(57)【要約】【課題】            ２型糖尿病に関するＷＮＴ遺伝子ファミリーの変異の情報を提供する。さらに、ＷＮＴ遺伝子ファミリーにおいて見出された遺伝子の変異を用いて、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を発症前に検出するための方法及びキットを提供する。【解決手段】        被験者から採取された生物学的な試料についてＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異を検出する。前記ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異は、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の第一イントロンの６９７４位、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位、第三イントロンの１０１６位、第四イントロンの４３８位、５７７６位及び６７６３位、並びに第五イントロンの４２４４位からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型であることが好ましい。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生物学的な試料についてＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異を検出することを特徴とする、ヒト２型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法。
【請求項２】
前記ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異が、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の第一イントロンの６９７４位、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位、第三イントロンの１０１６位、第四イントロンの４３８位、５７７６位及び６７６３位、並びに第五イントロンの４２４４位からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記一塩基多型が、第一イントロンのＴ６９７４Ｃ、第二イントロンのＧ１０７９Ｃ及びＧ１６３６Ｃ、第三イントロンのＴ１０１６Ｃ、第四イントロンのＧ４３８Ｃ、Ｃ５７７６Ｇ及びＴ６７６３Ｃ、並びに第五イントロンのＡ４２４４Ｃからなる群より選択される１つ以上の一塩基多型を含む場合、前記被験者が２型糖尿病に罹患する可能性の高いことを示す請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
配列番号３若しくは配列番号４のいずれかに示された少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、又はその相補体からなり、かつ配列番号３の１０１６位、並びに配列番号４の４３８位及び５７７６位におけるいずれか１つの一塩基多型部位を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記一塩基多型は、２型糖尿病に罹患する可能性に関していることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の第一イントロンの６９７４位、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位、第三イントロンの１０１６位、第四イントロンの４３８位、５７７６位及び６７６３位、並びに第五イントロンの４２４４位におけるいずれか１つの一塩基多型を検出することのできる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、アリル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクト・シークエンス法、インベーダー法、ＲＣＡ法、質量分析法、ＴａｑＭａｎ法、及びＤＮＡチップ法からなる群より選択されるいずれかの方法において使用することができる請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項８】
配列番号１１〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチドからなる請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅しうるＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、前記遺伝子の第一イントロンの６９７４番目、第二イントロンの１０７９番目及び１６３６番目、第三イントロンの１０１６番目、第四イントロンの４３８番目、５７７６番目及び６７６３番目、並びに第五イントロンの４２４４番目からなる群より選択されるいずれかの塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対。
【請求項１０】
配列番号５と６、配列番号７と８、又は配列番号９と１０に示した塩基配列からなる請求項９に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７若しくは８に記載のプローブ、及び／又は請求項９若しくは１０に記載のＰＣＲプライマー対を含む、２型糖尿病の発症前診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病に関連する遺伝子多型の検出方法に関する。さらに詳細には、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の一塩基多型を検出することによる、２型糖尿病に罹患する可能性に関する遺伝的素因の検出方法、そのための単離されたポリヌクレオチド、プローブ、ＰＣＲプライマー対、及びキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病は中年以降における最も一般的な生活習慣病の１つであり、我が国を含めた多くの国においてその罹患率が上昇している。２型糖尿病の原因は、末梢組織におけるインスリン抵抗性、及び膵ベータ細胞からのインスリン分泌低下によると考えられているが、その正確な機序は未だ不明である。
【０００３】
これまで２型糖尿病に対する感受性を付与する候補遺伝子として、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲＧ：peroxisome proliferator-activated receptor γ、非特許文献１参照）、カルパイン１０（ＣＡＰＮ１０：calpain-10、非特許文献２参照）、及びアディポネクチン（ＡＰＭ１：adiponectin、非特許文献３参照）等が報告されているが、これらの遺伝子は全ての糖尿病患者の極く少数の割合について説明できるのみであり、ほとんどの２型糖尿病に対する感受性遺伝子については未だ同定されていない。
【０００４】
一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、配列決定されたゲノムにおいて高頻度に検出される遺伝的変異が、糖尿病を含む種々の病気の有用なマーカーとなっている。発明者らは、インベーダー法とマルチプレックスＰＣＲとの組合せによるハイスループットＳＮＰ解析法を用いてゲノムワイドな研究を行い、糖尿病に関連する１つの遺伝子を既に報告している（特許文献１参照）。
