(57)【要約】【課題】  味噌等の発酵食品の製造において、抗変異原性等を示す生理活性物質として知られる遊離脂肪酸や脂肪酸エチルエステルの含有量が高いものを製造するのに適した麹菌アスペルギルス・オリゼを選抜し、該麹菌を用いた発酵食品の製造法を提供すること。【解決手段】  常法により製造した米麹の酵素力価がリパーゼ１５．０μ／ｇ以上であり、セルラーゼ０．７５μ／ｇ以上であるアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０      ）並びに発酵食品を製造するにあたり、種麹として該麹菌を用いることを特徴とする発酵食品の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
常法により製造した米麹の酵素力価がリパーゼ１５．０μ／ｇ以上であり、セルラーゼ０．７５μ／ｇ以上であるアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）。
【請求項２】
発酵食品を製造するにあたり、種麹として請求項１に記載のアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）を用いることを特徴とする発酵食品の製造方法。
【請求項３】
米、大豆、大麦及び小麦のうちの少なくとも１種を原料とし、請求項１に記載のアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）を種麹として用いて麹を製造し、さらに蒸煮大豆、食塩等を合わせ、必要により酵母菌、乳酸菌、エタノール等の添加を行い、熟成することを特徴とする遊離脂肪酸含量と脂肪酸エチルエステルの合計量が１．８％以上であり、抗変異原性が８７％以上である味噌、醤油等の発酵食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米麹の酵素力価が高いアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株並びに該麹菌を種麹として用いて遊離脂肪酸及び脂肪酸エチルエステルを高濃度で含む味噌等の発酵食品の製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
味噌の遊離脂肪酸、脂肪酸エチルエステルは、抗変異原活性を有する物質として知られている（非特許文献１及び２参照）。遊離脂肪酸は、エタノールと結合し脂肪酸エチルエステルとなる。また、脂肪酸エチルエステルは、味噌の香味に有益な成分として報告されている（非特許文献３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】岡崎秀，秋葉美智子，木村修一；味噌脂質中の抗変異原性物質の検索について、昭和５９年度日本農芸化学会大会講演要旨集、p636，(1984).
【非特許文献２】山本和子，大崎好子，加藤哲夫，西島基弘，宮崎利夫；味噌に含有される生理活性物質の検索（その４）抗変異原性物質について、味噌の科学と技術、42，65-70(1994).
【非特許文献３】安平仁美，糸賀啓治，望月務；味噌熟成への酵母の利用（第９報）味噌の香りに関する研究(６)、信州味噌研究所報告、14,33-34(1973).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
味噌製造時に用いる麹菌アスペルギルス・オリゼは、遊離脂肪酸、脂肪酸エチルエステルなどの物質を生産する酵素であるリパーゼの力価が一般に微弱である（大西邦男；味噌の熟成と脂質変化、日本醸造協会誌、78,848-853(1983)参照）。
そのため、遊離脂肪酸等の生産量が多い味噌などの発酵食品を製造するためには、該酵素力価の高い麹菌を使用する必要がある。しかし、該酵素力価の高いアスペルギルス・オリゼの選抜を行ったという報告は未だない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、食品産業用の麹菌株の中からリパーゼ及びセルラーゼの力価が高いアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株及びアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株を選抜することに成功した。さらに、これら麹菌を種麹として用いて味噌、醤油などの発酵食品を製造する方法を開発した。
【０００６】
請求項１に記載の本発明は、常法により製造した米麹の酵素力価がリパーゼ１５．０μ／ｇ以上であり、セルラーゼ０．７５μ／ｇ以上であるアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）である。
