(57)【要約】【課題】  測定対象物質と同一のカテゴリーに属する物質を内部標準物質に設定し、該内部標準物質に異なる質量を持たせるためのタグを結合することにより、質量数精度の高い質量分析法を提供することを目的とする。【解決手段】  少なくとも１つの内部標準物質に異なる質量を持たせるためのタグを結合することにより、質量数精度の高い質量分析を可能とする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる内部標準物質を用いた質量分析法であって、前記内部標準物質の少なくとも１つに異なる質量を持たせるためのタグを結合したことを特徴とする質量分析法。
【請求項２】
内部標準物質と測定対象物質が同一のカテゴリーに属する物質であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
内部標準物質、測定対象物質がオリゴヌクレオチドもしくはその誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
内部標準物質、測定対象物質がペプチドもしくはその誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の質量分析法。
【請求項５】
異なる質量を持たせるために行うタグの結合が、オリゴヌクレオチドもしくはその誘導体の塩基もしくは糖部位に行うものであることを特徴とする請求項３に記載の質量分析法。
【請求項６】
異なる質量を持たせるために行うタグの修飾が、オリゴペプチドもしくはその誘導体のアミノ酸残基に行うものであることを特徴とする請求項４に記載の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部標準物質を用いた、オリゴヌクレオチド等の質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）法と飛行時間型（ＴＯＦ）質量計測法を組み合わせたＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳによって、生体高分子の分析が可能となり、操作の簡便性、感度の良さから、オリゴヌクレオチドやタンパク質の分析に広く利用されるようになった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
生体高分子の中でも、オリゴヌクレオチドはアンチセンス法（例えば、非特許文献２参照）やＲＮＡｉ（例えば、非特許文献３参照）などの遺伝子発現制御法やマイクロアレイ用のプローブとして使用されている。これらの手法は、オリゴヌクレオチドの塩基配列に依存した原理であるため、使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列中に欠損や置換などが存在する場合、結果に誤りが生じるだけでなく、将来的に医薬品として利用した場合では、重篤な副作用を引き起こす危険性も考えられる。これらから、遺伝子発現制御法やマイクロアレイに使用する“機能性”オリゴヌクレオチドの塩基配列を確認することの必要性は明らかであり、確認する手段としてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳが使用されることが多い（例えば、非特許文献４参照）。
【０００４】
しかし、マイクロアレイには、数百〜数万という多種のオリゴヌクレオチドが使用されており、融解温度（Ｔｍ）が一定となるように、鎖長やＧＣ含量が類似した設計となっているため、それらの質量は近接したものとなっている場合が多い。そのため、質量による判別を行うためには、精度の高い測定が必要となる。しかし、オリゴヌクレオチドは質量数数千〜数万という巨大分子であるため、低分子化合物と比較すると測定の質量数精度は低い。質量数精度を向上させる工夫として内部標準物質を使用する方法があり、内部標準物質に求められる条件としては、測定対象物質と同時に分析できること、測定対象物質と判別できる程度に質量が近いことなどが挙げられ、測定対象物質より質量の小さい物質と大きい物質をそれぞれ少なくとも１つずつ使用するのが一般的である。オリゴヌクレオチドを分析する際の内部標準物質には前記見地よりオリゴヌクレオチドが最適であるが、先に述べたマイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドの場合では、質量の近接するのものが多種使用されているため、容易に内部標準を設定することができない。
【０００５】
この課題を解決する手段として、異なる質量を持たせることのできるタグで対象とする物質を結合する方法が考えられる。例えば、特許文献１の方法では、固相担体に固定化したプライマーと鎖停止反応に使用するジデオキシヌクレオチドの少なくとも一方に質量タグとなる物質を結合することによって、測定の多様性を増大させている。ただし、特許文献１の方法は、主に、増幅伸長産物の質量差からジデオキシヌクレオチドに対応する塩基を判別する手法であるため、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる伸長反応が進行してしまえば良い。これに対し、遺伝子発現制御やマイクロアレイに用いられるオリゴヌクレオチドは、塩基配列特有のハイブリダイゼーション安定性を利用した原理であるため、オリゴヌクレオチドに修飾を行ってしまうと、ハイブリダイゼーション安定性に影響してしまい、本来の機能を果たすことができない恐れがある。
【特許文献１】特開２００３−２３０３９４号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９、２００３年、ｐ．３−１４
【非特許文献２】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ５、１９９７年、ｐ．５０３−５１０
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、１９９８年、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社ホームページ、［ｏｎｌｉｎｅ］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、測定対象物質と同一のカテゴリーに属する物質を内部標準物質に設定し、該内部標準物質に異なる質量を持たせるためのタグを結合することにより、質量数精度の高い質量分析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、上記課題を解決するための鋭意検討を進めた結果、少なくとも１つの内部標準物質に異なる質量を持たせるためのタグを結合することにより、質量分析の質量数精度を向上する方法が有効であるとの結論に至った。
【０００８】
すなわち、本発明の技術内容は以下の構成を備えることにより前記課題を解決できた。
【０００９】
