疫反応することを示す。
【０５３４】
図９Ａ〜図９Ｄに、以下のサンプルのウェスタンブロット分析の結果を示す：レーン１、Ｙ５−５抗原３．２μｇ；レーン２、Ｙ５−５抗原１．６μｇ；レーン３、Ｙ５−５抗原０．８μｇ；レーン４、Ｙ５−５抗原０．４μｇ；レーン５、Ｙ５−５抗原０．２μｇ；レーン６、ＧＥ３−２抗原０．４μｇ；およびレーン７、Ｙ５−１０抗原０．４μｇ。ヒト血清ＪＣ（図９Ａ）、Ｔ５５８０６（図９Ｂ）、およびスーパーノーマル２血清（図９Ｃ）を１：１００に希釈した。ＲＭ００１なる抗ＧＳＴマウスモノクローナル抗体（図９Ｄ）を１：１０００に希釈した。矢印は、抗原Ｙ５．５、ＧＥ３．２およびＹ５．１０の位置を示す。これらの結果は、Ｙ５−５抗原のＪＣ血清との特異的免疫反応性を示す。さらに、抗原ＧＥ３−２およびＹ５−１０は、Ｔ５５８０６と反応した。
【０５３５】
しかし、Ｙ５−５抗原は、ＨＧＶ陽性血清のＴ５５８０６と反応しなかった。
【０５３６】
Ｙ５−１０抗原をまた、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画した。ゲルをクマシーブルータンパク質染色を用いて染色した。ゲルを、レーザーデンシトメーターを用いて純度のために走査した。Ｙ５−１０融合タンパク質の純度は、約９５％であった。
【０５３７】
（２．  ＥＮＶクローン）
免疫クローン（Ｑ７−１２−１）を、ＥＮＶエピトープライブラリーをＨＧＶ陽性血清のＪ２１０９４でスクリーニングすることにより、最初に単離した。配列特異的プライマーを用いて、Ｑ７−１２−１λｇｔ１１クローン内に含有されるＨＧＶ挿入物を単離した。Ｑ７−１２−１挿入物を切り出し、そしてｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により確認した（配列番号２７５）。
【０５３８】
（３．ＮＳ３クローン免疫クローン）
（Ｙ１２−１５−１）を、ＮＳ３エピトープライブラリーをＨＧＶ陽性血清のＥ５７９６３でスクリーニングすることにより、最初に単離した。配列特異的プライマーを用いて、Ｙ１２−１５−１λｇｔ１１クローン内に含有されるＨＧＶ挿入物を単離した。Ｙ１２−１５−１挿入物を切り出し、そしてｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により確認した（配列番号２７６）。
【０５３９】
免疫クローン（Ｙ１２−１０−３）を、ＮＳ３エピトープライブラリーをＨＧＶ陽性血清のＪ２１６８９でスクリーニングすることにより、最初に単離した。配列特異的プライマーを用いて、Ｙ１２−１０−３λｇｔ１１クローン内に含有されるＨＧＶ挿入物を単離した。Ｙ１２−１０−３挿入物を切り出し、そしてｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。選択したクローンによる融合タンパク質の産生を、ウエスタンブロット分析により評価した。挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により確認した（配列番号２７７）。
【０５４０】
（４．ＮＳ２クローン）
配列番号１４のＮＳ２領域の配列に対して相補的な配列由来の複数のネガティブストランドの免疫クローンを単離した。ＨＧＶのネガティブストランドによりコードされる、少なくと２つの重要なＯＲＦが存在する。これらのＯＲＦの第１は、Ｑ９系列のクローンにより示され、上記に記載した。これらのＯＲＦの第２は、配列番号１４の相補体のｎｔ６７２３とｎｔ７２５９との間に位置し、そしてまた、ｎｔ６７７４に５’メチオニンを有する。第２のＯＲＦは１６２アミノ酸タンパク質をコードする。
【０５４１】
これらのネガティブストランドＯＲＦの両方の配列の選択された部分を、発現ベクターｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。これらのすべてのサブクローンを、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＮＦ２１６１  ＳＩＳＰＡ物質のＰＣＲ増幅により得た。従って、これらは、ＨＧＶ−ＰＮＦ  ２１６１変異体の配列を含有する。表２３に、配列番号１４の相補体に関連して、ＯＲＦの名称、サイズおよび位置を示す。
【０５４２】
【表２３】
2006115845.tif 000031
この表の最初の２行は、配列番号１４の相補体に関連して、ＮＳ２領域の５’および３’ネガティブストランドのＯＲＦの位置と同一である。残りの行は、９クローンのすべてにより発現された特定のヌクレオチド配列を示す。これらのクローンのいくつかは、推定されるＨＧＶの開始メチオニンのＯＲＦに対して５’に位置するアミノ酸を発現することに留意されたい。さらに、最後に示したクローンのＫ３ｐ−ＫＦ２／ＫＲ１は、指示部分の３’ＯＲＦが続く５’ＯＲＦの指示部分を発現するキメラ体であることに留意されたい。
【０５４３】
これらのＤＮＡフラグメントのすべてを、引き続きｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。
【０５４４】
挿入物を含有するクローンもまた、同定し、そして確認した。
【０５４５】
（５．ＮＳ５Ａクローン）
表２４に、いくつかのＮＳ５ａクローンおよびそれらが対応する配列番号１４の領域を示す。
【０５４６】
【表２４】
2006115845.tif 000032
これらの配列を、コードタンパク質抗原の発現のために、ベクターｐＧＥＸ−Ｎｄｅにクローン化した。
【０５４７】
（Ｂ．  選択されたＨＧＶサブクローンのウェスタンブロット分析）
上記のネガティブおよびポジティブの両ストランド構築物の反応性を測定するために、種々のＨＧＶサブクローンを発現する細菌由来の細胞全体の溶解物を、本質的に実施例１３Ｂに記載の通りに調製した。次いで、発現タンパク質のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、タンパク質をニトロセルロースフィルターに移し、そしてフィルターをＨＧＶ陽性血清またはコントロール血清（例えば、抗ＳＪ２６  ＭＡＢ  ＲＭ０１）でプローブした。ブロットを、適切なリポーター抗体でインキュベーションした。
【０５４８】
試験したＨＧＶタンパク質に関して、タンパク質ＮＯＲＦ−Ｆ３／Ｒ２に対して明瞭な免疫反応性を、Ｊ２１６８９およびＴ５６６３３のＨＧＶ血清で検出した。ＮＯＲＦ−Ｆ３／Ｒ２サブクローンは、Ｑ９系列のネガティブストランドのエピトープクローンによってもコードされるアミノ酸配列を発現する。ＨＧＶ血清Ｔ５６６３３で観測された強い反応性により、ＨＧＶのネガティブストランドのこの領域の免疫反応性が確認される。ＮＯＲＦ−Ｆ３／Ｒ２タンパク質の反応性は、ＨＧＶ陰性個体のＲ０４３１６または他の５つの試験したＨＧＶ陰性スーパーノーマル血清のいずれかに由来する血清では観測されなかった。
【０５４９】
さらなるブロットにより、他の主要な５’ＯＲＦクローンであるＮＯＲＦ  ＫＦ２−Ｒ４（これは、５’ネガティブストランドに位置するＯＲＦのカルボキシ末端半分のアミノ酸を発現する）は、ＨＧＶ陽性血清のＴ５６６３３と反応しないことが示される。この観測と上記のＱ９エピトープクローンの位置とを一緒にすることにより、ネガティブストランドのこの領域の免疫原性エピトープが上記の５５アミノ酸（配列番号２７３）内に含有されることを示唆する。この配列が、他のＨＧＶ抗血清（Ｊ２１６８９を含む）により認識されるという事実は、この配列に対する免疫反応性がＨＧＶ感染個体間に比較的広がっていることを示す。
【０５５０】
