(57)【要約】【課題】脳梗塞の予防又は治療剤、およびそれを含有する飲食品又は医薬品の提供【解決手段】（１）６量体以上の高分子プロアントシアニジンを有効成分とする脳梗塞の予防又は治療剤。（２）上記（１）記載の剤を含有する、飲食品又は医薬品。（３）６量体以上の高分子プロアントシアニジンを含有し、脳梗塞の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品。６量体以上の高分子プロアントシアニジンは、低分子画分よりも脳梗塞の予防又は治療効果が優れており、食品産業及び医療上有用である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
６量体以上の高分子プロアントシアニジンを有効成分とする脳梗塞の予防又は治療剤。
【請求項２】
請求項１記載の剤を含有する、飲食品又は医薬品。
【請求項３】
６量体以上の高分子プロアントシアニジンを含有し、脳梗塞の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として脳梗塞の予防又は治療剤、およびそれを含有する飲食品又は医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓が脳血管に詰まるとその周囲の脳に酸素や栄養が届かなくなり、脳の組織が働かなくなったり、壊死したりする。この状態を脳梗塞という。脳梗塞はその成因により「脳血栓」と「脳塞栓」に分類される。脳梗塞は、生活習慣病の一種として注目されており、有効な予防又は治療剤が求められている。
【０００３】
プロアントシアニジンは、血栓形成抑制作用及び血小板凝集抑制作用を有し、血栓による循環不全又は血管の閉塞が関与する疾患、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳血管性痴呆等の治療又は予防のために有用であることが知られている（特許文献１参照）。
プロアントシアニジンには、構成単位が２つ以上重合した多量体（オリゴマー）が存在する。プロアントシアニジンオリゴマーは、重合度によって生理活性の強度が異なることが知られている（特許文献２、非特許文献１参照）。プロアントシアニジンの製造方法は公知である(特許文献３〜５参照)。また、特定の分子量（3,000〜10,000）を有するプロアントシアニジンも公知である（特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２３８２８９号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８７９２号公報
【特許文献３】特許第１６４３１０１号公報
【特許文献４】特許第２６９４７４８号公報
【特許文献５】特開平１１−０８０１４８号公報
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 1998, 46, p1460-1464
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主たる課題は、脳梗塞の予防又は治療剤およびそれを含む機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＵＦ膜によりプロアントシアニジンを高分子画分と低分子画分とに分離し、それぞれの画分について脳梗塞の予防又は治療効果を確認した。その結果、６量体以上の高分子プロアントシアニジンが、脳梗塞の予防又は治療剤として特に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）６量体以上の高分子プロアントシアニジンを有効成分とする脳梗塞の予防又は治療剤。
（２）上記（１）記載の剤を含有する、飲食品又は医薬品。
（３）６量体以上の高分子プロアントシアニジンを含有し、脳梗塞の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、６量体以上のプロアントシアニジンを有効成分とする脳梗塞の予防又は治療剤、およびそれを含有する飲食品又は医薬品が得られた。本発明は食品産業及び医療上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．本発明の高分子プロアントシアニジン
本発明における有効成分とは、６量体以上の高分子プロアントシアニジン（以下単に「高分子プロアントシアニジン」という）である。高分子プロアントシアニジンとは、フラバン−３−オールまたはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とし、該構成単位の６量体以上である化合物を意味する。
高分子プロアントシアニジンは、例えば、植物原料からプロアントシアニジン画分を抽出し、更に６量体以上のプロアントシアニジンを抽出・精製することにより得られる。また、化学的もしくは酵素的合成法、植物体や微生物体からの抽出法、発酵法さらにはこれらの組合せ法などにより得ることもできる。高分子プロアントシアニジンの調製法の具体例を以下に示す。
【００１０】
（１）プロアントシアニジン画分の調製
プロアントシアニジン画分を抽出するための植物体としては、ブドウ、クランベリー、カカオ、リンゴ、小豆、柿、キャベツ、大麦、麦芽、クルミ、アーモンド、カカオ、杉、桧、松、栃、樫等が利用できる。プロアントシアニジンが得られる限りは、植物体のどの部分を抽出してもよく、例えば、花、実、種子、果実もしくはこれらの果肉または皮類、及び根、樹木、樹皮、葉などの組織が使用できる。植物体は、乾燥したもの、生のもの、発酵させたものの何れでもよい。更に、果実のジュース類もしくは果実酒、ビール類、またはそれらの製造の際副産物として生成する粕類、または植物体の加工品なども挙げられる。プロアントシアニジンの含有量が高いという点で、植物体としては、ブドウの種子または皮が好適である。
