(57)【要約】【課題】神経系癌幹細胞を分離する方法、神経芽腫の予後診断薬などを提供する。【解決手段】神経系癌幹細胞におけるニューレキソフィリンファミリーの発現に基づいた神経系癌幹細胞を分離する方法、神経芽腫におけるニューレキソフィリンファミリーの発現に基づいた予後診断薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経系癌幹細胞の検出試薬。
【請求項２】
ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経系癌幹細胞の検出試薬。
【請求項３】
神経系癌細胞の集団から神経系癌幹細胞を分離する方法であって、
神経系癌細胞の集団とニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を接触させる工程と、
前記抗体と結合する細胞を選別する工程と、
を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の分離方法によって分離された神経系癌幹細胞。
【請求項５】
ニューレキソフィリン−２タンパク質が細胞表面に存在する、単離された神経系癌幹細胞。
【請求項６】
ニューレキソフィリン−１タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経芽腫の予後診断薬。
【請求項７】
ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経芽腫の予後診断薬。
【請求項８】
ニューレキソフィリン−１ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経芽腫の予後診断薬。
【請求項９】
ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経芽腫の予後診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系癌幹細胞の検出試薬、神経系癌幹細胞を分離する方法、神経系癌幹細胞、及び神経芽腫の予後診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、再生と幹細胞の生物学に関する知見が急速に増大している。ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立、成体の体細胞からの個体クローン作製の成功、組織幹細胞の同定と幹細胞の分化転換の解明など、発生や再生に関する大きな転機となる研究成果が発表されている（非特許文献１）。
【０００３】
１９７７年に癌幹細胞という概念が提唱され（非特許文献２）、１９８３年には白血病発症機構の研究から概念として癌幹細胞が考えられている（非特許文献３）。さらに、癌が成体幹細胞を起源とする病気であるという学説が目立つようになってきた（非特許文献４〜７）。
【０００４】
癌幹細胞の概念の概要は次の通りである。通常、胚性幹細胞は自己複製を行いながら、種々の器官の幹細胞へ分化し、さらに正常組織細胞へ分化する。しかし、幹細胞に何らかの刺激が加わり変異が生じると、悪性腫瘍（癌）幹細胞へ分化し、さらに癌細胞へ分化する。このとき分化した癌細胞は癌幹細胞よりも増殖が極めて速い（幹細胞は遅い自己複製能を有しているため）。従来の抗癌剤で死滅するのは増殖速度の速い癌細胞のみであり、癌幹細胞はその影響を受けない。したがって、癌幹細胞から再び癌細胞が分化し続け、結果的に癌が増殖することになる。
【０００５】
一方、神経芽腫は、小児期の脳腫瘍を除く悪性固形腫瘍の中で最も頻度の高い腫瘍である。神経芽腫は、神経堤の分化の過程の脊髄、交感神経節及び副腎から発生する。神経芽腫には、ときに自然消退することや、治療により神経節細胞へ分化することなどの特徴がある。このように特異的な生物学的特性を有した神経芽腫の細胞株を研究してきたRobert A Rossらによれば（非特許文献９）、神経芽腫の細胞株は形態学的に以下の３つのタイプに大別される。
（１）N-type neuroblastic/neroendocrine precursors
（２）S-type Shwannian/melanoblastic precursors
（３）I-type stem cells
【０００６】
Ｎ型の細胞は、小型で細長く折れ曲がった神経細胞体を有している。また、Ｎ／Ｃ比（核／細胞質比）は比較的大きく、短い複数の神経突起を有することを大きな特徴とする。さらに、細胞間の接着性が強く、細胞が密集し神経節様に集合する。Ｓ型の細胞は、卵円形の縦長の核を有し、細胞質が豊富である。また、神経突起は存在しない。細胞間の接着性は弱く、培地に対する接着性が強く、培養すると細胞同士が重層せずに一層で増殖する。Ｉ型の細胞はＮ型の細胞とＳ型の細胞の中間型であり、両細胞の特徴を併せ持っている。神経細胞体は比較的小型であり、Ｎ型の細胞と比較すると細胞質は豊富であり、神経突起を有する細胞と有しない細胞が混在する。細胞間の接着能と培地への接着能は同程度である。Ｎ型の細胞に比較的近い成長をし、細胞は何層にも重なり、神経細胞の集合体を形成する。
【０００７】
Ｉ型の細胞は、さらに次の特徴も有している。すべての神経芽腫が様々な分化段階の神経芽細胞を有している。Ｉ型の細胞は、神経細胞の特徴を有した細胞に分化することができる。Ｉ型の細胞は、神経芽腫のすべてのステージにおいて存在する。これらの特徴から、神経芽腫の分化の過程や生物学的特性においてＩ型の細胞は重要な存在である可能性があると考えられている。また、Ｉ型の細胞は、上記性質から、神経系の幹細胞又は神経系の癌幹細胞様の可能性がある。
【０００８】
一方、本発明者らは、神経芽腫の発生及び生物学的特性に関与する遺伝子の同定並びに新規予後因子の同定のために、神経芽腫ｃＤＮＡライブラリーから約５０００以上の遺伝子を単離してきた（特許文献１〜５及び非特許文献８）。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０１／６６７１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／６６７３３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／９７０９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／１０３０１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／３９９７５号パンフレット
【非特許文献１】桜田一洋ら、再生医療の産業化と幹細胞創薬、実験医学、２１巻、１１４２−１１４７頁（２００３年）
【非特許文献２】Hamburger AW et al., Primary bioassay of human tumor stem cells., Science,vol. 197, pp. 461-463 (1977)
【非特許文献３】McCulloch EA, Stem cells in normal and leukemic hemopoiesis (HenryStratton Lecture, 1982)., Blood, vol. 62, pp. 1-13 (1983)
【非特許文献４】日野裕史ら、幹細胞生物学と再生医学のこれから、実験医学、１９巻、１９３２−１９３７頁（２００１年）
【非特許文献５】Ruiz i Altaba A et al., Gli and hedgehog in cancer: tumours, embryosand stem cells., Nat. Rev. Cancer, vol. 2, pp. 361-372 (2002)
【非特許文献６】Tsai RY et al., A nucleolar mechanism controlling cell proliferationin stem cells and cancer cells., Genes Dev., vol. 16, pp. 2991-3003 (2002)
【非特許文献７】Kondo T et al., Persistence of a small subpopulation of cancerstem-like cells in the C6 glioma cell line., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,vol. 101, pp. 781-786 (2004)
