(57)【要約】【課題】    本発明は、汎用性を持ち、かつ簡便迅速に遺伝子増幅宿主細胞を得るための方法、およびそのような方法によって得られる哺乳動物細胞を提供することにある。【解決手段】  本発明によって、任意の外来遺伝子を含むベクターを特異的部位特異的組換えによって挿入しうる部位を複数有する哺乳動物細胞が提供される。  具体的には、本発明によって、第１の部位特異的組換え配列と選択マーカーを含有する発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、そのベクターに含まれる遺伝子および核酸配列をその選択マーカーに対応する遺伝子増幅誘導因子を用いて遺伝子増幅させ、その後、第２の部位特異的組換え配列と外来遺伝子を含有するベクターを導入し、第１の部位特異的組換え配列と第２の部位特異的組換え配列とを部位特異的組換え誘導因子の作用により部位特異的に組換えることによって製造される哺乳動物細胞が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体中に挿入された、部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含有する核酸断片を、少なくとも３個含有する、哺乳動物細胞。
【請求項２】
さらに、部位特異的組換え誘導因子を含有する、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
前記選択マーカー遺伝子が、以下からなる群から選択される、請求項１に記載の哺乳動物細胞：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ。
【請求項４】
前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素である、請求項３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
前記部位特異的組換え誘導因子がＣｒｅタンパク質であり、前記部位特異的組換え配列が野生型ｌｏｘＰ配列または変異型ｌｏｘＰ配列である、請求項２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、前記哺乳動物細胞の染色体のセントロメア近傍、テロメア近傍、またはテロメア極近傍に挿入されている、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
ＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、ＣＨＯ細胞の、Ｅ染色体のセントロメア近傍、Ｊ染色体のセントロメア近傍、Ｋ染色体のセントロメア近傍、Ｌ染色体のセントロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体テロメア側、Ｐ染色体テロメア近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、ＣＨＯ細胞の、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
染色体中に挿入された前記部位特異的組換え配列と相同な配列を含有する核酸断片を、部位特異的組換えによって染色体中に挿入し得る、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
染色体中に挿入された前記部位特異的組換え配列と相同な配列を含有する核酸断片を、部位特異的組換えによって染色体中に挿入した、請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記部位特異的組換えによって染色体中に挿入した核酸断片が、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子を含有する、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞が前記外来遺伝子の発現を行う条件下で培養する工程を包含する、外来遺伝子産物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の哺乳動物細胞を含むキット。
【請求項１５】
外来遺伝子を発現するために用いることができる哺乳動物細胞を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）第１の部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を該哺乳動物細胞の染色体に挿入する工程；および
（ｂ）該哺乳動物細胞を、遺伝子増幅誘導因子存在下で培養し、選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の遺伝子増幅を生じさせる工程；
を包含する、方法。
【請求項１６】
さらに、以下の工程を包含する、請求項１５に記載の製造方法：
（ｃ）前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である哺乳動物細胞を選択する工程。
【請求項１７】
さらに、以下の工程のいずれか：
（ｄ）該哺乳動物細胞中に、部位特異的組換え誘導因子を導入する工程；または
（ｄ’）該哺乳動物細胞中に、部位特異的組換え誘導因子を発現し得るベクターを導入する工程、
を包含する、請求項１５に記載の製造方法
【請求項１８】
さらに、以下の工程：
（ｅ）該哺乳動物細胞に、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入し、前記部位特異的組換え誘導因子によって、第１の部位特異的組換え配列と、第２の部位特異的組換え配列とを部位特異的組換えさせる工程
を包含する、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記選択マーカー遺伝子が、以下からなる群から選択される、請求項１５に記載の製造方法：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ。
【請求項２０】
前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記部位特異的組換え誘導因子がＣｒｅタンパク質であり、前記第１の部位特異的組換え配列および前記第２の部位特異的組換え配列の少なくとも１つが野生型または変異型ｌｏｘＰ配列である、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞由来の細胞である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記遺伝子増幅を生じさせる工程（ｂ）が、テロメア近傍に挿入されたベクターに含まれる遺伝子が増幅された細胞が選択的に出現する条件下で行われる、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法によって製造された、哺乳動物細胞。
【請求項２５】
外来遺伝子産物の製造方法であって、請求項１８に記載の方法によって製造された哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞が前記外来遺伝子の発現を行う条件下で培養する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝子を高効率で組換え発現するための哺乳動物宿主細胞の製造方法、ならびにそのような方法によって製造された宿主細胞、及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物において発現されるタンパク質には、糖鎖が付加したタンパク質、すなわち、糖タンパク質が含まれる。糖タンパク質中の糖鎖部分の機能は完全には解明されていないが、糖タンパク質分子と他の分子との間の相互作用、糖タンパク質を介した細胞間相互作用などにおいて重要な役割を担い、また、糖鎖部分の改変は、糖タンパク質の機能、免疫学的性質などに影響を与えると考えられている。そのため、所望の機能・特性を有する糖タンパク質の産生のためには、目的の糖鎖を有するタンパク質を産生する必要がある。
【０００３】
哺乳動物の糖タンパク質の糖鎖部分は一般に、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコースなどの複数種類の糖が、分岐を含む多様な結合様式で結合した複合型糖鎖構造を有する。また、複合型糖鎖構造は、細胞種によって異なるため、哺乳動物（例えば、ヒト）由来の糖タンパク質を発現するためには、哺乳動物細胞を組換え発現の宿主として使用することが必要となる。特に、タンパク質医薬品を製造する場合、適切な複合型糖鎖構造を有するタンパク質を製造する必要がある場合が多いことから、宿主として哺乳動物細胞を用いる必要がある。
【０００４】
しかし、哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる糖タンパク質の組換え発現は、細菌および酵母など他の宿主細胞と比較して、増殖速度の低さ、および高価な培地という欠点を有する。このような欠点を克服する１つの手段は、哺乳動物宿主細胞の組換え発現効率、すなわち、細胞当たり時間当たりのタンパク質の生産性、即ち比生産速度を上昇させることである。
【０００５】
比生産速度を上昇させるには、組換え発現させる遺伝子を強力なプロモーターに連結し、かつ組換え遺伝子のコピー数を増加させる遺伝子増幅を行うことが有効である。組換え発現のための強力なプロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、ヒト  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ヒト延長因子−１（ＥＦ−１）プロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ  最小熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ）のプロモーター、ヒト  メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒト  ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ヒト  アクチンプロモーター）、および人工のプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター（ＳＶ４０初期プロモーターとＨＴＬＶのＬＴＲプロモーターの融合）、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとニワトリ  アクチンプロモーターのハイブリッド）のような融合プロモーター）が周知であることから、これら周知のプロモーターまたはその改変体を用いることによって、組換え発現の発現量を容易に上昇させることができる。これに対して、所望の組換え遺伝子について遺伝子増幅を行うことは、多大な時間と労力を要する。
【０００６】
遺伝子増幅とは、特定の遺伝子を含んだ染色体ＤＮＡ領域のコピー数が増加することをいう。人工的に遺伝子増幅を起こして、遺伝子増幅した哺乳動物細胞を単離する方法としては、例えば、哺乳動物の培養細胞で薬剤耐性の細胞を段階的に選択していくことにより、その薬剤に対する耐性を担う遺伝子である薬剤耐性遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ））のコピー数を増加したクローンを単離する方法が挙げられる。この方法を用いて単離された哺乳動物細胞においては、薬剤耐性遺伝子のみならず、その近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅される。従って、所望の遺伝子が遺伝子増幅した細胞の単離は、その所望の遺伝子および薬剤耐性遺伝子を含む核酸断片を染色体に挿入するか、または、そのような遺伝子の部分配列をミニジーンとして含む核酸断片を染色体に挿入し、その薬剤耐性遺伝子が遺伝子増幅を起こした細胞を単離することによって、可能となる。この遺伝子増幅法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓｃｈｉｍｋｅ  ＲＴ．，”Ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８  Ｍａｙ  ５；２６３（１３）：５９８９−９２、Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨ，Ｂｕｃｋｅｌ  Ｐ，Ｗｉｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．”Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ”，Ｇｅｎｅ，１９８８  Ｊｕｎ  ３０；６６（２）：１９３−２０３、Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．”Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８５：５３７−６６に記載されている。
【０００７】
しかし、この方法を用いる場合には、遺伝子に対する汎用性がなく、所望の遺伝子ごとに段階的な薬剤耐性細胞の選択を行う必要がある。またこの選択は、１回あたり通常１〜３ヶ月程度必要であり、かつその選択を通常は５段階で行うため、選択工程全体としては、平均的に約７ヶ月必要であることから、所望の宿主細胞を選択するために多大な時間と労力を要する。なぜなら、形質転換された宿主細胞をいきなり高濃度の薬剤にさらせば、遺伝子増幅が起こる前に全ての細胞が死滅してしまうため、時間を要する薬剤耐性細胞の選択を、低濃度の薬剤から高濃度の薬剤まで段階的に薬剤濃度を上昇させながら繰り返す必要があるからである。
【０００８】
また、この遺伝子増幅の事象は、全ての細胞に同時に起こるのではなく、一部の細胞で様々なタイミングで起こり、その結果として得られる細胞集団はおのずと不均一なものとなり、また、たとえ高濃度の薬剤に耐性のクローンであっても必ずしも所望の遺伝子を増幅したクローンであるとは限らないので、その不均一な集団からさらに高効率で組換え発現を行う宿主細胞（すなわち、遺伝子のコピー数が最も高い細胞）をクローン化する労力および時間（通常１〜２ヶ月）がさらに必要となる。さらに、組換え発現タンパク質を工業生産する場合、とりわけ医薬品に供するために生産される場合には、厳しい品質管理が要求されるが、前記したヘテロな細胞集団を用いて生産すると、品質にバラツキが生じ品質管理が容易でないことからも、このクローニング作業が必要とされる。
【０００９】
さらに、この従来方法によって構築された細胞株の中には不安定であり、継代培養中にその細胞学的性質を変化させる株も存在する。そのため、クローン化された細胞の安定性について、さらに２ヶ月程度の阻害剤を含まない培地中で長時間培養を行い、細胞の安定性について試験する必要がある。
【００１０】
