(57)【要約】【課題】  臓器移植に好適に利用される異種移植用豚の細胞及びその選抜方法、並びに異種移植用豚を提供する。【解決手段】  本発明は、α-ガラクトース転移酵素を発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIを発現する豚細胞及びその選抜方法、並びに異種移植用豚である。本発明の異種移植用豚は、α-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でもその進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原も少ないので、異種移植に特有な急性期の拒絶反応を抑制する上で非常に有効である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-1,3-ガラクトース転移酵素（以下、GTという）を発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトN-アセチルグルコサミン転移酵素III（以下、GnT-IIIという）を発現している豚細胞。
【請求項２】
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現し、GT遺伝子のアレルの一方をノックアウト（以下、シングルGTKOという）した豚細胞と、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現し、GT遺伝子のアレルの両方をノックアウト（以下、ダブルGTKOという）した豚細胞とが混在する系に、
(a)ガラクトースα-1,3-ガラクトース（以下、α-Gal抗原という）と特異的に結合する物質を担体と結合させた物質；又は
(b)結合性を有する物質対の一方の物質にα-Gal抗原と特異的に結合する物質を結合した物質と、結合性を有する物質対の他方の物質に担体を結合させた物質；
を作用させることにより、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得ることを特徴とするヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞の選抜方法。
【請求項３】
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、抗ヒト補体制御因子抗体を作用させ、次いでα-Gal抗原に対する抗体（以下、抗α-Gal抗体という）及び補体を作用させて、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得ることを特徴とするヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞の選抜方法。
【請求項４】
GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞を有する異種移植用豚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は異種移植用豚の細胞及びその選抜方法、並びに異種移植用豚に関する。より詳細には、本発明はα-1,3-ガラクトース転移酵素（本明細書ではＧTという）を発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトN-アセチルグルコサミン転移酵素III（β-1,4-mannosyl-glycoprotein β-1,4-N-acetylglucoaminyltrasferase, EC 2.4.1.144。本明細書ではGnT-IIIという）を発現する豚細胞及びその選抜方法、並びに異種移植に特有な急性期の拒絶反応を生じない異種移植用豚に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器、組織、細胞などが機能不全をきたしている患者の治療において、臓器移植は極めて有用な療法であり、既に腎臓移植、肝臓移植、心臓移植などが行われている。臓器移植には同種移植と異種移植（レシピエント種と異なる種のドナー種の生きた臓器、組織又は細胞をレシピエント種に移植、埋込み、注入又は接触させること）があり、各々に長所と短所がある。同種移植は異種移植に比べて拒絶反応等の問題は少ないが、ヒトがレシピエントの場合にはドナーの数に限りがあるので、異種移植の研究開発が行われている。異種移植用ドナー動物としては、臓器サイズや形態がヒトのそれらに近く、繁殖・飼養等の技術も確立している豚が最も好ましいと考えられている。
豚の臓器（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚等）、組織（例えば、冠状動脈、脳硬膜、軟骨、角膜等）や細胞（例えば、膵臓ランゲルハンス島、脳黒質線条体細胞等）（以下、移植片という）をヒトに移植すると移植片は移植後短時日内で拒絶される。このような異種移植に特有な急性期の拒絶反応は超急性拒絶又は急性血管拒絶と呼ばれ、豚移植片に存在する異種抗原とヒト血清中の自然抗体の反応、それを契機とする補体依存性細胞傷害反応、血管内皮の活性化、凝固反応、NK細胞依存性細胞傷害反応等によって生じる。
【０００３】
豚移植片の主要な異種抗原は豚細胞の糖鎖（糖タンパク質、糖脂質）の非還元末端に存在するガラクトースα-1,3-ガラクト−ス（本明細書ではα-Gal抗原という）であり、GTの作用によりN-アセチルラクトサミンにガラクトースがα1,3結合して合成される。なお、旧大陸猿、類人猿及びヒトの場合には、GT遺伝子は偽遺伝子化している（非特許文献１参照）ので、α-Gal抗原を合成しない。逆に、α-Gal抗原に対する抗体（本明細書では抗α-Gal抗体という）を産生し保有している。
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 1990: 265; 7055-61
【０００４】
異種移植に特有な急性期の拒絶反応を回避する方法には、移植レシピエント（ヒト）に対する処置とドナー動物（豚）に対する処置がある。前者にはレシピエント血液中の自然抗体を吸着除去する方法、抗α-Gal抗体中和薬を投与する方法等があり、後者にはドナー動物にレシピエント種の補体制御因子を発現させる方法（例えば特許文献１、特許文献２など参照）、ドナー動物のα-Gal抗原を減少又は発現させない方法等がある。
【特許文献１】特表平05-503074号公報
【特許文献２】特開平11-239430号公報