【非特許文献８】Ohira M et al., Expression profiling and characterization of 4200genes cloned from primary neuroblastomas: identification of 305 genesdifferentially expressed between favorable and unfavorable subsets., Oncogene,vol. 22. pp. 5525-5536 (2003)
【非特許文献９】Petrenko AG et al., Structure and evolution of neurexophilin., J.Neurosci., vol. 16, pp. 4360-4369 (1996)
【非特許文献１０】Missler M et al., Neurexophilins form a conserved family ofneuropeptide-like glycoproteins., J. Neurosci., vol. 18, pp. 3630-3638 (1998)
【非特許文献１１】Missler M et al., Neurexophilin binding to alpha-neurexins. A singleLNS domain functions as an independently folding ligand-binding unit., J. Biol.Chem., vol. 273, pp. 34716-34723 (1998)
【非特許文献１２】Ross RA et al., Human neuroblastoma I-type cells are malignantneural crest stem cells., Cell Growth Differ., vol. 6, pp. 449-456 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の抗癌剤は癌細胞を標的として開発されており、癌幹細胞を標的とした抗癌剤は開発されていない。癌幹細胞を標的とした抗癌剤を開発できれば、新たなメカニズムに基づく抗癌剤として癌治療の選択の幅を広げることが可能となる。かかる抗癌剤の開発に際しては、癌幹細胞を分離することが重要となる。そこで、本発明は、癌幹細胞を分離する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、神経芽腫ｃＤＮＡライブラリーから単離された遺伝子の解析をさらに進め、神経芽腫の予後に関連したマーカーを見つけることができれば、そのマーカーに基づく神経芽腫の予後診断薬が開発でき、その予後診断薬を神経芽腫の患者の治療に役立てることが可能である。したがって、本発明は、神経芽腫の予後診断薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ニューレキソフィリン（Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎ；ＮＸＰＨ）は、２５２〜３０８個のアミノ酸からなる分泌タンパク質であり、ニューレキソフィリン−１からニューレキソフィリン−４までの４つのサブタイプが存在する（図１０参照）。また、ニューレキソフィリンはＮ末端にシグナルペプチドドメインを有する、ニューロペプチド様糖タンパク質である。ニューレキソフィリンはα−ニューレキシオンの細胞外ドメインと結合して、α−ニューレキシオンを活性化させることが知られており、α−ニューレキシオンの機能であるシナプス形成に関与している可能性があるとされている（例えば、非特許文献１０〜１２）。ヒト  ニューレキソフィリン−１のｍＲＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す（コード領域は、配列番号１の９１２〜１７２７番目である）。ヒト  ニューレキソフィリン−２、−３及び−４のコード領域の塩基配列を、それぞれ、配列表の配列番号３、５及び７に示す。また、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−２、−３及び−４タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列表の配列番号２、４、６及び８に示す。ヒト  ニューレキソフィリンファミリーのアミノ酸配列の配列比較を図１１に示す。
【００１３】
本発明者らは、ニューレキソフィリン−２が癌幹細胞様の性質を持つ細胞に特異的に発現していることを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供する。
（１）  ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経系癌幹細胞の検出試薬。
（２）  ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経系癌幹細胞の検出試薬。
（３）  神経系癌細胞の集団から神経系癌幹細胞を分離する方法であって、
神経系癌細胞の集団とニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を接触させる工程と、
前記抗体と結合する細胞を選別する工程と、
を含む方法。
（４）  前記（３）に記載の分離方法によって分離された神経系癌幹細胞。
（５）  ニューレキソフィリン−２タンパク質が細胞表面に存在する、単離された神経系癌幹細胞。
【００１４】
さらに、本発明者らは、ニューレキソフィリン−１及びニューレキソフィリン−２が神経芽腫の予後因子となり得ることを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の（６）〜（９）を提供する。
（６）  ニューレキソフィリン−１タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経芽腫の予後診断薬。
（７）  ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体からなる神経芽腫の予後診断薬。
（８）  ニューレキソフィリン−１ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経芽腫の予後診断薬。
（９）  ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる神経芽腫の予後診断薬。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、神経系癌幹細胞を提供することが可能である。単離された神経系癌幹細胞を用いて、新たなメカニズムに基づく抗癌剤の開発を行うことが可能となる。また、本発明によれば、神経芽腫の予後を診断することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
（神経系癌幹細胞の検出試薬）
本発明の神経系癌幹細胞の検出試薬は、ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体（ニューレキソフィリン−２特異的抗体）からなる。神経系癌幹細胞、特に神経芽腫の癌幹細胞において、ニューレキソフィリン−２が特異的に発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−２特異的抗体により神経系癌幹細胞の検出を行うものである。
【００１８】
ヒトの神経系癌幹細胞を検出するために、ニューレキソフィリン−２特異的抗体は、ヒト  ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体であることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−３及び−４である。また、ニューレキソフィリン−２特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１９】
神経系癌細胞の検出は、サンプルに本発明の検出試薬を接触させ、非特異的な結合を排除するために必要に応じて洗浄を行った後、検出試薬の存在を検出することより達成される。
【００２０】
