(57)【要約】【課題】ＳＥＬＥＸ操作を用いた、標的分子に対する核酸リガンドの同定方法であって、候補核酸が光反応性基を含む方法によって同定されるリガンドの提供。【解決手段】疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも１つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の診断に使用するための上記核酸リガンド。【選択図】図２２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも１つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の診断に使用するための上記核酸リガンド。
【請求項２】
前記リガンドがインビトロ試験として使用するための請求項１記載のリガンド。
【請求項３】
前記リガンドがインビトロイメージングに使用するための促進剤に結合している請求項１又は２記載のリガンド。
【請求項４】
疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも１つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の治療に使用するための上記核酸リガンド。
【請求項５】
前記光架橋がインビボで起こる請求項４記載のリガンド。
【請求項６】
前記リガンドは標的タンパク質を阻害するために使用される請求項４又は５記載のリガンド。
【請求項７】
前記リガンドは特異的な標的−活性薬学化合物を送達する際に使用するためのものである請求項４〜６のいずれか一項記載のリガンド。
【請求項８】
少なくとも１つの光反応性基を含む核酸リガンドの使用であって、該リガンドの標的タンパク質へのインビボでの共有結合的光架橋を含む使用のための製品の製造における上記使用。
【請求項９】
前記標的タンパク質が疾病、病態又は毒性状態と関連し、前記使用が疾病、病態又は毒性状態の診断のためのものである請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記標的タンパク質が疾病、病態又は毒性状態と関連し、前記使用が疾病、病態又は毒性状態の治療のためのものである請求項８記載の使用。
【請求項１１】
前記製品が治療剤、プローブ、標的タンパク質機能の阻害剤又は封鎖剤を含む請求項８〜１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
前記標的タンパク質が核酸結合タンパク質ではない請求項１〜１１のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
【請求項１３】
前記標的タンパク質が核酸結合タンパク質ではなく、前記リガンドが少なくとも１つの光反応性基を含み、照射なしでも標的タンパク質に結合することができ、前記リガンドが照射により前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することができる、標的タンパク質への核酸リガンド。
【請求項１４】
前記光反応性基が、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウラシル、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシシトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン及び７−デアザ−７−ブロモグアニンから成る群から選択される請求項１〜１３のいずれか一項記載のリガンド又は使用。
【請求項１５】
前記リガンドが１本鎖又は２本鎖ＲＮＡを含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
【請求項１６】
前記リガンドが１本鎖又は２本鎖ＤＮＡを含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
【請求項１７】
前記リガンドが修飾されたヌクレオチドを含む請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
【請求項１８】
前記修飾はバックボーン修飾、メチル化、シトシン環外アミンの修飾、２−位置における修飾又はハロゲン化基による置換から選択される請求項１７に記載のリガンド又は使用。
【請求項１９】
前記修飾は２−ＮＨ２、２−Ｆ、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、２−ＮＨ２−ヨードウラシル、２−ＮＨ２−ヨードシトシン、２−ＮＨ２−ヨードアデニン、２−ＮＨ２−ブロモウラシル、２−ＮＨ２−ブロモシトシン、及び２−ＮＨ２−ブロモアデニンから選択される請求項１７に記載のリガンド又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願）（現在放棄）の一部継続出願である「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／７１４，１３１（１９９１年６月１０日出願）の一部継続として出願された「核酸リガンドの光選択」なる名称の米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９４年９月１７日出願）の一部継続出願である。本出願はまた、「指数関数的富化によるリガンドの系統的展開：溶液ＳＥＬＥＸ」なる名称の米国特許出願第０８／１４３，５６４号（１９９３年１０月２５日出願）の一部継続でもある、この出願自体は米国特許出願第０７／７１４，１４１号の一部継続出願であり、かつ「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願；１９９３年１２月１４日に米国特許第５，２７０，１６３号として発行）の一部継続出願である。
【０００２】
この研究はNational Institutes of Health から資金援助された合衆国政府からの助成金によって支援されたものである。合衆国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一部として、標的分子に結合及び／又は光架橋する及び／又は標的分子を光不活化する核酸リガンドを選択する方法に関する。標的分子はタンパク質、病原菌、毒性物質又は任意の生物学的エフェクターであることができる。本発明の核酸リガンドは光反応性又は化学的反応性基を含み、特に、疾患又は病的状態若しくは中毒状態の診断及び／又は治療のために有用である。
【０００４】
本発明に用いられた基礎的方法はＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)の頭字語）と呼ばれる。溶液ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本明細書に述べる、ＳＥＬＥＸ方法の改良は標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとのより効果的な分割を可能にする。ＳＥＬＥＸの高アフィニティ核酸生成物の改良は、例えば検定方法、診断方法、細胞選別において、標的分子機能の阻害剤、治療剤、金属イオン封鎖剤等として、結合反応が適用される任意の目的に有用である。
【背景技術】
【０００５】
「指数関数的増加によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）、「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）及び「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願、米国特許第５，２７０，１６３号として発行）に開示されたＳＥＬＥＸ方法（以下では、ＳＥＬＥＸと呼ぶ）は、各々が非反復配列(unique sequence) を有し、反復配列の各々が所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である生成物の種類を提供し、これらの出願の全ては個別的に引用することにより本明細書に取込まれる（本明細書ではＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）。各核酸分子は所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が多様な二次元又は三次元構造を形成する充分な容量と、ポリマーであれモノマーであれ、実際に任意の化学化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ために利用可能な、充分な化学的多用性をそれらのモノマー内に有するという特有の洞察に基づくものである。任意のサイズの分子が標的として使用可能である。
【０００６】
ＳＥＬＥＸ方法は、結合アフィニティと選択性との実際に任意の所望の基準に達するために、同じ一般的選択テーマを用いた、候補物(candidate) の混合物からの選択と、構造的改良の段階的反復とを含む。好ましくはランダム化配列のセグメントを含む核酸混合物から出発して、この方法は結合のために有利な条件下で混合物を標的と接触させる工程と、標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分割する工程と、核酸−標的対を解離させる工程と、核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得る工程と、次に、必要なかぎりの多くのサイクルによって、結合、分割、解離及び増幅の工程を再び反復する工程とを含む。
【０００７】
理論によって縛られないが、ＳＥＬＥＸは、多数の可能な配列と構造とを含む核酸混合物内に、所定の標的に対する広範囲な結合アフィニティが存在するという発明者の洞察に基づく。例えば２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は４２０種の候補の可能性を有することができる。標的に対して大きいアフィニティ定数を有するものが標的と結合する最も大きな可能性を有する。分割、解離及び増幅後に、高い結合アフィニティの候補を多く含む、第２核酸混合物が形成される。追加の選択ラウンドが最良のリガンドの形成を促進して、ついには得られる核酸混合物が主として１種のみ又は数種の配列から構成されるまでになる。次に、これらをクローン化し、配列決定し、純粋リガンドとして結合アフィニティに関して個々に検査することができる。
【０００８】
選択、分割及び増幅のサイクルを、所望の目的に達するまで、繰り返す。大抵の一般的な場合には、サイクルの反復時に結合強度の有意な改良がもはや得られなくなるまで、選択／分割／増幅を続ける。この方法を用いて、約１０１８種ほど多くの核酸種のサンプルを形成することができる。試験混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、効果的な増幅のために必要な保存配列とを含む。ランダム化核酸配列の合成と、ランダムに開裂した細胞核酸からのサイズ選択とを含む、幾つかの方法で核酸配列変異体を製造することができる。可変配列部分は完全に又は部分的にランダムな配列を含むことができ；ランダム化配列と合体した保存配列のサブポーション(subportion)も含むことができる。選択／分割／増幅の反復の前に又は中に、突然変異生成によって、試験核酸中の配列変化が導入されるか又は増大することがある。
【０００９】
タンパク質への核酸の光架橋は、核酸中への光反応性官能基の組み入れによって達成されている。会合タンパク質に核酸を光架橋させる目的のために核酸中に組み入れられている光反応性基には、５−ブロモウラシル、４−チオウラシル、５−アジドウラシル、及び８−アジドアデニンがある（図１参照）。
ブロモウラシルは、ブロモデオキシウラシル（ＢｒｄＵ）及びブロモウラシル（ＢｒＵ）を、それぞれ、チミン及びウラシルと置換することによって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に組み入れられている。ＢｒＵ−ＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とを用いて、ウラシルに代わる５−ブロモウリジントリホスフェートによって製造されており、ＢｒＵ−ＲＮＡとＢｒｄＵ−ＤＮＡとは、標準核酸合成法（Talbot等（１９９０），Nucleic Acids Res.１８：３５２１）において５−ブロモウラシルホスホラミジットと５−ブロモデオキシウラシルホスホラミジットとをそれぞれ用いて製造されている。会合タンパク質へのＢｒｄＵ置換ＤＮＡの光架橋の若干の例を下記に挙げる：完全細胞におけるタンパク質へのＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Weintraub （１９７３），Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol.  ３８：２４７）；ｌａｃリプレッサーへのＢｒｄＵ置換ｌａｃオペレーターＤＮＡ（Lin と Riggs（１９７４），Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７１：９４７；Ogata とWilbert （１９７７），Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：４９７３；Barbier 等（１９８４）、Biochemistry  ２３：２９３３；WickとMatthews（１９９１），J. Biol. Chem.２６６：６１０６）；ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼへのＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Wolfs 等（１９８６），Eur. J. Biochem.  １５９：２６７）；環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート受容体タンパク質への大腸菌ＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Katouzian −  Safadi等（１９９１），Photochem. Photobiol. ５３：６１１）；ヒト胎児脳抽出物からのタンパク質への、ヒトポリオーマウイルスのＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Khalili 等（１９８８），ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２０５）；ＧＣＮ４，酵母転写アクチベーターへの酵母ＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Blatter 等（１９９２），Nature  ３５９：６５０）；及び染色体タンパク質Ｍｃ１への、Methanosarcina sp  ＣＨＴ１５５のＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Katouzian −Safadi 等（１９９１），Nucleic Acids Res.  １９：４９３７）。会合タンパク質へのＢｒＵ置換ＲＮＡの光架橋も報告されている：酵母ｔＲＮＡリガーゼへのＢｒＵ置換酵母先駆体ｔＲＮＡＰｈｅ（Tanner等（１９８８），Biochemistry  ２７：８８５２）及びＲ１７コートタンパク質へのＲ１７バクテリオファージゲノムのＢｒＵ置換ヘアピンＲＮＡ（Gott等（１９９１），Biochemistry  ３０：６２９０）。
【００１０】
４−チオウラシル置換ＲＮＡは、特に、種々な会合タンパク質にｔ−ＲＮＡを光架橋させるために用いられている（Favre （１９９０），Bioorganic Photochemistry，１巻： Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison編集，John Wiley & Sons ：ニューヨーク，３７９〜４２５頁；Tanner等（１９８８），上記文献）。４−チオウラシルは４−チオウリジントリホスフェートとＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを用いて、又は適当なホスホラミジットによる核酸合成を用いてＲＮＡ中に組み入れられている；これはまた、硫化水素を用いてシトシンのアミノ基をチオール基に変えることによって直接ＲＮＡ中に組み入れられている。核酸への光反応性基の部位特異的組み入れのさらに他の方法は４−チオウリジリル−（３’，５’）−グアノシンの使用を含む（Wyatt 等（１９９２），Genes & Development ６：２５４２）。
【００１１】
会合タンパク質に光架橋する５−アジドウラシル置換及び８−アジドアデニン置換核酸の例も知られている。架橋されている会合タンパク質には、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Evans 等（１９８９），Biochemistry ２８：７１３；Farrar等（１９９１），Biochemistry  ３０：３０７５）；Xenopus   ＴＦＩＩＩＡ，ジンクフィンガータンパク質（Lee 等（１９９１），J. Biol. Chem.  ２６６：１６４７８）；及び大腸菌リボソームタンパク質（Wower 等（１９８８），Biochemistry  ２７：８１１４）がある。５−アジドウラシルと８−アジドアデニンとはＤＮＡポリメラーゼ又は末端基トランスフェラーゼを用いてＤＮＡ中に組み入れられている。タンパク質はまた、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡに結合した８−アジドアデノシン  ３’，５’−ビホスフェート（Wower 等（１９８９），Biochemistry  ２８：１５６３）と、リブロースービホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに結合した８−アジドアデノシン  ５’−トリホスフェート（SalvucciとHaley （１９９０），Planta  １８１：２８７）とを励起させることによって、光化学的にも標識されている。
【００１２】
可能な光反応性基としての８−ブロモ−２’−デオキシアデノシンはホスホラミジットを介してＤＮＡ中に組み入れられている（Liu とVerdine （１９９２），Tetrahedron Lett. ３３：４２６５）。光化学反応性は今後まだ研究されなければならない。
【００１３】
会合タンパク質への５−ヨードウラシル置換核酸の光架橋は今までにまだ研究されていない、この理由はヨード基のサイズが問題のタンパク質への核酸の特異的な結合を妨害するからだと思われる。しかし、５−ヨード−２’−デオキシウラシル及び５−ヨード−２’−デオキシウリジン  トリホスフェートは大腸菌(E. coli）からのチミジンキナーゼに光結合(photocoupling) することが判明している（ChenとPrusoff （１９７７），Biochemistry  １６：３３１０）。
【００１４】
５−ブロモウラシル発色団の光化学反応性の機構的研究が、光架橋に関する研究を含めて、報告されている。最も重要なことには、ＢｒＵは波長依存性光化学を示す。３１０nm領域における照射は基底状態にまで崩壊するｎ，π* 一重項状態を占め、最低エネルギーの三重項状態（Dietz 等（１９８７），J. Am. Chem.Soc.  １０９：１７９３）、最も可能にはπ，π* 三重項（Rothman とKearns （１９６７），Photochem. Photobiol. ６：７７５）に項間交差する。三重項状態は初期電子転移とその後の共有結合形成とを介して、電子富化アミノ酸残基と反応する。電子富化芳香族アミノ酸残基チロシン、トリプトファン及びヒスチジンへ（Ito 等（１９８０），J. Am. Chem. Soc. １０２：７５３５；Dietz とKoch（１９８７），Photochem. Photobiol. ４６：９７１）並びにジスルフィド含有アミノ酸、シスチンへ（Dietz とKoch（１９８９），Photochem.Photobiol.４９：１２１）の三重項５−ブロモウラシルの光架橋が、モデル研究において実証されている。ペプチド結合さえもが三重項ＢｒＵへの光架橋のための可能な官能基である（Dietz 等（１９８７），上記文献）。３０８nmよりも多少短い波長はｎ，π* 及びπ，π* 一重項状態の両方を占める。π，π* 一重項は炭素−臭素結合ホモリシス並びに三重項マニホルドへの項間交差を受ける（Dietz 等（１９８７），上記文献）；項間交差は、一部は、ｎ，π* 一重項状態への内部転換を介して生ずると考えられる。炭素−臭素結合ホモリシスは核酸鎖切断を生じる可能性がある（HutchinsonとKoehnlein （１９８０），Prog. Subcell Biol.７：１；Shetlar （１９８０），Photochem. Photobiol. Rev.  ５：１０５；Saito とSugiyama（１９９０），Bioorganic Photochemistry,１巻：Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison 編集, John Wiley & Sons,ニューヨーク，３１７〜３７８頁）。波長依存性光化学は図２のJablonski 線図に略述し、モデル光架橋反応は図３に示す。
【００１５】
数種のＢｒＵ置換核タンパク質複合体の照射による光架橋の位置が研究されている。ｌａｃリプレッサー−ＢｒｄＵ−ｌａｃ−オペレーター複合体では、チロシン−１７への架橋が確立されている（Allen 等（１９９１），J. Biol. Chem.２６６：６１１３）。古細胞染色体タンパク質ＭＣｌ−ＢｒｄＵ−ＤＮＡ複合体では、トリプトファン−７４への架橋が包含されている。酵母ＢｒｄＵ置換ＤＮＡ−ＧＣＮ４酵母転写アクチベーターでは、アラニン−２３８への架橋が報告されている（Blatter 等（１９９２），上記文献）。この最後の例では、最初にπ，π* 一重項状態を占める核タンパク質を２５４nmにおいて照射した。
【００１６】
５−ヨードウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡ及び５−ヨード−２’−デオキシシトシン置換ＤＮＡについての反応性の一部の研究と機構的研究とは報告されている。５−ヨードウラシルと５−ヨード−２’−デオキシウラシルとは、過剰なシランを含むアセトニトリル−水中での、パイレックス（登録商標）ガラスを通して濾過した中圧水銀灯からの発光(emission)による照射時にアリルシランに５−位置において結合する；この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスとその後のアリルシランのπ−結合へのラジカル添加とを経て進行することが提案された（Saito 等（１９８６），J. Org. Chem. ５１：５１４８）。
【００１７】
５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡの好気性及び嫌気性光脱ヨウ素(photo-deiodination)は、励起波長の関数として研究されている；２４０nm領域における照射による量子収量に較べて、３１３nm領域における照射によると固有量子収量が四分の一に低下する。全ての波長において、この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスを含むと考えられている（RahnとSellin（１９８２），Photochem. Photobiol. ３５：４５９）。同様に、炭素−ヨウ素結合ホモリシスは５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡの３１３nmにおける照射時に生ずると考えられている（RahnとStafford（１９７９），Photochem.Photobiol.３０：４４９）。これらの研究のいずれにおいても、厳密に、単色光は用いられなかった。最近、５−ヨードウラシル置換二本鎖ＤＮＡが光化学的一本鎖切断を受けることが判明した（Sugiyama等（１９９３），J. Am. Chem. Soc. １１５：４４４３）。
【００１８】
３５０〜４００nmの領域におけるそれぞれのＳ０→Ｔ吸収帯の照射から、５−ブロモウラシルと５−ヨードウラシルとの三重項状態の直接の占有(population)が観察されたことは本発明に関しても重要である（Rothman とKearns（１９６７），上記文献）。
【００１９】
４−チオウラシル発色団の光物理学研究は反応性状態としてπ，π* 三重項状態を包含する。項間交差量子収量は１又は１に近似する。４−チオウラシル置換核タンパク質複合体内の光架橋が観察されているが、励起４−チオウラシルと反応性であるアミノ酸残基はまだ同定されていない（Favre （１９９０），上記文献）。６−位置における励起４−チオウラシルへのリシンのα−アミノ基の付加が報告されている；しかし、α−アミノ基はペプチド結合に含まれるので、この反応が核タンパク質複合体内の光架橋に重要であるとは考えられない（Ito 等（１９８０），Photochem. Photobiol. ３２：６８３）。
【００２０】
会合タンパク質へのアジド含有ヌクレオチド又は核酸の光架橋は一重項及び／又は三重項ニトレンの形成を介して進行すると考えられる（BayleyとKnowles （１９７７），Methods Enzymol.  ４６：６９；Czarnecki 等（１９７９），Methods Enzymol.  ５６：６４２；Hanna 等（１９９３），Nucleic Acids Res.２１：２０７３）。共有結合形成はＯ−Ｈ、Ｎ−Ｈ又はＣ−Ｈ結合におけるニトレンの挿入から生ずる。一重項ニトレンは優先的にヘテロ原子−Ｈ結合に入り、三重項ニトレンはＣ−Ｈ結合に入る。一重項ニトレンは求核付加反応を受けやすいアジリンに転位することもできる。タンパク質の求核性部位が隣接する場合には、この経路を介して架橋が生ずることも可能である。アジド官能基が環窒素に対してオルトに存在する場合には、アジド官能基の使用によって可能な問題が生ずる；アジドは非常に低光反応性であるテトラゾールと平衡して存在する。
【００２１】
Ｒ１７バクテリオファージのコートタンパク質−ＲＮＡヘアピン複合体は、インビトロにおけるこの系の簡単さのために、核酸−タンパク質光架橋の研究のために理想的な系である。この系は充分に特徴づけられており、ファージゲノム内のＲＮＡヘアピンに高アフィニティで結合するウイルスコートタンパク質から成る。インビボにおいて、コートタンパク質とＲＮＡヘアピンとの相互作用はファージ感染中に２つの役割を果たす：コートタンパク質はレプリカーゼ合成の翻訳リプレッサーとして役立ち（EggensとNathans （１９６９），J. Mol. Biol. ３９：２９３）、この複合体はキャプシド封入(encapsidation) のための核形成部位としても役立つ（Ling等（１９７０）Virology  ４０：９２０；Beckett 等（１９８８），J. Mol. Biol. ２０４：９３９）。野生型ヘアピン配列の多くの変形も高アフィニティでコートタンパク質に結合する（Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：５０５；Gott等（１９９１），Biochemistry  ３０：６２９０；Schneider 等（１９９２），J. Mol. Biol. ２２８：８６２）。ＳＥＬＥＸ方法による核酸リガンドの選択は、例えば物理的特徴に基づくような、種々な方法で達成することができる。物理的特徴に基づく選択は物理的構造、電気泳動移動度、溶解度及び分割挙動（partitioning behavier ）を含むことができる。特に本明細書に引用により取込まれる、「構造に基づく核酸の選択方法」なる名称の米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願）は、特異的な電気泳動挙動に基づく核酸配列の選択を開示する。ＳＥＬＥＸ手法は、例えばＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、一般的なクロマトグラフィー方法、特定溶剤中の溶解度又は２相間の分割のような、他の選択方法と組合せて用いることもできる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、１実施態様において、標的分子に結合及び／又は光架橋するランダム化核酸配列の能力に基づいて、ランダム化核酸配列の候補混合物から核酸リガンドを選択し、同定する方法を含む。この実施態様は一般に共有ＳＥＬＥＸと呼ばれ、特に、核酸リガンドと標的との間に共有結合を形成するために照射が必要である場合には、光ＳＥＬＥＸと呼ばれる。
【００２３】
この実施態様の１変形では、この方法は光反応性基を含む核酸配列の候補混合物を調製し；候補混合物を標的分子と接触させて、標的分子に対して高いアフィニティを有する核酸配列を標的分子と結合させ、核酸−標的分子複合体を形成し；核酸−標的分子複合体を照射して、核酸−標的分子複合体に組み入れられた一部の核酸を光反応性官能基を介して標的分子に架橋させ；この共有結合を利用して、候補混合物中の遊離核酸から架橋核酸−標的分子複合体を分割し；標的分子に光架橋した核酸配列を同定することを含む。このプロセスは標的分子に光架橋した核酸を増幅して、標的分子に光架橋することができる配列に富化した核酸混合物を得る反復工程をさらに含むことができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明のこの実施態様の他の変形では、ＳＥＬＥＸによって選択した、標的分子に対する核酸リガンドを、標的に架橋するそれらの能力に関して、さらに選択する。光反応性基を含まない、標的分子に対する核酸リガンドを最初にＳＥＬＥＸ方法によって同定する。次に、これらの選択した核酸リガンドに光反応性基を組み入れて、リガンドを標的分子に接触させる。核酸−標的分子複合体を照射し、標的分子に光架橋することができる核酸を同定する。
【００２５】
本発明のこの実施態様の他の変形では、候補混合物の核酸配列におけるあらゆる可能な位置に光反応性基を組み入れる。例えば、５−ヨードウラシルと５−ヨードシトシンとを全てのウラシル位置とシトシン位置とに置換代入することができる。標的分子に光架橋することができるような核酸配列に関して選択が生ずるように、核酸−標的分子複合体の照射によって第１回選択ラウンドを実施する。次に、標的分子に光架橋することができる核酸配列によってＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に最良に結合することができる架橋配列を選択する。
【００２６】
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含む核酸配列を照射なしの数回のラウンドでＳＥＬＥＸによって選択して、標的分子に対して部分的に強化したアフィニティを有する候補混合物を得る。次に、光ＳＥＬＥＸを照射によって実施して、標的分子に光架橋することができるリガンドを選択する。
【００２７】
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含まない核酸配列によってＳＥＬＥＸを完成するまで実施して、標的分子に対する核酸リガンドを選択する。選択したリガンドの配列に基づいて、各ヌクレオチド位置に単一光反応性基を含む関連核酸配列のファミリーを形成する。光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
【００２８】
本発明のこの実施態様の他の変形では、標的分子への結合及び／又は架橋によって標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドをＳＥＬＥＸ、光ＳＥＬＥＸ、又はこれらの方法の組合せによって選択する。
【００２９】
本発明のこの実施態様の他の変形では、特定疾患の経過に関連した固有標的分子に対する核酸リガンドを同定する。本発明のこの実施態様のさらに他の変形では、疾患状態に関連した標的分子に対する核酸リガンドを用いて、インビボにおける疾患を治療する。
【００３０】
本発明はさらに、光反応性基を含む核酸配列を包含する。この核酸配列は単一又は多重の光反応性基を含むことができる。さらに、これらの光反応性基は単一核酸配列において同一でも異なるものでもよい。本発明の核酸中に組み入れられる光反応性基は、照射時に標的分子と架橋を形成することができる任意の化学基を含む。但し、場合によっては、架橋の生成のために照射が不要であることもある。
【００３１】
本発明の核酸は一本鎖及び二本鎖ＲＮＡと一本鎖及び二本鎖ＤＮＡとを含む。本発明の核酸は２’−アミノ（２’−ＮＨ２）又は２’−フロロ（２’−Ｆ）−修飾ヌクレオチドのような修飾基を含むことができる。本発明の核酸はさらにバックボーン修飾を含むことができる。
【００３２】
本発明はさらに、修飾核酸を含む候補混合物を調製し、ＳＥＬＥＸプロセスに用いて、標的種に結合又は架橋する核酸リガンドを同定する方法を含む。この実施態様の１実施例では、候補混合物は全てのウラシル残基が５−ハロゲン化ウラシル残基によって置換された核酸から構成され、選択された標的に共有結合を形成する核酸リガンドが同定される。
【００３３】
溶液ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本発明の付加的実施態様は、溶液中で、分割マトリックスを用いずに又は用いる前に達成される、高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体とを有するリガンドを分割する幾つかの改良方法を提供する。一般に、溶液ＳＥＬＥＸ方法の重要なテーマは、核酸候補混合物を溶液中で処理して、最高アフィニティ核酸リガンド又は触媒ＲＮＡのＰＣＲ中の優先的増幅を生じることである。溶液ＳＥＬＥＸ方法は下記方法を含めた、幾つかの方法を介して高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体との分割を達成する：（１）最高アフィニティリガンドがＰＣＲ中に選択的に増幅されるように、識別可能なｃＤＮＡ生成物を生じるプライマー伸長抑制。プライマー伸長抑制はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを含む核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素及びＱβ−レプリカーゼの使用によって達成される。（２）この場合も、ＰＣＲ中に最高アフィニティリガンド増幅のみを生じるエンドヌクレアーゼ加水分解抑制。これは任意の３’→５’二本鎖エキソヌクレアーゼの使用によって達成される。（３）ＰＣＲ中に最高アフィニティリガンドのみの増幅を生じる識別可能なｃＤＮＡ分子を得るための線状〜環状形成。
【００３４】
溶液ＳＥＬＥＸ方法の１実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに相当するｃＤＮＡ合成が優先的にブロックされ、ＰＣＲによる増幅が不能になる。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅の前にアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に除去する。或いは、高アフィニティオリゴヌクレオチドをアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に取り出すことができる。ＳＥＬＥＸ方法のさらに他の実施態様では、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを選択的にヌクレアーゼ酵素消化に耐性にする。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを選択的に酵素的又は化学的に分解可能にする。
【００３５】
溶液ＳＥＬＥＸは先行技術の分割スキームを凌駕する改良である。本発明の方法によると、分割マトリックスに対するアフィニティのみを有するリガンドを偶発的に選択することなく分割を達成し、分割の速度及び精度を増強し、この手順を容易に自動化することができる。
【００３６】
本発明の開示は本発明を具体化し、例示する非限定的実施例を提供する。標的分子への結合及び光架橋によって核酸リガンドを選択する他の分割スキーム及び方法は、本発明の開示から、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ方法の変形を含む。本出願は、初期ＳＥＬＥＸ特許出願に記載された定義、特に米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）及び第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）に記載された定義を含む明細書全体を引用によって個別的に取込んでいる。共有結合ＳＥＬＥＸ又は光ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本発明の１実施態様の方法は標的分子に結合及び／又は光架橋することができる核酸リガンドを同定し、選択する。
【００３８】
本出願はまた、ＳＥＬＥＸ方法によって同定される核酸リガンドの改良分割方法を提供する。
【００３９】
ＳＥＬＥＸ方法は、その最も基本的な形式で、次の一連の工程によって定義されることができる：
（１）異なる配列の核酸から成る候補混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列領域（すなわち、候補混合物の各要素が同じ位置に同じ配列を含む）とランダム化配列領域とを含む。固定配列領域は（ａ）下記増幅工程を容易にするように；（ｂ）標的に結合すると判明した配列を模倣するように；又は（ｃ）候補混合物中で核酸が所定の構造配置を占める可能性を強化するように選択される。ランダム化配列は全体的にランダム化することができる（すなわち、任意の位置に塩基を発見する確率は四分の一である）又は一部のみをランダム化することができる（例えば、任意の位置に塩基を発見する確率は０〜１００％の任意のレベルで選択することができる）。
（２）標的と候補混合物の要素との結合に有利な条件下で、候補混合物を特定標的と接触させる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸との相互作用が、標的と、標的に対して最強アフィニティを有する核酸との間に核酸−標的対を形成すると考えられる。
（３）標的に対して最高アフィニティを有する核酸を標的に対して最低アフィニティを有する核酸から分割する。最高アフィニティ核酸に対応するごく少数の配列（及び恐らくは１分子のみの核酸）が候補混合物中に存在するので、候補混合物中の有意な量（約５〜１０％）が分割中に保持されるように分割基準を設定することが一般に望ましい。
（４）次に、標的に対して比較的高いアフィニティを有するものとして分割中に選択される核酸を増幅して、標的に対して比較的高いアフィニティを有する核酸に富化した、新しい候補混合物を形成する。
（５）上記分割工程と増補工程とを繰り返すことによって、新たに形成される候補混合物はますます少ない非反復配列(unique sequence) を含むようになり、標的に対する核酸混合物の平均アフィニティ度は一般に上昇する。ＳＥＬＥＸプロセスは、その究極まで推し進めると、標的分子に対して最高アフィニティを有する、オリジナル候補混合物からの核酸である非反復核酸を１種類又は少ない種類含む候補混合物を生じることになる。
【００４０】
ＳＥＬＥＸ特許出願はこの方法を開示し、さらに非常に詳しく説明する。この方法に使用可能な標的；初期候補混合物の調製方法；候補混合物内の核酸の分割方法；及び分割済み核酸を増幅して、富化候補混合物を形成する方法が含まれる。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質である又は核酸結合タンパク質ではない、両方のタンパク質標的を含む、幾つかの標的種に対して得られたリガンド溶液を述べる。
【００４１】
分割は、標的分子に結合したリガンドを標的分子に結合しない核酸から分離することができる任意のプロセスを意味する。より大ざっぱに述べると、分割は候補混合物中のあらゆる核酸を、標的分子に対するそれらの相対的アフィニティに基づいて、少なくとも２つのプールに分離することを可能にする。当該技術分野に周知の種々な方法によって、分割を達成することができる。核酸−タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合することができるが、非結合核酸はこのフィルターに結合することができない。特異的に核酸−標的複合体を保持するカラムを分割に用いることができる。例えば、カラムに結合した標的分子に会合することができるオリゴヌクレオチドは、最高アフィニティ核酸リガンドを分離し、単離するためにカラムクロマトグラフィーの使用を可能にする。リガンド−リガンド分割は濾過ゲル遅延(filtration gel retardation)、及び密度勾配遠心分離と同様に用いることができる。
【００４２】
Ｉ．光ＳＥＬＥＸ
本発明は、標的分子を結合、光架橋及び／又は光不活化する核酸リガンドを包含する。本明細書に記載する結合とは、一般的に、リガンドと標的との間の共有結合形成を意味するが、このような結合は必ずしも不可逆的ではない。本発明のある一定の核酸リガンドは、光線による照射時に、標的分子に光架橋することができる光反応性基を含む。本発明の付加的な核酸リガンドは照射の不存在下でも標的との結合を形成することができる。
【００４３】
１実施態様では、本発明は一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドである核酸リガンドを包含する。本発明の核酸リガンドは、光線による照射時に、特定標的分子に架橋することができる光反応性基を含むことができる。さらに、本発明は核酸リガンドをその任意の修飾を含めて包含する。本明細書における光反応性基への言及は、核酸残基に大きな反応性又は光反応性を与える、天然核酸残基への比較的簡単な修飾を単純に意味する。このような修飾は、限定する訳ではなく、シトシン環外アミンにおける修飾、ハロゲン化基（例えば、５’−ブロモ−ウラシル若しくは５’−ヨード−ウラシル）による置換、２’−位置における修飾（例えば２’−アミノ（２’−ＮＨ２）又は２’−フルオロ（２’−Ｆ））、バックボーン修飾、メチル化、異常な塩基対組合せ等を含む。例えば、本発明の核酸リガンドは例えば２’−ＮＨ２−ヨードウラシル、２’−ＮＨ２−ヨードシトシン、２’−ＮＨ２−ヨードアデニン、２’−ＮＨ２−ブロモウラシル、２’−ＮＨ２−ブロモシトシン及び２’−ＮＨ２−ブロモアデニンのような修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００４４】