さらに、Ｙ１２−１０−３タンパク質との明瞭な免疫反応性がＨＧＶ感染血清のＪ２１６８９、Ｊ２９３７４、およびＥ５７９６３で観測された。この反応性の  特異性は、ＩＰＴＧによるＹ１２−１０−３タンパク質発現の誘導の非存在下において、ＨＧＶ抗血清Ｊ２９３７４またはＥ５７９６３との免疫反応性が観測さ  れないことにより、さらに支持される。Ｙ１２−１０−３に対する反応性は、７つの試験したスーパーノーマル血清のいずれを用いても観測されなかった。
【０５５１】
（実施例１５  マルチ抗原ＨＧＶ診断アッセイ）
上記のエピトープクローンはすべてのＨＧＶ  ＰＣＲ陽性血清と反応しないようであるが、これらのクローンの多くは、それらを試験したＨＧＶ感染血清の実質的な画分と反応する。そのうえ、これらのタン  パク質は、ＨＧＶ陰性血清と実質的な交差反応性を示してない。従って、タンパク質の個々の反応性を足し合わせるように、これらのタンパク質のいくつかを組  み合わせる診断アッセイを構築し得る。このようなアッセイは、ＨＧＶ陽性血清の検出のための比較的高い感度およびＨＧＶ陰性血清との比較的低いバックグランドの反応性を有することが予想される。
【０５５２】
このようなアッセイにおいて有用なエピトープ／抗原の例として、ＮＯＲＦ−Ｆ３／Ｒ２（ＮＳ２ネガティブストランド）、Ｙ１２−１０−３（ＮＳ３）、Ｑ１１−Ｆ２−Ｒ１（ＮＳ５ａ）、Ｙ５−１０（ＮＳ５ａ）、Ｙ５−５（ＮＳ５ａ）、Ｑ１１−Ｆ２−Ｒ２（ＮＳ５ａの２つのエピトープを組み合わせる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５３】
このアッセイについて、個々の抗原は、典型的には、ＨＧＶ陽性血清の異なる部分（ｓｕｂｓｅｔ）を認識した異なる独特のエピトープを含有する抗原から選択される。
【０５５４】
さらに、このような抗原は、典型的には、ＨＧＶ陰性血清と有為に反応しない。本発明のガイダンスに従って、有用なさらなる免疫原性クローンを単離し得る。
【０５５５】
マルチ抗原診断アッセイは、多くの形式を取り得る。１つの実施態様において、このアッセイは、５つのＨＧＶタンパク質のそれぞれならびにニトロセルロース短片（ｓｔｒｉｐ）または他の便利な固相形式上の離れた位置でのコントロールタンパク質の固定化を必要とし得る。あるいは、例えば、ＨＧＶ融合タンパク質の非ウイルス部分は、挿入または欠失のいずれかにより改変され得る。その結果、それらは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびその後のウェスタンブロット分析に際して容易に識別し得る位置に自然に移動する。次いで、短片を、試験血清中でインキュベーションする。結合した抗体の検出後、次いで血清は、（ｉ）免疫反応性である抗原の数、および（ｉｉ）免疫学的反応の強度に基づいて評価される。非ＨＧＶコントロールタンパク質に対する反応性は、血清判定ができないことを示す。非ＨＧＶタンパク質との反応性により、血清はＨＧＶ陰性と分類される。
【０５５６】
ＥＬＩＳＡに基づくスクリーニングアッセイを、単一の反応区域において精製した抗原タンパク質を組み合わせることにより、または２つ以上の反応性エピトープを単一タンパク質（例えば、ＨＧＶモザイクポリペプチド）として発現するタンパク質構築物を作製することにより形成し得る。モザイクポリペプチドを構築する方法は、本明細書中に記載されている。上記のＱ１１−Ｆ２−Ｒ２構築物は、実際、単一のポリペプチド鎖中に２つの個別的なエピトープをコードする「マトリックスタンパク質」を表す。ウェスタンブロット分析は、このようなＥＬＩＳＡスクリーニング試験のための確認アッセイとして作用し得る。
【０５５７】
あるいはまたはさらに、全長のＨＧＶタンパク質（例えば、Ｅ２、ＮＳ５ａおよびＮＳ３）は、単一反応区域内に置かれ得る。このようなタンパク質と反応性である血清はまた、ウェスタンブロットアッセイによりＨＧＶ陽性と確認され得る。
【０５５８】
（実施例１６  大きなＨＧＶポリペプチドの発現）
（Ａ．より大きなＨＧＶ抗原のＥ．ｃｏｌｉにおける発現）
（１．クローニングおよび発現）
ＨＧＶエピトープ（小さな重複するＨＧＶ構築物により、またはファージライブラリースクリーニングによりカバーされない）の立体配置を同定するために、より大きなＨＧＶタンパク質構築物を、予想される切断部位（Ｂａｚａｎら、１９８９；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０ｂ；Ｇｒａｋｏｕｉら、１９９３；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）に基づいて、ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ）内に作製した。個々のＨＧＶタンパク質構築物を、ｐＧＥＸベクターにクローン化したＨＧＶ配列と同様の様式で作製した。
【０５５９】
簡潔に記すと、選択したＨＧＶ配列を、ＨＧＶ配列特異的プライマーを用いて、ＨＧＶ（＋）ヒト血清供給源からＲＴ−ＰＣＲ増幅した。プライマーは、ｐＥＴベクターにおけるクローニング操作のために、適切な制限部位を含むように操作した。目的のコード配列を、典型的には、ベクター内のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入し、Ｔ７．Ｔａｇリーダー配列を伴う５’インフレーム融合およびヘキサマーヒスチジン配列を伴う３’インフレーム融合を作製した。Ｔ７．Ｔａｇ（１１個のアミノ酸配列）は、抗Ｔ７．Ｔａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ）を用いる融合タンパク質の検出を可能にする。融合タンパク質のカルボキシル末端のヒスチジンヘキサマーは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いるタンパク質の精製を可能にする。
【０５６０】
ＨＧＶフラグメントを、適切に消化したｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター内に連結した。連結産物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＨＭＳ１７４；Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ）に形質転換した。形質転換したＨＭＳ１７４由来のプラスミドＤＮＡを、プライマーＴ７Ｆ（配列番号１５７）およびＴ７Ｒ（配列番号１５８）を用いるＰＣＲによりＨＧＶ配列の存在について分析した。これらのプライマーは、挿入分子に隣接するｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターの配列に相同である。ＰＣＲ産物のサイズは、挿入サイズ＋ベクター由来の約２６０ｂｐであった。
【０５６１】
各構築物について、ＰＣＲ結果は挿入配列の存在を確認した。適切な挿入物を有する形質転換体を選択し、ＨＧＶ挿入物を有するプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＨＧＶタンパク質の発現のために、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ）に導入した。
【０５６２】
ＨＧＶタンパク質の発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。Ｔ７．Ｔａｇ融合タンパク質の発現を、クマシーブルー染色ゲル上で、予想されるサイズのタンパク質の出現により追跡した。融合タンパク質の発現を、抗Ｔ７．Ｔａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ）を用いるウェスタンブロット分析により確認した。ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターにおいて発現したＨＧＶタンパク質を、表２５に示す。発現した配列の開始点および終了点は、配列番号１４に関連して示す。ＧＥ−Ｃａｐのアミノ酸配列を、配列番号１８５に示す。
