(57)【要約】【課題】糖尿病やがんなどの、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット(IRα)濃度の上昇を伴う疾患の治療剤のスクリーニングに有用な技術を提供することが、本発明の課題である。【解決手段】インスリン受容体発現細胞を高い糖濃度条件で培養したときに、培養上清中に放出されるIRα濃度を指標として、血中可溶性IRα濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を評価することができる。この条件下で、IRαをの培養上清中への放出を抑制する化合物を選択することにより、当該疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、被験化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を検出する方法：
(1) インスリン受容体を発現する細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程であって、高グルコース濃度条件下での培養の前または後に前記細胞を被験化合物と接触させるか、または被験化合物の存在下で前記細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程、；
(2) 高グルコース濃度条件下での培養後に、培養上清に含まれる可溶性インスリン受容体αサブユニットを測定する工程、；および
(3) (2)で測定された可溶性インスリン受容体αサブユニットの濃度が対照と比較して低下したときに、前記疾患の治療効果が検出される工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって前記疾患の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、前記疾患の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病およびがんのいずれかである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インスリン受容体を発現する細胞が、ヒトインスリン受容体の全長をコードする遺伝子を発現可能に形質転換された動物細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
次の要素を含む、被験化合物の血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療効果を検出するためのキット：
(1) インスリン受容体αサブユニットを発現する細胞であって、高グルコース濃度条件下で培養することによって培養上清中に可溶性のインスリン受容体αサブユニットを分泌する細胞、；
(2) (1)の細胞の生存を支持する培地；および
(3)培養上清中の可溶性のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
【請求項７】
高グルコース濃度条件下で培養することによって培養上清中に可溶性のインスリン受容体αサブユニットを分泌する細胞が、ヒトインスリン受容体の全長をコードする遺伝子を発現可能に形質転換された動物細胞である請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を検出する方法、ならびに当該作用を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、生体のエネルギー源であるグルコースの代謝調節において重要な役割を果たしているホルモンである。膵ランゲルハンス島β細胞で産生されたインスリンは、インスリンレセプターを有する細胞に作用し、細胞によるグルコースの取り込みを促す。インスリンの作用によって、生体の血糖値は適切な範囲に維持されている。糖尿病は、なんらかの原因によってインスリンの作用が不十分になった結果としてもたらされる病態の１つである。
インスリンの作用が不十分になる主な原因として、インスリンの分泌機能の異常と、インスリンに対する感受性の低下があげられる。前者は１型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus)と呼ばれる。１型糖尿病においては、インスリンに対する応答性は維持されているため、インスリンの投与によって血糖値のコントロールが可能である。１型糖尿病はインスリン依存性の糖尿病(Insulin Dependent Diabetes Mellitus;IDDM)とも呼ばれ、若年性の糖尿病の主な原因となっている。
【０００３】
一方、後者は、２型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus)と呼ばれている。２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病(Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus;NIDDM)とも呼ばれ、成人に多いタイプの糖尿病である。日本では糖尿病患者の９５%が２型糖尿病であると言われている。２型糖尿病患者は、生体のインスリンに対する応答性が低下しているため、インスリンを投与しても血糖値をコントロールすることができない。２型糖尿病は幾つかの遺伝子異常と、肥満、ストレス、加齢などの環境因子が加わって発症すると考えられている。現在、日本にも約７４０万人の２型糖尿病患者がいると言われており、その数は高齢化にともなって増加している。糖尿病予備軍も含めると１６２０万人もの患者がいるという予測もある。したがって、２型糖尿病の診断や治療は、現代社会の重要な研究課題である。
【０００４】
現在までのところ、２型糖尿病の原因遺伝子は明らかになっていない。インスリン作用機構に関与する因子の遺伝子、またはインスリン分泌に関与する因子の遺伝子が候補遺伝子と予想されている。このうち、インスリン作用に関与する因子としては、次のような因子が考えられている。
インスリンレセプター、
インスリンレセプターサブストレート−１(IRS-1)、
グルコーストランスポータータイプ４など
またインスリン分泌に関与する因子の遺伝子として、次のような因子の関与が予想されている。
グルコーストランスポータータイプ２、
グルコキナーゼ、
ミトコンドリア遺伝子など
【０００５】
さて、インスリンが標的細胞に作用するには、その細胞膜上に存在するインスリンレセプターと結合することが必須である。また２型糖尿病の初期には、インスリン抵抗性が存在するという多くの報告がある(非特許文献１／Taylor,S.I.Diabetes 41:1473-1490,1992)。これらのことから、インスリンレセプターの異常と糖尿病の関係についても検討されてきた。インスリンレセプターの機能に異常が存在すると、高度のインスリン抵抗性を示し、重篤な糖尿病となるはずである。
【０００６】
一方、最近になって本発明者を含む研究者によって多くのインスリンレセプター異常症が発見されている。これらのインスリンレセプター異常症においては、変異の種類によって、さまざまな検査結果、あるいは症状が見られることが明らかとなってきた(非特許文献２／M. Taira et al.,Science 245:63-66,1989、非特許文献３／F.Shimada et al.,Lancet335:1179-1181,1990)。これらの知見により２型糖尿病の発症原因の一部にインスリンレセプター遺伝子異常が存在する可能性が示唆された。実際本発明者らは、２型糖尿病の遺伝子診断を可能とする多型の１つを明らかにし、既に特許出願している（特許文献１／特開平8-103280）。本発明者らによって見出されたインスリンレセプターの多型は、βサブユニットの８３１位のThrがAlaに変異している(IRA831)。このアミノ酸の置換を原因とするインスリンレセプターの機能異常は確認されなかった。しかし、遺伝統計学的にはIRA831と２型糖尿病との強い関連性が示された。
【０００７】
インスリンレセプターは、αとβの２つのサブユニットで構成されるヘテロ４量体構造の受容体蛋白質である。αサブユニットは細胞外にあり、βサブユニットは細胞膜を貫通している。αサブユニットはそのC末端側にあるCys残基のSH基を介して、βサブユニットの細胞外ドメインとSS結合によって結合している。
インスリンがαサブユニットと結合すると、βサブユニットの細胞内ドメインのチロシン残基が自己リン酸化され、インスリンのシグナルが細胞に伝達される。細胞膜にあったインスリンレセプターは、インスリンとの結合の後にエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる（受容体の半減期は７時間）。インスリンレセプターの数はインスリン濃度の増加に伴って減少する。これを下降調節（down regulation）という。
【０００８】
