(57)【要約】【課題】本発明は、目的抗原（単数又は複数）をコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物中に導入することを含んでなる、脊椎動物を免疫化する方法に関する。【解決手段】宿主脊椎動物によるこの転写ユニットの取込みの結果として、目的の抗原（単数または複数）の発現が生じ、これにより体液性もしくは細胞性免疫応答、又は体液性及び細胞性免疫応答の両方が誘導される。誘導された体液性及び細胞性免疫応答は病原体による感染に対する防御を提供し、抗腫瘍応答を提供し、又は避妊を提供する。宿主は脊椎動物、鳥類、ヒトを含む哺乳動物のいずれでもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロタウイルス又は免疫不全ウイルスに対する防御的免疫応答を誘導することによる脊椎動物免疫化に使用するための医薬の製造における、プロモータ領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットの使用であって、この防御的免疫応答が目的抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答であるＤＮＡ転写ユニットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質、病原体、又は感染体に対し脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物を免疫化し、これにより該蛋白質の活性を妨害し、又は感染体の拡散及び増殖を制限し、そして病原体もしくは感染体によるその後のチャレンジに対する防御を可能とする体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不活性化生物もしくは減弱化生物又はそれらの産物でワクチン投与することは、宿主の耐性を強化する有効な方法であることが証明され、そして最終的にはある種の普通にみられる深刻な感染性疾病の根絶をもたらした。ワクチンの使用は宿主内の特異的免疫応答の刺激又は既に形成された抗体の移行に基づく。ある種の疾病、例えば灰白髄炎などのワクチンによる予防は免疫学の最大の勝利の一つである。
【０００３】
効果的なワクチンは、家畜やヒトに病気を惹起する感染体のうちの比較的少数に対してしか開発されてこなかった。このことは病原体の毒性株の生育及び減弱化を巡る技術的問題を反映している。最近、サブユニットワクチン（病原体からの特定の抗原のみを宿主に提示するワクチン）の開発に努力が傾けられている。サブユニットワクチンは事実上の副作用の存在なしに高レベルの防御を達成する潜在能力を有する。サブユニットワクチンは安定な、投与し易い、そして広範な使用に対する十分な費用−効果性のあるワクチンの開発のための機会をも提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はサブユニットワクチン化の１方法を提供する。具体的には、本発明は個体を免疫化する方法であって、目的抗原（単数又は複数）をコードするＤＮＡ及び転写用プロモーター部分（単数又は複数）をコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニット（単数又は複数）を個体中に導入することを含む方法に関する。単一の転写ユニット又は多重転写ユニットは、１個の抗原又は多重抗原に対する免疫化を達成するために個体に導入することができる。宿主細胞によるＤＮＡ転写ユニットの取込みの結果として目的の抗原（単数又は複数）の発現が生じ、これにより体液性免疫応答又は細胞性免疫応答又は体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘導する。誘導された体液性及び細胞性免疫応答は病原体による感染に対する防御を提供し、抗腫瘍応答を提供し、又は避妊を提供することができる。宿主は脊椎動物、鳥類、又はヒトを含む哺乳動物のいずれでもよい。
【０００５】
本発明は、免疫応答を高めることを目的とするＤＮＡ転写ユニットの使用に関する。一つの態様においては、個体は非経口的接種経路により免疫化される。非経口的接種経路としては、ＤＮＡ転写ユニットの静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、及び皮下投与などが挙げられる。皮膚に投与されたＤＮＡはＤＮＡ銃(DNA gun) を用いて送達することができる。第二の態様においては、ＤＮＡ転写ユニットが粘膜表面により取り込まれる（すなわち、粘膜表面の細胞中に入る）ようにＤＮＡ転写ユニットを呼吸粘膜表面などの粘膜表面と接触させることにより個体を免疫化する。粘膜投与のためのＤＮＡは微小体でカプセル化することができる。
【０００６】
本発明の方法により導入されるＤＮＡ転写ユニットは、ウイルス、細菌、カビ、又は寄生体などの感染体によりコードされる抗原、並びに病原体による感染に対し個体を免疫化する際に有効であることが実験的に確認された抗原性断片及びペプチドを発現するために使用することができる。上述したように、ＤＮＡ転写ユニットは避妊目的又は抗ガン治療の目的のためにも使用することができる。
【０００７】
発現の対象となる目的抗原は、免疫原として使用される抗原が内部型、表面型、分泌型、又は出芽(budding) 型及び集合型となるように設計することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は、
ロタウイルス又は免疫不全ウイルスに対する防御的免疫応答を誘導することによる脊椎動物免疫化に使用するための医薬の製造における、プロモータ領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットの使用であって、この防御的免疫応答が目的抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答であるＤＮＡ転写ユニットの使用
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
免疫化のためにＤＮＡを使用することの利点は多数ある。例えば、ＤＮＡによりコードされるいかなる抗原に対しても免疫化を行うことが可能となる。さらに、ＤＮＡにコードされた抗原はその天然状態における「純粋な」抗原として発現され、そして宿主細胞による正常な修飾を受ける。また、ＤＮＡは容易にそして安価に操作され、広範囲の温度にわたり乾燥産物として又は溶液状で安定である。従ってこの技術は、高度に効果的なサブユニットワクチンの開発に価値がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、蛋白質、病原体、又は感染体に対し脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物を免疫化し、これにより該蛋白質の活性を妨害し、又は感染体の拡散及び増殖を制限し、そして病原体もしくは感染体によるその後のチャレンジに対する防御を可能とする体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導する方法に関する。本発明の方法においては、免疫化を必要とする個体にＤＮＡ転写ユニットが投与される。
【００１１】
「免疫化」という言葉は、本明細書においては感染体によって惹起される感染（すなわち、病気）の発現を（部分的に又は完全に）防御する脊椎動物内での免疫応答の産生を指す。即ち、本発明により免疫化された脊椎動物は感染しないか又は免疫化されていない場合に起こるであろうよりもより軽度に感染する。
【００１２】
ＤＮＡ転写ユニットは、開始部位と終結部位とにより限界付けられるポリヌクレオチドであり、それは転写されて一次転写物を産生する。本明細書において用いられるとき、「ＤＮＡ転写ユニット」とは、少なくとも二つの成分を含む。抗原コードＤＮＡと転写プロモーター要素（単数又は複数）である。抗原コードＤＮＡは１個の抗原又は多重ＨＩＶ抗原や２又はそれ以上の異なる蛋白質もしくは感染体由来の抗原などの多重抗原をコードすることができる。このＤＮＡ転写ユニットは、このＤＮＡ転写ユニットの複製のための配列を含むベクター中に付加的に挿入することができる。ＤＮＡ転写ユニットはエンハンサー要素、スプライシングシグナル、終結シグナルやポリアデニル化シグナル、ウイルスレプリコンや細菌のプラスミド配列などの付加的な配列を随時含めることができる。本発明の方法では、一つのＤＮＡ転写ユニット（即ち、転写ユニットの１タイプ）を投与することができ、あるいは２種以上のＤＮＡ転写ユニットの組み合わせを投与することもできる。
【００１３】
ＤＮＡ転写ユニットは幾つかの既知の方法により作成することができる。例えば、既知の方法を用いて目的抗原をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。マニアティス（Maniatis) ら、モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル，２版、コールド・スプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９）を見よ。
【００１４】
ＤＮＡ転写ユニットは、ＤＮＡの取込みを増進し接種部位の免疫系細胞を補充する能力を有するアジュバントもしくは他の物質の存在下に個体に投与もしくは接種することができる。ＤＮＡ転写ユニットそれ自体は宿主細胞により提供される転写因子により又は転写ユニットにより提供される転写因子により宿主細胞中で発現させられることを理解すべきである。
【００１５】
「目的抗原」とは感染体により発現されるいかなる抗原又は抗原の組み合わせでもよく、あるいは防御的応答を誘導する能力をもつことが明らかとなったいかなる抗原又は抗原の組み合わせであってもよい。目的抗原は腫瘍抗原又は妊娠に対する予防を提供する抗原であってもよい。抗原（単数又は複数）は、天然に生ずるものでも、突然変異を受けたもの又は特異的に修飾されたものでもよい。抗原（単数又は複数）は、感染体のサブグループ（clades) 、サブタイプ又は血清型などの異なる形をとることができる。これらの抗原は細胞又は感染体の構造的成分であってもよく、そうでなくてもよい。コードされる抗原は、翻訳産物すなわちポリペプチドである。ポリペプチドは種々の長さをとることができる。それらはグリコシレーション、ミリストイレーション（myristoylation )又はホスホリレーションなどの正常宿主細胞による修飾を受けることができる。また、それらは細胞内発現、細胞外発現又は細胞表面発現を受けるように設計することもできる。さらに、それらが集合（assembly) を受け、細胞から放出されるように設計することができる。
【００１６】
それに対しＤＮＡ転写ユニットを用いることができる病原体の可能性のあるものとしては、ウイルス由来のＤＮＡコード抗原、クラミディア、マイコプラズマ、細菌、寄生体、又はカビが挙げられる。ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、ライノウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニアウイルス、ルベラウイルス、レオウイルス、ヘパドナウイルス、及びサル免疫不全ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスなどを含むレトロウイルスが挙げられる。細菌としては、ミコバクテリア、スピロヘータ、リケッチャ、クラミディア、及びマイコプラズマが挙げられる。カビとしては、酵母及び糸状菌が挙げられる。寄生体としてはマラリアが挙げられる。このリストは、本明細書に記載された方法によりそれに対し防御的免疫応答を創出することができる、可能性のある病原体のすべてを網羅するものではない。
【００１７】
個体には、いかなる非経口的経路により接種することもできる。例えば、個体には、静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋肉内の諸方法により又は遺伝子銃により接種することができる。個体には粘膜経路により接種することができる。ＤＮＡ転写ユニットは、ＤＮＡ含有点鼻剤、吸入剤、座剤などの種々の方法により、又は微小体によりカプセル化したＤＮＡにより粘膜表面に投与することができる。例えば、ＤＮＡ転写ユニットは鼻孔や気管などの呼吸粘膜表面に投与することができる。
【００１８】
生理食塩水などの生理学的に適合性のある適当な媒体は、いずれもＤＮＡ転写ユニットを個体に導入するのに適している。
【００１９】
本明細書に記載されたような免疫化は、異なる蛋白質を発現する多様なＤＮＡ転写ユニット（例えば、ベクター）を用いて達成することができる。本明細書に記載されたＤＮＡ転写ユニットは、本発明に用い得る転写ユニットの型の代表である。ＤＮＡ転写ユニットは、感染体の異なるサブグループ（clades) もしくは異なるサブタイプ由来の抗原などの単一感染体由来の抗原類をコードすることができ、そしてさらに２種以上の感染体由来の抗原類をコードすることができる。
【００２０】
本発明の一つの態様では、免疫化はネズミロタウイルスの中和キャプシド蛋白質ＶＰ７をコードするＤＮＡ転写ユニットを用いて達成された。別の態様においては、インフルエンザウイルス血球凝集素糖蛋白質が用いられた。血球凝集素糖蛋白質はウイルスの吸着及び侵入を媒介しそして抗体を中和するための主要な標的である。インフルエンザウイルス血球凝集素蛋白質は１４の異なる血清学的サブタイプを有する。特定の態様においては、（Ｈ７サブタイプ血球凝集素をコードするＤＮＡ転写ユニットを含んでなる）Ｈ７サブタイプのためのＤＮＡ発現ベクターを用いて、鳥類モデルのＨ７Ｎ７ウイルスでのチャレンジに対する防御を行った。別の特殊な態様においては、Ｈ１血球凝集素を発現するＤＮＡ転写ユニットを用い、ネズミモデルにおいてＨ１Ｎ１ウイルスに対する免疫化を行った。インフルエンザの異なるサブグループ（例えば、Ａ及びＢ）及び／又は異なるサブタイプ（サブグループＡのサブタイプ１〜１４など）に由来する多様な抗原をコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットの混合物も本発明に使用することができる。
【００２１】
また、マウス及び猿におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ＤＮＡ転写ユニット及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶmac ）ＤＮＡ転写ユニットの免疫原性を試験するために実験を行った。免疫不全ウイルスに対するＤＮＡワクチンは、広い細胞性及び体液性応答が得られるように設計される。これは、異種のＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡの混合物を用いることによって達成される。この混合物は二つの主要な成分を含む。第一はｄｐｏｌ構築物と呼ばれ、広範囲のＨＩＶ−１蛋白質に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を惹起するのに役立つ。第二はＥｎｖ構築物と呼ばれ、風土性の感染に存在するＥｎｖのスペクトラムに対する抗体応答を惹起するのに役立つ。
【００２２】
ｄｐｏｌＤＮＡ構築物は、９種の蛋白質のうちの１種が構築物中に含まれていないから、非感染性ＤＮＡをコードする。この構築物は生ウイルス感染の特徴の多くを真似する。減弱化は幾つかの突然変異により達成することができる。１例としては、点突然変異、欠失又は切断により長末端反復（ＬＴＲ）を非機能性とすること、及び点突然変異もしくは内部欠失によりポリメラーゼ遺伝子を非機能性とすることなどが挙げられる。他の遺伝子の発現の改変は任意である。こうして、これらの構築物は９種のＨＩＶ−１蛋白質のうちの８種（Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ及びＮｅｆ）又は９種のＳＩＶmac 蛋白質のうちの８種（Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｘ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ及びＮｅｆ）を発現するための機会を与える。ＨＩＶ−１蛋白質又はＳＩＶmac 蛋白質のこの広範なレパートリーの発現により、様々な組織適合性タイプの個体における免疫系の細胞障害性アームの活性化が容易になる。発現されるエピトープの数が増えれば、個体の組織適合性タイプにより認識され得るエピトープが存在する機会が増大する。組織適合性タイプはそれぞれ発現されたエピトープのサブセットをおそらく認識しそして提示するのであろう。
