(57)【要約】      （修正有）【課題】複合汚れに対して有効なアルカリプロテアーゼの洗浄性能を更に向上させ、酵素の比活性と耐熱性を高めることにより、高い洗浄性と生産性を併せ持つアルカリプロテアーゼの提供。【解決手段】特定なる配列で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又はこれと機能的に等価なアルカリプロテアーゼにおいて、下記（ａ）〜（e）から選ばれる１種類以上のアミノ酸残基の置換及び／又は挿入がなされ、且つ特定なる配列で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼより高い比活性及び／又は洗浄性を有するアルカリプロテアーゼ。（ａ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基（ｂ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基（ｃ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基（ｄ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基（ｅ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又はこれと機能的に等価なアルカリプロテアーゼにおいて、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１種類以上のアミノ酸残基の置換及び／又は挿入がなされ、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼより高い比活性及び／又は洗浄性を有するアルカリプロテアーゼ。
（ａ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の間への他のアミノ酸残基の挿入
（ｃ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｄ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｅ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
【請求項２】
アミノ酸残基の置換及び／又は挿入が下記１）〜５）で示される請求項１記載のアルカリプロテアーゼ
１）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換と（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入の組み合わせ
２）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
３）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入、（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換及び（ｄ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
４）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
５）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
【請求項３】
アミノ酸残基の置換及び／又は挿入が下記６）〜１６）で示される請求項１記載のアルカリプロテアーゼ
６）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換であって、他のアミノ酸残基が、リジン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン又はイソロイシンである
７）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入であって、他のアミノ酸残基が、リジン、ロイシン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン、チロシン又はアルギニンである
８）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換と（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）プロリン／（ｂ）イソロイシン、（ａ）ロイシン／（ｂ）セリン、（ａ）ロイシン／（ｂ）グリシン、（ａ）ロイシン／（ｂ）スレオニン、（ａ）セリン／（ｂ）アラニン、（ａ）セリン／（ｂ）アスパラギン、（ａ）セリン／（ｂ）グルタミン、（ａ）セリン／（ｂ）トリプトファン、（ａ）セリン／（ｂ）ヒスチジン、（ａ）セリン／（ｂ）グリシン、（ａ）リジン／（ｂ）セリン、（ａ）スレオニン／（ｂ）セリン、（ａ）イソロイシン／（ｂ）セリン、（ａ）メチオニン／（ｂ）セリン、（ａ）グリシン／（ｂ）セリン、（ａ）アルギニン／（ｂ）セリン、（ａ）グルタミン酸／（ｂ）セリン、（ａ）アスパラギン／（ｂ）セリン、（ａ）フェニルアラニン／（ｂ）セリン、（ａ）トリプトファン／（ｂ）セリン、（ａ）リジン／（ｂ）アラニン、（ａ）アルギニン／（ｂ）アラニン、（ａ）リジン／（ｂ）グリシン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリンである
９）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）スレオニン、セリン、グリシン又はアラニンである
１０）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入、（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換及び（ｄ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）アラニン、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）アルギニン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）メチオニンである
１１）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）セリン、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）グルタミン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）メチオニンである
１２）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ｂ）アラニン、アルギニン、グリシン又はロイシン／（ｅ）セリンである
