(57)【要約】  【課題】  基板上でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、核酸の増幅を行う核酸増幅方法に関するものであり、核酸増幅方法工程をより短時間で終了することができる核酸増幅方法を開発する。  【解決手段】  核酸増幅基板１０は、第一層と第二層が積層されたものであり、両者の間で空隙が形成されて反応液溜部２０が形成されている。本発明は、３種類のヒートブロックを使用して核酸増幅を行うものである。最初に核酸増幅基板１０を第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロック５５で挟む。続いて核酸増幅基板１０を第二反応を行う温度の近傍に温調された第二ヒートブロック５７で挟む。さらに続いて第三反応を行う温度の近傍に温調された第三ヒートブロック５６で挟む。本発明では、それぞれ別のヒートブロック５５，５６，５７によって核酸増幅基板１０を加熱するものであるから、ヒートブロック５５，５６，５７の加熱に要する時間は皆無、あるいは極めて短時間で足る。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液の温調を繰り返し、目的の核酸を増幅する核酸増幅方法において、前記反応液を基板の一部に充填し、当該基板を互いに異なる温度に温調された複数のヒートブロックに順次接触させることにより、反応液の温調を繰り返すことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
前記複数のヒートブロックは、第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロック、第二反応を行う温度近傍に温調された第二ヒートブロック、及び第三反応を行う温度近傍に温調された第三ヒートブロックからなり、前記基板を第一ヒートブロックに接触させ、続いて第二ヒートブロックに接触させ、さらに続いて第三ヒートブロックに接触させ、順次これを繰り返すことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
第一反応が二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させるディナチュレーション反応であり、第二反応が一本鎖核酸にプライマーを会合させるアニーリング反応であり、第三反応がポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応であることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
ヒートブロックは、二片が一対となったものであり、当該二片の間に基板を挟むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
基板は、反応液が充填される反応液溜部と、反応液を導入する反応液導入部と、前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、前記反応液溜部と反応液流路は、基板の内部に設けられた空隙によって形成されたものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填された基板を使用して、反応液の温調を繰り返し、目的の核酸の増幅を行う核酸増幅装置であって、互いに異なる温度に温調された複数のヒートブロックを有し、前記基板を各ヒートブロックに順次接触させる順次接触手段を備えたことを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項７】
前記複数のヒートブロックは、第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロック、第二反応を行う温度近傍に温調された第二ヒートブロック、及び第三反応を行う温度近傍に温調された第三ヒートブロックからなることを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
第一反応が二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させるディナチュレーション反応であり、第二反応が一本鎖核酸にプライマーを会合させるアニーリング反応であり、第三反応がポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応であることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
ヒートブロックは、二片が一対となったものであり、当該二片の間に基板を挟むことを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
順次接触手段は、基板を保持してこれを水平移動させるものであることを特徴とする請求項６乃至９のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
各ヒートブロックに基板を接触させる時間を設定するタイマを備えたことを特徴とする請求項６乃至１０のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【請求項１２】
使用する基板は、当該基板内で核酸を電気泳動させる電気泳動部と、電気泳動のための電極を接触させる電極接続部を備え、核酸増幅装置は、前記電極接続部に接触させる電極を備えることを特徴とする請求項５乃至１１のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
さらに蛍光検出手段を備えたことを特徴とする請求項１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
使用する基板は、当該基板内で核酸を電気泳動させる電気泳動部を備えるものであり、請求項６乃至１１のいずれかに記載の核酸増幅装置と、電気泳動・検出装置によって構成される核酸検知システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板を用いて行うＰＣＲ法等の核酸増幅方法に関するものである。また本発明は、ＰＣＲ法等の核酸増幅方法を活用した核酸増幅装置及び核酸検知システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡを活用した診断が注目を集めている。また農業分野における遺伝子組み換え作物の判定や品種の判定にもＤＮＡ鑑定が活用されている。
上記した様な診断や品種の判定は、血液や作物の試料に目的とするＤＮＡが存在するか否かによって行われるが、試料中の目的ＤＮＡは微量である場合が多い。そこでＤＮＡ診断やＤＮＡ鑑定に先立って、試料中に含まれる目的ＤＮＡを増幅することが必要である。  ここで試料中の目的ＤＮＡを特異的に増幅する方策として、各種の核酸増幅反応が提案されている。特にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法による核酸増幅反応は、バイオテクノロジー分野における基本技術となっている。
ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、基質、耐熱性ポリメラーゼ酵素等を混合した反応液を温度調節し、所定の３種類の温度に順次変化させ、これを繰り返すことによって目的とするＤＮＡを増幅する方法である。
【０００３】
すなわち反応液を、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させるディナチュレーション反応を行う温度に温調し、続いて一本鎖ＤＮＡにプライマーを会合させるアニーリング反応を行う温度に温調し、さらに続いて耐熱性ポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応を行う温度に温調する。この様に、反応液を三段階の温度に順次温調することにより、ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【０００４】
具体的には、反応液を各設定温度の条件の元に温調する工程を３０回程度繰返すことで、多量のＤＮＡ複製生産物を得る。なお、ディナチュレーション温度、アニーリング温度、二本鎖伸長の各反応温度はそれぞれ、９５℃、５０〜５５℃、７２℃程度である。
【０００５】
旧来、ＰＣＲ法はマイクロチューブを使用して行われ、当該マイクロチューブ内に試料やＰＣＲプライマーを含む反応液を入れ、さらにこのマイクロチューブを所定の温度雰囲気とすることによって行われてきた。
