(57)【要約】【課題】  本発明は、従来、抽出精製が困難なため、商用化が困難であったイツリンやサーファクチン等の抗菌活性物質を効率よく、含有率の高い粗分画として提供することを目的とする。また、本発明は、カビやバクテリア等の生物種に対する抗菌活性を有する該粗分画を商用可能なコストで容易に防カビ剤などの形態で提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、培養する菌を天然でスクリーニングされたイツリン高産生株バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を利用して、カビに対して有効な抗生物質であるイツリン、サーファクチンを主成分とする抗菌活性物質粗分画の生産効率を上げることを特徴とし、防カビ剤、殺菌・制菌、防カビ効果を有する洗剤、食用洗剤として、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株から得られたイツリン、サーファクチンを含有する粗分画を使用する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を固体又は液体培養し、
該バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の培養液から、イツリンの含量が高い粗分画を抽出精製することを特徴とするイツリンを含有する粗分画の製造方法。
【請求項２】
前記バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の固体培養物を水抽出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粗分画は、さらにサーファクチンを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって製造されたバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株産生イツリンを含有する粗分画。
【請求項５】
パラオキシ安息香酸エステルを加えたことを特徴とする請求項４に記載の粗分画。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の粗分画の抗菌活性機能を使用する真菌発育抑制剤。
【請求項７】
前記真菌発育抑制剤は、防カビ剤、殺菌剤、防カビ効果を有する洗剤、又は食用洗剤の少なくとも一つ以上であることを特徴とする請求項６に記載の真菌発育抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、枯草菌産生イツリンの粗分画製造方法に関し、より詳細には、枯草菌の一種である、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＤＢ９０１１菌株から産出されたイツリンの粗分画を抽出精製する製造方法に関し、さらに抽出精製された粗分画の抗菌活性機能を使用する、例えば、防カビ、殺菌・制菌、防カビ効果を有する洗剤、及び食用洗剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、防カビ剤や殺菌剤については強アルカリ、または、強酸性の細胞毒性の極めて高い化学薬品の溶液でバクテリアやカビを殺菌・抑制し、除去してきた。ところが、これらの化学薬品を含有する溶液は、その使用につき十分な注意を払わないと人体への悪影響を引き起こし、健康を害することがある。例えば、皮膚に付着すると、皮膚がただれたり、眼に入った場合には、失明することもあり得る。また、乳幼児の手の届くところに保管すると、誤飲して、健康を害するなど、化学薬品を含有する溶液は常に危険性が存在する。また、それらの薬剤を家庭の台所、洗面所や浴室、または防カビや抗菌が必要な食品工場などの工程や設備機器の洗浄で使用した場合、家庭排水や工場排水などの排水管を通して水系に流れ込み、水質汚染など環境破壊を導くなど、その使用においては人体に対するだけでなく、環境に対しても悪影響を引き起こす。
【０００３】
そのような背景から、近年、微生物などを利用した生物学的な薬品の研究が盛んに行われており、特定の菌類やバクテリア、ウィルスに対して耐性を有するような微生物の有用性が認められて、微生物を利用した防かび剤や殺菌・抗菌剤などが開発されている。特に、納豆菌の類縁であり、安全性の高い枯草菌から産出されるイツリンやサーファクチンは、枯草菌が芽胞を形成する際に菌体外に産出する物質であり、カビやバクテリアに対する特異的な抗菌作用を有することが認められ、植物病原菌に対する抗菌剤として使用されている（例えば、特許文献１、２参照）。また、例えば、サーファクチン単独では、農業分野において収穫後の農産物に適用する防カビ剤として活用されたり、医学分野では、喉の消毒薬として、うがい薬としても利用されている。また、サーファクチンにイツリンを加えた場合に、その効果はサーファクチン単体よりも多大な効果を有することが明らかにされている（特許文献１、２参照）。
