(57)【要約】      （修正有）【課題】多孔質担体にポリマーを充分に導入し、目的物の吸着能力および分離能が充分である分離剤を提供する。【解決手段】多孔質担体表面に、アミド、エーテル、チオエーテル、−ＮＨ−、エステル、チオエステル、ジスルフィドのいずれかを含む結合基（Ａ）と、四級炭素を介して、ポリマー（Ｂ）に結合してなる、下記式で示される化合物を分離材として使用する。2006341222.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質担体表面に、アミド、エーテル、チオエーテル、−ＮＨ−、エステル、チオエステル、ジスルフィドのいずれかを含む結合基（Ａ）と、四級炭素を介して、下記化学式２で示されるポリマー（Ｂ）に結合してなる、下記化学式１で示される分離剤
【化１】
2006341222.tif 000005
【化２】
2006341222.tif 000006
（式中Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立にシアノ基、カルボン酸エステル、置換基を有していても良いアルキル基のいずれかである。Ｒ３はＨまたはＣＨ３である。Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２または−ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５である（ここでＸは−ＯＨ、−ＮＲ６Ｒ７または−ＯＲ８である。Ｒ６およびＲ７はそれぞれ、アルキル基、フェニル基、アルキル基中に１０個までのＣ原子を有するフェニルアルキル基またはアルキル基中に１０個までのＣ原子を有するアルキルフェニル基であり、これらはアルコキシ基、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、カルボキシル基、スルホニル基、アセトキシ基、アセトアミノ基または−ＯＨから選択された１個以上の置換基を有することができ、またはＲ６およびＲ７は、それぞれＣ原子５〜１０個を有する環状基または二環状基であり、この基中に存在する１個以上のＣＨ基はＮにより、この基中に存在する１個以上のＣＨ２基はＮＨ、ＮＨとＳまたはＮＨとＯにより置き換えられていてもよく、またはＲ６およびＲ７のうちの一つは、Ｈであってもよく、またはＲ６およびＲ７は、これらの両方が酸性基であるか、両方が塩基性基であるか、またはこれらの両方または一方が中性基である。Ｒ８は、アルキル基、フェニル基、、アルキル基中に１０個までのＣ原子を有するフェニルアルキル基またはアルキル基中に１０個までのＣ原子を有するアルキルフェニル基であり、これらはアルコキシ基、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、カルボキシル基、スルホニル基、アセトキシ基、アセトアミノ基または−ＯＨから選択された１個以上の置換基を有することができる）。Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立にＨまたはＣＨ３であり、そしてＹが−ＯＨである場合にはＲ’およびＲ”のうちの一つは−ＯＨであってもよい。Ｒ４およびＲ５はそれぞれ、アルキル基、フェニル基、アルキル基中に１０個までのＣ原子を有するフェニルアルキル基またはアルキル基中に１０個までのＣ原子を有するアルキルフェニル基であり、これらはアルコキシ基、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、カルボキシル基、スルホニル基、アセトキシ基、アセトアミノ基または−ＯＨから選択された１以上の置換基を有することができ、またはＲ４およびＲ５は、それぞれＣ原子５〜１０個を有する環状基または二環状基であり、この基中に存在する１個以上のＣＨ基はＮにより、この基中に存在する１個以上のＣＨ２基はＮＨ、ＮＨとＳまたはＮＨとＯにより置き換えられていてもよく、またはＲ４およびＲ５のうちの一つは、Ｈであってもよく、またはＲ４およびＲ５は両方が酸性基であるか、両方が塩基性基であるか、またはこれらの両方または一方が中性基である）。
【請求項２】
化学式２においてＹが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘであり、Ｘは−ＯＨまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６およびＲ７はその一方がＨであり、他方がジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、カルボキシル基、スルホニル基のいずれか１種を有するアルキル基、またはジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、カルボキシ基、スルホニル基のいずれか１種と−ＯＨとを有するアルキル基である請求項１に記載の分離剤。
【請求項３】
結合基（Ａ）がアミド、エーテル、チオエーテル、−ＮＨ−の少なくとも１種を含む結合基である請求項１または２に記載の分離剤。
【請求項４】
多孔質担体がメタクリレート類を重合した親水性ポリマー、ポリスチレン、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる群から選択される担体である請求項１乃至３のいずれかに記載の分離剤。
【請求項５】
多孔質担体の平均孔径が５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分離剤。
