(57)【要約】【課題】従来のグラム染色法よりもはるかに短時間で染色することができ、かつ少量の検体の染色に対応可能な迅速簡便なグラム染色法及び装置を提供すること。【解決手段】試料の水洗を前染色、媒染・脱色、又は前染色、媒染、脱色の中間工程の後には行わず、最終工程の後染色の後にのみ行い、かつ中間工程、最終工程の作業時間を短縮することによるグラム染色法とこれに係るグラム染色装置を提供する。又、染色液の準備が不要で野外など任意の場所で使用可能な、染色液を予め浸透させた濾紙及びこれに係るグラム染色装置を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム染色法において、試料の水洗を前染色、媒染・脱色、又は、前染色、媒染、脱色の各中間工程の後には行わず、最終工程の後染色の後にのみ行い、かつ、中間、最終各工程の作業時間を短縮したことを特徴とする迅速簡便グラム染色方法。
【請求項２】
前記各工程の作業時間をすべて１０秒以内とすることを特徴とする迅速簡便グラム染色方法。
【請求項３】
前記各工程の作業時間をすべて１〜２秒とすることを特徴とする請求項１に記載の迅速簡便グラム染色方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかにおいて、前記最終工程の後に行う水洗時間を５秒以内とすることを特徴とする迅速簡便グラム染色方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかにおいて、前染色から前記最終工程後の水洗までの間、スライドグラスを水平面に対し長軸方向に傾斜して保持させることを特徴とする迅速簡便グラム染色方法。
【請求項６】
前記請求項１乃至５のいずれかに記載の迅速簡便グラム染色方法を実現する装置であって、前染色液、媒染液、脱色液、後染色液又は前染色液、媒染・脱色液、後染色液を内包する各々の槽と、各槽に直結した各々の配管と、各液を配管中に放出させる吐き出し弁と、放出された各液を試料に滴下させるヘッダー部と、洗浄水を放出させるための配管と、スライドグラスを支持する台と、スライドグラスの水平面との角度を調節する手段と、染色液と洗浄水の流通を制御する手段とから構成される迅速簡便グラム染色装置。
【請求項７】
前染色液、媒染液、脱色液、後染色液、又は、前染色液、媒染・脱色液、後染色液を染色の順番に従って区分けして、予め材料中に浸透させ又は材料の限定された部位に集結させて乾燥させたことを特徴とする染色用材料。
【請求項８】
前記請求項７記載の染色用材料において、区分けされた各液を浸透又は集結させ乾燥させた部分に隣接して設置した、各液の乾燥成分を再溶解するための溶液を保持する手段を有することを特徴とする染色用材料。
【請求項９】
前記請求項８記載の染色用材料を試料の上部に接して移動させる手段と、前記溶液を保持する手段を開裂する手段と、該開裂手段及び移動させる手段を制御する手段と、試料を保持する手段とからなることを特徴とするグラム染色装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病医院、研究所、検査センターにおいて、感染部位等より得られた検体から、原因微生物の検出等の生体情報を得るために行う顕微鏡検査に先立ち、顕微鏡標本を作製するための染色法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、感染症に対する抗菌薬の開発が進んでいるが、その一方、原因菌の特定をせずに、安易に抗菌薬に頼る傾向が顕著になってきている。その結果、抗菌薬の大量投与による医療費の増大、抗菌薬耐性菌の出現という新たな問題が生じてきており、原因菌の特定と特定された原因菌に対するピンポイントの治療対策の必要性が指摘されている。
【０００３】
微生物検査は感染症等の起炎菌を検出し、診断治療に結びつけるための検査であり、検査法としては、免疫血清学的検査、分子生物学的検査、顕微鏡による検査（鏡検）などがある。この中で、免疫血清学的検査は日数を要すること、検査コストが高いことがあり、分子生物学的検査は操作が煩雑なことが指摘されており、鏡検が最も手軽で基本的な微生物検査とされている。
【０００４】
微生物を光学顕微鏡で観察するためには、観察前に染色をするのが一般的である。スライドグラスに塗抹した試料中の微生物を染色することによって、微生物がその種類により違う色に染め分けられ、観察が容易となるからである。染色法としては、グラム染色法、抗酸菌（結核菌）染色法が代表的であるが、中でもグラム染色法は検索可能対象菌が広範囲のため、最も基本的かつ必須の染色法として多用されている。グラム染色法により染色された微生物の染色像からは起炎菌の推定が可能であり、係る推定により治療時の抗菌薬を選択する際の極めて有力な情報を獲得することができる。
