(57)【要約】【課題】  本発明は、従来取扱いの困難であった、アルカリ性の液体から生体高分子物質を除去するための方法の提供を課題とする。更に本発明は、生体高分子物質を利用して製造される有用物質の単離・精製のための方法の提供を課題とする。【解決手段】  本発明は、アルカリ性の液体に含まれる生体高分子物質にカチオン性高分子化合物を混合し、凝集物を分離する工程を含む、前記生体高分子物質の除去方法を提供する。微生物や酵素のような生体高分子物質をアルカリ性の液体から除去することができる。生体高分子物質を用いた有用物質の製造方法において、生体高分子物質の除去工程として応用することができる。本発明は、たとえば光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子物質を、ｐＨ１０以上の条件で混合する工程、および凝集物を分離する工程を含む、生体高分子物質の除去方法。
【請求項２】
カチオン性高分子化合物がポリビニルアミジン、ポリエチレンイミン、およびキトサンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物である請求項１記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項３】
生体高分子物質が、液体中に含まれる基質化合物を他の物質に変換する触媒作用を有している請求項１に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項４】
生体高分子物質を含む液体が、基質化合物、および生体高分子物質の触媒作用によって変換された基質化合物のいずれか、または両方を含んでいる請求項３に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項５】
基質化合物が、ラセミ体を構成する光学異性体を含む、請求項４に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項６】
ラセミ体が、式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【化１】
2006115730.tif 000013
で表されるDL-β-ヒドロキシアミノ酸である、請求項５に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項７】
DL-β-ヒドロキシアミノ酸が、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸である請求項６に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項８】
前記生体高分子物質が微生物および酵素のいずれかまたは両方である、請求項３に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項９】
前記他の物質への変換が、アルドール縮合反応、アルドール縮合の逆反応、脱炭酸反応、および加水分解反応からなる群から選ばれる少なくとも一つの反応によって行われる請求項８に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項１０】
前記生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子化合物を混合する前に、前記液体を予めｐＨ１．０〜３．５で、かつ６０℃以上で加熱処理する工程を付加的に含む請求項６に記載の生体高分子物質の除去方法。
【請求項１１】
前記生体高分子物質が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの生体高分子物質である、請求項６に記載の生体高分子物質の除去方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
次の工程を含む、物質の製造方法。
（１）原料と、当該原料に含まれる化合物に作用して別の物質に変換する触媒作用を有する生体高分子物質とを液体中で接触させ、生体高分子物質の触媒作用によって前記化合物を別の物質に変換する工程、
（２）前記生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子化合物をｐＨ１０以上の条件で混合し、生成する凝集物を分離する工程、および
（３）工程（１）において前記触媒作用によって変換された物質、および触媒作用によって変換されないで前記液体中に残った物質のいずれかを、工程（２）において凝集物を分離した液体から回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体高分子物質(biological high molecular materials)の除去方法に関する。加えて本発明は、反応液から生体高分子物質を除去する工程を含む、生体高分子物質を利用した物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物、あるいは酵素などの生体高分子物質による水溶性の低い有用物質の製造においては、反応液からの有用物質の回収のために種々の工程が用いられている。たとえば、強酸あるいは強アルカリ性を加えて有用物質を溶解した後、遠心分離、活性炭処理、限外ろ過膜処理、イオン交換樹脂処理、ブタノールによる抽出などによる回収方法が知られている（特許文献１〜４）。
しかし、強酸性においては金属製の機器が酸により腐食される可能性がある。そのため有用物質の溶解に用いる容器は、腐食されない材質に制限される。たとえば合成樹脂などの容器は酸性に耐えうる。しかしその強度は金属に劣る。また合成樹脂は、高温や低温にさらされると劣化してしまうので、限られた条件でしか利用できない。
【０００３】
一方、強アルカリ性では金属は腐食しない。たとえば水に難溶なアミノ酸であるL-トリプトファンの製造において、アルカリ性を利用した菌体の除去方法が利用された。すなわち、菌体を含む反応液を酸性で加熱した後、反応液をアルカリ性にしてトリプトファンを溶解することによって、菌体が分離された（特許文献５）。しかしアルカリ条件では、菌体が溶菌してしまう。その結果、菌体由来のタンパク質や核酸などの多様な生体高分子物質が反応液中に放出される。多量の生体高分子物質の存在は、目的とする化合物の精製を困難にする。微生物反応ではなく酵素を用いた場合には、溶菌の問題は無い。ところが、タンパク質である酵素を含む反応液は、アルカリ性ではしばしば発泡する。大量の泡は、遠心分離やカラムへのアプライをはじめとする精製操作を妨げる。
【０００４】
排水処理施設などにおいては、一般に、カチオン性高分子化合物が汚泥の凝集処理剤として使用されている。また、微生物菌体を含む反応液からの菌体の凝集と除去にカチオン性高分子化合物を利用することも公知である。しかし、公知の条件においては、カチオン性高分子化合物は、通常ｐＨ３から１０未満の範囲内で用いられている。通常のｐＨにおいては、菌体は負に帯電している。カチオン電荷を有する高分子化合物は、菌体の電荷を中和し、菌体表面上に吸着される。そして、菌体表面上の電荷と吸着された高分子の間の静電的引力によって菌体が凝集すると考えられている。カチオン性高分子化合物がカチオン電荷を持つためには、一般に、ｐＨ１０よりも低いｐＨが必要とされている。そのため、ｐＨ１０を越えるような条件の元では、カチオン性高分子化合物の菌体を凝集する作用が失われると考えられている（特許文献６〜８）。
【特許文献１】特開平６−１２５７８６
【特許文献２】特開２０００−２５３８９６
【特許文献３】特開平１−１８１７９７
【特許文献４】特開昭６０−９８９９５
【特許文献５】特開昭５９−４５８９７
【特許文献６】特開２００１−３７４６８
【特許文献７】特開平６−２１８４００
【特許文献８】特開昭５１−３０９００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
先に述べたように、アルカリ性の液体から生体高分子物質を除去することは、困難とされていた。そのため、たとえば、アルカリ性で溶解された物質については、共存する生体高分子物質の除去が課題であった。本発明の課題は、アルカリ性の液体から生体高分子物質を除去するための方法を提供することである。更に本発明は、微生物または酵素などの生体高分子物質を利用した物質の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、カチオン性高分子化合物が、強アルカリ性の液体中に含まれる生体高分子物質を凝集することを見出した。そして凝集した生体高分子物質を液体から分離することによって液体から除去できることを見出し、本発明を完成した。更に本発明者らは、カチオン性高分子化合物による生体高分子物質の除去方法を、物質の製造方法に応用できることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の生体高分子物質の除去方法および生体高分子物質を利用した物質の製造方法に関する。
【０００７】
〔１〕生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子物質を、ｐＨ１０以上の条件で混合する工程、および凝集物を分離する工程を含む、生体高分子物質の除去方法。
〔２〕カチオン性高分子化合物がポリビニルアミジン、ポリエチレンイミン、およびキトサンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物である〔１〕記載の生体高分子物質の除去方法。
〔３〕生体高分子物質が、液体中に含まれる基質化合物を他の物質に変換する触媒作用を有している〔１〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔４〕生体高分子物質を含む液体が、基質化合物、および生体高分子物質の触媒作用によって変換された基質化合物のいずれか、または両方を含んでいる〔３〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔５〕基質化合物が、ラセミ体を構成する光学異性体を含む、〔４〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔６〕ラセミ体が、式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【化２】
2006115730.tif 000002
