(57)【要約】【課題】  ＭＭＰ(マトリックスメタロプロテアーゼ)を阻害する新たな有効成分とその供給源を開発する。【解決手段】  下記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるアルテピリンＣを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤。好ましい態様に従えば、ＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣはアレクリンに由来し、別の好ましい態様に従えば、プロポリス、特にブラジル産のプロポリスに由来する。該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物として利用される。【化１】2006143685.tif 000006【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるアルテピリンＣを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【化１】
2006143685.tif 000005
【請求項２】
アルテピリンＣがアレクリンに由来することを特徴とする請求項１のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
アルテピリンＣがエタノール８０％と水２０％とから成る抽出液を用いてアレクリンの新芽または葉を抽出して得られたものであることを特徴とする請求項２のマトリックスプロテアーゼ阻害剤。
【請求項４】
アルテピリンＣがプロポリスに由来することを特徴とする請求項１のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項５】
プロポリスがブラジル産であることを特徴とする請求項４のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項６】
アルテピリンＣが、エタノール８０％と水２０％とから成る抽出液を用いてプロポリスを抽出して得られたものであることを特徴とする請求項５のマトリックスプロテアーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかのマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を含有することを特徴とする飲食用または口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix
metalloproteinase：以下、ＭＭＰと略記することがある）阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＭＰは細胞外マトリックスを分解する酵素群で、19種のヒトＭＭＰが報告されている〔岡田保典  産科と婦人科9 (7): 1115-1124,
2000（非特許文献１）〕。例えば、ゼラチナーゼであるＭＭＰ２は細胞外マトリックスの構成要素であるゼラチン、ラミニン、アグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する酵素であり、この酵素の働きを阻害することにより癌細胞の浸潤と転移が抑制されることが報告されている〔Imren S.他、Cancer Res 56:
2891-2895, 1996（非特許文献２）〕。
【０００３】
ＭＭＰ２は特に乳癌の転移に深く関与している〔中島元夫  日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：2号1998年（非特許文献３）〕。マトリライシンと呼ばれるＭＭＰ７は癌細胞特異的に産生され、ＭＭＰ２と同様にゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する。胃癌や大腸癌ではＭＭＰ７の発現と癌転移との相関が報告されている。また、細胞膜と結合するＭＴ１−ＭＭＰはプロテオグリカン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分解し、大腸癌細胞や乳癌細胞の遊走を引き起こすことが知られている〔Koshikawa N.他、J Cell Biol
148: 615-624, 2000（非特許文献４）〕。
【０００４】
細胞外マトリックスは哺乳動物の組織において細胞間のすきまを埋めている生体高分子であるが、この細胞外マトリックスの代謝はこれらのＭＭＰとＭＭＰ阻害因子（ＴＩＭＰ：tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）とのバランスにより調節されている。細胞外マトリックス成分の構造異常や、合成・分解の代謝バランスの崩れは、腫瘍転移、アレルギー（例：関節炎疾患、慢性関節リウマチ）、骨吸収疾患（例：骨粗鬆症）、歯周病、角膜腫瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの疾患の原因となる。よって、ＭＭＰ（ＭＭＰ活性）を阻害する物質は、これら６つの疾患に対する治療または予防薬として利用できる可能性がある。
