(57)【要約】      （修正有）【課題】スポットのサイズが縮小され、単位面積あたりに積載されるスポットの数と種類とが増大された、高いスポット密度を有する３次元配置プローブ型反応検出チップを提供する。【解決手段】少なくともその表面の一部に複数の穴を有する基板と；該穴の中にそれぞれ分離して埋め込まれた多孔質物質と；該多孔質物質の細孔表面を含む表面に固定されたプローブ分子と；を含んでなる、プローブ分子が固定された該多孔質物質を反応検出用スポットとして用いる反応検出チップであって、該穴の開口部の大きさが１００μｍ以下である上記反応検出チップである。【選択図】図５
2006029990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともその表面の一部に複数の穴を有する基板と；
該穴の中にそれぞれ分離して埋め込まれた多孔質物質と；
該多孔質物質の細孔表面を含む表面に固定されたプローブ分子と；
を含んでなる、プローブ分子が固定された該多孔質物質を反応検出用スポットとして用いる反応検出チップであって、
該穴の開口部の大きさが１００μｍ以下である上記反応検出チップ。
【請求項２】
前記穴がフォトリソグラフィー法により形成された、請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項３】
前記プローブ分子と結合した検体分子を、前記スポットに入射光を照射し該検体分子に付加された光学的に検知可能な分子からの応答により検出することを特徴とする、請求項１または２に記載の反応検出チップ。
【請求項４】
前記光学的に検知可能な分子が、蛍光色素分子である、請求項３に記載の反応検出チップ。
【請求項５】
前記多孔質物質の入射光に対する線吸収係数が10μｍ-1以下である、請求項３に記載の反応検出チップ。
【請求項６】
前記多孔質物質の埋め込み方向の厚さが、０．１μｍ以上である、請求項３に記載の反応検出チップ。
【請求項７】
前記多孔質物質が、前記複数の穴を有する基板の上に多孔質物質を成膜し、該多孔質物質を前記穴の内部のみに残存させて基板表面の多孔質物質を除去することにより形成された、請求項１〜６のいずれか１項に記載の反応検出チップ。
【請求項８】
前記多孔質物質の成膜がスピンコートにより形成された、請求項７に記載の反応検出チップ。
【請求項９】
前記多孔質物質の除去が研磨法によることを特徴とする、請求項７に記載の反応検出チップ。
【請求項１０】
前記多孔質物質に表面活性処理を施し；
前記プローブ分子に、該表面活性処理を施した多孔質物質と結合できる官能基を導入し；
官能基を連結させたプローブ分子を含むプローブ溶液を、前記スポットの位置に応じて局所的に多孔質物質に接触させ、該プローブ溶液を多孔質物質に浸透させる；
ことによって前記プローブ分子が前記多孔質物質に固定されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応検出チップに関する。特に、本発明は、遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される、多数の機能分子の認識が可能な反応検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今のバイオテクノロジーの著しい進展に伴い、機能分子の認識を可能にする反応検出チップが、ますます重要な役割を担いつつある。特に最近、反応検出チップの中でも、ＤＮＡチップが、高い注目を集めている。
【０００３】
遺伝子の変異、特に一塩基多型（塩基配列における一塩基の変異）の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献し、個々人の薬剤応答性や副作用の程度を調べる上にも必要である。また、遺伝子の発現状況、すなわち、遺伝子情報がｍＲＮＡに読み取られ、対応するタンパク質がつくられる状況を調べることは、遺伝子レベルで生命現象や病気を理解し、新薬を開発する上に非常に有用である。この遺伝子変異、あるいは、遺伝子の発現状況を速やかに検出する手段として、ＤＮＡチップが有効であることが知られている。
【０００４】
ＤＮＡチップとは、検体である各種ＤＮＡ断片とそれぞれ特異的に結合する性質を有する分子をプローブとし、それぞれのプローブを、担体の表面上に、それぞれの区画に対応させて配列し固定したものである。このプローブは、一本鎖にした検体ＤＮＡ断片に対し相補的な塩基配列を有する一本鎖のＤＮＡ断片あるいはオリゴヌクレオチドであることが一般的である。
【０００５】
