(57)【要約】      （修正有）【課題】良質穀粒に対する他の品種の混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定する方法及び技術を提供する。【解決手段】穀粒に他の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を用いて判別するに際し、対象品種では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現するネガティブバンド識別用分子マーカーを用いることを特徴とする穀類のＤＮＡ品種判別方法、ならびに対象品種のみに選択的に識別バンドが発現し、他の品種では、発現しないポジティブバンド識別用分子マーカーを含むことを特徴とする穀類のＤＮＡ品種判別用手法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米試料に他の品種が混合しているか否かを、当該米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を用いて判別するに際し、対象品種では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現するネガティブバンド識別用分子マーカーを用いることを特徴とする水稲のＤＮＡ品種判別方法。
【請求項２】
米試料が目的とする品種であるか否かを、当該米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を用いて判別するに際し、対象品種のみに識別バンドを選択的に発現するポジティブバンド識別用分子マーカーを用いることを特徴とする水稲のＤＮＡ品種判別方法。
【請求項３】
ＤＮＡ品種判別方法において、ネガティブバンド識別用分子マーカーを用いても識別バンドが発現しなかった場合において、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用分子マーカーおよび／または対象品種のみに特異的に発現しないネガティブバンド識別用分子マーカーを用いて、第２次のＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡ断片によって対象品種であることを定性的に確認することを特徴とする水稲のＤＮＡ品種判別方法。
【請求項４】
請求項１〜３記載の米試料のＤＮＡ品種判別方法において、ネガティブバンド識別用分子マーカーを用いて識別バンドが発現した場合において、試料米各１粒ずつから抽出したＤＮＡを鋳型として、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用分子マーカーおよび／または対象品種のみに特異的に発現しないネガティブバンド識別用分子マーカーを用いて、ＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡ断片の有無により、対象品種が混入された混合品種を定量的に確認することを特徴とする水稲のＤＮＡ品種判別方法。
【請求項５】
「彩のかがやき」、「コシヒカリ」、「キヌヒカリ」、「朝の光」、「ゆみみのり」、「あかね空」、「日本晴」、「アキニシキ」、「ひとめぼれ」、「月の光」、「ヒノヒカリ」のいずれかである請求項１〜４記載の米試料のＤＮＡ品種判別方法。
【請求項６】
品種間の識別性の高い識別バンドより選択された識別バンドから抽出されたＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側から設計された分子マーカーを用いて、米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行い、品種間の識別性の現れるバンドのみを増幅させ、電気泳動により検出することを特徴とする米試料の品種判別方法。
【請求項７】
「彩のかがやき」のみを識別するＴ８６ｐｆおよびＴ８６ｐｒからなる対合プライマーで構成されるポジティブプライマーセットおよび「彩のかがやき」以外を識別するＴ８６ｐｆおよびＴ８６ｐｒからなる対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマーセットを用いるＰＣＲ法により行う請求項１〜５のいずれかに記載の水稲のＤＮＡ品種判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、埼玉県育成の水稲品種「彩のかがやき」への他の品種の混合の有無および混合された品種の判定を行うためのＤＮＡ品種判別方法に関し、詳しくは籾、玄米、精米、米飯等の米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、選定した適正な分子マーカーの存在下にＰＣＲを行うことによって、増幅したＤＮＡ断片から品種混合の有無および混合された品種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】改正ＪＡＳ法のもと、米の包装での品種、産地、産年の表示が義務づけられている。農産物の虚偽表示など食に対する消費者の不安感や、農薬を削減した安心で安全な食の確保への関心が高まっており、消費者の信頼を獲得し続けることは、水田営農に関する施策の中でも最も重要な項目の一つである。【０００３】「米政策大綱」のもと、新たな需給調整システムが導入され、産地毎に売れた米の量に基づいて翌年の生産量が決定され、「売れない」米産地は米づくりから撤退を余儀なくされる。【０００４】農業が経営として成り立つためには売れる米をどれだけ確保できるかが重要である。【０００５】埼玉県では、埼玉県育成の良食味で減農薬栽培に有効な複数の病害虫に抵抗性を有する「彩のかがやき」を奨励しており、消費者の求める安心で安全な「売れる米づくり」を定着，推進しており、消費者が買った米が間違えなく、安心で安全な「彩のかがやき」であるかを明らかにする必要がある。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】しかしながら、稲および米の品種判別には、従来は稲植物体の形、葉の色、玄米の粒型、酵素活性の多型（アイソザイムパターン）などが用いられてきたが、精米あるいは精米粉の持つ情報のみによって、類似品種間の識別を行うことは困難であるため、科学的な裏付けを提示することが必須で、種子生産から米消費に至る一貫した検査機能を充実させることが不可欠の要件である。
