(57)【要約】【課題】形質転換成長因子β１（TGF−β１）受容体へのTGF−β１の結合のアンタゴニストペプチドの提供。【解決手段】PGFβ1由来のペプチド、タイプIII 受容体由来のペプチド、及びPGFβ1に結合することができるその他の蛋白質に由来するペプチド、であってTGF−β１受容体へのTGF−β１の結合を阻害するペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換成長因子β１（TGF−β１）受容体へのTGF−β１の結合のアンタゴニストペプチドであって、そして下記のペプチド：
P11   His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu
P12   Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
P29   His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
P106  Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val Asp Ile
P145  Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp
P57   Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu Ala
P59   Lys Glu Asn Val Pro Ser Thr Lys Asp Ser Ser Pro Ile Pro Pro
P63   Phe His Gly Leu Asp Thr Leu Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala
P134  Pro Pro Ala Leu Asp Asn Pro Leu Phe Pro Gly Glu Gly Ser Pro
P150  Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu
P152  Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His
の何れかを有するペプチド。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列：
P11   His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu
P12   Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
P29   His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
のいずれかを有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列：
P106  Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val Asp Ile
P145  Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp
の何れかを有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
下記のアミノ酸配列：
P57   Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu Ala
P59   Lys Glu Asn Val Pro Ser Thr Lys Asp Ser Ser Pro Ile Pro Pro
P63   Phe His Gly Leu Asp Thr Leu Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala
P134  Pro Pro Ala Leu Asp Asn Pro Leu Phe Pro Gly Glu Gly Ser Pro
P150  Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu
P152  Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His
の何れかを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンタゴニストペプチドを含んでなる肝臓疾患治療剤。
【請求項６】
前記肝臓疾患が肝線維症である請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
前記肝臓疾患が肝硬変である請求項５に記載の治療剤。
【請求項８】
肝臓疾患治療剤の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンタゴニストペプチドの使用。
【請求項９】
前記肝臓疾患が肝線維症である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記肝臓疾患が肝硬変である請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換成長因子β１（TGF−β１）受容体へのTGF−β１の結合のアンタゴニストペプチド、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖は、成長因子グループの種々のタンパク質により調節される（Schalch DS など. (1979) Endocrinology 104: 1143-1151）。細胞成長に関与し、そしてオートクライン及びパラクライン機構により作用することができる最も重要な成長因子は、形質転換成長因子（TGF）を包含する（Braun L. など. (1988) Cell Bid. 85: 1539-1543; Lyons RM and Moses HL (1990) Eur. J. Biochem. 187: 467-473）。
【０００３】
用語TGFは、ネズミ肉腫ウィルスにより形質転換された細胞系により生成される活性を記載するために最初に使用された（delarco JE and Todaro GJ (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4001-4005; Mizel SB など. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2205-2208）。それらの細胞の上清液は、増殖のために固体支持体を必要とする細胞の軟質寒天における正常な増殖を誘発することができた。より特別な研究は、関連するタンパク質のファミリーを含んで成る、TGFα及びTGFβと呼ばれる２種のTGF種類を示した。
【０００４】
そのTGFβファミリーは、ダイマー構造（Schlunneger MP and Grutter MG (1992) Nature 358: 430-434; Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18）の５種のイソフォーム（Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18）から成る。単一の種から精製された成熟タンパク質の調査は、それらの配列間で高い程度の同一性を示した（表１）。
【０００５】
【表１】
2006241166.tif 000002
【０００６】
TGFβ1は、Pre−Pro−TGFβ1と呼ばれる390個のアミノ酸の前駆体として合成される。最少の加水分解において、Pro−TGFβ1を生成する29個のアミノ酸の疎水性フラグメントの開放が存在する。次に、成熟TGFβ1が、TGFβ1の末端アミノを先行し、そして２個のアルギニンから成る領域におけるもう１つの切断により開放され、12kDaの分子量を有する112個のアミノ酸のタンパク質が生成される。生物学的活性形を生成するためには、それらのモノマーの２つがジスルフィド架橋により一緒に連結し、25kDaのダイマーを生成する。この構造の変更は、生物学的機能の損失を引き起こす（Barnard JA など. (1990) Brochim. Biophys. Acta 1032: 79-87）。
【０００７】
種々のドメインがTGFβ1の構造内に存在することが知られている。それらのドメインの１つは、アミノ酸40〜82間に位置することが見出されており、そしてTGFβ1のその細胞受容体への結合に関与する（Quian SW など. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6290-6294; Burmester JK など.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8628-8632）。
【発明の開示】
【０００８】
TGFβ1の受容体及び他の結合タンパク質
TGFβ1に対する５種のタイプの特異的な受容体が特徴づけられている（Cheifets S. など. (1988) J. Biol. Chem. 163: 17225-17228及びLopez Casillas F. (1991) Cell 67: 785-795）。それらの受容体は、異なったタイプのTGFβ1に対して異なった親和性を有する。タイプI, II及びIIIの受容体は、これまでの最良の理解である（Attisano L. など. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222: 71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 548-553; Yingling など. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242: 115-136）。
