(57)【要約】【課題】  簡便かつ効率的な肝癌非ヒト動物モデルの作製方法の提供。【解決手段】  非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入し、次いで該注入部位にコラーゲンシートを貼布することを特徴とする、肝癌非ヒト動物モデルの作製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入し、次いで該注入部位にコラーゲンシートを貼布することを特徴とする、肝癌非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項２】
コラーゲンシートが、血液凝固因子を被覆したコラーゲンシートである請求項１記載の肝癌非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項３】
コラーゲンシートが、フィブリノーゲン、トロンビン及びアプロチニンを被覆したコラーゲンシートである請求項１記載の肝癌非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項４】
非ヒト動物が、ラットである請求項１〜３のいずれか１項記載の肝癌非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項５】
非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入し、該注入部位にコラーゲンシートを貼布し、その後被験物質を投与することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
コラーゲンシートが、血液凝固因子を被覆したコラーゲンシートである請求項５記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
コラーゲンシートが、フィブリノーゲン、トロンビン及びアプロチニンを被覆したコラーゲンシートである請求項５記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
非ヒト動物が、ラットである請求項５〜７のいずれか１項記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便かつ効率的な肝癌非ヒト動物モデルの作製方法及びこれを用いる抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝癌の発症率は増加しており、肝癌の病態解明、および新たな治療法の開発が強く望まれている。肝癌治療の基礎研究には、肝癌非ヒト動物モデルが必要である。従来の肝癌動物モデルとして、ＬＥＣラット、化学発癌、コリン欠乏食による発癌、トランスジェニック・マウスによる肝発癌がその中心的存在であったが、その発癌過程やその生物学特性は必ずしもヒト肝細胞癌に酷似せず、モデル作製にも数ヶ月という日数を要していた。
【０００３】
一方、肝癌移植モデル、特にラット肝癌移植モデルの報告は少ない。従来の方法は、ドナーラットに肝癌細胞株を皮下注入し、増大した腫瘍を摘出し、ミンチ状にしたものをレシピエントラット肝に埋め込むという煩雑で長時間を要するものであった（非特許文献１）。また、ラットの肝臓に癌細胞を注入する方法（Needle Injectionモデル）においては、播種の頻度が高く、また腫瘍生着率が低いという問題があった（非特許文献２）。
【非特許文献１】Yang R, et al, J. Surg. Res. 1992；52：193-198
【非特許文献２】Chen JH, et al, Lab. Anim. 2004；38：79-84
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、簡便な操作で、腫瘍生着率が高く、かつ播種を生ぜず、癌腫の増殖の
再現性のある肝癌移植モデルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、動物の肝臓組織に癌細胞を注入する方法について種々検討してきたところ、外来肝癌細胞を肝被膜下に注入後、注入部位にコラーゲンシートを貼布すれば、穿刺に伴う播種が生じず、ヒト肝癌に類似した形態学的特徴をする肝癌移植モデルが簡便、かつ高い腫瘍生着率で得られることを見出した。さらに、この移植モデルを用いれば、肝癌治療の検討、特に抗癌剤のスクリーニングが容易にできることも見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入し、次いで該注入部位にコラーゲンシートを貼布することを特徴とする、肝癌非ヒト動物モデルの作製方法を提供するものである。
また、本発明は、非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入し、該注入部位にコラーゲンシートを貼布し、その後被験物質を投与することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、肝臓組織への穿刺に伴う播種が生じず、ヒト肝癌に類似した形態を有する癌が効率良く生着し、簡便かつ正確な肝癌動物モデルが作製できる。この肝癌動物モデルを用いれば、抗癌剤、特に肝癌治療剤の的確なスクリーニングできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられる動物は、非ヒト動物であれば特に制限されないが、操作性、モデル動物としての取り扱い性等の点から、ラット、マウス等のげっ歯類が好ましく、ラットが特に好ましい。
【０００９】
まず、本発明においては、非ヒト動物を開腹し、肝臓組織内に外来肝癌細胞を注入する。ここで、開腹手法は、移植部位である肝臓がみえるようにできる手法であればよい。なお、操作は麻酔下に行うのが好ましい。肝臓における癌細胞の注入部位は、肝実質細胞の存在する部位であればよく、例えば肝左葉等が好ましい。
【００１０】
