(57)【要約】【課題】プロテアソームへ導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内で癌抗原とユビキチンの融合蛋白質を産生させることができ、この操作により癌抗原に特異的なＣＤ８+キラーＴ細胞を主体とした強力な抗癌腫瘍免疫を誘導させることが可能な癌遺伝子ワクチンを提供する。【解決手段】ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子を結合した遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子を結合した遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチン。
【請求項２】
癌抗原遺伝子と、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８から選ばれる少なくとも１種のサイトカイン遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ユビキチンプロテアソーム系を応用した癌遺伝子ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等動物においては、抗原と称される物質が生体内に入り込んできた場合に抗体と呼ばれる物質を生成する能力が備わっていることが知られている。この目的は自己に害を及ぼす恐れのある物質又は生物、即ち抗原から生体を保護することにある。これは侵入した抗原を特異的に認識し、その抗原を分解、中和、不活性化することによって生体を保護しようとするものである。
近年、免疫学の著しい進歩により、侵入してきたあらゆる種類の抗原に対していかに巧妙に特異抗体が生成され、種々の免疫担当細胞が動員され、目的を達するのかといういわゆる免疫応答機構が明らかにされてきた。
免疫応答機構の一つで、一度侵入した抗原を記憶し、再度同じ抗原が侵入した場合に極めて迅速、有効に免疫応答を誘起するという性質を利用したものが、ワクチンである。ワクチンの技術は、不活性化した感染性生物又は感染性生物の構成物質の一部を予めヒトに接種し擬似感染を成立させることによって、感染時に生体内に記憶された免疫応答を有効に引き出し感染症に対する耐性を発揮させるというものである。
【０００３】
難治性感染症に対応するに最も適切な戦略はワクチンであることは紛れもない事実であり、現実的に臨床サイドからも早急な開発が期待されている。
しかしながら、世界的に蔓延し大きな社会問題となっているマラリア、結核、トキソプラズマ等の免疫回避エスケープ機構が複雑な細胞内寄生病原体に対するワクチンに関しては、これまで幾度となく開発が試みられてきたもののことごとく失敗に帰してきた。これは、これらの病原体の感染および寄生適応機構の解明が十分進まず、さらにそれらの病原体排除に要求される宿主防御機構も特定されていないことに起因する。エスケープ機構が複雑な病原体に対し十二分な予防効果を発揮するワクチン法を確立するためには、これまでのワクチン戦略を抜本的に見直し、感染免疫の分子論的基盤に立脚した総合的な研究を展開していく必要がある。
【０００４】
従来のワクチンで有効な効果が認められなかった原因としては、ワクチンが必ずしも防御に必須な免疫応答の誘導に至らなかったこと、さらにＴｈ１／Ｔｈ２をはじめとする免疫応答が防御免疫としての適切な方向へと結びついていないことが挙げられる。ＤＮＡワクチンは病原体標的遺伝子とユビキチン遺伝子等の免疫応答制御遺伝子との融合遺伝子を用いたフュージョンＤＮＡワクチン、それらのＤＮＡワクチンにインターロイキン１２（以下、「ＩＬ−１２」と略記する）、インターロイキン１５（以下、「ＩＬ−１５」と略記する）、インターロイキン１８（以下、「ＩＬ−１８」と略記する）等のサイトカイン遺伝子治療を併用したコンビネーションＤＮＡワクチン法を導入することにより、任意の免疫応答を誘導できることが最大の利点であり従来のワクチンの問題点を克服できうる有用な手法である。
【０００５】
本発明者らは、細胞内寄生原虫（トキソプラズマ、リーシュマニア及びクルーズトリパノソーマ及びマラリア）等の感染において、初期及び後期感染防御に関わる免疫細胞集団が異なることを明らかにした。また、従来のワクチン法ではなし得なかった任意の免疫応答の特異的防御及び誘導をフュージョンＤＮＡワクチン及びＩＬ−１２、ＩＬ−１５等のサイトカイン遺伝子とのコンビネーションＤＮＡワクチンを用いることにより、病原体のエスケープ機構の相違に対応した予防・治療法を確立することを最終目的としている。
さらに、免疫応答機構は、生体内に生ずる各種新生物生成疾患、即ち癌の発症に於いても重要な役割を担っているのではないかと考えられるようになってきた。即ちある種の免疫担当細胞は常に生体の全ての細胞と物体とを監視し非自己と判断された細胞を排除する機能を担っており、形質転換を起こした細胞即ち腫瘍細胞の発生もこれら監視機構によって常時チェックされており、発生した腫瘍細胞の多くは悪性な癌となる以前に排除されているのではないかという考えがあり、この機構は癌細胞を傷害するキラーＴ細胞をはじめ単核食細胞マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞などが司る主に細胞性免疫と呼ばれる仕組みによって成り立っていることが明らかとなってきた。
