(57)【要約】【課題】  本発明は、IP3の検出方法に関する。【解決手段】  イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R）のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を有するタンパク質の両末端それぞれに、蛍光のエネルギー移動（FRET）法に用いることのできるエネルギー供与体となる蛍光タンパク質およびエネルギー受容体となる蛍光タンパク質が融合した融合タンパク質を用いて、FRET法によりセルフリー系および細胞内のIP3濃度を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R）のアミノ酸第226〜575からなるIP3結合コアを含有するタンパク質の両末端それぞれに、蛍光のエネルギー移動（FRET）法に用いることのできるエネルギー供与体となる蛍光タンパク質と、エネルギー受容体となる蛍光タンパク質とがそれぞれ融合した融合タンパク質。
【請求項２】
IP3Rが、マウスタイプ１イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R1）である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
マウスIP3R1のIP3結合コアが、該IP3R1のアミノ酸第224〜575のアミノ酸配列からなる、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
上記IP3結合コアを含有するタンパク質の、N末端に上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質およびC末端に上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がそれぞれ融合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質がVenus、EYFPおよびReAshからなる群より選択されたものであり、かつ上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がECFPまたはFlAsHであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質がVenusであり、かつ上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がECFPであることを特徴とする、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸分子をそのコードタンパク質を発現し得る形で含む、細胞。
【請求項１１】
IP3RのIP3結合コアを含有するタンパク質を用いるIP3濃度を検出する方法であって、上記IP3結合コアにIP3が結合することにより起こる上記IP3結合コアを含有するタンパク質の構造変化をFRET法により検出することを特徴とする、上記方法。
【請求項１２】
IP3濃度を検出する方法であって、
a) 請求項１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を用意し、これに、IP3を含むと疑われる試料と接触させるステップ、および
b) 上記接触の前後における、融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１３】
IP3濃度を検出する方法であって、
a) マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列からなるIP3結合コアを含有するタンパク質のN末端にVenusが、C末端にECFPがそれぞれ融合している融合タンパク質を用意し、これに、IP3を含むと疑われる試料と接触させるステップ、および
b) 上記接触の前後において、該タンパク質にECFPの励起波長の光を照射し、ECFPによる蛍光強度とVenusによる蛍光強度とを測定して両者の比を求め、上記接触の前と後における該比を比較することにより、上記接触の前後における融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含み、ここで、該比の変化は試料中のIP3の濃度を反映するものである、上記方法。
【請求項１４】
細胞内のIP3濃度を検出する方法であって、
a) 請求項１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を、細胞内に導入するステップ、および
b) 該融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１５】
細胞内のIP3濃度を検出する方法であって、
a) マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列からなるIP3結合コアを含有するタンパク質のN末端にVenusが、C末端にECFPがそれぞれ融合している融合タンパク質を、細胞内に導入するステップ、および
b) 該細胞にECFPの励起波長の光を照射し、ECFPによる蛍光強度とVenusによる蛍光強度とを測定して両者の比を求め、融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含み、ここで、該比の変化は細胞内のIP3の濃度を反映するものである、上記方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、上記a)の融合タンパク質を細胞内に導入するステップが、該タンパク質を細胞内にインジェクションすることにより達成させることを特徴とする、上記方法。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の方法であって、上記a)の融合タンパク質を細胞内に導入するステップが、該タンパク質をコードする核酸分子を、発現可能な形で細胞内に導入することにより達成させることを特徴とする、上記方法。
【請求項１８】
IP3指示薬を製造するための、マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１９】
IP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸分子の、IP3指示薬を製造するための使用。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を含む、IP3検出用キット。
