(57)【要約】【課題】環境水中の有害物質を検知するバイオセンサにおいて、ゼロ点校正とフルスケール（スパン）校正を安定的にしかも短時間で行う技術、および通常の水質監視状態において上記ゼロ点校正とフルスケール（スパン）校正を行う技術を提供すること。【解決手段】検査水とバイオセンサ用の基質との混合物の温度をその検査水の酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内に保持し、酸素消費が最大となる状態での溶存酸素センサの出力値を記憶し、記憶した前記出力値を前記バイオセンサのゼロ点校正値とする。また、検査水を低温に保持した状態での計測値を基にし、その値から算出された値と、前記ゼロ点校正値との差分値を算出し、前記差分値を測定範囲としてスパンの大きさを求める。【選択図】        図１
2006071438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境水中の有害物質を検知するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水を水質監視をしている状態のままで検査水の温度を変化させ、その検査水の酸素消費が最大となるときおよび酸素消費率が最小となるときの溶存酸素センサの出力値を知り、それら二つの値を基にしてスパンの大きさを求めることを特徴とするバイオセンサの校正方法。
【請求項２】
環境水中の有害物質を検知するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水の温度を５〜３５℃に保持し、その温度範囲内で酸素消費が最大となるときの温度を探索し、その温度での溶存酸素センサの第一の出力値を記憶し、記憶した前記第一の出力値を前記バイオセンサのゼロ点校正値とすることを特徴とするバイオセンサの校正方法。
【請求項３】
検査水の温度をその検査水の酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内に保持することを特徴とする請求項２記載のバイオセンサの校正方法。
【請求項４】
環境水中の有害物質を検出するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水を低温に保持した状態での溶存酸素センサの第二の出力値と、請求項２記載の溶存酸素センサの第一の出力値との二種類の出力値を基にしてスパンの大きさを求めることを特徴とするバイオセンサの校正方法。
【請求項５】
検査水を低温に保持する温度が５℃以下であることを特徴とする請求項４記載のバイオセンサの校正方法。
【請求項６】
バイオセンサにおける呼吸阻害率がその閾値を越えたときに、溶存酸素センサの保守アラームを出力することを特徴とする請求項４または５記載のバイオセンサの校正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ応用水質計測器の新規な校正方法に関する。とくに上下水道の各プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水（以下、試料水ということがある）を対象として、水中の有害物質をモニタリングすることを目的としたバイオセンサ応用水質計測器の新規で簡便な校正方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは試料水中の測定対象化学物質を認識する分子識別素子ということができ、酵素や抗体などの生体機能性材料や微生物、細胞など生体そのものを利用し、これらの生物材料を多孔性高分子膜に化学的に包括または共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサと組合せて前記生物材料の分子識別信号を電気信号に変換して試料水中の化学物質の測定を行うセンサである。
バイオセンサは試料水を前記生体材料の固定化膜に接触させ、これによって生ずる生化学反応により生成または消費される物質の濃度変化を検出器で電流や電圧などの電気的な出力（以下、センサ出力と記載する）の変化に変換して測定する。
【０００３】
そのバイオセンサを使用した有害物質検出のための測定にあたっては、固定化した生体材料が安定に機能するように温度とpH条件を一定にすることが必要である。そのため、バイオセンサ応用計測器では、温度を一定に保つために試料水を一定温度に加温する熱交換器とセンサ温度を一定にする恒温槽が備えられ、また、pH条件を一定とするために緩衝溶液が用いられている。
【０００４】
