(57)【要約】【課題】複数のタンパク質の混合物である生体由来試料に含まれる標的タンパク質を検出・同定し、定量するための、新規タンパク質定量法を提供する。【解決手段】標的タンパク質に対するペプチドを合成し、安定同位体で標識した後、内部標準として生体由来試料に既知量を添加する。その後、プロテアーゼにてタンパク質をペプチドへ消化して、液体クロマトグラフィーを用いてペプチドの分離を行い、質量分析計で分析を行なう。既知量の内部標準ペプチドとタンパク質由来ペプチドのシグナル面積を比較することで、定量を行なう。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のタンパク質を含む生体由来試料中の標的タンパク質を、内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を用いて同定・定量するための方法であって、以下の(a)〜(e)の各工程を有することを特徴とする標的タンパク質の同定・定量法。
(a) 標的タンパク質に所定の断片化処理を行うことにより得られる標的ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、かつ、安定同位体で標識されたアミノ酸を配列内に１個以上含むことで特定の質量差をもつ内部標準ペプチド、あるいは、
標的タンパク質に所定の断片化処理を行うことにより得られる標的ペプチドと同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記同一のアミノ酸配列内に安定同位体で標識されたアミノ酸を１個以上含むことで特定の質量差をもつ内部標準ペプチド前駆体、を調製する工程
(b) 生体由来試料に、既知量の内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を加えて均一に混合する工程
(c)生体由来試料に含まれるタンパク質並びに内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を親和性タグ標識試薬により修飾した後、上記(a)工程における所定の断片化処理を行い、次いで親和性タグ標識された標的ペプチド及び内部標準ペプチドをその親和性を利用して、分離・濃縮する工程
(d) 分離・濃縮した画分のペプチドを質量分析計により分析し、標的ペプチドと内部標準ペプチドが特定の異なる質量差を示すシグナルのペアとして検出されることを利用し、標的ペプチド由来のシグナルを同定する工程
(e) 検出された標的ペプチドについて、質量分析計を用いてＭＳ／ＭＳによる内部配列解析を行い、標的タンパク質を同定するとともに、標的ペプチドのシグナル面積または高さと、既知量である内部標準ペプチドのシグナル面積または高さとをそれぞれ比較することで生体由来試料中の標的タンパク質を定量する工程
【請求項２】
１つの標的ペプチドに対し、各々質量の異なる内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を２種以上使用することを特徴とする請求項１記載の標的タンパク質の同定・定量法。
【請求項３】
内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体として、翻訳後修飾を受ける標的タンパク質におけると同様な修飾が施された内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の標的タンパク質の同定・定量法。
【請求項４】
複数の標的タンパク質にそれぞれ対応する複数の内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的タンパク質の同定・定量法。
【請求項５】
内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体が、以下の（１）〜（５）の少なくとも一つの条件を満たすことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的タンパク質の同定・定量法。
（１）酸化を受けるメチオニン残基に代表される、非生理的な修飾を受けるアミノ酸を含まないこと
（２）環化を起こすグルタミン残基やグルタミン酸残基をＮ末端に持たないこと
（３）親和性タグ標識試薬を反応させる例えばシステイン、リジンなどのアミノ酸残基を１個以上含むこと
（４）ペプチド断片に断片化を行う際の、断片化効率が高く断片化ミスを含まないこと
（５）分析に用いる質量分析計に対し適当な質量であること
