(57)【要約】      （修正有）【課題】ヌクレオチド配列の一部分が相同的である多数の生物または生物の一部の容易な特定（検出および／または定量）のためのマイクロアレイまたはバイオチップの技術を改善するための新しい方法（およびデバイス）を提供すること。【解決手段】遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントを同定し、該ヌクレオチド配列エレメントのＰＣＲによる増幅によって、標的ヌクレオチド配列を作成し、特定の配列を有する捕獲ヌクレオチド配列を持つアレイとのハイブリダイゼーションから生じるシグナルを検出することにより、遺伝子改変されている生物の検出および／または定量を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変植物のゲノム中に組込まれた外因性のヌクレオチド配列の少なくとも一部に対応する異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントであって生物学的サンプル中に存在するエレメントの同定および／または定量によって前記遺伝子改変植物を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ．所望により、ヌクレオチド配列エレメントを生物学的サンプルから抽出する工程；
ｂ．少なくとも２つの異なる遺伝子改変植物に存在するヌクレオチド配列エレメントと相同的である前記ヌクレオチド配列エレメントを増幅することができるプライマー対を使用して、ヌクレオチド配列エレメントまたはその一部を標的ヌクレオチド配列に増幅またはコピーする工程、この場合、前記ヌクレオチド配列エレメントは次のプロモーター、ターミネーターおよび／またはマーカー配列：Ｐ３５ｓ、Ｔ−ｎｏｓ、ｎｐｔＩＩ、ｐａｔ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＥＰＳＰＳからなる群から選択され、標的ヌクレオチド配列の長さは約１００塩基〜約２００塩基である；
ｃ．所望により、得られた標的ヌクレオチド配列を標識する工程；
ｄ．得られた標的ヌクレオチド配列を、不溶性の固体支持体に固体支持体表面の特定の位置で共有結合的連結によって結合している一本鎖の捕獲ヌクレオチド配列と接触させる工程；
ｅ．前記標的ヌクレオチド配列の結合を、前記標的ヌクレオチド配列と、特定の位置におけるその対応する捕獲ヌクレオチド配列との相補的な塩基対形成によるハイブリダイゼーションから生じるシグナルを検出することによって検出する工程、この場合、捕獲ヌクレオチド配列は、１ｃｍ２の固体支持体表面あたり少なくとも４つの異なる結合した一本鎖捕獲ヌクレオチド配列の密度を有して、アレイに従った特定の位置において不溶性の固体支持体に結合しており、また、捕獲ヌクレオチド配列は、検出および／または定量される標的ヌクレオチド配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能とする、１０塩基〜２００塩基を有する配列を含む；
ｆ．工程ｂ）〜工程ｅ）を、前記遺伝子改変植物の特異的な第２、第３、第４以上の異なるヌクレオチド配列エレメントについて繰り返す工程； 
ｇ．これらの異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの存在または非存在に基づいて遺伝子地図を構築する工程；および
ｈ．遺伝子地図に基づいて生物学的サンプル中の遺伝子改変植物を特定する工程。
【請求項２】
ヌクレオチド配列エレメントが約１００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、より好ましくは約１００ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さを有し、遺伝子改変植物のゲノム中に組込まれた外因性のヌクレオチド配列の少なくとも一部に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対応する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることを可能にする捕獲ヌクレオチド配列が、少なくとも６．８ｎｍのスペーサーによって固体支持体の表面から分離されている請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
捕獲ヌクレオチド配列は１０塩基〜４９塩基の配列を含み、この配列は検出および／または定量される標的ヌクレオチド配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
植物のゲノム中に組込まれる外因性ヌクレオチド配列が、抗生物質耐性遺伝子、調節配列、繰返し配列および／または特定の酵素活性をコードする遺伝子からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子改変植物が、以下の変種からなる群から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：ＢＴ１１、ＢＴ１７６、Ｇａ２１、Ｍｏｎ８１０、ＲＲＳ、Ｔ２５、Ｔ４５、Ｔｏｐａｓ１９／２、Ｓｔａｒｌｉｎｋ、ＮＫ６０３、ＧＴ７３、Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ  Ｌ６２、Ｆａｌｃｏｎ  ＧＳ４０／９０、ＭＳ１−ＲＦ１、ＭＳ１−ＲＦ２、ＭＳ８−ＲＦ３、１４４５、５３１、Ｍｏｎ８６３、Ｍｏｎ８１０ｘＭＯＮ８６３、ＴＣ１５０７およびＭａｉｓｇａｒｄ／ＲＲ。
【請求項７】
ヌクレオチド配列エレメントが、コンセンサスプライマーを用いて標的ヌクレオチド配列に増幅される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヌクレオチド配列エレメントが、同一のプライマー対を用いてｃＤＮＡへと逆転写されるｍＲＮＡ配列である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異なる遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントに対応する標的ヌクレオチド配列が、同一の捕獲ヌクレオチド配列上で検出される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
異なる遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントに対応する標的ヌクレオチド配列が、異なる捕獲ヌクレオチド配列上で検出される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
異なる遺伝子改変植物に特異的な異なるヌクレオチド配列エレメントを増幅および／またはコピーする工程ｂ）が同時に行われる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
異なる遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントに対応する標的ヌクレオチド配列を検出および／または定量する異なる工程ｃ）〜ｅ）が同時に行われる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
スペーサーが約２０塩基〜約１５０塩基のヌクレオチド配列である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の特定方法。
【請求項１４】
特定の位置における固体支持体の表面に結合した捕獲ヌクレオチド配列の密度が、１ｃｍ２の固体支持体表面あたり１０ｆｍｏｌを越え、好ましくは１００ｆｍｏｌより高い請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列エレメントの標的ヌクレオチド配列への増幅が、第一のテールの付いたプライマーおよびテールと同一またはテールに対して相補的な第二のプライマーによるＰＣＲ増幅によって行われる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１６】
テールの付いたプライマーが、第二のテールプライマーを用いた増幅前にまず破壊される請求項１５に記載の定量方法。
【請求項１７】
第一のテールの付いたプライマーおよび第二のテールプライマーが両方とも第一増幅工程から存在し、テールの付いたプライマーがテールプライマーより少なくとも５倍以上低い濃度である請求項１５または１６に記載の定量方法。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列エレメントの増幅および／またはコピー工程において用いられるプライマー対とは異なるプライマー対を用いた、ヌクレオチド配列エレメント以外の他のヌクレオチド配列の増幅工程をさらに含む請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項１９】
別の増幅工程に供される他のヌクレオチド配列が、植物の種、植物の属、または植物の科の検出のために特異的なヌクレオチド配列である請求項１７に記載の定量方法。
【請求項２０】
遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントの定量は、植物の形質転換されていない部分の配列または遺伝子の定量と比較される請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項２１】
遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントの定量は、既知のコピー数でアッセイ方法に組込まれる標準配列の定量と比較される請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項２２】
不溶性の固体支持体が、ガラス、電子工学デバイス、シリコーン支持体、プラスチック支持体、コンパクトディスク、フィルター、ゲル層、金属支持体、またはそれらの混合物からなる群から選択される請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列エレメントが、コンセンサスプライマーおよび所望により停止配列を用いて３′または５′末端の逆転写に供されるＲＮＡ配列である請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
固体支持体が、異なる遺伝子改変植物中に存在する同一のヌクレオチド配列エレメントに対応するすべての相同なまたは同一の標的配列の共通の検出のためのコンセンサス配列と共に相同な標的ヌクレオチド配列との結合のための捕獲ヌクレオチド配列を担持する請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
方法が少なくとも一つの標準の増幅をも含み、このシグナルがサンプル中の異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの量の定量のために用いられる請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
