(57)【要約】【課題】  測定試料中の異物などを目詰まりを生じることなく効率的に除去することができ、かつ、ヘモグロビン類などを含む生体試料の測定に使用しても、フィルターへの生体試料の吸着が少なく、目詰まりが生じ難く、さらに、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルター及び該フィルターを提供することにある。【解決手段】  液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムに至る液体流路に設置される液体クロマトグラフィー用フィルターであって、前記液体クロマトグラフィー用フィルターは、不織布と濾紙状フィルターとが積層されてなり、不織布側が前記分離カラムから遠い側に位置されるものであり、かつ、前記不織布の厚みは０．０５ｍｍ以上で空隙率は４０％から９０％であり、前記濾紙状フィルターの保留粒子径は５μｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムに至る液体流路に設置される液体クロマトグラフィー用フィルターであって、前記液体クロマトグラフィー用フィルターは、不織布と濾紙状フィルターとが積層されてなり、不織布側が前記分離カラムから遠い側に位置されるものであり、かつ、前記不織布の厚みは０．０５ｍｍ以上で空隙率は４０％から９０％であり、前記濾紙状フィルターの保留粒子径は５μｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。
【請求項２】
分離カラムの上流側に、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが前記分離カラムから遠い側に不織布が位置するように、一体的に設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムに至る液体流路に、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが前記分離カラムから遠い側に不織布が位置するように装着されたことを特徴とする液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項４】
試料を、分離カラムに至る液体流路に請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが前記分離カラムから遠い側に不織布が位置するように装着された液体クロマトグラフィーにより測定することを特徴とする測定方法。
【請求項５】
ヘモグロビン類を測定するものである、請求項４に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用フィルターに関する。さらに、本発明は前記フィルターが一体化された液体クロマトグラフィー用カラム、前記フィルターを用いた液体クロマトグラフィーシステム及び前記フィルターを用いた液体クロマトグラフィーによる測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機化学、生化学、医学等の分野において、試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフィーが汎用されている。例えば、液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特に安定型糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標として広く測定されている。糖化ヘモグロビンは、血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものであり、溶血液試料中のＨｂＡ１ｃの割合は、過去１ヶ月から２ヶ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので、糖尿病の診断の指標として利用されている。液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、分離カラムとしてカルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有するカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が充填されたものを用い、ｐＨ５．０からｐＨ９．０の溶離液を用いて行われている。
【０００３】
上記液体クロマトグラフィーは、溶離液等の移動相を送液ポンプにより分離カラムに送るとともに、流路途中より測定試料を導入し、測定試料を導入した後、溶離液の溶出力を変化させることにより、分離カラムに保持された測定試料中の成分を分離・分取する方法であり、得られた各成分は、検出器によって検出され、データ処理された後、クロマトグラムとして表される。このような液体クロマトグラフィーにおいては、主に試料中の異物などが分離カラムに混入するのを防ぐため、測定試料の導入部分から分離カラムに至る流路途中にフィルターが配置されていることが多い。また、異物などの他、分離カラム中の充填剤が漏れ出て検出器に混入するのを防ぐため、分離カラムから検出器に至る流路途中にフィルターが配置されていることもある。
【０００４】