ニューレキソフィリン−２特異的抗体は検出可能な標識が結合していてもよく、かかる標識としては、例えば、放射能標識や蛍光標識などが挙げられる。標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことが可能である。検出可能な標識がニューレキソフィリン−２特異的抗体に結合している場合、放射能や蛍光強度を測定することにより、神経系癌幹細胞を検出できる。また、検出可能な標識がニューレキソフィリン−２特異的抗体に結合していない場合には、ニューレキソフィリン−２特異的抗体と反応する二次抗体（放射能標識や蛍光標識などにより標識されている）をさらに用いることにより、神経系癌幹細胞を検出できる。
【００２１】
ニューレキソフィリン−２特異的抗体は当分野において一般的な方法で作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の作製を例に挙げて、以下に簡潔に説明する。まず、ニューレキソフィリン−２を発現している細胞や組織などからニューレキソフィリン−２タンパク質を精製するか、遺伝子組換え技術を利用してニューレキソフィリン−２タンパク質を調製する。得られたニューレキソフィリン−２タンパク質を免疫原としてマウスに投与する。免疫したマウスから脾臓を採取し、脾臓細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合して、ハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマをスクリーニングして、目的とする抗体産生細胞、すなわち、ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を産生する細胞を選択する。このようにして選択された抗体産生細胞の培養上清から目的の抗体が得られる。こうして得られた抗体は周知の方法により精製することができる。
【００２２】
次に、本発明の別の態様の神経系癌幹細胞の検出試薬について説明する。本発明の神経系癌幹細胞の検出試薬は、ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる。神経系癌幹細胞、特に神経芽腫の癌幹細胞において、ニューレキソフィリン−２が特異的に発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを特異的に増幅できる核酸増幅プライマーにより神経系癌幹細胞の検出を行うものである。
【００２３】
ヒトの神経系癌幹細胞を検出するために、核酸増幅プライマーは、ヒト  ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーであることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−３及び−４である。
【００２４】
ここで、核酸増幅プライマーとは核酸増幅技術に使用されるプライマーを指し、核酸増幅技術にはＰＣＲ（polymerase chain reaction）、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence-based amplification）、ＬＡＭＰ（loop-mediatedisothermal amplification）などが含まれるが、この中でもＰＣＲが特に好ましい。
【００２５】
神経系癌細胞の検出は、サンプルからＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、核酸増幅プライマーを用いて核酸増幅を行い、核酸の増幅を検出（例えば、電気泳動などにより検出できる）することより達成される。ＲＮＡの抽出は当分野で一般的な方法、例えば、ＡＧＰＣ法やグアニジン−塩化セシウム超遠心法などに従って行うことができる。
【００２６】
核酸増幅プライマーは使用する核酸増幅技術に応じて設計することができ、当業者であれば適切なプライマーを設計することが可能である。例えば、用いる核酸増幅技術がＰＣＲの場合、ニューレキソフィリン−２に特異的な塩基配列、すなわち、ニューレキソフィリン−２には存在するが他のニューレキソフィリンファミリーには存在しない塩基配列、を見出し、かかる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとすればよい。オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、一般的には１５〜２５塩基である。好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号３の１〜７７０番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号３の２６〜７９５番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。より好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号３の１〜３２６番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号３の３２７〜７９５番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。特に好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
（神経系癌幹細胞を分離する方法）
神経系癌細胞の集団から神経系癌幹細胞を分離する、本発明の方法は、
神経系癌細胞の集団とニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を接触させる工程と、
前記抗体と結合する細胞を選別する工程と、
を含む。神経系癌幹細胞、特に神経芽腫の癌幹細胞において、ニューレキソフィリン−２が特異的に発現しているという性質を利用して、また、ニューレキソフィリン−２は分泌タンパク質であるため細胞表面に発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−２に特異的に反応する抗体により神経系癌幹細胞を分離するものである。
【００２８】
ヒトの神経系癌幹細胞を検出するために、本発明の方法に使用する抗体は、ヒト  ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体であることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−３及び−４である。また、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２９】
本発明の方法は、フローサイトメトリーと組み合わせることで容易に達成することができる。まず、神経系癌幹細胞を含むと予想される神経系癌細胞の集団のサンプルを抗体と接触させて、ニューレキソフィリン−２タンパク質が細胞表面に存在する神経系癌幹細胞と抗体を結合させる。抗体は蛍光標識されていることが好ましく、標識に用いる蛍光色素はフローサイトメトリーに一般的に用いられている蛍光物質であることが好ましい。蛍光色素の具体例としては、ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−ＴＲ（ＰＥ−テキサスレッド）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）及びＡＰＣ−Ｃｙ７などが挙げられる。蛍光標識した抗体と接触させたサンプルをフローサイトメーターにセットし、抗体と結合した細胞を選別することにより、神経系癌幹細胞を分離することができる。
【００３０】
本発明の方法により分離された神経系癌幹細胞、すなわち、ニューレキソフィリン−２タンパク質が細胞表面に存在する単離された神経系癌幹細胞も、本発明の範囲に包含される。このようにして得られる神経系癌幹細胞は、神経系癌幹細胞を標的とする抗癌剤のスクリーニング方法に利用することが可能である。
【００３１】
（神経芽腫の予後診断薬）
本発明の神経芽腫の予後診断薬は、ニューレキソフィリン−１タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体（ニューレキソフィリン−１特異的抗体）からなる。予後良好な神経芽腫において、ニューレキソフィリン−１は高レベルに発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−１特異的抗体を用いて神経芽腫の予後を診断するものである。
【００３２】