【０００５】
グラム染色法では、基本的には、前染色、媒染、脱色、後染色の４工程（手順）を必要とするが、媒染と脱色を１つの工程にまとめるタイプのものもある。又、各工程の後には液を洗い流すために水洗が必要とされている。前染色ではクリスタルバイオレット等の塩素系色素で微生物を紫又は青色に染色する。次に、水洗の後にヨウ素を含むルゴール液で媒染処理をする。このときに、グラム陽性菌といわれる微生物はヨウ素を介して塩素系色素と細菌の組織が強固に結合するが、グラム陰性菌といわれる微生物は表層構造の差によりそのような結合は生じないと考えられている。水洗の後、エタノール等のアルコール脱色工程を経て、グラム陽性菌では脱色されずに紫又は青色を保持するが、グラム陰性菌は脱色され、無色となる。無色のままでは鏡検の際に観察がしにくいので、水洗の後に最後の工程、後染色でサフラニン等によりグラム陰性菌を赤く染め、更に水洗処理をする。この結果、ブドウ球菌又は肺炎球菌等の球菌類、炭素菌、破傷風菌等の有芽胞菌、ジフテリア、結核菌等のグラム陽性菌は紫又は青色に、髄膜炎菌、リン菌、大腸菌、コレラ菌、赤痢菌、チフス菌、百日咳菌、インフルエンザ菌、ペスト菌等のグラム陰性菌は赤色に染色されることとなる。
【０００６】
グラム染色法としてはハッカー変法が多く用いられていたが、最近ではフェイバー法、バーミー法（Ｂ＆Ｍ法）、バーミー変法（Ｂ＆Ｍ変法）、などが多く用いられつつある。  その中のフェイバー法の手順を図１（ａ−１）を参照しながら以下に説明を行う。フェイバー法の手順とは、試料を乾燥し、火炎固定等で固定した後に、以下の（１）〜（６）の処理工程を順に行うものである。
（１）ビクトリアブルー溶液で６０秒程度前染色し、
（２）１０秒程度水洗し、
（３）ピクリン酸・エタノール溶液を数回（３０秒程度）注入して媒染・脱色し、
（４）１０秒程度水洗し、
（５）フクシン又はサフラニン溶液で６０秒程度後染色し、
（６）最後に１０秒程度水洗し、乾燥するという工程となる。
【０００７】
次に、Ｂ＆Ｍ変法の手順を図２（ｂ−１）を参照しながら以下に説明を行う。Ｂ＆Ｍ変法の手順とは、検体の乾燥、固定後に、以下の（１）〜（８）の処理工程を順に行うものである。
（１）クリスタルバイオレット溶液で３０秒程度前染色し、
（２）１０秒程度水洗し、
（３）ヨウ素・水酸化ナトリウム溶液で３０秒程度媒染し、
（４）１０秒程度水洗し、
（５）アセトン・エタノール溶液で５秒程度脱色し、
（６）１０秒程度水洗し、
（７）パイフェル液で３０秒程度後染色し、
（８）最後に１０秒程度水洗し、乾燥するという工程となる。
他の方法でもほぼ同様の工程となり、水洗を含めると全体で６〜８工程、時間にして１３０〜１７０秒程度要していた。工程から工程への移行時間も加算すると３〜４分は必要であった。
なお、本明細書では、前染色、媒染、脱色又は前染色、媒染・脱色の工程を中間工程、後染色を最終工程と称する。
【０００８】
上記染色法は手作業で行われることが多い（用手法）が、既述のように工程が多いことから作業の手間がかかり、工程の途中で作業を中断した場合には再度、試料の作成からやり直さなければならないという不便さも生じていた。又、染色時間、水洗時間について、厳密な時間管理が要求されるために、染色結果が作業者の個人差によりばらつくという問題もあった。
【０００９】
これらの問題を解決するために機械化による様々な自動染色装置も提案されている（特許文献１，特許文献２，特許文献４，特許文献５、非特許文献１）。しかしいずれも作業を標準化し多数の試料について効率的に処理するものであり、工程そのものを根本的に見直したものではない。したがって、グラム染色法を迅速に実施するものではない。
又、多数の試料の同時処理を前提にするために多くの試料を集めることが必要となるが、個々に収集した試料について、他の一定数の試料が集まるまで手待ちの状態になる結果、かえって個々の患者に対して迅速な対応が確保できないという問題が生じることとなった。
【００１０】
機械化以外に染色法についての提案もいくつかなされている。例えば、前染色液に陰イオン界面活性剤を加えるものがある（特許文献３）が、これは染色像を鮮明にすることを目的とするものであり、本発明の目的とするものとは異なる。又、加温することにより工程を迅速化するものもある（特許文献６）が、水洗処理はそのままであり、又、各工程における時間短縮も本発明ほどの短縮ではなかった。
