(57)【要約】【課題】  工業的観点から効率的、大量、容易、且つ安価に製造することのできるホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  魚類の卵巣より抽出したことを特徴とするホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物、及びそれを用いてリン脂質の１位のアシル基を選択的に加水分解することにより得られる２‐アシル型リゾリン脂質が提供される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類の卵巣から抽出することを特徴とするホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物において、
前記魚類の卵巣はカツオ、マグロ類、サバ類の卵巣であることを特徴とするホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物。
【請求項３】
請求項１の組成物を用いてリン脂質又はリン脂質含有物中のリン脂質を加水分解して得られる２‐アシル型リゾリン脂質。
【請求項４】
請求項３の２‐アシル型リゾリン脂質であって、
２位に高度不飽和脂肪酸が結合していることを特徴とする２−アシル型リゾリン脂質。
【請求項５】
請求項４の２−アシル型リゾリン脂質において、
前記高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする２−アシル型リゾリン脂質。
【請求項６】
請求項１の組成物を用いて水産物由来のリン脂質またはリン脂質含有物中のリン脂質を加水分解することを特徴とする２位に高度不飽和脂肪酸が結合している２‐アシル型リゾリン脂質。
【請求項７】
請求項６の２−アシル型リゾリン脂質であって、
前記高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする２−アシル型リゾリン脂質。
【請求項８】
魚類の卵巣から抽出することを特徴とする２位に高度不飽和脂肪酸が結合している２‐アシル型リゾリン脂質をリン脂質中に１０％以上含有する脂質組成物。
【請求項９】
請求項８の脂質組成物であって、
前記高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする脂質組成物。
【請求項１０】
魚類の卵巣を用意する工程と、
前記魚類の卵巣からホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を抽出する工程と
を有することを特徴とするホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、
前記魚類の卵巣はカツオ、マグロ類、サバ類の卵巣であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
魚類の卵巣を用意する工程と、
前記魚類の卵巣からホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を抽出する工程と
前記ホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を用いてリン脂質又はリン脂質含有物中のリン脂質を加水分解して２‐アシル型リゾリン脂質を得る工程と
を有することを特徴とする２‐アシル型リゾリン脂質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、
前記２‐アシル型リゾリン脂質は、２位に高度不飽和脂肪酸が結合しているものであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、
前記２−アシル型リゾリン脂質の高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法において、
前記リン脂質またはリン脂質含有物は、水産物由来のものであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物、この組成物を用いて得られるＤＨＡなどの不飽和脂肪酸を含有する２‐アシル型リゾリン脂質、及びそれらの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡ）は記憶学習能力の向上、抗アレルギー、抗腫瘍などの優れた生理活性を持っていることが知られており、このＤＨＡを含有した健康食品が市場に多く出回っている。
【０００３】
