(57)【要約】【課題】  未確定因子の影響が排除された、精原幹細胞の増殖方法を提供すること【解決手段】  本発明は、精原幹細胞を無フィーダー又は無血清条件で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法を提供する。本発明の増殖方法を用いれば、フィーダー細胞や血清の不在下においても精原幹細胞を効率よく増殖させることが出来、未確定因子の影響を排除することができるので、従来法と比較して、より安定且つ簡易に、精原幹細胞としての能力を維持した状態で、精原幹細胞を増殖させることが可能である。また、精原幹細胞の臨床応用において、異種動物由来感染症の危険を回避することが出来る。従って本発明の増殖方法は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療方法および雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
該精原幹細胞は細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該細胞外マトリクスはラミニンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該精原幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該培地はＬＩＦを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該培地はＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの少なくとも何れかを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該精原幹細胞を血清を含む培地中で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該精原幹細胞をフィーダー細胞の馴化培地を含まない培地中で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
増殖した精原幹細胞は胚性表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該胚性表現型はＳＳＥＡ−１の陽性発現である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
精原幹細胞を無血清培地中で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法。
【請求項１２】
該培地はＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該培地はＬＩＦを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該培地はＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの少なくとも何れかを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該培地はＢ２７を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
精原幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
培養に供される精原幹細胞は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある、請求項１又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
培養に供される精原幹細胞は、精細管の基底膜に接触している分化段階にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培養に供される精原幹細胞は、インビトロ増殖のための増殖因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを要する分化段階にある精原幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを含む培地中で培養することにより得られたものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
精原幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該培地はＬＩＦを含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該培地は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む、請求項２０に記載の増殖方法。
【請求項２３】
請求項１又は１１に記載の方法を用いて、生体外で増殖された精原幹細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の精原幹細胞を含んでなる不妊治療剤。
【請求項２５】
以下の工程を含む、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
【請求項２７】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
【請求項２８】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２９】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項３０】
以下の工程を含む、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
【請求項３１】
以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
【請求項３２】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
【請求項３３】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項３４】
以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項３５】
精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養するための剤であって、細胞外マトリクス及び不溶性担体を含む剤。
【請求項３６】
該細胞外マトリクスはラミニンである、請求項３５に記載の剤。
【請求項３７】
該細胞外マトリクスは不溶性担体の表面に結合している、請求項３５に記載の剤。
【請求項３８】
精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することを含む、精原幹細胞の製造方法。
【請求項３９】
精原幹細胞を無血清培地中で培養することを含む、精原幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精原幹細胞を無フィーダー又は無血清条件で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法、該方法により生体外で増殖された精原幹細胞、該精原幹細胞に由来する精子、胚、非ヒト子孫の製造方法、精原幹細胞を無フィーダー条件で培養することにより増殖させるための剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
精原幹細胞は自己再生能力を有するユニークな集団である。分化することを運命付けられている他の精原細胞と異なり、精原幹細胞は継続的に自己再生し、分化した前駆細胞を産生することが出来る（de Rooij DG, Russell LD. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. J Androl 2000; 21: 776-798、Meistrich ML, van Beek MEAB. Spermatogonial stem cells. In: Desjardins, C, Ewing, L L (eds.), Cell and Molecular Biology of the Testis, New York: Oxford University Press; 1993: 266-295）。精原幹細胞はセルトリ細胞と密接に相互作用し、組織内に非ランダムに分布すると考えられている（Chiarini-Garcia H, Raymer AM, Russell LD. Non-random distribution of spermatogonia in rats: evidence of niches in the seminiferous tubules. Reproduction 2003; 126: 669-680）。一般的には、幹細胞は、幹細胞集団の増殖又は分化を制御する因子を提供する特殊な微小環境、即ちニッシェ（Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the heamopoietic stem cells. Blood Cells 1978; 4: 7-25）の内に存在する。このニッシェはもともとは仮想的な存在であったが、Drosophilaにおける近年の研究により、精巣内における幹細胞−ニッシェ相互作用の分子機構が解明された（Kiger AA, White-Cooper H, Fuller MT. Somatic support cells restrict germline stem cell self-renewal and promote differentiation. Nature 2000; 407: 750-754、Tran J, Brenner TJ, DiNardo S. Somatic control over the germline stem cell lineage during Drosophila spermatogenesis. Nature 2000; 407: 754-757）。例えば、幹細胞はＥ−カドヘリンを介してニッシェ内に接着し（Yamashita YM., Leanne Jones D., Fuller MT. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science 2003; 301: 1547-1550）、そして幹細胞の未分化状態はＪａｋ−Ｓｔａｔシグナリングにより維持されている（Kiger AA, Jones DL, Schulz C, Rogers MB, Fuller MT. Stem cell self-renewal specified by JAK-STAT activation in response to a support cell cue. Science 2001; 294: 2542-2545、Tulina N, Matunis E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science 2001; 294: 2546-2549）。他の自己再生組織における同様の研究が、幹細胞とニッシェを構成するストローマ細胞との密接な相互作用を明らかにした（Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature 2001; 414: 98-104）。これらの研究は幹細胞生物学における微小環境の重要な役割を立証したが、如何なる因子が哺乳類における精原幹細胞の自己再生に関与し、いかにしてそれが幹細胞のふるまいに影響を及ぼすかについてはほとんど知られていない。
【０００３】
この問題を研究するための価値のあるアプローチはインビトロにおいて幹細胞の自己再生分裂を再現することであろう。これは自己再生過程の最小限の外的要件を明らかにし、インビボにおける幹細胞‐ニッシェ相互作用についての重要な情報を提供するであろう。   近年、本願発明者らはマウス精原幹細胞を培養する方法を記載した（非特許文献１、ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６１２）。この方法においては、新生仔精巣からの精原幹細胞は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の存在下において、５ヶ月以上にわたり増殖することが可能であった。不妊レシピエント精巣内への移植後、培養細胞は幹細胞活性を保持し、精子形成を起こし、そして子孫を産生した。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）のための系（Evans MJ, Kaufmann MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292: 154-156、Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 7634-7638、Matsui Y, Zsebo K, Hogan BLM. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 1992; 70: 841-847、Resnick JL, Bixler LS, Cheng L, Donovan PJ. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature 1992; 359: 550-551）に加えて、当該方法は生殖系列細胞を増殖するための第３の方法である。これらの結果に基づき、本願発明者らはこの細胞を、他の２つの細胞型から区別するために、生殖系列幹細胞（ＧＳ細胞）と命名した。このＧＳ細胞培養系は精原幹細胞の自己再生を支持し、幹細胞−ニッシェ相互作用をインビトロで解析する見込みのある道筋を開拓する。
【０００４】
ここで、当該培養系において精原幹細胞の増殖をより促進させるためには、血清及びフィーダー細胞の存在下で精原幹細胞を培養することが好ましかった。しかしながら、培養における血清及びフィーダー細胞の使用は精原幹細胞を制御する因子についての我々の知識により制限されている。血清は複雑で、未確定な物質を含み、これは時折細胞の分化に影響を及ぼす（Barnes D, Sato G. Serum-free culture: a unifying approach. Cell; 1980: 22: 649-655）。例えば、神経幹細胞は血清を含む培養液中で培養された場合、前駆細胞へと分化し得る（Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 1992; 255: 1707-1710）。幹細胞付着のための物理的支持を提供することに加えて、フィーダー細胞は、幹細胞との相互作用を通して、多様な未確定の因子を産生することにより、幹細胞へも影響を及ぼす。従って、血清又はフィーダー細胞の存在は、培養条件を複雑にし、これをコントロール不能にする。
【０００５】
哺乳動物の幹細胞をフィーダー細胞を用いずに増殖させる方法としては、特許文献１にフィーダー細胞を含まない培養物中で霊長類由来始原幹細胞を増殖させる方法が開示されている。該方法は、霊長類由来始原幹細胞を、繊維芽細胞の細胞外マトリックス上で、繊維芽細胞の馴化培地等を用いて培養することを含むが、精原幹細胞に関しては開示されていない。
また、非特許文献２には、新鮮な調製された精原幹細胞が、ラミニンに優先的に付着し、幹細胞濃度は、ラミニンコートされたプレートでの選択後に、３乃至８倍程度に濃縮され、β１−及びα６−インテグリンがマウス精原幹細胞の表面マーカーであることが開示されているが、精原幹細胞の増殖に関しては記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ９９／２０７４１号パンフレット
【非特許文献１】カナツ−シノハラ，Ｍ（Kanatsu-Shinohara, M）ら著、バイオロジー  オブ  レプロダクション（Biology of Reproduction）、（米国）、第６９巻、第２号、ｐ．６１２-６１６、２００３年
【非特許文献２】シノハラ，Ｔ（Shinohara, T）ら著、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Proc Natl Acad Sci USA）、（米国）、第９６巻、ｐ．５５０４−５５０９、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、無血清又は無フィーダー細胞での精原幹細胞の効率的且つ安定な培養を樹立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＧＳ細胞等の精原幹細胞は血清及びフィーダー細胞の両者が不在である場合は効率的に増殖することが出来ないが、該細胞は血清又はフィーダー細胞の不在下においては効率的且つ安定に増殖し続けることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
（１）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法。
（２）該精原幹細胞は細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着する、上記（１）記載の方法。
（３）該細胞外マトリクスはラミニンである、上記（２）記載の方法。
（４）該精原幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する、上記（１）記載の方法。
（５）該培地はＬＩＦを更に含む、上記（４）記載の方法。
（６）該培地はＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの少なくとも何れかを更に含む、上記（４）記載の方法。
（７）該精原幹細胞を血清を含む培地中で培養する、上記（１）記載の方法。
（８）該精原幹細胞をフィーダー細胞の馴化培地を含まない培地中で培養する、上記（１）記載の方法。
（９）増殖した精原幹細胞は胚性表現型を有する、上記（１）記載の方法。
（１０）該胚性表現型はＳＳＥＡ−１の陽性発現である、上記（９）記載の方法。
（１１）精原幹細胞を無血清培地中で培養することを含む、精原幹細胞の増殖方法。
（１２）該培地はＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む、上記（１１）記載の方法。
（１３）該培地はＬＩＦを更に含む、上記（１２）記載の方法。
（１４）該培地はＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの少なくとも何れかを更に含む、上記（１２）記載の方法。
（１５）該培地はＢ２７を含む、上記（１１）記載の方法。
（１６）精原幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、上記（１１）記載の方法。
（１７）培養に供される精原幹細胞は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある、上記（１）又は（１１）記載の方法。
（１８）培養に供される精原幹細胞は、精細管の基底膜に接触している分化段階にある、上記（１７）記載の方法。
（１９）培養に供される精原幹細胞は、インビトロ増殖のための増殖因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを要する分化段階にある精原幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを含む培地中で培養することにより得られたものである、上記（１７）記載の方法。
（２０）精原幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する、上記（１７）記載の方法。
（２１）該培地はＬＩＦを含まない、上記（２０）記載の方法。
（２２）該培地は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む、上記（２０）記載の増殖方法。
（２３）上記（１）又は（１１）記載の方法を用いて、生体外で増殖された精原幹細胞。
（２４）上記（２３）記載の精原幹細胞を含んでなる不妊治療剤。
（２５）以下の工程を含む、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
（２６）以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
（２７）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
（２８）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
（２９）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
（３０）以下の工程を含む、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
（３１）以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
（３２）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
（３３）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
（３４）以下の工程を含む、精原幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）精原幹細胞を無血清培地中で培養することによって、精原幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた精原幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該精原幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