すでに、水中の有害物質検出用バイオセンサが開発され（たとえば特許文献１を参照）、実用化されている。このバイオセンサは、生体材料と検出器とから構成される。前記生体材料としては有害物質に極めて弱い微生物を用い、この微生物を生きたまま固定化して、たとえば高分子多孔膜で封じ込めた微生物膜が多用される。前記検出器としては溶存酸素電極が多用される。この微生物膜と溶存酸素電極が組合せられた呼吸活性検知型バイオセンサが好適である。
バイオセンサの一例を図５に基づいて説明する。
冷蔵保存した微生物膜１をフローセル４内に入れ、その上に溶存酸素電極２を取り付けて微生物膜１と密着させ、有害物質検出用微生物センサを構成する。センサ出力値はリード線３から情報記録装置(図示されていない)などの制御装置(図示されていない)に送られる。
このバイオセンサに、そのセンサに用いられている微生物の基質および微量栄養成分を一定濃度含む緩衝溶液と試料水を、普通は基質を１に対して５〜１５(容量比)の比率となるように混合した後、連続的に流すことにより、試料水での有害物質混入の連続監視を行う。ここでバイオセンサの生体材料としては有害物質に極めて弱い微生物である硝化細菌を用いる場合が多い。
【０００５】
ここで、図６の左図に基づいて、試料水中に存在する酸素の測定法を説明する。
試料水中に存在する酸素は、試料水に接触する微生物固定膜内にて、その膜内の微生物により消費される。消費されない該固定膜内の酸素は、固定膜と密着されている溶存酸素センサの電極にて水酸イオンに還元され、その反応による電流は変換器を介して、適宜出力される。前記試料水に微生物の栄養源である基質が存在すると消費酸素量は増えることなり、やがては全ての酸素が消費されることなる。
通常、前記のような硝化細菌を使用するバイオセンサ応用計測器では、微生物膜内の硝化細菌の数や活性をできるだけ長い期間安定に維持するために、硝化細菌の生育至適温度（30℃）、生育至適pH（9.0）等の至適条件を維持し、成育に必要な微量栄養成分を含む緩衝溶液を用いて測定を行っている。しかし、このような条件下でも試料水の水質や微生物膜内での硝化細菌の増殖サイクルに伴い、微生物膜の活性（硝化細菌の数や活性）は変動する。
【０００６】
バイオセンサに用いられる溶存酸素センサはガルバニ電池が多用され、そのセンサの構成の一例を図７に基づいて説明する。溶存酸素センサは少なくともその先端が、検査水（試料水）と酸素を透過させる隔膜（例えば四フッ化エチレン樹脂などの高分子膜）３１を介して接触されている。この膜３１と接触する試料水と反対側には、電解液３３が充填され、この電解液に浸漬されるようにアノード電極２９、カソード電極３０が、絶縁ガラス３２を介して設けられている。試料水中に溶存している酸素は、膜３１、電解液３３を拡散してカソード電極３０に達する。そして、このカソード電極３０において、酸素は下記（１）式に示す反応により水素イオン（ＯＨ- ）に還元される。
Ｏ2 ＋２Ｈ2 Ｏ＋４ｅ- →４ＯＨ-       （１） 
上記反応による電流は、たとえば電流計(図示してない)により検出され、その出力は演算部（図示していない）に入力され、ここで適宜演算処理することにより、試料水中に溶存している酸素の濃度が得られる。
【０００７】
前記溶存酸素センサを長期間連続運転している間に、一般的には化学反応により、析出物が発生する。これら析出物がたとえば前記アノード電極２９と酸素透過膜３１間に入り込むと、ゼロ点が不安定になったり、スパン巾が狭くなる。また、絶縁ガラス３２に微少なクラックが入るとゼロ点が不安定になる。センサ日常運転中にも、微生物膜1の表面に気泡が付着するとスパン巾が狭くなる。
そのため、日常運転で、一日一回程度、溶存酸素センサの校正を行うのが普通である。代表的な校正方法は、溶存酸素センサを校正するための標準溶液を使用して行う。
すなわち、センサの温度を３０℃の状態に調整し、それを基準とし、
まず、純水と微生物の栄養源である基質をバイオセンサの試料流路に流し、微生物が完全に酸素を消費する前提で、ゼロ点校正を行う。
次に、基質を含まない緩衝液と純水のみを、バイオセンサの試料流路に流し、微生物がほぼ酸素を消費できなくなる前提で、フルスケール（スパン）校正を行う。
【０００８】
【特許文献１】特公平７−８５０７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記校正方法における問題点としては、