遺伝子増幅した細胞を迅速に選択する方法が開発されてはいるものの（特開２００１−３７４７８）、いまだ、汎用性のある、外来遺伝子を高発現し得る哺乳動物細胞を製造する方法、およびそのような汎用性のある哺乳動物細胞は開発されていない。
【００１１】
従って、汎用性を持ち、かつ簡便迅速に遺伝子増幅宿主細胞を得るための方法、およびそのような方法によって得られた宿主細胞が望まれる。
【特許文献１】特開２００１−３７４７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、汎用性を持ち、かつ簡便迅速に遺伝子増幅宿主細胞を得るための方法、およびそのような方法によって得られる哺乳動物細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、任意の外来遺伝子を含むベクターを部位特異的組換えによって挿入し得る部位を複数有する哺乳動物細胞を開発することによって、達成された。
【００１４】
具体的には、本発明は、第１の部位特異的組換え配列と選択マーカーを含有する発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、そのベクターに含まれる核酸配列をその選択マーカーに対応する遺伝子増幅誘導因子を用いて遺伝子増幅させ、その後、第２の部位特異的組換え配列と外来遺伝子を含有するベクターを導入し、第１の部位特異的組換え配列と第２の部位特異的組換え配列とを部位特異的組換え誘導因子の作用により部位特異的に組換えることによって哺乳動物細胞を製造することによって達成された。
【００１５】
本発明において、第１の部位特異的組換え配列と選択マーカーを含有する発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、そのベクターに含まれる遺伝子および核酸配列をその選択マーカーに対応する遺伝子増幅誘導因子を用いて遺伝子増幅させることによって得られた哺乳動物細胞は、複数の部位特異的組換え配列を有する細胞である。従って、このようにして調製された哺乳動物細胞は、任意の外来遺伝子を染色体中に挿入し、その外来遺伝子を高発現するための哺乳動物細胞を簡便に調製するための材料として使用され得る。具体的には、このようにして調製された哺乳動物細胞に対して、任意の外来遺伝子と第２の部位特異的組換え配列とを含有するベクターを導入し、第１の部位特異的組換え配列と第２の部位特異的組換え配列とを部位特異的組換え誘導因子の作用により部位特異的に組換えることによって、任意の外来遺伝子を染色体中に複数コピー含む哺乳動物細胞が製造される。
【００１６】
本発明によって提供される製造方法に従って、外来遺伝子を高発現する哺乳動物細胞のが、従来法よりも簡便かつ迅速に提供される。さらに、本発明の哺乳動物細胞は、任意の外来遺伝子発現ベクターを複数コピー含むことができるという汎用性を持ち合わせる。
【００１７】
また、本発明において、効率的に遺伝子増幅が生じる染色体上の位置が、Ｅ染色体のセントロメア近傍、Ｊ染色体のセントロメア近傍、Ｋ染色体のセントロメア近傍、Ｌ染色体のセントロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体テロメア側、Ｐ染色体テロメア近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍であり、好ましくは、Ｋ染色体のセントロメア近傍、Ｌ染色体のセントロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体テロメア側、Ｐ染色体テロメア近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍であり、さらに好ましくは、Ｎ染色体のテロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体テロメア近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍であり、なおより好ましくは、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍であり、最も好ましくは、Ｐ染色体テロメア極近傍であるとして同定された。
【００１８】
従って、本発明において、外来遺伝子を発現するために用いることができる哺乳動物細胞を製造する方法であって、第１の部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を哺乳動物細胞の染色体に挿入し、その哺乳動物細胞を遺伝子増幅誘導因子存在下で培養して選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の遺伝子増幅を生じさせた後、その核酸断片の染色体中の挿入位置が、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である哺乳動物細胞を選択することによって、染色体中の遺伝子増幅を生じやすい位置に、第１の部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含む遺伝子増幅した核酸配列を有する哺乳動物宿主細胞を製造する方法を提供する。この様にして製造された哺乳動物宿主細胞は、（ｉ）さらなる遺伝子増幅を生じるために、遺伝子増幅誘導因子存在下で培養されるか、または（ｉｉ）部位特異的組換え誘導因子の作用によって、第１の部位特異的組換え配列と、第１の部位特異的組換え配列と相同な第２の部位特異的組換え配列との間での部位特異的組換えを生じさせ、第２の部位特異的組換え配列および外来遺伝子を含有する核酸断片を染色体中に挿入し、その後、さらなる遺伝子増幅を生じるために、遺伝子増幅誘導因子存在下で培養される。
【００１９】
従って、本発明は以下を提供する。
１．染色体中に挿入された、部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含有する核酸断片を、少なくとも３個含有する、哺乳動物細胞。
２．さらに、部位特異的組換え誘導因子を含有する、項目１に記載の哺乳動物細胞。
３．前記選択マーカー遺伝子が、以下からなる群から選択される、項目１に記載の哺乳動物細胞：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ。
４．前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素である、項目３に記載の哺乳動物細胞。
５．前記部位特異的組換え誘導因子がＣｒｅタンパク質であり、前記部位特異的組換え配列が野生型ｌｏｘＰ配列または変異型ｌｏｘＰ配列である、項目２に記載の哺乳動物細胞。
６．前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、前記哺乳動物細胞の染色体のセントロメア近傍、テロメア近傍、またはテロメア極近傍に挿入されている、項目１に記載の哺乳動物細胞。
７．ＣＨＯ細胞である、項目１に記載の哺乳動物細胞。
８．前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、ＣＨＯ細胞の、Ｅ染色体のセントロメア近傍、Ｊ染色体のセントロメア近傍、Ｋ染色体のセントロメア近傍、Ｌ染色体のセントロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体テロメア側、Ｐ染色体テロメア近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である、項目７に記載の哺乳動物細胞。
９．前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、ＣＨＯ細胞の、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である、項目８に記載の哺乳動物細胞。
１０．染色体中に挿入された前記部位特異的組換え配列と相同な配列を含有する核酸断片を、部位特異的組換えによって染色体中に挿入し得る、項目１に記載の哺乳動物細胞。
１１．染色体中に挿入された前記部位特異的組換え配列と相同な配列を含有する核酸断片を、部位特異的組換えによって染色体中に挿入した、項目１に記載の哺乳動物細胞。
１２．前記部位特異的組換えによって染色体中に挿入した核酸断片が、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子を含有する、項目１１に記載の哺乳動物細胞。
１３．項目１２に記載の哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞が前記外来遺伝子の発現を行う条件下で培養する工程を包含する、外来遺伝子産物の製造方法。
１４．項目１または２に記載の哺乳動物細胞を含むキット。
１５．外来遺伝子を発現するために用いることができる哺乳動物細胞を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）第１の部位特異的組換え配列および選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を該哺乳動物細胞の染色体に挿入する工程；および
（ｂ）該哺乳動物細胞を、遺伝子増幅誘導因子存在下で培養し、選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の遺伝子増幅を生じさせる工程；
を包含する、方法。
１６．さらに、以下の工程を包含する、項目１５に記載の製造方法：
（ｃ）前記核酸断片の染色体中の挿入位置が、Ｎ染色体のテロメア極近傍、またはＰ染色体テロメア極近傍である哺乳動物細胞を選択する工程。
１７．さらに、以下の工程のいずれか：
（ｄ）該哺乳動物細胞中に、部位特異的組換え誘導因子を導入する工程；または
（ｄ’）該哺乳動物細胞中に、部位特異的組換え誘導因子を発現し得るベクターを導入する工程、
を包含する、項目１５に記載の製造方法
１８．さらに、以下の工程：
（ｅ）該哺乳動物細胞に、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入し、前記部位特異的組換え誘導因子によって、第１の部位特異的組換え配列と、第２の部位特異的組換え配列とを部位特異的組換えさせる工程
を包含する、項目１７に記載の製造方法。
１９．前記選択マーカー遺伝子が、以下からなる群から選択される、項目１５に記載の製造方法：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ。
２０．前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素である、項目１９に記載の製造方法。
２１．前記部位特異的組換え誘導因子がＣｒｅタンパク質であり、前記第１の部位特異的組換え配列および前記第２の部位特異的組換え配列の少なくとも１つが野生型または変異型ｌｏｘＰ配列である、項目１７に記載の製造方法。
２２．前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞由来の細胞である、項目１５に記載の製造方法。
２３．前記遺伝子増幅を生じさせる工程（ｂ）が、テロメア近傍に挿入されたベクターに含まれる遺伝子が増幅された細胞が選択的に出現する条件下で行われる、項目１５に記載の製造方法。
２４．項目１５〜１８のいずれか１項に記載の方法によって製造された、哺乳動物細胞。
２５．外来遺伝子産物の製造方法であって、項目１８に記載の方法によって製造された哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞が前記外来遺伝子の発現を行う条件下で培養する工程を包含する、方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、外来遺伝子を高発現する哺乳動物細胞を、従来法よりも簡便かつ迅速に製造する方法、およびそのような方法によって製造された哺乳動物細胞が提供される。さらに、特定の遺伝子に限定されることのない、任意の外来遺伝子への適用が容易に可能である汎用哺乳動物細胞もまた、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２３】
本明細書において「部位特異的組換え配列」とは、哺乳動物細胞内において、部位特異的組換え誘導因子の作用に依存して部位特異的組換えを生じるが、部位特異的組換え誘導因子が作用しない場合には部位特異的組換えを生じない配列をいう。部位特異的組換えとは、１対の二本鎖ＤＮＡの相同な塩基配列をもつ部分において、部位特異的組換え誘導因子の作用に依存して起こる組換えをいう。
【００２４】
「部位特異的組換え」が生じたか否かは、例えば、以下の工程を包含する方法を用いて、容易に確認することができる：
（１）部位特異的組換え配列と外来遺伝子とを含む核酸断片を細胞内に導入する工程；および
（２）その外来遺伝子が染色体内の部位特異的組換え配列近傍に挿入されたか否かを、通常のゲノミックサザン・ハイブリダーゼーション法やゲノムＰＣＲ法を用いて検出する工程。
【００２５】
本明細書において「遺伝子増幅」とは、１組の染色体における特定の遺伝子の数が、生物の生活環において増幅する現象をいう。本明細書において「遺伝子増幅誘導因子」とは、その存在下で哺乳動物細胞を培養することによって、特定の遺伝子が遺伝子増幅を起こす因子をいう。遺伝子増幅誘導因子は、特定の遺伝子（単数または複数）の遺伝子増幅をもたらすが、その他の遺伝子に対しては、遺伝子増幅をもたらさない。本明細書において、遺伝子増幅誘導因子に対応する特定の遺伝子を、「選択マーカー」遺伝子ともいう。遺伝子増幅誘導因子が薬剤である場合、選択マーカー遺伝子としては、その薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００２６】
遺伝子増幅誘導因子と選択マーカー遺伝子の組み合わせは、例えば、哺乳動物細胞の増殖を阻害および／または抑制する因子と、その因子の作用を除去、抑制および／または阻害するタンパク質を発現する遺伝子との組み合わせである。遺伝子増幅誘導因子と選択マーカー遺伝子との好ましい組み合わせとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）とメソトレキセート（ＭＴＸ）との組み合わせ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）とメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）との組み合わせ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＣＡＤ）とＮ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＡＬＡ）との組み合わせ、メタロチオネイン（ＭＴ）とカドミウム（Ｃｄ２＋）との組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）とアデノシン、アラノシン、２’−デオキシコホルマイシンとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）とアデニン、アザセリン、コホルマイシンとの組み合わせ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼと、ミコフェノール酸との組み合わせ、ＵＭＰシンターゼと６−アザウリジン、ピラゾフラン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒａｎ）との組み合わせ、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ，  ＭＤＲ）と多剤薬剤との組み合わせ、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳ）とβ−アスパルチルヒドロキサム酸またはアルビジイン（ａｌｂｉｚｚｉｉｎｎ）との組み合わせ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）とα−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）との組み合わせ。