【０００７】本発明は、埼玉県育成の水稲品種「彩のかがやき」の良質穀粒に対する他の品種の混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定する方法を提供することを目的としている。
【０００８】そのために、個人識別などで利用されている遺伝子診断技術を使って品種の判別技術を開発し、「彩のかがやき」のみに特異的なＤＮＡ断片を増幅するオリゴヌクレオチド（「彩のかがやき」ポジティブプライマー）、「彩のかがやき」以外の品種に特異的なＤＮＡ断片を増幅するオリゴヌクレオチド（「彩のかがやき」ネガティブプライマー）およびその利用方法を提供しようとしている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】上記した目的を達成するために本発明は、「彩のかがやき」を間接的に識別できるように２種１組で用いられるオリゴヌクレオチドであって、「彩のかがやき」ポジティブプライマーセット；Ｔ８６ｐｆ（５’−ＴＣＧＴＡＣＡＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣ−３’）とＴ８６ｐｒ（５’−ＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣ−３’）。「彩のかがやき」ネガティブプライマーセット；Ｔ８６ｎｆ（５’−ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧ−３’）とｔ８６ｎｒ（５’−ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧ−３’）の塩基配列を有することを特徴とする。
【００１０】詳しくは、Ｔ８６ｐｆ（５’−ＴＣＧＴＡＣＡＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣ−３’）とＴ８６ｐｒ（５’−ＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、「彩のかがやき」のみに特異的な２５３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【００１１】Ｔ８６ｎｆ（５’−ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧ−３’）とｔ８６ｎｒ（５’−ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧ−３’）の塩基配列を有するプライマーセットは、「彩のかがやき」以外の品種に特異的な９７０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するときに用いられる。
【００１２】本発明を実施する方法では、上記第１種および第２種のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、上記のとおりの塩基配列を有する１９から２１塩基よりなるオリゴヌクレオチドであって、該２種のオリゴヌクレオチドは、上記米試料からゲノミックＤＮＡを抽出し、鋳型としてＰＣＲ反応（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）を行う際に、上記のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、各米試料の増幅ＤＮＡパターンを電気泳動法によって調べ、その泳動パターンにより特定の米試料を検出することによるものである。
【００１３】米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行うに際し、対象の品種には現れずに他の品種のみに特有に現れるネガティブバンド識別用分子マーカーを用いて第１次のＰＣＲを行い、発現したＤＮＡ断片によっては、試料が対象品種であるかを確認し、さらには品種混合の有無および混合された品種の同定を簡易迅速、かつ正確に行うことができるものである。
【００１４】上記のＤＮＡ品種判別方法において、ネガティブバンド識別用分子マーカーを用いても識別バンドが発現しなかった場合において、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用分子マーカーを用いてＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡ断片によって対象品種であることを確認することを特徴とするＤＮＡ品種判別方法である。
【００１５】本発明において、上記米試料のゲノミックＤＮＡを抽出精製する方法としてはＳＤＳ／酢酸カリウム法を用いた。