特許文献１には、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを、充填剤が収納されたカラム本体の少なくとも導出側にカラム本体と一体的に設けた高速液体クロマトグラフィー用カラムが開示されている。しかしながら、このフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを、たんぱく質や脂質等を含む血液、血清、血漿、尿等の生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し易く、測定を重ねるとフィルターが目詰まりし、フィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなるので、連続して多数の試料を測定できないという問題がある。また、仮に上記フィルターに表面処理を施し、生体試料の吸着を防止したとしても、繊維焼結フィルターは測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ易く、連続して測定を行うと目詰まりによりフィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなるので、連続して多数の試料を測定できないという問題がある。
【０００５】
さらに、特許文献２では、液体クロマトグラフィーにおけるカラムに至るまでの流路に、濾紙とメンブレンフィルターとを組み合わせたフィルターを、カラムから遠い側に濾紙が位置するように配置することを特徴とする、液体クロマトグラフにおけるサンプル中の不純物等の除去方法が開示されている。しかしながら、濾紙とメンブレンフィルターからなるフィルターは測定試料中の異物などにより目詰まりを生じ易く、連続測定すると短時間のうちにフィルターが目詰まりし、フィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなるので、連続して多数の試料を測定することができず、また、フィルター交換頻度が高くなるという問題がある。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２６０７６３号公報
【特許文献２】特開平５−２０３６３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、測定試料中の異物などを目詰まりを生じることなく効率的に除去することができ、かつ、ヘモグロビン類などを含む生体試料の測定に使用しても、フィルターへの生体試料の吸着が少なく、目詰まりが生じ難く、さらに、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルター及び該フィルターが分離カラムに一体的に設けられた液体クロマトグラフィー用カラムを提供することにある。
【０００８】
また、本発明の他の目的は、前記液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることにより、測定試料中の異物などを目詰まりを生じることなく効率的に除去することができ、かつ、ヘモグロビン類などを含む生体試料の測定に使用しても、フィルターへの生体試料の吸着が少なく、目詰まりが生じ難く、連続して多数の試料を高精度に測定することができる液体クロマトグラフィーシステムを提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の他の目的は、前記液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることで、測定試料中の異物などを目詰まりを生じることなく効率的に除去することができ、かつ、生体試料の測定に使用しても、フィルターへの生体試料の吸着が少なく、目詰まりが生じ難く、連続して多数の試料を高精度に測定することができ、特に、測定対象が高精度な連続測定が要求されるヘモグロビン類である場合に、ヘモグロビン類を連続的に高精度に分離・定量することができる測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター（以下、「フィルター」と記す）は、液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムに至る液体流路に設置されるフィルターであって、不織布と濾紙状フィルターとが積層されてなり、不織布側が前記カラムから遠い側に位置されるものであり、かつ、前記不織布の厚みは０．０５ｍｍ以上で空隙率は４０％から９０％であり、前記濾紙状フィルターの保留粒子径は５μｍ以下であることを特徴とする。
【００１１】
以下に本発明のフィルターについて詳述する。
本発明のフィルターに使用される不織布の素材は、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン繊維、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル繊維、ナイロン繊維、レーヨン繊維、アクリル繊維、ココナッツファイバー、塩化ビニリデン繊維、綿繊維、ウール、麻繊維、ガラス繊維等が挙げられ、上記素材は単独で使用してもよく、２種以上併用することもできる。
【００１２】
上記不織布の厚みは、０．０５ｍｍ以上であり、上限は適宜決定してよいが、通常は１０ｍｍ以下が好ましく、０．１ｍｍから５ｍｍの範囲内であることがより好ましい。不織布の厚みが、０．０５ｍｍ未満であると、測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ易くなり、また、生体試料を測定する場合には生体試料の吸着が生じた場合に目詰まりし易くなり、連続測定を行うと目詰まりによりフィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなる。また、１０ｍｍを超えると、不織布内に測定試料が拡散してしまい、正確な測定ができなくなる場合がある。
【００１３】
上記不織布の空隙率は、４０％から９０％の範囲内である。不織布の空隙率が４０％未満であると、測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ易くなり、また、生体試料を測定する場合には生体試料の吸着が生じた場合に目詰まりし易くなり、連続測定を行うとこれらの目詰まりによりフィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなる。不織布の空隙率が９０％を超えると、不織布内に測定試料が拡散してしまい、正確な測定ができなくなり、さらには、フィルター強度が弱くなり、フィルターの取り扱い時や測定時の液体移動相の圧力などにより破損する可能性がある。