【０００５】
ドナー動物のα-Gal抗原を減少又は発現させない方法には次のようなものがある。
（1）α-Gal抗原のα-ガラクトシド結合を切断するα-ガラクトシダーゼを作用させてα-Gal抗原を減少する方法；
（2）α-Gal抗原のβ-ガラクトシド結合を切断するエンドβ-ガラクトシダーゼを作用又は発現させてα-Gal抗原を減少する方法（特許文献３参照）；
【特許文献３】再表01/029200公報（3）GTと共通の基質（N-アセチルラクトサミン）に作用するGT以外の糖転移酵素（例えば、α1,2-フコース転移酵素等）を強制発現させα-Gal抗原の発現を競合阻害する方法（特許文献４参照）；
【特許文献４】WO95/34202A1公報（4）N-結合型糖鎖の分岐を阻害するGnT-IIIを発現させてα-Gal抗原及びα-Gal抗原以外のN-結合型糖鎖の合成を阻害する方法（特許文献５参照）；
【特許文献５】特開2002-291372号公報（5）GT遺伝子をノックアウト（KO）して、α-Gal抗原を発現させない方法（例えば特許文献６〜１２など参照）。
【特許文献６】特表平8-509603号公報
【特許文献７】特表平9-508277号公報
【特許文献８】特表平10-504442号公報
【特許文献９】特開2002-17360号公報
【特許文献１０】WO01/88096公報
【特許文献１１】WO03/055302公報
【特許文献１２】WO03/064658公報
【０００６】
なお、遺伝子ノックアウト哺乳動物の作製は、従来は胚性幹細胞株の樹立されていたマウスでのみ可能であったが、体細胞核移植法によるクローン羊の作製技術（非特許文献２参照）が開発されて以降、より具体的には体細胞核移植法による遺伝子ノックアウト羊の作製技術（非特許文献３参照）が開発されて以降、マウス以外の哺乳動物でも可能になった。
【非特許文献２】Nature 1996: 380; 64-6
【非特許文献３】Nature Biotechnol. 2001: 19; 559-62
【０００７】
霊長類への移植試験から、上記の(1)から（4）に記載の方法で作製された豚の移植片は異種移植に特有な急性期の拒絶反応を克服できないことが示された。上記の(5)に記載の方法で作製された豚の移植片のヒヒ体内での生着日数は、従来から開発されていたヒト補体制御因子を発現するトランスジェニック豚の移植片のそれと大差なかった（非特許文献４参照）。
【非特許文献４】Organ Biol. 2004: 11; 11-19  その要因は、豚細胞にはα-Gal抗原の合成に関わる第2のα-1,3GTが存在すること（非特許文献５参照）、GT遺伝子をKOした豚細胞といえどもα-Gal抗原が残存すること（通常レベルの約１−２％、非特許文献６参照）、豚細胞にはα-Gal抗原以外の異種抗原も発現していること（例えばH-D抗原、非特許文献７参照）等が関係していると思われる。
【非特許文献５】Xenotransplantation 2001: 8 (Supplement 1); 27
【非特許文献６】Transplantation 2003: 75; 430-6
【非特許文献７】Xenotransplantation 2004: 11; 237-46  このようなことから、α-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でもその進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原も少ない異種移植に特有な急性期の拒絶反応を抑制する豚細胞及び異種移植用豚が望まれていた。
【０００８】
豚移植片にα-Gal抗原を発現させないためには、後記の実施例が示すように、片方のアレルのGT遺伝子をKO（本明細書ではシングルGTKOという）するだけでは不十分であり、両方のアレルのGT遺伝子をKO（本明細書ではダブルGTKOという）する必要がある。そして、ダブルGTKO豚が作製された（例えば非特許文献８、９参照）。
【非特許文献８】Science 2003: 299; 411-414
【非特許文献９】PNAS 2004: 101; 7335-40
【０００９】
このダブルGTKO豚は、通常の非トランスジェニック豚から採取した豚体細胞にGTKO用ターゲティングベクターを導入し、相同組換えしたシングルGTKO豚細胞を作製し、選抜し、同シングルGTKO豚細胞を用いてシングルGTKOクローン豚胚を作製し、同シングルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植し、シングルGTKO豚の胎児を作製し、同シングルGTKO豚胎児から採取した細胞に変異を起こさせてダブルGTKO豚細胞を作製し、選抜し、同ダブルGTKO豚細胞を用いてダブルGTKOクローン豚胚を作製し、同ダブルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植して作製された。
【００１０】
上記のダブルGTKO豚の作製に際し、シングルGTKO豚細胞(α-Gal抗原を発現している）とダブルGTKO豚細胞（α-Gal抗原を発現していない）の混在する系の中からダブルGTKO豚細胞を選抜する方法としては、
(1)抗α-Gal抗体及び補体を作用させてシングルGTKO豚細胞を死滅させる方法（以下、補体セレクション法。前掲非特許文献６及び９参照）、
(2)α-Gal抗原への親和性と細胞致死活性を有するClostridium difficileのToxin Aを作用させてシングルGTKO豚細胞を死滅させる方法（以下、Toxin A 法。前掲非特許文献８参照）が採用された。
【００１１】
しかし、ヒト補体制御因子を発現しているトランスジェニック豚の体細胞を用いてダブルGTKO豚細胞を作製しようとする場合には、同細胞は発現したヒト補体制御因子の働きにより補体依存性細胞傷害反応を抑制するので、ヒト補体制御因子を発現しているシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞を選別するのに補体セレクション法をダイレクトには適用できないという問題があった。
また、GnT-IIIを発現しているトランスジェニック豚は、発現したGnT-IIIの働きによりα-Gal抗原の発現量が減少しているので、シングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞の選抜にToxin A法を適用しても効率的でないという問題があった。
【００１２】