（３５）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養するための剤であって、細胞外マトリクス及び不溶性担体を含む剤。
（３６）該細胞外マトリクスはラミニンである、上記（３５）記載の剤。
（３７）該細胞外マトリクスは不溶性担体の表面に結合している、上記（３５）記載の剤。
（３８）精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することを含む、精原幹細胞の製造方法。
（３９）精原幹細胞を無血清培地中で培養することを含む、精原幹細胞の製造方法。
（４０）不妊治療剤を製造するための、上記（２３）に記載の精原幹細胞の使用。
（４１）上記（２３）に記載の精原幹細胞を用いる、不妊の治療方法。
【０００９】
本発明の増殖方法を用いれば、フィーダー細胞や血清の不在下においても精原幹細胞を効率よく増殖させることが出来、未確定因子の影響を排除することができるので、従来法と比較してより安定且つ簡易に、精原幹細胞としての能力を維持した状態で、精原幹細胞を増殖させることが可能である。また、精原幹細胞の臨床応用において、異種動物由来感染症の危険を回避することが出来る。従って本発明の増殖方法は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療方法および雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに有用である。
更に、本発明の増殖方法は、フィーダー細胞や血清由来の未確定因子の影響を含まないので、精原幹細胞の増殖及び分化を制御する因子を評価するためのより確定的な試験を可能にし、精原幹細胞を支配する制御機構を理解する新たな機会を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳述する。なお、初めに、本明細書中で用いられる用語の意味を説明し、次いで、本発明の各局面について述べる。
【００１１】
精巣細胞とは、精巣を構成する全ての細胞を含み、例えば、精原幹細胞、雄性生殖細胞(gonocyte)、精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞、精子、ライディヒ細胞、セルトリ細胞、間細胞、生殖細胞等が挙げられる。
【００１２】
精原幹細胞とは、自己再生し、精子又はその前駆細胞（例えば精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等）へ分化し得る能力（精原幹細胞としての能力）を有する生殖系列細胞をいう。
精原幹細胞としては、例えば、始原生殖細胞(primordial germ cell)、雄性生殖細胞(gonocyte)、幹細胞である精原細胞（精原細胞のうち精原幹細胞としての能力を有する細胞）、生殖系列幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。本発明において、精原幹細胞は、好ましくは、雄性生殖細胞(gonocyte)、幹細胞である精原細胞又は生殖系列幹細胞（ＧＳ細胞）である。本発明において用いられる精原幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。
【００１３】
ＧＳ細胞とは、インビトロでＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的に増殖された精原幹細胞、例えば、非特許文献１に記載された方法により増殖された精原幹細胞をいう。
【００１４】
細胞が精原幹細胞であるか否かは、例えば、（Proc Natl Acad Sci USA、第９１巻、ｐ．１１２９８−１１３０２、１９９４）等に記載された方法に従って、不妊の雄性動物の精細管内に対象の細胞を移入し、該細胞が精細管内で精子形成コロニーを形成する能力を有するか否かを試験することにより判別することができる。該試験の結果、精子形成コロニーを形成する能力を有する細胞は精原幹細胞であると判別される。
【００１５】
脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、特に限られないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。
本発明において、脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。
【００１６】
精原幹細胞の増殖補助因子とは、精原幹細胞としての能力を維持した状態での精原幹細胞の増殖を補助する物質（例えばサイトカイン）をいい、より具体的には、精原幹細胞としての能力を維持した状態での精原幹細胞の増殖を誘導する物質、精原幹細胞としての能力を維持した状態での精原幹細胞の増殖を増強する物質、精原幹細胞としての能力の維持に寄与する物質等が含まれる。
該増殖補助因子としては、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の増殖因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の分化抑制性サイトカイン等が挙げられる。
本発明の増殖方法において培地に含まれうる増殖補助因子は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。
【００１７】
ＧＤＮＦレセプター作動性化合物とは、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターに結合して、該レセプターを介して細胞や生体を活性化し得る化合物を意味する。例えば、本発明の増殖方法において用いられたときに、ＧＤＮＦレセプターを介して精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る物質をいう。
【００１８】
ＧＤＮＦレセプター作動性化合物としては、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルトリン（Neurturin）、ペルセフィン（Persephin）、アルテミン(Artemin)等が挙げられる。ＧＤＮＦレセプター作動性化合物は、好ましくはＧＤＮＦである。
【００１９】
ＧＤＮＦとしては、例えば、ヒト及びラット（ＷＯ９３／０６１１６号パンフレット）、マウス（例えばGene 203, 2, 149-157, 1997参照)等のＧＤＮＦが例示される。
【００２０】
ＧＤＮＦレセプターとは、ＧＤＮＦの結合物質であって、ＧＤＮＦのシグナルを細胞内や生体内へ伝達可能な化合物を意味する。該レセプターとしては、特に、ＧＤＮＦのシグナル媒介性レセプターであるｃＲｅｔレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。
【００２１】
ＧＤＮＦの補助レセプターとは、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のシグナルを直接は細胞内や生体内へ伝達しないが、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のシグナルを伝達するレセプターを活性化する化合物を意味する。このような化合物は、特に、そのメンバーがＧＤＮＦファミリーレセプターα：ｓ（ＧＦＲα）と称されるレセプターである。これらはまた、ＧＤＮＦ、ペルセフィン、アルテミンおよびノルトリンのシグナル伝達レセプター複合体 (signaling receptor complex)と関係する。該ファミリーのレセプターとしては４メンバー（ＧＦＲα１〜４）(Jing, S., et al., Cell, 85, 9-10 (1996); Jing, S. Q., et al., J. Biol. Chem., 272, 33111-33117 (1997); Trean or, J. J., et al., Nature, 382, 80-83 (1996); Subanto, P., et al., Human Molecular Genetics, 6, 1267-1273 (1997))が既知である。これらは独立してシグナルを伝達することができるが、すべてがリガンド結合およびｃＲｅｔ活性化に不可欠である。
【００２２】
また、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物としては、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターを特異的に認識する抗体やその結合性フラグメント等も含まれる。
【００２３】
ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特表平1-502985号公報）、マウス（特表平1-502985号公報）、ヒツジ（特表平4-502554号公報）、ブタ（特表平4-502554号公報）、ウシ（特表平8-154681号公報）等のＬＩＦが例示される。
【００２４】
ＥＧＦとしては、例えば、マウス（例えばNature, 257, 325-327, 1975参照）、ヒト（例えばProc Natl Acad Sci USA, 88, 415, 1991参照）等のＥＧＦが例示される。
【００２５】
ｂＦＧＦとしては、例えば、ヒトｂＦＧＦ（例えばEndocrine Rev., 8, 95, 1987参照)、ウシｂＦＧＦ（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984参照)、マウスｂＦＧＦ（例えばDev. Biol., 138, 454-463, 1990参照）、ラットｂＦＧＦ（例えばBiochem. Biophys. Res. Commun., 157, 256-263, 1988参照）等が例示される。
【００２６】
また、上述の精原幹細胞の増殖補助因子は、本発明の増殖方法において用いられた際に、精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る範囲において、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。また、同様の範囲内において、上述の各増殖補助因子の野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。
【００２７】
変異体タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸の数は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００２８】
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは、70％以上、より好ましくは 80％以上、さらに好ましくは 90％以上、最も好ましくは 95％以上であることを意味する。相同性の割合（％）は、（Atlas of Protein Sequence and Structure v.5，p.124，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.（1972））に記載されているとおり、配列の整列を助するために100アミノ酸長中に４個のギャップを導入しうる場合には、比較する配列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の割合（％）として算出される。また、野生型のアミノ酸配列を有する上記各サイトカインに対する抗体との交差反応性に基づいて単離しうる任意のタンパク質、あるいは上記各サイトカインの野生型のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は遺伝子セグメントとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより単離される遺伝子によりコードされるタンパク質が、実質的に相同なものとして含まれる。
上記ストリンジェントな条件としては、例えばサムブルックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Expression of cloned genes in E. coli）（Molecular Cloning：A laboratory manual（1989））Cold Spring harbor Laboratory Press,New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61」等に記載されたハイブリダイゼーション条件（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（６．０×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ）中６８℃にてハイブリダイゼーションの後、以下の条件にて洗浄：洗浄液（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中室温５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中室温１５分、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中３７℃１時間、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中６８℃１時間）が例示される。
【００２９】
血清とは、血液から凝固成分を除いた部分をいう。血清としては、脊椎動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは上述の哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ヒト血清等）である。血清は非動化等の処理が加えられていることが好ましい。
また本発明において、血清の代替添加物（例えばKnockout SerumReplacement (KSR)（Invitrogen社製）等）も血清に含まれる。
【００３０】
フィーダー細胞とは、精原幹細胞と共に培養された際に、精原幹細胞としての能力を維持した状態での精原幹細胞の増殖を補助する環境を提供する、非精原幹細胞をいう。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞（マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス繊維芽細胞株ＳＴＯ等）等が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。
【００３１】
１．無フィーダー条件での精原幹細胞の増殖方法（方法Ｉ）
本発明の増殖方法（方法Ｉ）は、精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で不溶性担体に接着した状態で培養することを含む。
【００３２】
「フィーダー細胞の不在」とは、フィーダー細胞の実質的な不在、即ち培養物中のフィーダー細胞の数が、精原幹細胞としての能力を維持した状態での精原幹細胞の増殖を補助する環境を提供するには不十分である状態をいう。
【００３３】
不溶性担体としては、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられた際に、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されず、通常、細胞毒性がなく、滅菌可能で、タンパク質に親和性を有する部材を用いることができる。一般的にプラスチック系、ガラス系の部材が好ましい。しかし、不溶性担体は、金属やセラミックでもよく、一定の素材に限定されるものではない。
【００３４】
プラスチック系部材とは、成形性に優れた熱硬化性、熱可塑性ポリマーであって、例えば、ポリスチレン、メタクリル樹脂、ポリメチルペンテン、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリプロピレン、セルロース、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリルなどを使用することができるが、これらには限定されない。
【００３５】
ガラス系の部材とは、ケイ酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩などが、結晶化することなく、ガラス化したものを意味する。ガラス化傾向が強いという理由で、ケイ酸塩ガラスが好ましい。また、成形性に富み、対衝撃性が高いという理由で、ケイ酸塩ガラスを熱処理することによりつくる複合素材の一種である結晶化ガラスがより好ましい。
【００３６】
上記不溶性担体は、通常、シャーレ、プレート、フラスコ、ボトル、ビーズ、中空糸などの培養器材（培養に用いるための器具または材料）に成形して培養に提供される。
【００３７】
精原幹細胞の不溶性担体への接着の強度は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されないが、通常、物理的及び／又は化学的処理を施さなければ解離しない程度の強度である。該物理的処理としては、ピペッティングやタッピングによる処理等が挙げられる。該化学的処理としてはＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のキレート剤による処理や、トリプシン、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素による処理等が挙げられる。
【００３８】
精原幹細胞の不溶性担体への接着の態様は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されず、精原幹細胞は直接的或いは間接的に不溶性担体に接着し得るが、好ましくは、該細胞は基質を介して間接的に不溶性担体に接着する。
換言すれば、精原幹細胞は、好ましくは、不溶性担体の表面に結合した基質に付着することにより、間接的に不溶性担体に接着する。
【００３９】
該基質は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、精原幹細胞の不溶性担体への間接的な接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されない。該基質としては、例えば、細胞外マトリクス、ポリカチオン（ポリリジン等）等が挙げられるが、好ましくは細胞外マトリクスである。
【００４０】
細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子をいう。細胞外マトリクスとしては、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質等が挙げられ、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはラミニンである。
【００４１】
細胞外マトリクスは、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられた際に、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。また、同様の範囲内において、細胞外マトリクスの野生型アミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。
【００４２】
変異体タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸の数は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００４３】
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは、70％以上、より好ましくは 80％以上、さらに好ましくは 90％以上、最も好ましくは 95％以上であることを意味する。相同性の割合（％）は、（Atlas of Protein Sequence and Structure v.5，p.124，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.（1972））に記載されているとおり、配列の整列を助するために100アミノ酸長中に４個のギャップを導入しうる場合には、比較する配列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の割合（％）として算出される。また、野生型のアミノ酸配列を有する上記細胞外マトリクスに対する抗体との交差反応性に基づいて単離しうる任意のタンパク質、あるいは上記各細胞外マトリクスの野生型のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は遺伝子セグメントとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより単離される遺伝子によりコードされるタンパク質が、実質的に相同なものとして含まれる。
上記ストリンジェントな条件としては、例えばサムブルックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Expression of cloned genes in E. coli）（Molecular Cloning：A laboratory manual（1989））Cold Spring harbor Laboratory Press,New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61」等に記載されたハイブリダイゼーション条件（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（６．０×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ）中６８℃にてハイブリダイゼーションの後、以下の条件にて洗浄：洗浄液（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中室温５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中室温１５分、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中３７℃１時間、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中６８℃１時間）が例示される。