【請求項２１】
請求項８記載の核酸分子を含む、IP3検出用キット。
【請求項２２】
請求項９記載のベクターを含む、IP3検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IP3濃度の高感度測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）であり、哺乳動物では、3種の異なるIP3受容体が存在する。タイプ１IP3レセプター(IP3R1)は、中枢神経系、特に小脳において高発現している。マウスIP3R1は、2749アミノ酸からなり(非特許文献１参照)、３つの機能的に異なる領域に分かれている。すなわち、N末端近傍にIP3結合ドメイン、C末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら2つの領域のあいだに制御領域が存在する。IP3結合ドメインの欠失突然変異体解析より、IP3受容体のアミノ酸226〜578残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な領域であることが示され、IP3結合コアと呼ばれている(非特許文献２参照)。上記IP3結合コアにIP3が結合することにより、IP3受容体が立体構造変化を起こし、それによってチャネルの開口が誘発されると考えられているが、IP3により誘発されるIP3受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明である。
【０００３】
IP3受容体の活性化による細胞質Ca2+濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っており、IP3分子は様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。かかる細胞内のIP3の濃度変化を測定することは、細胞機能および種々の細胞応答の機序を解明する上で非常に重要であり、その測定方法の開発が急務であった。
【０００４】
しかし、in vitroでのIP3の定量に有効な指示薬として[3H]IP3を用いた方法が開発されているものの、放射性同位元素を使用するなどの点で簡便ではない。さらに、生細胞内のIP3濃度変化の経時的な検出法は、GFP-プレクストリン相同性ドメイン(pleckstrin homology domain)の細胞膜から細胞質への移行をモニターすることにより検出する方法があるが、該方法も間接的、かつ定量性及び空間解像度等の点で問題があるなど、必ずしも有効な方法ではないことが既に報告されている（J. van der Wal, R. Habets, P. Varnai, T. Balla, K. Jalink, J Biol Chem 276, 15337-44 (2001)., C. Xu, J. Watras, L. M. Loew, J Cell Biol 161, 779-91 (2003)., R. Irvine, Curr Biol 14, R308-10 (2004).）。加えて、本発明者らと同様にIP3結合コアを使用したIP3指示薬の報告があるが（Tanimura, A et.al., J Biol Chem,279, 38095-8）、この報告では、細胞の形質膜に局在させないとIP3指示薬が機能しないことから、既法では局所的なIP3の濃度変化を捉えることができるのみである。
【０００５】
本発明者らは、IP3R1に結合するIP3受容体結合タンパク質IRBIT(IP3R binding protein released with inositol 1,4,5-trisphospate)を見出している。IRBITは、in vitroおよびin vivoでIP3R1に結合し、生理的濃度のIP3によりIP3R1から解離する。このIRBITの特性を利用して、IP3の濃度を測定する方法を開発した（特許文献１参照）。
【０００６】
IRBITを用いて細胞内のIP3の濃度を測定する方法では、IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質と、IP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質との、タンパク質複合体を調製する必要がある。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２９６１２号公報
【非特許文献１】Furuichi, T., Yoshikawa, S., Miyawaki, A., Wada, K., Maeda, N., Mikoshiba, K. (1989) Nature 342, 32-38
【非特許文献２】Yoshikawa, F., Morita, M., Monkawa, T., Michikawa, T., Furuichi, T., and Mikoshiba, K. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18277-18284
【非特許文献３】J. van der Wal, R. Habets, P. Varnai, T. Balla, K. Jalink, J Biol Chem 276, 15337-44 (2001).
【非特許文献４】C. Xu, J. Watras, L. M. Loew, J Cell Biol 161, 779-91 (2003).,
【非特許文献５】R. Irvine, Curr Biol 14, R308-10 (2004).
【非特許文献６】Tanimura, A et.al., J Biol Chem,279, 38095-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生細胞内におけるIP3の濃度を測定するための、より簡便な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
IP3R1にIP3が結合すると、IP3R1の立体構造が変化するという仮説に基づいて、この立体構造の変化を利用するIP3の濃度を測定する方法の開発を試みた。IP3R1のIP3コア領域からなるタンパク質（本明細書中、IRIS: IP3R-based IP3 sensor）の両末端のそれぞれに、FRET法に利用可能なエネルギー受容体タンパク質またはエネルギー供与体タンパク質を融合したタンパク質を作製する。得られたタンパク質は、可溶性で細胞質に局在することが分かった。該タンパク質にIP3分子を結合させると、該タンパク質中のエネルギー受容タンパク質の蛍光が減少することが判った。このタンパク質の蛍光の減少を指標とするIP3の濃度の測定方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の態様：
