(57)【要約】【課題】  Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の検出に有用な抗ＣＲＰモノクローナル抗体であって、ＥＤＴＡ塩による構造変化の無いＣＲＰの構造を認識し、血清アミロイドＰに対する交差性を有しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体を効率よく提供すること。【解決手段】  ＣＲＰの構造変化を起こさない部分、かつ血清アミロイドＰと比較して立体構造の異なる部分におけるＣＲＰのアミノ酸配列をもとに作製したペプチドをもとに調製したペプチド抗原、およびＣＲＰを免疫原として使用し、哺乳動物に免疫した後、得られた脾臓細胞をもとに抗体産生細胞の作製を行う。【選択図】  図５
2006115716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）モノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法であって、
ＣＲＰのモノマー中の、カルシウムイオンの離脱により実質的に立体構造変化を起こさず、かつ血清アミロイドＰのモノマーと比較して実質的に立体構造の異なる部分に含まれるアミノ酸配列に基づいて作製された１種または複数種のペプチド抗原およびＣＲＰを免疫原として用いて免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞ラインとを細胞融合して、融合細胞を得る工程；および
ＣＲＰに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞ラインを該融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、ＣＲＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む、工程
を包含する、抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項２】
前記１種または複数種のペプチド抗原は、ＰＬＴＫ（配列番号２）、ＫＲＱＤ（配列番号３）、ＫＰＲＶＲＫＳＬ（配列番号４）、ＧＧＰＦ（配列番号５）、およびＬＷＰ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかもしくは全て、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項３】
前記１種または複数種のペプチド抗原は、前記ペプチドの全てを含む、請求項２に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項４】
前記１種または複数種のペプチド抗原は、ＰＬＴＫ（配列番号２）、ＫＲＱＤ（配列番号３）、ＫＰＲＶＲＫＳＬ（配列番号４）、ＧＧＰＦ（配列番号５）、およびＬＷＰ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかもしくは全て、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項５】
前記クローニングする工程において、カルシウムイオンの離脱したＣＲＰおよびカルシウムイオンの結合したＣＲＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む、請求項１に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項６】
前記クローニングする工程において、さらに血清アミロイドＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む、請求項１に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により作製された抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
【請求項９】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
【請求項１０】
請求項７に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された、抗ＣＲＰモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された、抗ＣＲＰモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項９に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された、抗ＣＲＰモノクローナル抗体。
【請求項１３】
検体中のＣＲＰを検出するための方法であって、
請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載のモノクローナル抗体とＣＲＰを含む検体とを混合する工程、および
前記混合物中での前記抗体とＣＲＰとの反応を光学的、電気的、または物理的な方法によって検出する工程を包含する、ＣＲＰ検出方法。
【請求項１４】
請求項１３のＣＲＰ検出方法に使用するためのＣＲＰ検出キットであって、
請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載のモノクローナル抗体を含む、
キット。
【請求項１５】
検体中のＣＲＰを検出するためのキットであって、
移動相としての第１の抗体と、固相としての第２の抗体とを担持した支持体を含み、
第１の抗体は、該支持体に移動可能に担持され、第２の抗体は該支持体に結合されており、
第１の抗体および第２の抗体は、請求項１０、請求項１１または請求項１２に記載の抗ＣＲＰモノクローナル抗体であり、第１の抗体は標識されている、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ反応性タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する細胞ライン、その作製方法、およびそれにより産生されたモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、代表的な急性相反応物質であり、炎症性疾患、体内組織の壊死などがある時に著しく増加する血清タンパク質である。ＣＲＰは、例えば、細菌またはウイルスでの感染症；慢性関節リュウマチなどの膠原病；悪性腫瘍；心筋梗塞；肝炎、肝硬変などの消化器疾患；大きな外傷のような広範囲の組織崩壊性疾患が存在する場合に高い値を示す。
【０００３】
そのため、ＣＲＰについての検査は、疾病特異性はないものの、被検体における組織崩壊性疾患の存在を検出するために非常に有用である。例えば、ＣＲＰに対する抗体を用いて、体調不良者の事前検査（ＣＲＰが陽性の場合は疾患を特定するためのさらなる検査を行う）、ＣＲＰ量の定量による病態スクリーニング、治療効果の確認、予後の判定等を行うことが出来る。
【０００４】
しかしながら、ＣＲＰに対する抗体には、ＣＲＰとアミノ酸配列および立体構造の類似した補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰ等と交差反応を起こすものもある。このような交差反応が生じると、ＣＲＰの検査における測定精度の低下を導く。したがって、従来、ＣＲＰを免疫学的手法により特異的に検出する測定精度を上げるために、血中に存在する補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交差反応性を有しない抗体の作製方法の開発が行われてきた（例えば、特許文献１を参照）。
【０００５】
一方、ＣＲＰは、カルシウム依存的に（Ｃａ2+イオンのＣＲＰへの結合／離脱に依存して）、立体構造が変化することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００６】
他方、交差反応性を有しない等の精密な性能を要求されるモノクローナル抗体試薬の開発には、実験動物の免疫から、細胞融合、スクリーニング、クローニング等の過程を経て抗体の確立に至るまでに、通常１年半から２年程度の長期間を要するが、この抗体開発期間の短縮が望まれている。
【特許文献１】特開２００１−００１８１号公報
