(57)【要約】【課題】コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅへの高い特異性を有し、特定の種類の硫酸化多糖の単離、特定の硫酸化多糖の検出等に用いうる、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対するモノクローナル抗体、並びに高い感度、高い特異性、優れた簡便性の少なくとも１つを達成しうる、被検試料中のコンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅとの検出方法を提供すること。【解決手段】コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対するモノクローナル抗体又はその一部；寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマ；該ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体；該モノクローナル抗体又はその一部を被検試料と接触させ、ついで、該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体又は該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体の形成の有無を測定する、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対するモノクローナル抗体又はその一部。
【請求項２】
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄのそれぞれとは反応せず、かつコンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれと反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその一部。
【請求項３】
寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマにより産生される、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその一部。
【請求項４】
寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体。
【請求項５】
寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部を被検試料と接触させ、ついで、該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体又は該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の硫酸化多糖の単離、特定の硫酸化多糖の検出、診断用プローブ等に有用な、高い特異性で特定のコンドロイチン硫酸に反応する抗体に関する。より詳しくは、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの単離、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出、炎症性疾患、アレルギー性疾患等の診断用プローブ等に有用な、モノクローナル抗体；高い特異性で検出することができる、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテオグリカンは、細胞表面及び細胞外マトリックスの主要成分であり、グリコサミノグリカンが、コアタンパク質に共有結合した分子である（非特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
また、前記グリコサミノグリカンは、成長因子等のシグナル伝達を介して、形態形成や組織機能の発現等に役割を果たすことが知られている（非特許文献２を参照のこと）
【０００４】
前記グリコサミノグリカンの１つであるコンドロイチン硫酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとから構成された二糖を繰返し単位とする分子である。前記コンドロイチン硫酸は、例えば、前炎症性因子とプロテオグリカンとの相互作用に役割を果たす可能性が示唆されている。前記コンドロイチン硫酸は、硫酸化された官能基の位置により、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸とも称される）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅに分類されている。
【０００５】
前記コンドロイチン硫酸に対する抗体として、例えば、コンドロイチン硫酸Ａとコンドロイチン硫酸Ｃとに反応する抗体であることが報告されている抗−コンドロイチン硫酸（例えば、非特許文献３、４、５、６、７を参照のこと）；コンドロイチン硫酸Ａを認識することが報告されている抗−コンドロイチン硫酸Ａ（例えば、非特許文献８及び９を参照のこと）；インタクトなコンドロイチン硫酸鎖上の決定基〔Ｄ−グルクロン酸−２−硫酸（α１−３）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸の二重構造（Ｄユニットという）〕を認識することが報告されている抗−コンドロイチン硫酸Ｄ（例えば、非特許文献１０及び１１を参照のこと）が挙げられる。
【０００６】
なお、コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅのうち、生体内で炎症反応に強い関与が報告されているケモカイン（例えば、ＳＬＣ等）と結合し、かつケモカインによる細胞の活性化を阻害しうるコンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅだけである（例えば、非特許文献２及び１２を参照のこと）。したがって、診断用プローブ、治療用抗体として用いるために、さらに、コンドロイチン硫酸Ｂやコンドロイチン硫酸Ｅに対して、より特異性の高い抗体が望まれている。
