(57)【要約】【課題】生体内及び生体外診断及び治療に有用な、生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を提供する。【解決手段】二特異的融合タンパク質であって、（１）標的を結合することができる第１結合ドメイン、（２）標的を結合することができる第２結合ドメイン、ここで各ドメインは異なる標的を結合することができ、及び（３）第１結合ドメインと第２結合ドメインを連結する、親水性アミノ酸と少なくとも１のペンタマー：ＥＥＡＫＫを含有するリンカーを含む、二特異的融合タンパク質；溶解性二特異的融合タンパク質であって、Ｂ７抗原と結合する第１結合ドメイン及びＣＤ４０抗原と結合する第２結合ドメインを含み、該第１結合ドメインと第２結合ドメインが、親水性アミノ酸と少なくとも１のペンタマー：ＥＥＡＫＫとを含有するリンカーによって連結されている、溶解性二特異的融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性アミノ酸及び少なくとも１のペンタマー：ＥＥＡＫＫを含有する親水性らせんペプチドを含むリンカーで結合している抗ＣＤ３／抗Ｌ６二特異的融合タンパク質。
【請求項２】
二特異的融合タンパク質であって、（１）標的を結合することができる第１結合ドメイン、（２）標的を結合することができる第２結合ドメイン、ここで各ドメインは異なる標的を結合することができ、及び（３）第１結合ドメインと第２結合ドメインを連結する、親水性アミノ酸と少なくとも１のペンタマー：ＥＥＡＫＫを含有するリンカー
を含む、二特異的融合タンパク質。
【請求項３】
溶解性二特異的融合タンパク質であって、Ｂ７抗原と結合する第１結合ドメイン及びＣＤ４０抗原と結合する第２結合ドメインを含み、該第１結合ドメインと第２結合ドメインが、親水性アミノ酸と少なくとも１のペンタマー：ＥＥＡＫＫとを含有するリンカーによって連結されている、溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項４】
さらに分子垂れはしを含む、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項５】
該分子垂れはしがＦｃフラグメントである、請求項４記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項６】
該分子垂れはしがＨＩＶフラグメントである、請求項４記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項７】
該分子垂れはしが赤血球凝集素エピトープ配列ＨＡＩである、請求項４記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項８】
第１結合ドメインがＣＴＬＡ４の細胞外部分である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項９】
第１結合ドメインがＢ７抗原を認識し及び結合する抗体の可変部の部分である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項１０】
第１結合ドメインがＣＤ２８の細胞外部分である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項１１】
第２結合ドメインがＣＤ４０抗原を認識し及び結合する抗体の可変部である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項１２】
第１結合ドメインがＣＴＬＡ４の細胞外部分であり、第２結合ドメインが抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の可変部である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【請求項１３】
第１結合ドメインがＣＤ２８の細胞外部分であり、第２結合ドメインが抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の可変部である、請求項３記載の溶解性二特異的融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、1993年２月１日に出願された米国特許出願第08/013,420号の一部継続出願であり、この明細書を本発明に参考として引用する。
本明細書において、種々の文献が言及される。本発明が関係している技術を更に詳細に述べるために、これらの文献の開示をすべて本明細書に参考として引用する。
本発明は、二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクター及び哺乳動物細胞における生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清から抗体を得るような伝統的な抗体手法又はハイブリドーマ手法に伴う課題のために、所望の結合特性とエフェクター機能をセットした抗体又は抗体誘導体分子（例えば、二特異的融合タンパク質）を設計、操作及び生産する遺伝子工学がますます頻繁に用いられてきている。
ヒト抗体を産生する安定なハイブリドーマの生産で困難に直面したことが、生体内抗体産生及び慣用の試験管内手法を克服するように設計された代替方法の開発をもたらした(Mayforth R.D., Quintans, J.(1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Eng. J. Med. 323:173-178; Waldmann, T.A.(1991) Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252:1657-1662; Winter, G., Milstein, C.(1991) Man-made Antibodies. Nature 349:293-299; Morrison, S.L.(1992) In Vitro antibodeis: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10:239-266 )。
【０００３】
治療用として、異なる標的抗原に対して２つの全抗体の結合特異性を結合する最初の試みは、化学的に結合した『異種複合体』分子を用いるものであった(Staerz, U.D., Kanagawa, O., Bevan, M.J.(1985) Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells. Nature 314:628-631; Perez, P., Hoffman, R.W., Shaw, S., Blurstone, J.A., Segal, D.M.(1985) Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target antibody. Nature 316:354-356; Liu, M.A., Kranz, D.M., Kurnick, J.T., Boyle, L.A., Levy, R., Eisen, H.N.(1985) Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648-8652; Jung, G., Ledbetter, J.A., Muller-Eberhard, H.J.(1987) Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4611-4615; Emmrich, F., Rieber, P., Kurrie, R., Eichmann, K.(1988) Selective stimulation of human T lymphocyte subsets by heteroconjugates of antibodies to the T cell receptor and to subset-specific differentiation antigens. Eur. J. Immunol. 18:645-648; Ledbetter, J.A., June, C.H., Rabinovitch, P.S., Grossmann, A., Tsu, T.T., Imboden, J.B.(1988) Signal transduction through CD4 proximity to the CD3/T cell receptor. Eur. J. Immunol. 18:525-532)。
【０００４】
これらの試みは、抗標的細胞抗体に化学的に結合したマウス又はヒトＣＤ３Ｔ細胞表面レセプターに特定されたモノクローナル抗体が細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による標的細胞の溶解の引き金となり、ＣＴＬの主要な組織不適合性複合体制限を克服したことを証明した。
二特異的抗体はハイブリッドハイブリドーマから異種ハイブリドーマ法により産生され、異種複合体に見られるものと同様の特性を試験管内で示した(Milstein, C., Cuello, A.C.(1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature 305:537-540; Ataerz, U.D., Bevan, M.J.(1986) Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1453-1457; Clark, M.R., Waldmann, H.(1987) T-cell killing of target cells induced by hybrid antibodies: comparison of two bispecific monoclonal antibodies. J. Natl. Cancer Inst. 79:1393-1401; Lanzavecchia, A., Scheidegger, D.(1987) The use of hybrid hybridomas to target cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol.17:105-111; Gilliland, L.K., Clark, M.R.,Waldmann, H.(1988) Universal bispecific antibody for targeting tumour cells for destruction by cytotoxic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7719-7723 )。しかしながら、この抗体は細胞融合から産生されたものである。
【０００５】
異種複合体又は細胞融合からの二特異的抗体を用いて得られた有望な結果にもかかわらず、いくつかの要因のために大量の治療適用には非実用的であった。
それらの要因としては、（１）多量の異種複合体の急速な生体内クリアランス、（２）両方の種類の分子を作成するために要する骨の折れる徹底的な方法、（３）同種複合体又は一特異的抗体にはない徹底的精製の必要及び（４）低収量が挙げられる。
一般的には、異種複合体又は二特異的抗体を用いることに関連する方法には、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖及び／又は軽（Ｌ）鎖をコードする配列を連結しない２つの異なる特異性を用いた共発現方法を含むので、ランダムＨ−Ｌ結合及び／又はランダム（ＨＬ）−（ＨＬ）結合の課題があり、正しい生産物が少量しか得られず且つ困難な精製計画を招いている。過度の一特異的又は非特異的タンパク質分子がある場合、精製が煩わしくなり確認が困難になることがある。
これらの課題を取り除くための努力として、単鎖二特異的又は二機能性抗体を作成するために遺伝子工学が用いられている(Haber等, 1990; Wels, W.,Harwerth, I.M.,Zwickl, M.,Hardman, N.,Groner B.,Hynes, N.E.(1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10:1128-1132; A. Traunecker等(1991) EMBO Journal10(12):3655-3659)。しかしながら、この努力は有望なものではなかった。
【０００６】
単鎖二特異的又は二機能性抗体が細菌系において産生されている。しかしながら、この融合タンパク質は不活性形態で生産された(Haber等,1990)。更に、生産されたこの融合タンパク質は、結合親和性及び／又は結合活性の低下を示すか又は所望の生産物を回収するために複雑な単離及び精製方法を要している(Haber等, 1990; Wels等, 1992a)。
単鎖一価抗体及び単鎖二機能性抗体が述べられている(Wels 等, 1992b)。これらの抗体分子は、そのサイズを最小にし且つその機能修飾を可能にするために遺伝子操作したものである。更に、この二機能性抗体は、アルカリ性ホスファターゼ細菌遺伝子の３′をｓｃＦv 遺伝子に結合したという点でのみ二機能性である。これらの二機能性抗体は単一の結合ドメイン（例えば、ＶL ＋ＶH ) を含み、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子をその標的に結合した抗体を検出するために単にマーカーとして用いたものである。
ＦｖＣＤ３及びＣＤ４配列を含む Janusin分子が述べられている(A. Traunecker等 “Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells, EMBO Journal 10(12):3655-3659 )。 Janusin構築物は、構築物のアミノ末端にＣＤ４分子の一部及び構築物のカルボキシ末端にＣＤ３の結合ドメイン（即ち、ＶL ＋ＶH ) を含んでいる。 Janusin分子は、ＣＤ３可変部をＣＤ４分子部分から分離するらせんペプチドリンカーを含んでいない。更に、 Janusin分子は、多量体又は集合体にしばしば見られる。集合体形成を避けるために、追加の精製をしばしば必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗体産生に関する上記課題の観点から本発明が求められている。現在、抗体手法に伴う課題、即ち、大量の特異的抗体を得ることの難しさが継続している。歴史的には、抗体は血清又はマウス由来のハイブリドーマから得られていた。しかしながら、血清はたいてい量が限られ品質が変化しうるものであった。更に、マウス由来の抗体は、非マウス体にしばしば有害な免疫応答を起こす傾向があることから、ヒト治療に対する有用性が制限されている。
抗体手法を個々に悩ます課題、たいていは実質量の機能性タンパク質分子の生産に伴う課題を克服するために、生物学的に活性な融合タンパク質の発現を促進する新規な発現ベクターを本明細書に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、二特異的融合タンパク質を提供する。
ここではさらに、一特異的又は二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。
１実施態様においては、発現ベクターは一特異的融合タンパク質をコードし（例えば、図１６）、このベクターは細胞表面抗原のような標的を結合することができる第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体一特異的単鎖カセットを含む。