【０５６３】
【表２５】
2006115845.tif 000033
図１２に、Ｔ７．Ｔａｇモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により示される各ＨＧＶタンパク質の発現を示す。図１２のレーンは、以下の通りである：レーン１、予め染色された分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；レーン２、非誘導ＧＥ−Ｃａｐの溶解物；レーン３〜１１、それぞれＩＰＴＧ誘導溶解物であるＧＥ−Ｃａｐ、Ｅ１ａ、Ｅ２、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ４、およびＮＳ５ｂの溶解物。レーン１２は１μｇの精製ＮＳ５ａを含有した。各抗原の位置を矢の先で示す。図１２に示すように、すべてのＨＧＶタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された。
【０５６４】
（２．ｐＥＴベクターにおいて発現したＨＧＶタンパク質のウェスタンブロット分析）
ｐＥＴベクターにおいて発現したＨＧＶタンパク質のウェスタンブロット分析を、実施例１１Ｃに記載の通りに、Ｅ．ｃｏｌｉの全細胞溶解物および前吸着させた血清を用いて行った。これらの分析の結果により、いくつかのｐＥＴ  ＨＧＶタンパク質がＨＧＶ陽性ヒト血清と特異的に免疫反応性であるが、しかしＨＧＶ陰性ヒト血清とは免疫反応性でないことが示された。ＧＥ−ＮＳ２ｂ−１タンパク質は、Ｊ２１６８９血清と免疫反応性であった。ＧＥ−ＮＳ５ａ−３タンパク質は、ウェスタンブロット分析において、ＪＣ、Ｔ５５８０６、Ｔ５６６３３、Ｊ２１６８９、Ｅ５７９６３およびＲ０００１を含む、いくつかのＨＧＶ（＋）血清と免疫反応性であった。これらの血清の中で、Ｔ５５８０６、Ｊ２１６８９およびＥ５７９６３は、（ＰＣＲ分析により）ＨＣＶとも同時に陽性である。ＧＥ−ＮＳ２ｂ−１またはＧＥ−ＮＳ５ａ−３はいずれも、いくつかの試験したＨＧＶ陰性血清と免疫反応性でなかった。
【０５６５】
図１０Ａ〜図１０Ｆに、抗原ＧＥ−ＮＳ２ｂ  １およびＧＥ−ＮＳ５ａ３の反応性を試験する、一連のウェスタンブロット実験の例示的な結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｆの各ブロットにおけるレーンは、以下の通りである：レーン１、非誘導ＧＥ−ＮＳ２ｂの溶解物；レーン２、ＩＰＴＧ誘導ＧＥ−ＮＳ２ｂの溶解物；レーン３、非誘導ＧＥ−ＮＳ５ａの溶解物；およびレーン４、ＩＰＴＧ誘導ＧＥ−ＮＳ５ａの溶解物。各ブロットを、ヒト血清またはマウスのモノクローナル抗体でインキュベートした：図１０Ａ、Ｊ２９３７４；図１０Ｂ、Ｊ２１６８９；図１０Ｃ、Ｔ５６６３３；図１０Ｄ、Ｔ４３６０８（スーパーノーマル血清）；図１０Ｅ、抗Ｔ７．Ｔａｇ；および図１０Ｆ、クマシーブルー染色ゲル。用いた血清またはモノクローナル抗体を、各ブロットの上部に示す。ヒト血清は１：１００に希釈し、そして抗Ｔ７．Ｔａｇマウスモノクローナル抗体は１：１０００に希釈した。
【０５６６】
上記に挙げた血清に加えて、ＧＥ−ＮＳ５ａを用いて、さらにＨＧＶ−ＰＣＲ陽性血清をスクリーニングした。これらのすべての分析の結果により、ＧＥ−ＮＳ５ａ抗原と複数のＨＧＶ感染血清との反応性が示された。ＧＥ−ＮＳ５ｂは、ＨＧＶ（＋）血清のＪＣおよびＴ５５８０６と免疫反応性であったが、試験したＨＧＶ（−）陰性血清とは免疫反応性でなかった。図１３Ａ〜図１３Ｅに、抗原ＧＥ−ＮＳ５ｂの反応性を試験する、一連のウェスタンブロット実験の結果を示す。図の各ブロットにおけるレーンは、以下の通りである：レーン１、予め染色された分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；レーン２、非誘導ＧＥ−ＮＳ５ｂの溶解物；レーン３、ＩＰＴＧ誘導ＧＥ−ＮＳ５ｂの溶解物。
【０５６７】
各ブロットを、ヒト血清またはマウスのモノクローナル抗体でインキュベートした：図１３Ａ、抗Ｔ７．Ｔａｇモノクローナル抗体；図１３Ｂ、ＪＣ；図１３Ｃ、Ｔ５５８０６；および図１３Ｄ、Ｔ４３６０８（スーパーノーマル血清）。図１３Ｅはクマシー染色である。
【０５６８】
図１４Ａ〜図１４Ｄに、抗原ＧＥ−Ｅ２の反応性を試験する、一連のウェスタンブロット実験の結果を示す。図１４Ａ〜図１４Ｄの各々におけるレーンは、以下の通りである：レーン１、予め染色された分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；レーン２、非誘導ＧＥ−Ｅ２の溶解物；レーン３、ＩＰＴＧ誘導ＧＥ−Ｅ２の溶解物。各ブロットを、ヒト血清またはマウスのモノクローナル抗体でインキュベートした：図１４Ａ、抗Ｔ７．Ｔａｇモノクローナル抗体；図１４Ｂ、３８３１７８１；および図１４Ｃ、Ｔ４３６０８（スーパーノーマル血清）。図１４Ｄはクマシー染色である。用いた血清またはモノクローナル抗体を、各ブロットの上部に示す。ＧＥ−Ｅ２タンパク質は、ＨＧＶ陽性血清３８３１７８１と免疫反応性であったが、スーパーノーマル血清のＴ４３６０８とは免疫反応性でなかった（それぞれ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。
【０５６９】
抗原ＧＥ−ＣａｐおよびＧＥ−ＮＳ４ａはまた、ＨＧＶ（＋）血清Ｊ２１６８９と特異的に免疫反応性であった。
【０５７０】
（Ｂ．より大きなＨＧＶ抗原の昆虫細胞における発現）
組換えバキュロウイルスを用いるタンパク質発現は、以下の利点を提供する：（ｉ）高レベルの組換えタンパク質の発現、そして（ｉｉ）効率的なタンパク質の輸送および修飾を含む高等真核生物系の利点。この系は、輸送されるタンパク質（例えば、ＨＧＶ  Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ２ａ）の発現に特に有用である。
【０５７１】
（１．クローニングおよび発現）
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの昆虫細胞培養物であるＳｆ２１およびＡｕｔｏｇｒａｆａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角症（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルスの誘導体である「ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ」（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＨＧＶポリペプチドの発現のために用いた。確立されたプロトコルを用いて、昆虫細胞を培養し、そしてバキュロウイルスプラスミド転移ベクターと線状化バキュロウイルスＤＮＡとの同時トランスフェクションにより、組換えバキュロウイルスを作製した（Ｋｉｎｇ、１９９２）。バキュロウイルスプラスミド転移ベクターの構築には、従来技術を用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。
【０５７２】
