(57)【要約】      （修正有）【課題】植物または動物細胞中の逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害する方法の提供。【解決手段】デオキシリボヌクレオシドフォスフェートの菌体内プールを減損させる化合物を、このウイルスの複製を阻害するのに有効な量投与する工程を含んでいる。ヒドロキシウレアが、こうした適当な化合物のうちの一つである。また、デオキシリボヌクレオシドフォスフェートを減損させる薬剤を、こうしたウイルスに感染した細胞へと投与することによって、不完全な逆転写酵素依存ウイルスのＤＮＡを生じさせる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシウレアおよびｄｄｌ、またはヒドロキシウレアおよび２’−フルオロプリンジデオキシヌクレオシドの相乗的な組み合わせからなる組成物。
【請求項２】
逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害するための治療薬の製造に際して使用される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記ｄｄｌまたは２’−フルオロプリンジデオキシヌクレオシドが、ＤＮＡの鎖伸長反応を終結させることによって前記ウイルスの複製を阻害する薬剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ＤＮＡの鎖伸長反応を終結させることによって前記ウイルスの複製を阻害するように働く前記ｄｄｌまたは２’−フルオロプリンジデオキシヌクレオシドが、ウイルスＤＮＡの合成を未熟なうちに終結させることで複製を阻害し、不完全なウイルスＤＮＡを生じさせる、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記の２’−フルオロプリンジデオキシヌクレオシドが、次の化合物：２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ａ、２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｉまたは２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｇのうちの一種である、請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には逆転写酵素依存ウイルスの分野に関するものである。更に詳細には、本発明は、菌体内のデオキシリボヌチレオシドの濃度を減少させる薬剤を、逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害する手段として使用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、その成長および複製を、宿主細胞成分に幾分か依存する微生物である。一般的には、宿主細胞中のウイルスの感染および複製は、その宿主が動物または植物のいずれかであろうと、疾病をもたらす。ウイルス感染によって引き起こされるヒトの疾病には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および肝炎が含まれる。この分野における一般的な議論は、「基礎ウイルス学：Fundamental Virology」第２版（B.N.Fields, D.M.Knipe, R.M. Chanock, M.S. Hirsh, J.L. Melnick, T.P Monath およびB. Roizman編、レイブンプレス  リミテッド、ニューヨーク、1991年） に記載されている。
【０００３】
レトロウイルスの複製
レトロウイルスは、一次的に脊椎動物に感染するウイルスの大きな一族を含んでいる。幾つかの腫瘍の誘起を含む多くの疾病は、レトロウイルスへの感染に関係している( 「基礎ウイルス学：Fundamental Virology」前出、第645 〜708 頁を参照) 。すべてのレトロウイルスは、その臨床的な兆候とは関係なく、関連する構造と複製の態様とを備えている。
【０００４】
レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を通して複製されるＲＮＡゲノムを含んでいる。この細胞中では、このウイルスゲノムは、二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の合成のための鋳型として働き、続いてこの分子が宿主細胞のゲノム中へと組み込まれる。この組み込みによって、時々感染した宿主細胞中への腫瘍の誘起がもたらされる。組み込みに続いて、結果物の複合配列が子孫のヴィリオンの生産をもたらし、ヴィリオンがこの感染した細胞から放出される。
【０００５】
レトロウイルスのライフサイクルの初期には、ＲＮＡゲノムが、ウイルス的に暗号化された逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ：ＲＴ）によって、ＤＮＡ中へと複製される。この酵素は、ＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型の双方を利用することができ、これによってこの感染中のＲＮＡゲノムからＤＮＡの第一の鎖（負の鎖）を生産し、およびこの第一のＤＮＡ鎖を鋳型として使用してＤＮＡの相補的な第二の鎖（正の鎖）を生産する。これらのＤＮＡ鎖を合成するために、このＲＴは、デオキシヌクレオシド  トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）と呼ばれる細胞性基質を使用している。
【０００６】
ヒトレトロウイルスは、白血病ウイルス（ＨＴＬＶ型ウイルス）および免疫不全ウイルス（ＨＩＶ型ウイルス）の中に分類できる。ＨＴＬＶ感染は、一つの型の白血病をもたらしうる。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ある形態のＨＩＶによって引き起こされ、ＨＩＶ−１はＨＩＶ−２よりも一層病原性である。ＨＴＬＶとＨＩＶとの双方が、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）に感染する。
【０００７】
他の動物レトロウイルスには、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）およびレンチウイルスが含まれる。病原性のＦｅＬＶ感染は、一般的にはネコに致死性の再生不良性貧血をもたらす。レンチウイルスは、ヒツジにビスナのような種々の神経性および免疫性の疾病をもたらし、ウマに感染性の貧血をもたらす。
【０００８】
ＨＩＶ感染
ＨＩＶ−１は、１９８３年に、ＡＩＤＳの病原因子として最初に同定された。このＡＩＤＳの流行は、現在、世界的に最も深刻な保健問題の一つである。医学的および社会的に見て破滅的な結果が、来世紀には進行しそうである。世界保健機構（ＷＨＯ）は、８００万人から１０００万人の人々が現在ＨＩＶに感染したものと見積もっており、次世紀にはほぼ十倍もの多くの人々が感染するであろうと見積もった。ＨＩＶ保菌者の大集団のために、有効な抗ウイルス治療の進歩が、医学上の優先事項となっている。
【０００９】
Ｂ型肝炎感染
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、肝細胞に選択的に感染する少なくとも３種類のウイルス（Ａ、ＢおよびＣ）のうちの一つである（ＨＢＶの一般的な議論については、「基礎ウイルス学：Fundamental Virology」前出、第９８９〜１０２１頁を参照）。ＨＢＶへの感染は、最小限の肝臓障害または慢性肝炎に対して感染力を持ち、肝硬変または肝臓癌（肝細胞癌またはＨＣＣ）をもたらしうる傾向がある。世界的には、２００万人以上の人々がＨＢＶに感染した。
【００１０】
他のウイルス
また、ヒト、動物および植物に感染する幾つかの他のウイルスも、複製については、逆転写酵素に依存している。これらには、ヒト中のＨＴＬＶ−１のような、幾つかの種中に存在していることが知られている白血病ウイルスのようなレトロウイルスが含まれるだけでなく、カリフラワーモザイクウイルス（植物ウイルス）のような逆転写酵素依存ウイルスを含む。
【００１１】
抗ウイルス治療