もう１つの実施態様においては、発現ベクターは二特異的融合タンパク質をコードし、このベクターは標的を結合することができる第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列及び標的を結合することができる第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含み、各ドメインは異種標的を結合することができる。
本発明は、また、哺乳動物細胞における生物学的に活性な一特異的又は二特異的融合タンパク質の生産方法を提供する。本方法は、（ａ）哺乳動物細胞に本発明の組換え体発現ベクターを移入し、（ｂ）段階（ａ）で移入した哺乳動物細胞を培養し、（ｃ）培養した哺乳動物細胞によって産生された生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を回収することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
本明細書で用いられる語句の意味を下記に説明する。
本明細書で用いられる『二特異的融合タンパク質』は、少なくとも２種の異なる標的を別々に又は同時に特異的に認識及び結合する免疫学的に反応する任意の分子を意味し、単鎖として表される。
本明細書で用いられる『一特異的融合タンパク質』は、標的を特異的に認識及び結合し、２本の免疫グロブリン重鎖、２本の免疫グロブリン軽鎖又は免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖及び／又はそのいずれかの部分を含む複合体である免疫学的に反応する任意の分子を意味し、単鎖として表される。
本明細書で用いられる『発現ベクター』は、（１）所望の遺伝子又はＤＮＡ配列を発現させるのに必要なプロモーター及び他の配列（例えば、リーダー配列）及び（２）所望の配列又はＤＮＡ配列を含む核酸分子を意味する。場合によっては、核酸分子は遺伝子転写物の安定性を高めるポリＡ及び／又は遺伝子の転写を増強するエンハンサー配列を含んでもよく、これにより遺伝子の発現が影響される。
本明細書で用いられる『結合ドメイン』は、標的の全結合領域又はその任意部分を認識及び結合する結合部位を意味する。具体例としては、（１）抗体の単一可変部（ＶL 又はＶH ）、（２）２種以上の可変部（例えば、ＶL ＋ＶH ；ＶL ＋ＶL ；又はＶH ＋ＶH ）又はその相補的決定領域（ＣＤＲ）又は（３）抗原（例えば、白血球抗原）又はその一部があるが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書で用いられる『分子垂れはし』は、本明細書で記載される融合タンパク質の検出及び精製を容易にすることができる分子をコードする任意のＤＮＡ配列を包含する。
本明細書で用いられる『二特異的単鎖カセット』は、標的を結合することができる第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列及び標的を結合することができる第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を包含し、各ドメインは別々に又は同時に異種標的を結合することができ、ＤＮＡ配列でコードされた両ドメインは同一カセット上にある。第１及び／又は第２結合ドメインは、２個の可変部（ＶL ＋ＶH 、ＶH ＋ＶL 、ＶL ＋ＶL 又はＶH ＋ＶH ）又は１個の可変部（ＶL 又はＶH ）であってもよい。また、第１及び／又は第２結合ドメインは、抗原又はその一部であってもよい。抗原の適切な例としては白血球抗原があるが、これに限定されない。第１結合ドメインは発現タンパク質のアミノ末端に又はその方向に位置し、一方第２結合ドメインは発現タンパク質のカルボキシ末端に又はその方向に位置する（二特異的単鎖ＤＮＡカセットのＤＮＡ配列の５′又は３′端に各々対応する）。
本明細書で用いられる『単鎖カセット』は、その標的の少なくとも一部を認識及び結合することがきるタンパク質をコードする配列を意味する。そのタンパク質は、複数の標的を認識及び結合するために複数部位を有してもよい。
【００１１】
本明細書で記載した本発明を完全に理解するために、更に下記の説明を述べる。
Ａ．ベクター
本明細書に記載される発現ベクターは、結合ドメインをコードするＤＮＡ配列（即ち、そのコーディング配列）又は調節配列、即ち、プロモーター又は発現プラスミド内で所望の遺伝子を発現させるのに必要な他の配列（例えば、リーダー配列）を全部又は部分的に置き換えることにより修飾することができる。
修飾した発現ベクター内の置換されたＤＮＡ配列は、任意の抗体又は他のレセプターの可変部をコードしてもよい。例えば、ＤＮＡ配列は、ＢＲ９６抗原、ＣＤ３、Ｌ６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４又はＢ７を認識及び結合する抗体の可変部をコードしてもよい。更に、ＤＮＡ配列は、他の細胞表面抗原に結合することができる可変部をコードしてもよい。また、結合ドメインは、白血球抗原のような抗原の全部又は一部をコードしてもよい。具体的な置換配列を挿入するかについての主要な問題は、置換された配列が所望の結合ドメインを発現することができるように『フレーム内』に位置するかどうかである。
【００１２】
置換された配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法でクローン化される。発現ベクターに挿入することができ、順次真核細胞を形質転換することによりＤＮＡ配列を発現することができる多数のＤＮＡ配列を作製するために、ＰＣＲが用いられる。特異的配列の増幅を達成する他のクローン化法、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いることもできる。
発現ベクターのプロモーターは、発現に用いられる細胞の種類又は挿入されるＤＮＡ配列により、他のプロモーターに容易に置き換えられる。プロモーターの適切な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）が挙げられる。
未変性の単量体としての抗体は、１分子当たり２本の相同な重鎖及び２本の相同な軽鎖を含む４連鎖の高分子である。各鎖は、可変（Ｖ）部と定常（Ｃ）部からなる。軽鎖の可変部（ＶL ）は、可変部（Ｖ）と結合部（Ｊ）遺伝子でコードされ、重鎖の可変部（ＶH ）は可変部（Ｖ）と介在多様性領域（Ｄ）を有する結合部（Ｊ）遺伝子でコードされる。ＶL ＋ＪL 又はＶH ＋ＤH ＋ＪH 配列でコードされた各可変部フラグメント（ＶL 又はＶH ）は、約１００個のアミノ酸で構成される。これらの配列内には、抗体の結合部位を作るアミノ酸を含むと思われる相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の超可変部が含まれる。ＣＤＲは、骨格領域（ＦＲ）と呼ばれる可変性の極めて低い４個の領域に散在する。
【００１３】
抗体の抗原結合部位は、典型的には、ＶL 及びＶH 領域ポリペプチドをそれらのβプリーツシート構造に結合することにより形成され、ＣＤＲ領域又はその近傍には鎖の間にループを含んでいる。時には、ＶL ＋ＶL 対又はＶH ＋ＶH （例えば、Ｇ１７−２軽鎖単量体）又はＶL 又はＶH 単独で抗原を結合することがある。
従って、『結合ドメイン』は、次の（ａ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ又は他の免疫グロブリン）のＶL ＋ＶH 領域、（ｂ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ又は他の免疫グロブリン）のＶL ＋ＶL 領域、（ｃ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ又は他の免疫グロブリン）のＶH ＋ＶH 領域、（ｄ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ又は他の免疫グロブリン）の単一ＶL 領域又は（ｅ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ又は他の免疫グロブリン）の単一ＶH 領域の１種又は組合わせを含む。
本発明による発現ベクターは、抗体配列を組込んでいるベクターに限定されない。抗原及びレセプターのような他の種類のタンパク質の結合ドメインをコードする配列を用いることもできる。即ち、ベクターは、複数の異なった標的を別々に又はほとんどは同時に結合することができる二特異的融合タンパク質をコードする。
【００１４】
本発明の１実施態様においては、組換え体単鎖カセットは、異なった特異性を各々有する複数の（１）可変部及び／又は（２）抗原又はその一部をコードする複合ＤＮＡ配列を含む。このカッセトにおいて、可変部をコードする配列は、（ａ）別の可変部又は（ｂ）抗原をコードするＤＮＡにリンカーで結合されることが好ましく、これらはすべて縦列に配置される。典型的には、そのようなリンカーはらせん構造である。らせんペプチドリンカーは、タンパク質分子を適切に折りたたむことができる。更に、らせんペプチドリンカーは、分子の溶解性を高めることができる。単一可変部単独で（ＶL 又はＶH ）発現するのと異なり、単鎖タンパク質として２個の可変部（ＶL ＋ＶH ；ＶL ＋ＶL ；ＶH ＋ＶH ）は、個々の可変部を短いリンカー、例えば、（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ)3リンカーで連結するとを必要とする。
全領域の短いリンカーは、ＶL ＋ＶH （ＦV ) フラグメントを有する免疫グロブリン鎖を結合するために用いられる(Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotny, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H.(1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an antidigoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Pluckthoen, 1991)。このリンカーは、タンパク質の折りたたみでは受動体である。一般に、このリンカーは親水性及び可撓性である。
【００１５】
慣用的には、ＦV フラグメントを有する免疫グロブリン鎖の連結には数種の手段、即ち、化学的架橋(Glockshuber等, 1991);ジスルフィド結合による自然架橋(Glockshuber等, 1990a); ジスルフィド結合のない自然結合; 及び遺伝的にコードされたペプチドリンカーによる結合がある(Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S.H., Riordan, G.S., Whitlow, M.(1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science 242:423-427; Huston 等, 1988a)。
単鎖カセットは、複数のリンカーを含んでもよい。リンカー数について主要な制約は、本発明のベクターでコードされた機能性融合タンパク質をなお発現することができるその数である。
本発明のらせんペプチドをコードするリンカー（配列番号１０、１１、１２）は、その誘導体分子を作製するために修飾される、即ち、分子内のアミノ酸置換により修飾される。このような誘導体分子は、らせんペプチドリンカーの機能性を保持する。即ち、この置換を有する分子は、本発明の新規な発現ベクターによってコードされた生物学的に活性なタンパク質生産物をなお発現することができる。
【００１６】
これらのアミノ酸置換としては、『保存的』として当該技術において既知のアミノ酸置換があるが、必ずしもこれに限定されない。
例えば、タンパク質においてしばしば『保存的アミノ酸置換』と称するある種アミノ酸置換をタンパク質の構造又は機能を変えずに行うことができることは、タンパク質化学の十分に確立された原理である。このような置換としては、疎水性アミノ酸のいずれかをイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかに；グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に又はその逆に；アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に又はその逆に；及びトレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に又はその逆に置換することが挙げられる。
他の置換も個々のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次構造におけるその役割によっては保存的とみなすことができる。例えば、アラニンとバリン（Ｖ）のように、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）もしばしば交換される。
【００１７】
相対的に疎水性のメチオニン（Ｍ）は、ロイシン及びイソロイシンとしばしば交換され、時にはバリンと交換される。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これらの２つのアミノ酸残基のｐＫの違いが重要でない場所ではしばしば交換される。また、他の置換も個々の環境において『保存的』とみなすことができる。
軽鎖及び／又は重鎖配列を有する抗体可変部及び非抗体結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするベクターは、本発明に包含される。第１及び／又は第２結合ドメインは、抗体の可変部であってもよい。また、第１及び／又は第２結合ドメインは、抗原又はその一部であってもよい。抗原の一部は、その部分が認識され、認識後これに分子が結合することができるものを包含することが好ましい。例えば、トランスメンブランタンパク質抗原においては、好ましい部分は細胞外部分である。しかしながら、他の部分も本発明に包含される。
適切な抗原及びレセプターの例としては、ＣＤ及び非ＣＤ分子があるが、これらに限定されない。
【００１８】
ＣＤ分子としては、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３／ＴｃＲ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤｗ５０、ＣＤ５１、ＣＤｗ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤ７６、ＣＤｗ７８が挙げられるが、これらに限定されない。
非ＣＤ分子としては、Ｂ７、Ｂ７（２）、ＣＴＬＡ４、ＢＲ９６、ＧＰ３９、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−２及びインターロイキン（ＩＬ）１−８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
例えば、ＣＤ２８抗原は、ほとんどの成熟ヒトＴ細胞(Damle等(1983) J.Immunol. 131:2296-2300)に見られる免疫グロブリンスーパーファミリーのホモ二量体糖タンパク質である(Aruffo, A., Seed, B.(1987) Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-efficiency COS cell expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577)。ＣＤ２８抗原と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、種々のポリクローナル刺激により起こされるＴ細胞応答を増加することができる。相同分子、ＣＴＬＡ４は、マウス細胞溶解Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの微分スクリーニングにより同定されている (Brunet等(1987) Nature 328:267-270)。