ＤＮＡチップのプローブが固定された面に検体ＤＮＡ断片を含む検体液を接触させ、検体ＤＮＡ断片と対応するプローブ間で結合を起こさせる。この結合は、通常、プローブと検体ＤＮＡ断片の対合する塩基間で水素結合する性質、すなわち、ハイブリダイゼーションを利用したものである。そして、このハイブリダイゼーションによる結合を何らかの手段で検出することにより、プローブと結合した検体ＤＮＡ断片を同定し、かつ、定量することができる。
【０００６】
このようなＤＮＡチップにおいては、プローブと検体液の接触は、微量な検体液をプローブに有効に作用させる目的から、プローブが固定された担体面の領域に検体液を滴下し、その上にカバーガラス等をかぶせて検体液を均等に行き渡らせる方法、いわゆる“カバーガラス法”にて行うことが一般的である。
【０００７】
また、上記検出手段として現在は、検体ＤＮＡ断片に標識として予め蛍光色素分子を付加し、プローブと結合した検体ＤＮＡ断片の蛍光色素分子からの蛍光の強度を測定することが一般的である。
【０００８】
【非特許文献１】Mark Schena編、加藤郁之進監訳、「ＤＮＡマイクロアレイ」TaKaRa
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところでこのようなＤＮＡチップにおいて測定される蛍光は、プローブとハイブリダイゼーション結合した検体ＤＮＡの蛍光色素分子からの蛍光、すなわち“シグナル成分”だけではない。（１）ハイブリダイゼーション以外のメカニズムによる、基板およびプローブに結合した検体ＤＮＡ断片の蛍光色素分子からの蛍光、（２）基板自体の蛍光、（３）基板に付着したほこりや汚れ、または測定光学系内部の汚れなどから発せられる蛍光、さらには（４）測定光学系が有する暗シグナル、などの検出を阻害する蛍光成分、すなわち“ノイズ成分”が存在する。
【００１０】
このようなノイズ成分の和が各ＤＮＡチップの各プローブで一定であるならば、測定蛍光値からその一定値を差し引くことでシグナル成分を求めることができる。しかし実際には、ノイズ成分の和は一定ではなく、ばらつきをもつ。そして、各プローブにおいてシグナル成分とノイズ成分をそれぞれ正確に分離することは事実上不可能である。よって、測定蛍光値の大小関係がシグナル成分の大小関係と確実に一致するように、ノイズ成分のばらつきの影響が十分小さくなるまでＳ／Ｎ比を上げることが必要である。特に一塩基多型の検出では、シグナル成分の小さな差を識別しなければならないので、このＳ／Ｎ比の向上は非常に重要である。
【００１１】
Ｓ／Ｎ比を向上させるために、従来２次元的に配置されているプローブを、基板に垂直な方向も含めて３次元的に配置し、シグナル発生源を３次元的にすることを通してシグナル成分を増大させる方法が考えられる。最近、この発想に基づくＤＮＡチップも開発され始めた。
【００１２】
しかしながら、今までに開発された、プローブを３次元配置にするＤＮＡチップには、「プローブが２次元配置のＤＮＡチップ、たとえば、スライドガラス表面にプローブを直接固定するタイプに比べると、スポット（同一種類のプローブの集合領域）のサイズを小さくすることが難しく、よって、チップ１枚当りのスポットの数と種類を増大させることが難しい」という問題点がある。すなわち、プローブが３次元的に配置されたＤＮＡチップでは、基板上のスポット位置に対し、孔、凹部、あるいは凸部を設ける必要があるため、スポットの小型化が難しかった。したがって、従来の３次元配置型ＤＮＡチップは、最小スポット径、最小スポットピッチともに、せいぜい数100μｍ程度であり、例えば、数万個以上のスポットが必要になる、発現解析用のＤＮＡチップには全く対応することができなかった。
【００１３】
そこで、本発明の課題は、スポットのサイズが縮小され、単位面積あたりに積載されるスポットの数と種類とが増大された、高いスポット密度を有する３次元配置プローブ型反応検出チップを提供することである。また、本発明の課題は、このようなチップを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、下記の手段により前記の課題を解決した。
すなわち、本発明は、少なくともその表面の一部に複数の穴を有する基板と；該穴の中にそれぞれ分離して埋め込まれた多孔質物質と；該多孔質物質の細孔表面を含む表面に固定されたプローブ分子と；を含んでなる、プローブ分子が固定された該多孔質物質を反応検出用スポットとして用いる反応検出チップであって、該穴の開口部の大きさが１００μｍ以下である上記反応検出チップである。
【００１５】
