(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速に蛋白質相互作用を解析する技術を確立し、高速・高感度な蛋白質相互作用解析を可能とした反応系を開発する方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む方法により、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙを無細胞系においてスクリーニングすることを可能とした；ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製する、ｂ）蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２における分割部位において、特定の蛋白質Ｘおよび候補物質を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２に各々結合させる、ｃ）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙのスクリーニング方法；
ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製する、
ｂ）蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２における分割部位において、特定の蛋白質Ｘおよび候補物質を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２に各々結合させる、
ｃ）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。
【請求項２】
以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙのスクリーニング方法；
ａ） 機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘをコードする遺伝子を各々調製し、該部分蛋白質Ａ１の分割部位において、蛋白質Ｘをコードする遺伝子を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１をコードする遺伝子に連結させた遺伝子を調製する、
ｂ）無細胞系において、ａ）で調製した遺伝子を発現させるとともに、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させ、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を調製する、
ｃ）無細胞系において、ｂ）で調製した蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。
【請求項３】
物質Ｙが蛋白質である、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
物質Ｙが低分子化合物である、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２と、蛋白質Ｘおよび候補物質の各々の結合および／または連結部位に１０００個以下のアミノ酸を挿入する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
工程ｂ）において、蛋白質Ｘおよび／または候補物質が翻訳後修飾された蛋白質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
物質Ｙが蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分と相互作用する物質であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙのスクリーニング方法；
ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を各々調製し、該部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする遺伝子の各分割部位において、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする遺伝子を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子に各々連結させた遺伝子を調製する、
ｂ）無細胞系において、ａ）で調製した遺伝子を発現させ、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を調製する、
ｃ）無細胞系において、ｂ）で調製した蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補蛋白質は蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙである、と判定する。
【請求項９】
工程ａ）において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子と、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子との各々の連結部位に１０００個以下のアミノ酸をコードする遺伝子を挿入する、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、蛋白質Ｘおよび／または候補蛋白質が翻訳後修飾された蛋白質であることを特徴とする、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
蛋白質Ｙが蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分と相互作用する蛋白質であることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
蛋白質Ｙが、蛋白質Ｙの翻訳後修飾部分において蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分に相互作用する蛋白質であることを特徴とする、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
翻訳後修飾が、リン酸化、糖鎖付加、および／または立体構造変化である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
工程ａ）をポリメラーゼ連鎖反応により行う、請求項２〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
機能を有する蛋白質Ａが転写関連蛋白質である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
転写関連蛋白質がＲＮＡポリメラーゼである、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
無細胞系が大腸菌抽出液である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
無細胞系がウサギ網状赤血球の溶出系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）抽出液、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、およびアフリカツメガエル卵母細胞抽出液から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
無細胞系が植物種子由来の胚芽抽出物を利用する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
植物種子がコムギ、オオムギ、イネ、コーンおよびホウレンソウから選択される、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
機能を有する蛋白質Ａの機能が転写機能である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
機能を有する蛋白質Ａの機能をレポーター遺伝子の発現レベルにより解析する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いる、蛋白質相互作用の検出方法。
【請求項２５】
請求項１〜７、および１１〜２３のいずれか１項に記載の工程に加え、少なくとも以下の工程を加えることを特徴とする、特定の蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚのスクリーニング方法；
ｅ）工程ｄ）において蛋白質Ａの機能が回復した場合において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させた蛋白質の相互作用を可能とする無細胞系の条件下、物質Ｚの候補物質を加え、該候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が変化した場合、候補物質は蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚである、と判定する。
【請求項２６】
