(57)【要約】      （修正有）【課題】  半月体形成性腎炎の検出方法及び検出用キットを提供する。【解決手段】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）の分析を、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１に特異的に結合する抗体又は断片を用いる免疫学的手法により実施する半月体形成性腎炎の検出方法、及びプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１に特異的に結合する抗体又は断片を含むことを特徴とする半月体形成性腎炎の検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を分析することを特徴とする、半月体形成性腎炎の検出方法。
【請求項２】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１の分析を、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１に特異的に結合する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法により実施する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、半月体形成性腎炎の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（plasminogen activator inhibitor-1；ＰＡＩ−１）を分析する、半月体形成性腎炎（半月体形成性糸球体腎炎とも称される）の検出方法に関する。本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＩ−１は、血糖値やインスリン、血清脂質、炎症性サイトカインなどにより発現調節を受ける線溶因子であるが、プラスミンの抑制を介して、血栓傾向と組織での細胞外基質の増加、線維化を誘導すると考えられている。ＰＡＩ−１は、急性心筋梗塞症、深部動脈血栓症、糸球体腎炎、アテローマ性動脈硬化症、敗血症、ＤＩＣ（disseminated intravascular coagulation；播種性血管内凝固症候群）等の血液凝固疾患における血管内皮障害を反映し、血液中のＰＡＩ−１の測定はこのような疾患の検出等に有用であることが報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、尿中ＰＡＩ−１量を測定することにより、糖尿病性腎症の進展度を判定することができることが報告されている（特許文献２）。特許文献２には、糖尿病性腎症、慢性腎炎、及びネフローゼ症候群の各患者における尿中ＰＡＩ−１量を測定したところ、糖尿病性腎症においてのみ、尿中ＰＡＩ−１量が有意に高く、尿中ＰＡＩ−１量が糖尿病性腎症の検出に非常に有用な指標となることが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−３３５２４号公報
【特許文献２】特開２００４−６１３４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、ＰＡＩ−１と各種疾患との関連性について、更に検討したところ、これまでＰＡＩ−１との関連性が知られていなかった半月体形成性腎炎においても、ＰＡＩ−１が有用な指標となることを見出し、本発明を完成させた。
なお、前記特許文献１には、糸球体腎炎と血中ＰＡＩ−１との関連性が開示されているが、糸球体腎炎は多くの疾患を包含する概念であり、特許文献１に記載の糸球体腎炎がいずれの腎炎を示しているかは全く不明であり、しかも、特定の糸球体腎炎が血中ＰＡＩ−１と関連性がある旨の記載も一切ない。例えば、糸球体腎炎は、急性糸球体腎炎（通常、数ヶ月で腎不全に陥る）と慢性糸球体腎炎（通常、１０〜２０年かかって腎不全に移行する）とに大別される。半月体形成性糸球体腎炎は、急性糸球体腎炎に分類され、その中でも急性進行性を示す糸球体腎炎であり、後述するとおり、尿中ＰＡＩ−１値が高値を示す。一方、慢性糸球体腎炎の内、例えば、膜性腎症、ＩｇＡ腎症（ベルジュ病）では、尿中ＰＡＩ−１値は高値を示さず、健常者と変わりがない。このように、糸球体腎炎と血中ＰＡＩ−１との関連性が開示されていても、各糸球体腎炎とＰＡＩ−１との関連性を予測することはできない。
【０００６】
従って、本発明の課題は、半月体形成性腎炎の検出方法及び検出用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、ＰＡＩ−１を分析することを特徴とする、半月体形成性腎炎の検出方法により解決することができる。
