(57)【要約】      （修正有）【課題】石蓮花抽出物および新規化合物、それを有効成分とする糖吸収抑制用組成物、活性酸素阻害用組成物ならびに健康食品を提供する。【解決手段】石蓮花から水または含水低級アルコールによる抽出によって得られる抽出物、該抽出物に含まれる化合物が、β−Ｄ−グルコノピラノシル基、α−Ｌ−ラムノピラノシル基またはβ−Ｄ−グルコノピラノシル−（１−３）−α−Ｌ−ラムノピラノシル基等を有する３，５，７，４’−テトラヒドロキシフラボン誘導体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式(Ｉ)：
【化１】
2006241054.tif 000063
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ互いに独立して水素原子またはヒドロキシ基を表し、Ｒ3は水素原子、β-D-グルコピラノシル基、α-L-ラムノピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基を表し、Ｒ4は水素原子、β-D-グルコピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基を表すが、但し、β-D-グルコピラノシル基の場合はその３位のヒドロキシ基の水素原子がアセチル基で置換していてもよく、α-L-ラムノピラノシル基の場合はその２位または３位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はラムノピラノシル基の２位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はグルコピラノシル基の６位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基もしくは２-ヒドロキシメチルプロピオニル基で置換していてもよい］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体。
【請求項２】
石蓮花を水または含水低級アルコールで抽出して得た抽出液が、請求項１に記載の少なくとも一つの化合物を含む石蓮花抽出物。
【請求項３】
石蓮花を水または含水低級アルコールで抽出して得た抽出液を、さらに必要に応じて酢酸エチル/水およびｎ-ブタノール/水で分配処理して得られる有機溶媒可溶画分を含み、請求項１に記載の少なくとも一つの化合物を含む請求項２に記載の石蓮花抽出物。
【請求項４】
石蓮花が、石蓮属植物のシノクラスラ インディカ、シノクラスラ ウンナンエンシス、シノクラスラ アンビグア、シノクラスラ デンシロスラータ、シノクラスラ テキネシス、シノクラスラ ロナイスチラ、エチェバリア グラウカまたはコチレドン グラウカである、請求項２または３に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物の少なくとも一つまたは請求項２または３に記載の抽出物を有効成分として含む医薬用組成物。
【請求項６】
組成物が、糖吸収抑制用組成物である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が、活性酸素阻害用組成物である請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一つに記載の組成物が添加されてなる健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石蓮花抽出物および該抽出物に含まれる新規化合物またはその塩に関する。
より具体的には、本発明は、有効成分として石蓮花抽出物および該抽出物に含まれる新規化合物の糖吸収抑制作用、アルドース還元酵素阻害作用および活性酸素阻害作用に基づく糖尿病などの生活習慣病の予防・治療用組成物ならびに該組成物を含む健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々は日常の食事において、主食あるいは副食として多くの炭水化物(例えばデンプンやショ糖など)を摂取している。摂取された炭水化物は、体内の酵素(例えばα-グルコシダーゼなど)により代謝され、単糖に分解された後、消化管から吸収される。
【０００３】
炭水化物の摂取量が増加すると、消化管から吸収され、血液中に移行する単糖の量も増加して高血糖となる。この高血糖が日常的に持続することにより、通常、肥満を経て糖尿病に罹患し、さらに場合によっては、糖尿病の悪化により合併症などの重大な疾病をもたらすことがある。
【０００４】
糖尿病による三大合併症として、通常、網膜症、神経障害および腎症があり、成人における失明の大部分が、糖尿病による網膜症に基づくと言われている。また、上記の三大合併症以外にも合併症として脳卒中や動脈硬化などの血管系疾患および高血圧症も知られている。
【０００５】
この糖尿病は、近年の食生活の欧米化、すなわち、高カロリー食の摂取および過食ならびに交通手段および交通機関の発達による生活習慣の変化、すなわち運動不足などが原因となり、成人のみならず若年にとっても増加する傾向にあり、現代病としてまた生活習慣病として大きな問題になっている。
【０００６】
現在、糖尿病の治療に用いられる医薬品としては、主に、膵インシュリン分泌促進作用を有するスルホニル尿素剤；肝の糖新生の抑制と末梢の筋肉、脂肪組織でのインシュリン感受性の亢進作用を有するビグアナイド系薬剤；消化管粘膜に存在し、デンプンやショ糖からブドウ糖を生成するα-グルコシターゼ(二糖類加水分解酵素)を阻害して血糖値上昇を抑制するα-グルコシダーゼ阻害剤(例えばアカルボース(バイエル社製、商品名；グルコバイ)およびボグリボース(武田薬品工業社製、商品名；ベイスン)等があり、経口投与用の糖尿病治療剤として広く使用されている。
【０００７】
しかしながら、上記の糖尿病治療剤は、一般に合成品であり、近年、胃腸障害、乳酸アシドーシスまたは重篤な肝障害の発生などが報告されており、その使用にあたっては医師の厳格な指導・管理が必要である。一方で、これらの副作用低減を目的とするアルドース還元酵素阻害剤(例えばエパルタット(小野薬品、商品名；キネダック))等も広く使用されている。
【０００８】
そこで、最近、副作用が少ない天然素材が注目され、健康食品としても種々上市されており、そのなかに抗糖尿病効果を標榜したものも多数認められるが、有効性に疑問のあるものが多く、具体的に効果が証明されたものがほとんどないのが実情である。
【０００９】
石蓮花は、中国に広く自生する石蓮属植物であり、中国の広西壮族自治区では、従来、食用として用いられてきた。
近年、この石蓮花の血糖降下剤としての応用および血糖降下作用についても報告されている(特許文献１および２)。
しかしながら、石蓮花抽出物が含む成分ならびに石蓮花抽出物のアルドース還元酵素阻害作用および活性酸素阻害作用についてはなんら報告されていない。
【００１０】
【特許文献１】特許第３０９７９９７号
【特許文献２】特開２００２−２３３３４２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、石蓮花抽出物が含有する成分の解明および用途の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、現在までになんら報告されていない石蓮花の成分およびその作用を明らかにすべく研究に着手し、石蓮花の水または低級アルコール抽出物および各精製段階における石蓮花抽出物の含有成分を鋭意研究し、新規フラボン誘導体を見出し、それらの化学構造を決定し、上記の課題を解決する。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、次の一般式(Ｉ)：
【化１】
2006241054.tif 000002
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ互いに独立して水素原子またはヒドロキシ基を表し、Ｒ3は水素原子、β-D-グルコピラノシル基、α-L-ラムノピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基を表し、Ｒ4は水素原子、β-D-グルコピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基を表すが、
【００１４】
但し、β-D-グルコピラノシル基の場合はその３位のヒドロキシ基の水素原子がアセチル基で置換していてもよく、α-L-ラムノピラノシル基の場合はその２位または３位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はラムノピラノシル基の２位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はグルコピラノシル基の６位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基もしくは２-ヒドロキシメチルプロピオニル基で置換していてもよい］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体が提供される。