（１）水質監視する検査水から緩衝液と純水に切り替えた後、純水と基質を含む緩衝液を試料流路に流し、ゼロ点校正を行い、次に、基質を含まない緩衝液と純水のみを、試料流路に流し、フルスケール（スパン）校正を安定的に行うとすると、そのために必要な時間はおよそ１時間半にも及んでしまう。その校正を行っている間は検査水を供給するバルブは閉じた状態とする必要があるため、水質監視ができない、という問題点がある。
（２）  また、微生物の活性状態は常に変動するために検査水と基質を与えても、例えば、図６の４の状態で示すように、微生物による酸素消費率が100％に至らず、溶存酸素センサの出力がゼロにならない場合があり、バイオセンサの校正時に、純水と基質を試料流路に流し、微生物が完全に酸素を消費する前提でのゼロ点校正ができない場合がある、という問題点もある。
前者の問題点は、バイオセンサ２台を並列運転することにより解決できるのであるが、そうすると、全てのコストが倍になるという新たな不都合さが生じてしまう。
後者の問題点に対する解決策は、現在までとくに報告されていない。
そこで、前記問題点を解決することが本発明の課題である。とくに、水質監視する検査水から緩衝液と純水に切り替えることなく、簡便にゼロ点校正とフルスケール（スパン）校正を行うことができるバイオセンサの校正方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決するために、研究を重ねた結果、バイオセンサと接触する検査水の酸素消費率に着目し、前記酸素消費率とバイオセンサにて有害物質の有無を検査される試料水の液温との関係は、特定の温度範囲では相関関係および可逆性があるという知見を得、この関係の程度（傾き）は微生物の活性に依存していることにも気づいた。また、検査水を低温（５℃以下）に保持した状態での酸素消費率は微生物の活性に関係なくおよそ２０％であることにも気づいた。それらの関係を利用すると共に、あらかじめ試験して得られた基本データ、たとえば溶存酸素センサ単体での液温に対するセンサ出力特性、を利用すれば、ゼロ点校正およびフルスケール（スパン）校正を従来方法よりも簡単に行うことができ、しかも従来方法とほぼ同じような正確さで行うことができることに気づいた。すなわち、従来の校正方法では必須であった「検査水」から「緩衝溶液と純水との混合物」に切り替える操作を省くことができ、検査水の温度を制御することによりゼロ点校正およびフルスケール（スパン）校正を簡単に行うことができることに気づいた。本発明者らは、さらに検討を重ね、遂に本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明の請求項１に係る発明は、環境水中の有害物質を検知するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水を水質監視している状態のまま、その検査水の酸素消費が最大、すなわち１００％となるときの溶存酸素センサの出力値、および酸素消費率が最小、すなわち通常では２０％となるときの溶存酸素センサの出力値を知り、それら二つの値を基にしてスパン巾の大きさを決定することを特徴とするバイオセンサの校正方法である。
本発明の請求項２に係る発明は、前記環境水の一部である検査水の温度を５〜３５℃に保持し、その温度範囲内で酸素消費が最大となるときの温度を探索し、その温度での溶存酸素センサの第一の出力値を記憶し、記憶した前記第一の出力値を前記バイオセンサのゼロ点校正値とすることを特徴とするバイオセンサの校正方法である。
本発明の請求項３に係る発明は、前記請求項２に係る発明において、検査水の温度をその検査水の酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内に保持することを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項４に係る発明は、環境水中の有害物質を検出するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水を低温に保持した状態での溶存酸素センサの第二の出力値と、請求項２記載の溶存酸素センサの第一の出力値との二種類の出力値を基にしてスパン巾の大きさを決定することを特徴とする発明である。
本発明の請求項５に係る発明は、前記請求項４に係る発明において、検査水を低温に保持する温度が５℃以下であり、検査水をその検査水の酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内に保持する温度が５〜３５℃であることを特徴とする。
