(57)【要約】【課題】治療用アミドの立体選択的調製のための酵素的方法の提供。【解決手段】（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの調製により例示されるように、第三級アルコール立体中心を有するＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの立体選択的調製のための新規な酵素的方法であって、このような化合物は、細胞カリウムチャンネルの開封剤であり、それゆえ、泌尿器失禁および他の疾患および病態（高血圧、喘息、末梢血管疾患およびアンギナを含む）の治療に有用である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用アミドの立体選択的調製のための酵素的方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬化合物を合成する方法、およびこのような化学化合物の合成に使用する中間体に関する。特に、本発明は、第三級アルコール立体中心を有するＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの立体選択的調製のための新規な酵素的方法、およびこのような化合物の合成に有用な鏡像異性体中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドおよび他のＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドは、１９９３年１２月２１日にＲｕｓｓｅｌｌらに発行された特許文献に開示されている。このような化合物は、前記特許に開示のように、細胞カリウムチャンネルの開封剤であり、それゆえ、泌尿器失禁および他の疾患および病態（高血圧、喘息、末梢血管疾患およびアンギナを含む）の治療に有用である。特許文献１はまた、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの（Ｓ）−（−）鏡像異性体を調製する方法を開示しており、この方法は、ジアステレオマーエステルの形成に続いて、クロマトグラフィー分離、およびそれに続く塩基処理によるエステル基の除去を使用する。
【特許文献１】米国特許第５，２７２，１６３号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの調製により例示されるように、第三級アルコール立体中心を有するＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの立体選択的調製のための新規な酵素的方法を提供する。このような化合物は、細胞カリウムチャンネルの開封剤であり、それゆえ、泌尿器失禁および他の疾患および病態（高血圧、喘息、末梢血管疾患およびアンギナを含む）の治療に有用である。
【０００４】
本発明の新規な方法は、Ｎ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドから形成したエステルのラセミ混合物の１個の鏡像異性体に由来のエステル基を選択的に切断する酵素的工程を使用する。この酵素的工程に続いて、そのように生成したアルコールからの残留エステルの分離を行うことができる。この酵素工程で切断しなかった回収エステルは、所望ならば、加水分解して、対応するアルコールを生成できる。
【０００５】
本発明はまた、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの調製で有用な（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸の調製により例示されるように、前記Ｎ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの合成で有用な中間体を合成する方法も提供する。
【０００６】
（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドで例示される、第三級アルコール立体中心を有するＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの立体選択的合成方法、およびこのような化合物の合成に有用な中間体は、本明細書中で提供される。
【０００７】
本発明によれば、以下が提供される：
（１）式Ｉの光学活性化合物を調製する方法であって、該方法は、式ＩＩのラセミ化合物を加水分解酵素で処理する工程を包含する：
【０００８】
【化３】
2006345873.tif 000002
ここで、Ｅは、窒素およびＣＺから選択され、ここで、Ｃは、環炭素であり、そしてＺは、以下で定義する置換基であり、ここで：
ＥがＣＺのとき、ＸおよびＺは、以下からなる群から選択される：
（Ａ）Ｘは、ＡｒＹであり、ここで、Ｙは、カルボニル、スルフィニルおよびスルホニルから選択した連結基であり、そしてＡｒは、以下からなる群から選択される：
ハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択した０個〜２個の置換基で置換したフェニル；
唯一のヘテロ原子として、１個〜２個の窒素原子を含有する六員環ヘテロアリール環；
窒素、酸素およびイオウから選択した１個〜２個のヘテロ原子を含有する五員環ヘテロアリール環；そして
Ｚは、水素、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される；および
（Ｂ）Ｘは、シアノであり、そしてＺは、フェニルチオ、フェニルスルフィニルおよびフェニルスルホニルからなる群から選択され、該フェニル環は、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択した０個〜２個の置換基で置換されている；そして
Ｅが窒素のとき、Ｘは、独立して、（Ａ）において上で示したＸの値のいずれかから選択される；そして
＊は、光学活性キラル中心である：
【０００９】
【化４】
2006345873.tif 000003
ここで、ＸおよびＥは、先に定義した意味を有する；そしてＲ１は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノおよびＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから独立して選択した１個またはそれ以上の置換基により必要に応じて置換したアルキルである。
（２）式Ｉの光学活性化合物から、式ＩＩの未反応化合物を分離する工程をさらに包含する、項目（１）に記載の方法。
（３）式ＩＩの未反応化合物を、式Ｉの対応するアルコールに転化する工程をさらに包含する、項目（２）に記載の方法。
（４）上記加水分解酵素が、リパーゼである、項目（１）に記載の方法。
（５）上記リパーゼが、ブタ膵臓リパーゼである、項目（４）に記載の方法。
（６）Ｒ１が、必要に応じて置換したＣ１〜Ｃ７アルキルである、項目（１）に記載の方法。
（７）式Ｉの上記光学活性化合物が、（Ｓ）−（−）−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドであり、式ＩＩの化合物のラセミ混合物を加水分解酵素で処理する上記工程が、Ｅが、ＣＺであり、Ｘが、ＡｒＹであり、Ｙが、カルボニルであり、Ａｒが、フェニルであり、そしてＺが、水素である式ＩＩの化合物を用いて行われる、項目（１）に記載の方法。
（８）（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を調製する方法であって、該方法は、式Ｖのラセミ化合物を、加水分解酵素で処理する工程を包含する：
【００１０】
【化５】
2006345873.tif 000004
ここで、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはフェニルである。
（９）上記加水分解酵素が、リパーゼである、項目（８）に記載の方法。