本発明の発現ベクターは、多特異的融合タンパク質をコードすることができるベクター、即ち、多数の標的と反応することができる分子を包含する。例えば、本発現ベクターは、単鎖に発現することができる三特異性融合タンパク質、即ち、３種の標的を認識及び結合する融合タンパク質をコードしてもよい。また、融合タンパク質は、４種の標的を認識及び結合することができる。
【００２０】
例えば、１実施態様においては、本発明のベクターによってコードされた一特異的融合タンパク質は、図１６の単鎖抗体と同じものである。
本発明の１実施態様においては、発現ベクターは、（１）抗体又は細胞表面抗原の第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列、（２）抗体又は細胞表面抗原の第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列、（３）第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列及び第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を連結するらせんペプチドをコードするリンカー及び（４）一又は二特異的融合タンパク質の検出のための分子垂れはしをコードするＤＮＡ配列を含む。
分子垂れはしは、抗体、センス又はアンチセンス相補的分子、酵素等の分子垂れはしを認識及び結合する適切な分子により同定される。分子垂れはしの例としては、Ｆc フラグメント、ＨＩＶフラグメント及び赤血球凝集素エピトープ配列ＨＡＩが挙げられる (Pati等(1992) Gene 114 (2):285-8)。
好ましい実施態様によれば、発現ベクターは、（１）抗体又は細胞表面抗原の第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列、（２）抗体又は細胞表面抗原の第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列、（３）第１結合ドメインをコードするＤＮＡ配列及び第２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を連結するらせんペプチドをコードするリンカーを含み、該ドメインの各々が同種又は異種標的又は抗原を結合することができる組換え体二特異的単鎖ＤＮＡカセットを含む。
【００２１】
本発明の実験によれば、第１及び／又は第２結合ドメインは細胞表面抗原又は白血球抗原と反応することができる。細胞表面抗原としては、ＣＤ３、Ｌ６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０又はＢ７のような分子が挙げられるが、これらに限定されない。即ち、第１及び／又は第２結合ドメインはＣＤ３と反応することができる。また、第１及び／又は第２結合ドメインはＬ６と反応することもできる。更に、第１及び／又は第２結合ドメインはＣＤ２８と反応することもできる。更に、第１及び／又は第２結合ドメインはＢ７と反応することもできる。更に、第１及び／又は第２結合ドメインはＣＤ４０と反応することもできる。
好ましい実施態様においては、発現ベクターはＣＣ９−２と称し、ATCC No.69235 として大腸菌プラスミド内でアメリカンティッシュカルチュアコレクション(ATCC)に寄託されている（ＣＣ９−２はｐＣＤＭ８内にＬ６ＶL リーダー配列−ＣＤ３ｓＦV −リンカー−Ｌ６ｓＦV −免疫グロブリンＦC を有する) 。任意のＤＮＡ配列が用いられることは当業者に明らかである。適切な配列及び発現のための正しい読み枠のためのカセットとして挿入されるように、用いられるべき可変部又は分子のコーディング配列が既知でなければならないことのみが要求される。
【００２２】
更に、任意の抗体の可変部をコードするＤＮＡ配列及びリガンドをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターも提供される。そのリガンドの例としては、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ３が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドの他の例としては、任意の白血球抗原がある。
例えば、本発明は、ＣＤ３と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列及びＬ６と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。第１又は第２結合ドメインがＣＤ３と反応してもよい。第１又は第２結合ドメインがＬ６と反応してもよい。
本発明は、更に、Ｂ７の少なくとも一部（例えば、細胞外部分）であるドメインをコードするＤＮＡ配列及びＬ６と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。
【００２３】
本発明は、更に、ＣＴＬＡ４と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列及びＬ６と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。第１又は第２結合ドメインがＣＴＬＡ４と反応してもよい。第１又は第２結合ドメインがＬ６と反応してもよい。
また、本発明は、ＣＤ２８と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列及びＬ６と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。第１又は第２結合ドメインがＣＤ２８と反応してもよい。第１又は第２結合ドメインがＬ６と反応してもよい。
例えば、本発明は、ＣＤ３と反応するドメインをコードするＤＮＡ配列及びＢ７の細胞外部分をコードするＤＮＡ配列を含む組換え体二特異的単鎖カセットを含む二特異的融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。
【００２４】
本発明によれば、発現ベクター及び生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の生産方法が提供される。一般に、これらの方法は、（１）抗体又は他の結合タンパク質を合成するＢ細胞ハイブリドーマ又は他の培養細胞からｍＲＮＡを単離し、（２）逆転写によりｃＤＮＡを合成し、（３）ＰＣＲプライマーとしてアンカー末端のオリゴヌクレオチド又は変性したオリゴヌクレオチドを用いて可変部のような結合ドメインをクローン化し、（４）そのクローン化した可変部の配列を決定し、（５）可変部遺伝子間の遺伝子融合を構築し、（６）その構築された可変部をＳａｌＩ及びＢｃｌＩで切断したｐＵＣＩｇベクター（又は他の適切なベクター）に挿入し、（７）適切な断片配置のクローンをスクリーニングし、そのクローンの配列を決定し、（８）そのクローンをｐＣＤＭ８又はｐｉＬＮＸＡｎのような適切な発現ベクターに移し、（９）ＤＥＡＥ−デキストラン法のような手法でＣＯＳ細胞に移入し、（１０）その移入された細胞を発現されるべき融合タンパク質に十分な時間、典型的には約７２時間インキュベートし、（１１）生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を生産するためにＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ及び／又はＥＬＩＳＡを用いたファクスでその細胞をスクリーニングすることを含む。
【００２５】
Ｂ．生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の生産方法
生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の生産方法を提供する。本方法は、二特異的融合タンパク質を生産するために、本発明の発現ベクターを移入した細胞を培養し、生産されたタンパク質を回収することを含む。
本発明は、更に、哺乳動物細胞における生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の生産方法を提供する。本方法は、（ａ）本発明の発現ベクターを哺乳動物細胞に移入し、（ｂ）段階（ａ）で移入した哺乳動物細胞を培養し、（ｃ）培養した哺乳動物細胞によって産生された生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を回収することを含む。
生物学的に活性な二特異的融合タンパク質の回収方法は、（ａ）分子垂れはしの存在によって生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を同定し、（ｂ）培養した哺乳動物細胞によって産生された生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を回収するために、同定した分子垂れはしのある生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を分子垂れはしのない分子から分離することを含む。
【００２６】
下記実施例においては、哺乳動物由来の細胞が用いられるが、本発明の実施において任意の真核細胞が有効である。例としては、ヒト細胞、例えば、線維芽細胞及びヒツジ、ブタ、マウス、ウシのような他の動物由来の細胞が挙げられる。哺乳動物細胞の具体例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＤＵＸ、Ｂ１１、Ｓｐ２／０、Ｗ１３８、ＤＨＫ及びＨＥＰＧ２細胞が挙げられる。
生物学的に活性な二特異的融合タンパク質が生体内及び生体外診断及び治療に有用な検出マーカー及び治療用薬剤に結合されることは明らかである。その生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を結合することができる検出マーカーの中には、酵素、常磁性イオン又は化合物、アビジン−ビオチン特異結合対のもの、蛍光団、発色団、化学発光団、重金属及び放射性同位元素がある。生物学的に活性な二特異的融合タンパク質を結合することができる治療用薬剤の中には、抗腫瘍剤、リンホカイン及び毒素がある。
【００２７】
Ｃ．本発明の発現ベクターを移入した細胞
発現ベクターの哺乳動物細胞への導入は、リン酸カルシウム移入(Graham, Vander Eb.(1973) Virol. 52:456-467)、ＤＥＡＥ−デキストラン移入 (Lopata, M.A.等,(1984) Nucl. Acids Res. 12:5707) 及び電気穿孔法 (Potter, H.等 (1984) PNAS 81:7161) により行われる。移入方法の選択は、何の種類の移入が行われるかに幾分左右される。電気穿孔法及びＣａＰＯ4 移入は、共に、安定に組込まれたＤＮＡを含むセルラインを効率よく生産するために用いられる。電気穿孔法はたいてい浮遊培養を用いて容易に行われ、ＣａＰＯ4 移入はたいてい粘着細胞を用いて容易に行われる。ＤＥＡＥ−デキストラン移入は安定なセルラインを生産する際には十分に作用しないが、一過性のプロトコールに用いる際にはＣａＰＯ4 移入より再現性が高い。他の移入方法も当該技術において既知である。
本明細書に記載される方法で生産された発現ベクター及び新規なタンパク質は上記可変部に限定されず、一般に、任意の単鎖二特異的融合タンパク質の構築、発現及びスクリーニングに適用できる。
【００２８】
Ｄ．本発明のベクターによってコードされた融合タンパク質の使用
分子垂れはしのない抗Ｌ６及び抗ＣＤ３単鎖誘導体は、Ｌ６又はＣＤ３関連の疾患を治療又は検出するための治療又は診断に有効である。例えば、Ｌ６ｓＦｖは検出用放射性核種に化学的に結合することができ、また治療用ＰＥ４０のような毒素に遺伝的に融合することができる。
短いｓＦｖフラグメントの方が腫瘍塊をよりよく浸透することができ且つ腫瘍部位の局在を改良したので、治療用薬剤を高レベルのＬ６抗原を発現する腫瘍細胞に対して標的とするには少量のＬ６ｓＦｖが効果的である(Colcher, D., Bird, R., Roselli, M., Hardman, K.D., Johnson, S.,Pope, S., Dodd, S.W., Pantoliano, M.W., Milenic, D.E., Schlom, J.(1990) In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197; Yokota, T., Milenic, D.E., Whitlow, M., Schlom, J.(1992) Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res. 52:3402-3408 )。
【００２９】
ＣＤ２８の連結反応のように第２シグナルなしのＴ細胞レセプターシグナルの送達はＴ細胞アネルギーを招くことがあるので、ＣＤ３ｓＦｖは生体内免疫抑制の誘導に十分適している。ＯＫＴ３のＦ（ａｂ′）２フラグメントが免疫抑制するとともに全抗体ＯＫＴ３誘導免疫抑制に関与するサイトカイン毒性を著しく低下させることが証明されている(Woodle, E.S., Thistlethwaithe, J.R., Ghobrial, I.A., Jolliffe, L.K., Stuart, F.P., Bluestone, J.A. (1991) OKT3 F(ab′)2 fragments: retention of the immunosuppressive properties of whole antibody with marked reduction in T cell activation and lymphokine release. Transplantation 52:354-360)。
【００３０】
おもしろいことに、ＣＤ３単鎖単一特異的抗体誘導体が未変性抗体と異なった機能特性を示した。ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ誘導体は、ＰＬＣγ１のチロシンリン酸化を強力に誘発し、未変性抗ＣＤ３ｍＡｂに比べてＰＬＣγ１とｐｐ３５／３５との結合を増加させる。この結合は、Ｔ細胞を最大限に刺激するように増加することが示されている(Kanner,S.B., Deans,J.P., Ledbetter,J.A.(1992a) Regulation of CD3-induced phospholipase C-γ1 (PLCγ1) tyrosine phosphorylation by CD4 and CD45 receptors. Immunology 75:441-447; Kanner,S.B., Ledbetter,J.A.(1992b) CD45 regulates TCR-induced signalling through tyrosine phosphorylation of phospholipase Cγ1. Biochem. Soc. Trans. 20:178-184 )。更に、Ｔ細胞のＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇによる刺激は、活性化を伴う細胞タンパク質のより全体のチロシンリン酸化をもたらした。この分子は未変性ｍＡｂより小さいので、ＣＤ３−ε上の結合ドメインがより利用され且つＴＣＲ／ＣＤ３結合チロシンキナーゼとの相互作用を改良することが可能である。
【００３１】
