(57)【要約】【課題】核酸の増幅効率が優れた新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。【解決手段】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であって、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素を使用する核酸増幅法ならびにそのための試薬。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima) のいずれかに由来する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる。
【請求項３】
下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【請求項４】
下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４０番目、第１４２番目および第１４４番目の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をグルタミン（Ｇｌｎ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をリジン（Ｌｙｓ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をアルギニン（Ａｒｇ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４４番目のＸ3 （Ｔｈｒ）をバリン（Ｖａｌ）に置換した請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項１４】
下記理化学的性質を有する改変された、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima) のいずれかに由来する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１３記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる。
【請求項１５】
下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【請求項１６】
下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４０番目、第１４２番目および第１４４番目の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載される遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクター。
【請求項１８】
ベクターが、ｐＬＥＤ−Ｍ１またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクターである請求項１７記載の遺伝子組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載される遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞が大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉである請求項１９記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載される遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法。
【請求項２２】
ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜１２のいずれか１項に記載される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項２３】
プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的である請求項２２記載の核酸増幅法。
【請求項２４】
加熱および冷却を繰り返す請求項２２記載の核酸増幅法。
【請求項２５】
一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜１２のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
【請求項２６】
一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜１２のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンまたは／およびカリウムイオン、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエキソヌクレアーゼ活性が低減された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素を用いた核酸の増幅方法ならびに該方法に使用する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究が多くなされている。ＰＣＲ反応に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス(Thermusthermophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Tthポリメラ−ゼ) やサーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Taqポリメラーゼ)などが用いられてきた。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、核酸の取り込みの際の正確性に欠けたり、増幅効率が低いなどの問題がある。
【０００３】
また、超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ、WO92/09689、特開平5-328969号公報）、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ、特開平6-7160号公報）、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(KODポリメラーゼ、特開平7-298879号公報）なども知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これら超好熱始原菌由来のポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が存在し、核酸の取り込みの際の正確性は、ＴａｑポリメラーゼやＴｔｈポリメラーゼに比べて優れている。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは核酸の増幅効率が充分でないなどの問題がある。また、超好熱始原菌、例えばパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来のポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が存在し、ＰＣＲの反応時間、酵素量、プライマー濃度等の条件が狭いとの問題がある。
【０００５】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応の上記問題点は、エキソヌクレアーゼ活性が強すぎることに起因すると考えられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、このエキソヌクレアーゼに関して高度に保存されたアミノ酸領域が知られている（EXO I, EXO II, EXO III 、図１）。エキソＩ（ＥＸＯＩ）領域にはＸ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフが存在し、これらのアミノ酸、Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グルタミン酸）はエキソヌクレアーゼ活性に必須であることが知られている。これらのアミノ酸、ＤとＥを中性アミノ酸であるＡ（アラニン）に置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減させることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この場合は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が弱くなりすぎており、核酸の取り込みの際の正確性や増幅効率に問題があり、新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。
【非特許文献１】Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol.268, 1965-1975
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、該酵素のＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることを見い出した。更に、これら改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、従来からＰＣＲに使用されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性および増幅効率が優れていることを見いだし、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００８】
また、本発明は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミ酸を他のアミノ酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子である。
【０００９】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクターである。
【００１０】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞である。
【００１１】
本発明は上記遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼの製造法である。
【００１２】
本発明はＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法である。
【００１３】