（１０）上記リパーゼが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼである、項目（９）に記載の方法。
（１１）式Ｖまたは式ＶＩの化合物：
【００１１】
【化６】
2006345873.tif 000005
ここで、Ｒ２は、Ｃ２−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはフェニルであり、＊は、光学活性キラル中心であるが、但し、該化合物が式Ｖを有するとき、Ｒ２は、エチルではない。
（１２）（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を調製する方法であって、該方法は、式ＶＩＩの化合物を、加水分解酵素で処理して、式ＶＩＩＩの対応する化合物を提供する工程；および式ＶＩＩＩの化合物を酸に転化する工程を包含する：
【００１２】
【化７】
2006345873.tif 000006
ここで、Ａは、ＣＮ、ＣＯＨ、ＣＨ（ＯＲ３）２、ＣＯＲ４、ＣＯＯＲ５、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ６またはＣＯＮＲ７Ｒ８である；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択される；そしてＲ９は、アルキル、アリールまたはアラルキルであり、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、必要に応じて、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから選択した置換基で置換されていてもよい：
【００１３】
【化８】
2006345873.tif 000007
ここで、Ａは、上で定義した意味を有し、そして＊は、光学活性キラル中心である。
（１３）上記加水分解酵素が、リパーゼである、項目（１２）に記載の方法。
（１４）上記リパーゼが、ブタ膵臓リパーゼである、項目（１３）に記載の方法。
（１５）式ＶＩＩＩでは、Ａが、ＣＮである、項目（１２）に記載の方法。
（１６）式ＶＩＩＩの化合物：
【００１４】
【化９】
2006345873.tif 000008
ここで、＊は、光学活性キラル中心である；そして
Ａは、ＣＮ、ＣＯＨ、ＣＨ（ＯＲ３）２、ＣＯＲ４、ＣＯＯＲ５、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮ
ＨＲ６またはＣＯＮＲ７Ｒ８である；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、アルキル、アリールから選択される；ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、必要に応じて、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから選択した置換基で置換されていてもよい。
（１７）Ａが、ＣＮである、項目（１６）に記載の化合物。
（１８）式ＶＩＩまたは式ＩＸの化合物：
【００１５】
【化１０】
2006345873.tif 000009
ここで、＊は、光学活性キラル中心である；そして
Ａは、ＣＮ、ＣＯＨ、ＣＨ（ＯＲ３）２、ＣＯＲ４、ＣＯＯＲ５、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ６またはＣＯＮＲ７Ｒ８である；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択される；そしてＲ９は、アルキル、アリールまたはアラルキルであり、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、必要に応じて、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから選択した置換基で置換されていてもよい；但し、ＡがＣＮのとき、Ｒ９は、メチルではない。
【００１６】
添付の請求の範囲で記載されるような本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の発明の詳細な説明において、それらの好ましい実施態様で記述されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の第一の局面は、式Ｉの光学活性化合物を調製する方法を提供し、該方法は、式ＩＩのラセミ化合物を加水分解酵素で処理する工程を包含する：
【００１８】
【化１１】
2006345873.tif 000010
ここで、Ｅは、窒素およびＣＺから選択され、ここで、Ｃは、環炭素であり、そしてＺは、以下で定義される置換基であり、ここで：
ＥがＣＺのとき、ＸおよびＺは、以下からなる群から選択される：
（Ａ）Ｘは、ＡｒＹであり、ここで、Ｙは、カルボニル、スルフィニルおよびスルホニルから選択した連結基であり、そしてＡｒは、以下からなる群から選択される：
ハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択した０個〜２個の置換基で置換したフェニル；
唯一のヘテロ原子として、１個〜２個の窒素原子を含有する六員環ヘテロアリール環；
窒素、酸素およびイオウから選択した１個〜２個のヘテロ原子を含有する五員環ヘテロアリール環；そして
Ｚは、水素、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される；および
（Ｂ）Ｘは、シアノであり、そしてＺは、フェニルチオ、フェニルスルフィニルおよびフェニルスルホニルからなる群から選択され、該フェニル環は、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ４アルコキシから選択した０個〜２個の置換基で置換されている；そして
Ｅが窒素のとき、Ｘは、独立して、（Ａ）において上で示したＸの値のいずれかから選択される；そして
＊は、光学活性キラル中心である。式ＩＩの化合物は、以下のように定義される：
【００１９】
【化１２】
2006345873.tif 000011
ここで、ＥおよびＸは、本明細書中で先に定義した意味を有する；そしてＲ１は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノおよびＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから独立して選択した１個またはそれ以上の置換基により必要に応じて置換したアルキルである。好ましくは、Ｒ１は、必要に応じて置換したＣ１−Ｃ７アルキル、より好ましくは、必要に応じて置換したＣ１−Ｃ５アルキルである。好ましい置換基は、ハロゲンであり、より好ましくは、クロロである。本発明の方法では、この加水分解酵素は、式ＩＩのエステルの１個の鏡像異性体に由来のエステル基を切断して、この酵素の特異性に依存して、式Ｉのアルコールとして、（Ｓ）または（Ｒ）鏡像異性体を提供し、他の鏡像異性体は、未反応基質中に残る。
【００２０】
本発明の方法はまた、この酵素的工程中に形成された生成物を、未反応出発物質から分離する工程、すなわち、この酵素的処理中に形成された式Ｉのアルコールと式ＩＩの未反応エステル出発化合物とを分離する工程も包含できる。この酵素は、式ＩＩの化合物のラセミ混合物の１個の鏡像異性体に由来のエステル基を切断して、このアルコールを生成する。式Ｉの化合物および式ＩＩの未反応エステル出発物質は、通常の方法（例えば、シリカカラム上のクロマトグラフィー）を用いて分離できる。所望の鏡像異性体が未反応エステルのとき、本発明の方法は、さらに、このエステルを対応するアルコールに転化することを包含できる。このエステルは、塩基（例えば、水酸化ナトリウム）で処理することにより、対応するアルコールに転化できる。
【００２１】