【００４４】
ラミニンは、通常、生体内において基底層の細胞外に局在するタンパク質であり、α、β、γの３種類のサブユニット鎖がコイルド−コイル（coiled-coil）ドメインを介して十字架様に会合したヘテロ３量体タンパク質である。
【００４５】
ラミニンを構成する３つのサブユニット鎖には各々複数のタイプがある。即ち、α鎖には５種類（α１、α２、α３、α４及びα５）、β鎖には３種類（β１、β２及びβ３）、γ鎖には３種類（γ１、γ２及びγ３）のタイプが存在する。例えば、α鎖としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにアクセス番号Ｐ２５３９１（ヒトラミニンα１）、Ｐ１９１３７（マウスラミニンα１）、Ｐ２４０４３（ヒトラミニンα２）、Ｑ６０６７５（マウスラミニンα２）、Ｑ１６７８７（ヒトラミニンα３）、Ｑ６１７８９（マウスラミニンα３）、ＡＡＢ１７０５３（ラットラミニンα３）、Ｑ１６３６３（ヒトラミニンα４）、ＣＡＡ７０９７０（マウスラミニンα４）、ＣＡＣ２２３１０（ヒトラミニンα５）、Ｑ６１００１（マウスラミニンα５）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白質等、β鎖としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにアクセス番号Ｐ０７９４２（ヒトラミニンβ１）、ＡＡＡ３９４０７（マウスラミニンβ１）、Ｐ５５２６８（ヒトラミニンβ２）、Ｑ６１２９２（マウスラミニンβ２）、Ｐ１５８００（ラットラミニンβ２）、ＢＡＡ２２２６３（ヒトラミニンβ３）、Ｑ６１０８７（マウスラミニンβ３）、としてアミノ酸配列が登録されている蛋白質等、γ鎖としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにアクセス番号ＡＡＡ５９４８８（ヒトラミニンγ１）、Ｐ０２４６８（マウスラミニンγ１）、Ｑ１３７５３（ヒトラミニンγ２）、Ｑ６１０９２（マウスラミニンγ２）、ＡＡＤ３６９９１（ヒトラミニンγ３）、ＡＡＦ０８９８３（マウスラミニンγ３）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白質等をそれぞれ挙げることができる。ラミニンのサブユニット鎖のタイプは、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられたときに、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る限りにおいて、特に限定されない。
【００４６】
また、ラミニンには、異なるタイプのサブユニット鎖の組合せを有する１２種類のアイソフォームが知られている。即ち、ラミニンには、ラミニン１（α１β１γ１）、ラミニン２（α２β１γ１）、ラミニン３（α１β２γ１）、ラミニン４（α２β２γ１）、ラミニン５（α３β３γ２）、ラミニン６（α３β１γ１）、ラミニン７（α３β２γ１）、ラミニン８（α４β１γ１）、ラミニン９（α４β２γ１）、ラミニン１０（α５β１γ１）、ラミニン１１（α５β２γ１）及びラミニン１２（α２β１γ３）からなるアイソフォームが知られている。ラミニンのアイソフォームは、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられたときに、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る限りにおいて、特に限定されない。
また、現在見出されていないが、将来見出され得る新たなラミニンアイソフォームも、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられたときに、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る限り、本発明の範囲内である。
【００４７】
ラミニンは、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられた際に、精原幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において、単離・精製されたものであっても、他の化合物（例えば上述の他の細胞外マトリクス）との混合物であってもよい。
【００４８】
ラミニンと他の化合物との混合物としては、例えばラミニン産生細胞（例えば繊維芽細胞等）の細胞外マトリックス等が挙げられる。ラミニン産生細胞の細胞外マトリックスは、例えば、ラミニン産生細胞を細胞培養容器中で培養し、該細胞をＥＤＴＡ含緩衝液等で除去し、細胞培養容器中の残留物を緩衝液で洗浄することによって調製することが出来る。或いは、マトリゲル(Matrigel)(Becton Dickinson)(マウス軟骨肉腫ＥＨＳが分泌する細胞外マトリクス成分の調製物。主成分としてラミニン、type IVコラーゲン等の基底膜成分を含む。) 等の市販品を用いてもよい。
【００４９】
精原幹細胞の基質への付着の態様は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、精原幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されず、基質の種類によっても異なるが、好ましくは精原幹細胞の細胞表面上の基質特異的なレセプターを介して、基質へ付着する。該レセプターとしては、基質が細胞外マトリクスである場合、インテグリン等の細胞接着分子が挙げられる。
【００５０】
細胞外マトリクスがラミニンである場合、精原幹細胞はラミニンレセプターを介してラミニンへ付着し得る。
ラミニンレセプターとしては、特に限定されないが、例えば、α１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α７β１、αＶβ３、α６β４等のインテグリンが挙げられる。ラミニンレセプターは、好ましくは、α３β１、α６β１、α６β４のインテグリンであり、より好ましくはα６β１インテグリンである。精原幹細胞は、α６β１インテグリンを高発現している（例えば非特許文献２参照）。
【００５１】
不溶性担体の表面とは、不溶性担体に接着した状態で精原幹細胞を培養するとき、培養される精原幹細胞の不溶性担体への接着を可能にする部分をいい、具体的には、培地を加えたときに培地と接する部位をいう。
【００５２】
精原幹細胞を、不溶性担体の表面に結合した基質に付着させ、間接的に不溶性担体に接着させた状態で培養する際、上記不溶性担体は、基質が表面に結合された不溶性担体を含む、あるいはかかる不溶性担体からなる上述の培養器材として提供され得る。
【００５３】
例えば、培養器材がシャーレやプレートの場合は、底部に基質が結合されたプラスチックあるいはガラス部材であり得る。また、培養器材がビーズの場合は、通常使用されるプラスチックあるいはガラスの培養容器等に基質が結合されたビーズを充填し、培地で満たして精原幹細胞を培養することができる。あるいは、基質が結合された中空糸をホローファイバーモジュールに組み込んで、精原幹細胞を培養することもできる。前記中空糸素材としてはセルロース系（再生セルロース、アセテート）、合成高分子系（ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ）を用いることができる。培養器材の形態は、培養に供せられた際に、結合された基質へ、培養される精原幹細胞が付着し、精原幹細胞の増殖が達成可能な様に使用できるものであれば特に限定されない。
【００５４】
基質を不溶性担体に結合する方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。
【００５５】
基質を非共有結合により不溶性担体に結合させる方法としては、例えば、基質を含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）中に不溶性担体を静置する方法が挙げられる。該方法の条件（緩衝液の種類、緩衝液中の基質の濃度、静置時間等）は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において該基質が結合した不溶性担体が用いられた際に、精原幹細胞の増殖を達成できる範囲において、適宜設定することが可能である。例えば基質がラミニン等の細胞外マトリクスであり、不溶性担体がプラスチックである場合、０．０５〜２００μｇ／ｍＬの濃度で基質を含む中性リン酸緩衝生理食塩水中に不溶性担体を０．０５〜２４時間程度静置することによって、基質が不溶性担体に結合する。
【００５６】
共有結合による結合方法としては、例えば不溶性担体表面を、官能基を有するシランカップリング剤で処理する方法が挙げられる。官能基の例としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基を導入することができる。シランカップリング剤の例としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン等を用いることができる（例えば特開２００３−１８９８４３号公報参照）。
【００５７】
不溶性担体に導入された官能基と基質との具体的な結合方法としては、例えば架橋剤を用いた方法が挙げられる。架橋剤の例としては、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−カルボジジイミダゾール、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、無水フタル酸、ヘキサメチレンジイソチアネートなどが挙げられる。
【００５８】
さらに基質の結合方法の一例として、特許３０５６５１２号公報に詳述されている光化学反応を用いた方法を用いることができる。かかる方法によれば、まず、アジド基等の官能基を有する化合物またはそのような化合物を含む物質を、不溶性担体の表面にコートする。このコーティングの上に、結合させる物質、本発明においては基質を存在させる。次に、前記表面上に紫外線を照射し、光化学反応によってアジド基の窒素原子と基質に存在する炭素原子とを共有結合させることができる。
【００５９】
この時、アジド基を有する化合物は、例えば、アジド基を導入したポリアクリル酸、ポリメタクリレート、ポリアリルアミン等が挙げられるが、これらには限定されない。また、アジド基を導入したポリ−Ｌ−リジン等のポリアミノ酸、ゼラチン等のタンパク質やアルギン酸、ヒアルロン酸等の多糖類のような生体高分子を用いることもできる。かかる化合物のコーティングは、アジド基等の官能基を有する化合物を溶解した溶液を担体表面に滴下し、乾燥するなどして容易に行うことができる。また、紫外線の照射は、水銀灯等の光源を使用して、３２０ｎｍ以上の波長で行うことが好ましい。
【００６０】
基質の結合方法の別の例としては、不溶性担体の表面に、アジド基および基質と共有結合可能な官能基を有する低分子化合物の薄膜を形成した後、紫外線照射により前記低分子化合物を固定し、さらに基質を共有結合させる方法がある。この時の官能基としてはスクシンイミド、マレイミド、ヨード酢酸などを用いることができる。しかし、これらは基質の結合方法の例であって、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  、ＲＩＴＣ８０−７、ＨＦ−Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ等が挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
【００６２】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられる培地は、通常の細胞培養で用いられる自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えばStemPro-Nutrient Supplement等）等が挙げられる。
当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で培地に含まれることが好ましい。
【００６３】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられる培地は、精原幹細胞の増殖補助因子を含み得る。
【００６４】
即ち、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられる培地は、好ましくは、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む。ＧＤＮＦレセプター作動性化合物は、精原幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強、精原幹細胞としての能力の維持等に極めて有用である。
培地中に含まれるＧＤＮＦレセプター作動性化合物の濃度は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
【００６５】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられる培地は、更にＬＩＦを含んでいてもよい。ＬＩＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常１０〜１０６units／ｍｌ、例えば１０〜１０５units／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ units／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３units／ｍｌである。
【００６６】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられる培地は、更にＥＧＦ及びｂＦＧＦの少なくともいずれかを含むことが出来る。ＥＧＦ及びｂＦＧＦは、精原幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、当該因子を培地に添加することで、より安定且つ効率的に精原幹細胞を増殖させることが出来る。
【００６７】
ｂＥＧＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。
【００６８】
ｂＦＧＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、精原幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
【００６９】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いられる培地は、血清を含むことが好ましい。フィーダー細胞の不在下において、血清は精原幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、血清を培地に添加することで、より安定且つ効率的に精原幹細胞を増殖させることが出来る。
血清の濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
【００７０】
ここで、培地に血清が、例えば２〜３０（ｖ／ｖ）％、好ましくは１０〜３０（ｖ／ｖ）％という高濃度で含まれる場合、培地にＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの何れか若しくは両者が含まれなくても、極めて安定した精原幹細胞の増殖が達成され得る。
【００７１】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ）においては、特に限定はされないが、培地へのフィーダー細胞の馴化培地の添加を要しない。これにより、より確実に異種動物由来感染症の危険を回避しつつ、安定且つ簡易に、精原幹細胞を増殖させることが可能となる。
【００７２】
ここで「フィーダー細胞の馴化培地」とは、フィーダー細胞由来の可溶性因子を含む培地をいい、フィーダー細胞の培養後培地の上清を回収することにより調製することができる。
【００７３】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）に供される精原幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば、生体から直接単離された細胞であっても、あるいは生体から単離された後に、生体外で培養された細胞（例えばＧＳ細胞）であってもよい。
【００７４】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、培養に生体から直接単離された精原幹細胞を用いる場合、まず、雄性動物の精巣より、精原幹細胞を含む精巣細胞を自体公知の方法で採取する。
この場合、用いる雄性動物は、出生前であっても、出生後であってもよいが、出生後の動物が入手が容易であり、好ましい。出生後の動物の齢は特に限定されず、新生仔、幼児、成体、老体のいずれであってもよい。
【００７５】
例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、ＤＮａｓｅ等の分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、非特許文献１等を参照）。精巣細胞は培地等により洗浄され、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に供される。
【００７６】
また、当該精巣細胞から、精原幹細胞を濃縮し、濃縮された精原幹細胞を得て、これを本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いてもよい。当該濃縮方法としては、例えば精原幹細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーターや、抗体磁性マイクロビーズ等により該細胞を濃縮する方法などが挙げられる。例えば、α６−インテグリン、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９等の細胞表面抗原を指標に精原幹細胞を濃縮することができる(例えば、Proc Natl Acad Sci USA, 97, 8346-8351, 2001等を参照)。あるいはヘキスト等のｄｙｅを用いて精原幹細胞を濃縮することも可能である（例えば、Development, 131, 479-487, 2004等を参照）。
【００７７】
次に、上述の精巣細胞を、上記培地中に懸濁し、細胞培養用容器内に播種し、培養する（第一の培養）。
精原幹細胞を基質（例えばラミニン）を介して不溶性担体に接着させた状態で培養する場合は、当該細胞培養用容器として、基質によりコートされたものが用いられる。以下の培養に用いられる細胞培養用容器も同様である。この結果、播種された精巣細胞に含まれる精原幹細胞は、基質に付着し、該基質を介して不溶性担体（細胞培養用容器）に接着する。
【００７８】
第一の培養を継続することのみによっても、精原幹細胞を増殖させることは可能であるが、好ましくは、第一の培養の開始から約６〜１８時間後（例えば一晩培養後）に、第一の培養における培養細胞、好ましくは接着している培養細胞（少なからず精原幹細胞を含む）を、ＥＤＴＡ処理、トリプシン処理等により分散し、別の細胞培養用容器へ継代する（第二の培養）。
継代された細胞は、培養条件によっても異なるが、通常継代後１週間以内に、細胞培養用容器の底面にコロニーを形成する。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。該コロニーは、細胞間架橋(intercellular bridge)と桑実胚(morula)様構造等により特徴付けられる形態を有している。
【００７９】
好ましくは、第二の培養の開始から通常５〜１４日後、細胞をトリプシン処理等により分散し、培地中に再度懸濁して、更に新しい細胞培養用容器へ継代する（第三の培養）。同様に継代を繰り返すことで、通常、培養開始から４週間経過後には、平坦な形状の体細胞は消滅する。継代の間隔、細胞の希釈率は、培養条件によって適宜判断されるが、例えば２〜５日間隔、１〜１／４希釈（培養初期においては好ましくは１〜１／２希釈）が例示される。また、確立されたＧＳ細胞（即ち安定したコロニー形成を有するＧＳ細胞）の継代の間隔、細胞の希釈率としては、例えば２〜５日間隔、１／４〜１／１０希釈が例示される。
【００８０】
培養開始後、通常約３〜６週間で、精原幹細胞のコロニーは安定する。
【００８１】
ここで、血清が培地中に含まれる場合、当該血清は精原幹細胞の培養開始時（例えば第一の培養時）の培地には、好ましくは濃度０．１〜５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは０．３〜３（ｖ／ｖ）％という比較的低濃度で含まれ、上記精原幹細胞を継代した後（例えば第二の培養以降）の培地中には、好ましくは濃度２〜３０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは５〜２０（ｖ／ｖ）％程度の濃度で含まれ得る。
このようにすることによって、培養開始時に精原幹細胞と共に培養中に含まれる繊維芽細胞等の精原幹細胞以外の細胞の増殖を抑制することが出来る。
【００８２】
なお、上記継代後も、培地に含まれる血清濃度は比較的低濃度であってもよいが、この場合、培地にＥＧＦ及びｂＦＧＦのうちの何れか若しくは両者が含まれることが好ましい。
【００８３】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）において、培養に生体外で培養された精原幹細胞を用いる場合には、例えば、まず上述と同様に雄性動物の精巣より、精原幹細胞を含む精巣細胞を採取し、これを例えば非特許文献1等に記載の方法等によりフィーダー細胞の存在下で培養した後に、精原幹細胞を回収し、これを本発明の増殖方法（方法Ｉ）に供する。回収される精原幹細胞はＧＳ細胞であり得る。
