(57)【要約】【課題】  本発明は、従来のＬＡＫ細胞の培養方法に比較して、ナチュラルキラー細胞の増殖が促進される培養方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明に係るナチュラルキラー細胞の増殖を促進する方法は、ナチュラルキラー細胞を含む細胞群を、ＣＤ５６分子のリガンドを含む培地中で培養する工程を特徴とするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞の増殖を促進させる方法であって、
ナチュラルキラー細胞を含む細胞群を、ＣＤ５６分子のリガンドを含む培地中で培養する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞群が、血液から得た単核球細胞またはリンパ球分画である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、さらにインターロイキン２を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ５６分子のリガンドが、グリコサミノグリカンである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ５６分子のリガンドが、グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカンである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ５６分子のリガンドが、グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカンを発現する細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカンを発現する細胞が、ヘパリチナーゼ処理またはコンドロイチナーゼ処理によって、そのナチュラルキラー細胞の増殖促進能が低下する細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸からなる群より選択される一以上の物質である、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを含むナチュラルキラー細胞の増殖を促進させる培養組成物：
（ａ）グリコサミノグリカン。
（ｂ）グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカン。
（ｃ）グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカンを発現する細胞。
【請求項１０】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸からなる群より選択される一以上の物質である、請求項９に記載の培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、ヒト白血球中に存在するナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と略す場合もある）を生体外で培養する際、その増殖を促進させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年になって、生体の細胞性免疫機能を応用した細胞免疫療法が癌をはじめとする様々な疾患の治療や予防に適用されるようになってきた。特に癌治療の分野では、ここ十数年にわたり世界中で多くの臨床試験が実施され、今日では外科的療法、化学療法、放射線療法に次ぐ第４の治療法として認知されるようになっている。【０００３】  癌を対象とした治療法を例にとると、細胞免疫療法は主に以下の３つの治療法に分類される。すなわちインターロイキン−２（以下ＩＬ−２と略す）などのサイトカインによって活性化されたリンパ球を治療に用いる「ＬＡＫ療法」（例えば、非特許文献１参照）、抗原特異的な細胞傷害性活性を有するキラーＴ細胞治療に用いる「活性化リンパ球移入療法」（例えば、非特許文献２参照）、そして癌抗原に特異的な免疫反応を誘導する能力を持つ樹状細胞を応用した「樹状細胞ワクチン療法」（例えば、非特許文献３参照）である。【０００４】  このうち「ＬＡＫ療法」は、体外に取り出したリンパ球分画をＩＬ−２存在下で培養することにより、ナチュラルキラー細胞をはじめとするリンパ球の癌細胞に対する殺傷能力が顕著に高まる現象を利用する療法である。すなわち、ＬＡＫ療法とは、末梢血から単核球分画（リンパ球＋単球）もしくは単核球分画より単球を取り除いたリンパ球分画を調製し、その分画をＩＬ−２を含有する培地で１〜２週間培養して抗腫瘍活性を強化させた後、この細胞を生体内に戻す療法であり、１９８０年代にＲｏｓｅｎｂｅｒｇらにより担癌患者を対象とした臨床研究が開始されたのを端緒とし、現在でも世界中で広く実施されている（例えば、非特許文献４参照）。このように、ＩＬ−２存在下で培養され、癌細胞に対する殺傷能力が高まるように誘導された細胞をＬＡＫ細胞と呼ぶ。
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ，Ｍｕｕｌ  ＬＭ，Ｌｅｉｔｍａｎ  Ｓ，Ｃｈａｎｇ  ＡＥ，Ｅｔｔｉｎｇｈａｕｓｅｎ  ＳＥ，Ｍａｔｏｒｙ  ＹＬ，Ｓｋｉｂｂｅｒ  ＪＭ，Ｓｈｉｌｏｎｉ  Ｅ，Ｖｅｔｔｏ  ＪＴ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８５  Ｄｅｃ  ５；３１３（２３）：１４８５−９２．