本発明のこの局面の好ましい実施態様は、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（式Ｉにおいて、ここで、＊は、（Ｓ）立体配置であり、Ｅは、ＣＺであり、Ｘは、ＡｒＹであり、Ｙは、カルボニルであり、Ａｒは、フェニルであり、そしてＺは、水素である）を調製する方法を提供する。
【００２２】
ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドは、当該技術分野で公知の通常の方法を用いて、エステルに転化できる。例えば、このラセミ化合物は、スキーム１で示すように、塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下にて、式ＩＩＩの酸塩化物と反応される：
【００２３】
【化１３】
2006345873.tif 000012
ここで、Ｒ１は、この上で定義した意味を有する。式ＩＩＩの好ましい化合物には、モノクロロアセチルクロライドおよびブチリルクロライドが挙げられる。ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドは、例えば、米国特許第５，３８２，５９８号の方法または本明細書中で記述の方法を用いて、調製できる。
【００２４】
Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドに由来の得られたエステルは、次いで、加水分解酵素（好ましくは、リパーゼ、より好ましくは、粗ブタ膵臓リパーゼ）と反応されるが、この加水分解酵素は、この（Ｒ）鏡像異性体に由来のエステル基を選択的に切断して、（Ｓ）鏡像異性体のエステルを残す。この反応は、好ましくは、共溶媒として第三級ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）を用いて、およそｐＨ  ７で、緩衝水溶液中で起こる。しかし、この緩衝水溶液のｐＨは、この反応で使用される酵素に依存することが分かる。この反応混合物中の共溶媒の存在は、任意である。この反応は、利用可能な基質が反応するまで進行し、これは、約１日間〜約３日間であり得る。この反応は、反応条件および使用する酵素に依存して、より速くまたはより遅く進行し得る。逆の特異性を有する酵素を用いて、この酵素的工程にて、この（Ｓ）鏡像異性体に由来のエステル基を直接切断することも可能であり得る。
【００２５】
【化１４】
2006345873.tif 000013
この（Ｓ）エステルは、標準的な方法（例えば、シリカカラム上のクロマトグラフィーまたは任意の他の適当な方法）により、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの（Ｒ）鏡像異性体から分離できる。このエステルが（Ｓ）鏡像異性体の場合には、それは、次いで、塩基（例えば、水性メタノールまたは他の溶媒中の水酸化ナトリウム）で処理されて、このエステル基が取り除かれ、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドが提供される。
【００２６】
本発明のこの局面は、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの合成により例示される。式Ｉの他のＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドは、スキームＩで記述の方法において、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドを、このような化合物のラセミ混合物で置き換えることにより、調製できる。一部の置換基には、保護基の使用が必要な場合がある。式Ｉの化合物のラセミ混合物は、米国特許第５，３８２，５９８号の方法に従って、調製できる。
【００２７】
スキーム２は、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの調製を示し、ここで、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸中間体は、酵素的方法よりもむしろ、分割剤を用いた選択的結晶化により、調製される。スキーム２で示すように、１，１，１−トリフルオロアセトン（１）は、酸（例えば、塩酸）の存在下にて、シアン化物（例えば、シアン化ナトリウム）と反応されて、ラセミ３，３，３−トリフル
オロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル（２）を形成する。このラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル（２）は、次いで、例えば、塩酸または硫酸で加水分解されて、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（３）を形成する。ラセミ（３）は、次いで、分割剤（例えば、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン（４））で選択的に結晶化されて、塩（５）を形成し、これは、ジアステレオマー純度まで再結晶できる。精製塩（６）は、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（７）を含有する。（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（７）は、この塩からの離脱後、有機塩基（例えば、トリエチルアミンまたはＨｕｎｉｇ塩基）を用いて、４−アミノベンゾフェノン（８）およびＳＯＣｌ２と反応されて、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（９）を形成し、これは、次いで、再結晶により精製できる。
【００２８】
Ｓ立体配置を有する式Ｉの他のＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドを調製するには、以下で規定した式ＩＶのアミンは、スキーム２に示す合成における４−アミノベンゾフェノン（８）と置き換えられる。
【００２９】
【化１５】
2006345873.tif 000014
このアミンは、類似の様式で、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸と反応されて、アミド生成物を生成し、これは、次いで、必要に応じ
て、通常の方法により、精製され得る。式ＩＶのアミンはまた、米国特許第５，２７２，１６３号で記述されている。
【００３０】
式ＩＶの化合物は、以下のように定義されている：
【００３１】
【化１６】
2006345873.tif 000015
ここで、ＸおよびＥは、この上で定義した意味を有する。式ＩＶのこのようなアミンは、米国特許第５，２７２，１６３号で開示の方法に従って、調製できる。
【００３２】
スキーム２に示す方法に加えて、式ＩＶの化合物の（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸とのカップリングは、他の適切な溶媒中および他の適切なカップリング剤の存在下にて、行なうことができる。標準的なペプチドカップリング試薬として当該技術分野で一般に公知の適切なカップリング試薬、例えば、チオニルクロライド（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３４、４４７、（１９９１））、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）およびジシクロヘキシルカルボジイミドは、必要に応じて、触媒（例えば、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）または４−ピロリジノピリジン）の存在下にて、使用できる。適切な溶媒には、ジメチルアセトアミド、ジクロロメタン、ベンゼン、テトラヒドロフランおよびジメチルホルムアミドが挙げられる。このカップリング反応は、約−４０℃〜４０℃の温度範囲で行うことができる。
【００３３】
