(57)【要約】【課題】  高発現させることによってＩＧｓの蓄積量をより向上させることのできる新規遺伝子とその利用方法を提供する。【解決手段】  シロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ挿入によるアクティベーションタギングライブラリから、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）抵抗性を有する変異体ｒｍｔ−１を選抜した。そして、この変異体ｒｍｔ−１において、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位に隣接して存在し、高発現している遺伝子をＩＧｓ合成に関与する新規遺伝子として単離した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成に関与するポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１または３に記載のポリヌクレオチドからなる形質転換体選抜用マーカー遺伝子。
【請求項６】
請求項１または３に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項１または３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、インドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドが発現している形質転換体。
【請求項８】
上記形質転換体は、植物細胞または植物体であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
上記植物細胞または植物体は、シロイヌナズナ由来のものであることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の植物体から得られる種子。
【請求項１１】
請求項７〜９の何れか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするインドールグルコシノレート類の生産方法。
【請求項１２】
請求項５に記載のマーカー遺伝子または請求項６に記載の組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファン類縁化合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファン類縁化合物に対する耐性を発現している細胞を選抜することからなる、形質転換細胞の選抜方法。
【請求項１３】
少なくとも請求項１または３に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項６に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成に関与する新規遺伝子およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルコシノレート類およびその分解産物は、病害虫抵抗性に関与することが知られている他、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツなどといったアブラナ科の農作物の香味、苦味の主要な成分であることが知られている。そのため、グルコシノレート類およびその分解産物は、病害虫抵抗性物質、香辛料、抗ガン剤をはじめとする製薬原料として利用することのできる有用物質である。
【０００３】
非特許文献１〜５には、トリプトファンを出発物質とする二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成に関与するシロイヌナズナ由来の遺伝子ＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ８３Ｂ３１（これらをＣＹＰ遺伝子と呼ぶ）について記載されている。このＣＹＰ遺伝子を植物中で高発現させると、ＩＧｓの合成量が増加することが確認されている。
【０００４】
また、非特許文献１および５には、合成されたＩＧｓが害虫を選択的に誘引することが記載されており、非特許文献１には、ＩＧｓが病害虫に対して抵抗性を有することが記載されている。
【非特許文献１】M.D. Mikkelsen, B.L. Petersen, C.E. Olsen, and B.A. Halkier, Amino Acids (2002) 22: 279-295
【非特許文献２】Michael Dalgaard Mikkelsen, Carsten Horslev Hansen, Ute Wittstock, and Barbara Ann Halkier, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 42, Issue of October 27, 33712-33717, 2000
【非特許文献３】Yunde Zhao, Anna K. Hull, Neeru R. Gupta, Kendrick A. Goss, Jose Alonso, Joseph R. Ecker, Jennifer Normanly, Joanne Chory, and John L. Celenza, GENES & DEVELOPMENT 16: 3100-3112 (2002)
【非特許文献４】Peter Naur, Bent Larsen Petersen, Michael Dalgaard Mikkelsen, Soren Bak, Hasse Rasmussen, Carl Erik Olsen, and Barbara Ann Halkier, Plant Physiology, September 2003, Vol.133, 63-72
【非特許文献５】Giamoustaris,A and Mithen, R., (1995) Ann Appl Biol.126:347-363
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記ＣＹＰ遺伝子を高発現させた変異植物を作製しても、ＩＧｓの蓄積量の増加率は、せいぜい野生型の５倍程度である（非特許文献１〜４参照）。ＩＧｓをより大量に蓄積することのできる変異植物が得られれば、病害虫抵抗性物質、香辛料、抗ガン剤などに利用できるＩＧｓをより効率的に取得することができるため、その実現が望まれている。また、上記ＣＰＹ遺伝子を高発現させた変異植物は、矮化、帯化などの外観上の異常を引き起こすため、実用化に支障をきたす可能性が高い。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高発現させることによってＩＧｓの蓄積量をより向上させることのできる新規遺伝子、および、当該遺伝子を高発現させることで、外観上の異常を引き起こすことなく、ＩＧｓを多量に蓄積することができる新品種の植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らが構築したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＴ−ＤＮＡ挿入によるアクティベーションタギングライブラリから、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）抵抗性を有する変異体ｒｍｔ−１を選抜した。そして、この変異体ｒｍｔ−１において、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位に隣接して存在し、高発現している遺伝子をＩＧｓ合成に関与する遺伝子（以下、この遺伝子をＲＭＴ−１遺伝子と呼ぶ）として単離し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明にかかるポリヌクレオチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成に関与するポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチドである。
