(57)【要約】【課題】  ニプコウ方式の共焦点顕微鏡においてＤＭＤを用いて標本の領域を選択的に照明して観察することができる共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】  光源２０からの照射光は集光レンズ１，回転式フィルタ１４を介してＤＭＤ２に入射し、ＤＭＤ２でオン制御された微小ミラー領域に照射した光のみがニプコウ板組立のマイクロレンズ５に入射する。マイクロレンズ５を通過した光はピンホール６で収束させられ対物レンズ８によって標本１０の選択された領域に結像する。標本１０の選択された領域から発せられる蛍光などの反射光は入射光路を逆向し、ダイクロイックミラー７によって反射され結像レンズ１１によって２次元光検出器に結像される。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源装置と、
２次元に配列された多数の微小ミラーを備え、選択された微小ミラーにより前記光源装置からの光を点状の照明光に変換して選択された微小ミラーの集合に応じた平行光束を形成するＤＭＤと、
多数のピンホールを有する第１ニプコウ板および多数のマイクロレンズを有する第２ニプコウ板よりなり、前記ＤＭＤからの平行光束を前記第２ニプコウ板のマイクロレンズで収束させて前記第１ニプコウ板のピンホールに結像させるニプコウ板組立と、
前記第１ニプコウ板のピンホールで結像された光束を視野の対応位置に結像させ、前記視野からの蛍光を逆向させる共焦点光学系と、
２次元光検出手段と、
前記第１および第２ニプコウ板の間に配置された色分割光学素子および該色分割光学素子からの反射光を前記光検出手段に結像するレンズ系からなる出力光学系と、
前記ＤＭＤの多数の微小ミラーを選択してオン，オフ制御する制御装置とを有し、
前記視野全体の一部を選択して照明を与えるように構成したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記ニプコウ板組立は高速回転させられ前記光検出手段に映像を形成することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記視野内には蛍光標本が留置されることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニプコウ板を用いた共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学的切断像が得られる共焦点顕微鏡はバイオ研究において広く用いられている。
これを実現するには、レーザ光を点状に絞って、この点の像を扇形に回転振動する鏡で振り、標本上にできる輝点によってレーザ走査する方式と、鏡の代わりに小孔（ピンホール）の開いた円板を回転させて、標本上にできるピンホールの像によって走査するニプコウ板式がある。輝点走査によって標本の蛍光物質を励起し、生ずる蛍光を共役位置にあるピンホールを通して集光し画像として観察できる。マイクロレンズの結合により光の利用効率を高めたマイクロレンズ付きニプコウ板は、明るく、高速の走査ができ、比較的安価であるため使用が広がっている。例えば本件発明者が提案している特許文献１や特許文献２にニプコウ円板組立が用いられている。
【０００３】
しかし、この方式の欠点は、視野の任意の指定した領域のみに照明光を与えてその領域のみを観察するということができず、常に視野全面を対象とした照明と観察になる。これは、蛍光染色した細胞の観察では都合が悪い場合がある。すなわち、蛍光観察には観察対象の退色という現象が伴い、観察する時間や与える光強度に応じて、その対象が見えないものに変化してしまうからである。
１つの視野に多数ある細胞のうち関心あるものだけを選択的に照明して観察できれば、対象としていないものには光が当たらず、順次観察していくことができる。
【０００４】
一方、前者のレーザ方式で実現するものとしてＤＭＤを用いたものが存在する。
これは、特許文献３，４および５等がある。
特許文献３記載の発明は、光源から出た光がＤＭＤのオン素子により反射され対物平面に焦点を結ぶ技術を開示している。対物平面で励起された蛍光は同一の光路を経てＤＭＤに戻り、半透明ミラーで反射されて一方のカメラに達する。焦点が外れた位置から発生した光はオフ素子によりミラーで反射され他方のカメラに達するようになっている。
特許文献４記載の走査型顕微鏡、走査型顕微鏡法における結像のための光学装置および方法の発明はレーザー光をマイクロミラーで反射させて標本に当て、反射された光を検出する共焦点走査型顕微鏡である。
【０００５】