請求項８〜２３のいずれか１項に記載の工程に加え、少なくとも以下の工程を加えることを特徴とする、特定の蛋白質Ｘと蛋白質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚのスクリーニング方法；
ｅ）工程ｄ）において蛋白質Ａの機能が回復した場合において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と蛋白質Ｙの融合蛋白質の相互作用を可能とする無細胞系の条件下、物質Ｚの候補物質を加え、候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が変化した場合、候補物質は蛋白質Ｘと蛋白質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚである、と判定する。
【請求項２７】
特定の蛋白質Ｘが疾病に関与する可能性がある蛋白質である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
物質Ｙが疾病に関与する可能性がある物質である、請求項１〜７、１１〜２５、および２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
蛋白質Ｙが疾病に関与する可能性がある蛋白質である、請求項８〜２４、２６および２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
物質Ｚが疾病に関与する可能性がある物質である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
以下のパーツを含むことを特徴とする、請求項１〜７、および１１〜２３、２５、２７、２８、および３０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの合成に用いるための試薬、
２）蛋白質Ａの機能を失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製するための試薬、
３）蛋白質Ａの分割部位において、部分蛋白質Ａ１およびＡ２に蛋白質Ｘおよび候補物質を各々結合するための試薬、
４）無細胞系で蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させるための試薬、
５）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
【請求項３２】
以下のパーツを含むことを特徴とする、請求項１〜７、および１１〜２３、２５、２７および２８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、および蛋白質Ｘをコードする各遺伝子を調製し、該部分蛋白質Ａ１をコードする遺伝子の分割部位において蛋白質Ｘをコードする各遺伝子を連結させた遺伝子を調製するための試薬、
２）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を合成するための試薬、
３）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させるための試薬、
４）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
【請求項３３】
以下のパーツを含むことを特徴とする、請求項８〜２３、２６、２７、２９、および３０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を調製し、該部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子の分割部位において蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を各々連結させた遺伝子を調製するための試薬、
２）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を合成するための試薬、
３）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質と蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を相互作用させるための試薬、
４）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
【請求項３４】
蛋白質Ｘおよび／または候補物質を翻訳後修飾するための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項３１または３２に記載の試薬またはキット。
【請求項３５】
蛋白質Ｘおよび／または候補蛋白質を翻訳後修飾するための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項３３に記載の試薬またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質相互作用検出方法に関する。より詳しくは、機能を有する蛋白質Ａの機能の失活および／またはその回復に基づいて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙを無細胞系においてスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子は、細胞あるいは個体の中で系統的に調節を受けて発現する。また、遺伝子から発現した多種類の蛋白質は、複雑に相互作用することで、細胞内及び細胞間で重要な働きをしている。蛋白質の相互作用が明らかになることは、医薬品の開発や農業での品種改良などにおいて非常に重要である。
【０００３】
特に、ヒトをはじめとする様々な生物のゲノム計画の終了に伴い、ゲノム計画で解析された遺伝子から発現される蛋白質の相互作用を解析することは、ゲノム機能の解析において極めて重要な研究課題となっている。また、機能を有する多種類の蛋白質を発現させる技術が確立されていないことも問題となっており、蛋白質の発現・相互作用を解析する技術の開発が求められている。しかしながら、従来の蛋白質の発現・相互作用解析技術では、迅速に蛋白質相互作用を解析することが困難である。
【０００４】
例えば、従来の蛋白質の発現・相互作用解析技術の主なものとしてＹｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ法（以下、Ｙ２Ｈ法）（非特許文献１）が知られている。Ｙ２Ｈ法は感度が高い反面、以下の理由から極めて擬陽性が出易く、Ｙ２Ｈ法による蛋白質相互作用の判定は実際上かなり困難である。  
【０００５】
Ｙ２Ｈ法では、蛋白質相互作用が細胞核内で、しかも転写装置の近傍で起こることが必要とされるため、Ｙ２Ｈ法は細胞質や特に細胞膜の蛋白質には不向きである。
また、Ｙ２Ｈ法では、蛋白質自身が転写活性を持つ場合も正確な評価ができない。さらに、Ｙ２Ｈ法では、哺乳類の蛋白質を酵母内でアッセイした場合、正確な蛋白質の折り畳みや翻訳後修飾が為されないこと、会合に必要な他の因子が存在しないことなどの理由から、実際には相互作用するにもかかわらず、該相互作用を同定できない場合がある。さらに、Ｙ２Ｈ法では、被検蛋白質がホモダイマーを形成する場合、ヘテロダイマーが競合することにより蛋白質相互作用が同定されない可能性がある。
【０００６】
また、Ｙ２Ｈ法は酵母細胞内で蛋白質を発現させて相互作用解析を行うため、致死遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質の相互作用を検出することは不可能である、という問題もある。
【０００７】
Ｙ２Ｈ法の他に、蛋白質相互作用検出法として、蛋白質アフィニティークロマトグラフィー法、免疫共沈降法、ファーウェスタン法、蛋白質／抗体アレイ、ＦＲＥＴ法、ファージディスプレイ法、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）、ＱＣＭ（水晶振動子）などがあるが、これまでに迅速に蛋白質相互作用を解析する技術は開発されていない。
【０００８】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】米国特許５，２８３，１７３
【非特許文献１】Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：ｐ．２４５−２４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、迅速に蛋白質相互作用を解析する技術を確立し、高速・高感度な蛋白質相互作用解析を可能とする反応系を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、無細胞系で蛋白質相互作用を検出する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下からなる。
１．以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙのスクリーニング方法；
ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製する、
ｂ）蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２における分割部位において、特定の蛋白質Ｘおよび候補物質を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２に各々結合させる、
