(57)【要約】【課題】  タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼを介する新しい細胞死（アポトーシス）の過程で生成する架橋不活性化された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識する抗体を作製し、いままで特異的に検出することが困難であったトランスグルタミナーゼ依存アポトーシス経路を特異的に検出する方法を提供すること。【解決手段】  架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識することができる抗体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識することができる抗体。
【請求項２】
ポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
架橋された転写因子Ｓｐ１が、分子量４５万以上の活性を失ったＳｐ１である、請求項１から３の何れかに記載の抗体。
【請求項５】
架橋された転写因子Ｓｐ１が、Ｓｐ１にトランスグルタミナーゼが作用することにより生成するものである、請求項１から４の何れかに記載の抗体。
【請求項６】
未架橋のＳｐ１は認識することができない、請求項１から５の何れかに記載の抗体。
【請求項７】
架橋された転写因子Ｓｐ１を抗原として免疫動物に投与し、該免疫動物から採取した架橋Ｓｐ１抗体画分からＳｐ１結合担体を用いた精製により未架橋Ｓｐ１を認識する抗体を除去することにより得られる、請求項１から６の何れかに記載の抗体。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載の抗体を含む、アポトーシス検出試薬。
【請求項９】
アポトーシスがトランスグルタミナーゼ依存性のものである、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
請求項１から７の何れかに記載の抗体を用いて、アポトーシスを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋重合化された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識する抗体、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、個体発生過程での肢芽形成、自己反応性免疫細胞の除去、がん細胞の除去など多くの生物系で認められる計画的細胞死である。アポトーシスの形態的特徴としては、染色体の凝集、細胞核の断片化、細胞表層微繊毛の消失、及び細胞質の凝縮などである。アポトーシスの過程では、カスパーゼと称される一群のシステインプロテアーゼの活性化カスケードが起こる。その結果、最終的にカスパーゼ３によってヌクレアーゼインヒビターのinhibitor of caspase-activated DNase（ICAD）が分解されるためにヌクレアーゼのCADが解き放たれて核に移行し、クロマチンの切断が引き起こされるが、カスパーゼ非依存のアポトーシス経路が存在することも知られていた（非特許文献５）。
【０００３】
トランスグルタミナーゼ（TG）は、タンパク質のGln-Lys残基間にイソペプチド結合を形成する一群のCa2+依存性タンパク質架橋酵素である。血漿TG、皮膚TG、組織TGなど現在少なくとも１０種類以上が知られており、その基質も多様である。発生過程における細胞死、肝臓・胸腺皮質・前立腺・乳腺・乾癬を起こした皮膚に見られる細胞死、神経疾患、ＨＩＶ感染、癌細胞の化学療法に伴う細胞死など、様々な生理的・病理的状況下において、アポトーシスに陥った組織・細胞は組織トランスグルタミナーゼを高発現することが知られており、組織トランスグルタミナーゼの発現誘導がアポトーシス誘起の一主要経路と考えられている（非特許文献１〜６）。
【０００４】
組織トランスグルタミナーゼとアポトーシスとの関係に関するこれまでの研究から、トランスグルタミナーゼは核に移行して転写因子Ｓｐ１を架橋不活性化することにより細胞の生存に必要な遺伝子やアポトーシスを阻害する遺伝子の発現を停止させる結果、アポトーシスを誘導していること、そしてこの機構がカスパーゼ非依存的であることが示唆されている。即ち、アポトーシスを起こした細胞においては、トランスグルタミナーゼによりＳｐ１が架橋されることが示唆されている（図１；非特許文献１〜６）。
【０００５】
アポトーシスの検出には、活性型カスパーゼ抗体（活性化の過程で切断された種々のカスパーゼの断面に対する抗体）や、カスパーゼの下流で切断されるクロマチンを検出する方法（TUNEL法）、カスパーゼの上流で動くチトクロームCの放出を検出する方法などが従来から用いられてきたが、トランスグルタミナーゼ依存アポトーシス経路は、カスパーゼ経路とは独立しており、上記した方法では特異的に検出することができなかった。
【０００６】
架橋されていないＳｐ１に対する抗体は既に市販されていたが、Ｓｐ１がトランスグルタミナーゼで架橋重合化されると、架橋重合化の程度に従いこの抗体に対する抗原性が低下し、同抗体では架橋不活性化されたＳｐ１を検出することができなかった。架橋されたSp1を特異的に認識できる抗体があれば、細胞内の架橋Ｓｐ１を検出・測定することにより、トランスグルタミナーゼ依存性のアポトーシスを検出できるが、このような抗体の作製は、これまでの所、報告がない。
【０００７】
【非特許文献１】Tissue transglutaminase, a key enzyme involved in liver diseases、Hepatol Res. 29巻1号、2004年５月発行、Wu J, Zern MA.、pp.1-8
