(57)【要約】【課題】天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質を開発し、該物質を有効成分とするアポトーシス誘発剤等の、該化合物に感受性を示す疾患用の医薬品、該物質を構成成分とする機能性飲食品等を提供すること。【解決手段】式１：2006282675.tif 000024で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分としてなる該化合物に感受性を示す疾患の治療、改善または予防用の医薬組成物、飲食品、化粧料等を提供する。該化合物は、アポトーシス誘発、制がん、活性酸素産生抑制、過酸化脂質ラジカル産生抑制、ＮＯ産生抑制等の活性を示し、抗酸化剤や、鮮度保持剤の有効成分としても有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
【化１】
2006282675.tif 000023
で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有、添加および／または希釈してなる、これらの化合物に感受性を示す疾患の症状改善用食品または飲料、または該疾患の予防用食品または飲料。
【請求項２】
糖化合物が、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される少なくとも１種の化合物を含有する物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物である請求項１記載の食品または飲料。
【請求項３】
式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される少なくとも１種の化合物を含有する物質が、寒天、アガロースおよびカラゲナンからなる群より選択される少なくとも１種の物質である請求項２記載の食品または飲料。
【請求項４】
糖化合物がアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１種の糖化合物である請求項１〜３いずれか１項に記載の食品または飲料。
【請求項５】
疾患が、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、一酸化窒素産生抑制を要する疾患または免疫調節を要する疾患である請求項１〜４のいずれか１項に記載の食品または飲料。
【請求項６】
請求項１に記載の式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする鮮度保持剤。
【請求項７】
糖化合物が、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される少なくとも１種の化合物を含有する物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物である請求項６記載の鮮度保持剤。
【請求項８】
式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される少なくとも１種の化合物を含有する物質が、寒天、アガロースおよびカラギーナンからなる群より選択される少なくとも１種の物質である請求項７記載の鮮度保持剤。
【請求項９】
糖化合物がアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１種の糖化合物である請求項６〜８いずれか１項記載の鮮度保持剤。
【請求項１０】
アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１種の糖化合物を有効成分とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類由来の生理活性物質の利用に関し、さらに詳しくは該生理活性物質を有効成分とする医薬、抗酸化剤、鮮度保持剤、化粧料、該生理活性組成物を含有する機能性食品または飲料、さらには機能性発現用糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis 、アポプトーシスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。
【０００３】
このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死である。すなわち、何らかの外部的または内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化されることにより、プログラム死タンパク質が生合成され、また、ある場合には不活性型として細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。こうして生成した活性型プログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。
【０００４】
このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現せしめることができれば、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。
【０００５】
寒天等の藻類由来のオリゴ糖は食品素材としての開発が期待されているが（非特許文献１；非特許文献２；特許文献１）、アポトーシス誘発作用等の生理機能は不明である。
【特許文献１】特開平６−３８６９１号公報
【非特許文献１】フードケミカル，１９８８−２，４０−４４
【非特許文献２】別冊フードケミカル−４，１９９０年１２月，１２７−１３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、天然物由来のアポトーシス誘発作用等の生理機能を有する安全性の高い物質を開発し、該物質を有効成分とするアポトーシス誘発剤等の、該化合物に感受性を示す疾患用の医薬品、該物質を構成成分とする機能性飲食品等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、式１：
【化１】
2006282675.tif 000002
で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化合物の少なくとも１種を有効成分として含有する、該化合物に感受性を示す疾患の治療または予防用医薬組成物である。
【０００８】
本発明の第２の態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化合物の少なくとも１種を含んでなる、これらの化合物に感受性を示す疾患の症状改善用飲食品または該疾患の予防用飲食品である。
【０００９】
本発明の第３の態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化合物の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤である。
【００１０】
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様の抗酸化剤を含有することを特徴とする飲食品である。
【００１１】
本発明の第５の態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される抗酸化用糖である。
【００１２】
本発明の第６の態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする鮮度保持剤である。
【００１３】
本発明の第７の態様は、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１種の糖化合物を有効成分とする化粧料である。
【００１４】
本発明の第８の態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含んでなる酸性飲食品である。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の医薬組成物、飲食品、抗酸化剤、鮮度保持剤または化粧料の製造における使用である。
【発明の効果】
【００１６】
アポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等の抗酸化剤、免疫調節剤の有効成分として有用な、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物、例えば、当該化合物含有物のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成するアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオース、３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の機能性物質が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、添付の図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明における式１で表される３，６−アンヒドロガラクトピラノース（以下、単に３，６−アンヒドロカラクトピラノースと称する）のアルデヒド体は、式２：
【化２】
2006282675.tif 000003
で表される化合物である。その抱水体は、式３：
【化３】
2006282675.tif 000004
で表される化合物である。また、３，６−アンヒドロガラクトピラノースの２−Ｏ−メチル化体は、式４：
【化４】
2006282675.tif 000005
で表される化合物である。さらに、該メチル化体のアルデヒド体は、式５：
【化５】
2006282675.tif 000006
で表される化合物である。その抱水体は、式６：
【化６】
2006282675.tif 000007
で表される化合物である。
【００１９】
本明細書における式１〜６の構造は、他の表現形で表わすことも可能であるが、それらも含め、また、可能なそれらの互変異性体も含めて、式
１〜６で表すものとする。また、式１〜６における立体配置は、所望の活性が得られる限り、特に限定するものではなく、Ｄ−型、Ｌ−型またはそれらの混合物であってよい。
【００２０】
本発明の可溶性糖化合物は、特に限定するものではないが、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体、その抱水体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物（以下、これらを「式１〜６の化合物」として総称する）の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物で、式１〜６の化合物の少なくとも１種を含有する物質（以下、単に原料物質という）を、pＨ７未満の酸性下で、酸分解および／または酵素分解して得ることができ、また、化学合成法によっても得ることができる。本発明の可溶性の糖化合物は、用時、固化または半固化（ゲル化）することが無い化合物であれば特に限定するものではない。したがって、用時においてゾル化する式１〜６の化合物より選択される少なくとも１種の化合物を含有する糖化合物は、本発明の可溶性の糖化合物に包含される。なお、本発明において好適に使用される該可溶性の糖化合物には、例えば、その非還元末端がＬ−ガラクトース−６−硫酸以外の糖である糖化合物であり、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物が包含される。
【００２１】
該可溶性糖化合物を得るのに用いる原料物質は、特に限定するものではなく、例えば、アガロース、アガロペクチン、フノラン、ポルフィラン、カラゲナン、フルセララン、ヒプネアン等の紅藻の粘質多糖［共立出版（株）発行、多糖生化学１−化学編−、第３１４頁（１９６９）］が例示される。
【００２２】
また、これらの多糖の含有物も、原料物質に包含される。例えば、アガロース、アガロペクチンの原料としてはテングサ科のマクサ、オニグサ、オオブサ、ヒラクサ、オバクサ、ユイキリ等、オゴノリ科のオゴノリ、オオオゴノリ等、イギス科のイギス、エゴノリ等、その他の紅藻類が用いられ、通常、数種類の藻類を配合して原料とする。原料藻類は、通常、天日に干して乾燥させたものを用いるが、本発明においては生の藻類および乾燥した藻類が使用できる。また、乾燥時に散水しながら漂白した、いわゆるさらし原藻も使用できる。
【００２３】
原料藻類を熱水抽出の後、冷却することによって「ところてん」が得られる。この「ところてん」から凍結脱水または圧搾脱水によって水分を除き、乾燥させることによって寒天が得られる。寒天はその起源となる藻類を問わず、また、棒状、帯状、板状、糸状、粉末状等の種々の形態のものを使用できる。通常、寒天は約７０％のアガロースと約３０％のアガロペクチンを含んでいるが、精製を進めてさらに高純度のアガロースを調製することが可能である。精製アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。
【００２４】
原料物質には、上記の寒天の原料藻類、ところてん、寒天、精製アガロース、精製アガロペクチン、これらの製造工程で得られる中間産物あるいは副産物が包含される。
【００２５】
アガロースは、交互に結合したＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを主構造とする多糖であり、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で結合している。α−１，３結合は希酸による温和な加水分解や、α−アガラーゼ［カーボハイドレート・リサーチ（Carbohydr. Res.）、第６６巻、第２０７頁（１９７８）］によって加水分解され、また、β−１，４結合はβ−アガラーゼによって選択的に加水分解される。
【００２６】
また、カラゲナンはスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科等の紅藻類に含まれる多糖であり、κ−カラゲナン、λ−カラゲナン、η−カラゲナンが知られている。
【００２７】
κ−カラゲナンは、Ｄ−ガラクトース−４−硫酸の１位と３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−４−硫酸の３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。λ−カラゲナンはＤ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−２，６−二硫酸の４位がβ−グリコシド結合で、また、Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸の１位とＤ−ガラクトースの３位がα−グリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。カラゲナンは食品のゲル化剤として利用されている。
【００２８】
上記の原料物質を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解したものも、本発明における原料物質に包含される。
【００２９】
化学的分解方法の例としては、酸性から中性での加水分解、物理的分解方法の例としては、電磁波や超音波の照射、酵素的分解方法の例としては、加水分解酵素、例えば、アガラーゼ、カラギナーゼ等による加水分解が挙げられる。
【００３０】
原料物質の酸性から中性での分解条件は、アポトーシス誘発性、制がん性、活性酸素産生抑制活性、一酸化窒素（以下、ＮＯと称する）産生抑制作用等の抗酸化活性または免疫調節活性等を有する式１〜６の化合物、これらの化合物の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオース（以下、単にカラビオースと称す）およびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物、また、その非還元末端がＬ−ガラクトース−６−硫酸以外の糖である、式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物が生成する条件であれば、特に限定はない。
【００３１】
例えば、原料物質を酸に溶解または懸濁し、反応させることにより、本発明で使用する式１〜６の化合物より選択される化合物、これらの化合物の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物が生成する。また、反応時に加熱することにより、式１〜６の化合物より選択される化合物およびこれらの化合物の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物の生成に必要な反応時間は短縮される。
【００３２】
原料物質、例えば、アガロースやアガロースを含有する物質を、溶解または懸濁する酸の種類に特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
【００３３】
酸の濃度も特に限定はないが、０．０００１〜５規定、好ましくは０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また、反応時間も特に限定するものではないが、数秒〜数日に設定すればよい。酸の種類と濃度、反応温度および反応時間は原料となる式１〜６の化合物より選択される少なくとも１種の化合物を含有する物質、例えば、アガロース、カラゲーナン等の種類および目的とする式１〜６の化合物より選択される化合物、それらの化合物を含有する糖化合物の生成量、目的とする式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物の重合度により適宜選択すればよい。一般に、弱酸よりも強酸、低濃度の酸よりも高濃度の酸、低温よりも高温を選択することにより酸分解反応は速やかに進行する。
【００３４】
また、固体酸を使用する場合は、一般に強陽イオン交換樹脂が、弱陽イオン交換樹脂より、分解反応の効率が良い。また、原料物質当たりの使用量が多い程、また作用温度が高いほど、酸分解反応が速やかに進行する。
【００３５】
例えば、寒天を０．１Ｎ塩酸に１０重量％に懸濁し、１００℃で１３分間加熱溶解し、不溶物を除去して得られる本発明に使用される糖化合物溶液は、冷却しても、その氷結点において、もはやゲル化しなくなる。この液に含まれる糖類をゲルろ過ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ等の方法で分析すると高分子の糖類はほとんど見られず、大部分が可溶性の１０糖以下の糖化合物に分解されている。同様に、固定酸の場合、市販の強陽イオン交換樹脂のＮａ型の１重量部を１Ｎ塩酸でＨ型とした後、７９重量部の脱塩水中に入れ、さらに寒天を１０重量部入れ懸濁し、９５℃で１８０分間加熱し得られる本発明の糖化合物溶液は、冷却しても、その氷結点において、もはやゲル化しなくなる。この液に含まれる糖類をゲルろ過ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ等の方法で分析すると高分子の糖類はほとんど見られず、大部分が可溶性の１０糖以下の糖化合物に分解されている。
【００３６】
また、本発明に使用する式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物の製造に際しては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は７０〜９５℃、加熱時間は数１０分〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、生理活性を有するオリゴ糖、例えば、抗酸化用オリゴ糖が多量に生成する。また、加水分解後において、酸性を維持し、アルカリ条件下としないことにより、生成した該生理活性オリゴ糖は長期間の保存安定性を示す。
【００３７】
