(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の細胞による最適なタンパク質合成条件探索の問題点である時間とコスト、そして労働力がかかりすぎる等を解消できる、細胞の破砕と精製、そして分析を連続的に行うマイクロチップを提供する。【解決手段】液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部１とニッケルキレートカラム２とＣＡＴタンパク質のＡＬＥＸＡ４８８による染色部３およびマイクロ流路電気泳動とタンパク質検出部４をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップ。【選択図】図１
2006220551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
タンパク質精製部にアフィニティカラムを含み、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置であることを特徴とする請求項１記載のマイクロチップ。
【請求項３】
該アフィニティカラムが金属のキレートカラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。  
【請求項４】
該アフィニティカラムがＧＳＴカラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。
【請求項５】
該アフィニティカラムが抗体カラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップ。        
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の発明は、細胞を用いてタンパク質を合成しようとする際、目的タンパク質の最適合成条件、合成効率、安定性などを迅速に判断することを可能にするマイクロチップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我々の体を構成する細胞の中では数万というタンパク質がそれぞれ異なる機能を持って、お互いが影響しあいながらバランスを維持することで、体を健康に保っている。このように、タンパク質は細胞が生きるための全ての生命現象に関わっているため、医学や生命工学の分野においてタンパク質の機能を知り、それを応用した疾患の診断や治療法の研究が盛んに行われている。タンパク質の機能を調べる、あるいはそれを使った応用研究を行う方法としては、タンパク質が本来存在すべき場所、つまり細胞の中においたままで調べたいタンパク質を何らかの方法でラベリングして研究する方法（in vivo研究）とタンパク質を細胞の中から取り出して、精製した後、その性質を細胞の外から調べる方法（in vitro研究）がある。タンパク質をin vitroで研究するためには、対象となるタンパク質を他のタンパク質や細胞内在物質から分離し、精製する必要があり、細胞からいかに速く、効率よくタンパク質を合成し、精製できるかは、研究全体のスループットを左右する最重要要素の一つとなる。
【０００３】
タンパク質の合成を行うための宿主細胞としては大腸菌や酵母など、タンパク質発現効率の良い細菌を使うことが最も一般的だが、発現させる目的タンパク質の性質によってはカイコ等の昆虫細胞や哺乳類の細胞を使う場合もある。また、近年は細胞の中からタンパク質を合成する因子のみを取りだしてタンパク質が合成できる無細胞タンパク質合成システムが考案され、タンパク質合成方法のバリエーションが増えている（非特許文献１〜３）。しかし、タンパク質の合成量と扱い安さ、そしてコストの安さから未だに大腸菌がタンパク質を大量に合成する際のファーストチョイスとなっている。
【０００４】
一方、合成したタンパク質の精製は従来、タンパク質間の電気的性質や大きさの違いなどを利用してカラムなどで数週間を費やして行ってきたが、長い時間がかかる上に、種々の装置を使いこなせるだけの研究者のスキールと精製に伴うタンパク質の変性や収率の低下などが問題になっていた。そこで、遺伝子工学的な手法を駆使し、精製したいタンパク質の一部分にタグ(tag）といわれる、他のタンパク質と区別しやすい配列を予め挿入し、そのタグ配列を目印として数時間内に目的のタンパク質を細胞内から精製する技術が考案され、広く普及している（非特許文献４〜６）。
【０００５】
また、どの程度のタンパク質が細胞によって合成され、精製されてきたかを確認する方法としては、精製したタンパク質の一部を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、クマシー色素や蛍光試薬による染色（ＳＹＰＲＯ  ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＰＲＯ  ｒｕｂｙ、ｃｙ、ＦＩＴＣなど）あるいは銀染色などでタンパク質を染色する方法があり、これによって精製したタンパク質が正しい大きさのものであるか、プロテアーゼなどによって分解はされていないかなどの情報が得られる（非特許文献７）。最近はこのＳＤＳ−ＰＡＧＥをマイクロ流路内（チップ上）で行うことで、染色や脱色にかかる時間を大幅に短縮することが可能となった（非特許文献８）。