本発明の検出方法の好ましい態様によれば、ＰＡＩ−１の分析を、ＰＡＩ−１に特異的に結合する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法により実施する。
また、本発明は、ＰＡＩ−１に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、半月体形成性腎炎の検出用キットに関する。
【発明の効果】
【０００８】
これまで、尿細管障害の指標としては尿中β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）が使用されてきた。尿中ＮＡＧは、近位尿細管の現在の細胞障害（膜透過性亢進）を原因として尿中へ逸脱した尿中ＮＡＧを観察していることになるが、これでは軽度の腎障害であるネフローゼ症候群と半月体形成性腎炎のような重度の腎障害とを識別することは不可能であった。また従来、半月体形成性腎炎の診断は腎生検でしか行われなかった。本発明によれば、腎不全への進行が急激で未治療では末期腎不全となることが不可避であった半月体形成性腎炎において、これを早期発見し、免疫抑制薬などの適切な早期治療により、腎不全からの回復が可能である。また、被検試料として尿を使用する本発明の好適態様においては、尿中ＰＡＩ−１測定を行うことにより、腎生検のような侵襲を伴うことなく、簡便かつ迅速に半月体形成性腎炎を推測し積極的に治療に移行することができる。
【０００９】
また、従来の腎疾患の検査では、尿蛋白、尿潜血検査が一般的であるが、蛋白尿及び血尿の有無のみでは腎疾患の存否を判断することができない。また、疾病に特異的でないので、より詳細な検査を必要とする。確定診断には、腎生検は必須であるが、腎生検法にはリスクがあり、安全な腎生検を施行するために、適応条件と禁忌条件を考慮する必要がある。また、得られた組織標本から正確な診断を下すためには質の高い光学顕微鏡、蛍光抗体法、電子顕微鏡標本の作製などが必要であり、これらによる総合的組織診断を行う必要があり、煩雑な過程を含む。最近では、糸球体機能検査として、糸球体濾過値測定が重要となっている。主な測定法としては、クレアチニンクリアランスが用いられているが、正確な蓄尿が必要であり、時間帯による測定値の変動があるので２４時間の蓄尿を必要とする。それ以外にも、外因性物質を用いた腎クリアランス法や放射性物質を用いた方法が実験室レベルでは検討されているが、実用化にはいたってない。これらに比して、本願発明の好適態様である、被検試料として尿を使用する態様では、随時尿でのＰＡＩ−１測定が可能であり、従来技術と比べてはるかに有用性があり、画期的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［１］半月体形成性腎炎の検出方法
本発明の検出方法では、ＰＡＩ−１を分析することにより、半月体形成性腎炎を検出する。
【００１１】
半月体形成性腎炎は、臨床症候分類において、急速進行性腎炎症候群に分類される疾患であり、免疫複合体の沈着あるいは好中球の活性化により、糸球体基底膜の断列が生じ、半月体を形成する。腎不全への進行が急激で、未治療では末期腎不全に到る。発見が早く、免疫抑制薬による適切な早期治療ができれば、腎不全からの回復が可能である。半月体形成性腎炎は、全身性血管炎の一病変として糸球体に血管炎が発症する場合もあるが、腎不全に至って初めて症状が出現する場合もある。
半月体形成性腎炎は、以下の３種類の型、すなわち、糸球体基底膜に対する自己抗体が病因と考えられる１型、糸球体基底膜やメサンギウムに免疫グロブリンや補体の沈着を認める２型、そして、患者血中に高頻度に好中球細胞質抗体を認める３型に分類することができる。
腎生検による従来の判定方法では、糸球体内のボーマン腔に３層以上の細胞層が形成（これを半月体と呼ぶ）され、近傍の係蹄の壊死像が観察された場合に、半月体形成性腎炎であると判定することができる。また、半月体形成性腎炎では、軽度から高度の尿細管上皮の炎症も観察される。
【００１２】
本明細書におけるＰＡＩ−１は、血中の組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のインヒビターであり、分子量約５万Ｄａ（例えば、ヒトでは３７９アミノ酸残基からなる）の一本鎖糖タンパク質である［Progress in Hemostasis and Thrombosis, Coller, B.S., ed. WB Saundears Philadelphia, 87-115 (1989)］。ＰＡＩ−１は種々の形態で存在し、例えば、それ自体フリーの遊離体として、あるいは、組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼとの複合体として存在することができる。例えば、ヒト尿中では、ＰＡＩ−１遊離体として、あるいは、腎臓で合成されて尿中に排泄されるウロキナーゼとの複合体（すなわち、ウロキナーゼとＰＡＩ−１との複合体）として、存在する。
