(57)【要約】【課題】抗体の高い分子認識能と酵素活性とを併せ持つ新規なヒト抗体酵素およびその生産方法を提供する。【解決手段】本発明のヒト抗体酵素は、アミノ酸配列から予測される抗体の立体構造中に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造上近接して存在するヒト生殖細胞系列遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む抗体酵素である。本発明のヒト抗体酵素はヒトに対して安全かつ有効に適用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖が、Ｖ１−９、Ｖ１−１３、Ｖ１−１８、Ｖ１−２２、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ３−３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ７、Ａ１０、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２３、Ａ２６、Ａ３０、Ｌ１４およびＬ２２からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とするヒト抗体酵素。
【請求項２】
重鎖が、ＶＨ１−２４、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３４およびＶＨ７−８１からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とするヒト抗体酵素。
【請求項３】
予測される抗体の立体構造中に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造上近接して存在することを特徴とする請求項１または２に記載のヒト抗体酵素。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または
配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項３に記載のヒト抗体酵素。
【請求項５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列、または
配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項３に記載のヒト抗体酵素。
【請求項６】
配列番号８に示されるアミノ酸配列、または
配列番号８に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項３に記載のヒト抗体酵素。
【請求項７】
１つのサブグループに属するヒト抗体酵素の生産方法であって、
ヒト生殖細胞系列抗体Ｖ遺伝子のリーダー配列中に存在するサブグループ特異的配列に基づくプライマーを用いて、ヒトリンパ球由来のｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応を行う工程、
増幅されたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基配列に基づいて酵素活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを選択する工程、および
選択されたｃＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させる工程
を包含することを特徴とするヒト抗体酵素生産方法。
【請求項８】
上記サブグループがＶｋａｐｐａ２であり、上記プライマーが配列番号１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載のヒト抗体酵素生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の高い分子認識能と酵素活性とを併せ持つヒト抗体酵素およびその生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体酵素は目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンである（非特許文献１参照）。したがって、抗体酵素は、医療、化学工業、食品工業等といった、多くの面で応用が期待されている。
【０００３】
抗体酵素としては、例えば、S.Paulらは、ＶＩＰ（神経ペプチド：Vasoactive Intestinal Peptide）に対するマウス由来抗体（抗ＶＩＰ抗体）の軽鎖（ＶＩＰａｓｅ）が、上記ＶＩＰを分解する活性を有することを報告している（非特許文献２参照）。また、本発明者らは、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の原因となるエイズウイルス（ＨＩＶ）の外膜タンパク質ｇｐ４１の不変領域を抗原とするマウス由来モノクローナル抗体を取得し、このモノクローナル抗体の機能を詳細に解析した結果、当該モノクローナル抗体の軽鎖領域は、ＨＩＶの外膜タンパク質ｇｐ４１を特異的に分解する、非常に高い活性を有することを報告している（非特許文献３参照）。さらに、本発明者らは、上記抗ＨＩＶ−１ｇｐ４１抗体軽鎖（４１Ｓ−２Ｌ）の超可変領域１（ＣＤＲ１）ペプチドに対するマウス由来抗体である抗４１Ｓ−２Ｌ鎖ＣＤＲ１領域ペプチド抗体の軽鎖（ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌ）が、上記抗ＨＩＶ−１ｇｐ４１抗体軽鎖（４１Ｓ−２Ｌ）を分解する活性を有していることを報告している（非特許文献４参照）。
【０００４】
また、本発明者らは、上記ＶＩＰａｓｅとｉ４１ＳＬ１−２−Ｌは相同性が高く、これらの立体構造中にセリン残基とアスパラギン酸残基とヒスチジン残基とが近接して存在し、この三つ組み残基様構造がペプチド分解活性と関連があることを見出している（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）
【非特許文献１】Uda T., Hifumi E. Journal of Bioscience and Bioengineering 97:289-93 (2004)
【非特許文献２】Paul S, Volle DJ, Beach CM, Johnson DR, Powell MJ, Massey RJ. Science 244:1158-62 (1989)
【非特許文献３】Hifumi E., Okamoto Y., Uda T. J. Biosci. Bioeng. 88(3):323-327 (1999)
【非特許文献４】Hifumi E., Kondo H., Mitsuda Y., Uda T. Biotechnol Bioeng. 84:485-93 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４に記載の抗体酵素はいずれもマウス由来である。また、特許文献１に開示されている、セリン残基とアスパラギン酸残基とヒスチジン残基とが近接して存在する三つ組み残基様構造とペプチド分解活性との関連性についても、マウス由来抗体酵素の解析により得られた知見である。
【０００６】
抗体酵素の特異的な抗原抗体反応および抗原に対しての酵素反応を起こす性質を利用すれば、病原タンパク質に対するミサイル療法等の薬理効果が期待できる。しかし、マウス由来抗体をヒトに適用した場合、ヒト抗マウス抗体抗体により不活化されることが知られている。したがって、抗体酵素を臨床に用いるためにはヒト由来抗体酵素を見出すことが必要であり、また目的のヒト抗体酵素を効率良く生産することが必要である。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗体の高い分子認識能と酵素活性とを併せ持つ新規なヒト抗体酵素およびその生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、データベースに登録されているヒト生殖細胞系列の抗体Ｖ遺伝子の塩基配列に基づいて抗体の立体構造を予測し、セリン残基とアスパラギン酸残基とヒスチジン残基とが近接して存在する三つ組み残基様構造の有無について探索した。その結果３９種類の生殖細胞系列遺伝子から予測される立体構造において、上記三つ組み残基様構造が見出された。さらに、ヒトサンプルから上記三つ組み残基様構造が見出された生殖細胞系列遺伝子由来のｃＤＮＡをクローニングし、発現タンパク質がペプチド分解活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るヒト抗体酵素は、軽鎖が、Ｖ１−９、Ｖ１−１３、Ｖ１−１８、Ｖ１−２２、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ３−３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ７、Ａ１０、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２３、Ａ２６、Ａ３０、Ｌ１４およびＬ２２からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴としている。
【００１０】
また、本発明に係るヒト抗体酵素は、重鎖が、ＶＨ１−２４、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３４およびＶＨ７−８１からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴としている。
【００１１】
上記ヒト生殖細胞系列遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含む抗体は、予測される抗体の立体構造中に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造上近接して存在する。すなわち、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有するヒト抗体酵素である。
【００１２】
本発明に係るヒト抗体酵素としては、より具体的には、配列番号２、４、８に示されるアミノ酸配列、または配列番号２、４、８に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列、からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むもの、を挙げることができる。
【００１３】
本発明に係るヒト抗体酵素生産方法は、１つのサブグループに属するヒト抗体酵素の生産方法であって、ヒト生殖細胞系列抗体Ｖ遺伝子のリーダー配列中に存在するサブグループ特異的配列に基づくプライマーを用いて、ヒトリンパ球由来のｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応を行う工程、増幅されたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基配列に基づいて酵素活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを選択する工程、および選択されたｃＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させる工程を包含することを特徴としている。
【００１４】
上記の方法により、目的サブグループに属するヒト抗体酵素を効率良く生産することが可能となる。
【００１５】
上記方法によりサブグループＶｋａｐｐａ２に属する抗体酵素を生産する場合には、配列番号１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヒト抗体酵素は、種々の感染症や癌等の病気の治療、診断に利用できるという効果を奏する。特に本発明のヒト抗体酵素はヒト由来であるため、ヒトに投与した場合でも異種タンパク質として免疫系により排除されないため、安全かつ有効にヒトに適用できるという効果を奏する。
【００１７】
また、本発明に係るヒト抗体酵素は、新しいバイオマテリアルとして新型のバイオセンサにも応用可能であり、病気の診断などの検査等にも利用可能である。
【００１８】