このようなことから、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているダブルGTKO豚細胞とその効率的な選抜方法が必要とされていた。また、このような豚細胞を体細胞核移植法に供して作製されるα-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でもその進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原が少なく、異種移植に特有な急性期の拒絶反応を生じない異種移植用豚が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来技術に存在する上記課題を解決するためになされたものであり、GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞及びその選抜方法、並びに異種移植に特有な急性期の拒絶反応を生じない異種移植用豚を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
(1) GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞；
(2)ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞とが混在する系に、
(a)α-Gal抗原と特異的に結合する物質を担体と結合させた物質；又は
(b)結合性を有する物質対の一方の物質にα-Gal抗原と特異的に結合する物質を結合した物質と、結合性を有する物質対の他方の物質に担体を結合させた物質；
を作用させることにより、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得ることを特徴とするヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞の選抜方法；
(3)ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、抗ヒト補体制御因子抗体を作用させ、次いで抗α-Gal抗体及び補体を作用させて、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得ることを特徴とするヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞の選抜方法；
(4)GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞を有する異種移植用豚；
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の豚細胞は、GTを発現していない（即ち、α-Gal抗原が発現しない）と共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞であり、当該豚細胞をドナー細胞とする体細胞核移植法を適用することにより、α-Gal抗原が発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現する異種移植用豚を提供することができる。
本発明の異種移植用豚は、α-Gal抗原が発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞を有する異種移植用豚であり、当該豚の臓器、組織、細胞などは、α-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でも補体反応の進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原も少ないので、異種移植に特有な急性期の拒絶反応を抑制する上で非常に有効である。
本発明の選抜方法は、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞とが混在する系から、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を選抜する方法であって、本発明の方法によれば、簡便且つ確実に当該ダブルGTKO豚細胞を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
α-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でもその進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原も少なく、異種移植に特有な急性期の拒絶反応を抑制する豚細胞及び異種移植用豚は、GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞及び異種移植用豚であり、下記により作製することができる。 
(1) 豚の臓器・組織、特に血管内皮細胞に発現させる調節遺伝子とヒト補体制御因子（DAF/CD55）からなる導入遺伝子を発現するトランスジェニック豚（前掲特許文献２参照）、又は超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とヒトGnT-IIIの遺伝子とヒト補体制御因子の遺伝子からなる導入遺伝子を発現するトランスジェニック豚（前掲特許文献５参照）から採取した細胞に、後述するGTKOターゲティングベクター（図１参照）を導入し、相同組換えしたシングルGTKO豚細胞を作製し、選抜し、同シングルGTKO豚細胞をドナー細胞とすると共に除核未受精豚卵子をレシピエント卵子とする核移植法によりシングルGTKOクローン豚胚を作製し、同シングルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植し、同シングルGTKO豚の胎児又は産仔から細胞を採取し、培養し、同培養細胞に変異を起こさせてダブルGTKO豚細胞を作製し、選抜し、同ダブルGTKO豚細胞をドナー細胞としてダブルGTKOクローン豚胚を作製し、同ダブルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植し、GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚の産仔を作製する；
【００１７】
