(57)【要約】【課題】  安定した品質を有し、製剤化工程および製剤への影響を防止できるレシチン化ス−パーオキシドディスムターゼ製品を提供する。【解決手段】  ヒト由来スーパーオキシドディスムターゼ等のスーパーオキシドディスムターゼをレシチン化して得られるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼの水性液を、該水性液が接する面がポリテトラフルオロエチレン、テトラフルオロエチレン−エチレン共重合体、テトラフルオロエチレン−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）共重合体等のフッ素樹脂からなる容器に収容したレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ製品。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ水性液を、該水性液が接する面がフッ素樹脂からなる容器に収容してなるレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ製品。
【請求項２】
フッ素樹脂がテトラフルオロエチレン−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）共重合体である請求項１記載のレシチン化スーパーオキシドディスムターゼ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レシチン化スーパーオキシドディスムターゼ製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと略記する。）は、動物、植物、微生物などの生体内に広く分布する酵素である。ＳＯＤは、反応性に富む遊離（フリー）の活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカルを不均化分解する活性を有する。ＳＯＤは、抗リウマチ剤、自己免疫性疾患治療剤、心筋梗塞治療剤、臓器移植時の使用、脳梗塞後の抗血栓剤の使用時に生体内で生じるラジカルの除去を目的とする使用、および種々の炎症への適用等が期待されている（非特許文献１参照。）。
ＳＯＤは、例えば、標的となる患部への集積性、生体内での安定性等を格段に向上させるために、ＳＯＤのレシチン化を行い、レシチン化ス−パーオキシドディスムターゼ（以下、ＰＣ−ＳＯＤと略記する。）としたものが製剤として提案されている（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特許第３０７０９８０号公報
【非特許文献１】谷口直之編、「活性酸素の臨床への展望」、医薬ジャーナル社、東京  ６１−１１１頁（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、該ＰＣ−ＳＯＤを水性液として保存した場合、活性のばらつきが生じる現象が認められた。この活性のばらつきは、製剤化工程および製剤に影響を与える可能性があった。
本発明は、かかる問題に鑑みてなされたものであり、安定した品質を有し、製剤化工程および製剤への影響を防止できるＰＣ−ＳＯＤ製品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、ＰＣ−ＳＯＤ水性液の活性のばらつきの一因が、これを収容する容器にあることを見出した。すなわち、ＰＣ−ＳＯＤ水性液をガラス製容器、またはポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等の非フッ素系樹脂からなる容器に保存した場合に、該容器の内壁面にＰＣ−ＳＯＤの吸着等が起こることによって、該水性液の活性低下が起こることをみいだした。そして容器の種類を検討した結果、該水性液が接する面がフッ素樹脂からなる容器を用いることによって活性の低下を抑制できることをみいだした。さらに、該容器を用いることにより、安定した品質で、低温条件下で製品を保存できることをみいだした。
すなわち本発明は、ＰＣ−ＳＯＤ水性液を、該水性液が接する面がフッ素樹脂からなる容器に収容したＰＣ−ＳＯＤ製品を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品中のＰＣ−ＳＯＤは、酵素活性が一定であることから、製剤化において含量のばらつきを考慮する必要がなく、得られる製剤の品質を一定にできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明におけるＰＣ−ＳＯＤ水性液は、ＰＣ−ＳＯＤを精製水、イオン交換水、蒸留水、注射用水等の水に溶解、懸濁、または分散させてなる液であり、溶解させてなる水溶液であることが好ましい。
ＰＣ−ＳＯＤ水性液中のＰＣ−ＳＯＤの量は、該水性液に対して０．１〜３００ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜５０ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。