【非特許文献１】スピリン（Ｓｐｉｒｉｎ、Ａ．）著、スプリンジャーベラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、２００２年、ｐ１８３−１９６
【非特許文献２】遠藤 弥重太、バイオインダストリー、２０００年、第１７巻、ｐ２０−２７
【非特許文献３】シミズら（Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．）、ネーチャバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２００１年、第１９巻，ｐ７５１−７５５
【非特許文献４】ジャービックら（Ｊａｒｖｉｋ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．）、アニュアルレビュージェネティックス（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１９９８年、３２、６０１−６１８
【非特許文献５】イバンら（Ｅｖａｎ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．）、モレキュラーセルラーバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８５年、第５巻、ｐ３６１０−３６１６
【非特許文献６】ホップら（Ｈｏｐｐ、Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８８年、第６巻，ｐ１２０５−１２１０
【非特許文献７】大島ら、ポストシークエンスタンパク質実験法、東京化学同人、２００２年、第１巻、ｐ２−５
【非特許文献８】タブチら（Ｔａｂｕｃｈｉ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００３年、第７５巻、ｐ３７９９−３８０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質を細胞より合成する、また合成したタンパク質を細胞の中から取り出して精製する、精製したタンパク質がどの程度の量で、純度であるかを評価する手段は、それぞれ飛躍的に発展してきた。しかし、細胞の中で今まさに起こっているタンパク質合成の効率をリアルタイムで確認するには、合成タンパク質を細胞から取りだし、それを精製して、合成量や純度を評価する一連の連続した操作を短時間内に行う必要があり、これを満たす手段は未だに存在しない。
【０００７】
生きた細胞の中で、人為的に合成されるタンパク質は時に細胞内の全タンパク質の数〜数十％を占めることもあり、細胞からしてみれば単なる異物である。そのため、タンパク質の合成効率は細胞固体によってまちまちであり、タンパク質合成に際しては、常に目的のタンパク質を最も効率よく合成する細胞固体を選別する必要がある。特に、大腸菌を用いたタンパク質合成においては同一種の大腸菌の中でも個体によって目的タンパク質の合成量が数倍も違うこともあるため、タンパク質の合成に最適な個体を選び出すことは非常に重要である。しかもこれは目的のタンパク質の種類や実験の諸条件よっても変化するため、実験を行う度に最適な固体を選別することが望ましい。また、大量の細胞を培養して多くのタンパク質を合成・精製しようとする際は、菌を培養する最中に目的タンパク質の合成程度を見極め、最もタンパク質合成の効率が良いタイミング（最高合成ポイント）を見計らって細胞を破砕、精製する必要がある。ここで「最高合成ポイント」とは、単なるタンパク質の合成量だけでなく、タンパク質が分解酵素などによって分解を受けない条件や最も高い比活性を保つ条件などもこれに含まれる。しかし、現状ではこれらの最適細胞固体の選別や最高合成ポイントの見極めは困難である。その理由としては、細胞内におけるタンパク質の合成量を確認するためには、その細胞を破砕し、目的タンパク質の精製を行った後に、電気泳動などを行う必要があり、そのためにはタンパク質の破砕に数時間、精製（タグを使った最短時間での精製としても）に数十分、電気泳動に１〜２時間、電気泳動後のタンパク質の可視化に数時間など、少なくとも半日〜数日間という時間がかかるためである。しかも、この方法では一度にハンドリング可能な試料の数はせいぜい数検体と、限界があり、そのスループットは非常に悪い。
【０００８】
