(57)【要約】【課題】患者検体を免疫測定試薬を用いて測定する際に、異常値を示す症例が確認されており、その対策として、薬剤の影響を回避しうるよりすぐれた方法が望まれていた。【解決手段】薬物の代謝物に特異的に反応する抗体を含有する薬物代謝物吸着剤を作製し、この吸着剤を検体と接触させることにより、検体中の薬物代謝物を吸着させることができる。この吸着剤は免疫測定試薬に含有させることができ、そのような免疫測定試薬を用いることにより、異常値を示す恐れの少ない免疫測定を行うことができる。  本発明は、特に検体中にジクロフェナク類の代謝物が共存し、かつ総トリヨードサイロニン及び／又は遊離型トリヨードサイロニンの免疫測定を行う際に有用である。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の代謝物に特異的に反応することを特徴とする、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を含有することを特徴とする、薬物代謝物の吸着剤。
【請求項３】
請求項２に記載の吸着剤を検体と接触させることを特徴とする、検体中の薬物代謝物の吸着方法。
【請求項４】
請求項２に記載の吸着剤を含有することを特徴とする、免疫測定試薬。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫測定試薬を用いることを特徴とする、免疫測定方法。
【請求項６】
薬物の代謝物が式［Ｉ］
【化１】
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で表されるジクロフェナク類の主要代謝物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項６に記載の抗体を含有することを特徴とする、ジクロフェナク類の主要代謝物の吸着剤。
【請求項８】
請求項７に記載の吸着剤を検体と接触させることを特徴とする、検体中のジクロフェナク類の主要代謝物の吸着方法。
【請求項９】
請求項７に記載の吸着剤を含有することを特徴とする、総トリヨードサイロニン及び／又は遊離型トリヨードサイロニンの免疫測定試薬。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫測定試薬を用いることを特徴とする、総トリヨードサイロニン及び／又は遊離型トリヨードサイロニンの免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の代謝物に特異的に反応する抗体、この抗体を含有する薬物代謝物の吸着剤、及びその用途等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
患者検体を免疫測定試薬を用いて測定する際に、異常値を示した症例が確認されている。この異常値は、自己抗体、異好性抗体によるものが原因として多かった。
【０００３】
近年、自己抗体、異好性抗体を保有しない患者検体において、薬剤を服用している際に異常値を示した症例が確認されており、特にジクロフェナク製剤を服用している患者検体において、総トリヨードサイロニンおよび／または遊離型トリヨードサイロニンの測定値が異常高値を示した症例が報告されている。この異常高値の原因は、抗トリヨードサイロニン抗体が検体中の薬剤と交差反応しているためと考えられ、そのため薬物と交差反応しない抗トリヨードサイロニン抗体を用いることにより、薬剤の影響を回避している（例えば、非特許文献１参照）。しかし、そのような交差反応性のない抗体の探索、測定系の再構築等が問題となっていた。
【０００４】
【非特許文献１】医学と薬学  第４４巻  第２号  第２７４−２７８頁  ２０００年８月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
異常値の対策に関しては前述のように様々な検討がなされている。しかしながら、薬物と交差反応性のない抗体の探索、測定系の再構築等が問題となり、他の方法により薬剤の影響を回避することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、薬物の代謝物に特異的に反応する抗体を生産し、これを検体と接触させることにより、検体中に存在する薬物または薬物代謝物の影響を回避する方法を見出し、本発明を完成したものである。
【０００７】
すなわち本発明は、薬物の代謝物に特異的に反応することを特徴とする抗体である。また本発明は、そのような抗体を含有することを特徴とする、薬物代謝物の吸着剤である。さらに本発明は、そのような吸着剤を検体と接触させることを特徴とする、検体中の薬物代謝物の吸着方法である。また本発明は、そのような吸着剤を含有することを特徴とする、免疫測定試薬である。さらに本発明は、そのような免疫測定試薬を用いることを特徴とする、免疫測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明において「薬物」とは特に限定されるものではないが、例えばメフェナム酸類、塩酸ジラゼプ類、リン酸ジソピラミド類、センノシド・カルシウム類、アテノール類、イコサペント酸エチル類、チアマゾール類、ジクロフェナク類等があげられる。
【０００９】