本発明の光ＳＥＬＥＸ方法の１実施態様では、候補混合物と呼ばれる、光反応性基を含む核酸配列のランダム化セットをある量の標的分子と混合して、標的分子との平衡結合を確立させる。この核酸−標的分子混合物に、光架橋がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証されるように完成するまで、光線を照射する。標的分子に緊密に結合する核酸の一部のみが標的と有効に架橋する。
【００４５】
本発明の候補混合物は１つ以上の化学的反応性基又は光反応性基を含むランダム化領域を有する核酸配列から成る。好ましくは反応性基は修飾核酸である。候補混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、有効な増幅のために必要な保存配列とを含む。可変な配列部分はランダム配列を完全に又は部分的に含むことができる；可変な配列部分はランダム化配列領域内に組み入れられた保存配列のサブポーションを含むこともできる。
【００４６】
好ましくは、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は少なくとも１つの化学的反応性基又は光反応性基を含む。さらに、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は、各位置において、反応性基を含む修飾ヌクレオチドによって部分的に又は完全に置換されることができる。候補混合物は１種類を越える反応性基を含むオリゴヌクレオチドから構成することもできる。
【００４７】
本発明の核酸リガンドによって結合及び／又は光架橋される標的分子は一般にタンパク質であり、疾患及び／又は中毒におけるそれらの役割に基づいて選択される。例は、それらに対して阻害剤が好ましい酵素又はそれらの検出が望ましいタンパク質である。しかし、標的分子は、それらに対してリガンドが望ましい任意の重要な化合物であることができる。標的分子は、限定する訳ではなく、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子等であることができる。
【００４８】
本出願の目的のための光反応性基は好ましくは、光発色団を含み、標的種と光架橋することができる修飾ヌクレオチドである。本明細書において以下に述べる幾つかの場合に光反応性基を挙げるとしても、核酸リガンドと標的との間に共有結合が生ずるために照射は必ずしも必要ではない。光反応性基は選択的に、標的又はオリゴヌクレオチドの非修飾部分によって吸収されない波長のスペクトルの光線を吸収する。本発明は、限定する訳ではなく、下記要素：５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）、５−ヨードウラシル（ＩＵ）、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラニル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、８−ブロモデオキシウリジン、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシシトシン、５−〔（４−アジドフェナシル）チオ〕シトシン、５−〔（４−アジドフェナシル）チオ〕ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン及び７−デアザ−７−ブロモグアニンから選択される光反応性基を含むオリゴヌクレオチドを包含する（図５）。１実施態様では、光反応性基は５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）と５−ヨードウラシル（ＩＵ）である。
【００４９】
本発明の光反応性基は会合核酸−標的対の照射時に標的種と結合を形成することができる。この会合対を本明細書では核タンパク質複合体と呼び、場合によっては、結合形成が生ずるために照射は必要ではない。典型的に生ずる光架橋は会合核酸と標的との間の共有結合の形成である。しかし、核酸と標的との間の緊密なイオン相互作用も照射時に生ずると考えられる。
【００５０】
１実施態様では、電磁線照射によって光架橋が生ずる。電磁線照射は紫外光線、可視光線、Ｘ線及びガンマー線を含む。５−ハロ置換デオキシウラシル及びデオキシシトシンは電離線に細胞を感作させることが知られる（Szybalski （１９７４），Cancer Chemother. Rep.  ５８：５３９）。
【００５１】
架橋実験は、ＩＵ又はＢｒＵのいずれかと、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンとが正確に並列することが高収量架橋が生ずるために必要であることを示している。本発明は、ランダムに組み入れられた光反応性基を有する分子を架橋する選択に関して、この発見を利用する。本発明の１実施態様では、光反応性基５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）又は５−ヨードウラシル（ＩＵ）を、ウリジントリホスフェートの代わりに存在する５−ハロウリジントリホスフェートと共にＴ７ポリメラーゼによって、ＲＮＡ中に組み入れる。５−ハロウリジントリホスフェートとウリジントリホスフェートとの混合物又は全ての５−ハロウリジントリホスフェートを用いることによって、組み入れ(incorporation) が達成される。３２Ｐ若しくは３３Ｐ標識ＲＮＡ又は非標識ＲＮＡ配列のランダム化セットは、標準方法を用いて合成される、ＤＮＡ鋳型のランダム化セットから得られる。
【００５２】
ＢｒＵ又はＩＵを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドのランダム化セットにある量の標的分子を混合する。光反応性発色団は、ウラシルの代わりにＢｒＵ又はＩＵとして、標準方法を用いてＲＮＡ中にランダムに組み入れる。このＲＮＡ−標的タンパク質混合物に３００〜３２５nmの範囲内の近紫外光線を、光架橋が完成するまで、照射する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基のみがタンパク質への共有結合を形成する。励起ＢｒＵ又はＩＵは、例えば酸化可能なアミノ酸残基のような反応性官能基の近くに存在しないかぎり、基底状態に戻る。５−ブロモウラシルの最低三重項状態と反応性であると確認されているアミノ酸残基には、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンを含む（図３）。機構的研究に基づいて可能な反応性を有する他の残基はフェニルアラニン、メチオニン、システイン、リシン及びアルギニンである。
【００５３】
架橋を形成しない核タンパク質複合体は、例えば熱及び／又は塩を用いる変性によるような、反応性媒質の調節によって容易に破壊されうる。タンパク質に共有結合した核酸はニトロセルロースフィルター上で、又は当業者に周知の他の分割方法によって遊離核酸から分離することができる。標的に共有結合した核酸を遊離核酸から分離するための代替方法には、ゲル電気泳動とその後の電気溶離(electroelution)、沈殿、示差溶解(differential solubility）、及びクロマトグラフィーがある。当業者にとって、選択すべき方法は少なくとも部分的に問題の標的分子に依存する。架橋した核酸は、例えばプロテイナーゼＫのような酵素によるタンパク質物質の消化によって、ニトロセルロースフィルターから放出される。この時点において、標的タンパク質に光架橋した５−ハロウラシル基は単一アミノ酸又は短ペプチドに結合する。逆転写酵素の読み取り能力（read−through ability)はウラシルの５−位置における置換基の組み入れによって影響されない、この理由は逆転写酵素（ＲＴ）がウラシルの５−位置をチミンの５−位置から識別しないからである。ビオチンほど大きい基をＲＮＡ分子中に組み入れるために、５−位置の誘導体化が利用されている。本発明の１実施態様では、標的を選択された光架橋した核酸から光解離又は化学的解離によって除去する。
【００５４】
特定ＲＮＡ配列の相補的核酸コピーを適当なプライマーによって製造する。ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼと第２プライマーとによって増幅する。ＤＮＡ合成工程及び増幅工程には、５−ハロ−２’−デオキシウラシルは用いられない。次に、候補混合物中の５−ハロウリジン対ウリジンと同じ比又は異なる比でウリジントリホスフェートの代わりに５−ハロウリジントリホスフェートを用いて、増幅済みＤＮＡをＲＮＡ配列中に転写する。
【００５５】
その後の光ＳＥＬＥＸラウンドでは、部分的に選択したＲＮＡ配列を再びある量の標的タンパク質と複合体化させる。続いて、核タンパク質複合体に３００〜３２５nmの領域において照射する。タンパク質に光架橋したＲＮＡ配列を再び、架橋していないＲＮＡ配列から分離する。ｃＤＮＡを調製し、増幅し、５−ハロウラシルを含むＲＮＡ配列の第３セットを調製する。標的タンパク質に高アフィニティで結合し、光架橋するＲＮＡリガンドが１種又は数種に収束するまで、このサイクルを続ける。後のサイクルにおける照射時間の短縮はさらに選択を強化することができる。特定ＲＮＡリガンドのｃＤＮＡを増幅し、ゲル精製し、配列決定する。或いは、ＲＮＡ配列を直接、配列決定することができる。次に、ウリジントリホスフェートの代わりに５−ハロウリジントリホスフェートを再び用いて、特定ＲＮＡ配列を適当な合成ＤＮＡ鋳型から転写する（実施例１１）。
【００５６】
本発明の他の実施態様では、それらの標的分子結合能力に関して予め選択したオリゴヌクレオチド配列に対して光ＳＥＬＥＸを実施する（実施例１２）。最初に、光反応性基を含まないオリゴヌクレオチドによってＳＥＬＥＸを実施する。リガンド中の特異的部位における光反応性核酸ヌクレオチドの置換によって、ＲＮＡリガンドを光反応性リガンドに転換する。初期リガンドの光化学活性な置換を幾つかのアプローチ（例えば、光反応性ヌクレオチドの特異的置換又は部分的なランダム取り込み）によって展開させることができる。特異的置換は光反応性オリゴヌクレオチドの位置をマニュアルで変化させる種々なオリゴヌクレオチドの合成に関係する。置換の位置は標的分子へのリガンドの結合に関する入手可能なデータに基づいて指示される。例えば、標的分子と相互作用すると知られる、分子の部分における初期リガンドに置換を実施する。その後の選択ラウンドでは、照射時の標的分子架橋能力に関して選択するために、光ＳＥＬＥＸを用いる。
【００５７】
本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸとその後のＳＥＬＥＸとによって核酸リガンドを選択する。光ＳＥＬＥＸは光反応性基を含むオリゴヌクレオチド配列によって最初に実施する。それらの標的分子架橋能力に関して選択した配列を次に標的分子結合能力に関してＳＥＬＥＸ方法に関して選択する（実施例１３）。
【００５８】
本発明の他の実施態様では、ＳＥＬＥＸによるオリゴヌクレオチドの限定選択に続いて、光ＳＥＬＥＸによって核酸リガンドを選択する（実施例１４）。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドによって初期ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを実施する。数回のＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に結合することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
【００５９】
本発明のさらに他の実施態様では、ＳＥＬＥＸによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化と、その後の光ＳＥＬＥＸによる選択とを実施する（実施例１５）。ＳＥＬＥＸを最初に、光反応性基を含まない核酸配列によって完成するまで実施する。この核酸リガンドの配列を用いて、限定ランダム化を介してオリゴヌクレオチドファミリーを形成する。その後に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
【００６０】
本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸを用いて、標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドを同定する（実施例１６）。
【００６１】
本発明のさらに他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸを診断的に適用して、特定の疾患状態に関連した固有(unique)タンパク質を同定する（実施例１７）。本発明のさらに他の実施態様では、特定の疾患状態に関連した標的分子を架橋することができる核酸リガンドをインビボで用いて、疾患状態を治療する方法として標的分子に架橋させる（実施例１８と１９）。
【００６２】
本発明の１実施態様では、光ＳＥＬＥＸによって同定されるＲＮＡリガンドを用いて、タンパク質に結合させ、次にタンパク質に光架橋させることによって、そのタンパク質の存在を検出する。この検出は、３２Ｐ又は３３Ｐ標識を組み入れて、ニトロセルロースフィルターによって保持される物質をシンチレーション計測によって検出するか、又は電気泳動ゲル上で正確に移動する物質を写真フィルムを用いて検出することによって、達成することができる。或いは、光ＳＥＬＥＸは蛍光発光分光法によって検出される蛍光発色団を生成する。モデルペプチドに対する５−ブロモウラシルの反応の生成物（図３に示す）に関する蛍光発光は、Dietz とKoch（１９８７）（上記文献）によって報告されている。本発明の他の実施態様では、蛍光標識をＲＮＡに共有結合させて、蛍光発光分光法によって検出する。本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸによって選択されるＲＮＡリガンドを用いて、標的タンパク質を同じプロセスによって阻害する。さらに他の実施態様では、光選択した(photoselected) リガンドを担体に結合させ、これを用いて、標的を共有結合的に捕捉する。
【００６３】
本発明の１実施態様では、５−ヨードウラシルを候補混合物のＲＮＡ配列に組み入れ、３２０〜３２５nmの範囲内の光線を用いて照射する。この組合せは、他の非特異的な光反応なしに、標的タンパク質への５−ハロウラシル発色団の領域選択性光架橋を保証する。特に、タンパク質のトリプトファン残基と、核酸のチミン塩基及びウラシル塩基とは光反応性であると知られている。図４に示すように、５−ヨードウラシルは３２５nmにおいて吸光するが、トリプトファンと標準核酸塩基とは吸光しない。３２５nmにおける５−ヨードウラシルのモル吸光係数は１６３Ｌ／mol ・cmである。３２０nmにおいて発光する周波数倍加チューナブル色素レーザー又は３２５nmにおいて発光するヘリウムカドミウムレーザーによって、３２０〜３２５nmの領域における単色光を供給することが好ましい。
【００６４】
本発明の１実施態様では、標的タンパク質に対する５−ヨードウラシル含有ＲＮＡ配列の光架橋のために３０８nmにおいて発光する塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマーレーザーを用いる。このレーザーによって、核タンパク質複合体の高収量の光架橋が数分間の照射時間内に達成される。
【００６５】
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対する５−ヨードウラシル含有ＲＮＡ配列の光架橋が、波長濾過３１３nm高圧水銀灯発光によって又は２５４nmにおいてはリンによって吸収され、３００〜３２５nmの領域において再発光する低圧水銀灯発光によって達成される。後者の発光をまた、細心に波長濾過して、リンによって吸収されない２５４nm光線と、タンパク質を損傷する可能性がある２９０〜３０５nm領域の光線とを除去する。
【００６６】
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対するＢｒＵ−又はＩＵ−含有ＲＮＡ配列の光架橋が、基底状態から三重項状態を直接に占める３５０〜４００nmの領域内の光線によって達成される。３５５nmにおけるネオジミウムＹＡＧレーザーの第３次高調波から又は３５１nmにおけるフッ化キセノン（ＸｅＦ）エキシマーレーザーからの第１次高調波からの単色光線が、これに関して、特に有用である。
【００６７】
本発明のさらに他の実施態様では、光反応性ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡに組み入れて、光反応性ヌクレオチドトリホスフェートを用いて又は用いずに、直接増幅する。
【００６８】
Ａ．共有結合ＳＥＬＥＸと、照射によって又は照射なしでＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に結合する核酸リガンド
光ＳＥＬＥＸを説明するために選択した標的タンパク質はＨＩＶ−１からのＲｅｖである。インビボにおけるＲｅｖの活性はＲｅｖ反応性要素（ＲＲＥ）（ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの高度構造化領域）との会合に起因する。Ｒｅｖの予備ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ実験は非常に高いアフィニティのＲＮＡリガンドの単離を可能にした。“６ａ”として知られる最高アフィニティリガンド（配列番号：５）は約１nMのＫｄを有する、これは図１６に示す。６ａの二次構造と、Ｒｅｖとのその相互作用とは充分に特徴づけられている。
【００６９】
光ＳＥＬＥＸのための核酸ライブラリーの構成はＲｅｖ６ａ配列（配列番号：５）に基づくものであった。ＳＥＬＥＸのためのデオキシオリゴヌクレオチド鋳型の合成中に、鋳型のランダム領域を、４投入(input) 塩基の比が６ａ配列中の対応塩基を支持するようにバイアスされる“バイアスランダム化”領域によって置換した（実際の比は６２．５：１２．５：１２．５：１２．５であった）。例えば、特定の位置の６ａ塩基がＧである場合には、この合成工程の塩基投入混合物はＧ６２．５％、他の３種の塩基の１２．５％である。
【００７０】
単置換ｉＵ核酸とタンパク質標的との間の高収量の領域特異的架橋の形成に用いられている光反応性ウラシル類似体５−ヨードウラシル（ｉＵ）（Willis等（１９９３），Science ２６２：１２５５）をこの実施例のために用いた。ｉＵ発色団は長波長紫外光線下で反応性であり、５−ブロモウラシルと同じ機構によって芳香族アミノ酸に光結合することができる（Dietz 等（１９８７），J. Am.Chem. Soc.１０９：１７９３）。上述したように、この研究のための標的はＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質であり、これはウイルスの生産性感染(productive infection)のために（Feinberg等（１９８６）Cell  ４６：８０７）及びウイルス構造遺伝子ｇａｇ，ｐｏｌとｅｎｖの発現のために（Emerman 等（１９８９），Cell  ５７：１１５５）必要である。Ｒｅｖと高アフィニティＲＮＡリガンドとの相互作用は充分に特徴づけられている。ＲＲＥ内の単一高アフィニティ部位(ＩＩＢステム)は同定されている（Heaphy等(１９９１),Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ８８：７３６６）。インビトロの遺伝的選択実験は、Ｒｅｖに高アフィニティで結合するＲＮＡリガンドを形成して、Ｒｅｖ：ＲＮＡ相互作用のために必要なＲＮＡ構造要素の決定を容易にしている（Bartel等（１９９１），Cell６７：５２９；Tuerk 等，In the Polymerase Chain Reaction（１９９３）；Jansen等（１９９４），J. Mol. Biol. ２３５：２３７）。
【００７１】
高アフィニティＲｅｖリガンド配列６ａ（配列番号：５）に基づく、“バイアスランダム化”ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーは約１０１４の非反復配列を含む。この鋳型を５−ｉＵＴＰによるインビトロＴ７転写に用いて、選択のための全置換ｉＵ  ＲＮＡを形成した。光ＳＥＬＥＸ手順はニトロセルロース分割を用いるＲｅｖのアフィニティ選択と、非架橋ＲＮＡ配列から架橋済み複合体を変性ポリアクリルアミドゲル分割する、核タンパク質複合体の単色ＵＶ照射とを交互に行った。最終操作は、競合体ｔＲＮＡを用いて、アフィニティと架橋とに関する同時選択を利用した。各ラウンドは選択と、その後の回収ＲＮＡからｃＤＮＡへの転化と、ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、ｉＵ−ＲＮＡの新たなプールを得るためのインビトロ転写を構成する。共有結合核タンパク質複合体として回収されたＲＮＡを増幅するために、適当なゲルスライスを単離し、プロテイナーゼＫ処理した。
【００７２】
ＲＮＡプールに対して最初にＲｅｖタンパク質による３ラウンドのアフィニティ選択を実施し、高アフィニティ配列をニトロセルロースフィルターによって分離した。次に、進化ＲＮＡプールに対して、過剰なＲｅｖタンパク質の存在下でＵＶレーザー照射を実施して、タンパク質架橋能力を有するＲＮＡ配列にタンパク質架橋させた。次に、架橋したＲＮＡ配列をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分割した。これらの架橋したＲＮＡをゲル物質から回収し、結合したＲｅｖタンパク質を消化させ、このＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いて、光ＳＥＬＥＸの次のラウンドでさらに増幅した。光架橋の第１ラウンドには、３０８nmＸｅＣｌエキシマーレーザーを用いた；その後に、３２５nmＨｅＣｄレーザーを用いた。
【００７３】
レーザー誘導架橋に対する４回選択ラウンド後に、ＲＮＡプールを再びアフィニティ選択の３ラウンドに通した。最後に、ＲＮＡプールを高アフィニティでのそのＲｅｖ結合能力と、このタンパク質架橋能力とに関して同時に選択した。これは光架橋反応において高濃度の非特異的核酸競合体を用いることによって達成された。
【００７４】
架橋した生成物は第１３回ラウンドまでに出発プールから約３０倍に増加した（図１５）。これらの条件下で、架橋の最大の増加はアフィニティの最大増強と相関する（第７ラウンドから第１０ラウンドまで）。
選択の１３ラウンド後に、ＰＣＲ生成物をクローン化し、５２種の単離物を配列決定した（図１６、配列番号：５〜５５）。全配列の７７％を占めるクラス１分子は非常に高度に保存されたモチーフ（５’ＫＤＡＡＣＡＮ・・・Ｎ’ＵＧＵＵＨ’Ｍ’３’）（配列番号：５６）を含む（図１７）。コンピュータ折り畳みアルゴリズム(computer folding algorithm)の予測によれば、この保存モチーフは塩基対から成り、ステム−ループ構造中に存在する。サブクラスａ〜ｄ（図１６、配列番号：５〜４３）は共通モチーフを得るために“バイアスランダム化”プールに用いた種々な手法を説明する。クラス２分子は非常に高度に保存された１０塩基配列（図１７，配列番号５７）を含み、この配列はＲＮＡの５’固定領域と折り重なって、クラス１又は６ａ（配列番号：５）モチーフとは異なる構造を形成すると予測される。全てのクラス１配列は、１〜１０nMの範囲の高アフィニティ解離定数（Ｋｄ）によって、Ｒｅｖへの二相結合を示す。クラス２配列は、３０〜５０nMのＫｄによって、Ｒｅｖへの一相結合を示す。ラウンド１３配列の分析は、クラス１群とクラス２群との共通モチーフの頻度が出発プールでは非常に小さく、幾つかの個別配列が光ＳＥＬＥＸ操作の突然変異的圧力によってのみ生じることを明らかにする。
【００７５】
架橋挙動は２クラスの間では異なる。高いＲｅｖ濃度（５００nM）と４分間の３２５nm照射下では、クラス２分子はクラス１分子よりも大きい架橋収量と効率を生じる（データは示さず）；恐らく、この挙動はＲｅｖに対して比較的低いアフィニティを有するクラス２分子を光ＳＥＬＥＸ操作下で競合させると考えられる。クラス１分子に関しては、長い照射時間が高分子量架橋種を生じると思われる。理論によって縛られる訳ではないが、Ｒｅｖに対する進化結合ドメインとＳＥＬＥＸにおける増幅のために必要な固定領域との両方を含むＲＮＡがＲＮＡ１分子につき１分子より多いＲｅｖを結合させることができると提案される。各ＲＮＡは平均して２１個のｉＵ塩基を含む（ＲＮＡ長さ−８６塩基）ので、高いタンパク質濃度において１分子より多いＲｅｖへの単一ＲＮＡの架橋を可能にする、光架橋のある種の混乱(promiscuity) が存在することが考えられる。クラス２分子は光架橋時に高分子量種をあまり生じない；これらは平均してｉＵをあまり含まず、付加的なＲｅｖ分子への架橋及び／又は光架橋を可能にしない構造を含むと考えられる。
【００７６】
ラウンド１３ＲＮＡの分析は、亜群(subpopulation) がレーザー照射なしにＲｅｖに架橋することができることを明らかにする。したがって、この単一実験セットは、照射なしの共有結合ＳＥＬＥＸと照射を用いる光ＳＥＬＥＸとの両方が同じ系において見い出されうることを実証した。分析したラウンド１３配列１５種の中の４配列はレーザー照射なしで架橋する（図１６）。これらの少ない配列から、レーザー独立性架橋を与える配列モチーフを同定することは容易に可能ではなかったが、全ての配列は今のところ１ａサブクラスに属すると見なされた。
【００７７】
レーザー依存性及びレーザー独立性架橋（それぞれ、ＬＤ−ＸＬ及びＬＩ−ＸＬ）をさらに研究して、全長クラス１分子と共に形成された第２照射生成物を回避するために、進化した配列のみを含む幾つかの小ＲＮＡを構成した。Trunc ２及びTrunc ２４（図１８及び１９）（配列番号：５８及び５９）は、それぞれ、クローン＃３と＃２４に基づき、０．５nM（trunc ２）及び２０nM（trunc ２４）のＫｄによってＲｅｖへの一相結合を示す。Trunc ２（図１８）はＬｄ−ＸＬ挙動を示し、Trunc ２４（図１９）はＬＩ−ＸＬとＬＤ−ＸＬの両方が可能である。
【００７８】
ＬＤ−ＸＬとＬＩ−ＸＬに関するコンホメーションと化学的必要条件とを調べるために、Trunc ２（配列番号：５８）及びTrunc ２４（配列番号：５９）と、幾つかのアルギニン富化モチーフ（ＡＲＭ）タンパク質とによって架橋反応を実施した。ＲＮＡ結合タンパク質のクラスは標的タンパク質、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ、並びにＨＩＶ−１  Ｔａｔ及び非常に類似したＨＩＶ−２  Ｒｅｖをも含む。trunc ２（図１８、配列番号：５８）とのＬＤ−ＸＬ反応は、trunc ２がＨＩＶ−１とＨＩＶ−２  Ｒｅｖタンパク質の両方に特異的に結合することができるが、ＨＩＶ−１  Ｔａｔには結合しないことを示す。僅かに異なる、２種類の移動核タンパク質複合体(migrating nucleoprotein complex) はtrunc ２が２個のｉＵヌクレオチドの１個を用いて、Ｒｅｖタンパク質に架橋する能力を表すと思われる。理論によって縛られる訳ではないが、両Ｒｅｖタンパク質の非常に類似したＡＲＭ中に存在するトリプトファン残基が本発明の高アフィニティＲＮＡリガンドの特異的光架橋のために必要なアミノ酸であることが提案される。
【００７９】
同じタンパク質によって実施したtrunc ２４  ＬＩ−ＸＬ（図１９、配列番号：５９）は、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖに対してのみの架橋を示す。trunc ３と同様にtrunc ２４もＨＩＶ−２  Ｒｅｖに光架橋することができる（データは図示せず）。このＬＩ−架橋が高度の変性条件下では、又は高濃度の核酸競合体によって可逆的であることも観察された。理論によって縛られる訳ではないが、これらの観察から、ＬＩ−ＸＬがＩＵの６位置とシステイン残基との間のMichael アダクツによって進行する、又は５位置置換反応が可能であることが仮定される。この仮定は、ｉＵがＵよりも容易にMichael アダクツを形成するという観察と、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖが３個のシステインを含むが、ＨＩＶ−２  Ｒｅｖはシステインを全く含まないという事実との両方に一致する。trunc ２４（配列番号：５９）とヒト繊維芽細胞核抽出物（１０μｇ）を、漸減する量のＨＩＶ−１  Ｒｅｖと共に含む複雑な混合物中でのtrunc ２４のＨＩＶ−１  Ｒｅｖ識別能力を試験する（図２０）。５０nMＲｅｖと、１：１００の重量比のＲｅｖ：核抽出物とにおいて、trunc ２４とＲｅｖとの間に非常に有意な架橋生成物を見ることが可能であった。核抽出物とtrunc ２４のみでは架橋生成物を生じなかった。
【００８０】
実施例１は、それぞれ、５−ブロモウリジントリホスフェート、５−ヨードウリジントリホスフェート及びウリジントリホスフェートを用いた、ヘアピンＲＮＡオリゴヌクレオチドＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の合成を説明する。バクテリオファージＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）に関するＲＮＡタンパク質結合曲線を決定する実験を実施例２において説明する。実施例３はＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡオリゴヌクレオチドの光架橋を述べる。３０８nmにおける塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマーレーザーによる照射後にＲＮＡ−１（配列番号：１）によって光架橋したＲ１７コートタンパク質のアミノ酸残基は実施例４において説明する。実施例５は３２５nmにおける単色発光によるＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−２（配列番号：２）の光架橋を述べる。実施例６はトランスイルミネーターによる広帯域発光照射後に得られるＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）とＲＮＡ−２（配列番号：２）との光架橋を説明する。実施例７は会合タンパク質への５−ブロモウラシル置換核酸によって達成された光架橋と同様な光架橋を生じるように思われる、５−ヨードウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとの光反応を述べる。Ｒ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製は実施例８に述べる。実施例９はＲ１７コートタンパク質へのＩＣ置換ＲＮＡリガンドの光架橋を説明する。
【００８１】
実施例１０はＤＮＡ中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れを説明する。実施例１１〜１５は特異的光反応性核酸リガンドの製造に用いられる光ＳＥＬＥＸプロトコールを説明する。実施例１１は連続的光ＳＥＬＥＸ方法を述べる。実施例１２は、ＳＥＬＥＸによって最初に選択した核酸リガンドを続いて、標的分子架橋能力に関して光ＳＥＬＥＸによって選択する方法を述べる。実施例１３は、光ＳＥＬＥＸによって同定した核酸リガンドに対して、次に、ＳＥＬＥＸによる選択を実施して、これらの核酸リガンドを標的分子結合能力に関して選択する。実施例１４は、限定ＳＥＬＥＸ選択を実施した後に、光ＳＥＬＥＸによる選択を実施する他の実施態様を説明する。実施例１５は、ＳＥＬＥＸによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化を実施し、その後に光ＳＥＬＥＸによる選択を実施する、本発明の実施態様を説明する。実施例１６は標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドの選択方法を説明する。実施例１７は、ＳＥＬＥＸ方法と光ＳＥＬＥＸ方法とを用いて、特定疾患の経過に関連したタンパク質を同定する診断手順を説明する。
【００８２】
実施例１８は光ＳＥＬＥＸによる疾患のインビボ治療方法を説明する。疾患状態に関連した標的分子に結合及び架橋することができるように光ＳＥＬＥＸ選択した核酸リガンドを当該技術分野に周知の幾つかの方法によって患者に導入する。例えば、光ＳＥＬＥＸリガンドは疾患を有する患者の適当な細胞に一時的に又は本質的に発現されることができる。或いは、光ＳＥＬＥＸリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖ＤＮＡとして患者の細胞に取り入れることができる。ヨウ素化シトシンを患者に投与した後に、Ｘ線を照射することができる。適当な細胞中で合成される核酸リガンド中に導入されるＩＣはリガンドを標的分子に架橋させて、標的分子を不活化させる。光ＳＥＬＥＸリガンドを患者中に導入する他の方法は、ハロゲン化リガンドの患者の細胞中へのリポソーム投与を含む。
【００８３】
実施例２０は、照射によって又は照射なしで、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に架橋する修飾核酸リガンドの製造を説明する。図１５は種々な選択ラウンドにおけるバルク候補混合物への架橋の結果を示す。ｒＤ１−ラウンド  １プールＲＮＡ；ｒＤ７−ラウンド７  プールＲＮＡ；ｒＤ１０−ラウンド  １０プールＲＮＡ；ｒＤ１３−ラウンド  １３プールＲＮＡ；ｒＤ１３／ＰＫ，光架橋ラウンド１３プールＲＮＡプロテイナーゼＫ処理（１００μｌ反応の中の３５μｌを０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテイナーゼＫ及び１mM  ＥＤＴＡ中で６５℃において１時間インキュベートした）；ｒＤ１３／無ｉＵ−ラウンド１３プールＲＮＡ  ＵＴＰ（ｉＵなし）による転写。Ｒ−遊離ＲＮＡ；ＸＬ−架橋核タンパク質複合体。
【００８４】
図１６は、１３ラウンドのＳＥＬＥＸ後に配列決定した配列を示す（配列番号：５〜５５）。配列を６ａ配列に対して最大相同を示すように整列させる。下線はコンピューターＲＮＡ折り畳みアルゴリズムによって提起される可能な塩基対合を表す。ダッシュ下線は６ａリガンド“バブル”モチーフを表す。下線によってフランクされる配列はループ領域又はバルジ領域のいずれかを表す。ダッシュは６ａとの整列(alignment) を最大にするように配置する。* は２単離物が得られたことを意味する。＋はレーザー独立性架橋を意味し、−はＨＩＶ−１Ｒｅｖに対するレーザー独立性架橋の欠損を意味する。図１７（配列番号：５６〜５７）はクラス１リガンドとクラス２リガンドとの共通配列を示す。図１８と１９はTrunc ２（配列番号：５８）及びTrunc ２４（配列番号：５９）の配列と特異性結果とを示す。５００nM  タンパク質と、ｔＲＮＡ  ２０μｇと、約１nMのキナーゼ処理trunc ２  ＲＮＡとを３７℃において１０分間インキュベートし、３２５nmにおいて４分間照射した。ｔ２−trunc ２  ＲＮＡ  タンパク質を添加せずに照射；ｔ２Ｒｅｖ１／０’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質及び照射０分間；ｔ２Ｒｅｖ１／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質及び照射４分間；ｔ２／Ｒｅｖ１／４’／ＰＫ−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質、照射４分間及び図１におけるようなプロキナーゼＫ処理；ｔ２／Ｒｅｖ２／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−２  Ｒｅｖタンパク質、及び照射４分間；ｔ２／Ｔａｔ／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、及び照射４分間。Ｒ−遊離ＲＮＡ；ＸＬ−架橋核タンパク質複合体。図２０はヒト核抽出物の存在下でのＨＩＶ−１  Ｒｅｖとのtrunc ２４光独立性架橋を示す。
【００８５】
II．溶液ＳＥＬＥＸ．
本発明のこの実施態様は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとを分割する幾つかの改良方法を提供する。本発明の方法は先行技術の分割方法を凌駕する幾つかの利点を有する：（１）この方法は、分割マトリックスに対する核酸リガンドを単離することなく、標的に対する核酸リガンドの単離を可能にする；（２）オリゴヌクレオチド候補混合物をスクリーニングする速度と精度とを高める；及び（３）溶液ＳＥＬＥＸ操作を単一試験管中で実施することができ、それによって分割工程を自動化することができる。
【００８６】
本発明の方法によって必要とされる材料及び方法は一般に、分子生物学実験室で用いられている。これらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＮＡ又はＤＮＡ転写、第２鎖ＤＮＡ合成、及びヌクレアーゼ消化を含む。実際に、これらの方法は図２１に図示するようにサイクル式に相互に関係する。
【００８７】
Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：１１５５によって開示され、図２１に示されるＳＥＬＥＸ方法では、一本鎖核酸候補混合物を核酸合成装置において確立された手順を用いて形成し、ｄＮＴＰ及びKlenowフラグメントと共にインキュベートして、二本鎖ＤＮＡ鋳型の群を形成した。これらの二本鎖ＤＮＡと、これらから転写されたＲＮＡとを精製して、標的分子と接触させる。標的分子に対して強化されたアフィニティを有するＲＮＡ配列が核酸−標的複合体を形成する。この後に結合核酸と非結合核酸とを分割し、標的分子を結合核酸から分離する。ｃＤＮＡを強化アフィニティ核酸から合成し、ＰＣＲ増幅によって二本鎖ＤＮＡを形成する。候補混合物のコンプレキシティ(complexity)が減少し、標的に対するそのアフィニティ及び特異性が最大になるまで、このサイクルを繰り返す。
【００８８】
溶液ＳＥＬＥＸ方法の新規な特徴は、核酸候補混合物の結合要素と遊離要素とを分割する手段である。本発明の方法の１実施態様では、２つの物理的に異なるｃＤＮＡプールの形成がプライマー伸長抑制の使用によって達成される。上記工程２と３の間で基本的ＳＥＬＥＸプロトコールに１つのｃＤＮＡ伸長工程を加え、２つの物理的に異なるｃＤＮＡプール・・・１つは標的に対して高アフィニティを有し、１つは標的に対して低アフィニティを有する・・・の形成を可能にし、これらのプールは相互から容易に区別され、分離される。プライマー伸長抑制分析は核酸に複合体化した部位結合タンパク質を試験するための一般的な方法であり（Hartz 等（１９８８）、Methods Enzymol.  １６４：４１９）、高アフィニティ複合体のｃＤＮＡ合成抑制能力に基づく。プライマー伸長抑制によって研究されるタンパク質−核酸相互作用の例はｍＲＮＡリボソーム結合部位に対するリボソーム結合（Hartz 等（１９８８），Meth. Enzym.  １６４：４１９）並びに非反復大腸菌翻訳因子（ＳＥＬＢタンパク質）のｍＲＮＡセレノシステイン挿入配列への結合（Baron 等（１９９３），Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ９０：４１８１）を含む。
【００８９】
溶液ＳＥＬＥＸスキームの１実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長は鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートの存在下で実施する。これらの条件下で、標的と迅速に解離する複合体を形成する、標的に対して低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドを、伸長不能なヌクレオチドによって終結した３’−末端を有する切頭ｃＤＮＡに転化させる。切頭ｃＤＮＡ鎖はＰＣＲプライマーにアニールすることができず、それ故、増殖不能である。これに反して、高アフィニティオリゴヌクレオチドと標的分子との間に形成される緊密な複合体は、緩慢な解離速度を特徴とし、ｃＤＮＡ伸長を抑制する。緊密に結合した標的分子によってｃＤＮＡ合成がブロックされるので、高アフィニティオリゴヌクレオチドから合成された新生(nascent) ｃＤＮＡ鎖に連鎖ターミネーターを組み入れない。標的と連鎖ターミネーターとが系から除去された、第２ラウンドのｃＤＮＡ伸長中に高アフィニティ複合体からの全長ｃＤＮＡが得られる。したがって、低アフィニティ複合体をプライマーアニーリング部位を欠いた切頭ｃＤＮＡに転化し、緊密な複合体は全長ｃＤＮＡに転化し、ＰＣＲによって増幅される（図２２）。この方法の厳しさは連鎖ターミネーター及びｄＮＴＰのモル比を変えることによって又は、プライマー伸長抑制はポリメラーゼ濃度に敏感であるので、ポリメラーゼの濃度を変えることによって、容易に調節される（Ringguist 等（１９９３），Biochemistry印刷中）。本明細書で用いるかぎり、“厳しさ”なる用語は、ＰＣＲ生成物に転化される遊離ＲＮＡの量を意味する。
【００９０】
それ故、本発明の１つの決定的な特徴は、強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを増幅可能な核酸プールと増幅不能な核酸プールとに、分割マトリックスを必要とせずに、分割するその可能性である。高アフィニティリガンドの選択的な増幅を可能にするのは、これらのｃＤＮＡプールの固有の性質である。
【００９１】
標的分子はタンパク質（核酸結合性タンパク質又は非核酸結合性タンパク質）、核酸、小分子又は金属イオンである。溶液ＳＥＬＥＸは鏡像異性体の分割並びに新たな触媒核酸の単離を可能にする。
【００９２】
プライマー伸長抑制は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びＱβ−レプリカーゼを含めた、幾つかの核酸ポリメラーゼのいずれかを用いて達成することができる。
【００９３】
核酸の候補混合物は、それから相補的鎖を合成することができる、核酸又は核酸誘導体を含む。
【００９４】
先行技術の分割方法はニトロセルロース又はアフィニティカラムの使用を含む。先行技術の分割方法の欠点の１つは、分割マトリックスに特異的に結合する核酸が標的に特異的に結合する核酸と共に選択されるマトリックスバインダーの現象であった。したがって、本発明の方法の利点の１つは、分割マトリックスの使用によって生ずる、好ましくない選択的圧力を、標的に高アフィニティを有する核酸が溶液中で選択され、増幅された後にこのようなマトリックスを初めて用いることによって克服することである。さらに、ポリメラーゼによる伸長を最強複合体のみが抑制可能であることに基づいて、ｃＤＮＡ合成中に強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを分割できることが最高アフィニティ核酸リガンドのみの選択を生じる。ナノモル以下の範囲内の解離定数を有する複合体が効果的にｃＤＮＡ合成をブロックすることが想定される。本発明の方法はこの限界で標的と結合する要素に関して核酸候補混合物を選択的にスクリーニングすると考えられる。
