(57)【要約】【課題】  細菌類を除去して新規なアルカリ性放線菌を含む放線菌群を広汎かつ効率的にスクリーニングする方法及びこれによる有用なアルカリ性放線菌の提供。【解決手段】  密度勾配を有するショ糖溶液上に放線菌を含む試料を載せて遠心分離し、細菌濃縮画分を除き、残る画分をアルカリ性培地に播種し、前記培地において成長した菌株を採取することを特徴とするアルカリ性放線菌の分離方法及びその方法により分離される新規放線菌。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
密度勾配を有するショ糖溶液上に放線菌を含む試料を載せて遠心分離し、細菌濃縮画分を除き、残る画分をアルカリ性培地に播種し、前記培地において成長した菌株を採取することを特徴とするアルカリ性放線菌の分離方法。
【請求項２】
濃度の異なる複数のショ糖溶液を遠心管内に高濃度から低濃度の順に重層して形成したショ糖密度勾配層を用いる請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
ショ糖密度勾配層が１５質量％よりも高い濃度の高濃度層の上に１５質量％よりも低い濃度の低濃度層を重層してなるものであり、遠心分離後、１５質量％より低い濃度の低濃度層を細菌濃縮画分として除去する請求項１または２に記載の分離方法。
【請求項４】
ショ糖密度として１０、２０、３０、４０、５０質量％の層（但し、各層とも前記表示値±５質量％未満の変動は許容される。）を用いる請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
アルカリ性培地で成育した放線菌を中性培地で培養し、成育しない菌株を選択する請求項１〜４のいずれかに記載の好アルカリ性放線菌の分離方法。
【請求項６】
アルカリ性培地がｐＨ９以上である請求項１〜５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項７】
分離されるアルカリ性放線菌がStreptomyces属、Nocardiopsis属、Saccharopolyspora属またはPseudonocardia属に属するアルカリ性放線菌である請求項１〜６のいずれかに記載の分離方法。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許生物寄託センターに平成１６年１２月２４日付で寄託申請され、以下の受領番号が付与されている下記放線菌：
（１）Streptomyces sp. 36-50B1：受領番号NITE AP-54
（２）Streptomyces sp. 74-50A2：受領番号NITE AP-55
（３）Streptomyces sp. 76-50B10：受領番号NITE AP-56
（４）Streptomyces sp. 76-20A4-a：受領番号NITE AP-57
（５）Streptomyces sp. 76-40B8：受領番号NITE AP-58
またはそれらの放線菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列との相同性が９８％以上であり、請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって得られる新規放線菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アルカリ性放線菌の分離方法及びその方法により分離される新規アルカリ性放線菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質、抗ウイルス物質、除草活性物質、植物成長促進物質、殺虫活性物質、人または動物において各種の生理活性を示す物質、バイオマスの活用や物質生産に有用な酵素等有用物質を生産する放線菌は多数知られている。また、放線菌自体も有害物質の分解や防虫・殺虫に用いられている。従って、新規な放線菌を見出すことによって、新たな有用物質を入手し得ると期待できる。
【０００３】
一般に放線菌の取得源（例えば、土壌、植物生葉、汽水域、昆虫腸内等）から特定の放線菌のみを採取するためには種々の選択培地を用いる必要がある。アルカリ域で生育する放線菌（本願では「アルカリ性放線菌」という。）を選択採取する目的ではアルカリ培地が用いられる。しかし、こうした試料には様々な細菌類も含まれており、多くの細菌類はアルカリ性環境を好むため、試料をアルカリ培地で培養すると細菌類の出現頻度が非常に高くなる。このため、通常、細菌と標的微生物とを含む試料から細菌を除去するのに用いられる乾燥法（風乾法）を用いても放線菌の採取は非常に困難である。
【０００４】