一方、最近、いくつかの疾患においてレセプターの異常に基づく疾患、血中にフリーのレセプターが存在することによる疾患が報告されている（非特許文献４／Frode TS, Tenconi P, Debiasi MR, Medeiros YS "Tumour necrosis factor-alpha, interleukin-2 soluble receptor and different inflammatory parameters in patients with rheumatoid arthritis." Mediators Inflamm. 2002 Dec; 11(6) : 345-9、非特許文献５／Baron AT, Cora EM, Lafky JM, Boardman CH, Buenafe MC, Rademaker A, Liu D, Fishman DA, Podratz KC, Maihle NJ "Soluble Epidermal Growth Factor Receptor (sEGFR/sErbB1) as a potential Risk, Screening, and Diagnostic Serum Biomarker of Epithelial Ovarian Cancer." Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003 Feb ; 12(2) : 103-13、非特許文献６／Beguin Y. "Soluble transferrin receptor for the evaluation of erythropoiesis and iron status." Clin Chem Acta, 2003 Mar ; 329(1-2) : 9-22）。また、インスリンレセプターαサブユニットを血中に放出するトランスジェニックマウスにおいて、高血糖、高インスリン血症が観察されている（非特許文献７／ERIK M. SCHAEFER et al. DIABETES vol.43, 143-153 ; 1994）。
【０００９】
またいくつかのサイトカイン受容体または増殖因子受容体の細胞外ドメインが、血清中を循環していることが以前に報告された（非特許文献８／Lauta, V. M. A review of the cytokine network in multiple myeloma: diagnostic,prognostic, and therapeutic implications. Cancer 97, 2440-52 (2003); 非特許文献９／４; Baumann, G. Growth hormone binding protein. The soluble growth hormone receptor. Minerva Endocrinol 27, 265-76 (2002); 非特許文献１０; Jones, S. A. & Rose-John, S. The role of soluble receptors in cytokine biology:the agonistic properties of the sIL-6R/IL-6 complex. Biochim Biophys Acta 1592,251-63 (2002)）。1972年にGavinらは、インスリン結合タンパク質が培養細胞の表面から脱落することを実証した（非特許文献１１／Gavin, J. R., 3rd, Buell, D. N. & Roth, J. Water-soluble insulin receptors from human lymphocytes. Science 178, 168-9 (1972)）。続いて、Pezzinoらは、ヒト血清中に82-kDaの高親和性インスリン結合タンパク質を認めた（非特許文献１２／Pezzino, V. et al. Identification and initial characterization of insulin receptorlike immunoreactivity in human plasma. J Clin Endocrinol Metab 74, 1116-21 (1992)）。更に本発明者らは、糖尿病患者やがん患者において、血中のインスリン受容体αサブユニットの濃度が、健常者と比較して有意に高いことを見出して特許出願した(特許文献２／WO2004/97414)。しかし糖尿病の病因とインスリン受容体の関係については、未だ明らかでない部分も残されている。
【００１０】
【非特許文献１】Taylor,S.I.Diabetes 41:1473-1490,1992
【非特許文献２】M. Taira et al.,Science 245:63-66,1989
【非特許文献３】F.Shimada et al.,Lancet335:1179-1181,1990
【非特許文献４】Frode TS, Tenconi P, Debiasi MR, Medeiros YS "Tumour necrosis factor-alpha, interleukin-2 soluble receptor and different inflammatory parameters in patients with rheumatoid arthritis." Mediators Inflamm. 2002 Dec; 11(6) : 345-9
【非特許文献５】Baron AT, Cora EM, Lafky JM, Boardman CH, Buenafe MC, Rademaker A, Liu D, Fishman DA, Podratz KC, Maihle NJ "Soluble Epidermal Growth Factor Receptor (sEGFR/sErbB1) as a potential Risk, Screening, and Diagnostic Serum Biomarker of Epithelial Ovarian Cancer." Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003 Feb ; 12(2) : 103-13
【非特許文献６】Beguin Y. "Soluble transferrin receptor for the evaluation of erythropoiesis and iron status." Clin Chem Acta, 2003 Mar ; 329(1-2) : 9-22
【非特許文献７】ERIK M. SCHAEFER et al. DIABETES vol.43, 143-153 ; 1994
【非特許文献８】Lauta, V. M. A review of the cytokine network in multiple myeloma: diagnostic,prognostic, and therapeutic implications. Cancer 97, 2440-52 (2003)
【非特許文献９】４; Baumann, G. Growth hormone binding protein. The soluble growth hormone receptor. Minerva Endocrinol 27, 265-76 (2002)
【非特許文献１０】Jones, S. A. & Rose-John, S. The role of soluble receptors in cytokine biology:the agonistic properties of the sIL-6R/IL-6 complex. Biochim Biophys Acta 1592,251-63 (2002)
【非特許文献１１】Gavin, J. R., 3rd, Buell, D. N. & Roth, J. Water-soluble insulin receptors from human lymphocytes. Science 178, 168-9 (1972)
【非特許文献１２】Pezzino, V. et al. Identification and initial characterization of insulin receptorlike immunoreactivity in human plasma. J Clin Endocrinol Metab 74, 1116-21 (1992)
【特許文献１】特開平8-103280
【特許文献２】WO2004/97414