フィーダー細胞の存在下での精原幹細胞の培養条件は、上述の基質を用いないこと、フィーダー細胞を用いることを除いて、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）の条件と同様であり得る。
【００８４】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）を用いることにより、精原幹細胞は、フィーダー細胞の不在下で、通常２ヶ月以上、好ましくは４ヶ月以上、より好ましくは６ヶ月以上にわたり、精原幹細胞としての能力を維持しながら安定に増殖することができる。
【００８５】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ）を用いれば、精原幹細胞を、フィーダー細胞の不在下で、通常５０日間で２〜１０６倍程度、好ましくは５０日間で４〜１０６倍程度にまで、精原幹細胞としての能力を維持しながら増殖させることが出来る。
【００８６】
なお、本発明の増殖方法（方法Ｉ）における細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
【００８７】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞は、精原幹細胞としての能力を高い効率で維持しているが、フィーダー細胞の存在下で増殖された精原幹細胞とは異なる形質を有し得る。
【００８８】
例えば、本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞は、胚性表現型を有する。胚性表現型とは、胚細胞（例えば始原生殖細胞）に特異的な形質であり、出生後の体細胞は通常有さないものをいう。
【００８９】
フィーダー細胞の存在下で増殖された精原幹細胞は、フローサイトメーターによる解析によれば、例えばマウスの細胞である場合、通常、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥＥ２、ＥｐＣＡＭ及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかの細胞表面抗原が陽性であり、好ましくは、全てが陽性である。また、ｃ−ｋｉｔは好ましくは弱陽性である。また、当該精原幹細胞は、ＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原からなる群から選ばれる少なくともいずれかの細胞表面抗原が陰性であり、好ましくはいずれの抗原も陰性である（例えば非特許文献１参照）。
【００９０】
これに対して、本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞はＳＳＥＡ−１が陽性である。また、ｃ−ｋｉｔの発現が低く、その発現レベルは、フローサイトメーターによるピーク蛍光強度として、フィーダー細胞存在下で増殖された精原幹細胞の１／２〜１／１００程度であり得る。その他の細胞表面抗原の発現は、フィーダー細胞の存在下で増殖された精原幹細胞と同様である。
【００９１】
ここで細胞表面マーカーの発現が「陽性」とは、細胞表面マーカーが細胞表面上に発現しており、当該細胞表面マーカーに対する特異的抗体による特異的結合が確認できることをいう。「弱陽性」とは、他の細胞と比較して、細胞表面マーカーの発現量が相対的に弱い、細胞表面マーカーの発現量の弱い集団が相対的に多い、又は細胞表面マーカーを発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
【００９２】
マウス以外の動物種の精原幹細胞においても、細胞表面マーカーの発現様式はマウスと同様である。ただし、当該動物種が生来的に保有していないマーカーがある場合は、当該マーカーは解析から除外されるなど、種差が考慮される。
【００９３】
ＳＳＥＡ−１の陽性発現は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）が、精原幹細胞上の細胞表面マーカー発現を変化させ、胚性表現型を誘導し、精原幹細胞がより原始的な特徴を獲得することを可能にし得ることを示唆する。
【００９４】
また、フィーダー細胞の存在下で増殖された精原幹細胞は、通常塊状のコロニーを形成するが、本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞は、繊維芽細胞様の外観を呈し、塊状を含む様々なパターンのコロニーを形成し得る。コロニーの一部は鎖を形成するか、網状構造を形成し、これは、精原細胞移植の後に、インビボで観察される精原幹細胞の増殖パターンに類似する（例えば、Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436参照）。
従って、本発明の増殖方法（方法Ｉ）は、精原幹細胞のよりインビボに近い状態でのコロニー増殖を可能にし、インビボにおける精原幹細胞の増殖パターンをより忠実に再現する点においても、精原幹細胞の研究等において、有用である。
【００９５】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該精原幹細胞は凍結保存・融解後も精原幹細胞としての能力を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。
【００９６】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）により増殖された精原幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽中で、１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を用いて行うことができる。具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、凍結させた細胞へＤＭＥＭ／ＦＣＳを滴下して融解する。細胞を遠心して洗浄した後、培地に再度懸濁する。
【００９７】
一度起眠した当該精原幹細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞の精原幹細胞としての能力は維持される。
【００９８】
本発明の増殖方法（方法Ｉ）を用いれば、フィーダー細胞の不在下においても、精原幹細胞を、精原幹細胞としての能力を維持した状態で効率よく、安定に増殖させることが可能である。
【００９９】
また、本発明は、精原幹細胞を細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養するための剤であって、細胞外マトリクス及び不溶性担体を含む剤に関する。
【０１００】
一態様において、該剤は細胞外マトリクスが表面に結合された不溶性担体を含む、あるいはかかる不溶性担体からなる上述の培養器材として提供され得る。細胞外マトリクスや不溶性担体の種類、培養器材の種類、細胞外マトリクスの不溶性担体表面への結合様式等は上述の通りである。
【０１０１】
また、細胞外マトリクスと不溶性担体とは分離されて包装され、キットの態様で提供されてもよい。この場合、細胞外マトリクスは、細胞外マトリクスを含有する緩衝液、或いは粉末等の状態であり得る。細胞外マトリクスは、生理学的に許容される担体、賦形剤、、防腐剤、安定剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤等を更に含む組成物として提供されてもよい。
【０１０２】
上記剤中の細胞外マトリクスの含有量は、本発明の増殖方法（方法Ｉ）に用いられた際に、精原幹細胞の増殖が達成しうる範囲において、特に限定されず、当業者であれば容易に設定することが出来る。
【０１０３】
また、上記剤と、上述の基礎培地、添加物、増殖補助因子、血清等を組合わせることによって、精原幹細胞を細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養するためのキットとすることもできる。これらの構成要素は必要に応じて予め混合しておくことも出来る。
【０１０４】
上記剤（又はキット）を本発明の増殖方法（方法Ｉ）において用いることによって、容易に精原幹細胞をフィーダー細胞の不在下で増殖させることが可能である。
【０１０５】
２．無血清条件での精原幹細胞の増殖方法（方法ＩＩ）
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）は、精原幹細胞を無血清培地中で培養することを含む。
【０１０６】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）において用いられる培地の基礎培地、該培地に加えられ得る添加物、精原幹細胞の増殖補助因子は方法Ｉと同様である。
【０１０７】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）において用いられる培地には、精原幹細胞の増殖をより増強させるために、Ｂ２７が補充されることが好ましい。
【０１０８】
Ｂ２７とは、神経細胞等の無血清培養に用いられる培養添加剤であり、その組成は、例えば（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）や、(Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989)等に開示されており、公知である。より具体的には、Ｂ２７はｄ−ビオチン、アルブミン（ＢＳＡ等）、カタラーゼ、Ｌ−カルニチン塩酸、コルチコステロン、エタノールアミン塩酸、Ｄ−ガラクトース（無水）、グルタチオン（還元）、インスリン（ウシ等、Ｚｎ）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン  ２塩酸、セレン酸ナトリウム（１０００×等）、スーパーオキシドディスムターゼ、Ｔ−３／アルブミン複合体、ＤＬ  α−トコフェロール（ビタミンＥ）、ＤＬ  α−トコフェロール酢酸（ビタミンＥ酢酸）、トランスフェリン（ヒト等、Iron-poor）及びビタミンＡ酢酸を含む組成物をいう。ここで、上述の組成からＤＬ  α−トコフェロール（ビタミンＥ）、ＤＬ  α−トコフェロール酢酸（ビタミンＥ酢酸）、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン及びビタミンＡ酢酸からなる群から選ばれる１又は２以上の構成要素を除いた組成物もＢ２７に含まれるものとする。
Ｂ２７における各構成要素の含有量は、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）において、精原幹細胞の増殖を増強させうる範囲で、特に限定されないが、例えば（Brewer, GJ, Torricelli, J.R., Evage, E.K., Price, P.J., Optimized Survival of Hipocampal Neurons in B27 Supplemented Neurobasal. A new Serum-free Medium Combination., J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）や、(Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989)等に開示された濃度が挙げられる。
Ｂ２７としては、B-27 Supplement（商品名）、B-27 Supplement Minus AO（商品名）、B-27 Supplement Minus Vitamin A（商品名）（以上、Invitrogen社製）等の市販品を用いてもよい。
Ｂ２７の培地への添加量は、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）において、精原幹細胞の増殖を増強させうる範囲で、特に限定されないが、例えばB-27 Supplement （Invitrogen社製）であれば、１〜１００μｌ／ｍｌ、好ましくは５〜４０μｌ／ｍｌ程度、培地に添加される。
【０１０９】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）においては、精原幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することが好ましい。精原幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することにより、精原幹細胞がフィーダー細胞に接着し、より効率的に増殖コロニーを形成することができる。
フィーダー細胞を用いる場合には、通常例えば６穴プレートの１穴あたり、１０５〜１０６個程度の細胞数が用いられる。
【０１１０】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）に供される精原幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば、生体から直接単離された細胞であっても、あるいは生体から単離された後に、生体外で培養された細胞（例えばＧＳ細胞）であってもよい。
好ましくは、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）に供される精原幹細胞は、生体から単離された後に、生体外で血清を含有する培地中で培養された細胞である。
【０１１１】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）において、培養に生体外で培養された精原幹細胞を用いる場合には、例えば、まず上述と同様に雄性動物の精巣より、精原幹細胞を含む精巣細胞を採取し、これを非特許文献1等に記載の方法や、上記方法Ｉ等により血清を含む培地中で培養した後に、精原幹細胞を回収し、これを本発明の増殖方法（方法ＩＩ）に供する。回収される精原幹細胞はＧＳ細胞であり得る。
血清の存在下での精原幹細胞の培養条件は、血清含有培地を用いることを除いて、本発明の培養方法（方法Ｉ又は方法ＩＩ）の条件と同様であり得る。
【０１１２】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）を用いることにより、精原幹細胞は、血清の不在下で、通常２ヶ月以上、好ましくは４ヶ月以上、より好ましくは６ヶ月以上にわたり、精原幹細胞としての能力を維持しながら安定に増殖することができる。
【０１１３】
また、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）を用いれば、精原幹細胞を、血清の不在下で、通常５０日間で２〜１０９倍程度、好ましくは５０日間で１０〜１０９倍程度、より好ましくは５０日間で１０２〜１０９倍程度にまで、精原幹細胞としての能力を維持しながら増殖させることが出来る。
驚くべきことに、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）により、無血清培地中で精原幹細胞を培養することにより、血清含有培地中での培養と比較して、極めて高い効率（例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上高い効率）の増殖を達成することが可能である。
【０１１４】
なお、本発明の増殖方法（方法ＩＩ）における細胞培養条件は、上記方法Ｉと同様に、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。
【０１１５】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）により増殖された精原幹細胞は、フローサイトメーターによる解析によれば、例えばマウスの細胞である場合、通常、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥＥ２、ＥｐＣＡＭ及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかの細胞表面抗原が陽性であり、好ましくは、全てが陽性である。また、ｃ−ｋｉｔは好ましくは弱陽性である。また、当該精原幹細胞は、ＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原からなる群から選ばれる少なくともいずれかの細胞表面抗原が陰性であり、好ましくはいずれの抗原も陰性である。
【０１１６】
なお、マウス以外の動物種の精原幹細胞においても、細胞表面マーカーの発現様式はマウスと同様である。ただし、当該動物種が生来的に保有していないマーカーがある場合は、当該マーカーは解析から除外されるなど、種差が考慮される。
【０１１７】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）により増殖された精原幹細胞は、上記方法Ｉと同様に、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。
【０１１８】
本発明の増殖方法（方法ＩＩ）を用いれば、無血清条件においても、精原幹細胞を、精原幹細胞としての能力を維持した状態で極めて高い効率で、安定に増殖させることが可能である。
【０１１９】
３．培養に供される精原幹細胞の分化段階
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）に供される精原幹細胞には、以下の２つの分化段階が存在し得ることが開示される。
（Ａ）インビトロ増殖のための増殖因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを要する分化段階（以下分化段階（Ａ）とする）。
（Ｂ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階（以下分化段階（Ｂ）とする）。
【０１２０】
換言すれば、分化段階（Ａ）にある精原幹細胞のインビトロにおけるＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的増殖には、ＬＩＦを要するが、分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞のインビトロにおけるＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的増殖にはＬＩＦを要しない。
【０１２１】
精原幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかは、例えば上述の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）や、非特許文献１に記載の増殖方法によって、精原幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを含む培地（培地（Ａ）とする）、又は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地（培地（Ｂ）とする）中で培養し、精原幹細胞が増殖するか否かを試験することで、当業者であれば容易に判別することが出来る。
分化段階（Ａ）の精原幹細胞は、上記培地（Ａ）中で増殖することができるが、上記（Ｂ）中では増殖することができない。
一方、分化段階（Ｂ）の精原幹細胞は、上記培地（Ａ）中及び上記培地（Ｂ）中で増殖することができる。
【０１２２】
上記試験においては、その感度を増幅させるため、上記培地（Ａ）及び（Ｂ）にＥＧＦ及びｂＦＧＦの少なくとも何れか若しくは両方を添加してもよい。
【０１２３】
「実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地」とは、上述の基礎培地、添加物、血清等に由来する成分を除き、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として、精原幹細胞の増殖を補助しうる濃度で含む培地をいう。
即ち、該培地は、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等のＧＤＮＦレセプター作動性化合物以外の増殖補助因子を精原幹細胞の増殖を補助しうる濃度では含まない。
「実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地」としては、例えば上述の基礎培地、添加物、血清及びＧＤＮＦレセプター作動性化合物からなる培地が挙げられる。
【０１２４】
また、種々の発生（成長）段階又は齢にある雄性動物の精巣から精原幹細胞を採取し、上述の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）や、非特許文献１に記載の増殖方法によって、該細胞を上記培地（Ａ）及び培地（Ｂ）中で培養し、精原幹細胞の増殖の有無を試験することで、上述の各分化段階の精原幹細胞を含む雄性動物の発生（成長）段階又は齢を、当業者であれば容易に決定することが出来る。
【０１２５】
一態様において、雄性動物の精巣の組織切片を顕微鏡下観察し（例えばInt. J. Androl., vol. 4, p. 475-493(1981) 、Cell Tiss. Res., vol. 154, p. 443-470(1974) などに記載の方法による）、そこに含まれる精原幹細胞の組織学的特徴等を指標として、精原幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかを判別することが出来る。
組織学的には、精原幹細胞は、雄性動物の出生前〜新生時期には精細管の管腔に存在しており、この時期の精原幹細胞を雄性生殖細胞(gonocyte)という。その後、雄性生殖細胞(gonocyte)は精細管の基底膜へ移動し、該基底膜と接触し、精原細胞へと分化し、精子形成を開始する。
ここで、精原幹細胞が精細管の管腔に存在している分化段階にあることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ａ）にあるとし得る。
