(57)【要約】【課題】  分析精度の高い試料分析装置及びそれを用いた試料分析方法を提供する。【解決手段】    試料分析装置１は、ラマンスペクトル測定装置１０と、分析部位特定装置２０と、分析装置３０と、入力装置３１と、標準データベース４０と、表示装置５０とを備えている。ラマンスペクトル測定装置１０は、試料Ｓへと照射される励起光を出射する励起光源である励起レーザ１１と、励起光が照射された前記試料からのラマン散乱光を分光する分光器１６と、分光器１６で分光されたラマン散乱光を検出する光検出器１７と、光検出器１７で検出されたラマン散乱光を計数してラマンスペクトルを得る計数回路１８とを有する。分析部位特定装置２０は、励起光が照射される試料Ｓの分析部位を特定するための部位特定信号を分析装置３０に対して出力する。【選択図】  図１
2006300611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラマン分光法を用いた試料分析装置であって、
試料に照射される励起光を出射する励起光源と、
前記励起光が照射された前記試料からのラマン散乱光を分光する分光手段と、
前記分光手段で分光された前記ラマン散乱光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段で検出された前記ラマン散乱光を計数してラマンスペクトルを得る計数手段と、
前記励起光が照射される前記試料の分析部位を特定する部位特定手段と、
前記部位特定手段によって特定される前記分析部位に応じて、前記計数手段において得られた前記試料の前記ラマンスペクトルの分析を行う分析手段と、
を備えることを特徴とする試料分析装置。
【請求項２】
前記分析手段は、前記分析部位に対して用意された前記ラマンスペクトルに関する標準データを基準として、前記計数手段において得られた前記試料の前記ラマンスペクトルを分析することを特徴とする請求項１に記載の試料分析装置。
【請求項３】
前記試料の各部位の標準データを保持する標準データ保持手段をさらに備えるとともに、
前記分析手段は、前記分析部位に応じて、当該分析部位の前記標準データを前記標準データ保持手段から取得して、前記計数手段において得られた前記試料の前記ラマンスペクトルを分析することを特徴とする請求項２に記載の試料分析装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の試料分析装置を用いた試料分析方法であって、
前記試料分析装置を用いて前記試料のラマンスペクトルを得るとともに、当該ラマンスペクトルによって前記試料の分析を行うことを特徴とする試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に対して励起光を照射し、ラマンスペクトルを取得して試料の分析を行うラマン分光法による試料分析装置、及びそれを用いた試料分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体組織等の試料に対してラマン分光測定を行い、得られたラマンスペクトルに基づいて正常な組織と癌組織との弁別をすることによって、癌の診断をすることが検討されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜３）。正常な組織と癌組織との弁別は、試料のラマンスペクトル中に現れるラマンピーク（ラマンバンド）の波長や強度等を分析することによって行われる。
【特許文献１】特開２００２−５８３５号公報
【非特許文献１】S.Kaminaka etal., "Near-infrared multichannel Raman spectroscopy toward real-time invivo cancer diagnosis", Journal of Raman Spectroscopy, 33, p.498-502(2002)
【非特許文献２】Y.Min et al.,"1064nm near-infrared multichannel Raman spectroscopy of fresh human lungtissues", Journal of Raman Spectroscopy, 36, p.73-76 (2005)
【非特許文献３】D.P.Lau etal., "Raman Spectroscopy for Optical Diagnosis in Normal and CancerousTissue of the Nasopharynx - Preliminary Findings", Lasers in Surgery andMedicine, 32, p.210-214 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ラマン分光測定を用いた癌の診断は、その潜在能力の高さから有効な診断方法として期待されている。そのため、ラマン分光測定を用いた癌診断では、ラマンスペクトルの分析精度を高め、その正診率をさらに向上することが望まれている。このようなラマンスペクトルの分析精度の問題は、癌診断以外の試料分析においても生じるものである。