バキュロウイルス転移ベクターｐＡｃＹＭ１（Ｋｉｎｇら、１９９２）を、ヒスチジンヘキサマーをコードする２本鎖オリゴヌクレオチドをベクターのＢａｍＨＩクローニング部位に連結することにより改変した（ベクターをｐＡｃＹＭＩＨと名付けた）。停止コドン（ＴＡＡ）を、ヒスチジンヘキサマー配列の後に置いた。これにより、ヒスチジンヘキサマーが発現タンパク質のカルボキシ末端に置かれる。親ベクターｐＡｃＹＭＩのＢａｍＨＩクローニング部位は、ｐＡｃＹＭＩＨ内にそのまま残り、ヒスチジンヘキサマーと種々の遺伝子をインフレームでクローン化するために使用し得た。ヒスチジンヘキサマーは、発現タンパク質の迅速で効率的な精製方法を提供する（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１）。
【０５７３】
第二のバキュロウイルス転移ベクター（ｐＶＴ−Ｂａｃ）もまた、同様に改変し、発現タンパク質のカルボキシ末端にヒスチジンヘキサマーが置かれる。ｐＡｃＹＭＩベクターと同様にｐＶＴ−Ｂａｃは、強力な後期ポリヘドリンプロモーターを含有する。さらに、ｐＶＴ−Ｂａｃはまた、強力な昆虫の輸送シグナル配列を備え、発現タンパク質の効率的な輸送を確実にする（Ｔｅｓｓｉｅｒら、１９９１）。ｐＶＴ−Ｂａｃベクターを、ヒスチジンヘキサマーをコードするの２本鎖オリゴヌクレオチドをベクターのＢａｍＨＩクローニング部位に連結することにより改変した（ｐＶＴ−ＢａｃＨベクターを得る）。親ベクターｐＶＴ−ＢａｃのＢａｍＨＩクローニング部位は、得られたｐＶＴ−ＢａｃＨ内にそのまま残り、昆虫のリーダー配列およびヒスチジンヘキサマー配列と遺伝子とともにインフレームでクローン化するために使用し得る。
【０５７４】
種々のＨＧＶ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを、逆転写ＰＣＲにより得た。ＨＧＶゲノムの領域を、予想される切断部位（Ｂａｚａｎら、１９８９；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０ｂ；Ｇｒａｋｏｕｉら、１９９３；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）に従って選択した。以下のプライマー対を、ＰＮＦ２１６１起源の核酸を用いるＲＴ−ＰＣＲ増幅反応において使用した：Ｅ１、配列番号２４２、配列番号２４３；Ｅ２Ｂ（ＨＧＶシグナル配列）、配列番号２４４、配列番号２４５；Ｅ２Ｃ（昆虫シグナル配列）、配列番号２４６、配列番号２４７；ＮＳ２ａ、配列番号２４８、配列番号２４９；ＮＳ２ｂ、配列番号２５０、配列番号２５１；ＮＳ３、配列番号２５２、配列番号２５３；ＮＳ４ａ、配列番号２５４、配列番号２５５；ＮＳ４ｂ、配列番号２５６、配列番号２５７；ＮＳ５ａ、配列番号２５８、配列番号２５９；ＮＳ５ｂ、配列番号２６０、配列番号２６１；およびＥ１−Ｅ２−ＮＳ２ａ、配列番号２６２、配列番号２６３。
【０５７５】
増幅したＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼで消化し、そしてＢａｍＨＩ切断したｐＡｃＹＭＩ、ｐＡｃＹＭＩＨ、ｐＶＴ−ＢａｃまたはｐＶＴ−ＢａｃＨベクターにクローン化した。Ｅ１およびＥ２のカルボキシ末端のアンカー（ａｎｃｈｏｒ）をコードする配列ならびにＮＳ５ｂのカルボキシ末端での疎水性配列を、その後のタンパク質精製を容易にするために除いた。
【０５７６】
ＨＧＶ配列を含有する組換えバキュロウイルスプラスミド転移ベクターを、線状化したバキュロウイルスＤＮＡとともに同時トランスフェクションした。そして組換えウイルスを、Ｘ−ｇａｌの存在下で白斑として選択した（Ｋｉｎｇら、１９９２）。組換えウイルスを、２回プラーク精製し、そして増殖させた。単層のＳｆ２１細胞は、細胞当たり５ｐ．ｆ．ｕの多重度で組換えバキュロウイルスを感染させ、そして２７℃で６０時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＮＮ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％「ＮＯＮＩＤＥＴ−Ｐ４０」）中で溶解した。封入体を、１４Ｋで５分間細胞サンプルをスピンすることにより単離した。封入体をタンパク質解離緩衝液（１０％２−メルカプトエタノール、１０％ＳＤＳ、２５％グリセロール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８、０．０２％ブロムフェノールブルー）中に再懸濁し、そして１００℃で１０分間インキュベートした。
【０５７７】
タンパク質の発現パターンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を、０．１％ＳＤＳ−１８％ＰＡＧＥにより分離し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
【０５７８】
大部分のＨＧＶタンパク質は高レベルに発現し、そしてクマシーブルー染色ゲル上で容易に検出し得た。ＮＳ５ａおよびＮＳ２ａポリペプチドを、３５Ｓメチオニンタンパク質標識により検出した（Ｋｉｎｇら、１９９２）。
【０５７９】
ＨＧＶ  Ｅ２タンパク質のグリコシル化を、以下のように試験した。Ｓｆ２１細胞を組換えバキュロウイルスで感染させ、そして上記のようにプロセスした。タンパク質を０．１％ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥにより分離し、「ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ−Ｐ」膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上にエレクトロブロットし、そしてマンノース残基に特異的なＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ凝集素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＤＩＧグリカン識別キット）と反応させた。自身のシグナル配列を伴って発現したＨＧＶ  Ｅ２タンパク質は、広範にグリコシル化されていた。このことは、予想されるＥ２シグナル配列がそのごとく機能し得ることを示す。
【０５８０】
（２．免疫蛍光アッセイ分析）
ＳＦ２１昆虫細胞を、上記のバキュロウイルスＨＧＶ構築物で感染させた。細胞を集め、１．５Ｋｒｐｍで３分間スピンし、１×ＰＢＳで洗浄し、そして再度スピンした。
【０５８１】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）（Ｋｉｎｇら、１９９２）について、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてガラススライドのウェルに載せ、細胞がスライドガラスのウェル内でサブコンフルエント層を形成するようにした。スライドガラスを風乾した。細胞を−７０℃で予冷したアセトンで１０分間固定し、ＰＢＳで５分間再度水和させた。過剰のＰＢＳをブロッティングにより除いた。固定した細胞を、以下の「ブロッキング」
緩衝液で１時間処理した：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、３％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、１％脱脂ミルクおよび０．１％ゼラチン。
【０５８２】