【０００９】
タイプIV受容体（Mackay K. and Danielpour D. (1991) J. Biol. Chem. 266: 9907-9911）及びタイプV受容体（Ichijo H. など. (1991) J. Biol. Chem. 266: 22459-22464）もまた記載されている。エンドグリンのトランスメンブラン及び細胞質ドメインが、ヒト及びラットの両者においてタイプIII受容体と約70％の類似性を有することがまた報告されている（Cheifetz S. など. (1993) J. Biol. Chem 267: 19027-19030; Bellon T. など. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2340-2345; Yamashita など. (1995) J. Biol. Chem. 269: 1995-2001; Zhang H. など. (1996) J. Immunol. 156: 564-573）。
【００１０】
RIIIは、TGFβ1を結合し、そして順に、RIと複合体を形成するRII（Yamashitaなど. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20172-20178）、又はRIの種々の分子がRIIと組み合わされている複合体（Weiss G. and Massague J. (1996) EMBO J. 15: 276-289）に、それを提供する作用を有するものである。RII−RI相互作用は、RIのリン酸化、及びMADR2タンパク質のような第２メッセンジャーにリン酸化するそのセリン/トレオニンキナーゼの続く活性化を生ぜしめる（Macias-Silva M. など., (1996) Cell 87: 1215-1224）。
【００１１】
肝分化及び再生におけるTGFβ1の役割
生成される効果は、成長のモーメント及び細胞の型に依存して異なる。
・肝臓星状細胞（Ito細胞）、すなわちマトリックスタンパク質の主要源に対して作用する細胞外マトリックスの拡大（Mustoe TA など. (1987) Science 237: 1333-1336）。
・上皮細胞及び肝細胞の分化（Florini JRなど. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16509-16513）。
【００１２】
・肝臓再生の工程の間の細胞の阻害。この効果は、インビボでの細胞静止の維持において非常に重要なものである（Kato Y. など. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 9552-9556）。
・ラット胎児肝臓細胞の培養物において観察されるような上皮増殖因子（EGF）の受容体のエンドサイトーシスの阻害（Noda M. and Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133: 426-437）。
【００１３】
肝線維症におけるTGFβ1の役割
TGFβ1は、細胞外マトリックスのタンパク質の生成において、肝臓星状細胞（脂肪細胞又はIto細胞）によりそれらの受容体の上昇を引き起こし、そしてマトリックスを分解するタンパク質分解酵素の合成を阻害する（Ignot RA and Massague J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 4337-4345）、肝線維症の工程に関連することが見出された（Czaja MJ. など. (1989) J. Cell Biol. 108: 2477-2482; Annoni G. など. (1992) J. Hepatol. 14: 259-164）。肝臓においては、TGFβ1は、肝臓星状細胞におけるコラーゲン及びフィブロネクチンの合成を誘発する（Weiner FR (1990) Hepatology 11: 111-117）。そのmRNAの誘発によるそれ自体の合成を高めることによっての自己−調節が存在する。
【００１４】
TGFβ1はまた、肝細胞及び活性化された肝臓星状細胞により合成されるα２−マクログロブリンの高められた合成に関与することも見出されている。TGFβ1に結合し、そしてその不活性化を引き起こすことによって（Bachem MG (1994) Ann NY Acad. Sci. 737: 421-424）、α２−マクログロブリンは、細胞外区画からTGFβ1を排除すると言われる。
慢性肝臓損傷を有する患者の調査は、TGFβ1の発現と、タイプIプロコラーゲンについてのmRNAの発現及びプロコラーゲンのタイプIIIペプチドの血清レベルとの間に相互関係が存在することを示した（Castilla A. など. (1991) N. Engl. J. Med. 324: 933-940）。
肝硬変を有する患者は、疾病、例えば門脈圧亢進症又は肝疾患の間に生じる合併症のために正常な生命の予測よりも短い生命の予測を有する。
【００１５】
細胞外マトリックスに対するTGFβ1の効果
細胞受容体とTGFβ1との相互作用は、次のものを引き起こす：
・プロコラーゲン、フィブロネクチン（Ignots RA など. (1987) J. Biol. Chem. 262: 6443-6446）、及び関連するタンパク質、例えば細胞外マトリックスの成分と相互作用することができる膜タンパク質（Carter WG (1982) J. Biol. Chem. 257: 13805: 12805-12815）の合成の活性化；
・マトリックスを分解することができるタンパク質分解酵素の合成の阻害（Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282）;
・タンパク質分解酵素のインヒビターの合成の刺激（Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282）。
【００１６】
それらの効果は、構成されるタンパク質のより高い再構成と組み合わされる場合、細胞外マトリックスの合計量の上昇を生ぜしめる、細胞外マトリックスとの細胞の相互作用の上昇を導く（Roberts CJ など. (1988) J. Biol. Chem. 263: 4586-4592）。それらの発現は、TGFβ1が瘢痕工程に関与されていることを確かめる（Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282; Barnard JA など. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1032: 79-87）。
【００１７】
リガンド−受容体相互作用のインヒビターとしてのペプチド
身体に存在する分子の類似体として、それらの機能の模倣のために、小さな分子、すなわち合成ペプチドを使用することの可能性が存在する。LeSateur などにより行われた研究は、受容体へのその結合を可能にする、β回転領域を模倣する神経成長因子（NGF）の環状化された類似体の使用の可能性を示す（LeSateur L. など. (1996) Nature Biotechnology 14: 1120-1122）。ペプチドにより介在されるブロッキングによりその受容体と相互作用する生来の因子を妨げる、ペプチド分子のアンタゴニストとしてそれらのペプチドを使用することも可能である（Lasarte JJ など. (1994) J. Acquired Immue Deficiency Syndromes 7: 129-134; Le Sateur など. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6564-6569）。
【００１８】
初期研究は、認識エピトープが連続的でない場合でさえ、リガンド−受容体相互作用のインヒビターとしての合成ペプチドの有用性を示している（Daniels AJ など. (1995) Mol. Pharmacol. 48: 425-432）。TGFβ1のタイプII受容体及びフェチュイン、すなわちタイプII受容体のグループにおける糖タンパク質に関して行われた他の研究は、TGFβ1とRIIとの相互作用のインヒビターとしての環化されたペプチドの使用可能性を示している（Demetrion M. など. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12755-12761）。この環化により、インビボで得られる構造に類似する構造を有するペプチドを得ることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の特定の記載：
上記理由のために、TGFβ1及びその受容体の両者に由来し、又はTGFβ1に結合する能力を有するタンパク質に由来するペプチドが、TGFβ1の作用のインヒビターであると思われる。従って、本発明者は、この可能性を調査することを決定した。
【００２０】
合成されるべきペプチドの選択
合成のためのペプチドを、それらがTGFβ1に由来するか又はその受容体に由来するかどうかに依存して、異なった手段で選択した。