【０００５】
２型糖尿病患者の多くは、遺伝的な要因に、環境因子（肥満、運動不足、脂肪の多い食生活など）が加わって発症すると考えられている。従って、糖尿病に関する遺伝因子を事前に診断し、発症前に糖尿病に罹患する可能性が高いと分かった人に対しては食事や運動面において注意することによって、糖尿病の発症を未然に防ぐことが可能となる。そのため、遺伝的に糖尿病に罹患する可能性が高い人を事前に検出し、また、糖尿病発症についてのメカニズムを遺伝的に解明するために、２型糖尿病に関連するより多くの多型を同定し、２型糖尿病の発症前診断の確度と有用性を高めることが求められている。
【０００６】
一方、ＷＮＴ遺伝子は、胚の発達や発癌における中心的な役割を果たすことが知られている。最近、ＷＮＴファミリーの１つのアイソフォームが脂肪生成(adipogenesis)に重要な役割を果たしていることが報告され（例えば、非特許文献４及び５参照）さらに、ＷＮＴシグナル伝達の１つのメディエーターとして知られている低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５：low density lipoprotein receptor-related protein 5)もまた、グルコース誘導性インスリン分泌に関与していることが示された（例えば、非特許文献６参照）。従って、ＷＮＴシグナル伝達経路に関連する遺伝子が、２型糖尿病の感受性を付与する候補遺伝子であることが考慮されるが、ＷＮＴ遺伝子群と２型糖尿病との関連性に焦点をあてた研究は未だ行われていない。
【０００７】
【特許文献１】特開2004-215647
【非特許文献１】Altshuler D et la., (2000) Nature Genet 26:76-80
【非特許文献２】Horikawa Y et al., (2000) Nature Genet 26:163-175
【非特許文献３】Hara K et al., (2002) Diabetes 51:536-540
【非特許文献４】Ross SE et al., (2000) Scirnce 11(289):950-953
【非特許文献５】Bennett CN et al., (2002) J Biol Chem 23:30998-31004
【非特許文献６】Fujino T et al., (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100:229-234
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような従来技術に鑑みてなされたものであって、２型糖尿病に関するＷＮＴ遺伝子ファミリーの変異の情報を提供することを目的とする。さらに、ＷＮＴ遺伝子ファミリーにおいて見出された遺伝子の変異を用いて、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を発症前に検出するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、２型糖尿病に対する感受性の付与に関し、ＷＮＴファミリー遺伝子の果たす役割の可能性を調べるために、ＷＮＴファミリーメンバーをコードする複数の遺伝子と日本人の２型糖尿病患者との相関研究（ケース・コントロール研究）を行った。その結果、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子における特定のＳＮＰ座が２型糖尿病と非常に強い相関性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第一の視点において、本発明のヒト２型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法は、被験者から採取された生物学的な試料についてＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異を検出することを特徴とする。前記ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異は、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の第一イントロンの６９７４位、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位、第三イントロンの１０１６位、第四イントロンの４３８位、５７７６位及び６７６３位、並びに第五イントロンの４２４４位からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型であることが好ましい。本発明のさらに好ましい実施形態において、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の第三イントロンの１０１６番目の塩基がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に、又は第四イントロンの４３８番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に、若しくは５７７６番目の塩基がシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）に置換されている場合に、前記被験者が２型糖尿病に罹患する可能性の高いことが示される。
【００１１】
本発明の第二の視点において、上記検出方法に用いることができるポリヌクレオチド、プローブ、及びプライマー対、並びにこれらを含んでなる２型糖尿病の発症前診断キットが提供される。具体的な塩基配列を含む好ましい実施形態については以下の実施例等に詳細に示される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法により、糖尿病発症前にこれらの多型における変異の有無を検出し、変異があると判断された人に関しては、２型糖尿病の遺伝的素因、すなわち、２型糖尿病に罹りやすい体質を遺伝的に有していることが示唆され、発症前に食事や運動に気をつけるよう指導し、必要があれば、予防的な治療を行って２型糖尿病の発症を予防することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（定義）
本明細書において、以下の用語は特記しない限り次のように定義される。「ＷＮＴ」とは、脂肪生成、筋形成、神経形成及び乳腺発達等の細胞の運命や分化に影響を与えるタンパク質ファミリー及びこれらをコードする遺伝子の名称である。遺伝子とはｃＤＮＡ、及びゲノム遺伝子を含む。ＷＮＴ−１遺伝子は最初にマウス乳癌におけるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の挿入部位として同定された。今日では、ＷＮＴファミリーは、ＷＮＴ５Ｂを含む１９の遺伝子からなることが知られている（詳細については、http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html参照）。ＷＮＴファミリーのほとんどのタンパク質は細胞から分泌され、細胞表面受容体、すなわちFrizzled受容体（７回膜貫通型）及びその共受容体（ＬＲＰ５及びＬＲＰ６）を介して作用すると考えられている。ＷＮＴ−１遺伝子は、β−カテニン経路を介して脂肪生成を阻害し、ＷＮＴ１０Ｂ遺伝子もまた脂肪生成の初期段階で重要な役割を果たすことが示されている。さらに、ＬＲＰ５は膵ベータ細胞におけるグルコース誘導性インスリン分泌と肝臓でのコレステロール代謝に何らかの役割を果たしていることが報告されている。