ｃ）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。
２．以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙのスクリーニング方法；
ａ） 機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘをコードする遺伝子を各々調製し、該部分蛋白質Ａ１の分割部位において、蛋白質Ｘをコードする遺伝子を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１をコードする遺伝子に連結させた遺伝子を調製する、
ｂ）無細胞系において、ａ）で調製した遺伝子を発現させるとともに、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させ、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を調製する、
ｃ）無細胞系において、ｂ）で調製した蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。
３．物質Ｙが蛋白質である、前項１または２に記載のスクリーニング方法。
４．物質Ｙが低分子化合物である、前項１または２に記載のスクリーニング方法。
５．蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２と、蛋白質Ｘおよび候補物質の各々の結合および／または連結部位に１０００個以下のアミノ酸を挿入する、前項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
６．工程ｂ）において、蛋白質Ｘおよび／または候補物質が翻訳後修飾された蛋白質であることを特徴とする、前項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
７．物質Ｙが蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分と相互作用する物質であることを特徴とする、前項１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
８．以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙのスクリーニング方法；
ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を各々調製し、該部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする遺伝子の各分割部位において、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする遺伝子を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子に各々連結させた遺伝子を調製する、
ｂ）無細胞系において、ａ）で調製した遺伝子を発現させ、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を調製する、
ｃ）無細胞系において、ｂ）で調製した蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を相互作用させる、
ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補蛋白質は蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙである、と判定する。
９．工程ａ）において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子と、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子との各々の連結部位に１０００個以下のアミノ酸をコードする遺伝子を挿入する、前項８に記載のスクリーニング方法。
１０．工程ｂ）において、蛋白質Ｘおよび／または候補蛋白質が翻訳後修飾された蛋白質であることを特徴とする、前項８または９に記載のスクリーニング方法。
１１．蛋白質Ｙが蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分と相互作用する蛋白質であることを特徴とする、前項６〜１０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１２．蛋白質Ｙが、蛋白質Ｙの翻訳後修飾部分において蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｘの翻訳後修飾部分に相互作用する蛋白質であることを特徴とする、前項６〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１３．翻訳後修飾が、リン酸化、糖鎖付加、および／または立体構造変化である、前項１〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１４．工程ａ）をポリメラーゼ連鎖反応により行う、前項２〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１５．機能を有する蛋白質Ａが転写関連蛋白質である、前項１〜１４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１６．転写関連蛋白質がＲＮＡポリメラーゼである、前項１５に記載のスクリーニング方法。
１７．ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、前項１６に記載のスクリーニング方法。
１８．無細胞系が大腸菌抽出液である、前項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１９．無細胞系がウサギ網状赤血球の溶出系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）抽出液、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、およびアフリカツメガエル卵母細胞抽出液から選択される、前項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２０．無細胞系が植物種子由来の胚芽抽出物を利用する、前項１〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２１．植物種子がコムギ、オオムギ、イネ、コーンおよびホウレンソウから選択される、前項２０に記載のスクリーニング方法。
２２．機能を有する蛋白質Ａの機能が転写機能である、前項１〜２１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２３．機能を有する蛋白質Ａの機能をレポーター遺伝子の発現レベルにより解析する、前項１〜２２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２４．前項１〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いる、蛋白質相互作用の検出方法。
２５．前項１〜７、および１１〜２３のいずれか１項に記載の工程に加え、少なくとも以下の工程を加えることを特徴とする、特定の蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚのスクリーニング方法；
ｅ）工程ｄ）において蛋白質Ａの機能が回復した場合において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させた蛋白質の相互作用を可能とする無細胞系の条件下、物質Ｚの候補物質を加え、該候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が変化した場合、候補物質は蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚである、と判定する。
２６．前項８〜２３のいずれか１項に記載の工程に加え、少なくとも以下の工程を加えることを特徴とする、特定の蛋白質Ｘと蛋白質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚのスクリーニング方法；
ｅ）工程ｄ）において蛋白質Ａの機能が回復した場合において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と蛋白質Ｙの融合蛋白質の相互作用を可能とする無細胞系の条件下、物質Ｚの候補物質を加え、候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が変化した場合、候補物質は蛋白質Ｘと蛋白質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚである、と判定する。