上記空隙率は、全自動細孔径分布測定装置（水銀ポロシメーター）により測定された値である。
【００１４】
上記不織布は、１枚の不織布から構成されてもよいが、不織布を複数枚組み合わせたものであってもよい。例えば、分離カラムから遠い側である試料導入側の不織布よりカラム側である試料導出側の不織布の空隙率が小さくなるような組み合わせで積層して使用することができる。積層の方法は特には限定されず、例えば、不織布を重ね合わせただけでもよいし、不織布同士を貼り合わせてもよく、また、不織布を重ね合わせた状態で圧縮成型してもよい。不織布の積層数は、通常、２層から３層の範囲内であるが、特には限定されず、必要に応じて増やしてもよい。
【００１５】
本発明のフィルターに用いる濾紙状フィルターは、通常濾紙と称されるセルロース繊維からなる紙の他、有機繊維、無機繊維等の各種繊維が濾紙状とされたものも含む。濾紙状フィルターの素材は特に限定されず、具体的には、例えば、セルロース繊維、ガラス繊維、フッ素樹脂繊維、シリカ繊維、チタン繊維、ステンレス繊維等が挙げられ、これらの素材は単独で使用してもよく、２種以上併用することもできる。また、強度補強、生体試料の吸着抑制等のために特殊処理を施した濾紙状フィルターも用いることができる。このような特殊処理が施された濾紙状フィルターとしては、例えば、湿潤強度を高めた濾紙（アドバンテック東洋社製：商品名「ウェットストレングス濾紙」）等が市販されている。
【００１６】
上記濾紙状フィルターの保留粒子径は、５μｍ以下であり、測定試料中の異物を確実に除去するために、３μｍ以下であることが好ましく、１．５μｍ以下であることがより好ましい。濾紙状フィルターの保留粒子径が、５μｍを超えてしまうと、測定試料中の異物などを濾過することができず、それら異物が分離カラムに流入し易くなり、分離カラムの液体透過圧力が上昇して正確な測定ができなくなったり、また、分離カラムの分離性能に悪影響を与える可能性がある。ここで、濾紙状フィルターの保留粒子径は、ＪＩＳ Ｐ３８０１で規定される硫酸バリウムなどの検液を自然濾過したときの漏洩粒子径の最大値である。
【００１７】
上記濾紙状フィルターは、１枚の濾紙状フィルターから構成されてもよいが、濾紙状フィルターを複数枚組み合わせたものであってもよい。例えば、不織布側の濾紙状フィルターよりカラム側である試料導出側の濾紙状フィルターの保留粒子径が小さくなるような組み合わせで積層して使用することができる。積層の方法は特には限定されず、例えば、濾紙状フィルターを重ね合わせただけでもよいし、濾紙状フィルター同士を貼り合わせてもよく、また、濾紙状フィルターを重ね合わせた状態で圧縮成型してもよい。濾紙状フィルターの積層数は、通常、２層から３層の範囲内であるが、特には限定されず、必要に応じて増やしてもよい。
【００１８】
本発明のフィルターは、上記不織布と上記濾紙状フィルターとが積層されてなり、生体試料の吸着を確実に防止するため、必要に応じてシリコーンコーティングされていてもよく、また、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていてもよい。シリコーンコーティング、ブロッキング処理等の表面処理は、上記不織布又は上記濾紙状フィルターのいずれかにだけ施されていてもよいし、フィルター全体に施されていてもよい。
【００１９】
上記シリコーンコーティングの材料としては、シリコーン被膜を形成できるものであれば、特に限定されず、例えば、硬化型シリコーンゴム、オイル、ワニス、ゴム、シラン等が挙げられ、好ましくは硬化型シリコーンゴムである。
【００２０】
上記ブロッキング試薬としては、例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどのたんぱく質、リン脂質などの極性脂質、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤等が挙げられる。ブロッキング処理の方法としては、例えば、上記不織布、濾紙状フィルター又はフィルターに０．０１重量％から５重量％のブロッキング試薬溶液を通液した後、乾燥させる方法等が挙げられる。
【００２１】
さらに、本発明のフィルターの強度を補強し、有効濾過面積を大きくするために、フィルターの両面、もしくは、カラム側に近い側、即ち濾紙状フィルター側に必要に応じて、支持体を使用することができる。支持体は、フィルター強度を補強し、有効濾過面積を大きくすることができるものであり、かつ、保留粒子径が上記濾紙状フィルターよりも大きいものであれば、特に限定されないが、メッシュ状のものが好ましい。具体的には、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート等の合成樹脂からなるメッシュシートや、ステンレス、チタン等の金属からなるメッシュシートが挙げられる。尚、ステンレスのように、生体試料を吸着し易い素材からなるメッシュシートの場合は、上記と同様に、その表面にシリコーンコーティングを施すか、或いはブロッキング試薬でブロッキング処理を施すのが好ましい。
【００２２】
本発明のフィルターの形状は、必要とされる強度及び有効濾過面積を有する形状であれば特には限定されず、所望の形状としてよい。例えば、液体流路の流れ方向から見た形状が、円状、楕円状、多角形状等のものが挙げられ、中でも、製造し易く、有効濾過面積を確保し易いので、円状のものが好ましい。
【００２３】