【０００７】
【非特許文献１】
カワシマら著、「トレンズ  イン  グリコサイエンス  アンド  グリコテクノロジー (Trends in Glycoscience and Glycotechnology) 」，2000年，第12巻，第67号，第283 頁−第294 頁
【非特許文献２】
カワシマら著、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(Journal of Biological Chemistry) 」，米国，2002年，第277 巻，第15号，第12921 頁- 第12930 頁
【非特許文献３】
アブニュール (Z. Avnur) ら著, 細胞培養におけるプロテオグリカン類と細胞外マトリックスとの間の空間的相互関係(Spatial interrelationships between proteoglycans and extracellular matrix in cell cultures.),「エクスペリメンタル  セル  リサーチ(Experimental Cell Research)」, 米国, 1985年, 第158 巻, 第321 頁- 第332 頁
【非特許文献４】
ヘイ(E.D.Hay) ら著，細胞外マトリックス(Extracellular matrix.),「ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー(The Journal of Cell Biology) 」, 米国, 1981年, 第91巻, 第205 頁- 第223 頁
【非特許文献５】
アプリン(J.D. Aplin)ら著，細胞外マトリックス構造、相互作用及び生物学的役割を有する複合糖質(Complex carbohydrates of the extracellular matrix structures, interactions and biological roles.), 「バイオキミカ  エ  バイオフィジカ  アクタ(Biochimica et biophysica acta) 」，エルセビエール  サイエンス(Elsevier Science)発行, 1982年，第694 巻、第375 頁- 第418 頁
【非特許文献６】
クリスナー(J.E. Christner)ら著, プロテオグリカンの免疫学的決定基(Immunological determinants of proteoglycans.), 「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(J. Biol. Chem.)」米国, 1980年, 第255 巻, 第7102頁- 第7105頁
【非特許文献７】
グリンネル(F. Grinnell) ら著, 細胞接着性及び細胞外基質(Cellular adhesiveness and extracellular substrate.), 「インターナショナル  レビュー  オブ  サイトロジー(International Review of Cytology), 1978年, 第53巻, 第65頁- 第144 頁
【非特許文献８】
オオヒラ(Oohira, A.)ら著, 「ニューロサイエンス(Neuroscience)」, 第60巻, 第145 頁- 第157 頁
【非特許文献９】
ヤマモト(Yamamoto Y.) ら著, ヒツジの前胃におけるコンドロイチン硫酸の免疫組織化学的局在化(Immunohistochemical localization of chondroitin sulfate in the forestomach of the seep.),  「ヨーロピアン  ジャーナルオブ  ヒストメミストリー(Eur. J. Histochem.)」, 1995年, 第39巻, 第265 頁- 第272 頁
【非特許文献１０】
ヤマガタ(Yamagata, M.)ら著, インタクトなコンドロイチン硫酸鎖におけるグルクロン酸２−硫酸含有決定因子を特異的に認識するモノクローナル抗体(A monoclonal antibody that specifically recognizes a glucuronic acid 2-sulfate-containing determinant in intact chondroitin sulfate chain.)  , 「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)」, 1987年, 第262 巻, 第4146頁- 第4152頁
【非特許文献１１】
ヤマガタ(Yamagata, M.)ら著, 細胞外基質に固定化されたプロテオグリカンによる細胞−基質接着の調節(Regulation of cell-substrate adhesion by proteoglycans immobilized on extracellular substrates.),「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)」, 1989年, 第264 巻, 第8012頁- 第8018頁
【非特許文献１２】
ヒロセ(Hirose J.) ら著，コンドロイチン硫酸Ｂは、ＳＬＣのＣ末端に結合することにより、２次リンパ球様組織ケモカイン（ＳＬＣ）への阻害作用を示す(Chondroitin sulfate B exerts its inhibitory effect on secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) by binding to the C-terminus of SLC.), 「バイオケミカ  バイオフィジカ  エ  アクタ(Biochimica Byophysica et Acta) 」, 2002年, 第1571巻, 第219 頁- 第224 頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅへの高い特異性を有し、特定の種類の硫酸化多糖の単離、特定の硫酸化多糖の検出等に用いうる、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対するモノクローナル抗体若しくはその一部、又は該モノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、前記モノクローナル抗体の安定な供給、効率のよい供給等を可能にしうるハイブリドーマを提供することを目的とする。さらに、本発明は、高い感度、高い特異性、優れた簡便性の少なくとも１つを達成しうる、被検試料中のコンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅとの検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対するモノクローナル抗体又はその一部、