【非特許文献２】Ｔａｋａｙａｍａ  Ｔ，Ｓｅｋｉｎｅ  Ｔ，Ｍａｋｕｕｃｈｉ  Ｍ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｓ，Ｋｏｓｕｇｅ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｊ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｋａｋｉｚｏｅ  Ｔ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０００  Ｓｅｐ  ２；３５６（９２３２）：８０２−７．
【非特許文献３】Ｎｅｓｔｌｅ  ＦＯ，Ａｌｉｊａｇｉｃ  Ｓ，Ｇｉｌｌｉｅｔ  Ｍ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｇｒａｂｂｅ  Ｓ，Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ，Ｂｕｒｇ  Ｇ，Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ  Ｄ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８  Ｍａｒ；４（３）：３２８−３２．
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９８６  Ｊｕｎ；１３（２）：２００−６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかしながら、上述した培養方法では、ＬＡＫ細胞の効果の主体となるナチュラルキラー細胞が常に効率よく増殖するとは限らないことが知られている。【０００６】  特に担癌患者ではナチュラルキラー細胞の培養が困難な症例がしばしば認められる。すなわち上記の一般的な培養方法で培養しても、ナチュラルキラー細胞の増殖がほとんど認められず、他の細胞、例えばＣＤ５６陽性、ＣＤ３陽性のＴ細胞の増殖が優勢となり、結果的にナチュラルキラー細胞をほとんど含まないＬＡＫ細胞が誘導されることになる。【０００７】  我々が、主に消化器癌の患者を対象として、常法にしたがってこれらの患者の末梢血リンパ球分画よりＬＡＫ細胞を誘導した結果、２０例中１１例では、健常人同様にナチュラルキラー細胞の増殖が旺盛なＬＡＫ細胞（ナチュラルキラー細胞の比率：平均２０．４％）を誘導することができたが、２０例中９例では、ＣＤ５６陽性、ＣＤ３陽性のＴ細胞が優位となり、ナチュラルキラー細胞の増殖はほとんど認められなかった（ナチュラルキラー細胞の比率：平均２．２％）。このようなＣＤ５６陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞優位なＬＡＫ細胞は、ナチュラルキラー細胞優位なＬＡＫ細胞と比べて、癌細胞に対する傷害活性およびインターフェロンγやＴＮＦαなどのサイトカイン産生能が著しく低い。したがってこのようなナチュラルキラー細胞の増殖がほとんど認められなかったＬＡＫ細胞を用いてもほとんど治療の効果が期待できない。【０００８】  そこで、上述のようなナチュラルキラー細胞の増殖が困難な患者、つまり例えば常法通り培養しても抗腫瘍活性の低いＣＤ５６陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞が優位となるような患者においてもＬＡＫ療法の恩恵を享受することが可能となるような新たな細胞培養法、すなわち抗腫瘍活性の強いナチュラルキラー細胞を良好に増殖させることを可能とする新たなＬＡＫ細胞の培養方法の開発が待ち望まれている。さらに従来までの方法でナチュラルキラー細胞の増殖が良好な患者の場合でも、その増殖をさらに促進することで、ＬＡＫ療法の効果もさらに高まることが期待される。【０００９】  一方、近年、リツキサンやハーセプチン等の腫瘍抗原特異的なモノクローナル抗体を主成分とする抗体医薬品が開発され治療に用いられているが、これらの医薬品の抗腫瘍作用の機序の一つがナチュラルキラー細胞による抗体依存性細胞傷害活性である事も明らかとなっている（Ｃａｒｓｏｎ  ＷＥ  他，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｏｃｔ；３１（１０）：３０１６−２５．およびＭａｌｏｎｅｙ  ＤＧ  他，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  Ｆｅｂ；２９（１  Ｓｕｐｐｌ  ２）：２−９．）。したがって、より多くのナチュラルキラー細胞の増殖が可能となれば、ＬＡＫ療法の有効性が高まることが期待されるのみでなく、上記のような抗体医薬品とＬＡＫ療法を併用することによって、その効果が相乗的に高まることが期待され、結果的に、さまざまな様相を呈する癌に対して、より有用な治療法を提供することが可能となると考えられる。【００１０】  そこで、本発明は、従来のＬＡＫ細胞の培養方法に比較して、ナチュラルキラー細胞の増殖が促進される培養方法、およびその培養方法に適する培養組成物を提供することを目���とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  かかる問題を解決するために鋭意検討した結果、発明者らは、ナチュラルキラー細胞を含む細胞群を、ナチュラルキラー細胞が発現するＣＤ５６分子のリガンドを含む培地中で培養することによって、ナチュラルキラー細胞の増殖を選択的に促進させる事が可能であることを見出した。