【０００９】
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１０】
上記のポリヌクレオチドによれば、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドを翻訳産物として得ることができる。
【００１１】
本発明にかかるポリペプチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするものである。
【００１２】
上記のポリペプチドによれば、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進することができる。
【００１３】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードするものであってもよい。上記のポリヌクレオチドによれば、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドを翻訳産物として得ることができる。
【００１４】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列からなるものであってもよい。この配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むゲノムの塩基配列である。
【００１５】
本発明にかかる形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記の何れかのポリヌクレオチドからなるものである。
【００１６】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、それが発現している細胞にトリプトファン類縁化合物（具体的には、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）など）に対する耐性を付与する。そのため、上記マーカー遺伝子は、当該トリプトファン類縁化合物に対する耐性を発現している形質転換細胞を選抜するためのマーカー遺伝子として利用することができる。
【００１７】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、それが発現している細胞にバクテリア、菌類に起因する植物の各種病害に対する抵抗性を付与するため、上記マーカー遺伝子を用いて形質転換体の選抜を行えば、病害抵抗性を有する形質転換体を取得することもできる。
【００１８】
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記の何れかのポリヌクレオチドを含むものである。上記の組換え発現ベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを細胞に導入するための組換え発現ベクターとして利用できるだけでなく、本発明に係るポリヌクレオチドを選抜マーカーとして用いた場合には、他の遺伝子を細胞に導入するための組換え発現ベクターとしても利用できる。
【００１９】
本発明にかかる形質転換体は、上記のポリヌクレオチドまたは上記の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、インドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドが発現しているものである。上記形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。また、上記植物細胞または植物体は、シロイヌナズナ由来のものであることが好ましい。
【００２０】
本発明にかかる上述の各形質転換体は、植物の生育に害となるトリプトファン類縁化合物（具体的には、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）など）に対して抵抗性を有する。
【００２１】
当該ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成が促進され、ＩＧｓの蓄積量を増加させることができる。
【００２２】
特に、上記形質転換体がシロイヌナズナの場合、ＩＧｓを野生型植物と比較して約２０倍蓄積することができる。つまり、この形質転換体は、ＩＧｓを高レベルに蓄積する変異植物である。また、この形質転換体は、非特許文献１〜５に記載のＣＹＰ遺伝子を高発現させた形質転換植物などで起きる植物の外観上の異常を引き起こさず、正常な外観を有している。それに加えて、この形質転換体は、稔性、１０００粒重など農作物として重要な形質には異常がないため、種々の目的に利用できる可能性を有しており、有用性が高い。
【００２３】
また、上記形質転換体を作製すれば、ＩＧｓおよびその派生物を大量に取得することができる。ＩＧｓおよび派生物は、アブラナ科の農作物（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツなど）の香味成分であるため、香辛料として利用することができる。また、ＩＧｓおよび派生物は、抗ガン作用を有することが知られており、上記形質転換体を利用することで、抗ガン剤の原料を効率的に生産することができる。また、本発明には上記形質転換植物から得られる種子も含まれる。
【００２４】
本発明にかかる形質転換体の具体例としては、本発明者らが構築したシロイヌナズナのアクティベーションタギングライブラリより選抜したｒｍｔ−１変異体が挙げられる。このｒｍｔ−１変異体においては、本発明にかかるポリヌクレオチドが高発現していることによって、野生型のシロイヌナズナと比較して約２０倍量のＩＧｓを蓄積することができる。
【００２５】
本発明にかかるインドールグルコシノレート類の生産方法は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするものである。上記の生産方法によれば、病害虫抵抗剤、香辛料、抗ガン剤などの原料として利用できるインドールグルコシノレート類を効率的に生産することができる。
【００２６】
