(57)【要約】【課題】  新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を用いたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの発現方法、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含んで成る酵素組成物並びに該α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は酵素組成物による植物及び／又は植物由来物の処理方法を提供すること、及び、Ｌ−アラビノースを安価に製造する方法を提供すること。【解決手段】  アクレモニウム属微生物に由来する新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該酵素活性を示すタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子並びに核酸構成物、該核酸構成物を含む発現ベクター、宿主細胞；α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は該酵素活性を示すタンパク質の製造法；α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は該酵素活性を示すタンパク質の各種用途。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクレモニウム属微生物に由来し、下記の特性を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ。
（ａ）基質特異性及び作用特性：α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解する。
（ｂ）分子量：５７，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：５．３〜５．５（等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ３〜４である。
（ｅ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ２〜７．５の範囲で安定であり、ｐＨ１．５〜２の範囲においても高い活性を保持している。
（ｆ）作用最適温度：５０℃である。
（ｇ）温度安定性：５０℃以下の範囲で安定である。
【請求項２】
アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項１記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなり、かつ、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち−２６〜−１番目の配列部分の一部又は全部をＮ末端側に含んでなるタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を構成するアミノ酸配列の改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
タンパク質が、糸状菌由来のものである請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
遺伝子が、糸状菌由来のものである請求項７記載の遺伝子。
【請求項９】
糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求項８記載の遺伝子。
【請求項１０】
アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項９記載の遺伝子。
【請求項１１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表される塩基配列からなる核酸構成物。
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸構成物を含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１記載の核酸構成物又は請求項１２記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
宿主が、大腸菌、酵母、放線菌又は糸状菌である請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属又はピキア属に属する微生物である請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエである請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
糸状菌が、アクレモニウム属、フミコーラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属又はフザリウム属に属する糸状菌である請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１８】
糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフザリウム・オキシスポーラスである請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から請求項１又は２記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを単離する工程を含んでなる請求項１又は２記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの製造法。
【請求項２０】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を単離する工程を含んでなる請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
【請求項２１】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる酵素組成物。
【請求項２２】
セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼのうち、いずれか一若しくは二以上の成分をさらに含有することを特徴とする請求項２１記載の酵素組成物。
【請求項２３】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する植物又は植物由来物加工及び／又は利用効率向上用酵素剤。
【請求項２４】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する飼料添加物。
【請求項２５】
請求項２４記載の飼料添加物を飼料に添加することを特徴とする消化能に優れる飼料の製造法。
【請求項２６】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する食品加工用酵素剤。
【請求項２７】
請求項２６記載の食品加工用酵素剤を用いる食品の製造法。
【請求項２８】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する木材パルプ処理剤。
【請求項２９】
請求項２８記載の木材パルプ処理剤を用いることを特徴とする木材パルプの処理法。
【請求項３０】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を用いることを特徴とするＬ−アラビノースの製造法。
【請求項３１】
請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を、α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を含有するオレンジファイバー、みかんジュース粕、アップルファイバー、リンゴジュース粕、ビートファイバー、ビートパルプ、米糖、大豆粕、落花生及びとうもろこし粕から選ばれる天然物に作用させてＬ−アラビノースを得ることを特徴とするＬ−アラビノースの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼとその利用方法に関し、詳しくはアクレモニウム属微生物に由来する新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、及び酵素組成物並びにこれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
穀類外皮には繊維質が多く含まれ、これらの繊維質はセルロースやヘミセルロース等から構成される。このうち、小麦ふすま、トウモロコシ外皮又はもみ殻のヘミセルロースは、主にキシロースとアラビノースからなるアラビノキシランという多糖であることが知られている。また、大豆皮にはヘミセルロースとしてアラビノガラクタンが含まれている。更に、ビートからショ糖を回収した後に排出されるパルプ（ビートパルプ）中におけるアラビノースは、その多数が、鎖状に結合した多糖類であるアラビナンとして存在する。
【０００３】
アラビノキシラン、アラビノガラクタン、及びアラビナンは、それぞれ、β−１，４結合したキシロースサブユニット、β−１，３又はβ−１，４結合したガラクトースサブユニット、及びα−１，５結合したＬ−アラビノフラノースサブユニットを主鎖とし、該主鎖に、側鎖としてのＬ−アラビノフラノース残基がα−（１→３）又はα−（１→２）の形で結合していることが知られている。
【０００４】
アラビノース含有多糖を分解する酵素をアラビナナーゼと総称し、その作用様式により、エンド−アラビナナーゼとα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼに分類される。
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、アラビナン等の多糖に含まれるα−１，５、１，３又は１，２−Ｌ−アラビノシド結合に作用し、Ｌ−アラビノフラノースを遊離させる反応を触媒すると考えられ、植物又は植物由来物中のヘミセルロース分解酵素、食品加工用酵素、又は木材パルプの脱リグニン化剤として近年注目されている。
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの各分野への応用例を挙げると、まず飼料用途では、飼料に添加することにより、家畜の増体及び／又は飼料効率を改善できる。食品分野では、ジュース生産における生産収量の増加、麦汁生産における濾過性の改善及び／又は収率の増加、ワイン醸造等における芳香成分の増加、食品の粘度またはゲル強度の増加に用いることができる。また、木材パルプを本酵素で処理することにより、パルプの脱リグニン化に利用できることが開示されている（特許文献１参照）。
【０００５】
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）の生産する酵素に関して言えば、セルラーゼやペクチナーゼ（ポリガラクチュロナーゼ）、キシラナーゼに関しては多くの報告がなされており（特許文献２、非特許文献１、２、及び３参照）、これらの酵素が飼料用途やサイレージ用途において有効であることが示されている（特許文献３及び特許文献４参照）。
しかしながら、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼに関しては未だ詳細な報告は無く、該宿主由来の酵素又は酵素組成物を産業上さらに有効利用するためにも、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの詳細な酵素的、タンパク質的諸性質の解明、及び該酵素をコードする遺伝子の単離が待ち望まれていた。