【００１３】
本発明においては、異なる種々の形態のＰＡＩ−１の総和として分析することもできるし、あるいは、その中の特定形態のＰＡＩ−１のみを対象に分析することもできる。例えば、抗ＰＡＩ−１抗体を用いる免疫学的手法によりＰＡＩ−１を分析する場合には、種々の形態のＰＡＩ−１を認識することのできる抗体（例えば、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体）を用いることにより、総ＰＡＩ−１量を分析することができ、一方、特定形態のＰＡＩ−１のみを認識することのできる抗体を用いることにより、特定形態のＰＡＩ−１のみを分析することができる。
【００１４】
本発明の検出方法において、ＰＡＩ−１を分析する方法としては、ＰＡＩ−１量を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＰＡＩ−１の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗ＰＡＩ−１抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。
【００１５】
ＰＡＩ−１分析方法として免疫学的手法を用いる場合には、抗ＰＡＩ−１抗体又はその断片は、公知の方法、例えば、特開２００４−６１３４５号公報に記載の方法に遵って調製することができ、各種免疫学的測定も、例えば、特開２００４−６１３４５号公報に記載の方法に従って実施することができる。
また、酵素学的測定法を用いる場合には、例えば、Chandler WL et al., Clin Chem, 35, 787-93 (1989)に記載の方法に従って、ＰＡＩ−１酵素活性を測定することにより、ＰＡＩ−１の量又は存在の有無を分析することができる。
【００１６】
本発明において、ＰＡＩ−１の分析に用いる被検試料としては、ＰＡＩ−１を含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調製物（例えば、生検標本、特には腎生検標本）等を挙げることができ、尿又は腎生検標本が好ましく、尿が特に好ましい。
【００１７】
被検試料として尿を使用する場合には、例えば、随時尿又は蓄尿などを使用することができる。臨床医学的な立場から、随時尿が好ましい。採取された尿は、直ちに解析に供されることが好ましいが、例えば、４〜−８０℃、好ましくは４〜−２０℃の低温条件下で保存しておくこともできる。保存に際しては、必要に応じて、タンパク質の変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を添加してもよい。また、これらの試料は、必要に応じて濃縮、精製等の前処理を行ってから解析に供してもよいが、濃縮の操作を加えずに未濃縮尿のまま解析に供されることが好ましい。
【００１８】
尿中の分析対象物質の分析においては、患者間の腎機能の差を補正する補正処理を行うことができ、このような補正により、患者の個体差、尿を採取した時間等により生じる差を補正して比較・解析を行うことができる。但し、腎機能の差を補正する指標は、腎不全患者等の腎機能が失われた患者の尿においては無意味であるので、腎機能が保持されている患者から採取された尿において行われることが好ましい。
このような補正に用いられる腎機能の指標としては、例えば、クレアチニン（Ｃｒ）、クレアチニンクリアランス（ＣＣｒ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、尿中ＮＡＧ等が挙げられる。中でも、医薬・臨床検査分野では、一般的にＣＣｒ又はＣｒが好ましく用いられる。具体的には、例えば、尿中ＰＡＩ−１値を尿中Ｃｒ値で除した値を、尿中補正ＰＡＩ−１値とすればよい。
【００１９】
本発明の検出方法では、ＰＡＩ−１の存在の有無、あるいは、ＰＡＩ−１量を測定することにより、半月体形成性腎炎を検出することができる。
例えば、被検試料として腎生検標本を用いる場合には、糸球体内のボーマン腔に３層以上の細胞層が形成（これを半月体と呼ぶ）され、近傍の係蹄の壊死像が観察された場合に、半月体形成性腎炎であると判定することができる。また、半月体形成性腎炎では、軽度から高度の尿細管上皮の炎症も観察される。
半月体形成性腎炎では、例えば、近位尿細管細胞（特には、肥大・突出した尿細管上皮細胞）及び／又は糸球体内細胞にＰＡＩ−１の存在が認められ、ＰＡＩ−１の存在の有無により、半月体形成性腎炎であるか否かを判定することができる。
【００２０】
