(57)【要約】【課題】生体組織や生体細胞等の試料の光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得する。【解決手段】光源ユニット２が蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出し、このレーザ光Ｌを光分割手段３が測定光Ｌ１と参照光Ｌ２とに分割する。周波数変調手段６が参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との間に僅かな周波数差を与えた後、合波手段５が反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とを合波する。干渉光検出手段７が反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とが合波されたときの干渉光Ｌ５を検出するとともに、蛍光検出手段８が試料Ｓの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光Ｌ４を検出する。そして、画像生成手段９が干渉光検出手段７により検出された干渉光Ｌ５から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段８により検出された蛍光Ｌ４から試料Ｓの蛍光断層画像を生成する。【選択図】図１
2006195240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、
前記蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、
該光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分光する光分割手段と、
該光分割手段により分光された前記参照光と、前記測定光が前記試料に照射されたときの該試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、
該周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた前記反射光と前記参照光とを合波する合波手段と、
該合波手段において前記反射光と前記参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、
前記測定光が前記試料に照射されたときに、該試料の前記蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記干渉光検出手段により検出された前記干渉光から前記試料の光断層画像を生成するとともに、前記蛍光検出手段により検出された蛍光から前記試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段と
を有することを特徴とする断層画像化装置。   
【請求項２】
前記蛍光色素が、２光子励起蛍光色素からなることを特徴とする請求項１に記載の断層画像化装置。
【請求項３】
前記光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出するモード同期ファイバレーザもしくはモード同期半導体レーザからなるレーザ光源と、該レーザ光源が射出した前記超短パルスレーザ光を伝搬させる、該超短パルスレーザ光の波長帯域において負分散特性を有する光ファイバとを有し、該光ファイバから前記低コヒーレンス光からなるレーザ光が射出されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の断層画像化装置。
【請求項４】
前記光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出する固体レーザからなるものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の断層画像化装置。
【請求項５】
前記光源ユニットが、近赤外域の波長からなる前記レーザ光を射出するものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の断層画像化装置。
【請求項６】
前記試料中に複数の集束部分を形成するように前記測定光を集光するマイクロレンズアレイを備え、前記合波手段が、前記測定光の前記複数の集束部分からそれぞれ反射した反射光と前記参照光とを合波するものであり、前記蛍光検出手段が、前記複数の集束部分おいて発生した複数の前記蛍光を検出するものであり、前記干渉光検出手段が、前記複数の反射光と前記複数の参照光とがそれぞれ干渉した複数の干渉光を検出するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の断層画像化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば生体組織や細胞等からなる試料の断層画像を取得する断層画像化装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体組織の観察においては生体組織の細胞の形態を観察する形態観察と、生体組織の細胞を構成する物質を観察する物質観察とが行われる。生体組織、特に生体細胞の形態観察および物質観察を行う方法として、生体組織の細胞を蛍光色素等により染色してコントラストを確保した後に光学顕微鏡で観察する方法が知られている。（たとえば特許文献１参照。）蛍光色素等により染色を行うのは、生物の細胞や生体組織の多くは無色透明であり細胞内外の屈折率が僅かであるためコントラストがつかず観察が難しいからである。ここで、形態観察を行うための蛍光色素と物質観察を行うための蛍光色素とは異なる種類のものが使用されており、異なる蛍光波長からなる複数の蛍光を検出することにより形態観察と物質観察とが行われる。
【０００３】
また、生体組織の形態観察を行うときには、上述した光学顕微鏡を用いる方法の他に位相差顕微鏡を用いる場合がある。（たとえば特許文献２参照。）この位相差顕微鏡は、光の回折、干渉という２つの性質を利用し、明暗のコントラストにより無色透明な標本を可視化する観察方法であって、標本への染色が不要であるという特徴を有している。
【特許文献１】特開２００４−７０３７１号公報
【特許文献２】特開２００１−３１１８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１のように複数の蛍光色素を用いて光学顕微鏡により観察を行った場合、形態観察のための蛍光色素と物質観察のための蛍光色素の双方から検出される蛍光もしくは反射像が混在することになるため、形態観察を行うための蛍光と物質の観察を行うための蛍光とが識別しづらいという問題がある。また、光学顕微鏡を用いるときには観察時に観察試料の薄片標本を作成して観察が行われるが、多細胞系や組織系の試料は光散乱が大きいため、光学顕微鏡では鮮明な画像の取得は困難であるという問題がある。
【０００５】
また、特許文献２のように、位相差顕微鏡を用いた場合、形態観察は行うことができるが、物質観察は試料を蛍光色素等により染色し光学顕微鏡を用いて行う必要がある。つまり、無染色の生体組織を位相差顕微鏡により形態観察した後、生体組織を蛍光色素等を用いて染色し、位相差顕微鏡により観察した部位と同一の部位を光学顕微鏡により観察しなければならない。したがって、形態観察と物質観察とを行うのに手間が掛かってしまうとともに、位相差顕微鏡により観察したときの生体組織の空間的座標と光学顕微鏡により観察したときの生体組織の空間的座標とを一致させるのが困難であるという問題がある。
【０００６】