で表されるDL-β-ヒドロキシアミノ酸である、〔５〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔７〕DL-β-ヒドロキシアミノ酸が、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸である〔６〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔８〕前記生体高分子物質が微生物および酵素のいずれかまたは両方である、〔３〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔９〕前記他の物質への変換が、アルドール縮合反応、アルドール縮合の逆反応、脱炭酸反応、および加水分解反応からなる群から選ばれる少なくとも一つの反応によって行われる〔８〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔１０〕前記生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子化合物を混合する前に、前記液体を予めｐＨ１．０〜３．５で、かつ６０℃以上で加熱処理する工程を付加的に含む〔６〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
〔１１〕前記生体高分子物質が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの生体高分子物質である、〔６〕に記載の生体高分子物質の除去方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔１２〕次の工程を含む、物質の製造方法。
（１）原料と、当該原料に含まれる化合物に作用して別の物質に変換する触媒作用を有する生体高分子物質とを液体中で接触させ、生体高分子物質の触媒作用によって前記化合物を別の物質に変換する工程、
（２）前記生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子化合物をｐＨ１０以上の条件で混合し、生成する凝集物を分離する工程、および
（３）工程（１）において前記触媒作用によって変換された物質、および触媒作用によって変換されないで前記液体中に残った物質のいずれかを、工程（２）において凝集物を分離した液体から回収する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、アルカリ条件下における生体高分子物質の除去方法が提供された。生体高分子物質は、様々な物質の製造に利用されている。たとえば生体高分子物質が、目的とする生成物を与える触媒作用を有していれば、目的とする化合物の生成に利用することができる。本発明による生体高分子物質の除去方法は、生体高分子物質を利用した物質の製造方法において、反応液からの生体高分子物質の除去に利用することができる。すなわち本発明によって、物質の製造に利用された生体高分子物質を、アルカリ条件下において除去することが可能となった。
特に、目的とする物質がアルカリ性で溶解される場合に、本発明の方法は有用である。本発明によれば、アルカリ性において、生体高分子物質を凝集物として容易に液体と分離することができる。そのため、特殊な機器を用いることなく、液体から生体高分子物質を除去することができる。
【０００９】
たとえば、医薬・農薬中間体として有用な光学活性β−ヒドロキシアミノ酸は、生物学的触媒の作用によって製造することができる。そして、生成された光学活性β−ヒドロキシアミノ酸は、アルカリ性条件下で溶解し、回収される。このとき、反応後の反応液から、本発明の除去方法を応用することによって、生体高分子物質が除去される。生体高分子物質の除去により、目的とする光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を容易に回収することができる。回収された光学活性β−ヒドロキシアミノ酸は、濃縮、あるいは晶析などの方法によって、より高度に精製することができる。本発明によって、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の回収と精製を妨げる原因となる生体高分子物質を効果的に除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子物質を、ｐＨ１０以上の条件で混合する工程、および凝集物を分離する工程を含む、生体高分子物質の除去方法に関する。本発明において、生体高分子物質とは、生物に由来する物質、あるいは生物そのもの、並びに生物を構成する組織を言う。生体高分子物質は、液体に溶解していても溶解していなくても良い。本発明における生体高分子物質には、たとえば細胞そのもの、細胞の分画、あるいは蛋白質等が含まれる。より具体的には、微生物菌体、菌体溶解物、酵素タンパク質またはタンパク質の分解物などが生体高分子物質に含まれる。
【００１１】
微生物菌体としては、野生株、遺伝子組換による形質転換微生物、あるいはそれらの菌体破砕物(cell homogenate)を挙げることができる。あるいは蛋白質としては、酵素活性を有する蛋白質を挙げることができる。蛋白質は天然型のみならず、組み換え体、あるいはアミノ酸配列の変異を含む変異体であってもよい。更に担体に固定化された微生物菌体あるいは蛋白質は、いずれも本発明における生体高分子物質に含まれる。
【００１２】
本発明の生体高分子物質の除去方法には、カチオン性高分子化合物が用いられる。本発明におけるカチオン性高分子化合物は、液体中でカチオン電荷を有する高分子化合物を言う。具体的には、ポリビニルアミジン、ポリエチレンイミン、およびキトサンなどの化合物を、本発明におけるカチオン性高分子化合物として利用することができる。これらのカチオン性高分子化合物としては、たとえば以下のように商業的に供給されている化合物を用いることもできる。
［ポリビニルアミジン］
クリフィックスＣＰ−１１１（栗田工業製、商品名）
クリフィックスＣＰ−１４１（栗田工業製、商品名）
［ポリエチレンイミン］
クリフィックスＣL-６０１（栗田工業製、商品名）
エポミンＳＰ−２００（日本触媒製、商品名）
エポミンＰ−１０００（日本触媒製、商品名）
［キトサン］
プレスエイド１０１（栗田工業製、商品名）
【００１３】
これらのカチオン性高分子化合物は、いずれも既に微生物の凝集剤などとして市販されている。しかし先に述べたように、通常、これらの凝集剤は、中性から酸性条件でなければ凝集効果が期待できないと考えられていた。アルカリ条件下でこれらのカチオン性高分子化合物を生体高分子物質の除去に利用できることは、本発明者らが明らかにした新規な知見である。
【００１４】
本発明において、カチオン性高分子化合物は、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることもできる。たとえば、ポリエチレンイミンとキトサンの組み合わせは好ましい。両者の同時添加によって生成される生体高分子物質の凝集物は、ろ過によって迅速に液体と分離することができる。また、本発明をβ-ヒドロキシアミノ酸の光学異性体の製造に応用した場合には、ポリエチレンイミンとキトサンの組み合わせによって、より効果的に生体高分子物質を除去することができる。すなわち本発明は、生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子物質を、ｐＨ１０以上の条件で混合する工程、および凝集物を分離する工程を含む、生体高分子物質の除去方法であって、前記カチオン性高分子化合物がポリエチレンイミンおよびキトサンである方法を提供する。
【００１５】
特に、微生物菌体の除去において、ポリエチレンイミンとキトサンの混合物は、優れた除去作用を示すことが確認された。したがってポリエチレンイミンとキトサンの混合物は、生体高分子物質、中でも微生物菌体のアルカリ条件下における除去のための好適なカチオン性高分子化合物の組み合わせであると言える。なお本発明においては、生体高分子物質である微生物菌体には、触媒活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現可能に保持した形質転換体も含まれる。
【００１６】
これらカチオン性高分子の添加濃度は、除去すべき生体高分子物質の濃度と種類、および添加する液体の条件などに応じて適宜設定することができる。たとえば、生体高分子物質である微生物菌体あるいは酵素が多量であれば、カチオン性高分子も十分な量を用いるのが望ましい。具体的には、カチオン性高分子化合物の濃度は、たとえば５０ppm〜１００００ppm、通常１００ppm〜５０００ppmの範囲から選択することができる。
【００１７】
本発明において、カチオン性高分子化合物は、生体高分子物質を含む液体に添加される。液体に含まれる生体高分子物質は、どのような状態で液体に存在していても良い。たとえば、その一部、あるいは全てが液体に分散(disperse)している生体高分子物質を本発明によって除去することができる。あるいは本発明の除去方法は、液体に溶解している生体高分子物質の除去にも有効である。
【００１８】
本発明において、液体には、生体高分子物質以外のものが混在していても良い。たとえば、触媒作用を有する生体高分子物質の基質となる化合物、触媒作用によって生成される化合物などが混在することができる。更に液体は、触媒作用の発現に必要な、補酵素、塩類、緩衝剤などを含むことができる。また、基質化合物などの溶解性を調節するために、液体のｐＨや温度を調節することができる。あるいは、異なる溶媒を液体に添加することもできる。たとえば、微生物反応または酵素反応で製造される有用物質が溶解している状態で添加することができる。
【００１９】
本発明は、特にアルカリ条件下における、生体高分子物質の除去に有用である。したがって、本発明においては、生体高分子物質に対してカチオン性高分子化合物がアルカリ性条件下で作用する条件が与えられる。本発明において、アルカリ性とは、通常ｐＨ１０以上を言う。好ましいｐＨとしては、たとえば１０−１４、通常１０−１２を示すことができる。具体的には、本発明は、液体へのカチオン性高分子化合物の添加の前、後、あるいは添加と同時の、いずれかのタイミングで、液体のｐＨを１０以上に調節する工程を含む。好ましくは、液体のｐＨを１０以上に調節した後に、カチオン性高分子化合物を添加する。蛋白質を多く含む液体のｐＨをアルカリにすると、精製操作の妨げになる発泡の原因となることは既に述べた。本発明においては、カチオン性高分子物質が蛋白質を凝集させる。その結果、液体中に溶解している蛋白質の濃度が低下して、発泡を抑制する効果がある。
【００２０】
たとえば、生体高分子物質に共存する化合物の溶解性を高めるためにアルカリ性とする場合には、ｐＨを調節するまでは、溶解していない化合物が液体中に存在している可能性がある。この状態でカチオン性高分子化合物を加えると、生体高分子物質が凝集する。その結果、生体高分子物質の凝集物の中に溶解していない化合物の一部が取り込まれる可能性がある。凝集物に取り込まれた化合物は、凝集物とともに液体から除去される可能性を否定できない。
一方、このような問題が無い場合には、ｐＨを調節するタイミングは任意である。つまり、カチオン性高分子化合物を加えた後にｐＨを調節することもできる。あるいは、カチオン性高分子化合物とともに塩基性化合物を添加することもできる。