【非特許文献１】アネット  Ｋ．シュライブ（Ａｎｎｅｔｔｅ  Ｋ．  Ｓｈｒｉｖｅ）他８名，「ヒトＣ反応性タンパク質の３次元構造」（Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ），ネイチャーストラクチュラルバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第３巻（ｖｏｌｕｍｅ  ３），第４号（ｎｕｍｂｅｒ  ４），１９９６年４月、ｐ．３４６−３５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の方法で得られた抗体は、補体Ｃ１ｑや血清アミロイドＰに対して交差反応性を示さないが、その中にはＣＲＰがＣａ2+イオンの離脱によって構造変化を起こした場合に、ＣＲＰを認識することができないものも含まれている。採血管で採取した血液中でＣＲＰ測定を行う場合に、採血管中で血液の抗凝固剤としてＥＤＴＡ塩を使用することも多く、そのような場合、ＥＤＴＡ塩のＣａ2+イオンキレート作用によるＣａ2+イオンの離脱で構造変化を起こしたＣＲＰをその抗体が認識できないとすると、測定精度の点で不利である。
【０００８】
そこで、本発明は、Ｃａ2+の結合したＣＲＰのみならず、Ｃａ2+離脱によって立体構造の変化したＣＲＰも同様に認識して特異的に結合し得、かつ同じペントラキシンファミリーに属して立体構造が非常に似通った血清アミロイドＰと交差反応を起こさない抗ＣＲＰモノクローナル抗体を産生する細胞ラインを作製する方法、その抗体産生細胞ライン、およびそれによって産生された抗体を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、交差反応性を有さないモノクローナル抗体の開発において、抗原分子中の特定配列のペプチド断片が実際の抗原分子中での特異構造をミミックする構造をとらないような場合でも、より少ない労力で所望のモノクローナル抗体を開発することを可能にするモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記従来の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＣＲＰのアミノ酸配列中のＣａ2+離脱によっても構造変化を起こさない部分であって、かつ血清アミロイドＰとは立体構造の異なる部分のペプチド断片と、ＣＲＰとの混合物を免疫原として用いて哺乳動物を免疫することによって、Ｃａ2+の結合したＣＲＰのみならず、Ｃａ2+の離脱によって構造変化したＣＲＰに対しても特異的に結合し得、かつ血清アミロイドＰとの交差反応を示さない抗ＣＲＰモノクローナル抗体を産生する細胞ラインを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、抗Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）モノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法であって、ＣＲＰのモノマー中の、カルシウムイオンの離脱により実質的に立体構造変化を起こさず、かつ血清アミロイドＰのモノマーと比較して実質的に立体構造の異なる部分に含まれるアミノ酸配列に基づいて作製された１種または複数種のペプチド抗原およびＣＲＰを免疫原として用いて免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞ラインとを細胞融合して、融合細胞を得る工程；およびＣＲＰに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞ラインを該融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、ＣＲＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む、工程を包含する、抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法を提供する。
【００１２】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法の好ましい実施形態では、上記１種または複数種のペプチド抗原は、ＰＬＴＫ（配列番号２）、ＫＲＱＤ（配列番号３）、ＫＰＲＶＲＫＳＬ（配列番号４）、ＧＧＰＦ（配列番号５）、およびＬＷＰ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかもしくは全て、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００１３】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法の好ましい実施形態では、上記１種または複数種のペプチド抗原は、上記ペプチドの全てを含む。
【００１４】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法の好ましい実施形態では、上記１種または複数種のペプチド抗原は、ＰＬＴＫ（配列番号２）、ＫＲＱＤ（配列番号３）、ＫＰＲＶＲＫＳＬ（配列番号４）、ＧＧＰＦ（配列番号５）、およびＬＷＰ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかもしくは全て、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００１５】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法の好ましい実施形態では、上記クローニングする工程において、カルシウムイオンの離脱したＣＲＰおよびカルシウムイオンの結合したＣＲＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む。
【００１６】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法の好ましい実施形態では、上記クローニングする工程において、さらに血清アミロイドＰに対する結合能について免疫測定法により検定することを含む。
【００１７】
本発明は、別の局面において、抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインを提供し、この細胞ラインは、上記本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法によって作製されている。
【００１８】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの好ましい実施形態は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ラインである。
【００１９】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの別の好ましい実施形態は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ラインである。
【００２０】
本発明は、さらに別の局面において、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を提供する。
【００２１】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の好ましい実施形態は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００２２】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の別の好ましい実施形態は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００２３】
本発明は、さらに別の局面において、検体中のＣＲＰを検出するための方法を提供する。この方法は、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナルと、ＣＲＰを含む検体とを混合する工程、および上記混合物中での上記抗体とＣＲＰとの反応を光学的、電気的、または物理的な方法によって検出する工程を包含することを特徴とする。好ましくは、上記本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、抗体受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００２４】
本発明はさらに別の局面において、上記ＣＲＰ検出方法に使用するためのＣＲＰ検出キットを提供し、このキットは、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体を含む。好ましくは、上記本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００２５】