【００１５】
また、石蓮花の水または含水低級アルコール抽出物(石蓮花抽出物)、および該抽出物の水および水と非混和性有機溶媒を用いる分配抽出物は、糖吸収抑制作用以外にもアルドース還元酵素阻害作用および活性酸素阻害作用を有するので、これらの抽出物に含まれる本発明による化合物も、いずれも糖吸収抑制作用および/または活性酸素阻害作用を有すると考えられ、これら作用を意図する医薬用組成物ならびに該組成物が添加されてなる健康食品が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、石蓮花抽出物、または該抽出物に含まれる本発明によるフラボン誘導体の少なくとも一つを有効成分とする糖吸収抑制用組成物として、安全に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、石蓮花の水または含水低級アルコール抽出物および/または該抽出物を必要に応じてさらに精製した石蓮花抽出物に含まれる上記の一般式(Ｉ)で表される３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体およびそれらの使用に関している。
【００１８】
また、本発明において用いられている用語「石蓮花」は漢薬名であり、ベンケイソウ科(Crassulacea)に属する石蓮(Sinocrassula)属植物の総称として、また、さらに同属植物を原料として開発された健康食品素材を意味する一般名称としても用いられている。
石蓮属植物は、パキスタン、インド北部から中国各地かけて広く分布し、岩山および石の上に自生する二年生または多年生植物である。
【００１９】
また、同属植物は、地域によっては多数の異名を有しており、例えば、メキシコなど熱帯アメリカではエチェバリア グラウカ(Echevaria glauca)またはコチレドン グラウカ(Cotyledon glauca)の別名でも知られている。
したがって、本発明における石蓮花とは、それらの中のいずれかに限定されるものではない。
【００２０】
上記の石蓮属植物としては、例えばシノクラスラ インディカ(Sinocrassula indica、石蓮)、シノクラスラ ウンナンエンシス(Sinocrassula yunnanensis、雲南石蓮)、シノクラスラ アンビグア(Sinocrassula ambigua、長萼石蓮)、シノクラスラ デンシロスラータ(Sinocrassula densirosulata、密叶石蓮)、シノクラスラ テキネシス(Sinocrassula techinesis、徳欽石蓮)、シノクラスラ ラナイスチラ(Sinocrassula lanaistyla、長柱石蓮)などが挙げられ、エチェバリア グラウカまたはコチレドン グラウカが含まれることもあり、それらの葉および茎などの地上部を用いることができる。また、市場で入手可能な石蓮属植物を原料する健康食品素材を用いることもできる。
【００２１】
本発明による石蓮花としては、上記の何れかの素材あるいは植物の地上部または全草を採取して直ぐにまたは乾燥し、そのままもしくは細断・粉砕したものを抽出材料として用いることができる。なかでも、細断・粉砕したものを用いると、抽出効率の点で好ましい。
【００２２】
本発明の抽出物の調製に用いられる溶媒に関して、水以外の低級アルコールとしては、炭素数１〜４のアルコール類が挙げられる。具体的には、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノールもしくはt-ブタノールまたはこれらの混液あるいはこれらの任意の割合における含水アルコール等が挙げられる。好ましくは、水またはエタノールが用いられる。さらに好ましくは、水または約８０％エタノールが用いられるが、本発明においては、含水エタノールのエタノール量が特に８０％に限定されるものではない。
これらの抽出用アルコールは、抽出材料に対して１〜５０倍 (容量)程度、好ましくは２〜１０倍 (容量)程度用いられる。
【００２３】
なお、抽出は、熱時または室温で行うことができ、抽出温度は、室温と溶媒の沸点の間で任意に設定できる。熱時抽出の場合、例えば、50℃〜抽出溶媒の沸点の温度で、振盪 (または撹拌)下もしくは非振盪下または還流下に、石蓮花の花部を上記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、30分間〜5時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、1時間〜20日間程度行うのが適当である。また、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分〜数時間加熱還流するのが好ましい。
【００２４】
また、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、上記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について1回だけ行ってもよいが、複数回、例えば、2〜5回程度繰り返すのが抽出効率の点から好ましい。
【００２５】
固形物を、抽出後にろ別して得られる抽出液は、常法により濃縮して抽出エキスとしてもよい。濃縮は、減圧下に行うのが好ましい。濃縮は抽出液が乾固するまで行ってもよい。
抽出物は、そのまま本発明の組成物を調製するのに用いてもよいが、粉末状または凍結乾燥品等として用いてもよい。これらの固形物とする方法は、当該分野で公知の方法を採用することができる。
【００２６】
したがって、本発明における抽出物とは、抽出液、抽出エキス、濃縮乾固物または凍結乾燥物のいずれも意味するが、本発明による抽出物は、精製せずにそのまま用いることもでき、本発明の一部を構成している。
【００２７】
しかしながら、本発明では、抽出液を濃縮した抽出物を、溶媒による分配抽出、すなわち、水と非混和性有機溶媒とを用いる分配抽出に単回または複数回付し、有機溶媒可溶画分と水溶性画分として分離することができる。
【００２８】
非混和性有機溶媒としては、酢酸エチル、n-ブタノール、ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられるが、中でも酢酸エチルが好ましい。
すなわち、アルコール抽出物を濃縮して得られた抽出物を、必要に応じて酢酸エチルと水を用いて分配し、酢酸エチル可溶画分と水溶性画分として得ることができる。
【００２９】
また、上記で得られる水溶性画分を、さらに水と非混和性有機溶媒を用いる分配抽出に付し、有機溶媒可溶画分と水溶性画分として分離することができる。
この場合の非混和性有機溶媒としては、n-ブタノール、ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられるが、中でもn-ブタノールが好ましい。
すなわち、上記の酢酸エチルと水との分配後の水溶性画分をそのままｎ-ブタノールとの分配に付すか、または該水溶性画分を濃縮して得られる残渣をさらに水とｎ-ブタノールとの分配に付し、n-ブタノール可溶性画分と水溶性画分を得ることができる。
したがって、上記の石蓮花抽出物を上記の水と非混和性有機溶媒とを用いる分配抽出に１回以上付したものも石蓮花抽出物として本発明を構成する。
【００３０】
分配抽出は、当該分野で通常行われる撹拌もしくは振盪分配法または液滴向流分配法などの常法に従って行うことができる。例えば、室温下、振盪下または非振盪下に、抽出エキスなどに対して、非混和性有機溶媒と水とを１〜５０倍 (容量)程度 (１:１０〜１０:１)加えて行うのが適当である。
【００３１】
なお、上記のアルコール抽出物および各分配抽出物は、上記のいずれの段階においても、濃縮する前後に精製処理に付すことができる。
精製処理には、上記の溶媒による分配抽出以外に、当業者に公知のクロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法等を単独で、または組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相もしくは逆相担体またはイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは遠心液体クロマトグラフィー等のいずれか、またはそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。
【００３２】
本発明者は、石蓮花の水または含水低級アルコール抽出物(石蓮花抽出物)の活性を検討した。
その結果、本発明者は、石蓮花抽出物が、糖吸収抑制作用を示すことを見出した。
【００３３】
さらに本発明者は、上記の石蓮花抽出物を酢酸エチル/水による分配処理に付し、得られた水溶性画分をさらにｎ-ブタノール/水による分配処理して得られる有機溶媒可溶画分を得た。