【０００５】
これまでにＭＭＰを阻害する物質が幾つか報告されている。例として、ヒドロキサム誘導体〔特開平８−８１４４３（特許文献１）〕、フラボノイド類〔特開平８−１０４６２８（特許文献２）、特開２０００−８００３５（特許文献３）〕、エスクレチン誘導体〔特開平８−１８３７８５（特許文献４）〕、スルホニルアミノ酸誘導体〔特開平９−３０９８７５（特許文献５）〕、テルペン類〔特開平１１−１３９９４７（特許文献６）〕、タンニン類〔特開２０００−３４４６７２（特許文献７）〕などが知られている。その他、有効成分は特定できていないが、ユーカリなどの植物エキスに、ＭＭＰの阻害作用があることも報告されている〔特開２００１−６４１９２（特許文献８）、特開２００１−１９２３１６（特許文献９）〕。
【特許文献１】特開平８−８１４４３
【特許文献２】特開平８−１０４６２８
【特許文献３】特開２０００−８００３５
【特許文献４】特開平８−１８３７８５
【特許文献５】特開平９−３０９８７５
【特許文献６】特開平１１−１３９９４７
【特許文献７】特開２０００−３４４６７２
【特許文献８】特開２００１−６４１９２
【特許文献９】特開２００１−１９２３１６
【非特許文献１】岡田保典  産科と婦人科9(7): 1115-1124, 2000
【非特許文献２】Imren S.他、Cancer Res 56: 2891-2895, 1996
【非特許文献３】中島元夫  日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：2号1998年
【非特許文献４】Koshikawa N.他、J Cell Biol 148: 615-624, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＭＭＰ阻害物質の各種分野における利用を促進するために、ＭＭＰを阻害する新たな有効成分とその供給源を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、研究を重ねた結果、或る種のプロポリスやその起源植物に含有されていることがあるアルテピリンＣにきわめて優れたＭＭＰの阻害能があることを見出し本発明を導き出した。
【０００８】
かくして、本発明は、下記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるアルテピリンＣを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤を提供するものである。
【０００９】
【化１】
2006143685.tif 000002
【００１０】
本発明の好ましい態様に従えば、本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣはアレクリンに由来する。本発明の別の好ましい態様に従えば、本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣはプロポリス、特にブラジル産のプロポリスに由来する。
さらに、本発明に従えば、上記のごとき本発明のＭＭＰ阻害剤の用途として該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、これまでに認識されていなかったアルテピリンＣから成る新しいタイプのＭＭＰ阻害剤とそれを含有する各種組成物を可能にするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に従うＭＭＰ阻害剤を構成するアルテピリンＣ（３，５−ジピレニル−４−ヒドロキシケイ皮酸）は、既述の式（Ｉ）で表わされるように、クマル酸などとともにケイ皮酸（桂皮酸）の類縁体であるが、驚くべきことに、クマル酸やケイ皮酸に比べて、著しく高いＭＭＰ阻害能を有することが本発明者によって見出され、この事実はこれまでに認識されていなかった。
【００１３】
アルテピリンＣは、合成によっても得ることはできるが、プロポリス（特にブラジル産プロポリス）およびその起源植物に一つであるアレクリン（Baccharis dracunculifolia）の抽出物に含有されていることが知られており〔例えば、Y.K. Park他、J. Agri. Food.
Chem., Vol.52, No.5: 1100-1103, 2004（非特許文献５）〕、これらを原料とすることが好ましい。
【非特許文献５】Y.K. Park他、J. Agri. Food. Chem., Vol.52, No.5:1100-1103, 2004
【００１４】
プロポリスはブラジル、中国、オーストラリア、ヨーロッパなど世界各国で採取されているが、その地域に生育しているプロポリスの源となる植物が異なるため、プロポリスに含まれる成分の種類や量に差がある場合もある〔熊澤茂則：ミツバチ科学、22(1): 1-8, 2001（非特許文献６）〕。ブラジル産プロポリスは、一般に、アレクリンを起源植物としており、アルテピリンＣの入手源として好適である。
