(57)【要約】【課題】  新規のプロスタグランジン産生阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤の提供。【解決手段】  カルコン化合物の中から選択されるプロスタグランジン産生阻害剤。リコカルコンＡまたはリコカルコンＢからなるプロスタグランジン産生阻害剤。前記プロスタグランジン産生阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルコン化合物の中から選択されるプロスタグランジン産生阻害剤。
【請求項２】
リコカルコンＡまたはリコカルコンＢからなるプロスタグランジン産生阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプロスタグランジン産生阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のプロスタグランジン産生阻害剤及び該プロスタグランジン産生阻害剤を有効成分として含む抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で免疫応答時などに発現するサイトカインのひとつにＩＬ-１βがある。ＩＬ-１βは主に単球、マクロファージ及びその類縁細胞がエンドトキシン（ＬＰＳ）やウイルスの刺激を受けることにより産生され、視床下部体温調節中枢や血管内皮細胞などの組織内でのプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２と略記する）産生の亢進や破骨細胞の活性化を起こす。その結果、発熱や組織障害、ブラジキニンによる発痛の増強などの炎症反応や骨吸収の促進などが惹起される。そのためＩＬ-１βは関節リウマチや骨粗鬆症などの疾患との関与が示唆されている（例えば、非特許文献１，２参照）。
【０００３】
従ってＩＬ-１βによるＰＧＥ２産生を阻害する物質は、ＰＧＥ２と関連して起こる炎症反応や疾患を予防及び治療するための医薬材料として有効である可能性があり、新規のＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２産生阻害物質が探求されている。本発明者らは甘草抽出物中にＩＬ−１βによるＰＧＥ２産生を阻害する物質を発見し、これを同定した。この物質はカルコン化合物であるリコカルコンＡであった。
【０００４】
リコカルコンＡは周知の化合物であり、これまでに抗腫瘍剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に有効な抗菌剤、化粧料、皮脂分泌抑制剤、ＨＩＶ遺伝子発現抑制剤などとしての用途が提案されている（例えば、非特許文献３，４及び特許文献１〜５参照）。しかし、後述するように該化合物がＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２産生阻害活性を有していることは従来知られておらず、新規の事項である。
【非特許文献１】上野晃憲、大石幸子、「炎症・アレルギーとプロスタノイド（１）炎症」、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）, 117, 255-261(2001)
【非特許文献２】岩倉洋一郎、「関節炎発症におけるＩＬ−１の役割」、最新医学、５７巻、４号、16(840)〜24(848)頁、2002.4
【非特許文献３】Tetrahedron Letters No.50,pp4461-4462,1975
【非特許文献４】Shoji Shibataら,"Inhibitory Effects of Licochalcone A Isolated from Glycyrrhiza inflata Root on Inflammatory Ear Edema and Tumour Promotion in Mice",Planta med. 57(1991),pp221-224
【特許文献１】特開平６−１２２６２３号公報
【特許文献２】特開平７−２６５６号公報
【特許文献３】特開平１０−７７２２１号公報
【特許文献４】特開２００１−１６３７１８号公報
【特許文献５】特開２００１−２５３８２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述した通り、ＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２の産生阻害物質は新規医薬品のシード化合物として期待されている。
本発明はＩＬ-１βによるＰＧＥ２産生を抑制して抗炎症作用を示す新規物質の提供を目的する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は前記目的を達成するため、カルコン化合物の中から選択されるプロスタグランジン産生阻害剤を提供する。