２７．特定の蛋白質Ｘが疾病に関与する可能性がある蛋白質である、前項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．物質Ｙが疾病に関与する可能性がある物質である、前項１〜７、１１〜２５、および２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．蛋白質Ｙが疾病に関与する可能性がある蛋白質である、前項８〜２４、２６および２７のいずれか１項に記載の方法。
３０．物質Ｚが疾病に関与する可能性がある物質である、前項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．以下のパーツを含むことを特徴とする、前項１〜７、および１１〜２３、２５、２７、２８、および３０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの合成に用いるための試薬、
２）蛋白質Ａの機能を失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製するための試薬、
３）蛋白質Ａの分割部位において、部分蛋白質Ａ１およびＡ２に蛋白質Ｘおよび候補物質を各々結合するための試薬、
４）無細胞系で蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させるための試薬、
５）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
３２．以下のパーツを含むことを特徴とする、前項１〜７、および１１〜２３、２５、２７および２８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、および蛋白質Ｘをコードする各遺伝子を調製し、該部分蛋白質Ａ１をコードする遺伝子の分割部位において蛋白質Ｘをコードする各遺伝子を連結させた遺伝子を調製するための試薬、
２）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を合成するための試薬、
３）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させるための試薬、
４）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
３３．以下のパーツを含むことを特徴とする、前項８〜２３、２６、２７、２９、および３０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する蛋白質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキット；
１）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を調製し、該部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子の分割部位において蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を各々連結させた遺伝子を調製するための試薬、
２）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を合成するための試薬、
３）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質と蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を相互作用させるための試薬、
４）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
３４．蛋白質Ｘおよび／または候補物質を翻訳後修飾するための試薬をさらに含むことを特徴とする、前項３１または３２に記載の試薬またはキット。
３５．蛋白質Ｘおよび／または候補蛋白質を翻訳後修飾するための試薬をさらに含むことを特徴とする、前項３３に記載の試薬またはキット。
【発明の効果】
【００１２】
無細胞系を用いて蛋白質相互作用を検出する本発明の方法により、高速・高感度で簡便な蛋白質相互作用の解析が可能となる。また、本発明の方法によれば、致死遺伝子がコードする蛋白質の相互作用が調べられるようになるばかりでなく、被検蛋白質を精製しなくとも、該蛋白質のｃＤＮＡがあれば蛋白質相互作用の解析が可能となる。さらに、本発明の方法には、遺伝子のクローニングや遺伝子導入（コンピテントセルへの形質転換）の操作は必要ない、といった利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一態様は、以下の工程を含む、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙのスクリーニング方法である；ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製する、ｂ）蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２における分割部位において、特定の蛋白質Ｘおよび候補物質を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２に各々結合させる、ｃ）無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる、ｄ）蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する。
【００１４】
「蛋白質Ｘ」は特に限定されないが、例として天然型アミノ酸で構成される蛋白質、非天然型アミノ酸で構成若しくは一部に含む蛋白質、（合成）ペプチドが挙げられる。これらは天然物自体でも良いし、遺伝子組み換え産物でも良いし、さらにこれらの誘導体、断片であってもよい。加えて、これらは修飾されていてもよく、置換、欠失、付加という操作がおこなわれていてもよい。「物質Ｙ」およびその候補物質は特に限定されないが、例として蛋白質、低分子化合物が挙げられる。前記蛋白質としては、非天然型アミノ酸で構成若しくは一部に含む蛋白質、天然型アミノ酸で構成される蛋白質が挙げられる。
【００１５】
前記低分子化合物として、リガンドとして機能する低分子化合物、（合成）ペプチドまたは非ペプチド性などの合成低分子化合物が挙げられる。リガンドとは、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子のように蛋白質と特異的に結合する物質をいう。リガンドとして、細胞膜上に存在する種々の受容体と結合するレクチン、ホルモン、神経伝達物質などが挙げられる。
【００１６】
蛋白質Ｘおよび／または物質Ｙは翻訳後修飾された蛋白質であってもよい。翻訳後修飾は特に限定されないが、例としてペプチド鎖の切断、糖鎖や脂肪酸の付加、脂質修飾アセチル化、脱アセチル化、リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、メチル化、イソプレニル化、ユビキチン化、チロシンリン酸化、ファルネシル化、脱イミノ化、アミド化、グリコシル化、ビタミンなど補酵素の付加などが挙げられる。
【００１７】
蛋白質Ｘおよび／または物質Ｙが翻訳後修飾されている場合、物質Ｙは蛋白質Ｘの翻訳後修飾部位と相互作用する物質であってもよい。また、物質Ｙが物質Ｙの翻訳後修飾部位で蛋白質Ｘと相互作用する物質であってもよい。さらに、蛋白質Ｘおよび物質Ｙが各々の翻訳後修飾部位で相互作用してもよい。
【００１８】
機能を有する蛋白質Ａは、当業者が適用できる技術範囲で解析することができる機能を有する蛋白質であればいずれのものであってもよい。蛋白質Ａとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼなどの転写酵素、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＨ、トランスポゾン蛋白質、ＤＮＡ修飾蛋白質、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、メチラーゼ、並びに抗体などが挙げられる。ここで、「転写酵素」とは、ある核酸を鋳型として他の核酸を合成する、例えばゲノムＤＮＡの配列を鋳型としてｍＲＮＡを合成する酵素をいう。
【００１９】
Ｔ７ＲＮＡＰは、バクテリオファージＴ７由来のポリメラーゼである。Ｔ７ＲＮＡＰはＴ７プロモーターから特異的に転写を開始し、ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡを５´→３´方向に合成する酵素である。Ｔ７ＲＮＡＰの構造は、すでに結晶構造解析により決定している（Ｊｅｒｕｚａｌｍｉ  Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｔｚ  Ｔ．Ａ．，ＥＭＢＯ，１９９８，１７，ｐ．４１０１−４１０３）。Ｎ４ＲＮＡポリメラーゼは現在知られているＲＮＡポリメラーゼのなかで唯一、２つのドメインからなるヘテロ二量体性構造をしており、アミノ酸配列からＴ７ＲＮＡＰと同様の構造を持つと考えられている（Ｗｉｌｌｉｓ  Ｓ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０００，１８４，ｐ．４９５２−４９６１）。本発明において代表例として使用した、Ｔ７ＲＮＡＰのアミノ酸配列を配列番号１に、Ｔ７ＲＮＡＰのＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
【００２０】
