(57)【要約】【課題】モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するマウスモノクローナル内部像抗−イディオタイプ抗体(Ａｂ２)の発生、産生および特徴付を提供すること。【解決手段】モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナルマウス内部像抗−イディオタイプ抗体(Ａｂ２)により解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナルマウス内部像抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)であって、Ａｂ１に対し１０倍過剰またはそれ以下の濃度において、ＢＲ５５−２マウスＩｇ２ａのルイスＹ陽性ヒト乳癌細胞系に対する結合阻害で評価したとき、９５％またはそれ以上の阻害能を有する、内部像抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナルマウス内部像抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)を、薬理学的に許容可能なアジュバント、担体または希釈剤と共に含む、ルイスＹ炭水化物発現細胞に対する免疫応答を産生するための免疫化用医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナルマウス内部像抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)を含む、ＢＲ５５−２のイディオタイプおよびＢＲ５５−２に対する結合特性を有する分子の定量的測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１.背景および導入
免疫系を使用する一つの研究は、イディオタイプ的相互作用を基本にしている。一つの抗体を他のものと区別する、Ｉｇ分子の抗原結合部位中および回りの独特な抗原決定基はイディオトープとして定義されている。与えられた抗体の可変領域に存在する全てのイディオトープを合わせてそのイディオタイプ(ｉｄ)と呼ぶ。イディオタイプの分子構造は相補性決定領域および可変領域のフレームワーク領域の両方に局所的であり、常にではないが一般的に、特異的に関連する重および軽鎖の両方からなる。
【０００２】
イディオタイプは、同系、同種異系または異種受容体中への抗体(しばしばＡｂ１と呼ぶ)の注射が抗イディオタイプ抗体(しばしばＡｂ２と呼ぶ)の産生を誘発するため、血清学的に定義された実在物である。イディオタイプ／抗イディオタイプ相互作用が存在するという仮定を基にして、生理学的に免疫系の受容体基本制御は、ニールス・ジェルネ(アナリティカル・イムノロジー、１２５Ｃ、３７３、１９７４)により仮定されている。彼のネットワーク理論は、免疫系を、各々抗原決定基(エピトープ)をその結合部位(パラトープ)を通して認識でき、各々本系の他の抗体または細胞表面受容体をそれを表示するイディオトープを通して認識できるＩｇ分子およびＴ−リンパ球上の受容体の収集物として見なす。多くの研究が、イディオタイプおよび抗イディオタイプ受容体がＢ−およびＴ−リンパ球の表面およびその分泌する抗体に存在することを実際証明している。
【０００３】
Ａｂ１およびＡｂ２の間の結合がＡｂ１が引き寄せられる抗原により阻害される場合、抗原認識を司る部位を抗体可変領域上に含むため、イディオタイプは結合部位関連と見なされる。これらの形態的には疑似抗原エピトープであるイディオタイプは、これらのエピトープの内部像と言われる。Ａｂ２および抗原の両方が関連Ａｂ１に結合しているため、それらは与えられた抗原の内部像を意味する同様の三次元構造を分け合っている。原則として内部像抗イディオタイプ抗体は、それから抗原がイディオタイプネットワークを経由して派生する抗原の置換基として見ることができる。従って、これらの代用抗原は活性免疫化プロトコールにおいて使用し得る。例えば、それらは、起源の抗原が明白な免疫反応を誘発するのに充分に免疫化されていなければ、利点を提供する。このように、非免疫源性炭化水素抗原に疑似の好適な内部像抗イディオタイプ抗体は、特にあるワクチン研究に有用であり得る。下記に、これらの論題を更に具体的に扱う。
【０００４】
ハイブリドーマ技術の導入の結果、ほとんどマウス起源であるモノクローナル抗体(Ｍａｂ)が、多くの人の癌の型に対して作られている。異種Ｍａｂにより検出されるほとんど全てのマーカーは、厳密には癌特異的ではないが、癌およびある正常および／または胎児組織に分離する分化抗原である。従って、それらは癌関連抗原(ＴＡＡ)と最も良く呼ばれる。異種Ｍａｂにより検出された人癌マーカーが癌患者の抗癌反応を引き起こせるかどうか、このような抗原が、癌患者の自己の癌に対する反応に実際関連するかどうか、各々のＴＡＡの性質に依存するが、まだ充分には理解されてない。同系宿主内で天然に免疫源か、免疫源を製造できるいずれかのＴＡＡは、治療のためにおよび恐らくは予防的利点で抗癌免疫を誘発するのに有効である可能性がある。
【０００５】
癌関連抗原は、しばしば“自己”の一部であり、癌患者における非常に乏しい免疫反応を誘発する。比較して、各々のＴＡＡの構造的エピトープに似ている三次元形を示す内部像抗イディオタイプ抗体は、癌をもつ宿主内では外部分子として認識される。従って、好適な抗−ｉｄＭａｂによる治療的または予防的でさえある免疫化により上昇した免疫反応は、抗癌免疫の原因となり得る。
【０００６】
抗−ｉｄＭａｂによる癌に対する治療的免疫化は、特に疾病の初期段階で好結果である。初期癌の手術の時、しばしば隠れた一つの癌細胞が既に患者の種々の器官内に転移している。これらの微小転移細胞は、しばしば臨床的に証明された癌組織診断および外科的手術による除去の数年後の転移癌の成育の原因となることは知られている。これまで、ほとんど全ての場合において、上皮細胞起源の転移癌が治療不可能である。従って、“最小残余癌”の有効な処置、例えば、巨大転移癌へ成長するのを予防するための隠れている微小転移細胞の破壊は、緊急の医学的要求である。病気のこの段階(アジュバント位置付け)において、既知の化学療法研究はむしろ悪結果である。しかしながら、最小残余病の段階における好適な内部像抗−ｉｄＭａｂによる免疫化による特異的抗癌免疫の導入は、免疫系により微小転移細胞を選択的に除去し得、増加した再発のない生存期間をもたらす。
【０００７】
ＢＲ５５−２に特異性のあるモノクローナル抗体(例えば、ウィスター、欧州特許第２８５０５９号、エム・ブラスチク−スリンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６２(１９８７)３７２−３７９またはゼット・ステプルスキーら、ハイブリドーマ、９(１９９０)２０１−２１０参照)は、人の固体癌の大部分に選択的に発生する炭化水素決定基であるルイスＹ６抗原を同定する。その特性を基本にして、抗体ＢＲ５５−２は、基本的に上皮癌の受動免疫治療に使用できる。
【０００８】
胚発生のある段階の間にもまた発生するルイスＹオリゴサッカライド決定基関連癌はそれ自身ほとんど免疫源性ではない。しかしながら、ルイスＹ抗原の構造エピトープに似せることにより内部像特性を伴う、ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)は、特に疾患の初期段階で、保護的抗癌免疫性を導入するのに有用である。
【０００９】
上皮起源の癌上への発現に加えて、ルイスＹ炭化水素抗原はまた人免疫不全ウィルス(ＨＩＶ)の感染の病理発生にもまた含まれる。後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)は、その病因がリンパ栄養性レトロウィルス(ＨＩＶ)の感染に関連するものとして同定されている明瞭な疾病として認識されている。本疾病は損なわれた細胞媒介免疫および完全な血中ヘルパーリンパ球減少症、特に減少したヘルパーＴ−リンパ球(ＣＤ４)に関連する疾患により特徴付けられる。ＡＩＤＳは、指定された臨床的特性のコンプレックスおよび血中Ｔ−リンパ球減少症により通常明示された前症候群が先である。前症候群は、ＡＩＤＳ関連コンプレックス(ＡＲＣ)と呼ばれる。
【００１０】
ＨＩＶは、過去２０年にわたって徹底的に研究されているウィルスの群に属する。レトロウィルスが人または動物細胞に侵入した場合、ＲＮＡはＤＮＡに変わり、宿主細胞内へ挿入し、次いで細胞自身のものであるかのようにウィルスの遺伝子を処置してしまう。ＨＩＶは数年間この細胞内に潜んで残り、体内の免疫系からの攻撃から安全で、宿主細胞が分裂する度に盲目的に複写されることができる。感染された細胞の活性化により急速なウィルス複写の引金が引かれた場合のみ、産生されたウィルス分子が細胞を殺し、血流中へ流れ出す。
【００１１】
ＨＩＶの特異的特性のため、既に人ゲノム中へ転写されたウィルスおよびプロウィルス両方の遺伝子情報を、既に感染した患者から除くことによる治療は成し遂げるのが難しい。従って、ほとんどの治療の試みは、ウィルス複製の本質的な段階を妨げることにより病気の進行を遅くする薬剤に集まっている。
【００１２】
安全で有効なワクチンの手段によるＨＩＶ−感染の予防および既に感染した患者の治療的介在が主要なゴールである。幾つかのワクチン研究が、前臨床または初期臨床段階で試験されている。それらは主に抗原としてのウィルス構造、特に、主要エンベロープグリコプロテインｇｐ１２０を基本にしている。
【００１３】
ウィルスに対して自然に発生する免疫反応はすべてのウィルスタンパク質に対する抗体および細胞性免疫の活性化からなる。しかしながら、ＨＩＶ−感染に対するこの宿主反応は、しばしば数年にわたり持続する無症候期間後の病気の進行を最終的に停止させるようには思えない。したがって、自然に発生し、最終的には非保護免疫反応の原因となる同じ抗原を基本にしたワクチン研究は、疑わしいままである。一つの主要な問題は、それによりウィルスがタイプ特異的中和抗−ｇｐ１２０抗体の攻撃から逃れられるＨＩＶの広範な異質性である。
【００１４】
ワクチンによる有効なＨＩＶの防御は、２つ：一つは血流中のウィルスの自由な移動に対して、もう一つは既に感染された細胞に対しての防御方法が必要である。インビトロおよびインビボＨＩＶ感染細胞は、その表面に変化したグリコシル化パターン、すなわちルイスＹ炭化水素決定基を示すことは知られている。本抗原が通常ある胎児発育段階の間においてのみ発生し、種々の悪性度にまた関連するため、ＨＩＶ−感染細胞上の発現は、レトロウィルス形質転換により誘発されたその別の分化状態を反映し得る。したがって、この表面表現型は、人ゲノムのＨＩＶによる形質転換に対する独特な細胞性宿主反応に似ている。
【００１５】
ＨＩＶ外被グリコプロテインは、感染細胞の機械的グリコシル化により行われる。従って、ＨＩＶにより製造される感染細胞のグリコシル化パターンの変化はまた自由に遊離されるウィルス分子上に見られる。結果として、このような細胞内で産生するＨＩＶの外被グリコプロテインは、またルイスＹ炭化水素決定基からなる。従って、ルイスＹオリゴサッカライドは、ＨＩＶ感染細胞および遊離ＨＩＶ−分子の両方に発現される特異的宿主反応を示す。
【００１６】
上記の考慮を基にして、ルイスＹ構造は、遊離ウィルスおよびＨＩＶ−感染細胞の両方に対するワクチン化法の使用の重要な必要性を満たす。更に、一般に、宿主がＨＩＶに対して反応するためには、ルイスＹ抗原はＨＩＶ種から独立して、そのウィルスの遺伝的変異性により影響を受けない。不幸にも、その炭化水素構造およびその胎児分化抗原としての“自己”特性を基本にして、ルイスＹはそれ自身ほとんど免疫源性ではない。この抗原に対する自然の免疫反応は人では検出されていない。しかしながら、ルイスＹ抗原の構造エピトープに似せることにより内部像特性を有するＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)は、ウィルス種と無関係な、遊離ＨＩＶおよびＨＩＶ感染細胞に対する予防的および治療的免疫の導入に有用であり得る。
【００１７】
独特なワクチンとしてのその予防的および治療的使用に加えて、モノクローナル内部像抗−ｉｄ抗体は、それが発生した抗体のイディオタイプに対して非常に特異的な試薬である。それらはほとんどＡｂ１の結合領域を排他的に認識する。この認識パターンはＡｂ１の他の決定基とは無関係である。言い換えると、好適な抗−ｉｄＭａｂは、その正確な三次元構造において、Ａｂ１の独特なイディオタイプからなる任意の分子を選択的に同定にする。従って、これらの抗−ｉｄＭａｂは、Ａｂ１のＦ(ａｂ')２−、Ｆａｂ−およびＦｖ−断片およびその変更変異体(変更変異体は異なった定常領域、例えばマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１からなるが、同一のイディオタイプを分けあっている)に、同等の親和性で結合する。加えて、内部像抗−ｉｄＭａｂのこの高い特異的認識パターンはまた組み換えＤＮＡ技術により得られた親マウスＭａｂの変異体を含む。
【００１８】
人の受動免疫治療におけるマウス抗体の反復使用により可能性のある問題に打ち勝つために、マウス／人キメラＭａｂが、選択した親マウスＭａｂの可変領域と人の定常領域を結合させることにより産生できる。人血清におけるこのようなマウス／人キメラＭａｂの検出のために、これらのキメラＭａｂが人の免疫グロブリンで自然に発生するのと同じ定常領域を有するため、非常に特異的な試薬が必要である。親マウスＡｂ１に対して発生した内部像抗−ｉｄＭａｂは、それ由来のキメラ抗体をまた認識する。これにより、このような抗−イディオタイプＭａｂが、例えば大過剰の正常人免疫グロブリンの存在下、マウス／人キメラＭａｂの血清濃度の特異的および感受性定量的測定に有用な試薬である。受動免疫治療に使用するための臨床的に興味深い特性によりＭａｂの特性を更に改善するために、親マウス抗体の最小必要部分、相補性決定領域(ＣＤＲ)のみが人可変領域フレームワークおよび人定常領域と結合している“完全に人化した”抗体が、組み換えＤＮＡ技術により構築できる。これらの“完全に人化した”Ｍａｂの設計および構築のために、配列相同性および分子造形モデルが、更に免疫源性は減少しているが、結合特性は有するマウスおよび人配列要素の組み合わせの選択のために使用される。親マウスＡｂ１のイディオタイプに対して発生したある内部像抗−ｉｄＭａｂは、もし以下の要求：