さらに、本発明のヒト抗体酵素生産方法を用いれば、ヒト抗体酵素を効率良く生産することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
（１）ヒト抗体酵素
本発明はヒト抗体酵素を提供するものである。抗体酵素とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応し、かつ酵素活性を有する免疫グロブリンである。なお、抗体は完全な抗体分子に限定されるものではなく、抗原に特異的に結合することができ、かつ酵素活性を有する抗体フラグメント（例えば、軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなど）でもよい。また、酵素活性は特に限定されるものではないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。
【００２１】
発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（特許文献１参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基との距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは、３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。以下、上記三つのアミノ酸残基が立体構造上近接している構造を「三つ組み残基様構造」と称する。上記三つのアミノ酸残基間の距離が３〜２０Å、なかでも特に３〜１０Åの範囲内であれば、十分に三つ組み残基様構造と基質（ペプチドや抗原タンパク質）とが反応できると考えられる。
【００２２】
抗体は、重鎖（Ｈ鎖：Heavy chain）と軽鎖（Ｌ鎖：Light chain）とから構成されている。重鎖および軽鎖は、可変領域（ＶＲ：Variable Region）と定常領域（ＣＲ：Constant Region）とから構成されており、可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ：Complimentarity Determining Region）を有している。ヒト抗体酵素において、上記三つ組み残基様構造が存在する部位は特に限定されるものではなく、軽鎖に存在しても重鎖に存在してもよい。
【００２３】
また、抗体遺伝子は、抗体可変領域および定常領域をコードする。可変領域構造遺伝子は、軽鎖ではＶ遺伝子およびＪ遺伝子から編成され、重鎖ではＶ遺伝子、Ｄ遺伝子およびＪ遺伝子から編成される。生殖細胞系列（以下「ｇｅｒｍｌｉｎｅ」とも称する。）遺伝子は、それぞれコードするアミノ酸配列が違うため、編成される可変領域構造遺伝子によってそれぞれの遺伝子産物である抗体も配列が違い、このことが抗体の多様性を引き起こす。マウス抗体酵素に関する解析の結果、ＶＩＰａｓｅ（抗ＶＩＰ遺伝子軽鎖）ではＶ遺伝子に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造上近接して存在するＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成するアミノ酸残基がコードされていることが見出されていることに加え、本発明者らが見出した多くのマウス抗体酵素の解析を行った結果から、本発明者らは、ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅの抗体Ｖ遺伝子のアミノ酸配列に基づいてコンピューター上で擬似抗体を作製し、予測される立体構造中の三つ組み残基様構造の有無を探索した。
【００２４】
すなわち、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）に登録されているヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ遺伝子について予測される立体構造中の三つ組み残基様構造の有無を探索した。その結果、合計３９種類のヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ遺伝子がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成するアミノ酸残基をコードすることを見出した。なお、詳細は後述の実施例１の記載を参照のこと。
【００２５】
具体的には、軽鎖Ｖ遺伝子に関しては、ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅでＶ１−９、Ｖ１−１３、Ｖ１−１８、Ｖ１−２２、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４およびＶ３−３の１０種、ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅでＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ７、Ａ１０、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２３、Ａ２６、Ａ３０、Ｌ１４およびＬ２２の１４種、合計２４遺伝子がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成するアミノ酸残基をコードしていた。なお、Ａ３とＡ１９、Ａ１０とＡ２６はそれぞれ同じアミノ酸配列をコードする重複遺伝子であった。
【００２６】
また、重鎖Ｖ遺伝子に関しては、ヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅでＶＨ１−２４、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３４およびＶＨ７−８１の１５種の遺伝子がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成するアミノ酸残基をコードしていた。
【００２７】
本発明のヒト抗体酵素は、軽鎖が、Ｖ１−９、Ｖ１−１３、Ｖ１−１８、Ｖ１−２２、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ３−３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ７、Ａ１０、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２３、Ａ２６、Ａ３０、Ｌ１４およびＬ２２からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むものであればよい。
【００２８】
また、本発明のヒト抗体酵素は、重鎖が、ＶＨ１−２４、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３４およびＶＨ７−８１からなる群より選択されるヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むものであればよい。
【００２９】
上記ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチド以外の部分は抗体を構成するポリペプチドであればどのようなポリペプチドからなるものでもよい。また、抗体酵素としては完全な抗体分子に限定されるものではなく、抗原に特異的に結合することができ、かつ酵素活性を有する抗体フラグメントでもよい。したがって、この条件を満たす限り、上記ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドを含むフラグメント、上記ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドの一部を含むフラグメント、上記ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされるポリペプチドの一部からなるフラグメントであってもよい。
【００３０】
なお、上記各ヒト生殖系列遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９〜５５に示されており、表１に記載のとおり対応する。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
また、上記各ヒト生殖系列遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９〜４４に示されるアミノ酸配列と完全に一致することを要するものではない。すなわち、上記各ヒト生殖系列遺伝子がコードするポリペプチドにおけるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造に影響を及ぼさない範囲を限度として変異を有するものであってもよい。変異を有するポリペプチドとしては、例えば各配列番号に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００３３】
上記「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３４】
好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、上記各ヒト生殖系列遺伝子がコードするポリペプチドにおけるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造に影響を及ぼさない。
【００３５】
本発明のヒト抗体酵素としては、配列番号２、４または８示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むヒト抗体酵素を挙げることができる。これらのアミノ酸配列からなるポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を構成し、立体構造中にＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を有することが確認されている。
【００３６】
なお、上記ポリペプチドはＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造に影響を及ぼさない範囲を限度として変異を有するものであってもよい。すなわち、配列番号２、４または８示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたされたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むヒト抗体酵素も本発明に含まれる。
【００３７】
また、抗体酵素としては完全な抗体分子に限定されるものではなく、抗原に特異的に結合することができ、かつ酵素活性を有する抗体フラグメントでもよいことは、既に説明したとおりである。
【００３８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトリンパ球からクローニングされたｃＤＮＡがコードするポリペプチドであり、ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ１−１３遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列と９９％一致する。また、ペプチド分解活性を有することが実験的に確認されている（実施例２参照）。
【００３９】
配列番号１には、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列が示される。ただし、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されるものではない。なお、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００４０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトリンパ球からヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶｋａｐｐａ２に属する遺伝子としてクローニングされたｃＤＮＡがコードするポリペプチドであり、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を有し、マウス由来抗体酵素であるＶＩＰａｓｅおよびｉ４１Ｓ−Ｌ−２と相同性が認められる。