本発明はさらに別の局面において、検体中のＣＲＰを検出するためのキットを提供する。このＣＲＰ検出用キットは、移動相としての第１の抗体と、固相としての第２の抗体とを担持した支持体を含み、第１の抗体は、該支持体に移動可能に担持され、第２の抗体は該支持体に結合されており、第１の抗体および第２の抗体は、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体であり、第１の抗体は標識されていることを特徴とする。好ましくは、上記本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号のモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生された抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００２６】
本明細書中で、「免疫（する）」とは、実験動物に抗原を注射して、実験動物の体内で免疫反応を起こし、その抗原に対応する抗体を産生させることをいうものとする。
【００２７】
本明細書中で、「免疫原」という用語は、当該分野で認識されている通常の意味で使用される。また、本明細書中で、「抗原」という用語は、「免疫原」と同義で使用される。
【００２８】
本明細書中で、「特定配列」とは、目的の抗原分子と、立体構造が類似する他の抗原分子とを比較した場合に、類似する他の抗原分子とは異なる立体構造（本明細書中で、「特異構造」と呼ぶこともある）をとる目的の抗原分子中の部分に対応するアミノ酸配列のことをいうものとする。
【００２９】
本発明の方法は、交差反応性を有さない抗ＣＲＰモノクローナル抗体を作製するために免疫応答を動物中で惹起するにおいて、特定配列に対応するＣＲＰペプチド断片とＣＲＰ分子全体とを組み合わせて免疫する。このような本発明の構成は、新規であり、かつ意外なものである。
【発明の効果】
【００３０】
上記構成により、本発明は、ＥＤＴＡ塩によるＣａ2+キレート作用によるＣＲＰ立体構造変化の影響を受けずにＣＲＰを認識し、かつＣＲＰと立体構造が非常に似通った血清アミロイドＰに交差反応を起こさない抗ＣＲＰモノクローナル抗体を提供することができる。
【００３１】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン、およびその作製方法、ならびにモノクローナル抗体によれば、血中のＣＲＰ測定において、血液の抗凝固剤ＥＤＴＡによる測定誤差を実質的になくす事が可能で、かつ交差反応が問題となる血清アミロイドＰとの誤反応も発生させない、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体を提供することができる。
【００３２】
加えて、本発明により、交差反応性を有さない等の性能を要求される抗体を作製する場合において、抗原の特定配列のペプチドが特異構造を完全にミミックしない場合であっても、スクリーニングを容易にすることができ、結果として、抗体開発期間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００３４】
本発明においては、特に指示のない限り、当該分野で既知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００３５】
（本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製に用いるＣＲＰペプチドの作製）
図１は、非特許文献１に開示されている、血液の抗凝固剤ＥＤＴＡによる脱Ｃａ2+イオン作用によりＣａ2+がＣＲＰから離脱してＣＲＰが構造変化を起こした状態と、構造変化を起こす前の状態とを、ＣＲＰのモノマーにおいて比較した図である。薄いグレーのワイヤーフレームモデルがＣａ2+イオンが結合した状態のＣＲＰモノマーを示し、濃いグレーのワイヤーフレームモデルがＣａ2+イオンがＥＤＴＡのキレート作用により離脱した状態のＣＲＰモノマーを示す。
【００３６】
抗ＣＲＰ抗体が、ＥＤＴＡのＣａ2+キレート作用に影響されずにＣＲＰを認識し得るには、Ｃａ2+の離脱前後でＣＲＰの分子構造が実質的に変化していない部分、つまり濃／淡グレーのワイヤーの重なった部分を認識する必要がある。
【００３７】
図２は、非特許文献１に開示されている、ＣＲＰおよび血清アミロイドＰの立体構造を、それぞれのモノマーどうしで比較した図である。ＣＲＰと血清アミロイドＰは、共にペントラキシンファミリーに属し、アミノ酸の一次配列で５１％の相同性を有する。比較的濃いグレーのワイヤーフレームモデルがＣａ2+イオンが結合した状態のＣＲＰを示し、比較的薄いグレーのワイヤーフレームモデルが血清アミロイドＰを示す。
【００３８】
抗ＣＲＰ抗体が、血清アミロイドＰとの交差反応性を有しないためには、血清アミロイドＰと比較して分子構造が実質的に異なるＣＲＰの部分、つまり濃／淡グレーのワイヤーの重ならない部分を認識する必要がある。
【００３９】
図３（ａ）は、Ｃａ2+の結合したＣＲＰ（タイプＩ）と血清アミロイドＰとの間で、そして図３（ｂ）は、Ｃａ2+の結合したＣＲＰとＣａ2+の結合していないＣＲＰ（タイプＩＩ）との間で、それぞれ、対応するアミノ酸がどの程度離れているかを示すグラフである。グラフの横軸はＣＲＰおよび血清アミロイドＰのアミノ酸番号、縦軸は対応するアミノ酸がどの程度離れているかを表す。
【００４０】
Ｃａ2+離脱に起因するＣＲＰの立体構造変化に影響されない抗体は、分子構造の実質的に変化していない部分、つまり図３（ｂ）のグラフの値の低い部分（アミノ酸同士の距離の離れていない部分）を認識する性能が必要である。また、血清アミロイドＰとの交差反応性を有しない抗体は、分子構造の実質的に異なる部分、つまり図３（ａ）のグラフの値の高い部分（アミノ酸同士の距離のできるだけ離れている部分）を認識する性能が必要である。これらの条件を満たす部分は、図３（ａ）および図３（ｂ）に影を付して示すように５カ所存在する。ここで、分子構造が「実質的に」変化していない部分とは、Ｃａ2+の結合／離脱により立体構造が変化したＣＲＰ間で立体構造を比較したときに、対応するアミノ酸位置間の距離が約１Å未満であるアミノ酸位置を含むＣＲＰの部分のことをいうものとする（図３（ｂ）を参照）。また、分子構造が「実質的に」異なる部分とは、血清アミロイドＰとＣＲＰとの間で立体構造を比較したときに、対応するアミノ酸位置間の距離が約１Å以上であるアミノ酸位置を含むＣＲＰの部分のことをいうものとする（図３（ａ）を参照）。
【００４１】
図４は、ＣＲＰのアミノ酸配列（配列番号１）を表す図である。図４中、図３（ａ）および図３（ｂ）より導き出した５カ所のアミノ酸配列、アミノ酸番号２５から２８のＰＬＴＫ（配列番号２）、アミノ酸番号５７から６０のＫＲＱＤ（配列番号３）、アミノ酸番号１１４から１２１のＫＰＲＶＲＫＳＬ（配列番号４）、アミノ酸番号１７７から１８０のＧＧＰＦ（配列番号５）、およびアミノ酸番号２０４から２０６のＬＷＰ（配列番号６）に影を付した。これらのアミノ酸配列に対応するペプチドを、本発明の目的のために、Ｆｍｏｃ法やｔＢｏｃ法のような常法により合成する。
【００４２】
（免疫のストラテジー）
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体に要求される性能は、（１）血清アミロイドＰに対して交差反応性を有さず、かつ（２）Ｃａ2+の結合／離脱によるＣＲＰの構造変化の前後で、ＣＲＰへの反応性が変わらないことである。
【００４３】
上記５種のアミノ酸配列で表されるＣＲＰペプチドの立体構造がＣＲＰ分子中の実際の立体構造をミミックしているとすれば、これらのペプチドを免疫原として抗体産生細胞を得ることにより、血清アミロイドＰとの交差性がなく、かつＣａ2+の離脱によるＣＲＰ構造変化に影響されない抗体の作製が可能となるはずである。
【００４４】
しかしながら、実際には、本発明者らの実験により、ＣＲＰの上記５種のペプチドを免疫原として使用して、所望の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインは得られなかった。
【００４５】
これは、上記ペプチドが特異構造をミミックしないからであろうと推測された。このような場合、従来は、抗原分子（ここでは、ＣＲＰ）をそのまま免疫原として用いて動物を免疫して免疫反応を生じさせた後、その動物から採取した脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞ラインとの融合細胞から交差反応を起こさない抗体を産生する抗体産生細胞ラインを、スクリーニングのステップを詳細に行うことにより得るという方法を採っていた。しかしながら、このような方法は、労力がかかる上に、目的の抗体を取得できない可能性も高い。
【００４６】
