(57)【要約】【課題】  マルチプレックス吸光度式微細加工チップ電気泳動システム、微細加工チップおよび使用方法が、タンパク質種の検出および同定に関与する。微細加工チップ電気泳動システムは、複数サンプルを同時に分析することができる。【解決手段】  そのシステムは、サンプルの第一次元分離のためのサンプルチャンバと、前記サンプルチャンバに対してほぼ垂直な前記サンプルの第二次元分離のための第一のチャネル平面アレイと、ならびに前記第一次元分離時に前記第一のチャネル平面アレイから前記サンプルチャンバを分離する障壁とを有する微細加工チップを用いるものである。使用に際しては、サンプルをサンプルチャンバに入れ、障壁をそのサンプルチャンバ周囲に設け、サンプルをサンプルチャンバ内で等電点電気泳動し、次に障壁を除き、サンプルを分子量に応じて第一のチャネルアレイで分離する。【選択図】  図７
2006071643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックス吸光度式微細加工チップ電気泳動システムであって、
サンプルの第一次元分離のためのサンプルチャンバと、
前記サンプルチャンバに対してほぼ垂直である、前記サンプルの第二次元分離のための第一のチャネル平面アレイと、
第一次元分離時に前記第一のチャネル平面アレイから前記サンプルチャンバを分離する障壁と、
を有する微細加工チップ；
前記第一のチャネル平面アレイを通過する光を検出するための光検出器；および
前記光検出器に対して配置された光源
を有することを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記微細加工チップがさらに、前記チャネルからのサンプルを集合させて受液するよう作製された、第一のチャネル平面アレイ出口端に対してほぼ横方向の受液チャンバを有する請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記微細加工チップがさらに、前記受液チャンバに固定され、前記チャネルからのサンプルを回収するよう作製された、前記チャネル平面アレイと一致するよう配列された回収管のアレイを有する請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記微細加工チップがさらに、前記チャネル平面アレイ内にゲルマトリクスを有する請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記チャネルを通ってサンプルを移動させるための電場を発生させるよう作製された前記微細加工チップ本体付近に配置された電場発生装置をさらに有する請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記微細加工チップ本体が、サンプルが吸収する光の波長範囲にわたって透明である請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記微細加工チップの第一のチャネル平面アレイが少なくとも約１０個のチャネルを有する請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記微細加工チップの第一のチャネル平面アレイが少なくとも約９０個のチャネルを有する請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記微細加工チップのチャネルの幅が、少なくとも５０ミクロンである請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記微細加工チップのチャネルの幅が、少なくとも２００ミクロンである請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記光検出器が、線形フォトダイオードアレイである請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記光源が、波長１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの光を放出する請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記光源が、約０．５ｍＷ〜約５０ｍＷの出力を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記チャネル平面アレイと前記光検出器との間に配置された光学フィルターをさらに有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記多チャネル平面アレイと前記光検出器との間に配置されたフラットフィールドレンズをさらに有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記光源と前記チャネル平面アレイとの間に配置されたコリメータレンズをさらに有する請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
複数のサンプルを分析する吸光度式電気泳動システムで用いられる微細加工チップであって、
サンプルの第一次元分離のためのサンプルチャンバ；
前記サンプルチャンバに対して隣接し、ほぼ垂直に配置された、前記サンプルの第二次元分離のための第一のチャネル平面アレイ；
第一次元分離時に前記第一のチャネル平面アレイから前記サンプルチャンバを分離する障壁；
前記サンプルチャンバに隣接配置された第一の電場発生装置；
前記第一のチャネル平面アレイに隣接配置された第二の電場発生装置
を有することを特徴とする微細加工チップ。
【請求項１８】
前記第一のチャネル平面アレイに隣接した受液チャンバをさらに有する請求項１７に記載の微細加工チップ。
【請求項１９】
前記サンプル供給チャンバに隣接配置された第二のチャネル平面アレイをさらに有する請求項１８に記載の微細加工チップ。
【請求項２０】
