(57)【要約】【課題】本発明の課題は、フローインジェクション法による生体内試料などに含有されるグルコース等の生化学物質の含有量を測定する新規方法及び装置を提供【解決手段】γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼ等の酵素を担持した触媒を、スラリー状で導入手段に供給し、毛細管チューブ内に導いて、毛細管チューブの外側に設けられている永久磁石の作用により毛細管チューブ端部付近にとどめ置いた状態とし、次にグルコース等の生化学物質を含む分析対象液体試料を前記導入手段と同様か、又は異なる導入手段から供給し、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼ等の酵素を担持した触媒と接触させて、発生する過酸化水素等の生成物を電気化学的手段等の検出手段により検出し、試料中に含まれるグルコース等の生成物の含有量を決定する方法及び装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に液体流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法において、γ−酸化鉄（スピネル型酸化鉄でＦｅ３Ｏ４ − γ−Ｆｅ２Ｏ３系固溶体）を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒を、スラリー状で導入手段に供給し、毛細管チューブ内に導いて、毛細管チューブの外側に設けられている永久磁石の作用により毛細管チューブ内にとどめ置いた状態とし、次に分析対象物を含む液体試料を前記導入手段と同様か、又は異なる導入手段から供給し、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒と接触させて、生じる生成物を生成物検出手段により検出し、試料中に含まれる分析対象物の含有量を決定することを特徴とする、分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法。
【請求項２】
分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に液体流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法において、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒をスラリー状として導入する導入手段及びこの導入手段と同様か、又は異なる分析対象物を含む液体試料の供給手段、これら供給手段を介して接続されている毛細管チューブ、毛細管チューブの外側に設けられている永久磁石からなる、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒を毛細管チューブの管内にとどめる手段、毛細管チューブの端部に接続して設けられている生成物検出手段からなることを特徴とする、分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に流れ系で反応させて分析対象物の含有量を分析する装置。
【請求項３】
分析対象物がグルコースであり、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素作用により生じる生成物が過酸化水素であり、そして生成物検出手段が電気化学的検出手段である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分析対象物がグルコースであり、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素作用により生じる生成物が過酸化水素であり、そして生成物検出手段が電気化学的検出手段である、請求項２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生化学、薬学、臨床検査等の分野における分析対象液体試料中の生化学物質の分析法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、臨床検査などにおいて、血中や尿中の生化学物質を分析するためには液体クロマトグラフィーが主に用いられているが、分離のためのカラムは高価であり、またサンプル量も多く、臨床検査の費用や被検査者の負担を軽減するために極微量の試料を高感度に検出し、かつ使用に限界がきた時に容易に新しい分離剤に交換できる分析法及びこれをシステム化した分析装置が研究されてきた。微細な流体を用いる方法の研究が進められており、この方法では、磁性ビーズを用いる方法が研究されており、イムノアッセイ法において、酵素を担持したもの、オリゴヌクレオチド及び生化学物質親和性溶剤を用いる方法の研究がある（非特許文献１，２，３）。
これらのうちの非特許文献１の方法では、磁性ビーズが微細流れ送入マニホールド内又は非特許文献２では毛細管電気泳動装置内のどのような場所であっても留め置くことができるようになっており、この場合に狭い流路と低速の流れを用いる事が提唱されている。磁性ビーズはフリットを使用する必要はなく、固体相の交換を簡単に行なうことができる。酵素固定化微小反応器を用いることにより、反応率を向上させることができ、分析法に用いられる生化学物質を安定に取り扱うことに成功している（非特許文献４）。
酵素及び抗体生化学分子をナノメーターサイズのシリカコートされた磁鉄鉱内に捕捉して用いる方法が、ゾルゲル法を用いて調製され、これを用いてバッチ式蛍光分析法が開発された（非特許文献５）。
酵素を磁性微小粒体（ＮＭＰ）に固定化したフローインジェクション法による実験例も知られている（非特許文献６）。
また、グルコースを、グルコースオキシダーゼを細孔が制御された多孔性ガラスに担持したものを用いるフローインジェクション分析法がある。グルコースの含有量を検出するに当たっては、生成する過酸化水素をルミノールと反応させ、化学発光検出器を用いる方法も知られている（非特許文献７）。
又、過酸化水素の分析には電気化学的手段を用いることにより有効な分析が可能になることも知られている（非特許文献８、９、１０、１１）。
【非特許文献１】Pollema, C.H.; Ruzicka, J.; Christian, G.D.; Lernmark A. Anal.Chem., 1992, 64, 1356-1361.