【００２７】
遺伝子増幅において、遺伝子増幅誘導因子の濃度を調整することによって、テロメアに挿入されたベクターに含まれる遺伝子が増幅された細胞が選択的に出現する条件とすることができることが公知である（特開２００１−３７４７８）
本明細書において染色体の「テロメア側」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を２つに均等に分割した場合のテロメア側の２分の１の領域をいう。本明細書において染色体の「セントロメア側」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を２つ均等に分割した場合のセントロメア側の２分の１の領域をいう。また、ここでいう「均等に分割」とは、染色体をＦＩＳＨ法を用いて観察した際の染色体の画像に基づいて、染色体を均等に分割することをいう。
【００２８】
本明細書において染色体の「テロメア近傍」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を３つに均等に分割した場合のテロメア側の３分の１の領域をいう。本明細書において染色体の「セントロメア近傍」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を３つに均等に分割した場合のセントロメア側の３分の１の領域をいう。
【００２９】
本明細書において染色体の「テロメア極近傍」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を４つに均等に分割した場合のテロメア側の４分の１の領域をいう。本明細書において染色体の「セントロメア極近傍」とは、染色体の短腕および長腕の各々について、セントロメアとテロメアとの間を４つに均等に分割した場合のセントロメア側の４分の１の領域をいう。
【００３０】
染色体中の外来遺伝子挿入位置のマッピングのための代表的な方法としては、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）が挙げられる。ＦＩＳＨ法では、導入した目的遺伝子をプローブに用い、対比染色にはＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いる。ＤＡＰＩを用いることにより染色体が染まり、濃淡のバンドがでるので、導入した目的遺伝子をプローブとしたＦＩＳＨによる画像とＤＡＰＩによる画像を重ね合わせることにより、染色体の挿入位置が特定できる。どの染色体に入ったかを特定するためには、染色体特有の蛍光プローブを用いて染める必要がある。ＣＨＯ細胞の場合にはそのようなプローブがないため、ＤＡＰＩで得られたバンドパターンを用いて、画像解析を行い、染色体を分類する。
【００３１】
本発明において、部位特異的組換え配列が、宿主染色体に挿入される。部位特異的組換え配列の挿入位置は特に限定されず、染色体のセントロメア側であっても、テロメア側であってもよい。部位特異的組換え配列の挿入位置は、好ましくは染色体のセントロメア近傍または染色体のテロメア近傍であり、より好ましくは染色体のテロメア近傍であり、さらにより好ましくは染色体のテロメア極近傍である。
【００３２】
本明細書において「部位特異的組換え誘導因子」とは、哺乳動物細胞内において、部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを生じさせる因子をいう。代表的には、この部位特異的組換え誘導因子は、タンパク質である。
【００３３】
「部位特異的組換え誘導因子」と「部位特異的組換え配列」とは、互いに特異性を有する。従って、特定の部位特異的組換え配列での部位特異的組換えを起こすためには、その部位特異的組換え配列に適切な部位特異的組換え誘導因子を選択する必要がある。代表的な「部位特異的組換え誘導因子」と「部位特異的組換え配列」との組み合わせとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バクテリオファージＰ１由来のｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｏｆ  Ｐ１）配列とＣｒｅ（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）タンパク質との組み合わせ、Ｆｌｐタンパク質とＦＲＴ部位との組み合わせ、φＣ３１とａｔｔＢ，ａｔｔＰとの組み合わせ（Ｔｈｏｒｐｅ，Ｈｅｌｅｎａ  Ｍ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔｕａｒｔ  Ｅ．；Ｓｍｉｔｈ，  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｃ．Ｍ．、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｇｅ  φＣ３１．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２０００），３８（２），２３２−２４１．）、リソルバーゼとｒｅｓ部位との組み合わせ（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  Ｐ．，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ：  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｏｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｗｉｓｔ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８６年２月；１６５（２）３４１−７）（一般的には、Ｓａｕｅｒ  Ｂ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；５（５）：５２１−７．を参照のこと）。
【００３４】
本発明の部位特異的組換え誘導因子と部位特異的組換え配列の組み合わせが適切であるか否かは、ゲノミックサザン・ハイブリダーゼーション、または、ゲノムＰＣＲを用いて「部位特異的組換え」が生じたか否かを試験することによって確認できる。
【００３５】
部位特異的組換え誘導因子と同様の部位特異的組換え機能を保持する限り、部位特異的組換え誘導因子に代えて部位特異的組換え誘導因子の改変体あるいはホモログまたはオルソログを使用することもできる。また、部位特異的組換え配列と相同な配列を、部位特異的組換え配列と部位特異的組換えを生じる標的の配列として、または部位特異的組換え配列の代わりに使用することもできる。
【００３６】
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００３７】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタ���ティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００３８】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
【００３９】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００４０】
本明細書において部位特異的組換え配列が「相同」であるとは、２以上の部位特異的組換え配列が互いに部位特異的組換え誘導因子に依存して哺乳動物細胞内で部位特異的組換えを起こす程度の相同性を有することをいう。従って、当業者は、部位特異的組換え配列に１〜数個の欠失、付加、および／または置換を導入してもなお元の部位特異的組換え配列に対して「相同」である配列を容易に得ることができる。
【００４１】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００４２】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００４３】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００４４】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００４５】
本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。
【００４６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００４８】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある核酸配列またはある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある核酸が部位特異的組換え配列である場合、その生物学的活性は、部位特異的組換え誘導因子の作用によって、その部位特異的組換え配列に対して相同である配列と特異的に部位特異的組換えを起こす活性である。ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。
【００４９】
部位特異的組換え誘導因子がタンパク質である場合、そのタンパク質中のアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００５０】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００５１】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００５２】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。本明細書において、これらもとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質を、「野生型」ポリペプチドまたは「野生型」ポリヌクレオチドともいう。本明細書において、用語「改変体」と「変異型」とは、置換可能に用いられる。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００５４】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、その生物学的機能を保持する配列をいう。アミノ酸配列をコードする場合、遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。
【００５５】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００５６】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００５７】
本明細書において使用されるポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性（部位特異的組換えを起こす活性などを含む）を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００５８】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００５９】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、部位特異的組換えを起こす機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００６０】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。
【００６１】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、哺乳動物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、哺乳動物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
【００６２】
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【００６３】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、動物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００６４】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｗｉｌｅｙ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００６５】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、哺乳動物細胞等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００６６】
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子など）のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。哺乳動物の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００６７】
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、哺乳動物宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００６８】
本発明において使用され得る「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４，（１９８１））、ｐＳＶ  １ＧＴ５−ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４，（１９８１））などが例示される。