【００２１】
本発明の生体高分子物質の除去方法は、生体高分子物質を利用した物質の製造方法に利用することができる。たとえば触媒作用を有する生体高分子物質を、原材料に作用させ、生成物を回収することにより、様々な物質が製造されている。具体的には、酵素作用を有する生体高分子物質によって、目的とする生成物を得る、あるいは目的とする物質に共存している物質を酵素的に除去して生成物を得ることができる。
触媒として利用された生体高分子物質は、一般に生成物の回収に先立ち、反応媒体から除去される。本発明の生体高分子物質の除去方法を、反応媒体からの生体高分子物質の除去方法として応用することができる。すなわち本発明における生体高分子物質を除去すべき液体として、生体高分子物質による物質の製造方法における反応媒体を用いることができる。このような反応媒体には、生体高分子物質に加えて、原料として加えた物質、生体高分子物質によって生成された物質、生体高分子物質の触媒作用に好適な条件を与えるための添加物などの様々な物質を含むことができる。
【００２２】
中でも本発明は、アルカリ条件下で製造すべき物質を溶解する溶解する工程を含む、物質の製造方法に好適である。製造工程において、アルカリ条件下で生体高分子物質を除去する工程を含む物質であれば、任意の物質の製造に本発明を応用することができる。たとえば、β−ヒドロキシアミノ酸は、その製造工程において、アルカリ性の媒体で溶解することができる。β−ヒドロキシアミノ酸の光学異性体は、医薬品や農薬の中間体として有用な化合物である。β−ヒドロキシアミノ酸のラセミ体を構成するD-体またはL-体のいずれかを、光学特異的に他の物質に変換すると、その光学異性体を得ることができる。この反応を生物学的触媒作用によって行うことができる。反応後の液体には、基質化合物として与えたβ−ヒドロキシアミノ酸の光学異性体が含まれている。β−ヒドロキシアミノ酸の光学異性体は、精製に先立ち、アルカリで溶解される。このとき、本発明の方法によって生体高分子物質を除去することができる。
【００２３】
なお本発明においは、基質化合物(substrate compounds)とは、触媒作用を受ける基質(substrate)を含む混合物であっても良い。すなわち、本発明において、基質化合物は、基質となる化合物と、基質とならない化合物（非基質化合物）の混合物であることができる。ある化合物に対する触媒の作用が、基質に対する触媒作用と比較して、相対的に低い、あるいは無い場合、その化合物は非基質化合物である。
【００２４】
したがって、光学特異的な触媒作用を受ける光学異性体（基質）を含むラセミ体は、基質化合物である。つまり上記の反応においては、基質化合物に含まれる基質（D-体かL-体のいずれか）が消費され、基質とならなかった化合物（非基質化合物）が反応液に残る。そして、残った化合物を光学異性体として回収することができる。
本発明において、ラセミ体と、回収される光学異性体は、それぞれ原料と生成物に相当する。すなわち、原材料を構成する物質であって、生体高分子物質の触媒作用によって原材料中に共存する他の物質を除かれた物質は、本発明における生成物に含まれる。
【００２５】
中性あるいは酸性において十分な溶解性を持たない化合物は、アルカリ性で溶解できる場合がある。例えばβ−ヒドロキシアミノ酸は、ｐＨをアルカリ性とすることで溶解性が高まる。したがってその製造においては、目的とするβ−ヒドロキシアミノ酸の含有量と溶解度によって、それらが十分に溶解するｐＨを適宜設定することができる。具体的にはｐＨ１０以上、好ましくは１０〜１２とすることで、室温において、β−ヒドロキシアミノ酸を十分に溶解することができる。ｐＨの調整には、任意の塩基を使用することができる。具体的には、NaOH、KOH、アンモニア水などの添加によって、ｐＨをアルカリに調整することができる。
【００２６】
β−ヒドロキシアミノ酸を含む反応媒体から本発明に基づいて生体高分子物質を除去するとき、生体高分子物質の除去に加えて、任意の工程を組み合わせることができる。たとえば、反応媒体の加熱、あるいは酸性処理によって、蛋白質などの生体高分子物質の沈殿を促進することができる。その結果、カチオン性高分子物質の添加量を減らすことができる。加熱および酸性処理の条件は、β−ヒドロキシアミノ酸の分解、あるいはラセミ化などの不利益を生じない範囲で適宜調節することができる。
【００２７】
具体的には、反応媒体をアルカリ条件とする前に、たとえばｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ１．０〜３．０で処理することができる。反応媒体を酸性とするために、任意の酸を添加することができる。通常、ｐＨの調整に使用される塩酸や硫酸等を、本発明における酸性処理に用いることができる。更に反応媒体を、酸性とした後に加熱することもできる。加熱の条件としては、たとえば６０℃以上、通常８０〜９５℃を示すことができる。加温のための時間は、たとえば０．１〜２４時間、通常０．５〜１２時間である。好ましくは、ｐＨを酸性とした後に８０〜９５℃で０．５〜１２時間処理することができる。
【００２８】
カチオン性高分子を添加して生じた凝集物はろ過、遠心分離、膜分離など通常の手段により容易に分離することができる。分離した溶液中のβ−ヒドロキシアミノ酸は、通常の方法を組み合せることで回収することができる。回収されたβ−ヒドロキシアミノ酸は、必要に応じて更に精製することができる。β−ヒドロキシアミノ酸の精製は、公知の方法によって精製することができる。精製方法としては、たとえば濃縮、イオン交換樹脂処理、抽出、活性炭処理、中和晶析、再結晶などが挙げられる。
【００２９】
本発明による生体高分子物質の除去方法は、アルカリ条件下で生体高分子物質を除去する工程を含む、任意の物質の製造方法に応用することができる。そして、たとえばβ−ヒドロキシアミノ酸の製造に有用であることは既に述べた。本発明の方法を応用することができるβ−ヒドロキシアミノ酸として、下式１（式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す）
【化３】
2006115730.tif 000003
で表される構造を有するDL-β-ヒドロキシアミノ酸を示すことができる。
【００３０】
式中Ｒは置換されても良い脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基を表す。具体的には、炭素数１０以下の低級アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１０以下のアルコキシ基、水酸基などで置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基または複素環式炭化水素基より選ばれた置換基である化合物である。より具体的シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、炭素数２０以下、好ましくは１０以下のアルキル基、アリル基、チエニル基等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、原料となるDL-β-ヒドロキシアミノ酸としては、D-β-ヒドロキシアミノ酸、L-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物が挙げられる。両者を等量に含む混合物が、ラセミ体である。DL-β-ヒドロキシアミノ酸としては、スレオ体またはエリスロ体のどちらでも使用できる。たとえば、Ｒがシクロヘキシル基の化合物に対して、本発明は有用である。具体的には、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を原料としてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を製造する場合に本発明の方法を利用することができる。
【００３２】
D-またはL-β-ヒドロキシアミノ酸の製造においては、いずれかの化合物に対して、光学特異的に作用する生体高分子物質が利用される。たとえば、以下の酵素、該酵素活性を有する微生物または微生物処理物を、生体高分子物質として利用することができる。本発明において、酵素活性を有する生体高分子物質を特に酵素活性物質(enzyme active materials)と記載することがある。
（１）アルドラーゼ類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する活性を有するL-アミノ酸アルドラーゼ類、あるいはグリシンと対応するアルデヒドからD-β-ヒドロキシアミノ酸を合成する活性を有するD-アミノ酸アルドラーゼ類
（２）脱炭酸酵素類：L-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的に脱炭酸し分解する活性を有するL-アミノ酸脱炭酸酵素類
（３）アシラーゼ類：N-アシル−DL-β-ヒドロキシアミノ酸を原料として、D体特異的に、あるいはL体特異的に加水分解する活性を有するアミノ酸アシラーゼ類
【００３３】
好ましい酵素としては、具体的には、L-フェニルセリンアルドラーゼ、L-スレオニンアルドラーゼ、L-アロ−スレオニンアルドラーゼ、D-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、L-低基質特異性スレオニンアルドラーゼ、D-スレオニンアルドラーゼ、D-アロ−スレオニンアルドラーゼ等を挙げることができる。中でも特に好ましい酵素として、L-フェニルセリンアルドラーゼを挙げることができる。なお、これらの酵素は公知であり、例えば以下に記載された手法により取得することができる。
特開平9-238680
ビタミン, 75, 2, 51-61, 2001
バイオサイエンスとインダストリー, Vol. 56, No. 11, 23-26, 1998
Nature, 181, 1533-1534, 1958
Biochim. Biophys. Acta, 258, 779-790 (1972)
FEMS Microbiology Letters, 151, 245-248, 1997
Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 702-708, 1998
Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 44-51, 2000
Eur. J. Biochem., 248, 385-393, 1997