被検試料として尿を用いる場合、半月体形成性腎炎の疑いのある患者から尿を採取し、尿中のＰＡＩ−１量を測定し、健常者から採取した尿中のＰＡＩ−１量と比較することにより、前記患者が半月体形成性腎炎であるか否かを判定することができる。
より具体的には、健常者のＰＡＩ−１量と比べて、前記患者のＰＡＩ−１量が有意に多い場合に、前記患者は半月体形成性腎炎であると判定することができる。一方、健常者のＰＡＩ−１量と前記患者のＰＡＩ−１量との間に有意な差がない場合、前記患者は半月体形成性腎炎でないと判定することができる。
【００２１】
ここで、健常者のＰＡＩ−１量は、前記患者と同時に測定することもできるし、あるいは、予め健常者群の平均値又は正常濃度範囲として決定しておくこともできる。好ましくは、予め健常者群におけるＰＡＩ−１の平均値及び正常濃度範囲から閾値を設定し、前記患者のＰＡＩ−１量が前記閾値を超えた場合、前記患者は半月体形成性腎炎であると判定することができる。一方、前記患者のＰＡＩ−１量が前記閾値を超えない場合、前記患者は半月体形成性腎炎でないと判定することができる。
【００２２】
［２］半月体形成性腎炎の検出用キット
本発明の検出用キットは、ＰＡＩ−１に特異的に結合する抗体又はその断片を含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＰＡＩ−１への特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
【００２３】
本発明の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態で、抗ＰＡＩ−１抗体又はその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
【００２４】
また、ラテックス凝集免疫測定法の場合には、抗体を担持させる固相担体としては、例えば、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、赤血球、シリカ、スチレン−ブタジエン共重合体、アルミナ、又はセラミックス等の粒子を用いることができる。中でもラテックス粒子が好ましく用いられ、例えば、ポリスチレンラテックス、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とスチレンの共重合体、スチレンとマレイン酸の共重合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体、スチレンとアクリル酸とアルキルアクリレートなどの共重合体、又は酢酸ビニルとアクリル酸の共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては、０．１〜１．０μｍ程度が好ましい。これらの担体粒子に、物理的吸着法又は化学結合法等を利用して抗ＰＡＩ−１抗体を担持させることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
《実施例１：各種疾患患者から採取した尿中におけるＰＡＩ−１量の測定》
本実施例では、半月体形成性腎炎（crescentic glomerulonephritis；ＣｒＧＮ）患者４名、移植腎（renal transplantation；ＲＴ）を実施した患者２名、顕性の糖尿病性腎症（diabetic nephropathy；ＤＮ）患者３６名、ネフローゼ症候群（nephrotic syndrome；ＮＳ）患者１０名、及び健常者１２名から採取した随時尿又は蓄尿を用いて、尿中のＰＡＩ−１量を測定した。
【００２７】
尿中ＰＡＩ−１の測定は、ウサギ抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体感作ラテックス試薬（血中総ＰＡＩ−１測定試薬ＬＰＩＡ・ｔＰＡＩテスト；三菱化学ヤトロン）と全自動免疫血清検査装置（ＬＰＩＡ−２００；三菱化学ヤトロン）を使用した。血中測定用パラメーターのサンプル量を５μＬから４０μＬに増量させて、測定範囲３〜２７０ｎｇ／ｍＬを０．０３〜１５ｎｇ／ｍＬへと変更することにより測定した。
また、尿生化学項目として、アルブミン（Ａｌｂ）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、及びクレアチニン（Ｃｒ）を測定した。
【００２８】
結果を表１に示す。表１に示すＰＡＩ−１値、アルブミン値、及びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ値は、それぞれ、クレアチニン量で補正した値、すなわち、各測定値をクレアチニン測定値で除した値である。なお、表中の記号「Ｕ」（例えば、U-PAI、U-Alb、U-NAG）は、尿中（urinary）の値であることを示す。
【００２９】
《表１》