【００６９】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【００７０】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【００７１】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。哺乳動物細胞において使用する場合、代表的なエンハンサーとしては、ＳＶ４０のエンハンサーが挙げられるが、これに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【００７２】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００７３】
哺乳動物動物に外来遺伝子を導入する方法は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。代表的な遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、エレクトロポーレーション、裸（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡを用いるＤＮＡ導入法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の生物が、動物の場合、トランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウィルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
【００７５】
本発明において使用され得る哺乳動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。
【００７６】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７７】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【００７８】
本明細書において、「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵巣、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７９】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、マウスのような動物を含む）をいう。
【００８０】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例１】
【００８１】
（選択マーカーを遺伝子増幅した細胞クローンの調製）
種々の条件化下で遺伝子増幅を行なった細胞を用いて、遺伝子増幅された外来遺伝子が挿入された染色体位置、および増幅されたコピー数を検討した。
（１．選択マーカーを含むベクターの導入）  
リポフェクション法によって、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ／ｈＧＭ−ＣＳＦ（６．８ｋｂ）（図１）（ＳＶ４０初期プロモーター及びマウスのｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣＮｏ．３７１４６）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、そして、ＳＶ４０初期プロモーター及びｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有するプラスミドｐＣＤ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５７５９４）をＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断し、これらをリンカーを介して連結することにより作製）を、ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、イスコフ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得た。このベクターを用いた場合の選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素である。
（２．挿入遺伝子の遺伝子増幅）
ジヒドロ葉酸還元酵素に対応する遺伝子増幅誘導因子は、メソトレキセート（ＭＴＸ）であるため、以下のように３通りに変化する濃度のＭＴＸを含むイスコフ培地（核酸−）に、細胞を１×１０５（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の濃度で接種し、細胞がコンフルエントになった時、耐性を獲得したものとみなし、ＭＴＸ濃度をさらに次の濃度に上昇させた。ＭＴＸ濃度の上限を１０００ｎＭとし、緩やかに上昇させる系から急激に上昇させる系まで培養することによって、遺伝子増幅を行った：
（１）０ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、および１０００ｎＭ；
（２）０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、および１０００ｎＭ；ならびに
（３）０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ。
【００８２】
ＭＴＸ濃度を上昇する過程では、これらのＭＴＸ濃度上昇条件によって生じるいろいろな性質を有する細胞を集団として選択するために、濃度上昇各ステップにおけるクローニング操作は一切行わなかった。
【００８３】
１０００ｎＭのＭＴＸに対して耐性を示す細胞が得られた後、以下の方法によって、細胞のクローニングを行った：
９６穴マイクロプレートそれぞれに細胞を１個ずつとなるよう接種した（全量２００μＬ）。１個の細胞からのコロニーであることを確認し、古い培地を吸引して捨てた後、０．２５％トリプシン溶液１００μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞がはがれて丸くなったら、新しい培地１００μＬを加えてよくビベッティングして、２４穴マイクロプレートに継代した（全量２ｍＬ）。コンフルエントまで培養した後、古い培地を吸引して捨て、０．２５％トリプシン溶液１ｍＬを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに、細胞がはがれて丸くなったら、新しい培地１ｍＬを加えてよくピベッティングして、継代（全量１０ｍＬ）てクローンを得た。
【００８４】
この結果、上記（１）の遺伝子増幅では、クローンＬ１−２０、クローンＬ１−１Ｃ、クローンＬ１−Ｂ、クローンＬ１−１、クローンＬ１−Ａ、クローンＬ１−Ｆ、およびクローンＬ１−Ｈが得られ、上記（２）の遺伝子増幅では、クローンＬ４−Ｂ、Ｌ４−Ｃ、Ｌ４−Ｉ、Ｌ４−Ｆ、Ｌ４−Ｇ、Ｌ４−Ｋ、Ｌ４−Ｍ、Ｌ４−Ｈ、およびＬ４−Ｎが得られ、上記（３）の遺伝子増幅では、クローンＬ５−３８、Ｌ５−５５、およびＬ５−３が得られた。これらクローンについて、実施例２に記載のとおりに、特徴付けを行った。
【実施例２】
【００８５】
（選択マーカーを遺伝子増幅したクローンの特徴付け）
実施例１で単離した細胞クローンについて、以下の方法を用いて、遺伝子増幅した遺伝子の染色体上の挿入位置、および遺伝子増幅の結果増幅されたコピー数を決定した。
（１．ＦＩＳＨ法による染色体の観察）
ＦＩＳＨ法を用いて、遺伝子増幅を受けた哺乳動物細胞について、染色体のどの位置にベクターが挿入されているのか、またどの程度遺伝子増幅が行われたのかを、確認した。
【００８６】
ＦＩＳＨ法は、以下の原理で行う：
（１）Ｍ期細胞を固定液で固定し、スライドガラスに滴下することによって、染色体標本を作製する。
（２）ニックトランスレーション法によって、プラスミドをビオチン標識して、２００〜６００ｂｐの大きさのプローブを作製する。
（３）変性したスライドガラス上のＤＮＡとプローブをハイブリダイゼーションする。
（４）ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジンを反応させる。
【００８７】
具体的には、以下の手順により、行った。
【００８８】
（１．１．染色体標本の作製）
染色体標本に用いるコルセミド溶液（１０μｇ／ｍＬ）は、デメコルシン（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ：  Ｄ６２７９）１ｍｇを／超純水１００ｍＬに溶解し、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌した後、４℃で保存した溶液を使用した。固定液は、メタノール：酢酸＝３：１を要時調製して使用した。７５ｍＭ  ＫＣｌ溶液は、ＫＣｌ  ０．５６ｇを超純水１００ｍＬに溶解して使用した。
【００８９】
以下の手順により、染色体標本を作製した。
１）中Ｔ−フラスコで細胞が８０−９０％程度コンフルエントの状態になった時、古い培地をピペットで吸引して捨て、新しい培地  ３０ｍＬを加えた。
２）コルセミド溶液６０μｌを加え、４−５時間インキュベートした。
３）Ｓｈａｋｅ−ｏｆｆ法（Ｋｕｒｉｋｉ  Ｈ，Ｓｏｎｔａ  Ｓ，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ．、Ｆｌｏｗ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．  １９９３；７（２）：１１９−２２．）により、Ｍ期の細胞を浮遊させた。
４）９５×ｇ（１，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した後、上清を捨てた。（細胞量が少ない場合は１，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。）
５）７５ｍＭ  ＫＣｌ  １．５ｍＬに懸濁して、室温で２０分間細胞を膨張させた。
（先のとがった１０  ｍＬ遠心管に移した。）
６）固定液を１滴加えて、氷中で５分間静置した。
７）遠心管を振とうしながら、固定液を３滴加えて、氷中で５分間静置した。
８）遠心管を振とうしながら、固定液を１０−１５滴加えて、氷中で５分間静置した。
９）遠心管を振とうしながら、固定液を１０−１５滴加え、さらに、二層になるまで、壁をつたわらせながら加え（総量８−１０ｍＬ）、パスツールピペットでおだやかに混和した。
１０）９５×ｇ（１，０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した後、上清を捨てた。
１１）新しい固定液５ｍＬに懸濁して、９５×ｇ（１，０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した後、上清を捨てた。この操作を３回繰り返した。
１２）適当量の固定液で希釈し、８０ｃｍ程度上から、濡らしたペーパータオル（キムワイプ）上においたスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ：Ｓ−２１２４）に滴下した。この操作によって、細胞の核膜を破壊して、染色体を露出させて固定した。
１３）位相差顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＣＫ２）で観察し、核のまわりに残さが残っていないか、染色体が透明でないことを確認した。この時、残さが見られる場合は、細胞滴下後、息を吹きかけてゆっくり乾燥させた。また、染色体が透明になる場合は、固定液の酢酸濃度を最大２：１（メタノール：酢酸）まで上げた。
１４）３７℃で一晩インキュベートした後、ブラックボックスに入れて４℃で保存した。開封時にはボックス内の温度が室温と同じになるまでふたを開けないようにした。
【００９０】
（１．２．プローブの標識）
１０×ＮＴ緩衝液（組成は、以下のとおり）                      １０μｌ
０．５ｍＭ  ｄＡＧＣ混合液                                    １０μｌ
ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ：１０９３０７０）          ４μｌ
０．１Ｍ  メルカプトエタノール                                １０μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ：６４２７１１）  ２μｌ
ＤＮアーゼＩ（Ｔａｋａｒａ：２２１０Ａ）                        ４μｌ
（冷水を用いて２０００〜１００００分の１に希釈したもの。ＮａＣｌを添加した氷水上で作成した）
ＲＮアーゼ溶液（１０  ｍｇ／ｍＬ）                              ２μｌ
（鋳型がＲＮａｓｅ処理されている場合は不要）
上記溶液に鋳型ＤＮＡ（総量１〜１０μｇ）を加え、総容量を１００μｌとして以下の手順で反応を行った。なお、反応時間、ＤＮアーゼＩ濃度はプラスミド調製ごとに適宜条件設定した。
１）上記の溶液を順に混合した。（酵素の希釈から、ここまでの操作は低温室で行った）。１５℃（低温室）で約２時間（９０分間〜１２０分間）インキュベートした後、−２０℃で保存した。
２）反応液を１００℃で１０分間（もしくは６８℃１５分間）インキュベートし、酵素を失活させた後、氷中で１０分間以上静置した。
３）２％のアガロースゲル電気泳動（ＴＢＥ緩衝液）で、２００−６００ｂｐとなっていることを確認した。
４）目的のフラグメント長より大きいときは、反応液にさらにＤＮアーゼＩを２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ１μｌを加えて、１５℃で３０分間インキュベートした。
５）反応液を、６８℃で１５分間処理し、酵素を失活させた。
６）−２０℃で保存した。再び電気泳動を行い、フラグメント長を確認した。
なお、使用した溶液の組成は、以下のとおりであった。
・１０×ＮＴ緩衝液は、ＢＳＡ０．５ｍｇを１０×ＮＴ  Ｂ液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）５０ｍＬ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １．０２ｇ、超純水  １００ｍＬ）１ｍＬに溶解し、孔径０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した後、−２０℃で保存したものを使用した。
・０．５ｍＭｄＡＧＣ混合液は、
ｄＡＴＰ（Ｔａｋａｒａ：  ４０２６）      ４．７μｌ
ｄＧＴＰ（Ｔａｋａｒａ：  ４０２７）      ４．９μｌ
ｄＣＴＰ（Ｔａｋａｒａ：  ４０２８）      ４．９μｌ
を滅菌水１ｍＬと混合して、−２０℃で保存した溶液を使用した。
