(57)【要約】      （修正有）【課題】因子ＶＩＩＩ阻害剤ならびに因子ＶＩＩＩのフォンビルブラント因子（ｖＷｆ）および／または膜リン脂質（ＰＬ）との結合を阻害する阻害剤によって誘導されるものをはじめとする免疫不全の診断および／または治療を改善するための、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列、その断片およびエピトープを得ること。【解決手段】因子ＶＩＩＩのポリペプチド配列のグルタミン酸１６４９とアスパラギン２０１９の間、好適にはアルギニン１６５２とアルギニン１９１７の間に含まれる、またはアラニン１０８とメチオニン３５５の間、アスパラギン酸４０３とアスパラギン酸７２５の間、もしくはリジン２０８５とリジン２２４９の間に含まれる、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列。【選択図】図１
2006316062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−下記の配列によって定義されるアルギニン１６５２とチロシン１６６４の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000024
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１６８１とアルギニン１６９６の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000025
−下記の配列によって定義されるトレオニン１７３９とチロシン１７４８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000026
−下記の配列によって定義されるアスパラギン１７７７とフェニルアラニン１７８５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000027
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１７９４とチロシン１８１５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000028
−下記の配列によって定義されるメチオニン１８２３とアスパラギン酸１８３１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000029
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８８５とフェニルアラニン１８９１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000030
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８９３とアラニン１９０１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000031
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１９０９とアルギニン１９１７の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000032
−下記の配列によって定義されるアラニン１０８とバリン１２８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000033
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８１とロイシン１９２の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000034
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２０３とグルタミン２１８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000035
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸３２７とメチオニン３５５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000036
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸４０３とリジン４２５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000037
−下記の配列によって定義されるバリン５１７とアルギニン５２７の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000038
−下記の配列によって定義されるヒスチジン６９３とグリシン７０１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000039
−下記の配列によって定義されるセリン７１０とアスパラギン酸７２５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000040
−下記の配列によって定義されるリジン２０８５とフェニルアラニン２０９３の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000041
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２１０８とグリシン２１２１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000042
−下記の配列によって定義されるグリシン２２４２とリジン２２４９の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000043
から成る群から選択されることを特徴とする、因子ＶＩＩＩの抗原断片。
【請求項２】
同一または異なる少なくとも２つの他のアミノ酸と結合したチロシンおよび／またはヒスチジンを含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の断片および／またはエピトープの強い部分。
【請求項３】
因子ＶＩＩＩ阻害剤との免疫親和性を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の断片または強い部分。
【請求項４】
抗因子ＶＩＩＩ抗体との免疫親和性を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の断片または強い部分。
【請求項５】
Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の受容体に対する免疫親和性を示すことを特徴とする、請求項３または４に記載の断片または強い部分。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一つに記載の少なくとも２つの異なる断片、少なくとも２つの異なるエピトープ、および／または少なくとも２つの異なる強い部分を含んでいることを特徴とする、立体配座依存性エピトープ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、および／またはエピトープもしくは断片の強い部分から成る群から選択された要素に結合したキャリアータンパク質またはキャリアーペプチドを含む複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、エピトープもしくは配列の強い部分、および／または複合体との免疫親和性を示すことを特徴とする、因子ＶＩＩＩ阻害剤。
【請求項９】
抗因子ＶＩＩＩ抗体またはその断片であることを特徴とする、請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の因子ＶＩＩＩ阻害剤に対するものであることを特徴とする抗阻害剤。