そこで、本発明は、試料の鮮明な光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することができる断層画像化装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の断層画像化装置は、蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分光する光分割手段と、光分割手段により分光された参照光と、測定光が試料に照射されたときの試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた反射光と参照光とを合波する合波手段と、合波手段において反射光と参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、測定光が試料に照射されたときに、試料の蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、干渉光検出手段により検出された干渉光から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段により検出された蛍光から試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段とを有することを特徴とするものである。
【０００８】
ここで、周波数変調手段は、参照光と反射光との間に僅かな周波数差を与えるものであれば、参照光に対し周波数シフトを行ってもよいし、反射光に対し周波数シフトを行うものであってもよい。ここで、「僅かに周波数シフトさせる」とは、参照光と反射光とが合波されたときに、参照光と反射光との差周波数で強弱を繰り返すビート信号が生じるような周波数のシフトを意味する。
【０００９】
また、試料は蛍光色素を有するものであればよく、蛍光色素により染色されているものであってもよいし、自己蛍光特性を有する細胞等を有する試料であってもよい。試料が蛍光色素により染色されている場合、蛍光色素は１光子励起蛍光色素であってもよいし、２光子励起蛍光色素であってもよい。
【００１０】
さらに、光源ユニットは、試料の蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出するものであればよく、このレーザ光が超短パルスレーザ光であってもよい。
【００１１】
ここで、「超短パルスレーザ光」とは、ピコ秒の単位が用いられる時間領域以下のパルス光を意味し、好ましくはフェムト秒（ｆｓ）のパルス光をいう。
【００１２】
この超短パルスレーザ光を射出する光源ユニットは、超短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、レーザ光源から射出された超短パルスレーザ光が入射される、負分散特性を有する光ファイバとを備えたものであってもよいし、超短パルスレーザ光を射出する固体レーザからなるものであってもよい。
【００１３】
ここで、「負分散特性」とは、波長が長くなると波長分散（ｐｓ／ｎｍ／ｋｍ）の値が小さくなることを意味し、この負分散特性を有する光ファイバにパルス光が入射されたとき、光ファイバ内においてパルス幅が圧縮され、このパルス幅が圧縮されたパルスレーザ光は、低コヒーレンス光として射出されるようになっている。上記負分散特性を有するファイバとして零分散ファイバあるいはフォトニッククリスタルファイバを用いることができる。
【００１４】
なお、光源ユニットから射出されるレーザ光の波長は、試料に含まれる蛍光色素の励起波長に合わせて適宜選択されるものであるが、近赤外域の波長からなるレーザ光であることが好ましい。ここで、「近赤外域」とは、７５０ｎｍ〜２５００ｎｍまでの波長帯域をいう。
【００１５】
さらに、断層画像化装置は、試料中に測定光の複数の集束部分を形成するマイクロレンズアレイを備えたものであってもよい。このとき、合波手段は、複数の集束部分から反射した複数の反射光と参照光とをそれぞれ合波するようになっている。また、蛍光検出手段は、複数の集束部分おいて発生した蛍光をそれぞれ検出するものであり、干渉光検出手段は、複数の反射光と複数の参照光とが干渉したときの干渉光をそれぞれ検出するようになっている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の画像取得装置によれば、蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する際に、画像生成手段が干渉光検出手段により検出された干渉光から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段により検出された蛍光から試料の蛍光断層画像を生成することにより、試料の形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料の効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。
【００１７】
また、従来のように光学顕微鏡を用いずに形態観察を行うことができるため、光散乱が大きい多細胞系や組織系の試料であっても、形態観察のための鮮明な光断層画像を取得することができ、試料のｉｎ  ｖｉｖｏ観察を行うことができる。
【００１８】
さらに、光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することにより、光断層画像と蛍光断層画像との空間的座標関係は常に一致させることができるため、高精度な生体組織の分析を行うことができる。
【００１９】
なお、蛍光色素が、２光子励起蛍光色素からなるものであれば、試料深部の測定を行うときに、試料の深部のみについての蛍光の励起が可能となり、試料深部の鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
【００２０】
また、光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出するモード同期ファイバレーザもしくはモード同期半導体レーザからなるレーザ光源と、レーザ光源が射出した超短パルスレーザ光を伝搬させる、超短パルスレーザ光の波長帯域において負分散特性を有する光ファイバとを有し、光ファイバから低コヒーレンス光からなるレーザ光が射出される構成であれば、高分解能な光断層画像を取得することができるようになる。特に、蛍光色素が２光子励起蛍光色素の場合、光源ユニットから射出されるレーザ光のパルス幅が狭くなっているため、蛍光色素を励起するレーザ強度を確保することができ、鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
【００２１】
さらに、光源ユニットが、近赤外域の波長からなるレーザ光を射出するものであれば、試料に対するレーザ光の透過性を向上させることができるため、たとえば多細胞系や組織系の試料に対しても試料内における散乱の影響を受けずに細胞レベルの高分解能な光断層画像を取得することができる。また、蛍光検出においても、試料に対するレーザ光の透過性を向上させることにより、試料の深部のみについての蛍光の励起が可能となり、試料深部の鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
【００２２】