また、精原幹細胞が精細管の基底膜に接触している分化段階にあることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ｂ）にあるとし得る。
【０１２６】
即ち、精原幹細胞が雄性生殖細胞(gonocyte)であることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ａ）にあるとし得る。
また、精原幹細胞が精原細胞であることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ｂ）にあるとし得る。
【０１２７】
より具体的には、上記分化段階（Ａ）にある精原幹細胞として、例えばマウスでは出生後４〜６日（例えば４日）、ラットでは出生後４〜６日（例えば４日）より前の分化段階にある精原幹細胞を挙げることができる。
また、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞として、上述の時期以降の分化段階にある精原幹細胞を挙げることができる。
【０１２８】
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）においては、上述の分化段階（Ａ）、（Ｂ）いずれの分化段階の精原幹細胞を用いることも可能である。
本発明の増殖方法に供され得る上記分化段階（Ａ）あるいは（Ｂ）にある精原幹細胞は、それぞれ上述の指標等に基づいて、方法Ｉに記載の方法等によって当該精原幹細胞を含む雄性動物の精巣より、上記方法により精巣細胞を採取することにより、該精原幹細胞を含む細胞集団として得ることが出来る。
【０１２９】
ここで、「上記分化段階（Ａ）（あるいは（Ｂ））にある精原幹細胞を含む精巣」とは、含まれる精原幹細胞のうち、少なくとも１０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％が上記分化段階（Ａ）（あるいは（Ｂ））にある精原幹細胞である精巣をいう。
【０１３０】
また、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞は、上記分化段階（Ａ）にある精原幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを含む培地中で培養することにより得ることが出来る。
【０１３１】
該分化段階（Ａ）にある精原幹細胞を培養し、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞を得る際の培養条件は、以下の点を除き、上述の本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）、或いは非特許文献１に記載された方法における培養条件と同様である。
（１）培地がＧＤＮＦレセプター作動性化合物及びＬＩＦを含むこと。
（２）培養期間が１〜３０日間程度で十分であること。
【０１３２】
該方法により得られた精原幹細胞が、上記分化段階（Ｂ）にあるか否かは、上述の培養方法によって、該細胞を実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で培養し、精原幹細胞の増殖の有無を試験することで、当業者であれば容易に判定することができる。
【０１３３】
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）において、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的に精原幹細胞を増殖させる場合、上記分化段階（Ａ）にある精原幹細胞を用いるときには、培地はＬＩＦを含むことが好ましい。
【０１３４】
また反対に、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）において、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的に精原幹細胞を増殖させる場合、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞を用いるときには、培地はＬＩＦを含まなくてもよい。
ＬＩＦを含まない培地とは、実質的にＬＩＦを含まない培地、即ちＬＩＦを精原幹細胞の増殖を補助し得る濃度では含まない培地をいう。
【０１３５】
また本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）において、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的に精原幹細胞を増殖させる場合、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞を用いるときには、培地は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地であってもよい。
【０１３６】
上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞を、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）に従って、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することにより増殖させた結果として得られる新たな精原幹細胞も分化段階（Ｂ）を維持している。
【０１３７】
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）において、特に、上記分化段階（Ｂ）にある精原幹細胞を用いた場合、培養の安定がフィーダー細胞又は血清に依存せず、且つＬＩＦにも依存しない、極めて安定で、効率的で、操作性がよく且つ経済的な培養を達成することが出来る。
【０１３８】
４．増殖された精原幹細胞に由来する精子、胚、非ヒト子孫等の製造方法
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞は、精原幹細胞としての能力を高い効率で維持しているので、該細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植することにより、該移植された細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物を製造することが出来る。移植された精原幹細胞は、精細管内において増殖し、精子形成コロニーを形成する。
【０１３９】
不妊非ヒト動物としては、ブスルファン等の抗癌剤投与によって不妊化された非ヒト雄性動物や、遺伝的に精子形成能力を欠損している非ヒト雄性動物（例えばＷマウスなど）等が挙げられる（非特許文献１、Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, No. 24, p. 11298-11302, 1994等を参照）。
【０１４０】
移植された精原幹細胞を高い効率で生着させる観点から、該不妊非ヒト動物の動物種は、移植される精原幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。また、該不妊非ヒト動物の系統も、移植される精原幹細胞の系統と同一であることが更に好ましい。
【０１４１】
動物種及び／又は系統が不妊非ヒト動物と移植される精原幹細胞との間で異なっている場合は、移植された細胞が拒絶される可能性を減弱する目的で、不妊非ヒト動物は免疫不全動物であることが好ましい。
該免疫不全動物としては、遺伝的に免疫機能を欠損している非ヒト動物（例えばヌードマウス等）や、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の細胞表面抗原（例えばＣＤ４等）に対する抗体を投与すること等により免疫寛容を誘導した非ヒト動物等が挙げられる。
【０１４２】
また、上述の方法によって得られた、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物から精子を採取することにより、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞由来の精子を製造することが出来る。
【０１４３】
更に、上述の方法により得られた精子を卵に受精させ、胚を得ることにより、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞由来の胚を製造することが出来る。
卵とは精子が受精可能な雌性配偶子をいう。卵としては、例えば、卵細胞、卵母細胞等が挙げられる。
精子と卵の受精は、顕微受精、ＩＶＦ等の周知の方法により行うことができる。
【０１４４】
また、上述の方法により得られた胚を、宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得ることにより、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞由来の非ヒト子孫を製造することが出来る。
【０１４５】
宿主雌動物は、特に限定されないが、好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。
胚が移入された宿主雌動物は、妊娠し、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞由来の非ヒト子孫を出産する。
【０１４６】
また、上述の方法により得られた、移植された精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物と雌とを自然交配し、非ヒト子孫を得ることによっても、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって増殖された精原幹細胞に由来する非ヒト子孫を製造することが出来る。
該自然交配に用いられる雌は、通常、野生型雌動物である。
【０１４７】
本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）を用いれば、精原幹細胞としての能力を維持した状態で長期間にわたって、安定に、精原幹細胞を増殖させることが可能であるので、自体公知の方法で、本発明の増殖方法により増殖された精原幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された精原幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した精原幹細胞等の遺伝子改変精原幹細胞を製造することができる。
【０１４８】
精原幹細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターを精原幹細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、センチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられる。
【０１４９】
ベクターを精原幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法が挙げられる。ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを細胞に導入してもよいし、ウイルス粒子を、細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを細胞に導入することができる。
【０１５０】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）を用いれば、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変精原幹細胞を選択することが出来る。例えば、ベクターと同時にマーカー遺伝子を細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。
【０１５１】
また、同様の方法を用いて、特定の遺伝子を欠損した精原幹細胞を得ることも可能である。特定の遺伝子を欠損した精原幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的組換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。即ち、特定の遺伝子の染色体ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすること等によって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（ターゲッティングベクター）を、相同組換え法により精原幹細胞の染色体に導入し、得られた細胞について当該特定の遺伝子のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した特定の遺伝子のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、特定の遺伝子を欠損した精原幹細胞を選択することにより得ることができる。或いは、組織特異的又は発達段階特異的な様式で特定の遺伝子を欠失させるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いてもよい（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。
【０１５２】
このようにして得られた、遺伝子改変精原幹細胞を用いて、上述と同様の方法によって、遺伝子改変精原幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物、遺伝子改変精原幹細胞に由来する精子（遺伝子改変精子）、遺伝子改変精原幹細胞に由来する胚（遺伝子改変胚）、遺伝子改変精原幹細胞に由来する非ヒト子孫（遺伝子改変非ヒト子孫あるいは遺伝子改変非ヒト動物）等を製造することが出来る。
【０１５３】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）、該方法により増殖された精原幹細胞は、雄の不妊治療に有用である。
【０１５４】
例えば、不妊患者の精巣からバイオプシーで精原幹細胞を採取し、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって試験管中で培養させる。そして、当該不妊患者の精細管中に増殖した精原幹細胞を注入（マイクロインジェクション）して、患者の精巣の精細管の中に培養細胞由来の精子形成を起させるという手法によって、実施することができる。この手法は、例えば、化学療法や放射線治療によって不妊になった場合に、特に効果的である。
このように、上記精原幹細胞は雄性動物の不妊治療に利用可能であるため、上記精原幹細胞を含む特に男性を対象とした不妊治療剤も本発明の範囲内である。
【０１５５】
また、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）、該方法により増殖された精原幹細胞は、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療に有用である。
【０１５６】
例えば、特定の遺伝子に変異を有する患者から、バイオプシーで精原幹細胞を採取し、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）によって試験管中で培養させる。そして、上述の遺伝子改変方法等により、該変異遺伝子を正常に機能する遺伝子と置換した精原幹細胞を作製し、その変異が子孫に伝わらないようにするという治療方法である。このような治療方法においても、精原幹細胞の維持および増殖が必要となるが、この場合に、本発明の増殖方法（方法Ｉ又はＩＩ）を有効に利用することができる。
【０１５７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１）
〔１〕材料及び方法
（１）動物
ＧＳ細胞はＤＢＡ／２バックグラウンドへかけ合せたトランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ６／Ｔｇ１４(act-EGFP-OsbY01)（Ｇｒｅｅｎと呼ぶ）（大阪大学の岡部博士より提供された）から現存プロトコール（Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616）に従って樹立された。減数分裂後にＥＧＦＰ発現のレベルは徐々に減弱するが、当該マウスの精原細胞及び精母細胞（spermatocyte）は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現する（Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 1997; 407: 313-319）。従って、移植後においてドナー細胞は容易に見分けられる。本実施例において用いられた全てのＧＳ細胞は０乃至２日齢の新生マウスに由来した。
無フィーダー培養のために、完全に樹立されたＧＳ細胞が、ラミニンコートプレート上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを２０μｇ／ｍｌの濃度でラミニン（BD Biosciences）を含むＰＢＳにより３７℃で一晩処理した後、該溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製した。
基礎培養培地は、StemPro  サプリメント（Invitrogen）、２５μｇ／ｍｌ  インシュリン、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、６０μＭ  プトレシン、３０ｎＭ  セレン酸ナトリウム、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０μｇ／ｍｌ  ピルビン酸、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸（Sigma）、５ｍｇ／ｍｌ  ウシアルブミン（ICN Biomedicals）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、ＭＥＭビタミン溶液（Invitrogen）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen）、１０−４Ｍ  アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、３０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、及び６０ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン（Sigma）が補充されたStemPro-34 SFM（Invitrogen）であった。使用した増殖補助因子は、２０ｎｇ／ｍｌ  マウスＥＧＦ（BD Biosciences）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトｂＦＧＦ（BD Biosciences）、１０３ U/ml  ＥＳＧＲＯ（マウス白血病抑制因子：ＬＩＦ、Invitrogen）、及び１０ｎｇ／ｍｌ  組換えラットＧＤＮＦ（R&D Systems）であった。増殖補助因子は必要に応じて加えられた。ＭＥＦ馴化培地は既述の通り調製された（Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2001; 19: 971-974）。血清補充培地はＦＣＳ（JRH Biosciences）を無血清培地へ加えることにより調製された。ＭＥＦ上での無血清培養実験においては、基礎培養培地にＢ２７（Invitrogen）  ２０μｌ／ｍｌが必要とされる増殖補助因子と共に培地に補充された。
細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃にて維持された。
【０１５９】
（２）抗体及び染色
使用された一次抗体は、ラット抗EpCAM(G8.8)、マウス抗SSEA-1(MC-480)（発生研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）、ラット抗ヒトα６−インテグリン(CD49f)(GoH3)、ビオチン化ハムスター抗ラットβ１−インテグリン(CD29)(Ha2/5)、ビオチン化ラット抗ＣＤ９抗原(KMC8)、アロフィコシアニン(APC)-接合ラット抗マウスc-kit(CD117)(2B8)(BD Biosciences)であった。APC-接合ヤギ抗ラットIgG(Cedarlane Laboratories)、APC-接合ストレプトアビジン(BD Biosciences)、及びAlexa Fluor 633-接合ヤギ抗マウスIgM(Molecular Probes)が、二次抗体として使用された。細胞染色技術については既述の通り（Shinohara T, Avarbock MR, Brinster RL. β1- and α6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 5504-5509）。細胞はFACS-Caliburシステムを用いて解析され、１０,０００イベントが集められた(BD Biosciences)。
【０１６０】
（３）マーカー遺伝子発現の解析