・ＲＮアーゼ溶液（１０  ｍｇ／ｍＬ）は、以下の溶液を１００℃で１５分間インキュベートした後、−２０℃で保存したものを使用した。
ＲＮアーゼＡ                            １０ｍｇ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）    １０μｌ
５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）              ３μｌ
超純水                                    １ｍＬ
・０．１Ｍ  メルカプトエタノール溶液は、原液（１４．３Ｍ）を１４０倍希釈した後、４℃で保存したものを使用した。
【００９１】
（１．３．プローブの標識の確認）
プローブ溶液の単位体積当たりに、どの程度のビオチン標識されたヌクレオチドが含まれているかを評価するために、プローブの標識のチェックを行った。
【００９２】
試薬として以下を使用した。
・緩衝液１（０．１Ｍ  マレイン酸，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；（ｐＨ７．５））
ｐＨ調整のため、以下の溶液にあらかじめＮａＯＨ１５ｇを添加した。ｐＨ調整後、オートクレーブした：
マレイン酸                  ２３．２１  ｇ
ＮａＣｌ                    １７．５３  ｇ
蒸留水                        ２  Ｌ
・緩衝液２；ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ：  １  ０９６  １７６）１０ｇを、１００ｍＬの緩衝液１に加え、電子レンジで以下の溶液を加熱しながら溶かした。オートクレーブ後、４℃で保存した。
・１Ｍ  ＭｇＣｌ２；以下の溶液をオートクレーブ後、常温で保存した：
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １０１．６５ｇ  ／超純水５００  ｍＬ
・緩衝液３（要時調整）（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）
以下の組成で調製した後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌した：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ                        ２．４２ｇ
ＮａＣｌ                                １．１７ｇ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２                        １０ｍＬ
蒸留水                              ２００ｍＬ。
【００９３】
上記試薬を用いて、以下の手順により、プローブの標識の確認を行った：
１）プローブ溶液を滅菌水で１／２０、１／２００、１／２０００、１／２００００、１／２０００００、１／２００００００に希釈した。
２）作製した希釈系列をナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ：  １  ２０９  ２９９）  １μＬずつスポットした。
３）１２０℃で３０分間ベーキングした。
４）片面３分間ずつ、両面をＵＶ架橋した。
５）メンブレンを緩衝液１で１０分間洗浄した。
６）メンブレンを緩衝液２  １０ｍＬと緩衝液１  ９０  ｍＬを用いて洗浄した。
７）ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ：  ＯＲ０４Ｌ）２μＬ、緩衝液２  １ｍＬ、緩衝液１  ９ｍＬ中にメンブレンを浸漬して、ハイブリバックコスモ・バイオ：Ｓ−１００１）を使用して密封し、メンブレンを３０分間インキュベートした。
８）メンブレンを緩衝液１  で１５分間洗浄した。この洗浄を２回繰り返した。）
９）メンブレンをサランラップ（旭化成）上でＣＳＰＤ（３−（４−メトキシスピロ｛ｌ，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルフォスフェート二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ  ｛ｌ，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）  ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｒｏｃｈｅ：  ＣＤ００５）１００μＬ、緩衝液３  １０ｍＬに浸し、室温で１０ｍｉｎインキュベートした。
１０）ハイブリバックを使用してシールしたメンブレンを３７℃で５〜１５分間プレインキュベートした。
１１）Ｘ線フィルム（富士写真フィルム：  ＲＸ−Ｕ）に１０分間程度露光した。
【００９４】
（１．４．ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションには、以下の溶液を用いた：
・２０×ＳＳＣ  （ｐＨ  ７．０）；  ＮａＣｌ  ３５０．６４ｇ、クエン酸ナトリウム  １７６．４６ｇ、超純水  ２Ｌ。
・変性溶液；  ホルムアミド（超特級；Ｒｏｃｈｅ  １００１４４）３５  ｍＬ、２０×ＳＳＣ  ５ｍＬ、滅菌水  ５０ｍＬ
・サケ精子ＤＮＡ溶液  （１μｇ／μＬ）；  サケ精子の粗抽出物をＴＥ緩衝液に溶かし、フェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿後、−２０℃で保存したものを使用した。
・２０％デキストラン硫酸溶液（２×ＳＳＣ中に溶解したもの）；  オートクレーブした５０％デキストラン硫酸溶液  ４００μＬ、２０×ＳＳＣ  １００μＬ、滅菌水  １ｍＬを４℃で保存したものを使用した。
【００９５】
上記試薬を用いて、以下の手順によって、実験を行った：
１）顕微鏡で観察しながら、スライドガラス上の染色体の存在する領域にダイヤモンドペンで印をつけた後、３７℃で３時間インキュベートした。
２）コプリンジャーに入れた変性溶液を６８〜７２℃に保温した。
（６７＋ｎ℃に設定した。（ｎ≦５，ｎはスライドの枚数））
３）プローブ反応液  ８μＬ（スライド１枚当たり０．１６〜１．６μｇ使用した。）とサケ精子ＤＮＡ溶液  ８μＬを混合し、エタノール沈殿した。
４）精製したプローブに１００％ホルムアミド  ６．５μＬ（スライド１枚当たり）を加えて、１００回ピペッティングすることにより懸濁した。
５）さらに、２０％デキストラン硫酸溶液  ６．５μＬ（スライド１枚当たり）を加えて、１００回ピペッティングすることにより懸濁した後、２０分間ボルテックスした。
（この後はスピンダウンしない。）
６）プローブ溶液を８０℃で１０ｍｉｎ変性した後、氷中で１０分間放置した。
７）スライドを変性溶液  （６８〜７２℃）で２分間インキュベートした。
８）コプリンジャーを用いて、７０％エタノール  （−２０℃）  で５分間インキュベートした。
９）コプリンジャーを用いて、９０％エタノール  （室温）  で５分間インキュベートした。
１０）コプリンジャーを用いて、１００％エタノール  （室温）  で５分間  脱水した後、試験管立てで風乾した。
１１）変性したプローブをカバーガラス  （ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ：  ２２×２２）上にマウントし、泡をかまないようにスライドガラスをのせた。
１２）ペーパボンド（コクヨ）で封入し、密封湿箱にスライドガラスをいれて、３７℃で一晩インキュベートした。シグナルが検出しにくいサンプルについては２４時間インキュベートした。
【００９６】
（１．５．シグナル検出のための固定化試料の調製）
シグナル検出のための固定化試料の調製には、以下の溶液を用いた：
・洗浄液１（要時調製）；
ホルムアミド                                ８０  ｍＬ
２０×ＳＳＣ                                １６  ｍＬ
滅菌水                                    １６０  ｍＬ
・洗浄液２；
２０×ＳＳＣ                                １６  ｍＬ
滅菌水                                    １６０  ｍＬ
・洗浄液３；
２０×ＳＳＣ                                ４０  ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０                            ２００  μＬ
滅菌水                                    ２００  ｍＬ
・ブロッキング溶液；以下の組成の溶液を作成後、孔径０．２２μｍフィルターで濾過したものを使用した。
Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）  ０．３  ｇ
２０×ＳＳＣ                                  ２  ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０                              １０  μＬ
滅菌水                      １０  ｍＬ
・検出液；以下の組成の溶液を作成後、孔径０．２２μｍフィルターで濾過したものを使用した。
Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印：ＵＫ−Ｂ８０）  ０．１  ｇ
２０×ＳＳＣ                                  ２  ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０                              １０  μＬ
滅菌水                                      １０  ｍＬ
・アンチフェード（Ａｎｔｉｆａｄｅ）溶液；
ＤＡＢＣＯ（ＳＩＧＭＡ：  Ｄ２５２２）０．２３３  ｇ
グリセロール                                  ９  ｍＬ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）      ０．２  ｍＬ
滅菌水                                      １０  ｍＬ
・ＤＡＰＩ溶液；
ＤＡＰＩストック溶液（４００μｇ／ｍＬ）    ４０  μＬ
２０×ＳＳＣ                                  ５  ｍＬ
滅菌水                                      ５０  ｍＬ。
【００９７】
上記試薬を用いて、以下の手順により、シグナル検出のための固定化試料を調製した：
１）モイストチェンバーからスライドを取り出し、ペーパーボンドを爪楊枝ではがして、カバーガラスを滑らせながらはずした。（モイストチェンバーは再び、インキュベーターで加温しておいた。）
２）スライドを、４３℃で保温した洗浄液１で５分間３回洗浄した。
３）スライドを、６０℃で保温した洗浄液２で５分間３回洗浄した。
４）ブロッキング溶液１５０μＬをカバーガラス（２４×５０）にマウントし、スライドガラスをのせた。
５）モイストチェンバー内で、３７℃、３０分間インキュベートした。
６）検出液６００μＬに対して、ＦＩＴＣアビジン１．５μＬを溶かしボルテックスした。１５０μＬをカバーガラスにマウントし、スライドガラスをのせた。
７）モイストチェンバー内で、３７℃、３０分間インキュベートした。
８）スライドガラスを、４３℃で保温した洗浄液３で５分間３〜４回洗浄した。
９）ＤＡＰＩ溶液５０ｍＬを作成し、スライドを５分間インキュベートした。
１０）スライドを二倍希釈した洗浄液３で５分間洗浄した。
１１）アンチフェード溶液４０μＬをカバーガラス（２４×５０）にマウントし、スライドガラスをのせた。
１２）マニキュアで固定した。
【００９８】
（１．６．顕微鏡による観察）
染色体上のシグナルの観察は、細胞生理学研究室にある蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｐｌａｎ２）において、３６５ｎｍ励起、ブルーフィルターを用いて行った。対物レンズは  ６３倍を用いた。画像としての取り込みは蛍光顕微鏡に備え付けの冷却ＣＣＤカメラ（フォトメトリクス社製  ＰＶＣＡＭカメラ）と画像解析ソフトＩＰＬａｂ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＴＭを用いて行った。使用後は、レンズをクリーナー（酢酸メチル  ６５ｍＬ、エタノール  ３０ｍＬ、ジエチルエーテル  ５ｍＬ）で拭いた。
【００９９】
（２．ＦＩＳＨ画像の解析）
ＦＩＳＨ画像データ（３６５ｎｍ励起  ブルーフィルターを用いた）を、マッキントッシュＰＣ  （Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃ．Ｇ３）を用い、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのマクロプログラムであるＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ  （ＣＨＩＡＳ  ＩＩＩ）（Ｆｕｋｕｉ  Ｋ．，Ｓａｄａｍｏｔｏ  Ｋ．，Ｏｈｕｅ  Ｓ．，Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．，Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，Ｓａｋａｋｉ  Ｓ．：Ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｓｕｂｄｕｒａｌ  ｈｅｍａｔｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｒｕｐｔｕｒｅｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｎｅｕｒｙｓｍ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ａｎｇｉｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．脳神経外科，１４，１３９７−１４０１（１９８６）、およびＫａｔｏ  Ｓ．，Ｆｕｋｕｉ  Ｋ．：Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ（ＣＰ）ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，  ＣＨＩＡＳ  ＩＩＩ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６，４７３−４７９（１９９８）によって解析を行い、以下の操作を行うことによって増幅遺伝子の染色体上における位置を同定した（工程の番号は、図２中の番号に対応）。