【００１２】  ＣＤ５６分子は接着分子の一つである神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のアイソフォームの一つであり、末梢血中では、ナチュラルキラー細胞や一部のＴ細胞のサブセットに発現することが知られていたが、これまでに、そのリガンドを加えることで、これらの細胞の増殖が促進されることはまったく知られていなかった。本発明に係る方法によれば、ＩＬ−２のみによる誘導ではナチュラルキラー細胞の増殖がほとんど認められず、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞等が優位となるような細胞群においても、ナチュラルキラー細胞の増殖が十分に促進される。また、もともとナチュラルキラー細胞の増殖が良好な細胞群の場合も、より多くのナチュラルキラー細胞を含有する細胞群を誘導することができる。【００１３】  ナチュラルキラー細胞を含む細胞群としては、例えば血液から得た単核球細胞やリンパ球分画が挙げられ、これらの細胞群は当業者であれば公知の方法に従って容易に調製することが可能である。
発明の一態様として、本発明は、ナチュラルキラー細胞を含む細胞群を培養する際に、ＣＤ５６分子のリガンドの一つであるグリコサミノグリカン類を培地に添加することでナチュラルキラー細胞の増殖を顕著に促進する培養方法を提供するものである。【００１４】  発明に用いるグリコサミノグリカンとしては、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などを用いることができる。これらは、いずれも硫酸基を持つ糖が規則正しく配列した多糖類であり、また、いずれもＣＤ５６分子に結合するリガンドとしての機能を有している。【００１４】  これらのグリコサミノグリカンは、一部の医薬品グレードのものを含め、試薬として容易に入手することが可能である。これらは主に動物の皮膚や軟骨などから精製されたものであるが、その由来は特定されるものではない。また上記のような天然由来のもののみならず、各々のグリコサミノグリカンの構成糖を用いて化学的に合成された人工的なグリコサミノグリカンを用いることも可能である。【００１５】  培養時に添加するグリコサミノグリカンの濃度は、特に限定されるものではないが、低濃度であれば十分な効果が期待できず、また濃度が高すぎても逆に細胞の生育に好ましくない作用を及ぼす可能性もあるため、例えばヘパリンの場合には最終濃度で０．１ユニット／ｍＬ〜１０００ユニット／ｍＬの範囲で、好ましくは０．５ユニット／ｍＬ〜５００ユニット／ｍＬ、最も好ましくは１ユニット／ｍＬ〜１００ユニット／ｍＬとする。またコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸の場合は、最終濃度で０．１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲で、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲とする。【００１６】  またこれらのグリコサミノグリカンは一種類のみ用いても、また二種以上の混合物として用いてもかまわない。【００１７】  さらにＣＤ５６分子のリガンドとしては、多糖体であるグリコサミノグリカンそのもののみならず、グリコサミノグリカンがコア蛋白質に結合した形態、すなわちグリコサミノグリカンを糖鎖の構成成分とするプロテオグリカンを用いることも可能である。【００１８】  発明の別の態様として、本発明は、細胞群を培養する際に、白血球単核球分画もしくはリンパ球分画を、細胞表面にヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸などを構成成分とするプロテオグリカンを発現する別の細胞と共培養することで、ナチュラルキラー細胞の増殖を顕著に促進する培養方法を提供するものである。【００１９】  共培養に用いることができる細胞は、各グリコサミノグリカン類に対する抗体を用いて常法によりフローサイトメーターや免疫染色により検索することが可能である。また、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ等の酵素で細胞表面グリコサミノグリカンを分解処理することでナチュラルキラー細胞の増殖促進作用が消失または減弱するような細胞も共培養に用いることができる。このような条件を満たす細胞としては、肝臓癌細胞株のＨｕＨ２（下記に具体例を示す）、骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２、乳癌細胞株のＭＣＦ７、また胆嚢癌細胞株であるＡＧなどが挙げられるが、本発明に用いることのできる細胞はこれらの細胞株に限定されるものではない。【００２０】  共培養に用いる細胞株とリンパ球との混合の比率は特定されないが、好ましくは１：１から１：１００の範囲で、さらに好ましくは１：５から１：２０の範囲で混合して培養することができる。【００２１】  また共培養に用いる細胞株自体が培養時に増殖するような好ましくない事態を防ぐために、事前にその分裂増殖能を抑制する処置を施すことが好ましい。