また、本発明の別の側面によれば、前記穴がフォトリソグラフィー法により形成された、前記の反応検出チップが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、前記プローブ分子と結合した検体分子を、前記スポットに入射光を照射し該検体分子に付加された光学的に検知可能な分子からの応答により検出することを特徴とする、前記の反応検出チップが提供される。
【００１６】
さらに、本発明の別の側面によれば、前記光学的に検知可能な分子が、蛍光色素分子である、前記の反応検出チップが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質の入射光に対する線吸収係数が10μｍ-1以下である、前記の反応検出チップが提供される。
【００１７】
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質の埋め込み方向の厚さが、０．１μｍ以上である、前記の反応検出チップが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質が、前記複数の穴を有する基板の上に多孔質物質を成膜し、該多孔質物質を前記穴の内部のみに残存させて基板表面の多孔質物質を除去することにより形成された、前記の反応検出チップが提供される。
【００１８】
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質の成膜がスピンコートにより形成された、前記の反応検出チップが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質の除去が研磨法によることを特徴とする、前記の反応検出チップが提供される。
【００１９】
さらに、本発明の別の側面によれば、前記多孔質物質に表面活性処理を施し；前記プローブ分子に、該表面活性処理を施した多孔質物質と結合できる官能基を導入し；官能基を連結させたプローブ分子を含むプローブ溶液を、前記スポットの位置に応じて局所的に多孔質物質に接触させ、該プローブ溶液を多孔質物質に浸透させる；ことによって前記プローブ分子が前記多孔質物質に固定されている、前記の反応検出チップが提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、スポットのサイズが縮小され、単位面積あたりに積載されるスポットの数と種類とが増大された、高いスポット密度を有する３次元配置プローブ型反応検出チップ、およびその製造方法が提供される。したがって、本発明によれば、高いスポット密度を有し、検出時のＳ／Ｎ比が良好な反応検出チップが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
［発明の概要］
本発明は、
少なくともその表面の一部に複数の穴を有する基板と；
該穴の中にそれぞれ分離して埋め込まれた多孔質物質と；
該多孔質物質の細孔表面を含む表面に固定されたプローブ分子；
とを含んでなる、プローブ分子が固定された該多孔質物質を反応検出用スポットとして用いる反応検出チップであって、
該穴の開口部の大きさが１００μｍ以下である上記反応検出チップである。
【００２２】
本発明の反応検出チップに使用する基板としては、公知のあらゆる材料を使用することができ、例えば、各種ガラスやシリコンなどを使用することができる。しかし、本発明においては、基板上の穴に埋め込み多孔質膜を形成させる際に焼成工程を行う場合があることから、本発明に用いる基板の材質は、耐熱性を有することが好ましく、４００℃以上の耐熱性を有することが特に好ましい。
【００２３】
本発明の反応検出チップに使用する多孔質物質としては、公知のあらゆる多孔質物質を使用することができる。特に、本発明においては、孔径の制御や官能基の付与が容易な多孔質物質が好ましく、例えば、多孔質ガラスなどのガラス系多孔質物質や多孔質セラミックスを好ましい例として挙げることができる。具体的には、特に、反応場として使用する場合に化学修飾しやすいことから、表面水酸基密度の高い分相性多孔質ガラスが好適である。
【００２４】
上記のような多孔質物質としては、半導体チップにおいて低誘電率層間絶縁膜として利用されるガラス系の多孔質物質を挙げることができる。ただし、低誘電率層間絶縁膜として用いるガラス系多孔質物質の細孔径は、数nm程度と小さい方が良いが、ＤＮＡチップのスポットとして用いるガラス系多孔質物質の細孔径は、検体分子を拡散させる都合上、１００nm程度と比較的大きい方が良い点に留意すべきである。また、検体分子を多孔質物質の内部まで拡散させる都合上、細孔同士は孤立しているのではなく、互いに連結して網目状になっていることが好ましい。
【００２５】