【００４１】
配列番号３には、上記配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列が示される。ただし、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されるものではない。
【００４２】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトリンパ球からヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶｋａｐｐａ２に属する遺伝子としてクローニングされたｃＤＮＡがコードするポリペプチドであり、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を有し、マウス由来抗体酵素であるＶＩＰａｓｅおよびｉ４１Ｓ−Ｌ−２と相同性が認められる。また、三つ組み残基様構造を構成するアミノ酸残基（Ｓ、ＨおよびＤ）の配置はＶＩＰａｓｅおよびｉ４１Ｓ−Ｌ−２での配置と一致している。
【００４３】
配列番号７には、上記配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列が示される。ただし、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されるものではない。
【００４４】
（２）ヒト抗体酵素生産方法
上記本発明のヒト抗体酵素は、例えば以下のようにして作製することができる。ただし以下に例示する方法に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等、一般の遺伝子組換えに必要な方法は、公知の実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed（Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」）に記載されている方法を適宜選択して用いることができる。
【００４５】
最初にヒトリンパ球を取得する。リンパ球を取得する方法は特に限定されない。例えば抹消血を採取し、遠心分離することにより取得することができる。また、市販の分離液（例えば、Ficollなど）を利用してもよい。
【００４６】
次に、リンパ球からＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ抽出は公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡ抽出用キットが多数市販されている。また、上記の操作を省略し、市販のヒトリンパ球由来ＲＮＡを用いることもできる。得られたＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う（ＲＴ−ＰＣＲ）。ここで、目的の抗体遺伝子のｃＤＮＡが増幅されるようにプライマーを設計する。例えば、本発明者らは、ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ抗体Ｖ遺伝子ヒトκ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのリーダー配列を比較し、サブグループごとの特異配列に基づくプライマーを設計することで、サブグループ選択的にｃＤＮＡを増幅できることを見出し、リーダー配列に基づくプライマーと定常領域の塩基配列に基づくプライマーを用いて目的のサブグループに属する抗体遺伝子のｃＤＮＡを増幅している。具体的にはサブグループＶｋａｐｐａ２に属する抗体酵素をコードするｃＤＮＡを増幅するために配列番号１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして使用している。ただし、これに限定されるものではない。また、ヒト抗体遺伝子を増幅する市販のプライマーを用いることもできる。
【００４７】
得られたｃＤＮＡを公知のクローニングベクターにクローニングし、公知の塩基配列決定法により塩基配列を決定し、目的のｃＤＮＡであることを確認する。ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、例えば、当該ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して発現させることができる。また、無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を発現させてもよい。
【００４８】
最後に発現タンパク質を精製する。精製方法は特に限定されるものではなく、公知の方法から適宜選択して用いればよい。発現方法や、用いた宿主細胞により適切な精製方法を選択することが好ましい。なお、得られたタンパク質が、目的の酵素活性を有すること、および抗原と特異的に結合することを確認することが好ましい。
【００４９】
なお、上記クローニングしたｃＤＮＡの塩基配列が目的のｃＤＮＡでない場合でも、ヒト抗体酵素を作製できる場合がある。例えば、クローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、コードするポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてコンピューター上で擬似抗体を作製して立体構造を予測したときに、三つ組み残基様構造を有していないことが明らかとなった場合でも、当該ｃＤＮＡに対して遺伝子工学的に変異を導入することにより、三つ組み残基様構造を有するようにすることができる。
【００５０】
より具体的には、例えば予測立体構造中に、近接するセリン残基およびアスパラギン酸残基は存在するが、これらに近接するヒスチジン残基が存在しない場合に、セリン残基およびアスパラギン酸残基と立体構造上近接している他のアミノ酸をヒスチジンに置換する変異を導入することでＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み様残基を有するヒト抗体酵素を作製することが可能である。ここで、変異を導入する方法は特に限定されるものではなく、例えば部位特異的変異誘導法等の公知の方法を用いることができる。また、変異導入により置換可能なアミノ酸の種類および数は限定されない。
【００５１】
ここで、本発明に係るヒト抗体酵素生産方法は、少なくとも以下の３工程が含まれるものであればよく、これら以外の工程については限定されない。
（ａ）ヒト生殖細胞系列抗体Ｖ遺伝子のリーダー配列中に存在するサブグループ特異的配列に基づくプライマーを用いて、ヒトリンパ球由来のｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応を行う工程（以下「核酸増幅工程」と称する。）
（ｂ）上記核酸増幅工程で増幅されたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基配列に基づいて酵素活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを選択する工程（以下「選択工程」と称する。）
（ｃ）上記選択工程で選択されたｃＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させる工程（以下「発現工程」と称する。）
上記（ａ）核酸増幅工程において用いるプライマーの設計は、ヒト生殖細胞系列抗体Ｖ遺伝子のリーダー配列を比較してサブグループ特異的配列を見出し、当該サブグループ特異的配列を有するようにプライマーを設計すればよい。具体的には、例えばヒトｇｅｒｍｌｉｎｅｋａｐｐａ鎖Ｖ遺伝子のリーダー配列を図１７に示すように比較する。サブグループＶｋａｐｐａ１（ＶＫ１）の０１２（最上列）の塩基配列を基準に比較すると、サブグループＶｋａｐｐａ２（ＶＫ２）では−３１位〜−２５位および−１８位〜−１２位の範囲にサブグループ特異的配列が見出される。また、サブグループＶｋａｐｐａ３（ＶＫ３）では−５７位〜−４６位および−４０位〜−３４位の範囲にサブグループ特異的配列が見出される。サブグループＶｋａｐｐａ４（ＶＫ４）、Ｖｋａｐｐａ５（ＶＫ５）およびＶｋａｐｐａ６（ＶＫ６）では、比較した全範囲に広く特異的配列が見出される。
【００５２】
このようなサブグループ特異的配列を有するようにプライマーを設計すれば、目的のサブグループに属する抗体のｃＤＮＡを効率良く増幅することができる。例えば、本発明者らは、サブグループＶｋａｐｐａ２に属する抗体酵素をコードするｃＤＮＡを増幅するために配列番号１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして使用している。
【００５３】
上記（ａ）核酸増幅工程において核酸を増幅する方法は特に限定されるものではないが、例えばＰＣＲを好適に用いることができる。
【００５４】
上記（ｂ）選択工程においては、公知の塩基配列決定法により塩基配列を決定すればよい。また、塩基配列に基づいて酵素活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを選択する方法としては、例えば、塩基配列から推定されるアミノ酸配列に基づいてコンピューター上で立体構造を予測しＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を有するものを選択する方法、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を有する抗体タンパク質をコードすることが明らかなヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ遺伝子の塩基配列との相同性を比較する方法などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
上記（ｃ）発現工程においてポリペプチドを発現させる方法は、例えば上述のように、選択されたｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して発現させる方法、無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を発現させる方法などを挙げることができる。
【００５６】
（３）ヒト抗体酵素の利用
上記本発明のヒト抗体酵素は、抗体の特異性の高い基質認識能と酵素活性とを併せ持つものである。また、ヒト由来であるため、ヒトに投与した場合でも異種タンパク質として免疫系により排除されず、安全かつ有効にヒトに適用できる。このため、例えば、細菌やウイルスが生体内に侵入し引き起こされる感染症等に対して、これらの原因となる細菌やウイルスに特異的なヒト抗体酵素を取得又は作製することにより、当該ヒト抗体酵素を診断や治療に用いることができると考えられる。また、例えば、癌に対しても、癌細胞に特異的に発現するタンパク質やポリペプチド等を特異的に認識するヒト抗体酵素を取得又は作製することにより、当該ヒト抗体酵素を用いて癌を診断、治療することが可能である。
【００５７】
また、これまでにない新薬に向けて、将来的に難病や薬剤耐性を克服する画期的な薬の開発に繋がる可能性や、新しい臨床診断法の開発にも繋がる可能性がある。
【００５８】
さらに、抗体の高い分子認識能と酵素の持つ基質変換能力とを併せ持つ抗体酵素は、新しいバイオマテリアルとして新型のバイオセンサにも応用可能であり、病気の診断、環境測定などの検査等にも利用可能である。
【００５９】
また、抗体酵素の有する触媒活性（酵素活性）を利用して、食品工業、化学工業において用いられる触媒等の反応促進剤などにも展開できると考えられる。
【００６０】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６１】
〔実施例１：ｇｅｒｍｌｉｎｅに基づくヒト抗体立体構造の予測〕
（１）方法
抗体Ｖ領域ｇｅｒｍｌｉｎｅにコードされているＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を探索するため、コンピューター上で擬似抗体を作製した。
【００６２】
ＮＣＢＩ IｇＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）に登録されているヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列をもとに擬似抗体ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の一次構造を作製した。
