(57)【要約】      （修正有）【課題】メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物、酵素、その製法、該酵素をコードする核酸を提供すること。【解決手段】ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物およびメタロエンドペプチダーゼの製造方法；メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸；組換えメタロエンドペプチダーゼ；該核酸を含有したメタロエンドペプチダーゼの発現用担体、該核酸を保持した形質転換細胞並びに該形質転換細胞を培養し、メタロエンドペプチダーゼを回収する組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物。
【請求項２】
８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）を培養して培養上清を得ることを特徴とする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法。
【請求項３】
該メタロエンドペプチダーゼが、
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式：
【化１】
2006197802.tif 000009
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
該メタロエンドペプチダーゼが、配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、下記アミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシン及びアラニン、
（２）バリン、イソロイシン及びロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
（４）セリン及びスレオニン、
（５）リジン及びアルギニン、
（６）フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれるものであり、下記式：
【化２】
2006197802.tif 000010
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式：
【化３】
2006197802.tif 000011
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する、メタロエンドペプチダーゼ。
【請求項６】
請求項２〜４いずれか１項に記載の製造方法により得られる、請求項５記載のメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項７】
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、下記式：
【化４】
2006197802.tif 000012
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸。
【請求項８】
請求項７記載の核酸によりコードされる、組換えメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項９】
請求項７記載の核酸を含有してなる、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸を保持してなる形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からメタロエンドペプチダーゼを回収することを特徴とする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタロエンドペプチダーゼを示す培養物、メタロエンドペプチダーゼ、その製造方法、該メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸、該メタロエンドペプチダーゼの発現用担体、形質転換細胞及び組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタロエンドペプチダーゼは、Ｌ−Ｔｒｐメチルエステルを加水分解して、光学活性α−アミノ酸の生成に重要な役割を果たす。
【０００３】
かかるメタロエンドペプチダーゼは、例えば、特定のメタロエンドペプチダーゼが有する特定の基質特異性を利用して、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基がアシル基等で修飾されているポリペプチドからそのアミノ末端ペプチドの単離や、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドおよびそのアミノ末端部の同定等に利用されている（特許文献１を参照のこと）。
【特許文献１】特開平９−２２４６９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、第１の側面は、他のタンパク質分解活性が実質的に検出されないこと、有機溶媒に対する耐性能を有すること、高いメタロエンドペプチダーゼ活性を示すこと、メタロエンドペプチダーゼ活性について、高い比活性を示すこと、酵素としての寿命が長いこと等の少なくとも１つの性質を有する、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物を提供することにある。また、本発明は、第２の側面は、容易に精製できること、大量に製造すること、他にタンパク質分解活性を有する酵素を実質的に伴わないこと等の少なくとも１つを可能にする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法を提供することにある。本発明は、第３の側面では、有機溶媒存在下におけるタンパク質分解活性に基づく反応を行なうこと、タンパク質の解析等の分析のための手段を提供すること、種々のペプチドを製造すること、医薬のための中間体化合物、リード化合物等を製造すること等の少なくとも１つを可能にする、メタロエンドペプチダーゼ又は組換えメタロエンドペプチダーゼを提供することにある。また、本発明は、第４の側面では、前記メタロエンドペプチダーゼを大量に製造すること、異種細胞において、前記メタロエンドペプチダーゼを発現させること、前記メタロエンドペプチダーゼと同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングすること、メタロエンドペプチダーゼの生理活性を向上させること等の少なくとも１つを可能にする、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸を提供することにある。本発明は、第６の側面は、前記メタロエンドペプチダーゼを異種細胞において発現させること等の少なくとも１つを可能にする、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体を提供することに関する。さらに、本発明は、第７の側面では、前記メタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に発現させること、前記メタロエンドペプチダーゼを容易に精製できる状態で発現させること、メタロエンドペプチダーゼの生理活性を向上させること等の少なくとも１つを可能にする、形質転換細胞を提供することにある。本発明は、第８の側面では、容易に精製できること、効率よく製造すること、メタロエンドペプチダーゼの生理活性を向上させること等の少なくとも１つを可能にする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法を提供することにある。本発明の他の課題は、本明細書の以下の記載から明らかに導かれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  ８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物、
〔２〕  ８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）を培養して培養上清を得ることを特徴とする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法、
〔３〕  該メタロエンドペプチダーゼが、
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式：
【０００６】
【化１】
2006197802.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、前記〔２〕載の製造方法、
〔４〕  該メタロエンドペプチダーゼが、配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、下記アミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシン及びアラニン、
（２）バリン、イソロイシン及びロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
（４）セリン及びスレオニン、
（５）リジン及びアルギニン、
（６）フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれるものであり、下記式：
【０００８】
【化２】
2006197802.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチドである、前記〔３〕載の製造方法、
〔５〕  （Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式：
【００１０】
【化３】
2006197802.tif 000004
【００１１】
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する、メタロエンドペプチダーゼ、
〔６〕  前記〔２〕〜〔４〕いずれか１項に記載の製造方法により得られる、前記〔５記載のメタロエンドペプチダーゼ、
〔７〕  （ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、下記式：
【００１２】
【化４】
2006197802.tif 000005
【００１３】
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸、
〔８〕  前記〔７〕記載の核酸によりコードされる、組換えメタロエンドペプチダーゼ、
〔９〕  前記〔７〕記載の核酸を含有してなる、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体、
〔１０〕  前記〔７〕記載の核酸を保持してなる形質転換細胞、
〔１１〕  前記〔１０〕記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からメタロエンドペプチダーゼを回収することを特徴とする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法、
【発明の効果】
【００１４】
