(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌の属による分類を目的に、同じ属の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の属の細菌は区別して検出できるようなＤＮＡプローブセットを提供する。【解決手段】感染症起炎菌遺伝子を検出するためのプローブセットは、合成された３８群のうちの一つまたは複数群から選択された一つ以上の塩基配列、或いはそれぞれの相補鎖配列から選択された一つ以上の塩基配列、の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含んで構成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症起炎菌遺伝子を検出するための感染症起炎菌検出用プローブセットであって、
下記第１群乃至第３８群のうちの１または複数群より選択されたひとつ以上の塩基配列、或いはそれぞれの相補鎖配列から選択されたひとつ以上の塩基配列、の１または複数を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含むことを特徴とする感染症起炎菌検出用プローブセット。
第１群
(1) CGAACAGACAAGGAGCTTGCTCC
(2) CGATAGTGAAAGATGGTTTTGCTATCACT
(3) AGAACATACGTGTAAGTAACTATGCACGT
(4) TTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCCC
(5) GTGGAGTAACCATTTGGAGCTAGCC
第２群
(1) AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTTT
(2) TGGTTCGATAGTGAAAGATGGCTTTGC
(3) CTTACCAAGGCAACGATACGTAGCC
(4) ACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTC
(5) GACCCTTCTAGAGATAGAAGTTTCCTTCG
第３群
(1) CCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATGG
(2) AAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTG
(3) ACGTGTAAGTAACTGTGCACGTCTTG
(4) ACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTC
(5) GGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCG
第４群
(1) ACGTTGGTAGGAGTGGAAAATCTACC
(2) AGGCAGTGGCTTAACCATTGTACG
(3) TAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGG
(4) TGACCGGCCTAGAGATAGGCTTTC
(5) GACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCA
第５群
(1) ATGCAAGCGCATCACTAGTAGATGG
(2) AGTCTGGAGTAAAAGGCTATGGCTCA
(3) TGCCGGAGCTAACGCAATAAGC
(4) GGAAGTTACTTCGGTACATCGGAGAC
(5) CGGTGACGGCAAGCTAATCTCTG
第６群
(1) TGGTGGGAGTGGAAAATCCACCA
(2) GCATTGGCTCAACCAATGTACGC
(3) CTTAGTGCCGGAGCTAACGCATT
(4) TTACTTCGGTACATCGGTGACAGGT
(5) TGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCC
第７群
(1) AGCTCTGTTGTAAGAGAAGAACGGGT
(2) GGCTGTGGCTTAACCATAGTATGCTT
(3) TTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAG
(4) CTGACCGCTCCAGAGATAGAGTTTTC
(5) GCTAATCTCTGAAAGCCAGTCTCAGT
第８群
(1) TGGTTTCGGTTTGAAAGGCGCTT
(2) AGAGTAGAATGTTCATCCCTTGACGG
(3) GCCCTTCAGTGCTGCAGCTAAC
(4) GACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCC
(5) GCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTA
第９群
(1) ACGCTTCTTTTTCCACCGGAGC
(2) CCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAA
(3) AATACCGTATAACAATCAAAACCGCATGG
(4) CAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTG
(5) AGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAA
第１０群
(1) AAGTTGGGAGGAAGAGCAGTTACCT
(2) ACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACA
(3) CTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTG
(4) GACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGG
(5) TAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAA
第１１群
(1) GGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTA
(2) AACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTA
(3) GGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCA
(4) ACCAGGCCTTGACATGCAGAGA
(5) GGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGT
第１２群
(1) CTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGC
(2) CTGGGCCAATACTGACGCTCATG
(3) TCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGA
(4) GAGTGCTCGAAAGAGAACCGGC
(5) TGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCT
第１３群
(1) AGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCA
(2) CAGGAGGAACATCCATGGCGAAG
