(57)【要約】【課題】  コレクチン類の生理活性に関する新たな検出方法を提供する。【解決手段】  ウィルスに感染した細胞を、コレクチン類の存在下または不在下の環境に置く。  コレクチン類の存在下で形成されたウィルス感染フォーカスの総面積と、コレクチン類の不在下で形成されたウィルス感染フォーカスの総面積とを比較して、感染細胞でのウィルスの出芽の抑制レベルを決定する。【選択図】  図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレクチン類の抗ウィルス活性を検出する方法であって、下記の工程、すなわち；
(Ａ) ウィルスの存在下で細胞を培養してウィルス感染細胞を取得し、
(Ｂ) コレクチン類の存在下または不在下の環境に当該感染細胞を置き、
(Ｃ) コレクチン類の存在下で形成されたウィルス感染フォーカスの総面積と、コレクチン類の不在下で形成されたウィルス感染フォーカスの総面積とを比較し、および
(Ｄ) 工程(Ｃ)での比較結果に基づいて、当該感染細胞でのウィルスの出芽の抑制レベルを決定する、
工程を含む、ことを特徴とするコレクチン類の抗ウィルス活性を検出する方法。
【請求項２】
前記コレクチン類が、(１)システインを含むＮ末端領域、(２)コラーゲン様領域、(３)ネック領域、および、(４)糖鎖認識領域を含む、カルシウム依存性レクチンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルシウム依存性レクチンが、マンノース結合タンパク質(ＭＢＰ)、ヒトマンノース結合タンパク質(ｈＭＢＰ)、コングルチニン、および、組換えコングルチニンからなるグループから選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウィルスが、インフルエンザＡウィルスである請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレクチン類の生理活性、特に、カルシウム依存性レクチンの抗ウィルス活性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コングルチニンは、カルシウム要求型の哺乳類Ｃ型レクチンファミリーに属するウシ血清中に存在する動物レクチンであり、Lee et al.,によって、その全アミノ酸配列(配列番号：１)が解析されている〔Lee et al., ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、266巻、2715-2723頁、1991年〕。
【０００３】
Ｃ型レクチンは、(１) システインを豊富に含むＮ末端領域、(２) コラーゲン様領域、(３) ネック領域、および(４) 糖鎖認識領域(ＣＲＤ)の４種の特徴的な領域を含む基本構造から構成されている〔Malhotra et al., ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur. J. Immunol.,) 22巻、1437-1445頁、1992年〕。
【０００４】
Ｃ型レクチンには、コングルチニンの他に、マンノース結合タンパク質(ＭＢＰ)、サーファクタントタンパク質Ａ(ＳＰ-Ａ)、およびサーファクタントタンパク質Ｄ(ＳＰ-Ｄ)なども含まれ、これらのレクチンを「コレクチン」と総称している。
【０００５】
脊椎動物では、細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌の侵入に対する最大の生体防御システムと考えられている。  しかしながら、最近になって、これらのレクチンによる非特異的な免疫応答が、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしていると考えられてきている〔Super et al., ランセット(Lancet)、II、1236-1239頁、1989年）。
【０００６】
宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、例えば、マンノース結合タンパク質の遺伝子上の変異によるマンノース結合タンパク質の血中濃度の低下によって、感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている〔Sumiya et al., ランセット(Lancet)、337巻、1569-1570頁、1991年〕。
【０００７】
本発明者は、以前に、コングルチニンおよびマンノース結合タンパク質が、Ｈ１およびＨ３タイプのインフルエンザＡウィルスの感染や赤血球凝集抑制活性を阻害することを見出した〔Wakamiya et al., グリココンジュゲイト・ジャーナル (Glycoconjugate J.)、８巻、235頁、1991年；Wakamiya et al., バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ(Biochem. Biophys. Res. Comm.)、187巻、1270-1278頁、1992年〕。