〔２〕  コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄのそれぞれとは反応せず、かつコンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれと反応する、前記〔１〕に記載のモノクローナル抗体又はその一部、
〔３〕  寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマにより産生される、前記〔１〕又は〔２〕に記載のモノクローナル抗体又はその一部、
〔４〕  寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体、
〔５〕  寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１のハイブリドーマ、並びに
〔６〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部を被検試料と接触させ、ついで、該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体又は該モノクロナール抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに反応するモノクローナル抗体である。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれに高い親和性で結合するモノクローナル抗体である。
【００１１】
より具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄのそれぞれとは反応せず、かつコンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれと反応するモノクローナル抗体である。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＭであり、軽鎖は、κ鎖である。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対して、高い抗原認識特異性を有するという優れた性質を発現する。
【００１４】
したがって、本発明のモノクロナール抗体によれば、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに特異的に反応するため、特定の種類の硫酸化多糖との反応に基づく診断用プローブ、具体的には、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれとの反応に基づく診断用プローブが提供されうるという優れた効果を発揮する。
【００１５】
また、本発明のモノクローナル抗体によれば、特定の種類の硫酸化多糖、具体的には、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅを、高い特異性で効率よく、単離することができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
さらに、本発明のモノクローナル抗体によれば、特定の硫酸化多糖、具体的には、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅを、高い特異性で、効率よく、高い感度で検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００１７】
本明細書において、前記「特異性」は、抗原に対する交差反応性及び抗原との親和性により評価される。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体に関して、前記「抗原に対する交差反応性」は、各種糖化合物、例えば、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ等を抗原として用い、ＥＬＩＳＡ法、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法等により、評価されうる。
【００１９】
また、本発明のモノクローナル抗体に関して、前記「抗原との親和性」は、モノクローナル抗体と抗原との結合速度定数、解離速度定数等により評価されうる。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｃｈ−１及びＣｈ−３と命名・表示され、それぞれ、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１として、２００２年１１月１日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されているハイブリドーマより、慣用の方法により、安定に、効率よく製造されうる。なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する前記寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１のハイブリドーマも本発明に含まれる。前記ハイブリドーマは、保護剤、例えば、セルバンカー（日本全薬工業株式会社製）を用いて１０6 個  細胞／ｍｌとなるように懸濁し、得られた産物を０. ５〜１ｍｌずつ保存用チューブに分注し、凍結、例えば、一旦、−８０℃で凍結させ、ついで、−１５０℃で凍結させることにより、凍結保存されうる。凍結保存されたハイブリドーマは、ウォーターバス中３７℃でインキュベートし、培養液を該ハイブリドーマの培養に用いるに適した後述の培地に交換することにより、適宜使用され得る。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えば、