(3) GCAATTTGGCACGCAGTATCGAAG
(4) ATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCG
(5) TTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGC
第１４群
(1) ACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGC
(2) GGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCT
(3) GGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGG
(4) CCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAG
(5) GTTGCTACACAGCGATGTGATGCTA
第１５群
(1) GCACTTTAAGCGAGGAGGAGGC
(2) ACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGT
(3) CGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTA
(4) GTCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAG
(5) AGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATG
第１６群
(1) CTTTTGGCAGGAAAGAAACGTCGC
(2) GAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAA
(3) TGTCAACTAGCTGTTGGGGCCT
(4) CTCGCAAGAGAACCGGAACACAG
(5) GAGCCAATCCCAGAAACCCGATC
(6) GGCGATTACCACGGTAGGATTCATG
第１７群
(1) CTCTCGCGTCAGGATATGCCCA
(2) CGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTG
(3) GGACAGATACTGACACTCAGATGCG
(4) TGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTT
(5) GAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGA
(6) ACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCC
第１８群
(1) TAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTG
(2) GTTGTGGTTAATAACCGCAGCGATTG
(3) GCATCCGAAACTGGCAGGCTAG
(4) AACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCC
(5) CAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGT
第１９群
(1) GTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATG
(2) TACTTTCAGCGGGGAGGAAGGG
(3) TGCATTCGAAACTGGCAGGCTG
(4) GGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGC
(5) GTCGGGAACTCAAAGGAGACTGC
第２０群
(1) TAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGG
(2) CCTCATGCCATCAGATGTGCCC
(3) GCGTTAAGGTTAATAACCTTGGCGATTGA
(4) ATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCT
(5) CAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTG
第２１群
(1) GCACAAGAGAGCTTGCTCTCTGG
(2) GTCTTCGGACCAAAGTGGGGGA
(3) CGAGGAGGAAGGCATTGTGGTTAAT
(4) AACCACAGTGATTGACGTTACTCGC
(5) TGCATTTGAAACTGGTCAGCTAGAGT
第２２群
(1) TAACGTCTACGGACCAAAGTGGGG
(2) TCAGCGAGGAGGAAGGGTTCAG
(3) GCACTGTTCATTGACGTTACTCGC
(4) TGAAATCCCCGCGCTTAACGTG
(5) AATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCT
第２３群
(1) ATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAG
(2) CGCATAATGTCTACGGACCAAAGCA
(3) ACCCTTATCAATTGACGTTACCCGC
(4) TTGCATCTGAAACTGGTTGGCTAGAG
(5) GTCTTGAACCGTGGCTTCTGGAG
第２４群
(1) TTCAGCGGGGAGGAAGGTGATAAA
(2) CGGCAATTAAGTCAGATGTGAAAGCC
(3) CTTGAACTGTGGCTTCTGCAGCTAA
(4) TAGAGGAGTGCCTTCGGGAACG
(5) CAAGCGGAACTCATAAAGTCTGTCGT
第２５群
(1) GCACCATCAGATGAACCCATATGGG
(2) CTTTCAGTCGGGAGGAAGGTGTTAAG
(3) CACAACGGTGGAGCATGGGTTT
(4) TATCCTTTGTTGCCAGCGCGTG
(5) GGCAAGCGGAACTCATAAAGTACGT
第２６群
(1) GGCTGTGACGTTACTCGCAGAAG
(2) CTGTCCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGG
(3) TGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCT
(4) AATCCTGCAGAGATGCGGGAGT
(5) GGGCTGCAAGCTAGCGATAGTG
第２７群
(1) TAATGCCTGGGGATCTGCCCAG
(2) TCGCGATTGGATGAACCCAGGT
(3) AAGGTTGGCAGCTAATATCTGTCAGC
(4) TGGGAATTGCATTTAAAACTGTTCAGCT
(5) TCTGGAATCCTGTAGAGATACGGGAGT
第２８群
(1) CCTATCAGCTTGTAGGCGGGGTA
(2) CCTTTTGGGTGAGTGTACCTTTCGAA
(3) CTGGAATTCTCGGTGTAACGGTGG
(4) TCTGTGTCGGAGCTAACGCGTTA
(5) GGTTCACAGGTGGTGCATGGTC
第２９群
(1) CCATGCTTTAGTGTGTGTGGTGGAA
(2) TAGGGACGAAGCTTTTGTGACGGTA
(3) CGTCGTCTGTGAAATTCCGGGG
(4) GGGCATAACTTGAGTGCTGTAGGG