本発明者は、これらの石蓮花抽出物、酢酸エチル可溶性画分およびｎ-ブチル可溶性画分についても活性を検討した。その結果、上記の抽出物および各有機溶媒可溶性画分が、糖吸収抑制作用以外に、アルドース還元酵素阻害作用および活性酸素阻害作用を示すことも見出した。
【００３４】
そこで、ここに得られた酢酸エチル可溶画分およびｎ-ブタノール可溶画分を、それぞれシリカゲルクロマトグラフィー、逆相カラムを用いたHPLCによる精製を繰り返し、含有成分の単離を行った。
【００３５】
その結果、本発明者は、既知物質としてケンフェロール、ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシド、ケンフェロール 7-O-α-L-ラムノピラノシド、ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド、マルチフロリンB、ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-ラムノピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド、ケルセチン、ケルセチン 3-O-β-D-グルコピラノシド、ケルセチン 3-O-β-D-グルコピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド、マルチノシドA、ルテオリン、(3S,5R,6R,7E,9S)-メガスティグマン-7-エン-3,5,6,9-テトロール 3-O-β-D-グルコピラノシド、(3S,5R,6R,7E,9S)-メガスティグマン-7-エン-3,5,6,9-テトロール 9-O-β-D-グルコピラノシド、L-フェニルアラニンを得た。
本発明者は、上記の既知物質以外に、さらに以下の新規化合物を見出して本発明を完成した。
【００３６】
すなわち、本発明によれば、次の一般式(Ｉ)：
【化２】
2006241054.tif 000003
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ互いに独立して水素原子またはヒドロキシ基を表し、Ｒ3は水素原子、β-D-グルコピラノシル基、α-L-ラムノピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基を表し、Ｒ4は水素原子、β-D-グルコピラノシル基またはβ-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基を表すが、
【００３７】
但し、β-D-グルコピラノシル基の場合はその３位のヒドロキシ基の水素原子がアセチル基で置換していてもよく、α-L-ラムノピラノシル基の場合はその２位または３位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はラムノピラノシル基の２位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基で置換していてもよく、β-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基の場合はグルコピラノシル基の６位のヒドロキシ基の水素原子が２-メチルプロピオニル基もしくは２-ヒドロキシメチルプロピオニル基で置換していてもよい］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体が提供される。
【００３８】
具体的には、式(Ｉ)の化合物において、Ｒ3がα-L-ラムノピラノシル基であり、Ｒ4が水素原子である、副式(ＩＩ)：
【化３】
2006241054.tif 000004
［式中、Ｒ1およびＲ2は式(Ｉ)の化合物で定義したとおりであり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素原子、２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基を表す］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体が提供される。
【００３９】
すなわち、式(ＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ5が２-メチルプロピオニル基である、式(１)：
【化４】
2006241054.tif 000005
で表される、化合物１が提供される。
【００４０】
また、式(ＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ5が２-メチルブチリル基である、式(２)：
【化５】
2006241054.tif 000006
で表される、化合物２が提供される。
【００４１】
また、式(ＩＩ)の化合物において、Ｒ1およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ2がヒドロキシ基であり、Ｒ5が２-メチルプロピオニル基である、式(１４)：
【化６】
2006241054.tif 000007
で表される、化合物１４が提供される。
【００４２】
また、式(ＩＩ)の化合物において、Ｒ1およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ2がヒドロキシ基であり、Ｒ5が２-メチルブチリル基である、式(１５)：
【化７】
2006241054.tif 000008
で表される化合物１５が提供される。
【００４３】
また、式(ＩＩ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共にヒドロキシ基であり、Ｒ5が２-メチルブチリル基であり、Ｒ6が水素原子である、式(１９)：
【化８】
2006241054.tif 000009
で表される化合物１９が提供される。
【００４４】
あるいは、本発明によれば、上記の式(Ｉ)の化合物において、Ｒ3がα-L-ラムノピラノシル基であり、Ｒ4がβ-D-グルコピラノシル基である、副式(ＩＩＩ)：
【化９】
2006241054.tif 000010
［式中、Ｒ1およびＲ2は式(Ｉ)の化合物で定義したとおりであり、Ｒ5およびＲ6は副式(ＩＩ)の化合物物で定義したとおりであり、Ｒ7は水素原子またはアセチル基を表す］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体が提供される。
【００４５】
すなわち、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ7がアセチル基である、式(３)：
【化１０】
2006241054.tif 000011
で表される化合物３が提供される。
【００４６】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ5が共に水素原子であり、Ｒ6が２-メチルプロピオニル基であり、Ｒ7がアセチル基である、式(４)：
【化１１】
2006241054.tif 000012
で表される化合物４が提供される。
【００４７】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ5が共に水素原子であり、Ｒ6が２-メチルブチリル基であり、Ｒ7がアセチル基である、式(５)：
【化１２】
2006241054.tif 000013
で表される化合物５が提供される。
【００４８】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6およびＲ7が共に水素原子であり、Ｒ5が２-メチルプロピオニル基である、式(６)：
【化１３】
2006241054.tif 000014
で表される化合物６が提供される。
【００４９】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ6が共に水素原子であり、Ｒ5が２-メチルブチリル基であり、Ｒ7がアセチル基である、式(７)：
【化１４】
2006241054.tif 000015
で表される化合物７が提供される。
【００５０】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1がヒドロキシ基であり、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が共に水素原子である、式(１３)：
【化１５】
2006241054.tif 000016
で表される化合物１３が提供される。
【００５１】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共にヒドロキシ基であり、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が共に水素原子である、式(２０)：
【化１６】
