(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの静脈血液の採取により、単球、マクロファージ、樹状細胞上の分子群を連続して測定でき、しかも正確な測定値を得ることができるＴｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）、ＣＤ１４分子および主要組織適合分子複合体の連続的測定方法を提供する。【解決手段】液体培地であるＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ１６４０ｗｉｔｈ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にそのヒト自身の血漿が１０％〜２０％となるように加え、血液から分離した単核球分画をその中で浮遊させた状態とし、８個のサンプルに分割した後、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲに対する蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリー分析器で各細胞膜上タンパク分子の量を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血液細胞中の単球、マクロファージ、樹状細胞膜上のＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲを連続的に定量化することを特徴とするＴｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）、ＣＤ１４分子および主要組織適合分子複合体の連続的測定方法。
【請求項２】
液体培地 であるＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ１６４０ｗｉｔｈ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にそのヒト自身の血漿が１０％〜２０％となるように加え、血液から分離した単核球分画をその中で浮遊させた状態とし、８個のサンプルに分割した後、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲに対する蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリー分析器で各細胞膜上タンパク分子を測定することを特徴とするＴｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）、ＣＤ１４分子および主要組織適合分子複合体の連続的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血漿を用いた細胞培養工学的手法によりフローサイトメトリー分析器で各細胞膜上タンパク分子を測定する医療産業分野の技術に属し、殊にＴｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）、ＣＤ１４分子および主要組織適合分子複合体の各測定定量化を連続的に行い得る測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞膜上のＴｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）を測定する際には、単核球分画（単球、マクロファージ、樹状細胞を含む）を無血清の液体培地であるＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ１６４０ｗｉｔｈ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）か、他の動物の血清を添加した低血清液体培地、あるいは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ:ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）にＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を０.１％の割合で添加した溶液に浮遊させてから、ＴＬＲｓに対する蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリー分析器にて蛍光強度を測定し、細胞膜上の各ＴＬＲｓ量の測定を行っていた（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、浮遊細胞と蛍光標識抗体の反応が完了するまでに室温で３０分〜６０分程度の時間が必要であり、さらに、フローサイトメトリーにて測定する間の時間がかかるため、この方法では、ヒト血液から採取した状態をそのまま反映した細胞膜上のＴＬＲｓ量は計測できない。なぜならば、時間の経過とともに細胞死(アポトーシスが主である)が進行、もしくは、細胞死が起こらなくとも細胞膜上のＴＬＲｓをはじめ各種蛋白レセプターに変化が起こってしまうためである。このことを防がなければ、実際にヒトの血管内を流れている状態のＣＤ１４陽性細胞(単球、マクロファージ、樹上細胞)膜上の正確なＴＬＲｓ量とはならず(正確性の問題)、まして、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲとフローサイトメトリーでの測定に要する約４５分から６０分間という時間だけ考えても、このようなレセプター群の連続的かつ正確な解析は不可能であった。
【０００３】
哺乳動物におけるＴＬＲｓは、１９９７年にJａｎｅｗａｙ、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖらによって発見された。その後、単球、マクロファージ、樹状細胞などの自然免疫にとって重要な細胞は、ＴＬＲ１とＴＬＲ２のヘテロダイマーとなったレセプターを介してグラム陽性菌の菌体成分（ペプチドグリカン、リポタイコ酸）を認識し、ＣＤ１４で捕捉されたリポポレサッカライド（ＬＰＳ）をＴＬＲ４に受け渡すかたちで、ＣＤ１４とＴＬＲ４がグラム陰性菌の認識に関与することが明らかとなった。また、ＴＬＲ３は、ウイルスの二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、ウイルスや細菌のＤＮＡの認識にあたることが知られている。ＴＬＲ５は、サルモネラ菌などの鞭毛を構成するタンパクであるフラジェリンを認識する。ＴＬＲ７とＴＬＲ８は、ウイルスＤＮＡを認識することが報告されている。現在まで、ＴＬＲｓは、１〜１０まで１０個知られているが、ＴＬＲ１０に関しては何を認識するレセプターなのか不明である。