【００１１】
植物体からプロアントシアニジン画分を抽出する場合は、各種植物体もしくはその破砕物などを、水又は溶媒を用いて抽出処理することにより粗プロアントシアニジンが得られる。得られた粗プロアントシアニジン画分をさらに吸着剤処理法、膜分離法、溶剤分別法などの精製法に供することにより、高純度プロアントシアニジン画分を得ることができる。高純度プロアントシアニジン画分は、例えば、ブドウ果実の種子、果皮または搾汁粕を冷水、熱水、含水エタノール、エタノールにて処理して粗プロアントシアニジン画分を得て、さらに吸着クロマトグラフィーに供して分子量による吸着分配を行なえばよい。吸着クロマトグラフィーは、セファデックスＬＨ−２０（米国ファルマシア製）、ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化成工業製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東ソー製）、シリカゲルＣ１８（ダイソー製）などを使用し、水及び適当な溶媒で吸脱着工程を一回または複数回行なえばよい。
【００１２】
また、植物体を原料とした果実酒、ビールなどの二次加工品をプロアントシアニジンの選択的吸着剤で処理して、該区分を濃縮し、さらに向流分配法、吸着クロマトグラフィーなどにより分別精製することによってもプロアントシアニジン画分が得られる。さらに微生物発酵に供してプロアントシアニジン以外の不純物を選択的に除去することによって、より高純度プロアントシアニジン画分が得られる。抽出に使用する溶媒は、限定されないが、冷水、熱水、低級アルコール、アセトン、アルキルケトン、酢酸、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、液体二酸化炭素等が挙げられ、特に含水低級アルコールおよび含水アセトンが好適である。これらの溶媒を２種類以上混合してもよく、抽出温度は含水低級アルコールの場合は室温から沸点が好適である。発酵に使用する微生物は、食品用途であれば特に限定されるものではないが、プロアントシアニジン存在下であることを考慮すれば酵母が特に望ましい。
なお、プロアントシアニジン画分としては市販品、例えばブドウ種子を原料とする商品名「グラヴィノール」（キッコーマン（株））、りんご未熟果を原料とする商品名「アップルフェノン」（ニッカウヰスキー（株））、海岸松の樹皮を原料とする商品名「ピクノジェノール」（ホーファーリサーチ社（スイス））等が使用できる。
【００１３】
（２）高分子プロアントシアニジンの調製
本発明の高分子プロアントシアニジンは、上記のプロアントシアニジン画分から、６量体以上のプロアントシアニジンを抽出することにより得られる。抽出は、ＨＰ２０等の合成樹脂を用いたクロマトグラフ法、酢酸エチル等の有機溶媒にて不要な分画を除く溶媒抽出除去法、分子量分画膜を用いた膜分離法等を用いることにより実施可能である。
【００１４】
具体的には例えば、プロアントシアニジン画分を、分画分子量５，０００のＵＦ膜を装着したスパイラル限外濾過モジュール（Millipore社製）に供し、透過液（低分子画分）と非透過液（高分子画分）とに分離する。本発明の高分子プロアントシアニジンは、非透過液（高分子画分）に含まれるので、該画分を凍結乾燥すればよい。
高分子画分または低分子画分に含まれるプロアントシアニジンの重合度は、塩酸分解した各画分を求核試薬（フロログルシノール等）と反応させた後、反応生成物をＨＰＬＣとＵＶ検出器とで分析すれば確認できる。また、プロアントシアニジンの重合度は、各画分をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）に供することにより確認できる。
２．脳梗塞の予防又は治療剤
本発明の高分子プロアントシアニジンは、脳梗塞の予防又は治療剤として、飲食品又は医薬品の分野において使用可能である。
【００１５】
高分子プロアントシアニジンを飲食品に添加して使用する場合、飲食品の種類、形態、及びその他の含有成分等に特に制約はなく、当業者に公知の任意の各種方法で容易に調製することが出来る。飲食品に添加する場合は、高分子プロアントシアニジン乾燥重量として、例えば、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ／体重を一日に摂食できる量を添加すればよい。本発明の高分子プロアントシアニジンは、それを含有し、脳梗塞の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品としても使用可能である。
【００１６】
高分子プロアントシアニジンを医薬品に添加して使用する場合、一般に使用される添加剤、担体、助剤等とともに製剤化し、常法に従って経口、非経口の製品として、医薬品の分野で利用すればよい。経口剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドリンク剤等が、非経口剤としては無菌溶液剤、懸濁液剤等の注射剤、軟膏剤、クリーム、水剤等の外用剤等が挙げられる。
【００１７】