ヒトの神経芽腫の予後を診断するために、ニューレキソフィリン−１特異的抗体は、ヒト  ニューレキソフィリン−１タンパク質と反応するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体であることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−２、−３及び−４である。また、ニューレキソフィリン−１特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３３】
神経芽腫の予後を診断するには、まず、被験者から神経芽腫を採取し、採取した神経芽腫から細胞を回収し、溶解液を用いて細胞溶解液を調製する。あるいは、ニューレキソフィリンは分泌タンパク質であることから、回収した神経芽腫細胞を培養し、その培養上清を細胞溶解液の代わりに用いてもよい。さらに、血液や尿を細胞溶解液の代わりに用いてもよい。調製した細胞溶解液（又は培養上清、血液、尿）とニューレキソフィリン−１特異的抗体とを接触させ、ニューレキソフィリン−１タンパク質の検出を行う。ニューレキソフィリン−１タンパク質が正常細胞に比べて高度に発現している場合には、神経芽腫の予後は良好であると診断できる。
【００３４】
ニューレキソフィリン−１特異的抗体は検出可能な標識が結合していてもよく、かかる標識としては、例えば、放射能標識や蛍光標識などが挙げられる。標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことが可能である。検出可能な標識がニューレキソフィリン−１特異的抗体に結合している場合、放射能や蛍光強度を測定することにより、ニューレキソフィリン−１タンパク質を検出できる。また、検出可能な標識がニューレキソフィリン−１特異的抗体に結合していない場合には、ニューレキソフィリン−１特異的抗体と反応する二次抗体（放射能標識や蛍光標識などにより標識されている）をさらに用いることにより、ニューレキソフィリン−１タンパク質を検出できる。
【００３５】
ニューレキソフィリン−１特異的抗体は当分野において一般的な方法で作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の作製を例に挙げて、以下に簡潔に説明する。まず、ニューレキソフィリン−１を発現している細胞や組織などからニューレキソフィリン−１タンパク質を精製するか、遺伝子組換え技術を利用してニューレキソフィリン−１タンパク質を調製する。得られたニューレキソフィリン−１タンパク質を免疫原としてマウスに投与する。免疫したマウスから脾臓を採取し、脾臓細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合して、ハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマをスクリーニングして、目的とする抗体産生細胞、すなわち、ニューレキソフィリン−１タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を産生する細胞を選択する。このようにして選択された抗体産生細胞の培養上清から目的の抗体が得られる。こうして得られた抗体は周知の方法により精製することができる。
【００３６】
次に、本発明の別の態様の神経芽腫の予後診断薬について説明する。本発明の神経芽腫の予後診断薬は、ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体（ニューレキソフィリン−２特異的抗体）からなる。予後不良な神経芽腫において、ニューレキソフィリン−２は高レベルに発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−２に特異的に反応する抗体を用いて神経芽腫の予後を診断するものである。
【００３７】
ヒトの神経芽腫の予後を診断するために、ニューレキソフィリン−２特異的抗体は、ヒト  ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体であることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−３及び−４である。また、ニューレキソフィリン−２特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３８】
神経芽腫の予後を診断するには、まず、被験者から神経芽腫を採取し、採取した神経芽腫から細胞を回収し、溶解液を用いて細胞溶解液を調製する。あるいは、ニューレキソフィリンは分泌タンパク質であることから、回収した神経芽腫細胞を培養し、その培養上清を細胞溶解液の代わりに用いてもよい。さらに、血液や尿を細胞溶解液の代わりに用いてもよい。調製した細胞溶解液（又は培養上清、血液、尿）とニューレキソフィリン−２特異的抗体とを接触させ、ニューレキソフィリン−２タンパク質の検出を行う。ニューレキソフィリン−２タンパク質が正常細胞に比べて高度に発現している場合には、神経芽腫の予後は不良であると診断できる。
【００３９】
ニューレキソフィリン−２特異的抗体は検出可能な標識が結合していてもよく、かかる標識としては、例えば、放射能標識や蛍光標識などが挙げられる。標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことが可能である。検出可能な標識がニューレキソフィリン−２特異的抗体に結合している場合、放射能や蛍光強度を測定することにより、ニューレキソフィリン−２タンパク質を検出できる。また、検出可能な標識がニューレキソフィリン−２特異的抗体に結合していない場合には、ニューレキソフィリン−２特異的抗体と反応する二次抗体（放射能標識や蛍光標識などにより標識されている）をさらに用いることにより、ニューレキソフィリン−２タンパク質を検出できる。
【００４０】
ニューレキソフィリン−２特異的抗体は当分野において一般的な方法で作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の作製を例に挙げて、以下に簡潔に説明する。まず、ニューレキソフィリン−２を発現している細胞や組織などからニューレキソフィリン−２タンパク質を精製するか、遺伝子組換え技術を利用してニューレキソフィリン−２タンパク質を調製する。得られたニューレキソフィリン−２タンパク質を免疫原としてマウスに投与する。免疫したマウスから脾臓を採取し、脾臓細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合して、ハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマをスクリーニングして、目的とする抗体産生細胞、すなわち、ニューレキソフィリン−２タンパク質と反応するが、他のニューレキソフィリンファミリータンパク質とは反応しない抗体を産生する細胞を選択する。このようにして選択された抗体産生細胞の培養上清から目的の抗体が得られる。こうして得られた抗体は周知の方法により精製することができる。
【００４１】
上記２種類の予後診断薬は、それぞれ単独で用いて予後診断を行ってもよく、両者を用いて予後診断を行ってもよいが、より正確な予後診断のためには、両者を用いて予後診断を行うことが好ましい。すなわち、ニューレキソフィリン−１タンパク質が高度に発現し、かつ、ニューレキソフィリン−２タンパク質が高度に発現していない場合には、神経芽腫の予後は良好であると診断でき、一方、ニューレキソフィリン−２タンパク質が高度に発現し、かつ、ニューレキソフィリン−１タンパク質が高度に発現していない場合には、神経芽腫の予後は不良であると診断できる。また、その他の予後因子（年齢、病期、ＴｒｋＡの発現、ＭＹＣＮの増幅など）と組み合わせて、予後診断を行ってもよい。
【００４２】
次に、本発明のさらに別の態様の神経芽腫の予後診断薬について説明する。さらに、本発明の神経芽腫の予後診断薬は、ニューレキソフィリン−１ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる。予後良好な神経芽腫において、ニューレキソフィリン−１は高レベルに発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−１ｍＲＮＡを特異的に増幅できる核酸増幅プライマーを用いて神経芽腫の予後を診断するものである。
【００４３】