【請求項６】
アゾ基を持つ化合物と多孔質担体とを有機溶媒、水溶液または有機溶媒と水との混合溶液中で直接または縮合剤により結合させ、次いで未結合のアゾ基を持つ化合物を除き、得られたアゾ基導入多孔質担体を、下記化学式３に示すモノマーと有機溶媒、水溶液または有機溶媒と水との混合溶液中で混合し、そのまま、または溶液中の酸素を除いた後、加熱または光照射することによって下記化学式３に示すモノマーをラジカル重合により多孔質担体に結合する、請求項１乃至５のいずれかに記載の分離剤の製造方法
【化３】
2006341222.tif 000007
（化学式３中のＲ’、Ｒ”、Ｒ３、Ｙは化学式２に記載のＲ’、Ｒ”、Ｒ３、Ｙと同一の意味を有する）。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれかに記載の分離剤をカラムに充填したクロマトグラフィー用カラム。
【請求項８】
生体高分子を含む溶液から請求項１乃至５のいずれかに記載の分離剤を用いて生体高分子を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
核酸、蛋白質等の除去，分離，精製に用いられる分離剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質、酵素、細胞構成単位、ペプチド、合成ペプチド、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗原、ウイルス、ウイルス断片、全細胞などの生物学的巨大分子（またはこれらの結合物、断片、修飾物、変成物などを含む）の分離及び精製は遺伝子工学およびバイオテクノロジーに関してきわめて重要になっている。これら生物学的巨大分子などの分離、精製に用いる分離材料として、ヒドロキシル基を有する基材を支持体としてその表面にＣｅ（ＩＶ）を作用させヒドロキシル基のα−Ｃ原子を介してグラフト重合によりポリマーを結合してなる分離材料が提案されている（特許文献１参照）。
【０００３】
前記分離材料は−ＯＨの結合したα炭素にＣｅ（ＩＶ）を作用させることにより一級または二級炭素ラジカルを発生させ、これにモノマーをラジカル重合により重合させることにより得られる。結果として得られた分離剤は基材とポリマーとが二級または三級の炭素を介して結合した構造となる。
【０００４】
担体にアゾ化合物を固定化し、これを加熱してラジカルを生じさせ、モノマーをラジカル重合により結合させる方法については公知である（非特許文献１及び２参照）。
【０００５】
担体にアゾ化合物を固定化し、これに陰陽両電荷を具備するビニルモノマーを重合させたイオンクロマトグラフィーの分離用充填剤について、特許文献２がある。ただし特許文献２記載の分離用充填材は重合させるモノマーとして陰陽両電荷を具備するビニルモノマーを使用している点、充填剤がイオンクロマトグラフィー用である点、分離対象種がイオンである点で異なっている。
【０００６】
【特許文献１】特許第３０５９４４３号
【特許文献２】特開２００１−１４１７１０号公報
【非特許文献１】Ｂ．  Ｖｏｌｌｍｅｒｔら；Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  ｃｈｅｍ．，３６，１７（１９５３）
【非特許文献２】Ｏ．  Ｐｌｕｋｅｒら；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，６０２−６１３（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の分離剤は−ＯＨの結合したα炭素にＣｅ（ＩＶ）を作用させることにより一級または二級炭素ラジカルを発生させ、これにモノマーをラジカル重合により重合させることによりなる。炭素ラジカルの安定性は三級＞二級＞一級＞ＣＨ３の順であることが知られているが、Ｃｅ（ＩＶ）を用いて炭素ラジカルを生じさせる場合、Ｃｅ（ＩＶ）はヒドロキシル基のα炭素にラジカルを生じさせるため生じた炭素ラジカルには−ＯＨが結合しており、三級炭素ラジカルを生じさせることはできない。特許文献１に記載の分離剤の製造方法ではＣｅ（ＩＶ）を作用させることにより得られた炭素ラジカルが一級または二級であるためモノマーとラジカル重合する前にその多くが失活し、結果として多孔質担体に導入されるポリマーの数は少ない。したがって特許文献１に記載の分離剤は多孔質担体にポリマーが充分結合しておらず、結果として得られた分離剤は目的物の吸着能力が不十分であり、また目的物の吸着能力が不十分である。
【０００８】
そこでこの発明は多孔質担体に結合した三級炭素ラジカルに化学式３に記載のモノマーをラジカル重合により結合させることにより、化学式１で示される、分離能および吸着能力が十分である分離剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は多孔質担体表面に、下記化学式２で示されるポリマー（Ｂ）がアミド、エーテル、チオエーテル、−ＮＨ−、エステル、チオエステル、ジスルフィドのいずれかを含む結合基（Ａ）と四級炭素を介して該担体とポリマー（Ｂ）とを結合してなる下記化学式１で示される分離剤であることを特徴とする。
【００１０】
【化１】
2006341222.tif 000002
【００１１】
【化２】
2006341222.tif 000003