通常、スクリーニングのステップおいて特異性の強い抗体を産生する細胞ラインを選別するが、本発明者らは、免疫の段階で目的とする抗体産生細胞の存在率を可能な限り高くしておけば、スクリーニングで目的の抗体産生細胞ラインを得る確率を高めることができると考えた。
【００４７】
そこで、本発明者らは、ＣＲＰのみを免疫するのではなく、ＣＲＰと上記５種のＣＲＰペプチドとを組み合わせて免疫原として使用することを試みた。それにより、予想外にも、スクリーニングのステップにおいて、単にＣＲＰのみを使用して免疫する場合よりも、血清アミロイドＰとの交差性がなく、かつＣａ2+の離脱によるＣＲＰ構造変化に影響されない抗体を産生する細胞ラインをより確実に選別することができた。
【００４８】
したがって、本発明の抗ＣＲＰ抗体産生細胞ライン作製方法の１つの実施形態では、上記５種のペプチドとＣＲＰとの混合物を免疫原として使用して免疫を行う。しかしながら、常に５種のペプチド断片の全てをＣＲＰと混合する必要はなく、血清アミロイドＰとの交差性がなく、かつＣａ2+の離脱によるＣＲＰ構造変化に影響されない抗体を産生する細胞ラインをスクリーニングで選別する確率を高める限り、５種のうちの少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、さらにより好ましくは少なくとも４種のペプチド断片と、ＣＲＰとを混合して免疫原として使用してもよいことは、本明細書の記載に基づいて当業者には理解し得るはずである。複数のペプチドを混合するときの組合せは、特に限定されることなく、最適なものを当業者は選択し得る。
【００４９】
上記５種のペプチドの長さは、上記の長さに限定されるわけではなく、１つ以上のアミノ酸をさらに付加したもの、または１つ以上のアミノ酸を欠失したものであっても、ＣＲＰと組み合わせて免疫に使用した場合に、血清アミロイドＰとの交差性がなく、かつＣａ2+の離脱によるＣＲＰ構造変化に影響されない抗ＣＲＰ抗体を産生する細胞ラインを得る確率を高める限り、本発明の方法において同様に使用され得ることは、当業者には理解され得る。また、上記５種のペプチドのいずれかにおいて、１つ以上のアミノ酸が置換されたものであっても、ＣＲＰと組み合わせて免疫に使用した場合に、血清アミロイドＰとの交差性がなく、かつＣａ2+の離脱によるＣＲＰ構造変化に影響されない抗ＣＲＰ抗体を産生する細胞ラインを得る確率を高める限り、本発明の方法において同様に使用され得ることもまた、当業者に理解され得る。このようなペプチドの改変は、ペプチド合成等の分野での常法により行い得る。
【００５０】
以下、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法を、作製手順に沿って説明する。
【００５１】
（免疫）
まず、上記ペプチド抗原とＣＲＰとの組合せを免疫原として、哺乳動物に免疫を行うことにより、動物体内で抗体産生細胞を調製する。
【００５２】
本発明に用い得る「哺乳動物」の例として、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであり、より好ましくはマウスである。マウスの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高い抗体力価を示すので、ＣＲＰとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係していることは公知である。また、細胞ラインの確立後の腹水による抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、ＣＲＰの免疫に好ましい例である。実験動物の齢は、特に限定されないが、代表的には約４週齢〜約１２週齢であり、好ましくは約６〜約１０週齢、より好ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。
【００５３】
免疫に用いられるＣＲＰは、人工のヒトＣＲＰ、天然のヒトＣＲＰ、またはそれらのモノマーサブユニットであり得る。好ましくは、天然のヒトＣＲＰが用いられる。ＣＲＰは、ヒトの血清から精製してもよいし、市販のものを使用しても良い。一方、免疫に用いられるＣＲＰペプチドは、常法により合成され得るが、合成されたものに限定されない。ＣＲＰペプチドは、免疫に使用する際には、動物体内での免疫反応を確実に起こさせるために、ＣＧＧ（Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇａｍｍａ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）のようなハプテンをＳＰＤＰ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）のような官能基導入剤を介して上記ペプチドに結合させて使用することが好ましい。なお、用いられ得るハプテンおよびその結合方法は、上記のものに限定されず、当業者が適宜最適なものを選択し得る。
【００５４】
免疫の前に、ペプチド抗原とＣＲＰは、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイコート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β−グルカン（多糖体）；ムラミジルペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げられる。これらのアジュバントは、投与経路、投与量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択することが好ましい。選択されたアジュバントの取り扱い、例えばＣＲＰとの混合方法などは当該分野で公知である。
【００５５】
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、抗原は哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免疫の後に、何回か繰り返される。追加免疫は、例えば最初の免疫から４週間後、６週間後、および半年後に行われ得る。
【００５６】
（抗体産生の確認）
免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血清のＣＲＰ結合活性の存在についてアッセイすることにより、哺乳動物の体内でＣＲＰに対する抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認する。適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法が挙げられる。抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示している必要がある。
【００５７】
（ブースト）
ＣＲＰ結合性抗体の産生を確認した後、脾臓を肥大させるために、ブースト（免疫原の追加注射）を行い得る。ブーストで投与される抗原の量は、最初に免疫される抗原量の約４〜５倍の量が望ましいが、これに限定されない。
【００５８】
ブーストは、代表的には抗原と不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行われる。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加注射）で投与されるペプチド抗原とＣＲＰとしては、アジュバントを加えず純粋品を用いることが望ましい。
【００５９】
（細胞融合）
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞ラインと細胞融合する。
【００６０】
融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞ラインの種類に依存するので、細胞融合には、増殖能力の優れた細胞ラインを用いることが好ましい。また、骨髄腫由来の細胞ラインは、融合する脾臓細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨髄腫由来の細胞ラインは、新たに調製しても良いし、市販のものを使用しても良い。マウスの骨髄腫由来の細胞ラインとしては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０．ＢＵ．１、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１などが挙げられる。抗体の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたものとなるため、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の使用が好ましい。ラット骨髄腫由来の細胞ラインとしては、２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。