【非特許文献２】Rashkovetsky, L.G.;Lyubarskaya, Y.V.; Foret F.; Hughes D.E.; Karger, B.L. J. Chromatogr.A. , 1997,781,197-204.
【非特許文献３】Choi, J.W.; Oh, K.W.;Thomas, J.H.; Heineman, W.R.; Halsall, H.B.; Nevin, J.H.; Helmicki, A.J.;Henderson, H.T.; Ahn, C.H. Lab Chip 2002, 2, 27-30.
【非特許文献４】Swindlehurst, C.A.;Nieman, T.A., Anal.Chim.Acta, 1988, 205, 195-205.
【非特許文献５】Thevenot, D.R.;Sternberg, R.; Coulet, P.R.; Laurent, J.; Gautheron, D.C., Anal.Chem., 1979, 51, 96-100.
【非特許文献６】Masoom, M.; Townshend,A., Anal.Chim.Acta, 1984, 166, 111-118.
【非特許文献７】Petersson, B.A., Anal.Chim.Acta,1988, 209, 231-237.
【非特許文献８】Murakami, K.; Kakemoto, M.; Harada, T.; Yamada, J., BunsekiKagaku, 1991, 40, 125-129.
【非特許文献９】Thevenot, D.R.; Sternberg, R.; Coulet, P.R.; Laurent, J.;Gautheron, D.C., Anal.Chem., 1979, 51, 96-100.
【非特許文献１０】Masoom, M.; Townshend,A., Anal.Chim.Acta, 1984, 166, 111-118.
【非特許文献１１】Petersson, B.A., Anal.Chim.Acta, 1988, 209, 231-237.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、フローインジェクション法による生体内試料などに含有されるグルコース等の生化学試料の含有量を、酵素を担持した磁性多孔質体を用いて測定する新規な方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前記課題について鋭意研究し、以下の手段により前記課題を解決できることを見いだした。
（１）酵素を固定化した磁性多孔質微小粒子からなる触媒をスラリー状で導入手段を経てフローインジェクションシステム装置内の毛細管チューブ内に供給し、永久磁石の働きにより検出部近傍に設けられた流路中に留めた状態とし、次に分析しようとする液体試料を供給し、触媒が留められている毛細管チューブ中で反応させて、反応生成物を検出して分析しようとする液体試料中に含まれる生化学物質の分量を決定する分析方法及び分析システムである。
（２）触媒として、酵素を固定化した磁性多孔質微小粒子を用いるものであり、多孔質微小粒子はシリカゲルからなり、該シリカゲルの平均粒径は５μｍ程度であり、平均細孔径は１０〜１００ｎｍ、好ましくは１５〜６０ｎｍ、最も好ましくは３０〜５０ｎｍであり、多孔質シリカゲルが高度な表面活性を有するものであり、かつ高度に酵素を担持したものを使用する。細孔内に酵素を固定化して担持させて該多孔質微小粒子を磁石による磁力でとどめるために用いる毛細管チューブの内径は０．０１〜２ｍｍ、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍ、最も好ましくは０．１〜０．３ｍｍである。本発明の流れ分析の流速は１〜２００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは２〜１００μＬ／ｍｉｎ、最も好ましくは３〜２０μＬ／ｍｉｎである。
【０００５】
本発明は以下の通りである。