しかしながらマイクロチューブを使用する方法は、相応の試料が必要であるが、微量の試料しか入手できない場合もあり、ＤＮＡ鑑定等ができない場合もあった。
またマイクロチューブを使用する方法は、ＤＮＡの増幅に時間がかかるという問題もあった。すなわち、マイクロチューブを使用する方法によると、ＤＮＡの増幅に２時間もの長時間を要した。
さらに増幅されたＤＮＡを分析するには、マイクロチューブから反応液を抜き出して別途分離装置にかける必要があり、さらに手間がかかるという不満もあった。
【０００６】
これに対してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を基板上で行い、さらに同一の基板上でＤＮＡの分離を行う方策が提案されている。
下記の特許文献は、いずれもＤＮＡの増幅と分離を一枚の基板上で行う技術を開示するものである。
【特許文献１】特開２００３−８３９６５号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２７０２０４号公報
【０００７】
特許文献１に開示された基板は、ガラス板等の表面に窪みや溝を形成し、上面開放のＰＣＲ槽を設けたものである。
特許文献１に開示された技術では、前記したＰＣＲ槽に反応液等を充填する。そして上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱してディナチュレーション反応を行わしめる。
続いて下部に設置された冷却装置でＰＣＲ槽中の反応液等を冷却してアニーリングを行う。
さらに続いて上部に設置された熱源によってＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱して二本鎖伸長反応を行わしめる。
そしてこれらを繰り返して試料のＤＮＡを増幅する。
【０００８】
特許文献２に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献２に開示された技術では、基板は底面側からのみ温調される。
すなわち特許文献２に開示された装置は、昇降機能を備えた基板載置台を持つ。そして当該基板載置台の上面に板状の加熱手段が配置されている。また基板載置台の下部には冷却手段が設けられている。
【０００９】
特許文献２に開示された技術によると、基板は、基板載置台上の板状加熱手段に載置される。そして基板を加熱する際には板状加熱手段を昇温する。一方、基板を冷却する場合は、基板載置台上を降下させ、板状加熱手段の背面側に冷却手段の一部を押し当て、加熱手段上の基板を冷却する。
【００１０】
特許文献３に開示された基板についても、上面開放のＰＣＲ槽が設けられ、ＰＣＲ槽に反応液等が充填されてＰＣＲが行われる。
特許文献３に開示された技術では、基板載置台とシールヘッド昇降機構を持ち、基板載置台とシールヘッド昇降機構の双方に加熱・冷却手段を備えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＤＮＡによる診断や鑑定は、今後ますます需要が増大するであろうと予想される。そのためＤＮＡの増幅をより簡便な方法で行うことができる技術の開発が急務である。また微量の試料をもって所望の診断等が行われることが望ましい。
さらにＤＮＡによる診断は、感染症の診断に利用される場合が多いので、ＤＮＡの増幅は迅速に行われなければならない。
【００１２】
ここで旧来のマイクロチューブを使用する方法によると、前記した様にＤＮＡの増幅に２時間もの長時間を要してしまう。
これに対して前記した特許文献に記載された様に、基板を使用する方策は、マイクロチューブを使用する方法に比べると短時間でＤＮＡの増幅を終えるが、それでも３０分程度の時間を要する。
すなわち特許文献１に開示された方策は、ＰＣＲ槽中の反応液等を非接触状態で加熱・冷却し、所望の反応を行わせるものであるから、基板に対する伝熱効率が悪く、基板が所望の温度に達するのに相当の時間が掛かってしまう。
【００１３】
これに対して特許文献２，３に記載された技術は、基板に加熱物等を直接接触させるものであるから、伝熱効率は高いものの、板状加熱手段の昇温や冷却に時間がかかってしまう。すなわち特許文献２に記載の方策では、基板を加熱する際に板状加熱手段を昇温する。そのため加熱手段の昇温自体に時間が掛かる。続いて基板を冷却することとなるが、特許文献２の方策によると、板状加熱手段の下部に設けた冷却手段を板状加熱手段を押し当てて板状加熱手段を冷却し、その冷熱をもって基板を冷却する。そのため板状加熱手段の冷却に時間が掛かることとなる。また基板を再度加熱する際には、一旦冷却された板状加熱手段を昇温することとなる。そのため特許文献２に記載の方策は、ＤＮＡ増幅に要する総時間が長い。
【００１４】
特許文献３に開示された方策についても同様であり、加熱・冷却手段自体の温度を変化させて基板を冷却するものであり、加熱・冷却手段の昇温と冷却に相当の過渡時間を有し、ＤＮＡ増幅に要する総時間が長いものとなってしまう。
【００１５】
特許文献２，３に共通する欠点は、一旦加熱状態にある加熱手段等を冷却して基板を冷却したり、一旦冷却状態にある加熱手段等を再加熱して基板を加熱するものであるから、加熱手段等が所望の温度に至るのに相当の時間が掛かってしまう点である。そのため特許文献２，３に開示された方策によると、ＤＮＡ増幅に長時間を要さざるを得ない。
【００１６】
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、ＰＣＲ等の核酸増幅反応工程をより短時間で終了することができる核酸増幅方法の開発を課題とする。また併せて本発明は、当該方法を実現するための装置及びシステムの開発を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液の温調を繰り返し、目的の核酸を増幅する核酸増幅方法において、前記反応液を基板の一部に充填し、当該基板を互いに異なる温度に温調された複数のヒートブロックに順次接触させることにより、反応液の温調を繰り返すことを特徴とする核酸増幅方法である。
【００１８】
本発明の核酸増幅方法は、基本的に複数のヒートブロックを使用して反応液の温調を繰り返し、核酸増幅反応を行うものである。
すなわち、本発明の核酸増幅方法では、互いに異なる温度に温調された複数のヒートブロックに順次接触させることにより、反応液の温調を繰り返す。前記した特許文献では、一旦昇温状態にあったヒートブロック等をわざわざ冷却して基板を冷却していたが、本発明では、複数のヒートブロックによって基板を加熱又は冷却するものであるから、ヒートブロックの昇温又は冷却に要する時間は皆無、あるいは極めて短時間で足る。
また本発明では、ヒートブロックを基板に接して基板を加熱又は冷却するものであるから、基板に対する伝熱効率が高く、基板は早期に所望の温度に達する。そのため本発明の核酸増幅方法によれば、核酸増幅のための所要時間が短い。
【００１９】
また請求項２に記載の発明は、前記複数のヒートブロックは、第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロック、第二反応を行う温度近傍に温調された第二ヒートブロック、及び第三反応を行う温度近傍に温調された第三ヒートブロックからなり、前記基板を第一ヒートブロックに接触させ、続いて第二ヒートブロックに接触させ、さらに続いて第三ヒートブロックに接触させ、順次これを繰り返すことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法である。
【００２０】
本発明の核酸増幅方法では、３種類のヒートブロックを使用して核酸増幅反応を行う。そして、３種類のヒートブロックは３種類の反応、すなわち、第一反応、第二反応、及び第三反応を行うそれぞれの温度近傍に温調されている。
本発明の核酸増幅方法では、まず基板を第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロックに接触させる。そのためヒートブロック自体を昇温又は冷却する時間は皆無あるいは極めて短時間で足る。
また続いて基板を第二反応を行う温度の近傍に温調された第二ヒートブロックに接触させる。前記した特許文献では、一旦昇温状態にあったヒートブロック等をわざわざ冷却して基板を冷却していたが、本発明では、第一ヒートブロックとは別のヒートブロックによって基板を加熱又は冷却するものであるから、ヒートブロックの昇温又は冷却に要する時間は皆無、あるいは極めて短時間で足る。
さらに本発明では、第三反応を行う温度の近傍に温調された第三ヒートブロックに接触させて基板を加熱又は冷却するが、本発明では、前記した第一ヒートブロック及び第二ヒートブロックとは別のヒートブロックによって基板を加熱又は冷却するものであるから、ヒートブロックの昇温又は冷却に要する時間は皆無、あるいは極めて短時間で足る。