これらの知見からさらに一歩進めて癌免疫を積極的に治療に応用しようという癌免疫療法という考えが提唱されるに至った。その中身としては、上に述べた感染症に対するワクチンと原理的に共通な能動免疫療法、即ち不活化させた癌細胞やその成分を接種することによって抗癌効果を引き出そうというものや、免疫賦活療法、即ち免疫応答機構そのものを非特異的に活性化させて抗癌免疫効果を高めるものがある。
【０００６】
一方、ほとんどの癌の免疫学的排除に対してＣＤ８+Ｔ細胞（キラーＴ細胞）が必須の関わりを持つことは周知の事実である。また、キラー細胞の認識の対象となる癌抗原のエピトープも多数同定されている。
しかしながら、それらのエピトープペプチドを用いた癌免疫治療の成功例は皆無に近い。これは癌患者の生体内ではそれらのエピトープに対応するＣＤ４+Ｔ細胞は誘導できるが、ＣＤ８+キラーＴ細胞が誘導されないことにある。
例えば、メラノーマ抗原に対して特異的にキラー細胞を活性化させるためにはその抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子に提示させることが必須である。そのためには、メラノーマ抗原を細胞質内酵素であるプロテアソームで処理させることが前提となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、プロテアソームへ導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内で癌抗原とユビキチンの融合蛋白質を産生させることができ、この操作により癌抗原に特異的なＣＤ８+キラーＴ細胞を主体とした強力な抗癌腫瘍免疫を誘導させることが可能な癌遺伝子ワクチンを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、細胞内寄生原虫（トキソプラズマ、リーシュマニア及びクルーズトリパノソーマ及びマラリア）等の感染において、初期及び後期感染防御に関わる免疫細胞集団が異なることを見出し、従来のワクチン法ではなし得なかった任意の免疫応答の特異的防御及び誘導をフュージョンＤＮＡワクチン及びＩＬ−１２、ＩＬ−１５等のサイトカイン遺伝子とのコンビネーションＤＮＡワクチンを用いることにより、病原体のエスケープ機構の相違に対応した予防・治療法の確立を目的とし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２］に記載した事項により特定される。
［１］ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子を結合した遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチン。
［２］癌抗原遺伝子と、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１種のサイトカイン遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチン。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の癌遺伝子ワクチンは、ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子を結合した遺伝子を含有することによって得ることができる。
また、本発明の癌遺伝子ワクチンは、癌抗原遺伝子と、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１種のサイトカイン遺伝子を含有するこによって得ることができる。
本遺伝子ワクチンに用いる遺伝子は、全てｎａｋｅｄ  ＤＮＡであり、ウィルスベクターを用いる必要がない。
【００１１】
癌拒絶抗原特異的なＣＤ８+陽性キラーＴ細胞を効率的に誘導するには、その前駆細胞がＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子と結合した腫瘍拒絶抗原を認識して活性化される必要があるが、通常ＡＰＣクラスＩ分子上での腫瘍拒絶抗原提示レベルは低い。ＡＰＣクラスＩ分子上に腫瘍拒絶抗原を効率的に発現させるためにＤＮＡワクチンを導入し、更に癌抗原遺伝子をユビキチン遺伝子と融合化することによって腫瘍拒絶抗原をプロテアソーム系に運ぶことが可能である。
すなわち、本発明においては、既知の癌抗原遺伝子をプロテアソームへのＴａｇ分子であるユビキチン遺伝子と融合化させることで、腫瘍抗原特異的キラーＴ細胞を主体とした強力な抗腫瘍免疫を誘導させるものである。
【００１２】
メラノーマや肺癌等の癌抗原に対して特異的にＣＤ８+キラーＴ細胞を活性化させるためにはその抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子に提示させることが必須である。そのためには、メラノーマ抗原を細胞質内酵素であるプロテアソームで処理させることが前提となる。本発明においては、プロテアソームへ導くＴａｇ分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより細胞質内でメラノーマ抗原とユビキチンの融合蛋白質を産生させるとともに、この操作によりメラノーマ抗原に特異的なＣＤ８+キラーＴ細胞を主体とした強力な抗メラノーマ腫瘍免疫を誘導させることが可能である。