１．イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R）のIP3結合コアを含有するタンパク質の両末端それぞれに、蛍光のエネルギー移動（FRET）法に用いることのできるエネルギー供与体となる蛍光タンパク質と、エネルギー受容体となる蛍光タンパク質とがそれぞれ融合した融合タンパク質；
２． IP3Rが、マウスタイプ１イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R1）である、上記１記載の融合タンパク質；
３．マウスIP3R1のIP3結合コアが、該IP3R1のアミノ酸第224〜575のアミノ酸配列からなる、上記２記載の融合タンパク質；
４．上記IP3結合コアを含有するタンパク質の、N末端に上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質およびC末端に上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がそれぞれ融合していることを特徴とする、上記１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質；
５．上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質がVenus、EYFPおよびReAshからなる群より選択されたものであり、かつ上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がECFPまたはFlAsHであることを特徴とする、上記１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質；
６．上記エネルギー受容体となる蛍光タンパク質がVenusであり、かつ上記エネルギー供与体となる蛍光タンパク質がECFPであることを特徴とする、上記５記載の融合タンパク質；
７．配列番号１のアミノ酸配列を有する上記１記載の融合タンパク質；
８．上記１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子；
９．上記８記載の核酸分子を含むベクター；
１０．上記８記載の核酸分子をそのコードタンパク質を発現し得る形で含む、細胞；
１１．イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R）のIP3結合コアを含有するタンパク質を用いるIP3濃度を検出する方法であって、上記IP3結合コアにIP3が結合することにより起こる上記IP3結合コアを含有するタンパク質の構造変化をFRET法により検出することを特徴とする、上記方法；
１２．IP3濃度を検出する方法であって、
a) 上記１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を用意し、これに、IP3を含むと疑われる試料と接触させるステップ、および
b) 上記接触の前後における、融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含む、上記方法；
１３．IP3濃度を検出する方法であって、
a) マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列からなるIP3結合コアを含有するタンパク質のN末端にVenusが、C末端にECFPがそれぞれ融合している融合タンパク質を用意し、これに、IP3を含むと疑われる試料と接触させるステップ、および
b) 上記接触の前後において、該タンパク質にECFPの励起波長の光を照射し、ECFPによる蛍光強度とVenusによる蛍光強度とを測定して両者の比を求め、上記接触の前と後における該比を比較することにより、上記接触の前後における融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含み、ここで、該比の変化は試料中のIP3の濃度を反映するものである、上記方法；
１４．細胞内のIP3濃度を検出する方法であって、
a) 上記１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を、細胞内に導入するステップ、および
b) 該融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含む、上記方法；
１５．細胞内のIP3濃度を検出する方法であって、
a) マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列からなるIP3結合コアを含有するタンパク質のN末端にVenusが、C末端にECFPがそれぞれ融合している融合タンパク質を、細胞内に導入するステップ、および
b) 該細胞にECFPの励起波長の光を照射し、ECFPによる蛍光強度とVenusによる蛍光強度とを測定して両者の比を求め、上記融合タンパク質からの蛍光の変化を検出するステップ、
を含み、ここで、該比の変化は細胞内のIP3の濃度を反映するものである、上記方法；
１６．上記１４または１５に記載の方法であって、上記a)の融合タンパク質を細胞内に導入するステップが、該タンパク質を細胞内にインジェクションすることにより達成させることを特徴とする、上記方法；
１７．上記１４または１５に記載の方法であって、上記a)の融合タンパク質を細胞内に導入するステップが、該タンパク質をコードする核酸分子を、発現可能な形で細胞内に導入することにより達成させることを特徴とする、上記方法；
１８．IP3指示薬を製造するための、マウスタイプ１イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R1）のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸分子；
１９．タイプ１イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R1）のアミノ酸第226〜578位のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸分子の、IP3指示薬を製造するための使用；