（2）(a)予め作製しておいたダブルGTKO豚から採取した細胞に豚の臓器・組織、特に血管内皮細胞に発現させる調節遺伝子とヒト補体制御因子からなる導入遺伝子、又は超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とヒトGnT-IIIの遺伝子とヒト補体制御因子の遺伝子からなる導入遺伝子を導入し、GTを発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を作製し、選抜し、同ダブルGTKO豚細胞をドナー細胞としてダブルGTKOクローン豚胚を作製し、同ダブルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植し；又は
(b)予め作製しておいたダブルGTKO豚と予め作製しておいた特に血管内皮細胞にヒト補体制御因子を発現するトランスジェニック豚又はヒトGnT-IIIを発現するトランスジェニック豚を交配し；
GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚の産仔を作製する；
【００１８】
(3)(a)上記(1)に記載のシングルGTKO豚（雌及び雄）の性成熟を待って交配し；又は
(b)上記(1) に記載のシングルGTKO豚（雌又は雄）の性成熟を待って通常豚と交配し、シングルGTKO豚のF1を得て（雌及び雄）、それらF1シングルGTKO豚の性成熟を待って交配し；
GTを発現していないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚の産仔を作製する。
【００１９】
なお、GTを発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現している豚細胞におけるヒト補体制御因子とは、ヒト補体制御因子であれば特に限定されず、DAF（CD55）、MCP（CD46）、CD59などを例示することができる。
【００２０】
上記(1)は、ダブルGTKO豚の作製に要する時日、労力及び費用の軽減効果の高いこと、並びにヒト補体制御因子（DAF/CD55）及び／又はヒトGnT-IIIの導入遺伝子が子孫に確実に伝達し、機能性蛋白質を確実に発現することが予め確認されている利点のあることから、本発明の最も好ましい様態である。なお、本発明のダブルGTKO豚細胞の選抜方法は上記(1)の外、上記(2)にも適用できる。
【００２１】
上記(1)に記載のトランスジェニック豚から採取する細胞、又は上記(2)に記載のダブルGTKO豚から採取する細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、筋肉細胞、神経細胞又は組織幹細胞等であり、より好ましくは線維芽細胞である。
【００２２】
豚のGTの遺伝子と相同組換えし、豚GT遺伝子を不活性化（遺伝子ノックアウト；KO）させるためのDNA配列（ターゲティングベクター。図１参照）は、
(a)豚GT遺伝子（前掲特許文献６及び７等参照）のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８及びエクソン９からなる群の１以上のエクソンと相同なDNA配列、
(b)上記(a)の５’側及び／又は３’側のイントロンと相同なDNA配列、及び
(c)上記(a)の機能を阻害するための上記(a)とは非相同なDNA配列；
からなる。
【００２３】
上記(c)のDNA配列は薬剤耐性遺伝子のDNA配列及び／又は同薬剤耐性遺伝子の発現を開始及び終止させるためのDNA配列からなる。薬剤耐性遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマシン(Hyg)耐性遺伝子等を、薬剤耐性遺伝子の発現を開始させるためのDNA配列としてIRES (Internal ribosome entry site)、Kozak配列等を、薬剤耐性遺伝子の発現を終止させるためのDNA配列としてポリA配列を例示することができる。またターゲティングベクターには制限酵素サイトを適宜配することができ、上記(b)のイントロンのDNA配列は同遺伝子型（isogenic）であることが好ましい。
【００２４】
ターゲティングベクターの豚細胞への導入は、エレクトロポレーション法、化学薬剤、例えばLipofectAMINE（商標）など用いる方法によることができる。
【００２５】
豚GT遺伝子とターゲティングベクターが相同組換えしたシングルGTKO豚細胞は、ターゲティングベクターに組み込まれた薬剤耐性遺伝子の種類に対応する適正濃度の薬剤を含む培地で培養し、選抜し、コロニーとして単離させることができる。単離したコロニーは、そのDNAをPCR、サザンブロティッグ等の遺伝子解析によりシングルGTKO豚細胞であること及び正常な核型であることを確認した後に、後記の異型接合性の喪失処理又はシングルGTKO豚胚作製用ドナー細胞に供することができる。
【００２６】
GTKOクローン豚胚及びGTKO豚は次により作製することができる。
屠場で採取した豚卵巣の卵胞から豚卵子−卵丘細胞複合物を吸引採取し、培地（システイン、EGF、eCG、ｈCG及び豚卵胞液を添加した、又は添加していないNCSU-23培地）中で培養し、ヒアルロニダーゼ処理して卵丘細胞を除去し、第一極体の放出された箇所周辺の細胞質を吸引除去して卵子の核を取り除き、同卵子（除核豚卵子）の一つにつきその卵周囲腔にシングルGTKO豚細胞又はダブルGTKO豚細胞の一つを挿入し、電気融合し、電気融合時と同時に又は電気融合時以降に、活性化してクローン豚胚を作製することができる。活性化は、電気処理又は化学薬剤処理によって行うことができる。
次に、予めホルモン処理（eCG、hCG）しておいた雌豚を麻酔下で開腹し、その卵管膨大部に上記のクローン豚胚を注入し、切開部を縫合し、移植したクローン豚胚を着床させられれば、受胎期間又は妊娠期間を経て豚胎児又は豚産仔が得られる。それらの豚の皮膚等の一部を採取し、各種の遺伝子解析（例えばPCR、サザンブロティッング、ノザンブロティング又はマイクロサテライト分析等）をすれば、シングルGTKO豚又はダブルGTKO豚であることを確認できる。なお、全ての動物ハンドリングは動物福祉の精神及び関連法規の規定に従って行われる。
【００２７】
シングルGTKO豚細胞を培養しておくと、ある種の確率で発生する変異によって、ダブルGTKO豚細胞が生じる。このような現象は異型接合性の喪失（Loss of heterozygosity; LOH）として知られている（Am. J. Hum. Genet. 1997: 61; 995-9）。
なお、LOH処理に供するシングルGTKO豚細胞としては、受胎雌豚への着床能力、初期発生能力、又は出産能力が確認されている点で、シングルGTKO豚胎児又はシングルGTKO豚産仔から調製されたシングルGTKO豚細胞を供することが望ましい。