早川らは希少放線菌であるNocardia属の選択分離法としてショ糖密度勾配遠心法の利用を提案している（M. Hayakawa et al., J. Appl. Microbiol., 95, 677-685 (2003)（非特許文献１））。この方法は、土壌中の全放線菌の中から希少なNocardia属の菌株を分離採取することを目的としたもので、異なる濃度の各ショ糖溶液を遠心管に順次重層し、その最上部に土壌懸濁液をさらに重層して遠心することにより、ショ糖の特定画分にNocardia属菌が濃縮され、これを中性域の選択培地で平板培養すると高効率でNocardia属の菌株が得られるというものである。
【０００５】
しかし、この方法は、Nocardia属菌株の選択分離を目的としたもので、アルカリ性放線菌と細菌類との分離を目的としたものではない。また、一般にアルカリ性放線菌と細菌類を含む試料から高い効率で分離する方法は知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】M. Hayakawa et al., J. Appl. Microbiol., 95, 677-685 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、細菌類を排除して新規なアルカリ性放線菌を効率的に分離する方法及びその方法により分離される新規アルカリ性放線菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ショ糖密度勾配遠心法とアルカリ培地との組み合せにより、予想外の高い効率でアルカリ性放線菌を選択採取できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のアルカリ性放線菌分離方法及びその方法により分離される新規アルカリ性放線菌を提供する。
【００１０】
１．密度勾配を有するショ糖溶液上に放線菌を含む試料を載せて遠心分離し、細菌濃縮画分を除き、残る画分をアルカリ性培地に播種し、前記培地において成長した菌株を採取することを特徴とするアルカリ性放線菌の分離方法。
２．濃度の異なる複数のショ糖溶液を遠心管内に高濃度から低濃度の順に重層して形成したショ糖密度勾配層を用いる前記１に記載の分離方法。
３．ショ糖密度勾配層が１５質量％よりも高い濃度の高濃度層の上に１５質量％よりも低い濃度の低濃度層を重層してなるものであり、遠心分離後、１５質量％より低い濃度の低濃度層を細菌濃縮画分として除去する前記１または２に記載の分離方法。
４．ショ糖密度として１０、２０、３０、４０、５０質量％の層（但し、各層とも前記表示値±５質量％未満の変動は許容される。）を用いる前記３に記載の分離方法。
５．アルカリ性培地で成育した放線菌を中性培地で培養し、成育しない菌株を選択する前記１〜４のいずれかに記載の好アルカリ性放線菌の分離方法。
６．アルカリ性培地がｐＨ９以上である前記１〜５のいずれかに記載の分離方法。
７．分離されるアルカリ性放線菌がStreptomyces属、Nocardiopsis属、Saccharopolyspora属またはPseudonocardia属に属するアルカリ性放線菌である前記１〜６のいずれかに記載の分離方法。
８．独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許生物寄託センターに平成１６年１２月２４日付で寄託申請され、以下の受領番号が付与されている下記放線菌：
（１）Streptomyces sp. 36-50B1：受領番号NITE AP-54
（２）Streptomyces sp. 74-50A2：受領番号NITE AP-55
（３）Streptomyces sp. 76-50B10：受領番号NITE AP-56
（４）Streptomyces sp. 76-20A4-a：受領番号NITE AP-57
（５）Streptomyces sp. 76-40B8：受領番号NITE AP-58
またはそれらの放線菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列との相同性が９８％以上であり、請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって得られる新規放線菌。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明による放線菌分離方法を説明する。
（Ａ−１）ショ糖勾配遠心分離
本発明による放線菌分離方法では、初めに放線菌分離源から放線菌混合物試料を調製する。分離源の環境は特に限定されないが、通常は土壌、淡水域、汽水域、植物体表面等を含む自然環境あるいは動物体内外（例えば、動物表面や昆虫腸内等）の生体内環境である。また、これらの環境から採取した放線菌叢に突然変異源を付与して突然変異を誘発した放線菌混合物をも用いることができる。
【００１２】