【０００８】
その後、さらに本発明者らのグループにより、コングルチニンをコードするｃＤＮＡクローンが取得され、コングルチニンと種々のサーファクタントタンパク質-Ｄ遺伝子との間の強い関連性も見出されている〔Suzuki et al., バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ(Biochem. Biophys.Res. Comm.)、191巻、335-342頁、1993年〕。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、コングルチニンは、生理活性医薬物質としての有用性が期待される物質でありながら、ウシ血清中からはごくわずかしかの量しか採取できず、また、動物にその採取源を依存しているためにその安定供給が困難であるとの問題点もあった。  そこで、コングルチニンの大量生産を意図すべく、遺伝子組換え手法を用いて、コングルチニンの大腸菌での発現が試みられた。
【００１０】
すなわち、まず、コングルチニンの全ｃＤＮＡを、ＰＣＲ(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション：Polymerase Chain Reaction)法により増幅し、これを発現ベクターpRSET-Ａに導入し、M13/T7ファージを用いて発現させた。  そして、得られた組換え体を解析した。  その結果、この場合、組換えコングルチニンの発現は確認できたものの、ウェスタン・ブロット法で組換え体の生成がようやく確認できる程度の発現量しか得られず、この方法は大量生産に不向きであった。
【００１１】
他の２〜３種類の発現ベクターについても、同様の方法によってその発現効果を試みたが、いずれも同程度もしくはそれ以下の発現が確認されるに止まり、効率的な発現系を確立するには至らなかった。  これは、コラーゲン様領域のような構造を有するタンパク質が大腸菌に存在しないために、コングルチニンの発現が困難であると考えられる。  また、真核生物細胞系で得られるコングルチニンは、その生産量が少なく、時に不適当な転写後修飾が起こることもある。
【００１２】
このように、コングルチニンは医薬品としての有用性が期待される物質でありながら、自然界から採取できる量はごくわずかである上に、遺伝子組換え手法によっても人為的に大量に得ることはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上述した従来技術が克服できなかった問題点に鑑みて発明されたものであり、(ｉ) コングルチニンのコラーゲン領域を構成する１７１個のアミノ酸配列（配列番号：２）の一部のアミノ酸配列、すなわち、Gly-Xaa-Xaa(配列番号：３、第２位および第３位のXaaはタンパク質構成アミノ酸である)の単位のアミノ酸配列を二つ含む６個のアミノ酸からなる極めて短いコラーゲン領域、(ii) ネック領域、および(iii) 糖鎖認識領域を含む組換えコングルチニンが、前述発現系と同様の方法によって、当該組換えコングルチニンが大量に生産できるとの知見に基づいて本発明を確立するに至ったものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の組換えコングルチニンは、極めて短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖鎖認識領域から構成されているにもかかわらず、天然型コングルチニンと同様の糖結合特異性、カルシウム依存性のコングルチネーション活性、ひいてはインフルエンザＡウィルスに対する赤血球凝集阻害(ＨＩ)活性、中和活性、およびウィルス増殖(感染拡大)阻止活性を有するものである。
【００１５】
また、本発明のコレクチン類の生理活性を検出する方法とは、ウィルス、特に、インフルエンザＡウィルスで予め感染させた細胞からの増殖ウィルスの発芽の抑制効果を測定することで、コングルチニンを含むコレクチン類の生理活性を検出する方法である。  この検出方法によれば、従来の検出方法(例えば、中和活性試験)で不活性と判断されたコレクチン類であっても、その生理活性が確認されるなど、コレクチン類の生理活性が正当にかつ多角的に評価できる。  併せて、本発明の検出方法により、コレクチン類の用途を定める際の適切な判断材料をもたらすものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の組換えコングルチニンに関して、実施例に沿って詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【００１７】