【０００４】
本発明は、分析精度の高い試料分析装置及びそれを用いた試料分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、上記した分析精度の問題について鋭意検討を重ねた結果、個体差はもとより、同一検体であっても分析対象となる部位ごとに測定されるラマンスペクトルの波形が異なるという事実を見いだした。そして、この事実に着目し、研究を重ねたところ、分析される試料の分析部位を特定し、その特定された分析部位に対応した方法でラマンスペクトルの分析を行うことによって、分析精度が高くなるという新たな事実を見出し、本発明に到達した。
【０００６】
このような検討結果を踏まえ、本発明による試料分析装置は、ラマン分光法を用いた試料分析装置であって、試料に照射される励起光を出射する励起光源と、励起光が照射された試料からのラマン散乱光を分光する分光手段と、分光手段で分光されたラマン散乱光を検出する光検出手段と、光検出手段で検出されたラマン散乱光を計数してラマンスペクトルを得る計数手段と、励起光が照射される試料の分析部位を特定する部位特定手段と、部位特定手段によって特定される分析部位に応じて、計数手段において得られた試料のラマンスペクトルの分析を行う分析手段と、を備えることを特徴とする。
【０００７】
この試料分析装置では、部位特定手段により分析部位が特定され、さらに特定された分析部位に応じて分析手段において試料のラマンスペクトルが分析される。本願発明者が見出したように、ラマンスペクトルの波形は、同一検体であっても部位ごとに異なるため、このように分析部位が特定されることにより、分析精度の向上が可能となる。
【０００８】
また、分析手段は、分析部位に対して用意されたラマンスペクトルに関する標準データを基準として、計数手段において得られた試料のラマンスペクトルを分析することが好ましい。標準データを基準とすることにより、分析精度のさらなる向上が図られる。
【０００９】
また、試料の各部位の標準データを保持する標準データ保持手段をさらに備えるとともに、分析手段は、分析部位に応じて、当該分析部位の標準データを標準データ保持手段から取得して、計数手段において得られた試料のラマンスペクトルを分析することが好ましい。標準データ保持手段によって標準データが保持され、そこから部位特定手段で特定された分析部位に対応した標準データを取得することにより、分析に要する時間の短縮化が可能となり、分析の効率化が図られる。
【００１０】
また、本発明による試料分析方法は、上記した試料分析装置を用いた試料分析方法であって、試料分析装置を用いて試料のラマンスペクトルを得るとともに、当該ラマンスペクトルによって試料の分析を行うことを特徴とする。これによって、高い分析精度で試料の分析を行うことが可能な試料分析方法とすることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、分析精度の高い試料分析装置及びそれを用いた試料分析方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面とともに、本発明による試料分析装置、及びそれを用いた試料分析方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１３】
図１は、本発明に係る試料分析装置の実施形態について概略的に示す構成図である。図１中において、試料分析装置１を用いた分析の対象となる生体試料などの試料は、符号Ｓによって示されている。
【００１４】
本実施形態による試料分析装置１は、図１に示すように、ラマンスペクトル測定装置１０と、分析部位特定装置２０と、分析装置３０と、入力装置３１と、標準データベース４０と、表示装置５０とを備えている。
【００１５】
ラマンスペクトル測定装置１０は、励起レーザ１１と、ダイクロイックミラー１２と、励起光集光光学系１３と、試料載置台１４と、散乱光集光光学系１５と、分光器１６と、光検出器１７と、計数回路１８とを備えて構成されている。励起レーザ１１は、試料Ｓに励起光として照射されるパルス状のレーザ光を出射して供給する励起光源である。この励起光は、試料Ｓでの非弾性散乱によってラマン（Raman）散乱光を生成するためのものである。
【００１６】
励起光の波長としては、例えば近赤外で所定の下限波長以上の波長範囲内の波長を用いることができる。具体的には、８５０ｎｍ以上、より好ましくは９００ｎｍ以上の波長範囲内にある所定波長を用いることが好適である。励起光の波長が上記範囲内である場合、励起光の照射によって発生する試料Ｓでの蛍光の強度は小さくなる。このような波長範囲のパルス励起光を供給する励起レーザ１１としては、例えば、波長１０６４ｎｍの光を供給するＮｄ：ＹＡＧパルスレーザなどがある。
【００１７】