この処置は、細胞株を共培養に用いる前に、マイトマイシンＣとともに培養したり、あるいは放射線を照射する等、当業者が一般的に用いる手法によって行う事ができる。【００２２】  さらに、本発明は、本発明を実施するための培養組成物をも提供する。【００２３】  この培養組成物は、リンパ球を培養するのに一般に用いられる培地を基本組成とし、そこにナチュラルキラー細胞の増殖を促す添加物としてグリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカン、および／またはグリコサミノグリカンを構成成分とするプロテオグリカンを発現する細胞を添加したものとして提供される。【００２４】リンパ球を培養するのに用いられる標準的な培地には、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＡＩＭ−Ｖ培地、Ｘ−ＶＩＶＯ培地などがある。よって基本組成となる基礎培地はこれらの標準的な培地をそのまま用いることもできるが、これらの培地に限定されるものでもなく、リンパ球培養が可能である培地であればどのような培地組成であってもかまわない。そして当該発明の培養組成物は、このような基本組成に、グリコサミノグリカンとして、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などを添加することで構成される。グリコサミノグリカンは、最終濃度でヘパリンでは０．１ユニット／ｍＬ〜１０００ユニット／ｍＬ、好ましくは０．５ユニット／ｍＬ〜５００ユニット／ｍＬ、最も好ましくは１ユニット／ｍＬ〜１００ユニット／ｍＬの濃度範囲で、またコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸では０．１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの濃度範囲で配合された形で提供される。
【発明の効果】
【００２５】  本発明に係る方法によれば、ナチュラルキラー細胞を含む細胞群を、ＣＤ５６分子のリガンドを含む培地で培養することにより、ナチュラルキラー細胞の増殖を選択的に促進することができる。本方法によれば、ＩＬ−２によってナチュラルキラー細胞の増殖が誘導されなかった細胞群においても、効率よくナチュラルキラー細胞を増殖させることが可能となると共に、もともとＩＬ−２によってナチュラルキラー細胞の増殖が誘導されやすい細胞群においても、より多くのナチュラルキラー細胞を含む培養物を得ることができる。このようにして得られたナチュラルキラー細胞を高い比率で含む細胞組成物を用いれば、ＬＡＫ療法の効果も高められ、また、リツキサンやハーセプチン等の抗体医薬品とＬＡＫ療法の併用により、有用な治療法を提供することも可能となると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】以下に具体的な例を記載して発明の効果を説明する。
【実施例１】  健常人由来サンプルにおける、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸によるナチュラルキラー細胞（＝ＮＫ細胞）の増殖の促進。【００２７】  健常人の末梢血３０ｍＬより、常法に従ってリンフォセパール（免疫生物研究所社製）を用いて６０，０００，０００個の末梢血単核球細胞を得た。その後この細胞をＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社製）に懸濁させて１５０ｃｍ２の培養用フラスコに播種した後に３７℃のＣＯ２インキュベーターで６０分間培養し、その後浮遊している細胞を回収し、３３，０００，０００個のリンパ球分画を得た。このリンパ球分画を、牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ〕を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２４ウェルの培養プレートに１，０００，０００個／１ｍＬ／ウェルとなるように播種した。またヘパラン硫酸（生化学工業（株）製）、コンドロイチン硫酸Ａ（生化学工業製）あるいはデルマタン硫酸を最終濃度で１００μｇ／ｍＬとなるように培地に加えた。その後３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養し、培養７日目に各ウェルに牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ加えて細胞を懸濁した後にその細胞懸濁液を２ウェルに播きかえ、また培養１１日目に同様の方法で２ウェルを４ウェルに播きかえて培養した。そして培養１４日目に、細胞を回収して血球計算盤を用いて細胞数を計測するとともに、フローサイトメーターを用いてＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性）の比率を計測し、ＮＫ細胞数を算出した。【００２８】  その結果を表１に示した。培養開始前の時点、すなわち末梢血リンパ球分画中に８．５％であったＮＫ細胞が、培地中に最終濃度で１００μｇ／ｍＬのヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａあるいはデルマタン硫酸を加えて２週間培養することで、各々４８．２％、２４．２％、４９．２％となり、またＮＫ細胞数も培養開始時の各々７２．５倍、２３．５倍、１１２．７倍となった。