【請求項１１】
抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体またはその断片であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、強い部分、複合体、阻害剤、および／または抗阻害剤から成る群から選択された少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、強い部分、複合体、阻害剤、および／または抗阻害剤から成る群から選択された少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする診断装置。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、強い部分、複合体、阻害剤、および／または抗阻害剤から成る群から選択された少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする精製装置。
【請求項１５】
診断キットであることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の装置。
【請求項１７】
請求項１２に記載の医薬品組成物を使用することを特徴とする、免疫障害の予防および／または治療のための医薬品調製方法。
【請求項１８】
免疫障害が、因子ＶＩＩＩ阻害剤、フォンビルブラント因子への因子ＶＩＩＩの結合の阻害剤、および／または膜リン脂質に対する因子ＶＩＩＩの結合の阻害剤によって誘発される障害であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬品調製方法。
【請求項１９】
−クロマトグラフィーカラムの固体担体に、請求項１〜７のいずれか１つに記載の断片、エピトープ、強い部分、および／または複合体から成る群から選択された要素を固定する過程、
−前記クロマトグラフィーカラムに、因子ＶＩＩＩ阻害剤を有する患者の生理的液体を通す過程、
−請求項１〜７のいずれか一つに記載の断片、エピトープ、強い部分、および／または複合体から成る群から選択された少なくとも１つの要素と免疫親和性を示した因子ＶＩＩＩ阻害剤の画分を溶出し、回収する過程、
から成ることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１つに記載の阻害剤および／または抗阻害剤の識別方法および獲得方法。
【請求項２０】
−回収した因子ＶＩＩＩ阻害剤をクロマトグラフィーカラムの固体担体上に固定する過程、
−抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体などの抗因子ＶＩＩＩ阻害剤を前記カラムに通す過程、
−因子ＶＩＩＩ阻害剤と免疫親和性を示した抗阻害剤を溶出し、回収する過程、
から成ることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトープおよびこのエピトープの強い部分、この配列に対する阻害剤、その断片、そのエピトープおよび／またはこのエピトープの強い部分、ならびに前記阻害剤に対する抗阻害剤に関するものである。
【０００２】
本発明はさらに上述の分子を含む医薬品組成物ならびに診断装置にも関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年、イオン交換クロマトグラフィーによって、あるいはもっと最近では免疫親和性によって血漿の大きなプールから精製された因子ＶＩＩＩの調製剤が、血友病患者のために十分な量で提供されている。
【０００４】
遺伝子工学によって得られた因子ＶＩＩＩの多種多様な調製剤が現在開発または臨床研究段階にある。これらの因子ＶＩＩＩは完全な分子、または欠失分子である（Ｂｉｈｏｒｅａｕ（１９９２））。
【０００５】
因子ＶＩＩＩは血漿凝固のグリコタンパク補助因子であり、因子Ｘ（ＦＸ）の活性化部位に作用する。因子ＶＩＩＩとその作用機構の特性化は、血漿中の濃度が低く、サイズが不揃いで、酵素分解感受性が極端に高いので一層困難である。この反応はＦＸの、活性化した因子Ｘ（ＦＸａ＝Ｓｔｕａｒｔ因子）へのタンパク質加水分解を含み、酵素（活性化した因子ＩＸすなわちＦＩＸａ）を含む複合体（Ｔｅｎａｓｅ複合体）、補助因子（活性化した因子ＶＩＩＩすなわちＦＶＩＩＩａ）、カルシウムイオンおよびリン脂質を介在させる。
【０００６】
因子ＶＩＩＩは非常に複雑なタンパク質なので、遺伝子配列は１９８４年以来判明しているものの（Ｖｅｒｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，ｐｐ．３１７−３４２（１９８４））、血漿因子ＶＩＩＩの完全な構造も（タンパク質の５０％近くの配列が決定されただけ）、炭水化物の正確な構造もまだ確立されていない。ＤＮＡの配列は因子ＶＩＩＩの一次配列を決定するものと認められた（バイオテクノロジーに由来する治療物質についてＦＤＡが規定した誘導体に対するまれな例外）。
【０００７】
しかしながら、血漿因子ＶＩＩＩと組換え因子ＶＩＩＩの間のわずかな差異が確定された。グリコシル化、注入後の血漿中半減期などである。
【０００８】
因子ＶＩＩＩは大半が肝細胞内で合成される。それは哺乳類、昆虫および酵母の細胞内でクローニングされた（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。これらの生命工学的方法で産生したグリコタンパク質は天然のタンパク質と比較して糖の構造と組成に差異があることがある。因子ＶＩＩＩのｃＤＮＡはトランスジェニックヒツジにも発現した（Ｈａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０００９】
ｃＤＮＡは、小胞体内で切断された１９のアミノ酸のシグナルペプチドを含む２３５１のアミノ酸のポリペプチドをコードする。翻訳後の修飾、つまりセリンおよびトレオニンのグリコシル化ならびに硫酸イオンのチロシン残基への付加は、ゴルジ装置内で起きる。成熟した後、タンパク質は次に、２価イオンによって結合された２１０ｋＤａ（１６４８残基）と８０ｋＤａ（１６４９から２３３２残基）の２本の鎖の形で血漿内に分泌され、そのもっとも軽いものはＮ−末端によってフォンビルブラント因子（ｖＷｆ）に非共有結合で結合する（因子ＶＩＩＩ１分子当たりｖＷｆ１分子）。血漿内でこの複合体は５０倍多いｖＷｆの存在の下で疎水および親水結合によって安定化される。後者は因子ＶＩＩＩのリン脂質への固定を阻害する。因子ＶＩＩＩが血小板に結合する事実は立証されたが、血小板の表面に発現した特異的受容体の存在は明確には実証されていない（Ｎｅｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。膜のリン脂質の上に固定した後、ＦＩＸａに対する親和性が高い結合部位を明らかにする（Ｂａｒｄｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００１０】
因子ＶＩＩＩはＡ１：Ａ２：Ｂ：Ａ３：Ｃ１：Ｃ２（図１）に組織された３つの構造ドメインＡ、Ｂ、Ｃで形成される（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ，１９９２；Ｂｉｈｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ドメインＡは４０％を越える相同性を有し、またセルロプラスミンとも相同である。さらに因子ＶのドメインＡと因子ＶＩＩＩのドメインＡの間にも３０％の相同性がある。ドメインＣは２回介在し、複合糖質と総電荷が負のリン脂質を結合することができる（Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ（１９９２）；Ｆａｙ，ＰＪ，１９９３）。それは電荷が負のリン脂質に結合することのできるレクチンとの相同性を有する。この辺りに血小板への固定部位が同定された（ドメインＣ２）（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０））。因子ＶＩＩＩの質量の４０％超をしめるドメインＢは特定の活性が全く知られていないが、例えば、トロンビンの作用から保護して因子ＶＩＩＩの調節に微妙な役割を果たしている可能性がある。他のタンパク質との相同性は知られていない。