【００１６】上記ＰＣＲ法は通常行われる方法で実施するが、本発明ではウイリアムズらの方法によって、反応混液を調製し、サーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ社）またはＴＰ６００（タカラバイオ社）等を用いて、ＤＮＡの増幅を行ったが、これに限定されるものでなく、ウイリアムズ方法の改変、その他の方法で行うことも可能である。
【００１７】上記増幅ＤＮＡの検出には、本発明では、上述のＰＣＲ反応液に泳動用色素液を加え、電気泳動装置を用い、１００Ｖで４０分間通電し、泳動終了後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液に２０分間浸漬して行った。泳動用バッファーとしてはＴＡＥ緩衝液を用い、又、ゲルは２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社、タイプＩ）をＴＡＥ緩衝液に溶解して作製した。写真撮影は、上述のエチジウムブロマイド染色したゲルを軽く水洗し、透過型紫外線照明装置の上に置き、紫外線を当てて撮影する。しかしながら、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。
【作用】
【００１８】米試料について、プライマーセットを用いてＤＮＡの増幅を行い、米品種に特異的なＤＮＡ断片の有無を電気泳動により検出し、識別を行うことができる。
【００１９】上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、米試料から抽出されたゲノムＤＮＡより「彩のかがやき」に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（Ｔ８６ｐプライマーセット）である。
５’−ＴＣＧＴＡＣＡＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＣ−３’および５’−ＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣ−３’
【００２０】また、上記分子マーカーは、ＰＣＲ反応において、米試料から抽出されたゲノムＤＮＡより「彩のかがやき」以外の品種に特異的なＤＮＡ断片を増幅するときに用いられ、以下の塩基配列からなる２種１組のオリゴヌクレオチド（Ｔ８６ｎプライマーセット）である。
５’−ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧ−３’および５’−ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧ−３’
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】以下、本発明の実施例を添付の図面を参照して具体的に説明する。【００２２】本発明は、品種間の識別性の高い識別バンドを増幅させるように設計された分子マーカーを用いて、米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行い、品種間の識別性の現れるＤＮＡ断片のみを増幅させ、電気泳動により検出することを特徴とする米試料の品種判別方法である。【００２３】これらの米試料は、適当な粉砕機器、例えばミル、ペンチ、乳鉢等によって粉砕して粉末試料とした後、以下の検出操作に供される。【００２４】＜ＤＮＡ抽出法＞米試料からＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法等を挙げることができる。しかし、有機溶媒を使用するため、廃液処理が問題となる。そのため、ＳＤＳ／酢酸カリウム法を用いるのが好ましい。
■例えば、薬包紙に挟んだ米をペンチで潰し、１．５ｍｌチューブに入れ、抽出用緩衝液（５０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）０．５ｍｌを添加し、軽く撹拌し、６７μｌの１０％ＳＤＳを添加する。
■室温に３０分間、放置する。
■６５℃で１０分間処理後、５Ｍ酢酸カリウム液１６０μｌを加えて混合し、１４，０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清４００μｌを回収する。
■イソプロパノール２００μｌを加え、１４，０００ｒｐｍ，１０分間遠心する。
■沈殿に７０％エタノール２５０μｌを添加し、１４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、洗浄する。
■５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス酢酸ｐＨ８．０及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して精製ＤＮＡとする。