(5) GTGTGAGGGTCTTCCACGACTTTC
(6) ACATATGCAGGATCGGCGTAGTGATA
(7) CTCATGAGAGACTGCCGGGGTTA
第３０群
(1) GTCTGAGGACGAAAGCTGGGGA
(2) CACTTTCAGTGGGGAGGAGGGT
(3) TGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGT
(4) AAAATAATTAGTGGCGCAGCAAACGC
(5) AGAGATGCATAAGTGCCTTCGGGA
第３１群
(1) AGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACC
(2) GTCTGTAACTGACACTGAGGCGC
(3) TTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAAC
(4) CTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGA
(5) TACAAAGAGCTGCAAGACCGCG
第３２群
(1) CGGTACCTTGACGGTACCTAACCA
(2) GCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGT
(3) GAGATAGGACGTCCCCTTCGGG
(4) TCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGG
(5) AGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAG
第３３群
(1) AAGGTCTCTTCGGAGACACTCGAG
(2) CACACCGGGATAAGCCTGGGAA
(3) GGATAGGACCACTTGGCGCATG
(4) CCTTGTGGTGGAAAGCTTTTGCG
(5) GAAGGTCCGGGTTCTCTCGGATT
第３４群
(1) AATCTGCCCTGCACTTCGGGAT
(2) AATACCGGATAGGACCTTTAGACGCA
(3) TCGGGTTTTCTCGGATTGACGGTA
(4) TCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACG
(5) GAGATAGGCGTTCCCTTGTGGC
第３５群
(1) AAACTCACAGCTTAACTGTGGGCG
(2) GGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG
(3) AGAGATAGGTATTCCCTTGTGGCCT
(4) GTAATGCCGGGGACTCGTAGGA
(5) GCAAGGTGGAGCGAATCCCTTAAA
第３６群
(1) TTTCGACAGGGACGAAGCGCAA
(2) GAAAACTTGGGGCTCAACCCCAA
(3) TGTGGGTTTCCTTCCACGGGAT
(4) AGATGTAGGCCCCCTTGTGGTC
(5) CGATACCGTGAGGTGGAGCGAA
第３７群
(1) GTAACAGGGGAAGCTTGCTTCTCG
(2) GAACTTCGGTCCTTGCGCCATC
(3) GTAAAGTACTTTCAGCCGGGAGGAAG
(4) AGGTGTTGATGCTAATAACCGCAGC
(5) TGAAGGTTGTGCCCTTGAGGAGT
第３８群
(1) CAGGAGCAAAGAGGGGGAACTTC
(2) CCTCTTGCTATCGGATGAACCCATATG
(3) AGGCGTTGATGCTAATATCATCAGCG
(4) CAGGCGGTTGATTAAGTTAGATGTGAAAT
(5) CCTGGGAATGGCATCTAAGACTGG
【請求項２】
請求項１に記載の感染症起炎菌検出用プローブセットに含まれるプローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項３】
感染症起炎菌の16S rRNA遺伝子配列をＰＣＲ増幅させるのに用いられるプライマであって、下記の第３９群の塩基配列のうちの少なくとも一つ以上と、下記の第４０群の少なくとも一つ以上の複数の塩基配列の各々を有するオリゴヌクレオチドからなる複数のプライマを含むことを特徴とする感染症起炎菌増幅反応用プライマセット。
第３９群
(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG
(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG
(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG
(4)GCGGTAGGCCTAACACATGCAAG
(5)GCGGCGTGCTTAACACATGCAAG
(6)GCGGGATGCCTTACACATGCAAG
(7)GCGGCATGCCTTACACATGCAAG
(8)GCGGCATGCTTAACACATGCAAG
(9)GCGGCGTGCTTAATACATGCAAG
第４０群
(1)ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC
(2)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC
(3)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC
(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGGTAC
(5)ATCCAGCGCCAGGTTCCCCTAG
【請求項４】
請求項２に記載の担体を用いて感染症起炎菌遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項５】
請求項３に記載の感染症起炎菌増幅反応用プライマセットを用いてＰＣＲ増幅処理を行なうことを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項６】
請求項３に記載の感染症起炎菌増幅反応用プライマセットを用いてＰＣＲ増幅処理を行なって、請求項２に記載の担体を用いて感染症起炎菌遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症疾患の原因菌の検出および同定に有用な感染症起因菌由来のプローブセット並びに、その担体および遺伝子検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップ(またはＤＮＡマイクロアレイともいう。以下同じ)を用いた遺伝子発現解析が創薬を始め種々の領域で行なわれている。それは、各種遺伝子セット(プローブ)が配置されたＤＮＡマイクロアレイに、それぞれ異なった検体ＤＮＡを反応させ、各検体に存在するそれぞれの遺伝子量を比較して、各ステージで大量に存在する(発現量の高い）遺伝子、或いは逆に不活性化している(発現量の低い)遺伝子を分類し、機能と関連付けて解析するものである。
【０００３】
感染症の起炎菌検査はその一例であり、江崎らは特許文献１において、ＤＮＡプローブとして染色体ＤＮＡが固定化されたＤＮＡチップを用いる微生物同定法を提案している。この方法によれば、互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することで検体中の未知微生物を検出することが可能である。
【０００４】