【００６３】
Ｖｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅをもとにした擬似抗体の一次構造は、ＶＬ鎖ＦＲ１〜ＣＤＲ３領域を各Ｖｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅアミノ酸配列、ＦＲ４領域をＪ領域Ｊｌａｍｂｄａ１アミノ酸配列（FGGGTKLTVLRQ、配列番号９）とした。
【００６４】
Ｖｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅをもとにした擬似抗体の一次構造は、ｋａｐｐａ鎖ＦＲ１〜ＣＤＲ３領域途中を各Ｖｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列、ＣＤＲ３領域末端〜ＦＲ４領域をＪｋａｐｐａ領域Ｊｋａｐｐａ１アミノ酸配列（WTFGQGTKVEIKRA、配列番号１０）とした。
【００６５】
立体構造予測計算にはＶＬ鎖とＶＨ鎖両方の一次構造が必要なため、擬似抗体に対となるＶＨ鎖はAnti PreS1 antibody clone 3c のＶＨ鎖（GenPept ACCESSIN AAF35175）、ＶＬ鎖はAnti PreS1 antibody clone 3c のＶＬ鎖（GenPept ACCESSIN AAF35178）とした（Choi,I.H., Park,S.G., Chung,J.H., Kim,I.J. and Hong,H.J. Generation of human Fab monoclonal antibodies against preS1 of hepatitis B virus using repertoire cloning. Hybridoma 17 (6), 535-540 (1998)）。
【００６６】
作製した一次構造をもとに、ＡｂＭ（Oxford Molecular、Oxford、UK）により目的抗体ＣＤＲ領域のループ構造とＦＲ領域の立体構造を予測した。ＡｂＭで予測された立体構造をもとに、InsightII/Discover３（Molecular Simulatoin、USA）により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【００６７】
PPC Protein AdviSer（FQS、Japan）により、立体構造から三つ組み残基を構成するＳｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）およびＡｓｐ（Ｄ）の残基群を探索した。Ｓｅｒ−Ｈｉｓα炭素原子間距離が１０Å以下、Ｈｉｓ−Ａｓｐα炭素原子間距離が１５Å以下である残基群を三つ組み残基様構造とした。
【００６８】
（２）結果
ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ計１２６種のアミノ酸配列に基づき、そのうちＨｉｓをコードするｇｅｒｍｌｉｎｅ６４種についてＡｂＭおよびInsightII/Discover３により疑似抗体の立体構造を予測した。その結果、５６種の疑似抗体立体構造を予測出来た（表１参照）。残り８種は全てｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４およびＶ５−６の疑似抗体であり、全てでＦＷＲ３領域が長いためＡｂＭでの立体構造予測計算が不能であった。
【００６９】
【表２】
2006197930.tif 000003
【００７０】
（ｉ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの探索
ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの総数は３６種であった。これらの予測立体構造でのＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の有無について分類した（表１参照）。その結果、Ｖｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ３６種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅはＶ１−９、Ｖ１−１３、Ｖ１−１８、Ｖ１−２２、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４およびＶ３−３の１０種であった。これらの予測立体構造を図１（ａ）〜（ｊ）に示した。
【００７１】
（ｉｉ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの探索
ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの総数は４６種であった。これらの予測立体構造でのＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の有無について分類した（表１参照）。その結果、Ｖｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ４６種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅはＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ７、Ａ１０、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２３、Ａ２６、Ａ３０、Ｌ１４およびＬ２２の１４種であった。なお、Ａ３とＡ１９、Ａ１０とＡ２６はそれぞれ同じアミノ酸配列をコードする重複遺伝子であった。これらの予測立体構造を図２（ａ）〜（ｌ）に示した。
【００７２】
（ｉｉｉ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの探索
ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの総数は４４種であった。これらの予測立体構造でのＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の有無について分類した（表１参照）。その結果、ＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ４４種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅはＶＨ１−２４、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３４およびＶＨ７−８１の１５種であった。これらの予測立体構造を図３（ａ）〜（ｏ）に示した。
【００７３】
（ｉｖ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅアミノ酸配列の比較
上述のように、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ３６種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅは１０種であった。これら１０種での共通配列を見出すため、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した。
【００７４】
結果を図４に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００７５】
ＣＤＲ１領域上にＨｉｓがある場合、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域上のＳｅｒ・ＡｓｐでＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が構成され、一部のｇｅｒｍｌｉｎｅではさらにＣＤＲ２領域上の残基も構成残基とすることが示された。また、ＣＤＲ３領域上にＨｉｓがある場合、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域上のＳｅｒ・ＡｓｐでＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が構成され、ＣＤＲ２領域上の残基は構成残基とされないことが示された。このことは、互いに遠いＣＤＲ２とＣＤＲ３領域の間では三つ組み残基様構造が構成されず、近接するＣＤＲ１とＣＤＲ２領域の間およびＣＤＲ１とＣＤＲ３領域の間で三つ組み残基様構造が構成されることを示すものである。
【００７６】
また、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅでは、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基はそのほとんどがＣＤＲ領域に局在していることが示された。上記１０ｇｅｒｍｌｉｎｅで見られるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基は、合計７３中６１（８４％）がＣＤＲ領域に存在していた。このことから、上記１０種のＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来で変異部位を持たない抗体鎖では抗原認識部位もしくはその付近でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成することが示され、抗原に対する酵素活性を持つ可能性が示唆された。
【００７７】
（ｖ）サブグループＶｌａｍｂｄａ１（ＶＬ１）のアミノ酸配列の比較
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードするｇｅｒｍｌｉｎｅの１つであるＶ１−１３はサブグループＶＬ１に属しており、またサブグループＶＬ１に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのなかでは、Ｖ１−１３およびＶ１−１８がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードしていた。そこで、サブグループＶＬ１に属するｇｅｒｍｌｉｎｅを比較した。
【００７８】
結果を図５に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はＶ１−１３と同一のアミノ酸であることを表し、「_」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００７９】
Ｖ１−１３はカバットの分類で３４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ３４）に対して三つ組み残基様構造の構築が可能な２残基のセリンと３残基のアスパラギン酸とが存在しており、そのうち１残基のセリン、２残基のアスパラギン酸およびヒスチジンがＶ１−１８と相同していた。
【００８０】
（ｖｉ）サブグループＶｌａｍｂｄａ３（ＶＬ３）のアミノ酸配列の比較
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードするＶ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３およびＶ２−１４はサブグループＶＬ３に属している。変異によりサブグループＶＬ３がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得するかを推測するため、サブグループＶＬ３に属するｇｅｒｍｌｉｎｅを比較した。
【００８１】
結果を図６に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はＶ２−１４と同一のアミノ酸であることを表し、「_」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００８２】
サブグループ全体を通して、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にセリンやヒスチジンが多い。したがって、ＣＤＲ３にヒスチジンが存在する４種類（Ｖ２−１４、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ２−１３）ではＣＤＲ３単独で三つ組み残基様構造を構築している。ＣＤＲ３にヒスチジンを持たないＶ２−１１やＶ２−１７の場合でも、変異によってＣＤＲ３にヒスチジンを持つと三つ組み残基様構造が構築可能と予測できる。また、これとは配置の異なる三つ組み残基様構造としてＣＤＲ２とＣＤＲ１との間で構築されるものもある。