本発明にかかる形質転換細胞の選抜方法は、上記のマーカー遺伝子または上記の組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファン類縁化合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファン類縁化合物に対する耐性を発現している細胞を選抜することからなるものである。
【００２７】
上記の選抜方法によれば、本発明のマーカー遺伝子を使用することで、これまで複数遺伝子を細胞に導入する際に使用できる選択マーカーの種類が制限されるといった問題を解決することができる。すなわち、通常選択マーカーとして使用されている抗生物質に対する耐性等の他に、トリプトファン類縁化合物、例えば５-メチルトリプトファンに対する抵抗性によって複数の目的ＤＮＡが導入された細胞の選抜が可能となる。また、本発明にかかるマーカー遺伝子を植物細胞に導入した場合、当該植物細胞から得られる形質転換植物の外観や稔性などには異常が起こらない。そのため、上記マーカー遺伝子を使用した本発明の選抜方法は有用である。
【００２８】
本発明にかかる形質転換キットは、少なくとも上記のポリヌクレオチド、あるいは、上記の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とするものである。上記の形質転換キットを用いれば、本発明に係るポリペプチドを発現する形質転換体を簡便かつ効率的に得ることができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明にかかるポリヌクレオチドによれば、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を行うことができる。そして、本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された本発明の形質転換体では、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成が促進され、ＩＧｓの蓄積量を増加させることができる。
【００３０】
ＩＧｓおよびその分解産物は、病害虫抵抗性物質として知られる他、製薬原料にもなる有用物質である。そのため、本発明の形質転換植物を利用すれば、これらの有用物質を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３２】
（１）本発明にかかるポリヌクレオチド
本発明にかかるポリヌクレオチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成を促進する活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【００３３】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドが意図される。
【００３４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００３５】
一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成に関与するポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
のいずれかである。
【００３６】
上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００３７】
上記のポリヌクレオチドのうち、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明者らが作製したシロイヌナズナの変異体ｒｍｔ−１において、高発現しているＲＭＴ−１遺伝子の塩基配列である。
【００３８】
また、他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の合成を促進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列
のいずれかである。
【００３９】
上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００４０】
また、他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列からなるものである。さらに別の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４１】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。つまり、本発明にかかるオリゴヌクレオチドであるアンチセンスＲＮＡを導入することによって、トリプトファンからインドールグルコシノレート類を合成する機能が低下し、植物中のインドールグルコシノレート類の含量を低下させることができる。
【００４２】
また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。本発明にかかるポリヌクレオチドの一例である、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、上記ＲＭＴ−１遺伝子のゲノムＤＮＡに相当する。このゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１に示される塩基配列中の第１〜５００番目の塩基配列、６０８〜６８８番目の塩基配列、９２６〜１２８６番目の塩基配列、１３２４〜１４０８番目の塩基配列、１４５４〜１５６６番目の塩基配列、１６０９〜１７３７番目の塩基配列、１８５２〜１９８３番目の塩基配列、２１０７〜２１９３番目の塩基配列、２３２３〜２４５７番目の塩基配列、２０５０〜２６０１番目の塩基配列、２６８５〜２９１８番目の塩基配列、３０００〜３０８８番目の塩基配列、３２２０〜３６０７番目の塩基配列、３８３４〜４０１５番目の塩基配列、４０９６〜４２１９番目の塩基配列、４３１３〜４４５１番目の塩基配列、４６５０〜４７９１番目の塩基配列、５０５７〜５１４１番目の塩基配列、５１９３〜５２９７番目の塩基配列、５４５７〜５６８５番目の塩基配列、５８２８〜６２７３番目の塩基配列、６３６９〜６４５６番目の塩基配列、６５３３〜６７９８番目の塩基配列、６９２２〜７０１３番目の塩基配列、７０５５〜７１０８番目の塩基配列、７１７２〜７２５１番目の塩基配列、７３６８〜７４６８番目の塩基配列、７６００〜７８５１番目の塩基配列、７９７０〜８０５８番目の塩基配列、８１３９〜８２３１番目の塩基配列、８５８４〜８６６５番目の塩基配列、８８１０〜９３００番目の塩基配列がそれぞれイントロン領域であり、それ以外の領域がエキソン領域である。そして、配列番号１に示す塩基配列は、上記ＲＭＴ−１遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の塩基配列である。
【００４３】
さらに、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４４】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００４５】
あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００４６】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、グルコシノレート類を二次代謝産物として生合成する植物、具体的にはアブラナ科に属する植物（例えば、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、シロイヌナズナなど）であることが好ましい。後述する実施例においては、シロイヌナズナから本発明にかかるポリヌクレオチドの一つであるＲＭＴ−１遺伝子を取得しているが、これに限定されるものではない。
【００４７】
（２）本発明にかかるポリペプチド
本発明にかかるポリペプチドは、上記（１）に記載したポリペプチドの翻訳産物であり、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するものである。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００４９】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００５０】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドである。
【００５２】
上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００５３】
なお、上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリペプチド、または、配列番号３に示される塩基配列からなるポリペプチドの翻訳産物である。このポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の第５４４〜５６６番目の領域、および、５７３〜５９５番目の領域に、Ｎ末端側が外側となる膜貫通ドメインを形成する。
【００５５】
（３）形質転換用マーカー遺伝子および形質転換細胞の選抜方法
本発明にかかるポリヌクレオチドは、形質転換用マーカー遺伝子として利用することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドからなるものであればよい。本発明にかかるポリヌクレオチドを導入された細胞はトリプトファン類縁化合物に対して耐性を有するため、トリプトファン類縁化合物を培地に添加することにより、当該ポリヌクレオチドが導入された細胞のみを選抜することが可能となる。選抜用薬剤として用いることができる細胞の増殖を阻害するトリプトファン類縁化合物としては、例えば、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）等を挙げることができる。
【００５６】
具体的に、本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換用マーカー遺伝子として利用するには、例えば、当該ポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを目的の細胞に導入する。当該発現ベクターが導入され、本発明に係るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現している細胞はトリプトファン類縁化合物に対して耐性を獲得するため、上記例示した選抜用薬剤が添加された培地においても増殖ができ、一方、当該発現ベクターが導入されていない細胞や本発明にかかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現していない細胞は増殖が阻害される。したがって、当該発現ベクターが導入され、本発明にかかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現している形質転換細胞のみを選抜することが可能となる。
【００５７】
上述の例では本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換細胞に発現させる遺伝子とマーカー遺伝子との両方の目的で用いているが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子としてのみ用いることも可能である。また、例えば、植物のカルス細胞に特異的な転写プロモーターを使用することにより、本発明にかかるポリヌクレオチドの選択マーカーとしての発現時期の制御も可能である。この場合は、さらに目的の細胞内で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて形質転換すればよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築せずに、本発明に係るポリヌクレオチドを単独で目的の細胞に導入することも可能である。
【００５８】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、それが発現している細胞にバクテリア、菌類に起因する植物の各種病害（うどん粉病、軟腐病、灰色カビ病、黒腐病、べと病など）に対する抵抗性を付与するため、交配育種における病害抵抗性個体を選抜するための遺伝子マーカーとしても利用することができる。
【００５９】
なお、本発明には上記本発明にかかるマーカー遺伝子または以下に説明する組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファン類縁化合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファン類縁化合物に対する耐性を発現している細胞を選抜する形質転換細胞の選抜方法も含まれる。
【００６０】
（４）組換え発現ベクターおよび形質転換キット
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００６１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００６２】
本組換え発現ベクターは、本発明にかかるポリペプチドを発現させるために用いることができることはいうまでもないが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子として利用し、他の遺伝子を組み込んで当該他の遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための組換え発現ベクターとしても利用できる。
【００６３】
本発明にかかるポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかるポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００６４】
上記ホスト細胞は、ＩＧｓ合成系を有する細胞、生物であれば、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えばアブラナ科植物やアブラナ科植物由来の植物細胞等を挙げることができる。
【００６５】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６６】