例え、最適細胞固体の選別はこの方法を用いて（時間をかけることで）できたとしても、最高合成ポイントの見極めはこの方法では到底無理（細胞の状態は刻々と変化していくため）であり、現状では見切りを付けて適当なタイミングで細胞を回収し、精製を行ってからその収率を確認するしかない状況にある。もし、目的のタンパク質を合成している最中に細胞内におけるタンパク質の合成量や純度を知ることができれば、タンパク質合成の効率を最適化することができるため、研究のスループットを向上させることが可能になる。また、細胞を用いたタンパク質の合成効率は培養温度、ｐＨ、培養時間、タンパク質合成誘導剤の添加時期や濃度、または誘導温度などによって大幅に変化するため、それらの条件を最適化することができれば、より多くの目的タンパク質を得ることができる。しかし、これらは現状では時間とコスト、労働力がかかりすぎるため、研究の大きなボトルネックとなっている。そこで、この出願の発明は、かかる現状を鑑みてなされたものであり、従来の細胞による最適なタンパク質合成条件探索の問題点（時間とコスト、そして労働力がかかりすぎる等）を解消できる、細胞の破砕と精製、そして分析を連続的に行うマイクロチップを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明は、上記の課題を解決するため、まず第１に、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、その一部に細胞の破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップを提供する。第２に、この出願の発明は、タンパク質精製部にアフィニティカラムを含み、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置であることを特徴とする請求項１記載のマイクロチップを提供する。第３に、この出願の発明は、該アフィニティカラムが金属のキレートカラムであること、第４に、該アフィニティカラムがＧＳＴカラムであること、第５に、該アフィニティカラムが抗体カラムであることを特徴とする請求項２記載のマイクロチップを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
この発明の液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、その一部に細胞破砕部とタンパク質の精製部および分析部をそれぞれ有するマイクロチップは、今まで別々に行われていた細胞の破砕や精製、分析といった各ステップを一枚のチップ上に集約することで、細胞によって合成されたタンパク質の量や純度をほぼリアルタイムで判ることが可能になる。マイクロ流路は空間を取らないため、１枚のチップ上に多数のマイクロ流路を設けることで、同時に多検体の解析が可能となり、タンパク質の合成に最適な細胞個体を選び出すためのスクリーニングが可能になる。また、細胞を集めてからその合成量を確認するまでの時間が１０〜２０分と非常に短いため、合成途中の様子をリアルタイムで判定し、最高合成ポイントにおける細胞の回収と精製が可能になる。これらの効果は、従来の細胞を用いたタンパク質合成に置いては大変な時間と手間がかかる、あるいは確認が不可能だったボトルネックを一気に広げるものであり、タンパク質研究のスループットを大幅に向上させるツールとなる。また、該マイクロチップを用いた解析は、使用する試薬や廃液の量を従来の技術に比べて遙かに減らせることで環境にも優しい解析法になることは言うまでもない。
【００１１】
本発明は、好ましくは、タンパク質精製の方法としてタンパク質と精製媒体間の特異的なアフィニティを利用することで、一回の精製ステップによりクルードな細胞破砕物の中から目的のタンパク質のみを精製することができるようになると共に、マイクロ流路内で精製したタンパク質を電気泳動することにより、その量や分子量、分解の有無などを瞬時に判断できる効果を持つ。
【００１２】
本発明は、より好ましくは、アフィニティカラムの中でも特にヒスチジンタグと金属の間のキレートカラムや請求項３のＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）とグルタチオン間の特異的結合を利用したＧＳＴカラム、および／または、抗原−抗体結合を利用した抗体かラムなどを用いることで、非常に特異的に目的のタンパク質のみを精製することが可能になる。
【００１３】
以上のように、該マイクロチップは細胞を用いたタンパク質の合成において、その合成条件を最適化させ、リアルタイムでのタンパク質の合成量や効率を判断できると共に、目的のタンパク質の合成に最も適した細胞固体を選別するツールとして用いることができるため、タンパク質を常に生産しその性質を調べる研究や産業用の目的でタンパク質を大量に生産する必要のある場合のタンパク質生産の再現性確保の必要性を満たすツールとして、その利用性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップである。
【００１５】
