(57)【要約】      （修正有）【課題】  可視領域の光照射により脱保護することができ、生細胞を用いた試験に好適に適用可能な保護基を提供する。【解決手段】  光分解性の保護基であって、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基（例えば、２−ニトロベンジル基、３，５−ジニトロベンジル基）からなる水酸基、アミノ基等を保護するための保護基及び該保護基を有する化合物に470nm付近の光を照射して保護基を脱保護する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光分解性の保護基であって、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基からなる保護基。
【請求項２】
水酸基又はアミノ基を保護するための請求項１に記載の保護基。
【請求項３】
470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基からなる保護基を有する化合物に470 nm付近の光を照射して上記の保護基を脱保護する方法。
【請求項４】
470 nm付近の光の照射により脱離可能な光分解性保護基を導入するための試薬であって、下記の式(I)：
【化１】
2006241133.tif 000006
（式中、X1 は脱離基を示し、R1 は水素原子を示すか、又は470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位を示し、 R2、R3、R4、及びR5はそれぞれ独立にニトロ基、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に置換可能な任意の置換基を示す（2個ないし4個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）が、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも一つはニトロ基であり、R6は水素原子、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位、あるいは1個若しくは2個の１価の置換基又は1個の2価の置換基を示し（2個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、ただし、R1及びR6として470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が少なくとも1個存在する）で表わされる試薬。
【請求項５】
光分解性の保護基であって、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した2-ニトロベンジル基あるいは470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した3,5-ジニトロベンジル基からなる保護基。
【請求項６】
水酸基又はアミノ基を保護するための請求項５に記載の保護基。
【請求項７】
470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した2-ニトロベンジル基あるいは470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した3,5-ジニトロベンジル基からなる保護基を有する化合物に470 nm付近の光を照射して上記の保護基を脱保護する方法。
【請求項８】
470 nm付近の光の照射により脱離可能な光分解性保護基を導入するための試薬であって、下記の式(II)及び（III）：
【化２】
2006241133.tif 000007
（式中、X1は脱離基を示し、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に置換可能な1〜3個の任意の1価の置換基を示し（2個又は3個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、R6は水素原子を示すか、あるいは1個若しくは2個の１価の置換基又は1個の2価の置換基を示し（2個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、ただし、R1及びR6として470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位基が少なくとも1個存在する）で表わされる試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は可視光の照射により容易に脱離する光分解性保護基に関する。
【背景技術】
【０００２】
光分解性保護基は、光照射によって瞬時に緩和な条件下で脱保護を行うことができる保護基である。光分解性保護基はいわゆるケージド化合物としてダイナミックな生体シグナル伝達の解析に応用されるほか、DNA固相合成などの有機合成にも応用されるようになってきた。典型的な光分解性保護基としてo-ニトロベンジル型の保護基が汎用されている（例えば、α-カルボキシ-2-ニトロベンジル基、1-（2-ニトロフェニル）エチル基、4,5-ジメトキシ-2-ニトロベンジル基、1-（4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル）エチル基及び5-カルボキシメトキシ-2-ニトロベンジル基など：モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, ninth Edition）の第17章（ケージング基とそれらの光分解））。
【０００３】
しかしながら、現在までに知られている光分解性保護基の種類は少ない。また、脱保護のためには紫外領域の光を照射する必要があり、生細胞を用いた試験への適用には適しないという問題がある。このような事情から、可視領域の光照射により脱保護することができ、生細胞を用いた試験に好適に適用可能な保護基の開発が望まれている。なお、Liらにより、クマリンとニトロベンジル基を併せ持つ分子が高い光分解効率を有することが報告されている（J. Am. Chem. Soc. 126, 4653-63 (2004)）。
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. 126, 4653-63 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、可視領域の光照射により脱保護することができ、生細胞を用いた試験に好適に適用可能な保護基を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基に可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収する光捕集部位を結合させた基を水酸基などの保護基として用いると、可視領域（特に470 nm付近）の光を照射することにより該保護基が容易に脱保護することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００６】
すなわち、本発明により、光分解性の保護基であって、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基からなる保護基が提供される。本発明の好ましい態様によれば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基を保護するための上記の保護基が提供される。
【０００７】