さらに、試料中に測定光の複数の集束部分を形成するマイクロレンズアレイを備え、合波手段が、複数の集束部分から反射した複数の反射光と参照光とをそれぞれ合波するものであり、蛍光検出手段が、複数の集束部分おいて発生した複数の蛍光を検出するものであり、干渉光検出手段が、複数の反射光と複数の参照光とがそれぞれ干渉したときの複数の干渉光を検出する構成であれば、試料の複数の部位に測定光を同時に走査しながら照射することが可能となるため、試料がたとえば短時間に状態が変化するような生体細胞の観察を精度よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、図面を参照して本発明の断層画像化装置の実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の断層画像化装置の第１の実施の形態を示す構成図である。断層画像化装置１は、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）計測による光断層画像と、蛍光検出による蛍光断層画像とを同時に取得する断層画像化装置であって、レーザ光を射出する光源ユニット２と、光源ユニット２から射出されたレーザ光Ｌを試料Ｓに照射する測定光Ｌ１と参照光Ｌ２とに分光する光分割手段３と、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段６と、反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とを合波する合波手段５と、合波手段５において反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とが合波されたときの干渉光Ｌ５を検出する干渉光検出手段７と、測定光Ｌ１が試料Ｓに照射されたときに、試料Ｓの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段８と、干渉光検出手段７により検出された干渉光Ｌ５から試料Ｓの光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段８により検出された蛍光Ｌ４から試料Ｓの蛍光断層画像を生成する画像生成手段９とを有する。
【００２４】
ここで、光源ユニット２は、たとえばスーパーコンティニウム（Ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）光源からなっており、図２に示すように、超短パルスレーザ光Ｌ０を射出するレーザ光源２ａと、レーザ光源２ａから射出された超短パルスレーザ光Ｌ０がレンズ２ｂを介して入射される、負分散特性を有する光ファイバ２ｃとを有し、光ファイバ２ｃから射出された超短パルスレーザ光がコリメートレンズ２ｄを介して光分割手段３に射出されるようになっている。
【００２５】
レーザ光源２ａは、たとえばエルビウム（Ｅｒ）ドープファイバーレーザーとＥｒ光増幅器とを有するモード同期ファイバレーザからなっており、たとえばパルス幅１４５ｆｓ、中心波長１．５５５μｍ、スペクトル幅約１８ｎｍの低コヒーレント光を射出するものである。なお、このモード同期ファイバリングレーザーの構成および動作原理の詳細は、「レーザ研究第２７巻１１号  ｐ７５６−７６１、モード同期ファイバリングレーザー、中沢  正隆他著、１９９９年１１月」に記載されている。
【００２６】
光ファイバ２ｃは、たとえば図３（ａ）に示すような波長１．５６μｍ前後において負分散特性を有している。ここで、超短パルスレーザ光Ｌ０が光ファイバ２ｃ内を伝搬するときパルス幅が圧縮するとともにスペクトル幅が広がる。具体的には、図３（ｂ）に示すように、パルス幅がｆｓオーダーとなる超短パルスレーザ光Ｌ０では自己位相変調効果により、パルス時間波形中の長波長成分が先に進み短波長成分が後になる。このような超短パルスレーザ光を負分散特性を有する光ファイバ２ｃ内において伝搬させたとき、パルス幅が圧縮される。たとえば超短パルスレーザ光Ｌ０が、上述のように、パルス幅１４５ｆｓ、中心波長１．５５５μｍ、スペクトル幅約１８ｎｍの低コヒーレント光である場合、図３（ｃ）に示すように、パルス幅約１０ｆｓ、スペクトル幅約８００ｎｍの広スペクトル帯域で近赤外域のレーザ光Ｌとして出力されるようになっている。
【００２７】
このように、負分散特性を有する光ファイバ２ｃ内にレーザ光源２ａから射出したパルス光を伝搬させることにより、パルス幅を圧縮してコヒーレント長を短くすることができるため、高い分解能により光断層画像を取得することができる。
【００２８】
なお、光源ユニット２として上述した構成の他に、レーザ光源２ａが中心波長７９５ｎｍ、スペクトル帯域７００ｎｍ〜１０００ｎｍのＴｉ：Ａｌ2Ｏ3レーザからなり、光ファイバ２ｃが、図４（ａ）に示すような波長８００ｎｍ前後において負分散特性を有するＰＣＦ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｆｉｂｅｒ）からなるものであってもよい。このとき、光ファイバ２ｃから射出されるレーザ光Ｌは、図４（ｂ）に示すような広スペクトル帯域な近赤外域のレーザ光Ｌとして光分割手段３に射出されるようになる。
【００２９】
さらに、負分散特性を有する光ファイバ２ｃとの組み合わせにおいて使用されるレーザ光源２ａとして、たとえば８００ｎｍ〜１３００ｎｍの近赤外域の波長からなるピコ秒〜サブピコ秒の短パルスレーザを射出するものであって、図５に示すようなＣｒ：ＬｉＳｒＡｌＦ６レーザ、Ｃｒ：ＬｉＣａＡｌＦ６レーザ、Ｃｒ：Ｍｇ６ＳＯ４レーザ、Ｃｒ：ＹＡＧレーザ、Ｙｂ：ＹＡＧレーザ等を用いることができる。
【００３０】
なお、上述のようにレーザ光源２ａと光ファイバ２ｃとを組み合わせた光源ユニット２について例示しているが、レーザ光源２ａから射出されたレーザ光を直接光分割手段３に入射するものであってもよい。具体的には、図５に示される固体レーザのうち、Ｃｒ：ＬｉＳｒＡｌＦ６レーザ、Ｃｒ：ＬｉＳｒＡｌＦ６レーザ、Ｃｒ：ＬｉＣａＡｌＦ６レーザ、Ｙｂ：ＹＡＧレーザから直接レーザ光Ｌを光分割手段３に射出するようにしてもよい。さらに、光源ユニット２として「レーザ研究第２７巻１１号  ｐ７３５−７４３、モード同期技術の基礎、張  吉男著、１９９９年１１月」、「レーザ研究第２７巻１１号  ｐ７４４−７４９、極短パルスモード同期固体レーザ、鳥塚  健二著、１９９９年１１月」に開示されているものを用いるようにしてもよい。
【００３１】
図１の光分割手段３はたとえばビームスプリッタからなっており、光源ユニット２から射出されたレーザ光Ｌの一部を透過させ、測定光Ｌ１として試料Ｓに照射させるようになっている。同時に、光源ユニット２から射出されたレーザ光Ｌの一部を反射させ、参照光Ｌ２として周波数変調手段６に入射させるようになっている。なお、このビームスプリッタは合波手段５としても機能するものであって、後述する反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とを合波するようになっている。
【００３２】
周波数変調手段６は、参照光Ｌ２に対し周波数シフトを行うことにより参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との間に僅かな周波数差を与えるものであって、光分割手段３により分光された参照光Ｌ２を合波手段５に反射する参照ミラー６ａと、参照ミラー６ａを参照光Ｌ２の光軸に直交する方向（矢印Ｙ方向）に移動させるミラー駆動手段６ｂとを備えている。そして、ミラー駆動手段６ｂが参照ミラー６ａの移動させたときに参照光Ｌ２に時間的な遅延が生じ、参照光Ｌ２の周波数がドップラーシフトにより僅かに変動する。よって、この周波数シフトした参照光Ｌ２が合波手段５に入射されるようになっている。なお、このミラー駆動手段６ｂの動作は駆動制御手段２０により制御されている。
【００３３】
光分割手段３と試料Ｓの間には集光レンズ４が配置されており、光分割手段３により分光された測定光Ｌ１は、集光レンズ４により集束して試料Ｓに照射されるようになっている。ここで、試料Ｓは、図６に示すように、たとえば走査ステージ１０上に載置されているものであって、ステージ駆動手段１１により矢印Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動可能に保持されている。図１のステージ駆動手段１１は駆動制御手段２０により制御されており、駆動制御手段２０は、光分割手段３から参照ミラー６ａまでの距離と光分割手段３から集光レンズ４の焦点位置までの距離とが等しくなるように、ミラー駆動手段６ｂおよびステージ駆動手段１１を制御するようになっている。これにより、合波手段５において参照光Ｌ２と反射光Ｌ３とが干渉し干渉光検出手段７において、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３の差周波数で強弱を繰り返すビート信号が検出されるようになる。
