(57)【要約】【課題】ウイルス性肝疾患を適切に診断ないし検出する。【解決手段】哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とするウイルス性肝疾患の診断方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とするウイルス性肝疾患の診断方法。
【請求項２】
前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なく
とも１種である請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求
項２に記載の診断方法。
【請求項４】
前記7-FCOH類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の診断方法。
【請求項５】
ウイルス性肝疾患が慢性肝炎及び肝硬変からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類を測定し、ウイルス性の慢性肝炎及び肝硬変を区別して診断することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の診断方法。
【請求項７】
ウイルス性肝疾患がC型肝炎ウイルスに起因する慢性肝炎及び肝硬変である請求項１〜６
のいずれかに記載の診断方法。
【請求項８】
哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とする。請求項１〜７のいずれかに記載の診断方法。
【請求項９】
還元剤がNaBH4である請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う請求項８に記載の診断方法。
【請求項１１】
還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類及び７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定してウイルス性肝疾患を診断するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性肝疾患の検出、評価ないし診断方法及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス（HCV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、Ａ型肝炎ウイルス（HＡV）などのウイルス感染症は、慢性肝炎、肝硬変などの肝疾患の主要な原因である。
【０００３】
これらの疾患は、放置すると肝線維化により慢性肝炎から肝硬変に徐々に移行する。進行したウイルス性肝疾患は、腹水、黄疸、静脈瘤、脳症、肝不全などの合併症を発症するリスクが高まると同時に、肝細胞癌のリスクも著しく増加する。
【０００４】
ウイルス性肝疾患は、早期に発見して治療すれば、治癒するかその進行を遅らせることが可能であるが、疾患が進行した後に発見されても有効な治療を行うのが困難であるため早期発見が重要である。一方、ウイルス性肝疾患は発見及び診断が難しいため、簡単な検査で診断する方法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ウイルス性肝疾患、特に、慢性肝炎と肝硬変を適切に診断ないし検出、評価するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑み検討を重ねた結果、HODE類及び7-FCOH類のサンプル中のレベルがウイルス性肝疾患の種類及び重症度と相関し、これらのサンプル中のレベルを調べることでウイルス性肝疾患の診断が可能になることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の診断方法及び診断キットを提供することを目的とする。
１．  哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とするウイルス性肝疾患の診断方法。
２．  前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる
少なくとも１種である項１に記載の診断方法。
３．  前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種であ
る項２に記載の診断方法。
４．  前記7-FCOH類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載の診断方法。
５．  ウイルス性肝疾患が慢性肝炎及び肝硬変からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
６．  哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類を測定し、ウイルス性の慢性肝炎及び肝硬変を区別して診断することを特徴とする、項１〜５のいずれかに記載の診断方法。
７．  ウイルス性肝疾患がC型肝炎ウイルスに起因する慢性肝炎及び肝硬変である項１〜
６のいずれかに記載の診断方法。
８．  哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とする。項１〜７のいずれかに記載の診断方法。
９．  還元剤がNaBH4である項８に記載の診断方法。
１０．  アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う項８に記載の診断方法。
１１．  還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類及び７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定してウイルス性肝疾患を診断するための診断キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ウイルス性肝疾患の診断方法及び診断キットを提供することができ、慢性肝炎、肝硬変の分別診断及び重症度に応じた診断が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、哺乳動物（特にヒト）のウイルス性肝疾患を検出もしくは診断するための方法として有用である。非ヒト哺乳動物のウイルス性肝疾患の診断ないし評価は、例えばウイルス性肝疾患の治療薬のスクリーニング系に応用することができる。
ウイルス性肝疾患の各疾患及びその重症度は、サンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類、７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類を測定ないし定量することにより評価、検出もしくは診断することができる。
本発明において、サンプルは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のものであり、好ましくはヒト由来である。