また、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基からなる保護基を有する化合物に470 nm付近の光を照射して上記の保護基を脱保護する方法、及び上記の保護基を有する化合物が本発明により提供される。
【０００８】
別の観点からは、光分解性の保護基を導入するための試薬であって、下記の式(I)：
【化１】
2006241133.tif 000002
（式中、X1は脱離基を示し、R1は水素原子を示すか、又は470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位を示し、R2、R3、R4、及びR5はそれぞれ独立にニトロ基、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に置換可能な任意の置換基を示す（2個ないし4個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）が、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも一つはニトロ基であり、R6は水素原子、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位、あるいは1個若しくは2個の１価の置換基又は1個の2価の置換基を示し（2個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、ただし、R1及びR6として470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が少なくとも1個存在する）で表わされる試薬が提供される。この発明の好ましい態様として、R1又はR6のいずれか1つがキサンテン骨格を有する光捕集部位である上記の試薬が提供される。
【０００９】
さらに、本発明によれば、以下の保護基、当該保護基を脱保護する方法、及び当該保護基を有する化合物が提供される。
すなわち、本発明により、光分解性の保護基であって、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した2-ニトロベンジル基あるいは470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した3,5-ジニトロベンジル基からなる保護基が提供される。本発明の好ましい態様によれば、水酸基又はアミノ基を保護するための上記の保護基が提供される。
また、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した2-ニトロベンジル基あるいは470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した3,5-ジニトロベンジル基からなる保護基を有する化合物に470 nm付近の光を照射して上記の保護基を脱保護する方法、及び上記の保護基を有する化合物が本発明により提供される。
【００１０】
別の観点からは、光分解性の保護基を導入するための試薬であって、下記の式(II)及び（III）：
【化２】
2006241133.tif 000003
（式中、X1は脱離基を示し、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に置換可能な1〜3個の任意の1価の置換基を示し（2個又は3個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、R6は水素原子を示すか、あるいは1個若しくは2個の１価の置換基又は1個の2価の置換基を示し（2個の置換基を示す場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい）、ただし、R1及びR6として470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が少なくとも1個存在する）で表わされる試薬が提供される。この発明の好ましい態様として、R1又はR6のいずれか1つがキサンテン骨格を有する光捕集部位である上記の試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の光分解性の保護基は、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基からなることを特徴としている。本発明の保護基により保護可能な反応性官能基は特に限定されないが、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基などを例示することができる。これらのうち、水酸基が好ましい。
470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が結合する一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基としては、2-ニトロベンジル基、3,5-ジニトロベンジル基が好ましい。
【００１２】
470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位は、一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基における任意の置換可能な位置に結合することができる。470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位は1個又は2個以上結合していてもよいが、1個結合していることが好ましい。例えば、470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位が一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基のベンゼン環上の任意の位置に一つ結合していることが望ましい。あるいは、保護すべき化合物自体が470 nm付近の光を吸収可能な光捕集部位として作用できる場合には、保護すべき化合物の水酸基やアミノ基などの反応性官能基に一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基を結合させてもよい。このような態様も本発明の範囲に包含される。この場合には、可視光の照射により一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基が切断されて、一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基を結合する前の化合物が再生する。
【００１３】
本発明の光分解性保護基の470 nm付近の光を吸収する光捕集部位は可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収すると、ベンゼン環上にニトロ基を有するベンジル部位との間で光誘起電子移動を起こし、この結果として脱離基が脱保護される。したがって、可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収する光捕集部位とベンゼン環上にニトロ基を有するベンジル部位との間で可視領域（特に470 nm付近）の光を照射により光誘起電子移動を起こす可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収する光捕集部位であることが必須である。効率良く光誘起電子移動を起こす可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収する光捕集部位としては、強い蛍光性を有するものが好適であり、光分解性保護基の脱保護が効率よく行える。
【００１４】