【００１１】
【特許文献１】特開平８−４３３８０号公報
【特許文献２】特開２０００−２３２８７５号公報
【特許文献３】特開２００３−１９６９４号公報
【特許文献４】特開２００２−１１６２０２号公報
【特許文献５】特表２００２−５０７７３８公報
【特許文献６】ＰＣＴ/JP０３/１５９３４号公報
【非特許文献１】２００２年「機器・試薬」２５巻５号  改良グラム染色液neo―Ｂ＆Ｍワコーと自動染色装置
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、感染症等の起炎菌の早期検出、早期診断、早期かつ適切な治療の選択に資するために迅速簡便なグラム染色方法及び装置を提供することである。すなわち従来のグラム染色法よりも、はるかに短時間で染色することができる染色法及び装置を提供し、又、少量の検体の染色に対応可能な装置を提供して、大病院のみならず中小病院、診療所等においても手軽にグラム染色を行うことを可能ならしめることにある。
【００１３】
本発明の発明者は、グラム染色法について鋭意研究を積み重ね、様々な知見を得てきたが、実験・研究について試行錯誤を繰り返した結果、従来必須と考えられていた中間工程後の水洗を省略しかつ各工程の時間を大幅に短縮しても従来と同様の効果を確保できることを見出し、本発明を完成したものである。中間工程後の水洗については、グラム染色関係者においては常識とされており、例えば、三輪書店「第２版  臨床微生物検査ハンドブック」９ページ、文光堂「第２版  図説臨床細菌検査」１６ページ、メディカルレビュ−社「感染症」１３７ページ、医歯薬出版株式会社「細菌・真菌学（第２版）」１２０ページ、日水製薬株式会社「フェイバーＧ」パンフレット、武藤化学株式会社ホームページ「バーミーＭ染色」等に必須の手順として掲載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点からは、「試料の水洗を前染色、媒染、脱色、又は、前染色、媒染・脱色の各中間工程の後には行わず、最終工程の後染色の後にのみ行い、かつ各工程の染色時間を短くした迅速簡便グラム染色方法」が提供される。
【００１５】
また、本発明の第２の観点からは、本発明の第１の観点の迅速簡便グラム染色方法において、「前染色、媒染、脱色、後染色、又は前染色、媒染・脱色、後染色の各工程の時間をすべて１０秒以内とした迅速簡便グラム染色方法」が提供される。
【００１６】
また、本発明の第３の観点からは、本発明の第１の観点の迅速簡便グラム染色方法において、「前染色、媒染、脱色、後染色、又は、前染色、媒染・脱色、後染色の各工程の時間をすべて１〜２秒以内とした迅速簡便グラム染色方法」が提供される。
【００１７】
また、本発明の第４の観点からは、本発明の第１乃至３の観点の迅速簡便グラム染色方法において、「最終工程の後染色後に行う水洗時間を５秒以内とした迅速簡便グラム染色方法」が提供される。
【００１８】
また、本発明の第５の観点からは、本発明の第１乃至４の観点の迅速簡便グラム染色方法において、「前染色から後染色後の水洗までの間、スライドグラスを水平面に対し長軸方向に傾斜して保持させることとした迅速簡便グラム染色方法」が提供される。
【００１９】
また、本発明の第６の観点からは、「本発明の第１乃至５の観点の迅速簡便グラム染色方法を実現する装置であって、前染色液、媒染液、脱色液、後染色液又は前染色液、媒染・脱色液、後染色液を内包する各々の槽と、各槽に直結した各々の配管と、各液を配管中に放出させる吐き出し弁と、放出された各液を試料に滴下させるヘッダー部と、洗浄水を放出させるための配管と、スライドグラスを支持する台と、スライドグラスの水平面との角度を調節する手段と、染色液と洗浄水の流通を制御する手段とから構成される迅速簡便グラム染色装置」が提供される。
【００２０】
また、本発明の第７の観点からは、「前染色液、媒染液、脱色液、後染色液、又は、前染色液、媒染・脱色液、後染色液を染色の順番に従って区分けして、予め材料中に浸透させ又は材料の限定された部位に集結させて乾燥させた染色用材料」が提供される。
【００２１】
また、本発明の第８の観点からは、本発明の第７の観点の染色用材料において、「区分けされた各液浸透又は集結させ乾燥させた部分に隣接して設置した、各液の乾燥成分を再溶解するための溶液を保持する手段を有する染色用材料」が提供される。
【００２２】