本発明の培養物は、他のタンパク質分解活性が実質的に検出されず、有機溶媒に対する耐性能を有し、高いメタロエンドペプチダーゼ活性及び高い比活性を示し、酵素としての寿命が長いという優れた性質を発現する。したがって、本発明の培養物によれば、タンパク質の解析等の分析を行なうことができ、種々のペプチド、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明のメタロエンドペプチダーゼの製造方法によれば、有機溶媒に対する耐性能を有し、特定のアミノ酸配列を認識し、切断するメタロエンドペプチダーゼを、容易に精製することができ、大量に製造することができるという優れた効果を奏する。本発明のメタロエンドペプチダーゼ又は組換えメタロエンドペプチダーゼによれば、有機溶媒存在下におけるタンパク質分解活性に基づく反応を行なうことができ、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチド、例えば、機能性ペプチドの製造、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造を行なうことができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸によれば、前記メタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に製造することができ、異種細胞において、前記メタロエンドペプチダーゼを発現させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸によれば、前記メタロエンドペプチダーゼと同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングすることができる。本発明のメタロエンドペプチダーゼの発現用担体によれば、前記メタロエンドペプチダーゼを異種細胞において発現させることができるという優れた効果を奏する。したがって、前記メタロエンドペプチダーゼの工業的な生産のための手段を提供することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の形質転換細胞によれば、前記メタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に、容易に精製できる状態で発現させることができ、該メタロエンドペプチダーゼを工業的に生産することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法によれば、前記メタロペプチダーゼを、容易に精製でき、効率よく製造することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字又は１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、Ａｌａ又はＡ、アルギニンは、Ａｒｇ又はＲ、アスパラギンは、Ａｓｎ又はＮ、アスパラギン酸は、Ａｓｐ又はＤ、システインは、Ｃｙｓ又はＣ、グルタミン酸は、Ｇｌｕ又はＥ、グルタミンは、Ｇｌｎ又はＱ、グリシンは、Ｇｌｙ又はＧ、ヒスチジンは、Ｈｉｓ又はＨ、イソロイシンは、Ｉｌｅ又はＩ、ロイシンは、Ｌｅｕ又はＬ、リジンは、Ｌｙｓ又はＫ、メチオニンは、Ｍｅｔ又はＭ、フェニルアラニンは、Ｐｈｅ又はＦ、プロリンは、Ｐｒｏ又はＰ、セリンは、Ｓｅｒ又はＳ、スレオニンは、Ｔｈｒ又はＴ、トリプトファンは、Ｔｒｐ又はＷ、チロシンは、Ｔｙｒ又はＹ、バリンは、Ｖａｌ又はＶを示す。
【００１６】
本発明は、１つの側面では、８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、ストレプトマイセス  セプタタス（Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ）  ＴＨ−２〔Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている〕を培養して培養上清として得られる、メタロエンドペプチダーゼ活性を示す培養物に関する。
【００１７】
本発明の培養物は、８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養して培養上清であることに１つの大きな特徴がある。
【００１８】
したがって、本発明の培養物は、メタロエンドペプチダーゼ以外のタンパク質分解活性が実質的に検出されないという優れた性質を発現する。そのため、本発明の培養物は、基質として認識し、切断する化合物の分解により生じる産物にばらつきが実質的に生じないため、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチド、例えば、機能性ペプチド、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造に好適である。また、かかる培養物によれば、後述のメタロエンドペプチダーゼを容易に精製することができる。
【００１９】
また、本発明の培養物によれば、８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養して得られたものであるため、高いメタロエンドペプチダーゼ活性及び比活性を示すという優れた性質を発現する。したがって、さらに精製することなく、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチド、例えば、機能性ペプチド、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造等に用いることができる。
【００２０】
本発明の培養物の製造に用いられる培地としては、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の生育に適した培地であり、炭素源としてグルコースを含有し、無機リン酸を含有するものであればよく、例えば、８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4とを含有し、かつ０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏと０．５重量%  ポリペプトンと０．５重量％  酵母エキスとを含有した培地等が挙げられる。
【００２１】
前記培地中におけるグルコースの含有量は、メタロエンドペプチダーゼ活性の発現を十分に誘導する観点から、好ましくは、８０ｍＭ以上であり、より好ましくは、１００ｍＭ以上であり、該グルコースによるメタロエンドペプチダーゼ活性の発現の誘導能を十分に発揮させる観点から、好ましくは、１６０ｍＭ以下であり、より好ましくは、１２０ｍＭ以下である。
【００２２】
なお、本発明においては、前記グルコースのかわりに、該グルコースの誘導体化合物として、例えば、培地中の他の成分と反応して生じた産物として用いてもよい。かかるグルコースの誘導体化合物としては、例えば、培地とともにオートクレーブすることにより生じる化合物が挙げられる。なお、この場合には、培地へのグルコースの配合量として、メタロエンドペプチダーゼ活性の発現を十分に誘導する観点から、最終濃度が、好ましくは、８０ｍＭ以上、より好ましくは、１００ｍＭ以上、該グルコースによるメタロエンドペプチダーゼ活性の発現の誘導能を十分に発揮させる観点から、好ましくは、１６０ｍＭ以下、より好ましくは、１２０ｍＭ以下となるように配合されていることが望ましい。
【００２３】
前記培地中における無機リン酸の含有量は、例えば、Ｋ2ＨＰＯ4の場合、メタロエンドペプチダーゼ活性の発現を十分に誘導する観点から、好ましくは、１０ｍＭ以上であり、より好ましくは、３０ｍＭ以上であり、該Ｋ2ＨＰＯ4によるメタロエンドペプチダーゼ活性の発現の誘導能を十分に発揮させる観点から、好ましくは、５０ｍＭ以下であり、より好ましくは、５０ｍＭ以下である。
【００２４】
前記Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培養条件としては、該Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２が生育する範囲であれば、特に限定されないが、３０℃前後、例えば、２５〜３４℃で、５日間前後、例えば、３〜５日間培養する条件が挙げられる。なお、前記Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培養は、菌体を良好に生育させる観点から、エアレーションを十分にすることが望ましく、例えば、１２５ｒｐｍで回転振盪させることが望ましい。
【００２５】
本発明の培養物は、前記Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養することにより得られた培養物を、細胞と培地成分とを分離しうる手段、例えば、遠心分離、限外ろ過等に供し、培地上清として得られうる。なお、本発明においては、得られた培養上清を適切な緩衝液等で透析してもよい。
【００２６】
本発明の培養物によるメタロエンドペプチダーゼ活性は、例えば、１００μＭ  ＦＲＥＴＳ−ＧＲＹＦＡ〔D-A2pr(Nma)-Gly-Arg-Tyr-Phe-Ala-Phe-Pro-Lys(Dnp)-D-Arg-D-Arg〕〔Ｄ−Ａ２ｐｒ（Ｎｍａ）−は、側鎖に２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）基を有するＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ａ２ｐｒ）基を示し、Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）は、ε−アミノ基に２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基を有するリジン残基を示す；配列番号：４〕を含有した溶液を、２ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）に溶解した溶液〕中、測定対象となる試料を、３７℃で１分間インキュベーションし、分光蛍光光度計によりλｅｘ  ３４０ｎｍ、λｅｍ  ４４０ｎｍを測定することにより、評価されうる。なお、メタロエンドペプチダーゼの活性の１ユニットは、１分間に１μｍｏｌのＦＲＥＴＳ−ＧＲＹＦＡを消化する酵素量として算出されうる。また、前記メタロエンドペプチダーゼ活性は、例えば、インキュベーション緩衝液〔８ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む０．２Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）中、リゾルフィン標識カゼインと測定対象の試料を、３７℃で１５分間インキュベーションし、その後、得られた産物に、５ｗ／ｖ％  トリクロロ酢酸を添加して、反応を停止させ、上清について、５７４ｎｍの吸収を測定することにより、タンパク質分解活性としても評価されうる。ここで、タンパク質分解活性の１ユニットは、１時間あたり、１μｍｏｌのリゾルフィン〔５２４ｎｍのリゾルフィンの分子減衰係数（εｍＭ＝６．６）〕を遊離した量として定義される。
【００２７】
また、本発明の培養物は、有機溶媒に対して耐性能を示すという優れた性質を発現する。したがって、本発明の培養物によれば、有機溶媒を用いた反応系において、メタロエンドペプチダーゼ活性に基づく反応を行なうことができる。そのため、例えば、一連の反応を有機溶媒中で行なう必要がある化合物の製造等にも用いることができる。
【００２８】
本発明は、他の側面では、８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養して培養上清を得ることを特徴とする、メタロエンドペプチダーゼの製造方法に関する。
【００２９】
本発明のメタロエンドペプチダーゼの製造方法は、本発明の培養物と同様の培養条件下にＳ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養して培地上清を得ることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法によれば、前記培地上清中に、メタロエンドペプチダーゼ以外のタンパク質分解活性が実質的に検出されないため、該メタロエンドペプチダーゼを、容易に精製することができる。
【００３０】
また、本発明の製造方法によれば、前記培地上清におけるメタロエンドペプチダーゼが前記培養条件下での培養により増加しているため、容易に、かつ大量に効率よくメタロエンドペプチダーゼを得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００３１】
本発明の製造方法としては、具体的には、例えば、