励起レーザ１１から供給された励起光は、ダイクロイックミラー１２及び励起光集光光学系１３によって試料Ｓへと導かれる。ダイクロイックミラー１２は、励起光の波長の光を選択的に反射し、それ以外の波長の光を透過する。したがって、ダイクロイックミラー１２は、励起レーザ１１から供給された励起光を反射して、試料Ｓに向かう光路へと励起光の光路を変更する。ダイクロイックミラー１２で反射された励起光の光路上には、励起光を集束させるための励起光集光光学系１３が設けられている。
【００１８】
励起光集光光学系１３は、励起光を集束する。集束された励起光は、試料載置台１４上に固定して配置された試料Ｓへと照射される。そして、試料Ｓにおいて、励起光の非弾性散乱によるラマン散乱光が生成される。このような構成において、励起レーザ１１からの励起光が照射されている試料Ｓの部位が、本試料分析装置１における分析部位となる。
【００１９】
ダイクロイックミラー１２は、試料Ｓで生成され放出されたラマン散乱光を透過する。散乱光集光光学系１５は、ダイクロイックミラー１２を透過したラマン散乱光を分光器１６に入射するように集束する。ダイクロイックミラー１２及び散乱光集光光学系１５は、試料Ｓからのラマン散乱光について、励起光の照射方向に対して後方散乱されたラマン散乱光を集光して測定するように構成されている。
【００２０】
分光器１６は、散乱光集光光学系１５によって集束されたラマン散乱光を分光する。光検出器１７は、分光器１６で分光されたラマン散乱光を検出する。光検出器１７でのラマン散乱光の検出は、分光器１６の出射スリットで選択された波長成分の光を検出することによって行われる。
【００２１】
光検出器１７としては、励起光によって決まるラマン散乱光の波長域の光に対して充分な感度を有するものが用いられる。具体的には、例えば、光電子増倍管やフォトダイオード、ＣＣＤなどを用いることが可能である。
【００２２】
また、ラマン散乱光の波長スペクトル（ラマンスペクトル）を得るためには、所定の波長域にわたって分光されたラマン散乱光の測定を行う必要がある。これに対して、単一の光検出器を用いた場合には、分光器１６の出射スリットによって選択される波長をスキャンしていくことによって、各波長成分のラマン散乱光を順次測定してラマンスペクトルを得る。
【００２３】
計数回路１８は、光検出器１７が光を検出して出力した検出信号を入力として、ラマン散乱光の計数を行う計数手段である。計数回路１８において、このように検出信号が計数されることによってラマンスペクトル測定装置１０では、試料Ｓのラマンスペクトルが得られる。このように、試料分析装置１は、ラマン分光法を用いている。
【００２４】
分析部位特定装置２０は、励起光が照射される試料Ｓの分析部位を特定するための部位特定手段である。この分析部位特定装置２０における分析部位の特定方法としては、分析部位特定装置２０において分析部位を自動で判断し特定する方法であっても、あるいは分析部位を手動で入力し特定する方法であってもよい。また、分析部位特定装置２０は、分析部位を特定するための部位特定信号を分析装置３０に対して出力する。
【００２５】
分析装置３０は、ラマンスペクトル測定装置１０の計数回路１８において得られた試料Ｓのラマンスペクトルデータについて必要なデータ分析を行う分析手段である。分析装置３０には、ラマンスペクトルデータが入力される。また、本実施形態においては、この分析装置３０に対し、分析部位特定装置２０からの部位特定信号が入力されている。分析装置３０は、この部位特定信号を参照し、特定される分析部位に応じて、試料Ｓのラマンスペクトルの分析を行う。
【００２６】
また、本実施形態に係る試料分析装置１における分析装置３０は、試料Ｓの分析部位のラマンスペクトルの分析において、分析部位に対して用意された標準データを基準として分析を行うことが可能なように構成されている。具体的には、本実施形態では、試料分析装置１は、試料Ｓの各部位の標準データを保持している標準データベース４０をさらに備えている。分析装置３０は、試料Ｓの分析部位のラマンスペクトルを分析するに際し、標準データベース４０から分析部位の標準データを取得し、こうして取得した標準データを基準として取得されたラマンスペクトルと照らし合わせることによって、分析を行う。
【００２７】
ここで、標準データとは、分析装置３０でのラマンスペクトルの分析の基準となるデータである。例えば試料Ｓの部位ごとの平均ラマンスペクトルを標準データとして用いることができる。より具体的には、例えば、試料分析装置１を癌の診断に用いる場合には、各部位に関する複数の正常な組織の平均ラマンスペクトル及び複数の癌に冒された組織の平均ラマンスペクトルをそれぞれ標準データとすることができる。
【００２８】
ラマンスペクトルの分析に用いられる分析装置３０、分析部位特定装置２０、及び標準データベース４０は、例えばＣＰＵ及びメモリ等を含むコンピュータによって構成することができる。また、これらの分析装置３０に対し、必要に応じて入力装置３１や表示装置５０を接続してもよい。
【００２９】
