(57)【要約】【課題】  細胞を足場に接着状態のまま電気穿孔を行い、かつ、生きたままの状態で観察する事ができる装置の提供を目的としている。【解決手段】  透明電極上に生体細胞を培養し、透明電極と対向電極の間に電気パルスを与えることにより透明電極上の生体細胞に遺伝子などの外的物質を導入する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気穿孔用キュベットの電極上に細胞を培養し、電極表面に細胞を付着させたまま外的物質を細胞内に導入することを特徴とする電気穿孔法。
【請求項２】
電気穿孔用キュベットの電極上に細胞を培養し、電極表面に細胞を付着させたまま外的物質を細胞内に導入する電気穿孔法に用いる電気穿孔用キュベットであって、前記キュベットの一方の電極が光学的に透明な電極であることを特徴とする電気穿孔用キュベット。
【請求項３】
底部に光学的に透明な電極を設置してなる所定の容積を有する容器と前記容器の上方から被せて前記容器を密封し、かつ前記透明電極に対向して配設した対向電極を備え、前記容器と上下方向に対向して設置される蓋体とを備えたことを特徴とする請求項２に記載の電気穿孔用キュベット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体細胞を足場に接着状態のまま電気穿孔を行う細胞電気穿孔装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の遺伝子操作において細胞内部に外的物質を導入する際には細胞膜に一時的に透過性を持たせる事が必要であり、リポフェクション法や電気穿孔法などが用いられてきた。このうち、リポフェクション法はリポフェクションに用いる薬剤に毒性があり、細胞種によっては使用できないという欠点がある。
【０００３】
電気穿孔法は例えば非特許文献１記載の方法であり、細胞を足場から剥がし、浮遊状態で細胞に比較的強力な電場を与える事によって細胞に微小開口を形成し、外的物質を導入する方法であるが、細胞を浮遊状態にする必要があるため、十分に分化した細胞や組織を形成している細胞には適用できない場合があるという欠点がある。また、未分化細胞に電気穿孔を行った場合も再び足場に接着させ、分化を誘導しなければならないが、電気穿孔法で導入した遺伝子の効果は48時間程度で消えてしまい、細胞が十分に分化した状態で導入遺伝子の効果を見る事は難しかった。
【０００４】
電気穿孔法における上記の問題を解決するため、特許文献１にあるような生体に直接接触させる形の電極や特許文献２にあるような針状の電極が公開されている。しかし、これらの方法は組織への遺伝子導入を目的として考案されており、外的物質導入後に細胞を生きたまま観察する事はできないという問題があった。
【０００５】
また、第３の遺伝子導入方法としてマイクロインジェクション方法がある。これは中空のガラスマイクロニードルを細胞に挿入し、外来物質を直接導入する方法だが、細胞一つ一つに手作業で導入することになるため、高い技術を持った人間が行っても導入できる細胞の数はごくわずかという欠点があった。
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５３２１６６号公報
【特許文献２】特表２００３−５０５１１４号公報
【非特許文献１】蛋白質、核酸、酵素、第３１巻、第１５９１〜１６０３頁（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来の技術では培養細胞を足場に接着状態のまま遺伝子などの外的物質を導入し、細胞が生きたまま観察する事が難しいという問題があった。
【０００８】
本発明は、細胞を足場に接着状態のまま電気穿孔を行い、かつ、生きたままの状態で観察する事ができる装置の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、透明電極上に生体細胞を培養し、透明電極と対向電極の間に電気パルスを与えることにより透明電極上の生体細胞に遺伝子などの外的物質を導入する事ができる。
【００１０】
また、本発明は、底部に光学的に透明な電極を設置してなる所定の容積を有する容器と前記容器の上方から被せて前記容器を密封し、かつ前記透明電極に対向して配設した対向電極を備え、前記容器と上下方向に対向して設置される蓋体とを備えたことを特徴とする電気穿孔用キュベットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