【０００６】
ところで、アラビノキシランを構成し、ビートパルプに含まれるＬ−アラビノースは、蔗糖に近い味質を有し、腸管粘膜からはほとんど吸収されることがないといった性質を持つ。また、腸管粘膜に存在するα−グルコシダーゼ活性を阻害することで蔗糖の分解を抑制し、血糖上昇を抑制することが知られている。このように、アラビノースはその有用性が注目されている。
【０００７】
このＬ−アラビノースは、ビートパルプなどに含まれるヘミセルロースをアルカリ抽出し、これを酸分解することにより製造できることが、既に報告されている（特許文献５、特許文献６、及び非特許文献４参照）。
しかし、これらの製造方法は、強酸、強アルカリ等の厳しい条件が要求されるため、反応装置、取り扱い操作上の問題は避けられない。さらに、これらの製造法ではコストがかかるため、Ｌ−アラビノースを製造する上での問題点となっていた。
【０００８】
一方、ビートパルプに酵素作用させてもＬ−アラビノースを製造できることが報告されている（特許文献７及び特許文献８参照）。
しかし、その製造方法では分解産物の分離・精製作業が複雑化して効率的にＬ−アラビノースを得難いという問題があった。
【０００９】
【特許文献１】特表平７−５０８１６２号公報
【特許文献２】ＷＯ９８／３９４２３号公報
【特許文献３】特開平４−１１７２４４号公報
【特許文献４】特開平７−２３６４３１号公報
【特許文献５】特開平９−２９９０９３号公報
【特許文献６】特開平１１−３１３７００号公報
【特許文献７】特開２００１−２８６２９４号公報
【特許文献８】特開２００２−４５１９４号公報
【非特許文献１】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，２４９３〜２５０１（１９８８）
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３３５９〜３３６０（１９８９）
【非特許文献３】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３０９  〜３１７（１９９０）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６４巻６号，６８５−６９１，１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを産業上有効利用するためには、該酵素を単離して精製し、酵素的及び物理的性質を明らかにすることが不可欠である。また、該酵素の発現増強及び大量生産を可能にするには、該酵素をコードする遺伝子を単離し解析することが必要となる。
また、飼料添加用酵素としては、低いｐＨ、好ましくはｐＨ３以下、より好ましくはｐＨ２以下で安定でなくてはならない。
【００１１】
本発明は、新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を用いたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの発現方法、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含んで成る酵素組成物並びに該α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は酵素組成物による植物及び／又は植物由来物の処理方法の提供を目的とするものである。
さらに、上述の通りＬ−アラビノースは高い機能性を有しながらも、従来のＬ−アラビノースの製造方法は、コストが高い問題があった。
本発明は、Ｌ−アラビノースを安価に製造する方法の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスの種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。その結果、これら酵素群の中から新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを見出し、該酵素をコードする遺伝子を単離した。該酵素は、ｐＨ２付近の比較的低いｐＨにおいて高い安定性を示した。
さらに、種々の植物又は植物由来物に対するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの作用効果を検討し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明により、下記の発明が提供される。
請求の範囲第１項：アクレモニウム属微生物に由来し、下記の特性を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ。
（ａ）基質特異性及び作用特性：α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解する。
（ｂ）分子量：５７，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：５．３〜５．５（等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ３〜４である。
（ｅ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ２〜７．５の範囲で安定であり、ｐＨ１．５〜２の範囲においても高い活性を保持している。
（ｆ）作用最適温度：５０℃である。
（ｇ）温度安定性：５０℃以下の範囲で安定である。
請求の範囲第２項：アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項１記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ。
【００１４】
請求の範囲第３項：以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなるタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなり、かつ、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち−２６〜−１番目の配列部分の一部又は全部をＮ末端側に含んでなるタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を構成するアミノ酸配列の改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
請求の範囲第４項：タンパク質が、糸状菌由来のものである請求項３記載のタンパク質。
請求の範囲第５項：糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求項４記載のタンパク質。
請求の範囲第６項：アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項５記載のタンパク質。
【００１５】
請求の範囲第７項：以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
請求の範囲第８項：遺伝子が、糸状菌由来のものである請求項７記載の遺伝子。
請求の範囲第９項：糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求項８記載の遺伝子。
請求の範囲第１０項：アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求項９記載の遺伝子。
【００１６】
請求の範囲第１１項：以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表される塩基配列からなる核酸構成物。
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
請求の範囲第１２項：請求項１１記載の核酸構成物を含んでなる発現ベクター。
【００１７】
請求の範囲第１３項：請求項１１記載の核酸構成物又は請求項１２記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
請求の範囲第１４項：宿主が、大腸菌、酵母、放線菌又は糸状菌である請求項１３記載の宿主細胞。
請求の範囲第１５項：酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属又はピキア属に属する微生物である請求項１４記載の宿主細胞。
請求の範囲第１６項：酵母が、サッカロミセス・セレビシエである請求項１５記載の細胞。
請求の範囲第１７項：糸状菌が、アクレモニウム属、フミコーラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属又はフザリウム属に属する糸状菌である請求項１４記載の宿主細胞。
請求の範囲第１８項：糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフザリウム・オキシスポーラスである請求項１７記載の宿主細胞。
【００１８】
請求の範囲第１９項：請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から請求項１又は２記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを単離する工程を含んでなる請求項１又は２記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの製造法。
請求の範囲第２０項：請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を単離する工程を含んでなる請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
【００１９】
請求の範囲第２１項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる酵素組成物。
請求の範囲第２２項：セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼのうち、いずれか一若しくは二以上の成分をさらに含有することを特徴とする請求項２１記載の酵素組成物。
【００２０】
請求の範囲第２３項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する植物又は植物由来物加工及び／又は利用効率向上用酵素剤。
請求の範囲第２４項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する飼料添加物。
請求の範囲第２５項：請求項２４記載の飼料添加物を飼料に添加することを特徴とする消化能に優れる飼料の製造法。
【００２１】
請求の範囲第２６項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する食品加工用酵素剤。
請求の範囲第２７項：請求項２６記載の食品加工用酵素剤を用いる食品の製造法。
請求の範囲第２８項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する木材パルプ処理剤。
請求の範囲第２９項：請求項２８記載の木材パルプ処理剤を用いることを特徴とする木材パルプの処理法。
【００２２】
請求の範囲第３０項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を用いることを特徴とするＬ−アラビノースの製造法。