一方、比較例として、グリコサミノグリカンを加えない条件で２週間培養した場合は、ＮＫ細胞の比率は１７・０％までしか増加せず、細胞数も１６．５倍に留まった。
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【実施例２】
【００２９】健常人由来サンプルにおけるヘパリンによるＮＫ細胞の増殖の促進。【００３０】  健常人の末梢血２０ｍＬより、常法に従ってリンフォセパールを用いて血単核球細胞を調製し、その後この細胞をＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して７５ｃｍ２の培養用フラスコに播種した後に３７℃のＣＯ２インキュベーターで６０分間培養し、その後浮遊している細胞を回収し、１３，０００，０００個のリンパ球分画を得た。このリンパ球分画を、牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２４ウェルの培養プレートに１，０００，０００個／１ｍＬ／ウェルとなるように播種した。またヘパリン（持田製薬製）を最終濃度で５ユニット／ｍＬとなるように加えた。その後３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養し、培養７日目に各ウェルに牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ加えて細胞を懸濁した後にその細胞懸濁液を２ウェルに播きかえ、また培養１１日目に同様の方法で２ウェルを４ウェルに播きかえて培養した。そして培養１４日目に、細胞を回収して血球計算盤を用いて細胞数を計測するとともに、フローサイトメーターを用いてＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性）の比率を計測し、ＮＫ細胞数を算出した。【００３１】  その結果を表２に示した。培養開始前の時点、すなわち末梢血リンパ球分画中に４．１％であったＮＫ細胞が、培地中に最終濃度で５ユニット／ｍＬのヘパリンを加えて２週間培養することで、１１．６％となり、ＮＫ細胞数も培養開始時の２１．６倍となった。
一方、比較例として、ヘパリンを加えない条件で２週間培養したところ、ＮＫ細胞の比率は５．５％までしか増加せず、細胞数も１０．２倍に留まった。
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【実施例３】
【００３２】担癌患者由来サンプルにおけるヘパリンによるＮＫ細胞の選択的な増殖の促進。【００３３】  肝臓癌の患者末梢血より調製したリンパ球分画を、２４ウェルの培養プレートに、牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、１，０００，０００個／１ｍＬ／ウェルとなるように播種した。またヘパリン（持田製薬（株）製）を最終濃度で５ユニットｍＬ（５単位／ｍＬ）となるように加えた。その後３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養し、培養７日目に各ウェルに牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ加えて細胞を懸濁した後にその細胞懸濁液を２ウェルに播きかえ、また培養１１日目に同様の方法で２ウェルを４ウェルに播きかえて培養した。そして培養１４日目に、細胞を回収して血球計算盤を用いて細胞数を計測するとともに、フローサイトメーターを用いてＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性）ならびにＣＤ５６陽性Ｔ細胞（ＣＤ３陽性、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陰性）の比率を計測し、各々の細胞数を算出した。【００３４】  その結果を表３に示した。培養開始前の時点、すなわち末梢血リンパ球分画中に５．０％であったＮＫ細胞が、培地中に最終濃度で５ユニット／ｍＬのヘパリンを加えて２週間培養することで、２７．９％となり、またＮＫ細胞数も培養開始時の３０．０倍となった。
比較例として、ヘパリンを加えない条件で２週間培養したところ、ＮＫ細胞の比率は１６．５％までしか増加せず、細胞数も１６．６倍に留まった。
一方、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞は、末梢血リンパ球分画中に１１．０％であり、ヘパリンを加えて培養した場合は３２．５％（細胞数１５．７倍）となり、ヘパリンを加えずに培養した場合は約４４．７％（細胞数２０．５倍）であった。
以上の結果から、ヘパリンはＮＫ細胞の増殖を促進する作用を有するが、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞の増殖には逆に抑制的に機能する作用を有することが明らかとなった。
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【実施例４】