ＰＣ−ＳＯＤ水性液は、ＰＣ−ＳＯＤおよび水以外の成分を含まないことが好ましい。
【０００７】
本発明におけるＰＣ−ＳＯＤは、ＳＯＤがレシチン化された化合物であり、公知ないしは周知のＰＣ−ＳＯＤが含まれる。
【０００８】
ＰＣ−ＳＯＤ中のＳＯＤとしては、天然型のＳＯＤ、または天然型のＳＯＤのアミノ酸残基の配列をコードする塩基配列の一部を、部位特異的突然変異法等の遺伝子操作を用いることにより変異させることによって発現したＳＯＤが挙げられる。
ＳＯＤの構造は、ヒト由来のＳＯＤと同一のアミノ酸配列を有するＳＯＤ（以下、ヒト由来ＳＯＤと記す。）が好ましい。
ヒト由来ＳＯＤの入手方法としては、特に限定されず、（１）ヒト起源のＳＯＤ、（２）ヒト起源のＳＯＤをコードする遺伝子配列の一部を、遺伝子操作を用いることにより変異させることによって発現させたＳＯＤ（たとえば、１１１位のシステイン残基がセリン残基に変異したＳＯＤ）等が挙げられる。
【０００９】
レシチン化とは、ＳＯＤにレシチン残基が直接または結合基を介して結合することをいう。該レシチン残基とは、レシチンのグリセロールの１位または２位の炭素原子に結合する脂肪酸１分子がとれて水酸基となったリゾレシチンにおいて、該水酸基に結合基が結合した基をいう。
本発明におけるＰＣ−ＳＯＤとしては、ＳＯＤのアミノ基に、グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの該水酸基から水素原子を除いた残基が、結合基を介してＳＯＤに結合した化合物であるのが好ましい。
結合基としては、直鎖状ジカルボン酸、およびその無水物、そのエステル、またはその反応性誘導体からなる化学的橋かけ剤に由来する残基が挙げられ、式−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ただし、ｎは２〜１０の整数を示す。）が好ましい。
【００１０】
上記（２）のＰＣ−ＳＯＤとしては、たとえば、特許第３０７０９８０号公報に記載される、下記式［１］で表されるＰＣ−ＳＯＤが好ましい。
Ａ−［Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−Ｂ］ｍ  ・・・［１］
Ａ：銅および／または亜鉛が配位した、１１１位がセリンで示されるヒト由来のＳＯＤの残基。
Ｂ：グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基。
ｍ：１以上の整数。
ｎ：２以上の整数。
【００１１】
ＰＣ−ＳＯＤ水性液の調製方法は、特に限定されず、たとえば特許第３０７０９８０号公報、特開平９−１１７２７９号公報等に記載の方法に従って実施でき、ＳＯＤのレシチン化反応を行ったあと、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法によって精製したのち、ＰＣ−ＳＯＤの濃度を所望の濃度に調整することによって得ることができる。
【００１２】
本発明における容器とは、ＰＣ−ＳＯＤ水性液が接する面がフッ素樹脂からなる容器であり、容器全体がフッ素樹脂からなる容器であってもよく、容器の内壁面がフッ素樹脂から構成される容器であってもよい。
フッ素樹脂としては、公知ないしは周知の含フッ素重合体からなるフッ素樹脂が挙げられる。含フッ素重合体としては、含フッ素重合性モノマーの１種以上を重合させた重合体、含フッ素重合性モノマーの１種以上とフッ素原子を含まない他の重合性モノマーの１種以上とを重合させた重合体が挙げられる。
含フッ素重合体の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）共重合体（ＰＦＡ）、ＣＦ２＝ＣＦＯ（ＣＦ２）２ＣＦ＝ＣＦ２の環化重合体、ペルフルオロ（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソール）重合体等が挙げられ、成型加工性に優れることから、ＰＦＡが好ましい。
ＰＦＡとしては、テトラフルオロエチレンのモノマー単位が０．１〜９９．９％、ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）のモノマー単位が９９．９〜０．０１％である共重合体が好ましい。
【００１３】
本発明における容器に用いるフッ素樹脂は、前記含フッ素重合体のみからなっていてもよく、または含フッ素重合体に可塑剤等の添加剤を添加した含フッ素重合体組成物からなっていてもよく、前者が好ましい。
容器として、含フッ素重合体または含フッ素重合体組成物を成型して、容器全体がフッ素樹脂からなる容器を用いる場合には、圧縮成形、押出し成形、射出成形、切出成形、溶融加工等の成形方法により製造した容器が好ましい。
また、容器の内壁面が含フッ素重合体または含フッ素重合体組成物等のフッ素樹脂から構成される容器を用いる場合には、非フッ素系重合体材料からなる容器の内壁面を前記含フッ素重合体または含フッ素重合体組成物から形成された被膜で被覆されてなる容器を用いることが好ましい。