可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収可能な光捕集部位としては、キサンテン骨格を有する光捕集部位などが好ましく、例えば、6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オンの6-位水酸基から水素原子を除いた残基などがより好ましいが、これらの特定の光捕集部位に限定されることはない。可視光領域に吸収を有するフルオレセイン骨格（主に450−490nm付近）、ローダミン骨格（主に500−580nm付近）、又は4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン骨格(BODIPY、登録商標、505/515, モレキュラー・プローブス社製)（主に500−650nm付近）などの化合物から水素原子などの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などを適宜除いてできる残基も可視領域の光を吸収可能な光捕集部位として前記と同様に扱うことができる。
【００１５】
可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収可能な光捕集部位が結合した一つ又は複数のニトロ基をベンゼン環に有するベンジル基を保護しようとする基へ導入するための試薬としては、上記の式(I)で表される化合物を用いることができる。式中、X1は脱離基を示し、例えば、臭素原子、塩素原子などのハロゲン原子、p-トルエンスルホニルオキシ基、メタンスルホニルオキシ基、ジアゾ基など、有機化学の分野で一般的に脱離基として用いられる基を用いることができる。R2、R3、R4、R5、又はR6が示す1価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキルスルホネート基などを挙げることができる。置換基として有していてもよい。R6が示す2価の置換基としては、例えば、アルキレンジオキシ基やオキソ基などを挙げることができる。
【００１６】
上記式(I)で表される化合物には、R1又はR6として可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収可能な光捕集部位が少なくとも1個存在する。可視領域（特に470 nm付近）の光を吸収可能な光捕集部位の種類は特に限定されず、上記のとおり、当業者に適宜選択可能である。上記の化合物を水酸基やアミノ基などの反応性官能基の保護基として導入する場合には、脱離基の性質に応じて、例えば適宜の塩基などを用いて一般的な保護基の導入方法に従って反応を行なえばよい。保護基の導入及び脱保護については、「プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス」（P. G. M. Wuts and T. Green, 第３版、1999年、Wiley, John ＆ Sons）などを参照することができる。
【００１７】
本発明の光分解性保護基を有する化合物としては、生理活性物質等を本発明の光分解性保護基で保護した化合物が有用である。これらの化合物は、光照射前は完全に元の生理活性が失われているが、光を照射することで元の生理活性を時空間的に制御して復活させることができる。例えば、ＡＴＰ、
【化３】
2006241133.tif 000004
ＧＴＰ、ｃＡＭＰなどの生理活性を有するヌクレオチドや
ＧＡＢＡ、
【化４】
2006241133.tif 000005
グルタミン酸などの神経伝達を司るアミノ酸等を本発明の光分解性保護基で保護した化合物は、生体機能メカニズム研究に用いることができ有用である。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：6-(3,5-ジニトロベンジルオキシ)-9-o-トルイルキサンテン-3-オン(3,5-DNB-2-Me TG)の合成
6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オン(1.0eq.)、3,5-ジニトロベンジルブロミド(1.0eq.)をN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、そこにCs2CO3(1.0eq.)を加えた。アルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光し、室温にて一晩攪拌した。反応終了後、反応液を大量の水で薄め、酢酸エチルで抽出した。溶媒溜去後、シリカゲルカラムにより精製した。
1H-NMR(CDCl3、300MHz)  2.09, 5.38, 6.46, 6.58, 6.88, 6.96, 7.03-7.06, 7.18, 7.35-7.48, 8.67, 9.06
HRMS(ESI+) Calcd for C27H19N2O7 483.1192(M+H). found 483.1184
【００１９】
例２：6-(2-ニトロベンジルオキシ)-9-o-トルイルキサンテン-3-オン(o-NB-2-Me TG)の合成
例1と同様にして、6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オン(1.0eq.)及びo-ニトロベンジルブロミド(1.0eq.)から合成した。
1H-NMR(CDCl3、300MHz)  2.08, 5.61, 6.46, 6.57, 6.86, 6.94, 7.02, 7.05, 7.16, 7.35-7.49, 7.55, 7.72, 7.84, 8.22
HRMS(ESI+) calcd for C27H20NO5 438.1342(M+H) .found 438.1326
【００２０】
例３
(a)サンプル調製
例１で得た3,5-DNB-2-Me TG又はo-NB-2-Me TGの濃度が3μMになるように0.1M リン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.4)に溶解した。共溶媒としてN,N-ジメチルホルムアミドを10%添加した。
(b)光照射
アルゴンレーザーを用いて470nmの光を照射した。128パルス×10回を1サイクルとした。
(c)結果
光照射に伴う吸収スペクトルの変化を図１に示す。光照射に伴い3,5-DNB-2-Me TG又はo-NB-2-Me TGの450nm付近のピークが減少し、490nm付近のピークが上昇してくることが分かる。これは、これらの化合物から6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オンがアンケージされてくることによるものである。この結果から、3,5-ジニトロベンジル基あるいは2-ニトロベンジル基に470 nmの可視光を吸収可能な光捕集部位が結合した場合には、470 nmの可視光の照射により3,5-ジニトロベンジル基あるいは2-ニトロベンジル基が容易に脱保護されることが明らかである。光照射をした際の6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オンによる蛍光の増大の様子を図２に示した。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】6-(3,5-ジニトロベンジルオキシ)-9-o-トルイルキサンテン-3-オン又は6-(2-ニトロベンジルオキシ)-9-o-トルイルキサンテン-3-オンに470 nmの光を照射した場合の吸収スペクトル変化を示した図である。
【図２】6-(3,5-ジニトロベンジルオキシ)-9-o-トルイルキサンテン-3-オンに470 nmの光を照射することにより6-ヒドロキシ-9-o-トルイルキサンテン-3-オンが放出され、それにより蛍光が増大する様子を示した図である。
【図１】
2006241133.tif 000008
【図２】
2006241133.tif 000009