本発明において使用する式１〜６の化合物より選択される化合物、これらの化合物の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物としては、原料物質の分解物をそのまま、もしくは中和して使用しても良いが、さらに精製して用いても良い。式１〜６の化合物より選択される化合物、該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等のオリゴ糖は、例えば、アポトーシス誘発活性または制がん活性を指標として精製することができる。精製手段としては化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等の従来公知の精製方法を組合せ、酸分解物中に生成した目的のアポトーシス誘発性物質である式１〜６の化合物より選択される化合物、該化合物の少なくとも１種を含有する可溶性の糖化合物を精製することができる。
【００３８】
こうして得られた化合物の構造は質量分析法、核磁気共鳴法、紫外吸収スペクトルの測定、赤外吸収スペクトルの測定等の公知の方法で解析できる。
【００３９】
本発明の有効成分の１例であるアガロビオースは、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβ−グリコシド結合で結合した２糖である。３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位はアノマー炭素であるのでα型とβ型が存在するが、どちらも本発明で使用するアガロビオースに包含される。
【００４０】
また、本発明で有効成分として使用する式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物とは、該式１〜６の化合物より選択される化合物の１位以外の水酸基に糖が結合したもので、アポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、ＮＯ産生抑制活性等の抗酸化活性および／または免疫調節活性を持つものであれば特に限定はない。例えば、原料物質の分解物、例えば、アガロースの酸分解物やα−アガラーゼ分解物であるアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、アガロデカオース、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等が挙げられる。また、カラゲナンの酸分解物やカラギナーゼ分解物、例えば、カラビオースが挙げられる。さらに、グルコース、マンノース、ガラクトース等のヘキソース、キシロース、アラビノース、リボース等のペントース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸等のウロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖、Ｎ−アセチルノイラミン酸等のシアル酸、フコース等のデオキシ糖、これらのエステル、アミドおよびラクトンより選択される糖が１個または複数個、式１〜６の化合物より選択される化合物の１位以外の水酸基に結合したものも本発明の、式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物に含まれる。さらに、これらの式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物にピルビン酸および／または硫酸基を結合したもの、また該糖化合物の水酸基がメチル化されたものも、本発明の式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物に包含される。なお、上記のごとく、本発明において式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に有する糖化合物とは、好適にはその非還元末端がＬ−ガラクトース−６−硫酸以外の糖である。
【００４１】
３，６−アンヒドロガラクトピラノースまたはその２−Ｏ−メチル化体を還元末端に有する糖化合物の還元末端の化合物の１位はアノマー炭素であるので、該化合物を還元末端に有する糖化合物にはα型とβ型が存在するが、どちらも３，６−アンヒドロガラクトピラノースまたはその２−Ｏ−メチル化体を還元末端に有する糖化合物として本発明で使用できる。
【００４２】
また、アポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、ＮＯ産生抑制活性等の抗酸化活性および／または免疫調節活性等の生理活性を持っていれば、分子量には特に限定はない。
【００４３】
本発明で使用する式１〜６の化合物より選択される化合物、該化合物を還元末端に有する糖化合物の還元末端の化合物としては、当然、α型、β型、アルデヒド型、抱水型の混合物およびＤ−型、Ｌ−型の混合物等も使用できる。
【００４４】
かくして、本発明で使用する式１〜６の化合物より選択される化合物、該化合物を還元末端に有する糖化合物はアポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、ＮＯ産生抑制活性等の抗酸化活性、免疫調節活性、抗アレルギー活性を有し、本発明によれば、まず、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とし含有する、これらの化合物の少なくとも１種に感受性を示す疾患の治療用または予防用の医薬組成物、例えば、それら疾患の治療剤または予防剤が提供される。
【００４５】
これらの化合物に感受性を示す疾患としては、例えば、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、過酸化脂質ラジカル産生抑制を要する疾患、ＮＯ産生抑制を要する疾患、または免疫調節を要する疾患、例えば、アレルギー性疾患等が包含され、本発明の治療用または予防用医薬組成物は、アポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、一酸化窒素産生抑制剤等の抗酸化剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗アレルギー剤等とすることができる。
【００４６】
例えば、本発明のアポトーシス誘発剤は、自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、がん細胞、ウイルス感染細胞等を排除するのに有効であり、アポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることにより、不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することができる。本発明のアポトーシス誘発剤が有効な疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病等の自己免疫疾患、リウマチ等が挙げられる。
【００４７】
本発明のアポトーシス誘発剤は、アポトーシス誘発方法に使用することができ、該方法はアポトーシス誘発機構の解明、アポトーシス誘発剤、アポトーシス誘発阻害剤のスクリーニング等に有用である。
【００４８】
なお、本発明のアポトーシス誘発剤によるアポトーシス誘発作用は、Caspaseの阻害剤、例えば、ＩＬ−１βコンバーティング・エンザイム・インヒビターＶ［Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン：宝酒造社製］により阻害されるので、Caspaseに依存するアポトーシスによる細胞死と考えられる。
【００４９】
このCaspaseは、種々の細胞死の際に先行して上昇すること、その過剰発現により、細胞死が誘導されること、ペプチド阻害剤や阻害タンパク質であるＣｒｍＡ、ｐ３５によりアポトーシスが抑制されること、Caspase−１、Caspase−３のノックアウトマウスでは正常に見られるアポトーシスの一部が抑制されることから、アポトーシスの重要なメディエーターとして機能していることが明らかにされている［生化学、第７０巻、第１４〜２１頁（１９９８）］。すなわち、アポトーシスの過程ではシステインプロテアーゼであるCaspaseが活性化され、核や細胞質のタンパク質を分解する。Caspaseは、まず前駆体として合成され、スプライシングにより活性化型となる。このCaspaseの活性化に至る制御が細胞の生死を決める。哺乳類では１０種類以上のCaspaseが存在し、上位のCaspaseが下位のCaspaseをスプライシングすることで細胞内タンパク質分解活性は雪崩式に増幅される［細胞工学、第１７巻、第８７５〜８８０頁（１９９８）］。反対に、システインプロテアーゼであるCaspaseの阻害剤でそのスプライシング活性を阻害すれば、Caspase依存型のアポトーシスによる細胞死を止めることができる。
【００５０】
また、本発明に使用する化合物は酸化物質、例えば、活性酸素の産生抑制に有用であり、該化合物を有効成分とする活性酸素産生抑制剤等の抗酸化剤は活性酸素の産生および／または過剰が起因となる疾病の治療または予防に有用である。
【００５１】
活性酸素は、大きくラジカルと非ラジカルの活性酸素に分類することができる。ラジカル系活性酸素には、ヒドロキシラジカル、ヒドロキシペルオキシラジカル、ペルオキシラジカル、アルコキシラジカル、二酸化窒素（ＮＯ２）、ＮＯ、チイルラジカル、スーパーオキシドがある。一方、非ラジカル系活性酸素には、一重項酸素、過酸化水素、脂質ヒドロペルオキシド、次亜塩素酸、オゾン、ペルオキシ亜硝酸がある。いずれも多くの病態、すなわち、各種の炎症性疾患、糖尿病、がん、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害などと関わりがある。
【００５２】
生体内では絶えずいくつかの経路で低濃度の活性酸素が生成している。これは生理的にミトコンドリアなどの電子伝達系から漏出するスーパーオキシドや、過酸化水素、銅や鉄などの遷移金属が触媒することによるヒドロキシラジカル、好中球や単球などによって生成される感染防御のための次亜塩素酸、アルギニンの分解により生成するＮＯなど、いずれも避けることのできないものである。これらの活性酸素生成に対して、生体は活性酸素消去系としての酵素、低分子化合物をもち、生成と消去のバランスを保っている。しかし、これらの経路がなんらかの原因で活性化されたり、逆に消去系が不活性化されて、活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることになる。このような状態を酸化ストレスという。さらに、生体内のバランスがずれた場合だけでなく、大気や食品などの生体外のものからも、生体は常に酸化ストレスにさらされており、日常生活を送る上で酸化ストレスは避けることができない。
【００５３】
すなわち、酸化ストレスは上記したように、様々な疾患と関わりがあり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況に曝されている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止にも、本発明の抗酸化剤、例えば、活性酸素産生抑制剤は有用である。
【００５４】
また、酸化ストレスに必ずつきまとうのが脂質過酸化反応であり、この反応は過酸化脂質ラジカルができると一挙に進む反応である。そこで生成される４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）はグルタチオンやタンパク質を特異的な標的とする毒性アルデヒドである。そのＨＮＥとタンパク質との反応生成物が、様々な病態組織において検出されており、酸化ストレスの関わる疾患病態の誘発因子ではないかと考えられている。そのため、過酸化脂質ラジカルの生成を抑えることのできる本発明に使用される抗酸化物質を含有する抗酸化剤は、酸化ストレスによる生活習慣病疾患の予防および治療に有用である。
【００５５】
ＮＯは、内皮細胞由来血管平滑筋弛緩因子（ＥＤＲＦ）の本体である［ネーチャー（Nature）、第３２７巻、第５２４〜５２６頁（１９８７）］。本発明により、ＮＯ産生の抑制を必要とする疾病治療剤または予防剤が提供される。
【００５６】
本発明において、ＮＯ産生の抑制を必要とする疾病とは、特に限定するものではないが、例えば、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、自己免疫疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、がん等があり、特表平９−５０４５２４号、特表平９−５０５２８８号、特表平８−５０１０６９号、特表平８−５１２３１８号、特表平６−５０８８４９号の各公報に記載の疾病を含むものである。
【００５７】
Ｌ―アルギニンと酸素からＬ―シトルリンとＮＯを生産するＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）には、常に発現しているｃＮＯＳと誘導型のｉＮＯＳがある。マクロファージ等において、ｉＮＯＳは、細胞毒素やサイトカイン（ＬＰＳ、ＩＮＦ−γ等）の刺激により誘導され、ＮＯを生産する。ｉＮＯＳ自体は生体系の維持においてなくてはならない存在である。しかし、一方で、種々の要因により必要以上に過剰発現し過剰なＮＯを産生することにより、種々の疾病を引き起こすことも明らかになっている。
【００５８】
本発明者らは、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースがこのｉＮＯＳの発現を抑制することを、ウエスタンブロティングによりタンパク質レベルで、ＲＴ−ＰＣＲによりメッセンジャーＲＮＡレベルで確認した。つまり、本発明で使用する化合物は、種々の要因により過剰に発現し過剰なＮＯを生産するｉＮＯＳの発現を抑制することにより、ＮＯ産生抑制を必要とする疾病の治療および予防に有効である。
【００５９】
本発明の化合物は、マクロファージのＮＯ産生を抑制し、マクロファージのＮＯ産生に起因する疾病、炎症、がん等の治療、予防に有用である。また、本発明に使用する糖化合物のＮＯ産生抑制はＮＯ産生誘起物質であるＬＰＳや、ＩＮＦ−γに対する拮抗阻害ではない。本発明に使用する糖化合物を予め加えておくことによって、ＮＯ産生抑制効果の増強が見られ、本発明の化合物は抗酸化物質の産生抑制の予防剤として極めて有用である。
【００６０】
本発明のＮＯ産生抑制剤は、ＮＯ産生機構研究、ＮＯ作用機作研究に有用であり、また、ＮＯ産生機構に関与する物質のスクリーニングに使用することもできる。
【００６１】
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、血管内皮増殖因子／血管透過性亢進因子（ＶＥＧＦ）はこの過程に重要な役割を演じている。様々ながん細胞においてＶＥＧＦがＮＯによって誘導される。本発明のＮＯ産生抑制剤はＮＯ産生を抑制することによってがん細胞のＶＥＧＦ産生も抑制し、その結果、がん組織周辺での血管新生が阻害される。がん細胞を皮下に移植して固形腫瘍を形成させたマウスに本発明のＮＯ産生抑制剤を投与するとがん組織の周辺の血管の形成が不十分となり、がんは脱落する。
【００６２】
ニトロソアミンは２級アミンにニトロソ基が付加した一群の化合物で数百種類が知られており、その多くがＤＮＡに損傷を加えることにより動物に対して発がん性を示す。ニトロソアミンはヒトの発がんにも深く関わっているとされており、通常、胃の中で亜硝酸塩とアミンが反応することによって生成する。ＮＯはpＨ中性の生理的条件下でもアミンと反応してニトロソアミンを生成する。また、疫学的にがんとの関係が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患者においてＮＯ産生は亢進している。したがって、本発明のＮＯ産生抑制剤を投与してＮＯ産生の亢進を防ぐことによって特にハイリスクグループの発がんを予防することができる。以上のように、本発明のＮＯ産生抑制剤は発がんの抑制とがん組織における血管新生阻害という２段階で制がん作用を示す。
【００６３】
ＮＯはまた、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち、血管透過性亢進作用を誘発し［マエダ（Madea)ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・カンサー・リサーチ（Japanese Journal of Cancer Research)、第８５巻、第３３１〜３３４頁（１９９４）］、また、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させる[サルベミニ（Salvemini）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proceedngs of National Academy of Sciences, USA）、第９０巻、第７２４０〜７２４４頁（１９９３）]。一方、ＮＯはスーパーオキシドラジカルと速やかに反応してペルオキシ亜硝酸イオンを生じ、ペルオキシ亜硝酸イオンが炎症性の細胞、組織障害を引き起こすとも考えられている。
【００６４】
活性化された免疫細胞が臓器に入り込み、サイトカインを放出するとＮＯの産生が誘導される。インスリン依存型糖尿病は膵島β細胞が特異的に破壊されることによって引き起こされる疾患であり、ＮＯによる破壊であるとされている。また、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎の患者の病変部の関節液には同患者の正常な関節や健常人の関節の関節液に比べて高濃度のＮＯが含まれている。これらの患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与すると病変部におけるＮＯ産生を抑制し、症状が改善する。
【００６５】
脳虚血中および再潅流後にはＮＯ産生が増大し、それに伴って脳組織が損傷を受ける。脳虚血時に患者に本発明のＮＯ産生抑制剤を投与することにより脳組織の損傷が軽減され、予後が改善される。
【００６６】
本発明の免疫調節剤は、リンパ球幼若化反応抑制作用、混合リンパ球反応抑制等の免疫調節作用を有し、本発明の免疫調節剤はこれらの免疫系、免疫因子の異常が起因となる疾病の治療剤または予防剤として有用である。
【００６７】
ここに、リンパ球幼若化反応とは、マイトジェンがリンパ球表面の受容体に結合し、リンパ球を活性化させ、その分裂、増殖を促す反応である。混合リンパ球反応とは、同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養することにより、主要組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、リンパ球の分裂、増殖が促進される反応である。本発明の免疫調節剤はこれらの反応を抑制し、リンパ球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、例えば慢性腎炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ等の慢性の疾患の治療または予防に特に有用であり、また移植片拒絶反応の抑制においても有用である。
【００６８】
ＩｇＥ抗体で感作されたマスト細胞は抗原の結合により脱顆粒が誘導されケミカルメディエターが放出される。このＩ型、すなわち、即時型アレルギー反応は喘息やアトピー性皮膚炎に代表されるアレルギー疾患において大きな役割を果たし、マスト細胞からのケミカルメディエターの放出を抑制する物質はこれらのアレルギー疾患の治療および予防に極めて有効であると考えられる。
【００６９】
Ｉ型アレルギー反応のモデルであるラット受動皮膚アナフィラキシー反応（ＰＣＡ）はマスト細胞の脱顆粒に始まり、つぎに顆粒中に含まれるヒスタミン、セロトニン等のケミカルメディエターが放出されて血管透過性の亢進を惹起し、最後には、皮膚局所に色素漏出を生じさせる反応である。本モデルは、現在イン・ビボの抗アレルギー剤の評価モデルとして最も繁用されている。
【００７０】
式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物は、ＰＣＡ抑制作用を有し、本発明によれば、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とする抗アレルギー剤も提供される。
【００７１】
この抗アレルギー剤はＩ型アレルギー反応抑制によって治療しうる疾患、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、蕁麻疹、接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等の治療、予防において極めて有用である。