次いで、一次抗体を固定化細胞に加えた。一次抗体は、一連のヒトＨＧＶ陽性血清および陽性のコントロールモノクローナル抗体を含んだ。使用前に、血清を、昆虫細胞溶解物を用いて、非特異的タンパク質について前吸着させた。前吸着は、４℃で一晩行った。非感染のＳＦ２１細胞を、陰性コントロールとして用いた。選択した一次抗体（血清）の添加後、スライドガラスを２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳで数回洗浄し、そして過剰の緩衝液を除いた。次いで、フルオレセイン（０．５μｇ／ｍｌの濃度）で結合させた二次抗体を、スライドガラス上のサンプルに添加した。二次抗体についてのインキュベーション時間および温度は、一次抗体と同じであった。インキュベーション後、スライドガラスをＰＢＳで洗浄し、そしてカバースリップ（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｐ）を載せた。次いで、細胞の蛍光を、蛍光顕微鏡を用いて測定した。
【０５８３】
この分析の結果は、以下の通りであった。ＨＧＶ抗原Ｅ１−Ｅ２−ＮＳ２ａを発現する細胞は、４／１０のＨＧＶ陽性血清と免疫反応性であり、そしてさらに２／１０の血清と弱い免疫反応性であった。Ｅ１を発現する細胞は、１／１０の血清と弱い免疫反応性であった。
【０５８４】
Ｅ２を発現する細胞は、３／１０の血清と免疫反応性であり、そして１／１０の血清と弱い免疫反応性であった。ＨＧＶ抗原を有する細胞のいずれも、スーパーノーマルコントロール血清と免疫反応性でなかった。
【０５８５】
（３．バキュロベクターで発現したＨＧＶタンパク質のウェスタンブロット分析）
組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ２１昆虫細胞で発現したＨＧＶタンパク質のウェスタンブロット分析もまた、実施した。封入体を上記のように調製し、そしてウェスタンブロット分析に供した。ウェスタンブロット分析を、前吸着させた血清を用いて実施した。この分析の結果より、Ｅ２タンパク質（内在性のＨＧＶシグナル配列（Ｅ２Ｂ）を有する１つの変異体、および昆虫のシグナル配列を有する第２の変異体（Ｅ２Ｃ））はＨＧＶ（＋）血清の３８３１７８１と特異的に免疫反応性であることを示した。
【０５８６】
図１５Ａ〜図１５Ｄに、バキュロ抗原Ｅ２ＢおよびＥ２Ｃの反応性を試験した、一連のウェスタンブロット実験の結果を示す。図１５Ａ〜図１５Ｄの各ブロットにおけるレーンは、以下の通りであった：レーン１、予め染色された分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；レーン２、Ｅ２Ｂ溶解物；レーン３、Ｅ２Ｃ溶解物；レーン４、β−ガラクトシダーゼ溶解物。各ブロットを、ヒトまたはウサギの血清でインキュベートした：図１５Ａ、ウサギ抗Ｅ２抗体；図１５Ｂ、３８３１７８１（ＨＧＶ−ＰＣＲ陽性血清）；図１５Ｃ、３８３８８５７（ＨＧＶ陰性血清）。図１５Ｄはクマシー染色である。用いた血清またはウサギ抗体は、各ブロットの上部に示す。ヒト血清は１：１００に希釈し、そしてウサギ血清は１：１０００に希釈した。
【０５８７】
さらに、昆虫細胞で発現したＨＧＶ抗原ＮＳ２ｂタンパク質は、Ｊ２１６８９と免疫反応性であった。これらの結果は、ｐＥＴ発現ＨＧＶタンパク質で得られた結果と一致する。
【０５８８】
（Ｃ．より大きい抗原のワクシニアでの発現）
（１．クローニングおよび発現）
ＨＧＶゲノムの種々の領域を、発現のためにワクシニアウイルスゲノムに組み込んだ。例示的なＨＧＶポリペプチド発現ストラテジーを、図１６に示す。ワクシニアウイルスで発現したＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１変異体）タンパク質を、図１６に模式的に図示する。完全長のポリタンパク質を、予想されるタンパク質の領域を示す四角枠により示す（比率は合っていない）：Ｃ＝塩基性の高いタンパク質、４Ａ＝ＮＳ４Ａ、４Ｂ＝ＮＳ４Ｂ、５ａ＝ＮＳ５Ａ、５ｂ＝ＮＳ５Ｂ。ヌクレオチドの位置（ポリタンパク質の下部）を有する個々の四角は、ワクシニアウイルスでの発現についてのＨＧＶの例示的な領域を表す。四角内の数字は、組換えウイルスの命名を表す。ウイルス＃１は、ＨＧＶＴ５５８０６株の塩基性の高いタンパク質領域（配列番号１８５）由来であった。
【０５８９】
２組の組換えウイルスを作製した。第一の組は、ＨＧＶ  ｃＤＮＡの配列分析に基づく個々のタンパク質ドメインに対応するＨＧＶ配列を含有した（図１６、フラグメント＃１〜＃９）。第二の組は、複数のタンパク質ドメインに広がる、全長のＨＧＶゲノムにまでのＨＧＶ配列を含有した（図１６、＃１０、＃１１、＃１４）。
【０５９０】
ＨＧＶゲノムの種々の領域を、ワクシニア発現ベクターのマルチクローニング部位にクローン化した。組換えワクシニアウイルス発現系を用いた。これには、細菌性ファージのＴ７系および高レベルの誘導発現のためのＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃリプレッサーを含んでいた（Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６；Ｅｌｒｏｙ−ｓｔｅｉｎ、１９８９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、１９９２；Ｍｏｓｓら）。従って、組換えタンパク質は、誘導剤（例えば、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ））の存在下においてのみ発現される。直接的クローニングおよびＰＣＲの両方を用いて、プラスミドを構築した。後者において、ワクシニアベクターへのクローニングに適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を、使用したプライマー内に取り入れ、個々のＤＮＡフラグメントを増幅した。
【０５９１】
ポリヒスチジンタグもまた、発現タンパク質を精製する際に使用するために、個々のＨＧＶドメインを含む各クローン内に取り入れた。ＨＧＶ−ＰＣＲ増幅産物適切な制限酵素で消化し、そしてワクシニアベクター内に連結した。標的ＨＧＶ  ｃＤＮＡフラグメントを、相同組換えおよび薬剤（ミコフェノール酸）選択によりワクシニアウイルスゲノム内に組み込んだ（Ｆａｌｋｎｅｒ、１９８８、Ｅａｒｌ、１９９１）。組換えウイルスを４回プラーク精製した後、ウイルスストックを作製した。
【０５９２】
ヌクレオチド中の各クローンの長さを図１６に示す。小さなクローンの群（＃１〜＃９）は、ＨＧＶエピトープマッピングに有用である。大きなクローン（例えば、＃１０、＃１１および＃１４）もまた、ＨＧＶポリタンパク質の切断部位を実験的にマッピングするのに有用である。さらに、図１６に示すクローンの他に、ＮＳ３からＮＳ５ｂの多数のドメインを含む他の組換えウイルスが構築され得る。
【０５９３】
発現プラスミドを、親のワクシニアウイルスを感染させていた哺乳動物細胞にトランスフェクトした。ＣＶ−１およびＢＳ−Ｃ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充した最少必須培地（ＭＥＭ）中で維持した。この細胞を用いて、トランスフェクションし（ＣＶ−１）、そして組換えウイルスの選択および増殖（ＢＳ−Ｃ−１）を行った。
【０５９４】
（２．組換えタンパク質発現の評価）
ＢＳ−Ｃ−１細胞を、ＩＰＴＧの存在下または非存在下において７時間、組換えウイルスで感染させた。その後、細胞を３５Ｓ−メチオニンでさらに１時間標識した（Ｚｈａｎｇ、１９９１）。簡潔に記すと、１×１０６個のＢＳ−Ｃ−１細胞を細胞当たり１０プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）で１時間、組換えウイルスで感染させ、次いで、さらに６時間、５ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下または非存在下で培地を補充した。細胞を、メチオニンを含まない培地に２．５％の透析したウシ胎児血清＋６０ｕＣｉの３５Ｓ−メチオニン（「ＴＲＡＮ  ３５Ｓ−ＬＡＢＥＬ」、ＩＣＮ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）を補充した６００ｕｌの培地を用いて、５ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下または非存在下でさらに６０分間パルス標識した。次いで、標識細胞を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％「ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００」の存在下で、氷上で１０分間溶解させた。核をスピンダウン（ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）し、そして上清を分析のために集めた。