Ｉ）  ８０〜１６０ｍＭ  グルコースと、１０〜５０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4との存在下に、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養して培養上清を得る工程、
ＩＩ）前記工程ＩＩ）で得られた培養上清を、例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、得られた産物を、前記緩衝液で平衡化された適切なイオン交換クロマトグラフィー、例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｖｉｖａｐｕｒｅ−Ｑスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製、プロダクト番号：ＶＳ−ＩＸ２０ＱＨＧＰ）に供し、例えば、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有した２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出する工程、
ＩＩＩ）前記工程ＩＩ）で得られた画分を、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、得られた産物を、ハイドロキシアパタイトカラムに供して、１０〜４００ｍＭ  リン酸カリウムのリニアグラジェントで、２００ｍＭ  リン酸カリウムの溶出画分として、メタロエンドペプチダーゼを含む画分を得る工程、及び
ＩＶ）前記工程ＩＩＩ）で得られた画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に対して透析し、前記緩衝液で平衡化された適切なイオン交換クロマトグラフィー、例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラム〔アマシャム  バイオテック社製〕に供して、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジェントで溶出し、１１５ｍＭの溶出画分として、メタロエンドペプチダーゼを含む画分を得る工程、
を含む方法等が挙げられる。なお、前記各工程において、メタロエンドペプチダーゼの活性測定は、前記と同様の手法により行なわれうる。また、各工程の間に必要に応じて、透析後の画分について、４０００×ｇで１０分間の遠心分離に供してもよい。
【００３２】
かかる製造方法により得られるメタロエンドペプチダーゼも本発明に含まれる。
【００３３】
本発明は、別の側面では、前記メタロエンドペプチダーゼに関する。
【００３４】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、より具体的には、以下の１．〜６．の性質を示す。
【００３５】
１．分子量
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、１２．５重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより算出された分子量が、約３５ｋＤで、リン酸緩衝化生理的食塩水で平衡化された商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム〔アマシャム  バイオテック社製〕を用いたゲル濾過法（流速０．５ｍｌ／分、カラムサイズ：１ｃｍ（内径）×３０ｃｍ）により算出された分子量が、約４０ｋＤであり、単量体である。
【００３６】
２．分子中の金属イオンの存在
本発明のメタロエンドペプチダーゼ１分子あたり、０．９亜鉛分子を有する。
【００３７】
３．インヒビターの影響
ＥＤＴＡ及びホスホルアミドンにより阻害される。
【００３８】
４．反応至適ｐＨ
ｐＨ５〜８、好ましくは、ｐＨ５．５〜７であり、特にｐＨ６．０付近で活性が最大になる
【００３９】
５．金属イオンの影響
１）  ２ｍＭ  カルシウム存在下で、至適反応温度の範囲の上限が約１０℃上昇し、カルシウム非存在下かつ１５℃でインキュベーションした場合の活性に対して、約１００％の相対活性の熱安定性を示す範囲の上限が約１０℃上昇する。
２）  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣｏＣｌ2、２ｍＭ  ＮｉＳＯ4、２ｍＭ  ＦｅＳＯ4及び２ｍＭ  ＺｎＳＯ4の存在下では、活性が増加せず、特に、２ｍＭ  ＮｉＳＯ4、２ｍＭ  ＦｅＳＯ4及び２ｍＭ  ＺｎＳＯ4の添加により、最大活性の２０％未満まで活性が減少する。
【００４０】
６．基質特異性
１）  前記メタロペプチダーゼ活性の測定法の条件下において、前記配列番号：３に示される基質について、Ｐ１位において、Ｐｈｅ残基、Ｌｅｕ残基、Ｔｙｒ残基、Ｍｅｔ残基、Ｔｈｒ残基及びＡｌａ残基の順で選択性があり、Ｐ２位における疎水性又は塩基性の残基及びＰ３位における塩基性又は小さい残基に選択的であり、Ｐ２及びＰ３位における酸性残基に選択的でない。具体的には、Ｐ２位において、Ａｌａ残基、Ａｒｇ残基、Ｖａｌ残基、Ｐｈｅ残基及びＬｙｓ残基に対する選択性、Ｐ３位において、Ａｒｇ残基、Ｖａｌ残基及びＡｌａ残基に対する選択性を示す。
２）  前記ＦＲＥＴＳ−ＧＲＹＦＡに対し、Ｋm値：５．０±１．６μＭ、ｋcat値：５．０±１．０（１／秒）、ｋcat／Ｋm：１．０±０．３０（１／秒・１／μＭ）。
【００４１】
また、本発明のメタロエンドペプチダーゼは、有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、エチレングリコール等、の存在下でもタンパク質分解活性、メタロエンドペプチダーゼ活性を示し、有機溶媒に対する耐性能を示す。したがって、本発明のメタロエンドペプチダーゼによれば、有機溶媒存在下におけるタンパク質分解活性に基づく反応を行なうことができ、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチド、例えば、機能性ペプチドの製造、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造を行なうことができる。
【００４２】
本発明のメタロエンドペプチダーゼとしては、より具体的には、
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有し、かつ下記式：
【００４３】
【化５】
2006197802.tif 000006
【００４４】
（式中、Ｘａａは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、メチオニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基、イソロイシン残基、リジン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、トリプトファン残基、バリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｙａａは、プロリン残基、チロシン残基、リジン残基、イソロイシン残基又はアスパラギン酸残基を示し、Ｚａａは、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基又はグルタミン酸残基、アルギニン残基を示す）
に示される配列（配列番号：３）を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用するポリペプチド等が挙げられる。
【００４５】
前記（Ａ）において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２のメタロエンドペプチダーゼのアミノ酸配列である。
【００４６】
また、本発明においては、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に、前記配列番号：３に示されるアミノ酸配列（認識配列）を認識し、該アミノ酸配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性、具体的には、該ペプチド結合を切断する活性を少なくとも示すものであれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼには、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列のバリアントの配列を有するポリペプチドも含まれる。前記配列番号：２に示され
るアミノ酸配列のバリアントとしては、前記（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列が挙げられる。また、後述の核酸によりコードされるポリペプチドであって、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に、前記認識配列を認識し、切断する活性を示すものであれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼに含まれる。
【００４７】
前記アミノ酸配列のバリアントの天然の供給源となる生物は、特に限定されるものではなく、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓに分類される他の株等が挙げられる。
【００４８】
前記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列番号：２に示される配列におけるアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加（以下、「変異」ともいう）の数は、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に、前記認識配列を認識し、切断する活性を示す範囲であればよく、少なくとも１個、好ましくは、１個〜複数個、より好ましくは、１個〜数個である。前記変異を有するアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に、所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に、所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する配列番号：２に示される配列のバリアントに準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異の導入は、例えば、慣用のＰＣＲを用いた部位特異的変異導入方法等により行なわれうる。
【００４９】
前記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、類似した物理学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換（保存的置換）されたアミノ酸配列が挙げられる。前記保存的置換は、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等に類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換、本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換等が挙げられる。より具体的には、前記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、下記アミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシン及びアラニン、
（２）バリン、イソロイシン及びロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
（４）セリン及びスレオニン、
（５）リジン及びアルギニン、
（６）フェニルアラニン及びチロシン
からなる群より選ばれたアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行なわれたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