ａ)人化変異体の結合領域の三次元構造が、親マウス抗体のものと非常に似ている
ｂ)特異的な抗−ｉｄ抗体が、正確にこの結合領域の三次元構造を認識する(“真正内部像抗体”)
が満たされていれば、ＣＤＲ−移植人化変異体に結合し得る。
【００１９】
従って、上記特性を有する抗−イディオタイプＭａｂは、例えば大過剰の正常人免疫グロブリンの存在下、完全に人化した(ＣＤＲ−移植)Ｍａｂの血清濃度の特異的および感受性定量的測定に特に有用な試薬である。
【００２０】
本発明は、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するマウスモノクローナル内部像抗−イディオタイプ抗体(Ａｂ２)の発生、産生および特徴付に関する。本発明の更なる部分はこれらの抗−イディオタイプＭａｂの、上皮起源の癌および小細胞肺癌およびＨＩＶ−感染が原因の疾病の有効な治療および予防的免疫化のための使用である。更に、これらの抗−イディオタイプＭａｂの、キメラおよび完全に人化された変異体(ＷＯ９２／０３１６５に記載のような)を含むＢＲ５５−２の特性を有する抗体またはその断片および誘導体の高い選択的および定量的測定およびＢＲ５５−２の特性を有する分子に一般に適応可能な選択的免疫親和精製法への使用もまた本発明の一部である。
【００２１】
２.抗体ＢＲ５５−２のイディオタイプに対するマウスモノクローナル抗−イディオタイプ抗体の発生および特徴付
望ましくない抗−イソタイプ免疫反応を最少にする試みにおいて、ＢＲ５５−２、マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')２−断片を免疫化のために選択した。マウスＭａｂＢＲ５５−２のイディオタイプに対するマウス抗−ｉｄＭａｂの充分な発生のために、同系宿主における好適な免疫反応を上昇させるために、免疫源性を最大にすることが重要である。したがって、Ｆｃ−部分が欠けている(開裂および精製は欧州特許出願第５２８,７６７号に記載)Ｆ(ａｂ')２−断片を、免疫源担体としてのキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に、記述された方法(ジェー・カールソンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７３、７２３、１９７８)にしたがって、異種二機能性リンカーＮ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(＝ＳＰＤＰ)を使用して結合した。
【００２２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、マウスＭａｂを発生させるのに典型的なプロトコールを基本にして、フロインド完全アジュバントを使用してＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３−Ｆ(ａｂ')２−ＫＬＨ−接合体で免疫化した。反復免疫化に続いて、マウス脾臓細胞を、マウスミエローマ細胞系ＳＰ２／０と融合した(実験の詳細は実施例１参照)。
【００２３】
培養されたハイブリドーマ細胞の好適な選択のために、その上清の連続した試験を行った。選択は以下の基準：
ａ)上清中のマウスＩｇＧの濃度を測定することによるハイブリドーマの分泌率(実験の詳細は実施例２参照)。大量のマウスＩｇＧを産生する細胞は、単一細胞培養にサブクローン化した。
ｂ)ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')２−断片に対する選択した上清の結合(実験の詳細は実施例３参照)。
ｃ)選択した上清による、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａのルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５人乳癌細胞への結合の阻害(実験の詳細は実施例４参照)。
を基本にした。
【００２４】
後者の試験は、Ａｂ２'の内部像特性を示すために考案される。免疫化に使用したＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')２−断片のＡｂ２'認識残存定常領域の検出を最少にするために、ＢＲ５５−２のマウスＩｇＧ２ａ変更変異体を結合に使用した。本試験は、試験ａ)のＩｇＧ濃度測定試験を基本にした定量法で行った(実施例２)。更に、過剰の非特異的マウス−ＩｇＧを、ＢＲ５５−２のイディオタイプに特異的でないＡｂ２'の検出を避けるために、本阻害実験に加えた。９５％以上の阻害能力(ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａのＳＫＢＲ５細胞系への結合の阻害)を有するＩｇＧを産生するハイブリドーマを選択した。
【００２５】
上記の試験法を使用して、６種の異なったハイブリドーマが最終的に選択され、発展させた(Ｅ４、Ｃ１１、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)。すべての６種のハイブリドーマは、マウスＩｇＧ１を、ウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ１／ペルオキシダーゼ(ツィメッドのような試薬)を使用したサブタイプＥＬＩＳＡで検出されたように産生する。
【００２６】
全ての６種のハイブリドーマを、ローラーフラスコ(Ｇ培地中３７℃、５％ＣＯ２；３、４日毎に培地を変える)中で培養し、上清を回収し、続いて精製した。
【００２７】
各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂを含有する各々の上清を、免疫親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。一般に、親和性クロマトグラフィーは非動化配位子と興味の対象の物質の間の相互作用を基本にしている。抗−イディオタイプ抗体ＢＲ５５−２の場合、親和性カラムのための非常に特異的な配位子は、選択した抗−イディオタイプＭａｂに結合するＭａｂＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａである(実験の詳細は実施例５参照)。
【００２８】
単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ(Ｅ４、Ｃ１１、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)の精製度は、分析的ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動により試験した。全ての６種の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの純度は＞９５％であった(実験の詳細は実施例６参照；ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動は図１および２に示す)。
【００２９】
精製抗−ｉｄＭａｂを、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５細胞系への結合を阻害する能力を測定することにより、定量的に特徴付けた。全ての抗−ｉｄＭａｂは、１：１化学量論を基本にしてＡｂ１のその抗原への結合を阻害する(実験の詳細は実施例７参照：代表的な結果を図３に示す)。
【００３０】
上記の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの内部像特性およびその代用癌抗原としての使用の決定的な確証は、異なった種の癌関連抗原に対するＡｂ３反応を発生する能力に基づく。エヌ・ジェルネのネットワーク理論に従って、内部像抗−ｉｄＭａｂ(Ａｂ２)による免疫化により誘発される抗体(Ａｂ３)は、Ａｂ１と同様の結合特性を有する。従って、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂでの免疫化により引き起こされる免疫反応は、ルイスＹ抗原陽性癌細胞に特異的である。結果として、防御抗癌免疫は人において抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる免疫化により誘発し得る。
【００３１】
Ａｂ３反応の特性の調査のために、ウサギおよびアカゲザルを、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃４ならびに担体およびアジュバントとしての水酸化アルミニウムで免疫化した。この緩和アジュバントは、人に使用する異なったワクチンに広く使用されている。陰性対照として、動物をまた同量の非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化した。５週間の間の４回の免疫化の後、血清を９週目で回収した(実験の詳細は実施例８参照)。血清ＩｇのルイスＹ抗原陽性ＳＫＲＢ５乳癌細胞系およびルイスＹ抗原陰性ＷＭ９メラノーマ細胞系への結合を測定した(実験の詳細は実施例９および１０参照)。
【００３２】
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４は、ウサギおよびアカゲザルの両方において、高抗体価液性免疫反応を示す。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物の血清Ｉｇは、ルイスＹ抗原陽性ＳＫＲＢ５細胞系に選択的に結合するが、ルイスＹ抗原陰性ＷＭ９メラノーマ細胞系には結合しない。比較して、非特異的マウス−ＩｇＧ１での免疫化では、ほとんど全く癌細胞結合血清Ｉｇは検出されない。これらの結果は表１に要約する。図４および５において、ウサギおよびアカゲザルの免疫化前および免疫化血清により、細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲＢ５細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物の血清ＩｇのＳＫＢＲ５細胞への結合は、血清の１：１００００希釈でもまだ検出できる。
【００３３】
最初の免疫化課程の２年後、各々のアカゲザルは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス−ＩｇＧ１の最初の単一追加抗原注射を受ける。同様の方法で、２回目の単一追加抗原注射を、最初の免疫化の３年後(＝最初の追加免疫の１年後)に受ける(実験の詳細は実施例８参照)。血清をこれらの追加免疫の前および後に回収する。
【００３４】
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイタープレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にしたＥＬＩＳＡを使用して測定した(実験の詳細は実施例１３参照)。全てのアカゲザルの血清において、最初の免疫化工程および最初および２回目の免疫追加の後に、非常に高い抗体価免疫反応が見られる。Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合は、血清の１：５００００希釈でもまだ観察できる。幾分低いが、まだ非常に明白な抗体価が、免疫追加の前にも血清で見られる。これらの結果は図６−８に示す。
【００３５】
非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理したアカゲザルの液性免疫反応もまた上記と同じＥＬＩＳＡを使用して検出した(実験の詳細は実施例１３参照)。期待されるように、Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に結合する血清抗体価は、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの血清で見られる抗体価より低い。非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの免疫反応が、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の定常領域と交差反応するが、抗−ｉｄの超可変領域を指向する免疫反応の部分が欠けている。これらの結果は図９−１０に示す。
【００３６】
免疫反応の癌特異性の証明のために、最初の免疫工程後および追加免疫の前および後、サル血清Ｉｇの数種のルイスＹ抗原陽性癌細胞系(乳、胃、腸および小細胞肺癌)およびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系への結合を測定した(実験の詳細は実施例１０参照)。最初の免疫化の２年後および最初の追加免疫前に抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で処置したアカゲザルにおいて、ルイスＹ抗原陽性癌細胞へ結合する血清Ｉｇはまだ検出できる。最初の追加免疫に続いて、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物において、特異的にルイスＹ抗原陽性癌細胞に結合する血清Ｉｇの途方もなく上昇した抗体価が観察されるが、抗原陰性細胞系への結合はほとんど全く観察されない。非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清において、どの時点でも特異的結合は観察されない。同様な結果が２回目の追加免疫の前および後で見られる。種々の時点での、数種の癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果は、図１１−２０に示す。