【００７２】
上記した本発明の治療用または予防用医薬組成物、例えば、アポトーシス誘発剤は、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化することにより製造できる。
【００７３】
一般的には、これらの化合物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
【００７４】
本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
【００７５】
医薬用担体は、上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また、経口剤の調製に当っては、さらに結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
【００７６】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い、本発明の有効成分であるアポトーシス誘発性を有する糖化合物を、希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
【００７７】
本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００７８】
本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００７９】
本発明の制がん剤は、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ、製剤化すれば製造することができる。制がん剤の製造は上記アポトーシス誘発剤の製造方法に準じ行うことができる。
【００８０】
制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００８１】
制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には、製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００８２】
また、本発明の抗酸化剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤、免疫調節剤、抗アレルギー剤は上記アポトーシス誘発剤に準じ製造することができ、用量、用法は上記アポトーシス誘発剤に準じて、使用すれば良い。
【００８３】
すなわち、抗酸化剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤、免疫調節剤または抗アレルギー剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
【００８４】
抗酸化剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤、免疫調節剤または抗アレルギー剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００８５】
つぎに、本発明の飲食品は、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物より生成する、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有、添加および／または希釈してなる食品または飲料であり、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用、抗酸化作用、免疫調節作用等により、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物の少なくとも１種に感受性を示す疾患、例えば、アポトーシス誘発を要する疾患、がん性疾患、活性酸素産生抑制を要する疾患、ＮＯ産生抑制を要する疾患、免疫調節を要する疾患、アレルギー性疾患等の症状改善、予防に極めて有用である。
【００８６】
本発明の食品または飲料の製造方法は、特に限定はないが、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造方法を採用でき、製造された食品または飲料に、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成する、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等から選ばれる少なくとも１種の化合物が有効成分として含有されていれば良い。
【００８７】
本発明の飲食品は、特に限定するものではないが、例えば、穀物加工品（例、小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（例、可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（例、豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（例、ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（例、冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（例、原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（例、ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（例、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（例、日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（例、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（例、しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（例、牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（例、レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（例、即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（例、すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（例、スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
【００８８】
本発明の飲食品には、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成する、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物から選択される少なくとも１種以上の化合物が含有、添加および／または希釈されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば、特に、その形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
【００８９】
３，６−アンヒドロガラクトピラノースまたはその２−Ｏ−メチル化体および該化合物を還元末端にもつ糖化合物は、ヘミアセタール環が開環しやすく、末端にアルデヒドができやすい。このアルデヒドおよび３，６−アンヒドロガラクトピラノースのアルデヒド体のアルデヒドは、アルデヒドに反応性を有する化合物、例えば、アミノ酸等のごとき求核性物質と反応しやすく、反応した式１〜６の化合物または糖化合物、例えば、オリゴ糖は、還元末端の式１〜６の化合物より選択される化合物を無くした状態になる。そのため、式１〜６の化合物より選択される化合物およびそれらの化合物を還元末端にもつオリゴ糖が有する様々な生理活性が失なわれてしまう。すなわち、飲料あるいは食品中で式１〜６の化合物より選択される化合物およびそれらの化合物を還元末端に有する糖化合物からなる群より選択される化合物を安定よく保持するには、これらのアルデヒドのモル濃度より、これらのアルデヒドに対して反応性を示す化合物のモル濃度を、低い状態に保つ必要がある。
【００９０】
そこで、本発明の食品または飲料の製造においては、従来制御されていなかった、これらのアルデヒドに反応性を示す化合物量の制御を行うことにより、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端にもつオリゴ糖からなる群より選択される化合物を実質的に減少させることなく、これらの化合物の高含有食品または飲料を提供することが可能となる。
【００９１】
また、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端にもつ糖化合物の還元末端における当該式１〜６の化合物より選択される化合物は酸性下において安定であることが見出され、本発明の食品または飲料の製造方法においてその全行程を酸性下で行い、得られる食品または飲料を酸性食品または酸性飲料とすることにより、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端にもつ可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を高含有する酸性食品または酸性飲料の提供が可能となる。
【００９２】
本発明の酸性食品または酸性飲料の製造において、原料物質を酸分解する酸の種類に特に限定はなく、有機、無機いずれの酸も使用できるが、得られる寒天酸分解物の風味は有機酸分解物の方が好ましく、好適には有機酸を使用することにより、新規な風味の酸性分解物を得ることができる。有機酸としては、目的に応じ選択すれば良く、単独でも、２種以上を併用しても良い。有機酸としては、例えば、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、コハク酸、フマール酸等が好適である。分解条件としては特に限定されるものではないが、有機酸として、例えば、クエン酸を使用する場合、原料物質、例えば、寒天の酸分解を６０〜１３０℃、好適には９０〜１０５℃で、３〜３００分、好適には３０〜２００分行うことにより、有機酸の酸味が変化し、味のバランスの良い、舌ざわりがまろやか、なめらかな酸味の組成物となる。有機酸量として０．０５〜３０重量％、好適には０．２〜１０重量％、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の含有物量として１〜２０重量％、好適には５〜１５重量％含有量となる加熱処理物が好ましい酸味の酸味料となる。得られる酸味料は清涼飲料、酸性調味料、酸性食品等の製造に極めて有用である。
【００９３】
本発明の酸性食品または酸性飲料は、生理活性を有する式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成する、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物を多量に含有し、これらが有するアポトーシス誘発作用、制がん作用等の生理機能によって、これらを摂取することにより発がん予防、がん抑制効果等の効果を有する食品または飲料である。すなわち、本発明の酸性食品または酸性飲料は、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に感受性を示す疾患の症状改善作用または予防作用を示す健康食品または飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な食品または飲料である。
【００９４】
また、本発明の、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成する、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物は、活性酸素産生抑制作用、過酸化脂質ラジカル産生抑制作用等の抗酸化活性を有し、抗酸化用食品用の抗酸化剤または抗酸化用飲料用の抗酸化剤、例えば活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等として抗酸化用食品または抗酸化用飲料の製造に使用することができる。
【００９５】
すなわち、本発明により、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する抗酸化剤、特に飲食品用の抗酸化剤が提供される。
【００９６】
本発明の抗酸化剤の剤型は特に限定されるものではなく、添加対象となる飲食品の種類によって常法に従って、粉末状、ペースト状、乳化物等の適宜な剤型にすることができ、本発明に使用する化合物および糖化合物から選択される化合物を有効成分として含有する抗酸化用飲食品は、本発明の抗酸化剤を使用することにより簡便に製造することができる。
【００９７】
本発明によれば、また、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される抗酸化用糖が提供される。例えば、該抗酸化用糖は、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物として得ることができる。また、その精製物、部分精製物等を使用することができる。原料物質としては、例えば、紅藻類由来の原料物質、例えば、寒天、アガロース、カラゲナン等が単独で、または２種以上を併用して使用できる。特に限定するものではないが、代表的な抗酸化用糖として、式１〜６の化合物より選択される化合物を含有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の抗酸化用糖が例示される。
【００９８】
本発明の抗酸化用糖は生体内の酸化物質、例えば、活性酸素の除去や産生抑制に有用であり、該抗酸化用糖は活性酸素の産生や過剰が起因となる疾病の症状改善または予防に有用である。
【００９９】
上記したように、生体内において活性酸素生成系が消去系に対して優位に立った場合、生体は酸化的障害を受けることにより生じる酸化ストレスは様々な疾患と関わり、生体は、常に酸化ストレスによる疾患、あるいは、疾病の悪化につながる状況にさらされている。したがって、このような酸化ストレスが引き起こす疾病の予防、治療あるいは悪化防止には、毎日、適度の抗酸化物質を摂取することが望ましい。毎日適度の量を摂取するには、飲食品から摂取するのが望ましく、本発明の抗酸化用糖を含有、希釈および／または添加してなる飲食品は抗酸化用食品または抗酸化用飲料として、また抗酸化ストレス食品または抗酸化ストレス飲料として極めて有用である。
【０１００】
本発明に使用する化合物および糖化合物より選択される化合物は保水性も合せ持ち、これらの少なくとも１種の化合物を有効成分とし抗便秘剤、抗便秘用食品、抗便秘用飲料を製造することができる。
【０１０１】
本発明によれば、さらに、式１〜６の化合物より選択される化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等のオリゴ糖を有効成分とする化粧料が提供される。該糖化合物は、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物として得ることができる。また、その精製物、部分精製物を使用することもできる。原料物質としては、例えば、紅藻類由来の原料物質、例えば、寒天、アガロース、カラゲナン等を単独で、または２種以上を併用して使用できる。
【０１０２】
化粧料としては、上記化合物を有効成分とし、クリーム、乳液、ローション、洗顔料、パック等の基礎化粧料、口紅、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、ボディソープ、石鹸等の形態に調製することができる。また、頭髪に対しても有効であり、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアーセットローション、ヘアーブロー剤、ヘアークリーム、ヘアーコート等のヘアー製品やシャンプー、リンス、ヘアートリートメント等の頭髪用トイレタリー等のヘアーケア製品の形態にすることができる。化粧料への配合量はその美白作用、保湿作用、抗酸化作用等により、適宜決定すればよい。化粧料の他の成分は通常化粧料に配合されるものが使用できる。なお、美白作用、保湿作用は常法にて測定すれば良く、例えば、特開平８−３１０９３７号公報記載の方法で測定することができる。
【０１０３】
本発明の化粧料は皮膚への美白作用、保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用、毛髪への保湿作用、抗酸化作用、活性酸素産生抑制作用、抗酸化ストレス作用等により優れた性質を示す。
【０１０４】
さらに、本発明によれば、式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等のオリゴ糖を有効成分とする鮮度保持剤が提供される。該化合物としては、例えば、原料物質のpＨ７未満の酸性下での酸分解物および／または酵素分解物として得ることができる。また、その精製物、部分精製物を使用することもできる。原料物質としては、例えば、紅藻類由来の式１〜６の化合物より選択される化合物を含有する物質、例えば、寒天、アガロース、カラゲナン等を単独で、または２種以上を併用して使用できる。
【０１０５】
式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を還元末端に含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、κ−カラビオースおよびβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の糖化合物は抗酸化作用、鮮度保持作用、チロシナーゼ活性阻害作用を有し、これらを有効成分として、公知の製剤化方法により、食品の変色、腐敗、酸化等を効果的に防止する食品の鮮度保持剤を製造することができる。本発明の鮮度保持剤は種々の食品、生鮮食品、加工食品等の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０１０６】
本発明に使用する式１〜６の化合物より選択される化合物および該化合物を含有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される化合物は、いずれも、１ｇ／ｋｇの投与量でマウスに経口または腹腔内投与しても急性毒性は認められない。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１０８】
実施例１
（１）市販の寒天粉末（和光純薬社製）４００ｍｇを１Ｎの塩酸２０ｍｌに懸濁し、電子レンジで加熱溶解した。溶解液を冷却し、水酸化ナトリウムでpＨを４とし、３８４ｍｇのクエン酸を添加し、水酸化ナトリウムでpＨを３に調整した。この水溶液に水を加えて４０ｍｌとし、１２０℃で４時間処理した。この酸分解液を水酸化ナトリウムによりpＨ６．５とし、０．２μｍ（コーニング社製）のフィルターでろ過した。
【０１０９】
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を同培地で２５００個／９０μｌとなるように懸濁した。この懸濁液を９６穴プレート（ファルコン社製）に９０μｌずつ分注し、それぞれの懸濁液に対して、上記の酸分解液、上記の酸分解液の１０倍希釈物、および水をそれぞれ１０μｌずつ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養し、培養開始後２４時間および４８時間に光学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、「アポトーシス実験プロトコール」［秀潤社、田沼靖一監修、第１５６頁（１９９４）］に従ったＭＴＴ法により、５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液10μl を加えてさらに４時間培養を続け、０．０４Ｎ塩酸含有２−プロパノール１００μｌを加えてよく撹拌し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定し、測定した吸光度から計算される生細胞数を比較した。