【００５０】
前記（Ｃ）において、前記配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、本明細書においては、前記配列同一性は、商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発株式会社製）によるマルチプルアラインメントにおいて使用可能なアルゴリズムをデフォルト値、より具体的には、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎによるＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  １〜２（アミノ酸配列ベース）、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で用いて、算出された値である。
【００５１】
本発明においては、前記配列同一性は、少なくとも７５％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００５２】
また、本発明のメタロエンドペプチダーゼは、自己消化を実質的にうけにくいという優れた性質を有し、例えば、サーモライシンに比べ、より酵素としての寿命が長いという優れた性質を発現する。したがって、使用時に安定的に保存できる。
【００５３】
本発明は、別の側面では、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示される配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ２、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、前記配列番号：３を認識し、該配列番号：３のアミノ酸番号：４のアミノ酸残基とアミノ酸番号：５のアミノ酸残基との間のペプチド結合に作用する活性を有する、メタロエンドペプチダーゼをコードする核酸に関する。
【００５４】
本発明の核酸によれば、前記メタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に製造することができる。また、本発明の核酸によれば、Ｓ.ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２とは異なる異種細胞において、前記メタロエンドペプチダーゼを発現させることができる。
【００５５】
前記（ａ）〜（ｂ）の塩基配列は、それぞれ、前記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
【００５６】
前記（ｃ）の「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェントな条件、好ましくは、高ストリンジェントな条件をいう。前記「ストリンジェントな条件」としては、より具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５重量％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡと５０体積％  ホルムアミドとを含む溶液中、室温、よりストリンジェントには、４５℃、よりストリンジェントには、６０℃で１２時間インキュベーションし、より低イオン強度、例えば、０．５×ＳＳＣ、好ましくは、０．２×ＳＳＣ、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、５０℃以上、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下で洗浄等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。また、本発明においては、前記配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、該核酸によりコードされるアミノ酸配列に関して、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも７５％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、特に好ましくは９８％以上であり、該核酸の塩基配列に関して、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列との配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、特に好ましくは９５％以上となる核酸との特異的なハイブリダイゼーションが達成されうる条件であることが望ましい。
【００５７】
なお、本明細書においては、塩基配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ  ６、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  ２．０、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １４、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ２の条件で算出された値である
【００５８】
また、本発明の核酸に基づき、前記メタロエンドペプチダーゼと同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングするための、プローブ及びプライマー対も提供できる。
【００５９】
前記プローブとしては、本発明の核酸若しくはそのアンチセンス鎖の全部又は一部が挙げられる。本発明の核酸の一部又はアンチセンス鎖の一部としては、例えば、前記配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸又はそのアンチセンス鎖の塩基配列（例えば、配列番号：１の塩基配列等）と、公知のデータベースの塩基配列とを比較して、例えば、３０％以下、好ましくは、２０％以下、より好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、０％の配列同一性を示す領域中の少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは、１８ヌクレオチド長以上であり、配列番号：１に示される塩基配列よりも短い長さである塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００６０】
前記プライマー対としては、本発明の核酸の塩基配列における連続した少なくとも９ヌクレオチド、好ましくは、連続した９〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、連続した１２〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、本発明の核酸の塩基配列中、前記オリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド残基離れたヌクレオチド残基を含む塩基配列に対応し、かつ連続した少なくとも９ヌクレオチド、好ましくは、連続した９〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、連続した１２〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対等が挙げられる。なお、前記プライマー対は、二次構造の形成、Ｔｍ値等を考慮し、慣用のプライマー設計用ソフトウェア等により、本発明のメタロエンドペプチダーゼに特有のアミノ酸配列を含有した領域、本発明の核酸に特有の塩基配列を含有した領域等を増幅するに適したプライマー対として設計されうる。
【００６１】
さらに、本発明の核酸によれば、前記メタロエンドペプチダーゼと同等の生理活性を示すアイソザイムを、Ｓ.ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２以外の生物から、スクリーニングすることができる。アイソザイムのスクリーニングは、本発明の核酸、前記プローブ又は前記プライマー対を用い、Ｓ.ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２以外の生物由来の核酸中の本発明の核酸、該プローブに対応する領域、該プライマー対を用いて得られたＰＣＲ増幅産物に対応する領域等を検出し、ついで、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法により、メタロエンドペプチダーゼ活性を検出できるポリペプチドをコードする核酸をスクリーニングすることにより行なわれうる。
【００６２】
特に、本発明の核酸及び前記プローブを用いる場合、被験試料として、例えば、生物の細胞や微生物のコロニー等の試料、該試料から抽出された核酸を膜上に固定したもの、該試料から抽出された核酸等が用いられうる。本発明の核酸又は前記プローブを用いる場合、上記のストリンジェント条件でハイブリダイゼーションを行なうことにより、アイソザイムをコードする核酸をスクリーニングできる。一方、プライマーを用いる場合、被験試料として、例えば、細胞、該細胞由来の抽出物等の試料が用いられうる。なお、ＰＣＲの際の鋳型となる核酸を損なわない範囲で前記試料中の他の成分を除去する操作を行なってもよい。かかるスクリーニングには、核酸を固定するための膜やハイブリダイゼーション緩衝液等に代表されるハイブリダイゼーション用の各種試薬、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用緩衝液等に代表されるＰＣＲ用試薬、プローブや増幅されたＤＮＡを検出するための試薬や微生物増殖用の培地、試料より核酸を抽出するための試薬等を適宜用いうる。
【００６３】
本発明は、他の側面では、本発明の核酸によりコードされる、組換えメタロエンドペプチダーゼに関する。
【００６４】
本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼによれば、有機溶媒存在下におけるタンパク質分解活性に基づく反応を行なうことができ、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチド、例えば、機能性ペプチドの製造、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造を行なうことができるという優れた効果を奏する。
【００６５】
本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼは、以下の製造方法により得られうる。
【００６６】
また、本発明は、別の側面では、本発明の核酸を含有した、メタロエンドペプチダーゼの発現用担体に関する。本明細書において、「発現用担体」とは、慣用の生物ベクター等を基本骨格として含有し、かつ適切な位置に本発明の核酸が作動可能に連結された核酸構築物；金粒子、リポソーム、デキストラン、リン酸カルシウム等の担体に、細胞内での発現に適したエレメント等を有する本発明の核酸を担持させた構築物等を意味する。
【００６７】
本発明のメタロエンドペプチダーゼの発現用担体によれば、前記メタロエンドペプチダーゼを、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２以外の細胞に導入することができ、それにより、異種細胞において、本発明のメタロエンドペプチダーゼを発現させることができる。したがって、本発明のメタロエンドペプチダーゼの工業的な生産のための手段を提供することができる。
【００６８】