放線菌混合物試料は、公知の任意の方法を用いて調製できる。例えば、土壌等の粒子状分離源から採取する場合は、粒子を滅菌イオン交換水に懸濁させる。淡水域等からの水性試料の場合は、懸濁化処理を省略できるほかは同様である。上記の懸濁時には、超音波洗浄器等による超音波振動を加えることが好ましい。これにより、土壌中の団粒構造が壊れ、放線菌の採取が容易になる。
【００１３】
次いで、この試料（沈殿または懸濁液）を密度勾配を有するショ糖溶液上に静かに載せる。具体的には、密度勾配を有するショ糖溶液上に放線菌を含む試料液を載せて遠心分離を行なう。調製するショ糖溶液は、本発明の目的では、最低限２層あればよく、低濃度層は１５質量％よりも低い濃度のショ糖濃度、例えば、１０質量％であり、高濃度層は１５質量％よりも高い濃度のショ糖濃度、例えば、３０質量％である。低濃度層も高濃度層も２層以上であってもよい。従って、本発明では、例えば、１０質量％−２０質量％−３０質量％の３層構造、１０質量％−２０質量％−３０質量％−４０質量％の４層構造、１０質量％−２０質量％−３０質量％−４０質量％−５０質量％の５層構造などをとることができる。但し、各層とも前記表示値±５質量％未満の変動は許容される（例えば、１０質量％層は５質量％超〜１５質量％未満の範囲の濃度を有すればよい。）。
【００１４】
ショ糖溶液は、ショ糖溶液は、必要に応じてｐＨ緩衝剤を含んでもよい。ショ糖溶液に対する試料の量は遠心分離時にショ糖勾配の重層構造を破壊しない程度の量であればよい。
【００１５】
遠心分離は、例えば、1,000〜3,500ｒｐｍ、好ましくは2,500〜3,000ｒｐｍの範囲内で３分間〜３時間程度、好ましくは７分間〜３０分間程度の時間をかけて行う。細菌は放線菌よりも低濃度層に捕捉される。遠心分離条件にもよるが、通常は上記で定義した意味での低濃度層（典型的には１０質量％層）を除去し、高濃度層を次のステップ（アルカリ培地による選択工程）に用いる。
【００１６】
（Ａ−２）アルカリ培地による選択
上記のようにして細菌を予備的に除去した後、高濃度層をアルカリ培地上に接種し、成育する放線菌を選択することにより、アルカリ性放線菌が効率的に採取できる。アルカリ培地は、最終ｐＨが９以上、好ましくは１０.０以上である。放線菌の成育に適したアルカリ培地の具体的組成は特に限定されず、一般的な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地にアルカリを添加して調製することができる。炭素源として、ブドウ糖、ショ糖、水飴、スターチ、デキストリン等の炭水化物、窒素源として、酵母エキス、大豆粉、ペプトン、小麦胚芽、コーンスティープ、硝酸塩、アンモニア塩等を使用することができる。その他必要に応じて、寒天（平板培養する場合）、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、銅、鉄その他の各種無機塩類及び菌の成長を促進する有機または無機化合物を添加する。アルカリとしては所定のｐＨを安定して維持できるものであれば特に限定されないが、炭酸ナトリウムが好ましい。
【００１７】
具体的には、種々の培地に２〜５％程度の炭酸ナトリウム溶液を加え、所望のｐＨを実現する組成とすればよい。目安として言えば、培地１Ｌに対しｐＨ１０に調整するために必要な炭酸ナトリウム量は約７〜２５ｇ程度である。さらに、好ましくは、放線菌の培養に適した成分、例えば、グリセリンやアスパラギン等を添加する。また、放線菌には無害であることが知られている抗生物質、例えば、ナリジキシン酸やトリメトプリム等を添加してもよい。
【００１８】
上記の培地をオートクレーブ等で滅菌し、ｐＨを安定させた後、遠心分離工程で得たショ糖高濃度層を接種し、培養を行う。培養は通常３日以上、好ましくは１週間〜１ヶ月かけて行う。培養後、生じたコロニーから放線菌を採取する。
【００１９】
取得した菌株は、形態学的または遺伝子解析による系統解析を行なって新規放線菌であるか否かを確認できる。系統解析にはリボソームＤＮＡ領域を用いることが好ましい。具体的には、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列による系統解析が可能である。
【００２０】
分子系統学的解析は、例えば、細菌用の１６ＳｒＤＮＡ用プライマー９Ｆ（配列番号１）と８０２Ｒ（配列番号２）を用いて（中川ら，遺伝子解析法，pp.83-140，日本放線菌学会編，放線菌の分類と同定，日本学会事務センター（2001））ＰＣＲ反応を行い、決定された約８００ｂｐの塩基配列についてＢＬＡＳＴ検索によって近縁種をデータベースから入手し、系統樹を作成する。上記以外のプライマーを用いることも可能である。
【００２１】
Ｂ．新規放線菌
以下、本発明の方法により分離される放線菌について説明する。
【００２２】
本発明の方法により現時点までに放線菌に属する以下の新規菌株が見出された。これらの菌株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許生物寄託センターに平成１６年１２月２４日付で寄託申請され、以下の受領番号が付与されている。