【００２３】
ｄｐｏｌ構築物も、制御的及び構造的ＨＩＶ−１蛋白質に対して向けられるＣＴＬ応答の上昇を容易にする。ｄｐｏｌＤＮＡによる制御的蛋白質の発現は、感染の最初に発現しそして潜伏感染において最も活性な蛋白質に対する細胞障害性応答を上昇させる機会を与える。これはワクチン投与された宿主に細胞がウイルスを生産する前に細胞を除去する可能性を与える。それはまた潜伏感染している細胞を除去する機会を与える。
【００２４】
Ｅｎｖ構築物の混合物をｄｐｏｌ構築物と一緒に用いてＥｎｖに対する広い抗体応答を生じさせる。細胞外ウイルスに曝される蛋白質はＥｎｖであるから、Ｅｎｖに対する広い体液性応答は重要である。すなわち、Ｅｎｖに対する抗体は中和及び補体媒介溶解などのプロセスにより感染を防止することができる。感染したヒトにおいて最も顕著な発生を受けるＨＩＶ−１蛋白質はＥｎｖであるから、Ｅｎｖに対する広い応答は重要である。Ｅｎｖの混合物は以下のものを含む。
（１）サブグループＡ〜ＦなどのＨＩＶ−１の異なるサブグループを表すＥｎｖ。これらは広い地理的防御を与えるために使用される（マイヤース(Myers) ら、Human Retrovirusesand AIDS, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos NM (1992))。
（２）感染の異なる相の指標となる生育特徴を示す又は異なる組織屈性(tissue tropisms) を有するサブグループ内からのＥｎｖ。これらは風土性の感染に存在するウイルスのスペクトラムに対する防御のために用いられる。
（３）異なる伝達経路に好ましいものの代表的なＥｎｖ。これらには、同性愛的伝達、異性愛的伝達、静脈内薬物使用による伝達、胎盤経由伝達又は新生児感染が挙げられる。
（４）目的の免疫応答を生起させるのに特に有効なＥｎｖの突然変異型。このようなＥｎｖの１例はヨゼフ  ソドロスキー(Joseph Sodroski) 博士（ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティテュート、ボストン、ＭＡ）によるＶ１、Ｖ２及びＶ３を欠失したＨＸＢ−２  Ｅｎｖである。このＥｎｖはＣＤ−４結合ドメインと関連するコンホーメーションを持つエピトープを保持しており、広い中和活性を持つ抗体を発生させるのに有効である（ワイアット(Wyatt) ら、1993、J. Virol. 67 4557-4565) 。
【００２５】
Ｅｎｖの異なる構造型がワクチンに使用されるＤＮＡにより発現される。これらの型はｓｇｐ１２０などのｇｐ１２０の可溶性型を含み得る。この型はＶ３ループ決定基に対する抗体を発生させる場合に特に有効である（アール(Earl)ら、1994，J. Virol. 印刷中）。発現させ得る第二の型はｓｇｐ１４０などのｇｐ１４０の可溶性型である。この型はＥｎｖの細胞外成分のオリゴマーを表し、ｇｐ４１に対する抗体並びにｇｐ１２０に対する抗体を発生させ、そしてウイルス粒子上に見出される集合エンベロープスパイク中に存在するＥｎｖのオリゴマー型を認識する抗体群をも発生させる（アール(Earl)ら、1994，J. Virol. 印刷中、ムーア(Moore) ら、J. Virol. 68, 469-484 (1994)) 。ｓｇｐ１２０とｓｇｐ１４０は細胞から放出され、抗原提示の主要組織適合性クラスII依存性経路へのそれらの進入を容易にし、そしてＴ細胞依存性Ｂ細胞応答の上昇を容易にする。Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）の天然型も発現することができる。Ｅｎｖのこの膜定着型はビリオン及び感染細胞の表面に見出されるＥｎｖの型を表す。
【００２６】
下記の実施例には、インフルエンザウイルスモデル、ロタウイルスモデル、及び免疫不全ウイルスモデルに使用するために設計された直接ＤＮＡ接種を用いるワクチン投与の試みを記述する。インフルエンザウイルスに対するワクチン投与の試みには、鳥類、ネズミ、及びフェレットをモデルとして用いる。鳥類及びネズミモデルでは、免疫化していない動物に対しては死をもたらすチャレンジの場合でも、致死的チャレンジに対する防御的免疫化が証明される。フェレットモデルの場合は、鼻孔におけるウイルス複製に対し防御的免疫化が証明されたが、免疫化されていない動物へのチャレンジの場合は鼻孔におけるウイルス複製が認められた。ロタウイルスに対するワクチン投与の試みにはネズミモデルが使用された。ネズミモデルでは、ロタウイルス蛋白質に対するＤＮＡ転写ユニットを投与された動物において抗体及び細胞障害性Ｔ細胞活性が証明された。この場合、対照ＤＮＡを投与された動物ではロタウイルスに対する抗体も細胞障害性Ｔ細胞活性も認められなかった。免疫不全ウイルスに対するワクチン投与の試みにはネズミモデルとサルモデルが用いられた。ネズミモデルでは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）に対するＤＮＡ転写ユニットを投与された動物において中和抗体を含む抗体及び細胞障害性Ｔ細胞活性が証明されたが、対照ＤＮＡを投与された動物では抗体も細胞障害性Ｔ細胞活性も認められなかった。サルモデルは、サル免疫不全ウイルス−マカク(macaque) （ＳＩＶmac ）の致死量チャレンジを防御する応答の発生を試験するために使用された。
【００２７】
本発明は下記の実施例によって例示されるが、これらはいかなる意味でも制限的に解すべきではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１
インフルエンザウイルスに対するニワトリの免疫化
インフルエンザウイルス血球凝集素タイプ７（Ｈ７）遺伝子を発現する複製可能なトリ白血症ウイルスをコードする、ｐＰ１／Ｈ７（図１）と呼ぶＤＮＡ転写ユニットをハント (Hunt）ら、J. of Virology, 62(8), 3014-3019 (1988) の記載のように構築した。Ｈ７を発現するが鳥ウイルスベクターポリメラーゼ及びエンベロープ蛋白質を欠損しているｐＰ１／Ｈ７の複製欠損誘導体をコードするＤＮＡユニットｐ１８８（図２）を、ｐＰ１／Ｈ７からＸｂａＩ断片を欠失させることにより構築した。トリ白血症ウイルスベクターをコードし、インフルエンザウイルス挿入物を持たないＤＮＡユニットｐＲＣＡＳ（図３）を、ヒューズ(Hughes)ら、J. of Virology, 61, 3004 (1987) に記載されたように構築した。ＤＮＡユットは接種のために０．２ｍｌ当たり１００μｇの濃度に食塩水で希釈した。
【００２９】
接種されたＤＮＡの致死的インフルエンザウイルスチャレンジに対する防御能力を試験するために、３週齢のニワトリの群にｐＰ１／Ｈ７、ｐ１８８、又はｐＲＣＡＳのＤＮＡを接種した。トリ白血症ウイルスフリー群（ＳＰＡＦＡＳ、ノリウィッチ、ＣＴ）として維持されている特異的病原体フリーのニワトリを接種用に使用した。ニワトリそれぞれに１００μｇのＤＮＡを静脈内に（ｉｖ）、１００μｇのＤＮＡを腹腔内に（ｉｐ）、そして１００μｇのＤＮＡを皮下に（ｓｃ）投与した。４週間後にニワトリを採血しそして３００μｇのＤＮＡ（１００μｇｉｖ、１００μｇｉｐ及び１００μｇｓｃ）でブーストした。ブースト後１週間目にニワトリを採血しそして高度に病原性の強いタイプＨ７トリインフルエンザウイルスであるＡ／ニワトリ／ビクトリア／１／８５（Ｈ７Ｎ７）（Ｃｋ／Ｖｉｃ／８５）の５０％致死量の１００倍量（100 leathal doses 50（１×１０4 卵感染投与量）で鼻孔からチャレンジした。Ｃｋ／Ｖｉｃ／８５のＨ７遺伝子は、免疫原性Ｈ７の遺伝子とはそのコドンの約１５％が異なっている（ハント(Hunt)ら、J. of Virology, 62 (6), 3014-3019 (1988)) 。従って、Ｃｋ／Ｖｉｃ／８５のチャレンジは、Ｈ７サブタイプ内の広い交差防御を獲得する能力の試験となる。Ｃｋ／Ｖｉｃ／８５はニワトリの内部器官及び脳の全体に素早く拡がり、４〜７日以内に死を惹起する。チャレンジ後、死の徴候についてニワトリを毎日１０日間観察した。チャレンジの１週間後及び１．５週間後に生存しているトリから血清を採取した。これらをブースト前及びブースト後の血清と共に抗Ｈ７抗体について分析するために使用した（以下を見よ）。
【００３０】
表１  Ｈ７血球凝集素をコードするＤＮＡを用いた致死的Ｈ７Ｎ７インフルエンザウイルスに対する防御
【表１】
2006316072.tif 000002
ａ（＜．）は６羽のトリの中の１羽が１０のＨＩタイターを持っていたことを意味する。
ｂ（＜）はすべてのトリが１０未満のタイターを持つことを意味する。
ｃ（＋）はすべてのトリが死んだことを意味する。
【００３１】
Ｈ７を発現するＤＮＡ転写ユニットは、ｐＰ１／Ｈ７又はｐ１８８を接種されたニワトリのすべてを防御した（表１）。対照的に、対照のＤＮＡであるｐＲＣＡＳの接種は、致死量のウイルスチャレンジに対しニワトリを防御することはできなかった。対照群のトリはチャレンジ後２日目に死の徴候を示し始めた。第３日目までに６羽の対照トリのうちの３羽が死にそして５日目までには対照トリのすべてが死んだ。血球凝集素を発現するＤＮＡを接種されたトリは病気の徴候を示さなかった。チャレンジ後１週間及び１．５週間までに、これらの群はすべて高レベルのＨＩ抗体を発現した。
【００３２】
付加的実験
複製欠損Ｈ７を発現するＤＮＡで免疫化することにより誘導される防御の再現性を評価するために、ｐ１８８及びｐＲＣＡＳのＤＮＡのみを接種に用いて上述の実験を３回繰り返した。実験条件の相違は、最初の実験におけるブースト後１週間の代わりにブースト後２週間目にチャレンジしたことであった。３週齢のＳＰＡＦＡＳニワトリに、３ルート（ｉｖ、ｉｐ及びｓｃ）のそれぞれから１００μｇのＤＮＡを接種した。４週間後にｉｖ、ｉｐ及びｓｃ投与により各１００μｇのＤＮＡを接種してブーストした。２週間後に、ニワトリに鼻孔経由でＣｋ／Ｖｉｃ／８５（Ｈ７Ｎ７）の５０％致死量の１００倍量（１００ lethal doses 50）をチャレンジした。
【００３３】
反復実験の結果により、表２に示すように、Ｈ７を発現するｐ１８８ＤＮＡは致死的チャレンジに対する防御を与え得ることが確認された。
【００３４】
表２  ｐ１８８ＤＮＡを用いた免疫化による致死的Ｈ７ウイルスチャレンジに対する防御の再現性a 
【表２】
2006316072.tif 000003
ａ  実験１は表１に示したものと同一である。−はテストしていないことを示す。
【００３５】
ｐ１８８接種ニワトリのすべてが致死的チャレンジに対し生き残った最初の実験とは対照的に、第２、第３、及び第４の実験における免疫化では、ワクチン投与されたトリの２８％〜８３％で防御が認められるという結果であった。さらに、ワクチン投与されたトリが病気の徴候を示さなかった最初の実験とは対照的に、反復実験における生存トリの大部分はチャレンジ後の病気の一過性の徴候を示した。最初の実験の場合と同じように、対照のＤＮＡは防御を示さなかった。これら４回の実験の結果をまとめると、５６羽のｐ１８８ワクチン投与を受けたトリのうちの２８羽が生き残り、５５羽の対照のトリのうちの僅か１羽だけが生き残った。従って、高度に有意な防御が達成された。免疫化するＨ７遺伝子とチャレンジするＨ７遺伝子がアミノ酸配列において約１５％の抗原性ドリフトを受けていることを考慮すると、このレベルの防御が得られたことは特に印象的である。
【００３６】
実施例２
ワクチン投与された動物と投与されない動物のＨ７に対する抗体応答の分析
ワクチン投与されたニワトリとワクチン投与されないニワトリのＨ７に対する抗体応答の比較をするために、実施例１の実験２（表２を見よ）に抗インフルエンザＡウイルス薬であるアマンタディン塩酸塩（ウエブスター(Webster), R. G.ら、J. Virol. 55, 173-176 (1985)) を投与したワクチン非投与群を含めた。５羽のアマンタディン処理トリのすべてが発病した。これらのうちの４羽は生き残り、それらから免疫化ニワトリと非免疫化ニワトリのＨ７に対する抗体応答を比較するために使用できる血清が得られた。
【００３７】
第２の実験において、ｐ１８８を接種されたトリ及びアマンタディン処理を受けたトリの血清を、Ｈ７及び他のインフルエンザウイルス蛋白質に対する抗体応答の経時変化を分析するために用いた。Ｈ７に対する抗体応答は、血球凝集阻止（ＨＩ）及びウイルス中和並びに酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量した。血球凝集阻止試験では、パーマー(Palmer)ら、アドバーンスド・ラボラトリー・テクニークス・フォー・インフルエンザ・ダイアグノシス、p.51-52 、イミュノロジーシリーズ  no.6、U.S. Department of Health, Education, and Welfare, Washington D.C. (1975)に記載されたように受容体を破壊する酵素で処理した血清を用いてマイクロタイタープレート中で分析した。中和抗体はニワトリ胚繊維芽細胞培養中で測定した。中和試験はウイルスの２００ＴＣＩＤ50に対するものであり、ウイルス複製の検出には細胞病理学及び血球凝集素を用いた。結果を下記の表３に示す。
【００３８】
【表３】
2006316072.tif 000004
【００３９】
ワクチン投与されたトリ及びアマンタディン処理を受けたトリにおける抗体応答の分析から、ｐ１８８がＨ７に対する抗体応答を開始させたことが明らかとなった。実験１（表１）におけるように、ＤＮＡの投与及びＤＮＡによるブーストはＨ７に対する抗体を低力価でしか誘導しなかった。しかし、チャレンジの１週間以内に、ＤＮＡ免疫化群はＨＩ及びＨ７に対する中和活性の高いタイターを持った。これらのタイターはその次の週にわたって（多少の増加はあるにしても）ほとんど増加しなかった。さらに、ワクチン投与されたトリのチャレンジ後の抗体の大部分はＨ７に対するものであった。この特異性はＨ７ウイルス（免疫原性血球凝集素タイプ）とＨ５ウイルス（このトリが曝されたことのない血球凝集素タイプ）に対するＥＬＩＳＡ抗体タイターを比較することによって示された。チャレンジ後の血清は、Ｈ５ウイルスに対するよりもＨ７ウイルスに対するＥＬＩＳＡ抗体を２０倍多く含んでいた。対照的に、アマンタディン処理群では、抗体の大部分はＨ７特異的ではなく、Ｈ５ウイルス及びＨ７ウイルスに共通な蛋白質に対するものであった。このことは、Ｈ５及びＨ７インフルエンザウイルスに対するＥＬＩＳＡ抗体のタイターが同程度であったことにより証明された。
【００４０】
実施例３
非レトロウイルス転写ユニットを用いるニワトリの免疫化
この実験は、レトロウイルスＤＮＡを欠くＤＮＡ転写ユニットを本明細書に記載の方法により防御的免疫応答を形成させるために使用しても成功することを証明するために行われた。ニワトリにワクチン投与するためこの実験に用いたベクターを図４及び図５に示す。図４はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型プロモーターの転写制御の下にインフルエンザウイルスＨ７サブタイプ血球凝集素を発現することができるプラスミドである、ｐＣＭＶ／Ｈ７の図式的表示である。図５はインフルエンザ抗原を発現することができない対照のプラスミドである、ｐＣＭＶ／対照を示す。これらのプラスミドは、ブライアン  カレン(Bryan Cullen)博士、デューク大学、ダーハム、ノースキャロライナ（Cullen, B.