【００９５】
プライマー伸長抑制の利用はオリゴヌクレオチド候補混合物を２プール：高い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド（増幅可能）及び低い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド（増幅不能）への分割を可能にする。上述したように、連鎖ターミネーターを用いて、第１伸長生成物を無効にして(poison)、低アフィニティｃＤＮＡを増幅不能にすることができる。
【００９６】
本発明の方法の他の実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティ核酸から生ずるｃＤＮＡを選択的に消化する。一本鎖ＤＮＡを切断する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的配列において、異なる効率で切断する。弱アフィニティ核酸と強アフィニティ核酸との分割は、４種類のｄＮＴＰの存在下でのプライマー伸長と、その後の標的の除去と、酵素切断に耐性である修飾ヌクレオチドによる第２伸長とによって達成される。この場合に、ｃＤＮＡプールを適当な制限酵素と共にインキュベートすると、第１伸長中に合成されたｃＤＮＡがプライマーアニーリング部位を除去するように切断されて、増幅不能なプールが得られる。制限部位（ＲＳ）においてヘアピンを用いて大きい効率の切断が達成されて、局部的な二本鎖領域が得られる（図２４）。
【００９７】
本発明の方法の他の実施態様では、生成ｃＤＮＡが酵素的又は化学的に選択的に分解されるように、第１伸長生成物中に修飾ヌクレオチドを組み入れることによって、低アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡ配列を選択的に分解可能にする。
【００９８】
本発明の方法の他の実施態様では、第１伸長生成物をアフィニティマトリックスによって系から除去することができる。或いは、マトリックスを用いて、第２伸長生成物、例えば高アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡを結合させることができる。この手法はｃＤＮＡ合成中の修飾塩基の組み入れに基づく。例えば、第１ｃＤＮＡ伸長をアフィニティマトリックス上での保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド、ヨウ素化ヌクレオチド、チオ標識ヌクレオチド又は任意の他の修飾ヌクレオチド）の存在下で実施することができる（図２５）。本発明の方法の代替実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特定の配列を組み入れることもできる。したがって、第１合成ｃＤＮＡを商業的に入手可能なマトリックス上で遅延させて、修飾ヌクレオチドと標的との不存在下で合成される第２合成ｃＤＮＡから分離することができる。
【００９９】
本発明の他の実施態様では、エキソヌクレアーゼ加水分解阻害を用いて、高アフィニティ二本鎖核酸リガンドのプールを形成する。
【０１００】
本発明のさらに他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸ方法を用いて、触媒核酸リガンドを単離する。
【０１０１】
本発明の他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸを用いて、一本鎖核酸を優先的に増幅させる。
【０１０２】
本発明の他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸ方法を自動化する。
【０１０３】
高アフィニティ核酸からのｃＤＮＡ合成を可能にする標的の除去も、多様な方法で達成することができる。例えば、標的を有機抽出によって除去するか、又は温度によって並びに溶媒の電解質含量の変化によって変性させることができる。さらに、本発明によって使用可能である候補混合物の分子レパートリーは、それから第２相補的鎖を合成することができる任意の分子を含む。一本鎖ＤＮＡ並びにＲＮＡを、多様な他の修飾ヌクレオチド及びそれらの誘導体が使用可能であると同様に、用いることができる。
【０１０４】
次の非限定的実施例は本発明の方法を説明する。実施例２１は、高アフィニティ核酸と低アフィニティ核酸との分割がプライマー伸長抑制によって達成される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２２は、分割が低アフィニティＲＮＡの制限酵素消化によって達成される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２３は、低アフィニティ核酸が高アフィニティ核酸から、アフィニティクロマトグラフィーによって分離される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２４はエンドヌクレアーゼ阻害の利用による高アフィニティ二本鎖核酸リガンドの単離を説明する。実施例２５は触媒核酸の単離を説明する。実施例２６は自動化溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。
【実施例】
【０１０５】
提供する実施例は、本発明を用いる方法を非限定的に説明する。本発明を用いる他の方法は本明細書の開示から当業者に明らかであろう。
【０１０６】
実施例１．  ＲＮＡ配列  ＲＮＡ−１、ＲＮＡ−２、ＲＮＡ−３、ＲＮＡ−７及びＲ−１７コートタンパク質の合成．
図６に示した、ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）並びに図１２に示したＲＮＡ−７（配列番号：４）を合成ＤＮＡ鋳型又はプラスミドからのインビトロ転写によって、Milliganと共同研究者が述べている方法（Milligan等（１９８７），Nucleic Acids Res.１５：８７８３）を用いて調製した。転写反応は４０mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．１，３７℃）と、１mMスペルミジンと、５mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５０μg ／mlと、０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、ポリエチレングリコール（ｍｒ８０００）８０mg／mlと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．１mg／mlとを用いた。３〜５mM  各ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）と、２５mM塩化マグネシウムと、１μM ＤＮＡ鋳型又はプラスミド０．１μg ／mlとを用いて、さらに多量のＲＮＡを調製した。ボディ標識(body-labeled)ＲＮＡを、１００μl 反応において１mM３種ＮＴＰの各々と、０．２５mM同等の放射標識ＮＴＰ（〔α−３２Ｐ〕ＮＴＰ，５μＣｉ）と、１５mM  ＭｇＣｌ２と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．１mg／mlとを用いて調製した。５−ヨードウリジントリホスフェートと５−ブロモウリジントリホスフェートを含むヌクレオチドはSigma Chemical Co.（ミズリー州，セントルイス）から得た。ＲＮＡフラグメントは２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。所望のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから溶離させ、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈殿させた。Ｒ１７バクテリオファージを大腸菌（Escherichia coli) 菌株Ｓ２６中で増殖させ、コートタンパク質をCarey と共同研究者が述べている方法（Carey 等（１９８３），Biochemistry  ２２：４７２３）を用いて精製した。
【０１０７】
実施例２．  Ｒ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１とＲＮＡ−２との結合定数．
バクテリオファージＲ１７コートタンパク質に対するヘアピン変異体ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）のＲＮＡ−タンパク質結合曲線を図７に示す。コートタンパク質とＲＮＡヘアピン変異体との間の会合定数をCarey と共同研究者が述べているニトロセルロースフィルター保持検定（Carey 等（１９８３），上記文献）を用いて測定した。１０mM酢酸マグネシウム、８０mM  ＫＣｌ、８０μg ／mlのＢＳＡ及び１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）（ＴＭＫバッファー）中で、定常な低濃度の３２Ｐ標識ＲＮＡを０．０６nM〜１μM の一連のコートタンパク質濃度と混合した。これらは架橋実験に用いた溶液条件と同じであった。４℃における４５〜６０分間のインキュベーション後に、混合物をニトロセルロースフィルターに通して濾過して、フィルター上に保留された複合体量を液体シンチレーション計測によって測定した。各実験に関して、データ点を非協同(non-cooperative）結合曲線に当てはめて、図７に示すKd値を算出した。
【０１０８】
実施例３．  ３０８nmにおけるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１とＲＮＡ−２との光架橋
３２Ｐ標識ＲＮＡ配列ＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）（５nM）と、Ｒ１７コートタンパク質（１２０nM）とを、それぞれ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）、８０mM  ＫＣｌ、１０mM  酢酸マグネシウム、８０μg ／mlのＢＳＡ中で氷上において１５〜２５分間インキュベートしてから、照射した。これらは、ＲＮＡをコートタンパク質に完全に結合させた条件と同じであった。ＲＮＡがヘアピンコンホメーションであることを保証するために、ＲＮＡを水中で８５℃に３分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した（GroebeとUhlenbech （１９８８），Nucleic Acids Res.１６：１７２５）。６０mbarキセノン、８０mbarヘリウム中５％ＨＣｌ及び２３６０mbarヘリウムを装填したLambda Physik ＥＭＧ−１０１エクサイマーレーザーを３０８nm照射に用いた。ＸｅＣｌレーザーの出力をＲＮＡ−タンパク質複合体を含む４mm幅Ｘ１cm光路長さの石英キュベット方向に非収束的(unfocussed)に導いた。 このレーザーを１０Hzにおいて６０ｍＪ／パルスの範囲内で操作した；しかし、レーザービームの約２５％のみが反応セル上に入射した。Ｒ１７バクテリオファージコートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）の光架橋収量を照射時間の関数として図８に示す。架橋ＲＮＡを非架橋ＲＮＡからＰＡＧＥによって分離し；収量をオートラジオグラフィーによって測定した。コートタンパク質に対する競合光損傷がＲＮＡへの結合を阻害するために、５−ブロモウラシル含有変異体ＲＮＡ−１（配列番号：１）の架橋は約４０％で最大であった（Gott等（１９９１），上記文献）。より短い照射時間のために、ＲＮＡ２に関してはコートタンパク質への少ない光損傷が生じた。
吸収された光子の関数としての架橋は、３０８nmにおける照射によってＢｒＵ−ＲＮＡ１の架橋の量子収量が０．０１４であり、ＩＵ−ＲＮＡ−２（配列番号：２）の架橋の量子収量が０．００６であることを実証した。ＩＵ−ＲＮＡ−２によっては、量子収量が低いにも拘わらず、３０８nmにおけるＩＵ発色団の吸収確率が数倍高いために、高い架橋収量が得られた。ＢｒＵとＩＵとは、それぞれ、３８５と２６４０Ｌ／mol ・cmのモル吸光係数によって３０８nmにおいて吸光する。それ故、タンパク質損傷の前にＩＵ−ＲＮＡの高レベルの光架橋が得られた。
【０１０９】
実施例４．  Ｒ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１の架橋に関係するアミノ酸残基の同定．
Ｒ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）の大規模架橋。  ３００nM５’−末端標識ＲＮＡと５００nMコートタンパク質とを含む溶液（１０ml）を１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）と、１０mMＭｇ（ＯＡｃ）２と、８０mM  ＫＣｌと、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（８０mg）と、５mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）との存在下で氷上において１０〜９０分間インキュベートした。３０８nmにおける単色光線照射のためには、Lambda Physik  ＥＭＧ−１０１エクサイマーレーザーを用いた。ビーム出力は１０Hzにおいて６９±５ｍＪ／パルスと測定された。ビームの約５０％が、サーモスタットで調温されたセルホルダー中の１cm光路長さ石英キュベット中に、７mm直径円形ビームマスク(beam mask）を通して収束した。レーザー出力をScientech ３６０−００１ディスクカロリーメーター出力計によって測定した。Laude ＲＣ３循環浴によって、温度を４±２℃に調節した。
２mlフラクションで実施した照射の直前に反応混合物（１０ml）を調製した。５分間照射した後に、タンパク質濃度を１μM にした。反応混合物を次に３分間インキュベートして、核タンパク質複合体中の光損傷したタンパク質を新しいタンパク質と交換させ、さらに５分間照射した。２０％変性ＰＡＧＥによって分析し、Molecular Dynamics Phosphoimager上で定量した架橋は２２％架橋であった。
サンプル（９０ml）は５．９nmolの架橋ＲＮＡと、２１nmolの遊離ＲＮＡと、９７nmolの遊離コートタンパク質と、ＢＳＡ（７．２mg）とを含有した。全体量を２０mlに減じ、２個の５０mlポリプロピレンねじぶた遠心管（Nalgen）に等分し、−２０℃において一晩エタノール沈殿させた。ＲＮＡ及びタンパク質をBeckman Ｊ２−２１遠心機の固定角度Ｊ−２０ローター中で１３，０００rpm において回転させて、ペレットにした。各ペレットを０．５Ｍ尿素、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）及び０．２％ＳＤＳの１ml中に４℃において４８時間振とうさせながら再懸濁させた。フラクションを一緒にし、次に、トリプシンの活性を減じないように、ＳＤＳを沈殿によって除去した。これは４０mM  ＫＣｌによって達成され、沈殿物を０．２２μm 酢酸セルローススピンフィルターによるスピニングによって除去した。この溶液（５００μl ）を用いて、トリプシン状態を最適化した。
【０１１０】
タンパク質分解消化．  遊離ＲＮＡとタンパク質とを含む残留架橋ＲＮＡ溶液（１．５ml）を、１Ｍ  尿素、２０mM  ＣａＣｌ２及び６mM  ＤＴＴを含む６mlにし、次にトリプシン−ＴＰＣＫ（２５１単位／mg）（１．６１mg（１：５ｗ／ｗ））を加えた。反応を３６℃において２時間進行させ、この時点でさらに１．６１mgのトリプシンを加えた。４時間目に、アリコート（100 μl ）を取り出し、急速凍結によって反応を停止させた。２０％ポリアクリルアミド１９：１架橋、７Ｍ尿素、９０mM  Ｔｒｉｓ−ボレート／２mM  ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲル電気泳動（２０％尿素変性ＰＡＧＥ）によって、反応を分析した。
消化された架橋ＤＮＡの精製．  トリプシン反応混合物を１０mlにして、塩のモル濃度を減じ、２４０μl ＤＥＡＥイオン交換遠心カラムに通して処理した。このカラムを１００mM  ＮａＣｌによって洗浄し、実験台(bench top）遠心機において乾式遠心して、遊離ペプチドを除去した。ＲＮＡと架橋トリプシンフラグメントとを含むカラム結合物質をカラムから６００mM  ＮａＣｌ（１ml）によって溶離し、カラムを乾式遠心した。さらに２００μl の６００mM  ＮａＣｌをカラムに通して遠心した。２フラクションをプールし、エタノール沈殿させ、４℃において３５分間、１０，０００rpm でペレット化した。ペレットを７Ｍ尿素−ＴＢＥバッファー、１０mM  ＤＴＴ、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシラノールの２５μｌ中に再懸濁させ、８５℃に４分間、加熱し、２０％変性ＰＡＧＥによって精製した。このゲルを６００Ｖにおいて３．５時間処理した。このゲルを５分間ホスホイメージ(phosphoimage)暴露させた。消化されたタンパク質−ＲＮＡ架橋をゲルから、Ｂｉｏ−ＲＡＤ製のＰＶＤＦタンパク質配列決定膜(sequencing membrane)(０．２ミクロン）上に電気分解式にブロットした。この膜を風乾させ、１分間クーマシー染色し、５０％ＭｅＯＨ：５０％Ｈ２Ｏ中で２分間汚れを除去し、脱イオンＨ２Ｏによって２回すすぎ洗いした。膜のオートラジオグラムを作成して、膜から取り出された、消化されたタンパク質ＲＮＡ架橋を可視化し、エドマン(Edman）分解を受けさせた。Howard Hughesの方法及びプロトコール（Clive Slaughter,テキサス大学  Howard Hughes 医学研究所（サウスウエスターン））を用いて、Applied Biosystems  ４７０Ａシークエンサーにおいて実施した自動化エドマン分解によって、固定化ペプチドの配列決定した。このエドマン分析は、架橋位置が既知アミノ酸配列に基づいてチロシン−８５であることを実証した（Weber （１９８３），Biochemistry  ６：３１４４）。
【０１１１】
実施例５．  ３０８nmにおけるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−２の光架橋
実施例３に述べた実験と同様な実験において、ＩＵ置換ＲＮＡ−２（配列番号：２）をＲ１７コートタンパク質に、Omnichrome  ＨｅＣｄレーザー（モデル３０７４−４０Ｍ３２５）からの３２５nmにおける単色発光によって光架橋させた。ＨｅＣｄレーザーの出力は３７mWであり、直径３mmのビーム全体がサンプル上に入射した。単位時間あたりの励起を高めるために、誘電体塗布凹面鏡によってビームを反射させて、サンプルに通して戻した。架橋ＲＮＡをＰＡＧＥによって非架橋ＲＮＡから分離し、収量をホスホイメージャーによって測定した。タンパク質に架橋したＲＮＡの％を照射時間の関数として図９に示す。Ｒ１７コートタンパク質に対する光損傷なしに、高収量架橋が生じた。別の実験では、さらに高い線量による３２５nmによるコートタンパク質のみの同様な照射が、Ｒ１７コートタンパク質と同じ結合定数を示すタンパク質を生じた。ＢｒＵ含有ＲＮＡ−１−Ｒ１７コートタンパク質複合体の３２５nm照射は、ＢｒＵ発色団が３２５nmにおいて透光性であるために、架橋を生じなかった。
【０１１２】
実施例６．  トランスイルミネーターによるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１及びＲＮＡ−２の光架橋．
実施例３に述べた実験と同様な実験において、ＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）をＲ１７コートタンパク質に、ポリスチレンによって濾過した、Fisher Biotech Transilluminator （モデルＦＢＴＩＶ−８１６）からの３１２nm範囲内の広帯域発光によって光架橋させた。架橋ＲＮＡをＰＡＧＥによって非架橋ＲＮＡから分離し、収量をオートラジオグラフィーによって測定した。タンパク質に架橋したＲＮＡの％を照射時間の関数として図１０に示す。
【０１１３】
実施例７．  ５−ヨードウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとの光反応
Dietz とKoch（１９８７）（上記文献）が開示するように、Ｎ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドを調製した。ヨードウラシルと１０モル当量過剰なＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドをＸｅＣｌエキシマーレーザーによる３０８nmにおける照射は、図１１に示すように、ブロモウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとからの光付加物(photoadduct）（構造６）（Dietz とKoch（１９８７），上記文献）と同様な光付加物を生じた。Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣと１Ｈ  ＮＭＲスペクトロスコピーとによって生成物比較を行った。会合タンパク質へのＩＵ置換核酸の光架橋の機構については殆ど知られていないが、この結果は、この光架橋の機構が会合タンパク質へのＢｒＵ置換核酸の光架橋の機構と同じであることを示唆する。
【０１１４】
実施例８．  タンパク質に光架橋したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
ＤＮＡ鋳型の代わりにプラスミドを用いて、実施例１に報告するような方法によって、ＲＮＡ−７（配列番号：４）（図１１）を製造した。実施例３に述べるように、光架橋を実施した。６．７５nM  ＲＮＡと１２０nM  Ｒ１７コートタンパク質とから成る反応混合物（４ml）をＸｅＣｌエキシマーレーザーからの非収束発光によって３０８nmにおいて、一度に２mlずつ、照射した。レーザーは５０ｍＪ／パルスを生じ、レーザーを１０Hzにおいて操作した。５分間の照射中に、この反応はほぼ定量的な架橋（８５〜９０％）にまで進行した。架橋後に、全反応混合物の１mlを取り出した；ＥＤＴＡ（８０mM）、ＳＤＳ（０．１％）及びＣａＣｌ２（０．１mM）を加え；存在する遊離（非結合）ＲＮＡを精製除去して；タンパク質をプロテイナーゼＫによって６０℃において３０分間消化させた。残留タンパク質に結合したＲＮＡをエタノール沈殿させ、塩を除去し、遠心してペレットにした。これらのペレットを７０％エタノールによって３回洗浄して、残留塩を除去した。逆転写反応を利用して、ＲＮＡ鋳型の相補的ＤＮＡコピーを製造した。１３−塩基プロモーターをＲＮＡにアニールし、逆転写反応を製造業者，Gibco （メリーランド州，ガイサースブルグ）の標準条件下で実施し、１時間後に停止させた。ｃＤＮＡを３２Ｐ標識デオキシシチジントリホスフェートによってボディ標識した。次に、０．２Ｍ水酸化ナトリウムによる１００℃における５分間の加水分解によって、ＲＮＡ鋳型を除去した。ｃＤＮＡの形成をＰＡＧＥによって追跡した。加水分解ラダー(ladder)とマーカーとをゲルに加えて、ｃＤＮＡの長さを測定した。このｃＤＮＡは４４ヌクレオチドＲＮＡ鋳型と同時移動した。架橋修飾の結果として、ｃＤＮＡの停止があったとしても、３１ヌクレオチドの短縮生成物が得られたと考えられる。ゲルの２２〜２５ヌクレオチド領域に少量の停止生成物が観察されたが、これはＲＮＡ鋳型上のｃＤＮＡの位置２５において開始するヘアピン二次構造から生じたと考えられる。ゲルの３１ヌクレオチド領域に停止は出現しなかった；このことは逆転写酵素が架橋の位置を通して読み取りを行ったことを実証した。ゲルの線図を図１４に示す。
【０１１５】
実施例９．  ヨードシトシン光架橋．
５−位置にシトシンを含み、Ｒ１７コートタンパク質に高アフィニティで結合したヘアピンＲＮＡ（ＲＮＡ８）に、５−ヨードシトシン（ＩＣ）を組み入れた。このＩＣ含有ＲＮＡをＲＮＡ９と名付ける。ＲＮＡ９（５nM）とＲ１７コートタンパク質（１２０nM）とを１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）／８０mM  ＫＣｌ／１０mM酢酸マグネシウム／８０μg ／ml  ＢＳＡ中で氷上において１５〜２５分間インキュベートしてから、照射した。コートタンパク質に結合したコンホメーションであることを保証するために、水中のＲＮＡを８５℃に３分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した（GroebeとUhlenbech （１９８８），上記文献）。この複合体を４℃において５分間照射し、この実験をＲＮＡ２及びＲＮＡ８コートタンパク質複合体の対照照射に比較した。ＲＮＡ８−コートタンパク質複合体の照射は架橋生成物を生じなかった。ＲＮＡ９−コートタンパク質複合体の照射は、ＲＮＡ２−コートタンパク質複合体の対照照射の収量（８０〜９０％）と同様な高収量（７０〜８０％）で形成される架橋の形成を生じた。ＲＮＡ９の架橋はループヘアピンの位置−５にＩＵを含むＲＮＡと同じ機構で生ずると推定される（図６と１２）。この推定は、ＲＮＡ８は光架橋しなかったので、架橋の特異性に基づく。
【０１１６】
実施例１０．  ＤＮＡリガンド中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れ．
上記方法による照射時に標的分子に架橋することができるＤＮＡリガンド中に、光反応性ヌクレオチドを組み入れることができる。５−ブロモデオキシウラシル（ＢｒｄＵ）、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン及び５−ヨード−２’−デオキシウラシルは、このような光反応性ヌクレオチドの例である。
【０１１７】
実施例１１．  光ＳＥＬＥＸ．
本発明の１実施態様では、標的分子に結合し、光架橋する核酸リガンドの選択に光ＳＥＬＥＸを完成まで適用する。
光反応性基を含む核酸オリゴヌクレオチドのランダム化セットを合成する。候補混合物のオリゴヌクレオチドを、利用可能な各位置において、光反応性基によって部分的に又は完全に飽和することができる。候補混合物を標的分子と接触させ、光の適当な波長において照射する。標的分子と架橋したオリゴヌクレオチドを残りのオリゴヌクレオチドから単離し、標的分子を除去する。単離したＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを作成し、増幅する。これらの増幅ｃＤＮＡ配列を光反応性基の存在下でＲＮＡ配列に転写し、必要に応じて、光ＳＥＬＥＸを繰り返す。
【０１１８】
実施例１２．  強化光架橋性リガンドの選択：光ＳＥＬＥＸを伴うＳＥＬＥＸ．
本発明の方法の１実施態様では、ＳＥＬＥＸによる核酸リガンドの選択後に、標的分子に架橋することができるリガンドに関して光ＳＥＬＥＸによって選択する。このプロトコールは、標的に光架橋することもできる、標的分子に対して高い結合アフィニティを有するリガンドを生じる。
特定トリホスフェートの代わりに反応性ヌクレオチドトリホスフェートによるＴ７ポリメラーゼ転写によって、ＲＮＡ中に光反応性ヌクレオチドを組み入れる。例えば、５−ブロモウリジントリホスフェートをウリジントリホスフェートと置換する、又は８−ブロモアデノシントリホスフェートをアデノシントリホスフェートと置換する。光反応性ヌクレオチドを含むＲＮＡ配列のランダム化セットを形成し、ＳＥＬＥＸ方法を適用する。最初の選択ラウンドを用いて、本質的に不良なバインダーを除去し、分子プールの質を向上させて、光反応性基を有し、標的分子に結合するＲＮＡプールを形成するように、分子プールを収斂させる(converge)。初期ＳＥＬＥＸラウンドからのアリコートを照射する、ラウンドが進行するにつれて、光架橋の強化をＰＡＧＥによって追跡する。架橋生成物を表す、緩慢な移動帯が明白になり始めたときに、ＲＮＡプールを光ＳＥＬＥＸのラウンド中に導入する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接して光反応性基を有するＲＮＡを反応させ、選択して、反応性標的残基に近接して反応性ヌクレオチドを有さないＲＮＡを除去する。
このプロトコールは、標的分子に対する予め同定されたリガンドに光ＳＥＬＥＸ選択を適用する。
【０１１９】
実施例１３．  ＳＥＬＥＸを伴う光ＳＥＬＥＸ
本発明の方法の他の実施態様では、標的分子に光架橋することができるＲＮＡリガンドを光ＳＥＬＥＸ方法によって予め選択する。その後に、ＳＥＬＥＸを実施して、架橋用オリゴヌクレオチドを標的分子結合能力に関して選択する。
【０１２０】
実施例１４．  光ＳＥＬＥＸを伴う限定ＳＥＬＥＸ
本発明のこの実施態様では、限定された回数の選択ラウンドでのＳＥＬＥＸ方法によって、核酸リガンドを選択する。実施例１２と同様に、ＳＥＬＥＸを完成まで適用しない。むしろ、標的分子に対して比較的大きいアフィニティを有するオリゴヌクレオチドに関して、候補混合物を部分的に選択する。候補混合物のランダムオリゴヌクレオチドは光反応性基を含む、初期ＳＥＬＥＸを照射なしに実施する。次に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に架橋することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
このプロトコールは、幾らか大きい標的分子結合能力を有する架橋用リガンドの、オリゴヌクレオチドプールからの選択を可能にし、ＳＥＬＥＸによる完成までの選択が架橋用リガンドを生成しない状況で有用である。
【０１２１】
実施例１５．  限定指向性(limited directed)光ＳＥＬＥＸ
本発明の方法の１実施態様では、ＳＥＬＥＸによって同定される核酸リガンドが限定されたランダム化を受けた後に、光ＳＥＬＥＸによる選択を受ける。
部分的ランダム化ＲＮＡの転写に用いるＤＮＡ鋳型の構成は初期選択リガンドの配列に基づくものであり、初期選択ＲＮＡ配列の位置に相補的である各位置に主としてヌクレオチドを含む。しかし、各位置はその位置におけるオリジナル配列を変えるシークエンサー中に、他の３種のヌクレオチドの各々の少量を用いることによっても、部分的にランダム化される。次に、反応ミックス中の特定のトリホスフェートに置換する光反応性トリホスフェート（すなわち、Ｕに対してＢｒＵ）によって、ＤＮＡ分子のこのセットから限定ＲＮＡプールを転写する。光反応性ヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子の部分的ランダム化セットにある量の標的タンパク質を混合する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基を有する結合ＲＮＡは、照射時に、共有結合架橋を形成する。結合し、架橋するＲＮＡを数回の光ＳＥＬＥＸラウンドで選択し、結合するが架橋しないＲＮＡから分離する。
【０１２２】
実施例１６．  標的分子の修飾方法．
本発明の他の実施態様では、標的分子を改質することができるリガンドを発展させるために光ＳＥＬＥＸを適用する。これらの状況下で、光ＳＥＬＥＸ又はＳＥＬＥＸによって選択されるリガンド上又は中への光反応性基の組み入れは、標的分子の生物学的活性が改良されるような、幾つかの方法で標的分子を改質することができる。例えば、標的分子を光架橋リガンドによって不活化することができる。不活化機構には、化学的修飾を誘出する、標的分子からの電子若しくは水素の抽出又は標的分子へのラジカル付加がある。これらの種々な機構は照射形式を変えることによって達成することができる。
紫外（ＵＶ）光線と共に標的分子の診断法として用いられる、光ＳＥＬＥＸによって選択されるリガンドも、照射光源をＸ線又はガンマー線に変えるならば、インビボにおいて同標的を不活化することもできる。生ずるビニルラジカルがヒドロキシラジカルと同様に、すなわち、標的分子の結合ドメインから水素原子を抽出することによって作用することができる。
放射能標識したＩＵ−若しくはＢｒＵ−置換ＲＮＡヘアピン配列に結合したＲ１７コートタンパク質のＸ線照射は、架橋の形成を生じることができる。ＢｒＵ−又はＩＵ−発色団をＸ線照射によって高いエネルギー状態に励起させて、その結果としてビニルラジカルを形成させることもできる（Mee （１９８７），Radiation Chemistry:principles and Applications （FarhatazizとRodgers 編集），ＶＣＨ  Publishers，ニューヨーク，４７７〜４９９頁）。このラジカルはＲ１７コートタンパク質の結合ドメインから水素を抽出し、それによって、そのＲＮＡリガンド結合能力を減ずるか又は抑制することができる。置換したＲＮＡの存在下及び不存在下でのＲ１７コートタンパク質のＸ線照射によって、不活化を試験する。架橋複合体の形成をＰＡＧＥによって分析する。タンパク質ドメインの修飾によって結合の改良を生じる、ＲＮＡのＸ線照射の効果をニトロセルロース結合検定によって追跡する。
【０１２３】
実施例１７．  特定の疾患経過に関連する固有タンパク質を同定するための光ＳＥＬＥＸの診断的使用．
診断方法の目的は、固有タンパク質の発現を特定の疾患経過と相互に関係づけることである。これらの相互関係の幾つかは、例えば細菌又はウイルス感染後に、明らかになるので、抗原特異性である抗原、又は非感染対象の血液中に検出されない、このような抗原に対する抗体を検出することができる。あまり明らかではない相互関係には、最も一般的な形の睾丸性癌の存在と直接相関するα−フェトタンパク質の血清中の発現がある。
生物学的タンパク質とヒトの重要な疾患との間のまだ知られていない相互関係の解明に、光ＳＥＬＥＸ方法を適用することができる。本発明の１実施態様では、疾患を有する患者から血清を採取し、血清中の全てのタンパク質に対するＲＮＡリガンドを製造し、正常血清に吸着させる。血清タンパク質に対するＲＮＡリガンドをＳＥＬＥＸ方法によって同定し、その後に光反応性基を組み入れる、又は１個以上の光反応性基を含むオリゴヌクレオチドの候補混合物から最初に選択して、光ＳＥＬＥＸによって同定することができる。未結合で残されたＲＮＡリガンドは疾患を有する患者からの血清中の固有タンパク質のみに特異的に結合するＲＮＡリガンドである。例えば、限られた数の血清タンパク質（例えば、１１種）に対するＲＮＡリガンドを最初に同定する。同定されたＲＮＡリガンドは標的タンパク質と可逆的に若しくは非可逆的に架橋することができる、可逆的若しくは光反応性官能基を有する修飾ＮＴＰを含む。あらゆるタンパク質に対する架橋リガンドの存在を任意に立証することができる。次に、ＲＮＡリガンドを取り出し、増幅する。次いで、ＲＮＡを第２ＳＥＬＥＸラウンドで転写する。次に、ＲＮＡを最初の１１種のタンパク質の中の非常に過剰な１０種に結合させ、固有タンパク質（１１番目）に特異的なＲＮＡリガンドを残す。次に、このＲＮＡを増幅する。これはサブトラクティブな（subtractive)方法である。
本発明の診断方法の１実施態様では、上記方法を用いて、異常なタンパク質（例えば、α−フェトタンパク質）に対するリガンドを同定する。重要な疾患を有する患者からの血清を得て、存在する全てのタンパク質に対するＲＮＡリガンドを同定する。これらのＲＮＡリガンドを正常な血清に吸着させ、未結合リガンドを残す。未結合リガンドは有力な診断剤であり、かつ疾患と特異的に関連する血清タンパク質を同定するためのツールである。
【０１２４】
実施例１８．  光架橋する核酸リガンドのインビボ利用による疾患の治療方法．
疾患状態と関連する標的分子に対する核酸リガンドを光ＳＥＬＥＸ方法によって選択する（実施例１１）。光ＳＥＬＥＸ選択核酸リガンドを技術上周知の幾つかの方法で患者に導入する。例えば、非ハロゲン化光ＳＥＬＥＸリガンドを、患者に移される幹細胞中にクローン化する。このリガンドは患者の細胞中に一過性に又は本質的に発現する。患者に投与されたＩＣはクローン化配列のオリゴヌクレオチド産物中に組み入れられる。照射時に、リガンドは標的分子に架橋することができる。照射は可視光線、３２５nm、３０８nm、Ｘ線、紫外線及び赤外線を含むことができる。
或いは、光ＳＥＬＥＸリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖ＤＮＡとして、患者の細胞に取り入れることができる。光ＳＥＬＥＸリガンドを患者に導入する他の方法は患者の細胞中へハロゲン化リガンドをリポソーム投与することを含む。
【０１２５】
実施例１９．  インビトロ診断法、インビボイメージング及び治療デバイスに用いるための光ＳＥＬＥＸリガンド．
疾患状態及び／又は異常な細胞（例えば、腫瘍細胞）と特異的に関係する分子を同定するために、光ＳＥＬＥＸを用いることができる。このようなマーカー分子と共有結合的に反応する光ＳＥＬＥＸ同定オリゴヌクレオチドを製造することができる。
本発明の１実施態様では、光ＳＥＬＥＸの標的は異常な血清又は腫瘍細胞（例えば、標的混合物）である。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドのライブラリー候補混合物を形成する。上記光ＳＥＬＥＸプロトコールの１つを用いて、異常な血清中又は腫瘍細胞上の固有タンパク質に光架橋することができるオリゴヌクレオチドを同定する。腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、インビトロ診断剤として又は促進剤に結合する場合にはインビトロイメージングのために有用である。さらに、腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、例えば、免疫活性化方法として、不活化方法として、又は特異的な標的活性の薬剤化合物の投与方法として治療的に使用可能である。
【０１２６】
実施例２０．  光ＳＥＬＥＸとＨＩＶ−１  Ｒｅｖ．
鋳型デオキシオリゴヌクレオチド合成の各位置において、ヌクレオチド試薬比は６２．５：１２．５：１２．５：１２．５であった。各位置において多量に加えるヌクレオチドは、同じ位置における６ａ配列（配列番号：５）中に見られるヌクレオチドに一致する。
クローン化と配列決定操作：  各ラウンドから単離したＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを製造し、ＰＣＲ増幅して、末端に固有のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する１１１ｂｐフラグメントを得た。フェノール／ＣＨＣｌ３処理したフラグメント及びｐＵＣｌ８ベクターを、一緒に、３７℃においてＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって一晩消化させ、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、沈殿させた。ベクターとＰＣＲ生成物の消化物を室温において４時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結させ、 コンピテントなＤＨ５α−Ｆ’細胞に形質転換させ、この細胞を次にアンピシリン含有ＬＢプレート上で成長させた。個別コロニーをＬＢ−アンピシリン培地中で一晩成長させ、Wizard（Promega)プラスミド調製キットを用いて、プラスミドを製造した。配列決定はSequenase （ＵＳＢ）キットを用いて実施した。
ニトロセルロースフィルター結合選択のための条件：全てのラウンドは約２０nM  ＲＮＡを用いた。ラウンド１と２：６nM Rev. ラウンド３：３nM Rev. ラウンド８：１nM Rev. ラウンド９〜１０：３nM Rev. 結合反応量は５mlから１mlまでの範囲であった。
架橋選択のための条件：  約５０〜１００nM折り畳み(folded)プールＲＮＡを、氷上で、１ｘＢＢ（５０mM  ＴｒｉｓＡｃ  pH７．７、２００mM  ＫＯＡｃ、１０mM  ＤＴＴ）中の０．２μM Ｒｅｖ（ラウンド４〜６）又は０．５μM Ｒｅｖ（ラウンド７）、１μM ＢＳＡに加えて、３７℃において５分間インキュベートした。次に、サンプルをＸｅＣｌエクサイマーレーザーによって３０８nmにおいて３分間（ラウンド４）、ＨｅＣｄレーザーによって３２５nmにおいて３０分間（ラウンド５）、３２５nmにおいて１０分間（ラウンド６）又は３２５nmにおいて１分間（ラウンド７）、３７℃において照射した。サンプルの約１／２を５０％ホルムアミド、ｔＲＮＡ（４０μg ）中で９０℃において４分間加熱し、８％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
次の操作を用いて、アクリルアミドゲルから架橋ＲＮＡを約８０％の回収率で溶離した：核タンパク質含有ゲルスライスを１ｘＰＫバッファー（１００mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  pH７．７、５０mM  ＮａＣｌ及び１０mM  ＥＤＴＡ）中で粉砕して、均質なスラリーにした。プロテイナーゼＫを１mg／mlの濃度まで加え、４２℃において３０分間インキュベートした。尿素濃度を約０．７Ｍ、１．９Ｍ及び３．３Ｍと高めながらの４２℃における１５分間のインキュベーションを実施した。得られた溶液をＤＭＣＳ処理グラスウールと０．２μm 酢酸セルロースフィルターとに通した。濾過した溶液をフェノール／ＣＨＣｌ３によって２回洗浄し、ＥｔＯＨ：イソプロパノールの１：１容量混合物によって沈殿させた。
各ラウンドからの架橋帯をシンチレーション液体中に入れて、Beckman ＬＳ−１３３液体シンチレーション系において計測した。架橋％＝〔（３２５nmにおける４分間照射後のＲＮＡ＋Ｒｅｖからの架橋生成物ｃｐｍ）−（照射したＲＮＡのみの架橋領域ｃｐｍ）〕／総ｃｐｍ。架橋における折り畳み増加(fold increase）はＲ１３架橋％／Ｄ３７架橋％である。
競合体ｔＲＮＡを用いた、アフィニティ及び架橋に関する同時選択を次のように実施した。１０μM 酵母ｔＲＮＡを１ｘＢＢ（５０mM  ＴｒｉｓＡｃ（pH＝７．５）、２００mM  ＫＯＡｃ、１０mM  ＤＴＴ）中の０．５μM Ｒｅｖ、１μM ＢＳＡに加えて、氷上で１０分間インキュベートした。２００，０００cpm （約５０〜１００nM最終濃度ＲＮＡ）を加えて、氷上でさらに１５〜６０分間インキュベートした後に、３７℃において５分間インキュベートした。次に、サンプルを３７℃においてＨｅＣｄレーザーによって３２５nmで４分間照射した。サンプルの約１／３を５０％ホルムアミド、ｔＲＮＡ（４０μg ）中で９０℃において４分間加熱し、８％ポリアクリルアミド／８Ｍ  尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