本発明に係る形質転換キットは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドまたは当該本発明にかかる組換え発現ベクターの少なくともいずれかを含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。当該形質転換キットを用いることにより、簡便かつ効率的に形質転換細胞を得ることができる。
【００６７】
（５）形質転換体
本発明にかかる形質転換体は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドまたは上記（４）に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、トリプトファンの二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類の合成を促進する活性を有するポリペプチドが発現している形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００６８】
また、ここで、「ポリヌクレオチドが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味するが、本発明では、これに加えてゲノム中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが生体内で高発現している場合も含むものとする。このゲノム中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが生体内で高発現している形質転換体の例としては、上述の変異体ｒｍｔ−１が挙げられる。
【００６９】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、トリプトファン合成系を有する細胞、生物であれば、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記（４）においてホスト細胞として例示した各種微生物等を挙げることができる。
【００７０】
本発明にかかる形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。このような形質転換植物は、細胞内または植物体内においてＩＧｓを合成することができる。そして、上記ポリヌクレオチドまたは組み換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、トリプトファンの二次代謝産物であるＩＧｓの合成が促進され、ＩＧｓの蓄積量を増加させることができる。このような形質転換体は、植物の病害虫に対する抵抗性を有する。
【００７１】
植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に限定しない。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを挙げることができる。なお、植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００７２】
植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、公知の種々の方法を用いることができる。また、形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行うことが可能である。
【００７３】
ゲノム内に本発明にかかるポリヌクレオチドが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体から得られる種子にも当該ポリヌクレオチドが導入されている。本発明には、形質転換植物から得られる種子も含まれる。
【００７４】
続いて、本発明の形質転換植物の性質について説明する。
【００７５】
本発明にかかる形質転換植物は、本発明にかかるポリヌクレオチドを導入されているため、植物に対して毒性を有する５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）などのトリプトファン類縁化合物に対して耐性を有する。
【００７６】
また、ＩＧｓの合成系に関与する遺伝子としては、上述のＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ８３Ｂ３１などが既に知られている。これらの遺伝子を高発現させても、合成されるＩＧｓの増加率は５倍程度である。これに対して、本発明にかかる形質転換植物ｒｍｔ−１は、ＩＧｓを２０倍という高レベルで蓄積する。ＩＧｓおよびその分解産物は、病害虫抵抗性物質として知られる他、製薬原料にもなる有用物質である。そのため、本発明の形質転換植物を利用すれば、これらの有用物質を効率的に生産することができる。
【００７７】
また、本発明の形質転換植物には、非選択性摂食害虫（非特異的摂食害虫、あるいはアブラナ科以外の植物に対する特異的摂食害虫：アワヨトウ、ハンスモンヨトウなど）の忌避効果が付与される。
【００７８】
本発明の形質転換植物には、選択性摂食害虫（特異的摂食害虫：コナガ、ヤガ、モンシロチョウなど）を誘引する性質が付与される。これらの害虫は、ＩＧｓの分解産物を産卵誘導物質として利用するため、これを高濃度で発散する本発明の形質転換植物に選択的に害虫を誘引し、産卵させることが可能となる。ＢＴ遺伝子あるいはＢＴ剤、ＩＧＲ剤などの農薬と併用することで、選択性摂食害虫の効果的な駆除、農作物の低農薬栽培が可能となる。
【００７９】
また、本発明の形質転換植物は、上述のＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ８３Ｂ３１を高発現させた形質転換植物などで起きる植物の外観上の異常を引き起こさず、正常な外観を有している。それに加えて、この形質転換植物は、稔性、１０００粒重など農作物として重要な形質には異常がないため、種々の目的に利用できる可能性を有しており、有用性が高い。
【００８０】
また、本発明の形質転換植物からは、ＩＧｓおよびその派生物を多量に得ることができる。ＩＧｓおよびその派生物は、アブラナ科の農作物（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツなど）の香味、苦味成分の主たるものであり、香辛料の原料として利用することができる。また、本発明の形質転換植物において、導入されるポリヌクレオチドの発現を随意に制御することで、植物の食味を多様に変化させることができる。
【００８１】
また、ＩＧｓおよびその派生物は、抗ガン効果があることが知られており、当該形質転換植物を使用して抗ガン剤の原料を効率的に生産することができる。
【００８２】
（６）ＩＧｓの生産方法
本発明は、本発明にかかる形質転換体を用いてインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）を生産する方法を提供する。
【００８３】
一実施形態において、本発明にかかるＩＧｓの生産方法は、本発明にかかるポリヌクレオチドが導入された形質転換体またはその組織を用いてＩＧｓを生産することを特徴とする。なお、上記形質転換体は植物である。
【００８４】
