(57)【要約】      （修正有）【課題】  反応液中に析出したD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収することができる光学活性アミノ酸の製造方法の提供。【解決手段】  酵素活性物質によるD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、反応液中に析出した生成物を溶解することによって回収する方法を確立した。こうして回収された光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を精製することによって、目的とする化合物を効率的に得ることができる。医薬品あるいは農薬の中間体として有用な、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を工業レベルで効率的に製造することができる。【選択図】図１
2006115726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を反応溶液中に析出濃度以上に蓄積させる工程と、
蓄積したDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を30℃〜80℃に保持することによって溶解させ、溶解したDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程とを含むDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項２】
酵素活性物質がDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸と共存しており、DまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させた反応溶液から酵素活性物質を除去した後に、D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を晶析させる工程をさらに含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
反応溶液をｐＨ＝０．１〜２．５とすることによってD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させる、請求項１または請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
反応溶液をｐＨ＝０．２〜２．０とし、かつ、４０〜７０℃で４時間以上保持することによって、D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させる請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
β−ヒドロキシアミノ酸が下式１（式中Rは置換されてもよい脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【化１】
2006115726.tif 000005
で表されるβ−ヒドロキシアミノ酸である、請求項１乃至請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
Ｒが置換されていてもよいシクロヘキシル基である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
酵素活性物質がL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有している、請求項１乃至請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
酵素活性物質が下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７記載の製造方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸、特にD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸等のD-β-ヒドロキシアミノ酸は医薬や農薬等の合成中間体として有用な物質であり、安価な製造方法が望まれている。以下、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸と記載するときは、特に断らない限り、「D-β-ヒドロキシアミノ酸またはL-β-ヒドロキシアミノ酸」を意味する。
【０００３】
光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法としては、有機合成による化学合成法（特許文献１）と酵素活性物質を利用した生物学的手法（特許文献２、特許文献３）が知られている。工業的な製造方法としては、より安価に合成することが可能である酵素活性物質を利用した手法が好ましい。生物学的手法は、一般に酵素活性物質による反応工程と反応液からの目的物である光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の分離精製工程からなる。酵素活性物質と生成物である光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の分離は、工業的に行う反応の場合は困難な面が多い。
【０００４】
工業的に物質生産を行う上では、反応槽あたりの生産量を向上させること、つまり生産物を高濃度蓄積させることが、経済的に有利である。一方、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は、その構造によっては、水に対する溶解性が非常に低い場合がある。溶解性の低い光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の蓄積量が増大すると、反応液中に一部もしくは大部分の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が析出してしまう。析出した生成物は、多くの場合、固形物として存在する酵素活性物質等との分離を困難にする。
【０００５】
溶解性の低い化合物は、しばしば、なんらかの手段によって目的とする化合物を溶解することによって回収される。つまり、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を一旦溶解した後、酵素活性物質を分離し、さらにイオン交換樹脂で処理する方法が考えられる。具体的には、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を溶解するために反応液に水を加えることができる。
【０００６】
溶解された光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は、イオン交換処理した後に、濃縮等の晶析操作を経て粗結晶とすることができる。その後更に高純度の製品を得るために脱色操作、再結晶操作により光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の結晶を得られる。しかし、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は、その構造によっては水に対する溶解度が極めて低く、上記したような方法では、一旦溶解させるために多量の水を要する。その結果、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の濃度が低下し、以降の分離精製工程が煩雑となる等の問題がある。
【０００７】
このように、反応液中に析出した原料、並びに光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を分離精製する方法として、工業レベルで耐えうる効果的な手法は報告されていない。
【特許文献１】特開平１−３１７３９１
【特許文献２】特開平２−２０７７９３
【特許文献３】特開平６−１６５６９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酵素活性物質の混在下で、反応液中に析出した光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を回収することができる光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