方法が少なくとも一つの標準の増幅をも含み、このシグナルがサンプル中の異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの量のコピー数の定量のために用いられる請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
同一の科または同一の種からのサンプル中の異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの特定量の量の定量が、同一の科または同一の種のすべてのメンバー中に存在するエレメントの量に対する植物の特異的なエレメントの量を比較することによって行われる請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を行うための手段および媒体、および一本鎖捕獲ヌクレオチド配列が結合している不溶性の固体支持体を含む診断および／または定量キットであって、前記一本鎖捕獲ヌクレオチド配列が、検出および／または定量されるＰ３５ｓ、Ｔ−ｎｏｓ、ｎｐｔＩＩ、ｐａｔ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＥＰＳＰＳヌクレオチド配列エレメントのうち少なくとも４つについて特異的な約１０塩基〜約２００塩基の配列を含み、かつ約３０塩基〜約６００塩基の全長を有し、前記一本鎖捕獲ヌクレオチド配列が１ｃｍ２の固体支持体表面あたり少なくとも４つの一本鎖捕獲ヌクレオチド配列の密度を有して、アレイに従って固体支持体の表面上に配置されているキット。
【請求項２９】
捕獲ヌクレオチド配列が、検出および／または定量されるヌクレオチド配列エレメントＰ３５ｓ、Ｔ−ｎｏｓ、ｎｐｔＩＩ、ｐａｔ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＥＰＳＰＳについて特異的な以下の配列を含む請求項２８に記載の診断キット：
2006345855.tif 000012
この場合、捕獲ヌクレオチド配列Ｃｒｙ１Ａｂ−１はＢＴ１７６に対して特異的であり、Ｃｒｙ１Ａｂ−２はＭｏｎ  ８１１０に対して特異的であり、Ｃｒｙ１Ａｂ−３はＢＴ１１に対して特異的であり、捕獲ヌクレオチド配列ＥＰＳＰＳ７はＧＡ１に対して特異的であり、ＥＰＳＰＳ８はＲＲＳに対して特異的である。
【請求項３０】
異なる遺伝子エレメントの検出および／または同定および生物の特定において得られる実験結果の分析のためのコンピュータプログラムの形の手段を含む請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３１】
検出される可能性がある生物の遺伝子エレメントの組成を有するデータバンクを含む請求項２８に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断の分野であり、生物学的サンプルに存在する可能性がありかつ異なる遺伝子改変植物において相同的であり得る遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントの同定および／または定量を行うための方法および手段に関連する。
【０００２】
本発明は、同じ属または同じ科の生物の特定および／または定量のために、および遺伝子改変されている生物の検出および／または定量のために特に好適である。
【背景技術】
【０００３】
バイオチップ技術の開発により、所与のアレイにおいて多数のヌクレオチド配列を同時に検出することが可能であり、従って、対応する生物またはその生物の一部分を特定することが可能である。しかしながら、検出は、ＰＣＲによる増幅と併せて行わなければならず、それぞれの生物において１回のＰＣＲを行い、検出のためにマイクロアレイを使用することはあまり都合の良いことではない。従って、多数の生物を検出するための方法を、複数の生物を特定することを保つ一方で、ＰＣＲ反応の数を少なくするために考えなければならない。
【０００４】
最新技術
Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．は、プロセス処理の各工程でマスクを使用することによって特定の位置における固体支持体上でオリゴヌクレオチドを直接的に合成するための方法を開発している。この方法は、所望する配列を所望の位置において得るために、成長途中のオリゴヌクレオチドに新しいヌクレオチドを付加することを含む。この方法はフォトリソグラフィー技術に由来しており、新しいヌクレオチドが付加される前に放出される光保護基の使用と併用される（欧州特許ＥＰ−Ａ１−０４７６０１４、米国特許第５４４５９３４号、米国特許第５１４３８５４号および米国特許第５５１０２７０号）。しかしながら、小さいオリゴヌクレオチドのみが表面に存在するだけであり、この方法は、主として、アレイ上に結合したそれぞれの特異的なオリゴヌクレオチドに対応する陽性スポットのパターンを配列決定し、または同定するための用途が見出されている。標的配列の特長づけが、そのようなパターンを参照物と比較することによって得られる。この技術は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｒｐｏＢ遺伝子の同定に応用された（国際特許出願公開ＷＯ９７／２９２１２および同ＷＯ９８／２８４４４）。この場合、捕獲ヌクレオチド配列は３０未満のヌクレオチドを含み、一塩基だけが異なり得る２つの異なる配列の分析から、同定が行われる（ＳＮＰの同定または遺伝子型決定）。１つの塩基において異なる２つのオリゴヌクレオチドの識別は、それらの長さがより小さいときにはより大きくなるので、小さい捕獲ヌクレオチド配列（これは１０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドから構成される長さを有する）が好ましい。
【０００５】
この方法の感度の欠如が、遺伝子増幅（ＰＣＲ）から生じるアンプリコンを直接的に検出することができないという事実によって例示される。Ｔ３配列またはＴ７配列を有するプライマーを用いた二重の増幅、次いで、ＲＮＡポリメラーゼを用いた逆転写が必要である。これらのＲＮＡは約４０塩基の断片に切断され、その後、アレイにおいて検出される（国際特許出願公開ＷＯ９７／２９２１２の実施例１）。しかしながら、長いＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントは、表面に存在する捕獲プローブに非常にゆっくりハイブリダイゼーションする。従って、この方法は、相同性が配列に沿って変化し、結果として、断片の一部分が同じ捕獲プローブにハイブリダイゼーションし得るので、相同的な配列の検出には適していない。従って、結果を解釈するためのソフトウエアを、得られた結果の解釈を可能にするためにこの方法では組み込まなければならない。
【０００６】
しかしながら、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーに基づく遺伝子発現アレイについては、小さい捕獲プローブアレイを使用するとき、同じ問題に直面する。すなわち、ハイブリダイゼーション速度が低い。従って、所与の遺伝子の存在を証明するシグナルのパターンを得るために、フラグメントはより小さい断片に切断され、また、この方法では、いくつかの捕獲ヌクレオチド配列の使用が要求される（国際特許出願公開ＷＯ９７／１０３６４および同ＷＯ９７／２７３１７）。この切断はまた、標識されたヌクレオチドの数を低下させ、従って、得られるシグナルを低下させる。この場合、長い捕獲ヌクレオチド配列の使用は一層良好な感度をその検出にもたらす。多くの遺伝子発現適用において、長い捕獲プローブの使用は、検出されるｃＤＮＡが、異なる配列を有する遺伝子に由来するときには、それらの間での交差反応がないので、問題とならない。長い捕獲ヌクレオチド配列は、要求される感度を与える。しかしながら、長い捕獲ヌクレオチド配列は他の相同的な配列にハイブリダイゼーションすることになる。
【０００７】
アレイは多様性検出に良く適する。しかし、生物学的サンプルにおける物質は非常に低い量で存在するので、何らかの方法を、ＰＣＲとアレイとの組合せが効率的であるために考えなければならない。分析サンプルに存在する可能性があるそれぞれの可能な生物についてＰＣＲを行い、その後、増幅されたサンプルを個々に検出および／または同定することは、あまり効率的ではないが、当技術分野の一部である。多数の生物がサンプルに存在する可能性があるとき、使用されるプライマーの数は制限されなければならない。そのような場合、異なるチューブにおいて実現されるならば、非常に多数のＰＣＲがもたらされるか、または、多重ＰＣＲが行われるときには非特異的な増幅がもたらされるからである。従って、ＰＣＲを簡略化し、かつ、ＰＣＲとアレイ設計との間での組合せ法を開発することが求められている。
【０００８】
そのような状況が、生物学的サンプルにおける遺伝子改変（ＧＭ）植物または遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の検出および／または特定において存在する。ＧＭＯは、受容生物への異種の遺伝子構築物の挿入を通常の場合には意味する特有の形質転換事象によって定義される。一体化している遺伝子構築物はいくつかのエレメント（通常の場合、少なくとも、目的とする遺伝子、開始シグナルとして機能するプロモーター、および、遺伝子発現を調節するための停止シグナルとして機能するターミネーター）から構成される。加えて、構築物は、クローニングベクターに由来するＤＮＡ配列が隣接している場合がある。遺伝子改変植物の大多数は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）および／またはＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ−３５Ｓ）もしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼのターミネーター（Ｔ−Ｎｏｓ）を含有する構築物により形質転換されている。最も一般的に使用されているクローニングベクターは、アンピシリン抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子（ｂｌａ）を含有するｐＢＲ３２２、または、ネオマイシン／カナマイシン抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含有するベクターである。
【０００９】
いくつかの国々はＧＭＯおよびＧＭ由来食品についての義務的な表示規則を有する。特に、欧州の規則は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）からなるか、または、食品成分の０．９％を超える割合で遺伝子改変生物（ＧＭＯ）を含有する食品および飼料の表示が必須であることを命じている（欧州規則第１８２９／２００３）。表示のためのこの０．９％の限界は、アッセイの変動性を考慮に入れるために、検出限界が０．１％以下であることをもたらしている。そのような限界はサンプルにおけるゲノムの数百コピー以下に対応する。
【００１０】