【００１１】
それは因子ＶＩＩＩで確認された２５のうち１９のグリコシル化部位を有する。ヒトとブタの因子ＶＩＩＩのアミノ酸の配列の比較から、この領域Ｂにおける主要な相違が明らかにされた。しかしながら、ブタの因子ＶＩＩＩは阻害剤を示す血友病患者の治療に効果的に使用された。この所見から、この領域Ｂのコード部分が欠失し、血友病の治療のための欠失した組換え因子ＶＩＩＩの産生を可能にする因子ＶＩＩＩ遺伝子の構築に至った。
【００１２】
免疫精製によって、様々な形の活性因子ＶＩＩＩが単離され、それらは共通して８０ｋＤａの軽鎖を有し、その重鎖は２１０から９０ｋＤａの分子量を有することがある。これらの形は重鎖のＣ末端の段階的分解により生じる。２本の鎖の結合は非共有結合であり、ドメインＡ１とＡ３に関与する残基の間の２価金属イオン（Ｍｅ++）の結合によって生じる。活性化複合体（５０−４５ｋＤａ）（接近可能なドメインＡ２を有する重鎖）と７０ｋＤａ（軽鎖）の形成後、不活性化段階が観察されたが、これはおそらくトロンビンとの長い接触と、５０ｋＤａと４５ｋＤａの断片の解離によるものである。因子ＶＩＩＩａは、重鎖のタンパク質加水分解の後に、活性化したプロテインＣ（ＡＰＣ）によっても不活性化される。この不活性化は因子ＶＩＩＩａがリン脂質表面に固定されたときに加速する。この因子ＶＩＩＩａの活性の「ダウンレギュレーション」は血小板酵素によるリン酸化に依存する（Ｋａｌａｆａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０））。
【００１３】
今日までに単離された各種のマウスのモノクローナル抗体によって認識された大半のエピトープは、因子ＶＩＩＩの「機能部位」に位置しているとは思われない。因子ＶＩＩＩの活性に対する効果（発色試験および／または凝固試験の阻害）を有する抗体によって認識されるいくつかのエピトープが同定された。
【００１４】
これらの抗原決定基は断片３５１−３６５（ドメインＡ１−重鎖）、７１３−７４０（ドメインＡ２）、１６７０−１６８４（ドメインＡ３−軽鎖）（軽鎖のＮＨ2末端）または２３０３−２３３２（ドメインＣ２−軽鎖)（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃ，（１９９０））、断片７０１−７５０（Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））、１６７３−１６８９（Ｌｅｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））、３３０−４７２、１６９４−１７８２（ＥＰ−０  ２０２  ８５３)、３２２−７４０および２１７０−２３２２（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））によって構成される。
【００１５】
抗体はこれら各種の部位を認識し、それぞれ、因子ＶＩＩＩの活性化、ｖＷｆの結合、またはリン脂質の結合に干渉する。
【００１６】
試験管内での古典的な活性試験を阻害しないその他の抗体は、活性部位から遠く離れた分子の部位に固定することによって、凝固カスケードの他の構成要素との因子ＶＩＩＩの作用に影響する可能性がある。活性部位は、このように修飾され、その特性のいくつかを変化させて因子ＶＩＩＩの天然の折り畳みに干渉する可能性がある（「アロステリックモデル」）。
【００１７】
これらの「マッピング」実験は大腸菌の中でクローニングされた因子ＶＩＩＩ遺伝子の断片によって合成されたペプチドを使用し、これらのモノクローナル抗体によって認識された抗原決定基のおよその位置しか示さない。事実、識別された断片のサイズは３０から１００アミノ酸に渡っている。
【００１８】
現在、タンパク質の抗原部位を明確に識別するために、タンパク質を結晶化し、Ｘ線で分析する必要がある。残念ながら、高分子であることが結晶化の大きな障害になっている因子ＶＩＩＩについては、データは全くない。
【００１９】
抗原領域はこれら領域の親水性と一致している。つまり、オリゴペプチド配列が外部媒体にさらされる（表面に位置する）ほど、この部分は免疫化反応において認識されやすくなる。反対に、一般的にタンパク質の内部に位置する疎水性部分は、抗原性が低いと考えられる。
【００２０】
現在、血友病患者、臨床医および分画業者の念頭を占めているのは、病原性の血漿汚染と副作用が一切ない、精製された因子ＶＩＩＩを入手可能にすることである。
【００２１】
しかしながら、マウスのモノクローナル抗体を用いた免疫精製の後でも、哺乳類の細胞内における遺伝子組換えによって得た後でも、高純度で精製した因子ＶＩＩＩは極度に不安定で、その理由は明確ではない。それを安定化させるために、精製過程でヒト血漿アルブミンを大量に添加して、最終的な特異的活性がタンパク質１ｍｇあたり２−３Ｕ程度になるようにする。ＣＨＯ細胞内で、天然の安定化因子であるフォンビルブラント因子とともに同時発現したｒ因子ＶＩＩＩについても同様である。これらのデータが示唆するところでは、精製過程が、因子ＶＩＩＩの天然の折り畳みに干渉できるようになることで因子ＶＩＩＩ分子に影響し、程度の差はあっても安定した立体配座の変化を引き起こし、患者の中に注入した後に新たな潜在的エピトープが明らかになる可能性がある。
【００２２】
報告（Ｌｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｓｕｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）；Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））によれば、多数の治療上の因子ＶＩＩＩ投与を受ける血友病患者の５から５０％に見られる重篤な合併症の１つが、因子ＶＩＩＩを不活性化し、それ以降の一切の因子ＶＩＩＩ投与を無効にする、抗体（阻害剤）の出現である。
【００２３】
病理的抗因子ＶＩＩＩ活性を有する自己抗体の自然発生は非血友病患者においてはまれであり（有病率＝１０-5）、免疫不全のある、あるいは産褥期の高齢者に見られる（Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９１），Ｈｕｌｔｉｎ（１９９１））。３４３５人の血友病患者の多重研究により、５歳未満の患者を含めてすべての年齢群に関与していることがわかった。大多数（８２％）が非常に高い反応（＞１０ＢＵ）を示した（Ｓｕｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））。この抗因子ＶＩＩＩ抗体は主としてＩｇＧ４タイプのＩｇＧから構成されるとされているが、ＩｇＧ２（Ｇｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｂ）、ＩｇＡおよびＩｇＭも報告されている（Ｌｏｔｔｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７））。これらは他の哺乳類の精製された異種の因子ＶＩＩＩ分子とはあまり反応しない（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２））。現時点では、一部の血友病患者で阻害剤の発生を誘発する原因は分かっていない。遺伝子欠失の重篤性と、免疫反応が因子ＶＩＩＩを自己のタンパク質と認めなくなることとの間に関連があるとしても、この関連はごく一部の患者においてしか実証されていない。遺伝子マーカーに結びつく、特異的な宿主の感受性は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の特定の決定基との選択的な関連（Ｈｏｙｅｒ（１９９１））のようには実証されていないが、これはおそらく、特異的抗体によって認識される因子ＶＩＩＩのすべてのエピトープがまだ決定されていないからである。