(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の蛋白質に結合しやすい重原子を効率よく検出する方法を提供する。【解決手段】蛋白質との結合に適した重原子の検索方法は、蛋白質の重原子化における重原子化蛋白質の調整を行うに際し、実現された蛋白質の重原子化に関する多数の重原子結合蛋白質の情報を予め重原子結合蛋白質情報としてデータベース化する。ターゲット蛋白質のアミノ酸配列と上記重原子結合蛋白質情報とにより、重原子化に適する重原子試薬数を絞り込むことにより重原子化に適した重原子を特定する。さらに重原子との結合実績が確認されている重原子結合残基モチーフを予めモチーフ情報としてデータベース化し、前記ターゲット蛋白質のアミノ酸配列内の重原子結合残基モチーフがあるものを上記モチーフ情報より検索して特定し、該検索結果より重原子の種類と重原子結合残基により重原子結合残基候補及び重原子試薬を検索して特定するものである。【選択図】          図２
2006285628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の重原子化における重原子化タンパク質の調整を行うに際し、実現されたタンパク質の重原子化に関する多数の重原子結合タンパク質の情報を予め重原子結合タンパク質情報としてデータベース化し、ターゲットとなるタンパク質のアミノ酸配列と上記重原子結合タンパク質情報とにより、重原子化に適する重原子試薬数を絞り込むことにより重原子化に適した重原子を特定する方法において、重原子との結合実績が確認されている重原子結合残基モチーフを予めモチーフ情報としてデータベース化し、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列内の重原子結合残基モチーフがあるものを上記モチーフ情報より検索して特定し、該検索結果より重原子の種類と重原子結合残基により重原子結合残基候補及び重原子試薬を検索して特定するタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項２】
モチーフ情報が重原子と重原子結合残基配列との結合関係のいずれか一方を基準にして体系的に整理された情報である請求項１のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項３】
重原子の種類を基準にして重原子の種類毎に重原子結合残基配列を対応させて体系的に整理された請求項２のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項４】
重原子化に適する重原子試薬数を絞り込む条件としてターゲットとなるタンパク質の結晶化条件を加え、該結晶化条件が結晶化剤，バッファー，ｐＨ，添加剤のうち１又は２以上の組合せである請求項１，２又は３のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項５】
重原子結合残基モチーフとの結合実績のある重原子がＨｇ，Ｓｍ，Ｐｔ，Ａｕ，Ａｇ，Ｇｄ，Ｐｂである請求項１，２，３又は４のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項６】
重原子との結合実績のある重原子結合残基モチーフがＣＣ，ＣＸＣ，ＣＸＧ，ＧＸＣ，ＨＸＨ，ＨＸＥ，ＣＸＸＣ，ＣＸＸＧ，ＣＸＸＡ，ＧＸＸＣ，ＡＸＸＣ，ＣＸＸＸＣ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＣＸＸＸＭ，ＣＸＸＸＶ，ＣＸＸＸＦ，ＣＸＸＸＴ，ＣＸＸＸＡ，ＴＸＸＸＣ，ＩＸＸＸＣ，ＡＸＸＸＣ，ＭＸＸＸＣ，ＫＸＸＸＣ，ＰＸＸＸＣ，ＧＸＸＸＣ，ＧＸＸＣＧ，ＨＸＸＸＭ，ＨＸＸＱＸＱ，ＧＭＴＣＸＸＣ，ＭＴ／ＨＣＸＸＣ，ＧＸＸＸＣＧＸＸＴ，ＧＭＴＣＸＸＣ，ＣＱＸＸＣ，ＬＣ，ＣＸＥ，ＨＸＶ，ＩＨＸＶ，ＣＸＫ，ＣＸＸＧ，ＣＸＥＧ，ＣＸＸＸＥ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＶＸＸＸＣ，ＬＸＸＸＣ，ＤＸＸＨＸＶ，ＫＸＣＸＸＸＧ，ＭＸＫ，ＭＸＧ，ＭＸＸＧ，ＭＸＸＴ，ＲＸＸＭ，ＫＸＸＭ，ＴＸＸＭ，ＧＸＸＭ，ＭＸＸＸＭ，ＭＸＸＸＫ，ＭＸＸＸＡ，ＭＸＸＸＹ，ＭＸＸＸＴ，ＭＸＸＸＨ，ＭＸＸＸＧ，ＫＸＸＸＭ，ＱＸＸＸＭ，ＬＸＸＸＭ，ＧＸＸＸＭ，ＧＭＸＸＴ，ＧＸＸＭＸＧ，ＥＥ，ＤＤ，ＥＸＥ，ＥＸＤ，ＤＸＤ，ＩＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＧ，ＤＸＸＥ，ＤＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＤＸＸＸＤ，ＰＸＸＸＹ，ＥＥ，ＥＸＧ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＸＥ，ＲＥＸＸＥ，ＲＥＸＸＥＥ，Ｄ／ＥＹＸＸＶ，ＥＥ，ＥＸＥ，ＤＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＥＱＸＸＥ，ＬＸＸＸＥ（但しＸは任意のアミノ酸）である請求項５のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【請求項７】