R., Cell 45, 973-982 (1986)) のｐＢＣ１２／ＣＭＶベクターの誘導体である。
【００４１】
ｐＣＭＶ／Ｈ７（非レトロウイルスに基づくＤＮＡ転写ユニット）を用いる実験では、免疫応答を形成させるために、免疫化及びブーストは実施例１に記載したものと同じ接種スケジュールを用いたが、異なる接種ルートを用いた。具体的には、１００μｇのＤＮＡを静脈内、腹腔内及び筋肉内の３種のルートのそれぞれから接種した。ブーストはワクチン投与の場合と同じＤＮＡ投与量及び同じ接種部位を用いた。チャレンジはブースト後１〜２週間であり、実質的に１００％死滅が達成できるようにＣｋ／Ｖｉｃ／８５の５０％致死量の１００倍量（１００ lethal doses 50）を用いた。ｐＣＭＶ／Ｈ７ＤＮＡの５回の独立の実験の結果を下記の表４に示す。
【００４２】
表４  ｐＣＭＶ／Ｈ７ＤＮＡを用いる免疫化によるＣｋ／Ｖｉｃ／８５（Ｈ７Ｎ７）インフルエンザウイルスの致死量チャレンジに対する防御
【表４】
2006316072.tif 000005
【００４３】
ワクチン投与のためにｐＣＭＶ／Ｈ７を用いる５回のニワトリの実験では、約６０％のニワトリが防御された。このレベルの生存はレトロウイルスに基づくベクターｐ１８８で得られたレベル（表２）と極めて似ている。レトロウイルスに基づくベクターを用いる試みの場合と同様に、生存体の多くがインフルエンザの一過性の徴候を発現した。従って、レトロウイルスに基づくベクターで得られた防御に匹敵する防御が非レトロウイルスに基づくベクターでも得ることができる。
【００４４】
非レトロウイルスに基づくベクターでの実験におけるＨ７への抗体応答も、レトロウイルスに基づくベクターでの抗体応答と類似していた（表３、表４）。具体的には、防御的応答は、チャレンジ後のＨ７特異的抗体の急激な上昇（１週間以内）と関連していた。ワクチン投与及びブースト後の血清は低レベルか検出不可能なレベルの抗Ｈ７抗体しか含んでいなかった。チャレンジ前の抗体が低レベルであることはチャレンジ後の抗体の急激な上昇と併せ考えると、防御はチャレンジ感染により移動可能とされ記憶応答を確立したＤＮＡ転写ユニットにより媒介されたものであることが示唆される。こうして、動物にワクチン投与するために非レトロウイルスＤＮＡ発現ベクター（ウイルス抗原をコードするＤＮＡ転写ユニットを含む）を用いて、かなりの防御が達成された。
【００４５】
実施例４
ｐＣＭＶ／Ｈ１ＤＮＡを用いるワクチン投与によるマウスの免疫化：種々の接種ルートの分析
ｐＣＭＶ／Ｈ１と呼ぶＤＮＡ転写ユニットは、マウス適応Ａ／ＰＲ／８／３４Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスでの致死量チャレンジに対しマウスを免疫化するために使用して成功した。この転写ユニットはＣＭＶ即時型プロモーターの転写調節の下にインフルエンザタイプＨ１血球凝集素をコードする。この構築に用いられたＨ１インフルエンザウイルス血球凝集素遺伝子は、ウインターズ(Winters) ら、Nature 292, 72 (1981) により詳細に記載されており、そしてチャレンジウイルスにおけるＨ１インフルエンザウイルス血球凝集素遺伝子と同一である。ベクターはＨ７の発現のために実施例３で使用したものと同一である（図５を見よ）。ｐＣＭＶ／Ｈ１転写ユニットは図６に図示してある。
【００４６】
【表５】
2006316072.tif 000006
【００４７】
マウスにおけるワクチン投与の試みは６−から８−週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＮＡを投与することにより行われた。タイム０に１回及び４週間後に第２回目と、２回のＤＮＡ接種を行った。試験動物は実験中観察し、マウスはチャレンジ時を最初に以後規則的に秤量した。致死的チャレンジは、メトファン（ピットマン−ムーア、ムンデライン、ＩＬ）で麻酔をかけたマウスの肺にウイルスを吸入させることにより、第２回目の接種後１０日目に投与した。チャレンジはマウス適応Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスの２５０プラーク形成ユニット（５０％致死量（ＬＤ50）の１０〜１００倍）を０．１％ウシ血清アルブミンを補填した食塩水１００μlに含むものからなるものであった。チャレンジウイルスは気道中で局在化された複製を受け、１〜２週間以内に肺炎による死の原因となった。ＤＮＡ接種のルートは次のものを含む。静脈内（尾部静脈）、腹腔内、筋肉内（両方とも四頭筋）、鼻内（メトファンで麻酔したマウスの鼻孔にＤＮＡを滴下して投与）、皮内（足の裏）、及び皮下（うなじ）。一般にＤＮＡ１００μｇを試験部位当たり食塩水１００μlに溶かして投与した。足の裏への接種はＤＮＡ５０μｇを２５μlに溶かして投与した。
【００４８】
表６は、食塩中のｐＣＭＶ／Ｈ１ＤＮＡの接種によるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスの致死量チャレンジに対するマウスの防御を示す結果を表す。表６中のデータは４回の独立の実験の結果を集積したものである。示されたルートは静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、筋肉内（ｉｍ）、鼻孔内（ｉｎ）、皮内（ｉｄ）、及び皮下（ｓｃ）である。インフルエンザの徴候には、体重減少、毛の乱れ（ruffled fur)、及び嗜眠状態(lethargy)が挙げられる。この徴候は次のようにスコアした。＋は一過性の体重減少が見られたが毛は滑らかでありそして活動のレベルは正常のもの、＋＋は一過性の体重減少と一部毛の乱れ及び嗜眠状態が見られたもの、＋＋＋は一過性の体重減少及びより激しい毛の乱れと嗜眠状態が見られたもの、＋＋＋＋はより大きな体重減少並びに激しい毛の乱れと嗜眠状態が見られたもの、＋＋＋＋＋は体重減少及び死に至るインフルエンザの重篤な徴候が見られたものである。確率は対照群に対するワクチン投与群の生存率と死亡率を比較することによりフィッシャーの直接両側検定(Fisher's exact two-tailed test)を用いて計算した。
【００４９】
表６  種々のルートからのｐＣＭＶ／Ｈ１接種によるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の致死量チャレンジに対する防御
【表６】
2006316072.tif 000007
【００５０】
筋肉内接種、静脈内接種、又は３種のルート（筋肉内、静脈内、及び腹腔内）のすべてによる接種の場合に優れた生存がみられた。これらの群の、比較的軽いインフルエンザは毛の乱れ及び一過性の体重減少に関連するものであった。鼻孔からＤＮＡを投与されたマウスでは、生存率は良かったが、より激しいインフルエンザが発症した。皮内接種及び皮下接種を受けたマウスでは、生存率はさらに悪く（６７〜７５％）そしてインフルエンザのより厳しい徴候が発症した。腹腔内注射のみを受けたマウスは全く致死量チャレンジに生き残ることができなかった。対照群（ｐＣＭＶ／対照ＤＮＡ又はＤＮＡなしを接種）はインフルエンザの厳しい徴候が発症し、チャレンジに対し極めて僅かしか（１３％）生き残れなかった。従って、筋肉内、静脈内、鼻孔内及び皮内の各投与ルートは良好な防御を提供した。
【００５１】
これらの結果は、トランスフェクションの効率が必ずしもワクチン投与の効率を決定するものではないことを示すものである。げっ歯類動物の筋肉の高いＤＮＡ取込み能及び高いＤＮＡ発現能（ウオルフ(Wolff, J. A.)ら、Science 247, 1465-1468 (1990) 、ウオルフ(Wolff, J. A.)ら、BioTechniques 11, 474-485 (1991)、アクサディ(Acsadi, G.)ら、New Biol. 3, 71-81 (1991))は、筋肉内ワクチン投与の異常な効率と相関しなかった。筋肉内接種は良い結果を与えたが静脈内接種より良いということはなく、そしてＤＮＡの鼻孔滴下投与よりも幾らか良いにすぎなかった。同様な結果が４種のルートに対するニワトリでの実験（以下に記す）でも得られた。この場合は、静脈内接種及び気管内接種が筋肉内接種により得られたものと同等な防御レベルを達成した。
【００５２】
実施例５
ニワトリのインフルエンザモデルにおけるｐＣＭＶ／Ｈ７の異種経路接種による防御的免疫化
ＤＮＡワクチン投与に対する接種経路の影響を、トリのインフルエンザウイルスモデルでさらに評価した。実施例１に記載したように、ニワトリにおける接種経路についてＤＮＡワクチン投与実験を行った。接種経路としては次のものが含まれる。静脈内（羽根静脈）、筋肉内（胸筋肉）、気管内（ＤＮＡ滴を気管内に投与）、皮下（うなじ）、粘液嚢内（ニワトリの肛門(vent)の直ぐ上に注射）、及び眼窩内（ＤＮＡ滴を眼に投与）。一般に、１００又は２００μｇのＤＮＡを２００μｌの食塩水に溶かして投与した。結果を下記の表７に示す。ｐ１８８ＤＮＡ及びｐＲＣＡＳＤＮＡのデータは３回の独立の実験の集計である。ｐＣＭＶ／Ｈ７ＤＮＡ及びｐＣＭＶ／対照ＤＮＡのデータは２回の独立の実験の集計である。確率は対照群に対するワクチン投与群の生存率及び死亡率を比較してフィッシャーの直接両側検定を用いて計算した。示された経路は、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、気管内（ｉｔ）、粘液嚢内（ｉｂ）、及び眼窩内（ｉｏ）である。
【００５３】
表７  異種経路によるＤＮＡ接種後のＣｋ／Ｖｉｃ／８５（Ｈ７Ｎ７）の致死的チャレンジに対するニワトリの防御a 
【表７】
2006316072.tif 000008
ａ  対照のデータは表２及び表４のデータと同一である。
【００５４】
接種経路についてのニワトリでの実験では、ワクチンＤＮＡの静脈内投与、筋肉内投与、及び粘膜内投与に対して良い効率が証明された。これらの群は、３種の経路のそれぞれからＤＮＡ投与を受けた群（表２及び表４）のそれの約１／２の防御レベルを示した（２４〜３０％）。皮下、腹腔内、粘液嚢内、及び眼窩内における接種では悪い防御か全く防御を示さなかった。対照のＤＮＡを投与されたニワトリは致死的インフルエンザを発症し、このチャレンジに対しほとんど生き残れなかった（約２％）。実験群内では、生き残ったニワトリでもインフルエンザ関連疾病の重症度はさまざまであった。
【００５５】
実施例６
マウス表皮へのＤＮＡの遺伝子銃送達(gene gun delivery) による防御的免疫化
表皮へＤＮＡを送達するためにＤＮＡ銃を使用することができるか否かをテストするために、アクセル・パーティクル・ボムバードメント・デバイス（アグラセツス、ミドルトン、ＷＩ）を用いて、マウスの表皮にＤＮＡ被覆金ビーズを送達した。これらの実験はアグラセツス，インクのジョエル  Ｒ．ヘインズ(Joel R. Haynes)博士と共同で行った。
【００５６】
マウスへのＤＮＡの遺伝子銃送達のために、０．９５μｍの金の粉末（デグッサ、サウスペインフィールド、ＮＪ）の１０ｍｇ及び適当量のプラスミドＤＮＡを５０μｌの０．１Ｍスペルミディンを含む１．５ｍｌ遠心分離用チューブ中に添加してプラスミドＤＮＡを金粒子に固定した。ボルテックス攪拌しながら２．５ＭのＣａＣｌ2 ５０μｌを添加してプラスミドＤＮＡと金を共沈澱させた後、沈澱物をアブソリュートエタノールで洗浄し、２．０ｍｌのエタノール中に再懸濁した。金／ＤＮＡ懸濁液をキャップ付きバイアルに移し、２〜５秒間音波発生水浴中に漬け、塊を溶解した。金／ＤＮＡ懸濁液１６３μｌを１．８ｃｍ×１．８ｃｍマイラー(Mylar) シートに載せ、数分間放置した後、メニスカスを破壊し、過剰のエタノールを吸引して除いた。金／ＤＮＡ被覆マイラーシートを真空下で乾燥し、保存した。シート当たりのＤＮＡの総量はＤＮＡ／金の比の関数であり、シート当たり０．２〜０．０００２μｇの範囲であった。動物をケタセット／ロンプン（１０：２）の３０μｌで麻酔した。腹部の標的部を剃り、剃り残しの皮膚角質層を除くため２分間ネール(Nair)( カーターワラス、ＮＹ）で処理した。遺伝子送達の前に水で標的部を徹底的に洗浄した。ＤＮＡ被覆金粒子を、電気スパーク放電を起動力として用いるアクセルの装置を用いて腹部の皮膚内に送達した（ヤング(Yang, M. S.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990))。各動物は、１７ｋＶの放電電圧で、免疫当たり２回の非重複送達を受けた。このビーズは細胞内へＤＮＡを送達し、そこでＤＮＡは溶解しそして発現することができる（ヤング(Yang, M. S.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)、ウイリアムズ(Williams, R. S.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730 (1991))。発現は一過性であり、発現の大部分は表皮の通常の脱落により２〜３日以内に消失する（ウイリアムズ(Williams, R. S.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730 (1991) 、未発表の観察) 。
【００５７】
表皮中へのＤＮＡ被覆金粒子の遺伝子銃に基づく注入(acceleration)は、表８に示すようにＤＮＡ免疫化のこれまでに最も効率的な方法であることが分かった。データは４回の独立の実験の集計である。確率は、対照群に対するワクチン投与群の生存率及び死亡率を比較してフィッシャーの両側直接検定を用いて計算した。インフルエンザの徴候の記述については表６の上記の議論を見よ。
【００５８】
表８  遺伝子銃送達ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡ接種によるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の致死量チャレンジに対する防御
【表８】
2006316072.tif 000009
【００５９】
ネズミモデルにおける銃送達ＤＮＡのこれらのテストは、９５％生存率を達成するのに僅か０．４μｇのＤＮＡで十分であることを明らかにした。これらの生存体はチャレンジ後のインフルエンザの極めて限られた徴候を示すか全く徴候を示さなかった。０．０４μｇの銃送達ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡを受けたマウスは約６５％の生存率を示しそしてかなり重いインフルエンザの徴候を呈した。０．００４〜０．０００４μｇのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡを受けたマウスは、チャレンジに屈伏した。生理食塩注射のテストの場合のように、対照ＤＮＡを受けたマウスは重いインフルエンザの徴候を呈し、生存は極限られていた（１４％）。こうして、マウスの表皮へのＤＮＡの遺伝子銃送達により免疫化の高い効率が達成された。この方法による免疫化は生理食塩接種よりも２５０〜２５００倍少ないＤＮＡ（１００〜２００μｇのＤＮＡに対し０．４〜０．００４μｇのＤＮＡ）しか必要としなかった（表６及び表７を見よ）。