▲１▼前記寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１のハイブリドーマを適切な培地中、５％  ＣＯ2 、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得る工程、及び
▲２▼該培養上清から、モノクローナル抗体を精製する工程、
を行なうことにより得られうる。
【００２２】
前記工程▲１▼において、ハイブリドーマの培地としては、本発明のハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるに適した慣用の栄養培地又は慣用の基本培地の改変培地等が挙げられる。前記基本培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＥＸ−ＣＥＬ  ６１０−ＨＳＦハイブリドーマ無血清培地等が挙げられる。また、培地のｐＨは、７〜８、好ましくは、約７．４であることが望ましい。
【００２３】
前記基本培地は、目的に応じて、例えば、血清、ホルモン、サイトカイン等をさらに含有してもよい。本発明のハイブリドーマの培養に用いられうる培地としては、具体的には、例えば、１０％  ＦＣＳと１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと１％  Ｌ−グルタミンと１％  ピルビン酸ナトリウムと１％  非必須アミノ酸と１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンと５×１０-5  Ｍ２−メルカプトエタノールと、１／１００  ＩＬ−６（ＩＬ−６産生細胞株の培養上清１％）とを補追したＲＰＭＩ−１６４０培地；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと１％  Ｌ−グルタミンと１％  ピルビン酸ナトリウムと１％  非必須アミノ酸と１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンと５×１０-5  Ｍ  ２−メルカプトエタノールと１／１００  ＩＬ−６（ＩＬ−６産生細胞株の培養上清１％）とを補追したＥＸ−ＣＥＬ  ６１０−ＨＳＦハイブリドーマ無血清培地等が挙げられる。
【００２４】
前記工程▲１▼におけるハイブリドーマの培養条件としては、例えば、５％  ＣＯ2 、３７℃で数日間のインキュベーション等が挙げられる。
【００２５】
前記工程▲２▼において、モノクローナル抗体の精製は、前記工程▲１▼で得られた培養上清を、硫酸ナトリウム、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行なうことができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体には、前記寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。
【００２７】
なお、本発明においては、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに反応するものであれば、本発明のモノクローナル抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆｖ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅのアフィニティー精製、該コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出、炎症性疾患、アレルギー性疾患等の診断用プローブ、該コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの局在部位への薬物送達への応用が期待される。
【００２９】
また、前記コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅは、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４に結合する。したがって、本発明のモノクロナール抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとへの特異的な反応を介して、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４に関連する疾患を治療、予防又は診断すること等への応用が可能になる。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部により、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅのアフィニティー精製に用いるための担体も提供されうる。
【００３１】
かかる担体としては、例えば、該モノクローナル抗体又はその一部を慣用の支持体に担持させた担体が挙げられる。
【００３２】
前記支持体としては、ポリスチレンビーズ、セファロース等が挙げられる。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部を支持体に担持させるには、例えば、ブロムシアン法等が行なわれうる。
【００３４】
担体に吸着したコンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの溶出は、担体上の本発明のモノクローナル抗体又はその一部とコンドロイチン硫酸Ｂ又はコンドロイチン硫酸Ｅとの間のイオン結合、水素結合、疎水結合等を解離させる試薬、例えば、酢酸アンモニウム、ブタノール等により行なわれうる。
【００３５】