2006241054.tif 000017
で表される化合物２０が提供される。
【００５２】
また、式(ＩＩＩ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ6およびＲ7が共に水素原子であり、Ｒ2がヒドロキシ基であり、Ｒ5が２-メチルブチリル基である、式(１６)：
【化１７】
2006241054.tif 000018
で表される化合物１６が提供される。
【００５３】
あるいは、本発明によれば、上記の式(Ｉ)の化合物において、Ｒ3が水素原子またはβ-D-グルコピラノシル基であり、Ｒ4がβ-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-L-ラムノピラノシル基である、副式(ＩＶ)：
【化１８】
2006241054.tif 000019
［式中、Ｒ1およびＲ2は式(Ｉ)の化合物で定義したとおりであり、Ｒ8は２-メチルプロピオニル基または２-ヒドロキシメチルプロピオニル基を表す］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体が提供される。
【００５４】
すなわち、式(ＩＶ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が共に水素原子であり、Ｒ8が２-メチルプロピオニル基である、式(１０)：
【化１９】
2006241054.tif 000020
で表される化合物１０が提供される。
【００５５】
また、式(ＩＶ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子であり、Ｒ3がβ-D-グルコピラノシル基であり、Ｒ8が２-メチルプロピオニル基である、式(１１)：
【化２０】
2006241054.tif 000021
で表される化合物１１が提供される。
【００５６】
式(ＩＶ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子であり、Ｒ3がβ-D-グルコピラノシル基であり、Ｒ8が２-ヒドロキシメチルプロピオニル基である、式(１２)：
【化２１】
2006241054.tif 000022
で表される化合物１２が提供される。
【００５７】
また、式(ＩＶ)の化合物において、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がヒドロキシ基であり、Ｒ3がβ-D-グルコピラノシル基であり、Ｒ8が２-ヒドロキシメチルプロピオニル基である、式(１８)：
【化２２】
2006241054.tif 000023
で表される化合物１８が提供される。
【００５８】
あるいは、本発明によれば、上記の式(Ｉ)の化合物において、Ｒ3がβ-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-L-ラムノピラノシル基であり、Ｒ4がβ-D-グルコピラノシル基である、副式(Ｖ)：
【化２３】
2006241054.tif 000024
［式中、Ｒ1およびＲ2は式(Ｉ)の化合物で定義したとおりであり、Ｒ7は副式(ＩＩＩ)の化合物で定義したとおりであり、Ｒ9は２-メチルプロピオニル基または２-メチルブチリル基である］
で表される、３,５,７,４'-テトラヒドロキシフラボン誘導体も提供される。
【００５９】
すなわち、式(Ｖ)の化合物において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ7が共に水素原子であり、Ｒ9が２-メチルプロピオニル基である、式(８)：
【化２４】
2006241054.tif 000025
で表される化合物８が提供される。
【００６０】
また、式(Ｖ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共に水素原子であり、Ｒ7がアセチル基であり、Ｒ9が２-メチルブチリル基である、式(９)：
【化２５】
2006241054.tif 000026
で表される化合物９が提供される。
【００６１】
また、式(Ｖ)の化合物において、Ｒ1およびＲ7が共に水素原子であり、Ｒ2がヒドロキシ基であり、Ｒ9が２-メチルブチリルである、式(１７)：
【化２６】
2006241054.tif 000027
で表される化合物１７が提供される。
【００６２】
また、(Ｖ)の化合物において、Ｒ1およびＲ2が共にヒドロキシ基であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ9が２-メチルブチリル基である、式(２２)：
【化２７】
2006241054.tif 000028
で表される化合物２２も提供される。
【００６３】
すなわち、本発明者は、上記の化合物１〜２０および２２を含む石蓮花抽出物、酢酸エチル可溶性画分ならびにｎ-ブタノール可溶性画分が、いずれも糖吸収抑制、アルドース還元酵素阻害作用および活性酸素阻害作用を有することを見出し、本発明を完成した。
したがって、本発明によれば、石蓮花抽出物または該抽出物に含まれる化合物１〜２０および２２の少なくとも一つを有効成分として含む医薬組成物が提供される。
【００６４】
すなわち、本発明によれば、石蓮花抽出物または該抽出物に含まれる化合物１〜２２の少なくとも一つを有効成分として含む糖吸収抑制用組成物が提供される。
また、本発明によれば、石蓮花抽出物または該抽出物に含まれる化合物１〜２２の少なくとも一つを有効成分として含むアルドース還元酵素阻害用組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、石蓮花抽出物または該抽出物に含まれる化合物１〜２２の少なくとも一つを有効成分として含む活性酸素阻害用組成物が提供される。
ここで、アルドース還元酵素は、糖尿病の合併症である網膜症および腎症と深い関係があるとされており、一方、活性酸素は、一般に、生体内で過酸化脂質の増加に関与しており、糖尿病、心筋梗塞、動脈硬化、癌、脳卒中、白内障、高血圧および老人性痴呆症の疾患に罹患し易くなるといった問題が指摘されている。
【００６５】
したがって、本発明によれば、現代病として代表的なこれら糖尿病、肥満および活性酸素などが関連する生活習慣病の予防または治療を意図した医薬組成物が提供される。
その上、本発明によれば、該組成物を含む健康食品が提供される。
【００６６】
本発明の石蓮花抽出物、すなわち、水もしくは含水低級アルコール抽出物、該抽出物の酢酸エチル可溶画分および/またはｎ-ブタノール可溶画分あるいは該抽出物に含まれる化合物１〜２０および２２のいずれかは、そのままの状態、または医薬的に許容される医薬品添加物のような適当な媒体で希釈して、あるいは医薬品の製造分野において公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等、種々の医薬品の形態に製剤化して使用することができる。
【００６７】
散剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤のような固形製剤を製造する場合、医薬的に許容される医薬品添加物としては、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど)、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤(例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど)、着色剤および矯味矯臭剤などを用いることができる。
【００６８】
錠剤は、通常の方法によりフィルムコーティングなどのコーティングを施すことができ、有効成分を即時、遅延または持続放出できるようにすることができる。
また、カプセル剤は、有効成分を適当な賦形剤などと混合し、得られた混合物をゼラチンソフトまたはハードカプセルに充填することにより得ることができる。
【００６９】
液体製剤は、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、使用前に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。
このような液体製剤を製造する場合、医薬的に許容される医薬品添加物としては、溶剤(例えばオリーブ油、大豆油のような油性溶剤、水、アルコール、プロピレングリコールのような親水性溶剤など)、溶解補助剤(例えばポリエチレングリコール、コレステロールなど)、乳化剤(例えば界面活性剤など)、懸濁化剤(ポリビニル系化合物、セルロース類のような親水性高分子、界面活性剤など)、保存剤(例えばｐ-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、ソルビン酸など)、および所望により着色剤や矯味矯臭剤などを用いることができる。
【００７０】
また、本発明による化合物または組成物を有効成分として食品に添加したものを健康食品として利用することができる。