特許文献５は、本件発明者が提案したもので、落射形と透過形のＤＭＤを用いた共焦点走査顕微鏡であり、ＤＭＤを用いて輝点の大きさや走査速度，走査のパターンを自由に変えることができる共焦点顕微鏡を実現するものである。
上記特許文献３，４および５いずれも標本の走査領域の選択は可能であるが、光の利用効率はマイクロレンズ付きニプコウ板式と比較して劣り、結果として暗い像になる。
また、共焦点顕微鏡ではなく蛍光顕微鏡において照射領域を制御するものとしてＤＭＤを有するものが特許文献６に開示されている。
特許文献６記載の発明は、蛍光顕微鏡に関するもので図１において光源２３から照射された照明光がコレクタレンズ２２により集光され、ディジタル微小ミラー２０１において選択的に反射してディジタル微小ミラーを視野絞りとして使用することにより標本への部分的な照明を可能として退色を防止しているが、マイクロレンズ付きニプコウ板を備えた共焦点顕微鏡への適用を示す記載やそれらを示唆する記述はない。
【特許文献１】特願２００３−１８７１４２号公報
【特許文献２】特許３０９９０６３号
【特許文献３】特開平１１−１９４２７５号公報
【特許文献４】特開２００２−１３１６４９号公報
【特許文献５】特願２００３−１８６７６８号公報
【特許文献６】特開２００３−１０７３６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記ニプコウ板方式共焦点顕微鏡が持っている上記欠点を解決するもので、その目的はニプコウ方式の共焦点顕微鏡において光の利用効率を高めつつＤＭＤを用いて標本の領域を選択的に照明して観察することができる共焦点顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために本発明の請求項１は、光源装置と、２次元に配列された多数の微小ミラーを備え、選択された微小ミラーにより前記光源装置からの光を点状の照明光に変換して選択された微小ミラーの集合に応じた平行光束を形成するＤＭＤと、多数のピンホールを有する第１ニプコウ板および多数のマイクロレンズを有する第２ニプコウ板よりなり、前記ＤＭＤからの平行光束を前記第２ニプコウ板のマイクロレンズで収束させて前記第１ニプコウ板のピンホールに結像させるニプコウ板組立と、前記第１ニプコウ板のピンホールで結像された光束を視野の対応位置に結像させ、前記視野からの蛍光を逆向させる共焦点光学系と、２次元光検出手段と、前記第１および第２ニプコウ板の間に配置された色分割光学素子および該色分割光学素子からの反射光を前記光検出手段に結像するレンズ系からなる出力光学系と、前記ＤＭＤの多数の微小ミラーを選択してオン，オフ制御する制御装置とを有し、前記視野全体の一部を選択して照明を与えるように構成したことを特徴とする。
本発明の請求項２は、請求項１記載の発明において前記ニプコウ板組立は高速回転させられ前記光検出手段に映像を形成することを特徴とする。
本発明の請求項３は、請求項１記載の発明において前記視野内には蛍光標本が留置されることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
上記構成によれば、視野の任意の指定した領域のみに光源の光利用効率を高めた光を照射してその照射領域のみを観察することができる。
レーザの波長を選択し、ＤＭＤによりケージド化合物の光解除領域と解除光の強度、そして観察領域を任意に選択すれば、ニプコウ板共焦点顕微鏡によって標本を観察しながらケージド化合物の光による解除にも応用でき、ケージド試薬の広い応用に用いることができる。例えば、細胞などの生きた標本の化学刺激があり、それによって生ずる細胞の反応を、そのまま共焦点顕微鏡での蛍光観察によって捉えることができる。
図７に細胞等の生きた標本の各領域を順番に化学刺激したときの蛍光画像の一例を示す。ある細胞における特定の受容体の局在を探索するに当たり、複数の微小領域で順次光解除刺激を行い細胞内応答を観察できる。
また、ＤＭＤによる照明領域（或いはＲＯＩ）の設定は、円や四角と言った単調な図形に止まらず、細胞形態の輪郭などの複雑な絵や文字も可能であり、細胞への文字の印刷などにおいて、ある限られた断層面だけに限局した印刷という形をとることができる。
光源としてレーザ以外のものも使用可能である。いくつかの波長の光が混合している（例えば白色光のような）光源を用いるならば、ＤＭＤの階調調整機能と高速に切り換えられるフィルタの色指定とを同期させて領域別の色の投影も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面等を参照して本発明の実施の形態を詳しく説明する。
