(57)【要約】【課題】実験室内において安定的にトマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌の識別を可能にする。【解決手段】トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌に特徴的なエンド型ペクチン分解酵素またはエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子と密接に連鎖する４種類（ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３プライマーセットおよびｓｐｒｌプライマーセット）の分子マーカーである本発明の第１種および第２種のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、ＰＣＲ反応によって、増幅されるトマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌に特有なＤＮＡ断片を電気泳動により検出し、トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌を間接的に識別することができる。【選択図】    図１
2006345844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌の有無を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、第１種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧ−３’の塩基配列を有しており、第２種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡ−３’の塩基配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
トマト萎凋病菌レース１およびレース３の有無を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、第１種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣ−３’の塩基配列を有しており、第２種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＣＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’の塩基配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
トマト萎凋病菌レース２およびレース３の有無を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、第１種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡ−３’の塩基配列を有しており、第２種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡ−３’の塩基配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
トマト根腐萎凋病菌の有無を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、第１種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣ−３’の塩基配列を有しており、第２種のオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’の塩基配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドを組み合わせて、トマト萎凋性病害菌から抽出されたゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことにより、トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌を判定することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、トマトのフザリウム菌の検定に関し、詳しくは、トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌の検出に際して、トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌を識別できる分子マーカー（オリゴヌクレオチド）に関する。
【背景技術】
【０００２】トマトは多くの国で経済的に高い重要な収穫物である。トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）の３つの生理学的レース（レース１，レース２，レース３）およびトマト根腐萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｒａｄｉｃｉｓ−ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）によって起こるフザリウム病は世界中で最も重大なトマトの病気の一つである。抵抗性品種の導入，農薬，温湯浸漬処理にも関わらず、感染はいまだに主要な問題となっている。【０００３】これらの病気は見ただけではどの種類の病気かを区別することはできない。萎凋性病害の対策には環境的，経済的に台木の利用が有効であるが、病気の種類によって台木の種類が違うため、正確な病気の診断が必要である。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】しかしながら、今までの病気の診断は検定植物に病原菌を接種して、発病程度や病状から判断しているため、１か月以上を要し、即時性を欠いており、次作に間に合わないことがある。そこで、より簡単に短時間で且つ実験室内でフザリウム菌を検定できる方法が望まれていた。