【００３５】ＩＬ−２によりＣＤ５６陽性Ｔ細胞が優位となる担癌患者由来サンプルにおける、コンドロイチン硫酸Ａおよびデルマタン硫酸によるＮＫ細胞の選択的な増殖の促進。【００３６】  胃癌患者の末梢血より調製したリンパ球分画を、２４ウェルの培養プレートに、牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、１，０００，０００個／１ｍＬ／ウェルとなるように播種した。またコンドロイチン硫酸Ａあるいはデルマタン硫酸を最終濃度で１００μｇ／ｍＬとなるように培地に加えた。その後３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養し、培養７日目に各ウェルに牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ加えて細胞を懸濁した後にその細胞懸濁液を２ウェルに播きかえ、また培養１１日目に同様の方法で２ウェルを４ウェルに播きかえて培養した。そして培養１４日目に、細胞を回収して血球計算盤を用いて細胞数を計測するとともに、フローサイトメーターを用いてＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６陽性）の比率ならびにＣＤ３陽性、ＣＤ５６陽性細胞の比率を計測し、ＮＫ細胞数およびＣＤ５６陽性Ｔ細胞数を算出した。【００３７】  その結果を表４に示した。培養開始前の時点、すなわち末梢血リンパ球分画中に１．３％であったＮＫ細胞は、グリコサミノグリカンを加えない条件で２週間培養したところ、細胞数は４．５倍に増加したものの、その比率は０．５％に低下した。しかしながら培地中に最終濃度で１００μｇ／ｍＬのコンドロイチン硫酸Ａもしくはデルマタン硫酸を加えて２週間培養すると、ＮＫ細胞の比率は各々２．４％、２．３％となり、またＮＫ細胞数も各々培養開始時の２６．１倍および２６．３倍となり、ＮＫ細胞の増殖が顕著に促進されることが明らかとなった。
一方、末梢血リンパ球分画中に１．２％であったＣＤ５６陽性Ｔ細胞数は、グリコサミノグリカンを加えない条件で２週間培養することで、細胞数は４２０．８倍に増加し、その比率は約４２．２％となった。一方、１００μｇ／ｍＬのコンドロイチン硫酸Ａもしくはデルマタン硫酸存在下で２週間培養した場合も、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞の比率は各々３６．９％および３９．８％となり、また細胞数も各々培養開始時の４５８．３倍および５２１．８倍であり、ＣＤ５６陽性Ｔ細胞数の増殖はグリコサミノグリカンを加えない場合とほぼ同程度であった。
以上の結果から、コンドロイチン硫酸Ａもしくはデルマタン硫酸の添加によってＮＫ細胞の増殖が選択的に促進されることが確認された。
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【実施例５】
【００３８】健常人由来サンプルにおけるグリコサミノグリカン発現細胞との共培養によるＮＫ細胞の選択的な増殖の促進。【００３９】健常人の末梢血より調製したリンパ球分画を、２４ウェルの培養プレートに、牛胎児血清１０％、ＩＬ−２（１，０００国際単位／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２，０００，０００個／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。また、予め最終濃度で５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ存在下で３０分培養してその分裂増殖能を停止させたＨｕＨ２細胞株（肝臓癌細胞株）を、２００，０００個／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した（リンパ球分画細胞数：ＨｕＨ２細胞数＝１０：１）。また一部のＨｕＨ２細胞は、事前にリン酸緩衝生理食塩水中にて最終濃度で１０ｍＵ／ｍＬのヘパリチナーゼＩ（生化学工業製）、で３７℃、４時間酵素処理を行うことで細胞表面のグリコサミノグリカンを消化し、酵素処理を行わなかった細胞を用いた場合と比較した。【００４０】  その結果を表５に示した。培養開始前の時点、すなわち末梢血リンパ球分画中に６．８％であったＮＫ細胞は、ＩＬ−２存在下で７日間培養したところ、ＮＫ細胞の比率は１０．４％、細胞数は１．９倍に増加したが、ＨｕＨ２細胞と共培養することでＮＫ細胞の比率は１４．５％、細胞数は培養開始時の３．７倍となり、ＮＫ細胞の増殖が顕著に促進されることが明らかとなった。一方、事前にヘパリチナーゼＩで前処理を行なったＨｕＨ２細胞と共培養すると、ＮＫ細胞の比率は１１．９％となり、またＮＫ細胞数も培養開始時の２．５倍となり、ヘパリチナーゼＩで細胞表面のグリコサミノグリカンを消化したＨｕＨ２細胞では、無処置のＨｕＨ２細胞と比較してＮＫ細胞の増殖を促進する作用の顕著な低下が認められた。
以上の結果から、ＨｕＨ２細胞との共培養によりＮＫ細胞の増殖が選択的に促進されること、そしてそのＮＫ細胞の増殖促進作用がＨｕＨ２細胞の発現するグリコサミノグリカンを介した作用であることが確認された。
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【発明の産業上の利用分野】
【００４１】  本発明は、ヒト白血球中に存在するナチュラルキラー細胞を生体外で培養して増殖させる方法に関するものである。本発明に記載された方法で培養されたナチュラルキラー細胞は、癌やウイルス性疾患等の治療および／または予防のための細胞免疫療法に用いることができる。