【００２１】
本発明の核酸増幅方法に適用される核酸増幅反応の例としては、ＰＣＲ法、ＬＴＲ（Ligase Chain Reaction）法等が挙げられるが、ＰＣＲ法が代表的である。ＰＣＲ法の場合は、第一反応、第二反応、第三反応の各反応に、ディナチュレーション反応、アニーリング反応、及び二本鎖伸長反応を適宜割り振ればよい。また、ＬＴＲ法の場合は、各反応にディナチュレーション反応、アニーリング反応、及び核酸連結反応を適宜割り振ればよい。また、核酸増幅反応に必要な成分としては、例えばＰＣＲ法の場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。同様に、ＬＣＲ法の場合は、目的ＤＮＡ、プローブ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ等が挙げられる。
【００２２】
また請求項３に記載の発明は、第一反応が二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させるディナチュレーション反応であり、第二反応が一本鎖核酸にプライマーを会合させるアニーリング反応であり、第三反応がポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応であることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅方法である。
【００２３】
本発明の核酸増幅方法では、ディナチュレーション反応、アニーリング反応、及び二本鎖伸長反応を繰り返す。すなわち、基板をディナチュレーション反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロックに接触させて基板を昇温し、続いてアニーリング反応を行う温度の近傍に温調された第二ヒートブロックに接触させて基板を冷却し、続いて二本鎖伸長反応を行う温度の近傍に温調された第三ヒートブロックに接触させて基板を冷却する。冷却された基板は再び第一ヒートブロックと接触して昇温され、以下、同じサイクルを繰り返す。本発明の核酸増幅方法によれば、極めて短時間でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことができる。
【００２４】
また請求項４に記載の発明は、ヒートブロックは、二片が一対となったものであり、当該二片の間に基板を挟むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅方法である。
【００２５】
本発明の核酸増幅方法では、二片の間に基板を挟んで基板を温調するから、基板内部の反応液は、早期に目的温度に達する。そのため本発明の核酸増幅方法によると、核酸増幅反応をさらに短時間で終了させることができる。
【００２６】
また請求項５に記載の発明は、基板は、反応液が充填される反応液溜部と、反応液を導入する反応液導入部と、前記反応液導入部と反応液溜部を繋ぐ反応液流路を備え、前記反応液溜部と反応液流路は、基板の内部に設けられた空隙によって形成されたものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅方法である。
【００２７】
本発明の核酸増幅方法で使用する基板では、反応液溜部は、基板の内部に設けられた空隙によって構成されており、半密閉状態である。そのため基板の表面に物が触れても、反応液によって汚染されることはない。また基板が振動を受けても反応液が反応液溜部からこぼれることはない。
さらに本発明で採用する基板は、反応液を導入する反応液導入部を備え、反応液は反応液導入部から基板内に導入される。本発明で採用する基板では、反応液導入部と反応液溜部の間に反応液流路が設けられているので、反応液溜部と反応液導入部の間に相当の距離があり、反応液溜部の反応液が洩れにくい。
【００２８】
また請求項６に記載の発明は、核酸増幅反応に必要な成分を含む反応液が充填された基板を使用して、反応液の温調を繰り返し、目的の核酸の増幅を行う核酸増幅装置であって、互いに異なる温度に温調された複数のヒートブロックを有し、前記基板を各ヒートブロックに順次接触させる順次接触手段を備えたことを特徴とする核酸増幅装置である。
【００２９】
本発明の核酸増幅装置では、複数のヒートブロックを有し、これらが互いに異なる温度に温調されており、各ヒートブロックに基板を接触させる。そのため本発明の核酸増幅装置では、核酸増幅反応工程の最中にヒートブロックの温度を変化させる必要がない。したがって本発明の核酸増幅装置を使用すると、短時間で核酸増幅反応を行うことができる。
【００３０】
また請求項７に記載の発明は、前記複数のヒートブロックは、第一反応を行う温度近傍に温調された第一ヒートブロック、第二反応を行う温度近傍に温調された第二ヒートブロック、及び第三反応を行う温度近傍に温調された第三ヒートブロックからなることを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅装置である。
【００３１】
本発明の核酸増幅装置では、３種類のヒートブロックを有し、これらがそれぞれ第一反応を行う温度の近傍温度、第二反応を行う温度の近傍温度、第三反応を行う温度の近傍温度に温調されており、それぞれの温度に調節されたヒートブロックに基板を接触させる。そのため本発明の核酸増幅装置では、第一反応〜第三反応を繰り返す工程で各ヒートブロックの温度を変化させる必要がない。したがって本発明の核酸増幅装置を使用すると、短時間で核酸増幅反応を行うことができる。
【００３２】
また請求項８に記載の発明は、第一反応が二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させるディナチュレーション反応であり、第二反応が一本鎖核酸にプライマーを会合させるアニーリング反応であり、第三反応がポリメラーゼ酵素による二本鎖伸長反応であることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅装置である。
【００３３】
本発明の核酸増幅装置においては、３種類のヒートブロックが、それぞれディナチュレーション反応を行う温度の近傍温度、アニーリング反応を行う温度の近傍温度、二本鎖伸長反応を行う温度の近傍温度に温調されており、それぞれの温度に調節されたヒートブロックに基板を接触させる。そのため本発明の核酸増幅装置では、核酸増幅反応工程の最中にヒートブロックの温度を変化させる必要がない。したがって本発明の核酸増幅装置を使用すると、短時間でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことができる。
【００３４】
また請求項９に記載の発明は、ヒートブロックは、二片が一対となったものであり、当該二片の間に基板を挟むことを特徴とする請求項６乃至８のいずれかに記載の核酸増幅装置である。
【００３５】
本発明の核酸増幅装置では、二片の間に基板を挟んで基板を温調するから、基板内部の反応液は、早期に目的温度に達する。そのため、本発明の核酸増幅装置によると核酸増幅反応をさらに短時間で終了させることができる。
【００３６】
また順次接触手段は、基板を保持してこれを水平移動させるものであることが推奨される（請求項１０）。
【００３７】
すなわち本発明では、基板を複数のヒートブロックに順次接触させて反応液を温度調節するものであるから、基板あるいはヒートブロックのいずれかを移動させる必要がある。ここで基板とヒートブロックの重量を比較すると、基板の方がはるかに軽い。そこで本発明の実施に際しては、基板を保持してこれを水平移動させることが推奨される。
【００３８】
また本発明者らの実験によると、基板内の反応液は、極めて短時間の内に所望の温度に達することが判明した。さらに、反応液は、相当の正確さで所望の温度となることも分かった。そのため反応液の温度制御は、ヒートブロックに接している時間を制御することによって行うことが推奨される。
この知見に基づいて完成された請求項１０に記載の発明は、順次接触手段は、基板を保持してこれを水平移動させるものであることを特徴とする請求項６乃至９のいずれかに記載の核酸増幅装置である。
【００３９】
また、各ヒートブロックに基板を接触させる時間を設定するタイマを備えることが奨励される（請求項１１）。
【００４０】
本発明の核酸増幅装置によると、基板と各ヒートブロックの接触時間を簡単に制御でき、より確実に核酸増幅反応を行うことができる。
【００４１】