本発明は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜１２のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、例えばパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡの合成速度や熱安定性を保持したまま、改変前の該酵素に比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させた改変型耐熱性酵素を作り出すことができた。また、ＤＮＡ合成速度が少なくとも２０塩基／秒であって、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間処理で１０％以上の残存活性を保持することができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、改変前の酵素に比べて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した酵素を用いることにより、改変前の酵素を用いるよりも増幅効率が上昇する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であって、Ｘ1ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフを含むエキソ１（ＥＸＯ１）領域を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、その起源を問わない。例えば、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ、パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。
【００１６】
本発明では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、改変前の酵素に比べて、９５％以下、好ましくは９０〜０％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が得られる。置換するアミノ酸の種類によって、種々の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られる。
【００１７】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、Ｘ1 、Ｘ2 およびＸ3 の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であり、さらに、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる。
【００１８】
また、本発明の別な実施態様としては、さらに下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
【００１９】
本発明の別な実施態様としては、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフのうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【００２０】
本発明では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ1 ＤＸ2 ＥＸ3 モチーフとしては、例えばＰｈｅＡｓｐＩｌｅＧｌｕＴｈｒがある。
【００２１】
本発明の一実施態様としては、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、９５％以下である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４０番目、第１４２番目および第１４４番目の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
【００２２】
本発明のさらに具体な例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４２番目のＸ2 （Ｉｌｅ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４４番目のＸ3 （Ｔｈｒ）をバリン（Ｖａｌ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００２３】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００２４】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム １５ｍＭ ジチオスレイトール １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０cpm/pmol〔 3Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
【００２５】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測定法は、５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム，1mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA,5 μg トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブにに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００２６】
本発明において、ＤＮＡ合成速度とは、単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(20mM Tris-HCl(pH7.5), 8mM塩化マグネシウム、7.5mM ジチオスレイトール、100 μg/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2μCi [α-32P]dCTP)を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム、10mM EDTA, 5% フィコール、0.05% ブロモフェノールブルー) を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求める。
【００２７】
本発明において、熱安定性とは、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。
【００２８】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、天然型ＫＯＤポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白工学的手法により、天然型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した新規な酵素を製造する方法がある。
【００２９】
変異を導入するためのＫＯＤポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、パイロコッカス(Pyrococcous) ｓｐ．ＫＯＤ由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子を用いた。
【００３０】
本発明の別な実施態様は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入して、天然型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下した新規な酵素を製造する。
【００３１】
天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも用いることができる。例えば天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異などの方法を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損されたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用いた in vivoでの変異の導入も可能である。本発明で使用したカメレオン site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン社製）とは、(1) 目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーと選択プライマーとアニーリングさせる。(2) 次にＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成を行った後、ライゲースにてライゲーション反応を行う。(3) 選択プライマー中に存在しないが、鋳型となるプラスミドに存在する制限酵素でプラスミドを切断し、変異の挿入されていないＤＮＡを切断する。(4) 次に残されたプラスミドで大腸菌を形質転換する。(5) 形質転換体から変異プラスミドを調製し、(3),(4) を繰り返し、目的とする変異の挿入されたプラスミドを得る方法である。
【００３２】
上記改変ポリメラーゼ遺伝子をベクターに挿入して、例えば大腸菌を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法は、公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば超音波処理やガラスビール破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素を熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。次に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、両者の活性比率を天然型ＫＯＤポリメラーゼを比較することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した酵素をスクリーニングすることができる。
【００３３】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後、硫安沈殿によりＫＯＤポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテク）ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一のバンドを示す程度に純化される。
【００３４】
