(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速、正確に染色体異常を検定することによって、検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断し、疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる染色体異常検出方法を提供する。【解決手段】（ａ）ゲノムライブラリーから収得した各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と；（ｂ）染色体異常の有無を確認する対象染色体部位を選定する段階と；（ｃ）前記（ａ）段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、対象染色体部位を検出できるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％で、プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、プローブは対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び（ｄ）プローブをマイクロアレイに固定する段階を含んで、染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイを製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と；
（ｂ）染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と；
（ｃ）前記（ａ）段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、
前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であり、
前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、
前記プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び
（ｄ）前記プローブをマイクロアレイに固定する段階を含む染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項２】
前記ゲノムライブラリーはＢＡＣ、ＨＡＣ、ＴＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１及びコスミドからなる群より選択されるベクターで製造されるものである、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項３】
前記（ａ）段階の同定はゲノムDNA断片の塩基序列、染色体上位置、その機能及び疾患連関性からなる群より選択される情報を確認することを含む、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項４】
前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１−１乃至１−３３８に記載したゲノムDNA断片からなる群より１種以上選択されるものである、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項５】
前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表２に記載したゲノムDNA断片からなる群より１種以上選択されるものである、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項６】
前記（ｂ）段階の対象染色体部位は疾患特異的変異性を含む、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項７】
前記（ｃ）段階のプローブは１０乃至３００kbpの大きさを含み、前記マイクロアレイにスポット当り２乃至１００pg濃度に固定される、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項８】
前記マイクロアレイは一つのスポットに１種または最少２種以上のプローブが固定される、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項９】
前記染色体異常は核酸序列変異、染色体数増幅、染色体数欠損、染色体逆位及び染色体転座からなる群より選択される、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項１０】
前記染色体異常は染色体数異常であり、
前記染色体数異常はダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-１６、症候群CMT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群よりなる群より選択される疾患である、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項１１】
前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表３の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表４の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表５の１乃至２８番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表６の１乃至７５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表７の１乃至１０番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-１６症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表８の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表９の１乃至２３５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１０の１乃至２９９番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１１の１乃至２３１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記プローブは明細書に記載された表１２の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１３の１乃至１３７番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１４の１乃至３２１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１５の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１６の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１７の１乃至２８２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表１８の１乃至７２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択されることを含む、請求項１に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
【請求項１２】
RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含むマイクロアレイ製造方法であって、
前記マイクロアレイは一つのスポット当り２種以上のプローブを含み、
前記一つのスポットに固定される２種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、
前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であるマイクロアレイ製造方法。
【請求項１３】
前記ゲノムDNAは下記表１の１乃至２５８５１番のBAC DNAまたは表２の１乃至１４４０番のBAC DNAからなる群より選択されるものである、請求項１２に記載のマイクロアレイ製造方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３番のいずれか一項による方法で製造された染色体異常検出用マイクロアレイ。
【請求項１５】
表１の１乃至２５８５１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップ。
【請求項１６】
明細書に記載された表２の１乃至１４４０番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップ。
【請求項１７】
明細書に記載された表３の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むダウン症候群検定用DNAチップ。
【請求項１８】
明細書に記載された表４の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むパトー症候群検定用DNAチップ。
【請求項１９】
明細書に記載された表５の１乃至２８番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むエドワード症候群検定用DNAチップ。
【請求項２０】
明細書に記載された表６の１乃至７５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むターナー症候群検定用DNAチップ。
【請求項２１】
明細書に記載された表７の１乃至１０番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むクラインフェルター症候群検定用DNAチップ。
【請求項２２】
明細書に記載された表８の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むATR-１６症候群検定用DNAチップ。
【請求項２３】
明細書に記載された表９の１乃至２３５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むCMT1A検定用DNAチップ。
【請求項２４】
明細書に記載された表１０の１乃至２９９番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む猫なき症候群検定用DNAチップ。
【請求項２５】
明細書に記載された表１１の１乃至２３１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むDiGeorge症候群検定用DNAチップ。
【請求項２６】
明細書に記載された表１２の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むHNPP疾患検定用DNAチップ。
【請求項２７】
明細書に記載された表１３の１乃至１３７番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むミラー・ディッカー症候群検定用DNAチップ。
【請求項２８】
明細書に記載された表１４の１乃至３２１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むプラダーウィリー症候群検定用DNAチップ。
【請求項２９】
明細書に記載された表１５の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むルビンシュタイン・テイビ症候群検定用DNAチップ。
【請求項３０】
明細書に記載された表１６の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むスミスマゲネス症候群検定用DNAチップ。
【請求項３１】
明細書に記載された表１７の１乃至２８２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むウィリアムズ症候群検定用DNAチップ。
【請求項３２】
明細書に記載された表１８の１乃至７２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むウォルフ・ヒルシュホーン症候群検定用DNAチップ。
【請求項３３】
明細書に記載された表２乃至表１８に記載されたゲノムDNA断片からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む産前/産後染色体異常検定用DNAチップ。
【請求項３４】
（ａ）請求項１乃至請求項１３のうちのいずれか一項による方法で染色体異常検出用マイクロアレイを製造する段階と；  