すなわち、大腸菌での部分コングルチニンの発現(実施例１）、組換えコングルチニンの構造的検討(実施例２)、組換えコングルチニンと天然コングルチニンの糖結合活性の検討(実施例３)、組換えコングルチニンのコングルチネーション活性試験(実施例４)、赤血球凝集抑制(ＨＩ)試験(実施例５)、中和活性試験(実施例６)、ウィルス増殖〔感染拡大〕阻止試験(実施例７)、およびコレクチン類の生理活性の検出(実施例８)について、以下に説明する。
【実施例】
【００１８】
実施例１：大腸菌での部分コングルチニンの発現
(１) ＲＴ-ＰＣＲ法による部分コングルチニンＤＮＡフラグメントの調製
Suzukiらの方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ(Biochem. Biophys. Res. Comm.)、191巻、335-342頁、1993年〕に従い、まず、ウシコングルチニンのｃＤＮＡ配列に基づいて、以下の配列を有するＰＣＲ用プライマーをデザインし、そして合成した。  これらプライマーは、それぞれ制限酵素XhoIおよびEcoRIの切断部位を含んでいる。
【００１９】
５'-GGCTCGAGGGGGAGAGTGGGCTTGCAGA-３' （配列番号：４）
５'-GGGAATTCTCAAAACTCGCAGATCACAA-３' （配列番号：５）
１×反応緩衝液、１μＭの各プライマー、２００μＭのdNTPs、１単位のディープ・ベント・ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス社製）および10ngのｃＤＮＡを含む反応混合物50μlを試料として用いた。  アトー社製ＰＣＲ反応装置(ザイモリアクター(登録商標))を用いて、92℃で１分間の変性、60℃で１分間のアニーリング、および72℃で２分間のＰＣＲ反応を、35サイクル繰り返して、497bpのＰＣＲ生成物を得た。
【００２０】
(２) 部分コングルチニン生成物の形質転換体の調製
実施例１(１)で得られたＰＣＲ生成物を、制限酵素XhoIおよびEcoRIで消化した後、ＤＮＡライゲーションキット(宝酒造製)を用いて、細菌の発現ベクターであるpRSET-Ａ(インビトロゲン社製)に挿入した。  そして、ライゲーション混液を、E. coli JM109中に形質導入し、コングルチニンＤＮＡの631bpから1113bpに対応する部分コングルチニンＤＮＡが挿入された形質転換体を得た(図１参照)。
【００２１】
このフラグメントの配列は、完全なコングルチニンタンパク質の191番目から351番目のアミノ酸残基に相当しており、すなわち、短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖認識領域のシーケンスを含んだ形態にて正確に増幅を行っていた。  また、この操作でのＰＣＲ反応のエラーは認められなかった。  かくして、かような部分コングルチニンを高レベルで産生する、所望の安定な形質転換体が得られた。
【００２２】
(３) 組換えコングルチニンタンパク質の発現および精製
完全な挿入体(部分コングルチニンＤＮＡ)を含む形質転換したE. coliの単一コロニーをＳＯＢ培地(アンピシリン50μg/l含有)中で、37℃で一晩培養した。  培養液1.2mlを200mlのＳＯＢ培地(アンピシリン50μg/l含有)に接種し、そのOD600nm値が約０.３になるまで培養した。  濃度が最終的に１mMになるようにイソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクシド(ＩＰＴＧ)を加え、さらに１時間培養した。  この細胞を、E. coliラクトースプロモーターにより活動するT7RNAポリメラーゼ遺伝子を含むM13ファージで、MOI ５pfu/細胞で感染させ、さらに３時間培養した。  培養液を、3,000ｇで15分間遠心分離して集菌した。
【００２３】
細菌のペレットを20mlの緩衝液Ａ(塩酸グアニジン６Ｍ、リン酸ナトリウム20mM、塩化ナトリウム500mＭ、pH７.８)中に懸濁した後、超音波処理(15秒、出力70％、10回処理)により溶菌した。
【００２４】
43,000ｇで30分間遠心分離した後、上清に、ニッケル-ＮＴＡアガロース(キアゲン社製)を加えて15分間反応させた。  反応物をカラムに流し込み、このカラムをＴＢＳ/ＮＴ液(トリス-塩酸20mM、塩化ナトリウム140mM、0.05％アジ化ナトリウム、0.05％ツィーン20(登録商標)、pH７.４)で洗浄し、さらに、ＴＢＳ/ＮＴＣ液(５mMの塩化カルシウムを含むＴＢＳ/ＮＴ液)で十分に洗浄した。  融合タンパク質を、０.５Mのイミダゾールを含むＴＢＳ/ＮＴＣ液で溶出した。  溶出液を、1,000倍容量のＴＢＳ/ＮＴＣ液に対して３回透析した。  透析および遠心分離した後、上清を、マンナン-セファロースカラム(CNBr活性化セファロース４Ｂ(ファルマシア社製)にマンナン(シグマ社製)を結合させたアフィニティーカラム)に流した。  ＴＢＳ/ＮＴＣ液で洗浄した後、結合したタンパク質を、５mMのＮ-アセチルグルコサミンを含むＴＢＳ/ＮＴＣ液で溶出した。
【００２５】