本実施形態の好ましい局面において、本発明にかかるＩＧｓの生産方法は、本発明にかかるポリヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを植物に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。さらに、本実施形態にかかるＩＧｓの生産方法は、上記植物からＩＧｓを抽出する工程を包含することが好ましい。
【００８５】
本発明のＩＧｓの生産方法によれば、ＩＧｓを多量に蓄積する本発明の形質転換体を利用しているため、病害虫抵抗剤、香辛料、抗ガン剤などの原料として利用できるＩＧｓを効率的に生産することができる。
【００８６】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８７】
本実施例では、本発明にかかるポリヌクレオチドの一つであるＲＭＴ−１遺伝子の単離、および、本発明にかかる形質転換体の一つであるｒｍｔ−１の機能解析を行った。
【００８８】
〔実施例１：ＲＭＴ−１遺伝子の単離〕
実施例１では、先ず、本発明者らのグループで独自に構築したシロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ挿入によるアクティベーションタギングライブラリ（ベクターは、R. Walden氏より提供されたもの）から５−メチルトリプトファンに対する抵抗性を有する変異体であるｒｍｔ−１を選抜した。
【００８９】
なお、上記アクティベーションタギングライブラリについては、下記の参考文献１〜３に記載されている。
【００９０】
参考文献１：Muto H, Yabe N, Asami T, Hasunuma K, Yamamoto KT. 
Overexpression of Constitutive Differential Growth 1 Gene, Which Encodes a RLCKVII-Subfamily Protein Kinase, Causes Abnormal Differential and Elongation Growth after Organ Differentiation in Arabidopsis.
Plant Physiol. 2004 Oct;136(2) Vol 136, pp.3124-3133
参考文献２：Fujibe T, Saji H, Arakawa K, Yabe N, Takeuchi Y, Yamamoto KT.
A methyl viologen-resistant mutant of Arabidopsis, which is allelic to ozone-sensitive rcd1, is tolerant to supplemental ultraviolet-B irradiation.
Plant Physiol. 2004 Jan;134(1):275-85. 
参考文献３：Nakazawa M, Yabe N, Ichikawa T, Yamamoto YY, Yoshizumi T, Hasunuma K, Matsui M.
DFL1, an auxin-responsive GH3 gene homologue, negatively regulates shoot cell elongation and lateral root formation, and positively regulates the light response of hypocotyl length.
Plant J. 2001 Jan;25(2):213-21.
このｒｍｔ−１では、Ｔ−ＤＮＡと表現型の共分離が確認されたため、既知挿入Ｔ−ＤＮＡ配列を利用し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によりＴ−ＤＮＡ挿入隣接ゲノム領域を回収した。回収した隣接配列を解析した結果、図１に示すように、Ｔ−ＤＮＡはシロイヌナズナの第５染色体上にhead-to-head（頭合わせ）で２コピー挿入されていることが確認された。図１には、シロイヌナズナの第５染色体において、Ｔ−ＤＮＡが挿入された部位およびその周辺領域を模式的に示す。
【００９１】
アクティベーションタギングは、ゲノムに挿入されたＣａＭＶ３５ＳＲＮＡプロモーター由来のエンハンサー配列により、挿入近傍に位置する遺伝子を転写レベルで活性化し、機能獲得型変異を単離する方法である。ここで単離された変異体ｒｍｔ−１においては、図１に示すように、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位に隣接して両側約３ｋｂの位置にそれぞれ１つずつの推定ＯＲＦ（ＯＲＦα、ＯＲＦβ）が存在していた。この２つの推定ＯＲＦについて、ＲＴ−ＰＣＲによって転写産物蓄積量を検定した結果、一方のＯＲＦαのみで転写産物がｒｍｔ−１特異的に蓄積していた（図１のＲＴ−ＰＣＲの結果を参照。なお、この図において、「Ｃｏｌ」は野生型シロイヌナズナを示す。）。なお、周辺に位置する他の推定ＯＲＦについて４０ｋｂの範囲で検討したが、ｒｍｔ−１変異体特異的に転写産物の蓄積が認められるものは存在しなかった。
【００９２】
そこで、このＯＲＦαが変異体ｒｍｒ−１の表現型の原因遺伝子（ＲＭＴ−１遺伝子）であると推測された。このＯＲＦαの塩基配列を確認したところ、そのオープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であることが確認され、そのゲノムの塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列であることが確認された。
【００９３】
次に、ｒｍｔ−１変異体において、既知のＩＧｓ合成関連遺伝子群（具体的には、Ｔｒｐ合成関連遺伝子：ＡＳＡ１、ＡＳＡ２、ＡＴＲ−１、フィトアレキシン合成関連遺伝子：ＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ８３Ａ１、ＣＹＰ７９Ｂ３、ＣＹＰ８３Ｂ１、ＣＹＰ７９Ｆ１、ＳＵＲ１、ＣＹＰ７９Ｆ１、ＣＹＰ８２Ｇ１、病害虫防御関連遺伝子：ＰＲ１、ＰＤＦ１．２）について、ＲＴ−ＰＣＲによってその転写産物蓄積量を検討した。
【００９４】
その結果を図２に示す。図２（ａ）にはＴｒｐ合成関連遺伝子の結果を示し、図２（ｂ）にはフィトアレキシン合成関連遺伝子の結果を示し、図２（ｃ）には病害虫防御関連遺伝子の結果を示す。また、比較のために野生型（Ｃｏｌ）の各遺伝子についてもＲＴ−ＰＣＲを行った。図では、各遺伝子について、左側に野生型の結果を示し、右側にｒｍｔ−１の結果を示している。図２に示すように、これら既知の遺伝子では、野生型Ｃｏｌ（左側）とｒｍｔ−１（右側）との間の転写産物の蓄積量に有意な差は見られなかった。このことから、ｒｍｔ−１の表現型の原因遺伝子（ＲＭＴ−１遺伝子）は、新規の遺伝子であることが示唆される。
【００９５】
〔実施例２：ｒｍｔ−１の機能の調査〕
実施例２では、変異体ｒｍｔ−１の機能解析を行った。なお、ここでは比較のために、野生型、および、既知の変異体ｔｒｐ−５についても同様の実験を行った。ｔｒｐ−５は、５ＭＴ抵抗性を有し、トリプトファン合成の律速酵素の一つであるアントラニル酸合成酵素（ＡＳ）活性が細胞内トリプトファン濃度によるフィードバック阻害を受けないという特性を有している。
【００９６】