ヒトの神経芽腫の予後を診断するために、核酸増幅プライマーは、ヒト  ニューレキソフィリン−１ｍＲＮＡを増幅するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーであることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−２、−３及び−４である。
【００４４】
ここで、核酸増幅プライマーとは核酸増幅技術に使用されるプライマーを指し、核酸増幅技術にはＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰなどが含まれるが、この中でもＰＣＲが特に好ましい。
【００４５】
神経芽腫の予後診断は、被験者から神経芽腫を採取し、採取した神経芽腫から細胞を回収し、回収した細胞からＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、核酸増幅プライマーを用いて核酸増幅を行い、核酸の増幅を検出（例えば、電気泳動などにより検出できる）することより達成される。ニューレキソフィリン−１のｍＲＮＡが正常細胞に比べて高度に発現している場合には、神経芽腫の予後は良好であると診断できる。ＲＮＡの抽出は当分野で一般的な方法、例えば、ＡＧＰＣ法やグアニジン−塩化セシウム超遠心法などに従って行うことができる。
【００４６】
核酸増幅プライマーは使用する核酸増幅技術に応じて設計することができ、当業者であれば適切なプライマーを設計することが可能である。例えば、用いる核酸増幅技術がＰＣＲの場合、ニューレキソフィリン−１に特異的な塩基配列、すなわち、ニューレキソフィリン−１には存在するが他のニューレキソフィリンファミリーには存在しない塩基配列、を見出し、かかる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとすればよい。オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、一般的には１５〜２５塩基である。好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号１の１〜２８９３番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号１の２６〜２９１８番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。より好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号１の１〜１４０５番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号１の１４０６〜２８８１番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。特に好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４７】
次に、本発明のさらに別の態様の神経芽腫の予後診断薬について説明する。本発明の神経芽腫の予後診断薬は、ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーからなる。予後不良な神経芽腫において、ニューレキソフィリン−２は高レベルに発現しているという性質を利用して、ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを特異的に増幅できる核酸増幅プライマーを用いて神経芽腫の予後を診断するものである。
【００４８】
ヒトの神経芽腫の予後を診断するために、核酸増幅プライマーは、ヒト  ニューレキソフィリン−２ｍＲＮＡを増幅するが、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーｍＲＮＡを増幅しない核酸増幅プライマーであることが好ましい。また、他のヒト  ニューレキソフィリンファミリーとは、具体的には、ヒト  ニューレキソフィリン−１、−３及び−４である。
【００４９】
ここで、核酸増幅プライマーとは核酸増幅技術に使用されるプライマーを指し、核酸増幅技術にはＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰなどが含まれるが、この中でもＰＣＲが特に好ましい。
【００５０】
神経芽腫の予後診断は、被験者から神経芽腫を採取し、採取した神経芽腫から細胞を回収し、回収した細胞からＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、核酸増幅プライマーを用いて核酸増幅を行い、核酸の増幅を検出（例えば、電気泳動などにより検出できる）することより達成される。ニューレキソフィリン−２のｍＲＮＡが正常細胞に比べて高度に発現している場合には、神経芽腫の予後は不良であると診断できる。ＲＮＡの抽出は当分野で一般的な方法、例えば、ＡＧＰＣ法やグアニジン−塩化セシウム超遠心法などに従って行うことができる。
【００５１】
核酸増幅プライマーは使用する核酸増幅技術に応じて設計することができ、当業者であれば適切なプライマーを設計することが可能である。例えば、用いる核酸増幅技術がＰＣＲの場合、ニューレキソフィリン−２に特異的な塩基配列、すなわち、ニューレキソフィリン−２には存在するが他のニューレキソフィリンファミリーには存在しない塩基配列、を見出し、かかる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとすればよい。オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、一般的には１５〜２５塩基である。好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号３の１〜７７０番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号３の２６〜７９５番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。より好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは、配列番号３の１〜３２６番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは、配列番号３の３２７〜７９５番の範囲から選択される１５〜２５の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。特に好ましいＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーは配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
上記２種類の予後診断薬は、それぞれ単独で用いて予後診断を行ってもよく、両者を用いて予後診断を行ってもよいが、より正確な予後診断のためには、両者を用いて予後診断を行うことが好ましい。すなわち、ニューレキソフィリン−１のｍＲＮＡが高度に発現し、かつ、ニューレキソフィリン−２のｍＲＮＡが高度に発現していない場合には、神経芽腫の予後は良好であると診断でき、一方、ニューレキソフィリン−２のｍＲＮＡが高度に発現し、かつ、ニューレキソフィリン−１のｍＲＮＡが高度に発現していない場合には、神経芽腫の予後は不良であると診断できる。また、その他の予後因子（年齢、病期、ＴｒｋＡの発現、ＭＹＣＮの増幅など）と組み合わせて、予後診断を行ってもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１：ＮＸＰＨと予後の関連性）
神経芽腫を以下の方法により予後良好なものと予後不良なものとに分類した。１９９５年〜２００１年の間に日本において神経芽腫と診断された１１０人の子供の癌を調べた。神経芽腫の診断は、手術によって得た癌検体を嶋田らの分類に従って組織学的に評価することにより行った。国際神経芽腫ステージングシステム（ＩＮＳＳ）に従って、癌のステージ分けした。全ての患者はマススクリーニングによって同定されておらず、全て孤発的なケースであった。５０の癌が予後良好の組織像を示し（ステージ１、２又は４ｓ）、６０の癌が予後不良の組織像を示した（ステージ３又は４）。
【００５５】