【００３７】
最初の免疫化工程の前および後および最初の追加免疫の前および後の異なったサル血清でも同様のＩｇの免疫反応のパターンが、ルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５細胞の膜調整物への結合実験で証明できる(実験の詳細は実施例１１参照)。結果は表２に要約する。
【００３８】
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化することによりアカゲザルで誘発された液性免疫反応の更なる詳細を更に分析するために、ワクチン処理したサルの異なった血清をセファロースと組み合わせた抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を導入したカラムで免疫精製した(実験の詳細は実施例１２参照)。この選択的一工程法により、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に対する完全な液性免疫反応が、全ての他の妨害血清タンパク質から分離される。最初の実験において、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルのＩｇを、最初の免疫化工程の９週間後に得られた血清から免疫精製した。第２の実験において、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルのＩｇを、２回目の免疫追加の４及び９週間後に得た溜た血清から免疫精製した。その抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４カラム上での保持を基本にして、得られたＩｇ−フラクションは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４抗体分子の種々のエピトープに、特異的に結合する。これらのＩｇ−フラクションは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の定常領域に対する抗体(抗−アイソタイプ免疫反応)および、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を含む可変領域に対する抗体(抗−イディオタオプ免疫反応)を含む。導入部で述べたイディオタイプネットワーク理論を基にして、後者の部分(ＡＢ３)は、ＢＲ５５−２特異性を有する抗体(ＡＢ１)と同等な結合特性を示すため、特に重要である。
【００３９】
２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよび抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４のエスケーパーフラクションの結合を測定した(実験の詳細は、実施例１３参照)。免疫精製Ｉｇ−フラクションは、強く抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に結合するが、エスケーパーフラクションでは結合は検出されない。この結果により、本免疫精製法の選択性および効力が証明される(結果は図２１に示す)。
【００４０】
次に、２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよびエスケーパーフラクションおよび親マウスＭａｂ(ＡＢ１)の人化変形の結合特性を、ＳＫＢＲ５乳癌細胞で比較した。本人化ＡＢ１変形(ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１)を、アカゲザルＩｇ(非常に緊密に関連するアカゲザルＩｇにまた結合するヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキシダーゼ)の検出にまた使用した同じ試薬で検出できるため、比較を容易にするために選択した。ほとんど全ての癌細胞結合反応性は、免疫精製Ｉｇ−フラクション中で促進される。この結果により、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の免疫化により誘発されたアカゲザルＩｇとルイスＹ抗原陽性癌細胞系の交差反応性が証明される。更に、重量を基本にして、免疫精製Ｉｇ−フラクションの結合強度は、ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１(ＡＢ１)より僅か５倍少ないだけである。免疫精製Ｉｇ−フラクションのある部分のみが抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を指向し、本ネットワーク理論に従うとこの部分のみがＡＢ１と同等な結合特性を有することを考慮に入れると、この結果は注目すべきである。アカゲザル血清の免疫親和性精製の収率を基にして、免疫精製Ｉｇ−フラクションの抗体価量は約２００μg／ml血清であり、ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１と同等な癌細胞結合特性のＩｇの約４０μg／mlに対応する(結果は図２２に示し、実験の詳細は実施例１０および１２参照)。
【００４１】
免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)とＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１のルイスＹ陽性乳癌細胞系ＳＫＢＲ５およびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系ＷＭ９に対する結合特性の比較を図２３に示す(実験の詳細は実施例１０参照)。ＡＢ３フラクションおよびＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の両方が上記のルイスＹ陽性細胞系に強く結合するが、両方の抗体はルイスＹ陰性細胞系には特異的に結合しない。これらの結果により、ＡＢ３−フラクションおよび人化ＡＢ１変形の結合パターンの類似性が証明される。
【００４２】
ＡＢ３−フラクションの同様な免疫反応性のパターンは、ルイスＹ陽性ＳＫＢＲ５細胞系およびルイスＹ陰性細胞系ＷＭ９の膜フラクションを使用したＥＬＩＳＡによりまた観察される。ＡＢ３−フラクションの実質的な結合は、ルイスＹ陽性細胞膜に対してのみ検出される(結果は図２４に示し、実験の詳細は実施例１１参照)。
【００４３】
免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)の結合特性は、更に数種のルイスＹ陽性人癌細胞系(小細胞肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌)で実証された。免疫精製サルＩｇは、試験した細胞系に強く結合する(結果は図２５に示し、実験の詳細は実施例１０参照)。
【００４４】
ＡＢ１抗体ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３は、癌細胞への結合に続いて、人エフェクター機構の活性化を経由した癌細胞破壊を媒介する。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化して誘発したアカゲザルＩｇの癌細胞破壊の能力を試験するために、免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)を使用した。この実験のために、ＡＢ３−フラクションを最初の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による免疫化工程の９週間後に得たアカゲザルの血清から免疫精製した(上記参照)。このＡＢ３−フラクションを、人ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用したＡＤＣＣ実験において、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)と比較した(結果は図２６に示し、実験の詳細は実施例１４参照)。免疫精製ＡＢ３−フラクションは、高濃度で、人エフェクター細胞の活性化による癌細胞破壊を、マウスＡＢ１と同等に媒介する。この結果により、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でのワクチン処理による選択的癌細胞細胞毒性の示唆が証明される。免疫精製Ｉｇ−フラクションのある部分のみしか、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を指向せず、この部分が癌細胞に結合し、ＡＤＣＣを媒介すると思われるため、高濃度のＡＢ３が必要である。
【００４５】
導入部で述べたように、ルイスＹ炭化水素抗原はまたＨＩＶに感染した人白血球上に発現することが知られている。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清ＩｇのＨＩＶ感染細胞に対する結合行動を調べるため、最初の免疫化工程前および９週間後に得られたサル血清を、人血清中のＨＩＶ−陽性性を検出するために作られた商業的に入手可能な試験キットで試験した。本試験は、抗−人ＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用した間接免疫蛍光により検出された人血清ＩｇのＨＩＶ−感染人Ｔ細胞系ＰＡＬＬへ結合する能力を基本にしている。人およびアカケザルのＩｇの大きな類似性のため、試験キットの本来の試薬はまたアカケザルＩｇにも適応できる。非感染ＰＡＬＬ細胞への結合を対照として使用する(実験の詳細は実施例１５参照)。
【００４６】
正常アカケザル血清では、ＨＩＶ感染および非感染ＰＡＬＬ細胞の両方のバックグラウンド免疫蛍光は、正常人血清で検出されたバックグラウンド免疫蛍光より僅かに高い。しかしながら、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルの血清ＩｇのみがＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞と実質的に結合するが、非感染ＰＡＬＬ細胞への結合はほとんど全く検出されない。非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清ＩｇのＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞に対する反応性は、明らかにあまり促進されておらず、正常サル血清で見られるバックグラウンドの免疫蛍光と非常に近い(結果は表３に要約する)。
【００４７】
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルのＩｇは、２回目の免疫追加の４及び９週間後に得た貯蔵血清から、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４カラム(上記参照)を使用して免疫精製した。本免疫精製Ｉｇ(ＡＢ３)の結合特性を、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)と、既に述べた人血清中のＨＩＶ−血清陽性性を検出するために設計された商業的に入手可能な試験キット中で比較した(実験の詳細は実施例１５参照)。免疫精製Ｉｇ−フラクション(ＡＢ３)は選択的にＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞に結合するが、非感染ＰＡＬＬ細胞への結合は検出されない。同様な結合パターンがＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)で見られる。これらの結果は表４に要約する。
【００４８】
種々の癌およびＨＩＶが原因である疾病の予防および処置のための独特なワクチンとしての使用に加えて、本発明で記載のＢＲ５５−２の結合領域に対して発生した内部像抗−イディオタイプＭａｂは、ＢＲ５５−２への結合特性を有するモノクローナル抗体、その誘導体または断片の定量的測定の有力な道具である。例えば、人血清中の全てのマウスのＢＲ５５−２のサブタイプの濃度を選択的に測定するのに使用できる。ＢＲ５５−２の結合領域の三次元構造の認識のため、これらの抗−ｉｄＭａｂは免疫反応性ＢＲ５５−２構造のみに結合する。この特性は、既知の抗−定常領域剤を基本にしたものより優れた検出系を導く。免疫反応性ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａの定量的測定のためのＥＬＩＳＡ系は、実施例１６に記載され、人血清中のＭａｂの典型的な標準曲線は図２７に示す。
【００４９】
本発明で記載の抗−ｉｄＭａｂを基にした同様なＥＬＩＳＡ系が、人血清中のＢＲ５５−２の免疫反応性マウス／人キメラの高度に選択的な定量的測定に適用できる。これらのキメラはＢＲ５５−２の可変領域および人定常領域からなる(例えば人ＩｇＧ１または人ＩｇＧ３)。人血清中での大量に過剰な正常人Ｉｇのため(＞１０mg／ml)、このようなマウス／人キメラは、血清に存在する任意の人Ｉｇに結合する既知の抗−人−Ｆｃ剤を使用して人血清中では検出できない。選択的ＥＬＩＳＡ系は実施例１７および１８に記載し、人血清中での典型的な標準曲線は図２８および２９に示す。
