(57)【要約】      （修正有）【課題】広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスを迅速かつ簡便に検出できる方法および測定器具を提供する。【解決手段】フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とするフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出法、とりわけ、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップ。前記第一の抗体と第二の抗体の何れか一方または両者がＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とするフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出法。
【請求項２】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れもが、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
前記第一の抗体および前記第二の抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するモノクローナル抗体である請求項１又は２に記載の検出法。
【請求項４】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れか一方が、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項１に記載の検出法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するものである請求項４に記載の検出法。
【請求項６】
前記第一の抗体および第二の抗体の何れか一方を担体に固定しておく請求項１乃至５の何れか１項に記載の検出法。
【請求項７】
フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記ＮＳ３蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス由来のＮＳ３蛋白と前記第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項８】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れもが、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項７に記載の測定法。
【請求項９】
前記第一の抗体および前記第二の抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するモノクローナル抗体である請求項７または８に記載の測定法。
【請求項１０】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れか一方が、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項７に記載の測定法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するものである請求項１０に記載の測定法。
【請求項１２】
前記第二の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項７乃至１１の何れか１項に記載の測定法。
【請求項１３】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項７乃至１２の何れか１項に記載の測定法。
【請求項１４】
フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なよう配置されてなるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス検出用イムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１５】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れもが、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項１４に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１６】
前記第一の抗体および前記第二の抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するモノクローナル抗体である請求項１４または１５に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１７】
前記第一の抗体および前記第二の抗体の何れか一方が、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である請求項１４に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が配列番号３のアミノ酸配列を備えるＮＳ３蛋白の断片に対するものである請求項１７に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１９】
前記第二の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項１４乃至１８の何れか１項に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項２０】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項１４乃至１９の何れか１項に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップに関するものであり、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに起因する疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスとしては、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus : BVDV）、豚コレラウイルス（Classical Swine Fever virus : CSFV）、ボーダー病ウイルス（Border Disease virus : BDV）などが知られている。ＢＶＤＶは牛や水牛に感染して牛ウイルス性下痢・粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease）を発症させる。この牛ウイルス性下痢・粘膜病は、家畜伝染病予防法における届出伝染病に指定されている。ＣＳＦＶおよびＢＤＶは、ＢＶＤＶと近縁のウイルスであり、それぞれ豚および羊に感染して豚コレラおよびボーダー病を発症させる。豚コレラは、家畜伝染病予防法における法定伝染病に指定されている。ボーダー病は、牛ウイルス性下痢・粘膜病と同様の症状を羊に発生させる。