ＨＩＶのようなＲＴ依存ウイルスと戦うのに有効な薬物治療を発展させる強い要望がある。こうした努力が、最近、英国−アイルランド−フランスコンコード決定の結論で主張されており、これが報告するところでは、ヌクレオシド類縁体ジドブジン（zidovudine：ＡＺＴ）は、ＨＩＶ−１に感染した患者の治療の大黒柱であるが、無症候性の患者の生存および疾病の改善を向上させることには失敗した。ジダノシン（didanosine:ddl）のような他のヌクレオシド類縁体が、現在評価されている。疾病の改善および患者の生存の終点に対するddl の作用は、十分には実験されていない。また、非競合性のＨＩＶ−１ＲＴ阻害剤およびＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤も、最近開発された。これらの化合物の高い効力にも係わらず、インビトロおよびインビボにおける初期の試験は、これらの薬剤に対して耐性のあるＨＩＶ−１の変種（免疫回避突然変異体）の急速な発生によって特徴付けられてきた。異なる抗ウイルス活性および薬剤動学的特性を有しているのにも係わらず、ここで記載した薬剤はすべてＨＩＶ−１タンパク質を直接の標的としている。
【００１２】
この後者のアプローチは継続されなければならないけれども、我々は、逆転写酵素依存ウイルスの複製に必要な一種以上の細胞成分を標的とする、異なる抗ウイルス戦略を開発した。
【発明の開示】
【００１３】
発明の要約
本発明は、デオキシヌクレオシド  フォスフェートの菌体内濃度を減少させる薬剤が、逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害するという発見に基づいている。こうした薬剤は、デオキシヌクレオシド  フォスフェートの菌体内合成を阻害すること、またはデオキシヌクレオシド  フォスフェートの菌体内プールを減損させることのいずれかによって、作用する。デオキシヌクレオシド  フォスフェートを制限することによる成長の阻害に対して感受性のウイルスは、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、カリフラワーモザイクウイルスおよび他の逆転写酵素依存ウイルスを含む、レトロウイルスである。一つの例としては、ヒドロキシウレアは、リボヌクレオチド  リダクターゼの酵素活性を阻害することによって、菌体中のデオキシヌクレオシド  フォスフェートの合成を制限する。この機構によって、または菌体内のデオキシヌクレオシド  フォスフェートの生産をもたらす他の生合成ステップに影響することによって、菌体内のデオキシヌクレオシド  フォスフェートの蓄積を同様に阻害する、他の化合物が知られている。菌体内のデオキシヌクレオシド  フォスフェートを制限する化合物は、抗ウイルスヌクレオシド類縁体と関連して使用することができ、これら自体が天然のヌクレオシドと競合する阻害剤として治療能力があり、抗ウイルス治療の有効性を向上させる。菌体内のデオキシヌクレオシド  フォスフェートを減損させる化合物は、特にウイルスがヌクレオシド類縁体治療に対して免疫性となり始めたときには、抗ウイルス性のヌクレオシド  フォスフェート類縁体に対する治療の代替手段として使用できる。
【００１４】
本発明の一つの態様は、動物細胞中の逆転写酵素依存ウイルス複製を阻害するための方法であって、この細胞へと、デオキシヌクレオシド  フォスフェートの菌体内のプールを減損させる化合物を、ウイルスの複製を阻害するために有効な量、投与する工程を含んでいる。例えば、このウイルスは、レトロウイルス、または逆転写酵素に依存するＤＮＡウイルスであって良い。一つの態様におけるデオキシヌクレオシド  フォスフェートを減損させる化合物は、デオキシヌクレオチド合成阻害剤である。他の態様においては、このデオキシヌクレオシド  フォスフェートを減損させる化合物は、リボヌクレオチド  リダクターゼの阻害剤である。好適な化合物の一つはヒドロキシウレアである。
【００１５】
本発明は、インビトロまたはインビボで細胞上に使用することができる。種々の好適な態様において、前記動物は、哺乳類または鳥類である。好ましくは、この動物はヒトである。
【００１６】
一つの特定の態様においては、このウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、この細胞はヒト細胞である。他の特定の態様においては、このウイルスはＢ型肝炎であり、この細胞はヒト細胞である。
【００１７】
本発明の方法は、デオキシヌクレオシド  フォスフェートの菌体内プールを減損させてＤＮＡ鎖の伸長速度を制限してウイルスの複製を制限することによって、実施できる。例えば、ＡＺＴおよびｄｄｌ、ｄｄＣおよび２’−フルオロジデオキシヌクレオシドのようなジデオキシヌクレオシドは、このようにしてウイルスの複製を制限する。有効な２’−フルオロジデオキシヌクレオシドには、２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ａ、２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｉおよび２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｇのような、２’−フルオロ  プリン  ジデオキシヌクレオシドが含まれる。これらの化合物を使用すると、ウイルスＤＮＡ合成の未熟な終結がもたらされ、不完全なウイルスＤＮＡが生産される。
【００１８】
本発明の他の態様は、動物細胞中の逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害する方法であって、この細胞へと、デオキシリボヌクレオシド  フォスフェートの菌体内プールを減損させる化合物を投与し、およびこの細胞へと、デオキシリボヌクレオシド  フォスフェートのプールと競合する抗ウイルスヌクレオシド  フォスフェート類縁体をも投与する工程を含んでいる。好適な抗ウイルスヌクレオシドフォスフェート類縁体には、ＡＺＴ、ｄｄｌおよびｄｄＣが含まれる。
【００１９】
本発明の異なる態様は、動物細胞中の逆転写酵素依存ウイルスから、不完全なウイルスＤＮＡを生じさせる方法に関するものであり、この細胞へと、デオキシリボヌクレオシド  フォスフェートの菌体内プールを減損させる化合物を、このウイルスの複製を阻害するのに有効な量、投与する工程を含んでいる。
最後に、本発明は、植物細胞中の逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害する方法に関するものであり、この細胞へと、デオキシリボヌクレオシド  フォスフェートの菌体内プールを減損させる化合物を、このウイルスの複製を阻害するのに有効な量、投与する工程を含んでいる。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、デオキシヌクレオシド  トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）の菌体内の濃度の減少が、逆転写酵素依存ウイルスの複製を選択的に阻害するという発見に基づいている。この戦略に基づくウイルスの阻害へのアプローチは、ウイルスの免疫回避突然変異体の発生の引き金を引くことを回避できるので、有利である。反対に、ウイルスタンパク質を直接的に選択的に圧迫することは、こうした突然変異体の生成を促進するものと予想されうる。
【００２１】
本発明の実施に際しては、ヒドロキシウレアが、菌体中のｄＮＴＰレベルを減損させる好適な化合物の一つである。この化合物は、リボヌクレオチド  リダクターゼの多くの阻害剤のうちの一つであり、ＤＮＡ合成のための、リボヌクレオシド  ジフォスフェートのそのデオキシリボヌクレオシド対応物への還元を触媒する酵素である。他のリボヌクレオチド  リダクターゼ阻害剤には、グアナゾール、３，４─ジヒドロキシベンゾ─ヒドロキサミック酸、Ｎ─３，４，５─テトラヒドロキシベンズイミドアミドＨＣｌ、３，４─ジヒドロキシベンズアミドオキシムＨＣｌ、５−ヒドロキシ─２─ホルミルピリジン  チオセミカルバゾンおよびα−（Ｎ）−ヘテロサイクリック  カルボキシアルデヒド  チオセミカルバゾン、４─メチル─５─アミノ─１─ホルミルイソキノリン  チオセミカルバゾン、Ｎ─ヒドロキシ─Ｎ’─アミノ─グアニジン（ＨＡＧ）誘導体、５─メチル─４─アミノイソキノリン  チオセミカルバゾン、ジアジクオン（diaziquone），ドクソルビシン(doxorubicin) 、２，３−ジヒドロキシベンゾイル─ジペプチドおよび3,4-ジヒドロキシルベンゾイル─ジペプチド、鉄錯化2-アセチルピリジン５−〔（２─クロロアニリノ）─チオカルボニル〕−チオカルボノヒドラゾン（３４８Ｕ８７）、鉄錯化２−アセチルピリジン─５─〔（ジメチルアミノ）チオカルボニル〕─チオカルボノヒドラゾン（Ａ１１１０Ｕ）、２’─デオキシ─２’─メチレンシチジン  ５’─ジフォスフェート（ＭｄＣＤＰ）および２’─デオキシ─２’，２’─ジフルオロシチジン５’─ジフォスフェート（ＤＦｄＣＤＰ）、２─クロロ─９─（２─デオキシ─２─フルオロ─β─Ｄ─アラビノフラノシル）─アデノシン（Ｃｌ─ａｒａ−Ａ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）、２─２’─ジピリジル─６─カルボチオアミド、アクリルヌクレオシド類縁体のフォスフォニルメチルエーテル〔例えば、プリンおよびピリミジン塩基のＮ−（Ｓ）−（３─ヒドロキシ─２─フォスフォニルメトキシプロピルおよびＮ−２−フォスフォニルメトキシエチル）誘導体のジフォスフェート〕、ニトロソウレア化合物、アシルクロヌクレオシド  ヒドロクサミック酸〔例えば、Ｎ−ヒドロキシ─α─（２─ヒドロキシエトキシ）─１（２Ｈ）─ピリミジンアセトアミド１─３、および２─アセチルピリジン  ４─（２─モルホリノエチル）チオセミカルバゾン（Ａ７２３Ｕ）〕。