【００３４】
なお、図６において、走査ステージ１０が矢印Ｚ方向に移動することにより、試料Ｓ中の焦点位置を移動させるようにしているが、集光レンズ４を矢印Ｚ方向に移動させることにより、試料Ｓ中の焦点位置を移動させるようにしてもよい。
【００３５】
合波手段５は、光分割手段３としても機能するビームスプリッタからなり、周波数変調手段６により周波数シフトされた参照光Ｌ２と試料Ｓからの反射光Ｌ３とを合波しミラー１２ｂ側に射出するようになっている。同時に、合波手段５は、試料Ｓから射出された蛍光をダイクロイックミラー１２ａ側に反射させるようになっている。
【００３６】
干渉光検出手段７は、たとえばヘテロダイン干渉計等からなっており、干渉光Ｌ５の光強度を検出するようになっている。具体的には、光分割手段３から参照ミラー６ａまでの光路長と、光分割手段３から集光レンズ４の焦点位置までの光路長が等しいときに、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との周波数差で強弱を繰り返すビート信号が発生する。干渉光検出手段７は発生したビート信号の強度を検出するようになっている。
【００３７】
蛍光検出手段８は、たとえばＣＣＤカメラ等の撮影手段からなっており、合波手段５からダイクロイックミラー１２ａおよび反射光カットフィルター８ａを介して入射される蛍光の光強度を検出するものである。なお、蛍光検出手段８は特定の波長帯域の蛍光のみ検出するものであってもよいし、複数の波長帯域の蛍光を波長帯域毎に検出するものであってもよい。
【００３８】
画像生成手段９は、干渉光検出手段７により検出された干渉光Ｌ５から光断層画像を取得するとともに、蛍光検出手段８により検出された蛍光Ｌ４から蛍光断層画像を取得するものである。さらに、画像生成手段９は、取得した断層光断層画像と断層蛍光断層画像と表示部５０に表示させる機能を有している。
【００３９】
ここで、試料Ｓが有する蛍光色素について詳しく説明する。試料Ｓが蛍光色素により染色されたものであってもよいし、自己蛍光特性を有する細胞等を有するものであってもよいが、試料が蛍光色素により染色されている場合、蛍光色素は２光子励起蛍光色素であることが好ましい。２光子励起蛍光色素を用いたときには集光レンズ４により集光された測定光Ｌ１の集束部分のみから蛍光を発光するようになる。なお、２光子励起過程についての詳細な原理については、「レーザ研究第２７巻１１号  ｐ７４４−７４９、多光子顕微鏡による半導体材料内部欠陥の３次元観察、河田  善正著、２００３年６月」に記載されている。
【００４０】
すなわち、図７（ａ）に示すように、２光子励起蛍光色素は、波長λ２の２つのフォトンを同時に吸収し基底状態の電子が励起される。２光子励起過程の発生効率は光強度分布の２乗に比例するため、図７（ｂ）に示すように、光強度の大きな測定光Ｌ１の集束部分（ビームウエスト）ＢＷ近傍のみで蛍光Ｌ４が発生し、集束部分ＢＷ以外ではほとんど２光子励起過程が生じない。このため、試料Ｓの深部に測定光Ｌ１を集束させたときであっても測定光Ｌ１が吸収されることがなく、試料Ｓの深い（矢印Ｚ方向）部分における蛍光をも検出することができる。
【００４１】
一方、１光子励起蛍光色素は、図８（ａ）に示すように、基底状態にある電子が励起エネルギーに対応する波長λ１のフォトンを１つ吸収し励起状態になる。なお、上述した１光子励起蛍光色素と２光子励起蛍光色素との電子の励起準位が同じ場合、２光子過程の励起光の波長λ２は１光子過程の励起光の波長λ１の倍になる（λ２＝２λ１）。したがって、図８（ｂ）に示すように、光強度の大きなレーザ光の集束部分ＢＷのみならず、その集束部分ＢＷの近傍においても発光してしまう。
【００４２】
生体試料では各種内在色素などは可視光を吸収し蛍光等を発するものが多いため、１光子励起過程に用いられる励起光（可視光）自体が生体組織で強く散乱されること、および図８（ｂ）のように１光子過程の蛍光発光のためにレーザ光伝搬領域全体から蛍光が発生すること等により、１光子励起蛍光色素を用いたときには試料深部の観察は困難である。一方、２光子励起蛍光色素の場合、１光子励起過程で用いられる励起光（可視光）の波長λ１に対して２倍の波長λ２となるような、たとえば８００ｎｍ〜１３００ｎｍの近赤外域の励起光が用いられるため、生体組織に対する透過性がよくなり、試料深部への限局した光励起が可能となる。
【００４３】
さらに、図２から図５に示すような近赤外域の広帯域な超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット２を用いることにより、高分解能な光断層画像の取得と鮮明な蛍光断層画像の取得を同時に行うことができる。
【００４４】
まず、光源ユニット２と光断層画像との関係について説明する。試料Ｓの光断層画像を取得する際に、光軸方向の分解能は光源のコヒーレンス長が規律となる。このため、より高い分解能を得るためには、広いスペクトル帯域の光源が有効である。一方、横方向の分解能は光スポットの大きさで決まるため、空間コヒーレンスの高い光源が必要となる。すなわち、面内分解能と光軸方向分解能とを両立させるためには、空間コヒーレンスが高く、時間コヒーレンスの低い（スペクトル帯域の広い）光源が必要となる。このとき、上述した光源ユニット２から射出される超短パルスレーザ光はこの相反する要求を満たすことができる。よって、広いスペクトル帯域であって近赤外域の超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット２を用いることにより、高分解能な光断層画像を取得することができる。
【００４５】
次に、光源ユニット２と蛍光断層画像との関係について説明する。蛍光断層画像を取得する際に、２光子過程を効率的に発生させるためには、光強度を強くすることが求められ、空間軸（光の集光）と時間軸の集中化（短パルス化）とは有効である。よって、蛍光色素が２光子励起蛍光色素であるときに、光源ユニット２が超短パルス・広スペクトル帯域のレーザ光Ｌを射出するものであれば、鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
【００４６】
このように、近赤外域の広帯域な超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット２を用いることにより、高分解能な光断層画像の取得と鮮明な蛍光断層画像の取得を同時に行うことができる。
【００４７】
なお、２光子励起蛍光色素の種類は、試料Ｓにおける観察したい物質に予め蛍光試薬を結合させ、あるいは環境（たとえばｐＨなどのイオン濃度）変化に対し蛍光特性が変化するように選択される。特に、２光子励起蛍光色素として２光子励起効率の高いものを用いることが好ましい。具体的には、２光子励起蛍光色素の２光子吸収断面積が１０2ＧＭ（１ＧＭ＝１×１０-50ｃｍ4  ｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｈｏｔｏｎ−１）以上であることが好ましく、たとえば文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．１９９５，６７，３７０３、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９５，６７，２４３３、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９６，６８，３５４９、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９７，８１，２５２９等に記載されているスチルバゾリウム誘電体、特開２００３−２０４６９号公報の３−９頁に記載された化合物、特開２００３−１８３２１３号公報の５−１７頁に記載された化合物、特開２００４−１２３６６８号公報の８−１１頁に記載された化合物等が用いられる。特に、特開２００３−２０４６９号公報、特開２００３−１８３２１３号公報、特開２００４−１２３６６８号公報に記載された２光子吸収化合物を用いることが好ましい。