【００１３】
従来のリコンビナントサイトカイン蛋白を用いた方法では、一度に大量投与を必要とするため副作用が強く、臨床応用が困難な場合が多い。しかし、遺伝子銃を用いたサイトカイン遺伝子治療法では、目的とする蛋白が少量かつ持続的に一定期間供給されるため安全性が高く、連日投与の必要がなく、かつ効果的である。
本発明により、発現される蛋白は大腸菌で合成されるリコンビナント蛋白と異なり、発現蛋白への糖鎖の付加が起こり、本来の蛋白構造が保たれる。
【００１４】
ＩＬ−１２等のサイトカイン遺伝子との共導入（コンビネーションＤＮＡワクチン）、あるいはワクチンベクターを工夫することで（フュージョンＤＮＡワクチン）、ＭＨＣクラスIIあるいはＭＨＣクラスＩ依存型免疫応答の選択的誘導が容易である。この選択的誘導はリコンビナントワクチンでは困難である。
本発明におけるワクチンは、リコンビナント蛋白質ワクチンや病原体蛋白質を用いたワクチンと異なり、頻回投与によってもアナフィラキシーショックを引き起こす可能性は少なく、安全性に優れる。また、リコンビナント蛋白質ワクチン／サイトカインに比べ精製・調製が簡便かつ経済的である。
【００１５】
従来のウィルスベクターを用いた遺伝子治療の最も重大かつ致命的欠点の一つは、ウィルスベクターに対する抗体が産生されやすく、頻回投与ではウィルスベクターの排除あるいはアナフィラキシーショックを惹起する危険性がある。それに比べて、ウィルスベクターを用いないｎａｋｅｄ  ＤＮＡによる遺伝子治療、ＤＮＡワクチンでは、生体への反復投与が容易かつ安全に行うことができる。さらにウィルスベクターを用いる場合に比してｎａｋｅｄ  ＤＮＡ遺伝子の構築は非常に容易である。
本発明においては、ウィルスベクターを用いないので遺伝子の構築が容易で、しかもウィルスベクターの強毒化による感染の危険性が極めて少ない。また、ウィルスベクターを用いないのでｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ内にインテグレーションされる可能性が非常に低い。
【００１６】
メラノーマや肺癌等の細胞上のキラーＴ細胞エピトープの同定については、▲１▼腫瘍を認識するＴ細胞（腫瘍反応性Ｔ細胞）を用いる方法と、▲２▼腫瘍抗原の候補となる分子に対するＴ細胞を誘導する方法に大別される。しかし、現在のところ、このように同定されたキラーＴ細胞認識エピトープで免疫しても生体内では有効にキラーＴ細胞を誘導するには至っていない。その原因として、これらのエピトープで免疫しても、キラーＴ細胞を誘導するための必須の課程である、細胞内酵素であるプロテアーゼによるそれらのエピトープ抗原の処理が起こらないからである。そこで、本発明においては、既知のキラーＴ細胞エピトープの遺伝子を用いてプロテアソームへのＴａｇ（誘導）分子のユビキチン遺伝子と融合化することにより、プロテアソームでの抗原処理（Processing）に導き、必然的に腫瘍抗原特異的キラーＴ細胞を誘導し活性化する。すなわち、既知のキラーＴ細胞認識エピトープを使用し、文献上のキラーＴ細胞認識エピトープの検索を行い、そのエピトープについて遺伝子バンク上で配列を確認する。
【００１７】
本発明においては、キラーＴ細胞を効率的に誘導するエピトープの検索は、既知の癌抗原遺伝子をプロテアソームへのＴａｇ分子であるユビキチン遺伝子と融合化させることで、腫瘍抗原特異的キラーＴ細胞を主体とした強力な抗腫瘍免疫を誘導させるものである。なお、Ｔａｇ分子であるユビキチン等は抗原提示細胞内に恒常的に存在しており、細胞内で産出された異物抗原や細胞内に注入された癌抗原遺伝子産物と非選択的に結合しプロテアソームへ移送される。
【００１８】
本発明におけるキラーＴ細胞エピトープの遺伝子の構築については、キラーＴ細胞エピトープ既知配列をデータベースより検索し、その配列両端についてプライマーを合成し、腫瘍細胞よりフェノール・クロロフォルム法によりＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡをテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて逆転写し、遺伝子を構築する。ここで、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、ＤＮＡ鎖の特定部位のみ繰り返し複製する反応で、微量のＤＮＡを１,０００，０００倍程度まで増幅できる。複製反応のプライマーとしては、増幅部両端の塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチオを用いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより行う。また、ＲＴ−ＰＣＲ法（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡからＤＮＡを合成し、その後は通常用いられるＰＣＲ法によって、特定のＤＮＡ部位を増幅する方法である。
【００１９】