【００８３】
（ｖｉｉ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅアミノ酸配列の比較
上述のように、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ４６種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅは１４種であった。これら１４種での共通配列を見出すため、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した。
【００８４】
結果を図７に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００８５】
１４鎖中カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で２７ｄ番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ２７ｄ）を持つｇｅｒｍｌｉｎｅは７鎖、９３番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ９３）を持つｇｅｒｍｌｉｎｅは３鎖であり、ｇｅｒｍｌｉｎｅ間で相同性が高い。また、サブグループＶｋａｐｐａ２（ＶＫ２）に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのほとんどがＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を形成するという特徴が見出された。
【００８６】
ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１、Ａ１７およびＡ１８はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）、２７ａ番目のセリン（Ｓｅｒ２７ａ）および９３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９３）で構成しており、マウス由来抗体酵素として公知の抗ＶＩＰ抗体Ｌ鎖およびｉ４１ＳＬ１−２（抗４１Ｓ−２Ｌ鎖ＣＤＲ１領域ペプチド抗体）で見られるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造と同じ配置である。
【００８７】
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅで、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基はそのほとんどがＣＤＲ領域、特にＣＤＲ１およびＣＤＲ３に局在する傾向を認めた。このことから、以上１０種のＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来で変異部位を持たない抗体鎖では抗原認識部位もしくはその付近でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成することが示され、抗原に対する酵素活性を持つ可能性が示唆された。
【００８８】
（ｖｉｉｉ）サブグループＶｋａｐｐａ１（ＶＫ１）のアミノ酸配列の比較
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードするｇｅｒｍｌｉｎｅであるＡ３０、Ｌ２２およびＬ１４はサブグループＶＫ１に属している。変異によりサブグループＶＫ１がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得するかを推測するため、サブグループＶＫ１に属するｇｅｒｍｌｉｎｅを比較した。
【００８９】
結果を図８に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はＡ３０と同一のアミノ酸であることを表し、「_」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００９０】
サブグループＶＫ１ではＨｉｓをコードするｇｅｒｍｌｉｎｅはＡ３０、Ｌ２２およびＬ１４であった。Ａ３０とＬ２２とＬ１４ではそれぞれＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基配置が違っていた。Ａ３０ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）、３２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ３２）、９１番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９１）および９３番目のセリン（Ｓｅｒ９３）でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が構成されている。他のサブグループＶＫ１ｇｅｒｍｌｉｎｅでは１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）および９３番目のセリン（Ｓｅｒ９３）はよく保存されているが３２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ３２）はほとんど保存されておらず９１番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９１）は全く保存されていない。このことから、サブグループＶＫ１のＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードしていないｇｅｒｍｌｉｎｅで置換が起こり９１番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９１）を獲得し、同時に１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）がコードされている場合、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得する可能性が考えられる。
【００９１】
Ｌ２２ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ５０）、５３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ５３）、５５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ５５）、５９番目のセリン（Ｓｅｒ５９）および６０番目のセリン（Ｓｅｒ６０）でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が構成されている。
【００９２】
Ｌ１４ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で４６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ４６）、５５番目のセリン（Ｓｅｒ５５）、８２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ８２）でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が構成されている。
【００９３】
他のサブグループＶＫ１ｇｅｒｍｌｉｎｅではその全てで６０番目のセリン（Ｓｅｒ６０）が保存されているものの、それ以外の構成残基はほとんど保存されていない。
【００９４】
このことから、サブグループＶＫ１はｇｅｒｍｌｉｎｅＬ２２で見られるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を保存しないことが示された。カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）および９３番目のセリン（Ｓｅｒ９３）をコードする一部のｇｅｒｍｌｉｎｅでは、変異により９１番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９１）を獲得した場合Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得する可能性が考えられる。
【００９５】
（ｉｘ）サブグループＶｋａｐｐａ２（ＶＫ２）のアミノ酸配列の比較
ＶＫｇｅｒｍｌｉｎｅでＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つｇｅｒｍｌｉｎｅの多くがサブグループＶＫ２に属していた。変異によりサブグループＶＫ２がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得するかを推測するため、サブグループＶＫ２に属するｇｅｒｍｌｉｎｅを比較した。
【００９６】
結果を図９に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はＡ３／Ａ１９と同一のアミノ酸であることを表し、「_」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【００９７】
サブグループＶＫ２において、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造をコードしていないｇｅｒｍｌｉｎｅはＨｉｓをコードしていないＯ１／Ｏ１１のみである。ＳｅｒおよびＡｓｐの配置はサブグループＶＫ２全体で保存されている。このことから、ｇｅｒｍｌｉｎｅＯ１／Ｏ１１で置換が起こりカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で２７ｄ番目のヒスチジン（Ｈｉｓ２７ｄ）もしくは９３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９３）を獲得した場合、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得する可能性が考えられる。
【００９８】
なお、１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１）、２７ａ番目のセリン（Ｓｅｒ２７ａ）および９３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ９３）で構築される三つ組み残基様構造はマウスで最も高い頻度で見られ、かつ実績のある組合せである。
【００９９】
（ｘ）Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅアミノ酸配列の比較
上述のように、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴに登録されているＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ４４種中、予測立体構造でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造が見られたｇｅｒｍｌｉｎｅは１５種であった。これら１５種での共通配列を見出すため、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した。
【０１００】
結果を図１０に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【０１０１】
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのうち１２種はサブグループＶＨ３に属しており、共通配列が見られる。全体としては共通のＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造構成配列は見られない。
【０１０２】