【００６１】
細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行われる。細胞融合法の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００６２】
得られた融合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基づいて、所望の融合細胞を選択し得る。
【００６３】
（細胞選別およびクローニング）
融合細胞から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、血液の抗凝固剤によるＣａ2+キレート作用により構造変化を起こさないＣＲＰの部位を認識して結合能を有すると共に、血清アミロイドＰと結合能を有さない抗体を産生する融合細胞を得るために、ＣＲＰ、キレート作用により構造変化を起こしたＣＲＰ、血清アミロイドＰの３種類に対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞ラインをクローニングする。従って、本明細書中で「ＣＲＰに対して特異的なモノクローナル抗体」とは、ＣＲＰのＣａ2+イオン離脱による立体構造の変化に拘わらずＣＲＰを認識してそれに結合し得ると共に、血清アミロイドＰに結合能を有さない抗体をいうものとする。
【００６４】
「結合能を有する」とは、インヒビションＥＬＩＳＡ法での測定においてインヒビションがかかることをいう。「インヒビションがかかる」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、競合物質（インヒビター）の存在下で、インヒビターの非存在下と比較して減少することをいう。「インヒビションがかからない」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、インヒビターの存在下および非存在下で実質的に同等であることをいう。「インヒビションの半値」とは、インヒビターの非存在下での吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。
【００６５】
抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００６６】
融合細胞のクローニングには、当該分野で公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例としては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界希釈法が好ましい。
【００６７】
細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クローニングの初期の段階から行うことが好ましい。
【００６８】
このようにして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細胞ラインが最終的に選別される。
【００６９】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞ラインは、液体窒素中で半永久的に保存され得る。
【００７０】
（抗体の精製）
上記のようにして選別されたモノクローナル抗体産生細胞ラインを大量培養することにより、ＣＲＰに対して特異的なモノクローナル抗体を大量に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞ラインの大量培養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産生される。
【００７１】
大量培養により得られた腹水または培養上清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられる。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約９８％以上の純度となるように精製される。
【００７２】
（抗体の評価）
精製されたモノクローナル抗体の結合能をインヒビションＥＬＩＳＡのような方法でＣａ2+離脱したＣＲＰへの結合能および血清アミロイドＰに対する結合能を評価することにより、得られた抗体が、所望の性能を有するか否かを確認し得る。
【００７３】
（検体中のＣＲＰの検出方法）
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体を使用して、検体中のＣＲＰを検出するための方法が提供される。本発明のＣＲＰ検出方法では、ＣＲＰを含む検体と本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインにより産生されたモノクローナル抗体とを混合して免疫反応させ、その反応を光学的、電気的、または物理的な方法によって検出する。光学的な方法の例としては、吸光度測定、蛍光測定等が挙げられる。電気的な方法の例としては、抗体電極を用いた測定、ＳＰＲ（surface plasmon resonance）等が挙げられる。また、物理的な方法の例としては、分子量測定等が挙げられる。
【００７４】
（ＣＲＰ検出のためのモノクローナル抗体キット）
本発明に従って、ＣＲＰを検出するためのキットが提供される。一実施形態において、本発明のＣＲＰ検出用キットは、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体を含み、例えば、上記の検体中のＣＲＰの検出方法において使用され得る。
【００７５】
別の実施形態としては、本発明のＣＲＰ検出用キットは、例えば、抗原抗体結合反応に基づいて水性試料中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィーのために提供され得る。このようなＣＲＰ検出用キットは、クロマトグラフィーのための支持体を含み、支持体は、固相として支持体に結合された抗体と、移動相として支持体に移動可能に担持された抗体とを含む。
【００７６】
図１１は、本発明のＣＲＰ検出キットの一実施形態に係る、イムノクロマト法に基づくＣＲＰ検出キットに含まれる支持体としてのテストストリップを示す模式図である。示されるように、ＣＲＰ検出キットのテストストリップ（支持体）は、サンプル滴下部、移動相、および固相を備え、固相として支持体に結合された抗体と、移動相として支持体に移動可能に担持された抗体とを含む。
【００７７】
支持体は、ニトロセルロースメンブレンなどの材質で形成され得るがこれに限定されず、固相化抗体を保持する性質と、サンプルが毛管現象できれいに流れていくような性質とを有する限り、他の材質（例えば、ろ紙、不織布、セラミックスなど）でできていてもよい。
【００７８】
固相に結合された抗体としては、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法によって産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。より好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号の細胞ラインにより産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。
【００７９】
移動相の抗体としては、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法によって産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。より好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号の細胞ラインにより産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。移動相としての抗体は、任意の標識により標識されている。標識の例としては、酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付いた粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識などが挙げられる。抗体は、当該分野で公知の方法により標識される。移動相抗体としてはまた、ＣＲＰに高い結合能を有する限り、他の抗体を使用してもよい。他の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。他の抗体は、モノクローナル抗体であることが移動相の抗体として使用するために特に好ましい。