動物モデル及びヒトにおける臨床試験において、抗ＴＣＲ又は抗ＣＤ３ｍＡｂは標的細胞抗原に架橋する際に標的細胞に対してＴ細胞応答を強めることが示されている。異種複合又は二特異的ｍＡｂは、細胞障害性Ｔリンパ球又はリンパ球活性化キラー細胞を活性にして悪性標的細胞 (Staerz等, 1986a; Perez等, 1985a; Perez, P., Hoffman, R.W., Titus, J.A., Segal, D.M. (1986) Specific targeting of human peripheral blood T cells by heteroaggregates containing anti-T3 crosslinked to anti-target cell antibodies. J. Exp. Med. 163:166-178; Liu等, 1985a; Staerz 等, 1986b)又はウイルス感染標的細胞(Paya, C.V., McKean, D.J., Segal, D.M., Schoon, R.A., Schowalter, S.D., Leibson, P.J. (1989) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity. J. Immunol. 142:666-671; Zarling, J.M., Moran, P.A., Grosmaire, L.S., McClure, J., shriver, K., Ledbetter, J.A.(1988) Lysis of cells infected with HIV-1 by human lymphocytes targeted with monoclonal antibody heteroconjugates. J. Immunol., 140:2609-2613; voss, L.M., David, C.S., Showalter, S.D., Paya, C.V., Liebson, P.J.(1992) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity in vivo. Int. Immunol. 4:417-420) を破壊する。
【００３２】
抗ＣＤ３ｍＡｂは強力なサイトカイン毒性を生体内で誘導することができる(Abramowicz, D., Schandene, L., Goldman, M., Crusiaux, A., Vereerstraeten, P., De Pauw, L., Wybran, J., Kinnaert, P., Dupont, E., Toussaint, C.(1989) Release of tumor necrosis factor, interleukin-2, and gamma interferon in serum after injection of OKT3 monoclonal antibody in kidney transplant recipients. Transplantation 47:606-608) が、二特異的ｍＡｂで治療した患者は、患者のＴ細胞を試験管内で試薬で前処理してから再投与したので、サイトカイン毒性を生じない(Mezzanzanica, D., Canevari, S., Colnaghi, M.I.(1991) Retargeting of human lymphocytes against human ovarian carcinoma cells by bispecific antibodies: from laboratory to clinic. Int. J. Clin. Lab. Res. 21:159-164; Nitta, T., Sato, K., Yagita, H., Okumura, K., Ishii, S. (1990) Preliminary trial of specific targeting therapy against malignant glioma. Lancet 335:368-371)。マウスモデルにおいて、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントのような未変性ｍＡｂより小さい分子は、一特異的抗腫瘍特異性及び二特異的抗ＣＤ３、抗腫瘍特異性の双方に対して腫瘍局在の増加を示している(van Dijk, J., Zegveld, S.T., Fleuren, G.J., Warnaar, S.O.(1991) Localization of monoclonal antibody G250 and bispecific monoclonal antibody CD3/G250 in human renal cell carcinoma xenografts: relative effects of size and affinity. Int. J. Cancer 48:738-743; Nelson, H., Ramsey, P.S., Kerr, L.A., McKean, D.J., Donohue, J.H.(1990) Regional and systemic distribution of anti-tumor x anti-CD3 heteroconjugate antibodies and cultured human peripheral blood lymphocytes in a human colon cancer xenograft. J. Immunol. 145:3507-3515)。
【００３３】
ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ分子は、新規な分子として哺乳動物がん治療、例えば、ヒトがん治療に有効である。この分子は、ＣＤ３及び腫瘍抗原Ｌ６双方の結合特異性を含み、Ｌ６陽性腫瘍細胞の存在下にＴ細胞増殖を誘導し且つこれらの細胞に対してＣＴＬ破壊を特定することが試験管内で示されている。この２つの異なった結合特異性は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに結合して初めは垂れはしとして二特異的分子の確認及び精製のために作用する。この垂れはしは、これ自体垂れはしの付いた二特異的タンパク質の小さな全サイズが未変性ＩｇＧの約２／３まで残る相対的に小さなドメイン（約５０ｋＤａ）である。この垂れはしはヒト由来であるので、この分子の全体の免疫原性は全マウスＩｇＧより著しく低いことが予想される。骨格領域を人化し、また、既知のヒトタンパク質のらせんに似るようにらせんリンカーの溶媒接触部分を構築するような二特異的タンパク質の免疫原性を更に低下させるための追加の修飾も行われる。Ｉｇ部分は親和性尾部として作用したが、生体内で二特異的タンパク質の半減期を増加させることもできる。
【００３４】
１報告書において、ヒトＩｇＧ１定常部に融合したキメラマウス抗結腸直腸がんｍＡｂ可変部(Steplewski, Z., Sun, L.K., Sherman, C.W., Ghrayeb, J., Daddona, P., Koprowski, H.(1988) Biological activity of human-mouse IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumor activity. proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4852-4856) を転移結腸がんの１０人の患者に投与すると、循環時間が６倍増加することが示されている(LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb, J., Khazaeli, M.B. (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220-4224)。
更に、本発明の二特異的融合タンパク質に用いたＩｇ尾部は、ＣＨ２ドメインで変異される（残基２３８でプロリンからセリンに）。この変異は、ヒトＩｇＧ１尾部とＦｃレセプターとの相互作用により仲介されるＡＤＣＣ活性を切断する。これは、生体内でＣＤ３陽性Ｔ細胞とＦｃレセプターをもつ細胞との間の『相互的』破壊を防止するにちがいない(Clark等, 1987a)。最後に、二特異的分子はＣＯＳ細胞の一過性移入から発現されるが、タンパク質は安定な移入系で発現されることが可能である。
【００３５】
本発明の利点：  本発明は、現在の抗体産生方法に伴う課題を克服する。
二特異的融合タンパク質を生産するに当たり他のもので直面した課題を克服するために、既存のＣＯＳ細胞発現系を適応して組換え体二特異的単鎖カセットＤＮＡから機能性単鎖抗体誘導体を分泌することを達成した。単鎖抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをヒト抗原（例えば、ＣＤ３及びＬ６）に対するマウス抗体の可変部に融合することにより構築した。Ｆｃ領域は、種々の特異性を有する融合タンパク質の同定及び精製に便利な分子垂れはしとして作用した。抗体のこのセグメントによって与えられるエフェクター機能は、ある種の治療に有効であある。
生物学的に活性な分子の回収は、単一結合特異性を有する分子の場合でさえ問題のある細菌発現系と異なり、本発明は、発現した生物学的に活性な融合タンパク質を含む培養上清を生じ、次いで、慣用的なアフィニティークロマトグラフィーで精製されるＣＯＳ細胞からの一過性発現を提供する。おもしろいことに、生産された単鎖二特異的融合タンパク質分子は、親抗体と異なった特性を示す。
【００３６】
生物学的に活性な分子の回収が単一結合特異性のみを有する分子の場合でさえ問題があることから、これらの二特異的融合タンパク質分子の哺乳動物発現が選ばれた。哺乳動物発現により抗体誘導体の簡便で急速な産生が得られ、分子間の確認、評価及び比較が相対的に短時間で可能なためには重要なことである。
個々のタンパク質ドメインが相互交換可能な組換え体二特異的単鎖カセットＤＮＡ上にある遺伝子融合は、新規な組合わせを作り、急速な交換を行い且つ所望の機能を行うのにそれらの効能に対して種々のドメインをスクリーニングするための可能性が生じる。一過性移入系における構築物の発現は、初めの組換え及びスクリーニング段階の場合の他の生産方法より好ましい。このスクリーニングから所望のサブセットの特徴を示す分子だけが、大量生産用の第２発現系にシャトルすること、長いあるいは複雑な作製を排除すること及び作成した大多数の分子の単離操作を必要とする。
【００３７】
相互交換可能なＤＮＡカセットを有する組換え体二特異的単鎖ＤＮＡカセット、即ち、単鎖可変部又は別のものに交換することができる他の結合ドメインをコードするＤＮＡカセットとしてより大きな分子に構築された抗体結合部位の急速な構築、発現及び分析系を開発することに着手した。第１及び第２結合ドメインの配列は、置換あるいは相互交換することができる。異種の配列は既存のものと置き換えてもよい。
前述の構築物と異なり、第１又は第２結合ドメインのいずれか又は双方に任意の可変部を配置することができるので、この二特異的単鎖カセットは有用である。
抗体構造ドメインの新規な組合わせを構築することにより、例えば、２つの関連のない結合特異性及び所望のエフェクター機能を結合する分子が作製され、治療可能性が改良される。そのような二特異的単鎖抗体誘導体が２つの非相互作用細胞表面レセプターのアダプター分子として作用すると人工レセプター−リガンド対を生じる。
【００３８】
ここでのデータは、組換え体二特異的単鎖ＤＮＡカセットから発現された二特異的融合タンパク質が、多くの組織培養操作又はＣＤ３に対する毒性一特異的抗体の可能性をなくす精製を必要としないで生体内及び生体外でヒト腫瘍発現Ｌ６に対するＴ細胞による細胞障害性応答を標的とすることができることを示している。
腫瘍細胞結合及びＴ細胞結合及び活性化に対する特異性を結合する単鎖抗体誘導体は、ヒト疾患に対する単一のモノクローナル抗体に基づく治療より著しい改良を与える。ここに記載した遺伝子融合の設計、構築、発現及び試験の方法は、関連のない分子の機能性ドメイン間の新規な組合わせを単一分子内で共に機能する能力について試験する場合、迅速性、簡便さ及び再現性において著しい利点を与える有用なものである。
下記の実施例において、本発明を具体的に説明する。実施例は本発明を更に理解するために記載されるが、前記特許請求の範囲で記載した本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３９】
材料及び方法：
発現ベクターの修飾：
スタッファーフラグメントを得られた融合タンパク質に対してある機能特性を与えるいくつかの短いスタッファーフラグメントに置き換えることにより、プラスミドｐＣＤＭ８及びｐｉＬＮＸＡｎを修飾した。
哺乳動物発現ベクターは、ベクターの上部に沿って示されている修正と追加が行われた図で表される。融合カセットの発現はＣＭＶプロモーターによって進み、細菌及び哺乳動物細胞における複製はベクターの下部に示された適切な起源によって得られる。ベクターは、適切な宿主細菌株内のｐ３プラスミドに存在するアンピシリン及びテトラサイクリン遺伝子のナンセンス変異を抑圧するｓｕｐＦ遺伝子を含む。終結及びポリＡ付加シグナルは、ＳＶ４０から適切な領域で設けられる。
【００４０】
スタッファー領域の５′端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて抗Ｌ６抗体（本明細書では抗Ｌ６とも呼ばれる）の軽鎖可変部から得られた融合タンパク質を分泌するためのリーダー配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩカセットを挿入した（図１）。この配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ付着端突出部分を有する７２−ｍｅｒ相補的オリゴヌクレオチドにコードされた。使用したセンスオリゴヌクレオチドはL6VL-LP5/AGC TTA TGG ATT TTC AAG TGC AGA TTT TCA GCT TCC TGC TAA TCA GTG CTT CAG TCA TAA TGT CCA GAG GAG（配列番号１）であり、相補的オリゴヌクレオチドはL6VL-LP3/TCG ACT CCT CTG GAC ATT ATG ACT GAA GCA CTG ATT AGC AGG AAG CTG AAA ATC TGC ACT TGA AAA TCC ATA (配列番号２）であった。センスオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, ID) 、連結反応の前に、以前に発表された方法(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.(1989) Molecular cloning - a laboratory manual, second edition. ISBN 0-87969-309-6) に従って補体にアニールした。オリゴヌクレオチドの１本だけをキナーゼして複数の縦列挿入を防止した。
【００４１】
更に、スタッファーフラグメントの３′端のＸｂａＩ部位を用いてカルボキシル末端のＢｃｌＩ及びＸｂａＩ制限部位に隣接した分子垂れはし又は簡単な停止コドンを挿入した（図１）。試験した分子垂れはしは、ヒトＩｇＧ１、ｇｐ１１０のＶ３ループからのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ペプチド、ＦＬＡＧペプチド及びヒトＣ−κからの定常部ドメインを含んだ。ヒトＩｇＧ１配列を、骨髄腫発現ヒト−マウスキメラＬ６のＲＮＡからの結合逆転写（トリ骨髄芽球症ウイルス; Life Sciences, St. Petersburg, FL)及び／又はＰＣＲ反応によりキメラＬ６トランスフェクトーマのＲＮＡから単離した。ヒンジあるいはＣＨ２領域に適切な変異を含む前進プライマーを用いてＰＣＲ反応からＦｃドメインの各種変異誘導体を構築した。
【００４２】