【０００５】本発明は、これらの課題を対処するために案出されたものであり、フザリウム菌のペクチン分解酵素遺伝子の解析に係わる一連の研究中にトマトのフザリウム菌を特異的に検出できるオリゴヌクレオチドを開発し、該オリゴヌクレオチドを提供しようとしている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】上記した目的を達成するために本発明は、トマトのフザリウム菌を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、トマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌特異的プライマーセット；ｕｎｉｆ（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧ−３’）とｕｎｉｒ（５’−ＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡ−３’）。トマト萎凋病菌レース１およびレース３特異的プライマーセット；ｓｐ１３ｆ（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣ−３’）とｓｐ１３ｒ（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’）。トマト萎凋病菌レース２およびレース３特異的プライマーセット；ｓｐ２３ｆ（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡ−３’）とｓｐ２３ｒ（５’−ＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡ−３’）。トマト根腐萎凋病菌特異的プライマーセット；ｓｐｒｌｆ（５’−ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣ−３’）とｓｐｒｌｒ（５’−ＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’）の塩基配列を有することを特徴とする。
【０００７】詳しくは、ｕｎｉｆ（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧ−３’）とｕｎｉｒ（５’−ＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、トマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌に特異的な６７２ｂｐＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【０００８】ｓｐ１３ｆ（５’−ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣ−３’）とｓｐ１３ｒ（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、トマト萎凋病菌レース１およびレース３に特異的な４４５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【０００９】ｓｐ２３ｆ（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡ−３’）とｓｐ２３ｒ（５’−ＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、トマト萎凋病菌レース２およびレース３に特異的な５１８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【００１０】ｓｐｒｌｆ（５’−ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣ−３’）とｐｒｌｒ（５’−ＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、トマト根腐萎凋病菌に特異的な９４７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【００１１】本発明を実施する方法では、上記第１種および第２種のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、上記のとおりの塩基配列を有する２０から２２塩基よりなるオリゴヌクレオチドであって、該２種のオリゴヌクレオチドは、上記フザリウム菌からゲノミックＤＮＡを抽出し、鋳型としてＰＣＲ反応（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）を行う際に、上記のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、各個体の増幅ＤＮＡパターンを電気泳動法によって調べ、その泳動パターンにより特定のフザリウム菌を検出することによるものである。
【００１２】本発明において、上記菌のゲノミックＤＮＡを抽出精製する方法としてはＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）を用いた。
【００１３】上記ＰＣＲ法は通常行われる方法で実施するが、本発明ではウイリアムズらの方法によって、反応混液を調整し、サーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ社）またはＴＰ６００（タカラバイオ社）等を用いて、ＤＮＡの増幅を行ったが、これに限定されるものでなく、ウイリアムズ方法の改変、その他の方法で行うことも可能である。
【００１４】上記増幅ＤＮＡの検出には、本発明では、上述のＰＣＲ反応液に泳動用色素液を加え、電気泳動装置を用い、１００Ｖで４０分間通電し、泳動終了後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液に２０分間浸漬して行った。泳動用バッファーとしてはＴＡＥバッファーを用い、又、ゲルは２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社、タイプＩ）をＴＡＥバッファーに溶解して作製した。写真撮影は、上述のエチジウムブロマイド染色したゲルを軽く水洗し、透過型紫外線照明装置の上に置き、紫外線を当てて撮影する。しかしながら、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。
【作用】
【００１５】トマトのフザリウム菌について、上記プライマーセットを用いてＤＮＡの増幅を行い、フザリウム菌に特異的なＤＮＡ断片の有無を電気泳動により検出し、識別を行うことができる。
【００１６】上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、フザリウム菌から抽出されたゲノムＤＮＡよりトマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（ｕｎｉプライマーセット）である。
５’−ＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧ−３’および５’−ＧＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡ−３’
【００１７】また、上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、フザリウム菌から抽出されたゲノムＤＮＡよりトマト萎凋病菌レース１およびレース３に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（ｓｐ１３プライマーセット）である。