図１は、本発明による共焦点顕微鏡の概略を示すブロック図である。
共焦点顕微鏡は、共焦点光学系，ニプコウ板組立，出力光学系，ＤＭＤ，照明光学系を備えている。照明光学系には光源装置からの光が入射する。
カメラ装置は出力光学系からの光学信号を検出してモニタに出力する。ＣＰＵ，メモリ回路，制御プログラムなどから構成される制御装置はＤＭＤの選択した領域の微小ミラーをオンオフ制御するＤＭＤ制御部やニプコウ板組立の回転を駆動制御する回転制御部の機能を備えている。
複数領域で蛍光強度の統一を図る場合や動きのある標本を追跡する場合は、２次元光検出器の出力信号をＤＭＤ制御部を含む制御装置にフィードバックし、該制御装置が励起光強度（ＤＭＤの階調調整機能を利用）やＲＯＩを自動的に調整するように構成される。
また、白色光源により異なる励起光で複数領域を観察する場合にはＲＯＩと励起光用フィルタ（照明光学系などに設けられる），ダイクロイックミラー（吸収フィルタもある場合、これも含む）はそれぞれ同期して切り替えるようにする必要があり、かかる場合ＤＭＤ制御部を含む制御装置は励起用フィルタとダイクロイックミラー（吸収フィルタもある場合、これも含む）も同時に制御するように構成される。
操作部からの入力により視野に載置された標本のＲＯＩを選択してモニタにより観察することができる。
【００１０】
光源装置からの光は照明光学系によって所定の波長帯域に変換されてＤＭＤに導かれる。ＤＭＤの照明範囲についてＤＭＤ制御部の制御の下にＲＯＩが選択されてオンオフの制御が行われる。オン制御された微小ミラー群による光はその微小ミラー群対応の平行光束となり、該平行光束はニプコウ板組立のマイクロレンズ付きニプコウ板の対応のマイクロレンズに入射し、該マイクロレンズで収束されてピンホール付きニプコウ板のピンホールで結像する。ピンホールで結像した光は共焦点光学系によって標本の選択した領域に結像させられる。標本の選択した領域で発生した蛍光や散乱光は共焦点光学系を戻り出力光学系によって２次元光検出器（カメラ装置）に導かれ映像表示のための処理がなされてモニタに表示される。
回転制御部によってニプコウ板組立を高速回転させることにより秒当たり所定枚数の標本の画像を得ることができる。
【００１１】
図２は、本発明による共焦点顕微鏡の実施の形態を示す図である。
集光レンズ１および回転式フィルタ１４は照明用光学系を構成する。ニプコウ板組立は多数の螺旋状のピンホール６を有するニプコウ板４ａおよび各ピンホール対応に設けられた多数のマイクロレンズ５を有するニプコウ板４ｂが回転軸１５により連結されて構成される。共焦点光学系は多数のマイクロレンズ５を有するニプコウ板４ｂ，多数のピンホール６を有するニプコウ板４ａ，ピンホール位置に対する共役の位置に結像させる対物レンズ６により構成される。出力光学系はニプコウ板４ａおよび４ｂの光路上に挿入されたダイクロイックミラー７と結像レンズ１１により構成される。カバーガラス９の上に標本が搭載され、該標本は顕微鏡の視野内の、ピンホール６に対する共役位置を含む位置である。
【００１２】
光源２０は所定波長のレーザ光を用いる他、幾つかの波長が混ざり合った光源が用いられる。この実施の形態は白色光のランプを用いたものであり、ＲＯＩを各色で投影することができる。図３に照明用光学系に挿入した回転式フィルタの一例を示す。
赤波長領域のフィルタ１４ａ，緑波長領域のフィルタ１４ｂ，青波長領域のフィルタ１４ｃが円周上に配置されており、回転軸１６で回転させて各ＲＯＩ毎に色を変えて投影することができる。
【００１３】
光源２０からの照明光はレンズ１により平行光束にされ、回転式フィルタ１４を通過してＤＭＤ２の各微小ミラーを照射する。図４にＤＭＤの所定のＲＯＩをオン制御した場合を示す。ＤＭＤ２の２５が照射可能領域であり、ＤＭＤ制御部の制御の下に領域（Ｒ1 ）２ａと領域（Ｒ2 ）２ｂの微小ミラーが選択されてオン状態となっている。
照射領域２５の他の領域は微小ミラーがオフの領域である。ＤＭＤ制御部によって順番に照射領域２５の各領域を選択していくことができる。また、この選択された領域（Ｒ1 ），（Ｒ2 ）は矩形領域であるが、その形や大きさは自由に設定することが可能である。
【００１４】
オン制御された微小ミラーの領域（Ｒ1 ）および領域（Ｒ2 ）からの反射光は平行光束となってニプコウ板４ｂのそれぞれ対応のマイクロレンズ５に入射する。