前記第二のチャネル平面アレイにほぼ隣接した緩衝液チャンバをさらに有する請求項１９に記載の微細加工チップ。
【請求項２１】
前記第一のチャネル平面アレイ内にゲルマトリクスをさらに含む請求項２０に記載の微細加工チップ。
【請求項２２】
等電点電気泳動後にタンパク質を含むサンプルに電荷を供給するよう作製された前記第二のチャネル平面アレイ内の緩衝液をさらに含む請求項２１に記載の微細加工チップ。
【請求項２３】
前記チャネルからのサンプルを回収するよう作製された前記受液チャンバ内の回収管アレイをさらに有する請求項２２に記載の微細加工チップ。
【請求項２４】
前記第一のチャネル平面アレイが２〜２５ｃｍの長さを有する請求項１７に記載の微細加工チップ。
【請求項２５】
前記第一のチャネル平面アレイが少なくとも約９０個のチャネルを有する請求項１７に記載の微細加工チップ。
【請求項２６】
前記サンプルチャンバが、前記チャネル平面アレイを超えて延在することで、前記サンプルチャンバの一部分を画定している請求項１７に記載の微細加工チップ。
【請求項２７】
前記サンプルチャンバが、前記サンプル中のタンパク質を前記一部分に等電点電気泳動させ得るような最適化されたサンプルマトリクスを含む請求項２６に記載の微細加工チップ。
【請求項２８】
前記サンプルを、前記一部分から、電気浸透流駆動可動化によって前記第一のチャネル平面アレイに対し一直線上にある前記サンプルチャンバ中に移動させることができる請求項２７に記載の微細加工チップ。
【請求項２９】
前記サンプルを、前記一部分から、動電的可動化によって前記第一のチャネル平面アレイに対し一直線上にある前記サンプルチャンバ中に移動させることができる請求項２７に記載の微細加工チップ。
【請求項３０】
前記サンプルを、前記一部分から、流体力学的可動化によって前記第一のチャネル平面アレイに対し一直線上にある前記サンプルチャンバ中に移動させることができる請求項２７に記載の微細加工チップ。
【請求項３１】
前記障壁が、等電点電気泳動時にサンプルチャンバと前記第一のチャネル平面アレイとの間の電流を低減する請求項１７に記載の微細加工チップ。
【請求項３２】
前記障壁が、前記第一のチャネル平面アレイの凍結領域である請求項３１に記載の微細加工チップ。
【請求項３３】
マルチプレックス吸光度式微細加工チップ電気泳動システムの使用方法であって、
等電点電気泳動によって処理されるべきサンプルをサンプルチャンバに充填する段階；
前記サンプルチャンバと第一のチャネルアレイとの間に障壁を設ける段階；
前記サンプルチャンバ内で前記サンプルの等電点電気泳動を行う段階；
前記サンプルチャンバと前記第一のチャネルアレイとの間に設けられている前記障壁を回避する段階;
前記第一のチャネルアレイ中で前記サンプルを分子量に応じて分離する段階；
光源から前記第一のチャネルアレイを通る光を放出する段階；および
前記光源からの光を光検出器で検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項３４】
第二の平面チャネルアレイに緩衝液を充填する段階；
サンプル供給チャンバ内の前記サンプルを緩衝液で処理する段階
をさらに有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第一のチャネルアレイにゲルマトリクスを充填して、前記第一のチャネルアレイ内での分子量に応じた前記サンプルの分離を促進する段階をさらに有する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一のチャネルアレイからの前記サンプルを受液チャンバに回収する段階をさらに有する請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くはマルチプレックス吸光度式電気泳動システムに関する。具体的には本発明は、マルチプレックス吸光度式電気泳動システムで使用される微細加工チップおよびプロテオミクス研究での微細加工チップの使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが完了したことで、ゲノム配列に依存した多数のポストゲノム応用が一気に登場することになった。しかしながら、ＤＮＡ配列情報のみでは、遺伝子発現、共翻訳的および翻訳後修飾および表現型あるいは薬剤投与、細胞周期、腫瘍遺伝子、加齢、ストレスおよび疾患などの多重遺伝子現象を予測することはできない。恐らくは５０万のヒトタンパク質およびその生理的状態もしくは疾患状態との関係が解明されるのは、かなり先のことになる。プロテオームは、最近登場した新たな基本概念であって、機能性分子レベルで複雑な多変量性疾患の生化学的および生理的機序を解明する闘いにおいて重要な役割を果たすはずである。プロテオミクスは、生理的プロセスをさらに解明するための異なる状態下でのプロテオームの定性的および定量的比較と定義することができる。プロテオミクスは、生理的状態または疾患状態における細胞系での遺伝子調節およびタンパク質プロファイルの変化を解明する努力において重要なテーマとなりつつある。まだ初期の段階ではあるが、プロテオミクスはすでに、生物学および医学における革命的な変化を約束するものである。
【０００３】
プロテオーム研究が発展し、それは現在でもなお、二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）、そしてさらに最近では複合クロマトグラフィー法（例：ＬＣ−ＬＣ）などの多元的分離法の中心的技術に依存している。後者の方法が一般的になりつつあるにも拘わらず、二次元ゲル電気泳動は、複雑なタンパク質の混合物を分離することができ、全細胞、組織、さらには全生命体レベルでの多重遺伝子現象を追跡できることから、現在もなお最も頻繁に選択される選択法の一つとなっている。
【０００４】
