(57)【要約】【課題】  アレルギー誘発物質を簡便かつ迅速に検出する方法を提供する。【解決手段】  アレルギー誘発物質の検出方法であって、下記の工程：(a)被検物質と血清蛋白質とを接触させる工程；及び(b)被検物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを電気泳動により確認する工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー誘発物質の検出方法であって、下記の工程：
(a)被検物質と血清蛋白質とを接触させる工程；及び
(b)被検物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを電気泳動により確認する工程
を含む方法。
【請求項２】
血清蛋白質がアルブミンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気泳動をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により行う請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー誘発物質の簡便な検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、わが国の産業界で使われている化学物質は、主なものだけでも約55,000種類を数えるといわれており、需要の多様化に伴い、毎年、新たに500種類以上の化学物質が労働の現場に導入されている。これらの化学物質の中にアレルギー誘発能の高い化学物質が当然含まれていると考えられており、数多くの化学物質のなかからそのようなアレルギー誘発物質を検出することは極めて重要である。
【０００３】
ある化合物がアレルギー誘発能を有しているか否かは、従来、動物を用いた実験により確認されている。例えば、Ｉ型アレルギー誘発能試験としては、モルモットやラットを用いた全身性の能動アナフィラキシー試験（ASA試験）や、局所性の受身アナフィラキシー試験（PCA試験）などがある。ASA試験は、被検物質を一定間隔で反復投与し、アナフィラキシーショック症状の誘発の有無を調べる試験であり、PCA試験は、正常動物に被検物質感作血清を皮内投与した後被検物質を静注し、皮内注射部位にアナフィラキシー反応により生じる炎症の大きさから測定する試験である。また、IV型アレルギー誘発能試験としては、被検物質をモルモットやマウスに投与し、その物質を再投与あるいは塗布した皮膚部位の炎症の大きさから遅延型過敏症の誘発能を測定する方法が採用されており、物質の投与方法によりDraize試験、Buehler試験、maximization試験などがある。また、炎症の代わりに物質が再曝露された耳介のリンパ節でのリンパ球増殖反応を測定する局所リンパ節反応試験（local lymph node assay, LLNA）が代替試験法として用いられる。さらにLLNA法の応用として、リンパ節細胞が産生するサイトカインプロフィールを解析する方法もある。
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、いずれも多くの実験動物と比較的長期の試験期間が必要であり、費用と時間の観点から大きな問題を有しており、さらに動物とヒトの種差などからヒトの化学物質によるアレルギーを予知する手段としては必ずしも適切ではないという問題もある。従って、短時間に、かつ簡便にアレルギー誘発物質を検出する方法の開発が切望されていた。
【０００５】
一方、血清蛋白質と化学物質との結合性に関して、非特許文献１ (Gauggel D. L. et al., J. Appl. Toxicol., 13, 307, 1993)には、化学物質（ハプテン）と結合したアルブミンの変化を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で検出する方法が記載されている。上記文献には、ハプテン−蛋白抱合体のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動について短い記述があるが、実験データは何ら示されていない。本発明者らの研究によれば、非特許文献１の記載とは全く異なり、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではアレルギー誘発物質と反応させた血清アルブミンは多くの場合一つのバンドのみを与え、一方、等電点電気泳動ではアルブミン自体がすでに多バンドであることが確認されている。従って、非特許文献１のこの部分の記載については信憑性が乏しい。また、非特許文献１にはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動によりアレルギー物質の検出が可能であることは示唆ないし教示されていない。