【非特許文献６】熊澤茂則：ミツバチ科学、22(1):1-8, 2001
【００１５】
プロポリスまたはアレクリンからアルテピリンＣを得るには、一般に、それらを抽出操作に供して抽出物とする。抽出は、アルコール、疎水性有機溶媒、または超臨界状態の二酸化炭素などを用いて行なうことができるが、本発明者は、エタノール８０％と水２０％（体積比）とから成る抽出剤を用いることにより、プロポリス（特にブラジル産）またはアレクリン（特にその新芽もしくは葉）からアルテピリンＣが効率的に抽出できることを見出している。
【００１６】
以上のようにして得られるプロポリス抽出物またはアレクリン抽出物は精製または濃縮または希釈して、あるいはそのままの状態で各種の組成物、特に飲食用または口腔用組成物の成分として用いられるのに好適である。界面活性剤を用いて水に乳化させて使用することもできるし、単独または副原材料と混合してカプセルや錠剤に包含して製剤化することもできる。プロポリス抽出物またはアレクリン抽出物を混合して得られた飲食組成物（例：菓子、パン、飴、ガム、飲料水など）は癌転移などの疾病予防を目的として利用できる。また、プロポリス抽出物やアレクリン抽出物を歯磨き粉またはうがい液等に混合して得られた口腔組成物は歯周病予防のために利用することもできる。プロポリスおよびアレクリンの成分であるアルテピリンＣも如上のプロポリス抽出物やアレクリン抽出物と同様の仕様・態様で利用できる。
【００１７】
（財）日本健康・栄養食品協会の「健康補助食品の摂取量、取扱方法表示の手引き」によれば、飲用組成物としてプロポリス抽出物の１日当りの摂取量は２０ミリグラムから１００ミリグラム（体重５０キログラム当り）であることが望ましいとされる。プロポリス抽出物含有飲食品は国内において１０年以上の販売実績があり、食経験上および科学的に安全であることが認められている。実際、急性毒性試験を実施し、大人の一度の経口摂取量が乾重量８グラムを超えない限り安全性に問題がないことを確認している。
【００１８】
プロポリス抽出物に対するアルテピリンＣの含有比率を考慮すると、飲食用組成物として利用する場合、アルテピリンＣの１日当りの経口摂取量は3ミリグラムから15ミリグラムが望ましい。アレクリン抽出物を飲食用組成物に使用する場合も、アルテピリンＣの摂取量が同様の基準になるようにするのが好ましい。
【００１９】
プロポリス抽出物、アレクリン抽出物またはアルテピリンＣを歯磨き粉等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用する場合、歯磨き粉に対するプロポリス抽出物、アレクリン抽出物またはアルテピリンＣの含有率は特に限定されるものではないが、十分な効果を期待するためには少なすぎるのは好ましくなく、例えば、プロポリス抽出物濃度は３％（Ｗ／Ｗ）以上が望ましい。
以下に、本発明の特徴を更に具体的に示すため実施例を記すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００２０】
桂皮酸類縁体によるＭＭＰ阻害活性測定
市販されている高純度アルテピリンＣおよびその類似体であるクマル酸や桂皮酸を入手した（入手先：和光純薬工業（株））。それらを用いて３種のＭＭＰ〔マトリライシン（ＭＭＰ−７）、膜結合型のＭＴ１−ＭＭＰ、およびゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）〕に対する阻害率を測定した。これらのＭＭＰの活性型タンパク質の調製は公知の方法（特許文献７：特開２０００−３４４６７２）に従って大略次のように行なった。
まず、これら3種のｃDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌に感染させ、その大腸菌内で大量発現させた。発現したタンパク質をアフィニティーカラムで精製し、再構成（リフォールディング）を行った。MMP−７とMT1−MMPはトリプシンと反応させて、活性型のタンパク質を調整した。一方、MMP−２についてはｐ‐ＡＭＰＡ（p-aminophenylmercuric
acetate：ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀）と反応させ、活性型のタンパク質を調整した。
【００２１】
次に、アルテピリンＣ、３種のクマル酸（オルト−クマル酸、メタ−クマル酸、パラ−クマル酸の構造異性体）、桂皮酸を50％エタノールで10mg／mlに調製した。次にこれらの３標品を２倍ずつ1024倍まで希釈し、それぞれの標品ごとに11サンプルを調製した。これに、上記のように調製した活性型ＭＭＰのそれぞれを加え、37℃で15分間プレインキュベーション後、蛍光性ペプチド基質のＭＯＣＡｃ／ＤＮＰペプチド120μl（4.16μM）を加えて、37℃に保ちながら蛍光マイクロプレートリーダー（検出条件：励起波長320nm、蛍光波長390nm）で15分ごとに、120分間経時的に測定を行なった。測定後に20mM  ＥＤＴＡ20μlを加えて反応を停止させ、蛍光ＵＶ検出器付ＨＰＬＣに5μl注入してペプチドの検出を行なった（検出条件：70％アセトニトリル／0.1%ＴＦＡ／30nm、ＵＶ280nm、流量1.0ml／分）。なお、阻害率の算出は次の計算法に従った。