【００３４】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ属に属し、下記（１）−（３）の性状により特徴づけられるL-フェニルセリンアルドラーゼ産生能を有する微生物より調製することができる。シュードモナス・プチダ属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を好適に挙げることができる。すなわちシュードモナス・プチダ属から単離され、以下の性状によって特徴付けられるL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明における酵素活性物質として利用することができる。あるいは、当該酵素を産生するシュードモナス・プチダ属微生物そのもの、あるいはその処理物を本発明の酵素活性物質として利用することができる。
（１） 作用
L-フェニルセリンに作用し、ベンズアルデヒドとグリシンを生成する。
（２） 基質特異性
(a) L-スレオ-フェニルセリン、およびL-エリスロ-フェニルセリンに共に作用するが、D-スレオ-フェニルセリン、およびD-エリスロ−フェニルセリンには実質的に作用しない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体には作用するが、D-エリスロ体には実質的に作用しない。
（３） 分子量
ゲル濾過における分子量が190,000-210,000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が35,000。
【００３５】
本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性は、例えば次のように確認することができる。
活性測定法：
20 mM DL-スレオ-フェニルセリン、200 mM TAPS-NaOH緩衝液(pH8.5)、20μM ピリドキサール-5'-リン酸（以下、PLPと省略する）および酵素を含む0.5 mLの反応液中で、30℃、10分間反応を行い、1 N HClを0.5 mL添加することによって反応を停止する。生成したベンズアルデヒドを次の方法によって定量する。1.0 mLの反応終了液に0.15 mLの0.1％ 2,4−ジニトロフェニルヒドラジンを含む2N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、30℃、20分静置する。更に、3 mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、0.85 mLの3 N NaOHを加え、10分間静置する。その溶液の475 nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、30℃において1分間に1 μmolのベンズアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。
【００３６】
また本発明において、触媒作用の影響を受けないとは、基質として各化合物を与えたときに、同じ条件で測定された両基質に対する活性を１００としたときに、当該化合物に対する活性がたとえば１０％以下、好ましくは５％以下の場合に、影響を受けないと言う。具体的には、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株由来のL-フェニルセリンアルドラーゼの、以下の化合物に対する活性は、それぞれ対応する両基質に対して以下のとおりである。
(a) L-スレオ-フェニルセリンまたはL-エリスロ-フェニルセリンに対する活性を１００とするとき、D-スレオ-フェニルセリンおよびD-エリスロ−フェニルセリンに対する活性は確認できない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体に対する活性を１００とするとき、D-エリスロ体に対する作用は確認できない。
【００３７】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本酵素は、DL-スレオ-フェニルセリンなどにより誘導されるため、培地に誘導物質を添加することが好ましい。例えば、１．０％ペプトン、０．２％リン酸1水素2カリウム、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキスを含むｐＨ７．２のペプトン培地に０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地が好適に利用される。
【００３８】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、微生物の培養物から、例えば、以下のようにして精製することができる。シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を上記０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含むペプトン培地中で十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護するのが望ましい。
還元剤：2-メルカプトエタノール等
プロテアーゼ阻害剤：フェニルメタンフルホニルフルオリド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、および金属キレーター等
ＰＬＰ
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、たとえば以下のような各種の蛋白質の分画方法、およびクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。
蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー
より具体的には、たとえば、以下の各工程にしたがって、無細胞抽出液から目的とする酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。各工程の詳細な条件は、たとえば実施例に記載したとおりとすることができる。
４０−６０％硫安分割；
ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー；
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；
ＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換クロマトグラフィー(２回目)
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；(２回目)
ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー；
【００３９】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株に由来するL-フェニルセリンアルドラーゼは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる。本発明に利用する酵素活性物質はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログを含む。すなわち本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質とは、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を含む。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【００４０】
あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、更に付加的なアミノ酸配列を有する蛋白質も、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の活性を有する限り、本発明における酵素活性物質として利用することができる。たとえば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列にHisタグなどを付加した蛋白質は、本発明における酵素活性物質に含まれる。更に、これらの蛋白質を発現する形質転換体、およびそれが産生する組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００４１】
本発明に利用するL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物理化学的、酵素化学的性状を有することを意味する。
【００４２】
当業者であれば、配列番号：１記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを得ることが可能である。
【００４３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００４４】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性状（１）および（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSC を含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４５】
さらに、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００４６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い相同性を示したのは、ラルストニア・ソラナシアラム(Ralstonia solanacearum)由来の予想低基質特異性アルドラーゼ（６８％）であった。機能が同定されている蛋白質の中では、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) PAO1株由来の低基質特異性L-スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列は、配列番号：２に対する相同性が４１%であった。
【００４７】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドをプローブとして、土壌等の環境サンプルから直接得られたDNAからスクリーニングすることによっても目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、環境サンプルから得られたDNAの物理的消化物、酵素的消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。上記方法で、ハイブリダイズするＤＮＡを得た後、得られたＤＮＡ塩基配列を解析した結果、コードするアミノ酸配列がL-フェニルセリンアルドラーゼと７０％以上の相同性を有するものは、同様の機能を有することが期待できる。こうして得られたDNAをもつプラスミドによって形質転換された大腸菌も、本発明に利用することができる。