【０００４】
しかしながら、イツリンを人工的に製造する場合、その産生菌からの製造工程は非常に不安定であり、天然に採取する場合と比べて、一定の効率で産出できず、多大なコストがかかるという問題がある。
【０００５】
さらにまた、従来の化学薬品を使った防カビ剤や殺菌剤の別の問題点として、化学薬品を使用する防カビ剤などは漂白剤を使用することで一見すると表面上落ちたように見えるが、実際には洗剤がイツリンほどカビ特異的に有効でないため、実用上は効果が高くないという問題がある。
【特許文献１】特許第３１３２１９５号
【特許文献２】特許第３２３７２４０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は上述に鑑みてなされたものであり、従来、抽出精製が困難なため、一定の効率で商用化が困難であった、カビに対して特異的に作用するイツリンを含有率の高い粗分画として提供することを目的とする。また、本発明は、カビやバクテリア等の生物種に対する抗菌活性を有する前記粗分画を商用可能なコストで容易に防カビ剤などの形態で真菌抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を利用して、カビに対して有効な抗生物質であるイツリン、サーファクチンを主成分とする抗菌活性物質粗分画の生産効率を上げることによって上記課題が解決できることを見出して、本件発明を完成させたものである。
【０００８】
即ち、上記目的は、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を固体又は液体培養し、
該バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の培養液から、イツリンの含量が高い粗分画を抽出精製することを特徴とするイツリンを含有する粗分画の製造方法によって達成される。
【０００９】
請求項１に記載の発明によれば、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株からイツリンの含量が高い粗分画を抽出精製する製造方法によって、一定の効率で粗分画の製造ができる。
【００１０】
請求項２にかかる発明は、請求項１に記載の発明において、前記バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の固体培養物を水抽出することを特徴とする。
【００１１】
請求項２に記載の発明によれば、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株からイツリンの含量が高い粗分画を製造する、新規な抽出方法を提供できる。
【００１２】
請求項３にかかる発明は、請求項１又は２に記載の発明において、前記粗分画は、さらにサーファクチンを含むことを特徴とする。
【００１３】
請求項３に記載の発明によれば、粗分画にイツリンとサーファクチンを含むことによって、さらに有効な抗菌作用を有することができる。
【００１４】
請求項４にかかる発明は、請求項１〜３に記載の方法によって製造されたバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株産生イツリンを含有する粗分画によって達成される。
【００１５】
請求項４に記載の発明によれば、カビに対する特異的な抗菌作用を有し、一定の効率で製造できるバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株産生イツリンを含有する粗分画が提供できる。
【００１６】
請求項５にかかる発明は、請求項４に記載の発明において、パラオキシ安息香酸エステルを加えたことを特徴とする。
【００１７】
請求項５に記載の発明によれば、イツリンを含有する粗分画にパラオキシ安息香酸エステルを加えたことによって、さらに効果的な抗菌作用を有することができる。
【００１８】
請求項６にかかる発明は、請求項４又は５に記載の粗分画の抗菌活性機能を使用する真菌発育抑制剤によって達成される。
【００１９】
請求項６に記載の発明によれば、カビに特異的に抗菌活性を有するイツリンの含量が高い粗分画を使用することにより、カビを退治する効果が極めて高い真菌発育抑制剤ができる。
【００２０】
請求項７にかかる発明は、請求項６に記載の発明において、前記真菌発育抑制剤は、防カビ剤、殺菌剤、防カビ効果を有する洗剤、又は食用洗剤の少なくとも一つ以上であることを特徴とする。
【００２１】
請求項７に記載の発明によれば、防カビ剤、殺菌剤、防カビ効果を有する洗剤、又は食用洗剤の少なくとも一つ以上によって、中性で人体に無害な防カビ剤として、日常生活の施設等での防カビを提供でき、さらに飲用しても安心な防カビ剤として利用可能である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を使用して、カビに特異的に抗菌活性を有するイツリンを製造するため、カビを退治する効果が極めて高く、且つ安定してイツリンを製造することができる。また、イツリンは環状ペプチドであり、弱い界面活性を有することから、間違って飲用したとしても、胃を荒らす程度の副作用であり、通常は人が消化可能な安全な物質であるため、食用可能な防カビ剤を提供することができる。さらにまた、環境に廃棄されても環境微生物によって概ね２週間以内に分解されるため、環境に負荷がかからない防カビ剤や殺菌剤とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の最良の実施形態について詳細に説明する。