また使用する基板は、当該基板内で核酸を電気泳動させる電気泳動部と、電気泳動のための電極を接触させる電極接続部を備え、核酸増幅装置は、前記電極接続部に接触させる電極を備えることが推奨される（請求項１２）。
【００４２】
本発明の核酸増幅装置によると、核酸の増幅と分離を一つの装置で行うことができる。
【００４３】
また請求項１３に記載の発明は、さらに蛍光検出手段を備えたことを特徴とする請求項１２に記載の核酸増幅装置である。
【００４４】
本発明の核酸増幅装置によると、核酸の増幅と分離及び検出を一つの装置で行うことができる。
【００４５】
また請求項１４に記載の発明は、使用する基板は、当該基板内で核酸を電気泳動させる電気泳動部を備えるものであり、請求項６乃至１１のいずれかに記載の核酸増幅装置と、電気泳動・検出装置によって構成される核酸検知システムである。
【００４６】
本発明の核酸増幅装置によると、核酸の増幅と分離及び検出を一つのシステムで行うことができる。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の核酸増幅方法及び核酸増幅装置によると、ＰＣＲ等の核酸増幅反応による核酸の増幅を短時間で行うことができる。
また特に請求項１２，１３，１４に記載の発明によると、核酸の分離や検出についても一つの装置やシステムによって行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
本発明の実施形態の核酸増幅方法は、前記した様に反応液が充填された基板を使用し、当該基板内で核酸増幅反応を行うものである。
そこで、装置等の説明に先立って、本発明の実施形態で使用する基板について説明する。
図１は、本発明の実施形態で使用する核酸増幅基板の正面図である。図２は、図１の核酸増幅基板の斜視図である。図３は、図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。図４は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。図５は、図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。図６は、図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【００４９】
図において、１０は、本発明の実施形態で使用する核酸増幅基板を示す。核酸増幅基板１０は略長方形の板状であり、その大きさは、３０×４０ｍｍ〜７０×１００ｍｍ程度である。
【００５０】
核酸増幅基板１０は、ガラス板からなる第一層１１とシリコンゴムからなる第二層１２が積層されたものである。第一層１１は、主として全体の剛性を確保するために設けられた層であり、ガラスの他、石英、アクリル樹脂等の材質のものが使用可能である。
第二層１２は、第一層１１との界面に空隙を形成させるために設けられた層であり、微細な溝や凹部が形成可能な素材が選択される。シリコンゴムの例としては、ＰＤＭＳ(Polydimethylsiloxane)を挙げることができる。また、シリコンゴムの他、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のプラスチック、ガラス、石英等、様々の材質が使用可能である。
試料を光学的に検出する場合には、第一層１１及び第二層１２は、透明あるいは光透過性であることが望ましい。
【００５１】
本実施形態では、第一層１１たるガラス板は、図４、図５に示すように表裏面とも平滑である。これに対して第二層１２たるシリコンゴムには、図４、図５の様に第一層１１との接触面側に微細な溝５が設けられ、第一層１１と第二層１２の間に空隙６が形成される。
また第二層１２には図１、図２の様に複数の貫通孔が設けられており、当該貫通孔によって空隙と外部とが連通する。
【００５２】
上記した空隙内及び開口は、いずれも親水処理がなされており、その表面は、親水性である。
【００５３】
第一層１１の厚さは、０．２〜５．０ｍｍ程度である。第一層１１の厚さが、０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、ヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。逆に第一層１１の厚さが５．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。第一層の厚さとして最も好適な範囲は、０，２〜０．６ｍｍ程度である。
【００５４】
第二層１２の厚さは一様ではなく、後記する反応液溜部２０が設けられたエリアＤは、図２の様に他のエリアに比べて厚さが薄い。具体的には反応液溜部２０の厚さが０．２〜１．０ｍｍあり、他の部位の厚さは０．６〜３ｍｍである。
第二層の反応液溜部２０に相当する部位は、その厚さが０．２ｍｍ未満の場合は、全体の剛性が低く、撓みが大きくてヒートブロックで挟んで加熱するのには適しない。当該部位の厚さが１．０ｍｍを越えると、ヒートブロックから内部に熱が伝わり難い。この点から最も推奨される範囲は、０．３ｍｍ〜０．６ｍｍ程度である。
後記する電気泳動部２１は、外部から熱影響を受けないことが望ましく、第二層の厚さは、反応液溜部２０よりも厚く設計されている。また電気泳動部２１に電極を取り付ける関係上もある程度の厚さをもつことが望ましい。
【００５５】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、空隙６のパターン（溝パターン）によって図１の様に４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８が形成されている。
【００５６】
上記した４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８は、いずれも略同一形状であるので、図１の最下部に図示された核酸増幅・分離流路１８をこれらの代表例として説明する。
【００５７】
核酸増幅・分離流路１８は、図１，３に示す様な反応液溜部２０と電気泳動部２１を有し、これらの周辺に反応液往復流路２２、反応液吸引路２３、核酸供給路２５が設けられたものである。
さらに核酸増幅・分離流路１８には、反応液導入開口（反応液導入部）３０、吸引用開口３１、核酸供給路末端側開口３３、泳動部始端側開口３５、泳動部終端側開口３６が設けられている。各開口３０，３１，３３，３５，３６は、いずれも第二層１２に設けられた貫通孔によって構成されており、第一層１１と第二層１２の間で形成される空隙６と外部とを連通するものである。
【００５８】
以下、順次説明する。
反応液溜部２０は、内部に反応液を貯留することを目的として形成された空隙部分である。本実施形態では、反応液溜部２０は、Ｓ字カーブ状に曲がった流路４０を密状態に繋げて作られている。見方を変えると、反応液溜部２０は、正面視が略正方形の空隙内に隔壁７（図５）が設けられ、ジグザクで迷路状の流路を設けたものであるとも言える。反応液溜部２０内の流路は直列である。すなわち反応液溜部２０内においては、略同一長さの８本の直線路４１が平行に配され、隣接する直線路４１の端部同士が曲路４３で接続され、全体として直列状となっている。
曲路４３は、図３（ｂ）の様な円状の流路である。曲路は、図３（ｃ）の様な角型の流路であってもよいが、角型の流路は角の部位に気泡が残留し易いので、図３（ｂ）の様な円状の流路を採用することが推奨される。
【００５９】
反応液溜部２０は、前記した様に内部に反応液を貯留する為に形成された部分であるため、内部の流路は、他の部位の流路に比べて幅、深さ、共に大きい。
すなわち反応液溜部２０内の流路は、前記した様に第二層１２の界面に形成された溝によって構成されているが、当該溝の幅は、１００μｍ〜５００μｍ、より好ましくは２５０〜４５０μｍである。
また反応液溜部２０の溝の深さは、１００〜３００μｍである。なお他の部位における溝の深さは、１０〜５０μｍ程度である。
反応液溜部２０の溝の断面積（流路の断面積）は、０．０１〜０．１５平方ミリであり、他の部位の溝に比べて３倍から５０倍大きい。
反応液溜部２０の全体の容積は、３〜１０ミリリットル程度である。
【００６０】
反応液溜部２０の一端側は、反応液往復流路２２を介して反応液導入開口（反応液導入部）３０と連通している。反応液導入開口３０は、核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられた開口である。反応液導入開口３０と反応液溜部２０を結ぶ反応液往復流路２２は、直線を基調とするものであり、「Ｕ」路や「Ｓ」路は無い。
【００６１】