【００２２】
ｄＮＴＰの合成を阻害し、さもなくば少なくとも一種のｄＮＴＰの菌体内プールを減損させる化合物を、あらゆる通常の経路で投与することができる。処理した細胞がインビトロの場合には、単にこの化合物を、菌体が成長している培地中へと導入することができる。他方、処理すべき菌体が、より大きな微生物の一部分である場合、即ち、処理がインビボである場合には、動物への投与は、経口的な経路であってよく、または静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下内、経皮内、粘膜内（例えば、吸入によって、または座剤によって）、またはあらゆる他の適当な経路によることができる。植物体への投与は、噴霧、散布、灌水への適用、または他のあらゆる手段によって達成できる。
【００２３】
４種類のデオキシヌクレオシド  フォスフェートのうちいずれの一種の菌体プールを減損させることも、本発明の範囲内にあるものと考えられることを、銘記するべきである。更には、ヌクレオシドのモノ─、ジ─およびトリフォスフェートの減損も本発明の範囲内にある。
【００２４】
本発明のｄＮＴＰを減損させる薬剤の特定の用量、毒性およびデリバリーの機構は、いずれも既に知られているか、または通常の経験的技術によって容易に決定できる。ｄＮＴＰを減損させる化合物の幾つかは、菌体内のデリバリーに毒性または困難性を示しうるけれども、他の化合物は（ヒドロキシウレアのような）、集中的に研究されてきており、好適な薬理学的特性を有していることが見いだされている。
【００２５】
これらの化合物についての好適なヒト用の用量は、広く変動しうる。しかし、こうした用量は、本分野に習熟した者は容易に決定することができる。例えば、成人のヒトに対する用量は、約０．１ｍｇから約１ｇか、または１０ｇさえも予期できる。
【００２６】
一つの好適な態様においては、この用量は、菌体内のｄＮＴＰのプールが、逆転写酵素依存ウイルスのＫｍよりも低い濃度にまで減損するが、しかしＤＮＡポリメラーゼα、βおよびγのような内因性の細胞性ポリメラーゼのＫｍを越えるようにする。これによって、ウイルスの複製の選択的な阻害が、著しい細胞毒性なしに可能になる。
【００２７】
ヒドロキシウレアは、広範な抗腫瘍性の薬剤として、癌の治療に広く使用されてきている（Ｒ．Ｃ．Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ「腫瘍学講義：Seminers in Oncology」１９、（Ｓｕｐｐｌ．９）、１１（１９９２年））。ヒドロキシウレアは、経口的な摂取の後に容易に吸収され、脳脊髄液を含む体液中へと急速に拡散し、受動的拡散によって細胞内へと効率的に入る（前出）。その毒性は顕著ではなく、他の化学療法剤と比較して容易に制御できる。
【００２８】
ヒトの化学療法においては、ヒドロキシウレアは、２種類の基本的なスケジュールを使用して投与されている。（ａ）１日当たり、１ｋｇ当たり、２０〜４０ｍｇの連続的な毎日の経口的な用法、または（ｂ）毎３日ごとに、１ｋｇ当たり８０ｍｇの間欠的な用法。いずれのスケジュールも、ウイルス感染の治療に採用しうる。しかし、治療への反応が変化しうるので、末梢白血球のカウント数を監視することによって、白血病が生じたときには治療を中止することができる。同様の用量の範囲を、本発明の実施に際して適用することができる。
ウイルスの逆転写酵素が一般的にはｄＮＴＰの水準の減少に対して非常に敏感であるものとすると、ヒドロキシウレアの用量が少ないことも、ウイルスの感染を治療するのに有効でありうる。このようにヒドロキシウレアの用量が少ないことによって、白血球に対する毒性が減少しうる。慢性的な治療中のＡＩＤＳ患者においては、ＲＴ−依存ウイルスの複製を有効に減少させるあらゆる用量が、有用でありうる。
【００２９】
本発明の実施に際しては、逆転写酵素の活性の阻害と、ＨＩＶ−１合成の損傷とを、ヒドロキシウレアで細胞を処理することによって達成する。特定の条件下においては、不完全なＨＩＶ−１ＤＮＡが、この細胞に対する明確な毒性作用なしに、生成する。不完全なウイルスＤＮＡは、ＰＢＬ中では急速に劣化することが示されている（Ｚａｃｋ等、前出、１９９０年および１９９２年）。従って、本発明は、菌体内のｄＮＴＰのプールを変性させることによってＨＩＶの複製を阻害する新規な方法を提供している。これを達成するためには、ヒドロキシウレアのような薬剤を薬剤学的な範囲で使用する。
【００３０】
また、本発明が包含している抗ウイルス治療は、ｄＮＴＰを減損させる薬剤を、通常のまたは新規なヌクレオシド  フォスフェート類縁体と関連して使用することに基づいている。菌体内のｄＮＴＰのプールを減損させることによって、ヒドロキシウレアのような薬剤は、ＡＺＴ、ｄｄｌ、ｄｄＣ、２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ａ、２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｉおよび２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ｇのようなヌクレオシド  フォスフェート類縁体によるＨＩＶ感染の治療効果を向上させるものと予期される。これらの類縁体は、ヒドロキシウレアの抗ウイルス機構とは異なる抗ウイルス機構にもとづいて、菌体のｄＮＴＰの競合体として作用する。２’−フルオロ  ヌクレオシドの記述は、マルケスによって、〔「Ｊ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」３３、９７８〜９８５頁、１９９０年〕に記載されている。現在、抗ウイルス治療には、成人のヒトに対しては、１日当たり５００ｍｇのＡＺＴまたはｄｄｌや、１日当たり２ｍｇのｄｄＣの用量を必要とする。これと同様の用量を、本発明において採用することができる。しかし、ｄＮＴＰを減損させる薬剤を使用することによって、これらのヌクレオシド  フォスフェート類縁体の有効性が向上しうるので、これらは低い用量で、または低い頻度で使用しうる。
【００３１】
抗ウイルスヌクレオシド  フォスフェート類縁体を使用するのに際しての問題の一つは、免疫回避突然変異体の発現である。こうした変種は、通常は、ＲＴを暗号化する遺伝子中の突然変異に由来している。我々が考えるところでは、低レベルのヌクレオチドを使用して作用しうるＲＴ突然変異体の発現は、ありそうもない出来事であろう。従って、我々が考えるところでは、菌体内のｄＮＴＰプールを減損させるヒドロキシウレアのような抗ウイルス薬剤は、ＲＴ免疫回避突然変異体の進化を選好しないであろう。更には、菌体内のｄＮＴＰプールを減損させる薬剤は、ＲＴ免疫回避突然変異体が発現したような場合に、ウイルス疾病の治療に価値を有しうる。
【００３２】
ｄＮＴＰを減損させる薬剤およびヌクレオシド  フォスフェート類縁体は、異なる阻害機構を有しているので、これらの薬剤の組み合わせが、相乗的な阻害作用をもたらすであろうことを予測する。ヒドロキシウレアによって、または同様に作用する薬剤によって、菌体内のヌクレオチドプールを減損させることで、ｄＮＴＰの競合体として作用するヌクレオシド  フォスフェート類縁体の治療効果は、向上するものと期待される。こうした薬剤を組み合わせた治療は、ヌクレオシド  フォスフェート類縁体の用量が低くとも一層有効にしうるので、毒性の減少をも、もたらしうる。
【００３３】
ＨＩＶ−１ＲＴは分散性の酵素なので、ヒドロキシウレアのような薬剤によって誘起される低レベルのｄＮＴＰは、前進型酵素として知られている（Huber 等、前出: Kati等、前出:U. Hubscher、前出）菌体内ＤＮＡポリメラーゼα、βまたはγよりも、ＲＴに影響しうることを期待する。ＲＴに対するこの選択的な効果は、他の抗ウイルス薬剤に対して生ずるよりも低い細胞毒性効果をもたらしうる。
【００３４】
レトロウイルスとは異なり、ＨＢＶは、部分的に二本鎖ゲノムを有し、部分的に一本鎖ゲノムを有するＤＮＡウイルスである。しかし、レトロウイルスと同じように、ＨＢＶゲノムの複製のプロセスにおける初期に、逆転写酵素が必要である。このＲＴは、ＨＢＶゲノムによって特定され、ウイルスの複製が生ずるところで、感染した宿主の肝細胞中で合成される。
【００３５】