本発明における「マイクロチップ」の基材は特に限定されないが、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰまたはＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコン等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類およびその複合体、表面を絶縁材料で被覆した金属およびその複合体、セラミックスおよびその複合体等が好ましく用いられる。本発明の「マイクロチップ」は「精製タンパク質の分析部」において、蛍光や吸光、発光等の光学的手段により分析をおこなうため、基板の透明度の高さや自家蛍光の低さ等が重要なポイントとなる場合があることから、中でも、基板にはＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＭＰ、ＰＤＭＳ、石英ガラスが特に好ましく用いられる。また、試料間のクロスコンタミネーションを防ぐ意味からは、チップは使い捨てが望ましいことから、安価に大量生産可能な樹脂製の基板が好ましく、従ってＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＭＰ等がさらに好ましく使用される。
【００１６】
また、本発明のマイクロチップの大きさは特に限定されないが、既存のマイクロチップ用の検出器、例えば日立製コスモアイ等の装置で、精製したタンパク質の蛍光強度、吸光度等が測定できる大きさであることが好ましい。また、作製したマイクロチップの大きさに合わせて検出器を設計することも可能である。
【００１７】
本発明のマイクロチップの製造方法は特に限定されず、上記の基材からなるチップ上に「試料解析チャンネル」が１個ないし複数設けられているものであれば良い。ここで「試料解析チャンネル」とは、液体を流すためのマイクロ流路が設けられ、該マイクロ流路の一部に細胞破砕部とタンパク質精製部および精製タンパク質の分析部をそれぞれ有することを特徴とするマイクロチップにおいて、「３つの機能部位」、即ち、「細胞破砕部」、「タンパク質精製部」、「精製タンパク質の分析部」がマイクロ流路によって繋がっている状態のものを意味する。本発明の「マイクロチップ」は目的のタンパク質を発現している細胞をチップ上で破砕して目的のタンパク質を細胞から分離し、その中から目的のタンパク質のみを連続的に精製、分析することを目的とするものである。従って、「試料解析チャンネル」における「３つの機能部位」は「細胞破砕部」、「タンパク質精製部」、「精製タンパク質の分析部」の順に試料が流れるように配置されている。本発明のマイクロチップの最も典型的で単純な形を図１に示す。
【００１８】
本発明のマイクロチップ上で一度に処理できる試料の数は特に限定されないが、１〜５０検体が好ましく、５〜２０検体がより好ましい。従って、１枚のチップ上に「試料解析チャンネル」を複数設け、各チャンネルで異なる細胞やタンパク質の合成条件を同時に検討することにより、簡便かつ迅速に最適な合成条件を決定することができる。
【００１９】
本発明における「マイクロ流路」は、一般的なマイクロフルイディクス型チップを作製する方法で作成できるが、一般的なマイクロフルイディクス型チップは凹部を形成した板状の基材を別基材と接合して作製される。あるいは貫通したスリット形状を有する薄膜とこれを挟み込む少なくとも２つの基材によっても作製可能である。ここで「接合」とは、複数の基材を重ね合わせ、必要であればマイクロ流路から流体の漏れを起こさないようにする手法を指す。より具体的には、単純な重ね合わせ、プラズマ処理などによる表面活性化、加熱を伴う方法、圧力を印加する方法、電場を印加する方法、接着剤を用いる方法、溶剤を用いる方法、およびこれらの組み合わせがある。不可逆に接合するだけでなく、使用時に治具により押さえつける加圧方式によって接合を行うこともできる。ここで凹部の形成方法は基材としてガラス類を使用する場合はフォトファブリケーション技術により形成される。ここでフォトファブリケーション技術とは、フォトマスクのパターンを転写して複製を作成する技術のことをいう。一般的には、フォトレジストと呼ばれる感光性材料をメタルマスクを介して基板表面に塗布した後、光でパターンを転写し、転写した平面的パターンからエッチングなどにより立体的な形に加工する。エッチングの方法は、ウェットエッチングが好ましい。この時用いられるエッチャントは特に限定されないが、フッ酸系の溶液が一般的に使用される。また、樹脂を使用する場合は、金型を用いた一般的な成形方法が好適に利用され、例えば射出成形、押出成形、ブロー成形、真空成形が挙げられる。また、ホットプレスにより樹脂平板に金型のパターンを形成する方法も好適に用いられる。本発明の「マイクロ流路」は、試料を下流に運搬するための空間であり、各機能部位（細胞破砕部、タンパク質精製部、タンパク質分析部）間、あるいはチップと外部とを結ぶ細管である。好ましくは基材面上に加工された幅１０〜２００μｍ、深さは１〜１、０００μｍであるか、基材を貫通するように加工された直径１０μｍ以上、１ｍｍ以下の管形状であることが望ましいが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本マイクロチップにおける送液方法には、圧力、濃度、電場、磁場の差、あるいは勾配を利用する方法、表面力を利用する方法、慣性力を利用する方法およびこれらの組み合わせがあるがこれに限定されるものではない。