５’−ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣ−３’および５’−ＴＣＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’
【００１８】また、上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、フザリウム菌から抽出されたゲノムＤＮＡよりトマト萎凋病菌レース２およびレース３に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（ｓｐ２３プライマーセット）である。
５’−ＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡ−３’および５’−ＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡ−３’
【００１９】また、上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、フザリウム菌から抽出されたゲノムＤＮＡよりトマト根腐萎凋病菌に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（ｓｐｒｌプライマーセット）である。
５’−ＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣ−３’および５’−ＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】以下、本発明の実施例を添付の図面を参照して具体的に説明する。【００２１】＜ＤＮＡ抽出法＞ＤＮＡの抽出にはＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）を用いた。
■１．５ｍｌチューブにＳｏｌｎＩ３００μｌを分注する。
■３０ｍｇの菌叢をスパチラーで上記チューブに入れ、１〜２秒間、ボルテックスする。
■ＳｏｌｎＩＩ１５０μｌを添加し、５〜６秒間、ボルテックスする。
■５０℃で１５分間処理後、ＳｏｌｎＩＩＩ１５０μｌを加え、１〜２秒間、ボルテックスする。氷上で１５分間静置後、１４，０００ｒｐｍ、１０〜１５分間遠心分離する。
■水相３５０μｌを回収し、−２０℃エタノール８７５μｌを添加、混合し、１４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離する。
■沈殿に７０％エタノール２５０μｌを添加し、１４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、洗浄する。
■上清を捨て遠心エバポレーターで乾固し、１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス酢酸ｐＨ８．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して、精製ＤＮＡとする。【００２２】＜ＰＣＲ反応＞精製ＤＮＡの希釈液５．０μｌ，１０倍濃度ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）３．０μｌ，１０  ｍＭ  ｄＮＴＰ（タカラバイオ社）１．０  μｌ，５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）０．１５  μｌ，２０ｐｍｏｌｅ／μｌ各プライマー（キアゲン社）０．１５μｌ，滅菌水２０．５５μｌを加えて３０．０μｌとした。【００２３】以上の反応混液を、サーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ社）またはＴＰ６００（タカラバイオ社）を用いて、９４℃４分、（９４℃１分、６２℃１分、７２℃２分）を５０サイクル、７２℃５分間処理し、増幅したＤＮＡ断片を得る。上記したＰＣＲ反応に必要とした時間は、約４時間半であった。【００２４】＜増幅ＤＮＡの検出＞電気泳動用ゲルは２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社製タイプＩ）を使用した。０．４２ｇのアガロースを３０ｍｌのＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス酢酸ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、５．９ｃｍ×１０．７ｃｍ×０．５ｃｍのゲルを作製する。泳動用緩衝液としてはＴＡＥ緩衝液を使用した。【００２５】ＰＣＲ反応液５μｌに色素液２μｌを加えて試料とし、これを電気泳動装置ｍｕｐｉｄ（コスモバイオ社）を使用して１００Ｖで約４０分間泳動を行った。染色は泳動後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液に２０分間浸漬して行った。【００２７】＜写真撮影＞エチジウムブロマイド染色後、軽く水洗したゲルを透過型紫外線照明装置トランスイルミネーター（フナコシ社）の上におき、シャッタースピード１／１秒、絞り１１で撮影した。フイルムはポラロイドフイルム  タイプ６６７、カメラ装置はＭＰ−４ランド・カメラ（ポラロイド社）、フイルターは赤色フイルターＭＣ−Ｒ１（ケンコー社）を使用した。結果を図１、図２、図３および図４に示す。【００２６】＜試験結果＞【００２７】＜エンド型ペクチン分解酵素およびエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子配列の決定＞【００２８】トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３，トマト根腐萎凋病菌のエンド型ペクチン分解酵素およびエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子の部分配列、それぞれ１５７７ｂｐおよび１４７９ｂｐをＧｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステム社）を用いて決定した。【００２９】ＰＣＲ反応液を最終濃度６０％イソプロピルアルコールで遠心分離し、沈殿物を１／１０濃度ＴＥ緩衝液に懸濁した。断片の濃度は分光光度計ＤＵ６４０（ベックマン・コールター）を用いて２６０ｎｍの吸光度から計算した。シークエンス条件は断片１０００ｂｐ当たり２０．０  ｎｇとし、シークエンス用プライマー３．２ｐｍｏｌ，ＢｉｇＤｙｅ（ＴＭ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステム社）４．０μｌを加え合計で２０μｌになるように調製した。温度制御はＰＴＣ２００を使用し，９６℃３０秒，５０℃１５秒，６０℃４分を２５回反復した。【００３０】＜判別用プライマーの設計＞