【０５９５】
細胞溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（Ｆｌｉｎｇ、１９８６；Ｓｃｈａｇｇｅｒ、１９８７）。ゲルを５０％メタノールおよび１０％酢酸で固定した後、フルオログラフ溶液「ＡＭＰＬＩＦＹ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で処理した。ゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルムに感光させた。
【０５９６】
この方法を用いて、挿入物＃４〜＃１１、および＃１４（図１６）を含有するウイルスによるＨＧＶポリペプチドの発現が確認された。他の領域に対応するポリペプチドの発現を、同様に確認した。例えば、ＮＳ５ａ構築物において、ＩＰＴＧの誘導の際に、特別なポリペプチドが産生され、これは４６ｋＤａタンパク質標準のすぐ下に移動した。このタンパク質は、ＩＰＴＧの非存在下での感染においては見られなかった。このことより、ＮＳ５ａ組換えタンパク質としての、このタンパク質の同一性を確証した。
【０５９７】
さらに、個々のウイルス感染物由来の３５Ｓ−Ｍｅｔ標識細胞溶解物に対するＨＧＶ領域特異的抗血清（例えば、目的の領域由来の単離されたＨＧＶポリペプチドに対して惹起したウサギ抗血清）を用いる限定された免疫沈降を、組換えウイルス由来のタンパク質発現を評価するために行った。例えば、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂの発現が確認された。組換えタンパク質発現を評価するための代替方法は、ＨＧＶ領域特異的抗血清でウェスタンブロット分析を行うことである。
【０５９８】
＃１４ウイルスにおいて全長のＨＧＶのポリタンパク質が発現された場合（図１６）、ＮＳ２、ＮＳ３およびＮＳ５Ａのプロセスされた産物が、ＨＧＶ領域特異的抗血清での免疫沈降を用いて検出された。このことは、ポリタンパク質のプロセシングを評価するための全長のＨＧＶクローンの有用性を示す。
【０５９９】
図１６に示す発現ストラテジーと類似の発現ストラティジーを用いて、候補のＨＧＶタンパク質／抗原を、酵母またはＣＨＯ細胞で発現し得る。酵母は、高レベルの発現、経済的な操作、および商業的生産のための規模拡大の容易さを提供する。ＣＨＯ細胞株は、例えば、ワクチン開発に有用な大規模なタンパク質生産および精製のための組換えタンパク質の増殖培地への分泌を可能にする。
【０６００】
（実施例１７  塩基性の高いタンパク質をコードするＨＧＶ）
（Ａ．ＰＮＦおよびＴ５５８０６由来のＨＧＶの翻訳における開始のために使用されるメチオニンの決定）
ＨＧＶ−ＰＮＦ  ２１６１変異体において、（配列番号１４に関連して）ヌクレオチド（ｎｔ）４５９に位置するメチオニンは、ポリタンパク質に関してインフレームである。「カプシド」領域は、３２アミノ酸の長さであるようである。単離した他のＨＧＶ（例えば、Ｔ５５８０６）では、この領域はさらに長い（例えば、約８３アミノ酸）。ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１変異体において、（配列番号１４に関連して）ｎｔ３４９に位置するメチオニンは、ポリタンパク質配列に関してインフレームでない。しかし、ＨＧＶ−Ｔ５５８０６変異体における同じ位置のメチオニンは、ポリタンパク質に関してインフレームである。ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１において、この位置で読み通しまたはリボゾームのフレームシフトが存在するかを確認するために、以下の実験を行った。
【０６０１】
以下のものを含む構築物を作製した：（ｉ）ＨＧＶＥ１領域の上流のすべてのＭＥＴコドンを有するＨＧＶゲノム配列（例えば、ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１では６個のこのようなＭＥＴが存在し、そしてＴ５５８０６では５個のこのようなＭＥＴが存在する）、（ｉｉ）リボゾームのシフトまたは読み通しを生じるか否かの決定を可能にする各構築物についての２つの異なる３’末端。所定のゲノムＤＮＡについて、両方の翻訳産物が同じサイズであれば、そのことは、翻訳産物が停止コドンで早まって停止したことを示唆する。一方、読み通しまたはフレームシフトが生じれば、２つの産物は５５アミノ酸違うことが予想される。
【０６０２】
ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１変異体およびＨＧＶ−Ｔ５５８０６変異体由来の配列を含有する合計２１個の構築物をｐＧＥＸベクターにサブクローン化し、そして対応するタンパク質をＥ．ｃｏｌｉで発現させた。得られた翻訳産物のサイズを、クマシー染色ゲルならびにモノクローナル抗ＧＳＴ抗体でブロットされるウェスタンとの両方により測定した。誘導サンプルおよび非誘導サンプルを、各構築物について調製した。
【０６０３】
この結果は、タンパク質産物のサイズが、ポリタンパク質に関してインフレームにある最初のＭＥＴでの翻訳開始により予想されるサイズに対応したことを示した。フレームシフトまたは読み通しの証拠はなかった。
【０６０４】
（Ｂ．  塩基性の高いタンパク質をコードする代替物）
Ｆｉｃｋｅｔｔ（１９８２）の方法を用いて、（ｉ）前記のポリタンパク質に代わり得る、（ｉｉ）ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１とＨＧＶ−ＪＣとの間の保存性を示す、そして（ｉｉｉ）ｐＨ１０以上に予想される等電点を有する、タンパク質を潜在的にコードし得る配列についてＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１およびＨＧＶ−ＪＣのゲノム配列を走査した。２つのこのような可能性を有するタンパク質が同定された。
【０６０５】
第一のタンパク質は、ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１において（配列番号１４に関連して）残基６２８〜残基８８２により、そしてＨＧＶ−ＪＣにおいて（配列番号１８２に関連して）残基５５６〜残基８１０によりコードされる。このタンパク質は８５アミノ酸の長さであり、ＨＦＶ９４−１とＪＣ９Ｂとの間の相同性は７５％より大きく、そして予想されるｐＩは１１．６〜１２．３である。
【０６０６】
第二のタンパク質は、ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１において（配列番号１４に関連して）残基６８４４〜残基７１２５により、そしてＨＧＶ−ＪＣにおいて（配列番号１８２関連して）残基６７７２〜残基７０５３によりコードされる。このタンパク質は９４アミノ酸の長さであり、ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１とＨＧＶ−ＪＣとの間の相同性は８８％より大きく、そして予想されるｐＩは１２．４〜１２．７である。