■種子に含まれている大量のアミロースが、ＤＮＡ抽出を邪魔するため、アミラーゼで処理する方法もあるが、今回のＳＤＳ／酢酸カリウム法では、アミラーゼ処理することなしに、ＤＮＡの抽出が可能であり、操作時間の短縮となる。【００２５】＜ＰＣＲ反応：ポジティブプライマーセットの場合＞精製ＤＮＡの１０倍希釈液２．５μｌ，１０倍濃度ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）１．５μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（タカラバイオ社）１．２μｌ，５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ（タカラバイオ）０．０７５μｌ，１０ｐｍｏｌｅ／μｌ各プライマー（キアゲン社）０．７５μｌ，滅菌水８．２２５μｌを加えて１５．０μｌとした。【００２６】以上の反応混液を、ＴＰ６００（タカラバイオ社）を用いて、９４℃４分、（９４℃３０秒、５０℃１５秒、７２℃１分）を４５サイクル、７２℃５分間処理し、増幅したＤＮＡ断片を得る。上記したＰＣＲ反応に必要とした時間は、約２時間半であった。【００２７】＜ＰＣＲ反応：ネガティブプライマーセットの場合＞精製ＤＮＡの１０倍希釈液２．５μｌ，１０倍濃度ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）１．５μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（タカラバイオ社）０．２５μｌ，５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）０．０７５μｌ，１０ｐｍｏｌｅ／μｌ各プライマー（キアゲン社）０．７５μｌ，滅菌水９．１７５μｌを加えて１５．０μｌとした。【００２８】以上の反応混液を、ＴＰ６００（タカラバイオ社）を用いて、９４℃４分、（９４℃３０秒、６０℃１５秒、７２℃１分）を４５サイクル、７２℃５分間処理し、増幅したＤＮＡ断片を得る。上記したＰＣＲ反応に必要とした時間は、約２時間半であった。【００２９】＜増幅ＤＮＡの検出＞電気泳動用ゲルは２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社製タイプＩ）を使用した。０．４２ｇのアガロースを３０ｍｌのＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス酢酸ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、５．９ｃｍ×１０．７ｃｍ×０．５ｃｍのゲルを作製する。泳動用緩衝液としてはＴＡＥ緩衝液を使用した。【００３０】ＰＣＲ反応液５μｌに色素液２μｌを加えて試料とし、これを電気泳動装置ｍｕｐｉｄ（コスモバイオ社）を使用して１００Ｖで約４０分間泳動を行った。染色は泳動後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液に２０分間浸漬して行った。【００３１】＜写真撮影＞エチジウムブロマイド染色後、軽く水洗したゲルを透過型紫外線照明装置トランスイルミネーター（フナコシ社）の上におき、シャッタースピード１／１秒、絞り１１で撮影した。フイルムはポラロイドフイルムタイプ６６７、カメラ装置はＭＰ−４ランド・カメラ（ポラロイド社）、フイルターは赤色フイルターＭＣ−Ｒ１（ケンコー社）を使用した。結果を図１、図２、図３、図４および図５に示す。【００３２】＜試験結果＞【００３３】＜ＲＡＰＤプライマーの一次選択＞「彩のかがやき」および埼玉県の平成１５年度における作付け上位品種である９品種（「コシヒカリ」，「キヌヒカリ」，「朝の光」，「ゆめみのり」，「あかね空」，「日本晴」，「アキニシキ」，「ひとめぼれ」，「月の光」）の１０品種（ほぼ１００％の作付け）の玄米１粒からＤＮＡを抽出した。【００３４】ＤＮＡを適正なランダムプライマーの存在下でＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡの分子量の相違を電気泳動によって検出する技術（ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｏｄ）法による判別技術）を用いて、増幅したＤＮＡの多数の泳動バンドのうちから、識別性のあるバンドを選別する。【００３５】ＲＡＰＤ法は、２５種類のＡｒｂｉｔｒａｙ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ａ−Ａ０１〜Ａ−Ａ２５）（ニッポンジーン社）を用いてマニュアルにしたがって実施した。ＲＡＰＤ反応液１０μｌを２．０％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡ断片を観察した。【００３６】まず、「彩のかがやき」および「コシヒカリ」の２品種を用いてＲＡＰＤ法を実施し、２５種類中８種類のＲＡＰＤプライマー（Ａ０１，Ａ０３，Ａ０７，Ａ０８，Ａ２１，Ａ２４，Ａ２５）で「彩のかがやき」に特異的な断片が、２５種類中１種類のプライマー（Ａ０８）で「彩のかがやき」に非特異的な断片が認められる（図１）。【００３７】＜ＲＡＰＤプライマーの二次選択＞８種類のＲＡＰＤプライマー（Ａ０１，Ａ０３，Ａ０８，Ａ１２，Ａ１８，Ａ２１，Ａ２４，Ａ２５）について、さらに「キヌヒカリ」，「朝の光」を追加してＲＡＰＤプライマーの絞り込みを行い、４種類のＲＡＰＤプライマー（Ａ０１，Ａ０８，Ａ１８，Ａ２５）が有望である（図２）。【００３８】有望な各バンドは次の通りである。【００３９】（１）識別バンドＡ０１（約５６０ｂｐ）
このバンドは、「彩のかがやき」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」，「キヌヒカリ」および「朝の光」では見られない。【００４０】（２）識別バンドＡ０８（約９５０ｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」，「キヌヒカリ」および「朝の光」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「彩のかがやき」では見られない。【００４１】（３）識別バンドＡ１８（約４００ｂｐ）