かかる担体は、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの残基を構成単位の１つとする糖鎖の精製、該糖鎖のソーティング、後述のコンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出、炎症性疾患、アレルギー性疾患等の診断用プローブ等にも応用しうる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部により、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法も提供される。
【００３７】
本発明の検出方法は、本発明のモノクローナル抗体又はその一部を被検試料と接触させ、ついで、該モノクロナール抗体若しくはその一部とコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体又は該モノクロナール抗体若しくはその一部とコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体の形成の有無を測定することを１つの大きな特徴とする。
【００３８】
本発明の検出方法によれば、高い感度で、高い特異性で、かつ簡便に、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅを検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００３９】
本発明の検出方法においては、まず、被検試料とモノクローナル抗体又はその一部とを接触させる。
【００４０】
本発明のモノクロナール抗体若しくはその一部とコンドロイチン硫酸Ｂとの複合体又は該モノクロナール抗体若しくはその一部とコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体の形成は、例えば、本発明のモノクローナル抗体に対する抗体又は本発明のモノクローナル抗体の一部に対する抗体等の二次抗体により、複合体を捕捉することにより検出されうる。
【００４１】
ここで、検出を容易にし、かつ感度を向上させる観点から、前記二次抗体は、ｉ）慣用の標識物質により標識されたものであること、又は
ｉｉ）ラテックス等の支持体に担持されたものであること、
が望ましい。
【００４２】
前記標識物質としては、例えば、蛍光物質、酵素、放射活性物質等が挙げられる。前記蛍光物質としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン  イソチオシアネート、ローダミン  イソチオシアネート等が挙げられる。前記酵素としては、特に限定されないが、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００４３】
前記ｉ）においては、標識物質の存在を指標として、前記複合体を検出できる。具体的には、前記複合体は、標識物質が蛍光物質である場合、該蛍光物質に応じた波長での蛍光を指標として検出され、標識物質が酵素である場合、該酵素の基質として酵素の反応により発色する物質を用い、発色を指標として検出されうる。
【００４４】
前記ｉｉ）においては、ラテックスの凝集度合いを指標として前記複合体を検出できる。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの存在量、局在部位等が正常状態とは変化するような疾患等の診断用プローブとしても使用できる。かかる疾患としては、炎症性疾患、アレルギー性疾患等が挙げられる。
【００４６】
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、任意の薬物を、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの局在部位へ送達することにも利用されうる。この場合、本発明のモノクローナル抗体又はその一部と薬物とは、該薬物の薬理活性を妨げない官能基により結合されうる。また、前記薬物をリポソーム、生分解性ポリマー等のマイクロカプセルに封入し、得られた産物と本発明のモノクローナル抗体又はその一部とを、結合させてもよい。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４８】
実施例１  免疫原の作製
抗原として用いるコンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ  Ｅ）の抗原性を高めるため、以下のように、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンドロイチン硫酸Ｅを結合させた。
【００４９】
まず、５ｍｇのＥＥＤＱ（シグマ社製、商品番号：Ｅ１００４）を５００μｌのエタノールに溶解させ、ＥＥＤＱ溶液を得た。また、５ｍｇのＣＳ  Ｅ（生化学工業社製、商品番号：４００６７８）を４００μｌの蒸留水に溶解し、ＣＳ  Ｅ溶液を得た。その後、前記ＥＥＤＱ溶液と、前記ＣＳ  Ｅ溶液とを混合し、室温で１時間インキュベートした。
【００５０】
ついで、得られた混合物に、５００μｌの蒸留水に溶解したＢＳＡ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、商品番号：Ａ４５０３〕を添加し、４℃で１８時間インキュベートした。その後、得られた混合液をＰＢＳに対して透析することにより、ＢＳＡに結合しなかったＣＳ  Ｅを除去した。得られた産物をＣＳ  Ｅ−ＢＳＡと命名し、免疫原として用いた。
【００５１】
実施例２  ハイブリドーマの作製
５０μｌのＣＳ  Ｅ−ＢＳＡ（ＣＳ  Ｅ約５０μｇ相当量) を５０μｌのＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント〔タイターマックス  インコーポレーティッド（ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｉｎｃ）製〕と混合した。得られた混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２週間間隔で２回、腹腔内投与した。なお、前記ＢＡＬＢ／ｃマウスとして、ＳＬＣにより購入した５週令のＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）  ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを飼育することにより得られた６週令のマウスを用いた。