ＭＹＣＮがシングルコピーであり、かつ、ＴｒｋＡが高発現しているステージ１の神経芽腫を１６サンプル（予後良好な神経芽腫）、ＭＹＣＮが増幅されているステージ３又は４の神経芽腫を１６サンプル（予後不良な神経芽腫）、を用いて、半定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＮＸＰＨの発現を解析した。ｃＤＮＡを、２００ユニットのSuperscript II逆転写酵素（Life Technologies, Inc.）及びランダムプライマー（寶酒造）を含む２０μｌの反応溶液中で５μｇのトータルＲＮＡを用いて合成した。得られたｃＤＮＡ断片を１０倍に希釈して、ＰＣＲ鋳型とした。使用したＮＸＰＨのＰＣＲプライマーを表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
増幅したＧＡＰＤＨ断片は内部定量対照として使用し、プライマー配列は以下の通りである：フォワードプライマー：5'-CTGCACCAACAATATCCC-3'（配列番号１７）、リバースプライマー：5'-GTAGAGACAGGCTTTCAC-3'（配列番号１８）。ＰＣＲ増幅は、サーマルサイクラー（パーキン・エルマー）を用いて、３７サイクル行った（予熱は９５℃、２分間；変性は９５℃で１５秒間；アニーリングは、ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−３に対しては５９℃で１５秒間、ＮＸＰＨ−２に対しては５７℃で１５秒間、ＮＸＰＨ−４に対しては６２℃で１５秒間；伸長は７２℃で２０秒間）。ＧＡＰＤＨも、サイクル数を２８、アニーリング温度を５８℃とした以外は同一の条件下で増幅した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【００５８】
電気泳動の結果の一部を図１に示す。ＮＸＰＨ−１は予後良好群で高発現しているのに対して、ＮＸＰＨ−２は予後不良群で高発現していることが分かった。
【００５９】
（実施例２：正常組織におけるＮＰＸＨの発現）
実施例１と同様の半定量的ＲＴ−ＰＣＴにより、ヒトの正常組織におけるＮＰＸＨの発現を調べた。その結果を図２に示す。ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２は神経組織での発現が高く、ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−３は神経芽腫の発生母地である副腎でも発現が高かった。
【００６０】
（実施例３：様々な細胞株におけるＮＸＰＨの発現）
実施例１と同様の半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、神経芽腫を含む様々な悪性腫瘍細胞株でのＮＰＸＨの発現を調べた。調べた細胞株は、以下の通りである：２５の神経芽腫細胞株（CHP134, GANB, GOTO, IMR32, SMS-KAN, KP-N-NS, LA-N-5, NB1, NB9,NBTu1, NGP, NLF, NMB, RTBM1, SMS-SAN, SK-N-BE, TGW, TNB, SMS-KCN, LHN, NB69,NBLS, 0AN, CNB-RT 及び SH-SY5Y）並びにその他の悪性腫瘍細胞株である、骨肉種（OST, SAOS-2 及び NOS-1）、横紋筋肉腫（RMS-MK 及び ASPS-KY）、大腸腺腫（COLO-320）、乳癌（MDA-MB-453）、メラノーマ（G-361, G32tg 及び A875）、甲状腺癌（TTC-11）)及び肺癌（A-549）。これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；GIBCO BRL）及び５０μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬）にて加湿、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
【００６１】
図３には神経芽腫細胞株の結果を示し、図４にはその他の悪性腫瘍細胞株の結果を示す。図３から分かるように、神経芽腫におけるＭＹＣＮ増幅群と非増幅（シングルコピー）群との間でＮＸＰＨの発現の差は認められなかった。また、図４から分かるように、骨肉腫や横紋筋肉腫といった神経堤細胞由来の悪性腫瘍細胞株において、ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２が高度に発現していた。
【００６２】
（実施例４：ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２の定量的発現解析）
ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２の定量的発現解析を行い、それらの発現量と予後の相関を調べた。また、他の予後因子との相関も調べた。
【００６３】
定量的発現解析は以下の方法で行った。半定量的ＲＴ−ＰＣＲと同じ方法でｃＤＮＡを調製し、２０倍希釈したものを２μｌ用いて、各ＰＣＲ反応を行った。ＮＸＰＨ−１及び２のプライマー及びＴａｑｍａｎプローブは、プライマー設計ソフトウェアであるPrimer Express TM（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）を用いて設計した。Ｔａｑｍａｎ  ＧＡＰＤＨ  コントロール試薬キット（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）を用いて、コントロールとしてＧＡＰＤＨを発現させた。２μｌのｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ溶液、０．３μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー並びに０．２μＭのＴａｑｍａｎプローブを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は次の通りである：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、そして、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の５０回の増幅。
【００６４】
また、統計解析は以下の方法で行った。スチューデントのｔ検定を使って、ＮＸＰＨ−１の発現及び他の因子（年齢など）との可能性のある関連を調べた。ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２の発現の値が歪んでいたため、ｔ検定及びＣｏｘ回帰を使用する際には、ログ変換して正規性を得た。高レベル及び低レベルのＮＸＰＨの区別は中央値に基づいており、癌のステージ、ＭＹＣＮのコピー又は生存とは無関係である。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を算出し、生存分布をログランク検定を用いて比較した。Ｃｏｘ回帰モデルを使って、ＮＸＰＨ−１／ＮＨＰＨ−２、年齢、ＭＹＣＮ、起源及び生存の間の関連を調べた。Ｐ値が＜０．０５の場合に統計学的有意性があるとした。統計解析は、Stata 7.0. (Stata Corp. 2001. Stata Statistical Software: Release7.0 College Station, TX: Stata Corporation)を用いて行った。
【００６５】
ＮＸＰＨ−１の発現量を中央値で２群に分け、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法による解析結果を図５に示す。また、ＮＸＰＨ−２についても同様に解析を行い、その結果を図６に示す。図５に示すようにＮＸＰＨ−１の高発現は良好な予後と有意に相関を示していた。一方、図６に示すようにＮＸＰＨ−２の低発現は良好な予後と有意に相関を示していた。
【００６６】
図７及び８に、ＮＸＰＨと他の予後因子との相関を示す。ＮＸＰＨ−１は年齢、病期、ＴｒｋＡの発現、ＭＹＣＮの増幅と相関関係があった。その一方、ＮＸＰＨ−２は病期、ＭＹＣＮの増幅と有意に相関関係があった。
【００６７】
（実施例５：様々な神経芽腫におけるＮＸＰＨの発現）
Robert A. Ross博士から提供された６種類の神経芽腫SH-SY5Y（Ｎ型）、SH-IN（Ｉ型）、SH-EPI（Ｓ型）、SK-N-BE(2)-M17（Ｎ型）、SK-N-BE(2)-C（Ｉ型）及びSK-N-BE(2)-S（Ｓ型）を１０％ＦＢＳ（ただし、SH-INの場合のみ１５％とした）、非必須アミノ酸、グルタミンを含む、Eagle MEMとHam F-12とを１：１で混合した培地で培養した。実施例１と同様のＲＴ−ＰＣＲにより、これらの神経芽腫におけるＮＸＰＨの発現を調べた。