【０１１０】
この結果、上記酸分解液およびその１０倍希釈液を添加した培地においては、水を添加したものに比べ著しく生細胞数が減少した。また、死細胞においてアポトーシス小体が観察された。
【０１１１】
（２）寒天粉末４００ｍｇを１Ｎの塩酸２０ｍｌに懸濁し、電子レンジで加熱溶解し、酸分解液を調製した。溶解液を冷却後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液pＨ３を２０ｍｌ添加し、水酸化ナトリウムでpＨを６．５とし、０．２μｍ（コーニング社製）のフィルターでろ過し、酸分解液を得た。
【０１１２】
この酸分解液およびこの酸分解液を１０倍に希釈したものを上記実施例１−（１）と同じ方法によりＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。その結果この酸分解液も実施例１−（１）記載の酸分解液とほぼ同等のがん細胞増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を示した。
【０１１３】
（３）寒天粉末４００ｍｇを１Ｎの塩酸４０ｍｌに懸濁し、沸騰湯浴上で溶解し、溶解液を得た。この溶解液を八等分し、沸騰湯浴上でそれぞれ０、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０分間保持した後,、冷却し、２Ｎの水酸化ナトリウムでpＨを６．５に調整した。
【０１１４】
それぞれの処理液を実施例１−（１）と同じ方法によりＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。その結果、０分および３０分処理液に関しては実施例１−（１）記載の酸分解液と同等の活性を示したが、６０分以上の処理液は両活性を示さなかった。
【０１１５】
（４）３０ｍｌの１、０．５、０．２５、０．１３、０．０６３、０．０３１、０．０１６、０．００７８Ｎの塩酸にそれぞれ３００ｍｇの寒天粉末を懸濁し、沸騰湯浴上で１０分間保持し、溶解液を調製した。この溶解液を冷却後、２Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを６．５に調整した。
【０１１６】
それぞれの処理液を実施例１−（１）と同じ方法によりＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。その結果、１Ｎ（ｐＨ０．０５）から、０．０６３Ｎ（pＨ１．３）の塩酸処理液に関しては実施例１−（１）記載の酸分解液と同等の活性を示した。０．０６３Ｎ未満の塩酸濃度では塩酸濃度が低下するにつれて活性は減少したが、０．００７８Ｎの塩酸処理液においても両活性は検出された。
【０１１７】
（５）４０ｍｌの１Ｎ塩酸および０．１２Ｎ塩酸にそれぞれ４００ｍｇの寒天粉末を添加し、沸騰湯浴上で１０分間保持し、溶解液を調製した。この溶解液を２Ｎの水酸化ナトリウムでpＨ６．５に中和後、セルロファインＧＣＬ−２５を用い溶出液１０％エタノール含有の０．２ＭＮａＣｌでゲルろ過を行った。それぞれの溶出液につき、実施例１−（１）と同じ方法によりＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性およびアポトーシス誘発活性を測定した。なお増殖抑制活性は相対活性として下記の様に測定した。
【０１１８】
それぞれの溶出液を添加して３日間培養したＨＬ−６０細胞に関して実施例１−（１）記載のＭＴＴ法により５９０ｎｍの吸光度を求める（ＡｂｓＴ）。
【０１１９】
溶出液の代りにゲルろ過用溶出液を添加して培養したＨＬ−６０細胞に関して実施例１−（１）記載のＭＴＴ法により５９０ｎｍの吸光度を求める（ＡｂｓＣ）。
相対活性：ＡｂｓＣ−ＡｂｓＴ
【０１２０】
図１に寒天の０．１２Ｎ塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す。図中縦軸はフェノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量（吸光度４８０ｎｍ：白丸印）または相対活性（黒丸印）を示し、横軸は分画番号（１分画１２ｍｌ）を示す。
【０１２１】
図２に寒天の１Ｎ塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す。図中縦軸はフェノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量（吸光度４８０ｎｍ：白丸印）または相対活性（黒丸印）を示し、横軸は分画番号（１分画１２ｍｌ）を示す。
【０１２２】
図１、図２に示すように寒天の酸分解物はがん細胞増殖抑制活性を示し、また死細胞にはアポトーシス小体が観察された。
【０１２３】
図１の分画番号５１〜６４の溶出液、および分画番号６５〜８４の溶出液をそれぞれ合せ、アポトーシス誘発用および／または制がん用の糖化合物を調製した。
【０１２４】
図２の分画番号６０〜７８の溶出液、および分画番号７９〜９５の溶出液をそれぞれ合せ、アポトーシス誘発用および／または制がん用の糖化合物を調製した。
【０１２５】
実施例２
（１）市販の寒天（アガー  ノーブル（Agar Noble）、ディフコ社製）１ｇを１００ｍｌの０．１Ｎ塩酸に懸濁し、沸騰するまで電子レンジで加熱して溶解した。室温まで冷却してpＨ６に調整した後、コスモナイスフィルター（ナカライテスク社製）でろ過し、そのろ液２ｍｌ を以下の逆相ＨＰＬＣで分離した。
カラム：TSK-gel ODS 80Ts（20mm× 250mm、東ソー社製）
TSK guard column ODS-80Ts （20mm× 50mm 、東ソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
流速：９ｍｌ／分
検出：２１５ｎｍ における吸光度
【０１２６】
各溶出ピークを分取し、減圧下乾固した後、３００μｌの水に溶解した。各画分をろ過滅菌し、１０μｌずつ９６穴マイクロタイタープレートに入れた。そこに５,０００個のＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を含む１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）９０μｌを加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で48時間培養した。光学顕微鏡で細胞の形態を観察した後、５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド  リン酸緩衝食塩水溶液１０μｌを加えてさらに４時間培養を続け、０．０４Ｎ塩酸含有２−プロパノール１００μｌを加えてよく撹拌し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定して、これを細胞増殖度とした。
【０１２７】
その結果８．２６分のピーク由来の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。
【０１２８】
（２）実施例２−（１）記載の８．２６分のピーク由来の画分１００μｌを以下のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーで分離した。
カラム：TSK-gel α-2500 （7.8mm ×300mm 、東ソー社製）
TSK guard columnα（6mm ×40mm、東ソー社製）
移動相：０．０１％ ＴＦＡ水溶液
流速：０．８ｍｌ／分
検出：示差屈折計
【０１２９】
サイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーでの分離図を図３に示す。すなわち、図３は寒天の酸分解物のサイズ排除HPLCクロマトグラムを示す図であり、横軸は溶出時間（分）、縦軸は示差屈折計の出力を示す。
【０１３０】
分離された各ピークを分取して減圧下乾固した。各画分を１０ｍｇ／ｍｌとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した後、上記実施例２−（１）記載の方法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、溶出時間８．８７分と９．４０分のピークが両活性を有していた。
【０１３１】
溶出時間８．８７分の物質と９．４０分の物質をリン酸緩衝食塩水に溶解し、３７℃で１時間放置した後、同様のサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。その結果、どちらの試料でも溶出時間８．８７分と９．４０分のピークが見られ、ピークの面積の比がほぼ等しかった。よって、リン酸緩衝水溶液状態で溶出時間８．８７分の物質と９．４０分の物質は平衡状態にあることが明らかとなった。
【０１３２】
溶出時間８．８７分と９．４０分のピーク由来の画分を合せ減圧下乾固し、アポトーシス誘発性および制がん性物質を得た。
【０１３３】
（３）実施例２−（２）記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質の質量分析をＤＸ３０２質量分析計（日本電子社製）を用いて行った。グリセロールをマトリックスとして用い、ネガティブイオンモードで測定した。
ＦＡＢ−ＭＳ
ｍ／ｚ 323［M −H］− 
415［M+グリセロール−H］− 
507［M+２グリセロール−H］−
【０１３４】
その結果を図４に示す。すなわち、図４はアポトーシス誘発性および制がん性物質のマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度(％) を示す。
【０１３５】
実施例２−（２）で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質の核磁気共鳴スペクトルを測定した。核磁気共鳴装置はＪＮＭ−Ａ５００（日本電子社製）を用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ
δ3.36 (1H, dd, J=8.0, 10.0Hz)、3.51 (1H, dd, J=3.0, 10.0Hz)、3.56 (1H, m)、3.58 (1H, m)、3.63 (1H, m)、3.67 (1H, m)、3.70 (1H, dd, J=3.0, 10.0Hz)、3.77 (1H, d, J=3.0Hz）、3.83 (1H, dd, J=4.5, 10.0Hz)、3.93 (1H, dd, J=5.0, 3.5Hz) 、4.23 (1H, m)、4.25 (1H, m)、4.41 (1H, d, J=8.0Hz) 、4.85 (1H, d, J=6.0Hz) 
試料は重水に溶解し、ＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして示した。
１３Ｃ−ＮＭＲ
δ61.9、 69.4 、71.5、73.37 、73.42 、73.8、76.0、76.1、83.7、86.5、90.7、103.3 
試料は重水に溶解し、ジオキサンの化学シフト値を６７．４ｐｐｍとして示した。
【０１３６】
図５にアポトーシス誘発性および制がん性物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図５において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ)を、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０１３７】
また、試料を重ジメチルスルホキシドに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
１Ｈ−ＮＭＲ
δ9.60（1H，アルデヒドのH）
【０１３８】
図６にアポトーシス誘発性および制がん制物質の重ジメチルスルホキシド溶媒での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図６において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を、縦軸はシグナル強度を示す。
【０１３９】
これらの質量分析、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲの解析結果より、実施例２−（２）記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質はアガロビオースと同定された。なお、アガロビオースの還元末端の３，６−アンヒドロガラクトースは、非水溶媒中では主として開環したアルデヒド体として存在していることが重ジメチルスルホキシド溶媒での１Ｈ−ＮＭＲにより示された。また、水溶液中ではアルデヒド体の抱水体として存在していることが、重水溶媒での１Ｈ−ＮＭＲにより示された。
【０１４０】
以上の結果より実施例２−（２）で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質はアガロビオースであることが明らかになった。
【０１４１】
（４）実施例２−（２）で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質、すなわち、アガロビオースを0.７８ｍｇ／ｍｌとなるように水に溶解し、１０μl を９６穴マイクロタイタープレートのウェルに入れ、上記実施例２−（１）記載の方法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、光学顕微鏡観察においてアポトーシス小体が見られ、対照の水添加区分に比べ、アガロビオース添加区分では細胞増殖が約８６％抑制されていた。すなわち、アガロビオースは７８μｇ／ｍｌでＨＬ−６０細胞にアポトーシスを誘発し、細胞増殖を抑制した。
【０１４２】
実施例３
（１）市販の寒天（Agar  Noble）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでpＨ中性付近まで中和した後、コスモナイスフィルターでろ過し、以下の順相ＨＰＬＣで分離した。
カラム：TSK-gel Amide-80 (21.5mm × 300mm、東ソー社製）
溶媒Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：５ｍｌ／分
溶出：溶媒Ａから溶媒Ｂへの直線濃度勾配（８０分間）→溶媒Ｂ（２０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
試料アプライ量：２ｍｌ
【０１４３】
保持時間６６．７分、７８．５分および８５．５分のピークを分取して質量分析を行ったところ、これらの物質は、各々、アガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースであった。上記のＨＰＬＣによる分離を８回繰り返して減圧下に乾固し、１２２ｍｇのアガロビオース、１１１ｍｇのアガロテトラオースおよび５５ｍｇのアガロヘキサオースを得た。
【０１４４】
その結果を図７〜図１０に示す。すなわち、図７はアガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースの順相ＨＰＬＣの溶出パターンを示す図であり、横軸は保持時間（分）を、縦軸は１９５ｎｍにおける吸光度を示す。図８は６６．７分のピークのマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値を、縦軸は相対強度（％）を示す。図９は７８．５分のピークのマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値を、縦軸は相対強度（％）を示す。図１０は８５．５分のピークのマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値を、縦軸は相対強度（％）を示す。
【０１４５】
（２）実施例３−（１）で得たアガロビオースの１００ｍＭ水溶液４５０μｌに１０倍濃度のリン酸緩衝食塩水（宝酒造社製、Ｔ９００）５０μｌと１０単位／μｌのβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社製、Ｇ５６３５）リン酸緩衝食塩水溶液５０μｌを加えて混合し、３７℃で１時間反応させた。
【０１４６】
この反応液に５ｍｌの１−ブタノール：エタノール＝１：１混合液を加えた後、遠心によって不溶物を除いた。この液をカラムクロマトグラフィー用シリカゲルＢＷ−３００ＳＰ（３×５０ｃｍ、富士シリシア化学社製）にアプライし、１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：１を溶離液としてコンプレッサーで０．３ｋｇ／ｃｍ２に加圧し、分離を行った。１画分当り７ｍｌになるようにフラクショネーションを行い、各画分の一部をとって薄層クロマトグラフィーで分析したところ、１４番から１７番までの画分に高純度の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが含まれていた。これらの画分を集めて減圧下に乾固して３．８ｍｇの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得た。本物質の構造は質量分析法および核磁気共鳴法によって確認した。
【０１４７】
その結果を図１1〜図１３に示す。すなわち、図１１は３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値を、縦軸は相対強度（％）を示す。図１２は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの重水溶媒での、また図１３は重ジメチルスルホキシド溶媒での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０１４８】
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースにおいても、重ジメチルスルホキシド溶媒での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが９．６０ｐｐｍにアルデヒドの水素のシグナルを示すことから、非水溶媒中では開環したアルデヒド体として存在し、また重水での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、水溶液中では、そのアルデヒド体の抱水体として存在していることが示された。
【０１４９】
実施例４
（１）実施例３で得た３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの２０ｍＭ水溶液を滅菌水で２倍、４倍および８倍希釈し、実施例２−（１）記載の方法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの２倍希釈液添加区分（終濃度１ｍＭ）でアポトーシス小体が観察され、５９０ｎｍにおける吸光度が対照の水添加区分の２分の１以下となった。
【０１５０】
（２）実施例３−（１）で得たアガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースの５０ｍＭ水溶液をろ過滅菌し、滅菌水で２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍および１２８倍希釈した。実施例２−（１）記載の方法でこれらの希釈液の各種細胞に対する増殖抑制活性を測定した。用いた細胞および培地を表１、表２に示す。
【０１５１】
【表１】
2006282675.tif 000008
【０１５２】
【表２】
2006282675.tif 000009
【０１５３】
この結果、アガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースはこれらの細胞に対して増殖抑制活性を示した。その結果を表３に示す。なお、表３中の数字は５９０ｎｍにおける吸光度が水添加の対照に比べて２分の１以下となった区分に添加した希釈液の希釈倍率を表し、１倍希釈は細胞培養液中の濃度５ｍＭに相当する。つぎにアガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースにおいて、５９０ｎｍにおける吸光度の変化をもとに、５０％の増殖抑制率を示す濃度（ＩＣ５０）を算出し、表４に示す。