本発明のフィルターのサイズは、直径が１ｍｍから１００ｍｍが好ましく、２ｍｍから５０ｍｍがより好ましい。フィルターの直径が１ｍｍ未満であると、フィルターの有効濾過面積が不十分になるとともに、フィルターが試料中の異物などにより目詰まりし易くなり、また、生体試料を測定する場合には生体試料が吸着した場合に目詰まりし易くなるので、連続測定できる回数が減少し、フィルターの交換頻度が多くなる。直径が１００ｍｍを超えてしまうとフィルター内に測定試料が拡散してしまい、正確に測定できなくなったり、また、フィルターが必要以上に大きくなる。尚、上記直径は、フィルター形状が円状である場合にはその直径であるが、その他の形状の場合には、フィルターが接して収まる円を仮想した場合の仮想円の直径である。
【００２４】
本発明のフィルターの厚み、即ち、液体流路の流れ方向の長さは、０．１ｍｍから５０ｍｍの範囲内であることが好ましく、０．２ｍｍから１０ｍｍの範囲内であることがより好ましい。フィルターの厚みが、０．１ｍｍ未満であると、フィルターが測定試料中の異物などにより目詰まりし易くなり、また、生体試料を測定する場合には生体試料の吸着が生じた場合に目詰まりし易くなり、連続測定を行うと目詰まりによりフィルターの濾過圧力が上昇して正確な測定ができなくなる可能性がある。フィルターの厚みが５０ｍｍを超えてしまうと、フィルター内に測定試料が拡散してしまい、正確な測定ができなくなる可能性がある。ここで、フィルターの厚みとは、不織布と濾紙状フィルターの合計厚みであり、例えば、上記支持体が積層される場合などは、支持体の厚みは含まない。
【００２５】
本発明のフィルターによる測定試料中の異物などの捕集能力は、本発明のフィルターが比較的空隙率の高い不織布と濾紙状フィルターからなるので、濾紙状フィルターの保留粒子径で定義することができる。そのため、本発明のフィルターの保留粒子径は、５μｍ以下であることが好ましく、測定試料の異物などを確実に除去するために、３μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。本発明のフィルターの保留粒子径が、５μｍを超えてしまうと、測定試料中の異物などを濾過することができず、それら異物などが分離カラムに流入し易くなり、分離カラムの液体透過圧力が上昇して正確な測定ができなくなったり、また、分離カラムの分離性能に悪影響を与える可能性がある。ここで、本発明のフィルターの保留粒子径は、濾紙状フィルターの保留粒子径と同様、ＪＩＳ Ｐ３８０１で規定される硫酸バリウムなどの検液を自然濾過したときの漏洩粒子径の最大値である。
【００２６】
本発明のフィルターは、液体クロマトグラフィーの分離カラムに至る液体流路において、分離カラムから離れた側から、不織布、濾紙状フィルターの順となるように設置される。尚、本発明のフィルターは、少なくとも分離カラムに至る液体流路に設置されていればよく、それ以外の位置、例えば、分離カラムの導出側などに設置されていてもよい。分離カラムの導出側にも設置する場合は、分離カラムから充填剤がもれ出てきた際にこれらを捕集することができる。この場合、フィルターの濾紙状フィルターを分離カラム側とするのが好ましい。
【００２７】
次に、本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーシステムについて説明する。
本発明のフィルターは、分離カラムに至る液体流路途中に位置していればよく、分離カラムとは別体のホルダーに装着されて設置されても、分離カラムと同一容器内、即ち分離カラム本体に収容されて装着されてもよい。さらに、分離カラムと離れて設置されても、分離カラムと一体的に設置されてもよい。しかしながら、フィルターの交換作業、フィルターの取り扱い性等を考慮すると、フィルターは分離カラムとは別体のホルダーに装着し、かつ、分離カラムとは離して設置しておくのが好ましい。一方、分離カラムに上記フィルターを一体的に設けておき、これらを液体クロマトグラフィー用カラムとしておけば、部材の数を減らすことができ、作業性が向上する。
【００２８】
本発明のフィルターが装着されるホルダーの形状は、特に限定されず、フィルターを保持することができ、かつ、測定試料の拡散が起こりにくく、本発明のフィルターとホルダーの間に気密性が保持できるものであれば、公知のホルダーを使用することができる。ホルダーの材質としては、例えば、ステンレスなどの金属、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等が挙げられ、中でも生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、ステンレスのような生体試料の吸着が起こりやすい材質のものは、シリコーンコーティングを施したり、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン等の生体試料の吸着を抑制する材質で被覆するのが好ましい。
【００２９】
上記分離カラム本体の材質は、分離カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタンなど等の金属、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンなど等のプラスチック、ガラス等が挙げられる。ステンレス等の金属を用いる場合は、生体試料が吸着し易いので、分離カラム本体の内面にシリコーンコーティングを施したり、或いはフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン等の生体試料の吸着を抑制する材質で被覆するのが好ましい。
【００３０】
分離カラム本体におけるシリコーンコーティングの厚みは、０．１ｎｍから１００μｍの範囲内が好ましく、０．１ｎｍから１０μｍの範囲内がより好ましく、０．７ｎｍから２μｍの範囲内がさらに好ましい。シリコーンコーティングの厚みが、０．１ｎｍ未満であると、シリコーンコーティングすること自体が困難になり、１００μｍを超えてしまうと、分離カラムの分離性能に影響を与える可能性がある。
【００３１】