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇と疾患の関連性を明らかにし、当該疾患の治療効果を検出し、治療に有用な化合物をスクリーニングするための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、糖尿病やがん患者の血中において、遊離ヒトインスリン受容体のαサブユニット(hIRα)の増加が観察されることを明らかにしてきた。更に本発明者らは、糖尿病患者における、血中の遊離ヒトインスリン受容体のαサブユニット(hIRα)の増加と、疾患との関係について研究を重ねた。その結果、高い糖濃度におかれた細胞が、インスリン受容体αサブユニットを放出することを確認した。加えて、インスリン受容体αサブユニットの放出が、受容体分子の切断によってもたらされていることも明らかにした。生体においては、血中に放出されたαサブユニットは、インスリンと結合するため、インスリンの作用を妨害する。これが糖尿病における、インスリン抵抗性のメカニズムの一つであることが明らかにされた。
したがって、糖によって誘導されるインスリン受容体αサブユニットの放出を抑制することが、インスリン抵抗性の解除による糖尿病治療のための戦略として有効であると考えられた。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の、被験化合物の血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を検出する方法、ならびにこの方法に基づく当該疾患の治療薬のスクリーニング方法とそのためのキットに関する。
〔１〕次の工程を含む、被験化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を検出する方法：
(1) インスリン受容体を発現する細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程であって、高グルコース濃度条件下での培養の前または後に前記細胞を被験化合物と接触させるか、または被験化合物の存在下で前記細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程、；
(2) 高グルコース濃度条件下での培養後に、培養上清に含まれる可溶性インスリン受容体αサブユニットを測定する工程、；および
(3) (2)で測定された可溶性インスリン受容体αサブユニットの濃度が対照と比較して低下したときに、前記疾患の治療効果が検出される工程。
〔２〕〔１〕に記載の方法によって前記疾患の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、前記疾患の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
〔３〕血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病およびがんのいずれかである〔１〕または２に記載の方法。
〔４〕血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病である〔３〕に記載の方法。
〔５〕インスリン受容体を発現する細胞が、ヒトインスリン受容体の全長をコードする遺伝子を発現可能に形質転換された動物細胞である〔１〕に記載の方法。
〔６〕次の要素を含む、被験化合物の血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療効果を検出するためのキット：
(1) インスリン受容体αサブユニットを発現する細胞であって、高グルコース濃度条件下で培養することによって培養上清中に可溶性のインスリン受容体αサブユニットを分泌する細胞、；
(2) (1)の細胞の生存を支持する培地；および
(3)培養上清中の可溶性のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
〔７〕高グルコース濃度条件下で培養することによって培養上清中に可溶性のインスリン受容体αサブユニットを分泌する細胞が、ヒトインスリン受容体の全長をコードする遺伝子を発現可能に形質転換された動物細胞である〔６〕に記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明において、糖尿病のインスリン抵抗性の新たなメカニズムが明らかにされた。すなわち、糖によって細胞のインスリン受容体αサブユニットが放出され、インスリンの作用を妨げることが確認された。したがって、糖によって誘導される細胞からのインスリン受容体αサブユニットの放出を抑制しうる化合物は、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療薬として有効である。本発明によって提供された糖尿病の新たな治療戦略は、従来の治療方法では十分な効果をあげられなかった糖尿病において、新たな治療方法を提供することができる。あるいは、従来の治療方法と組み合わせることによって、より効果的な治療方法を実現できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、次の工程を含む、被験化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を検出する方法に関する。
(1) インスリン受容体を発現する細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程であって、高グルコース濃度条件下での培養の前または後に前記細胞を被験化合物と接触させるか、または被験化合物の存在下で前記細胞を高グルコース濃度条件下で培養する工程、；
(2) 高グルコース濃度条件下での培養後に、培養上清に含まれる可溶性インスリン受容体αサブユニットを測定する工程、；および
(3) (2)で測定された可溶性インスリン受容体αサブユニットの濃度が対照と比較して低下したときに、前記疾患の治療効果が検出される工程。
【００１５】
本発明に基づく治療効果の検出方法は、前記疾患の治療効果を有する化合物のスクリーニングに有用である。すなわち本発明は、前記工程(1)-(3)によって前記疾患の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、前記疾患の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【００１６】
本発明において、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患としては、糖尿病およびがんを示すことができる。血中可溶性インスリン受容体αサブユニットとは、細胞膜から遊離した状態で、血中に存在しているαサブユニットを含む断片、あるいはαサブユニットの断片を言う。αサブユニットは、通常、βサブユニットの細胞外ドメインとSS結合によって、細胞膜上に固定されている。血中可溶性インスリン受容体αサブユニットは、たとえば次のような原因によって、血中に遊離する。
−βサブユニットの細胞外ドメインの細胞膜からの遊離、
−SS結合の切断、あるいは
−αサブユニット内のβサブユニット結合部分との切断
特に糖尿病においては、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇は、インスリン抵抗性の原因となる。したがって、本発明によって選択された化合物によって可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を抑制すれば、インスリン抵抗性の解除に有効である。
【００１７】
本発明において、インスリン受容体を発現する細胞としては、ヒトインスリン受容体の全長をコードする遺伝子を発現可能に保持した動物細胞を用いることができる。本発明において、インスリン受容体の種類は限定されない。すなわち、当該インスリン受容体を細胞で発現させたときに、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導されるものであれば、任意のインスリン受容体を用いることができる。たとえばヒトのインスリン受容体は既にその遺伝子が単離され構造が決定されている(GenBank Accession No. NM_000208)。したがって、当業者は、その塩基配列情報に基づいて、目的の遺伝子を単離し、発現可能に保持した細胞を作成することができる。あるいは、その塩基配列情報やアミノ酸配列情報に基づいて、他の種のホモログを得ることもできる。
【００１８】
更に、本発明におけるインスリン受容体は、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される限り、改変が許容される。たとえば、天然型のインスリン受容体のアミノ酸配列(GenBank Accession No. NM_000208)において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される蛋白質は、本発明におけるインスリン受容体として利用することができる。
【００１９】
本発明において変異の対象となるアミノ酸の数は、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される限り制限されない。インスリンレセプターαサブユニットの場合、変異するアミノ酸の数は通常、100アミノ酸以内であり、好ましくは50アミノ酸以内であり、さらに好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内である。またその変異部位は、βサブユニットとの結合が維持され、かつ糖によってαサブユニットの放出が誘導される限り制限されない。