【０００４】
一方、主要適合因子複合体（ＭＨＣ）は、クラス１とクラス２が存在し、クロスプリゼンテーションが起こり得るものの、おおまかなところ、ＭＨＣクラス１は、内因性抗原をＣＤ８陽性リンパ球Ｔ細胞へ抗原提示する役割を担い、ＭＨＣクラス２は、外因性抗原をＣＤ４陽性リンパ球Ｔ細胞へ抗原提示する役割を担う。両者とも獲得免疫に重要な因子となっている。ＭＨＣは、ヒトでは、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）と呼ばれ、クラス１は、主にＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃであり、ＭＨＣクラス２は、ＨＬＡ−ＤＲがその一部を成す。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ｂｅｆｏｅｒ  ｐｒｉｎｔ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ３１，２００１：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｏｐｅｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｈｅａｔ−Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ７０ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４の４／１５頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトの疾患においてウイルス感染症なのか、細菌感染症なのか、また、感染症ではなく他の疾患なのか鑑別できないことが少なからずある。また、細菌感染症であっても、その細菌を同定できないことも多い。例えば、感染性心内膜炎や敗血症（血液培養やエンドトキシン測定にたよってきたが、抗生剤投与療法中であれば、その細菌同定の可能性は低いし、たとえ抗生剤投与中でなくとも８０％程度の同定率とされる。)、あるいは、サンプルが採取できない箇所における感染症では、内科的に細菌同定できる手段が、皆無という場合も存在する。
【０００７】
上記のような症例において、ＴＬＲｓ、ＣＤ１４およびＨＬＡの測定は、細菌感染なのか、ウイルス感染なのか、または、異なる疾患に起因したものなのか、さらには、細菌感染であれば、グラム陽性菌なのか、あるいは、グラム陰性菌なのかを迅速かつ正確に診断する検査方法に成り得る。しかしながら、臨床的実施に対しては、ＴＬＲｓ、ＣＤ１４およびＨＬＡの量測定において、その確実なる再現性に加え、患者の血管中を流れている血液細胞そのものを反映したかたちでの正確性が当然に要求される。
【０００８】
本発明は、患者の血液から分離した単核球分画（単球、マクロファージ、樹状細胞を含む）に最適な処理を施すことで、フローサイトメトリー機器を使用し、感染症の有無あるいは疾患鑑別という課題の解決に寄与しようとするものである。本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究の結果、感染症の起炎菌（グラム陽性菌かグラム陰性菌か）あるいは、ウイルス感染に応じて、それらを認識するとされる特定のＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ分子の定量化に成功し、健常者のそれらに比べて増加することを見い出した。これにより、身体における感染箇所の特定はできないまでも、患者が感染症に侵されているかどうかの診断を迅速かつ正確に行うことができ、医療上きわめて有用な検査方法を提供することができる。
【０００９】
患者の状態を正確に反映したＣＤ１４陽性細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞）を、そのままのかたちでフローサイトメトリーでの測定へともっていけるかどうか、つまり、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲと連続的に解析しても最初から最後まで正確な量測定が行えているのかどうかが問題であった（正確性の問題）。従来の方法では、これだけの数の分子を連続的に解析するため、時間がかかりすぎ、細胞にストレスを与え、最悪の場合には、主にアポトーシスを引き起こし、その解析結果は、正確性を欠いたものであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、患者の血漿を１０％〜２０％含む液体培地であるＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ１６４０ｗｉｔｈ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：以下、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍと略する）に分離した単核球分画を浮遊させた上で、蛍光標識抗体と室温で３０〜６０分間反応させ、フローサイトメトリーにてＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ分子の量を順次測定すれば、さらに測定に必要な２倍以上の時間をかけても、同一のサンプルは２０％誤差範囲でもって測定できることが判明した。したがって、患者血漿を１０％〜２０％量とした液体培地に添加するというこの条件は、アポトーシスを防ぎ、また細胞へのストレスを最小限に止め、患者本来の細胞に最も近い状態で測定を行っているものとみなせる。
【００１１】
実際、上記方法手順に従う測定方法により、起炎菌の確定した感染症患者（本測定を行うことに同意を得た）と健康者ボランティア群との比較検討を行うことで起炎菌のグラム陽性、陰性かを迅速かつ高感度に指摘でき、正確な補助的診断を行うことに成功した（有効性）。上述した検討の結果、「患者血漿を１０％〜２０％含む液体培地（ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ)に分離した単核球分画を浮遊させた上で、蛍光標識抗体と室温で３０〜６０分間反応させ、フローサイトメトリーにてＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ分子の量を順次測定する」という条件が、その他血漿添加濃度の条件に比べ最も望ましいと結論された。
【００１２】