また、大野らは感染症の起炎菌検査のためのＤＮＡチップに用いるプローブとして、特許文献２で制限酵素断片を利用した真菌の検出用プローブを、特許文献３で緑膿菌の検出用プローブを、特許文献４でEscherichia coli(エシェリキア コリ)菌、klebsiella pneumoniae(クレブシエラ ニューモニエ)菌ならびにEnterobacter cloacae(エンテロバクター クロアカエ)菌の制限酵素断片を利用した検出用プローブをそれぞれ提案している。
【特許文献１】特開２００１−２９９３９６号公報
【特許文献２】特開平６−１３３７９８号公報
【特許文献３】特開平１０−３０４８９６号公報
【特許文献４】特開平１０−３０４８９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来技術に示したＤＮＡチップは、染色体ＤＮＡ或いは制限酵素断片等のＤＮＡプローブを利用するものであり、いずれも微生物から直接取り出したＤＮＡを材料としている。このため、一度に大量に調製することは困難であり、臨床診断用には適さないという問題があった。これは臨床診断用に用いるためには、安価で均質なＤＮＡチップの大量生産が必要であり、このためにプローブ溶液として均質なＤＮＡの大量調整が不可欠となるが、ＤＮＡプローブでは、このような大量調製ができないからである。なお、ＤＮＡプローブであっても、ＰＣＲ増幅反応を利用することで当該ＤＮＡを徐々に増加させていくことは可能であるが、ＰＣＲ反応では、一度に大量調製することは困難であることから、臨床診断用に利用することは難しい。
【０００６】
また、ＤＮＡプローブは塩基長が長いため、類似菌種間における菌種の同定が困難であり、例えば感染症検出用には適さないという問題があった。これは、感染症の治療においては菌種の特定とそれに応じた抗生剤の選択・投与が必要であり、このために感染症検出用プローブには、同種内の詳細な区別までは必要としないまでも(つまり同種内は一括検出でき)、類似する他の種の細菌は区別して検出できるような機能が求められるからである。一方、例えば特許文献４で示されているエシェリキア コリ菌、クレブシエラ ニューモニエ菌、エンテロバクター クロアカエ菌の制限酵素断片を用いたＤＮＡチップでは、プローブの塩基長が長いために、これら３菌種相互間に交差反応が生じてしまい、類似する個々の菌を区別することができず、感染症検出用に利用することは難しい。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、一度に大量調整することが可能であり、かつ、類似菌種間における菌種の同定が可能な感染症検出用プローブを提供することを目的とする。
【０００８】
より具体的には、感染症の複数種の原因菌の種による分類に適した感染症検出用プローブセットを提供することを目的とするものである。
【０００９】
また、これらの類似菌種間の差異がＤＮＡチップ上で精度良く評価可能であるよう、感染症検出用プローブと検体とのハイブリッド体の安定性も考慮したプローブセットを提供することを目的とする。
【００１０】
また、これらの感染症検出用プローブと検体との反応を行なう為に、これらの感染症検出用プローブが固定された担体を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、検体溶液との反応の過程で、これらの感染症検出用プローブが安定に担体上に固定され、再現性の高い感染症起炎菌遺伝子の検出結果を得るために、化学的に固定された担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するための本発明による感染症起炎菌検出用プローブセットは、
下記第１群乃至第38群のうちの１または複数群より選択されたひとつ以上の塩基配列、或いはそれぞれの相補鎖配列から選択されたひとつ以上の塩基配列、の１または複数を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含むことを特徴とする。
【００１３】
ここで、第１群乃至第38群の塩基配列群はそれぞれ、
【００１４】
【表１】
2006129810.tif 000002
【００１５】
【表２】
2006129810.tif 000003
【００１６】
【表３】
2006129810.tif 000004
【００１７】
【表４】
2006129810.tif 000005
【００１８】
【表５】
2006129810.tif 000006
【００１９】
【表６】
2006129810.tif 000007
【００２０】
【表７】
2006129810.tif 000008
【００２１】
である。
【００２２】
また、上記の目的を達成するための本発明による感染症起炎菌検出用プライマセットは、
下記第39群のうちの少なくとも1つ以上と、第40群のうちの少なくとも１つ以上の複数の塩基配列の各々を有するオリゴヌクレオチドからなる複数のプライマを含むこと特徴とする。
【００２３】
ここで、第39群乃至第40群の塩基配列群はそれぞれ、
【００２４】
【表８】
2006129810.tif 000009
【００２５】
である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、一度に大量調整することが可能であり、かつ、類似菌種間における菌種の同定が可能な感染症検出用プローブを提供することができる。より具体的には、感染症の複数種の原因菌の種による分類に適した感染症検出用プローブセットを提供することが可能となる。
【００２７】
また、これらの類似菌種間の差異がＤＮＡチップ上で精度良く評価可能であるよう、感染症検出用プローブと検体とのハイブリッド体の安定性も考慮したプローブセットを提供することが可能となる。
【００２８】
また、これらの感染症検出用プローブと検体との反応を行なう為に、これらの感染症検出用プローブが固定された担体を提供することができる。
【００２９】
さらに、検体溶液との反応の過程で、これらの感染症検出用プローブが安定に担体上に固定され、再現性の高い検出結果を得るために、化学的に固定された担体が提供できる。
【００３０】
また、上記担体を用いた、感染症起炎菌遺伝子を検出する遺伝子検査方法を提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００３２】
以下の実施形態では、感染症の起炎菌同定の為のオリゴヌクレオチドプローブ、より具体的には、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、エンテロバクター クロアカエ菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌のいずれか、或いは複数菌を検出する為のプローブが示される。すなわち、上記10種類の感染症起炎菌の遺伝子のうちの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を過不足なく検出するための核酸プローブセットが開示される。
【００３３】
本実施形態によれば、上記感染症起炎菌の遺伝子の核酸配列を含む検査溶液と反応せしめるための上記オリゴヌクレオチドプローブは、上記表に示した第１群〜第38群のうちのいずれかの群に属する塩基配列を含む。
【００３４】
ここで、各群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが検出する微生物を以下の表２に示す。
【００３５】
【表９】
2006129810.tif 000010
【００３６】
これらのプローブ配列の相補的な配列もまた、同じ機能を有する為にプローブ配列として有効である。
【００３７】