そのような規則の要求を満たすために、また、正確な情報によって選択の自由を消費者に保障するために、いくつかのＧＭＯ分析方法が既に記載されており、欧州の実施試験所によって現在使用されている。試験所が分析のために受け入れる製造物は、多くの場合、加工および純化されているので、目標となる分析物の性状および量は、しばしば、いずれかの検出方法の感度の障害となっている。現在利用可能な方法の中で、電気泳動を伴うＰＣＲ法は、日常的な適用においてＧＭ由来物を検出するための最も高感度かつ信頼できる方法として一般に受け入れられている。
【００１１】
ＧＭＯの試験が単純なスクリーニングＰＣＲに限定される場合がある。しかしながら、ＤＮＡが得られるＧＭＯの特異的な特定、または、ＧＭＯ由来ＤＮＡの確実な定量は、特に、検出されるＧＭＯの数が継続的に増大し続けているので、急激に費用を増大させる。
【００１２】
到達すべき感度のために、サンプルから得られる遺伝物質は最初にＰＣＲによって増幅され、その後、検出される。ＰＣＲに基づくＧＭＯ検査は、その特異性レベルに対応して、少なくとも４つのカテゴリーに分類することができる。それぞれのカテゴリーは、ＰＣＲにおいて増幅されるＤＮＡフラグメントの組成に対応する（スクリーニング用標的、遺伝子特異的標的、構築物特異的標的および事象特異的標的）。
【００１３】
ＰＣＲ法の第１のカテゴリーは、Ｐ−３５Ｓ、Ｔ−３５Ｓ、Ｔ−Ｎｏｓ、ｂｌａまたはｎｐｔＩＩの遺伝子エレメントを標的としており、遺伝子改変物についてスクリーニングするために広く適用されている（Ｍａｔｓｕｏｋａ他、２００２、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、９３：３５〜３８）。しかしながら、スクリーニング用標的の１つの存在はＧＭＯ由来ＤＮＡの存在を必ずしも意味していないので、これらのスクリーニング方法を、ＧＭＯを特定するために使用することができない。Ｐ−３５ＳまたはＴ−３５Ｓの起源は、自然界に存在するＣａＭＶであり得る（Ｗｏｌｆ他、２０００、Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２１０：３６７〜３７２）。
【００１４】
ＰＣＲ法の第２のカテゴリーは、目的とする遺伝子（例えば、ＣｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子）を標的とするものであり、スクリーニング法よりも特異的である（Ｖａｌｔｉｌｉｎｇｏｍ他、１９９９、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、４７：５２６１〜５２６６）。利用可能な遺伝子の選択は、利用可能なプロモーターおよびターミネーターの選択よりも大きい。通常、特定の遺伝子の増幅についての陽性シグナルは、ＧＭ由来ＤＮＡが存在することを意味しており、多くの場合、そのＤＮＡがどのＧＭＯに由来するかを特定することが可能である。
【００１５】
ＰＣＲ法の第３のカテゴリーは、遺伝子構築物（特異的な構築物）の隣接エレメント間の接合部、例えば、プロモーターと、目的とする遺伝子との間の接合物を標的とする（例えば、Ｍｏｎ８１０トウモロコシ；Ｐ−３５Ｓ−ｈｓｐ７０イントロンＩ）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、１９９８、Ｌｅｂｅｎｓｍ−Ｗｉｓｓ  ｕ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３１：６６４〜６６７）。これらの方法に関して、陽性のシグナルは、ＧＭ由来物が存在するときに現れるだけである。しかしながら、完全な遺伝子構築物が２つ以上のＧＭＯに形質転換されていることがあり、または、将来の形質転換のために使用されることがある。
形質転換事象の唯一の特有の痕跡は、現在の技術の範囲内では、受け入れたゲノムと、挿入されたＤＮＡとの間での組み込み座における接合部である。この接合部がＰＣＲ法の第４のカテゴリーの標的である。残念ながら、そのような事象特異的な方法でさえ、その限界を有する。２つのＧＭＯが交配されているとき（例えば、２つの異なるＧＭトウモロコシ（例えば、Ｔ２５およびＭｏｎ８１０など）が交配されているとき）、生じるハイブリッド子孫は、両方の事象の痕跡を含む遺伝子改変を含有することがあり、ＰＣＲ検査ではその２つの親と区別することができない。この検出の１つの重要な制限は、特定するためのそれぞれのＧＭＯについて１つの特異的なプライマー対が要求されることである。
【００１６】
これらのアッセイの一部は従来のＰＣＲに基づいており、所与サンプルにおけるＧＭＯの定性的方法を可能にしている。他のアッセイ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ他、２００３、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：１７９〜１９８）などはサンプルにおけるＧＭＯの定量を可能にしている。
【００１７】
ＧＭＯに由来するＤＮＡをＰＣＲに基づいて検出するための大きな制限は、適用可能なＰＣＲプライマーに関する情報の入手、および、信頼できる分析のために好適なＤＮＡの入手である。ＧＭＯ分析のためのいくつかのＰＣＲプライマー対が開発され、発表されているが、これらのプライマーの多くは適用範囲が限定されている（例えば、１つのＧＭＯのスクリーニングまたは特定のためだけに好適なプライマー）。
【００１８】
食品の加工、例えば、粉砕、加熱、酸処理および他の加工などは、約２００ｂｐ〜４００ｂｐの小さいフラグメントでＤＮＡを急速に分解し、また、純化は、ＤＮＡの効率的な除去をもたらし得る。従って、多くの製造物はＧＭＯ由来ＤＮＡをほとんど含有しておらず、また、このＤＮＡはフラグメント化されていることが多い。結果として、ＧＭＯを加工食品において検出することができるためには、プライマー対は小さいフラグメント（１００ｂｐ〜２００ｐ）を標的にしなければならない。
【００１９】
１回のアッセイで検出することができるＧＭＯの数を広げることが求められている。また、新しいＧＭＯを含むために容易に機能が高められる方法も求められている。多重ＰＣＲは、理論的には、数個のＧＭＯの同時検出を可能にする。しかしながら、いくつかの小さい増幅産物は電気泳動によって容易に識別されないので、そのようなアッセイは、実施することが容易ではない。また、多重ＰＣＲは、通常、１つだけの増幅と比較して低下した感度をもたらし、このことはＧＭＯ検出のための重要な欠点である。
【００２０】
米国特許出願２００３０１９８９４３Ａ１は、ＰＣＲ増幅されたＧＭＯを、コンセンサスプライマーを使用してチップ上で特定するための方法を記載する。実施例１５に記載されるようなアンプリコンのサイズは約１０００ｂｐ〜約３０００ｂｐの間で構成される。結果として、この方法は新鮮な葉また種子に対して適用可能であるにすぎない。これは、粉砕、加熱または酸処理によって得られる加工食品はＤＮＡを約２００ｂｐ〜４００ｂｐの小さいフラグメントで分解しているからである。順方向および逆方向のコンセンサスプライマーが、異なる遺伝子エレメントにおいて選ばれ（例えば、プロモーター−３５Ｓにおけるセンスプライマー（配列番号１９２）およびターミネーター−３５Ｓにおけるアンチセンスプライマー（配列番号１９３））、または、１つが遺伝子エレメントにおいて、もう一方が植物ゲノムとの境界領域において選ばれる（例えば、オクトピンの左側境界におけるセンスプライマー（配列番号１９８）およびＥＰＳＰＳにおけるアンチセンスプライマー（配列番号１９９））。このようなプライマーの配列が実施例１５に示される。捕獲プローブが、コンセンサスプライマーによって定められる配列において選択され、通常的には、遺伝子エレメント（例えば、ＣＴＰ１、ＣＴＰ２、ＥＰＳＰＳ、Ｃｒｙ１ａｂ、ｈｓｐ７０、イントロン、Ｐａｔ）において選択される。ＧＭＯが、アレイにおける１つのスポットシグナルに対応する１つの捕獲プローブによって特定される。しかしながら、多くのＧＭＯが同じ遺伝子エレメントを含有するので、曖昧でない特定を得ることを非常に困難である。
【００２１】
この先行技術方法の第１の制限は、特定できるＧＭＯの数が小さいこと、および、多くのＧＭＯが同じ遺伝子エレメントを含有するので、曖昧でない特定を得ることが困難であることである。
【００２２】
この先行技術方法の別の制限は、約２００ｂｐ〜４００ｂｐの小さいフラグメントでＤＮＡを急速に分解する粉砕、加熱、酸処理および他の加工によって加工された食品に対して行うことができないことである。その結果、多くの製造物は少量のＧＭＯ由来ＤＮＡを含有し、また、回収されたＤＮＡ配列はフラグメント化されていることが多い。さらに、この方法は新鮮な葉また種子に対して適用可能であるにすぎない。ＰＣＲは、異なる遺伝子エレメントにおけるコンセンサスプライマー（例えば、プロモーター−３５Ｓにおけるセンスプライマー（配列番号１９２）およびターミネーター−３５Ｓにおけるアンチセンス（配列番号１９３））の使用に基づくか、または、１つが遺伝子エレメントにおいて、もう一方が植物ゲノムとの境界領域においてであるプライマー（例えば、オクトピンの左側境界におけるセンスプライマー（配列番号１９８）およびＥＰＳＰＳにおけるアンチセンス（配列番号１９９））の使用に基づく。このようなプライマーの配列が実施例１５（第２２欄）に示されている。
【発明の開示】
【００２３】
発明の目的
本発明は、それらのヌクレオチド配列の一部分が相同的である多数の生物または生物の一部の容易な特定（検出および／または定量）のためのマイクロアレイまたはバイオチップの技術を改善するための新しい方法（およびデバイス）を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、増幅工程における限定された数のプライマーの使用を要求する簡略化された技術に基づくそのような方法（およびデバイス）に、このマイクロアレイ上の単一スポットシグナルを検出および／または記録することによる特定の増幅された標的配列の特定（検出および／または定量）を提供することであり、この場合、このシグナルは、それらの対応する捕獲配列を有する標的配列の特異的な結合から生じている。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、特に遺伝子改変植物（ＧＭ植物）または遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の検出において、それらの配列のいくつかの一部分が同一または非常に相同的である生物を特定することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、生物学的サンプルに存在する遺伝物質の起源同定、特に、その生物学的サンプルがどの遺伝子改変植物から得られているかの起源同定を簡略化するそのような方法を提案することである。
【００２７】
定義
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「アレイ」、「プローブ」、「標的核酸」、「実質的に結合する」、「特異的なハイブリダイゼーション」、「背景」、「定量」の各用語は、国際特許出願公開ＷＯ９７／２７３１７（参照として本明細書中に組み込まれる）において記載される用語である。
【００２８】