前記生物ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＴｋｍＳ２〔ミシマ（Ｍｉｓｈｉｍａ  Ｎ．）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．第１３巻、８６４−８６８（１９９７）〕、ｐＯＭａｌ〔ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）等の大腸菌用プラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１等の大腸菌用ファージベクター；ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＩＣＺα（インビトロジェン社製）等の酵母用ベクター；ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ等の昆虫細胞用ベクター；ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４等の動物細胞用ベクター等が挙げられる。かかるベクターには、適切なプロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター等）、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等のエレメントを適宜有していてもよい。
【００６９】
また、前記ベクターは、本発明のメタロエンドペプチダーゼを、慣用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ等）や融合パートナー（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等）と融合した状態で発現させうるベクターであってもよい。
【００７０】
本発明は、さらに別の側面では、本発明の核酸を保持した形質転換細胞に関する。本発明の形質転換細胞は、本発明のメタロエンドペプチダーゼの発現用担体を適切な宿主に導入することにより得られる。
【００７１】
本発明の形質転換細胞によれば、本発明の前記メタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に、容易に精製できる状態で発現させることができ、それにより、該メタロエンドペプチダーゼを工業的に生産することができる
【００７２】
前記宿主としては、大腸菌、酵母（例えば、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａ等）、枯草菌等が挙げられる。
【００７３】
また、宿主への本発明の発現用担体の導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクル銃によるボンバードメント法等が挙げられる。
【００７４】
宿主への本発明の発現用担体の導入により得られた細胞が、目的の形質転換細胞であることは、細胞又は該細胞の培養上清について、前記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法により、前記メタロエンドペプチダーゼ活性が検出されることを指標として、確認されうる。
【００７５】
本発明は、さらに別の側面では、本発明の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からメタロエンドペプチダーゼを回収することを特徴とする組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法に関する。
【００７６】
本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法によれば、本発明の形質転換細胞が用いられているため、前記メタロペプチダーゼを、容易に精製でき、効率よく製造することができるという優れた効果を奏する。
【００７７】
本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼの製造方法においては、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等について、メタロエンドペプチダーゼの発現の最適な条件を決定することによって、効率よく組換えメタロエンドペプチダーゼを生産させることができる。
【００７８】
形質転換細胞の培養物からメタロエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換細胞が大腸菌のように細胞内にメタロエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法の他、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換細胞によっては発現産物が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行なえばよい。
【００７９】
形質転換細胞が生産する組換えメタロエンドペプチダーゼは、それが細胞内に生産されるときは細胞内の他のタンパク質、他のポリペプチド等が共存するが、これらは発現されるメタロエンドペプチダーゼの量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、メタロエンドペプチダーゼが菌体外に分泌される。
【００８０】
本発明のメタロエンドペプチダーゼ又は本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼを用い、例えば、カレント  プロトコルズ  イン  イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）〔ジョン  Ｅ．コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、１９９２年、ジョンワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｅｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ）発行〕等に記載の方法に準じて、適切な動物を免疫することにより、本発明のメタロエンドペプチダーゼ又は本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼに対するモノクローナル抗体又はその抗体断片を得ることができる。前記抗体としては、本発明のメタロエンドペプチダーゼ又は本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が挙げられる。かかる抗体又はその抗体断片によれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼ又は本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼのアフィニティー精製、検出、機能阻害等が可能になる。前記抗体断片としては、モノクローナル抗体を、例えば、パパインで消化することにより得られるＦａｂフラグメント、モノクローナル抗体を、例えば、ペプシンで消化することにより得られるＦ（ａｂ’）2フラグメント等が挙げられる。
【００８１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ（Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ）  ＴＨ−２の培地上清中にタンパク質分解活性が見出された。かかる培地上清中に見出されるタンパク質分解活性について、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を、５００ｍＬ容バッフルフラスコにおいて、炭素源と窒素源と０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏと０．５重量%  ポリペプトンと０．５重量％  酵母エキスとを含む培地  ５０ｍＬ中、３０℃で５日間、１２５ｒｐｍで回転振盪させながら培養し、炭素源及び無機リン酸による影響を調べた。
【００８３】
また、タンパク質分解活性を、以下のように決定した。１．５ｍＬ容試料チューブ中、基質溶液［ユニバーサルプロテアーゼ基質〔リゾルフィン標識カゼイン、ロシュ  モレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕、４ｍｇ／ｍＬ  水］  ５０μＬと、インキュベーション緩衝液〔８ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む０．２Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）〕  ５０μＬと測定対象の試料溶液  １００μＬとを混合し、得られた反応混合物を、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、前記混合物に、５ｗ／ｖ％  トリクロロ酢酸  ４８０μＬを添加することにより反応を停止させた。ついで、前記混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションし、ついで、２００００×ｇ、５分間で遠心分離した。得られた上清  ４００μＬと、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）  ６００μＬとをピペットでとり、１．５ｍＬ容キュベットに入れ、混合した。その後、試料の代わりに蒸留水を反応混合物に添加したブランクに対して、その５７４ｎｍの吸収を直ちに測定した。なお、タンパク質分解活性の１ユニットは、アッセイ条件下で１時間あたり、１μｍｏｌのリゾルフィンを遊離した量として定義した。また、５２４ｎｍのリゾルフィンの分子減衰係数（εｍＭ＝６．６）を、タンパク質分解活性を算出するのに用いた。また、タンパク質量を、タンパク質アッセイキット〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いて、製造者の説明書に従って、測定した。
【００８４】
その結果、炭素源のなかでも、グルコースを含む培地でＳ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を培養した場合、フルクトース等の他の炭素源を含む培地で培養した場合に比べ、培地上清中に見出されるタンパク質分解活性が高くなることがわかった。
【００８５】
ついで、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培地上清中のタンパク質分解活性に対するグルコース及びＫ2ＨＰＯ4の影響を調べた。その結果を図１に示す。
【００８６】
図１に示されるように、培地中におけるグルコース含有量の増加により、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培地上清中に見出されるタンパク質分解活性が増加した。また、２．０重量％  グルコースと０．８重量％  Ｋ2ＨＰＯ4とを含む培地を用いた場合、培地上清の比活性及びＳＳＭＰ含有量が最も高かった。したがって、以下の実施例において、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培養には、培地〔組成：２．０重量%（１１０ｍＭ）  グルコース、０．８重量％（４５ｍＭ）  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量%  ポリペプトン、０．５重量％  酵母エキス、残部水〕を用いた。
【００８７】
また、前記培養上清について、リゾルフィンカゼインの分解活性を調べた。その結果、前記培養上清中には、タンパク質分解活性を示す酵素は１種類しか見出されなかった。したがって、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２により、工業的に、タンパク質分解活性を示す酵素を製造できることが示唆された。
【実施例２】
【００８８】
Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２を、５００ｍＬ容バッフルフラスコにおいて、培地〔組成：２．０重量%（１１０ｍＭ）  グルコース、０．８重量％（４５ｍＭ）  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量%  ポリペプトン、０．５重量％  酵母エキス、残部水〕  ５０ｍＬ中、３０℃で５日間、１２５ｒｐｍで回転振盪させながら培養し、培養物を得た。