請求項２に記載の本発明は、発酵食品を製造するにあたり、種麹として請求項１に記載のアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）を用いることを特徴とする発酵食品の製造方法である。
請求項３に記載の本発明は、米、大豆、大麦及び小麦のうちの少なくとも１種を原料とし、請求項１に記載のアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）を種麹として用いて麹を製造し、さらに蒸煮大豆、食塩等を合わせ、必要により酵母菌、乳酸菌、エタノール等の添加を行い、熟成することを特徴とする遊離脂肪酸含量と脂肪酸エチルエステルの合計値が１．８％以上であり、抗変異原性が８７％以上である味噌、醤油等の発酵食品の製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、リパーゼ及びセルラーゼの力価が高いアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株及びアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株が提供される。これらの麹菌を種麹として用いて味噌などの発酵食品を製造することにより、従来よりも高濃度の遊離脂肪酸を含む発酵食品の生産に役立てることができる。また、遊離脂肪酸は、味噌などに存在するエタノールと結合して脂肪酸エチルエステルとなる。また、これらの麹菌と酵母を併用することにより従来よりも高濃度の脂肪酸エチルエステルを含む味噌などの生産に役立てることができる。そのため、本発明の方法によれば、抗変異原活性の高い発酵食品を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るリパーゼ及びセルラーゼの力価が高いアスペルギルス・オリゼは、株式会社秋田今野商店において保存されている食品産業用麹菌株を用いて、常法により米麹を製造し、得られた米麹の酵素力価を測定してリパーゼ及びセルラーゼの力価が高い麹菌を選抜することにより獲得することができる。ここで、常法による米麹の製造法とは、例えば冷却した蒸し米に種麹を接種し、麹蓋あるいは製麹装置を用い、品温を３０℃から４０℃に保つように、保温し、手入れなどの操作を行い、４０〜４８時間程度の時間をかけて製造する方法を意味する。
本発明者は、この方法で米麹の酵素力価がリパーゼ１５．０μ／ｇ以上であり、セルラーゼ０．７５μ／ｇ以上であるアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株及び同AOK１３９株を選抜した。これらの麹菌は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０、アスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２である。
【０００９】
また、これらの麹菌を使用して製造した味噌の遊離脂肪酸量は、酵母を用いない条件で通常の製法（例えば脂質２０％程度の大豆を用い、大豆と米の重量割合が等量、食塩分１１〜１２％、水分４２〜４８％の条件で、大豆、米麹、塩、種水を混合、らい砕などの処理をして仕込んだ味噌を室温下または加温下で２〜１２ヶ月程度、熟成する製造方法）の場合、1.３％以上である。なお、酵母等の添加により脂肪酸エチルエステルや遊離脂肪酸の量を増加させることが可能で、酵母を十分に発酵させた味噌等では両者の合計量が１．８％以上となる。
上記したように、味噌の遊離脂肪酸、脂肪酸エチルエステルは、抗変異原活性を有する物質として知られているが、アスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５５０）又はアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５６２）を用いて製造した味噌を１０倍容の８０％（ｖ／ｖ）メタノールで抽出して得た抽出液８０μLを試料として、各試料に変異原としてTrp-P-2(=3-Amino-1-metyl-5H-pyrido(4,3-b)indole acetate) ２００nmol／mL溶液 １００μL、S9mix(S9/コファクターAセット、オリエンタル酵母社製をPhosphate buffered saline で４倍希釈）５００μL、Salmonella typhimurium TA(IFO 14193)の培養液（３７℃、一晩振盪）１００μLをそれぞれ加え、３７℃で２０分加温した後、軟寒天２mLを加え、測定用プレートに撒き、３７℃で２日間培養した後のアミノ酸非要求性の復帰変異株の数を測定（Ｓとする）し、一方サンプルの代わりに同量の溶媒を用い、これに変異原を加え、以下同様の操作を行った場合の変異株の数をＴ、変異原の代わりにジメチルスルホキシドを加え、以下同様の操作を行った場合の変異株の数をＢとして求め、これらを以下の式に代入して抗変異原性を求めたところ、８７％以上であった。