組換えコングルチニンの精製度を、後述するようにして、ＳＤＳ-ＰＡＧＥまたはウェスタン・ブロット法により解析した。
【００２６】
(４) ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ-ＰＡＧＥには、４〜20％の濃度勾配のポリアクリルアミドゲルを用いた。  また、ポリペプチドを、１％のクマシーブルー(ＣＢＢ)で染色した。  その結果を、図２に示した。  図２において、レーンＭは標準タンパク質、レーン１は全細胞溶解物、レーン２は塩酸グアニジン可溶画分、レーン３は塩酸グアニジン不溶画分、レーン４はニッケル-アガロースカラム溶出画分、そして、レーン５はマンナン-セファロースカラム溶出画分を示す。  アミノ酸配列から推定される組換え融合コングルチニンの分子量は22.5kDaであるが、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる解析では、27kDaであった。  また、エンテロキナーゼによる組換えコングルチニンの消化は不完全であるが、消化した微量の組換えコングルチニンのＮ末端アミノ酸配列は、成熟したコングルチニンと一致した。
【００２７】
(５) マンナン-セファロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび各画分のウェスタン・ブロッティング検定
マンナン-セファロースカラム溶出画分を、４〜20％の濃度勾配のポリアクリルアミドゲル、１％のクマシーブルー染色の条件下で、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。  タンパク質をニトロセルロース膜上に転写した後、これを2,000倍希釈のウサギ抗コングルチニン血清と共にインキュベートし、続いて抗ウサギＩgG結合ビオチン(ベクター社製)と反応させ、最後に、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン(BRL社製)と反応させた。  ＮＢＴ/ＢＣＩＰ(ＢＲＬ製)をアルカリホスファターゼの発色基質として用いた。      
【００２８】
そして、溶出パターンの結果を図３に示した。  組換えコングルチニンは、天然コングルチニンと同様に、５mMのＮ-アセチルグルコサミンで溶出した。  このことは、この融合タンパク質が、マンナンに対し強い親和性を有していることを示すに他ならない。  また、組換えコングルチニンの最終精製量は、E. coliの培養液１リットルあたり２.８mgであった。
【００２９】
実施例２：組換えコングルチニンの構造的検討
(１) 組換え融合コングルチニンの化学的架橋
天然コングルチニンは、９〜１８量体のポリペプチドから構成されている(Kawasaki et al., アーティブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.)、305巻、533-540頁、1993年）。  最も大きな多量体の分子量は約1,000kDaであり、典型的な多量体構造は４個の３量体構造物が十文字構造を形成したものである(Strang et al., バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、234巻、381-389頁、1986年）。  そこで、組換えコングルチニンについても、その構造について調査した。
【００３０】
組換えコングルチニンタンパク質を、10mMの塩化カルシウムを含んだPBS緩衝液に22.8μg/mlの濃度で溶かした。  検体を、０mM、０.１５mM、０.３mM、０.６mM、１.２mM、２.５mMおよび５mMのビス(スルホスクシニミジル)スベラートにより、37℃で、20分間処理した後、４〜20％濃度勾配のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。  その結果を、図４に示した。  図４の結果から、組換え融合コングルチニンは、分子量27kDaの単量体および三量体から構成されていることが確認された。
【００３１】
(２) ゲル濾過クロマトグラフィー
精製した組換えコングルチニンを、10mMのEDTAを含むpH８.０のＴＢＳ緩衝液を用い、流速０.５ml/分で、スーパーロース６(ファルマシア社製)により処理した。  そして、40μgの組換えコングルチニンを、このカラムに流した。  分画を、280nmで測定した。  組換えタンパク質の回収量を、クマシータンパク質アッセイ試薬(ピアス社製)で検定した。
【００３２】
そして、以下に示す抗ウシコングルチニンウサギ血清を用いたサンドウィッチELISA系を各分画に適用した。  カラムの検量には、ファルマシア社製標準分子量キット(チログロブリン(THY)、フェリチン(FER)、カタラーゼ、アルドラーゼ(ALD)、アルブミン(BSA)、オボアルブミン(OVA)、キモトリプシノーゲンＡ(CHY)、リボヌクレアーゼＡ)を用いた。      