入力装置３１は、例えば、分析部位特定装置２０に対する分析部位についての情報の入力、ラマンスペクトル測定装置１０及び分析装置３０によるラマンスペクトルの測定、分析動作の制御等に用いることができる。また、表示装置５０は、例えば、ラマンスペクトル測定装置１０によって得られたラマンスペクトル、分析装置３０によって得られた分析結果、あるいは特定されている分析部位の表示等に用いることができる。
【００３０】
次に、試料分析装置１を用いた試料の分析方法について説明する。まず、ラマンスペクトル測定装置１０で、試料Ｓのラマンスペクトルを生成する。すなわち、励起レーザ１１が励起光を出射し、出射された励起光はダイクロイックミラー１２及び励起光集光光学系１３を介して試料Ｓへと照射される。励起光が照射された試料Ｓでは、励起光の非弾性散乱によるラマン散乱光が生成され放射される。試料Ｓから放射されたラマン散乱光は、分光器１６において分光される。分光器１６で分光されたラマン散乱光は、光検出器１７で検出される。光検出器１７で検出されたラマン散乱光は、計数回路１８で計数され、試料Ｓのラマンスペクトルが生成される。生成されたラマンスペクトルは、ラマンスペクトル測定装置１０から分析装置３０へと出力される。
【００３１】
励起レーザ１１から出射される励起光が試料Ｓへと照射されることに対応して、分析部位特定装置２０では、分析部位が特定される。分析部位特定装置２０での分析部位の特定方法は、例えば自動あるいは手動による。分析部位特定装置２０において分析部位が特定されると、分析部位特定信号が分析部位特定装置２０から分析装置３０へ出力される。
【００３２】
分析装置３０には、上述したように、試料Ｓのラマンスペクトル及び分析部位を特定する部位特定信号が入力される。こうした入力に基づき、分析装置３０は試料Ｓのラマンスペクトルを分析する。分析装置３０は、試料Ｓのラマンスペクトルの分析に際し、部位特定信号に基づいて標準データベース４０から分析部位の標準データを取得する。分析装置３０では、こうして得た分析部位の標準データを基準として試料Ｓのラマンスペクトルを分析する。
【００３３】
こうして試料Ｓのラマンスペクトルについて分析された結果及び試料Ｓのラマンスペクトルは、表示装置５０で表示される。
【００３４】
次に、この試料分析装置１の効果について説明する。この試料分析装置１は、励起光が照射される試料Ｓの分析部位を特定する分析部位特定装置２０を備える。そのため、分析部位特定装置２０を備える試料分析装置１では、試料Ｓのラマンスペクトルの分析において、分析部位に応じた分析を行うことができる。ここで、本願発明者が見出したように、同一検体であっても部位ごとに異なるラマンスペクトルの波形を示す。そのため、分析部位に応じた分析のできる試料分析装置１では、分析精度を向上させることが可能となる。
【００３５】
例えば、ラマン分光による胃癌診断では、肺癌の診断に比べ正診率が低かった。しかし、この試料分析装置１を用いることによって胃癌診断の正診率のさらなる向上を図ることが可能となると考えられる。
【００３６】
また、この試料分析装置１の分析装置３０は、試料Ｓのラマンスペクトルを分析する際に、この分析部位に対して用意された標準データを基準として分析を行う。このように、試料Ｓのラマンスペクトルの分析が、基準となるデータに基づいて行われることにより、分析精度のさらなる向上を図ることが可能となる。
【００３７】
試料分析装置１では、分析の基準となる標準データは、標準データベース４０において保持されている。そして、分析装置３０では、分析部位特定装置２０によって特定された分析部位に応じて、標準データベース４０からその分析部位の標準データが取得され、この標準データを基準として試料Ｓのラマンスペクトルが分析される。このように、標準データベース４０において、試料の各部位の標準データが保持されているため、分析装置３０は、例えば毎回標準データを計算により取得等しなくてよく、その結果、分析に要する時間の短縮化が可能となる。
【００３８】
分析装置３０での分析は、各部位に関する複数の正常な組織の平均ラマンスペクトル及び複数の癌に冒された組織の平均ラマンスペクトルをそれぞれ標準データとする場合であれば以下に例示するように行うことができる。例えば、試料Ｓのラマンスペクトルの波形が、各平均ラマンスペクトルの波形のどちらにより近いかを最小２乗法で決定することにより、試料Ｓが正常であるか、あるいは癌に冒されているかの分析をすることができる。
【００３９】
また、こうした効果を有する試料分析装置１を用いた試料の分析方法によれば、高い分析精度で試料の分析を行うことが可能となる。
【００４０】
図２は、ラマンスペクトル測定装置の構成の一例を示す図である。このラマンスペクトル測定装置１０Ａは、図１に示した試料分析装置１に用いられるラマンスペクトル測定装置１０の変形例を示すものである。
【００４１】
このラマンスペクトル測定装置１０Ａは、励起レーザ１１と、導光光学系６１と、試料載置台１４と、集光光学系７１と、分光器１６とを備えて構成されている。
【００４２】