さらなる局面では、本発明は、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドおよび米国特許第５，２７２，１６３号に開示の他のＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドの合成に有用な（Ｓ）鏡像異性体中間体を調製する立体選択的方法を提供する。（Ｓ）鏡像異性体中間体は、分割剤（例えば、α−メチルベンジルアミンまたはノルエフェドリン）を用いて、単調な立体選択的塩形成工程なしに、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドまたは他のＮ−アリールまたは式ＩのＮ−ピリジルプロパンアミドを調製することを可能にする。本発明は、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルおよび（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を調製する複数の立体選択的方法を提供し、各方法は、酵素的工程を含む。
【００３４】
このような中間体を調製する第一の立体選択的方法では、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸は、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼ（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ）を用いて、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエステルの選択的切断により、調製される。この方法は、好ましくは、式Ｖを有する３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエステルを、加水分解酵素で処理することを包含する：
【００３５】
【化１７】
2006345873.tif 000016
ここで、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはフェニルである。このエステルは、通常の方法（例えば、鉱酸および適切なアルコールを用いたラセミ酸からの調製）を用いて、調製できる。例えば、このプロピルエステルおよびブチルエステルは、少量の濃硫酸または乾燥塩酸の存在下にて、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸とプロパノールまたはブタノールとを反応させて、それぞれ、プロピルエステルまたはブチルエステルを形成することにより、調製できる。式Ｖのエステルはまた、適切なアルコールの存在下でのラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルと硫酸との加水分解により、調製できる。
【００３６】
式Ｖのエステルは、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼ（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ）により選択的に切断されて、エステルおよび酸の生成物混合物を形成する。この加水分解酵素との反応は、好ましくは、使用する酵素が良好な反応速度を与えるのに適当なｐＨ（通常、約ｐＨ５と約ｐＨ９との間）で、水性緩衝溶液中で行われる。共溶媒（例えば、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ））もまた、使用できる。この反応は、充分な量のエステルが反応されるまで、通常、約１日〜３日後まで、進行する。実際の反応時間は、使用する酵素、基質および溶媒のような要因に依存する。このエステルおよび酸は、次いで、シリカゲル上のクロマトグラフィーまたは当該技術分野で任意の公知の他の適当な方法を用いて、分離できる。この酵素の選択性に依存して、所望の（Ｓ）鏡像異性体は、回収された未反応エステルまたは遊離酸として存在できる。この未反応エステルが（Ｓ）鏡像異性体を含有する場合には、このエステル基は、次いで、塩基（例えば、水酸化ナトリウム）との反応に続く中和により除去されて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸が生成する。
【００３７】
（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドを調製するために、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸は、次いで、本明細書中の方法に従って、４−アミノベンゾフェノンと反応される。式Ｉの他のＮ−アリールまたはＮ−ピリジルプロパンアミドは、ここで記述のように、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を用い、スキーム２で示した合成において、４−アミノベンゾフェノンを式ＩＶのアミンで置き換えて、調製できる。
【００３８】
式Ｖの化合物は、本発明の他の局面を構成する：
【００３９】
【化１８】
2006345873.tif 000017
ここで、Ｒ２は、Ｃ３−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはフェニルである。
【００４０】
式ＶＩの化合物は、本発明のさらなる局面を構成する：
【００４１】
【化１９】
2006345873.tif 000018
ここで、＊は、光学活性キラル中心であり、そしてＲ２は、Ｃ２−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはフェニルである。好ましくは、＊は、（Ｓ）立体配置を有する光学活性キラル中心である。
【００４２】
このような中間体を調製する第二の立体選択的方法では、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸は、式ＶＩＩの化合物を
【００４３】
【化２０】
2006345873.tif 000019
（ここで、Ａは、ＣＮ、ＣＯＨ、ＣＨ（ＯＲ３）２、ＣＯＲ４、ＣＯＯＲ５、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ６またはＣＯＮＲ７Ｒ８である；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択される；そしてＲ９は、アルキル、アリールまたはアラルキルであり、そのいずれかは、必要に応じて、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノから選択される置換基で置換されていてもよい）、そのエステル基を選択的に切断する加水分解酵素（例えば、リパーゼ、（例えば、粗ブタ膵臓リ
パーゼ））で処理するかまたは反応させて、式ＶＩＩＩの対応するアルコールを得、そして式ＶＩＩＩの化合物のＡ基を酸（すなわち、ＣＯＯＨ基）に転化することにより、調製される：
【００４４】
【化２１】
2006345873.tif 000020
ここで、＊は、光学活性キラル中心であり、そしてＡは、ここで先に定義した意味を有する。Ｒ９は、好ましくは、必要に応じて置換したＣ１−Ｃ１０アルキル、より好ましくは、Ｃ１−Ｃ５アルキルである。Ａは、好ましくは、ＣＮである。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、より好ましくは、Ｃ１−Ｃ５アルキルである。
【００４５】
この加水分解酵素との反応は、水性緩衝液中で行うことができ、この溶液のｐＨは、使用する酵素に対して、適当な値（一般に、約ｐＨ７と約ｐＨ７．５の間）に調整される。共溶媒（例えば、ＭＴＢＥ）もまた、使用できる。この反応は、充分な量のエステルが反応するまで、進行する。この反応は、通常、約３日間進行するが、実際の時間は、使用する酵素、基質および溶媒のような要因に依存する。
【００４６】