【００１０】
（数１）
抗変異原性（％）＝[（Ｔ−Ｓ）／（Ｔ−Ｂ）]×１００
【００１１】
次に、アスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株及び／又は同AOK１３９株を使用して味噌や醤油などの発酵食品を製造する方法については、基本的に通常の方法と同様に行えばよいが、味噌の製造を代表例として説明する。
常法による味噌の製造法とは、例えば冷却した蒸し米に、上記麹菌を種麹として接種し、麹蓋あるいは製麹装置を用い、品温を３０℃から４０℃に保つように保温し、手入れなどの操作を行い、４０時間から５０時間をかけて米麹を製造する。次に、製造した米麹に蒸煮大豆、塩、種水を混合し、らい砕を行った後、必要に応じて酵母、乳酸菌、エタノール等を添加し、熟成容器に仕込んで仕込み味噌とする。仕込み味噌を室温下または加温下で２〜１２ヶ月程度、熟成させ、風味を整えて製品味噌を製造する方法である。酵母等の添加により脂肪酸エチルエステルや遊離脂肪酸の量を増加させることができる。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりその技術範囲が限定されるものではない。
【００１３】
〔実施例１〕
株式会社秋田今野商店所有の食品産業用アスペルギルス・オリゼの麹菌２１菌株から次のような選抜試験を行った。麹菌を１．５kgの蒸し米にそれぞれ接種し、恒温恒湿器の温湿度のプログラム管理下、木製の麹蓋中で単一の麹菌からなる米麹の製造を行った。温湿度の条件は、開始後２４時間まで温度３６℃、相対湿度８０％；２４時間から４８時間まで温度３２℃、相対湿度８０％で行った。
製造した米麹の酵素力価（表１）を調べた結果、AOK１３８株およびAOK１３９株を用いた米麹のリパーゼ、セルラーゼがともに他の米麹よりも高い値を示した。なお、酵素力価の測定は以下の方法で行った。
【００１４】
リパーゼは、大日本製薬株式会社製のリパーゼキットＳを用いて測定した。すなわち、米麹５ｇにＭ／１０リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍLを加え、氷冷下、ホモジナイズ３分後、アドバンテック社製Ｎｏ．２のろ紙により濾過し、酵素液を作成した。キットの発色液１ｍL、エステラーゼ阻害剤２０μLに酵素液１ｍLを加え、３０℃で５分間保持後、キットの基質１００μLを加え、遮光下３０℃で６０分間リパーゼの酵素反応を行い、反応停止液２ｍLを加え混和し、４１２ｎｍの測色を行った（サンプル値）。ブランクは、キットの発色液１ｍLエステラーゼ阻害剤２０μLに酵素液１ｍLを加え、３０℃で５分間保持、エステラーゼ阻害を行った後、遮光下３０℃にて６０分間保持し、反応停止液２ｍLを加え混和し、さらにキットの基質１００μLを加え混和し、４１２ｎｍの測色を行った（ブランク値）。リパーゼ酵素活性は、１５０×（サンプル値−ブランク値）により計算した。
セルラーゼは、醤油試験法に準じて以下のように測定した。すなわち、米麹５ｇに水５０ｍLを加え、振とう機で２０℃にて１分間あたり１２０回転の振とうを行い、アドバンテック社製Ｎｏ．２のろ紙によりろ過した。ろ過液２０ｍLを透析膜に入れ、流水中で一晩透析し、透析内液、洗液を合わせて、３０ｍLとして酵素液を作成した。０．５％カルボキシメチルセルロース１ｍLを３０℃で５分間保持した後、酵素液１ｍLを加え、３０℃で６０分間反応させた。反応液１ｍLに含まれる還元糖量をグルコース相当量として測定した（サンプル値）。ブランクは、反応前１ｍLの０．５％カルボキシメチルセルロースと酵素液の等量混合液の還元糖量を同様に測定した（ブランク値）。セルラーゼ活性は、（サンプル値−ブランク値）／４により計算した。
【００１５】
【表１】
2006345712.tif 000002
【００１６】
製造した各米麹と大豆（原料米と大豆の重量割合は等量）を用いて、食塩１１．５％、水分４５％、各味噌の重量が４kgになるように酵母無添加の味噌仕込みを行った。味噌の熟成は３０℃で行い、１ヶ月目に切り返し（仕込み味噌を上下入れ替える作業）を行い、２ヶ月経過時で熟成を終了した。対照として株式会社秋田今野商店より市販されている種麹「味噌用」（商品名）を用いた味噌を同時に製造した。
製造した味噌の脂質を基準味噌分析法により抽出し、ガスクロマトグラフにより脂肪酸エチルエステル及び遊離脂肪酸を分析した。その結果、用いる麹菌により味噌の遊離脂肪酸量に大きな差があり（表２）、AOK１３８株またはAOK１３９株を用いた味噌の遊離脂肪酸量は最も多かった。すなわち、AOK１３８株又はAOK１３９株を使用した味噌の遊離脂肪酸量は味噌１００g中で１．６３、１．５１gであり、対照の種麹（商品名：「味噌用」）を使用した味噌１００g中の０．４６gよりも明らかに多い結果となった。