ＣＤＲ１領域にＨｉｓを持つｇｅｒｍｌｉｎｅが１５種中１０種見られ、共通してＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびその近傍領域でＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を構成していた。上記１５ｇｅｒｍｌｉｎｅで見られるＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基は、計７８中４７（６０％）がＣＤＲ領域に存在していた。ＣＤＲ３領域の残基をＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造構成残基の対象としていないためｌａｍｂｄａ鎖およびｋａｐｐａ鎖に比べＣＤＲ領域内の構成残基の割合が低くなっているものの、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で４９番目のセリン（Ｓｅｒ４９）や７２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ７２）などのＦＲ領域の残基が多く含まれている点でＬ鎖とは異なる。
【０１０３】
（ｘｉ）サブグループＶＨ３のアミノ酸配列の比較
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅの１５種中１２種がサブグループＶＨ３に属していた。変異によりサブグループＶＨ３がＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得するかを推測するため、サブグループＶＨ３に属するｇｅｒｍｌｉｎｅを比較した。
【０１０４】
結果を図１１に示した。図中１段目は領域名を、２段目はカバットの分類における十の位の数字を、３段目はカバットの分類における一の位の数字またはアルファベットを表す。また、図中「−」はカバットの分類における番号に対応するアミノ酸が存在しないことを表す。網がけの残基はＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基であることを示す。
【０１０５】
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つ１２種のｇｅｒｍｌｉｎｅのうち、８種がカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で３５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ３５）を共通してコードし、かつＨｉｓ３５をＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基としていた。それら８種のうち５種が共通してカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で４９番目のセリン（Ｓｅｒ４９）をＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基としている。また、それら８種のうち４種が共通してカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で６１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ６１）をＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基としており、それら８種のうち６種が共通してカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類で７２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ７２）は、をＳ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造の構成残基としている。
【０１０６】
Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持たないｇｅｒｍｌｉｎｅはＨｉｓをコードしていない。しかしながら、ＨｉｓをコードしていないｇｅｒｍｌｉｎｅにおいてもＳｅｒ４９、、Ａｓｐ６１、Ａｓｐ７２はよく保存されている。したがって、Ｓｅｒ４９と、Ａｓｐ６１またはＡｓｐ７２の少なくともいずれか一方をコードするｇｅｒｍｌｉｎｅがＨｉｓ３５を変異により獲得した場合、Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を獲得する可能性が考えられる。
【０１０７】
〔実施例２：ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域タンパク質の発現および機能解析〕
（１）方法
（ｉ）ヒト末梢血由来白血球サンプルの調製
白血球サンプルは健常被験者の末梢血より調製した。1mg/mlのEDTA-2Na(WAKO社)を加えて抗凝固処理した全血サンプル20mlに等量の緩衝溶液(0.1% D-glucose, 50μM CaCl2, 980μM MgCl2, 5.4mM KCl, 145mM Tris, pH=7.6 by 10N HClおよび140mM NaCl(いずれもWAKO社)を混合したもの)を加えた。あらかじめ分注しておいた3ml Ficoll-Paque Reagent(Amersham Biosciences社)の上部にこのサンプル溶液4mlを重層し、400×g、18〜20℃で30分〜40分間遠心した。リンパ球層のみを取り出し、前述の緩衝溶液で2回洗浄したペレットを白血球サンプルとして用いた。
【０１０８】
（ｉｉ）RNAの調製
RNA抽出はISOGEN kit(ISOGEN社)を用いてすべてRNase-freeの条件下で行った。得られた白血球サンプルに対して1mlのISOGEN solutionを添加し、シリンジを用いたピペッティングにより細胞を破砕した。室温に5分間放置後、0.2mlのクロロフォルム溶液(WAKO社)を加え12000×g、4℃で15分間遠心分離を行った。得られた水層に対し0.5ml Isopropanol(WAKO社)を添加し、12000×g、4℃で10分間遠心後、得られたペレットをtotal RNAサンプルとして用いた。
【０１０９】
（ｉｉｉ）ヒト末梢血リンパ球由来λ鎖cDNAライブラリーの作成
末梢血リンパ球由来λ鎖cDNAライブラリーの作成はReverTra DashTM (TOYOBO社)を用いてRNase-freeの条件下で行った。白血球由来total RNAサンプル1μgに対して5×RT buffer 4μl、10pmol/μl Oligo(dT)20 primer 1.0μl、10mM each dNTP mixture 2.0μl、10U/μl RNase inhibitor 1.0μl、Rever Tra AceTM1.0μlを混合し、TaKaRa社のサーマルサイクラーを用いて42℃で20分間逆転写反応を行いcDNAを合成した。つぎにこのcDNAサンプル全量に対してNovagen社のHuman Igλ VL 5’-A primer(5’-GGGAATTCATCATGRCCTGSWCYCCTCTCYTYCTSWYC-3’、配列番号１１)、Igλ VL 3’-1 primer(5’-CCCCAAGCTTGAAGCTCCTCAGAGGAGGG-3’、 配列番号１２)およびNovaTaqTMHot Start DNA Polymeraseを用いたPCR反応を行った。反応条件は次のとおりである；94℃/10分間の活性化に引き続いて94℃/15秒、69℃/2分間を40サイクルで行った。増幅産物はInvitrogen社のTOPO-TA cloning kitを用いてpCR4-TOPO vectorにcloningし、ライブラリーとした。
【０１１０】
（ｉｖ）germline cDNAの単離
はじめにgermline V1-13のアミノ酸配列とこの系列に属する他の抗体の配列を比較し、V1-13 抗体において比較的有意に存在する箇所を検索した（図１２参照）。次にこの箇所に由来するcDNAに基づくプライマーをsense鎖(5’-GSITMYGAYGTICAYTGGTA-3’、配列番号１３)、anti-sense鎖(5’-IYGRTACCARTGIACRTCRKA-3’、配列番号１４)の2通り合成した。続いて上記Novagen社のIgλ VL 5’-A primerとanti-sense鎖primer間、sense鎖primerと上記Novagen社のIgλ VL 3’-1 primer間でそれぞれPlatinum Taq Pfx Taq polymerase(Invotrogen社)を用いたPCR反応を行い目的とするgerm line cDNA領域の一部を合成した。最後にこれら2つのDNAフラグメントを混合した状態でPlatinum Taq Pfx Taq polymerase(Invotrogen社)を用いたPCR反応を行い、cDNA全長を得た。反応条件は次のとおりである。94℃/2分間の活性化に引き続いて94℃/20秒、57℃/30秒、68℃/1分を30サイクル行い、最後に72℃/5分間の反応を行った。増幅産物は2% agarose電気泳動でバンドを確認後、Zero Blunt TOPO PCR cloning kit(Invotrogen社)を用いてpCR-BluntII-TOPO vectorにcloningした。
【０１１１】
（ｖ）PCR増幅産物の塩基配列解析
得られたPCR産物の塩基配列解析はLong-Read Tower(Amersham Bioscience社)を用いて行った。Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Sequencing kitを用いて得られたplasmid DNA 1.0μgに対してM13 primerを用いた反応を行った。反応条件は次のとおりである；94℃/20秒、52℃/30秒、72℃/1分を30サイクル行った。反応後はエタノール沈殿より増幅産物を回収し、このペレットをFormamide loading dye溶液6μlに溶解後2μlシークエンスゲルにアプライした。
【０１１２】
得られた塩基配列はNCBIのIgBlastによる相同性検索を行い、いずれのgermlineに由来するものであるかの特定を行った。
【０１１３】
（ｖｉ）抗体分子のタンパク質発現と精製
得られたcDNAに由来するタンパク質の合成はPURESYSTEM classicII(Postgenome社)を用いて行った。まず、全長として得られたcDNAには非翻訳領域が含まれているため、このcDNAの再構成を行った。抗体分子の5’側(N末端側)に翻訳領域の一部と開始コドン(Met)とRBS配列を含んだprimer(5’-AAGGAGATATACCAATGCAGTCTGTGCTGACG-3’、配列番号１５)を、さらに3’側(C末側)に翻訳領域の一部と終止コドンを含んだprimer(5’-TATTCATTAGGGCTGACCTAGGACGGTGACCT-3’、配列番号１６)を設計し、Platinum Taq Pfx Taq polymerase(Invotrogen社)を用いたPCR反応を行った。次にこのPCR産物 20pmol分をPURESYSTEM Solution A 500μl、PURESYSTEM Solution B 200μlと混合し、RNase-free waterで全量を1000μlとした後、37℃で4時間反応した。
【０１１４】
この反応液を氷中に浸して反応を停止させた後、全量をYM-100限外ろ過膜(Millipore社)に移し1500×g、4℃で30分間遠心し、リボソームタンパク質を除去した。ろ液には0.05% TritonX-100、1/10 volume Ni-NTA agarose(Qiagen社)を加えて4℃で60分間vortex後、マイクロバイオスピンエンプティカラム(Bio Rad社)に移し1500×g、4℃で3分間遠心することによりresinを除き、精製タンパク質とした。
【０１１５】
（ｖｉｉ）発現タンパク質の活性試験
発現したタンパク質の活性判定にはペプチド研究所のMCA基質を用いた。終濃度0.1μMに調製した発現タンパク質と終濃度200μMに調製したMCA基質溶液とを10mM PB (pH=6.5)中で混合し、このうちの200μlを96well fluoro plate (Nunc社)に移した。25℃、遮光条件下でインキュベーション後、経過時間ごとの蛍光強度をWAKO社製 LS-Plate manager2000を用いて[Ex；360nm、Em；465nm]の条件で測定した。