１３）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）イソロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）ヒスチジン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）セリン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）ロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）アルギニン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）リジン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン又は（ａ）リジン／（ｂ）セリン／（ｅ）セリンである
１４）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）イソロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）アスパラギン又は（ａ）プロリン／（ｂ）アラニン／（ｅ）アスパラギンである
１５）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ｂ）アラニン／（ｅ）メチオニン又はスレオニンである
１６）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）リジン／（ｂ）セリン／（ｅ）アスパラギン又はイソロイシンである
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼと機能的に等価なアルカリプロテアーゼが、配列番号１において１３２位、１３３位、１３４位若しくは１３５位又はこれらに相当する位置以外のアミノ酸残基が１〜数個欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものである請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼと機能的に等価なアルカリプロテアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５記載のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
宿主が微生物である請求項７記載ベクターを導入した形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ、それをコードする遺伝子に及び当該アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することである。しかし、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（特許文献１参照）。斯かるアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
上記アルカリプロテアーゼ群は、皮脂汚れ等の混在する条件下でも高い洗浄性能を有するが、更に高い洗浄性能が求められていることも事実である。また、このように洗浄性に優れたプロテアーゼを工業的に大量生産するには、生産性を高めることも必要である。生産性を向上させる方法としては、生産菌の変異育種による改良、プロテアーゼをコードする遺伝子あるいはその発現制御に関わる遺伝子を改変してタンパク質分泌量を高める方法、プロテアーゼをコードする遺伝子を改変して、比活性を向上させる方法が挙げられる。そこで、本発明者らは、上記アルカリプロテアーゼの遺伝子改変について検討し、タンパク質分泌能や比活性が向上した変異アルカリプロテアーゼを見出した（特許文献２、３）。
【０００６】
しかしながら、大量に且つ廉価な酵素を生産するには更なる生産性の向上が必須であり、その為には更なる比活性の向上や分泌量の向上または洗浄力の向上などが求められていた。
【特許文献１】国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−０００１２２号公報
【特許文献３】特開２００４−０５７１９５号公報
【非特許文献１】Saekiら, Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 313-319, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、複合汚れに対して有効なアルカリプロテアーゼの洗浄性能を更に向上させ、酵素の比活性を高めることにより、高い洗浄性と生産性を併せ持つアルカリプロテアーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼについて、これらのアミノ酸配列の適切なアライメントをとることにより、改変候補となるアミノ酸の選抜を試み、任意のアミノ酸への置換、挿入、欠失等の部位特異的変異導入を行なった。その結果、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、比活性を向上させるには当該アミノ酸配列中の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。更に洗浄性能を向上させるには当該アミノ酸配列中の特定位置に特定のアミノ酸残基の挿入が必要であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又はこれと機能的に等価なアルカリプロテアーゼにおいて、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１種類以上のアミノ酸残基の置換及び／又は挿入がなされ、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼより高い比活性及び／又は洗浄性を有するアルカリプロテアーゼを提供するものである。
（ａ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、
（ｂ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の間への他のアミノ酸残基の挿入、
（ｃ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、
（ｄ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換及び
（ｅ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
【００１０】
また本発明は、該アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、該アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、複合汚れに対しても優れた洗浄性を有するアルカリプロテアーゼの洗浄性能及び、酵素の比活性を高めることにより、洗浄剤に配合するのに適したアルカリプロテアーゼを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又はこれと機能的に等価なアルカリプロテアーゼにおいて、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１種類以上のアミノ酸残基の置換及び／又は挿入がなされたもので、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼより比活性又は洗浄性が向上していることが好ましく、さらに比活性及び洗浄性の向上していることが好ましい。