本発明に用いる蛋白質Ａ及びＸ、当該蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体由来の生物学的試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。本発明に用いる蛋白質は、次の手法で調製することができる。
【００２１】
例えば、目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的な遺伝子工学的手法〔「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」，１９８９，コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８，丸善株式会社；Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２１９，ｐ．６６６−６７１；Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９，ストックトンプレス等を参照〕により取得可能である。
【００２２】
例えば、目的蛋白質の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、該蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該ｃＤＮＡライブラリーから該ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応〔以下、ＰＣＲ法（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２１９，ｐ．６６６−６７１）〕により増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、蛋白質Ａ又はＸを取得できる。
【００２３】
本発明に用いる蛋白質Ａ及びＸはまた、一般的な化学合成法により製造することができる。蛋白質の化学合成方法として、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られている。いずれの方法も利用可能である。化学合成により得られる該蛋白質はさらに、慣用の各種精製方法により適宜精製を行うことができる。
【００２４】
１．ａ）機能を有する蛋白質Ａの機能が失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製する工程について
機能を有する蛋白質Ａの「機能が失活する」とは、蛋白質の機能（活性）が再生可能に失われることをいい、蛋白質がその機能を発揮できない状態をいう。蛋白質の機能はその立体構造によって決定される。多くの蛋白質では、分割、加熱、加圧、ｐＨ値の変化、変性剤の添加などの操作により二次以上の高次構造が変化し、その機能（活性）を失う。これを蛋白質の変性という。多くの蛋白質において、変性は可逆的な過程であることが確認されている。
【００２５】
本発明の方法においては、蛋白質Ａを分割してその機能を失活させることが望ましい。蛋白質Ａの「分割」とは、蛋白質Ａを複数に分けることをいい、例えば二つに分けることができる。蛋白質Ａの分割部位としては、蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１に蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させた蛋白質が相互作用することにより、分割により失活していた蛋白質Ａの機能が回復することが可能となるような分割部位で蛋白質Ａを分割することが望ましい。
【００２６】
例えば、蛋白質Ａが複数の機能ドメインから構成されている場合、蛋白質Ａの機能を失活させるためには、蛋白質Ａの機能ドメインごとに分割することが望ましい。例えば、蛋白質ＡがＴ７ＲＮＡＰの場合は、Ｔ７ＲＮＡＰは２つのドメインからなるヘテロ二量体性構造をしていると考えられている為、２つのドメインごとに分割することが好ましい。より詳しくは、Ｔ７ＲＮＡＰを４４４〜４５７番目のアミノ酸の前後で２つに分割することが好適に例示される（図１）。
【００２７】
蛋白質Ａの分割方法としては、プロテアーゼ、臭化シアンによる切断などの蛋白質工学的手法、および遺伝子工学的手法が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、蛋白質Ａをコードする遺伝子を鋳型として用いて、部分蛋白質Ａ１およびＡ２を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲ法により、目的とする蛋白質の部分蛋白質をコードする遺伝子を合成し、無細胞系で発現させる方法が例示される。
【００２８】
２．蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２における分割部位において、特定の蛋白質Ｘおよび候補物質を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２に各々結合させる工程ｂ）について
この工程では、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２の各分割部位に、蛋白質Ｘおよび物質Ｙの候補物質を各々結合させる。部分蛋白質Ａ１が蛋白質ＡのＮ末端側（前半）部分であり、部分蛋白質Ａ２が蛋白質ＡのＣ末端側（後半）部分であった場合、分割部位は部分蛋白質Ａ１のＣ末端、部分蛋白質Ａ２のＮ末端に存在することになる。
【００２９】
部分蛋白質Ａ１およびＡ２と蛋白質Ｘ、および物質Ｙの候補物質の各「結合」として、イオン結合および共有結合などの化学結合、並びに、配位結合、ファンデルワールス結合および水素結合などの半永続的な結合が挙げられる。該結合は、部分蛋白質Ａ１とＡ２の相互作用、および蛋白質Ｘと候補物質との相互作用に作用しない結合であることが望ましい。結合方法としては、化学反応を利用する手法、蛋白質工学的手法、および遺伝子工学的手法などの当業者に周知の手法から、結合の性質に適した手法を用いることができる。
【００３０】
遺伝子工学的手法による結合の一例として、次のような方法を用いることができる；まず、部分蛋白質と蛋白質Ｘおよび候補物質を部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする各遺伝子を各々調製する。次に、該部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする遺伝子の各分割部位において、蛋白質Ｘおよび候補蛋白質をコードする遺伝子を蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１およびＡ２をコードする各遺伝子に連結させた各遺伝子をサブクローニング法またはＰＣＲ法により各々調製する。そして、各遺伝子を無細胞系で各々発現させることにより、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの融合蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２と候補蛋白質の融合蛋白質を調製することができる。
【００３１】
無細胞系とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（インビトロ）で蛋白質を合成する系をいう。無細胞系として、鋳型としてのｍＲＮＡからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのＤＮＡから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系が挙げられる。これら無細胞系としては、転写、若しくは転写及び翻訳に必要な成分を人工的に混合することにより構築されたもの、細胞抽出物からなる無細胞蛋白質合成系、又は両者を混合することにより構築されたものを用いることができる。無細胞系による蛋白質の合成は、通常、２５〜３７℃にて約１．５〜４時間反応させることにより行うことができる。
【００３２】
前記無細胞系は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、プロトプラスト等の植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞を主として脱核することにより得られ、転写及び翻訳に必要な各種成分が高含有されている。無細胞系として、大腸菌Ｓ３０抽出物又は植物種子由来の胚芽抽出物を含有するもの、ウサギ網状赤血球の溶出系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）抽出液、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、およびアフリカツメガエル卵母細胞抽出液等が好適に用いられる。
【００３３】
植物種子の一例として、コムギ、オオムギ、イネ、コーンおよびホウレンソウが挙げられる。また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた大腸菌等の細胞抽出液も好適に用いられる。
【００３４】
本発明の方法においては、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘ、およびＡ２と候補物質の各々の連結部位に、スペーサーとして好ましくは１０００個以下、より好ましくは１００個以下、さらに好ましくは５０個以下、特に好ましくは１０個以下のアミノ酸を挿入することが可能である。