非フッ素系材料からなる容器としては、ガラス；ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリカーボネート等の非フッ素系樹脂；アルミニウム、ステンレス等の金属等からなる容器が挙げられ、容器の密閉性が高く、容器破損の可能性を低減できる点から、非フッ素系樹脂または金属からなる容器が好ましい。
また、含フッ素重合体または含フッ素重合体組成物から形成された被膜の膜厚としては０．１μｍ〜５ｍｍが好ましい。
【００１４】
本発明における容器の形状、大きさは、特に限定はなく、ＰＣ−ＳＯＤ製品の用途、出荷形態等に応じて適宜設定すればよい。形状としては、バイアル瓶等が挙げられる。
本発明における容器が蓋を有する場合には、蓋部分はフッ素樹脂から構成されていても、他の樹脂から構成されていてもよい。後者の場合には、ＰＣ−ＳＯＤ水性液が接する面はフッ素樹脂から構成されていることが好ましい。
【００１５】
フッ素樹脂からなる容器に収容されるＰＣ−ＳＯＤ水性液の容量は、該容器の内容積に対し、１／１０００以上の容量が好ましく、１／１００以上の容量が特に好ましく、上限量は、凍結時のＰＣ−ＳＯＤ水性液の体積増の観点から、０．９／１が好ましい。
【００１６】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品は、ＰＣ−ＳＯＤ水性液を容器に充填した後、充填口を密閉または密封して得ることができる。また、必要に応じて、容器中の気相部分を窒素置換する等の操作を行ってもよい。
【００１７】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品の保管については、０℃以下の低温条件が好ましく、−２０〜−８０℃で保管するのが特に好ましい。特にフッ素樹脂からなる容器を用いた場合には、低温条件で保管する際に、水性液が凍結して容積が増加したとしても、容器の破損等をおこすことなく製品の品質を一定に保ちうる。
【００１８】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品中のＰＣ−ＳＯＤ水性液は、添加剤の添加、希釈、乾燥、濾過等の操作を行うことによって製剤とすることができる。製剤形態としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用事溶解用固形製剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げられる。
【実施例】
【００１９】
以下に本発明を具体的に説明するが，本発明はこれら実施例に限られるものではない。
［参考例１］ＰＣ−ＳＯＤ水性液の製造
２０Ｌのフラスコに注射用蒸留水（大塚製薬社製、商品名：大塚蒸留水、以下同様。）（９０００ｍＬ）を添加し、ホウ酸（２７．７ｇ）、ＮａＯＨ（３．６ｇ）、ＫＣｌ（３３．７ｇ）を順次添加し溶解した。つぎに、ＳＯＤ水溶液（１００ｇ、ＳＯＤ濃度１１３．６ｍｇ／ｍＬ）を添加後、２１０ｒｐｍで撹拌しながら、クロマトチャンバー内で８℃にしておいたイソプロピルアルコール（２０００ｍＬ）を３３ｍＬ／分で滴下し、ＳＯＤ溶液を調製した。
【００２０】
特許第３０７０９８０号公報に記載の方法に従って製造した下記レシチン誘導体（１５．７ｇ）をイソプロピルアルコール（５００ｍＬ）に溶解した。つぎに、疎水性フィルターで濾過し、不溶物を除去した。濾液にイソプロピルアルコールを添加し、総容量を８０００ｍＬとしてレシチン誘導体溶液を調製した。溶液温度は８℃であった。つぎに、このレシチン誘導体溶液（８０００ｍＬ）を、前記ＳＯＤ溶液中に６６ｍＬ／分で滴下し、２１０ｒｐｍで４時間撹拌した液を反応液とした。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
ホウ酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５±０．２）とメタノールとの１：１（容量比）混合溶液であらかじめ平衡化したイオン交換樹脂（Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  ｓｆ  Ａ−５００）を充填したカラムに、反応液全量を担持させた。前記混合溶液で未吸着物質を溶出し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１Ｈ−テトラゾール、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを含む画分を得た。
次いで、ＮａＣｌを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５±０．２、ＮａＣｌ濃度＝２５ｍｍｏｌ／Ｌ）とメタノールとの１：１（容量比）からなる溶出溶媒を用いて、未修飾ＳＯＤを溶出させた。
次いで、ＮａＣｌを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５±０．２、ＮａＣｌ濃度＝２００ｍｍｏｌ／Ｌ）とメタノールとの１：１（容量比）からなる溶出溶媒を用いて溶出した画分をＰＣ−ＳＯＤ組成物画分とした。
【００２３】