（１）分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に液体流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法において、γ−酸化鉄（スピネル型酸化鉄でＦｅ３Ｏ４ − γ−Ｆｅ２Ｏ３系固溶体）を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒を、スラリー状で導入手段に供給し、毛細管チューブ内に導いて、毛細管チューブの外側に設けられている永久磁石の作用により毛細管チューブ内にとどめ置いた状態とし、次に分析対象物を含む液体試料を前記導入手段と同様か、又は異なる導入手段から供給し、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒と接触させて、生じる生成物を生成物検出手段により検出し、試料中に含まれる分析対象物の含有量を決定することを特徴とする、分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法。
（２）分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に液体流れ系中で反応させて分析対象物の含有量を分析する方法において、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒をスラリー状として導入する導入手段及びこの導入手段と同様か、又は異なる分析対象物を含む液体試料の供給手段、これら供給手段を介して接続されている毛細管チューブ、毛細管チューブの外側に設けられている永久磁石からなる、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに酵素を担持した触媒を毛細管チューブの管内にとどめる手段、毛細管チューブの端部に接続して設けられている生成物検出手段からなることを特徴とする、分析対象物を含む液体試料を、酵素を担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に流れ系で反応させて分析対象物の含有量を分析する装置。
本発明は好ましくは以下の通りである。
（３）分析対象物がグルコースであり、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素作用により生じる生成物が過酸化水素であり、そして生成物検出手段が電気化学的検出手段である、上記（１）に記載の方法。
（４）分析対象物がグルコースであり、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素作用により生じる生成物が過酸化水素であり、そして生成物検出手段が電気化学的検出手段である、上記（２）に記載の装置。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、微量の分析対象物を含有する液体試料を用いて、短時間に連続的に、かつ高感度に測定することができる方法及び装置が得られる。ここで使用される酵素担持磁性多孔質体は、使用の限界がきたら磁石を脱着して系外に排出することができ、また磁石を装着して磁性多孔質体を導入することにより、容易に新たなものに置き換えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
分析対象物がグルコースであり、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素作用により生じる生成物が過酸化水素であり、そして生成物検出手段が電気化学的検出手段である、本発明の好適な装置について図１により説明する。
γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持したものを、スラリー状として導入する導入手段（I1:スラリー導入用インジェクター）及びそのスラリー状流体の搬送手段（P1:送液ポンプ）が、毛細管チューブの端部に設けられている。
又、この導入手段とは相違して、グルコースを含む試料の導入手段（I2:サンプル導入用インジェクター）及びその試料の搬送手段（P2:シリンジ送液ポンプ）が、同じく、毛細管チューブの端部に設けられている。
毛細管チューブの端部のチューブの外側には、チューブを介して上下に永久磁石（Magnet）が設けられている。この永久磁石は、前記γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持したものを、支持体を全く用いずに毛細管内に分析操作中にとどめる役割を果たしている。
【０００８】
本発明の方法は、グルコースを含む試料を、グルコースオキシダーゼを担持した磁性シリカゲル多孔質担体からなる触媒の存在下に流れ系で反応させてグルコースの含有量を分析する方法である。
この方法では、グルコースを含む試料は、生化学、薬学、臨床検査、食品等の分野における分析対象となる試料であり、発酵製品、ヒトの尿などである。その他水溶液にすることができるものであれば、試料調製した後、分析対象とすることができる。適宜、試料中のグルコースが検出できる適当な濃度となる水溶液状に希釈して用いる。