【００８０】
使用時には、ＣＲＰを含むサンプル溶液をサンプル滴下部に滴下する。滴下されたサンプルが支持体中を浸透して移動相に達すると、サンプル中のＣＲＰは移動相の抗体と結合する。次いで、サンプルは固相まで浸透し、移動相の抗体と結合した状態のＣＲＰは固相に固定された抗体と結合すると、呈色する。
【００８１】
本発明のキットは、当該分野で公知の方法により適切に作製され得る。なお、本発明のキットは、上記の形態に限定されず、免疫比濁、蛍光免疫、ＳＰＲ等の形態でもよい。
【００８２】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
（ペプチド抗原の調製）
図４に示す５種のペプチド断片を、それぞれ常法に従って合成した。合成した５種類のペプチドを同量混合し、ＳＰＤＰ（同仁製）用いて、ハプテンとしてのＣＧＧ（Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇａｍｍａ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）と重合させ、ペプチド抗原を調製した。
【００８４】
（免疫）
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞ライン確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【００８５】
ペプチド抗原０．２ｍｇと、ＣＲＰ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＩＮＣ．製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ  ：  ＲＤＩ−ＳＣＰ１００−０）０．２ｍｇを混合し、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍｌを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＦＲＥＵＮＤ，  ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍにて充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００８６】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）２匹に、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ腹腔内に注射した。以降１週間おきに計４回、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製してこれと同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化したエマルジョンを、前回と同じ腹腔に１００μｌずつ注射した。
【００８７】
（抗体産生の確認）
２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血して血清を分離し、得られた血清を用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いてＣＲＰに対するバインディングおよびインヒビションにより抗体産生の確認と性能の評価を行った。０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したもの）で調製した５μｇ／ｍＬ  ＣＲＰを１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを固相として使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【００８８】
その結果、２匹のマウス全てにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められ、さらに、インヒビションの半値が１０-9Ｍ以下である事が確認出来た。
【００８９】
（細胞融合）
免疫した２匹のマウスの中から、１−＃２−４を選び、ＰＢＳを用いて調製したＣＲＰおよびＣＲＰペプチド抗原を含む免疫原を２００μｇ注射した。
【００９０】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１、５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞ライン（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【００９１】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、それぞれ９６ウェルプレート３枚に播いた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行った。
【００９２】
（細胞選別およびクローニング）
８日後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取し、ＥＬＩＳＡにてＣＲＰに対するバインディングを評価した。その際、固相として０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍｌの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。ＣＲＰに対して高い結合能を示す融合細胞を含む培養液を１２枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地を加えた。
【００９３】
同様に１１、１３、および１７日目に培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡにてＣＲＰに対するバインディング、インヒビションの評価を行った。インヒビションの評価の際には、固相として０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍｌの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第二抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。１１日目にはＣＲＰに高い結合能を有し、インヒビションがかかった３８ウェルを選択してＨＡＴ培地で６ウェルプレートに継代、１３日目には３８から２７ウェルを選択、１７日目には２７から４ウェルを選択してＨＴ培地で中フラスコに継代した。
【００９４】
選択した上記４種の（Ｈ１−２ＩＶ７、Ｈ１−２ＩＶ２６、Ｈ１−２ＩＶ２９、Ｈ１−２ＩＶ３４）ハイブリドーマを、限界希釈法により１個／ウェルの条件でクローニングした。抗体の性能をＥＬＩＳＡによるＣＲＰに対するバインディングとインヒビションで順次評価しながらウェルを選択し、最終的に最も性能、細胞の状態等の良いクローンを１株選択した。
【００９５】
この細胞株は、ＣＲＰに対して結合能を示し、ＣＲＰが構造変化しても結合能が変化せず、血清アミロイドＰに対して交差反応を起こさない抗体を産生する細胞株であり、細胞ライン名：Ｈ１−２ＩＶ２６−３３と命名し、生命研に平成１６年６月７日に国内寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００３９号）。
【００９６】
Ｈ１−２ＩＶ２６−３３株の産生する抗体を、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体と称する。
【００９７】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞ラインは、遠心分離して上清を取り除き、１×１０7細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【００９８】
（抗体の精製）
Ｈ１−２ＩＶ２６−３３を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させ腹水を採取した。腹水をプロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、以下の条件でＨ１−２ＩＶ２６−３３抗体を精製した。
【００９９】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ  グリシン・３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１００】