本発明に係る癌遺伝子ワクチンは、病気罹患の際に免疫学的により好ましい免疫応答のできる免疫システムが達成されるような、あらゆる組成物をも含むことができる。通常、ワクチンは免疫決定要因と、この免疫決定要因の応答を、迅速強化するような作用を呈する免疫助成剤とを含み、免疫決定要因は免疫助成剤と組み合わせて用いるのが好適である。免疫助成剤は、通常用いられる、例えば、フロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）複合体助成剤や、フロインド非複合体助成剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。尚、本発明の癌遺伝子ワクチンは、免疫助成剤を用いなくとも効能を有する。
【００２０】
本発明におけるユビキチンは、蛋白質の分解提示シグナルの機能等を有する保存性の高い蛋白質であり、ユビキチン遺伝子は、細胞内に生じた異常タンパク質を排除する他、様々な生物機能に関係しているユビキチンタンパク質をコードする。
本明細書においては、ユビキチンをコードする遺伝子のプロモーター、ユビキチンをコードする構造遺伝子、及びこれら両者を含むＤＮＡ配列を、併せて「ユビキチン遺伝子」ということがある。
本発明に係るユビキチン遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（２０ｇ）当たり、２μｇ〜１０μｇ、好ましくは、４μｇ〜６μｇである。この範囲外になるにつれ抗癌腫瘍免疫効果が減弱する。
【００２１】
本発明における癌抗原遺伝子とは、癌抗原遺伝子とユビキチン遺伝子等のプロテアソームへのＴａｇ（誘導）分子との融合遺伝子である。
本発明に係る癌抗原遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（２０ｇ）当たり、２μｇ〜１０μｇ、好ましくは、４μｇ〜６μｇである。この範囲外になるにつれ抗癌腫瘍免疫効果が減弱する。
【００２２】
本発明におけるサイトカイン遺伝子は、多くの機能を有し、免疫細胞の分化、増殖及び活性化を誘導することができる遺伝子であり、例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長因子（ＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８である。
本発明におけるサイトカイン遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（約２０ｇ）当たり、２μｇ〜１０μｇ、好ましくは、４μｇ〜６μｇである。この範囲外になるにつれ抗癌腫瘍免疫効果が減弱する。
【００２３】
ユビキチン化した遺伝子、癌抗原遺伝子及びサイトカイン遺伝子は、上述したＲＴ−ＰＣＲ法で構築されるが、この方法に限定されるものではない。具体的には、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡからＤＮＡを合成し、この後、ＰＣＲ法によりＤＮＡ鎖の特定部位のみ繰り返し複製し、微量のＤＮＡを増幅した後、大腸菌に形質転換し、３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行う。その後、遠心を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分をＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ溶液に溶解する。続いてアルカリ溶液ＮａＯＨ／ＳＤＳ溶液にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止める為中和溶液酢酸カリウムにて中和する。その後、核酸精製用陰イオン交換樹脂カラムに溶液をｌｏａｄし、ＮａＣｌ／酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、ＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにて溶出する。尚、その遺伝子が実際に細胞内で発現することは、ｃｏｓ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔして確認する。ここで、癌抗原遺伝子とＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１種のサイトカイン遺伝子は、１：１で混合させるのが好ましいが、種々の条件により適宜変更できる。
【００２４】
本発明に係る癌遺伝子ワクチンは、主に、腫瘍疾患、具体的には、肝癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫及び肺、結腸、乳房、膀胱、卵巣、精巣、前立腺、睾丸腫瘍、子宮、頚部、膵臓、胃、大腸、小腸、その他の器官の癌を包含する多様なタイプの癌や白血病等の治療あるいは予防に有効に使用できる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、これらの例は単なる実例であって本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変更させてもよい。
【００２６】
実施例１
本実施例において、ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子とを結合した遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＴＲＰ−２）を調製した。