タンパク質を重原子化して重原子化タンパク質を調整するに際し、ＣＣ，ＣＸＣ，ＣＸＧ，ＧＸＣ，ＨＸＨ，ＨＸＥ，ＣＸＸＧ，ＣＸＸＡ，ＧＸＸＣ，ＡＸＸＣ，ＣＸＸＸＣ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＣＸＸＸＭ，ＣＸＸＸＶ，ＣＸＸＸＦ，ＣＸＸＸＴ，ＣＸＸＸＡ，ＴＸＸＸＣ，ＩＸＸＸＣ，ＡＸＸＸＣ，ＭＸＸＸＣ，ＫＸＸＸＣ，ＰＸＸＸＣ，ＧＸＸＸＣ，ＧＸＸＣＧ，ＨＸＸＸＭ，ＨＸＸＱＸＱ，ＧＸＸＸＣＧＸＸＴ，ＣＱＸＸＣ，ＬＣ，ＣＸＥ，ＨＸＶ，ＩＨＸＶ，ＣＸＫ，ＣＸＸＧ，ＣＸＥＧ，ＣＸＸＸＥ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＶＸＸＸＣ，ＬＸＸＸＣ，ＤＸＸＨＸＶ，ＫＸＣＸＸＸＧ，ＭＸＫ，ＭＸＧ，ＭＸＸＧ，ＭＸＸＴ，ＲＸＸＭ，ＫＸＸＭ，ＴＸＸＭ，ＧＸＸＭ，ＭＸＸＸＭ，ＭＸＸＸＫ，ＭＸＸＸＡ，ＭＸＸＸＹ，ＭＸＸＸＴ，ＭＸＸＸＨ，ＭＸＸＸＧ，ＫＸＸＸＭ，ＱＸＸＸＭ，ＬＸＸＸＭ，ＧＸＸＸＭ，ＧＭＸＸＴ，ＧＸＸＭＸＧ，ＥＥ，ＤＤ，ＥＸＥ，ＥＸＤ，ＤＸＤ，ＩＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＧ，ＤＸＸＥ，ＤＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＤＸＸＸＤ，ＰＸＸＸＹ，ＥＥ，ＥＸＧ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＸＥ，ＲＥＸＸＥ，ＲＥＸＸＥＥ，Ｄ／ＥＹＸＸＶ，ＥＥ，ＥＸＥ，ＤＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＥＱＸＸＥ，ＬＸＸＸＥから選択される少なくとも一つの重原子結合残基モチーフとターゲットとなる前記タンパク質のアミノ酸配列とを比較する工程と、該工程に次いで、ターゲットとなるタンパク質が重原子結合残基モチーフを有する場合に当該重原子結合残基モチーフが結合する重原子を、ターゲットとなるタンパク質を重原子化するための重原子候補として選択する工程とを含む、ターゲットとなるタンパク質との結合に適した重原子の検索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重原子化タンパク質の調整を行う際、ターゲットとなるタンパク質に結合しやすいと考えられる重原子を検索する方法に関し、特に既存の重原子結合タンパク質の情報をデータベース化することによって見出した重原子結合残基モチーフを基にタンパク質に結合しやすい重原子を効率よく検出することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造を決定する手段として現在主に使われているのはＸ線結晶構造解析と核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）によるものである。近年、ＮＭＲによって決定されたタンパク質の構造の件数は増えつつあるが、まだＸ線を用いた手法が主流である。Ｘ線構造解析の場合、タンパク質構造を決定するにはその位相を決定する必要がある。その位相決定の手法は現在２種類が主流である。一つ目は重原子置換タンパク質を用いた実験位相によるもの（重原子置換法）である。二つ目はよく似た構造であると考えられる既存のタンパク質（モデルタンパク質）の構造座標を用いてその位相を決定する方法（分子置換法）である。
【０００３】
【非特許文献１】ブランデルとジョンソン（Blundell, T. L. & Johnson, L. N.）著，「プロテイン  クリスタログラフィー（Protein Ｃrystallography）」，（英国），アカデミック・プレス（Academic press），１９７６年，ｐ．１８３−２３９