以下、採取した血液より分離した単核球分画を患者血漿含有ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ（１０％〜２０％の濃度で）内に浮遊し、蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリーにてＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ分子の量を順次測定することの正確性を検討した結果と上記結論に至る経過を記載した。
ヒト正常健康者（本検査測定に参加することに同意を得た血液提供者）よりヘパリンを入れた注射器で血液を３０ｍｌ採取し、単核球分画（単球、マクロファージ、樹状細胞を含む）を分離し、−８０℃で冷凍保存しておいた。その際、得られた血漿も同様に−８０℃で冷凍保存しておいた。
【００１３】
冷凍保存しておいた単核球を３７℃で解凍し、遠心操作を行い、上清を除去した。ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍにヒト血漿濃度が１０％となるように添加し、全部で１６ｍｌとした液体内に単核球を浮遊させた。これを１６本の１．５ｍｌ清潔チューブに１ｍｌずつ分注し、すべてのチューブにＦＩＴＣで蛍光標識したＣＤ１４抗体を入れ、１本目と９本目はＣＤ１４抗体のみ、２本目と１０本目はＰＥで蛍光標識したＴＬＲ１抗体を、３本目と１１本目はＰＥで蛍光標識したＴＬＲ２抗体を、４本目と１２本目はＰＥで蛍光標識したＴＬＲ３抗体を、５本目と１３本目はＰＥで蛍光標識したＴＬＲ４抗体を、６本目と１４本目はＰＥで蛍光標識したＴＬＲ９抗体を、７本目と１５本目はＰＥで蛍光標識したＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体を、８本目と１６本目はＰＥで蛍光標識したＨＬＡ−ＤＲ抗体をそれぞれに入れ、室温で３０分〜４５分間反応させ抗原抗体反応を完了させた。
【００１４】
フローサイトメトリーでの分析は、まず、励起させるレーザー光の波長を４８８ｎｍとし、１本目のＦＩＴＣ蛍光標識したＣＤ１４抗体のみを入れたサンプルの解析を行った。コンピューター上で、前方散乱と側方散乱に分けたグラフ画面上で、ＣＤ１４陽性細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞）が多く集まる細胞集団を曲線ゲート（以下、Ａゲートと略する）で囲み、さらに、側方散乱を横軸にＣＤ１４の陽性度を表わす対数軸を縦軸にとったグラフでＦＩＴＣ蛍光を５２０ｎｍの側方散乱光で拾い、ＣＤ１４が陽性となる細胞群を四角ゲート（以下、Ｂゲートと略する）で囲んで、そのＡとＢの両ゲート内に入る細胞のみに関して分析を行うよう設定した。そして、ＣＤ１４陽性細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞）が持つ自家蛍光とＣＤ１４細胞のＣＤ１４平均蛍光強度（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をまず測定しておいた。
【００１５】
次に、２本目のサンプル、ＦＩＴＣ蛍光標識したＣＤ１４抗体とＰＥで蛍光標識したＴＬＲ１抗体の分析を行い、ＡとＢの両ゲートに入る細胞集団の細胞膜上に存在するＴＬＲ１量を６１０ｎｍの蛍光波長を拾い、ＴＬＲ１のＭＦＩの測定を行った。この値をＣＤ１４陽性細胞の自家蛍光ＭＦＩで割った値を１細胞あたりの膜表面に発現しているＴＬＲ１レセプターの量とし数値化した。同様に、２本目〜８本目のサンプルを分析器にかけ、連続的にＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲの測定数値化を行った。この測定の間に要した時間はおよそ１時間であった。続いて、同じ１本目〜８本目と同じサンプルである９本目〜１６本目のサンプルに関して、１時間遅れで上記すべての値に関して測定を行った。
【００１６】
また、３名の別人の正常健康者より採血し、冷凍保存しておいた単核球を３７℃で解凍し、遠心操作を行い、上清を除去した。ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍにヒト血漿濃度が、それぞれ２０％、２５％、５％となるように添加し、すべての血漿濃度の場合に全部で１６ｍｌとした液体内に単核球を浮遊させることで、上述の操作を行い、それぞれ１本目〜８本目、さらに同じサンプルである９本目〜１６本目の合計１６本のサンプルを準備し、フローサイトメトリー解析を行った。２０％、２５％、５％ヒト血漿入りの各３名の１本目〜８本目のサンプルを連続して計るまで約１時間を要し、すべて一時間遅れで各３名の９本目〜１６本目のサンプルに関して、分析を行った。
【００１７】
フローサイトメトリーを用いた測定方法では、細胞と各蛍光標識抗体とを反応させる必要があり、最低でも抗原抗体反応が完了するためには、３０分から４５分程度の時間経過が必須となる。この経過時間にフローサイトメトリーでの測定に要する時間を加えれば、患者の感染症を反映したそのままの細胞状態で、ＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲを、順次連続的に測定することは、従来方法論に従っては、不可能である。そのため、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍにそのヒト自身の血漿を入れ込むことを発案した。
従来のＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに細胞群を浮遊させフローサイトメトリーで測定する方法では、細胞にストレスを与え、約１時間も経てばアポトーシスが生じてくる。このことは、フローサイトメトリーによる解析コンピューター画面上Ａゲートの細胞集団が左下方へ外れていくことで表わされ、５％と２５％ヒト血漿でも、抗体と反応させてから約１時間３０分も経過すれば、Ａゲート内の細胞の数的割合は減り、左下方への細胞集団の移動が観察されることで示された。
ここに、感染症を含むその他疾患（自己免疫疾患）の有無をこれら自然免疫、獲得免疫に関与する細胞膜上分子を利用して明らかとするためには、すべての分子にわたって連続的に測定する必要が生じる。
【００１８】