ＵＢ−ＴＲＰ−２遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ培地５００ｍｌ中で３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行った。
次いで、４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに溶解した。続いて、アルカリ溶液２００ｍＭＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液１０ｍｌにて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液３．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１０ｍｌにて中和した。
その後、６００ｍＭＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ．製）に中和溶液を室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った上清をｌｏａｄし、８００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、１．２５Ｍ ＮａＣｌ／１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて溶出した。
【００２７】
実施例２
本実施例において、癌抗原遺伝子とＩＬ−１２遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（ＴＲＰ−２+ＩＬ−１２）を調製した。
ＴＲＰ−２遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ培地５００ｍｌ中で３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行った。
次いで、４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに溶解した。続いて、アルカリ溶液２００ｍＭＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液１０ｍｌにて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液３．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１０ｍｌにて中和した。
その後、６００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ．製）に中和溶液を室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った上清をｌｏａｄし、８００ｍＭＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、１．２５Ｍ ＮａＣｌ／１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて溶出した。
同様の方法にて、ＩＬ−１２遺伝子を含有する発現プラスミドを培養、精製を行った。
このようにして得られた癌抗原遺伝子（ＴＲＰ−２）と、ＩＬ−１２遺伝子を１：１で混合し、癌抗原遺伝子とＩＬ−１２遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（ＴＲＰ−２＋ＩＬ−１２）を調製した。
【００２８】
比較例１
本比較例において、癌抗原遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（ＴＲＰ−２）を調製した。
ＴＲＰ−２遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌  ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ培地５００ｍｌ中で３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行った。
次いで、４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに溶解した。続いて、アルカリ溶液２００ｍＭ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液１０ｍｌにて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液３．１Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１０ｍｌにて中和した。
その後、６００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ．製）に中和溶液を室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った上清をｌｏａｄし、８００ｍＭＮａＣｌ／１００ｍＭ 酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、１．２５ＭＮａＣｌ／１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて溶出した。