【００５０】
完全に人化したＢＲ５５−２の変異体は、マウス親Ｍａｂの相補性決定領域(ＣＤＲ)を、人のフレームワークおよび定常領域へ融合させることにより構築する。コンピューター造形の手段により、選択した人フレームワークのある点変異が、親マウスＭａｂと比較してルイスＹ陽性癌細胞に対する結合親和性を実質的に損失しない人化変異体を導く。従って、本来のマウスアミノ酸配列の少しの部分のみのこれらの人化変異体は、結合特性が未変化で残っていることを測定する。著しく、本発明で記載の全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂはまたこれらの親マウスＩｇＧ３Ｍａｂの人化ＩｇＧ１変異体のイディオタイプに強く結合する。抗−ｉｄＭａｂのＡＢ１人化変異体への結合行動は、上記のマウス／人キメラＭａｂと同等である。これは、ファルマシアのＢＩＡｃｏｒｅ(商標)系を使用した生物特異的相互作用分析により証明される。殆どの場合、高濃度で、抗−ｉｄＢＲ５５−２およびＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間で殆ど１：１化学量論が観察される。実験の詳細は実施例１９に示し、抗体価曲線は図３０−３５に示す。これらの発見は抗−ｉｄＭａｂの、全てのＢＲ５５−２の変異体の超可変領域の無傷三次元形への結合の結合特性およびその内部像特性を証明する最重要点である。
【００５１】
この独特および選択的認識パターンを基にして、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂはまた、人血清中で、血清中に存在する大過剰の人免疫グロブリンにもかかわらず、ＢＲ５５−２に特性を有する免疫反応性人化抗体の高度に選択的定量測定に使用できる。同じＥＬＩＳＡ系がまたサル血清中でのＢＲ５５−２に特性を有する人化抗体の定量的測定に有用である。例えば、人化ＢＲ５５−２Ｍａｂの受動免疫治療のための、前臨床開発間に必要なサル毒性および薬物動態の研究に非常に重要である。ＥＬＩＳＡ系は実施例２０に記載し、人血清における典型的標準曲線は図３６に示す。
【００５２】
ＢＲ５５−２全ての変異体の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる結合領域の認識はまたＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合をＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１およびＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３と比較することにより証明される。両方のキメラは、一定量の親マウスＭａｂの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合を用量依存的に競合阻害する。この競合ＥＬＩＳＡは実施例２１に記載し、結果は図３７に示す。
【００５３】
ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗原陽性癌細胞系への結合は、補体媒介破壊に必須である。従って、癌細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる阻害は、Ａｂ１の細胞表面上のその抗原への結合を阻止する能力を反映する。ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系に対するＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介された補体依存細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による有効な中和を図３８に示し、実験の詳細は実施例２２参照。
【００５４】
ＢＲ５５−２の無傷結合領域の全ての構造の非常に特異的な認識のため、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂは、全てのＢＲ５５−２の変異体の単一工程免疫精製法に使用できる。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４はＣＨ−セファロース４Ｂと結合する。この免疫親和性材料は、例えばインビトロで培養されたＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の直接の精製に使用できる。キメラＭａｂは、純度＞９５％で、収率７５％で得られた。非常に選択性のため、本免疫精製法はプロテインＡを使用した親和性精製より優れている。実験の詳細は実施例２３、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは図３９に示す。不純物は検出されない。同じ方法が、同様の好結果で、ＣＤＲの移植により得たＢＲ５５−２の人化変異体の細胞培養上清の非常に有効な一工程精製に適応できる。
【００５５】
結論として、ウサギおよびアカゲザルのマウスモノクローナルＩｇＧ１抗−イディオタイプ抗体によるＢＲ５５−２(抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４)に特性を有する抗体のイディオタイプに対する免疫化は、ルイスＹ陽性人癌細胞に特異的に結合する高い抗体価免疫反応を導く。アカゲザルの実験で証明されるように、反復追加免疫化により、抗−癌免疫性が数年維持される。これらの免疫化により人エフェクター細胞存在下で誘発されたＩｇは、癌細胞毒性をＡＤＣＣ中で示す。抗−ｉｄ免疫化の特異性は、アカゲザルの対照群の非特異的マウスＩｇＧ１による免疫化により証明される。非特異的マウスＩｇＧ１に対する実質的免疫反応にもかかわらず、任意の種類の癌細胞への特異的結合は検出されない。
【００５６】
これらの結果により、人における保護的抗癌免疫性の誘発を目的とする治療および予防的活性免疫化のための抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのルイスＹ癌関連抗原の代替物としての使用は、最重要点である。
【００５７】
更に、アカゲザルの抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる免疫化は、選択的にＨＩＶ−感染陽性細胞に特異的にまた結合する高い抗体価免疫反応を導く。これらの細胞は、ルイスＹを発現することが知られている。比較して、アカゲザルの非特異的マウスＩｇＧ１による免疫化は、ＨＩＶ−陽性または陰性細胞への特異的結合を導かない。
【００５８】
これらの結果から、ＨＩＶおよびＨＩＶ感染が原因である疾病の保護的免疫性の誘発を目的とする治療および予防的ワクチン処理のための抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのルイスＹ炭水化物抗原の代替物としての使用は、最重要点である。
【００５９】
抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの予防的および治療的ワクチンとしての使用に加えて、これらの内部像抗−ｉｄＭａｂは、血清中または他の体液中におけるキメラおよび人化変異体を含むＢＲ５５−２に特異性を有する分子の、非常に選択的および定量的測定に有用な試薬である。好適なマトリックスと共有結合したこれらの抗−ｉｄＭａｂは、ＢＲ５５−２に特異性を有するすべての分子の高収率で非常に選択的な単一工程免疫親和性精製にまた使用できる。
【００６０】
以下の実施例は本発明を説明する。略語は以下の意味を有する：
ＡＤＣＣ：      抗体依存性細胞性細胞毒性
ＢＳＡ：        牛血清アルブミン
ＣＤＣ：        補体依存細胞毒性
ＤＭＥＭ：      ダルベッコ修飾イーグル培地
ＥＤＣ：        Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミドヒドロクロリド
ＥＬＩＳＡ:     酵素結合免疫吸着測定
ＦＣＳ：        牛胎児血清
ＨＢＳ：        ヘペス緩衝化食塩水
Ｍａｂ：        モノクローナル抗体
ＮＨＳ：        Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
ＰＢＭＳ：      末梢血単核細胞
ＰＢＳ：        リン酸緩衝化食塩水
RAM-IgG1：      ウサギ抗マウスＩｇＧ１免疫グロブリン
ＲＰＭＩ：      ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチテュート
ＳＤＳ：        ドデシル硫酸ナトリウム
ＫＬＨ：        キーホルリンペットヘモシアニン
ＳＰＤＰ：      Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジル−ジチオプロピオ
ン酸)
ＰＡＧＥ：      ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＩＥＦ：        等電点電気泳動
ＰＥＧ：        ポリエチレングリコール
ＦＩＴＣ：      フルオリンイソチオシアネート
ＩＦＡ：        免疫蛍光測定。
【００６１】
実施例中で記載される材料は以下の通りである：
マイクロタイタープレート：イムノプレートII(ヌンク)
細胞系：
ＳＫＢＲ５:     人乳癌細胞系
ＣＡＴＯ：      人胃癌細胞系
ＳＷ９４８:     人大腸癌細胞系
ＳＷ２：        人小細胞肺癌系
ＷＭ９：        人メラノーマ細胞系
ＰＡＬＬ：      人Ｔ−細胞系
ＳＰ２：        マウスミエローマ細胞系
培地Ａ：        ＲＰＭＩ１６４０＋２ｇ／ｌＮａＨＣＯ３
１００Ｕ／mlペニシリンＧ
１００μg／ml硫酸ストレプトマイシン
４mMグルタミン
１０％ＦＣＳ(熱不活性、γ−グロブリン−不存在)
培地Ｂ：        ＲＰＭＩ１６４０＋２ｇ／ｌＮａＨＣＯ３
１００Ｕ／mlペニシリンＧ
１００μg／ml硫酸ストレプトマイシン
４mMグルタミン
１０％ＦＣＳ(熱不活性)
培地Ｃ：        ＤＭＥＭ
１０％ＮＣＴＣ−１３５(合成培地、ギブコ)
１％ＭＥＭ不必須アミノ酸(ギブコ)
０.５％ピルビン酸ナトリウム
０.５％オキサロ酢酸(シグマ)
２０％熱不活性ＦＣＳ
４mMグルタミン
１００Ｕ／mlペニシリンＧ
１００μg／ml硫酸ストレプトマイシン
培地Ｄ：        培地Ｃ＋１.３６mg／ｌヒポキサンチン
０.３９mg／ｌチミジン
培地Ｅ：        培地Ｄ＋０.４mg／ｌアミノプテリン
培地Ｆ：        培地Ｃ＋マウス胸腺細胞(２５ml培地Ｃに懸濁した一匹のＢａ
ｌｂ／ｃマウスの胸腺細胞)
培地Ｇ：        ＤＭＥＭ
１０％熱不活性ＦＣＳ
４mMグルタミン
１００Ｕ／mlペニシリンＧ
１００μg／ml硫酸ストレプトマイシン
培地Ｈ：        １０mMＮ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−エタン
スルホン酸
３.４mMエチレンジニトロテトラ酢酸
０.１５Ｍ  ＮａＣｌ
０.００５％Ｐ２０(ファルマシア・バイオセンサー・アクチエ                ボラーク、ウプサラ、スウェーデン)
ＰＥＧ：        ポリ−エチレン−グリコール(ＭＷ＝３４００)
１ｇが１mlＤＭＥＭに溶解
ＰＢＳ欠乏：    １３８.０mM  ＮａＣｌ
１.５mM  ＫＯＨ
２.７mM  ＫＣｌ
６.５mM  Ｎａ２ＨＰＯ４
ｐＨ  ７.２
コーティング緩衝液： １５mM  Ｎａ２ＣＯ３
３５mM  ＮａＨＣＯ３
３mM  ＮａＮ３
ｐＨ  ９.６
染色緩衝液：    ２４.３mMクエン酸
５１.４mM  Ｎａ２ＨＰＯ４
ｐＨ  ５.０
洗浄用緩衝液：  ＰＢＳ欠乏中
２％  ＮａＣｌ
０.２％トリトンＸ−１００
基質溶液：      ４０mg  ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド
１００ml染色緩衝液
２０μl  Ｈ２Ｏ２  ３０％
結合緩衝液：    ０.１Ｍ  トリス／ＨＣｌ
０.２Ｍ  ＮａＣｌ
ｐＨ  ７.５
溶出緩衝液：    ０.１５Ｍ  グリシン／ＨＣｌ
０.２Ｍ  ＮａＣｌ
ｐＨ  ２.８
連結緩衝液：    ０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ３
０.５Ｍ  ＮａＣｌ
ｐＨ  ８.０
【実施例】
【００６２】
実施例１：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの発生
１.１：マウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスを各々、ＳＰＤＰを経由してＫＬＨと組み合わせたＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')−断片１００μlで、記載のように(ジェー・カルソンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７３、７２３、１９７８)、以下の計画の腹腔内注射により免疫化する：
０日：接合体１００μg(ＰＢＳ欠乏中１mg／ml)＋フロインド完全アジュバント１００μl
７および２８日：接合体１００μg(ＰＢＳ欠乏中１mg／ml)＋フロインド不完全アジュバント１００μl
【００６３】
最初の免疫化i.v.の８、９、１０および１１日後、全４回の追加免疫(各々ＰＢＳ欠乏中１００μl中接合体１００μg)を与える。１２日に脾臓を無菌的に取り出し、ＰＢＳ欠乏に懸濁し、３回ＰＢＳ欠乏で洗浄する。