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を同定・定量する方法に関するものである。さらに詳細に説明すると、本発明は、多種類のタンパク質混合物である生体由来試料から任意の標的タンパク質を同定・定量するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム解析の終了に伴い、膨大な遺伝子情報が明らかになった。この遺伝子情報を解析し、どのような遺伝子が、いつ・どこで・どれくらい働いているかを理解して生命活動を記述することが課題とされている。しかし、実際に生命活動を担っているのはタンパク質であり、遺伝子とタンパク質の働いている量や存在量が必ずしも一致しないことから、遺伝子とタンパク質の両方について、時間的、空間的および量的な情報を得ることで初めて生命活動が理解できると考えられている。そのために、時間および空間的な相違に関係なく利用できる、普遍的なタンパク質の定量法が求められている。
【０００３】
複数のタンパク質を含む混合物から任意の標的タンパク質を特異的に同定・定量する方法としては、ELISA 法やRIA法が一般によく利用される。これらの方法は、標的タンパク質に対する抗体を用いているため、良質の抗体を使用すれば高感度検出が可能である。また96 ウェルなどのマルチプレートを用いることで、一度に多種類のサンプルの分析ができる点で優れている。しかしながら、分析には抗体が不可欠であり、抗体作製に時間を要するうえ、測定の精度が使用する抗体の特異性の程度により変化するため、擬陽性が出現しやすいといった問題がある。また、抗体を用いた方法では、修飾された特定のタンパク質やアイソザイム、アイソフォーム、一塩基多型遺伝子由来タンパク質などのアミノ酸配列が極めて類似したタンパク質群から１アミノ酸の違いを識別して標的タンパク質のみを同定・定量することは極めて困難である。
【０００４】
活性測定法は、標的タンパク質が酵素活性を持つ場合に、標的タンパク質が触媒する化学反応の結果生成される生成物や副生成物を直接もしくは間接的に検出することで定量を行なう方法であり、簡便に標的タンパク質の検出・定量ができる点で優れているが、酵素活性を持つタンパク質でのみ分析が可能であるため、汎用性が低いという問題点がある。また活性に影響を及ぼす物質の有無などの測定条件により測定値が変動するため、測定結果が必ずしも生体内の存在量を正確に反映しているわけではないという欠点がある。
【０００５】
安定同位体を用いたタンパク質の定量法に関しては、米国のアエバーソルドらが開発した方法が発表されている（（公表番号）特表２００２−５２３０５８）。この方法は、タンパク質に含まれるシステイン残基をビオチン化修飾試薬にて標識して、その標識ビオチンに対する親和性を利用して精製を行い、２種類の生体由来試料間での含有タンパク質の個々の量を比較する方法である。
この方法では、安定同位体を組み込んだ質量の異なる２種類の標識試薬を用いることで、２種類の生体由来試料由来のタンパク質を質量差で区別している。複数の生体由来試料を簡便に比較出来る点で非常に優れているが、２種類の標識試薬の標識効率の違いから測定誤差が生じやすく、特定のタンパク質の濃度の定量を行うことは出来ないという欠点がある。
【０００６】
安定同位体を用いて、タンパク質の濃度を定量する方法としては、米国のストットらの手法が報告されている（Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004; 18: 491-498）。この方法では、安定同位体を組み込んだペプチドを標準物質として用いることで、タンパク質の濃度を定量できる。この方法は標準物質を用いて検量線を作製し濃度を測定している点で優れているが、断片化した試料中の全ペプチドを逆相クロマトグラフィーで分離するのみで、標的タンパク質もしくは標的ペプチドの分離・濃縮が不十分であるため、得られるシグナルパターンが複雑であり、複合サンプル中にある微量タンパク質を定量することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上述のような従来のタンパク質定量技術の問題点を鑑み、生体由来試料中に含まれる標的タンパク質の存在量（濃度）をその種類や性質、存在場所、認識抗体の特性などにかかわらず、定量できる普遍的な方法を提供することである。