本発明において多孔質担体としては、例えばアクリレート類、メタクリレート類、ビニルアルコール類を重合した親水性ポリマー、ポリスチレン、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、アガロースベースの多糖類、セルロース、セルロース誘導体、架橋したデキストラン、シリカゲルなどがあげられる。これらの多孔質担体の形状は例えば粒子状、繊維状、膜状あるいは内部に貫通孔を持ち、一体型の形状をなすものなどがあげられる。これらはあらかじめ基材がエポキシ基などの官能基をもっているものでも、あるいは例えば一般に芳香族環に官能基を導入するのに用いられるクロロメチル化のように、基材に後から官能基を導入してもあるいは官能基を再度別の官能基に変換しても良い。官能基としては例えばエポキシ基、アミノ基、−ＯＨ、スルホヒドリル基、カルボキシル基（またはその活性エステル化物（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル）、またはその誘導体（酸クロリド、酸無水物））、アルデヒド基、ピリジルジスルフィド基などがあげられるが、特にエポキシ基、アミノ基、カルボキシル基、またはカルボキシル基の誘導体（活性エステル化物（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル）、酸クロリド、酸無水物）などが好適である。
【００１２】
アゾ基を持つ化合物としては種々のものが用いられるが、例として４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイッククロリド）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイックアシッド）などをあげることができる。
【００１３】
アゾ基を持つ化合物を多孔質担体に導入する方法としては、特に制限はなく、適宜の方法で行われる。例を示せば、前記多孔質担体がアミノ基を持つ場合、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中室温または冷却して加え、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイックアシッド）と反応させて行うことができる。反応は遮光して行うことが望ましいが、遮光せずに行うこともできる。
【００１４】
官能基の導入された多孔質担体とアゾ基を持つ化合物とが結合した結果として得られる結合基（Ａ）としては例としてアミド、エーテル、チオエーテル、−ＮＨ−、エステル、チオエステル、ジスルフィドをあげることができる。なかでもアミド、エーテル、−ＮＨ−は耐アルカリ性が高く、好適である。
【００１５】
多孔質担体に結合基（Ａ）および四級炭素を介して結合するポリマー（Ｂ）は、下記化学式３で示されたモノマーをラジカル重合することで得る。
【００１６】
【化３】
2006341222.tif 000004
これらのモノマーはいずれも、中性、酸性、または塩基性であることができ、有機溶媒、水溶液あるいは有機溶媒と水溶液の混合溶液中でラジカル重合することができる物質である。
【００１７】
前記多孔質担体にアゾ基を導入したものに対し、化学式３のモノマーを重合させる方法としては、特に制限はなく、適宜の方法で行われる。例を示せば、多孔質担体にアゾ基を導入したものを水溶液あるいは有機溶媒またはその混合物中に分散し、モノマーを加え、加熱または光照射することにより重合を開始させて行うことができる。溶液はそのまままたは溶液中の酸素を除いて行うことができるが、溶液中の酸素を除いて行うことが望ましい。酸素の除去は適宜の方法を用いることができるが例えば減圧と窒素充填を繰り返しても良い。
【発明の効果】
【００１８】
以上説明したように、この発明に係る分離剤にあっては、多孔質担体に結合した三級の炭素ラジカルに化学式３に記載のモノマーをラジカル重合により結合させることにより、多孔質担体に導入されるポリマーの数が多くなり、良好な結合能および分離能を発揮することができる。
【実施例】
【００１９】
以下本発明の実施例について、具体的に説明する。これらの例においては原材料として、メタクリレート類の親水性ポリマーにアミノ基が結合した多孔質担体であるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ（東ソー製）が使用されている。
【００２０】
実施例１  弱塩基性イオン交換体の製造
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍをガラスフィルター上で３回Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬製、特級）で洗浄した。減圧吸引濾過し、サクションドライ多孔質担体を得た。
【００２１】
２００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを１Ｌのセパラブルフラスコに加えた。室温で１０ｇの４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイックアシッド）（和光純薬製  商品名Ｖ−５０１）を加えた。１５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライ製、ペプチド合成特製試薬）を加えた。１５ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライ製、ペプチド合成特製試薬）を加えた。上記サクションドライ多孔質担体を加えた。２００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で１昼夜攪拌した。ゲルをガラスフィルター上で水で洗浄し、続いて減圧吸引濾過し、アゾ化合物を固定化したサクションドライ多孔質担体を得た。