【００６４】
１.２：ハイブリダイゼーション
これらの脾臓細胞をＳＰ２／０細胞懸濁液中に１：１の比で加え、９００ｇで５分遠心する。ＰＥＧ−溶液１ml(３７℃)を細胞ペレットに１分以内に滴下し、ＰＢＳ欠乏１ml(３７℃)で翌分以内に希釈する。培地Ｃ１０mlを穏やかに攪拌しながら加え、懸濁液をＰＢＳ欠乏で５０mlに希釈する。懸濁液を８００ｇで５分遠心し、ペレットを培地Ｄに再懸濁し、細胞をマイクロタイタープレート(ヌンク９６)のウェルに、２.５×１０５細胞／ウェルの濃度で移す。一晩、３７℃、５％ＣＯ２でのインキュベーションの後、培地Ｅ１００μl／ウェルを加える。７２時間後および４日毎に培地を新しい培地Ｄに代える。
【００６５】
実施例２：ハイブリドーマ上清中のマウスＩｇＧの定量的測定
ウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ(ノルディック試薬のようなもの：コーティング緩衝液中１：１０００)の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分インキュベーションする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄する。培養２週間後に得られたハイブリドーマ上清の１００μlのアリコートを加え、プレートを３７℃で６０分インキュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ディアノヴァの試薬のようなウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベーションの後、プレートを４回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝液で洗浄する。基質溶液の１００μlのアリコートを加え、色の濃くなるのを５分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４の５０μlのアリコートを加えることにより停止させる。光学的励起を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００６６】
実施例３：ハイブリドーマ上清−ＩｇＧのＢＲ５５−２Ｆ(ａｂ')２−断片に対する特異的結合(ＥＬＩＳＡ)
充分なマウスＩｇＧ(即ち培地ブランクより１０倍以上光学密度が高い)を産生するハイブリドーマを、培地Ｆ中の単一細胞培養にサブクローン化し、培地Ｃ内で更に２週間培養する。上清を、ＢＲ５５−２のＦ(ａｂ')−断片(１０μg／ml；コーティング緩衝液中の希釈)の１００μlのアリコートを使用して実施例２に記載のように試験する。
【００６７】
実施例４：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａのＳＫＢＲ５人乳癌細胞への結合のハイブリドーマ上清−ＩｇＧによる阻害(細胞−ＥＬＩＳＡ)
上記測定で陽性の全てのハイブリドーマ上清を、以下のように試験する：
マイクロタイタプレートをポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミド(２０−３０kD；ＰＢＳ欠乏中２０μg／ml；１００μl／ウェル；３０分、室温)で予備処理し、２回ＰＢＳ欠乏(２００μl／ウェル)で洗浄し、次いで、培地Ｂ中のＳＫＢＲ５細胞懸濁液(４×１０６細胞／ml)５０μl／ウェルと共に一晩４℃でインキュベーションする。上清を除去した後、５０μlグルタールジアルデヒド／ウェル(生理食塩水中０.１％)で５分間、室温で固定し、上清を除去し、細胞をＰＢＳ欠乏／１％ＢＳＡ／０.１％ＮａＮ３２００μl／ウェル中に再懸濁し、１時間室温に置く。上清を除去し、プレートを２回０.０５％トゥイン２０含有ＰＢＳ２００μl／ウェルで洗浄する。
【００６８】
１μg／mlマウス−ＩｇＧに調整したハイブリドーマ上清を１０倍過剰の非特異的マウス−ＩｇＧと共に３０分、３７℃でインキュベーションする。これらのサンプルを０.５μg／mlＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａと共に３０分、３７℃でインキュベーションする。本混合物１００μlを細胞に加え、プレートを１時間、３７℃でインキュベーションする。
【００６９】
混合物の後処理：非結合抗体を２回１００μl／ウェル氷冷０.０５％トゥイン２０含有ＰＢＳで洗い出す。ペルオキシダーゼ−結合抗体(ツィメッド試薬のようなウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。４５分、３７℃でインキュベーションした後、ウェルを３回上記ＰＢＳ／トゥイン２０溶液で洗浄し、次いで基質溶液１００μlを各々のウェルに加える。５分後、色の濃くなるのを４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止させる。抗体の細胞への結合を４９２nmの光学的励起を測定することにより決定する(参考測定６２０nm)。
【００７０】
実施例５：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの免疫親和精製
５.１：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａセファロースの調製
凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ１０ｇを１mM  ＨＣｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM  ＨＣｌ  ２ｌで１５分洗浄する。配位子(ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａ  １２０mg)を連結緩衝液５０mlに溶解し、栓をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１時間１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベーションし、残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクルは、ｐＨ４(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄、続くｐＨ８(０.１Ｍ  トリス、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄から成る。
【００７１】
５.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの単離
クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ＢＩＯ  ＲＥＸ  ＭＰカラム直径１.５cm)をＭａｂＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａセファロース(容量３５ml)で満たす。ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。結合緩衝液による平衡化の後、抗−ｉｄＢＲ５５−２含有条件媒質をカラムに流速１５ml／分でかける。エスケーパーフラクションの溶出の後、結合抗−ｉｄＢＲ５５−２が溶出緩衝液と共に脱着し、脱着後すぐに１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で中和する。
【００７２】
５.３：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの濃縮
溶出抗体溶液(０.１２mg／ml)の濃縮を、ＰＭ１０ジアフロ膜を使用した攪拌アミコン超濾過セル中で行う。ＩｇＧに対する溶質拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最終濃縮は３.７mg／mlである。
【００７３】
実施例６：精製抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの特徴付け
６.１：Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー
カラム：      Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５／５(ファルマシア)
緩衝液Ａ：    ２０mMトリエタノールアミン、ｐＨ７.７
緩衝液Ｂ：    ２０mMトリエタノールアミン、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.７
流速：        １ml／分
検出：        ＵＶ２８０nm
勾配：        直線２％／分
結果：        全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂにおいて＞９５％純度と分かった
【００７４】
６.２：高速サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：      ゾルバックスＧＦ２５０、９.４×２５０mm
緩衝液：      ０.１Ｍリン酸ナトリウム、０.２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.０
流速：        １ml／分
検出：        ＵＶ２８０nm
結果：        全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂにおいて＞９５％純度と分かった
【００７５】
６.３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、レミリーの方法に従って、還元および非還元の両方で行う。不純物は検出されない(結果は図１に示す)。
【００７６】
６.４：等電点電気泳動
分析は、ｐＨ勾配３−９(ファストゲルＩＥＦ３−９)を使用してファスト−システム(ファルマシア)および銀染色で行う(結果は図２に示す)。
【００７７】
実施例７：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＳＫＢＲ５細胞系への結合(細胞−ＥＬＩＳＡ)−精製抗−ｉｄＭａｂによる阻害
マイクロタイタプレートの予備処理を実施例４に記載のように行う。各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂを２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ欠乏で希釈する(１０から０.５μg／ml)。各々のこれらの希釈に、１μg／mlＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３を加える。本混合物の１００μlを細胞に加え、プレートを１時間、３７℃でインキュベーションする。本混合物を実施例４に記載のように後処理する。ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の細胞への結合の程度を４９２nmの光学的励起を測定することにより決定する(参考測定６２０nm)。
【００７８】
実施例８:抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるウサギおよびアカゲザルの免疫化
８.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるウサギの免疫化
３匹の雌チンチラウサギを、水酸化アルミニウムに吸着した抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(抗体１mg＋Ａｌ(ＯＨ)３３.３mg／ＰＢＳ欠乏ml)３００μgの皮内投与により、１、８、１５および３６日に免疫化する。３匹のウサギを、陰性対照として、同様の条件下、同量の非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化する。血清を免疫化前および最初の免疫９週間後に回収する。
【００７９】
８.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるアカゲザルの免疫化
３匹アカゲザルを、水酸化アルミニウムに吸着した抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(抗体１mg＋Ａｌ(ＯＨ)３３.３mg／ＰＢＳ欠乏ml)０.１mg／kgの皮下(s.c.)投与により、１、８、１５および３６日に免疫化する。２匹のアカゲザルを、陰性対照として、同様の条件下、同量の非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化する。血清を免疫化前および最初の免疫４および９週間後に回収する。
【００８０】
最初の免疫化過程の２年後、同じサルは、各々抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス−ＩｇＧ(上記と同量および同製剤)の最初の追加免疫注射を受ける。血清を最初の追加免疫化の前および１および４週間後に集める。
最初の免疫化過程の３年後(＝最初の追加免疫注射の１年後)、同じサルは、各々抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス−ＩｇＧ(上記と同量および同製剤)の２回目の追加免疫注射を受ける。血清を２回目の追加免疫化の前および１、４および９週間後に集める。
【００８１】
実施例９：ＳＫＢＲ５またはＷＭ９細胞系へのウサギ血清Ｉｇの結合(細胞−ＥＬＩＳＡ)