また本発明はリコカルコンＡまたはリコカルコンＢからなるプロスタグランジン産生阻害剤を提供する。
さらに本発明は、前記プロスタグランジン産生阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規のプロスタグランジン産生阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のプロスタグランジン産生阻害剤は、プロスタグランジン産生阻害活性をもつカルコン化合物からなる。本発明において、好適なカルコン化合物は、リコカルコンＡまたはリコカルコンＢであり、より好ましくは下記式（１）で表されるリコカルコンＡである。
【０００９】
【化１】
2006282639.tif 000002
【００１０】
また、本発明のプロスタグランジン産生阻害剤は、塩酸、リン酸、有機酸、金属イオン等と薬理的に許容される塩を形成し得る。本発明のプロスタグランジン産生阻害剤は、このような薬理学的に許容される塩の形態となった化合物をも包含する。
【００１１】
前記リコカルコンＡ、リコカルコンＢは周知であり、例えば非特許文献３（Tetrahedron Letters No.50,pp4461-4462,1975）にはリコカルコンＡ、リコカルコンＢの構造に関して記載されている。また非特許文献４（Shoji Shibataら,"Inhibitory Effects of Licochalcone A Isolated from Glycyrrhiza inflata Root on Inflammatory Ear Edema and Tumour Promotion in Mice",Planta med. 57(1991),pp221-224）には、リコカルコンＡに関してマウスの耳の浮腫及び腫瘍形成の抑制効果について記載されている。またこの非特許文献４には、甘草（Xin-jiang liquorice）の酢酸エチル抽出液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製してリコカルコンＡを得ることが記載されている。従って、該化合物は公知の抽出方法によって市販の甘草等から得ることができる。
【００１２】
本発明のプロスタグランジン産生阻害剤は、後述する実施例で実証した通り、ＩＬ-１βにより誘起されるＰＧＥ２の産生阻害活性を有している。ＩＬ-１βは生体内で免疫応答時などに発現するサイトカインの一つであり、生体内でＰＧＥ２産生の亢進を起こす物質である。このＩＬ-１βを、実施例で用いたヒト皮膚線維芽細胞のような培養細胞を含む培地に添加すると、該細胞のＰＧＥ２産生が亢進され培地中のＰＧＥ２濃度が上昇する。しかし、培地にＩＬ-１βとともに本発明のプロスタグランジン産生阻害剤を添加した場合には、ＰＧＥ２産生が阻害される。従って、本発明のプロスタグランジン産生阻害剤は、ＩＬ-１βにより誘起されるＰＧＥ２の産生亢進に起因する炎症反応を抑制し、種々の部位に生じる炎症反応を予防及び治療するための抗炎症剤として用いることができる。
【００１３】
前記プロスタグランジン産生阻害剤を有効成分として含む本発明の抗炎症剤は、常法により錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、吸入剤等の製剤形態、または軟膏、塗布液等の皮膚外用剤等の製剤とすることができ、経口または非経口投与により抗炎症剤として臨床に供し得る。投与量は治療するべき症状及び投与方法により左右されるが、通常は、成人１日あたり１μｇから１０ｇを単一投与または１日数回に分けて投与することができる。
【００１４】
前記のように経口投与の製剤形態としては、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤などがあり、これらの製剤には製薬上許容される賦形剤として、澱粉、乳糖、マンニトール、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が配合され、滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムが添加される。またゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン等を結合剤として用い得る。注射剤、吸入剤、外用剤等の非経口のための製剤としては無菌の水性または非水性の溶剤、または乳濁剤があげられる。非水性の溶液剤または懸濁剤の基剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が用いられる。一方、坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール等を用いることができる。