【０００９】
この試料中に含まれるグルコースを触媒としてグルコースオキシダーゼの存在下に反応させ、生成する過酸化水素を発生させ、過酸化水素の発生量を電気化学的な手段により測定し、予め測定してある検量線の結果を参照して試料中のグルコースの含有量を算出する。
触媒は、磁性体であるγ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルを製造し、得られたγ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルに触媒となるグルコースオキシダーゼを担持して得られる。
【００１０】
シリカゲルは、平均粒径が２〜１００μｍの範囲のものが用いられる。比表面積としては２０〜８００m2/g、細孔容積は０．３０〜１．５ml/g程度の範囲のものが採用される。
シリカゲルをクエン酸エタノール溶液に浸漬し、超音波処理を施した後に硝酸第２鉄エタノ−ル溶液で処理し、窒素の存在下に焼成してγ−酸化鉄をシリカゲルの細孔内に堆積させる。γ−酸化鉄が細孔内に堆積させた構造として得られた事についてはＸ線解析により確認する。
次に、アミノプロピルトリエトキシシラン、グルタルアルデヒド溶液（２５％）、グルコースオキシダーゼを用いて、前報（Masoom, M.; Townshend, A., Anal.Chim.Acta, 1984, 166, 111-118.  Murakami, K.; Kakemoto, M.; Harada, T.; Yamada, J., Bunseki Kagaku, 1991, 40, 125-129.  Weibel, M.K.; Dritschilo, W.; Bright, H.J.; Humphrey, A.E., Anal. Biochem., 1973,52, 402-414.）に従い、以下の通りの方法により固定化を行なう。
前記によって得られたγ−酸化鉄を担持した磁性シリカゲルを、トルエンに溶解させたアミノプロピルトリエトキシシラン溶液中に添加し、攪拌を行ないつつ２時間還流下に加熱する。反応終了後、得られた懸濁液をガラスろ過器中におき、残ったアミノプロピルトリエトキシシラン溶液を真空ろ過器によりろ過する。次に溶剤で洗浄し、各々３回この操作を繰り返し、１昼夜かけて室温で真空下に乾燥させる。生成物をビーカーに取り、０．１モル/L燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の２重量％グルタルアルデヒド溶液２０ｍＬを添加し、室温で２時間その状態を保ち、懸濁液をガラスろ過器に入れて、残ったグルタルアルデヒド溶液を真空ろ過により除去する。生成物をビーカーに取り、２重量％のグルタルアルデヒドを含む０．１モル／L燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬを添加し、室温で２時間その状態を保った。
反応終了後、懸濁液をガラスろ過器に入れて、残ったグルタルアルデヒド溶液を真空ろ過により除去した。そして純水３０ｍＬで５回にわたり、洗浄した。生成物を再びビーカーにとり、２ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼを含む０．０３モル／Ｌ燐酸緩衝液を添加した。冷蔵庫内で４℃で８時間攪拌し、グルコースオキシダーゼを担持させた。反応終了後、懸濁液をガラスろ過器中に移し、真空ろ過により残っているグルコースオキシダーゼを除去した。３０ｍＬの純水で５回にわたり洗浄した。
【００１１】
多孔性シリカゲルの細孔内にγ-酸化鉄を担持し、次に細孔内にグルコースオキダーゼを担持して得られるグルコースオキダーゼ固定化微小磁性粒子（IＭＭＰ）を用いてフローインジェクション分析を行なう工程は以下の通りである。
液体流れ系をポリ４フッ化エチレン製毛細管チューブで形成し、Ｐ1送液ポンプ及びＰ２送液ポンプを有するように設置し、スラリー導入用インジェクターI1及びグルコース液体試料導入用インジェクターI２を設け、さらに端部に強力な永久磁石を毛細管チューブ外部に設置し、端部に電気化学的検出器を設置する。
Ｐ1送液ポンプを用いて、移動相の流量を調節して流れ系の安定化を図る。
次に、Ｐ２送液ポンプを用いて流量が前記移動相より遅い速度でスラリー導入用インジェクターI1から、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持した触媒を供給して、磁石部分に留めおいた状態に保つ。次にグルコースを含有する分析液体試料を試料導入用インジェクーＩ２から、Ｐ２送液ポンプの速度を変更して供給する。そして生成する過酸化水素を電気化学的検知器で測定する。検知器で標準物質を用いて予め測定した結果から作成した検量線に基づいて測定する試料の濃度を決定する。