（ｂ）前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、検出可能な第１標識物質で標識した検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識した標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定する段階と；  
（ｃ）前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断する段階と；
を含む染色体異常検出方法。
【請求項３５】
前記第１標識物質及び第２標識物質は互いに異なる物質であるか同一物質である、請求項３４に記載の染色体異常検出方法。
【請求項３６】
前記標識物質は放射線同位元素、蛍光物質、化学発光体及び酵素からなる群より選択された物質である、請求項３４に記載の染色体異常検出方法。
【請求項３７】
前記検体は体液、組織または細胞であり、
前記体液は唾液、血液、小便、精液及び羊水からなる群より選択されるものである、請求項３４に記載の染色体異常検出方法。
【請求項３８】
前記（ｃ）段階において、
検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、
前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、または
前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体DNAの染色体異常を判断する、請求項３４に記載の染色体異常検出方法。
【請求項３９】
（ａ）ゲノムDNA断片内連続された２０乃至１００bpを含むプローブを選択し、これをマイクロアレイ上に固定する段階であって、
前記ゲノムDNA断片は明細書に記載された表１に記載されたBAC DNAまたは表２に記載されたBAC DNAから選択され、  
前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であり、
前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、
（ｂ）前記マイクロアレイ上のDNA層に、検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と；
（ｃ）前記混成化比率の測定結果から、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析する段階と；
を含む染色体異常検出方法。
【請求項４０】
前記マイクロアレイは一つのスポットに１種または２種以上のプローブを含む、請求項３９に記載の染色体異常検出方法。
【請求項４１】
前記染色体異常は染色体数異常であり、
前記染色体数異常はダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-１６、症候群CMT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群よりなる群より選択される疾患である、請求項３９に記載の染色体異常検出方法。
【請求項４２】
前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表３の１乃至３４番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表４の１乃至３４番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表５の１乃至２８番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表６の１乃至７５番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表７の１乃至１０番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-１６症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表８の１乃至１４１番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表９の１乃至２３５番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１０の１乃至２９９番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１１の１乃至２３１番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１２の１乃至１６５番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１３の１乃至１３７番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１４の１乃至３２１番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１５の１乃至１４１番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１６の１乃至１６５番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１７の１乃至２８２番からなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記（ａ）段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表１８の１乃至７２番からなる群より選択されることを含む、請求項３９に記載の染色体異常検出方法。
【請求項４３】
（ａ）RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階であって、
前記マイクロアレイは一つのスポット当り２種以上のプローブを含み、
前記一つのスポットに固定される互いに異なる序列を有するプローブは染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、
前記遺伝子表現型は増幅または欠損であり、
（ｂ）前記製造したマイクロアレイに、検出可能な第１標識物質で標識された検体試料及び検出可能な第２標識物質で標識された標準試料を同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上の検体試料及び標準試料の混成化比率を測定する段階と；
（ｃ）前記測定の結果、検体試料及び標準試料の混成化比率が同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増幅があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体試料の染色体異常を判断する段階と；
を含む染色体数異常疾患の診断方法。
【請求項４４】
前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記プローブは表３の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記プローブは表４の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記プローブは表５の１乃至２８番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記プローブは表６の１乃至７５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記プローブは表７の１乃至１０番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-１６症候群である場合、前記プローブは表８の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記プローブは表９の１乃至２３５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記プローブは表１０の１乃至２９９番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記プローブは表１１の１乃至２３１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記プローブは表１２の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記プローブは表１３の１乃至１３７番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記プローブは表１４の１乃至３２１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記プローブは表１５の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記プローブは表１６の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記プローブは表１７の１乃至２８２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記プローブは表１８の１乃至７２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーからなる群より選択されることを含む、請求項４３に記載の染色体数異常疾患の診断方法。
【請求項４５】
（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と;
（ｂ）前記（ａ）段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と;
（ｃ）前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と；
（ｄ）前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階と；
を含む疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。
【請求項４６】
前記検体DNA及び標準DNAは各々互いに異なる標識物または同一標識物で標識したことを特徴とする、請求項４５に記載の疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。
【請求項４７】
前記標識物は放射線同位元素、蛍光物質、化学発光体及び酵素からなる群より選択された物質である、請求項４６に記載の疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は染色体異常検定方法に関し、より詳しくは迅速、正確に染色体異常を検定することによって、検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断することができ、疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる染色体異常検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
染色体異常は遺伝子障害及び退行性疾患と関係があり、個別染色体の欠損または重複、染色体一部分の損失または重複、染色体の切れ、逆位及び転座などを示す。染色体異常は生物体の遺伝子均衡を破り、胎児死亡または深刻な精神的且つ肉体的欠陥を引き起こす。例えば、ダウン症候群は染色体２１番が３倍数に存在して引き起こされるもので、代表的な染色体数異常疾患である。その他にもエドワード症候群（１８+）、パトー症候群（１３+）、ターナー症候群（XO）及びクラインフェルター症候群（XXY）が染色体数異常疾患に属する。
【０００３】
染色体異常は核型分析（Karyotype）及びFISH（Fluorescent In Situ Hybridization）で診断される。前記方法は正確性に比べて、時間と労働が多くかかり、特に核型分析は細胞培養時間が多く要求される短所がある。また、FISHは分析対象が既存の塩基序列及び染色体内位置特性などが明らかになったものにのみ限定される短所がある。前記FISHの短所を解決した方法として、ゲノム混成化比較法（CGH）がある。CGHは全ゲノムを分析して染色体数異常を示す部位を検出する。しかし、CGHはFISHに比べて解像度が低い短所がある。
他の方法として、DNAマイクロアレイシステムを使用することができる。DNAマイクロアレイシステムはアレイ上に集積された生分子に応じてcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ及びゲノムマイクロアレイに分類される。cDNAマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイは製作が簡便な長所があるが、アレイ上に固定可能なプローブの数的限界、過剰なプローブの製作費用及びプローブ以外の部位における染色体異常を検査することが難しいという短所がある。これに反し、ゲノムDNAマイクロアレイはプローブの準備が容易で、染色体の広範囲な部分における染色体異常を検査することができ、染色体内イントロン部位における異常を検査することができるという長所があるが、機能及び染色体上の位置が確認された複数のDNA切片を準備することが難しい短所がある。