【００１４】
「多型」(polymorphism)とは、同一集団上において、ある遺伝子座にある対立遺伝子が二種以上存在し、その頻度が１％以上ある状態をいい、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート多型、マイクロサテライト多型、挿入／欠失型多型等を含む。１個の塩基が他の塩基に置き換わっているものを一塩基多型（ＳＮＰ）といい、ＳＮＰはヒトゲノムにおいては数百塩基対から１０００塩基対に１ヶ所の割合で存在すると推測されている。また、２塩基から数十塩基を１単位とする配列が繰返し存在する部位において、その繰返し回数が個人間で異なるものは、タンデムリピート多型やマイクロサテライト多型と呼ばれている。ＳＮＰはその存在する位置によって機能が異なり、ポリペプチドの翻訳領域に存在してアミノ酸配列の置換や欠失を引き起こし、遺伝子の機能に影響を与えるものや、プロモーターやイントロン等の発現調節領域に存在して遺伝子発現量に影響を与えるもの、あるいは他の領域に存在して遺伝子発現への影響はほとんど無いもの等がある。
【００１５】
本明細書において、「生物学的な試料」とは、生物に由来するポリヌクレオチドを含有する試料であって、種々の組織や細胞から採取される、生きている、若しくは死滅した、又は考古学的な試料をも含む。具体的には体液（血液、尿、唾液等）、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等である。
【００１６】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡおよびそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定しないが、一般的には約１０塩基以上をいう。一方、「ポリヌクレオチド」よりも比較的短いものを「オリゴヌクレオチド」という場合もあり、「オリゴヌクレオチド」の長さは、一般的には、約５０塩基以下である。
【００１７】
（２型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法）
本発明の一つの実施形態において、被験者から生物学的な試料を採取し、前記試料についてＷＮＴ５Ｂ遺伝子の変異を検出することを特徴とするヒト２型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法が提供される。ここで、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子とは、ＷＮＴファミリーの１つの遺伝子であって、成人の前立腺や胎児の脳において中程度に発現し、成人の肝臓や腎臓でわずかに発現していることが知られている遺伝子である。ＷＮＴ５Ｂ遺伝子は、また、軟骨細胞などのいくつかのタイプの細胞の分化や増殖にも関与していることが報告されており、配列番号１に示された塩基配列のヒト由来ｃＤＮＡを含む。さらに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＷＮＴ５Ｂに特徴的な細胞の分化誘導能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、及び哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という条件は当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、２つの核酸断片が、サムブルックら(Sambrook,J.)の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現(Expression of cloned genes in E.coli)」(Molecular Cloning:A laboratory manual:2nd. edition(1989))Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA,9.47-9.62および11.45-11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００１８】
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
【００１９】
ヒトゲノムにおいて、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子は第１２番染色体のｐ１３．３に存在し、６つのエクソンに分断されて図２に示したような構造を有する。図２は本発明に係るＷＮＴ５Ｂ遺伝子上に同定されたＳＮＰ部位を模式的に表したものである。ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子は、ＷＮＴ５Ｂのコード領域のみならず、イントロン、５’フランキング領域、３’フランキング領域をも含む。図２には、全部で８７個のＳＮＰの存在部位が示されているが、＃は、２型糖尿病と強い関連性を示すイントロン４（＋４３８、Ｃ／Ｇ）のＳＮＰであり、＊は、ＩＭＳ−ＪＳＴのＳＮＰデータベースから選択されたＳＮＰｓを示す。
【００２０】
２型糖尿病との関連性（相関性）は、臨床的な方法によって２型糖尿病と診断された被験者集団（症例群）と一般集団（対照群）から得た生物学的試料を分析し、本発明に係る多型性との関連をカイ２乗法等により統計的に分析することによって、これらの変異が２型糖尿病と関連しているか否かを検定することができる。ハーディ・ワインベルグ平衡(Nielsen DM, et al., (1998) Am J Hum Genet 63:1531-1540)や連鎖不平衡（ＬＤ）係数（Ｄ’及びΔ；Devlin B, et al., (1995) Genomics 20:311-322）等の統計的解析は、当業者に公知のプログラム等を用いて行うことができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、２型糖尿病との関連性を有するＳＮＰは、第一イントロンの６９７４位のシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）（以下「Ｃ／Ｔ」と称する場合があるが、この場合、出現頻度の高い野生型塩基を先に、出現頻度の低い変異型塩基を後に記載する。）、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位のシトシン（Ｃ）／グアニン（Ｇ）、第三イントロンの１０１６位のシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）、第四イントロンの４３８位のシトシン（Ｃ）／グアニン（Ｇ）、５７７６位のグアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）、及び６７６３位のシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）、並びに第五イントロンの４２４４位のアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）である。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の第一イントロンにおける６９７４番目の塩基がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（以下このような塩基置換を、「Ｔ６９７４Ｃ」と称する。）