さらに因子ＶＩＩＩの異なる調製法が、その構造、その物理化学特性またはその天然の微小環境に影響する（Ｖｅｒｍｅｙｌｅｎ，Ｊ  ａｎｄ  Ｐｅｅｒｌｉｎｃｋ（１９９１）；Ｇｏｍｐｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｐｅｅｒｌｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））。Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅら（１９８３）は、リン脂質がヒトの特異的抗体による不活性化から凝血活性を保護する可能性を示した。病理的兆候のない健康なドナーの１７％（５００の提供された血漿に対してスクリーニングを実施）に天然の抗因子ＶＩＩＩ抗体が存在することは、生理学的な因子ＶＩＩＩが有する３次元的構造の相をもっとよく知ることの重要性を示している（Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉａｖｏｎｉ（１９９２））。
【００２４】
動物モデルにおける、また臨床試験の際の、リンパ球混合培養物について研究した輸血では、輸血を受けた側の免疫修飾の変化が認められ、同種免疫と一部の免疫機能のダウンレギュレーションが誘導された。これは抑制細胞や抗イディオタイプ抗体の形、またはＮＫ細胞の減少で現れる。すべてはある程度の耐性を誘導したかのように現れる。これらの作用はインターロイキン−２（ＩＬ−２）を投与することで逆転できる（Ｔｒｉｕｌｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。試験管内では、ＩＬ−２の分泌の阻害効果ならびに末梢血液の単核細胞の増殖が、因子ＶＩＩＩのクリオプレシピテートまたは純度の低い調製物（タンパク質１ｍｇあたり０．５から１０Ｕ）の存在の下で得られた（Ｍａｄｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｗａｄｈｗａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。これらの効果は、ｒ因子ＶＩＩＩまたは免疫親和性によって精製された因子ＶＩＩＩが存在するときは観察されなかった。後者の調製物はＴ細胞を活性化する効果がある（Ｍａｄｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかしながら、これらのデータを生体内の状況に直接適用することはできない。
【００２５】
臨床的に投与する前に、因子ＶＩＩＩ調製物の免疫原性もしくは免疫修飾効果、または宿主の感受性に関する予測を可能にする実験モデルは存在しない。このモデルは、特異的活性が非常に高い、免疫精製あるいはＤＮＡ工学技術によって得られた因子ＶＩＩＩ調製物を使用する現在の臨床試験において抗因子ＶＩＩＩ抗体の発生頻度が増加しているだけに、絶対的に必要である（Ｓｅｒｅｍｅｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１））。さらに、Ａｌｅｄｏｒｆ（１９９３）は、以前に輸血を受けたことがない（ＰＵＰＳ）初体験の被験者に対してこれら２つのタイプの調製物を使用すると最高２７％の阻害剤の有病率が観察されることを示した。
【００２６】
抗因子ＶＩＩＩ免疫反応を示す患者は、重い、攻撃的な、極端に高価な手段の使用が必要な、重大な状況にいる。もっとも広く使用されている技術の一つが、濃縮プロトロンビン複合体（ＦＥＩＢＡ）と組み合わせて（Ｂｏｎｎプロトコール）極めて高用量の因子ＶＩＩＩ（１００から２００Ｕ／ｋｇ／日）を定期的に注射して、個体に充満させることであり（Ｅｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８））、これによって血液中の阻害剤の割合を効果的に下げることができる（Ｓｕｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）。さらに、この種の治療は非常に長期間継続しなければならない（Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。もっと低い用量の因子ＶＩＩＩを使用して実施した試験では、抗因子ＶＩＩＩ抗体の割合がはるかに低い患者においてある程度の成功が認められた（Ｇｒｕｐｐｏ，（１９９１））。
【００２７】
別の方法は、患者の抗因子ＶＩＩＩによって中和されず止血を可能にする、ブタの因子ＶＩＩＩのようなヒト以外の種の因子ＶＩＩＩの使用である。多重研究によって、このような治療の利点が明らかにされたが、同時に抗ブタ因子ＶＩＩＩ抗体の存在も明らかにされた（Ｌｏｚｉｅｒ（１９９３）；Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；Ｈａｙ  ａｎｄ  Ｂｏｌｔｏｎ−Ｍａｇｇｓ（１９９１）；Ｃｌｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））。組換えＤＮＡによって得られた活性化した因子ＶＩＩＩも、阻害剤を示す患者において凝固を生じさせる別の方法として使用された（Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１））。
【００２８】
最近、阻害剤の割合を減らすために効果を上げた戦略は（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０））、シクロホスファミドなどの細胞増殖抑制剤で処理しながら、プロテインＡに全てのＩｇＧを固相において吸収することを可能にするために、患者に体外循環を施すというものである。
【００２９】
免疫抑制処置との組み合わせの有無を問わず、多価の免疫グロブリンの静脈投与（ＩＶＩＧ）は比較的効果があることがわかったが、この有効性の理由はまだ十分確定されていない。様々な仮説が立てられ、ＩｇＧ合成のフィードバック阻害、そのクリアランスの促進、サプレッサーＴ細胞の活性化（Ｂｌｏｏｍ（１９９２））などが挙げられている。興味深いことに、これらの市販の静脈投与用免疫グロブリンは、可変部（イディオタイプ）において抗因子ＶＩＩＩ抗体と反応してそれらを中和することのできる抗体を含んでいるという。この抗イディオタイプ抗体の活性はそれぞれのドナーに固有で、ＩｇＧプールにおいて相乗作用があると思われる（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））。
【００３０】
残念ながらこれらのアプローチのいずれも、安全性、有効性および費用の面から不十分であることがわかった。
【非特許文献１】Ｖｅｒｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，ｐｐ．３１７−３４２（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、因子ＶＩＩＩ阻害剤ならびに因子ＶＩＩＩのフォンビルブラント因子（ｖＷｆ）および／または膜リン脂質（ＰＬ）との結合を阻害する阻害剤によって誘導されるものをはじめとする免疫不全の診断および／または治療を改善するための、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列、その断片およびエピトープを得ることを目的とする。
【００３２】
本発明の別の目的は、同じく免疫不全の診断および／または治療を改善するために、この抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトープとの免疫親和性を示す阻害剤を得ることである。
【００３３】
補足的な目的は、免疫不全の診断および／または治療を改善するために、上述の前記阻害剤に対する抗体をはじめとする抗阻害剤を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