１）ＴＩＦＦ形式のＦＩＳＨ画像をＩＰＬａｂ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＴＭにより取得し、ＣＨＩＡＳ  ＩＩＩのプログラムに取り込んだ。
２）取得した画像内の染色体領域を決定し、その染色体領域をプログラムに従い抽出した。
３）抽出した染色体画像を２５６階調のグレースケールに正規化した。
４）染色体のセントロメア位置の決定を行い、染色体の中心上に線を描き、その線上の濃度値を数値化した。
５）数値に基づいて２５６階調のバンドパターン描き、最終的に濃淡の２値化を行うことによって染色体のバンドパターンを決定した
（３．ドットブロットによるコピー数の定量）
細胞内のＤＮＡは、野村の方法（野村  慎太郎  細胞工学，  別冊９，  脱アイソトーププロトコール，秀潤社  ３５−４３（１９９４））に従って、ＲａｐｉｄＰｒｅｐＴＭ  Ｍｉｃｒｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ：２７−５２２５−０１）を用いて抽出した。プローブに用いるためのＤＮＡは、細胞に導入したプラスミドであるｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰ中のｄｈｆｒ遺伝子のみをＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−ｒａｄ：７３２−６００９）を用いて回収した。コピー数の定量は、ＤＩＧ−ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ：  １０９３６５７）を用いて、Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇによって、
（１）細胞から、ＤＮＡを抽出する。
（２）ランダムプライム法によって、プラスミドをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識してプローブを作製する。
（３）ＤＮＡをナイロンメンブレンにアプライし、プローブをハイブリダイゼーションする。
（４）アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を結合させる。
（５）基質を加えて発色させる。
という工程によって、行った。より具体的には、以下のとおりに行った。
【０１００】
（３．１．ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐＴＭ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いる染色体ＤＮＡの抽出）
製造業者の指示に従って、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐＴＭ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、以下のように染色体ＤＮＡの抽出を行った。
１)  １．５ｍＬポリプロピレンチューブに１．０〜２．０×１０６の細胞を培地懸濁液、もしくはＰＢＳ懸濁液として回収し（８，０００×ｇ  （１０，０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した後）、２０〜４０μＬ液量残して上清を除去した。
２)  ボルテックスで混合した。
３)  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ溶液  ３００μＬを加えてゆるくピペッティングして細胞を溶解させた。（サンプルはこの状態で室温で１８ヶ月保てる）
４)  溶解した細胞に１．５μＬのＲＮアーゼＡ  溶液を加える。
５)  チューブを約２５回転倒混和し、３７℃で１５分間〜１時間インキュベートした。
６)  室温までサンプルを冷やした後、１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  溶液を加えた。
７)  均一に混ざるまで２０秒以上ボルテックスした。
８)  １５，０００×ｇ  （１４，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離することで、タンパク質が沈殿した。
９)  ＤＮＡを含む上澄みを３００μＬの１００％イソプロパノールの入ったチューブに移した。
１０)  ＤＮＡが白い糸状になるまで、チューブを約５０回転倒混和した。
１１)  １５，０００×ｇ  （１４，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離して、上澄みを捨てた。
１２)  ペーパータオル上にたてて、上澄みを吸収させた。
１３)  ７０％エタノールを３００μＬ加え、数回転倒混和した。
１４)  １５，０００×ｇ  （１４，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離して、上澄みを捨てた。
１５)  ペーパータオル上にたてて、１５分間乾燥させた。
１６)  ＤＮＡを溶解するため、１００μＬのＤＮＡ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ溶液をくわえた。
１７)  室温で一晩インキュベート、または６５℃で１時間インキュベートした。
１８)  冷蔵保存した。長期保存の場合は−２０℃か−８０℃で保存した。
１９)  使用の際はエタノール沈殿を行い、緩衝液を交換した。
【０１０１】
（３．２．ＤＮＡの定量）
試料として用いた染色体ＤＮＡの定量は、１０×ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびＨ３３２５８アッセイ溶液（ＴＮＥ緩衝液１００ｍＬを孔径０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した後、１ｍｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８  １０μＬを加えた。）と以下の方法を用いて、を行った。
１）標準試料として、λ−ＤＮＡ（３２５μｇ／ｍＬ）（Ｔａｋａｒａ：  ３０１０）の希釈系列（０、２０．４、４０．７、８１．３、１６２．５、３２５ｎｇ／ＴＥ  １０μＬ）を作成した。
２）１．５ｍＬポリピロピレンチューブに入った上記（１）の溶液１０μＬとサンプルにそれぞれ２ｍＬ  Ｈ３３２５８アッセイ溶液を加え、混合した。
３）蛍光測定用セルに上記（２）の溶液を移し、蛍光光度計（励起波長３６５ｎｍ、放射波長４５５ｎｍ）を用いて測定した。
４）ＥｘｃｅｌＴＭ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を用いて標準直線を引き、ＤＮＡ濃度を算出した。
５）得られた値より、サンプル中のＤＮＡ濃度を調整した。
【０１０２】
（３．３．プローブの作製）
１）  目的の遺伝子に応じて、ｄｈｆｒ、ｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をＰＣＲを用いて、クローニングした。ＰＣＲには、反応液として：Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ：  ＲＲ００１）  ０．５μＬ、１０×Ｔａｑ緩衝液  １０μＬ、ｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）  ８μＬ、プライマー１（センス鎖）  １００ｐｍｏｌ、プライマー２  （アンチセンス鎖）  １００ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ（＞１μｇ）  （代表的には０．１μｇ）を用いた。
【０１０３】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーにおいて、９４°Ｃ  ２分間加熱の後、１サイクル当たり９４°Ｃ  ３０秒間、５５〜６５°Ｃ  ３０秒間、７４°Ｃ  １分間を２５〜３０サイクル行い、その後、７４°Ｃ  ７分間加熱後、４°Ｃにて保存した。
２）  ＰＣＲ終了後、ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍａｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：２７−９６０２−０１）にて、未反応物を除去し、緩衝液を蒸留水に交換した。
３）  ２６０ｎｍでの吸収によってＤＮＡ濃度を定量した。
４）  ０．０１−３μｇのＤＮＡをＤＩＧラベルに用いた。標識効率によって、用いるＤＮＡ濃度は変化させた。
５）  必要量のＤＮＡをポリプロピレンチューブに分取し、最終容量が１６μＬになるように調整した。
６）  上記（５）の溶液を１００℃で１０分間変性させた後、氷中（氷／ＮａＣｌ）で１０分間以上静置した。
６）  氷中のマイクロチューブで、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（Ｒｏｃｈｅ：  １５８５  ６０６）４μＬと、変性直後のＤＮＡ１６μＬとを混合した。
７）  ３７℃で２０時間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１μＬを加えて反応を終了させた。
【０１０４】
（３．４．標識プローブ濃度の検定）
標識プローブ濃度の検定には、以下の試薬を用いた：
・緩衝液１（ｐＨ７．５）：０．１Ｍ  マレイン酸、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ調整のため、ＮａＯＨ  １５ｇをあらかじめ加えておき、オートクレーブした。）
・緩衝液２；ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ：  １  ０９６  １７６）１０ｇを、１００ｍＬの緩衝液１に加え、溶液を加熱しながら溶かした。オートクレーブ後、４℃で保存した。
・緩衝液３（要時調製）；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を孔径０．２２  μｍのフィルターで濾過滅菌して使用した。
・洗浄緩衝液；Ｔｗｅｅｎ２０  １．５ｍＬ／緩衝液１  ５００ｍＬ。
【０１０５】
上記試薬と以下の方法を用いて、標識プローブ濃度の検定を行った。
１）  標準試料（ｐＢＲ３２２、ＤＩＧ標識したコントロールＤＮＡ）とサンプルをＴＥ緩衝液でそれぞれ、１／２０（１  ｎｇ／μＬ）、１／２００（１００  ｐｇ／μＬ）、１／２，０００（１０  ｐｇ／Ｌ）、１／２０，０００（１  ｐｇ／μＬ）、１／２００，０００（０．１  ｐｇ／μＬ）、１／２，０００，０００（０．０１  ｐｇ／μＬ）に希釈した。
２）  この希釈系列を、ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ：  １  ２０９  ２９９）に、１μＬづつスポットた。
３）  あらかじめ１２０℃にしておいたオーブン中で、１２０℃で３０分間ベーキングした。
４）  両面３分間ずつトランスイルミネーター上でＵＶ架橋した。
５）  メンブレンを緩衝液１で１０分間洗浄した。
６）  メンブレンを緩衝液２  １０ｍＬと緩衝液１  ９０ｍＬで３０分間洗浄した。
７）  抗体溶液（抗−ＤＩＧ  ＡＰ  Ｆａｂフラグメント）２μＬ（使用前に１４，０００×ｇで３分間ほど遠心分離した後、その上澄みを用いた。）、緩衝液２  １ｍＬ、緩衝液１  ９ｍＬでハイブリパック（コスモ・バイオ：−１００１）を使用してシールしたメンブレンを３０分間インキュベートした。
８）  メンブレンを緩衝液１で１５分間２回洗浄した。
９）  メンブレンを緩衝液３で２分間静置した。
１０）  メンブレンをサランラップ（旭化成）上でＣＳＰＤ（Ｒｏｃｈｅ：  ＣＤ００５）１００  μＬ、緩衝液３  １０ｍＬに浸し、室温で１０分間程度インキュベートした。
１１）  ハイブリパックを使用してシールしたメンブレンを３７℃で５〜１５分間プレインキュベーションした。
１２）  Ｘ線フィルムに露光した。
【０１０６】
（３．５．ハイブリダイゼーション）
１０２オーダーのコピー数を定量する場合は、１．０×１０５細胞分（０．２４μｇ）の染色体ＤＮＡを用い、１０１オーダーのコピー数を定量する場合は、１．０×１０６細胞分（２．３８μｇ）の染色体ＤＮＡを用いた。ハイブリダイゼーション緩衝液としては、２０×ＳＳＣ  ２５ｍＬ、緩衝液２  １０ｍＬ、Ｎ−ラウロイルサルコシン  ０．１ｇを含む水溶液をオートクレーブした後、１０％  ＳＤＳ  ０．２  ｍＬ加えて４℃で保存した溶液を使用した。
【０１０７】
上記試薬と以下の方法を用いて、ハイブリダイゼーションを行った：
１）  プラスミドｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰをＢｇｌ  ＩＩで３７℃、１．５時間、制限酵素処理した。
２）  ４００コピー／１００μＬ溶液を作成し、標準試料として希釈系列を作製した。（実験目的によってコピー数の希釈系列を変更し計算した。２００コピー〜１０コピーを用いた）
３）  細胞株によってコピー数の希釈系列を変更し計算した。１０５〜１０６細胞分の染色体ＤＮＡで評価した。
４）  標準として使用するプラスミドの希釈系列、および、サンプル染色体ＤＮＡを１００℃で１０分間変性させた
５）  氷中（氷／ＮａＣｌ）で１０分間以上冷却した。
６）  あらかじめ、１０×ＳＳＣにて濡らしておいた、メンブレン（Ｒｏｃｈｅ：  １  ２０９  ２２９）及び濾紙（ＢＩＯ−ＲＡＤ：  １６２０１０１）３枚をブロッティング装置に装着した。
７）  ＤＮＡをＢＩＯ−ＤＯＴＴＭ  ＳＦ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、真空引きしながら、メンブレンにブロットした。（メンブレンとスロットに間が空かないよう、ネジは強く閉めた。）
８）  １０×ＳＳＣ  １００μＬをスロットに流し、２回洗浄した。
９）  １２０℃、３０分間、ベーキングした。
１０）  両面を３分間ずつＵＶ架橋した。
１１）  ハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｃｍ２あたり２０ｍＬ）で、シールしたメンブレンを６８℃で１時間インキュベートした。
１２）  １ｍＬ中に５μＬのＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｃｍ２あたり２．５ｍＬ）で、シールしたメンブレンを６８℃で一晩インキュベートした。
【０１０８】
（３．６．免疫学的検出）
免疫学的検出には、以下の試薬を用いた：
・１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；ドデシル硫酸ナトリウム１０ｇ／蒸留水  １００ｍＬ