「ヌクレオチド三リン酸」、「ヌクレオチド」、「プライマー配列」の各用語は、国際特許出願公開ＷＯ００／７２０１８および国際特許出願ＰＣＴ／ＢＥ００／００１２３の文書において記載される用語である。
【００２９】
用語「相同的な遺伝子配列」または用語「相同的なヌクレオチド配列エレメント」は、対応する位置において同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合が純粋にランダムなアラインメントの場合よりも大きいアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。それらは、配列が、比較される２つの配列の一方における付加または欠失（ギャップのような欠失）を考慮に入れて最適にアラインメントされた後、ヌクレオチドまたはアミノ酸の全体と比較して、それぞれの位置において見出される同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合として定義される最少の相同性（または配列同一性）を示すとき、相同的であると見なされる。所与のタンパク質をコードするが、異なる生物のように遺伝子的に異なる供給源に存在する遺伝子は、通常、相同的である。所与の生物ではまた、同じファミリーのタンパク質または酵素（インターロイキン、チトクロームｂ、ｐ．４５０）をコードする遺伝子は、通常、相同的である。相同的な配列は、それらの配列に沿って一部分でのみ、少数の一部分もしくは部分で、または全てで相同的であり得るので、相同性（または配列同一性）の程度は大きく変化し得る。配列において同一である配列の相同的な一部分または部分は完全に相同的であり、または、保存されている、または、同一であると言われる。細胞トランスフェクションのためのような遺伝子構築物は同一または相同的な一部分を含有することができる（例えば、ヌクレオチド配列エレメントとして下記において定義される配列部分など）。
【００３０】
これらのヌクレオチド配列エレメントには、調節配列（例えば、ターミネーター、プロモーターなど）、または、植物のゲノムに組み込まれている目的とする遺伝子（抗生物質マーカー）、または、目的とする分子の産生に関与する配列、または、これらの配列の一部分（部分）が含まれる。これらのヌクレオチド配列エレメントはまた、反復配列、および／または、特定の酵素活性をコードする遺伝子、または、これらの配列の一部分（部分）であり得る。保存された三次元構造をもたらすタンパク質ドメインは、通常、相同的な配列によってコードされており、多くの場合、特有のエキソンによってコードされることさえある。
【００３１】
大きな程度の不変性をそれらの配列において示す配列は、高度に保存されていると言われ、大きな程度の相同性をもたらす。
「遺伝子地図」は、生物のゲノム（好ましくは、植物のゲノム）におけるこれらの様々なヌクレオチド配列エレメントの構成である。
【００３２】
「生物学的サンプル」は、遺伝子改変植物の、または、起源が遺伝子改変植物である特異的な異なるおよび多数のヌクレオチド配列エレメントを含み得る任意の媒体を意味する。
【００３３】
例えば、かかる生物学的サンプルは、食品、食品成分または食品添加物であり得る。
【００３４】
生物学的サンプルはまた、遺伝子改変植物が混入し得る固体または液体の抽出物であり得る。生物学的サンプルは、あるタイプの遺伝子改変植物に特異的なこれらのヌクレオチド配列エレメントの抽出工程に供することができる。
【００３５】
用語「遺伝子改変植物」は、何らかの遺伝子改変、特に、その植物にとって外因性のエレメント（目的とする遺伝子および／または遺伝子マーカーに隣接するプロモーター配列およびターミネーター配列）を含むカセット配列の挿入を受けているすべてのタイプの植物に対応する。
【００３６】
発明の概要
本発明は、下記の工程を含む、生物学的サンプルにおける遺伝子改変植物に特異的な異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの同定および／または定量のための方法に関連する：
ａ．所望により、ヌクレオチド配列エレメントを生物学的サンプルから抽出する工程；
ｂ．少なくとも２つの異なる遺伝子改変植物に存在するヌクレオチド配列エレメントと相同的であるこのヌクレオチド配列エレメントを増幅することができるプライマー対を使用して、ヌクレオチド配列エレメントを標的ヌクレオチド配列に増幅またはコピーする工程；
ｃ．所望により、得られた標的ヌクレオチド配列を標識する工程；
ｄ．得られた標的ヌクレオチド配列を、不溶性の固体支持体に固体支持体表面の特定の位置で共有結合的連結によって結合している一本鎖の捕獲ヌクレオチド配列と接触させる工程；
ｅ．この標的ヌクレオチド配列の結合を、この標的ヌクレオチド配列と、特定の位置におけるその対応する捕獲ヌクレオチド配列との相補的な塩基対形成によるハイブリダイゼーションから生じるシグナルを検出することによって検出する工程、この場合、捕獲ヌクレオチド配列は、１ｃｍ２の固体支持体表面あたり少なくとも４つの異なる結合した一本鎖捕獲ヌクレオチド配列の密度を有して、アレイに従った特定の位置において不溶性の固体支持体に結合しており、また、捕獲ヌクレオチド配列は、検出および／または定量される標的ヌクレオチド配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能とする、１０塩基〜２００塩基（好ましくは、１０塩基〜４９塩基）を有する配列を含む；
ｆ．工程ｂ）〜工程ｅ）を、この遺伝子改変植物に特異的な第２、第３、第４以上の異なるヌクレオチド配列エレメントについて繰り返す工程；および
ｇ．遺伝子改変植物をこれらの異なるかつ多数のヌクレオチド配列エレメントの存在または非存在によって生物学的サンプルにおいて特定する工程。
【００３７】
本発明者らは、一部の適用について、マイクロアレイ検出と一緒の組み合わせられた特定の増幅の方法を使用して生物の遺伝子地図を明らかにすることによって、相同的な配列を有する、分析サンプルに存在する可能性がある多くの他の生物の中の１つまたはいくつかの生物の特定を大幅に簡略化することが可能であることを発見している。この方法は、コンセンサスプライマー対を使用する限定された数の増幅工程と、標的ヌクレオチド配列の存在（捕獲ヌクレオチド配列と、その対応する標的ヌクレオチド配列との間での結合）に対応し、かつ、検出された標的ヌクレオチド配列の存在を、検出および／または定量に供された生物学的サンプルにおける（微）生物に特異的なこれらのヌクレオチド配列エレメントの同定（存在または非存在）に相関させる単一シグナルのアレイ上での検出、定量および／または記録とを組み合わせている。
【００３８】
本発明による方法およびデバイスは、他の相同的な配列エレメントの中での生物の特異的なヌクレオチド配列エレメントの容易な同定／検出、および、可能であれば、その定量（生物学的サンプルにおけるこれらの生物のコピー数または存在の特長づけ）を可能にしている。
【００３９】
同定（特定）が、好ましくはアレイの形態で、支持体または基体の表面に存在する特異的な捕獲ヌクレオチド配列における結合の後に得られる。標的配列の同定（特定）が、可能性のある混入物（非結合の配列）を洗浄した後、１つの標的配列について、１つの特定の位置における単一スポットシグナルを検出し、所望により、記録することによって直接的に得られる（この場合、対応する捕獲ヌクレオチド配列は予め結合していた）。しかし、この場合、標的配列の同定は、マイクロアレイ上のスポットの複雑なパターンの分析の結果ではなく、また、増幅された標的配列のフラグメント化は要求されない。
【００４０】
一本鎖の標的配列、および、二本鎖の標的配列さえも、少なくとも２つの部分（１つが、固体支持体表面（好ましくは、非多孔性の支持体）に対する１つだけの好都合には事前に決定された（規定された）連結により結合したスペーサーである；もう一方の部分は、増幅されたヌクレオチド標的配列との相補的な塩基対形成によって特異的にハイブリダイゼーションすることができる特異的なヌクレオチド配列である）から構成される結合した捕獲ヌクレオチド配列を使用することによって、アレイ上の他の相同的な配列から高感度で都合良く識別することができる。
【００４１】
さらに、この検出は、高濃度の捕獲ヌクレオチド配列が固体支持体の表面に結合しているならば、大きく増大する。
【００４２】
本発明は、（生物学的サンプルに存在する可能性がある）生物学的生物またはその一部に由来する特異的なヌクレオチド配列エレメントを、他の異なる生物または変種から得られた少なくとも４つの他の相同的な（または同一の）ヌクレオチド配列エレメントから同定することに関連する。この場合、この他の生物は、同じ生物学的サンプルに存在し得、かつ、サンプルにおいて検出および／または定量されるエレメントと相同的または同一のヌクレオチド配列を有し得る。
【００４３】
この同定（サンプルにおけるこれらのエレメントの存在または非存在）が、最初に、数個のコンセンサスプライマー対によるヌクレオチド配列エレメントの遺伝子増幅、続いて（洗浄後）、これらの増幅工程から得られる可能な異なる増幅された標的配列の識別によって得られる。この識別は、所与の（特定および所定の）位置において固体支持体表面に結合した捕獲ヌクレオチド配列のアレイ上のハイブリダイゼーションによって都合良く得られる。
【００４４】
これらの標的配列の、予想された位置でのそれらの対応する捕獲ヌクレオチド配列における特異的な結合から得られるシグナル（この場合、１つの位置シグナルが、特異的な標的配列の結合について特異的である）を検出し、可能であれば、記録することによって、異なる標的ヌクレオチド配列の存在および／または非存在により、サンプルにおける異なる特異的なヌクレオチド配列エレメントの存在および／または非存在を決定することが可能になる。
【００４５】
本発明による方法はさらに、サンプルにおけるヌクレオチド配列エレメントの存在および／または非存在を、
・特定の生物、
・遺伝子改変生物（ＧＭＯ）、特に、遺伝子改変植物、
・配列における遺伝子特徴（変異、欠失、挿入）、
・生物学的サンプルが得られた患者（ヒトを含む）のガンを含む遺伝的疾患の診断的傾向または進展（モニタリング）
の存在および／または特定（同定）に相関させる工程を含む。
【００４６】
本発明による方法は、同一または非常に相同的である（好ましくは、８０％を超える相同性を有し、さらには、９０％を超える相同性さえ有する）それらの遺伝子配列のいくつかの一部分（エレメント）と、異なるいくつかの一部分とを有する生物学的サンプル中のＧＭＯまたは他の生物またはそれらの一部分の検出およびスクリーニングのために特に好適である。そのために、非常に多数のそのような生物がサンプルに存在し得る。
【００４７】
本発明は、１回のアッセイで、検出に続いて、存在および非存在について、アレイ上での（標的ヌクレオチド配列へのそれらの増幅の後での）ヌクレオチド配列エレメントの同定を可能にする。この検出は、好ましくは、これらの生物の遺伝子地図の決定に対して比較される。
【００４８】