【００２０】
アミノ酸配列の変異は、人為的なものであっても、自然において生じる変異であってもよい。アミノ酸を置換する場合には、保存的置換を利用することができる。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換が、保存的置換と呼ばれている。
【００２１】
例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、いずれも非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性のアミノ酸としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。あるいは、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。更に、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループを構成するアミノ酸は、互いに似た性質を有している。そのため、グループ内の他のアミノ酸に置換したときに、蛋白質の機能が維持される可能性が高い。
【００２２】
天然型のインスリン受容体のアミノ酸配列(GenBank Accession No. NM_000208)と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される蛋白質も、本発明におけるインスリン受容体として利用することができる。更に、天然型のインスリン受容体のアミノ酸配列(GenBank Accession No. NM_000208)をコードするDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAによってコードされ、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される蛋白質も、本発明におけるインスリン受容体として利用することができる。
【００２３】
ハイブリダイゼーションの条件としては具体的には、例えば5×SSC、ホルムアミド非存在下で25℃の条件が挙げられる。好ましくは6×SSC、40％ホルムアミドで25℃で行う。更に好ましくは5×SSC、50％ホルムアミドで40℃で行う。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、例えば、2×SSC、37℃で洗浄する。好ましくは1×SSC、55℃で洗浄する。更に好ましくは1×SSC、60℃で洗浄する。
また、ハイブリダイゼーションスクリーニングに代えて、インスリン受容体遺伝子の塩基配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、PCR法を利用して本発明のポリヌクレオチドを単離することもできる。
【００２４】
上記ハイブリダイゼーションスクリーニングまたはPCR法により単離することができる、ポリヌクレオチドは、通常、天然型のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と高い相同性を有する。本発明における高い相同性とは、ポリヌクレオチドの一部ではなく全体にわたって少なくとも２０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の配列の同一性を有することを言う。塩基配列の相同性を決定するためのアルゴリズムが公知である（宮田隆ら著「コンピューターによる遺伝子のホモロジー解析」（遺伝子研究法Ｉ、東京化学同人））。
【００２５】
本発明において、インスリン受容体が改変体である場合には、放出されるαサブユニットは、天然型のαサブユニットとは異なるアミノ酸配列を含むことができる。つまり、インスリン受容体の改変体においては、放出されるαサブユニットも改変体であってよい。
【００２６】
本発明において、インスリン受容体は、糖によってそのαサブユニットの放出が誘導される限り、付加的なアミノ酸配列を有することができる。たとえば、予めαサブユニットをGFPのようなシグナル生成分子との融合蛋白質として発現させれば、その放出をGFPを検出することによって知ることができる。このようなマーカー分子と融合したαサブユニットで構成されるインスリン受容体は、本発明におけるインスリン受容体として有用である。
【００２７】
インスリン受容体（改変体を含む）を発現する細胞は、たとえば次のようにして作成することができる(WO2004/97414)。すなわち、前記インスリン受容体をコードする遺伝子を単離し、適当な発現制御領域の制御下に発現するように連結する。あるいはインスリン受容体の改変体をコードするDNAを合成し、適当な発現制御領域の制御下に連結して発現カセットを構築する。得られた発現カセットを、目的とする細胞に導入し、発現させればよい。発現用ベクターには、目的とする細胞に合った発現ベクターを利用することができる。本発明に利用することができる細胞は、好ましくは真核細胞である。たとえば、酵母、昆虫、両生類、爬虫類、そして動物の細胞を、示すことができる。中でも動物細胞は、本発明において好ましい細胞である。動物細胞としては、通常、外来性の遺伝子の発現に用いられる細胞を利用することができる。たとえば、CHOは本発明におけるインスリン受容体遺伝子の発現細胞として好ましい。動物細胞用の発現ベクターとしては、pCXN2、あるいはpRc/CMV2（インビトロジェン）などを用いることができる。
【００２８】
細胞は、当該細胞の生育を支持できる培地で培養される。たとえばCHO細胞は、F-12 Nutrient Mixture (Ham's F-12, Invitrogen, Carlsbad, CA) 培地において培養することができる。その他、RPMI1640、MEM、DEMEMなどの培地を利用することもできる。培地には、細胞の成育を支持する補助成分を加えても良い。たとえば、牛胎児血清(FCS)は、動物細胞の培養にしばしば用いられる補助成分である。
【００２９】
本発明においては、細胞は、高グルコース濃度条件下で培養される。一般的な細胞培養用培地の糖濃度は、5.5-11.1mM (1000-2000 mg/L)である。これに対して本発明においては、15 mM以上、たとえば15 - 30mM 、好ましくは16.5 - 27.5mMにおいて細胞を培養することにより、培養上清中へのインスリン受容体αサブユニットの放出を誘導する。グルコース濃度を高くするタイミングは任意である。すなわち、一定時間の培養後にグルコース濃度を高めることもできるし、最初から高いグルコース濃度で培養することもできる。いずれにせよ、高いグルコース濃度で所定時間の培養の後に、培養上清に放出されたαサブユニットを測定する。高いグルコース濃度で培養する時間は、たとえば5-40時間、通常10-30時間、好ましくは15-25時間である。
【００３０】
通常の培養条件で、インスリンレセプター遺伝子を形質転換体において発現させた場合には、βサブユニットの膜貫通ドメインの機能によって、レセプター分子の大部分は細胞膜上に局在する。その結果、培養上清中に存在するαサブユニットの濃度は低い水準にとどまる。しかし、上記のような高いグルコース濃度条件下では、培養上清中に有意に高い濃度のαサブユニットが確認できる。本発明において、測定すべき培養上清中の可溶性インスリン受容体αサブユニットとは、細胞膜から離れて存在するαサブユニットを言う。αサブユニットには、(1)αサブユニットとβサブユニットの一部を含むインスリン受容体の断片、(2)βサブユニットの構造を伴わないαサブユニット分子、および(3)αサブユニットの断片が含まれる。細胞膜から離れて存在するαサブユニットは、細胞から培養上清を分離することによって測定することができる。細胞は、遠心分離などの操作で、培養上清と分離することができる。また、たとえば、培地の流通を許す細胞不透過性の膜や担体中に封入した状態で細胞を培養することによって、培養上清の取得を容易にすることもできる。
【００３１】
本発明は、被験化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果が評価される。本発明における被験化合物は、高グルコース濃度条件下での培養の前または後に前記細胞と接触させるか、または被験化合物の存在下で前記細胞を高グルコース濃度条件下で培養することができる。被験化合物としては、たとえば天然または合成された蛋白質、ペプチド、抗体、動植物や細菌の細胞抽出物、培養上清、あるいは低分子化合物などを用いることができる。これらの被験化合物は、化合物ライブラリーや、遺伝子ライブラリーから得ることもできる。
【００３２】