【０１１６】
（２）結果
（ｉ）germline cDNAの単離
得られたPCR産物の塩基配列をNCBIのIgBlastにより相同性解析した結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、このPCR産物はV1-13 cDNAと99.9%の相同性を有していた。2箇所の変異部分に関しては、異なる複数のクローンを解析したが同じ結果であった。このため、この部位ついてはサンプル由来の配列であると考えられる。なお、図示していないが、アミノ酸配列においては100%の一致が確認された。
【０１１７】
（ｉｉ）cDNA由来タンパク質の発現
上記方法に記載のプライマーにより、タンパク質発現のために再構成したcDNAの5’上流側および3’下流側の塩基配列を図１４に示した。このcDNAを鋳型として発現させたタンパク質をSDS-PAGEに供した結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、予想される分子量（11.7kD）の位置にバンドが出現した。
【０１１８】
（ｉｉｉ）発現タンパク質のペプチド分解試験
MCA基質を用いて測定した発現タンパク質のペプチド分解活性を図１６に示した。なお、各反応は独立に３回行い、その平均値を示した。図１６から明らかなように、用いた５種類のペプチドのうち３種類に対して発現タンパク質は分解活性を有していた。以上の結果から、ヒト抗体を構成する当該発現タンパク質はペプチド分解能を有していることが明らかとなった。
【０１１９】
〔実施例３：ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子の単離〕
（１）方法
（ｉ）ヒトリンパ球の単離
健常人から採取した末梢血20mlに20mlのbalanced solutionを加え、3ml Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences社)に重層して400×g、室温で40分間遠心した。分離したリンパ球層を分取し、3倍量のbalanced solutionを加えて60×g、室温10分間遠心した。上清を除き、沈澱を6mlのbalanced solution で洗浄し、60×g、室温10分間遠心した。以上の操作により4.0×107のリンパ球を単離した。
【０１２０】
（ｉｉ）total RNAの調製
total RNAの抽出のためにISOGEN（ニッポンジーン社）を用いた。上記単離したリンパ球に0.8mlのISOGENを加え、攪拌し室温で5分間静置してリンパ球を溶解した。0.2mlのchloroformを加え、攪拌して室温で3分間静置した。12000×g、4℃で15分間遠心し、水層を抽出した。0.5ml isopropanolを加え、攪拌して-20℃で１時間静置した。12000×g、4℃で10分間遠心し、上清を捨て1mlの70% ethanolを加えて沈澱を洗浄した。7500×g、4℃で5分間遠心し、上清を捨て10分間真空乾燥した。沈澱にDEPC処理水を加えて溶解した。以上の操作により6.98μgのtotal RNAが得られた。
【０１２１】
（ｉｉｉ）RT-PCR
cDNA合成には、First Strand cDNA Synthesis Kit（Novagen）を用いた。すなわち、上記total RNAからOligo(dT)プライマーを用いてcDNAを合成した。次に、このcDNAを鋳型とし、上流プライマーとしてサブグループVkappa2リーダー配列に対するKAP2L primer（5’-TCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCT-3’、配列番号１７）を、下流プライマーとしてヒトκ鎖定常領域に対するHuIgLVk3-1primer（5’-TTCCCAAGCTTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3’、配列番号１８、Novagen社）を用い、変性94℃10分間に続き、94℃20秒、60℃20秒、72℃40秒を30サイクル行った後、最終伸長反応72℃4分間のPCRによりDNAを増幅した。なお、PCRにはNovaTaq PCR Kit（Novagen社）を用いた。
【０１２２】
（ｉｖ）ヒト抗体可変領域遺伝子の同定
PCR産物のクローニングのためpGEM-T Easy Vector System（Promega社）を用い、pGEM-T Easy VectorにPCR産物を挿入した。構築したベクターを大腸菌(E.coli)DH5α株に形質転換した。定法に従い、形質転換した大腸菌を培養し、PCR産物がクローニングされたプラスミドを回収、精製した。塩基配列解析のため、Thermo Sequenase Cy5Dye Terminator Cycle Sequence Kit（Amersham社）を用いた。T7primerを用い、40サイクルで94℃20秒、52℃30秒、72℃80秒で反応させた。シーケンサーはLong-Read Tower（Amersham社）を用いた。
【０１２３】
（ｖ）立体構造予測
上記解析により得られた塩基配列から推測されるアミノ酸配列の一次構造に基づき、AbM (Oxford Molecular、 Oxford、UK)により目的抗体CDR領域のループ構造とFR領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、InsightII/Discover3 (Molecular Simulatoin、USA)により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１２４】
（２）結果
（ｉ）サブグループVkappa2（VK2）特異配列の探索
ヒトκ鎖各germlineリーダー配列の塩基配列を比較した結果を図１７に示した。図１７からわかるように、germline毎での特異配列は見られなかったが、各サブグループ毎での特異配列が見られた。サブグループVK2ではサブグループVkappa1（VK1）に対して下流で、サブグループVkappa3（VK3）はVK1に対して上流で、それ以外のサブグループではVK1に対して全体的に非相同領域が見られた。このことから、リーダー配列に対するプライマーを用いることで、サブグループ選択的にヒト抗体遺伝子を増幅できると考えられた。
【０１２５】
（ｉｉ）サブグループVkappa2（VK2）由来抗体可変領域遺伝子の単離
上記方法に記載のKAP2L primerおよびHuIgkVL3-1primerで増幅したサブグループVK2由来抗体可変領域遺伝子が３クローン得られた。以下、これら３クローンをpHVK-1、pHVK-3、pHVK-4と表記する。図１８にpHVK-1の塩基配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した。図１９にpHVK-3の塩基配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示した。図２０にpHVK-4の塩基配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示した。NCBIのigBLASTによる相同性比較の結果、pHVK-1はgermline A3/A19由来、pHVK-3およびpHVK-4はgermline A18由来と推定された（図２１、図２２および図２３参照）。
【０１２６】
（ｉｉｉ）VIPaseおよびi41SL1-2-Lとの相同性比較
pVHK-1、pVHK-3およびpVHK-4の可変領域のアミノ酸配列と、マウス由来抗体酵素として公知のVIPaseおよびi41SL1-2-Lの軽鎖可変領域のアミノ酸配列との相同性を比較した。結果を図２４に示した。
【０１２７】
図２４から明らかなように、pVHK-1、pVHK-3およびpVHK-4は、VIPaseおよびi41S-L-2と相同性が見られた。VIPaseおよびi41S-L-2での三つ組み残基様構造の構成残基について比較すると、pVHK-1およびpHVK-3ではHis残基の配置が保存されてないのに対し、SerおよびAsp残基の配置は一致した。pHVK-4では、VIPaseおよびi41S-L-2でのS-H-D三つ組み残基様構造の構成残基の配置と一致した。なお、pHVK-3はHisをコードしていなかった。
【０１２８】
（ｉｖ）予測立体構造からの三つ組み残基様構造の探索
pVHK-1、pVHK-3およびpVHK-4のアミノ酸配列に基づいて予測立体構造を構築し、三つ組み残基様構造を探索した。その結果、pHVK-1およびpHVK-4で三つ組み残基様構造が見られた。図２５にpVHK-1のアミノ酸配列に基づく予測立体構造を示した。図２６にpVHK-4のアミノ酸配列に基づく予測立体構造を示した。
【０１２９】
pHVK-1ではVIPaseおよびi41S-L-2とは違う配置での三つ組み残基様構造が見られた。一方、pHVK-4ではVIPaseおよびi41S-L-2と同じ配置での三つ組み残基様構造が見られた。このことから、pHVK-4産物ではVIPaseおよびi41S-L-2と同じ分解活性を持つことが予想された。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明のヒト抗体酵素は、医療業、製薬産業、試薬産業、医療機器産業、食品産業などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】（ａ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−９のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｂ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−１３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｃ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−１８のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｄ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−２２のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｅ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ２−６のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｆ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ２−７のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｇ−１）および（ｇ−２）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ２−８のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｈ）ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ２−１３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｉ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ２−１４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｊ）はヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ３−３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図である。