・２×ＳＳＣ・０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；ＳＳＣ溶液をオートクレーブ後、ＳＤＳを加えた。
・０．１×ＳＳＣ・０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；ＳＳＣ溶液をオートクレーブ後、ＳＤＳを加えた。
・ハイブリダイゼーション緩衝液；（２０×ＳＳＣ  ２５ｍＬ、１０％ＳＤＳ  ０．２ｍＬ、緩衝液２  １０ｍＬ、Ｎ−ラウロイルサルコシン  ０．１ｇ）
・緩衝液１（ｐＨ  ７．５）：０．１Ｍ  マレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）ｐＨ調整のため、ＮａＯＨ  １５ｇをあらかじめ加えておいた。オートクレーブした。
・緩衝液２；ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ：  １  ０９６  １７６）１０ｇを、１００ｍＬの緩衝液１に加え、加熱しながら溶かした。オートクレーブ後、４℃で保存した。
・緩衝液３（要時調製）；Ｔｒｉｓ  ２．４２ｇ、ＮａＣｌ  １．１７ｇ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２  １０ｍＬを蒸留水２００ｍＬに溶解し孔径０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌して使用した。
・洗浄緩衝液；Ｔｗｅｅｎ２０  １．５ｍＬ／緩衝液１  ５００ｍＬ
上記の試薬を用い、以下の方法を用いて、免疫学的検出を行った：
１）  ２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳを４０℃、０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳを６８℃、洗浄緩衝液を４０℃で保温した。
２）  メンブレンを２５０Ｌの２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ（４０℃）溶液で５分間、２回洗浄した。
３）  メンブレンを２５０ｍｌの０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ（６８℃）溶液中で１５分間２回、洗浄した。  
４）  メンブレンを２５０ｍＬの洗浄緩衝液（４０℃）で５分間１回、洗浄した。
５）  緩衝液２  １０ｍＬ、緩衝液１  ９０ｍＬで、室温、にて３０分間振とうインキュベートした。
６）  抗体溶液  （抗−ＤＩＧ−アルカリホスファターゼ）０．５μＬ（使用前に１４，０００×ｇ，３分間ほど遠心分離したのち上澄みを使った。）、緩衝液２  １ｍＬ、緩衝液１  ９ｍＬでシールしたメンブレンを３０分間振とうインキュベートした。
７）  メンブレンを２５０ｍＬの洗浄緩衝液（４０℃）で７分間３回、洗浄した。
８）  メンブレンを緩衝液３中で２分間静置した。
９）  メンブレンをサランラップ上でＣＳＰＤ３０μＬ、緩衝液３  ３ｍＬに浸し、室温で１０分間程度インキュベートした。
１０）  シールしたメンブレンを３７℃で５〜１５分間プレインキュベーションした。
１１）  Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ：  ５０ＮＩＦ）に露光した。
１２）  Ｘ線フィルムのシグナルをスキャナーで取り込み、Ｇｅｌ  Ｐｌｏｔｔｉｎｇ  Ｍａｃｒｏｓ（ＮＩＨが開発したＮＩＨ  ｉｍａｇｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／から入手可能）中のマクロコマンドプログラム）で定量した。
【０１０９】
（４．ＦＩＳＨ法およびドットブロッティング法の結果）
上記記載の本実施例に従ってＦＩＳＨ法の実験を行った結果、染色体における遺伝子増幅が、図３上段の１〜９の四角で示す特定の領域において観察された（Ｅ染色体のセントロメア近傍、Ｊ染色体のセントロメア近傍、Ｋ染色体のセントロメア近傍、Ｌ染色体のセントロメア近傍、Ｎ染色体のテロメア極近傍、Ｐ染色体のテロメア側、Ｐ染色体のテロメア極近傍）。図３中の１〜９の四角で示す特定の領域において観察された遺伝子増幅のコピー数を、各クローン毎に示した（図３下段）。
【０１１０】
Ｐ染色体のテロメア極近傍において、最も高いコピー数（９５、１０８、１１７、１１９、１２５、１４１、１６６コピー）を生じた遺伝子増幅が確認された。
【０１１１】
以上の結果から、Ｎ染色体のテロメア極近傍、およびＰ染色体のテロメア極近傍に部位特異的組換え配列を挿入した場合に、効率的に遺伝子増幅されることが明らかとなった。特に、Ｐ染色体のテロメア極近傍に部位特異的組換え配列を挿入した場合に、遺伝子増幅されたコピー数が最も多かった。
【０１１２】
最適な遺伝子増幅条件は、Ｐ染色体のテロメア極近傍に挿入された遺伝子が遺伝子増幅されたクローンが選択的に出現する条件であることが理解できる。具体的には、遺伝子増幅誘導因子としてＭＴＸを用いた場合、（１）０ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、および１０００ｎＭの順番でＭＴＸ濃度を上昇させた場合のみではなく、（２）０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、および１０００ｎＭの順番でＭＴＸ濃度を上昇させた場合にも、Ｐ染色体のテロメア極近傍に挿入された遺伝子が増幅された細胞クローンを得ることができた。０ｎＭの次に１００ｎＭのＭＴＸを使用した場合においてもＰ染色体のテロメア極近傍に挿入された遺伝子が増幅された細胞（クローンＬ４−Ｎ）が得られたことは、初期のＭＴＸ濃度のみが重要なのではなく、その後のＭＴＸ濃度の上昇条件を緩やかにすることによっても、テロメア極近傍に核酸断片が挿入したクローンを得ることができたことを示す。従って、テロメア極近傍に核酸断片が挿入された細胞クローンを得やすい条件とは、ＭＴＸ濃度の上昇の程度を緩やかにする条件である。
【０１１３】
理論に拘束されることを意図しないが、ＭＴＸ濃度の上昇を急激に行う場合、選択マーカー遺伝子の遺伝子増幅速度が、ＭＴＸ濃度の上昇に追いつかず、その結果、遺伝子増幅以外の原因によってＭＴＸ耐性を獲得したクローンが出現する可能性が増加すると考えられる。
【実施例３】
【０１１４】
（第１の部位特異的組換え配列および選択マーカーを含有する核酸断片を高コピー数で染色体中に有する細胞クローンの調製）
汎用性のある高発現型哺乳動物宿主細胞を調製するために、部位特異的組換え配列および選択マーカーを含有する核酸断片を高コピー数で有する細胞クローンを、以下のように遺伝子増幅を利用して調製した。
【０１１５】
（１．第１の部位特異的組換え配列および選択マーカーを含むベクターの導入）  
第１の部位特異的組換え配列として、挿入された配列の切り出しを抑えることができる、配列番号３に記載の変異ｌｏｘＰ配列を用いた（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５  Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【０１１６】
選択マーカーとして、ＳＶ４０プロモーターおよびｐｏｌｙＡ＋付加シグナルと作動可能に連結したジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を用いた。強力なプロモーターであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを用いた。これら配列を含むベクターｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰ（５．８ｋｂ）を構築し（図４）、リポフェクション法によって、ＣＨＯ細胞に導入した。
【０１１７】
（２．挿入遺伝子の遺伝子増幅）
最初に５０ｎＭのＭＴＸを含み、核酸を含まないイスコフ培地を用いて、初発細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌである細胞を用いて培養した。細胞がコンフルエントになった時、耐性を獲得したものとみなし、７０株の細胞をクローニングした。これらのクローンのうち、４０株について、ＦＩＳＨ法による染色体上の挿入位置の確認が可能であった。
【０１１８】
なお、この実験においては、これらのＭＴＸ濃度上昇条件によって生じるいろいろな性質を有する細胞を集団として選択するために、濃度上昇各ステップにおけるクローニング操作は一切行わず、１０００ｎＭのＭＴＸに対して耐性を示す細胞が得られた後、細胞のクローニングを行った。
【０１１９】
（３．ＦＩＳＨ法およびドットブロッティング法による単離した遺伝子増幅クローンの特徴付け）
単離した遺伝子増幅クローンの特徴付けを、実施例２に記載の方法に従って、行った。
【０１２０】
（４．ＦＩＳＨ法およびドットブロッティング法の結果）
単離した３６株中、９株がＰ染色体のテロメア極近傍で遺伝子増幅している細胞株であった。これら９株の細胞株中、遺伝子のコピー数が高い（約２０〜３０コピー）細胞株は１株であった。この細胞クローンを「Ｃ２０」と称する。
【０１２１】
染色体のセントロメア近傍において遺伝子増幅している細胞株が４株単離されたが、これら４株は全て、遺伝子のコピー数が数コピー程度と低かった。一方、Ｐ染色体以外の染色体のテロメア近傍において遺伝子増幅している細胞株が２３株単離された。これら細胞株において、遺伝子増幅している染色体部位は、Ａ染色体テロメア近傍、Ｂ染色体テロメア近傍、Ｄ染色体テロメア近傍、Ｆ染色体テロメア近傍、Ｇ染色体テロメア近傍、Ｉ染色体テロメア近傍、Ｊ染色体テロメア近傍、Ｋ染色体テロメア近傍、Ｎ染色体テロメア近傍、Ｐ染色体テロメア近傍であった。これら２３株中、Ｐ染色体テロメア近傍に核酸断片が挿入されていたクローンは、９株であった。その９株中遺伝子のコピー数が高い（２０〜３０コピー）細胞株は、１株であった。代表的な結果を図５に示す。
【０１２２】
従って、第１の部位特異的組換え配列および選択マーカーを含む核酸断片を遺伝子増幅した場合でも、選択マーカーのみを遺伝子増幅する場合と同様の結果が得られた。
【実施例４】
【０１２３】
（実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞を用いる、所望の外来遺伝子を高コピー数で染色体中に有する哺乳動物宿主細胞の調製−１）
実施例３で調製した第１の部位特異的組換え配列および選択マーカーを含有する核酸断片を高コピー数で染色体中に有する汎用哺乳動物宿主細胞Ｃ２０株に、（１）プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入し、（２）部位特異的組換え誘導因子を導入することによって、所望の外来遺伝子を高コピー数で染色体中に有する哺乳動物宿主細胞を調製する。
【０１２４】
なお、以下の手順は、（１）プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入し、その後、（２）部位特異的組換え誘導因子を導入する手順で記載されているが、これら（１）と（２）を逆の順番で行うことも可能である。
【０１２５】
具体的には、以下の手順を行う。
【０１２６】
（１．実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞への、外来遺伝子を含む核酸断片の導入）
プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片として、ｐＩＲＥＳｎｅｏ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  コード番号：６９３８−１）に含まれる、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）由来のＩＲＥＳ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、および変異型ｌｏｘＰ配列（配列番号５）を含む、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰベクター（５．３ｋｂ）を、リポフェクション法により実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞Ｃ２０株に導入し、３５ｍｍのシャーレーに播種し、培養する。
【０１２７】
（２．部位特異的組換え誘導因子の宿主細胞への導入）
（２．１．組換えＣｒｅタンパク質の調製）
ｌｏｘＰ配列を部位特異的に組換えるタンパク質である、Ｃｒｅの改変体を以下のように調製する。
【０１２８】
遺伝子増幅誘導因子としてのＣｒｅタンパク質を直接細胞内に導入する場合（「直接導入法」）は、Ｃｒｅ組換えタンパク質を高効率にＣ２０株細胞内および核内に導入するために、Ｃｒｅタンパク質にＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加した。
【０１２９】
このＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列は、核内へ高効率に移行するという報告が数多くなされているＨＩＶ−ＩウイルスのＴａｔタンパク質及びＲｅｖタンパク質（Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，  Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）由来であり、４９−５７番目のＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列９残基のみでタンパク質の細胞内及び核内への運搬能力が確認されている（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。そのため、Ｃｒｅタンパク質を効率的に核内に移行するために、Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を用いた。
【０１３０】
（２．１．１．Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質発現ベクターの調製）
Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質発現ベクターを調製するために、Ｔａｔ配列中のＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列をコードする塩基配列（配列番号６：５’−ｃｇｔａａｇａａｇｃｇｇｃｇｔｃａｇｃｇｇｃｇｃａｇａ−３’）をプライマーに挿入して正方向プライマー「Ｔａｔ−Ｃｒｅ−ｆｏｒｗａｒｄ」（配列番号７：５’−ＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣＣＧＴＡＣＡＣＣ−３’）を作製した。逆方向プライマー「Ｔａｔ−Ｃｒｅ−ｒｅｖｅｒｓｅ」には、組換えＣｒｅタンパク質の精製を容易にするためにＨｉｓ６−Ｔａｇを付加した（配列番号８：５’−ＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣ−３’）。