本発明の反応検出チップに使用するプローブ分子としては、公知のあらゆるプローブ分子を使用することができ、例えば、検体である一本鎖のＤＮＡ断片に対し相補的な塩基配列を有する、一本鎖のＤＮＡ断片あるいはオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００２６】
さらに、本発明の反応検出チップにおいて、基板上に設けられた穴の開口部の大きさは、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下、さらに好ましくは２０μｍ以下である。開口部の大きさを１００μｍ以下にすることによって、１つの反応検出チップ上により多くのプローブを組み込み、高密度チップを作製することが可能になり、これによって、ハイスループット分析が可能になる。したがって、本発明の反応検出チップによれば、例えば、数万個以上のスポットが必要とされる発現解析用のＤＮＡチップに対応することも可能である。
【００２７】
製造方法
本発明の反応検出チップは、以下の方法によって製造することができる。
すなわち、本発明においては、基板の面に平行な方向のみならず垂直な方向も含めた３次元的なプローブ配置を実現するために、多孔質物質からなる埋め込み構造において、多孔質物質の表面（細孔表面を含む）にプローブ分子を固定することによって、プローブの集合領域であるスポットを作製することができる。このような多孔質物質の埋め込み構造を有する反応検出チップは、特開２００２−１１１１４９号公報に既に開示されている。また、このような埋め込み構造（ダマシン構造）は、半導体チップにおける、配線、電極、素子分離等の形成に利用されている。本発明においては、半導体チップにおいて埋め込み構造を形成するために用いられる手法を使用することができる。
【００２８】
本発明の反応検出チップは、上記公報に記載されているチップと比較して、チップ上のスポットの大きさが１００μｍ以下と極めて小さく、本発明においては開口部の形成法が特に重要である。本発明において使用できる基板加工法は、特に限定されず、基板上に精密微細加工を施すことができる公知のあらゆる方法を利用することができる。しかしながら、本発明においては、基板上に埋め込み多孔質膜を形成する際に焼成を行う場合があるため、本発明に用いる基板の材質は、焼成時の熱に耐えることができるような、高い耐熱性を有するものが好ましい。そのため、このような材質の基板に精密微細加工をすることを考慮すると、フォトリソグラフィー法によりエッチングマスクを形成させ、基板の材質に適したエッチング法によりエッチングすることによって、基板を加工することが、特に好ましい。本発明において使用できるエッチング法は特に限定されず、ドライエッチングおよびウェットエッチングのいずれも使用することができるが、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）法を始めとする高い異方性を有するエッチング法がより好ましい。
【００２９】
次いで、本発明においては、多孔質物質を基板に埋め込む。本発明においては、埋め込み法も特に限定されないが、以下のような方法により、多孔質物質を埋め込むことが可能である。
【００３０】
すなわち、本発明においては、上述のようにフォトリソグラフィー法およびドライエッチング法によりスポットアレイに対応する穴が形成された基板上に、スピンコート法により多孔質物質を成膜することができる。そして、この成膜した面を研磨して基板表面の多孔質物質を除去し、多孔質物質が穴にのみ残存するように、つまり、多孔質物質が基板に埋め込まれるように、埋め込み多孔質物質を形成させることができる。
【００３１】
最後に、本発明においては、埋め込み多孔質物質の表面（細孔表面を含む）にプローブ分子を固定する。プローブ分子の固定法は特に限定されないが、以下のように行うことができる。すなわち、プローブ分子を含むプローブ溶液を、埋め込み多孔質物質の位置に対応して多孔質物質に局所的に接触させ、プローブ溶液を多孔質膜に浸透させることによって、プローブ分子を多孔質物質に固定する。本発明においては、表面処理により多孔質膜にあらかじめ官能基を導入し、プローブ分子にもあらかじめ官能基を導入しておくことが可能である。こうすることにより、これらの官能基間に共有結合を形成させ、プローブ分子を多孔質膜の細孔を含む表面に固定することができる。
【００３２】
本発明の反応検出チップの使用態様