ＤＨＡとは、炭素数２２、不飽和結合６ヶ所を有する高度不飽和脂肪酸の一種である。このＤＨＡは化学的な合成による量産は不可能であるため、現在のところ魚油からトリアシルグリセロール（中性脂質）に結合した形で大量に単離され、商品化されている。しかし生体内、特に脳におけるＤＨＡの存在はリン脂質に結合した形態であり、さらに、このＤＨＡ結合型リン脂質は、脂質改善、脳機能改善や抗腫瘍作用などにおいてトリアシルグリセロール型のＤＨＡよりもさらに生理活性が高いことが明らかとなっている。
【０００４】
一方、リン脂質の一種であるリゾリン脂質は、通常のリン脂質より高い界面活性を有していることが知られている。さらに、乳化性が強い、金属イオンが高濃度に存在しても乳化性が低下しない、などの優れた特性を有しているため、リゾリン脂質は食品への使用、化粧品用乳化剤などに幅広く利用され得る。
【０００５】
このリゾリン脂質はアシル基に脂肪酸が１つ結合しているリン脂質のことを指し、このうち、グリセリン骨格の２位にＤＨＡが結合した２‐ＤＨＡ‐リゾホスファチジルコリン（以下２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣ）は、脳へのＤＨＡ輸送能力や赤血球変形能が高いと報告されている。この２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣを製造するためには基質として２位にＤＨＡが結合しているホスファチジルコリンに、ホスホリパーゼＡ１活性を持つ酵素を作用させる必要がある。
【０００６】
ホスホリパーゼは、リン脂質の作用部位によってＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄに再分類されており、このうち、リン脂質のｓｎ−１位又は２位に結合している脂肪酸を加水分解するものとしては、ｓｎ‐１位を加水分解するホスホリパーゼＡ１、ｓｎ‐２位を加水分解するＡ２、さらにはｓｎ‐１位又は２位をランダムに加水分解するホスホリパーゼＢが知られている。これらのうち、ホスホリパーゼＡ１については、例えば、以下の特許文献１〜３が参考になる。
【特許文献１】特開平６−６２８５０号公報
【特許文献２】特開平７−３１４７２号公報
【特許文献３】特開平７−２２２５９２号公報
【０００７】
しかし、現在一般に市販されているホスホリパーゼはブタ膵臓やヘビ毒由来のホスホリパーゼＡ２であるが、これでは２−ＤＨＡ−ＬＰＣを含む２‐アシル型リゾリン脂質は得られない。
【０００８】
最近、アスペルギルス属やサイクロバクター属の微生物あるいは培養液に見られるホスホリパーゼＡ１活性を利用した２‐アシル型リゾリン脂質の製法が開発されてきているが、培養方法や酵素の抽出方法が煩雑である。さらに、ホスホリパーゼＡ１は哺乳動物の脳、肝臓、膵臓、血小板などに存在することが知られているが、現在のところ、これらの組織を原料とした工業的な生産は全く行われていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、工業的観点から効率的、大量、容易、且つ安価に製造することのできるホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を提供することを目的とするものである。さらに、本発明で得られたホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を用いて、２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣあるいは２位に高度不飽和脂肪酸が結合したリゾリン脂質を提供することもその目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、魚類卵巣中にホスホリパーゼＡ１活性が存在することを見出し、それを含有する組成物の抽出に成功した。そしてさらに、それをＤＨＡ結合型のリン脂質数種類を基質して酵素反応を行った結果、２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣが濃縮できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の主要な観点によれば、魚類の卵巣から抽出することを特徴としたホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物が提供される。
【００１２】
ここで、前記魚類の卵巣は、これに限定するものではないが、カツオ・マグロ類、サバ類、サケ・マス類、タラ類などの卵巣を含むものである。これらの魚類の卵巣はなるべく鮮度の良い状態で使用することが望ましい。
【００１３】
なお、この魚類の卵巣は、サケ、タラなどの一部の魚種を除いては大部分が未利用であることから、本発明は未利用水産物の有効活用という観点からも価値がある。