また、本発明の第９の観点からは、本発明の第８の観点の染色用材料を、試料の上部に接して移動させる手段と、前記溶液を保持する手段を開裂する手段と、該開裂手段及び移動させる手段を制御する手段と、試料を保持する手段とからなることを特徴とするグラム染色装置が提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の第１の観点によれば、中間工程後の水洗を省略し、後染色の後にのみ水洗を行い、かつ、各工程の染色時間をより短くしたことにより、中間工程における水洗の時間が省略でき、工程の切り替えに要する時間も削減でき、各工程そのものの時間も短縮できることから、全染色時間を大幅に短縮できる。
又、各工程における作業時間を短縮することにより、前工程の染色液等の液の残留を防止することもできる。更に、工程数の減少により作業者間の染色結果のばらつきを軽減できる。
【００２４】
本発明の第２の観点によれば、各工程における作業時間をすべて１０秒以内とすることにより、全体の染色時間を更に短縮することができる。又、各工程における染色時間を１０秒以内に制限することにより、前工程の染色液等の残留を更に有効に防止でき、鮮明な染色像を確保できる。
【００２５】
本発明の第３の観点によれば、各工程における染色等の時間をすべて１〜２秒以内とすることにより、全体の染色時間を１０〜２０秒程度に短縮できる。又、前工程の染色液等の残留をほとんど完全に防止でき、鮮明な染色像を確保できる。
【００２６】
本発明の第４の観点によれば、後染色後の水洗時間を５秒以内とすることにより、全体の染色時間を１０秒以内に短縮でき、かつ過水洗に伴って生じる染色像の不鮮明さを防止できる。
【００２７】
本発明の第５の観点によれば、スライドグラスを傾斜させておくことにより、新たに滴下された染色液が、前工程における染色液を下方に押し流し、水洗に相当する効果を発揮しつつ迅速に次工程に移行することができる。
【００２８】
本発明の第６の観点によれば、発明に係る装置により作業の手間を省き、一定の精度を保持する迅速グラム染色を実現できる。工程がシンプルなことから装置も簡便なものが可能となり、少数試料（検体）の染色ニーズに対応可能である。したがって、診察後の染色により、推定された原因菌に対するピンポイントの治療が可能となる。
【００２９】
本発明の第７の観点によれば、各工程の染色液を予め浸透させた材料を用いることにより、染色液の補充の必要がなくなり、簡便に染色が可能になる。
【００３０】
本発明の第８の観点によれば、前記材料中に浸透又は集結させ乾燥させた染色液等を再液化するために、染色液等の乾燥成分を溶解する液を前記材料中に保持することにより、溶解液を用意する必要がなくなり一層簡便にグラム染色をすることが可能となる。
【００３１】
本発明の第９の観点によれば、材料に予め浸透させた染色液を溶解し、滲出した染色液が試料中の検体に浸透することにより染色を行う装置によって、グラム染色が極めて簡便にできることとなる。したがって、野外等任意の場所で採取した検体を染色することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための最良の形態を表及び図面に基づいて説明する。
【実施例１】
【００３３】
フェイバー法による染色において、中間の水洗を省略して後染色の後にのみ水洗を行い、かつ、前染色、媒染・脱色、後染色の時間をいずれも１秒程度とする方法を実施した。
前染色、媒染・脱色、後染色の各時間は、従来通り数十秒とすると、水洗を省略することにより前工程の液が洗い流されずに残留し後の工程の効果を妨げることになるので、各々１０秒程度以内にする必要がある。
又、前工程の液の影響をより一層防ぐためには各々５秒以内が好ましく、前工程の液の影響を完全に防ぐためには各々１〜２秒以内が特に好ましい。なお、本発明はフェイバー法に限定されるものではない。
以下、本発明によるグラム染色方法（フェイバー法）の処理フローについて、図１（ａ−２）に用いて説明する。
【００３４】
先ず、標準検体（グラム陰性菌としての大腸菌とグラム陽性菌としてのブドウ球菌）の含まれた試料を白金耳で取り、脱脂した清浄スライドグラス上の滅菌蒸留水と十分に混合し、薄く延ばす。次に自然乾燥（風乾）させた後、火炎固定を行う。火炎固定はスライドグラスの下から、ガスバーナーの弱火をゆっくりと３回通過させることにより行う。火炎固定により菌のたんぱく質を変性させ、菌をスライドグラス上に強固に固着することとなる。
【００３５】
スライドグラスを水平面に対し３０度〜６０度、好ましくは４５度長軸方向に傾斜させ、傾斜角度を保持する。