本発明の反応検出チップの使用態様は特に限定されないが、例えば、以下のように使用することができる。すなわち、光学的に検知可能なラベル分子を検体分子にあらかじめ付加させておくことにより、プローブ分子と検体分子とが結合した場合、プローブ分子付き埋め込み多孔質物質から成るスポットに入射光を照射し、検体分子に予め付加された光学的に検知可能なラベル分子からの応答を調べることによって、検体分子を検出することができる。光学的に検知可能なラベル分子としては、公知のあらゆるものを使用することができ、例えば、一般的に使用されている蛍光色素による標識を利用することも可能である。入射光は、標識を検出できるものであれば特に限定されず、例えば、可視光領域の単波長や、紫外光、赤外光を使用することができる。具体的には、蛍光色素としてフルオレセインを用いる場合、波長４９４ｎｍの単色光、蛍光色素としてＣＹ３を用いる場合、波長５５２ｎｍの単色光を用いることができる。
【００３３】
したがって、光を利用した検出方法を採用する場合を考慮すると、本発明の反応検出チップにおいて使用する多孔質物質は、入射光に対して透明であることが好ましく、具体的には線吸収係数が10μｍ-1以下であることが好ましい。線吸収係数が10μｍ-1より大きいと、入射光が多孔質物質内部に０．１μｍ（１００ｎｍ）程度未満しか進入できないため、プローブ分子同士の平均間隔が一般に数10nm程度であることを考慮すると、入射光進入距離内に存在するプローブ分子数が数個未満になってしまい、ラベル分子からの応答強度が小さくなってしまうからである。したがって、本発明の反応検出チップのようにプローブが３次元的に配置されている場合、線吸収係数が10μｍ-1より大きいと、基板と垂直方向におけるシグナルの積算効果が期待できず、３次元配置プローブとしての意味をなさなくなってしまう。
【００３４】
［発明を実施するための最良の形態］
以下、図面を参照しつつ、本発明の反応検出チップを詳細に説明する。
図１に、本発明のＤＮＡチップの一例を示す。図２は、スポット２の断面（図１の点線に対応）を示している。このようにスポット２は、基板１の表面に形成した穴３に多孔質膜４を埋め込んだ構造になっている。
【００３５】
図３ａ〜ｅに、この埋め込み構造の作製法の一例を示す。すなわち、図３ｂに示すように、最初に、基板１の表面にスポット２のアレイに対応する穴３を形成する。このような穴３のアレイは、基板１としてシリコン基板を選択した場合、例えば、フォトリソグラフィー法および／またはシリコンに対するドライエッチング法により形成することが可能である。
【００３６】
続いて、図３ｃに示すように、穴３が形成された基板１の表面上に、検出時に光学測定で用いる光に関して透明度の高い多孔質膜４を形成する。このような多孔質膜４としては、半導体チップにおいて低誘電率層間絶縁膜として利用される、ガラス系の多孔質膜が好適である。この種の膜は、スピンコート法により成膜した後、適当な熱処理を行うことにより多孔質化することにより得ることができる。
【００３７】
次に、多孔質膜４を穴３の内部のみに残存させて、図３ｄに示すような埋め込み多孔質膜５を形成する。このような埋め込み構造を実現する方法として、半導体チップにおいては、化学的機械研磨（CMP）法を用いることが一般的である。本発明のＤＮＡチップにおいても、同様の研磨法を用いることにより、埋め込み多孔質膜５を形成することが可能である。ただし、研磨粒子が埋め込み多孔質膜５の細孔に詰まることを防止する目的で、研磨粒子を含まない研磨液を用いたり、樹脂製の研磨パッドの代わりに砥石を用いる等の工夫をすることが好ましい。そして、どのような研磨を行った場合も、細孔に浸入した研磨屑を除去する目的で、研磨後に超音波等によって洗浄することが好ましい。
【００３８】
そして最後に、埋め込み多孔質膜５の細孔を含む表面に、プローブ分子を固定する。
まず、反応性に富む活性分子の溶液に基板１を浸し、埋め込み多孔質膜５の表面に官能基を導入する。一方、プローブ分子にも予め末端に官能基を付加しておき、この末端修飾プローブ分子を溶解させたプローブ溶液を作製する。そして、このプローブ溶液を埋め込み多孔質膜５の位置に対応して局所的に接触させ、プローブ溶液を埋め込み多孔質膜５に浸透させる。浸透後、適当な熱処理により、プローブ分子と埋め込み多孔質膜５のそれぞれの官能基間で共有結合を起こさせ、プローブ分子を埋め込み多孔質膜５の細孔を含む表面に固定する。上記の活性分子としては、多孔質膜４がガラス系の場合、ガラス表面のシラノール基と結合する性質を有するものとなり、シランカップリング剤等が候補になる。
【００３９】
埋め込み多孔質膜５の位置に対応してプローブ溶液を局所的に接触させる具体的な方法としては、穴３のサイズがある程度大きく、かつ、ピッチがある程度広い場合、“スタンフォード”タイプのＤＮＡチップのスポッティングで通常用いられるスポッターを用いて接触させる方法を挙げることができる。埋め込み多孔質膜５は浸透性が高いので、滴下、あるいは、点着されたプローブ溶液は、埋め込み多孔質膜５に自動的に吸い込まれていく。