２−ＤＥは、２次元で互いに直角の方向に移動させることで、サンプル中のタンパク質を分離および同定する方法である。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は第一の次元で使用され、等電点（ｐＩ）に従ってタンパク質を分離するものである。ｐＩは、両性物質の電荷が中性となるｐＨである。ｐＨがある物質のｐＩより高いと、それは負電荷を有し、その逆も言える。ｐＨ勾配のある媒体にタンパク質を置き、電場を加えると、タンパク質は最初に反対電荷を有する電極に向かって移動する。それが移動するに連れて、タンパク質の正味電荷と移動度が低下し、そのタンパク質の速度が低下する。最終的にタンパク質は、そのｐＩに等しいｐＨ勾配の点に到達し、そこで中性となり、移動を停止する。そのタンパク質がより低い（高い）ｐＨの領域まで拡散することが偶発的に起こったとしても、それは正電荷（負電荷）を帯びることになって、電場によって陰極（陽極）の方向に強制的に戻される。このようにしてタンパク質は、それらの個々の特徴的なｐＩ値でｐＨ勾配におけるシャープな帯域に集中する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、タンパク質分離を分子量に基づいて行う第２の次元の分離方法である。ＳＤＳは全てのタンパク質に結合し、その基本的な効果は、タンパク質が均一な負電荷／質量比で移動するという点である。ポリアクリルアミドゲルの孔が、大きさ（すなわち、分子量）に応じてタンパク質を篩分けする。相対的に小さいタンパク質の方が、相対的に大きいタンパク質より、電場下でゲルを通って速く移動することから、分子篩が行われる。一次元電気泳動による分離方法と比較して、二次元の方法によって、サンプルをより広い面積で分離することが可能となり、各成分の分離能が高くなる。例えば、約１００の帯域しか分離できないＰＡＧＥ一次元分離とは異なり、二次元ゲルによる分離は、それよりかなり複雑なサンプルを分析することができる（例えば、一般的な二次元試験では、数千のスポットを分離することができる）。
【０００５】
最初に開発された時、２−ＤＥは、第一次元のＩＥＦ分離のためのｐＨ勾配を発生させるのにキャリア両性電解質（ＣＡ）を利用した。しかしながら、ＣＡ−ＩＥＦには多くの欠点がある。第一に、フォーカシングが長時間になるとｐＨ勾配が陰極端方向に移動することを意味する陰極ドリフトのため、平衡ＣＡ−ＩＥＦが得られない。第二に、ｐＨ勾配の再現性も、ＣＡ調製物のバッチ間のばらつきと、ＣＡの入手源による影響を受ける。従って、ＣＡ−ＩＥＦによって発生する二次元ゲル間の空間的な再現性の低さのために、研究室間での二次元ゲルデータの交換が大きな問題となっている。ｐＨ勾配の不安定さおよび再現性のなさという問題は、ＩＥＦにおける固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）の導入によって解決された。アクリルアミドのマトリクスと共重合したある種の化学物質は、かなり安定なｐＨ勾配を形成する。ＩＰＧの利点には、陰極ドリフトの回避、再現性の向上がある。さらに、ＩＰＧを導入することで、分離能が大幅に改善され、特に狭い範囲のＩＰＧではそれが顕著である。その進歩により、二次元ゲル電気泳動がプロテオーム分析の中核的技術となり、ペプチドフィンガープリント法、アミノ酸組成分析、ペプチド配列決定および質量分析によるスポット同定が容易になる。
【０００６】
しかしながら、この２−ＤＥ法にも、プロテオミクス研究でのその使用を制限し得る多くの欠点がある。二次元ゲル電気泳動の欠点には、労働集約的である点（サンプル処理、ゲル調製、染色）、時間がかかる点（通常は、一つの分析を完了するのに複数日を要する）、自動化が容易ではない点（常に人が監視する必要がある）などがある。スループットの低さが、プロテオーム分析に対する従来の手法の費用対効果に影響する別の重要な要素である。過去１０年間にわたって電気泳動法では多くの改良が行われてきたが、二次元ゲル電気泳動に関連する上記の欠点はなおも存在する。その方法は、なおも冗長で、効率が低く、従来の二次元ゲルで複雑なタンパク質混合物を調製、装填、分離および目視化するのに要する時間はかなり長い。プロテオミクス研究のニーズを満足するためには、１）分離能が高くなったものでなければならない；２）感度が上がり、迅速化されたものでなければならない；３）自動化され、使用が容易でなければならない；４）高スループットの分析を行う能力がなければならない；５）より良くは、ＭＳなどの他のいくつかの技術と組合せる可能性を持っている、という特徴を有する新たな技術を開発する必要が現在もある。
【０００７】
非常に多様な分子の分離において従来のゲル電気泳動に勝る多くの利点を提供するキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いることで、迅速さ、感度、分離能および自動化における改善を行うことができる。並列のキャピラリー管を同時に用いるマルチプレックスキャピラリー電気泳動も、スループットを高めるものである。マイクロチップ上でのＣＥは、化学分析における次の革命をもたらす上で有望な最近登場した新技術である。過去１０年間にわたり、分析装置の微細加工の分野は、難解な技術から、商業的に利用可能なシステムになるにつれて認知された技術へと成長してきた。それは短時間に数百個のサンプルを同時に定量する能力を有し、従来のＣＥよりＭＳとの連携が容易でもある。自然なｐＨ勾配（Analytical Chemistry, 2000, 72, 3745-3751）または両性電解質によって形成するｐＨ勾配（Electrophoresis, 2002, 23, 3638-3645）を用いる微細加工装置での等電点電気泳動法が報告されている。それは、従来の二次元ゲル電気泳動での第一次元分離に似ている。他方、微小流体チャネル中でタンパク質をその大きさに基づいて分離する研究が行われている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5372-5377）。しかしながら、それらの利用は単一チャネル装置に基づいたものであることから、一次元分離のみを提供するものである。ホワイトサイズ（Whitesides）らは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）によるチップ装置を構築し、それによって二次元ゲル電気泳動を行っている（Analytical Chemistry, 2002, 74, 1772-1778）。第一次元は等電点電気泳動法であり、第二次元はＳＤＳゲル電気泳動である。しかしながら第一次元分離の後、装置を手動で分解し、再度組み立てることで、第一次元チャネルを第二次元チャネルに物理的に接続する必要があることから、その装置は部分的に自動化されていない。