【００３３】
図５に示すように、94kDa(31画分）、39kDa(34画分)および4.6kDa(39画分)の三つの主要なピークを確認した。  しかしながら、定量分析によれば、39画分にはタンパク質は認められなかった。  また、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ後の銀染色によっても、4.6kDaの画分は染色されなかった。  この画分は、200nmおよび280nmの紫外部吸収から、ペプチドでないことが確認された。
【００３４】
以上の結果から、コングルチニンは、コラーゲン領域が存在しなくても三量体を形成できることが明らかになった。  さらに、この結果は、コングルチニンと同様に、Ｃ型レクチンファミリーに属する組換えヒト−マンノース結合タンパク質やウシ-肺サーファクタントタンパク質Ｄが、コラーゲン領域を欠いていても、ネック領域を介して３量体を形成するという事実と一致している(Sheriff et al., ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー(Nature Struct. Biol.)、１巻、789-794頁、1994年；Hoppe et al., FEBSレターズ(FEBS Lett.)、344巻、191-195頁、1994年）。
【００３５】
実施例３：組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの糖結合活性
(１) 糖結合特異活性
マイクロタイタープレートを、マンナン(10μg/ml)を含む100μlのコーティング緩衝液(炭酸ナトリウム15mM、炭酸水素ナトリウム35mM、0.05％アジ化ナトリウム、pH9.6)中、４℃で、１晩表面処理した。  各段階後に、プレートをＴＢＳ/ＮＴＣ液(トリス-塩酸20mM、塩化ナトリウム140mM、0.05％アジ化ナトリウム、0.05％ツィーン20(登録商標）、pH７.４、塩化カルシウム５mM)で３回洗浄した。  コーティングが完了した後、プレートを、15％のウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ/ＮＴＣ液で、室温で、１時間処理し、固定した。
【００３６】
組換えコングルチニンまたは天然コングルチニンの単独希釈物(０、１、10、100および1,000ng/ml)あるいは種々の糖類の希釈液との混合物をＴＢＳ/ＮＴＣ、または20mMのＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミン(Ａ)もしくは10mMのEDTAを含むＴＢＳ/ＮＴＣに添加した。
【００３７】
ＴＢＳ/ＮＴＣＢで1,000倍または2,000倍に希釈したウサギ抗天然コングルチニン血清およびヤギ抗ウサギＩgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物(バイオ・ラッド社製)を添加し、37℃で、１時間インキュベートした。  最後に、ＴＭＢ基質液(KPL社製ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質システム)100μlを各ウェルに加えた。  １Ｍのリン酸 100μlを添加する前後に、450nmあるいは655nmでの吸光度を測定した(フロー・ラブス社製タイターテック・マルチスキャン・プラスＭＫIIプレート・リーダー）。  そして、糖抑制試験は、このELISA系を用いて、Lu et al.,の方法(バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、284巻、795-802頁、1992年）に従って実施した。
【００３８】
マイクロタイター・プレートを、酵母マンナン(１μg/ウェル)でコートした後、組換えコングルチニンと糖類を共に反応させた。  抑制曲線と比較して、結合を50％抑制する糖濃度をＩ50として算出した。  このようにして得られた結果を、表１に示した。  表１の結果から明らかなように、組換えコングルチニンの糖結合活性は、天然コングルチニンとほぼ一致していた。  また、図６および図７に示すように、組換えコングルチニンの結合活性は、天然コングルチニンと同様に、カルシウムイオン依存性であった。  さらに、この結合活性は、Ｎ-アセチルグルコサミンにより抑制された。  一方、組換えコングルチニンに融合したヒスチジンのタグは、マンナンへの結合活性および結合特異性には影響しなかった。
【００３９】
【表１】
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実施例４：組換えコングルチニンのコングルチネーション活性試験