このＨＢＶウイルスゲノムの複製がＲＴに依存しているために、ｄＮＴＰの合成を阻害する治療薬で人々を治療することによって、ｄＮＴＰのプールを制限する方法が、ＨＢＶウイルスの複製を制限するのに際しても有効であると予期される。ほとんどすべての細胞型内へと拡散するヒドロキシウレアのような薬剤は、ＨＢＶの肝臓内の複製を制限するのに特に有効であろう。
【００３６】
ＨＢＶの複製を制限することは、２つの重要な効果を有する。最初に、これは感染者から感染していない人々への感染性のヴィリオンの拡散を制限する。第二に、これは感染者において、慢性肝炎のような症状を軽減させる。一般的には、ＨＢＶの複製が消滅した後に、肝機能が向上する。また、ＨＣＣの発生は、ＨＢＶに感染したヒトにおけるよりもはるかに高いので、集団における感染が減少すると、おそらく肝臓癌の発生率の減少をもたらしうる。
【００３７】
上記したように、ヒドロキシウレア（または類似のｄＮＴＰ制限薬剤）を、他の機構を通して作用するアデニン  アラビノシド、アラ−モノフォスフェート、アシクログアノジン(acyclovir) 、６−デオキシアシクログアノジン(6-deoxyacyclovir)、およびα、β、γインターフェロンのような抗ウイルス性薬剤と関連して使用することは、これらの抗ＨＢＶ薬剤の有効性も向上させうる。これは、ＨＩＶ感染を治療するのに使用される抗ウイルスヌクレオシド  フォスフェート類縁体の機構と類似した機構によって、競合的な阻害剤として作用するアデニン  アラビノシドについて、特に期待される。更には、ヒドロキシウレア（または同様のｄＮＴＰを制限する薬剤）によって治療すると、抗ウイルス薬剤を単独で使用して治療するのに必要な用量よりも低い用量で、抗ウイルス性薬剤を一層有効にすることができた。
【００３８】
上記したように、抗ウイルス薬剤に対して耐性となり始めたＨＢＶへの感染を有している人々に、ヒドロキシウレア（または類似のｄＮＴＰを制限する薬剤）を使用する方法も、本発明に包含される。
【００３９】
動物または植物に感染する他のウイルスもまた、それらの複製に際してＲＴ活性に依存している。カリフラワーモザイクウイルスは、そのＤＮＡゲノムの複製に際してＲＴを使用するウイルスの一例である。
【００４０】
他の逆転写酵素依存ウイルスのウイルス複製を阻害するために菌体内のｄＮＴＰプールを制限する化合物を植物に適用することは、こうした化合物を、広範なＲＴ依存ウイルスに感染した、ヒトを含む動物に使用することと同様に、本発明の範囲内である。
【００４１】
本発明の原理および本発明の実施形態は、次の非制限的な実施例を参照することによって、より良く理解できるであろう。
【００４２】
ＰＢＬのＨＩＶ−１への感染の鍵となるステップは、ＨＩＶ−１ＲＴの作用によってウイルスＲＮＡゲノムを二本鎖ｄＮＴＰ中へと変換させることである。ウイルスＤＮＡの合成は、感染したＰＢＬの種々の状態と異なっている。無刺激のＰＢＬにおいては、ウイルスＤＮＡの合成は、マイトジェンによって刺激されたＰＢＬにおけると同様に有効に開始しうる。しかし、こうして刺激された細胞とは対照的に、無刺激のＰＢＬにおけるＤＮＡの合成は、未成熟のうちに終結し（J. A. Zack等、「細胞:Cell 」61:213頁、1990年） 、（J. A. Zack等、「ウイルス学:Virology 」66:1717 頁、1992年） 、ＨＩＶ−１の子孫を生産しない（Zack等、前出:M. Stevenson 等「EMBO J. 」9:1551頁、1990年:M. I. Bukrinsky等、「Science 」254:423 頁、1991年） 。このプロセスは、組み込まれていないウイルスＤＮＡのプールをもたらし(Stevenson等、前出:  Bukrinsky等、前出) 、これはインビトロに感染した無刺激のＰＢＬおよびインビボに感染した休止中のＰＢＬの双方において、無活動を保持しうる（ Zack 等、前出、1990年および1991年: Stevenson 等、前出: Bukrinsky 等、前出） 。これらの細胞の刺激は、ＨＩＶ−１のＤＮＡのレスキューをもたらし、ウイルスの子孫の生産および組み込みをもたらす( 前出) 。不完全なウイルスＤＮＡも、ＨＩＶ−１の成熟した感染性の粒子と共に見いだされるが、しかしこのＤＮＡの生物学的役割は不明瞭である(F. Lori  等「J. Virol. 」66、5067頁、1992年: D. Trono  前出、66:4893 頁、1992年) 。
【００４３】
感染した細胞中でＨＩＶ−１ゲノムの複製を定量するのに使用できる方法を実施例１に例示する。この実施例において、感染した無刺激ＰＢＬ及び刺激したＰＢＬ中でのＨＩＶ−１ＤＮＡ合成率を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いることによって定量的に分析した。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ＨＩＶ複製
以前に成熟ＨＩＶ−１ヴィリオン中でＨＩＶ−１ＤＮＡを定量するために適用したＰＣＲアッセイ（F.Lorl等，前出;D,Trono, 前出）を、ＨＩＶ−１ゲノムの数個の領域を増殖させるために用いた。ウイルス性ＤＮＡを増殖させるために用いたプライマー対は、Ｍ６６７／ＡＡ５５、Ｍ６６７／ＢＢ３０１及びＭ６６７／Ｍ６６１であった（M.Stevenson 等，前出;M.I.Bukrinsky等，前出pra ）。Ｍ６６７は、長い末端反復（ＬＴＲ）のＲ領域中のセンスプライマーである。ＡＡ５５は、ＰＢ（ｔＲＮＡプライマー結合）領域にＳ′に接しているアンチセンスプライマーである。Ｍ６６７／ＡＡ５５プライマー対は、ＲＴによって初期に合成される負の鎖領域を増殖させてＲ−Ｕ５と呼ばれる生成物を生ずる。ＢＢ３０１は、ＰＢ領域に対して相補的である。Ｍ６６７／ＢＢ３０１による増殖は、正の鎖ＤＮＡの存在下に達成することができ、そのＤＮＡは右ＬＴＲから上側のポリプリン系（tract）で開始するように合成され、そして鋳型の一方の末端に進行した後、ＰＢ領域まで伸長させてＲ−ＰＢと呼ばれる生成物を生ずる（H.E.Varmus and R.Swanstrom,in 「Repllcation of Retroviruses.」 RNA Tumor Viruses.R.Weiss,N.Teich,H.Varmus,J.Coffin,Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,1984),pp.369-521） 。負の鎖は、十分には完成されないが、ＰＢ領域に対して相補的であるＲＮＡ配列がこれらの実験において消化されているので、増殖することは期待することができない。Ｍ６６１は、ｇａｇ領域中のアンチセンスプライマーである。Ｍ６６７／Ｍ６６１による増殖は、完成した負の鎖ＤＮＡの存在を反映して、Ｒ−ｇａｇと呼ばれる生成物を生ずる。これらのプライマーは、３個の異なる複製工程で逆転写の範囲を決定するように設計されていた。３個の異なる複製工程としては、Ｒ−Ｕ５、初期の正の鎖合成；Ｒ−ＰＢ、ｔＲＮＡプライマー結合領域までの初期の正の鎖合成；及びＲ−ｇａｇ、完成した正の鎖合成である。これらの工程は、逆転写の間に連続的な順序で生ずる（Varmus and Swanstrom, 前出） 。ウイルスによって運搬されたＤＮＡが完全な長さの負の鎖ＤＮＡである場合には、ＰＣＲ定量法によって分析された３個の領域は、等価の水準に増殖されるべきである。J.A.Zact等、前出(1990);and J.A.Zact 等、前出(1992)に報告されているように、βグロビン配列をこれと同じＤＮＡ抽出液から増殖させて使用されたＤＮＡの総量を標準化した。
【００４５】
ウイルスＤＮＡは、無刺激ＰＢＬが感染した後に直ちに検出し、この時に観察されたＤＮＡの総量はＨＩＶ−１IIIＢ種の感染の初期複合性（ＭＯＩ）に比例していた（M.Popovic 等、Sciens224:497(1984)）。１及び１０のＭＯＩを使用して、ウイルスＤＮＡがＲ−Ｕ５，Ｒ−ＰＢ及びＲ−ｇａｇ領域について、ＨＸＢ２（ＲＩＰ７）プラスミドＤＮＡ（J.M.McCune,et al.,Cell53:55(1988)）のそれぞれ約１００及び１０００のコピーに相当するＨＩＶ−１ＤＮＡ標準と同等に検出された。
【００４６】
このＤＮＡは不完全に複製されて、成熟したＨＩＶ−１粒子（F.Lori等、前出；D.Trono 前出）を伴う典型的な形態となる。これらの結果が示唆するところでは、感染の初期段階でＰＢＬ中に観察される不完全なＤＮＡの部分が、感染したウイルスによって運搬されたＤＮＡに起因していた。次に、感染後７２時間経過した後のウイルスＤＮＡ合成を分析した。無刺激ＰＢＬ中のＨＩＶ−１ＤＮＡ合成は、刺激したＰＢＬ中のＨＩＶ−１ＤＮＡ合成よりも著しく遅く、しかも効果的ではなかった。特に、無刺激ＰＢＬにおいては、レトロウイルスＤＮＡ複製の開始点でのウイルスＤＮＡの初期合成（略ｔＲＮＡプライマー結合領域の直接の上流側で、ＰＣＲ反応のＲ−Ｕ５生成物と示す）は、感染後比較的速く（１０時間後）行われ、その間完全な長さの負の鎖ＤＮＡ合成の完了は、著しく遅れる（感染後４８から７２時間で、ＰＣＲアッセイのＲ−ｇａｇ生成物と示す）。これに対し、完全な長さの負の鎖ＤＮＡの合成が刺激したＰＢＬ中で感染後１０時間以内に完了した。更に、刺激したＰＢＬにおいては、ＤＮＡ合成は、無刺激ＰＢＬ中のＤＮＡ合成よりも著しく高い水準でその時間中に次第に増加した。