【００４８】
上述した化合物には生体分子と共有結合、イオン結合または配位結合しうる反応性置換基を導入することが望ましい。反応性置換基としては、たとえばサクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジニル基などが挙げられる。またスルホン酸基およびその塩、カルボキシル基およびその塩、水酸基、ポリエーテル基等の推算性基を導入しておくことが望ましい。このとき、反応性基および水溶性基の導入は公知の方法により行われる。
【００４９】
このような外因性材料に２光子励起効率の高いものを用いることにより、従来観察が困難であった散乱の大きい多細胞系や組織系での細胞機能の画像化を実現することができる。つまり、試料Ｓの蛍光検出は、観察したい物質に予め蛍光試料を結合させ、あるいは環境変化（たとえばｐＨなどのイオン濃度等）に対し蛍光特性が変化する試薬を用いることにより、生体細胞、組織の機能情報をとらえることにより行われる。よって、このような外因性材料に２光子励起効率の高いものを用いることにより、従来観察が困難であった散乱の大きい多細胞系や組織系での細胞機能の画像化を実現することができる。
【００５０】
次に、図１から図８を参照して本発明の断層画像化装置１の動作例ついて説明する。まず、光源ユニット２において、レーザ光源２ａから射出された超短パルスレーザ光Ｌ０が光ファイバ２ｃにおいてパルス圧縮され、このパルス圧縮されたレーザ光Ｌがコリメートレンズ２ｄを介して光分割手段３に射出される（図２参照）。その後、レーザ光Ｌは光分割手段３により、試料Ｓに照射される測定光Ｌ１と周波数変調手段６に入射される参照光Ｌ２とに分光される。
【００５１】
分光された測定光Ｌ１が集光レンズ４を介して試料Ｓに照射されたとき、測定光Ｌ１が試料において反射したときの反射光Ｌ３と、測定光Ｌ１により試料Ｓの蛍光色素が励起されたことによる蛍光Ｌ４とが試料から射出し、集光レンズ４を介して合波手段５に入射される。一方、参照光Ｌ２は周波数変調手段６において周波数シフトが施された後、合波手段５に入射される。
【００５２】
合波手段５において参照光Ｌ２と反射光Ｌ３とが合波し、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との干渉光Ｌ５がダイクロイックミラー１２ａ、ミラー１２ｂを介して干渉光検出手段７に入射される。一方、蛍光Ｌ４はダイクロイックミラー１２ａにおいて反射し蛍光検出手段８に入射される。そして、画像生成手段９において、干渉光検出手段７により検出された干渉光Ｌ５から光断層画像が生成するとともに、蛍光検出手段８により検出された蛍光から蛍光断層画像が生成される。
【００５３】
ここで、試料Ｓへの測定光Ｌ１の照射は試料Ｓを移動させながら行われるものであり、測定光Ｌ１が照射された試料Ｓの各部位における干渉光Ｌ５および蛍光Ｌ４が、それぞれ干渉光検出手段７および蛍光検出手段８により検出される。そして、試料Ｓの各部位における干渉光Ｌ５および蛍光Ｌ４から光断層画像および蛍光断層画像が生成される。
【００５４】
図９は多細胞系もしくは生体組織系からなる試料Ｓの１細胞のＸＺ断層画像を取得する際に測定光Ｌ１を照射したときの様子を示す模式図、図１０は図９の測定光Ｌ１の走査により検出されるビート信号の一例を示すグラフ図、図１１は図９の測定光Ｌ１の走査により検出される蛍光を示すグラフ図であり、図９から図１１を参照して画像生成手段９について具体的に説明する。なお、図９において試料Ｓの細胞膜Ｓ１が２光子励起蛍光色素により染色されているものとする。
【００５５】
試料Ｓの細胞膜Ｓ１上（Ｘ＝ＸＬ、Ｚ＝Ｚａ）に測定光Ｌ１の集束部分が位置したとき、細胞膜Ｓ１は屈折率の境界部分であるため反射光Ｌ３が発生する。すると、干渉光検出手段７において図１０（ａ）に示すような強度のビート信号が検出される。なお、図１０（ａ）において、核Ｓ２（Ｚ＝Ｚｂ、Ｚｃ）および細胞膜Ｓ１（Ｚ＝Ｚｄ）においても反射光Ｌ３が発生するが、参照ミラー６ａの位置による光路長の違いにより細胞膜Ｓ１（Ｚ＝Ｚａ）からの反射光Ｌ３が一番強いものとなっている。
【００５６】
また、細胞膜Ｓ１は２光子励起蛍光色素により染色されているため、測定光Ｌ１の集束部分が位置したとき蛍光が射出する。そして、図１１に示すように、蛍光検出手段８においてＺ＝Ｚａにおける蛍光の光強度が検出される。
【００５７】
次に、測定光Ｌ１の集束部分が矢印Ｚ１方向に移動していき、試料Ｓの核Ｓ２の部分（Ｚ＝Ｚｂ）に位置したとき、核Ｓ２の外周は屈折率の境界部分であるため反射光Ｌ３が発生し、干渉光検出手段７において図１０（ｂ）に示すような強度のビート信号が取得される。一方、核Ｓ２は２光子励起蛍光色素により染色されていないため、蛍光Ｌ４は検出されない（図１１参照）。
【００５８】
さらに、測定光Ｌ１の集束部分ＢＷが矢印Ｚ１方向に移動していき、試料Ｓの核Ｓ２の外周部分（Ｚ＝Ｚｃ）に位置したとき、干渉光検出手段７において、図１０（ｃ）に示すようなビート信号が検出される。一方、核Ｓ２は２光子励起蛍光色素により染色されていないため、蛍光Ｌ４は検出されない（図１１参照）。
【００５９】
測定光Ｌ１の集束部分ＢＷが矢印Ｚ１方向に移動していき、試料Ｓの細胞膜Ｓ１の部分（Ｚ＝Ｚｄ）に位置したとき、干渉光検出手段７において、図１０（ｄ）に示すようなビート信号が検出される。また、細胞膜Ｓ１は２光子励起蛍光色素により染色されているため蛍光Ｌ４が射出し、蛍光検出手段８において蛍光Ｌ４が検出される（図１１参照）。
【００６０】
そして、画像生成手段９において、図１０（Ｅ）に示すように、干渉光検出手段７において検出されたビート信号強度を加算平均し、Ｘ＝ＸＬ上を矢印Ｚ方向に集束部分ＢＷを走査させたときのビート信号の強度が算出される。
【００６１】
上述のような測定光Ｌ１の集束部分を矢印Ｚ方向に移動させたときの蛍光Ｌ４および干渉光Ｌ５の検出が試料Ｓを矢印Ｘ方向に移動させながら行われる。すると、画像生成手段９において、測定光Ｌ１の集束部分ＢＷのＸ座標およびＺ座標と、干渉光検出手段７において検出された干渉光Ｌ５の光強度とが取得され、図１２（ａ）に示すようなＸＺ平面における光断層画像が生成される。同時に、画像生成手段９において、測定光Ｌ１の集束部分ＢＷのＸ座標およびＺ座標と、蛍光検出手段８において検出された蛍光Ｌ４の光強度とから図１２（ｂ）に示すようなＸＺ平面における蛍光断層画像が生成される。
【００６２】
そして、画像生成手段９により、図１２（ａ）、（ｂ）のように断層光断層画像と断層蛍光断層画像とが並べて表示部５０に表示され、もしくは図１２（ｃ）に示すように、断層光断層画像と断層蛍光断層画像とを重ねて表示される。
【００６３】
このように、試料Ｓの形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料Ｓの効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。また、従来のように光学顕微鏡を用いずに形態観察を行うことができるため、光散乱が大きい多細胞系や組織系の試料であっても、形態観察のための鮮明な光断層画像を取得することができ、試料のｉｎ  ｖｉｖｏ観察を行うことができる。さらに、光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することにより、光断層画像と蛍光断層画像との空間的座標関係は常に一致させることができるため、高精度な生体組織の分析を行うことができる。
【００６４】