請求の範囲第３１項：請求項１又は２に記載のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、請求項３〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、若しくは請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の酵素組成物を、α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を含有するオレンジファイバー、みかんジュース粕、アップルファイバー、リンゴジュース粕、ビートファイバー、ビートパルプ、米糖、大豆粕、落花生及びとうもろこし粕から選ばれる天然物に作用させてＬ−アラビノースを得ることを特徴とするＬ−アラビノースの製造法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、アクレモニウム属微生物由来の新規α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。また、新規α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの効率的な製造方法も提供される。
さらに、このα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼまたは該酵素を包含する酵素組成物を植物又は植物由来物の加工などに利用する技術も提供され、飼料分野や食品分野、Ｌ−アラビノースの製造など様々な用途での利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明に係る酵素は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示す酵素、すなわちα−Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ  ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＥＣ３．２．１．５５であり、具体的には、α−Ｌ−アラビノフラノシド又はアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解する酵素を意味する。
【００２５】
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを生産する微生物としては、アクレモニウム属微生物（アクレモニウム属の糸状菌）を挙げることができる。アクレモニウム属微生物としては、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）などがある。
これらの微生物によるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの製造については、既知の方法、例えば、特公昭６０−４３９５４号公報又は特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に従って行えば良く、上記微生物の培養終了後の培養物からα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを採取することができる。ここで、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とするか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
【００２６】
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて、部分精製又は高度に精製して得ることができる。
精製方法としては、常法、即ち硫安などによる塩析法；アルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００２７】
（１）本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ
本発明の第１の態様によれば、アクレモニウム属由来の、前記請求項１に記載の特性を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示す新規酵素が提供される。より詳細な本酵素の特性は、次の通りである。
（ａ）基質特異性及び作用特性
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解する。
すなわち、本発明の酵素は、上記したように、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示す酵素、すなわちα−Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ  ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＥＣ３．２．１．５５であり、具体的にはα−Ｌ−アラビノフラノシド又はアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解するものである。
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、アラビナン、アラビノキシランに対して高い活性を示し、アラビノガラクタンに対しては相対的に低い活性を示す。また、側鎖をもたないリニアアラビナンにも作用し、Ｌ−アラビノフラノースを遊離する。
尚、本発明の酵素のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性は、ＤＮＳ法（Ｂｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９５２）等により、アラビナン、アラビノガラクタン、アラビノキシラン等に対するアラビノース遊離活性を測定することにより調べることができる。
【００２８】
（ｂ）分子量
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定の結果、５７，０００である。
（ｃ）等電点
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの等電点は、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定の結果、５．３〜５．５である。
（ｄ）至適ｐＨ
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの至適ｐＨは、温度３７℃の処理条件下、アラビナン分解活性においてｐＨ３〜４であるが、約ｐＨ１．５〜５．５の範囲で高い活性を有している（図１）。
【００２９】
（ｅ）安定ｐＨ範囲
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、室温（２２℃）、２４時間処理において、ｐＨ２〜７．５の範囲で安定であり、ｐＨ１．５〜２の範囲においても高い活性を保持している（図２）。
（ｆ）作用最適温度
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの作用最適温度は、ｐＨ３．５の処理条件下、アラビナン分解活性において約５０℃であるが、約４０〜６０℃の範囲においても高い活性を有している（図３）。
（ｇ）温度安定性
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、ｐＨ３．５、２４時間処理において、５０℃以下の範囲で安定である（図４）。
【００３０】
（ｈ）比活性
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのアラビナン分解活性における比活性は、約２９単位／ｍｇタンパク質である。
ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の定義については以下の通りとした。
・アラビナン分解活性
ｐＨ３．５、３７℃で、５ｍｇ／ｍｌアラビナン溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌの還元Ｌ−アラビノフラノースを生成する酵素量を１単位と定義した。
【００３１】
本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、アクレモニウム属微生物、より好ましくはアクレモニウム・セルロリティカス、更により好ましくは、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）から得ることができる。
【００３２】
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、該酵素活性を利用して各種製品に作用させることができる。その場合の使用方法としては、上記利用分野で通常使われるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ１．５〜５、温度５０℃以下の範囲が適当である。本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの使用量は、時間と共にそれぞれの目的が達するように調製すれば十分な効果を得ることができる。
【００３３】
（２）本発明のタンパク質
本発明の第２の態様によれば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるタンパク質が提供される。
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなるタンパク質。
ここで、「配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部」とは、例えばプローブとして利用可能な程度の長さ、さらには、その一部の配列であっても依然としてα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を維持するその部分配列を意味するものとする。
【００３４】
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部又は全部を含んでなり、かつ、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち−２６〜−１番目の配列部分の一部又は全部をＮ末端側に含んでなるタンパク質。
このタンパク質（ｂ）は、言い換えれば、前記タンパク質（ａ）において、上記タンパク質のＮ末端に、さらに配列番号１に記載の−２６〜−１番目の配列部分の一部又は全部を有するタンパク質を意味する。従って、「配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１〜４８１番目の配列部分の一部」については、前記タンパク質（ａ）について説明したのと同様である。
ここで、「配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち−２６〜−１番目の配列部分」は、シグナルペプチドと考えられることから、「配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち−２６〜−１番目の配列部分の一部」とは、シグナルペプチド活性を保持する配列であって、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
【００３５】