【０００３】
ＢＶＤＶには細胞病原性（CP）と非細胞病原性(NCP)のウイルスがあり、ＣＰウイルスに感染して牛ウイルス性下痢・粘膜病の急性症状を発した牛の発見は比較的容易である。しかしながら、ＮＣＰウイルスは、一部の株を除き、一般の牛に感染しても症状は穏やかであり、妊娠牛が感染した場合、胎児感染が起こり、異常産が発生し、酪農家にとっては大きな損失となる。また、ＮＣＰウイルスが妊娠５０〜１５０日の妊娠牛に感染した場合、免疫寛容により持続感染牛が生まれることがある。持続感染牛は、見かけ上は正常で生まれてくるが、終生体内でウイルスを産生し、酪農場における正常な牛に対する感染源となる。このようにしてＮＣＰウイルスに感染した牛は、ＣＰウイルスの重感染あるいはＮＣＰウイルスからＣＰウイルスへの変異によって消化管のびらんや潰瘍を特徴とする致死的な粘膜病を発生し、酪農家に大きな痛手を与える。
【０００４】
したがって、ＢＶＤＶの清浄化には持続感染牛の摘発および淘汰が重要である。現在、ＢＶＤＶの検出法としては血液サンプルからのウイルス分離やPCR法が用いられており、また、持続感染牛を検出するためのＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法検査キットも市販されているが、これらは結果が得られるまでに時間がかかる。また、従来のＥＬＩＳＡ法では、変異を受けやすい構造蛋白に対する抗体を用いているため、広範囲のＢＶＤＶまたはフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出に必ずしも十分に対応するものではなかった。
【０００５】
本発明者らは、既に、フラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体を数種類取得しているが、これらのモノクローナル抗体が第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法において有用であるかどうかについては未だ何ら検討を行っていない（非特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】第１３５回日本獣医学会学術集会講演要旨集、２００３年３月３０日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスを迅速かつ簡便に検出できる方法および測定器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、今般、フラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対する抗体が、第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィー測定法で使用する抗体として使用でき、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスを広範囲に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とするフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの検出法が提供される。
【００１０】
また、本発明の他の局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記ＮＳ３蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス由来のＮＳ３蛋白と前記第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
【００１１】
また、本発明の更に他の局面によれば、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なよう配置されてなるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルス検出用イムノクロマト法テストストリップが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィー測定法において、抗体としてフラビウイルス科ペスチウイルス属の共通抗原であるＮＳ３蛋白に対する抗体、とりわけ、モノクローナル抗体を使用することとしたので、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属する広範囲のウイルスを簡単な方法で迅速に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いられる上記第一の抗体および第二の抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、一般に、少なくとも一方の抗体をモノクローナル抗体とすることが好ましく、両方の抗体をモノクローナル抗体とすることが特に好ましい。
【００１４】
本発明において好ましいモノクローナル抗体は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白と免疫染色法およびウエスタンブロット法の何れにおいても反応するモノクローナル抗体である。ウエスタンブロット法は、下記実施例で詳述するように、ＢＶＤＶなどのフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの感染細胞や、遺伝子工学的に発現させて精製されたＮＳ３蛋白をドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、メンブランに転写された蛋白にモノクローナル抗体を反応させることにより行われる。このようなウエスタンブロット法の過程でＮＳ３蛋白は変性を受けると考えられるが、上記好ましいモノクローナル抗体は、このような変性を受けない抗原決定基（エピトープ）を認識するものとして特徴付けられる。
【００１５】