図１３は本発明の断層画像化装置の別の実施の形態を示す模式図であり、図１３を参照して断層画像化装置１００について説明する。なお、図１３の断層画像化装置１００において、図１の断層画像化装置１と同一の構成を有する部位には同一の符号を付してその説明を省略する。図１３の断層画像化装置１００が、図１の断層画像化装置１と異なる点は、試料Ｓに測定光Ｌ１を照射する際にいわゆるマルチビーム走査を行う点である。なお、マルチビーム走査方式については「レーザ研究第３１巻６号  ｐ３７１−３７４、リアルタイム非線形光学顕微鏡の開発と生物細胞の動的観察、中村  收  他著、２００３年６月」および特開２０００−１９３８８９号公報に開示されている。
【００６５】
具体的には、試料Ｓ上への測定光Ｌ１の集光がマイクロレンズアレイディスク１４０により行われるものであって、マイクロレンズアレイディスク１４０は、複数の集光レンズ１４０ａ、１４０ｂ、１４０ｃがアレイ状に配列された構造を有している。また、マイクロレンズアレイディスク１４０は、回転制御部１４１により回転可能に設けられており、マイクロレンズアレイディスク１４０が回転することにより、測定光Ｌ１の集束部分が試料Ｓ内を走査するようになっている。なお、複数の集光レンズ１４０ａ〜１４０ｃに対し測定光Ｌ１を入射するため、光分割手段３により分光された測定光Ｌ１は、ミラー１０１により反射され、測定光Ｌ１のビーム径を広げる拡大レンズ群１１０に入射され拡大された後、マイクロレンズアレイディスク１４０に入射されるようになっている。よって、試料Ｓ上には複数の集光レンズ１４０ａ〜１４０ｃにより測定光Ｌ１の複数の集束部分が形成されることになる。
【００６６】
マイクロレンズアレイ１４０を透過した複数の測定光Ｌ１は、リレーレンズ１４４、対物レンズ１４５を介して試料Ｓに照射される。すると、試料Ｓ中の測定光Ｌ１の複数の集束部分からそれぞれ反射光Ｌ３および蛍光Ｌ４が射出され、反射光Ｌ３は対物レンズ１４５、リレーレンズ１４４、ビームスプリッタ１４３およびコリメートレンズ１４６を介して合波手段（ビームスプリッタ）６に入射される。蛍光Ｌ４は、対物レンズ１４５、リレーレンズ１４４、ビームスプリッタ１４２および結像レンズ１４７を介して蛍光検出手段１０８に入射される。なお、蛍光検出手段１０８は、試料Ｓの複数の部位から射出された複数の蛍光Ｌ４を同時に検出する機能を有している。
【００６７】
一方、参照光Ｌ２はミラー１０２を介して周波数変調手段１６０に入射される。この周波数変調手段１６０は、回折格子１６１、フーリエ変換レンズ１６２、参照ミラー１６３等を備えており、参照ミラー１６３はミラー駆動手段１６４により揺動可能に設けられている。そして、参照光Ｌ２は回折格子１６１、フーリエ変換レンズ１６２を介して参照ミラー１６３に入射され、再びフーリエ変換レンズ１６２を介して回折格子１６１に入射された後、ミラー１０３側に射出される。このとき、参照ミラー１６３の角度によって回折格子１６１への参照光Ｌ２の入射位置が変わることにより、参照光Ｌ２の時間的な遅延が生じ、時間的な遅延によるドップラーシフトによる参照光Ｌ２の周波数シフトが行われるようになっている。
【００６８】
周波数変調手段１６０により周波数シフトされた参照光Ｌ２はビーム拡大機能およびダイナミックフォーカス機能を有するレンズ群１２０により拡大された後、合波手段５に入射される。そして、合波手段５において参照光Ｌ２と複数の反射光Ｌ３とがそれぞれ合波される。合波された参照光Ｌ２と複数の反射光Ｌ３との干渉光Ｌ５がビームスプリッタ１５５により光分割されて、レンズ１５０ａ、シャッター１５１ａを介して干渉光検出手段１０７ａに入射されるとともに、レンズ１５０ｂ、シャッター１５１ｂを介して干渉光検出手段１０７ｂに入射される。
【００６９】
そして、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ａがこの干渉光Ｌ５の光強度を検出するようになっている。このとき、シャッター１５１ａ、１５１ｂを交互に開閉を行うことにより、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ｂが交互に干渉光Ｌ５の検出を行うようにすることにより、測定光Ｌ２の走査速度に合わせた干渉光Ｌ５の検出を行うことができる。なお、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ｂは、試料Ｓの複数の部位から射出された複数の蛍光Ｌ４を同時に検出するようになっている。
【００７０】
そして、画像生成手段９は、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ｂおよび蛍光検出手段１０８において検出された干渉光Ｌ５および蛍光Ｌ４からそれぞれ光断層画像および蛍光断層画像を生成するようになっている。なお、上述した回転制御部１４１、ミラー駆動手段１６４は図１３において図示しない駆動制御手段により制御されており、画像取得手段９この駆動制御手段から測定光Ｌ２が照射された試料Ｓの位置情報を取得するようになっている。
【００７１】
このようなマルチビーム走査方式の断層画像化装置１００を用いることにより、試料Ｓに対し測定光Ｌ１を高速に走査することが可能となるため、試料Ｓがたとえば短時間に状態が変化するような生体細胞の観察を精度よく行うことができる。また、上述のような断層画像化装置１００であっても、試料の形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料の効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。
【００７２】
なお、本発明の実施の形態は上記実施の形態に限定されない。たとえば上記各実施の形態において、周波数変調手段は参照光に対し参照ミラーもしくは回折格子等を用いてドップラーシフトによる周波数変調を行うようにしているが、たとえば光学変調器等を用いて周波数シフトを行うようにしてもよい。さらに、周波数変調手段は参照光Ｌ２に対し周波数シフトを行うようにしているが、反射光Ｌ３に対し周波数シフトをするものであってもよい。具体的には、たとえば周波数変調手段が試料Ｓに振動を加えるものであって、試料Ｓの振動によりドップラーシフトによる周波数変調を行うようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の断層画像化装置の好ましい実施の形態を示す模式図
【図２】図１の断層画像化装置における光源ユニットの一例を示す模式図
【図３】図２の光源ユニットにおいて用いられる光ファイバの特性を示すグラフ図
【図４】図２の光源ユニットにおいて用いられる別の光ファイバの特性を示すグラフ図
【図５】図２の光源ユニットにおいて用いられる固体レーザの一例を示す表
【図６】図１の断層画像化装置における試料を載置する走査ステージの一例を示す模式図
【図７】試料の蛍光色素が２光子励起蛍光色素の場合の模式図
【図８】試料の蛍光色素が１光子励起蛍光色素の場合の模式図
【図９】試料に測定光が走査しながら照射される様子を示す模式図
【図１０】図９のように試料に測定光が照射されたときに干渉光検出手段において検出される信号の様子を示すグラフ図
【図１１】図９のように試料に測定光が照射されたときに蛍光検出手段において検出される信号の様子を示すグラフ図
【図１２】図９のように試料に測定光が照射されたときに画像生成手段により生成された光断層画像および蛍光断層画像の一例を示す模式図
【図１３】本発明の断層画像化装置の別の実施の形態を示す模式図
【符号の説明】
【００７４】
１、１００     断層画像化装置
２     光源ユニット
２ａ   レーザ光源
２ｃ   光ファイバ
３     光分割手段
４     集光手段
５     合波手段
６     周波数変調手段
６ａ   参照ミラー
６ｂ   ミラー駆動手段
７     干渉光検出手段
８     蛍光検出手段
９     マイクロレンズアレイディスク
９     画像生成手段
１０   走査ステージ
１１   ステージ駆動手段
１２ａ ダイクロイックミラー
１２ａ ビームスプリッタ
１２ｂ ミラー
ＢＷ   集束部分
Ｌ０   超短パルスレーザ光
Ｌ     レーザ光
Ｌ１   測定光
Ｌ２   参照光