（ａ）１３３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）１３３位と１３４位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基の間への他のアミノ酸残基の挿入
（ｃ）挿入前の１３４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｄ）挿入前の１３５位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｅ）１３２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
斯かるアルカリプロテアーゼは、野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１４】
また、上記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる２種類以上のアミノ酸残基の置換及び／又は挿入の好適な組み合わせとしては、例えば、以下の１）〜５）が挙げられる。
１）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換と（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入の組み合わせ
２）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
３）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入、（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換及び（ｄ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
４）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせ
５）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の
組み合わせ
【００１５】
さらに、本発明のアルカリプロテアーゼの好適な具体例として、以下の６）〜１６）で示されるものが挙げられる。
６）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換であって、他のアミノ酸残基が、リジン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン又はイソロイシンである
７）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入であって、他のアミノ酸残基が、リジン、ロイシン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン、チロシン又はアルギニンである
８）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換と（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）プロリン／（ｂ）イソロイシン、（ａ）ロイシン／（ｂ）セリン、（ａ）ロイシン／（ｂ）グリシン、（ａ）ロイシン／（ｂ）スレオニン、（ａ）セリン／（ｂ）アラニン、（ａ）セリン／（ｂ）アスパラギン、（ａ）セリン／（ｂ）グルタミン、（ａ）セリン／（ｂ）トリプトファン、（ａ）セリン／（ｂ）ヒスチジン、（ａ）セリン／（ｂ）グリシン、（ａ）リジン／（ｂ）セリン、（ａ）スレオニン／（ｂ）セリン、（ａ）イソロイシン／（ｂ）セリン、（ａ）メチオニン／（ｂ）セリン、（ａ）グリシン／（ｂ）セリン、（ａ）アルギニン／（ｂ）セリン、（ａ）グルタミン酸／（ｂ）セリン、（ａ）アスパラギン／（ｂ）セリン、（ａ）フェニルアラニン／（ｂ）セリン、（ａ）トリプトファン／（ｂ）セリン、（ａ）リジン／（ｂ）アラニン、（ａ）アルギニン／（ｂ）アラニン、（ａ）リジン／（ｂ）グリシン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリンである
９）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）スレオニン、セリン、グリシン又はアラニンである
１０）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入、（ｃ）で示されるアミノ酸残基の置換及び（ｄ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）アラニン、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）アルギニン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｃ）セリン／（ｄ）メチオニンである
１１）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）セリン、（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）グルタミン又は（ａ）セリン／（ｂ）セリン／（ｅ）メチオニンである
１２）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ｂ）アラニン、アルギニン、グリシン又はロイシン／（ｅ）セリンである
１３）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）イソロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）ヒスチジン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）セリン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）ロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）アルギニン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン、（ａ）リジン／（ｂ）アラニン／（ｅ）セリン又は（ａ）リジン／（ｂ）セリン／（ｅ）セリンである
１４）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）イソロイシン／（ｂ）アラニン／（ｅ）アスパラギン又は（ａ）プロリン／（ｂ）アラニン／（ｅ）アスパラギンである
１５）（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ｂ）アラニン／（ｅ）メチオニン又はスレオニンである
１６）（ａ）で示されるアミノ酸残基の置換、（ｂ）で示されるアミノ酸残基の挿入及び（ｅ）で示されるアミノ酸残基の置換の組み合わせであって、置換及び挿入される他のアミノ酸残基がそれぞれ、（ａ）リジン／（ｂ）セリン／（ｅ）アスパラギン又はイソロイシンである