励起レーザ１１から供給された励起光は、導光光学系６１によって試料Ｓへと導かれる。この導光光学系６１は、光路を設定または変更する反射ミラーなどの光学素子を組み合わせて構成される。また、図２に示した構成においては、導光光学系６１の光路上に、光強度を調整するためのＮＤフィルター６２、及び励起光を集束させるための集束レンズ６３が設けられている。
【００４３】
導光光学系６１を構成しているこれらの各光学素子を通過した励起光は、試料Ｓに対向する位置（図２中の試料Ｓの上方）に設けられた反射ミラー６４を介して、試料載置台１４上に固定して配置された試料Ｓへと照射される。
【００４４】
なお、試料載置台１４は、励起光の照射位置（集束位置）に対して、試料Ｓの位置を移動または調整可能なＸＹＺ−可動ステージとすることが好ましい。また、図２に示すように、試料Ｓに対する励起光の照射位置を目視して確認するために、可視光のレーザ光を供給する位置合わせ用のレーザ光源７６（例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ）が設置されていてもよい。このレーザ光源７６は、試料Ｓ及び試料載置台１４に対して反射ミラー６４とは反対側に設置されている。また、レーザ光源７６からの可視レーザ光の試料Ｓへの光路は、反射ミラー６４から試料Ｓへの励起光の光路と同軸に位置合わせされている。これによって、レーザ光源７６からの可視レーザ光の試料Ｓでの照射位置を用いて、目視で励起光の照射位置を確認することができる。
【００４５】
試料Ｓで生成して放出されたラマン散乱光は、集光光学系７１によって所定の集束位置へと導光、集束される。この集光光学系７１は、反射ミラー７２、コリメートレンズ７３、及び集束レンズ７５を有し、試料Ｓからのラマン散乱光について、励起光の照射方向に対して後方散乱されたラマン散乱光を集光して測定するように構成されている。
【００４６】
試料Ｓと反射ミラー６４との間には、アルミニウムミラーなどの反射ミラー７２が設置されている。この反射ミラー７２は、試料Ｓから所定の角度範囲で後方に放出されたラマン散乱光を反射して、分光器１６の入射位置に向かう光路へと、ラマン散乱光の光路を変更する。光路が変更されたラマン散乱光は、コリメートレンズ７３及び集束レンズ７５を介して導光され、分光器１６の入射位置へと集束される。なお、反射ミラー７２には、試料Ｓへと照射される励起光の光軸を含む部位に、励起光を通過させるための開口が設けられている。
【００４７】
また、コリメートレンズ７３と集束レンズ７５との間には、ホログラフィックノッチフィルター７４が設置されている。このノッチフィルター７４は、試料Ｓからの光のうち、強度の強いレイリー（Rayleigh）散乱光などを除去するために用いられる。
【００４８】
ノッチフィルター７４によってレイリー散乱光が除去されるとともに、コリメートレンズ７３及び集束レンズ７５によって集束されたラマン散乱光は、分光器１６によって分光された後、その出射スリットで選択された波長成分の光が、光検出器１７によって検出される。
【００４９】
光検出器１７で検出されたラマン散乱光の検出信号は、光検出器１７からプリアンプ８２を介して同時計数回路９１へと入力される。また、この同時計数回路９１には、フォトダイオード６６からの検出信号が入力されている。このフォトダイオード６６は、励起レーザ１１からの励起光の光路上に設置されたハーフミラー６５によって分岐された励起光の一部を検出する位置に設置されている。
【００５０】
同時計数回路９１は、以上の構成によって、光検出器１７で検出されたラマン散乱光の計数を、励起レーザ１１からの励起光の出射タイミングに対して同期されたタイミングで行うための同期計数手段として機能している。すなわち、同時計数回路９１は、フォトダイオード６６から入力される励起光検出信号によって、励起レーザ１１から供給されているパルス状の励起光の出射タイミングを、それぞれのパルス光について特定する。そして、その出射タイミングと同期させるためのゲートをかけて、光検出器１７から入力されるラマン散乱光検出信号の計数を実行する。
【００５１】
同時計数回路９１によるラマン散乱光の計数は、パーソナルコンピュータなどを用いた分光測定制御装置９０によって制御される。また、この分光測定制御装置９０は、分光器１６などの各装置の動作等を制御するとともに、同時計数回路９１によって計数されたラマン散乱光の計数データの取得や、データ加工、記憶装置への記憶など、計数データに対して必要なデータ処理を行う。また、この分光測定制御装置９０に代わり、図１に示した分析装置３０で同時計数回路９１での計数を制御してもよい。
【００５２】
上記した試料分析装置によって得られるラマンスペクトル及びその分析方法について、具体的な測定例とともにさらに説明する。測定に用いたラマンスペクトル測定装置の具体的な構成については、励起レーザ１１として、波長１０６４ｎｍのパルス光を周波数１０ｋＨｚ、パルス幅１０ｎｓ、平均出力１００ｍＷで供給するＮｄ：ＹＡＧパルスレーザ光源を用いた。分光器１６では、６００溝／ｍｍの１．０μｍ−ブレーズ回折格子によって、測定するラマン散乱光の分散を行った。そして、分光されたラマン散乱光に対して、光検出器１７として近赤外光に感度を有するＩｎＧａＡｓ光電子増倍管（浜松ホトニクス）を用いて、ラマン散乱光を検出した。