触媒活性が減少した場合には触媒を流し去り、当初の手順に従って、分析を継続することができる。
【００１２】
以下に実施例により本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明の内容についてはこの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
シリカゲルの選択は以下の通りである。
本発明で用いられたシリカゲルは、富士シリシア化学株式会社製の製品であり、平均粒径は１０μｍであった。これを原料にして磁性体を製造することとした。
表１  原料シリカゲルの細孔構造について
2006029978.tif 000002
【実施例２】
【００１４】
スーパーミクロビーズシリカは、平均粒径が５μｍ、名目細孔径は３０ｎｍ、比表面積：１０３ｍ２／ｇ、細孔容積：１．１５ｍＬ／ｇ、平均細孔径：３０．１ｎｍの性状である。
これを購入し、グルコースオキシダーゼを担持させて磁性微小粒体（ＩＭＭＰ）を製造することとした。これについてシリカゲルの平均細孔径についてＢＥＴ法又は水銀圧入法による比表面積及び細孔容積を測定した。
【００１５】
細孔の内側にγ−酸化鉄を部分的に有する磁性シリカゲルを以下の手順に従って製造した。
表１に示されているシリカゲル微小粒子（０．５ｇ）を、クエン酸（３ｍＬ）の０．７５モル／Ｌ  エタノール溶液中に添加し、３０分にわたり超音波処理を行った。遠心分離機にかけて、シリカゲルを６０℃で１２時間にわたり乾燥させ、１モル／Ｌ  Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２０エタノール溶液（３ｍＬ）中で３０分間超音波処理を行った。遠心分離を行なった後に、再び同じ条件で再び乾燥させた。得られたシリカゲルはアルミニウム製皿に載せて、窒素気流中にて４００℃で１時間石英管中で焼成した。シリカゲルの色は黒褐色からオレンジ赤に直ちに変化した。アルミニウム製皿を石英管中から取り出して冷却した。ＣＥインストルメント（イタリア・ミラン）のＣＨＮ分析器ＥＡ１１１０を用いて元素分析を行なった。試料の磁化を室温で振動磁化測定器（ＴＭ-ＶＳＭ１５５０ＨＧＣ）（玉川製作所製（日本・仙台））を用いて、磁界範囲プラスマイナス１５ｋＯｅの条件下に測定した。細孔の内側に酸化鉄を担持したシリカゲルの粉状Ｘ線回析パターンを、ＣｕＫα照射を利用するＭａｃ科学株式会社製（日本・横浜）のＸ線回析計により記録した（図４）。電子顕微鏡写真を株式会社日立製作所（日本・東京）Ｓ−８００ＳＥＭ及び日立ＴＥＭを用いて撮影した。５７Ｆｅメスバウワースペクトル測定を前報（Iijima, S.; Nomura, A.; Mizukami, F.; Shin, S.; Mizutani, F., J. Radioanal. Nucl. Chem., 1999, 239, 297-302）に記載した定常加速器を用いて測定した（図５）。異性体シフト（isomer shift）が純鉄（α−Ｆｅ）を基準にして報告されている。
【００１６】
磁性化して焼成後の結果は以下の通りである。
表２  磁性化処理後のシリカゲルの細孔構造について
2006029978.tif 000003
【００１７】
表３    磁性化処理後のシリカゲルの細孔構造について
2006029978.tif 000004
【実施例３】
【００１８】
グルコースオキシダーゼIＭＭＰの調製
グルコースオキシダーゼIＭＭＰの調製法は以下の通りに行なった。
アミノプロピルトリエトキシシラン（株式会社チッソ製（日本・水俣））、グルタルアルデヒド溶液（２５％）（和光純薬株式会社（日本・大阪））、グルコースオキシダーゼ（アスペルギルス・ニガー由来）（アメリカ・セントルイス）を購入した。グルコースオキシダーゼの固定化の手順は、前報（Masoom, M.; Townshend, A., Anal.Chim.Acta, 1984, 166, 111-118.  Murakami, K.; Kakemoto, M.; Harada, T.; Yamada, J., Bunseki Kagaku, 1991, 40, 125-129.  Weibel, M.K.; Dritschilo, W.; Bright, H.J.; Humphrey, A.E., Anal. Biochem., 1973,