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を構成するアミノ酸配列の改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明において改変タンパク質とは、上記のタンパク質のアミノ酸配列において、複数（例えば、１〜数個）のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、又は置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然としてα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、すなわち本発明の第１の態様にて説明した各種特性を保持するものを意味する。
【００３６】
本発明の第２の態様のタンパク質は、糸状菌、好ましくはアクレモニウム属微生物、より好ましくはアクレモニウム・セルロリティカス、更により好ましくは、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）から得ることができる。
【００３７】
本発明のタンパク質は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、すなわち本発明の第１の態様で説明した各種特性を有するものである。従って、該酵素活性を利用して各種製品に作用させることができる。その場合の使用方法としては、上記利用分野で通常使われるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ１．５〜５、温度５０℃以下の範囲が適当である。本発明のタンパク質の使用量は、時間と共にそれぞれの目的が達するように調製すれば十分な効果を得ることができる。
【００３８】
（３）本発明の遺伝子
本発明の第２の態様により、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを構成するタンパク質のアミノ酸配列が与えられるので、それをコードする遺伝子の塩基配列は容易に定まり、よって、配列番号１に記載のアミノ酸配列及びその改変タンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。
そこで、本発明の第３の態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列及びその改変タンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるＤＮＡからなる遺伝子が提供される。
【００３９】
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする典型的配列である。配列表の配列番号２に記載の塩基配列は、１〜３番目のＡＴＧで始まり、１５２２〜１５２４番目のＴＧＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、同塩基配列の７９〜８１番目の塩基部分は、４８１残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００４０】
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明において改変配列とは、上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を意味する。
ストリンジェントな条件とは、プローブとして標識化した配列番号２に記載のＤＮＡ配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬ  ダイレクト  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ラベリング検出システム（アマシャム社製）の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、前記プローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った後、０．４％  ＳＤＳ、６Ｍ  尿素添加１倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ；１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、１０分間の洗浄を２回行うような条件である。
【００４１】
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
すなわち、本ＤＮＡ（ｃ）は、本発明の第２の態様のタンパク質をコードするＤＮＡであって、上記ＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）に含まれないものを全て含む趣旨である。ここで、改変タンパク質については、上記本発明の第２の態様のタンパク質の（ｃ）タンパク質の説明で述べたとおりである。
【００４２】
本発明の第３の態様の遺伝子は、糸状菌、好ましくはアクレモニウム属微生物、より好ましくはアクレモニウム・セルロリティカス、更により好ましくは、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）から得ることができる。
宿主アクレモニウム・セルロリティカス中で多量に発現しているα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子（ａｂｆ）は、例えば以下の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスから単離することができる。
すなわち、アクレモニウム・セルロリティカス由来の染色体ライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００４３】
本発明の遺伝子は、本発明の第２の態様のタンパク質をコードすると共に、該タンパク質は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、すなわち本発明の第１の態様で説明した各種活性を有するものであるから、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをもコードするものである。
したがって、本発明の遺伝子は、本発明の第２の態様のタンパク質及び本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの効率的な製造に寄与するものである。
【００４４】
（４）本発明の核酸構成物
また、本発明の第３の態様として示した遺伝子は、ＤＮＡ構成物やＲＮＡ構成物などの核酸構成物として各種遺伝子関連技術に利用することもでき、このような核酸構成物を提供するのが本発明の第４の態様である。
すなわち、本発明の第４の態様は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表される塩基配列からなる核酸構成物である。
（ａ）配列表の配列番号２で示される塩基配列。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその改変タンパク質であり、かつα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の詳細については、本発明の第３の態様の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＤＮＡを構成する塩基配列に関し説明した通りである。
【００４５】
本発明の第４の態様の核酸構成物は、上記した糸状菌やその他の生物など天然由来のものであっても良いし、全合成したものであっても良い。また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでも良い。
【００４６】
本発明の核酸構成物は、本発明の第２の態様のタンパク質をコードすると共に、該タンパク質は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、すなわち本発明の第１の態様で説明した各種活性を有するものであるから、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをもコードするものである。
したがって、本発明の核酸構成物は、本発明の第２の態様のタンパク質及び本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの効率的な製造に寄与するものである。
そして、本発明の核酸構成物は、ＤＮＡ構成物やＲＮＡ構成物として、各種遺伝子関連技術に利用することができ、例えば、細胞内に導入し、ターゲットとする遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４７】
（５）本発明の発現ベクター
本発明の第５の態様によれば、本発明の第４の態様である核酸構成物を含んでなる発現ベクターが提供される。
この本発明の発現ベクターは、宿主微生物内で複製可能で、かつ、上記本発明の核酸構成物を、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなるものである。
【００４８】
本発明の発現ベクターは、自己複製ベクター、即ち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発明の発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、実際に宿主細胞に導入された際に所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記した本発明の核酸構成物の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列（塩基配列）や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、ターミネーター、及びシグナルペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。
プロモーターは、宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。
また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００５０】
本発明の発現ベクターを構築する際の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法に従うことができる。
例えば、導入する宿主細胞として、糸状菌の一種であるアクレモニウム・セルロリティカスを用いる場合は、特開２００１−１７１８０号公報に記載の方法で行うことができる。すなわち、アクレモニウム・セルロリティカスにおいて最も高発現しているｃｂｈ１遺伝子のプロモーターの下流に、前記した本発明の核酸構成物を連結させて遺伝子発現用の組換えベクターを作製する。この発現ベクターを、アクレモニウム・セルロリティカスに導入することにより、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼタンパク質を大量に発現させることができる。
【００５１】
（６）本発明の宿主細胞
さらに、本発明の第６の態様によれば、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。
この宿主−ベクター系は、特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母、放線菌、糸状菌などを用いた系、および、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