【非特許文献２】トム・エル・ブランデル（Tom L. Blundell），外３名，“ヘビー・アトム・データバンク（Heavy atom databank）”［online］，［平成１７年３月１５日検索］，インターネット＜URL：http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/had/＞
【非特許文献３】「バイオケミストリー（Biochemistry）」，（米国），アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（American Ｃhemical Society），１９９７年，第３６巻，２３号，ｐ．６８８５−６８９５
【非特許文献４】「ネイチャー（Nature）」，（英国），マクミラン・ジャーナル（Macmillan Journal），２００２年，第４１８巻，６８９７号，ｐ．５６２−５６６
【非特許文献５】「ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー（Nature structural biology）」，（米国），ネイチャー・パブ（Nature Pub.），２０００年，第７巻，９号，ｐ．７６６−７７１
【非特許文献６】「ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー（Nature structural biology）」，（米国），ネイチャー・パブ（Nature Pub.），１９９８年，第５巻，１号，ｐ．４７−５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記の分子置換法の場合、多くのタンパク質はそのモデルタンパク質がないため、用いることができない場合が多い。また重原子置換法の場合、そのタンパク質の重原子化には多数の重原子試薬を試みなければならず、タンパク質重原子化の成功率は低いという問題がある。さらにBlundell & Johnsonによって書かれた重原子化に成功したタンパク質に関するテキスト（タンパク質名、結晶化条件、重原子試薬、重原子と結合したアミノ酸残基が記述されている）もあるが（非特許文献１参照）、その登録件数の少なさゆえに重原子誘導体作成の成功率は低いという問題があった。
【０００５】
また、タンパク質名と結晶化条件から結合しやすい重原子をウェブ上で検索できるシステムもあるが、タンパク質名からの検索ではその数に限りがあり、多々ある機能未知タンパク質や登録されていないタンパク質などは上記の検索システムでは同定が非常に困難であった（非特許文献２参照）。
【０００６】
さらに水銀や銀などの重原子はこれまでにそのタンパク質結合残基モチーフが幾つか報告されているが、報告されているモチーフの数は少なく、タンパク質重原子化のための重原子検索にはこれまで使われていないのが現状である（非特許文献３〜６参照）。
【０００７】
この発明は、これらの課題を解決又は改善し、新規のタンパク質に結合しやすい重原子を効率よく検出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の方法は、第１に、タンパク質の重原子化における重原子化タンパク質の調整を行うに際し、実現されたタンパク質の重原子化に関する多数の重原子結合タンパク質の情報を予め重原子結合タンパク質情報としてデータベース化し、ターゲットとなるタンパク質のアミノ酸配列と上記重原子結合タンパク質情報とにより、重原子化に適する重原子試薬数を絞り込むことにより重原子化に適した重原子を特定する方法において、重原子との結合実績が確認されている重原子結合残基モチーフを予めモチーフ情報としてデータベース化し、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列内の重原子結合残基モチーフがあるものを上記モチーフ情報より検索して特定し、該検索結果より重原子の種類と重原子結合残基により重原子結合残基候補及び重原子試薬を検索して特定することを特徴としている。
【０００９】
第２に、モチーフ情報が重原子と重原子結合残基配列との結合関係のいずれか一方を基準にして体系的に整理された情報であることを特徴としている。
【００１０】
第３に、重原子の種類を基準にして重原子の種類毎に重原子結合残基配列を対応させて体系的に整理されたことを特徴としている。
【００１１】
第４に、重原子化に適する重原子試薬数を絞り込む条件としてターゲットとなるタンパク質の結晶化条件を加え、該結晶化条件が結晶化剤，バッファー，ｐＨ，添加剤のうち１又は２以上の組合せであることを特徴としている。
【００１２】
第５に、重原子結合残基モチーフとの結合実績のある重原子がＨｇ，Ｓｍ，Ｐｔ，Ａｕ，Ａｇ，Ｇｄ，Ｐｂであることを特徴としている。