通常、第一の抗体と第二の抗体を用いるサンドイッチ式免疫測定法においては、第一の抗体と第二の抗体とは抗原決定基（エピトープ）が相互に異なるものが使用され、所謂「ヘテロ」の組み合わせで用いられる。本発明において、「ヘテロ」の組み合わせで第一の抗体および第二の抗体を構成することは何ら妨げられるものではない。しかしながら、下記実施例で詳述するように、上記好ましいモノクローナル抗体は、第一の抗体と第二の抗体を用いるサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法において、第一の抗体と第二の抗体の両方に使用することができ、所謂「ホモ」の組み合わせ（すなわち、第一の抗体と第二の抗体が同じモノクローナル抗体）で用いることができる。このことは、上記好ましいモノクローナル抗体が認識する抗原決定基（エピトープ）は、ＮＳ３蛋白上に複数存在することを示唆する。したがって、上記好ましいモノクローナル抗体は、ＮＳ３蛋白上に複数存在するウエスタンブロット法によって変性を受けない同一の抗原決定基（エピトープ）を認識するモノクローナル抗体として特徴付けることもできる。
【００１６】
フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスのＮＳ３蛋白に関しては、例えば、ＢＶＤＶ  Ｎｏｓｅ株のＮＳ３蛋白の遺伝子配列およびアミノ酸配列は日本DNAデータバンクアクセス番号AB078951から入手可能であり、配列表の配列番号３に示されるものは下記実施例で取得されたＢＶＤＶ  Ｎｏｓｅ株由来のＮＳ３蛋白断片のアミノ酸配列である。また、ＣＳＦＶおよびＢＤＶについても、幾つかの株について、ＮＳ３遺伝子の完全長または部分配列が公開されている。したがって、このような遺伝子配列またはアミノ酸配列の情報を参照して適当なプライマーＤＮＡを合成し、適当なフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスからＮＳ３遺伝子を取得し、これをクローニングして遺伝子工学的に発現させることにより、ＮＳ３蛋白を入手できる。
ＮＳ３遺伝子を取得するために用いるフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスとしては、寄託機関に保存されている各種の株の他、各種の野外株を取得して用いることもできる。寄託機関に保存されている株としては、例えば、ＢＶＤＶ  ＮｅｗＹｏｒｋ  １（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−１５６１）、ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｌｏｎｅｄ）（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−１４２２）、ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−５３４）、ＢＤＶ  ３１（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−９９６）などが挙げられる。ＢＶＤＶの野外株としては、例えば、Ｎｏｓｅ、ＣＰ７、Ｎｏ．１２、ＴＫ８７−２  ｎｃｐ、ＮＭ８７−１  ｎｃｐ、ＩＳ２５ＣＰ／０１、Ｏｒｅｇｏｎ、Ｎｏｓｅ  Ｅｎｄ−、Ｎｏｓｅ  Ｅｎｄ＋、ＫＳ８６−１  ｎｃｐ、ＫＳ８６−１  ｃｐ、１９０  ｎｃｐ、Ｓｏ  ＣＰ／７５、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ１、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ２、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ３、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ４、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ５、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ６、Ｔｏｃｈｉｇｉ−Ｎ７、ＢＶＤＶ／Ａｏｍｏｒｉ／１／０２、ＢＶＤＶ／Ｓａｐｐｏｒｏ／１／０２、ＫＺ−９１  ｃｐ、ＫＺ−９１  ｎｃｐなどが知られている。ＣＳＦＶの野外株としては、例えば、ＡＬＤ、Ａｍｅｓ、ＧＰＥ−、Ｋａｎａｇａｗａ／７４、Ｙａｍａｇａｔａ／８０、Ｓｈｉｍａｎｅ／８０、Ｍｉｙａｚａｋｉ／８１、Ｏｇａｔａｍｕｒａ／６８、ＰＡＶ−１、ＫＰＰ／９３、ＮＲＳＭ／９３、Ｃｈｉｂａ／８０、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／８０、ＷＢ８２  ＥＮＤ＋、ＷＢ８２などが知られている。ＢＤＶの野外株としては、例えば、Ｍｏｒｅｄｕｎ株などが知られている。また、市販の生ワクチンなどからこれらのウイルスを単離して使用することもできる。
ＮＳ３遺伝子は、これらの広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスにおいて共通に保存されているものであり、下記の実施例で示されるように、一般に取得される抗ＮＳ３蛋白モノクローナル抗体の多くは、ＢＶＤＶ  Ｎｏｓｅ株、ＣＳＦＶ  ＧＰＥ−株、ＢＤＶ  Ｍｏｒｅｄｕｎ株などの広範囲のフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスと交差反応し、各種ウイルス間のＮＳ３蛋白のアミノ酸ホモロジーは９０％程度を示す。したがって、配列番号３に示されるようなＮＳ３遺伝子に関する情報および上記フラビウイルス科ペスチウイルス属の各種ウイルスの少なくとも１種を入手し、本明細書の記載を参照することにより、ＮＳ３蛋白またはその断片およびそれに対する抗体を作成できる。
【００１７】
本発明において、抗体の製造および該抗体を使用する検出法および測定法における各ステップは、それぞれ、それ自体、公知の免疫学的手法に準拠して行なわれる。
本発明において、ポリクローナル抗体は、例えば、ＢＶＤＶのようなフラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスの感染細胞の培養上清から抽出精製したＮＳ３蛋白またはクローニングされたＮＳ３蛋白の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したＮＳ３蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から得られる。
【００１８】