より詳しく述べると、抗体やタンパク質固有の活性を利用せずに、高感度検出・高精度同定・高精度定量を実現することのできるタンパク質定量法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決する方法として、標的タンパク質を直接定量するのではなく、消化して得られる標的ペプチドを質量分析計にて定量することを特徴とするタンパク質定量法に着目し鋭意検討を行なった結果、高感度検出・高精度同定を可能にする安定同位体標識内部標準ペプチドの設計法ならびにペプチドの分離・濃縮方法を見出し、さらには高精度定量を実現するためのペプチド断片化処理効率の補正法を見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）複数のタンパク質を含む生体由来試料中の標的タンパク質を、内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を用いて同定・定量するための方法であって、以下の(ａ)〜(ｅ)の各工程を有することを特徴とする標的タンパク質の同定・定量法。
(ａ) 標的タンパク質に所定の断片化処理を行うことにより得られる標的ペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、かつ、安定同位体で標識されたアミノ酸を配列内に１個以上含むことで特定の質量差をもつ内部標準ペプチド、あるいは、
標的タンパク質に所定の断片化処理を行うことにより得られる標的ペプチドと同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記同一のアミノ酸配列内に安定同位体で標識されたアミノ酸を１個以上含むことで特定の質量差をもつ内部標準ペプチド前駆体、を調製する工程
(ｂ) 生体由来試料に、既知量の内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を加えて均一に混合する工程
(ｃ)生体由来試料に含まれるタンパク質並びに内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を親和性タグ標識試薬により修飾した後、上記(a)工程における所定の断片化処理を行い、次いで親和性タグ標識された標的ペプチド及び内部標準ペプチドをその親和性を利用して、分離・濃縮する工程
(ｄ) 分離・濃縮した画分のペプチドを質量分析計により分析し、標的ペプチドと内部標準ペプチドが特定の異なる質量差を示すシグナルのペアとして検出されることを利用し、標的ペプチド由来のシグナルを同定する工程
(ｅ) 検出された標的ペプチドについて、質量分析計を用いてＭＳ／ＭＳによる内部配列解析を行い、標的タンパク質を同定するとともに、標的ペプチドのシグナル面積または高さと、既知量である内部標準ペプチドのシグナル面積または高さとをそれぞれ比較することで生体由来試料中の標的タンパク質を定量する工程
（２）１つの標的ペプチドに対し、各々質量の異なる内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を２種以上使用することを特徴とする上記（１）に記載の標的タンパク質の同定・定量法。
（３）内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体として、翻訳後修飾を受ける標的タンパク質におけると同様な修飾が施された内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体を用いることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の標的タンパク質の同定・定量法。
（４）複数の標的タンパク質にそれぞれ対応する複数の内部標準ペプチド又は／及び内部標準ペプチド前駆体を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の標的タンパク質の同定・定量法。
（５）内部標準ペプチド又は内部標準ペプチド前駆体が、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも一つの条件を満たすことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の標的タンパク質の同定・定量法。
（ａ）酸化を受けるメチオニン残基に代表される、非生理的な修飾を受けるアミノ酸を含まないこと
（ｂ）環化を起こすグルタミン残基やグルタミン酸残基をＮ末端に持たないこと
（ｃ）親和性タグ標識試薬を反応させる例えばシステイン、リジンなどのアミノ酸残基を１個以上含むこと
（ｄ）ペプチド断片に断片化を行う際の、断片化効率が高く断片化ミスを含まないこと
（ｅ）分析に用いる質量分析計に対し適当な質量であること
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