これらの結果から、味噌の遊離脂肪酸を生産することにおいて最も優れた成績を示したAOK１３８株及びAOK１３９株を選抜した。
【００１７】
【表２】
2006345712.tif 000003
【００１８】
〔実施例２〕
実施例１において製造した味噌５ｇに８０％(v/v)メタノール５０mLを加え、ホモジナイザー（日本精機製作所BLA-５０１）を用い３分間磨砕した後、３０００rpm、１０分間の遠心分離を行い、その上清をサンプルとして抗変異原性試験に供した。抗変異原性試験はAmes試験のプレインキュベーション法により以下の条件で行った。各サンプル８０μLに変異原としてTrp-P-２(=３-Amino-1-methyl-５H-pyrido(４，３-b)indole acetate、和光純薬工業製)２００nmol/mLジメチルスルホキシド溶液１００μL、S９mix（S９/コファクターＡセット、オリエンタル酵母社製をPhosphate buffered salineで４倍希釈）５００μL、Salmonella typhimurium TA９８(IFO １４１９３)の培養液（３７℃で一晩振盪）１００μLをそれぞれ加え、３７℃で２０分加温した後、軟寒天２ｍLを加え、測定用プレートに撒き、３７℃で２日間培養後のアミノ酸非要求性の復帰変異株の数を測定（Ｓとする）した。
サンプルの代わりに同量の溶媒を用い、変異原を加え同様の操作を行った場合の変異株数をＴ、変異原の代わりに溶媒（ジメチルスルホキシド）を用いて同様の操作を行った場合の変異株数をＢとして、以下の式により抗変異原性を求めた。
【００１９】
（数２）
抗変異原性（％）＝[（Ｔ−Ｓ）／（Ｔ−Ｂ）]×１００
【００２０】
２連の試験を３回行った結果を表３に示した。
表３から明らかなように、AOK１３８株とAOK１３９株を用いて製造した味噌の抗変異原性は、他の味噌に比べ明らかに高い結果を示した。
【００２１】
【表３】
2006345712.tif 000004
【００２２】
〔実施例３〕
味噌の製造において、実施例１で選抜した２株の該麹菌AOK１３８株及びAOK１３９株と市販種麹との比較を行った。すなわち、酵母（チゴサッカロマイセス・ルキシーＡＭ−２）の添加を行う条件で、各米麹と大豆（原料米と大豆の重量割合は等量）を用いて、食塩１１．５％、水分４５％、重量が４kgになるように仕込みを行い、３０℃、２ヶ月間熟成させて味噌の製造試験を行った。比較した種麹は、市販種麹メーカー５社の８種類であり、種麹以外は同一条件で味噌を製造し、脂肪酸エチルエステル量および遊離脂肪酸量について比較を行った。結果を表４に示す。
【００２３】
【表４】
2006345712.tif 000005
【００２４】
表４から明らかなように、AOK１３８株又はAOK１３９株と酵母を併用した味噌は、脂肪酸エチルエステル及び遊離脂肪酸を他の味噌よりも高濃度に含むことが認められた。すなわち、該麹菌AOK１３８株又はAOK１３９株を酵母と併用することにより、味噌の遊離脂肪酸と脂肪酸エチルエステルを高濃度で生産させることが可能となった。
【００２５】
〔実施例４〕
実施例１で選抜したAOK１３９株を種麹として用いた味噌の試験製造を味噌製造企業において実施した。すなわち、各企業で通常行っている条件で該種麹を用いた味噌を製造し、同時期に製造した対照の味噌と比較した。
結果を表５に示す。表から明らかなように、試験製造を行ったすべての企業において遊離脂肪酸濃度の増加を認めた。また、酵母を併用した企業においては、脂肪酸エチルエステルの増加も認められた。
この結果から、AOK１３９株が味噌の遊離脂肪酸の増加に役立つこと、また該種麹を酵母と併用することにより、脂肪酸エチルエステルの増加に役立つことを、実際の味噌製造工場においても認めた。
さらに、一部の味噌について実施例２と同様に味噌の抗変異原性を測定した。その結果を表６に示したが、AOK１３９株を使用した味噌の抗変異原性は、従来の味噌に比べて高いことを認めた。
【００２６】
【表５】
2006345712.tif 000006
【００２７】
【表６】
2006345712.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、リパーゼ及びセルラーゼの力価が高いアスペルギルス・オリゼ  AOK１３８株及びアスペルギルス・オリゼ  AOK１３９株が提供される。これらの麹菌を種麹として用いて味噌などの発酵食品を製造することにより、従来よりも高濃度の遊離脂肪酸、脂肪酸エチルエステルを含み、高い抗変異原性を有する発酵食品を製造することができる。