【００４０】
ただし、穴３のサイズが小さく、かつ、ピッチが狭い場合（サイズが50μm角程度以下、ピッチが100μｍ程度以下の場合）、すなわち、スポット２密度が高い場合は、専用のスポッターにてスポッティングすることが推奨される。
【００４１】
この専用スポッターには、極めて微量の液をスポッティングする能力は要求されるが、スポッティングされた液滴の形状を制御する能力までは要求されない。ここで、穴３の大きさが20μｍ×20μｍ×10μｍ、多孔質膜４の細孔容積が1.3ml/gである場合、１つのスポット２当りのプローブ溶液量は3plと微量である。したがって、スポッティングされた液滴は、埋め込み多孔質膜５に吸い込まれスポット２領域全体に自動的に拡散するので、その場にとどまって決まった形状になる必要はなく、スポッティングされた液滴の形状を制御する必要はないということになる。
【００４２】
この特徴を鑑みると、基板の表面に対し先端部を非接触の状態でスポッティング液を飛ばすタイプよりは、先端部を直接接触させスポッティング液を点着するタイプのスポッターの方が微量スポッティングという観点から適している。先端部にプローブ溶液を濡れ性により付着させ、この先端部より濡れ性の高い埋め込み多孔質膜５にプローブ溶液を移行させる方法等が好適である。
【００４３】
また、キャピラリーの中にスポッティング液を存在させ、キャピラリーの先端をスポットに接触させ、キャピラリーの回りを軽く加熱することによりキャピラリー中の熱膨張したスポッティング液を押し出すようなスポッターを用いるのも一つの方法である。本発明に関して言えば、スポッティング液であるプローブ溶液が埋め込み多孔質膜５の表面にひとたび接触すれば、スポット２当りにおけるプローブ溶液の適量が自動的に移送される効果が期待できる。このスポッターに関しては、実施例２において詳述する。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明のＤＮＡチップの形態および製法をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
図４に、本発明のＤＮＡチップの製造工程について、その流れ図を示す。
［１］番目に、シリコン基板の表面にスポットのアレイに対応する穴を形成する。
この目的で、シリコン基板１の表面上に厚さ10μｍのレジスト膜６を塗布して、フォトリソグラフィー法により、図３ａに示すようなパターニングを行う（(1-1)）。次に、パターニングされたレジスト膜６をエッチングマスクとして、シリコン基板１に対し、図３ｂに示す穴３をドライエッチング法により形成し、残存するレジスト膜６を剥離する（(1-2)）。穴３は、大きさ20μｍ角、深さ10μｍであり、40μｍピッチで250個×250個並んでいる（図１参照）。このドライエッチングは、高いエッチングレートが要求されるため、誘導結合型プラズマを利用したエッチング装置により行われることが好ましい。
【００４６】
［２］番目に、シリコン基板１上に、穴３を埋め込むように多孔質膜４を成膜する。具体的には、特開平１１−０３１６９０号公報に開示された内容をもとにした以下の手続きによって成膜する。
まず、SiO2換算10wt%のシラノール縮合体微粒子をメタノールに含有させてメタノール溶液を作製し、さらにこの溶液5mlにトリフェニルシラノールを200mg添加し、攪拌溶解して多孔質膜形成用のSOG溶液を作製する。このSOG溶液を、シリコン基板１上に滴下したのち、200rpmで30s保持するスピンコート法により厚さ1.5μｍの塗布膜を形成する。厚膜を形成するためには、メタノールの量を少なめに調整して、SOG溶液の粘性を高めに調整しておくことが好ましい（(2-1)）。続いて、塗布膜を160℃で5min間ホットプレートにてベークすることにより多孔質化し、その後、電気炉を用いて窒素雰囲気中で400℃、60minの熱処理を行うことにより、SiO2系の多孔質膜４を焼成する（(2-2)）。この多孔質膜４と同等の多孔質膜に対して吸光度測定を行ったところ、可視光波長領域における線吸収係数は１μｍ-1未満であった。上述したように本発明の多孔質膜の線吸収係数は10μｍ-1以下であることが好ましいが、本実施例の多孔質膜はこの値を下回っており、十分に透明度が高いことが確認された。
【００４７】