【０６０７】
これらの２つのタンパク質の例は、ＨＧＶの塩基性の高いタンパク質が潜在的に発現され得ることを表す。
【０６０８】
（実施例１８  さらなるＨＧＶ単離物のクローニングおよび診断プライマーの設計）
（Ａ．  ＨＧＶ−ＰＮＦ  ２１６１のｃＤＮＡクローンの構築）
ＰＮＦ２１６１由来のほぼ完全長のＨＧＶゲノムのｃＤＮＡクローンを、３個の重複したＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化することにより構築した。この構築に用いたＰＣＲ産物は、「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ」（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いる逆転写、その後の長い標的配列の増幅を可能にする反応条件を用いたＰＣＲ（「ｒＴｔｈ−ＸＬ」ポリメラーゼおよび「ＸＬ  ＰＣＲ  ＢＵＦＦＥＲＳ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により得た。これらの「長範囲（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）」ＰＣＲ反応のために使用したｒＴｔｈ酵素は、誤って取り込まれたヌクレオチドを訂正する校正活性（すなわち、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性）を有し、従って高い忠実度のＰＣＲを提供する。
【０６０９】
以下の３つの産物を用いて、ＨＧＶゲノムを構築した：（ｉ）ＧＶ７５−３６ＦＥ（配列番号２２８）およびＧＶ７５−７０６４ＲＬＥ（配列番号２２９）のプライマーを用いて増幅した６．７ｋｂの内部産物（配列番号１４のｎｔ２１０１〜ｎｔ８８３４）、（ｉｉ）２８Ｆ（配列番号２３０）およびＦＶ９４−２８６４Ｒ（配列番号２３１）を用いて増幅した２．８ｋｂの５’末端産物（配列番号１４のｎｔ３８〜ｎｔ２８９９）、および（ｉｉｉ）ＦＶ９４−６４３９Ｆ（配列番号２３２）およびＦＶ９４−９３３１Ｒ（配列番号２３３）を用いて増幅した２．９ｋｂの３’末端産物（配列番号１４のｎｔ６４４９〜ｎｔ９３６６）。
【０６１０】
最初に、６．７ｋｂの内部フラグメントを「ＴＡ−ベクター」ｐＣＲＩＩにクローン化し、クローンＨＧＶ７を作製した。続いて、６．１ｋｂＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをＨＧＶ７から除き、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ消化した２．８ｋｂの５’末端産物（プライマー２８Ｆは、人為的なＸｂａＩ部位を含有する）と合わせ、そしてＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＧＥＭ３Ｚにクローン化した。
【０６１１】
この８．８ｋｂクローン（これは、ＨＧＶゲノムの３’部分の約０．６ｋｂを欠く）を、ＨＧＶ−ＫＥＸ−２と称した。ほぼ完全長のＨＧＶゲノムを構築するために、３’末端ＨＧＶ産物をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（プライマーＦＶ９４−９３３１Ｒは、人為的なＥｃｏＲＩ部位を含有する）で消化し、そしてＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＨＧＶ−ＫＥＸ−２プラスミドにクローン化し、９３２９ｎｔのクローン化ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１配列（配列番号１４のｎｔ３８〜ｎｔ９３６６）を作製した。これを３Ｚ−ＨＧＶ９４−６と称する。３Ｚ−ＨＧＶ９４−６の完全配列を、配列番号２３４として示す。
【０６１２】
クローン３Ｚ−ＨＧＶ９４−６を用いて、インビトロ転写された完全長のＨＧＶ  ＲＮＡまたはその一部分を作製し得る（例えば、ＳＰ６ポリメラーゼを用いる）。ＲＮＡ分子を用いて、ヒト細胞株をトランスフェクトし得る。このアプローチを用いて、ウイルスゲノムの種々の領域をマップし、その複製を研究し、そしてヒト細胞におけるＨＧＶ病原性の機構を理解し得る（Ｒｉｃｅら、１９８９；Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら、１９９２；Ｙｏｏら、１９９５）。
【０６１３】
（Ｂ．ＪＣ変異体のクローニング）
１ｍｌのＪＣ血清を、４０，０００ｒｐｍで２時間スピンした（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｓｐｉｎｃｏ  Ｒｏｔｏｒ  ７０．１Ｔｉ）。得られたペレットを「ＴＲＩＲＥＡＧＥＮＴ」（ＭＲＣ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて抽出した結果、３つの相が形成された。上相はＲＮＡのみを含有した。この相を取り出し、そしてＲＮＡをエタノール沈澱により回収した。
【０６１４】
ＨＧＶ  ｃＤＮＡ分子を２つの方法によりＪＣサンプルから生成した。第一の方法は、特異的かつネスト（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いるＪＣ核酸サンプルの増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）であった。プライマー配列は、ＰＮＦ２１６１血清から得られたＨＧＶ配列に基づいた。プライマーを選択するために用いた判断基準は、（ｉ）高いＧ／Ｃ含量を有する領域、および（ｉｉ）非反復配列、であった。
【０６１５】
ＨＧＶ  ｃＤＮＡ分子を生成するために用いた第二の方法は、ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１）特異的プライマーを用いる増幅、その後の３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブを用いるＨＧＶ特異的配列の同定であった。このようなＤＮＡハイブリダイゼーションを、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記載されるように行った。ＰＣＲ由来のクローンは、以下のいずれかを行った：（ｉ）「ＴＡ」ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）へのクローン化およびベクタープライマー（ＴＡＲおよびＴＡＦ）を用いた配列決定、または（ｉｉ）ＰＣＲ増幅後の直接の配列決定。プローブ配列およびプライマー配列の両方は、ＰＮＦ２１６１血清から得られたＨＧＶ変異体に基づいた。
【０６１６】
これらの２つのアプローチにより、ＪＣ血清由来の多数の重複ＨＧＶフラグメントを得た。これらのフラグメントのそれぞれを、クローン化し、そして配列決定した。配列をアライン（ａｌｉｇｎ）して、配列番号１８２（ポリペプチド配列、配列番号１８３）として示されるＨＧＶ（ＪＣ変異体）のコンセンサス配列を得た。ＨＧＶ（ＪＣ変異体）ウイルスの各領域の配列は、少なくとも３つの異なる、重複した独立クローンからのコンセンサスに基づいた。
【０６１７】
（Ｃ．他のＨＧＶ変異体）
ＨＧＶ  ＰＮＦ  ２１６１変異体配列およびＪＣ変異体配列に加えて、３つの部分的なＨＧＶ単離物を、上記と同様の方法により、ＢＧ３４、Ｔ５５８０６およびＥＢ２０の血清から得た。これらの単離物の部分配列を以下に示す：配列番号１７６（ＢＧ３４核酸）、配列番号１７７（ＢＧ３４ポリペプチド）、配列番号１７８（Ｔ５５８０６核酸）、配列番号１７９（Ｔ５５８０６ポリペプチド）、配列番号１８０（ＥＢ２０−２核酸）、および配列番号１８１（ＥＢ２０−２ポリペプチド）。