アルコールおよびエステルの混合物は、次いで、通常の方法（例えば、シリカゲル上のクロマトグラフィー）により、分離できる。この酵素の選択性に依存して、所望の（Ｓ）鏡像異性体は、回収（未反応）エステルまたはアルコールとして存在できる。所望の（Ｓ）鏡像異性体が回収エステルの場合、このエステルは、次いで、塩基（例えば、水酸化ナトリウム）で処理でき、このエステル基が除去される。このＡ基は、標準的な方法により、カルボキシル基に転化されて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸が得られる。必要に応じて、Ａの性質に依存して、このエステル除去工程およびニトリル加水分解工程を組み合わせることができる。
【００４７】
好ましい実施態様では、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸は、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルと酸との反応により、調製される。（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルは、塩酸の存在下にて、１，１，１−トリフルオロアセトンとシアン化ナトリウムとを反応させて、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルを形成することにより、調製できる。このラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルは、次いで、酸塩化物（例えば、ブチリルクロライド）と反応されて、エステルを形成する。このラセミエステルは、このエステル基を（Ｒ）鏡像異性体から選択的に切断して（Ｓ）鏡像異性体のエステルを残すリパーゼ酵素（例えば、粗ブタ膵臓リパーゼ）と反応される。この（Ｓ）鏡像異性体のエステル基は、次いで、標準的な方法を用いて除去されて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルが得られ、これは、次いで、酸（例えば、硫酸または塩酸）で処理されて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を形成する。
【００４８】
本発明のさらなる局面は、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリルを調製する方法を提供し、この方法は、式ＶＩＩの化合物（ここで、Ａは、ＣＮである）を加水分解酵素（好ましくは、リパーゼ、例えば、粗ブタ膵臓リパーゼ）で処理することを包含する。
【００４９】
それゆえ、本発明はまた、式ＶＩＩの化合物および式ＩＸの化合物を提供する：
【００５０】
【化２２】
2006345873.tif 000021
ここで、ＡおよびＲ９は、ここで先に定義した意味を有する；
【００５１】
【化２３】
2006345873.tif 000022
ここで、＊は、光学活性キラル中心であり、そしてＡおよびＲ９は、ここで先に定義した意味を有する。好ましくは、＊は、（Ｓ）立体配置を有する光学活性キラル中心を表わす。
【００５２】
本発明はまた、式ＶＩＩＩの化合物を提供する：
【００５３】
【化２４】
2006345873.tif 000023
ここで、＊は、光学活性キラル中心であり、そしてＡは、ここで先に定義した意味を有する。好ましくは、＊は、（Ｓ）立体配置を有する光学活性キラル中心を表わす。
【００５４】
本明細書中に記載の方法の酵素的工程は、エステル基を選択的に切断してアルコールを形成できる任意のタイプの加水分解酵素（例えば、リパーゼ、エステラーゼ、ペプチターゼまたはプロテアーゼ）を用いて、行うことができる。この酵素は、微生物培養物から、または植物または動物から得ることができる。このような酵素は、市販されているか、または当該技術分野で公知の方法により調製できる。リパーゼ酵素は、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドから形成したエステルおよび本明細書中で記述の他のエステルを選択的に切断して、適当な収率で、これらの鏡像異性体を分割できることが分かった。市販のリパーゼ調製物は、その（Ｒ）鏡像異性体に由来のエステル基を優先的に切断し、その（Ｓ）鏡像異性体をエステル形状で残すことが分かった。好ましいリパーゼは、粗ブタ膵臓リパーゼであり、これは、市販されている。他の種に由来のリパーゼもまた使用できる。ブタ膵臓リパーゼは、良好な特異性および反応速度を与える。本発明で有用な酵素は市販されており、さらに処理せずに、入手した状態で、この反応混合物中で使用できるか、またはこれらの酵素は、例えば、ｐＨ  ７〜７．５程度の緩衝液に溶解し、そして支持体（例えば、ガラスビーズ、ケイソウ土、木炭、イオン交換樹脂またはシリカゲル）に吸着させるかまたは重合体支持体に共有結合させることにより、前処理できる。
【００５５】
典型的には、本発明の方法の酵素的工程は、１：１０〜１００：１（重量：重量）の基質：酵素比で、行うことができる。５：１〜１：１の基質：酵素比は、良好な結果を与えることが分かった。基質と酵素との比は、出発物質、使用する酵素および反応条件（例えば、温度および溶媒）のような要因に依存して、良好な反応速度を生じるように変える必要があるかも知れない。この酵素反応は、この出発物質に由来のエステル基の切断により充分な量のアルコールが形成されるまで、進行する。一般に、この酵素反応は、約１２時間〜約４日間または５日間、好ましくは、約１日間〜３日間進行する。
【００５６】
この反応混合物のｐＨは、一般に、約５〜約９、好ましくは、約７〜約８である。この酵素的工程は、一般に、約１５℃〜約４０℃、好ましくは、約２５℃〜約３８℃の温度で行われる。これらの反応条件は、出発物質、使用する酵素および溶媒のような要因に依存して、良好な反応速度を与えるように、前記範囲内（またはその範囲外）で変える必要であり得る。
【００５７】
この反応混合物中で使用する溶媒および任意の共溶媒は、この反応で使用する酵素および基質のような要因に依存して変わる。この溶媒はまた、この酵素反応の選択性および／または速度に影響を与える場合があり（このような場合には、この溶媒は、（他の溶媒に関して）、反応速度を高めるように選択できる）、および／または所望の鏡像異性体に対する酵素の選択性に影響を与える場合がある。この反応混合物の溶媒は、任意の通常の水性緩衝液（リン酸二水素カリウム緩衝液）であり得る。この反応に適切な共溶媒には、ＭＴＢＥが挙げられる。
【００５８】
この酵素的分割反応は、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドに由来のラセミエステルおよび酪酸および粗ブタ膵臓リパーゼを用い、１：１（ｗｔ／ｗｔ）の基質：酵素比を使用して、２日間で、ほぼ完結する（すなわち、この（Ｒ）エステルのほとんど全ての反応）。同じ物質の５：１（ｗｔ／ｗｔ）の基質：酵素比は、２日間で、このエステルのおよそ２５％の加水分解を生じた。ブタ膵臓リパーゼと、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドに由来のラセミエステルおよび酪酸との反応により、回収エステルの加水分解後、収率３５％（利用可能な（Ｓ）エステル７０％）で、９８．５％（Ｓ）異性体過剰の鏡像異性体が得られた。
【００５９】
ここで使用するアルキル、およびアルコキシおよびアラルキルのアルキル部分には、直鎖基および分枝鎖基が含まれる。
【００６０】
アルキルの特定の意味には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが含まれる。
【００６１】
アルコキシの特定の意味には、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびブトキシが含まれる。
【００６２】
アラルキルの特定の意味には、ベンジル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルが含まれる。
【００６３】