【０１５４】
【表３】
2006282675.tif 000010
【０１５５】
【表４】
2006282675.tif 000011
【０１５６】
実施例５
市販の寒天５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却した後、ＮａＯＨでpＨ中性付近まで中和した本加熱処理液２ｍｌを、水で洗浄した活性炭素（６０−１５０メッシュ、ナカライテスク社製、０７９−２１）を充てんしたカラム（１０×２５５ｍｍ）にアプライした。２００ｍｌの水で洗浄後、２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、２５％、２７．５％、３０％、３５％、４０％、４５％および５０％エタノール水溶液それぞれ２００ｍｌでこの順に溶出した。
【０１５７】
各溶出画分を減圧下１０倍濃縮してシリカゲルシート６０Ｆ２５４（メルク社製）にスポットし、１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：１で展開した後、オルシノール試薬［４００ｍｇのオルシン一水和物（ナカライテスク社製）を２２．８ｍｌの硫酸に溶解し、水を加えて２００ｍｌとしたもの］を噴霧してスポットを観察した。
【０１５８】
その結果、５％および７．５％エタノール水溶液溶出画分にはアガロビオース、１５％および１７．５％エタノール水溶液溶出画分にはアガロテトラオース、２２．５％および２５％エタノール水溶液溶出画分にはアガロヘキサオース、２７．５％および３０％エタノール水溶液溶出画分にはアガロオクタオースがそれぞれ高純度で含まれていた。
【０１５９】
実施例６
実施例５で得たアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースおよびアガロオクタオース（以下、これらのオリゴ糖をアガロオリゴ糖と称する場合がある）を２．５ｍＭおよび１．２５ｍＭになるように水に溶解し、ろ過滅菌した。ＨＬ−６０細胞を２．５×１０５個／４．５ｍｌになるように１０％ウシ胎児血清含有RPMI1640培地に懸濁し、上記各オリゴ糖水溶液０．５ｍｌを添加して５％炭酸ガス存在下、３７℃で２４時間および４８時間培養した。細胞培養液の一部を取り、トリパンブルーを加えて顕鏡し、生細胞数を測定した。その結果、各区分において水添加区分（対照）に比べて生細胞数が減少しており、アポトーシス小体が観察された。
【０１６０】
その結果を図１４、図１５に示す。すなわち、図１４は終濃度２５０μＭのオリゴ糖を添加してＨＬ−６０細胞を培養したときの培養時間と生細胞数を示す図であり、図１５は終濃度１２５μＭのオリゴ糖を添加してＨＬ−６０細胞を培養したときの培養時間と生細胞数を示す図である。図１４および図１５において、横軸は培養時間（時間）を、縦軸は生細胞数（×１０５／５ｍｌ）を示し、黒丸印（●）は水添加（対照）を、ひし形印（◇）はアガロビオース添加を、白丸印（○）はアガロテトラオース添加を、三角印（△）はアガロヘキサオース添加を、四角印（□）はアガロオクタオース添加を示す。
【０１６１】
実施例７
（１）κ−カラゲナン（シグマ社製、Ｃ−１２６３）またはλ−カラゲナン（和光純薬社製、０３８−１４２５２）０．２ｇを２０ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、９５℃で１０分間加熱した。１Ｎ  ＮａＯＨで中和した後、水で１．５倍、２．２５倍、３．３８倍および５．０６倍希釈して実施例２−（１）の方法でＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖阻害活性を測定した。その結果、κ−カラゲナン加熱物の１．５倍、２．２５倍および３．３８倍希釈液添加区分とλ−カラゲナン加熱物の１．５倍および２．２５倍希釈液添加区分において５９０ｎｍにおける吸光度が対照の水添加区分の２分の１以下となり、またアポトーシス小体が見られた。
【０１６２】
（２）市販の寒天（アガー  ノーブル）、アガロースＬ０３（宝酒造社製）、および市販の棒寒天をそれぞれ１％となるように０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１５分間加熱した。この加熱液を冷却後、１Ｎ  ＮａＯＨで中和した後、水で２倍、４倍、８倍および１６倍希釈して実施例２−（１）の方法でＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性を測定した。その結果寒天およびアガロースの酸分解物の２〜８倍希釈液添加区分と棒寒天酸分解物の２倍、４倍希釈液添加区分において５９０ｎｍにおける吸光度が対照の水添加区分の２分の１以下となり、またアポトーシス小体が見られた。
上記酸分解物をそれぞれ順相ＨＰＬＣで分析したところ、いずれの分解物においてもアガロビオースをはじめとするアガロオリゴ糖が検出された。
【０１６３】
実施例８
（１）市販の寒天を以下の酸の水溶液に１％濃度になるように懸濁した。０．５Ｍ、１Ｍまたは２Ｍ  クエン酸；０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍまたは２Ｍ  硝酸；０．１Ｍまたは０．５Ｍ硫酸；０．１Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍ  リン酸；０．１Ｍ  塩酸。
【０１６４】
これらの寒天懸濁液を電子レンジで溶解するまで加熱後ＮａＯＨで中和し、蒸留水で２、４、８、１６または３２倍に希釈して実施例２−（１）記載の方法でＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。
【０１６５】
この結果、上記の各種酸加熱処理を行った寒天はＨＬ−６０に対してアポトーシスを誘発し、細胞増殖を抑制した。その結果を表５に示す。なお、表５中の数字は５９０ｎｍにおける吸光度が水添加の対照に比べて２分の１以下となった希釈液の希釈倍率を示す。また、括弧内の数字は寒天を加えずに本実施例で使用した最大濃度の酸をＮａＯＨで中和後、蒸留水で希釈して添加した場合の、５９０ｎｍにおける吸光度が水添加の対照に比べて２分の１以下となった希釈液の希釈倍率を示す。
【０１６６】
【表５】
2006282675.tif 000012
【０１６７】
（２）実施例８−（１）で得た寒天の酸加熱処理物を以下の順相ＨＰＬＣで分析した。
カラム：ＰＡＬＰＡＫ  ｔｙｐｅ  Ｓ（４．６×２５０ｍｍ、宝酒造社製、ＣＡ８３００）
溶媒Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／分
溶出：溶媒Ａ（１０分間）→溶媒Ａから溶媒Ｂの直線濃度勾配（４０分間）→溶媒Ｂ（１０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
カラム温度：４０℃
【０１６８】
この結果、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ  クエン酸、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ  硝酸、０．１Ｍ、０．５Ｍ硫酸、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ  リン酸、０．１Ｍ  塩酸中で加熱処理を行った試料にアガロビオースをはじめとするアガロオリゴ糖が含まれていた。
【０１６９】
その代表的な結果を図１６に示す。すなわち、図１６は０．５Ｍ  リン酸中で加熱処理を行った寒天の順相ＨＰＬＣの溶出パターンを示す図であり、横軸は保持時間（分）を、縦軸は１９５ｎｍにおける吸光度を示す。
【０１７０】
実施例９
市販の寒天（伊那寒天タイプＳ−７、伊那食品工業社製）５ｇを２０、５０または１００ｍＭ  クエン酸  ４５ｍｌに懸濁し、９５℃で加熱し、下記時間加熱後に一部をサンプリングした。
【０１７１】
２０ｍＭ  クエン酸処理物は３１０分、３５０分、３８０分、４４０分および５３０分、５０ｍＭ  クエン酸処理物は１００分、１２０分、１４０分、１６０分、１８０分、２００分、２２０分、２４０分、２６０分、２９０分および３２０分、１００ｍＭ  クエン酸処理物は６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１２０分、１４０分、１６０分、１８０分、２００分、２２０分および２４０分。
【０１７２】
各試料の１０倍希釈液１μｌをシリカゲル６０シートＦ２５４（メルク社製）にスポットして１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：１で展開し、オルシノール−硫酸法で検出した。
【０１７３】
この結果、各試料にアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース等のアガロオリゴ糖が含まれていた。
【０１７４】
２０ｍＭ  クエン酸処理物は３５０分加熱までアガロオリゴ糖の含量が増加し、それ以後はほぼ一定になった。
【０１７５】
５０ｍＭ  クエン酸処理物は２００分加熱までアガロオリゴ糖の含量が増加し、それ以後はほぼ一定になった。
【０１７６】
１００ｍＭ  クエン酸処理物は１６０分加熱までアガロオリゴ糖の含量が増加し、それ以後はほぼ一定になった。
【０１７７】
高濃度のクエン酸で処理した試料ほど最終的なアガロオリゴ糖の含量は高かった。
【０１７８】
実施例８−（２）と同様の順相ＨＰＬＣで各試料を分析したところ、薄層クロマトグラフィーと同様の結果が得られた。ただし、１００ｍＭ  クエン酸処理物には５０ｍＭ  クエン酸処理物よりも多量の不純物が含まれており、加熱時間と共に不純物は増加した。
【０１７９】
実施例１０
（１）実施例３−（１）で調製したアガロビオースを０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１ｍＭとなるように溶解した。各試料１μｌをシリカゲル６０シートＦ２５４にスポットしてクロロホルム：メタノール：酢酸＝７：２：２の溶媒で３回展開し、オルシノールー硫酸法で発色させた。発色させたシートはFOTODYNE FOTO/Analyst Archiver Ecripse（セントラル科学貿易社販売）により画像データとして取込み、この画像データを画像解析ソフト1-D Basic （アドバンスド  アメリカン  バイオテクノロジー社製）により画像処理を行い、各濃度のアガロビオースのスポットの強度を数値化して検量線を作製した。
【０１８０】
検量線のグラフを図１７に示す。すなわち、図１７はアガロビオースの検量線を示す図であり、各濃度のアガロビオースに対するスポットの強度をグラフとし、横軸はアガロビオースの濃度（mM）、縦軸はスポットの強度を示す。また、図１７中の計算式はスポットの強度（ｙ）とアガロビオースの濃度（ｘ）の関係を表したものであり、アガロビオースの濃度が未知の試料において、スポットの強度を得ることにより計算式からアガロビオースの濃度が算出される。
【０１８１】
また、同様にして実施例５で得たアガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースの検量線を作成した。
【０１８２】
（２）市販の寒天（アガー  ノーブル）０．２ｇを９０ｍｌの水に懸濁し、電子レンジで加熱溶解し室温付近まで冷却した。ここに１Ｍ  ＨＣｌあるいは１Ｍ  クエン酸を１０ｍｌ加え、それぞれ０．２％寒天０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液および０．２％寒天０．１Ｍ  クエン酸溶液を調製した。この溶液を９０℃で加熱し、５分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２１時間の各時間でサンプリングした。各試料は実施例１０−（１）に記載の方法で薄層クロマトグラフィーを行い、スポットの強度を求めてアガロビオースの濃度を算出した。なお、各試料はアガロビオースの濃度が０．０５ｍＭから１ｍＭの範囲に収まるように適宜希釈した。
【０１８３】
図１８、図１９に０．２％寒天０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液および０．２％寒天０．１Ｍ  クエン酸溶液における加熱時間とアガロビオースの生成量との関係を示す。すなわち、図１８は、０．２％寒天の０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液における加熱時間とアガロビオースの生成量との関係を示す図であり、図１９は０．２％寒天の０．１Ｍ  クエン酸溶液における加熱時間とアガロビオースの生成量との関係を示す図である。図１８、図１９において、横軸は加熱時間（時間）、縦軸はアガロビオースの濃度（mM）を示す。
【０１８４】
図１８に示されるように、０．２％寒天の０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液では、１時間でアガロビオースの濃度は最高に達し、それ以降減少が認められた。また、図１９に示されるように、０．２％寒天の０．１Ｍ  クエン酸溶液では、８時間までアガロビオースの濃度は徐々に増加し、２１時間目で減少が認められた。なお、０．２％寒天の０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液における５分加熱試料および０．２％寒天の０．１Ｍ  クエン酸溶液における５、１０、２０分加熱試料においてはアガロビオースの濃度は検出限界以下であった。
【０１８５】
（３）５、５０、５００ｍＭのクエン酸に１０％になるようにアガー  ノーブルを懸濁し、６５、８０、９５℃で加熱し、加熱後、３０分、１、２、４、８、２４時間でサンプリングし、アガロオリゴ糖の生成量を実施例１０−（１）記載の方法で測定した。
【０１８６】
その結果、アガーを５ｍＭクエン酸に溶解した場合は、８０℃で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られたが、６５℃ではアガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。９５℃ではアガロビオースは８〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオースも８〜２４時間で高い値を示した。アガーを５０ｍＭクエン酸に溶解した場合は、６５℃ではアガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。８０℃ではアガロビオースは２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースは４〜８時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースは４〜８時間で高い値を示した。アガーを５００ｍＭクエン酸に溶解した場合は、６５℃では４〜２４時間で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られた。８０℃ではアガロビオースは２〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオースは１〜６時間で高い値を示した。アガロオクタオースは１〜２時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは１〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオースは１〜２時間で高い値を示した。アガロヘキサオース、アガロオクタオースは３０分から１時間で高い値を示した。
【０１８７】
５００ｍＭクエン酸による加水分解の例を図２０および図２１に示す。すなわち、図２０は５００ｍＭクエン酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印：アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。また、図２１は５００ｍＭクエン酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。
【０１８８】
（４）５０、５００、１０００ｍＭの酢酸を使用し、実施例１０−（３）と同様の方法で、アガロオリゴ糖の生成を測定した。
【０１８９】
その結果、アガーを５０ｍＭ酢酸に溶解した場合は、８０℃で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られたが、６５℃ではアガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。アガーを５００ｍＭ酢酸に溶解した場合は、６５℃ではアガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。８０℃および９５℃では若干のアガロオリゴ糖の生成が見られた。アガーを１０００ｍＭ酢酸に溶解した場合は、６５℃ではアガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。８０℃ではアガロビオースは２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースは８時間で若干生成されていた。９５℃では、アガロビオースは８時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースも８時間で高い値を示した。
【０１９０】
（５）６０、６００、１２００ｍＭの乳酸を使用し、実施例１０−（３）と同様の方法で、アガロオリゴ糖の生成を測定した。
【０１９１】
その結果、アガーを６０ｍＭ乳酸に溶解した場合は、９５℃で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られたが、６５、８０℃では、アガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。アガーを６００ｍＭ乳酸に溶解した場合は、８０℃ではアガロビオースは８〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオースは４〜８時間で高い値を示した。アガロオクタオースは４時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは４〜８時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオースは２〜６時間で高い値を示した。アガーを１２００ｍＭ乳酸に溶解した場合は、８０℃ではアガロビオースは４〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオースは２〜６時間で高い値を示した。アガロオクタオースは２時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは２〜８時間で高い値を示し、アガロテトラオース、アガロヘキサオースは１〜２時間で高い値を示した。
【０１９２】
１２００ｍＭ乳酸による加水分解の例を図２２および図２３に示す。すなわち、図２２は１２００ｍＭ乳酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。また、図２３は１２００ｍＭ乳酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印：アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。
【０１９３】
（６）２０、２００、１０００ｍＭのリンゴ酸を使用し、実施例１０−（３）と同様の方法で、アガロオリゴ糖の生成を測定した。
【０１９４】