このバンドは、「彩のかがやき」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」，「キヌヒカリ」および「朝の光」では見られない。【００４２】（４）識別バンドＡ２５（約２７０ｂｐ）
このバンドは、「彩のかがやき」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」，「キヌヒカリ」および「朝の光」では見られない。【００４３】＜ＲＡＰＤプライマーの遺伝子解析＞それぞれのＲＡＰＤプライマーは特異的な断片以外の断片が現れているため、このようにして検出された品種間の識別性の現れたＤＮＡ断片から、次のようにして一対の対合プライマーを作製する。すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出、回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増殖し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。【００４４】決定された塩基配列から、対合プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型である米試料由来のＤＮＡのうちのランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さとを有する米の品種判定に有用な分子マーカーを設計することができる。【００４５】「彩のかがやき」にのみ特異的なプライマー（ポジティブプライマー）および「彩のかがやき」以外に特異的なプライマー（ネガティブプライマー）を作製する。【００４６】分子マーカーを選定することにより、最初のＰＣＲにおいてランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、第２次のＰＣＲにおいては、品種識別に有用な識別用ＤＮＡ断片となる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。【００４７】これらの分子マーカーは、上記したような一連の手順により、すなわち米試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたＰＣＲにより品種間の識別性の現れるバンドを切り出して、クローニング、シークエンスして識別部分のＤＮＡ塩基配列を決定し、その配列と予想Ｔｍに基づいて本発明者が設計したものである。【００４８】本発明では、このような分子マーカーを用いて、先に抽出した鋳型ＤＮＡと共にＰＣＲ法を行う。分子マーカーを選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別用分子マーカーとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。その結果、本発明の目的とする米の品種判別が可能となる。【００４９】＜開発したプライマー群の検討＞
作製したＲＡＰＤプライマー（Ａ０１，Ａ０８，Ａ１８，Ａ２５）から有望なＤＮＡ断片の塩基配列結果からの数種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、有望なプライマーセットを選抜する（図３）。【００５０】＜「彩のかがやき」ポジティブプライマー＞
「彩のかがやき」ポジティブプライマーを用いて、１０品種でＰＣＲを行った結果、「彩のかがやき」にのみＤＮＡ断片が認められ、「彩のかがやき」の検出に有効である（図４）。【００５１】＜「彩のかがやき」ネガティブプライマー＞
「彩のかがやき」以外の９品種に陽性となる「彩のかがやき」ネガティブプライマーを用いて、１０品種でＰＣＲを行った結果、「彩のかがやき」以外にＤＮＡ断片が認められ、「彩のかがやき」以外の検出に有効である（図５）。【００５２】本発明において、対象品種のみに特異的に発現するポジティブプライマーセットとは、対象品種のみに発現する特異的なＤＮＡ断片であり、対象品種である「彩のかがやき」に独自のＤＮＡ断片を示すものである。また、対象品種のみに発現しないネガティブプライマーセットとは、「彩のかがやき」以外の上記対象品種に特異的なＤＮＡ断を示すものである。【００５３】＜品種判別技術の利用方法＞【００５４】＜１  定性試験＞無作為に２０粒の米試料を選び、ＤＮＡを抽出し、「彩のかがやき」ポジティブプライマーおよび「彩のかがやき」ネガティブプライマーを用いてＰＣＲで検定する。ポジティブプライマーで陽性、かつネガティブプライマーで陰性の場合、１００％「彩のかがやき」と判定できる。ポジティブプライマーで陽性または陰性、かつネガティブプライマーで陰性の場合、「彩のかがやき」以外の混種の疑いがある（図６）。【００５５】＜２  定量試験＞混種の疑いがある場合、無作為に２０粒の米試料を選び、ＤＮＡを抽出し、１粒ずつ「彩のかがやき」ポジティブプライマーおよび「彩のかがやき」ネガティブプライマーを用いてＰＣＲで検定し、混種の確認および混種割合を判別する（図６）。【００５６】図１において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
コは、「コシヒカリ」，かは、「彩のかがやき」，Ｍは、分子量マーカー，Ａ０１〜Ａ２５は、
2006345843.tif 000003
な断片である。【００５７】図２において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、「朝の光」，かは、「彩のかがやき」，Ｍは、分子量マーカー，Ａ０１〜Ａ２５は、使用したＲＡＰＤプライマー，２．０％（Ｗ／
2006345843.tif 000004