移植に用いられる外来肝癌細胞としては、株化されている肝癌細胞が好ましく、増殖力の強いラット肝癌細胞株が好ましい。肝癌細胞株の例としては、ＫＤＨ−８が挙げられる。肝癌細胞は懸濁液として用い、１×１０4個程度を注入するのが好ましい。
【００１１】
注入手段は特に制限されず、注射針により注入すればよい。
【００１２】
肝癌細胞注入後、注入部位にコラーゲンシートを貼布する。コラーゲンシートの貼布により、癌細胞の注入部からの漏れが回避でき、その結果として播種が防止でき、癌細胞の生着率が向上する。用いるコラーゲンシートとしては、ウマコラーゲン、ウシコラーゲン、ブタコラーゲン等の動物由来のコラーゲンであればよい。シートの厚さは４mm前後、大きさ３〜５mm角が好ましい。また、コラーゲンシートには、少なくとも貼付面に、血液凝固因子が被覆されているのが、出血防止、播種防止等の点でより好ましい。被覆される血液凝固因子としては、フィブリノーゲン、トロンビン、アプロチニン等が挙げられ、このうち、フィブリノーゲン、トロンビン及びアプロチニンの３種を用いるのが好ましい。このような血液凝固因子を被覆したコラーゲンシートの市販品としては、タココンブ（ＺＬＢベーリング社製）が挙げられる。
【００１３】
上記の操作により、２週間後には肝臓に孤立性の腫瘍が生着する。３〜４週間後には、腫瘍がさらに増殖し、腫瘍中心部に壊死がみられ、ヒト肝細胞癌の症状に酷似したものとなる。また、この間、従来の注入法でみられた播種は全く認められず、再現性よく、肝癌移植モデルが得られる。
【００１４】
このように、本発明方法によれば、簡便な操作により、再現性よく、ヒトの肝細胞癌に酷似した肝移植モデルが得られるので、肝癌細胞移植後に被験物質を投与し、その経過を観察すれば、抗癌剤のスクリーニングができる。
【００１５】
被験物質の投与は、肝癌細胞注入後であればよく、コラーゲンシートを貼付した後が好ましい。また被験物質の投与手段は、静脈、動脈等への投与でもよく、また肝臓への局所投与でもよい。
【００１６】
被験物質が肝癌治療において有用か否かは、肝癌の組織学的検査、分子生物学的解析、コンピューター断層写真撮影装置（CT）、超音波等によりコントロール群と対比することにより、癌細胞の増殖等を判断することにより行うことができる。なお、本発明における抗癌剤には、直接癌細胞の増殖を抑制する作用を有するものだけでなく、免疫作用や血管新生阻害作用などにより間接的に癌細胞の増殖を抑制するものも含まれる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１８】
Ａ．材料及び方法
（１）細胞培養
肝癌細胞株ＫＤＨ−８は、３′−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼンで誘発されたＷＫＡ／Ｈｏｋラットの肝癌細胞から、株化されたものである（Cancer Immunol. Immunother. 2002；51：381-388）。ＫＤＨ−８細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（日水製薬）中で増殖させた。細胞は、５％ＣＯ2及び９５％空気のインキュベータ中３７℃でインキュベートした。
（２）ラット肝癌移植モデルの作製
対象として１０〜１２週齢ＷＫＡＨ／Ｈｋｍ雄性ラット２０匹を用いた。ＫＤＨ−８細胞１．０×１０4個をリン酸緩衝液０．１mLに懸濁し、ラット開腹下に２７ゲージ針を用いて、肝左葉の被膜下実質内に注入した。注入部位にタココンブ（ＺＬＢベーリング社）を貼付した。閉腹し移植手術を終了とした。１４、２１、２８日後に腫瘍の大きさを、再開腹下、またはCT下にて測定した。
（６）肝動脈結紮モデル
肝癌細胞注入１４日後に再度開腹し、無作為に選定されたラット１０匹に対してヒト肝癌治療における肝動脈塞栓術に類似させるため、固有肝動脈の結紮を行った。また残りの１０匹は開腹のみで、動脈結紮を行わない非処置群とし、その後７、１４日後に腫瘍の大きさを、開腹下、またはCT下にて測定した。
【００１９】
Ｂ．結果
（１）ＫＤＨ−８肝癌細胞の増殖性
肝臓にＫＤＨ−８細胞を注入した２０匹のラット全例に単結節の腫瘍の出現をみた（図１）。なお、腹腔内に播種性の変化はみられなかった。注入１４日後最大平均腫瘍径は５．１±０．２３mm（平均値±標準誤差）であった。２１日後において、中心性壊死が出現し、２８日後には、最大腫瘍径は２０mmを超えていた（CT所見：図２）。両群における増殖曲線を図４示す。動脈結紮群は、結紮７及び１４日後に有意な腫瘍の増殖抑制が認められた。
【００２０】
（２）腫瘍の組織学的所見
ＫＤＨ−８肝癌細胞は組織学的には柵状構造はなく、腺腔形成を伴う低分化の肝細胞癌であり、周囲組織との境界は明瞭であった。（図３ａ、ｂ）。抗ＶＥＧＦ抗体による免疫組織染色では、ＫＤＨ−８肝癌細胞中にＶＥＧＦの強発現がみられた（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】肝癌細胞株注入１４日後の肝臓を示す写真である。（孤立性の腫瘍がみられる（矢頭）。矢印は細胞株注入時（１４日前）に付着されたタココンブ。）
【図２】肝癌細胞株注入２８日後ＣＴ所見を示す図である。（肝左葉に中心部壊死を伴った径２１mm大の腫瘤を認める。）
【図３】肝癌細胞株注入２週後の組織染色結果を示す図である。（腫瘍は境界明瞭な結節で、組織学的に低分化な肝細胞癌である。Ａ:ヘマトキシエオジン染色４０倍、Ｂ：ヘマトキシエオジン染色２００倍）
【図４】ＫＤＨ−８ラット肝癌における腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図５】抗ＶＥＧＦ抗体による免疫染色を示す図である。（ＫＤＨ−８肝癌内にはＶＥＧＦの高発現がみられる。）
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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