【００５２】
前記腹腔内投与の２週間後から、毎週１回、計４回、５０μｌのＣＳ  Ｅ−ＢＳＡを、マウスに静脈注射することにより、追加免疫を行なった。その後、最後の免疫の３日後にマウスを屠殺し、脾臓を得た。
【００５３】
得られた脾臓を、メッシュ上で、スパーテルの背側で押しつぶし、ついで、ＲＰＭＩ１４６０培地で灌流し、慣用の方法により、単細胞浮遊液として脾細胞を得た。ついで、常法により、脾細胞とマウスミエローマ細胞ＰＡＩとの細胞融合を行なった。得られた細胞について、ＨＡＴ培地を用いて、３７℃で培養することにより、生存した細胞として細胞融合株を選択し、ハイブリドーマを得た。
【００５４】
試験例１  抗体活性スクリーニングのためのＥＬＩＳＡ
（１）コンドロイチン化合物に反応する抗体のスクリーニング
前記実施例２で得られたハイブリドーマの各培養上清中の抗体、公知の抗体〔ＣＳ５６（生化学工業社製）、ＭＯ−２２５（生化学工業社製）、Ｆ５８−１０Ｅ４（生化学工業社製）及び５−Ｄ−４（生化学工業社製）〕について、各種コンドロイチン硫酸に対する活性をＥＬＩＳＡにより検討した。
【００５５】
なお、前記ＣＳ５６は、コンドロイチン硫酸を広く認識する抗体であり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのグリコサミノグリカン部分に特異的で、コンドロイチン硫酸Ａとコンドロイチン硫酸Ｃとに反応するが、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）とは反応しない抗体である〔前記非特許文献３〜７〕。前記ＭＯ−２２５は、コンドロイチン硫酸上の決定基（Ｄ−グルクロン酸−２−硫酸（α１−３）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸の二重構造：Ｄ−ユニット）を認識する抗体である〔前記非特許文献１０及び１１〕。前記Ｆ５８−１０Ｅ４は、ヘパラン硫酸を認識する抗体である〔デービッド(David, G.) ら, J. Cell. Biol., 119, 961-975(1992); 及びバイ(Bai, X. M.)ら, J.Histochem. Cytochem., 42, 1043-1054 (1994)〕。前記５−Ｄ−４は、ケラタン硫酸を認識する抗体である〔ケーターソン(Caterson, B.)ら, J. Biol. Chem., 258, 8848 (1983); 及びメーメット(Mehmet, H.)ら, Eur. J. Biochem., 157, 385-391 (1986) 〕
【００５６】
９６穴マイクロタイタープレート（コスター  ３６９０）に、１ウェルあたり２５μｌの抗原、すなわち、各種グルコサミノグリカンとＢＳＡとの複合体〔リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で１８時間インキュベートし、それにより、抗原を固定化した。
【００５７】
なお、前記抗原として、各種グリコサミノグリカン、すなわち、コンドロイチン（コンドロイチン硫酸を脱硫酸したもの; 生化学工業社製、商品番号：４００６４０）、コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ鼻軟骨由来；生化学工業社製、商品番号：４００６５５）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮膚由来；生化学工業社製、商品番号：４００６６０）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来；生化学工業社製、商品番号：４００６７５）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来；生化学工業社製、商品番号：４００６７６）、コンドロイチン硫酸Ｅ（イカ軟骨由来；生化学工業社製、商品番号：４００６７８）、ケラタン硫酸（ウシ角膜由来；生化学工業、商品番号：４００７６０）、ヒアルロン硫酸（ウシ腎臓由来; 生化学工業社製、商品番号：４００７００）、ヒアルロン酸（ヒト臍帯由来、アイシーエヌ社製、商品番号：３６２４２１）を用いた。
【００５８】
各ウェルを、１００μｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ついで、各ウェルに、１ウェルあたり１５０μｌの３重量％  ＢＳＡ（シグマ社製  ３８０３）を添加し、１時間インキュベートすることによりブロッキングを行なった。その後、各ウェルを、１ウェルあたり１５０μｌの洗浄バッファー〔組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ  ＣａＣｌ2 、０．０５重量％  ＴｗｅｅｎTM２０〕で３回洗浄した。
【００５９】
ついで、各ウェルに、１ウェルあたり２５μｌのハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で１時間半インキュベートし、各ウェルを、前記洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、二次抗体として、ぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体〔アメリカンクアレックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）社製の商品名：ＨＲＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋Ｍを前記洗浄バッファーで１０００倍希釈したもの〕を、各ウェルに、１ウェルあたり１５０μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、各ウェルを、１ウェルあたり１００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、さらに、１ウェルあたり２００μｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。