【非特許文献２】生体内バイオハイブリッド反応: 架橋多機能性酵素トランスグルタミナーゼによるタンパク質の機能変換、化学工業54巻12号、2003年12月発行、辰川英樹、小嶋聡一、pp.908-915
【非特許文献３】Transglutaminase 2: an enigmatic enzyme with diverse functions.  Trends Biochem Sci. 27巻10号、2002年10月発行、Fesus L, Piacentini M.、pp.534-539
【非特許文献４】トランスグルタミナーゼ関連疾患の分子病態、実験医学18巻10号、2000年発行、一瀬白帝、  小嶋聡一 、pp.1421-1425
【非特許文献５】トランスグルタミナーゼとアポトーシス、生化学72巻3号、2000年発行、小嶋聡一、一瀬白帝、pp.198-202
【非特許文献６】トランスグルタミナーゼ：タンパク質架橋反応が司る多彩な生命現象、細胞工学18巻7号、1999年発行、小嶋聡一、一瀬白帝、pp.1030-1038
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼを介する新しい細胞死（アポトーシス）の過程で生成する架橋不活性化された転写因子Sp1を特異的に認識する抗体を作製し、今まで特異的に検出することが困難であったトランスグルタミナーゼ依存アポトーシス経路を特異的に検出する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
トランスグルタミナーゼを介するアポトーシスでは、アポトーシスを誘導する種々の刺激を受けた細胞中でトランスグルタミナーゼが細胞の核に移行し、細胞の生存に必須である転写因子Ｓｐ１を架橋不活性化することが原因であることが最近わかってきた。本発明では、架橋不活性化したＳｐ１だけを特異的に認識する抗体を作製した。この抗体を用いることにより、従来市販されている架橋されていないSp1に対する抗体では、特異的に検出できなかった（区別できなかった）トランスグルタミナーゼ依存アポトーシスに陥った細胞や組織を、特異的に検出することが可能となった。
【００１０】
即ち、本発明によれば、架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識することができる抗体が提供される。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
好ましくは、架橋された転写因子Ｓｐ１は、分子量４５万以上の活性を失ったSp1である。
好ましくは、架橋された転写因子Ｓｐ１は、Ｓｐ１にトランスグルタミナーゼが作用することにより生成するものである。
好ましくは、本発明の抗体は、未架橋のＳｐ１は認識することができない。
【００１１】
好ましくは、本発明の抗体は、架橋された転写因子Ｓｐ１を抗原として免疫動物に投与し、該免疫動物から採取した架橋Ｓｐ１抗体画分からＳｐ１結合担体を用いた精製により未架橋Ｓｐ１を認識する抗体を除去することにより得られる抗体である。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗体を含む、アポトーシス検出試薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を用いて、アポトーシスを検出する方法が提供される。
好ましくは、検出対象となるアポトーシスはトランスグルタミナーゼ依存性のものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗体を用いることにより、すでにトランスグルタミナーゼ依存アポトーシスの関与が示唆されている、肝疾患にける肝細胞のアポトーシスや、神経変性疾患における神経細胞のアポトーシス、抗癌剤による癌細胞のアポトーシスを検出するとともに、これまでトランスグルタミナーゼの関与が知られていなかった病態におけるトランスグルタミナーゼ依存アポトーシスの関与を検出することが可能となり、得られた知見を基に、例えばトランスグルタミナーゼに対する特異的な阻害剤や抗体を用いてトランスグルタミナーゼ依存アポトーシス経路をコントロールすることに基づく新しい治療・予防法が開発されるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の抗体は、架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識することを特徴とする抗体である。本発明で言う「架橋された転写因子Ｓｐ１」とは、好ましくはＳｐ１にトランスグルタミナーゼが作用することにより生成する架橋されたＳｐ１である。通常、このような架橋されたＳｐ１は、少なくとも５分子以上のＳｐ１が架橋重合化したもので、分子量４５万以上を有している。本発明の抗体は、好ましくは、未架橋のＳｐ１を認識しない抗体である。トランスグルタミナーゼが基質タンパク質に作用すると基質となるリジン残基とグルタミン残基の間にイソペプチド結合という架橋構造が形成される。本発明の抗体は、好ましくは、トランスグルタミナーゼの作用によってＳｐ１分子内および分子間に形成されるイソペプチド結合を含む構造（アミノ酸配列または立体構造）を認識する抗体である。
【００１５】
本発明の抗体の具体例としては、架橋された転写因子Ｓｐ１を抗原として免疫動物に投与し、該免疫動物から採取した架橋Ｓｐ１抗体画分からＳｐ１結合担体を用いた精製により未架橋Ｓｐ１を認識する抗体を除去することにより得られる抗体を挙げることができる。
【００１６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよい。本発明の抗体の作製は定法により行なうことができる。
【００１７】