以下、実施例により本発明の作用効果を実証する。
【実施例】
【００１５】
［実施例１］
市販の甘草から非特許文献４（Shoji Shibataら,"Inhibitory Effects of Licochalcone A Isolated from Glycyrrhiza inflata Root on Inflammatory Ear Edema and Tumour Promotion in Mice",Planta med. 57(1991),pp221-224）に記載された抽出・精製方法に従ってリコカルコンＡを得た。このリコカルコンＡを用い、そのＰＧＥ２産生阻害活性を調べた。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（４次培養、クラボウ社製）を１０％血清添加α−minimum essential medium（α−ＭＥＭ）を用いて４８穴マルチプレートに１×１０４個／２５０μＬの細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエント後、０．５％血清添加α−ＭＥＭを用いて４８時間低血清培養を行った。
その後、ＩＬ-１β（刺激物質）１ｎｇ／ｍＬ及びリコカルコンＡを下記表１中に記した各濃度で含む０．５％血清添加α−ＭＥＭへと培地の交換を行い、薬剤処理として２４時間培養した。培養後回収した培地上清中のＰＧＥ２と産生量をＥＬＩＳＡ（Cayman Chemical社製、商品名Prostaglandin E２ Express EIA Kitを使用して製造者の指示に従って測定）にて定量した。
また、ＰＧＥ２産生阻害剤として周知の物質である下記式
【００１６】
【化２】
2006282639.tif 000003
【００１７】
で表される化合物（以下、ＮＳ-３９８と記す、Cayman Chemical社製の市販品を使用）を参考例として用い、実施例と同様のアッセイを行った。
【００１８】
それぞれの結果は、コントロール（ＩＬ-１β１ｎｇ／ｍＬ処理群）に対する阻害率（％）として、平均値±標準誤差で示し、有意差検定をＴｕｋｅｙの検定（Tukey's multiple test）で行った。結果を下記表１にまとめて記す。
【００１９】
【表１】
2006282639.tif 000004
【００２０】
表１に示した結果から、本発明に係るリコカルコンＡは、ＮＳ-３９８と同様にＩＬ-１βの刺激により誘発された細胞のＰＧＥ２産生を阻害したことから、ＮＳ-３９８と同様の作用機序によりＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２の産生阻害活性を有していると示唆される。
またリコカルコンＡは、ＩＣ５０が１５ｎＭという強いＰＧＥ２の産生阻害活性を有していることが実証された。
【００２１】
［実施例２］
・ＣＯＸ（cyclooxygenase）−１によるＰＧＥ２産生に対する阻害作用。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ社製）を１０％血清添加α−ＭＥＭを用いて４８ウェルマルチウェルプレートに１×１０４個／２５０μＬの濃度で播種した。コンフルエントに達した細胞をデキサメタゾン１００ｎＭで２４時間処理し、細胞を洗浄した後に被験薬を３０分間インキュベートした。その後、アラキドン酸（最終濃度１００μＭ）を添加し３０分間インキュベートし、培養上清を回収した。被験薬は、リコカルコンＡ、ＣＯＸ−１／−２阻害剤のインドメタシン（Sigma社製）及びＣＯＸ−２選択的阻害剤として知られるＮＳ−３９８（ＮＳ、Cayman Chemical社製）である。培養上清中のＰＧＥ２含量は、ELISA kit（Cayman Chemical社製、商品名Prostaglandin E２ Express EIA Kit）にて定量した。結果は無処置群に対する阻害率として平均値±標準誤差（S.E.）で表し、有意差検定をTukey's multiple testで行った。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
2006282639.tif 000005
【００２３】
表２の結果から、リコカルコンＡは、ＣＯＸ−２由来によるＰＧＥ２産生を十分に阻害できる濃度でもアラキドン酸刺激によるＣＯＸ−１によるＰＧＥ２産生を抑えることができなかった。ＣＯＸ−２選択的阻害剤であるＮＳ−３９８も同様に抑制効果が見られなかった。一方、ＣＯＸ−１／−２阻害剤のインドメタシンは有意にＰＧＥ２産生を抑制した。これらの結果は、リコカルコンＡがヒトＣＯＸ−２由来ＰＧＥ２産生を選択的に阻害することを示唆している。
【００２４】
［実施例３］
・ＣＯＸ−１，２タンパク産生に対する影響。