、第二イントロンの１０７９番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ｇ１０７９Ｃ）及び１６３６番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ｇ１６３６Ｃ）、第三イントロンの１０１６番目の塩基がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ｔ１０１６Ｃ）、第四イントロンの４３８番目の塩基がグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ｇ４３８Ｃ）、５７７６番目の塩基がシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）に置換されている場合（Ｃ５７７６Ｇ）及び６７６３番目の塩基がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ｔ６７６３Ｃ）、並びに第五イントロンの４２４４番目の塩基がアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）に置換されている場合（Ａ４２４４Ｃ）のいずれか１つ以上の一塩基多型を含む場合、前記被験者が２型糖尿病に罹患する可能性の高いことが示される。
【００２３】
上記ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の多型を決定する方法としては、以下のような種々の公知技術を用いて、（１）少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、（２）多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブ（アリル特異的プローブ）による検出、（３）多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定等の方法により行うことができる。例えば、ダイレクト・シークエンシング法等によりゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。一方、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後、上記（１）〜（３）の検出手段を用いることもできる。ＤＮＡを増幅するための種々の方法は当業者に公知であり、例えば、所望のＤＮＡ断片をクローン化したり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増殖方法(ＳＤＡ；Walker G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 392-396 (1992))、転写反応に基づいた増殖方法（ Kwoh D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 1173-1177 (1989))、自己持続複製反応(Guatelli J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1874-1878 (1990))、Ｑ−βレプリカーゼシステム(Lizardi P. et al. Bio/Technology 6, 1197-1202 (1988))、核酸配列に基づいた増殖反応（ＮＡＳＢＡ；Lewis R. Genetic Engineering News 12, 1 (1992))、修復連鎖反応（ＲＣＫ）、ＬＡＭＰ法（WO00/28082）等により行うことができるがこれらに限定されない。
【００２４】
増殖反応産物は、種々の方法によりＳＮＰを決定することができ、例えば、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、及び制限酵素断片長の解析（ＲＦＬＰ）等が含まれる。一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）による検出技術もまた、アクリルアミドゲル等に基づく分離方法であるが、非変性条件下で行われる。好適なキャピラリー電気泳動によって行うこともできる。この技術は、種々のＤＮＡ断片をそれらの立体配置（コンフォメーション）に従って識別し得る(Orita et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (1989), Cotton Mutat. Res. 285, 125-144 (1993), Hayashi Genet. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992))。
【００２５】
ＴａｑＭａｎ法（商標）と呼ばれる方法は、アリル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である（Livak et al., PCR Methods and Applications 4:357-362, 1995、及び米国特許第５５２８８４８号参照）。蛍光色素と消光物質により標識したアリル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時にＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、また、ＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアリルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００２６】
ＤＮＡの増幅を伴なわない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー法（商標）は２種類のオリゴヌクレオチド（インベーダープローブとアリルプローブ）を用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づいており、例えば、米国特許第５８４６７１７号、第５６１４４０２号、第５７１９０２８号、第５５４１３１１号及び第５８４３６６９号等に記載されている。この方法は目的とする塩基配列を２種類の異なるプローブで認識する。第１のプローブは一般的にインベーダープローブと呼ばれ、目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的である。第２のプローブはアリルプローブと呼ばれ、その３’末端側は目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であるが、５’末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するテール又はフラップと呼ばれる配列を含む。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入し、この構造がCleavaseにより切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。好ましくは、遊離したフラップを定量するために蛍光色素とクエンチャーで標識された第３のＦＲＥＴ(fluorescence resonance energy transfer)プローブ（フラップと相補的な配列、及び自己相補的な配列を含む）を用いることができる。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブと結合して特異的な構造を形成し、CleavaseによりＦＲＥＴプローブの蛍光色素部分が切断されて蛍光が発生する。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、プライマーの蛍光標識を必要とせず、短時間で大量のサンプルを処理することができる方法である。ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行う。伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する。