高グルコース濃度条件下での培養と被験化合物と細胞の接触の後、培養上清中に放出されたインスリン受容体αサブユニットが測定される。インスリン受容体αサブユニットを測定する方法は特に制限されない。具体的には、ウエスタンブロット、HPLC、各種のイムノアッセイなどによって、αサブユニットを測定することができる。中でも、発明者らが確立したαサブユニットに特異的なELISA(WO2004/97414)は、本発明におけるαサブユニットの測定方法として好ましい。
【００３３】
培養上清に含まれる可溶性のαサブユニットの測定の結果を対照と比較することによって、被験化合物の、αサブユニットの放出に与える影響が評価される。本発明において、対照には、たとえば被験化合物を与えなかった細胞において観察された可溶性αサブユニットの濃度を用いることができる。あるいは、可溶性αサブユニットの放出に対する抑制作用が明らかな物質を加えた場合のαサブユニットの濃度を対照として比較すれば、その物質よりもより強い作用を有する化合物を見出することもできる。たとえば後に述べる実施例において、ある種のプロテアーゼ阻害剤は、高いグルコース濃度条件下でのαサブユニットの放出を抑制する作用を有していた。したがって、このプロテアーゼ阻害剤を添加したときのαサブユニットの濃度を対照とすれば、被験化合物が、プロテアーゼ阻害剤よりも強力な抑制作用を有することを確認することができる。
【００３４】
本発明に基づいて、被験化合物の、高い濃度の糖によって誘導されるインスリン受容体αサブユニットの放出を抑制する作用を検出することができる。更に、目的とする作用を有する被験化合物を選択することによって、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３５】
本発明の検出方法、あるいはスクリーニング方法に必要な要素を、予め組み合わせてキットを構成することができる。すなわち本発明は、次の要素を含む、被験化合物の血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療効果を検出するためのキットに関する。これらの要素の具体的な構成について既に述べたとおりである。
(1) インスリン受容体αサブユニットを発現する細胞であって、高グルコース濃度条件下で培養することによって培養上清中に可溶性のインスリン受容体αサブユニットを分泌する細胞、；
(2) (1)の細胞の生存を支持する培地；および
(3)培養上清中の可溶性のインスリン受容体αサブユニット測定試薬。
【００３６】
本発明に基づいて選択された血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を有する化合物を投与することにより、当該疾患を治療することができる。すなわち本発明は、本発明のスクリーニングによって選択された化合物を投与する工程を含む、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療方法に関する。本発明の治療方法は、高いグルコース濃度によって誘導されるインスリン受容体のαサブユニットの細胞からの放出を抑制する工程を含む、糖尿病の治療方法を含む。
【００３７】
あるいは本発明は、本発明のスクリーニングによって選択された化合物を有効成分として含有する、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療剤を提供する。更に本発明は、本発明のスクリーニングによって選択された化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療における使用に関する。加えて本発明は、本発明のスクリーニングによって選択された化合物の、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患を治療するための医薬組成物の製造における使用に関する。あるいは本発明は、本発明のスクリーニングによって選択された化合物を、薬学的に許容される単体と配合する工程を含む、血中可溶性インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の治療剤の製造方法に関する。
【００３８】
本発明のスクリーニングによって選択された化合物、糖尿病などの治療剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることができる。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、物質の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］インスリン受容体サンドイッチELISA系
ELISAマイクロタイタープレート（#473768、Nunc）を、0.1 M炭酸緩衝液（pH9.6）で3μg/ml濃度に希釈した50μlの捕獲抗体で、4℃で16時間コーティングした。
抗ヒトIRαサブユニット特異的抗体；クローン5D9（Morgan, D. O., Ho, L., Korn, L. J. & Roth, R. A. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 328-32 (1986).）
抗IRβサブユニット抗体；OncogeneのAb-4#GR36（Wu, A., Sciacca, L. & Baserga, R. J Cell Physiol 195, 453-60 (2003).））
次に、1% BSA（ウシ血清アルブミン）、0.1% NaN3、および5%ショ糖を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)でプレートを4℃で16時間ブロッキングし、その後乾燥させた。ヒト血清中のIRを測定するには、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.1% NaN3、150 mM NaCl、1% BSA、5%正常マウス血清（Sigma）、および0.1% Tween20を含む試料希釈緩衝液で血清を希釈し、希釈した試料50μlをELISAプレートの各ウェルに添加し、20℃で1時間インキュベートした。PBS-T（0.005% Tween20を含むPBS）でプレートを3回すすいだ後、50μl（200 pg/ml）のビオチン化レポーター抗体（抗IRα抗体、Lab Visioinの#87-3）を各ウェルに添加し、20℃で1時間インキュベートした。PBS-Tで5回すすいだ後、各ウェルに50μl（20 mM Tris-Hcl(pH 7.5)、150 mM Nacl、1% BSA、および0.15%プロクリンで1/4000希釈）のストレプトアビジン-HRP（Amersham、#RPN4410）を添加し、20℃で0.5時間インキュベートした。プレートをPBS-Tで5回洗浄し、50μlのTMB（テトラメチルベンジジン）基質溶液（#TMBUS-100、Moss）を添加することにより反応を開始させ、20℃で0.5時間反応を進行させた。100μlの0.18 M H2SO4で反応を停止し、Model500マイクロプレートリーダー（BioRad）により450 nMで吸光度を測定した（参照は630 nM）。ELISA系の標準hIRαタンパク質は、以前に記載したようにCHO-hIR-SspIの培地から精製した（Kanezaki, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 309, 572-7 (2003).）。
【００４０】
本ELISAは非常に正確かつ特異的であり、インスリン（1000μU/mlまで）、ヘモグロビン（500 mg /mlまで）、ビリルビン（200 mg /mlまで）、ヒト免疫グロブリン（4 mg/mlまで）、またはリウマチ因子（IgM型、500 IU/mlまで）に影響を受けない、hIRαおよび全長hIRに対するELISA法を確立した（図１Ａ〜１Ｅ、およびデータは示さず）。測定結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。CHO-hIR細胞は培地中に明らかにhIRαを放出したが、全長hIRは放出しなかった。
【００４１】
実験に用いたCHO-hIRは、次の操作により調製した(WO2004/97414)。まずCHO細胞でインスリンレセプターを発現させるためのcDNAを構築した。ヒトインスリン受容体の全長cDNA(NM_000208)を含むpcDL1-HIR717(Ebina et al. Cell. 40, 747-758, 1985)を利用した。インスリンレセプターのcDNAを動物細胞発現ベクターpCXN2に挿入してhIR発現プラスミドを得た。それぞれの制限酵素はTakara(Otsu, Japan)及びNew England BioLabs(Beverly, MA)より購入した。