組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンのコングルチネーション活性を、マイクロタイタープレートアッセイシステムにより測定した。  Wakamiyaらの方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ(Biochem. Biophys. Res. Comm.)、187巻、1270-1278頁、1992年〕に従い、iC3b結合ヒツジ赤血球細胞を作製した。  10倍希釈した新鮮ウマ血清と等量の抗フォルスマン抗体の混合物で感作し、37℃で、10分間培養して、１％iC3b結合ヒツジ赤血球細胞を得た。
【００４０】
ベロナール緩衝液のみ、あるいは30mMのＮ-アセチルグルコサミン含有ベロナール緩衝液中に、50μlの１％iC3b結合ヒツジ赤血球細胞および組換えコングルチニン、もしくは天然コングルチニン50μlを加え、37℃で培養し、コングルチネーション活性を測定した。  凝集を生じる最も低濃度のタンパク質を含む濃度をコングルチネーションの力価とし、その結果を図８に示した。
【００４１】
図８において、レーンＡは天然コングルチニン、レーンＢは組換えコングルチニン、レーンＣは30mMのＮ-アセチルグルコサミン含有組換えコングルチニンを示す。  コングルチネーションの力価は、天然コングルチニンが０.１６μg/mlであるのに対して、組換えコングルチニンは１.３〜２.５μg/mlであった。  また、その活性は、30mMのＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)で完全に阻害された。
【００４２】
実施例５：赤血球凝集抑制(ＨＩ)試験
(１) ウィルス
インフルエンザＡウィルスのＡ/Ibaraki/１/90 (H3N2:インフルエンザウィルスＡ香港型）、Ａ/Osaka/869/95 (H3N2)、Ａ/Beijing/352/89 (H3N2)、Ａ/Adachi/１/57 (H2N2)、およびＡ/Suita/１/89 (H1N1:インフルエンザウィルスＡソ連型)を、赤血球凝集抑制(ＨＩ)試験に用いた。  ウィルスは標準的な方法で、ＣＡＭ(卵しょうのう膜)で増殖させ、使用時まで−70℃で保存した。  ウィルス増殖用培地としては、３％組織培養用ビタミン、0.2％アルブミン、0.1％グルコース、および0.2ng/mlのアセチレートトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ培地を用いた。
【００４３】
(２) 組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制(ＨＩ)活性
Okuno et al.,の方法（ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、28巻、1308-1313頁、1990年)に従い、１％ヒヨコ赤血球を用い、96穴マイクロタイタープレートにより実施した。  エーテル処理した卵由来のウィルス抗原を用いた。  ＴＢＳ/Ｃ(５mMの塩化カルシウム含有ＴＢＳ液)中の培養混合液には、30mMのＮ-アセチルグルコサミンまたは10mMのEDTA以外は何も加えない。  室温で１時間培養後、ウィルス介在性のヒヨコ赤血球凝集に対する組換え部分コングルチニン(rBKg-CRD)の効果を調査した。  その結果を、表２に示す。  また、Ａ/Ibaraki/１/90における結果を、図９に示す。  図９において、レーンＡは天然コングルチニン、レーンＢ、レーンＣおよびレーンＤは組換え部分コングルチニンで、レーンＢは添加物なし、レーンＣは30mMのＮ-アセチルグルコサミン添加グループ、レーンＤは10mMのEDTA添加グループを示す。
【００４４】
【表２】
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赤血球凝集抑制(ＨＩ)活性は、用量依存性かつカルシウム依存性であった。  また、組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制(ＨＩ)活性は、天然コングルチニンやラット肺サーファクタントタンパク質-Ｄ、ヒト肺サーファクタントタンパク質-Ｄの力価（Hartshorn et al., ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション(J. Clin. Invest.)、94巻、311-319頁、1994年)とほぼ同様の力価を示した。
【００４５】
実施例６：中和活性試験
(１) ウィルス
インフルエンザＡウィルスのＡ/Ibaraki/１/90(H3N2:インフルエンザウィルスＡ香港型）、およびＡ/Suita/１/89(H1N1:インフルエンザウィルスＡソ連型)を用いた。
【００４６】
(２) 中和活性試験