52, 402-414.）に従い、以下の通り行なった。
前記によって得られた磁性シリカゲル０．５ｇを、水冷却器を有する平底フラスコ中にとり、トルエン２０ｍＬに溶解させた１０重量％アミノプロピルトリエトキシシラン溶液中に添加した。そして、金属攪拌子により攪拌を行ないつつ２時間還流下に加熱した。反応終了後、得られた懸濁液をガラスろ過器中におき、残ったアモノプロピルトリエトキシシラン溶液を真空ろ過器によりろ過した。次にベンゼン３０ｍＬ及びジクロロメタン３０ｍＬで洗浄し、各々３回この操作を繰り返し、１昼夜かけて室温で真空下に乾燥させた。生成物をビーカーに取り、２重量％のグルタルアルデヒドを含む０．１モル／Ｌ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬを添加し、室温で２時間その状態を保った。
反応終了後、懸濁液をガラスろ過器に入れて、残ったグルタルアルデヒド溶液を真空ろ過により除去した。そして純水３０ｍＬで５回にわたり、洗浄した。生成物を再びビーカーにとり、２ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼを含む０．０３モル／Ｌ燐酸緩衝液を添加した。冷蔵庫内で４℃で８時間攪拌し、グルコースオキシダーゼを担持させた。反応終了後、懸濁液をガラスろ過器中に移し、真空ろ過により残っているグルコースオキシダーゼを除去した。３０ｍＬの純水で５回にわたり洗浄した。磁性シリカゲル、未処理シリカゲル７種類に対して同様な手順によってグルコースオキシダーゼを担持した。得られた性状は以下の通りであった。
【００１９】
表４    磁性多孔性シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持した触媒の性状
2006029978.tif 000005
【００２０】
グルコースオキシダーゼIＭＭＰによるグルコース濃度を分析するためのフローインジェクション法の手順
図１に示した装置を用いてフローインジェクション法によるグルコースオキシダーゼIＭＭＰによるグルコース濃度の測定を以下により行なった。
平均粒径５μｍ及び平均細孔径３０ｎｍのシリカゲル（比表面積：１０３ｍ３／ｇ、細孔容積：１．１５ｍＬ／ｇ、平均細孔径：３０．１ｎｍ）に、γ-酸化鉄を担持し、次にグルコースオキシダーゼを担持して得られるグルコースオキシダーゼIＭＭＰを用いた。試料となるβ−Ｄ−グルコースをＣａｒｌｏ  Ｅｒｂａ社から購入した。過酸化水素はＢｅｌ社より購入した。これは過マンガン酸カリウムを用いるものである。
Ｐ1送液ポンプは、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ＰＭ８０（ＢＡＳ社（アメリカ・ウエストラファイエット））のより流量の多いものを対象とするものである。
Ｐ2送液ポンプは、ＢＥＥシリンジポンプ（ＢＡＳ社製）のより流量の少ないものを対象とするものである。
電気化学的検出器は、ＢＡＳ社製のＬＣ４Ｂ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒである。これは、+１．０００Ｖで釣り合いを保たれているガラスカーボン電極である。
スラリー導入用インジェクター（I1）は、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  Ｔｙｐｅ７１２５インジェクタ−２０μＬサンプルループである。
グルコースを含む試料の導入手段（I2）は、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  Ｔｙｐｅ７１２５（ｉ）であり、２μＬサンプルループである。
導入手段に接続する毛細管チューブは、ポリ４フッ化エチレン（商標名テフロン）製毛細管チューブ（内径０．１７ｍｍ×長さ９０ｍｍ  外径１／１６’’）を使用した。
フローインジェクション中に移動相は、ｐＨ４．５に調整された０．１モル／Ｌ燐酸緩衝液であった。
永久磁石は、φ６×５ｍｍのＮｄ-Ｆｅ-Ｂ磁石（ネオヂ磁石  Ａｓ  Ｏｎｅ株式会社（日本・大阪）製を使用した。１対の磁石が鉄製の連結支持部により接合されている構造であり、１対の磁石の間隔は、前記毛細管チューブ（外径１６’’）の外径と同じである。これにより、毛細管チューブは磁石に固定されている（図２）。磁石の磁力密度を、１対の磁石の中央部分で測定した結果は、８．６５ｋＧであった（ガウス／テスラ  メータ  モデル５０８０（ＳＹＰＲＩＳ（アメリカ・オーランド））を使用した）。