【００３５】
３．無細胞系において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させる工程ｃ）について
特定の蛋白質Ｘと物質Ｙが「相互作用」する、とは、特定の蛋白質Ｘと物質Ｙがある様式により互いに作用を及ぼすことをいう。「ある様式」とは、結合、物理学的接触、近接等を含むものであり、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれのものであってもよい。
【００３６】
４．蛋白質Ａの機能を解析し該機能が回復した場合、候補物質は蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙである、と判定する工程ｄ）について
この工程は、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と、部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質の間で相互作用が認められる場合、分割により失活した蛋白質Ａの機能が回復する原理を用いる。当該原理の概略を図２に示す。判定方法としては、特に限定されるものではなく、当該蛋白質Ａの機能を利用し、当業者の技術範囲で適用できるものであればいずれの手法を用いてもよい。
【００３７】
判定方法の一例として、蛋白質Ａが転写因子である場合、蛋白質Ａのレポーター遺伝子の発現を解析する方法が挙げられる。このような蛋白質Ａの機能の解析に用いるレポーターの好適な例として、ペプチド、蛋白質、酵素が挙げられる。具体的には、蛍光タンパク質、色素タンパク質、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、 クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが好適に挙げられる。例えば、レポーターがペプチドおよび蛋白質の場合は吸光度測定により、蛍光蛋白質の場合は蛍光強度により、色素蛋白質の場合は吸光度測定または比色検出により、ルシフェラーゼの場合は発光検出により、酵素の場合は酵素活性による測定により、蛋白質Ａの機能を測定することができる。
【００３８】
レポーターとして蛍光蛋白質を用いた場合、蛍光強度の測定により蛋白質Ａの機能を解析することができる。この場合、蛋白質Ａの機能回復が認められた場合のみ、蛋白質Ａのレポーター遺伝子より蛍光蛋白質が発現される系となる。この系では、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と部分蛋白質Ａ２と候補物質を結合させた蛋白質の間で相互作用が起こらない場合、蛋白質Ａの活性はないため蛍光蛋白質は発現されない。したがって、前記蛋白質間で相互作用が起こった場合のみ、蛍光蛋白質が発現されて蛍光を発することとなる。
【００３９】
本発明において、蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘの結合蛋白質および蛋白質Ａ２と候補物質の結合蛋白質の発現、それらの相互作用反応、および蛋白質Ａの機能の解析は１つの試験管（無細胞系）内で同時に行うことができる。例えば、試験管内に前記両結合蛋白質をコードするｃＤＮＡを滴下した後、転写・翻訳反応を行い、ついでレポーター遺伝子の発現を行い、レポーター遺伝子産物の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、前記両蛋白質（蛋白質Ｘと候補物質）の相互作用を解析し、該相互作用が認められた場合、候補物質は蛋白質Ｘに相互作用する物質Ｙであると判定することができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより蛋白質Ｘと物質Ｙの蛋白質相互作用を検出することができる。また、検出された蛋白質相互作用をさらに確認するには、得られた相互作用する蛋白質の情報を基にその遺伝子をクローニングし発現させて、実験的に確認すればよい。さらに、例えば蛋白質Ｘおよび／または物質Ｙのアミノ酸配列において相互作用部位であると予測される部位のアミノ酸配列に変異などを公知の方法で導入し、相互作用出来なくなることを確認することで、該部位が相互作用部位であることを特定することもできる。
【００４１】
本発明の方法にさらに次の工程を加え、特定の蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚのスクリーニングすることができる；ｅ）工程ｄ）において蛋白質Ａの機能が回復した場合において、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に物質Ｙを結合させた蛋白質の相互作用を可能とする無細胞系の条件下、物質Ｚの候補物質を加え、該候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が変化した場合、候補物質は蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚである、と判定する。
【００４２】
「物質Ｚ」およびその候補物質は、特に限定されないが、例として蛋白質、低分子化合物が挙げられる。より詳しくは天然型アミノ酸で構成される蛋白質、非天然型アミノ酸で構成される蛋白質、受容体に対するリガンドとして機能する低分子化合物、合成ペプチドや非ペプチド性の合成低分子化合物などが挙げられる。
【００４３】
物質Ｚの候補物質は、部分蛋白質Ａ１と部分蛋白質Ａ２の相互作用に作用せずに、部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質、および部分蛋白質Ａ２と物質Ｙを結合させた蛋白質の相互作用に影響を与える物質であることが望ましい。また、物質Ｚは無細胞系の蛋白質合成量には影響しない物質であることが望ましい。
【００４４】
工程ｄ）では、物質Ｚの候補物質そのものを添加するか、または、物質Ｚの候補物質をコードする遺伝子を添加し無細胞系で発現させることにより、蛋白質Ａの機能の変化を観察することができる。
【００４５】
物質Ｚの候補物質の添加により「蛋白質Ａの機能が変化する」とは、該候補物質の添加により、蛋白質Ａの機能が促進または抑制されることを示す。物質Ｚの候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が促進された場合、該候補物質は蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を促進する物質である、と判定することができる。また、物質Ｚの候補物質の添加により蛋白質Ａの機能が抑制された場合、該候補物質は蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を阻害する物質である、と判定することができる。
【００４６】
本発明の方法は疾病に関与する物質のスクリーニング方法として用いることができる。例えば、蛋白質Ｘが疾病に関与する蛋白質である場合、蛋白質Ｘに相互作用する物質Ｙの情報を元に、自体公知の方法を用いて、該疾病の治療剤および／または予防剤、診断剤に適用することが可能である。また、蛋白質Ｘと物質Ｙの相互作用を調整する物質Ｚの情報を元に、自体公知の方法を用いて、該疾病の該疾病の治療剤および／または予防剤、診断剤に適用することが可能である。
【００４７】
本発明の一態様は、以下のパーツを含むことを特徴とする、本発明のスクリーニング方法を用いて、特定の蛋白質Ｘと相互作用する物質Ｙをスクリーニングするための試薬またはキットである；１）機能を有する蛋白質Ａの合成に用いるための試薬、２）蛋白質Ａの機能を失活するように蛋白質Ａを分割した部分蛋白質Ａ１およびＡ２を調製するための試薬、３）蛋白質Ａの分割部位において、部分蛋白質Ａ１およびＡ２に蛋白質Ｘおよび候補物質を各々結合するための試薬、４）無細胞系で蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ１と蛋白質Ｘを結合させた蛋白質と蛋白質Ａの部分蛋白質Ａ２に候補物質を結合させた蛋白質を相互作用させるための試薬、５）蛋白質Ａの機能を解析するための試薬。
【００４８】
本発明の別の一態様は、上記のパーツに加えてさらに、蛋白質Ｘおよび／または物質Ｙを翻訳後修飾するための試薬をさらに含むことを特徴とする試薬またはキットである。このような試薬として、リン酸化酵素、小胞体、ゴルジ体、糖転移酵素、シャペロン蛋白などが挙げられる。
【実施例１】
【００４９】
結合することが既知であるポリペプチドｇａｌ４およびｇａｌ１１を、機能が失活するように分割されたＴ７ＲＮＡＰの各分割部位に各々結合させた融合蛋白質をコードする各遺伝子を調製し、無細胞系で各々発現させ、Ｔ７ＲＮＡＰの機能が回復するか否かを解析した。
【００５０】