このような薬物は生体内で代謝され、代謝物へと変化するが、本発明ではこの薬物代謝物に特異的に反応する抗体を用いる。ここでいう抗体とは特に限定はなく、例えば抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等があげられる。抗血清は、例えば薬物の代謝物をウシ血清アルブミン等のたん白質に標識し、常法に従い、これを動物に免疫して、その血清成分から得ることができる。ポリクローナル抗体は、例えば上述方法により得られた抗血清を精製する事により得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば薬物の代謝物をウシ血清アルブミン等のたん白質に標識し、常法に従い、これを動物に免疫して、抗体生産能を持つ脾臓Ｂ細胞を選別し、動物のミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を樹立し、さらにこれを動物の腹腔内に注入して得られる腹水から精製して得ることができる。または、細胞培養法等により得ることができる。
【００１０】
このような薬物代謝物と特異的に反応する抗体は、薬物代謝物の吸着剤として用いることができる。即ちそのような吸着剤を検体と接触させることにより、検体中の薬物代謝物は、それに特異的に反応する抗体と反応し、結果として検体中に残存する遊離の（即ち、抗体と反応していない）薬物代謝物を低減させることができる。このため、このように処理された検体を免疫測定に用いることにより、検体中に共存していた薬物代謝物の悪影響を低減させた免疫測定を行うことができる。
【００１１】
なお検体を吸着剤と接触させる処理は、免疫測定の前に行ってもよく、また免疫測定と同時に行ってもよいが、試薬等の簡略化のために同時に行うほうが好ましい。従って、吸着剤は免疫測定試薬中に含有されることが好ましく、そのような吸着剤を含有する免疫測定試薬を用いて免疫測定を行うことが好ましい。
【００１２】
免疫測定試薬としては、抗原抗体反応を利用したものであれば特に限定はなく、例えばサンドイッチ法、競合法、凝集法などにより測定するための試薬である。
【００１３】
検体としては特に限定はないが、例えば生体由来の試料として尿、血液、血清、血漿、その他体液、組織などがあげられる。
【００１４】
以上のような吸着剤及び免疫測定試薬は、特にジクロフェナク製剤を服用している患者検体の総トリヨードサイロニン及び／又は遊離型トリヨードサイロニンの免疫測定において特に有用であるため、以下に詳しく説明する。
【００１５】
健常人血清に、式［ＩＩ］
【００１６】
【化１】
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で表されるジクロフェナク類（式中、Ｘは水素又はアルカリ金属を示す）を添加して、免疫測定試薬により遊離型トリヨードサイロニン測定を行ったところ、異常高値は示さなかった（本発明において、「アルカリ金属」はリチウム、ナトリウム、カリウム等である。）。
【００１７】
しかし、健常人血清に式［Ｉ］
【００１８】
【化２】
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で表されるジクロフェナク製剤の主要代謝物（式中、Ｘは前記と同様を示す）を添加して、免疫測定試薬により遊離型トリヨードサイロニン測定を行ったところ、異常高値を示す結果となった。
【００１９】
以上の結果より、遊離型トリヨードサイロニン測定において異常高値を示す原因は、ジクロフェナク類そのものではなく、ジクロフェナク類の主要代謝物が関与していると考えられる。また構造的にも式［ＩＩＩ］
【００２０】
【化３】
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で表されるトリヨードサイロニンは、式［ＩＩ］で表されるジクロフェナク類よりも、式［Ｉ］で表される主要代謝物に類似していることから、
【００２１】
【化４】
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免疫反応試薬に使用している抗トリヨードサイロニン抗体が、式［Ｉ］で表されるジクロフェナク類の主要代謝物へ交差反応することによるものと考えられる。
【００２２】
この結果を確認するために、上述の方法により得られた抗体の中で、式［Ｉ］で表されるジクロフェナク類の主要代謝物に特異的に反応する抗体を含有させた遊離型トリヨードサイロニン測定用免疫反応試薬を作製し、そのような抗体を含有させなかった免疫反応試薬を用いた場合に異常高値を示す検体を測定したところ、異常高値が回避されていることを確認した。
【発明の効果】
【００２３】
本発明による薬物代謝物に特異的に反応する抗体は、薬物代謝物の吸着剤とすることができ、その吸着剤を検体と接触させることにより、検体中の薬物代謝物を吸着させることができる。この吸着剤は免疫測定試薬に含有させることができ、そのような免疫測定試薬を用いることにより、異常値を示す恐れの少ない免疫測定を行うことができる。
【００２４】
本発明は、特に薬物の代謝物が式［Ｉ］で表されるジクロフェナク類の主要代謝物であり、かつ総トリヨードサイロニン及び／又は遊離型トリヨードサイロニンの免疫測定を行う際に有用である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。しかし本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
【００２７】
【化５】
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窒素雰囲気下、０℃で［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸（化合物［１］）（１９０ｍｇ，０．６０９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０５ｍｇ，０．９１２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１７５ｍｇ，０．９１３ｍｍｏｌ）を投入した。４℃で終夜攪拌した後、反応混合物を飽和食塩水溶液に投じ酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で溶離し、２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸スクシンイミジルエステル（化合物［２］）（６４．５ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ，２５．９％）を白色粉末として得た。