ＬＩ架橋用ＲＮＡリガンドは４分間の３２５nmレーザー照射によってさらに架橋生成物を形成する。
切頭ＲＮＡを生成するために用いる鋳型オリゴは次の通りである：
PTS-1; 5′-TAATACGACTCACTATA-3′，（配列番号：６０）DNA-2;
５′-GAGTGGAAACACACGTGGTGTTTCATACACCCTATAGTGAGTCGTATTA- ３′（配列番号：６１），及びDNA-24; ５′-AGGGTTAACAGGTGTGCCTGTTAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-３′（配列番号：６２）．
ＰＴＳ−１をＤＮＡ−２又はＤＮＡ−２４と共にアニールして、Ｔ７転写のための鋳型を製造する。
６ａ（配列番号：５）に比べた個々の分子の変化数を計算するために、各分子を６ａに最大の類似性になるように配向させた。ギャップを１変化として数えて、切頭分子は無変化として計数した。各クラス中に分子を見いだす平均確率を算出するために；特異的変化（ｓ）と非特異的変化（ｎｓ）と無変化（ｕ）との平均数を計算して、次式に用いた：
（Ｐ）＝（．１２５）ｓ（．３７５）ｎｓ（．６２５）ｕ．クラスＩａ（Ｐ）＝９ｘ１０−１５；Ｉｂ（Ｐ）＝３ｘ１０−１５；Ｉｃ（Ｐ）＝７ｘ１０−１３；Ｉｄ（Ｐ）＝３ｘ１０−１５；クラスＩＩ（Ｐ）＝２ｘ１０−１４。出発群は１０１４分子から成るので、（Ｐ）＜１０−１４を有する配列は表されない。（ｓ）は大文字の共通ヌクレオチドを生じるために必要な変化であり；（ｎｓ）は付加的な変化である。
ヒト核抽出物の存在下でＨＩＶ−１  Ｒｅｖと光独立性に架橋するTrunc ２４（配列番号：５９）を次のように測定した：Trunc ２４  ＲＮＡと、核抽出物と、Ｒｅｖタンパク質とを一緒にし、氷上で１０分間インキュベートした。サンプルに８Ｍ尿素含有バッファーを１：１で混合し、分析のために７Ｍ尿素、８％ポリアクリルアミドゲル上に置いた、ＸＬは核タンパク質複合体を意味し、ＲＮＡは遊離のtrunc ２４  ＲＮＡを意味する。
【０１２７】
実施例２１．  プライマー伸長抑制溶液ＳＥＬＥＸ．
プライマー伸長抑制は、緊密に結合した標的分子が高アフィニティオリゴヌクレオチドのｃＤＮＡ合成を阻害しうることに基づき、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅可能なｃＤＮＡプールと、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅不能なｃＤＮＡプールとの形成を生じる。したがって、溶液ＳＥＬＥＸのＰＣＲ工程は両ｃＤＮＡプールの間の分割スクリーンとして作用する。核酸合成、プライマー伸長抑制及びＰＣＲに関する一般的なプロトコールを本明細書では提供する。さらに、特定の核酸リガンドを分離するためのＮ−アクリロイルアミノフェニル水銀ゲル電気泳動条件を述べる。核酸リガンドをクローン化し、配列決定する方法はTuerk とGold（１９９０）（上記文献）が述べている通りである。
ＲＮＡ合成．  ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とをインキュベートすることによって、ＲＮＡ候補混合物を生成した。反応条件は８％ポリエチレングリコール８０００、５mMジチオトレイトール、４０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１２mMＭｇＣｌ２、１mMスペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２mMヌクレオチドトリホスフェート及び１単位／μl   ＲＮＡポリメラーゼである。反応は３７℃において２時間インキュベートする。
転写プロトコールを用いて、修飾ヌクレオチドを有するＲＮＡを生成する。この転写反応はヌクレオチドトリホスフェート誘導体によってプライムされることができ（修飾５’末端を形成するため）、修飾ヌクレオチドを新生ＲＮＡ鎖に、又はＲＮＡ生成物の５’末端若しくは３’末端に連結したオリゴヌクレオチド若しくはそれらの誘導体にランダムに組み入れることができる。
プライマー伸長抑制．  プライマー伸長抑制をHartz 等（１９８８）（上記文献）が開示するように実施する。簡単には、候補混合物のオリゴヌクレオチドを蒸留水中で６５℃において３分間、２倍モル過剰のプライマーと共にインキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドプライマーを候補混合物のオリゴヌクレオチドの３’末端にアニールする。このアニーリング反応を氷上で冷却し、その後に１／１０量の１０ｘ濃縮伸長用バッファー（例えば、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、６０mM  ＮＨ４Ｃｌ、１０mM  酢酸Ｍｇ、６mM  β−メルカプトエタノール、及び０．４mMヌクレオチドトリホスフェート）を添加する。ポリメラーゼの添加と、０〜８０℃の範囲内の種々な温度のいずれかにおける数秒間から数時間までの範囲内の時間のインキュベーションとによって、プライマー伸長が開始される。本発明の方法の１実施態様では、低アフィニティ核酸が連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを優先的に組み入れるように、これらの連鎖ターミネーターの存在下でプライマー伸長を最初に実施する。次に、高アフィニティ核酸から標的を除去し、連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを除去した後に、第２プライマー伸長を実施する。
ポリメラーゼ連鎖反応．  一本鎖又は二本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチド鋳型をバッファー（５０mM  ＫＣｌ、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．６）、２．５mM  ＭｇＣｌ２、１．７mg／ml  ＢＳＡ、１mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び１μM プライマー）中で１単位／μl 熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートすることによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が達成される。標準熱サイクルは９５℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、及び７２℃１分間であり、これを必要に応じて繰り返す。ＰＣＲプロトコールの１改良方法は、一本鎖又は二本鎖の鋳型を単一種の細長いプライマーのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって一本鎖ＤＮＡを生成し、細長い生成物を生じる。ＰＣＲは上記プライマー伸長工程によって増幅可能にされるオリゴヌクレオチドを優先的に増幅する。
（Ｎ−アクリロイルアミノ）フェニル水銀ゲル電気泳動．  Ｎ−アクリロイルアミンフェニル水銀（ＡＰＭ）を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動をＩｇｌｏｉ（１９８８），Biochemistry  ２７：３８４２が開示するように実施した。酢酸（ｐ−アミノフェニル）水銀（０．３５ｇ）にアセトニトリル（８ml）を０℃において混合し、次に１．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（２ml）を加えることによって、ＡＰＭを合成した。次に、塩化アクリロイル（全体で０．２ml）を激しく撹拌しながら加え、反応を４℃において一晩インキュベートした。固相を遠心分離によって回収し、水で洗浄し、ジオキサン（８．５ml）中で５０℃に加温することによって溶解した後に、濾過して、不溶な汚染物を除去した。室温での放置中にＡＲＭ結晶が形成され、この固体を再び水で洗浄し、真空下で乾燥させた。ＡＲＭを４℃において保存した。所定量のアクリルアミド、ビス（アクリルアミド）、尿素を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓボレート／ＥＤＴＡ（pH８．３）中に含む溶液に、ホルムアミド中ＡＰＭの１mg／ml溶液の適当なアリコートを加えることによって、ＡＰＭポリアクリルアミドゲルを調製した。ゲル溶液１０mlにつき１％過硫酸アンモニウム（０．５ml）とＴＥＭＥＤ（７μl ）とを加えることによって、重合を開始させた。
【０１２８】
実施例２２．  酵素的又は化学的分解溶液ＳＥＬＥＸ．
酵素又は化学薬品を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡのプールを選択的に分解することができる。本発明の１実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡのプールを選択的に分解する。一本鎖ＤＮＡを開裂する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的な配列において、異なる効率で開裂する。
制限酵素の消化は多様な、配列特異性の制限エンドヌクレアーゼによって実施することができる。一本鎖ＤＮＡを開裂するエンドヌクレアーゼには、ＤｄｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｎＩＩ、ＰｓｔＩ及びＲｓａＩがある。これらの酵素は分子生物学の分野に熟練した人に周知の標準条件下で用いられる。核酸制限配列と部位特異性制限ヌクレオチドとの適当な組合せを用いて、二本鎖核酸を開裂することもできる。
基本的な溶液ＳＥＬＥＸ操作は、ＳＥＬＥＸ特許出願に述べられているように、実施される。４個のｄＮＴＴの存在下で最初のｃＤＮＡ伸長を実施し、次に標的を除去する。制限エンドヌクレアーゼによる酵素開裂に耐性である修飾ヌクレオチドによって第２ｃＤＮＡ伸長を実施する。ｃＤＮＡ伸長生成物の混合物を適当な制限酵素と共にインキュベートする。遊離核酸からの第１ｃＤＮＡ伸長生成物を開裂して、プライマーアニーリング部位を除去し、このｃＤＮＡプールをＰＣＲによって増幅不能にする。制限エンドヌクレアーゼによる開裂の効率は、制限部位（ＲＳ）にヘアピンを用いて、図２４に示すように局在二本鎖領域を形成することによって改良することができる。
或いは、第１ｃＤＮＡ伸長生成物を修飾ヌクレオチドの組み入れによって他のクラスの酵素によっても選択的に分解可能にする。例えば、低アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼに感受性のヌクレオチドによって合成することができ、高アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡは耐性ヌクレオチドを組み入れることができる。
低アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡの化学分解は、ピペリジンを用いた、上述のような７−メチルグアノシン、５−ブロモウラシル若しくは５−ヨードウラシルの組み入れ、又は光分解によって達成することができる（Sasse −DwightとGralla（１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：１４６；Aigen とGumport （１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：４３３；Hockensmith 等（１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：２１１）。
【０１２９】
実施例２３．  アフィニティクロマトグラフィーを伴う溶液ＳＥＬＥＸ．
第１ｃＤＮＡ伸長生成物又は第２ｃＤＮＡ伸長生成物のいずれかの選択的除去はアフィニティクロマトグラフィーによって達成することができる。第１ｃＤＮＡ伸長生成物の除去は遊離核酸又は低アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡプールを除去する。第２ｃＤＮＡ伸長生成物の除去は高アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡを保留する。この手法はｃＤＮＡ合成中の修飾ヌクレオチドの組み入れに基づく。
第１伸長生成物の選択的除去．  基本的溶液ＳＥＬＥＸプロトコール後に、アフィニティマトリックス上への第１ｃＤＮＡプールの保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド）の存在下で、第１ｃＤＮＡ伸長を実施する（図２５）。次に、標的を除去し、第２ｃＤＮＡ伸長を非修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。修飾ヌクレオチドを組み入れたｃＤＮＡを対応アフィニティリガンドを含むカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって取り出すことができる。標的に対して高いアフィニティを有する核酸に対応するｃＤＮＡプールは残留し、ＰＣＲによって増幅される。
第２伸長生成物の選択的除去．  基本的溶液ＳＥＬＥＸプロトコール後に、第１ｃＤＮＡ伸長を４個のｄＮＴＴの存在下で実施し、上述のようにアフィニティマトリックス上への第２ｃＤＮＡプールの保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド）の存在下で、第２ｃＤＮＡ伸長を実施する。
アフィニティマトリックスへのアニーリングのための非反復配列の組み入れ．
本発明の方法の代替え実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特別な配列を選択的に組み入れることもできる。したがって、上述のように、商業的に入手可能なマトリックス上で、第１又は第２合成ｃＤＮＡを遅延させ、精製することができる。
【０１３０】
実施例２４．  エキソヌクレアーゼ阻害溶液ＳＥＬＥＸ
エキソヌクレアーゼ阻害を用いて、二本鎖リガンドを単離することができる。標的分子に緊密に結合した二本鎖核酸リガンドは結合部位の３’末端においてエキソヌクレアーゼ加水分解を阻害する。これは、長い一本鎖５’オーバーハング(overhang)と中央塩基対領域とも含む、加水分解に耐性な核酸分子群を生じる（図２６参照）。この核酸分子は任意のポリメラーゼに対する基質であり、ポリメラーゼと共のインキュベーションは二本鎖出発物質を生成する。この分子をＰＣＲによって増幅する。標的分子に緊密に結合しない、核酸候補混合物の要素は初期エキソヌクレアーゼ工程中に消化される。
二本鎖核酸の３’→５’加水分解は任意の二本鎖特異性３’→５’エキソヌクレアーゼと共のインキュベーションによって達成される。エキソヌクレアーゼIII は二本鎖ＤＮＡ３’→５’を特異的に加水分解して、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０），５mM  ＭｇＣｌ２、１０mM  β−メルカプトエタノールを含む、種々なバッファー中で３７℃において活性である。
【０１３１】
実施例２５．  触媒核酸を単離するための溶液ＳＥＬＥＸ方法
溶液ＳＥＬＥＸを用いて、触媒核酸配列を単離することができる。本発明のこの実施態様は線状から環状への転換(transformation)を利用して、触媒核酸から非触媒核酸を分類する。
図２７に示すように、ＰＣＲ工程を利用して、核酸候補混合物を触媒要素に関して選別することができる。自己環化するか、又はそれらの５’末端若しくは３’末端をリガーゼによる環化を可能にするように変える触媒核酸をＰＣＲによって増幅する。この図は候補混合物の触媒要素による環形成を説明する；候補混合物の非触媒要素は線状に留まる。環化後に、５’末端にアニールするプライマーと共に、候補混合物をインキュベートする。本発明のこの実施態様では、環状オリゴヌクレオチド要素のみがｃＤＮＡを生成し、ＰＣＲ工程中に増幅される。
この手法は、自己環化を直接触媒するか又は、リガーゼと共にインキュベーションによって増幅可能な形状が生ずるように、それら自身の末端を変える核酸を単離する。図２７に示すように、ｃＤＮＡプライマーと候補混合物のオリゴヌクレオチドの５’末端との特別な相互作用が環状分子のみの増幅を可能にする。本発明の方法の他の実施態様では、この手法を変更して、新規な反応を触媒する触媒核酸の単離を可能にする。
【０１３２】
実施態様２６．  溶液ＳＥＬＥＸの自動化
この自動化溶液ＳＥＬＥＸプロトコールは自動化ＤＮＡ合成装置に用いられる方法の変更である。ビオチン／アビジン相互作用又は多様な共有結合クロマトグラフィー方法のいずれかによって、核酸候補混合物を固体サポートに結合させる（例えば、マレイミド又は無水シトラコン酸サポートへの修飾ヌクレオチドの縮合）。結合した核酸候補混合物は目標の結合のために良好な基質を提供し、カラムはＳＥＬＥＸ操作のための単一反応器の使用を可能にする。プライマー伸長抑制を利用して、低アフィニティリガンドと高アフィニティリガンドとを物理的に選別する。低アフィニティ核酸は、実施例２２に述べたようにｃＤＮＡを分解可能にする、第１ｃＤＮＡ伸長工程中の修飾塩基の組み入れによって分解されることができ、高アフィニティリガンドは分解不能なｃＤＮＡにコピーされ、ＰＣＲによって増幅される。溶液ＳＥＬＥＸの付加的ラウンドでは、任意に同じ又は異なる反応器において、ＰＣＲ形成候補混合物を精製するか、又はＲＮＡに転写し、第２固体サポートに再結合させる。このプロセスを必要に応じて繰り返す。
【０１３３】
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：Gold, Larry
Wills, Michael
Koch, Tad
Ringquist, Steven
Jensen, Kirt
Atkinson, Brent
（ii）発明の名称：  指数関数的富化によるリガントの系統的進化：核酸リガントの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ
（iii)配列数：  ６４
（iv）通信住所：
（Ａ）  住所：Swanson ＆Bratschun, L. L. C.
（Ｂ）  通り：８４００Ｅ．  Prentice Place, Suite ２００
（Ｃ）  町：イングルウッド
（Ｄ）  州：コロラド
（Ｅ）  国：米国
（Ｆ）  郵便番号：８０１１１
（ｖ）コンピューター読み取り可能形式
（Ａ）媒体型：ディスケット，５．２５インチ，３６０Kb，ストレージ
（Ｂ）コンピューター：  ＩＢＭ
（Ｃ）操作システム：  ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：  ワードパーフェクト  ５．１
（vi）本出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii)先行出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／１２３，９３５
（Ｂ）出願日：  １９９３年９月１７日
（vii)先行出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／１４３，５６４
（Ｂ）出願日：  １９９３年１０月２５日
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）名前：  Barry J. Swanson
（Ｂ）登録番号：３３，２１５
（Ｃ）参考文献／ドケット番号：ＮＥＸ１０／ＰＣＴ
（ix）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：（３０３）７９３−３３３３
（Ｂ）ＦＡＸ：（３０３）７９３−３４３３
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは５−ブロモウラシルである
（xi）配列：配列番号：１：
2006129870.tif 000003
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは５−ヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：２：
2006129870.tif 000004
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは結合水素分子である
（xi）配列：配列番号：３：
2006129870.tif 000005
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：全てのＵは５−ヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：４：
2006129870.tif 000006
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５：
2006129870.tif 000007
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６：
2006129870.tif 000008
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：７：
2006129870.tif 000009
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：８：
2006129870.tif 000010
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：９：
2006129870.tif 000011
（２）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１０：
2006129870.tif 000012
（２）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１１：
2006129870.tif 000013
（２）配列番号：１２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１２：
2006129870.tif 000014
（２）配列番号：１３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１３：
2006129870.tif 000015
（２）配列番号：１４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１４：
2006129870.tif 000016
（２）配列番号：１５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１５：
2006129870.tif 000017
（２）配列番号：１６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１６：
2006129870.tif 000018
（２）配列番号：１７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１７：
2006129870.tif 000019
（２）配列番号：１８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１８：
2006129870.tif 000020
（２）配列番号：１９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１９：
2006129870.tif 000021
（２）配列番号：２０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２０：
2006129870.tif 000022
（２）配列番号：２１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２１：
2006129870.tif 000023
（２）配列番号：２２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２２：
2006129870.tif 000024
（２）配列番号：２３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２３：
2006129870.tif 000025
（２）配列番号：２４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２４：
2006129870.tif 000026
（２）配列番号：２５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２５：
2006129870.tif 000027
（２）配列番号：２６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２６：
2006129870.tif 000028
（２）配列番号：２７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２７：
2006129870.tif 000029
（２）配列番号：２８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２８：
2006129870.tif 000030
（２）配列番号：２９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２９：
2006129870.tif 000031
（２）配列番号：３０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３０：
2006129870.tif 000032
（２）配列番号：３１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３１：
2006129870.tif 000033
（２）配列番号：３２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３２：
2006129870.tif 000034
（２）配列番号：３３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３３：
2006129870.tif 000035
（２）配列番号：３４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３４：
2006129870.tif 000036
（２）配列番号：３５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３５：
2006129870.tif 000037
（２）配列番号：３６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３６：
2006129870.tif 000038
（２）配列番号：３７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３７：
2006129870.tif 000039
（２）配列番号：３８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３８：
2006129870.tif 000040
（２）配列番号：３９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３９：
2006129870.tif 000041
（２）配列番号：４０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４０：
2006129870.tif 000042
（２）配列番号：４１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４１：
2006129870.tif 000043
（２）配列番号：４２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４２：
2006129870.tif 000044
（２）配列番号：４３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４３：
2006129870.tif 000045
（２）配列番号：４４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４４：
2006129870.tif 000046
（２）配列番号：４５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４５：
2006129870.tif 000047
（２）配列番号：４６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４６：
2006129870.tif 000048
（２）配列番号：４７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４７：
2006129870.tif 000049
（２）配列番号：４８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４８：
2006129870.tif 000050
（２）配列番号：４９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４９：
2006129870.tif 000051
（２）配列番号：５０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５０：
2006129870.tif 000052
（２）配列番号：５１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５１：
2006129870.tif 000053
（２）配列番号：５２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５２：
2006129870.tif 000054
（２）配列番号：５３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５３：
2006129870.tif 000055
（２）配列番号：５４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５４：
2006129870.tif 000056
（２）配列番号：５５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５５：
2006129870.tif 000057
（２）配列番号：５６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１と２０におけるＮは１−２相補的塩基対を示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置３におけるＮは１または３ヌクレオチドを示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１０と１２におけるＮは１−４相補的塩基対を示す
（ix）特徴：（Ｄ）その他の情報：位置１１におけるＮは４又は５ヌクレオチドを示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５６：
2006129870.tif 000058
（２）配列番号：５７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５７：
2006129870.tif 000059
（２）配列番号：５８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５８：
2006129870.tif 000060
（２）配列番号：５９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５９：
2006129870.tif 000061
（２）配列番号：６０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６０：
2006129870.tif 000062
（２）配列番号：６１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６１：
2006129870.tif 000063
（２）配列番号：６２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６２：
2006129870.tif 000064
（２）配列番号：６３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６３：
2006129870.tif 000065
（２）配列番号：６４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６４：
2006129870.tif 000066
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は核酸に組み入れられた光反応性発色団の構造を示す。
【図２】図２は５−ブロモウラシル発色団のJablonski エネルギーレベル線図と種々な励起状態の反応性とを示す。
【図３−１】図３−１は例えばチロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンのようなアミノ酸残基に対する５−ブロモウラシル発色団の光架橋のモデル反応を示す。
【図３−２】図３−２は例えばチロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンのようなアミノ酸残基に対する５−ブロモウラシル発色団の光架橋のモデル反応を示す。
【図４】図４はＴＭＫ  pH８．５バッファー（１００mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、１０mM酢酸マグネシウム、及び８０mM塩化カリウム）中のチミジン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及びＬ−トリプトファンによるＵＶ吸収を比較する。ＸｅＣｌ及びＨｅＣｄレーザーの発光波長も示す。トリプトファン又はチミジンの吸収を伴わない、３２５nmにおける５−ヨードウラシルによる吸収が特に重要である。３２５nmにおける５−ヨードウラシルのモル吸光係数は１６３Ｌ／mol ・cmである。
【図５−１】図５−１はランダム化核酸配列に組み入れることができる光反応性発色団の構造を示す。
【図５−２】図５−２はランダム化核酸配列に組み入れることができる光反応性発色団の構造を示す。
【図６】図６は、それぞれ、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及びウラシルを含むヘアピンＲＮＡ配列  ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の構造を示す。これらは、Ｒ１７コートタンパク質に緊密に結合するＲ１７バクテリオファージゲノムの野生型ヘアピンの変異体である。
【図７】図７はＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の結合曲線を示す。結合曲線から算出した結合定数も記載する。
【図８】図８はＸｅＣｌエキシマーレーザーからの３０８nmでの単色光照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。照射期間中のコートタンパク質への競合光損傷のためにＲＮＡ−１（配列番号：１）の光架橋は４０％において最大化した。ＲＮＡ−２（配列番号：２）によっては、より短い照射時間のためにコートタンパク質へのより軽度の光損傷が生じた。
【図９】図９はＸｅＣｄレーザーからの３２５nmでの単色光照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。データをオリジナル電気泳動ゲルフォーマットにおいても示す。記号ＩＵＸＬはタンパク質に架橋したＲＮＡを特徴づける。光架橋の近似定量的収量が得られた。
【図１０】図１０はトランスイルミネーターからの３１２nm領域における広帯域照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。タンパク質と恐らくはＲＮＡ配列に対する光損傷のために定量的収量未満の光架橋が得られた。
【図１１】図１１は過剰なＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミド（構造５）の存在下での５−ヨードウラシルと５−ブロモウラシルとの３０８nmにおける照射からの同じ生成物（構造６）の形成を示す。
【図１２−１】図１２−１は、コートタンパク質の大部分の酵素消化を伴う、３０８nm光線によるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−７（配列番号：４）の光架橋を示す。
【図１２−２】図１２−２は、コートタンパク質の大部分の酵素消化を伴う、３０８nm光線によるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−７（配列番号：４）の光架橋を示す。
【図１３】図１３は図１２のコートタンパク質（配列番号：４）の酵素消化後のＲＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡの形成を示す。
【図１４】図１４は、図１２及び図１３に示したように、修飾ヌクレオチド含有ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの生成を示す実施例８のポリアクリルアミドゲルを示す。修飾ヌクレオチドは小ペプチドによって５−位置において置換した５−ヨードウラシルとウラシルとであった。図１１に示したモデル構造に基づくと、ペプチドはチロシン残基のフェノール環を介してウラシルに結合する可能性が大きかった。
【図１５】図１５はｔＲＮＡ競合を用いた、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質への〔α−３２Ｐ〕ＧＴＰ標識プールＲＮＡの光架橋を示す。
【図１６−１】図１６−１（配列番号：５〜２１）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１６−２】図１６−２（配列番号：２２〜４０）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１６−３】図１６−３（配列番号：４１〜５５）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１７】図１７（配列番号：５６〜５７）はクラス１リガンドとクラス２リガンドとの共通配列を示す。クラス１：クラス１及びクラス２分子の共通二次構造。Ｎ１−Ｎ１’は１−２相補的塩基対を意味し；Ｎ２−Ｎ２’は１−４相補的塩基対を意味し、Ｄ−Ｈ’はＡ−Ｕ、Ｕ−Ａ又はＧ−Ｃ塩基対であり；Ｋ−Ｍ’はＧ−Ｃ又はＵ−Ａ塩基対である（１６）。クラス２：太線(bold)配列はクラス２分子を特徴づける高度に保存された１０ヌクレオチドを表す；塩基対合は分子の５’固定端部を含む。
【図１８Ａ】図１８Ａ（配列番号：５８）はtrunc ２の配列と予測二次構造とを示す。
【図１８Ｂ】図１８ＢはＡＲＭタンパク質へのtrunc ２光架橋の特異性を実証するゲルを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａはtrunc ２４（配列番号：５９）の配列と予測二次構造とを示す。
【図１９Ｂ】図１９ＢはＡＲＭタンパク質へのレーザー独立性架橋の特異性を実証するゲルを示す。
【図２０】図２０はヒト核抽出物の存在下でのＨＩＶ−１  Ｒｅｖとのtrunc ２４（配列番号：５９）光独立性架橋を示す。
【図２１】図２１はＳＥＬＥＸ工程間のサイクル的関係を説明する。核酸合成装置上での確立された方法によって候補オリゴヌクレオチドの一本鎖核酸レパートリーを調製し、ＰＣＲによって増幅して、二本鎖ＤＮＡ分子集団を製造する。それぞれ、非対称ＰＣＲ又は転写によって、候補ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を製造して、精製し、標的分子と複合体化させる。この後に、結合核酸と非結合核酸とを分割し、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅して、二本鎖ＤＮＡを製造する。
【図２２】図２２は、プライマー伸長抑制を利用して、識別可能なｃＤＮＡプール−増幅可能な高アフィニティオリゴヌクレオチドｃＤＮＡプール及び増幅不能な低アフィニティオリゴヌクレオチドｃＤＮＡプールを形成する、溶液ＳＥＬＥＸの１実施態様を説明する。この実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長は例えばｄｄＧのような連鎖停止ヌクレオチドの存在下で実施する。標的分子とジデオキシヌクレオチドとを除去した後に、第２ｃＤＮＡ伸長を４ｄＮＴＰの存在下で実施する。高アフィニティオリゴヌクレオチドから全長ｃＤＮＡが優先的に合成されるため、その後のＰＣＲ工程では高アフィニティｃＤＮＡプールが増幅される。
【図２３】図２３は図２２に示した実施態様に関するサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスを説明する。
【図２４】図２４は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割が制限酵素消化によって達成されるサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。この実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長を４ｄＮＴＰによって実施して、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを生じる。次に標的を除去して、第２ｃＤＮＡ伸長を酵素開裂に対して耐性の修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。次に、このｃＤＮＡプールを制限酵素と共にインキュベートする、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡプールのみがその後のＰＣＲ工程において増幅可能である。