【０００８】
これらの上記マイクロチップに基づく研究では蛍光検出を用いていたが、それにはタンパク質を色素で標識する必要があり、それによってサンプルの特性（例えば、ｐＩおよび分子量）が変わることになる。実施が容易であり、特に有機化合物および生物学的に重要な化合物の遠紫外線（２００〜２２０ｎｍ）検出において利用可能性が広くなることから、ＵＶ（紫外線）吸収検出がより有用である。ＵＶ検出システムでは、キャピラリー管または微細加工チャネルの断面をＵＶ光源で照射する。光検出器が、管を通過する光を検出する。ＵＶ吸収性サンプル成分がキャピラリー管の照射部分を通過すると、光検出器が通過光の減少を検出する（吸光度を示す）。このようにして、吸光度−時間のプロットであるエレクトロフェログラムを得ることができる。多くの商業的なＣＥおよびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）システムで、リアルタイムで分析物の吸収スペクトラムを得るのに、光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）が用いられている。流れにおける単一の点からの透過光が格子によって分散され、直線配列を通って記録される。ＰＣＴ出願である国際公開第０１／１８５２８号パンフレットでヤン（Yeung）らは、複数のサンプルを同時に分析するためのマルチプレックス吸光度式キャピラリー電気泳動システムを開示している。ＵＶ吸光度を利用することで、従来の二次元ゲル電気泳動で用いられる長時間の主要な要因となっているタンパク質染色の必要性がなくなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主たる目的は、改善されたマルチプレックス吸光度式システムによってプロテオミクス研究での上記のニーズを満足することにある。
【００１０】
別の目的は、より高い迅速性、より高い感度、より高い分離能およびより高いスループットを提供する、自動化された、二次元ゲル電気泳動の代替法である。
【００１１】
さらに別の目的は、一次元で等電点電気泳動法を行うことができ、別の次元で大きさによるタンパク質分離を行うことができるチップに基づく微小流体装置である。
【００１２】
さらに別の目的には、分離機構、および二次元ゲル電気泳動と同様に記録される種類の情報が含まれる。さらに別の目的には、ＵＶ吸光度検出が含まれる。
【００１３】
上記および／または他の目的の一以上が、本明細書および特許請求の範囲から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、微細加工チップ電気泳動システムは、複雑なタンパク質サンプルを分析することができる。そのシステムは、サンプルチャンバと、長手方向への第一のチャネル平面アレイと、前記サンプルチャンバを前記第一のチャネル平面アレイから分離する障壁とがある本体を有する微細加工チップを含む。そのシステムには、前記チャネルを通過する光を検出するための光検出器および前記光検出器に対して配置された光源がある。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、微細加工チップによって複雑なタンパク質サンプルの分析が容易になる。前記微細加工チップは、サンプルの第一次元分離のためのサンプルチャンバを有する。前記微細加工チップには、前記サンプルチャンバに長手方向で隣接し、ほぼ垂直である第一のチャネル平面アレイと第一次元分離時に前記第一のチャネル平面アレイから前記サンプルチャンバを分離する障壁とを有する微細加工チップ本体がある。前記微細加工チップは、前記サンプルチャンバに隣接配置された第一の電場発生装置および分子量によってサンプルを分離するよう作製された前記第一のチャネル平面アレイに隣接する第二の電場発生装置を有する。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、マルチプレックス吸光度式微細加工チップ電気泳動システムの使用方法が提供される。その方法は、サンプルチャンバに等電点電気泳動法によって処理されるべきサンプルを充填する段階、そして次に前記サンプルチャンバの周囲に障壁を設ける段階を含む。前記方法は、前記サンプル供給チャンバ内で等電点電気泳動法を行う段階、前記障壁を回避する段階、そして次に前記サンプルを第一のチャネルアレイ中に引き込む段階も有している。その方法はさらに、第一のチャネルアレイを通って光源から光を放出する段階、次に光検出器によって前記光源からの光を検出する段階を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
前記において説明した本発明は、マルチプレックス吸光度式電気泳動システムで用いられる微細加工チップである。本発明のシステムおよび方法は、タンパク質種の分離、検出および同定のためのものである。
【００１８】
本出願人らによれば、「チップ」とは、複数のサンプルに対して特化された電気的、化学的および／または機械的特性を有するように加工された個別の材料片を意味する。本出願人らによれば「微細加工」とは、約０．１μｍ〜約５００μｍの範囲の少なくとも一つの加工寸法を有する装置の構造的要素または特徴を指す。