一方、BAC（Bacterial Artificial Chromosome）クローンは人間の全ゲノムが一定の大きさに挿入されたBACベクターを含む菌株で、各菌株は一つの人間DNA切片を含んでいて、挿入されたDNAの塩基序列及び染色体上の位置を分析することによって、特定染色体部位のDNA切片に対応するBACクローンを羅列することができる。したがって、特定DNA切片を各BACクローンから容易に収得することができる長所がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記従来技術の問題点を解決するために案出されたものであって、染色体異常検定用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、一つのスポットに２種以上のプローブが固定されたマイクロアレイ製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップを提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-１６（alpha−thalassemia retardation）症候群、CAT1A（Charcot-Marie-Tooth neuropathy 1A）、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP（Hereditary Neuropathy with liability to pressure palsies）疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ブビンステインテイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群及び産前-産後染色体異常からなる群より選択された疾患に対する検定用DNAチップを提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した染色体異常検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した染色体数疾患の診断方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した疾患に特異的な染色体異常を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために本発明は、（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、（ｂ）染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と、（ｃ）前記（ａ）段階の同定されたゲノムDNA断片のうちの、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であり、前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、前記プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び（ｄ）前記プローブをマイクロアレイに固定する段階を含む染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法を提供する。
【００１２】
また、本発明はRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含むマイクロアレイ製造方法であって、前記マイクロアレイは一つのスポット当り２種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される２種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であるマイクロアレイ製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は表１の１乃至２５８５１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップを提供する。
【００１４】
また、本発明は、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-１６症候群、CAT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ブビンステインテイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群及び産前-産後染色体異常からなる群より選択された疾患に対する検定用DNAチップを提供する。
【００１５】
また、本発明は（ａ）染色体異常検出用マイクロアレイを製造する段階、（ｂ）前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、標識した検体ゲノムDNA及び標識した標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定する段階と、（ｃ）前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断する段階を含む染色体異常検出方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は（ａ）ゲノムDNA断片内連続された２０乃至１００bpを含むプローブを選択し、これをマイクロアレイ上に固定する段階であって、前記ゲノムDNA断片は下記表１に記載されたDNAから選択され、前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であり、前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、（ｂ）前記マイクロアレイ上のDNA層に、検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、（ｃ）前記混成化比率の測定結果から、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析する段階を含む染色体異常検出方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は（ａ）RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階であって、前記マイクロアレイは一つのスポット当り２種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される互いに異なる序列を有するプローブは染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は増幅または欠損であり、（ｂ）前記製造したマイクロアレイに、検出可能な第こと標識物質で標識された検体試料及び検出可能な第２標識物質で標識された標準試料を同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上の検体試料及び標準試料の混成化比率を測定する段階と、（ｃ）前記測定結果、検体試料及び標準試料の混成化比率が同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増幅があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体試料の染色体異常を判断する段階を含む染色体数異常疾患の診断方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と、（ｃ）前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、（ｄ）前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階を含む疾患に特異的な染色体異常を検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の染色体異常検出方法は迅速、正確に染色体異常を検定することによって検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断することができる。また、本発明の方法は疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で言及する“生物体”は植物、昆虫、動物または人間を意味する。
本発明で言及する“ゲノムDNAマイクロアレイ”は生物体のゲノムDNA切片が固定されたマイクロアレイである。ゲノムDNAマイクロアレイは、ゲノムライブラリーを構成する各々のクローンから各々分離または増幅して収得した生物のゲノムDNA断片をプローブとして使用することができる。
【００２１】
本発明で言及する“クローン”は生物の全ゲノム断片を含むベクターに形質転換された細胞株を意味する。前記ベクター及び細胞株は通常のゲノムDNAライブラリーの製造時に使用されるベクター及び細胞株であり、代表的なベクターとしては、BAC（Bacterial  Artificial Chromosome）、HAC（Hμman Artificial Chromosome）、TAC（Transformation competent Artificial Chromosome）、YAC（Yeast Artificial Chromosome）、Pac（P1-derived Artificial chromosome）、P1（Phage）及びコスミドがあるが、これに限られるわけではない。BACベクターの例としてはpECBAC1及びpBeloBACIIがあり、PACベクターの例としてはpCYPAC1があり、YACベクターの例としてはpYAC4があり、コスミドの例としてはSuperCos-1があり、P1ベクターの例としてはpAd10sacBIIがある。前記ベクターの宿主は各ベクターによって適切に選択して使用することができ、例えば、E.coli、酵母、ウイルスがある。前記ゲノムライブラリー及びクローンは通常の方法によって製造することができる。
【００２２】
本発明で言及する“プローブ”はマイクロアレイ上に固定されて試料内に含まれている相同のDNAと混成化されるもので、DNA、RNA、cDNAまたはmRNAであってもよく、DNAの場合、オリゴマーであってもよい。プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であってもよく、好ましくは最大７０％、さらに好ましくは最大５０％、最も好ましくは最大４０％であり得る。プローブの大きさはゲノムDNAの場合１０乃至３５０ｋｂであってもよく、オリゴマーの場合、２０乃至３００bp、好ましくは２０乃至１００bpであり、cDNAまたはRNAの場合、１００bp乃至１０ｋｂであってもよいが、これらに限られるわけではない。プローブは塩基序列が生物体の全染色体で単一位置性を含むことが好ましい。
【００２３】
マイクロアレイ
本発明によるマイクロアレイはRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含む方法で製造することができる。前記マイクロアレイは一つのスポット当り１種または２種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される２種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含むことができ、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。
前記プローブはゲノムDNA断片であってもよく、前記ゲノムDNA断片から由来したRNA断片、cDNA断片またはオリゴマーであってもよい。プローブはマイクロアレイの目的によって適切な種類を選択して使用する。マイクロアレイは通常のマイクロアレイ製造方法と同様な方法で実施することができる。一実施例として、プローブはマイクロアレイ用基板に物理的結合または化学的結合によって固定する。前記基板は公知の全ての種類の物質であってもよく、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、前記基板表面にDNAを固定することができる反応基やニトロセルロースまたは３次構造形成物がさらに含まれてもよい。その例としては、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質がある。
【００２４】
プローブの固定は、通常のDNAマイクロアレイ製造方法で使用する方法によって実施することができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を使用することができる。
【００２５】