実際、生物の異なる遺伝子地図における検出されたエレメントの一部またはすべての存在または非存在により、生物学的サンプルに存在する特定の生物の特定が可能になる。これらのエレメントの存在または非存在はまた、データバンクに示されたそれぞれの生物を正しく特定するための検索エレメントのすべての遺伝子地図を含むデータバンクまたはデータ表と相関させることができる。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明による方法はまた、特定の遺伝子エレメントを有するが、検出される生物のそれぞれの遺伝子地図を有するデータバンクの一部でないとして分類されている、ある科の一部である生物の検出および／または特定のための手段を提供する。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明による方法はまた、異なるエレメントの検出および／または同定、ならびに、生物の特定のときに得られた実験結果の分析のための手段を、コンピュータープログラムの形態で提供する。このプログラムはまた、好ましくはデータバンクに、検出される可能性がある生物のエレメントの組成を提供する。
【００５１】
好ましい実施形態において、生物の異なる遺伝子地図の要素は表に編成され、アッセイの結果が表のデータと１つずつ比較される。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、検索された生物のエレメント特徴のすべてについてではなく、１つまたはいくつかの検索エレメントを有する生物を決定するために好適である。その場合、その生物は不明生物として列挙される。
【００５３】
本発明は、好ましくは、現在のエレメントを含む表と、生物の特定を実験データから選び出すための方法とを必要とする。
【００５４】
特定の実施形態において、異なる生物に由来する配列が、同じプライマーによりまとめて、部分的に増幅され、得られた標的配列が、共通する捕獲配列において検出される。
【００５５】
別の実施形態において、異なる生物に由来する標的配列が、同じプライマーによりまとめて、または部分的に増幅されるが、特異的な捕獲配列において検出される。
【００５６】
さらなる別の好ましい実施形態において、アレイは、異なる生物の同じ（増幅された）標的ヌクレオチド配列について特異的な捕獲配列と、異なる生物から得られた同じ（増幅された）標的配列について共通する捕獲配列との両方を含有する。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、表Ｉおよび表ＩＩに示されるように、挿入された外因性のヌクレオチド配列エレメントを有するＧＭＯ植物に対して行われる。ＧＭＯのエレメントが、本発明の方法によって提供されるように検出される。特定の適用において、Ｐ３５ｓ、Ｔ−ｎｏｓ、ｎｐｔＩＩ、ｐａｔ、Ｃｒｙ１Ａｂ、ＥＰＳＰＳである６つのエレメント（またはそれらの一部分）が、実施例２において示されるように、６つのプライマーを用いて３つの異なるチューブで増幅される。この手段は、好都合には、ＣａＭＶの可能な存在を検出するための適切なコントロール、および、植物種の特定のための適切なコントロールを含む。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明は、（増幅された）標的ヌクレオチドの標的配列の数よりも多い数の生物を特定するための方法を提供する。この場合、検出することができる生物の数は、増幅の数＋少なくとも２であり、より良好には、増幅の数＋５であり、さらにより良好には、増幅の数＋１０以上である。
【００５９】
本発明の方法は、（表１の）９種のＧＭＯを検出および／または特定するために適用され、また、（表２の）２１種のＧＭＯを検出および／または特定するために適用される。
【００６０】
実施例３において検出される遺伝子エレメントを２つずつ比較することによってＧＭＯ生物を特定するための例が表３に示される。この例では、また、マイクロアレイにおいて検出される特定のエレメントを考えると、遺伝子マッピングは、別の生物に関して同一のマッピングを示した３つのＧＭＯ生物を除いて、それぞれのＧＭＯについて特異的である。表４に示される結果は、ＧＭＯを定量することができること、および、検出レベルが、サンプルに存在するＧＭＯの０．１％未満であることを示している。本発明の方法は、生物学的サンプルにおいて低い濃度で存在する生物の多数かつ複雑な分析のために特に好適である。
【００６１】
本発明によれば、遺伝子増幅のための好ましい方法は、増幅される特定の配列について、コンセンサスである２つの逆平行プライマーを使用するＰＣＲである。
【００６２】
検出および／または定量される生物は、得られた遺伝物質を含む任意の生物学的材料に存在し得る（ウイルス、菌類、細菌、植物細胞または動物細胞、ヒトを含む）。生物学的サンプルはまた、微生物、生体異物または汚染物質が存在する任意の培養培地、ならびに、植物または動物（ヒトを含む）の器官、組織、細胞または生物学的流体（血液、血清、尿など）から得られる抽出物であり得る。
【００６３】
本発明によるキットまたはデバイスはまた、本発明による方法を行うための様々な媒体またはデバイスを含むことができる。このキット（またはデバイス）はまた、自動装置（例えば、分析される生物学的サンプルに存在する多数のヌクレオチド配列を検出および／または定量するためのハイスループットスクリーニング装置など）に含めることができる。このキットまたは装置は、本発明による方法のすべての工程、または、いくつかの特定の工程のみを行うために適合化することができる。
【００６４】
本発明の診断キットおよび／または定量キットは、本発明の方法を行うための手段および媒体（好ましくは、一本鎖捕獲ヌクレオチド配列が結合している不溶性の固体支持体）を含むことができ、この場合、この一本鎖捕獲ヌクレオチド配列は、検出および／または定量されるＰ３５ｓヌクレオチド配列、Ｔ−ｎｏｓヌクレオチド配列、ｎｐｔＩＩヌクレオチド配列、ｃｒｙ１Ａｂヌクレオチド配列およびＥＰＳＰＳヌクレオチド配列のうちの少なくとも３つについて特異的な約１０塩基〜約２００塩基の間の配列を含有し、かつ、約３０塩基〜約６００塩基から構成される全長を有し、また、この一本鎖捕獲ヌクレオチド配列は、１ｃｍ２の固体支持体表面あたり少なくとも４つの一本鎖捕獲ヌクレオチド配列の密度でアレイに従って固体支持体の表面に配置される。
【００６５】
本発明による方法は、１ｃｍ２の固体支持体表面あたり少なくとも４つ（好ましくは少なくとも１０、１６、２０、５０、１００、１０００、４０００、１００００以上）の異なる捕獲ヌクレオチド配列の密度でアレイに従っていくつかの一本鎖捕獲ヌクレオチド配列が結合している（好ましくは、直接的な共有結合的連結によって、または、スペーサーの中間体によって固体支持体の表面に結合している）不溶性の固体支持体を少なくとも含む、特異的な同定（診断および／または定量）ためのキットまたはデバイスを使用することによって行うことができ、この場合、この捕獲ヌクレオチド配列は、好都合には、（スペーサーを含めて）約３０塩基〜約６００塩基から構成される長さを有し、かつ、標的について特異的である約１０塩基〜約６０塩基の配列を含有する（このことは、この配列のこの塩基は、相補的なハイブリダイゼーションによって標的の配列上においてそれらの相補的な塩基との結合を形成することができることを意味する）。好ましくは、このハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件のもとで（当業者に広く知られている条件のもとで）得られる。
【００６６】
本発明による方法（キット（デバイス）または装置）において、標的に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列の一部（または一部分）は、約１０塩基〜約６０塩基から、好ましくは約１５塩基〜約４０塩基から、より好ましくは約２０塩基〜約３０塩基から構成される。これらの塩基は、好ましくは、捕獲ヌクレオチド配列の末端または末端付近に位置する連続した配列として割り当てられる。この配列は、検出のための特異的な配列であると見なされる。本発明の好ましい形態において、特異的な捕獲ヌクレオチド配列と支持体との間に位置する配列は非特異的な配列である。
【００６７】
本発明による方法（キットまたはデバイス）において、捕獲ヌクレオチド配列は、１６塩基〜６００塩基（好ましくは３０塩基〜３００塩基、より好ましくは４０塩基〜１５０塩基）を有する配列であり、スペーサーは、少なくとも６．８ｎｍの長さ（少なくとも４個の炭素原子）を有する化学的な鎖、２０塩基を超える長さ（好ましくは５０塩基〜１５０塩基の長さ）のヌクレオチド配列、または、ヌクレオチド誘導体（例えば、ＰＭＡなど）である。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態において、捕獲ヌクレオチド配列は一本鎖として化学合成される。捕獲ヌクレオチド配列は、１００塩基よりも短いオリゴヌクレオチドまたは１００塩基よりも長いオリゴヌクレオチドのいずれかであっても、ポリヌクレオチドであり、一本鎖は、プログラム化された自動合成機で容易に合成される。そのような配列は、官能化基（例えば、支持体における共有結合的な結合のためのアミンまたはスルフィドなど）を高濃度で有することができる。
【００６９】
長い捕獲ヌクレオチド配列（典型的には１００ヌクレオチドを超え、または、さらには１５０ヌクレオチドを超える）は、好ましくは、（捕獲ヌクレオチド配列の特異的な部分と、非特異的な部分（スペーサー）とを含有するプラスミドに組み込まれた配列の）ＰＣＲ増幅によって合成される。
【００７０】
本発明による方法（キット（デバイス）または装置）は、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されるヌクレオチド配列（それらの全長について部分的または全体的に相同的である配列を含む）の検出および／または定量のために好適である。
【００７１】
本発明による方法（キット（デバイス）または装置）において、捕獲ヌクレオチド配列は、好都合には、好ましくは、本明細書中下記に記載されるように、それらの末端の１つによって、不溶性の固体支持体に共有結合的に結合する（または固定される）。
【００７２】
本発明による方法は、約１０ｎＭ未満の濃度で、約１ｎＭ未満の濃度で、好ましくは、約０．１ｎＭ未満の濃度で、より好ましくは０．０１ｎＭ（＝１ｆｍｏｌ／１００μｌ）未満の濃度で溶液に存在するアンプリコンを用いた同定（検出および定量）を可能にする十分な結果を与える。
【００７３】
本発明の別の重要な態様は、非常に高濃度の捕獲ヌクレオチド配列を表面において使用することである。アレイが、直径が約０．２ｎｍ〜０．４ｎｍである表面を有するスポットのために０．１ｎｌ〜１ｎｌの程度である非常に少ない体積の溶液をスポットすることによりロボットによって作製される。少なすぎるならば、結合の収率が直ちに低下し、検出できなくなる。スポット溶液における約６００ｎＭ〜約３０００ｎＭの間の捕獲ヌクレオチド配列の濃度が好ましい。しかしながら、約１００ｎＭもの低い濃度も依然として、有利な場合（共有結合による固定の収率が高いとき、または、検出される標的が一本鎖であり、高い濃度で存在するとき）には陽性の結果を与える。そのような低いスポット濃度は２０ｆｍｏｌ／ｃｍ２もの低い捕獲ヌクレオチド配列の密度を与える。他方で、より高い密度は捕獲溶液の濃度によってアッセイにおいて限定されただけであった。しかし、３０００ｎＭよりもさらに高い濃度は良好な結果を与える。