【００２９】
比較例２
本比較例において、ＩＬ−１２遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（ＩＬ−１２）を調製した。
ＩＬ−１２遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌  ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ培地５００ｍｌ中で３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行った。
次いで、４℃、１２０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに溶解した。続いて、アルカリ溶液２００ｍＭＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液１０ｍｌにて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液３．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１０ｍｌにて中和した。
その後、６００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ．製）に中和溶液を室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った上清をｌｏａｄし、８００ｍＭＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、１．２５ＭＮａＣｌ／１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて溶出した。
【００３０】
実施例３
実施例１、実施例２及び比較例１、比較例２で調製した癌遺伝子ワクチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を、マウスメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）を担癌した１０週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）雌マウスに対して、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を用いて、腹部皮下に１週間ごとに導入し、３日おきに腫瘍の大きさを観察した。尚、マウスは一群につき６匹を用い、担癌（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した日をｄａｙ０とした。Ｃｈａｌｌｅｎｇｅしたメラノーマ細胞数は、マウス一匹当たり２×１０５個である。遺伝子ワクチンの導入はｄａｙ２より開始した。
これにより、どの癌遺伝子ワクチンがＤＮＡワクチンによる癌免疫治療に効果的かを調査した。その結果を図１に示す。
【００３１】
図１はＤＮＡワクチンによる癌免疫治療効果を示すグラフである。
図１の（１）は対照群（非処理群）における測定結果を示し、（２）は実施例１（ＵＢ−ＴＲＰ−２遺伝子導入群）における測定結果を示し、（３）は比較例１（ＴＲＰ−２遺伝子単独導入群）における測定結果を示し、（４）は比較例２（ＩＬ−１２単独導入群）における測定結果を示し、（５）は実施例２（ＴＲＰ−２遺伝子とＩＬ−１２遺伝子の共導入群）における測定結果を示す。ここで、図１の（１）、（５）中、横に並んだ●は、腫瘍の大きさが同じであることを表している。
図１より、（１）の対照群（非処理群）でのＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスのメラノーマは経時的に増大するのに対し、実施例１及び実施例２のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスのメラノーマは２５日目においてもほとんど生着せず、著しい抗腫瘍効果が認められた。一方、比較例１及び比較例２でのＢ６マウスのメラノーマにおいては、遺伝子導入の効果は認められなかった。
また、実施例１、実施例２におけるワクチンをマウスへ導入した際、導入局所にわずかに脱毛が見られる程度で、全身状態に全く悪影響を及ぼさず、無害であった。
更に、実施例１、実施例２及び比較例１、比較例２におけるワクチンの導入は、全て正常組織部位への導入であり、必ずしも発癌部位への導入を必要とせず、発癌部位と正常組織部位のどちらにも効果的であった。
【００３２】
次に、ＤＮＡワクチンによるメラノーマの肺転移効果を調べた。尚、この実験では一群４匹を用い、担癌１４日目（ｄａｙ１４）に２×１０５のメラノーマを静脈内に移入し、肺での転移数をカウントした。その結果を表１（表１）に示す。
【００３３】
【表１】
表１
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【００３４】
表１より、非処置（ｃｏｎｔｒｏｌ）マウスでは一匹あたり２０４個の転移腫瘍（メラノーマ）が認められたが、ＵＢ−ＴＲＰ−２遺伝子導入群ではわずか３７個であった。また、ＴＲＰ−２＋ＩＬ−１２群では非処置群と有意差が認められなかった。すなわち、本発明におけるＤＮＡワクチン治療法が転移癌に対しても効果的であった。