【００１３】
第６に、重原子との結合実績のある重原子結合残基モチーフがＣＣ，ＣＸＣ，ＣＸＧ，ＧＸＣ，ＨＸＨ，ＨＸＥ，ＣＸＸＣ，ＣＸＸＧ，ＣＸＸＡ，ＧＸＸＣ，ＡＸＸＣ，ＣＸＸＸＣ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＣＸＸＸＭ，ＣＸＸＸＶ，ＣＸＸＸＦ，ＣＸＸＸＴ，ＣＸＸＸＡ，ＴＸＸＸＣ，ＩＸＸＸＣ，ＡＸＸＸＣ，ＭＸＸＸＣ，ＫＸＸＸＣ，ＰＸＸＸＣ，ＧＸＸＸＣ，ＧＸＸＣＧ，ＨＸＸＸＭ，ＨＸＸＱＸＱ，ＧＭＴＣＸＸＣ，ＭＴ／ＨＣＸＸＣ，ＧＸＸＸＣＧＸＸＴ，ＧＭＴＣＸＸＣ，ＣＱＸＸＣ，ＬＣ，ＣＸＥ，ＨＸＶ，ＩＨＸＶ，ＣＸＫ，ＣＸＸＧ，ＣＸＥＧ，ＣＸＸＸＥ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＶＸＸＸＣ，ＬＸＸＸＣ，ＤＸＸＨＸＶ，ＫＸＣＸＸＸＧ，ＭＸＫ，ＭＸＧ，ＭＸＸＧ，ＭＸＸＴ，ＲＸＸＭ，ＫＸＸＭ，ＴＸＸＭ，ＧＸＸＭ，ＭＸＸＸＭ，ＭＸＸＸＫ，ＭＸＸＸＡ，ＭＸＸＸＹ，ＭＸＸＸＴ，ＭＸＸＸＨ，ＭＸＸＸＧ，ＫＸＸＸＭ，ＱＸＸＸＭ，ＬＸＸＸＭ，ＧＸＸＸＭ，ＧＭＸＸＴ，ＧＸＸＭＸＧ，ＥＥ，ＤＤ，ＥＸＥ，ＥＸＤ，ＤＸＤ，ＩＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＧ，ＤＸＸＥ，ＤＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＤＸＸＸＤ，ＰＸＸＸＹ，ＥＥ，ＥＸＧ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＸＥ，ＲＥＸＸＥ，ＲＥＸＸＥＥ，Ｄ／ＥＹＸＸＶ，ＥＥ，ＥＸＥ，ＤＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＥＱＸＸＥ，ＬＸＸＸＥ（但しＸは任意のアミノ酸）であることを特徴としている。
【００１４】
第７に、タンパク質を重原子化して重原子化タンパク質を調整するに際し、ＣＣ，ＣＸＣ，ＣＸＧ，ＧＸＣ，ＨＸＨ，ＨＸＥ，ＣＸＸＧ，ＣＸＸＡ，ＧＸＸＣ，ＡＸＸＣ，ＣＸＸＸＣ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＣＸＸＸＭ，ＣＸＸＸＶ，ＣＸＸＸＦ，ＣＸＸＸＴ，ＣＸＸＸＡ，ＴＸＸＸＣ，ＩＸＸＸＣ，ＡＸＸＸＣ，ＭＸＸＸＣ，ＫＸＸＸＣ，ＰＸＸＸＣ，ＧＸＸＸＣ，ＧＸＸＣＧ，ＨＸＸＸＭ，ＨＸＸＱＸＱ，ＧＸＸＸＣＧＸＸＴ，ＣＱＸＸＣ，ＬＣ，ＣＸＥ，ＨＸＶ，ＩＨＸＶ，ＣＸＫ，ＣＸＸＧ，ＣＸＥＧ，ＣＸＸＸＥ，ＣＸＸＸＤ，ＣＸＸＸＧ，ＶＸＸＸＣ，ＬＸＸＸＣ，ＤＸＸＨＸＶ，ＫＸＣＸＸＸＧ，ＭＸＫ，ＭＸＧ，ＭＸＸＧ，ＭＸＸＴ，ＲＸＸＭ，ＫＸＸＭ，ＴＸＸＭ，ＧＸＸＭ，ＭＸＸＸＭ，ＭＸＸＸＫ，ＭＸＸＸＡ，ＭＸＸＸＹ，ＭＸＸＸＴ，ＭＸＸＸＨ，ＭＸＸＸＧ，ＫＸＸＸＭ，ＱＸＸＸＭ，ＬＸＸＸＭ，ＧＸＸＸＭ，ＧＭＸＸＴ，ＧＸＸＭＸＧ，ＥＥ，ＤＤ，ＥＸＥ，ＥＸＤ，ＤＸＤ，ＩＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＧ，ＤＸＸＥ，ＤＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＤＸＸＸＤ，ＰＸＸＸＹ，ＥＥ，ＥＸＧ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＸＥ，ＲＥＸＸＥ，ＲＥＸＸＥＥ，Ｄ／ＥＹＸＸＶ，ＥＥ，ＥＸＥ，ＤＸＤ，ＥＸＸＥ，ＥＸＸＤ，ＥＸＸＸＥ，ＥＱＸＸＥ，ＬＸＸＸＥから選択される少なくとも一つの重原子結合残基モチーフとターゲットとなる前記タンパク質のアミノ酸配列とを比較する工程と、該工程に次いで、ターゲットとなるタンパク質が重原子結合残基モチーフを有する場合に当該重原子結合残基モチーフが結合する重原子を、ターゲットとなるタンパク質を重原子化するための重原子候補として選択する工程とを含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１５】
ターゲットとなるタンパク質のアミノ酸配列から重原子結合残基モチーフを探すことで、従来行っていた結晶化条件と重原子に結合しやすいアミノ酸残基一つからの検索方法と比べ、タンパク質への重原子導入効率が大幅に向上した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、重原子結合残基モチーフとそのモチーフを使用したタンパク質との結合に適した重原子の検索方法について説明する。
【００１７】