【図２５】図２５は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割がアフィニティクロマトグラフィーによって達成されるサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。第１ｃＤＮＡ伸長を例えばビオチニル化ヌクレオチドのような修飾塩基の存在下で実施する、これは低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡプールをアフィニティカラムに保持させる。
【図２６】図２６は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割がエキソヌクレアーゼ阻害によって達成されて、標的分子に対して高アフィニティを有する二本鎖核酸集団の形成を生じる溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。
【図２７】図２７は、触媒核酸が選択され、単離される溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１９Ａ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月12日(2005.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願）（現在放棄）の一部継続出願である「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／７１４，１３１（１９９１年６月１０日出願）の一部継続として出願された「核酸リガンドの光選択」なる名称の米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９４年９月１７日出願）の一部継続出願である。本出願はまた、「指数関数的富化によるリガンドの系統的展開：溶液ＳＥＬＥＸ」なる名称の米国特許出願第０８／１４３，５６４号（１９９３年１０月２５日出願）の一部継続でもある、この出願自体は米国特許出願第０７／７１４，１４１号の一部継続出願であり、かつ「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願；１９９３年１２月１４日に米国特許第５，２７０，１６３号として発行）の一部継続出願である。
【０００２】
この研究はNational Institutes of Health から資金援助された合衆国政府からの助成金によって支援されたものである。合衆国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一部として、標的分子に結合及び／又は光架橋する及び／又は標的分子を光不活化する核酸リガンドを選択する方法に関する。標的分子はタンパク質、病原菌、毒性物質又は任意の生物学的エフェクターであることができる。本発明の核酸リガンドは光反応性又は化学的反応性基を含み、特に、疾患又は病的状態若しくは中毒状態の診断及び／又は治療のために有用である。
【０００４】
本発明に用いられた基礎的方法はＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)の頭字語）と呼ばれる。溶液ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本明細書に述べる、ＳＥＬＥＸ方法の改良は標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとのより効果的な分割を可能にする。ＳＥＬＥＸの高アフィニティ核酸生成物の改良は、例えば検定方法、診断方法、細胞選別において、標的分子機能の阻害剤、治療剤、金属イオン封鎖剤等として、結合反応が適用される任意の目的に有用である。
【背景技術】
【０００５】
「指数関数的増加によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）、「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）及び「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願、米国特許第５，２７０，１６３号として発行）に開示されたＳＥＬＥＸ方法（以下では、ＳＥＬＥＸと呼ぶ）は、各々が非反復配列(unique sequence) を有し、反復配列の各々が所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である生成物の種類を提供し、これらの出願の全ては個別的に引用することにより本明細書に取込まれる（本明細書ではＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）。各核酸分子は所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が多様な二次元又は三次元構造を形成する充分な容量と、ポリマーであれモノマーであれ、実際に任意の化学化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ために利用可能な、充分な化学的多用性をそれらのモノマー内に有するという特有の洞察に基づくものである。任意のサイズの分子が標的として使用可能である。
【０００６】
ＳＥＬＥＸ方法は、結合アフィニティと選択性との実際に任意の所望の基準に達するために、同じ一般的選択テーマを用いた、候補物(candidate) の混合物からの選択と、構造的改良の段階的反復とを含む。好ましくはランダム化配列のセグメントを含む核酸混合物から出発して、この方法は結合のために有利な条件下で混合物を標的と接触させる工程と、標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分割する工程と、核酸−標的対を解離させる工程と、核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得る工程と、次に、必要なかぎりの多くのサイクルによって、結合、分割、解離及び増幅の工程を再び反復する工程とを含む。
【０００７】
理論によって縛られないが、ＳＥＬＥＸは、多数の可能な配列と構造とを含む核酸混合物内に、所定の標的に対する広範囲な結合アフィニティが存在するという発明者の洞察に基づく。例えば２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は４２０種の候補の可能性を有することができる。標的に対して大きいアフィニティ定数を有するものが標的と結合する最も大きな可能性を有する。分割、解離及び増幅後に、高い結合アフィニティの候補を多く含む、第２核酸混合物が形成される。追加の選択ラウンドが最良のリガンドの形成を促進して、ついには得られる核酸混合物が主として１種のみ又は数種の配列から構成されるまでになる。次に、これらをクローン化し、配列決定し、純粋リガンドとして結合アフィニティに関して個々に検査することができる。
【０００８】
選択、分割及び増幅のサイクルを、所望の目的に達するまで、繰り返す。大抵の一般的な場合には、サイクルの反復時に結合強度の有意な改良がもはや得られなくなるまで、選択／分割／増幅を続ける。この方法を用いて、約１０１８種ほど多くの核酸種のサンプルを形成することができる。試験混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、効果的な増幅のために必要な保存配列とを含む。ランダム化核酸配列の合成と、ランダムに開裂した細胞核酸からのサイズ選択とを含む、幾つかの方法で核酸配列変異体を製造することができる。可変配列部分は完全に又は部分的にランダムな配列を含むことができ；ランダム化配列と合体した保存配列のサブポーション(subportion)も含むことができる。選択／分割／増幅の反復の前に又は中に、突然変異生成によって、試験核酸中の配列変化が導入されるか又は増大することがある。
【０００９】
タンパク質への核酸の光架橋は、核酸中への光反応性官能基の組み入れによって達成されている。会合タンパク質に核酸を光架橋させる目的のために核酸中に組み入れられている光反応性基には、５−ブロモウラシル、４−チオウラシル、５−アジドウラシル、及び８−アジドアデニンがある（図１参照）。
ブロモウラシルは、ブロモデオキシウラシル（ＢｒｄＵ）及びブロモウラシル（ＢｒＵ）を、それぞれ、チミン及びウラシルと置換することによって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に組み入れられている。ＢｒＵ−ＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とを用いて、ウラシルに代わる５−ブロモウリジントリホスフェートによって製造されており、ＢｒＵ−ＲＮＡとＢｒｄＵ−ＤＮＡとは、標準核酸合成法（Talbot等（１９９０），Nucleic Acids Res.１８：３５２１）において５−ブロモウラシルホスホラミジットと５−ブロモデオキシウラシルホスホラミジットとをそれぞれ用いて製造されている。会合タンパク質へのＢｒｄＵ置換ＤＮＡの光架橋の若干の例を下記に挙げる：完全細胞におけるタンパク質へのＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Weintraub （１９７３），Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol.  ３８：２４７）；ｌａｃリプレッサーへのＢｒｄＵ置換ｌａｃオペレーターＤＮＡ（Lin と Riggs（１９７４），Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７１：９４７；Ogata とWilbert （１９７７），Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：４９７３；Barbier 等（１９８４）、Biochemistry  ２３：２９３３；WickとMatthews（１９９１），J. Biol. Chem.２６６：６１０６）；ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼへのＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Wolfs 等（１９８６），Eur. J. Biochem.  １５９：２６７）；環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート受容体タンパク質への大腸菌ＢｒｄＵ置換ＤＮＡ（Katouzian −  Safadi等（１９９１），Photochem. Photobiol. ５３：６１１）；ヒト胎児脳抽出物からのタンパク質への、ヒトポリオーマウイルスのＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Khalili 等（１９８８），ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２０５）；ＧＣＮ４，酵母転写アクチベーターへの酵母ＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Blatter 等（１９９２），Nature  ３５９：６５０）；及び染色体タンパク質Ｍｃ１への、Methanosarcina sp  ＣＨＴ１５５のＢｒｄＵ置換ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Katouzian −Safadi 等（１９９１），Nucleic Acids Res.  １９：４９３７）。会合タンパク質へのＢｒＵ置換ＲＮＡの光架橋も報告されている：酵母ｔＲＮＡリガーゼへのＢｒＵ置換酵母先駆体ｔＲＮＡＰｈｅ（Tanner等（１９８８），Biochemistry  ２７：８８５２）及びＲ１７コートタンパク質へのＲ１７バクテリオファージゲノムのＢｒＵ置換ヘアピンＲＮＡ（Gott等（１９９１），Biochemistry  ３０：６２９０）。
【００１０】
４−チオウラシル置換ＲＮＡは、特に、種々な会合タンパク質にｔ−ＲＮＡを光架橋させるために用いられている（Favre （１９９０），Bioorganic Photochemistry，１巻： Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison編集，John Wiley & Sons ：ニューヨーク，３７９〜４２５頁；Tanner等（１９８８），上記文献）。４−チオウラシルは４−チオウリジントリホスフェートとＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを用いて、又は適当なホスホラミジットによる核酸合成を用いてＲＮＡ中に組み入れられている；これはまた、硫化水素を用いてシトシンのアミノ基をチオール基に変えることによって直接ＲＮＡ中に組み入れられている。核酸への光反応性基の部位特異的組み入れのさらに他の方法は４−チオウリジリル−（３’，５’）−グアノシンの使用を含む（Wyatt 等（１９９２），Genes & Development ６：２５４２）。
【００１１】
会合タンパク質に光架橋する５−アジドウラシル置換及び８−アジドアデニン置換核酸の例も知られている。架橋されている会合タンパク質には、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Evans 等（１９８９），Biochemistry ２８：７１３；Farrar等（１９９１），Biochemistry  ３０：３０７５）；Xenopus   ＴＦＩＩＩＡ，ジンクフィンガータンパク質（Lee 等（１９９１），J. Biol. Chem.  ２６６：１６４７８）；及び大腸菌リボソームタンパク質（Wower 等（１９８８），Biochemistry  ２７：８１１４）がある。５−アジドウラシルと８−アジドアデニンとはＤＮＡポリメラーゼ又は末端基トランスフェラーゼを用いてＤＮＡ中に組み入れられている。タンパク質はまた、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡに結合した８−アジドアデノシン  ３’，５’−ビホスフェート（Wower 等（１９８９），Biochemistry  ２８：１５６３）と、リブロースービホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに結合した８−アジドアデノシン  ５’−トリホスフェート（SalvucciとHaley （１９９０），Planta  １８１：２８７）とを励起させることによって、光化学的にも標識されている。
【００１２】
可能な光反応性基としての８−ブロモ−２’−デオキシアデノシンはホスホラミジットを介してＤＮＡ中に組み入れられている（Liu とVerdine （１９９２），Tetrahedron Lett. ３３：４２６５）。光化学反応性は今後まだ研究されなければならない。
【００１３】
会合タンパク質への５−ヨードウラシル置換核酸の光架橋は今までにまだ研究されていない、この理由はヨード基のサイズが問題のタンパク質への核酸の特異的な結合を妨害するからだと思われる。しかし、５−ヨード−２’−デオキシウラシル及び５−ヨード−２’−デオキシウリジン  トリホスフェートは大腸菌(E. coli）からのチミジンキナーゼに光結合(photocoupling) することが判明している（ChenとPrusoff （１９７７），Biochemistry  １６：３３１０）。
【００１４】
５−ブロモウラシル発色団の光化学反応性の機構的研究が、光架橋に関する研究を含めて、報告されている。最も重要なことには、ＢｒＵは波長依存性光化学を示す。３１０nm領域における照射は基底状態にまで崩壊するｎ，π* 一重項状態を占め、最低エネルギーの三重項状態（Dietz 等（１９８７），J. Am. Chem.Soc.  １０９：１７９３）、最も可能にはπ，π* 三重項（Rothman とKearns （１９６７），Photochem. Photobiol. ６：７７５）に項間交差する。三重項状態は初期電子転移とその後の共有結合形成とを介して、電子富化アミノ酸残基と反応する。電子富化芳香族アミノ酸残基チロシン、トリプトファン及びヒスチジンへ（Ito 等（１９８０），J. Am. Chem. Soc. １０２：７５３５；Dietz とKoch（１９８７），Photochem. Photobiol. ４６：９７１）並びにジスルフィド含有アミノ酸、シスチンへ（Dietz とKoch（１９８９），Photochem.Photobiol.４９：１２１）の三重項５−ブロモウラシルの光架橋が、モデル研究において実証されている。ペプチド結合さえもが三重項ＢｒＵへの光架橋のための可能な官能基である（Dietz 等（１９８７），上記文献）。３０８nmよりも多少短い波長はｎ，π* 及びπ，π* 一重項状態の両方を占める。π，π* 一重項は炭素−臭素結合ホモリシス並びに三重項マニホルドへの項間交差を受ける（Dietz 等（１９８７），上記文献）；項間交差は、一部は、ｎ，π* 一重項状態への内部転換を介して生ずると考えられる。炭素−臭素結合ホモリシスは核酸鎖切断を生じる可能性がある（HutchinsonとKoehnlein （１９８０），Prog. Subcell Biol.７：１；Shetlar （１９８０），Photochem. Photobiol. Rev.  ５：１０５；Saito とSugiyama（１９９０），Bioorganic Photochemistry,１巻：Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison 編集, John Wiley & Sons,ニューヨーク，３１７〜３７８頁）。波長依存性光化学は図２のJablonski 線図に略述し、モデル光架橋反応は図３に示す。
【００１５】
数種のＢｒＵ置換核タンパク質複合体の照射による光架橋の位置が研究されている。ｌａｃリプレッサー−ＢｒｄＵ−ｌａｃ−オペレーター複合体では、チロシン−１７への架橋が確立されている（Allen 等（１９９１），J. Biol. Chem.２６６：６１１３）。古細胞染色体タンパク質ＭＣｌ−ＢｒｄＵ−ＤＮＡ複合体では、トリプトファン−７４への架橋が包含されている。酵母ＢｒｄＵ置換ＤＮＡ−ＧＣＮ４酵母転写アクチベーターでは、アラニン−２３８への架橋が報告されている（Blatter 等（１９９２），上記文献）。この最後の例では、最初にπ，π* 一重項状態を占める核タンパク質を２５４nmにおいて照射した。
【００１６】
５−ヨードウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡ及び５−ヨード−２’−デオキシシトシン置換ＤＮＡについての反応性の一部の研究と機構的研究とは報告されている。５−ヨードウラシルと５−ヨード−２’−デオキシウラシルとは、過剰なシランを含むアセトニトリル−水中での、パイレックス（登録商標）ガラスを通して濾過した中圧水銀灯からの発光(emission)による照射時にアリルシランに５−位置において結合する；この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスとその後のアリルシランのπ−結合へのラジカル添加とを経て進行することが提案された（Saito 等（１９８６），J. Org. Chem. ５１：５１４８）。
【００１７】
５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡの好気性及び嫌気性光脱ヨウ素(photo-deiodination)は、励起波長の関数として研究されている；２４０nm領域における照射による量子収量に較べて、３１３nm領域における照射によると固有量子収量が四分の一に低下する。全ての波長において、この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスを含むと考えられている（RahnとSellin（１９８２），Photochem. Photobiol. ３５：４５９）。同様に、炭素−ヨウ素結合ホモリシスは５−ヨード−２’−デオキシウラシル置換ＤＮＡの３１３nmにおける照射時に生ずると考えられている（RahnとStafford（１９７９），Photochem.Photobiol.３０：４４９）。これらの研究のいずれにおいても、厳密に、単色光は用いられなかった。最近、５−ヨードウラシル置換二本鎖ＤＮＡが光化学的一本鎖切断を受けることが判明した（Sugiyama等（１９９３），J. Am. Chem. Soc. １１５：４４４３）。
【００１８】
３５０〜４００nmの領域におけるそれぞれのＳ０→Ｔ吸収帯の照射から、５−ブロモウラシルと５−ヨードウラシルとの三重項状態の直接の占有(population)が観察されたことは本発明に関しても重要である（Rothman とKearns（１９６７），上記文献）。
【００１９】
４−チオウラシル発色団の光物理学研究は反応性状態としてπ，π* 三重項状態を包含する。項間交差量子収量は１又は１に近似する。４−チオウラシル置換核タンパク質複合体内の光架橋が観察されているが、励起４−チオウラシルと反応性であるアミノ酸残基はまだ同定されていない（Favre （１９９０），上記文献）。６−位置における励起４−チオウラシルへのリシンのα−アミノ基の付加が報告されている；しかし、α−アミノ基はペプチド結合に含まれるので、この反応が核タンパク質複合体内の光架橋に重要であるとは考えられない（Ito 等（１９８０），Photochem. Photobiol. ３２：６８３）。
【００２０】
会合タンパク質へのアジド含有ヌクレオチド又は核酸の光架橋は一重項及び／又は三重項ニトレンの形成を介して進行すると考えられる（BayleyとKnowles （１９７７），Methods Enzymol.  ４６：６９；Czarnecki 等（１９７９），Methods Enzymol.  ５６：６４２；Hanna 等（１９９３），Nucleic Acids Res.２１：２０７３）。共有結合形成はＯ−Ｈ、Ｎ−Ｈ又はＣ−Ｈ結合におけるニトレンの挿入から生ずる。一重項ニトレンは優先的にヘテロ原子−Ｈ結合に入り、三重項ニトレンはＣ−Ｈ結合に入る。一重項ニトレンは求核付加反応を受けやすいアジリンに転位することもできる。タンパク質の求核性部位が隣接する場合には、この経路を介して架橋が生ずることも可能である。アジド官能基が環窒素に対してオルトに存在する場合には、アジド官能基の使用によって可能な問題が生ずる；アジドは非常に低光反応性であるテトラゾールと平衡して存在する。
【００２１】
Ｒ１７バクテリオファージのコートタンパク質−ＲＮＡヘアピン複合体は、インビトロにおけるこの系の簡単さのために、核酸−タンパク質光架橋の研究のために理想的な系である。この系は充分に特徴づけられており、ファージゲノム内のＲＮＡヘアピンに高アフィニティで結合するウイルスコートタンパク質から成る。インビボにおいて、コートタンパク質とＲＮＡヘアピンとの相互作用はファージ感染中に２つの役割を果たす：コートタンパク質はレプリカーゼ合成の翻訳リプレッサーとして役立ち（EggensとNathans （１９６９），J. Mol. Biol. ３９：２９３）、この複合体はキャプシド封入(encapsidation) のための核形成部位としても役立つ（Ling等（１９７０）Virology  ４０：９２０；Beckett 等（１９８８），J. Mol. Biol. ２０４：９３９）。野生型ヘアピン配列の多くの変形も高アフィニティでコートタンパク質に結合する（Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：５０５；Gott等（１９９１），Biochemistry  ３０：６２９０；Schneider 等（１９９２），J. Mol. Biol. ２２８：８６２）。ＳＥＬＥＸ方法による核酸リガンドの選択は、例えば物理的特徴に基づくような、種々な方法で達成することができる。物理的特徴に基づく選択は物理的構造、電気泳動移動度、溶解度及び分割挙動（partitioning behavier ）を含むことができる。特に本明細書に引用により取込まれる、「構造に基づく核酸の選択方法」なる名称の米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願）は、特異的な電気泳動挙動に基づく核酸配列の選択を開示する。ＳＥＬＥＸ手法は、例えばＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、一般的なクロマトグラフィー方法、特定溶剤中の溶解度又は２相間の分割のような、他の選択方法と組合せて用いることもできる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、１実施態様において、標的分子に結合及び／又は光架橋するランダム化核酸配列の能力に基づいて、ランダム化核酸配列の候補混合物から核酸リガンドを選択し、同定する方法を含む。この実施態様は一般に共有ＳＥＬＥＸと呼ばれ、特に、核酸リガンドと標的との間に共有結合を形成するために照射が必要である場合には、光ＳＥＬＥＸと呼ばれる。
【００２３】
この実施態様の１変形では、この方法は光反応性基を含む核酸配列の候補混合物を調製し；候補混合物を標的分子と接触させて、標的分子に対して高いアフィニティを有する核酸配列を標的分子と結合させ、核酸−標的分子複合体を形成し；核酸−標的分子複合体を照射して、核酸−標的分子複合体に組み入れられた一部の核酸を光反応性官能基を介して標的分子に架橋させ；この共有結合を利用して、候補混合物中の遊離核酸から架橋核酸−標的分子複合体を分割し；標的分子に光架橋した核酸配列を同定することを含む。このプロセスは標的分子に光架橋した核酸を増幅して、標的分子に光架橋することができる配列に富化した核酸混合物を得る反復工程をさらに含むことができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明のこの実施態様の他の変形では、ＳＥＬＥＸによって選択した、標的分子に対する核酸リガンドを、標的に架橋するそれらの能力に関して、さらに選択する。光反応性基を含まない、標的分子に対する核酸リガンドを最初にＳＥＬＥＸ方法によって同定する。次に、これらの選択した核酸リガンドに光反応性基を組み入れて、リガンドを標的分子に接触させる。核酸−標的分子複合体を照射し、標的分子に光架橋することができる核酸を同定する。
【００２５】
本発明のこの実施態様の他の変形では、候補混合物の核酸配列におけるあらゆる可能な位置に光反応性基を組み入れる。例えば、５−ヨードウラシルと５−ヨードシトシンとを全てのウラシル位置とシトシン位置とに置換代入することができる。標的分子に光架橋することができるような核酸配列に関して選択が生ずるように、核酸−標的分子複合体の照射によって第１回選択ラウンドを実施する。次に、標的分子に光架橋することができる核酸配列によってＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に最良に結合することができる架橋配列を選択する。
【００２６】
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含む核酸配列を照射なしの数回のラウンドでＳＥＬＥＸによって選択して、標的分子に対して部分的に強化したアフィニティを有する候補混合物を得る。次に、光ＳＥＬＥＸを照射によって実施して、標的分子に光架橋することができるリガンドを選択する。
【００２７】
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含まない核酸配列によってＳＥＬＥＸを完成するまで実施して、標的分子に対する核酸リガンドを選択する。選択したリガンドの配列に基づいて、各ヌクレオチド位置に単一光反応性基を含む関連核酸配列のファミリーを形成する。光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
【００２８】
本発明のこの実施態様の他の変形では、標的分子への結合及び／又は架橋によって標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドをＳＥＬＥＸ、光ＳＥＬＥＸ、又はこれらの方法の組合せによって選択する。
【００２９】
本発明のこの実施態様の他の変形では、特定疾患の経過に関連した固有標的分子に対する核酸リガンドを同定する。本発明のこの実施態様のさらに他の変形では、疾患状態に関連した標的分子に対する核酸リガンドを用いて、インビボにおける疾患を治療する。
【００３０】
本発明はさらに、光反応性基を含む核酸配列を包含する。この核酸配列は単一又は多重の光反応性基を含むことができる。さらに、これらの光反応性基は単一核酸配列において同一でも異なるものでもよい。本発明の核酸中に組み入れられる光反応性基は、照射時に標的分子と架橋を形成することができる任意の化学基を含む。但し、場合によっては、架橋の生成のために照射が不要であることもある。
【００３１】
本発明の核酸は一本鎖及び二本鎖ＲＮＡと一本鎖及び二本鎖ＤＮＡとを含む。本発明の核酸は２’−アミノ（２’−ＮＨ２）又は２’−フロロ（２’−Ｆ）−修飾ヌクレオチドのような修飾基を含むことができる。本発明の核酸はさらにバックボーン修飾を含むことができる。
【００３２】
本発明はさらに、修飾核酸を含む候補混合物を調製し、ＳＥＬＥＸプロセスに用いて、標的種に結合又は架橋する核酸リガンドを同定する方法を含む。この実施態様の１実施例では、候補混合物は全てのウラシル残基が５−ハロゲン化ウラシル残基によって置換された核酸から構成され、選択された標的に共有結合を形成する核酸リガンドが同定される。
【００３３】
溶液ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本発明の付加的実施態様は、溶液中で、分割マトリックスを用いずに又は用いる前に達成される、高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体とを有するリガンドを分割する幾つかの改良方法を提供する。一般に、溶液ＳＥＬＥＸ方法の重要なテーマは、核酸候補混合物を溶液中で処理して、最高アフィニティ核酸リガンド又は触媒ＲＮＡのＰＣＲ中の優先的増幅を生じることである。溶液ＳＥＬＥＸ方法は下記方法を含めた、幾つかの方法を介して高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体との分割を達成する：（１）最高アフィニティリガンドがＰＣＲ中に選択的に増幅されるように、識別可能なｃＤＮＡ生成物を生じるプライマー伸長抑制。プライマー伸長抑制はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを含む核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素及びＱβ−レプリカーゼの使用によって達成される。（２）この場合も、ＰＣＲ中に最高アフィニティリガンド増幅のみを生じるエンドヌクレアーゼ加水分解抑制。これは任意の３’→５’二本鎖エキソヌクレアーゼの使用によって達成される。（３）ＰＣＲ中に最高アフィニティリガンドのみの増幅を生じる識別可能なｃＤＮＡ分子を得るための線状〜環状形成。
【００３４】
溶液ＳＥＬＥＸ方法の１実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに相当するｃＤＮＡ合成が優先的にブロックされ、ＰＣＲによる増幅が不能になる。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅の前にアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に除去する。或いは、高アフィニティオリゴヌクレオチドをアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に取り出すことができる。ＳＥＬＥＸ方法のさらに他の実施態様では、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを選択的にヌクレアーゼ酵素消化に耐性にする。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを選択的に酵素的又は化学的に分解可能にする。
【００３５】
溶液ＳＥＬＥＸは先行技術の分割スキームを凌駕する改良である。本発明の方法によると、分割マトリックスに対するアフィニティのみを有するリガンドを偶発的に選択することなく分割を達成し、分割の速度及び精度を増強し、この手順を容易に自動化することができる。
【００３６】
本発明の開示は本発明を具体化し、例示する非限定的実施例を提供する。標的分子への結合及び光架橋によって核酸リガンドを選択する他の分割スキーム及び方法は、本発明の開示から、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ方法の変形を含む。本出願は、初期ＳＥＬＥＸ特許出願に記載された定義、特に米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）及び第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）に記載された定義を含む明細書全体を引用によって個別的に取込んでいる。共有結合ＳＥＬＥＸ又は光ＳＥＬＥＸと呼ばれる、本発明の１実施態様の方法は標的分子に結合及び／又は光架橋することができる核酸リガンドを同定し、選択する。
【００３８】
本出願はまた、ＳＥＬＥＸ方法によって同定される核酸リガンドの改良分割方法を提供する。
【００３９】
ＳＥＬＥＸ方法は、その最も基本的な形式で、次の一連の工程によって定義されることができる：
（１）異なる配列の核酸から成る候補混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列領域（すなわち、候補混合物の各要素が同じ位置に同じ配列を含む）とランダム化配列領域とを含む。固定配列領域は（ａ）下記増幅工程を容易にするように；（ｂ）標的に結合すると判明した配列を模倣するように；又は（ｃ）候補混合物中で核酸が所定の構造配置を占める可能性を強化するように選択される。ランダム化配列は全体的にランダム化することができる（すなわち、任意の位置に塩基を発見する確率は四分の一である）又は一部のみをランダム化することができる（例えば、任意の位置に塩基を発見する確率は０〜１００％の任意のレベルで選択することができる）。
（２）標的と候補混合物の要素との結合に有利な条件下で、候補混合物を特定標的と接触させる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸との相互作用が、標的と、標的に対して最強アフィニティを有する核酸との間に核酸−標的対を形成すると考えられる。
（３）標的に対して最高アフィニティを有する核酸を標的に対して最低アフィニティを有する核酸から分割する。最高アフィニティ核酸に対応するごく少数の配列（及び恐らくは１分子のみの核酸）が候補混合物中に存在するので、候補混合物中の有意な量（約５〜１０％）が分割中に保持されるように分割基準を設定することが一般に望ましい。
（４）次に、標的に対して比較的高いアフィニティを有するものとして分割中に選択される核酸を増幅して、標的に対して比較的高いアフィニティを有する核酸に富化した、新しい候補混合物を形成する。
（５）上記分割工程と増補工程とを繰り返すことによって、新たに形成される候補混合物はますます少ない非反復配列(unique sequence) を含むようになり、標的に対する核酸混合物の平均アフィニティ度は一般に上昇する。ＳＥＬＥＸプロセスは、その究極まで推し進めると、標的分子に対して最高アフィニティを有する、オリジナル候補混合物からの核酸である非反復核酸を１種類又は少ない種類含む候補混合物を生じることになる。
【００４０】
ＳＥＬＥＸ特許出願はこの方法を開示し、さらに非常に詳しく説明する。この方法に使用可能な標的；初期候補混合物の調製方法；候補混合物内の核酸の分割方法；及び分割済み核酸を増幅して、富化候補混合物を形成する方法が含まれる。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質である又は核酸結合タンパク質ではない、両方のタンパク質標的を含む、幾つかの標的種に対して得られたリガンド溶液を述べる。
【００４１】
分割は、標的分子に結合したリガンドを標的分子に結合しない核酸から分離することができる任意のプロセスを意味する。より大ざっぱに述べると、分割は候補混合物中のあらゆる核酸を、標的分子に対するそれらの相対的アフィニティに基づいて、少なくとも２つのプールに分離することを可能にする。当該技術分野に周知の種々な方法によって、分割を達成することができる。核酸−タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合することができるが、非結合核酸はこのフィルターに結合することができない。特異的に核酸−標的複合体を保持するカラムを分割に用いることができる。例えば、カラムに結合した標的分子に会合することができるオリゴヌクレオチドは、最高アフィニティ核酸リガンドを分離し、単離するためにカラムクロマトグラフィーの使用を可能にする。リガンド−リガンド分割は濾過ゲル遅延(filtration gel retardation)、及び密度勾配遠心分離と同様に用いることができる。
【００４２】
Ｉ．光ＳＥＬＥＸ
本発明は、標的分子を結合、光架橋及び／又は光不活化する核酸リガンドを包含する。本明細書に記載する結合とは、一般的に、リガンドと標的との間の共有結合形成を意味するが、このような結合は必ずしも不可逆的ではない。本発明のある一定の核酸リガンドは、光線による照射時に、標的分子に光架橋することができる光反応性基を含む。本発明の付加的な核酸リガンドは照射の不存在下でも標的との結合を形成することができる。
【００４３】
１実施態様では、本発明は一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドである核酸リガンドを包含する。本発明の核酸リガンドは、光線による照射時に、特定標的分子に架橋することができる光反応性基を含むことができる。さらに、本発明は核酸リガンドをその任意の修飾を含めて包含する。本明細書における光反応性基への言及は、核酸残基に大きな反応性又は光反応性を与える、天然核酸残基への比較的簡単な修飾を単純に意味する。このような修飾は、限定する訳ではなく、シトシン環外アミンにおける修飾、ハロゲン化基（例えば、５’−ブロモ−ウラシル若しくは５’−ヨード−ウラシル）による置換、２’−位置における修飾（例えば２’−アミノ（２’−ＮＨ２）又は２’−フルオロ（２’−Ｆ））、バックボーン修飾、メチル化、異常な塩基対組合せ等を含む。例えば、本発明の核酸リガンドは例えば２’−ＮＨ２−ヨードウラシル、２’−ＮＨ２−ヨードシトシン、２’−ＮＨ２−ヨードアデニン、２’−ＮＨ２−ブロモウラシル、２’−ＮＨ２−ブロモシトシン及び２’−ＮＨ２−ブロモアデニンのような修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００４４】
本発明の光ＳＥＬＥＸ方法の１実施態様では、候補混合物と呼ばれる、光反応性基を含む核酸配列のランダム化セットをある量の標的分子と混合して、標的分子との平衡結合を確立させる。この核酸−標的分子混合物に、光架橋がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証されるように完成するまで、光線を照射する。標的分子に緊密に結合する核酸の一部のみが標的と有効に架橋する。
【００４５】
本発明の候補混合物は１つ以上の化学的反応性基又は光反応性基を含むランダム化領域を有する核酸配列から成る。好ましくは反応性基は修飾核酸である。候補混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、有効な増幅のために必要な保存配列とを含む。可変な配列部分はランダム配列を完全に又は部分的に含むことができる；可変な配列部分はランダム化配列領域内に組み入れられた保存配列のサブポーションを含むこともできる。
【００４６】
好ましくは、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は少なくとも１つの化学的反応性基又は光反応性基を含む。さらに、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は、各位置において、反応性基を含む修飾ヌクレオチドによって部分的に又は完全に置換されることができる。候補混合物は１種類を越える反応性基を含むオリゴヌクレオチドから構成することもできる。
【００４７】
本発明の核酸リガンドによって結合及び／又は光架橋される標的分子は一般にタンパク質であり、疾患及び／又は中毒におけるそれらの役割に基づいて選択される。例は、それらに対して阻害剤が好ましい酵素又はそれらの検出が望ましいタンパク質である。しかし、標的分子は、それらに対してリガンドが望ましい任意の重要な化合物であることができる。標的分子は、限定する訳ではなく、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子等であることができる。
【００４８】
本出願の目的のための光反応性基は好ましくは、光発色団を含み、標的種と光架橋することができる修飾ヌクレオチドである。本明細書において以下に述べる幾つかの場合に光反応性基を挙げるとしても、核酸リガンドと標的との間に共有結合が生ずるために照射は必ずしも必要ではない。光反応性基は選択的に、標的又はオリゴヌクレオチドの非修飾部分によって吸収されない波長のスペクトルの光線を吸収する。本発明は、限定する訳ではなく、下記要素：５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）、５−ヨードウラシル（ＩＵ）、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラニル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、８−ブロモデオキシウリジン、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシシトシン、５−〔（４−アジドフェナシル）チオ〕シトシン、５−〔（４−アジドフェナシル）チオ〕ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン及び７−デアザ−７−ブロモグアニンから選択される光反応性基を含むオリゴヌクレオチドを包含する（図５）。１実施態様では、光反応性基は５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）と５−ヨードウラシル（ＩＵ）である。
【００４９】
本発明の光反応性基は会合核酸−標的対の照射時に標的種と結合を形成することができる。この会合対を本明細書では核タンパク質複合体と呼び、場合によっては、結合形成が生ずるために照射は必要ではない。典型的に生ずる光架橋は会合核酸と標的との間の共有結合の形成である。しかし、核酸と標的との間の緊密なイオン相互作用も照射時に生ずると考えられる。