【００５８】図３において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
コは、「コシヒカリ」、かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカー，▲１▼〜▲４▼は、ＲＡＰＤプライマーＡ０１、Ａ０８、Ａ１８およびＡ２５をクローニングして得られた遺伝子配列から作製したプライマーセットの一部，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。【００５９】図４において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、：「朝の光」，ゆは、「ゆめみのり」，あは、：「あかね空」，日は、「日本晴」，アは、「アキニシキ」，ひは、「ひとめぼれ」，月は、「月の光」，かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカー，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。【００６０】図５において、各レーンに対する説明は、以下の通りである。
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、：「朝の光」，ゆは、「ゆめみのり」，あは、：「あかね空」，日は、「日本晴」，アは、「アキニシキ」，ひは、「ひとめぼれ」，月は、「月の光」，かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカー，２．０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル使用である。
【発明の効果】
【００６１】本発明によれば、米試料に他の品種が混合していることを、抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを用いて判別するすることができ、かつ混入しいる品種を識別することができる。すなわち、第１次ＰＣＲによって、簡易迅速に品種混合の有無を判定することができ、少量でも他の品種が混合していれば、判別できる。さらに、第２次ＰＣＲによって、当該混合品種を同定することができる。
【００６２】特に、本発明では識別性の高い分子マーカーによるＰＣＲを行うために、目的とする識別バンド以外のバンドが消失し、たとえば対象が「コシヒカリ」系統のような近縁種の場合にも、正確な品種判別が可能である。しかも、品種判別を短時間、かつ低コストで実施することができる。
【００６３】したがって、生産者等が簡易に米のトレーサビリティを行える技術が確立され、種子や出荷の生産物を各段階で迅速に判別することが可能となり、生産者が自信を持って、消費者等に安心で安全な県農産物を供給することができる。
【００６４】生産物、流通物を各段階で容易に判別することが可能となり、消費者への正確な情報提供ルートを整備することによって、消費者の食に対する信頼を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２５種類のＲＡＰＤプライマーの一次選抜の電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
【符号の説明】
コは、「コシヒカリ」，かは、「彩のかがやき」，Ｍは、分子量マーカー，Ａ０１〜Ａ２５は、
2006345843.tif 000005
【図２】
ＲＡＰＤプライマーの二次選抜の電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、「朝の光」，かは、「彩のかがやき」，Ｍ
2006345843.tif 000006
な断片をそれぞれ示す。
【図３】
開発したプライマーによる特異性検討結果の電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
コは、「コシヒカリ」、かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカー，▲１▼〜▲４▼は、ＲＡＰＤプライマーＡ０１、Ａ０８、Ａ１８およびＡ２５をクローニングして得られた遺伝子配列から作製したプライマーセットをそれぞれ示す。
【図４】
作製したポジティブプライマーの特異性検討結果の電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、：「朝の光」，ゆは、「ゆめみのり」，あは、：「あかね空」，日は、「日本晴」，アは、「アキニシキ」，ひは、「ひとめぼれ」，月は、「月の光」，かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカーをそれぞれ示す。
【図５】
作製したネガティブプライマーの特異性検討結果の電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。
〔符号の説明〕
コは、「コシヒカリ」，キは、「キヌヒカリ」，朝は、：「朝の光」，ゆは、「ゆめみのり」，あは、：「あかね空」，日は、「日本晴」，アは、「アキニシキ」，ひは、「ひとめぼれ」，月は、「月の光」，かは、「彩のかがやき」、Ｍは、分子量マーカーをそれぞれ示す。
【図６】
ポジティブプライマーおよびネガティブプライマーの利用方法を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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