１．重原子結合残基モチーフ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（http://www.rcsb.org/pdb/），Blundell & Johnsonのテキスト（非特許文献１）及びこれまでに得た重原子誘導体タンパク質の結晶構造などを合わせて約８００件の重原子結合部位を調べた。ここで、引用した各重原子Ｈｇ（水銀），Ｓｍ（サマリウム），Ｐｔ（白金），Ａｕ（金），Ａｇ（銀），Ｇｄ（ガドリウム），Ｐｂ（鉛），Ｘｅ（キセノン），Ｂｒ（臭素）Ｋｒ（クリプトン），Ｅｕ（ユーロピウム），Ｔｌ（タリウム），Ｐｄ（パラジウム），Ｏｓ（オスミウム），Ｌｕ（ルテチウム）に関する２５０件のＰＤＢコードを表１に示す。但しBlundell & Johnson のテキスト（非特許文献１）においてＰＤＢコードが不明なものについては除いた。ＰＤＢコードとは、そのタンパク質の登録データを整理保存するために付与された英数字４文字からなる記号である。
【００１８】
上記約８００件の重原子結合部位に関して説明すると、多くの場合、１つのＰＤＢコードに対して複数の重原子結合部位がある。したがって約２５０件のＰＤＢコードでは約６００件の重原子結合部位があり、それら情報を入力したものである。加えて、Blundell & Johnsonのテキストから約２００件入力した結果得られたものである。
【００１９】
【表１】
2006285628.tif 000003
【００２０】
以上の検索の結果、以下の表２に示すように７種類の重原子に対して９７個の重原子結合残基モチーフを検出した。モチーフとは各種のタンパク質のアミノ酸配列中に認められる２以上のアミノ酸残基から構成される構成単位のことである。表２中のアミノ酸配列は各々の重原子と結合し易いアミノ酸配列を示している。アミノ酸配列は後述の表５に示す一文字表記で示しており、Ｘはいずれのアミノ酸であっても良いという意味である。
【００２１】
【表２】
2006285628.tif 000004
【００２２】
上記重原子結合残基モチーフの内、非特許文献３〜６によって知られている４個を除いたものはすべて本発明者によって新たに見出されたものであり、これらは本発明（請求項７）のようなタンパク質の重原子化に最適な重原子候補をスクリーニングするために特に有用であるほか、結合モチーフと既知タンパク質とを融合タンパク質にして、既知タンパク質を重原子にてラベル可能にするという用途及び効果もある。
【００２３】
２．重原子の検索方法
（１）最初に検索したいタンパク質結晶とそのタンパク質のアミノ酸配列を用意する。
（２）ターゲットタンパク質が持つアミノ酸配列からそれらアミノ酸残基と過去の重原子
結合タンパク質のデータベース（どの重原子試薬を使ってタンパク質を結晶化した
か、その重原子がどのアミノ酸残基に結合したか、またその他の結晶化条件を調べ
体系化したもの）を参照し、重原子と結合しやすいと思われる残基とその重原子試
薬、およびその使用時の結晶化条件を検索によって見つける。
【００２４】
上記データベースにはProtein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/）, 
Blundell & Johnson のテキスト（非特許文献１）, および発明者がこれまでに得
た重原子誘導体タンパク質の結晶構造、それらを合わせて約８００件の重原子結合
部位に関する情報が入っている。具体的にその情報は各ＰＤＢコードに対応する重
原子名、重原子試薬、重原子試薬濃度、重原子化の方法（ソーキング、もしくは共
結晶、ソーキングの場合はそのソーキング時間）、ハーベストの有無、バックソー
クの有無、バックソークを行った場合はその時間、重原子が結合したアミノ酸残基
、結晶化条件（結晶化剤、添加剤、バッファー名、ｐＨ）、タンパク質名、ＰＤＢ
コード、論文で報告してある場合はその雑誌名、年号、ページ番号である。
【００２５】
また、この段階では多くのアミノ酸残基が様々な重原子に結合することが予想さ
れ、その重原子試薬の数も膨大である場合が多い。ここで、重原子検索で使用する
各重原子Ｈｇ（水銀），Ｓｍ（サマリウム），Ｐｔ（白金），Ａｕ（金），Ａｇ
（銀），Ｇｄ（ガドリウム），Ｐｂ（鉛），Ｘｅ（キセノン），Ｂｒ（臭素），
Ｋｒ（クリプトン），Ｅｕ（ユーロピウム），Ｔｌ（タリウム），Ｐｄ（パラジウ
ム），Ｏｓ（オスミウム），Ｌｕ（ルテチウム）に関する８８種類の試薬を表３に
示す。
【００２６】
【表３】
2006285628.tif 000005
【００２７】
（３）重原子結合残基とその重原子試薬が特定できれば、次にターゲットとなるタンパク
質の結晶が得られた条件（結晶化剤、バッファー名、ｐＨ）と上記（２）で得た結