【００８９】
なお、以下の操作について、特に言及しない限り、全ての実験を４℃で行なった。また、タンパク質分解活性の測定は、前記実施例と同様に行なった。
【００９０】
前記培養物  ２０ｍＬを、限外ろ過装置（ミリポア社製、０．４５μｍ孔径）に供して、培地ろ過物を得た。得られたろ過物を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。
【００９１】
透析後に得られた産物を、７４００×ｇで１０分間で遠心分離した。得られた試料を、前記２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：Ｖｉｖａｐｕｒｅ−Ｑスピンカラム〔Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製〕に供し、ついで、前記カラムに結合したタンパク質を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有した２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で溶出させた。得られた溶出液を、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。
【００９２】
透析後に得られた産物を、７４００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清を、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した商品名：バイオスケールＣＨＴ２−Ｉハイドロキシアパタイトカラム〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製；０．７ｃｍ（内径）×５．２ｃｍ、流速：１ｍｌ／分〕に供し、１０ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）によるリニアグラジェントによる溶出により、２００ｍＭ  リン酸カリウムの溶出画分として、高いタンパク質分解活性を有する画分を得た。得られた画分を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に対して透析した。
【００９３】
透析後に得られた産物を、７４００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で予め平衡化した商品名：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラム〔アマシャム  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製；０．５ｃｍ（内径）×５ｃｍ、流速：１ｍｌ／分〕に供し、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジェントで溶出し、１１５ｍＭの溶出画分として高いタンパク質分解活性を有する画分を得た。
【００９４】
Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２の培地上清からのタンパク質分解活性を有する酵素の精製表を表１に示す。
【００９５】
また、商品名：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラムに供した後に得られた画分について、１２．５重量％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用ゲル〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕に供した。その結果を図２に示す。
【００９６】
【表１】
2006197802.tif 000007
【００９７】
表１及び図２に示されるように、タンパク質分解活性を有する酵素を、培養濾過物（培地上清）  ２０ｍＬから３ステップ手順により、純度２．２倍、収率１６．６％で、均一に精製することができた。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、前記タンパク質分解活性を有する酵素は、約３５ｋＤの分子量を有することがわかった。
【００９８】
さらに、前記商品名：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラムに供した後に得られた画分を、リン酸緩衝化生理的食塩水で平衡化された商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム〔アマシャム  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕に供した。なお、分子量マーカーとして、ゲル濾過用タンパク質分子マーカー.（オリエンタル酵母株式会社製）を用いた。
【００９９】
その結果、タンパク質分解活性を有する酵素は、分子量約４０ｋＤの単量体であることがわかった。
【実施例３】
【０１００】
（１）タンパク質分解活性を有する酵素に対するインヒビターの影響
前記実施例２で得られた酵素を、２４μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調整し、酵素溶液を得た。得られた酵素溶液  ２０μＬと、インヒビター溶液［プロテアーゼインヒビターセット〔ロシュ  モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)〕］  ５μＬと、８ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む０．２Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）  １２．５μＬとを混合し、３７℃で１０分間インキュベーションした。ついで、得られた混合物に、ユニバーサル基質溶液（Ｈ2Ｏ中、４ｍｇ／ｍＬ）  １２．５μＬを添加し、得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。その後、得られた産物を、３０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を得た。得られた上清  １００μＬと０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）  １５０μＬとを、９６ウェルマイクロプレートのウェルに添加し、混合した。
【０１０１】
その後、得られた混合物について、残存活性を、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍでプレート中の溶液の吸収を測定することにより、決定した。その結果を、表２に示す。
【０１０２】
【表２】
2006197802.tif 000008
【０１０３】
表２に示されるように、前記実施例２で得られた酵素は、ＥＤＴＡ及びホスホルアミドンにより特に阻害された。これは、かかる酵素がメタロエンドペプチダーゼファミリーに属することを示す。以下、かかるＳ．ｓｅｐｔａｔｕｓ由来のメタロエンドペプチダーゼをＳＳＭＰともいう。
【０１０４】
（２）ＳＳＭＰ中の亜鉛量の解析
原子吸光分析法による、ＳＳＭＰに存在する亜鉛の解析を行なった。その結果、１酵素分子あたり、０．９亜鉛分子が測定された。
【０１０５】
（３）ＳＳＭＰのタンパク質分解活性へのｐＨの影響
前記実施例１におけるタンパク質分解活性の測定において、インキュベーション緩衝液に用いる緩衝液として、ｐＨ５．３、ｐＨ５．５、ｐＨ５．８、ｐＨ６．１及びｐＨ６．５それぞれの酢酸緩衝液、ｐＨ６．０、ｐＨ６．３、ｐＨ６．８、ｐＨ７．１及びｐＨ７．４それぞれのリン酸カリウム緩衝液並びにｐＨ７．０、ｐＨ７．２、ｐＨ７．６、ｐＨ７．９及びｐＨ８．２それぞれのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ＳＳＭＰのタンパク質分解活性を測定した。結果を、図３に示す。なお、図３中、相対活性は、最も高い活性を示したｐＨにおける活性を１００として算出した値により示した。
【０１０６】
その結果、図３に示されるように、活性は、ｐＨ６．０付近で至適化され、弱酸性条件下で最大であった。
【０１０７】
（４）ＳＳＭＰのタンパク質分解活性へのカルシウムイオンの影響
ＳＳＭＰ活性及び安定性へのカルシウムイオンの影響を調べた。
【０１０８】
ＳＳＭＰ溶液（２４μｇ／ｍＬ）  ２０ｍＬを、０〜１０ｍＭ  カルシウム存在下に、３７℃で５分間プレインキュベーションした。ついで、得られた混合物を用い、前記実施例１のタンパク質分解活性の測定と同様に、活性を測定した。図４のパネル（Ａ）に結果を示す。なお、相対活性は、カルシウム非存在下の場合の活性を、１００として算出した値で示す。
【０１０９】
図４のパネル（Ａ）に示されるように、カルシウムの最終濃度が、２ｍＭを超えた場合、ＳＳＭＰ活性は、阻害された。
【０１１０】
また、ＳＳＭＰ溶液（２４μｇ／ｍＬ）  ２０ｍＬを、最終濃度２ｍＭ  カルシウム存在下に、３７℃で５分間プレインキュベーションした。ついで、得られた混合物を用い、前記実施例１のタンパク質分解活性の測定と同様に、活性を測定した。図４のパネル（Ｂ）に結果を示す。なお、相対活性は、至適温度における活性を１００として算出した値で示す。
【０１１１】
さらに、ＳＳＭＰ溶液の濃度を、０．１ｍｇ  タンパク質／ｍＬの濃度に調整した。前記ＳＳＭＰ溶液を、サーマルサイクラー（タカラバイオ社製、商品名：ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  サーマルサイクラーＭＰ）を用いて、最終濃度２ｍＭ  カルシウム存在下又は非存在下に、１５〜８０℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、残存活性を、タンパク質分解活性から決定した。結果を図４のパネル（Ｃ）に示す。なお、残存活性は、１５℃でのインキュベーションの場合の活性を１００として算出した値で示す。
【０１１２】
その結果、図４のパネル（Ｂ）及びパネル（Ｃ）に示されるように、カルシウムの存在により、カルシウム非存在下での至適温度及び熱安定性に比べ、至適温度及び熱安定性が約１０℃シフトした。なお、同条件下、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣｏＣｌ2、２ｍＭ  ＮｉＳＯ4、２ｍＭ  ＦｅＳＯ4及び２ｍＭ  ＺｎＳＯ4を用いても活性の増加は見られなかった。特に、２ｍＭ  ＮｉＳＯ4、２ｍＭ  ＦｅＳＯ4及び２ｍＭ  ＺｎＳＯ4の添加により、最大活性の２０％未満まで活性が減少した。
【実施例４】
【０１１３】
（１）蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴＳ）コンビナトリアルライブラリーによる基質特異性の解析
ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー〔ペプチド研究所製〕は、図５に示される構造を有し、アミノ末端Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ａ２ｐｒ）残基の側鎖に結合した高い蛍光２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）基を含み、Ｌｙｓのε−アミノ基に連結した２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基により効率よく消光するという性質を有する基質のライブラリーである。
【０１１４】