アリールの特定の意味には、フェニルが含まれる。
【００６４】
アルキルアミノの特定の意味には、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノおよびブチルアミノが含まれる。
【００６５】
ジアルキルアミノの特定の意味には、ジメチルアミノおよびジエチルアミノが含まれる。
【００６６】
窒素原子を１個〜２個含有する六員環ヘテロアリール環としてのＡｒの特定の意味には、２−、３−および４−ピリジル、２−ピラジニル、２−および４−ピリミジニルおよび３−および４−ピリダジニルが含まれる。
【００６７】
窒素、酸素およびイオウから選択したヘテロ原子１個〜２個を含有する五員環ヘテロアリール環としてのＡｒの特定の意味には、３−、４−および５−イソチアゾリル、２−、４−および５−オキサゾリル、２−、４−および５−チアゾリル、２−および３−フリル、ならびに２−および３−フリルが含まれる。
【００６８】
ハロゲンとの用語は、他に指示がなければ、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを表わす。
【００６９】
＊は、ＲまたはＳ立体配置の光学活性キラル中心を表わす。
【００７０】
本発明を、さらに、以下の実施例に関連して例示するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００７１】
（実施例１：（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの合成）
（Ａ．Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドから誘導したラセミ酪酸エステルの調製）
ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（２５ｇ）およびトリエチルアミン（１５ｍｌ）を、アセトニトリル（１５０ｍｌ）中にて、０〜５℃で撹拌し、１０℃未満で、１５分間にわたって、ブチリルクロライド（１０ｍｌ）を添加した。１０℃未満で２時間４５分後、さらにトリエチルアミン（２ｍｌ）およびブチリルクロライド（１ｍｌ）を添加し、この反応系を、２０℃で１時間３０分間撹拌した。このとき、さらにブチリルクロライド（１ｍｌ）を添加した。この反応は、さらに３０分後に、完結した。水（４５０ｍｌ）に次いで酢酸エ
チル（１７５ｍｌ）を添加し、この混合物を１５分間撹拌し、次いで、分離した。その水層を酢酸エチル（１７５ｍｌ）で再抽出し、次いで、合わせた有機抽出物を５０％ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、濾過し、そしてエバポレートした。このオイルを、熱ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）（６０ｍｌ）に溶解させ、１０分間にわたってヘキサン（４００ｍｌ）をゆっくりと添加し、次いで、１時間にわたって５℃まで冷却することにより、結晶化した。５℃で３０分後、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドから誘導したラセミ酪酸（ｂｕｔｒｙｉｃ）エステルを濾過により除き、ヘキサン（５０ｍｌ）で洗浄し、そして真空中で４０℃で乾燥した。収量：２６ｇ（８６％）。
【００７２】
（Ｂ．Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドから誘導した酪酸エステルの酵素的加水分解）
５ミリモルのリン酸二水素カリウム溶液（５０ｍｌ）を、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（２ｍｌ）でｐＨ７に調整し、ブタ膵臓リパーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、Ｔｒｅｆｏｒｅｓｔ、ＵＫ）（０．２ｇ）を添加し、そのｐＨを、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（２ｍｌ）で７．１に再調整した。Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（１ｇ）から誘導したラセミ酪酸エステルをＭＴＢＥ（１０ｍｌ）に溶解し、そして上の反応系に添加し、さらにＭＴＢＥ（２ｍｌ）で洗浄した。この反応系を、最初に７．０５ｍａｘ／７．００ｍｉｎにｐＨ制御した状態で、３８℃で撹拌した。２４時間後、さらにブタ膵臓リパーゼ（０．８ｇ）を添加し、そのｐＨを７．５５ｍａｘ／７．５０ｍｉｎに調整し、さらに４２時間そのままにし、その時点で、全体で１０ｍｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。この反応混合物を２Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）でｐＨ３．５に酸性化し、１５分間撹拌し、次いで、酢酸エチル（３０ｍｌ）を添加し、この混合物をさらに１０分間撹拌した。次いで、この混合物を濾過し、その残留物を酢酸エチル（２０ｍｌ）で洗浄した。その水相を分離し、そして酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を５０％ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、濾過し、そして部分的に結晶化したオイルになるまでエバポレートした。収量：０．９５ｇ。この生成物は、（Ｒ）−アルコール（９９％鏡像異性体過剰）およびエステルの混合物であった。
【００７３】
（生成物の分離）
この生成物は、エステルを除去するための５％酢酸エチル／トルエンに次いでアルコールを除去するための５０％酢酸エチル／トルエンで溶出するＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、分離した。アルコール収量：３３８ｍｇ；９７．６％鏡像異性体過剰の（Ｒ）−鏡像異性体。エステル収量：４１５ｍｇ。
【００７４】
（Ｃ．回収エステルの加水分解）
回収エステル（４１５ｍｇ）をメタノール（２５ｍｌ）に溶解し、１００°ＴＷ水酸化ナトリウム溶液を添加し、そして２０℃で３０分間撹拌した。水（７０ｍｌ）を添加し、この混合物を２Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）でｐＨ２まで酸性化し、次いで、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。これらの有機抽出物を５０％ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、濾過し、そして白色固体になるまでエバポレートした。（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの収量：２９７ｍｇ（７１．７％、９８．５％鏡像異性体過剰）。
【００７５】
（実施例２：エステルの加水分解速度および反応の特異性に対する酸部分の効果）
ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドおよび対応する酸塩酸塩から、一連のエステルを調製した。これらを、ブタ膵臓リパーゼにより切断させて、２４時間後に分析した。
【００７６】
リン酸緩衝液（５０ｍｌ）を３８℃でｐＨ７．６に調整し、酵素（０．２ｇ）を添加し、そのｐＨを７．６に再調整した。ＭＴＢＥ中のＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（１．０ｇ）から誘導したラセミエステルを添加し、続いて、ＭＴＢＥ（合計１２ｍｌ）で洗浄し、次いで、この混合物を、自動滴定機および０．１Ｎ  ＮａＯＨを用いて、ｐＨ制御下にて、約３８℃で撹拌した。この反応の終了時点で、この混合物のｐＨを２Ｎ  ＨＣｌで５未満まで調整し、その生成物を酢酸エチルに抽出した。このエステルおよびアルコールは、クロマトグラフィーにより分離してもよく、回収エステルは、メタノール中のＮａＯＨを用いて加水分解してもよい。この（Ｒ）および（Ｓ）アルコールは、Ｃｈｉｒａｃｅｌ  ＯＪ（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）カラムを用いた高速（ｈｙｇｈ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析して、その鏡像異性体の純度を決定した。