上記のように構成された本発明の方法によれば、第１に、タンパク質を直接定量するのではなく、消化処理により得たペプチド断片を定量するので、タンパク質分子の溶解性に影響されず、様々な化学的性質を持つタンパク質を同一の方法で取り扱うことが可能となる。第２に親和性タグ標識試薬を用いて修飾を行うことで、親和性タグ標識されたペプチドはアフィニティークロマトグラフィを用いて容易に分離・濃縮を行うことが可能となる。第３に本発明の方法によれば、質量分析計を用いて測定を行うので、数fmolのタンパク質を定量することが可能であり、且つ、ペプチドの内部配列解析による同定を行うことで、擬陽性の無い同定が可能であり、アイソザイムやアイソフォームなどのアミノ酸配列が極めて類似したタンパク質群から１アミノ酸の違いを識別することで標的タンパク質を同定・定量することが可能となる。第４に、複数の標的タンパク質にそれぞれ対応する内部標準ペプチドを同時に使用することで、一度の分析から、複数の標的タンパク質の定量を行うことが可能となる。第５に、1種類のペプチドに対して、複数種の質量差をつけた内部標準ペプチドを同時に用いることにより、検量線を作成し、より正確な定量を行うことができる。第６に、内部標準ペプチドのN末端とC末端に、ペプチド断片に消化する際に除去される配列を付加したペプチド（内部標準ペプチド前駆体）を用いることにより、標的タンパク質からペプチドが切り出される断片化反応の効率の影響による誤差を補正した高精度定量が可能となる。例えば、トリプシンを用いた場合においては、負電荷を帯びたアスパラギン酸とグルタミン酸が切断される部位に隣接している場合は、断片化が抑制される。このように断片化が抑制される場合においては、その断片化反応の効率を補正することでより高精度な定量が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本出願の発明のタンパク質定量法では、まず、生体由来試料から抽出したタンパク質溶液に、既知量の安定同位体標識ペプチドを内部標準として添加する。安定同位体標識により、生体由来試料に含まれるタンパク質由来ペプチドと内部標準として加えたペプチドとは、質量差で区別することが可能である。ここでペプチドの安定同位体標識には、ペプチド合成の際に安定同位体を組み込むことで標識することが可能である。また、安定同位体を含んだ試薬を反応させて、安定同位体標識を行なうことも可能であるが、この場合は、生体由来試料に含まれるタンパク質に対して、同位体組成の異なる試薬を用いて標識を行なう必要がある。内部標準として加えるペプチドは、酸化や環化に代表される人為的な修飾によって質量に変化が生まれる可能性の低い配列であり、ペプチドへ消化する際の消化効率の高い配列を選択する。さらに、質量分析に適した長さ、具体的には、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）を用いる場合においては、600 Da 〜 4000 Da の範囲の配列を選択する。タンパク質の属するファミリーやアイソフォームの違いを見分ける場合には、ファミリーやアイソフォーム間で保存されていない、特異的な配列を選定する必要がある。次にタンパク質をペプチド断片に消化する。タンパク質をペプチド断片に消化する方法としては、トリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いる方法、臭化シアンに代表される化学的切断方法、を使用することができる。
【００１１】
タンパク質をペプチド断片に消化した混合物の中から、標的ペプチドの分離を行う。分離には、液体クロマトグラフィーを用いて行う。具体的には、ペプチドの電荷の違いを利用して分離を行なう陽イオン交換クロマトグラフィー、ペプチドの疎水性の違いを利用して分離を行なう逆相クロマトグラフィーを組み合わせて分離を行なうことができる。また、ビオチンであればアビジン、マルトースであればマルトース結合タンパク質、グルタチオンであればグルタチオン トランスフェラーゼのように親和性タグ標識試薬に対する親和性が利用できる場合や標的ペプチドに対する抗体がある場合においては、アフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、を使用することも可能である。複数種類のペプチドが含まれる混合物から、標的ペプチドの分離を行なうことで検出感度が向上し、また、精度の良い定量が可能となる。ここで標的ペプチドの分離は、標的ペプチドの純度を上げることが目的であり、その他のペプチド全てを排除する必要は無い。