酵素活性物質の存在下で、溶解性の低い生成物を回収することにはしばしば困難を伴う。本発明者らは鋭意検討の結果、酵素活性物質による光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、反応液中に析出した生成物を溶解することによって回収する方法を確立した。こうして回収された光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を精製することによって、目的とする化合物を効率的に得ることができることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供する。
【００１０】
［１］  反応溶液中で酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を反応溶液中に析出濃度以上に蓄積させる工程と、
蓄積したDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を30℃〜80℃に保持することによって溶解させ、溶解したDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程とを含むDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
［２］  酵素活性物質がDまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸と共存しており、DまたはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させた反応溶液から酵素活性物質を除去した後に、D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を晶析させる工程をさらに含む、上記［１］記載の製造方法。
［３］  反応溶液をｐＨ＝０．１〜２．５とすることによってD-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させる、上記［１］または［２］記載の製造方法。
［４］  反応溶液をｐＨ＝０．２〜２．０とし、かつ、４０〜７０℃で４時間以上保持することによって、D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させる上記［３］記載の製造方法。
［５］  β−ヒドロキシアミノ酸が下式１（式中Rは置換されてもよい脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【化１】
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で表されるβ−ヒドロキシアミノ酸である、上記［１］乃至上記［４］記載の製造方法。
［６］  Ｒが置換されていてもよいシクロヘキシル基である上記［５］記載の製造方法。
［７］  酵素活性物質がL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有している、上記［１］乃至上記［６］記載の製造方法。
［８］  酵素活性物質が下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［７］記載の製造方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、溶解性の低い光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を、酵素活性物質の存在下で回収することができる製造方法が提供された。本発明において、特にｐＨの調節によって光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を可溶化する工程を採用したとき、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を十分に溶解することができる。たとえば、酸性条件においては、少量の酸の添加によって光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を容易に溶解し、回収することができる。酸性条件においては、微生物菌体のような酵素活性物質と光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を容易に分離することができる。本発明によって、工業的なレベルに応用しうる、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させて光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を反応溶液中に析出濃度以上に蓄積させる工程と、蓄積した光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を溶解させ、酵素活性物質を除去する工程とを含む光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。
【００１３】
本発明の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造においては、DL-β-ヒドロキシアミノ酸のD-体またはL-体のいずれかの化合物に対して、光学特異的に作用する酵素活性物質(enzyme active materials)が利用される。本発明において、酵素活性物質とは、DL-β-ヒドロキシアミノ酸のD-体またはL-体のいずれかの化合物に対して光学特異的に作用し、他の物質に変換する反応を触媒することができる物質と定義される。光学特異的な作用とは、いずれかの光学異性体に対して、他方の異性体に対する作用よりも高い触媒作用を有することを言う。たとえば、以下の酵素、該酵素活性を有する微生物または微生物処理物を、酵素活性物質として利用することができる。
【００１４】
（１）アルドラーゼ類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する活性を有するL-アミノ酸アルドラーゼ類、あるいはグリシンと対応するアルデヒドからD-β-ヒドロキシアミノ酸を合成する活性を有するD-アミノ酸アルドラーゼ類
（２）脱炭酸酵素類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的に脱炭酸し分解する活性を有するL-アミノ酸脱炭酸酵素類
（３）アシラーゼ類：N-アシル−DL-β-ヒドロキシアミノ酸を原料として、D体特異的に、あるいはL体特異的に加水分解する活性を有するアミノ酸アシラーゼ類
【００１５】
好ましい酵素としては、具体的には、次のような酵素を示すことができる。
L-フェニルセリンアルドラーゼ、
L-スレオニンアルドラーゼ、
L-アロ−スレオニンアルドラーゼ、
D-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、
L-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、
D-スレオニンアルドラーゼ、
D-アロ−スレオニンアルドラーゼ等
【００１６】
中でも、L-フェニルセリンアルドラーゼは本発明における好ましい酵素である。これらの酵素は公知であり、例えば以下に記載された手法により取得することができる。
特開平9-238680
ビタミン, 75, 2, 51-61, 2001
バイオサイエンスとインダストリー, Vol. 56, No. 11, 23-26, 1998
Nature, 181, 1533-1534, 1958
Biochim. Biophys. Acta, 258, 779-790 (1972)
FEMS Microbiology Letters, 151, 245-248, 1997
Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 702-708, 1998
Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 44-51, 2000
Eur. J. Biochem., 248, 385-393, 1997
使用する酵素活性物質の量は、通常は０．０１〜１００００ U/mL、好ましくは０．１〜１０００ U/mL、より好ましくは１〜５００ U/mL程度とすることができる。
【００１７】
例えば、Ｌ-フェニルセリンアルドラーゼのＬ-エリスロ-２-アミノ-３-シク
ロヘキシル-３-ヒドロキシプロピオン酸の分解活性は以下のように測定すること
ができる。２０ｍＭ ＤＬ-エリスロ-２-アミノ-３-シクロヘキシル-３-ヒド
ロキシプロピオン酸、２００ｍＭ TAPS-NaOH緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM ピリド
キサール-５’-リン酸（以下、ＰＬＰと省略する）および酵素を含む０．５mLの反
応液中で、３０℃、１０分間反応を行い、1 N ＨＣｌを０．５mL添加することによっ