プローブはマイクロアレイ上の一つのスポット当り２乃至１００pgに固定することができ、スポット当り同一塩基序列からなる１種のプローブを固定したり、２種以上のプローブを混合して固定することができる。また、マイクロアレイ上のスポットは１倍数以上であってもよく、好ましくは２乃至３倍水で構成することができる。この時、スポットは円形または直径５０乃至５００μm、スポットの間隔は１０乃至５００μmであり得る。しかし、スポットの大きさ及び稠密度はマイクロアレイ分析システムの解像度によって適切に調節することが良い。
【００２６】
本発明のマイクロアレイはマイクロウェルプレート、例えば９６ウォールプレートのウォールに位置させ、既存の９６ウォールプレートを利用した自動装備（例、Biomek、Genetix  robo）に試料分子、標識、混成化及び洗浄過程を機械的に処理することができる。
【００２７】
ゲノムDNA断片
ゲノムDNA断片は、生物体の全染色体から目的とした大きさ及び目的とした塩基序列を含む形態に収得したり、生物体のゲノムライブラリーからクローニングしたりまたは化学的に合成することができる。
【００２８】
ゲノムDNA断片の大きさはゲノムDNAマイクロアレイの分析解像度によって調節できるが、平均１００乃至３５０kbの大きさを有する。全染色体上で起こる染色体異常の最少変化であるMicro-deletionが１Mbであることを勘案すれば、平均１００乃至３５０kb大きさのゲノムDNAで構成される本発明のBACチップは染色体異常を分析する時に非常に高い解像度を実現することができるのは自明なことである。
【００２９】
下記表１-１乃至表１-４０１及び表２は各BACクローン名、染色体上位置及び連関された遺伝子情報を記載しており、染色体上位置を利用して人間ゲノム序列が公開されたデータベース、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTサイト、特にhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&CLIENT=web&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=%28none%29&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTMl&NCBI_GI=on&PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=34&SET_DEFAULTS.y=8&SHOW_OVERVIEW=on&END_OF_HTTPGET=Yes&SHOW_LINKOUT=yes&GET_SEQUENCE=yesで各々のゲノムDNA塩基序列を確認することができる。
【００３０】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５６】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６４】
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【表１−６５】
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【表１−６６】
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【表１−６９】
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【表１−７０】
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【表１−７１】
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【表１−７２】
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【表１−７３】
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【表１−７４】
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【表１−７５】
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【表１−７６】
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【表１−７７】
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【表１−７８】
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【表１−７９】
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【表１−８０】
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【表１−８１】
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【表１−８２】
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【表１−８３】
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【表１−８４】
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【表１−８５】
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【表１−８６】
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【表１−８７】
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【表１−８８】
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【表１−８９】
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【表１−９０】
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【表１−９１】
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【表１−９２】
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【表１−９３】
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【表１−９４】
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【表１−９５】
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【表１−９６】
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【表１−９７】
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【表１−９８】
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【表１−９９】
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【表１−１００】
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【表１−１０１】
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【表１−１０２】
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【表１−１０３】
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【表１−１０４】
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【表１−１０５】
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【表１−１０６】
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【表１−１０７】
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【表１−３６３】
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【表１−３６４】
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【表１−３６５】
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【表１−３６６】
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【表１−３６７】
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【表１−３６８】
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【表１−３６９】
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【表１−３７０】
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【表１−３７１】
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【表１−３７２】
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【表１−３７３】
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【表１−３７４】
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【表１−３７５】
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【表１−３７６】
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【表１−３７７】
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【表１−３７８】
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【表１−３７９】
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【表１−３８０】
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【表１−３８１】
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【表１−３８２】
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【表１−３８３】
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【表１−３８４】
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【表１−３８５】
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【表１−３８６】
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【表１−３８７】
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【表１−３８８】
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【表１−３８９】
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【表１−３９０】
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【表１−３９１】
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【表１−３９２】
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【表１−３９３】
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【表１−３９４】
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【表１−３９５】
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【表１−３９６】
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【表１−３９７】