【００５０】
１実施態様では、電磁線照射によって光架橋が生ずる。電磁線照射は紫外光線、可視光線、Ｘ線及びガンマー線を含む。５−ハロ置換デオキシウラシル及びデオキシシトシンは電離線に細胞を感作させることが知られる（Szybalski （１９７４），Cancer Chemother. Rep.  ５８：５３９）。
【００５１】
架橋実験は、ＩＵ又はＢｒＵのいずれかと、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンとが正確に並列することが高収量架橋が生ずるために必要であることを示している。本発明は、ランダムに組み入れられた光反応性基を有する分子を架橋する選択に関して、この発見を利用する。本発明の１実施態様では、光反応性基５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）又は５−ヨードウラシル（ＩＵ）を、ウリジントリホスフェートの代わりに存在する５−ハロウリジントリホスフェートと共にＴ７ポリメラーゼによって、ＲＮＡ中に組み入れる。５−ハロウリジントリホスフェートとウリジントリホスフェートとの混合物又は全ての５−ハロウリジントリホスフェートを用いることによって、組み入れ(incorporation) が達成される。３２Ｐ若しくは３３Ｐ標識ＲＮＡ又は非標識ＲＮＡ配列のランダム化セットは、標準方法を用いて合成される、ＤＮＡ鋳型のランダム化セットから得られる。
【００５２】
ＢｒＵ又はＩＵを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドのランダム化セットにある量の標的分子を混合する。光反応性発色団は、ウラシルの代わりにＢｒＵ又はＩＵとして、標準方法を用いてＲＮＡ中にランダムに組み入れる。このＲＮＡ−標的タンパク質混合物に３００〜３２５nmの範囲内の近紫外光線を、光架橋が完成するまで、照射する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基のみがタンパク質への共有結合を形成する。励起ＢｒＵ又はＩＵは、例えば酸化可能なアミノ酸残基のような反応性官能基の近くに存在しないかぎり、基底状態に戻る。５−ブロモウラシルの最低三重項状態と反応性であると確認されているアミノ酸残基には、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンを含む（図３）。機構的研究に基づいて可能な反応性を有する他の残基はフェニルアラニン、メチオニン、システイン、リシン及びアルギニンである。
【００５３】
架橋を形成しない核タンパク質複合体は、例えば熱及び／又は塩を用いる変性によるような、反応性媒質の調節によって容易に破壊されうる。タンパク質に共有結合した核酸はニトロセルロースフィルター上で、又は当業者に周知の他の分割方法によって遊離核酸から分離することができる。標的に共有結合した核酸を遊離核酸から分離するための代替方法には、ゲル電気泳動とその後の電気溶離(electroelution)、沈殿、示差溶解(differential solubility）、及びクロマトグラフィーがある。当業者にとって、選択すべき方法は少なくとも部分的に問題の標的分子に依存する。架橋した核酸は、例えばプロテイナーゼＫのような酵素によるタンパク質物質の消化によって、ニトロセルロースフィルターから放出される。この時点において、標的タンパク質に光架橋した５−ハロウラシル基は単一アミノ酸又は短ペプチドに結合する。逆転写酵素の読み取り能力（read−through ability)はウラシルの５−位置における置換基の組み入れによって影響されない、この理由は逆転写酵素（ＲＴ）がウラシルの５−位置をチミンの５−位置から識別しないからである。ビオチンほど大きい基をＲＮＡ分子中に組み入れるために、５−位置の誘導体化が利用されている。本発明の１実施態様では、標的を選択された光架橋した核酸から光解離又は化学的解離によって除去する。
【００５４】
特定ＲＮＡ配列の相補的核酸コピーを適当なプライマーによって製造する。ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼと第２プライマーとによって増幅する。ＤＮＡ合成工程及び増幅工程には、５−ハロ−２’−デオキシウラシルは用いられない。次に、候補混合物中の５−ハロウリジン対ウリジンと同じ比又は異なる比でウリジントリホスフェートの代わりに５−ハロウリジントリホスフェートを用いて、増幅済みＤＮＡをＲＮＡ配列中に転写する。
【００５５】
その後の光ＳＥＬＥＸラウンドでは、部分的に選択したＲＮＡ配列を再びある量の標的タンパク質と複合体化させる。続いて、核タンパク質複合体に３００〜３２５nmの領域において照射する。タンパク質に光架橋したＲＮＡ配列を再び、架橋していないＲＮＡ配列から分離する。ｃＤＮＡを調製し、増幅し、５−ハロウラシルを含むＲＮＡ配列の第３セットを調製する。標的タンパク質に高アフィニティで結合し、光架橋するＲＮＡリガンドが１種又は数種に収束するまで、このサイクルを続ける。後のサイクルにおける照射時間の短縮はさらに選択を強化することができる。特定ＲＮＡリガンドのｃＤＮＡを増幅し、ゲル精製し、配列決定する。或いは、ＲＮＡ配列を直接、配列決定することができる。次に、ウリジントリホスフェートの代わりに５−ハロウリジントリホスフェートを再び用いて、特定ＲＮＡ配列を適当な合成ＤＮＡ鋳型から転写する（実施例１１）。
【００５６】
本発明の他の実施態様では、それらの標的分子結合能力に関して予め選択したオリゴヌクレオチド配列に対して光ＳＥＬＥＸを実施する（実施例１２）。最初に、光反応性基を含まないオリゴヌクレオチドによってＳＥＬＥＸを実施する。リガンド中の特異的部位における光反応性核酸ヌクレオチドの置換によって、ＲＮＡリガンドを光反応性リガンドに転換する。初期リガンドの光化学活性な置換を幾つかのアプローチ（例えば、光反応性ヌクレオチドの特異的置換又は部分的なランダム取り込み）によって展開させることができる。特異的置換は光反応性オリゴヌクレオチドの位置をマニュアルで変化させる種々なオリゴヌクレオチドの合成に関係する。置換の位置は標的分子へのリガンドの結合に関する入手可能なデータに基づいて指示される。例えば、標的分子と相互作用すると知られる、分子の部分における初期リガンドに置換を実施する。その後の選択ラウンドでは、照射時の標的分子架橋能力に関して選択するために、光ＳＥＬＥＸを用いる。
【００５７】
本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸとその後のＳＥＬＥＸとによって核酸リガンドを選択する。光ＳＥＬＥＸは光反応性基を含むオリゴヌクレオチド配列によって最初に実施する。それらの標的分子架橋能力に関して選択した配列を次に標的分子結合能力に関してＳＥＬＥＸ方法に関して選択する（実施例１３）。
【００５８】
本発明の他の実施態様では、ＳＥＬＥＸによるオリゴヌクレオチドの限定選択に続いて、光ＳＥＬＥＸによって核酸リガンドを選択する（実施例１４）。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドによって初期ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを実施する。数回のＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に結合することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
【００５９】
本発明のさらに他の実施態様では、ＳＥＬＥＸによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化と、その後の光ＳＥＬＥＸによる選択とを実施する（実施例１５）。ＳＥＬＥＸを最初に、光反応性基を含まない核酸配列によって完成するまで実施する。この核酸リガンドの配列を用いて、限定ランダム化を介してオリゴヌクレオチドファミリーを形成する。その後に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
【００６０】
本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸを用いて、標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドを同定する（実施例１６）。
【００６１】
本発明のさらに他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸを診断的に適用して、特定の疾患状態に関連した固有(unique)タンパク質を同定する（実施例１７）。本発明のさらに他の実施態様では、特定の疾患状態に関連した標的分子を架橋することができる核酸リガンドをインビボで用いて、疾患状態を治療する方法として標的分子に架橋させる（実施例１８と１９）。
【００６２】
本発明の１実施態様では、光ＳＥＬＥＸによって同定されるＲＮＡリガンドを用いて、タンパク質に結合させ、次にタンパク質に光架橋させることによって、そのタンパク質の存在を検出する。この検出は、３２Ｐ又は３３Ｐ標識を組み入れて、ニトロセルロースフィルターによって保持される物質をシンチレーション計測によって検出するか、又は電気泳動ゲル上で正確に移動する物質を写真フィルムを用いて検出することによって、達成することができる。或いは、光ＳＥＬＥＸは蛍光発光分光法によって検出される蛍光発色団を生成する。モデルペプチドに対する５−ブロモウラシルの反応の生成物（図３に示す）に関する蛍光発光は、Dietz とKoch（１９８７）（上記文献）によって報告されている。本発明の他の実施態様では、蛍光標識をＲＮＡに共有結合させて、蛍光発光分光法によって検出する。本発明の他の実施態様では、光ＳＥＬＥＸによって選択されるＲＮＡリガンドを用いて、標的タンパク質を同じプロセスによって阻害する。さらに他の実施態様では、光選択した(photoselected) リガンドを担体に結合させ、これを用いて、標的を共有結合的に捕捉する。
【００６３】
本発明の１実施態様では、５−ヨードウラシルを候補混合物のＲＮＡ配列に組み入れ、３２０〜３２５nmの範囲内の光線を用いて照射する。この組合せは、他の非特異的な光反応なしに、標的タンパク質への５−ハロウラシル発色団の領域選択性光架橋を保証する。特に、タンパク質のトリプトファン残基と、核酸のチミン塩基及びウラシル塩基とは光反応性であると知られている。図４に示すように、５−ヨードウラシルは３２５nmにおいて吸光するが、トリプトファンと標準核酸塩基とは吸光しない。３２５nmにおける５−ヨードウラシルのモル吸光係数は１６３Ｌ／mol ・cmである。３２０nmにおいて発光する周波数倍加チューナブル色素レーザー又は３２５nmにおいて発光するヘリウムカドミウムレーザーによって、３２０〜３２５nmの領域における単色光を供給することが好ましい。
【００６４】
本発明の１実施態様では、標的タンパク質に対する５−ヨードウラシル含有ＲＮＡ配列の光架橋のために３０８nmにおいて発光する塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマーレーザーを用いる。このレーザーによって、核タンパク質複合体の高収量の光架橋が数分間の照射時間内に達成される。
【００６５】
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対する５−ヨードウラシル含有ＲＮＡ配列の光架橋が、波長濾過３１３nm高圧水銀灯発光によって又は２５４nmにおいてはリンによって吸収され、３００〜３２５nmの領域において再発光する低圧水銀灯発光によって達成される。後者の発光をまた、細心に波長濾過して、リンによって吸収されない２５４nm光線と、タンパク質を損傷する可能性がある２９０〜３０５nm領域の光線とを除去する。
【００６６】
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対するＢｒＵ−又はＩＵ−含有ＲＮＡ配列の光架橋が、基底状態から三重項状態を直接に占める３５０〜４００nmの領域内の光線によって達成される。３５５nmにおけるネオジミウムＹＡＧレーザーの第３次高調波から又は３５１nmにおけるフッ化キセノン（ＸｅＦ）エキシマーレーザーからの第１次高調波からの単色光線が、これに関して、特に有用である。
【００６７】
本発明のさらに他の実施態様では、光反応性ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡに組み入れて、光反応性ヌクレオチドトリホスフェートを用いて又は用いずに、直接増幅する。
【００６８】
Ａ．共有結合ＳＥＬＥＸと、照射によって又は照射なしでＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に結合する核酸リガンド
光ＳＥＬＥＸを説明するために選択した標的タンパク質はＨＩＶ−１からのＲｅｖである。インビボにおけるＲｅｖの活性はＲｅｖ反応性要素（ＲＲＥ）（ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの高度構造化領域）との会合に起因する。Ｒｅｖの予備ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ実験は非常に高いアフィニティのＲＮＡリガンドの単離を可能にした。“６ａ”として知られる最高アフィニティリガンド（配列番号：５）は約１nMのＫｄを有する、これは図１６に示す。６ａの二次構造と、Ｒｅｖとのその相互作用とは充分に特徴づけられている。
【００６９】
光ＳＥＬＥＸのための核酸ライブラリーの構成はＲｅｖ６ａ配列（配列番号：５）に基づくものであった。ＳＥＬＥＸのためのデオキシオリゴヌクレオチド鋳型の合成中に、鋳型のランダム領域を、４投入(input) 塩基の比が６ａ配列中の対応塩基を支持するようにバイアスされる“バイアスランダム化”領域によって置換した（実際の比は６２．５：１２．５：１２．５：１２．５であった）。例えば、特定の位置の６ａ塩基がＧである場合には、この合成工程の塩基投入混合物はＧ６２．５％、他の３種の塩基の１２．５％である。
【００７０】
単置換ｉＵ核酸とタンパク質標的との間の高収量の領域特異的架橋の形成に用いられている光反応性ウラシル類似体５−ヨードウラシル（ｉＵ）（Willis等（１９９３），Science ２６２：１２５５）をこの実施例のために用いた。ｉＵ発色団は長波長紫外光線下で反応性であり、５−ブロモウラシルと同じ機構によって芳香族アミノ酸に光結合することができる（Dietz 等（１９８７），J. Am.Chem. Soc.１０９：１７９３）。上述したように、この研究のための標的はＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質であり、これはウイルスの生産性感染(productive infection)のために（Feinberg等（１９８６）Cell  ４６：８０７）及びウイルス構造遺伝子ｇａｇ，ｐｏｌとｅｎｖの発現のために（Emerman 等（１９８９），Cell  ５７：１１５５）必要である。Ｒｅｖと高アフィニティＲＮＡリガンドとの相互作用は充分に特徴づけられている。ＲＲＥ内の単一高アフィニティ部位(ＩＩＢステム)は同定されている（Heaphy等(１９９１),Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ８８：７３６６）。インビトロの遺伝的選択実験は、Ｒｅｖに高アフィニティで結合するＲＮＡリガンドを形成して、Ｒｅｖ：ＲＮＡ相互作用のために必要なＲＮＡ構造要素の決定を容易にしている（Bartel等（１９９１），Cell６７：５２９；Tuerk 等，In the Polymerase Chain Reaction（１９９３）；Jansen等（１９９４），J. Mol. Biol. ２３５：２３７）。
【００７１】
高アフィニティＲｅｖリガンド配列６ａ（配列番号：５）に基づく、“バイアスランダム化”ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーは約１０１４の非反復配列を含む。この鋳型を５−ｉＵＴＰによるインビトロＴ７転写に用いて、選択のための全置換ｉＵ  ＲＮＡを形成した。光ＳＥＬＥＸ手順はニトロセルロース分割を用いるＲｅｖのアフィニティ選択と、非架橋ＲＮＡ配列から架橋済み複合体を変性ポリアクリルアミドゲル分割する、核タンパク質複合体の単色ＵＶ照射とを交互に行った。最終操作は、競合体ｔＲＮＡを用いて、アフィニティと架橋とに関する同時選択を利用した。各ラウンドは選択と、その後の回収ＲＮＡからｃＤＮＡへの転化と、ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、ｉＵ−ＲＮＡの新たなプールを得るためのインビトロ転写を構成する。共有結合核タンパク質複合体として回収されたＲＮＡを増幅するために、適当なゲルスライスを単離し、プロテイナーゼＫ処理した。
【００７２】
ＲＮＡプールに対して最初にＲｅｖタンパク質による３ラウンドのアフィニティ選択を実施し、高アフィニティ配列をニトロセルロースフィルターによって分離した。次に、進化ＲＮＡプールに対して、過剰なＲｅｖタンパク質の存在下でＵＶレーザー照射を実施して、タンパク質架橋能力を有するＲＮＡ配列にタンパク質架橋させた。次に、架橋したＲＮＡ配列をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分割した。これらの架橋したＲＮＡをゲル物質から回収し、結合したＲｅｖタンパク質を消化させ、このＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いて、光ＳＥＬＥＸの次のラウンドでさらに増幅した。光架橋の第１ラウンドには、３０８nmＸｅＣｌエキシマーレーザーを用いた；その後に、３２５nmＨｅＣｄレーザーを用いた。
【００７３】
レーザー誘導架橋に対する４回選択ラウンド後に、ＲＮＡプールを再びアフィニティ選択の３ラウンドに通した。最後に、ＲＮＡプールを高アフィニティでのそのＲｅｖ結合能力と、このタンパク質架橋能力とに関して同時に選択した。これは光架橋反応において高濃度の非特異的核酸競合体を用いることによって達成された。
【００７４】
架橋した生成物は第１３回ラウンドまでに出発プールから約３０倍に増加した（図１５）。これらの条件下で、架橋の最大の増加はアフィニティの最大増強と相関する（第７ラウンドから第１０ラウンドまで）。
選択の１３ラウンド後に、ＰＣＲ生成物をクローン化し、５２種の単離物を配列決定した（図１６、配列番号：５〜５５）。全配列の７７％を占めるクラス１分子は非常に高度に保存されたモチーフ（５’ＫＤＡＡＣＡＮ・・・Ｎ’ＵＧＵＵＨ’Ｍ’３’）（配列番号：５６）を含む（図１７）。コンピュータ折り畳みアルゴリズム(computer folding algorithm)の予測によれば、この保存モチーフは塩基対から成り、ステム−ループ構造中に存在する。サブクラスａ〜ｄ（図１６、配列番号：５〜４３）は共通モチーフを得るために“バイアスランダム化”プールに用いた種々な手法を説明する。クラス２分子は非常に高度に保存された１０塩基配列（図１７，配列番号５７）を含み、この配列はＲＮＡの５’固定領域と折り重なって、クラス１又は６ａ（配列番号：５）モチーフとは異なる構造を形成すると予測される。全てのクラス１配列は、１〜１０nMの範囲の高アフィニティ解離定数（Ｋｄ）によって、Ｒｅｖへの二相結合を示す。クラス２配列は、３０〜５０nMのＫｄによって、Ｒｅｖへの一相結合を示す。ラウンド１３配列の分析は、クラス１群とクラス２群との共通モチーフの頻度が出発プールでは非常に小さく、幾つかの個別配列が光ＳＥＬＥＸ操作の突然変異的圧力によってのみ生じることを明らかにする。
【００７５】
架橋挙動は２クラスの間では異なる。高いＲｅｖ濃度（５００nM）と４分間の３２５nm照射下では、クラス２分子はクラス１分子よりも大きい架橋収量と効率を生じる（データは示さず）；恐らく、この挙動はＲｅｖに対して比較的低いアフィニティを有するクラス２分子を光ＳＥＬＥＸ操作下で競合させると考えられる。クラス１分子に関しては、長い照射時間が高分子量架橋種を生じると思われる。理論によって縛られる訳ではないが、Ｒｅｖに対する進化結合ドメインとＳＥＬＥＸにおける増幅のために必要な固定領域との両方を含むＲＮＡがＲＮＡ１分子につき１分子より多いＲｅｖを結合させることができると提案される。各ＲＮＡは平均して２１個のｉＵ塩基を含む（ＲＮＡ長さ−８６塩基）ので、高いタンパク質濃度において１分子より多いＲｅｖへの単一ＲＮＡの架橋を可能にする、光架橋のある種の混乱(promiscuity) が存在することが考えられる。クラス２分子は光架橋時に高分子量種をあまり生じない；これらは平均してｉＵをあまり含まず、付加的なＲｅｖ分子への架橋及び／又は光架橋を可能にしない構造を含むと考えられる。
【００７６】
ラウンド１３ＲＮＡの分析は、亜群(subpopulation) がレーザー照射なしにＲｅｖに架橋することができることを明らかにする。したがって、この単一実験セットは、照射なしの共有結合ＳＥＬＥＸと照射を用いる光ＳＥＬＥＸとの両方が同じ系において見い出されうることを実証した。分析したラウンド１３配列１５種の中の４配列はレーザー照射なしで架橋する（図１６）。これらの少ない配列から、レーザー独立性架橋を与える配列モチーフを同定することは容易に可能ではなかったが、全ての配列は今のところ１ａサブクラスに属すると見なされた。
【００７７】
レーザー依存性及びレーザー独立性架橋（それぞれ、ＬＤ−ＸＬ及びＬＩ−ＸＬ）をさらに研究して、全長クラス１分子と共に形成された第２照射生成物を回避するために、進化した配列のみを含む幾つかの小ＲＮＡを構成した。Trunc ２及びTrunc ２４（図１８及び１９）（配列番号：５８及び５９）は、それぞれ、クローン＃３と＃２４に基づき、０．５nM（trunc ２）及び２０nM（trunc ２４）のＫｄによってＲｅｖへの一相結合を示す。Trunc ２（図１８）はＬｄ−ＸＬ挙動を示し、Trunc ２４（図１９）はＬＩ−ＸＬとＬＤ−ＸＬの両方が可能である。
【００７８】
ＬＤ−ＸＬとＬＩ−ＸＬに関するコンホメーションと化学的必要条件とを調べるために、Trunc ２（配列番号：５８）及びTrunc ２４（配列番号：５９）と、幾つかのアルギニン富化モチーフ（ＡＲＭ）タンパク質とによって架橋反応を実施した。ＲＮＡ結合タンパク質のクラスは標的タンパク質、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ、並びにＨＩＶ−１  Ｔａｔ及び非常に類似したＨＩＶ−２  Ｒｅｖをも含む。trunc ２（図１８、配列番号：５８）とのＬＤ−ＸＬ反応は、trunc ２がＨＩＶ−１とＨＩＶ−２  Ｒｅｖタンパク質の両方に特異的に結合することができるが、ＨＩＶ−１  Ｔａｔには結合しないことを示す。僅かに異なる、２種類の移動核タンパク質複合体(migrating nucleoprotein complex) はtrunc ２が２個のｉＵヌクレオチドの１個を用いて、Ｒｅｖタンパク質に架橋する能力を表すと思われる。理論によって縛られる訳ではないが、両Ｒｅｖタンパク質の非常に類似したＡＲＭ中に存在するトリプトファン残基が本発明の高アフィニティＲＮＡリガンドの特異的光架橋のために必要なアミノ酸であることが提案される。
【００７９】
同じタンパク質によって実施したtrunc ２４  ＬＩ−ＸＬ（図１９、配列番号：５９）は、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖに対してのみの架橋を示す。trunc ３と同様にtrunc ２４もＨＩＶ−２  Ｒｅｖに光架橋することができる（データは図示せず）。このＬＩ−架橋が高度の変性条件下では、又は高濃度の核酸競合体によって可逆的であることも観察された。理論によって縛られる訳ではないが、これらの観察から、ＬＩ−ＸＬがＩＵの６位置とシステイン残基との間のMichael アダクツによって進行する、又は５位置置換反応が可能であることが仮定される。この仮定は、ｉＵがＵよりも容易にMichael アダクツを形成するという観察と、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖが３個のシステインを含むが、ＨＩＶ−２  Ｒｅｖはシステインを全く含まないという事実との両方に一致する。trunc ２４（配列番号：５９）とヒト繊維芽細胞核抽出物（１０μｇ）を、漸減する量のＨＩＶ−１  Ｒｅｖと共に含む複雑な混合物中でのtrunc ２４のＨＩＶ−１  Ｒｅｖ識別能力を試験する（図２０）。５０nMＲｅｖと、１：１００の重量比のＲｅｖ：核抽出物とにおいて、trunc ２４とＲｅｖとの間に非常に有意な架橋生成物を見ることが可能であった。核抽出物とtrunc ２４のみでは架橋生成物を生じなかった。
【００８０】
実施例１は、それぞれ、５−ブロモウリジントリホスフェート、５−ヨードウリジントリホスフェート及びウリジントリホスフェートを用いた、ヘアピンＲＮＡオリゴヌクレオチドＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の合成を説明する。バクテリオファージＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）に関するＲＮＡタンパク質結合曲線を決定する実験を実施例２において説明する。実施例３はＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡオリゴヌクレオチドの光架橋を述べる。３０８nmにおける塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマーレーザーによる照射後にＲＮＡ−１（配列番号：１）によって光架橋したＲ１７コートタンパク質のアミノ酸残基は実施例４において説明する。実施例５は３２５nmにおける単色発光によるＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−２（配列番号：２）の光架橋を述べる。実施例６はトランスイルミネーターによる広帯域発光照射後に得られるＲ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）とＲＮＡ−２（配列番号：２）との光架橋を説明する。実施例７は会合タンパク質への５−ブロモウラシル置換核酸によって達成された光架橋と同様な光架橋を生じるように思われる、５−ヨードウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとの光反応を述べる。Ｒ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製は実施例８に述べる。実施例９はＲ１７コートタンパク質へのＩＣ置換ＲＮＡリガンドの光架橋を説明する。
【００８１】
実施例１０はＤＮＡ中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れを説明する。実施例１１〜１５は特異的光反応性核酸リガンドの製造に用いられる光ＳＥＬＥＸプロトコールを説明する。実施例１１は連続的光ＳＥＬＥＸ方法を述べる。実施例１２は、ＳＥＬＥＸによって最初に選択した核酸リガンドを続いて、標的分子架橋能力に関して光ＳＥＬＥＸによって選択する方法を述べる。実施例１３は、光ＳＥＬＥＸによって同定した核酸リガンドに対して、次に、ＳＥＬＥＸによる選択を実施して、これらの核酸リガンドを標的分子結合能力に関して選択する。実施例１４は、限定ＳＥＬＥＸ選択を実施した後に、光ＳＥＬＥＸによる選択を実施する他の実施態様を説明する。実施例１５は、ＳＥＬＥＸによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化を実施し、その後に光ＳＥＬＥＸによる選択を実施する、本発明の実施態様を説明する。実施例１６は標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドの選択方法を説明する。実施例１７は、ＳＥＬＥＸ方法と光ＳＥＬＥＸ方法とを用いて、特定疾患の経過に関連したタンパク質を同定する診断手順を説明する。
【００８２】
実施例１８は光ＳＥＬＥＸによる疾患のインビボ治療方法を説明する。疾患状態に関連した標的分子に結合及び架橋することができるように光ＳＥＬＥＸ選択した核酸リガンドを当該技術分野に周知の幾つかの方法によって患者に導入する。例えば、光ＳＥＬＥＸリガンドは疾患を有する患者の適当な細胞に一時的に又は本質的に発現されることができる。或いは、光ＳＥＬＥＸリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖ＤＮＡとして患者の細胞に取り入れることができる。ヨウ素化シトシンを患者に投与した後に、Ｘ線を照射することができる。適当な細胞中で合成される核酸リガンド中に導入されるＩＣはリガンドを標的分子に架橋させて、標的分子を不活化させる。光ＳＥＬＥＸリガンドを患者中に導入する他の方法は、ハロゲン化リガンドの患者の細胞中へのリポソーム投与を含む。
【００８３】
実施例２０は、照射によって又は照射なしで、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に架橋する修飾核酸リガンドの製造を説明する。図１５は種々な選択ラウンドにおけるバルク候補混合物への架橋の結果を示す。ｒＤ１−ラウンド  １プールＲＮＡ；ｒＤ７−ラウンド７  プールＲＮＡ；ｒＤ１０−ラウンド  １０プールＲＮＡ；ｒＤ１３−ラウンド  １３プールＲＮＡ；ｒＤ１３／ＰＫ，光架橋ラウンド１３プールＲＮＡプロテイナーゼＫ処理（１００μｌ反応の中の３５μｌを０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／mlプロテイナーゼＫ及び１mM  ＥＤＴＡ中で６５℃において１時間インキュベートした）；ｒＤ１３／無ｉＵ−ラウンド１３プールＲＮＡ  ＵＴＰ（ｉＵなし）による転写。Ｒ−遊離ＲＮＡ；ＸＬ−架橋核タンパク質複合体。
【００８４】
図１６は、１３ラウンドのＳＥＬＥＸ後に配列決定した配列を示す（配列番号：５〜５５）。配列を６ａ配列に対して最大相同を示すように整列させる。下線はコンピューターＲＮＡ折り畳みアルゴリズムによって提起される可能な塩基対合を表す。ダッシュ下線は６ａリガンド“バブル”モチーフを表す。下線によってフランクされる配列はループ領域又はバルジ領域のいずれかを表す。ダッシュは６ａとの整列(alignment) を最大にするように配置する。* は２単離物が得られたことを意味する。＋はレーザー独立性架橋を意味し、−はＨＩＶ−１Ｒｅｖに対するレーザー独立性架橋の欠損を意味する。図１７（配列番号：５６〜５７）はクラス１リガンドとクラス２リガンドとの共通配列を示す。図１８と１９はTrunc ２（配列番号：５８）及びTrunc ２４（配列番号：５９）の配列と特異性結果とを示す。５００nM  タンパク質と、ｔＲＮＡ  ２０μｇと、約１nMのキナーゼ処理trunc ２  ＲＮＡとを３７℃において１０分間インキュベートし、３２５nmにおいて４分間照射した。ｔ２−trunc ２  ＲＮＡ  タンパク質を添加せずに照射；ｔ２Ｒｅｖ１／０’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質及び照射０分間；ｔ２Ｒｅｖ１／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質及び照射４分間；ｔ２／Ｒｅｖ１／４’／ＰＫ−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質、照射４分間及び図１におけるようなプロキナーゼＫ処理；ｔ２／Ｒｅｖ２／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−２  Ｒｅｖタンパク質、及び照射４分間；ｔ２／Ｔａｔ／４’−trunc ２  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、及び照射４分間。Ｒ−遊離ＲＮＡ；ＸＬ−架橋核タンパク質複合体。図２０はヒト核抽出物の存在下でのＨＩＶ−１  Ｒｅｖとのtrunc ２４光独立性架橋を示す。
【００８５】
II．溶液ＳＥＬＥＸ．
本発明のこの実施態様は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとを分割する幾つかの改良方法を提供する。本発明の方法は先行技術の分割方法を凌駕する幾つかの利点を有する：（１）この方法は、分割マトリックスに対する核酸リガンドを単離することなく、標的に対する核酸リガンドの単離を可能にする；（２）オリゴヌクレオチド候補混合物をスクリーニングする速度と精度とを高める；及び（３）溶液ＳＥＬＥＸ操作を単一試験管中で実施することができ、それによって分割工程を自動化することができる。
【００８６】
本発明の方法によって必要とされる材料及び方法は一般に、分子生物学実験室で用いられている。これらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＮＡ又はＤＮＡ転写、第２鎖ＤＮＡ合成、及びヌクレアーゼ消化を含む。実際に、これらの方法は図２１に図示するようにサイクル式に相互に関係する。
【００８７】
Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：１１５５によって開示され、図２１に示されるＳＥＬＥＸ方法では、一本鎖核酸候補混合物を核酸合成装置において確立された手順を用いて形成し、ｄＮＴＰ及びKlenowフラグメントと共にインキュベートして、二本鎖ＤＮＡ鋳型の群を形成した。これらの二本鎖ＤＮＡと、これらから転写されたＲＮＡとを精製して、標的分子と接触させる。標的分子に対して強化されたアフィニティを有するＲＮＡ配列が核酸−標的複合体を形成する。この後に結合核酸と非結合核酸とを分割し、標的分子を結合核酸から分離する。ｃＤＮＡを強化アフィニティ核酸から合成し、ＰＣＲ増幅によって二本鎖ＤＮＡを形成する。候補混合物のコンプレキシティ(complexity)が減少し、標的に対するそのアフィニティ及び特異性が最大になるまで、このサイクルを繰り返す。
【００８８】
溶液ＳＥＬＥＸ方法の新規な特徴は、核酸候補混合物の結合要素と遊離要素とを分割する手段である。本発明の方法の１実施態様では、２つの物理的に異なるｃＤＮＡプールの形成がプライマー伸長抑制の使用によって達成される。上記工程２と３の間で基本的ＳＥＬＥＸプロトコールに１つのｃＤＮＡ伸長工程を加え、２つの物理的に異なるｃＤＮＡプール・・・１つは標的に対して高アフィニティを有し、１つは標的に対して低アフィニティを有する・・・の形成を可能にし、これらのプールは相互から容易に区別され、分離される。プライマー伸長抑制分析は核酸に複合体化した部位結合タンパク質を試験するための一般的な方法であり（Hartz 等（１９８８）、Methods Enzymol.  １６４：４１９）、高アフィニティ複合体のｃＤＮＡ合成抑制能力に基づく。プライマー伸長抑制によって研究されるタンパク質−核酸相互作用の例はｍＲＮＡリボソーム結合部位に対するリボソーム結合（Hartz 等（１９８８），Meth. Enzym.  １６４：４１９）並びに非反復大腸菌翻訳因子（ＳＥＬＢタンパク質）のｍＲＮＡセレノシステイン挿入配列への結合（Baron 等（１９９３），Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ９０：４１８１）を含む。
【００８９】
溶液ＳＥＬＥＸスキームの１実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長は鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートの存在下で実施する。これらの条件下で、標的と迅速に解離する複合体を形成する、標的に対して低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドを、伸長不能なヌクレオチドによって終結した３’−末端を有する切頭ｃＤＮＡに転化させる。切頭ｃＤＮＡ鎖はＰＣＲプライマーにアニールすることができず、それ故、増殖不能である。これに反して、高アフィニティオリゴヌクレオチドと標的分子との間に形成される緊密な複合体は、緩慢な解離速度を特徴とし、ｃＤＮＡ伸長を抑制する。緊密に結合した標的分子によってｃＤＮＡ合成がブロックされるので、高アフィニティオリゴヌクレオチドから合成された新生(nascent) ｃＤＮＡ鎖に連鎖ターミネーターを組み入れない。標的と連鎖ターミネーターとが系から除去された、第２ラウンドのｃＤＮＡ伸長中に高アフィニティ複合体からの全長ｃＤＮＡが得られる。したがって、低アフィニティ複合体をプライマーアニーリング部位を欠いた切頭ｃＤＮＡに転化し、緊密な複合体は全長ｃＤＮＡに転化し、ＰＣＲによって増幅される（図２２）。この方法の厳しさは連鎖ターミネーター及びｄＮＴＰのモル比を変えることによって又は、プライマー伸長抑制はポリメラーゼ濃度に敏感であるので、ポリメラーゼの濃度を変えることによって、容易に調節される（Ringguist 等（１９９３），Biochemistry印刷中）。本明細書で用いるかぎり、“厳しさ”なる用語は、ＰＣＲ生成物に転化される遊離ＲＮＡの量を意味する。
【００９０】
それ故、本発明の１つの決定的な特徴は、強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを増幅可能な核酸プールと増幅不能な核酸プールとに、分割マトリックスを必要とせずに、分割するその可能性である。高アフィニティリガンドの選択的な増幅を可能にするのは、これらのｃＤＮＡプールの固有の性質である。
【００９１】
標的分子はタンパク質（核酸結合性タンパク質又は非核酸結合性タンパク質）、核酸、小分子又は金属イオンである。溶液ＳＥＬＥＸは鏡像異性体の分割並びに新たな触媒核酸の単離を可能にする。
【００９２】
プライマー伸長抑制は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びＱβ−レプリカーゼを含めた、幾つかの核酸ポリメラーゼのいずれかを用いて達成することができる。
【００９３】
核酸の候補混合物は、それから相補的鎖を合成することができる、核酸又は核酸誘導体を含む。
【００９４】
先行技術の分割方法はニトロセルロース又はアフィニティカラムの使用を含む。先行技術の分割方法の欠点の１つは、分割マトリックスに特異的に結合する核酸が標的に特異的に結合する核酸と共に選択されるマトリックスバインダーの現象であった。したがって、本発明の方法の利点の１つは、分割マトリックスの使用によって生ずる、好ましくない選択的圧力を、標的に高アフィニティを有する核酸が溶液中で選択され、増幅された後にこのようなマトリックスを初めて用いることによって克服することである。さらに、ポリメラーゼによる伸長を最強複合体のみが抑制可能であることに基づいて、ｃＤＮＡ合成中に強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを分割できることが最高アフィニティ核酸リガンドのみの選択を生じる。ナノモル以下の範囲内の解離定数を有する複合体が効果的にｃＤＮＡ合成をブロックすることが想定される。本発明の方法はこの限界で標的と結合する要素に関して核酸候補混合物を選択的にスクリーニングすると考えられる。
【００９５】
プライマー伸長抑制の利用はオリゴヌクレオチド候補混合物を２プール：高い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド（増幅可能）及び低い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド（増幅不能）への分割を可能にする。上述したように、連鎖ターミネーターを用いて、第１伸長生成物を無効にして(poison)、低アフィニティｃＤＮＡを増幅不能にすることができる。
【００９６】
本発明の方法の他の実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティ核酸から生ずるｃＤＮＡを選択的に消化する。一本鎖ＤＮＡを切断する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的配列において、異なる効率で切断する。弱アフィニティ核酸と強アフィニティ核酸との分割は、４種類のｄＮＴＰの存在下でのプライマー伸長と、その後の標的の除去と、酵素切断に耐性である修飾ヌクレオチドによる第２伸長とによって達成される。この場合に、ｃＤＮＡプールを適当な制限酵素と共にインキュベートすると、第１伸長中に合成されたｃＤＮＡがプライマーアニーリング部位を除去するように切断されて、増幅不能なプールが得られる。制限部位（ＲＳ）においてヘアピンを用いて大きい効率の切断が達成されて、局部的な二本鎖領域が得られる（図２４）。
【００９７】
本発明の方法の他の実施態様では、生成ｃＤＮＡが酵素的又は化学的に選択的に分解されるように、第１伸長生成物中に修飾ヌクレオチドを組み入れることによって、低アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡ配列を選択的に分解可能にする。
【００９８】
本発明の方法の他の実施態様では、第１伸長生成物をアフィニティマトリックスによって系から除去することができる。或いは、マトリックスを用いて、第２伸長生成物、例えば高アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡを結合させることができる。この手法はｃＤＮＡ合成中の修飾塩基の組み入れに基づく。例えば、第１ｃＤＮＡ伸長をアフィニティマトリックス上での保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化ヌクレオチド、ヨウ素化ヌクレオチド、チオ標識ヌクレオチド又は任意の他の修飾ヌクレオチド）の存在下で実施することができる（図２５）。本発明の方法の代替実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特定の配列を組み入れることもできる。したがって、第１合成ｃＤＮＡを商業的に入手可能なマトリックス上で遅延させて、修飾ヌクレオチドと標的との不存在下で合成される第２合成ｃＤＮＡから分離することができる。
【００９９】
本発明の他の実施態様では、エキソヌクレアーゼ加水分解阻害を用いて、高アフィニティ二本鎖核酸リガンドのプールを形成する。
【０１００】
本発明のさらに他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸ方法を用いて、触媒核酸リガンドを単離する。
【０１０１】
本発明の他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸを用いて、一本鎖核酸を優先的に増幅させる。
【０１０２】
本発明の他の実施態様では、溶液ＳＥＬＥＸ方法を自動化する。
【０１０３】