【００１９】
図１および図２について説明すると、数字１０は吸光度式電気泳動システムを指す。光線１４が光源１２で発生し、コリメータレンズ１６、微細加工チップ２０、フラットフィールドレンズ２２、光学フィルター２４を通って進み、検出器２６に集まる。
【００２０】
光源１２から光が放出される領域と微細加工チップ２０との間の距離は、本発明の実施にはあまり重要ではない。しかしながら、光源１２から光が放出される領域と微細加工チップ２０との間の距離が短いほど、微細加工チップ２０が受ける光が多くなる。微細加工チップ２０が受ける光が多いほど、検出感度が高くなる。光源１２から光が放出される領域と微細加工チップ２０との間の距離が大きくなるほど、微細加工チップ２０が受け取る光の均一性が高くなる。
【００２１】
好ましくは、微細加工チップ２０と検出器２６との間の距離は、アレイ全体を見ることができ、焦点が合うような距離である。図２には、光源１２から放出される光の側面図を示してある。
【００２２】
図３でわかる通り、微細加工チップ２０は本体３０とカバー３２を有する。本体とカバーは、エポキシ結合などの熱結合および／または他の結合法によって互いに貼り付けられている。本体３０は、互いに対向する長手方向側面３４と互いに対向する横方向側面３６を有する。本体３０は、上面３８と底面４０も有する。
【００２３】
微細加工チップの本体３０およびカバー３２に好ましい材料には、プラスチック、ポリ（ジメチルシロキサン）ＰＤＭＳ、石英もしくは溶融シリカ、ガラスおよび他の非導電性材料などがあるが、これらに限定されるものではない。微細加工チャネルおよびチャンバは、フォトリソグラフィー、湿式化学的エッチング、レーザアブレーション、エアアブレーション、射出成形、エンボス加工および他の方法などの各種加工方法によって、微細加工チップ本体３０上に形成することができる。
【００２４】
ＰＤＭＳ−石英による方法を用いる場合、ＰＤＭＳと石英の間の結合は、Ｏ２プラズマ処理を用いる。ＰＤＭＳを石英に結合させる方法は、それらを接触させる前にＯ２プラズマ中３０ワットで６０秒間にわたり基板を処理してから、基板間に空気が取り込まれるのを避けてそれらを注意深く接触させるというものである。次に、ＰＤＭＳ−石英製品を６０℃の乾燥機中で１０分間アニーリングすることで、ＰＤＭＳと石英との間の不可逆的結合を促進する。次に、ＰＤＭＳフィルムに穴を開けて、チャンバおよびチャネルへのアクセスを確保することができる。穴を覆うようにコネクタを貼り付けることで、ポンプ、バルブまたはシリンジなどの外部装置への接続を容易にすることができる。
【００２５】
図４でわかるように、本体３０の上面３８上には、個々の第一のチャネル４４から構成される第一のチャネル平面アレイ４２がある。第一のチャネル４２は、第一のチャネル入口端４６および第一のチャネル出口端４８を有する。
【００２６】
「（複数の）チャネル」４２は、複数個、好ましくは少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約９０個、そして望ましくは、本明細書に記載のシステムが収容可能な数である。微細加工チップ２０により、光源１２からの光が、光源１２に対向する微細加工チップ本体３０を通り、チャネル４２中のサンプルを通り、検出器２６に対向する微細加工チップカバー３２を通過することができる。そこで、微細加工本体３０およびカバー３２は望ましくは透明である。ただし、場合によっては、微細加工本体３０およびカバー３２は半透明であることができる。少なくとも一部が光の通過を可能とすることで、第一のチャネル平面アレイ４２中のサンプルが光照射され、吸収性化学種およびサンプルによって吸収されない光が検出器２６によって検出可能となる限りにおいて、微細加工本体３０およびカバー３２の全体が、上記のように光源１２からの光を通過させ得ることは必要ではない。
【００２７】
通常、本体３０によって画定されるチャネル４２は、平滑な表面を有するものでなければならない。チャネル４２の断面は、本発明においてはあまり重要ではない。しかしながら、個々のチャネル４４の断面が小さいほど、より多くのチャネル４４をより小さいスペースで用いることが可能であることから、高度に多重化された利用分野で微細加工チップ２０の有用性が高まる。
【００２８】
本体３０は、長さ４〜３０ｃｍの長手方向側面34および幅２〜１０ｃｍの横方向側面３６を有することができる。本体３０は、微細加工チップ２０の構造的完全性を維持するだけの十分な厚さを有するべきであるが、逆に、第一のチャネル４２を通る光の通過を妨げるほどの厚さであってはならない。
【００２９】
図５および６からわかるように、第一のチャネル４２の形状は本発明においてはあまり重要ではない。第一のチャネル４２は、任意の適切な形状を有することができる。しかしながら、チャネル４４の大きさは５０〜２００μｍである。望ましくは、チャネル４２の形状は密に充填する上で役立つものであり、迷光の発生が最小限となるものである。第一のチャネル４２は長さ約５ｃｍ〜約２５ｃｍのものである。
【００３０】
平面アレイにおけるチャネル４４は、互いに隣接して実質的に平行であり、第一のチャネル平面アレイ４２を形成している。
【００３１】
図３でわかるように、本体３０の上面３８は、第一のチャネル平面アレイ入口端４６に対してほぼ横方向に配置された本体上で画定されるサンプルチャンバまたはサンプルチャネル５０を有する。サンプルチャンバ５０は、サンプルの等電点電気泳動用に、そして第一のチャネル平面アレイ４２にサンプルを供給するために作製されたものである。サンプルチャンバ５０は、対向する側辺上に配置されたサンプル供給管５２、５４を有する。サンプル供給管５２、５４は、微細加工チップ２０のカバー３２を通過し、サンプルチャンバ５０に接触している。管５２、５４は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレートなどの不活性材料製であることができる。