本発明における好ましい態様によれば、酵母（酵母細胞）を用いることにより、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は本発明の第２の態様のタンパク質を効率的に発現させ得る。酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。さらに、それらの好ましい例としては、サッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。
【００５２】
さらに、本発明における好ましい態様によれば、糸状菌を用いることにより、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は本発明の第２の態様のタンパク質を効率的に発現させ得る。宿主糸状菌としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物があげられる。さらに、それらの好ましい例としては、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｅｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。
本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を得る際の手順及び方法も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００５３】
このような本発明の宿主細胞の具体例として、実施例に記載するように、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含んでなるプラスミド（発現ベクター）で形質転換された大腸菌を挙げることができる。この形質転換大腸菌は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２４３の受託番号のもと日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５４】
（７）本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又はタンパク質の製造法
本発明によれば、上記本発明の第６の態様の宿主細胞を適当な培地で培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から、上記の本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は本発明の第２の態様のタンパク質を単離して得ることができ、このような製造法を提供するのが本発明の第７の態様である。
すなわち、本発明の第７の態様は、上記本発明の第６の態様の宿主細胞を適当な培地で培養し、培養後の宿主細胞及び／又はその培養液から、上記の本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は本発明の第２の態様のタンパク質を単離する工程を含んでなるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又はタンパク質の製造法に関する。
【００５５】
宿主細胞を培養する際の手順及び条件は、使用する宿主細胞（形質転換前）のそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を単離し回収（採取）する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００５６】
（８）本発明の酵素組成物
本発明の第８の態様によれば、上記本発明の第１の態様α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又は第２の態様のタンパク質を含んでなる酵素組成物が提供される。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明の酵素組成物は、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質を含むものであれば、その他に酵素組成物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されるものであって良い。また、本発明における酵素組成物は、適当な形状、例えば粉末または液体状に成形し調製することができる。
【００５７】
本発明の酵素組成物は、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロン酸リアーゼのうち、いずれか一若しくは二以上の成分を更に含有するものであっても良い。これらの酵素を含むことにより、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ等を単独で含んで成る酵素組成物に比べて、植物又は植物由来物の利用加工効率をより一層向上させることが期待できる。
【００５８】
本発明の酵素組成物の使用方法としては、上記利用分野で通常使われるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ１．５〜５、温度５０℃以下の範囲が適当である。酵素組成物の使用量は、時間と共にそれぞれの目的が達するように調製すれば十分な効果を得ることができる。
【００５９】
（９）本発明の植物又は植物由来加工物の加工及び／又は利用効率向上用酵素剤
本発明の、第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物は、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基の分解性能に優れており、よって、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基を含有する植物又は植物由来物の加工や利用性（利用効率）の向上に適している。このような植物又は植物由来加工物の加工及び／又は利用効率向上用酵素剤を提供するのが、本発明の第９の態様である。
すなわち、本発明の第９の態様は、本発明の第１の態様の又は第７の態様において得られるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、若しくは第８の態様の酵素組成物を含有する植物又は植物由来物加工及び／又は利用効率向上用酵素剤を提供する。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明の植物又は植物由来物の対象となる植物又は植物由来物の植物品種は特に限定されず全ての植物組織に適用可能である。また、その用途も限定されず、飼料分野（例えば牧草）、食品分野（例えば、野菜、果実）等に広く応用可能である。植物由来物の具体例を挙げると、加工した果汁、ピューレ、ペースト、絞り粕、抽出粕にも適用することができる。
【００６０】
（１０）本発明の飼料添加物
本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物は、動物飼料中で用いることにより、飼料中のアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基を分解し、又は酵素組成物中に含まれる種々の酵素との相乗作用により飼料中の繊維質を効率的に分解し、これら飼料中の繊維質の消化能を改善することができ、このような飼料添加物を提供するのが、本発明の第１０の態様である。
すなわち、本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様の、又は第７の態様において得られるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、若しくは第８の態様の酵素組成物を含有する飼料添加物を提供する。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明の飼料添加物は、飼料に添加されることにより、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが、動物飼料中のアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等に含まれるα−Ｌ−アラビノフラノシド結合を加水分解することにより、飼料中の繊維質を効率的に分解する。特に、酵素組成物として、各種酵素を含有するものを用いる場合は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼと各種酵素の相乗作用により、飼料中の繊維質を効率的に分解し、飼料作物の細胞内に蓄積されているタンパク質の利用をより促進させることができる。
特に、本発明の飼料添加物に含まれるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、ｐＨ２〜７．５の範囲で安定であり、ｐＨ１．５〜２の範囲においても高い活性を保持していることから、特に飼料添加物（飼料添加用酵素）として飼料に添加されることにより、各種家畜の消化管内においても失活することなく高い活性を保持し、有効に作用できるものと考えられる。
【００６１】
（１１）本発明の食品加工用酵素剤
本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物は、食品の加工に用いることにより、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去、醸造、製パンにおける醗酵歩合の向上などの効果を得ることができ、このような食品加工用酵素剤を提供するのが、本発明の第１１の態様である。
すなわち、本発明の第１１の態様は、本発明の第１の態様の又は第７の態様において得られるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、若しくは第８の態様の酵素組成物を含有する食品加工用酵素剤を提供する。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明の第１１の態様の食品加工用酵素剤は、食品の製造に用いることにより、上述したように製造上の効率向上を図ることができると共に、特性が改善されたジュース、ワイン、パン等の食品を効率良く得ることができる。
【００６２】
（１２）本発明の木材パルプ処理剤
本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物は、木材パルプの処理に用いられることにより、塩素等の漂白化合物を用いずに脱リグニン化することができる。
すなわち、本発明の第１２の態様は、本発明の第１の態様の又は第７の態様において得られるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、若しくは第８の態様の酵素組成物を含有する木材パルプ処理剤を提供する。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明の第１２の態様の木材パルプ処理剤の対象となる木材パルプは、特に限定されず、あらゆる種類のリグノセルロース性材料を包含するものとする。
従って、本発明の第１２の態様の木材パルプ処理剤は、木材パルプの処理に用いることにより、塩素等の漂白化合物を用いずに脱リグニン化することが可能である。
【００６３】
（１３）本発明のＬ−アラビノースの製造法
本発明の、第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物は、ビートパルプ等に作用させることにより、Ｌ−アラビノースを安価に製造することができ、このようなＬ−アラビノースの製造法を提供するのが本発明の第１３の態様である。