圧力では加圧と減圧があり、ポンプやガスボンベ、加圧器、減圧器、落差などを組み合わせて流体を移動させることができる。電場には直流電場、交流電場、あるいは任意波形の電場を用いることができる。直流電場では電気浸透流、電気泳動を、交流電場では誘電泳動などの原理によって流体、あるいは流体の成分を移動させることができ、任意波形ではこれらの現象の組み合わせにより移動させることができる。磁場、あるいは電場によって流体にけん濁させた粒子を移動させ、その結果として流体を移動させることができる。表面力には毛管現象がある。流体と接する面を改質、加工するなどで表面力の差、あるいは勾配を形成し、流体の移動を制御することができる。慣性力を利用する場合には、チップ全体を遠心器に配置して利用する方法や、チップに一時的な加速度を与える方法がある。これらの組み合わせには、複数の手法を同時に行うものと、機能部位ごとにそれぞれ個別の移動方法を行うことができる。  
【００２１】
本発明において「細胞」とは目的のタンパク質を発現している状態であれば生死を問わない。細胞の種類は細胞壁がないか容易に破砕が可能な大腸菌や昆虫細胞または動物細胞が特に好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、酵母や植物細胞、ウイルスなど用いることも可能である。本発明における「細胞破砕部」とは目的のタンパク質を発現している細胞を破砕する部位であり、本発明における細胞の「破砕」とは細胞の表面である細胞壁や細胞膜のいずれまたは両方を溶解、変性、物理的摩擦などによって無くすか、表面に穴を開けることで細胞内在性のタンパク質を細胞外に放出させられるものを意味する。細胞の破砕には「細胞破砕剤」を用いるが、本発明において「細胞破砕剤」とはタンパク質、糖、脂質の分解酵素や超音波、界面活性剤、タンパク質変成剤、ガラスやセラミックからなるビーズなどが上げられるが、これに限定されるものではない。分解酵素には例えば、リゾチム、グルスラーゼ、グルカナーゼ、キナーゼ、リパーゼなどがあるが、これに限定されるものではない。界面活性剤としてはアニオン系としてデオキシコール酸、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）、カチオン系として臭化セチルトリメチルアンモニウム、非イオン系としてＴｗｅｅｎ、ＢＲＩＪ、ＴＲＩＴＯＮ、ＭＥＧＡ、双性イオン系としてＣＨＡＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴなどが例挙できるが、これに限定されるものではない。タンパク質変成剤としては尿素、グアニジン、塩、熱、圧力、凍結などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の細胞の破砕は、上記に列挙した破砕剤の内１つないし複数を併用することで細胞を好ましくは１０分以内、更に好ましくは５分以内、更に好ましくは２分以内に６０％以上破砕できるものを意味する。本発明における「細胞破砕部」は空間体積として０．１〜１００μＬであることが好ましく、０．５〜５０μＬであることがより好ましい。０．１μＬ以下だと体積が小さすぎるため、破砕した細胞から得られる目的タンパク質の量が少なく、細胞破砕から精製タンパク質の検出部までの途中経路における目的タンパク質の吸着などからタンパク質の検出が困難となるため、また、１００μＬ以上だと目的タンパク質の量と共に副産物としての細胞の残骸の量も増え、下流の「タンパク質の精製部」における速やかなタンパク質精製を妨害やマイクロ流路の詰まりが起こりやすくなるため、それぞれ好ましくない。
【００２３】
本発明において「タンパク質精製部」は細胞を細胞破砕剤によって破砕して得た細胞抽出物から目的のタンパク質を「精製」する機能部位であり、本発明における「精製」とは目的タンパク質の濃度を質量比（目的タンパク質の質量：目的タンパク質以外のタンパク質の質量）で少なくとも７０％以上にすることを指す。
【００２４】
本発明のマイクロチップは、好ましくは、タンパク質精製部にアフィニティカラムを含む。
【００２５】
本発明のマイクロチップにおいて、好ましく用いられる「アフィニティカラム」について説明する。「アフィニティカラム」とは、金属イオンや、抗原、抗体、ヘパリン、ストレプトアビジン、ビオチン、ベンザミジン、グルタチオン、アルギニン、カルモジュリン、ゼラチン、リジン、マンノース、ＤＮＡ、２’５’アデノシン２リン酸、核酸、酵素基質、酵素阻害剤などのアフィニティ活性を持つ物質をガラス、アガロース、シリカ、アクリルアミドなどからなるビーズやＰＶＤＦ膜、セルロース膜、磁性を持つビーズやフィルムなどの「担体」に固相化したものを意味する。
【００２６】