本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することができる。プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、１方は他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返す。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、２価イオン、例えばマグネシウムイオンおよび１価イオン、例えばアンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液およびこれらのイオンを含むともに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤、例えばTriton X-100および緩衝液が存在していてもよい。
【００３５】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンまたは／およびカリウムイオン、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を用いて本発明を説明する。
参考例１
超好熱始原菌ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島にて単離した超好熱始原菌ＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、超好熱始原菌ＫＯＤ株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ) の保存領域アミノ酸配列に基づき、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' および5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3')を合成した。この２種のプライマーを使用し、調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。
【００３７】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡ断片をプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Ｋｂｐ）。さらに、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドｐＢＳ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物より大腸菌(E.coli JM109)を形質転換して、ライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーから、ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(E.coli JM109/pSBKOD1)を取得した。
【００３８】
取得したクローン株、(E.coli JM109/pSBKOD1)よりプラスミド、ｐＳＢＫＯＤ１を回収し、常法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１）。
【００３９】
完全なポリメラーゼ遺伝子を作成するため、２箇所の介在配列（１３７４〜２４５３ｂｐ：２７０８〜４３１６ｂｐ）をＰＣＲ融合法により取り除いた。ＰＣＲ融合法では、クローン株より回収したプラスミドを鋳型に、３組のプライマーを組み合わせて、各々ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を増幅した。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設計した。また、両端には別々な制限酵素サイト（Ｎ末端側：ＥｃｏＲＶ、Ｃ末端側：ＢａｍＨＩ）が創出されるように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中、構造上中央に位置する断片と、Ｎ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。また、同様に構造上、中央に位置する断片と、Ｃ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端にＥｃｏＲＶ、Ｃ末端にＢａｍＨＩサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクター、ｐＥＴ−８ｃのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用し、サブクローニングして、組換え発現ベクター（ｐＥＴ−ｐｏｌ）を得た。なお、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ｐｏｌは、生命工学工業研究所へ寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５１３）。
【００４０】
実施例１
ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子のサブクローニング
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドｐＥＴ−ｐｏｌからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。すなわちｐＥＴ−ｐｏｌを制限酵素、ＸｂａＩとＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断し、約２．３ｋｂのＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット（東洋紡製 Ligation high) を用いて、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）と連結した。次に、市販のコンピテントセル（東洋紡製 competent high JM109)を用いて形質転換を行った。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で３５℃で１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。さらに、部分塩基配列を確認してＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＫＯＤ１を得た。
【００４１】
実施例２
改変型遺伝子（ＩＮ）の作製および改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドｐＫＯＤ１を用いて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのうち、Ｘ2 のイソロイシンをアスパラギンに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した（ｐＫＯＤＩＮ）。作製はカメレオンsite-directed mutagenesisキット（ストラタジーン社製）を用いた。方法は取扱説明書に準じて行った。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号５に記載のプライマーを用いた。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）を得た。
【００４２】
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（MolecularCloning 、ｐ．Ａ．２に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの破砕緩衝液（10mMTris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に, 細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、 硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0), 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20, 0.1%ノニデットP40, 50%グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＮ）を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
【００４３】
（試薬）
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム １５ｍＭ ジチオスレイトール １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡＢ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０cpm/pmol〔 3Ｈ〕ｄＴＴＰＤ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
【００４４】
（方法）Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合後、上記熱処理液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４５】
実施例３
変異体（ＩＥ）遺伝子の作製および改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのうち、Ｘ2 のイソロイシンをグルタミン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＥ）。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号６に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＥ）を得た。
【００４６】
実施例４
変異体（ＩＱ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのうち、Ｘ2 のイソロイシンをグルタミンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＱ）。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号７に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＱ）を得た。
【００４７】
実施例５
変異体（ＩＤ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのうち、Ｘ2 のイソロイシンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＤ）。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号８に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＤ）を得た。