【００４８】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより目的のDNAを得ることができる。
あるいは、PCRによって得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株のライブラリーをスクリーニングすることによって目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。
【００４９】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列情報に基づいて、その5'側あるいは3'側の塩基配列を取得することもできる。このような方法として、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）を利用することができる。あるいは、既知の断片配列情報に基づいて未知の領域を取得するための方法として、逆PCR(Inverse PCR;Genetics 120, 621-623 ,1988）も公知である。逆PCRにおいては、自己環化によって環状化されたDNAライブラリーが用いられる。このようなライブラリーは、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させることにより得ることができる。一方、逆PCR用のプライマーは、既知のcDNAの塩基配列に対して、その外側（未知の領域）に向かって相補鎖合成反応が進むようにデザインされる。鋳型となるDNAは環状化されているので、逆PCRによって未知の領域を増幅産物として得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００５０】
このようにして単離された、ホモログをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログの発現ベクターを得ることができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを組換え体として得ることができる。こうして得られた形質転換体、およびそれが産生するホモログの組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００５１】
本発明においてL-フェニルセリンアルドラーゼまたはそのホモログを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
【００５２】
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属等宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００５３】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００５４】
微生物菌体内などにおいて、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００５５】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００５６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００５７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００５８】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175, 1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００６０】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００６１】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614,1979)等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００６２】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003,1992)。
【００６３】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99,1991)、pUWL-KS （Gene 165,149-150, 1995)等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53, 1997)。
【００６４】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００６５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド(J. Bacteriol. 145, 382-390, 1981)、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６６】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である(Mol. Cell. Biol. 6, 80,1986)。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J. 6, 729, 1987)。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００６７】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267, 1985)などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター(Agri. Biol. Chem. 54, 2521, 1990)等が利用可能である。
【００６８】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である(Yeast 7, 431-443, 1991)。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており(Mol. Cell. Biol. 5, 3376, 1985)、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる(Nucleic Acids Res. 15, 3859, 1987)。
【００６９】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587,1987)、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００７０】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287,1989)。
【００７１】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる(Biotechnology 7, 596-603, 1989)。
【００７２】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されている。具体的には、蚕などの昆虫(Nature 315, 592-594,1985)、あるいは菜種、トウモロコシ、およびジャガイモ等の植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されている。これらの宿主・ベクター系も、本発明に利用できる。
【００７３】
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応溶液の接触形態は任意である。たとえば原料を含む溶媒に、酵素活性物質を混合することによって、両者を接触させることができる。酵素活性物質が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素活性物質が分散され、必要に応じて両者を分離することができる。あるいは原料を含む溶媒と、酵素活性物質を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形態は、酵素活性物質の回収と再利用を容易にする。本発明において、両者の接触形態は、これらの具体例に限定されない。
本発明において、酵素活性物質としては、配列番号：２に記載の蛋白質、またはそのホモログを機能的に発現する形質転換体並びにその処理物を用いることができる。例えば、pKK-PSA1により形質転換された大腸菌は、本発明における形質転換体として好ましい。
【００７４】
更に、本発明における酵素活性物質には、具体的には以下に示す酵素活性物質が含まれる。
界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生
物；
凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体；
ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液；
無細胞抽出液を部分精製したもの；
精製された酵素；
形質転換体あるいは酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物；
【００７５】
以上のように、本発明による生体高分子物質の除去方法は、種々の物質の製造方法に応用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、物質の製造方法に関する。
（１）原料と、当該原料に含まれる化合物に作用して別の物質に変換する触媒作用を有する生体高分子物質とを液体中で接触させ、生体高分子物質の触媒作用によって前記化合物を別の物質に変換する工程、
（２）前記生体高分子物質を含む液体とカチオン性高分子化合物をｐＨ１０以上の条件で混合し、生成する凝集物を分離する工程、および
（３）工程（１）において前記触媒作用によって変換された物質、および触媒作用によって変換されないで前記液体中に残った物質のいずれかを、工程（２）において凝集物を分離した液体から回収する工程
本発明による物質の製造方法における生体高分子物質には、本明細書に記載された様々な物質が含まれる。本発明の物質の製造方法は、たとえば光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造において有用である。本発明によって提供される光学活性β-ヒドロキシアミノ酸の製造に用いられる原料と、生体高分子物質、そして生成物として得ることができる光学活性β-ヒドロキシアミノ酸については既に述べた。以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００７６】