一方、領域（Ｒ1 ）および領域（Ｒ2 ）以外の照射領域２５の光は、その領域の微小ミラーのオフによりニプコウ板４ｂの方向以外に導かれ、光トラップ１３により吸収される。対応のマイクロレンズ５に入射した光は、対応のピンホール６に結像される。この２つのニプコウ板の構成によって入射する光の利用効率が高められ、ピンホール以外の板表面で反射されるノイズ光が減少する。
【００１５】
図５にニプコウ板組立の一例を示す。
ニプコウ板４ａのピンホール６は、螺旋状に所定間隔で配置され、これら螺旋状ピンホール群は円板全体に多数設けられている。ニプコウ板４ｂには各ピンホール対応に多数のマイクロレンズ５が配置されている。ニプコウ板組立を回転制御部により回転させることにより標本の画像をモニタに表示することができる。螺旋状ピンホール群の数とニプコウ板の回転速度（分速）を適宜制御することにより例えば秒当たりの表示駒数を変更することができる。例えは、ニプコウ板を数千ｒｐｍで、螺旋状ピンホール群の数を１０個程度形成することにより、１駒を数ｍｍＳで表示することができる。
【００１６】
ピンホール６を通過した光は対物レンズ８で標本１０の選択位置に結像される。
図６は、標本の選択位置から蛍光が発生している状態を示す。
ＤＭＤの領域（Ｒ1 ）からの光２６ａは標本１０の前面からｚ1 だけ入射した位置に焦点を結ぶ。縦横方向は領域（Ｒ1 ）に対応する位置ｘ1 ，ｙ1 に結像する。また、ＤＭＤの領域（Ｒ2 ）からの光２６ｂは標本１０の前面からｚ1 だけ入射した位置に焦点を結び、縦横方向は領域（Ｒ2 ）に対応する位置ｘ2 ，ｙ2 に結像する。
標本１０の結像位置に存在する物質により例えば蛍光２７が発生し、蛍光２７は共焦点光学系を戻り、蛍光波長帯を反射するダイクロイックミラー７で結像レンズ１１に導かれる。結像レンズ１１によって２次元光検出器１２に蛍光が結像し標本１０の位置ｘ1 ，ｙ1 ，ｚ1 と位置ｘ2 ，ｙ2 ，ｚ1 に像が検出される。
２次元光検出器１２では光電変換され、この電気信号は、カメラ装置内で所定の信号方式に処理された後モニタに表示される。
【００１７】
以上の実施の形態では出力光学系にダイクロイックミラーを用いた例を説明したが、出力（蛍光）の波長帯域を分離できる光学素子であれば、他の光学素子を用いても良い。ダイクロイックミラーに加えて吸収フィルタを挿入しダイクロイックミラーからの反射光を吸収フィルタに導き、吸収フィルタからの透過光を光検出手段に結像させても良い。また、回転式フィルタを挿入して照射光をＲＧＢの波長域にする例を示したが、回転フィルタを挿入することなく光源装置で必要となる波長または波長域を発生させても良い。
さらに光源装置に白色光を用いＤＭＤの階調調整機能と高速に切り換えられるフィルタの色指定とを同期させて領域別の色の投影を行う具体例は以下のような場合である。
細胞外刺激に対する細胞内応答の可視化の際にＤＭＤとフィルタにより細胞外の特定の領域に、特定の波長（色）でケージド化合物の光解除刺激を行った後、ＤＭＤとフィルタを切り替えて細胞内の特定の領域に、特定の励起波長で蛍光を観察するものである。なお、刺激−応答反応が非常に速ければ高速に切り替える必要がある。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
ＤＭＤにより標本の照射領域を選択できるニプコウ式共焦点顕微鏡で、医学やバイオ研究などの広い範囲で応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による共焦点顕微鏡の概略を示すブロック図である。
【図２】本発明による共焦点顕微鏡の実施の形態を示す図である。
【図３】回転式フィルタの一例を示す図である。
【図４】ＤＭＤのＲＯＩを説明するための図である。
【図５】ニプコウ板組立の一例を説明するための図である。
【図６】標本の選択領域での蛍光の発生を説明するための図である。
【図７】細胞等の生きた標本の各領域を順番に化学刺激したときの蛍光画像の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００２０】
１  集光レンズ
２  ＤＭＤ（ディジタル・マイクロミラー・デバイス）
３  微小ミラー群（オン状態）
４  マイクロレンズ付きニプコウ板
５  マイクロレンズ
６  ピンホール
７  色分割鏡（ダイクロイックミラー）
８  対物レンズ
９  カバーガラス
１０  共焦点像となる標本の領域
１１  結像レンズ
１２  ２次元光検出器（カメラ）
１３  光トラップ
１４  回転式フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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