（２−１）５−ＭＴに対する抵抗性の濃度依存性、および、種々のＴｒｐ類縁化合物に対する抵抗性の調査
野生型、変異体（ｒｍｔ−１、ｔｒｐ−５）において、５−ＭＴに対する抵抗性の濃度依存性を調べた。先ず、１％のスクロース、１％植物寒天、および、種々の濃度の５ＭＴを含む垂直に配置された１／２ＭＳ固体培地に、野生型および２種類の変異体の種子をまいた。そして、播種後１２日目にそれぞれの根の長さを測定した。その結果を図３（ａ）に示す。図３（ａ）のグラフでは、横軸に５−ＭＴの長さを示し、縦軸に根の長さを示している。この図に示すように、変異体ｒｍｔ−１は、野生型および変異体ｔｒｐ−５と比較して、５−ＭＴによって根の成長が抑制されにくいということが確認された。
【００９７】
次に、濃度１００μＭの種々のＴｒｐ類縁化合物（５ＭＴ、５ＦＴ、６ＭＡ（６−メチルアントラニル酸塩）、Ｌ−Ｔｒｐ）に対する抵抗性を調べた。先ず、１％のスクロース、１％植物寒天、および、濃度１００μＭの種々のＴｒｐ類縁化合物を含む垂直に配置された１／２ＭＳ固体培地に、野生型および２種類の変異体の種子をまいた。そして、播種後１２日目にそれぞれの根の長さを測定した。その結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）のグラフでは、１２個体の平均と標準偏差を示す。図３（ｂ）のグラフでは、横軸に各植物種および各Ｔｒｐ類縁化合物の種類を示し、縦軸に根の長さを示している。この図に示すように、変異体ｒｍｔ−１は、野生型および変異体ｔｒｐ−５と比較して、５−ＭＴ、５−ＦＴに対する高い抵抗性を有していることが確認された。以上の結果から、変異体ｒｍｔ−１は、植物に投与すると致死的な５−ＭＴ、５−ＦＴに対して高い抵抗性を有していると言える。
【００９８】
（２−２）遊離トリプトファン含量とＡＳ活性の調査
続いて、変異体ｒｍｔ−１に付与された５ＭＴ抵抗性が何に起因するものかについての調査を行った。ｒｍｔ−１が５−ＭＴ抵抗性を有する原因として第一に考えられるのは、ＡＳの活性変化およびそれに起因する細胞内トリプトファンの濃度上昇である。
【００９９】
そこで、ここでは、野生型（Ｃｏｌ）と変異体ｒｍｔ−１において、遊離トリプトファンの含有量と、ＡＳ活性を調査して、それぞれの比較を行った。
【０１００】
まず、野生型（Ｃｏｌ）と変異体ｒｍｔ−１における遊離トリプトファン濃度を調べるために、播種後１４日目の各植物体の地上部（ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔ）および根（ｒｏｏｔ）の成分が、１０容量あるいは２０容量のメタノールでそれぞれ抽出された。抽出物は、以下の条件下で逆相ＨＰＬＣを行って解析された。
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ４．６×１５０ｍｍ、勾配：５％−４０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ（３０分）、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ
その結果を図４（ａ）に示す。なお、図４（ａ）のグラフには、３検体の平均値と標準偏差を示す。また、グラフにおけるｒｍｔ−１（１）、および、ｒｍｔ−１（２）は、ともにホモ接合体を樹立する過程で取得された分離個体番号であり、基本的には遺伝的に同一のものである。
この図に示すように、ｒｍｔ−１変異体における遊離トリプトファンの含有量は、野生型と比較してやや多い程度であることが確認された。
【０１０１】
次に、野生型（Ｃｏｌ）と変異体ｒｍｔ−１におけるＡＳ活性を調べるために、播種後１４日目の各植物体について、地上部（ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔ）と根（ｒｏｏｔ）の成分が抽出された。その結果を図４（ｂ）に示す。なお、図４（ｂ）のグラフでは、縦軸にＡＳ活性（ｐｋａｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示している。また、この図４（ｂ）のグラフでは、３検体の平均値と標準偏差を示す。この図に示すように、ｒｍｔ−１変異体におけるＡＳ活性は、野生型と比較してせいぜい２倍程度であることが確認された。
【０１０２】
以上の結果から、ｒｍｔ−１が５−ＭＴ抵抗性を有する原因は、ＡＳの活性変化およびそれに起因する細胞内トリプトファンの濃度ではないことが示唆された。
【０１０３】
（２−３）Ｔｒｐおよび５−ＭＴによるＡＳのフィードバック阻害の変化の調査
ｒｍｔ−１が５−ＭＴ抵抗性を有する原因として次に考えられるのは、Ｔｒｐおよび５−ＭＴによるＡＳのフィードバック阻害の変化である。
【０１０４】
そこで、野生型および変異体ｒｍｔ−１において、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ、５ＭＴの添加による用量依存的なＡＳ活性のフィードバック阻害の解析を行った。播種後１４日目の植物体の地上部（ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔ）および根（ｒｏｏｔ）の抽出物が、ＡＳ活性の決定に使用された。図５（ａ）には地上部の結果を示し、図５（ｂ）には根の結果を示す。なお、図５の各グラフに示す値は、３検体の平均値である。この図に示すように、野生型と変異体ｒｍｔ−１とで有意な差は見られず、ｒｍｔ−１が５−ＭＴ抵抗性を有する原因は、ＡＳのフィードバック阻害が解除されたことによるものではないことが示唆された。
【０１０５】
（２−４）ｒｍｔ−１変異体の地上部の代謝産物のプロファイリング
次に、ｒｍｔ−１変異体の地上部の代謝産物のプロファイリングを行った。播種後１４日目のｒｍｔ−１変異体の地上部の成分が１０容量のメタノールで抽出された。抽出物は、以下の条件下で逆相ＨＰＬＣを行って解析された。
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ４．６×１５０ｍｍ、勾配：５％−４０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ（３０分）、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ
その結果を図６、７に示す。図６は、逆相ＨＰＬＣによるプロファイリングチャートを示し、図７は、このプロファイリングチャートから得られた主要なピークを同定し、その面積を算出してグラフ化したものである。図７の各グラフに示す値は３検体の平均値である。図６中「Ｎ．Ｉ．」で示すものは、同定できなかったものを示す。本実施例では、比較のために野生型（図では「Ｃｏｌｕｍｂｉａ（ＷＴ）」と記す）についても代謝産物のプロファイリングを行った。その結果も図６にあわせて示す。
【０１０６】
図６、７に示すように、ｒｍｔ−１では、ピークＡのインドールグルコシノレート（ＩＧＳ）の蓄積量が、特異的に野生型に比べて約２０倍程度増加していることが確認された。
【０１０７】
（２−５）ｒｍｔ−１変異体の根の代謝産物のプロファイリング