すなわち、本発明の第１３の態様は、本発明の、第１の態様の又は第７の態様において得られるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、若しくは第８の態様の酵素組成物を用いることを特徴とするＬ−アラビノースの製造法を提供する。
ここで、本発明の第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、又は第２の態様のタンパク質は、本発明の第７の態様の製造法により製造されることが好ましい。
本発明のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ等を作用させる対象としては、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のα−Ｌ−アラビノフラノシル残基を含有するオレンジファイバー、みかんジュース粕、アップルファイバー、リンゴジュース粕、ビートファイバー、ビートパルプ、米糖、大豆粕、落花生及びとうもろこし粕等の天然物を挙げることができる。特に、上記列挙されたうちから選ばれる一つ以上の天然物に対し作用させることにより、アラビノースのうち、その有用性が特に注目されるＬ−アラビノースを得ることができる。
【００６４】
本発明のＬ−アラビノースの製造法をより詳細に説明すると、次の通りである。
まず、本発明において各種天然物に作用させる酵素の量は特に限定されず、原料中からＬ−アラビノースを遊離するのに必要な量であればよい。酵素分解は、ビートパルプ等を水性媒体に懸濁させ、ここへ第１の態様のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、第２の態様のタンパク質、及び第８の態様の酵素組成物を加えて、攪拌しながら若しくは静置して反応させればよい。反応の温度としては、４５〜５５℃、特に５０℃が望ましい。反応液のｐＨは、１．５〜５が望ましい。反応時間は、使用するビートパルプ等と酵素の量に依存するが、通常５〜４８時間に設定するのが好ましい。
反応終了後の溶液をそのまま、もしくはさらに１００℃以上で熱処理して溶液を固液分離（遠心分離、ろ過、デカンテーションその他）して、Ｌ−アラビノース溶液を得る。得られたＬ−アラビノース溶液はケイソウ土ろ過、濾紙ろ過、精密ろ過その他のろ過処理を単用又は組み合せて行った後、加熱、減圧、減圧加熱、限外ろ過等の常法に従って濃縮し、濃縮液を得る。得られた濃縮液は、イオン交換樹脂や活性炭等を用いた各種クロマトグラフィーを用いて常法に促して精製してもよい。また、精製したＬ−アラビノース溶液を前記と同様に濃縮し、得られた濃縮液を冷却して（種晶を添加してもよい）結晶Ｌ−アラビノースを得てもよい。
【００６５】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの精製
（１）酵素原末の調製
アクレモニウム属微生物由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ原末を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、すべて以下の組成からなる培地を常法により加熱滅菌したものを用いた。
【００６７】
〔培地組成〕
綿実油粕２％、セルロース２％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１％、硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）。
【００６８】
上記培地５００ｍｌに、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）を接種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして１５Ｌにスケールアップし、さらにスケールアップを続けて最終的に６００Ｌタンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ原末は５．０ｋｇであった。
【００６９】
（２）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの精製
（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として、以下に示した方法で精製した。
【００７０】
ｉ）弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）に上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．５）で吸着せしめ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．５）中にＮａＣｌを各０Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、及び０．８Ｍ含有せしめ、ステップワイズ溶出を行い、０．１〜０．１５Ｍ、好ましくは０．１Ｍで溶出されるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性画分を分取した。
【００７１】
ii）強塩基性イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ（１０／１０）に上記ｉ）で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性画分をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）で吸着させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）中にＮａＣｌを０Ｍから０．３Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【００７２】
iii）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（ファルマシア社製）に上記ii）で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性画分を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０）で通過させ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示した画分を分取した。
【実施例２】
【００７３】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの酵素的、タンパク質的諸性質
（１）基質特異性及び作用特性
実施例１で得た精製α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの各種基質に対する活性を調べた。すなわち、アラビナン、アラビノガラクタン、及びアラビノキシラン（いずれもＭｅｇａｚｙｍｅ社製）のそれぞれに対するアラビノース遊離活性をＤＮＳ法（Ｂｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９５２）により調べた。
その結果、アラビナン、次いでアラビノキシランからの遊離が高い一方、アラビノガラクタンからの遊離活性は相対的に低かった。
また、アラビナンとリニアアラビナンに対する作用を比較した結果、リニアアラビナンからも相当量のアラビノース（Ｌ−アラビノフラノース）を遊離することが明らかとなった。
【００７４】
（２）至適ｐＨ
実施例１で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの至適ｐＨを調べた。すなわち、グリシン−塩酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ１〜３．５）、酢酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ３．５〜６）及びリン酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ６〜８）にてｐＨを調整し、酵素を５ｍｇ／ｍｌアラビナンと共に３７℃で処理してアラビナン分解活性を測定し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図１に示す。なお、図１中の◇はグリシン−塩酸緩衝液、□は酢酸緩衝液、△はリン酸緩衝液の各緩衝液中における結果を示す。
図１から明らかなように、本酵素は、ｐＨ３〜４のときに最大の活性を示すと共に、約ｐＨ１．５〜５．５においても高い活性を有していた。
【００７５】
（３）安定ｐＨ範囲
実施例１で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのｐＨ安定性を調べた。すなわち、グリシン−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ１〜３．５）、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ３．５〜６）、リン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ６〜８）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８〜９）、及びＣＨＥＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ９〜１０）にてｐＨを調整し、酵素を室温（２２℃）にて２４時間処理した後、これらを希釈し、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ３．５）中にて５ｍｇ／ｍｌアラビナンと共に３７℃で処理してアラビナン分解活性を測定し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性とｐＨとの関係を図２に示す。なお、図２中の◇はグリシン−塩酸緩衝液、□は酢酸緩衝液、△はリン酸緩衝液、○はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、×はＣＨＥＳ緩衝液の各緩衝液中における結果を示す。
図２から明らかなように、本酵素はｐＨ２〜７．５の範囲で安定であり、ｐＨ１．５〜２の範囲においても高い活性を有していた。
【００７６】
（４）至適温度（作用最適温度）
実施例１で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの至適温度（作用最適温度）を調べた。すなわち、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ３．５）中にて酵素を５ｍｇ／ｍｌアラビナンと共に２０〜６０℃にて処理してアラビナン分解活性を測定し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性と温度との関係を図３に示す。
図３から明らかなように、本酵素の至適温度は５０℃であったが、約４０〜６０℃の範囲において高い活性を有していた。
【００７７】
（５） 温度安定性