実施例中ではエリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸はＡＣＨＰと略す。
本発明におけるＡＣＨＰの定量及び光学純度の測定は高速液体クロマトグラフィーにより行った。ただし、光学純度の測定においてはＡＣＨＰをさらにｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化して測定した。
【００７７】
（参考例１）
DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法
〔１〕3-シクロヘキシル-2-プロペン酸の製造方法
マロン酸２３．９ｇにトルエン５８．１を加え、６５℃まで昇温し、ピリジン２７．１ｇ、ピペリジン０．５４ｇを滴下した。さらにシクロヘキシルアルデヒド３０．０ｇを滴下後、１０時間反応させた。反応終了後冷却し、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９３．３ｇを加え攪拌後、上層のトルエン相を除去した。下層にｔ−ブチルメチルエーテル５５．５ｇ、濃塩酸５５．８ｇを加え、攪拌後下層を除去した。上層のｔ−ブチルメチルエーテル相に水２４．８ｇ及び濃塩酸０．２９ｇを加え、攪拌後下層を除去した。上層のｔ−ブチルメチルエーテル相を減圧濃縮し、3-シクロヘキシル-2-プロペン酸３３．０ｇを得た。
【００７８】
〔２〕3-シクロヘキシル-2,3-エポキシプロピオン酸の製造
タングステン酸ナトリウム２水和物４３ｇに水６４．４ｇを加え溶解させ、４０℃に加温した。これに3-シクロヘキシル-2-プロペン酸２０ｇ及びメタノール１５．８ｇを加え、さらに３０％過酸化水素水２９．４ｇを滴下した。２５％水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを４．５〜５．０の範囲にコントロールしながら４０℃にて２０時間反応させた。反応終了後１０℃以下まで冷却し、３５％重亜硫酸ナトリウム及び２５％水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ４．０〜６．０に保ちながら滴下し、過酸化水素を分解した。減圧条件下にてメタノールを留去した後、濃塩酸を用いてｐＨを２．０〜３．０に調整した。ｔ−ブチルメチルエーテル６７６ｇを加え３０分以上攪拌した後、３０分以上静置した。下層を分液した後、上層をろ過した。このろ液を減圧下で濃縮することで淡黄色油状の3-シクロヘキシル-2,3-エポキシプロピオン酸１６．２ｇを得た。
【００７９】
〔３〕２−ベンジルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸の製造
3-シクロヘキシル-2,3-エポキシプロピオン酸１０．０ｇに水２１．０ｇ及び２５％水酸化ナトリウム水溶液９．４ｇを加え溶解させ、４０−５５℃に昇温した。ベンジルアミン１８．９ｇを滴下し、９０℃で１０時間反応させた。反応後３０℃以下まで冷却した後、濃塩酸１７．１ｇ、水６１．１ｇ、ｔ−ブチルメチルエーテル９．９ｇの混合液に反応液を滴下した。滴下後２５％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを３．５に調整し、３０分攪拌した。析出した結晶をろ過し、結晶をアセトン、水で洗浄し、５０℃で減圧下乾燥することで2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸１３．９ｇを得た。
【００８０】
〔４〕DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法
２−ベンジルアミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸１３．０ｇにメタノール６２．８ｇ、水３９．４ｇ、２５％水酸化ナトリウム水溶液７．５ｇ及び触媒として５０％含水水酸化パラジウム（活性炭担持物）０．７ｇを加え、水素ガスで５００kPaまで加圧し、５０℃で４時間反応を行った。反応後１２％水酸化ナトリウム水溶液７．７ｇを加えて３０分攪拌後、濾過することで触媒を除去した。ろ液を減圧濃縮し、メタノール、トルエンを除去し、濃塩酸にてｐＨを５．８に調整した。析出した結晶を濾過し、水で洗浄後、減圧下乾燥することでDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸７．９ｇを得た。
【００８１】
（参考例２）
シュードモナス・プチダ・バイオバ-A 24-1株 (Pseudomonas putida biovar. A)の培養
シュードモナス・プチダ・バイオバ-A 24-1株を1.0%ペプトン、0.2%リン酸1水素2カリウム、0.2%リン酸２水素１カリウム、0.2%塩化ナトリウム、0.01%硫酸マグネシウム・７水和物、0.01%酵母エキスを含むpH7.2のペプトン培地に植菌し、30℃、12時間振盪培養した。同ペプトン培地に0.2%DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地に植菌し、更に30℃、24時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
【００８２】
（参考例３）
Ｌ-フェニルセリンアルドラーゼの精製
参考例２により調製した菌体289ｇを、0.1M TES-NaOH緩衝液（pH7.2）、2mM エチレンジアミン4酢酸(EDTA)、0.02% 2-メルカプトエタノールを含む菌体破砕液に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を10mM TES-NaOH緩衝液（pH7.2）、1mM EDTA、0.01%2-メルカプトエタノール、50μM PLPを含む緩衝液１に透析し、無細胞抽出液とした。
【００８３】
無細胞抽出液に40%飽和まで硫安を添加し、遠心分離により沈殿を除去した。その上清に60%飽和まで硫安を添加し、遠心分離の沈殿画分として本酵素を回収した。
沈殿画分を緩衝液1に溶解し、同緩衝液に透析後、緩衝液１で平衡化したDEAE-セルロースカラム（4.8 ｘ 38ｃm）に本酵素を吸着させた。緩衝液1、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M塩化カリウムを含む緩衝液1で段階溶出した結果、本酵素は、0.15M及び0.2M塩化カリウムを含む緩衝液1で溶出した。活性画分を集め、10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.2）、0.01%2-メルカプトエタノールを含む緩衝液2に対して透析した。
【００８４】
次に、緩衝液2で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（1.7 x 18ｃm）に酵素を吸着させ、0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.1Mリン酸カリウム緩衝液で段階溶出した。0.01M、0.02M及び0.03Mリン酸緩衝液で溶出した活性画分を回収し、濃縮後、緩衝液１に透析した。
緩衝液１で平衡化したDEAE-セルロース（1.7 ｘ 19cm）に透析した酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M塩化カリウムを含む緩衝液1で段階溶出を行った。本酵素は、0.15M塩化カリウムを含む緩衝液１で溶出した。活性画分を濃縮後、緩衝液２に透析した。
【００８５】
緩衝液２で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（1.7 x 18cm）に酵素を吸着し、緩衝液2で洗浄後、0.01M、0.03M、0.05Mリン酸カリウム緩衝液で溶出した。本酵素は、0.03Mリン酸カリウムで溶出した。活性画分を回収、濃縮後、緩衝液１に対して透析した。
緩衝液１で平衡化したMono Qカラム（0.5 ｘ 5cm）に酵素を吸着し、同緩衝液で洗浄後、0から0.5M塩化カリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、精製酵素とした。
精製酵素をゲル電気泳動に供した結果、Native-ポリアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドいずれの条件においても単一バンドを示した。
【００８６】
精製の要約を表１「L-フェニルセリンアルドラーゼの精製」に示した。
【表１】
2006115730.tif 000004
【００８７】
（参考例４）
L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKK-PSA1の構築
〔１〕  シュードモナス  プチダからの染色体ＤＮＡの精製
シュードモナス・プチダ・バイオバ−Ａ  ２４−１株を１．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウムを含む培地で培養し、菌体を調製した。染色体ＤＮＡは、Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)に記載の方法により菌体から精製した。
【００８８】
〔２〕L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のコア配列のクローニング
参考例２で得られた精製酵素をトリプシン消化して得られたペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３及び配列番号：４）を元に、プライマー１２及びプライマーＣを合成した。
配列番号：３    
Gln-Ala-Gly-Pro-Tyr-Gly-Thr-Asp-Glu-Leu
配列番号：４
Phe-Gly-PHe-Tyr-His-Asp-Arg-Trp
配列番号：５  プライマー１２
GGGAATTCAGGCGGGCCCGTATGGCACCGACCGACGA
配列番号：６  プライマーＣ
AAGCCGAAGATAGTGCTGGGCGACCCCTAGGGG
【００８９】
各５０pmolのプライマーセット、１０nmolのｄＮＴＰ、５０ngの染色体ＤＮＡ、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液（パーキンエルマー社製）、３mMのＭｇＣｌ２、２．５UのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、１分）、アニール（５０℃、２分）、伸張（６５℃、３分）を３０サイクル、ＤＮＡ Thermal Cycler（パーキンエルマー社製）を用いてＰＣＲを行った。