【００６０】
実施例７
ｐＣＭＶ／Ｈ１のワクチン投与を受けたマウスにおける抗体応答
実施例４及び６に上記したネズミの実験において、各ＤＮＡの接種の直前と、チャレンジの直前と、及びチャレンジ後に２回、それぞれ血清を採取した。麻酔したマウスの眼の静脈から４０μｌの非ヘパリン化ミクロヘマトクリット管に採血した。同一グループ内のメンバーから得た血清をプールした。ニワトリの赤血球細胞及びカオリンで前処理してバックグラウンド活性を除去したマウスの血清を用いて血球凝集阻止試験を行った（ノバック(Novak M.)ら、Vaccine 11, 55-60 (1993)) 。血球凝集阻止タイターは血球凝集の完全阻止を与える最大血清希釈度の逆数である。マウス抗体のイソタイプは、標準プロトコールと精製Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスで被覆されたミクロウエルプレートを用いる酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により決定した。これらの検定は、タイターで類似の活性を持つイソタイプ特異的ペルオキシダーゼ結合抗体（シグマ・イムノケミカルズ）の１：１０００希釈を使用した。血清分析のデータは下記の表９に示す。データは所与の条件に対し陽性のスコアであった血清プールの最終希釈の逆数の幾何平均である。
【００６１】
表９  マウスへのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの接種経路をテストするワクチン投与実験における抗体応答
【表９】
2006316072.tif 000010
＊  ３種の血清プールの一つのみについてＨＩ活性を試験した。ワクチン投与前＝ＤＮＡワクチン投与前の採血、１０ｄ  ＰＢ＝第２回目ＤＮＡ接種後１０日目に採血（チャレンジ前）、４ｄ  ＰＣ＝チャレンジ後４日目に採血。＃テスト＝血清プールが試験された群の数（そのプールに寄与する動物の血清の数）。ＮＴ＝試験しなかった。＜＝この試験で用いられた最小希釈度の血清でも活性は検出されなかった。
【００６２】
さまざまな経路によるＤＮＡワクチン投与は記憶抗体応答を引き起こすようであった。ＤＮＡワクチン投与及びブースター接種は検出不可能な程度に低い血球凝集阻止抗体及びＥＬＩＳＡ活性を発生させたにすぎなかった。これらの低レベルの活性はチャレンジ後に急速に増大した。ニワトリの実験（表３及び表５）の場合のように、チャレンジ前には動物中での防御は起こったが、抗インフルエンザ抗体のレベルは検出不可能であった。しかしながら、ＤＮＡ接種がチャレンジ前抗体の検出可能なタイターを生じたグループでは、最上の防御が認められた。
【００６３】
抗インフルエンザウイルス抗体のイソタイプをスコアするためにＥＬＩＳＡを使用すると、免疫化がＩｇＧ応答の引金となったことが明らかとなった。ＤＮＡの銃送達、静脈内接種又は筋肉内接種によりワクチン投与を受けたマウスの血清では、チャレンジ前には抗インフルエンザＩｇＧの低いタイターしか検出し得なかった。ＩｇＧの検出不可能タイターの境界線はＤＮＡの鼻孔滴下を受けたマウスの血清中に存在した（このＤＮＡ投与経路により与えられるより貧弱な防御と一致している）。チャレンジ後４日目までに、最良の防御を受けたマウス中でＩｇＧレベルの増加が検出された。対照的に、対照のＤＮＡを受けたマウスは、チャレンジ後の第２回目の血清採取まで抗インフルエンザウイルスＩｇＧのレベルは検出可能でなかった。これは、ワクチン投与群がチャレンジへの二次的抗体応答を受け、対照群が受けなかったことと一致した。
【００６４】
これらの実験は、ＤＮＡ接種がＴ−ヘルパー記憶及びＢ−細胞記憶の両方を引き起こしたことを示す。この記憶は、チャレンジされた動物中の二次的応答の上昇を支持することにより防御を与えるように見えた。記憶の惹起の証拠はＩｇＧイソタイプに属する抗体を上昇させるＤＮＡ接種によって与えられる。なぜなら、ＩｇＧはＴ−細胞の助けに応答して免疫グロブリンの再配列を受けた分化したプラズマ細胞により産生されるからである（アバス(Abbas, A. K.)ら、セルラー  アンド  モレキュラー  イムノロジー（サウンダース、フィラデルフィア、ＰＡ），pp. 187-197 (1991)) 。チャレンジへの応答における記憶の移動可能性に対する証拠が、チャレンジ後の血清ＩｇＧの急速な上昇に見出される。
【００６５】
チャレンジ前及びチャレンジ後の血清の両方において、ＩｇＭ及びＩｇＡは検出限界ぎりぎりから検出不可能のレベルで検出された。この実験を通じて、これらの免疫グロブリンイソタイプが低レベルであったことから、ＤＮＡ接種のどの経路も血清ＩｇＭ又はＩｇＡを上昇させるには効果的でなかったことが明らかであった。
【００６６】
実施例８
Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザチャレンジに対するフェレット獣を防御するためのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡ転写ユニットの使用
フェレット獣のインフルエンザモデルはヒトのインフルエザ感染に多くの類似性を有するので、このインフルエンザモデルにおけるｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡ免疫化に関する研究を行った。最初の実験では、生理食塩水中の精製ｐＣＭＶ／Ｈ１のＤＮＡを用い、１ヶ月間隔で筋肉内接種によりフェレットを免疫化した。若い雌成獣フェレットを前採血しついで後足それぞれに１２５μｌずつ２回注射し総量５００μｌを接種することにより、食塩水中の５００μｇのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡ又はｐＣＭＶ／対照ＤＮＡを用いてワクチン投与した。１頭のフェレットは１ヶ月間隔で５００μｇのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの筋肉内接種を３回受け、一方第２の動物は１ヶ月間隔で５００μｇのｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの筋肉内接種を２回受けた。対照の動物は１ヶ月間隔で５００μｇのｐＣＭＶ／対照ＤＮＡの筋肉内接種を３回受けた。
【００６７】
メトファン麻酔をかけたフェレットを、最終ＤＮＡ接種後１週間目に鼻孔経由でＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の１０7.7 卵感染投与量50を用いてチャレンジした。ケタミン麻酔下にチャレンジ後３、５及び７日目に鼻孔洗浄液を集めた。鼻孔洗浄液中のウイルスタイター測定は記載（カッツ(Katz, J. M.) 及びウエブスター(Webster, R.G.) 、J. Infect. Dis. 160, 191-198 (1989)) されたように卵中で行った。データは下記の表１０に示す。
【００６８】
表１０  Ｈ１ウイルスに対する、ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの筋肉内接種によるフェレットの防御
【表１０】
2006316072.tif 000011
【００６９】
鼻孔洗浄液を分析すると、チャレンジ後３日目のフェレットのすべての洗浄液に同様に高いウイルスタイターが明らかとなった。興味あることに、ｐＣＭＶ／Ｈ１の３回接種を受けたフェレットはチャレンジ後５日目までに鼻孔感染がほとんど治癒し（cleared)、その５日目の鼻孔洗浄液はｍｌ当たり１０卵感染投与量50のウイルス未満を含むにすぎなかった。この時点でｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの２回接種を受けたフェレットではその鼻孔洗浄液中のウイルスのタイターが１０倍減少していた。対照的に、対照ＤＮＡを受けたフェレットでは、その鼻孔洗浄液のウイルスタイターには、減少があるにしても僅かであった。チャレンジ後７日までにすべてのフェレットでその鼻孔感染が治癒した。対照ＤＮＡを受けた２頭のフェレットの場合と比べて、ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの３回筋肉内接種を受けたフェレットではウイルスの遙に急速な治癒が認められ、ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの２回筋肉内接種を受けたフェレットでもかなり早い治癒が認められたことから、ｐＣＭＶ／Ｈ１の筋肉内接種が何らかの抗インフルエンザ免疫を上昇させたことが示唆される。
【００７０】
遺伝子銃接種
免疫誘導の効率を高めるために、フェレットでアクセル遺伝子銃を用いてＤＮＡ被覆金ビーズをフェレットの皮膚内に送達する第２の実験を行った。腹部表皮を遺伝子銃送達ＤＮＡの標的として用い、１ヶ月間隔で２回の遺伝子銃ＤＮＡ投与をフェレットに行った。遺伝子銃接種をケタミンで麻酔した若い雌成獣フェレットに施した。皮膚は剃り、脱毛剤ネール(NAIR)（カーター−ワラス、ニューヨーク）で処理した。前述のように、ＤＮＡビーズ（１〜３ミクロン）を接種用に調製した（ファイナン(Fynan) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11478-11482 (1993))。接種には、１５ｋＶの送達電圧を用いた。フェレットを２μｇ又は０．４μｇのＤＮＡで接種した。２μｇのＤＮＡを接種されたフェレットは０．２μｇのＤＮＡを被覆された０．８ｍｇのビーズからなるショットを１０回受けた。０．４μｇのＤＮＡを受けたフェレットは同様のショットを２回受けた。
【００７１】
第２回目のＤＮＡ免疫化の１週間後に、メトファンで麻酔したフェレットに鼻孔を介して１０6.7 卵感染投与量のＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを投与することによりチャレンジした。このチャレンジは、第１回目のチャレンジでのウイルス複製が高レベルであったので、筋肉内接種を用いた実験の場合よりも１０倍低いものであった。チャレンジ後３日目及び５日目にケタミン麻酔下に鼻孔洗浄液を集め、上述のようにウイルスをタイター測定した。データを下記の表１１に示す。
【００７２】
表１１  ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡの遺伝子銃接種によるＨ１ウイルスに対するフェレットの防御
【表１１】
2006316072.tif 000012
【００７３】
遺伝子銃ワクチン投与を受けたフェレットのチャレンジ後の鼻孔洗浄液を分析することにより、２μｇのＤＮＡを受けた３頭のフェレット及び０．４μｇのＤＮＡを受けた３頭のフェレットのうちの１頭はこのチャレンジから完全に防御された。このことはチャレンジ後３日目のこれらの動物の鼻孔洗浄液中にウイルスを回収することができなかったことにより証明された。０．４μｇのＤＮＡを受けた残りの２頭の動物及び対照の動物は防御されず、チャレンジ後３日目の動物の鼻孔洗浄液中に存在するウイルスのタイターを容易に検出することができた。この実験では、すべての動物（対照およびワクチン投与されたもの）が感染後５日目までにそれらの鼻孔洗浄液中にウイルスを検出できなくなった。
【００７４】
遺伝子銃実験に用いたフェレットを次にＤＮＡ投与及びウイルスチャレンジに対する抗体応答について分析した。これらの試験ではＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に対する中和活性を試験した。抗体のタイター測定は記載されたように行った（カッツ(Katz, J. M.) 及びウエブスター(Webster, R. G.)、J. Infect. Dis. 160, 191-198 (1989))。中和活性のタイターは、ウイルスの２００  ５０％組織培養感染投与量を完全中和する血清の最大希釈度の逆数である。データは下記の表１２に示す。
【００７５】
表１２  遺伝子銃送達ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡでワクチン投与されそしてＡ／Ｐｒ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスでチャレンジされたフェレットにおける中和抗体
【表１２】
2006316072.tif 000013
【００７６】
ＤＮＡブースト後チャレンジ前の中和抗体が、２μｇの遺伝子銃送達ＤＮＡを受けた動物のうちの２頭に検出された。２μｇのＤＮＡを受けた第３の動物（鼻孔洗浄液中のウイルスの存在に対しては完全に防御された動物）のチャレンジ前の血清中には中和抗体は検出されなかった。鼻孔洗浄液中にウイルスを発生させなかった０．４μｇのＤＮＡを受けたフェレットの血清にも中和抗体は検出されなかった。
【００７７】
チャレンジ前の抗体を有する動物では、防御はおそらく中和抗体の存在並びに中和抗体に対する記憶応答の動態化によるものであろう。検出可能なレベルのチャレンジ前抗体を持たずに防御された動物では、防御は感染による記憶応答の急速な動態化と感染を制御する動態化された応答とによるものであろう。ワクチン投与を受けた動物でチャレンジ前抗体の存在しない場合の防御も、マウスやニワトリでの予めＤＮＡワクチン投与を行った研究（表３、５及び９を参照）（ファイナン(Fynan) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11478-11482 (1993) 、ロビンソン(Robinson)ら、Vaccine 11, 957-960 (1993)) 及びレトロウイルスベクターやポックスウイルスベクターを用いてインフルエンザウイルス血球凝集素糖蛋白質を発現させるワクチン投与実験においても観察されている（ハント(Hunt)ら、J. Virol. 62, 3014-3019 (1988)、ウエブスター(Webster) ら、Vaccine 9, 303-308 (1991))。
【００７８】
実施例９
粘膜投与のための微小体カプセル化ＤＮＡ