２つの異なった結合特異性、ヒトＬ６腫瘍抗原及びヒトＣＤ３−εの可変部を挿入及び発現することにより、修飾発現ベクターを試験した。単鎖抗体誘導体は、融合される分子垂れはしによって、種々の結合活性及び親和性を有する抗原を結合した。ＣＨ１及びＣκドメインなしにもかかわらず、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインが未変性抗体の結合特性を再現する点で最も満足すべき垂れはしであった。他の各種垂れはしを構築及び試験したが、Ｃκ(Traunecker, A., Lanzavecchia, A.M., Karjalainen, K.(1991) Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J. 10:3655-3659) 及びＦＬＡＧペプチドは共に確実に機能しなかった。ヒト免疫不全ウイルスによってコードされたｇｐ１１０のＶ３ループからのペプチドRKSIRIQRGPGRAFVTIGKI（配列番号３）も親和性尾部として用い、ペプチド特異的ｍＡｂ１１0.３によって認識された。この垂れはしは融合されるＦｖによって可変結果を生じ、Ｌ６に融合される際には適切に機能せず、ＣＤ３に融合される際には満足に機能した。
【００４３】
ペプチド２９(RKSIRIQRGPGRAFVTIGKI)（配列番号３）は、ＨＩＶのｇｐ１１０のＶ３ループセグメントに相当する（ＨＩＶペプチド）。付着末端突出部分を有する２本の７６−ｍｅｒ相補的オリゴヌクレオチドをアニールして、分子垂れはしを作った。センスオリゴヌクレオチドはＢｃｌＩ突出部分、Ｖ３ループ配列及び停止コドンHIVSTOP5 GA TCA AGA TCC GCG GAA ATC GAT TAG AAT CCA GAG AGG CCC TGG GCG CGC CTT CGT TAC GAT CGG CAA GAT CTA GT（配列番号４）を含み、相補的プライマーはＸｂａｌ突出部分HIVSTOP3/CTA GAC TAG ATC TTG CCG ATC GTA ACG AAG GCG CGC CCA GGG CCT CTC TGG ATT CTA ATC GAT TTC CGC GGA TCT T（配列番号５）を含んだ。センスオリゴヌクレオチドをリン酸化し、非リン酸化逆プライマーにアニールした後、上記ＢｃｌＩ−ＸｂａＩ消化ベクターに連結した。
アミノ末端垂れはしとして有用なＩＢＩ製のＦＬＡＧペプチドが垂れはしの付いたタンパク質のカルボキシル末端に配置した際になお作用するかを試験した。次の５１−ｍｅｒ配列：FLAG5/GAT CAA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG TGA GCG GCC GCG AAT TCG TC（配列番号６）及びFLAG3/CTA GAG ACG AAT TCG CGG CCG CTC ACT TGT CAT CGT CGT CCT TGT AGT CTT(配列番号６）を含む相補的オリゴヌクレオチドを設計した。これらの配列をキナーゼし、アニールし、抗体結合ドメインに対するベクター末端に連結した。ヒトＣκ配列を上記のようにキメラＬ６ＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得た。Ｃκを単離するための前向きプライマーはL6CK5BCL/GGT GCT CTG ATC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC (配列番号８）であり、逆向きプラマーはL6CK3XBA/CCT CCT CAT TCT AGA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT (配列番号９）であった。
【００４４】
ＣＤ３とＬ６結合ドメインの間に組換え体二特異的単鎖カセットを作るために用いられるらせんペプチドリンカーをＧＡＴＣ付着端突出部分を有する７８−ｍｅｒ相補的オリゴヌクレオチドにコードした。センスオリゴヌクレオチドは、Fvlink1/GAT CAA TCC AAC TCT GAA GAA GCA AAG AAA GAG GAG GCC AAA AAG GAG GAA GCC AAG AAT CTA ACA GCC TCG AGA GC (配列番号１０）であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドはFvlink2/GAT CGC TCT CGA GGC TGT TAG ATT TCT TGG CTT CCT CCT TTT TGG CCT CCT CTT TCT TTG CTT CTT CAG AGT TGG ATT(配列番号１１）である。コードされたペプチドは親水性であり、分子の溶解性を高める荷電したアミノ酸(DQSNSEEAKKEEAKKEEAKKSNSLESL)(配列番号１２）に富んでいる。配列モチーフ (EEAKK)n は、荷電したアミノ酸に富んでいるために特に親水性である。
ＰＣＲ反応（１００μl の全反応量中）は、２０μモル各ｄＮＴＰ、５０−１００ピコモルプライマー、１−１０ng鋳型及びＴａｑポリメラーゼ (Stratagene又はBoehringer-Mannheim)を含むＴａｑポリメラーゼバッファー(Stratagene, Torrey Pines, CA 又はBoehringer-Mannheim)中で行った。反応は、パーキン−エルマーセタスターミナルサイクラーを用いて、典型的には９４℃で１分、５５℃で１分及び７２℃で１分の工程からなる３０サイクルプログラムで行った。連結産物をＭＣ１０６１／ｐ３に形質転換し、適切な挿入プラスミドのコロニーをスクリーンした。陽性クローンをＤＮＡ配列決定及びミニ移入により検定した。
【００４５】
Ｖ領域の単離：
キメラＬ６トランスフェクトーマのＲＮＡをＮＰ−４０急速溶菌法を用いて単離し、重鎖及び軽鎖双方の全長ＤＮＡをＬ６及びヒト定常部として発表されている配列と同じプライマーを用いて増幅した(Hieter, P.S., Maz, E.E., Seidman, J.G., Maizel, J.V. Jr., Leder, P.(1980) Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Cell 22:197-207; Liu 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3438-3442) が、制限部位をクローン化のために結合した。これらの全長ｃＤＮＡを鋳型として第２ＰＣＲ反応に用いて可変部をサブクローン化した。１実施例においては、可変部のサブフラグメントを、特異的プライマーよりむしろランダム六量体を用いて作ったｃＤＮＡからＰＣＲによりクローン化した。
【００４６】
Ｇ１９−４細胞由来ＲＮＡをＮＰ−４０急速溶菌法を用いて抽出した。抗ＣＤ３ハイブリドーマＧ１９−４のＶL 及びＶH 配列を確立されたＰＣＲ法を用いて増幅した(Orlandi, R., Gussow, D.H., Jones, P.T., Winter, G.(1989) Cloning immunoglobulin variable regions for expression by the Polymerase Chain Reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. 86:3833-3837)。ＡＭＶ逆転写酵素(Life Sciences) 及び重鎖又は軽鎖の定常部に相補的なプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。第１鎖ｃＤＮＡ産物を末端トランスフェラーゼ(Stratagene, Torrey Pines, California)を用いてポリＧにつないだ。次いで、１００ピコモルの各プライマー及び第１鎖合成からの１−２μl の精製したＧ末端のｃＤＮＡ遺伝子の完全なｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＡＮＣＴＡＩＬ前向きプライマーはナンセンスＤＮＡ配列及びアンカー配列に相補的なポリＣ配列を含み、ＡＮＣ−ＥＲ前向きプライマーはＥｃｏＲＩ部位及びアンカー部位の上流のナンセンス配列を含み、ＭＨγＣ及びＭＣＫ−３逆向きプライマーは各々重鎖及び軽鎖の定常部に相補的な第１鎖プライマー内の配列を含んだ。プライマー配列は次の通りであった。
ANCTAIL: 5′-GCATGTGCAAGTCCGATGAGTCCCCCCCCCCCCCC-3′      配列番号１３、
ANC-ER:  5′-ACGTCGAGAATTCGCATGTGCAAGTCCGATGAGTCC -3′    配列番号１４、
MHγC:   5′-A(TC)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC-3′  配列番号１５、
MCK-1:   5′-CTTCCACTTGACATTGATGTCTTTG-3′                配列番号１６、
MCK-3:   5′-CAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3 ′                  配列番号１７
【００４７】
免疫染色及びファクス分析：
Jurkat細胞、抹消血リンパ球及び／又はＬ６陽性腫瘍細胞（Ｈ２９８１又はＨ３６３９）を間接免疫染色により解析した。Ｈ２９８１細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ(GIBCO-BRL) 中でインキュベートしてフラスコから剥がした。細胞を種々の濃度の単鎖抗体又は未変性親抗体と結合バッファー(GIBCO-BRL) 中４℃で４０分間インキュベートした。第１段階後細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合第２段階試薬と４℃で更に３０−４０分間インキュベートした。第２段階抗体は、次のものの１種とした：マウスｍＡｂの場合ヤギ抗マウスＩｇ、単一Ｉｇ融合物の場合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Tago, Inc., Burlingame, CA)、ＨＩＶペプチド融合物の場合ｇｐ１１０のＶ３ループに特定されたＦＩＴＣ−１１0.３及び全種類のＬ６含有構築物の場合Ｌ６抗体に対するＦＩＴＣ−αイディオタイプ（１Ｂ）。４０対数アンプリファイアを備えたファクスＩＶセルソーター(Becton Dickenson and Co., Mountain View, CA) で蛍光を分析した。
２種の抗体を全量１０μg/mlの抗体まで種々の割合で共に混合した後に細胞を加えることにより、競合アッセイを行った。２種の抗体のうち１種をＦＩＴＣ、通常はキメラ又はマウスＬ６又は未変性Ｇ１９−４で標識した。阻害アッセイの場合には、第２ＦＩＴＣ結合抗体を加える３０分前に、第１抗体を加えた。
【００４８】
融合タンパク質の細胞培養、移入及び精製：
前記発現プラスミドをＣＯＳ細胞に移入した(Linsley, P.S., Brady, W., Grosmaire, L., Aruffo, A., Damle, N.K., Ledbetter, J.A.(1991) Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J. Exp Med. 173:721-730; Aruffo and Seed, 1987a)。プラスミドＤＮＡを全量１２ml／１５０mmプレート中１μg/mlで移入培養液に加えた。移入したＣＯＳ細胞の３採取物からの使用済み無血清培養液をプールし、Ｉｇ、ＨＩＶ又はＳＴＯＰ分子垂れはしを含む融合タンパク質を精製するために使用した。細胞デブリを低速遠心により除去し、上清を0.２μm フィルターでときどきろ過した後精製した。Ｉｇ融合移入物の培養液を0.０５M クエン酸ナトリウム、ｐＨ8.０(Linsley等, 1991a)で平衡化した固定化プロテインＡ (Repligen Corp., Cambridge, MA)のカラムに加えた。５００mlの上清に対して１mlの充填床容量プロテインＡを用いた。培養液を２回用いた後、カラムを１００mMリン酸ナトリウム、ｐＨ8.０で洗浄し、結合タンパク質を0.０５M クエン酸ナトリウム、ｐＨ３で溶離した。画分を１／５容量１M トリスｐＨ8.０を含む試験管に集めた。Ａ230 吸収物質のピークを含む画分をプールし、使用前にＰＢＳで透析した。ローリー法に基づくバイオラドタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を求めた。
【００４９】
他の分子垂れはしを含む融合タンパク質の場合、ファーマシア社の説明書に従いＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを用いて適当な抗体（抗Ｌ６イディオタイプｍＡｂ１３Ｂ又はｇｐ１１０のＶ３ループに特定された抗ＨＩＶｍＡｂ１１0.３）を固定化して、アフィニティーカラムを作った。親和性基質は約５mgのｍＡｂ／ml床容量を含み、典型的なカラムサイズ１×５cm（４ml）とした。試料をｐＨ７に調整し、予め0.１M クエン酸、ｐＨ2.２で洗浄し、ＰＢＳ、ｐＨ7.２中で平衡化してある適切なイムノアフィニティーカラムに加えた。カラムをＰＢＳで十分洗浄し、結合物質を0.１M クエン酸塩ｐＨ3.０で溶離し、次いで直ちにトリスで中和した。精製した抗体誘導体を最後にＰＢＳに透析し、滅菌ろ過した。
【００５０】
細胞接着アッセイ：
１０mMＥＤＴＡの存在下に実質的に(Linsley, P.S., Clark, E.A., Ledbetter, J.A. (1990) T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031-5035)に記載されているように接着アッセイを行った。Jurkat細胞をまず51Ｃｒで標識し、抗体刺激とインキュベートし、洗浄し、Ｈ２９８１腫瘍細胞とインキュベートし、顕微鏡的に試験した。Ｈ２９８１に対する非特異的結合を防止するために、Jurkat及びＨ２９８１単層を無関係な抗体とインキュベートしてＦｃレセプターを飽和した後、ＣＤ３Ｉｇ（本明細書ではＣＤ３ＦｖＩｇとも呼ぶ）、Ｌ６Ｉｇ（本明細書ではＬ６ＦｖＩｇとも呼ぶ）又はＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ（本明細書ではＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇとも呼ぶ）抗体誘導体を加えた。接着反応が完了した後、単層を氷冷ＲＰＭＩ培養液で５回洗浄し、0.５M ＮａＯＨを加えて可溶化し、γカウンターで放射能を測定した。全結合放射能(cpm) を標識細胞の比活性(cpm／細胞）で割って、結合した細胞数を算出した（図１３）。
【００５１】
図１３において、Ｈ２９８１腫瘍細胞の単層を１０5 細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種し、0.１％パラホルムアルデヒドに２３℃で２０分間固定し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで阻止し、単独で又は指定した抗体と３７℃で１時間予備インキュベートした。抗ＣＤ３（Ｇ１９−４）及び抗Ｌ６ｍＡｂの異種結合体を陽性対照として用いた。指示した場合を除いてすべての抗体を２０μg で用いた。Jurkat細胞を51Ｃｒで標識し、１０mMＥＤＴＡ中で予備インキュベートし、腫瘍細胞及び抗体に加えた。プレートを１０００rpm で２分間攪拌することにより接着を開始した。反応物を３７℃で４５分間インキュベートし、氷冷ＲＰＭＩで５回洗浄し、0.５N ＮａＯＨに溶解した。遊離した数をγ計数により求めた。データは結合した細胞数を示した（×１０3)。３回の測定平均と標準偏差（誤差のすじ）が示されている。