その結果、アガーを２０ｍＭリンゴ酸に溶解した場合は、９５℃で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られたが、６５、８０℃では、アガロオリゴ糖はほとんど生成されなかった。アガーを２００ｍＭリンゴ酸に溶解した場合は、６５℃では２４時間で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られた。８０℃ではアガロビオースは８〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオースは４〜８時間で高い値を示した。アガロヘキサオースは４時間で高い値を示した。アガロオクタオースは４時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは４〜８時間で高い値を示し、アガロテトラオースは４時間で高い値を示した。アガーを１０００ｍＭリンゴ酸に溶解した場合は、６５℃では２４時間で若干のアガロオリゴ糖の生成が見られた。８０℃ではアガロビオースは２〜２４時間で高い値を示し、アガロテトラオースは２〜６時間で高い値を示した。アガロヘキサオース、アガロオクタオースは２時間で高い値を示した。９５℃では、アガロビオースは１〜８時間で高いい値を示し、アガロテトラオースは１〜２時間で高い値を示した。アガロヘキサオース、アガロオクタオースは１時間で高い値を示した。
【０１９５】
１０００ｍＭリンゴ酸によるアガーの加水分解の例を図２４および図２５に示す。すなわち、図２４は１０００ｍＭリンゴ酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印：アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。また図２５は１０００ｍＭリンゴ酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図であり、図中縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印アガロテトラオース、四角印：アガロヘキサオース、×印：アガロオクタオース）、横軸は時間を示す。
【０１９６】
（７）１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭのリンゴ酸に、１０％になるようにノーブルアガーを懸濁し、７０、８０、９０℃で加熱した。加熱後、３０分、１、２、３、４、８、２４時間でサンプリングし、アガロオリゴ糖の生成を実施例１０−（３）と同様の方法で測定した。
【０１９７】
３００ｍＭ以上のリンゴ酸濃度では、７０℃でも、８時間以上で高いアガロオリゴ糖の生成が見られた。１０００ｍＭ、７０℃での加水分解の例を図２６に示す。すなわち、図２６は、１０００ｍＭリンゴ酸、７０℃におけるアガロオリゴ糖の生成を示す図であり、図中、縦軸はアガロオリゴ糖生成量（丸印：アガロビオース、三角印：アガロテトラオース）、横軸は時間を示す。
【０１９８】
上記実施例１０−（３）〜（７）の結果より、アガロオリゴ糖の製造に用いる酸としてはクエン酸、乳酸、リンゴ酸、酸の濃度は数十ｍＭから数Ｍ、加熱温度は７０〜９５℃、加熱時間は数十分から２４時間が好ましい。
【０１９９】
（８）Ｆ −キット乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイム株式会社製コード１７６３０３）を用い、アガロビオースにβ−ガラクトシダーゼを作用させ、生成されるガラクトースの濃度を測定する方法でアガロビオースの定量を行った。
【０２００】
キットの使用方法に従い定量を行ったが、β−ガラクトシダーゼの反応は、３７℃、１時間に変更した。検量線はラクトースを用いて作製し、ラクトース換算のモル濃度（ｍＭ）を算出した後、アガロビオース濃度（ｍｇ／ｍｌ）に変換した。
【０２０１】
上記実施例で調製したアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースを用い、上記方法で定量を試みた。その結果、アガロビオースは、計算値と実測値が一致した。その一方で、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースは、上記方法では実質的に検出されなかった。つまり、アガロビオース以外のアガロオリゴ糖は、上記検出方法では実質的に検出されないことが明らかとなり、上記方法を用いることにより、アガロオリゴ糖中のアガロビオースの濃度測定を行うことができることが明らかになった。
【０２０２】
（９）市販の寒天（伊那寒天タイプＳ−７：伊那食品工業社製）１００ｇおよびＨ型の強陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ１０４Ｈ：三菱化成製）１０ｇを９５℃の脱塩水９００ｇ中で混合し、９５℃で撹拌しつつ１８０分間、寒天の酸分解を行った。ついで、室温まで冷却し、活性炭１％Ｗ／Ｗ、およびセライト５４５（セライト社製）０．５％Ｗ／Ｗボディフィードでろ過し、ろ液を調製した。
【０２０３】
実施例８−（２）と同様の順相ＨＰＬＣで調製したろ液を分析し、アガロオリゴ糖としてアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースが主成分として生成していることを確認した。
【０２０４】
該ろ液は、pＨ２．４、酸度１．７、ブリックス９．４％、上記実施例１０−（８）記載のＦ−キット乳糖／ガラクトースを用いて測定したアガロビオース量は７．４％であった。
【０２０５】
（１０）脱塩水１００ｇ中へ、Ｈ型の強陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ１０４Ｈ）を１８．５ｇ入れ、９５℃で撹拌した。寒天（伊那寒天タイプＳ−７）は以下、１０分間隔で、各１０ｇを５回添加し、ついで、各１５ｇを２回添加し、さらに、各２０ｇを３回添加し、最後に３０ｇを添加した。寒天の合計添加量を１８５ｇとした後、９５℃で１５０分撹拌し、ついで、室温まで冷却した。デカンテーションにより樹脂と液を分けた後、分離液へ活性炭３％Ｗ／Ｗ、およびセライト５４５（セライト社製）０．５％Ｗ／Ｗボディフィードでろ過し、ろ液を調製した。
【０２０６】
実施例８−（２）と同様の順相ＨＰＬＣで調製したろ液を分析し、アガロオリゴ糖としてアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースが主成分として生成していることを確認した。
【０２０７】
該ろ液はpＨ１．２、酸度１１．９、ブリックス６４％、上記実施例１０−（８）記載のＦ−キット乳糖／ガラクトースを用いて測定したアガロビオース量は２４．４％であった。
【０２０８】
（１１）市販の寒天（伊那寒天タイプＳ−７）１００ｇを用い、種々のリン酸濃度の脱イオン水で１リットルにあわせ、９５℃で撹拌しつつ寒天液化を行った。
【０２０９】
また、１％Ｗ／Ｖクエン酸濃度の脱イオン水１リットルに合わせたものを用いリン酸と同様にして寒天液化を行った。液化とはその氷結点においてもゲル化しない状態を意味し、その状態になる時間（液化時間）を測定した。また、液化時およびその後のアガロビオース生成量を上記実施例１０−（８）記載のＦ−キット乳糖／ガラクトースを用いて測定した。
【０２１０】
その結果を表６、表７に示す。
【０２１１】
【表６】
2006282675.tif 000013
【０２１２】
【表７】
2006282675.tif 000014
【０２１３】
実施例１１
（１）市販の寒天（伊那寒天タイプＳ−７、伊那食品工業社製）１５０ｇ、食添用クエン酸（無水）（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１５ｇを脱イオン水で１．５リットルに合せ、品温９２℃に上昇させた後、９２〜９５℃に、撹拌下に１３０分保持した。ついで、室温まで冷却し、セライト５４５（セライト社製）の０．５％ボディフィードでろ過し、ろ液（寒天分解オリゴ糖溶液）を調製した。実施例８−（２）と同様の順相ＨＰＬＣで調製したろ液を分析し、糖化合物としてアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースが主成分として生成していることを確認した。
【０２１４】
該ろ液のｐＨは約２．６、酸度は０．９２、ブリックスは９．２％、実施例１０−（８）記載の方法で測定したアガロビオース生成量は４３．１ｍＭであった。
【０２１５】
（２）実施例１１−（１）にて調製したろ液（寒天分解オリゴ糖溶液）を２０倍に希釈し、酸味料、甘味料、フレーバーを添加し、アガロビオース２．２５ｍＭの清涼飲料を製造した。
【０２１６】
その配合表を表８および表９に示す。すなわち表８、はグレープフルーツ味清涼飲料の配合表であり、表９はシソ味清涼飲料の配合表である。
【０２１７】
それぞれの表に示す原料を水に添加し、溶解して清涼飲料を調製し、２００ｍｌ空缶に分注した。表５に示す配合の清涼飲料はカーボネーションして０．８ｋｇ／ｃｍ２（２０℃）のガス圧となる炭酸飲料とした。
【０２１８】
それぞれの飲料の分析値を表８、表９の下欄に示す。
【０２１９】
【表８】
2006282675.tif 000015
【０２２０】
【表９】
2006282675.tif 000016
【０２２１】
それぞれの本発明品の炭酸飲料についてパネラー１０名で５段階（５良、１悪）の官能評価を行った。対象は寒天分解オリゴ糖溶液の代わりに酸度を同様にしたクエン酸液で置換したものを用いた。
【０２２２】
グレープフルーツ味の官能評価の平均値を表１０に、シソ味の官能評価の平均値を表１１に示す。
【０２２３】
【表１０】
2006282675.tif 000017
【０２２４】
【表１１】
2006282675.tif 000018
【０２２５】
本発明品はそれぞれ対照に比べ、飲料の味のバランスが調い、舌ざわり感がまろやかで、なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の飲料となった。また、カーボネーション前の清涼飲料も、それぞれ上記と同様の新規な味覚の本発明品の飲料であった。
【０２２６】
（３）上記表８、表９記載の清涼飲料にエチルアルコール６％Ｖ／Ｖ、または８％Ｖ／Ｖに成るようにエチルアルコールを加えて調製し、２００ｍｌ空缶に分注した。ついで、該アルコール飲料をカーボネーションして０．８ｋｇ／ｃｍ２（２０℃）のガス圧となる本発明の清涼炭酸アルコール飲料を製造した。
【０２２７】
本発明の清涼炭酸アルコール飲料は寒天分解オリゴ糖溶液を含有しない対照と比べ、飲料の味のバランスが調い、舌ざわり感がまろやかで、なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の清涼炭酸アルコール飲料となった。
【０２２８】
実施例１２
（１）寒天のクエン酸分解物を含有する飲料を下記のように調製した。その配合表を表１２に示す。すなわち、表１２の本発明品１は実施例１１−（１）にて調製したろ液（寒天オリゴ糖液）を０．１％Ｗ／Ｖおよび寒天（ウルトラ寒天ＡＸ−３０：伊那食品工業社製）０．２５％Ｗ／Ｖ、クエン酸０．０７％Ｗ／Ｖを用いた。本発明品２は寒天オリゴ糖液は添加せず、寒天０．２５％Ｗ／Ｖ、クエン酸０．０８％Ｗ／Ｖを用いた。本発明品１および２はそれぞれ寒天を温水で溶解後、他の材料を混合し、酸性下で９３℃、１０秒間、９３℃未満〜８０℃で２０分間、さらに８０℃未満〜７５℃で１５分間の加熱を行い寒天のクエン酸分解物を含有する飲料を製造した。一方、対照は本発明品２と同配合であるが９３℃、１０秒の加熱条件で行った。
【０２２９】
それぞれのとろみのついた寒天クエン酸分解物含有飲料（本発明品１および２）についてパネラー１０名で５段階（５良、１悪）の官能評価を行った。官能評価の平均値を表１３に示す。
【０２３０】
【表１２】
2006282675.tif 000019
【０２３１】
【表１３】
2006282675.tif 000020
【０２３２】
本発明品１および２は対照に比べ、飲料の味のバランスが調い、とろみもほどよく、舌ざわり感がまろやかで、なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の飲料となった。また添加クエン酸存在下の加熱処理により、本発明品１および２において抗酸化用オリゴ糖、アガロビオースの生成が認められ、新規な抗酸化用オリゴ糖含有飲料が提供された。
【０２３３】
また、８０℃未満〜７５℃で１５分間の加熱条件を、７５℃で１日、８５℃で５分間、１０３℃で５分間、１２２℃で４５秒間にそれぞれ置き換えてアガロビオースの生成量を実施例１０−（８）記載の方法で測定したところ、それぞれ０．０３ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０４ｍＭおよび０．０５ｍＭであり、加熱処理により、アガロビオースが生成すること、また、加熱条件が強くなるほど、アガロビオース生成が増加することも確認された。
【０２３４】
（２）実施例１２−（１）記載の本発明品１、本発明品２および対照の飲料にエチルアルコール２％Ｖ／Ｖ、または４％Ｖ／Ｖになるようにエチルアルコールを加え、その分残余の脱塩水を減少させてアルコール飲料を調製した。
【０２３５】
本発明品１、本発明品２にそれぞれ対応するアルコール飲料は対照のアルコール飲料に比べ、飲料の味のバランスが調い、とろみもほどよく、舌ざわり感がまろやかで、なめらかな感じに仕上っているとの評価で新規な味覚の飲料となった。
【０２３６】
また、上記本発明のアルコール飲料の凍結物は、シャーベット状の良好な食感を示した。
【０２３７】
実施例１３
（１）市販の寒天（アガー  ノーブル）を１％濃度になるように０．１Ｎ塩酸に懸濁し、３７℃で５時間、１６時間または４８時間処理した。この処理液を蒸留水で１０倍希釈し、実施例９に記載の薄層クロマトグラフィーで分析したところ、５時間処理でアガロオリゴ糖の生成がわずかに認められ、１６時間処理では５時間処理よりも増加し、４８時間処理ではさらに増加した。
【０２３８】
（２）市販の寒天（アガー  ノーブル)を１％濃度になるようにリン酸緩衝食塩水または蒸留水に懸濁し、１２１℃で４時間加熱した。この加熱処理物を蒸留水で１０倍希釈し、実施例９に記載の薄層クロマトグラフィーで分析したところ、リン酸緩衝食塩水中で加熱処理した試料には痕跡量の、蒸留水中で加熱処理した試料にはそれよりも明らかに多量のアガロオリゴ糖の生成が認められた。なお、前者の加熱処理後のpＨは約７、後者のそれは約５であり、室温まで冷却すると前者はゲル化したが後者はゲル化しなかった。
【０２３９】
実施例１４
（１）寒天（アガー  ノーブル)を１０％濃度となるように０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１９分間加熱した。水で平衡化したトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＨＷ４０Ｃ（東ソー社製）カラム（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）に上記試料１０ｍｌをアプライし、毎分１．４ｍｌの流速で水を移動相としてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出する物質は示差屈折計で検出し、７ｍｌずつ分取した。
【０２４０】
溶出時間４０６分、４３５分、４７１分および５２４分にピークが認められ、実施例９に記載の薄層クロマトグラフィーで各ピークに対応する画分を分析したところ、これらは順にアガロオクタオース、アガロヘキサオース、アガロテトラオースおよびアガロビオースであることが明らかになった。これらの画分を凍結乾燥して３０ｍｇのアガロオクタオース、１００ｍｇのアガロヘキサオース、１５０ｍｇのアガロテトラオースおよび１４０ｍｇのアガロビオースを得た。
【０２４１】
（２）実施例１４−（１）で得たアガロビオース、アガロテトラオースの各１００ｍＭ水溶液２５μｌに１００ｍｌのＬ−システイン水溶液５０μｌ を加え、リン酸緩衝食塩水９２５μｌ を加え、３７℃で１時間または１６時間反応させた。同様の反応をＬ−システイン水溶液の代りに同濃度のＬ−リジン水溶液においても行った。
【０２４２】
各反応試料１μｌをシリカゲルシート６０Ｆ２５４にスポットして１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：１で展開し、オルシノール硫酸法で検出した。
【０２４３】
この結果、Ｌ−システインの１時間反応試料において、アガロビオース、アガロテトラオースのスポットが消失していた。また、Ｌ−システイン、Ｌ−リジンの16時間反応試料においては、どの試料もアガロビオース、アガロテトラオースのスポットが消失していた。
【０２４４】
実施例８−（２）と同様の順相ＨＰＬＣで各試料を分析したところ、薄層クロマトグラフィーと同様の結果が得られた。
【０２４５】
（３）実施例１４−（２）で調製した各反応試料１０μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウエルに入れ、実施例２−（１）記載の方法でＨＬ−６０に対するがん細胞増殖抑制活性を測定した。
【０２４６】
その結果、アガロビオース、アガロテトラオースのスポットが消失した試料において活性の消失が見られた。すなわち、アガロビオース、アガロテトラオースとＬ−システインの１時間反応試料およびアガロビオース、アガロテトラオースとＬ−システイン、Ｌ−リジンの１６時間反応試料において、同濃度のアガロビオース、アガロテトラオースと比較して、細胞増殖抑制活性が約１／１０となっていた。
【０２４７】
実施例１５
（１）κ−カラゲナン（シグマ社製、Ｃ−１２６３）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１６分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでpＨ中性付近まで中和した後、コスモナイスフィルターでろ過し、以下の順相HＨＰＬＣで分離した。
カラム：PALPAK type S （4.６×250mm 、宝酒造社製、CA8300）
溶媒Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／分
溶出：溶媒Ａ（１０分間）→溶媒A から溶媒Ｂの直線濃度勾配（４０分間）→溶媒Ｂ（１０分間）
検出：２１５ｎｍ における吸光度
カラム温度：４０℃
試料アプライ量：５０μｌ
【０２４８】
順相ＨＰＬＣでの分離図を図２７に示す。すなわち、図２７はκ−カラゲナン酸分解物の順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図であり、横軸は保持時間（分）、縦軸は２１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【０２４９】
各溶出ピークを分取し、減圧下乾固した後、１００μｌの水に溶解した。各画分をろ過滅菌し、実施例２−（１）記載の方法でＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖阻害活性を測定した。その結果、２７．７９７分、３３．９０５〜３４．７８４分、３６．２２６〜３６．６５４分の各ピーク由来の画分を添加した区分において、アポトーシス小体が観察され、対照の水添加区分に比べて５９０ｎｍにおける吸光度が低く、細胞増殖が阻害されていた。
【０２５０】
溶出時間２７．７９７分のピーク由来の画分を上記ＨＰＬＣの条件で１２回分離して集めて減圧下乾固し、アポトーシス誘発性および制がん性物質を得た。
【０２５１】
（２）実施例１５−（１）記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質の質量分析をＤＫ３０２質量分析計（日本電子社製）を用いて行った。グリセロールをマトリックスとして用い、ネガティブイオンモードで測定した。
ＦＡＢ−ＭＳ
m ／z  403［M −H］− 
495［M+グリセロール−H］−
【０２５２】
その結果を図２８に示す。すなわち、図２８はアポトーシス誘発性および制がん性物質のマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
【０２５３】
実施例１５−（１）で得たアポトーシス誘発性および制がん性物質の核磁気共鳴スペクトルを測定した。核磁気共鳴装置はＪＮＭ−Ａ５００（日本電子社製）を用いた。
【０２５４】
図２９にアポトーシス誘発性および制がん性物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図２９において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０２５５】