本発明の抗体は、例えば、架橋された転写因子Ｓｐ１を抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。抗原として用いる架橋された転写因子Ｓｐ１は、Ｓｐ１にトランスグルタミナーゼを作用させることにより作製することができる。本発明では、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。
【００１８】
抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕 、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００１９】
免疫感作した哺乳動物を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
【００２０】
本発明の抗体は、特に、上記のようにして取得した架橋Ｓｐ１抗体画分から、Ｓｐ１結合担体を用いた精製により、未架橋Ｓｐ１を認識する抗体を除去することにより得られるものであることが好ましい。Ｓｐ１結合担体を用いた精製を行うことにより未架橋Ｓｐ１を認識する抗体を除去することによって、架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識することができ、未架橋のＳｐ１は認識することができない抗体を取得することができる。
【００２１】
また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。
【００２２】
モノクローナル抗体の作製は、当業者に既知の方法により行うことができ、例えば、ハイブリドーマを用いた方法により行うことができる。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
【００２３】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様の架橋された転写因子Ｓｐ１を使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原（架橋された転写因子Ｓｐ１）との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
【００２４】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等によりスクリーニングを行なうことにより、架橋された転写因子Ｓｐ１を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
【００２５】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００２６】
また、上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
【００２７】
本発明の抗体は標識抗体として使用することもできる。標識抗体を作製することにより、架橋された転写因子Ｓｐ１の検出や測定を簡便に行うことができる。抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているものから適宜選択することができる。
【００２８】
標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、該抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。
【００２９】
標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば２，２’ −アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）等を用いる。
【００３０】
標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその断片を標識することができる。  本発明の抗体又はその断片と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。
【００３１】
標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテクスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラッテクスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数十nm〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
【００３２】
本発明の抗体又はその断片と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合することが可能である。
【００３３】
なお、標識としては、上記以外にもアフィニティー標識（例えば、ビオチン等）、又は、同位体標識（例えば、125Ｉ等）等を使用することもできる。
【００３４】
本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法で行なうことができ、その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。
【００３５】
本発明の抗体を用いることにより、生体試料又は組織中において、架橋された転写因子Ｓｐ１を検出又は測定することができ、これによりアポトーシスを検出・診断することができる。即ち、本発明の抗体は、アポトーシス検出試薬として使用することができる。本発明の抗体を用いたアポトーシス検出試薬、及びアポトーシス検出方法も本発明の範囲内である。検出対象となるアポトーシスは、好ましくはトランスグルタミナーゼ依存性のものである。