【００３６】
前染色はビクトリアブルー溶液（日水製薬製）を、傾斜したスライドグラスの両端のうち高い方の端（以下「高端部」という）の上方から注ぐことにより行う。ビクトリアブルー溶液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、前染色が行われる。かかる前染色に要する時間は１秒程度である。
次にスライドグラスの傾斜を保持したまま、スライドグラスの高端部の上方からピクリン酸とアルコールの混合溶液（日水製薬製）を注ぐ。ピクリン酸とアルコールの混合溶液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、媒染、脱色が行われる。この媒染・脱色に要する時間も１秒程度である。次にスライドグラスをの傾斜を保持したまま、フクシン溶液（日水製薬製）をスライドグラスの高端部の上方から注ぐ。フクシン溶液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、後染色が行われる。後染色に要する時間も１秒程度である。最後に、スライドグラスの高端部の上方から水道水を注ぐ。注ぐ時間も１秒程度である。
【００３７】
水洗後、自然乾燥し、油を塗布した後に顕微鏡で染色像を評価した。評価は優、良、可、不可の４段階評価とした。
４段階評価の基準は、
（１）優は、「全体的に染色像が安定しており、観察しやすく、グラム陽性菌、グラム陰性菌の色調が明確であって判断が容易なもの」とし、
（２）良は、「染色性良好で、グラム陽性菌、グラム陰性菌の判断もしやすいが、顕微鏡における視野の中には観察しにくい部分が稀にある。」とし、
（３）可は、「全体的にややムラがあり、観察しにくい部分がある。グラム陽性菌が過剰脱色されている傾向にある。」とし、
（４）不可は、「全体的にムラが多く、観察しにくい。グラム陽性菌が陰性色に染まる傾向が目立つ。」とした。
鏡検時の４段階評価は一般的な評価法である。
【００３８】
評価結果について、下記表１に示す。ここで、表１は、本発明によるグラム染色実験と通常法によるグラム染色実験の結果の評価データを示している。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
評価結果については表１に記載の通り、全３０例中、優評価１９、良評価１０、可評価
不可評価０であった。
【００４１】
なお、本実験と比較するために通常法による試験も実施した。通常法のフェイバー法（図１（ａ−１））による実験条件は、以下の（１）〜（６）の処理工程に示す。
（１）ビクトリアブルー溶液を注いで６０秒保持し、
（２）水洗を１０秒間行い、
（３）ピクリン酸とエタノールの混合溶液を注いで３０秒保持し、
（４）水洗を１０秒間行い、
（５）フクシン溶液を注いで６０秒保持し、
（６）水洗を１０秒行うというものである。
通常法の試験においてはスライドグラスは傾斜させなかった。
【００４２】
通常法の評価結果は、表１に記載の通り全３０例中、優評価２６、良評価３、可評価０、不可評価１であった。このことから、極めて短時間に行った、本発明に係る染色が通常法によるものに比べ遜色がないものであることが分かる。本発明に係る染色の時間は合計で１０秒以内である。一方通常法による染色の時間は３分以上である。
【実施例２】
【００４３】
バーミー変法による染色において、中間工程後の水洗を省略して後染色の後にのみ水洗を行い、かつ前染色、媒染、脱色、後染色の時間をいずれも１秒間とする方法を実施した。
以下、本発明によるグラム染色方法（バーミー変法）の処理フローについて、図２（ｂ−２）に用いて説明する。
【００４４】
試料として実施例１と同様に標準検体を用意し、染色前の準備として、試料のスライドグラス上への塗布及び固定を行った。塗布及び固定の方法は実施例１と同じである。
【００４５】
スライドグラスを水平面に対し３０度〜６０度、好ましくは４５度長軸方向に傾斜させ、傾斜角度を保持する。
【００４６】
前染色はクリスタルバイオレット溶液（武藤化学製）を、傾斜したスライドグラスの高端部の上方から注ぐことにより行う。クリスタルバイオレット溶液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、前染色が行われる。かかる前染色に要する時間は１秒程度である。次にスライドグラスの傾斜を保持したまま、スライドグラスの高端部の上方から、よう素と水酸化ナトリウムの溶液（武藤化学製）を注ぐ。よう素と水酸化ナトリウムの混合溶液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、媒染が行われる。この媒染に要する時間も１秒程度である。次にスライドグラスの傾斜を保持したまま、スライドグラスの高端部の上方から、アセトン・エタノール液を注ぐ。