２０．上記１〜７のいずれか1項記載の融合タンパク質を含む、IP3検出用キット；
２１．上記８記載の核酸分子を含む、IP3検出用キット；ならびに
２２．上記９記載のベクターを含む、IP3検出用キット；
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、IP3濃度の高感度測定が可能となった。本発明の方法は、1種類の融合タンパク質を用意するだけでよく、従来の方法に比べて簡便かつ安価に実施可能である。また、上記融合タンパク質を生細胞内で強制発現させることにより、生細胞内でのIP3濃度の変動が高感度で測定でき、時間的・空間的解析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に用いる、FRET法とは、蛍光のエネルギー移動（FRET：fluorescence resonance energy transfer）を利用して、タンパク質分子間相互作用を解析するために開発された手法である。FRETとは、２つの蛍光団が互いに近距離で適切な位置関係にある時に、一方の蛍光団（エネルギー供与体(donor)）から、もう一つのより長波長側の蛍光団（エネルギー受容体(acceptor)）へ励起エネルギーが移動する現象である。2つの分子を特定の2種の蛍光分子で標識することにより、その２つの分子間の相互作用の変化をFRET効率の変化として測定することができる。
【００１３】
本発明においては、マウスIP3R1のIP3コア領域であるアミノ酸配列を有するタンパク質IRISの両末端をそれぞれ、エネルギー供与体とエネルギー受容体とで標識し、IRISにIP3が結合することにより、エネルギー受容体の蛍光強度の変化を検出するという手法を用いる。すなわち、本発明において用いるFRET法は、2つのタンパク質分子の分子間相互作用を検出するのではなく、１つのタンパク質のN末端とC末端にエネルギー受容体とエネルギー供与体がそれぞれ連結されており、これら互いの距離が変動することによる蛍光強度の変化を指標とするものである。
【００１４】
なお、既に報告されているマウスIP3R1のIP3結合コア領域はアミノ酸第226〜578位であるが、本発明のIRISには、この領域のほぼ全域を含む第224〜275位のアミノ酸配列を用いた。このIRISが、IP3と結合することが本発明者らの実験により確認されたため、IP3結合に必要なIP3結合コア領域はアミノ酸第226〜575の領域で十分であることも判明した。
【００１５】
したがって、マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を有するタンパク質の両末端それぞれに、FRET法のエネルギー供与体となる蛍光タンパク質およびエネルギー受容体となる蛍光タンパク質が融合した融合タンパク質は、IP3指示薬として利用することができる。
【００１６】
なお、本発明に用いられるIP3R1はマウスのものであるが、他の動物種（例えばラットまたはヒト等）由来のIP3R1のIP3結合コア領域を用いてもよい。さらには、タイプ２（IP3R2）またはタイプ３（IP3R3）のIP3RのIP3結合コア領域を用いることもできる。各動物種のIP3R1、IP3R2およびIP3R3のアミノ酸配列は、公知のデータベース等から入手できる。それぞれのIP3結合コア領域もまた、当業者であれば容易に推測できる。例えば、コンピュータソフトウェア（Blast等）を用いた相同性解析により、マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位に対応する領域を検索するという手法も有効である。マウスのタイプIIおよびタイプIIIのIP3Rでは、第224〜604位のアミノ酸配列部分がIP3結合能を有することが既に判っているため、かかる配列を含むか、または該配列の一部であってIP3結合能を有するアミノ酸配列を含む配列を用いることもできる。
【００１７】
本発明に用いる、FRET法のエネルギー供与体となる蛍光分子は、シアン色蛍光タンパク質(CFP)またはこれの改良物であるECFPもしくはFlAsHが好ましく、特にECFPが好ましい。また、エネルギー受容体となる蛍光分子は、黄色蛍光タンパク質(YFP)、Venus、ReAshが好ましいが、特にVenusが好ましい。さらにまた、FRET法に用いるための蛍光分子は今後種々のものが開発されるであろうと予測されるが、それらもまた本発明の実施に使用可能であろう。また、Proc. Natl. Acad. Sci. 101巻 10554〜10559頁 2004年(Nagai, T.ら)に報告されている、Venusの改良体であるcp173Venus、cp49Venus、cp157Venus、cp195Venusおよびcp229Venusのいずれかをエネルギー受容体として用いることも有効であると考えられる。
【００１８】
エネルギー供与体と受容体は、どちらがIRISのNおよびC末端のいずれに連結していてもよい。N末端側にエネルギー受容体が、C末端側にエネルギー供与体が連結していることが好ましい。
【００１９】
かかる融合タンパク質の最も好ましい例として挙げられる、IRISのN末端にVenusが、C末端にECFPがそれぞれ融合している融合タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。
【００２０】
かかる融合タンパク質は、エネルギー供与体をコードするDNA、IP3RのIP3結合ドメインをコードするDNA、およびエネルギー受容体をコードするDNAのそれぞれをインフレームになるように連結し、これを発現ベクター等に挿入して宿主にて発現させることにより、得ることができる。IRIS、すなわちIP3R1のアミノ酸第226〜578位のアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の第242〜593位の配列であり、これをコードするDNAは当業者であれば容易に作製することができ、この両端にエネルギー供与体および受容体をコードするDNAをインフレームで連結することにより、上記融合タンパク質をコードするDNAを得ることができる。これらをインフレームで連結する技法もまた、当業者には公知である。IP3R1のアミノ酸第226〜575位を含むIRISは、両末端にEcoRI部位を有しており、該部位を利用してエネルギー供与体および受容体をコードするDNAと融合させることもできる。IRISと各エネルギー供与体および受容体との間には、１〜５アミノ酸残基、好ましくは１または２アミノ酸残基からなるリンカーが挿入されていてもよい。