【００３６】
上記の通り、本発明の抗体は、生体内における架橋された転写因子Ｓｐ１を検出又は測定することができ、これによりアポトーシスを検出・診断することができる。即ち、本発明の抗体は、転写因子Ｓｐ１の架橋が関与する疾患（肝疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、各種硬化性疾患（肝硬変、動脈硬化、腎不全、強皮症など）、癌）及びアポトーシス関連疾患（例えば、アポトーシスの減少に起因する疾患としては悪性腫瘍（癌）、白血病、自己免疫性疾患、ウイルス感染疾患（ＨＩＶ感染など）、増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、肝炎、および腎疾患などが挙げられ、アポトーシスの増加に起因する疾患としてはエイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、および中毒性肝疾患などが挙げられる）の診断薬として有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：ヒト組換え転写因子Ｓｐ１の作製と精製
ヒトＳｐ１ cDNAを挿入したpIVEX plasmid vercter 15μgを使用し、Rapid Translation System (RTS) 500（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、転写／翻訳反応を行ない（最終容量1ml, 30℃、18時間反応）、ヒスチジン標識したヒト組換えＳｐ１を大量に作製した。ヒト組換えＳｐ１はQIAGENのNi-NTAアフィニティーセファロースで精製した。RTS反応溶液50μlを溶解バッファー（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM イミダゾール, 20 mM 2-メルカプトエタノール, 0.1% Triton X-100, 10×Complete protease inhibitor cocktail (Roche); pH 8.0）中で200μlのNi-NTAセファロースと4℃で１時間反応させた後に4℃、8000×g、10秒遠心した。沈殿したビーズを洗浄バッファー 1 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 35 mM イミダゾール, 0.1% Triton X-100; pH 8.0)、及び、洗浄バッファー 2 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 50 mM イミダゾール, 0.1% Triton X-100; pH 6.3) 1mlずつで順次洗った。洗い終わったビーズを100μlの溶出バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM イミダゾール, 0.1% Triton X-100; pH 5.9) 中で4℃、１時間インキュベーションした後にスピンカラム (Bio-Rad Laboratories) に移し、4℃、800×gで4分遠心してＳｐ１を溶出した。
【００３８】
実施例２：架橋Ｓｐ１（抗原）の作製と免疫
精製したＳｐ１（終濃度1μM）を試験管内で精製モルモット肝トランスグルタミナーゼ（TG; シグマ アルドリッチ）（終濃度1μM）とHBS反応バッファー (10 mM CaCl2, 100 mM DTT, 0.6 mg/mlヘパリン) 中で37℃、１時間反応させた。この反応液を8％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後にCBB染色により、架橋Ｓｐ１のバンドを確認した（図２）。架橋Ｓｐ１ 20μgを含むバンドを切り出し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズして、アジュバンド(MPL +TDM +CWS Emulsion (RIB)) 0.5 mg/ml, 100μlと共にウサギ背中皮下に免疫した。免疫は情報に従い、初回免疫1ヶ月後から３ヶ月間毎週行った。
【００３９】
実施例３：架橋Ｓｐ１抗体画分の精製
免疫前のウサギ、並びに追加免疫したウサギから毎週血液を採取し、情報に従い抗血清を得た。抗血清中の抗体の力価は架橋Ｓｐ１をコートしたイムノプレートを用いたELISAにより評価し、1/1000希釈でOD1.2以上のものを抗体精製に用いた。抗体の精製はプロテインAセファロース （シグマ アルドリッチ）を用いて行った。得られた抗体の濃度はBCA assay kit (PIERCE) を用いて決定した。
【００４０】
実施例４：TG結合セファロース、並びにＳｐ１結合セファロースを用いた架橋Ｓｐ１抗体画分からのTG並びにＳｐ１認識抗体の除去（架橋Ｓｐ１特異抗体の精製）
得られた抗体画分からTG及び架橋していないＳｐ１を認識する抗体を除去した。1 mgのTGを反応バッファー (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl; pH 8.3) 中で100μl NHSビーズと結合させた後に、過剰な活性基をエタノールアミンを用いて不活化させることによりTG結合セファロースを得た。Ｓｐ１結合セファロースは上記のＳｐ１精製の手順と同じように、50μlのRTS反応溶液を溶解バッファー（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM イミダゾール, 20 mM 2-メルカプトエタノール, 0.1％Triton X-100, 10×Complete protease inhibitor cocktail (Roche); pH 8.0）中で200μlのNi-NTAセファロースと4℃で１時間反応させて作製した。これらのTG結合セファロース、並びにＳｐ１結合セファロースを架橋Ｓｐ１抗体画分と4℃で一晩反応させ、TGおよび架橋していないＳｐ１を認識する抗体を除去することで、架橋Ｓｐ１特異抗体を得た。