【００６８】
図９に示した結果から明らかなように、ＮＸＰＨ−２がＩ型の細胞に特異的に発現していた。
【００６９】
（実施例６：半定量ＲＴ−ＰＣＲ法によるＮＸＰＨの発現解析）
臨床検体及び細胞株から得られた全ＲＮＡ  １μｇを用いて、実施例１と同様の条件でＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＮＸＰＨと強い結合を示すニューレキシン（ＮＲＸＮ）遺伝子についても分析した。結果を図１２に示す。ＮＸＰＨ−１は予後良好群で高発現しているのに対して、ＮＸＰＨ−２は予後不良群で高発現していることが分かった。ＮＸＰＨ−３及び−４は両群での発現の差は認められなかった。一方、ＮＲＸＮはα−ＮＲＸＮ（Ｉα）が予後良好群で発現が高かった。
【００７０】
（実施例７：ウエスタンブロット法によるＮＸＰＨの発現解析）
臨床検体及び細胞株から細胞を回収し、回収した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳ緩衝液で溶解した。サンプル間のタンパク質の量が等しくなるように調整した後、タンパク質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜（東洋濾紙）に転写した。非特異的な結合をＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）に懸濁した０．５％無脂肪ドライミルクでブロッキングした後、ＮＸＰＨポリクローナル抗体（常法により抗ヒト  ＮＸＰＨ−１ポリクローナル抗体及び抗ヒト  ＮＸＰＨ−２ポリクローナル抗体を作製した）又は抗アクチン抗体（２０−３３；シグマ・ケミカル）とともにインキュベートし、horse radish Peroxidase-Conjugated Goat Anti rabbit IgG SecondaryAntibody（セル・シグナリング・テクノロジー）でさらにインキュベートした。検出には、Enhanced Chemiluminescence（ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク）法を用いた。
【００７１】
臨床検体はケース番号：１３８３（ステージ４、ＭＹＣＮ増幅）、１３４７及び１３９９（ステージ１、ＭＹＣＮシングルコピー）の３症例を用い、神経芽種細胞株は図１３に示した６種類を用いた。図１３に結果を示すように、ＮＸＰＨ−１の発現は、細胞株ではＭＹＣＮの増幅の有無に関わらず発現が認められた。臨床検体ではＭＹＣＮが増幅していない予後良好な症例（ケース番号：１３４７及び１３９９）でのみ発現が認められた。ＮＸＰＨ−２の発現は、細胞株ではＭＹＣＮの増幅の有無に関わらず認められた。臨床検体では全症例で発現が認められなかった。
【００７２】
（実施例８：in situハイブリダイゼーションによるＮＸＰＨの発現解析）
マウス  ＮＸＰＨ−１のｃＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０４３９４２；塩基番号１８−８１５；７９８ｂｐ）とマウス  ＮＸＰＨ−２のｃＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００８７５２；塩基番号６８９−１３８１；６９３ｂｐ）をＰＣＲ法にて増幅し、pBluescript II KS+ベクター（ストラタジーン）にクローニングした。これを鋳型としてＴ３及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いたin Vitro転写により、アンチセンス及びセンスＲＮＡプローブをジゴキシゲニン−ＵＴＰ存在下で合成した。このプローブを用いて、マウスのホールマウント及び切片のin situハイブリダイゼーションを行った。アルカリホスファターゼ反応は、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いて行った。
【００７３】
図１４にin situハイブリダイゼーションの結果を示す。（ａ）は胎生１０．５日のＮＸＰＨ−１の側面図を示し、（ｂ）は胎生１０．５日のＮＸＰＨ−２の側面図を示し、（ｃ）は胎生１１．５日のＮＸＰＨ−２の側面図を示し、（ｄ）は胎生１２．５日のＮＸＰＨ−１の矢状断面図を示し、（ｅ）は胎生１２．５日の脊髄横断面図を示す。in situハイブリダイゼーションの結果から、ＮＸＰＨ−２は脳組織で発現していることが明らかとなった。胎生１０．５日では中脳、前脳及び尾でＮＸＰＨ−２は発現していたが、胎生１１．５日では前脳のみに限局していた。一方、ＮＸＰＨ−１は神経組織全体に広く発現が認められた。胎生１２．５日の神経管横断面図における発現は大脳皮質に限局していた。ＮＸＰＨ−１は分化が進んだ組織での発現がみられ、一方、ＮＸＰＨ−２は未分化な組織での発現がみられた。
【００７４】
（実施例９：定量的同時ＲＴ−ＰＣＲ法によるＮＸＰＨ−２の発現量と予後の相関）
一般に予後予測が困難とされている神経芽腫中間リスク群（１歳以上でステージ３又は４でＭＹＣＮ非増幅）におけるヒト  ＮＸＰＨ−２の発現量を定量的同時ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて２８症例について調べ、ＮＸＰＨ−２の発現量と神経芽腫の予後の相関について統計学的に解析した。
【００７５】
実施例１と同様の方法でｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡ  ２μｇにＴａｑＭａｎ  ユニバーサルＰＣＲプライマーミックス（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）とＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）で設計した特異的プライマー０．３μＭとＴａｑＭａｎプローブ０．２μＭを加え、２５μｌの反応系で行った。ＰＣＲ反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００シーケンス・ディテクション・システム（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）を用いて、５０℃／２分ならびに９５℃／１０分加温の後、９５℃／１５秒と６０℃／１分のサイクルを５０サイクル行った。ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ））を用いて、ＧＡＰＤＨを同様に測定し、ｃＤＮＡの内部標準とした。各サンプルはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで測定し、ＧＡＰＤＨに対する相対的定量解析を行った。ＮＸＰＨ−２の発現量を中央値で２群に分け、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を図１５に示す。神経芽腫中間リスク群においてもＮＸＰＨ−２の発現は、予後と有意に相関していた（ｐ＝０．０４４９）。
【００７６】
（実施例１０：ＥＩＡ法によるＮＸＰＨの発現量と予後の相関）
Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法にて３３症例の神経芽腫患者の血中のＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２のタンパク質濃度を測定し、予後との相関について調べた。
【００７７】