５％と２５％濃度では、１本目〜８本目のサンプルを測定終了した時点（抗体処理から約２時間３０分後）では、同一であるはずの９本目〜１６本目のサンプルの測定値に最大で±５０％の変化が生じた。このことにより、抗体と反応させて後に１本目〜８本目のサンプルを順次測定する間にも、細胞変性が進行しているのは確実であり、測定した値が患者の細胞状態を表わしたものとは考え難いと結論された。さらに、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃは、細胞にストレスがかかれば、細胞内変性タンパクが増え、その抗原提示を行うため、細胞膜上の量は増えてくる。５％ヒト血漿濃度では、この現象が起こっており、アポトーシスが生じなくとも、測定するＣＤ１４陽性細胞にストレスがかかっていることが観察され、このような細胞膜上各種レセプターの測定量は、正確なものとはいえない。逆に、２５％ヒト血漿濃度では、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ量が減少することが観察された。このことは、ストレス緩和もしくはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞に自己細胞であることを認識させる必要性がなくなっているために起こっている現象とみなされ、このように２５％高濃度血漿の場合でも、細胞膜上各種レセプターの測定量は、信頼性（正確性）を欠いたものであった。以上より、５％と２５％ヒト血漿では、ＣＤ１４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＨＬＡ−Ａ,Ｂ,Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲを順次連続して正確な測定を行うことは、不可能であった。
【００１９】
しかしながら、１０％〜２０％ヒト血漿濃度では、アポトーシスもほとんど起こることなく（Ａゲートから外れる細胞数もほとんどなく）、１本目〜８本目のサンプルの測定値と１時間遅れで測定した９本目〜１６本目のサンプルの測定値は、いずれも±２０％の変化に留まった。ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ分子の抗体処理を行ってから約３時間以内での時間的変化もほとんど認められなかった。これらの事実より、患者の細胞状態を最も正確に表わす測定には、１０％〜２０％ヒト血漿含有ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍでの細胞抗体処理する方法が適切であり、その後のフローサイトメトリーによる各種細胞膜上タンパク量の測定値は、患者のもった免疫担当細胞群の状態そのものに最も近いものと判断され得る。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、患者の静脈血液の採取により、単球、マクロファージ、樹状細胞上のこれら分子群（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ)を連続して測定でき、しかも正確な測定値が得られる。これにより、ヒトの疾患においてウイルス感染症なのか、細菌感染症なのか、また、感染症ではなく別の疾患なのか鑑別できるようになる。また、細菌感染症と明らかに判っていても、その細菌を同定できないことも多かった。例えば、抗生剤投与療法中であれば、感染性心内膜炎や敗血症の血液培養による細菌同定率は低いが、たとえ抗生剤投与中であっても、菌体成分に反応する細胞の特性をみる本発明では、細菌のグラム陽性菌かグラム陰性菌かを判断でき、治療にとって非常に有用な情報を与えるものとなる。さらに、サンプルが採取できない箇所における炎症があったとしても、採血という簡易的方法により、感染症の有無について判断できる。
また、本発明は、患者血液から分離した単核球分画（単球、マクロファージ、樹状細胞を含む）に最適な処理を施すことで、フローサイトメトリー機器を使用し、感染症の有無あるいは疾患鑑別という課題の解決に寄与しようとするものであり、患者が感染症に侵されているかどうかの診断が、迅速かつ正確に行え、従来にはなかった医療上有用な補助的検査方法を提供するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を図面に示す測定結果に基づいて詳細に説明する。
本発明に係るフローサイトメトリーのコンピューターの画面上に設定した各グラフの一覧を列記して示した。図１から図４は、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図５から図８はＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに２０％ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図９から図１２はＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに５％ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図１３から図１６はＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに２５％ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。
【００２２】
詳述すると、まず、図１（ａ）は、前方散乱を縦軸に側方散乱を横軸にとったグラフであり、単核球細胞群のなかでも、その細胞の大きさおよび細胞内小器官密度により、ある程度、各種細胞集団に分けることが可能となる。Ａの曲線形態ゲートに囲まれた部分に多くのＣＤ１４陽性細胞が存在する。図１（ｂ）は、ＡゲートにおいてＣＤ１４陽性細胞をさらにＢゲートに入る細胞集団として分けたもので、以下の解析は、ＡとＢの両ゲートに入ったもののみ、つまり、単球、マクロファージ、樹状細胞について解析するようコンピューター設定を行った結果を示す。図中、右側の図１（ｃ）と図１（ｄ）は、図１（ａ）と図１（ｂ）を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図２（ａ）と図２（ｂ）は、それぞれ、ＦＩＴＣ標識ＣＤ１４抗体でとらえたＣＤ１４の平均蛍光強度(ＭＦＩ:ｍｅａｎ  ｆｌｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ)とＡ、Ｂ両ゲートに入ったＣＤ１４陽性細胞の（単球、マクロファージ、樹状細胞）の自家蛍光を表わしたグラフである。図中、右側の図２（ｃ）と図２（ｄ）は、図２（ａ）と図２（ｂ）を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図３（ａ）〜（ｅ）は、ＰＥ標識ＴＬＲ１，２，３，４，９でとらえた各ＴＬＲのフローサイトメトリーでの一次元解析を表わすグラフで、それらのＭＦＩ値とそれらの値を自家蛍光ＭＦＩで割った値、つまり、各ＴＬＲの細胞表面発現量を示すものである。