【００１６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼとしては、例えばプロテアーゼＫＰ４３〔バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０５１４２３〕が挙げられる。
【００１７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼと機能的に等価なアルカリプロテアーゼとしては、野生型又は野生型の変異体であってもよい。例えば、配列番号１において１３２位、１３３位、１３４位若しくは１３５位又はこれらに相当する位置以外のアミノ酸残基が１〜数個欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、或いは配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼと同様の性質を有するものが挙げられる。特に、ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００であるものが好ましい。ここで、酸化剤耐性を有することとしては、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中で、３０℃、２０分間の放置後の残存活性が少なくとも５０％以上を保持していることが挙げられる。
【００１８】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０[バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０３]、プロテアーゼＥ−１[バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０２]、プロテアーゼＹａ[バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０４]、プロテアーゼＳＤ５２１[バチルス ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０５]、プロテアーゼＡ−１[ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０６]、プロテアーゼＡ−２[ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７]、プロテアーゼ９８６５〔バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕や、特開２００２−２１８９８９、特開２００２−３０６１７６、特開２００３−１２５７８３、特開２００４−０００１２２、特開２００４−０５７１９５に記載の変異プロテアーゼ、配列番号１のアミノ酸配列の６３位をセリンに置換した変異体、８９位をヒスチジンに置換した変異体、１２０位をアルギニンに置換した変異体、６３位及び１８７位をセリンに置換した変異体、２２６位をチロシンに置換した変異体、２９６位をバリンに置換した変異体、３０４位をセリンに置換した変異体（特開２００４-３０５１７５）、配列番号１のアミノ酸配列の１５位をヒスチジンに置換した変異体、１６位をスレオニン又はグルタミンに置換した変異体、１６６位をグリシンに置換した変異体、１６７位をバリンに置換した変異体、３４６位をアルギニンに置換した変異体、４０５位をアスパラギン酸に置換した変異体（特開２００４-３０５１７６）、などが挙げられる。
【００１９】
なお、アミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を１として解析を行なうことにより算出される。
【００２０】
また、本発明おいて、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行なうことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２１】
すなわち、上記方法でアミノ酸配列を整列させた図１より、
（１）配列番号１の１３２位のアミノ酸残基はアラニン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１３１位のアラニン残基というように特定することができる。
（２）配列番号１の１３３位のアミノ酸残基はアラニン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＹａにおいては１３２位のプロリン残基というように特定することができる。
（３）配列番号１の１３４位のアミノ酸残基はバリン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては１３４位のバリン残基というように特定することができる。
（４）配列番号１の１３５位のアミノ酸残基はアスパラギン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＳＤ５２１においては１３４位のアスパラギン残基というように特定することができる。
【００２２】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列の（１）１３２位、（２）１３３位（３）１３４位、（４）１３５位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記で例示したプロテアーゼＫＰ９８６０、プロテアーゼＥ−１、プロテアーゼＹａ、プロテアーゼＳＤ５２１、プロテアーゼＡ−１、プロテアーゼＡ−２、プロテアーゼ９８６５について示す（表１）。
【００２３】
【表１】
2006129865.tif 000002
【００２４】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「これと機能的に等価なアルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。
例えば、プロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し、前記６）〜１６）で示されるアミノ酸残基の置換又は／及び挿入を行なう、又はこれと機能的に等価なアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において当該位置に相当する位置のアミノ酸残基に対して同様の置換又は／及び挿入を行なうことで得ることができる。
【００２５】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号２）に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行なえばよい。
【００２６】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラ)等を用いて行なうことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２７】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００２８】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、親アルカリプロテアーゼに比べ、比活性の向上、及び／又は洗浄力の向上が認められるという性質を新に獲得したものである。