図１は因子ＶＩＩＩのポリペプチド配列を図示したものである。
【００３５】
図２は、１から３７１のアミノ酸の番号を付け直した因子ＶＩＩＩのＡ３配列の親水性を図示したものである（それぞれのアミノ酸についての表面値）。
【００３６】
図３はこの因子ＶＩＩＩのＡ３配列の柔軟性を図示したものである。
【００３７】
図４はこの因子ＶＩＩＩのＡ３配列の接近可能性を図示したものである。
【００３８】
図５は図２から４に示した値の総和を全体として図示したものである。
【００３９】
図６はＥＬＩＳＡ試験によってマウスの血清内の抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在を明らかにした図である。
【００４０】
本発明は、Ｖｅｒｈａｒら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．３３９（１９８４））が記載しているような、因子ＶＩＩＩおよび／またはその断片の抗原ポリペプチド配列に関するものである。
【００４１】
「因子ＶＩＩＩのポリペプチド配列」とは、因子ＶＩＩＩの合成および／または遺伝子操作による（即ち、場合によっては、血液凝固機構に関与しない部分が欠失した配列も含む）、Ｃｏｈｎ画分Ｉをはじめとする血漿プールの精製によって得られた、場合によってはグリコシル化した、ヒトまたは動物の天然の配列を意味する。
【００４２】
本発明は特に、アラニン３２２−セリン７５０、ロイシン１６５５−アルギニン１６８９、リジン１６９４−プロリン１７８２およびアスパラギン酸２１７０−チロシン２３３２断片が欠失した、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列に関するものである。
【００４３】
本発明は特に、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＣ（Ｃ１およびＣ２）に関するものである。
【００４４】
以下本明細書において、アミノ酸は下表に示したごとく３文字の略号または１文字の記号で示すものとする。
【表１】
2006316062.tif 000003
【００４５】
本発明の第一の実施態様は、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列Ａ３、その断片および／またはエピトープに関するものである。前記配列は、Ｖｅｒｈａｒら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．３３９（１９８４））およびＴｏｏｌｅら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．３４２−３４７（１９８４））が公表しているような因子ＶＩＩＩのポリペプチド配列のグルタミン酸１６４９とアスパラギン２０１９の間に含まれ、好適にはアルギニン１６５２とアルギニン１９１７の間またはアルギニン１８０３とアルギニン１９１７の間に含まれる。
【００４６】
好適には、前記配列の断片は、アルギニン１６５２とアルギニン１６９６、好適にはアルギニン１６５２とアルギニン１６８９の間、トレオニン１７３９とアスパラギン酸１８３１の間、またはグルタミン酸１８８５とアルギニン１９１７の間に含まれる。
【００４７】
本発明は、
−下記の配列によって定義されるアルギニン１６５２とチロシン１６６４の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000004
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１６８１とアルギニン１６９６の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000005
−下記の配列によって定義されるトレオニン１７３９とチロシン１７４８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000006
−下記の配列によって定義されるアスパラギン１７７７とフェニルアラニン１７８５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000007
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１７９４とチロシン１８１５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000008
−下記の配列によって定義されるメチオニン１８２３とアスパラギン酸１８３１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000009
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８８５とフェニルアラニン１８９１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000010
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８９３とアラニン１９０１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000011
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１９０９とアルギニン１９１７の間に含まれるエピトープ
2006316062.tif 000012
をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。
【００４８】
有利には、前記配列、その特定の断片、およびそのエピトープは、付属の図の２から５に示した抗原特性を示す。
【００４９】
本発明のもう一つの推奨実施態様は、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列Ａ１、その断片および／またはエピトープに関するものである。
【００５０】
好適には、前記配列の断片は、アラニン１０８とメチオニン３５５の間に、好適にはアラニン１０８とグルタミン２２８の間に含まれる。
【００５１】
本発明はさらに、
−下記の配列によって定義されるアラニン１０８とバリン１２８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000013
−下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８１とロイシン１９２の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000014
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２０３とグルタミン２１８の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000015
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸３２７とメチオニン３５５の間に含まれるエピトープ：
2006316062.tif 000016
をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。
【００５２】
本発明のもう一つの推奨実施態様は、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列Ａ２、その断片および／またはエピトープに関するものである。
【００５３】
好適には、前記配列の断片は、アスパラギン酸４０３とアスパラギン酸７２５の間に、好適にはヒスチジン６９３とアスパラギン酸７２５の間に含まれる。
【００５４】
本発明はさらに、
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸４０３とリジン４２５の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000017