致死量のインフルエンザウイルスチャレンジに対する防御的応答を発生させる微小体カプセル化ＤＮＡの能力を試験することにより、ＤＮＡ接種のための粘膜経路をさらに発展させた。ネズミインフルエンザウイルスモデルをこれらの研究に使用した。ウイルス・リサーチ・インスティチュート，インク，ケムブリッジ，ＭＡにおいて、ｐＣＭＶ／Ｈ１ＤＮＡ及びｐＣＭＶ／対照ＤＮＡをアルギン酸塩の微小体中にカプセル化した。各群が一次接種及びブーストを受ける実験を行った。Ａ群は一次接種として遺伝子銃送達ＤＮＡの０．４μｇを受け、ブーストは受けなかった。Ｂ群は一次接種及びブーストとして０．４μｇの遺伝子銃送達ＤＮＡを受けた。Ｃ群は一次接種として０．４μｇの遺伝子銃送達ＤＮＡを受けそしてブーストとしてアルギン酸塩カプセル化ＤＮＡの１００μｇを受けた。Ｄ群は一次接種及びブースト接種の両方において１００μｇのアルギン酸塩カプセル化ＤＮＡを受けた。アルギン酸塩カプセル化ＤＮＡの各投与はメトファンで麻酔されたマウスの鼻孔に１００μｌの水に懸濁して送達することにより行った。第２のＤＮＡ接種後１０日目に、メトファンで麻酔したマウスの鼻孔にＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスの５００ｐｆｕを投与して致死量チャレンジを行った。４頭の対照群は同量のｐＣＭＶ／対照ＤＮＡを受けた後ｐＣＭＶ／Ｈ１ＤＮＡを受けた群と同様の処理を受けた。この実験のデータを表１３に示す。
【００７９】
表１３  インフルエンザウイルスの致死量チャレンジに対する微小体中ワクチンＤＮＡ投与によるマウスの防御
【表１３】
2006316072.tif 000014
＊銃＝遺伝子銃送達、ｍｓ  ｉ．ｎ．＝アルギン酸塩微小体にカプセル化されたＤＮＡ。
【００８０】
アルギン酸塩カプセル化ＤＮＡの鼻孔内投与は良好な防御を与えた。アルギン酸塩カプセル化ｐＣＭＶ／Ｈ１・ＤＮＡを受けたワクチン投与群は、それぞれアルギン酸塩カプセル化ｐＣＭＶ／対照ＤＮＡを受けた群よりもはるかに良好な生存率を示した。アルギン酸塩カプセル化ＤＮＡのみを受けたマウス６頭のうちの４頭は生存し、インフルエンザの極めて軽度の徴候を示した。対照的に、アルギン酸塩カプセル化ｐＣＭＶ／対照ＤＮＡを受けたものは、４頭のうち僅かに１頭だけが生き残った。対照群はすべてインフルエンザの重い徴候を呈した。１回だけ銃接種を受けた群はインフルエンザの軽度の徴候を示し、５０％の生存率（３／６マウス）であった。アルギン酸塩ブーストを付加するとインフルエンザの徴候に対しさらに良い防御及びさらに高い生存率（５／６マウス生存）がみられた。２回の遺伝子銃ＤＮＡ送達は最も良い生存率を与え、すべてのマウスが生存しインフルエンザの徴候も全く示さなかった。
【００８１】
実施例１０
ロタウイルス蛋白質をコードするＤＮＡ転写ユニットを用いるマウスの免疫化
マウスを免疫化する能力についてロタウイルスＤＮＡ転写ユニットを試験した。マウスについてロタウイルスに対するワクチン投与のためにこの実験で用いたｐＣＭＶ／ＶＰ７ベクターは、プラスミドｐＣＭＶ／ＶＰ７がネズミロタウイルス中和キャプシド蛋白質ＶＰ７を発現することができるものである点を除き、図４及び６に示すものと類似している。ＶＰ７ＤＮＡはハリー  グリーンバーグ（Harry Greenberg)博士、スタンフォード大学、Palo Alto, CA, USAから入手した。
【００８２】
免疫応答を生ぜしめるためにｐＣＭＶ／ＶＰ７を用いるマウスの実験において、０．４μｇのＤＮＡを腹部皮膚に（上述のように）遺伝子銃で送達した。すべてのワクチン投与の後４週間目にブーストを行った。このブーストはワクチン投与と同じＤＮＡ投与量で、同じ接種部位に行った。ブースト後１〜２週間に抗体及び細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）について試験した。データは表１４及び図７に示す。
【００８３】
表１４  ｐＣＭＶ／ＶＰ７ＤＮＡ接種マウスの血清中の抗ＶＰ７抗体
【表１４】
2006316072.tif 000015
＊抗ＶＰ７抗体は全マウスＥＤＩＭロタウイルスに対しＥＬＩＳＡにより検定した。
【００８４】
ｐＣＭＶ／ＶＰ７ＤＮＡにより発生した全ＥＤＩＭウイルスに対する抗体ＥＬＩＳＡタイターを表１４に示す。１：２００の抗体タイターがＶＰ７遺伝子（ｐＣＭＶ／ＶＰ７）に対するＤＮＡ転写ユニットにより発生した。生のＥＤＩＭネズミロタウイルスの１回接種により得られる抗体のタイターは１：８００のタイターを与えた（示していない）。ｐＣＭＶ／対照プラスミドのみでは有意のタイターは得られなかった。
【００８５】
プラスミドｐＣＭＶ／ＶＰ７がネズミロタウイルス感染細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導することができることも見出された。クロミウム放出ＣＴＬ試験の結果を図７に示す。ｐＣＭＶ／ＶＰ７を接種されたマウスの脾臓細胞における特異的溶解のパーセントは、ＥＤＩＭロタウイルスを経口感染させたマウスで得られた４５％溶解と比べて、エフェクター対標的比が６０：１の場合で約３０％であった。
【００８６】
実施例１１
ＨＩＶ−１に対する免疫化のためのＤＮＡ構築物
ＨＩＶ−１に対する免疫化のために２系列のＤＮＡ転写ユニットを調製する。その第一はｐＢＣ１２／ＣＭＶベクター（上記及び図５を見よ）を用いてＨＩＶ−１配列のための転写制御要素を提供する。ｐＢＣ１２／ＣＭＶベクターにおいては、ＨＩＶ−１蛋白質の発現はＲｅｖ依存性である。第二の系列はJames I. Mullinsラボラトリー（スタンフォード大学）（Palo Alto, CA)で開発されたＪＷ４３０３ベクターを用いる（図８を見よ）。これらのベクターはＥｎｖのＲｅｖ非依存性発現を支持する。ＪＷ４３０３ベクター及びそれに伴うオリゴヌクレオチドはＨＩＶ−１単離物すべてのＥｎｖのＰＣＲ増幅断片のクローニングを容易にするように設計される。
【００８７】
ｐＢＣ１２／ＣＭＶに基づくベクター
ｐＢＣ１２／ＣＭＶに基づくベクター中へのクローニングはすべてｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２中で行った。具体的には、挿入断片は、ＩＬ−２のｃＤＮＡのＢａｍＨＩからＨｉｎＤIII までの断片と置換された。これらのクローニングには３種の挿入物が用いられた（図１０〜１２）。
【００８８】
ｐＣＭＶ／ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ（図１０）
図９は、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３（ＮＬ４−３）プロウイルスＤＮＡ及びその会合した長末端反復（ＬＴＲ）配列及び読み取り枠(open reading frames) を図示する。ｐＮＬ４−３はマルコーム(Malcolm, A.) 博士、マーチンス・ラボラトリー(National Institutes of Health, Bethesda, MD) から提供された( アダチ(Adachi)ら、J. Virol. 59, 284-291 (1986)) 。ＨＩＶ．ＮＬ４−３株のジーンバンク受託番号はＭ１９９１である。ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ挿入物は非感染性ＨＩＶ−１粒子をコードし、生のしかし非感染性の感染を真似るように構築された。非感染性の粒子をコードする挿入物を得るために、それぞれＨａｅII及びＢａｎII消化を用いて５’−ＬＴＲのすべて及び３’−ＬＴＲの大部分をｐＮＬ４−３から欠失させた。１９３２ｂｐの内部ＢａｌＩ欠失によりｐｏｌ遺伝子を非機能性とした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析を用いてＧａｇ及びＥｎｖの発現が証明された。Ｇａｇ蛋白質とＥｎｖ蛋白質は細胞内及び培養基の中の両方に存在した。このことは、Ｇａｇが粒子形成に要求される唯一のＨＩＶ−１蛋白質であることからも予想された。
【００８９】
ｐＣＭＶ／ＨＩＶ−１−ＨＸＢ−２．ｅｎｖ（ＨＸＢ−２．ｅｎｖ）（図１１）
ＨＸＢ−２．ｅｎｖは完全なＨＸＢ−２Ｅｎｖ及びＲｅｖを発現するように設計された。ＨＩＶ．ＨＸＢ２株のジーンバンク受託番号はＫ０３４５５及びＭ３８４３２である。正常なＨＩＶ−１のＥｎｖの発現はＲｅｖ依存性であるから、Ｒｅｖはこの構築物中に含まれる。この構築物はヨゼフ  ソドロスキー(Joseph Sodroski) 博士（ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティチュート，ボストン，ＭＡ）（ヘルゼート(Helseth) ら、J. Virol. 64, 2416-2420 (1990)) のｐＳＶIII.env 構築物のＳａｌＩからＸｈｏＩまでの断片をｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２のＩＬ−２のＢａｍＨＩからＨｉｎｄIII 断片と置換することにより得られた。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、Ｅｎｖの発現が証明された。
【００９０】
ｐＣＭＶ／ＨＩＶ−ＮＬ４−３．ｅｎｖ（ＮＬＶ−３．ｅｎｖ）（図１２）
ＨＩＶ−１Ｅｎｖ及びＲｅｖを発現する構築物の第二の例であるＮＬ４−３．ｅｎｖはＨＸＢ−２／ＮＬ４−３Ｅｎｖ融合蛋白質及びＲｅｖを発現した。この構築物においては、ＨＸＢ−２ｅｎｖの末端付近のユニークな制限部位であるＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩを用いてＮＬ４−３配列をｐＣＭＶ／ＨＸＢ−２．ｅｎｖ内の相同的なＨＸＢ−２ｅｎｖ配列と置換した。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析によりＥｎｖの発現が証明された。
【００９１】
ＪＷ４３０３に基づくベクター
ＪＷ４３０３プラスミドは、ＣＭＶ即時型プロモーター由来の約２０００ｂｐとウシ成長ホルモン由来の配列を挿入物発現のために使用する（図８）。ＣＭＶ即時型プロモーター由来の配列はＣＭＶイントロンＡをコードする配列を含む。このイントロンは挿入された遺伝子の発現を高めることができる（チャップマン(Chapman) ら、Nucleic Acids Research14, 3979-3986 (1991))。ＪＷ４３０３ベクターは組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA) 蛋白質に対する合成リーダー配列を含む。この合成リーダーはＥｎｖ発現の開始部位を提供する。組織プラスミノーゲン活性化因子のリーダーはグリコシル化蛋白質の合成及び分泌を加速する（ヘイグウッド(Haigwood)ら、Prot. Eng. 2, 611-620 (1989)) 。デザイナーオリゴヌクレオチドからのＰＣＲ増幅を用い、ＴＰＡリーダーとフレームを合わせて挿入されたｅｎｖ断片を作成した。ＨＩＶ−１の異なるサブグループの配列に共通な５’−オリゴヌクレオチドをＨＩＶ−１ｅｎｖ配列のどれかと成熟Ｅｎｖの正常末端の又はその付近のＴＰＡリーダーに融合させる。このオリゴヌクレオチドはＪＷ４３０３中へのサブクローニングのために合成ＴＰＡリーダー内のユニークな制限部位を使用できるように設計される。例えば、５’−オリゴヌクレオチドＪＡｐｃｒ５０３は、ＨＩＶ−１のサブグループＢ単離物に対する成熟Ｅｎｖのアミノ酸６の直前でＴＰＡリーダーの融合を可能とするＸｂａＩ部位を含む。
【００９２】
３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＥｎｖの分泌型ｇｐ１２０（ｓｇｐ１２０）、分泌型ｇｐ１４０（ｓｇｐ１４０）、又は正常なｇｐ１６０型を構築することができる（図１３〜１６を見よ）。Ｅｎｖのｓｇｐ１２０型をコードするＤＮＡ断片を、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間のプロテアーゼ切断部位をコードする配列の又はその付近の共通アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて合成する。サブグループＢウイルスのこのようなオリゴヌクレオチドの１例は、ＪＡｐｃｒ５０４（配列表の配列番号：２）である。Ｅｎｖのｓｇｐ１４０型をコードするＤＮＡをｇｐ４１の膜結合領域 (membrane anchor domain)の又はその付近の共通配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて合成する。サブグループＢウイルスのこのようなオリゴヌクレオチドの１例は、ＪＡｐｃｒ５０２（配列表の配列番号：３）である。完全ＥｎｖをコードするＤＮＡを細胞質ドメイン内又はｇｐ１６０のＣ末端の３’側の共通配列をコードするオリゴヌクレオチドを用いて合成する。サブグループＢ  ＨＩＶ−１のこのようなオリゴヌクレオチドの１例は、ＪＡｐｃｒ５０６である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＪＷ４３０３又はＪＷ４３０３の誘導体中へのクローニングを容易にするユニークな制限部位を有する。例えば、ＪＡｐｃｒ５０２及びＪＡｐｃｒ５０４はＪＷ４３０３内のユニークなＢａｍＨＩ部位内にクローニングするためのＢａｍＨＩ部位を含んでいる。
【００９３】
ＪＷ４３０３／ＨＩＶ−１−ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１２０（ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１２０）
ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１２０（図１４を見よ）は、ＪＡｐｃｒ５０３（ｇｔｃｇｃｔｃｃｔｃｔａｇａｔｔｇｔｇｇｇｔｃａｃａｇｔｃｔａｔｔａｔｇｇｇｇｔａｃｃ）（配列表の配列番号：１）とＪＡｐｃｒ５０４（ｇｇｔｃｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｇｃａｃｃａｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｇｃｃ）（配列表の配列番号：２）を用いてｐＣＭＶ／ＨＸＢ−２．ｅｎｖからの配列を増幅して合成した。この増幅された断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化したＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクトした細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１２０の存在が明らかにされた。
【００９４】
ＪＷ４３０３／ＨＩＶ−１−ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１４０（ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１４０）