サンプルとしては、血液（血漿、血清、血球（赤血球、白血球）を含む）、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部（生検等により得られる）などが挙げられ、好ましくは血液（血漿、血清、血球を含む）、特に血漿または血清が例示される。
【００１０】
本発明で診断可能なウイルス性肝疾患は、慢性肝炎、肝硬変である。これらは、HODE類、7-FCOH類などのサンプル中のレベルを測定することにより診断可能である。ウイルス性肝疾患の原因となる肝炎ウイルスとしてはHCV，HBV，HAVなどが挙げられるが、好ましく
はHCVが例示される。
【００１１】
ＨＯＤＥ類としては、水酸基を有するオクタデカジエノイックアシッド（octadecadienoic acid）が挙げられ、該ＨＯＤＥの２つの二重結合は、(E, E)、(E, Z)もしくは(Z, E)のいずれか或いはこれらの混合物であってもよい。HODEとしては、具体的には9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。診断方法の測定対象として好ましいHODEは、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEである。HODE類としては、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEを含む総HODEを測定するのが好ましい。
【００１２】
リノール酸（２つの二重結合がZ, Z(シス型)）が酸化されると、ZEないしEZ、或いはEEのHODE類に異性化する。このときのHODE類において、(Z, E)体と(E, Z)体の合計量と、(E, E)体の比（R）は
R＝｛(Z, E)体と(E, Z)体の合計量｝／(E, E)体の量
により計算できる。HODE類の上記比（R）が低い方がウイルス性肝疾患に罹患している可
能性が高く、該比(R)が高いほどウイルス性肝疾患が重篤である可能性が高い。
【００１３】
７−ヒドロキシコレステロール（7-FCOH）類としては、７α−ヒドロキシコレステロール（７α−ＦＣＯＨ）、７β−ヒドロキシコレステロール（７β−ＦＣＯＨ）が挙げられる。好ましい7-FCOH類は、7β-FCOHである。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいHODE類の構造式を以下に示す。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
HODE類、7-FCOH類は、例えば以下のようにして定量することができる。
【００１７】
サンプルは、まず還元剤で処理されて、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド等の活性酸素との反応生成物をその還元体に導き、それ以上の分解を抑制するのが好ましい。例えば、HODEの原料であるリノール酸などは、活性酸素と反応してヒドロペルオキシドになる。
【００１８】
これを還元体に導くと、9-HODEまたは13-HODEなどに変換される。なお、HODEは、哺乳
動物生体内の活性酸素と反応し、さらに還元されて9-HODE、13-HODEなどに導かれるが、
一重項酸素と反応すると10-HODEまたは12-HODEに変換され得る。
【００１９】
生体サンプルを還元して過酸化物を安定なＨＯＤＥ類、7-FCOH類に導くための還元剤としては、ヒドロペルオキシドを還元できるが、炭素−炭素二重結合、カルボキシル（ＣＯＯＨ）基、エステル基などは還元しない還元剤が使用され、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ソディウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3）などが挙げられる。
【００２０】
還元反応は、還元剤を１当量から過剰量用い、メタノール、エタノールなどのアルコール又は含水アルコール中で、０℃〜５０℃程度の温度下に１分から５時間程度反応させる
ことにより有利に進行する。
【００２１】
7-FCOH類についてもHODE類と同様にヒドロペルオキシド（OOH）或いはペルオキシド（OO）を経由しているので、還元処理により、さらなる分解が抑制されて、これらをより正
確に測定することができる。
【００２２】
上記の還元処理により生成する9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODE、7α-FCOH、7β-FCOHなどのHODE類、7-FCOH類は比較的安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される
。
【００２３】
上記で得られた還元体は、HODE類の脂肪酸型のものも存在するが、多くはホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールエステル、トリグリセライド、ジグリセライドなどのグリセリンエステルとして存在する。従って、このエステルを加水分解して高級脂肪酸に導くために、アルカリ処理剤、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物と反応させてHODEを脂肪酸に導く。
【００２４】
アルカリ処理により３位の水酸基がエステル化されていた７−ヒドロキシコレステロールエステルが対応する７−ヒドロキシコレステロールに変換される。
【００２５】
アルカリ加水分解は塩基の存在下に、室温から溶媒の沸騰する程度の温度下に１０分間から２４時間程度行うことにより有利に進行する。塩基としては、溶液をアルカリ性にしてエステルを加水分解できるものであれば特に限定されないが、例えばアルカリ金属水酸化物（NaOH, KOH, LiOHなど）、アルカリ土類金属水酸化物（Ca(OH)2, Mg(OH)2, Ba(OH)2）など）、アルカリ金属炭酸水素塩（NaHCO3, KHCO3, LiHCO3）, アルカリ金属炭酸塩（Na2CO3, K2CO3, Li2CO3）などが挙げられる。好ましい塩基はNaOH, KOH, LiOHなどのアル
カリ金属水酸化物である。
【００２６】
加水分解は、水中で行ってもよく、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，Ｎ−メチルピロリドン、などの溶媒を水と混合して行うこともできる。
【００２７】
このような加水分解によって、遊離形態と共にエステル形態の酸化物（HODE類、7-FCOH類）を測定することができる。
【００２８】
ＨＯＤＥが生体内で生成するメカニズムを以下に示す。
【００２９】
【化２】
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【００３０】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、一方が(ＣＨ２)４ＣＨ３を示し、他方が(ＣＨ２)７ＣＯＯＨを示す。ｈｐｏはヒドロペルオキシドを示す。）