【００４８】
実施例６
変異体（ＴＶ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸ０１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのうち、Ｘ3 のチロシンをバリンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＴＶ））。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＴＶ）を得た。
【００４９】
実施例７
変異体（ＩＫ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのＸのうち、Ｘ2 のイソロイシンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＫ）。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＫ）を得た。
【００５０】
実施例８
変異体（ＩＲ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ1 ＤＸ2 ＥＸ 3モチーフのＸのうち、Ｘ2 のイソロイシンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＲ））。選択プライマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを用いた。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＲ）を得た。
【００５１】
実施例９
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の確認
上記実施例２〜８で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測定した。対照として、天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）を用いた。５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃),10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム, 1mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5μg トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブにに分注し、上記ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．５ユニット、１ユニット、１．５ユニット加えて、７５℃で１０分間反応させた。氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡを５０ｍｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、2%ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合した。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離した。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定した。図２R>２に各ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性とＤＮＡの分解率を示した。更に天然型のＫＯＤポリメラーゼとのエキソヌクレアーゼ活性の比を図３に示した。このように本発明によれば様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることを示した。天然型のＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対して、ＩＮは約９５％、ＩＥは約７６％、ＩＱは約６４％、ＩＤは約５２％、ＴＶは約４８％、ＩＫは約３０％、ＩＲは約０％の同活性を有していた。
【００５２】
実施例１０
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ
天然型ＫＯＤポリメラーゼまたは改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＮ，ＩＥ，ＩＱ，ＩＤ，ＴＶ，ＩＫ，ＩＲを用いて、ＰＣＲ反応を行った。５０ｍｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム, 1mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 1ng の制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたプラスミドpBR322、１０ピコモルの配列表１２、１３記載のプライマー）に各酵素を２．５ユニット加えてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用いた。また反応条件は９４℃、３０秒→６８℃、２分３０秒を２５サイクル行った。また、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡製）も同様にしてＰＣＲ反応を行った。ただし、反応液組成は（10mM Tris-HCl(pH8.8 at 25 ℃), 50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.2mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 1ng の制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたプラスミドpBR322、１０ピコモルの配列表１２および１３記載のプライマー）で行った。反応終了後、５ｍｌの反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約４．３kbのターゲットの増幅を確認した。図４にアガロースゲル電気泳動の結果を示した。この結果、改変型ＤＮＡポリメラーゼＩＮ，ＩＥ，ＩＱ，ＩＤ，ＴＶ，ＩＫ，ＩＲを用いてＰＣＲを行った場合、天然型のＫＯＤポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅であった。
【００５３】
実施例１１
改変型ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲでのＤＮＡ合成の正確性の測定
天然型のＫＯＤポリメラーゼ、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、ＩＲおよびＴａｑポリメラーゼについて、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の正確性を以下の方法にて測定した。プラスミドｐＵＲ２８８（Current Protocols in Molecular Biology 1.5.6に記載）を制限酵素ＳｃａＩで切断した。このプラスミドを１ｎｇ用いて実施例１０記載の方法と同様の方法にてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約5.３kbのターゲットの増幅を確認した。残りの反応液をフェノール／クロロホルム処理し、次にエタノール沈殿を行った。沈殿を乾燥後５０μｌのＨｉｇｈバッファー（50mM Tris-HCl(pH7.5),100mMNaCl,10mM MgCl2, 1mM DTT)に溶解した。さらに制限酵素ＳｃａＩ（東洋紡製）を１０ユニット加えて、３７℃で１６時間反応させた。アガロースゲル電気泳動にて目的の増幅産物を分離し、その部分のアガロースを切り出した。このアガロースからジーンクリーン２（BIO101社製）を用いてＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡ１０ｎｇを１０μｌになるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で希釈し、ライゲーションキット（東洋紡製 Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ）の反応液１０μｌを加えて１６℃で３０分間反応した。次に市販のコンピーテントセル（東洋紡製 competent high JM109) を用いて形質転換を行った。
【００５４】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（IPTG、ナカライテスク社製）、０．７％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ（ナカライテスク社製））を含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で３５℃で１６時間培養し、コロニーをカウントした。ｐＵＲ２８８にはｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）が存在する。従って、ＰＣＲ中のＤＮＡ合成が正確に行われた場合、上記寒天培地では青いコロニーを形成する。逆にＤＮＡ合成中に誤りが起こり、ｌａｃＺ遺伝子のコードするβ−ガラクトシダーゼ活性が低下あるいは欠失した場合、薄い青色ないしは白色のコロニーを形成する。この薄い青コロニーと白コロニーを変異コロニーとして、各酵素を用いた場合の変異率（％）を表１に示した。
【００５５】
【表１】
2006197947.tif 000002
【００５６】
表１に示したように、本発明で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、ＩＲは、天然型のＫＯＤポリメラーゼには劣るものの、Ｔａｑポリメラーゼより変異率が低く、すなわちＤＮＡ合成の正確性が高かった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソ（ＥＸＯ）領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】改変型ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性とＤＮＡ分解率を示す図である。
【図３】天然型ＫＯＤとのエキソヌクレアーゼ活性の比率を示す図である。
【図４】改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲの結果を示す図である。
【図１】
2006197947.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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