【００２８】
（実施例２）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２６３ｍｇを５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、これを透析チューブに１回に５Ｌの緩衝液を用い、４時間以上、３回透析を行った。透析終了後、０．４５μｍフィルターを装着したシリンジにＢＳＡ溶液をとり、ろ過を行った。この時の体積は２４．４ｍＬ、濃度は９．２５ｍｇ／ｍＬであった。この溶液に２１ｍＬの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、濃度を５．０ｍｇ／ｍＬとした。
この溶液を反応容器に移し４±１℃に制御された恒温槽１５分に浸漬した。これに２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸スクシンイミジルエステルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（濃度：３１４ｍｇ／ｍＬ）を０．４５ｍＬ投入した。磁気攪拌子を用いて滴下終了後３０±１分静かに攪拌した後攪拌を止め、１７±１時間恒温槽に放置した。反応終了後、反応溶液を透析チューブに移し、０．１Ｍリン酸／ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２〜８℃で透析を行った。１回に１０Ｌのリン酸緩衝液を用い、５時間以上、４回透析を行った。透析終了後、０．２２μｍフィルターを装着したシリンジに上で作製したウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸をとり、ろ過を行った。この結果、３２．５ｍＬのウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸が得られ、その濃度は６５７９ｍＡ（ただし、１Ａは吸光度２７９ｎｍで１．０）であった。
【００２９】
（実施例３）
実施例２にて得られたウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸１ｍｇをダルベコ−リン酸緩衝食塩水２ｍＬに溶解し、この溶液にＦＣＡ２ｍＬ添加して０℃にて混合した。得られたエマルジョンを家兎の腹腔内に注射した。約２週間後、ウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸０．５ｍｇをダルベコ−リン酸緩衝食塩水１ｍＬに溶解し、この溶液にＦＩＣＡ１ｍＬ添加して０℃にて混合し、得られたエマルジョンを家兎の腹腔内に注射し、約２週間間隔でこの操作を３回繰り返した。その後に家兎の血液を採取し、血清成分を分離して目的とする抗血清を得た。
【００３０】
（実施例４）
実施例２にて得られたウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸０．１ｍｇをダルベコ−リン酸緩衝食塩水０．２ｍＬに溶解し、この溶液にＦＣＡ０．２ｍＬ添加して０℃にて混合した。得られたエマルジョンをマウスの腹腔内に注射した。約２週間後、ウシ血清アルブミン標識［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸０．１ｍｇをダルベコ−リン酸緩衝食塩水０．２ｍＬに溶解し、この溶液にＦＩＣＡ０．２ｍＬ添加して０℃にて混合し、得られたエマルジョンをマウスの腹腔内に注射し、約２週間間隔でこの操作を３回繰り返した。このマウスから脾臓Ｂ細胞を取り出し、ミエローマ細胞株とをＰＥＧ法による細胞融合を行いハイブリドーマを得た。
【００３１】
（実施例５）
プリスタン０．５ｍＬをマウスの腹腔内に注射した。約４週間後、実施例４にて得られたハイブリドーマを含む溶液０．５ｍＬをマウスの腹腔内に注射した。約２週間後、腹水を採取した。この腹水採取は約５日間隔で５回採取した。この腹水をプロテインＧカラムにて精製することにより、目的とするモノクローナル抗体を得た。
【００３２】
（実施例６）
【００３３】
【化６】
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ジクロフェナク類として［２−（２，６−ジクロロ−フェニルアミノ）フェニル］酢酸ナトリウム塩をエタノールに溶解し、この溶液を健常人血清に２５μｇ／ｍＬとなる様に添加した。このサンプルを全自動酵素免疫測定装置ＡＩＡ−２１（東ソー株式会社製）と酵素免疫測定試薬Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＦＴ３）（識別番号：ＳＴ）（東ソー株式会社製）（式［Ｉ］で表されるジクロフェナク類の主要代謝物に特異的に反応する抗体は含有していない）を用いて、遊離型トリヨードサイロニンの測定を行った。添加前の健常人血清の測定値は２．８７ｐｇ／ｍＬであり、添加後のサンプル測定値は３．４２ｐｇ／ｍＬであり、１．１９倍の上昇で若干高値となったものの、正常値の範囲内であったため、この［２−（２，６−ジクロロ−フェニルアミノ）フェニル］酢酸ナトリウム塩は測定値に影響を与えるものではないと判断された。