マイクロタイタープレートの前処理は実施例４に記載のように行う。好適な予備希釈したウサギ血清の１００μlのアリコートを細胞に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションする。抗体の細胞への結合を、４９２nmの励起を測定することにより決定する(参考測定６２０nm)。
実施例１０：ＳＫＢＲ５、ＣＡＴＯ、ＳＷ９４８、ＳＷ２およびＷＭ９人癌細胞系へのアカゲザル血清Ｉgまたは免疫精製Ｉg(ＡＢ３)の結合(細胞-ＥＬＩＳＡ)
【００８２】
マイクロタイタープレートの前処理は実施例４に記載のように行う。好適な予備希釈したアカゲザル血清Ｉｇまたは免疫精製アカゲザルＩｇ(実施例１２をまた参考)および対照としてＢＲ５５−２人化ＩｇＧ１の１００μlのアリコートを細胞に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションする。混合物を実施例４に記載のように後処理する。抗体の細胞への結合を、４９２nmの励起を測定することにより決定する(参考測定６２０nm)。
【００８３】
実施例１１：アカゲザル血清Ｉｇまたは免疫精製Ｉｇ(ＡＢ３)のＳＫＢＲ５−またはＷＭ９−癌細胞−膜調製物への結合(ＥＬＩＳＡ)
ルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系およびルイスＹ陰性ＷＭ９メラノーマ細胞系の膜を、ディー・トムら、バイオケミカル・ジャーナル、１６８、１８７−１９４(１９７７)に記載のように調製した。各々の膜調製物(１０μg／ml；コーティング緩衝液中希釈)の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、＋４℃で一晩インキュベーションする。プレートを４回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄する。ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中、好適な希釈のアカゲザル血清または免疫精製アカゲザルＩｇ(２をまた参照)の１００μlのアリコートを加え、プレートを６０分、３７℃でインキュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン＆コーポレイテッドの試薬のようなヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキシダーゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベーションの後、プレートを２回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝液で洗浄する。
【００８４】
基質溶液１００μlのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の５０μlのアリコートを加えることにより停止させる。光学密度(ＯＤ)を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００８５】
実施例１２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(ＡＢ３)で免疫化したアカゲザルの血清Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースを使用した免疫親和精製
１２.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースの調製
凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ９ｇを１mM  ＨＣｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM  ＨＣｌ２ｌで１５分洗浄する。配位子(抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４  ９５mg)を連結緩衝液５０mlに溶解し、栓をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１時間１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベーションし、残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクルは、ｐＨ４(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄、続くｐＨ８(０.１Ｍ  トリス、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄から成る。
【００８６】
１２.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザル血清Ｉｇ(ＡＢ３)の単離
クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ファルマシアカラムＨＲ５／２、ベッド容積５×２５mm)を抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース(容量０.５ml)で満たす。ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。出発材料は抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルから、免疫開始９週間後に得た血清２mlである。他の一連の実験のために、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルから、２回目の追加免疫４および９週間後に得た保存血清２mlを使用した。各々の血清を結合緩衝液中１：２に希釈し、カラムにかける。エスケーパーフラクションの溶出の後、結合アカゲザル免疫グロブリンが溶出緩衝液と共に脱着し、脱着後すぐに１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で中和する。
【００８７】
実施例１３：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザル血清Ｉｇまたは免疫精製Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合(ＥＬＩＳＡ)
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティング緩衝液中希釈)の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分インキュベーションする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄する。サル血清または免疫精製サルＩｇをＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中希釈する。各々のサンプルの１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、プレートを６０分、３７℃でインキュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン＆コーポレイテッドの試薬のようなヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキシダーゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベーションの後、プレートを４回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝液で洗浄する。基質溶液１００μlのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の５０μlのアリコートを加えることにより停止させる。光学密度(ＯＤ)を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００８８】
実施例１４：人ＰＢＭＣを使用した免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介されるＳＫＢＲ５細胞に対する抗体依存細胞毒性(ＡＤＣＣ)
測定の前日、ＳＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、細胞培養フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ２に保つ。
【００８９】
標的細胞の５１Ｃｒ標識：
細胞を培養フラスコから回収し、培地Ａ８００μl中５×１０６細胞の濃度で３７℃／５％ＣＯ２で１時間、１００μCi  Ｎａ２５１ＣｒＯ４とインキュベーションする。細胞を、次いで培地Ａで洗浄し、過剰の５１Ｃｒを除去し、新鮮培地Ａに再懸濁し、その濃度を２.５×１０５細胞／mlに調製する。
【００９０】
ＰＢＭＣの単離：
ヘパリン処理した新鮮人血液５０mlを０.１％グルコース含有ＰＢＳ完全６０mlで希釈する。本溶液の１５mlのアリコートをフィコール−パーク溶液１５mlの上に重層し、管を４００ｇで３０から６０分遠心する。血漿上清を廃棄し、ＰＢＭＣ層を回収し、ＰＢＳ完全＋０.１％グルコース５０mlで希釈する。約８０ｇ(１０分)で遠心後、ペレットをＰＢＳ完全＋０.１％グルコース２５−３０mlに再懸濁し、再遠心(８０ｇ、１０分)し、ペレットを回収し、培地Ａに懸濁し、細胞を計数し、懸濁液を約２×１０６から９×１０６細胞／mlとなるように培地Ａで希釈する。１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートの各々のウェルにピペットで移し、エフェクター細胞を一晩３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションする。
【００９１】
ＡＤＣＣ：
５１Ｃｒ−標識標的細胞１００μlを予備インキュベーションしたエフェクター細胞に、エフェクター細胞対標的細胞の所望の比で加える。所望の濃度にＰＢＳ欠乏で希釈した免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３  ５０μlを加え、プレートを一晩(約１８時間)３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションする。上清をスカトロン−ハーベスティング・プレスで回収し、γ−カウンターで計数する。これは実験的遊離の値を産生する。全５１Ｃｒ遊離は、ＰＢＭＣを２％ＳＤＳ、５０mM  Ｎａ２ＣＯ３および１０mM  ＥＤＴＡ１００μlと置き換え、抗体溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換えることにより上記のように決定する。自然５１Ｃｒ遊離はＰＢＭＣを培地Ａ１００μlと置き換え、抗体溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換えて得る。
【００９２】
計数後、結果を以下のように計算する：
実験的遊離  −  自然遊離
溶解％＝  ―――――――――――――×１００
全遊離  −  自然遊離
【００９３】
実施例１５：ＨＩＶ−感染／非感染ＰＡＬＬ−細胞へのアカゲザル血清、免疫精製アカゲザルＩｇまたはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の結合(間接的免疫蛍光測定、ＩＦＡ−抗−ＨＩＶ１−キット、バルドハイム)
商業的に入手可能な免疫蛍光測定キット(バルドハイム＆コーポレイテッド；ＨＩＶ血清陽性性を決定するために購入)において、ＨＩＶ−感染および非感染ＰＡＬＬ細胞(人Ｔ細胞系)をスライドに固定する。実験方法は本質的に提供者のガイドラインに従う。１％ＢＳＡと共に３０分、３７℃でインキュベーションした後、スライドをアカゲザル血清(濃縮およびＰＢＳ欠乏中１：１０希釈)または正常人血清中で希釈した免疫精製アカゲザルＩｇ(ＡＢ３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３と共に１時間、３７℃でインキュベーションする。ＨＩＶ陽性人血清(試験キットの一部由来)を陽性対照として、正常人血清を陰性対照として使用する。試験サンプルの非結合決定基を３回ＰＢＳ欠乏で洗い出し、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ欠乏中の抗−人−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ試薬(試験キットの一部)または抗−マウス−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ(マウスＭａｂの検出のため)の１：２０希釈を加える。３７℃で３０分インキュベーション、３回ＰＢＳ欠乏で洗浄およびスライドのはめ込みの後、免疫蛍光が蛍光マイクロスコープ内で観察され、得点する(０＝蛍光なし、５＝最大蛍光)。
【００９４】
実施例１６：人血清中の免疫活性ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａを測定するための抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用したＥＬＩＳＡ
抗−ｉｄ−ＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティング緩衝液中希釈)の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分インキュベーションする。