【００４７】
要約すると、我々の発見によれば、無刺激ＰＢＬ中で生産されるウイルスＤＮＡの総量は、刺激したＰＢＬ中で生産されるウイルスＤＮＡの総量よりも著しく低い。７２時間後でさえ、無刺激ＰＬＢ中のウイルスＤＮＡの総量は、成長の１０時間後の刺激したＰＢＬ中で生産されたウイルスＤＮＡの総量よりも、約１０倍少なかった。成長の７２時間後には、刺激したＰＢＬ中で生産されるウイルスＤＮＡの総量は、無刺激ＰＢＬ中に生産される総量よりも、少なくとも１００倍大きかった。
【００４８】
相対立する結果が、感染した無刺激リンパ球中のＨＩＶ−１ＤＮＡの形態に関して以前に報告されている。感染した無刺激細胞中の不完全なＤＮＡは、Zackらによって報告されている（前出,1990 及び1992）。一方、Stevenson ら（前出）が示したように、潜伏期の完全なＤＮＡは無刺激ＰＢＬ中に存在するが、このＤＮＡは組込まれていない。これらの矛盾は、ＤＮＡ合成が無刺激ＰＢＬ中でゆっくり、しかも非能率的な挙動で進行しているという我々の発見によって説明することができる。
【００４９】
従来の研究で示された所では、チミジンキナーゼやデオキシサイチジンキナーゼなどのｄＮＴＰ合成のための反応性のある細胞性酵素が、無刺激ＰＢＬ中で極めて低い活性を有し、活性化されたＰＢＬ中で劇的に増加した（L.Pegoraro及び M.G.Bernengo,「Exp.Cell Res, 」68:283(1971)） 。ｄＮＴＰ合成の低い水準及びＤＮＡ複製中のｄＮＴＰの高い回転率（J.Jl及びC.K.Mathews,「Mol.Gen.Genet.」226:257(1991)）によって、菌体内ｄＮＴＰプールが消耗するであろう。安定した状態の動学においては、ｄＮＴＰプールがミカエリス定数Ｋｍより著しく低い場合には、ＨＩＶ−１ＲＴの触媒作用能力の大部分が消費され、かつウイルスＤＮＡ合成の割合が、ｄＮＴＰ濃度の変化に対して非常に敏感になることが期待されるであろう（I.H.Segel,「 Biochemical Calculations 」(John Wiley & Sons,New York,1975)）。
【００５０】
実施例２に、上記した低水準の無刺激ＰＢＬ中のｄＮＴＰと低い割合でのウイルスＤＮＡ合成との相関関係を示す。
【００５１】
実施例２
ｄＮＴＰプールとＨＩＶ複製との相関関係
ＰＢＬを、１０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンＡ（ＰＨＡ）の存在下又は不存在下で４８時間培養した。菌体内ｄＮＴＰを、６０％メタノールを用いて抽出し、次いで合成したオリゴヌクレオチドを用いてエンザイムアッセイによって検査した（P.A.Sherman 及びA.J.Fyfe, 「Anal.Biochem. 」180:222(1989)）。データ３回の実験の中間値を示す。鋳型として６００塩基グロビンｍＲＮＡを用いてＫｍ値を決定し、その値はｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰに対してそれぞれ３．８、４．０、３．９及び２．６μＭであった。ＰＢＬの細胞量をクールターカウンターチャナライザーを用いて測定し、その細胞量は、それぞれ、無刺激ＰＢＬに対しては約０．２５μｌ／１０6 個の細胞であり、刺激したＰＢＬに対しては約０．３８μｌ／１０6 個の細胞であった。
【００５２】
表１に示すように、無刺激ＰＢＬ中のｄＮＴＰの水準は、刺激したＰＢＬにおける水準よりも著しく低い。後者は、ＨＩＶ−１ＲＴのＫｍより著しく高かった。同様な結果が、ＨＩＶ−１に感染した後に得られた。
【００５３】
【表１】
2006143743.tif 000002
【００５４】
我々はまた、無刺激ＰＢＬ及び刺激したＰＢＬ中で見出されたものと等価のｄＮＴＰ濃度で組み換え体ＨＩＶ−１ＲＴのインビトロ活性を評価した。ＤＮＡをグロビンｍＲＮＡ鋳型及びオリゴｄＴ18プライマーを用いて合成した（プライマー伸長アッセイ）。このＨＩＶ−１ＲＴ反応混合物は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭのＭｇＣｌ2 、７６ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、１：５比におけるオリゴｄＴ18でプライマー化された８０ｎＭのグロビンｍＲＮＡ、および表１に示すように、（ａ）無刺激細胞に対し等価な濃度のｄＮＴＰおよび（ｂ）刺激した細胞に対し等価な濃度のｄＮＴＰを含んでいた。組み換え体ＨＩＶ−１ＲＴ（アメリカバイオテクノロジ社から得た）を５Ｕ／ｍｌ使用した。
【００５５】
無刺激状態を特徴づけるヌクレオチド濃度下において、総ＤＮＡ合成の割合および収率は刺激した状態に対応する速度及び収率より著しく低い。無刺激状態および刺激した状態に対するＨＩＶ−１ＲＴによるｄＴＭＰの組み込みの割合を、表２に示す。この表から、ＤＮＡ合成が、刺激したＰＢＬにおけるよりも無刺激ＰＢＬにおけるほうが遅く、しかも効率的でない理由を説明することができる。
【００５６】
【表２】
2006143743.tif 000003
【００５７】
鋳型プライマーが、５’末端に32［Ｐ］で標識されたオリゴ（ｄＴ）16を用いてプライマー化された６００塩基グロビンｍＲＮＡである他は、上述したプライマー伸長アッセイを用いて、ＨＩＶ−１ＲＴの作用方法およびＤＮＡ生成物の大きさを更に調べた。等分試料を、０、１５、３０、６０及び１２０分で採取した。反応生成物を（ａ）１５％および（ｂ）６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。
【００５８】
２つのタイプのＨＩＶＲＴ活性、即ち最初に分散する活性ともっと遅く進行する活性とが明らかとなった。最初に分散する形態においては、ＲＴは、発生鎖中にｄＮＴＰを組み込んだ後にしばしば分離され始め不連続な分子量のＤＮＡ生成物をもたらす。このことは特に、無刺激ＰＢＬのｄＮＴＰ濃度特性について明らかであった。ゲルレーンにおいて、これは１６−メル（mer）プライマー（０分）から約７０−メルプライマー（無刺激状態下で６０分後）までの大きさが変化する生成物のはしご状出現を生じた。無刺激ＰＢＬ状態で１２０分培養した後、最も長いＤＮＡ生成物を測定すると、約７０〜１００ｎｔであった。約７０の新規なヌクレオシド（ｎｔ）を加えた後、ＨＩＶ−１ＲＴの進行が増大し、しかもより高い分子量のＤＮＡが合成された。進行は、刺激したＰＢＬにおけるｄＮＴＰ濃度と同様のｄＮＴＰ濃度で、主として観察された。進行は、７０〜１００ｎｔを超えるＤＮＡ生成物をもたらす刺激したＰＢＬ状態下で、１５分間培養した後に見られた。そして進行はこの実験の間中継続し、１２０分間培養をした後、完全な長さの転写をもたらした。これに対し、無刺激状態下では１２０分間培養を行った後でさえ、殆どあるいは全く進行が見られなかった。これらの結果は、生体内ｄＮＴＰのみを低濃度にした場合には、刺激したＰＢＬ中で損傷したＤＮＡの伸長が観察されることを、十分に説明できることを示唆している。
【００５９】
ＨＩＶ−１ＲＴ活性のこの二相性のパターンは、他人の酵素作用研究（H.E.Huber 等, 「J.Bio.Chem. 」264:4669(1989)；W.M.Kati,K.A.Johnson,L.F.Jirva,K．S.Anderson, 同上 267:25988(1992)） に一致し、そしてE.ｃoli pol IおよびIII、ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼ、および哺乳類ＤＮＡポリメラーゼσおよびγの様な、進行ポリメラーゼである複製ＤＮＡポリメラーゼの大部分の作用と異なる（Huber,等、前出Kati等、前出:U.Hubscher,「Experientia 」39:1(1983)） 。
【００６０】
実施例３は、オキシ尿素を用いて、菌体内ｄＮＴＰ濃度を低下させることができ、かつこのような次善のｄＮＴＰ濃度では、ＰＢＬ内でのＨＩＶ−１  ＤＮＡ合成が不完全となることを例示する。これらの方法において用いられる１ｍＭのオキシ尿素の濃度は、ヒトにおける標準的な臨床的プロトコルの間の血液濃度に近似する(R. C. Donehower, Seminars in Oncology 19(Suppl. 9), 11(1992))。特に、オキシ尿素は、２００倍高い濃度（２００ｍＭ）においても、ＲＴ酵素活性を直接阻害しなかった。