図面右側の図３（ｆ）〜（ｊ）は、図３（ａ）〜（ｅ）を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図４（ａ）と図４（ｂ）は、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ,Ｂ,Ｃ抗体とＰＥ標識ＨＬＡ−ＤＲ抗体でとらえたＨＬＡ−Ａ,Ｂ,ＣとＨＬＡ−ＤＲのフローサイトメトーでの一次元解析を表わすグラフで、それらのＭＦＩ値とそれらの値を自家蛍光ＭＦＩで割った値、つまり、各ＨＬＡの細胞表面発現量を示す。図中、右側の図４（ｃ）と図４（ｄ）は、図４（ａ）と図４（ｂ）を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図５から図８に示すグラフは、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに２０％ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図１から図４に示すグラフとそれぞれ同じものである。図９から図１２に示すグラフは、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに５％ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図１から図４に示すグラフとそれぞれ同じものである。図１３から図１６に示すグラフは、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍに２５％ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図１から図４に示すグラフとそれぞれ同じものである。
【００２３】
先ず、本検査の実施にあたり同意を得た正常健康者ボランティア（実施例で行ったのは４名）からノボ・ヘパリン（１００００単位/１０ｍｌ）１ｍｌ入り注射器にて３０ｍｌの静脈採血を行い、清潔操作にて最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ入りリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ／ＥＤＴＡと略する）を２０ｍｌ添加し、室温、４００ｇで３５分間遠心した後、上部の１．５倍に希釈された血漿と下部の赤血球とに分離し、その中間に存在するバフィーコート層を採取した（慎重に希釈された上部の血漿を別の清潔容器に移し取りながら）。採取した８〜１０ｍｌ程のバフィーコートをＰＢＳ／ＥＤＴＡで３５ｍｌまで希釈し、１５ｍｌのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商品名：第一化学薬品株式会製，ＪＡＰＡＮ）を入れた新たな５０ｍｌ容器に３５ｍｌの細胞溶液を緩やかに入れ上乗せし２層に分かれるようにする。再び、４００ｇで３５分間遠心し、上清を取り除きながら中間層にできた１０ｍｌ程度の単核球層を分離する。ＰＢＳ／ＥＤＴＡで５０ｍｌとし、３００ｇで１０分間遠心し、沈澱した細胞を吸い取らないよう慎重に上清を除き、混入している血小板を取り除く。次に、再度５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡで撹拌し、細胞を浮遊させ、２５０ｇで１０分間遠心を２度繰り返し行い、混入している血小板を取り除く操作を行った。最後に、細胞凍結保存液であるセルバンカー２（商品名：＃ＺＣＢ-２０１、ダイアトロン，ＪＡＰＡＮ）の１．５ｍｌに沈澱した単核球細胞を浮遊させ、−８０℃の冷蔵庫に保存した。最初に分離したＰＢＳ／ＥＤＴＡで希釈された血漿も同じく−８０℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【００２４】
フローサイトメトリーでのＴＬＲｓ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲの解析時において、−８０℃で単核球細胞を保存液に入れ、ストックしておいたチューブを３７℃の温浴につけ、約５分間かけて溶解させた。続いて３００ｇの遠心を１０分間行い、細胞を沈澱させ、上清を吸い取った。
ヒト血漿各濃度（本実施例で行ったのは、５％、１０％、２０％、２５％の濃度）含有ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内に沈澱細胞を浮遊させ、１．５ｍｌチューブを８本準備しておき、均等に８サンプルに分注した（本実施例では、時間差をみるため、２倍の１６本に分注した。）。速やかにすべてのサンプルにＦＩＴＣ標識ＣＤ１４抗体を５μｌ添加していき、次いで２本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ１抗体を５μｌ添加した。３本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ２抗体を、４本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ３抗体を、５本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ４抗体を、６本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ９抗体を、７本目のサンプルには、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体を、８本目のサンプルには、ＰＥ標識ＨＬＡ−ＤＲ抗体を、それぞれ５μｌ添加した。そして、室温で３０分〜４５分程度時間をおき、抗原抗体反応を進行させた。
【００２５】
その後、フローサイトメトリー機器での分析を行ったが、その蛍光励起レーザー光の波長は、４８８ｎｍとした。ＦＩＴＣ蛍光は、５２０ｎｍを中心にして拾い、光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。ＰＥ蛍光は、６１０ｎｍを中心にして拾い、別の光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。
図１（ａ）は、前方散乱（細胞の大きさを表わす）と側方散乱（細胞内の小器官密度を表わす）から考えて、Ａの曲線形態ゲート内に囲まれた細胞集団が、単球、マクロファージ、樹状細胞を多く含む集団であることが予測された。その左下方の数的割合の多い集団は、リンパ球の集団である。図１（ｂ）では、予測通り、Ａゲートに囲まれた部分は、約８０％の細胞が、ＣＤ１４陽性細胞でＢの四角ゲート内に入ってきた。したがって、Ａ、Ｂ両ゲート内に入った細胞群のみの分析は、ほぼ単球、マクロファージ、樹状細胞のみの分析を行ったに等しい（ＣＤ１４陽性細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞のみであるから）。
【００２６】
図２（ａ）は、縦軸に細胞数をとり、積分面積値に等しいＣＤ１４細胞群の平均蛍光強度（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を表わしたグラフであり、その数値は積分面積値に等しい。図２（ｂ）では、ＰＥ標識の抗体を入れていない６１０ｎｍ蛍光波長を拾いＣＤ１４陽性細胞群が自らもつ自家蛍光のこの波長範囲内での強さを表わした。すべての物質は、原子でできており、当然のことながら自家蛍光をもっている。細胞も例外ではない。
【００２７】
図３（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、６１０ｎｍ蛍光波長を拾ってＰＥ標識ＴＬＲ１、２、３、４、９抗体処理後のＭＦＩ値を解析した結果である。ここで得られた各ＭＦＩ値をＣＤ１４陽性細胞のもつ自家蛍光のＭＦＩで割った値をもって、各ＴＬＲｓの細胞膜上の発現量を数値化できる。
【００２８】
図４（ａ）と（ｂ）は、それぞれＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体とＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理した際の、６１０ｎｍ蛍光波長を拾ったＭＦＩ値を表わしたもので、これら数値をＣＤ１４陽性細胞のもつ自家蛍光のＭＦＩで割れば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲの量を数値化できる。
【００２９】
図１〜図４を通して、右側のグラフはすべて、左側のグラフと抗体処理時間を同じくした完全に同一のサンプルではあるが、フローサイトメトリーでの解析を故意に１時間遅延させてから行ったものである。
【実施例１】
【００３０】
炎症所見のない正常健康者で、本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ，ＵＳＡ：１００００単位／１０ｍｌ）１ｍｌ入り注射器にて３０ｍｌの静脈採血を行った。清潔操作にて最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ入りリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）(以下、ＰＢＳ／ＥＤＴＡと略する)の２０ｍｌを添加し、スイングローターにセットし、ブレーキなしで２０℃、４００ｇで３５分間遠心した。バフィーコート層の上部５ｍｌを残し、最上部の１．５倍に希釈された血漿を慎重に別の清潔５０ｍｌ円錐チューブに移し取りながら、その中間に存在するバフィコート層をさらに別の５０ｍｌ円錐チューブに採取した（下部層は、赤血球）。採取した８〜１０ｍｌ程のバフィーコートにＰＢＳ／ＥＤＴＡを加え３５ｍｌとし、転倒混和した。新たに５０ｍｌ円錐チューブに１５ｍｌのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商品名：第一化学薬品株式会製，ＪＡＰＡＮ）を入れ、３５ｍｌに希釈したバフィーコート層を緩やかに入れ重層した。これをスイングローターにセットし、ブレーキなしで２０℃、４００ｇで３５分間遠心した。上清を取り除きながら中間層にできた１０ｍｌ程度の単核球層を分離し、清潔な５０ｍｌ円錐チューブに移した。そして、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで５０ｍｌとし、３００ｇで１０分間遠心し、沈澱した細胞を吸い取らないよう慎重に上清を取り除いた。次に、再度５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡで撹拌し、細胞を浮遊させ、２５０ｇで１０分間遠心を２度繰り返し行い、混入している血小板を取り除く操作を行った。最後に、細胞凍結保存液であるセルバンカー２（＃ＺＣＢ-２０１、ダイアトロン，ＪＡＰＡＮ）の１．５ｍｌに沈澱した単核球細胞群を浮遊させ、−８０℃の冷蔵庫に保存した。最初に分離したＰＢＳで希釈された血漿も同じく−８０℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【００３１】
−８０℃で単核球細胞を保存液に入れ、ストックしておいたチューブとＰＢＳ／ＥＤＴＡで希釈したそのヒトの血漿を３７℃の温浴につけ、約５分間かけて溶解させた。続いて細胞の入ったストックチューブを３００ｇの遠心に１０分間かけ、細胞を沈澱させ、上清の保存液を吸い取った。
ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度が１０％になるように血漿を加え１６ｍｌの細胞懸濁液を準備した。そこに沈澱細胞を浮遊させ、１．５ｍｌチューブの１６本に等しく分注した。速やかにすべてのサンプルにＦＩＴＣ標識ＣＤ１４抗体（ｅｂｌｏｓｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１１−０１４９．ＵＳＡ）を５μｌ添加していき、次いで２本目と１０本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９９１１，ＵＳＡ）を５μｌ添加した。３本目と１１本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２-９９２２，ＵＳＡ）を、４本目と１２本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９０３９，ＵＳＡ）を、５本目と１３本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９９１７，ＵＳＡ）を、６本目と１４本目のサンプルには、ＰＥ標識ＴＬＲ９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９０９９，ＵＳＡ）を、７本目と１５本目のサンプルには、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９９８３  ＵＳＡ）を、８本目と１６本目のサンプルには、ＰＥ標識ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２−９９５６，ＵＳＡ）を、それぞれ５μｌ添加した。そして、室温で３０分〜４５分程度時間をおき、抗原抗体反応を進行させた。
【００３２】