増幅したＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー社製）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサ−ABI PRISMTM 310（パーキンエルマー社製）により行った。得られた配列を配列番号７に示した。
【００９０】
〔３〕L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子の全領域のクローニング
コア配列の塩基配列を元に、プローブＵ２及びプローブＣの３つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらの合成ＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
配列番号８：  プローブＵ２
TGATGACCGTCGACGGCCCG
配列番号９：  プローブＣ
CGGCCTTCAGCAGCGCATCGA
【００９１】
すなわち、制限酵素SpHIで消化した染色体ＤＮＡを泳動したアガロースゲルをナイロンメンブレンフィルター（デュポン社製）ブロッティングした。ブロッティングしたメンブレンを２×ＳＳＣ溶液で洗浄後、０．４  Ｍ  ＮａＯＨで１分間アルカリ処理し固定した。続いて０．２  Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）−２×ＳＳＣ溶液で中和処理後、風乾した。このメンブレンをハイブリダイゼーション液（０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン、０．７５mM ＮａＣｌ、７５mM  クエン酸ナトリウム、１％  ＳＤＳ）に浸し、４５〜５５℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った。次に、２５０μgの熱変性サケ精子ＤＮＡと３２Ｐでラベルしたプローブを加えたハイブリダイゼーション液で更に４５〜５５℃で一晩ハイブリダイゼーション処理した。ハイブリダイズしたメンブレンを６×ＳＳＣ−０．５％  ＳＤＳ溶液で洗浄した。続いて同溶液で５５℃、２分間洗浄し、２×ＳＳＣ溶液で軽くすすいだ後、風乾し、オートラジオグラフィーを行った。
【００９２】
その結果、染色体ＤＮＡをSpHIで消化して得られた約６．７kbのＤＮＡ断片が、どちらのプローブとも強くハイブリダイズすることが確認されたため、該ＤＮＡ断片部分をゲルから切り出し、同制限酵素SpHIで消化したpUC19とTaKaRa DNA Ligation Kit（タカラバイオ製）を用いて、ライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡによって大腸菌JM109株を形質転換し、約７００個のクローン株を得た。
【００９３】
得られた約７００個のクローン株について、合成ＤＮＡプローブＵ２用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、放射活性が強い４１個のコロニーを選択した。これらのクローン株から目的とする約６．７kbの挿入ＤＮＡ断片を含むプラスミドを選択し、pPSA2とした。
pPSA2の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、コア配列を含む１０７４bpのオープンリーディングフレーム(ORF)を確認できた。得られた塩基配列及びこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１及び配列番号：２に示した。
【００９４】
〔４〕L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子高発現プラスミドpKK-PSA1の構築
該L-フェニルセリンアルドラーゼの高発現株を構築した。まず、pPSA2の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をもとに、該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のORFの上流部位及び下流部位に対応するそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマーPSA-ECO及びプライマーPSA-HINを合成した。
配列番号：１０  プライマー  PSA-ECO
GGGAATTCGACCATCAGGCGAGCGTCAA
配列番号：１１  プライマー  PSA-HIN
GGAAGCTTCCAGAGCGAGCACAGCCGCCAC
【００９５】
プラスミドpPSA2を鋳型として、各１０pmolのプライマーセット、０．２mMのｄＮＴＰ、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（パーキンエルマー社製）、２．５UのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（５０℃、３０秒）、伸張（７２℃、１分）を３０サイクル、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマー社製）を用いてＰＣＲを行った。増幅ＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて二重消化し、同様に二重消化したpKK223-3にライゲーションしてpKK-PSA1を得た。該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKK-PSA1はFERM-P-20054として寄託された。
以下に、寄託物を特定するための情報を記載する。
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日：平成１６年４月１３日
（ｃ）受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２００５４
【００９６】
（参考例５）
L-フェニルセリンアルドラーゼの活性確認
参考例４で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を、アンピシリン（５０mg/L）を含む液体LB培地（バクト−トリプトン１０g/L、バクト−酵母エキス５g/L、塩化ナトリウム１０g/L、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で終夜培養した後、アンピシリン（５０mg/L）を含む２×ＹＴ培地（バクト−トリプトン２０g/L、バクト−酵母エキス１０g/L、塩化ナトリウム１０g/L、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で培養した後、０．１mM  ＩＰＴＧにより誘導を４時間行い、遠心分離により集菌体を得た。集菌後、０．０２％  ２−メルカプトエタノール、２mM  ＥＤＴＡ、２０μM  ピリドキサール-5'-リン酸を含む１００mM  ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣD-２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を無細胞抽出液としてL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を測定した結果、２０．０U/mgの比活性を有することが確認できた。
【００９７】
（参考例６）
大腸菌JM109 (pKK-PSA1)を用いたD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成
参考例４により得られたプラスミドpKK-PSA1を有する大腸菌JM109株を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
４００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸および菌体を含む１０  mLの反応液を、攪拌下、３０℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の定量、及び光学純度を分析した。
結果を表２に示した。DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の濃度を１％、５％とした何れの場合においても、不要な異性体の分解は完全に進行し、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸が９９．０％ｅ．ｅ．以上の光学純度で得られることが確認できた。
【００９８】
【表２】
2006115730.tif 000005
ＡＣＨＰの定量
カラム：Wakosil II 5C18, φ４．６mm×２５０mm（和光純薬工業）
移動相：５０mM  カリウムリン酸緩衝液ｐＨ２．５／アセトニトリル［９５：５］
カラム温度：４０℃
流速：１．０ml/min
検出：２１０nm
【００９９】
Ｂｏｃ−ＡＣＨＰ光学純度の測定
カラム：キラルセル(Chiralcel) AD-H（ダイセル化学工業），φ４．６mm×２５０mm
移動相：n-ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸［９００：１０：１］
カラム温度：２５℃
流速：１．０mL/min
検出：２１０nm
保持時間：L-エリスロ体  １０．８分、D-エリスロ体  １２．３分、スレオ体  ８．７分、１４．５分
注）スレオ体のＤ，Ｌ判定は未決定
【０１００】
ＡＣＨＰのＮ−Ｂｏｃ化
ＡＣＨＰ約０．０１mmolを含むサンプルに０．５mLの５０mM  Ｎａ２ＢＯ４−ＮａＯＨ緩衝液，ｐＨ１０．８を添加し、良く攪拌し、ＡＣＨＰを溶解させた。不溶物があればろ過、および遠心分離により除いた。この溶液に０．５mLメタノールを添加した後、ジ-tert-ブチルジカーボネート０．０１２mmolを加え、３０℃、２時間攪拌した。次いで０．４mLの５％ＫＨＳＯ３を添加し、ｐＨが３以下であることを確認した。次いで１．５mLの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を分離し、減圧下に酢酸エチルを留去した。この残渣を適量のＨＰＬＣ移動相（n-ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸［９００：１０：１］）に溶かし、光学純度測定サンプルとした。
【０１０１】
（実施例１）カチオン性、アニオン性高分子化合物のスクリーニング