これらの質量分析、１Ｈ−ＮＭＲの解析結果より、実施１５−（１）記載のアポトーシス誘発性および制がん性物質はκ−カラビオース［β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−スルフェート−（１→４）−３, ６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース］と同定された。
【０２５６】
以上より、実施例１５−（１）で得たアポトーシス誘発性および制ガン性物質はκ−カラビオースであることが明らかとなった。
【０２５７】
（３）実施例１５−（１）で得たκ−カラビオースを１．５６ｍＭとなるように水に溶解し、１０μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに入れ、実施例２−（１）記載の方法でアポトーシス誘発活性とがん細胞増殖抑制活性を測定した。その結果、光学顕微鏡観察においてアポトーシス小体が見られ、対照の水添加区分に比べ、κ−カラビオース添加区分では細胞増殖が約７０％抑制されていた。よって、κ−カラビオースは１５６μＭでＨＬ−６０細胞にアポトーシスを誘発し、細胞増殖を抑制した。
【０２５８】
実施例１６
（１）市販の寒天粉末（和光純薬社製）４．５ｇを０．１Ｎの塩酸１５０ｍｌ に懸濁し、電子レンジで加熱溶解し、溶解液を沸騰湯浴上で１０分間保持した。この加熱処理後室温になるまで加熱処理寒天溶液を放冷し、遠心分離により不溶物を除去した。つぎに、遠心上清を回収し、１Ｎの水酸化ナトリウムでpＨ６．８に調整した。この遠心上清１５０ｍｌに対し同量の酢酸エチルを添加後、強く撹拌し、酢酸エチル相と水相に分配した。分配された水相をエバポレーターで乾固し、再度１５０ｍｌの水に溶解した、溶解時の不溶物を遠心分離により除去し上清を得た。また酢酸エチル相は、エバポレーターで乾固し、１００ｍｌのイオン交換水に溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウムでpＨを６．５に調整した。
【０２５９】
酢酸エチル相、水相をポアサイズ０．２μｍのフィルター（コーニング社製）でろ過滅菌した後、水で１０、２０、３０倍に希釈し、実施例２−（１）と同じ方法によりＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を測定した。その結果、水相には増殖抑制活性が認められたが、酢酸エチル相には増殖抑制活性が認められなかった。
【０２６０】
調製した水相溶液５０ｍｌをセルロファインＧＣＬ−２５カラム（４１×９０５ｍｍ）によりゲルろ過した。溶出液としては１０％エタノール含有の０．２Ｍ  ＮａＣｌ。図３０に溶出図を示す。すなわち、図３０はセルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過の結果を示す図であり、図中縦軸はフェノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量（吸光度４９０ｎｍ: 黒丸印）、横軸は分画番号（１分画１０ｍｌ）を示す。
【０２６１】
各溶出画分をシリカゲルシート６０Ｆ２５４（メルク社製）に各１μｌをスポットし、１−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２で展開した後、オルシノール試薬［４００ｍｇのオルシン一水和物（和光純薬社製）を２２．８ｍｌの硫酸に溶解し、水を加えて２００mlとしたもの］を噴霧し、１５０℃に加熱したホットプレート上で加熱し、スポットを観察した。
【０２６２】
上記のＴＬＣ分析によりスポットが確認された分画番号４０から１２０を、各々、５本ずつまとめた後、滅菌ろ過し、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を測定した。その結果、分画番号８６から９０に最も強い増殖抑制活性が認められた。
【０２６３】
（２）分画番号８６から８８を回収し、エバポレーターで乾固し、０．９４ｇの粉体を得た。得られた粉体を３０ｍｌの９０％エタノールに溶解し、５Ｃフィルター（ADVANTEC社製）で白色沈殿物を除去し、セファデックス（Sephadex）ＬＨ−２０カラム（３５×６５０ｍｍ）によりゲルろ過した。溶出液としては９０％エタノールを用いた。図３１に溶出図を示す。すなわち、図３１はセファデックスＬＨ−２０カラムによるゲルろ過の結果を示す図であり、図中、縦軸はフェノール硫酸法により測定した溶出液中の糖含量（吸光度４９０ｎｍ: 黒丸印）、横軸は分画番号（１分画１０ｍｌ）を示す。
【０２６４】
各溶出画分を上記と同様シリカゲルシートを用いて分析した。
【０２６５】
ＴＬＣ分析の結果検出された成分は、分画番号３０から３５、３６から４０、４１から４４、４５から４８、４９から５３の５グループに大別された。各分画番号につき１２５μｌを上記のグループにまとめ、エバポレーターで乾固し、５００μｌのイオン交換水に溶解し、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
【０２６６】
ＨＬ−６０細胞に対して最も強い増殖抑制活性のあった分画番号３６から４０をエバポレーターで乾固し、５ｍｌのｌ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２に溶解し、これを、１−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２で洗浄したシリカゲル６０Ｆ２５４を充填したカラム（２０×７１０ｍｍ）にアプライした。溶出液としては１−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２を用いた（１画分＝３ｍｌ）。
【０２６７】
各溶出画分を上記と同様に、シリカゲルシートを用いて分析した。その結果、検出された成分は、分画番号４６から５２（グループ１）、６０から７０（グループ２）、７２から８４（グループ３）、８６から９４（グループ４）、９６から１２０（グループ５）に大別された。
【０２６８】
各グループをエバポレーターで乾固し、各々５ｍｌのイオン交換水に溶解し、ポアサイズ０．４５μｍのフィルター（IWAKI 社製）でろ過した。得られた各溶液のＨＬ−６０に対する増殖抑制活性を測定した。その結果、グループ３、４、５に増殖抑制活性が認められた。
【０２６９】
グループ４、５の構造についてはＴＬＣ分析および質量分析により、アガロビオースであることを確認した。
【０２７０】
グループ３の構造については、質量分析およびＮＭＲ分析によって、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３,６−アンヒドロ−２−０−メチル−Ｌ−ガラクトースであることが確認された。図３２は、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−3,６−アンヒドロ−２−０−メチル−Ｌ−ガラクトースのマススペクトルを示す図であり、横軸はｍ/ｚ 値、縦軸は相対強度（％）を示す。また、図３３はβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−3,６−アンヒドロ−２−０−メチル−Ｌ−ガラクトースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
【０２７１】
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３，６−アンヒドロ−２−０−メチル−Ｌ−ガラクトースは、アガロビオースと同様、ＨＬ−６０細胞に対して強い細胞増殖抑制活性を有することが判明した。
【０２７２】
実施例１７
（１）実施例３で得た寒天由来糖類の過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を以下のようにして測定した。
【０２７３】
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)３Ａ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ＮＣＴＣ  ８３１９）を５ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ディフコ社製、００３７−１７−８）に接種し、３７℃で１晩培養した。遠心によって菌体を集め、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、１×１０７コロニー形成単位／ｍｌになるようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。１００μｌの上記菌懸濁液、１００μｌの試料水溶液、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌメトヘモグロビン（シグマ社製、Ｍ９２５０）水溶液および６００μｌのリン酸緩衝食塩水および１００μｌの５０ｍＭ  tert−ブチルヒドロペルオキシド（片山化学社製、０３−４９９０）水溶液を混合して３７℃で３０分間反応させた。１ｍｌの２×ＮＭＰ培地［８ｇのニュートリエントブロス（ディフコ社製、０００３−０１−６）、５ｇのトリプトン（ディフコ社製、０１２３−１７−３）、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのマンニトール（ナカライテスク社製、２１３−０３）、０．０３５ｇのフェノールレッド（ナカライテスク社製、２６８−０７）を蒸留水に溶解して５００ｍｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、ろ過滅菌したもの］を加えて反応を停止し、ＮＭＰ培地（２×ＮＭＰ培地を滅菌水で２倍希釈したもの）で３倍ずつ１２段階希釈したもの各１６０μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で１晩培養した。培地の色を肉眼で観察し、菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したウェルが見られた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。
【０２７４】
その結果を表１４に示す。表１４において、＋は菌の生育したウェルが見られた試料を、−は菌の生育したウェルが見られなかった試料を示す。また、表の最上列に示した濃度はtert−ブチルヒドロペルオキシドおよび菌体を３７℃で３０分間反応させた反応液中の試料の濃度である。
【０２７５】
【表１４】
2006282675.tif 000021
【０２７６】
以上の結果、アガロビオースとアガロテトラオースに強い過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が見られた。カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースにも同様の活性を認めた。
【０２７７】
（２）市販の寒天（伊奈寒天タイプＳ−７、伊奈食品工業社製）５ｇを５０ｍＭクエン酸４５ｍｌに懸濁し、９３℃で１５５分加熱し、ＮａＯＨでpＨ６に調製したサンプル（クエン酸処理物）と、１００ｍＭ塩酸４５ｍｌに懸濁し、９５℃で１３分加熱し、ＮａＯＨでpＨ６に調製したサンプル（塩酸処理物）を水で１、２、４、８、１０、１００倍希釈し、過酸化脂質ラジカル生成抑制活性を実施例１７−（１）と同様の方法で測定した。その結果、クエン酸処理物、塩酸処理物のどちらも１０倍希釈まで活性が確認され、どちらも同等の過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が確認された。
【０２７８】
実施例１８
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によるリンパ球幼若化反応に対するアガロビオースの抑制作用
ｄｄＹマウス（日本ＳＬＣ；オス、７週令）より脾臓を摘出し、細かく粉砕して１０％牛胎児血清（ハイクローン）を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ）に懸濁して単細胞液を得た。細胞浮遊液をプラスチックシャーレに播種して炭酸ガス培養器で３７℃、２時間培養し、接着性細胞をシャーレに接着させて除き、非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。細胞濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μｌ／ウェルで播種し、対照群以外の各ウェルに、各濃度のアガロビオースを添加した。さらに、全てのウェルに５μｇのＣｏｎＡ（ナカライテスク）を添加し、炭酸ガス培養器で３７℃、１日間培養した。培養後１μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、さらに１日間培養して細胞への取込み量を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０２７９】
その結果を図３４に示す。すなわち、図３４はＣｏｎＡによるリンパ球幼若化反応においてアガロビオース濃度と、３Ｈ−チミジン取込み量との関係を示す図であり、横軸はアガロビオース濃度、縦軸は３Ｈ−チミジン取込み量（ｃｐｍ）を示す。白棒グラフは刺激なしの場合の、斜線棒グラフはＣｏｎＡにより刺激した場合の３Ｈ−チミジン取込み量を示す。図３４から明らかなように、マイトジェン刺激のマウスリンパ球の増殖に対しアガロビオースは用量依存的な抑制作用を示し、１００μｇ／ｍｌでほぼ完全に抑え、リンパ球の活性化に対する抑制作用が認められた。また、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースにも同様の活性を認めた。
【０２８０】
実施例１９
混合リンパ球反応に対するアガロビオースの抑制作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ；オス、６週令）およびＣ５７ＢＬ／６マウス（日本ＳＬＣ；オス、６週令）より脾臓を摘出し、上記の方法により脾臓リンパ球を得た。各細胞浮遊液の濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調整し、１００μｌずつを混合して９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。対照群以外の各ウェルに、各濃度のアガロビオースを添加し、炭酸ガス培養器で３７℃、４日間培養した。培養後１μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、さらに１日間培養して細胞への取込み量を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０２８１】
その結果を図３５に示す。すなわち、図３５は混合リンパ球反応においてアガロビオース濃度と、３Ｈ−チミジン取込み量との関係を示す図であり、横軸はアガロビオース濃度、縦軸は３Ｈ−チミジン取込み量（ｃｐｍ）を示す。白棒グラフはいずれかの系統由来の細胞を単独で用いた場合の、斜線棒グラフは両系統由来の細胞を混合した場合の３Ｈ−チミジン取込み量を示す。図３５から明らかなように、アロ抗原刺激により活性化されたリンパ球に対してアガロビオースは用量依存的な抑制作用を示し、１０μｇ／ｍｌでほぼ完全に抑え、リンパ球の活性化に対する抑制作用が認められた。また、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースにも同様の活性を認めた。
【０２８２】
実施例２０
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７１）を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８穴マイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）と１０μｌの５０００、１５００、５００、１５０または５０μＭ  アガロビオースまたはネオアガロビオース（シグマ社製、Ｇ４４１０）水溶液を添加し、さらに１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分およびアガロビオースまたはネオアガロビオースを加えない区分を設定した。
【０２８３】
上記培養後、１００μl の培地に１００μl の４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
【０２８４】
この結果、アガロビオースは濃度依存的にＬＰＳによるＮＯ産生誘導を抑制し、ネオアガロビオースは抑制しなかった。その結果を図３６と図３７に示す。すなわち、図３６はアガロビオースを添加して各培養条件で培養した時の、培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図３７はネオアガロビオースを添加して各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図３６、図３７において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
【０２８５】
アガロビオースの代りに、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、カラビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースを用いても同様の結果が得られた。
【０２８６】
（２）市販の寒天（伊那寒天タイプＳ−７、伊那食品工業社製）５ｇを４５ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁して９５℃で１３分間処理した。室温まで冷却した後、ＮａＯＨで中和し、０．２２μｍのＭＩＬＬＥＸ−ＧＰフィルター（ミリポア社製、SLGPR25LS）でろ過した。この試料（寒天塩酸分解溶液）と実施例１１−（１）で得た寒天分解オリゴ糖溶液（寒天クエン酸分解溶液）について、実施例２０−（１）記載の方法でＮＯ抑制活性を測定した。すなわち、あらかじめ４８穴マイクロタイタープレートで培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、各ウエルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌのＬＰＳと１０μｌの上記試料の２０倍希釈液を加え、測定を行った。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分、上記試料を加えない区分および２．５ｍＭクエン酸を加えた区分を設定した。また、測定はすべて２連で行った。
【０２８７】
この結果、寒天塩酸分解溶液、寒天クエン酸分解溶液ともにＬＰＳによるＮＯ産生誘導を抑制した。その結果を図３８に示す。すなわち、図３８は寒天塩酸分解溶液、寒天クエン酸分解溶液を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図３８において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
【０２８８】
（３）実施例２０−（２）と同様の方法で、１００ｍＭ  ガラクトース（ナカライテスク社製、コード１６５−１１）、１００ｍＭ  ３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース（フナコシ社製、コードＧ０００２）水溶液を用いて、ＮＯ産生抑制活性の評価を行った。
【０２８９】
その結果、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースはＮＯ産生を抑制したが、ガラクトースは抑制しなかった。その結果を図３９に示す。すなわち、図３９は３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、ガラクトースを添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図３９において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
【０２９０】