【００５２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法：
４％スタッカーを用いて直線勾配６−１５％を生じるアクリルアミドゲルを２２５ボルトで３時間又は８mAmpで一晩行った。ウェスタンセミドライ移動装置(Ellard Instruments, Seattle, WA) を用いてニトロセルロース膜にゲルを１３０mAmpで１時間ブロットして免疫反応で検出した。ブロットを１％無脂肪乳、ＰＢＳ中0.０５％ＮＰ−４０ (BLOTTO、即ち、阻止バッファー) で１−２時間阻止した。第１抗体をアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ (Boehringer-Mannheim)とＢＬＯＴＴＯ中１：１５００の希釈度で又は非Ｉｇ融合物、即ち、Ｉｇ垂れはしのないＳｆV の検出用の適切な希釈度の非結合マウス又はキメラ抗体又は抗イディオタイプ抗体とインキュベートした。いずれの場合にもブロットをＢＬＯＴＴＯで３回洗浄し、第２工程を必要とする場合にはアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス又は抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。ブロットをウェスタンブルー(Promega, Madison, WI)で展開し、反応を蒸留水で停止した。
【００５３】
抗ｐ−ｔｙｒとの免疫沈降及びウェスタンブロット法：
JurkatＴ細胞を刺激しない（０）か又は指定した濃度の未変性Ｇ１９−４Ｍａｂ(Ledbetter, J.A., Norris, N.A., Grossmann, A., Grosmaire, L.S., June, C.H., Ucklin, F.M., Cosand, W.L., Rabinovitch P.S.(1989) Enhancd transmembrane signalling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggest molecular interactions between receptors on the T cell surface. Mol. Immunol. 26:137-145)又はＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇで刺激し、ホスファターゼ及びプロテアーゼインヒビター（１mMオルトバナジン酸ナトリウム、１mMＰＭＳＦ、２mMＥＧＴＡ、0.５％アプロチニン及び１０μg/mlロイペプチン）を含む修飾ＲＩＰＡバッファー(Kanner, S.B., Reynolds, A.B., Parsons, J.T.(1989) Immunoaffinity purification of tyrosine-phosphorylated cellular proteins. J. Immunol. Methods 120:115-124) に溶解した。細胞溶解物を透明にし（１４０００rpm で１０分）、ウサギ抗ｐ−ｔｙｒあるいはＰＬＣγ１抗血清で免疫沈降させた。免疫複合体をプロテインＡ−セファロースビーズ(Pharmacia, Piscataway, NJ) で回収し、洗浄した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）で分離し、ＰＶＤＦ Immobilon(Millipore, Bedford, MA)に４℃で２時間移した。イムノブロットを阻止した後、阻止バッファー中0.５μg/mlのアフィニティー精製ウサギ抗ｐ−ｔｙｒを加えた。１μCi/ml の高比活性 125Ｉ標識プロテインＡ(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) 及びオートラジオグラフィーを用いて検出した。
【００５４】
増殖アッセイ：
抹消血リンパ球をリンパ球分離培養液(Organon Teknika,Durham, NC)で希釈及び遠心して単離した。リンパ球を無血清ＲＰＭＩ１６４０で数回洗浄し、細胞濃度を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで１０6 細胞／mlに調整した。細胞を９６ウェル、平底プレートで培養した（0.２ml容量中５×１０4 細胞／ウェル）。３日培養の最後の６−８時間に１μCi/ml の[3H]チミジン取込みによ、３回の試料について増殖を測定した。ＰＢＬを１μg/mlＰＨＡ(Wellcome, Charlotte, NC) と培養し、ＰＨＡのない培養液で１日静止することにより、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞を調製した。
Ｈ２９８１腫瘍細胞を１0,０００ラドで照射した後、増殖アッセイに使用した。細胞を、融合タンパク質に前結合し洗浄した後ＰＢＬとインキュベートする（『前結合』試料）かあるいは３日培養で溶液に融合タンパク質と含めた（『溶液』試料）。前結合試料の洗浄は非結合タンパク質を除去するので、腫瘍細胞に結合したタンパク質のみがアッセイでＰＢＬの刺激を与える。ＰＢＬの力価が照射細胞に対して次のように測定された：（２：１）、５：１、１２５：１、（６２５：１）、ここで最初の数は腫瘍細胞の減少数と比べて存在したＰＢＬ（５×１０４細胞／ウェル）の相対数を意味する。
【００５５】
細胞毒性アッセイ：
Ｈ２９８１腫瘍細胞を[51Cr]と２時間インキュベートし後、融合タンパク質（0.１μg/ml〜１０μg/ml）及びＰＢＬ（各種エフェクター：標的比１０：１〜１００：１で）とインキュベートした。細胞を全量0.２ml中１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で５時間培養した後、計数した。γカウンターでクロミウム放出を測定して腫瘍細胞を標的とした細胞毒性を測定した。
【００５６】
ＣＯＳ細胞は組換え体二特異的単鎖カセットＤＮＡからの抗体を発現することができる：  急速検出、精製及び確認を容易にする抗体分子の一過性哺乳動物発現系を開発することに着手した。種々の特異性及びドメインの交換を有する分子に適応させて作成、試験及び異種単鎖二特異的抗体との間の比較を簡易化するのに、系が十分有用であることは重要なことであった。表面レセプターの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＩｇＧ１の重鎖との間の融合タンパク質を作ることにより可溶性細胞表面レセプターを発現するＣＯＳ細胞一過性発現系を従来の研究者らは満足して用いている(Aruffo and Seed, 1987b; Linsley等, 1991b)。
本系は、分子を分泌し且つ培養上清から活性形態として容易に回収することができることから、細菌発現系に対して魅力のある代替品として選ばれた。最初の実験は、ＣＯＳ細胞一過性発現系がゲノム配列よりむしろｃＤＮＡを用いてそのままの機能性ＩｇＧ分子を発現及び分泌することができるかを調べた。抗腫瘍抗原Ｌ６特異性をコードする全長κ及びγｃＤＮＡカセットをｐＣＤＭ８に連結し、挿入ベクターをＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞に共移入した。培養上清がＬ６陽性腫瘍細胞に対して結合活性をもつ１００−５００ ng/mlのタンパク質レベルを含むことを見出し、ＣＯＳ細胞が組換え体二特異的単鎖カセットＤＮＡから未変性抗体を構築し分泌することができることを示した。
【００５７】
哺乳動物発現ベクターの適応：
そのような分子のＣＯＳ細胞発現能が証明されると、個々のタンパク質ドメインをコードする相互交換可能なカセットを用いた単鎖抗体分子を発現する発現ベクターｐＣＤＭ８及びｐｉＬＮＸＡｎを修飾した。ベクターｐＣＤＭ８及びｐｉＬＮＸは、調節領域の下流に位置するポリリンカー／スタッファー領域に挿入された遺伝子の発現を達成するために、サイトメガロウイルスあるいはＡＭＶプロモーター及びエンハンサーを用いる。ポリリンカー内の可変部挿入部位に隣接する２つの短いｃＤＮＡカセットを含むように、この領域を作り変えた。図１は、ベクターの修飾を図で示したものであり、ベクターの修飾及び発現した単鎖分子の可変部の配置の模式図である。Ｌ６κ軽鎖可変部からのリーダーペプチドを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａＩＩ断片をポリリンカーの５′端に挿入してこれに融合した分子の分泌を達成した。ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするＢｃＩＩ−ＸｂａＩ、即ち、分子垂れしをポリリンカーの３′端のフレーム内に融合して種々の特異性を有する分子の検出及び精製を容易にする。重鎖及び軽鎖の可変部をコードする単鎖抗体カセットＤＮＡを短いペプチドリンカーによって相互に結合し、これらの２つの短いフランキングカセットの間に単一のオープンリーディングフレームを作るようにＳａＩＩ−ＢｃＩＩ断片（他の適合性末端もときどき用いた）として挿入した。これにより、既存の哺乳動物発現ベクターを適応して任意の特異性を有する単鎖抗体分子（ＳＣＡ）をコードするｃＤＮＡカセットの有効な発現が得られた。本系は、異種分子垂れはし、リンカー及び結合特異性をコードするカセットが可溶性機能分子の発現における相対的有効性に匹敵するように急速発現、精製、スクリーニング及び融合タンパク質の変更が可能である。
【００５８】
単鎖一特異的Ｌ６ＦV −Ｉｇ、ＣＤ３ＦV 及び二特異的ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ抗体誘導体の構築及び発現：
２つの異なる結合特異性をモデルとして用いて適応した単鎖抗体発現系を試験した。Ｌ６腫瘍抗原及びＣＤ３Ｔ細胞表面レセプターに特定された抗体の重鎖及び軽鎖の可変部を材料及び方法で記載したように単離した。
抗Ｌ６及びＧ１９−４の可変部をオーバーラップ拡張ＰＣＲを用いて単一のコーディング領域に融合してＶL のカルボキシル末端とＶH のアミノ末端の間に(Gly4Ser)3リンカーを作った。
図２は、Ｇ１９−４の軽鎖及び重鎖可変部を(Gly4Ser)3と融合して作った単のオープンリーディングフレームを示すものである。
Ｌ６軽鎖可変部のリーダーペプチド（点描領域）、ＣＤ３−Ｌ６抗原結合ドメイン（陰のない領域）及びヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（陰のある領域）をコードするｃＤＮＡ構築物を材料及び方法で記載したように構築した（図２）。
【００５９】
図２において、スタッファーフラグメントを除き且つ単鎖抗体分子の発現のためのアダプター配列に置き換えることにより、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＭ８を修飾した。発現分子の分泌を得るために、抗Ｌ６の軽鎖可変部のリーダーペプチドをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を挿入した。融合構築物の検出、精製及び確認を容易にするために、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをＢｃｌＩ−ＸｂａＩ部分として下流に含めた。ＨＩＶ由来のＶ３ループの一部をコードする短い分子垂れはし配列もＣＤ３構築物に用いた。リーダー配列と垂れはしの間に、ＶL とＶH との間の融合カセットを挿入し、２つのドメインを(Gly4Ser)3アミ酸リンカーで分けた。
第１カセットとＦｃドメインとの間のＢｃｌＩ部位に第２ＶL −ＶH カセットを挿入することにより、二特異的分子を構築することができた。立体障害を防止し溶解性を改良するために、２７アミノ酸らせんペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドで２つの結合特異性を相互に離した。
表示した配列は各ドメイン間の連結を示し、構築で導入されたアミノ酸は太文字体で示されている。
【００６０】
可変部融合カセットを修飾発現ベクターに挿入して図２に示した遺伝子融合を作り、ＣＯＳ細胞に移入した。無血清使用済培養液を集め、タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。還元又は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたタンパク質のウェスタンブロットをアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧで図３に示したようにプローブした。パネルＡ及びＢは、Ｌ６Ｆｖ−Ｉｇ及びＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ融合タンパク質が還元及び非還元両条件下でＭr ５5,０００を有する単一種として移動したことを示し、このおよそのサイズはこれらの単鎖抗体誘導体が予想される。同様に、ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的分子がこれらの両条件下でＭr 〜９4,０００を有する単一種として移動した。比較すると、ヒトヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の野生型配列に融合したマウス可変部からなるキメラＬ６ｍＡｂ又はＬ６野生型二量体(WTD) は、還元及び変性の程度により著しい移動度差を示し、これらの分子の重鎖定常部がジスルフィド結合で結合して二量体を形成したことを示した。時折、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロットがＭr ＞１０0,０００で移動する一特異的分子又はＭr ＞２０0,０００で移動する二特異的分子の場合に極めてわずかなバンドを示した。
【００６１】
抗Ｌ６軽鎖シグナルペプチド、抗体結合特異性をコードする可変部融合及びヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む単一のオープンリーディングフレームを作るように、ＶL −ＶH 融合カセットを適応したベクターに挿入した。短いらせんペプチドリンカーを介したＣＤ３及びＬ６融合カセットを融合することにより、ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合カセットを作り、一特異的構築物の場合のように挿入した。発現系の最初の試験に使用した分子垂れはしは、鎖内ジスルフィド結合を減じるか又は排除するためにヒンジジスルフィドをセリンに変えたヒトＦｃの変異誘導体とした。これらの単鎖構築物をＣＯＳ細胞に個別に移入し、融合タンパク質を固定化プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーで培養上清から精製した。
精製タンパク質の収量は、典型的には、Ｌ６Ｉｇ融合タンパク質の場合約２mg／リットル、ＣＤ３Ｉｇの場合約１０mg／リットル及びＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的分子の場合約0.５mg／リットルであった。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧでプローブしたタンパク質のウェスタンブロットを図３に示す。Ｍr ５5,０００で移動するＣＤ３Ｉｇ及びＬ６Ｉｇレーンに単一種が見られ、およそのサイズがこれらの単鎖抗体誘導体として予想されるが、陰性対照レーンには見られない（図３）。ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的分子は、Ｍr 約９5,０００−９8,０００で移動し、より高い分子量バンドがＭr ＞２０0,０００に見られる（図３）。
【００６２】