【００３２】
微細加工チップ２０は、第一のチャネル平面アレイ出口端４８に対してほぼ横方向に位置する受液チャンバ５６も有し、第一のチャネルアレイ４２からサンプルを集めて受液するために作製されたものである。受液チャンバ５６は、微細加工チップ２０のカバー３２を通り、受液チャンバ５６に入る管５８、６０を有する。管５８、６０は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンまたポリエチレンテレフタレートなどの不活性材料製である。それらの管を用いて、第一のチャネル平面アレイ４２にゲルマトリクス６６を供給することができる。
【００３３】
個々の回収管６４から構成される回収管のアレイ６２が受液チャンバ５６内にさらに配置されていて、第一のチャネル平面アレイ４２から来るであろうサンプルを回収する。回収管は、個々のチャネル４４のサンプルを回収するだけの微細なものであることができる。あるいは回収管６２は、個々のチャネルより広くなっていることで、複数のチャネル４４の集合したものを回収するようにすることができる。図４でわかるように、サンプルチャンバは、物理的境界９８で画定および延在したサンプルチャンバ９９を有することで、第一のチャネルアレイ４４と位置合わせして外側へ延在することができる。
【００３４】
この延在チャンバの目的は、第一次元のＩＥＦ分離の分離能をさらに高めることにある。サンプルの化学的性質を最適化することで（すなわち、サンプルマトリクス中のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）濃度を変えることによって）、タンパク質を、延在サンプルチャンバ９９のみに集中させることができる。この延在ＩＥＦチャネル９９は画定された壁９８を有していることから、タンパク質はかなり高い分離能で分離することができる。ＩＥＦが終了すると、集中したタンパク質の帯域をサンプルチャンバ５０に移動する。
【００３５】
集中帯域の可動化（mobilization）は非常に重要である。流体力学的（hydrodynamic）可動化、ＥＯＦ（電気浸透流）駆動（EOF-driving）可動化および動電的（electrokinetic）可動化などの各種可動化を用いることができる。第一の選択は、電流設定に追加的な修正が必要ないことからＥＯＦ駆動可動化である。残ったＥＯＦは、分離されたタンパク質帯域を延在チャンバ９９からサンプルチャンバ５０中に移動させる一方、分離能はかなり保存される。結果から、ＥＯＦが集中タンパク質帯域の可動化を実現することができることが示された。
【００３６】
図８〜９および１１〜１２に示したゲルマトリクス６６は、第一のチャネルアレイ４２内にある。このゲルマトリクスは、一定の濃度での水溶性ポリマーおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から作製することができる。
【００３７】
第一の電場発生装置は、供給チャンバ５０の対向する側面３４に隣接して配置され、等電点電気泳動によってサンプルを分離するために作製された第一の端子７０および第二の端子７２を有する。
【００３８】
第二の電場発生装置は、本体３０の横方向側面３６上に配置された第一の端子７４および第二の端子７６を有する。第一の端子７４および第二の端子７６の組合せは、微細加工チップ２０を横切る長手方向電場を発生させるために作製されている。
【００３９】
図４でわかるように、微細加工チップ２０は、個々の第二のチャネル８４から構成される第二のチャネル平面アレイ８２も有することができる。第二のチャネル平面アレイ８２は、第二のチャネル入口端８６および第二のチャネル出口端８８を有する。
【００４０】
緩衝液チャンバ９０は、カバー３２を貫通して緩衝液チャンバ９０に入る緩衝液供給管９２を有する。その管９２を用いて、緩衝液１０４を緩衝液チャンバ９０に供給することができる。緩衝液チャンバ中の緩衝液は第二のチャネル平面アレイ８２を満たす。緩衝液は、等電点電気泳動後にタンパク質を含むサンプルにＳＤＳを供給するためのものである。
【００４１】
図７〜９および１０〜１２に図示するため、６種類の成分から構成されるサンプルがサンプル供給チャンバ５０中に分けて描かれている。成分１２０はｐＨ３．４の等電点および中程度の分子量を有する。成分１２２は、ｐＨ３．５の等電点および大きい分子量を有する。成分１２４は、６．２の等電点と小さい分子量を有する。成分１２６は、７．６の等電点と大きい分子量を有する。成分１２８は、８．２の等電点と中程度の分子量を有する。成分１３０は、９．１の等電点と小さい分子量を有する。
【００４２】
図７でわかるように、微細加工チップをマルチプレックス吸光度式電気泳動システムで用いることができる。微細加工チップ２０には最初に、サンプル供給チャンバ５０に入れたサンプル１０２が供給される。
【００４３】
サンプル供給チャンバ５０中のサンプルは、好ましくは１〜３％の両性担体とともに用いることができる。両性担体を用いると、等電点電気泳動でのｐＨ勾配範囲はｐＨ３〜１０である。サンプル供給チャンバ５０中のサンプルは、両性電解質を含まない溶液とともに用いることができる。両性電解質を含まない溶液では、等電点電気泳動におけるｐＨ勾配範囲は、ｐＨ１〜１４である。図７および１２は、両性担体溶液を用いる微細加工チップを示したものであることから、等電点の範囲はｐＨ３〜１０である。
【００４４】