各菌のプローブの設計は、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、また、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきがなく、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように行なった。
【００３８】
これらのオリゴヌクレオチドプローブは、担体上に結合された２種以上のプローブと検体とのハイブリダイゼーション反応において、安定なハイブリッド体を形成し、良好な結果を与えるように設計されている。
【００３９】
さらに、本発明にかかる感染症検出用プローブが固定された担体は、オリゴヌクレオチドをＢＪプリンタを用いて吐出し、化学的に結合させることで作製することを特徴としている。これにより、従来法に比べ、プローブがはがれにくくなるうえに、感度が向上するという付帯的な効果も得られる。つまり、従来から一般的に用いられるスタンフォード法と呼ばれるスタンピング法によりＤＮＡチップを生成した場合(例えば、宝酒造は、がん疾患に関連するヒト由来既知遺伝子のｃＤＮＡ断片をスポット或いはスタンプにより塗布することでＤＮＡチップを生成している)、塗布したＤＮＡがはがれやすいという欠点があった。また、従来のように、ＤＮＡチップ上で合成によりプローブを配置した場合(例えば、AffymerixのＤＮＡチップ等)は、各プローブ配列の合成収量が異なる為に、正確な評価ができないという欠点があった。本発明にかかる担体は、かかる点についても考慮して作製されており、従来に比べ安定に固定され、はがれにくく、高感度と高精度の検出ができる点を特徴としている。以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００４０】
本実施形態のＤＮＡチップが検査の対象とする検体としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、髄液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物を対象とする。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、または空気清浄器等のフィルタなど、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体全てが挙げられる。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象とする。
【００４１】
また、本実施形態のＤＮＡチップが対象とする検体としては、抽出した核酸そのものでも良いが、１６ｓ ｒＲＮＡ検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いて調製された増幅検体、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調製された検体、ＰＣＲ以外の増幅方法により調製された検体、可視化のために各種標識法により標識された検体等、いずれの調製法により調製された検体をも含む。
【００４２】
また、本実施形態のＤＮＡチップに用いられる担体は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等あらゆるものを含む。さらに、その基板の表面をプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものも含む。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものは、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。
【００４３】
本発明に用いられる化学的な固定化方法としては、例えば、マレイミド基とチオール(−ＳＨ)基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール(−ＳＨ)基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。
【００４４】
マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide:Dojin社製)との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上5'-Thiol-ModifierC6(Glen Research社製)を用いることにより行なうことができる。
【００４５】
固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基(固相上)とアミノ基(核酸プローブ末端)の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。
【００４６】
以下、レジオネラ ニューモフィラ菌を検出するための感染症起炎菌検出用プローブを用いた実施例により、更に詳細に説明するが、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus saprophyticus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Streptococcus sanguinis、Enterococcus avium、Enterococcus faecium、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Burkholderia cepacia、Stenotrophomonas maltophilia、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Achromobacter xylosoxidans、Vibrio vulnificus、Citrobacter freundii、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Hafnia alvei、Serratia liquefaciens、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Morganella morganii、Aeromonas hydrophila、Aeromonas sobria、Gardnerella vaginalis、Corynebacterium diphtheriae、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium chelonae、Nocardia asteroides、Salmonella Choleraesuis、Providencia rettgeriについても、以下の実施例で説明するのと同様の手法によりプローブセットの設計、生成ができるとともに、検査処理(ハイブリダイゼーション反応）を行なうことができる。
【実施例】
【００４７】
１ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ法を用いた微生物の検出
１．プローブＤＮＡの準備
レジオネラ ニューモフィラ株検出用プローブとして表３に示す核酸配列を設計した。具体的には、レジオネラ ニューモフィラ菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、表３に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている(なお、本実施例では各プローブ塩基配列は表１に示した、第30群の配列と完全に一致したものを用いたが、完全一致に限定される必要はなく、該各プローブ塩基配列を含む20から30程度の塩基長を有するプローブ塩基配列も表３に示す各プローブ塩基配列に含まれるものとする)。