また、モノクローナル抗体は、例えば、上記と同様に抽出精製したＮＳ３蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめる。増殖せしめた株を前記のようにして得られたＮＳ３蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより抗ＮＳ３蛋白抗体産生株を選別する。
【００１９】
本発明において、前記第一の抗体および第二の抗体の何れか一方を担体に固定しておくことも可能であり、これにより、例えば、ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィー測定法を容易に実施できる。
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。第一の抗体および第二の抗体は、上述のように、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。なお、第一の抗原決定基と第二の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第一の抗体および第二の抗体は上記「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、例えば、第一の抗体および第二の抗体の両方に上記の好ましいモノクローナル抗体を使用できる。
【００２０】
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば、図３に示されるテストストリップが挙げられる。図３において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【００２１】
含浸部材２は、前記第一の抗体が結合する第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００２２】
第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００２３】
図３に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図３の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図３の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
【００２４】
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００２５】
さらに、市販品の場合、図３のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。
【００２６】
かくして、生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
【００２７】
被験試料としては、特に制限はなく、例えば、血液、（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿等の体外に採取された体液が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。本発明で検出するＮＳ３蛋白は非構造蛋白であり、ウイルス粒子中にはほとんど存在せず、ウイルスが増殖する細胞内でのみ発現する。したがって、ウイルスが感染している細胞として白血球を抽出して被験試料とすることが好ましい。
【００２８】
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
【実施例】
【００２９】
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
使用したウイルスとその培養方法
以下の例では、野外株であるBVDV Nose株、CSFV GPE-株およびBDV Moredun株を使用した。
【００３１】
BVDVの増殖には牛腎臓由来株化細胞（MDBK-HS細胞）、牛胎子筋肉初代培養細胞（BFM細胞）または牛精巣初代培養細胞（BT細胞）を用いた。MDBK-HS細胞は、本発明者らがMDBK細胞を馬血清添加培養液で増殖可能に馴化したものである。
CSFVの増殖には豚腎臓由来株化細胞であるCPK細胞またはPK-15細胞を用いた。
BDVの増殖には羊胎子腎臓初代培養細胞（LK-9細胞）を用いた。LK-9細胞は、本発明者らが新生子羊の腎臓より作成した。
【００３２】
MDBK-HS細胞およびBFM細胞の培養にはイーグル最小必須培地（日水製薬）に加熱非働化した馬血清 10%（Invitrogen）、Tryptose Phosphate Broth 3mg/ml（Becton Dickinson）、L-グルタミン 0.3mg/ml（和光純薬）、ペニシリンGカリウム 100単位/ml（萬有製薬）、硫酸ストレプトマイシン 100μg/ml（明治製菓）、Gentacin 40μg/ml（Schering-Plough）を加えた後、重炭酸ナトリウム（和光純薬）でpHを調整した培養液を用いた。
BT細胞の培養には上述の培養液の馬血清を5%とし、5%のBVDV-free牛準胎児血清（三菱ウェルファーマ）を加えた培養液を用いた。
CPK細胞およびPK-15細胞の培養には上述の培養液の馬血清を5%とした培養液を用いた。
LK-9細胞の培養には上述の培養液の血清を10%のBVDV-free牛準胎児血清とした培養液を用いた。
【００３３】
本発明で使用した実験プロトコールの詳細は下記のとおりである。
免疫染色法
免疫染色法はOffice International Des Epizooties（2000）の方法に従った。単層を形成した培養細胞にm.o.i.=1でウイルスを接種し、37℃で48時間培養後、培養上清を除去し、感染細胞をPBSで1回洗浄した。乾燥後、70〜80℃で1時間熱固定した。モノクローナル抗体を含むマウス腹水を抗体希釈液［1% Bovine Serum Albumin Fraction V（Roche）および0.05% Tween 20（Nacalai Tesque）を含むPBS］で1,000倍に希釈した。これを1次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、同様に1,000倍に希釈したGoat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugate（Bio-Rad）を2次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、基質液［1.8mM 3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）（Sigma）および0.01% 過酸化水素水（三菱瓦斯化学）を含む50mM 酢酸緩衝液（pH5.0）］を添加し、37℃で30分反応させた。基質液を除き、細胞面を水道水で洗浄後、細胞を検鏡しウイルス抗原の有無を判定した。