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【表１−３９８】
2006115844.tif 000399
【表１−３９９】
2006115844.tif 000400
【表１−４００】
2006115844.tif 000401
【表１−４０１】
2006115844.tif 000402
【００３１】
前記表１は、前記ゲノムライブラリーから収得したゲノムDNA断片を示したもので、ゲノムDNAマイクロアレイにプローブとして提供できる。前記ゲノムDNAマイクロアレイは、染色体異常診断の対象となる生物の全ゲノムに全て対応できる個数のゲノムDNA断片を含んだり、染色体異常を検定しようとする部位または目的遺伝子に対応するゲノムDNA断片を含む。生物の全ゲノムに対する染色体異常を診断しようとする場合、ゲノムDNA断片数は生物ゲノム大きさをゲノムDNA断片大きさに分けて算出することができる。例えば、人間を対象とした染色体異常ゲノムDNAマイクロアレイの場合、人間ゲノム大きさ３×１０９bpを平均１００乃至３５０kbのゲノムDNA断片に分けて見れば、約３０，０００乃至８５７個のゲノムDNA断片またはクローンが要求される。ゲノムDNA断片の大きさが大きいほど、要求されるゲノムDNA断片数またはクローンの数は減少する。前記表１のゲノムDNA断片は人間の全ゲノムを全て含む。
また、プローブとして下記表２のゲノムDNA断片を使用することができる。下記表２のゲノムDNA断片は人間の全ゲノムで特徴的な異常を示す頻度の高い部位のみを選別して示したもので、表２の１４４０個のBAC DNAを含むBACライブラリーは２００４年８月６日付で韓国生命工学研究院生物資源センターにKCTC10681BPとして寄託した。
【００３２】
【表２−１】
2006115844.tif 000403
【表２−２】
2006115844.tif 000404
【表２−３】
2006115844.tif 000405
【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
2006115844.tif 000410
【表２−９】
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【表２−１０】
2006115844.tif 000412
【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
2006115844.tif 000422
【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
2006115844.tif 000432
【表２−３１】
2006115844.tif 000433
【００３３】
ゲノムライブラリー
ゲノムライブラリーは公知の方法で容易に製造することができる。一実施例として、人間BAC DNAの場合、BACライブラリー製作、BACクローン内に挿入されたBAC DNAの一部序列分析、前記序列と同定された人間ゲノム序列との相同性分析によるBAC DNAの位置及び全塩基序列確認、FISH（（Fluorescent In Situ Hybridization）を利用したBAC DNAのゲノム上位置再確認及び各BACクローンからBAC DNA回収の段階を通じてBAC DNAを収得することができる。以下に各段階をさらに詳細に説明する。
【００３４】
（１）ゲノムライブラリー製作
人種別人間のゲノムを分離した後、制限酵素、例えばHindIII、BamHI及び/または超音波粉砕を処理して切断し、PFGE（Pulse Field Gel Electrophoresis）を通じて平均１００乃至３５０Kb大きさのDNA切れを収得する。これは同一制限酵素で処理されたBAC、PAC、P1、YACまたはコスミドベクターに挿入した後、宿主細胞、例えばE.coliに形質転換させる。前記方法で製造された各人間ゲノムDNA切れを含んでいる細胞株をクローンと言う。本発明者は前記方法で全９６，７６８クローンを製作した。
【００３５】
（２）挿入されたゲノムDNA断片の位置及び全塩基序列確認
各クローンに存在するゲノムDNA断片はバイオインフォマティクスを利用した相同性分析で、既に塩基序列が公知された人間ゲノム序列と相同性分析を実施する。この時、使用可能であった相同性分析データベースはNCBI、UC Santa Cruz、及びSanger Instituteがある。
【００３６】
相同分析のために、まず、クローンに形質導入したベクターに特異的なプライマーで末端序列分析し、挿入されたゲノムDNA断片の両末端序列を一部、例えば１００乃至７００bp序列分析する。前記過程はベクターの塩基序列及び切断地図が確認された状態であるので、本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に実施することができる。分析されたゲノムDNA断片の両末端序列を人間ゲノム序列が存在するデータベースに入力して相同性検索を実施し、一致する部位を確認することによってゲノムDNA断片の人間ゲノム上の位置及び全塩基序列を確認する。
【００３７】
（３）FISHを利用したゲノムDNA断片のゲノム上位置再確認
省略可能な段階であるが、ゲノムDNA断片のゲノム上の位置を再確認するために実施することができる。
ゲノムDNA断片をプローブとして使用し、これに蛍光標識した後、これを細胞分裂中期段階の人間染色体に反応させる。蛍光標識信号を認識してゲノムDNA断片の染色体上結合部を再確認する。
【００３８】
（４）クローンからゲノムDNA断片回収
公知の方法または市販されているゲノムDNA回収キットを利用して各クローンからゲノムDNA断片を回収する。
【００３９】
前記段階を通じて各クローン別に挿入されたゲノムDNA断片を同定する。これに各クローン別ゲノムDNA断片の特徴、つまり、染色体内位置、塩基序列、その機能、関連遺伝子または疾患情報を整理し、DNAチップの用途によって適切なゲノムDNA断片を選択して容易に準備することができる長所がある。特に、特定疾患診断用チップを製造しようとする場合、疾患発病または予後に染色体異常を示すと確認または推定されるゲノム部位に対応するゲノムDNA断片のみを各々のクローンから容易に回収することができる。
【００４０】
本発明の一実施例として、韓国人ゲノムに対するBACライブラリーから収得したゲノムDNA切片は前記表１の通りである。
【００４１】
染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造
本発明は染色体異常検出用DNAマイクロアレイに関し、その製造方法は（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、（ｂ）染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と、（ｃ）前記（ａ）段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階と、（ｄ）前記プローブをマイクロアレイに固定する段階とを含む。
【００４２】
前記（ａ）段階において、前記ゲノムDNA断片は前記表１に記載したゲノムDNA断片からなる群より１種以上選択することができ、好ましくは染色体異常を確認しようとする目的部位または疾患の種類によって適切なゲノムDNA断片を選別して使用することができる。
前記（ｂ）段階において、前記染色体異常は核酸序列変異、染色体数増幅、染色体数欠損、染色体逆位及び染色体転座からなる群より選択することができ、好ましくは染色体数異常である。染色体数異常疾患の例としては、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-１６症候群、CMT1A症候群、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群がある。
【００４３】
前記（ｂ）段階において、対象染色体部位は疾患特異的変異性を含む部位、例えば、疾患に特異的な染色体数増幅または欠損を示す染色体部位で、これは本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に採択することができる。
【００４４】
前記（ｃ）段階において、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片を選別する。この時、ゲノムDNA断片の染色体上位置、塩基序列、疾病関連性及び機能を分析して適切なゲノムDNA断片を選択する。好ましくは塩基序列内反復序列含有比率が最大８５％であり、ゲノムDNA断片を構成する塩基序列が染色体内単一位置性を有することをプローブとして選択することが良い。プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含むことができる。
【００４５】
前記（ｄ）段階は、選別したプローブをマイクロアレイ用基板に固定する段階で、これは通常の方法であり得る。例えば、プローブとしてゲノムDNA断片が挿入されたゲノムDNAライブラリーベクターのDNAを全て使用することができ、前記ゲノムDNA断片が挿入されたベクターDNAを超音波粉砕などの方法で部分的に切断したDNA切片を前記基板に固定することができる。このような方法はゲノムDNAマイクロアレイを製造する時の通常の方法であるので、本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に実施することができる。
本発明は以下の一実施例で染色体異常疾患別マイクロアレイまたはDNAチップ構成を例示する。
（１）ダウン症候群
ダウン症候群は核型別にtrisomy２１、モザイク型、転座型に分類され、各々が占める頻度は９３％、２〜３％、３〜５％である。本発明で診断しようとする核型はtrisomy２１である。
【００４６】
ダウン症候群診断用DNAチップは、表３の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００４７】
【表３−１】
2006115844.tif 000434
【表３−２】
2006115844.tif 000435
【００４８】
（２）パトー症候群
パトー症候群は核型trisomy１３を確認して診断する。
パトー症候群診断用BACチップは、表４の１乃至３４番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットにで固定することができる。
【００４９】
【表４−１】
2006115844.tif 000436
【表４−２】
2006115844.tif 000437
【００５０】
（３）エドワード症候群
エドワード症候群は核型trisomy１８を確認して診断する。
エドワード症候群診断用BACチップは、表５の１乃至２８番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００５１】
【表５−１】
2006115844.tif 000438
【表５−２】
2006115844.tif 000439
【００５２】
（４）ターナー症候群
ターナー症候群は核型４５、XOを確認して診断する。
ターナー症候群診断用DNAチップは、表６の１乃至７５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００５３】
【表６−１】
2006115844.tif 000440
【表６−２】
2006115844.tif 000441
【００５４】
（５）クラインフェルター症候群
クラインフェルター症候群は核型XXYを診断する。
クラインフェルター症候群診断用DNAチップは、表７の１乃至１０番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００５５】
【表７】
2006115844.tif 000442
【００５６】
（６）ATR-１６症候群
ATR-１６症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ATR-１６症候群診断用DNAチップは、表８の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００５７】
【表８−１】
2006115844.tif 000443
【表８−２】
2006115844.tif 000444
【表８−３】
2006115844.tif 000445
【表８−４】
2006115844.tif 000446
【００５８】
（７）CMT1A
CMT1A症候群は核型duplication17P12であるが、segmental trisomyを診断する。
CMT1A症候群診断用DNAチップは、表９の１乃至２３５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００５９】
【表９−１】
2006115844.tif 000447
【表９−２】
2006115844.tif 000448
【表９−３】
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【表９−４】
2006115844.tif 000450
【表９−５】