TGFβ1の配列の場合、ペプチドは、TGFβ1の完全な配列を含む15個のアミノ酸から合成された。個々のペプチドは、その２種の中間隣接物と同じような10個のアミノ酸を有した。
【００２１】
その受容体の配列の場合、ペプチドは、本発明者の実験室において企画されたソフトウェアに基づいて選択された。コンピュータープログラムの１つは、２種のアミノ酸を、部分的に相補的な領域を予測するために比較する。アミノ酸配列を補足するアミノ酸の疎水性及び親水性に基づいて、最も暴露されるタンパク質の領域を予測することができる他のプログラムも使用した。
【００２２】
ペプチドの合成
ペプチドは、α−アミノ基の一時的保護基としてフルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）を用いて、固相法（Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-34）により合成された（Atherton など. (1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546）。少量の多数のペプチドの合成のために、96個のペプチドの同時合成を可能にする多合成機が使用された（Barras-Cuestaなど. (1991) Biologicals 19: 187-190）。ペプチドは、使用まで、固体状態で−80℃で貯蔵された。
【００２３】
HPLCによるペプチドの精製
合成されたペプチドを、Waters 600E-900システム（Millpore Corp., Bedford, USA）を用いて、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析し、そして精製した。
【００２４】
Waters Radial-Pak（商標）C18 300Å15μm, 8×100mmカラム（Millipore Corp., Bedford, USA）を、分析用HPLCによるペプチドの分析のために使用した。ペプチドを、蒸留水中、TFAの0.1%溶液において、1mg/ml の最大濃度まで溶解した。前記ペプチドの溶液（100μl）をカラムに注入し、そして1ml/分の流速で、0.1％TFAにより、水/アセトニトリルグラジエント（図15）（Romil Ltd., Cambridge, USA）において溶出した。ペプチドを含んだ画分を、220nm及び280nmでのその吸光度により検出した（Photodiode Array Detector, Waters 991, Millopore Corp., Fedford, USA）。
【００２５】
Waters Delta-Pak（商標）C18 300Å15μm, 25×100mm カラム（Millipore Corp., Bedford, USA）を、その精製のために使用した。ペプチドを溶解し、5ml/分の流速で同じグラジエントを用いて、前記の場合におけるのと同じ条件下で注入した（2ml）。純粋なペプチドを含む画分をフラスコに集めた。
【００２６】
インビトロ試験ペプチドの活性の調査：
細胞系
ミンク肺上皮に由来する系統、すなわちMV−１−Luを用いた（CCL−64, American Type Cell Culture, Virginia, USA）。細胞を、集密性以下に達するまで、37℃及び５％CO2で、ストーブにおいて、162cm2の培養フラスコ（Costar Corporation, Cambridge, USA）において増殖した。次の完全培地を使用した：５％のウシ胎児血清（FCS, Biological Industries, Kibbuts Beit Haemek, Israel）, 10mMのHEPES（１MのHEPES緩衝液、Bio−Whittaker, Verviers, Belgium）及び抗生物質（100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン）により補充された、L−グルタミンを有するRPMI 1640 (GibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland)。
【００２７】
MV−１−Lu細胞系の増殖の阻害の試験
上記のようにして増殖されたMV−１−Lu細胞を、5mlのトリプシン−EDTA（Biological Industries, Kibbutz Baemek, Israel）を用いて、培養フラスコの底から除去し、完全培地に再懸濁し、そして1500回転/分で８分間、遠心分離した。遠心分離の後、細胞を完全培地において、50,000個の細胞/mlの濃度に再懸濁した。試験を行うために、10mlの細胞懸濁液を採取し、そして96−ウェルの平底培養プレート（Costar Corporation, Cambridge, USA）において、100μl/ウェルで分散し、そして37℃及び5％のCO2で一晩、インキュベートし、ウェルの底への細胞の付着を可能にした。
【００２８】
この時間の最後で、試験されるべきペプチドをRPMIに採取し、RPMI中、200pg/mlの濃度のTGFβ1の存在下で200μg/mlの濃度にした（R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK）。ウェルにおけるFCSの最終濃度は2.5％であった。24時間のインキュベーションの後、１μCiのトリチウム化されたチミジンをウェル当たり添加し（25Ci/mモルの[メチル−3H]−チミジン、Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK）、そしてさらに12時間インキュベートした（Grukeck−Loebenstein B. など. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FM など. (1990) Clin. Exp. Immunol 81: 278-285）。
【００２９】
インキュベーション期間の最後で、細胞をトリプシン−EDTAによりウェルの底から除去し、そして細胞を破壊する手動収穫機（Titertek cell harvester, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA）を用いて集め、ニトロセルロースフィルター（Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA）にDNAを集め、ここでそれを固定した。フィルターをそれぞれ、5mlのポリプロピレンに配置し、これに、4mlのシンチレーション液体を添加した（Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona, Spain）。個々の管の活性を、βLKBシンチレーションカウンター（Beta plate system, LKB, Uppsala, Sweden）により90秒間、定量化した。
細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害の調査
細胞受容体の選択的ラベリング（親和性ラベリング）
MV−１−Lu細胞を、培養フラスコから除去し、それらを37℃で10分間、10mlの溶液１（128mMのNaCl、5mMのKCｌ、25mMの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホネート、pH7.5, 5mMのグルコース及び1mMのEDTA） と共にインキュベートした。このようにして除去された細胞を、溶液２（128mMのNaCl, 5mMのKCl, 50mM の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホネート、pH7.5, 1.2mMのCaCl2, 1.2mMのMgSO4及び5mg/mlのBSA）に再懸濁し、そして1000×gでの5分間の遠心分離により集めた。遠心分離の後、細胞を106個の細胞/mlの濃度で溶液２に再懸濁した。
【００３０】
この細胞懸濁液から、0.5mlおアリコートを24ウェルプレートにおいて製造し（Greiner GmbH, Frickenhausen, Germany）、ペプチドを、0.8mg/mlの溶液50μlで添加し、次にこれを撹拌しながら、４℃で２時間インキュベートした。次に、125I−TGFβ1（２μCi）を添加し、277.2pMの最終濃度にし（125I−TGFβ1ヒト組換え800−2200Ci/mモル、Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK）、そしてこれを撹拌しながら、4℃でさらに２時間インキュベートした。
【００３１】
インキュベーションの後、細胞を遠心分離管に移し、そして12,000×gで１時間、冷却下で遠心分離した。次に、それらを冷溶液２により２度洗浄し、そして0.5mlの冷溶液２、5μlのジメチルスルホキシド（DMSO 99% Sigma Chemical Co., St. Louis, USA）及びジスクシミジルスルベレート（DSS, Pierce Chemical Co., Rockford, USA）に再懸濁し、最終濃度0.25mMのDSSを付与した。反応を、0.25Mのサッカロース、10mMのトリム及び1mMのEDTA（pH7.4）を含む溶液により希釈し、遠心分離及び洗浄により停止した。
【００３２】