【０６１８】
（Ｄ．診断ＰＣＲのための代わりのプライマー）
ＰＣＲプライマーおよび対応するアッセイ開発は、保存領域の解析に典型的に基づく、ＨＧＶゲノムの領域に由来し得る。ＨＧＶ−ＪＣ変異体とＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１変異体との比較に基づいて、ＨＧＶの５’非翻訳領域を、ＨＧＶ単離物の検出についてのさらなるＰＣＲに基づく診断試験の開発のために、このような領域の１つとして選択した。２つの例示的なプライマーは、ＦＶ−９４−２２Ｆ（配列番号１２４）およびＦＶ９４−７２４Ｒ（配列番号１２５）である。これらのプライマーは、ＨＧＶゲノムの約７２８ｂｐフラグメントを増幅する。
【０６１９】
配列分析を、ＨＧＶの３６個の単離物（ＰＮＦ２１６１およびＪＣを含む、表２６参照）についてこれらの２つのプライマーを用いた反応からの増幅産物に対して行った。複数の配列アラインメント（表２６）、および保存領域のさらなる決定について、約７２８ｂｐ増幅産物の約４００ｂｐの領域（配列番号１４のｎｔ６９〜ｎｔ４６９）を用いた（下記参照）。
【０６２０】
【表２６】
2006115845.tif 000034
【０６２１】
【表２７】
2006115845.tif 000035
サンプル中のＨＧＶ単離物の検出のために、増幅に基づく（例えば、ＰＣＲ）またはプローブに基づく方法／アッセイの開発には、適切なプライマー／プローブ配列の選択が包含される。このようなアッセイのための２つの判断基準は、低コピーの感度およびＨＧＶ配列に対する特異性である。配列のアラインメント（上記のような）は、プライマー／プローブ選択および設計を手助けし得る。
【０６２２】
プライマー選択のためのいくつかの判断基準は、以下の通りである：（ｉ）正方向および逆方向プライマー対は、配列中に有意な相補性がないこと、および（ｉｉ）プライマーは有意な自己相補性または二次構造の形成能を有さないこと。これらの予防により、プライマーのダイマーまたはオリゴマー生成の可能性を最小にする。
【０６２３】
プライマーは、必要に応じて、異なる単離物間で変異を示さない配列領域から設計されるが、既知の単離物の相違の原因である塩基位置で、混合塩基合成または中和（ｎｅｕｔｒａｌ）塩基（例えば、イノシン）を組み込むことにより、相同性のより低い領域からもまた設計され得る。以下の２群のプライマーは、ＨＧＶゲノムの検出のためのＰＣＲに基づくアッセイの開発において用いられ得るプライマーの例である：正方向プライマー（配列番号２２２、配列番号２２３および配列番号２２４）；ならびに逆方向プライマー（配列番号２２５、配列番号２２６および配列番号２２７）。
【０６２４】
種々の組合せのプライマーが、ＨＧＶ診断アッセイの開発において用いられ得る。
【０６２５】
最適な組合せのプライマーは実験的に決定され、そして代表的には、アッセイ感度およびアッセイ特異性について考慮される。このような考慮には、以下が挙げられる：（ｉ）効率的な増幅および容易な産物検出のための１００ｂｐ〜３００ｂｐ長のＰＣＲ産物；（ｉｉ）少なくとも１０コピーの標的ＨＧＶを再現よく検出する能力、および（ｉｉｉ）大部分のＨＧＶ変異体を再現よく検出する能力。
【０６２６】
さらに、プローブ配列は、混合塩基合成または中和塩基合成を伴って同様に設計され得、および／またはストリンジェンシーを下げて大部分のＨＧＶ変異体を検出し得る。
【０６２７】
本発明を特定の方法および実施態様について参考文献とともに記載したが、本発明から逸脱することなく、種々の改変および変更をなし得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０６２８】
【図１】図１は、配列番号１４オープンリーディングフレームと４７０−２０−１クローンとの関係を示す。
【図２】図２は、グルタチオンアフィニティーカラムから溶出したグラジエント画分由来の代表的なタンパク質プロファイルを示す。
【図３】図３は、図２からの画分サンプルの代表的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、アニオン交換カラムから溶出したグラジエント分画由来の代表的なタンパク質プロファイルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａからの分画サンプルの代表的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４Ａからの分画サンプルの代表的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ＨＧＶとフラビウイルス科の２つの他のメンバー（ブタコレラウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）とのアミノ酸アライメントを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＨＧＶとフラビウイルス科の２つの他のメンバー（ブタコレラウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）とのアミノ酸アライメントを示す。
【図６】図６は、ＨＧＶエピトープを有する細菌性発現プラスミドであるベクターｐＧＥＸ−Ｈｉｓｂ−ＧＥ３−２の部分地図を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、精製されたＨＧＶ  ＧＥ３−２タンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、精製されたＨＧＶ  Ｙ５−１０抗原のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、以下の抗原は、Ｙ５−５、ＧＥ−３およびＹ５−１０のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、抗原ＧＥ−ＮＳ２ｂおよびＧＥ−ＮＳ５ａのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、ＨＧＶのコード配列のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを表す。
【図１２】図１２は、抗Ｔ７．Ｔａｇモノクローナル抗体を有するＨＧＶ  ｐＥＴクローンのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＨＧＶ  ｐＥＴクローンＧＥ−ＮＳ５ｂのウェスタンブロット分析の結果を示す。図１３Ｅは、対応するクマシー染色ゲルを示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＨＧＶ  ｐＥＴクローンＧＥ−Ｅ２のウェスタンブロット分析の結果を示す。図１４Ｄは、対応するクマシー染色ゲルを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１３Ｃは、ＨＧＶ  ｐＥＴクローンＧＥ−ＮＳ５ｂのウェスタンブロット分析の結果を示す。図１５Ｄは、対応するクマシー染色ゲルを示す。
【図１６】図１６は、ＨＧＶのコード領域の略図表示を示す。
【０６２９】
［配列表］
2006115845.tif 000036
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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