【００７４】
これらの非常に高い濃度および長いプローブの使用は本発明の２つの予想外の特徴的な特色である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの理論では、溶液における２つのＤＮＡ相補的配列の間でのハイブリダイゼーション速度はＤＮＡの長さの平方根に比例し、短い方が制限因子であることが提示されていた（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．およびＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｎ．、１９６８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３、５８４）。要求される特異性を得るために、捕獲ヌクレオチド配列の特異的な配列は、標的と比較して、小さくしなければならなかった。そのうえ、標的ヌクレオチド配列はＰＣＲ増幅後に得られ、二本鎖であった。その結果、標的ヌクレオチド配列は、溶液中では、拡散が低い固体支持体に固定された小さい配列にハイブリダイゼーションするよりもはるかに速く再会合し、従って、反応速度をさらに一層低下させる。同じ短い特異的な配列とのハイブリダイゼーションの収率における非常に大きい増大が認められることは予想外であった。
【００７５】
スポット上で「結合」する標的ヌクレオチド配列の量は、存在する捕獲ヌクレオチド配列の量と比較して、非常に小さい。従って、大過剰の捕獲ヌクレオチド配列が存在し、さらにより多くの捕獲ヌクレオチド配列の結合が得られる理由はなかった。
【００７６】
増幅またはコピーの後、そして、標識化が、標識されたヌクレオチドの取り込みによって行われるとき、全長配列に対する検出を行うことができ、より多くのマーカーが、ハイブリダイゼーションした標的に存在し、これにより、アッセイは高感度になる。
【００７７】
本発明による方法（キットおよび装置）は、他の結合した捕獲ヌクレオチド配列の使用を含むことができ、この場合、他の結合した捕獲ヌクレオチド配列は以前の特徴と同じ特徴を有することができ、また、（好ましくは、共通するプライマーによって増幅された）相同的な配列の別の一群から標的配列を同定するために使用することができる。
【００７８】
他の配列の検出は、好都合には、同じアレイにおいて、（すなわち、同じ標的についてのコンセンサスな捕獲ヌクレオチド配列とともに定量のために使用される標準的なヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることによって）行うことができる。この他の捕獲ヌクレオチド配列は、１０塩基〜６０塩基よりも長い特異的な配列および６００塩基もの大きい全長を（可能であれば）有し、また、不溶性の固体支持体に、（好ましくは、本発明に関連する他の結合した捕獲ヌクレオチド配列配列を用いて作製されたアレイにおいて）結合する。長い捕獲ヌクレオチド配列はまた、所与の遺伝子エレメントのすべての配列とのハイブリダイゼーションのためのコンセンサスな捕獲ヌクレオチド配列としてアレイ上に存在させることができ、従って、生物学的サンプルにおけるある科の生物の存在または非存在に関する情報を与える。
【００７９】
本発明による固体支持体は、ゲル層、ガラス、電子工学デバイス、シリコーン支持体もしくはプラスチック支持体、ポリマー、コンパクトディスク、金属支持体、またはそれらの混合物からなる群から選択される材料を用いて作製される（欧州特許ＥＰ０５３５２４２、米国特許第５７３６２５７号、国際特許出願公開ＷＯ９９／３５４９９、米国特許第５５５２２７０号などを参照のこと）。好都合には、この固体支持体は、本発明による方法を改善するためのさらなる手段（バーコード、マーカーなど）または媒体を含むことができる１枚のガラス製スライドである。
【００８０】
本発明による方法において使用される増幅工程は、好都合には、広く知られている増幅プロトコルによって得られ、好ましくは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＣＰＴ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＲまたはＡｖａｌａｎｃｈｅ  ＤＮＡ技術からなる群から選択される増幅プロトコルによって得られる。
【００８１】
好都合には、同定される標的ヌクレオチド配列は、一本鎖捕獲ヌクレオチド配列とのそのハイブリダイゼーションの前に標識される。（当業者から知られている技術による）この標識化はまた、（方法が増幅工程を含むならば）、好ましくは、変性前に、増幅された標的ヌクレオチド配列において得られる。
【００８２】
好都合には、標的ヌクレオチド配列の長さは、好ましくは５０塩基〜８００塩基（好ましくは１００塩基〜４００塩基、より好ましくは１００塩基〜２００塩基）の限定された長さであるように選択される。この好ましい要件は、サンプルに存在する可能性がある要求される配列を増幅するためのコンセンサスプライマーを見つけ出す可能性に依存する。長すぎるヌクレオチド配列標的は、より速く再配置し、捕獲ヌクレオチド配列における固定化を阻害し得る二次構造を取ることがある。
【００８３】
遺伝子の検出はまた、本発明の好ましい適用である。相同的な遺伝子の検出が、本発明において記載されるように、最初にｍＲＮＡの逆転写、次いでコンセンサスプライマーによる増幅によって得られる。
【００８４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法（キット（デバイス）または装置）は、好都合には、生物学的サンプルに一緒または別々に存在する異なるＧＭＯの特定のために使用され、この場合、この特定は、植物または動物または細菌または酵母にそれらのゲノムの遺伝子改変によって組み込まれているヌクレオチド配列エレメントを検出することによって得られる。
【００８５】
好ましくは、プライマーと、増幅および検出されるこのＧＭＯ配列の特定の一部とが、実施例２および実施例３に示される。これらのプライマーにより、下記のヌクレオチドエレメント（Ｐ３５ｓ、Ｔ−ｎｅｏ、ｎｐｔＩＩ、ｐａｔ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＥＰＳＰＳ）のうちの少なくとも３つの部分的配列または配列全体が、サンプルに存在するときには増幅され、その後、アレイにおいて検出された。
【００８６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法（キット（デバイス）または装置）は、好都合には、ＢＴ１１、ＢＴ１７６、Ｇａ２１、Ｍｏｎ８１０、ＲＲＳ、Ｔ２５、Ｔ４５、Ｔｏｐａｓ１９／２、Ｓｔａｒｌｉｎｋ、ＮＫ６０３、ＧＴ７３、Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ  Ｌ６２、Ｆａｌｃｏｎ  ＧＳ４０／９０、ＭＳ１−ＲＦ１、ＭＳ１−ＲＦ２、ＭＳ８−ＲＦ３、１４４５、５３１、Ｍｏｎ８６３、Ｍｏｎ８１０ｘＭＯＮ８６３、ＴＣ１５０７およびＭａｉｓｇａｒｄ／ＲＲのうちの少なくとも４つのＧＭＯ植物の特定のために使用される。
【００８７】
９種の植物ＧＭＯの本発明による検出が表１ならびに実施例２および実施例３に示される。検出および特定を行うためのアレイが図１に示される。同様に、２１種の植物ＧＭＯの検出が表２に示され、ＧＭＯを個々に特定するためのデータバンクが表３に示される。ＧＭＯのリストが、ＢＡＴＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｍｏ−ｗａｔｃｈ．ｏｒｇ／ｇｍｏ−ｗａｔｃｈ／ＧＶＯ−ｒｅｐｏｒｔ１４０７０３．ｐｄｆ）およびＡｇＢｉｏｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｂｉｏｓ．ｃｏｍ／ｄｂａｓｅ．ｐｈｐ）などのデータベースに示される。
【００８８】
データバンクはまた、ＧＭＯに存在するヌクレオチド配列エレメントの一覧を提供する。既知または不明の概念は、通常、食品、穀物または動物飼料における許容されたＧＭＯまたは許容されないＧＭＯに関連づけられる。許容されたＧＭＯは広く知られており、それらの遺伝子地図における遺伝子エレメントの存在が知られている。許容されないＧＭＯは演繹的に不明である。本発明は、不明ＧＭＯの存在を、その正体の予測とともに、または、その正体の予測を伴うことなく検出することを可能にする。
【００８９】
アレイ上でのハイブリダイゼーションの後、標的ヌクレオチド配列は現在の技術によって検出することができる。標識化を伴わない場合、好ましい方法は、現在はアレイに適合化されている質量分析法（米国特許第５８２１０６０号）によるか、または、薬剤を介在させ、その後、蛍光検出を行うこと（国際特許出願公開ＷＯ９７／２７３２９、または、Ｆｏｄｏｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５５頁（１９９３））による標的の同定である。
【００９０】
標識された関連する検出は多数である。異なる標識分子の総説が国際特許出願公開ＷＯ９７／２７３１７に示される。標識分子は、既に標識されているプライマーを使用して、あるいは、標識されているヌクレオチドをコピー工程または増幅工程の期間中に取り込むことによって得られる。標識化はまた、検出可能な成分を、調べられるＲＮＡまたはＤＮＡに連結することによって得ることができる（リガーゼによって配列の末端に連結される標識されたオリゴヌクレオチド）。ＲＮＡまたはＤＮＡのフラグメントもまた、キナーゼ、トランスフェラーゼまたは同様な酵素を使用して、その５’ＯＨ端または３’ＯＨ端に標識ヌクレオチドを取り込むことができる。
【００９１】
最も頻繁に使用され、かつ好まれる標識は、市販のアレイスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ）を使用することによってアレイを分析するために好適である、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７のような蛍光色素である。
【００９２】
放射性標識化、非放射性標識化、または、特異的なリガンド（ストレプトアビジンまたは抗体）によりその後で認識される小分子による間接的な標識化は一般的な方法である。アレイ上での標的固定化の生じるシグナルは、蛍光性、比色的、拡散、エレクトロルミネセンス的、生物発光的または化学発光的、磁気的、電気的（例えば、インピドメトリー的）またはボルタンメトリー的である（米国特許第５３１２５２７号）。好ましい方法は、沈殿物を得るために、結合した標的を金で標識すること、または、後でスキャナーによって容易に検出および定量される銀染色の使用に基づく。
【００９３】
定量は、アレイ上におけるハイブリダイゼーション収率および検出規模（これは、標的ヌクレオチド配列および参照配列について同一である）だけでなく、抽出工程、増幅（またはコピー化）工程および標識化工程をも考慮に入れなければならない。
【００９４】