【００５３】
図３は、図１に示す試料分析装置を用いて測定された、ヒト胃鉗子片試料の各部位におけるラマンスペクトルの測定例である。図３のグラフＡは正常なヒト胃鉗子片試料のラマンスペクトルを、グラフＢは低分化型腺癌であるヒト胃鉗子片試料のラマンスペクトルをそれぞれ表す。グラフＡとグラフＢとを比較すると、両者に違いは見られるが、その差は、肺から採取した正常な組織と癌組織とのラマンスペクトルの差に比べるとわずかである。
【００５４】
次に、同一検体における胃の部位による影響を検討するために、図４に示す胃の解剖学定点５点Ａ１、Ａ２、ＩＡ、Ｂ１、Ｂ２で組織を採取し、測定を行った。その結果を以下に示す。図４の上方が、胃の上方に相当する。したがって、定点Ａ１、Ａ２、ＩＡは胃の下部における定点であり、定点Ｂ１、Ｂ２は胃の上部における定点である。
【００５５】
図５は、胃の解剖学定点５点Ａ１、Ａ２、ＩＡ、Ｂ１、Ｂ２で組織を採取しラマンスペクトル測定を行った結果である。図５では、実線で表したグラフが定点Ａ１、Ａ２から採取した試料のラマンスペクトルを表し、波線で表したグラフが定点ＩＡから採取した試料のラマンスペクトルを表し、点線で表したグラフが定点Ｂ１、Ｂ２から採取した試料のラマンスペクトルを表す。試料としては、内視鏡下で各定点についてそれぞれ２つずつ採取したものを用いた。したがって、試料は全１０個であり、図５では１０本の波形が示されている。図５に示されるように、各波形に若干の違いはあるが、同一定点から採取された２つの試料による波形は、互いに非常に近い形状をしている。このことから、図５における波形は、光源や光検出器を含めた測定系の違いではなく、試料そのものの持つ物性の違いを反映していると考えられる。また、別の観点から考えると、この装置は、測定したラマンスペクトルによって測定部位の違いをも表すことができる非常に高精度なものであると考えることもできる。
【００５６】
図６は、図５の波数１２００ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１付近のラマンスペクトルを拡大して示したものである。図６では、白抜きの円で示したグラフが定点Ａ１、Ａ２から採取した試料のラマンスペクトルを表し、白抜きの四角形で示したグラフが定点ＩＡから採取した試料のラマンスペクトルを表し、白抜きの三角形で示したグラフが定点Ｂ１、Ｂ２から採取した試料のラマンスペクトルを表す。図６から、胃の下部に相当する３つの定点Ａ１、Ａ２、ＩＡから採取した組織のラマンスペクトルの波形はそれぞれ似ており、また胃の上部に相当する２つの定点Ｂ１、Ｂ２から採取した組織のラマンスペクトルの波形はそれぞれ互いに似ていることが理解される。
【００５７】
こうして部位によってラマンスペクトルの波形が異なることは、脂肪含量に関係するのではないかとの観点から、以下のような検討を行った。脂肪含量は、波数１６６０ｃｍ−１（アミドＩバンド；タンパク含量の指標）でのラマンピーク強度に対する波数１４５０ｃｍ−１（ＣＨ変角由来；アルキル鎖によりこの波数でのラマンピーク強度が強くなる）でのラマンピーク強度の比によって表すことができると考えられる。そこで、図７において、２つの検体（胃）Ｓ１、Ｓ２の脂肪含量を表すラマンピーク強度比を示す。
【００５８】
図７のグラフの横軸は胃の解剖学定点Ａ１、Ａ２、ＩＡ、Ｂ１、Ｂ２を、胃の下部から上部への位置関係に基づいて表しており、縦軸は各定点でのラマンピーク強度比を表す。また、図７では、白抜きの四角形で示されたグラフが、検体Ｓ１から採取した試料のラマンピーク強度比を表し、白抜きの円で示されたグラフが、検体Ｓ２から採取した試料のラマンピーク強度比を表す。図７から理解されるように、２つの検体Ｓ１、Ｓ２の各部位におけるラマンピーク強度比は互いに比較的等しい。さらに、２つの検体Ｓ１、Ｓ２の双方とも、胃の上部に相当する定点Ｂ１、Ｂ２でのラマンピーク強度比の値が、胃の下部に相当する定点Ａ１、Ａ２、ＩＡでのラマンピーク強度比の値に比べて高い。このように、図７から、胃の部位ごとにラマンスペクトルの波形に違いが現れること、またその傾向は検体が変わっても共通していることが理解される。これらの結果から、ラマン分光による胃癌の診断において、分析部位を特定することにより、診断精度の向上が図れるのではないかと考察される。
【００５９】