本発明におけるアフィニティカラムの「担体」はもちろん上記に限るものではなく、上記のアフィニティ活性を持つ物質を物理的、あるいは共有結合によって表面に保持できるものであればよい。担体の形状もビーズや膜あるいはフィルム状に限るものではなく、例えば、スポンジ形状や繊維形状を形成する材料によっても成し遂げられる。繊維形状を形成する担体の材料としては例えば、ナイロン、シルク、アミロイド繊維などが挙げられるが、これに限るものではない。本発明におけるアフィニティカラムによる目的タンパク質の精製原理は、目的タンパク質の種類によって異なるが、例えば、金属とのキレート作用や抗原−抗体反応、糖鎖−レクチン結合、酵素とその酵素の阻害剤間の特異結合反応、核酸とタンパク質間の特異的結合反応、ＧＳＴ−グルタチオン結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合など、目的タンパク質が持つ特異的な性質を利用して目的タンパク質をアフィニティカラムに結合させることで、目的タンパク質以外を除去することで行う。もちろん、目的タンパク質と精製媒体間のアフィニティの種類は上記に限定されるものではない。本発明のマイクロチップでは、特に、該アフィニティカラムが金属のキレートカラム、ＧＳＴカラム、または、抗体カラムであることが好ましい。
【００２７】
本発明の「タンパク質精製部」は、例えば、０．０１〜１０mｇの目的タンパク質が結合できるアフィニティカラムをチップ上の「細胞破砕部」と「精製タンパク質の分析部」の間に設けることで作製できる。形状はどのようなものでも良いが、目的タンパク質の結合が効率よく行われることが望ましいことから試料が流れる同方向にある程度の長さを持つことが望ましい。しかし、長すぎると試料の流れが悪くなり、流圧を上げる原因になるため、本発明における「タンパク質精製部」の形状や長さはこれらの要素を考慮して適宣選択する必要がある。例えば、平均粒径３０mｍの磁性を持つビーズ上にニッケルを保持したアフィニティカラムの場合、カラムの形状が直線形状であれば、少なくともその幅と深さはビーズの平均粒径である３０mｍ以上であることが好ましく、試料が流れる際の流圧を考慮すると６０mｍ以上が望ましい。しかし、カラムの幅と深さがあまり広いと、目的タンパク質（この場合はヒスチジンタグ融合タンパク質）がカラム上のニッケル金属と触れ合う（結合する）時間が短くなるため、精製の効率が低下するおそれがあるので３００mｍ以下に設定することが望ましい。
【００２８】
「タンパク質精製部」を設ける際は、アフィニティカラムの精製媒体が下流に流れないようせき止める構造が好ましい。このせき止め構造は、精製媒体がビーズである場合は「タンパク質精製部」から「精製タンパク質の分析部」に抜ける出口の構造をビーズの平均球形より狭くすることで成し遂げられる。また、磁性を持つビーズを利用する際はチップの外部から磁石によってビーズをタンパク質精製部の中に滞在させる方法も考えられる。      
【００２９】
本発明におけるマイクロチップでは、好ましくは、アフィニティカラムは、金属のキレートカラムである。  
【００３０】
本発明において好ましく用いられる「金属のキレートカラム」とは、精製媒体としてニッケル、亜鉛、銅、コバルト、バナジウムなどの２価以上の金属イオンを担体に固定化したものを意味し、これによって精製可能なタンパク質としては「ヒスチジンタグ」を有するタンパク質やリン酸の修飾を受けたタンパク質など、金属と特異的に結合するタンパク質が挙げられる。ここで「ヒスチジンタグ」は、産物であるタンパク質の一部の配列に少なくとも６個以上のヒスチジン残基が一次配列上で連続するあるいは３次構造的に集合しているものを指し、その作製は遺伝子レベルで目的タンパク質を発現する遺伝子の一部に上記のヒスチジンをコードする配列を融合して発現することより成し遂げられる。「ＧＳＴカラム」とは精製媒体上にグルタチオンが固定化されているもの、また「抗体かラム」とは精製媒体上に抗体の全長またはその一部または抗体類似体として生体から作られる抗体以外でも抗原となる物質を特異的に認識できる生体由来または人工的な化合物を指し、例えば、抗体の抗原認識部位だけを遺伝子組み替えによって改変して得られる単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）やアフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））などが挙げられる。この抗体類似体の取得方法としては遺伝子組み替えによって抗体類似体を発現するプラスミドを作製し、大腸菌や酵母、昆虫、動物、植物等の細胞、または細胞を用いない無細胞タンパク質合成系を用いて生産し、精製する方法や抗体をタンパク質分解酵素等で切断し、その一部を精製して使う方法、また抗体類似体がタンパク質で無い場合は化学合成による合成等が考えられる。
【００３１】