【００２１】
得られた融合タンパク質をコードするDNAから該タンパク質を得ることは当業者には容易である。
【００２２】
さらにまた、融合タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするRNA配列も当業者であれば容易に決定でき、その配列を有するRNAを合成して、これから該タンパク質を作製することも可能である。
【００２３】
したがって、上記融合タンパク質をコードする核酸(DNAおよびRNAを含む)もまた、本発明の範囲に包含される。また、IP3RのIP3結合コア領域を含むタンパク質、例えば、マウスIP3R1のアミノ酸第226〜575位のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明の範囲に包含され得る。これらの核酸およびタンパク質を使用して、IP3を検出またはIP3の濃度を検出するための試薬、すなわちIP3指示薬を製造できることは、上記より理解されよう。
【００２４】
さらにまた、本発明の融合タンパク質、または本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むIP3検出用キットもまた、本発明の範囲に包含される。かかるキットは、所定の濃度のIP3を含む、IP3の滴定曲線作製用のIP3標準溶液、または測定用バッファー（例えば、EDTA、2-メルカプトエタノール、および/またはNP-40を適切な濃度で含む、100mM NaCl含有10mM HEPES(pH7.2)）を含んでいてもよい。さらにまた、コントロール実験用に、本発明の融合タンパク質の不活性型、またはそれをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む上記キットの場合、該核酸は発現カセットまたは発現ベクターの形態で含まれていてもよい。また、該キットには、トランスフェクト用の試薬をさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の融合タンパク質を用いるIP3濃度の検出は、セルフリーの系だけでなく、生細胞内でも実施可能である。本発明における「IP3濃度の検出」とは、IP3の定性的検出および定量的検出のいずれをも包含する。また、相対的および/または経時的なIP3濃度の変化を検出することも包含する。本発明の方法は、生理的な範囲内のpH環境下および/またはCa2+存在下でIP3を検出可能である。IP3の代謝産物である、1,4-IP2および1,3,4,5-IP4の存在による影響は、十分に無視できる程度に低く、IP3を特異的に検出し得る。したがって、本発明の方法は、任意の生物学的サンプル（細胞溶解液、細胞抽出物を含む）におけるIP3の定量、生細胞におけるIP3濃度変化の検出等に非常に有用である。
【００２６】
セルフリーの系でIP3濃度を検出する場合は、上記融合タンパク質を用意し、対象とするIP3を含むと疑われる試料と接触させ、その際の融合タンパク質のエネルギー供与体および受容体からの蛍光スペクトルの変化を測定する。より具体的には、試料と接触する前に、融合タンパク質のエネルギー供与体による蛍光強度とエネルギー受容体による蛍光強度を測定し、その比を求め、試料と接触させた後にもそれぞれの蛍光強度を測定して同様に比を求め、それを比較するとよい。「エネルギー供与体による蛍光強度」とは、エネルギー供与体である蛍光団の蛍光励起波長の光を照射した際に該蛍光団から発光される特定の波長の蛍光強度であり、エネルギー供与体としてCFPまたはECFPを用いた場合、その励起波長である約433nmの光を照射した場合の蛍光スペクトルのピークまたはその付近の波長、すなわち460〜510nm、好ましくは470〜478nm、例えば475nmの蛍光強度を指す。「エネルギー受容体による蛍光強度」とは、エネルギー供与体である蛍光団の蛍光励起波長の光を照射した際に、エネルギー供与体の蛍光を受けて励起されたエネルギー受容体である蛍光団から発光される特定の波長の蛍光強度をいう。すなわち、例えば、エネルギー受容体がVenusまたはYFPである場合、その蛍光スペクトルのピークまたはその付近の波長、すなわち、515〜560nm、好ましくは525〜533nm、例えば530nmの蛍光強度を指す。これらの波長は、蛍光団の種類により異なり、また融合タンパク質の周辺環境(バッファー、温度等)により微妙に変動する場合があり得るが、試料の試験に用いる条件下で融合タンパク質を用いて蛍光スペクトルを取得することでピークが得られる波長を判断することができる。
【００２７】
例えば、エネルギー供与体にECFP、エネルギー供与体にVenusを用いた融合タンパク質の場合、そのIP3結合コア領域にIP3が結合することにより、Venusの蛍光スペクトルのピーク強度は減少することが、本発明者らによって見出された。したがって、上記蛍光強度の比を、ECFPの蛍光強度に対するVenusの蛍光強度とした場合、該比はIP3が結合することにより増大するため、試料中のIP3濃度が高いほど該比は大きくなる。
【００２８】
試料を試験する前に、所定の数種類の濃度のIP3に対する蛍光強度の比を上記の通り求め、濃度に対する蛍光強度比の滴定曲線を得ておき、該滴定曲線から試料中のIP3濃度を決定することにより、定量的なIP3濃度の検出が可能となる。
【００２９】
本発明の方法によると、10-7〜10-5Mの濃度のIP3を定量的に検出することが可能である。測定の際の、IRIS-575の濃度は、当業者であれば適宜設定できる。
【００３０】
用いる融合タンパク質は、実質的に単離されたものが好ましく、純度は高い方が好ましいが、完全に単離されたものである必要はなく、該融合タンパク質を適切な濃度で含む溶液を用いることができる。
【００３１】
かかる試験は、IRISとIP3の結合およびエネルギー供与体蛍光団の励起および供与体および受容体蛍光団双方の蛍光が十分に得られる環境下であれば、任意の環境下で行なうことができるが、10〜40℃程度の温度、好ましくは15〜30℃、例えば約20℃で、生理的緩衝液中にて行なうことができる。生理的緩衝液は、種々のものが公知であり、任意のものを使用できるが、例えば、10mM HEPES(pH7.4：100mM NaCl)が挙げられる。さらに、キレート剤、タンパク質変性防止剤、プロテアーゼ阻害剤等（例えばEDTA、2-メルカプトエタノール、非イオン性界面活性剤(例えばNP-40)）を添加して、IRISおよびIP3以外の混入物による影響を抑制することができることは、当業者であれば容易に理解でき、実施する環境に応じて適切なものを選択し、反応溶液に適量添加することは、当業者であれば容易である。