【００２８】
ＲＣＡ(rolling circle amplification)法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段をＳＮＰタイピングに応用したものである。ＳＮＰ（アリル）の識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる(Lizardi, P.M. et al., Nat. Genet. 19, 225 (1998))。
【００２９】
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡチップ法は、多くのＳＮＰｓを迅速に検出する手段として有用である。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術によりアレイ上で合成して１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの(Affymetrix社製、米国特許第５４２４１８６号、同第５７４４１０１号、及び同第６０４０１３８号等参照)や、あらかじめ調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている(米国特許第６０４０１３８号参照)。
【００３０】
（ポリヌクレオチド、プライマ−対、及びキット）
本発明の他の実施形態において、上記ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、上記多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、上記多型を検出するためのポリヌクレオチド、プローブ及びそのためのキットが提供される。
【００３１】
一つの実施形態において、本形態のポリヌクレオチドは、配列番号３若しくは配列番号４のいずれかに示された少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、又はその相補体からなり、かつ配列番号３の１０１６位、並びに配列番号４の４３８位及び５７７６位から選択されるいずれか１つの一塩基多型を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記いずれか１つの一塩基多型は、２型糖尿病に罹患する可能性に関している単離されたポリヌクレオチドである。従って、上記３ヶ所の一塩基多型の何れも含まないポリヌクレオチドは本形態に含まれない。これらの塩基配列は好ましくは配列番号３の１０１６位のチミンがシトシンに、配列番号４の４３８位のグアニンがシトシンに、又は配列番号４の５７７６位のシトシンがグアニンに置換されているものを含む。
【００３２】
これらのポリヌクレオチドは、天然物であっても、合成物であっても良い。例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞内で複製して製造することができる。あるいは、試験管内で合成して製造しても良い。合成方法としてはＰＣＲ等によりＤＮＡを増幅することも、化学的に合成することもできる。これらのポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝子多型を検出するために用いることができる。
【００３３】
他の一つの実施形態において、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅しうるＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、前記遺伝子の第一イントロンの６９７４番目、第二イントロンの１０７９番目及び１６３６番目、第三イントロンの１０１６番目、第四イントロンの４３８番目、５７７６番目及び６７６３番目、並びに第五イントロンの４２４４番目からなる群より選択されるいずれかの塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対が提供される。本形態のプライマー対は、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の上記多型部位の上流及び下流の特定の領域の各鎖と実質的に相補的になるように設計される。これらの各プライマーは、２５〜２５００塩基対離れた領域においてハイブリダイズすることができるが、増幅産物の塩基配列の決定又は分子量の解析を容易にするため、増幅産物の大きさが１００〜５００塩基対であることが好ましい。より好ましくは、増幅産物の大きさは８０〜２００塩基対である。これらのオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好ましくは配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０に示したそれぞれ２０〜２２塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。これらのプライマーは増幅されたＤＮＡ断片の検出を容易にするために標識することができる。標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、ストレプトアビジン、アビジン、磁気ビーズ、抗原及び抗体等が用いられる。
【００３４】
さらに別の実施形態において、ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の第一イントロンの６９７４位、第二イントロンの１０７９位及び１６３６位、第三イントロンの１０１６位、第四イントロンの４３８位、５７７６位及び６７６３位、並びに第五イントロンの４２４４位からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型を検出することのできるポリヌクレオチドが提供される。検出方法には種々の方法があるが、例えば、インベーダー法による検出を行う場合は、ＳＮＰ部位から鋳型の３’側に相補的に結合するように設計されたインベーダープローブとＳＮＰ部位から鋳型の５’側に相補的な配列を含み、その５’側に鋳型の配列とは無関係な配列（フラップ）を有するアリルプローブとが提供される。ＳＮＰ部位の配列であるインベーダープローブの３’末端は任意の塩基でよい。
【００３５】
ＴａｑＭａｎプローブは、ＳＮＰ部位を含み、鋳型と相補的な約２０塩基程度の長さのポリヌクレオチドである。５’末端はＦＡＭやＶＩＣ等の蛍光色素により、また、３’末端はクエンチャー（消光物質）により標識される。
【００３６】
ＲＣＡ法に用いるパドロックプローブは、両端がゲノム上のＳＮＰ周辺約２０塩基ずつからなり、その２つをバックボーンと呼ばれる特異的な配列が連結する。
【００３７】
１つの実施形態として、ヒトゲノムＤＮＡを直接又は、増幅されたＤＮＡ断片を用いて塩基配列を決定することができる。塩基配列決定用のシークエンスプライマーとしては、ＳＮＰ部位の上流又は下流の適当な部位と実質的に相補的になるように設計される。これらのシークエンスプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。また、検出を容易にするために標識されたものであっても良い。標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性微粒子、抗原及び抗体等を用いることができる。