【００７１】
健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で保健、健康維持・増進等を目的とした食品を意味し、例えば、固形、半固形または液体の製品、具体的には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。
これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、上記の抽出物を添加して、健康食品とすることができる。
【００７２】
石蓮花抽出物および該抽出物が含む本発明による化合物の使用量は、年齢、症状等によって異なるが、例えば該抽出物の濃縮乾固物を予防・治療に用いる場合には、成人１回につき0.1〜10ｇ程度、好ましくは0.3〜2ｇ程度使用できる。また、健康食品として使用する場合には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し上記乾固物を、0.1〜5ｇ程度の範囲で用いることができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明の石蓮花抽出物、該抽出物が含有する本発明による化合物１〜２１および２２の精製法、それらの諸物性値および構造並びにこれらの作用に関する実施例を具体的に説明するが、以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を何等制限するものではない。
【００７４】
なお、実施例では、特に記載がない限り、以下の各種溶媒、クロマトグラフィー用担体およびHPLC用カラムを用いた：
Wistar系雄性ラット：紀和実験動物研究所(和歌山)
メタノール(MeOH)：ナカライテスク社製、特級
エタノール(EtOH)：ナカライテスク社製、特級
クロロホルム：ナカライテスク社製、特級
ジメチルスルホキサイド(DMSO)：ナカライテスク社製、特級
【００７５】
酢酸エチル(AcOEt)：ナカライテスク社製、特級
ｎ-ブタノール(BuOH)：ナカライテスク社製、特級
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル (SiO2)：富士シリシア社製、ＢＷ-200、150〜350メッシュ
逆相カラムクロマトグラフィー用ODSシリカゲル：富士シリシア社製、Chromatorex ODS DM1020T、100〜200メッシュ。
HPLC用ODSカラム：YMC社製、YMC-Pack ODS-A (250×20mm)
【００７６】
また、核磁気共鳴 (NMR)スペクトルにおいて、化学シフトδは百万分の一 (ppm)で表示し、略語はそれぞれ次の意味を有する： s：シングレット；br s：幅広いシングレット；d：ダブレット；dd：ダブルダブレット；t：トリプレット； q：クァルテット；dq：ダブルクァルテット；ddq：ダブルダブルクァルテット；qq：クァルテットクァルテット；m：マルチプレット；Ac；アセチル基；Glc：グルコピラノシル基；Rha：ラムノピラノシル基；MB：２-メチルプロピオニル基；IB：２-メチルブチリル基；K：ケンフェロール；Q：ケルセチン。
【００７７】
なお、以下の実施例において単離した本発明による新規化合物は、UV、IR、旋光度、各種質量分析、1H-および13C-NMR(1H；500 MHz、13C；125 MHz、溶媒：DMSO-ｄ6)などの種々の測定結果に基づき同定した。
さらに、化合物の化学構造および絶対構造は、H-HおよびまたはC-H COSYやHMBCなどのような各種2次元NMRの測定結果やアルカリ加水分解物の各種分析結果にも基づいて決定した。
また、以下の実施例で得られた既知物質は、上記の各種分析結果および標品との比較からその構造を決定した。
【００７８】
実施例１
石蓮花抽出物の調製および該抽出物の精製
例えば、約80％の含水エタノールを用いて、石蓮花抽出物を調製し、該抽出物を精製した例を表１に示し、以下の手順で行った。
【００７９】
【表１】
2006241054.tif 000029
【００８０】
（１）石蓮花抽出物の調製
石蓮花9.9 kgを約80％エタノール２０Lで加熱還流下に３時間抽出し、冷却後にろ過し、ろ取物を再度抽出に付した。この抽出操作を3回繰り返し、合わせたろ液を減圧下に濃縮して石蓮花抽出物764 g (7.7％)を得た。
【００８１】
（２）石蓮花抽出物の酢酸エチルおよび水による分配抽出
次いで、上記で得られた抽出物725 gを、酢酸エチル５Lと水５Lとによる分配抽出に付し、各抽出液を減圧下に濃縮して、酢酸エチル可溶画分 (237g、2.5％)と水可溶画分 (４８７g、５.１％)を得た。
【００８２】
（３）水可溶画分のｎ-ブタノールおよび水による分配抽出
さらに、上記で得られた水可溶画分４８７gを、ｎ-ブタノール５Lと水５Lとによる分配抽出に付し、各抽出液を減圧下に濃縮し、ｎ-ブタノール可溶画分 (164 g、1.7％)と水可溶画分 (323 g、3.4％)を得た。
【００８３】
（４）石蓮花抽出物の酢酸エチル可溶画分含有成分の単離と同定
上記で得られた酢酸エチル可溶画分100.0 gをクロロホルム：メタノール(100：0〜90：10〜80：20〜70：30〜60：40)の濃度勾配の混液で溶出し、最後にメタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー (シリカゲル2.5 kg)に付し、フラクションE1〜8 (Fr. E1〜Fr. E8)を上記の表１に示す割合で得た。
次いで、フラクションE４ １１.８５ｇを、メタノール：水 (40：60〜50：50〜60：40〜75：25〜90：10〜98：2〜100：0)の濃度勾配の混液で溶出する逆相ODSクロマトグラフィー (ODSシリカゲル350 g)、およびメタノール：水 (55：45または70：30)の混液を移動相とするHPLCに付して、既知物質ルテリオン20.2 mgおよびケンフェロール25.6 mgと共に新規化合物１(E451) 12.6 mgおよび化合物２(E4521) 11.6 mgを得た。
【００８４】
以下に、フラクションE４から得られた化合物１(E451)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共に構造式を用いて示す。
【００８５】
化合物１(E451)：
黄色粉末、C25H26O11、MW： 502
［α］D26  -26.3°(c 0.60、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 525.1373、(M+H)+： 503.1553 
実測値：525.1377、503.1547
UV [MeOH、nm (logε)]： 266 (4.20)、322 (3.99)
IR ( KBr、cm-1)： 3430、2962、1719、1655、1597、1026
FABMS： m/z 525 (M+Na)+、503 (M+H)+
【００８６】
【化２８】
2006241054.tif 000030
【００８７】
同様に、フラクションE４から得られた化合物２(E4521)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共に構造式を用いて示す。
化合物２(E4521)：
黄色粉末、C26H28O11、MW： 516
［α］D27  -78.8° (c 0.50、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 539.1529
実測値： 539.1522
UV [MeOH、nm (logε)]： 267 (4.14)、319 (4.10)
IR ( KBr、cm-1)： 3410、2962、1720、1655、1597、1026
FABMS： m/z 539 (M+Na)+
【００８８】
【化２９】
2006241054.tif 000031
【００８９】
次いで、フラクションE５ 5.30ｇを、上記のフラクションE４の精製と同様にして、既知物質ケルセチン96.6 mgと共に新規の化合物１9(E525) 12.1 mg、化合物１４(E527) 17.6 mg、化合物７(E528) 23.0 mg、化合物４(E531) 13.0 mg、化合物１５(E532) 7.1 mg、化合物５(E542) 28.6 mgを得た。
【００９０】
以下に、フラクションE５から得られた化合物１9(E525)、化合物１４(E527)、化合物７(E528)、化合物４(E531)、化合物１５(E532)および化合物５(E542)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共にそれらの構造式を用いて示す。
【００９１】
化合物１９(E525)：
黄色粉末、C26H28O13、MW： 548