全ＲＮＡがTrizol（Invitrogen）を用いて単離された。ＲＴ‐ＰＣＲのためにｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡがSuperscriptTMII（RNase H- 逆転写酵素、Invitrogen）により合成され、ＰＣＲがrTaq（Takara）を用いて行われた。Oct-4、Rex-1、neurogenin3(ngn3)、c-ret、Mvh、Fragilis及びStellaのためのＲＴ‐ＰＣＲは特異的プライマーを用いて、既述の通り行われた（Keller G, Kennedy M, Papayannopoulou T, Wiles MV. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol 1993; 13: 473-486、Feng L-X, Chen Y, Dettin L, Reijo Pera RA, Herr JC, Goldberg E, Dym M. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line. Science 2002; 297: 392-395、Goolsby J, Marty MC, Heletz D, Chiappelli J, Tashko G, Yarnell D, Fishman PS, Dhib-Jalbut S, Bever Jr CT, Trisler D. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 14926-14931、Yoshida S, Takakura A, Ohbo K, Abe K, Wakabayashi J, Yamamoto M, Suda T, Nabeshima Y. Neurogenin3 delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis. Dev Biol 2004; 269: 447-458、Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 11457-11462）。
【０１６１】
（４）移植及び解析
およそ５μｌのドナー細胞懸濁液がWBB6F1-W/Wv(Ｗと呼ぶ；Japan SLCより購入した)レシピエント精巣の精細管内へ輸出管を通して注入された（Silvers WK. Dominant spotting, Patch, and Rump-White. In: Silvers WK (ed.), The Coat Colors of Mice, New York: Springer; 1979: 206-223、Ogawa T, Arechaga JM, Avarbock MR, Brinster RL. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules. Int J Dev Biol 1997; 41: 111-122）。各レシピエントの精巣では、注入物が細管の７５〜８０％を占めた。レシピエントマウスに対して５０μｇの抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）が、移植から０、２、４日後に腹腔内に投与され、異質遺伝的なドナー細胞に対する寛容が誘導された（Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki, N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Honjo T, Shinohara T. Allogeneic offspring produced by male germ line stem cell transplantation into infertile mouse testis. Biol Reprod 2003; 68: 167-173）。
コロニーをカウントするために、レシピエントマウス精巣は、ドナー細胞移植後２ヶ月で回収されＵＶ光下にて蛍光を観察することにより解析された（Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 1997; 407: 313-319）。宿主精巣細胞は内在性の蛍光を有さないので、ドナー生殖細胞は特異的に見分けられた。生殖細胞のクラスターは、細管の全周囲を占め、少なくとも０．１ｍｍの長さを有する場合に、コロニーと定義された（Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436）。全ての動物実験のプロトコルは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によって承認されたものである。
【０１６２】
（５）顕微受精
レシピエント精巣の精細管は慎重に解剖され、生殖細胞が機械的に回収された。顕微受精が既述のように行われた（Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52: 709-720）。２４時間培養後に４細胞期に達した胚がday-1偽妊娠ＩＣＲ雌マウスの卵管に移入された。１９．５日目に取り出された生育胎仔は、ＩＣＲ里親マウスの授乳によって育てられた。
【０１６３】
〔２〕結果
（１）ＧＳ細胞の無血清培養
精原幹細胞の無血清培養系を樹立するために、本願発明者らは初めに、血清がＧＳ細胞を樹立するために必要とされるか否かを試験した（図１Ａ、左上）。精巣細胞が、樹立プロトコル［Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616］に従って新生仔のＧｒｅｅｎマウスから調製され、そしてゼラチンコートされたプレートで培養した。培地にＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、およびＧＤＮＦが補充された。血清の非存在下でわずかな細胞がプレートに付着し、その殆どは培地中に浮遊していた。細胞は時折、凝集を形成したが、生殖細胞の明白な増殖は認められなかった。しかし血清の存在下では、細胞のいくらかは次の日までにゼラチンコートされたプレートに付着し、浮遊している細胞を勢いよくピペッティングすることによって回収することができた。これらの細胞は比較的雄性生殖細胞（gonocyte）に富み、さらなる培養のために、新しい培養プレートに移された。これらの細胞を低濃度（０．３乃至２％）の血清中で培養した場合、線維芽細胞性の体細胞は培養開始の２〜３日後までに培養プレート上で増殖を始めた。生殖細胞の大多数が体細胞に付着し、５〜７日目までに生殖細胞コロニーを形成し始めた。対照的に、高濃度（５〜１５％）の血清を培地に添加した場合、生殖細胞は体細胞でさらに増殖し、コロニーを形成した。しかしこれらのコロニーは、線維芽細胞の大量の増殖に起因して、最終的に消失した。これらの結果は、ＧＳ細胞を樹立するためには培地に血清を添加することが望ましいが、高濃度の血清の存在は生殖細胞コロニーの繁殖を抑制することを示す。
【０１６４】
次に本願発明者らは、樹立されたＧＳ細胞がインビトロ増殖のために血清を必要とするか否かを決定した。ＥＧＦＰ発現ＧＳ細胞が、１％血清の存在下で新生仔のＧｒｅｅｎマウス精巣から樹立された。培養細胞がコンフルエントになった時に、新しいプレートに継代（×１−１／２希釈）された。培養開始後３〜４週間以内は、度重なる継代に伴いわずかな線維芽細胞性体細胞が存在し、そしてＧＳ細胞はさらなる増殖のためにマイトマイシンＣ処理ＭＥＦに移された。培養開始の６３日後、本願発明者らはＥＧＦＰ発現ＧＳ細胞を無血清培養に移した。この培養において本願発明者らは、培地から血清を取り除き、幹細胞増殖を増大させるために培地にＢ２７を補充した。ＭＥＦに移す際、ＧＳ細胞はＭＥＦに付着し、これらの細胞はＧＳ細胞の特徴的な形態を維持した（図１Ａ、中上）。血清含有培養中のＧＳ細胞と同様に、これらの細胞は無血清条件下で４乃至６日毎に継代された。しかし細胞増殖は無血清条件において、さらに劇的であった；ＧＳ細胞は１％血清を含む培地において５日後に約５倍に増殖したが、無血清培地においては、同じ培養期間で１２倍まで増殖した。フローサイトメトリー分析は血清の除去に起因して細胞表面マーカー発現において有意な変化を示さなかった：ＧＳ細胞は、ＥｐＣＡＭ［Anderson R, Schaible K, Heasman J, Wylie CC. Expression of the homophilic adhesion molecule, Ep-CAM, in the mammalian germ line. J Reprod Fertil. 1999; 116: 379-384］、ＣＤ９［Kanatsu-Shinohara M, Toyokuni S, Shinohara T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biol Reprod 2004; 70: 70-75］、α６−インテグリンおよびβ−１インテグリン［Shinohara T, Avarbock MR, Brinster RL. β1- andα6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 5504-5509］を強く発現した；これらの細胞は、ｃ−ｋｉｔ［Yoshinaga K, Nishikawa S, Ogawa M, Hayashi S-I, Kunisada T, Fujimoto T, Nishikawa S-I. Role of c-kit in mouse spermatogenesis: identification of spermatogonia as a specific site of c-kit expression and function. Development 1991; 113: 689-699］を弱く発現し、そしてＳＳＥＡ−１［Solter D, Knowles BB. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1). Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: 5565-5569］を発現しなかった（図２Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、培養細胞が他の始原生殖細胞（ＰＧＣ）マーカーまたは精原細胞マーカー（Ｏｃｔ−４を含む）［Pesce M, Scholer HR. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development. Stem Cells 2001; 19: 271-278］を発現したことを示した（図２Ｂ）。
【０１６５】
培養細胞が、精細管を集団化する能力を有するか否かを試験するために、本願発明者らは、精原細胞移植技術［Brinster RL, Zimmermann JW. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 11298-11302］を用いた。この技術はコンピテントな精原幹細胞を、不妊の動物の空の精細管を再集団化させ、成熟した精子へと分化させることができる。無血清培養物中で６乃至２５日間培養したＥＧＦＰ発現ＧＳが、免疫抑制されたＷマウス［Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki, N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Honjo T, Shinohara T. Allogeneic offspring produced by male germ line stem cell transplantation into infertile mouse testis. Biol Reprod 2003; 68: 167-173］の精細管へと移植された（図３Ａ）。Ｗはｃ−ｋｉｔ遺伝子［Geissler EN, Ryan MA, Housman DE. The dominant white spotting (W) locus of the mouse encodes the c-kit proto-oncogene. Cell 1988; 55: 185-192］の変異の結果、分化しつつある生殖細胞を欠損している（図３Ｂ）；従って、レシピエント精巣における精子形成はいずれも、培養したドナー細胞に由来する。様々な数の継代の後、細胞は再度移植され、この期間の間の幹細胞の数の増加を測定した。移植の２ヵ月後、レシピエントマウスは屠殺され、そして精巣中のコロニーが、ＵＶ光照射の下で計数された。結果を表１に示す。
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
表１は無血清培養中の精原幹細胞の増殖を示す。表中の値は平均値±標準誤差である。それぞれの移植について、少なくとも４つのレシピエント精巣からの結果である。ａは、無血清培養の開始から移植までの日数である。ｂは、２つの時点の間における全細胞数又は幹細胞数の増加である。なお、細胞数及び幹細胞数の増加の値は、無血清培養開始から６日後の値を１としたときのものである。
【０１６８】
表１に示すように、幹細胞数の約６．５×１０７倍の増殖が、培養中の４６日の間（培養開始後６日から５２日までの間）に観察された。この間、総細胞数は、８．５×１０７倍増加した（図1Ｂ）。移植コロニーの生着率が１０％と仮定すると［Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436］、培養物中の幹細胞の濃度は、６．６×１０−３〜１．３×１０−２の範囲であった。レシピエントの精巣の組織学的分析は、正常に見える精子形成の存在を確認した（図３Ｃ）。成熟した精子形成細胞が精細管中で観察された。細胞は少なくとも３ヶ月の間、無血清条件で増殖し続けた。これらの結果は、ＧＳ細胞は無血清条件で増殖し得ること、およびこれらの細胞は、精細管環境中へと移された場合に正常な精子形成を起こす能力を有することを示す。
【０１６９】
（２）ＧＳ細胞の無フィーダー培養
次いで、本願発明者らは、ＧＳ細胞増殖におけるフィーダー細胞の役割を調査した。ラミニンがＧＳ細胞増殖を支持する際に、ＭＥＦに取って換わり得るか否かを試験するために、６０日間ＭＥＦ上で培養されたＥＧＦＰ発現ＧＳ細胞が、ラミニン上に移された。
この実験において、本願発明者らは種々の組み合わせのサイトカインを試験すると同時に、いくつかの実験において、ＭＥＦフィーダー細胞からの馴化培地の効果をも試験した。なぜならば、それは無フィーダー培地条件下で未分化でいるために、ヒトＥＳ細胞にとって必須であるからである［Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2001; 19: 971-974］。表２に結果を示す。
【０１７０】
【表２】
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【０１７１】
表２は、無フィーダー培養における精原幹細胞の増殖を示す。表中の値は平均値±標準誤差である。少なくとも４つのレシピエント精巣からの結果をしめす。ＥはＥＧＦを、ＦはｂＦＧＦを、ＧはＧＤＮＦを、ＬはＬＩＦを、ＣＭは馴化培地を、それぞれ示す。ａは、無フィーダー培養の開始から移植までの日数である。ｂは、２つの時点の間における全細胞数又は幹細胞数の増加である。なお、試験１における細胞数及び幹細胞数の増加の値は、無フィーダー培養開始から３１日の値を１としたときのものである。
【０１７２】
表２に示されるように、ＧＳ細胞は、試験した５つ全ての条件下で増殖することができた。これらの細胞は、培地がＧＤＮＦを含む限り、増殖し続け、そして、１％ＦＣＳを含む培地中でのＧＳ細胞増殖を促進するためには、ＥＧＦ又はｂＦＧＦのいずれかで十分であった。しかし、細胞はたとえ培地がＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方を補充されていても、ＧＤＮＦの非存在下で増殖できなかった。ＧＤＮＦの補充の後にのみ、細胞は増殖を再開した。本願発明者らは、ＧＳ細胞増殖に対する、ＬＩＦまたはＭＥＦの培養上清の特定の効果を見出せなかった。無フィーダー培養においては、培地に血清を添加することが好ましかった。なぜならば、ＧＳ細胞は、無血清培地中で培養された場合、ラミニンに付着しなかったからである。
【０１７３】
ラミニンへ移すと、ＧＳ細胞はそれらの形態を徐々に変化させた。ＧＳ細胞はＭＥＦフィーダー細胞上において、概して塊を形成した（図1Ａ、左上）が、これらの細胞はラミニン上では塊を含む様々なパターンを形成し（図１Ａ、右上）、そして線維芽細胞様の外観を有していた（図１Ａ、左下）。時折細胞は鎖を形成するか、または網状構造を形成した（図１Ａ、中下）。これは精原細胞移植の後に、インビボで観察された精原幹細胞の増殖パターンに類似していた［Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436］。無フィーダー培養における細胞の形態は、細胞密度に依存するようであった。一般的に細胞は低い細胞密度で塊を形成する傾向があるが、高い細胞密度では、線維芽細胞状になる。比較的高い密度で播種した場合、ＧＳ細胞はウェルの底で増殖および分散し、ウェルの表面全体を覆った（図１Ａ、右下）。
【０１７４】
表現型を確認するために、培養細胞を細胞表面マーカーの発現について、フローサイトメトリーを用いて分析した（図２Ａ）。ラミニン上における細胞は、ＭＥＦ上におけるＧＳ細胞に類似する表現型を有していた；しかし、ｃ−ｋｉｔの発現が低下したのみならず、ＳＳＥＡ−１の発現が開始された。ＭＥＦ上におけるＧＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１を発現しない［Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616］のに対して、ラミニン上における有意な割合の細胞は、この分子を発現した。サイトカインの型に関わらず、細胞表面マーカー発現において、有意な差異は認められなかった（データ示さず）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、培養細胞がＰＧＣマーカー（Ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｓｔｅｌｌａ）を発現するのみならず、精原細胞マーカー（ｎｇｎ３）［Yoshida S, Takakura A, Ohbo K, Abe K, Wakabayashi J, Yamamoto M, Suda T, Nabeshima Y. Neurogenin3 delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis. Dev Biol 2004; 269: 447-458，Saitou M, Barton SC, Surani MA. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice. Nature 2002; 418: 293-300］もまた発現することを示した（図２Ｂ）。ＳＳＥＡ−１は、ＰＧＣ上において発現されるが、通常精原細胞上においては発現されないので、このことは、無フィーダー培養が細胞表面マーカー発現を変化させ、そして、部分的な胚性表現型を誘導することを示唆した。
【０１７５】
培養した細胞が、なおも精細管を集団化し、そして精子形成を生じる能力を保持しているか否かを試験するために、様々な期間（９乃至３９日の範囲）培養されたＥＧＦＰ発現ＧＳ細胞がトリプシンを用いて回収され、免疫抑制Ｗマウスの精細管内へと微注入された（図３Ｄ）。４乃至３１継代の後３５乃至１８６日目で細胞が再度収集され、この期間の間の幹細胞の数の増加を測定した。同じサイトカインの組み合わせを有する、少なくとも２つの異なる培養物が移植された。レシピエントの精巣におけるコロニー数の分析は、幹細胞数がサイトカインの組み合わせに関わらず、５つ全ての実験において増加したことを示した。幹細胞のコロニー形成効率を１０％と仮定すると［Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436］、幹細胞の濃度は、４．３×１０−４乃至１．３×１０−２の範囲であった。総細胞数は、６ヶ月の培養期間の間に、約１．２×１０９倍に増加した（図１Ｂ）。組織切片は、レシピエントの精巣における精子形成の存在を確認し、そして精子形成細胞の全てのステージが見出された（図３Ｅ）。
【０１７６】
これらの生殖細胞が機能的に正常であることをさらに確認するために、本願発明者らは顕微受精（不妊の動物およびヒトから子孫を導くために一般的に用いられる技術［Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52: 709-720，Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet 1992; 340: 17-18］）を用いて、培養細胞から子孫を作成することを試みた。ＥＧＦＰ発現ＧＳ細胞が、無フィーダー条件で４ヶ月培養され、３匹の免疫抑制されたＷマウスへと移植された。移植の４ヶ月後、２匹のレシピエントが屠殺された。それらの精巣が、機械的に分離され、生きている精子形成細胞が、集団化した管の断片のピペッティングを繰り返すことにより回収された；ＥＧＦＰ発現がＵＶ光の下で確認された。細胞懸濁液が凍結され、液体窒素中で保存された。２１日間の保存の後、成熟した精子または伸長した精子細胞(spermatide)が、Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２  Ｆ１マウス由来の卵母細胞へと微注入された。合計８３個の卵を構築し、２細胞期へと成長した５６個の卵が、顕微受精の次の日に、５匹の偽妊娠雌性レシピエントへと移入された。これらのレシピエント雌は、合計１１匹の子孫を産み、そしてこれらのうち９匹は、成体へと成長した（４匹の雄および５匹の雌）。これらの子孫は繁殖力があり、そして次の世代へとＥＧＦＰ遺伝子を伝達することができた（図３Ｆ）。従ってこれらの結果は、無フィーダー培養におけるＧＳ細胞は、精細管でコロニー形成する能力を保持し、正常に分化して繁殖力のある子孫を産生し得ることを示す。
【０１７７】
〔３〕考察