て反応を停止させる。生成したシクロヘキシルアルデヒドを次の方法によって定量す
る。
【００１８】
１．０mLの反応終了液に０．５mLの２．５ｍM ２，４-ジニトロフェニルヒドラジ
ンを含む１．２N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、３０℃、２０分静置する。更に、
３mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、０．８５mLの３N NaOHを加え、１０
分間静置する。その溶液の４７５nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、３０℃
において1分間に1μmolのシクロヘキシルアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユ
ニット(U)とした。
【００１９】
反応温度は酵素活性物質がその酵素作用を維持できる温度を選択することができる。具体的には、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃を示すことができる。また反応ｐＨも、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる範囲を選択することができる。通常は、ｐＨ６〜１１、好ましくは、ｐＨ７〜１０、より好ましくはｐＨ８〜９．５を示すことができる。反応は、攪拌下で行うことができる。
【００２０】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ属に属し、下記（１）−（３）の性状により特徴づけられるL-フェニルセリンアルドラーゼ産生能を有する微生物より調製することができる。シュードモナス・プチダ属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を好適に挙げることができる。すなわちシュードモナス・プチダ属から単離され、以下の性状によって特徴付けられるL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明における酵素活性物質として利用することができる。あるいは、当該酵素を産生するシュードモナス・プチダ属微生物そのもの、あるいはその処理物を本発明の酵素活性物質として利用することができる。
（１） 作用
L-フェニルセリンに作用し、ベンズアルデヒドとグリシンを生成する。
（２） 基質特異性
(a) L-スレオ-フェニルセリン、およびL-エリスロ-フェニルセリンに共に作用するが、D-スレオ-フェニルセリン、およびD-エリスロ−フェニルセリンには実質的に作用しない。
(b)DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体には作用するが、D-エリスロ体には実質的に作用しない。
（３） 分子量
ゲル濾過における分子量が190,000-210,000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が35,000。
【００２１】
本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性は、例えば次のように確認することができる。
活性測定法：
２０mM ＤＬ-スレオ-フェニルセリン、２００mM TAPS-NaOH緩衝液(pH８．５)、５
０μM ＰＬＰおよび酵素を含む０．５mLの反応液中で、３０℃、１０分間反応を行
い、1 N ＨＣｌを０．５mL添加することによって反応を停止する。生成したベンズ
アルデヒドを次の方法によって定量する。１．０mLの反応終了液に０．５mLの２．
５ｍM ２，４-ジニトロフェニルヒドラジンを含む１．２N塩酸溶液を加え、素早く
攪拌し、３０℃、２０分静置する。更に、３mLのエタノールを加え、素早く攪拌した
後、０．８５mLの３N NaOHを加え、１０分間静置する。その溶液の４７５nmにおけ
る吸光度を測定する。酵素活性は、３０℃において1分間に1μmolのベンズアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。
【００２２】
また本発明において、触媒作用の影響を受けないとは、基質として各化合物を与えたときに、同じ条件で測定された両基質に対する活性を１００としたときに、当該化合物に対する活性がたとえば１０％以下、好ましくは５％以下の場合に、影響を受けないと言う。具体的には、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株由来のL-フェニルセリンアルドラーゼの、以下の化合物に対する活性は、それぞれ対応する両基質に対して以下のとおりである。
(a) L-スレオ-フェニルセリンまたはL-エリスロ-フェニルセリンに対する活性を１００とするとき、D-スレオ-フェニルセリンおよびD-エリスロ−フェニルセリンに対する活性は確認できない。
(b)DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体に対する活性を１００とするとき、D-エリスロ体に対する作用は確認できない。
【００２３】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本酵素は、DL-スレオ-フェニルセリンなどにより誘導されるため、培地に誘導物質を添加することが好ましい。例えば、１．０％ペプトン、０．２％リン酸1水素2カリウム、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキスを含むｐＨ７．２のペプトン培地に０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地が好適に利用される。
【００２４】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、微生物の培養物から、例えば、以下のようにして精製することができる。シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を上記０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含むペプトン培地中で十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護するのが望ましい。
還元剤：2-メルカプトエタノール等
プロテアーゼ阻害剤：フェニルメタンフルホニルフルオリド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、および金属キレーター等
ＰＬＰ
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、たとえば以下のような各種の蛋白質の分画方法、およびクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。
蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー
より具体的には、たとえば、以下の各工程にしたがって、無細胞抽出液から目的とする酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。各工程の詳細な条件は、たとえば実施例に記載したとおりとすることができる。
４０−６０％硫安分割；
ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー；
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；
ＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換クロマトグラフィー(２回目)
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；(２回目)
ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー；
【００２５】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株に由来するL-フェニルセリンアルドラーゼは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる。本発明に利用する酵素活性物質はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログを含む。すなわち本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質とは、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を含む。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【００２６】
あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、更に付加的なアミノ酸配列を有する蛋白質も、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の活性を有する限り、本発明における酵素活性物質として利用することができる。たとえば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列にHisタグなどを付加した蛋白質は、本発明における酵素活性物質に含まれる。更に、これらの蛋白質を発現する形質転換体、およびそれが産生する組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００２７】
本発明に利用するL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物理化学的、酵素化学的性状を有することを意味する。
【００２８】
当業者であれば、配列番号：１記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを得ることが可能である。
【００２９】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００３０】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性状（１）および（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSC を含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３１】
さらに、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００３２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い相同性を示したのは、ラルストニア・ソラナシアラム(Ralstonia solanacearum)由来の予想低基質特異性アルドラーゼ（６８％）であった。機能が同定されている蛋白質の中では、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) PAO1株由来の低基質特異性L-スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列は、配列番号：２に対する相同性が４１%であった。
【００３３】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドをプローブとして、土壌等の環境サンプルから直接得られたDNAからスクリーニングすることによっても目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、環境サンプルから得られたDNAの物理的消化物、酵素的消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。上記方法で、ハイブリダイズするＤＮＡを得た後、得られたＤＮＡ塩基配列を解析した結果、コードするアミノ酸配列がL-フェニルセリンアルドラーゼと７０％以上の相同性を有するものは、同様の機能を有することが期待できる。こうして得られたDNAをもつプラスミドによって形質転換された大腸菌も、本発明に利用することができる。
【００３４】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより目的のDNAを得ることができる。
あるいは、PCRによって得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株のライブラリーをスクリーニングすることによって目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。
【００３５】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列情報に基づいて、その5'側あるいは3'側の塩基配列を取得することもできる。このような方法として、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）を利用することができる。あるいは、既知の断片配列情報に基づいて未知の領域を取得するための方法として、逆PCR(Inverse PCR;Genetics 120, 621-623 ,1988）も公知である。逆PCRにおいては、自己環化によって環状化されたDNAライブラリーが用いられる。このようなライブラリーは、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させることにより得ることができる。一方、逆PCR用のプライマーは、既知のcDNAの塩基配列に対して、その外側（未知の領域）に向かって相補鎖合成反応が進むようにデザインされる。鋳型となるDNAは環状化されているので、逆PCRによって未知の領域を増幅産物として得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００３６】
このようにして単離された、ホモログをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログの発現ベクターを得ることができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを組換え体として得ることができる。こうして得られた形質転換体、およびそれが産生するホモログの組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００３７】
本発明においてL-フェニルセリンアルドラーゼまたはそのホモログを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
【００３８】
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属等宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００３９】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００４０】
微生物菌体内などにおいて、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーター等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００４１】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００４２】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００４３】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００４４】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００４５】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175, 1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００４６】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４７】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614,1979)等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４８】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003,1992)。
【００４９】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99,1991)、pUWL-KS （Gene 165,149-150, 1995)等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53, 1997)。