本発明の請求項６に係る発明は、バイオセンサにおける呼吸阻害率がその閾値を越えたときに、溶存酸素センサの保守アラームを出力することを特徴とする請求項４または５記載のバイオセンサの校正方法である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、酸素消費率（%）は次のようにして算出される。
酸素消費率（%）がどの程度であるか知りたい液体を、微生物として硝化細菌を用いたバイオセンサの試料流路に流し、その酸素消費率は、下記（２）式から求めることができる。
酸素消費率（%）＝[（Ａ−Ｂ）／Ａ]×１００    (２)
式中、Ａは前記液体を流したときに硝化細菌が溶存酸素を消費しないとき、あるいは前記液体の酸素消費率が０％のときのバイオセンサにおける溶存酸素センサ出力値を意味し、Ｂは任意の時点での溶存酸素センサ出力値を意味する。すなわち、「Ａ」の値が分かっているときには、任意の時点での溶存酸素センサ出力値を測定すれば、そのときの液体の酸素消費率の値を算出することができることになる。
前記液体としては、緩衝溶液と純水との混合物、検査水などを例示できる。ここで、基質とは微生物センサに用いられる微生物の栄養源となるものであり、一般的に用いられる基質を用いればよい。緩衝溶液とは試料水のｐＨを一定範囲に保持することを主目的とし、一般的に使用される緩衝溶液を使用できる。
【００１４】
本発明では、環境水に有害物質が存在するか、の点をモニタリングするのであるが、環境水中に硝化細菌の呼吸を阻害するような有害物質が存在すると、バイオセンサの微生物膜内の微生物が呼吸阻害され、環境水の一部について検査した試料水中の溶存酸素濃度が上昇して、センサ出力が増加する。このときのセンサ出力値（Ｚ）とセンサ校正値を用いて、（３）式から呼吸阻害率を求めることができる。
呼吸阻害率（%）＝[（Ｚ−Ｙ）／（Ａ−Ｙ）]×１００    （３）
式中、Ｙは基質を含む緩衝用液と純水を流した（硝化細菌が溶存酸素を消費する）時のセンサ出力値を意味し、センサ校正値は、（Ａ−Ｙ）を意味する。ここで、Ｙでの基質の含有量は基質を１に対して緩衝用液と純水を５〜１５(容量比)の比率となるようにする。
【００１５】
本発明では、前記環境水の一部である検査水の温度を５〜３５℃に保持し、その温度範囲内で酸素消費が最大となるときの温度を探索する。その中でもとくに前記酸素消費率とバイオセンサにて有害物質の有無を検査される試料水の液温とが相関関係および可逆性がある温度の範囲内に保持し、その温度範囲内で酸素消費が最大となるときの温度を探索する。
検査される試料水の液温が、前記酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる（以下、相関関係および可逆性が保たれる、ということがある）範囲では、検査される試料水の液温を高くすれば、前記酸素消費率も増加し、検査される試料水の液温を低くすれば、前記酸素消費率も減少することを意味する。
そこで、本発明はその性質を利用するバイオセンサの新規な校正方法であり、バイオセンサの校正を、検査水(環境水)を水質監視している最中に行うことを特徴とする。すなわち、本発明のゼロ点校正方法はつぎのとおりである。
通常の検査水を水質監視している状態において、その検査水の温度を５〜３５℃に保持し、微生物膜と接触した試料水の酸素消費率が１００％になるとき（すなわち、酸素消費が最大となるとき）の温度領域を探索し、そのときの溶存酸素センサの第一の出力値を記憶させ、該記憶した第一の出力値が０Ｖを示すようにゼロ点校正を行う。ここで、溶存酸素センサの出力値を記憶させる方法およびその記憶した出力値が０Ｖを示すようにゼロ点校正を行う方法は、一般的な方法を適用すればよい。  
【００１６】
前記検査水の温度を変更する温度の範囲は相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内であればさらに好ましい。具体的には５〜２５℃、とくに５〜２０℃の範囲内とすると好ましい結果をもたらす。
本発明でのゼロ点校正方法において、より具体的には、検査水と基質との混合物の温度を徐々に低下させ、一定の温度に到達したら、検査水と基質との混合物の温度を徐々に上げていき、バイオセンサの微生物膜と接触した試料水の酸素消費率が１００％になるとき（すなわち、酸素消費が最大となるとき）の温度領域を探索し、そのときの溶存酸素センサの第一の出力値を記憶させ、該記憶した第一の出力値が０Ｖを示すようにゼロ点校正を行う方法を、例示できる。
前記一定の温度としては、検査水の温度が、溶存酸素センサの出力が０Ｖ以上になるときの温度とすることが好ましい。
【００１７】
次に、本発明のスパン調整するスパン校正の方法について説明する。本発明では、検査水を水質監視している最中にスパン校正を行うことを特徴とする。ここで、好まし