【００１４】
また、本発明の第２の主要な観点によれば、魚類の卵巣から抽出されたホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物を用いて、リン脂質又はリン脂質含有物中のリン脂質を加水分解して得られる２‐アシル型リゾリン脂質が提供される。
【００１５】
さらに、前記リン脂質は天然由来のものであっても合成されたものであってもよいが、本発明の１実施形態によれば、これに限定されるものではないが、水産物由来のリン脂質またはリン脂質含有物中のリン脂質である。
【００１６】
また本発明の１実施形態によれば、前記魚類の卵巣から抽出されたホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物によって得られる２−アシル型リゾリン脂質は、これに限定されるものではないが、２位に高度不飽和脂肪酸が結合しているリゾリン脂質である。さらに、前記高度不飽和脂肪酸は、これに限定されるものではないが、ドコサヘキサエン酸であることが好ましい。
【００１７】
一般的なリン脂質である大豆レシチンや卵黄レシチンは、リン脂質中のリゾリン脂質含有率が約０．５〜４％と少なく、結合している脂肪酸はパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸など不飽和度が低い脂肪酸である。また、乳化剤として工業的に作られた大豆リゾレシチンはホスホリパーゼＡ２によって調製されるため、１位に飽和脂肪酸が結合したリゾリン脂質である。
【００１８】
そこで本発明者らは、リゾリン脂質の含有量がより高いリン脂質を得るためにさらに研究を進めた。本発明者らは、カツオ、サバなどの魚類の卵巣には元来リン脂質中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）組成比が高い、且つＬＰＣ中のＤＨＡ組成比も高いことに着目した結果、魚類の卵巣から直接水又は有機溶媒を用いて２−ＤＨＡ−ＬＰＣを含む２−アシル型リゾリン脂質が抽出できることを見出した。
【００１９】
すなわち、本発明の第３の主要な観点によれば、魚類の卵巣から抽出することを特徴とする２位に高度不飽和脂肪酸が結合している２‐アシル型リゾリン脂質をリン脂質中に１０％以上含有する脂質組成物が提供される。
【００２０】
また、本発明の１実施形態によれば、前記高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である脂質組成物が提供される。
【００２１】
また、本発明の第４の観点によれば、上記ホスホリパーゼＡ１活性を有する組成物及び２−アシル型リゾリン脂質の製造方法が提供される。
【００２２】
このような構成によれば、容易に、且つ安価にｓｎ‐２位にＤＨＡもしくは高度不飽和脂肪酸を結合させたリゾリン脂質を高濃度に濃縮することができる。
【００２３】
この発明の更なる特徴及び顕著な効果は、次に記載する発明の実施の形態の項の記載から当業者にとって明らかになるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、魚類の卵巣から抽出したホスホリパーゼＡ１活性を有する酵素を提供するものである。
【００２６】
ここで、前記魚類の卵巣は、これに限定するものではないが、カツオ・マグロ類、サバ類、サケ・マス類、タラ類などの卵巣を含むものである。これらの魚類の卵巣はなるべく鮮度の良い状態で使用することが望ましい。この魚類の卵巣は、サケ、タラなどの一部の魚種を除いては大部分が未利用であることから、本発明は未利用水産物の有効活用という顕著な効果を奏するものである。
【００２７】
次に、この実施形態においてホスホリパーゼＡ１活性を有する酵素を抽出する方法を説明する。
【００２８】
まず、カツオ・マグロ類、サバ類、サケ・マス類、タラ類などの卵巣を用意し、アセトン、エーテル、エタノールなどの有機溶媒により組織から脱脂を行った後に、乾燥して卵巣脱脂パウダーを得る。次にリン酸、トリス−塩酸などの緩衝液で酵素抽出を行う。卵巣からの脱脂、乾燥及び抽出の際の温度は３０℃以下であるが、５℃以下が望ましい。
【００２９】
次に、得られた酵素を基質とともに緩衝液中で反応を行う。使用する基質としては、ｓｎ‐２位のＤＨＡ組成比が高いリン脂質であるほど２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣを高濃度に得ることができる。反応条件は酵素により脂肪酸が加水分解される条件であればいずれでも良いが、好ましくは反応温度０〜５０℃、反応時間１０分〜４８時間、反応液のｐＨ３〜８の範囲である。また、反応液は緩衝液以外に水、有機溶媒などでも良い。
【００３０】