【００５０】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００５１】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド(J. Bacteriol. 145, 382-390, 1981)、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５２】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である(Mol. Cell. Biol. 6, 80,1986)。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J. 6, 729, 1987)。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５３】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267, 1985)などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター(Agri. Biol. Chem. 54, 2521, 1990)等が利用可能である。
【００５４】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である(Yeast 7, 431-443, 1991)。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており(Mol. Cell. Biol. 5, 3376, 1985)、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる(Nucleic Acids Res. 15, 3859, 1987)。
【００５５】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587,1987)、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００５６】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287,1989)。
【００５７】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる(Biotechnology 7, 596-603, 1989)。
【００５８】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されている。具体的には、蚕などの昆虫(Nature 315, 592-594,1985)、あるいは菜種、トウモロコシ、およびジャガイモ等の植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されている。これらの宿主・ベクター系も、本発明に利用できる。
【００５９】
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応溶液の接触形態は任意である。たとえば原料を含む溶媒に、酵素活性物質を混合することによって、両者を接触させることができる。酵素活性物質が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素活性物質が分散され、必要に応じて両者を分離することができる。あるいは原料を含む溶媒と、酵素活性物質を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形態は、酵素活性物質の回収と再利用を容易にする。本発明において、両者の接触形態は、これらの具体例に限定されない。
本発明において、酵素活性物質としては、配列番号：２に記載の蛋白質、またはそのホモログを機能的に発現する形質転換体並びにその処理物を用いることができる。例えば、pKK-PSA1により形質転換された大腸菌は、本発明における形質転換体として好ましい。
【００６０】
更に、本発明における酵素活性物質には、具体的には以下に示す酵素活性物質が含まれる。
界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生
物；
凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体；
ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液；
無細胞抽出液を部分精製したもの；
精製された酵素；
形質転換体あるいは酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物；
【００６１】
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応液に、任意の添加物を添加することができる。添加物は、酵素活性の増強、酵素活性の安定化、あるいは反応液の流動性の増加などを目的として添加される。本発明において好適に用いることができる酵素活性物質は、補酵素としてＰＬＰを利用する。したがって反応液中にＰＬＰを添加することによって、その酵素活性を増強し、そして安定化すことができる。
【００６２】
ＰＬＰの反応液中の濃度は、通常０．０００１〜１０mM、好ましくは０．００１〜１mM、より好ましくは０．００５〜０．１mMである。また、反応においてアルデヒド誘導体が生じる場合には、亜硫酸水素ナトリウムを添加することによって、酵素活性を安定化することもできる。亜硫酸水素ナトリウムの反応液中の濃度は、通常、生じるアルデヒド誘導体の０．０５〜５等量、好ましくは０．１〜２等量、より好ましくは、０．５〜１等量である。
【００６３】
本発明において、単離することができる光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は高濃度条件下で析出するものであれば特に限定されない。たとえば、下式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【００６４】
【化２】
2006115726.tif 000004
で表される構造を有するβ-ヒドロキシアミノ酸は原料として有用である。
本発明によるDL-β-ヒドロキシアミノ酸は、DL-エリスロβ−ヒドロキシアミノ酸およびDＬ−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれか、または両方であることを意味する。
【００６５】
式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す。具体的には、炭素数１０以下の低級アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１０以下のアルコキシ基、水酸基などで置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基または複素環式炭化水素基より選ばれた置換基である化合物である。より具体的シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、炭素数２０以下、好ましくは１０以下のアルキル基、アリル基、チエニル基等が挙げられる。
【００６６】
特に、Ｒがシクロヘキシル基である化合物は、本発明における好ましい化合物である。すなわち、たとえばDL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を原料としてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法において、本発明は有用である。
【００６７】
反応の原料であるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度は制限されない。通常１〜６０％、好ましくは２〜３０％、より好ましくは５〜１５％、より好ましくは２．５〜７．５％の濃度の原料を使用することができる。ここで例示した原料の濃度は、反応液を構成する溶媒の重量に対する原料の重量％である。本発明においては、反応液に対する原料の濃度は、原料の溶解状態とは無関係である。したがって、原料の溶解状態に関わらず、添加された原料が同じときには濃度は一定である。つまり原料は、完全に溶解している溶液状態であってもよく、本発明において好適に扱える範囲で、完全には溶解していない懸濁状態でも良い。
【００６８】
本発明において、原料として好ましいDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物である。混合物中のＤ体とＬ体の比率は、Ｄ体：Ｌ体＝１０：９０〜９０：１０であり、好ましくは、Ｄ体：Ｌ体＝２５：７５〜７５：２５、より好ましくはＤ体：Ｌ体＝５０：５０（ラセミ体）である。