【００３８】
他の実施形態において、２型糖尿病の発症前診断キットが提供される。このキットには、上記ヒトＷＮＴ５Ｂ遺伝子の多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、及び上記多型を検出するためのポリヌクレオチドの何れか又は両方が含まれる。被験試料からまず目的ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを用いて遺伝子多型を決定することができる。一方、ＤＮＡの増幅反応を行わずに、ゲノムＤＮＡから直接多型を決定することも可能である。このような方法としてはインベーダー法等が挙げられる。キットには、任意に選択されるものとして、ＤＮＡの抽出試薬、精製試薬、ＰＣＲのための試薬、例えば１０倍濃縮緩衝液や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）等を含むことができる。
【実施例１】
【００３９】
ＷＮＴ遺伝子ファミリーにおける糖尿病関連ＳＮＰの同定
［ＤＮＡ試料の調製］
滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、又は千葉西総合病院の外来診療室に定期的に通院している２型糖尿病患者の末梢血よりＤＮＡ試料を調製した。糖尿病の診断は、世界保健機構（ＷＨＯ）の診断基準に従って行った。２型糖尿病は、ゆっくりとした成人発症型の病状を示す被験者として臨床的に規定される。抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体陽性の被験者、又はミトコンドリア病（ミトコンドリア筋障害、脳障害、乳酸アシドーシス、及び発作性発症）及びMaturity-onset diabetes of the young(MODY)の患者は除外した。対照被験者は、日本のいくつかの医学研究所において募集された一般集団のメンバー（５６４人の対照群１と、３７５人対照群２）から構成された。書面によるインフォームドコンセントを各患者から取得し、実験方法については理化学研究所及び本研究に参加したそれぞれの研究機関における倫理委員会の承認を受けた。ＤＮＡの抽出は、標準的なフェノール／クロロホルム法を用いて行った。すなわち、末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍ、５分間遠心して血清を除去し、赤血球溶解液を加え室温で２０分インキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿（白血球成分）を回収し、プロテネースＫで３７℃、４時間以上処理した。等量のフェノールを加え３０００ｒｐｍで１０分間遠心して水相を回収し、続いて、フェノールクロロホルム処理、クロロホルム処理の後、イソプロパノールでＤＮＡを沈殿させた。沈殿を７０％エタノールでリンスした後ＴＥ溶液に溶解した。
【００４０】
［ＳＮＰ遺伝子型の特定］
遺伝子型特定実験のためのＳＮＰはＩＭＳ−ＪＳＴ日本ＳＮＰデータベース(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から選択した。１１種類のＷＮＴ遺伝子に全部で４５個のＳＮＰが見出された。まず最初に、１８８人の２型糖尿病患者（症例群１）、及び５６４人の一般集団（対照群１）における各ＳＮＰの遺伝子座位における遺伝子型をインベーダーアッセイ又はタックマン法により決定した。インベーダーアッセイを行う前に、マルチプレックスＰＣＲにより標的部位を増幅した。マルチプレックスＰＣＲは、１６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、６．７μＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｘＴａｑｍｉｘ（２．５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ、３１．２５Ｕ／μｌのＴａｑ抗体）、０％又は１０％のＤＭＳＯ、０．２５μＭ各プライマーの反応液中で、変性９５℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを４０回繰り返して行った。得られたＰＣＲ産物を希釈して。３８４プレートに分注した後、風乾して、３μｌのインベーダー反応液及びプローブミックスを加えた。６３℃で２０分間反応させた後、蛍光測定し、遺伝子型を判定した。
【００４１】
また、タックマン法は、ゲノムＤＮＡ（１ｎｇ／ウェル）を３８４プレートに分注した後、風乾して、タックマン反応液５ｍｌを加えた。ＰＣＲ反応を行った後、蛍光測定し、遺伝子型を判定した。なお、これらの実験に用いたプライマーやプローブの塩基配列の一例を以下に示した。
【００４２】
【表１】
2006115811.tif 000003
【００４３】
（インベーダーアッセイに用いたプローブの塩基配列）
イントロン３＋１０１６の塩基がＣであるものを検出する特異的プローブ：
5'-ATGACGTGGCAGACCGGCATCTCGCATGTCCTTTG-3'（配列番号１１）
イントロン３＋１０１６の塩基がＴであるものを検出する特異的プローブ：
5'-CGCGCCGAGGT GGCATCTCGCATGTCCTTTG-3'（配列番号１２）
イントロン３＋１０１６の塩基がＣであるかＴであるかを検出するインベーダープローブ：5'-CCAGAGTCTGTCTGGGGCATTN-3'（配列番号１３、但しＮは任意の塩基）
イントロン４＋４３８の塩基がＣであるものを検出するための特異的プローブ：
5'-ATGACGTGGCAGACGAAGTGGAAGAGGCAAAAATC-3'（配列番号１４）
イントロン４＋４３８の塩基がＧであるものを検出するための特異的プローブ：
5'-CGCGCCGAGGCAAGTGGAAGAGGCAAAAATC-3'（配列番号１５）
イントロン４＋４３８の塩基がＣであるかＧであるかを検出するためのインベーダープローブ：5'-CTATCTCTCTGTCAAAGGTTN-3'（配列番号１６、但しＮは任意の塩基）
【００４４】
（タックマン法に用いたプローブの塩基配列）
イントロン４＋５７７６の塩基がＧであるものを検出するＴａｑＭａｎプローブ：
5'-CCTCTAAATACCCAGATCA-3'（配列番号１７）
イントロン４＋５７７６の塩基がＣであるものを検出するＴａｑＭａｎプローブ：
5'-CCTCTAAATACGCAGATCA-3'（配列番号１８）
【００４５】
以下に示した統計的な解析において、ハプロタイプ構造の解析はＥＭアルゴリズムを用いたハプロタイプフェージングの推定とハプロタイプブロックの構築により行った。ＳＮＰｓ間の相互作用を解析するために、ロジスティック回帰分析を行った。個人が対照群よりも症例群に属している確立ｐは、以下のロジスティックモデルに従って一連のＳＮＰｓによる影響を受けることが推測される。例えば、１つのＳＮＰについては：ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ａ０＋ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２である。ここでは、遺伝子型が１／１、１／２及び２／２のそれぞれについて、ｘ１＝−１，０及び１、並びにｘ２＝−０．５，０．５及び−０．５のコード化スキームを用いて加算効果ｘ１と優性／劣性効果ｘ２を表した。重みは、最大尤度法により推測し、帰無仮説ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝ａ０（一定値）との比較により検定した。複数のＳＮＰｓに対しては、さらに追加のＳＮＰｓ主要効果に加え相互作用効果を追加してそれらの効果が有意か否か段階的に検定した。検定はＲを用いて行った。集団構造を評価するために、無作為に選択した６６個のＳＮＰｓについてＷｒｉｇｈｔのＦ統計を実施し、それぞれのグループ間の単一の統計値（ＦＳＴ）を計算した。遺伝子型解析の結果、１１種類のＷＮＴ遺伝子における４０個のＳＮＰについて遺伝子型を特定することができた。結果を下記表１に示す。