細胞の沈殿物を、Triton X-100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) 1% (v/v), 10mMのトリス（pH7.0）、1mMのEDTA, 0.1mM のフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/mlのペプスタチン及び１μg/mlのロイペプチン（Sigma Chemical Co., St. Louis, USA）の溶液0.5mlに再懸濁し、そして４℃で40分間インキュベートした。界面活性剤において不溶性である画分を、12,000×gでの15分間の遠心分離により分離した。海面活性剤において可溶性である画分（上清液）及び不溶性である画分（沈殿物）を、−20℃で凍結した（Massague J. and Like B. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2636-2645）。
【００３３】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質の電気泳動
界面活性剤において可溶性及び不溶性の画分を、7.5％及び220ボルトで５〜６時間のアクリルアミド/ビスアクリルアミドゲルにおける電気泳動による分析のために使用した。
タンパク質を、メタノール（50％）、酢酸（10％）及び蒸留水におけるクーマシーブリリアントブルー（商標）R250 (Serra Feinbiochemi ca gmbH, Heidelberg, Germany) の溶液により30分間、染色した。続く洗浄を、第１の洗浄においては、メタノール（50％）、酢酸（10%）及び蒸留水の溶液により15分間もたらし、そして続く洗浄においては、メタノール（2.5％）、酢酸（0.5％）及び蒸留水の溶液により、バックグラウンドの色が除去されるまで、もたらした。
【００３４】
流動細胞計測法（フローサイトメトリー）
細胞受容体への、ペプチドにより仲介されるTGFβ1の結合の阻害を、直接的な免疫蛍光方法により測定した。免疫蛍光キットをこのために使用した（Fluorokine rh TGFβ−ビオチン、R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK）。子の試験は、シグナル強度が細胞受容体に結合されるTGFβ1の量に依存するよう、特定の態様での細胞受容体に結合するビオチニル化されたTGFβ1の能力、及びフルオレセインによりラベルされたアビジンとビオチンとの続く相互作用に基づかれている。
【００３５】
162cm2 のフラスコにおいて増殖されたMV−１−Lu細胞を、溶液１（上記に記載される）を用いて除去し、そして500×gで５分間の遠心分離のために生理食塩水に再懸濁した。遠心分離の後、細胞を、４×106個の細胞/mlの濃度で生理食塩水に再び再懸濁した。その細胞懸濁液25μlを、12×75mmの硼珪酸塩管に添加し、これに、40μlのRPMI 1640培地における試験されるペプチド（0.42μg/μlの最終濃度）及び10μlのビオチニルされたTGFβ1を添加した。
【００３６】
特異性の対照として、キットにより供給されるビオチニル化された試薬10μlを添加し、10μlのビオチニル化されたTGFβ1を陽性の対照として添加し、そして20μlの抗−TGFβ1阻止抗体を負の対照として添加した。生理食塩水を、75μlの合計体積が達成されるまで、すべての対照に添加した。すべての管を、暗室において、４℃で１時間インキュベートした。
【００３７】
インキュベーション期間の最後で、10μlのフルオレセイン−ラベルされたアビジンを添加し、暗室において4℃で30分間インキュベートし、その後、２mlの洗浄溶液(RDF1)を添加し、続いて500×ｇで6分間、遠心分離した。細胞沈殿物を、細胞計測のために冷PBS0.2ml に再懸濁した（FACScan, Becoton Dickinson Immunocytometry Systems, California, USA）。この方法は、レザー線がそれに対して入射する場合、個々の細胞により発せられる蛍光のコンピュータープログラム（Lisys（商標）II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California USA）による測定を可能にする。図16は、流動細胞計測法による分析からの典型的な像を示す。
【００３８】
受容体へのTGFβ1の結合の阻害に基づくデータを得るために、試験の正の対照を、TGFβ1−ビオチン（M2）及びラベルされていない細胞（M1）に結合している、ラベルされた細胞に対応する領域の範囲を定めるために使用した。その領域の範囲が定められると、それらの個々に位置する細胞の百分率を計算した。同じことを、ペプチドがTGFβ1−ビオチン又は細胞と共にインキュベートされた場合に得られるデータにより、それらがそれぞれ受容体又は又はTGFβ1のいずれかに由来するかに依存して、行った。それらのデータにより、個々のペプチドの％阻害率を次の式を用いて計算した：100−（（M2ペプチド−M2陰性）×100/（M2陽性−M2陰性））。
【００３９】
インビトロ実験線維症の実験モデル：
同腹子（生後５週±1.5週）からの雄白色ラット（albino Wistar 株）を、年齢及び初期体重において均等であるグループを得るために使用した。実験を通して、動物は、明及び暗の１２時間サイクルを伴って、一定温度（22℃）の条件下に保持された。それらは、水及び食物を自由に得ることができた。
【００４０】
肝硬変（HC）を、１週当たり２度、11週間、四塩化炭素の吸入により誘発した（Lopez Novoa JM など. (1976) Patologia IX: 223-240; Camps J. など. (1987) Gastroenterology 93: 498-505）。CCl4への暴露は、ガス洗浄−ボトルを通して、3ｌ/分の流速で、圧縮された空気を泡立てることによってもたらされる。１分間の暴露を、まず用い、４週目で４分に達するまで、週当たり１分づつ高めた。
【００４１】
CCl4は、第５週の間は、投与されず、５分間の暴露を、６週目で再び開始した。この暴露時間を、11週目で維持した。400mg/ｌのフェノバルビタール（Luminal（商標）, Bayer, Leverkusen, Germany）を、CCl4への暴露の開始の１週前から、実験期間の最後まで、飲料水に添加した。処理の開始の前、１週間放置し、ここでそれらはCCl4を投与されなかった。処理の間、それらは記録されるように（図２）、毎週の用量のCCl4を投与された。
【００４２】
動物の分布
動物を、肝硬変の誘発工程の開始の前、４種のグループに分けた。
健康な対照（Co）：線維症工程にゆだねられなかった動物。
処理された健康な対照（Co＋P144）：線維症工程にゆだねられておらず、そして最後の３週間、ペプチドp144を投与された動物（ラットTto2のグループの処理と同時に起こる）。
硬変対照１（Ci1）：週２度、CCl4の吸入により硬変の誘発工程にゆだねられた動物。それらの動物は、５週目に達すると、次の２つのグループに分離された：
【００４３】
硬変対照１（Ci1）：ペプチドP144の投与を伴わないで、11週目まで、線維症の誘発工程にゆだね続けられた動物。それらは、誘発工程（５週〜11週）を通して、塩溶液血清を１日おきに投与された。
治療された硬変１（Tto1）：５週から11週まで、線維症の誘発工程の間、１日おきに、タイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を投与された動物。
硬度対照２（Ci2）：ペプチドP144又は塩溶液血清を受けないで、線維症の誘発工程にゆだね続けた動物。このグループは、11週に達すると、さらに２つのグループに細分割された。
【００４４】
硬変対照２（Ci2）：対照として維持される、いずれのタイプの処理にもゆだねられていない硬変動物。それらの動物は、３週間（13週〜15週まで）塩溶液血清の注入を受けた。
治療された硬変２（Tto2）：３週間（13週〜15週まで）、タイプIII受容体の配列に由来するペプチドにより処理された硬変動物。
【００４５】
動物の処理
・グループTto1：それらの動物は、線維症工程の間、処理を受けた。
ペプチドによる処理は５週目に開始し（５分間のCCl4への暴露の前）、そして硬変誘発工程の11週目の最後まで続けた。
グループTto2：それらの動物は、硬変の誘発工程の完結の後（11週目）、処理を受けた。処理は、CCl4の最後の吸入の１週間後、開始し、そして21日間続けた。
処理の開始の前、及びその完結に基づいて、ペプチドにより処理されたすべての動物から血液を採取した。ペプチドを、生理食塩水500μl中、70μgの用量（動物当たり）で、腹部領域における皮下注射により投与した。
【００４６】
殺動物及び肝臓切開
ラットのモデル及びマウスのモデルの両者において、ペプチドによる動物の処理の完結に基づいて、毛細管を有する眼窩後方叢から採血した後、断頭により、動物を、殺害した。
すぐにこれに続いて、肝臓を切開し、そしてサンプルを採取した。
サンプルを切断し、そして後での組織学的試験のために、固定溶液としてのホルモルに配置した。他のフラグメントを、凍結管に配置し、これを液体窒素に含浸し、そして次に、−80℃で貯蔵した。
【００４７】
肝臓の解剖病理学的評価
組織学的試験を、少なくとも24時間、前もってホルモルに固定された肝臓のフラグメントに対して行い、この後、それらをエタノール（70％）に配置した。