Ｌ３   反射光
Ｌ４   蛍光
Ｌ５   干渉光
Ｓ     試料
【図１】
2006195240.tif 000003
【図２】
2006195240.tif 000004
【図３】
2006195240.tif 000005
【図４】
2006195240.tif 000006
【図５】
2006195240.tif 000007
【図６】
2006195240.tif 000008
【図７】
2006195240.tif 000009
【図８】
2006195240.tif 000010
【図９】
2006195240.tif 000011
【図１０】
2006195240.tif 000012
【図１１】
2006195240.tif 000013
【図１２】
2006195240.tif 000014
【図１３】
2006195240.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月13日(2006.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、
前記蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、
該光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分割する光分割手段と、
該光分割手段により分割された前記参照光と、前記測定光が前記試料に照射されたときの該試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、
該周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた前記反射光と前記参照光とを合波する合波手段と、
該合波手段において前記反射光と前記参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、
前記測定光が前記試料に照射されたときに、該試料の前記蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記干渉光検出手段により検出された前記干渉光から前記試料の光断層画像を生成するとともに、前記蛍光検出手段により検出された蛍光から前記試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段と
を有することを特徴とする断層画像化装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
生体組織の観察においては生体組織の細胞の形態を観察する形態観察と、生体組織の細胞を構成する物質を観察する物質観察とが行われる。生体組織、特に生体細胞の形態観察および物質観察を行う方法として、生体組織の細胞を蛍光色素等により染色してコントラストを確保した後に光学顕微鏡で観察する方法が知られている（たとえば特許文献１参照）。蛍光色素等により染色を行うのは、生物の細胞や生体組織の多くは無色透明であり細胞内外の屈折率差が僅かであるためコントラストがつかず観察が難しいからである。ここで、形態観察を行うための蛍光色素と物質観察を行うための蛍光色素とは異なる種類のものが使用されており、異なる蛍光波長からなる複数の蛍光を検出することにより形態観察と物質観察とが行われる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の断層画像化装置は、蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分割する光分割手段と、光分割手段により分割された参照光と、測定光が試料に照射されたときの試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた反射光と参照光とを合波する合波手段と、合波手段において反射光と参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、測定光が試料に照射されたときに、試料の蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、干渉光検出手段により検出された干渉光から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段により検出された蛍光から試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段とを有することを特徴とするものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
以下、図面を参照して本発明の断層画像化装置の実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の断層画像化装置の第１の実施の形態を示す構成図である。断層画像化装置１は、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）計測による光断層画像と、蛍光検出による蛍光断層画像とを同時に取得する断層画像化装置であって、レーザ光を射出する光源ユニット２と、光源ユニット２から射出されたレーザ光Ｌを試料Ｓに照射する測定光Ｌ１と参照光Ｌ２とに分割する光分割手段３と、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段６と、反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とを合波する合波手段５と、合波手段５において反射光Ｌ３と参照光Ｌ２とが合波されたときの干渉光Ｌ５を検出する干渉光検出手段７と、測定光Ｌ１が試料Ｓに照射されたときに、試料Ｓの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段８と、干渉光検出手段７により検出された干渉光Ｌ５から試料Ｓの光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段８により検出された蛍光Ｌ４から試料Ｓの蛍光断層画像を生成する画像生成手段９とを有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
周波数変調手段６は、参照光Ｌ２に対し周波数シフトを行うことにより参照光Ｌ２と反射光Ｌ３との間に僅かな周波数差を与えるものであって、光分割手段３により分割された参照光Ｌ２を合波手段５に反射する参照ミラー６ａと、参照ミラー６ａを参照光Ｌ２の光軸に直交する方向（矢印Ｙ方向）に移動させるミラー駆動手段６ｂとを備えている。そして、ミラー駆動手段６ｂが参照ミラー６ａの移動させたときに参照光Ｌ２に時間的な遅延が生じ、参照光Ｌ２の周波数がドップラーシフトにより僅かに変動する。よって、この周波数シフトした参照光Ｌ２が合波手段５に入射されるようになっている。なお、このミラー駆動手段６ｂの動作は駆動制御手段２０により制御されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