ｇａｌ４、ｇａｌ１１はともに酵母の転写因子である。ｇａｌ１１（野生型）の変異型としてｇａｌ１１Ｐを用いた。  ｇａｌ１１Ｐは、ｇａｌ１１の３４２番目のアミノ酸であるアスパラギンをバリンに置換ものである。ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐは相互作用するのに対して、ｇａｌ４およびｇａｌ１１（ＷＴ：野生型）は相互作用しないことが知られている（Ｄｏｖｅ，  Ｓ．  Ｌ．  ＆  Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄ，Ａ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９８、１２，ｐ．７４５−７５４．；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，ｐ．２３５９−２３６７．；Ｊｏｕｎｇ  Ｊ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，２０００，９７，ｐ．７３８２−７３８７）。
【００５１】
本発明において使用できるｇａｌ４のアミノ酸配列を配列番号３に、ｇａｌ４のＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、ｇａｌ１１のアミノ酸配列を配列番号５に、ｇａｌ１１のＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。
【００５２】
＜方法＞
図１に示すように、Ｔ７ＲＮＡＰの４４４〜４５７番目のアミノ酸〔ＧＫＰＩＧＫＥＧＹ（１文字表記）〕をＮ４ＲＮＡポリメラーゼＩＩのアミノ酸配列〔ＫＥＶＩＣＭＱＴＦＴＡＲ（１文字表記）〕に置換し、置換部分のアミノ酸ＤとＭとの間でＴ７ＲＮＡＰを２分割したＤＮＡを調製した。次に、各分割部位にそれぞれ２種類のポリペプチドｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐの部分配列を３個のアラニンを介して配置させた各ＤＮＡを各々調製した。
【００５３】
１．Ｔ７ＲＮＡＰの前半部分の作製
Ｔ７バクテリオファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型核酸として用い、Ｃ１３−Ｆｄ１およびＣ１３Ｒｖ２−ＰＰプライマーでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応で用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社製）、ＰＣＲ反応用バッファーは製造業者のユーザーマニュアルの指示に従い調整した（カタログコードＲＲ００１Ａ）。反応温度はサーマルサイクラー９７００（アプライドバイオシステムズ社製）上でプログラムした。ＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、３分］を１サイクル、［９４℃、１５秒、５５℃、３０秒および７２℃、３０秒］を５サイクル、［９４℃、１５秒、６５℃、３０秒および７２℃、３０秒］を２０サイクル、［７２℃、２分］を１サイクル行った後、４℃にて静置。
【００５４】
２． Ｔ７ＲＮＡＰの後半部分の作製
上記した前半部分と同様に、Ｔ７バクテリオファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型核酸として用い、Ｃ１３−Ｆｄ３およびＣ１３Ｒｖ４プライマーでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応で用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社製）、ＰＣＲ反応用バッファーは製造業者のユーザーマニュアルの指示に従い調整した（カタログコードＲＲ００１Ａ）。反応温度はサーマルサイクラー９７００（アプライドバイオシステムズ社製）上でプログラムした。ＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、３分］を１サイクル、［９４℃、１５秒、５５℃、３０秒および７２℃、３０秒］を５サイクル、［９４℃、１５秒、６５℃、３０秒および７２℃、３０秒］を２０サイクル、［７２℃、２分］を１サイクル行った後、４℃にて静置。
【００５５】
Ｔ７ＲＮＡＰの部分蛋白質の作製のために用いたＰＣＲ用プライマーは以下である。
Ｃ１３−Ｆｄ１：５´−ａｔｇａａｃａｃｇａｔｔａａｃａｔｃｇｃｔａａｇａａｃｇ−３´（配列番号７）
Ｃ１３−Ｒｖ２−Ｐ：５´−ａｔｃａａｔｔａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｃａｇｃａａａｔｔｃａａｇｃａｇｔｃｃｔｔｔｇ−３´（配列番号８）
Ｃ１３−Ｆｄ３：５´−ａｔｇｃａａａｃｔｔｔｔａｃｔｇｃｃｃｇｔｔａｃｔｇｇｃｔｇａａａａｔｃｃａｃｇｇｔｇ−３´（配列番号９）
Ｃ１３−Ｒｖ４：５´−ｔｔａｃｇｃｇａａｃｇｃｇａａｇｔｃｃｇａｃｔｃｔａａｇａｔｇｔ−３´（配列番号１０）
【００５６】
３． ｇａｌ４、ｇａｌ１１およびｇａｌ１１Ｐの部分配列の増幅
ｇａｌ４、ｇａｌ１１Ｐ遺伝子はプラスミド（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社製）、ｇａｌ１１（野生型）は酵母（ＡＴＣＣ  ７６６２４）ゲノムを鋳型として用いＰＣＲ法にて得た。ＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、２分］を１サイクル、［９４℃、３０秒、６３℃、３０秒、および７２℃、３０秒］を３０サイクル、［７２℃、２分］を１サイクル行った後、４℃にて静置。
【００５７】
ｇａｌ４、ｇａｌ１１およびｇａｌ１１Ｐの部分配列の増幅のために用いたプライマーは以下である。
ｇａｌ４−Ｆｄ：５´−ｇａａｔｃａａｇｇｃｔａｇａａａｇａｃｔｇｇａａｃａｇ−３´（配列番号１１）
ｇａｌ４−Ｒｖ：５´−ａａａｔａａｔｃｃｔｇｔｔａａｃａａｔｇｃｔｔｔｔａｔａｔｃｃｔｇｔａａａｇａａｔｃｃ−３´（配列番号１２）
ｇａｌ１１−Ｆｄ：５´−ｃｃｔｃａａｃａｇｃａｇｃａａａｔｇｃａａｃｃ−３´（配列番号１３）
ｇａｌ１１−Ｒｖ：５´−ｃａａａｇｃｔｔｇｇａｔｔｔｔｔｃｔｃａｇｇｇｃｃ−３´（配列番号１４）
【００５８】
４． ｇａｌ４、ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰとの連結
４−１．ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰとの連結
ｇａｌ１１、ｇａｌ１１Ｐ部分配列は、下記プライマーＣ１４−２ｇ１１−ｔおよびＣ１４−２ｇ１１−ｂを用いてＴ７ＲＮＡＰ前半部分と、また、下記プライマーＣ１４−４−ｇ１１−ｔおよびＣ１４−４−ｇ１１−ｔを用いてＴ７ＲＮＡＰ後半部分と共にＰＣＲ法を用いてそれぞれＤＮＡを連結した。ＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、２分］を１サイクル、［９４℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、６０秒］を５サイクル行った後、４℃にて静置。
【００５９】
４−２．ｇａｌ４とＴ７ＲＮＡＰとの連結
ｇａｌ４部分配列は、下記プライマーｃ１４−３−ｇ４ｔ、ｃ１４−３−ｇ４ｂを用いてＴ７ＲＮＡＰ後半部分、下記プライマーＣ１４−１−ｇ４−ｔおよびＣ１４−１−ｇ４−ｂを用いてＴ７  ＲＮＡＰ前半部分と共にＰＣＲ法を用いてそれぞれＤＮＡを連結した。ＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、２分］を１サイクル、［９４℃、３０秒、５０℃、３０秒、および７２℃、６０秒］を５サイクル行った後、４℃にて静置。    
【００６０】
ｇａｌ４、ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰとの連結に用いたプライマーは下記である。
Ｃ１４−１−ｇ４−ｔ ：５´−ｇａａａａａａｇａａｇｔａａｔｔｇａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇａａｔｃａａｇｇｃｔａｇａａａｇａｃｔｇｇａａｃａｇ−３´（配列番号１５）
Ｃ１４−１−ｇ４−ｂ：５´−ｃｔｇｔｔｃｃａｇｔｃｔｔｔｃｔａｇｃｃｔｔｇａｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｔｃａａｔｔａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｃ−３´（配列番号１６）
Ｃ１４−２ｇ１１−ｔ：５´−ｇａａａａａａｇａａｇｔａａｔｔｇａｔｇｃａｇｃａｇｃａｃｃｔｃａａｃａｇｃａｇｃａａａｔｇｃａａｃｃ−３´（配列番号１７）
Ｃ１４−２ｇ１１−ｂ：５´−ｇｇｔｔｇｃａｔｔｔｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇａｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｔｃａａｔｔａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｃ−３´（配列番号１８）
ｃ１４−３−ｇ４ｔ：５´−ｇｇａｔｔｃｔｔｔａｃａｇｇａｔａｔａａａａｇｃａｔｔｇｔｔａａｃａｇｇａｔｔａｔｔｔｇｃａｇｃａｇｃａａｔｇｃａａ−３´（配列番号１９）
ｃ１４−３−ｇ４ｂ：５´−ｔｔｇｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃａａａｔａａｔｃｃｔｇｔｔａａｃａａｔｇｃｔｔｔｔａｔａｔｃｃｔｇｔａａａｇａａｔｃｃ−３´（配列番号２０）
ｃ１４−４−ｇ１１−ｔ：５´−ｇｇｃｃｃｔｇａｇａａａａａｔｃｃａａｇｃｔｔｔｇｇｃａｇｃａｇｃａａｔｇｃａａａｃｔｔｔｔａｃｔｇｃｃｃｇｔｔａｃ−３´（配列番号２１）