続いて、図１に示す試料分析装置を用いて胃から採取した組織を分析した例について説明する。ここでは、３２名分の症例について検討した。３２名分のそれぞれの検体から、正常部及び癌部の鉗子片をそれぞれ３片ずつ試料として採取した。こうして得た各試料に対し、測定位置を変え２〜３回測定を行うことにより、各試料につき２〜３つのラマンスペクトルを取得した。なお、正常部の鉗子片（試料）採取場所については、あらかじめ限定して採取を行った。具体的には、癌部近傍から採取した正常部鉗子片（試料）が４例であり、胃の上部のみから採取した正常部鉗子片（試料）が８例であり、胃の下部から上部に至るそれぞれの部位から採取した正常部鉗子片（試料）が２０例である。このようにして、正常部から採取した試料のラマンスペクトルを２７８波形、癌部から採取した試料のラマンスペクトルを３１０波形取得した。ここで、癌部とは、病理診断の結果陽性であると診断された組織をいい、正常部とは、病理診断の結果陰性であると診断された組織をいう。
【００６０】
こうして得られたラマンスペクトルについて、図１に示す試料分析装置によって分析を行った結果を表１に示す。分析に際し、まず、正常部及び癌部のそれぞれの全ラマンスペクトルの平均ラマンスペクトルを算出した。そして、これらの平均ラマンスペクトルを標準診断波形（標準データ）として、個々のラマンスペクトルの波形が正常部及び癌部の平均ラマンスペクトルのどちらにより近いかを最小２乗法により決定することにより、分析を行った。ただし、閾値を設け、どちらの平均ラマンスペクトルの波形からも離れていると判断された場合には、判定不能とした。
【表１】
2006300611.tif 000003
【００６１】
表１の「全波形対象」の欄に示した結果は、全ラマンスペクトルを対象として、すなわち分析部位を特定することなく分析した結果である。表１の「胃下部」の欄に示した結果は、図１に示す試料分析装置によって、胃の下部から採取された試料のラマンスペクトルについて、分析部位を特定して分析した結果である。表１の「胃中部・上部」の欄に示した結果は、図１に示す試料分析装置によって、胃の中部・上部から採取された試料のラマンスペクトルについて、分析部位を特定して分析した結果である。
【００６２】
感度とは、癌部から採取された試料の分析において、そのラマンスペクトル波形が癌であると正確に分析された割合を表す。特異度とは、正常部から採取された試料の分析において、そのラマンスペクトル波形が正常であると正確に分析された割合を表す。正診率とは、癌部から採取された試料は癌と、正常部から採取された試料は正常と正確に分析した割合を表す。以下に、感度、特異度、及び正診率の定義を具体的に示す。
感度（％）＝ａ／Ａ×１００  …（１）
特異度（％）＝ｂ／Ｂ×１００  …（２）
正診率（％）＝（ａ＋ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００  …（３）
【００６３】
（１）〜（３）式において、Ａは癌部から採取した試料の数を表し、Ｂは正常部から採取した試料の数を表す。また、ａは、図１に示す試料分析装置を用いて試料を分析した結果、癌であると分析された試料の数を表し、ｂは正常である（癌でない）と分析された試料の数を表す。
【００６４】
（１）式より（１−ａ／Ａ）が偽陽性の割合を、（２）式より（１−ｂ／Ｂ）が偽陰性の割合を示すことがわかる。
【００６５】
表１に示した各感度及び各特異度を比較すると、試料を取得した分析部位を特定して分析を行った場合（胃下部、胃中部・上部）の方が、全試料について分析を行った場合（全波形対象）より、感度が約１０％、特異度が約８〜１０％向上したことがわかる。
【００６６】
表２に、１０名分の検体のラマンスペクトル波形から算出した平均ラマンスペクトルを診断用標準波形（標準データ）として、各ラマンスペクトル波形の分析を行った結果を示す。表1に示した感度、特異度、及び正診率を求めた際の分析とは、診断用標準波形（標準データ）を全ラマンスペクトル波形から算出したのではなく、１０名分の検体のラマンスペクトル波形から算出している点で異なり、その他の分析方法については同様である。
【表２】
2006300611.tif 000004
【００６７】
表２の「全波形対象」の欄に示した結果は、全ラマンスペクトルについて分析した結果である。「正常部（胃下部を除く）」の欄に示した結果は、正常部から採取した試料のうち胃の下部から採取した試料を除いたもののラマンスペクトルについて、図１に示す試料分析装置によって、分析部位を特定して分析を行った結果である。言い換えると、表２の「正常部（胃下部を除く）」の欄に示した特異度は、胃の中部及び上部から採取した正常部の試料のラマンスペクトルについて、分析部位を特定して分析を行った結果といえる。なお、「正常部（胃下部を除く）」の欄に示した結果を求める際には、胃下部から取得した試料のラマンスペクトル以外のラマンスペクトルによって算出された平均ラマンスペクトルを、診断用標準波形（標準データ）としている。
【００６８】
表１及び表２を比較すると、全試料について分析を行った場合の感度及び特異度は、標準データを全ラマンスペクトルから算出した場合（表１）と１０名分の検体のラマンスペクトルから算出した場合（表２）とで、ほぼ同程度であったことがわかる。このことから、１０名分程度のラマンスペクトルから算出された標準診断波形（標準データ）であっても、分析の基準とできると考えられ、実際に応用しやすいと考えられる。
【００６９】