【００４２】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、F-12 Nutrient Mixture (Ham's F-12, Invitrogen, Carlsbad, CA) 培地を用いて5% CO2インキュベーターで培養した。10μgの発現プラスミドを制限酵素Sca Iにより直線化し、400 mg/L Geneticin (G418) (Sigma, St. Louis,Missouri)と共にエレクトロポレーションによりCHO細胞に導入した。トランスフェクションから24時間後より10mg/Lネオマイシン耐性F-12培地に交換し、2週間後に残ったコロニーを単離した。hIRの発現については、ポリアクリルアミド電気泳動および抗IRα抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
【００４３】
［実施例２］ウェスタンブロッティング法による、CHO-hIR細胞の培地中に存在する可溶性hIRαの構造の検討
次に、ウェスタンブロッティング法により、CHO-hIR細胞の培地中に存在する可溶性hIRαの構造について検討した。図２Ｃの上のパネルに示すように、可溶性hIRαはCHO-hIR細胞の培地中に検出されたが（レーン2）、親のCHO細胞の培地中には検出されなかった（レーン1）。このバンドは、CHO-hIR溶解液から135 kDA hIRαと共に移動した（レーン4）。図２Ｃの下のパネルに示すように、hIRβはCHO-hIR細胞の培地中に検出されなかった（レーン2）。これらの結果は、hIR全長ELISAの結果と一致した（図２Ｂ）。しかし、hIRβの細胞外ドメイン（195アミノ酸）がCHO-hIR細胞の培地中に存在する可能性は否定できていない。
【００４４】
［実施例３］ヒト血清試料からのIRαの検出
本発明者らは次に、コムギ胚芽凝集素(WGA)結合アフィニティークロマトグラフィー（Amasham）および抗IRα特異的抗体(5D9)を用いた免疫沈降により部分精製した後、IRα特異的抗体(N-20)で免疫ブロッティングすることにより、ヒト血清試料からIRαを検出することを試みた。図３に示すように、部分精製後、hIRαに相当するバンドが抗αサブユニット特異的抗体を用いた免疫ブロッティングにより認められ、ブロットでのシグナル強度のピークはαサブユニットELISAにおける吸光度のピークと一致した。さらに、hIRαは、非特異的IgGを用いた対照免疫沈降では検出されなかった（図４Ａ）。ヒト血清試料中のIRが元のヘテロ二量体として存在するかどうかを判定するため、同じフィルターを抗IRβ抗体を用いた免疫ブロッティングにも供した。このアッセイでβサブユニットは検出されず（図４Ｂ）、このことからヒト血清中のhIRαは細胞表面からの脱落過程に由来し、損傷した組織から放出されたのではないらしいことが示唆される。現時点では、ヒト血清中のhIRαの構造および特徴については試験していない。しかし、培養細胞を用いた本発明者らの以前の結果に基づき、血清IRαは二量体であり、インスリンに結合すると考えられる（Kanezaki, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 309, 572-7 (2003).）。
【００４５】
［実施例４］糖尿病患者の試料中のhIRα濃度の測定
ヒト血清中にhIRαが存在する臨床的意義を調べるため、糖尿病(DM)患者の試料中のhIRα濃度を測定した。まず、正常個体のhIRα濃度の一日の変動を試験した。図１Ｆに示すように、食後の状態であっても濃度は変化しなかった。次に、DM患者（1型および2型糖尿病の両方）、およびWHOの基準に従った経口ブドウ糖負荷試験により正常血糖であることが確認された正常血糖の対照被験者（徳島地域の対照-1）の血清試料を測定した（Alberti, K. G. & Zimmet, P. Z. Diabet Med 15, 539-53 (1998).）。経口ブドウ糖負荷試験は、世界保健機構の糖尿病のガイドラインに従い、糖尿病の既往歴がなく、かつ3親等内の血縁者に糖尿病家族歴がない健常日本人ボランティアに対して、75 gの経口投与により行った。
【００４６】
図５Ａに示すように、2型糖尿病患者は、対照被験者と比較して有意に高い血清hIRα濃度を示した［56.5±19.9 ng/ml（2型DM-1、n=474）対 39.8±10.0 ng/ml（対照-1、n=123）、p＜0.001］。モル濃度に基づくと、DM患者のhIRα濃度は、空腹時血漿インスリン濃度の約3.5倍に相当する。一方、全長IRはいずれの群の血清試料中にも検出されなかった（データは示さず）。興味深いことに、血清hIRα濃度は1型DM患者でも上昇していた［50.1±15.6 ng/ml（n=53）、p＜0.001 対 対照-1］。糖尿病患者のすべての群の30%を超える患者が、カットオフ値（59.8 ng/ml；対照-1の平均値+2S.D.）よりも高いhIRα濃度を示した。異なる地域の人々の間にhIRα濃度の相違はなかった。
【００４７】
［実施例５］hIRα濃度とDM患者の臨床的パラメータとの相関関係の解析
次に、hIRα濃度とDM患者の臨床的パラメータとの相関関係を解析した（表1）。hIRα濃度と空腹時血糖値およびHbA1c濃度を含む血糖値との、有意な正の相関関係があった（表1ならびに図６Ａおよび図６Ｂ）。
［表１］
2006345722.tif 000002
データは平均値±SDとして表す。各因子と血清hIRα濃度との相関係数は、年齢および性別以外はピアソンの相関係数検定により決定した。年齢および性別に関しては、それぞれ順位検定によるスピアマンの相関係数およびスチューデントのt検定を用いた。HOMA-IR（インスリン抵抗性の恒常性モデル評価スコア）およびHOMA-β（β細胞機能のHOMA）は、空腹時血漿グルコース(FPG)およびインスリン（IRI；免疫反応性インスリン）濃度から算出した。BMI；肥満度指数、U-CPR；尿中C-ペプチド免疫反応性、IRI；免疫反応性インスリン。施設（滋賀医科大学付属病院の中央臨床検査室）の検査値の参照値（正常範囲）を示す。
【００４８】
一方、hIRα濃度は、空腹時IRI（免疫反応性インスリン）濃度、尿中CPR（C-ペプチド免疫反応性）排除（24時間総量）、またはHOMA-β（β細胞機能を評価するための恒常性モデル）を含むインスリン分泌のマーカーとは相関していなかった。これらの結果から、血漿中へのhIRαの放出は血糖値によって制御され、分泌されたインスリンによって制御されないことが示唆される。hIRα濃度はまた、2型DM-1の年齢と非常に弱い相関関係を示したが（図６Ｃ）、対照-1、対照-2、および2型DM-2の年齢とは相関関係を示さなかった。
【００４９】
表1に示すように、性別、血圧、肥満度指数(BMI)、%脂肪、ウエスト/ヒップ比、血清乳酸濃度、または血清脂質濃度（総コレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロール、および遊離脂肪酸）を含む標準的な臨床的パラメータとの他の相関関係はなかった。さらに、患者が受けている治療の種類の間に、αサブユニット濃度の有意な相違はなかった。hIRα濃度と血糖値との関連性をさらに確認するため、HbA1c濃度がこの3年間（2000年3月〜2003年3月）に大きく変化した（＞1.8%）18人の患者について検査した。図５Ｂに示すように、血清hIRα濃度の変化とHbA1c濃度の変化には強い正の相関関係があり、これにより血清hIRα濃度が比較的長期の血糖調節状態によっても決定され得ることが示唆される。
【００５０】
さらに、一人の患者の臨床経過を追跡した。軽度の糖尿病性ケトアシドーシスのため（1型DMの発症）、15歳の日本人女性患者が病院（徳島大学病院）に運ばれた。入院時、FPG、HbA1c、およびhIRα濃度はそれぞれ392 mg/dl、13.4%、および88.5 ng/mlであった。強化インスリン療法（41単位/日）を行ってから7日後、患者の血糖値はほぼ正常になり、hIRα濃度は57 ng/mlまで減少した。糖尿病を発症してから4年後、患者の血糖調節はインスリン36単位で維持され、HbA1cおよびhIRα濃度はそれぞれ6.0%および32.0 ng/mlであった。本発明者らはまた、1型DMの他の7症例を発症から追跡し、hIRα濃度の同様の変化を認めた（Yokotaら、未発表データ）。これらの臨床データをすべて総合すると、hIRα濃度は血糖値の変化に対応しており、このことから血清hIRα濃度と血糖調節との間に関連性があることが示唆される。
【００５１】
［実施例６］CHO細胞株の培地中に分泌されたhIRαのELISAアッセイ
したがって、本発明者らは、可溶性hIRαがヒト血清中に存在し、その血清濃度が血糖値と相関していることを見出した。hIRαが高グルコース状態で放出される機構を調べるため、再度細胞培養系を用いた。高グルコース状態がCHO-hIR細胞からの可溶性hIRαの放出を促進し得るかどうかを試験した。
【００５２】