いスパン校正法を説明する。すなわち、水質監視し続ける中で、水質監視する水の一部を検査水として前記フローセルに導く。その検査水を低温（５℃以下）に下げ、所定時間経過したときの状態を観察すれば、バイオセンサと接触する検査水中の酸素消費率は微生物膜の活性に関係なく、ほぼ２０％付近で一定になることを見出した（図２）。
すなわち、同じ微生物を用いるが、その微生物の数を変えた３種の微生物から成るバイオセンサを作製し、それぞれのバイオセンサを用いて基質を含む検査水の液温と酸素消費率との関係を調べた結果、図２のような結果が得られた。なお、図２の中で、活性高とは微生物の数が多いバイオセンサを意味し、活性低とは微生物の数が少ないバイオセンサを意味し、活性高中とは微生物の数が両者の間のバイオセンサを意味する。
そこで、検査水を低温に保持した状態での溶存酸素センサの第二の出力値と、前記ゼロ点校正値である溶存酸素センサの第一の出力値との二種類の出力値を基にしてスパン調整することができる。より詳しく説明すると、前記第一の出力値を記憶させ、その第一の出力値とデータベースから読み出された数値とから計算値を得、その計算値をデータベースに格納されている標準値と照合して溶存酸素センサの出力値の低下分を算出し、その低下分だけ補正した基準値と上記第一の出力値との差分値を算出し、スパン測定することができる。
ここで、データベースから読み出された数値の一例は、液温が約３℃の時には酸素消費率が２０％であるというデータであり、このデータと前記第一の出力値を前記式（２）に代入して、前記計算値を得ることができる。
すなわち、先ず微生物膜が存在しない、溶存酸素センサ単体での液温に対するセンサ出力特性を取得する。この特性を溶存酸素センサ単体の基準特性として、データべースとして持つておくが、この特性は、電極に汚れ等の外的要因が付加されると、センサ出力値が低下方向へシフトする。
次に、溶存酸素センサに微生物を担持した微生物膜を組み合わせ、液温を変化させて微生物膜を通して得られる溶存酸素センサ出力は、出力値が最大の時に溶存酸素濃度値が最大であるため、微生物の活性が無く酸素消費率０%であり、逆に出力値がゼロの時に、微生物の活性が最大で酸素をすべて消費するため、溶存酸素濃度値がゼロを検出したことになるので、酸素消費率としては１００%を意味する。
実際に、微生物膜を組み合わせた溶存酸素センサの出力値は、液温を変化させると、液温が低いときにはセンサ出力が高く、液温が高いときにはセンサ出力は低くなる。ここで、発明者が得た知見、すなわち、微生物膜の活性の違いに関係無く、液温が約３℃を境にして、それ以下の液温にしても酸素消費率が約２０%一定となること、および液温が約２０℃を境に、それ以上の液温に対して酸素消費率が１００%と一定となること、を利用する。
詳しく説明すると、前記 （２）式のＢが、液温が３℃のときに計測したセンサ出力値であると、酸素消費率が２０%となるＡの値を計算することができる。この算出したＡ値を、初期の微生物が存在しない溶存酸素センサ単体の基準特性での３℃の時の値（以下、Ａ(0)ということがある）と比較し、その低下率を計算して、データべ-スの基準特性全体にその低下率を掛けて補正すれば、補正後の液温に対する前記（２）式のＡ値が取得できる。
そして、ゼロ点は、液温を２０℃に上昇させ、微生物が酸素をすべて消費する状態にすれば、その時が酸素消費率１００%の時に溶存酸素センサ出力値として記憶すれば、ゼロ点調整は完了する。かくして、このゼロ点調整値と上記液温３℃でのＢ値とを基にしてスパンの大きさを求めることができる。
【００１８】
本発明では、前記バイオセンサにおいて、あらかじめ呼吸阻害率の閾値を設定しておき、その呼吸阻害率の閾値を超えた場合に、試料水中の有害物質検知の警報を出力するようにすることが望ましい。前記呼吸阻害率の閾値としては、約１０％以上が望ましい。
本発明では、呼吸阻害率の閾値を超えた場合には、センサが感知し、信号を出力するようにしておき、警報を出力するようにしておくことが望ましい。前記閾値を超えた場合における感知方法、感知した情報に基づき信号を出力する方法、警報を出力する方法、およびそれらの手段・装置はこの技術分野で一般的に使用する方法を採用すればよい。
【００１９】
なお、本発明においては、使用する電解液、酸素透過膜、溶存酸素電極など、あるいは微生物センサや検査水の加熱・恒温装置、微生物センサに備える溶存酸素センサからの出力値の検出、校正、制御装置など、本発明を実施するための各種機器・装置類はとくに制限されるものではなく、この技術分野で一般的に使用される各種機器・装置類を使用することができる。