［α］D23  +60.2° (c 0.80、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 571.1428
実測値： 571.1422
UV [MeOH、nm (logε)]： 261 (4.08)、344 (3.83)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2960、1719、1655、1611、1075
FABMS： m/z 717 (M+Na)+
【００９２】
【化３０】
2006241054.tif 000032
【００９３】
化合物１４(E527)：
黄色粉末、C25H26O12、MW： 518
［α］D25  +810° (c 1.20、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 541.1322、(M+H)+： 519.1503
実測値： 541.1328、519.1509
UV [MeOH、nm (logε)]： 256 (4.18)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2920、1726、1655、1597、1026
FABMS： m/z 541 (M+Na)+、519 (M+H)+
【００９４】
【化３１】
2006241054.tif 000033
【００９５】
化合物７(E528)：
黄色粉末、C34H40O17、MW： 720
［α］D27   -84.1° (c 0.50、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 743.2158、(M+H)+： 721.2347
実測値： 743.2168、： 721.2344
UV [MeOH、nm (logε)]： 266 (4.35)、350 (4.26)
IR ( KBr、cm-1)： 3410、2960、1719、1649、1597、1073
FABMS： m/z  743 (M+Na)+
【００９６】
【化３２】
2006241054.tif 000034
【００９７】
化合物４(E531)：
黄色粉末、C33H38O17、MW： 706
［α］D25   -45.2° (c 1.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 729.2007
実測値： 729.2000
UV [MeOH、nm (logε)]： 267 (4.28)、350 (4.19)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2936、1732、1655、1599、1065
FABMS： m/z  729 (M+Na)+
【００９８】
【化３３】
2006241054.tif 000035
【００９９】
化合物１５(E532)：
黄色粉末、C26H28O12、MW： 532
［α］D25  -51.1° (c 0.50、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 555.1478
実測値： 555.1483
UV [MeOH、nm (logε)]： 256 (4.22)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2936、1719、1655、1597、1059
FABMS： m/z 555 (M+Na)+
【０１００】
【化３４】
2006241054.tif 000036
【０１０１】
化合物５(E542)：
黄色粉末、C34H40O17、MW： 720
［α］D26   -61.4° (c 1.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 743.2163
実測値： 743.2168
UV [MeOH、nm (logε)]： 268 (4.55)、349 (4.48)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2922、1730、1655、1599、1069
FABMS： m/z  743 (M+Na)+
【０１０２】
【化３５】
2006241054.tif 000037
【０１０３】
さらに、フラクションE６ 0.68ｇを、上記のフラクションE４の精製と同様にして、既知物質ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシド14.0 mgおよびケンフェロール 7-O-α-L-ラムノピラノシド32.9 mgと共に新規の化合物３(E6131) 4.6 mg、化合物６(E6132) 10.0 mg、化合物１６(E614) 11.3 mgおよび化合物１０(E6192) 14.7 mgを得た。
【０１０４】
以下に、フラクションE６から得られた化合物３(E6131)、化合物６(E6132)、化合物１６(E614)および化合物１０(E6192)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共にそれらの構造式を用いて示す。
【０１０５】
化合物３(E6131)：
黄色粉末、C29H32O16、MW： 636
［α］D25   -30.2° (c 1.50、MeOH)
高分解能FABMS：計算値 (M+Na)+： 659.1588、(M+H)+： 637.1769
実測値：： 659.1595、： 637.1782
UV [MeOH、nm (logε)]： 267 (4.14)、319 (4.10)
IR ( KBr、cm-1)： 3410、2919、1719、1655、1597、1062
FABMS： m/z 659 (M+Na)+、637 (M+H)+
【０１０６】
【化３６】
2006241054.tif 000038
【０１０７】
化合物６(E6132)：
黄色粉末、C31H36O16、MW： 664
［α］D25   -62.5° (c 0.70、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 687.1901
実測値： 687.1908
UV [MeOH、nm (logε)]： 267 (4.29)、349 (4.21)
IR ( KBr、cm-1)： 3410、2940、1719、1650、1597、1065
FABMS： m/z  687 (M+Na)+
【０１０８】
【化３７】
2006241054.tif 000039
【０１０９】
化合物１６(E614)：
黄色粉末、C32H38O17、MW： 694
［α］D23   -32.2° (c 0.50、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 717.2007
実測値： 717.2003
UV [MeOH、nm (logε)]： 258 (4.32)、355 (4.19)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2960、1726、1662、1603、1077
FABMS： m/z 717 (M+Na)+
【０１１０】
【化３８】
2006241054.tif 000040
【０１１１】
化合物１０(E6192)：
黄色粉末、C31H36O16、MW： 664
［α］D26   -88.9° (c 1.0、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 687.1904
実測値： 687.1901
UV [MeOH、nm (logε)]： 265 (4.31)、347 (4.16)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2962、1736、1655、1610、1068
FABMS： m/z 687 (M+Na)+
【０１１２】
【化３９】
2006241054.tif 000041
【０１１３】
（５）石蓮花抽出物のｎ-ブタノール可溶画分含有成分の単離と同定
次いで、上記で得られたｎ-ブタノール可溶画分95.0 gをクロロホルム：メタノール(90：10〜80：20〜70：30〜60：40〜50：50)の濃度勾配の混液で溶出し、最後にメタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー (シリカゲル2.5 kg)に付し、フラクションB1〜8 (Fr. B1〜Fr. B8)をそれぞれ前記の表１に示す割合で得た。
【０１１４】
次いで、フラクションB４ 9.0ｇを、メタノール：水 (20：80〜30：70〜40：60〜50：50〜60：40〜70：30〜90：10〜100：0の濃度勾配の混液で溶出する逆相ODSシリカゲルクロマトグラフィー (ODSシリカゲル270 g)、およびメタノール：水 (35：65または50：50)の混液を移動相とするHPLCに付して、既知物質ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド830 mgと共に新規の化合物８(B481) 72.0 mg、化合物１７(B482) 348.6 mg、化合物１８(B483) 35.4 mgおよび化合物９(B484) 150.4 mgを得た。