【００２４】
イツリンやサーファクチンは、枯草菌が芽胞を形成する際に菌体外に産出する物質であり、カビに対する特異的な抗生物質として知られている。上記したように、サーファクチンだけでも抗カビ・抗菌作用を有するが、そこにイツリンが加わることで、サーファクチンの濃度が低くても、抗カビ・抗菌作用を有し、さらにまた、イツリンだけでも十分な抗カビ・抗菌作用を有する。
【００２５】
従来のイツリンはバチルス菌（Bacillus sp.）を培養し、菌体外の産生物として培養液を処理することにより抽出され、クロマトグラフィー等の技術によって精製されてきた。しかし、その製造は不安定であり、収率が非常に悪く、商用化には適していなかった。
【００２６】
そこで、本発明は、培養する菌を天然でスクリーニングされたイツリン高産生株バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を利用して生産効率を上げたことを特徴とする。さらに、イツリンやサーファクチン等低分子量タンパク質を含めたほとんどのタンパク質を強塩酸環境下で強制的に沈殿させ、従来法と同じアルコール抽出で効率よく、対象となるイツリンの含量が高い粗分画を抽出精製する。この粗分画には、サーファクチン等の低分子タンパク質を含み得る。この過程で、フィルター滅菌を実施し、かつ、限外濾過によって高分子タンパクを除くことにより、イツリンやサーファクチンの経時的な力価減衰の原因と考えられるタンパク質分解酵素を分離する。
【００２７】
以上の操作を効率よく実施することで商用可能なコストで製造可能となったイツリン、サーファクチンを主成分とする抗菌活性物質粗分画をカビ、バクテリア等について有効性の確認を行ったところ、約７０ｐｐｍで効率よくカビの繁殖を抑制したり、バクテリアを殺菌したことから、従来、トマト立ち枯れ病に対して１０００ｐｐｍ程度で有効なサーファクチンとは対照的に、１２ｐｐｍ程度で有効なイツリンの含量が高い粗分画が製造できた。
【００２８】
また、本発明のイツリンはバチルス・サブチリスＤＢ９０１１菌株から菌体外に産出される微生物の天然物質であり、人体にほとんど害がないことから、本発明により食品の滅菌目的の洗剤としても利用可能となる。また、中性で人体に無害な防カビ剤として生活中の施設等での防カビが可能である。従来、枯草菌を優性菌として利用する施設の病原菌対策等において、無菌のバクテリアやカビを殺菌・抑制し、宿主が存在しないため、ウィルスについても有用な施設等の殺菌剤として利用可能である。従来、化学薬品では刺激性や毒性が強く、他の洗剤等との併用が不可能であった防カビ剤に直接触れても、飲んでも安心な防カビ剤として利用可能となる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明の製法にしたがって実施した具体例を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
従来のバチルス菌（Bacillus sp.）に代わって、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を利用した。
【００３０】
本発明によると、そのイツリン高産生株バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を培養し、その培養液を処理することによって、イツリンの含有が高い粗分画を抽出し精製する。具体的な培養液の処理方法としては、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の液体培地又は固体培地を調製し、イツリンやサーファクチン等低分子量タンパク質を含めたほとんどのタンパク質を強制的に沈殿させるように培養液を強塩酸環境にさせて、従来法と同じアルコール抽出で効率よく、対象となるイツリンの含量が高い粗分画を抽出精製した。このようにして得られた粗分画には、サーファクチンが含まれてもよい。この過程で、フィルター滅菌を実施し、かつ、限外濾過によって高分子タンパクを除くことにより、イツリンやサーファクチンの経時的な力価減衰の原因と考えられるタンパク質分解酵素を分離した。
【００３１】
下記に、より詳細に本発明のイツリンの粗分画の製造方法を記載する。
【００３２】
まず、イツリンの粗分画を製造する前段階としてのバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の調製方法について図１及び２を参照しながら説明する。
【００３３】