【００６９】
同様に、原料として好ましいDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物であり、その混合物中のＤ体とＬ体の比率は、Ｄ体：Ｌ体＝１０：９０〜９０：１０であり、好ましくは、Ｄ体：Ｌ体＝２５：７５〜７５：２５、より好ましくはＤ体：Ｌ体＝５０：５０（ラセミ体）である。
【００７０】
本発明によれば、上記活性を有する酵素活性物質の混在下、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が析出した反応液から、溶解工程を経て、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が回収される。回収された光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は、脱色、再結晶等の操作を必要とせずに、高純度の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を単離することができる。本発明において、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の溶解方法は限定されない。
【００７１】
たとえば、反応液に一部析出した状態の光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を、酸性条件下で溶解することができる。溶解のためのｐＨは、通常ｐＨ０．１〜２．５、好ましくはｐＨ０．２〜ｐＨ２．０、より好ましくはｐＨ０．４〜１．５の範囲から選択することができる。ｐＨは、酸を添加することによって調整することができる。ｐＨの調整には、任意の酸を利用することができる。たとえば、硫酸、塩酸、リン酸等の鉱酸は、本発明におけるｐＨの調整に有用である。本発明において、酸性条件による光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の溶解は、好ましい態様である。
【００７２】
ｐＨは、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の種類と量、溶媒の温度、あるいは溶媒の種類などの条件に応じて適宜選択することができる。光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の溶解が不十分な場合には、回収率が低下する場合がある。一方、過剰な酸の添加は、中和晶析の過程で不必要な無機塩を生じる原因となる。多量の無機塩は、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の精製を妨げる可能性がある。したがって、本発明において、酸性条件下で光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する場合には、目的とする化合物の種類と量に応じて、適切なｐＨを選択するのが望ましい。
【００７３】
また、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸をアルカリ化によって溶解することもできる。ただし酵素活性物質として微生物の菌体を用いた場合には、ｐＨをアルカリ性側にすることで、溶菌が誘導されることがある。溶菌によって反応液中に溶出した微生物菌体の内容物を、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸から取り除くのは困難な場合が多い。したがって、反応液中に微生物菌体が存在する状態で反応液をアルカリ性にすることは避けるのが好ましい。
【００７４】
一方、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を溶解するための温度条件としては、通常３０℃〜８０℃、好ましくは４０℃〜７０℃、より好ましくは４０℃〜６０℃を示すことができる。一般に、温度が高いほど溶解性は高まる。しかし、高温で処理すると、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が分解される、あるいはラセミ化することがある。
【００７５】
更に、ｐＨを維持したまま、加温によって析出した光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が溶解する場合には、加温操作によって目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を溶解することもできる。
【００７６】
したがって、たとえば、一般的な緩衝液中に析出した光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を十分に溶解して、高純度で回収するための具体的な条件としては、たとえば次のような条件を示すことができる。
温度：４０℃−７０℃
ｐＨ：０．２−２．０
【００７７】
本発明において、溶解のための時間は限定されない。与えられた条件において、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が十分に溶解したところで溶解工程を終了することができる。例えば先に示したような条件を与えた場合、２〜７２時間、好ましくは、４〜４８時間、より好ましくは、６〜２４時間で、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を十分に溶解することができる。また、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の溶解を促進するためには攪拌下で行うことがより好ましい。
【００７８】
本発明において、溶解すべき光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を含む反応液には、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の他に、酵素活性物質が存在していても良い。更に、酵素活性物質による反応の促進あるいは維持に有用な種々の添加物の共存をも許容される。このような添加物には、たとえば次のようなものが用いられる。
酵素活性を増強するための添加剤、
酵素活性を安定化させるための添加剤、
反応液の流動性を維持または増強させるための添加剤
【００７９】
例えば、酵素活性の増強あるいは維持のために、補酵素の添加は有効である。先に例示したL-フェニルセリンアルドラーゼは、補酵素であるＰＬＰを添加することにより、その酵素活性が増強される。
【００８０】
したがって、酵素活性物質による反応が終了した反応液を、酵素活性物質などを含んだまま、本発明による製造方法に用いることができる。あるいは、反応液中に析出した光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を含む固形分を一旦分離して、水中に再分散したものを対象として、本発明の溶解工程を実施することもできる。反応液中の固形分は、遠心分離あるいは膜濾過によって分離することができる。
【００８１】
本発明において、溶解された光学活性β-ヒドロキシアミノ酸は、酵素活性物質の除去工程を経て光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の水溶液とされる。酵素活性物質を除去する方法は限定されない。例えば、微生物菌体からなる酵素活性物質は、遠心分離や膜濾過によって除去することができる。
本発明によって得られた光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の水溶液からは、晶析などの方法によって目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を精製することができる。たとえば、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を酸性で溶解した場合には、アルカリを添加することによる中和晶析によって、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の結晶を取得することができる。中和晶析に使用するアルカリ塩は限定されない。
【００８２】
一般に、酸性条件を利用する中和晶析においては、酸との反応によって不溶性の塩を生成しないアルカリ塩の使用が推奨される。例えば、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムなどを用いることができる。中和晶析するｐＨは、目的とする光学活性β-ヒドロキシアミノ酸が結晶として得られるｐＨの範囲から選択される。具体的には、たとえばｐＨ２．５〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ４．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ５．０〜７．０である。
