(57)【要約】【課題】  角層中の酸化タンパク質の評価結果を肌質の改善などに活用すること。【解決手段】  本発明は、角層中の酸化タンパク質を指標とした角層の柔軟性・弾力性の評価方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
角層中の酸化タンパク質を指標とする、肌の柔軟性・弾力性を評価するための方法。
【請求項２】
皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで角層酸化タンパク質の検出を行う、請求項１記載の肌の柔軟性・弾力性を評価するための方法。
【請求項３】
肌の柔軟性・弾力性を指標とする、角層中のタンパク質の酸化度を検出するための方法。
【請求項４】
角層中のタンパク質の酸化を抑制することにより、肌の柔軟性・弾力性を保持・向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層中の酸化タンパク質を指標とした肌の柔軟性・弾力性の評価方法、肌の柔軟性・弾力性を指標とした角層中のタンパク質の酸化度の検出方法、さらには角層中のタンパク質の酸化を抑制することにより、肌の柔軟性・弾力性を保持・向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌質（または皮膚の状態）を的確に把握することは、より健康な皮膚を維持するための的確なスキンケアを行う上で重要である。そのため、化粧品によるスキンケアを実施するに際し、例えば、美容技術者による問診などを通じて、化粧品の使用者の肌質が評価されてきた。また、肌質の客観的な評価を目的として、各種の計測機器を使用して、観察又は測定されるパラメーターにより、皮膚の状態または機能を評価することも行われている。
【０００３】
近年、皮膚の加齢に伴う老化や光老化との関係で、角層酸化タンパク質の研究が盛んに行われている。主な酸化タンパク質として、酸化を受けた結果カルボニル基の導入されたタンパク質があり、一般に、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されてカルボニル基となった結果生成されたものと、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで生成されたものとがある。酸化タンパク質は老化関連での研究が豊富にされており、加齢（脳、肝、線維芽細胞）、アルツハイマー病、早老症（Werner症候群）等において増加することが認められている。
【０００４】
皮膚においては、皮膚表面の皮脂がフリーラジカルによって酸化し、過酸化脂質が生成することでタンパク質の酸化は開始され、いったん過酸化脂質が生成されると、酸化は連鎖的に進行し、肌表面に刺激を与えるだけにとどまらず、角質層の奥まで入り込んで細胞にダメージを与えるものと考えられる。従って、皮膚の酸化タンパク質の性状、例えば存在量、分布状態等を評価し、肌質または皮膚の状態を把握し、その後のスキンケア法の方針決定や化粧品の選定のためにその評価結果を何らかの形で活用できるものと期待される。しかしながら、現在のところ、酸化タンパク質と皮膚のダメージとの間に漠然とした関係が存在すると予測されてはいるものの、角層タンパク質の酸化が皮膚の性状に実際にどのような影響を及ぼしているかについては解明されるに至っていない。
【０００５】
【特許文献１】特開2001-91514号公報
【非特許文献１】FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406
【非特許文献２】J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359
【非特許文献３】J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625
【非特許文献４】Analytical Biochemistry 1987, 161, 245-257
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
皮膚に存在する酸化タンパク質の評価結果を肌質の改善などに活用できれば、皮膚学的・化粧学的側面において極めて有益であると予測され、例えば近年における化粧品業界などで行われている適切なスキンケア法などのアドバイスを目的とするカウンセリングサービスの提供のための有力な手段ともなり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記事実を鑑み、角層タンパク質が皮膚の性状に及ぼす影響を検討したところ、角層タンパク質の酸化が進行するにつれ肌の柔軟性・弾力性が失われていくことを見出した。紫外線照射や乾燥、老化などが原因で肌の柔軟性・弾力性が失われることはある程度予想されるが、肌の柔軟性・弾力性の低下に角層タンパク質の酸化が関与していることははじめて見出された事実であり、このような事実の解明は皮膚学的、化粧品学的見地から極めて有意義である。
【０００８】
従って、上記事実の解明に基づき、本発明は第一の観点において、角層中の酸化タンパク質を指標とする、肌の柔軟性・弾力性を評価するための方法を提供する。好適な態様において、角層酸化タンパク質の検出は、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで行う。酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、好ましくは酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質、例えばフルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジドなどを用いて行う。
別の観点からすると、本発明は、肌の柔軟性・弾力性を指標とする、角層中のタンパク質の酸化度を検出するための方法を提供する。
さらには、本発明は角層中のタンパク質の酸化を抑制することにより、肌の柔軟性・弾力性を保持・向上させる方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
角層タンパク質の酸化が及ぼす肌への影響の解明により、角層酸化タンパク質を指標としたスキンケア手段の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
第一の観点において、本発明は、角層中の酸化タンパク質を指標とする、肌の柔軟性・弾力性を評価するための方法を提供する。