果から検索することにより、重原子試薬を特定する。ただし結晶化条件によっては
参照データ側との完全一致がない場合も考えられるため、結晶化剤、バッファー名
、ｐＨそれぞれ個別の絞込み機能も付ける。ここまでが従来の検索方法である。こ
の段階ではまだ多くの重原子試薬候補があり、それらを一つ一つ調べる作業は膨大
な時間を費やす。
【００２８】
（４）次に、ターゲットタンパク質のアミノ酸配列中に、上記表２に示した９７の重原子
結合残基モチーフがあるか否かを検索する。重原子結合残基モチーフがある場合、
そのターゲットとなるタンパク質に結合しやすいと考えられる重原子の種類とその
結合残基が特定されるため、上記（３）で得た結果より重原子試薬候補の数を大幅
に絞込むことができ、より最適な重原子試薬が見つかる。
【００２９】
重原子結合残基モチーフがない場合、結晶化条件からの絞込みで得られた重原子
試薬を表示する。モチーフがない場合、検索結果件数が多数表示されることが考え
られるため、特定の重原子、特定のアミノ酸残基の絞込みも可能にしている。その
機能は従来から重原子と結合しやすいと考えられているシステインやメチオニンの
ようなアミノ酸残基を優先的に考慮することでより効率よく重原子検索が行える。
【００３０】
（５）重原子試薬が決定したら、結晶化溶液に重原子試薬を溶かし、最終濃度２０ｍＭか
ら０．１ｍＭの範囲で調製する。
（６）調製し終わった重原子試薬にタンパク質結晶を浸す（最初は重原子試薬濃度２０ｍ
Ｍから行う）。ここでタンパク質結晶にひび割れや溶解が生じたら、重原子試薬濃
度を低くする。また、重原子試薬を混ぜた結晶化溶液を使った結晶化（重原子との
共結晶）も試みる。
（７）重原子処理が終わった結晶はＸ線回折実験を行い、その重原子が取り込まれたかど
うかを得られた回折イメージから確認する。
【００３１】
３．重原子の検索の具体例
図１〜３に基づき説明する。本発明の重原子の検索システム１はキーボード等の入力手段２，中央処理装置３，ディスプレイ等の出力手段４，データベース６から構成されている。データベース６は重原子結合タンパク質情報６ａ，モチーフ情報６ｂから構成されている。
【００３２】
前記重原子結合タンパク質情報６ａにはProtein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/）, Blundell & Johnson のテキスト（非特許文献１）, および発明者がこれまでに得た重原子誘導体タンパク質の結晶構造、それらから合わせて約８００件の重原子結合部位に関する情報が記憶されている。具体的にその情報は重原子名、重原子試薬、重原子試薬濃度、重原子化の方法（ソーキング、もしくは共結晶、ソーキングの場合はそのソーキング時間）、ハーベストの有無、バックソークの有無、バックソークを行った場合はその時間、重原子が結合したアミノ酸残基、結晶化条件（結晶化剤、添加剤、バッファー名、pH）、タンパク質名、ＰＤＢコード、論文で報告してある場合はその雑誌名、年号、ページ番号である。
【００３３】
またモチーフ情報６ｂには上記表２に示した９７の重原子結合残基モチーフが重原子の種類を基準に体系的に整理され記憶されている。データベース６の記憶方法としては、ＲＡＭ，ＲＯＭ等の半導体記憶素子を用いても、ＣＤ−ＲＯＭ，ＤＶＤ等の磁気ディスクを用いても良い。
【００３４】
図２のフローチャートに基づき本検索の動きを説明する。この検索システムはアミノ酸配列内に重原子結合残基モチーフを持つものと、持たないもの両方に対応している。最初に検索したいタンパク質のアミノ酸一文字表示の配列を入力する（Ｓ１）。ここで、ターゲットタンパク質が持つアミノ酸とデータベースとを参照し（Ｓ２）、それぞれアミノ酸残基ごとに結合すると考えられる重原子、その重原子試薬、参照データ側の結晶化条件を出力し表示する。ここで、データベースには次にこれら得られた結果とターゲットタンパク質の結晶が得られた条件(結晶化剤、バッファー名、ｐＨ)から重原子試薬を絞り込む（Ｓ３）。
【００３５】
結晶化条件によっては参照側との完全一致がない場合も考えられるため、結晶化剤、バッファー名、ｐＨそれぞれ個別の絞込み機能も付けることもできる。アミノ酸配列内の重原子結合残基モチーフの有無を自動で検索する（Ｓ４）。検索する重原子結合残基モチーフは表２で示した９７の重原子結合残基モチーフを使う。ここで、モチーフがある場合はそのモチーフの重原子の種類とその結合残基から重原子試薬を決定する（Ｓ５）。そして決定された重原子試薬を表示する（Ｓ６）。
【００３６】