【００６０】
各ウェルに、１ウェルあたり２５μｌのＯ−フェニレンジアミン（クエン酸緩衝液中、０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加して、インキュベートすることにより、ＨＲＰの反応により発色を行なった。また、各ウェルに、１Ｍ  硫酸を１ウェルあたり２５μｌ添加することにより、前記反応を停止させた。発色及び該発色の強度を、４００ｎｍの波長での吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００６１】
その結果、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに反応する培養上清として、ハイブリドーマ９−１２の培養上清とハイブリドーマ３Ｇ８の培養上清が得られた。なお、かかるハイブリドーマ９−１２及びハイブリドーマ３Ｇ８は、それぞれ、後述のＣｈ−１抗体を産生するハイブリドーマ及びＣｈ−３抗体を産生するハイブリドーマに対応する。
【００６２】
（２）抗原認識特異性の検討
抗原として、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ及びコンドロイチン硫酸Ｅを用い、前記（１）と同様に、ＥＬＩＳＡを行なった。なお、コンドロイチン硫酸以外の比較対照として、リン酸緩衝化生理食塩水のみの場合、ＢＳＡ添加のみの場合も測定した。培養上清に関する陰性対照として、培養液（ハイブリドーマを培養していないもの）、培養上清の比較対照として、市販のＣＳ５６抗体を用いた。ハイブリドーマ９−１２（後述のＣｈ−１抗体を産生するハイブリドーマ）の培養上清の結果を図１に示し、ハイブリドーマ３Ｇ８（後述のＣｈ−３抗体を産生するハイブリドーマ）の培養上清の結果を図２に示す。
【００６３】
なお、図１中、レーン１は、前記ハイブリドーマ９−１２のサブクローン１の培養上清を用いた結果、レーン２は、ハイブリドーマ９−１２のサブクローン２の培養上清を用いた結果、レーン３は、ハイブリドーマ９−１２のサブクローン３の培養上清を用いた結果、レーン４は、市販のＣＳ５６抗体（生化学工業）を用いた結果、レーン５は、陰性対照として、培養液を用いた結果を示す。各レーンにおけるバー１は、リン酸緩衝化生理的食塩水のみ、バー２は、ＢＳＡ、バー３は、コンドロイチン、バー４は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー５は、コンドロイチン硫酸Ｂ、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｃ、バー７は、コンドロイチン硫酸Ｄ、バー８は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。また、図２中、レーン１は、ハイブリドーマ３Ｇ８  サブクローン１の培養上清を用いた結果、レーン２は、ハイブリドーマ３Ｇ８  サブクローン２の培養上清を用いた結果、レーン３は、市販の抗コンドロイチン硫酸モノクローナル抗体であるＣＳ５６抗体を用いた結果、レーン４は、市販の抗コンドロイチン硫酸モノクローナル抗体であるＭＯ−２２５抗体を用いた結果、レーン５は、市販の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体であるＦ５８−１０Ｅ４抗体を用いた結果、レーン６は、市販の抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体である５−Ｄ−４抗体を用いた結果を示す。各レーンにおけるバー１は、リン酸緩衝化生理的食塩水のみ、バー２は、ＢＳＡ、バー３は、コンドロイチン硫酸ＡとＢＳＡ、バー４は、コンドロイチン硫酸ＢとＢＳＡ、バー５は、コンドロイチン硫酸ＣとＢＳＡ、バー６は、コンドロイチン硫酸ＤとＢＳＡ、バー７は、コンドロイチン硫酸ＥとＢＳＡ、バー８は、コンドロイチン硫酸Ｅ’とＢＳＡ、バー９は、コンドロイチンとＢＳＡ、バー１０は、ヘパラン硫酸とＢＳＡ、バー１１は、ケラタン硫酸とＢＳＡ、バー１２は、ヒアルロン酸とＢＳＡを用いた結果を示す。なお、バー８における「コンドロイチン硫酸Ｅ’」の表記は、前記バー７の実験にて用いられたコンドロイチン硫酸Ｅとは異なるロット番号のものを意味する。
【００６４】
図１のレーン１、２及び３に示されるように、ハイブリドーマ９−１２の異なるサブクローンの培養上清について調べた結果、どのサブクローンも同様の反応性であることを示すことがわかった。図１のレーン１、２及び３に示されるハイブリドーマ９−１２の培養上清は、驚くべく、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対して特異的に強く反応し、特異性が高いことが示された。
【００６５】
また、図２に示されるハイブリドーマ３Ｇ８の培養上清は、驚くべく、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対して特異的に強く反応し、特異性が高いことが示された。
【００６６】
一方、図１のレーン４に示されるように、公知の抗体ＣＳ５６は、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄのそれぞれに対して強く反応したが、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｅに対しても弱く反応した。また、図２のレーン３に示されるように、公知の抗体ＣＳ５６は、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄのそれぞれに対して強く反応したが、コンドロイチン硫酸Ｅ’に対しても弱く反応した。また、図２のレーン４に示されるように、公知の抗体ＭＯ−２２５は、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、並びにコンドロイチン硫酸Ｅ’のそれぞれに対して強く反応した。図３のレーン５に示されるように、公知の抗体Ｆ５８−１０Ｅ４は、ヘパラン硫酸に対して強く反応した。図３のレーン６に示されるように、公知の抗体５−Ｄ−４は、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｅ’及びケラタン硫酸のそれぞれに対して強く反応したが、コンドロイチン硫酸Ａに対しても弱く反応した。