【００２８】
シングルGTKO豚細胞(α-Gal抗原を発現している）とダブルGTKO豚細胞（α-Gal抗原を発現していない）の混在する系の中からダブルGTKO豚細胞のみを選抜する方法として、一般的には、（1）抗α-Gal抗体及び補体を作用させてシングルGTKO豚細胞を溶解(lysis)・死滅させる方法（補体セレクション法）、又は（2）α-Gal抗原への親和性と細胞致死活性を有するClostridium difficileのToxin Aを作用させてシングルGTKO豚細胞を死滅させる方法（Toxin A 法）が適用される。
【００２９】
しかし、(1)本発明のヒト補体制御因子を発現しているGTKO豚細胞は、 シングルGTKO又はダブルGTKOに関わらず、ヒト補体制御因子を発現しているので、ヒト補体セレクション法によるダイレクトな選抜はできない、また(2)本発明のヒトGnT-IIIを発現しているGTKO豚細胞は、シングルGTKOでもα-Gal抗原の発現量が減少しており、Toxin Aの結合量及び細胞致死活性は減少しているので、Toxin A法を適用しても効率的な選抜はできない。
【００３０】
このような問題から、本願発明者らは、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系から、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を選択的に選別する方法を検討した結果、下記の方法により達成できることが判明した。即ち、
(1)ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、
(a)α-Gal抗原と特異的に結合する物質を担体と結合させた物質；又は
(b)結合性を有する物質対の一方の物質にα-Gal抗原と特異的に結合する物質を結合した物質と、結合性を有する物質対の他方の物質に担体を結合させた物質；
を作用させることにより、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得る；又は
(2)ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、抗ヒト補体制御因子抗体を作用させ、次いで抗α-Gal抗体及び補体を作用させて、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を除去し、ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞を得る。
【００３１】
上記(1)の方法において、α-Gal抗原と特異的に結合する物質としては、例えばα-Gal抗原特異的レクチン（Griffonia simplicifolia 1 isolectin B4; GS1 B4）、抗α-Gal抗原抗体などが例示できる。
また、上記物質などを結合させる担体としては、生化学分野で使用されている慣用の担体（例えばセファロース等）を使用することができるが、操作の簡便性の面から磁気ビーズを使用するのが好ましい。
更に、結合性を有する物質対とは、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチン（又はイミノビオチン、ジチオビオチン等）の組合せ、コンカナバリンＡと糖類（例えばグルコース等）の組合せなどが例示でき、結合性を有する物質対については当業者に熟知されている。
担体とα-Gal抗原と特異的に結合する物質との結合、結合性を有する物質対の物質と担体との結合、同物質とα-Gal抗原と特異的に結合する物質との結合は、化学的結合法などの慣用の方法にて行うことができる。
【００３２】
本発明の選別方法の一例をより具体的に説明する。
(1)磁気ビーズ法
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、
(a)磁気ビーズ標識α-Gal抗原特異的レクチン（Griffonia simplicifolia 1 isolectin B4; GS1 B4）を作用させ；又は
(b)ビオチン標識GS1 B4レクチンとストレプトアビジン標識磁気ビーズを作用させ；又は
(c)ストレプトアビジン標識GS1 B4レクチンとビオチン標識磁気ビーズを作用させ；
その後に磁気ビーズと結合したα-Gal抗原を発現しているシングルGTKO豚細胞に磁石を作用させて除去すれば、ダブルGTKO豚細胞を選抜することができる。
また、上記のGS1 B4レクチンに代えて、磁気ビーズ標識抗α-Gal抗原抗体、ビオチン標識抗α-Gal抗原抗体とストレプトアビジン標識磁気ビーズ、又は、ストレプトアビジン標識抗α-Gal抗原抗体とビオチン標識磁気ビーズを使用することができる。
さらに、上記の磁気ビーズの利用に代えて、慣用の担体を利用することもできる。
【００３３】
(2) 抗ヒト補体制御因子抗体併用法
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞と同ダブルGTKO豚細胞が混在する系に、抗ヒト補体制御因子抗体を作用させてヒト補体制御因子をブロックした後に、抗α-Gal抗体及び補体（例えばヒト血清）を適用してシングルGTKO豚細胞を溶解・死滅させれば、ダブルGTKO豚細胞を選別することができる。
なお、抗ヒト補体制御因子抗体併用法に供される抗ヒト補体制御因子抗体としては、補体レセプターを有さない抗体、例えば、IgGのFab画分、IgY等でなければならない。抗ヒト補体制御因子抗体併用法に供される補体としては、ヒト補体に限定されない。
【００３４】
このようにして選別されたGTを発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現する豚細胞を用いて、上記のクローンGTKO豚胚及びGTKO豚の作製方法を適用すれば、GTを発現しないと共にヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現する豚細胞及び異種移植用豚、即ちα-Gal抗原が発現していないと共に万一補体反応が惹起された場合でもその進行を抑制し及び／又はα-Gal抗原以外の異種抗原も少ない、異種移植に特有な急性期の拒絶反応を抑制する異種移植用豚を作製することができる。従って、当該豚の臓器（例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚等）、組織（例えば冠状動脈、脳硬膜、軟骨、角膜、神経等）、細胞（例えば心筋、膵臓ランゲルハンス島、脳黒質線条体細胞等）などは異種移植用移植片として好適に利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