【００１２】
次に分離されたペプチドを質量分析計を用いて検出する。質量分析計を用いることで、数fmolの標的タンパク質の検出が可能となる。そのうえ、ＭＳ／ＭＳ分析を行なうことで、ペプチドの内部配列情報を解析することが可能となり、擬陽性の無い同定が可能となる。質量分析におけるイオン化の方法は各装置に応じて適宜選択することができる。例えば、電子イオン化法（EI法）、化学イオン化法（CI法）、高速原子衝撃法（FAB法）、エレクトロスプレーイオン化法（ESI法）、大気圧化学イオン化法（APCI法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI法）などの様々な方法が挙げられる。質量分析では、各種イオン化法により生成したペプチド由来イオンはアナライザーで質量に応じて分離される。例えば、磁場型質量分離装置（Sector MS）、四重極型質量分離装置（QMS）、飛行時間型質量分離装置（TOFMS）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（FT-ICRMS）、が挙げられ、さらにこれらを組み合わせたアナライザーが例示される。クロマトグラフィーの溶出位置と質量からペプチドの同定を有意に行うことも可能であるが、ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、検出されたペプチドの内部配列解析を行いタンパク質同定までを行なうことが望ましい。
【００１３】
質量分析により、未知量の標的タンパク質由来ペプチドのシグナル（a）と既知量の内部標準ペプチド由来のシグナル（b）とが検出される。このそれぞれのシグナルの面積（m1、m2）と測定試料中に含まれるペプチドの量（x1、x2）の関係は比例関係にあるため
m1:x1=m2:x2
で示され、
x1=m1×x2／m2
が成立する。
従って、m1、m2は、測定値であり、x2は既知量であることから、標的タンパク質の量（x1）が測定できる。
【００１４】
1種類のペプチドに対して、＋9 Da、＋15 Da、＋21 Da などの質量差をつけた複数種類の内部標準ペプチドを同時に用いる場合は、各内部標準ペプチドの面積（M9、M15、M21）と標的タンパク質由来ペプチドの面積（M0）との関係から、検量線を作成して定量することが可能となる。
【００１５】
本出願の発明は、タンパク質の量を測定する方法であるが、リン酸化、糖鎖化、ニトロ化、シトルリン化などの翻訳後修飾を受ける部分に対応する内部標準ペプチドを、翻訳後修飾部位を含んだペプチドとして合成し使用することで、翻訳後修飾を受けた標的タンパク質の量を測定することが可能となる。また、生体内に存在するペプチドに対する内部標準ペプチドを合成し使用すれば、ペプチドの量を測定することも可能となる。
【００１６】
生体由来試料に複数の標的タンパク質に対する各々の内部標準ペプチドを加えることも可能である。この場合、1つの試料中に存在する複数の標的タンパク質の量を同時に測定することが可能となる。
【実施例】
【００１７】
ウシ血清アルブミン（BSA）の定量
内部標準ペプチド
標的タンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）を定量するため、BSAのアミノ酸配列から、下記配列を内部標準ペプチドとして選定した。
内部標準ペプチド
BSA-3 ( + 9)：SL* HTL* FGDEL**CK
BSA-3 (+15)：SL* HTL**FGDEL**CK
BSA-3 (+21)：SL**HTL**FGDEL**CK
L* ：１ Da重い ロイシン
L**：７ Da重い ロイシン
上記ペプチドは、BSAをトリプシンにてペプチドに消化して質量分析を行い、得られたシグナルの中から、以下の５つの条件を満たすペプチドとして選定した。
1. 酸化を受けるメチオニン残基に代表される、非生理的な修飾を受けるアミノ酸を含まない。
2. 環化を起こすグルタミン残基やグルタミン酸残基をＮ末端に持たない。
3. 親和性タグ標識試薬を反応させる例えばシステイン、リジンなどのアミノ酸残基を１個以上含む。好ましくは反応させる１種類のアミノ酸について２個以上含まない。
4. ペプチド断片に断片化を行う際の、断片化効率が高く断片化ミスを含まない。
5. 分析に用いる質量分析計に対し適当な質量である。例えば、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）を用いる場合においては、600 Da 〜 4000 Da の範囲である。
【００１８】
親和性タグ標識・ペプチド断片化