還元剤処理によりコレステロールおよびコレステロールエステルの過酸化物ないしカルボニル化合物は、下式のように７α−ヒドロキシコレステロール又は７β−ヒドロキシコレステロールに導かれる。
7-FCOH類の生成メカニズム
【００３１】
【化３】
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【００３２】
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような
通常の分析手段を用いて、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類などの物質を定量し、ウイルス性肝疾患の診断及び重症度を評価することができる。
【００３３】
本発明は、さらに、HODE類及び７−ヒドロキシコレステロール類を測定し、ウイルス性肝疾患を検出、診断ないし評価するためのキットに関する。
【００３４】
該キットは、哺乳動物（特に好ましくはヒト）由来のサンプルを還元し、ヒドロペルオキシド等の過酸化物をアルコールに導くための還元剤、および、エステル型のヒドロペルオキシドを遊離のカルボン酸に鹸化するためのアルカリ処理剤を含む。
【００３５】
キットに含まれる還元剤は、サンプルの過酸化物を還元するための過剰量含まれるのが好ましく、例えば１サンプルあたり０．１〜１００mg程度（或いは3マイクロモル〜3ミリモル）使用される。好ましい還元剤は、NaBH4である。
【００３６】
また、アルカリ処理剤はエステルを加水分解できる量であれば特に限定されないが、例えば１〜１０００mg程度（或いは0.2〜20ミリモル）使用される。
【００３７】
本発明のキットは、さらに還元剤をサンプルに加えた還元反応に使用される溶剤を含むことができる。好ましい溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコール系溶剤が例示される。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例1
C型肝炎患者の内で慢性肝炎患者55名（平均年齢58.9歳SD12.7歳）さらにC型肝炎患者の内で肝硬変患者27名（平均年齢65.0歳SD14.6歳）から採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿2ｍｌを正確に測りとり、内部標準物質として8-アイ
ソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4および9-ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド-ｄ4をそれぞれ50ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボ
ロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した
後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル
／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ  ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社
製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／
８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド
（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌを質量分析装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、血漿中の濃度として、トータルヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを得た。一方、疾病歴がない健常者50名（平均年齢55.1歳SD14.9歳）の血漿をまったく同様に測定した。図1に示すように、ANOVA-Duncanによる統計解析
の結果、トータルヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドは健常者に比べて慢性肝炎患者、肝硬変患者の値は有意に高いことがわかった。また、慢性肝炎患者および肝硬変患者のトータルヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを2群間ｔ検定によって統計解
析を行ったところ、肝硬変患者の方が慢性肝炎患者に比べて有意に高いことがわかった。このように、血漿のトータルヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを測定することによって、従来、生検を行わなければ確定診断が行えなかった肝硬変患者を容易に診断することが可能となった。
実施例2
C型肝炎患者の内で慢性肝炎患者13名（平均年齢65.5歳SD14.7歳）から採血し、即座に
遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿0.5 ｍｌを正確に測りとり、内部標準物質として、16ヒドロキシヘキサデカン酸50ngを添加した。メタノール1.0mlを添加
した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した
後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を2ｍｌおよびジエチルエーテルを2ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。20体積％酢酸水溶液2ｍｌを添加して、加水分解反応を停止した後、ヘキサン3ｍｌを添加した。1分間激しく攪拌した後、4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上層であるヘキサンおよびジエチルエーテル層から3.0 ml採取し、窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬
社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌを質量分析装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、トータル7-ヒドロキシコレステロール（M/Z=456でのイオン強
度）を定量した。図2に示すように、2群間統計解析ｔ検定を行ったところ、健常者に比べて慢性肝炎患者のトータル7-ヒドロキシコレステロール(T-FCOH)値は有意に高いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１の結果を示す。
【図２】実施例２の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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