エンド型ペクチン分解酵素およびエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子の部分塩基配列をもとにトマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌に特異的なプライマーを作成した。【００３１】トマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌に特異的なｕｎｉプライマーセットは各菌エンド型ペクチン分解酵素遺伝子に共通な配列をもとに作製した。【００３２】レース１およびレース３に特異的なｓｐ１３プライマーセットはエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子の配列をもとに作製した。【００３３】レース２およびレース３に特異的なｓｐ２３プライマーセットはエンド型ペクチン分解酵素遺伝子の配列をもとに作製した。【００３４】トマト根腐萎凋病菌に特異的なｓｐれｌプライマーセットはエキソ型ペクチン分解酵素遺伝子の配列をもとに作製した。【００３５】ｕｎｉプライマーセットを用いてＰＣＲをすることにより、トマト萎凋病菌レース１，レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌の４菌を特異的に検出することが可能である。【００３６】ｓｐ１３プライマーセットを用いてＰＣＲをすることにより、トマト萎凋病菌レース１およびレース３を、ｓｐ２３プライマーセットを用いてＰＣＲをすることにより、トマト萎凋病菌レース２およびレース３を、ｓｐｒｌプライマーセットを用いてＰＣＲをすることにより、トマト根腐萎凋病菌を特異的に検出することが可能である（図１）。【００３７】＜ＰＣＲ条件の検討＞【００３８】アニーリング温度を５２℃から７０℃まで２℃づつ増加させてＰＣＲをした結果、トマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌では、６２℃以下では明確なＤＮＡ断片が認められる。他のフザリウム菌は５２℃および５４℃わずかなＤＮＡ断片が認められるが、５６℃以上では認められない。【００３９】反応液中のＤＮＡ量を最終濃度０．００１ｐｇ／μｌから１０，０００ｐｇ／μｌで反応を行った結果、０．００１ｐｇ／μｌおよび０．０１ｐｇ／μｌのＤＮＡ濃度ではＤＮＡ断片は認められない。０．１ｐｇ／μｌ以下のＤＮＡ濃度では薄いＤＮＡ断片が認められ、１．０ｐｇ／μｌ以上のＤＮＡ濃度であれば、明確なＤＮＡ断片が認められる。【００４０】ＰＣＲの反復数を２０回から５０回まで変化させ、ＰＣＲ産物を観察した結果、２０回ではＤＮＡ断片が認められず、３０回では弱いＤＮＡ断片が認められる。４０回および５０回の反応では十分に増幅しており、非特異的反応も生じない。【００４１】＜国内各地から収集したフザリウム菌の検出＞【００４２】トマト萎凋病菌レース１を９株，レース２を１１株，レース３を５株，トマト根腐萎凋病菌９株およびその他１５種類のフザリウム菌を２９株、計６３株を供試（表１）した結果、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３プライマーセットおよびｓｐｒｌプライマーセットを組み合わせることにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ（キャベツ萎黄病菌）以外は判別できる。また、トマト萎凋性病害は、トマト萎凋病菌レース１は８９％の精度であり、レース２，レース３およびトマト根腐萎凋病菌は１００％判定できる（表１，図１，図２）。【００４３】＜感染植物からの検出＞【００４４】圃場から萎凋症状��呈しているトマト苗３株を採取して、菌叢の一部をかき取り、ＩＳＯＰＬＡＮＴでＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行った。生物検定は浸根接種法により行った。その結果、ＰＣＲ法により特異的に菌の検出が可能である（図３）。ＰＣＲ法による菌の種類判別結果と判別植物による生物検定結果は一致しており、圃場のトマト萎凋性病害を診断することができる。【００４５】＜汚染土壌中からの検出＞【００４６】径１２ｃｍのポットに滅菌土壌約４００ｇを詰め、ＰＤＡ培地で培養したトマト萎凋病菌レース２菌を約２０ｍｇを混和し、その後、播種後１週間目にトマト萎凋病菌レース２に感受性であるトマト品種「ハウス桃太郎」稚苗を定植し、一定時間後に、植物体を回収した。ＤＮＡはＩＳＯＰＬＡＮＴで精製し、ＰＣＲを行い、植物体からの菌の検出について検討した結果、定植１５日目のトマト稚苗根から３株のうち１株より病原菌の検出が可能であり、定植２０日目のトマト稚苗根からは３株のうち３株から病原菌の検出が可能である（図４）。【００４７】感染している植物と同様に、弱く感染している組織のほとんど目に見えない徴候の早い段階において、ＰＣＲ法による検定は生体内で種を識別することができる。圃場で萎凋症状を呈しているトマト苗、または土壌中にトマト稚苗を定植して２０日後にＰＣＲ法による検定により、病気の種類や汚染状況の診断ができる。感染植物からの検出も可能であり、検定効率が向上する。【００４８】図１において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉは、トマト萎凋病菌，ｒａｄｉｃｉｓ−ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉは、トマト根腐萎凋病菌，ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍおよびｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅは、トマト萎凋性病害以外のフザリウム菌であるキュウリつる割病菌およびナス半枯病菌である。ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカー，Ｂはブランクラン，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。【００４９】図２において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