ＣｒＧＮ    ＲＴ       ＤＮ        ＮＳ      健常者    
データ数（Ｎ）          ２２      １３       ３６        １０       １２
log(U-PAI, ng/gCr)    2.4±0.4  2.6±0.6   2.5±0.8    1.7±0.5    1.2±0.3
log(U-Alb, mg/gCr)    3.2±0.2  2.0±0.6   3.2±0.4    3.3±0.4    0.7±0.4
U-NAG(U/gCr)         14.5±0.2  9.2±2.2  23.0±10.1  24.4±19.1   6.5±2.9  
【００３０】
表１に示すように、ｌｏｇ（尿中ＰＡＩ）値に関して、半月体形成性腎炎（ＣｒＧＮ）患者群、移植腎（ＲＴ）患者群、及び糖尿病性腎症（ＤＮ）患者群で、健常者に比べて有意に高値であった（Ｐ＜０．００１）。ｌｏｇ（尿中Ａｌｂ）値に関して、半月体形成性腎炎患者群、糖尿病性腎症患者群、及びネフローゼ症候群（ＮＳ）患者群で、移植腎患者群及び健常者に比べて有意に高値であった（Ｐ＜０．００１）。尿中ＮＡＧ値に関して、糖尿病性腎症患者群及びネフローゼ症候群患者群で、移植腎患者群及び健常者に比べて有意に高値であった（Ｐ＜０．０１）。
また、表１に示していないが、糖尿病性腎症患者群、半月体形成性腎炎患者群、及び移植腎患者群において、ｌｏｇ（尿中ＰＡＩ）値は、尿中ＮＡＧ値に正相関を示した（ｒ２；０．３１９、０．２８６、０．６１３、ｐ＜０．０５）。
【００３１】
《実施例２：各種疾患患者由来の腎生検標本におけるＰＡＩ−１免疫染色》
本実施例では、半月体形成性腎炎患者（２例）及び微小変化型ネフローゼ症候群患者に由来する腎生検標本（ホルマリン固定）について、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体（三菱化学）を用いた免疫組織染色（Envison法）を実施した。
半月体形成性腎炎患者由来の腎生検標本の免疫染色像を図１（２００倍）及び図２（４００倍）に、微小変化型ネフローゼ症候群患者の免疫染色像を図３及び図４（４００倍）にそれぞれ示す。
【００３２】
半月体形成性腎炎患者由来の腎生検標本に関しては、図１に示すように、一部の近位尿細管の尿細管細胞［矢じり（arrowhead）で示す］と糸球体内細胞［矢印（arrow）で示す］に明らかなＰＡＩ−１染色が認められた。また、図２に示すように、肥大し、突出した尿細管上皮細胞にＰＡＩ−１の存在が確認された。
一方、微小変化型ネフローゼ症候群患者由来の腎生検標本に関しては、ＰＡＩ−１の特異染色は認められなかった（図３及び図４）。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の検出方法及び検出用キットは、半月体形成性腎炎の検出の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】半月体形成性腎炎患者由来の腎生検標本について、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色を実施した結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真（２００倍）である。
【図２】半月体形成性腎炎患者由来の腎生検標本について、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色を実施した結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真（４００倍）である。
【図３】微小変化型ネフローゼ症候群患者由来の腎生検標本について、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色を実施した結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真（４００倍）である。
【図４】微小変化型ネフローゼ症候群患者由来の腎生検標本について、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色を実施した結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真（４００倍）である。
【図１】
2006053041.tif 000002
【図２】
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【図３】
2006053041.tif 000004
【図４】
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