製剤化に当り、錠剤、カプセル剤等に混和される佐薬としては次のようなものが挙げられる。すなわち、デキストリン、セルロース等の賦形剤、ゼラチン、アラビアゴム、コーンスターチ等の統合剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ゼラチン化澱粉、アルギン酸等の膨化剤、ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味料、ペパーミント、ブドウ、オレンジ、レモン等の香料等である。また、カプセル剤の場合は、上記の材料に加えて油脂のような液体担体を含有させることもできる。
【００１８】
更に、他の材料を被覆剤として又は製剤の物理的形態を変化させるために含有させることができる。例えば、錠剤はセラツク、砂糖で被覆させることができるし、シロップ又はエリキシルは活性化合物として、ショ糖は甘味料として、メチルパラベン又はプロピルパラベンは防腐剤として、ペパーミント、ブドウ、オレンジ、レモン香味等は香料としてそれぞれ含有させることができる。
【００１９】
注射剤のための無菌組成物は、高分子プロアントシアニジンを、注射用水や大豆油、ゴマ油、椰子油等のような天然植物油又はエチルオレエートのような合成脂肪ビヒクルに溶解又は懸濁させる通常の方法によって処方することができる。注射剤においては、防腐剤、酸化防止剤、緩衝剤等は必要に応じて配合することができる。
そして、本発明の高分子プロアントシアニジンを脳梗塞の予防又は治療剤として使用する場合は、高分子プロアントシアニジン乾燥重量として０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ／体重を一日一回もしくは数回投与する量、すなわち０．１〜６００ｍｇ／ｋｇ／体重／日程度の投与量とすればよい。
【実施例】
【００２０】
＜高分子プロアントシアニジンの調製＞
有賀らが開発した方法（特許第１６４３１０１号公報、特許第２６９４７４８号公報）および徳武らが開発した方法（特開平１１−０８０１４８号公報）に従って行った。すなわち、ブドウ種子１００ｋｇを原料とし、７５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）３００Ｌを加え１２０分間還流抽出を行った。種子をステンレスフィルターにて除去した後、減圧濃縮を行い、濃縮液をスプレードライにて粉末化することによりプロアントシアニジン画分５ｋｇを得た。当該画分のプロアントシアニジン含量は９５％であった。
上記プロアントシアニジン画分１０ｇを２５％エタノール溶液に溶解し、プロアントシアニジン１０％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。その溶液を、分画分子量５，０００のＵＦ膜を装着したスパイラル限外濾過モジュール（Prep/scale-TTF cardridge、Millipore社製）に供し、透過液（低分子画分）と非透過液（高分子画分）とに分離した。
【００２１】
次いで、低分子画分と高分子画分をそれぞれ凍結乾燥し、低分子プロアントシアニジン６．０８ｇと、高分子プロアントシアニジン３．５６ｇとを得た。
【００２２】
プロアントシアニジンの定量は、BroadhurstとJonesの方法（J. Sci. Food Agric., 29, 788-794(1978) ）により行った。すなわちプロアントシアニジン含有試料をバニリンと反応後、濃塩酸で処理してプロアントシアニジンを発色させ、波長５００ｎｍにおける吸光度の測定値と、（＋）−カテキンを標準品として作成した検量線とからプロアントシアニジンを定量した。
＜プロアントシアニジンの重合度の確認＞
低分子画分又は高分子画分に含まれるプロアントシアニジンの重合度は以下の方法で行った。すなわち、薄層クロマトグラフィーに低分子画分、高分子画分それぞれのサンプルを負荷した。その際、予め合成吸着樹脂にて５量体を分離精製し、ＮＭＲにて５量体である事を確認したサンプルを標品として用いた。
以上により、低分子画分には５量体以下のプロアントシアニジンが含まれること、及び高分子画分には６量体以上のプロアントシアニジンが含まれることを確認した。
【００２３】
＜実験動物＞
脳梗塞モデルとして、８週齢のオスのマウスに光照射により活性酸素を出す色素（ローズベンガル）１０ｍｇ／ｍｌを０．２ｍｌ腹腔内注射し、脳の特定部位に光を２０分照射することにより、虚血を作成した。２４時間後に脳を取り出し、虚血の程度を脳組織の状態を検定するＴＴＣ染色、Ｎｉｓｓｅｌ染色により評価した。
【００２４】
＜実験結果＞
上記で調製した高分子画分又は低分子画分を、プロアントシアニジン量として１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように飲料水に溶解し、７日間マウスに投与した。なお、蒸留水をコントロールとして比較対照とした。その結果を図１に示す。水投与群の脳組織中の障害エリアが１．５８ｍｍ２であったのに対し、低分子画分投与群は０．６２ｍｍ２、高分子画分投与群は０．１７ｍｍ２であった。
【００２５】
５量体以下の低分子プロアントシアニジンに比べ、高分子プロアントシアニジン（すなわち６量体以上のプロアントシアニジン）は、脳梗塞に起因する脳組織の障害を抑制する効果が強いことが確認された。高分子プロアントシアニジンが脳梗塞の予防又は治療用として特に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】水投与群、低分子プロアントシアニジン画分投与群及び高分子プロアントシアニジン画分投与群における、脳梗塞に起因する脳組織の障害エリアを示した説明図である。（実施例）
【図１】
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