【非特許文献１】J. Appl. Toxicol., 13, 307, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、アレルギー誘発物質を簡便かつ迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、アレルギー誘発物質は血清アルブミンなどの血清蛋白質と反応してその三次構造を変化させること、及びそのように三次構造が変化した血清蛋白質は電気泳動により無反応の血清蛋白質と分離可能であることを見出した。また、被検物質と血清蛋白質とを共存させた系において、被検物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質の存在を上記のように電気泳動により証明することによって、該被検物質がアレルギー誘発物質であると判定できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明により、アレルギー誘発物質の検出方法であって、下記の工程：
(a)被検物質と血清蛋白質とを接触させる工程；及び
(b)被検物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを電気泳動により確認する工程
を含む方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、血清蛋白質がアルブミンである上記の方法；電気泳動をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により行う上記の方法；及び電気泳動をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動の組み合わせにより行なう上記の方法が提供される。
【０００９】
また、別の観点からは、アレルギー疾患の診断方法であって、ヒトを含む哺乳類動物から採取された血液中に含まれる血清蛋白質を電気泳動に付して、アレルギー誘発物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを確認する工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、動物を用いた長期間の煩雑なアレルギー誘発試験を行なうことなく、被検物質がアレルギー誘発物質であるか否かを迅速かつ簡便に確認することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、アレルギー誘発物質の検出方法であって、(a)被検物質と血清蛋白質とを接触させる工程；及び(b)被検物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを電気泳動により確認する工程を含むことを特徴としている。
工程(a)において用いられる被検物質の種類は特に限定されない。例えば、低分子有機化合物類、高分子有機化合物類、蛋白質類、糖化合物類、脂質類、核酸類など、いかなるものを検出対象として用いてもよい。これらのうち、低分子有機化合物を好ましい被検物質として挙げることができる。低分子有機化合物の化学構造は特に限定されず、任意の官能基を１個又は２個以上を有していてもよく、任意のヘテロ原子（例えば酸素原子、窒素原子、又はイオウ原子など）を含んでいてもよい。直鎖若しくは分枝鎖、飽和、部分飽和、若しくは芳香族の環構造（環構造は単環若しくは多環のいずれの構造であってもよい）、あるいはそれらの組み合わせからなる任意の構造を含んでいてもよい。
【００１２】
工程(a)において用いられる血清蛋白質の種類も特に限定されないが、例えば、アルブミンやグロビンなどを挙げることができる。なかでもアルブミンが好ましい。アルブミンとしては、ヒト血清から分離調製したもののほか、乾燥アルブミンとして提供されている市販品など、いかなる形態又は由来のものを用いてもよい。
【００１３】
血清蛋白質と被検物質とを接触させる工程は、例えば、血清蛋白質を含む水性媒体に被検物質を添加することにより行われるが、この操作は特に限定されず、水性媒体中で血清蛋白質と被検物質とが接触可能な状態であればいかなる操作を選択してもよい。水性媒体としては、水、リン酸バッファーなどの緩衝液、生理食塩水などを用いることができ、必要に応じて、グリセリンやエチレングリコール、ジメチルスルホキシドなどの水混和性有機溶媒を少量添加してもよい。上記の接触を行なう温度及び時間は特に限定されないが、一般的には、血清蛋白質が変性しない温度範囲（例えば0℃〜40℃程度、好ましくは20〜37℃程度）で、数時間から数日間、好ましくは24〜48時間程度の処理を行なえばよい。上記の接触は、好ましくは生理的環境と同等の中性付近、例えばpH 7.0〜7.5程度の範囲で行なうことが望ましい。この接触工程は上記のようにイン・ビトロで行なってもよいが、被検物質をヒトを含む哺乳類動物に投与して、血液を採取する方法によりイン・ビボで行なうこともできる。また、被検物質に曝露された可能性のあるヒトを含む哺乳類動物の血液を採取して工程(a)に代えることも可能である。
【００１４】