脱水の後、それらをパラフィンブロックに埋封した。３μmの厚さの連続的切片を、Leitz回転ミクロトーム及び鋼製羽を用いて、得られたブロックから調製した。染色の前、断片を、60℃でストーブにおいて15分間、それらを加熱した後、15分間、キシレンにおいてパラフィン除去し（AnalaR, BDH, Poole UK）、そしてそれらを、100％、96％、80％、及び70％の低下する濃度のアルコールに連続的に通すことにより、そして最終的に水において水和化した。次の染料を使用した：
ヘマトキシリン−エオシン；
Masson’s 三原色（Locquin M. and Langeron, (1985) Manual de Microscopia Ed. Labor S.A. Burcelona）：コラーゲンタンパク質のための特定の染料の使用（緑色光）；
Sirius Red: コラーゲンに対して特異的な染料。
【００４８】
肝線維症の確認：像分析
得られるサンプルの像分析のために、個々の調製物の種々の視野の写真を取るビデオカメラ（Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan）に連結された光顕微鏡を使用した（Olympus BH-2, Tokyo, Japan）。６個の視野を、Sirius Red により染色された個々の調製物からランダムに採取した。獲得された種々の像を、線維症の領域及び調製物の合計領域を計算するコンピュータープログラム（Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, France）により分析した。
【００４９】
それらのデータから、線維症指数（線維症の領域/合計領域）を、個々の視野について計算した。このプログラムを使用できるためには、サンプル分析の工程の自動化を可能にする、偏光された光フィルター（Olympus U-POT, Tokyo, Japan）及び緑光フィルター（Olympus IF550, Tokyo, Japan）を用いることによって、像獲得を改良する必要がある。
【００５０】
パラフィン−処理された組織の14μm切片におけるコラーゲンの検出
この技法のために使用される14μmの切片を、前記３μm切片と同じ手段で得た。それらの切片を、キシレンにおいて12時間、パラフィン除去の工程にゆだねた。パラフィンが除去されるとすぐに、サンプルを、それらを、96％、80％、50％の異なった濃度のアルコールに通し、その工程を蒸留水において完結することにより水和化した。
【００５１】
水和化の後、それらを、暗室において15分間、160mlの飽和ピクリン酸（Merck, Darmstadt, Germany）中、160mgのFast Green FCF (Fluka Chemika-BioChemika, Buchs, Switzerland) の溶液における予備染色の工程にゆだねた。サンプルを、それらがもはや洗浄水を着色しなくなるまで、水への含浸により洗浄した。過剰の染色が除去された後、サンプルを、160mlの飽和ピクリン酸中、160mgのDirect Red 80 (Fluka Chemika-BioChemika Buchs, Switzerland) 及び64mgのFast Green の溶液において、暗室において30分間、染色した。それらを、過剰染色を除去するまで、再び洗浄し、そして次に、サンプルを、小さなヘラによりサンプルをこすることによってスライドから除去した。
【００５２】
この手段で除去された切片を、0.1NのNaOH及びメタノールの溶液（１：１）（Quimon, Montplet & Esteban S.A., Barcelona, Spain）3ml を含む別々の管に配置した。0.1NのNaOH及びメタノールの溶液にアリコートをブランクとして用いて、540nm及び630nmの波長で、分光計（Lambda 2 UV/VIS 分光計、Perkin-Elmer, Norwalk, USA）による読み取りのために、種々の管からアリコートを採取した（Lopez de Leon A. and RojKind (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. など. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469）。
【００５３】
Gaudio E. など. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469)の研究に従って、次の式を、コラーゲン及び合計タンパク質の量を見出すために使用した：
【数１】
2006241166.tif 000003
【００５４】
結果の統計学的分析
インビボ実験において得られたデータを、統計学的分析にゆだねた。定量変数の正規性は、Shapiro−Wilks試験により確かめられた。
データは正常な分布に調節されていないので、非パラメーター統計学的分析を採用した。グループ間の比較は、Kruskal-Wallis H, 続いてMann-Whitney Uの比較によりもたらされた。データは、四分位数間領域（ボックスの高さ）と共に、データのメジアン（個々のボックス内の濃い線）の表示を伴って、ボックスによりグラフ的に示され、そして個々のボックスの“ホイスカー(whiskers)”は、与えられる四分位数間領域内の最高及び最低の観察を表す。
【００５５】
変数間の会合は、Fisher’s 精度試験を用いて調べられた。ロジステック回帰は、それらの変数の会合の独立性を調べるために使用された。
0.05に等しいか又はそれ以下のPの値は、有意として見なされた。
すべての統計学的分析は、Window  V6.1.3のためのプログラムSPSSを用いて行われた。
【００５６】
TGFβ1の活性のインビトロ阻害：
MV−１−Lu系の細胞増殖の阻害試験
TGFβ1は、MV−１−Lu細胞系のインビトロ増殖を阻害できるサイトカインであり（Grubeck−Loebenstein B. など. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FNなど. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 278-285）、従って、この系はTGFβ1に対するペプチドのブロッキング効果を試験するために使用された。培地、細胞及びチミジンの種々の組み合わせの後、本発明者は、試験のための最も適切な条件を決定するために、培養におけるNV−１−Lu細胞による[メチル−3H]
【００５７】
チミジンの組み込みに対する種々の濃度のTGFβ1の効果を研究した。この条件は図３に示される。
最適濃度のMV−１−Lu細胞（5000個の細胞/ウェル）及び約90％の阻害率を生成できる最小濃度のTGFβ1（200pg/ml；図18）の両者が決定されると、200μg/mlの濃度での合成ペプチドの阻害効果が試験された。
【００５８】
合成ペプチドによるTGFβ1の活性のインビトロ阻害性
上記セクション：合成されるべきペプチドの選択に示されるようにして選択された、TGFβ1活性の実質的なインヒビターである合成ペプチド（TGFβ1に結合するタンパク質及びTGFβ1自体に由来するそれら）を、MV−１−Lu細胞系を用いて試験した。ペプチドを、ウシ胎児血清を有さない緩衝されたRPMI培地に溶解し、そして次の方法を使用した：
【００５９】
受容体の配列に属するか、又はTGFβ1の親水性のピークに対して相補的なペプチドを、このサイトカインの存在下で30分間インキュベートし、そして次に、細胞培養物と組合した。TGFβ1の配列に由来するペプチドを、それらは細胞表面の受容体と相互作用するので、TGFβ1の添加の前、細胞培養物に添加した。それらのインキュベーションは、細胞を添加するために使用されるのと同じ培地100μlにおいてもたらされた。活性ペプチドは、TGFβ1を阻害するその能力に依存して、高いか又は低い程度、細胞増殖を可能にした。
【００６０】
TGFβ1由来のペプチドによるTGFβ1の阻害
第1の段階においては、TGFβ1由来のオーバーラッピングペプチドを合成した。それらのペプチド（表２）を、それらのいくつかが細胞受容体に結合し、従ってそれらの受容体への天然のTGFβ1の結合を妨げることを期待して合成した。
表２．TGFβ1由来のペプチド。ペプチドの番号が、その完全な配列におけるその位置及びそのアミノ配列と共に示されている。合成を便利にするために、すべてのペプチドは、表に示されないC−末端で付加されたアラニンにより合成された。
【００６１】
【表２】
2006241166.tif 000004
【００６２】
図４は、TGFβ1の活性に対する、表６に示されるペプチドの阻害効果を示す。TGFβ1はMV−１−Lu細胞の増殖を阻害するので、ペプチドによるこのサイトカインの阻害は、MV−１−Lu細胞の増殖の再確立を導く。
図４から見出され得るように、TGFβ1の配列に由来するペプチドP12は、TGFβ1のより高い阻害活性を示すペプチドである。ペプチドP12の阻害効果のより詳細な研究のためには、下記に記載される、サイトカインの阻害に対するペプチドの濃度の効果についての研究が行われた。
【００６３】
ペプチドP12によるTGFβ1の阻害の用量−応答試験
TGFβ1の活性の阻害に対するペプチドP12の濃度の効果を調べた。このペプチドは試験培地において容易に溶解できないので、原溶液又は懸濁液は公称濃度のペプチド（ペプチドが完全に溶解している場合に達成されている）により調製され、そしてアリコートがそれらから取られ、そして濾過され、又はさらに、阻害試験のために直接的に使用された。
【００６４】
図５は、濾過の前及び後、公称濃度のペプチドの阻害効果を試験する。濾過を伴って及びそれを伴わないでのペプチドP12は実際的に同じ活性を有することが見出され得る。