図２は、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の製造方法のフローチャートである。図２から分かるように、製造方法は、概略すると、種母培養と本培養とからなる培養、集菌・乾燥及び製造用原体の製造の各段階によって実行される。より詳細な説明は、下記に段階ごとに順次説明する。
【００３４】
まず、製造用種菌であるＤＢ９０１１菌株の凍結乾燥保存アンプル（例えば、エー・エイチ・シー社アルスタ製品、又は、１９９１年５月２１付けで通商産業省工業技術院微生物工学研究所（現・独立行政法人産業技術工業研究所特許生物寄託センター）に微工研条寄第３４１８５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４１８）として寄託。）を開封し滅菌水を加え、この液のー白金耳を普通寒天培地（ニッスイ）に画線培養し３７℃で２〜３日培養する。この平板培地に滅菌水を加え、菌をかきとり作成した菌懸濁液をスクリュー管１本当たり１ｍｌ分注し、−８０℃に保存する。性状試験（通常のバチルス菌滅菌条件（１２１℃、１．２気圧、２０分）で生き残り、かつ、イツリン粗分画の産生を１Ｘ１０10ｃｆｕ／ｇで１０ｋｇあたり１ｇ以上を示し、かつ、特許第３０４０２３４号に記載の表現形を示す菌株）を行い合格したものを種母培養の種菌として用いる。
【００３５】
次いで、図１に示すような組成で培地を調製し、種母培養を行う。種母培養、つまり前培養は、フラスコ培養と３０Ｌ醗酵槽（ジャー）培養の二段階で行う。具体的には、フラスコ培養は、５００ｍｌ容三角フラスコ振とう培養を行い、下記にその培養条件を記載する。
培地：仕込み量１００ｍｌ。消泡剤として日本油脂製「ディスフォームＣＣ−１１８」を０．１％添加。
種菌接種量：凍結保存懸濁液を解凍し、フラスコ１本に１００μｌ接種。
培養温度：３７℃。
回転数：２００ｒｐｍ。
培養時間：１６乃至２４時間。
【００３６】
このフラスコ培養に次いで、３０Ｌジャー培養を行い、下記にその培養条件を記載する。
培地：仕込み量１８Ｌ。消泡剤として日本油脂製「ディスフォームＣＣ−１１８」を培地殺菌前に０．５％添加、培養中に１％滴下する。
種菌量：上記フラスコ培養したフラスコ２本を接種。
培養温度：３７℃。
回転数：５００ｒｐｍ。
内圧：１ｋｇ／ｃｍ２−Ｇ。
通気量：０．１乃至０．４ｖｖｍ。
培養時間：８乃至１６時間。
【００３７】
これまでの種母培養に次いで、本培養を３立方メートルの醗酵槽を用いて培養する。下記にその培養条件を記載する。
培地：仕込み量１８００Ｌ。消泡剤として日本油脂製「ディスフォームＣＣ−１１８」を培地殺菌前に０．５％添加、培養中に１．５％滴下する。
種菌量：上記３０Ｌジャーで培養した培養液１８Ｌを接種する。
培養温度：３７℃。
回転数：２５０ｒｐｍ。
内圧：１ｋｇ／ｃｍ２−Ｇ。
通気量：０．１乃至０．４ｖｖｍ。
培養時間：２４時間。
【００３８】
培養が終了した後、集菌・乾燥段階を行う。集菌・乾燥段階は、集菌、乾燥、凍結乾燥菌体中の菌数計数法、及び凍結乾燥菌体の保存からなる。
【００３９】
集菌は、連続遠心機（シャープレスタイプ）を用いて８，０００ｒｐｍで集菌し、乾燥段階に移る。
【００４０】
乾燥は、凍結乾燥又はスプレードライの何れかの手法で行う。
【００４１】
凍結乾燥の手法は、集菌した湿菌体（菌濃度約３０％）に水を菌濃度２０％になるように加えた後、ディスパーミルで懸濁し、これを凍結乾燥する。乾燥後の菌体の固まりはミキサーで破砕する。
【００４２】
一方、スプレードライの手法は、集菌した湿菌体（菌濃度約３０％）に水を菌濃度１０乃至１５％になるように加えた後、ディスパーミルで懸濁し、これを出口温度８０乃至１００℃の条件でスプレードライヤーにかける。
【００４３】
乾燥後、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の規格の試験法（予め保存された差分スクリーニングによって得られたＤＢ９０１１菌株に特異的なＰＣＲタグとのコロニーハイブリダイゼーション法により確認し、フローサイトメトリー（純粋培養時に限る）または希釈プレート法による）に準ずる菌数計数法によって、凍結乾燥菌体中の菌数を計測する。
【００４４】
次いで、乾燥菌体は、アルミラミネートの袋に入れヒートシールをして、室温保存する。
【００４５】
その後、これはさらなる製造工程の処理のために使用されてよく、例えば、健康補助食品、製薬剤などにして使用する製造用原体として調製することもできる。
【００４６】
この段階では、製造用原体中の菌数が１０９個／ｇ以上の任意の数になるよう、凍結乾燥菌体に乳糖、ブドウ糖、スキムミルク等を加え、攪拌混合する。製造用原体中の菌数は、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の規格の試験法（フローサイトメトリー（純粋培養時に限る）または希釈プレート法による）に準ずる。製造用原体は、アルミラミネート又はポリエチレンの袋に入れ、倉庫内で室温保存する。このようにして調製されて保存された製造用原体は、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を利用する様々な用途において、適宜修正されて使用されてよい。