【００３４】
ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
SDS-PAGEはLaemmli（1970）の方法に従った。試料に試料用緩衝液［0.1M Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS（Nacalai Tesque）、10% 2-Mercaptoethanol（Merck）、20% グリセリン（和光純薬）および0.005% ブロモ・フェノール・ブルー（キシダ化学）］を等量加え、5分間煮沸し可溶化した。試料としてウイルス感染細胞を用いる際は、感染細胞に可溶化バッファー［0.1M Tris-HCl（pH7.6）、0.1M NaCl、1% Nonidet P-40（Nacalai Tesque）、1% Triton X-100およびComplete, Mini, EDTA-free（Roche）］を加えた後、同様に処理した。可溶化した試料は7.5%あるいは10% ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した。ゲルはCoomassie Brilliant Blue R-250（Nacalai Tesque）で染色した。
【００３５】
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法はTowbinら（1979）の方法に従った。まず、SDS-PAGEで分画された蛋白をImmobilon-P Transfer Membrane（Millipore）に転写した。メンブランを5%のスキムミルクを含むPBSでブロッキングした。次に、6xHis Monoclonal Antibody（Clontech）またはモノクローナル抗体を含むマウス腹水を0.5%のスキムミルクを含むPBSで5,000倍に希釈し、メンブランと反応させた。洗浄後、同様に5,000倍に希釈したGoat Anti-Mouse IgG-HRP Conjugateと反応させた。洗浄後、発光基質溶液（Lumi-Light Western Blotting Substrate、Roche）に浸して、暗室でフィルム（Hyperfilm ECL、Amersham）に感光させ、現像した。
【００３６】
モノクローナル抗体のビオチン標識
モノクローナル抗体を含むマウス腹水約5mlを孔径0.45μmのフィルター（Millex HV Filter Unit、Millipore）で濾過後、MAbTrap Kit（Amersham）を用いて精製した。ELISAおよび蛋白量の測定をおこない、抗体を含むフラクションを選別し、これを10mM HEPES緩衝液（pH8.5）に対して透析した。
精製したモノクローナル抗体2.5〜4.0mgに2.0〜3.0μlのビオチン溶液［100mM Biotin-AC5-OSu（同仁化学）を含むDimethyl Sulfoxide（Nacalai Tesque）］を添加し、25℃で4時間反応させた。このとき、精製したモノクローナル抗体に対して約10倍モル量のビオチンを反応させた。反応液をPBSに対して透析した後、同容量のグリセリンを加え、ビオチン標識モノクローナル抗体とした。
【００３７】
酵素結合抗体法（ELISA）による結合競合試験
ELISAによる結合競合試験（競合ELISA試験）はKimura-Kurodaら（1983）の方法に従った。組換えＮＳ３蛋白を蛋白量1.2μg/mlにPBSで希釈し抗原液とした。モノクローナル抗体を含むマウス腹水をBSA5T［0.5% Bovine Serum Albumin Fraction Vおよび0.05% Tween 20を含むPBS］で1:100から4倍階段希釈したものを競合抗体として反応させた。ビオチン標識モノクローナル抗体はあらかじめ設定した希釈倍数にBSA5Tで調整して用いた。Avidin-HRP Conjugate（Bio-Rad）を1% Tween 20および5% スキムミルクを含むPBSで3,000倍に希釈し反応させた後、ELISAと同様にして405nmにおける吸光度を測定した。
競合率は次式により算出した。
競合率 (%) = 100 x ( ODfree − ODsample ) / ( ODfree − ODhomo )
ここでODfreeは競合抗体が存在しない（ビオチン標識モノクローナル抗体のみを反応させた）ときの吸光度、ODhomoはビオチン標識モノクローナル抗体とホモの競合抗体が存在するときの吸光度およびODsampleは各々の競合抗体が存在するときの吸光度を示す。
【００３８】
参考例１（ＮＳ３遺伝子のクローニング）
単層を形成したBFM細胞に感染多重度（multiplicity of infection、m.o.i.）1でBVDV Nose株を接種した。37℃で48時間培養後、この感染細胞にRNA抽出試薬（TRIzol Reagent、Invitrogen）を加え、ウイルスRNAを抽出した。抽出したRNAからRNA LA PCR Kit（AMV）Ver.1.1（宝酒造）を用いて逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法によりＮＳ３遺伝子を増幅した。プライマーとして NS3Hel-1F（sense）：5’-CGAATTCGAAGGGTGGTTGGTAGAGTCAAAG-3’ （配列番号１）および NS3Hel-2R（antisense）：5’-CAAGCTTTTACAACCCGGCCACTTGCTTCAGT-3’ （配列番号２）を用いた。なおプライマーの塩基配列のうち、下線は制限酵素の部位（EcoRI；GAATTC、HindIII；AAGCTT）を、NS3Hel-2Rの5’末端から８〜１０番目のTAAは終止コドン（TAA）を示す。
【００３９】
得られたPCR産物の一部を0.8% アガロースゲル（アガロース S、和光純薬）で電気泳動し、ＮＳ３遺伝子の増幅を確認した後、全量を泳動し、目的のバンドを含むゲルを切り出した。このゲルからMinElute Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてＮＳ３遺伝子断片を精製し、pGEM-T Vector System I（Promega）を用いてベクターにクローニングした。QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）を用いて抽出、精製されたプラスミドは、制限酵素EcoRI（東洋紡）およびHindIII（Boehringer Mannheim）で切断した後、0.8% アガロースゲルで電気泳動し、目的遺伝子が挿入されていることを確認した。