2006115844.tif 000451
【表９−６】
2006115844.tif 000452
【００６０】
（８）猫なき症候群
猫なき症候群は核型deletion 5P15.1-3を診断する。
猫なき症候群診断用DNAチップは、表１０の１乃至２９９番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００６１】
【表１０−１】
2006115844.tif 000453
【表１０−２】
2006115844.tif 000454
【表１０−３】
2006115844.tif 000455
【表１０−４】
2006115844.tif 000456
【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
2006115844.tif 000459
【表１０−８】
2006115844.tif 000460
【００６２】
（９）DiGeorge症候群
DiGeorge症候群は核型deletion 22q11.1-2を診断する。
DiGeorge症候群診断用DNAチップは、表１１の１乃至２３１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００６３】
【表１１−１】
2006115844.tif 000461
【表１１−２】
2006115844.tif 000462
【表１１−３】
2006115844.tif 000463
【表１１−４】
2006115844.tif 000464
【表１１−５】
2006115844.tif 000465
【表１１−６】
2006115844.tif 000466
【００６４】
（１０）HNPP疾患
HNPP疾患は核型deletion 17P11-12を診断する。
HNPP疾患診断用DNAチップは、表１２の１乃至１６５番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００６５】
【表１２−１】
2006115844.tif 000467
【表１２−２】
2006115844.tif 000468
【表１２−３】
2006115844.tif 000469
【表１２−４】
2006115844.tif 000470
【表１２−５】
2006115844.tif 000471
【００６６】
（１１）ミラー・ディッカー症候群
ミラー・ディッカー症候群は核型deletion 17P13.2-3を診断する。
ミラー・ディッカー症候群診断用DNAチップは、表１３の１乃至１３７番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００６７】
【表１３−１】
2006115844.tif 000472
【表１３−２】
2006115844.tif 000473
【表１３−３】
2006115844.tif 000474
【表１３−４】
2006115844.tif 000475
【００６８】
（１２）プラダーウィリー症候群
プラダーウィリー症候群は核型deletion 15q11-13を診断する。
プラダーウィリー症候群診断用DNAチップは、表１４の１乃至３２１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００６９】
【表１４−１】
2006115844.tif 000476
【表１４−２】
2006115844.tif 000477
【表１４−３】
2006115844.tif 000478
【表１４−４】
2006115844.tif 000479
【表１４−５】
2006115844.tif 000480
【表１４−６】
2006115844.tif 000481
【表１４−７】
2006115844.tif 000482
【表１４−８】
2006115844.tif 000483
【００７０】
（１３）ルビンシュタイン・テイビ症候群
ルビンシュタイン・テイビ症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ルビンシュタイン・テイビ症候群診断用DNAチップは、表１５の１乃至１４１番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００７１】
【表１５−１】
2006115844.tif 000484
【表１５−２】
2006115844.tif 000485
【表１５−３】
2006115844.tif 000486
【表１５−４】
2006115844.tif 000487
【００７２】
（１４）スミスマゲネス症候群
スミスマゲネス症候群は核型deletion 17P11.2を診断する。
スミスマゲネス症候群診断用DNAチップは、表１６の１乃至１６５からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００７３】
【表１６−１】
2006115844.tif 000488
【表１６−２】
2006115844.tif 000489
【表１６−３】
2006115844.tif 000490
【表１６−４】
2006115844.tif 000491
【表１６−５】
2006115844.tif 000492
【００７４】
（１５）ウィリアムズ症候群
ウィリアムズ症候群は核型deletion 7q11.2を診断する。
ウィリアムズ症候群診断用DNAチップは、表１７の１乃至２８２番からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００７５】
【表１７−１】
2006115844.tif 000493
【表１７−２】
2006115844.tif 000494
【表１７−３】
2006115844.tif 000495
【表１７−４】
2006115844.tif 000496
【表１７−５】
2006115844.tif 000497
【表１７−６】
2006115844.tif 000498
【表１７−７】
2006115844.tif 000499
【００７６】
（１６）ウォルフ・ヒルシュホーン症候群
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群は核型deletion 4P16.3を診断する。
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群診断用DNAチップは、表１８の１乃至７２からなる群より選択された１種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された２０乃至１００bpの１種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した１００bp乃至１０kbpの１種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。２種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
【００７７】
【表１８−１】
2006115844.tif 000500
【表１８−２】
2006115844.tif 000501
【表１８−３】
2006115844.tif 000502
【００７８】
また、本発明は一実施例として、産前/産後診断用DNAマイクロアレイを提供する。産前/産後診断用DNAマイクロアレイは通常の産前/産後診断にターゲットになる疾患または全染色体上の変異検出を目的とし、各疾患に関する染色体部位を検出することができるゲノムDNAまたは前記ゲノムDNAから由来したオリゴマー、cDNAまたはRNAをプローブとして含む。この時、産前/産後診断用DNAマイクロアレイは一つのアレイに各ターゲット疾患別染色体変異を検出することができるプローブが１種乃至複数種固定されていることもある。産前/産後診断にターゲットとなる染色体部位は、主に、１３、１８、２１、Ｘ及びＹからなる群より選択することができ、具体的な疾患としてはパトー、エドワード、ダウン、ターナー及びクラインフェルターがあるが、これに限られるわけではない。
【００７９】
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは染色体異常を最少２５０bp単位に検出することができるので解像度が非常に高く、既存の核型分析及びFISH方法に比べて簡便である。
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは挿入されたゲノムDNA断片の染色体内位置及び塩基序列が確認されたクローンからゲノムDNAチップの目的によって好ましいゲノムDNA断片を多量容易に確保することができる長所があり、生物のゲノム上染色体異常を容易に検出することができ、染色体異常がエキソン部位以外のイントロン部位で発生する場合まで検出でき、検出された染色体異常にから特定疾患との関連性を例示することができ、内因的または外部的要因による生物のゲノム変異様相を観察することができ、各疾患特異的診断チップを容易に提供することができ、人間種特異的または人間特異的な多様性を研究するのに非常に有用である。
【００８０】
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは染色体変異による疾患を診断することができ、特に染色体数異常による疾患及び癌を診断するのに非常に有用である。
【００８１】
一つのスポット当り２種以上のプローブが固定されたマイクロアレイ
本発明は１スポット当り２種以上のプローブが混合固定されたマイクロアレイに関する。１スポットに混用されるプローブの比率は各種類別同一比率であることができ、その対象はRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択することができる。前記一つのスポットに固定される２種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。前記ゲノムDNAは前記表１の１乃至２５８５１番からなる群より選択することができ、RNA断片、cDNA断片またはオリゴマーまた前記ゲノムDNAから由来したものであり得る。
【００８２】
マイクロアレイを利用した染色体異常検出方法
本発明の染色体異常検出方法は染色体異常検出用マイクロアレイを製造し、前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定した後、前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断することを含む。前記混成化比率において、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断しまたは前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析することができる。
【００８３】
前記プローブはゲノムDNA断片、オリゴマー、cDNAまたはRNAであってもよく、ゲノムDNAの例としては表１の記載されたゲノムDNA断片がある。
【００８４】
前記検体は人間または動物から収得した生体試料、例えば体液（例、唾液、血液、小便、精液、羊水など）、組織または細胞であり得、前記生体試料から通常の方法でDNAを抽出及び分離することができる。
【００８５】
前記第１標識物質及び第２標識物質は同一であるか互いに異なる物質であってもよく、例えば、互いに独立的に蛍光物質、放射能同位元素、化学発光体または酵素であり得る。その例としては、Cy３、Cy５、Alexa Fluor３５０、Alexa Fluor４３０、Alexa Fluor４８８、Alexa Fluor５３２、Alexa Fluor５４６、Alexa Fluor５９４、Alexa Fluor６５８、シアニン-３、シアニン-５、フルオレセイン、ボディピ、テキサスレッド、FITC（Fluorescein Isothiocyanate）、ローダミン、d-NTP（including d-UTP）、アミノ-アリル修正されたdNTPsを有する反応性染料、洋ワサビ過酸化酵素、ビオチンなどがある。
【００８６】
これをより詳細に説明すれば下記の通りである。
段階１:検体試料（ゲノムDNA）抽出
試料から通常の方法または公知のキットを利用してゲノムDNAを抽出する。検体ゲノムDNAは１００ng  乃至１ug準備する。
段階２:標識
検体と標準ゲノムDNAはランダムプライミングを通じて各々互いに異なる標識物で標識した後、標識された検体及び標準ゲノムDNAを収得する。
一例として、検体はCy３（青色）で標識し、標準ゲノムDNAはCy５（赤色）で標識することができる。
段階３:マイクロアレイチップに反応
標識された検体及び標準ゲノムDNAを１:１重両比に混合し、混合物はマイクロアレイに処理して反応させた後、洗浄する。
マイクロアレイに処理する混合物のDNA量は２００乃至２ugであってもよく、処理時の混合物は混成化緩衝液に懸濁して処理することができる。混成化緩衝液は公知の溶液を含む。また、BACチップは混合物処理前段階で、非特異的な混成化を防止することができる物質、例えばサケ精子DNAを反応させることができる。
段階４:分析
反応が完了したマイクロアレイは標識物質の検出可能なスキャナーに入れてスキャンした後、マイクロアレイ上に置かれたプローブ情報及びスポット位置が入力されたプログラムを利用して混成化の可否を分析する。