分離カラム本体内側のコーティング割合は、分離カラム本体内側の全表面積に対して、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。コーティング割合が１０％未満であると、生体試料などが分離カラム本体内側に吸着するのを抑制することが困難になる。
【００３２】
また、分離カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキング処理されてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング処理の方法としては、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターに用いられるブロッキング処理として前述したものと同様である。
【００３３】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムにおいては、上記フィルターを設けること以外は、従来の液体クロマトグラフィーシステムと同様のものが使用される。
【００３４】
本発明のフィルターが装着された液体クロマトグラフィーを用いて試料を測定する方法としては、測定試料を本発明のフィルターよりも上流において導入すればよく、その他は従来の液体クロマトグラフィーと同様に行うことができる。また、液体クロマトグラフィーの中でも、高速液体クロマトグラフィーにより測定するのが好ましい。
【００３５】
上記測定試料としては、従来液体クロマトグラフィーにより測定可能なものであれば特には限定されず、例えば、血液、血清、血漿、尿などの生体試料が挙げられ、特に血液中のヘモグロビン類、好ましくはＨｂＡ１ｃを分離、定量するものであるのが好ましい。ヘモグロビン類、特にＨｂＡ１ｃの測定は、短時間で正確な連続測定が要求されるものである一方、フィルターを用いると目詰まりが生じ易く、高速液体クロマトグラフィーにおいて本発明のフィルターを用いることにより、短時間で正確な連続測定が可能となる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、厚みが０．０５ｍｍ以上で、空隙率が４０％から９０％の不織布と、保留粒子径が５μｍ以下の濾紙状フィルターとが積層されてなり、不織布が上流側となるように構成されているので、測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ難く、また、ヘモグロビン類などを含む生体試料の測定に使用した場合であっても、フィルターへの生体試料の吸着が生じ難く、故に、多数の試料を連続して測定しても、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に少なく、正確な測定を行うことができる。しかも、フィルター性能の寿命が非常に長いので、フィルターの交換頻度を少なくすることができ、測定の効率を上げることができる。
【００３７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、上記フィルターが分離カラムと一体的に設けられたものであるので、上記効果に加えて、部材の数を減らすことができ、作業性が向上する。
【００３８】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムは、上記フィルターが装着されたものであるので、測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ難く、また、ヘモグロビン類などを含む生体試料の測定に使用した場合であっても、フィルターへの生体試料の吸着が生じ難く、故に、多数の試料を連続して測定しても、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に少なく、正確な測定を行うことができる。しかも、フィルター性能の寿命が非常に長いので、フィルターの交換頻度を少なくすることができ、測定の効率を上げることができる。さらに、上記フィルターを分離カラムから離して設置した場合には、フィルターの交換作業を効率的に行うことができる。
【００３９】
本発明の測定方法は、上記フィルターが装着された液体クロマトグラフィーを用いているので、測定試料中の異物などにより目詰まりが生じ難く、また、生体試料の測定に使用した場合であっても、フィルターへの生体試料の吸着が生じ難く、故に、多数の試料を連続して測定しても、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に少なく、正確な測定を行うことができる。特に、短時間で正確な連続測定が要求される血液中のヘモグロビン類、好ましくはＨｂＡ１ｃの測定に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
不織布(旭化成工業社製：商品名「マイクロウェブ」、素材ポリエステル繊維、厚み０．１ｍｍ、空隙率７０％）、濾紙状フィルター(アドバンテック東洋社製：商品名「高純度濾紙Ｎｏ．５Ｃ」、素材セルロース繊維、保留粒子径１μｍ）、及び支持体(アドバンテック東洋社製：メッシュシート、素材ポリエステル）をこの順に重ね合わせた後、直径８ｍｍの円状に打ち抜き、本発明のフィルターを一体成形品として製造した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．３ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００４２】
（実施例２）
濾紙状フィルターとして濾紙状フィルター(アドバンテック東洋社製：商品名「ウェットストレングス濾紙Ｎｏ．４１２」、素材セルロース繊維、保留粒子径１.５μｍ)を用いたこと以外は実施例１と同様にして本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．４ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００４３】
（実施例３）