アセトン・エタノール液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、脱色が行われる。この脱色に要する時間も１秒程度である。次にスライドグラスをの傾斜を保持したまま、パイフェル液（武藤化学製）をスライドグラスの高端部の上方から注ぐ。  パイフェル液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、後染色が行われる。後染色に要する時間も１秒程度である。最後に、スライドグラスの高端部の上方から水道水を注ぐ。注ぐ時間も１秒程度である。
【００４７】
水洗後、自然乾燥し、油を塗布した後に顕微鏡で染色像を評価した。評価方法は実施例１に係る方法と同じである。評価結果は、表１に記載の通り全３０例中、優評価１６、良評価９、可評価１、不可評価４であった。
【００４８】
なお、本実験と比較するために通常法による試験も実施した。通常法のバーミー変法（図２（ｂ−１））による実施条件は、以下の（１）〜（８）の処理工程に示す。
（１）クリスタルバイオレット溶液を注いで３０秒保持し、
（２）水洗を１０秒間行い、
（３）よう素と水酸化ナトリウムの溶液を注いで３０秒保持し、
（４）水洗を１０秒間行い、
（５）アセトンとエタノールの溶液を注いで５秒保持し、
（６）水洗を１０秒行い、
（７）パイフェル液を注いで３０秒間保持し、
（８）最後に水洗を１０秒間行うというものである。
通常法においてはスライドグラスは傾斜させなかった。
【００４９】
通常法の評価結果は、表１に記載の通り全３０例中、優評価９、良評価８、可評価５、不可評価８であった。このことから、極めて短時間に行った、本発明に係る染色が通常法によるものに比べ遜色がないものであることが分かる。本発明による染色時間は１０秒以内である。一方、従来法による染色時間は約３分である。
【実施例３】
【００５０】
確認のために中間工程後の水洗のみを省略し、各工程の時間を従来通りとして実施して
みた。試料として実施例１同様に標準検体を用意し、染色前の準備として、試料のスライ
ドグラス上への塗布及び固定を行った。塗布及び固定の方法は実施例１と同じである。な
お、染色法はフェーバー法による。
【００５１】
前染色はビクトリアブルー溶液（日水製薬製）をスライドグラス全体を薄く覆う程度に
注ぎそのまま６０秒間保持する。次にスライドグラスを水平面に対し３０度から６０度、好ましくは、４５度傾け、ピクリン酸とアルコールの混合溶液（日水製薬製）を傾斜面の上方からゆっくりと注ぎ、その後スライドグラスの傾斜を水平に戻して３０秒間保持して、媒染、脱色を行う。ピクリン酸とエタノール液を注ぐ動作は２乃至３回に分けて繰り返しても良い。次にスライドグラスを水平面に対し３０度から６０度、好ましくは４５度傾け、フクシン溶液（日水製薬製）を傾斜面の上方からゆっくりと注ぎ、その後スライドグラスの傾斜を水平に戻して６０秒間保持することにより後染色を行う。  最後に、スライドグラスの上方から１０秒間水道水を注ぐ。
【００５２】
上記評価法に基づく評価結果を下記表２に示す。ここで、表２は、通常法によるグラム染色法で、中間工程後の水洗のみ省略した実験結果の評価データを示している。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
上記評価法に基づく評価結果は、表２に記載の通り８検体中、優３検体、良１検体、不可４検体であった。顕微鏡における視野の中には、染色液の結晶が残っているものがあり、又、グラム陽性菌が陰性色に染まる傾向が認められた。このことから、単に中間工程における水洗を省略したのみでは、鮮明な染色像を確保することは困難であると推察される。
【実施例４】
【００５５】
次に、本発明に係るグラム染色装置について、図３により説明する。図３は本発明のグラム染色装置の正面図である。図３によるグラム染色装置は、前染色液の槽aと、媒染・脱色液の槽ｂと、後染色液の槽ｃと、前染色液ａをスライドグラス上の試料に滴下させるための配管ａ１と、媒染・脱色液ｂを試料に滴下させるための配管ｂ１と、後染色液を試料に滴下させるための配管ｃ１と前染色液ａを配管ａ１に流通させる吐き出し弁ａ２と、媒染・脱色液を配管ｂ１に流通させる吐き出し弁ｂ２と、後染色液ｃを配管ｃ１に流通させる吐き出し弁ｃ２と、ヘッダーｅと、水道水を試料に滴下させるための配管ｄ１と、スライドグラスを支持する台ｇと、ｇの水平面との角度を調節する手段ｈと、染色液と水道水の流通を制御する手段（図示していない）とから構成される。