【００４６】
【表２】
2006115811.tif 000004
【００４７】
統計的な解析により有意差（ｐ＜０．０５）を示した６個のＳＮＰ座位（ＷＮＴ２遺伝子内の２つ、ＷＮＴ５Ａ遺伝子内の２つ、及びＷＮＴ５Ｂ遺伝子内の２つ）について、さらに別の試料（７３３人の患者と３７５人の対照者）を用いて解析した。その結果、染色体１２ｐ１３．３に存在するＷＮＴ５Ｂ遺伝子の２つのＳＮＰ座位のみが２型糖尿病と関連していることが分かった（イントロン４＋４３８、Ｃ／Ｇ；ＣＣ対ＣＧ＋ＧＧ、χ２＝１５．６、Ｐ＝０．００００８、オッズ比＝１．７４［９５％信頼区間１．３２−２．２９］、イントロン４＋６７６３、Ｃ／Ｔ；ＣＣ対ＣＴ＋ＴＴ、χ２＝８．３、Ｐ＝０．０４、オッズ比＝１．４６［９５％信頼区間１．１３−１．８８］、表３参照）。
【００４８】
【表３】
2006115811.tif 000005
【００４９】
この結果が、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の代わりにその近傍にある他の遺伝子と２型糖尿病との関連性を反映している可能性を除外するために、この遺伝子座周辺に存在し、対立遺伝子の頻度が０．１以上である３４個のＳＮＰを用いて連鎖不平衡（ＬＤ）マッピングを行った。イントロン４のＳＮＰ（＋４３８、Ｃ／Ｇ）周辺の夫々２つのＳＮＰ間におけるＬＤ係数（Ｄ’及びΔ）を計算した。本解析で用いた全てのＳＮＰｓの変異型対立遺伝子(minor allele)の頻度は１０％以上である。その結果を図１に示す。＊は、イントロン４のＳＮＰ（＋４３８、Ｃ／Ｇ）を表わす。図１に示したように、このＳＮＰ部位の上流約２０ｋｂ及び下流約１０ｋｂにわたって連鎖不平衡であることが分かった。それ故、２型糖尿病への感受性にとって重要な領域は３０ｋｂの連鎖不平衡ブロック内に存在すると思われ、この領域内にはＷＮＴ５Ｂ遺伝子のみが含まれる。従って、この遺伝子座における２型糖尿病との関連性は、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子自身によって説明することができることが結論付けられた。
【００５０】
［ＷＮＴ５Ｂ遺伝子領域における新たなＳＮＰの発見］
次に、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の全領域における遺伝的な多型を検索し、７６個の新規ＳＮＰを同定した。図２に示したように、この遺伝子全体では合計８７個のＳＮＰが存在するが、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子のコード領域内には１つの変異も見出すことができなかった。これら８７個のＳＮＰ部位のうち、４５個のＳＮＰについて遺伝子型を特定することができた。第２の患者及び対照者の試料（症例群２及び対照群２）による関連性を解析した結果、下記表４に示したように、いくつかのＳＮＰ部位が２型糖尿病と有意な関連性を示し、特に、第３イントロン及び第４イントロンに存在するＳＮＰが２型糖尿病との強い関連性を示した（イントロン３＋１０１６、χ２＝１４．８、Ｐ＝０．０００１、オッズ比＝１．７３［９５％信頼区間１．３１−２．２９］、イントロン４＋４３８、χ２＝１５．６、Ｐ＝０．００００８、オッズ比＝１．７４［９５％信頼区間１．３２−２．２９］、イントロン４＋５７７６、χ２＝１５．９、Ｐ＝０．００００７、オッズ比＝１．７３［９５％信頼区間１．３２−２．２７］）。
【００５１】
続いて、ＥＭアルゴリズムを用いてハプロタイプ構造を調べたところ、イントロン４＋４３８Ｃ／Ｇを含む５つのＳＮＰｓ（ＷＮＴ５Ｂ遺伝子内で０．１５以上の対立遺伝子頻度を有する）が１つのハプロタイプブロックを構成することが分かった。図３Ａには、５つのＳＮＰ、すなわち、５６：イントロン３＋４３９、５７：イントロン３＋１０１６、５８：イントロン４＋４３８、６７：イントロン４＋５７７６、及び７１：イントロン４＋６７６３によって構成されるハプロタイプを示す。図３Ａに示した５つの一般的なハプロタイプは集団の９０％以上をカバーした。２型糖尿病と夫々のハプロタイプとの関連性について調べた結果、ハプロタイプ１と２が２型糖尿病と有意な相関性を示すことが分かった（ａ：ハプロタイプ１対その他：χ２＝４．４１、Ｐ＝０．０３６、オッズ比＝１．２４、９５％信頼区間１．０１〜１．５２、ｂ：ハプロタイプ２対その他：χ２＝５．５９、Ｐ＝０．０１８、オッズ比＝０．７７、９５％信頼区間０．６３〜０．９６）。しかしながら、これらのハプロタイプの相関性は単一の部位ほど強くはない。なお、図３Ｂの縦軸Δは、イントロン４＋４３８のＳＮＰとＷＮＴ５Ｂ遺伝子内の他のＳＮＰとの間のＬＤ係数を計算し、プロットしたものである。
【００５２】
さらに、ロジスティック回帰分析によりＳＮＰｓ間の関連性について評価した結果、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子のイントロン４＋４３８部位のＳＮＰと、ＷＮＴ２遺伝子の３’−フランキング領域＋１６２９部位のＳＮＰとの間に有意な関連性を見出した（ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の劣性ＳＮＰにＷＮＴ２遺伝子の追加的ＳＮＰを加算すると、相関性；Ｐ＝０．００７、混合された経験的Ｐ＝０．００００３５、オッズ比＝２．２２、９５％信頼区間１．５８〜３．１１）であった。
【００５３】
【表４】
2006115811.tif 000006
【実施例２】
【００５４】
脂肪細胞におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現
２型糖尿病の原因におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の関与の可能性を調べるために、まず最初にマウスＷＮＴ５Ｂ遺伝子の脂肪生成中の発現パターンを定量的リアルタイムＰＣＲにより調べた。分化誘導後０、１，２、３、４、５、６、７、及び１０日目の３Ｔ３−Ｌ１細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、図４に示したように、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現は分化誘導２日後に最も大量であり、その後さらに脂肪細胞への分化に伴って急速に減少した。
【００５５】
次に、脂肪細胞の分化に対するマウスＷＮＴ５Ｂ遺伝子の過剰発現の影響を調べた。マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本、大阪）から入手して、集密になるまで培養し、脂肪細胞に分化誘導した。分化誘導後の種々の段階においてマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞からトリゾール試薬（商品名、インビトロジェン社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行った。脂肪生成中の内在性ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現、及びＷＮＴ５Ｂを過剰発現する３Ｔ３−Ｌ１細胞内でのマウスＰＰＡＲ−γ（ＰＰＡＲＧ）、マウスＣ／ＥＢＰ−α（ＣＥＢＰＡ）、マウスアディポネクチン（ＡＰＭ１）、及びマウスレプチン（ＬＥＰ）遺伝子の発現を、分化誘導後の種々の段階で抽出された全ＲＮＡを用いて、ＳＹＢＲグリーン検出リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Mx3000PTMマルチプレックス定量ＰＣＲシステム、Stratagene社）により調べた。測定結果はマウス３６Ｂ４(Arbp)により標準化した。上記各遺伝子の検出のために用いたプライマーは以下のとおりである。