その後、フローサイトメトリー機器（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）での分析を行ったが、その蛍光励起レーザー光の波長は、４８８ｎｍとし、ＦＩＴＣ蛍光は、５２０ｎｍを中心にして拾い、光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。ＰＥ蛍光は、６１０ｎｍを中心にして拾い、別の光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度の測定を行った。
図１（ａ）は、前方散乱（細胞の大きさを表わす）と側方散乱（細胞内の小器官密度を表わす）から考えて、Ａの曲線形態ゲート内に囲まれた細胞集団が、単球、マクロファージ、樹状細胞を多く含んだ集団であることが、それら細胞形態より予測された。その左下方の数的割合の多い集団は、Ｔ、Ｂリンパ球の集団であることも確かめた。図１（ｂ）では、予測通り、Ａゲートに囲まれた部分の約８０％の細胞が、ＣＤ１４陽性細胞であり、Ｂの四角ゲート内に入ってきた。したがって、Ａ、Ｂ両ゲート内に入った細胞群のみの分析を行うようコンピューターを設定し、単球、マクロファージ、樹状細胞のみの分析を行った（ＣＤ１４陽性細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞のみであるから)。
【００３３】
図２（ａ）は、縦軸に細胞数をとり、その積分面積値を表わすＣＤ１４細胞群の平均蛍光強度（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をコンピューターグラフ上に描かせ数値化した（ＰＥ蛍光のみの一次元解析）。図２（ｂ）では、ＰＥ標識の抗体を入れていない６１０ｎｍ蛍光波長を拾い、ＣＤ１４陽性細胞群が自らもつ自家蛍光のこの波長範囲内での強さをコンピューターグラフ上に表わした (すべての物質は、原子でできており、当然のことながら自家蛍光をもっているため、細胞も例外ではない)。
【００３４】
図３（ａ）〜（ｅ）の結果は、ＰＥ標識ＴＬＲ１、２、３、４、９抗体処理後、２本目から６本目のサンプルを連続的に解析していき、６１０ｎｍ蛍光波長を拾ったＡとＢの両ゲートに入った細胞のみの一次元解析であり、それぞれのＭＦＩ値を示した。ここで得られた各ＭＦＩ値をＣＤ１４陽性細胞のもつ自家蛍光のＭＦＩで割った値をもって、各ＴＬＲｓの細胞膜上の発現量として数値化した。
【００３５】
図４（ａ）と（ｂ）は、それぞれＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体とＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理した際の、６１０ｎｍ蛍光波長を拾ったＭＦＩ値を表わしたもので、これら数値をＣＤ１４陽性細胞のもつ自家蛍光のＭＦＩで割り、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲの量として数値化した。
【００３６】
続いて、図１乃至図４を通して、図中、右側のグラフはすべて、左側のグラフと抗体処理時間を同じくした完全に同一のサンプルの測定結果ではあるものの、フローサイトメトリーでの解析を故意に１時間遅らせてから連続的に実施例１と同様にして計測したものである。
【実施例２】
【００３７】
別の正常健康者で、この本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ，ＵＳＡ：１００００単位/１０ｍｌ）１ｍｌ入り注射器にて３０ｍｌの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、（００１９）においては、単核球分画沈澱細胞を懸濁するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度に関して、この場合２０％になるように血漿を加え、全体を１６ｍｌの細胞懸濁液とし、同様に１６本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーでの１〜８本目の測定値と故意に１時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である９〜１６本目の測定値とを比較した。
【実施例３】
【００３８】
３人目の正常健康者で、この本研究への参加に同意し、血液を提供して頂ける方より、ノボ・ヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ，ＵＳＡ：１００００単位/１０ｍｌ）１ｍｌ入り注射器にて３０ｍｌの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、単核球分画沈澱細胞を懸濁するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度に関して、この場合５％になるように血漿を加え、全体を１６ｍｌの細胞懸濁液とし、同様に１６本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーでの１〜８本目の測定値と故意に１時間遅くらせてから連続的に解析した同一のサンプル群である９〜１６本目の測定値とを比較した。
【実施例４】
【００３９】
４人目の正常健康者で、本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ，ＵＳＡ：１００００単位/１０ｍｌ）１ｍｌ入り注射器にて３０ｍｌの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、単核球分画沈澱細胞を懸濁するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度に関して、この場合２５％になるように血漿を加え、全体を１６ｍｌの細胞液とし、同様に１６本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーで１〜８本目の測定値と故意に１時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である９〜１６本目の測定値とを比較した。
【００４０】
本実験系での実施例１から実施例４までの結果のまとめと結論を以下に記載する。