濾紙状フィルターとして濾紙状フィルター(アドバンテック東洋社製：商品名「標準用濾紙、Ｎｏ．１３１」、素材セルロース繊維、保留粒子径３μｍ)を用いたこと以外は実施例１と同様にして本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．４ｍｍであり、保留粒子径は３μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００４４】
（実施例４）
不織布として不織布(旭化成社製：商品名「エルタス」、素材ポリエステル繊維、空隙率６０％）を厚み０．８ｍｍになるように積層して用いたこと以外は実施例１と同様にして本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは１ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００４５】
（実施例５）
支持体(アドバンテック東洋社製：メッシュシート、素材ポリエステル）、不織布(旭化成社製：商品名「エルタス」、素材ポリプロピレン繊維、厚み０．８ｍｍ、空隙率５５％）、濾紙状フィルター(アドバンテック東洋社製：商品名「高純度濾紙Ｎｏ．５Ｃ」、素材セルロース繊維、保留粒子径１μｍ）、及び支持体(アドバンテック東洋社製：メッシュシート、素材ポリエステル）をこの順に重ね合わせた後、直径８ｍｍの円状に打ち抜き、本発明のフィルターを一体成形品として製造した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは１ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布が積層された支持体側が流路上流となるように配置される。
【００４６】
（実施例６）
濾紙状フィルターとして濾紙状フィルター（アドバンテック東洋社製：商品名「標準用濾紙Ｎｏ．２」、素材セルロース繊維、保留粒子径５μｍ)を用いたこと以外は実施例５と同様にして本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは１ｍｍであり、保留粒子径は５μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布が積層された支持体側が流路上流となるように配置される。
【００４７】
（比較例１）
不織布として不織布(旭化成社製：商品名「エルタス」、素材ポリプロピレン繊維、空隙率６０％) を、厚も０．８ｍｍになるように積層して用い、濾紙状フィルターとして濾紙状フィルター(アドバンテック東洋社製：商品名「高純度濾紙Ｎｏ．５Ａ」、素材セルロース繊維、保留粒子径７μｍ)を用いたこと以外は実施例５と同様にしてフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは１ｍｍであり、保留粒子径は７μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布が積層された支持体側が流路上流となるように配置される。
【００４８】
（比較例２）
不織布の代わりにメンブレンフィルター(素材酢酸セルロース、孔径０．８μｍ) を用いたこと以外は実施例１と同様にしてフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．４ｍｍであり、保留粒子径は０．８μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは濾紙状フィルター側が流路上流となるように配置される。
【００４９】
（比較例３）
濾紙状フィルター (アドバンテック東洋社製：商品名「標準用濾紙Ｎｏ．２」、素材セルロース繊維、保留粒子径５μｍ)、濾紙状フィルター（アドバンテック東洋社製：商品名「高純度濾紙Ｎｏ．５Ｃ」、素材セルロース繊維、保留粒子径１μｍ) 、メンブレンフィルター(素材酢酸セルロース、孔径０．８μｍ)、及び実施例１と同様の支持体をこの順に重ね合わせた後、直径８ｍｍの円状に打ち抜き、フィルターを一体成形品として製造した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．７ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは濾紙状フィルター側が流路上流となるように配置される。
【００５０】
（比較例４）
濾紙を使用しなかったこと以外は実施例１と同様にしてフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．１ｍｍであり、保留粒子径は１０μｍから１００μｍの範囲内であった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００５１】
実施例１から６及び比較例１から４で作製したホルダーに保持されたフィルターを用いて、以下のようにして、（１）生体試料測定時の圧力上昇の程度と（２）生体試料の吸着性及び測定値への影響とを評価した。
【００５２】
（１）生体試料測定時の圧力上昇の程度
以下に示した測定条件の液体クロマトグラフィーにおいて、実施例１から６及び比較例１から４で作製したホルダーに保持されたフィルターを分離カラムの試料導入側に接続して、生体試料測定時の圧力上昇試験を行った。尚、実施例１から４及び比較例４のフィルターは不織布側が分離カラムから遠い側になるように、実施例５及び６並びに比較例１のフィルターは不織布が積層された支持体側が分離カラムから遠い側になるように、比較例２及び３のフィルターは濾紙状フィルター側が分離カラムから遠い側になるようにして接続した。
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）
溶離液Ｂ：３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流速：２．０ｍｌ/分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