【００４０】
参考例２（組換えＮＳ３蛋白の発現と精製）
目的遺伝子が挿入された参考例１のプラスミドをQIAGEN Plasmid Midi Kit（Qiagen）を用いて大量精製した。このプラスミドを制限酵素EcoRIおよびHindIIIで切断した後、MinElute Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてゲルから目的のＮＳ３遺伝子断片を抽出、精製した。
Esherichia coli（E. coli）発現用ベクターpET-32c（Novagen）を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで切断した後、脱リン酸化処理（アルカリフォスファターゼ処理）した。このpET-32cベクターとＮＳ３遺伝子断片を混和後、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いてライゲーション反応をおこなった。ライゲーション後の反応液をE. coli JM109株（東洋紡）に導入した後、LB寒天平板培地で培養した。得られたコロニーの菌液からQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで処理した後、目的遺伝子が挿入されているクローンを選択した。作製された発現ベクターの遺伝子マップを図1に示す。
【００４１】
目的遺伝子がクローニングされた組換えＮＳ３プラスミド（pET-32c/BVDV Nose NS3）を、組換え蛋白発現用宿主E. coli BL21(DE3)pLysS（Novagen）に導入した。導入菌をLB寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをLB液体培地で培養した。1mM IPTG（宝酒造）を添加して組換えＮＳ３蛋白の発現を誘導した後、E. coliを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［0.5% Triton X-100（Sigma）、10mM Imidazole、20mM Phosphateおよび0.5M NaCl（pH7.4）（Amersham）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＮＳ３蛋白をHisTrap Kit（Amersham）を用いて精製した。この精製蛋白をPBSに対して透析し、目的の組換えＮＳ３蛋白とした。
【００４２】
なお、上記可溶化サンプルと上記精製蛋白をSDS-PAGEで解析したところ、約75kDaの位置に発現蛋白が単一のバンドとして確認された（図2）。BVDV Nose株のＮＳ３蛋白のアミノ酸配列（Nagaiら、2003、日本DNAデータバンクアクセス番号 AB078951）より、ＮＳ３蛋白の分子量は約75〜80kDaと推定される。うち本参考例においてE. coliで発現させた領域の分子量は約57kDaと予想される。さらにpET-32cベクターを用いることにより約18kDaのTrx蛋白を融合発現しているので、予想される組換えＮＳ３蛋白の分子量は約75kDaと計算される。これは図2の発現後の可溶化サンプルおよび精製蛋白で検出されたバンドの分子量と合致している。さらに、このバンドは、6xHis Monoclonal Antibodyを用いたウエスタンブロットにより約75kDaの位置に検出され、ELISAによりＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体JCU/BVD/CF10（TropBio）と反応した（データ示さず）。なお、ここで得られたＮＳ蛋白断片のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示した。
【００４３】
参考例３（ＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体の作出）
参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を抗原として、ＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体（以下、単に「抗ＮＳ３抗体」ということもある）を作出した。モノクローナル抗体の作出はKidaら（1982）の方法に従っておこなった。100μgの組換えＮＳ３蛋白と等量のAdjuvant Complete Freund（Difco）を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
【００４４】
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）にL-グルタミン 0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム 100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン 100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し（DMEM）、これに牛胎児血清（JRH）を10%となるように加えた培養液を用いた。
【００４５】
細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とSp2/0-Ag14細胞を混合し、そこにPolyethylene glycol solution（Sigma）を添加することによりおこなった。融合細胞はHAT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthine、0.4μM Aminopterinおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、酵素結合抗体法（ELISA）により培養上清中の抗体産生を確認した。ELISAはKidaら（1982）の方法に従った。
【００４６】
抗体産生陽性の細胞をHT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthineおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、さらに血清加DMEMで培養を続けた。抗体産生陽性の細胞は軟寒天上コロニー形成法（Kidaら、1982）によりクローニングした。クローニングした細胞は、2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecane（Sigma）を接種しておいたマウス（BALB/c、リタイア、日本SLC）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をモノクローナル抗体として用いた。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。