１６本のサンプルを準備し、フローサイトメトリーでの１〜８本目の解析と故意に１時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である９〜１６本目を測定値と比較検討した結果より、まず、沈澱細胞群（単核球分画）を懸濁するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度に関して、５％の場合には、前方散乱を縦軸に側方散乱を横軸にとって描いたグラフ上の単球、マクロファージ、樹状細胞が多く集まったＡゲート内の細胞が、時間経過とともに左下方へと外れていき（アポトーシスを表わす）、フローサイトメーターで解析を行った最初のサンプルでは、全体の６.９％がゲート内に入っていたはずが、約１時間後には、４.８％にまで減少した。さらに、ＣＤ１４のＭＦＩ値にも変化が生じた。同一サンプルであるにもかかわらず、ＴＬＲ３においては、１時間経過後に＋４６％もの差異を生じ、ＴＬＲ９においては、−６７％の差異が生じた。その他ＴＬＲ１で＋２３％の違いがでた。以上のことより、避けられない抗原抗体反応の時間経過内に、１サンプル〜９サンプルにおいても、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものになっていない可能性が大きく、正確性を欠くことが判る。
【００４１】
次に、沈澱細胞群（単核球分画）を懸濁するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度に関して、２５％の場合にも、Ａゲート内の細胞が、時間経過とともに左下方へと外れていき、全体の６.４％あった細胞群が４.９％に減少した。ＨＬＡ−Ａ,Ｂ,Ｃ分子発現に−２８％の差異を生じ、ＴＬＲ２で、−４１％もの差異が出た。また、ＴＬＲ９では、＋３５％の違いが生じ、ヒト血漿濃度を高濃度にしても、アポトーシスは避けられず、これらレセプター群の連続的測定において、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものになっていない可能性は大きい。
【００４２】
一方、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度を１０％と２０％にした場合、１０％では、Ａゲート内細胞数割合が、６.２％から４.７％へと減少するにもかかわらず（２０％では、Ａゲート内細胞数割合が、３.５％から３.８％と減少することはなかったが）、すべての測定結果が、±２０％以内におさまり、特に、ＨＬＡ−Ａ,Ｂ,Ｃ分子発現量に時間的変化が起こっていないということは、細胞へのストレスの少なさを意味したものである。
したがって、フローサイトメトリーによって、これらレセプター群を連続的に測定することにおいて、抗原抗体反応時間、解析時間を合わせた時間経過があるとしても、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものに近い状態になっている可能性が大きいのは、ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ内のヒト血漿濃度を１０％〜２０％にし、単核球分画を混濁させ、測定を行った場合であると判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、前方散乱及び側方散乱を測定した結果とＣＤ１４陽性細胞集団を示すグラフである。
【図２】１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、ＣＤ１４蛍光強度を測定した結果とそれらの細胞集団を示すグラフである。
【図３】１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＴＬＲの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＨＬＡの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】２０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、前方散乱及び側方散乱を測定した結果と、ＣＤ１４陽性細胞を示すグラフである。
【図６】２０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、ＣＤ１４蛍光強度を測定した結果とそれら細胞集団の自家蛍光を示すグラフである。
【図７】２０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＴＬＲの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図８】２０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＨＬＡの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図９】５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、前方散乱及び側方散乱を測定した結果とＣＤ１４陽性細胞集団を示すグラフである。
【図１０】５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、ＣＤ１４蛍光強度を測定した結果とそれら細胞集団の自家蛍光を示すグラフである。
【図１１】５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＴＬＲの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＨＬＡの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】２５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、前方散乱及び側方散乱を測定した結果とＣＤ１４陽性細胞集団を示すグラフである。
【図１４】２５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、ＣＤ１４蛍光強度を測定した結果とそれら細胞集団の自家蛍光を示すグラフである。
【図１５】２５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＴＬＲの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１６】２５％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ条件下において、各ＨＬＡの細胞表面発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2006046977.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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