図５に示されるＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー（４７５ペプチド基質の全て）と、２ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）と、実施例２で得られた精製ＳＳＭＰ  ５０ｎｇとを混合し、３７℃でインキュベーションし、λｅｘ  ３５５ｎｍ及びλｅｍ  ４６０ｎｍでの蛍光強度の増加について、商品名：ＡＲＶＯ  １４２０マルチラベルカウンター〔パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製〕を用いて、モニターした。なお、ＸａａがＧｌｙであるＦＲＥＴＳ−２５Ｇｌｙの２種の分解産物を用いて、検量線を作成し、該検量線に基づき、ＳＳＭＰのＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａに対する基質特異性を評価した。結果を図６に示す。
【０１１５】
その結果、図６に示されるように、基質中のＰ１位（図５中、Ｘａａ）におけるアミノ酸残基について、ＳＳＭＰは、Ｐ１位において、降順で、Ｐｈｅ残基、Ｌｅｕ残基、Ｔｙｒ残基、Ｍｅｔ残基、Ｔｈｒ残基及びＡｌａ残基に選択性があった。
【０１１６】
ついで、二次スクリーニングのために最もよい基質として、Ｘａａが、Ｐｈｅ残基であるＦＲＥＴＳ−２５Ｐｈｅと、２ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）と、２００ｎｇの精製ＳＳＭＰ  ２００ｎｇとを混合し、３７℃で５分間インキュベーションし、ついで、ＥＤＴＡを反応混合物に添加して、反応を停止させ、基質の切断速度を商品名：ＡＲＶＯ  １４２０マルチラベルカウンター〔パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製〕で測定した。これにより、基質中のＰ２位（図５中、Ｙａａ）及びＰ３位（図５中、Ｚａａ）に対するＳＳＭＰによる選択性を調べた。なお、ＸａａがＧｌｙであるＦＲＥＴＳ−２５Ｇｌｙの２種の分解産物を用いて、検量線を作成し、該検量線に基づき、ＳＳＭＰのＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａに対する基質特異性を評価した。
【０１１７】
その結果、得られた産物は、反応前の試料に比べ、約１５％まで消化された。また、得られた産物を、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）に供し、ＳＳＭＰにより消化されたＦＲＥＴＳ−２５Ｐｈｅ由来の配列を同定した。
【０１１８】
図７に示されるように、ＳＳＭＰは、Ｐ２位のＴｙｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＬｙｓに対する選択性並びにＰ３位のＡｒｇ、Ｖａｌ及びＡｌａに対する選択性を示した。すなわち、ＳＳＭＰは、Ｐ２位における疎水性又は塩基性の残基及びＰ３位における塩基性又は小さい残基に選択的であり、ＳＳＭＰは、Ｐ２及びＰ３位における酸性残基に選択的でないことがわかる。 
【０１１９】
（２）反応速度論的解析
前記（１）の結果に基づき、コンセンサス基質：
D-A2pr(Nma)-Gly-Arg-Tyr-Phe-Ala-Phe-Pro-Lys(Dnp)-D-Arg-D-Arg
（ＦＲＥＴＳ−ＧＲＹＦＡ；配列番号：４）をデザインし、合成した。２ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）で、前記コンセンサス基質を、１．６〜１００μＭとなるように希釈し、各基質溶液  ４９０μＬを得た。得られた希釈溶液  ４９０μＬを、３７℃で５分間プレインキュベーションした。精製ＳＳＭＰ（２．５ｎｇ／μＬ）  １０μＬを前記基質溶液に添加し、ついで、得られた混合物を、３７℃で１分間インキュベーションした。なお、サーマルセルホルダーに設置した前記混合物について、Ｈｉｔａｃｈｉ分光蛍光光度計Ｆ−４５００を用い、λｅｘ  ３４０ｎｍ、λｅｍ  ４４０ｎｍを測定した。反応速度は、Ｎｍａ溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。
【０１２０】
その結果、前記コンセンサス基質に対するＫm、ｋcat及びｋcat／Ｋmは、それぞれ、５．０±１．６μＭ、５．０±１．０（１／秒）及び１．０±０．３０（１／秒・１／μＭ）であった。
【実施例５】
【０１２１】
（１）ＳＳＭＰのＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列の決定
前記実施例２で得られた精製ＳＳＭＰを、１２．５重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ついで、得られたゲル中のタンパク質を、商品名：トランスブロットＳＤセル〔バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製〕を用い、製造者の説明書に準じて、商品名：シーケブロットＰＶＤＦ〔バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製〕にエレクトロブロッティングした。ブロットされたＳＳＭＰについて、プロテインシークエンサーに供して、Ｎ末端アミノ酸配列を同定した。また、ＳＳＭＰを、トリプシンで処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、ＬＣ−ＭＳにより解析し、内部アミノ酸配列を同定した。なお、アミノ酸配列の解析において、Ｉｌｅ及びＬｅｕは、同じ分子量のため、互いに区別できなかった。Ｇｌｎ及びＬｙｓは、分子量がほぼ等しいため、互いに区別化できなかった。
【０１２２】
その結果、ＳＳＭＰのＮ末端アミノ酸配列は、GTGTSTYSGNVPLTT（配列番号：５）であった。下線部の配列を用いて、センスプライマーを作製した。また、ＳＳＭＰの内部アミノ酸配列は、TGSGF(Q/K)(I/L)EDGAR（配列番号：６）、TYNSPTYDNSK（配列番号：７）TTYFTSTTNYK（配列番号：８）及びAATWTA(I/L)NVK（配列番号：９）であった。下線部の配列を用いて、アンチセンスプライマーを作製した。
【０１２３】
（２）インバースＰＣＲによるｓｓｍｐ遺伝子のクローニング
ゲノムＤＮＡを、ホップウッド（Ｄ．Ａ  Ｈｏｐｗｏｏｄ）らの方法〔Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５年、第７０頁−第８４頁〕に準じて、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２から調製した。
【０１２４】
ＳＳＭＰのＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列からデザインした２つの縮重プライマー（各４μＭ）：
5’-GG(GC)AACGT(GC)CC(GC)CT(GC)AC(GC)AC-3’（配列番号：１０）、及び
5’-TCGTA(GC)GT(GC)GG(GC)(GC)(AT)GTTGTA-3’（配列番号：１１）
と、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲシステム〔ロシュ  モレキュラーバイオケミカル(Roche Molecular Biochemicals)社製〕と、０．５Ｍ  ＧＣ−ＲＩＣＨリゾルーションソルーション（商品名）とを用い、前記Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行ない、ｓｓｍｐ遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅した。前記ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃で３分インキュベーションし、９５℃で３０秒と５４℃で３０秒と７２℃で４５秒とからなる反応を１０サイクル、９５℃で３０秒と、５４℃で３０秒と７２℃で４５秒（ただし、１サイクル毎に５秒延長）とからなる反応を２０サイクル、７２℃で７分間の伸長を行なう条件とした。
【０１２５】
ＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕にクローン化し、シークエンスした。
【０１２６】
ついで、クローン化されたＰＣＲ産物の内部ＤＮＡ配列プライマー：
5’-ACCAACTCCACCGACACCTGG-3’（配列番号：１２、配列番号：１のヌクレオチド番号：２０８３−２１０３に対応）、及び
5’-CTTGTCGGTGCCGTTGTTGGC-3’（配列番号：１３、配列番号：１のヌクレオチド番号：ヌクレオチド番号：２４５５−２４７５の相補鎖に対応）
と、商品名：ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット〔ロシュ  モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)〕とを用い、９５℃２分のインキュベーション後、９５℃１０秒と６０℃３０秒と７２℃２分とを１サイクルとする１０サイクルの反応を行ない、ついで、９５℃１０秒と６０℃３０秒と７２℃２分（ただし１サイクル毎に２０秒増やす）とを１サイクルとする２０サイクルの反応を行ない、７２℃で７分間インキュベーションすることにより、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを合成した。
【０１２７】
前記Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２のゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、１．０重量％  アガロースゲルで電気泳動した。得られたゲルを、商品名：ＨｙｂｏｎｄＮ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にブロッティングした。得られた膜と、前記ＤＩＧ標識プローブと、商品名：Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ社製）とを、４２℃一晩ハイブリダイゼーションを行なった。ついで、膜を、２×ＳＳＣと０．１重量％  ＳＤＳとを含む溶液を用いて２５℃で５分間２回洗浄し、０．１×ＳＳＣと０．１重量％  ＤＳＤとを含む溶液を用いて６８℃で１５分間２回洗浄した。その後、商品名：Ａｎｔｉ-Ｄｉｇｏｘｇｅｎｉｎ  ＡＰ  Ｆａｂフラグメントと、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ  Ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ロシュ社製）とを用いて、シグナルを検出した。
【０１２８】
その結果、約１．６ｋｂのＶａｎ９１Ｉ消化断片、約１．１ｋｂのＳａｌＩ消化断片及び３．３ｋｂのＡｐａＩ消化断片がプローブとハイブリダイズした。
【０１２９】
ついで、これらの断片を、アガロース電気泳動で回収し、セルフライゲーションした。ライゲーション産物を鋳型とし、ｓｓｍｐ遺伝子の部分ＤＮＡ断片からデザインしたプライマー（各１μＭ）のセット：
Ｖａｎ９１Ｉ消化断片の増幅のために、
5'-TACCTGCTGTCCGAGGGCAGC-3'（配列番号：１４、配列番号：１のヌクレオチド番号：2638-2658に対応）、及び
5'-CGCCCCGTCTTCGAGCTGGAAGCC-3'（配列番号：１５、配列番号：１のヌクレオチド番号：1999-2022の相補鎖に対応）；
ＳａｌＩ消化断片の増幅のために、
5'-TACCTGCTGTCCGAGGGCAGC-3'（配列番号：１６、配列番号：１のヌクレオチド番号：２６３８−２６５８に対応）、及び
5'-GTAGAAGTCCCAGGTGACGGC-3'（配列番号：１７、配列番号：１のヌクレオチド番号：２１４９−２１６９の相補鎖に対応）；
ＡｐａＩ消化断片の増幅のために、
5'-TGCGCTGTCGGAGGCGGTGG-3'（配列番号：１８、配列番号：１のヌクレオチド番号：２９８９−３００８に対応）、及び
5'-CGCCGAGCCGCTCTGCACTCC-3'（配列番号：１９、配列番号：１のヌクレオチド番号：１３６９−１３８９の相補鎖に対応）