以上説明したように本発明によれば、透明電極上に培養した生体細胞を足場に接着した状態のまま電気穿孔により遺伝子などの外的物質を導入する事が可能となる。また、細胞接着面は透明板であるため、生体細胞の形態を光学的に観察することが可能である。細胞生物学の分野では導入した外的物質が分化した細胞内でどのように振る舞い、どのような場所に局在しているのかを調べることがその主たる手法であり、細胞が生きた状態のまま光学的な観察が可能という点は大きな利点である。以上のような特徴から、この電気穿孔装置は細胞を分化誘導した後など足場から剥がす事によって細胞が死んでしまうような状況での外的物質の導入に有用である。また、本発明によって得られる装置を用いた外的物質の導入手法は特別な技術を必要とせず、誰にでも簡便に再現性が高い実験が行えるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
【実施例】
【００１３】
図１は本発明の実施の形態による電気穿孔装置の概略構成を示す図である。図１を参照すると、容器（１）の下部に透明電極（２）が電気伝導面が上向きになるように設置されており、この透明電極上に生体細胞（４）を培養する。
【００１４】
透明電極外周部は、容器の下部に設置された金属電極板（３）と上面を接するよう配置される。このような形態により、容器内部の培養液が金属電極と接する事なく、電気パルス発生装置と接続された下部電極（６）から通電可能となる。
【００１５】
対向電極（５）は蓋体（７）に設置され、生体細胞に電気穿孔を与える時に用いられ、通常培養時には電極がない蓋体で培養する事ができる。電気穿孔時には透明電極（２）と対向電極（５）の間を生体細胞に導入しようとする外的物質を含む溶液を満たし、電気パルスを与えることによって透明電極上の生体細胞に一時的に透過性を与え、外的物質を生体細胞に導入する。
【００１６】
本実施例では低栄養培地で筋肉様組織へと分化誘導されるC2C12筋芽細胞を用いた。この細胞はリポフェクションでは遺伝子を導入することが難しく、また、分化誘導後に基板から剥がすと死んでしまうため、電気穿孔法を用いることもできないため本発明による方法が最適な遺伝子導入法である。C2C12筋芽細胞をZnOでコートしたガラス基板上にてダルベッコ改変イーゲル培地＋10% 牛胎児血清において培養した（図３）。３日間上記条件で培養後、ダルベッコ改変イーゲル培地＋2%ウシ血清に置換し、１週間培養することによって分化したC2C12筋管細胞を得た（図４）。細胞どうしが融合し、チューブ上の構造を示していることから分化していることがわかる。
【００１７】
ZnOでコートしたガラス基板上にて培養した分化誘導後のC2C12細胞に本発明による装置によってCFP遺伝子を導入した。電気パルス発生装置としてBio-Rad社のGenePulsar Xcellを用い、電圧150V、静電容量1000mFの指数減衰パルスを電極間隔3mmでDNA濃度100mg/mlのPBS中で与えた。その後、ダルベッコ改変イーゲル培地＋2%ウシ血清にて24時間培養し、蛍光顕微鏡によってCFPの蛍光を観察した（図５）。蛍光を発している細胞（図５で白く見える細胞）が観察された事から、本発明による装置によって細胞が足場に接着した状態のままCFP遺伝子が導入され、その遺伝子が細胞中で発現していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明に係わる電気穿孔装置は、分子生物学、細胞生物学、遺伝子工学、再生医療など様々な分野に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態による電気穿孔用キュベットの概略構成である。
【図２】本発明の実施の形態による電気穿孔用キュベットの外観斜視図である。
【図３】ZnOコートされたガラス基板上で培養された分化誘導前のC2C12細胞
【図４】ZnOコートされたガラス基板上で培養された分化誘導後のC2C12細胞
【図５】本発明による方法によってCFP蛍光タンパク質を導入されたC2C12細胞の蛍光顕微鏡画像。
【符号の説明】
【００２０】
１                容器
２                透明電極
３                金属電極板
４                生体細胞
５                対向電極
６                下部電極
７                蓋体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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