上記工程(a)において、被検物質がアレルギー誘発物質である場合には、被検物質と血清蛋白質とが反応して、その結果、三次構造が変化した血清蛋白質が生成する。三次構造が変化した血清蛋白質とは、アレルギー誘発物質の反応性官能基が血清蛋白質のアミノ酸残基と反応して共有結合を形成し、該アレルギー誘発物質が共有結合したポリペプチドにより形成される蛋白の三次構造が該血清蛋白質の三次構造とは異なるものになった場合のほか、アレルギー誘発物質と血清蛋白質との物理化学的な相互作用により、該血清蛋白質の三次構造に変化が生じた場合、あるいは血清蛋白質が反応により会合して巨大分子になった場合などを含め、該血清蛋白質の立体構造に何らかの変化が生じた状態を意味している。本明細書において「反応」とは共有結合が形成される化学反応を含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。多くの場合、アレルギー誘発物質との化学反応により共有結合が形成されて血清蛋白質の三次構造に変化が生じる。
【００１５】
本発明の方法では、アレルギー誘発物質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質を電気泳動により分析することができる。反応により三次構造が変化した血清蛋白質は、反応前の血清蛋白質とは異なる泳動挙動を示し、反応前の血清蛋白質とは異なる位置にバンドを与えるので、電気泳動により反応前の血清蛋白質とは異なるバンドの存在を確認することによって、反応により三次構造が変化した血清蛋白質が生成したことを証明できる。電気泳動の種類及び条件は特に限定されず、アレルギー誘発物質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質と反応前の血清蛋白質とを分離できるものであればいかなるものを採用してもよいが、例えば、硫酸ドデシルナトリウム塩−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)や等電点電気泳動(IEF)などが好適である。これらの２つの電気泳動法を組み合わせて分析することにより、極めて精度の高い分析が可能になる。
【００１６】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、外来化学物質が免疫原性を持つには、血清蛋白質と結合して該血清蛋白質の三次構造に変化を与え、反応後の蛋白質が非自己蛋白質として認識される必要がある。本発明者は、非自己蛋白質として認識される程度に三次構造に変化が生じた血清蛋白質は、電気泳動によって反応前の血清蛋白質と分離可能であることを初めて見出し、被検物質がアレルギー誘発物質であるか否かを、(a)イン・ビトロでの２成分の接触工程と、(b)その後の電気泳動工程により、簡便かつ迅速に判定できることを見出した。本発明の方法は、免疫反応を用いずに、電気泳動により被検物質のアレルギー感作性をスクリーニングできるので、従来法に比べて試験期間が大幅に短縮されており、動物も用いないので時間及び経費の両面から有用である。
【００１７】
また、本発明の方法を応用して、患者の血清蛋白質の三次構造変化を調べることによりアレルギー性疾患を診断することも可能である。より具体的には、上記の診断は、ヒトを含む哺乳類動物から採取された血液中に含まれる血清蛋白質を電気泳動に付して、アレルギー誘発物質と血清蛋白質との反応により三次構造が変化した血清蛋白質が存在するか否かを確認することにより行なうことができる。そのような診断方法を行うためには自動化された診断装置を作製して用いることも可能である。
【実施例】
【００１８】
例１
グルタルアルデヒド及びトルエン-2,4-ジイソシアナートはアレルギー誘発物質であることが知られている。一方、2,5-ヘキサンジオンは蛋白質と結合することは知られているが、アレルギー誘発能はないとされている。ヒト血清アルブミンと上記の３種類の化学物質(グルタルアルデヒド、トルエン2,4-ジイソシアネート(TDI)、及び2,5-ヘキサンジオン)とを50％ ジメチルスルホキシドを含むリン酸バッファー（pH 7.5）中で24〜48時間接触させ、得られた試料をSDS-PAGE及びIEFで分析した。また、フタル酸、無水フタル酸、ビスフェノールA(BAP)、ビスフェノールAジグリシジルエーテル(BADGE)、及びジアミノジフェニルエーテルを被検物質として用いて同様に処理を行なった、SDS-PAGEの結果を図１に、IEFの結果を図２に示す。
【００１９】
アルブミンは分子量66,000であり、図１に示すように一本のバンドとして染色される（Lane 1）。2,5-ヘキサンジオンで処理した試料では66,000のバンドにほとんど変化が認められない（Lane 2）。グルタルアルデヒド及びトルエン-2,4-ジイソシアネートで処理した試料では、泳動パターンが無処理アルブミン（Lane１)と異なっていることがわかる（Lane 3及び10）。これらの結果から、アレルギー誘発物質であるグルタルアルデヒド及びトルエン-2,4-ジイソシアネートはそれぞれアルブミンに反応してアルブミンの三次構造に変化を与えていること、及びアレルギー誘発性ではない2,5-ヘキサンジオンはアルブミンと反応してもアルブミンの三次構造に実質的な変化を与えていないことが分かる。また、アレルギー非誘発性であるフタル酸、ビスフェノールA、及びジアミノジフェニルエーテルで処理した試料では、いずれも泳動パターンに変化は認めらなかった。一方、アレルギー誘発物質である無水フタル酸、ビスフェノールAジグリシジルエーテル、及びビスフェノールAジグリシジルエーテルとジアミノジフェニルエーテルとの混合物で処理した試料では、バンドの出現位置が無処理アルブミン（Lane１)と異なり、アルブミンの三次構造が変化していることが認められた。