【００８３】
本発明において、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸を加温によって溶解した場合には、酵素活性物質を除去した後に、回収された水溶液の温度を下げることにより、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の結晶を得ることができる。
晶析によって得られた、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の結晶は、遠心分離、あるいは膜濾過によって回収することができる。
【００８４】
アルドラーゼによる反応の場合のグリシン等、反応により生じた不純物は水または水とメタノールなどの親水性有機溶媒の混合液を用いて結晶を洗浄すること等により効果的に除去することができる。また、反応により生じたアルデヒドは、アルデヒドの溶解性が高く、光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の溶解性が低い有機溶媒等を用いて結晶を洗浄すること等により除去することができる。上記有機溶媒としては、イソプロピルアルコール、メタノール、アルコール等が挙げられる。
【００８５】
あるいは水に対する溶解度が低い有機溶媒を用いて除菌工程前あるいは晶析工程前に抽出することができる。抽出のための有機溶媒としては、トルエン、ヘキサン、酢酸エチル、ｔ−メチルブチルエーテル等が挙げられる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下に示す「％」は、いずれも「原料または生産物の重量／反応液の重量(w/w)」を意味する。
e.e.は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-エリスロ体の濃度］−［L-エリスロ体の濃度］）
／（［D-エリスロ体の濃度］＋［L-エリスロ体の濃度］）） ｘ １００
【００８７】
同様に、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合には、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-スレオ体の濃度］−［L-スレオ体の濃度］）
／（［D-スレオ体の濃度］＋［Ｌ−スレオ体の濃度］）） ｘ １００
【００８８】
また、d.e.は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合には、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-エリスロ体の濃度］＋［L-エリスロ体の濃度］−［D-スレオ体の濃度］−［L-スレオ体の濃度］）/（［D-エリスロ体の濃度］＋［L-エリスロ体の濃度］＋［D-スレオ体の濃度］＋［L-スレオ体の濃度］）） ｘ １００
【００８９】
同様に、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合には、次の式で表される数値を意味する。
（（［D-スレオ体の濃度］＋［L-スレオ体の濃度］−［D-エリスロ体の濃度］−［L-エリスロ体の濃度］）／（［D-スレオ体の濃度］＋［L-スレオ体の濃度］＋［D-エリスロ体の濃度］＋［L-エリスロ体の濃度］）） ｘ １００
【００９０】
DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、およびDまたはL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸は、下記の「分析方法―１」の方法によって定量的に分析した。また、D−エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度は、「分析方法―２」の方法によって分析した。
【００９１】
分析方法−１  （DLまたはDまたはL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の定量分析方法）
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ II ５Ｃ１８ ＨＧ（φ４．６ mm×２５０ mm）
温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ nm
流速：１．０ mL/min
溶媒：５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）/アセトニトリル＝９５/５
【００９２】
分析方法−２  （D−エリスロ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の光学純度分析方法）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（φ４．６  mm×２５０  mm）
温度：２５℃
検出：ＵＶ２１０  nm
流速：１．０  mL/min
溶媒：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
【００９３】
（実施例１）  シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株 (Pseudomonas putida biovar A ２４−１)由来L-フェニルセリンアルドラーゼを発現する菌体懸濁液の調製
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株 (Pseudomonas putida biovar A ２４−１)由来L-フェニルセリンアルドラーゼを発現するプラスミドpKK-PSA1（FERM P-20054）を保持する大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）をアンピシリン（５０ μｇ/ｍＬ）を含むLB培地（１％バクト-トリプトン、０．５％バクト-酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で培養し、０．１ mM IPTGで目的遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌して大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を得た。
【００９４】
（実施例２）エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の光学純度分析
反応液０．０５ｇをサンプリングし、５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．８）０．５mLを添加して懸濁し、遠心分離して得た上清に、メタノール０．５mLと無水N−ターシャリーブトキシカルボニル０．０１ｇを加えて30℃で１時間反応させた。その後、反応液に５％硫酸水素カリウム水溶液０．４mLを加え、酢酸エチル２．０mLで抽出した。有機層を乾固させ、ヘキサン／エタノール＝90／10の溶媒に溶解し、分析方法−２で測定した。
【００９５】
（比較例１）
実施例１で得られた大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
【００９６】
50 μM PLP、７％ DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸ナトリウム（Ｄ−ＡＣＨＰ・Ｎａ）および菌体を含む４５７ ｇの反応液をｐＨ８．５に調整し、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD−ＡＣＨＰの光学純度分析を実施例２に記載の方法によって分析した。光学純度を分析した結果、９７．１％e.e.（Ｄ−エリスロ体）、９３．７％d.e.（エリスロ体）であった。反応を終了した反応液からD−ＡＣＨＰを精製した。
【００９７】
反応を終了した反応液に、硫酸を添加してｐＨ０．５に調整した後、２５℃で１０分間程度放置した。次に、その溶液を遠心分離によって除菌し、上清を回収した。この上清には２１．９％の回収率でＤ−ＡＣＨＰを溶解させることができた。ここでの回収率とは、反応液中の生産物がどの程度溶解しているかを表し、以下のように算出した。
回収率(%) = [遠心分離によって得られた上清中に溶解しているACHP量]／[反応終了時に液中に存在するACHPの量]