また反応液溜部２０の他端側は、反応液吸引路２３を介して吸引用開口３１と連通している。吸引用開口３１についても核酸増幅基板１０に設けられた開口である。反応液吸引路２３は、曲路を基調としたものであり、Ｓ字カーブ状に曲がった流路である。反応液吸引路２３の曲路は、流路抵抗の増大を目的としたものであり、図３（ｃ）の様な角型である。
反応液吸引路２３の曲部は、「移動抑制手段」として機能する。
【００６２】
電気泳動部２１は、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路であり、中途部分で核酸供給路２５と交差する。泳動部始端側開口３５から交差部５０に至る間は、泳動準備路５１であり、単に通電路として機能する。
泳動準備路５１は、複数の曲路を有して相当量の距離が確保されている。
【００６３】
交差部５０から泳動部終端側開口３６に至る間は泳動路５２であり、後記する様にゲルが充填され、増幅されたＤＮＡ等の核酸が実際に泳動され分離される部分である。
泳動路５２は、一部が「く」の字状に折れているが、基本的には直線を基調としている。
【００６４】
核酸供給路２５は、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３を接続するものであり、その中間部分で前記した様に電気泳動部２１と交差する。
反応液導入開口３０は、前記した様に核酸増幅基板１０の中央部近傍に設けられているので、交差部５０に至る間は、反応液溜部２０側に戻る方向に延びる流路となる。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の流路には、「コ」の字状に曲げられた部位が設けられている。当該「コ」の字状に曲がった部位は、流路が平行に並ぶものであるが、平行に並ぶ流路同士の間には相当の距離があり、当該部位における圧力損失は少ない。すなわち前記した「コ」の字状部は、流路抵抗を増大するために設けられたものではなく、反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の距離を所定長以上確保するために設けられたものである。
本実施形態では、交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る流路のレイアウトは、反応液導入開口３０から交差部５０に至る流路のレイアウトと対称形である。
【００６５】
本実施形態では、前記した通り４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を有し、各流路のレイアウトは多少相違するが、いずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８も、電気泳動部２１の流路の長さは同一である。すなわち各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の、泳動部始端側開口３５から泳動部終端側開口３６に至る流路の距離はいずれも同一である。また泳動部始端側開口３５から交差部５０までの距離、及び交差部５０から泳動部終端側開口３６までの距離についても、各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００６６】
核酸供給路２５についても同様であり、反応液導入開口３０と核酸供給路末端側開口３３の長さはいずれの核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８でも同一である。また反応液導入開口３０から交差部５０に至る間の長さ、及び交差部５０から核酸供給路末端側開口３３に至る長さも各核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８の間で相違はない。
【００６７】
本実施形態では、図１の様に、核酸増幅反応を行う反応液溜部２０のエリアＡと電気泳動を行わしめるエリアＢが分離されており、両者の間に相当の距離がある。この距離Ｃは、反応液溜部２０の熱が電気泳動部２１に伝わらない距離であり、核酸増幅基板１０の板厚（最も厚い部分の厚み）の３倍以上、又はガラス板からなる第一層１１の板厚の５倍以上である。
【００６８】
上記した電気泳動部２１及び核酸供給路２５には、核酸の電気泳動に一般的に使用される水性ポリマーからなるゲルが充填される。当該ゲルの例としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメトキシセルロース等が挙げられる。
ゲルの濃度は、分離する核酸の大きさによって適宜選択される。核酸がＤＮＡの場合を例にとると、数１０〜数１００塩基対程度の大きさのＤＮＡであれば、５％程度のポリジメチルアクリルアミドを使用することができる。１０００塩基対を越える様なＤＮＡの場合は、０．５〜２．５％程度のアガロースゲルを使用することができる。
なお、ゲルには、あらかじめエチジウムブロマイドの様な蛍光を発するインターカレーターを含ませておくことが一般的である。そのようにすれば、電気泳動に供されたＤＮＡ等の核酸が泳動と同時にエチジウムブロマイド等で染色され、ただちに蛍光検出器で染色された核酸を検出することができる。
【００６９】
電気泳動部２１及び核酸供給路２５に対するゲルの充填は、核酸増幅基板１０を使用する直前に行うことが望ましい。
ゲルの充填は、泳動部終端側開口３６から圧入することにより行われる。
【００７０】
次に本実施形態の核酸増幅方法に使用する増幅・分離装置について図７乃至図１３を参照しつつ説明する。
図７は、図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う増幅・分離装置の斜視図である。図８は、図７に示す増幅・分離装置の温調装置の構成（反応液注入・吸引機構を除く）を示す斜視図である。図９は、さらに図８に示す温調装置の第一ヒートブロック（第三ヒートブロック）及びブロック昇降機構の斜視図である。図１０は、第一ヒートブロック（第三ヒートブロック）の分解断面斜視図である。図１１は、第二ヒートブロック及びその周辺部の断面斜視図である。図１２は、第二ヒートブロックの分解断面斜視図である。図１３は、図７に示す増幅・分離装置の温調装置の基板送り機構の要部の斜視図である。
【００７１】
図７に示す増幅・分離装置７５は、大きく分けて核酸増幅を行う温調装置８０と電気泳動・検出装置８１及び制御装置が一つのベース上に設置されたものである。
【００７２】
温調装置８０は、３組のヒートブロック５５，５６，５７と、３基のブロック昇降機構６９と、基板送り機構５８と、反応液注入・吸引機構４５（図７にのみ図示）及び３台の温度調節装置を備えたものである。
３組のヒートブロック５５，５６，５７の内、右端に図示されたヒートブロック５５は、第一反応を行う温度近傍に温度調節されるものであり、第一ヒートブロックとして機能する。左端のヒートブロック５７は、第二反応を行う温度近傍に温度調節されるものであり、第二ヒートブロックとして機能する。中央のヒートブロック５６は、第三反応を行う温度近傍に温度調節されるものであり、第三ヒートブロックとして機能する。核酸増幅反応がＰＣＲの場合は、後述する様に、第一反応をディナチュレーション反応に、第二反応をアニーリング反応に、第三反応を二本鎖伸長反応に対応させ、ヒートブロック５５，５６，５７を各反応に適した温度近傍に温度調節する。
【００７３】
装置の右端に図示された第一ヒートブロック５５は、図８，９に示す様にそれぞれ上片５５ａと下片５５ｂを有する。
第一ヒートブロック５５の上片５５ａ及び下片５５ｂは、図１０の様にそれぞれブロック本体６３，６４と、これを覆う断熱材６５，６６によって構成されている。
ブロック本体６３，６４は、いずれもアルミニウムや銅合金等の熱伝導性と蓄熱性に優れた金属によって作られている。ブロック本体６３，６４は略直方体であるが、下面側又は上面側に凸部６７，６８が設けられている。凸部６７，６８は、いずれもブロック本体６３，６４の中央にあり、長手方向に延びる。凸部６７，６８の先端部分は平滑であり、熱伝導性に優れたシート７３，７４が接着されている。当該シート７３，７４には例えばシリコンを素材とするものが採用される。
ヒートブロック本体６３，６４には、それぞれ電気ヒータ７６，７７と、温度センサー７８，７９が内蔵されている。
【００７４】
断熱部材６５，６６は、図１０に示すような溝形形状をしており、前記したブロック本体６３，６４の凸部形成面以外の５面を覆う。逆に言えば、ブロック本体６３，６４の凸部６７，６８は、露出する。
【００７５】
次に第二ヒートブロック５７について説明する。第二ヒートブロック５７は、前記した第一ヒートブロックと同様に上片５７ａと下片５７ｂを有する。