ｆ．ｓｐ．ｃｏｌｏｃａｓｉａｅは、サトイモ萎凋病菌，ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓは、キャベツ萎黄病菌，ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍは、キュウリつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｄｉａｎｔｈｉは、カーネーション立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅは、イチゴ萎黄病菌，ｆ，ｓｐ．ｌａｇｅｎａｒｉａｅは、ユウガオつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅは、ナス半枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓは、メロンつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍは、スイカつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｒａｐｈａｎｉは、ダイコン萎黄病菌，ｆ．ｓｐ．ｐｈａｓｅｏｌｉは、アズキ立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍは、ダイズ立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｔｕｌｉｐａｅは、チューリップ球根腐敗病菌，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。【００５０】図３において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカー，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。【００３６】図４において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカー，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。
【発明の効果】
【００５１】以上説明したとおり、本発明を用いることによって、フザリウム菌やフザリウム菌が感染した植物からゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ｕｎｉブライマーセットを用いた場合にはトマト萎凋病菌およびトマト根腐萎凋病菌に特異的なＤＮＡ断片（約６７２ｂｐ）が増幅・検出され、ｓｐ１３プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った場合にはトマト萎凋病菌レース１およびレース３から特異的なＤＮＡ断片（約４４５ｂｐ）が増幅・検出され、ｓｐ２３プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った場合にはトマト萎凋病菌レース２およびレース３から特異的なＤＮＡ断片（約５１８ｂｐ）が増幅・検出され、ｓｐｒｌプライマーを用いてＰＣＲを行った場合にはトマト根腐萎凋病菌から特異的なＤＮＡ断片（約９４７ｂｐ）が増幅・検出され、４種のプライマーセット（ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３プライマーセットおよびｓｐｒｌプライマーキット）を組み合わせてＰＣＲを行うことにより、トマト萎凋病菌の各レースおよびトマト根腐萎凋病菌を識別することができる。
【００５２】したがって、従来行われていた生物的なレース検定に加えて、実験室内で安定的かつ効率的にレースを判別することが可能となる。これにより、検定に関わる労力が省力化される。
【００５３】この技術を利用することによって、今まで１か月以上要していた病原菌の診断が半日で出来るようになり、迅速な野菜の土壌伝染性病害対策が可能になった。
【表１】
2006345844.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【符号の説明】
【図１】
電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉは、トマト萎凋病菌，ｒａｄｉｃｉｓ−ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉは、トマト根腐萎凋病菌，ｆ，ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍおよびｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅは、トマト萎凋性病害以外のフザリウム菌であるキュウリつる割病菌およびナス半枯病菌である。ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカー，Ｂはブランクランをそれぞれ示す。
【図２】
電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
ｆ．ｓｐ．ｃｏｌｏｃａｓｉａｅは、サトイモ萎凋病菌，ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓは、キャベツ萎黄病菌，ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍは、キュウリつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｄｉａｎｔｈｉは、カーネーション立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅは、イチゴ萎黄病菌，ｆ．ｓｐ．ｌａｇｅｎａｒｉａｅは、ユウガオつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅは、ナス半枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓは、メロンつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍは、スイカつる割病菌，ｆ．ｓｐ．ｒａｐｈａｎｉは、ダイコン萎黄病菌，ｆ．ｓｐ．ｐｈａｓｅｏｌｉは、アズキ立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍは、ダイズ立枯病菌，ｆ．ｓｐ．ｔｕｌｉｐａｅチューリップ球根腐敗病菌を示す。
【図３】
電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット，ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカーをそれぞれ示す。
【図４】
電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
ｕｎｉは、ｕｎｉプライマーセット  ｓｐ１３は、ｓｐ１３プライマーセット，ｓｐ２３はｓｐ２３プライマーセット，ｓｐｒｌはｓｐｒｌプライマーセット，Ｍは、分子量マーカーをそれぞれ示す。
【図１】
2006345844.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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