【００９５】
プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄する。ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａ含有人血清をＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中好適な希釈で試験する。これらのサンプルの１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、６０分、３７℃でインキュベーションする。標準として、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２を正常人血清で１０μg／mlに予備希釈する。ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中の好適な希釈を上記のように処理する。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ツィメッド試薬のようなウサギ−抗−マウスＩｇＧ３／ペルオキシダーゼまたはウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベーションした後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２回染色液で洗浄する。
【００９６】
基質溶液１００μlのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の５０μlのアリコートを加えることにより停止させる。光学的励起を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
血清サンプルのＯＤ値は、標準曲線から読み取り、μg／mlで表す。
【００９７】
実施例１７：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１を測定するためのＥＬＩＳＡ
ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１含有人血清を上記実施例１６に記載のように、ペルオキシダーゼ結合抗体(ケミコン＆カンパニーの試薬のようなヤギ−抗−人ＩｇＧ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)を使用して試験する。
【００９８】
実施例１８：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３を測定するためのＥＬＩＳＡ
ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３含有人血清を上記実施例１７に記載のように試験する。
【００９９】
実施例１９：ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１およびＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１と抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの間の実時間生特異的相互作用測定
実験はファルマシア・バイオセンサー・アクチエボラーク、ウプサラ、スウェーデンのＢＩＡcore(商標)系で行った。ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１またはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の非動化ＲＡＭ−ＩｇＧ１(ファルマシア・バイオセンサー・アクチエボラーク、ウプサラ、スウェーデンの試薬のような)に捕獲された種々のマウスＩｇＧ１抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂへの結合を実時間生特異的相互作用測定で測定した。
【０１００】
系の流速を５μl／分に調製した。センサーチップを蒸留水３５μl中のＮＨＳ０.２０１mgおよびＥＤＣ１.３１３mgで活性化した。１０mM  酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５.０  ３５μlに３０μg／mlの濃度で溶解されたＲＡＭ−ＩｇＧ１を、次いで活性化センサー表面と反応させた。残存遊離活性化部位を１Ｍ  エタノールアミンヒドロクロリド／ＮａＯＨ、ｐＨ８.５  ３５μlで遮断した。
【０１０１】
測定は３段階で行った：
１)各々の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ(Ｅ４、Ｃ１１、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)を培地Ｈで希釈し、最終濃度１０から１７μg／mlにした。各々の測定において、抗−イディオタイプ抗体をＲＡＭ−ＩｇＧ１に本溶液３５μlをセンサー表面を通すことにより結合させた。結合抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの質量の比である“反応単位”を記録し蓄積した。
２)マウス／人キメラＩｇＧ１の希釈２０μlおよび培地Ｈ中の１−１００μg／mlの濃度の人化ＩｇＧ１を次いで注入し、捕獲抗−ｉｄに結合させる。結合Ｍａｂの質量の比である“反応単位”を記録し蓄積した。
３)次いで、センサー表面を１Ｍ  ギ酸５μlおよび８Ｍ  尿素５μlの連続注入による次の分析のために再生した。
【０１０２】
結合率を第２抗体(ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１またはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１)で得られた最大反応単位および最初の抗体(各々の抗−イディオタイプＭａｂ)で得られた最大反応単位で計算することにより決定した。
実施例２０：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の測定のためのＥＬＩＳＡ
ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１含有人血清を、実施例１７に記載のように試験する。
【０１０３】
実施例２１：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合のＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１またはＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３による競合
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティング緩衝液中の希釈)の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分インキュベーションする。
プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄する。キメラ人ＩｇＧ１またはキメラ人ＩｇＧ３をＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳで希釈する(０.５μg／mlから３ng／ml)。これらの各々の希釈に、０.０５μg／mlＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３を加える。これらのサンプルの１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、６０分、３７℃でインキュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン・コーポレイテッド試薬のようなヤギ−抗−ヒトＩｇＧ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコートを加える。
【０１０４】
３０分、３７℃でインキュベーションした後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２回染色液で洗浄する。
基質溶液１００μlのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の５０μlのアリコートを加えることにより停止させる。光学密度(ＯＤ)を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【０１０５】
実施例２２：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介されるＳＫＢＲ５細胞系への補体依存細胞毒性(ＣＤＣ)−抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による阻害
測定の前日、ＳＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、細胞培養フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ２に保つ。
【０１０６】
標的細胞の５１Ｃｒ標識：
細胞を培養フラスコから回収し、培地Ａ８００μl中５×１０６細胞の濃度で３７℃／５％ＣＯ２で１時間、１００μCi  Ｎａ２５１ＣｒＯ４とインキュベーションする。細胞を、次いで培地Ａで洗浄し、過剰の５１Ｃｒを除去し、新鮮培地Ａに再懸濁し、その濃度を２.５×１０５細胞／mlに調製する。
【０１０７】
ＣＤＣ：
本標的細胞の懸濁液の１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで移す。ＰＢＳ欠乏中所望の濃度に希釈した抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の５０μlのアリコートを加える。次いで２μg／mlＢＲ５５−２／ＩｇＧ３含有人血清の１００μlのアリコートをウェル毎に加え、細胞を一晩、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションする。上清をスカトロン−ハーベスティング・プレスで回収し、γ−カウンターで計数する。これは実験的遊離の値を産生する。
【０１０８】
全５１Ｃｒ遊離は、人血清を２％ＳＤＳ、５０mM  Ｎａ２ＣＯ３および１０mM  ＥＤＴＡと置き換え、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換えることにより上記のように決定する。自然５１Ｃｒ遊離は人血清を培地Ａと置き換え、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換えて得る。
【０１０９】
計数後、結果を以下のように計算する：
実験的遊離  −  自然遊離
溶解％＝  ――――――――――――――  ×１００
全遊離  −  自然遊離
【０１１０】
実施例２３：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４セファロースを使用したＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の免疫親和精製
２３.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースの調製
凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ９ｇを１mM  ＨＣｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM  ＨＣｌ２ｌで１５分洗浄する。配位子(抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４  ９５mg)を連結緩衝液５０mlに溶解し、栓をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１時間１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベーションし、残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクルは、ｐＨ４(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄、続くｐＨ８(０.１Ｍ  トリス、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)での洗浄から成る。
【０１１１】
２３.２：ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の単離
クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ＢＩＯ  ＲＥＸ  ＭＰカラム直径１.５cm)を抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース(容量３５ml)で満たす。ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。出発物質はＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１条件培地１００ｌである。中空ファイバーカートリッジＰ１０を装着したアミコンＤＣ２濃縮系を使用した５：１濃縮後、濃縮物をカラムにかける。エスケーパーフラクションの溶出の後、結合ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１が溶出緩衝液と共に脱着し、脱着後すぐに１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で中和する。