実施例１において本願発明者らは、精原幹細胞がインビトロにおいて血清又は体細胞性フィーダー細胞の完全不在下で、増殖可能であることを示した。血清及びフィーダー細胞は多くの未確定の成分を含有し、それらは添加された物質の効果を覆い隠し、幹細胞分化に影響を及ぼす（Barnes D, Sato G. Serum-free culture: a unifying approach. Cell; 1980: 22: 649-655）。本願発明者らは、以前の試験において血清を用いた（Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616）。なぜなら、新生仔の雄性生殖細胞(gonocyte)からのＧＳ細胞の初期発生の効率的な誘導には、培地へ血清を添加することが好ましいからである。無血清条件下で精原幹細胞を培養するための多くの試みがなされているが（Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL. Culture conditions and single growth factors affect fate determination of mouse spermatogonial stem cells. Biol Reprod 2004; 71: 722-731、Dirami G, Ravindranath N, Pursel V, Dym M. Effects of stem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM. Biol Reprod 1999; 61:225-230、Creemers LB, den Ouden K, van Pelt AMM, de Rooij DG. Maintenance of adult mouse type A spermatogonia in vitro: influence of serum and growth factors and comparison with prepubertal spermatogonial cell culture. Reproduction 2002; 124: 791-799）、精原幹細胞の長期の増殖を誘導することは不可能であった。実施例１において、本願発明者らは、ＧＳ細胞培養の開始及び維持は異なる過程のようであり、完全に樹立されたＧＳ細胞の維持には血清を要さないことを見出した。ＧＳ細胞培養が新生仔期にある雄性生殖細胞（gonocyte）から始まり、樹立されたＧＳ細胞が精原細胞の特徴を有するならば（Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616）、雄性生殖細胞（gonocyte）はインビトロ培養の間に精原細胞の特徴を獲得すると思われ、血清中の何らかの成分がこの転換を引き起こすものと考えられる。雄性生殖細胞（gonocyte）からの精原細胞の発生は、おそらくは多数の分化段階を含み、それは形質学的変化や幹細胞の細胞表面マーカーの変化へ反映される（Ryu B-Y, Orwig KE, Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL. Phenotypic and functional characteristics of male germline stem cells in rats. Dev Biol 2004; 274: 158-170、Dettin L, Ravindranas N, Hofmann MC, Dym M. Morphological characterization of the spermatogonial subtypes in neonatal mouse testis. Biol Reprod 2003; 69: 1565-1571、McLean DJ, Friel PJ, Johnston DS, Griswold MD. Characterization of spermatogonial stem cell maturation and differentiation in neonatal mice. Biol Reprod 2003; 69: 2085-2091）。最近の研究も、思春期前の生殖細胞は、インビトロにおいて２倍生存可能であることを示している（Creemers LB, den Ouden K, van Pelt AMM, de Rooij DG. Maintenance of adult mouse type A spermatogonia in vitro: influence of serum and growth factors and comparison with prepubertal spermatogonial cell culture. Reproduction 2002; 124: 791-799）。雄性生殖細胞（gonocyte）から精原細胞又はＧＳ細胞への転換に影響を及ぼす因子を決定するために更なる研究が必要であるが、樹立されたＧＳ細胞の無血清培養は精原幹細胞の増殖及び分化を制御するメカニズムを特徴付けるのに有用であろう。重要なことには、実施例１の結果はＧＳ細胞の成長は無血清条���下においても刺激されることを示した。他の幹細胞培養の報告と一致して、無血清条件は精原幹細胞の改良された培養条件であり、ＧＳ細胞の自己再生過程についての我々の理解を増大させるのみならず、ＧＳ細胞のより効率的な操作を可能にするであろう。
【０１７８】
幹細胞は通常、インビボにおいて未分化状態を維持するためにストローマ細胞を要する（Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature 2001; 414: 98-104）。ストローマ細胞はまた、インビトロにおける幹細胞の生存を増強する（Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature 2001; 414: 98-104）；造血幹細胞を用いた古典的な研究は、幹細胞活性が骨髄フィーダーなしでは急速に失われることを示した（Dexter TM, Spooncer E. Growth and differentiation in the hematopoietic system. Annu Rev Cell Biol 1987; 3: 423-441）。同様に、ＰＧＣも生存又はＥＧ細胞への転換のために繊維芽細胞フィーダーを要する（Matsui Y, Zsebo K, Hogan BLM. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 1992; 70: 841-847、Resnick JL, Bixler LS, Cheng L, Donovan PJ. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature 1992; 359: 550-551）。精原幹細胞培養においては、マウス精原幹細胞はインビトロでＳＴＯフィーダー上でおよそ４ヶ月にわたり生存できるが、培養皿上で直接培養した場合は１週間以内に消失したことが当初報告され（Nagano M, Avarbock MR, Leonida EB, Brinster CJ, Brinster RL. Culture of mouse spermatogonial stem cells. Tissue Cell 1998; 30: 389-397）、これはインビトロにおいて精原幹細胞を維持するためにはフィーダー層が必須であることを示した。しかしながら、その後に引続き行われた研究は、ＳＴＯフィーダー上においてさえ培養物中の精原幹細胞の数は減少し、幹細胞の１０から２０％のみが、インビトロにおいて1週間後に回収できたことを明らかにした（Nagano M, Ryu B-Y, Brinster CJ, Avarbock MR, Brinster RL. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol Reprod 2003; 68: 2207-2214）。同様の結果が最近ラットについて報告された（Orwig KE, Avarbock MR, Brinster RL. Retrovirus-mediated modification of male germline stem cells in rats. Biol Reprod 2002; 67: 874-879、Kent Hamra F, Schultz N, Chapman KM, Grellhesl DM, Cronkhite JT, Hammer RE, Garbers DL. Defining the spermatogonial stem cell. Dev Biol 2004; 269: 393-410）。フィーダー細胞のタイプは幹細胞の生存に影響を与える；ラット精原幹細胞はＳＴＯ細胞上よりもセルトリ細胞上においてより長期に生存することが報告されたが、（Kent Hamra F, Schultz N, Chapman KM, Grellhesl DM, Cronkhite JT, Hammer RE, Garbers DL. Defining the spermatogonial stem cell. Dev Biol 2004; 269: 393-410）、他の研究においては、セルトリ細胞はマウスにおいては精原幹細胞に対してネガティブな効果を有することが示されている（Nagano M, Ryu B-Y, Brinster CJ, Avarbock MR, Brinster RL. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol Reprod 2003; 68: 2207-2214）。これらの培養条件は精原幹細胞の長期間の増殖を誘導することは出来ないが、ＧＳ細胞培養条件の開発は、インビトロにおける精原幹細胞の自己再生分裂におけるフィーダー細胞の必要性を評価する機会を提供する。実施例１の結果は、ラミニンがＭＥＦフィーダー層の代わりに用いられ得ることを立証し、精原幹細胞の自己再生分裂の誘導にフィーダー層は必須ではないことを示唆している。
【０１７９】
興味深いことに、無フィーダー培養条件とＭＥＦに基づく培養との間には多くの相違点があることに気づく。例えばラミニン上のＧＳ細胞は、様々なタイプのコロニーを形成する傾向があり、鎖状(chain)から塊状(clump)にまで及ぶが、ＭＥＦ上のＧＳ細胞は通常、塊(clump)を形成する。鎖状のコロニーの形成は精細管環境中への精原細胞移植後の精子形成コロニーを思い出させる（Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436）。逆に塊タイプのコロニーの形成は、ＧＤＮＦをセルトリ細胞において過剰発現させたときに、インビボにおいても観察されている（Yomogida K, Yagura Y, Tadokoro Y, Nishimune Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol Reprod 2003; 69: 1303-1307）。ＧＤＮＦは精原幹細胞の自己再生分裂のための必須の因子である（Meng X, Lindahl M, Hyvonen ME, Parvinen M, de Rooij DG, Hess MW, Raatikainen-Ahokas A, Sainio K, Rauvala H, Lakso M, Pichel JG, Westphal H, Saarma M, Sariola H. Regulation of cell fate decision of undifferentiated spermatogonia by GDNF. Science 2000; 287: 1489-1493）；ＧＤＮＦの過剰発現は生殖細胞の分化の欠失を引き起こし、インビボにおいて精原幹細胞の塊形成及び増殖を誘導する（Yomogida K, Yagura Y, Tadokoro Y, Nishimune Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol Reprod 2003; 69: 1303-1307）。これらの観察は、コロニーの形態はＧＤＮＦの量に依存し、精原幹細胞は正常には鎖形成を伴いながら増殖し、幹細胞の増殖が強力に刺激された時には塊を形成することを示唆した。実施例１においては、ＧＤＮＦは実験を通じて同一の濃度にて用いられたので、該結果はＭＥＦフィーダー細胞はＧＤＮＦの効果を増強するか、又は精原幹細胞の増殖を刺激する何か他の分子を分泌することによりポジティブな効果を発揮する事を示唆する。これは、ラミニン上におけるＧＳ細胞増殖が、ＭＥＦ系を用いたときのそれよりもより遅いという観察によって支持される。従って、幹細胞とＭＥＦとの間の細胞−細胞相互作用が追加的な成長刺激を提供し、これがコロニー形態の変化として現れたのかもしれない。
【０１８０】
無フィーダー培養の他の予期しない特徴は、表面マーカー発現における変化であった。特にＳＳＥＡ-１の発現は思いもよらないものであった。ＳＳＥＡ-１は初期胚及びＰＧＣ上に発現するが、その発現は妊娠中期後に消失する（Cooke JE, Godin I, Ffrench-Constant C, Heasman J, Wylie C. Culture and manipulation of primordial germ cells. In: Wassarman, P. M., DePamphilis, M. L. (eds.), Guide to techniques in mouse development, San Diego: Academic Press; 1993: 37-58）。しかし同時に、ラミニン上のＧＳ細胞は、出生後精巣中の未分化精原細胞のマーカーである（Yoshida S, Takakura A, Ohbo K, Abe K, Wakabayashi J, Yamamoto M, Suda T, Nabeshima Y. Neurogenin3 delineates the earliest stages of spermatogenesis in the mouse testis. Dev Biol 2004; 269: 447-458）ｎｇｎ３も発現した。ｃ-ｋｉｔを発現している細胞の割合も、無フィーダー培養において減少した。従って、ＧＳ細胞における遺伝子発現のパターンは培養環境によって影響される。無フィーダー培養において、なぜＧＳ細胞がそのような胚性マーカーを発現し始めるのか、不明である。これは非生理学的環境に対する、精原幹細胞の異常な反応を反映しているという可能性を排除する事は出来ないが、インビボにおいてＳＳＥＡ-１を発現する精原幹細胞の稀な集団が存在し得る。幹細胞は極めてわずかしか存在せず（１０４精巣細胞中に２乃至３個のみ）（Meistrich ML, van Beek MEAB. Spermatogonial stem cells. In: Desjardins, C, Ewing, L L (eds.), Cell and Molecular Biology of the Testis, New York: Oxford University Press; 1993: 266-295、Tegelenbosch RAJ, de Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 F1 hybrid mouse. Mutation Res 1993; 290: 193-200）、その様な稀な集団が、精巣切片において通常の免疫組織学的方法を用いた検出を逃れる事があり得る。近年の研究も精原幹細胞集団のヘテロジェナイティを示唆している（Tadokoro Y, Yomogida K, Ohta H, Tohada A, Nishimune Y. Homeostatic regulation of germinal stem cell proliferation by the GDNF/FSH pathway. Mech Dev 2002; 113: 29-39）。そのような集団の増殖はインビボで体細胞により、そしてインビトロにおいてＭＥＦフィーダーによっても阻害されており、しかし無フィーダー条件下での培養が当該細胞集団におけるその相対頻度を変化させたのかもしれない。あるいは、おそらくＧＳ細胞は、より原始的な特徴を有する細胞へと変化する能力を有する。ＰＧＣは特殊な条件下で培養されたときに、ＥＳ様細胞（ＥＧ細胞）へと転換できることがよく知られている。ＥＧ細胞は、もっぱら性交後８．５乃至１２．５日（ｄｐｃ）のＰＧＣに由来してきたが（Matsui Y, Zsebo K, Hogan BLM. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 1992; 70: 841-847.、Resnick JL, Bixler LS, Cheng L, Donovan PJ. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature 1992; 359: 550-551）、出生後の生殖細胞も同様の特徴を保持しているかもしれない。ＧＳ細胞は出生後の雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）に由来しており、生殖系列に運命づけられている点でＥＧ細胞とは異なっている。しかしながら、実施例１の結果が示す通り、培養条件の改変はＧＳ細胞に幹細胞の性質を誘導することが可能であり、該細胞がより原始的な特徴を獲得することを可能にし得る。
【０１８１】
異なるコロニーの形態や表面マーカー発現にも関わらず、ラミニン上のＧＳ細胞は、不妊マウス内への移植により、精子形成コロニー及び子孫を産生する能力を保持している。自己再生の能力を幹細胞の特徴として定義するならば、その結果は、培養細胞は精原幹細胞としての幹細胞活性を有することを示している。最近の研究において、成熟した精細管中での胎仔の生殖系列細胞の挙動が報告された（Ohta H, Wakayama T, Nishimune Y. Commitment of fetal male germ cells to spermatogonial stem cells during mouse embryonic development. Biol Reprod 2004; 1286-1291）：これによれば、１２．５ｄｐｃ胚からのＰＧＣは精子形成コロニーを産生出来ないが、１４．５ｄｐｃ後の雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）は精細管を集団化し、精子形成コロニーを産生できる。これらの結果に基づけば、ＰＧＣは１２．５から１４．５ｄｐｃの間に精原細胞へと運命づけられるのかもしれない。実施例１においては、ＳＳＥＡ-１の発現はＧＳ細胞の胎仔性形質を示唆したが、精子形成は移植レシピエントにおいて効率よく起こり、これはラミニン上のＧＳ細胞は、ＳＳＥＡ-１発現に関わらず、機能的に精原幹細胞と同等であることを示す。まとめると、実施例１の結果は、精原幹細胞の自己再生分裂には体細胞ストローマ細胞との直接的な接触は不要であり、サイトカイン（増殖補助因子）やラミニンがニッシェ機能の少なくともいくつかの局面に取って代わることが出来る事を立証している。
【０１８２】
血清含有培養中ではラミニンはＭＥＦに置き換わることが可能であったが、無血清条件下ではＧＳ細胞を効率よくラミニン上で増殖させることは困難であった。血清中の何の因子がラミニンへのＧＳ細胞の接着を促進するのかは不明である。ＧＳ細胞は同一の無血清培地中で、ＭＥＦへは付着できたが、ラミニンへの付着は減少した：従って、ＭＥＦはおそらくはＧＳ細胞の付着を介在する他の分子を発現しているか、又は血清は該分子或いは代替分子を提供することにより、ＭＥＦの代わりとなることが出来る。ＭＥＦ細胞は、ラミニン、タイプＩＶコラーゲン及びファイブロネクチンを含む、多様な細胞外マトリクス分子をその表面に分泌する（Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2001; 19: 971-974）。基底膜の組成は異なる組織において有意に相違するが、ラミニンのみが精原幹細胞のための最善の微小環境を提供するものではないかもしれない。例えば、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａにおける遺伝学的研究は、分化又は幹細胞をニッシェへつなぎとめておくことにおけるＥ‐カドヘリンの重要な役割を立証している（Yamashita YM., Leanne Jones D., Fuller MT. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science 2003; 301: 1547-1550）。カドヘリン分子はマウスにおけるＰＧＣや精原細胞上にも発現しており（Bendel-Stenzel MR, Gomperts M, Anderson R, Heasman J, Wylie C. The role of cadherins during primordial germ cell migration and early gonad formation in the mouse. Mech Dev 2000; 91: 143-152、Wu JC, Gregory CW, DePhilip RM. Expression of E-cadherin in immature rat and mouse testis and in rat Sertoli cell cultures. Biol Reprod 1993; 49: 1353-1361）、該分子はほ乳類の精原幹細胞の生物学においても同様の役割を果たしているかもしれない。接着分子は幹細胞のための重要なシグナルを送達するので（Gonzalez-Reyes A. Stem cells, niches and cadherins: a view from Drosophila. J Cell Sci 2003; 116: 949-954）、幹細胞‐ニッシェ相互作用に含まれる他の候補分子を同定する事が重要であり、それは本発明の増殖方法の更なる改良に役立ち得る。
【０１８３】