【発明の効果】
【００２０】
（１）従来の校正では、純水と微生物の栄養源である基質を試料流路に流し、ゼロ点校正を行い、緩衝液と純水のみを試料流路に流し、フルスケール（スパン）校正を安定的に行うのに必要な時間はおよそ１時間半かかっていたが、本発明により、大幅に短縮することができるようになり、しかも検査水の水質監視している運転状態でできるようになったことから、従来連続水質監視のためには、バイオセンサ２台を並列運転していたものが、一台で連続監視が可能になり、大幅にコスト削減ができる。
また、（２）従来の校正では、微生物の活性状態は常に変動するために検査水と基質を与えても、例えば、微生物の酸素消費率が100％に至らず、溶存酸素センサの出力がゼロｍＶにならない場合があり、校正時に、純水と基質を試料流路に流し、微生物が完全に酸素を消費する前提でのゼロ点校正ができない場合があったが、本発明により、常に酸素消費率が100％に維持できるため、正確なゼロ点補正ができる。
さらに、（３）本発明では、温度を変化させて、微生物の活性の程度を知ることができる。それゆえ、微生物の活性度のチェックが常時できるので、微生物の品質管理の手段としても活用できる効果がある。
【発明の実施の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を図に基づき詳細に説明する。
（モニタリング）
図４に基づき、本発明の試料水に有害物質が存在するかどうかモニタリングするときの流れを説明する。
はじめにバイオセンサ６を図４に示すように３０℃に設定された恒温槽７に取り付ける。
まず、ゼロ点校正のための基質３４を含む緩衝溶液と純水９とをそれぞれ電磁弁７ｄ、７ｂおよび送液ポンプ１３ｂ、１３ａを経て、熱交換器１４で所定の温度に調整した後、恒温槽７に流し、バイオセンサ６の酸素消費率を１００%まで達成させ、そのときの内生呼吸状態のセンサ出力値を表示部１９、制御部２０、記録計２１などからなる制御部に送り、記憶させる。
次に、純水９および緩衝溶液１１を上記と同様に流し、その酸素消費率が０%のときのセンサ出力値を前記制御部に送り、記憶させる。
この二つの数値を基にしてスパンを決める。
次いで、上記電磁弁を閉じて、検査水８を電磁弁７ａ、送液ポンプ１３ａ、熱交換器１４を経て、バイオセンサに送り、検査水中に有毒物質が存在するかどうか、モニタリングする。
【００２２】
（バイオセンサによる酸素消費率の温度依存性）
上記図４の装置を用いて、バイオセンサによる検査水中の酸素消費率の温度依存性を調べた。その結果を図２に示す。
すなわち、活性が高いバイオセンサ、活性が低いバイオセンサ、それらの間の活性のバイオセンサのいずれを用いても、検査水中の酸素消費率は温度に依存することが明らかになった。図２で、横軸が試料水の検査水の液温であり、縦軸はその試料水の酸素消費率である。
【００２３】
（ゼロ校正の方法）
本発明のゼロ点校正の方法を図１に基づき詳しく説明する。
上記のように検査水中に有毒物質が存在するかどうか、試料水を水質監視を続けていると、やがてゼロ点が不安定になったり、スパン巾が狭くなったりする。その不都合さを解消するため、バイオセンサの溶存酸素センサの校正を行う。本発明では検査水から基質を含む緩衝溶液と純水との混合物に切り替えることでの検査水のモニタリングを中止せずに、溶存酸素センサの校正を行うことができる。        
以下、水質監視をしている状態において、溶存酸素センサの校正を行う方法を説明する。
校正装置２６からの情報に基づき、恒温槽温度制御回路２４と恒温槽加熱冷却機２３により、恒温槽の温度を３０℃から徐々に低下させ、溶存酸素電極からの出力信号を検出回路２５で検知し、試料水の酸素消費率が１００％よりもやや下回る範囲の領域を探索し、次いで徐々に試料水の温度を上昇させて、約２０℃に達しときに試料水の酸素消費率が１００％になったことを知った。所定時間経過させ溶存酸素電極からの出力が一定になったことを確認すると共にそのときの溶存酸素センサの出力値を記憶させ、そのときの出力値を０Ｖとするゼロ校正を行う。なお、試料水の温度は温度計２４ｂによりモニターし、恒温槽温度制御回路２４にフィードバックする。
【００２４】
（スパン校正の方法）
本発明のスパン校正の方法を詳しく説明する。
本発明では検査水から基質を含まない緩衝溶液と純水との混合物に切り替えることでの検査水のモニタリングを中止せずに、溶存酸素センサのスパン校正を行うことができる。
以下、水質監視をしている状態において、溶存酸素センサのスパン校正を行う方法を説明する。
上記と同様に、試料水を水質監視している状態において、  