反応終了後には加熱あるいは有機溶媒を加えることによって酵素を失活させ、通常の製造方法によって脂質を分離することができる。たとえば、酵素反応液にクロロホルム／メタノールを加えて、攪拌、遠心分離後、クロロホルム相を回収して減圧乾固させれば良い。また、さらにリン脂質を回収する場合にはシリカゲルカラムなどを用いたクロマト法を用いることができる。
【００３１】
上記材料のうち、カツオ、サバなどの卵巣は元来リン脂質中のＬＰＣ組成比が高く、かつ、ＬＰＣ中のＤＨＡ組成比も高い。したがって、魚類の卵巣から直接水又は有機溶媒で抽出しても２‐ＤＨＡ‐ＬＰＣを得ることができる。
【００３２】
次に、以下の実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００３３】
実施例１．魚類卵巣７種類よりホスホリパーゼＡ１活性酵素を抽出した。具体的には、カツオ、クロマグロ、キハダ、マサバ、ゴマサバ、シロサケ、スケトウダラの卵巣を各々低温で粉砕し、４倍容量のアセトンを加えて４℃で２０分間攪拌した。攪拌終了後、アセトンを交換してこの操作を計３回行った。次に溶媒をエーテルに換えてさらに２０分間攪拌してから、遠心残さをろ紙に移して、冷蔵庫内で１晩乾燥させた。
【００３４】
次に乾燥粉末に対して４倍量（ｗ／ｖ）のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、４℃で1時間３０分間攪拌した。その後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、上清部分を粗酵素液として酵素反応に使用した。
【００３５】
基質として１‐パルミトイル‐２‐オレオイルホスファチジルコリン１０ｍｇ、粗酵素液０．５ｍｌ、カルシウム３５ｍＭ、コール酸ナトリウム０．５ｍｌをトリス−塩酸緩衝液３ｍｌ中で２時間、２０℃で反応させた。その後、反応液中からクロロホルムとメタノールの混合溶媒により脂質を回収し、シルカゲルカラムによりリン脂質と遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を分画した。リン脂質画分はシリカゲルＴＬＣによりホスファチジルコリン（ＰＣ）とリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に分けてから各々のバンドをかきとってＢａｒｔｌｅｔｔ法によりリン量を定量した。また、ＦＦＡは塩酸−メタノールを用いてメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフにより定量した。
【００３６】
図１は魚類７種類の卵巣から抽出した粗酵素液の脂肪酸加水分解能（図１ａ）、及びＬＰＣ生成能（２０℃・２時間反応：図１ｂ、反応終了時：図１ｃ）の分析結果を示した。また、図２ではカツオの各部位から抽出した粗酵素液の脂肪酸加水分解能（図２ａ）及びＬＰＣ生成能（２０℃・２時間反応：図２ｂ、反応終了時：図２ｃ）の分析結果を示した。１ｂ、２ｂ（％  ｏｆ  ＰＬ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は粗酵素中のタンパク質１ｍｇ当たりの分解脂肪酸量、ＬＰＣ生成量であり、１ｃ、２ｃ（％  ｏｆ  ＰＬ）は最終的に反応時間が終了した時に得られたＬＰＣ量である。これらの結果から、魚類卵巣及びカツオ各部位から抽出した組成物はホスホリパーゼＡ１活性を有していることが確認された。なお、それはカツオの卵巣で特に高く、組成物を得るにはカツオの卵巣が原料として最も適していると思われる。
【００３７】
実施例２．カツオ卵巣粗酵素液の特性を調べた。方法は実施例１と同様である。図３に温度依存性、図４にｐＨ依存性について調べた結果を示した。さらに図５では、基質として１‐Ｃ１６：０‐２‐Ｃ１８：１‐ＰＣ（１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルコリン）、１‐Ｃ１８：１‐２‐Ｃ１６：０‐ＰＣ（１-オレオイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン）、及び１‐Ｃ１６：０‐２‐Ｃ１８：１‐ＰＥ（１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルエタノールアミン）を用いて基質依存性（生成した脂肪酸で検討した場合：図５ａ、ＬｙｓｏＰＬ生成量で検討した場合：図５ｂ）について調べた結果を示した。なおＬｙｓｏＰＬとは、この実験で使用した基質はＰＣとＰＥであり、反応して得られるものはＬＰＣとＬＰＥであるから、図中ではその両方を意味するためのものである。以上の結果より、カツオ卵巣抽出物のホスホリパーゼＡ１活性の至適反応条件は２０〜３０℃、ｐＨ６〜７であったが、０℃や１０℃といった低温度帯でも比較的高い活性が認められた。高度不飽和脂肪酸は一般に酸化されやすいので、製造条件によっては本抽出酵素を１０℃以下の低温で反応させることにより、より品質の高いリゾリン脂質が得られるものと考えられた。