【００３２】
さらにまた、エネルギー供与体および受容体として用いる蛍光団に応じて適切な励起波長用フィルターと蛍光波長用フィルターのセットを用いることにより、画像として蛍光強度をモニターすることができ、また画像を解析することによりIP3の定量的検出を実施できる。
【００３３】
本発明の融合タンパク質を用いて細胞内のIP3濃度変化を検出する場合、上記融合タンパク質を対象とする細胞内にインジェクションするか、または対象とする細胞内で上記融合タンパク質を発現させるとよい。
【００３４】
細胞内へのタンパク質のインジェクションは、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実施できる。また、対象とする細胞内で上記融合タンパク質を発現させるためには、該タンパク質をコードする核酸を、該タンパク質が発現可能な形態で細胞内に導入すればよく、種々の公知の方法で行なうことができ、当業者であれば、適切な方法を選択することができる。例えば、発現ベクターを用いて、細胞にトランスフェクトすることもできる。
【００３５】
この際の該タンパク質の濃度は、当業者は適切に設定することができるが、例えば、最終的に10〜200μg/ml、好ましくは40〜100μg/mlになるようにするとよい。本発明の融合タンパク質は可溶性タンパク質であり、細胞質内に均等に分布し得る。
【００３６】
該タンパク質を発現している細胞に、上記同様に励起波長を照射して、該タンパク質由来の蛍光を検出することができる。細胞内のIP3濃度が上昇すると、エネルギー受容体による蛍光強度が変化する。また、細胞の特定部位における該変化をモニターすることで、細胞内における局部的IP3濃度変化を検出することもでき、さらに細胞を顕微鏡下での画像解析により、細胞内でのIP3濃度変化の局在性の変化を経時的にモニターすることも可能である。
【００３７】
さらにまた、本発明の融合タンパク質は可溶性タンパク質であるため、細胞質中に均一に分布するが、該融合タンパク質に核移行シグナルペプチドまたは細胞膜局在シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを付加したタンパク質を用いることにより、核内または細胞膜等の細胞内の特定の部位に局在させることが可能となる。これによって、細胞内の特定の部位におけるIP3濃度変化を検出することも可能である。
【実施例１】
【００３８】
IP3R1のIP3結合コア領域（IP3R1の224〜575位のアミノ酸配列部分）のcDNAを公知の方法で得た。これとインフレームになるように5’側にVenusをコードするDNAおよび3’側にECFPをコードするDNAを連結したcDNAを作製した。かかるcDNAにより図１a上段に示す融合タンパク質（本明細書中、IRIS-575）がコードされる。配列を配列番号１に示す。
【００３９】
さらに、IP3R1のIP3結合コア領域（IRIS）内の267位のスレオニンがアラニンに、508位のリジンがグルタミン酸に、それぞれ変異したドミナントネガティブ型の変異体（すなわち、IP3と結合できない変異体：Sawano, A and Miyawaki, A., Nucleic Acids Res 28 E78 (2000)）に、同様にVenusとECFPとが融合したタンパク質をコードするcDNAを作製した（図1a下段）。該cDNAの上流側にヒスチジンタグをコードするcDNAをさらに連結した。
【００４０】
該cDNAをpFastBac1（GIBCO/BRL）内に挿入し、SF9バキュロウイルス発現システム（GIBCO/BRL）にて発現させ、Ni-アガロースカラムおよびHiTrapへパリンカラム（Amersham Biosciences）を用いて精製することにより、IRIS-575およびIRIS-Dmutを得た。
【００４１】
in vitroにおいて、IRIS-575のIP3による蛍光変化を測定した。10mM HEPES(pH7.2：100mM NaCl、1mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、0.5％NP-40)中、20℃にて、10μMのIP3を添加し、420nmにて励起し、その蛍光スペクトルを測定した（図１b）。IP3を添加しなかったコントロールと比較した場合、525nmの蛍光ピークが減少することがわかった。IRIS-Dmutについても同様に測定した（図１c）。IRIS-Dmutでは、525nmでの蛍光ピークの減少は認められなかった。したがって、この蛍光ピークの減少は、IRISとIP3との結合によるものである。IP3との結合によりIRISの立体構造が変化し、VenusとECFPとの位置関係に変化が生じたためと考えられる。
【００４２】
この蛍光スペクトル変化のIP3濃度依存性を確認するために、IP3による滴定を行なった。525nm(yellow)ピーク強度に対する475nm（cyan）のピーク強度の比(C/Y)とIP3濃度との関係を図1ｄに示す。過剰量のIP3を添加した場合では、C/Yの増加が25.1±0.8％(n=6)であった。あらに、図１ｄの滴定曲線より、IP3の感度を求めたところ、Kd=437nM±30nM、n=6)であり、IP3R1のIP3結合ドメインの結合定数(Kd=336nM；Natsume,Tら、Biochem Biophys Res Commun 260, 527-33,(1999))とほぼ一致した。このことからも、IRIS-575は、IP3R1が活性化される生理学的濃度のIP3を検出できることが示唆される。
【００４３】
上記蛍光スペクトルの変化をさらに詳細に検討すべく、IP3の代謝産物である1,4-IP2および1,3,4,5-IP4によるIRIS-575の蛍光スペクトル変化を調べた(図１e)。IP3によるC/Y比の変化は、IP4およびIP2による変化のそれぞれ50倍および400倍であった。このことから、IRIS-575はIP3濃度を高感度かつ特異的に測定し得ることが示された。さらに、Ca2+による影響を調べた（図１ｆ）。反応溶液中に1μMのCa2+を添加しても、C/Y比には全く影響を与えなかった。このことから、生細胞内のカルシウム濃度に影響されることなく、IRIS-575によるIP3濃度の測定が可能である。さらにまた、pHによる影響も検討したが、生理的pHの範囲である、pH7.0〜7.8の範囲では、C/Y比は影響を受けなかった(図１ｇ)。
【００４４】