【図２】（ａ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｂ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ２のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｃ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ３／Ａ１９のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｄ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ５のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｅ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ７のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｆ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１０／Ａ２６のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｇ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１７のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｈ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１８のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｉ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ２３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｊ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ３０のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｋ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＬ１４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｌ）はヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＬ２２のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図である。
【図３】（ａ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ１−２４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｂ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−９のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｃ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−１３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｄ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−１６のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｅ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−２０のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｆ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−３０のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｇ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−３３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｈ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−３５のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｉ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−４３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｊ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−６４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｋ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−７２のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｌ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−７３のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｍ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ３−７４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｎ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ４−３４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図であり、（ｏ）はヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅＶＨ７−８１のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図である。
【図４】Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図５】ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶＬ１に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図６】ヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶＬ３に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図７】Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図８】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶＫ１に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図９】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶＫ２に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１０】Ｓ−Ｈ−Ｄ三つ組み残基様構造を持つヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１１】ヒトＶＨ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅのサブグループＶＨ３に属するｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１２】ｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−１３のアミノ酸配列とヒトＶｌａｍｂｄａ鎖の他のｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列とを比較した図である。
【図１３】ヒト白血球サンプルから単離したヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列とＩｇＢｌａｓｔに登録されているｇｅｒｍｌｉｎｅＶ１−１３の塩基配列とを比較した図である。
【図１４】ヒト白血球サンプルから単離したヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを再構成したｃＤＮＡの５’上流側および３’下流側の塩基配列を示す図である。
【図１５】ヒト白血球サンプルから単離したヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域をコードするｃＤＮＡに基づいて発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図１６】ヒト白血球サンプルから単離したヒトＶｌａｍｂｄａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域をコードするｃＤＮＡに基づいて発現したタンパク質のペプチド分解活性を試験した結果を示す図である。
【図１７】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅリーダー配列の塩基配列を比較した図である。
【図１８】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−１の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−３の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−４の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２１】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−１の塩基配列と、ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ３およびｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１９の塩基配列とを比較した図である。
【図２２】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−３の塩基配列と、ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１８の塩基配列とを比較した図である。
【図２３】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−４の塩基配列と、ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１８の塩基配列とを比較した図である。
【図２４】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンのｐＨＶＫ−１、ｐＨＶＫ−３およびｐＨＶＫ−４の可変領域のアミノ酸配列と、マウス由来抗体酵素であるＶＩＰａｓｅおよびｉ４１ＳＬ１−２−Ｌの軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを比較した図である。
【図２５】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−１のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図である。
【図２６】ヒトＶｋａｐｐａ鎖ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来抗体可変領域遺伝子クローンの１つであるｐＨＶＫ−４のアミノ酸配列に基づく抗体可変領域の予測立体構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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