【００８７】
検体の染色体が正常である場合、プローブに混成化された検体及び標準ゲノムDNA比率は１:１であるので、スポットが黄色を示す。
【００８８】
検体の染色体が増幅された変異を有する場合、プローブに検体が標準ゲノムDNAに比べて高い比率に混成化されてスポットは青色を示す。
【００８９】
検体の染色体が欠損された変異を有する場合、プローブに標準ゲノムDNAが検体に比べて高い比率に混成化されてスポットは赤色を示す。
【００９０】
したがって、マイクロアレイ上の各スポットの蛍光を確認し、検体の特定DNA増幅または欠損変異を検出することができる。
【００９１】
疾患に特異的な染色体異常検出方法
また、本発明は疾患に特異的な染色体異常を検出する方法に関し、（ａ）生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と、（ｃ）前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第１標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第２標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、（ｄ）前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階とを含む。
【００９２】
前記方法で、各疾患別染色体異常有無及び異常部位が未確認された場合、疾患特異的染色体異常を容易に確認することができる。
【００９３】
一実施例として、人間ゲノムBACライブラリーから獲得したBACクローンを利用してBACチップを製造する。この時、BACチップ上を構成するBAC DNAは人間ゲノム全体に対応したりまたは特定染色体または遺伝子に対するものであり得る。
【００９４】
人間ゲノム全体に対応するBAC DNAで構成されたBACチップは下記の目的として使用することができる。
（１）検体のゲノム全体で染色体異常を検出して検体の健康状態及び検出された染色体異常が特定疾患との連関性が明らかになった場合、疾患診断に使用される。
（２）特定疾患性患者のDNAを検体として使用して分析し、特定疾患と連関性ある染色体異常を同定し、これをその後、同一疾患診断に有用な表示子として使用する。
（３）特定物質、例えば薬物または化合物によって引き起こされる染色体異常を分析する。
（４）個体または人種別ゲノム多様性を確認する。
特定染色体または遺伝子に対するBACチップはターゲットになる部位に対する染色体異常をより細密に検出するのに使用することができる。
【００９５】
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【００９６】
実施例１:BACクローンの製造
１-１.ゲノムライブラリー製造
韓国人のゲノムを分離した後、HindIII酵素処理とPFGEを通じて約１００Kb程度のDNA切れを得た。平均１００KbのDNA切れをBACベクターに結合した後、E.coli.宿主細胞に形質転換した。ここで、各々のDNA切れを含んでいるE.coli.細胞株をクローンと言い、前記ゲノムライブラリー製作を通じて全９６，７６８クローンを確保した（図１）。
【００９７】
１-１-１．ゲノム分離
韓国人の精液２０mlで全ゲノムDNAを抽出した後、アガロースゲル上に電気泳動して抽出されたDNAの質と量を分析した。
【００９８】
１-１-２.ゲノム断片化及び精製
ゲノムDNAをBamHIで切断した後、これをPFGゲルに電気泳動した後、１００Kb位置に展開された部分のみを取ってDNA切れを分離した。
【００９９】
１-１-３.形質転換
DNA切れをBACベクター（pECBAC1）のBamHIに挿入した後、これを宿主細胞（Competent cell、E.coli DH１０B BAC）に形質転換させた。その後、固体培地で培養して各々のクローンを収得した後、これを再び９６ウォールフォーマット細胞培養ブロットに接種して３７℃回転培養器で１８時間、３００rpmで培養した。
【０１００】
１-１-４.ライブラリー細胞原液製造
３８４ウォールプレートに６５％グリセロル２５μlを分け入れ、９６ウォール培養ブロットで培養した細胞２５μlを入れる（４個の９６ウォールフォーマット細胞培養ブロットで培養した細胞は一つの３８４ウォールプレートに集められて保管される）。前記３８４ウォールは上部を封して-７０℃に保管した。
【０１０１】
１-２.末端部塩基序列分析
BACベクターに特異的なプライマーで１００Kb DNA切れの両端５００bpを分析し、各クローン別挿入されたゲノムDNA情報を確認及び記録した。
【０１０２】
１-２-１．BAC DNAの分離
９６ウォール培養ブロットに１×LB１mlを入れ、ライブラリー細胞原液２μlを接種する。この時、３４８ウォールプレート一つに保管されている細胞は９６ウォール培養ブロット４個に分けて培養した。回転培養器で３７℃、１８時間、３００rpmで培養した後、各ウォール当り２５μlずつ５倍数に試料原液を製作した。残りは遠心分離（１０００rpm、１５分）して細胞を収得した。Montage mini-prep.キットを利用してDNAを回収した。
【０１０３】
１-２-２.序列分析
T７及びM１３Rプライマーを使用して各クローンに挿入されたゲノムDNA切れの両末端を分析し、ABL３７００自動序列分析機で塩基序列を判断した。
【０１０４】
１-３.生物情報学
分析した塩基序列は生物情報学技術を利用して人間ゲノムプロジェクトで明らかになった人間全ゲノム序列と相同性を比較した。前記過程を通じて各クローンが含んでいるBAC DNAのゲノム上位置と全塩基序列を明らかにした。
【０１０５】
１-３-１．Blast検索
分析した末端序列を利用してBlast検索したし、相同性分析で各クローンのゲノム上位置を確認した。
【０１０６】
１-３-２.遺伝子/マーカー選別
ゲノムライブラリーから収得した各クローン別ゲノムDNA切れのうち、癌関連遺伝子/STSマーカーを含むクローンを選別した。
【０１０７】
１-４.BACクローンの地図製作（BAC Clone mapping by FISH）
各BACクローンのゲノム上位置をより正確に確認するために、各BACクローン内含まれたゲノムDNA切れをプローブとして使用してFISHを実施した。FISH技法はDNAの相補的結合の原理を利用したもので、染色体の特定部位にのみ特異的に結合するプローブをガラススライド上に固定されている染色体に直接結合させることによって、染色体内プローブの位置を確認する。
確認されたBACクローン別ゲノムDNA断片の染色体位置は表１に示した。
【０１０８】
実施例２:BACチップの製造
２-１．BACチップの製作に使用されるクローンの選別
人間染色体の数的異常と関する特定遺伝疾患の診断を目的としてBACライブラリーで各染色体番号別に１４４０個のクローンを選別した。１４４０個のクローンは表１９に示した。
【０１０９】
【表１９−１】
2006115844.tif 000503
【表１９−２】
2006115844.tif 000504
【表１９−３】
2006115844.tif 000505
【表１９−４】
2006115844.tif 000506
【０１１０】
前記選別した全１４４０個のゲノムDNA断片各々の染色体位置及び全大きさは下記表２０及び図２Ａ-Ｈに示す。
【０１１１】
【表２０】
2006115844.tif 000507
【０１１２】
２-２．クローンからゲノムDNA断片分離
クロラムフェニコール溶液（１００％アルコール１００ml+クロラムフェニコール３４０mg）４００μlが含まれている１X LB（DIFCO，Cat.No ２４４６２０）８５mlに各BACクローン原液２μlを接種した。３７℃で１５時間２５０rpmで回転培養した後、６，０００rpm、４℃、５分遠心分離してペレットを収得した後、QUIAGEN-tip 1００（QIAGEN  plasmid midikit）を使用してDNAを抽出した。
【０１１３】
BAC DNA１mlのうちの８５０μlは超音波粉砕してスライド点滴DNAとして利用し、３μlはアガロースゲル上に電気泳動用として利用した。また、無作為に選別された一部BAC DNA２０μlはPFG（Pulse field gel electrophoresis）電気泳動検査用として利用した。
【０１１４】
２-２-１．アガロースゲル電気泳動
分離したBAC DNAを確認するために、蒸溜水に溶解したBAC DNA３μlを取ってNot I制限酵素処理して反応させ、０．８５％アガロースゲルに展開させた。展開様相を確認してゲノムDNA断片が含まれたBAC DNAを選別した。
【０１１５】
２-２-２．PFG電気泳動（CHEFF 162-00133、BIO-RAD）
一回BAC DNA抽出単位である４８個のBACクローンのうち、６個を無作為に選別してPFG電気泳動を実施し、６個のクローンの中で１個でも不良が出れば、一回抽出分量である４８個のBACクローンを再び抽出した。
【０１１６】
６-３．点滴
１４４０個のクローンから収得したゲノムDNA断片をマイクロアレイに点滴した。本実験では図３の１２個のサブアレイを利用しており、各サブアレイには３６０（３０×１２）個のスポットがあり、同一なゲノムDNA断片は横方向に３回点滴した。つまり、一つのサブアレイには１２０種類（３６０/３）の互いに異なるゲノムDNA断片が点滴されており、１２個のサブアレイには１４４０個のゲノムDNA断片が存在する。各サブアレイ別点滴されたゲノムDNA断片数及び標的染色体番号は下記表２１及び図４A-ｆに示した。
【０１１７】
【表２１−１】
2006115844.tif 000508
【表２１−２】
2006115844.tif 000509
【０１１８】
２-３-１．試料準備
BAC DNA溶液を遠心分離（１２，０００rpm、１０min）した後、上層液８５０μlを回収し、下記条件で超音波分解を実施した。
【０１１９】
-超音波分解条件-
時間:５秒、温度:２５℃、パルス:０．１/０．１
秒音波分解が終わった１４４０個のBAC DNA全てを１％のアガロースゲルに電気泳動して超音波分解がよく行われたかどうかを確認した。超音波分解されたDNAは０．５Kb乃至１０Kb位置に分布しなければならない。BAC DNA溶液はSpeedVAC（SAVANT、AES2010-220）で濃縮/乾燥させた後、蒸溜水４５μlに溶解した後、混合して粘性を確認した。粘性の高い試料は超音波分解を反復実施した。その後、点滴溶液（１００％DMSO、１．２ug/μlニトロセルロース）４５μlを添加し、３８４プレート（ウェル当り３０μl）に移動させる。空き空間には５０％のDMSO３０μlを満たす。
【０１２０】
前記準備した試料は一ヶ月以上保管する時-７０℃で、それ以下の期間に保管する場合-２０℃で保管する。使用前に解凍して２０００rpmで１分間スピンダウンして使用する。
【０１２１】
２-３-２．基板準備
２５mm×７５mm×１mm規格のガラス基板を準備した。ガラス基板はアミノ-シラン処理されたものである。
【０１２２】
２-３-３．点滴
Gene Machine Micro Grid１００を利用して基板のスポット当り５-１０pgに点滴した。この時、窒素シリンダー数値は１０３．４kPa乃至１３７．９kPaとし、真空ポンプを作動して７４．５kPa乃至１０１．６kPaを維持した。
【０１２３】
実験例１:染色体数異常分析
ダウン症候群、エドワード症候群、パトー症候群、ターナー症候群及びクラインフェルター症候群患者から各々の検体細胞を収得し、これを実施例２のBACチップに反応させた。
【０１２４】
（実験方法）
１．ゲノムDNAの抽出
血液から市販されるPuregene DNA isolation Kit（Gentra, Cat. No D5500A）を利用して５００ng  の検体DNAを収得した。また、標準細胞を対象として同様な方法で実施して標準試料を収得した。
２．プローブ標識
検体と標準試料各々は無作為的プライミングでCy３（Cy３-dCTP）及びCy５（Cy５-dCTP）各々で標識した後、QIAGEN社のpurification Kitで精製した。
【０１２５】
１）標識
（１）チューブにDNA（検体または標準試料）２１μl（５００ng）を取り入れ、２．５×ランダム反応バッファー２０μlを加える。
（２）チューブを１００℃の熱板で５分間沸かした後、直ちに氷上に５分間放置する。
（３）スピンダウン後、２mMのdNTP溶液を５μlずつチューブに入れる（２mMのdNTP溶液製造:１００mM dATP、dGTP、dTTPは各々２０μlずつ、dCTPは１０ずつ取り、これにTE３０μlを入れて互いによく混合する）。
（４）検体はCy３、標準試料はCy５を各々３μlずつ入れる。
（５）クレノー断片を１．２μlずつ入れる。
（６）ピペッティングして均一に混合した後、スピンダウンして３７℃のインキュベータで反応させる。
【０１２６】
２）スピンコラムを利用した精製（QIAGEN、Qiaquick PCR purification Kit）
（１）前記反応液５０μlに２５０μlのPB（結合緩衝液）を入れ、準備されたスピンコラムに落とす。
（２）スピンコラムを１３,２００rpmで１分３０秒間遠心分離する。
（３）スピンコラム内に７５０μlのPE（洗浄緩衝液）を入れる。