そして、［３］番目に、図３ｄに示すように、シリコン基板１の上面をストッパーとして、穴３のみに多孔質膜４が残存するまで多孔質膜４を研磨し、埋め込み多孔質膜５を形成する。この(3-1)の研磨は、研磨パッドとして１μｍ程度のアルミナ砥粒から成る研磨フィルム、あるいは、砥石を用い、研磨液として純水を用いた研磨を通常の研磨装置により行うことで達成できる。多孔質膜４は細孔径が100nm程度と大きいため、シリコン基板１に比し非常に脆弱であるので、このような機械的作用のみによる研磨で良好な埋め込み形状を容易に実現することができる。それから、研磨屑を除去する目的で、シリコン基板１に対し純水中で超音波洗浄を行い、その後、乾燥させる（(3-2)）。
【００４８】
［４］番目に、埋め込み多孔質膜５の細孔を含む表面に、プローブ分子を固定する。
(4-1)の、埋め込み多孔質膜５の細孔を含む全表面への官能基の導入は、特公平４−５００６７１号公報（「サポート結合オリゴヌクレオチド」（特許第３１２９７２３号））に提示された以下の手順による。まず、グリシドキシプロピルトリメトキシシランをトルエンに溶解した溶液を90℃に保ち、そこへシリコン基板１を12h浸漬する。続いてシリコン基板１をメタノールとエーテルで洗浄し、乾燥させた後、濃硫酸を触媒量だけ含むヘキサエチレングリコールを80℃に保ち、そこへシリコン基板１を12h浸漬する。その後、シリコン基板１をメタノールとエーテルで洗浄し、乾燥させる。こうして埋め込み多孔質膜５の細孔を含む表面に、官能基としてアルキルヒドロキシル基が導入される。
【００４９】
一方、(4-2)として、末端にアミノ化修飾を施したプローブ分子を純水に溶解し、濃度10pmol/μl程度のプローブ溶液を作製する。このプローブ分子は、化学合成によるオリゴヌクレオチド等である。そして図３ｅに示すように、スポッターの接触針７をスポット２の埋め込み多孔質膜５に接触させ、各スポット２のプローブ種に対応するプローブ溶液の注入を行う。接触針７の先端部は、曲率半径10μｍ程度の半球状になっており、ガラス等の親水性の固体から形成されている。接触針７の先端部は、親水性なので、プローブ溶液を濡れ性で保持することができる。そして、さらに濡れ性の高い埋め込み多孔質膜５に接触針７の先端部を接触させることにより、プローブ溶液を接触針７の先端部から埋め込み多孔質膜５へ移行させることができる。異なるプローブ分子を有する各プローブ溶液はそれぞれ別々の容器に満たされており、接触針７の先端部をこの容器中のプローブ溶液に浸して、プローブ溶液を先端部に濡れ性を利用して保持してから各スポット２に対し点着を行う。点着と点着の合間に、別種のプローブ溶液が混じるのを防ぐ目的で、接触針７の先端部を洗浄し乾燥させる操作を入れる。
【００５０】
点着後、シリコン基板１を100℃に設定した恒温機の中に保持し、埋め込み多孔質膜５のヒドロキシル基とプローブ分子のアミノ基の結合反応を促進させ、プローブ分子の埋め込み多孔質膜５への固定反応を行う（(4-3)）。その後、余剰のプローブ溶液を除去する目的でシリコン基板１を純水で軽く洗浄し、それから乾燥させて、本実施例のＤＮＡチップを完成させる。
【００５１】
本発明のＤＮＡチップの製造における最大のポイントは、スポットへのプローブ溶液の点着である。スポット密度が高く、かつ、スポット種（固定するプローブ分子の種類）が多いＤＮＡチップを作製するためには、微量なプローブ溶液を素早く点着することが重要だからである。
【００５２】
ただし、“スタンフォード”タイプのＤＮＡチップ、すなわち、プローブ溶液の滴下により二次元平面上に直接プローブ分子を固定するＤＮＡチップの製造において使用されるスポッターで要求される、“滴下されたスポット液の形状と体積の安定”という性能は、本発明のＤＮＡチップの製造において使用されるスポッターにおいては必ずしも要求されない。本発明では、基板面から下に掘り込まれた埋め込みスポットにスポット液を浸透させるからであり、プローブ分子として結合しなかった余剰のスポット液は、結合反応後に洗い流せば済むからである。ある下限以上の微量なスポット液を確実に分配するスポッターとして、本実施例では濡れ性を利用してスポット液を保持する先端部を有する接触針による点着タイプのスポッターを提案した。
【００５３】
こうして、プローブ配置が３次元であるため検出感度が高く、かつ、スポット密度が高いＤＮＡチップを実現することが可能になる。さらに、本実施例で製造したＤＮＡチップのスポットは、基板面の下に掘り込まれた埋め込み型であり、基板面の上に突出していないので、検体液とプローブのハイブリダイゼーション結合反応時に通常行われる“カバーガラス法”を全く問題なく採用することができる。また、ハイブリダイゼーション結合反応後の洗浄、ハイブリダイゼーション結合の検出も、従来の２次元配置プローブのＤＮＡチップと同様の操作により行うことが可能である。