【００４７】
なお、精製した組換え蛋白にはE. coli由来成分が極微量混入していると考えられる。そこでpET-32cベクターに遺伝子を挿入せずに発現させた蛋白（ET-32c Trx）を組換えＮＳ３蛋白と同様に精製し、対照抗原としてELISAに供した。これにより、Trx蛋白あるいはE. coli由来成分に対する抗体産生細胞を除外し、ＮＳ３蛋白に対する抗体産生細胞のみをスクリーニングした。
最終的にＮＳ３蛋白に対するモノクローナル抗体産生細胞が10クローン得られた。これらのモノクローナル抗体のイムノグロブリンアイソタイプはすべてIgG1であった。
【００４８】
作出した10クローンのモノクローナル抗体とBVDV Nose株、CSFV GPE-株およびBDV Moredun株との反応性を免疫染色法により検討した。また、ウエスタンブロット法によりBVDV Nose株との反応性を解析した。10クローンは、反応性の違いにより4群に分けられた（表１）。A群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応し、またウエスタンブロット法でもBVDV Nose株と反応するモノクローナル抗体であり、37/4および46/1の2クローンがこれに分類された。B群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応するが、ウエスタンブロット法ではBVDV Nose株と反応性を示さない抗体であり、2/8、7/5、23/4および49/2の4クローンがこれに分類された。C群は、免疫染色法でBVDV Nose株と反応するが、CSFV GPE-株とは反応せず、またウエスタンブロット法でBVDV Nose株と反応性を示さない抗体であり、9/1、34/6および50/1の3クローンがこれに分類された。D群は、免疫染色法でBVDV Nose株、CSFV GPE-株、BDV Moredun株のすべてと反応性を示さず、ウエスタンブロット法でのみBVDV Nose株と反応する抗体であり、33/1の1クローンがこれに分類された。
【００４９】
さらに、これらのモノクローナル抗体の抗原認識部位を同定するため、作出した10クローンのうち、5クローン（7/5、23/4、37/4、46/1および49/2）の抗体をビオチンで標識した。続いて、これら5クローンのビオチン標識抗体と未標識のモノクローナル抗体（競合抗体）との間で競合ELISA試験をおこなった。競合パターンにより5クローンのモノクローナル抗体は3群に分けられた（表１）。I群にはクローン37/4および46/1が属し、この2クローンはそれぞれ互いに競合した。II群にはクローン23/4および49/2が分類され、I群同様互いに競合した。III群にはクローン7/5が属した。クローン7/5は、競合抗体として用いたときはホモの標識抗体としか競合しないが、標識抗体として用いたときは他の4クローンともある程度の競合を示した。以上の成績より、これらの5クローンはＮＳ３蛋白上に存在する少なくとも3つの異なる抗原部位を認識していることが推察された。
【００５０】
【表１】
2006071631.tif 000002
【００５１】
実施例１（抗ＮＳ３抗体を用いたイムノクロマトキット）
参考例３で得られたモノクローナル抗体のうちクローン46/1（マウス腹水、未精製、ELISA価 ≧ 1,638,400）およびクローン49/2（マウス腹水、未精製、ELISA価 ≧ 1,638,400）を用い、イムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成し、試験を行った。
【００５２】
（１）抗ＮＳ３抗体の調製
参考例３で得られたクローン46/1および49/2のそれぞれを、さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗ＮＳ３抗体とした。
【００５３】
（２）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
【００５４】
（３）金コロイド標識抗ＮＳ３抗体溶液の調製
上記（１）で得られた抗ＮＳ３抗体の蛋白換算重量1μg（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記（２）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」と記す）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗ＮＳ３抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600×G、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
【００５５】
（４）ＮＳ３蛋白測定用イムノクロマト法テストストリップの作成
図３に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
（４−１）ＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。
抗ＮＳ３抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、このクロマト展開用膜担体におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、ＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。
【００５６】
（４−２）金コロイド標識抗体含浸部材
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材２とした。
（４−３）イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図３と同様のイムノクロマト法テストストリップを作成した。
【００５７】
（５）試験
上記（１）のクローン46/1および49/2を表２に示すように組み合わせて使用し、サンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィーにおいて最適のモノクローナル抗体の組み合わせを検討した。