【００２２】
阻害率：  ＨＰＬＣによる分析結果から算出した阻害率
阻害率（％）＝(Ａ−Ｂ)／Ａ×100
Ａ＝ＭＴ１−ＭＭＰのピーク高さ
Ｂ＝各サンプルのピーク高さ
【００２３】
さらに、ＭＭＰ阻害活性の程度を定量的に比較評価するため、各サンプルの阻害率からＩＣ50を算出し、評価指標として用いた。ＩＣ50とは「一定条件下でＭＭＰの活性を50%阻害するために必要な検体の濃度」であり、この数値が小さいほど阻害活性が高いと言える。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2006143685.tif 000003
【００２５】
表１に示すように、クマル酸や桂皮酸と比較して、アルテピリンＣは著しく高いＭＭＰ阻害活性があることを発見した。特に、ＭＴ１−ＭＭＰとＭＭＰ７に対しては、桂皮酸には阻害活性がないが、アルテピリンＣはクマル酸に比べて３〜８倍の阻害効果を有している。また、ＭＭＰ２に対しても優れた阻害活性を有している。したがって、アルテピリンＣは、ＭＭＰ阻害物質として既述のように特定の疾患に対する治療または予防の効果が期待できる。
【実施例２】
【００２６】
プロポリス抽出物によるＭＭＰ阻害活性測定
ブラジル産プロポリス原塊1グラムを粉砕し、木屑などのゴミを除去した後、抽出剤として（Ａ）エタノール99.5%＋残部水、（Ｂ）エタノール80％＋水20％、（Ｃ）エタノール50％＋水50%、（Ｄ）水、または（Ｅ）グリセリン80%＋水20%（ミセル化抽出液）のそれぞれ3mlを用いて、すり鉢で磨り潰し、３日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ紙（６μmメッシュ）して得られた上清を各プロポリス抽出物とした。その抽出物を濃縮後、エタノールで希釈することにより固形分濃度が20％（W／W））になるように調整した。市販されているアルテピリンCを標品として、HPLCによる分析を行い、これら5種のプロポリス抽出物に含まれるアルテピリンCを定量した。
それぞれの抽出剤を用いて得られたプロポリス抽出物の有効成分の量を表２に示し、さらに、アルテピリンＣの含有量を図１に示す。なお、表２に示す各成分の量は次のようにして求めたものである。
【００２７】
【表２】
2006143685.tif 000004
【００２８】
抽出剤として（エタノール80%＋水20%）を用いた場合に、特にアルテピリンＣが効率的に抽出された。そこで、このプロポリス抽出物を用いて、実施例１と同様の手法により、ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ）に対する阻害率およびＩＣ50を求めた。なお、阻害率は、実施例１と同様にＨＰＬＣによる分析結果から算出した。表２における回収率とは、原料であるプロポリス原塊の重量に対する、得られた抽出物の重量比である。ブラジル産プロポリス抽出物のＩＣ50（mg／ml）は0.038であった。
【実施例３】
【００２９】
アレクリン抽出物によるＭＭＰ阻害活性測定
アレクリンの新芽１グラムに抽出剤として３mlのエタノール80%と水20%を加え、すり鉢で磨り潰し、３日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ紙（６μmメッシュ）して得られた上清をアレクリン抽出物（１番絞り）とした。さらに、その絞り残渣に前記抽出剤を加え、同様に抽出した（２番絞り）。最終的に、これらの抽出物を混合し、試験用のアレクリン抽出物とした。実施例１と同様にしてＭＭＰ活性の阻害率を測定し、ＭＴ１−ＭＭＰに対するＩＣ50（mg／ml）を算出したところ、0.047であった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、プロポリス抽出物またはその起源植物アレクリンの抽出物含有成分であるアルテピリンＣを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することが可能になった。これらを阻害剤として用いることにより、腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などのマトリックスメタロプロテアーゼ関連疾患の予防または治療効果の期待できる組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】各種の抽出剤を用いてプロポリスを抽出した場合のアルテピリンＣの含有量を示す。ただし、各サンプル中のプロポリス抽出物の固形分としての濃度は20％（W/W）に調整した。
【図１】
2006143685.tif 000007