【００５６】
試料として実施例１同様に標準検体を用意し、染色前の準備として、試料のスライドグラス上への塗布及び固定を行った。塗布及び固定の方法は実施例１と同じである。
【００５７】
支持台ｇに載置されたスライドグラスｆを角度調整手段ｈにより水平面に対し３０度〜６０度、好ましくは４５度長軸方向に傾斜させ、設定された傾斜角度を保持する。
【００５８】
槽ａ中の前染色液は図外制御手段により、弁ａ２、配管ａ１を通じて、傾斜したスライドグラスの両端のうち高い方の端（以下「高端部」という」の上方から滴下される。前染色液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、前染色が行われる。かかる前染色に要する時間は１秒程度である。次に、槽ｂ中の媒染・脱色液が図外制御手段により、弁ｂ２、配管ｂ１を通じて、傾斜角度を保持したスライドグラスの高端部の上方から滴下される。媒染・脱色液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、媒染、脱色が行われる。この媒染・脱色に要する時間も１秒程度である。次に槽ｃ中の後染色液が図外制御手段により、弁ｃ２、配管ｃ１を通じて、傾斜角度を保持したスライドグラスの高端部の上方から滴下される。後染色液はスライドグラス下端部に向かって流れる間に試料を浸し、後染色が行われる。後染色に要する時間も１秒程度である。最後に、水道水が図外制御手段により、配管ｄ１を通じて、傾斜角度を保持したスライドグラスの高端部の上方から滴下される。水道水を滴下する時間も１秒程度である。
【実施例５】
【００５９】
実施例４のグラム染色装置をより簡易な道具に置き換えることも可能である。以下、簡易型グラム染色装置の構成に基づいて説明する。横に固定されたビニール製のそれぞれが独立したスポイド容器を４つ設け、各スポイドの流出口を束ねて、これをスライドグラスの一端に取り付ける。フェーバー法によるグラム染色を行なう場合には、スポイド容器の１つに前染色用のビクトリアブルー溶液（日水製薬製）、１つに媒染・脱色用のピクリン酸とエタノールの混合液（日水製薬製）、１つに後染色用のフクシン溶液（日水製薬製）、１つに後染色後の洗浄水を注入する。染色工程の順番に該当するスポイドから染色液を流出することで、実施例４と同様の染色を実施することが可能である。なお、本実施例はフェイバー法に限定されるものではない。
【実施例６】
【００６０】
次に、本発明に係る染色用材料を図４により説明する。図４は、前染色液を浸透・乾燥させた濾紙ｉの一部ｊと、媒染・脱色液を浸透・乾燥させた濾紙ｉの一部ｌと、後染色液を浸透・乾燥させた濾紙ｉの一部ｎと、ｊに隣接し内部に２０％アルコールを含んだ凸部ｋと、ｊとｌの間に位置し内部に２０％アルコール溶液を含んだ凸部ｍと、ｌとｎの間に位置し内部に２０％アルコールを含んだ凸部ｏとから成る。
【００６１】
試料として実施例１同様に標準検体を用意し、染色前の準備として、試料のスライドグラス上への塗布及び固定を行った。塗布及び固定の方法は実施例１と同じである。
【００６２】
スライドグラスを水平面に対し３０度〜６０度、好ましくは４５度長軸方向に傾斜させ、傾斜角度を保持した。
【００６３】
前染色は、凸部ｋを穿孔し内部に含まれたアルコールをｊに浸透させることにより乾燥した前染色液を再液化し、再液化し浸出した前染色液が下部に接した試料に浸透することにより行われる。浸透はアルコールを傾斜したスライドグラスの両端のうち高い方の端（以下「高端部」という）に滲出させることにより行う。なお、本発明はスライドグラスを傾斜させて行うことに限定されるものではない。次にスライドグラスの傾斜を保持したまま、開裂された凸部ｍの内部のアルコールをｌに浸透させる。アルコールによって再液化した媒染・脱色液が滲出して、スライドグラス高端部から濾紙に接した試料に浸透することにより媒染・脱色が行われる。次に同様の方法で凸部ｏ内部のアルコールがｎに浸透し、再液化した後染色液が濾紙に接した試料に浸透して後染色が行われる。最後に、スライドグラスの上方から水道水を注ぐ。なお、本発明は染色液を浸透させた材料（好ましくは「濾紙」）を用いることに特徴があり、中間の水洗を省略して迅速にグラム染色を行う場合に限定されるものではない。