従って、本発明のアルカリプロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
【００２９】
洗浄剤組成物中への本発明品プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５０００ＰＵが配合できるが、経済性等を考慮し、５００ＰＵ以下が好ましい。
【００３０】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明品プロテアーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、プロペラーゼ、プラフェクト（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル、ステインザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、プラスター（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ、ライペックス（登録商標；ノボザイムズ社）が挙げられる。
【００３１】
洗浄剤組成物中で本発明品プロテアーゼ以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５００ＰＵが好ましい。セルラーゼを併用する場合は、特開平１０−３１３８５９号公報の段落〔００２０〕に記載の酵素活性測定方法より決定される単位（ＫＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり３００〜３００００００ＫＵが好ましい。
【００３２】
またアミラーゼを併用する場合は、特開平１１−４３６９０号公報の段落〔００４０〕記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位（ＩＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５０〜５０００００ＩＵが好ましい。
【００３３】
さらにリパーゼを併用する場合は、特表平８−５０００１３号公報の実施例１記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位（ＬＵ）づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１００００〜１００００００ＬＵが好ましい。
【００３４】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００３５】
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
【００３６】
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００３７】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３８】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３９】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００４０】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【００４１】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００４２】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００４３】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００４４】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４５】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明品プロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
【００４６】
斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。
【実施例】
【００４７】
実施例１
アミノ酸配列のアライメントの結果（図１）から、バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０ｋｂ（配列番号２）に対して部位特異的変異を導入するアミノ酸残基を６３位、１０１位、１３３位に特定し、任意のアミノ酸を導入するようにプライマーをデザインした。６３位の変異導入にはプライマー１（配列番号３）とプライマー２（配列番号４）及びプライマー３（配列番号５）とプライマー４（配列番号６）を、１０１位の変異導入にはプライマー１とプライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）とプライマー４を、１３３位の変異導入にはプライマー１とプライマー７（配列番号９）及びプライマー８（配列番号１０）とプライマー４を用いＰＣＲを行った。プライマー１にはセンス鎖の５’末端側にBamHIリンカーを、プライマー４にはアンチセンス鎖の５’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー２とプライマー３、プライマー５とプライマー６、プライマー７とプライマー８は、それぞれの５’末端から１０〜１５ｂｐの長さで互いに相補するようにデザインした。ＰＣＲのＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ (タカラ)を用い、ＰＣＲの条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクルとし３０サイクル反応させた。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロッシュ）にて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、９４℃で２分間ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクルとし３０サイクル反応させ、リコンビナントＰＣＲを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー１とプライマー４によりＰＣＲを行なった。９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaI（ロッシュ）により切断した。増幅ＤＮＡ断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドｐＨＡ６４（特許第３４９２９３号：プロモーター６４の下流にBamHI、XbaI切断部位を有する）と混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルス  エスピー  ＫＳＭ９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）を形質転換した。