ＨＸＢ−２．ｓｇｐ１４０（図１５を見よ）は、ＪＡｐｃｒ５０３（配列表の配列番号：１）とＪＡｐｃｒ５０２（ｃｇａｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｔｔａｔｇｔｃａａａｃｃａａｔｔｃｃａｃ）（配列表の配列番号：３）を用いてｐＣＭＶ／ＨＸＢ−２．ｅｎｖからの配列を増幅することにより構築した。増幅された断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化したＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクトした細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１２０の存在が明らかにされた。
【００９５】
実施例１２
ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３  ｐＢＣ１２ＣＭＶに基づくベクターの免疫原性テスト
ｐＢＣ１２／ＣＭＶに基づくベクターで免疫化する試みをＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。６〜８週齢のマウスを静脈内（ｉｖ）及び筋肉内（ｉｍ）経路の両方でＤＮＡ２００μｇの一連の注射により免疫化した（免疫化のスケジュールは図１７に示す）。６尾ずつのマウスからなる４実験群にＤＮＡを投与した。Ａ群は挿入物のないｐＣＭＶ／対照ＤＮＡを投与された。Ｂ群はｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡを受けた。Ｃ群はｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡを受けた。Ｄ群はｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡ１００μｇとｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡ１００μｇの混合物を受けた。マウスを免疫化に先立って採血し、免疫化後の種々の時点で採血した。各採血時に同一テスト群のマウスからの血清をプールした。実験の終わりにマウスを屠殺し脾臓を採取し、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＮＬ４−３Ｅｎｖ内の既知の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープに対するＣＴＬ活性について試験した。
【００９６】
抗Ｅｎｖ抗体のレベルを酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ミクロタイタープレートのウエルをウエル当たり０．４μｇの精製ｇｐ１２０（アメリカン・バイオテクノロジー・インク、ケムブリッジ、ＭＡから購入）で被覆した。マウスの血清をカオリンで前処理して非特異的活性を除去した（ノバク(Novak) ら、Vaccine 11, 55-60 (1993)) 。異なる希釈度の供試血清をウエル内でインキュベートし、そして抗ｇｐ１２０ＩｇＧの量をアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて測定した。適当な基質を添加し、光学密度を測定するためＥＬＩＳＡリーダーを用いて発色を評価した。対照群（Ａ群）の血清について得られた光学密度値を実験群（Ｂ、Ｃ、Ｄ群）について得られた値から差し引いた。
【００９７】
ＤＮＡ免疫化はＨＩＶ−１エンベロープに対する長寿命の抗体応答を発生させた（図１８、１９及び２０）。容易に検出される抗Ｅｎｖ抗体のレベルは、採血４（第３のＤＮＡ免疫化の１．５週間後）に出現した（図１８）。これらの抗体のレベルは持続し、採血５（第３のＤＮＡインキュベーション後４週間）においても同様なレベルの抗体が存在した（図１８）。ＤＮＡ免疫化群４、５及び６は抗Ｅｎｖ抗体のタイターを実質的に上昇させた（免疫化４、５及び６の１．５週間後の採血８を見よ）（図１８）。これらのより高いレベルの抗体は持続し、経時的にゆるやかな減衰を示した。２回のショットのそれぞれ当たり０．４μｇのＤＮＡを用いた腹部表皮への２回の遺伝子銃接種は抗Ｅｎｖ抗体のタイターを増加させなかった（図１９）。実験動物を遺伝子銃接種後さらに１４週間飼育した。この間に抗Ｅｎｖ抗体の良好なタイターが持続した（図２０）。
【００９８】
ｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖ  ＤＮＡ、ｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ  ＤＮＡ、及びｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖ  ＤＮＡとｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ  ＤＮＡの混合物は全体的に同様な抗体上昇能力を有していた（図１８）。これらのＤＮＡのそれぞれにおいて、抗Ｅｎｖ抗体の最高のレベルが採血８で得られた（図１８及び図１９）。これらの血清はすべて約１：３２００の終点タイターを有していた（図２１）。ｄｐｏｌ  ＤＮＡ及びｅｎｖ  ＤＮＡの混合物は抗ＥｎｖＩｇＧの最高のタイターを発生させた（図１８、１９及び２１）。しかしながら、これらのより高いタイターは、ＤＮＡが単一種として与えられたときに発生したタイターとは４倍も異ならなかった（図２１）。
【００９９】
生理食塩水中の多重ＤＮＡ接種及び遺伝子銃ブーストにより発生した抗Ｅｎｖ・ＥＬＩＳＡ抗体のレベルを、アグラセトゥス，インク( ミドルトン、WI) のジョエル ヘインズ(Joel Haynes) によりＥｎｖ発現ＤＮＡの遺伝子銃送達のみを用いて得られた結果と比較した（図２２）。図１７の実験における、ＮＬ４−３．ｅｎｖを接種されたマウスからの採血８の血清プール中に存在するレベルは、遺伝子銃ＤＮＡのみを受けたマウスの高い応答マウスの血清で見出されたレベルと中程度の応答マウスの血清のレベルとの中間であった。このことは図１７中で示された実験におけるテスト群からプールされた血清と一致し、この血清は腹部表皮への０．４μｇＤＮＡの３回遺伝子銃送達により発生したタイターと極めてよく似たタイターをもっていた。
【０１００】
マウスから得た血清は、ＮＬ４−３に対する中和活性についても試験した。これらの試験は、５０〜１００感染ユニットのＮＬ４−３を熱失活させそしてカオリン処理した各種希釈度のマウス血清とインキュベートすることにより行った。インキュベーションは３７℃で１時間行った。インキュベーション後に対数増殖期のＨ９細胞を添加した。２４時間後にこの細胞を洗浄し新鮮培地を与えた。４日後に培養物をトリトン−Ｘ１００で溶解し抗原捕捉ＥＬＩＳＡを用いてＮＬ４−３の複製を分析した。このような試験３回の結果を表１５に要約する。表１５のデータはＮＬ４−３複製の９０％以上阻止を与える血清の最終希釈度の逆数である。ＨＩＶ−ＩｇはＡＩＤＳ貯蔵所，ベセスダ，ＭＤから入手したセロポジティブなヒトからのプールされた免疫グロブリンである。
【０１０１】
表１５  ＤＮＡ免疫化血清におけるＮＬ４−３に対する中和抗体のタイター
【表１５】
2006316072.tif 000016
【０１０２】
中和試験により、ＤＮＡ免疫化マウスにおいて極めて高い中和活性が示された。ＥＬＩＳＡデータと一致して、ＮＬ４−３．ｅｎｖ  ＤＮＡで免疫化されたマウスとＮＬ４−３．ｄｐｏｌ  ＤＮＡで免疫化されたマウスとは中和抗体のタイターが匹敵していた。これもＥＬＩＳＡデータと一致して、中和抗体は極めて良好な持続性を示し、最後のＤＮＡ接種後１４週間に４倍以下の低下しか受けなかった。こうして、ＤＮＡ接種はＮＬ４−３に対する顕著な中和活性を発生させた。これはＤＮＡ発現細胞によるＨＩＶ−１  Ｅｎｖの天然型の提示を反映している。
【０１０３】
ジョエル  ヘインズ(Joel Haynes）博士、アグラセトゥス、インクにより細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性についての試験が行われた。ＣＴＬ分析のために、マウスを殺し、応答体の脾臓細胞を採取し、１０ユニット／ｍｌのラットインターロイキン−２を含むＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌゲンタミシン（ＲＰＭＩ−１０）中に再懸濁した。刺激因子である脾臓細胞は無経験動物からの脾臓細胞を１×１０7 細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ−１０に懸濁し、マイトマイシンＣを最終濃度２５μｇ／ｍｌまで添加することにより調製した。刺激細胞をマイトマイシンＣの存在下に３７℃で２５分間インキュベートし、ＲＰＭＩ−１０で洗浄し、次いでＢＡＬＢ／ｃマウスにより認識される既知のＣＴＬエピトープを提示する合成ペプチド（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ）（配列表の配列番号：４）でパルスした。およそ同数の刺激細胞と応答細胞とを５〜６日間同時培養した。イン・ビトロで刺激された応答細胞の、クロミウム51負荷ペプチドでパルスされたＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３標的細胞の溶解能を測定するために、細胞障害性試験が用いられた。
【０１０４】
ＤＮＡ免疫化は実験の終了時に容易に検出される細胞障害性Ｔ細胞活性を発生させた（最後のＤＮＡ免疫化後１４週目）（図２３）。Ｅｎｖ  ペプチドパルス化標的細胞のＣＴＬ活性は、ｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖ  ＤＮＡ、ｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ  ＤＮＡ、及びｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｅｎｖ  ＤＮＡとｐＣＭＶ／ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ  ＤＮＡの混合物で免疫化されたマウスについて同様であった。
【０１０５】
実施例１３
ＳＩＶmac に対する免疫化のためのＤＮＡ構築物
ＳＩＶ構築物
ＨＩＶ−１の場合と同様に、ＳＩＶmac に対する免疫化のために２系列のＤＮＡ転写ユニットを調製した。これらの第１は、ブライアン  Ｒ．クレン(Cullen)博士のｐＢＣ１２／ＣＭＶベクターを使用する（上記及び図５を見よ）。第２の系列はジェームス  Ｉ．ムリンス  ラボラトリー（上記及び図８を見よ）で開発されたＪＷ４３０３ベクターを用いた。
【０１０６】
ｐＢＣ１２／ＣＭＶに基づくＳＩＶベクター
ｐＢＣ１２／ＣＭＶに基づくベクターへのクローニングはｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２中で行われた。ＳＩＶ２３９挿入物はＳＩＶ２３９プロウイルスＤＮＡをコードするプラスミドから調製された（図２６）。これらのプラスミド（ｐ２３９ＳｐＳｐ５’及びｐ２３９ＳｐＥ３’）は、ロナルド  Ｃ．デスロジアース(Desrosiers)博士、ニューイングランド・リージョナル・プライメート・リサーチ・センター（サウスボロー、ＭＡ）により提供された。具体的には、ｐＣＭＶ／ＳＩＶ２３９．ｄｐｏｌ（２３９．ｄｐｏｌ）挿入物（図２７）をｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２内のＩＬ−２ｃＤＮＡのＢａｍＨＩからＨｉｎｄIII までの断片と置換した。この２３９．ｄｐｏｌ挿入物は、ＮａｒＩ欠失により５’ＬＴＲ非機能性とし、内部のＢｓｔＥII欠失によりｐｏｌ非機能性とし、そしてＳｔｕＩ消化でＬＴＲの大部分を除去することにより構築した。ｐ２３９ＳｐＥ３’は、点彩により示された欠陥ｎｅｆ遺伝子をコードする。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析を用いてＧａｇ及びＥｎｖの発現が証明された。Ｇａｇ及びＥｎｖ蛋白質は細胞内及び培養基内の両方に存在した。このことはＧａｇが粒子形成のために要求される唯一のＳＩＶ−１蛋白質であることから予期されたとおりであった。
【０１０７】
ＪＷ４３０３に基づくベクター
ＳＩＶに対するＪＷ４３０３・ＤＮＡ転写ユニットはＳＩＶｅｎｖ配列のＰＣＲ増幅断片を用いて構築した（図２６−２９）。５’センスプライマーはＴＰＡリーダーとの融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築において役に立った。３’アンチセンス  オリゴヌクレオチドを用いてｓｇｐ１２０、ｓｇｐ１４０、及び全長ＳＩＶｅｎｖ断片を作成した。
【０１０８】
ＪＷ４３０３／ＳＩＶ２３９．ｓｇｐ１２０（２３９．ｓｇｐ１２０）（図２７）
２３９．ｓｇｐ１２０は、ｐ２３９ｓｐＥ３’からの配列を増幅するためにオリゴヌクレオチドＪＡｐｃｒ１９及びオリゴヌクレオチドＪＷｐｃｒ８を用いて合成した。増幅された断片をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクト細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１２０が見出された。ＳＩＶ２３９は赤毛猿(macaques)におけるワクチン投与実験のための確立されたモデルであるから、この構築に２３９配列を使用した。ＳＩＶ２３９はＳＩＶ２５１の突然変異体であり、後者も構築物の作成に使用される（以下を見よ）。ＳＩＶ２３９株に対するジーンバンク受託番号はＭ３３２６２、Ｍ６１０６２、及びＭ６１０９３である。ＳＩＶ２５１株に対するジーンバンク受託番号はＭ１９４９９及びＸ０６３９３である。
【０１０９】
ｐＪＷ４３０３／ＳＩＶ２３９．ｓｇｐ１４０（２３９．ｓｇｐ１４０）（図２８）
２３９．ｓｇｐ１４０は、ｐ２３９ＳｐＥ３’からの配列を増幅するためにオリゴヌクレオチドＪＡｐｃｒ１９とオリゴヌクレオチドＨＫｐｃｒ２を用いて構築された。増幅された断片をＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化したｐＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクトした細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１４０が見出された。上に指摘したように、２３９配列が用いられたのは、２３９ウイルスが赤毛猿のワクチン投与実験のためのモデルとして確立されているからである。
【０１１０】
ｐＪＷ４３０３／ＳＩＶ２５１．ｓｇｐ１４０（２５１．ｓｇｐ１４０）（図２８）