ＰＣ−ＳＯＤ組成物画分を限外濾過することにより塩類およびメタノールを除き、注射用蒸留水に置換し、濃度を調整するために濃縮した。限外濾過膜には、ミリポア社のＰＬＧＣ０００５（分画分子量１０，０００、膜面積０．５ｍ２）を用いた。限外濾過透過側の電気伝導度が、注射用蒸留水と同じになったところで濾過操作を終了し、さらに溶液中のＰＣ−ＳＯＤ濃度を約４０ｍｇ／ｍＬに調整してＰＣ−ＳＯＤ組成物の水性液（Ｌｏｔ．００１）を得た。ここまでの操作は、４℃に保冷したクロマトチャンバー内で、液温を測定しながら実施した。
【００２４】
分取用ＨＰＬＣにより、ＰＣ−ＳＯＤ組成物中のＰＣ−ＳＯＤの各ピークに対応する画分を分取した。ＨＰＬＣのカラムには、Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ−ＲＰ（７５ｍｍ×４．６ｍｍ、東ソー社製）を用い、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸と２０％アセトニトリルとの水溶液、０．０７５％トリフルオロ酢酸と９０％アセトニトリルの水溶液を濃度勾配をかけて、０．８ｍＬ／分で流した。検出器としてはＵＶ検出器（波長２２０ｎｍ）を用い、カラム温度は室温とした。
得られた画分についてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、ＰＣ−ＳＯＤの分子量、およびフラグメントを測定した。ＰＣ−ＳＯＤの１分子に結合するレシチン誘導体の結合数（ｍ）と、各結合数に相当するＰＣ−ＳＯＤの比率（モル％）、ｍの平均値、およびＰＣ−ＳＯＤ二量体あたりのｍの平均値を求めた。その結果、水性液に含まれるＰＣ−ＳＯＤには１〜４分子のレシチン誘導体が結合しており、ｍ＝１であるＰＣ−ＳＯＤが３１モル％、ｍ＝２であるＰＣ−ＳＯＤが４３モル％、ｍ＝３であるＰＣ−ＳＯＤが１６モル％、ｍ＝４であるＰＣ−ＳＯＤが１０モル％であり、ｍの平均値が２であり、二量体あたりのｍの平均値が４であった。
【００２５】
［実施例１］
内容積３０ｍＬのＰＦＡ（ＮＡＬＧＥＮＥ社製）製容器５個に、参考例１で製造したＰＣ−ＳＯＤ水性液を各５ｍＬ入れ、−６０℃で１か月間保存した。その結果、ＰＦＡ製容器の破損は観測されなかった。
【００２６】
［比較例１］
内容積５０ｍＬのガラス製容器５個に、参考例１で製造したＰＣ−ＳＯＤ水性液を各２５ｍＬ入れ、−６０℃で１か月間保存した。その結果、２個のガラス製容器に亀裂が入り、破損していることが分かった。
【００２７】
［実施例２］
内容積１００ｍＬおよび５００ｍＬのＰＦＡ製容器に、参考例１で製造したＰＣ−ＳＯＤ水性液を各容器の内容積の約半量入れ、−８０℃で凍結させ、１日保存し、その後室温に戻した。
各容器内の試料につき、比活性値の測定と、ＨＰＬＣ分析を行った。比活性値は、Ｙ．Ｏｙａｎａｇｉ（ＳＯＤと活性酸素調節剤、９５Ｐ，（１９８９））、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４、６０４９、（１９６９））、Ｋ．Ａｓａｄａ（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８、４７１、（１９７４））に記載の方法に従って求めた。
比活性値
保存前：３２９５、保存後：３２００
ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣの分析条件は、カラムとして、ＹＭＣ  Ａ−５０２  Ｓ−５  １２０Ａ  ＣＮ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用い、移動相には、０．１％トリフルオロ酢酸と２０％アセトニトリルとの水溶液、および０．０７５％トリフルオロ酢酸と９０％アセトニトリルとの水溶液を、濃度勾配をかけて０．８ｍＬ／分で流した。検出器はＵＶ検出器（波長２２０ｎｍ）を用い、カラム温度を室温とした。
ＨＰＬＣ分析によると、保存前のＰＣ−ＳＯＤ濃度を１００．０％とすると、保存後の濃度も１００．０％であった。
以上の結果から、ＰＦＡ製容器に保存した場合には、ＰＣ−ＳＯＤの容器内壁への吸着は認められなかった。
【００２８】
［比較例２］  
半径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのポリプロピレン製容器（内容積５ｍＬ）に、参考例１で製造したＰＣ−ＳＯＤ水性液を、高さ３ｃｍまで入れ、０℃で１時間保存する。実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ分析を行う。ＨＰＬＣ分析によると、保存前のＰＣ−ＳＯＤの濃度を１００．０％とすると、保存後の含量が９９．１％まで減少する。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品は、収容されるＰＣ−ＳＯＤ水性液の保存中の活性低下が防止でき、容器破損の懸念もない。そのため、本発明のＰＣ−ＳＯＤ製品を用いることにより、活性が一定であり安定した性質を有するＰＣ−ＳＯＤ製剤を得ることができる。