−下記の配列によって定義されるバリン５１７とアルギニン５２７の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000018
−下記の配列によって定義されるヒスチジン６９３とグリシン７０１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000019
−下記の配列によって定義されるセリン７１０とアスパラギン酸７２５の間に含まれるエピトープ
2006316062.tif 000020
をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。
【００５５】
本発明のもう一つの推奨実施態様は、因子ＶＩＩＩの抗原ポリペプチド配列Ｃ、その断片および／またはエピトープに関するものである。好適には、前記配列の断片は、リジン２０８５とリジン２２４９の間に、好適にはリジン２０８５とグリシン２１２１の間に含まれる。
【００５６】
本発明はさらに、
−下記の配列によって定義されるリジン２０８５とフェニルアラニン２０９３の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000021
−下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２１０８とグリシン２１２１の間に含まれるエピトープ、
2006316062.tif 000022
−下記の配列によって定義されるグリシン２２４２とリジン２２４９の間に含まれるエピトープ
2006316062.tif 000023
をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。
【００５７】
本発明はさらに、前記エピトープまたは前記断片の強い部分、即ち因子ＶＩＩＩ阻害剤に対して意外にも特に高い親和性を示す、アミノ酸のチロシンとヒスチジンを含む前記エピトープの配列の部分にも関するものである。好適には、これらの強い部分は、同一または別の他の少なくとも２つのアミノ酸と結合した前記アミノ酸チロシンまたはヒスチジンを含んでいる。
【００５８】
これらの配列、これらの断片およびこれらのエピトープ、特にエピトープまたは断片の強い部分は、Ｐａｒｋｅｒ，ＧｕｏおよびＨｏｄｇｅｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，ｐｐ５４２５−５４３２（１９８６））が記載しているような高い親水性、ＫａｒｐｌｕｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ（Ｋａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ７２，ｐ２１２（１９８５）が記載しているような大きな柔軟性、およびＪａｎｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７，ｐｐ４９１−４９２（１９７９）が記載しているような大きな接近可能性によって、特に有利に特徴づけられる（参照：図２から５）。
【００５９】
これらの断片およびこれらのエピトープは特に因子ＶＩＩＩタンパク質の表面に露出し、顕著な抗原特性を示す。
【００６０】
有利には、前記ポリペプチド配列、その断片、そのエピトープおよび／または前記断片もしくはエピトープのこれらの強い部分は、さらに、独立して免疫原性であり（即ち、ＢＳＡ、ヘモシアニンなどの大きなサイズのタンパク質と複合体を形成しなくても免疫原性となる）、好適には抗因子ＶＩＩＩ抗体などの因子ＶＩＩＩ阻害剤との免疫親和性を示し、および／または、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の受容体に対する免疫親和性を示す。
【００６１】
この配列、これらの断片、これらのエピトープ、および／または前記断片もしくは前記エピトープの強い部分は、ウサギに注射したときに免疫反応（抗体の合成）を引き起こす。
【００６２】
これらの特徴は、それぞれ１６から２２のアミノ酸である比較的「長い」アミノ酸配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のエピトープについては、特に重要である。
【００６３】
従って、これらの配列は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に対する強い免疫原性を有する。
【００６４】
しかしながら、これらの配列は合成によって簡単に得られるほど十分短い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
例えば、ペプチドＡｓｐ１６８１−Ａｒｇ１６９６とＡｓｐ３２７−Ｍｅｔ３５５を、ＥＬＩＳＡ試験によってマウスの血清内の抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在を明らかにするために合成した。
【００６６】
遊離ペプチド（結合タンパク質に結合していない）を、次の手順に従って２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射した。
−０日：不完全フロイントアジュバント内で乳化したペプチド１００μｇを筋肉注射した。
−７、１４、２１および２８日：ペプチド５０μｇによる免疫化。
【００６７】
毎日、注射の前に血液サンプルを採取した。ポリスチレンマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を、４０ＩＵ／ｍｌで希釈した血漿因子の調製剤で満たした。５０μｌのマウス抗血清の段階希釈物（１／６０、１／３００および１／６００）をウェルに添加した。インキュベーションおよび洗浄の後、抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在を、ビオチンで標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の１／５０００希釈物を５０μｌ添加して明らかにした。インキュベーションおよび洗浄の後、ウェルを５０μｌのアビジン＝ペルオキシダーゼ（１／２５００）とインキュベートし、洗浄し、最後に、１００ｍｌのＯＰＤをウェルに添加した。光学密度を４９０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡの結果を付属の図６に示した（ＥＸ１、ＥＸ２およびブランクの役割を果たすサンプルＢＬＣ）。
【００６８】
本発明はさらに、前記配列の少なくとも２つの異なる断片、配列の少なくとも２つのエピトープ、および／または本発明による、上述のように識別された、前記エピトープまたは前記異なる断片の少なくとも２つの強い部分を含む、立体配座依存性エピトープにも関するものである。
【００６９】
立体配座依存性エピトープは、タンパク質が三次構造または四次構造に折り畳んだ際に互いに近接して位置する、ポリペプチド配列の２つまたはそれ以上の異なる部分で構成される。
【００７０】
これらのエピトープは、Ｂリンパ球（組織適合性の強い遺伝子座（ＭＨＣ  Ｉおよび／またはＩＩ）を介して）および／または抗因子ＶＩＩＩ抗体（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７６，ｐ４３７（１９９０））をはじめとする因子ＶＩＩＩ阻害剤により、好適には同時に、「認識」される（即ち、免疫親和性を示すことができる）。
【００７１】
好適には、前記配列、前記断片、前記エピトープおよび／または前記エピトープもしくは前記断片の強い部分は、ＢＳＡまたはヘモシアニンなどのキャリアータンパク質またはキャリアーペプチドと複合体を形成して、より強い免疫原性を示す複合体を形成する。
【００７２】
本発明の別の側面は、本発明による抗原ポリペプチド配列、前記配列の断片およびエピトープ、前記エピトープもしくは前記断片の強い部分、および／または本発明による複合体との免疫親和性を示す、因子ＶＩＩＩ阻害剤に関するものである。
【００７３】