図７でわかるように、第一のチャネルアレイ４２および第二のチャネルアレイ８２の部分１０８を凍結させることで、サンプル１０２を孤立させる。凍結部分１０８により、等電点電気泳動時に側面のチャネルを通過する電流はかなり低下する。凍結部分１０８により、サンプルチャンバ５０で分離されるサンプルに悪影響を与えるサンプルおよび緩衝種の拡散が低減される。水冷式放熱板を有する熱電気冷却器１１０Ａ〜Ｃ（ＴＥＣ）を用いて、緩衝液が凍結する温度に到達させることができる。３つのＴＥＣ装置を用いて、チャネルの所望の異なる部分を凍結させることができる。最初に、全てのチャネルにＳＤＳ篩緩衝液を充填する。サンプルをＩＥＦチャネル中に充填する前に、ＴＥＣ１（１１０Ａ）およびＴＥＣ３（１１０Ｃ）を動作させて、サンプルチャンバ５０の両側に配置された第二次元のチャネルを凍結させる。次に、ＩＥＦチャンバにサンプル溶液を充填し、図７でわかるようにＩＥＦ分離を開始する。電場によって、サンプルは等電点まで移動する。サンプルがその等電点になると、静止する。ＩＥＦ分離終了後、ＴＥＣ２（１１０Ｂ）を動作させて、サンプルチャンバ５０で集中したタンパク質帯域を凍結させる。次に、ＴＥＣ１（１１０Ａ）およびＴＥＣ３（１１０Ｃ）を動作停止し、図８でわかるように、ＩＥＦチャネル５０の凍結状態を維持しながら、第二次元チャネルを解凍する。次の段階で、高電圧電源装置をオンにし、ＩＥＦチャネル５０を解凍することで、図９のように集中したタンパク質帯域は第二次元チャネル４２に注入され、分離することができる。
【００４５】
図１０でわかるように、別法として、サンプルチャンバ５０内での分離を促進する手法には、物理的境界９８を有するチャンバ延在部９９を用いるものなどがある。サンプルの化学的性質を最適化することで（すなわちＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）のサンプルマトリクス中での濃度を変えることで）、第一の端子７０および第二の端子７２を有する第一の電場発生装置を用いて、チャンバ延在部９９でのみタンパク質を集中させることができる。ＩＥＦチャネルのこの部分は両側に画定された壁を有していることから、タンパク質をより高い分離能で分離することができる。前述のように、サンプル充填およびＩＥＦ分離を行う前に、ＴＥＣ１（１１０Ａ）およびＴＥＣ３（１１０Ｃ）を動作させて、第二次元チャネルを凍結させる。次に、集中したタンパク質帯域をサンプルチャンバ５０の方へ移動させる。その移動プロセスを注意深く制御することで、分離能が保存されることが期待される。移動が終了したら、ＴＥＣ２（１１０Ｂ）を動作させてサンプルチャンバ５０で集中したタンパク質帯域を凍結させる。次に、ＴＥＣ１（１１０Ａ）およびＴＥＣ３（１１０Ｃ）を動作停止し、ＩＥＦチャネル５０の凍結を維持しながら第二次元チャネルを解凍する。次の段階として、高電圧電源装置をオンにし、ＩＥＦチャネル５０を解凍することで、集中したタンパク質帯域が第二次元チャネル４２に注入され、分離することができる。
【００４６】
可動化プロセスには、流体力学的可動化、ＥＯＦ（電気浸透流）可動化および動電的可動化などがある。図示のように、電気的セットアップに追加の変更が必要ないことから、ＥＯＦ駆動可能化が用いられる。
【００４７】
緩衝液チャンバ９０には、ＳＤＳを含む緩衝液１０４が入っている。図１１でわかるように、チャンバ９０からの緩衝液１０４で、第二のチャネル平面アレイ８４を満たす。サンプル供給チャンバ５０内において、緩衝液１０４でサンプル１０２を処理する。
【００４８】
図１２でわかるように、サンプルを緩衝液で処理すると、それは電荷を持つ。その電荷によって、サンプルを電場での電気泳動により分離することができる。サンプルは、第一のチャネルアレイ内でゲルマトリクス６６に触れさせると、第一のチャネルアレイ４２内において分子量に応じて分離することができる。この分離は、第一の端子７４および第二の端子７６を有する第二の電場発生装置を用いることで行われる。
【００４９】
図１でわかるように、サンプルが第一のチャネルアレイに沿って移動するに連れて、光源１２から放射された光線を横切る。この光が、光検出器２６によって光源上を通過するサンプルを検出する手段を提供する。サンプル１０２が光線１１４を横切ったら、それは受液チャンバ５６に回収することができる。
【００５０】
マイクロチップは再利用可能である。所望のサンプルが通過したら、第一の平面アレイ４２におけるゲルマトリクスを流し出して、新たなゲルマトリクスに交換することができる。サンプルは再供給することができる。緩衝液は交換することができる。これら成分の供給および除去は、管５２、５４、５８、６０および９２によって行うことができる。
【００５１】
等電点電気泳動および電気泳動分離に用いられる電位は、本発明においてはあまり重要ではない。代表的な電位は、５０００〜３００００Ｖの範囲である。
【００５２】
この方法の間、特にチャネル平面アレイ４２の近傍で多量の熱が発生する場合、冷却を行って、熱を放散させる必要がある。ファンによって、微細加工チップ２０を冷却することができる。
【００５３】
図１および２でわかるように、検出器２６は、任意の適切な吸収検出手段を有することができる。検出器２６は、望ましくは直線アレイで配置された複数の感光素子のような複数の吸収検出素子を有することが好ましい。ただし、二次元画像アレイ検出器を用いることができる。検出器２６は望ましくは固定して搭載することで、フリッカー雑音を低減する。
【００５４】
光源１２は好ましくは、約１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの範囲の波長の光を放出する。好適な光源１２の例には、水銀（紫外（ＵＶ）光吸収用）、タングステン（可視光吸収用）、ヨウ素（ＵＶ光吸収用）、亜鉛（ＵＶ光吸収用）、カドミウム（ＵＶ光吸収用）、キセノン（ＵＶ光吸収用）または重水素（ＵＶ光吸収用）灯などがある。望ましくは光源１２は、対象の化学種が吸収する波長の光を放出する。対象化学種がどの波長の光を吸収するかは、標準的な吸収スペクトル装置を用いて確認することができる。あるいは、そのような情報を提供するスペクトル測定表を当該技術分野では利用可能であり、国立科学技術研究所（National Institute of Science and Technology）によるものなどがある。望ましくは、与えられた、検出または測定を行うべき化学種について、最大吸収波長の光を選択することで、より少ない量の吸収性化学種が検出可能となる。光源１２は、点光源であることができる。また好ましくは、光源１２は約０．５ｍＷ〜約５０ｍＷの出力を有する。