参考例５と同様にしてプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を培養した。４００mM  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、５．４％(wt/wt)  DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、上記培養液７５ｇ分の菌体を含む合計１５０ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で２０時間反応し、D-ＡＣＰＨ  ２６．３g/Lを含む反応液を得た。この反応液１００ｇに２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、遠心分離にて菌体など不溶物を除去した。この上清を２．０mLずつ試験管に分注し、それぞれ表３に示した０．２％の栗田工業製凝集剤水溶液０．３mL（クリフィックスＣＬ-６０１のみ５％液を０．３mL）を添加し、新たに凝集物が生成するかを観察した。凝集物の生成量の多さを＋の個数で、生成しなかったものは−で示した。この結果、単独の添加ではクリフィックスＣＬ−６０１、ＣＰ−１１１が凝集物を生じ、他の凝集剤は効果が見られなかった。また、５％クリフィックスＣＬ−６０１と０．２％プレスエイド１０１を同時に０．３mLずつ添加すると凝集物の生成量は明らかに増加し、同時添加の効果が見られた。
【０１０２】
【表３】
2006115730.tif 000006
【０１０３】
（実施例２）カチオン性高分子化合物の添加
参考例５と同様にしてプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を培養した。４００mM  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、５．４％(wt/wt)  DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、上記培養液７５ｇ分の菌体を含む合計１５０ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で２０時間反応し、D-ＡＣＰＨ  ２６．３g/Lを含む反応液を得た。この反応液１００ｇに２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、遠心分離にて菌体など不溶物を除去した。この上清を３０ｇずつ３つに分けて、それぞれに以下のカチオン性高分子化合物を添加後、軽く振盪し、１時間静置した。
（１）無添加、
（２）クリフィックスＣＬ−６０１  ７５００ppm、
（３）プレスエイド１０１  ３００ppm、
生じた凝集物を遠心分離し、上清を得た。それぞれ室温にて１０％硫酸水で中和晶析し、ｐＨ６．０とした。４℃で一夜静置した後、ろ過により結晶を回収し、１５mLの冷精製水でリンス、５０℃、減圧下に乾燥した。ＡＣＨＰ含量、ろ過時間他は表４の通りであった。この結果、カチオン性高分子の添加、特にプレスエイド１０１とクリフィックスＣＬ−６０１の同時添加がろ過時間の短縮、結晶純度向上に特に有効であることが判明した。
【０１０４】
【表４】
2006115730.tif 000007
注）ろ過はφ２１mm、桐山ロート使用、水流アスピレーターで吸引
【０１０５】
（実施例３）
参考例４で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を培養した。４００mM  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、５．４％(wt/wt)  DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、上記培養液２００ｇ分の菌体を含む合計４００ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で２０時間反応し、D-ＡＣＰＨ  ２６．５g/Lを含む反応液を得た。この反応液２００ｇに２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、０．２％プレスエイド１０１  ３０ｇ、５％クリフィックスＣL-６０１  ３０ｇを添加後、軽く攪拌し、１時間静置した。生じた凝集物を遠心分離し、上清を得た。この上清を室温にて２０％硫酸水で中和晶析し、ｐＨ６．０とした。４℃で一夜静置した後、ろ過により結晶を回収し、３０mLの冷精製水、次いで３０mLの２−プロパノールでリンスした。この湿結晶を５０℃、減圧下に乾燥し、ＡＣＨＰ結晶４．８４ｇを得た。ＡＣＨＰ含量８５．０％。光学純度９９．０％ee以上、９９．０％de以上であった。
【０１０６】
（実施例４）酸処理ｐＨの比較
参考例４で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を培養した。３５０mM  Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、５．４％(wt/wt)  DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、上記培養液７５ｇ分より遠心集菌した菌体を含む合計１５０ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で２０時間反応し、D-ＡＣＰＨ  ２６．１g/Lを含む反応液を得た（光学純度９８．６％ee、９６．６％de）。この反応液を１５ｇずつ、３つに分け、濃硫酸にてｐＨ２．５、３．０、３．５に調整し、これら液をそれぞれ８０℃、攪拌しながら６時間加熱処理した。冷却後、２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、遠心分離にて菌体など不溶物を除去した。この上清を室温にて１０％硫酸水で中和晶析し、ｐＨ６．０とした。４℃で一夜放置した後、ろ過により結晶を回収し、５mLの冷精製水でリンスし、５０℃、減圧下に乾燥した。ＡＣＨＰ含量は表５の通りであった。この結果、ｐＨ３．０以下での加熱処理が有効であることが判明した。
【０１０７】
【表５】
2006115730.tif 000008
【０１０８】
（実施例５）ポリビニルアミジンの添加
実施例４で調製した反応液３０ｇのｐＨを濃硫酸にて３．０に調整し、８０℃、６時間、攪拌しながら加熱した。冷却後、２５％ＮａＯＨ水(w/v)を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、遠心分離にて菌体など不溶物を除去した。この上清を１０ｇずつ２つ分け、一方には栗田工業製クリフィックスＣＰ−１１１  ０．２％液を３．０ｇ添加し軽く振った。１．５時間静置した後、遠心分離し、上清を得た。両上清を室温にて１０％硫酸水で中和し、実施例１と同様にしてＡＣＨＰ結晶を得た。両結晶の比較を表６にまとめた。ポリビニルアミジン添加の有効性が明らかとなった。
【０１０９】
【表６】
2006115730.tif 000009
【０１１０】
（実施例６）菌体分離前のカチオン高分子化合物の添加
参考例４で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を培養した。２５０mM  Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０μM  ピリドキサール-5'-リン酸、５．４％(wt/wt)  DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、上記培養液３５ｇ分の菌体を含む合計７０ｇの反応液を、攪拌下、３０℃で２０時間反応し、D-ＡＣＰＨ  ２６．３g/Lを含む反応液を得た。この反応液３０ｇのｐＨを濃硫酸で３．０に調整し、８０℃、６時間加熱した。冷却後、２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０としてＡＣＰＨを溶解し、１０ｇずつ３つに分けた。（１）は遠心分離にて菌体など不溶物を除去した。もう２本には栗田工業製クリフィックスＣＰ−１１１  ０．４％液をそれぞれ（２）０．７５ｇ、（３）１．１３ｇ添加し軽く振った。１．５時間静置した後、生じた凝集物と菌体を遠心分離し、上清を得た。両上清を室温にて１０％硫酸水で中和し、実施例１と同様にしてＡＣＨＰ結晶を得た。両結晶の比較を表７にまとめた。ポリビニルアミジンは菌体分離前に添加しても有効であった。
【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
（実施例７）加熱処理温度の検討
実施例６で調製した反応液を濃硫酸でｐＨ３．０に調整した。これを１０ｇずつ１００mL容ナスフラスコに入れ、６０℃、８０℃、９５℃でスターラーで攪拌しながら加熱を行い、０、１、３、６時間後に０．２mLずつサンプリングし、ＡＣＨＰの光学純度の変化を測定した。また、６時間加熱後、２５％ＮａＯＨ水を加えてｐＨ１１．０とし、ＡＣＨＰ結晶を完全に溶解したのち、遠心分離（４０００×ｇ，１０分間）で不溶物を除去した。得られた上清を比較したところ、加熱しなかった場合は強い濁りが、６０℃は濁りが見られたが、８０℃、９５℃は清澄な液で、加熱によりタンパク質など生体高分子物質が沈殿、除去されたことが分かった。また、光学純度については、表８−１、２に示すように６０℃、８０℃では変化が見られなかった。
【０１１３】
【表８−１】
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【０１１４】
【表８−２】
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【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によって、アルカリ条件における生体高分子物質の除去方法が提供された。本発明は、たとえば、アルカリ条件で溶解された物質に共存する生体高分子物質の除去に有用である。たとえば、触媒作用を有する生体高分子物質を利用する物質の製造方法において、反応媒体中の生体高分子物質を本発明によって除去することができる。本発明に基づいて生体高分子物質を除去することによって、目的物質を特殊な機器を使用せず容易に回収することが可能となった。
たとえば、触媒作用を有する生体高分子物質を用いた光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法は、アルカリ条件で溶解する工程を含む。光学活性β−ヒドロキシアミノ酸は、医薬・農薬中間体として有用な物質である。本発明の生体高分子物質の除去方法を、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の製造に利用すれば、生体高分子物質を容易に除去することができる。本発明を利用することによって、光学活性β−ヒドロキシアミノ酸を工業的規模で効率的に製造することができる。
【配列表】
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