【０１３１】
上記のプライマーを用いて、ｐＢＳ１８５  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０３４７−０１１；）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。反応液の一部をアガロースゲル電気泳動することによって、目的断片を確認した。ＰＣＲ産物をＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：４５−００４６）中にクローニングし、ｐＣＲ２．１ベクターに組み込まれたＴａｔ４９−５７−Ｃｒｅを取得した。
【０１３２】
このｐＣＲ２．１から制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩ切断によってＴａｔ４９−５７−ＣｒｅをコードするＤＮＡ断片を取得し、ベクターｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＮＶ５０９）と連結して、Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質であるＴａｔ４９−５７−Ｃｒｅタンパク質の発現ベクターとする。
【０１３３】
（２．１．２．Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質の発現）
大腸菌を宿主細胞として、Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質を以下のように発現する：
１）  Ｔａｔ４９−５７−Ｃｒｅタンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換する。
２）  この大腸菌を、１００ｍＬ  ＬＢ培地（カナマイシン添加）でＯＤ６００＝０．６程度になるまで３７℃で培養する。
３）  ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに３時間培養する。
４）  培養液を氷冷し、７０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心し、集菌する。
５）  培養液の０．２５倍量の冷えた２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に集菌した大腸菌を懸濁し、再び同条件で集菌する。
【０１３４】
（２．１．３．Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列を付加したＣｒｅタンパク質の抽出および精製）
上記１．１．２．において集菌した大腸菌を、以下のように、超音波破砕する。
１）  大腸菌を培養液の１／２０量の超音波処理緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、ポリプロピレンチューブに移す。
２）  氷冷しながら１０〜１５秒間ずつ数回に分けて超音波をかける。
３）  細胞片、不溶物を除去するため、１１，０００×ｇ、３０分間、４℃で遠心する。
４）  細胞抽出液（上清）を０．４５μｍのフィルターでろ過する。
【０１３５】
上記ろ過物から、以下のようにＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ：１７−０４０８−０１）を用いてＨｉｓ−ｔａｇを付加した、Ａｒｇ−ｒｉｃｈ配列付加Ｃｒｅタンパク質を精製する。精製には、以下の緩衝液を使用する：
・結合バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ７．４、
・溶出バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣ、５００ｍＭ  イミダゾ−ル、ｐＨ７．４。
・１Ｍ  硫酸ニッケル溶液。
【０１３６】
これら緩衝液を用いて、以下のとおりに精製する：
１）  カラムをシリンジに接続し、０．５ｍｌの０．１Ｍ硫酸ニッケル溶液を流速１滴／２秒で送液する。
２）  ５ｍｌの超純水を流速１滴／秒で送液する。
３）  １０ｍｌの結合バッファーを流速１滴／秒で送液する。
４）  細胞抽出液を流速１滴／２秒で送液し、溶出液を回収する（非吸着画分）。
５）  結合バッファーを流速１滴／秒で送液する。５ｍＬ毎にＡ２８０を測定し、その値が一定になるまで結合バッファーを流し続ける。
６）  ５ｍｌの溶出バッファーを流速１滴／秒で送液して、溶出液を回収し、精製タンパク質溶液とする。
７）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により溶出液中のＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列付加Ｃｒｅタンパク質を確認する。
８）  Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列付加Ｃｒｅタンパク質を定量する。
【０１３７】
（２．２．調製した部位特異的組換え誘導因子の宿主細胞への導入による部位特異的組換え）
調製した部位特異的組換え誘導因子である組換えＣｒｅタンパク質を宿主細胞Ｃ２０株へ導入することにより、部位特異的組換えを生じさせる。
【０１３８】
実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞に対して、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入した後、以下に記載のように部位特異的組換え誘導因子である改変Ｃｒｅタンパク質を作用させて、染色体中の第１の部位特異的組換え配列と細胞に導入された核酸断片中の第１の部位特異的組換え配列との間で部位特異的組換えを生じさせ、その結果、プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を哺乳動物宿主細胞染色体中に挿入させる。
１）  上記１．に記載のとおり、リポフェクション法によってトランスフェクションしたＣ２０株の細胞を、８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養する。
２）  新しい培地に交換し、上記２．で調製したＴａｔ４９−５７−Ｃｒｅタンパク質を終濃度３μＭとなるように添加する。
３）  ３７℃で３時間インキュベートし、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄する。
【０１３９】
（２．３．部位特異的組換え体の確認）
部位特異的組換え体を、以下の３つの方法のいずれか１つ、または以下の３つの方法の任意の組み合わせを用いて、確認する：
（１）  Ｇ４１８選択培地による確認
組み換えにより染色体に挿入されるｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰ上にはＧ４１８耐性遺伝子が存在するが、その発現はｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰによって染色体に導入されたＣＭＶプロモーターに依存する。そのため、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰは部位特異的組み換えによって染色体に挿入されなければ、得られた形質転換体はＧ４１８耐性を持たない。この原理を利用して、Ｇ４１８選択培地で増殖するクローンを、部位特異的組み換えを生じたクローンとして同定する。
（２）  ＰＣＲ法による確認
部位特異的組み換えを生じた場合に予想される染色体配列を鋳型としてＰＣＲを行い、目的バンドが得られるか否かで組換えの成否を判断可能である。
（３）  ｈＧＭ−ＣＳＦの発現の確認
Ｇ４１８耐性遺伝子と同様、ｈＧＭ−ＣＳＦの発現も、ｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰによって染色体に導入されたＣＭＶプロモーターに依存する。そのため、ｈＧＭ−ＣＳＦは、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰが部位特異的組み換えによって染色体に挿入された場合のみ発現する。
【実施例５】
【０１４０】
（実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞Ｃ２０株を用いる、所望の外来遺伝子を高コピー数で染色体中に有する哺乳動物宿主細胞の調製−２）
実施例３で調製した第１の部位特異的組換え配列および選択マーカーを含有する核酸断片を高コピー数で染色体中に有する汎用哺乳動物宿主細胞に、（１）部位特異的組換え誘導因子を発現し得るベクターを導入し、（２）プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片を導入することによって、所望の外来遺伝子を高コピー数で染色体中に有する哺乳動物宿主細胞を調製する。
【０１４１】
なお、上記の遺伝子導入（１）および（２）は、どちらのトランスフェクションを先に行ってもよく、また、同時に行ってもよい（コトランスフェクション）。
【０１４２】
具体的には、以下の手順を行う。
【０１４３】
（１．実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞Ｃ２０株への、外来遺伝子を含む核酸断片の導入）
プロモーターに作動可能に連結した外来遺伝子および、第１の部位特異的組換え配列に相同な第２の部位特異的組換え配列を含有する核酸断片として、ｐＩＲＥＳｎｅｏ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  コード番号：６９３８−１）に含まれる、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）由来のＩＲＥＳ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、および変異型ｌｏｘＰ配列（配列番号５）を含む、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰベクター（５．３ｋｂ）を、リポフェクション法により実施例３で調製した汎用哺乳動物宿主細胞Ｃ２０株に導入し、３５ｍｍのシャーレーに播種し、培養する。
【０１４４】
（２．部位特異的組換え誘導因子を発現し得るベクターの宿主細胞への導入）
部位特異的組換え誘導因子としてのＣｒｅタンパク質を発現するベクターとして、Ｃｒｅ発現アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅ（理研ジーンバンク、ＲＢＤ：１７４８、ＣＡＧプロモーター下でＣｒｅタンパク質を発現する）を用いて、以下のように、宿主細胞へ導入する。
１）  コラーゲンコートした７５ｃｍ３ボトルに、ＩＭＤＭ（イスコフ）培地（核酸−）１５ｍｌ中で、実施例３で調製したＣＨＯ細胞１×１０７ｃｅｌｌｓとアデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅ２×１０８ＰＦＵを混合し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで、インキュベーションする。
２）  数回シーソーのように数秒周期でボトルを穏やかに振り、ウイルス液をまんべんなく行き渡らせる。この操作を２０分ごとに３回行う。
３）  培地を１４ｍｌ添加して、３７℃、２日間、インキュベーションを続ける。
【０１４５】
（３．部位特異的組換え体の確認）
部位特異的組換え体を、以下の３つの方法のいずれか１つ、または以下の３つの方法の任意の組み合わせを用いて、確認する：
（１）  Ｇ４１８選択培地による確認
組み換えにより染色体に挿入されるｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰ上にはＧ４１８耐性遺伝子が存在するが、その発現はｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰによって染色体に導入されたＣＭＶプロモーターに依存する。そのため、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰは部位特異的組み換えによって染色体に挿入されなければ、得られた形質転換体はＧ４１８耐性を持たない。この原理を利用して、Ｇ４１８選択培地で増殖するクローンを、部位特異的組み換えを生じたクローンとして同定する。
（２）  ＰＣＲ法による確認
部位特異的組み換えを生じた場合に予想される染色体配列を鋳型としてＰＣＲを行い、目的バンドが得られるか否かで組換えの成否を判断可能である。
（３）  ｈＧＭ−ＣＳＦの発現の確認
Ｇ４１８耐性遺伝子と同様、ｈＧＭ−ＣＳＦの発現も、ｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰによって染色体に導入されたＣＭＶプロモーターに依存する。そのため、ｈＧＭ−ＣＳＦは、ｐＩＲＥＳ−ＰｒｏｍｌｏｘＰが部位特異的組み換えによって染色体に挿入された場合のみ発現する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ／ｈＧＭ−ＣＳＦを模式的に表す図である。
【図２】図２は、本発明において用いた、ＦＩＳＨ法による増幅遺伝子の染色体上における位置の同定方法であるＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＣＨＩＡＳ  ＩＩＩ）を用いた染色体画像解析を模式的に示した図である。
【図３】図３は、実施例２の結果、遺伝子増幅が確認された染色体位置および遺伝子増幅のコピー数を示す模式図である。
【図４】図４は、プラスミドｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰを模式的に示した図である。
【図５】図５は、実施例３の結果を示す。ｄｈｆｒ−ｍｌｏｘＰで形質転換した細胞を５０ｎＭ  ＭＴＸ添加により選択し、６０株の細胞をクローニングし、それぞれの細胞株に対して、ＦＩＳＨ法及びドットブロッティング法を行い、遺伝子増幅を確認した。遺伝子増幅が確認された染色体位置および遺伝子増幅のコピー数が模式的に示されている。
【配列表フリーテキスト】
【０１４７】
配列番号１  Ｃｒｅ（核酸配列）
配列番号２  Ｃｒｅ（アミノ酸配列）
配列番号３  ｌｏｘＰ（野生型核酸配列）
配列番号４  ｌｏｘＰ（変異型核酸配列  その１）
配列番号５  ｌｏｘＰ（変異型核酸配列  その２）
配列番号６  Ｔａｔ配列由来のＡｒｇ−ｒｉｃｈ配列
配列番号７  Ｔａｔ−Ｃｒｅ−Ｆｏｒｗａｒｄ  プライマー
配列番号８  Ｔａｔ−Ｃｒｅ−Ｒｅｖｅｒｅｓｅ  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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