（１）Streptomyces sp. 36-50B1：受領番号NITE AP-54
（２）Streptomyces sp. 74-50A2：受領番号NITE AP-55
（３）Streptomyces sp. 76-50B10：受領番号NITE AP-56
（４）Streptomyces sp. 76-20A4-a：受領番号NITE AP-57
（５）Streptomyces sp. 76-40B8：受領番号NITE AP-58
【００２３】
上記菌株（１）〜（５）は、Streptomyces alkalophilus DSM41834、Streptomyces sp. 11AG8、Streptomyces sp. F50970及びStreptomyces sp. YIM80244との、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列における相同性が９７％以下である。
【００２４】
本発明は、本発明による上記新規放線菌の分離方法により得られる新規な菌株だけでなく、これらの新規菌株と同種（１６ＳｒＤＮＡの塩基配列について９８％以上の相同性を有するもの）の菌株をも含む。
【００２５】
このような新規放線菌の培養物から、これまで知られていない、抗生物質、抗ウイルス物質、植物成長調整物質、殺虫活性物質、人または動物において各種の生理活性を示す物質が得られる可能性があり、バイオマスの活用や物質生産に有用な酵素等が発見される可能性がある。また、新規放線菌自体が物質分解や防虫・殺虫剤として用いられ得る可能性もあり、新規化合物が見出される可能性もある。
【００２６】
抗生物質には、抗細菌性抗生物質、抗真菌性抗生物質、抗原生動物物質が含まれる。植物成長調整物質には、除草活性物質、植物成長促進物質が含まれる。人または動物における生理活性物質は、各種の薬理作用物質、例えば、抗動脈硬化剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、制癌剤が含まれる。物質分解の対象には、各種の有害物質（例えば、ダイオキシン等）が含まれる。防虫・殺虫としては、いわゆる昆虫天敵放線菌としての使用が含まれ、水稲食害昆虫、野菜食害昆虫、果樹食害昆虫、樹木食害昆虫がその対象として含まれる。新規化合物には、例えば、有色物質、立体異性を有する化合物が含まれる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、土壌試料は、千葉県君津市、千葉県木更津市、東京都井の頭公園、鳥取県米子水鳥公園、島根県神西湖及び広島県宮島、東京都小笠原諸島父島等で採取した。
【００２８】
実施例１：
土壌１００ｍｇを滅菌水１ｍｌに入れよく撹拌し、土壌懸濁液を調製した。次いで滅菌水にショ糖を溶解して濃度５０％、４０％、３０％、２０％、１０％のショ糖溶液をそれぞれ調製し、１ｍｌずつ遠心管にパスツールピペットを用いて静かに重層させ、その最上部に土壌懸濁液０．１ｍｌを静かに載せた。これを３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、１０％ショ糖溶液部分をピペットで吸い上げ除去した。
一方、表１に示すアルカリ培地Ａ（ＡＬ−Ａ）及びアルカリ培地Ｂ（ＡＬ−Ｂ）を直径９ｃｍのシャーレに入れて平板培養用の培地を用意し、前記２０％〜５０％のショ糖溶液濃度層から各１００μｌずつとって植菌した。これらのアルカリ培地は、別府らの培地(M. Sato, T. Beppu and K. Arima, Studies on antibiotics produced at high alkaline pH., Agri. Biol. Chem., 47, 2019-2027(1983))を参考にした。培養は２８℃で２週間行った。
なお、ＩＳＰ―２培地については後述する。
【００２９】
【表１】
2006197898.tif 000002
【００３０】
アルカリ培地Ａ及びアルカリ培地Ｂ上では細菌類の繁殖もわずかに見られるが、放線菌に対する相対数としては減少しており出現する放線菌コロニーからほぼ１００％の確率で放線菌を分離することができる。結果として６０土壌試料から合計１５８株のアルカリ性放線菌を得た。
【００３１】
比較例１：
実施例１で用いた試料（遠心分離前）を前記アルカリ培地Ａ及びアルカリ培地Ｂで培養すると、細菌と放線菌のコロニーが重なり、放線菌の分離は不可能である。また１０％ショ糖溶液部分を培養すると細菌のみコロニーが出現し、放線菌のコロニーは出現しない。
【００３２】
比較例２：