表２に示すように、全ラマンスペクトルについて分析を行い算出された特異度が６３．７％であるのに対し、正常部を採取した分析部位を胃の上部・中部であると特定して分析を行い算出された特異度は８０．３％と大きく向上している。このことから、特に分析部位を特定することなく算出された平均ラマンスペクトルである診断用標準波形（標準データ）に基づいた分析では、胃の下部から採取された試料のラマンスペクトル波形は正しく分析されなかったことを意味している。すなわち、胃の下部から採取された試料の分析には、胃の下部用の標準データが必要であると言える。
【００７０】
表１及び表２の結果から、分析部位を特定し、各部位に対して診断用標準波形（標準データ）を作成する事により、分析の精度を向上させることが可能になると考えられる。今回は、分析部位を大きく２箇所に分類したが、さらに細かく分類する事により、一層の分析精度の向上が可能であると考えられる。胃癌において、癌の境界がどこまでであるかを知る事は、縮小手術が要求されていることを考慮すると、実際の外科手術に際しても重要であると考えられる。また、内視鏡下でのラマンスペクトル測定を利用した癌診断の際も、癌の領域を知る事は非常に意義深い。
【００７１】
ここでは、胃癌の組織について分析した結果を示したが、鼻咽腔、口腔、食道、大腸、子宮頚など、他の管空組織に関しても、それぞれの表面が必ずしも均一とは限らないため、本発明を応用できるものと考えられる。なお、非特許文献３には、胃と同じく管腔組織である鼻咽腔についてのラマン分光による癌診断の例が開示されている。ただし、非特許文献３に記載された例では、同一検体における癌／非癌の違いがスペクトル中の特定部分の強度比として現れている、としている。しかし、この差を上回る検体間の分散があるため、診断へと発展させるにはさらなる工夫を要すると考えられる。また、非特許文献３においては、測定部位によって波形が異なることについては全く議論されていない。
【００７２】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、ラマンスペクトル測定装置１０は、図８に示すように、ファイバー光学系Ｆを用いていてもよい。あるいは、ラマンスペクトル測定装置１０は、図９に示すように、顕微鏡光学系Ｍを用いていてもよい。これらの構成は、測定対象物（摘出組織、術中の生体組織、内視鏡下の組織など）に併せて選択することができる。
【００７３】
また、分析部位特定装置２０での分析部位の特定方法は、分析部位特定装置２０において分析部位を自動で判断する手段を備えるように構成されていても、あるいは手動で分析部位を入力するように構成されていてもよい。
【００７４】
また、試料のラマンスペクトルの分析は、必ずしも標準データを用いて行わなくてもよい。また、試料分析装置は、標準データを保持する標準データベースを必ずしも備えていなくてもよく、例えば分析の際に標準データを入力してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、分析精度の高い試料分析装置及びそれを用いた試料分析方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】試料分析装置の実施形態について概略的に示す構成図である。
【図２】ラマンスペクトル測定装置の変形例の構成について概略的に示す構成図である。
【図３】図１に示した試料分析装置によって取得されたヒト胃鉗子片試料のラマンスペクトルを示すグラフである。
【図４】胃の解剖学定点を示すための図である。
【図５】胃の解剖学定点で採取された組織のラマンスペクトルを示すグラフである。
【図６】胃の解剖学定点で採取された組織のラマンスペクトルを示すグラフである。
【図７】胃の各解剖定点から採取された組織に対するラマンピーク強度比を示すグラフである。
【図８】変形例に係るラマンスペクトル測定装置の構成について概略的に示す構成図である。
【図９】変形例に係るラマンスペクトル測定装置の構成について概略的に示す構成図である。
【符号の説明】
【００７７】
１…試料分析装置、１０…ラマンスペクトル測定装置、１１…励起レーザ、１２…ダイクロイックミラー、１３…励起光集光光学系、１４…試料載置台、１５…散乱光集光光学系、１６…分光器、１７…光検出器、１８…計数回路、２０…分析部位特定装置、３０…分析装置、３１…入力装置、４０…標準データベース、５０…表示装置、６１…導光光学系、６２…フィルター、６３…集光光学系、６４…反射ミラー、６５…ハーフミラー、６６…フォトダイオード、７１…集光光学系、７２…反射ミラー、７３…コリメートレンズ、７４…ノッチフィルター、７５…集束レンズ、７６…レーザ光源、８２…プリアンプ、９０…分光測定制御装置、９１…同時計数回路、Ｆ…ファイバ光学系、Ｍ…顕微鏡光学系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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