高アフィニティ核酸からのｃＤＮＡ合成を可能にする標的の除去も、多様な方法で達成することができる。例えば、標的を有機抽出によって除去するか、又は温度によって並びに溶媒の電解質含量の変化によって変性させることができる。さらに、本発明によって使用可能である候補混合物の分子レパートリーは、それから第２相補的鎖を合成することができる任意の分子を含む。一本鎖ＤＮＡ並びにＲＮＡを、多様な他の修飾ヌクレオチド及びそれらの誘導体が使用可能であると同様に、用いることができる。
【０１０４】
次の非限定的実施例は本発明の方法を説明する。実施例２１は、高アフィニティ核酸と低アフィニティ核酸との分割がプライマー伸長抑制によって達成される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２２は、分割が低アフィニティＲＮＡの制限酵素消化によって達成される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２３は、低アフィニティ核酸が高アフィニティ核酸から、アフィニティクロマトグラフィーによって分離される溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。実施例２４はエンドヌクレアーゼ阻害の利用による高アフィニティ二本鎖核酸リガンドの単離を説明する。実施例２５は触媒核酸の単離を説明する。実施例２６は自動化溶液ＳＥＬＥＸ方法を説明する。
【実施例】
【０１０５】
提供する実施例は、本発明を用いる方法を非限定的に説明する。本発明を用いる他の方法は本明細書の開示から当業者に明らかであろう。
【０１０６】
実施例１．  ＲＮＡ配列  ＲＮＡ−１、ＲＮＡ−２、ＲＮＡ−３、ＲＮＡ−７及びＲ−１７コートタンパク質の合成．
図６に示した、ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）並びに図１２に示したＲＮＡ−７（配列番号：４）を合成ＤＮＡ鋳型又はプラスミドからのインビトロ転写によって、Milliganと共同研究者が述べている方法（Milligan等（１９８７），Nucleic Acids Res.１５：８７８３）を用いて調製した。転写反応は４０mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．１，３７℃）と、１mMスペルミジンと、５mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５０μg ／mlと、０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、ポリエチレングリコール（ｍｒ８０００）８０mg／mlと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．１mg／mlとを用いた。３〜５mM  各ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）と、２５mM塩化マグネシウムと、１μM ＤＮＡ鋳型又はプラスミド０．１μg ／mlとを用いて、さらに多量のＲＮＡを調製した。ボディ標識(body-labeled)ＲＮＡを、１００μl 反応において１mM３種ＮＴＰの各々と、０．２５mM同等の放射標識ＮＴＰ（〔α−３２Ｐ〕ＮＴＰ，５μＣｉ）と、１５mM  ＭｇＣｌ２と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．１mg／mlとを用いて調製した。５−ヨードウリジントリホスフェートと５−ブロモウリジントリホスフェートを含むヌクレオチドはSigma Chemical Co.（ミズリー州，セントルイス）から得た。ＲＮＡフラグメントは２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。所望のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから溶離させ、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈殿させた。Ｒ１７バクテリオファージを大腸菌（Escherichia coli) 菌株Ｓ２６中で増殖させ、コートタンパク質をCarey と共同研究者が述べている方法（Carey 等（１９８３），Biochemistry  ２２：４７２３）を用いて精製した。
【０１０７】
実施例２．  Ｒ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１とＲＮＡ−２との結合定数．
バクテリオファージＲ１７コートタンパク質に対するヘアピン変異体ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）のＲＮＡ−タンパク質結合曲線を図７に示す。コートタンパク質とＲＮＡヘアピン変異体との間の会合定数をCarey と共同研究者が述べているニトロセルロースフィルター保持検定（Carey 等（１９８３），上記文献）を用いて測定した。１０mM酢酸マグネシウム、８０mM  ＫＣｌ、８０μg ／mlのＢＳＡ及び１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）（ＴＭＫバッファー）中で、定常な低濃度の３２Ｐ標識ＲＮＡを０．０６nM〜１μM の一連のコートタンパク質濃度と混合した。これらは架橋実験に用いた溶液条件と同じであった。４℃における４５〜６０分間のインキュベーション後に、混合物をニトロセルロースフィルターに通して濾過して、フィルター上に保留された複合体量を液体シンチレーション計測によって測定した。各実験に関して、データ点を非協同(non-cooperative）結合曲線に当てはめて、図７に示すKd値を算出した。
【０１０８】
実施例３．  ３０８nmにおけるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１とＲＮＡ−２との光架橋
３２Ｐ標識ＲＮＡ配列ＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）（５nM）と、Ｒ１７コートタンパク質（１２０nM）とを、それぞれ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）、８０mM  ＫＣｌ、１０mM  酢酸マグネシウム、８０μg ／mlのＢＳＡ中で氷上において１５〜２５分間インキュベートしてから、照射した。これらは、ＲＮＡをコートタンパク質に完全に結合させた条件と同じであった。ＲＮＡがヘアピンコンホメーションであることを保証するために、ＲＮＡを水中で８５℃に３分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した（GroebeとUhlenbech （１９８８），Nucleic Acids Res.１６：１７２５）。６０mbarキセノン、８０mbarヘリウム中５％ＨＣｌ及び２３６０mbarヘリウムを装填したLambda Physik ＥＭＧ−１０１エクサイマーレーザーを３０８nm照射に用いた。ＸｅＣｌレーザーの出力をＲＮＡ−タンパク質複合体を含む４mm幅Ｘ１cm光路長さの石英キュベット方向に非収束的(unfocussed)に導いた。 このレーザーを１０Hzにおいて６０ｍＪ／パルスの範囲内で操作した；しかし、レーザービームの約２５％のみが反応セル上に入射した。Ｒ１７バクテリオファージコートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）の光架橋収量を照射時間の関数として図８に示す。架橋ＲＮＡを非架橋ＲＮＡからＰＡＧＥによって分離し；収量をオートラジオグラフィーによって測定した。コートタンパク質に対する競合光損傷がＲＮＡへの結合を阻害するために、５−ブロモウラシル含有変異体ＲＮＡ−１（配列番号：１）の架橋は約４０％で最大であった（Gott等（１９９１），上記文献）。より短い照射時間のために、ＲＮＡ２に関してはコートタンパク質への少ない光損傷が生じた。
吸収された光子の関数としての架橋は、３０８nmにおける照射によってＢｒＵ−ＲＮＡ１の架橋の量子収量が０．０１４であり、ＩＵ−ＲＮＡ−２（配列番号：２）の架橋の量子収量が０．００６であることを実証した。ＩＵ−ＲＮＡ−２によっては、量子収量が低いにも拘わらず、３０８nmにおけるＩＵ発色団の吸収確率が数倍高いために、高い架橋収量が得られた。ＢｒＵとＩＵとは、それぞれ、３８５と２６４０Ｌ／mol ・cmのモル吸光係数によって３０８nmにおいて吸光する。それ故、タンパク質損傷の前にＩＵ−ＲＮＡの高レベルの光架橋が得られた。
【０１０９】
実施例４．  Ｒ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１の架橋に関係するアミノ酸残基の同定．
Ｒ１７コートタンパク質へのＲＮＡ−１（配列番号：１）の大規模架橋。  ３００nM５’−末端標識ＲＮＡと５００nMコートタンパク質とを含む溶液（１０ml）を１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）と、１０mMＭｇ（ＯＡｃ）２と、８０mM  ＫＣｌと、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（８０mg）と、５mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）との存在下で氷上において１０〜９０分間インキュベートした。３０８nmにおける単色光線照射のためには、Lambda Physik  ＥＭＧ−１０１エクサイマーレーザーを用いた。ビーム出力は１０Hzにおいて６９±５ｍＪ／パルスと測定された。ビームの約５０％が、サーモスタットで調温されたセルホルダー中の１cm光路長さ石英キュベット中に、７mm直径円形ビームマスク(beam mask）を通して収束した。レーザー出力をScientech ３６０−００１ディスクカロリーメーター出力計によって測定した。Laude ＲＣ３循環浴によって、温度を４±２℃に調節した。
２mlフラクションで実施した照射の直前に反応混合物（１０ml）を調製した。５分間照射した後に、タンパク質濃度を１μM にした。反応混合物を次に３分間インキュベートして、核タンパク質複合体中の光損傷したタンパク質を新しいタンパク質と交換させ、さらに５分間照射した。２０％変性ＰＡＧＥによって分析し、Molecular Dynamics Phosphoimager上で定量した架橋は２２％架橋であった。
サンプル（９０ml）は５．９nmolの架橋ＲＮＡと、２１nmolの遊離ＲＮＡと、９７nmolの遊離コートタンパク質と、ＢＳＡ（７．２mg）とを含有した。全体量を２０mlに減じ、２個の５０mlポリプロピレンねじぶた遠心管（Nalgen）に等分し、−２０℃において一晩エタノール沈殿させた。ＲＮＡ及びタンパク質をBeckman Ｊ２−２１遠心機の固定角度Ｊ−２０ローター中で１３，０００rpm において回転させて、ペレットにした。各ペレットを０．５Ｍ尿素、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）及び０．２％ＳＤＳの１ml中に４℃において４８時間振とうさせながら再懸濁させた。フラクションを一緒にし、次に、トリプシンの活性を減じないように、ＳＤＳを沈殿によって除去した。これは４０mM  ＫＣｌによって達成され、沈殿物を０．２２μm 酢酸セルローススピンフィルターによるスピニングによって除去した。この溶液（５００μl ）を用いて、トリプシン状態を最適化した。
【０１１０】
タンパク質分解消化．  遊離ＲＮＡとタンパク質とを含む残留架橋ＲＮＡ溶液（１．５ml）を、１Ｍ  尿素、２０mM  ＣａＣｌ２及び６mM  ＤＴＴを含む６mlにし、次にトリプシン−ＴＰＣＫ（２５１単位／mg）（１．６１mg（１：５ｗ／ｗ））を加えた。反応を３６℃において２時間進行させ、この時点でさらに１．６１mgのトリプシンを加えた。４時間目に、アリコート（100 μl ）を取り出し、急速凍結によって反応を停止させた。２０％ポリアクリルアミド１９：１架橋、７Ｍ尿素、９０mM  Ｔｒｉｓ−ボレート／２mM  ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲル電気泳動（２０％尿素変性ＰＡＧＥ）によって、反応を分析した。
消化された架橋ＤＮＡの精製．  トリプシン反応混合物を１０mlにして、塩のモル濃度を減じ、２４０μl ＤＥＡＥイオン交換遠心カラムに通して処理した。このカラムを１００mM  ＮａＣｌによって洗浄し、実験台(bench top）遠心機において乾式遠心して、遊離ペプチドを除去した。ＲＮＡと架橋トリプシンフラグメントとを含むカラム結合物質をカラムから６００mM  ＮａＣｌ（１ml）によって溶離し、カラムを乾式遠心した。さらに２００μl の６００mM  ＮａＣｌをカラムに通して遠心した。２フラクションをプールし、エタノール沈殿させ、４℃において３５分間、１０，０００rpm でペレット化した。ペレットを７Ｍ尿素−ＴＢＥバッファー、１０mM  ＤＴＴ、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシラノールの２５μｌ中に再懸濁させ、８５℃に４分間、加熱し、２０％変性ＰＡＧＥによって精製した。このゲルを６００Ｖにおいて３．５時間処理した。このゲルを５分間ホスホイメージ(phosphoimage)暴露させた。消化されたタンパク質−ＲＮＡ架橋をゲルから、Ｂｉｏ−ＲＡＤ製のＰＶＤＦタンパク質配列決定膜(sequencing membrane)(０．２ミクロン）上に電気分解式にブロットした。この膜を風乾させ、１分間クーマシー染色し、５０％ＭｅＯＨ：５０％Ｈ２Ｏ中で２分間汚れを除去し、脱イオンＨ２Ｏによって２回すすぎ洗いした。膜のオートラジオグラムを作成して、膜から取り出された、消化されたタンパク質ＲＮＡ架橋を可視化し、エドマン(Edman）分解を受けさせた。Howard Hughesの方法及びプロトコール（Clive Slaughter,テキサス大学  Howard Hughes 医学研究所（サウスウエスターン））を用いて、Applied Biosystems  ４７０Ａシークエンサーにおいて実施した自動化エドマン分解によって、固定化ペプチドの配列決定した。このエドマン分析は、架橋位置が既知アミノ酸配列に基づいてチロシン−８５であることを実証した（Weber （１９８３），Biochemistry  ６：３１４４）。
【０１１１】
実施例５．  ３０８nmにおけるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−２の光架橋
実施例３に述べた実験と同様な実験において、ＩＵ置換ＲＮＡ−２（配列番号：２）をＲ１７コートタンパク質に、Omnichrome  ＨｅＣｄレーザー（モデル３０７４−４０Ｍ３２５）からの３２５nmにおける単色発光によって光架橋させた。ＨｅＣｄレーザーの出力は３７mWであり、直径３mmのビーム全体がサンプル上に入射した。単位時間あたりの励起を高めるために、誘電体塗布凹面鏡によってビームを反射させて、サンプルに通して戻した。架橋ＲＮＡをＰＡＧＥによって非架橋ＲＮＡから分離し、収量をホスホイメージャーによって測定した。タンパク質に架橋したＲＮＡの％を照射時間の関数として図９に示す。Ｒ１７コートタンパク質に対する光損傷なしに、高収量架橋が生じた。別の実験では、さらに高い線量による３２５nmによるコートタンパク質のみの同様な照射が、Ｒ１７コートタンパク質と同じ結合定数を示すタンパク質を生じた。ＢｒＵ含有ＲＮＡ−１−Ｒ１７コートタンパク質複合体の３２５nm照射は、ＢｒＵ発色団が３２５nmにおいて透光性であるために、架橋を生じなかった。
【０１１２】
実施例６．  トランスイルミネーターによるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１及びＲＮＡ−２の光架橋．
実施例３に述べた実験と同様な実験において、ＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）をＲ１７コートタンパク質に、ポリスチレンによって濾過した、Fisher Biotech Transilluminator （モデルＦＢＴＩＶ−８１６）からの３１２nm範囲内の広帯域発光によって光架橋させた。架橋ＲＮＡをＰＡＧＥによって非架橋ＲＮＡから分離し、収量をオートラジオグラフィーによって測定した。タンパク質に架橋したＲＮＡの％を照射時間の関数として図１０に示す。
【０１１３】
実施例７．  ５−ヨードウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとの光反応
Dietz とKoch（１９８７）（上記文献）が開示するように、Ｎ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドを調製した。ヨードウラシルと１０モル当量過剰なＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドをＸｅＣｌエキシマーレーザーによる３０８nmにおける照射は、図１１に示すように、ブロモウラシルとＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミドとからの光付加物(photoadduct）（構造６）（Dietz とKoch（１９８７），上記文献）と同様な光付加物を生じた。Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣと１Ｈ  ＮＭＲスペクトロスコピーとによって生成物比較を行った。会合タンパク質へのＩＵ置換核酸の光架橋の機構については殆ど知られていないが、この結果は、この光架橋の機構が会合タンパク質へのＢｒＵ置換核酸の光架橋の機構と同じであることを示唆する。
【０１１４】
実施例８．  タンパク質に光架橋したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
ＤＮＡ鋳型の代わりにプラスミドを用いて、実施例１に報告するような方法によって、ＲＮＡ−７（配列番号：４）（図１１）を製造した。実施例３に述べるように、光架橋を実施した。６．７５nM  ＲＮＡと１２０nM  Ｒ１７コートタンパク質とから成る反応混合物（４ml）をＸｅＣｌエキシマーレーザーからの非収束発光によって３０８nmにおいて、一度に２mlずつ、照射した。レーザーは５０ｍＪ／パルスを生じ、レーザーを１０Hzにおいて操作した。５分間の照射中に、この反応はほぼ定量的な架橋（８５〜９０％）にまで進行した。架橋後に、全反応混合物の１mlを取り出した；ＥＤＴＡ（８０mM）、ＳＤＳ（０．１％）及びＣａＣｌ２（０．１mM）を加え；存在する遊離（非結合）ＲＮＡを精製除去して；タンパク質をプロテイナーゼＫによって６０℃において３０分間消化させた。残留タンパク質に結合したＲＮＡをエタノール沈殿させ、塩を除去し、遠心してペレットにした。これらのペレットを７０％エタノールによって３回洗浄して、残留塩を除去した。逆転写反応を利用して、ＲＮＡ鋳型の相補的ＤＮＡコピーを製造した。１３−塩基プロモーターをＲＮＡにアニールし、逆転写反応を製造業者，Gibco （メリーランド州，ガイサースブルグ）の標準条件下で実施し、１時間後に停止させた。ｃＤＮＡを３２Ｐ標識デオキシシチジントリホスフェートによってボディ標識した。次に、０．２Ｍ水酸化ナトリウムによる１００℃における５分間の加水分解によって、ＲＮＡ鋳型を除去した。ｃＤＮＡの形成をＰＡＧＥによって追跡した。加水分解ラダー(ladder)とマーカーとをゲルに加えて、ｃＤＮＡの長さを測定した。このｃＤＮＡは４４ヌクレオチドＲＮＡ鋳型と同時移動した。架橋修飾の結果として、ｃＤＮＡの停止があったとしても、３１ヌクレオチドの短縮生成物が得られたと考えられる。ゲルの２２〜２５ヌクレオチド領域に少量の停止生成物が観察されたが、これはＲＮＡ鋳型上のｃＤＮＡの位置２５において開始するヘアピン二次構造から生じたと考えられる。ゲルの３１ヌクレオチド領域に停止は出現しなかった；このことは逆転写酵素が架橋の位置を通して読み取りを行ったことを実証した。ゲルの線図を図１４に示す。
【０１１５】
実施例９．  ヨードシトシン光架橋．
５−位置にシトシンを含み、Ｒ１７コートタンパク質に高アフィニティで結合したヘアピンＲＮＡ（ＲＮＡ８）に、５−ヨードシトシン（ＩＣ）を組み入れた。このＩＣ含有ＲＮＡをＲＮＡ９と名付ける。ＲＮＡ９（５nM）とＲ１７コートタンパク質（１２０nM）とを１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５、４℃）／８０mM  ＫＣｌ／１０mM酢酸マグネシウム／８０μg ／ml  ＢＳＡ中で氷上において１５〜２５分間インキュベートしてから、照射した。コートタンパク質に結合したコンホメーションであることを保証するために、水中のＲＮＡを８５℃に３分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した（GroebeとUhlenbech （１９８８），上記文献）。この複合体を４℃において５分間照射し、この実験をＲＮＡ２及びＲＮＡ８コートタンパク質複合体の対照照射に比較した。ＲＮＡ８−コートタンパク質複合体の照射は架橋生成物を生じなかった。ＲＮＡ９−コートタンパク質複合体の照射は、ＲＮＡ２−コートタンパク質複合体の対照照射の収量（８０〜９０％）と同様な高収量（７０〜８０％）で形成される架橋の形成を生じた。ＲＮＡ９の架橋はループヘアピンの位置−５にＩＵを含むＲＮＡと同じ機構で生ずると推定される（図６と１２）。この推定は、ＲＮＡ８は光架橋しなかったので、架橋の特異性に基づく。
【０１１６】
実施例１０．  ＤＮＡリガンド中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れ．
上記方法による照射時に標的分子に架橋することができるＤＮＡリガンド中に、光反応性ヌクレオチドを組み入れることができる。５−ブロモデオキシウラシル（ＢｒｄＵ）、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン及び５−ヨード−２’−デオキシウラシルは、このような光反応性ヌクレオチドの例である。
【０１１７】
実施例１１．  光ＳＥＬＥＸ．
本発明の１実施態様では、標的分子に結合し、光架橋する核酸リガンドの選択に光ＳＥＬＥＸを完成まで適用する。
光反応性基を含む核酸オリゴヌクレオチドのランダム化セットを合成する。候補混合物のオリゴヌクレオチドを、利用可能な各位置において、光反応性基によって部分的に又は完全に飽和することができる。候補混合物を標的分子と接触させ、光の適当な波長において照射する。標的分子と架橋したオリゴヌクレオチドを残りのオリゴヌクレオチドから単離し、標的分子を除去する。単離したＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを作成し、増幅する。これらの増幅ｃＤＮＡ配列を光反応性基の存在下でＲＮＡ配列に転写し、必要に応じて、光ＳＥＬＥＸを繰り返す。
【０１１８】
実施例１２．  強化光架橋性リガンドの選択：光ＳＥＬＥＸを伴うＳＥＬＥＸ．
本発明の方法の１実施態様では、ＳＥＬＥＸによる核酸リガンドの選択後に、標的分子に架橋することができるリガンドに関して光ＳＥＬＥＸによって選択する。このプロトコールは、標的に光架橋することもできる、標的分子に対して高い結合アフィニティを有するリガンドを生じる。
特定トリホスフェートの代わりに反応性ヌクレオチドトリホスフェートによるＴ７ポリメラーゼ転写によって、ＲＮＡ中に光反応性ヌクレオチドを組み入れる。例えば、５−ブロモウリジントリホスフェートをウリジントリホスフェートと置換する、又は８−ブロモアデノシントリホスフェートをアデノシントリホスフェートと置換する。光反応性ヌクレオチドを含むＲＮＡ配列のランダム化セットを形成し、ＳＥＬＥＸ方法を適用する。最初の選択ラウンドを用いて、本質的に不良なバインダーを除去し、分子プールの質を向上させて、光反応性基を有し、標的分子に結合するＲＮＡプールを形成するように、分子プールを収斂させる(converge)。初期ＳＥＬＥＸラウンドからのアリコートを照射する、ラウンドが進行するにつれて、光架橋の強化をＰＡＧＥによって追跡する。架橋生成物を表す、緩慢な移動帯が明白になり始めたときに、ＲＮＡプールを光ＳＥＬＥＸのラウンド中に導入する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接して光反応性基を有するＲＮＡを反応させ、選択して、反応性標的残基に近接して反応性ヌクレオチドを有さないＲＮＡを除去する。
このプロトコールは、標的分子に対する予め同定されたリガンドに光ＳＥＬＥＸ選択を適用する。
【０１１９】
実施例１３．  ＳＥＬＥＸを伴う光ＳＥＬＥＸ
本発明の方法の他の実施態様では、標的分子に光架橋することができるＲＮＡリガンドを光ＳＥＬＥＸ方法によって予め選択する。その後に、ＳＥＬＥＸを実施して、架橋用オリゴヌクレオチドを標的分子結合能力に関して選択する。
【０１２０】
実施例１４．  光ＳＥＬＥＸを伴う限定ＳＥＬＥＸ
本発明のこの実施態様では、限定された回数の選択ラウンドでのＳＥＬＥＸ方法によって、核酸リガンドを選択する。実施例１２と同様に、ＳＥＬＥＸを完成まで適用しない。むしろ、標的分子に対して比較的大きいアフィニティを有するオリゴヌクレオチドに関して、候補混合物を部分的に選択する。候補混合物のランダムオリゴヌクレオチドは光反応性基を含む、初期ＳＥＬＥＸを照射なしに実施する。次に、光ＳＥＬＥＸを実施して、標的分子に架橋することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
このプロトコールは、幾らか大きい標的分子結合能力を有する架橋用リガンドの、オリゴヌクレオチドプールからの選択を可能にし、ＳＥＬＥＸによる完成までの選択が架橋用リガンドを生成しない状況で有用である。
【０１２１】
実施例１５．  限定指向性(limited directed)光ＳＥＬＥＸ
本発明の方法の１実施態様では、ＳＥＬＥＸによって同定される核酸リガンドが限定されたランダム化を受けた後に、光ＳＥＬＥＸによる選択を受ける。
部分的ランダム化ＲＮＡの転写に用いるＤＮＡ鋳型の構成は初期選択リガンドの配列に基づくものであり、初期選択ＲＮＡ配列の位置に相補的である各位置に主としてヌクレオチドを含む。しかし、各位置はその位置におけるオリジナル配列を変えるシークエンサー中に、他の３種のヌクレオチドの各々の少量を用いることによっても、部分的にランダム化される。次に、反応ミックス中の特定のトリホスフェートに置換する光反応性トリホスフェート（すなわち、Ｕに対してＢｒＵ）によって、ＤＮＡ分子のこのセットから限定ＲＮＡプールを転写する。光反応性ヌクレオチドを含む、ＲＮＡ分子の部分的ランダム化セットにある量の標的タンパク質を混合する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基を有する結合ＲＮＡは、照射時に、共有結合架橋を形成する。結合し、架橋するＲＮＡを数回の光ＳＥＬＥＸラウンドで選択し、結合するが架橋しないＲＮＡから分離する。
【０１２２】
実施例１６．  標的分子の修飾方法．
本発明の他の実施態様では、標的分子を改質することができるリガンドを発展させるために光ＳＥＬＥＸを適用する。これらの状況下で、光ＳＥＬＥＸ又はＳＥＬＥＸによって選択されるリガンド上又は中への光反応性基の組み入れは、標的分子の生物学的活性が改良されるような、幾つかの方法で標的分子を改質することができる。例えば、標的分子を光架橋リガンドによって不活化することができる。不活化機構には、化学的修飾を誘出する、標的分子からの電子若しくは水素の抽出又は標的分子へのラジカル付加がある。これらの種々な機構は照射形式を変えることによって達成することができる。
紫外（ＵＶ）光線と共に標的分子の診断法として用いられる、光ＳＥＬＥＸによって選択されるリガンドも、照射光源をＸ線又はガンマー線に変えるならば、インビボにおいて同標的を不活化することもできる。生ずるビニルラジカルがヒドロキシラジカルと同様に、すなわち、標的分子の結合ドメインから水素原子を抽出することによって作用することができる。
放射能標識したＩＵ−若しくはＢｒＵ−置換ＲＮＡヘアピン配列に結合したＲ１７コートタンパク質のＸ線照射は、架橋の形成を生じることができる。ＢｒＵ−又はＩＵ−発色団をＸ線照射によって高いエネルギー状態に励起させて、その結果としてビニルラジカルを形成させることもできる（Mee （１９８７），Radiation Chemistry:principles and Applications （FarhatazizとRodgers 編集），ＶＣＨ  Publishers，ニューヨーク，４７７〜４９９頁）。このラジカルはＲ１７コートタンパク質の結合ドメインから水素を抽出し、それによって、そのＲＮＡリガンド結合能力を減ずるか又は抑制することができる。置換したＲＮＡの存在下及び不存在下でのＲ１７コートタンパク質のＸ線照射によって、不活化を試験する。架橋複合体の形成をＰＡＧＥによって分析する。タンパク質ドメインの修飾によって結合の改良を生じる、ＲＮＡのＸ線照射の効果をニトロセルロース結合検定によって追跡する。
【０１２３】
実施例１７．  特定の疾患経過に関連する固有タンパク質を同定するための光ＳＥＬＥＸの診断的使用．
診断方法の目的は、固有タンパク質の発現を特定の疾患経過と相互に関係づけることである。これらの相互関係の幾つかは、例えば細菌又はウイルス感染後に、明らかになるので、抗原特異性である抗原、又は非感染対象の血液中に検出されない、このような抗原に対する抗体を検出することができる。あまり明らかではない相互関係には、最も一般的な形の睾丸性癌の存在と直接相関するα−フェトタンパク質の血清中の発現がある。
生物学的タンパク質とヒトの重要な疾患との間のまだ知られていない相互関係の解明に、光ＳＥＬＥＸ方法を適用することができる。本発明の１実施態様では、疾患を有する患者から血清を採取し、血清中の全てのタンパク質に対するＲＮＡリガンドを製造し、正常血清に吸着させる。血清タンパク質に対するＲＮＡリガンドをＳＥＬＥＸ方法によって同定し、その後に光反応性基を組み入れる、又は１個以上の光反応性基を含むオリゴヌクレオチドの候補混合物から最初に選択して、光ＳＥＬＥＸによって同定することができる。未結合で残されたＲＮＡリガンドは疾患を有する患者からの血清中の固有タンパク質のみに特異的に結合するＲＮＡリガンドである。例えば、限られた数の血清タンパク質（例えば、１１種）に対するＲＮＡリガンドを最初に同定する。同定されたＲＮＡリガンドは標的タンパク質と可逆的に若しくは非可逆的に架橋することができる、可逆的若しくは光反応性官能基を有する修飾ＮＴＰを含む。あらゆるタンパク質に対する架橋リガンドの存在を任意に立証することができる。次に、ＲＮＡリガンドを取り出し、増幅する。次いで、ＲＮＡを第２ＳＥＬＥＸラウンドで転写する。次に、ＲＮＡを最初の１１種のタンパク質の中の非常に過剰な１０種に結合させ、固有タンパク質（１１番目）に特異的なＲＮＡリガンドを残す。次に、このＲＮＡを増幅する。これはサブトラクティブな（subtractive)方法である。
本発明の診断方法の１実施態様では、上記方法を用いて、異常なタンパク質（例えば、α−フェトタンパク質）に対するリガンドを同定する。重要な疾患を有する患者からの血清を得て、存在する全てのタンパク質に対するＲＮＡリガンドを同定する。これらのＲＮＡリガンドを正常な血清に吸着させ、未結合リガンドを残す。未結合リガンドは有力な診断剤であり、かつ疾患と特異的に関連する血清タンパク質を同定するためのツールである。
【０１２４】
実施例１８．  光架橋する核酸リガンドのインビボ利用による疾患の治療方法．
疾患状態と関連する標的分子に対する核酸リガンドを光ＳＥＬＥＸ方法によって選択する（実施例１１）。光ＳＥＬＥＸ選択核酸リガンドを技術上周知の幾つかの方法で患者に導入する。例えば、非ハロゲン化光ＳＥＬＥＸリガンドを、患者に移される幹細胞中にクローン化する。このリガンドは患者の細胞中に一過性に又は本質的に発現する。患者に投与されたＩＣはクローン化配列のオリゴヌクレオチド産物中に組み入れられる。照射時に、リガンドは標的分子に架橋することができる。照射は可視光線、３２５nm、３０８nm、Ｘ線、紫外線及び赤外線を含むことができる。
或いは、光ＳＥＬＥＸリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖ＤＮＡとして、患者の細胞に取り入れることができる。光ＳＥＬＥＸリガンドを患者に導入する他の方法は患者の細胞中へハロゲン化リガンドをリポソーム投与することを含む。
【０１２５】
実施例１９．  インビトロ診断法、インビボイメージング及び治療デバイスに用いるための光ＳＥＬＥＸリガンド．
疾患状態及び／又は異常な細胞（例えば、腫瘍細胞）と特異的に関係する分子を同定するために、光ＳＥＬＥＸを用いることができる。このようなマーカー分子と共有結合的に反応する光ＳＥＬＥＸ同定オリゴヌクレオチドを製造することができる。
本発明の１実施態様では、光ＳＥＬＥＸの標的は異常な血清又は腫瘍細胞（例えば、標的混合物）である。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドのライブラリー候補混合物を形成する。上記光ＳＥＬＥＸプロトコールの１つを用いて、異常な血清中又は腫瘍細胞上の固有タンパク質に光架橋することができるオリゴヌクレオチドを同定する。腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、インビトロ診断剤として又は促進剤に結合する場合にはインビトロイメージングのために有用である。さらに、腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、例えば、免疫活性化方法として、不活化方法として、又は特異的な標的活性の薬剤化合物の投与方法として治療的に使用可能である。
【０１２６】
実施例２０．  光ＳＥＬＥＸとＨＩＶ−１  Ｒｅｖ．
鋳型デオキシオリゴヌクレオチド合成の各位置において、ヌクレオチド試薬比は６２．５：１２．５：１２．５：１２．５であった。各位置において多量に加えるヌクレオチドは、同じ位置における６ａ配列（配列番号：５）中に見られるヌクレオチドに一致する。
クローン化と配列決定操作：  各ラウンドから単離したＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを製造し、ＰＣＲ増幅して、末端に固有のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する１１１ｂｐフラグメントを得た。フェノール／ＣＨＣｌ３処理したフラグメント及びｐＵＣｌ８ベクターを、一緒に、３７℃においてＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとによって一晩消化させ、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、沈殿させた。ベクターとＰＣＲ生成物の消化物を室温において４時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結させ、 コンピテントなＤＨ５α−Ｆ’細胞に形質転換させ、この細胞を次にアンピシリン含有ＬＢプレート上で成長させた。個別コロニーをＬＢ−アンピシリン培地中で一晩成長させ、Wizard（Promega)プラスミド調製キットを用いて、プラスミドを製造した。配列決定はSequenase （ＵＳＢ）キットを用いて実施した。
ニトロセルロースフィルター結合選択のための条件：全てのラウンドは約２０nM  ＲＮＡを用いた。ラウンド１と２：６nM Rev. ラウンド３：３nM Rev. ラウンド８：１nM Rev. ラウンド９〜１０：３nM Rev. 結合反応量は５mlから１mlまでの範囲であった。
架橋選択のための条件：  約５０〜１００nM折り畳み(folded)プールＲＮＡを、氷上で、１ｘＢＢ（５０mM  ＴｒｉｓＡｃ  pH７．７、２００mM  ＫＯＡｃ、１０mM  ＤＴＴ）中の０．２μM Ｒｅｖ（ラウンド４〜６）又は０．５μM Ｒｅｖ（ラウンド７）、１μM ＢＳＡに加えて、３７℃において５分間インキュベートした。次に、サンプルをＸｅＣｌエクサイマーレーザーによって３０８nmにおいて３分間（ラウンド４）、ＨｅＣｄレーザーによって３２５nmにおいて３０分間（ラウンド５）、３２５nmにおいて１０分間（ラウンド６）又は３２５nmにおいて１分間（ラウンド７）、３７℃において照射した。サンプルの約１／２を５０％ホルムアミド、ｔＲＮＡ（４０μg ）中で９０℃において４分間加熱し、８％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
次の操作を用いて、アクリルアミドゲルから架橋ＲＮＡを約８０％の回収率で溶離した：核タンパク質含有ゲルスライスを１ｘＰＫバッファー（１００mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  pH７．７、５０mM  ＮａＣｌ及び１０mM  ＥＤＴＡ）中で粉砕して、均質なスラリーにした。プロテイナーゼＫを１mg／mlの濃度まで加え、４２℃において３０分間インキュベートした。尿素濃度を約０．７Ｍ、１．９Ｍ及び３．３Ｍと高めながらの４２℃における１５分間のインキュベーションを実施した。得られた溶液をＤＭＣＳ処理グラスウールと０．２μm 酢酸セルロースフィルターとに通した。濾過した溶液をフェノール／ＣＨＣｌ３によって２回洗浄し、ＥｔＯＨ：イソプロパノールの１：１容量混合物によって沈殿させた。
各ラウンドからの架橋帯をシンチレーション液体中に入れて、Beckman ＬＳ−１３３液体シンチレーション系において計測した。架橋％＝〔（３２５nmにおける４分間照射後のＲＮＡ＋Ｒｅｖからの架橋生成物ｃｐｍ）−（照射したＲＮＡのみの架橋領域ｃｐｍ）〕／総ｃｐｍ。架橋における折り畳み増加(fold increase）はＲ１３架橋％／Ｄ３７架橋％である。
競合体ｔＲＮＡを用いた、アフィニティ及び架橋に関する同時選択を次のように実施した。１０μM 酵母ｔＲＮＡを１ｘＢＢ（５０mM  ＴｒｉｓＡｃ（pH＝７．５）、２００mM  ＫＯＡｃ、１０mM  ＤＴＴ）中の０．５μM Ｒｅｖ、１μM ＢＳＡに加えて、氷上で１０分間インキュベートした。２００，０００cpm （約５０〜１００nM最終濃度ＲＮＡ）を加えて、氷上でさらに１５〜６０分間インキュベートした後に、３７℃において５分間インキュベートした。次に、サンプルを３７℃においてＨｅＣｄレーザーによって３２５nmで４分間照射した。サンプルの約１／３を５０％ホルムアミド、ｔＲＮＡ（４０μg ）中で９０℃において４分間加熱し、８％ポリアクリルアミド／８Ｍ  尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
ＬＩ架橋用ＲＮＡリガンドは４分間の３２５nmレーザー照射によってさらに架橋生成物を形成する。
切頭ＲＮＡを生成するために用いる鋳型オリゴは次の通りである：
PTS-1; 5′-TAATACGACTCACTATA-3′，（配列番号：６０）DNA-2;
５′-GAGTGGAAACACACGTGGTGTTTCATACACCCTATAGTGAGTCGTATTA- ３′（配列番号：６１），及びDNA-24; ５′-AGGGTTAACAGGTGTGCCTGTTAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-３′（配列番号：６２）．
ＰＴＳ−１をＤＮＡ−２又はＤＮＡ−２４と共にアニールして、Ｔ７転写のための鋳型を製造する。
６ａ（配列番号：５）に比べた個々の分子の変化数を計算するために、各分子を６ａに最大の類似性になるように配向させた。ギャップを１変化として数えて、切頭分子は無変化として計数した。各クラス中に分子を見いだす平均確率を算出するために；特異的変化（ｓ）と非特異的変化（ｎｓ）と無変化（ｕ）との平均数を計算して、次式に用いた：
（Ｐ）＝（．１２５）ｓ（．３７５）ｎｓ（．６２５）ｕ．クラスＩａ（Ｐ）＝９ｘ１０−１５；Ｉｂ（Ｐ）＝３ｘ１０−１５；Ｉｃ（Ｐ）＝７ｘ１０−１３；Ｉｄ（Ｐ）＝３ｘ１０−１５；クラスＩＩ（Ｐ）＝２ｘ１０−１４。出発群は１０１４分子から成るので、（Ｐ）＜１０−１４を有する配列は表されない。（ｓ）は大文字の共通ヌクレオチドを生じるために必要な変化であり；（ｎｓ）は付加的な変化である。
ヒト核抽出物の存在下でＨＩＶ−１  Ｒｅｖと光独立性に架橋するTrunc ２４（配列番号：５９）を次のように測定した：Trunc ２４  ＲＮＡと、核抽出物と、Ｒｅｖタンパク質とを一緒にし、氷上で１０分間インキュベートした。サンプルに８Ｍ尿素含有バッファーを１：１で混合し、分析のために７Ｍ尿素、８％ポリアクリルアミドゲル上に置いた、ＸＬは核タンパク質複合体を意味し、ＲＮＡは遊離のtrunc ２４  ＲＮＡを意味する。
【０１２７】
実施例２１．  プライマー伸長抑制溶液ＳＥＬＥＸ．
プライマー伸長抑制は、緊密に結合した標的分子が高アフィニティオリゴヌクレオチドのｃＤＮＡ合成を阻害しうることに基づき、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅可能なｃＤＮＡプールと、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅不能なｃＤＮＡプールとの形成を生じる。したがって、溶液ＳＥＬＥＸのＰＣＲ工程は両ｃＤＮＡプールの間の分割スクリーンとして作用する。核酸合成、プライマー伸長抑制及びＰＣＲに関する一般的なプロトコールを本明細書では提供する。さらに、特定の核酸リガンドを分離するためのＮ−アクリロイルアミノフェニル水銀ゲル電気泳動条件を述べる。核酸リガンドをクローン化し、配列決定する方法はTuerk とGold（１９９０）（上記文献）が述べている通りである。
ＲＮＡ合成．  ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡ鋳型とをインキュベートすることによって、ＲＮＡ候補混合物を生成した。反応条件は８％ポリエチレングリコール８０００、５mMジチオトレイトール、４０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１２mMＭｇＣｌ２、１mMスペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２mMヌクレオチドトリホスフェート及び１単位／μl   ＲＮＡポリメラーゼである。反応は３７℃において２時間インキュベートする。
転写プロトコールを用いて、修飾ヌクレオチドを有するＲＮＡを生成する。この転写反応はヌクレオチドトリホスフェート誘導体によってプライムされることができ（修飾５’末端を形成するため）、修飾ヌクレオチドを新生ＲＮＡ鎖に、又はＲＮＡ生成物の５’末端若しくは３’末端に連結したオリゴヌクレオチド若しくはそれらの誘導体にランダムに組み入れることができる。