実施例１で用いた試料（懸濁前）を一般的に細菌除去のために用いられる風乾法（一週間以上通気下で試料を乾燥させる）で処理した後、１００μｌずつ前記アルカリ培地Ａ及びアルカリ培地Ｂに接種して、実施例１と同一条件で培養を行った。風乾法でも細菌数が多く、放線菌のコロニーとの分離は困難であり、結果として５０土壌試料実施してアルカリ性放線菌を１０株しか分離することができなかった。このように、土壌試料中に多数含まれるアルカリ性細菌は風乾法では除去困難であり、効率的なアルカリ性放線菌の分離は困難である。
【００３３】
実施例２：
実施例１で得た１５８株のアルカリ性放線菌を、下記の培地に植菌して、成育ｐＨ条件を検討した。ｐＨ以外の培養条件は実施例１と同様である。
（ａ）アルカリ培地Ａ：実施例１で用いたアルカリ培地Ａ
（ｂ）中性培地Ａ：実施例１で用いたアルカリ培地Ａから炭酸ナトリウムのみを成分から除いたもの。
（ｃ）一般中性培地：表１に示すイースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−２）。
【００３４】
その結果、（ａ）のみで成育し、（ｂ）、（ｃ）のいずれでも成育しない好アルカリ性放線菌が２２株、（ａ）及び（ｂ）で成育し、（ｃ）では成育しない耐アルカリ性放線菌が１１６株、（ａ）及び（ｂ）に加え、（ｃ）でも成育する耐アルカリ性放線菌が２０株得られた。
【００３５】
これらの菌株について既知の菌株との類縁関係を分子系統解析により調べたところ、図１〜２に示す通りであり、５株の新規放線菌が得られた。なお、図１と２は図中★印で同レベルに接続する。
【００３６】
なお、放線菌の分子系統学的解析は、具体的には以下の手順で行った。放線菌の菌体からＤＮＡを抽出するために、ＦａｓｔＤＮＡ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１社製）のプロトコールにしたがって放線菌の菌体を破壊し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの精製には、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のスピン・カラムを使用し、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡ用プライマーの９Ｆ（配列番号１）と１５４１Ｒ（配列番号３）によって（中川ら，遺伝子解析法，pp.83-140，日本放線菌学会編，放線菌の分類と同定，日本学会事務センター（2001））、１６Ｓの全長１，５００ｂｐをＰＣＲ反応によって増幅させた（LA Taq DNA polymerase、宝酒造製を使用）。ＰＣＲのサイクル・プログラムは、９８℃、２分間のプレ・ヒーティング後に、９８℃を３０秒間、５２℃を３０秒間、７２℃を９０秒間の３０サイクルを行った。このサイクル後、７２℃、４分間の伸長ステップを行った。
得られたＰＣＲ増幅産物について１％アガローズゲル電気泳動で生成量及び長さ（約１，５００ｂｐ）を確認した後、ダイレクト・シーケンスによって、塩基配列を決定した。すなわち、プライマー９Ｆ（配列番号１）及び８０２Ｒ（配列番号２）を用いて、シーケンシング反応を行い（BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit、アプライド・バイオシステムズ社製を使用）、キャピラリー・シーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００によって約８００ｂｐの塩基配列を決定した。
配列番号１）
5'-gagtttgatcctggctcag-3'
配列番号２）
5'-taccagggtatctaatcc-3'
配列番号３）
5'-aaggaggtgatccagcc-3'
【００３７】
以上の結果から、本発明の方法によれば、細菌を実質的に除去して効率的なアルカリ性放線菌の分離採取を行ない得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法は、従来の乾燥法とは異なり、ショ糖密度勾配法とアルカリ培地とを組み合せて放線菌の効率的分離採取を可能としたものである。本発明の方法は、種々の環境（例えば熱帯地域）の植物、昆虫、土壌サンプルからの菌分離にも有効と考えられる。また、本発明の方法では、特に好アルカリ性放線菌の分離が容易であり、種々の有用性を有する新規菌株が分離され得る。そのためこのように分離された新規放線菌は、医薬、農薬等の生理活性物質の開発において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明方法（実施例１）により分離した放線菌株とNocardiopsis属菌株との分子系統学的関係を示す系統樹。
【図２】本発明方法（実施例１）により分離した放線菌株とStreptomyces属菌株との分子系統学的関係を示す系統樹。
【図１】
2006197898.tif 000003
【図２】
2006197898.tif 000004
【配列表】
2006197898000001.app