（４）スピンコラムを１３,２００rpmで１分３０秒間遠心分離する。
（５）２mlのチューブ内に集まった溶液を捨てる。
（６）遠心分離する。
（７）スピンコラムにEB（流出緩衝液）５０μlをコラム内に落とし、３分間常温に放置する。
（８）スピンコラムを１３,２００rpmで１分３０秒間遠心分離する。 
（９）EB３０μlをコラム内に落として３分間常温に放置する。
（１０）スピンコラムを１３,２００rpmで１分３０秒間遠心分離する
【０１２７】
３）エタノール沈殿
（１）検体DNA（Cy３ラベリング）８０μl、対照DNA（Cy５ラベリング  ）８０μl、Cot I DNA３０μl、３Mのクエン酸ナトリウム２０μl、冷たい１００％のエタノール５００μlを混合する。
（２）-２０℃で６０分間放置する。
（３）１３，０００rpm、４℃で２０分間遠心分離する。
（４）遠心分離後、紫色沈殿物が生じる。上層液を捨てる。
（５）冷たい７０％のエタノール５００μlを混合した後、１３，０００rpm、４℃で１０分間遠心分離する。
（６）上層液を捨ててスピンダウンした後、ピペットで残ったエタノールを除去する。
（７）暗室で１０分間放置する。
（８）沈殿物にアレイ混成化溶液４４μlとイーストｔRNA溶液４μlを入れる。３０分以上暗室放置すれば、沈殿物が溶けて紫色を浮かび、これをプローブ検液として使用する。
【０１２８】
４．混成化反応
-BACチップ前処理-
（１）ダイアモンドペンでBACチップの上下を表示する。
（２）ハイブリッド溶液３０μlにサケ精子DNA１０μlを添加する。
（３）混合物を７０℃の熱板で１０分間変性させた後、氷に５分間放置する。
（４）BACチップに混合物４０μlをローディングし、湿気のあるスライドボックスに入れて３０分間放置する。
（５）BACチップは３次蒸溜水に１０秒間浸して２回反復洗浄する。
（６）BACチップはイソプロパノールに洗浄した後、５５０rpmで５分間遠心分離してスライドを乾燥させる。
【０１２９】
-混成化-
（１）紫色のプローブ検液４４μlを７０℃の熱板で１５分間変性させた後、BACチップに反応させる。
（２）３７℃インキュベータで１時間放置する。
（３）ハイブリッド化溶液をローディングする。
（４）カバーガラスを２０×４０mmに覆う。
（５）スライドボックスに入れて約５rpmの振盪機上に置く。温度３７℃、湿度１００％に維持されたインキュベータで４８〜７２時間ハイブリッド化させる。
【０１３０】
-洗浄-
（１）５０％のホルムアミド及び２X SSCを含む溶液（pH７．３）を４６℃で加えてBACチップを１５分間洗浄する。
（２）２X SSC及び０．１％SDSを含む４６℃の溶液で３０分間洗浄する。
（３）PN緩衝液（０．２MのNa2HPO4（pH９．０）及び０．２MのNaH2PO4（pH４．３）を含む混合液（pH８．０）１００ml、蒸溜水１００ml及びNP40 ２００μl間遠心分離してスライドを乾燥させる。
【０１３１】
４．スキャニングと分析
BACチップをマイクロアレイチップ分析装置（MAC VIEWER、２等級、A661200）に挿入してスキャニングし、Cy３とCy５フィルターを通じて各々のスキャンイメージを得た。BACチップに点滴されたゲノムDNA断片に対する情報が入力されたBACチップ分析プログラム（Macrogen）を利用して前記スキャンイメージ結果を分析した。
【０１３２】
１）スキャニング
a.マイクロアレイチップ分析装置の使用前準備事項
マイクロアレイチップ分析装置をPCIが内蔵されたパソコンに連結する。パソコンの推奨仕様は次の通りである:
-IBMペンティアム（登録商標）III以上
-Windows（登録商標） NT４．０またはWindows（登録商標）２０００
-７６８MB RAM以上
-ハードディスク３０GB以上
-保存/再保存性CD-ROM
-１２８０×１０２４ディスプレイシステム（１６M colors）
スキャン時、チャンネルをCy３及びCy５に選択し、露出時間は１secを使用した。焦点を合せた後、スキャンし、ファイル名を指定して保存した。
【０１３３】
２）分析
スキャンファイルをBACチップに対し情報が入力された分析ソフトウェアであるBAC Chip Analysis Program（Macrogen）で実行し、Log Ratio Chartを求めた。
BACチップの最終実験結果は全上染色体（１番-２２番）とＸ、Ｙ性染色体を均等に含んでいる１４４０個のBACクローンに対するLog２ base T/R値を染色体順に示す。T/R値は検体の蛍光強度（CY３）を対照の蛍光強度（CY５）に分けた値で、二つの蛍光染料の強度が同一であれば、０の値、検体の蛍光強度が強ければ、０>０．２、そして対照群の蛍光強度が強ければ０<０．２になる。各染色体のLog２ base T/R値の平均値及び平均図表から各染色体の増幅または損失有無によって各染色体の数的変化を判別した。上染色体の場合、検体と対照群の染色体数が２個に全て同一であり、同じ蛍光強度を有するために染色体別平均値が０になり、特定染色体の増幅がある場合、当該染色体の平均値が０．２以上増加する。性染色体の場合、染色体数によって上染色体と同一様相を示すが、検体の性別を考慮して判断した。対照群は男性のDNAを使用するので、検体が男性のDNAである場合、上染色体と同様な方法で判定するが、検体が女性のDNAである場合にはＹ染色体の平均値が-０．４未満に示され、Ｘ染色体は約０．２以上増加する。各染色体の数的異常判定は以下の判定機準表２２による。
【０１３４】
【表２２】
2006115844.tif 000510
【０１３５】
（結果）
図５乃至１４は検体DNAに対する染色体数異常診断結果を示す図面である。図５はＸ染色体のLog２ T/R値が０．２より大きい０．４２１と確認され、検体の性別が女性であることを確認することができ、１３番染色体を除いた上染色体のLog２ T/R値が-０．２乃至０．２の間に属して正常であることが分かるが、１３番染色体は０．２７３であるので、１３番目染色体が増幅されたことが分かる。つまり、図５の結果はパトー症候群の女性患者であることを示す。
【０１３６】
図６では、１３番染色体のLog２ T/R値が０．３２であり、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．０１１、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-０．０７６であるので、パトー症候群の男性と診断される。
【０１３７】
図７は、１８番染色体のLog２ T/R値が０．３９０であり、Ｘ染色体のLog２ T/R値が-０．００４、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-０．１１８であるので、エドワード症候群の男性と診断される。
【０１３８】
図８は、１８番染色体のLog２ T/R値が０．３６７であり、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．３８０、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-１．２２７であるので、エドワード症候群の女性と診断される。
【０１３９】
図９は、２１番染色体のLog２ T/R値が０．２６３であり、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．４２８、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-１．１８６であるので、ダウン症候群の女性と診断される。
【０１４０】
図１０は、２１番染色体のLog２ T/R値が０．２６０であり、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．３４４、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-０．１４９であるので、検体DNAは２１番染色体が増幅されており、Ｘ染色体がさらに一つ増幅された核型XXYを有すると診断される。
【０１４１】
図１１は、Ｘ染色体のLog２ T/R値が-０．０７１であり、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-１．９８７であるので、核型XOを有するターナー症候群と診断される。
【０１４２】
図１２は、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．４４６であり、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-０．００９１であるので、核型XXYを有するクラインフェルター症候群と診断される。
【０１４３】
図１３は、Ｘ染色体のLog２ T/R値が０．３９５であり、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-１．１３１であるので、正常女性と診断される。
【０１４４】
図１４は、Ｘ染色体のLog２ T/R値が-０．０１０であり、Ｙ染色体のLog２ T/R値が-０．１０８であるので、正常男性と診断される。
【０１４５】
実験例２
実験例１と同様な方法で実施しており、単に検体及び対照群DNAの標識は全てCyｅ３とした。スキャン後、分析する時、スポット信号のLog２ T/R値を使用しており、表２２の基準によって分析した。図１５はダウン症候群検体DNAのBACチップ分析結果を示した図面で、２１番染色体が増幅された信号が観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】pECBAC1ベクターの切断地図である。
【図２Ａ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｂ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｃ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｄ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｅ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｆ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｇ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図２Ｈ】実施例２のBACチップに使用されたプローブの染色体内位置を示す図面である。
【図３】実施例２のBACチップの構成を示す図面である。
【図４Ａ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図４Ｂ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図４Ｃ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図４Ｄ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図４Ｅ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図４Ｆ】実施例２のBACチップで各染色体に特異的なプローブ位置を示す図面である。
【図５】パトー症候群女性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図６】パトー症候群男性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図７】エドワード症候群男性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図８】エドワード症候群女性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図９】ダウン症候群女性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１０】２１番染色体が増幅されており、Ｘ染色体がさらに一つ増幅された核型XXYを有する女性のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１１】ターナー症候群疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１２】クラインフェルター症候群疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１３】正常女性のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１４】正常男性のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１５】ダウン症候群女性疾患者のBACチップ分析結果を示す図面である。
【図１】
2006115844.tif 000511
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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