磁石を固定しているポリ４フッ化エチレン製毛細管チューブは、外径１／１６ ’’、内径０．２５ｍｍ及び長さ１５０mmであった。
スラリ−の濃度（スラリー導入用インジェクター（I1）を介して供給されるものであり、２０μＬサンプルループを有するもの）は、１０μｇ／μＬグルコースオキシダーゼ１ＭＭＰであった。かくして、グルコースオキシダーゼ１ＭＭＰが０．２ｍｇで供給された。
Ｐ1送液ポンプを用いて、移動相の流量を１００μＬ／ｍｉｎに調節して流れ系の安定化を図った後、Ｐ２を用いて流量が毎５０μＬ／ｓｅｃで、スラリー導入用インジェクター（I1）から、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持した触媒を供給して、磁石部分に留めおいた。次にグルコースを含有する分析液体試料の流量を調整した。流量については、いくつかの実験例の結果から、グルコースオキシダーゼIＭＭＰの流量は５μＬ／ｍｉｎが適切であることがわかった（図５）。グルコースオキシダーゼIＭＭＰ、グルコース及び過酸化水素溶液による変換率を適切な値とするために、移動相と同じ溶媒を用いた。磁石によりγ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持した触媒を留め置いた後に、電気化学的検出器のベースラインを安定化した後、Ｉ１を定められた位置に固定化し、グルコースをＩ２インジェクションバルブから導入した（凡そ１μＬ）。
又、この導入手段とは相違して、グルコースを含む試料の導入手段（I2:サンプル導入用インジェクター）及びその試料の搬送手段（P２）が、同じく、毛細管チューブの端部に設けられているものを、スラリー状で導入手段に供給し、毛細管チューブ内に導いて、毛細管チューブの端部のチューブの外側に設けられている永久磁石の作用により毛細管端部付近にとどめ置いた状態とし、次にグルコースを含む試料を前記導入手段と異なる導入手段から供給し、γ−酸化鉄を細孔内に担持した微小多孔質シリカゲルにグルコースオキシダーゼを担持したものと接触させて、発生する過酸化水素を電気化学的手段（ＢＡＳ社製のＬＣ４Ｂ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）により計測した。結果は図６である。
以上の結果から、グルコースオキシダーゼIＭＭＰの流量は５μＬ／ｍｉｎである。グルコース液体試料（２μＬ）において、２．５×１０−６モル／Ｌから５．０×１０−４モル／Ｌ（Ｒ＝０．９９９５）で直線であり、検知限界は、注入されたグルコースに対して１．０×１０−６モル／Ｌ、０．３６ｎｇ（Ｓ／Ｎ＝３）であった。５×１０−４モル／Ｌのグルコース濃度に対してＲＳＤ＝１．４８％（ｎ＝＆）であった。触媒の安定性は良好であり、１０℃冷蔵庫に保管し、６ヶ月以上に渡り活性を維持していた。
【実施例４】
【００２１】
このフローインジェクション法は発酵培地中のグルコースの活性測定にも適用できることを証明するために以下のような実験を実施した。酵母抽出物を基にした発酵培地ＹＥＰＧ  １０ｇ／Ｌ（メルク社製（ドイツ・ダルムシュタート））、大豆かす由来のペプトン１０ｇ／Ｌ（メルク社製（ドイツ・ダルムシュタート））、およびＤ−グルコース７５ｇ／Ｌ（メルク社製（ドイツ・ダルムシュタート））をそれぞれ２０℃で保存しておいたものを解凍し、移動相によって１０４倍に希釈してからフローインジェクション・マニホールドへ導入した。グルコースの活性測定は標準添加法により行った。流速は５０μ／ｍｉｎに調整した。グルコースの活性濃度は７２．５８ｇ／Ｌであり、この値はＣＯＢＡＳ  ＩＮＴＥＧＲＡ装置（ロッシュダイアグノスティックス社製（スイス・バーゼル））を使用する比較実験法の値７２．５３ｇ／Ｌに合致しており、本法の生化学分野への実用化の可能性が証明された。
【符号の説明】
【００２２】
P1  送液ポンプ  
P2    シリンジ送液ポンプ  
I1    スラリー導入用インジェクター  
I2    サンプル導入用インジェクター  
D    検出器
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の装置の概略を示す図
【図２】本発明で用いた永久磁石の状態を示す図
【図３】磁性シリカゲルの分析図
【図４】磁性シリカゲルの分析図
【図５】グルコースを含有する試料の流量に対する反応率を示す図
【図６】過酸化水素の反応による応答の状態を示す図
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図４】
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