阻害剤とは、因子ＶＩＩＩとともに、および／またはそれに対して介在して、免疫不全を引き起こす可能性のある、一切の生物学的分子または細胞を意味する。
【００７４】
特に、かかる阻害剤は、前記因子ＶＩＩＩを不活性化し、ならびに／または因子ＶＩＩＩとフォンビルブラント因子および／または膜リン脂質との結合を阻害する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（ガンマグロブリン）または（前記抗体の超可変部Ｆａｂなどの）抗因子ＶＩＩＩ抗体の断片であることがある。
【００７５】
有利には、前記阻害剤は、ヒトの抗体を産生するＳＣＩＤ−ｈｕマウスのような、ヒトの免疫系を有する「キメラ」動物によって合成される。
【００７６】
ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウスは、抗原受容体に関与する遺伝子の組換えの機能障害により、機能的Ｂリンパ球またはＴリンパ細胞が欠損している。ＳＣＩＤマウスの免疫系は、胎児の臓器あるいは末梢血液から得られるヒト由来の免疫担当細胞によって再構成することができる（Ｍｏｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８））。
【００７７】
いったん再構成されると、これらのＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、自発的にあるいは免疫付与の後、ヒト抗体を産生する。
【００７８】
ヒトとマウスの因子ＶＩＩＩの間に劇的な交差反応は存在しないと思われる（Ｋｅｓｓｌｅｒ，１９９１）。
【００７９】
末梢血液のリンパ球を、様々なタイプのドナーから採取した：非血友病のボランティア、古典的方法で検出できる阻害剤が欠損した血友病患者、阻害剤の割合が高い血友病の患者、および自己抗体を産生するドナー。
【００８０】
このモデルを２種類の研究に使用した。まず、単一のドナーの細胞でマウスを再構成し、系の再現可能性を検証した後、複数個の因子ＶＩＩＩ調整剤の免疫原性を比較することができる。
【００８１】
他方、このモデルによって、クローンレベルでの抗因子ＶＩＩＩ反応を得て、研究することができる。
【００８２】
Ｂ細胞のモノクローナル抗体の特異的反応の研究は極めて重要である。なぜならこのことにより因子ＶＩＩＩの配列依存性エピトープおよび立体配座依存性エピトープの正確な識別が可能になるからである。Ｂ細胞は、抗因子ＶＩＩＩ抗体を産生するマウスの脾臓から、抗ＣＤ４０抗体の存在の有無を問わず、クーロン培養されるか、あるいはＥＢＶウィルスの存在の下で形質転換される。抗ＣＤ４０抗体は膜抗原を認識し、線維芽細胞株の存在の下でＢ細胞を活性化する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９１））。従って、これらの免疫的にドミナントなエピトープを免疫治療の標的候補として使用することが可能である。
【００８３】
Ｂリンパ球のクローンに担持されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩマーカーの決定は、遺伝子レベルで抗因子ＶＩＩＩ抗体の免疫反応を分析することを可能にし、それによって特異的Ｔ細胞による認識を追跡することができる。これもまたこの病理に結びつく危険因子の存在を確かめるための優れた方法である。
【００８４】
抗因子ＶＩＩＩモノクローナル抗体の調製のために選択されたＢＡＬＢ／Ｃマウスに、あらかじめ２週間間隔で３回、組換え因子ＶＩＩＩ（ｒ因子ＶＩＩＩ）溶液を注射する。このタイプの調製剤は、タンパク質による汚染が最小限の高濃度の高純度因子ＶＩＩＩを含むという利点がある。最後の注射から４日目に、脾細胞をマウスの骨髄腫細胞（ＳＰ２０７）と融合した（ｖａｎ  Ｓｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｉｅ（１９８２））。抗因子ＶＩＩＩ抗体を産生するハイブリドーマを、その上であらかじめｒ因子ＶＩＩＩを不溶化したポリスチレンプレートを使用して、ＥＬＩＳＡ技術によって選別する。抗因子ＶＩＩＩ抗体を含むハイブリドーマの上澄みを限界希釈法でクローニングし、次いで試験管内で培養した。
【００８５】
抗体を、これらの上澄みからクロマトグラフィーによって精製した。
【００８６】
軽鎖（ｋまたはｌ）および抗因子ＶＩＩＩモノクローナル抗体のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）の定量化、決定は、ＥＬＩＳＡ技術で実施する。
【００８７】
因子ＶＩＩＩ分子の上で認識されたエピトープは、天然の、またはトロンビンで酵素切断した因子ＶＩＩＩの溶液の免疫転移技術によって決定する。
【００８８】
産生された抗因子ＶＩＩＩモノクローナル抗体の機能阻害能力は、個別に、凝集法（Ｂｅｔｈｅｓｄａ法）（Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５））によって、および因子ＶＩＩＩと活性型因子ＩＸの組み合わせによって活性化された因子Ｘが有する、無色基質を有色基質に変える能力に基づく発色法（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４））によって評価する。
【００８９】
ヒトモノクローナル抗因子ＶＩＩＩ抗体を産生する細胞系統は、ヒトのリンパ球で免疫系を再構成した後に因子ＶＩＩＩの異なるバッチで免疫付与した、ＳＣＩＤマウスの腹腔から採取したヒトＢリンパ球から誘導される。Ｂリンパ球は、その上にモノクローナル抗ＣＤ４０抗体が固定された、免疫グロブリンのＦｃ部分に対する受容体を発現する線維芽細胞の存在の下で培養する。ＣＤ４０受容体の重合によって活性化したこれらの細胞を次に感染させ、エプスタイン・バーウィルスで不死化する（Ｋｏｚｂｏｒ，（１９８１））。次に、所望の抗体を産生する細胞の系統をサブクローニングすることができる。
【００９０】
本発明のもう一つの側面は、先に述べた因子ＶＩＩＩ阻害剤に対するものであることを特徴とする抗阻害剤に関するものである。
【００９１】
因子ＶＩＩＩ阻害剤に対する抗阻害剤とは、前記阻害剤に干渉して確実にそれを不活性化することのできる一切の生物学的分子および／または細胞を意味する。
【００９２】
好適には、かかる抗阻害剤は、抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその断片である。
【００９３】
有利には、因子ＶＩＩＩ阻害剤に対するこれらの抗阻害剤は、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスなどのヒト免疫系を有する「キメラ」動物によって合成される。
【００９４】
１０μｇ／ｍｌ未満の残留免疫グロブリンを産生するマウスだけを実験に使用した。
【００９５】
モデルは、破傷風に対して免疫付与したボランティアの末梢白血球を使用して開発した。
【００９６】
再構成は、ヒト由来の１５から２０，１０６の単核細胞を一度腹腔内注射して実施した。これらの細胞は、末梢血液（およそ２００ｍｌ）のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いた勾配遠心分離により得られた。単一のドナーから１２から２０頭のマウスを再構成することができる。ヒト免疫グロブリンの産生は経時測定した。
【００９７】
抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体は、セファロースカラム上に共有結合で固定されたヒト抗因子ＶＩＩＩ抗体を用いる免疫親和性によって、またはプロテインＧカラム上のＦｃ部分によって抗イディオタイプ抗体を見出す確率を高めるために、７２００以上のドナーにより自主的に提供されたものにより構成された出発血漿プールから精製した。分画の後、Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法による分画の後、ＩｇＧが豊富な２つの画分、因子ｒＩＩと因子ｒＩＩＩが得られた。これらは抗イディオタイプ抗体の精製の出発調製物に使えるであろう。これらのモノクローナル抗体は血友病患者から採取したＢ細胞から得られるであろう。これらの細胞は、ＳＣＩＤマウス内であらかじめ増殖させ、ＥＢＶウィルスによって分泌細胞培養体に形質変換した。これらのヒトモノクローナル抗体の使用によって、治療用調製物内にヒト以外のタンパク質が導入されるのが防止される。これらの調製物を、詳細な免疫化学分析によって、大多数の潜在血友病患者に由来する阻害剤を中和する効果について評価した。物理的（ＵＶＣＦ線による処理）、熱的および／または化学的（例えば、溶剤−洗剤による）ウィルス不活性化のいくつかの段階が、できる限り高いウィルス安全性を確保するために精製工程に導入される。
【００９８】
ヒト抗体に固有のイディオタイプを分子の可変部を配列決定して分析する。これらのデータは極めて重要である。なぜならそれらは診断にも抗因子ＶＩＩＩ抗体産生の制御にも大きな有用性を持つからである。
【００９９】
現在まで、抗原抗体複合体の作成に必要な抗体源は自己のものであり、即ち患者自身が抗体を提供していた。少し前から、循環する因子ＶＩＩＩの割合が正常な健常者が産生する抗因子ＶＩＩＩ抗体の血漿内活性が、対応する抗イディオタイプ抗体によって制限されることがわかっている。ガンマグロブリンプールから調製された抗因子ＶＩＩＩ抗体は、有利に自己のものに代わることができる。
【０１００】
同様に、血友病患者またはそうでない人の阻害剤を産生する、ＥＢＶウィルスによって形質転換されたヒトＢ細胞を得ることもできる。このようにして４系統が得られ、そのうち１つが因子ＶＩＩＩの軽鎖を認識する。ＳＣＩＤマウスに血友病患者またはそうでない人に由来する阻害剤分泌Ｂ細胞を再増殖させた。産生を、血漿因子ＶＩＩＩおよび組換え因子ＶＩＩＩの注射によって刺激した。このように、前記阻害剤を産生する試験管内での連続培養を行うことができる。この技術によって、抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体の連続産生を行うこともできる。
【０１０１】
本発明のもう１つの側面は、因子ＶＩＩＩの前記抗原ポリペプチド配列、その断片、そのエピトープ、および／または前記エピトープもしくは前記断片の強い部分、それらに対する因子ＶＩＩＩ阻害剤、当該阻害剤に対する抗阻害剤、および／またはそれらの混合物から成る群から選択された要素を含む、医薬品組成物に関するものである。
【０１０２】
本発明の別の側面は、本発明による抗原ポリペプチド配列、その断片、そのエピトープ、および／または前記エピトープもしくは前記断片の強い部分、本発明による複合体、それらに対する阻害剤、当該阻害剤に対する抗阻害剤、および／またはそれらの混合物から成る群から選択された要素を含む、診断キットまたはクロマトグラフィーカラム（記載例：Ｅｚｚｅｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））などの診断および／または精製装置に関するものである。
【０１０３】
従って、精製装置は、クロマトグラフィーカラムの固相に固定された因子ＶＩＩＩ配列、その断片、エピトープ、および／または前記断片もしくはエピトープの強い部分を含む、Ｅｚｚｅｄｉｎｅら（１９９３）が記載しているようなクロマトグラフィーカラムから成ることができる。
【０１０４】
次に、因子ＶＩＩＩ阻害剤を含む、患者の生理的液体（例えば血清）をこのクロマトグラフィーカラムに通し、前記阻害剤（例えば抗体）を、前記因子ＶＩＩＩ、前記断片、前記エピトープまたは前記強い部分上に特異的に固定させる。
【０１０５】
溶出した後、抗阻害剤（抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体）と反応させて、前記阻害剤を回収することができる。
【０１０６】
固体相に因子ＶＩＩＩ阻害剤が固定されたクロマトグラフィーカラムにこれらの抗阻害剤を通して、血清内に存在する抗抗因子ＶＩＩＩイディオタイプ抗体を特性化することもできる。
【０１０７】
本発明の最後の側面は、因子ＶＩＩＩ阻害剤、因子ＶＩＩＩとフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）との結合の阻害剤、および／または膜リン脂質に対する因子ＶＩＩＩの結合の阻害剤によって誘発されるものをはじめとした免疫障害の予防および／または治療のための医薬品調製のために、本発明による医薬品組成物を使用することに関するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】因子ＶＩＩＩのポリペプチド配列を示した図。
【図２】１から３７１のアミノ酸の番号を付け直した因子ＶＩＩＩのＡ３配列の親水性を示したグラフ。
【図３】因子ＶＩＩＩのＡ３配列の柔軟性を示したグラフ。
【図４】因子ＶＩＩＩのＡ３配列の接近可能性を示したグラフ。
【図５】図２から４に示した値の総和を全体として示したグラフ。
【図６】ＥＬＩＳＡ試験によってマウスの血清内の抗因子ＶＩＩＩ抗体の存在を示したグラフ。
【０１０９】
参考文献
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−Ｓｕｌｔａｎ，Ｙ，Ｒｏｓｓｉ，Ｆ  ａｎｄ  Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ，Ｍ（１９８７），Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．８４，８２８−８３１
−Ｓｕｌｔａｎ，Ｙ，Ｗｈｉｔｅ，ＧＣ，Ａｒｏｎｓｔａｍ，Ａ，Ｂｏｓｓｅｒ，Ｃ，Ｂｒａｃｋｍａｎｎ，ＨＨ  ｅｔ  ａｌ（１９８６），Ｎｏｕｖ  Ｒｅｖ  Ｆｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２８，８５−８９
−Ｓｕｌｔａｎ，Ｙ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９９２），Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６７，６００−６０２
−Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｌ，Ｂｒｏｇｌｉ，Ｍ，Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ，Ｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｋ（１９８４）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ  Ｒｅｓ  ３４，４５７
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−Ｗａｄｈｗａ，Ｍ，Ｄｉｌｇｅｒ，Ｐ，Ｔｕｂｂｓ，Ｊ，Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ，Ｔ，Ｍａｈｏｎ，Ｂ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｒ（１９９２），Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ８２，５７８−５８３
−Ｗａｒｅ，Ｊ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，ＭＪ，Ｌｏ，Ｍ，ｄｅ  Ｇｒａａｆ，Ｓ  ａｎｄ  Ｆｕｌｃｈｅｒ，ＣＡ（１９９２），Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎ  ３，７０３−７１６
−Ｗｅｂｂ，Ｅ，Ｔｋａｌｃｅｖｉｃ，Ｓ，Ｈｏｃｋｉｎｇ，Ｄ  ａｎｄ  Ｎｉｓｂｅｔ，Ｉ（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９０，５３６−５４３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006316062.tif 000049