【００６１】
実施例３
オキシ尿素を用いることによる、ＨＩＶ複製の阻害
マイトジェン（ＰＨＡ）により刺激されたＰＢＬに感染させた後に、オキシ尿素の存在下および不存在下で、ＨＩＶ−１  ＤＮＡ合成を測定した。ＰＨＡによる刺激の４８時間後、および１ｍＭのオキシ尿素での前処理の２４時間後に、菌体を、オキシ尿素の存在下で、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ(Popovic等、前記)に感染させた。オキシ尿素処理を省略した以外は、同様にして、対照菌体を処理した。菌体アリコートを、感染から２４、４８および７２時間後に採取し、対照菌体と比較した、ｄＮＴＰレベルの割合として、ｄＮＴＰ合成阻害の測定に関して分析した(ShermanおよびFyfe、前記)。
【００６２】
表３に例示した、本実験の結果は、ｄＮＴＰプールから、１ｍＭのオキシ尿素の存在下で温置した、刺激したＰＢＬが、顕著に減少したことを示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
さらに、ＰＨＡで刺激したＰＢＬの感染後に、オキシ尿素の存在下または不存在下で、上記したＰＣＲ分析を用いて、ＨＩＶ−１  ＤＮＡ合成を測定した。比較として用いた標準は、ＨＸＢ２（ＲＩＰ７）プラスミドＤＮＡ（コピーの数；McCune等、前記）およびβグロブリンＤＮＡ（ナノグラム）の希釈系列であった。
【００６５】
ｄＮＴＰの減少は、ＨＩＶ−１  ＤＮＡ合成速度に顕著に影響し、刺激したＰＢＬ中でのウィルス性ＤＮＡ合成の完成を阻害した。さらに、ｄＮＴＰの減少により、完全な長さの陰性鎖状ウィルス性ＤＮＡの生成が遅延し、これは、オキシ尿素で処理していない菌体と比較して、わずかな量（７２時間後に、約１０〜１００倍少ない）でのみ見られた。阻害のパターンは、無刺激ＰＢＬにおいて観察されたものと、極めて類似していた。７２時間後、菌体生存率は、オキシ尿素で処理した菌体と、未処理の菌体との間で、同等であった。
【００６６】
ほとんどの循環するインビボリンパ球が無刺激であるため、誘導ＨＩＶ−１の保存宿主として作用する、無刺激の感染したＰＢＬの集団の関連が、確認された（Zack等、前記、1990および1992; Stevenson 等、前記; Bukrinsky 等、前記）。これらの菌体中の、潜伏ウィルス性ＰＤＮＡプールは、マイトジェン性刺激後のウィルス性レスキューにおいて、明らかな役割を有する（ｌｄ．）。本発明者等の結果は、無刺激ＰＢＬ中の潜伏ＨＩＶ−１  ＤＮＡの、無効果の逆転写およびその後の形成の機構を示す。他の機構が、無刺激ＰＢＬ中でのＨＩＶ−１複製を遮断しうるが、天然に存在する低レベルのｄＮＴＰは、逆転写を阻害するのに十分である。
【００６７】
実施例４は、標的菌体を、オキシ尿素単独で、またはヌクレオシドリン酸類縁体ｄｄｌと組み合わせて処理することにより、ＨＩＶ−１ウィルス性発現が阻害されることを例示する。特に、ＨＩＶ−１で感染した、ＰＨＡで刺激したＰＢＬ中の、ＲＴのウィルス性発現は、１ｍＭのオキシ尿素での予備感染処理により、顕著に低下した。
【００６８】
実施例４
オキシ尿素および／またはｄｄｌを用いることによる、ＨＩＶ発現の阻害
ＰＢＬをＰＨＡで，４８時間刺激し、１ｍＭのオキシ尿素で２４時間処理し、次に、薬物の存在下で、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ(Popovic等、前記)に感染させた。オキシ尿素処理を省略した以外は、同様にして、対照細胞を処理した。細胞上澄みアリコートを、感染から２、５および９日後に採取し、ＲＴ活性に関してアッセイした。ＲＴ活性を、実施例２と同様にして監視した。この方法の結果を、表４に示す。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
ＰＢＬ細胞を、オキシ尿素とｄｄｌとの組み合わせにより処理した際に、細胞上澄み液中で検出された、ＨＩＶタンパク質ｐ２４発現は、顕著に減少した（表５）。
【００７１】
【表５】
2006143743.tif 000006
【００７２】
さらに、オキシ尿素およびｄｄｌは、共働して、ＨＩＶ−１  ｐ２４発現を阻害した。即ち、細胞を、一方または他方の薬物単独でよりむしろ、両方の薬物で処理した際に、ｐ２４発現は、一層低下した。例えば、表５は、５μＭのｄｄｌで細胞を処理することにより、感染の１２日後に、細胞上澄み液１ミリリットルあたり１２５ｎｇのｐ２４が生じた一方、５０μＭのオキシ尿素で処理することにより、感染の１２日後に、１４８ｎｇ／ミリリットルのｐ２４が生じたことを示す。しかし、細胞を、５μＭのｄｄｌと、５０μＭのオキシ尿素との両方で処理した際には、感染の１２日後に、わずか２４ｎｇ／ミリリットルのｐ２４が検出された。この共働作用のために、比較的低い濃度のオキシ尿素およびｄｄｌを組み合わせることにより、同一の濃度で、オキシ尿素のみまたはｄｄｌのみで処理した場合と比較して、ｐ２４発現を効果的に低下させることができた。
【００７３】
実施例４の手順は、標的細胞を、感染前に、オキシ尿素および／またはｄｄｌで前処理することを含んでいた一方、本発明者等は、すでに、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢウィルスに感染した細胞において、薬物処理の効果を試験した。後者の手順において、本発明者等は、インビトロ感染の過程でのｐ２４生成を測定して、活性化されたＰＢＬにおけるＨＩＶ−１の複製の阻害を評価した。
【００７４】
実施例５
ｐ２４生成におけるオキシ尿素の影響
健康なドナーからのＰＢＬを、ＰＨＡおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）で２日間刺激した後に、２時間、３７℃で，ＨＩＶ−１［ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ］（ｍ．ｏ．ｌ．＝１）に感染させた。残留ウィルスを洗浄除去した後、菌体を、オキシ尿素および／またはｄｄｌで、所望の濃度で処理した（薬物を含まない上澄み液を、対照として用いた）。３〜４日ごとに、上澄み液を採取して、ｐ２４に関して分析し、菌体をカウントし、新鮮な上澄み液および薬物を加えた。試料を、(a)上澄み液中でのｐ２４生成、(b)生菌体のカウントおよび(c)(a)および(b)において表された値の間の比率に関して分析した。これらの方法からの結果を、図１ａ〜１ｃに示す。
【００７５】
図１ａに示すように、単独で低濃度で、またはｄｄｌと組み合わせて用いた際に、ＨＩＶ−１複製は、投与量依存の方式で阻害された。特に、オキシ尿素と、ｄｄｌとを組み合わせた際には、ＨＩＶ−１複製は完全に遮断され（＞９９．９％）、これにより、この薬物の組み合わせの、強力な共働作用が示された。細胞毒性分析は、２種の薬物の既知の特性を反映する。オキシ尿素は、主に、細胞性塞栓薬物として作用することが知られている。しかし、連続的に薬物に暴露する結果、事実上、若干の細胞毒性効果が生じる。（(Yarbro, J.W., Semin. Oncol. 19:1 (1992)) 。これは、０．１ｍＭのオキシ尿素濃度における、本発明者等の実験でも観察された（図１ｂ）。しかし、細胞活動停止および細胞毒性効果は、事実上、薬物濃度が低下した際に消失した（図１ｂ）。ｄｄｌの細胞毒性は、本発明者等の実験において用いた投与量においては、低いことが知られており、これは、ＡＩＤＳ治療患者において観察された血漿濃度に相当する（Faulds, D.およびBrogden, R.N. Drugs 44:94(1992)）。２種の薬物の組み合わせによっては、オキシ尿素を単独で用いた場合と比較して、細胞毒性は顕著には変化しなかった。このことは、オキシ尿素／ｄｄｌを組み合わせることの他の利点を示す。その理由は、細胞毒性が顕著に増大することなく、抗ウィルス効果が、共働的に増大したからである。
【００７６】
種々の薬物濃度で、または感染の過程において観察された、種々の数の生細胞が、本発明者等のデータに影響を与えたか否かを理解するために（より少ない生存細胞が、ウィルス形成をより低くした）、本発明者等は、ｐ２４発現を、生細胞の数に標準化した（図１ｃ）。本発明者等の結果は、オキシ尿素の抗ウィルス性は、低濃度においては，細胞毒性により媒介されないことを示す。
【００７７】
本発明者等は、オキシ尿素の阻害活性を、単独で、またはＡＺＴと組み合わせて、一次ヒトマクロファージＨＩＶ−１感染に関して試験した。本発明者等は、一次ＰＢＬを用いた、本発明者等の結果と比較して、マクロファージを用いた種々の実験の中で、大きい生存性を見いだしたが（各実験において、同一のドナーが、ＰＢＬおよびマクロファージの両方の源として用いられることに注意されたい）、オキシ尿素による、ＨＩＶ−１形成の投与量依存性阻害は、なお一貫して、一次ＰＢＬを用いた場合より効力が大きい。