抗原として参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を用い、イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材に、当該抗原液を１００μｌ（濃度０．３２μg/l）を表２に示す濃度に希釈して滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色の度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（弱い着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表２に示す。
【００５８】
表２に示されるように、金コロイド標識抗体にクローン49/2を用いた場合、捕捉部位の抗体としてクローン46/1および49/2の何れを使用しても感度を得ることはできなかった。これに対し、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用いた場合、最適であることが示された。金コロイド標識抗体としてクローン46/1を用い、捕捉部位の抗体としてクローン49/2を用いた場合も実施可能であると考えられるが、Blankにおける非特異的呈色が生じ、いわゆる非特異的反応を示した。
このことから、クローン46/1が属する表１のＡ群のモノクローナル抗体が最適であることが示された。また、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用いることができることから、クローン46/1が認識するＮＳ３蛋白の抗原部位は複数存在することが示唆された。
【００５９】
【表２】
2006071631.tif 000003
【００６０】
実施例２（イムノクロマト法テストストリップの感度の検討）
金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にクローン46/1を用い、実施例１と同じ方法でイムノクロマト法テストストリップを作成した。
参考例２で得られた組換えＮＳ３蛋白を精製後、バッファーをPBSに置換したもの（濃度0.32μg/μl）を検体希釈液で希釈して、各濃度に調整し、被験試料とした。この被験試料100μlを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、捕捉部位で捕捉された組換えＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表３に示した。表３から、約３pg/ml以上の濃度のＮＳ３蛋白を検出可能であることがわかる。
【００６１】
【表３】
2006071631.tif 000004
【００６２】
実施例３（ウイルスを感染させた培養細胞中のＮＳ３蛋白の検出）
培養細胞にBVDV及び同じフラビウイルス科ペスチウイルス属の２種の豚コレラウイルス（CSFV）を接種した。この培養細胞を可溶化し、その溶液を被験試料とした。そして、被験試料100μlを実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、捕捉部位で捕捉されたＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表４に示した。表４から、本発明によれば、BVDVだけでなく、CSFVなどのフラビウイルス科ペスチウイルス属に属するウイルスを検出できることがわかる。
【００６３】
【表４】
2006071631.tif 000005
【００６４】
実施例４（野外持続感染牛および健康牛の白血球抽出液中のBVDV-ＮＳ３蛋白の検出）
各種野外持続感染牛および健康牛よりそれぞれの血液を採取し、赤血球のみを破裂させ、白血球のみを回収した。これに1%NP40を含むPBSを加え、白血球を可溶化させた。これを遠心分離し、上清を回収した。この遠心上清を被験試料とした。そして、被験試料100μlを実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位で捕捉されたＮＳ３蛋白と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の５段階に区分して判定した。その結果を表５に示した。表５から、本発明によれば、感染牛と健康牛を明確に識別することができ、本発明が、感染牛の摘発に有用であることがわかる。
【００６５】
【表５】
2006071631.tif 000006
【００６６】
実施例５（豚コレラウイルスの検出）
ミニブタ3頭に対し、1頭当たり107 TCID50の豚コレラウイルス野外強毒株を接種した。経時的に採血を行い、白血球画分を回収した。回収した白血球より白血球抽出液を調製し、実施例２で得られたテストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位の呈色を肉眼で観察した。またすべての検体よりウイルス分離を実施した。その結果を表６に示した。
表６から、採取した血液より調製した白血球抽出液からはウイルス接種6日後より死亡までの間、検体中のNS3抗原を検出することが可能であり、イムノクロマトグラフィー測定法で簡便かつ迅速に豚コレラウイルス感染を判定できることがわかる。
【００６７】
【表６】
2006071631.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに共通に存在するＮＳ３蛋白に対する抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、フラビウイルス科ペスチウイルス属に属する広範囲のウイルスを簡単な方法で迅速に検出できるので、フラビウイルス科ペスチウイルス属ウイルスに起因する疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】参考例２で作成した組換えＮＳ３プラスミド（pET-32c/BVDV Nose NS3）の作成手順および遺伝子マップを示す概略図である。
【図２】参考例２で発現および精製した組換えＮＳ３蛋白のSDS-PAGE像である。
【図３】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
【００７０】
１  粘着シート
２  含浸部材
３  膜担体
３１  捕捉部位
４  吸収用部材
５  試料添加用部材
【図１】
2006071631.tif 000008
【図３】
2006071631.tif 000009
【図２】
2006071631.tif 000010
【配列表】
2006071631000001.app