測定開始より０分から３分の間は溶離液Ａを流し、３分から５分の間は溶離液Ｂを流し、５分から１０分の間は溶離液Ａを流した。
【００５３】
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ―１００のリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）で１００倍に希釈して測定試料とした。その測定試料を、上記液体クロマトグラフィーのフィルターよりも上流にある試料注入口から、検体数８００まで連続的に注入して、フィルターの濾過圧力の上昇値を検体数１００ごとに測定した。その測定結果を表１に示した。
フィルターの濾過圧力の上昇値（Ｎ／ｍｍ２）＝測定時のフィルター濾過圧力（Ｎ／ｍｍ２）−検体注入前のフィルター濾過圧力（Ｎ／ｍｍ２）
また、検体数８００を注入し終わった後、分離カラムの液体透過圧力の上昇値を測定し、表２に示した。
分離カラムの液体透過圧力の上昇値（Ｎ／ｍｍ２）＝測定時の分離カラムの液体透過圧力（Ｎ／ｍｍ２）−検体注入前の分離カラムの液体透過圧力（Ｎ／ｍｍ２）
【００５４】
【表１】
2006138724.tif 000002
【００５５】
【表２】
2006138724.tif 000003
【００５６】
表１に示すように、実施例１から６で得られたフィルターは、４００検体を測定し終えた後でもフィルターの濾過圧力は変化しておらず、これらのフィルターは目詰まりが生じ難いことがわかる。また、表２に示すように、実施例１から６で得られたフィルターを用いた場合は、８００検体測定終了後であっても、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇がなく、フィルターにより測定試料中の異物などが除去され、分離カラムに混入していないことがわかる。比較例１及び４で得られたフィルターでは、フィルターの濾過圧力の上昇はなかったが、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇は１０Ｎ／ｍｍ２にもなった。これは、比較例１及び４で得られたフィルターの異物トラップ性が悪く、分離カラムに異物が混入したためと考えられる。また比較例２及び３では、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇はなかったが、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に高くなっている。フィルターの濾過圧力が上昇すると、測定が正確にできなくなったり、耐圧性が低い測定装置を用いた場合には測定自体が困難になったりするので、フィルター交換を頻繁に行う必要がある。
【００５７】
以上より、本発明のフィルターは、連続測定を行った場合でもフィルターの濾過圧力の上昇が少なく、また、本発明のフィルターを用いることで、測定試料中の異物などが分離カラムに混入するのを確実に防止することができ、分離カラムの液体透過圧力が上昇することもない。
【００５８】
（２）生体試料の吸着性及び測定値への影響
以下に示した測定条件の液体クロマトグラフィーにおいて、実施例１から６及び比較例１から４で作製したホルダーに保持されたフィルターを用いて、生体試料の吸着性及び測定値への影響を評価した。
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液に５０ｍｍｏｌ／ｌ過塩素酸ナトリウムを添加（ｐＨ５．４）
溶離液Ｂ：５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液に３００ｍｍｏｌ／ｌ過塩素酸ナトリウムを添加（ｐＨ５．４）
流速：２．０ｍｌ/分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
測定開始より０分から３分の間は溶離液Ａを流し、３分から５分の間は溶離液Ｂを流し、５分から１０分の間は溶離液Ａを流した。
【００５９】
市販のコントロール血液のレベル２（グリコＨｂコントロール、国際試薬（株））を添付資料通りに溶解希釈し、測定試料１とした。また、血液抗凝固剤ヘパリンＮａ添加した健常人血（（１）生体試料測定時の圧力上昇試験と同様の方法で１００倍希釈して溶血したもの）を測定試料２とした。測定試料１及び２について、ＨｂＡ１ｃ値の測定を交互に行った。測定は、コントロール血液のレベル２を１検体測定後、健常人血を５検体測定することを１０回繰り返し、即ち、この順序で、コントロール血液のレベル２を合計１０回測定した。
得られたコントロール血液のレベル２の各測定におけるＨｂＡ１ｃ値を表３に示した。さらに、これらのＨｂＡ１ｃ値の平均値、標準偏差及びＣＶ値を算出し、表３に示した。
【００６０】
【表３】
2006138724.tif 000004
【００６１】
表１及び２の結果より、比較例１及び４で得られたフィルターは異物トラップ性が悪く、分離カラムに異物が混入すると考えられが、表３の結果を併せると異物などが分離カラムへ流入すると、安定した正確な測定値が得られないことがわかる。
【００６２】
（実施例７から１１）
不織布の厚みを表４に示した通りとした以外は実施例１と同様にして、本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは、表４に示した不織布の厚みに濾紙状フィルターの厚みである０．２ｍｍを加えた値であり、保留粒子径はいずれも１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００６３】
（比較例６）
不織布を使用しなかった以外は実施例１と同様にして、フィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．２ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは濾紙状フィルター側が流路上流となるように配置される。