２５１．ｓｇｐ１４０は、ｐＭ４０ＫＳＩＶ２５１ｅｎｖ（ロナルド  Ｃ．デスロジアース(Desrosiers)博士、ニューイングランド・プライメート・リサーチ・センター、サウスボロー、ＭＡから入手した）からの配列を増幅するためにオリゴヌクレオチドＪａｐｃｒ１９とオリゴヌクレオチドＨｋｐｃｒ２を用いて構築した。増幅された断片をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクト細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１４０が見出された。
【０１１１】
ｐＪＷ４３０３／ＳＩＶ３１６．ｓｇｐ１４０（３１６．ｓｇｐ１４０）（図２８）
３１６．ｓｇｐ１４０は、ロナルド  Ｃ．デスロジアース (Desrosiers)博士、ニューイングランド・プライメート・リサーチ・センターから入手したＰＣＲｅｎｖクローン３１６−３からの配列を増幅するためオリゴヌクレオチドＪａｐｃｒ１９とオリゴヌクレオチドＨｋｐｃｒ２を用いて構築した。増幅された断片をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＪＷ４３０３中にサブクローニングした。トランスフェクトしたコス細胞のウエスタンブロット分析により、トランスフェクト細胞内及び培養基内の両方にｓｇ１２０が見出された。ＳＩＶ３１６はＳＩＶ２３９の突然変異体であり、後者は単球／マクロファージ屈性 (tropism) を有する（モリ(Mori) K. ら、J. Virology 66(4), 2067-2075 (1992))。
【０１１２】
実施例１４
ＳＩＶ  ＤＮＡワクチン投与実験の設計
赤毛猿を免疫化するためにＳＩＶをコードするＤＮＡを用いてワクチン投与実験を試みた。雄及び雌の若い免疫能力を有する動物をこの実験に用いる。三回のＤＮＡ接種が実験の１週と３週、１１週と１３週、及び２１週と２３週に行われる。最終ＤＮＡ接種の２週間後に致死量チャレンジが投与される。このチャレンジは、静脈内接種により投与されるＳＩＶ２３９の１０猿感染ユニットからなる。
【０１１３】
３群の猿を実験に用いる。各群は３種の異なるＳＩＶ２３９ＤＮＡ、すなわち２３９．ｄｐｏｌ、２３９．ｓｇｐ１２０、及び２３９．ｓｇｐ１４０（図２５、２７及び２８）の投与を受ける。各ＤＮＡ接種時に、第１群の４頭の赤毛猿はｉｖ経路とｉｍ経路の両方からの接種によりこれらのＤＮＡのそれぞれ５００μｇ並びにふとももの皮膚に各３種のＤＮＡからなる２回の遺伝子銃ショット（アクセル・インストルメント）及び腹部皮膚に３種のＤＮＡからなる２回の銃ショットを受ける。第２の群の猿はふとももの皮膚に３種のＤＮＡからなる２回の遺伝子銃ショット及び腹部皮膚に３種ＤＮＡからなる２回の銃ショットを受ける。第３群は５００μｇのｐＣＭＶ／対照ＤＮＡ及び１ｍｇのｐＪＷ４３０３ＤＮＡを静脈内及び筋肉内接種経路の両方により、並びにふとももの皮膚に投与するｐＣＭＶ／対照の２回遺伝子銃ショット及びｐＪＷ４３０３ＤＮＡの４回銃ショット及び腹部皮膚に投与されるｐＣＭＶ／対照の２回遺伝子銃ショット及びｐＪＷ４３０３ＤＮＡの４回銃ショットを受ける。
【０１１４】
２３９．ｄｐｏｌの遺伝子銃ショットは、ＳＩＶmac Ｒｅｖ及び２３９．ｄｐｏｌに対するＤＮＡ転写ユニットの等モル量を負荷されたビーズを用いて行われた。皮膚細胞における付加的なＲｅｖの発現はＧａｇ及びＥｎｖの発現レベルを増加させる。ＳＩＶmac Ｒｅｖに対する転写ユニットはグレゴリーＡ．ビグリアンティ（Viglianti)博士、マサチューセッツ大学メディカルセンター、ウースター、ＭＡから入手した。
【０１１５】
１１週と１３週及び２１週と２３週の接種のために付加的なＥｎｖコードＤＮＡをワクチンに添加する。これらは感染動物で生ずるＳＩＶ突然変異体に対する応答を含めるように免疫応答を拡げるために付加される。応答の拡大を可能とするために、猿の二つのワクチン群（上記の１群及び２群）は、２５１．ｓｇｐ１４０の２回の遺伝子銃ショット及び３１６．ｓｇｐ１４０の２回の遺伝子銃ショットを受ける。これらは腹部表皮に送達される。これらのショットは実験の１週及び３週に受けた同じショットに付け加えて投与される。
【０１１６】
実施例１５
ワクチン転写ユニットに使用するための患者単離物からのＨＩＶ−１ｅｎｖ配列の分子クローニング
健康なセロポジティブな感染相に特徴的なゆっくりとした／低い、非シンシチウム誘導性の単球／マクロファージ屈性ウイルスを表すサブグループＢ  ＨＩＶ−１単離物に対するｅｎｖ配列、並びにＡＩＤＳ患者に見出される急速な／高い、シンシチウム誘導性のＴ細胞株屈性ウイルスを表すｅｎｖ配列を得るために、２系列の一連の患者単離物をエバ  マリア  フェンヨ(Fenyo) 博士、カロリンスカ・インスティチュート、スエーデンから入手した（Von Gegerfelt, A. ら、Virol. 185, 162-168 (1991)( 表１６を見よ）。これらの単離物は感染の健康なセロポジティブな相からＡＩＤＳ相までの進行の期間の２〜３年間にわたって得られたものであった。一系列は患者５からのものであり、第２は患者６からのものであった。
【０１１７】
【表１６】
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【０１１８】
単離物からのエンベロープ配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により回収された。培養上清をマイトジェンで刺激したＰＢＬ上で一度増殖させた。感染後５日目でより激しい単離物に対する高レベルのシンシチウムが出現した時にＤＮＡを調製した。次いでＰＣＲ増幅を用いて分子量約２．１ｋｂのｅｎｖのＫｐｎＩからＢａｍIII までの断片を回収した。この断片は実質的にｇｐ１２０のすべてをコードし、ｇｐ１２０の１３個のＮ末端アミノ酸だけに対するコドンを欠いている。それはまた、ｇｐ４１の約３４０個のアミノ酸のうちの約２４０個をコードし、これはｇｐ４１の細胞外ドメイン及び貫膜ドメインのすべて並びに高度に酸性な配列を含む細胞内ドメインの部分を含んでいる。
【０１１９】
ＰＣＲ反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは保存された制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように、並びにマイヤースデータベース( マイヤース（Meyers) ら、Human Retrovirus and AIDS, Los Alamos National Laboratory, LosAlamos, NM, 1992)中の現在のＨＩＶ−１単離物中に完全に保存されている３’塩基の数を最大にするように選択される。実際の増幅は、２５０ｎｇのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、及び１ユニットのアムプリタックを用い、最終量１００μｌで行った。
【０１２０】
クローンを、ロナルド  Ｃ．デスロジアース(Desrosiers)博士（ニューイングランド・プライメート・リサーチ・センター、サウスボロー、ＭＡ）により提供されたｐＮＬ４−３の右半分中にクローニングした。これは、（ｉ）ＰＣＲ増幅されたｅｎｖ配列のＫｐｎＩからＢａｍＨＩまでの２．１ｋｂ断片、（ii) ｐＮＬ４−３からのＥｃｏＲＩからＫｐｎＩまでの０．６ｋｂ断片（３’ｖｐｒから５’ｅｎｖまでの配列）、及び（iii)  ｐＮＬ４−３の右半分のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片（３’ｅｎｖ配列、ｎｅｆ配列、ＬＴＲ配列及びプラスミド配列を含む）の３片クローニングとして行われた。クローンが得られると、Ｖ３ループの配列及び隣接する配列が得られる（表１７を見よ）。この配列は、このクローンが汚染物ではなく、さらなるサブクローニングをモニターするための指紋配列(signature sequence)を提供する。
【０１２１】
表１７  患者５及び患者６からの一連の単離物由来のｅｎｖクローン、Ｖ３ループ配列及び隣接するＣ−末端配列、比較配列及び共通配列
【表１７】
2006316072.tif 000018
【０１２２】
次いで、クローンについて、コス−１細胞中へのｐＮＬ４−３の左半分と同時トランスフェクションし、マイトジェン刺激ＰＢＬと共に同時培養を行うことにより、その生物学的活性を試験した。ｐ６Ｂ−１、ｐ６Ａ−１、ｐ６Ｃ−１、ｐ６Ｄ−１とＮＬ４−３．ｅｎｖ組換え体は機能性のｅｎｖをコードし、これらをそこから回収した培養物に特徴的な増殖を支える。これらのｅｎｖは疾病の異なるステージ及び患者単離物に特徴的な異なる増殖を表す。これらのｅｎｖはＰＣＲ増幅断片上を移動し、免疫原性テストのためのｐＪＷ４０３０ベクター中に移る（上記の図１３〜１６を見よ）。
【０１２３】
均等物
当技術分野に熟練せる者は単なる日常的実験を用いて本明細書に記載された発明の具体的態様に均等な多くの事を認識し又は確認することができるであろう。これらのそしてその他のこのような均等物は以下の請求の範囲に包含されるものである。
【０１２４】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[１]  ロタウイルス又は免疫不全ウイルスに対する防御的免疫応答を誘導することによる脊椎動物免疫化に使用するための医薬の製造における、プロモータ領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットの使用であって、この防御的免疫応答が目的抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答であるＤＮＡ転写ユニットの使用。
[２]  ロタウイルス又は免疫不全ウイルスに対する防御的免疫応答を誘導することにより脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法はプロモータ領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物に投与することを含んでなる方法であり、これによる防御的免疫応答が目的の抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答である方法。
[３]  ＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、この転写ユニットがプロモータ領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、このＤＮＡが微小体でカプセル化されている(microsphere encapsulated)ものである生産物。
[４]  目的の抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することによる脊椎動物免疫化における使用などの治療における使用のための、微小体でカプセル化されているＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、該転写ユニットがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものである生産物。
[５]  目的の抗原に対して誘導される体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することによる脊椎動物免疫化に使用するための医薬の製造のための、微小体でカプセル化されているＤＮＡ転写ユニットの使用であって、該転写ユニットがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものである、使用。
[６]  脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法が微小体でカプセル化されたＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物に投与することを含み、このＤＮＡ転写ユニットがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、これによる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が目的抗原に対するもの／又は目的抗原に対して誘導されるものである、方法。
[７]  １個以上のＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、転写ユニットのそれぞれがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、これによる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が目的抗原に対するもの／又は目的抗原に対して誘導されるものであり、一つの転写ユニットに対する目的抗原が他の転写ユニットの目的抗原もしくは複数の他の転写ユニットそれぞれの目的抗原とは異なるものである、生産物。
[８]  治療に使用するための１個以上のＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、転写ユニットのそれぞれがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、一つの転写ユニットに対する目的抗原が他の転写ユニットの目的抗原もしくは複数の他の転写ユニットそれぞれの目的抗原とは異なっており、該治療における使用が、例えば該生産物を投与することにより脊椎動物を免疫化する方法であって、これによる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が該目的抗原に対するものであり／又は該目的抗原に対して誘導されるものである、生産物。
[９]  脊椎動物に生産物を投与することによる該脊椎動物を免疫化するための医薬の製造における１個以上のＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物の使用であって、該転写ユニットのそれぞれがプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、これによる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が目的抗原に対するもの／又は目的抗原に対して誘導されるものであり、一つの転写ユニットに対する目的抗原が他の転写ユニットの目的抗原もしくは複数の他の転写ユニットそれぞれの目的抗原とは異なっているものである、使用。