ヒト補体制御因子及び／又はヒトN-アセチルグルコサミン転移酵素III（GnT-III）を発現する豚細胞
超急性拒絶の生じる局所の細胞でヒト補体制御因子DAFとヒトGnT-IIIを発現しているトランスジェニック豚（Transplant. Proc. 2003: 35; 516-7）と通常豚を交配し、妊娠28から33日めの胎児を回収し、細切した後、0.25％トリプシン−0.02％EDTA（Gibco BRL）で37℃、30分間処理し、10％牛胎児血清加DMEM培地（Gibco BRL）を用いて37℃と5％CO2で培養し、ヒトDAFとヒトGnT-IIIのDNAを有すると共に正常な核型を有する細胞を選抜した。
同様に、超急性拒絶の生じる局所の細胞でヒトDAFを発現しているトランスジェニック豚（Mol. Reprod. Del. 2002: 61; 302-11）と通常豚を交配し、ヒトDAFを有すると共に正常な核型を有する細胞を選抜した。
なお、当該豚細胞がヒトDAF又はヒトGnT-IIIのDNAを有することは後記の方法により、また正常な核型を有することは染色体標本作製法（「組織培養の技術」、日本組織培養学会編）により確認した。
【００３７】
実施例２
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているシングルGTKO豚細胞
上記の豚細胞（細胞数：2 x 106）にGTKO用ターゲティングベクター(10μg。図１)をエレクトロポレーション（300V、975μFD）し、1から4日間培養した。その後、ハイグロマイシン（50から200μg/ml）加培地で7から14日間培養し、ターゲティングベクター導入後20から30日目にコロニーをピックアップし、ヒトDAFとヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞を選抜した。同様に、ヒトDAFを発現するシングルGTKO豚細胞を選抜した。
当該豚細胞がシングルGTKO豚細胞であることは後記のサザンブロッティングにより確認した。即ち、通常豚（野生型）の細胞では3000bpのバンドのみが観察されたが、シングルGTKO豚では3000bpと5350bpのバンドが観察された（図2のレーン１と2）。そして、当該シングルGTKO細胞をシングルGTKOクローン豚胚の作製に供した。
【００３８】
実施例３
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているシングルGTKOクローン豚胚
屠場にて採取した豚卵巣の卵胞から豚卵子−卵丘細胞複合物（直径3から6mm）を吸引採取し、0.6 mM システイン、10 ng/ml EGF、10 IU/ml eCG、10 IU/ml ｈCG及び豚卵胞液を添加(10％(v/v))したNCSU-23培地を用いて、38.5℃と5％CO2で15から26時間培養し、更にホルモン等を添加していないNCSU-23培地で15から26時間培養した。その後、ヒアルロニダーゼ（1 mg/ml）で処理して卵丘細胞を除去し、第一極体を放出した卵子を採取した。0.3％(w/v)ポリビニルピロリドン、10％(v/v)牛胎児血清及び7.5 μg/mlサイトカラシンBを含む10 mM Hepes緩衝液チロード乳糖培地で豚卵子から卵丘細胞を除去し、直ちにピペット（直径35μm）を用いて、第一極体及びその周辺の細胞質を（細胞質全体の約10％）を吸引し、豚卵子の核を取り除いた（除核という）。なお、豚卵子が除核されていることをヘキスト33342（5 μg/ml）で染色して確認した。
次に、上記の除核された豚卵子を0.3％ポリビニルピロリドンを含むHepes緩衝液チロード乳糖培地に静置し、ピペット（直径20μm）を用いて、卵周囲腔にドナー細胞（ヒトDAFとヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞、又はヒトDAFを発現するシングルGTKO豚細胞）を注入し、ドナー細胞−卵子複合物を作製し、2本の電極間に置き、電気細胞融合装置（島津製作所）を用いて、電気融合、活性化処理を行った。即ち、0.1 mM MgSO4と0.05 mM CaCl2を含む0.27 Mマンニトール溶液中で上記のドナー細胞−卵子複合物を160 V/mm、30μ秒間の直流電流及び1 MHz、5 V、 5秒間の交流電流で細胞融合し、5 μg/mlサイトカラシンBを含むNCSU-23培地を用いて1から1.5時間培養した後、100 V/mm、100 μ秒間の直流電流で活性化処理した。又は0.1 mM MgSO4のみを含む0.27 Mマンニトール溶液中で180 V/mm、10μ秒間の直流電流及び1 MHz、5 V、 5秒間の交流電流で細胞融合し、1から1.5時間後150 V/mm、100μ秒間の直流電流にて活性化し、5 μg/mlサイトカラシンBを含むNCSU-23培地にて3時間培養し、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKOクローン豚胚、又はヒトDAFを発現するシングルGTKOクローン豚胚を作製した。
【００３９】
実施例４
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているシングルGTKOクローン豚胚の受胎雌豚への移植
三元交雑種雌豚（LW/LｘD）に1,000 IUのeCGを筋肉注射し、その65から80時間後に1,500 IUのhCGを筋肉注射した。その2から3日後に、麻酔下で開腹し、その卵管膨大部に上記のクローン豚胚を注入し、切開部を縫合した。そして、上記のシングルGTKOクローン豚胚の受胎雌豚への移植後28から35日めに、受胎雌豚を開腹してヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚胎児を回収した。
同様に、ヒトDAFを発現するシングルGTKO豚胎児を回収した。また、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKOクローン豚胚の移植後110日目に、健康なヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚の産仔を得た。