一般に肌の柔軟性や弾力性が失われると、皮膚のたるみやしわの増大といった老化現象の原因となる。従って、柔軟性又は弾力性の保持された肌は美容上きわめて好ましい外観を示すことになる。また、柔軟性又は弾力性が高い皮膚では肌にはりがあり、若々しい健康な状態になる。そのため肌が柔軟性又は弾力性を有することは美容学上極めて重要であり、一般に肌の柔軟性又は弾力性は美容技術者などの美容専門家の主観を頼りとした官能テストなどにより行われていた。本発明は角層中の酸化タンパク質を指標とすることで、より詳しくは角層中の酸化タンパク質の存在量、分布状態等を検出することで、肌の柔軟性又は弾力性をより簡単かつ客観的な手段で調べることを可能とする。
【００１１】
角層酸化タンパク質に関する研究が多々行われており、その検出方法にも様々なものが知られている。本発明において、角層酸化タンパク質の検出方法は特に制限されるものではなく、当業界周知の様々な方法を利用することができる。例えば、J.J.Thiele et al. FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406に記載の角層酸化タンパク質の検出方法では、粘着テープを皮膚表層に貼付け、剥がすといったいわゆるテープストリッピング操作を行うことで角層の付着したテープ（「テープ角層」）を獲得し、酸化タンパク質をELISAにて検出する方法である。J.J.Thiele et al. J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359に記載の方法は、テープ角層からタンパク質抽出を行い、可溶性成分をDNPH標識し、SDS-PAGEにかけ、抗DNP抗体を用いてウェスタンブロットを行うことで酸化タンパク質の検出を行っている。C.S.Sander et al. J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625に記載の方法は、ヒト皮膚組織切片をDNPHで標識し、抗DNPで染色することで酸化タンパク質の検出を行っている。
【００１２】
本発明の好適な態様において、角層酸化タンパク質の検出は、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで行う。かかる検出は蛍光顕微鏡下で行うことができる。酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、好ましくは酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質、例えばフルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジドなどを用いて行ってよい。この方法によれば、例えば蛍光顕微鏡により得た検出結果を画像化することで、皮膚角質層の酸化タンパク質の皮膚上での性状の二次元的な情報を簡易に獲得し、例えば化粧品等の販売の際のカウンセリングサービスにおけるかかる酸化タンパク質の情報の活用を図ることが可能となる。
【００１３】
本発明において、皮膚由来の角層試料は、身体のいずれの部分に由来する試料でもよく、また、かような試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。該試料の由来する身体の部位または領域の典型例としては、顔面の頬、額、手甲および体幹などを挙げることができる。
【００１４】
このような試料は、所謂、外科的手段等の侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、殊に肌質の評価を目的とする場合には、簡易さを理由に、非侵襲的な方法により皮膚から取得されるものであることが好ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されているテープストリッピングや擦過法等を挙げることができる。
【００１５】
テープストリッピングは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付、剥がすことを実施することで、皮膚の二次元的状態をその粘着テープにそのまま転写させることができるため、本発明において特に好ましい。テープストリッピングによりテープ角層を採取し、裁断せずにそのままの状態で酸化タンパク質を特異的に蛍光染色すれば、実際の皮膚の二次元的性状に対応した酸化タンパク質の二次元的情報が得られることとなる。
【００１６】
テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape (3M社製）等が使用できる。
【００１７】
本発明の好適な態様において利用できる酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基
―ＮＨＮＨ2
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジドなどが挙げられる。
【００１８】
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は、具体的には、例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００１９】
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、ビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの組合わせを用いることもできる。ビオチンヒドラジドもヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。この場合、まず酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを結合させ、しかる後に蛍光標識アビジンをビオチンーアビジン結合を介してビオチンヒドラジドに結合させ、その結果酸化タンパク質は蛍光標識される。ビオチンヒドラジドは当業界においてよく知られ、例えばピアース社から製造販売されているものを使用することができる。また、蛍光アビジンは、例えばフルオレセインアビジンなどが使用できる。
【００２０】
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は、具体的には、例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(5)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００２１】
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、酸化タンパク質のカルボニル基にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、そのジニトロフェノール部分を蛍光色素で標識することで行うこともできる。従って、本発明の更なる好適な態様では、酸化タンパク質のカルボニル基に結合させたジニトロフェニルヒドラジンのジニトロフェノール部分を蛍光免疫測定法等で検出することができる。