[１０]  脊椎動物を免疫化する方法であって、該方法は１個以上のＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物に投与することを含んでなる方法であり、該転写ユニットはそれぞれプロモーター領域のＤＮＡに機能的に連結しかつ目的抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、これによる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答が目的抗原に対するもの／又は目的抗原に対して誘導されるものであり、一つの転写ユニットに対する目的抗原が他の転写ユニットの目的抗原もしくは複数の他の転写ユニットそれぞれの目的抗原とは異なっているものである、方法。
[１１]  異なる抗原がインフルエンザウイルス由来の防御的応答を誘導するものである、前記[７]、[８]、[９]又は[１０]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[１２]  異なる抗原がインフルエンザの異なるサブタイプ由来のものである前記[１１]記載の生産物、使用又は方法。
[１３]  異なる抗原がインフルエンザの異なるサブグループ由来のものである前記[１１]記載の生産物、使用又は方法。
[１４]  異なる抗原がインフルエンザの異なるサブタイプ由来のもの及びインフルエンザの異なるサブグループ由来のものである前記[１１]記載の生産物、使用又は方法。
[１５]  異なる抗原が免疫不全ウイルス由来の防御的応答を誘導するものである、前記[７]、[８]、[９]又は[１０]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[１６]  異なる抗原が免疫不全ウイルスの異なるサブグループを表すものである、前記[１５]記載の生産物、使用又は方法。
[１７]  異なる抗原が免疫不全ウイルスの異なる感染相（phases of infection)を表すものである、前記[１５]記載の生産物、使用又は方法。
[１８]  異なる抗原が免疫不全ウイルスの異なる組織屈性(tissue tropisms) を表すものである、前記[１５]記載の生産物、使用又は方法。
[１９]  異なる抗原が免疫不全ウイルスの異なる伝達ルートを表すものである、前記[１５]記載の生産物、使用又は方法。
[２０]  転写ユニットが微小体でカプセル化されているものである、前記[１]、[２]、又は[７]〜[１９]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２１]  １個以上の転写ユニットが脊椎動物に投与されるものであり、一つの転写ユニットに対する目的抗原が他の転写ユニットの目的抗原又は複数の他の転写ユニットそれぞれの目的抗原とは異なっているものである、前記[１]〜[６]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２２]  前記[１１]〜[１９]のいずれかの特徴をさらに含む前記[２１]記載の生産物、使用又は方法。
[２３]  静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、及び皮下内からなる群より選択される投与経路を介して脊椎動物に投与するための先行する前記[１]〜[２２]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２４]  粘膜表面への接触により脊椎動物へ投与するための前記[１]〜[２２]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２５]  該粘膜表面が鼻粘膜表面又は気管粘膜表面などの呼吸器系粘膜表面である、前記[２４]記載の生産物、使用又は方法。
[２６]  転写ユニットのプロモーター領域がレトロウイルス起源のもの又は非レトロウイルス起源のものである、先行する前記[１]〜[２５]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２７]  該脊椎動物がヒトなどの哺乳動物である、先行する前記[１]〜[２６]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２８]  該転写ユニットが宿主細胞因子により直接発現されるものである、先行する前記[１]〜[２７]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[２９]  該目的抗原がウイルスに対する防御的免疫応答を誘導することができるものである、先行する前記[１]〜[２８]いずれか記載の生産物、使用又は方法。
[３０]  該ウイルスがインフルエンザウイルスである前記[２９]記載の生産物、使用又は方法。
[３１]  該目的抗原がインフルエンザウイルスの赤血球凝集素である、前記[３０]記載の生産物、使用又は方法。
[３２]  該ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである前記[２９]記載の生産物、使用又は方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、複製可能なレトロウイルスベクターにより発現されるインフルエンザウイルス血球凝集素タイプ７（Ｈ７）遺伝子を含んでなるＤＮＡ転写ユニット（ｐＰ１／Ｈ７と呼ばれる）を含む細菌プラスミドの図式的表示である。
【図２】図２は、複製欠損レトロウイルスベクターにより発現されるインフルエンザウイルス血球凝集素タイプ７（Ｈ７）遺伝子を含んでなるＤＮＡ転写ユニット（ｐ１８８）を含む細菌プラスミドの図式的表示である。
【図３】図３は、対照として使用された、Ｈ７挿入物を含まないレトロウイルスベクター（ｐＲＣＡＳ）を含んでなる細菌プラスミドの図式的表示である。
【図４】図４は、サブタイプＨ７血球凝集素をコードするインフルエンザウイルス抗原ＤＮＡ転写ユニットを含んでなる非レトロウイルスベクターの図式的表示である。
【図５】図５は、インフルエンザウイルス抗原をコードしていない対照ＤＮＡ転写ユニットを含んでなる非レトロウイルスベクターの図式的表示である。
【図６】図６は、サブタイプＨ１血球凝集素をコードするインフルエンザウイルス抗原ＤＮＡ転写ユニットを含んでなる非レトロウイルスベクターの図式的表示である。
【図７】図７は、対照との比較において、ＥＤＩＭ  ＶＰ７ロタウイルスｃＤＮＡを遺伝子銃により接種されたマウスの細胞障害性Ｔ細胞応答を示す棒グラフである。黒棒は標的に対するエフェクターの比が６０：１であり、縞の棒は標的に対するエフェクターの比が３０：１である。
【図８】図８は、ＣＭＶイントロンＡ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）蛋白質に対するリーダー配列、及びウシ成長ホルモンのポリＡ配列を含んでなるｐＪＷ４３０３ベクターの図式的表示である。
【図９】図９は、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの図式的表示である。
【図１０】図１０は、ＮＬ４−３．ｄｐｏｌ挿入物の図式的表示である。
【図１１】図１１は、ＨＸＢ−２．ｅｎｖ挿入物の図式的表示である。
【図１２】図１２は、ＮＬ４−３．ｅｎｖ挿入物の図式的表示である。
【図１３】図１３は、ＨＩＶ−１  ｅｎｖＤＮＡの図式的表示である。
【図１４】図１４は、ｓｇｐ１２０．ｅｎｖ挿入物の図式的表示である。
【図１５】図１５は、ｓｇｐ１４０．ｅｎｖ挿入物の図式的表示である。
【図１６】図１６は、ｓｇｐ１６０．ｅｎｖ挿入物の図式的表示である。
【図１７】図１７は、ＨＩＶ−１ベクターに対しマウスで用いられたＤＮＡ免疫化スケジュールを示す図である。
【図１８】図１８は、静脈接種及び筋肉内接種によりマウス中に発現された抗−ｇｐ１２０抗体の発現量を示す棒グラフである。点彩を施した棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、縞を施した棒はＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、白棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡとＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡの両方を投与されたマウスの血清である。
【図１９】図１９は、静脈内接種及び筋肉内接種後に遺伝子銃接種を行ったマウス中で発現した抗−ｇｐ１２０抗体の量を図示する棒グラフである。点彩を施した棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、縞を施した棒はＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、白棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡとＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡの両方を投与されたマウスの血清である。
【図２０】図２０は、ＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡとＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡの両方を投与されたマウス中におけるマウス抗−ｇｐ１２０タイターの長寿を示す棒グラフである。
【図２１】図２１はＤＮＡ接種後のマウス中に発現した抗−ｇｐ１２０抗体の力価を示す棒グラフである。点彩を施した棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、縞を施した棒はＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡを投与されたマウスの血清であり、白棒はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡとＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡの両方を投与されたマウスの血清である。
【図２２】図２２は、遺伝子銃ｅｎｖＤＮＡ接種によりマウス中に発現した抗−ｅｎｖ抗体の量を示す棒グラフである。薄い黒棒は遺伝子銃のみによってＮＬ４−３．ｅｎｖを接種された高応答マウスから得られた結果であり、縞を施した棒は遺伝子銃のみによって接種された中程度応答マウスから得られた結果であり、黒色棒は静脈内経路及び筋肉内経路でＮＬ４−３．ｅｎｖを接種されたマウスの採血８から得られた結果である。
【図２３】図２３は、ＨＩＶ−１接種マウスの細胞障害性Ｔ細胞活性を示すグラフである。白丸はベクターを接種されたマウスからの結果であり、黒丸はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡを、黒三角はＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡを、黒四角はＮＬ４−３．ｅｎｖＤＮＡとＮＬ４−３．ｄｐｏｌＤＮＡの両方を投与されたマウスの血清である。Ｅ：Ｔは標的に対するエフェクターの比である。
【図２４】図２４は、ＳＩＶ−２３９プロウイルスＤＮＡの図式的表示である。
【図２５】図２５は、ＳＩＶ−２３９．ｄｐｏｌ挿入物の図式的表示である。
【図２６】図２６は、ＳＩＶ−２３９．ｅｎｖＤＮＡの図式的表示である。
【図２７】図２７は、ＳＩＶｓｇｐ１２０挿入物の図式的表示である。
【図２８】図２８は、ＳＩＶｓｇｐ１４０挿入物の図式的表示である。
【図２９】図２９は、ＳＩＶｓｇｐ１６０挿入物の図式的表示である。
【図３０】図３０は、ＰＣＲ増幅に用いられた制限部位及びオリゴヌクレオチド並びにＨＩＶ−１患者単離物からのｅｎｖのサブクローニングを示す図式的表示である。
【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2006316072.tif 000046
【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の免疫化に使用するためのＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、該ＤＮＡ転写ユニットは、プロモータ領域を含むＤＮＡに作動可能に連結したロタウイルスの抗原をコードしているＤＮＡを含み、該生産物がロタウイルス抗原に対して体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の双方を誘導する、生産物。
【請求項２】
ＤＮＡ転写ユニットを含んでなる生産物であって、この転写ユニットが、プロモータ領域を含むＤＮＡに作動可能に連結した抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、このＤＮＡが微小体でカプセル化されている(microsphere encapsulated)ものである生産物。
【請求項３】
１個を超えるＤＮＡ転写ユニットを含んでなる脊椎動物免疫化に使用するための生産物であって、転写ユニットのそれぞれがプロモータ領域を含むＤＮＡに作動可能に連結した抗原をコードしているＤＮＡを含んでなるものであり、該生産物が抗原に対して体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の双方を誘導し、一つの転写ユニットに対する抗原が別の転写ユニット（１つまたは複数）の抗原とは異なるものである、生産物。
【請求項４】
異なる抗原がインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するものである、請求項３記載の生産物。
【請求項５】
異なる抗原がインフルエンザの異なるサブタイプ由来のものである請求項４記載の生産物。
【請求項６】
異なる抗原がインフルエンザの異なるサブグループ由来のものである請求項４記載の生産物。
【請求項７】
異なる抗原がインフルエンザの異なるサブタイプ由来のもの及びインフルエンザの異なるサブグループ由来のものである請求項４記載の生産物。
【請求項８】
静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、及び皮下からなる群より選択される投与経路を介して脊椎動物に投与するために適合させる、請求項１〜７いずれか記載の生産物。
【請求項９】
粘膜表面への接触により脊椎動物へ投与するために適合させる、請求項１〜７いずれか記載の生産物。
【請求項１０】
転写ユニットのプロモータ領域がレトロウイルス起源のものである、請求項１〜９いずれか記載の生産物。
【請求項１１】
転写ユニットのプロモータ領域が非レトロウイルス起源のものである、請求項１〜９いずれか記載の生産物。