【００５６】
ＷＮＴ５Ｂ用センス鎖：5'-CCAGTGCAGAGACCGGAGATG-3'（配列番号１９）；アンチセンス鎖：5'- GTTGTCCACGGTGCTGCAGTTC-3'（配列番号２０）
Ａｒｂｐ用センス鎖：5'-CAACGGCAGCATTTATAACCC-3' （配列番号２１）；アンチセンス鎖：5'- CCCATTGATGATGGAGTGTGG-3', （配列番号２２）
ＰＰＡＲＧ用センス鎖：5'-TTTGAAAGAAGCGGTGAACCAC-3'（配列番号２３）;アンチセンス鎖：5'-ACCATTGGGTCAGCTCTTGTG-3', （配列番号２４）
ＣＥＢＰＡ用センス鎖：5'-AAAGCCAAGAAGTCGGTGGAC-3'（配列番号２５）;アンチセンス鎖：5'-GGTCATTGTCACTGGTCAACTCC-3', （配列番号２６）
ＡＰＭ１用センス鎖：5'-GGGTGAGACAGGAGATGTTGGAATG-3'（配列番号２７）;アンチセンス鎖：5'-GCCAGTAAATGTAGAGTCGTTGACG-3'（配列番号２８）, 
ＬＥＰ用センス鎖：5'-TCCAGAAAGTCCAGGATGACACCAA-3'（配列番号２９）;アンチセンス鎖：5'-TCAGCATTCAGGGCTAACATCCAAC-3'（配列番号３０）
【００５７】
各増幅反応は、１ｘＥＸ  Ｔａｑ緩衝液、２００ｎＭｄＮＴＰ、１／２００００ＳＹＢＲグリーン、８００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、０．０５Ｕ／ｍｌのＥＴ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、２．７５ｎｇ／ｍｌのＴａｑＳｔａｒｔ抗体、及び５ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む２５μｌの反応溶液中で、５０℃で２分間、９５℃で１０分間インキュベートした後、９５℃で３０秒間と６０℃で６０秒間のサイクルを４０回繰り返した。
【００５８】
マウスＷＮＴ５Ｂ遺伝子をコードするアデノウイルスベクターは、アデノウイルス発現ベクターキット（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて構築した。分化誘導４８時間前に、３Ｔ３−Ｌ１細胞を感染効率５０(pfu/cell)のウイルスで６時間感染させ、分化誘導後の所定日に試料を調製した。
【００５９】
分化誘導後の指定された日に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて３．７％ホルムアルデヒドで２時間固定した。固定された細胞をオイルレッドＯ(oil red O)で１５分間室温にてインキュベートした。細胞を水で１回洗浄後、細胞内の染色された脂肪液滴を光学顕微鏡で観察した。定量化のため、色素をイソプロパノールで抽出し、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６０】
その結果を図５Ａ，Ｂに示した。ＷＮＴ５Ｂを過剰発現させた細胞は、対照実験としてｌａｃＺ遺伝子を発現させた細胞に比べて、顕著に３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を促進した（脂肪液滴の含量は、分化誘導後４日、７日、及び１０日後で夫々１．６倍、１．９倍及び１．７倍、Ｐ＜０．０５）。なお、２つのグループ間の統計的有意性は独立のｔ−検定を用いて解析し、Ｐ値＜０．０５で有意性ありと考えられる。
【００６１】
脂肪生成段階で重要な役割を果たすと思われるＣＥＢＰＡ及びＰＰＡＲＧ遺伝子の発現についても、ＷＮＴ５Ｂの過剰発現細胞で評価した（図６Ａ及び６Ｂ）。さらに、同じ細胞におけるいくつかのアディポサイトカインの発現も調べたところ、ＡＰＭ１及びＬＥＰ遺伝子の発現が顕著に増加していることが分かった。一方、ＩＬ−６やＲＳＴＮの発現は、ＷＮＴ５Ｂの過剰発現細胞と対照細胞とで変化なかった（データ未提示）。
【００６２】
これらの結果より、前駆脂肪細胞におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の過剰発現は、対照細胞に比べて明らかに脂肪細胞への分化を促進することが示された。分化した脂肪細胞は内分泌細胞として働くことが知られており、いわゆるアディポサイトカインと呼ばれるいくつかのサイトカインを分泌することができる。脂肪細胞によって産生、分泌されるこれらのサイトカインは、全身的なインスリン感受性に関わっていると考えられている。したがって、ＷＮＴ５Ｂ遺伝子の過剰発現によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＡＰＭ１やＬＥＰの発現が顕著に増加するという上記の結果から、個人間におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現や働きの違いが、アディポサイトカインの産生を含む脂肪細胞の機能に影響を与えることによって２型糖尿病に対する感受性に寄与していることが推測される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＷＮＴ５Ｂ遺伝子周辺の連鎖不平衡マッピングを示す。
【図２】ＷＮＴ５Ｂ遺伝子において同定された多型を示す。
【図３】Ａ）ＷＮＴ５Ｂ遺伝子内のハプロタイプ構造の分析と推定されたハプロタイプ頻度を示す。Ｂ）ＬＤ係数を示す。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の発現パターンを示す。
【図５】３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪生成におけるＷＮＴ５Ｂ遺伝子の過剰発現の影響を示す。Ａ）は分化誘導後５日目にオイルレッドＯで脂肪液滴を染色した。Ｂ）はオイルレッドＯ染色の定量的な解析である。＊は対照細胞（ｌａｃＺ）に対してＰ＜０．０５であることを示す。
【図６】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の遺伝子発現における過剰発現させたＷＮＴ５Ｂ遺伝子の影響を示す。Ａ）はＰＰＡＲＧ遺伝子、Ｂ）はＣＥＢＰＡ遺伝子、Ｃ）はアディポネクチン遺伝子及びＤ）はレプチン遺伝子である。＊は対照細胞（ｌａｃＺ）に対してＰ＜０．０５であること、＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。
【図１】
2006115811.tif 000007
【図２】
2006115811.tif 000008
【図３】
2006115811.tif 000009
【図４】
2006115811.tif 000010
【図５】
2006115811.tif 000011
【図６】
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【配列表】
2006115811000001.app