実験は以下の条件で行った。CHO細胞、CHO-hIR細胞を、10%ウシ胎仔血清（FCS、Invitrogen）を添加したHAM F12栄養混合液で、5% CO2大気中37℃で維持した。細胞を6ウェルマルチプレート（Corning）にプレーティングした後、細胞をOPTI-MEM（Invitrogen）で1回洗浄し、1 ml/ウェルのOPTI-MEMと共に24時間インキュベートした。その後培地を回収し、1,300 xgで10分間遠心分離して剥離した細胞を除去し、上清をELISA系に供した。培地の遠心分離を100,000 xg、60分間で試験したが、データは本質的に変わらなかった。
【００５３】
図７Ａに示すように、高グルコースは用量依存的様式で、CHO-hIR細胞から培地中へのhIRαの放出を促進した。また、血清αサブユニット濃度とインスリン分泌のパラメータとの間に有意な相関関係がないことを示すデータと一致して、培養細胞からのhIRαの放出に及ぼすインスリンの有意な影響は認められなかった（図７Ａ）。高マンニトールもまた、おそらくは浸透圧効果によりhIRαの放出に対してわずかな促進効果を有したが、その効果はグルコースの効果よりも低かった（データは示さず）。培地中のhIRαの絶対濃度は実験ごとに変動するが、グルコースがhIRα濃度を促進する能力はすべての実験で常に認められた（図７Ａおよび図７Ｂを参照のこと）。したがって、高グルコースが培養細胞からのhIRαの放出を増強する能力は、血糖値が上昇した患者で認められる血清可溶性hIRα濃度の増加と一致した。
【００５４】
［実施例７］がん患者血清中のインスリン受容体αサブユニットの測定
次いで、ベンダーより購入した各種がん患者血清を検体として、インスリン受容体αサブユニットの濃度を測定した。測定した患者検体は、肺癌、食道癌、すい臓癌、結腸癌、乳癌、肝臓癌、直腸癌各10検体である。測定の結果を表２及び図８に示す。インスリン受容体αサブユニットの濃度は、いずれの癌においても健常人と比較して有意に高い値を示した。このことから、血中におけるインスリン受容体αサブユニットの測定は、癌の診断に有用であるといえる。
［表２］
---------------------------------
13ng/mL以上    陽性率（％）
=================================
肺癌       20/20         100
食道癌     10/10         100
すい臓癌    9/10          90
結腸癌     19/20          95
乳癌        9/10          90
肝臓癌      6/10          60
直腸癌     10/10         100
皮膚癌      8/10          80
健常者      0/70           0
----------------------------------
【００５５】
多くの膜タンパク質は、「切断(shedding)」として知られる過程である、タンパク質分解性の放出を起こしやすい可溶性細胞外ドメインを有する（Moss, M. L. & Lambert, M. H. Essays Biochem 38, 141-53 (2002).）。ほとんどの場合、切断は、ADAM（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン）ファミリーの膜結合型亜鉛メタロプロテアーゼ（特に、ADAM10およびADAM17/TACE）による茎部（膜貫通部分と球状の細胞外ドメインとの間）におけるタンパク質分解切断によって起こる。したがって本発明者らは、広域MMP阻害剤、GM6001（Calbiochem）がhIRの放出に影響を及ぼすかどうかを検討することにより、メタロプロテアーゼ(MMP)が関与しているかどうかを試験した。
【００５６】
図７Ｂに示すように、高グルコースによって促進されるhIRαのCHO-hIR細胞からの放出は、GM6001で予め処理することにより著しく減少するのに対して（Schultz, G. S. et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 33, 3325-31 (1992).）、GM6001の不活性類似体（GM-NC、Calbiochem #364210）では放出はさらに増大し、このことからこの過程におけるMMPの関与が示唆される。ほとんどのMMPは、プロテインキナーゼC(PKC)を含む様々なプロテインキナーゼによってリン酸化されることが示されているC末端細胞質尾部を有する。このリン酸化により、続いてプロテアーゼ活性が活性化される（Roghani, M. et al. J Biol Chem 274, 3531-40 (1999).、Izumi, Y. et al. Embo J 17, 7260-72 (1998).）。
【００５７】
やはりIRを発現する（King, G. L. & Johnson, S. M. Science 227, 1583-6 (1985).）内皮細胞を含む（Inoguchi, T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 11059-63 (1992).）高グルコース状態での、ジアシルグリセロールの新規合成によるPKCの活性化はよく知られている（Kikkawa, R., Koya, D. & Haneda, M. Am J Kidney Dis 41, S19-21 (2003).Ishii, H., Koya, D. & King, G. L. J Mol Med 76, 21-31 (1998).）。
【００５８】
これらのすべてのデータから、高グルコースがPKC活性化を促進し、次にこのPKCがMMPを活性化してhIRαの血漿中への放出を引き起こし、hIRαがインスリンを補足し、よってグルコース濃度がさらに上昇するというグルコース毒性の悪循環が示唆される。仮説の後半は、精製hIRαをマウスに注射することによってインビボで血糖値が上昇したことを示す本発明者らの以前の研究によって支持される（Kanezaki, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 309, 572-7 (2003).）。可溶性hIRαがヒト血清中に存在し、血糖値の高い患者ではこの血清濃度が上昇していることが示されたことから、hIRαの増加がグルコース毒性の要因の1つとして血糖調節の悪化に関与している可能性があることを提唱する。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、糖尿病に対する治療効果の検出方法、ならびにこの方法に基づく治療薬のスクリーニング方法が提供された。日本では糖尿病患者の９５%が２型糖尿病であると言われている。２型糖尿病患者は、生体のインスリンに対する応答性が低下しているため、インスリンを投与しても血糖値をコントロールすることができない。２型糖尿病は幾つかの遺伝子異常と、肥満、ストレス、加齢などの環境因子が加わって発症すると考えられている。現在、日本にも約７４０万人の２型糖尿病患者がいると言われており、その数は高齢化にともなって増加している。糖尿病予備軍も含めると１６２０万人もの患者がいるという予測もある。したがって、２型糖尿病の診断や治療は、現代社会の重要な研究課題である。
【００６０】
本発明は、糖尿病の病因の一つに、高血糖に伴って血中に放出されるインスリン受容体αサブユニットが、インスリンの作用を阻害している可能性を示した。更に、インスリン受容体αサブユニットの放出が、あるしゅのプロテアーゼ阻害剤によって抑制されることを明らかにした。このことは、インスリン受容体αサブユニットの放出が、正常なインスリン受容体の切断によってもたらされていることを裏付けている。そして、その放出の抑制を通じてインスリンによる血糖調節機構を助けることが、糖尿病の治療戦略として有効であることが証明された。このように、本発明は、糖尿病治療に対する新しいアプローチを実現した。
【００６１】