Ｌ６Ｉｇ、ＣＤ３Ｉｇ及びＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ融合タンパク質の結合活性：
本発明の単鎖抗体誘導体の機能活性を調べ且つこの分子が抗原特異結合することができることを証明するために、まずＦｃドメイン融合タンパク質の細胞発現標的抗原に対する結合を試験した。ヒト腫瘍細胞系Ｈ２９８１は、高レベルのＬ６標的抗原を発現するが、ＣＤ３又はＢＲ９６を発現せず、ヒトJurkatセルラインはＣＤ３を発現するが、Ｌ６又はＢＲ９６を発現しない。第２段階試薬としてＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇを用いて蛍光活性化セルソーター分析により、結合を検出した。図３に示されるように、融合タンパク質は未変性親抗体（即ち、未変性抗Ｌ６及びＧ１９−４抗体）と同様の細胞発現標的抗原に特異的に結合するが、検出可能レベルの抗原のない細胞には結合しない。ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的融合タンパク質は、Jurkat及びＨ２９８１細胞の双方に結合し、これらの分子が１種以上の特異性を有することを間接的に示した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ又はＬ６結合特異性に特定されたＦＩＴＣ結合抗イディオタイプ抗体を用いて検出が得られるかでも同様の結果が見られた。
【００６３】
１０μg/mlの抗体誘導体をＨ２９８１腫瘍細胞（Ｌ６陽性）、Jurkat細胞（ＣＤ３陽性）又はＨ３３９６腫瘍細胞（ＢＲ９６陽性）とインキュベートした（図４）。細胞を洗浄し、第２段階試薬としてＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。次いで、合計１0,０００個の染色細胞をファクスで分析した（図４）。図３は、Ｌ６Ｉｇ、ＣＤ３Ｉｇ及びＣＤ３−Ｌ６Ｉｇが細胞発現標的抗原に結合することを示している。
融合タンパク質の生物学的特性を調べるために、個々の分子の予想又は所望の特性に基づいて種々の機能アッセイを用いた。従って、各単鎖分子の結果が別々に存在し、Ｌ６Ｉｇ単鎖抗体誘導体から始める。
【００６４】
Ｌ６融合タンパク質の結合活性に関する種々の分子垂れはし配列の影響：
各種分子垂れはし配列を材料及び方法で記載したように構築し、Ｌ６結合ドメインに融合し、これらの領域を用いてプロテインＡに対する結合標的又はそれらを標的とした特異抗体として発現融合構築物を検出及び精製することができるかを求めた。Ｌ６結合ドメインに直接融合した場合、Ｃκ、ＨＩＶペプチド及びＦＬＡＧペプチドはすべて信頼できる分子垂れはしとして機能しなかった。これら３種のペプチドはすべて、認識可能なＬ６を発現する移入細胞をもたらさなかった。検出が分子垂れはしによらずＬ６抗イディオタイプ抗体を利用する場合でさえ、Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する結合アッセイにおいて機能性融合タンパク質を検出できなかった。
【００６５】
Ｌ６誘導体によるエフェクター機能に関する種々のＦｃドメインの影響：
分子垂れはしのないＬ６結合ドメインの単純ｓＦｖ（ｓＦｖ）及び異種Ｆｃドメイン変異体に結合した各種−Ｉｇ融合物を含む他のＬ６誘導体を構築した。図５及び図６に示されるように、ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインに導入された変異に基づく呼称を各Ｆｃ構築物に示した。野生型二量体 (WTD)は、すべてのＦｃドメイン配列に対して野生型であり、この領域内のアミノ酸残基に対して未変性抗体と同一である。単量体構築物は配列置換、即ち、システイン残基を含み、ヒンジジスルフィドをセリンに変異する (HS1)。単量体１（mut1としても知られる)(HS2)は、ＩｇＧ１エフェクター機能を仲介するに当たり重要な領域であるＣＨ２ドメイン内の残基２３８においてプロリンをセリンに置き換わることを含む。単量体(HS3) は、このＣＨ２領域内の数個の残基（２３４−２３８）に対して変異する。二量体ｍｕｔ１(DM1) はＦｃドメインのヒンジ領域に野生型配列を含むが、残基２３４−２３８をコードするＣＨ２配列の変異体でもある。
【００６６】
Ｌ６のＳｆｖは、Ｌ６ＶL −ＶH 融合カセットの後に他の分子垂れはし配列よりむしろ停止コドンを含んでいる。これらの分子の各々を構築し、ＣＯＳ細胞に移入し、プロテインＡセファロースあるいは固定化Ｌ６抗イディオタイプ抗体カラムを用いて精製タンパク質を発現した。飽和及び阻害結合分析において、融合タンパク質を未変性キメラＬ６抗体及びＦａｂ′誘導体と比較した（図７−８）。Ｌ６Ｆｃ変異体は未変性抗体と極めて類似した飽和曲線を生じる（図７）が、Ｓｆｖ融合タンパク質は十分に結合しなかった（図６）。増加量の試験抗体を腫瘍細胞とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合キメラＬ６を加えることにより阻害試験を行った。再度、すべての−Ｉｇ融合物及びキメラ抗体に対して同様の曲線が見られ（図８）、Ｓｆｖ及びＦａｂ′は未変性抗体の結合を阻害する能力が減少した（図７）。未変性抗体の結合と拮抗又は阻害しないにもかかわらず、Ｓｆｖ融合タンパク質はこの実験において化学的に調製されたＬ６Ｆａｂ分子よりわずかに良好であった。
【００６７】
ヒトＩｇＧ１に関与するエフェクター機能を仲介するこれらの分子の相対的能力を、抗体による細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は補体による細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイにより測定し、特異的溶解を抗体濃度の関数としてプロットした。ヒンジ領域に欠失のある変異体はすべてＡＤＣＣ仲介能に影響しなかったが、ＣＨ２ドメイン変異体はいずれもこの過程を仲介しなかった。驚くべきことに、キメラＬ６はＣＤＣをかなり良好に仲介するが、Ｌ６誘導体はいずれも腫瘍標的の補体媒介性溶解を刺激することができたことを発見した。
ヒト腫瘍抗原Ｌ６に特定されたマウス抗体の可変部をＣＯＳ細胞で発現したヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの各種誘導体に融合し、融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製した（図１７−２０）。
構築した各Ｆｃドメインが示され、配列置換は下線を引いたアミノ酸で示される。各構築物の精製タンパク質は、飽和及び阻害アッセイにおいてキメラＬ６に匹敵した。更に、Ｈ２９８１腫瘍細胞を５１Ｃｒで２時間標識し、洗浄し、これに１０倍連続希釈の抗体を含むＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ及びヒトＰＢＬ（ＡＤＣＣ）あるいはウサギ補体（ＣＤＣ）に加えることにより、これらの分子のＡＤＣＣ及びＣＤＣのような正常なＩｇＧ１エフェクター機能を仲介する能力を測定した。検定物を4.５時間インキュベートし、攪拌し、遊離した数をγカウンターで測定した。数値は、３回の培養の平均を示した（ＳＥＭ＜１０％）。
【００６８】
ＣＤ３単鎖抗体は未変性抗体と量的に異なる他は質的に同様な生物活性を示す：
−Ｉｇ融合物、−ＨＩＶペプチド融合タンパク質、ＶL −ＶH ｓＦｖ（垂れはしなし）及びＣＤ３−Ｌ６Ｆｖ−Ｉｇ二特異的分子を含む各種ＣＤ３融合タンパク質を構築した。
ＨＩＶペプチドは、ＣＤ３に融合した場合信頼できる分子垂れはしとして作用した。３単鎖融合タンパク質の検出及び精製を可能にした。垂れはしを付けた分子を固定化プロテインＡ（−Ｉｇ融合物）又は１１0.３抗体（ＨＩＶ融合物）を用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。単純Ｓｆｖはろ過した上清溶液として用い、Ｇ１９−４抗体のJurkat細胞に対する結合を阻害する上清の能力を測定することにより近似の濃縮物を評価した。これらの変質した分子のＣＤ３Ｔ細胞レセプター複合体に対する結合によって生じた細胞応答を調べた。各分子をｉｎｄｏ−１の入った末梢血リンパ球又はＴ細胞に結合し、細胞内カルシウムの移動をフローサイトメトリーによりモニターした。図９−１２に示されるように、未変性Ｇ１９−４抗体の等価濃縮物と比べるとＩｇ及びＨＩＶ融合タンパク質の双方が膜貫通シグナル活性を高めた。単純Ｓｆｖはカルシウムシグナルを生じるが、未変性抗体に見られるように強くも長くもなかった。
【００６９】
一及び二特異的誘導体の連結配列を含む抗ＣＤ３可変部の配列を図２１に示す。Ｉｇ融合タンパク質は固定化プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製し、Ｓｆｖはろ過上清として用いた。既知濃度の親Ｇ１９−４ＭａｂのJurkat細胞に対する結合を遮断する移入上清の能力を測定することにより、Ｓｆｖの濃度を推定した。ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ分子のシグナル活性を分析するために、ＰＬＣγ１のチロシンリン酸化誘導能を試験した。JurkatＴ細胞をＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ又は未変性Ｇ１９−４Ｍａｂで刺激し、細胞溶解物のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＤＶＦ膜に移し、抗ｐ−ｔｙｒ又は抗ＰＬＣγ１でプローブした。驚くべきことに、我々は、ＣＤ３Ｆｖ−ＩｇがＰＬＣγ１を含む全細胞溶解物中の細胞タンパク質のチロシンリン酸化を強力に誘導し且つ多量のｐｐ３５／３６リンタンパク質がＰＬＣγ１と結合していることを見出した（図２２−２３）。更に、ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ及びＣＤ３Ｓｆｖの双方がＰＢＬ中でカルシウムフラックスを誘導し、未変性Ｇ１９−４Ｍａｂの等価濃度に見られるものより程度が高かった。
【００７０】
図２１においては、抗ＣＤ３ＭａｂＧ１９−４の重鎖及び軽鎖の可変部がＰＣＲでクローン化されている。これらのｃＤＮＡカセットから構築した遺伝子融合のヌクレオチド及びタンパク質配列を(Gly4Ser)3リンカーと共に太文字体で示。ＶL −ＶH 融合カセットのアミノ末端をＳａｌＩ部位でＬ６軽鎖可変部リーダーペプチドに融合し、カルボキシ末端をＢｃｌＩ部位でＦｃドメインのヒンジ領域に直接融合するか又は短い『らせん』ペプチドリンカーに融合して二特異的ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ抗体誘導体を構築した。Ｌ６の可変部は、図１及び２に示されるように、『らせん』リンカーの反対の端にフレーム内で融合した。
図２２−２３においては、示されているように、Jurkat細胞（１０7/試料）５、２０又は８０μg/mlの未変性抗ＣＤ３ＭａｂＧ１９−４又は１、５又は２０μg/mlのＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇで１分又は３分間刺激した。細胞溶解物のタンパク質をウサギ抗ｐ−ｔｙｒ（パネルＡ）又はＰＬＣγ１抗血清（パネルＢ）で免疫沈降させ、プロテインＡセファロースで回収し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、精製したウサギ抗ｐ−ｔｙｒ及び125I標識プロテンＡで検出した。
【００７１】
図９−１２は、ＣＤ３Ｆｖ融合誘導体が異なったレベルの膜貫通シグナル活性を示す線グラフである。図９−１０は、ＣＤ３ＦｖＩｇが末梢血Ｔ細胞内で細胞内カルシウムを移動することを示すものである。フローサイトメトリー及びカルシウム結合染料を用いて、ＣＤ３ＦｖＩｇ（−・−・−）、未変性ＣＤ３Ｍａｂ( ---- )又は非Ｔ細胞結合対照Ｌ６ＦｖＩｇ( .... )による刺激に伴う細胞内遊離カルシウムの濃度をモニターした。各刺激（２μg)をｉｎｄｏ−１の入った充填Ｔ細胞に１分の時点（矢印）１３０nm＝静止細胞で及び％応答細胞のように加えた。
図１１−１２は、ＣＤ３ＦｖＩｇで前処理すると次のクロスリンクしたＣＤ２の刺激に対して末梢血Ｔ細胞の応答を脱感作することを示している。ｉｎｄｏ−１の入った細胞を１μg のＣＤ３ＦｖＩｇ、２μg の未変性ＣＤ３ｍＡｂ又はＬ６ＦｖＩｇ（非Ｔ細胞結合対照）と３７℃で１５分間インキュベートした。ビオチニル化抗ＣＤ２ｍＡｂ（５μg ）を１分の時点で加え、５分の時点でアビジン（２０μg ）によってクロスリンクした。次いで、クロスリンクしたＣＤ２に対する応答を５分間モニターした。データは、([Ｃa2+ ])１３０nm＝静止細胞（ネルＡ）及び％応答細胞（パネルＢ）として示されている。
【００７２】
種々の濃度のＣＤ３抗体誘導体を用いた刺激に応答する末梢血リンパ球及び精製Ｔ細胞の増殖アッセイにおいて、３誘導体すべてがＴ細胞を活性化することを見出した。１μg/mlの抗体処理において測定した増殖応答を表１に示す。増殖応答の同様のパターンが0.２及び５μg/mlにおいても見られた。データは、ＣＤ３誘導体がマウス抗体の未変性Ｇ１９−４（ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇと比較）あるいはＦａｂフラグメント（ｓＦｖと比較）で見られたものと同様のＴ細胞内増殖応答をもたらすことを示している。未変性Ｇ１９−４で見られるものよりＰＢＬの強い増殖を生じるＰＭＡとの相乗作用で作用するＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇを除き、遺伝子操作した分子は精製Ｔ細胞のわずかに強い増殖レベル及びＰＢＬのわずかに弱いレベルを刺激した。
２種の垂れはしを付けたＣＤ３融合タンパク質が未変性活性より強い膜貫通シグナル活性を示したので、これらの分子がＴ細胞増殖にどのように影響するかを求めた。末梢血リンパ球及び精製Ｔ細胞を種々の濃度の抗体誘導体と７２時間インキュベートし、トリチウムを入れたチミジンで６時間標識した後、回収し、計数した。表１に１μg/mlにおける抗体処理の結果を示す。増殖応答の同様のパターンが0.２及び５μg/mlにも見られた。
【００７３】
【表１】
2006241165.tif 000002
【００７４】
細胞を１μＣi/ウェル[3H]チミジンで６時間パルス標識して７２時間培養し後増殖を測定した。Ｔ細胞を２種のプラスチック粘着で単核細胞及びＢ細胞から離し、次いでナイロンウールカラムに通過させることにより精製した。
データは、ここで試験した条件下、ＣＤ３誘導体の結合がマウス抗体のＧ１９−４（Ｉｇ融合）あるいはＦａｂフラグメント（ＨＩＶ及びＳＴＯＰ融合）で見られるのと同様のＴ細胞の増殖応答をもたらすことを示している。遺伝子操作した分子は、精製Ｔ細胞のわずかに強い増殖レベル及びＰＢＬのわずかに弱いレベルを刺激する傾向があったが、ほとんどの場合、それらの差はわずかである。このパターンの唯一の例外は、ＣＤ３ｓＦｖＩｇ及びＣＤ３ＨＩＶ構築物がＰＭＡと相乗作用して生じた未変性Ｇ１９−４に比べて強い増殖応答である。
【００７５】
ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質はJurkat細胞とＨ２９８１腫瘍細胞との間の接着を仲介する。