なお、反応終了時に液中に存在するACHPは、サンプリングした反応液を等量の1N NaOHで懸濁して溶解し、それを遠心分離した上清を試料として分析方法−１の方法によって定量した。
【００９８】
酸処理室温放置の前後で、光学純度の低下は認められなかった。得た上清を２５％ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．０に調整し、中和晶析を行った。その後、晶析液を５C濾紙で濾過した。得られた濾さいを冷水、冷イソプロピルアルコールでリンスしてＤ−ＡＣＨＰの湿結晶４．９２ｇが得られた。湿結晶を減圧下乾燥し、白色のＤ−ＡＣＨＰの結晶３．２５ｇ（純度９０．８％、９９．４％e.e.（D−エリスロ体）、９７．３％d.e.（エリスロ体）、一貫単離収率１０．３％）を得た。
【００９９】
（比較例２）
実施例１で得られた大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、50 μM PLP、６％ DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸ナトリウム（Ｄ−ＡＣＨＰ・Ｎａ）および菌体を含む４０ ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したＤ−ＡＣＨＰの光学純度分析を実施例２に記載の方法によって分析した。光学純度を分析した結果、９４．２％e.e.（Ｄ−エリスロ体）、９４．２％d.e.（エリスロ体）であった。この反応液からＤ−ＡＣＨＰを精製した。
【０１００】
反応を終了後の反応液に、硫酸を添加してｐＨ３．０に調整した後、９５℃に昇温し、攪拌しながら６時間加熱処理した。次に、酸処理及び加熱処理が終了した溶液を遠心分離によって除菌した。光学純度分析の結果、加熱前は９３．９％e.e.（Ｄ−エリスロ体）、９５．５％d.e.（エリスロ体）であったものが、加熱後は９１．７％e.e.（Ｄ−エリスロ体）、８３．７％d.e.（エリスロ体）に低下し、９５℃での加熱によって顕著な光学純度の低下が認められた。
【０１０１】
（実施例３）
実施例１で得られた大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
５０ mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、50 μM PLP、６％ DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸ナトリウム（Ｄ−ＡＣＨＰ・Ｎａ）および菌体を含む１０ ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したＤ−ＡＣＨＰの光学純度分析を実施例２に記載の方法によって分析した。光学純度を分析した結果、９８．８％e.e.（D-エリスロ体）、９２．０％d.e.（エリスロ体）であった。
【０１０２】
反応終了後の反応液を５ ｇずつに等分し、それぞれ、硫酸を添加してｐＨ０．５に調整した後、２５℃及び５０℃で攪拌した。各温度で攪拌による生成物の溶解の程度を図１に示す。
【０１０３】
５０℃で攪拌したものは、５時間でほぼ１００％の回収率でＤ−ＡＣＨＰを溶解させることができたが、２５℃で攪拌したものは２４時間後も約８０％の回収率でしかＤ−ＡＣＨＰを溶解させることができなかった。ここで回収率とは、反応液中の生成物がどの程度溶解しているかを表し、以下のように算出した。
【０１０４】
回収率(%) = [遠心分離によって得られた上清中に溶解しているACHP量]／[反応終了時に液中に存在するACHPの量]
なお、反応終了時に液中に存在するACHPは、サンプリングした反応液を等量の1N NaOHで懸濁して溶解し、それを遠心分離した上清を試料として分析方法−１の方法によって定量した。
【０１０５】
（実施例４）
実施例１で得られた大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を用いてD−エリスロ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
５０ mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、50 μM PLP、６％ DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸ナトリウム（Ｄ−ＡＣＨＰ・Ｎａ）および菌体を含む１０ ｇの反応液を攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したＤ−ＡＣＨＰの光学純度分析を実施例２に記載の方法によって分析した。光学純度を分析した結果、９３．４％e.e.（D-エリスロ体）、９２．５％d.e.（エリスロ体）であった。この反応液からＤ−ＡＣＨＰを精製した。
【０１０６】
反応終了後の反応液に、硫酸を添加してｐＨ０．５に調整した後、５０℃に昇温し、攪拌しながら５時間加熱した。次に、その溶液を遠心分離によって除菌し、上清を回収した。この上清には９３．９％の回収率でＤ−ＡＣＨＰを溶解させることができた。ここで回収率とは、反応液中の生産物がどの程度溶解しているかを表し、以下のように算出した。
【０１０７】
回収率(%) = [遠心分離によって得られた上清中に溶解しているACHP量]／[反応終了時に液中に存在するACHPの量]
なお、反応終了時に液中に存在するACHPは、サンプリングした反応液を等量の1N NaOHで懸濁して溶解し、それを遠心分離した上清を試料として分析方法−１の方法によって定量した。
【０１０８】
酸処理及び加熱処理の前後で、光学純度の低下は認められなかった。得た上清を２５％ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．０に調整し、中和晶析を行った。その後、晶析液を５C濾紙で濾過した。得られた濾さいを冷水、冷イソプロピルアルコールでリンスしてＤ−ＡＣＨＰの湿結晶０．４４ｇが得られた。湿結晶を減圧下乾燥し、白色のＤ−ＡＣＨＰの結晶０．２７ｇ（純度９０．６％、９７．９％e.e.（D−エリスロ体）、９６．０％d.e.（エリスロ体）、一貫単離収率４５．５％）を得た。
【０１０９】
（実施例５）
実施例１で得られた大腸菌HB101株（HB101 (pKK-PSA1)）の菌体を用いてD−エリスロ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
50 μM PLP、６％ DL-エリスロ2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸ナトリウム（Ｄ−ＡＣＨＰ・Ｎａ）および菌体を含む７０ ｇの反応液をｐＨ８．０に調整し、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したＤ−ＡＣＨＰの光学純度分析を実施例２に記載の方法によって分析した。光学純度を分析した結果、９８．１％e.e.（Ｄ−エリスロ体）、９４．２％d.e.（エリスロ体）であった。この反応液からＤ−ＡＣＨＰを精製した。
【０１１０】
反応終了後の反応液に、濃硫酸を添加してｐＨ０．９に調整した後、５０℃に昇温し、攪拌しながら２４時間加熱した。次に、酸処理及び加熱処理が終了した溶液を遠心分離によって除菌し、上清を回収した。この上清には９８．８％の回収率でＤ−ＡＣＨＰを溶解させることができた。ここでの回収率とは、反応液中の生産物がどの程度溶解しているかを表し、以下のように算出した。
【０１１１】
回収率(%) = [遠心分離によって得られた上清中に溶解しているACHP量]／[反応終了時に液中に存在するACHPの量]
なお、反応終了時に液中に存在するACHPは、サンプリングした反応液を等量の1N NaOHで懸濁して溶解し、それを遠心分離した上清を試料として分析方法−１の方法によって定量した。
【０１１２】
酸処理及び加熱処理の前後で、光学純度の低下は認められなかった。得た上清を、２５％ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．０に調整し、中和晶析を行った。その後、晶析液を５Ｃ濾紙で濾過した。得られた濾さいを冷水、冷イソプロピルアルコールでリンスしてＤ−ＡＣＨＰの湿結晶３１．７７ｇが得られた。湿結晶を減圧下乾燥し、白色のＤ−ＡＣＨＰの結晶１．４７ｇ（純度９９．９％、９９．８％e.e.（D−エリスロ体）、９８．２％d.e.（エリスロ体）、一貫単離収率３９．２％）を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】各温度における、攪拌による生成物の溶解の程度を示す。図中、縦軸は回収率(%)を、横軸は攪拌時間（時間/hr）を示す。
【図１】
2006115726.tif 000006
【配列表】
2006115726000001.app