糖尿病患者と同様に、がん患者においても、血中のインスリン受容体αサブユニットの上昇が確認された。がんにおいても糖尿病と同様に、インスリン受容体の切断による血中へのαサブユニットの放出が起きていると考えられた。したがって、その放出を抑制することが、がんの治療戦略として有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】（Ａ）図１（Ａ）は、IR ELISA系の図式モデルである。hIRα特異的ELISAに関しては、どちらもhIRα上の異なるエピトープを認識しインスリンがそれらの結合を妨げないことから、捕捉用にモノクローナル抗hIRα抗体5D9(Morgan, D. O., Ho, L., Korn, L. J. & Roth, R. A. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 328-32 (1986))を、レポーターとして83-7を用いた(Wu, A., Sciacca, L. & Baserga, R.  J Cell Physiol 195, 453-60 (2003).)。全長hIR ELISAに関しては、捕捉用に抗hIRβ抗体(Wu, A., Sciacca, L. & Baserga, R.  J Cell Physiol 195, 453-60 (2003).)を、レポーターとしてビオチン化抗IRα抗体(83-7)を用いた。（Ｂ）図１（Ｂ）は、ELISA系に用いた標準タンパク質（IRαサブユニット）の銀染色像である。複数段階の精製後(Kanezaki, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 309, 572-7 (2003).)、タンパク質をSDS-PAGEに供し、標準的な銀染色手順に従ってゲルを銀染色した。（Ｃ）図１（Ｃ）は、αサブユニット特異的ELISA系の希釈直線性試験結果を示すグラフである。5つのヒト血清試料を、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.1% NaN3、150 mM NaCl、1% BSA、5%正常マウス血清（Sigma）、および0.1% Tween20を含む試料希釈緩衝液で段階希釈した後（1/1〜1/32）、αサブユニット特異的ELISA系に供した。（Ｄ）図１（Ｄ）は、 αサブユニッ特異的ELISA系の回収試験結果を示すグラフである。4つの血清試料を既知量（0、22.5、45、90、180 ng/ml濃度）の標準タンパク質に添加し、hIRα特異的ELISA系によりその回収を測定した。データは%回収によって表す（論理的添加量を100%と定義した、平均値±SD）。（Ｅ）図１（Ｅ）は、αサブユニット特異的ELISA系の再現性試験結果を示す表である。8つのヒト血清試料を8つ組みでhIRα特異的ELISA系に供した。変動係数を表す。（Ｆ）図１（Ｆ）は、 血清αサブユニット濃度の日変化を示すグラフである。午前8時（空腹時）、午後2時（食後2時間）、および午後6時（食前）に4人の被験者から採血を行い、得られた血清をELISA系に供した。データは、午前8時の濃度に対する%変化（平均値±SD）によって表した。
【図２】図２は、CHO-hIR細胞の培地における、hIR全体ではなくhIRαサブユニットの検出結果を示す図である。(A)、(B) 6ウェル培養ディッシュ中のコンフルエントなCHO細胞、CHO-hIR細胞をOPTI-MEMと共にさらに24時間インキュベートし、培地を回収して遠心分離し（1,300 xg、10分）、得られた上清をαサブユニット特異的またはhIR全長ELISA系に供した。細胞なしでインキュベートした値を減じたデータを、3回の実験の平均値±SEとして表す。***；ボンフェローニ-ダンカンの多重比較検定によるP＜0.001。(C) P150ディッシュのプレート中のコンフルエントなCHO細胞、CHO-hIR細胞をOPTI-MEMと共にさらに24時間インキュベートし、培地(15 ml)を回収して遠心分離し（1,300 xg、10分）、得られた上清を、15μgの抗（ヒト特異的）IRα抗体(5D9)（レーン1、2）(Morgan, D. O., Ho, L., Korn, L. J. & Roth, R. A. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 328-32 (1986))または抗IRβ抗体(29B4)（レーン3）(Morgan, D. O., Ho, L., Korn, L. J. & Roth, R. A. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 328-32 (1986))を用いた免疫沈降、ならびに抗IRα抗体（上のパネル、N-20、Santa Cruz）および抗IRβ抗体（下のパネル、C-19、Santa Cruz）を用いたウェスタンブロッティングに供した。
【図３】図３は、 ヒト血清における可溶性IRαサブユニットの検出結果を示す図である。患者から採取した10 mlのヒト血清（hIRα：-120 ng/ml）を、緩衝液PS［0.5 M NaClを含む20 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）］で50 mlに希釈し、WGAカラム（総容積2 ml）に供した。カラムを緩衝液PSで洗浄し、0.3 M N-アセチルグルコサミンを含む緩衝液PSで溶出した。画分の一定分割量（1 mlのうちの300μl）を、5D9を用いた免疫沈降および抗IRαサブユニット抗体（N-20、Santa Cruz）を用いたウェスタンブロッティングに供した。各画分の450 nMにおける吸光度(A450)を、hIRαELISAと同様にプロットする。
【図４】図４は、S2 ヒト血清における、βサブユニット(B)でなく可溶性IRαサブユニット(A)の検出結果を示す写真である。(A) ヒト血清10 mlをWGAカラムを用いた分画に供し（各1 ml）、画分の一定分割量（300μl）（レーン3、4、7、8）またはCHO-hIR細胞溶解液（レーン1、2、5、6）を、抗IRα特異的抗体(H-78、Santa Cruz、レーン1、3、5、6)または正常ウサギIgG（レーン2、4、6、8）を用いて免疫沈降し、抗IRαサブユニット抗体（N-20、Santa Cruz）を用いてウェスタンブロッティングした。(B) 同じフィルターを抗IR bサブユニット抗体（N-19、Santa Cruz）で再プロービングした。データは、再現性のあった3回の実験の代表的なものである。
【図５】図５は、 糖尿病患者のIRαサブユニット濃度を示す図である。（Ａ）糖尿病患者と正常血糖対照被験者との血清hIRα濃度の比較。［2型DM-1；滋賀医科大学付属病院のDMを有する外来患者（N=474）、2型DM-2；徳島大学病院の2型DMを有する外来患者（N=162）、1型DM；徳島大学病院の外来患者（N=53）、対照-1；OGTTにより正常血糖であることが確認された、徳島大学の健常非糖尿病ボランティア（N=123）、対照-2；正常FPGおよびHbA1c濃度が調査済みの株式会社医学生物研究所の健常非糖尿病ボランティア（N=120）］。データは平均値±SDとして表す。カットオフ値（59.8 ng/ml）は、対照-1の平均値+2SDにより決定した。***；スチューデントのt検定によるP＜0.001。（Ｂ）選択した（ΔHbAc1＞1.8）2型DM-1患者（N=18）での、36ヶ月間（2000年3月〜2004年3月）における血清hIRα濃度の変化とHbA1c濃度の変化との相関関係を示す散布図。相関係数は、ピアソンの相関係数検定によって決定した。
【図６】図６は、S3 2型DM-1における、血清hIRα濃度と空腹時血漿グルコース(A)、HbA1c(B)、および年齢(C)との相関関係を示す散布図である。FOGおよびHbA1cに関しては、相関係数はピアソンの相関係数検定によって決定した。年齢に関しては、相関係数は順位検定によるスピアマンの相関係数によって決定した。
【図７】図７は、 インスリンではなく高グルコースにより、メタロプロテイナーゼに依存した様式でαサブユニットのCHO-hIR細胞からの放出が増大した結果を示す図である。(A) 6ウェル培養ディッシュ中のコンフルエントなCHO-hIR細胞を、示した濃度のグルコースおよびインスリン(100 nM)を添加したOPTI-MEMと共にさらに24時間インキュベートし、培養液を回収して遠心分離し（1,300 xg、10分）、得られた上清をαサブユニット特異的ELISA系に供した。細胞なしでインキュベートした値を減じたデータを、3回の実験の平均値±SEとして表す。***；ボンフェローニ-ダンカンの多重比較検定により基礎レベル（5.5 mMグルコース/インスリンなし）と比較したP＜0.001。(B) 培養細胞からのαサブユニットの放出に対するMMP阻害剤（GM6001、およびその非活性の陰性対照；GM-NC）の影響。6ウェル培養ディッシュ中のコンフルエントなCHO-hIR細胞を、DMSOに溶解したGM6001（またはGM-NC）溶液を示した濃度で添加したOPTI-MEM（最終DMSO濃度は0.1%であった）と共にさらに24時間インキュベートし、培地を回収して遠心分離し（1,300 xg、10分）、得られた上清をαサブユニット特異的ELISA系に供した。データを3回の実験の平均値±SEとして表す。**；ボンフェローニ-ダンカンの多重比較検定によるP＜0.01、***；同検定によるP＜0.001。
【図８】図８は、各種がん患者および健常者血清中のインスリン受容体αサブユニット濃度の分布を示す図である。図中、縦軸は血清中のインスリン受容体αサブユニット濃度測定値(ng/mL)を、横軸は疾患（がん）の種類を示す。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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