（抗体の評価）
上記のアフィニティーにより精製したＨ１−２ＩＶ２６−３３抗体について、ＣＲＰおよびＥＤＴＡ塩で処理して構造変化したＣＲＰを使用して、ならびにＣＲＰの希釈系列および血清アミロイドＰの希釈系列をインヒビターとして用いて、ＥＬＩＳＡまたはインヒビションＥＬＩＳＡで抗体性能の評価を行った。図５〜図７にその結果を示す。
【０１０１】
図５は、ＥＬＩＳＡ法による、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体のＣＲＰに対する反応性を表したグラフである。シンボル（●）で表されるグラフは、Ｃａ2+イオンを内包した通常の構造を保ったＣＲＰのＨ１−２ＩＶ２６−３３抗体への反応性を示し、シンボル（▲）で表されるグラフは、ＥＤＴＡ塩のＣａ2+イオンキレート作用によりＣａ2+が離脱して構造変化を起こしたＣＲＰのＨ１−２ＩＶ２６−３３抗体への反応性を示す。示されるように、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体は、Ｃａ2+イオンの離脱に伴うＣＲＰの構造変化に拘わらず、ＣＲＰを認識し、それに対して結合し得ることがわかる。
【０１０２】
図６は、ＣＲＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体の固相ＣＲＰに対する反応性を表したグラフである。グラフから明らかなように、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体の固相ＣＲＰへの結合は、インヒビターとしてのＣＲＰの存在によって阻害され、インヒビションの半値は約８×１０-11Ｍであり、最高性能として約１×１０-11ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。
【０１０３】
図７は、血清アミロイドＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体のＣＲＰへの反応性を示すグラフである。グラフから明らかなように、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体の固相ＣＲＰへの結合は、インヒビターとしての血清アミロイドＰの存在によっては阻害されなかった。このことは、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体が血清アミロイドＰには結合能を有さないことを示す。
【０１０４】
したがって、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞作製方法によって、ＣＲＰのＣａ2+イオンの結合／離脱による構造変化の影響を受けず、かつ血清アミロイドＰに対して交差反応を示さない抗体を産生する細胞ラインが確実に作製し得ることが示された。
【実施例２】
【０１０５】
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞ライン確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１０６】
（免疫）
実施例１と同様に調製したペプチド抗原０．２ｍｇと、ＣＲＰ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＩＮＣ．製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ  ：  ＲＤＩ−ＳＣＰ１００−０）０．２ｍｇを混合し、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍｌを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＦＲＥＵＮＤ，    ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍにて充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１０７】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）２匹（２−＃４−３および２−＃１−３）に、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ皮下に注射した。
【０１０８】
以降２週間おきに計４回、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製してこれと同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化したエマルジョンを、前回と同じ皮下に１００μｌずつ注射した。
【０１０９】
（抗体産生の確認）
２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血して血清を分離し、得られた血清を用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いたバインディングおよびインヒビションにより抗体産生の確認と性能の評価を行った。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ  ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１１０】
その結果、２匹のマウス全てにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められ、さらに、インヒビションの半値が１０-9Ｍ以下である事が確認出来た。
【０１１１】
（細胞融合）
免疫したマウスの中から、２−＃４−３を選び、ＰＢＳを用いて調製したＣＲＰおよびＣＲＰペプチド抗原を含む免疫原を５００μｇ注射した。
【０１１２】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１、５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞ライン（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１１３】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、それぞれ９６ウェルプレート３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行った。
【０１１４】
（細胞選別およびクローニング）
１１日後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取し、ＥＬＩＳＡにてＣＲＰに対するバインディングを評価した。５２ウェルを選択してＨＡＴ培地で２４ウェルプレートに継代した。
【０１１５】
１６日後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取し、ＥＬＩＳＡにてＣＲＰに対するバインディングを評価した。１８ウェルを選択してＨＴ培地で６ウェルプレートに継代した。
【０１１６】
２０日後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取し、ＥＬＩＳＡにてＣＲＰに対するバインディングとインヒビションを評価した。５ウェルを選択してＨＴ培地で中フラスコに継代した。
【０１１７】
選択した上記５種の（Ｈ２−４ＩＩＩ３６、Ｈ２−４ＩＩＩ３８、Ｈ２−４ＩＩＩ４４、Ｈ２−４ＩＩＩ４６、Ｈ２−４ＩＩＩ５２）ハイブリドーマを、限界希釈法により２個／ウェルの条件でクローニングした。抗体の性能をＥＬＩＳＡによるＣＲＰに対するバインディングとインヒビションで順次評価しながらウェルを選択し、最終的に最も性能、細胞の状態等の良いクローンを１株選択した。
【０１１８】
この細胞株は、ＣＲＰに対して結合能を示し、ＣＲＰが構造変化しても結合能が変化せず、血清アミロイドＰに対して交差反応を起こさない抗体を産生する細胞株であり、細胞ライン名：Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４と命名し、生命研に平成１６年６月７日に国内寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４０号）。
【０１１９】
Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４株の産生する抗体を、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体と称する。