そして第二ヒートブロック５７の上片５７ａ及び下片５７ｂについてもそれぞれブロック本体８２，８３を備える。ブロック本体８２，８３の素材、形状、構造は、前記した第一ヒートブロック５５のブロック本体６３，６４と同一であり、アルミニウム等を素材とし、略直方体であって一つの面に凸部８４，８５が設けられている。また凸部８４，８５の先端部分にシート８６，８７が接着されている。
ヒートブロック本体８２，８３には、それぞれ電気ヒータ７６，７７と、温度センサー７８，７９が内蔵されている。
【００７６】
前記した第一ヒートブロック５５では、ブロック本体６３，６４の周囲に断熱材６５，６６が設けられていたが、第二ヒートブロック５７ではこれに代わって放熱部材９５，９６が設けられている。断熱部材９５，９６は、アルミニウム又は銅合金の様な熱伝導性に優れた素材で作られており、溝部９７，９８を有し、当該溝部９７，９８内にブロック本体８２，８３が挿入されている。
また放熱部材９５，９６には多数のフィン１００が設けられている。
【００７７】
第二ヒートブロック５７は図１１の様に全体が通風室１０１によって覆われている。そして通風室１０１の一部に送風機１０２が取り付けられている。そのため第二ヒートブロック５７は送風機１０２によって通風雰囲気に晒され、冷却機能を備えている。なお送風機１０２は、通風室１０１内の空気を排気する方向に回転する。送風機１０２を回転することにより、開口１１０から通風室１０１内に空気が導入され、ブロック本体６３，６４が冷却される。
【００７８】
第三ヒートブロック５６は、前記した第一ヒートブロックと全く同一の構造であり、上片５６ａと下片５６ｂを有する。第三ヒートブロック５６の細部については、第一ヒートブロックと同一であるから説明を省略する。
【００７９】
ブロック昇降機構６９は、いずれも同一の形状及び構造であるから、第一ヒートブロックが取り付けられる第一ブロック昇降機構６９を代表例として説明する。
【００８０】
第一ブロック昇降機構６９は、上部側昇降機構６９ａと下部側昇降機構６９ｂによって構成されている。上部側昇降機構６９ａと下部側昇降機構６９ｂは、多少形状が相違するものの、機構学的には同一である。
上部側昇降機構６９ａと下部側昇降機構６９ｂは、いずれもカム１０４ａ，１０４ｂと、アーム部１０３ａ，１０３ｂを有する。
カム１０４ａ，１０４ｂには共通する軸１０５が挿通され、当該軸１０５は、図８に示すステップモータ１０７によって回転される。
アーム部１０３ａ，１０３ｂは、いずれも略「Ｌ」字状をしており、一方の端部にカムフォロー１０６ａ，１０６ｂが設けられている。
またアーム部１０３ａ，１０３ｂの他端側には、ヒートブロック取付バー１０８ａ，１０８ｂが設けられている。ヒートブロック取付バー１０８ａ，１０８ｂは板状であり、取付けられた状態では、図８，９に示すように水平姿勢となる。
【００８１】
アーム部１０３ａ，１０３ｂは、図示しないガイドによって保持されており、垂直方向にのみ移動可能に規制されている。またアーム部１０３ａ，１０３ｂのカムフォロー１０６ａ，１０６ｂは前記したカム１０４ａ，１０４ｂと常時接触している。そのためステップモータ１０７によってカム１０４ａ，１０４ｂが回転すると、カムフォロー１０６ａ，１０６ｂがカム１０４ａ，１０４ｂに追従して昇降し、カムフォロー１０６ａ，１０６ｂと一体のアーム部１０３ａ，１０３ｂも昇降する。本実施形態では、二つのカム１０４ａ，１０４ｂは、１８０°位相が異なる姿勢に取り付けられており、一方のアーム部１０３ａが上昇すると他方のアーム部１０３ｂが下降する。また一方のアーム部１０３ａが下降すると、他方のアーム部１０３ｂは上昇する。したがってステップモータ１０７によってカム１０４ａ，１０４ｂが回転すると、ヒートブロック取付バー１０８ａ，１０８ｂは互いに近接方向又は離反方向に移動する。
【００８２】
またアーム部１０３ａ，１０３ｂのヒートブロック取付バー１０８ａ，１０８ｂには、各二本のバネ１０９を介してヒートブロックの上片又は下片が取り付けられている。そのため前記した様にステップモータ１０７によってカム１０４ａ，１０４ｂが回転すると、ヒートブロックの上片及び下片が近接方向又は離反方向に移動する。
【００８３】
次に基板送り機構５８について説明する。基板送り機構５８は、核酸増幅基板１０を保持して水平移動させ、核酸増幅基板１０を各ヒートブロックに順次挟ませるものである。
基板送り機構５８は、図８、図１３に示すように、ガイド部５９と駆動機構６０と、基板載置台６１によって構成されている。ガイド部５９は具体的にはガイドレール６２である。また駆動機構６０は、一対の歯付きプーリ７０ａ，７０ｂに歯付きベルト７１が懸架されたものである。歯付きプーリ７０ａ，７０ｂは、回転軸７２が鉛直方向となる様に支持されている。そして一方の歯付きプーリ７０ａにはステップモータ５４が接続されている。
【００８４】
ガイドレール６２は、水平方向に延びるものであり、前記した歯付きベルト７１の一方側の面に沿って固定されている。
基板載置台６１は、略逆「Ｌ」字であり、取付状態を基準として水平部８８及び垂直部８９を有する。垂直部８９の一面にはガイド受け部９０が形成されており、前記したガイドレール６２と嵌合している。
また基板載置台６１の垂直部８９は、前記した歯付きベルト７１にも固定されている。したがってステップモータ１０７を回転して歯付きベルト７１を走行させると、基板載置台６１は、ガイドレール６２に沿って水平方向に移動する。
【００８５】
基板載置台６１の水平部８８は、核酸増幅基板１０を取り付ける部位である。基板載置台６１の水平部８８であって、その先端近傍には、長方形の開口９１が形成されている。
【００８６】
本実施形態の温調装置８０では、３基のブロック昇降機構６９が並べて立設され、これに共通の軸１０５が挿通されている。そして第一ブロック昇降機構６９には、第一ヒートブロック５５が取り付けられ、第二ブロック昇降機構６９には、第二ヒートブロック５７が取り付けられ、第三ブロック昇降機構６９には、第三ヒートブロック５６が取り付けられている。
基板送り機構５８は、前記した３基のブロック昇降機構６９の前面側に配置されている。
【００８７】
前記した様に、基板載置台６１の水平部８８には核酸増幅基板１０が取り付けられる。ここで基板載置台６１の水平部８８には前記した様に開口９１が設けられており、当該開口９１に核酸増幅基板１０の反応液溜部２０の領域が一致する様に取り付けられる。なお基板載置台６１の水平部８８には、図示しない基板押さえが設けられている。基板押さえは、板バネによって核酸増幅基板１０を押圧するものであり、核酸増幅基板１０の振動を防止する機能を持つ。
【００８８】
そして核酸増幅基板１０は、基板送り機構５８によって水平移動される。基板送り機構５８は各ブロック昇降機構６９の前面で停止される。またブロック昇降機構６９によって、各ヒートブロックの上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂが昇降してその間に核酸増幅基板１０を挟むことができる。ヒートブロック５５，５６，５７が挟む位置は、核酸増幅基板１０の反応液溜部２０の領域だけであり、電気泳動部２１は挟まない。即ちヒートブロック５５，５６，５７の上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂには、それぞれ凸状部が設けられいるが、当該凸状部が基板載置台６１の開口９１と一致する状態で、基板送り機構５８が位置決め停止され、その位置においてヒートブロックの上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂが昇降する。そのため前記した様に核酸増幅基板１０の反応液溜部２０の領域だけがヒートブロック５５，５６，５７によって挟まれる。
ここで各ヒートブロック５５，５６，５７は、バネ１０９を介してブロック昇降機構６９に取り付けられており、さらにヒートブロック５５，５６，５７の凸状部にはシート７３，７４が取り付けられているので、ヒートブロックの上片５５ａ，５６ａ，５７ａと下片５５ｂ，５６ｂ，５７ｂは、核酸増幅基板１０の反応液溜部２０と密接する。
【００８９】
また３組のヒートブロック５５，５６，５７は、正面の温度調節器９２，９３，９４によって予め所定の温度に温度調節されている。すなわち各ヒートブロック５５，５６，５７に取り付けられた温度センサーの信号は、それぞれ各温度調節器９２，９３，９４に入力され、電気ヒータが温度調節器９２，９３，９４によってＰＩＤ制御される。また第二ヒートブロック５７に関しては、送風機の送風量もＰＩＤ制御される。
核酸増幅反応がＰＣＲの場合は、、向かって右端の第一ヒートブロック５５は、ディナチュレーション温度（９５℃）近傍に温度調節される。左端の第二ヒートブロック５７は、アニーリング温度（５５℃）近傍に温度調節される。中央の第三ヒートブロック５６は、二本鎖伸長の各反応温度（７２℃）近傍に温度調節される。