したがって、生理的pHの範囲内で細胞内Ca2+濃度またはpHが変動した場合でも、IRIS-575による細胞内IP3濃度の測定は可能である。
【００４５】
この新規IP3指示薬をベースに、IP3結合部位に遺伝子の点変異を導入し、IP3に対して様々な結合強度を持つ指示薬を作ることも可能である。図１hに示すように、IP3結合部位に存在する塩基性アミノ酸である、アルギニン(R)、リジン(K)を中性のアミノ酸であるグルタミン(Q)に変換した。R241Q、K249Q、R504Q、R506Q（241、249、504、506の数字はマウスIP3R1の１番目のアミノ酸から数えた、各アミノ酸の番号である）の４つの指示薬を作成した。これらはそれぞれIP3に対して異なった結合強度を示し、野生型（変異の入っていないIRIS-575）、K249Q、R504Q、R506Q、R241Qの順番にIP3への結合強度が高かった。
【実施例２】
【００４６】
ホヤ細胞内におけるIP3濃度の検出
ホヤCiona savignyiの卵に、精製したIRIS-575とIndo-1を公知の方法(Yoshida、M.ら、Dev. Biol.203, 122-33)にしたがって、マイクロインジェクションし、授精後のIP3濃度およびCa2+濃度の上昇を検出した。ホヤの受精卵は受精直後にIP3誘導性の細胞内ストアからのCa2+放出が起こることがわかっている(Miyazaki,S.ら、Science 257, 251-5 (1992)、およびRunft, L.L.ら、Dev. Biol. 245, 237-54 (2002))。Ca2+濃度およびIP3濃度のプロファイルを図２aおよびｂに示す。受精直後のIP3濃度の上昇およびその後の緩やかな減少、そして、受精後約30秒前後における再上昇とその後の緩やかな減少が観察された。これはIndo-1により検出した細胞内Ca2+濃度の変動と経時的にほぼ一致していたことからも、IRIS-575の蛍光変化が細胞内IP3濃度を反映していることが裏付けられる。加えて、IRIS-575により測定された、卵内のIP3濃度変動は非常に緩やかであった。これは濃度が振動するCa2+とは対照的である。GFP-プレクストリン相同性ドメインによって測定されたIP3変動は、Ca2+と同様に振動するものであった。この結果の不一致は（J. van der Wal, R. Habets, P. Varnai, T. Balla, K. Jalink, J Biol Chem 276, 15337-44 (2001)., C. Xu, J. Watras, L. M. Loew, J Cell Biol 161, 779-91 (2003)., R. Irvine, Curr Biol 14, R308-10 (2004).）らによって示されたようにGFP-プレクストリン相同性ドメインは、IP3の変動よりも、前駆物質であるPIP2の変動を反映しやすいためと推測される。
【００４７】
さらに、細胞内IP3濃度の画像による検出を行なった。40〜100μgのタンパク質が導入されるように、IRIS-575とIndo-1とのマイクロインジェクションは上記と同様の方法で行ない、受精させた。20℃にて、冷却CCDカメラORCA-ER(Hamamatsu Photonics)を装備したIX-71倒立顕微鏡(Olympus)にて、対物倍率10×(n.a.0.4)または20×(n.a.0.75)の画像を得た。IRIS-575の蛍光検出は、425〜445nmの励起フィルターと460〜510および515〜560 nmの発光用フィルターを用いて、IRIS-575からの蛍光を検出した。IRIS-575により検出されたIP3の濃度変化は460〜510nm（Cyan:C） の蛍光強度を515〜560 nm （Yellow:Y）の蛍光強度で割った値により示した（C/Y）。450nmのビームスプリッターミラーを、光路に挿入した。Indo-1の蛍光検出は、333〜348nmの励起フィルターと420〜440および460〜510nmの発光用フィルターを用いて、Indo-1の蛍光を検出した。400nmのビームスプリッターミラーを、光路に挿入した。Indo-1により検出されたCa2+の濃度変化は425〜445nmの蛍光強度を460〜510nmの蛍光強度で割った値により示した（Indo-1 ratio）。解析は、TI Workbench ソフトウェアにより行なった。
【００４８】
受精直後の受精卵について得られた画像を図３に示す。左上から2段にわたって、経時的な変化をモニターしている。各段の上側がIRIS-575のC/Y比画像、下側がIndo-1 ratio画像である。受精後、細胞内でのIP3濃度の上昇およびCa2+濃度の上昇が画像から観察される。さらに、IP3の細胞内局在も画像に反映することができた。
【００４９】
哺乳動物細胞内におけるIP3濃度の検出
TransITトランスフェクションリエージェント(Mirus)を用いて、常法にしたがってIRIS-575タンパク質をCOS-7細胞において強制発現させた。細胞内のIRIS-575の局在を図４aに示した。IRIS-575が細胞質に一様に局在することが分かる。トランスフェクションの12〜36時間後の細胞を以下の実験に用いた。一般的なCa2+色素を取り込ませる方法として、細胞は実験の直前に3μMのIndo-1のAM体溶液に浸しておいた。細胞を、37℃にて、1g/lのグルコースを添加した生理的濃度のHEPESバッファー流（流速2ml/分）中に保持し、0.3μMまたは1.0μMのATPにて細胞を刺激した。該ATP刺激に応答して、IRIS-575の蛍光が変化した(図４ｂ)。図４b最上段は、460〜510nmにおけるシアン蛍光（C）、上中段は515〜560nmにおける黄色蛍光の（Y）変動を示す。これらの比(C/Y)を中下段に示す。ATP刺激に応答してC/Yは増加し、ATP刺激による細胞内IP3濃度の上昇が検出されている。また、ホヤ卵での実験と同様にIndo-1との同時イメージングによって、Ca2+の変動も平行して測定することができた（最下段）。
【００５０】
さらに、IRIS-575による細胞内IP3濃度の検出の感度を証明するために、人為的に細胞内IP3濃度のオシレーションを誘発し、それを検出できるか否かを調べた。上記細胞を、60μMのβ-escinで3分間処理して透過化し、この細胞を用いてIP3不含のバッファーの入った水槽と、500μM IP3を含むバッファーの入った水槽(いずれも流速4ml/分)とに30秒毎に入れ換えて、IRIS-575の蛍光を検出した。結果を図４cに示す。グラフ上端の実線は、細胞が500nM IP3を含むバッファーと接触していた時間を示す。図４cからわかるように、IRIS-575のC/Y比は、細胞内IP3濃度変化を非常に鋭敏かつ高感度に反映し得る。さらにこの実験から、卵での、IP3がCa2+と同期して振動しないという結果が間違っていないということを示すことができる。実際、細胞内のIP3濃度が振動していればIRIS-575は、その変動を正しく反映し得るからである。