実施例１で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの温度安定性を調べた。すなわち、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ３．５）中にて酵素を２０〜７０℃にて２４時間処理した後、これらを希釈し、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ３．５）中にて５ｍｇ／ｍｌアラビナンと共に３７℃で処理してアラビナン分解活性を測定し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性と温度との関係を図４に示す。
図４から明らかなように、本酵素は、５０℃以下の範囲で安定であった。
【００７８】
（６）分子量
実施例１で得たα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの分子量を決定するために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ゲル）を行った。
その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの分子量は約５７，０００と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの分子量は、以下の第１表に示す通りである。
【００７９】
【表１】
2006129718.tif 000002
【００８０】
（７）等電点
実施例１で得られたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの等電点（ｐＩ）を決定するために、ＬＫＢ両性等電点電気泳動装置を用いてポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動を行った。なお、この試験に用いた標準サンプルの等電点は、以下の第２表に示す通りである。
その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの等電点はおよそ５．３〜５．５と算出された。
【００８１】
【表２】
2006129718.tif 000003
【００８２】
（８）比活性
実施例１で得られたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのアラビナン分解活性における比活性を調べた。すなわち、ｐＨ３．５、３７℃で、５ｍｇ／ｍｌアラビナン溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌの還元Ｌ−アラビノフラノースを生成する酵素量を１単位と定義した。
その結果、比活性は、約２９単位／ｍｇタンパク質であった。
【実施例３】
【００８３】
アクレモニウム・セルロリティカス由来α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の単離
（１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例１で精製されたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのタンパク質を、電気泳動システム（テフコ社製）と１２％のポリアクリルアミドゲルを用い、電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、マルチフォーＩＩ（ファルマシアバイオテク社製）にて、添付のプロトコールに従い、ポリビニリデンジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ、ミリポア社製）に転写した。この膜をクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、約５０ｋＤａのタンパク質がブロットされている部分を切り出した。
【００８４】
Ｎ末端アミノ酸配列の決定は、プロテインシークエンサー  Ｍｏｄｅｌ  ４９２（ＰＥバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示される通りであることが明らかとなった。この配列に関してＢＬＡＳＴを用いてホモロジー検索を行ったところ、トリコデルマ・リーセイのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼと高い相同性を示した。
【００８５】
一方、内部アミノ酸配列の決定は、以下のようにして実施した。
すなわち、まず、精製したタンパク質を凍結乾燥後、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。タンパク質に対し１／１００モル量のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し、３７℃にて４８時間反応させた。同分解産物をＭｏｄｅｌ１７２μプレパラティブＨＰＬＣシステム（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いてカラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８  ２２０×２．１ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、５％  アセトニトリル〜０．０８５％ＴＦＡ、３５％アセトニトリルグラジェント）を行い、２種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列は、前述のプロテインシークエンサーにより決定した。
その結果、内部アミノ酸配列として、配列表の配列番号４及び配列番号５のそれぞれに示されるアミノ酸配列が含まれることが明らかとなった。
【００８６】
（２）ゲノムＤＮＡの単離
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）を（Ｓ）培地（２％ブイヨン、０．５％イーストエキス、及び２％グルコース）で３０℃にて２日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕された菌体からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを単離した。
【００８７】
（３）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのＤＮＡ断片の単離
精製されたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの、前記（１）で決定された部分アミノ酸配列をもとに、それぞれ配列表の配列番号６及び配列番号７に示される塩基配列からなる２つのプライマーを合成した。これらのプライマーを用い、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株から単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、添付のバッファー、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ及び１０μＭの上記プライマーを用い、９４℃−３分間、（９４℃−１分間、４２℃−１分間、７２℃−４５秒間）×３０回、７２℃−３分間の条件で反応を行った。この反応により約５６０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅し、このＤＮＡ断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）ベクターに挿入した。
このようにしてクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。
その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、糸状菌のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と相同性を示し、目的とするα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。
【００８８】
（４）ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの作製
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株を、セルラーゼ誘導培地（４％セルロース、１％バクトペプトン、０．６％硝酸カリウム、０．２％尿素、０．１６％塩化カリウム、０．１２％硫酸マグネシウム、１．２％燐酸一カリウム、０．００１％硫酸亜鉛、０．００１％硫酸マンガン及び０．００１％硫酸銅（ｐＨ４．０））で３２℃にて４日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕された菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを単離した。
さらに全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｍＲＮＡを精製した。
【００８９】
こうして得られたｍＲＮＡから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをファージベクターのＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入した。
このようにして作製された組換えファージベクターについて、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社製）により、添付のマニュアルに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーは、５．５×１０５ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓであった。
さらに、このｃＤＮＡライブラリーを、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩに添付のプロトコールに従い増幅した。この増幅したｃＤＮＡライブラリー中の組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。
【００９０】
（５）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の単離
プラークの形成されたプレート上に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）をのせ、プラークを付着させた。このメンブレンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。こうして作製したメンブレンとＰＣＲにより増幅したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）により、添付のプロトコールに従って、スクリーニングを行った。このようにして選抜した陽性クローンからプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）へのｉｎ ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎは、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩに添付のプロトコールに従い実施した。
【００９１】
プラスミドベクター中のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼｃＤＮＡの塩基配列の決定は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニングサイト近傍のシークエンス用プライマー、又は解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥバイオシステムズ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。