結果がペプチドP12により得られると、ペプチドを、N−末端及びC−末端方向に延長し、そしてその活性に対する効果を調べることが決定された。さらに、その溶解性を改良し、そしてTGFβ1の阻害活性に対するその配列における２個のシステインの重要性を研究するために、その配列の変更が行われた。合成されるペプチドが表３に示される。
【００６５】
【表３】
2006241166.tif 000005
【００６６】
図６は、表３におけるペプチドによるTGFβ1の阻害の結果を示す。
ペプチドP29が活性的であることが図６から見出され得る。このペプチドは、前に試験されたペプチドP12を包含し、そしてN−末端の方に９個の特別なアミノ酸を有する（図４）。キメラ組換えタンパク質を用いて、Quian SWなど. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6290-6294及びBurmester JK など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8628-8632) により行われた調査は、このサイトカインの活性のために必要であるTGFβ1の領域（成熟TGFβ1の配列におけるアミノ酸40〜82）を同定した。
【００６７】
ペプチドP12（アミノ酸43〜56）よりも大きな領域にわたって延長するペプチドP29（成熟TGFβ1の配列におけるアミノ酸34〜56）が、循環におけるTGFβ1の構造のような立体構造を獲得できることが推測された。この理由のために、ペプチドP29は、親和性ラベリングに基づいて、細胞受容体への結合の試験のために使用された。
【００６８】
ペプチドP29によるその受容体へのTGFβ1の結合の阻害の試験（親和性ラベリング）
TGFβ1の配列に由来するペプチドP29を、その細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害についてのその能力を確証するために親和性ラベリング試験に使用した（材料及び方法）。
使用される一連の125I− TGFβ1の異なった活性のために、試験において使用されるペプチドの濃度を、個々の場合に使用される一連の125I−TGFβ1の濃度に従って調節した。それらの試験の結果は、図７及び８に示される。
さらなる試験を、細胞受容体への125I−TGFβ1の結合を阻止するために必要とされる最少濃度を見出すために行った。
【００６９】
ラットのタイプIII受容体の配列に由来するペプチドによるTGFβ1の阻害
TGFβ1の活性のインヒビターである新規ペプチドを見出すために、ラットのタイプIII受容体に由来するペプチドを合成した。TGFβ1の配列のアミノ酸阻止に対する相補的であるものとして予測されるそれらの配列の領域に基づいて、いくつかのペプチドを選択した。それらのペプチドが遊離TGFβ１に結合することができ、それを隔離し、そして細胞受容体へのその結合を妨げることが所望される。
【００７０】
他のペプチドを、10個のアミノ酸をオーバーラップし、そしてタイプIII受容体の細胞外領域の一部（アミノ酸45〜410）をカバーすることによって合成した。受容体の細胞外領域に対応する可溶性タイプIII受容体が存在することは、記載されており、ここで前記領域は膜から切断され、そして循環におけるTGFβ1の隔離体として作用する（Lopez Casillas F. など.（1991）Cell67：785−795）。
【００７１】
後での研究は、TGFβ1に結合する２種の可能な領域を記載しており、それらの１つは受容体のN−末端に位置し（Lopez-Casillasなど. (1994) J. Cell Biol. 124: 557-568）、そして他の１つはC−末端側の膜に最も隣接する領域に位置する（Fukushima D. など. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22710−22715；Pepin MC など. (1995) FEBS Lett 377: 368-372）。それらの理由のために、この受容体の細胞外領域のペプチドを、それらのペプチドが循環TGFβ1を隔離することができる仮定に基づいて合成した。合成されるペプチドは表４〜６に示される。
【００７２】
表４〜６．ラットのタイプIII受容体に由来するペプチド。ペプチドの番号及びその配列が示される。P39〜P65はTGFβ1に対して相補的であるものとして測定されるペプチドであり、そしてP66〜P138は受容体の細胞外領域をカバーするオーバーラップするペプチドである。合成を便利にするために、すべてのペプチドは、表に示されていないC−末端で付加されるアラニンにより合成した。
【００７３】
【表４】
2006241166.tif 000006
【００７４】
【表５】
2006241166.tif 000007
【００７５】
【表６】
2006241166.tif 000008
【００７６】
表４におけるペプチドを、MV−１−Lu細胞系の阻害のモデルにおいてTGFβ1を阻害するそれらの能力について試験した。TGFβ1はこの系の増殖を阻害することができるので、ペプチドによるTGFβ1の阻害は、細胞増殖を再確立することができた。それらの試験は、図９〜12に示される。
図９〜12に見出され得るように、MV−１−Lu細胞系の増殖を、高いか又は低い程度に阻害することができる種々のペプチドが存在するが、しかしペプチドP54のみがTGFβ1の活性をほとんど完全に阻害することができる。このペプチドのより十分な調査を行うために、試験を、200pg/mlの固定された濃度のTGFβ1に対して異なった濃度のペプチドを用いて行った。
【００７７】
ペプチドP54によるTGFβ1の阻害の用量−応答試験
TGFβ1の活性の阻害に対するペプチドP54の濃度を調べた。このペプチドの低い溶解性の観点から、呼称濃度のペプチドを有する原液を、ペプチドP12の場合に行われたようにして、調製し、そしてアリコートをそれらから取り、そして濾過し、又はさらに、阻害試験について直接的に使用した。
図13は、濾過の前及び後、呼称濃度のペプチドの阻害効果を試験する。ペプチドP54の濾液において測定できる阻害活性が存在しないことが見出され得る。
【００７８】
使用される用量に依存する態様でTGFβ1の活性を阻害するペプチドP54の能力を確証した後、本発明者は、低い用量での溶解性及び従って、その活性を改良するために、P54の配列を基礎として取り、新規ペプチドを合成した。ヒトタイプIII受容体に由来する２種のペプチドをまた合成した。それらのペプチドの１つ（P144）は、ペプチドP54と同様である。他の１つのペプチド（P145）は、活性をまた示した、ラットのタイプIII受容体のペプチドP106に類似する。それらの新規ペプチドは表７に示される。
表７．ペプチドP54（ペプチドP139〜P143）及びヒトタイプIII受容体（ペプチドP144及びP145）の修飾に由来するペプチド。
【００７９】
【表７】
2006241166.tif 000009
表７におけるペプチドの活性の試験が図14に示される。
ペプチドP144によるTGFβ1の阻害の用量−応答試験
用量−応答試験を、ヒトタイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144により、その活性が濃度に依存するかどうかを試験するために行った（図15）。ペプチドの活性が試験に使用されるペプチドの濃度の低下と共に低下することが見出され得る。
【００８０】
ペプチドP144によるその受容体へのTGFβの結合の阻害の試験（親和性ラベリング）
ヒトタイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を、その細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害についてのその能力を確証するために親和性ラベリング試験に使用した（材料及び方法）。
使用される一連の125I− TGFβ1の異なった活性のために、試験において使用されるペプチドの濃度を、個々の場合に使用される一連の125I−TGFβ1の濃度に従って調節した。それらの試験の結果は、図15に示される。
【００８１】
ペプチドP144によるその細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害を確証するために、新規試験を、ペプチドP144を滴定するために行った。ペプチドは、125I− TGFβ1のモル濃度の２×105倍の濃度でその活性を失うことが観察された。
TGFβ1に結合する能力を有し、そしてTGFβ1に対して相補的であるとして予測される他のタンパク質に由来するペプチドによるTGFβ1の阻害：
【００８２】
TGFβ1に結合することができるタンパク質に由来する、表６におけるペプチドを、この系列において合成した。
表８及び９．TGFβ1に結合することができる種々のタンパク質（タイプII受容体P146、P149に対するフェチュインP147, P154に対するエンドグリンP150及びP179に対するα2−マクログロブリンP155）に由来するペプチド。ペプチドの番号が、完全な配列におけるその位置、そのアミノ酸配列及びその起源と共に示されている。合成を便利にするために、すべてのペプチドは、表に示されないC−末端で付加されるアラニンにより合成された。
【００８３】
【表８】
2006241166.tif 000010
【００８４】
【表９】
2006241166.tif 000011
【００８５】
図17及び18は、表８及び９に由来するペプチドの阻害活性を示す。