６０ｍｍディッシュに播種してコンフルエントに達した正常ヒト皮膚線維芽細胞にデキサメタゾン（ＤＥＸ，１００ｎＭ）、ＮＳ−３９８（ＮＳ，１００ｎＭ）、リコカルコンＡ（Lico A，１μＭ）を６時間処理後、培地を除去しリン酸緩衝液でセルスクレーパーを用いて細胞を回収した。細胞浮遊液の遠心分離後、採取した細胞はホモジナイザーで粉砕し遠心後の上清をＣＯＸ−１タンパク液とした。一方、ＣＯＸ−２タンパク液はコンフルエント細胞にＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）とともにデキサメタゾン（１００ｎＭ）、ＮＳ−３９８（１００ｎＭ）、リコカルコンＡ（１μＭ）をそれぞれ６時間処理後、前述した方法と同様にして得た。
１μＬ（タンパク含量５０ｎｇ）のＣＯＸ−１，ＣＯＸ−２スタンダード（Cayman Chemical社製）及び１０μＬ（タンパク含量３０μｇ）のＣＯＸ−１，ＣＯＸ−２タンパク液を５−２０％グラディエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル(ATTO社製）にそれぞれアプライし、コンパクトＰＡＧＥ(ATTO社製）で電気泳動を行った。泳動後ゲルをＰＶＤＦメンブレン(ATTO社製）にコンパクトブロット(ATTO社製）でブロッティングした。１％スキムミルク（和光純薬社製）でブロッキングしたメンブレンにＣＯＸ−１ポリクローナル抗体（Oxford社製）、もしくはＣＯＸ−２ポリクローナル抗体（Cayman Chemical社製）を４℃、一晩反応させた。０．１％Tween-20（Bio-Rad社製）添加リン酸緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識二次抗体（Amersham Biosciences社製）を室温で１時間反応させた。二次抗体を洗浄した後、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences社製）でＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２タンパクに対して生じた化学発光をライトキャプチャー(ATTO社製）で検出した。結果を図１に示す。
【００２５】
図１の結果から、ＣＯＸ−１タンパクの発現は、既知の報告通りＩＬ−１βにより誘導されなかった。また、ＣＯＸ−１タンパクの発現にはリコカルコンＡを含む被験薬に対して影響がなかった。ＣＯＸ−２タンパクは、ＩＬ−１βにより顕著に誘導された。デキサメタゾンは、ＣＯＸ−２タンパク発現を完全に抑制した。一方、リコカルコンＡ及びＮＳ−３９８はＣＯＸ−２タンパク発現に対して影響を与えなかった。これらのことから、リコカルコンＡのＰＧＥ２産生阻害効果は、ＣＯＸ−２の発現を抑えるステロイド作用と異なり、ＮＳ−３９８と同様にＣＯＸ−２選択的活性阻害であることが考えられる。
【００２６】
［実施例４］
・ｓＰＬＡ２（分泌型ホスホリパーゼＡ２）活性阻害作用。
酵素活性の測定にはｓＰＬＡ２ Assay kit（Cayman Chemical社製）を用いた。９６ウェルプレートにｓＰＬＡ２を含むｂｅｅ  ｖｅｎｏｍおよび被験薬を入れ、基質としてジヘプタノイルチオ−ＰＣを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート中にエルマン試薬（Ellman's reagent）による発色を４０５ｎｍの吸光度で測定し、その傾きからｓＰＬＡ２活性を算出した。被験薬は、リコカルコンＡ、ＮＳ−３９８（ＮＳ、Cayman Chemical社製）及びｓＰＬＡ２活性阻害剤であるプロスタグランジンＢｘ（PGBx、Cayman Chemical社製）である。結果は、無処置群に対する阻害率として平均値±標準誤差（S.E.）で表し、有意差検定をTukey's multiple testで行った。結果を図２に示す。
【００２７】
図２の結果から、ｓＰＬＡ２活性阻害剤であるプロスタグランジンＢｘは、用量依存的にｓＰＬＡ２活性を阻害した。リコカルコンＡも用量依存的な効果を示し、高濃度（１００μＭ）で有意にｓＰＬＡ２活性を阻害した。一方、ＮＳ−３９８には抑制効果がみられなかった。この結果から、リコカルコンＡには高濃度であるが炎症反応に関与するｓＰＬＡ２活性を抑制する作用があることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る実施例３の結果を表し、各被験薬（デキサメタゾン、ＮＳ−３９８、リコカルコンＡ）によるＣＯＸ−１，２タンパクの発現状態を示すグラフである。
【図２】本発明に係る実施例４の結果を表し、各被験薬（リコカルコンＡ、ＰＧＢｘ、ＮＳ−３９８）によるｓＰＬＡ２活性の阻害率を示すグラフである。
【図１】
2006282639.tif 000006
【図２】
2006282639.tif 000007