動物ハンドリングの全ては動物福祉の精神及び関連法規の規定に従って行った。なお、当該豚胎児及び豚産仔がヒトDAF、ヒトGnT-III又はターゲティングベクターのDNAを有することは後記の方法により、正常な核型を有することは前記の方法により確認した。
【００４０】
実施例５
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているダブルGTKO豚細胞
上記のヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現してシングルGTKOクローン豚胎児を細切し、上記と同様に培養し、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現する正常な核型を有するシングルGTKO豚細胞を調製した。同様にして、ヒトDAFを発現する正常な核型を有するシングルGTKO豚細胞を調製した。
(a)磁気ビーズ法
上記のDAF及びGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞又は上記のDAFを発現するシングルGTKO豚細胞（3-5ｘ106）にビオチン標識α-Gal抗原特異的レクチン（Griffonia simplicifolia 1 isolectin B4; GS1 B4；10μg）を作用させ（4℃、0.5から2時間）、引続きストレプトアビジン標識磁気ビーズを作用させ（4℃、0.5から2時間）、その後に磁石を作用させ、磁石に結合した余剰の磁気ビーズ及び磁気ビーズと結合した細胞を取り除いた。除去後の反応液に含まれる細胞を培養し、15から21日後に形成されたコロニーについて後記の方法によりダブルGTKO豚細胞を同定した。そして、5350bpのバンドのみが観察されるヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞が得られた（図2のレーン3）。なお、供試コロニー数中のダブルGTKO豚細胞コロニー数の割合は6/55（10.9％）であった。
同様に、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚細胞が得られた。
また、上記のビオチン標識α-Gal抗原特異的レクチン及びストレプトアビジン標識磁気ビーズに代えて磁気ビーズ標識抗α-Gal抗原抗体を作用させ場合でも、ダブルGTKO豚細胞を回収することができた。
【００４１】
(b)Toxin A法
上記のDAF及びGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞（5 x 105）をToxin A（0.5から2μg/ml）加培地で2時間培養した後、通常培地で培養し、21から25日後に形成されたコロニーについて上記と同様にダブルGTKO豚細胞を同定した。その結果、5350bpのバンドのみが観察されるヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞が得られた。なお、供試コロニー数中のダブルGTKO豚細胞コロニー数の割合は2/76（2.6％）であった。そして、同ダブルGTKO豚細胞の選抜にToxin A法を適用しても、磁気ビーズ法と同程度の効率は得られなかった（2.6％ vs 10.9％）。
【００４２】
(c)抗ヒト補体制御因子抗体併用法
上記のヒト補体制御因子及びヒトGnT-IIIを発現するシングルGTKO豚細胞（5x105）に抗DAF抗体（Fab画分、5μg）を作用させ（4℃、0.5から2時間）、DAFをマスクした。洗浄後、ヒト血清1mlと反応させた（37℃、0.5から2時間）。反応後、細胞を回収し、培養した。15から25日後、形成されたコロニーについて上記と同様にダブルGTKO豚細胞を同定した。そして、同ダブルGTKO豚細胞の選抜の効率は8.9％であった。
【００４３】
実施例６
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているダブルGTKO豚
上記の方法に準じて、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚細胞からダブルGTKOクローン豚胚を作製し、ダブルGTKOクローン豚胚を受胎雌豚に移植し、移植後110日めに健康な産仔を得た。同産仔について、ヒトDAFのDNA、ヒトGnT-IIIのDNA及びGTKOターゲティングベクターのDNAの有無、並びに、ヒトDAF、ヒトGnT-III及びα-Gal抗原の発現を調べた。それらの結果から、同産仔はヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚であることが確認された。
同様に、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚細胞からダブルGTKOクローン豚胚を作製し、同胚を受胎雌豚に移植し、移植後110日めに健康な産仔を得て、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚であることを確認した。
次に、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するGTKO豚細胞、及び、ヒトDAFを発現するGTKO豚細胞について、ビオチン標識GSIB4及びフィコエリスリン標識ストレプトアビジンを用いたα-Gal抗原のFACS解析を行ったところ、ダブルGTKO豚細胞にはα-Gal抗原の発現は確認されなかった。一方、シングルGTKO豚細胞のα-Gal抗原量は通常豚のそれに比べれば減少しているが、大量に残存していることが確認された（図３）。
【００４４】
実施例７
ヒト補体制御因子及び／又はヒトGnT-IIIを発現しているダブルGTKO豚細胞の補体反応抵抗性
通常豚（野生型）、ヒトDAFを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚から採取した細胞についてヒト補体への抵抗性試験を行った。その結果を表１に示す。
通常豚の細胞致死率は100％であったが、ヒトDAFを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚並びにヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚の細胞致死率は減少した。特に、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚の細胞致死率はより減少し、またヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚の細胞致死率は更に減少した。