【００９０】
反応液注入・吸引機構４５は、小型の加圧装置と真空装置を備えたものである。
【００９１】
電気泳動・検出装置８１の内部は図示しないが、電気泳動装置と蛍光検出装置を内蔵するものである。電気泳動装置は、増幅核酸移動用の電極と、増幅核酸泳動用の電極を備える。
【００９２】
制御装置９９は、具体的にはコンピュータであり、電気泳動・検出装置８１から出力された信号を解析するものである。また制御装置９９の内蔵するタイマによって各ヒートブロック５５，５６，５７が核酸増幅基板１０を挟む時間が制御される。すなわち制御装置９９は、内部に第１から第３タイマを備える。そして第１タイマによって第一ヒートブロック５５が核酸増幅基板１０を挟む時間が設定される。同様に、第２タイマによって第二ヒートブロック５７が核酸増幅基板１０を挟む時間が設定され、第３タイマによって第三ヒートブロック５６が核酸増幅基板１０を挟む時間が設定される。各タイマで設定される温度は、いずれも数秒である。
【００９３】
次に、本発明の実施形態の核酸増幅方法を増幅・分離装置７５の動作を追って説明する。図１４は、図７に示す増幅・分離装置７５の温調装置の動作を説明するフローチャートである。図１５は、反応液導入口３０から反応液溜部２０に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。図１６は、反応液溜部２０から反応液導入口３０側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。図１７は、核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
【００９４】
前述した核酸増幅基板１０は、基板送り機構５８に装着されて装置が起動される。そして基板送り機構５８が駆動し、核酸増幅基板１０はまず最初に反応液注入・吸引機構４５の位置に移送される。
反応液注入・吸引機構４５では、図１５（ａ）に示すように、反応液導入開口３０に反応液が注入される。
この反応液は、核酸増幅反応に必要な成分を全て含むものである。核酸増幅反応がＰＣＲである場合は、鋳型ＤＮＡ、プライマー、デオキシヌクレオチド３リン酸類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が混合されたものが反応液となる。この場合、プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合もある。プライマーにあらかじめ蛍光標識がなされる場合は、増幅されたＤＮＡはすでに蛍光標識されているので、電気泳動部２１のゲルにインターカレーターを添加する必要はない。
【００９５】
本実施形態では、反応液導入開口３０に注入された反応液は、毛細管現象によって反応液往復流路２２に引き込まれ、反応液溜部２０に充填される。この際、反応液往復流路２２及び反応液溜部２０が親水性であるから、試料が表面に馴染みやすく、反応液導入開口３０への試料の導入が容易である。さらに、反応液溜部２０において基板から試料への熱伝導がよい。
また必要に応じて吸引用開口３１に真空源が接続される。その結果、反応液導入開口３０に注入された反応液は、真空源の負圧によって吸引され、反応液往復流路２２を流れて図１５（ｂ）の様に反応液溜部２０に入る。
【００９６】
そして次に核酸増幅基板１０内で核酸増幅反応が行われる。以下、核酸増幅反応がＰＣＲである場合を例に温調装置８０の動作を説明する。
この工程における温調装置８０の動作は、図１４のフローチャートの通りである。
具体的には、基板送り機構５８を動作し（ステップ１）、最も右の第一ヒートブロック５５に核酸増幅基板１０を移送し（ステップ２）、ヒートブロックの上片５５ａ及び下片５５ｂで核酸増幅基板１０の反応液溜部２０を挟む（ステップ３）。
ステップ３で第一ヒートブロックを閉止する（上片５５ａと下片５５ｂを近接させて両者の間隔を閉じ、核酸増幅基板１０を挟む）と第一タイマが計時を開始する。そしてステップ４で第一タイマがアップしたことが確認されると、第一ヒートブロックを開く（上片５５ａと下片５５ｂを離反させて両者の間隔を開き、核酸増幅基板１０を開放する）。
ここで当該第一ヒートブロック５５は、予めディナチュレーション温度の近傍に温度調節されている。また核酸増幅基板１０は薄く、特にヒートブロック５５で挟まれる反応液溜部２０は厚さが薄い。そのため反応液溜部２０の反応液は、第一タイマで設定された数秒の内にディナチュレーション温度に達し、ディナチュレーション反応が速やかに進む。
【００９７】
また本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０は、核酸増幅基板１０内の空隙６内に形成されており、上面側と下面側は完全に密閉されている。そのためヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟んでも、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５５が汚染されることはない。
【００９８】
数秒間、ヒートブロック５５で反応液溜部２０を挟み続け、ディナチュレーション温度に維持した後（ステップ５）前記した様に核酸増幅基板１０を開放し（ステップ６）、再度基板送り機構５８を動作させる（ステップ７）。そして核酸増幅基板１０を移動して左端に設けられた第二ヒートブロック５７の位置に核酸増幅基板１０を運ぶ（ステップ８）、この時、核酸増幅基板１０は相当の振動や衝撃を受けるが、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはない。
【００９９】
そして左端に設けられたヒートブロック５７によって核酸増幅基板１０を挟む（ステップ９）。この場合も、反応液溜部２０だけがヒートブロック５７で挟まれ、反応液溜部２０内の反応液は、ただちにアニーリング温度に達する（ステップ１０）。
またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５７が汚染されることはない。
【０１００】
そしてアニーリングが終了すると（ステップ１１）、再度核酸増幅基板１０を移動し（ステップ１３）、中央のヒートブロック５６で、核酸増幅基板１０を挟み（ステップ１５）、二本鎖伸長反応が行われる（ステップ１６）。またこの場合についても、反応液溜部２０から反応液が洩れ出ることはなく、ヒートブロック５６が汚染されることはない。
【０１０１】
二本鎖伸長反応が終了すると（ステップ１７）、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を移動させ（ステップ１８）、最初のヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を挟み、再度ディナチュレーション反応を行わしめる。
以後、先と同様の一連の工程を３０回程度繰り返し、ＰＣＲ法によって目的のＤＮＡを増幅させる。
すなわちステップ１９で一連の工程を終えると、制御装置内のカウンタが＋１となる。そして続くステップ２０でカウンタの数値が３０であるか否かを確認する。ステップ２０でカウンタの数値が３０未満であるならばステップ１に戻り、前述した一連の動作を繰り返す。
ステップ２０で３０以上であるならば、核酸増幅工程を終える。
【０１０２】
この様に、本実施形態では、反応液溜部２０内の反応液は昇温と冷却が繰り返され、内部の反応液は、膨張と収縮が繰り返される。また本実施形態では、ヒートブロック５５，５６，５７によって反応液溜部２０を挟むので、反応液溜部２０の表裏面側の壁は、繰り返し圧縮される。
【０１０３】
しかしながら本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０から反応液が流出することはない。
すなわち本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部に隔壁７（図５）が設けられてジグザグ状の流路が形成されており、全体の流路抵抗が高く、内部における反応液の移動が抑制されている。さらに本実施形態では、反応液溜部２０の近傍に反応液吸引路２３が設けられているが、反応液吸引路２３は、曲路を基調とした流路であり、当該流路も「移動抑制手段」として機能する。
そのため本実施形態の核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内外における反応液の移動が少なく、反応液の多くは反応液溜部２０に残る。
【０１０４】