【００５５】
好ましくは、生データセットから単一ダイオードエレクトロフェログラムを導出し、検出器２６で収集した透過光強度を吸光度値に変換することで分析する。あるいは、５個、好ましくは３個もの隣接するダイオードをアレイの各チャネル４４についてまとめて、全体的な信号／ノイズ比を高くすることができる。数学的平滑化を用いて、シグナルの歪みを起こすことなく、ノイズを大幅に低減することができる。それに関しては、できるだけ高いデータ収集率を用いて、平滑化のための多くのデータ点を提供するようにする必要がある。
【００５６】
チャネルが微細加工チップ本体３０中に直接形成されることから、微細加工チップ２０によって、キャピラリー管の使用および欠点が回避される。キャピラリー管では、光源１２からの光が、光源に向いたキャピラリー管の壁、キャピラリー管中のサンプル、そして検出器に向いたキャピラリー管の壁を通過することを許容している。そこで、本体に直接チャネルを形成することにより、キャピラリー管壁を透過する光を用いることで起こる変動が排除される。通常、そのキャピラリー管は平滑な表面と均一な厚さの壁を有する。しかしながら、製造におけるばらつきにより、平滑ではない表面や厚さに変動のある壁が生じる場合がある。そこで、チャネルを本体に直接形成することで、キャピラリー管の製造で生じるばらつきが排除される。キャピラリー管は、サンプルを保持するための多様な断面を有する。しかしながら、サンプルを保持するための微細加工チャネルは、キャピラリー管の断面より小さく形成することができ、圧縮してよりコンパクトに形成することができる。サンプル保持用の断面を小さく、コンパクトに形成するほど、装置の有用性が高くなる。従って、より小さいスペースでより多くのチャネルを用いることができることから、微細加工チップは、高度に多重化された用途では、キャピラリー管のアレイより有用である。代表的には、平面アレイでのキャピラリー管は、互いに実質的に平行かつ隣接して配置される。しかしながら、キャピラリー壁の直径にわずかな不一致があると、それらが全長において接触できなくなり得る。微細加工チップは、本体３０に直接微細加工されたチャネルを有することで、この問題を解決するものである。
【００５７】
上記の利点を全て有し、装置が縮小された微細加工チップ２０は、以前のキャピラリー管デザインより効率が高い。この効率の良さにより、分析時間の短縮、可能性としてロボット工学による分析ユニットとしての微細加工チップの挿入および取り出しが可能である点、そしてより小さくコンパクトな面積で複数の試験が実施可能である点など、キャピラリー管デザインに勝る利点が得られる。
【００５８】
以上の図面および明細書では、本発明の好ましい実施形態について説明した。そして、具体的な用語を用いているが、それらは包括的かつ説明的な意味でのみ用いられるものであって、限定を目的とするものではない。添付の特許請求の範囲にさらに詳細に定義される本発明の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、状況により都合が良いことが示唆されたり必要である場合には、部品の形態および割合ならびに均等物の置換における変更が想到される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】吸光度式微細加工チップ電気泳動システムの斜視図である。
【図２】微細加工チップ上に配置された光源と検出器の側面図である。
【図３】本発明の微細加工チップの斜視図である。
【図４】サンプルチャンバが延在された微細加工チップの斜視図である。
【図５】５−５線での図３の断面図である。
【図６】６−６線での図３の断面図である。
【図７】６種類の混合された化学種を含むサンプルチャンバ内のサンプルを有する微細加工チップの斜視図である。
【図８】６種類の化学種が等電点電気泳動されたサンプルチャンバ内のサンプルを有する微細加工チップの斜視図である。
【図９】分子量によって分類された化学種を有する微細加工チップの斜視図である。
【図１０】６種類の混合された化学種を含むサンプルチャンバ内のサンプルを有する延在されたサンプルチャンバがある微細加工チップの斜視図である。
【図１１】６種類の化学種が等電点電気泳動されたサンプルチャンバ内のサンプルを有する延在されたサンプルチャンバがある微細加工チップの斜視図である。
【図１２】分子量によって分類された化学種を有する延在されたサンプルチャンバがある微細加工チップの斜視図である。
【符号の説明】
【００６０】
１０  吸光度式電気泳動システム
１２  光源
１４  光線
１６  コリメータレンズ
２０  微細加工チップ
２２  フラットフィールドレンズ
２４  光学フィルター
２６  光検出器
４２  第一のチャネル平面アレイ
５０  サンプルチャンバ
５６  受液チャンバ
６４  回収管
６６  ゲルマトリクス
８２  第二のチャネル平面アレイ
９０  緩衝液チャンバ
９９  延在サンプルチャンバ１０４  緩衝液
１０８  障壁
【図１】
2006071643.tif 000003
【図２】
2006071643.tif 000004
【図３】
2006071643.tif 000005
【図４】
2006071643.tif 000006
【図５】
2006071643.tif 000007
【図６】
2006071643.tif 000008
【図７】
2006071643.tif 000009
【図８】
2006071643.tif 000010
【図９】
2006071643.tif 000011
【図１０】
2006071643.tif 000012
【図１１】
2006071643.tif 000013
【図１２】
2006071643.tif 000014
【外国語明細書】
2006071643000001.pdf