【００２０】
等電点電気泳動（図２）では、アルブミンは等電点4.7〜5.2付近に数本のバンドを与える（Lane 1）。2,5-ヘキサンジオンで処理した試料ではアルブミンの等電点にほとんど変化が認められない(lane 2)。一方、グルタルアルデヒド及びトルエン-2,4-ジイソシアネートで処理した試料では、無処理アルブミン（Lane 1）とは異なった等電点を持った蛋白質が生成していることが分かる（Lane 3及びLane 10）。これらの結果から、アレルギー誘発物質であるグルタルアルデヒド及びトルエン-2,4-ジイソシアネートはそれぞれアルブミンに反応してアルブミンの等電点に変化を与えていること、及びアレルギー誘発性ではない2,5-ヘキサンジオンはアルブミンと反応してもアルブミンの等電点に実質的な変化を与えていないことが分かる。また、アレルギー非誘発性であるフタル酸、ビスフェノールA、及びジアミノジフェニルエーテルで処理した試料では、いずれもアルブミンの等電点に実質的に変化を与えなかった。一方、アレルギー誘発物質である無水フタル酸、ビスフェノールAジグリシジルエーテル、及びビスフェノールAジグリシジルエーテルとジアミノジフェニルエーテルとの混合物で処理した試料ではアルブミンの三次構造変化により、さまざまな等電点の蛋白質が生成されていた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法により、被検物質と血清蛋白質（ヒト・アルブミン）とを接触させた後にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により試料を分析した結果を示した写真である。Lane 1：ヒトアルブミン(HSA) 10 mg/ml、Lane 2：HSA 10 mg/ml＋2,5-ヘキサンジオン(10 mM)、Lane 3:HSA 10 mg/ml＋グルタルアルデヒド(10 mM)、Lane 4：HSA 10 mg/ml＋フタル酸(10 mM)、Lane 5：HSA 10 mg/ml＋無水フタル酸(10 mM)、Lane 6：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA(10 mM)、Lane 7：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA ジグリシジルエーテル(10 mM)、Lane 8：HSA 10 mg/ml＋ジアミノジフェニルエーテル(10 mM)、Lane 9：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA ジグリシジルエーテル＋ジアミノジフェニルエーテル(各10 mM)、Lane 10：HSA 10 mg/ml＋トルエン2,4-ジイソシアネート(10 mM)、M：分子量マーカー（Nakarai）
【図２】本発明の方法により、被検物質と血清蛋白質（ヒト・アルブミン）とを接触させた後に等電点電気泳動により試料を分析した結果を示した写真である。Lane 1：ヒトアルブミン(HSA) 10 mg/ml、Lane 2：HSA 10 mg/ml＋2,5-ヘキサンジオン(10 mM)、Lane 3:HSA 10 mg/ml＋グルタルアルデヒド(10 mM)、Lane 4：HSA 10 mg/ml＋フタル酸(10 mM)、Lane 5：HSA 10 mg/ml＋無水フタル酸(10 mM)、Lane 6：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA(10 mM)、Lane 7：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA ジグリシジルエーテル(10 mM)、Lane 8：HSA 10 mg/ml＋ジアミノジフェニルエーテル(10 mM)、Lane 9：HSA 10 mg/ml＋ビスフェノールA ジグリシジルエーテル＋ジアミノジフェニルエーテル(各10 mM)、Lane 10：HSA 10 mg/ml＋トルエン2,4-ジイソシアネート(10 mM)、M：IEF標準試料(Bio-Rad, 161-0310)
【図１】
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【図２】
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