と、０．５Ｍ  商品名：ＧＣ−ＲＩＣＨリゾルーションソルーションと、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲシステム〔ロシュ  モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)社製〕とを用いて、ＰＣＲを行なった。
【０１３０】
前記ＰＣＲのサーマルプロファイルは、アニーリング温度を５８℃、伸長時間を、Ｖａｎ９１Ｉ消化断片の場合、４５秒、ＳａｌＩ消化断片の場合、２５秒、ＡｐａＩ消化断片の場合、６０秒としたことを除き、上記と同様である。得られたＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕にクローン化し、シークエンスした。結果を図８に示す。
【０１３１】
図８に示されるように、得られた塩基配列（配列番号：１、ＤＤＢＪデータベースアクセッション番号：ＡＢ１８０３６）は、全ｓｓｍｐ遺伝子の塩基配列を含む。
【０１３２】
前記配列番号：１に示される塩基配列と、Ｎ末端アミノ酸配列解析及び内部アミノ酸配列解析の結果から、配列番号：１のヌクレオチド番号：２９０２−２９０４にインフレーム終止コドンＴＧＡが存在することがわかる。
【０１３３】
推定アミノ酸配列から、Ｎ末端プレ配列（３３アミノ酸残基）及びＮ末端プロ配列（１８４アミノ酸残基）を有すると思われる。また、前記配列番号：１に示される塩基配列において、推定リボソーム結合部位（図８中、「ＳＤ」）が、Ｎ末端プレ配列に対応する塩基配列の上流に見出された。推定リボソーム結合部位からＮ−プレ配列に対応する塩基配列の領域において、ＡＴＧ開始コドンはなかったが、ヌクレオチド１２８８−１２９０に見出されたＴＴＧコドンが、開始コドンとして同様に作用することが推定された。
【０１３４】
ｓｓｍｐ遺伝子のオープンリーディングフレームは、１６１７ヌクレオチド長であり、推定分子量５６２３２を有する５３８アミノ酸のＳＳＭＰをコードすることが推定された。成熟ＳＳＭＰ酵素の算出された分子量は、３４０６２であり、図２に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づき算出された分子量（約３５ｋＤ）と一致した。
【実施例６】
【０１３５】
培養上清  ５０μＬと、５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と、２ｍＭ  ＣａＣｌ2  ２９５０μＬと、脱イオン水（対照）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、エチレングリコール（ＥＧ）又はメタノール（ＭｅＯＨ）  １０００μＬとを混合した。得られた混合物を、３０℃で、１６０ｒｐｍ／分で回転振盪しながらインキュベーションした。対照として、前記脱塩水を用いた混合物について、４℃で静置してインキュベーションした。なお、インキュベーション開始から０時間、２０．１時間後、６８．１時間後、１１５．９時間後、１８７．４時間後、２８７．０時間後及び３５５．０時間後それぞれに、混合物から１０μＬ容量の溶液をサンプリングした。
【０１３６】
前記溶液  １０μＬを、５０μＭ  ＦＲＥＴＳ−ＧＲＹＦＡと２ｍＭ  ＣａＣｌ2  とを含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）  ４９０μＬに添加し、３７℃でインキュベーションし、５−１０秒の反応速度をλＥｘ／Ｅｍ＝３４０／４４０ｎｍ（３４０ｎｍで励起、４４０ｎｍで発光）により測定した。結果を図９に示す。
【０１３７】
図９に示されるように、培養上清に見出されるタンパク質分解活性は、有機溶媒存在下においても安定して見出された。したがって、ＳＳＭＰが、有機溶媒に対して耐性であることが示唆される。
【比較例１】
【０１３８】
市販のサーモライシンについて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析し、透析前及び透析後のサーモライシン  １０μｇを１５重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図１０に示す。
【０１３９】
その結果、図１０に示されるように、サーモライシンは、透析により自己消化をうけることがわかる。一方、本発明のメタロエンドペプチダーゼは、図２に示されるように、透析後であっても、自己消化産物が検出されず、酵素としての寿命がサーモライシンに比べても長いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明により、タンパク質の解析等の分析、種々のペプチドの製造、医薬のための中間体化合物、リード化合物等の製造のたけの手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２によるプロテアーゼ産生におけるグルコース及びＫ2ＨＰＯ4の影響に示す図である。培地Ａ−Ｅは、グルコース、Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキスを含む。グルコース含有量及びＫ2ＨＰＯ4含有量を図中に示す。黒バーは、培地上清のタンパク質分解活性を示し、バーは、比活性を示す。
【０１４２】
【図２】図２は、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２由来の精製ＳＳＭＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１は、低分子量タンパク質マーカー（分子量、９４，０００、６７，０００、４３，０００、３０，０００、２０，１００及び１４，４００）、レーン２は、２μｇの精製ＳＳＭＰを示す。
【０１４３】
【図３】図３は、ＳＳＭＰのタンパク質分解活性のｐＨの影響を示す図である。活性は、最も高いｐＨ〔酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）〕の相対活性として示す。黒丸印は、酢酸緩衝液、黒三角印は、リン酸カリウム緩衝液、黒四角は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を示す。
【０１４４】
【図４】図４は、ＳＳＭＰのタンパク質分解活性の活性及び熱安定性におけるカルシウムの影響を示す図である。パネル（Ａ）は、ＳＳＭＰ活性におけるカルシウム濃度の影響を示す。活性は、最も高い至適温度における場合の相対活性として示す。パネル（Ｂ）は、ＳＳＭＰ活性の至適温度におけるカルシウムの影響を示す図である。活性は、最も高い至適温度における場合の相対活性として示す。パネル（Ｃ）は、ＳＳＭＰ活性の熱安定性におけるカルシウムの影響を示す。１５℃でのインキュベーションにおける相対活性として示す。白丸は、カルシウム非存在下、黒丸は、２ｍＭ  カルシウム存在下を示す。
【０１４５】
【図５】図５は、ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーの構造を示す。Ｘａａは、システインを除く１９天然アミノ酸のそれぞれを取り込んだ定位置である。それぞれ決まったＸａａについて、Ｙａａ位における５アミノ酸残基（Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ及びＤ）の混合物を、Ｚａａ位の５アミノ酸残基（Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ及びＲ）の混合物とともに取り込んだ。
【０１４６】
【図６】図６は、ＦＲＥＴＳ−２５  Ｘａａコンビナトリアルライブラリーを用いたＰ１位の一次スクリーニングを示す図である。
【０１４７】
【図７】図７は、ＦＲＥＴＳ−２５Ｐｈｅを用いたＰ２位及びＰ３位の二次スクリーニングを示す図である。パネル（Ａ）は、ＦＲＥＴＳ−２５Ｐｈｅの構造を示す。パネル（Ｂ）は、ＦＲＥＴＳ−２５Ｐｈｅを用いて決定したＰ２及びＰ３選択性を示す。相対蛍光強度を、ＬＣ−ＭＳによるピーク面積から決定した。切断部位を矢印で示す。
【０１４８】
【図８】図８は、ｓｓｍｐ遺伝子の塩基配列を示す図である。ｓｓｍｐ遺伝子の推定−３５及び−１０配列に下線を付す。高プリン配列、ＡＧＧＡＧＡ、開始コドンの上流５ヌクレオチドはリボソーム結合（ＳＤ）配列として働く。亜鉛結合のコンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）を囲んだ。ｓｓｍｐ遺伝子のシグナル配列は、Argクラスター領域（Arg残基は、太字で示す）及び疎水性領域（斜線）に分けることができた。シグナルペプチドについての推定切断部位（白三角）を示す。ＳＳＭＰ成熟の際、二次切断（部位は、黒三角により示される）は、恐らく、分泌後に起こる。アミノ酸配列から推定される一次構造において、Ｎ末端配列（下線）及び内部配列（二重線）が見出された。
【０１４９】
【図９】図９は、有機溶媒耐性を示す図である。
【０１５０】
【図１０】図１０は、サーモライシンの自己消化を示す図である。図中、パネル（Ａ）は、透析前のサーモライシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、パネル（Ｂ）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析した後のサーモライシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
配列番号：３は、ＳＳＭＰの基質のコンセンサス配列のアミノ酸配列である。第２位のＸａａは、Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ又はＲである。第３位のＸａａは、Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ又はＤである。第４位のＸａａは、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、Ｅ、Ｐ又はＤである。
【０１５２】
配列番号：４は、ＳＳＭＰの基質のコンセンサス配列のアミノ酸配列である。第１位のＧｌｙは、側鎖に２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル基を有するＤ−２、３−ジアミノプロピオン酸基を有する。第８位のＬｙｓは、ε−アミノ基に２、４−ジニトロフェニル基を有する。
【０１５３】
配列番号：６において、第６位のＸａａは、Ｑ又はＫである。第７位のＸａａは、Ｉ又はＬである。
【０１５４】
配列番号：９において、第７位のＸａａは、Ｉ又はＬである。
【０１５５】
配列番号：１０は、ＳＳＭＰの部分配列を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１５６】
配列番号：１１は、ＳＳＭＰの部分配列を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１５７】
配列番号：１２は、ＳＳＭＰ内部配列プライマーの配列である。
【０１５８】
配列番号：１３は、ＳＳＭＰ内部配列プライマーの配列である。
【０１５９】
配列番号：１４は、Ｖａｎ９１Ｉ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１６０】
配列番号：１５は、Ｖａｎ９１Ｉ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１６１】
配列番号：１６は、ＳａｌＩ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１６２】
配列番号：１７は、ＳａｌＩ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１６３】
配列番号：１８は、ＡｐａＩ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【０１６４】
配列番号：１９は、ＡｐａＩ断片を増幅するためのプライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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