【０１１５】
以下に、フラクションB４から得られた化合物８(B481)、化合物１７(B482)、化合物１８(B483)および化合物９(B484)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共にそれらの構造式を用いて示す。
【０１１６】
化合物８(B481)：
黄色粉末、C38H46O21、MW： 826
［α］D23  -44.5° (c 2.0、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 849.2429
実測値： 849.2438
UV [MeOH、nm (logε)]： 266 (4.33)、350 (4.26)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2922、1721、1655、1599、1074
FABMS： m/z 849 (M+Na)+
【０１１７】
【化４０】
2006241054.tif 000042
【０１１８】
化合物１７(B482)：
黄色粉末、C38H48O22、MW： 856
［α］D25  -47.8° (c 2.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 879.2535
実測値： 879.2540
UV [MeOH、nm (logε)]： 257 (4.49)、358 (4.37)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2936、1725、1655、1599、1076
FABMS： m/z 879 (M+Na)+
【０１１９】
【化４１】
2006241054.tif 000043
【０１２０】
化合物１８(B483)：
黄色粉末、C42H54O22、MW： 942
［α］D26  +325.9° (c 2.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 965.2903
実測値： 965.2909
UV [MeOH、nm (logε)]： 257 (4.34)、357 (4.22)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2936、1728、1655、1597、1063
FABMS： m/z 965 (M+Na)+
【０１２１】
【化４２】
2006241054.tif 000044
【０１２２】
化合物９(B484)：
黄色粉末、C38H48O21、MW： 840
［α］D25  -52.6° (c 1.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 863.2586
実測値： 863.2581
UV [MeOH、nm (logε)]： 266 (4.31)、350 (4.24)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2934、1728、1655、1599、1079
FABMS： m/z 863 (M+Na)+
【０１２３】
【化４３】
2006241054.tif 000045
【０１２４】
次いで上記で得られたフラクションB５ 11.9ｇを、上記のフラクションB４の精製と同様にして、既知物質L-フェニルアラニン20.4 mg、(3S,5R,6R,7E,9S)-メガスティグマン-7-エン-3,5,6,9-テトロール 3-O-β-D-グルコピラノシド30.9 mg、(3S,5R,6R,7E,9S)-メガスティグマン-7-エン-3,5,6,9-テトロール 9-O-β-D-グルコピラノシド69.0 mg、ケルセチン 3-O-β-D-グルコピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド50.0 mg、ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド17.9 mg、ケンフェロール 3-O-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-ラムノピラノシル-7-O-α-L-ラムノピラノシド9.6 mgおよびマルチノシドA27.6 mgと共に、新規の化合物２０(B552) 50.6 mg、化合物１３(B561) 23.0 mg、化合物１２(B583) 13.1 mg、化合物１１(B586) 15.8 mgおよび化合物２２(B595) 47.8 mgを得た。
【０１２５】
以下に、フラクションB５から得られた化合物２０(B552)、化合物１３(B561)、化合物１２(B583)、化合物１１(B586)および化合物２２(B595)の諸物性値、ならびに1H-および13C-NMRデータを原子間の相関と共にそれらの構造式を用いて示す。
【０１２６】
化合物２０(B552)：
黄色粉末、C27H30O17、MW： 626
［α］D25  +71.3° (c 2.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 649.1381
実測値： 649.1385
UV [MeOH、nm (logε)]： 276 (4.26)、350 (4.08)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2960、1655、1605、1059
FABMS： m/z 649 (M+Na)+
【０１２７】
【化４４】
2006241054.tif 000046
【０１２８】
化合物１３(B561)：
黄色粉末、C27H30O16、MW： 610
［α］D25  +14.5° (c 1.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値 (M+Na)+： 633.1432
実測値： 633.1425
UV [MeOH、nm (logε)]： 277 (4.28)、306 (4.11)、330 (4.11)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2962、1736、1655、1603、1057
FABMS： m/z 633 (M+Na)+
【０１２９】
【化４５】
2006241054.tif 000047
【０１３０】
化合物１２(B583)：
黄色粉末、C37H46O22、MW： 842
［α］D26  -10.5° (c 0.7、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 865.2378
実測値： 865.2381
UV [MeOH、nm (logε)]： 265 (4.31)、344 (4.13)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2924、1719、1655、1605、1075
FABMS： m/z 865 (M+Na)+
【０１３１】
【化４６】
2006241054.tif 000048
【０１３２】
化合物１１(B586)：
黄色粉末、C37H46O21、MW： 826
［α］D26  -10.5° (c 0.7、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 849.2429
実測値： 849.2436
UV [MeOH、nm (logε)]： 266 (4.40)、343 (4.23)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2975、1719、1655、1603、1074
FABMS： m/z 849 (M+Na)+
【０１３３】
【化４７】
2006241054.tif 000049
【０１３４】
化合物２２(B595)：
黄色粉末、C38H48O23、MW： 872
［α］D25   +76.5° (c 1.00、MeOH)
高分解能FABMS：計算値(M+Na)+： 895.2484
実測値： 895.2488
UV [MeOH、nm (logε)]： 270 (4.27)、351 (4.09)
IR ( KBr、cm-1)： 3432、2936、1724、1655、1605、1076
FABMS： m/z 895 (M+Na)+
【０１３５】
【化４８】
2006241054.tif 000050
【０１３６】
本発明において単離した化合物の13C-NMRデータをまとめて以下の表２に示す。
【表２】
2006241054.tif 000051
【０１３７】
【表２−１】
2006241054.tif 000052
【０１３８】