【０１２０】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞ラインは、遠心分離して上清を取り除き、１×１０7細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１２１】
（抗体の精製）
Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させ腹水を採取した。腹水をプロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、以下の条件でＨ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体を精製した。
【０１２２】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ  グリシン・３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１２３】
（抗体の評価）
上記のアフィニティーにより精製したＨ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体について、ＣＲＰおよびＥＤＴＡ塩で処理して構造変化したＣＲＰを使用して、ならびにＣＲＰの希釈系列および血清アミロイドＰの希釈系列をインヒビターとして用いて、ＥＬＩＳＡまたはインヒビションＥＬＩＳＡで抗体性能の評価を行った。図８〜図１０にその結果を示す。
【０１２４】
図８は、ＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体のＣＲＰに対する抗体の反応性を表したグラフである。シンボル（●）で表されるグラフは、Ｃａ2+イオンを内包した通常の構造を保ったＣＲＰのＨ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体への反応性を示し、シンボル（▲）で表されるグラフは、ＥＤＴＡ塩のＣａ2+イオンキレート作用によりＣａ2+が離脱して構造変化を起こしたＣＲＰのＨ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体への反応性を示す。グラフより、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体は、Ｃａ2+イオンの離脱に伴うＣＲＰの構造変化に拘わらず、ＣＲＰを認識し、それに対して結合し得ることがわかる。
【０１２５】
図９は、ＣＲＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体の固相ＣＲＰに対する反応性を表したグラフである。グラフから明らかなように、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体の固相ＣＲＰへの結合は、インヒビターとしてのＣＲＰの存在によって阻害され、インヒビションの半値は約１×１０-10Ｍであり、最高性能として約１×１０-11ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。
【０１２６】
図１０は、血清アミロイドＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体のＣＲＰへの反応性を示すグラフである。グラフから明らかなように、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体の固相ＣＲＰへの結合は、インヒビターとしての血清アミロイドＰの存在によっては阻害されなかった。このことは、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体が血清アミロイドＰには結合能を有さないことを示す。
【０１２７】
したがって、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインの作製方法によって、ＣＲＰのＣａ2+イオンの結合／離脱による構造変化の影響を受けず、かつ血清アミロイドＰに対して交差反応を示さない抗体を産生する細胞ラインが確実に作製し得ることが示された。
【０１２８】
以上、実施例にて具体的に示したように、本発明の方法により、ＣＲＰのＣａ2+の結合／離脱による構造変化に拘わらずＣＲＰを認識し、かつ血清アミロイドＰと交差反応を示さない抗体を産生する抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞ラインを難なく得ることができる。これは、特異配列のペプチドとＣＲＰとを組み合わせることで、ペプチドが完全にＣＲＰ分子中での実際の立体構造を完全にミミックする構造を取らなくても、緩く似た構造をとれば、ＣＲＰ分子中の対応する部分との相乗作用によって、実際の特異構造に近い構造に対する免疫反応が増強され、免疫された動物の脾臓細胞中での目的とする抗体産生細胞の存在率が上昇するからであろうと推測される。
【０１２９】
本発明のように、抗原の特定配列のペプチドと、抗原の分子全体とを組み合わせて免疫原として用いることで免疫された動物の脾臓細胞中での特定配列に対して特異的な抗体を産生する抗体産生細胞の生存率を上昇させる方法は、抗ＣＲＰ抗体に関してのみならず、交差反応性の問題を有する他のタンパク質（またはポリペプチド）に対する抗体の作製においても同様に適用し得ることは、当業者に理解され得る。
【０１３０】
以上、本発明を詳細に説明してきたが、前述の説明はあらゆる点において本発明の例示にすぎず、その範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲を逸脱することなく種々の改良や変形を行うことができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナルは、医療の分野において検査項目として重要視されているＣＲＰの免疫測定に用いる事が可能である。本発明の抗体は、検査課程の血液処理に対応し、さらに血清アミロイドＰとの交差性も有しないため、医療診断等の分野において非常に有用である。
【０１３２】
また、人に対応する検査だけでなく、交差反応性によっては、犬や猫などのペット、牛や豚、羊などの家畜などのＣＲＰ測定にも応用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】非特許文献１に開示されている、血液の抗凝固剤ＥＤＴＡによる脱Ｃａ2+イオン作用によりＣａ2+がＣＲＰから離脱してＣＲＰが構造変化を起こした状態と構造変化を起こす前の状態とを、ＣＲＰのモノマーにおいて比較した図
【図２】非特許文献１に開示されている、ＣＲＰおよび血清アミロイドＰの立体構造を、それぞれのモノマーどうしで比較した図
【図３ａ】Ｃａ2+の結合したＣＲＰと血清アミロイドＰとの間で、対応するアミノ酸同士の間の距離を示すグラフ
【図３ｂ】Ｃａ2+の結合したＣＲＰとＣａ2+の結合していないＣＲＰとの間で、対応するアミノ酸同士の間の距離を示すグラフ
【図４】ＣＲＰのアミノ酸配列を表す図
【図５】ＥＬＩＳＡ法による、ＣＲＰの構造変化の前後におけるＨ１−２ＩＶ２６−３３抗体のＣＲＰに対する反応性を表したグラフ
【図６】ＣＲＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体の固相ＣＲＰに対する反応性を表したグラフ
【図７】血清アミロイドＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ１−２ＩＶ２６−３３抗体のＣＲＰへの反応性を示すグラフ
【図８】ＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体のＣＲＰに対する抗体の反応性を表したグラフ
【図９】ＣＲＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体の固相ＣＲＰに対する反応性を表したグラフ
【図１０】血清アミロイドＰをインヒビターとして使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法による、Ｈ２−４ＩＩＩ３８−１４抗体のＣＲＰへの反応性を示すグラフ
【図１１】本発明のＣＲＰ検出キットの一実施形態を示す模式図
【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図５】
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【図８】
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【配列表】
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