【００３５】
実施例４
本実施例において、担癌動物へのＤＮＡワクチンがキラーＴ細胞を効果的に活性化していることを測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＬ−４細胞にＴＲＰ−２ペプタイドを付着させたものを標的細胞とし、クローム遊離法によりキラーＴ細胞活性を測定した。その結果を図２に示すが、このアッセイには、図１のｄａｙ２５のマウス（一群６匹）を用いその平均値を示す。
図２はＤＮＡワクチンによるキラーＴ細胞の活性化を示すグラフである。
図２の（ａ）はＴＲＰ−２ペプタイドを付着させていないＥＬ−４細胞を用いてキラーＴ細胞活性を測定した結果を示し、ｎｅｇａｔｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌを表す。（ｂ）はＴＲＰ−２ペプタイドを付着させたＥＬ−４細胞を標的細胞として用いたＫｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙの測定結果を示す。
図２の（２）より、実施例１のＵＢ−ＴＲＰ−２群では強いキラーＴ細胞活性が認められた。一方、比較例１のＴＲＰ−２単独群では、わずかに活性が認められたが、対照群のＵＢ遺伝子単独処置群では全く活性が認められなかった。
【００３６】
実施例５
本実施例において、抗腫瘍効果がユビキチンプロテアソーム系を介してであることをプロテアソーム阻害剤を用いて調べた。
実施例１で調製されたＵＢ−ＴＲＰ−２をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクトした細胞にプロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２を添加した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ2存在下で培養後、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗体にて抗原を確認した。その結果を図３に示す。
プロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２非存在下では抗原を確認することができないが、阻害剤存在下では量依存的に抗原バンドが強く確認された。この結果より、ユビキチン化した抗原は阻害剤非存在下では、ユビキチンープロテアソーム経路により抗原は速やかに分解され、ＭＨＣクラスＩを介してＣＤ８+Ｔ細胞を活性化することが示唆された。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、プロテアソームへ導くＴａｇ分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内で癌抗原とユビキチンの融合蛋白質を産生させることができ、この操作により癌抗原に特異的なＣＤ８+キラーＴ細胞を主体とした強力な抗癌腫瘍免疫を誘導させることが可能な癌遺伝子ワクチンを得ることができる。
本発明に係るユビキチン化癌遺伝子の導入が無害であるとともに、遺伝子導入が発癌部位と正常組織部位のどちらにも効果的であるだけでなく、本発明におけるＤＮＡワクチン治療法が転移癌に対しても効果的であり、安全性に優れる。
【００３８】
本発明により発現される蛋白は大腸菌で合成されるリコンビナント蛋白と異なり、発現蛋白への糖鎖の付加が起こり、本来の蛋白構造が保たれ、目的とする蛋白が少量かつ持続的に一定期間供給されるため安全性が高く、連日投与の必要がなく、かつ効果的である。
また、ＩＬ−１２等のサイトカイン遺伝子との共導入（コンビネーションＤＮＡワクチン）あるいは、ワクチンベクターを工夫することで（フュージョンＤＮＡワクチン）ＭＨＣクラスIIあるいはＭＨＣクラスＩ依存型免疫応答の選択的誘導が容易である。
【００３９】
本発明におけるワクチンは、リコンビナント蛋白質ワクチンや病原体蛋白質を用いたワクチンと異なり、頻回投与によってもアナフィラキシーショックを引き起こす可能性は少なく、安全性に優れる。また、リコンビナント蛋白質ワクチン／サイトカインに比べ精製・調製が簡便かつ経済的である。
本遺伝子ワクチンに用いる遺伝子は、全てｎａｋｅｄ  ＤＮＡであり、ウィルスベクターを用いる必要がないため、遺伝子銃を用いた遺伝子治療、ＤＮＡワクチンでは、生体への反復投与が容易かつ安全に行うことができる。しかも、遺伝子の構築が容易で、しかもウィルスベクターの強毒化による感染の危険性が極めて少ない。また、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ内にインテグレーションされる可能性が非常に低い。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡワクチンによる癌免疫治療効果を示すグラフ
【図２】ＤＮＡワクチンによるキラーＴ細胞の活性化を示すグラフ
【図３】ＴＲＰ−２がユビキチンと結合することによりプロテアソームで分解されることをプロテアソーム阻害剤を使用して証明したグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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