ウサギ抗ヒト  ＮＸＰＨ−１抗体及びウサギ抗ヒト  ＮＸＰＨ−２抗体を室温でマイクロタイタープレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅｓ、ナルジェヌンクインターナショナル）上に２０時間コーティングし、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有）で洗浄し、ウェルを０．２５％スキムミルク（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）でブロッキングした後、０．１％スキムミルクと等量混和した血漿サンプルを５０μｌ添加した。室温で１時間放置した後、マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を計測した。３３症例の分類は以下の通りである：予後良好１５症例（ステージ１又は２、ＭＹＣＮシングルコピー）及び予後不良１８症例（ステージ３又は４、ＭＹＣＮ増幅）。結果を図１６に示す。（ａ）は各群におけるＮＸＰＨ−１の血中濃度を示し、（ｂ）は各群におけるＮＸＰＨ−２の血中濃度を示す。ＮＸＰＨ−１の平均濃度は予後良好群で２６４ｎｇ／ｍｌ、予後不良群で１４２ｎｇ／ｍｌであったのに対し、ＮＸＰＨ−１の平均濃度は予後良好群で２００ｎｇ／ｍｌ、予後不良群で７６１ｎｇ／ｍｌであった。このように、ＮＸＰＨ−１の濃度は予後良好群で有意に高く（ｐ＝０．０３２）、ＮＸＰＨ−２の濃度は予後不良群で有意に高かった（ｐ＝０．０４６）。
【００７８】
（実施例１１：ＮＸＰＨのＮＩＨ−３Ｔ３細胞への導入）
マウス胎児線維芽細胞由来のＮＩＨ−３Ｔ３細胞にＮＸＰＨを過剰発現させ、増殖曲線の変化と軟寒天中におけるコロニー形成能を調べた。
【００７９】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、加熱処理した１０％ウシ血清（ＣＳ、ギブコＢＲＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ）を用いて培養した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞への遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ遺伝子試薬（インビトロジェン）を用いて行った。発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３を用い、ＮＸＰＨ−１及びＮＸＰＨ−２を組み込んだ。導入に用いたＮＸＰＨ−１の発現プラスミドＤＮＡ量は１．０μｇ及び２．０μｇであり、それぞれＮＩＨ−ＮＸＰＨ−１［１．０］及びＮＩＨ−ＮＸＰＨ−１［２．０］と表記した。導入に用いたＮＸＰＨ−２の発現プラスミドＤＮＡ量は０．５μｇ及び１．０μｇであり、それぞれＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［０．５］及びＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［１．０］と表記した。また、コントロールはＮＩＨ−ｐｃＤＮＡ３と表記した。
【００８０】
１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地で作製した０．３％寒天培地（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ；ＢＭＡ）にＮＩＨ−３Ｔ３細胞（２．５×１０３個／６０ｍｍディッシュ）を混合し、１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地で溶解し６０ｍｍディッシュに固化させた０．５３％寒天培地の上に重層した。５％ＣＯ２、３７℃で２１日間培養し、直径０．１ｍｍ以上のコロニーを算定した。
【００８１】
図１７にＮＸＰＨを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖曲線を示す。（ａ）がＮＸＰＨ−２を過剰発現させたときの増殖曲線であり、（ｂ）がＮＸＰＨ−１を過剰発現させたときの増殖曲線である。ＮＸＰＨ−２を過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ベクターコントロールＮＩＨ−ｐｃＤＮＡ３と比較して、ＮＸＰＨ−２の発現量に従い増殖能が上昇した。また、細胞数倍増時間（Ｃｅｌｌ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ  Ｔｉｍｅ）は、ＮＩＨ−ｐｃＤＮＡ３が２６．４時間、ＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［０．５］が２３．９時間、ＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［１．０］が１６．１時間であった。一方、ＮＸＰＨ−１を過剰発現させた細胞の増殖曲線、細胞数倍増時間はともに、ベクターコントロールと比較して明らかな差は認められなかった。
【００８２】
図１８に各細胞のコロニーの顕微鏡写真を示し、図１９に各細胞のコロニー数を示した。軟寒天培地中でのコロニー形成能は、ＮＸＰＨ−２を過剰発現させた場合、その発現量に従って上昇した。培養開始後２１日目の直径０．１ｍｍ以上のコロニー数は、ＮＩＨ−ｐｃＤＮＡ３が１．８±０．６個であったのに対して、ＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［０．５］が１９．０±１．８個（ｐ＝０．０３１）、ＮＩＨ−ＮＸＰＨ−２［１．０］が２７．８±２．５個（ｐ＝０．０１６）であった。ＮＸＰＨ−１を過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、コロニー形成は認められたが、大きさ、数ともにＮＸＰＨ−２過剰発現細胞に比べて小型かつ少数であった。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】実施例１における電気泳動の結果を表す図である。
【図２】実施例２における電気泳動の結果を表す図である。
【図３】実施例３における電気泳動の結果（神経芽腫細胞株）を表す図である。
【図４】実施例３における電気泳動の結果（その他の悪性腫瘍細胞株）を表す図である。
【図５】ＮＸＰＨ−１のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の結果を表す図である。（ａ）は正規化されたＮＸＰＨ−１の発現量を表し、（ｂ）は生存曲線を表す。
【図６】ＮＸＰＨ−２のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の結果を表す図である。（ａ）は正規化されたＮＸＰＨ−１の発現量を表し、（ｂ）は生存曲線を表す。
【図７】ＮＸＰＨと他の予後因子との相関を表す図である。
【図８】ＮＸＰＨと他の予後因子との相関を表す図である。
【図９】実施例５における電気泳動の結果を表す図である。
【図１０】ＮＸＰＨファミリーのタンパク質の構造を表す図である。
【図１１】ヒト  ＮＸＰＨファミリーのアミノ酸配列の配列比較を表す図である。
【図１２】実施例６における電気泳動の結果を表す図である。
【図１３】実施例７におけるウエスタンブロットの結果を表す図である。
【図１４】実施例８におけるin situハイブリダイゼーションの結果を表す図である。（ａ）は胎生１０．５日のＮＸＰＨ−１の側面図を示す。Ａは前部を、Ｄは背部を、Ｐは後部を、Ｖは腹部を示す。（ｂ）は胎生１０．５日のＮＸＰＨ−２の側面図を示す。ｍｂｒは中脳を、ｆｂｒは前脳を、ｔは尾を表す。（ｃ）は胎生１１．５日のＮＸＰＨ−２の側面図を示す。ｆｂｒは前脳を、ｏｅは嗅上皮を、ｔは尾を表す。（ｄ）は胎生１２．５日のＮＸＰＨ−１の矢状断面図を示す。Ｓｐは脊髄を表す。（ｅ）は胎生１２．５日の脊髄横断面図を示す。ＭＬは外套層を表す。
【図１５】神経芽腫中間リスク群における、ＮＸＰＨ−２のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の結果を表す図である。
【図１６】予後良好群及び予後不良群における、ＮＸＰＨの血中濃度を表す図である。（ａ）はＮＸＰＨ−１の結果を、（ｂ）はＮＸＰＨ−２の結果を表す。
【図１７】ＮＸＰＨを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖曲線を表す図である。（ａ）はＮＸＰＨ−２の結果を、（ｂ）はＮＸＰＨ−１の結果を表す。
【図１８】ＮＸＰＨを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のコロニーの顕微鏡写真を表す図である。
【図１９】ＮＸＰＨを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のコロニー数を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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