【００７７】
その転化率は、その安息香酸エステルおよび酢酸フェニルの反応（これらは、極めて遅い）以外は、その（Ｒ）アルコールを未反応エステルから分離した後に、この（Ｒ）アルコール生成物の鏡像異性体過剰度と共に、測定した。結果を、表１に示す。
【００７８】
（表１）
【００７９】
【表１】
2006345873.tif 000024
このモノクロロ酢酸エステルは、試験した他のエステルのいずれよりも相当に速く加水分解した。この反応は、５０％の点を優に超えて継続し、残留エステルから回収した（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド中では、検出可能な（Ｒ）異性体は存在せず、このことは、良好な選択性を意味する。
【００８０】
（実施例３：Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドおよび酪酸から形成したラセミエステルの加水分解）
Ａ．スキーム２に従って、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸および４−アミノベンゾフェノンから、ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドを調製し、その酪酸エステルに転化した。この酪酸エステルを、一連のエステラーゼおよびリパーゼに対してスクリーニングした。３０℃でｐＨ７．５に維持した緩衝液中で、この酵素（０．１ｇ）に、ＤＭＳＯ（０．３ｍｌ）中のＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（０．５ｇ）のラセミ酪酸エステルを添加した。結果を、表２に示す。
【００８１】
（表２）
【００８２】
【表２】
2006345873.tif 000025
Ｂ．スキーム２に従って、ラセミ３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸および４−アミノベンゾフェノンから、ラセミＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドを調製し、その酪酸エステルに転化した。この酪酸エステルを、ブタ膵臓リパーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）を用いて加水分解した。３０℃でｐＨ７．５に維持した緩衝液中で、この酵素（０．１ｇ）に、ＭＴＢＥ（５ｍｌ）中のＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド（０．５ｇ）のラセミ酪酸エステルを添加した。ブタ膵臓リパーゼを用いると、この反応は、２日間で約２５％の転化率まで進行し、そして所望の（Ｓ）鏡像異性体は、極めてわずかしか加水分解しなかったことが明らかとなった。さらに多くのブタ膵臓リパーゼ（０．２ｇ）を添加すると、さらに３時間後に、３５％の反応が得られ、ワークアップにより、約９９％鏡像異性体過剰で、この（Ｒ）アルコールが得られた。この生成物をクロマトグラフィーにかけて、９９％鏡像異性体過剰の（Ｒ）アルコールが得られたが、加水分解後の回収エステルは、５０％の鏡像異性体過剰を有していた。
【００８３】
この反応は、１：１（ｗ／ｗ）の酵素：基質を用いると、２日間でほぼ完結し、回収エステルを加水分解した後、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドの注入ラセミ酪酸エステルを基準にして、収率３５％で９８．５％鏡像異性体過剰で（すなわち、利用可能な（Ｓ）エステルの７０％）、（Ｓ）−（−）−Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミドが得られた。
【００８４】
（実施例４：３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエステルの酵素的分割）
７．１０ｍａｘ／７．０７ｍｉｎに設定したｐＨ制御器を用いて、３８℃で、これらの反応を行った。５ミリモルのリン酸二水素カリウム溶液（１００ｍｌ）および固定化Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ(R)  ＳＰ４３５、Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｎ）（２ｇ）を共に撹拌し、そのｐＨを、３８℃で、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｌ）で、７．１に調整した。必要に応じてメチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（５０ｍｌ）または第三級ブタノール（５０ｍｌ）に溶解した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（５ｇ）のラセミメチルエステル、エチルエステルまたはブチルエステルを添加した。この反応混合物を、約５０％の加水分解に対応する量の０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液が添加されるまで、この反応混合物を撹拌した。必要に応じて、この加水分解の速度を上げるために、より多くの量の酵素を添加してもよい。
【００８５】
さらにＭＴＢＥ（５０ｍｌ）を添加し、この反応混合物を１５分間撹拌し、次いで、濾過し、その残留物をＭＴＢＥ（１５ｍｌ）で洗浄した。その水層を分離し、そしてＭＴＢＥ（３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、次いで、濾過し、そしてエバポレートして、未反応エステルを得た。このエステルの鏡像異性体割合は、キラルシフト試薬（例えば、２，２，２−トリフルオロ−１−（９−アンスリル）エタノール（ｔｆａｅ））を用いるＮＭＲ分析により決定できる。この分離から得た水層を約ｐＨ２まで酸性化し、そしてＭＴＢＥまたは酢酸エチルのいずれか（２×５０ｍｌ）で抽出した。これらの有機抽出物をケイソウ土（２ｇ）で濾過し、ブラインで洗浄し、濾過し、そしてエバポレートしてさせて、分割３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸を得、これは、その固体の濾出前に、ヘキサンで粉末化できる。この酸の鏡像異性体純度は、Ｌ−（−）−α−メチルベンジルアミンの存在下にて、ＮＭＲにより決定し得る。
【００８６】
（ｉ）３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のメチルエステル、エチルエステルおよびブチルエステルの共溶媒なしの加水分解の結果を、表３にて、以下に示す。
【００８７】
【表３】
2006345873.tif 000026
（ｉｉ）種々の共溶媒を用いた３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエチルエステルの加水分解の結果を、表４にて、以下に示す。
【００８８】
【表４】
2006345873.tif 000027
（実施例５：３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエステルの酵素的分割）
（実施例５Ａ）
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかにて反応を行った：