本発明は、インビトロにおいて、明確な条件下で精原幹細胞の自己再生分裂を再現する第一の段階を提供するが、自己再生分裂とそのニッシェへの関与のより詳細な解析を可能にするために、より改良された培養系を開発していくことが望まれる。例えば、非対称分裂や自己再生分裂のような、特定のタイプの自己再生を導く培養条件を樹立する事が重要であろう（Meistrich ML, van Beek MEAB. Spermatogonial stem cells. In: Desjardins, C, Ewing, L L (eds.), Cell and Molecular Biology of the Testis, New York: Oxford University Press; 1993: 266-295）。この意味で、無血清培養系及び無フィーダー培養系は、個々の因子の幹細胞への影響を評価するためのより確定的な試験を可能にするので、本発明の増殖方法は極めて有用である。決定的な因子の特定は、精原幹細胞の自己再生分裂がどのようにして制御されているかについての我々の知識を増大させ、雄性生殖系列改変のためのより効率的な技術の発展を我々にもたらすであろう。
【０１８４】
（参考例１）
〔１〕実験方法および実験材料
（１）動物
精巣細胞は、ＤＢＡ／２マウス、あるいはＤＢＡ／２バックグラウンドへかけあわせたトランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ６／Ｔｇ１４(act-EGFP-Osby01)（以下 Green miceと呼ぶことがある）の新生仔（０日齢）、仔（５日齢）又は成体（４〜５週齢）から、２段階酵素分解によって集められ、培養に使用された。
培養された細胞は、Ｗマウス（４週齢、Japan SLC製）へ移植された。Ｗレシピエントを使用した実験では、５０μｇの抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）が、移植から０、２、４日後に腹腔内に投与され、異質遺伝的なドナー細胞への耐性が誘導された。全ての動物実験のプロトコルは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によって承認されたものである。
【０１８５】
（２）培養条件
基礎培養培地としては、実施例１と同様の添加物が補充されたStemPro-34 SFM (Invitrogen社製)培地を使用した。ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ及び胎仔ウシ血清は実施例１と同様のものを使用した。ＧＤＮＦ及び胎仔ウシ血清は、それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌ、１（ｖ／ｖ）％の濃度で、特にことわりのある場合を除き、常に培地に添加した。ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦは、特にことわりのある場合を除き、それぞれ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０３units/mlの濃度で適宜培地に添加した。
細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃で維持された。
【０１８６】
（３）精原幹細胞の採取
精巣細胞はコラゲナーゼ（タイプＩＶ、シグマ社製）およびトリプシン（インビトロゲン社製）を用いた２段階酵素分解によって採集された。
即ち、マウスの精巣を摘出し、ＰＢＳ中で白膜を除去し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｉ型）を含むハンクス液中、３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をほぐした。ＰＢＳにより２回洗浄してはがれた間質の細胞を除去した後、１．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅを含む０．２５％トリプシン液中で３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をばらばらにした。ＰＢＳを加え、トリプシンを不活性化した後、ピペッティングを行って細胞浮遊液を得た。
【０１８７】
新生仔の精巣を用いた場合には、上記細胞浮遊液をそのまま培養に用いた。
一方、仔又は成体の精巣を用いた場合は、上記細胞浮遊液を２０〜３０μｍのナイロンメッシュに通して未消化細胞塊を除去し、６００×ｇで５分間遠心して精巣細胞を回収し、更に、該精巣細胞から抗ＣＤ９抗体を用いて磁気ビーズ法により、ＣＤ９陽性細胞として精原幹細胞を濃縮した。
【０１８８】
回収された精原幹細胞は培地中に分散され、ゼラチンコートされたプレート、あるいはマイトマイシンＣで不活性化されたマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）上へ移された（第一の培養）。
【０１８９】
第一の培養の開始から一晩培養後に、第一の培養における培養細胞、好ましくは浮遊している培養細胞（少なからず精原幹細胞を含む）を、別の細胞培養用容器へ継代した（第二の培養）。継代された細胞は、培養条件によっても異なるが、通常継代後１週間以内に、細胞培養用容器の底面にコロニーを形成した。
【０１９０】
第二の培養の開始から５〜１４日後、細胞をトリプシン処理等により分散し、培地中に再度懸濁して、更に新しい培養用プレートへ継代した（第三の培養）。同様に継代を繰り返すことで、平坦な形状の体細胞は消滅した。２度目あるいは３度目の継代以降は、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養した。細胞は２〜５日毎に、１〜１／４希釈（培養初期においては好ましくは１〜１／２希釈）で継代された。３〜４週間までには、細胞は比較的安定した状態におちついた。その後、細胞は２〜５日毎に、１／４〜１／１０希釈で継代された。
【０１９１】
一部の実験においては、培養によって得られた精原幹細胞（ＧＳ細胞）を増殖補助因子としてＧＤＮＦのみを含み、ＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有しない培地中で培養した。
【０１９２】
（４）抗体染色
上記条件で培養された細胞の性質を確認するために、従来公知の精子形成細胞に対する分子マーカーの発現を調べるフローサイトメトリーが、以下のようにして実施された。
一次抗体として、実施例１で用いられた抗体に加えて、ラット抗マウスＣＤ９抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）、ラット抗ＴＤＡ抗原(EE2)（大阪大学西宗博士より提供）が使用された。二次抗体としては、実施例１と同一の抗体が用いられた。細胞染色及び解析は実施例１と同様に実施された。
【０１９３】
（５）培養された精原幹細胞の移植
上記の培養方法によって得られた精原幹細胞を含む約２μｌのドナー細胞懸濁液は、輸出管を通してＷマウスの精巣へ導入された。各レシピエントの精巣では、注入物が細管の７５〜８０％を占めた。成体のレシピエントマウスは、アバーティンインジェクソン（６４０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔された。
コロニーをカウントするために、レシピエントマウスのテストでは、ドナー細胞移植後７〜８週間でレシピエント精巣を摘出し、紫外線下で蛍光を観察することによって解析された。ホストの精巣細胞は内因性の蛍光発光を有しないため、ドナー細胞は、明確に特定された。細胞の集団は、精細管の全周囲を占め、少なくとも０．１ｍｍの長さを有する場合に、コロニーと定義された。
【０１９４】
（６）組織学的解析
新生仔（０日齢）、仔（５日齢）および成体（４〜５週齢）のマウスの精巣が採取され、常法により組織切片が作成された。切片はヌクレアー・ファスト・レッド（nuclear fast red）にて染色され、顕微鏡下観察された。
【０１９５】
〔２〕結果
（１）精原幹細胞の試験管内増殖について
新生仔マウス（０日齢）由来の精原幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地中でフィーダー細胞と共に培養しても増殖は確認されず、コロニーを形成しなかったが（図４左上参照）、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地中においては、有意な増殖が観察され、コロニーを形成した（図４右上参照）。
一方、仔（５日齢）マウス由来の精原幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地並びにＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地のいずれを用いた場合においても有意な増殖が観察され、コロニーを形成した(図４左下及び右下)。
また、成体（４〜５週齢）マウス由来の精原幹細胞も、仔マウスと同様に、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地並びにＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地のいずれを用いても有意な増殖が観察され、コロニーを形成した（データ示さず）。
【０１９６】
この実験における培養細胞（すなわち、精原幹細胞）のフィーダー細胞上での増殖の様子を図５のグラフに示す。このグラフにおいて、横軸は培養開始からの経過日数を、縦軸には相対的な細胞数を示す。図５に示すように、仔マウス由来の精原幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合においても、約４ヶ月間にわたってログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認された。培養開始から４ヶ月間で細胞数は約１０９倍に増殖した。ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合においても、同様の増殖が確認された（データ示さず）。
【０１９７】
一方、新生仔マウス由来の精原幹細胞は、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合は、４ヶ月間にわたって、ログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認されたが、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合には、ほとんど細胞増殖は観察されなかった（データ示さず）。
【０１９８】
また、新生仔のマウス由来の精原幹細胞をＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地で５〜１５日間培養した後に、培養細胞を回収し、該細胞をＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地中でフィーダー細胞と共培養すると、仔マウス由来の精原幹細胞と同様に長期間にわたって細胞増殖が持続し、コロニーを形成した（データ示さず）。
【０１９９】
更に、上記にて調製された新生仔マウス（０日齢）由来の精原幹細胞は、培養開始から４ヶ月後に、培地を１５％ＦＣＳ含有ＧＤＮＦ含有ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ不含培地に転換して、引続きフィーダー細胞と共培養することによっても、引き続き増殖を維持した（図６）。精原幹細胞の細胞数は、培地変換後５日で５．９７±０．５３倍（ｎ＝３）、１１日で３８．９０±８．４４倍（ｎ＝３）（いずれの値も平均値±標準誤差で示す）に増加した。
【０２００】
以上の結果から、精原幹細胞の分化段階には、以下の２つが存在することが示唆された。
（Ａ）インビトロ増殖のための増殖因子としてグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階（分化段階（Ａ））。
（Ｂ）実質的にグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のみを精原幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階（分化段階（Ｂ））。
【０２０１】
また、新生動物の精原幹細胞は分化段階（Ａ）にあり、仔及び成体動物の精原幹細胞は分化段階（Ｂ）にあることが明らかとなった。
更に、分化段階（Ａ）にある精原幹細胞を、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより、分化段階（Ｂ）へと分化することが示唆された。
【０２０２】
（２）培養細胞の性質について
仔グリーンマウス（Green Mouse）の精原幹細胞をフィーダー細胞の存在下、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地により増殖させ、細胞の表面の特徴をフローサイトメトリーによって解析した。このマウスのＧＦＰ遺伝子は、精原幹細胞を含むあらゆる場所で発現する。それゆえ、培養されたＧＦＰを含む細胞は、ＵＶ照射下での観察によってフィーダー細胞から区別することができる。
結果を図７に示す。図７に示す各図は、（ａ）から順にα６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、c-kit、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ９、フォルスマン抗原という分子マーカーを用いて解析を行った結果である。なお、黒の実線で囲む白色のカラムがコントロール免疫グロブリンの場合の結果であり、黒色カラムが各分子マーカー（抗体）の場合の結果である。
培養された細胞は、α６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、ＣＤ９に対してポジティブであった。
また、多くの細胞はc-kitに対してネガティブであったが、弱い発現が確認され、これによっていくつかのコロニーが分化していることが示唆された。
培養された細胞は、ＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原が陰性であった。
これらの結果から、増殖された細胞の大部分は未分化の精原細胞の性質を有するということが分かった。
【０２０３】
（３）精原細胞移植技術による幹細胞活性の決定
上記（２）の結果に基づき、培養された細胞が本当に精原幹細胞であるか確認するために、精原細胞移植が実施された。
仔グリーンマウス（Green Mouse）の精原幹細胞がフィーダー細胞の存在下、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地により２９〜５８日の期間培養され、収穫された細胞が、Ｗマウスの精細管へ移植された。移植実験におけるコロニーは、移植から７〜８週間後にＵＶ照射下で蛍光によって確認された。
結果を図８に示す。本実験によって得られたＷレシピエント精巣の解析では、外見上正常な精子形成を有する多数の精細管を満たした培養細胞によって、広大なコロニー形成が行われることが実証された（図８）。この結果、培養された細胞が精原幹細胞であることが確認された。
【０２０４】
（４）組織学的解析
新生仔（０日齢）、仔（５日齢）及び成体（４〜５週齢）のそれぞれのマウスの組織学的解析結果を図９に示す。
新生仔の精原幹細胞は精細管の管腔に存在しているが（図９ｄ）、５日齢の仔においては、精原幹細胞は精細管の基底膜に接触しており（図９ｅ）、成体においては精原幹細胞が精細管の基底膜に強固に接着している様子が観察された（図９ｆ）。
以上より、上記組織学的特徴を指標として、精原幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかを判別可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０２０５】
本発明の増殖方法を用いれば、フィーダー細胞や血清の不在下においても精原幹細胞を効率よく増殖させることが出来、未確定因子の影響を排除することができるので、従来法と比較して、より安定且つ簡易に、精原幹細胞としての能力を維持した状態で、精原幹細胞を増殖させることが可能である。また、精原幹細胞の臨床応用において、異種動物由来感染症の危険を回避することが出来る。従って本発明の増殖方法は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療方法および雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに有用である。
更に、本発明の増殖方法は、フィーダー細胞や血清由来の未確定因子の影響を含まないので、精原幹細胞の増殖及び分化を制御する因子を評価するためのより確定的な試験を可能にし、精原幹細胞を支配する制御機構を理解する新たな機会を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】ＧＳ細胞のインビトロ成長を示す図である。Ａは培養細胞の形態を示す写真である。左上のパネルはＭＥＦ上、血清含有培地中でのＧＳ細胞を、中央上のパネルはＭＥＦ上、無血清培地中でのＧＳ細胞を、右上のパネルはラミニン上でのＧＳ細胞をそれぞれ示す。左下のパネルはラミニン上でのＧＳ細胞を示し、丸いコロニーが観察される。中央下のパネルはラミニン上でのＧＳ細胞を示し、生殖細胞の鎖形成が観察される。右下のパネルはラミニン上でのＧＳ細胞を示し、培養ウェル中でコンフルエントなＧＳ細胞が観察される。Ｂは無血清（Ｓｅｒｕｍ‐ｆｒｅｅ）又は無フィーダー（Ｆｅｅｄｅｒ‐ｆｒｅｅ）条件におけるＧＳ細胞の増殖を示すグラフである。スケールバーは１００μｍに相当する。
【図２】培養細胞の形質的特徴付けを示す図である。Ａは各分子マーカーを用いて、フローサイトメトリーによって培養細胞の性質を試験した結果を示すグラフである。縦軸には細胞数（個）を、横軸には相対的蛍光強度を示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。上段（ｓｅｒｕｍ（−））は無血清培養に、下段（ｆｅｅｄｅｒ（−））は無フィーダー培養にそれぞれ相当する。無血清培養においてはＧＳ細胞を解析するためにＥＧＦＰ陽性細胞のみがゲートされた。ＢはＲＴ-ＰＣＲ解析を示す図である。特異的プライマーを用いて、無血清（ｓｅｒｕｍ（−））又は無フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ（−））条件下でのＧＳ細胞からのｃＤＮＡを増幅した。「ＭＥＦ」は血清及びフィーダー存在下での培養に相当する。
【図３】培養細胞からの精子形成および子孫の産生を示す写真である。Ａは無血清培養からのＥＧＦＰ発現ドナーＧＳ細胞を受けたレシピエント精巣を示す。ＢはＷマウス精巣の組織学的様相（非移植対照）を示し、分化した生殖細胞の不在が観察される。Ｃは無血清培養からのドナーＧＳ細胞を受けたＷマウス精巣の組織学的様相を示し、正常な様相の精子形成及び伸長した精子細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）がみられる。Ｄは無フィーダー培養からのＧＦＰ発現ドナーＧＳ細胞を受けたレシピエント精巣を示す。Ｅは正常な精子形成を示すレシピエント精巣の組織学的様相を示す。Ｆは無フィーダー培養からのＧＳ細胞に起因するＦ２子孫を示す。ＵＶ光下での緑色の蛍光により、ドナー導入遺伝子の存在が立証される（矢印）。対照同腹子においては蛍光は観察されない（矢頭）。スケールバーは１ｍｍ（Ａ，Ｄ）、１００μｍ（Ｂ，Ｃ）、５０μｍ（Ｅ）にそれぞれ相当する。
【図４】実施例における、マウスの精巣細胞からの精原幹細胞増殖コロニーの発達を顕微鏡で観察した結果を示す図である。左上図は新生仔のマウス精巣細胞のＬＩＦ（−）培地による培養、右上図は新生仔マウス精巣細胞のＬＩＦ（＋）培地による培養、左下図は５日齢仔マウス精巣細胞のＬＩＦ（−）培地による培養、右下図は５日齢仔マウス精巣細胞のＬＩＦ（＋）培地による培養をそれぞれ示す。スケールバーは５０μｍに相当する。
【図５】実施例において培養された精原幹細胞の増殖を示すグラフであり、具体的には、ＧＦＰ標識でフィーダー細胞と区別できる精原幹細胞の数を測定したものである。縦軸には培養開始時の細胞数を１としたときの相対的細胞数（倍）を、横軸には培養開始後の日数を示す。
【図６】１５％ＦＣＳ含有ＧＤＮＦ含有ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ不含培地中での精原幹細胞の増殖を示すグラフである。縦軸には培地転換時の細胞数を１としたときの相対的な細胞数（平均値±標準誤差）を、横軸には培地転換後の日数を示す。
【図７】の（ａ）〜（ｈ）は、実施例において、各分子マーカーを用いて、フローサイトメトリーによって培養細胞の性質を試験した結果を示すグラフである。縦軸には細胞数（個）を、横軸には相対的蛍光強度を示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。（ａ）〜（ｈ）に示す各グラフは、分子マーカーとして、（ａ）から順に、α６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、c-kit、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ９、フォルスマン抗原をそれぞれ用いた場合である。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）95.91%、（ｂ）98.12%、（ｃ）96.75%、（ｄ）99.89%、（ｅ）12.74%、（ｆ）0.06%、（ｇ）99.84%、（ｈ）0.80%である。
【図８】実施例における、移植後の精原幹細胞からの精子形成を示す図である。ＵＶ照射下で蛍光を示すＧＦＰ標識された精原幹細胞由来の精子形成コロニーを示す。
【図９】精巣の巨視的（上段（ａ）〜（ｃ））及び組織学的（下段（ｄ）〜（ｆ））外観を示す図である。新生仔（０日齢）、仔（５日齢）及び成体（４〜５週齢）の精巣を、それぞれ左、中央、右に示す。新生仔から成体へ成熟するに伴い、精巣内に間質系細胞がより多く存在する。下段の挿入図内の矢印は生殖細胞（精原幹細胞）を示す。上段のスケールバーは２ｍｍ、下段挿入図のスケールバーは２０μｍに相当する。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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