このことから、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚の細胞は、ヒト血清中の抗α-Gal抗原抗体と反応せず、及び／又は、ヒト血清中の抗体とα-Gal抗原以外の抗原の反応により惹起される補体反応も抑制されることが確認された。
さらに、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚の細胞は、ヒト血清中の抗α-Gal抗原と反応せず、更に、豚細胞のα-Gal抗原以外の抗原との反応も生ぜず、ヒト血清中の抗体と豚細胞の異種抗原との反応により惹起される補体反応も抑制されることが確認された。
即ち、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚の細胞は異種移植に特有な急性期の拒絶反応を惹起するヒト血清との反応を抑制することが確認された。さらに、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚の細胞は異種移植に特有な急性期の拒絶反応を惹起するヒト血清との反応をより効率的に抑制することが確認された。
【００４５】
2006129736.tif 000002
【００４６】
上記の一連の実験は下記の方法により行った。
導入遺伝子DNAの同定方法
本発明の豚細胞及び豚のゲノムに組み込まれたヒトDAF、ヒトGnT-III及びGTKOターゲティングベクターのDNAを次の条件で同定した。
(1)ヒトDAFのDNAの同定
供試豚から抽出したDNAを鋳型として、ヒトDAFのcDNA由来の5'- GGCCTTCCCCCAGATGTACCTAATGCC（配列番号１）をセンスプライマー、同5'- TCCATAATGGTCACGTTCCCCTTG（配列番号２）をアンチセンスプライマーとするPCR反応を行った（条件；94℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間、30回）。そして、各サンプルをミニゲル（エチジウム・ブロマイド入り）で泳動し、導入遺伝子の有無を検出し同定した。
(2) ヒトGnT-IIIのDNAの同定
供試豚から抽出したDNAを鋳型として、ヒトGnT-IIIのcDNA由来の5'- GGTGGACGCCTTTGTGGTGTGC（配列番号３）をセンスプライマー、同5'- GCCGGTGCGGTTCTCATACTGT（配列番号４）をアンチセンスプライマーとするPCR反応を行い、上記と同様にして同定した。
(3) GTKOターゲティングベクターのDNAの同定
(a)サザンブロッティング用プローブの作製
豚から抽出したDNAについて、CCCTGCTGCCACCTGCTCTAACTCT（配列番号５）及びACTGGGTCTCCCATTGCCATCCTCT（配列番号６）をプライマーとしてPCR（94℃30秒間、68℃30秒間、72℃1分間、35サイクル：PCR DIG Probe Synthesis Kit、Roche社）し、豚GT遺伝子エクソン９の3´側のDNA配列から成るサザンブロッティング用Dig標識プローブを作製した。
(b)サザンブロッティングによるGTKOターゲティングベクターの同定
供試豚の尻尾から抽出したゲノム5μgをEcoRVで消化し、1％アガロース用いて電気泳動し、メンブランに転写した。このメンブランを上記(a)に記載のDig（digoxigenin）標識プローブとハイブリダイズさせた。洗浄後、メンブランにアルカリフォスファターゼ標識抗Dig抗体と化学発光試薬を作用させた。通常豚、シングルGTKO豚及びダブルGTKO豚の場合には、それぞれ、3000bpのみ、3000bpと5350bp、及び5350bpのみのバンドが検出される。
【００４７】
導入遺伝子産物の測定方法
(1)ヒトDAF蛋白質の測定
供試豚の耳から採取した線維芽細胞を10％牛胎児血清加DMEM培地で培養し、洗浄し、ビオチン標識抗DAF抗体（IA10）及びフィコエリスリン標識ストレプトアビジンで処理し、FACS解析した（Mol. Reprod. Dev. 2002: 61; 302-11）。
(2)ヒトGnT-IIIの酵素活性の測定
供試豚の線維芽細胞を溶解してライゼイトを調製し、ピリジルアミン化二分岐糖鎖（pyridylaminated biantennary-sugar chain）を基質としてヒトGnT-IIIの酵素活性を測定した（J. Biol. Chem. 2001: 276; 39310-19）。
(3)α-Gal抗原の測定
供試豚の線維芽細胞をビオチン標識GS1B4及びフィコエリスリン標識ストレプトアビジンで処理し、FACS解析した。
(4)ヒト補体への抵抗性試験
通常豚（野生型）、ヒトDAFを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するトランスジェニック豚、ヒトDAFを発現するダブルGTKO豚、ヒトDAF及びヒトGnT-IIIを発現するダブルGTKO豚から採種した細胞をそれぞれ1ｘ104個ずつ96穴プレートに播種した。24時間培養後、培養上清を除去し、ヒト血清20％あるいは40％を含む培地で培養した（37℃、1.5から3時間）。培養後、培養上清中に含まれる乳酸脱水素酵素（LDH）の量を指標として死亡細胞数を測定し（MTX LDH Kit、極東製薬）、細胞致死率を計算した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】豚α-1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターを示す図である。なお、同図は、豚GT遺伝子として、エクソン９を用いた場合の例である。
【図２】サザンブロテッィング法による豚α-1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子の野生型、シングルノックアウト型及びダブルノックアウト型の別を示す図である。
【図３】α-Gal抗原量のFACS分析結果を示す図である。
【図１】
2006129736.tif 000003
【図２】
2006129736.tif 000004
【図３】
2006129736.tif 000005
【配列表】
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