【００５１】
以上の結果より、IRIS-575のC/Y比は、セルフリーおよび細胞内のIP3濃度変化をリアルタイムで高感度に検出し得ることがわかる。本発明の方法は、従来のIP3濃度の検出法に比べて、非常に正確に細胞質のIP3濃度の変化を検出することができる。
【実施例３】
【００５２】
細胞局所でのIP3濃度測定
IRIS-575の遺伝子の5’端にミリスチル化・パルミチル化ターゲットシグナル（MP-IRIS-575）、及び核移行シグナルを付加した（NLS-IRIS-575）。これらの遺伝子をHeLa細胞に強制発現させ、それぞれ細胞膜直下、核に局在させた（図５a、b）。それぞれ、細胞全体が染まっているIndo-1の蛍光像(図5a中央、b右)と比べて、IRIS-575のシグナルが細胞膜直下（図５a右）、及び核内（図５b右）に観察されている。図５a右図はMP-IRIS-575を発現した細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した像である。MP-IRIS-575が細胞膜直下に多く存在していることが分かる。この細胞を10μMのヒスタミンで刺激することにより、細胞内局所でのIP3濃度変化（図５ｃ、ｄともに上図）をCa2+（図５ｃ、ｄともに下図）と同時に測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１aは、実施例に用いた本発明の融合タンパク質（IRIS-575:上段）と、本発明の融合タンパク質のドミナントネガティブ型（IRIS-Dmut:上段）の構造を模式的に示したものである。図１bおよびcはそれぞれ、IP3によるIRIS-575およびIRIS-Dmutの蛍光スペクトルの変化を示す。IP3の存在によりIRIS-575の蛍光強度は、エネルギー受容体であるVenusの約525nmにおける蛍光強度が減少する。図１dは、IP3濃度依存的なIRIS-575の蛍光変化を示す。Venusの約525nmにおける蛍光強度（Y）に対するエネルギー供与体ECFPの475nmの蛍光強度（C）の比（C/Y）で示した。10-5以下の濃度でIP3の濃度依存的にC/Yの値は増加していた。図１eは、IP3と、IP3の代謝産物である1,4-IP2および1,3,4,5-IP4それぞれによるIRIS-575の蛍光変化をC/Y比で示す。IP3によるC/Y比の変化は、IP4およびIP2による変化のそれぞれ50倍および400倍であった。図１fは、Ca2+存在下のIRIS-575の蛍光変化をC/Y比で示す。１μMのCa2+によってIRIS-575の蛍光変化は影響を受けなかった。図１gは、IRIS-575の蛍光変化へのpHによる影響を検討した結果である。pH7.0〜7.8の範囲では、C/Y比は影響を受けなかった。図１hは、IRIS-575および、IP3結合部位に点変異を導入したIP3指示薬の蛍光変化のIP3依存性を示したものである。赤は野生型のIP3結合部位を持つIRIS-575、黄色は249番目のリジンをグルタミンに変換したもの（K249Q）、青は504番目のアルギニンをグルタミンに変換したもの(R504Q)、水色は506番目のアルギニンをグルタミンに変換したもの(R506Q)、緑は241番目のアルギニンをグルタミンに変換したもの(R241Q)のデータを示している。
【図２】図２は、受精卵のIP3とCa2+の変化を示す。図２a、bとも、矢印は精子を添加した時点を示す。グラフは4秒毎に取得したデータをグラフ化したものである。図２aは、Indo-1により測定したCa2+の濃度変化であり、上方のバーは、初期の一過性Ca2+上昇を示している。図２bは、IRIS-575により測定したIP3の濃度変化である。
【図３】図３は、受精卵の初期の一過性Ca2+上昇時のIP3（C/Y）とCa2+の変化（Indo-1 ratio）を検出した画像である。左上から2段に渡って経時的にモニターしている。上側がIRIS-575によるIP3の検出であり下側がIndo-1によるCa2+の検出である。
【図４】図４は、IRIS-575を強制発現させたCOS-7細胞におけるIP3濃度の変化を検出した結果である。図４aは、上記COS-7細胞に強制発現させたIRIS-575の蛍光像である。図４bは0.3μMおよび1.0μMそれぞれの濃度のATPで刺激した際の蛍光変化を示す。単一のCOS-1細胞を420〜440nmの光で励起し、460〜510nmの蛍光強度（C）および515〜450の蛍光強度（Y）をそれぞれ最上段および上中段に示す。これらの比C/Yを中下段に示す。最下段にはIndo-1のratio変化を示している。図４cは、上記COS-7細胞のIP3濃度を人為的に変動させて、IRIS-575の蛍光変化をC/Yで示している。上部のバーは、細胞外液中に500nMのIP3が存在した時間を示している。
【図５】図５は、細胞膜移行型と、核移行型のIRIS-575を強制発現させたHeLa細胞における、IRIS-575の細胞内局在と、ヒスタミン刺激によるIRIS-575とIndo-1の蛍光比変化を示したプロットである。図５aはミリスチル化・パルミチル化ターゲットシグナルをN末端に付加したIRIS-575（MP-IRIS-575、左端）、及びIndo-1（中央）の蛍光像である。また右端の像は、既存の方法にて共焦点レーザー顕微鏡を使用し、Venusを励起してMP-IRIS-575を発現した細胞の断層像を示している。図５bはSV-40・T抗原の核移行シグナルをN末端に付加したIRIS-575（NLS-IRIS-575、左）、及びIndo-1（右）の蛍光像である。図５cは細胞を10uMのヒスタミンで刺激したときのMP-IRIS-575の(C/Y ratio)（左）、Indo-1 ratio（右）の経時変化を示している。また図５dは、ｃと同様の刺激を与えたときのNLS-IRIS-575のC/Y比（左）、Indo-1 ratio（右）の経時変化を示している。図５ｃ、ｄのグラフ上に示したバーは、ヒスタミンが測定液に添加されていた時間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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