ｃ１４−４−ｇ１１−ｔ：５´−ｇｔａａｃｇｇｇｃａｇｔａａａａｇｔｔｔｇｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃａａａｇｃｔｔｇｇａｔｔｔｔｔｃｔｃａｇｇｇｃｃ−３´（配列番号２２）
【００６１】
４−３．Ｔ３プロモーターの連結
下記のプライマーをフォワードプライマーとして、４−２で用いたリバースプライマーにストップコドンを付したプライマーをリバースプライマーとして用い、ＰＣＲ法により４−２．で得られた各ＤＮＡ断片にＴ３プロモーターを連結させた。
【００６２】
４−２で用いたリバースプライマーには各ＤＮＡ断片の３´末端に終止コドン配列をＰＣＲ法にて付加した。このようにして作製したリバースプライマーの配列は５´−ｔａｔｔｃａｔｔａＮＮＮ・・・ＮＮＮ−３´であった。ここでｔｔａは終止コドンの配列であり、ＮＮＮ・・・ＮＮＮの部分は４−２で用いたリバースプライマーの５´末端の配列である。ＮＮＮの部分の鎖長は２０塩基以下とし、配列やＴｍ値により適宜調製した。
【００６３】
４−２．で得られた各ＤＮＡ断片にＴ３プロモーターを連結するためのＰＣＲは次の条件で行った；［９４℃、１分］を１サイクル、［９４℃、３０秒、４０℃、１分、および７２℃、１分］を５サイクル、［９４℃、１５〜３０秒、５８℃、３０秒、および７２℃、３０秒〜１分］を２５サイクル、［７２℃、２〜７分］を１サイクル行った後、４℃にて静置。ＰＣＲ条件は各ＤＮＡ断片の鎖長に合わせて適宜反応時間を調整した。作製したＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）はＭｉｎ  Ｅｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｃａｔ．Ｎｏ．２８００４（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて製造元のプロトコールに従い精製した。
【００６４】
Ｔ３プロモーターの連結には、下記のプライマーを用いた。
Ｕｎｉｖ−Ｐｒｉｍｅｒ（Ｔ３）：ｇａａａｔａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａｇａｃｃａｃａａｃｇｇｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａ（配列番号２３）
【００６５】
５．無細胞系における蛋白質発現
無細胞系として、大腸菌を破砕した無細胞蛋白質合成系を用いた。無細胞蛋白質合成試薬はＴ７ＲＮＡＰ活性を持たないものを用いた。そのような無細胞蛋白質合成系試薬として、Ｐｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ポストゲノム研究所社製）を用い、当該試薬よりＴ７ＲＮＡＰを除いた。一般に大腸菌を破砕した無細胞蛋白質合成系は、反応液中にＤＮＡやＲＮＡ分解酵素、プロテアーゼが混入していると言われている。Ｐｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍは転写翻訳系に関わる因子を再構成した無細胞蛋白質合成反応系であり、反応系中にこれら（転写・翻訳に無関係な）酵素類の混入は無いものと思われる。反応は３０℃にて約３．５時間行った。
【００６６】
６．相互作用検出
相互作用解析は、ｐｕｒｅｓｙｓｔｅｍ  ｃｌａｓｓｉｃ  ＩＩ（ポストゲノム研究所社製）よりＴ７ＲＮＡＰを除いたものを入手し、ここに、１．Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（和光純薬社製、またはＰｒｏｍｅｇａ社製）、２．Ｔ７ＲＮＡＰの下流にＧＦＰを付加したＤＮＡ断片、を混合した反応液を調整した後、次の構造を有するＤＮＡ断片を反応系に加えることによって行った。測定は蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用い、反応は３０℃で行った。
【００６７】
ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐは相互作用するのに対して、ｇａｌ４およびｇａｌ１１（ＷＴ：野生型）は相互作用しないことが知られている（ＰＮＡＳ，２０００，９７，ｐ．７３８２）。このため、ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐ（図３中、■と●）は相互作用しＴ７ＲＮＡＰの機能回復が起こり、ＧＦＰの蛍光が観察されるのに対して、ｇａｌ４およびｇａｌ１１ＷＴ（図３中、▲、▼）は相互作用しないため、蛍光は見られないと予測された。
【００６８】
＜結果＞
図３に示すように、ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐ（図３中、■と●）では蛍光強度の上昇がみられたのに対して、ｇａｌ４およびｇａｌ１１ＷＴ（図３中、▲、▼）では蛍光は見られなかった。この結果から、ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐは相互作用がある、ｇａｌ４およびｇａｌ１１ＷＴは相互作用がない、ということが確認された。本実験方法の概略を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の方法は、蛋白質相互作用の検出だけでなく、創薬、阻害剤の開発への応用が可能である。また、本発明の方法は、ＥＢＭ（ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、すなわち、入手しうる最も確かな証拠をもとに、科学的根拠に基づいて行われる保健医療マネージメントの医療スタイルの支援ツールへの応用も可能である。ＥＢＭは、科学的根拠のない治療方法を排除し、根拠のある医療を推進しようとするもので、個々の患者を対象にした治療方法の決定を目的とするものであり、本発明の方法は医療の分野においても非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Ｔ７ＲＮＡＰの分割部位の模式図を示す。Ｔ７ＲＮＡＰの４４４〜４５７番目のアミノ酸〔ＧＫＰＩＧＫＥＧＹ（１文字表記）〕をＮ４ＲＮＡポリメラーゼＩＩのアミノ酸配列〔ＫＥＶＩＣＭＱＴＦＴＡＲ（１文字表記）〕に置換し、置換部分のアミノ酸ＤとＭとの間でＴ７ＲＮＡＰを２分割したＤＮＡを調製した。（実施例１）
【図２】本発明の方法の原理を示す模式図である。（実施例１）
【図３】相互作用を蛍光強度により検出した結果を示す。ｇａｌ４およびｇａｌ１１Ｐ（■と●）では蛍光強度の上昇がみられたのに対して、ｇａｌ４およびｇａｌ１１ＷＴ（▲、▼）では蛍光は見られなかった。（実施例１）
【図４】実験の概略図を示す。（実施例１）
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１：Ｔ７ＲＮＡＰのアミノ酸配列。
配列番号２：Ｔ７ＲＮＡＰのＤＮＡの塩基配列。
配列番号３：ｇａｌ４のアミノ酸配列。
配列番号４：ｇａｌ４のＤＮＡの塩基配列。
配列場号５：ｇａｌ１１のアミノ酸配列。
配列番号６：ｇａｌ１１のＤＮＡの塩基配列。
配列番号７：Ｔ７ＲＮＡＰの部分蛋白質（前半部分）作製用フォワードプライマー。
配列番号８：Ｔ７ＲＮＡＰの部分蛋白質（前半部分）作製用リバースプライマー。
配列番号９：Ｔ７ＲＮＡＰの部分蛋白質（後半部分）作製用フォワードプライマー。
配列番号１０：Ｔ７ＲＮＡＰの部分蛋白質（後半部分）作製用リバースプライマー。
配列番号１１：ｇａｌ４の部分配列の増幅用フォワードプライマー。
配列番号１２：ｇａｌ４の部分配列の増幅用リバースプライマー。
配列番号１３：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１Ｐの部分配列増幅用フォワードプライマー。
配列番号１４：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１Ｐの部分配列増幅用リバースプライマー。
配列番号１５：ｇａｌ４とＴ７ＲＮＡＰ（後半部分）との連結用フォワードプライマー。
配列番号１６：ｇａｌ４とＴ７ＲＮＡＰ（後半部分）との連結用リバースプライマー。
配列番号１７：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰ（前半部分）との連結用フォワードプライマー。
配列番号１８：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰ（前半部分）との連結用リバースプライマー。
配列番号１９：ｇａｌ４とＴ７ＲＮＡＰ（前半部分）との連結のために用いた、ＰＣＲ用フォワードプライマーである。
配列番号２０：ｇａｌ４とＴ７ＲＮＡＰ（前半部分）との連結用リバースプライマー。
配列番号２１：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰ（後半部分）との連結用フォワードプライマー。
配列番号２２：ｇａｌ１１およびｇａｌ１１ＰとＴ７ＲＮＡＰ（後半部分）との連結用リバースプライマー。
配列番号２３：Ｔ３プロモーター連結用プライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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