本発明による方法はまた、既知の濃度で加えられた標準のヌクレオチド配列（外部標準または内部標準）を使用することによる標的ヌクレオチド配列の定量を得るための手段を含むことができる。捕獲ヌクレオチド配列はまた、（おそらくは、増幅またはコピー化の後で）標的ヌクレオチド配列と同じ条件で標準物を固定するようにアレイ上に存在する；本発明による方法は、捕獲ヌクレオチド配列と標準物との間での相補的な塩基対形成により形成される二本鎖ヌクレオチド配列の形成から生じるシグナルを定量する工程と、生物学的サンプルにおける検出および／または定量されるヌクレオチド配列エレメントの存在を定量するために、二本鎖ヌクレオチド配列の形成から生じるシグナルを、捕獲ヌクレオチド配列と標的との間での相補的な塩基対形成により形成される二本鎖ヌクレオチド配列から生じるシグナルを用いて相関分析する工程とを含む。
【００９５】
好都合には、標準物は、生物学的サンプルにおいて加えられるか、または、抽出工程の後で加えられ、そして、同じプライマーにより増幅またはコピーされ、かつ／あるいは、標的ヌクレオチド配列と同一であるか、または、標的ヌクレオチド配列に対して最大でも２０％しか違わない長さおよびＧＣ含有量を有する。より好ましくは、標準物は、国際特許出願公開ＷＯ９８／１１２５３の文書に見出される内部標準の特徴を有する競合的な内部標準として設計される。このような内部標準は、標的に対して共通であるその配列の一部分と、異なる特異的な一部分とを有する。内部標準はまた、標的ヌクレオチド配列の増幅またはコピーのために使用される２つのプライマーの相補的である配列をその２つの末端はまたはその近くに有し、また、類似するＧＣ含有量を有する（国際特許出願公開ＷＯ９８／１１２５３）。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態において、標準物および標的ヌクレオチド配列の共通する部分は、同じプライマーにより増幅されたすべての標的ヌクレオチド配列に対して相同的であるヌクレオチド配列（すなわち、定量される同じ科または生物に属するヌクレオチド配列）を意味する。
【００９７】
好ましくは、この特異的な配列による標準物のハイブリダイゼーション収率は標的配列のハイブリダイゼーション収率と同一であるか、または、標的配列のハイブリダイゼーション収率から最大でも２０％しか違わず、定量が、国際特許出願公開ＷＯ９８／１１２５３に記載されるように得られる。
【００９８】
この標準のヌクレオチド配列（外部標準および／または内部標準）はまた、好都合には、おそらくは、本発明による異なる工程を行うために必要なすべての媒体および手段（ハイブリダイゼーション媒体および培養培地、ポリメラーゼおよび他の酵素、標準配列、標識分子など）とともに、キット（デバイス）または装置に含められる。
【００９９】
好都合には、バイオチップはまた、特定のプライマー対によって増幅されている特異的に増幅された標的ヌクレオチド配列のいくつかを特異的に検出するためのスポットを含有する。そのようなスポットは、好ましくは、１つの生物の特定を確認するために、あるいは、非常に相同的または同一のヌクレオチド配列エレメントを有する２つの生物を識別するために加えられる。
【０１００】
好都合には、バイオチップはまた、様々な濃度（すなわち、４つ）の標識された捕獲ヌクレオチド配列を有するスポットを含有する。これらの標識された捕獲ヌクレオチド配列は既知濃度の溶液からスポットされ、それらのシグナルにより、ハイブリダイゼーションの結果を絶対量に転換することが可能になる。標識された捕獲ヌクレオチド配列はまた、検出の再現性について試験することを可能にする。
【０１０１】
固体支持体（バイオチップ）は、マイクロ流体工学技術の使用に基づく液体溶液の制御を介して別のチャンバーおよび自動装置につながれた支持体に挿入することができる。そのようなマイクロラボラトリー系に挿入されることによって、固体支持体（バイオチップ）は、前工程（例えば、ＤＮＡの抽出、ＰＣＲによる増幅）または後工程（標識化および検出）についてさえ、自動化された装置によって、インキュベーション、加熱、洗浄および標識化することができる。すべてのこれらの工程を同じ固体支持体において行うことができる。
【０１０２】
好都合には、バイオチップはまた、植物種の検出および／または特定および／または定量のための捕獲ヌクレオチド配列を含有し、特定の実施形態では、植物の特定はまた、植物種の特異的な特定のＧＭＯを特定するために使用される。
【０１０３】
特定の実施形態において、植物または生物の特定のヌクレオチド配列エレメントが、植物または生物の特定のために使用され、また、特別な実施形態ではＧＭＯのために使用される。
【０１０４】
生物の定量は、好ましくは、その生物に存在する遺伝子エレメントについてのシグナルを定量することによって行われる。
【０１０５】
別の実施形態において、１つの生物の定量が、その生物に特異的な標的ヌクレオチド配列の量を科に特異的な標的ヌクレオチド配列に対して比較することによって、その科に対して行われる。より具体的には、ＧＭＯの定量が、植物マーカーと比較して、サンプルに存在する特定のＧＭＯエレメントの量を比較することによって行われる。これら２つの間での比率により、サンプルにおける１つの植物種のＧＭＯの割合を計算することできる。
【０１０６】
好都合には、特定の生物の定量が、生物に特異的な標的の量を、分析溶液に加えられた標準物の所与のコピー数と比較することによってサンプルにおけるコピー数に関して行われる。好ましい実施形態において、遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントの定量が、既知のコピー数でアッセイ法に組み込まれた標準配列の定量と比較される。別の実施形態では、遺伝子改変植物に特異的なヌクレオチド配列エレメントの定量が植物の非形質転換部分の遺伝子または配列の定量と比較される。
【０１０７】
特定の実施形態において、定量が、テールの付いた（ｔａｉｌｅｄ）プライマーを使用するＰＣＲ、次いで、テールに対して同一または相補的な第２のプライマーを使用するＰＣＲによる標的ヌクレオチド配列および標準物の増幅の後で行われる。テールの付いた第１のプライマーは、共通するテールを有しており、Ｋｎｕｔ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００３（６月１日）、３１：ｅ６２）によって記載されるように、特定のエレメントおよび標準物または植物マーカーに対して向けられる。増幅は、最初、テールの付いたプライマーを用いて５サイクル〜２０サイクルにわたって行われ、次いで、テールの付いたプライマーを破壊し、プライマーを加えた後、５サイクル〜４０サイクルにわたって行われる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、増幅は、テールの付いたプライマーと、共通のテールプライマーとの適切な比率（少なくとも１／５であり、好ましくは１／１０である）の使用を考えると、第１のプライマーを何ら破壊することなく、増幅の開始からともに存在するテール付プライマーおよび第２のテールプライマーを用いて行われる。
【０１０９】
好都合には、ＧＭＯのための定量法および検出法は、非ＧＭＯ植物と比較して、ＧＭＯがサンプルに０．１％〜５％存在する範囲で行われる。標準化の典型的な標準曲線は、非ＧＭＯ種における０．１％、０．５％、１％、２％および５％のＧＭＯの範囲にあるＧＭＯサンプルを含む。既知のＧＭＯ含有サンプルの標識化および／または検出のための調節は０．９％および０．５％の範囲にある。不明ＧＭＯは、商業化について許容されると認められないＧＭＯであり、サンプルにおいて見出すことができない。検出法は、０．１％もの低いそのような不明ＧＭＯをサンプルにおいて検出することが要求される。
【０１１０】
本発明は、添付された図を参照して下記の非限定的な実施例において詳しく記載される。
【０１１１】
図１は様々なＧＭＯの異なるエレメントを検出するための、また、実施例３において提供されるようなそれらのスクリーニングおよび特定のためのアレイの設計を表す。
【０１１２】
図２は本発明において提供されるアレイによる２つのＧＭＯの分析に対する結果の一例を示す。
【０１１３】
図３は本発明において提供されるアレイによる２つのＧＭＯの分析に対する結果の一例を示す。
【０１１４】
図４は本発明において提供されるアレイによる様々な濃度でのいくつかのＧＭＯの分析の全体的な結果を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１５】
実施例
実施例１：アレイでの標的配列の検出
捕獲ヌクレオチド配列および標的の作製
標的ヌクレオチド配列を、下記のプロトコルを使用するＰＣＲ増幅によって得る。
【０１１６】
ＰＣＲを、１Ｘ緩衝液Ｂｉｏｔｏｏｌｓ（２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μＭの各プライマー（プライマーの１つがビオチン化されている）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＰ、ｄＧＴＰ、および４００μＭのｄＵＴＰを含む）、１．２５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＢｉｏｔｏｏｌｓ、および０．５ＵのＵＮＧを含有する２５μｌの最終体積で行う。サンプルを最初に２２℃で１０分間インキュベーションし、その後、９４℃で５分間変性する。その後、９４℃で３０秒、５６℃で４０秒および７２℃で１分からなる３５サイクルの増幅を行い、７２℃で１０分間の最後の伸長を行う。ＵＮＧとのインキュベーションを２０℃で１０分間行い、不活性化を９５℃１０分間行う。水のコントロールを増幅の陰性コントロールとして使用する。捕獲ヌクレオチド配列の配列は一本鎖ヌクレオチドである。
【０１１７】
バイオチップはまた、それらの対応する捕獲ヌクレオチド配列においてハイブリダイゼーションしたＣ２ｂ２遺伝子のビオチン化されたポリヌクレオチドである陽性コントロールと、捕獲非特異的ヌクレオチド配列である陰性コントロールとを含有する。
【０１１８】
捕獲ヌクレオチド配列の固定化
アミン化ＤＮＡをアルデヒド誘導体化ガラスに結合するために、Ｓｃｈｅｎａ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１０６１４（１９９６））によって記載されるプロトコルに従った。アミン化された捕獲ヌクレオチド配列を、１５０ｎＭ〜３０００ｎＭに及ぶ濃度での溶液からスポットした。捕獲ヌクレオチド配列を、自家製のロボットデバイスを用いて、シリル化された顕微鏡用スライドガラスに印刷した（Ｇｅｎｅｔｉｘ（英国）から得られる２５０μｍのピン、および、Ｃｅｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、米国）から得られるシリル化された（アルデヒド）顕微鏡用スライドガラス）。スポットは直径が４００μｍであり、分注された体積は約０．５ｎｌである。スライドガラスを室温で乾燥し、使用するまで４℃で保存した。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション
アレイをハイブリダイゼーションフレームで覆い、製造者（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）により提案されるように処理する。５０μｌのハイブリダイゼーション溶液（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＨｙｂｒｉＢｕｆｆｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ）において、アンプリコン、ブロッキングハイブリダイゼーション溶液、陽性のハイブリダイゼーションコントロールおよび少量の水を含有する４５μｌの溶液を加えた。増幅された標的ヌクレオチド配列の体積を、要求される検出レベル、および、取り込まれるアンプリコン溶液の数に従って調節した。典型的な実験を、それぞれが９μｌの４つのアンプリコン溶液を用いて行った。最終溶液を、ハイブリダイゼーションチャンバーにより枠取りされたアレイに負荷した。陽性コントロールのために、２ｎＭの２７ｂｐのビオチン化Ｃ２ｂ２プローブを溶液に加え、一方で、それらの対応する捕獲ヌクレオチド配列をアレイにスポットした。アレイを、０．５ＮのＮａＯＨと事前にインキュベーションすることによって予備変性した。ハイブリダイゼーションを６０℃で１時間行った。スライドガラスを洗浄緩衝液により４回洗浄した。
【０１２０】
比色法による検出
ガラスサンプルを、ブロッッキング緩衝液に１０００ｘ希釈されたコロイド状金により標識されたストレプトアビジンの８００μｌと室温で４５分間インキュベーションした。洗浄緩衝液による５回の洗浄の後、金の存在を、染色用の発色溶液（Ｓｉｌｖｅｒｑｕａｎｔ試薬、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して銀を還元する触媒反応のために役立てた。スライドガラスを、ＳｉｌｖｅｒｑｕａｎｔのＡ液およびＢ液の発色混合物と５分間、１回インキュベーションし、その後、水により洗浄し、乾燥し、マイクロアレイリーダーを使用して分析した。その後、各アレイ（スライドガラス）を特定の定量ソフトウエアによって定量した。
【０１２１】
蛍光検出
ガラスサンプルを、Ｃｙａｎｉｎ３またはＣｙａｎｉｎ５により標識されたストレプトアビジンと室温で４５分間インキュベーションした。洗浄後、ガラスサンプルを乾燥し、その後、室温で保存した。検出をアレイスキャナーＧＳＭ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、米国）において行った。その後、各アレイ（スライドガラス）を特定の定量ソフトウエアによって定量した。
【０１２２】
実施例２：アレイにおけるＧＭＯ標的配列の検出
ＧＭＯの遺伝子エレメントの分析
実験を、実施例１において提案されるように行う。下記のエレメントを増幅するための３つのＰＣＲを行う：
2006345855.tif 000002
下記の特異的配列が、検出される異なるエレメントのための捕獲ヌクレオチド配列において存在する：
2006345855.tif 000003
【０１２３】
捕獲ヌクレオチド配列のｃｒｙ１はＢＴ１７６について特異的であり、ｃｒｙ２はＭｏｎ８１１０について特異的であり、ｃｒｙ３はＢＴ１１について特異的である。捕獲ヌクレオチド配列のＥＰＳＰＳ７はＧＡ１について特異的であり、ＥＰＳＰＳ２はＲＲＳについて特異的である。
【０１２４】
バイオチップはまた、植物種の検出を含む。増幅を別個のチューブで行う。
【０１２５】
Ｒｕｂｉｓｃｏアクチバーゼおよびスクロースシンターゼについてのコンセンサスプライマーは下記の通りである：
2006345855.tif 000004
植物種の検出のための捕獲ヌクレオチド配列は下記の通りである：
６つの植物種を特異的に特定するための捕獲プローブ：
2006345855.tif 000005
【０１２６】
実施例３：植物の特異的な特定を含むアレイにおけるＧＭＯ標的配列の検出
ＧＭＯの検出を、実施例２に記載されるように、３つのＰＣＲと、捕獲プローブとを用いて行う。下記の実施例では、第４のＰＣＲが植物種の分析のために加えられる。
2006345855.tif 000006
以下の特定の配列が捕獲プローブ上に存在する。
2006345855.tif 000007
2006345855.tif 000008
2006345855.tif 000009
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2006345855.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】様々なＧＭＯの異なるエレメントを検出するための、および実施例３において提供されるようなそれらのスクリーニングおよび特定のためのアレイの設計を表す。
【図２】本発明において提供されるアレイによる２つのＧＭＯの分析に対する結果の一例を示す。
【図３】本発明において提供されるアレイによる２つのＧＭＯの分析に対する結果の一例を示す。
【図４】本発明において提供されるアレイによる様々な濃度でのいくつかのＧＭＯの分析の全体的な結果を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号１は、フォワードＴｎｏｓプライマーの配列である。
配列番号２は、リバースＴｎｏｓプライマーの配列である。
配列番号３は、フォワードＰ３５Ｓプライマーの配列である。
配列番号４は、リバースＰ３５Ｓプライマーの配列である。
配列番号５は、フォワードｎｐｔＩＩプライマーの配列である。
配列番号６は、リバースｎｐｔＩＩプライマーの配列である。
配列番号７は、ＰＣＲコントロールのフォワードプライマーの配列である。
配列番号８は、ＰＣＲコントロールのリバースプライマーの配列である。
配列番号９は、フォワードＣａＭＶプライマーの配列である。
配列番号１０は、リバースＣａＭＶプライマーの配列である。
配列番号１１は、フォワードＰｎｏｓ−ｎｐｔＩＩプライマーの配列である。
配列番号１２は、リバースＰｎｏｓ−ｎｐｔＩＩプライマーの配列である。
配列番号１３は、フォワードＰａｔプライマーの配列である。
配列番号１４は、リバースＰａｔプライマーの配列である。
配列番号１５は、フォワードＣｒｙ１Ａｂプライマーの配列である。
配列番号１６は、リバースＣｒｙ１Ａｂプライマーの配列である。
配列番号１７は、ＥＰＳＰＳプライマー１の配列である。
配列番号１８は、ＥＰＳＰＳプライマー２の配列である。
配列番号１９は、ＥＰＳＰＳプライマー３の配列である。
配列番号２０は、Ｐ３５Ｓ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、Ｔｎｏｓ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、ｎｐｔＩＩＡ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ｇｕｔ（ＰＣＲコントロール）捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、Ｐａｔ１捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、ｃｒｙ１捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、ｃｒｙ２捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、ｃｒｙ３捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、ｅｐｓｐｓ７捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、ｅｐｓｐｓ８捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、ｎｐｔＩＩｈ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、ＣａＭＶ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、フォワードｒｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ遺伝子プライマーＰｒａ１の配列である。
配列番号３３は、リバースｒｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ遺伝子プライマーＰｒａ２の配列である。
配列番号３４は、フォワードスクロースシンターゼ遺伝子プライマーＰｓｓ１の配列である。
配列番号３５は、リバースｒｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ遺伝子プライマーＰｓｓ２の配列である。
配列番号３６は、トウモロコシＴＰｓｓ８捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、ダイズＴＰｓｓ９捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、コメＴＰｓｓ７捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、ナタネＯＴＲｃｏ１２捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、トマトＰＴＲｔｏｍ４捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、テンサイＰＴＲｂｅｔｔ２捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号４２は、フォワードダイズレクチンプライマーの配列である。
配列番号４３は、リバースダイズレクチンプライマーの配列である。
配列番号４４は、フォワードナタネクルシフェリンプライマーの配列である。
配列番号４５は、リバースナタネクルシフェリンプライマーの配列である。
配列番号４６は、フォワードトウモロコシインベルターゼプライマーの配列である。
配列番号４７は、リバーストウモロコシインベルターゼプライマーの配列である。
配列番号４８は、フォワードトマトｒＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号４９は、リバーストマトｒＤＮＡプライマーの配列である。
配列番号５０は、フォワード植物一般Ｒｂｃ１プライマーの配列である。
配列番号５１は、リバース植物一般Ｒｂｃ１プライマーの配列である。
配列番号５２は、ダイズレクチン捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号５３は、ナタネクルシフェリン捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号５４は、トウモロコシインベルターゼ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号５５、トマトｒＤＮＡ捕獲ヌクレオチド配列である。
配列番号５６は、一般植物捕獲ヌクレオチド配列である。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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