【００４７】
本発明では、この段階でバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を固体培地又は液体培地のいずれかの培地で培養し、次いで、その培養液を処理することによって、イツリンの含有が高い粗分画を抽出し精製する（図３、４及び５参照）。
【００４８】
本発明のイツリンの粗分画を製造するために、液体培地での培養も可能であるが、固体培養の方がバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株のイツリンの生産効率が高かったり、培養後のバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の保存や、その後の処理に好ましい条件となるために、一般的には固体培地での培養が望ましい。固体培養に用いられる固体培地としては「ふすま」が一般的であるが、本発明では「オカラ」を用いた。オカラを用いた固体培養は、既知の技術であり、正田  誠（東京工業大学  資源科学研究所  教授）「液体および固体培養を用いた枯草菌による抗菌物質の生産特性」に詳細に記載されているので、ここでは概要について述べるだけとする。固体培養は、１５ｇスケールから３ｋｇスケールまでが可能であるが、いずれのスケールで実行する場合もオカラの殺菌処理が必要である。具体的な殺菌処理としては、ＫＨ２ＰＯ４と、ＭｇＳＯ４の無機塩及びグルコースを補給し、水分含量をほぼ８０％に調整した後、１２０℃で２０分間殺菌を行い、室温で冷却後、再度、１２０℃で２０分間の殺菌が必要である。
【００４９】
１５ｇスケールの固体培養の場合は、三角フラスコに１５ｇのオカラを入れ、上記のバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を加えて、恒温槽において２５℃での培養が好ましい。
【００５０】
また、３００〜５００ｇスケールの固体培養の場合は、ガラスの円筒型容器を用いる。この場合、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株がイツリンの生産量を高めるために、容器の下部にパイプを入れ、外部から酸素の供給を行い、空気流量はほぼ２ｖｖｍとした。
【００５１】
３ｋｇスケールの固体培養は、液体培養に用いる内容積７リットルの培養槽を用いることができ、３００〜５００ｇスケールと同様に、空気をパイプで下部から送風し、その速度は２ｖｖｍとした。
【００５２】
液体培養は、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ  ３％、グルコース  １％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ０．０５％の組成の培地に上記のバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を加えて、フラスコで振とう培養するか、培養槽で攪拌培養する。
【００５３】
図３に示すように、固体培養の場合は、固体培地の３〜５倍容の水を加えて攪拌し、ネルで絞り抽出を２〜３回繰り返して行い、抽出液を得る。その後、セルロース膜などで０．４５ミクロン濾過を行い、無菌原抽出液とする。
【００５４】
代替として、液体培養を行う場合は、図４に示すように、７０００ｇで１０〜３０分間の遠心分離を行い、次いで、上清をセルロース膜などで０．４５ミクロン濾過を行い、固体培養の場合と同様に、無菌原抽出液とする。
【００５５】
いずれの処理で得られた無菌原抽出液は、図５に示すように、イツリン等低分子量タンパク質を含めたほとんどのタンパク質を強制的に沈殿させるように抽出液をｐＨ２．５〜３の強塩酸環境にさせて沈殿させて、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、二層の沈殿物のうち、不透明な下層を従来法と同じアルコール抽出、例えば、３〜５倍容のエタノール又はメタノールと攪拌して、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿物を再度数回のアルコール抽出処理、で効率よく、対象となるイツリンの含量が高い粗分画を抽出精製した。このようにして得られた粗分画には、サーファクチンが含まれてもよい。この過程で、フィルター滅菌を実施し、かつ、セルロース膜等を用いて限外濾過（分子量５０，０００）によって高分子タンパクを除くことにより、タンパク質分解酵素を分離した。ここで除去されたタンパク質分解酵素は、イツリンやサーファクチンの経時的な力価減衰の原因と考えられる。
【００５６】
これによって得られた、様々なイツリン濃度のイツリンとサーファクチンの粗分画を８種類のカビに対して適用した。下記に、コントロール実験を含めたカビの培地などの詳細な条件を記す。
使用培地：ポテトデキストロース寒天培地（栄研）