【００７８】
実施例６は、オキシ尿素の、マクロファージにおけるＨＩＶ感染の阻害剤としての効力を例示する。さらに、本実施例は、マクロファージの、ＨＩＶ感染の阻害剤としての、オキシ尿素とＡＺＴとの強力な共働効果を例示する。
【００７９】
実施例６
オキシ尿素および／またはＡＺＴによる、マクロファージ中でのＨＩＶ−１阻害の時間経過
健康なドナーからのＰＢＬを精製した後の、菌体の付着により、マクロファージを得た。顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激性因子での処理から１４日後に、菌体を、ＨＩＶ−１菌種Ｂａ−Ｌに、一夜を通じて感染させた(Gartner等、Science 233:215(1986))。その後、菌体を洗浄し、オキシ尿素および／またはＡＺＴで、所望の濃度において処理した。４〜５日ごとに、上澄み液を採取し、ｐ２４に関して分析し、新鮮な上澄み液および薬物を加えた。本実験においては、細胞毒性効果は観察されなかった（表６参照）。これらの実験の結果を、図２に示す。
【００８０】
本発明者等の結果は、０．０５ｍＭという低いオキシ尿素の濃度により，ＨＩＶ−１複製が遮断された（＞９９．９％）ことを示す。２種の薬物がそれぞれ部分的な効果のみを有する濃度において、一層低い投与量のオキシ尿素およびＡＺＴを用いた結果、完全な阻害が達成された（＞９９．９％）。従って、マクロファージにおいて観察された、オキシ尿素およびＡＺＴの共働効果は、オキシ尿素およびｄｄｌで処理した一次ＰＢＬを用いて得られた結果と整合する。
【００８１】
オキシ尿素が、一次ヒト細胞において、２種の異なるＨＩＶ−１菌種を阻害したという、本発明者等の例証は、この薬物が，単独でも、組み合わせても、インビボで有効であることを示す。この可能性をさらに試験するために、本発明者等は、薬物試験に用いられる他のインビトロシステムを用いることにより、前記した観察結果を確認した。このインビトロシステムにおいては、ＨＩＶ−１に感染した個体から分離した一次細胞を用いた。本発明者等は、このＨＩＶ−１阻害のモデルが、インビボ条件に極めて近似していると確信する。その理由は、ここでは、インビボにおいて達成された感染を設定するにあたり、一次細胞とウィルス性分離株とが組み合わせて用いられるからである。
【００８２】
実施例７は、オキシ尿素が、単独で、またはヌクレオシド類縁体と組み合わせて、ＨＩＶ−１に感染した患者から直接分離した細胞中で、ＨＩＶ−１複製を阻害することを例示する。
【００８３】
実施例７
ＨＩＶ−１に感染した患者からの、活性化されたＰＢＬ中での、ＨＩＶ−１の阻害
ＰＢＬを分離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２で２日間刺激した。その後、オキシ尿素およびｄｄｌを、特定の濃度で加えた。ＨＩＶ−１感染の程度を、実施例５に記載したように分析した。試料を、(a)上澄み液中でのｐ２４生成、(b)生菌体のカウントに関して試験した。
【００８４】
もう一度、投与量依存性方式で、ＨＩＶ−１複製を阻害したオキシ尿素および、これとｄｄｌとの組み合わせは、強力な共働効果を示した（図３ａ）。しかし、若干の例において、オキシ尿素の、薬理効果と細胞毒性効果との両方が、一層顕著であり（図３ａ，３ｂ）、特に、ＡＩＤＳの進行した段階において、ＨＩＶ−１に感染した患者からの細胞に関して、（健康なドナーに由来し、図１に示した、ＰＢＬに関する実験と比較して）低い投与量のオキシ尿素を用いた。また、若干の場合において（図３に示すように）、オキシ尿素およびｄｄｌの両方は、最も低いレベルにおいて、ＨＩＶ−１複製を刺激したが、これは、個別に用いた際にのみであった。
【００８５】
この現象は、感染した患者からの細胞を用いることには、限られなかった。その理由は、健康なドナーからの細胞を用いた際にも、このことが、時折観察されたからである。しかし、ウィルス性であるか，細胞源であるかを問わず、刺激効果は、オキシ尿素および、いずれかのヌクレオシド類縁体を、組み合わせて用いた際には、観察されなかった（図示せず）。
【００８６】
実施例８は、健康なドナーから分離したマクロファージおよび活性化されたＰＢＬの、ＨＩＶ−１感染に対する、高い投与量のオキシ尿素の影響を例示する。
【００８７】
実施例８
ＨＩＶ−１感染に対する、高濃度のオキシ尿素の影響
１ｍＭのオキシ尿素を用いて、図１（ＰＢＬに関して）および２（マクロファージに関して）に記載したように、実験を実施した。ＨＩＶ−１阻害の百分率を、未処理の対照と比較して、ｐ２４の生成を基準として計算した。マクロファージの薬物処理を、１４日後に中止した。この実験の結果を、表６に示す。
【００８８】
【表６】
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【００８９】
１ｍＭのオキシ尿素を用いて、連続的に処理することにより、活性化されたＰＢＬおよびマクロファージの両方において、ＨＩＶ−１複製は完全に遮断された。しかし、活性化されたＰＢＬにおいて、これらの濃度では、毒性効果が、初期において観察されたが、これに対して、マクロファージにおいては、顕著な毒性はなかった。さらに、若干の実験において、感染したマクロファージにおいて、ＨＩＶ−１複製がなかったことが、薬物処理を度外視してから数週間後においても記録された。
【００９０】
オキシ尿素が、単独で、またはヌクレオシド類縁体と組み合わせて、一次のヒト細胞中で、インビトロで、ＨＩＶ−１複製を効果的に遮断したという、本発明者等の発見は、この薬物が、ヒトの治療においても有用であることを示唆する。
【００９１】
実施例９は、インビボでのＨＩＶ−１複製を調整するために計画されたプロトコルにおいて、オキシ尿素を用い、これにより処理した個体に利益を与えることを記載する。
【００９２】
実施例９
ＨＩＶに感染したヒトへのヒドロキシウレアの投与
一種またはそれ以上の血清陽性の志願者を最初に同定した。これらの志願者から取り出した血液試料を、あらゆる適当な定量手段を使用してＣＤ4 + Ｔ細胞について試験した。こうした定量手段には、フローサイトメーターが含まれるが、これには限定されない。数週間から数カ月に至るまでの間、ＣＤ4 + Ｔ細胞の数が定常的に減少するのを、疾病の進行の指標として観察する。
【００９３】
次いで、このＨＩＶに感染した志願者を、薬剤試験の被検体に供し、この試験はヒドロキシウレアを単独で含んでおり、またはヌクレオシド類縁体との組み合わせにおいて含んでいる。このヌクレオシド類縁体は、ｄｄｌ、ｄｄＣまたはＡＺＴのいずれからなっていてもよく、またはこれらの組み合わせからなっていてよい。ヒドロキシウレアは、薬剤上許容される賦形剤と組み合せ、１日当たり、１ｋｇ当たり、２０〜４０ｍｇの用量で投与する。この薬剤の用量を調整し、約１ｍＭのヒドロキシウレアの血中濃度を定常的にもたらす。この濃度を選択するのは、これがヒトの標準的な臨床的プロトコルの間のヒドロキシウレアの血中濃度に近いからである。ヒドロキシウレアをヌクレオシド類縁体と共に使用する場合には、この類縁体の用量は、医学および薬学分野において通常のものに従って決定する。
【００９４】
薬剤治療の１月後に、再び血液試料を取り出し、ＣＤ4 + Ｔ−細胞を試験する。ヒドロキシウレアの抗ウイルス活性の治療上の有効性の指標として、このＴ−細胞の個数が安定したか、または増大した。最も劇的な改善が、ヒドロキシウレアのヌクレオシド類縁体との組み合わせを受容した志願者において、観察される。  続く実施例では、逆転写酵素依存ウイルスの複製を阻害するために、ヒドロキシウレアおよび特定の鎖を集結するヌクレオシド類縁体の組み合わせを使用して得られた結果を示した。また、我々が期待するところでは、他のジデオキシヌクレオシド  フォスフェート類縁体、およびその誘導体の鎖の集結の効率が、ヒドロキシウレアを含む薬剤治療を組み合わせることによって向上する。従って、マルケス等によって「Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．」３３：９７８〜９８６頁、１９９０年において記載されたもののような、プリンジデオキシヌクレオシドのフッ素化誘導体が、ヒドロキシウレアと組み合わせて投与したときに、特定の抗ウイルス活性の可能性を示すことが予期される。好ましくは、こうしたフッ素化誘導体は、酸性条件下におけるその化学的な安定性のために、経口的な投薬として有用であると期待される。
【００９５】
実施例９は、鎖を終結させるヌクレオシド類縁体の種々のフッ素化誘導体およびヒドロキシウレアのインビトロの抗ウイルス作用を評価するのに使用できる実験を記述している。
【００９６】
実施例９
ＨＩＶの形質発現を阻害する鎖終結性のヌクレオシド類縁体のフッ素化誘導体およびヒドロキシウレアの使用