【００２２】
このようなジニトロフェニルヒドラジンを利用して蛍光標識する場合、酸化タンパク質の検出は、具体的には、例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5）中のジニトロフェニルヒドラジン（DNPH)を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、抗DNP抗体、例えばウサギDNP抗体（ZYMED社製）の同生理溶液を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)反応終了後に同生理溶液にて十分に洗浄し、上記抗DNP抗体に特異的な蛍光標識二次抗体、例えばフルオレセイン標識抗ウサギIg（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(5)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(6)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００２３】
別の観点からすると、本発明は、肌の柔軟性・弾力性を指標とする、角層中のタンパク質の酸化度を検出するための方法を提供する。上述のとおり、本発明者は角層タンパク質の酸化が肌の柔軟性・弾力性に影響を及ぼすことを見出したが、角層タンパク質の酸化は皮膚に肌の老化を含むその他の様々な性状に影響を及ぼしている可能性もある。従って、肌の柔軟性・弾力性を指標に、角層タンパク質の酸化が原因とする皮膚老化をはじめとする様々なその他の性状の早期発見・対処が可能ともなり得る。上述のとおり、角層や肌の柔軟性・弾力性は美容技術者などの美容専門家の主観を頼りとした官能テストなどにより行うことができる。
【００２４】
本発明はまた、角層中のタンパク質の酸化を抑制することにより、肌の柔軟性・弾力性を保持する方法を提供する。角層タンパク質の酸化の抑制は、適当な抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ビタミンＥなどの周知の化合物を適当な溶媒に溶解し、肌に適量適用するなどして達成可能である。
【００２５】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実験１：角層酸化タンパク質を指標とする角層の「柔軟性・弾力性」の評価
白豚皮（NIBS系、日生研株式会社）より角層を単離し水、１０ｍＭのアクロレイン（東京化成工業株式会社）溶液に３時間浸漬して酸化処理した。アクロレインはタンパク質に作用することで酸化させ、アルデヒドタンパク質付加体を生成する。酸化処理後、蒸留水で３時間洗浄した。洗浄後、角層側を上に向けてシャーレ上で24時間乾燥（湿度５０％、温度２５℃）させた。コントロールとしては、アクロレインで処理しないこと以外は同様に処理した豚皮を使用した。
【００２７】
このようにして酸化処理した豚皮の柔軟性・弾力性を、そのヤング率を指標として調べた。
アクロレイン処理した角層又は無処理の角層を２０mm×５mmにカットした。この厚みをミツトヨ測定力可変式デジタルマイクロメーター（測定圧０．５Ｎ）を使用して測定し、カットした角層の断面積を得た。次に島津EZ-TESTにより引っ張り試験（掴み感覚１０mm）を実施し、得られる力一歪曲線のフック領域傾きを角層断面積で割り、ヤング率を計算した。
【００２８】
その結果を図１に示す。コントロールに比べ、酸化処理した豚皮の硬さは有意に増大した。従って、角層中の酸化タンパク質の量が増大するにつれ、肌の柔軟性・弾力性が失われることがわかった。
【００２９】
実験２：酸化処理による皮膚力学特性と角層酸化タンパク質の量の評価
ヒト前腕を洗浄後、CUTOMETER SEM575（Courage+Khazaka製）にて力学特性の測定を行った。続いて０．１５％次亜塩素酸ナトリウムPBS水溶液あるいはPBS水溶液を１００μｌ適用した。翌日、試験部位を洗浄した後、試験部位の力学特性の測定を行った。あわせて試験部位をテープストリッピングして角層を採取し、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによって酸化タンパクを蛍光標識して酸化タンパク量を測定した。力学特性は得られるＲ０（最大引張り幅）として得られるパラメーターの処理前後の比を処理部位とコントロール部位で比較した。その結果を図２に示す。角層をIn vivoで酸化処理すると、実際に角層は酸化され、それに伴って皮膚の柔軟性が低下することが確認された。
【００３０】
実験３：酸化処理による角層タンパク質２次構造変化の検討
ユカタン黒豚皮（日本チャールズ・リバー株式会社）より角層（２×２cm）を単離し水、１０ｍＭのアクロレイン（東京化成工業株式会社）溶液に３時間浸漬して酸化処理した。アクロレインはタンパク質に作用することで酸化させ、アルデヒドタンパク質付加体を生成する。酸化処理後、蒸留水で３時間洗浄した。洗浄後、角層側を上に向けてシャーレ上で24時間乾燥（湿度５０％、温度２５℃）させた。コントロールとしては、アクロレインで処理しないこと以外は同様に処理した豚皮を使用した。
【００３１】
このようにして酸化処理した豚皮中の角層タンパク質の２次構造の変化を検討した。
SENS IR Technology社顕微FTIR III  umanat IRにダイヤモンドプリズムを装着し、マイクロATR-IR法によって得られる角層赤外スペクトルアミドＩ領域をバンド分解してタンパク質２次構造（βシート、αヘリックス、ランダムコイル）の存在比を推測定した。
【００３２】
その結果を図３に示す。コントロールに比べ、酸化処理した豚皮のαヘリックス含量及びβシート含量は減少するのに対し、ランダムコイル含量は顕著に増大した。
蚕のフィブロインタンパク質ではβシート構造はシルク特有の強さやしなやかさなどの力学特性と関連があると考えられていることから、酸化処理した角層におけるβシート構造の減少とランダムコイルの増加は、酸化処理による角層の硬化と関連があると推測される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】アクロレイン処理による豚皮角層のヤング率の変化。
【図２】酸化処理による皮膚力学特性の変化と角層酸化タンパク質の量の関係。
【図３】アクロレイン処理による豚皮角層タンパク質２次構造の変化。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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