プライマー伸長抑制．  プライマー伸長抑制をHartz 等（１９８８）（上記文献）が開示するように実施する。簡単には、候補混合物のオリゴヌクレオチドを蒸留水中で６５℃において３分間、２倍モル過剰のプライマーと共にインキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドプライマーを候補混合物のオリゴヌクレオチドの３’末端にアニールする。このアニーリング反応を氷上で冷却し、その後に１／１０量の１０ｘ濃縮伸長用バッファー（例えば、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、６０mM  ＮＨ４Ｃｌ、１０mM  酢酸Ｍｇ、６mM  β−メルカプトエタノール、及び０．４mMヌクレオチドトリホスフェート）を添加する。ポリメラーゼの添加と、０〜８０℃の範囲内の種々な温度のいずれかにおける数秒間から数時間までの範囲内の時間のインキュベーションとによって、プライマー伸長が開始される。本発明の方法の１実施態様では、低アフィニティ核酸が連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを優先的に組み入れるように、これらの連鎖ターミネーターの存在下でプライマー伸長を最初に実施する。次に、高アフィニティ核酸から標的を除去し、連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを除去した後に、第２プライマー伸長を実施する。
ポリメラーゼ連鎖反応．  一本鎖又は二本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチド鋳型をバッファー（５０mM  ＫＣｌ、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．６）、２．５mM  ＭｇＣｌ２、１．７mg／ml  ＢＳＡ、１mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び１μM プライマー）中で１単位／μl 熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートすることによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が達成される。標準熱サイクルは９５℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、及び７２℃１分間であり、これを必要に応じて繰り返す。ＰＣＲプロトコールの１改良方法は、一本鎖又は二本鎖の鋳型を単一種の細長いプライマーのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって一本鎖ＤＮＡを生成し、細長い生成物を生じる。ＰＣＲは上記プライマー伸長工程によって増幅可能にされるオリゴヌクレオチドを優先的に増幅する。
（Ｎ−アクリロイルアミノ）フェニル水銀ゲル電気泳動．  Ｎ−アクリロイルアミンフェニル水銀（ＡＰＭ）を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動をＩｇｌｏｉ（１９８８），Biochemistry  ２７：３８４２が開示するように実施した。酢酸（ｐ−アミノフェニル）水銀（０．３５ｇ）にアセトニトリル（８ml）を０℃において混合し、次に１．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（２ml）を加えることによって、ＡＰＭを合成した。次に、塩化アクリロイル（全体で０．２ml）を激しく撹拌しながら加え、反応を４℃において一晩インキュベートした。固相を遠心分離によって回収し、水で洗浄し、ジオキサン（８．５ml）中で５０℃に加温することによって溶解した後に、濾過して、不溶な汚染物を除去した。室温での放置中にＡＲＭ結晶が形成され、この固体を再び水で洗浄し、真空下で乾燥させた。ＡＲＭを４℃において保存した。所定量のアクリルアミド、ビス（アクリルアミド）、尿素を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓボレート／ＥＤＴＡ（pH８．３）中に含む溶液に、ホルムアミド中ＡＰＭの１mg／ml溶液の適当なアリコートを加えることによって、ＡＰＭポリアクリルアミドゲルを調製した。ゲル溶液１０mlにつき１％過硫酸アンモニウム（０．５ml）とＴＥＭＥＤ（７μl ）とを加えることによって、重合を開始させた。
【０１２８】
実施例２２．  酵素的又は化学的分解溶液ＳＥＬＥＸ．
酵素又は化学薬品を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡのプールを選択的に分解することができる。本発明の１実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡのプールを選択的に分解する。一本鎖ＤＮＡを開裂する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的な配列において、異なる効率で開裂する。
制限酵素の消化は多様な、配列特異性の制限エンドヌクレアーゼによって実施することができる。一本鎖ＤＮＡを開裂するエンドヌクレアーゼには、ＤｄｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭｎＩＩ、ＰｓｔＩ及びＲｓａＩがある。これらの酵素は分子生物学の分野に熟練した人に周知の標準条件下で用いられる。核酸制限配列と部位特異性制限ヌクレオチドとの適当な組合せを用いて、二本鎖核酸を開裂することもできる。
基本的な溶液ＳＥＬＥＸ操作は、ＳＥＬＥＸ特許出願に述べられているように、実施される。４個のｄＮＴＴの存在下で最初のｃＤＮＡ伸長を実施し、次に標的を除去する。制限エンドヌクレアーゼによる酵素開裂に耐性である修飾ヌクレオチドによって第２ｃＤＮＡ伸長を実施する。ｃＤＮＡ伸長生成物の混合物を適当な制限酵素と共にインキュベートする。遊離核酸からの第１ｃＤＮＡ伸長生成物を開裂して、プライマーアニーリング部位を除去し、このｃＤＮＡプールをＰＣＲによって増幅不能にする。制限エンドヌクレアーゼによる開裂の効率は、制限部位（ＲＳ）にヘアピンを用いて、図２４に示すように局在二本鎖領域を形成することによって改良することができる。
或いは、第１ｃＤＮＡ伸長生成物を修飾ヌクレオチドの組み入れによって他のクラスの酵素によっても選択的に分解可能にする。例えば、低アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼに感受性のヌクレオチドによって合成することができ、高アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡは耐性ヌクレオチドを組み入れることができる。
低アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡの化学分解は、ピペリジンを用いた、上述のような７−メチルグアノシン、５−ブロモウラシル若しくは５−ヨードウラシルの組み入れ、又は光分解によって達成することができる（Sasse −DwightとGralla（１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：１４６；Aigen とGumport （１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：４３３；Hockensmith 等（１９９１），Methods Enzymol.  ２０８：２１１）。
【０１２９】
実施例２３．  アフィニティクロマトグラフィーを伴う溶液ＳＥＬＥＸ．
第１ｃＤＮＡ伸長生成物又は第２ｃＤＮＡ伸長生成物のいずれかの選択的除去はアフィニティクロマトグラフィーによって達成することができる。第１ｃＤＮＡ伸長生成物の除去は遊離核酸又は低アフィニティ核酸に対応するｃＤＮＡプールを除去する。第２ｃＤＮＡ伸長生成物の除去は高アフィニティリガンドに対応するｃＤＮＡを保留する。この手法はｃＤＮＡ合成中の修飾ヌクレオチドの組み入れに基づく。
第１伸長生成物の選択的除去．  基本的溶液ＳＥＬＥＸプロトコール後に、アフィニティマトリックス上への第１ｃＤＮＡプールの保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド）の存在下で、第１ｃＤＮＡ伸長を実施する（図２５）。次に、標的を除去し、第２ｃＤＮＡ伸長を非修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。修飾ヌクレオチドを組み入れたｃＤＮＡを対応アフィニティリガンドを含むカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって取り出すことができる。標的に対して高いアフィニティを有する核酸に対応するｃＤＮＡプールは残留し、ＰＣＲによって増幅される。
第２伸長生成物の選択的除去．  基本的溶液ＳＥＬＥＸプロトコール後に、第１ｃＤＮＡ伸長を４個のｄＮＴＴの存在下で実施し、上述のようにアフィニティマトリックス上への第２ｃＤＮＡプールの保持を可能にする修飾塩基（例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド）の存在下で、第２ｃＤＮＡ伸長を実施する。
アフィニティマトリックスへのアニーリングのための非反復配列の組み入れ．
本発明の方法の代替え実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特別な配列を選択的に組み入れることもできる。したがって、上述のように、商業的に入手可能なマトリックス上で、第１又は第２合成ｃＤＮＡを遅延させ、精製することができる。
【０１３０】
実施例２４．  エキソヌクレアーゼ阻害溶液ＳＥＬＥＸ
エキソヌクレアーゼ阻害を用いて、二本鎖リガンドを単離することができる。標的分子に緊密に結合した二本鎖核酸リガンドは結合部位の３’末端においてエキソヌクレアーゼ加水分解を阻害する。これは、長い一本鎖５’オーバーハング(overhang)と中央塩基対領域とも含む、加水分解に耐性な核酸分子群を生じる（図２６参照）。この核酸分子は任意のポリメラーゼに対する基質であり、ポリメラーゼと共のインキュベーションは二本鎖出発物質を生成する。この分子をＰＣＲによって増幅する。標的分子に緊密に結合しない、核酸候補混合物の要素は初期エキソヌクレアーゼ工程中に消化される。
二本鎖核酸の３’→５’加水分解は任意の二本鎖特異性３’→５’エキソヌクレアーゼと共のインキュベーションによって達成される。エキソヌクレアーゼIII は二本鎖ＤＮＡ３’→５’を特異的に加水分解して、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０），５mM  ＭｇＣｌ２、１０mM  β−メルカプトエタノールを含む、種々なバッファー中で３７℃において活性である。
【０１３１】
実施例２５．  触媒核酸を単離するための溶液ＳＥＬＥＸ方法
溶液ＳＥＬＥＸを用いて、触媒核酸配列を単離することができる。本発明のこの実施態様は線状から環状への転換(transformation)を利用して、触媒核酸から非触媒核酸を分類する。
図２７に示すように、ＰＣＲ工程を利用して、核酸候補混合物を触媒要素に関して選別することができる。自己環化するか、又はそれらの５’末端若しくは３’末端をリガーゼによる環化を可能にするように変える触媒核酸をＰＣＲによって増幅する。この図は候補混合物の触媒要素による環形成を説明する；候補混合物の非触媒要素は線状に留まる。環化後に、５’末端にアニールするプライマーと共に、候補混合物をインキュベートする。本発明のこの実施態様では、環状オリゴヌクレオチド要素のみがｃＤＮＡを生成し、ＰＣＲ工程中に増幅される。
この手法は、自己環化を直接触媒するか又は、リガーゼと共にインキュベーションによって増幅可能な形状が生ずるように、それら自身の末端を変える核酸を単離する。図２７に示すように、ｃＤＮＡプライマーと候補混合物のオリゴヌクレオチドの５’末端との特別な相互作用が環状分子のみの増幅を可能にする。本発明の方法の他の実施態様では、この手法を変更して、新規な反応を触媒する触媒核酸の単離を可能にする。
【０１３２】
実施態様２６．  溶液ＳＥＬＥＸの自動化
この自動化溶液ＳＥＬＥＸプロトコールは自動化ＤＮＡ合成装置に用いられる方法の変更である。ビオチン／アビジン相互作用又は多様な共有結合クロマトグラフィー方法のいずれかによって、核酸候補混合物を固体サポートに結合させる（例えば、マレイミド又は無水シトラコン酸サポートへの修飾ヌクレオチドの縮合）。結合した核酸候補混合物は目標の結合のために良好な基質を提供し、カラムはＳＥＬＥＸ操作のための単一反応器の使用を可能にする。プライマー伸長抑制を利用して、低アフィニティリガンドと高アフィニティリガンドとを物理的に選別する。低アフィニティ核酸は、実施例２２に述べたようにｃＤＮＡを分解可能にする、第１ｃＤＮＡ伸長工程中の修飾塩基の組み入れによって分解されることができ、高アフィニティリガンドは分解不能なｃＤＮＡにコピーされ、ＰＣＲによって増幅される。溶液ＳＥＬＥＸの付加的ラウンドでは、任意に同じ又は異なる反応器において、ＰＣＲ形成候補混合物を精製するか、又はＲＮＡに転写し、第２固体サポートに再結合させる。このプロセスを必要に応じて繰り返す。
【０１３３】
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：Gold, Larry
Wills, Michael
Koch, Tad
Ringquist, Steven
Jensen, Kirt
Atkinson, Brent
（ii）発明の名称：  指数関数的富化によるリガントの系統的進化：核酸リガントの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ
（iii)配列数：  ６４
（iv）通信住所：
（Ａ）  住所：Swanson ＆Bratschun, L. L. C.
（Ｂ）  通り：８４００Ｅ．  Prentice Place, Suite ２００
（Ｃ）  町：イングルウッド
（Ｄ）  州：コロラド
（Ｅ）  国：米国
（Ｆ）  郵便番号：８０１１１
（ｖ）コンピューター読み取り可能形式
（Ａ）媒体型：ディスケット，５．２５インチ，３６０Kb，ストレージ
（Ｂ）コンピューター：  ＩＢＭ
（Ｃ）操作システム：  ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：  ワードパーフェクト  ５．１
（vi）本出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii)先行出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／１２３，９３５
（Ｂ）出願日：  １９９３年９月１７日
（vii)先行出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／１４３，５６４
（Ｂ）出願日：  １９９３年１０月２５日
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）名前：  Barry J. Swanson
（Ｂ）登録番号：３３，２１５
（Ｃ）参考文献／ドケット番号：ＮＥＸ１０／ＰＣＴ
（ix）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：（３０３）７９３−３３３３
（Ｂ）ＦＡＸ：（３０３）７９３−３４３３
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは５−ブロモウラシルである
（xi）配列：配列番号：１：
2006129870.tif 000101
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは５−ヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：２：
2006129870.tif 000102
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１３におけるＵは結合水素分子である
（xi）配列：配列番号：３：
2006129870.tif 000103
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：全てのＵは５−ヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：４：
2006129870.tif 000104
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５：
2006129870.tif 000105
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６：
2006129870.tif 000106
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：７：
2006129870.tif 000107
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：８：
2006129870.tif 000108
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：９：
2006129870.tif 000109
（２）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１０：
2006129870.tif 000110
（２）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１１：
2006129870.tif 000111
（２）配列番号：１２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１２：
2006129870.tif 000112
（２）配列番号：１３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１３：
2006129870.tif 000113
（２）配列番号：１４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１４：
2006129870.tif 000114
（２）配列番号：１５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１５：
2006129870.tif 000115
（２）配列番号：１６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１６：
2006129870.tif 000116
（２）配列番号：１７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１７：
2006129870.tif 000117
（２）配列番号：１８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１８：
2006129870.tif 000118
（２）配列番号：１９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：１９：
2006129870.tif 000119
（２）配列番号：２０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２０：
2006129870.tif 000120
（２）配列番号：２１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２１：
2006129870.tif 000121
（２）配列番号：２２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２２：
2006129870.tif 000122
（２）配列番号：２３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２３：
2006129870.tif 000123
（２）配列番号：２４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２４：
2006129870.tif 000124
（２）配列番号：２５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２５：
2006129870.tif 000125
（２）配列番号：２６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２６：
2006129870.tif 000126
（２）配列番号：２７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２７：
2006129870.tif 000127
（２）配列番号：２８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２８：
2006129870.tif 000128
（２）配列番号：２９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：２９：
2006129870.tif 000129
（２）配列番号：３０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３０：
2006129870.tif 000130
（２）配列番号：３１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３１：
2006129870.tif 000131
（２）配列番号：３２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３２：
2006129870.tif 000132
（２）配列番号：３３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３３：
2006129870.tif 000133
（２）配列番号：３４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３４：
2006129870.tif 000134
（２）配列番号：３５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３５：
2006129870.tif 000135
（２）配列番号：３６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３６：
2006129870.tif 000136
（２）配列番号：３７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３７：
2006129870.tif 000137
（２）配列番号：３８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３８：
2006129870.tif 000138
（２）配列番号：３９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：３９：
2006129870.tif 000139
（２）配列番号：４０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４０：
2006129870.tif 000140
（２）配列番号：４１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４１：
2006129870.tif 000141
（２）配列番号：４２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４２：
2006129870.tif 000142
（２）配列番号：４３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４３：
2006129870.tif 000143
（２）配列番号：４４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４４：
2006129870.tif 000144
（２）配列番号：４５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４５：
2006129870.tif 000145
（２）配列番号：４６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４６：
2006129870.tif 000146
（２）配列番号：４７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４７：
2006129870.tif 000147
（２）配列番号：４８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４８：
2006129870.tif 000148
（２）配列番号：４９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：４９：
2006129870.tif 000149
（２）配列番号：５０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５０：
2006129870.tif 000150
（２）配列番号：５１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５１：
2006129870.tif 000151
（２）配列番号：５２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５２：
2006129870.tif 000152
（２）配列番号：５３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５３：
2006129870.tif 000153
（２）配列番号：５４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５４：
2006129870.tif 000154
（２）配列番号：５５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５５：
2006129870.tif 000155
（２）配列番号：５６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１と２０におけるＮは１−２相補的塩基対を示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置３におけるＮは１または３ヌクレオチドを示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：位置１０と１２におけるＮは１−４相補的塩基対を示す
（ix）特徴：（Ｄ）その他の情報：位置１１におけるＮは４又は５ヌクレオチドを示す
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５６：
2006129870.tif 000156
（２）配列番号：５７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５７：
2006129870.tif 000157
（２）配列番号：５８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報：Ｕはヨードウラシルである
（xi）配列：配列番号：５８：
2006129870.tif 000158
（２）配列番号：５９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：５９：
2006129870.tif 000159
（２）配列番号：６０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６０：
2006129870.tif 000160
（２）配列番号：６１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６１：
2006129870.tif 000161
（２）配列番号：６２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６２：
2006129870.tif 000162
（２）配列番号：６３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６３：
2006129870.tif 000163
（２）配列番号：６４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（xi）配列：配列番号：６４：
2006129870.tif 000164
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は核酸に組み入れられた光反応性発色団の構造を示す。
【図２】図２は５−ブロモウラシル発色団のJablonski エネルギーレベル線図と種々な励起状態の反応性とを示す。
【図３−１】図３−１は例えばチロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンのようなアミノ酸残基に対する５−ブロモウラシル発色団の光架橋のモデル反応を示す。
【図３−２】図３−２は例えばチロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンのようなアミノ酸残基に対する５−ブロモウラシル発色団の光架橋のモデル反応を示す。
【図４】図４はＴＭＫ  pH８．５バッファー（１００mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、１０mM酢酸マグネシウム、及び８０mM塩化カリウム）中のチミジン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及びＬ−トリプトファンによるＵＶ吸収を比較する。ＸｅＣｌ及びＨｅＣｄレーザーの発光波長も示す。トリプトファン又はチミジンの吸収を伴わない、３２５nmにおける５−ヨードウラシルによる吸収が特に重要である。３２５nmにおける５−ヨードウラシルのモル吸光係数は１６３Ｌ／mol ・cmである。
【図５−１】図５−１はランダム化核酸配列に組み入れることができる光反応性発色団の構造を示す。
【図５−２】図５−２はランダム化核酸配列に組み入れることができる光反応性発色団の構造を示す。
【図６】図６は、それぞれ、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル及びウラシルを含むヘアピンＲＮＡ配列  ＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の構造を示す。これらは、Ｒ１７コートタンパク質に緊密に結合するＲ１７バクテリオファージゲノムの野生型ヘアピンの変異体である。
【図７】図７はＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−１（配列番号：１）、ＲＮＡ−２（配列番号：２）及びＲＮＡ−３（配列番号：３）の結合曲線を示す。結合曲線から算出した結合定数も記載する。
【図８】図８はＸｅＣｌエキシマーレーザーからの３０８nmでの単色光照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−１（配列番号：１）及びＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。照射期間中のコートタンパク質への競合光損傷のためにＲＮＡ−１（配列番号：１）の光架橋は４０％において最大化した。ＲＮＡ−２（配列番号：２）によっては、より短い照射時間のためにコートタンパク質へのより軽度の光損傷が生じた。
【図９】図９はＸｅＣｄレーザーからの３２５nmでの単色光照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。データをオリジナル電気泳動ゲルフォーマットにおいても示す。記号ＩＵＸＬはタンパク質に架橋したＲＮＡを特徴づける。光架橋の近似定量的収量が得られた。
【図１０】図１０はトランスイルミネーターからの３１２nm領域における広帯域照射によってＲ１７コートタンパク質に光架橋したＲＮＡ−２（配列番号：２）の割合を時間の関数として示す。タンパク質と恐らくはＲＮＡ配列に対する光損傷のために定量的収量未満の光架橋が得られた。
【図１１】図１１は過剰なＮ−アセチルチロシン  Ｎ−エチルアミド（構造５）の存在下での５−ヨードウラシルと５−ブロモウラシルとの３０８nmにおける照射からの同じ生成物（構造６）の形成を示す。
【図１２−１】図１２−１は、コートタンパク質の大部分の酵素消化を伴う、３０８nm光線によるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−７（配列番号：４）の光架橋を示す。
【図１２−２】図１２−２は、コートタンパク質の大部分の酵素消化を伴う、３０８nm光線によるＲ１７コートタンパク質に対するＲＮＡ−７（配列番号：４）の光架橋を示す。
【図１３】図１３は図１２のコートタンパク質（配列番号：４）の酵素消化後のＲＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡの形成を示す。
【図１４】図１４は、図１２及び図１３に示したように、修飾ヌクレオチド含有ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの生成を示す実施例８のポリアクリルアミドゲルを示す。修飾ヌクレオチドは小ペプチドによって５−位置において置換した５−ヨードウラシルとウラシルとであった。図１１に示したモデル構造に基づくと、ペプチドはチロシン残基のフェノール環を介してウラシルに結合する可能性が大きかった。
【図１５】図１５はｔＲＮＡ競合を用いた、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質への〔α−３２Ｐ〕ＧＴＰ標識プールＲＮＡの光架橋を示す。
【図１６−１】図１６−１（配列番号：５〜２１）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１６−２】図１６−２（配列番号：２２〜４０）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１６−３】図１６−３（配列番号：４１〜５５）は本明細書において６ａ（配列番号：５）と呼ぶ、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質に対する既に同定済みのＲＮＡリガンドの配列を示す。ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質への光架橋のために選択したラウンド１３からの５２配列も示す。
【図１７】図１７（配列番号：５６〜５７）はクラス１リガンドとクラス２リガンドとの共通配列を示す。クラス１：クラス１及びクラス２分子の共通二次構造。Ｎ１−Ｎ１’は１−２相補的塩基対を意味し；Ｎ２−Ｎ２’は１−４相補的塩基対を意味し、Ｄ−Ｈ’はＡ−Ｕ、Ｕ−Ａ又はＧ−Ｃ塩基対であり；Ｋ−Ｍ’はＧ−Ｃ又はＵ−Ａ塩基対である（１６）。クラス２：太線(bold)配列はクラス２分子を特徴づける高度に保存された１０ヌクレオチドを表す；塩基対合は分子の５’固定端部を含む。
【図１８Ａ】図１８Ａ（配列番号：５８）はtrunc ２の配列と予測二次構造とを示す。
【図１８Ｂ】図１８ＢはＡＲＭタンパク質へのtrunc ２光架橋の特異性を実証するゲルを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａはtrunc ２４（配列番号：５９）の配列と予測二次構造とを示す。
【図１９Ｂ】図１９ＢはＡＲＭタンパク質へのレーザー独立性架橋の特異性を実証するゲルを示す。
【図２０】図２０はヒト核抽出物の存在下でのＨＩＶ−１  Ｒｅｖとのtrunc ２４（配列番号：５９）光独立性架橋を示す。
【図２１】図２１はＳＥＬＥＸ工程間のサイクル的関係を説明する。核酸合成装置上での確立された方法によって候補オリゴヌクレオチドの一本鎖核酸レパートリーを調製し、ＰＣＲによって増幅して、二本鎖ＤＮＡ分子集団を製造する。それぞれ、非対称ＰＣＲ又は転写によって、候補ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を製造して、精製し、標的分子と複合体化させる。この後に、結合核酸と非結合核酸とを分割し、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅して、二本鎖ＤＮＡを製造する。
【図２２】図２２は、プライマー伸長抑制を利用して、識別可能なｃＤＮＡプール−増幅可能な高アフィニティオリゴヌクレオチドｃＤＮＡプール及び増幅不能な低アフィニティオリゴヌクレオチドｃＤＮＡプールを形成する、溶液ＳＥＬＥＸの１実施態様を説明する。この実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長は例えばｄｄＧのような連鎖停止ヌクレオチドの存在下で実施する。標的分子とジデオキシヌクレオチドとを除去した後に、第２ｃＤＮＡ伸長を４ｄＮＴＰの存在下で実施する。高アフィニティオリゴヌクレオチドから全長ｃＤＮＡが優先的に合成されるため、その後のＰＣＲ工程では高アフィニティｃＤＮＡプールが増幅される。
【図２３】図２３は図２２に示した実施態様に関するサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスを説明する。
【図２４】図２４は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割が制限酵素消化によって達成されるサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。この実施態様では、第１ｃＤＮＡ伸長を４ｄＮＴＰによって実施して、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡを生じる。次に標的を除去して、第２ｃＤＮＡ伸長を酵素開裂に対して耐性の修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。次に、このｃＤＮＡプールを制限酵素と共にインキュベートする、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡプールのみがその後のＰＣＲ工程において増幅可能である。
【図２５】図２５は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割がアフィニティクロマトグラフィーによって達成されるサイクル溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。第１ｃＤＮＡ伸長を例えばビオチニル化ヌクレオチドのような修飾塩基の存在下で実施する、これは低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するｃＤＮＡプールをアフィニティカラムに保持させる。
【図２６】図２６は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの分割がエキソヌクレアーゼ阻害によって達成されて、標的分子に対して高アフィニティを有する二本鎖核酸集団の形成を生じる溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。
【図２７】図２７は、触媒核酸が選択され、単離される溶液ＳＥＬＥＸプロセスの１実施態様を説明する。
【配列表フリーテキスト】
【０１３５】
配列番号：１
＜２２２＞  （１３）．．（１３）
＜２２３＞  ５−ブロモウラシル
配列番号：２
＜２２２＞  （１３）．．（１３）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
配列番号：３
＜２２２＞  （１３）．．（１３）
＜２２３＞  結合水素分子を有する
配列番号：４
＜２２２＞  （６）．．（６）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （１２）．．（１３）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （１９）．．（１９）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （２３）．．（２４）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （３０）．．（３０）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （４０）．．（４０）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
＜２２２＞  （４２）．．（４２）
＜２２３＞  ５−ヨードウラシル
配列番号：５６
＜２２２＞  （２０）．．（２０）
＜２２３＞  位置１におけるｎと１−２相補的な塩基
＜２２２＞  （３）．．（３）
＜２２３＞  １又は３ヌクレオチド
＜２２２＞  （１２）．．（１２）
＜２２３＞  位置１０におけるｎと１−４相補的な塩基
＜２２２＞  （１１）．．（１１）
＜２２３＞  ４又は５ヌクレオチド
＜２２２＞  （１３）．．（１３）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （１５）．．（１６）
＜２２３＞  ヨードウラシル
配列番号：５７
＜２２２＞  （７）．．（７）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （１１）．．（１２）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （１５）．．（１５）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （２０）．．（２１）
＜２２３＞  ヨードウラシル
配列番号：５８
＜２２２＞  （４）．．（４）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （８）．．（８）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （２０）．．（２０）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （２２）．．（２２）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （２４）．．（２６）
＜２２３＞  ヨードウラシル
＜２２２＞  （３１）．．（３１）
＜２２３＞  ヨードウラシル