図17及び18に見出され得るように、ペプチドP150のみが、50％以上の活性を示した。しかしながら、Demetriou M. など. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12755-12761により活性的であるものとして記載されたペプチドP146及びP149は、この試験のために使用される条件下で活性的であることが見出されなかった。
TGFβ1のその細胞受容体への結合に対する合成ペプチドの阻害効果の流動細胞計測法による測定：
【００８６】
前の合成位に由来するペプチド、すなわちTGFβ1の配列から合成されたそれらのペプチド及びタイプIII受容体からのそれらのペプチドを、細胞計測法により、TGFβ1の細胞受容体への結合を阻害するそれらの能力を測定するために使用した。それらの試験においては、細胞を、アビジン−FITCを用いて検出されるであろう、TGFβ1−ビオチンの添加の前、ペプチドと共にインキュベートする（材料及び方法）。次に、アビジン−FITCにより放される蛍光を測定した：これは、細胞に結合されるTGFβ1の量に直接的に比例し、そしてペプチドの活性に反比例するであろう。最も適切なペプチドにより得られる結果が図19及び表10に示される。
【００８７】
表10．MV−１−Lu1細胞の増殖の阻害のバイオアッセイにより測定される、いくつかのペプチドのTGFβ1の阻害活性（ペプチド濃度200μ/ml）と、流動細胞計測法2を用いて測定されるその細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害（ペプチド濃度420μg/ml）との比較。
【００８８】
【表１０】
2006241166.tif 000012
【００８９】
TGFβ1の活性のインビボ阻害：
MV−１−Lu細胞系の増殖の阻害のバイオアッセイにおいて活性的であることがわかっているヒトタイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を、CCl4による試験的硬変の誘発におけるその阻害効果を研究するためにラットにおけるインビボ試験に使用した。
【００９０】
Wistarラットにおける実験的硬変のモデル
このモデルにおいては、肝硬変を、材料及び方法に記載のようにして、１週当たり2度、11週間、四塩化炭素の注入により誘発する（Lopez Novoa JM など. (1976) Patologia IX: 223-240: Camps J. など. (1987) Gastroenterology93: 498-505）。
【００９１】
ペプチドP144を次の２種のプロトコールに従って投与した：
１．プロトコール１：ペプチドを、硬変誘発工程（11週間）の間、腹腔内経路により１日おきに投与した。図20及び21。
２．プロトコール２：ペプチドを、硬変が確立されると、すなわち硬変の誘発の開始から12週目で、３週間、腹腔内経路により1日おきに投与した。図22及び23。
【００９２】
両プロトコールにおけるコラーゲンの生成を、次の２種の技法により測定した：
図36及び38は、Fast Green 及びDirect Redによる肝臓切片（動物当たり２個）の染色、色彩の溶出及び分光計による読み取りにより測定される全コラーゲン生成を示す（材料及び方法）（Lopez de Leon A. and Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. など。（1993）Int. J. Exp. Path. 74: 463-469）。
【００９３】
図21及び23は、光顕微鏡を用いての、Sirius Red により染色された肝臓切片の像分析により測定されるコラーゲン生成を示す（材料及び方法）。
図20に見出され得るように、ペプチドP144により処理されたラットグループ（Tto1）と硬変ラットの対照グループ（Ci1）との間の、合計タンパク質に対するコラーゲンの割合の研究に基づく有意な差異が観察される（P<0.05）。図37においては、ペプチドP144により処理されたラットのグループ（Tto1）と硬変ラットの対照グループ（Ci1）との間の差異はまた、線維症の領域が調べられる場合、有意である（P<0.001）。
【００９４】
処理されたラットについての結果を示す図22及び23に見出され得るように、硬変が確立されると、ペプチドP144により処理されたラットのグループ（Tto2） と処理されていない硬変ラット（Ci2）との間の差異は、線維症を測定するための２種の技法のいずれかを用いる場合、有意ではない。
コラーゲンを測定するために使用される２種の技法を、個々の調製における調査のための視野の選択のランダム性、及び従って、像分析の有効性を確かめるために、線状回帰を用いて比較した（図24及び25）。
【００９５】
図24及び25から見出され得るように、高い有意性である（F≦0.001）、両者の場合、R>0.85を有する２種の技法間の相互関係が存在する。これは、調査のための像の獲得が完全にランダムにもたらされたことを確証し、そして像分析により得られたデータの有効性を確立する。
図26及び27は、硬変誘発工程の間に処理されたラット（Ci1及びTto1）の肝臓から得られた、Sirius Red により染色された肝臓調製物からの10倍の倍率での光顕微鏡により得られる像を示す。
【００９６】
図26における像は、いずれのタイプのフィルターも使用しないで得られた。
図27は、それらの像が特定のソフトウェアーを用いて研究のために改良された後の像を示す。それらの改良は、像の品質を改良し、そしてそれらの自動試験を促進するために、２種のフィルター、すなわち偏光された光及び緑色光の２種のフィルターの適用から成る。
図26及び27は、硬変ラット（Ci1）から得られた像と、ペプチドP144により処理されたラット（Tto1）から得られた像との間に差異が存在することを示す。
【００９７】
プロトコール１及び２間の有効性の差異は、TGFβ1の生成は、硬変が誘発されると（プロトコール１）、CCl4による硬変の誘発工程の間（プロトコール１）よりも低い事実によるものであり、その結果、ペプチドP144による処理の効果がプロトコール1においてよりもプロトコール２において明白に低い。
硬変の誘発の工程の最後での処理されていない硬変ラットのグループ（Ci1）と、誘発の最後から４週目での処理されていない硬変ラット（Ci2）とを比較する場合、２種のグループ間に有意な差異（P＝0.016）が存在（図28）することが見出され、これは、硬変剤が除去される場合、硬変の部分的緩衝が存在することを示し、この観察は種々の業者により公開されている（Szende-Zなど. (1992) in Viro 6: 355-361: Columbano A (1996) Carcinogenesis 17: 395-400）。
【００９８】
２種のプロトコール間の有効性のそれらの差異はまた、プロトコール自体によるものであり得る。なぜならば、プロトコール２の動物は１日おきに３週間、単に処理され、そしてプロトコール１の動物はそれよりも長い期間（１日おきに、７週間）、処理されるからである。
【００９９】
得られる結果は、異なったタンパク質に由来する合成ペプチドによりTGFβ1をインビトロ及びインビボで阻害することが可能であることを示す。将来、それらのペプチドの生物学的活性を高めることは、非常に興味あるものであろう。これは、それらの配列の個々のアミノ酸を他の19個の個々のアミノ酸により組織的に置換することによって達成され得る。より高い活性を有するペプチドが達成されると、生物における阻害剤の平均寿命を高めるために、そのミモトープ（McConnell-SJ (1994) Gene 151: 115-118; Steward-MW (1995) J. Viro. 69: 7668-7673）を調製する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、流動細胞計測法により測定される、ペプチドP144によるMV−１−Lu細胞へのTGFβ1の結合の阻害性を示す。A：ビオチニル化されたTGFβ1と共にインキュベートされ、そしてアビジン−FITCにより増殖せしめられた細胞の試験にもとづいて得られた像；B：TGFβ1の添加を伴わないで、アビジン−FITCと共にインキュベートされた細胞に基づいて得られた像；C：0.42μg/mlの濃度で、ペプチドP144と共にインキュベートされる前、TGFβ1と共にインキュベートされ、そしてアビジン−FITCにより増殖された細胞の試験に基づいて得られた像。発せられる蛍光は横軸上に示され、そして縦軸は蛍光の個々の値に対する細胞の数を示す。TGFβ1−ビオチン及びアビジン−FITCによりラベルされた細胞（M1）及びラベルされていない細胞（M1）に対応する領域がまた示されている。
【０１０１】
【図２】図２は、CCl4による硬変の工程の図示である。黒の矢印は、CCl4の毎週の２回の用量がラットに投与される場合を示し、そして黒の点線の矢印は、１回の毎週の用量が存在する場合を示す。灰色の矢印は、ペプチドP144の投与を示す。A：健康な対照；B：健康な対照＋P144；B1：ペプチド70μg/日による；C：硬変；C1：塩溶液による；C2：ペプチド70μg/日による；D：CCl4＋フェノバルビタールによる硬変；D1＋塩溶液；D2：＋ペプチド70μg/日。
【図３】図３は、MV−１−Lu細胞の増殖に対するTGFβ1の効果。細胞を、示されるTGFβ1の濃度（pg/ml）で5000個の細胞/ウェルの密度で培養した。横軸：TGFβ1濃度（pg/ml）; 縦軸：c.p.m.