【００４８】
【表１０】
2006129810.tif 000011
【００４９】
表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の５'末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−30℃の冷凍庫に保存した。
【００５０】
２．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備
起炎菌検出用の為の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子(標的遺伝子)増幅用ＰＣＲ Primerとして表４に示す核酸配列を設計した。具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約1500塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。
【００５１】
【表１１】
2006129810.tif 000012
【００５２】
表中に示したPrimerは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Forward Primerを９種、Reverse Primerを５種を混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００５３】
３．レジオネラ ニューモフィラ菌(Legionella pneumophila) Genome ＤＮＡ(モデル検体)の抽出
[３−１] 微生物の培養 ＆ Genome ＤＮＡ抽出の前処理
まず、レジオネラ ニューモフィラ標準株(ATCC33152)を、定法に従って培養した。この微生物培養液を1.5 ml容量のマイクロチューブに1.0 ml(OD600=0.7)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5min、４℃)。次に、上精を捨てた後、Enzyme Buffer (50mM Tris-HCl：p.H. 8.0、25mM EDTA)300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、５min、４℃)。上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
【００５４】
Lysozyme                   50 μl （20 mg/ml in Enzyme Buffer）
N-Acetylmuramidase SG      50 μl （0.2 mg/ml in Enzyme Buffer）
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。
【００５５】
[３−２] Genome抽出
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット(MagExtractor -Genome-：TOYOBO社製)を用いて行った。
【００５６】
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて、10分間激しく攪拌した(ステップ１)
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ２)
次に、洗浄液900μlを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ４)。
【００５７】
上記ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄を行なう(ステップ５)。その後、70％エタノール900μlを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁した(ステップ６)
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ７)
ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる２度目の洗浄(ステップ８)を行った後、回収された磁性粒子に純水100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行った(ステップ９)
次に分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。
【００５８】
[３−３] 回収したGenome ＤＮＡの検査
回収された微生物(レジオネラ ニューモフィラ株)のGenome ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。本実施例では、約10μgのGenome ＤＮＡが回収され、Genome ＤＮＡのデグラデーションやｒRNAの混入は認められなかった。回収したGenome ＤＮＡは、最終濃度50ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００５９】
４．ＤＮＡマイクロアレイの作製
[４−１] ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ：25mm×75mm×１mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００６０】
[４−２] 表面処理
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、１%の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下ＥＭＣＳと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3 mg/mlとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。
【００６１】
ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６２】
[４−３] プローブＤＮＡ
実施例で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６３】
[４−４] ＢＪプリンタによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン7.5 wt%、チオジグリコール7.5 wt%、尿素7.5 wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0 wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した５種類のプローブ(表３)の夫々を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンタ(商品名：BJF-850 キヤノン社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６４】
なおここで用いたバブルジェットプリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンタは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120μmピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００６５】