（４）実施例２０−（１）記載のダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／mlになるように懸濁し、４８穴マイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１０時間培養した。ついで、１０μlの５,０００μＭアガロビオース水溶液を添加して、それぞれ１、２、４、６時間培養した。その後、培養上清を除去し、各ウェルに新たに上記ダルベッコ改良イーグル培地を５００μｌずつ加え、１０μｌの２．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ、８００Ｕ／ｍｌのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、コスモバイオ社販売、GZM-MG-IFN）水溶液を添加して１時間培養した。その後、培養上清を除去し、各ウェルに新たに上記ダルベッコ改良イーグル培地を５００μｌずつ加え、さらに１６時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を実施例２０−（１）記載の方法で行った。なお、対照としてＬＰＳ、ＩＦＮ−γ水溶液を加えない区分およびアガロビオースを加えない区分を設定した。また、測定はすべて２連で行った。
【０２９１】
この結果、アガロビオースは前もって細胞に添加されている時間が長いほど、ＮＯの産生を抑制した。すなわち、アガロビオースをあらかじめ細胞培養培地に添加しておくことで、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γで誘導されるＮＯの産生を抑制、予防できた。その結果を図４０に示す。図４０は各培養条件で培養したときの培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。図４０において横軸は培養条件を示し、縦軸はＮＯ２−濃度を示す。また、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースに同様の活性を認めた。
【０２９２】
実施例２１
（１）寒天粉末（和光純薬社製）を終濃度３％となるように５０ｍＭクエン酸溶液にいれ、９５℃、１６０分の加熱処理を行い、制がん試験用のオリゴ糖溶液を調製した。
【０２９３】
日本チャールスリバー社より４週令、雄性のヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＢａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕ）を購入し、１週間予備飼育した。このマウスにヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）を１．５×１０６細胞／マウスとなるように皮下移植した。
【０２９４】
大腸がん細胞株移植２週間目から、上記制がん試験用オリゴ糖溶液を使用直前にpＨ６．５に調整したものを週に５日、飲料水として自由に摂取させた。マウス１匹当り１日平均３．５ｍｌ摂取していた。また、飼育用餌としてオリエンタル酵母社製のＭＦを自由に摂取させた。
【０２９５】
オリゴ糖投与開始後４週間目にオリゴ糖投与群の各マウスの固形がんを摘出し、その重量を、通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較した。なお本試験は各群１０匹で行った。
【０２９６】
その結果、制がん試験用試料の経口投与群において有意ながん増殖抑制が認められ、寒天由来のオリゴ糖は経口投与において、強い制がん作用を示した。
【０２９７】
その結果を図４１に示す。すなわち、図４１は本発明のオリゴ糖の制がん活性を示す図であり、縦軸は固形がん重量（ｇ）、横軸は対照群、オリゴ糖投与群を示す。
【０２９８】
なお、制がん試験用試料中和物の経口投与群において、完全にがんが消失した個体が１例あった。
【０２９９】
（２）実施例１１−（１）記載の寒天オリゴ糖溶液を用い、エールリッヒ腹水がんに対する制がん試験を行った。
【０３００】
５週齢の雌性ｄｄＹ系マウス（体重約２５ｇ）を用い、エーリッヒがん細胞を腹腔内投与（１．２×１０６細胞／マウス）し、生存数より平均生存日数および延命率を算定した。
【０３０１】
マウスは１群８匹で対照群、実施例１１−（１）記載の寒天分解オリゴ糖溶液の３．３倍希釈液摂取群および１６．７倍希釈液摂取群の３群を設定した。すなわち、実施例１１−（１）にて調製した寒天分解オリゴ糖溶液のそれぞれの水希釈液を調製し、がん細胞投与の３日前より自由に飲水摂取させた。寒天分解オリゴ糖溶液の３．３倍希釈液摂取群の１日当たりの該希釈液摂取量は５ｍｌ／日／マウスであった。寒天分解オリゴ糖溶液の１６．７倍希釈液摂取群の１日当たりの該希釈液摂取量は６ｍｌ／日／マウスであった。なお、対照群は１日当たり７ｍｌ／マウスの水摂取であった。
【０３０２】
その結果、対照群では平均生存日数が１１．８日であったのに対し、寒天分解オリゴ糖溶液の３．３倍希釈液摂取群、および寒天分解オリゴ糖溶液の１６．７倍希釈液摂取群の平均生存日数は、それぞれ１９．８日および１４．４日であり、延命率はそれぞれ１６８％および１２２％と有意な延命効果が認められた。
【０３０３】
実施例２２
ウィスター系ラット（オス、５週齢、体重約１５０ｇ；日本エスエルシー）の腹腔内に１００μｇの卵白アルブミン（ＯＡ；シグマ社）および１ｍｌのアラム［商品名イムジェクト  アラム(Imject Alum)；ピアス社］を注射して感作し、１４日後に腹大動脈より抹消血を採取し、その血清を抗ＯＡ抗体とした。
【０３０４】
ウィスター系ラット（オス、７週齢、体重約２００ｇ；日本エスエルシー）の剃毛した背部に抗ＯＡ抗体 １００μｌを皮下投与して受動感作した。感作４８時間後に実施例１１−（１）記載の寒天分解オリゴ糖溶液またはその１０倍水希釈液２ｍｌを各郡４匹のラットの腹腔内に投与した。対照郡のラットには２ｍｌの水を腹腔内に投与した。
【０３０５】
投与３０分後に０．１％  ＯＡ、０．５％エバンスブルー（ナカライテスク）を含んだ生理食塩水１ｍｌを尾静脈より注射してＰＣＡを惹起した。抗原誘発３０分後にラットを断頭、放血死させ、背部の色素が漏出した部位を切除し回収した。
【０３０６】
回収した皮膚は１ｍｌの１Ｎ  ＫＣｌ（ナカライテスク）に浸して１晩放置した後、０．６Ｎ  Ｈ３ＰＯ４（メルク社）を含んだアセトン液（ナカライテスク）９ｍｌを加えて色素を抽出し、ＥＬＩＳＡリーダーで６２０ｎｍの吸光度を測定した。皮膚の漏出色素量はエバンスブルーの検量線より求めた。
【０３０７】
結果を図４２に示す。すなわち、図４２は本発明のオリゴ糖のＰＣＡ抑制を示す図であり、図中縦軸は色素漏出量（μｇ／部位）、横軸は使用した寒天分解オリゴ糖溶液を示す。
【０３０８】
図に示すように、寒天分解オリゴ糖溶液の投与により、ＰＣＡによる色素漏出は半分以下まで抑制され、対照に比べ有意の差（ｐ＜０．０５）を示した。
【０３０９】
また、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースに同様の効果を認めた。
【０３１０】
実施例２３
６穴プレートに５×１０４細胞／穴／２ｍｌ培地となるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁したマウスメラノーマ細胞Ｂ１６ＢＬ６を分注し、３７℃でインキュベートした。２日目に、１００μｌのアガロビオース溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７日目に培地を交換し、同時に１００μｌのアガロビオース溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。８日目に細胞を回収し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を分解処理した後、４００ｎｍの吸光度を測定し、メラニン産生抑制作用を検定した。
【０３１１】
すなわち、培地を吸引除去した後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した０．２５％トリプシンを１穴当り０．３ｍｌ添加し、３７℃で１０分インキュベートした。ついで、２ｍｌの新しい培地を添加し、細胞を懸濁して試験管に回収した。ついで、培地を遠心除去した後、２ｍｌのＰＢＳで細胞を懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去した後、細胞に３０μｌの５ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）と１μｌの７０,０００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を加えて良く混合した後、３７℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡを分解した。そして１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ加え、５０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを分解した。最後に１００μｇ／ｍｌのプロテイネースＫ（シグマ社製）、０．１％トリトンＸおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．８）を細胞数２×１０６に対して液の総量が２００μｌとなるように加え、３７℃で１６時間インキュベートした後、４００ｎｍの吸光度を測定した。
【０３１２】
結果を表１５に示す。表１５に示すようにアガロビオース５０、１００μｇ／ｍｌの濃度においてメラニン産生阻害活性が認められ、アガロビオースの美白効果が確認された。また、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオースおよび３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースに同様の効果を認めた。
【０３１３】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【０３１４】
以上記載したごとく、本発明によれば、アポトーシス誘発剤、制がん剤、活性酸素産生抑制剤、過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、ＮＯ産生抑制剤等の抗酸化剤、免疫調節剤の有効成分として有用な、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、そのアルデヒド体およびそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物ならびに該化合物を含有する可溶性の糖化合物、例えば、当該化合物含有物のpＨ７未満の酸性下での酸分解および／または酵素分解により生成するアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオース、３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトース等の機能性物質が提供される。
【０３１５】
これらの物質は、アポトーシス誘発用医薬、制がん用医薬、活性酸素産生抑制用医薬、ＮＯ産生抑制用医薬等の抗酸化用医薬、免疫調節用医薬、抗アレルギ用医薬の有効成分として有用であり、また、これらの糖化合物から選択される糖化合物を含有、添加および／または希釈してなる食品または飲料はアポトーシス誘発作用、制がん作用、活性酸素産生抑制作用、ＮＯ産生抑制作用等の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用を有する機能性食品または飲料として有用であり、がん患者やウイルス性疾患患者の病変細胞にアポトーシスを誘発し、これらの疾患の予防、症状改善に有効な食品または飲料が提供される。とりわけ、大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の上記化合物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞にアポトーシスを起こすことができるため、本発明の食品または飲料は消化器系がんの予防、症状改善に優れた効果を有している。さらに、その活性酸素産生抑制作用等の抗酸化作用により上記の食品または飲料は抗酸化ストレス用食品または飲料としても優れている。
【０３１６】
また本発明の機能性物質は、活性酸素産生抑制用の抗酸化用糖として有用であり、本発明の抗酸化用糖を含有、希釈および／または添加してなる食品または飲料は、活性酸素等の生体内酸化物質が起因となる疾病の症状改善用食品または飲料として有用である。さらに、本発明の食品または飲料はその有効成分である３，６−アンヒドロガラクトピラノースもしくはそのアルデヒド体またはそれらの２−Ｏ−メチル化体より選択される化合物および／または該化合物を含有する糖化合物の作用により、便秘改善または予防に効果を有する。
【０３１７】
本発明により提供される抗酸化用糖は食品または飲料に活性酸素産生抑制作用等の抗酸化性を付与する新機能性糖化合物として有用である。
【０３１８】
また、本発明の機能性物質は鮮度保持効果を有し、食品、生鮮物の味や鮮度の保持に極めて有用である。
【０３１９】
さらに、本発明の糖化合物を含有する化粧料は美白用、保湿用化粧料として有用である。
【０３２０】
本発明によれば、当該機能性物質を含有、希釈および／または添加してなる酸性食品または酸性飲料も提供されるが、該食品または飲料の製造方法においては、該機能性物質の含量に影響を及ぼす因子が実質的に除去されており、極めて有用性の高い、機能性物質の高含有食品または高含有飲料が得られる。さらに、有機酸存在下で製造される酸味料も呈味性、機能性に優れた新規酸味料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３２１】
【図１】図１は、寒天の０．１２Ｎ塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す図である。
【図２】図２は、寒天の１Ｎ塩酸分解物のゲルろ過の溶出図を示す図である。
【図３】図３は、寒天の酸分解物のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、アポトーシス誘発性および制がん性物質のマススペクトルを示す図である。
【図５】図５は、アポトーシス誘発性および制がん性物質（抱水体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】図６は、アポトーシス誘発性および制がん性物質（アルデヒド体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】図７は、アガロビオース、アガロテトラオースおよびアガロヘキサオースの順相ＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図８】図８は、６６．７分のピークのマススペクトルを示す図である。
【図９】図９は、７８．５分のピークのマススペクトルを示す図である。
【図１０】図１０は、８５．５分のピークのマススペクトルを示す図である。
【図１１】図１１は、３，６−アンヒドロ−Ｌ− ガラクトースのマススペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（抱水体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１３】図１３は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（アルデヒド体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】図１４は、終濃度２５０μＭのオリゴ糖を添加してＨＬ−６０細胞を培養したときの培養時間と生細胞数を示す図である。
【図１５】図１５は、終濃度１２５μＭのオリゴ糖を添加してＨＬ−６０細胞を培養したときの培養時間と生細胞数を示す図である。
【図１６】図１６は、０．５Ｍリン酸中で加熱処理を行った寒天の順相ＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図１７】図１７は、アガロビオースの検量線を示す図である。
【図１８】図１８は、０．２％寒天の０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液における加熱時間とアガロビオースの生成量との関係を示す図である。
【図１９】図１９は、０．２％寒天の０．１Ｍクエン酸溶液における加熱時間とアガロビオースの生成量との関係を示す図である。
【図２０】図２０は、５００ｍＭクエン酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２１】図２１は、５００ｍＭクエン酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２２】図２２は、１２００ｍＭ乳酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２３】図２３は、１２００ｍＭ乳酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２４】図２４は、１０００ｍＭリンゴ酸、８０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２５】図２５は、１０００ｍＭリンゴ酸、９５℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２６】図２６は、１０００ｍＭリンゴ酸、７０℃におけるアガロオリゴ糖生成を示す図である。
【図２７】図２７は、κ−カラゲナン酸分解物の順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２８】図２８は、アポトーシス誘発性および制がん性物質のマススペクトルを示す図である。
【図２９】図２９は、アポトーシス誘発性および制がん性物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３０】図３０は、セルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過の結果を示す図である。
【図３１】図３１は、セファデックスＬＨ−２０カラムによるゲルろ過の結果を示す図である。
【図３２】図３２は、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースのマススペクトルを示す図である。
【図３３】図３３は、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３，６−アンヒドロ−２−Ｏ−メチル−Ｌ−ガラクトースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３４】図３４は、ＣｏｎＡによるリンパ球幼若化反応においてアガロビオース濃度と３Ｈ−チミジン取込み量の関係を示す図である。
【図３５】図３５は、混合リンパ球反応においてアガロビオース濃度と３Ｈ−チミジン取込み量の関係を示す図である。
【図３６】図３６は、アガロビオースを添加して、各培養条件で培養した時の、培地中のＮＯ２ー濃度を示す図である。
【図３７】図３７は、ネオアガロビオースを添加して、各培養条件で培養した時の培地中のＮＯ２ー濃度を示す図である。
【図３８】図３８は、寒天塩酸分解溶液、寒天クエン酸分解溶液を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図３９】図３９は、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、ガラクトースを添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図４０】図４０は、各培養条件で培養したときの培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
【図４１】図４１は、本発明のオリゴ糖の制がん活性を示す図である。
【図４２】図４２は、本発明のオリゴ糖のＰＣＡ反応抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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