次に、ｒｍｔ−１変異体の根の代謝産物のプロファイリングを行った。播種後１４日目のｒｍｔ−１変異体の根の成分が２０容量のメタノールで抽出された。抽出物は、以下の条件下で逆相ＨＰＬＣを行って解析された。
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ４．６×１５０ｍｍ、勾配：５％−４０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ（３０分）、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ
その結果を図８、９に示す。図８は、逆相ＨＰＬＣによるプロファイリングチャートを示し、図９は、このプロファイリングチャートから得られた主要なピークを同定し、その面積を算出してグラフ化したものである。図９の各グラフに示す値は３検体の平均値である。図８中「Ｎ．Ｉ．」で示すものは、同定できなかったものを示す。本実施例では、比較のために野生型（図では「Ｃｏｌｕｍｂｉａ（ＷＴ）」と記す）についても代謝産物のプロファイリングを行った。その結果も図８にあわせて示す。
【０１０８】
図８、９に示すように、地上部ほどではないが、ｒｍｔ−１では、ピークＡのインドールグルコシノレート（ＩＧＳ）の蓄積量が、特異的に野生型に比べて約５倍程度増加していることが確認された。
【０１０９】
（２−６）ｒｍｔ−１変異体の乾燥種子の代謝産物のプロファイリング
次に、アブラナ科植物の種子では特異的なグルコシノレート類（例えば、マスタードオイルの辛味成分）が蓄積していることが知られていることから、ｒｍｔ−１変異体の乾燥種子の代謝産物のプロファイリングを行った。１００ｍｇのｒｍｔ−１変異体の乾燥種子の成分が２０容量のメタノールで抽出された。抽出物は、以下の条件下で逆相ＨＰＬＣを行って解析された。
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ４．６×１５０ｍｍ、勾配：５％−４０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ（３０分）、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ
その結果を図１０に示す。図１０は、逆相ＨＰＬＣによるプロファイリングチャートを示す。本実施例では、比較のために野生型（図では「Ｃｏｌ」と記す）についても代謝産物のプロファイリングを行った。その結果も図１０にあわせて示す。
【０１１０】
図１０に示すように、乾燥種子では、地上部・根と異なりｒｍｔ−１変異体と野生型との間で変化は認められなかった。
【０１１１】
（２−７）カビ、病原性微生物に対するｒｍｔ−１の抵抗性の調査
植物に感染して病害を発生させるカビ（Alternaria brassicicola）および病原性微生物（Erwinia carotovora）に対するｒｍｔ−１変異体の抵抗性の調査を行った。比較のために、野生型に対しても同様の実験を行った。カビあるいは病原性微生物の感染は、以下のようにして行った。
【０１１２】
培養されたカビ（Alternaria brassicicola（ＮＣＢＲ３１２２６））の分生胞子を５×１０５個／ｍｌ濃度で含む懸濁液の小滴３μｌを、播種後１４日目のｒｍｔ−１および野生型の４つの葉に接種した。図１１の上段には、接種後８６時間が経過した各植物体の様子を示す。
【０１１３】
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に０．５−１．０×１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌの濃度で懸濁された病原性微生物（Erwinia carotovora（ＮＣＢＲ３３８０））の３μｌの小滴が、播種後１４日目のｒｍｔ−１および野生型４つの葉の上に置かれた。図１１の下段には、播種後８６時間が経過した各植物体の様子を示す。
【０１１４】
図１１に示すように、ｒｍｔ−１変異体の抵抗性を野生型と比較した場合、カビ（Alternaria brassicicola）に対する抵抗性については大きな差は認められなかったが、感染すると植物に軟腐病を発症させる軟腐病菌（Erwinia carotovora）に対してより高い抵抗性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、ＩＧｓを多量に蓄積することのできる新品種の植物を得ることができる。ＩＧｓおよびその分解産物は、病害虫抵抗性物質、香辛料、抗ガン剤をはじめとする製薬原料として利用することのできる有用物質であるため、本発明は、農業、食品製造業、医薬品製造分野などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】シロイヌナズナの第５染色体において、Ｔ−ＤＮＡが挿入された部位およびその周辺領域を示す模式図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、野生型と変異体ｒｍｔ−１について、既知のＩＧｓ合成関連遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲによって比較した結果を示す模式図である。
【図３】（ａ）は、野生型および変異体（ｒｍｔ−１、ｔｒｐ−５）において、５−ＭＴに対する抵抗性の濃度依存性を調べた結果を示すグラフである。（ｂ）は、野生型および変異体（ｒｍｔ−１、ｔｒｐ−５）において、種々のＴｒｐ類縁化合物に対する抵抗性を調べた結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は、野生型と変異体ｒｍｔ−１において、遊離トリプトファンの含有量を調べた結果を示すグラフである。（ｂ）は、野生型と変異体ｒｍｔ−１において、ＡＳ活性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】野生型および変異体ｒｍｔ−１において、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ、５ＭＴの添加による用量依存的なＡＳ活性のフィードバック阻害の解析を行った結果を示すグラフである。（ａ）には地上部の結果を示し、（ｂ）には根の結果を示す。
【図６】ｒｍｔ−１変異体の地上部の代謝産物を逆相ＨＰＬＣでプロファイリングした結果を示すプロファイリングチャートである。
【図７】図６に示すプロファイリングチャートから得られた主要なピークを同定し、その面積を算出してグラフ化したものである。
【図８】ｒｍｔ−１変異体の根の代謝産物を逆相ＨＰＬＣでプロファイリングした結果を示すプロファイリングチャートである。
【図９】図８に示すプロファイリングチャートから得られた主要なピークを同定し、その面積を算出してグラフ化したものである。
【図１０】ｒｍｔ−１変異体の乾燥種子の代謝産物を逆相ＨＰＬＣでプロファイリングした結果を示すプロファイリングチャートである。
【図１１】カビ、および、病原性微生物に感染したｒｍｔ−１変異体および野生型の植物の様子を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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