【００６４】
（比較例７）
不織布の厚みを０．０１ｍｍとした以外は実施例１と同様にして、フィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．２ｍｍであり、保留粒子径は１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作製した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００６５】
【表４】
2006138724.tif 000005
【００６６】
次に、実施例７から１１並びに比較例６及び７で作製したホルダーに保持されたフィルターを用いて、実施例１と同様に（１）生体試料測定時の圧力上昇の程度を評価した。尚、実施例７から１１及び比較例７のフィルターは不織布側が分離カラムから遠い側になるように、比較例６のフィルターは濾紙状フィルター側が分離カラムから遠い側になるようにして接続した。
得られたフィルターの濾過圧力の上昇値は表５に、分離カラムの液体透過圧力の上昇値は表６に示した。
【００６７】
【表５】
2006138724.tif 000006
【００６８】
【表６】
2006138724.tif 000007
【００６９】
表５に示すように、実施例７から１１で得られたフィルターは、４００検体を測定し終えた後でもフィルターの濾過圧力は変化しておらず、これらのフィルターは目詰まりが生じ難いことがわかる。また、表６に示すように、実施例７から１１で得られたフィルターを用いた場合は、８００検体測定終了後であっても、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇がなく、フィルターにより測定試料中の異物などが除去され、分離カラムに混入していないことがわかる。比較例６及び７では、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇はなかったが、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に高くなっている。フィルターの濾過圧力が上昇すると、測定が正確にできなくなったり、耐圧性が低い測定装置を用いた場合には測定自体が困難になったりするので、フィルター交換を頻繁に行う必要がある。
【００７０】
以上より、本発明のフィルターは、不織布の厚みが０．０５ｍｍより薄くなると、連続測定を行った場合にフィルターの濾過圧力が上昇する傾向があることが明らかになった。
【００７１】
（実施例１２から１６）
不織布の空隙率を表７に示した通りとした以外は実施例８（不織布の厚み０．２ｍｍ）と同様にして、本発明のフィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．４ｍｍであり、保留粒子径はいずれも１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作成した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００７２】
（比較例８及び９）
不織布の空隙率を表７に示した通りとした以外は実施例８（不織布の厚み０．２ｍｍ）と同様にして、フィルターを作製した。得られたフィルターの支持体を除く厚みは０．４ｍｍであり、保留粒子径はいずれも１μｍであった。
このフィルターをステンレス製ホルダーに嵌め込み、ホルダーを螺子で固定して、ホルダーに保持されたフィルターを作成した。尚、このフィルターは不織布側が流路上流となるように配置される。
【００７３】
【表７】
2006138724.tif 000008
【００７４】
次に、実施例１２から１６並びに比較例８及び９で作製したホルダーに保持されたフィルターを用いて、実施零１と同様に（１）生体試料測定時の圧力上昇の程度を評価した。尚、フィルターはいずれも不織布側が分離カラムから遠い側になるように接続した。
得られたフィルターの濾過圧力の上昇値は表８に、分離カラムの液体透過圧力の上昇値は表９に示した。
【００７５】
【表８】
2006138724.tif 000009
【００７６】
【表９】
2006138724.tif 000010
【００７７】
表８に示すように、実施例１２から１６で得られたフィルターは、４００検体を測定し終えた後でもフィルターの濾過圧力は変化しておらず、これらのフィルターは目詰まりが生じ難いことがわかる。また、表９に示すように、実施例１２から１６で得られたフィルターを用いた場合は、８００検体測定終了後であっても、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇がなく、フィルターにより測定試料中の異物などが除去され、分離カラムに混入していないことがわかる。比較例８では、フィルターよりも下流側に位置する分離カラムの液体透過圧力の上昇はなかったが、フィルターの濾過圧力の上昇が非常に高くなっている。フィルターの濾過圧力が上昇すると、測定が正確にできなくなったり、耐圧性が低い測定装置を用いた場合には測定自体が困難になったりするので、フィルター交換を頻繁に行う必要がある。また、比較例９では、フィルターの濾過圧力の上昇は殆ど認められなかったが、測定で得られたＨｂＡ１ｃのピークがブロード化した。この原因は、フィルターに使用されている不織布の空隙率が９０％超と大きいため、測定試料の不織布中での拡散が必要以上に大きくなってしまったためと考えられる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月11日(2005.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【表４】
2006138724.tif 000011