【００４８】
９８６５株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地[スキムミルク(ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン(ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％、炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ]に生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、５ｍLの種母培地[６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．０５％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．２５％炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで３０ｍLの主培地[８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００４９】
得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はＳｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（以下、ＡＡＰＦ：シグマ）を基質とした活性測定法により、タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。野生型酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清の値と比較することにより、プロテアーゼ活性の向上が認められた変異プロテアーゼ遺伝子を選抜した。
【００５０】
選抜された形質転換体からＨｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロッシュ）を用いプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。プラスミドＤＮＡ３００ｎｇを鋳型として、適宜合成したプライマーとＢｉｇ  Ｄｙｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いて２０μＬの反応系でＰＣＲを行い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７７型（アプライドバイオシステムズ）を用いた解析に供した。
【００５１】
その結果、プロテアーゼ活性が向上した変異体は１３３位のアラニンがグルタミン、アスパラギン、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジンであった。これらの培養液の一部を希釈し、２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）カラムにかけ、非吸着画分を回収することにより、ほぼ均一なプロテアーゼを得た。精製酵素のタンパク質量、ＡＡＰＦ分解活性を測定した結果、上記変異の導入によりそれぞれ比活性が１．２倍〜２倍に向上したことを確認した（表２）。
【００５２】
【表２】
2006129865.tif 000003
【００５３】
アミノ酸はアルファベット１文字で表し、アミノ酸を置換した部位を数値で表記している。置換前のアミノ酸を数値の前に、置換後のアミノ酸を数値の後に示した。例えばＡ１３３Ｑの場合、１３３位のアラニンをグルタミンに置換した変異体を表している。以下、表３、図２−１〜２−６においても同様に表現した。
【００５４】
次に１３３位の変異により多様性を与えるために以下の変異を導入した。
（１）１３３位と１３４位の間に任意の１アミノ酸を挿入
（２）１３３位を任意のアミノ酸に置換し、更に任意の１アミノ酸の挿入
（３）１３３位を任意のアミノ酸に置換し、更に任意の１アミノ酸を挿入し、１３４位を任意のアミノ酸に置換
（４）１３３位を任意のアミノ酸に置換し、更に任意の１アミノ酸を挿入し、１３４位及び１３５位を任意のアミノ酸に置換
（５）１３２位を任意のアミノ酸に置換し更に、１３３位と１３４位の間に任意の１アミノ酸の挿入
（６）１３２位及び１３３位を任意のアミノ酸に置換し、更に任意の１アミノ酸の挿入
【００５５】
（１）の変異導入にはプライマー１とプライマー７及びプライマー９（配列番号１１）とプライマー４を、（２）の変異導入にはプライマー１とプライマー７及びプライマー１０（配列番号１２）とプライマー４を、（３）の変異導入にはプライマー１とプライマー７及びプライマー１１（配列番号１３）とプライマー４を、（４）の変異導入にはプライマー１とプライマー７及びプライマー１２（配列番号１４）とプライマー４を、（５）の変異導入にはプライマー１とプライマー１３（配列番号１５）及びプライマー１４（配列番号１６）とプライマー４を、（６）の変異導入にはプライマー１とプライマー７及びプライマー１５（配列番号１７）とプライマー４を用い、前述の通りリコンビナントＰＣＲにより変異導入がなされた遺伝子を得た。前記ｐＨＡ６４に結合後、９８６５株を形質転換し、培養を行なうことにより変異体の評価を行なった。
その結果、以下の変異体において野生型を上回るプロテアーゼ活性の向上が認められた。
【００５６】
（１）の変異導入から
１３３位と１３４位の間の挿入アミノ酸残基；リジン、チロシン
（２）の変異導入から
１３３位＋挿入アミノ酸残基；プロリン＋イソロイシン、ロイシン＋セリン、ロイシン＋グリシン、ロイシン＋スレオニン、セリン＋セリン、リジン＋セリン、イソロイシン＋セリン、アルギニン＋セリン、リジン＋アラニン、リジン＋グリシン
（３）の変異導入から
１３３位＋挿入アミノ酸残基／１３４位；セリン＋セリン／スレオニン、セリン＋セリン／セリン、セリン＋セリン／グリシン、セリン＋セリン／アラニン
（４）の変異導入から
１３３位＋挿入アミノ酸残基／１３４位／１３５位；セリン＋セリン／セリン／アラニン、セリン＋セリン／セリン／アルギニン、セリン＋セリン／セリン／メチオニン
（５）の変異導入から
１３２位／１３３位と１３４位の間の挿入アミノ酸残基；セリン／アラニン、セリン／グリシン、メチオニン／アラニン、スレオニン／アラニン
（６）の変異導入から
１３２位／１３３位＋挿入アミノ酸残基；セリン／セリン＋セリン、グルタミン／セリン＋セリン、メチオニン／セリン＋セリン、セリン／イソロイシン＋アラニン、セリン／リジン＋アラニン、セリン／リジン＋セリン、アスパラギン／プロリン＋アラニン、アスパラギン酸／リジン＋セリン、イソロイシン／リジン＋セリン
【００５７】
上述の方法にて比活性を求めた結果、これらの変異体において野生型の１．２倍〜４．８倍の比活性向上を確認した（表３）。
【００５８】
【表３】
2006129865.tif 000004
【００５９】