校正装置２６からの情報に基づき、恒温槽温度制御回路２４と恒温槽加熱冷却機２３により、恒温槽の温度を５℃以下まで徐々に低下させ、所定時間経過し、溶存酸素電極からの出力が一定になったことを確認すると共にそのときの温度（例えば３℃）を記憶する。
次に、基本データ集から必要な基本データを格納した溶存酸素センサ温度特性データベース２７から、上記溶存酸素電極からの出力が一定になった温度（Ｔ）での溶存酸素センサのスパン基本データを取得する。基本データとしては、たとえば図３で示されるような、微生物膜が無く、温度（Ｔ）と基質を含まない緩衝溶液と純水との混合物の前記式（２）における「Ａ」値である溶存酸素センサ単体で使用初期の出力値を示す基本データを例示できる。この基本データから、温度（Ｔ）での、前記「Ａ」値である溶存酸素センサ出力値（ｃ）を求めることができる。たとえば、Ｔ＝３℃のときには、図３から「Ａ」値＝２．３ｍＶであることが分かり、この値を記憶する。
上記Ｔ＝３℃のときの検査水の酸素消費率は図２からも知ることができるが、２０%であることがすでにわかっているので、液温が３℃のときの溶存酸素センサ出力値を上記式（２）における「Ｂ」値に代入し、酸素消費率が２０%となるＡ値を求めればよい。すなわち、上記式（２）に、酸素消費率＝２０％、上記Ｔ＝３℃のときの検査水の溶存酸素センサ出力値の実測値である１．８０ｍＶをＢに代入すれば「Ａ」値は、２．２５ｍＶであることが分かる。
この「Ａ」の値と上記ゼロ点校正値との差をもってスパン巾とすることにより、バイオセンサの溶存酸素センサのスパン巾を決定できる。つまり、図３の３℃の溶存酸素センサ出力値である上記Ａ値に相当する２．３ｍＶが、ある時点で２．２５ｍＶに下がった（シフトした）ので、水質監視開始初期の値が９７．８％になったことが分かる。したがって、特定データベース２７に格納されている図３の特性全体を９７．８％となるように下げればよいことになる。水質監視運転中に任意の時点で、ある液温でのＢ値を測定すれば、前記式（２）を用いてその液温でのＡ値を読み出し、酸素消費率を算出することができることになる。
【００２５】
本発明でのバイオセンサに設置する呼吸阻害率の閾値を試料水中の有害物質検知方法およびその警報を出力する方法について説明する。
本発明での前記閾値を超えた場合における感知方法、感知した情報に基づき信号を出力する方法、警報を出力する方法、およびそれらの手段・装置はこの技術分野で一般的に使用する方法を採用すればよい。
図１に示されるように、一定の温度にて環境水をモニタリングする過程において、溶存酸素センサ出力値を常に監視することになるが、呼吸素材率を求める上記式（３）にその出力値を代入して、その出力値に相当する呼吸阻害率を算出する。その算出値が呼吸阻害率の閾値を超えるときには、警報出力を出すことになる。なお、呼吸阻害率を求める上記式（３）おいて、「Ａ」の値は基本データ(図３)から求めることができる。Ｙは前記ゼロ点校正値であり、通常０〜０．０１ｍＶである。
【００２６】
今までの記載から本発明を次のように記載することもできる。
（１）環境水中の有害物質を検知するバイオセンサにおいて、前記環境水の一部である検査水の温度を水質監視をしている状態のまま制御してその検査水の酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度、および低温に下げたときのそれぞれの溶存酸素センサの出力値を得、それら二つの出力値を基にしてバイオセンサをスパン調整することを特徴とするバイオセンサの校正方法。
（２）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサの校正方法であって、前記環境水の一部を取分け、その一部の環境水の温度を調整して環境水の酸素消費率が１００％となるときの溶存酸素センサの出力値を計測し、その計測値を前記溶存酸素センサのゼロ点校正値とすることを特徴とするバイオセンサの校正方法。
（３）前記一部の環境水の温度を酸素消費率と液温との間に相関関係および可逆性が保たれる温度の範囲内にて調整することを特徴とする上記（１）に記載されたバイオセンサの校正方法。
（４）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサの校正方法であって、前記一部の環境水の酸素消費率を制御して前記溶存酸素センサのゼロ点校正値を決定すると共に、前記一部の環境水を低温に保持し、その温度での溶存酸素センサの出力値（ａ）を計測し、その出力値（ａ）を基にして得られた出力値と前記ゼロ点校正値とからスパン巾を決定することを特徴とするバイオセンサの校正方法。