健康な提供者から分離したＰＢＬを、標準的なプロトコルを使用して、４８時間、ＰＨＡおよびＩＬ−２によって刺激する。これと同時に、これらの細胞を、ヒドロキシウレア単独で予備処理し、またはｄｄｌまたは鎖終結性のヌクレオシドのフッ素化誘導体のいずれかとの組み合わせで予備処理する。この方法におけるｄｄｌの使用は、ヒドロキシウレアによって向上したｐ２４の生産の阻害を積極的に制御するものとして働く。４８時間の終わりには、このように処理した細胞の試料は、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ（Ｐｏｐｏｖｉｃ等、前出）に感染する。次いで、細胞の上澄み液の等分試料を、感染後の種々の時間の時点で採取し、ＨＩＶ−１への感染の指標として、ｐ２４抗原の存在を分析する。この方法において得られる実施例の結果を、表７に定量的に示す。
【００９７】
【表７】
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【００９８】
表７に示したもののような結果から確認されるであろうことは、鎖終結性のフッ素化されたヌクレオシド類縁体の抗ウイルス活性が、ヒドロキシウレアと組み合わせて使用したときに、向上することである。
【００９９】
我々が示したところでは、ヒドロキシウレアは有効なＨＩＶ−１の阻害剤である。注目すべきことに、これらの抗ウイルス特性は、単に刺激されていないＰＢＬおよびマクロファージにおける薬剤の細胞活動停止的な効果および細胞毒性の効果によっては、媒介されていなかった。我々がこれが真実であると考える理由は、これらの細胞が、無刺激の（ＰＢＬ）または終結的に分化した（マクロファージ）のいずれかであり、従って高レベルのｄＮＴＰの合成を必要とはしなかったからである。ＰＢＬの活性化の後でさえも、ｄＮＴＰの合成は細胞の循環のために必要であり、その抗ウイルスおよび細胞毒性の作用は、低い薬剤の濃度では識別できなかった。活性化されたＰＢＬにおけるヒドロキシウレアの選択的な抗ＨＩＶ−１活性は、ＨＩＶ−１ＲＴの分散性によって部分的には説明することができる。細胞ポリメラーゼと比較すると、ＲＴの分散性は、低い菌体内濃度のｄＮＴＰに対して一層感受性となしうる。活性化されたＰＢＬにおいては、リンパ球内のウイルスの複製が細胞分裂を必要とするので、ヒドロキシウレアの細胞活動停止的な特性は、おそらくその抗ウイルス活性に対して寄与している。
【０１００】
ｄＮＴＰの菌体内の濃度を減少させることによって、ｄｄｌまたはＡＺＴのようなヌクレオシド類縁体の摂取および代謝を増大させる一方、ヒドロキシウレアは菌体内のｄＮＴＰとヌクレオシド類縁体との間の比率を減少させ、これによってこれらの抗ウイルス作用を向上させる。
【０１０１】
ヒドロキシウレアと、ｄｄｌまたはＡＺＴのいずれかとの組み合わせは、抗ウイルス治療に対して極度に有効であることが証明された。特に、この組み合わせによって、ＨＩＶ−１の複製の９９．９％を越える阻害を達成するのに必要な薬剤の濃度を減少させ、これらの細胞毒性を増大させることなしに、個別の薬剤の使用を越える明らかな相乗効果が得られた。また、低い用量の薬剤を個別に使用したときにときどき観察されたウイルスの刺激という現象も、除去された。従って、これらの薬剤の使用の組み合わせは、有利であり、無症候性の血清陽性の個人に対しても安全である。
【０１０２】
ＡＩＤＳの治療にヒドロキシウレアを使用することは、幾つかの利益を提供する。ヒトに３０年以上使用された後なので、この薬剤の特性は良く確立されている。その極度の拡散性の結果として、この薬剤は、中央神経系の細胞を含むすべての組織内に、無限と見えるＶｍａｘで入りうる（モーガン、Ｊ．Ｓ，、クリーシー、Ｄ．Ｃ．およびライト  Ｊ．Ａ．「Biochem. Biophys. Res. Commun,」１３４：１２５４頁、１９８６年）。ヒドロキシウレアがマクロファージ中におけるＨＩＶ−１の複製を阻害するのに高度に有効であるという事実に立脚すると、この薬剤がＡＩＤＳの神経上の症候に対して有効であることが予期され、これはマクロファージ中のウイルスの複製作用に基づくものと考えられる（ケーニッヒ  Ｓ．等「Science 」２３３、１０８９頁、１９８６年）。ヒドロキシウレアの活性は、菌体内の薬剤の代謝に依存していない。従って、ヌクレオシド類縁体とは対照的に、ヒドロキシウレアは、その活性状態とは独立に、すべての細胞中で有効であるものと予期される。ヒドロキシウレアは、穏やかな細胞毒性の薬剤に分類されており、免疫欠損を引き起こさない。骨髄毒性は、ヒドロキシウレアの用量を制限する毒性である。しかし、こうした毒性は、容易に監視でき、この用量を減少させた後に、またはこの治療を中止した後に、定常的にかつ急速に回復可能である（Donehouer R. C. 「Semin. Oncol. 」19:11 頁、1992年） 。末梢細胞の計数のような単純なパラメーターを監視することによって、ヒドロキシウレアを、何年も、ときには何十年も投与することができる。更には、白血病の治療に使用する用量( 約0.5 〜2.5mM)のように、ヒドロキシウレアを非常に高い用量で使用したときのみに、骨髄の毒性が激しくなる(Beit R. J. 等、「Cancer」46:455、1980年) 。我々の実験のほとんどにおいては、これらの水準よりも２〜３倍低いヒドロキシウレア濃度でも、未だＨＩＶ−１の複製を完全に阻害するのに十分であった。ヒドロキシウレアは経口的に投与することができ、ＡＩＤＳの治療に現在使用されている他の薬剤よりもはるかに安い。ヒドロキシウレアは、ＨＩＶ−１を直接的には阻害せずに、この菌体の酵素であるリボヌクレオチド  リダクターゼの阻害を介して、阻害している。菌体の酵素は、生理学的条件下では突然変異をせず、ＨＩＶ−１のヒドロキシウレアに対する耐性は、従来の薬剤について生ずるよりも、はるかに少ないであろうことを予期できる。これによって、ＨＩＶ−１の免疫回避突然変異体の発生を回避しうる。現在のところ、試験されてきた抗ウイルス薬剤のいずれも、免疫回避突然変異体の進化を防止しなかった。この失敗は、ＡＩＤＳに対する闘いの主要な欲求不満をなしている。更には、ヌクレオシド類縁体によるＡＩＤＳの犠牲者の治療の間に生ずる免疫回避突然変異体の発生もまた、これらの薬剤をヒドロキシウレアと組み合わせて使用するときには、減少するはずである。ヌクレオシド類縁体とヒドロキシウレアとの組み合わせによる相乗効果がウイルスの複製を阻害するので、これは免疫回避突然変異体の進化をもたらすウイルスの突然変異のプロセスにおいて必要不可欠でありうる。
【０１０３】
我々の意見では、ＡＩＤＳの治療としてヒドロキシウレアを使用するのに、２つの主要な戦略を続けることができる。その１つ目は、低い用量のヒドロキシウレアを使用することである。この場合には、上記した理由から、薬剤の組み合わせが推奨され、無症候性の血清陽性の個人を含む試みが安全でありうる。この２つ目の戦略は、白血病に使用されている用量と類似のプロトコルによって、高い水準のヒドロキシウレアを使用することである。この戦略は、ＨＩＶ−１に対して一層有効であり得、また複製中のＰＢＬ生産ウイルスを殺しうる。しかし、パージの目的のための高用量のヒドロキシウレアと、引き続いて維持される低用量とを交互に用いることによって、双方の戦略の組み合わせを設計することができる。
【０１０４】
本発明の特定の実施例を詳細に記載してきたけれども、本分野に習熟した者には明白であろうように、これらの実施例は制限的なものではなく、例示的なものであって、本発明の真の範囲は、続く特許請求の範囲によって規定される範囲である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒドロキシウレアおよびｄｄｌの濃度の関数としての、ＨＩＶ−１に感染したＰＢＬ内のｐ２４の形質発現を図示している。
【図１Ｂ】図２Ｂは、ヒドロキシウレアおよびｄｄｌの濃度の関数としての、ＨＩＶ−１に感染した培養物中の生存ＰＢＬの数を図示している。
【図１Ｃ】Ｈｕおよびｄｄｌの濃度の関数としての、生存菌体数に対して正規化されたＨＩＶ−１ｐ２４の形質発現を示す。
【図２】図２は、ヒドロキシウレアおよびＡＺＴの濃度の関数としての、ＨＩＶ−１に感染したヒトプライマリマクロファージ中のｐ２４形質発現を図示している。
【図３Ａ】図３Ａは、ＨＩＶ−１に感染した患者から分離した、活性化されたＰＢＬ中のｄｄｌによって、および／またはヒドロキシウレアによるｐ２４の阻害の時間経過を図示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒドロキシウレアおよび／ｄｄｌによって処理された培養物中で生存している、ＨＩＶ−１に感染した患者から分離した生存菌体の数を図示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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