またモチーフがない場合、結晶化条件からの絞込みで得られた重原子試薬を表示する（Ｓ７）。ここで、モチーフがない場合、検索結果件数が多数表示されることが考えられるため、特定の重原子、特定のアミノ酸残基の絞込みも可能である。その機能は従来から重原子と結合しやすいと考えられている、システインやメチオニンのようなアミノ酸残基を優先的に考慮することでより効率よく重原子検索が行える。
【００３７】
図３に基づき具体的な例を示しながら本検索方法の動きを説明する。図３に示したアミノ酸配列例は検索方法の流れを分かりやすくするためのものであり実存するものではない。また、スペースの都合上検索結果の一部を削除している。
先ずステップ１（Ｓ１）において
アミノ酸配列ＣＡＡＨＭＡＡＡを入力する。
【００３８】
（Ｓ２において）
Ｓ１におけるアミノ酸配列内にはアミノ酸のＭが１個，Ｃが１個，Ａが５個，Ｈが１個ある。これら残基に相当する重原子試薬をデータ６ａから検索した結果、ステップ２（Ｓ２）では、
Ｃ…ＨｇＣｌ2（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
Ｃ…ＥＭＴＳ（ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７）
Ｈ…ＰｄＣｌ2（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
Ｍ…Ｋ2ＰｔＣｌ4（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
Ｍ…Ｋ2Ｐｔ（ＣＮ）4（ＮａＣｌ、ＭＥＳバッファー、ｐＨ６）
と表示される。
【００３９】
Ｓ３において、結晶化条件がＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー 、ｐＨ５の場合、その結晶化条件で最適な重原子試薬を絞り込んだ結果、
Ｃ…ＨｇＣｌ2（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
Ｈ…ＰｄＣｌ2（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
Ｍ…Ｋ2ＰｔＣｌ4（ＰＥＧ４Ｋ、酢酸バッファー、ｐＨ５）
と表示される。
【００４０】
Ｓ４において、データ６ｂを参照し、アミノ酸配列内の重原子結合残基モチーフを検索し、重原子結合残基モチーフがあった場合（図３のＹｅｓの場合）、
アミノ酸配列内に水銀結合モチーフＣＸＸＸＭ（ＣＡＡＨＭ）が検出されたので、
重原子結合残基：Ｃ、
重原子名：水銀
と表示される。
【００４１】
Ｓ５において、重原子の種類と結合残基でさらに絞り込む。
Ｓ６において、Ｃ：ＨｇＣｌ2と表示される。
Ｓ７において、また、Ｓ４において重原子結合残基モチーフがなかった場合（図３のＮｏの場合）は、
Ｃ…ＨｇＣｌ２
Ｈ…ＰｄＣｌ２
Ｍ…Ｋ２ＰｔＣｌ４
と表示される。
【実施例１】
【００４２】
本発明のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法の有用性を調べるため、１０個の異なるタンパク質（サンプル番号１〜１０，ＨＴＰＦ  ＩＤ  ００１２６，１１４９２，１２０４５，１１０５５，１１７３１，００３６７,１０９５０，１００１７，０００６９，００４０３）の結晶を用いて重原子化を試みた。実験結果を以下の表４に示す。
【００４３】
【表４】
2006285628.tif 000006
以下、一例としてサンプル番号１，ＨＴＰＦ  ＩＤ  ００１２６のタンパク質の重原子試薬の決定方法の具体例を順次説明する。
１）アミノ酸配列内にある残基と過去の重原子結合タンパク質の情報（どの重原子試薬を
使ってその重原子がどのアミノ酸残基に結合したか、またその時の結晶化条件を調べ
たもの）を参照し重原子と結合しやすいアミノ酸残基を検索した。そのアミノ酸配列
を下記に示す。
ＭＫＡＬＡＬＩＡＨＤＡＫＫＤＥＭＶＡＦＣＬＲＨＫＤＶＬＡＲＹＰＬＬＡＴＧＴＴ
ＧＡＲＩＱＥＡＴＧＬＡＶＥＲＶＬＳＧＰＬＧＧＤＬＱＩＧＡＲＶＡＥＧＫＶＬＡＶ
ＶＦＬＱＤＰＬＴＡＫＰＨＥＰＤＶＱＡＬＭＲＶＣＮＶＨＧＶＰＬＡＴＮＬＶＡＡＥ
ＡＬＩＡＷＩＲＫＧＴＰＱ
注１）上記アミノ酸配列は別記の三文字表記のアミノ酸配列表を表５に基づき、一文
字表記で示したものである。
注２）上記アミノ酸配列中の下線部は重原子結合残基モチーフを示す。
【００４４】
【表５】
2006285628.tif 000007
ここで、このアミノ酸配列から重原子と結合しやすい残基を検索すると、その重原子結合残基に適合する重原子試薬とそれぞれの結晶化条件の情報が７７６件検索された。
【００４５】