次に本発明による化合物の1H-NMRのデータをまとめて以下の表３に示す。
【表３】
2006241054.tif 000053
【０１３９】
【表３−１】
2006241054.tif 000054
【０１４０】
【表３−２】
2006241054.tif 000055
【０１４１】
【表３−３】
2006241054.tif 000056
【０１４２】
【表３−４】
2006241054.tif 000057
【０１４３】
試験例１
血糖値上昇抑制効果の測定方法：
以下の表に示した数からなり、約24時間絶食させた各群のWistar系雄性ラット(体重約130〜140 g)に、上記の実施例で得られた石蓮花の80％含水エタノール抽出エキスの濃縮乾固物(以下、石蓮花抽出物)を被験物質として、以下のショ糖負荷ラットまたはブドウ糖負荷ラットにおける血糖値上昇抑制作用(糖吸収抑制作用)を調べた。
【０１４４】
すなわち、以下の表に示す量の石蓮花抽出物をそれぞれ5％アラビアゴム末水溶液に懸濁させて被験サンプルとして各群のラットに経口投与(5 ml/kg)し、30分後に20％ショ糖または10％ブトウ糖水溶液を5 ml/kgの用量で経口投与した。
20％ショ糖溶液または10％ブドウ糖溶液の投与30、60および120分後に、エーテル麻酔下でラットの眼窩静脈より約0.4 mlずつ採血し、血液を遠心分離 (5000 rpm、10分)により血清を分離後、グルコースオキシダーゼ法(グルコースCIIテストワコー、和光純薬)により血清中グルコース濃度をそれぞれ測定した。
【０１４５】
なお、正常群には、アラビアゴム末の5％水溶液および水のみを投与した。
また、コントロール群には、アラビアゴム末の5％水溶液および上記の糖溶液をそれぞれ投与した。
ショ糖負荷ラットにおける石蓮花抽出物の血糖値上昇抑制作用を以下の表４に示す。
なお、以下の表において示された数値は平均値±標準誤差で表し、正常群と被験物質投与群の平均値の差の検定には、一元配置の分散分析後にドゥネット(Dunnett)の方法を用いた。
【０１４６】
表４：石蓮花抽出物投与後ショ糖負荷ラット血糖値に及ぼす影響
【表４】
2006241054.tif 000058
値は平均値±標準偏差
対照と比べ有意差：* ｐ＜0.01、** p＜0.05
【０１４７】
また、ブドウ糖負荷ラットにおける石蓮花抽出物の血糖上昇抑制作用を以下の表５に示す。
表５：石蓮花抽出物投与後ブドウ糖負荷ラット血糖値に及ぼす影響
【表５】
2006241054.tif 000059
値は平均値±標準偏差
対照と比べ有意差：* ｐ＜0.01、** p＜0.05
【０１４８】
以上の結果から、本発明による石蓮花抽出物が、ショ糖およびブドウ糖負荷ラットにおいて有意に血糖値上昇抑制作用、すなわち糖吸収抑制作用を有することが判明した。
【０１４９】
試験例２
石蓮花抽出物のアルドース還元酵素阻害活性試験
Wistar系雄性ラットの水晶体を10 mM、2-メルカプトエタノール含有135 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)中でホモジナイズし、遠心分離(100,000 rpm、30分、4℃)した。その上清を粗酵素含有溶液として用いた。粗酵素含有溶液をリン酸緩衝液(pH 7.0)に溶解し、以下の反応条件で、10 nmolのNADPが生成する濃度に希釈し、酵素フラクションとして用いた。
【０１５０】
反応混合液は、500μl中に180 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)、100 mM Li2SO4、0.03 mM NADPH、基質として1mM DL-グリセルアルデヒド、酵素フラクション100μl及び被験サンプルのDMSO溶液25μlを含むように調製した。反応は30℃でNADPHの添加により開始した。30分間インキュベートした後、0.5 M HCl 150μlを加え反応を停止した。
反応停止後、溶液に10 mMイミダゾール含有6M NaOH 0.5 mlを加え、60℃で20分間加熱して、NADPを蛍光性物質に変換させた。生成した蛍光性物質を、室温で蛍光分光光度計（LS50B、パーキンエルマー製）を用いて測定し(励起波長360nm、測定波長460nm)、得られた値より50％阻害濃度（IC50）を算出した。
なお、比較対照物質としてエパルレスタット(epalrestat)およびルチンを用いた(IC50＝0.072および9.0μM)。
【０１５１】
被験物質として、上記の実施例１で得られた石蓮花の80％含水エタノール抽出物、酢酸エチル可溶性画分、ｎ-ブタノール可溶性画分および水溶性画分の濃縮乾固物を用いて、上記の試験方法に従って測定したラットの水晶体由来のアルドース還元酵素に及ぼす石蓮花抽出物および各画分の作用を以下の表６に示す。
【０１５２】
表６：石蓮花抽出物および各画分のラット水晶体由来アルドース還元酵素阻害作用
【表６】
2006241054.tif 000060
【０１５３】
上記の結果から、石蓮花抽出物の酢酸エチル可溶性画分およびｎ-ブタノール可溶性画分がラット水晶体由来アルドース還元酵素の活性を強力に阻害することが判明した。
【０１５４】
試験例３
石蓮花抽出物のスーパーオキシド（・Ｏ2-）消去活性試験
100μMキサンチン、100μM EDTA、25μM WST-1を含む50 mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH 10.2)および被験サンプルを含む反応液2.9 mlを37℃で10分間予備加温し、58 mU/mlキサンチンオキシダーゼ100μlを加えて反応を停止し、・Ｏ2-により還元されて精製したWST-1フォルマゾンの吸収度を450 nmで測定した。
被験物質として、上記の実施例１で得られた石蓮花の80％含水エタノール抽出物、酢酸エチル可溶性画分、ｎ-ブタノール可溶性画分および水溶性画分の濃縮乾固物を用いて、上記の試験方法に従って測定したスーパーオキシド消去活性に及ぼす石蓮花抽出物および各画分の作用を以下の表７に示す。
【０１５５】
表７：蓮花抽出物および各画分のスーパーオキシドの消去活性作用(ＷＳＴ-１法)
【表７】
2006241054.tif 000061
【０１５６】
上記の結果から、石蓮花抽出物、酢酸エチル可溶性画分およびｎ-ブタノール可溶性画分のいずれもがスーパーオキシド、すなわち活性酸素阻害作用を有し、特に酢酸エチル可溶性画分およびｎ-ブタノール可溶性画分の作用が強いことが判明した。
【０１５７】
石蓮花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性試験
0.1 M酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5) 1.0 ml、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカルの200μMエタノール溶液0.5 mlおよび各濃度の被験物質のエタノール溶液1.0 mlを混合した。室温にて３０分間放置した後、517 nmにおける吸光度を測定し、吸光度の変化からDPPHラジカル(終濃度40μM)を50％消去するのに要した被験物質の濃度(ＳＣ50)を算出した。
【０１５８】
なお、被験物質としては、上記の実施例１で得られた石蓮花の80％含水エタノール抽出物、酢酸エチル可溶性画分、ｎ-ブタノール可溶性画分および水溶性画分の濃縮乾固物を用い、それぞれＤＭＳＯに溶解した後、エタノールで希釈(DMSO終濃度1.0％)して用い、上記の試験方法に従って測定したDPPHラジカル消去活性に及ぼす石蓮花抽出物および各画分の作用を以下の表８に示す。
なお、比較対照としてはα-トコフェロール(ＳＣ50＝4.2μg/ml)、(+)-カテキン(ＳＣ50＝1.7μg/ml)およびガリック酸(ＳＣ50＝0.66μg/ml)を用いた。
【０１５９】
表８：石蓮花抽出物および各画分のDPPHラジカル消去活性作用
【表８】
2006241054.tif 000062
【０１６０】
上記の結果から、石蓮花抽出物、酢酸エチル可溶性画分、ｎ-ブタノール可溶性画分および水溶性画分のいずれもがDPPHラジカル消去作用を有するが、特に酢酸エチル可溶性画分およびｎ-ブタノール可溶性画分の作用が強いことが判明した。
【０１６１】
実施例２
当該分野で公知の方法にしたがって、石蓮花エタノール抽出物の乾燥物10重量部を乳糖25重量部と混合し、ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に抽出物が500 mg含有されるゼラチンカプセル剤を得た。
【０１６２】
実施例３
実施例1で得られた酢酸エチル可溶画分を実施例２のエタノール抽出物に替えて、実施例２と同様にして、ゼラチンカプセル剤を得た。
【０１６３】
実施例４
実施例1で得られたn-ブタノール可溶画分を実施例２のエタノール抽出物に替えて、実施例２と同様にして、ゼラチンカプセル剤を得た。