本実施例中では、親和性タグ標識前のタンパク質に下記の既知量の内部標準ペプチドをそれぞれ加えた。
BSA-3 ( + 9)     25 pmol
BSA-3 ( + 15)    50 pmol
BSA-3 ( + 21)   100 pmol
親和性タグ標識として N-ビオチノイル-N'-ヨードアセチルエチレンジアミン（以下ビオチンと記載） を用いてシステイン残基の親和性タグ標識を行った。ビオチンで標識することにより、ペプチドの質量は、326.42 Da 増加する。
標識したタンパク質及び内部標準ペプチドにトリプシンを加えてペプチド断片を調製した。
【００１９】
ペプチドの分離
ペプチドの分離には、陽イオン交換クロマトグラフィーとアフィニティクロマトグラフィー、逆相クトマトグラフィーを組み合わせて行った。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィーシステム（ビジョンワークステーション : アプライドバイオシステムズ社）に、ポリスルフォエチル A カラム（5 μm, 300 Å bead, 4.6×100 mm : ポリエルシー社）を接続して行なった。アセトニトリルを含むリン酸緩衝液（pH 3.0）を用いて、ペプチド混合物をカラム担体へ吸着させた。カラムの洗浄を行なった後、塩濃度を上げることでペプチドを溶出した。
アフィニティクロマトグラフィーは、親和性タグ標識試薬として用いたビオチンのアビジンに対する親和性を利用して行なった。具体的には高速液体クロマトグラフィーシステム（ビジョンワークステーション : アプライドバイオシステムズ社）に、アイキャット カートリッジ-アビジン カラム（4.0×15 mm : アプライドバイオシステムズ社）を接続した。リン酸緩衝液（pH 7.2）を用いて、ペプチド混合物をカラムへ充填しカラム担体へ吸着させた。カラムの洗浄を行なった後、0.4%トリフルオロ酢酸を含む30%アセトニトリル水溶液でペプチドを溶出した。
逆相クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィーシステム（アリアンス 2690 : ウォーターズ社）に、シンメトリー C18（3.5μm, 1.0×150mm : ウォーターズ社）を接続して行なった。トリフルオロ酢酸を含む水溶液を用いて、ペプチド混合物をカラム担体へ吸着させた後、アセトニトリル濃度を上げて、ペプチドを溶出した。
本実施例中では、内部標準ペプチドを単独で用いた予備実験により、陽イオン交換クロマトグラフィーと逆相クトマトグラフィーにおける溶出位置を調べてから、本サンプルでの実験を行った。この予備実験を行うことで、効率よく実験を進めることが可能である。
【００２０】
質量分析計による測定
液体クロマトグラフィーで分離したペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量分析装置（アプライドバイオシステムズ 4700 プロテオミクスアナライザー : アプライドバイオシステムズ社）を用いて定量した。得られたシグナルの中から、3種類の内部標準ペプチドを含む4種類のシグナル群が検出された（図1）。3種類の内部標準ペプチド（b, c, d）の添加量とシグナル面積との比から検量線を作成し（図2）、BSAを定量した。定量結果を、表1で示す。
【００２１】
【表１】
2006300758.tif 000003
表１から、50 pmol のBSAを定量した結果、52.02 ± 1.69  pmol（n=3）であることが明らかとなった。この結果から、誤差4%未満で定量を行なえることが確認された。
このように、1つのペプチドに対して質量差をつけた複数の内部標準ペプチドを使用することで、検量線を用いた高精度の定量を行なうことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例で説明した１つのペプチドに対して、質量差をつけた複数の内部標準ペプチドを使用した例を示した図である。（a）は50 pmol のBSA由来シグナル、（b）は25 pmol の +9 Da 内部標準ペプチド由来シグナル、（c）は50 pmol の +15 Da 内部標準ペプチド由来シグナル、（d）は100 pmol の +21 Da 内部標準ペプチド由来シグナルをそれぞれ示す。
【図２】図１で示した3種類の内部標準ペプチド（b, c, d）の添加量とシグナル面積比から検量線を作成した図である。BSA由来ペプチド量の値を矢印で示す。
【図１】
2006300758.tif 000004
【図２】
2006300758.tif 000005