【０１０２】
【図４】図４はTGFβ1からのペプチドのTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図５】図５は、濾過された（◆）及び濾過されていない（●）、種々の呼称濃度のペプチドP12の存在下でのTGFβ1（200pg/ml）の活性の％阻害率を示す。
【図６】図６は、TGFβ1からのペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【０１０３】
【図７】図７は、TGFβ1の受容体の親和性ラベリング試験のオートラジオグラフを示す。レーンC1：0.3μCiの活性に対応する0.16μMの濃度の125I− TGFβ1による細胞のインキュベーションの効果（正の対照）。レーンC2：125I− TGFβ1の濃度よりも10倍、高い濃度の非放射性TGFβ1による細胞のプレインキュベーションの効果（負の対照）。レーンC3：プレインキュベーション125I− TGFβ1のモル濃度よりも106倍、高い濃度でのペプチドP29によりもたらされた。ペプチドP29及び非放射性TGFβ1の両者によるタイプI, II及び細胞受容体への125I− TGFβ1の結合の阻害性が存在することが見出され得る。
【０１０４】
【図８】図８は、TGFβ1の受容体の親和性ラベリング試験のオートラジオグラフを示す。レーンC1〜C6：125I− TGFβ1の添加の前、異なった濃度（それぞれ、125I− TGFβ1のモル濃度の106, 8×105, 6×105, 4×105, 2×105培）のペプチドP29によるMV−１−Lu細胞のプレインキュベーションの効果。レーンC7：125I−TGFβ1の添加の前、ラベルされていないTGFβ1（125I− TGFβ1のモル濃度の102倍）によるMV−１−Lu細胞のプレインキュベーションの効果（負の対照）。レーンC8：従来のプレインキュベーションを伴わないで、0.4μCiの活性に対応する0.42μMの濃度の125I− TGFβ1によるMV−１−Lu細胞のインキュベーションの効果（正の対照）。
【０１０５】
【図９】図９は、TGFβ1の領域に対して相補的として推定される受容体ペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を表す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図１０】図10は、タイプIII受容体の細胞外領域に由来するオーバーラッピングペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図１１】図11は、タイプIII受容体の細胞外領域に由来するオーバーラッピングペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【０１０６】
【図１２】図12は、タイプIII受容体の細胞外領域に由来するオーバーラッピングペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図１３】図13は、濾過された（◆）及び濾過されていない（●）、異なった呼称濃度のペプチドP54の存在下でのTGFβ1（200pg/ml）の活性の％阻害率を示す。
【図１４】図14は、ペプチドP54（P139〜P143）、及びヒトタイプIII受容体に由来するペプチド（P144及び145）の修飾に由来する受容体ペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【０１０７】
【図１５】図15は、濾過を伴わないで、異なった呼称濃度のペプチドP144の存在下でTGFβ1（200pg/ml）の活性の％阻害率を示す。
【図１６】図16は、TGFβ1の受容体の親和性ラベリング試験のオートラジオグラフを示す。レーンC1：プレインキュベーションが125I− TGFβ1のモル濃度よりも106倍高い濃度でのペプチドP144によりもたらされた。レーンC2及びC3：125I− TGFβ1の濃度よりも10倍高い濃度の非放射性TGFβ１による細胞のプレインキュベーションの効果（負の対照）。レーンC4及びC5：0.2μCiの活性に対応する0.1μMの濃度の125I− TGFβ1による細胞のインキュベーションの効果（正の対照）。ペプチドP144及び非放射性TGFβ1の両者による細胞受容体への125I− TGFβ1の結合の阻害が存在することが見出され得る。
【０１０８】
【図１７】図17は、ヒトタイプII受容体（P146）、フェチュイン（P147〜P149）及びエンドグリン（P150〜P154）に由来するペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図１８】図18は、α２−マクログロブリンに由来するペプチドによるTGFβ1（200pg/ml）の％阻害率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100％のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−１−Lu細胞の増殖に対応する。
【図１９】図１９は、種々の合成ペプチドによるMV−１−Lu細胞へのTGFβ1の結合の％阻害率を示す。阻害は、個々のペプチドについてラベルされた細胞（蛍光を放す）及びラベルされていない細胞（蛍光を放していない）の％を測定することによって調べられた。
【０１０９】
【図２０】図20は、CCl4による実験的な硬変の間、コラーゲン合成に対するペプチドP144の投与の効果を示す。合計タンパク質の対するコラーゲンの割合は、縦軸上に示される。横軸は、次の種々のラットグループを示す：Co＝健康なラット；Co＋P144＝ペプチドP144により処理された健康なラット：Tto1＝CCl4による硬度の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、１日おきにペプチドP144を投与されたラット；及びCi1＝11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144により処理されていないラット。
【図２１】図21は、CCl4による実験的な硬変の間、コラーゲン合成に対するペプチドP144の投与の効果を示す。縦軸は、Sirius Redにより処理された組織調製物における合計領域に対する線維症の領域の割合を示す。横軸は、次の種々のラットグループを示す：Co＝健康なラット；Co＋P144＝ペプチドにより処理された健康なラット：Tto1＝CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、１日おきにペプチドP144を投与されたラット；及びCi1＝11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144により処理されていないラット。
【０１１０】
【図２２】図22は、硬変がCCl4により誘発された後、コラーゲン合成に対するペプチドP144の投与の効果を示す。縦軸は、合計タンパク質に対するコラーゲンの割合を示す。横軸は、次の種々のラットグループを示す：Co＝健康なラット；Co＋P144＝ペプチドP144により処理された健康なラット：Tto1＝CCl4による硬度の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、１日おきにペプチドP144を投与されたラット；及びCi1＝11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144により処理されていないラット。
【図２３】図23は、硬変がCCl4により誘発された後、コラーゲン合成に対するペプチドP144の投与の効果を示す。縦軸は、組織調製物における合計領域に対する線維症の領域の割合を示す。横軸は、次の種々のラットグループを示す：Co＝健康なラット；Co＋P144＝ペプチドP144により処理された健康なラット：Tto1＝CCl4による硬度の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、１日おきにペプチドP144を投与されたラット；及びCi1＝11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144により処理されていないラット。
【０１１１】
【図２４】図24は、使用される２種の技法により得られた、コラーゲンの量及び線維症の領域に基づくデータの比較を示す。横軸は、像分析により得られる、合計領域に対する線維症の領域の割合の値を示す。縦軸は、Direct Red 及びFast Green により染色された肝臓切片の分光分析により得られる、mg合計タンパク質に対するμgコラーゲンの割合の値を示す。R2が示される。（F≦0.001）。
【図２５】図25は、プロトコール2の最後でサンプルを試験するために使用される２種の技法により得られた、コラーゲンの量及び線維症の領域に基づくデータの比較を示す。横軸は、像分析により得られる、合計領域に対する線維症の領域の割合の値を示す。縦軸は、Direct Red 及びFast Green により染色された肝臓切片の分光分析により得られる、mg合計タンパク質に対するμgコラーゲンの割合の値を示す。R2が示される。（F≦0.001）。
【０１１２】
【図２６】図26は、Sirius Red により染色されたラット肝臓調製物から光顕微鏡（10倍）により得られた24の視野の代表である像を示す。CCl4による硬変の誘発の最後での硬変ラット（Ci1）及びCCl4による硬変の誘発の間、ペプチドP144により処理された硬変ラット（Tio1）。異なった視野が個々の動物から得られた調製物から取られた（R＝ラット及びC＝視野）。
【図２７】図27は、Sirius Red により染色されたラット肝臓調製物から光顕微鏡（10倍）により得られた24の視野の代表である像を示す。CCl4による硬変の誘発の最後での硬変ラット（Ci1）及びCCl4による硬変の誘発の間、ペプチドP144により処理された硬変ラット（Tio1）。異なった視野が個々の動物から得られた調製物から取られた（R＝ラット及びC＝視野）。偏光された光及び緑色フィルターが、コラーゲン繊維を示すために使用された。
【図２８】図28は、処理されていない硬変ラットの２種のグループ間の比較を示す。Ci1は、CCl4による硬変の誘発の12週間の最終での硬変ラットであり、そしてCi2は、硬変の誘発の工程の最後から４週目での硬変ラットである。P＝0.016。縦軸：繊維症の領域/合計領域。
【図１】
2006241166.tif 000013
【図２】
2006241166.tif 000014
【図３】
2006241166.tif 000015
【図４】
2006241166.tif 000016
【図５】
2006241166.tif 000017
【図６】
2006241166.tif 000018
【図７】
2006241166.tif 000019
【図８】
2006241166.tif 000020
【図９】
2006241166.tif 000021
【図１０】
2006241166.tif 000022
【図１１】
2006241166.tif 000023
【図１２】
2006241166.tif 000024
【図１３】
2006241166.tif 000025
【図１４】
2006241166.tif 000026
【図１５】
2006241166.tif 000027
【図１６】
2006241166.tif 000028
【図１７】
2006241166.tif 000029
【図１８】
2006241166.tif 000030
【図１９】
2006241166.tif 000031
【図２０】
2006241166.tif 000032
【図２１】
2006241166.tif 000033
【図２２】
2006241166.tif 000034
【図２３】
2006241166.tif 000035
【図２４】
2006241166.tif 000036
【図２５】
2006241166.tif 000037
【図２６】
2006241166.tif 000038
【図２７】
2006241166.tif 000039
【図２８】
2006241166.tif 000040
【配列表】
2006241166000001.app