Okuno et al.,の方法(ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、28巻、1308-1313頁、1990年)に従って、中和活性試験を行った。  96穴マイクロタイタープレート上で、組換えコングルチニンとインフルエンザウィルスを混合し、さらに10％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で培養されたMadin-Darby Canine Kidney(MDCK)細胞を加えて数日間培養した後、各種コングルチニンの中和活性を測定した。インフルエンザウィルスの感染フォーカスを、抗インフルエンザウィルス・マウスモノクローナル抗体、抗マウスIgGヤギ血清、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ(PAP)染色システムにより検出した。
【００４７】
以下の表３に、組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの中和活性の比較結果を示した。  また、中和価は、50％感染阻止濃度で示した。
【００４８】
【表３】
2006115858.tif 000005
実施例７：ウィルス増殖（感染拡大）阻止試験
(１) ウィルス
インフルエンザＡウィルスのＡ/Ibaraki/１/90(H3N2:インフルエンザウィルスＡ香港型)を用いた。
【００４９】
(２) ウィルス増殖（感染拡大）阻止試験
24穴マイクロタイタープレート上で、10％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で培養されたMadin-Darby Canine Kidney(MDCK)細胞に、インフルエンザウィルスを接種した。  細胞を洗浄した後に、０、１および２μg/mlの組換えコングルチニンを含有する０.５％トラガカントゴム(シグマ社製)を含むインフルエンザウィルス増殖培地を用いて、３日間培養した。  実施例６(２)の中和活性試験と同様に操作し、ＰＡＰ染色法にてウィルス感染フォーカスの総面積を求めた。  対照として、組換えコングルチニンを含有しないグループを用いた。  その結果を、図１０(ａ)および(ｂ)に示す。  図１０(ａ)および(ｂ)の結果から明らかなように、組換えコングルチニンは、濃度依存的にインフルエンザウィルスの感染フォーカスの面積を減少させ、ウィルス増殖阻止効果を呈した。  なお、この効果は、２μg/mlのＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)により阻害された(図１１)。
【００５０】
実施例８：コレクチン類の生理活性の検出
ウィルスで予め感染させた細胞での増殖ウィルスの発芽の抑制効果を測定することで、コレクチン類の生理活性を検出する方法を構築した。  すなわち、従来の生理活性の検出方法(例えば、実施例６に記載の中和活性の検出)とは、先にコレクチン類とウィルスを混合し、コレクチン類と結合しなかったウィルスを細胞に感染させ、その感染度からコレクチン類とウィルスの結合、つまり中和活性を測定するものであった(図１２(ａ))。  これに対して、本発明の検出方法では、ウィルスで予め感染させた細胞での増殖ウィルスの発芽の抑制効果を測定することで、コレクチン類の生理活性を検出しようとするものである(図１２(ｂ))。
【００５１】
そして、実施例５に記載の赤血球凝集阻害(ＨＩ)活性の測定方法、実施例６に記載の中和活性の測定方法、ウェスターンブロット法に従ったヘマグルチニン(ＨＡ)結合の検定、および実施例７に記載の本発明の検出方法に従って、インフルエンザＡウィルスに対する生理活性を測定した。  また、各種コレクチンのインフルエンザＡウィルスに対する中和活性を実施例６に記載の方法に従って測定した。  それらの結果を、下記表４および表５にそれぞれ示した。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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上記表４および表５から明らかなように、従来法では、ｈＭＢＰは天然型ならびに組換型のいずれでもインフルエンザウィルスに対する中和活性が認められなかった。  これに対して、本発明方法では、天然型ｈＭＢＰがウィルス増殖(感染拡大)を阻止するというｈＭＢＰに関する新たな知見を得るに至った。  なお、天然型ｈＭＢＰと組換型ｈＭＢＰ-ＣＲＤについて、対照にコレクチン類を含まない緩衝液を用いて、実施例７に記載の本発明の検出方法に従い、そのウィルスの発芽抑制効果を測定した。  その結果を、下記表６および図１３に示した。
【００５４】
【表６】