（５）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサの校正方法であって、前記一部の環境水の酸素消費率を制御して前記溶存酸素センサのゼロ点校正値を決定すると共に、前記一部の環境水を低温に保持し、その温度での溶存酸素センサの出力値（ａ）を計測し、その計測値を上記式２に代入して得られた環境水の酸素消費率が２０％となるときの溶存酸素センサの出力値（ｅ）を算出し、該算出された出力値（ｅ）と前記ゼロ点校正値とからスパン巾を決定することを特徴とするバイオセンサの校正方法。
【００２７】
（６）前記環境水を低温に保持する温度が５℃以下であることを特徴とする上記（４）あるいは（５）に記載されたバイオセンサの校正方法。
（７）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサを備えた水質監視モニタの運転方法であって、前記環境水の一部の温度を制御して環境水の酸素消費率が１００％となるときの溶存酸素センサの出力値を計測し、その計測値を前記溶存酸素センサのゼロ点校正値とすることを特徴とするバイオセンサを備えた水質監視モニタの運転方法。
（８）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサを備えた水質監視モニタの運転方法であって、前記環境水の一部の酸素消費率を制御して前記溶存酸素センサのゼロ点校正値を決定すると共に、前記一部の環境水を低温に保持し、その温度での溶存酸素センサの出力値（ａ）を上記式２に代入して、その環境水の酸素消費率が２０％となるときの溶存酸素センサの出力値（ｅ）を求め、求められた出力値（ｅ）と前記ゼロ点校正値とからスパン巾を決定することを特徴とするバイオセンサを備えた水質監視モニタの運転方法。
（９）環境水中の有害物質を検出するバイオセンサの校正方法であって、環境水の一部である検査水の代わりに基質を含む緩衝溶液と純水との混合物をバイオセンサの試料流路に流し、酸素消費率が１００％となるときの溶存酸素センサの出力値を計測し、その計測値を前記溶存酸素センサのゼロ点校正値とし、次いで前記基質と純水との混合物の代わりに検査水をバイオセンサの試料流路に流し、低温に保持し、その温度での溶存酸素センサの出力値（ａ）を上記式２に代入して、その環境水の酸素消費率が２０％となるときの溶存酸素センサの出力値（ｅ）を求め、求められた出力値（ｅ）と前記ゼロ点校正値とからスパン巾を決定することを特徴とするバイオセンサの校正方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明で使用する溶存酸素センサの校正装置を説明する図
【図２】バイオセンサによる酸素消費率の温度依存性を説明する図
【図３】溶存酸素センサの温度依存性を説明する図
【図４】バイオセンサ応用水質計の構成を示すフロー図
【図５】バイオセンサの構成を示す模式図
【図６】バイオセンサの原理と電極の構成を示す図
【図７】溶存酸素センサの構成図
【符号の説明】
【００２９】
1      微生物膜
2      溶存酸素センサ
3      リード線
4    フローセル
5      試料流路
6            微生物センサ
7            恒温槽
8            検査水
9            純水
10            酸洗浄水
11            緩衝液    
12a〜12f        電磁弁
13a〜13b        送液ポンプ
14            熱交換器
15            エアポンプ
16            圧力センサ
17            ローラークランプ
18            二方切換三方弁
19            表示部
20            制御部
21            記録計
22            測定部
23    恒温槽加熱冷却機
24    恒温槽温度制御回路
24b   温度計
25    検出回路
26    校正装置
27    溶存酸素センサ温度特性データベース
29    アノード電極
30    カソード電極
31    酸素透過膜
32    絶縁ガラス
33    電解液
34    基質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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