培養条件：２５℃、７日間
試験方法：
１．ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）を１２１℃、１５分間において、高圧蒸気滅菌させた。
２．高圧蒸気滅菌後、５０℃に冷却した培地にそれぞれ所定量のイツリン液（０ｐｐｍ（コントロール）、９ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、３５ｐｐｍ、６８ｐｐｍ及び１３８ｐｐｍ）を入れ、混合し、シャーレに２０ｍｌずつ流した。
３．上記段階２の培地が固化した後、寒天培地に発育した真菌をコルクボーラーで抜き、シャーレの中央に置いた。
４．２５℃で７日間、暗室で培養した後、各シャーレで、それぞれのイツリン濃度におけるコントロールに対するカビの面積比を測定した。
【００５７】
表１は、その抗カビ作用をコントロールに対する面積比で示した表であり、さらに図６は、それをグラフに示したものである。
【００５８】
【表１】
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この結果からわかるように、カビの種類に関わらず、イツリン濃度が１３８ｐｐｍの場合には、すべてのカビに対して、有効であることが分かる。また、カビの種類によっては、９ｐｐｍだけでも有効に効果を奏する場合もあり、特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅに対しては、濃度の濃淡に関わり無く、非常に有効に作用することが分かった。
【００５９】
また、この結果はイツリン、サーファクチンを含む粗分画での効果であり、さらに精製した純度の高いイツリンだと、本実施例で行った濃度よりもさらに薄い濃度で有効な効果を有することが期待される。
（実施例２）
図７は、イツリンの粗分画を製造するための抽出精製方法の一例として行った結果をシグマ社のイツリンＡと比較した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分析結果を示す。
【００６０】
本実施例２では、実施例１で述べた方法で製造したバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を固体培地で培養し、抽出精製処理を行い、イツリンの粗分画を得た。具体的な手法として、まず、固体培養物を１２１℃で１５分間のオートクレーブを行い、これに１０倍量の水を加えて、ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整した。次いで、６０〜８０℃で１時間抽出処理を行った。この段階で、濾過助剤として珪藻土を加え、布などを用いて濾過を行い、得られた濾液をＨＣｌでｐＨ３〜４に調整した。次いで、この液を遠心分離処理し、沈殿物をイツリン粗分画として得た。
【００６１】
この結果から、得られた粗分画はシグマ社のイツリンＡに酷似しており、イツリンの含有量が高いことが分かる。
【００６２】
したがって、上記の実施例から明らかなように、バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株から特異的な抗真菌物質であるイツリンの含有量が高い粗分画を効率よく抽出精製できる。また、その粗分画は、化学薬品の防カビ剤や殺菌剤に代わって使用することができる。
【００６３】
また、イツリンだけでも十分な抗カビ・抗菌作用を有するが、自然物のイツリンは４〜５日で効果が減少するので、特に、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシベンゾエート（パラベン））を加えた場合に、防カビ・殺菌剤等としてさらに優れた効果を発揮することができる。
【００６４】
さらにまた、イツリンの特性から食しても安全な抗カビ剤として提供することができる。
【００６５】
以上本発明の好ましい実施例について詳述したが、本発明はかかる特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を製造する培地の組成図である。
【図２】バチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株を製造するフローチャートである。
【図３】固体培地からイツリン粗分画を製造する工程を示すフローチャートである。
【図４】液体培地からイツリン粗分画を製造する工程を示すフローチャートである。
【図５】図３又は図４に続くイツリン粗分画の製造工程（３）を示すフローチャートである。
【図６】様々なイツリン濃度のイツリンとサーファクチンの粗分画を８種類のカビに対して適用した場合の抗カビ作用をコントロールに対する面積比で示したグラフである。
【図７】実施例２の手法で行ったイツリン粗分画のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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