２）重原子結合残基とその重原子試薬が特定できれば、次に結晶が得られた条件（結晶化
剤、バッファー、ｐＨ）から、どのような重原子試薬が相応しいか絞り込む。
Blundell & Johnsonによって書かれたテキスト（非特許文献１）でも指摘されている
ように、重原子とアミノ酸の結合は化学反応による共有結合が多いため、その反応時
のｐＨがその結合に大きく影響する。また、ｐＨは重原子試薬の溶解性にも影響する
ため、ある結晶化条件ではその重原子試薬が結晶化溶液に溶けない場合もある。幾つ
かの重原子試薬は結晶化剤と反応し沈殿してしまうこともある。したがって、結晶化
条件からの重原子試薬の絞込みは大変重要な過程である。
【００４６】
上記タンパク質ＨＴＰＦ  ＩＤ  ００１２６は硫酸リチウム，サイトレートバッフ
ァー，ｐＨ４．６の条件で結晶を得た。その条件で先に記した７７６件のデータと参
照した場合、７件該当した（下記の表６参照）。ここで本来なら、ターゲットタンパ
ク質の結晶化条件との完全一致が望ましいが、いくつかのタンパク質サンプルを使っ
て検索した結果、その完全一致はほとんどなく、多くの場合ｐＨを主体とした絞り込
みが主流となる。
【００４７】
【表６】
2006285628.tif 000008
【００４８】
３）次にアミノ酸配列中に重原子結合残基モチーフがあるか否かを検索した。本検索方法
ではこれまでに見つかった７種類の重原子（Ｈｇ，Ａｇ，Ａｕ，Ｐｔ，Ｓｍ，Ｇｄ，
Ｐｂ）に関する９７のモチーフを用いる(上記の表２参照)。ここで重原子結合残基モ
チーフがある場合、そのターゲットとなるタンパク質に結合し易いと考えられる重原
子の種類と結合残基が特定されるため、候補となる重原子試薬の数が大幅に減少する
。
【００４９】
ＨＴＰＦ ＩＤ ００１２６のアミノ酸配列（別記  配列表参照）から表２の９７個
のアミノ酸結合残基モチーフを検索した結果、その配列内にＣＮＶＨＧ（上記下線部
のＣｙｓ９９〜Ｇｌｙ１０３）が検出された。これは水銀結合残基モチーフＣＸＸＸ
Ｇに当たる（システインＣとグリシンＧの間にある３個のＸはどのアミノ酸であって
もよい）。そこで、このタンパク質に取り込まれる可能性がある金属は水銀であり重
原子結合残基はＣであると特定できた。したがって、２）で得られた候補のうち、ア
ミノ酸残基にＣが存在し且つ重原子試薬に水銀が含まれているという条件から、最適
な重原子試薬をＨｇＣｌ2と決定した。
【００５０】
＜結論及び考察＞
タンパク質１０サンプル中(サンプル番号１〜１０)、重原子化に成功したサンプルの数は８サンプル(サンプル番号１〜８)あった。
また表２の重原子結合残基モチーフを用いた重原子の検索では９個のタンパク質サンプル(サンプル番号１〜７，９，１０)で１１種類の重原子に関するタンパク質との結合に適したと予想される重原子結合残基モチーフがあった。そこでこれらの重原子に相当する重原子試薬１４種類を用いて重原子化を試みた結果、８種の試薬で重原子化に成功した（上記の表４参照）。これは重原子化成功率約６４％に相当する。
一方、表５の結果から、重原子結合残基モチーフが検出されなかった場合の重原子化の成功率は約５４％になる。したがって、これらの実験結果から、この重原子結合残基モチーフを用いた重原子検索方法は、タンパク質の重原子化を行うのにあたり、効率良く重原子を見つける事ができると言える。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法は、新たな薬品や食品等を開発するために必要なタンパク質の結晶構造の解析に際して行われるタンパク質の重原子化に利用するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明のタンパク質との結合に適した重原子の検索システムを示す概念図である。
【図２】本発明のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法を示すフロー図である。
【図３】本発明のタンパク質との結合に適した重原子の検索方法を示すフロー図の各ステップに表示される出力例を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１    検索システム
２    入力手段
３    中央処理装置
４    出力手段
６    データベース
６ａ  重原子結合タンパク質情報
６ｂ  モチーフ情報
【図１】
2006285628.tif 000009
【図２】
2006285628.tif 000010
【図３】
2006285628.tif 000011
【配列表】
2006285628000001.app