【００４１】
実施例５：架橋Ｓｐ１特異抗体の抗原認識特異性（図３）
精製Ｓｐ１（終濃度200 nM）を精製モルモット肝TG（終濃度5 nM）とHBSバッファー (10 mM CaCl2, 100 mM DTT) 中、37℃で2日間反応させた。反応液を8％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離したタンパク質をPVDF膜上に転写した後に、市販のＳｐ１抗体 (IC6 (Santa Cruz))（終濃度2μg/ml；レーン１及び２）並びに精製（TG結合セファロース、Ｓｐ１結合セファロースを用いたTG認識抗体、非架橋Ｓｐ１認識抗体除去操作）前（レーン３及び４）後（レーン５及び６）の架橋Ｓｐ１抗体（終濃度10μg/ml）を用いてウエスタンブロットを行った。発色は西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（終濃度0.5μg/ml）を用いてECL反応により行った。その結果、市販の架橋していないＳｐ１に対する従来の抗体では架橋不活性化されたＳｐ１が検出されないのに対して、今回作製した架橋Ｓｐ１特異抗体はこれを大変良く検出することがわかった。
【００４２】
実施例６：架橋Ｓｐ１特異抗体による抗癌剤処理によりアポトーシスに陥った肝癌細胞の検出（図４）
ヒト肝癌細胞株 (JHH, 1×105個/ml) をカバーガラス入り培養皿に蒔き、抗癌剤である非環式レチノイド (AR, 終濃度10μM) で24時間処理した。その後、3.7％ホルムアルデヒドで細胞をカバーガラス上に固定し、0.3％Triton X-100で浸透化させた。H33258（カルビオケム、終濃度 0.1μg/ml）及びそれぞれの抗体（免疫前の抗血清から精製した抗体（終濃度 2.8μg/ml）、市販Ｓｐ１抗体(anti-Sp1 polyclonal antibody (シグマ アルドリッチ)（終濃度 4μg/ml）、架橋Ｓｐ１特異抗体（終濃度 4μg/ml）)と4℃、1晩インキュベーションした後に、二次抗体としてFITC結合ヒツジ抗ウサギIgG抗体 (Jackson)（終濃度 1μg/ml） を使用して染色を行った。結果は蛍光顕微鏡（ライカ）で観察し、写真に記録した。市販の架橋していないＳｐ１に対する従来の抗体では、抗癌剤によりアポトーシスに陥った細胞と生きている細胞を見分けることができないが、今回作製した架橋Ｓｐ１特異抗体は、アポトーシスに陥った細胞のみ染色した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、架橋不活性化Ｓｐ１認識抗体によるトランスグルタミナーゼ依存性アポトーシス経路の検出を示す。図１に示すように、アポトーシスのシグナル伝達経路は大きく分けて２つ存在すると考えられる。１つはカスパーゼが活性化されて最終的にDNAが断片化をされる経路であり、もう１つがトランスグルタミナーゼの発現が上がり、核に移行することでＳｐ１などの転写因子やDNAを取り巻くヒストンタンパク質を凝集させる経路である。本発明の抗体は、このトランスグルタミナーゼで誘導したアポトーシスで引き起こされる架橋（凝集）したＳｐ１を特異的に認識する抗体であり、トランスグルタミナーゼ誘導アポトーシスを検出し、その程度を調べることができる。
【図２】図２は、トランスグルタミナーゼによるＳｐ１の架橋反応を示す。RTSで作製、精製したＳｐ１と精製モルモット肝トランスグルタミナーゼ（終濃度各1μM）をHBS反応バッファー (10 mM CaCl2, 100 mM DTT, 0.6 mg/mlヘパリン) 中で37℃で図に示す異なる時間反応させた後に、反応液を8％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、CBB染色により架橋Ｓｐ１、非架橋Ｓｐ１、TGを染色した。
【図３】図３は、架橋Ｓｐ１特異抗体の抗原認識特異性を示す。精製Ｓｐ１（終濃度200 nM）を精製モルモット肝TG（終濃度5 nM）の作用のあるなしで反応させたのちに、市販Ｓｐ１抗体 (IC6 (Santa Cruz))（終濃度2μg/ml）並びに精製（TG結合セファロース、Ｓｐ１結合セファロースを用いたTG認識抗体、非架橋Ｓｐ１認識抗体除去操作）前後の架橋Ｓｐ１抗体（終濃度10μg/ml）を用いてウエスタンブロットを行った。レーン１、３、５：トランスグルタミナーゼによる架橋反応をかけなかったサンプル；レーン２、４、６：トランスグルタミナーゼによる架橋反応をかけたサンプル。レーン１及び２：市販Ｓｐ１抗体により検出されたバンド；レーン３及び４：精製前架橋Ｓｐ１抗体により検出されたバンド；レーン５及び６：精製後架橋Ｓｐ１抗体により検出されたバンド
【図４】図４は、抗癌剤処理によりアポトーシスに陥った肝癌細胞に見られる架橋Ｓｐ１特異抗体による染色像を示す。ヒト肝癌細胞株を抗癌剤非環式レチノイド (AR)もしくは対象としてARの溶剤であるエタノール(EtOH)で処理した後に、細胞を固定し、ヘキスト３３２５８（Hoechst）を用いた核染色（青）と各種抗体（Antibody;免疫前抗体[Pre Immune]、市販Ｓｐ１抗体[Anti-Sp1]、架橋Ｓｐ１特異抗体[Anti-CL Ｓｐ１]）を用いた免疫染色（緑）による２重染色を行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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