【００３８】
実施例３．カツオ卵巣よりクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて全脂質を抽出し、それをシリカゲルカラムで分画してリン脂質を得た。また、カツオ卵巣の凍結乾燥品からエタノール抽出により粗精製油を得た。これらを基質として、カツオ卵巣粗酵素液で２０℃、６時間酵素反応を行った。まず図６は基質としてリン脂質を用い、リン脂質組成（ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＳＰＭ：スフィンゴミエリン、ＰＣ：ホスファチジルコリン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、Ｏｔｈｅｒｓ：その他のリン脂質）の経時変化（ｍｏｌ％：図６ａ）、生成した脂肪酸としてＣ１６：０（パルミチン酸）、Ｃ１８：０（ステアリン酸）、Ｃ１８：１ｎ‐９（オレイン酸）、Ｃ２２：６ｎ‐３（ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ））量の経時変化（図６ｂ）、リン脂質中のＤＨＡの経時変化（図６ｃ）について検討した結果を示している。次に図７は基質として全脂質を用い、ＬＰＣ組成比の経時変化（図７ａ）、ＤＨＡ組成比の経時変化（図７ｂ）について検討した結果である。図８は基質として粗精製油を用い、ＬＰＣ組成比の経時変化について検討した結果を示している。いずれの実験においても、カツオ卵巣粗酵素は含有するリン脂質を加水分解し、リン脂質中のＬＰＣ組成比及びＤＨＡ組成比を高めた。
【００３９】
実施例４．静岡県焼津市のかつお節工場及びなまり節工場において、加工工程で排出した卵巣を６工場から合計２１個体を得た。これらからクロロホルムとメタノールの混合溶媒で脂質を抽出し、それをシリカゲルカラムで分画してリン脂質を得た。これをＴＬＣで分画した後、Ｂａｒｌｅｔｔ法によりリンを測定し、リン脂質中のリゾリン脂質量を測定した。その結果、リゾリン脂質はリン脂質中に平均３５．８％含まれることが分かった。また１‐アシル型‐リゾリン脂質と２‐アシル型‐リゾリン脂質を分画する為、シリカゲルカラムで分画したリン脂質５ｍｇにホスホリパーゼＣ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ起源)を２０ｕｎｉｔ反応させてｓｎ‐３位に結合しているリン酸基を加水分解した。次に、非極性系の展開溶媒を用いたＴＬＣによって、１‐アシル型‐リゾリン脂質由来の１‐モノグリセライドと２‐アシル型-リゾリン脂質由来の２‐モノグリセライドを得た。これらをメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィーによりリゾリン脂質の結合位置別の脂肪酸組成を測定した（図９）。その結果、２位に高度不飽和脂肪酸を結合したリゾリン脂質がリゾリン脂質中５４．０％を占め、これはリン脂質全体の平均１９．３％に相当した。
【００４０】
以上より、本発明による魚類卵巣由来ホスホリパーゼを活用することにより、ｓｎ‐２位にＤＨＡもしくは高度不飽和脂肪酸を結合させたリゾリン脂質を高濃度に濃縮することができる。また、本発明で得られたＤＨＡ濃縮物は医薬用のほか、健康食品、食品添加物素材として利用できる。
【００４１】
本発明の特定の好ましい実施形態及び実施例は上記で記載、例証されているが、本発明はこれらの１実施形態や１実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】魚種別のホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）活性を比較したグラフ。
【図２】カツオ各部位のＰＬＡ１活性を比較したグラフ。
【図３】カツオ卵巣ホスホリパーゼの温度依存性を示したグラフ。
【図４】カツオ卵巣ホスホリパーゼのｐＨ依存性を示したグラフ。
【図５】カツオ卵巣ホスホリパーゼの基質依存性を示したグラフ。
【図６】基質リン脂質の酵素分解の結果を示したグラフ。
【図７】基質全脂質の酵素分解の結果を示したグラフ。
【図８】基質粗精製油の酵素分解の結果を示したグラフ。
【図９】リゾリン脂質の結合脂肪酸の組成を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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