１３３位と１３４位との間の挿入アミノ酸を＋で示した。例えばＡ１３３Ｐ＋Ｉの場合、１３３位をプロリンに置換し、更にイソロイシンを挿入した変異体を表し、＋Ｋの場合、１３３位と１３４位との間にリジンの挿入がある変異体を表している。図２−１〜２−６においても同様に表現した。
【００６０】
変異体の洗浄力を評価した結果、例えば以下の変異体において野生型を上回る洗浄性能が認められた（図２−１〜２−６）。
（１）１３３位；イソロイシン、バリン
（２）１３３位と１３４位の間の挿入アミノ酸残基；リジン、ロイシン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン、チロシン、アルギニン
（３）１３３位＋挿入アミノ酸残基；セリン＋セリン、セリン＋アラニン、セリン＋アスパラギン、セリン＋グルタミン、セリン＋トリプトファン、セリン＋ヒスチジン、セリン＋グリシン、ロイシン＋セリン、リジン＋セリン、スレオニン＋セリン、イソロイシン＋セリン、メチオニン＋セリン、グリシン＋セリン、アルギニン＋セリン、グルタミン酸＋セリン、アスパラギン＋セリン、フェニルアラニン＋セリン、トリプトファン＋セリン、リジン＋アラニン、アルギニン＋アラニン、リジン＋グリシン
（４）１３３位＋挿入アミノ酸残基／１３４位；セリン＋セリン／セリン、セリン＋セリン／スレオニン
（５）１３３位＋挿入アミノ酸残基／１３４位／１３５位；セリン＋セリン／セリン／メチオニン
（６）１３２位／１３３位と１３４位の間の挿入アミノ酸残基；セリン／アラニン、セリン／アルギニン、セリン／グリシン、セリン／ロイシン、スレオニン／アラニン
（７）１３２位／１３３位＋挿入アミノ酸残基；セリン／ヒスチジン＋アラニン、セリン／セリン＋アラニン、セリン／ロイシン＋アラニン、セリン／アルギニン＋アラニン、セリン／リジン＋アラニン、セリン／リジン＋セリン、アスパラギン／イソロイシン＋アラニン、アスパラギン／プロリン＋アラニン、アスパラギン酸／リジン＋セリン
【００６１】
また、２ｍＭ塩化カルシウム水溶液中で７５℃、１０分間熱処理した後のＡＡＰＦ分解活性を測定し、未処理の酵素サンプルを１００％とした場合の残存活性を算出し、耐熱性を検討した。その結果、野生型の残存活性が５０％であるのに対し、１３３位＋挿入アミノ酸残基の組み合わせがセリン＋セリンの変異体では７６％と、約１.５倍の残存活性の向上が認められた。
【００６２】
上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体はＡＡＰＦに対する分解活性を向上させる、洗浄力を向上させる、（１３３位＋挿入アミノ酸残基の組み合わせがセリン＋セリンの変異体については、さらに耐熱性を向上させる）こと以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００６３】
試験例１  プロテアーゼ活性測定法（合成基質法）
１００ｍＭ  ＡＡＰＦ（ＤＭＳＯに溶解；終濃度３ｍＭ）、０.２Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０.５；終濃度５０ｍＭ）及び適宜希釈した培養上清５０μＬを加え、１００μＬに調製後、マイクロプレートリーダー（ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ；Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて３０℃、１５分間振盪しながら４１４ｎｍの吸光度を経時的に測定し、単位時間当たりの吸光度の変化（ＯＤ４１４／ｍｉｎ）を求めた。得られた傾きに酵素の希釈率を乗じた値をプロテアーゼの力価とし、変異体の相対評価を行なった。
【００６４】
試験例２  プロテアーゼ活性測定法（カゼイン法）
カゼイン（ハンマーステイン氏法：メルク）１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）１ｍＬを３０℃、５分間恒温した後、０．１ｍＬの酵素液を添加し反応を開始した。１５分間反応させた後、２ｍＬの反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸／０．２２Ｍ酢酸ナトリウム／０．３３Ｍ酢酸）を加えた。室温で３０分間放置し、沈殿物をワットマンＮｏ１濾紙を用いて濾過した。分解産物はＬｏｗｒｙらの方法により定量した。即ち、０．５ｍＬの濾液に２．５ｍＬのアルカリ性銅溶液（１％ロッシェル塩：１％硫酸銅・５水和物：２％炭酸ナトリウム／０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液＝１：１：１００）を加え、３０℃で１０分間恒温した後、０．２５ｍＬのフェノール試薬［市販のフェノール試薬（関東化学）を脱イオン水にて２倍に希釈した溶液］を添加、よく攪拌し、３０℃で３０分間放置した。その後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。プロテアーゼ１単位（１ＰＵ）は、上記反応条件下において１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質を生成するのに必要な酵素量とした。
【００６５】
試験例３  相対洗浄率
変異酵素の洗浄力評価は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行った。市販の衣料用洗剤（アタック；花王、２００２年１０月製造）から配合されている酵素造粒物を除いたものを所定の使用濃度になるように調製した溶液に、酵素を最終濃度で４０ｍＰＵ／Ｌになるように添加した。次いで、汚染布ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血液／ミルク／カーボン）を６×６ｃｍ画に裁断したものを添加し、特に断りのない限り２０℃で洗浄（８０ｒｐｍ）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算出した（下式）。
【００６６】
洗浄率（％）＝（Ｌ２−Ｌ１）／（Ｌ０−Ｌ１）×１００
Ｌ０：汚染布の原布の明度
Ｌ１：洗浄前の汚染布の明度
Ｌ２：洗浄後の汚染布の明度
相対洗浄率は野生型酵素の洗浄率を１００とした場合の変異体の洗浄率とした。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性の高いプロテアーゼのアミノ酸    配列を整列させた図である。
【図２−１】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図２−２】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図２−３】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図２−４】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図２−５】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図２−６】本発明アルカリプロテアーゼの洗浄力を示した図である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【配列表】
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