（ａ）５０ｍＭクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６、４ｍｌ）を含有する７ｍｌガラスバイアル。
【００８９】
この緩衝液に、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエチルエステル（４０ｍｇ）を懸濁し、酵素（１０ｍｇ）を添加して、この反応を開始した。これらの反応系を２２℃で穏やかに撹拌した。または
（ｂ）５ｍＭクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６、３０ｍｌ）を含有する５０ｍｌジャケット付きガラス反応容器。
【００９０】
この緩衝液に、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエチルエステル（３００ｍｇ）を懸濁し、そのｐＨを、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて、７．６に再調整した。酵素（７５ｍｇ）を添加して、この反応を開始した。これらの反応系を２８℃で撹拌し、そのｐＨを、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いた自動滴定により、７．６で維持した。
【００９１】
この反応混合物の試料（０．２ｍｌ）を一定間隔で取り出し、そしてヘキサン（１．８ｍｌ）で抽出した。ガスクロマトグラフィーにより残留エステル濃度を測定することにより、加水分解の程度について、試料を分析した。自動滴定機で反応を行った場合、加水分解の程度はまた、水酸化ナトリウム溶液の消費からも決定できる。
【００９２】
このエステルの濃度は、以下の条件下にて、ガスクロマトグラフィーにより決定した：クロマトグラフ：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ８５００；カラム：ＤＢ５（３０メーター）、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；オーブン：１２０℃；検出器：２５０℃；注射器：２５０℃；キャリヤーガス：ヘリウムガス；圧力：８ｐｓｉ；検出器：ＦＩＤ。このエチルエステルの保持時間は、２．８分間であった。
【００９３】
残留エステルの鏡像異性体過剰もまた、以下の条件下にて、ガスクロマトグラフィーにより決定した：クロマトグラフ：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ８５００；カラム：ＣＰ  Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ  ＣＢ（２５メーター）、Ｃｈｒｏｍｐａｋ；オーブン：温度勾配等温１〜８０℃、３分間、ランプ−２０℃／分で２分間、等温２〜１２０℃で６分間；他の設定は、非キラル分析と同じである。この（Ｓ）−鏡像異性体の保持時間は、４．０分間であり、そしてこの（Ｒ）−鏡像異性体の保持時間は、４．１分間であった。
【００９４】
これらの結果を、表５に示す。表５で示すように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅおよびＳＰ５３９酵素による３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエチルエステルの加水分解により、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸のエチルエステルの（Ｒ）鏡像異性体に対して、良好な選択性が得られた。
【００９５】
（実施例５Ｂ）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ（Ｓｉｇｍａ）およびＳＰ５３９（Ｎｏｖｏ）からの酵素（プロテアーゼ）もまた、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸のブチルエステルを加水分解するのに使用した。分析操作は、実施例５Ａでエチルエステルに対して使用したものと同じであった。このブチルエステルに対する保持時間は、４．６分間であった（ＤＢ５カラム）。その（Ｓ）−鏡像異性体に対する保持時間は、６．１分間であった。その（Ｒ）−鏡像異性体に対する保持時間は、６．３分間であった（ＣＰ  Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ  ＣＢカラム）。
【００９６】
実施例５Ａでエチルエステルに対して記述したものと同じｐＨ自動滴定機にて、実験を行った。時間の経過ごとに、試料を取り出した。結果を、表６および７に示す。
【００９７】
【表５】
2006345873.tif 000028
【００９８】
【表６】
2006345873.tif 000029
【００９９】
【表７】
2006345873.tif 000030
（実施例６：３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニトリルの酪酸エステルの酵素的分割）
この反応は、７．５ｍａｘ／７．４５ｍｉｎに設定したｐＨ制御器を用いて、３８℃で行った。５ミリモルのリン酸二水素カリウム溶液（１００ｍｌ）および粗ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）（１ｇ）を共に撹拌し、そのｐＨを、３８℃で、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍｌ）を用いて、７．５に調整した。ＭＴＢＥ（２０ｍｌ）に溶解した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル（５ｇ）のラセミ酪酸エステルを添加し、さらに多くのＭＴＢＥ（５ｍｌ）で洗浄した。７時間後、さらにＰＰＬ（１ｇ）を添加し、この反応系を一晩撹拌し、その時点で、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（３０ｍｌ）を添加した。さらに７時間後、さらに０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１４ｍｌ）を添加し、さらに多くのＰＰＬ（２ｇ）を添加したが、中和のためには、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（１０ｍｌ）を必要とした。この反応系を、さらに２日間撹拌し、その後、さらに０．１Ｎ  ＮａＯＨ（６９ｍｌ）を添加した（理論量１１９ｍｌに対して、酵素触媒加水分解により、全体で１１３ｍｌを消費した）。
【０１００】
ＭＴＢＥ（５０ｍｌ）、ケイソウ土（２ｇ）および２Ｎ塩酸（５ｍｌ）を添加して、ｐＨを５に調整し、この反応混合物を１５分間撹拌し、次いで、濾過した。その水層を分離し、そしてＭＴＢＥ（５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を５０％ブラインで洗浄し、次いで、濾過し、そしてエバポレートした。得られたオイル（３．３ｇ）を、溶離液としてジクロロメタンを用いたシリカゲルフラッシュカラム上にて、クロマトグラフィーにかけた。未反応エステル（９５０ｍｇ）を回収したところ、シフト試薬の存在下でのＮＭＲにより、単一の鏡像異性体であることが明らかとなった。
【０１０１】
回収したエステル（１００ｍｇ）、水（１ｍｌ）および濃塩酸（２ｍｌ）を、１００℃で６時間、共に加熱し、次いで、２０℃で一晩撹拌した。飽和ブライン（２ｍｌ）を添加し、この混合物をＭＴＢＥ（２×５ｍｌ）で抽出した。このＭＴＢＥ溶液を濾過し、そしてエバポレートして、オイルおよびある種の固体を得、これを、ヘキサン（２ｍｌ）で粉末化した。この固体（１４．５ｍｇ）を濾過により取り除き、そしてヘキサン（５ｍｌ）で洗浄した。Ｌ（−）−α−メチルベンジルアミンの存在下でのＮＭＲにより、これは、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸の（Ｓ）−鏡像異性体であることが明らかとなった。