【０１１２】
２３.３：ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の濃縮
溶出抗体溶液の濃縮を、ＰＭ１０ジアフロ膜を使用した攪拌アミコン超濾過セル中で行う。ＩｇＧに対する溶質拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最終濃縮は３.３６mg／mlである。
【０１１３】
２３.４：精製ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の特徴付け
２３.４.１：Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー
カラム：      Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５／５(ファルマシア)
緩衝液Ａ：    ２０mM  ＴＥＡ、ｐＨ７.７
緩衝液Ｂ：    ２０mM  ＴＥＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.７
流速：        １ml／分
検出：        ＵＶ２８０nm
勾配：        直線２％／分
結果：        ＞９５％純度
【０１１４】
２３.４.２：高速サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：      ゾルバックスＧＦ２５０、９.４×２５０mm
緩衝液：      ０.１Ｍリン酸ナトリウム、０.２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.０
流速：        １ml／分
検出：        ＵＶ２８０nm
結果：        ＞９５％純度
【０１１５】
２３.４.３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、還元条件下レミリーの方法に従って行う(結果は図１０に示す)。
出発物質
マウスモノクローナル抗体ＢＲ５５−２は、例えばそれぞれハイブリドーマＢＲ５５.２(ＢＲ５５−２／ＩｇＧ３)およびＢＲ５５.２ｓ２ａ(ＢＲ−５５−２／ＩｇＧ２ａ)から入手可能である。
【０１１６】
これらのハイブリドーマは、本来それぞれ１９８７年２月１７日および１９８７年３月１０日に、アメリカ合衆国２０８５２マサチューセッツ州、ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ブタペスト条約の規則の下、受託番号それぞれＡＴＣＣ  ＨＢ９３２４およびＡＴＣＣ  ＨＢ９３４７で寄託された。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２】単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの等電点電気泳動を示す。
【図３】抗−ｉｄＭａｂがＡｂ１のその抗原への結合を阻害することを示すグラフである。
【図４】ウサギにおける細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲＢ５細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。
【図５】サルにおける細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲＢ５細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。
【図６】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイタープレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にしたＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフである。
【図７】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイタープレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にしたＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフである。
【図８】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイタープレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にしたＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフである。
【図９】非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理したアカゲザルの液性免疫反応をＥＬＩＳＡを使用して検出した結果を示すグラフである。
【図１０】非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理したアカゲザルの液性免疫反応をＥＬＩＳＡを使用して検出した結果を示すグラフである。
【図１１】種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１２】種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１３】種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１４】種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１５】種々の時点での、胃癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１６】種々の時点での、胃癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１７】種々の時点での、小細胞肺癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１８】種々の時点での、小細胞肺癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図１９】種々の時点での、大腸癌細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図２０】種々の時点での、メラノーマ細胞系を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフである。
【図２１】２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよび抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４のエスケーパーフラクションの結合を測定した結果を示すグラフである。
【図２２】２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよびエスケーパーフラクションおよび親マウスＭａｂ(ＡＢ１)の人化変形の結合特性を、ＳＫＢＲ５乳癌細胞で比較した結果を示すグラフである。
【図２３】免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)とＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１のルイスＹ陽性乳癌細胞系ＳＫＢＲ５およびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系ＷＭ９に対する結合特性の比較を示すグラフである。
【図２４】ルイスＹ陽性ＳＫＢＲ５細胞系およびルイスＹ陰性細胞系ＷＭ９の膜フラクションを使用したＥＬＩＳＡにより観察される、ＡＢ３−フラクションの同様な免疫反応性のパターンを示すグラフである。
【図２５】免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)の結合特性を示すグラフである。
【図２６】ＡＢ３−フラクションを、人ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用したＡＤＣＣ実験において、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)と比較した結果を示すグラフである。
【図２７】人血清中のＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図２８】人血清中のＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図２９】人血清中のＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図３０】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３１】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３２】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３３】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３４】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３５】抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の結合を示すグラフである。
【図３６】人血清のＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図３７】ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合をＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１およびＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３との比較によりＢＲ５５−２全ての変異体の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる結合領域の認識を示すグラフである。
【図３８】ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系に対するＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介された補体依存細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による有効な中和を示すグラフである。
【図３９】本発明を免疫精製法に使用した結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１】
2006143738.tif 000002
【図２】
2006143738.tif 000003
【図３】
2006143738.tif 000004
【図４】
2006143738.tif 000005
【図５】
2006143738.tif 000006
【図６】
2006143738.tif 000007
【図７】
2006143738.tif 000008
【図８】
2006143738.tif 000009
【図９】
2006143738.tif 000010
【図１０】
2006143738.tif 000011
【図１１】
2006143738.tif 000012
【図１２】
2006143738.tif 000013
【図１３】
2006143738.tif 000014
【図１４】
2006143738.tif 000015
【図１５】
2006143738.tif 000016
【図１６】
2006143738.tif 000017
【図１７】
2006143738.tif 000018
【図１８】
2006143738.tif 000019
【図１９】
2006143738.tif 000020
【図２０】
2006143738.tif 000021
【図２１】
2006143738.tif 000022
【図２２】
2006143738.tif 000023
【図２３】
2006143738.tif 000024
【図２４】
2006143738.tif 000025
【図２５】
2006143738.tif 000026
【図２６】
2006143738.tif 000027
【図２７】
2006143738.tif 000028
【図２８】
2006143738.tif 000029
【図２９】
2006143738.tif 000030
【図３０】
2006143738.tif 000031
【図３１】
2006143738.tif 000032
【図３２】
2006143738.tif 000033
【図３３】
2006143738.tif 000034
【図３４】
2006143738.tif 000035
【図３５】
2006143738.tif 000036
【図３６】
2006143738.tif 000037
【図３７】
2006143738.tif 000038
【図３８】
2006143738.tif 000039
【図３９】
2006143738.tif 000040