以前に開発された細胞接着(Linsley等, 1990a)を用いてＣＤ３−Ｌ６二特異的単分子がＣＤ３又はＬ６発現細胞に同時に結合できるかを求めた。まずJurkat細胞を抗ＣＤ３又はＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇとインキュベートした。細胞を洗浄し、Ｌ６ＦｖＩｇあり又はなしで予備インキュベートしたＨ２９８１粘着細胞に加えた。Ｈ２９８１単層（図１３）の顕微鏡試験は、ＣＤ３及びＬ６レセプターがリガンドで遮断されない場合だけを除いて、ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇタンパク質がＥＤＴＡの存在下にJurkat細胞とＨ２９８１腫瘍細胞との間の接着を仲介したことを示した。Jurkat細胞を51Ｃｒで前標識し、次いで融合タンパク質及びＨ２９８１腫瘍細胞とインキュベートした。ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質の存在下に標識していない単層に結合したカウント数は、連結していないＣＤ３及びＬ６抗体に前結合した細胞より非常に多かった。
ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的融合タンパク質は、Ｈ２９８１腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を標的とする（図１４）。Ｈ２９８１腫瘍細胞を51Ｃｒで２時間標識し、標的に対するエフェクター比１０：１及び１００：１で抗体刺激及びＰＢＬとインキュベートした（図１４）。クロミウムの遊離を材料及び方法で記載したように測定し、３回の実験から各抗体誘導体に特異的な溶解を表にした（ＳＥＭ＜１２％)(図１４）。阻害アッセイの場合、ＣＤ３又はＬ６Ｉｇ単一特異性誘導体を適切な種類の細胞とインキュベートした後、ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的分子を加えた（図１４）。いずれも単一特異性分子と予備インキュベートすると細胞毒性の二特異的構築物による刺激を阻害することができなかった（図１４）。
【００７６】
ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質はＨ２９８１腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を標的とする。
次に、これら２つの抗原結合ドメインを単分子に結合することの生物学的結果を求めた。腫瘍細胞とＴ細胞との間の接着を促進する遺伝子操作した二機能性分子がレセプター結合に対する応答の種類又は程度を変えると推論された。
ＩｇＧ媒介性エフェクター機能から背景原因を排除するために、ＣＨ２内のプロリンからセリンへの変異及びヒンジ領域内のいくつかのシステインからセリンへの置換の結果としてこれらの機能を仲介しないＦｃ単量体の変異体に分子の抗原結合部分を結合した。溶解の場合の標的としてＨ２９８１腫瘍細胞を用いて標準細胞毒性アッセイを行った。腫瘍に対する細胞毒性を標的とするために静止又は未変性細胞を活性化することができる場合には、エフェクター細胞として静止ＰＢＬを用いて求めた（図１４）。
【００７７】
ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ分子は、標的に対するエフェクター比１０：１において３０％の特異的溶解を仲介し、１００：１の比では特異的溶解が７１％に上昇する。ＣＤ３ＦｖＩｇ及びＬ６ＦｖＩｇを一緒に混合したもの又は両分子単独の場合の特異的溶解レベルは、Ｅ：Ｔ１０：１で３〜５％及びＥ：Ｔ１００：１で９〜２０％である。破壊レベルをわずかに減少したが、ＣＤ３ＦｖＩｇ及びＬ６ＦｖＩｇ抗体誘導体はＣＤ３−Ｌ６融合タンパク質により仲介された標的細胞毒性を完全に遮断しなかった。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽球も本アッセイにおいてエフェクターとして用いたが、高レベルの背景破壊を示した。
ＣＤ３−Ｌ６Ｉｇ二特異的融合タンパク質は、Ｈ２９８１腫瘍細胞に結合すると高レベルのＴ細胞増殖を刺激する（図１５）。ＰＢＬを単離し、必要とするＴ細胞増殖刺激物質及び照射Ｈ２９８１腫瘍細胞を存在させて培養した。刺激物質を１又は１０μg/mlのいずれかの溶液として加えた。前結合実験の場合、Ｈ２９８１腫瘍細胞に照射し、１０μg/mlの抗体誘導体と氷上で１時間インキュベートし、数回洗浄して非結合抗体を除去し、種々の割合で５×１０4 細胞／ウェルのＰＢＬに加えた。３日培養した後、[3H]チミジンの取込みにより６時間増殖を定した。各処理について４回の培養により数値を求めた（ＳＥＭ＜１５％）。
【００７８】
ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質は試験管内で高レベルのＴ細胞増殖を刺激する。
ＣＤ３Ｔ細胞表面レセプター（ＣＤ３／ＴＣＲ複合体）をＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ融合タンパク質で誘発するとＴ細胞増殖を刺激するかを調べた。照射Ｈ２９８１腫瘍細胞とインキュベートした静止ＰＢＬ及び刺激（融合タンパク質）の溶解したものを用いて、増殖アッセイを行った。
また、刺激タンパク質を照射腫瘍細胞に前結合し、非結合タンパク質を数回洗浄して除去した後、アッセイに含め、ＣＤ３によってＴ細胞の刺激に寄与するものからＬ６抗原に結合できない分子を排除した。Ｈ２９８１腫瘍細胞はＦｃドメインで変異した抗体誘導体にさえ非特異的に結合する傾向があったので、アッセイからこの非特異的背景の原因を排除するために、不適当な抗体を細胞とインキュベートした後に問題の刺激を加えた。図１５は、溶解及び前結合両増殖実験の結果を示すものである。
【００７９】
増殖レベルは１０μg/mlのＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的融合タンパク質の存在下で著しく増大し、有為レベルの増殖が１μg/mlでさえも見られた。Ｌ６ＦｖＩｇを腫瘍細胞に前結合した後に二特異的分子を加えると、被覆腫瘍細胞によって誘導されるこのＴ細胞増殖の刺激が排除された。ＣＤ３ＩＧ融合タンパク質は、腫瘍細胞のあり又はなしに依存しない溶液中に存在すると著しいレベルの増殖を刺激することができた。背景レベルの増殖のみがこれらの条件下で見られるので、これらの分子が腫瘍細胞前結合アッセイの洗浄段階で除去されたことは明らかである。これらの結果は、Ｈ２９８１腫瘍細胞に結合した際に、Ｔ細胞の細胞毒性及び刺激Ｔ細胞増殖を標的とするＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質の能力を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】種々の分子垂れはし又は単純な停止コドンを含む組換え体一特異的単鎖カセットを含むｐＣＤＭ８発現ベクターの図である。
【図２】組換え体二特異的単鎖カセットを含むｐＣＤＭ８発現ベクターの図である。
【図３】単鎖抗Ｌ６、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ３−Ｌ６二特異的融合タンパク質分子のウェスタンブロット写真である。ＣＯＳ細胞移入からの使用済み無血清培養液を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。タンパク質を増量バッファーに再浮遊し、非還元（Ａ）又は還元（Ｂ）条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（５−１６％）電気泳動にかけ、ニトロセルロースにブロットし、アルカリ性ホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧで検出した。パネルＡ：レーン１＝キメラＬ６ｍＡｂ（0.５μg)；レーン２＝抗Ｌ６ＷＴＤ（0.５μg)；レーン３＝ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的（0.５μg)；レーン４＝Ｌ６ＦｖＩｇ（0.６μg)；及びレーン５＝ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ（0.４μg)。パネルＢ：レーン１＝ＣＤ３Ｆｖ−Ｉｇ（0.４μg)；レーン２＝Ｌ６ＦｖＩｇ（0.６μg)；レーン３＝ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的（0.５μg)；レーン４＝抗Ｌ６ＷＴＤ（0.５μg)；及びレーン５＝キメラＬ６ｍＡｂ（0.５μg)。
【図４】細胞発現標的抗原に結合するＬ６ＦｖＩｇ、ＣＤ３ＦｖＩｇ、ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ及びＢＲ９６を示すファクスプロットである。
【図５】Ｌ６ＦｖがヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの各種異種変異誘導体に融合したことを示す。ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインに導入された各変異体及び配列変化を示す。更に、各構築物のＣＤＣ及びＡＤＣＣ仲介能を示す。
【００８１】
【図６】累進的に低くした濃度（３倍連続希釈）のＨ２９８１腫瘍細胞とインキュベートしたＬ６誘導体又はキメラＬ６の飽和分析の線グラフであり、第２段階試薬としてＬ６に対するＦＩＴＣ結合抗イディオタイプを用いて結合を検出した。これらのデータから飽和結合曲線を作り、蛍光強度を抗体濃度の関数としてプロットした。記号の説明：キメラＬ６（白ダイヤモンド形）、ＷＴＤ（白四角）、ＤＭ１（白三角）、ＨＳ１（＋記号）、ＨＳ２（『Ｘ』記号）及びＨＳ３（白丸）
【図７】ファクス分析の前に連続希釈の各抗体誘導体と３０分間及び１μg/mlのＦＩＴＣ結合Ｌ６と３０分間インキュベートしたＨ２９８１腫瘍細胞の阻害分析の線グラフである。蛍光強度を各分子の抗体濃度の関数としてプロットした。記号の説明：キメラＬ６（白ダイヤモンド形）、ＷＴＤ（白四角）、ＤＭ１（白三角）、ＨＳ１（＋記号）、ＨＳ２（『Ｘ』記号）及びＨＳ３（白丸）。
【図８】Ｈ２９８１腫瘍細胞を51Ｃｒで２時間標識し、洗浄し、１０倍連続希釈の抗体誘導体を含むＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ及びエフェクター細胞としてヒトＰＢＬに１００：１の標的に対するエフェクター比で加えた。分析物を4.５時間インキュベートし、攪拌し、１００μl の遊離数をγカウンターを用いて測定した。次式を用いて破壊％を算出した：破壊％＝〔（平均ｃｐｍ−平均自然遊離）／（平均最大遊離−平均自然遊離）〕×１００。数値は３回の培養の平均を示す（ＳＥＭ＜１０％）。
【図９】ＣＤ３ＦｖＩｇが抹消血Ｔ細胞の細胞内カルシウムを移動し、ＣＤ３ＦｖＩｇとの前処理が次のクロスリンクしたＣＤ２の刺激に対する抹消血Ｔ細胞の応答を脱感作することを示す線グラフである。
【図１０】ＣＤ３ＦｖＩｇが抹消血Ｔ細胞の細胞内カルシウムを移動し、ＣＤ３ＦｖＩｇとの前処理が次のクロスリンクしたＣＤ２の刺激に対する抹消血Ｔ細胞の応答を脱感作することを示す線グラフである。
【００８２】
【図１１】ＣＤ３ＦｖＩｇが抹消血Ｔ細胞の細胞内カルシウムを移動し、ＣＤ３ＦｖＩｇとの前処理が次のクロスリンクしたＣＤ２の刺激に対する抹消血Ｔ細胞の応答を脱感作することを示す線グラフである。
【図１２】ＣＤ３ＦｖＩｇが抹消血Ｔ細胞の細胞内カルシウムを移動し、ＣＤ３ＦｖＩｇとの前処理が次のクロスリンクしたＣＤ２の刺激に対する抹消血Ｔ細胞の応答を脱感作することを示す線グラフである。
【図１３】二特異的分子ＣＤ３−Ｌ６ＩｇがＨ２９８１とJurkat細胞との間の接着を仲介するのでＣＤ３及びＬ６発現細胞に同時に結合することができることを示す棒グラフである。
【図１４】ＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的融合タンパク質がＨ２９８１腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を標的とすることを示す棒グラフである。
【図１５】Ｈ２９８１腫瘍細胞に結合した際にＣＤ３−Ｌ６ＦｖＩｇ二特異的タンパク質が高レベルのＴ細胞増殖を刺激することを示す棒グラフである。
【００８３】
【図１６】融合タンパク質として一特異的抗体可変部の発現のための発現ベクターｐＣＤＭ８をヒトＩｇＧ１のＦｃドメインで修飾することを示す図式である。
【図１７】黒い線で示したリンカー配列及び斜線で示した各機能性ドメインを含むＬ６Ｆｖ−Ｉｇ誘導体構造の図である。
【図１８】キメラＬ６、ＷＴＤ、ＤＭ１、ＨＳ１、ＨＳ２及びＨＳ３のＦｃ構築物及びそれらの配列の比較及びＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の有無を示す。Ｌ６ＦｖはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの各種異種変異誘導体に融合した。ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインに導入された配列変化を下線を引いたアミノ酸で示し、構築物同定を左に示す。
【図１９】51Ｃｒで２時間標識し、洗浄し、１０倍連続希釈の抗体誘導体を含むＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ及びエフェクター細胞としてヒトＰＢＬに１００：１の標的に対するエフェクター比で加えたＨ２９８１腫瘍細胞のＡＤＣＣ特性の線グラフである。分析物を4.５時間インキュベートし、攪拌し、１００μl の上清の遊離数を測定した。破壊％を〔（平均ｃｐｍ−平均自然遊離）／（平均最大遊離−平均自然遊離）〕×１００として算出した。数値は３回の培養の平均を示す（ＳＥＭ＜１０％）。記号の説明：キメラＬ６（白ダイヤモンド形）、ＷＴＤ（白四角）、ＤＭ１（白三角）、ＨＳ１（＋記号）、ＨＳ２（『Ｘ』記号）及びＨＳ３（白丸）。
【図２０】ＰＢＬの代わりに補体を用いた以外は図１９と同様に補体破壊を測定するために行ったアッセイの線グラフである。記号の説明：キメラＬ６（白ダイヤモンド形）、ＷＴＤ（白四角）、ＤＭ１（白三角）、ＨＳ１（＋記号）、ＨＳ２（『Ｘ』記号）及びＨＳ３（白丸）。
【００８４】
【図２１】Ｌ６ＶL リーダー、ＣＤ３ＦV （Ｖ L−Ｖ H）及びＦｖｌｉｎｋらせんリンカーのアミノ酸及び核酸配列である。
【図２２】ＣＤ３ＦｖＩｇが強力なチロシンリン酸化及びＴ細胞内のＰＬＣγ１の活性化を刺激し、ＰＬＣγ１とｐｐ３５／３６との結合を誘導することを示すＰＡＧＥゲルである。
【図２３】ＣＤ３ＦｖＩｇが強力なチロシンリン酸化及びＴ細胞内のＰＬＣγ１の活性化を刺激し、ＰＬＣγ１とｐｐ３５／３６との結合を誘導することを示すＰＡＧＥゲルである。
【図１】
2006241165.tif 000003
【図２】
2006241165.tif 000004
【図３】
2006241165.tif 000005
【図４】
2006241165.tif 000006
【図５】
2006241165.tif 000007
【図６】
2006241165.tif 000008
【図７】
2006241165.tif 000009
【図８】
2006241165.tif 000010
【図９】
2006241165.tif 000011
【図１０】
2006241165.tif 000012
【図１１】
2006241165.tif 000013
【図１２】
2006241165.tif 000014
【図１３】
2006241165.tif 000015
【図１４】
2006241165.tif 000016
【図１５】
2006241165.tif 000017
【図１６】
2006241165.tif 000018
【図１７】
2006241165.tif 000019
【図１８】
2006241165.tif 000020
【図１９】
2006241165.tif 000021
【図２０】
2006241165.tif 000022
【図２１】
2006241165.tif 000023
【図２２】
2006241165.tif 000024
【図２３】
2006241165.tif 000025
【配列表】
2006241165000001.app