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上記表６および図１３の結果から、天然型ｈＭＢＰがウィルス増殖(感染拡大)を阻止するという知見の正当性が確認された。  このｈＭＢＰの作用に関する新たな知見を別の角度から立証すべく、以下の実験を行った。  まず、24穴マイクロタイタープレート上で、10％ウシ胎児血清を含むイーグルMEM培地で培養されたMadin-Darby Canine Kidney(MDCK)細胞に、インフルエンザＡウィルスを接種した。  細胞を洗浄した後に、０、0.25および0.5μg/mlのｈＭＢＰを含有する0.5％トラガカントゴム(シグマ社製)を含むインフルエンザＡウィルス増殖培地を用いて、３日間培養した。  実施例６(２)の中和活性試験と同様にて操作し、ＰＡＰ染色法にてウィルス感染フォーカスの総面積を求めた。  対照として、１μg/mlのＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を含むグループを用いた。  その結果を、図１４に示す。  図１４の結果から明らかなように、ｈＭＢＰは、濃度依存的にインフルエンザＡウィルスの感染フォーカスの面積を減少させ、ウィルス増殖阻止効果を呈した。  そして、部分組換えコングルチニン(rBKg-CRD)、ｈＭＢＰ、およびウサギＭＢＰを用いて、前述した手順に従ってインフルエンザＡウィルスに対する生理活性を測定した実験でも同様の傾向が認められた(図１５)。  なお、この場合、rBKg-CRDについては１μg/mlのＮ-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を、またｈＭＢＰならびにウサギＭＢＰについては１μg/mlのマンノースを、それぞれ対照として用いた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、従来、動物(ウシ)から極めて低収率でしか取得できなかったコングルチニンと同等の生理活性を呈する組換えコングルチニンを、人為的に大量に生産する手段を実現ならしめたのである。  また、本発明の組換えコングルチニンが、天然型コングルチニンと同質の生理活性を呈することから、医薬品としての有用性も期待できる。  さらに、本発明の組換えコングルチニンが、天然型コングルチニンの部分的構造体であり、天然型コングルチニンと比較してタンパク分子量が小さいことから、精製が容易になるなどの製造工程上の利点も併せ持つものである。
【００５６】
そして、本発明によれば、コレクチン類の生理活性を測定するための新たな検出方法が提供され、コレクチン類の生理活性が従来の検出方法との組み合わせにおいて多角的に評価できる。  併せて、本発明の検出方法により、コレクチン類の用途を定める際の適切な判断材料がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】組換えコングルチニンＤＮＡによる形質転換用ベクターを示す図である。
【図２】組換え融合コングルチニンのＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】マンナン−セファロース・アフィニティー・クロマトグラフィーによる各画分の吸光度測定、ＣＢＢ染色およびウェスタン・ブロッティングの結果を示す図である。
【図４】ビス(スルホスクシニミジル)スベラート処理後のＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】(ａ)、(ｂ)および(ｃ)は、組換えコングルチニンのゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図６】組換えコングルチニン、および20mMのＮ−アセチルグルコサミン含有組換えコングルチニンのマンナンに対する結合能を示すグラフである。
【図７】組換えコングルチニン、および10mMのEDTA含有組換えコングルチニンのマンナンに対する結合能を示すグラフである。
【図８】マイクロタイタープレートアッセイシステムによる組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンのコングルチネーション活性を示す図である。
【図９】天然型コングルチニンおよび組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制(ＨＩ)活性を示す図である。
【図１０】(ａ)および(ｂ)は、組換えコングルチニン(rBKg-ＣＲＤ)のウィルス増殖（感染拡大）阻止活性を示す図である。
【図１１】(ａ)および(ｂ)は、組換えコングルチニン(rBKg-ＣＲＤ)のウィルス増殖（感染拡大）阻止活性を示す図である。
【図１２】(ａ)および(ｂ)は、それぞれ従来の中和活性試験および本発明の検出方法での作用機序を示す模式図である。
【図１３】ヒトマンノース結合タンパク質(ｈＭＢＰ)による感染阻害効果を示す図である。
【図１４】ヒトマンノース結合タンパク質(ｈＭＢＰ)による感染阻害効果を示すグラフである。
【図１５】組換えコングルチニン(rBKg-ＣＲＤ)、ｈＭＢＰおよびウサギMBPによる感染阻害効果を示す図である。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【配列表】
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