続いて、この改造バブルジェットプリンタを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００６６】
[４−５] 洗浄
30分間の反応後、100mMのＮａＣｌを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定した遺伝子チップを得た。
【００６７】
５．検体の増幅と標識化(ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み)
検体となる微生物遺伝子の増幅、および、標識化反応を以下に示す。
【００６８】
【表１２】
2006129810.tif 000013
【００６９】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【００７０】
【表１３】
2006129810.tif 000014
【００７１】
反応終了後、精製用カラム(QIAGEN  QIAquick PCR Purification Kit)を用いてPrimerを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。
【００７２】
６．ハイブリダイゼーション
上述の[４．ＤＮＡマイクロアレイの作製]で作製した遺伝子チップと[５．検体の増幅と標識化(PCR増幅＆蛍光標識の取り込み)]で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
【００７３】
[６−１]遺伝子チップのブロッキング
ＢＳＡ(牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製)を1wt％となるように100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に[４．ＤＮＡマイクロアレイの作製]で作製した遺伝子チップを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む2xSSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、ｐＨ 7.0)で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００７４】
[６−２]ハイブリダイゼーション
水切りした遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７５】
[６−３]ハイブリダイゼーション条件
65℃  3min  →  92℃  2min  →  45℃  3hr  →  Wash  2ｘSSC / 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2xSSC at 20℃  → (Rinse with H2O  :  Manual)  →  Spin dry。
【００７６】
７．微生物の検出(蛍光測定)
上記ハイブリダイゼーション反応終了後の遺伝子チップを遺伝子チップ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いて蛍光測定を行った。その結果、再現性良く、十分なシグナルでLegionella pneumophilaを検出することができた。また、他の菌のプローブに対するハイブリッド体は検出されなかった。
【００７７】
以下の表５に、ハイブリダイゼーション反応によって得られた蛍光輝度値と、その蛍光輝度値とバックグランドの輝度との比をS/Nとして求めた値を示す。この表５に示すデータにより、Legionella pneumophila用に作成した表３に示したプローブの蛍光輝度が、他のプローブと比較して高い蛍光輝度を示していることが分かる。
【００７８】
【表１４】
2006129810.tif 000015
【００７９】
【表１５】
2006129810.tif 000016
【００８０】
【表１６】
2006129810.tif 000017
【００８１】
【表１７】
2006129810.tif 000018
【００８２】
【表１８】
2006129810.tif 000019
【００８３】
【表１９】
2006129810.tif 000020
【００８４】
【表２０】
2006129810.tif 000021
【００８５】
なお、上記実施例では、特にLegionella pneumophilaを検出した例を挙げて説明したが、前述の表２に示す他の菌であっても、同様の手法により設計したプローブ担体を用いてハイブリダイゼーションを行なうことにより、それぞれ菌用に設計したプローブから得られる蛍光輝度が高くなる結果が得られ、再現性良く、十分なシグナルで、それぞれの菌を検出することができた。
【００８６】
以上説明したように、上記実施例によれば、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus saprophyticus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Streptococcus sanguinis、Enterococcus avium、Enterococcus faecium、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Burkholderia cepacia、Stenotrophomonas maltophilia、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Achromobacter xylosoxidans、Vibrio vulnificus、Citrobacter freundii、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Hafnia alvei、Serratia liquefaciens、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Morganella morganii、Aeromonas hydrophila、Aeromonas sobria、Gardnerella vaginalis、Corynebacterium diphtheriae、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium chelonae、Nocardia asteroides、Salmonella choleraesuis、Providencia rettgeri及びLegionella pneumophilaの38種菌を検出可能なプローブセットを固定したマクロアレイを用いて、感染症起炎菌を同定することが可能になり、微生物由来のＤＮＡプローブの問題を解決した。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは化学的に大量合成が可能であり、精製や濃度のコントロールが可能である。また、細菌の種による分類を目的に、同じ種の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の種の細菌は区別して検出できるようなプローブセットが提供できた。
【００８７】
また、上記実施形態によれば、感染症起炎菌遺伝子の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を過不足なく検出することにより、該感染症起炎菌の存在を効率良く、また高い精度で判定することができる。