本発明における「精製タンパク質の分析部」とは「タンパク質精製部」より精製した目的タンパク質を検出し、定量することで、目的タンパク質の量や精製度、または細胞内における分解度などを判定する機能部位である。分析の手法は目的タンパク質の定量が可能なものであれば良く、全タンパク質の定量が可能なＢｒａｄｆｏｒｄ法やＬｏｗｒｙ法、抗体を用いたＥＬＩＳＡなどの免疫染色、質量分析による精製タンパク質の質量解析、電気泳動法などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００３２】
本発明のマイクロチップは、好ましくは、精製タンパク質の分析部がマイクロ流路内での電気泳動装置である。本発明における「マイクロ流路内での電気泳動」とは「タンパク質精製部」で精製した目的のタンパク質を大きさやその電気的性質の違いによって分離できればどのような形態のものでも良く、具体的な方法としては、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、検出部分のマイクロ流路をキャピラリーとして用いたキャピラリー電気泳動、等電点電気泳動などが挙げられる。マイクロ流路内での電気泳動を行うための媒体は固体状、ゲル状、ゾル状、溶液状のいずれかの形状であり、アクリルアミドやポリエチレングリコールなどのポリマーやｐＨを振った緩衝液などが考えられるが、これに限るものではない。ＰＡＧＥは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを使用することができる。本発明で特に好ましく用いられるのはＳＤＳ−ＰＡＧＥである。具体的な方法としては、タンパク質合成槽からマイクロ流路を通り搬送されてきたタンパク質溶液に、尿素、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２−メルカプトエタノールなどを加えてタンパク質を変性させ、さらにマイクロ流路でＰＡＧＥを行うことで達成される。なお、タンパク検出部分に充填するゲルの組成は、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いられるゲル組成であれば問題ない。ただし、合成ターゲットとなるタンパク質の分子量に合わせてアクリルアミド濃度を変えることが好ましい。具体的には、アクリルアミド濃度をタンパク質の分子量が５万〜１０万のときは７．５％程度、３万〜７万の時は１０％程度、１万〜４万の時は１５％程度にすることが好ましい。また、このゲルに低濃度のメチルセルロースを加えることも好ましい。
【００３３】
マイクロ流路内での電気泳動によって目的タンパク質を検出するためにはタンパク質を電気泳動する前に予め染色しておく必要がある。この精製したタンパク質の染色とは、後の検出操作での感度を向上させることを目的として、信号を増幅させる染色物質により精製したタンパク質を標識することを指す。このタンパク質の標識は、タンパク質精製部で精製したタンパク質を染色のために特別に設けた染色槽で染色する方法やタンパク質の精製部において目的タンパク質がアフィニティカラムに結合している状態で染色を行う方法、または細胞破砕部において細胞を破砕した直後に全てのタンパク質を染色してから精製を行う方法などが考えられる。タンパク質を染色する染色試薬としては、後の検出部でタンパク質を認識できるものであればよく、例えば蛍光標識試薬、放射同位元素標識試薬、発光標識試薬等が好適に用いられる。簡便に標識可能で、取り扱いも容易であり、さらには種類が豊富であることから、蛍光標識試薬が好ましく用いられる。蛍光染色に用いる蛍光色素としては、タンパク質への蛍光標識が可能なもの、すなわちタンパク質のアミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、あるいはスルフヒドリル基（−ＳＨ）を標識できる試薬が好ましい。アミノ基を標識する試薬としては、イソチオシアネート基、ニトロアリールハライド基、酸クロリド、活性エステルなどを反応活性基とする蛍光物質が、カルボキシル基を標識する試薬としては、ブロモメチル基を反応活性基とする蛍光物質が、スルフヒドリル基を標識する試薬としては、マレイミド基、アリールハライド基などを反応活性基とする蛍光物質がそれぞれ好適に用いられる。本発明においては、タンパク質溶液と混合するだけで短時間で蛍光ラベルできるという簡便さが必要とされることから、例えばＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｔａｎｇｅｒｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等が特に好適に用いられる。特に、目的のタンパク質がタグを有する場合はそのタグを標識することで、より特異的に目的タンパク質のみを検出することができる。例えば、ヒスチジンタグを有するタンパク質の標識にはＰｒｏ−Ｑ（登録商標）ｓａｐｐｈｉｒｅを用いることができる。なお、溶液中に存在するタンパク質すべてを蛍光標識するには、過剰量の蛍光色素を反応させる必要があり、この場合未反応の蛍光色素が残存することが考えられるが、蛍光色素の分子量はタンパク質と比較して概して小さいため、後の検出操作により標識されたタンパク質と容易に区別できる。なお、例えばＧｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）のような、蛍光を有するタンパク質が目的タンパク質である場合は、ここで示した標識操作を省略することができる。  