【００６７】
したがって、公知の抗体に比べ、ハイブリドーマ９−１２由来の抗体及びハイブリドーマ３Ｇ８由来の抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂとコンドロイチン硫酸Ｅとに対し、より特異性が高いことが示された。
【００６８】
ついで、ハイブリドーマ９−１２及びハイブリドーマ３Ｇ８について、常法通り、限界希釈法を行ない、それぞれのクローンを得た。以下、９−１２由来のクローンをＣｈ−１といい、３Ｇ８由来のクローンをＣｈ−３という。また、前記Ｃｈ−１に由来するモノクローナル抗体を、Ｃｈ−１抗体といい、前記Ｃｈ−３に由来するモノクローナル抗体を、Ｃｈ−３抗体という。なお、Ｃｈ−１は、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９０として、Ｃｈ−３は、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９１として、２００２年１１月１日（寄託日）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に、寄託されている。
【００６９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体若しくはその一部、又は該モノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチンＥに対し、高い抗原認識特異性を示すという優れた効果を奏する。したがって、本発明のモノクローナル抗体若しくはその一部、又は該モノクローナル抗体と同一のエピトープを特異的に認識する抗体は、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅのアフィニティー精製、該コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出、炎症性疾患、アレルギー性疾患等の診断用プローブ、該コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの局在部位への薬物送達への応用等が期待される。また、本発明のハイブリドーマによれば、前記モノクローナル抗体を安定に、効率よく供給することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のコンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法によれば、高い感度で、高い特異性で、かつ簡便に、コンドロイチン硫酸Ｂ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｅを検出することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各種グリコサミノグリカンに対するハイブリドーマ９−１２（Ｃｈ−１抗体を産生するハイブリドーマ）の培養上清の反応性を調べた結果を示す図である。図中、レーン１は、ハイブリドーマ９−１２のサブクローン１の培養上清を用いた結果、レーン２は、ハイブリドーマ９−１２のサブクローン２の培養上清を用いた結果、レーン３は、ハイブリドーマ９−１２のサブクローン３の培養上清を用いた結果、レーン４は、市販のＣＳ５６抗体を用いた結果、レーン５は、陰性対照として、培養液を用いた結果を示す。各レーンにおけるバー１は、リン酸緩衝化生理的食塩水のみ、バー２は、ＢＳＡ、バー３は、コンドロイチン、バー４は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー５は、コンドロイチン硫酸Ｂ、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｃ、バー７は、コンドロイチン硫酸Ｄ、バー８は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。
【図２】図２は、各種グリコサミノグリカンに対するハイブリドーマ３Ｇ８（Ｃｈ−３抗体を産生するハイブリドーマ）の培養上清の反応性を調べた結果を示す図である。図中、レーン１は、ハイブリドーマ３Ｇ８  サブクローン１の培養上清を用いた結果、レーン２は、ハイブリドーマ３Ｇ８  サブクローン２の培養上清を用いた結果、レーン３は、市販の抗コンドロイチン硫酸モノクローナル抗体であるＣＳ５６抗体を用いた結果、レーン４は、市販の抗コンドロイチン硫酸モノクローナル抗体であるＭＯ−２２５抗体を用いた結果、レーン５は、市販の抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体であるＦ５８−１０Ｅ４抗体を用いた結果、レーン６は、市販の抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体である５−Ｄ−４抗体を用いた結果を示す。各レーンにおけるバー１は、リン酸緩衝化生理的食塩水のみ、バー２は、ＢＳＡ、バー３は、コンドロイチン硫酸ＡとＢＳＡ、バー４は、コンドロイチン硫酸ＢとＢＳＡ、バー５は、コンドロイチン硫酸ＣとＢＳＡ、バー６は、コンドロイチン硫酸ＤとＢＳＡ、バー７は、コンドロイチン硫酸ＥとＢＳＡ、バー８は、コンドロイチン硫酸Ｅ’（バー７のコンドロイチン硫酸Ｅとはロット番号が異なるもの）とＢＳＡ、バー９は、コンドロイチンとＢＳＡ、バー１０は、ヘパラン硫酸とＢＳＡ、バー１１は、ケラタン硫酸とＢＳＡ、バー１２は、ヒアルロン酸とＢＳＡを用いた結果を示す。
【図１】
2006129701.tif 000002
【図２】
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