さらに本実施形態では、前記した様に、反応液溜部２０の内部に流路が形成されており、図５の様に流路の隔壁７の先端が第一層１１の表面と接している。そのため反応液溜部２０が圧縮力を受けたとき、当該圧縮力は、流路の隔壁７で負担され、反応液溜部２０の表面側の撓みが少ない。
すなわち本実施形態では、流路の隔壁７が耐圧縮部として機能し、反応液溜部２０の表面側を撓ませない。
そのため本実施形態では、反応液溜部２０に負荷される圧力が小さく、反応液溜部２０から反応液を排出させようとする力自体が小さい。
したがって本実施形態の核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０内の反応液が昇温と冷却を繰り返し、且つ反応液溜部２０が繰り返し圧縮されるにも係わらず、反応液の多くが反応液溜部２０に残留する。逆に言えば、本実施形態の核酸増幅基板１０は、少ない試料でＰＣＲ法等によるＤＮＡ増幅を行うことができる。
【０１０５】
核酸増幅反応によって核酸増幅が終了すると、基板送り機構５８によって核酸増幅基板１０を再度反応液注入・吸引機構４５の位置に移送する。
そして図１６（ａ）の様に吸引用開口３１に加圧源Ｐを接続し、吸引用開口３１側を高圧雰囲気にして反応液溜部２０内の反応液を押し出す。反応液は、図１６（ａ）の様に反応液往復流路２２を戻って反応液導入開口３０に戻る（図１６（ｂ））。
【０１０６】
この状態で、基板移載機構４６によって核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移載する。
電気泳動・検出装置８１内においては、最初に図１７（ａ）に示すように反応液導入開口３０と、核酸供給路末端側開口３３に電極が接続され、核酸供給路末端側開口３３を正、反応液導入開口３０側を負として直流電流が通電される。
【０１０７】
その結果、反応液導入開口３０内の核酸が核酸供給路末端側開口３３側に移動する。
そして続いて図１７（ｂ）の様に泳動部始端側開口３５と泳動部終端側開口３６に電極が接続され、泳動部終端側開口３６を正、泳動部始端側開口３５を負として直流電流が通電される。
その結果、交差部５０に到達していた核酸が泳動部終端側開口３６側に引き寄せられ、核酸は泳動路５２において分子量の大きさに従って分離される。そして、図示しない蛍光検出装置によって蛍光分析が行われる。なおこの時、核酸供給路末端側開口３３と反応液導入開口３０側は、いずれも泳動部始端側開口３５の電位と泳動部終端側開口３６の電位に対して中間の電位となる様に制御することが望ましい。
【０１０８】
以上説明した増幅・分離装置７５では、３組のヒートブロック５５，５６，５７を備え、基板送り機構５８を往復移動させて各ヒートブロック５５，５６，５７で順次核酸増幅基板１０を挟む構成を開示した。しかし本発明はこの様な構成に限定されるものではなく、より多数のヒートブロックを備えたものであってもよい。たとえば、３０組のヒートブロックを一列に並べ、核酸増幅基板１０を一方通行に流してもよい。この場合は、核酸増幅基板１０の核酸増幅反応を連続的に行うことができる。
【０１０９】
また上記した増幅・分離装置７５では、カム１０４によってヒートブロック５５，５６，５７を動作させたが、ソレノイドや空気圧シリンダ等を採用することも可能である。
【０１１０】
上記した実施形態では、ヒートブロックが固定位置にあって、核酸増幅基板１０が水平移動する構成を例示したが、逆に核酸増幅基板１０が固定位置にあり、ヒートブロック側が移動してもよい。
【０１１１】
また上記した実施形態では、核酸増幅基板１０では、反応液溜部２０の内部にジグザグ状の流路４０が形成したものを例に挙げた。本実施形態の様に内部に流路４０を形成する構造を採用すると、前記した様に反応液溜部２０の流路抵抗が高まり、且つ反応液溜部２０の表面側の撓みが小さなものとなり、反応液溜部２０の反応液が消失しにくく、推奨される構造である。しかしながら本発明は、単一室であり且つ内部が空洞状態の反応液溜部を持つ基板の使用を否定するものではない。
【０１１２】
本実施形態の核酸増幅基板１０では、４系統の核酸増幅・分離流路１５，１６，１７，１８を設けたが、核酸増幅・分離流路の数は任意であり、１系統でも５系統以上でもよい。
【実施例１】
【０１１３】
次に、本発明の効果を確認するために行った実施例について説明する。
本発明者らは、図１に示す核酸増幅基板１０を試作し、実験を行った。実験に使用した鋳型ＤＮＡは、ブタゲノムから得た２００塩基対の塩基断片であり、従来技術のＰＣＲ装置で増幅したＰＣＲ産物である。実験には、このＰＣＲ産物を希釈して使用した。
プライマーは、上記した鋳型ＤＮＡを得る際に使用したものと同一のフォワード、リバースのプライマーを使用した。
酵素、基質、バッファー等の他の試薬類は、タカラバイオ株式会社製の「TaKaRa Taq」を含むキットを用いた。
【０１１４】
ＰＣＲに使用した反応液は、約８〜１０ミリリットルであり、反応液導入開口３０に供給し、吸引用開口３１から吸引して反応液溜部２０に導いた。
なお実験で試作した核酸増幅基板１０は、反応液溜部２０の容積が約５ミリリットルであり、残量は、吸引用開口３１に残った。
そして図７に示す装置を使用してＰＣＲ及び電気泳動を行わしめた。
温調装置８０のヒートブロック５５は、反応液溜部２０をディナチュレーション温度とするために、９８．５℃に温調した。
またヒートブロック５７は、反応液溜部２０をアニーリング温度とするために、５３．０℃に温調した。
さらにヒートブロック５６は、反応液溜部２０を二本鎖伸長の反応温度とするために７４．５℃に温調した。
【０１１５】
そしてヒートブロック５５で核酸増幅基板１０を５秒間挟んでディナチュレーション反応を行わしめ、続いてヒートブロック５７で５秒間挟んでアニーリングを行い、さらに続いてヒートブロック５６で５秒間挟んで二本鎖伸長の反応を行わしめた。これを３０回繰り返した。
以上のＰＣＲ法に要した時間は、約１０分であった。
そして核酸増幅基板１０を電気泳動・検出装置８１に移し、ＤＮＡの泳動実験を行ったところ、明らかに鋳型ＤＮＡが増幅されたものと見られるピークが出現した。
そのため、本実施例の核酸増幅基板１０によって、ＤＮＡが増幅可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明の実施形態で使用する核酸増幅基板の正面図である。
【図２】図１の核酸増幅基板の斜視図である。
【図３】図１の核酸増幅基板の二系統の核酸増幅・分離流路の正面図である。
【図４】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の第一層と第二層の分解斜視図である。
【図５】図１の核酸増幅基板の反応液溜部周辺の拡大断面図である。
【図６】図１の核酸増幅基板の反応液導入口周辺の拡大斜視図である。
【図７】図１の核酸増幅基板を装着して核酸増幅及び分離を行う増幅・分離装置の斜視図である。
【図８】図７に示す増幅・分離装置の温調装置の構成（反応液注入・吸引機構を除く）を示す斜視図である。
【図９】さらに図８に示す温調装置の第一ヒートブロック（第三ヒートブロック）及びブロック昇降機構の斜視図である。
【図１０】第一ヒートブロック（第三ヒートブロック）の分解断面斜視図である。
【図１１】第二ヒートブロック及びその周辺部の断面斜視図である。
【図１２】第二ヒートブロックの分解断面斜視図である。
【図１３】図７に示す増幅・分離装置の温調装置の基板送り機構の要部の斜視図である。
【図１４】図７に示す増幅・分離装置の温調装置の動作を説明するフローチャートである。
【図１５】反応液導入口から反応液溜部に反応液を送る際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１６】反応液溜部から反応液導入口側に反応液を戻す際における反応液の挙動を示す説明図である。
【図１７】核酸を分離する際における反応液の挙動を示す説明図である。
【符号の説明】
【０１１７】
６  空隙
１０  核酸増幅基板（基板）
２０  反応液溜部
２１  電気泳動部
２２  反応液往復流路（反応液流路）
３０  反応液導入開口（反応液導入部、電極接続部）
３３  核酸供給路末端側開口（電極接続部）
３５  泳動路始端側開口（電極接続部）
３６  泳動部終端側開口（電極接続部）
５５  第一ヒートブロック（ヒートブロック）
５６  第三ヒートブロック（ヒートブロック）
５７  第二ヒートブロック（ヒートブロック）
５８  基板送り機構（順次接触手段）
７５  増幅・分離装置（核酸検知システム）
８０  温調装置（核酸増幅装置）
８１  電気泳動・検出装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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