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３５】
以下の実施例においては、本発明のマイクロチップとして図１に示すようなＰＭＭＡ基板のものを使用した。実施例１はヒスチジンタグ付きのＣＡＴタンパク質（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を合成した大腸菌をマイクロチップ上で破砕し、連続して金属キレートカラムで精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその合成量を確認したものである。使用したチップ上で溶液を流すマイクロ流路は特に言及がある場合を除いて、流路は幅１００mｍ、深さ６０mｍのものを使用した。
【００３６】
（実施例１）
（大腸菌で合成したＣＡＴタンパク質の分析）  
Ｃ−末端に６個のヒスチジンを融合させたＣＡＴタンパク質は、発現ベクターによって大腸菌ＢＬ２１内で合成させた。ＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養したシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で取り、チップ上に予め入っていた３mｌのＢ−ＰＡＲ（ＰＩＥＲＣＥ社）＋８Ｍグアニジン塩酸の溶液に懸濁し、４０℃、１分間加熱した。この処理により、大腸菌は完全に破砕（溶解）され、大腸菌懸濁液は濁りがなく、澄んだ溶液となった。この溶液は５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液が入っている注射器によって下流に追い出され、大腸菌破砕物中のＣＡＴタンパク質をニッケルキレートカラムに結合させた。この際、ニッケルキレートカラムはタンパク質破砕部の下流にあり、幅２００mｍ、深さ６０mｍの流路内に平均球形３８mｍのニッケルアガロースビーズが５ｍｍ積まれたものである。５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液を打ち終わった後、更に５０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾール溶液で洗浄を行った。ニッケルキレートカラムからのＣＡＴタンパク質の抽出は２０mｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋２０ｍＭＥＤＴＡ溶液で行い、抽出したＣＡＴタンパク質はＡＬＥＸＡ４８８（インビトロジェン社）で６分間ラベリングし、０．１％ＳＤＳが入っている５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．３で１分間させた後、同一チップ上の下流に設けてあるマイクロ流路内での電気泳動によって定量した。電気泳動はポリアクリルアミド（平均分子量７０万〜１００万）を用いて、陰極側に変性・ラベリングしたＣＡＴタンパク質導入し陽極側に３秒間電気泳動させた。この際の電力は陰極側を１００Ｖ、陽極側を５００Ｖに設定して行った。泳動中のＣＡＴタンパク質の定量は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）を用いて検出（励起波長４８０、蛍光波長５１０ｎｍ）した信号をキャプチャーソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）で定量した。定量は標品のＣＡＴタンパク質を電気泳動し、試料導入量が１ｎｌとして計算した。電気泳動の結果、精製したＣＡＴタンパク質はシングルバンドを形成し、その濃度を逆算すると、本実施例で大腸菌によって合成したＣＡＴタンパク質は２．２ｍｇ／１ｇ菌体であることが判った。本実施例によって、大腸菌の破砕から金属キレートカラムによる精製、電気泳動までを１枚のチップ上で、１０分以内に行うことに成功した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】この発明の実施例におけるマイクロチップの概略摸式図である。１〜４は、各部位の働きを示している。
【図２】この発明の実施例におけるＣＡＴタンパク質のマイクロ流路電気泳動の結果をキャプチャーソフト表したものである。
【符号の説明】
【００３８】
１ 細胞の破砕部
２ ニッケルキレートカラム
３ ＣＡＴタンパク質のＡＬＥＸＡ４８８による染色部
４ マイクロ流路電気泳動とタンパク質検出部
【図１】
2006220551.tif 000003
【図２】
2006220551.tif 000004