【００５４】
［実施例２］
本実施例では、本発明のＤＮＡチップにおける埋め込みスポットへのスポッティングに適した、別の形態のスポッターについて説明する。図５は、本実施例のスポッターを用いて、プローブ溶液を、埋め込みスポット、すなわち、埋め込み多孔質膜５に点着する様子を表す。
【００５５】
まず、毛管現象を利用して、各プローブ溶液が満たされている容器からプローブ溶液をキャピラリー８に吸い上げる。ガラス製のキャピラリー８を用いる場合は、プローブ溶液にエタノールを混ぜると吸い上げが容易になる。
そして、内部にプローブ溶液を満たしたキャピラリー８の先端部を埋め込み多孔質膜５の上面に接触させる。
【００５６】
このキャピラリー８の先端から数mm上の部位の回りには、加熱部９が巻き付けられてある。この加熱部９は内部に電熱線によるコイルを有し、このコイルに電流を流すことにより、発生するジュール熱が局所的かつ瞬時にキャピラリー８内部のプローブ溶液を加温する。この加温により、キャピラリー８内部のプローブ溶液は熱膨張し、キャピラリー８の先端部からプローブ溶液が押し出され、接触している埋め込み多孔質膜５へプローブ溶液が浸透していく。
【００５７】
この熱膨張によるプローブ溶液の押し出し量は、極めて微量で良く、スポット２の１つ当りに必要とされるプローブ溶液の全量に必ずしも満たなくて良い。プローブ溶液は、キャピラリー８から濡れ性のより高い埋め込み多孔質膜５へ自動的に吸い出され、スポット２全体がプローブ溶液で十分に潤えば、この吸出しは自動的に停止するからである。
【００５８】
点着と点着の合間でのキャピラリー８の洗浄は、洗浄用に用意したエタノールにキャピラリー８の先端を浸してエタノールを吸い上げ、キャピラリー８の先端をスポンジ等に押し付けてエタノールを吸い出すか、あるいは、キャピラリー８中のエタノールを空気等で押し出し、その後、キャピラリー８を乾燥させるような工夫を凝らせば良い。
【００５９】
［実施例３］
本実施例では、本発明のＤＮＡチップにおける埋め込みスポットへのスポッティングに適した、別の形態のスポッターを提示する。このスポッターは、ＤＮＡチップにおける複数のスポットに対し点着を同時に行うことができる。図６に本実施例のスポッターを示す。このスポッターは、大きく分けて、プローブ溶液を貯めるタンク１０、プローブ溶液を導く導入管１１、キャピラリー８の集合体、および加熱部９を含んで構成される。
【００６０】
タンク１０には各スポット２に対応するプローブ溶液を入れる。これらのプローブ溶液は導入管１１により各キャピラリー８の先端部まで導かれる。キャピラリー８の先端部の配置は、スポット２の配置と完全に一致しており、点着時にはキャピラリー８の先端部のすべてが対応する各スポット２の上面に接触するように位置合わせする。
【００６１】
キャピラリー８を束ねて固定する役割も担う加熱部９は、実施例２と同様、内部に電熱線によるコイルを有し、このコイルに電流を流すことにより、発生するジュール熱で局所的かつ瞬時に複数のキャピラリー８内部のプローブ溶液を同時に加温する。実施例２と同様に、この加温により、キャピラリー８内部のプローブ溶液が熱膨張し、キャピラリー８の先端部からプローブ溶液が押し出され、接触している埋め込み多孔質膜５へプローブ溶液が浸透していく。
【００６２】
このように本実施例では、ＤＮＡチップ１枚の全スポットに対し一括してスポッティングすることも可能なため、ＤＮＡチップの製造時間が短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡチップにおけるスポット配置を示す図である。
【図２】図２は、本発明のＤＮＡチップにおけるスポットの断面図を示す。
【図３】図３ａ〜図３ｅは、本発明のＤＮＡチップの製造工程を説明する図である。
【図４】図４は、本発明のＤＮＡチップの製造工程を説明する流れ図である。
【図５】図５は、実施例２において使用するスポッターを示す。
【図６】図６は、実施例３において使用するスポッターを示す。
【符号の説明】
【００６４】
１    基板、シリコン基板
２    スポット
３    穴
４    多孔質膜
５    埋め込み多孔質膜
６    レジスト膜
７    接触針
８    キャピラリー
９    加熱部
１０  タンク
１１  導入管
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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