このようにしてアクレモニウム・セルロリティカスのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼｃＤＮＡの１６８５ｂｐの塩基配列を決定した。本ｃＤＮＡは１５２４ｂｐの塩基配列（配列番号２）からなる１個のＯＲＦを含み、約５０ｋＤａのタンパク質（配列番号１）をコードすることが明らかとなった。
このＯＲＦから予測されるタンパク質に関してＢＬＡＳＴを用いてホモロジー検索を行ったところ、アクレモニウム・セルロリティカスのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、トリコデルマ・リーセイのα−Ｌ−α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（Ｑ９２４５５）に最も高い相同性（７９％）を示していた。
【実施例４】
【００９２】
アクレモニウム・セルロリティカス由来α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の過剰発現
（１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子発現用の組換えベクターの作製
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼｃＤＮＡの挿入されたプラスミドを鋳型とし、それぞれ配列表の配列番号８及び配列番号９記載の塩基配列からなる２つのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、添付のバッファーとｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、１００ｎｇプラスミドＤＮＡ及び１μＭの上記プライマーを用い、９４℃−３分間、（９４℃−３０秒間、４８℃−３０秒間、７２℃−１分間）×３０回、７２℃−３分間の条件で反応を行った。
こうして得られたＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）に挿入し、ｐＡＢＦを作製した。
【００９３】
このようにして得られたアラビノフラノシダーゼのコード域を含むプラスミドベクターｐＡＢＦで形質転換された大腸菌（ＪＭ１０９）は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２４３の受託番号のもと、日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
ｐＡＢＦをＳｔｕ  ＩとＳｐｈ  Ｉで切断し、これを特開２００１−１７１８０号公報に記載されているｐＣＢＨＥＸ／ＤｔＲ２のＨｐａ  ＩとＳｐｈ  Ｉの間に挿入し、タンパク質発現用プラスミドｐＣＢＨＥＸ／ＤｔＲ２／ＡＢＦを作製した。
【００９４】
（２）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の宿主への導入
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株を、（Ｓ）培地で３０℃にて１６時間培養し、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心することにより集菌した。得られた菌体を０．５Ｍ  シュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  キチナーゼ、１０ｍｇ／ｍｌ  ザイモリアーゼ、３０ｍｇ／ｍｌ  β−グルクロニダーゼ及び０．５Ｍ  シュークロース）に懸濁した。３０℃で６０分〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿によりこの懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣバッファー（０．５Ｍ  シュークロース、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
以上のようにして調製したプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣバッファーに懸濁し、この１００μｌに対し１０μｇのＤＮＡ溶液（１０μｌ）を加え、氷上に５分間静置した。次に、４００μｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣバッファーを加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心分離したプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣバッファーに懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心して、最終的に１００μｌのＳＵＴＣバッファーに懸濁した。
【００９５】
以上の処理をしたプロトプラストを、ハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍｌ）添加（Ａ）培地（３．９％ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）、１７．１％シュークロース）上に、（Ａ）軟寒天とともに重層し、３０℃、５〜９日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
【００９６】
（３）アクレモニウム・セルロリティカス形質転換体におけるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの発現と酵素活性の測定
ハイグロマイシンＢに対する耐性度の高いもの２株（形質転換体１（ＡＡ−１）及び形質転換体２（ＡＡ−５））をセルラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。その結果を図５に示す。尚、図５中、上段のマーカーは、左側から分子量マーカー、親株の結果、形質転換体１の結果、形質転換体２の結果、及び分子量マーカーをそれぞれ示す。右側の数字は分子量を、左側の矢印はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのバンド部分を示す。
図５から明らかなように、形質転換体は、親株よりもα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ分泌量が向上していた。
また、１ｍｌの培養上清あたりのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性（ｕ／ｍｌ）を、表３に示す。
【００９７】
【表３】
2006129718.tif 000004
【００９８】
表３から明らかなように、形質転換体は、親株よりも高い活性を示し、特に形質転換体１は、親株の約２．５倍の比活性を示した。
【実施例５】
【００９９】
ビートパルプを分解することによるＬ−アラビノース製造方法
（１） ビートパルプの酵素分解
ビートパルプ７５０ｇを１５Ｌの水に懸濁した後、酵素組成物７．５ｇを添加し、５０℃で２４時間攪拌しながら反応した。反応終了後、反応液を濾布遠心分離器（濾布４００ｍｅｓｈ）にて分離し、水溶性画分を得た。この水溶性画分をろ過することによりＬ−アラビノースを含む清澄な溶液１２Ｌを得た。この溶液中の糖の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析の条件としては、分析用カラムとしてＳｈｏｄｅｘ社製ＳＵＧＡＲ  ＳＰＯ８１０（２本連結）を用い、カラム温度８０℃、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎとし、超純水で溶出を行った。糖の検出はエバポレイティブ光散乱検出法（ＳＥＤＥＸ社）により行い、標準品の定量値からＬ−アラビノースの含量を求めた。上記の反応後の溶液を分析した結果、１２Ｌ中に４５．６ｇのＬ−アラビノースが蓄積していた。
【０１００】
（２） クロマトグラフィーによるＬ−アラビノース画分の精製
上記溶液に粉末活性炭（武田薬品社製、商品名白鷺ＦＡ）１．５ｇを加えて５５℃で１時間撹拌し、Ｎｏ．２ろ紙にてろ過した。ろ液を減圧下で加熱濃縮し、Ｂｒｉｘ３７．６の濃縮液を得た。この溶液をクロマトグラフィーを用いて分離精製し、Ｌ−アラビノース画分を得た。クロマトグラフィーの条件としては、イオン交換樹脂（オルガノ社製ＦＸ１０８０、Ｃａ２＋型、ベッドボリューム１．８Ｌ）を用いて水で溶出した。精製したＬ−アラビノース画分はＬ−アラビノース１３．７ｇ（純度７３．７％、固形分当たり）であった。
【０１０１】
（３） Ｌ−アラビノースの結晶化
上記Ｌ−アラビノース画分を減圧下で加熱濃縮（７０℃）しＢｒｉｘ６０となるまで濃縮した。この濃縮液に少量の結晶Ｌ−アラビノースを添加し、７０℃から４℃に冷却した。この溶液をろ過することにより、１０．１ｇの結晶Ｌ−アラビノース（純度９９．９％以上）を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明により、アクレモニウム属微生物由来の新規α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。また、新規α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの効率的な製造方法も提供される。
さらに、このα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼまたは該酵素を包含する酵素組成物を植物又は植物由来物の加工などに利用する技術も提供され、飼料分野や食品分野、Ｌ−アラビノースの製造など様々な用途での利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの３７℃における至適ｐＨを示す図である。
【図２】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの室温（２２℃）、２４時間処理におけるｐＨ安定性を示す図である。
【図３】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのｐＨ３．５における至適温度を示す図である。
【図４】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのｐＨ３．５、２４時間処理における温度安定性を示す図である。
【図５】アクレモニウム・セルロリティカス形質転換体におけるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの発現を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１０４】
図５中、上段は各列の意味を示し、左側から分子量マーカー、親株の結果、形質転換体１の結果、形質転換体２の結果、及び分子量マーカーをそれぞれ示す。右側の数字は分子量を、左側の矢印はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのバンド部分を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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