【実施例７】
【００６４】
次に、本発明に係るグラム染色用材料を用いた装置の１実施例について、図５により説明する。図５に記載の装置の構成は、実施例６に記載の材料（濾紙）ｉを横方向に移動させる手段ｐと、凸部を穿孔し内部のアルコールを漏出させる手段ｒと、穿孔（開裂）しアルコールを漏出させる手段ｒと移動手段ｐを制御する手段ｑと、スライドグラスｆとスライドグラスを支持する手段ｓと、支持手段ｓの角度を調整する手段ｔから構成される。
【００６５】
スライドグラスを水平面に対し３０度〜６０度、好ましくは４５度長軸方向に傾斜させ、傾斜角度を保持した。
【００６６】
前染色は濾紙ｉが、ｑにより制御されたｉを移動させる手段ｐにより、図面右方向に移動し、凸部穿孔手段ｒによりｋが穿孔され、内部に含まれたアルコールがｊに浸透し、ｊに含まれている乾燥した前染色液が再液化し、再液化した前染色液が滲出して下部に接する試料に浸透することにより行われる。浸透は傾斜したスライドグラスの両端のうち高い方の端（以下「高端部」という）から浸出させることにより行われる。
なお、本発明はスライドグラスを傾斜させて行うことに限定されるものではない。次にスライドグラスの傾斜を保持したまま、濾紙ｉを右方向に移動させ、同様の方法で、凸部ｍ内のアルコールをｌに浸透させ、アルコールによって再液化した媒染・脱色液が浸出し、試料に浸透することにより媒染・脱色が行われる。次に同様の方法で凸部ｏの内部のアルコールがｎに浸透し、再液化した後染色液が試料に浸出して後染色が行われる。最後に、スライドグラスの上方から水道水を注ぐ（図示していない）。なお、本発明は染色液を浸透させた材料（好ましくは「濾紙」）を用いることに特徴があり、中間の水洗を省略して迅速にグラム染色を行う場合に限定されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によるグラム染色法、グラム染色装置は、迅速にかつ簡便にグラム染色を行うことを可能とするものである。したがって、従来の病院、医院、検査機関等に限定されず、中小の病医院でも活用される可能性が大きい。また、ハンディ性を活かして保健所、学校、公共施設、飲食施設、スーパーマーケット、野外など従来グラム染色が行われていなかった場所でも活用されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】通常法によるグラム染色方法（フェイバー法）の処理フロー図を（ａ−１）に、本発明によるグラム染色方法（フェイバー法）の処理フロー図を（ａ−２）に示している。
【図２】通常法によるグラム染色方法（Ｂ＆Ｍ変法）の処理フロー図を（ｂ−１）に、本発明によるグラム染色方法（Ｂ＆Ｍ変法）の処理フロー図を（ｂ−２）に示している。
【図３】本発明に係るグラム染色装置である。
【図４】本発明に係るグラム染色用材料である。
【図５】本発明に係るグラム染色用材料を用いた装置である。
【符号の説明】
【００６９】
ａ      前染色液の槽  
ａ１    前染色液が流通する配管
ａ２    前染色液の流通を制御する弁
ｂ      媒染・脱色液の槽
ｂ１    媒染・脱色液が流通する配管
ｂ２    媒染・脱色液の流通を制御する弁
ｃ      後染色液の槽
ｃ１    後染色液が流通する配管
ｃ２    後染色液の流通を制御する弁
ｄ１    水道水が流通する配管
ｅ      ヘッダー
ｆ      スライドグラス
ｇ      スライドグラスを支持する台
ｈ      スライドグラス支持台の水平面との角度を調整する手段  
ｉ      濾紙
ｊ      前染色液を浸透・乾燥させた濾紙の一部
ｋ      ｊに隣接し２０％アルコールを含んだ凸部
ｌ      媒染・脱色液を浸透・乾燥させた濾紙の一部
ｍ      ｊとｌの中間に位置し、２０％アルコールを含んだ凸部
ｎ      後染色液を浸透・乾燥させた濾紙の一部
ｏ      ｌとｎの中間に位置し、２０％アルコールを含んだ凸部
ｐ      濾紙ｉを横方向に移動させる手段
ｑ      移動手段ｐと凸部開裂手段ｒを制御する手段
ｒ      濾紙ｉ中の凸部を開裂する手段
ｓ      スライドグラス支持手段
ｔ      スライドグラス指示手段と水平面との角度を調節する手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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