光分割手段３と試料Ｓの間には集光レンズ４が配置されており、光分割手段３により分割された測定光Ｌ１は、集光レンズ４により集束して試料Ｓに照射されるようになっている。ここで、試料Ｓは、図６に示すように、たとえば走査ステージ１０上に載置されているものであって、ステージ駆動手段１１により矢印Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動可能に保持されている。図１のステージ駆動手段１１は駆動制御手段２０により制御されており、駆動制御手段２０は、光分割手段３から参照ミラー６ａまでの距離と光分割手段３から集光レンズ４の焦点位置までの距離とが等しくなるように、ミラー駆動手段６ｂおよびステージ駆動手段１１を制御するようになっている。これにより、合波手段５において参照光Ｌ２と反射光Ｌ３とが干渉し干渉光検出手段７において、参照光Ｌ２と反射光Ｌ３の差周波数で強弱を繰り返すビート信号が検出されるようになる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ここで、試料Ｓが有する蛍光色素について詳しく説明する。試料Ｓが蛍光色素により染色されたものであってもよいし、自己蛍光特性を有する細胞等を有するものであってもよいが、試料が蛍光色素により染色されている場合、蛍光色素は２光子励起蛍光色素であることが好ましい。２光子励起蛍光色素を用いたときには集光レンズ４により集光された測定光Ｌ１の集束部分のみから蛍光を発光するようになる。なお、２光子励起過程についての詳細な原理については、「レーザ研究第２７巻１１号  ｐ７４４−７４９、多光子顕微鏡による半導体材料内部欠陥の３次元観察、川田  善正著、２００３年６月」に記載されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
なお、２光子励起蛍光色素の種類は、試料Ｓにおける観察したい物質に予め蛍光試薬を結合させ、あるいは環境（たとえばｐＨなどのイオン濃度）変化に対し蛍光特性が変化するように選択される。特に、２光子励起蛍光色素として２光子励起効率の高いものを用いることが好ましい。具体的には、２光子励起蛍光色素の２光子吸収断面積が１０2ＧＭ（１ＧＭ＝１×１０-50ｃｍ4  ｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｈｏｔｏｎ−１）以上であることが好ましく、たとえば文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．１９９５，６７，３７０３、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９５，６７，２４３３、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９６，６８，３５４９、文献Ｈｅ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９７，８１，２５２９等に記載されているスチルバゾリウム誘電体、特開２００３−２０４６９号公報の３−９頁に記載された化合物、特開２００３−１８３２１３号公報の５−１７頁に記載された化合物、特開２００４−１２３６６８号公報の８−１１頁に記載された化合物等が用いられる。特に、特開２００３−２０４６９号公報、特開２００３−１８３２１３号公報、特開２００４−１２３６６８号公報に記載された２光子吸収化合物を用いることが好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
上述した化合物には生体分子と共有結合、イオン結合または配位結合しうる反応性置換基を導入することが望ましい。反応性置換基としては、たとえばサクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジニル基などが挙げられる。またスルホン酸基およびその塩、カルボキシル基およびその塩、水酸基、ポリエーテル基等の水溶性基を導入しておくことが望ましい。このとき、反応性基および水溶性基の導入は公知の方法により行われる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
次に、図１から図８を参照して本発明の断層画像化装置１の動作例ついて説明する。まず、光源ユニット２において、レーザ光源２ａから射出された超短パルスレーザ光Ｌ０が光ファイバ２ｃにおいてパルス圧縮され、このパルス圧縮されたレーザ光Ｌがコリメートレンズ２ｄを介して光分割手段３に射出される（図２参照）。その後、レーザ光Ｌは光分割手段３により、試料Ｓに照射される測定光Ｌ１と周波数変調手段６に入射される参照光Ｌ２とに分割される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
分割された測定光Ｌ１が集光レンズ４を介して試料Ｓに照射されたとき、測定光Ｌ１が試料において反射したときの反射光Ｌ３と、測定光Ｌ１により試料Ｓの蛍光色素が励起されたことによる蛍光Ｌ４とが試料から射出し、集光レンズ４を介して合波手段５に入射される。一方、参照光Ｌ２は周波数変調手段６において周波数シフトが施された後、合波手段５に入射される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
そして、画像生成手段９により、図１２（ａ）、（ｂ）のように光断層画像と蛍光断層画像とが並べて表示部５０に表示され、もしくは図１２（ｃ）に示すように、光断層画像と蛍光断層画像とが重ねて表示される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
具体的には、試料Ｓ上への測定光Ｌ１の集光がマイクロレンズアレイディスク１４０により行われるものであって、マイクロレンズアレイディスク１４０は、複数の集光レンズ１４０ａ、１４０ｂ、１４０ｃがアレイ状に配列された構造を有している。また、マイクロレンズアレイディスク１４０は、回転制御部１４１により回転可能に設けられており、マイクロレンズアレイディスク１４０が回転することにより、測定光Ｌ１の集束部分が試料Ｓ内を走査するようになっている。なお、複数の集光レンズ１４０ａ〜１４０ｃに対し測定光Ｌ１を入射するため、光分割手段３により分割された測定光Ｌ１は、ミラー１０１により反射され、測定光Ｌ１のビーム径を広げる拡大レンズ群１１０に入射され拡大された後、マイクロレンズアレイディスク１４０に入射されるようになっている。よって、試料Ｓ上には複数の集光レンズ１４０ａ〜１４０ｃにより測定光Ｌ１の複数の集束部分が形成されることになる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
マイクロレンズアレイ１４０を透過した複数の測定光Ｌ１は、リレーレンズ１４４、対物レンズ１４５を介して試料Ｓに照射される。すると、試料Ｓ中の測定光Ｌ１の複数の集束部分からそれぞれ反射光Ｌ３および蛍光Ｌ４が射出され、反射光Ｌ３は対物レンズ１４５、リレーレンズ１４４、ビームスプリッタ１４３およびコリメートレンズ１４６を介して合波手段（ビームスプリッタ）５に入射される。蛍光Ｌ４は、対物レンズ１４５、リレーレンズ１４４、ビームスプリッタ１４２および結像レンズ１４７を介して蛍光検出手段１０８に入射される。なお、蛍光検出手段１０８は、試料Ｓの複数の部位から射出された複数の蛍光Ｌ４を同時に検出する機能を有している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
そして、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ａがこの干渉光Ｌ５の光強度を検出するようになっている。このとき、シャッター１５１ａ、１５１ｂを交互に開閉を行うことにより、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ｂが交互に干渉光Ｌ５の検出を行うようにすることにより、測定光Ｌ２の走査速度に合わせた干渉光Ｌ５の検出を行うことができる。なお、蛍光検出手段１０８は、試料Ｓの複数の部位から射出された複数の蛍光Ｌ４を同時に検出するようになっている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
そして、画像生成手段９は、干渉光検出手段１０７ａ、１０７ｂおよび蛍光検出手段１０８において検出された干渉光Ｌ５および蛍光Ｌ４からそれぞれ光断層画像および蛍光断層画像を生成するようになっている。なお、上述した回転制御部１４１、ミラー駆動手段１６４は図１３において図示しない駆動制御手段により制御されており、画像取得手段９はこの駆動制御手段から測定光Ｌ２が照射された試料Ｓの位置情報を取得するようになっている。