【００３４】
（実施例７）
【００３５】
【化７】
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ジクロフェナク類の主要代謝物である［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸を０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、この溶液を健常人血清に１０μｇ／ｍＬとなる様に添加した。このサンプルを、実施例６と同様の装置及び酵素免疫測定試薬を用いて遊離型トリヨードサイロニンの測定を行った。［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸を添加する前の健常人血清の測定値は２．８４ｐｇ／ｍＬであり、添加後のサンプル測定値は６．８５ｐｇ／ｍＬであり、２．４１倍の上昇となり、異常高値を確認した。特に添加量は実施例６の半分以下であるにもかかわらず、測定値は倍増し異常高値を示したため、この［２−（２，６−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）フェニル］酢酸は測定値に大きな影響を与えることが理解される。
【００３６】
（実施例８）
健常者にボルタレン錠（ジクロフェナク製剤）２５ｍｇを２錠（計５０ｍｇ）経口投与し、投与前、投与後１時間、２時間、４時間の血清サンプルを採取した。このサンプルを、実施例６と同様の装置及び酵素免疫測定試薬を用いて遊離型トリヨードサイロニンの測定を行った。投与前の健常人血清の測定値は２．５４ｐｇ／ｍＬであり、投与後１時間、２時間、４時間の血清のサンプル測定値はそれぞれ５．７４ｐｇ／ｍＬ、９．９０ｐｇ／ｍＬ、６．７４ｐｇ／ｍＬであり、それぞれ２．２６倍、３．９０倍、２．５５倍の上昇となり、ボルタレンの投与による異常高値を確認した。
【００３７】
（実施例９）
実施例３にて得られた抗血清１０倍希釈品５μＬを添加した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬（抗血清を添加した以外は、実施例６で用いた酵素免疫測定試薬と同様の組成）を作製した。健常者にボルタレン錠（ジクロフェナク製剤）２５ｍｇを２錠（計５０ｍｇ）経口投与し、投与後２時間の血清サンプルを採取した。このサンプルを、実施例６と同様の装置及び酵素免疫測定試薬、ならびに前述のように抗血清を添加して作製した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬を用いて、遊離型トリヨードサイロニンの測定を行った。実施例６と同様の酵素免疫測定試薬を用いたときの測定値は５．４１ｐｇ／ｍＬであり、抗血清を添加して作製した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬を用いたときの測定値は２．４９ｐｇ／ｍＬと１／２以下に下降し、抗血清を添加することによりジクロフェナク製剤の影響回避を確認した。
【００３８】
（実施例１０）
実施例５にて得られたモノクローナル抗体２０μｇを添加した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬（モノクローナル抗体を添加した以外は、実施例６で用いた酵素免疫測定試薬と同様の組成）を作製した。健常者にボルタレン錠（ジクロフェナク製剤）２５ｍｇを２錠（計５０ｍｇ）経口投与し、投与後２時間の血清サンプルを採取した。このサンプルを実施例６と同様の装置及び酵素免疫測定試薬、ならびに前述のようにモノクローナル抗体を添加して作製した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬を用いて、遊離型トリヨードサイロニンの測定を行った。実施例６と同様の酵素免疫測定試薬を用いたときの測定値は７．７９ｐｇ／ｍＬであり、モノクローナル抗体を添加して作製した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬を用いたときの測定値は２．１４ｐｇ／ｍＬと１／３以下に下降し、モノクローナル抗体の添加により、ジクロフェナク製剤の影響回避を確認した。
【００３９】
（実施例１１）
健常者にボルタレン錠（ジクロフェナク製剤）２５ｍｇを２錠（計５０ｍｇ）経口投与し、投与後の遊離型トリヨードサイロニン測定値の経時変化を、実施例１０と同様の方法にて検討した。結果を図１に示す。実施例６と同様の酵素免疫測定試薬を用いたときの測定値は、投与後３〜５時間をピークとする遊離型トリヨードサイロニン値の顕著な上昇が認められた（図中、白丸）が、モノクローナル抗体を添加して作製した遊離型トリヨードサイロニン免疫測定試薬では測定値の上昇は認められなかった（図中、黒丸）。
【００４０】
（実施例１２）
ジクロフェナク製剤を投与されていない一般の検体について、実施例１０と同様の装置及び２種の免疫測定試薬を用いて、遊離型トリヨードサイロニン測定を行った。その結果、２種の免疫測定試薬間には良好な相関性があることを確認した。結果を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１１で得られた、投与後の経過時間と遊離型トリヨードサイロニン値との関係を示す図である。
【図２】実施例１２で得られた、２種の免疫測定試薬間の相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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