（１）複数の異なる内部標準物質を用いた質量分析法であって、前記内部標準物質の少なくとも１つに異なる質量を持たせるためのタグを結合したことを特徴とする質量分析法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る質量分析によれば、機能性オリゴヌクレオチドの機能に影響することなく、精度の高い測定を行うことができ、遺伝子発現制御やマイクロアレイ用に用いられる機能性オリゴヌクレオチドの品質管理の分野で有効であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を適用した質量分析法について詳細に説明する。
【００１２】
先に述べたマイクロアレイ用の塩基数・塩基組成の類似した多種オリゴヌクレオチドを質量分析の対象物質とするような場合、個々のオリゴヌクレオチドを判別するためには、高い質量数精度での測定が必要となる。そこで、本発明では、内部標準物質を使用するわけであるが、オリゴヌクレオチドを分析する際の内部標準物質としては、オリゴヌクレオチドが最適である。オリゴヌクレオチドを内部標準物質として使用すれば、測定対象とするオリゴヌクレオチドと同時に分析することが可能である。
【００１３】
また、内部標準物質の質量は判別できる程度に測定対象物質の質量と近いことが好ましく、測定対象物質より質量の小さい物質と大きい物質をそれぞれ少なくとも１つずつ使用するのが一般的である。ただし、オリゴヌクレオチドは比較的質量の近接する核酸塩基（アデニン：３１３．２、シトシン：２８９．２、グアニン：３２９．２、チミン：３０４．２）から構成されているため、塩基組成を変化するだけでは、マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドに対する内部標準オリゴヌクレオチドを設定するのは困難である。そこで、本発明では、内部標準オリゴヌクレオチドの質量が、測定対象とするオリゴヌクレオチドの質量と異なる条件で測定を可能とするため、内部標準物質に異なる質量を持たせることが可能なタグを結合する。
【００１４】
たとえば、内部標準オリゴヌクレオチドにタグとしてフッ素（Ｆ）元素を１つ結合すると質量を１９変化することが可能である。同様に塩素（Ｃｌ）では３５．５、臭素（Ｂｒ）元素では７９．９、ヨウ素（Ｉ）元素では１２６．９だけ質量を変化することができる。これらのタグはオリゴヌクレオチドの塩基数以下であれば、複数個あるいは異なるタグを組み合わせて使用することも可能であり、さまざまな質量差を生じさせることが可能である。これらのタグは、オリゴヌクレオチドの合成時にタグを結合した核酸塩基を使用することで取り入れることができ、容易に導入が可能である。
【００１５】
また、タグを結合する場合の質量変化は増加のみであるため、計算が容易である事も利点の１つである。これに対し、塩基組成を変えることによってオリゴヌクレオチドの質量を変化する場合では、４つの塩基の質量差（９、１５、１６、４０）から生じる質量差であるため、生じる質量差に制限がある。また塩基の質量差の組み合わせを考える際、質量変化が増加・減少の両方であるため、非常に計算が煩雑である。
【００１６】
特に、核酸塩基の種類による質量差（９、１５、１６、４０）よりも大きく、塩基数を増減することによって生じる質量差（２８９．２、３０４．２、３１３．２、３２９．２）よりも小さい質量差を生じさせることが可能なタグを使用すれば、より測定対象オリゴヌクレオチドの質量に近い内部標準オリゴヌクレオチドを設定することが可能であり、質量数精度の高い測定が可能であると考えられる。
【００１７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
質量タグの結合によるオリゴヌクレオチドの質量改変
（１）質量改変オリゴヌクレオチドの作製
配列番号１および２に記載のオリゴヌクレオチドは塩基配列が異なるが、塩基数・塩基組成が同じであるため、質量はともに７６６６．１である。
【００１９】
配列番号１：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡ−３’
配列番号２：５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡ−３’
【００２０】
当然、これら配列番号１および２に記載のオリゴヌクレオチドを同時に質量分析することは不可能であるが、配列番号３〜１０に記載のオリゴヌクレオチドのように、異なる質量を持たせるためのタグとなる元素を少なくとも１つ結合することで配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドと異なる質量に改変することが可能である。
【００２１】
配列番号３：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｆ）Ａ−３’
配列番号４：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｃｌ）Ａ−３’
配列番号５：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｂｒ）Ａ−３’
配列番号６：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｉ）Ａ−３’
配列番号７：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｆ）ＡＣＧＵ（Ｆ）Ａ−３’
配列番号８：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｆ）Ａ−３’
配列番号９：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｂｒ）ＡＣＧＵ（Ｆ）−３’
配列番号１０：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＵ（Ｆ）−３’
※Ｕ（Ｆ）はデオキシウリジンの５位にフッ素元素を結合した塩基であることを示す。
※Ｕ（Ｃｌ）はデオキシウリジンの５位に塩素元素を結合した塩基であることを示す。
※Ｕ（Ｂｒ）はデオキシウリジンの５位に臭素元素を結合した塩基であることを示す。
※Ｕ（Ｉ）はデオキシウリジンの５位にヨウ素元素を結合した塩基であることを示す。
【００２２】
以上の各オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ受託合成会社（株式会社  Ｂｅｘ）に依頼し、合成した。
【００２３】
（２）質量改変オリゴヌクレオチドの質量分析
それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬとなるように超純水に溶解した配列番号１〜１０に記載のオリゴヌクレオチド水溶液をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ用ターゲットＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ  ３８４／４００μｍ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）のアンカー部にそれぞれ０．５μＬずつ滴下した。滴下した各オリゴヌクレオチド水溶液が乾燥した後、各スポットにＤＮＡ用マトリックス水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ  ３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、２ｍｇ／ｍＬ  Ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｉｔｒａｔｅ）を１．０μＬずつ滴下した。滴下したマトリックス水溶液が乾燥した後、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析装置（ａｕｔｏｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ社製）にて質量分析を行った。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2006300752.tif 000002
【００２５】
表１の結果から、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドの質量に対して、質量タグとしてハロゲン元素を結合した、配列番号３〜１０に記載のオリゴヌクレオチドは、各タグの質量に対応する質量差を生じたことが確認された。以上から、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドに質量タグを結合し、配列番号３〜１０に記載のオリゴヌクレオチドのように質量改変オリゴヌクレオチドとすることで、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドと同時に分析することが可能となり、本発明が内部標準オリゴヌクレオチドの設定時に有効な手段となることが示された。
【実施例２】
【００２６】
質量改変オリゴヌクレオチドを内部標準とした質量分析
配列番号１１〜１５に記載のオリゴヌクレオチドを質量分析によって判別する場合、内部標準オリゴヌクレオチドとして、通常、配列番号１６および１７に記載のオリゴヌクレオチドのように、ある塩基を置換したもの、もしくは、配列番号１８および１９のように塩基数を変更したものなどが考えられる。
【００２７】
配列番号１１：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧ−３’
配列番号１２：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ−３’
配列番号１３：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡ−３’
配列番号１４：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣ−３’
配列番号１５：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧ−３’
配列番号１６：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＴ−３’
配列番号１７：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＴ−３’
配列番号１８：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣ−３’
配列番号１９：５’−ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ−３’
【００２８】
先に述べた通り、塩基を置換する場合では、質量差が４種類の核酸塩基の質量差から生じるため、生じる質量差は小さい。特に、アデニンとチミンを置換した場合では、質量差は９しかなく、配列番号１１〜１５に記載のオリゴヌクレオチドを分析する際のピーク幅と同程度であり、内部標準オリゴヌクレオチドとして同時に分析することは困難である。また、複数の置換を組み合わせた場合でも、生じる質量差には制限がある。
【００２９】
塩基数を変更する場合では、塩基数を１つ変えることによって約３００の質量差を生じることしかできず、狭い質量範囲で内部標準オリゴヌクレオチドを設定することは困難である。特に、配列番号１１〜１５に記載のオリゴヌクレオチドのように塩基数が１ずつ異なるオリゴヌクレオチドを測定対象とする場合は、最も塩基数の小さい配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチドよりもさらに塩基数の小さいオリゴヌクレオチドと、最も塩基数の大きい配列番号１５に記載のオリゴヌクレオチドよりもさらに塩基数の大きいオリゴヌクレオチド、の２つしか設定することができない。
【００３０】
これらに対し、本発明では、質量タグを結合することによって、内部標準オリゴヌクレオチドとして配列番号２０〜２５のようなオリゴヌクレオチドを設定することが可能となる。
【００３１】
配列番号２０：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣ−３’
配列番号２１：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧ−３’
配列番号２２：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ−３’
配列番号２３：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡ−３’
配列番号２４：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣ−３’
配列番号２５：５’−ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｃｌ）ＡＣＧＵ（Ｉ）ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣ−３’
【００３２】
配列番号１１〜２５に記載のオリゴヌクレオチドを実施例１と同様の条件で質量分析を行った結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2006300752.tif 000003
【００３４】
表２より、質量タグを結合することで設定した内部標準オリゴヌクレオチド（配列番号２０〜２５）の質量は、塩基置換・塩基数変更によって設定した内部標準オリゴヌクレオチドの質量（配列番号１６〜１９）と比較して、測定対象であるオリゴヌクレオチド（配列番号１１〜１５）の質量と十分判別できる程度の質量差を有しており、かつ、狭い質量範囲で内部標準オリゴヌクレオチドの設定が可能あることが示された。
【００３５】
以上から、質量タグを結合することによって、複数の測定対象であるオリゴヌクレオチドに対する内部標準オリゴヌクレオチドを設定することが容易となることが示され、本発明の有効性が実証された。