【００２２】
１Ｌ三口丸底フラスコを恒温水槽に浸漬し、７５℃に加熱した。上記アゾ化合物を固定化したサクションドライ化多孔質担体５０ｇと３００ｍＬの水と２０ｇの３−アクリルアミド−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬製）（以下、３−アクリルアミド）を混合した。担体を分散させた。スラリーを反応容器に移した。減圧、窒素の充填を３回繰り返すことにより反応系の酸素を除いた。窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応生成物をグラスフィルターに移し吸引濾過し、グラスフィルター上で水、１Ｍ  ＮａＣｌ、水、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、水、１Ｍ  塩酸、０．５Ｍ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０、水の順で洗浄した。
ウシ血清アルブミンに対する結合量はゲル１ｍＬあたり１８４ｍｇ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０）であった。
【００２３】
実施例２  強カチオン交換体の製造
製造は実施例１と同様に行うが、３−アクリルアミドのかわりに２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（和光純薬製）を３０ｇ使用した。
リゾチュームに対する結合量はゲル１ｍＬあたり９７．２ｍｇ（２０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０）であった。
【００２４】
実施例３
第一実施例で得られた分離剤を直径７．５ｍｍＩＤ×７．５ｃｍステンレス製カラムにスラリー法で充填し、そのカラムを液体クロマトグラフィーシステムに組み込んだ。検出器としては可視紫外検出器を用い、２８０ｎｍの吸収を検出した。溶離液は２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０と１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を使用し、サンプル注入後５分から４５分で０Ｍから０．６６７ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶離した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。サンプルとしてコンアルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびトリプシンインヒビターがそれぞれ２ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に溶解した生体高分子混合溶液を１ｍＬ使用した。結果を図１に示す。３種とも分離されていることがわかる。
【００２５】
比較例１  弱塩基性イオン交換体の製造
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｍ（東ソー製）をガラスフィルター上にとり３回水で洗浄した。減圧吸引濾過し、サクションドライ多孔質担体を得た。３−アクリルアミドを３９ｇビーカーに測り取り、２７０ｍＬの水を加えて溶解した。これにサクションドライ多孔質担体１８０ｇを加えた。濃硝酸を加え、ｐＨを２．５に調整した。これを１Ｌの３口丸底フラスコに移し、滴下漏斗をとりつけた。別の容器に２０ｍＬの水をとり、これに０．９ｇの濃硝酸と３．９ｇの硝酸アンモニウムセリウムを溶解した。この溶液を先の３つ口丸底フラスコに取り付けた滴下漏斗に注いだ。反応容器を減圧し、窒素を加えた。この操作を３回繰り返した。窒素雰囲気下、激しく攪拌しながら滴下漏斗内の溶液を３分で滴下した。滴下終了後ゆるやかに攪拌しながら４２℃で１６時間攪拌した。反応終了後、ゲルをガラスフィルタに移し、水、０．４Ｍ  Ｎａ２ＳＯ３、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、水、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．５Ｍ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０、水で洗浄した。
ウシ血清アルブミンに対する結合量は、ゲル１ｍＬあたり７０．１ｍｇ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．０）であった。
【００２６】
比較例２
比較例１で得られた分離剤を実施例３と同様にカラムに充填し、生体高分子混合溶液を分離させた。結果を図２に示す。分離が不十分である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１の分離剤を充填したカラムのクロマトグラムである。
【図２】比較例１の分離剤を充填したカラムのクロマトグラムである。
【図１】
2006341222.tif 000009
【図２】
2006341222.tif 000010