(57)【要約】【課題】    測定範囲を広げ、更に低濃度域の測定をより高感度化するラテックス凝集法を提供すること。【解決手段】  感作ラテックス粒子を用いたラテックス凝集法により被検抗原を測定する方法は、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を用い、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体で感作され、各ラテックス粒子上に感作される抗体の純度は、特定の範囲内にあり、小ラテックス粒子１個当たりに感作される抗体の量と大ラテックス粒子１個当たりに感作される抗体の量の比、大ラテックス粒子の平均粒径、小ラテックス粒子の平均粒径、抗原抗体反応系中の大感作ラテックス粒子の濃度、反応系中の小感作ラテックス粒子の濃度が特定の範囲にあり、大感作ラテックス粒子及び小感作ラテックス粒子を緩衝液中に浮遊させた状態で被検抗原と反応させ、次いで、感作ラテックス粒子の凝集を光学的に測定することを含む。【選択図】  図３Ａ
2006071297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感作ラテックス粒子を用いたラテックス凝集法により被検抗原を測定する方法であって、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を用い、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片で感作され、各ラテックス粒子上に感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、前記小ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量は、前記大ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量の０．５〜１０重量％であり、前記大ラテックス粒子の平均粒径は0.15〜0.29μｍであり、前記小ラテックス粒子の平均粒径は0.05〜0.10μｍであり、抗原抗体反応系中の前記大感作ラテックス粒子の濃度が0.01〜0.04w/v%、反応系中の前記小感作ラテックス粒子の濃度が0.05〜0.2w/v%になるように前記大感作ラテックス粒子及び前記小感作ラテックス粒子を緩衝液中に浮遊させた状態で前記被検抗原と反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を光学的に測定することを含む、ラテックス凝集法による抗原の測定方法。
【請求項２】
前記大ラテックス粒子には、吸着等温１００％ライン上の最大吸着量の８５％ないし１２０％の量の前記抗体又はその抗原結合性断片が感作される請求項１記載の方法。
【請求項３】
緩衝液中に、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を含み、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片で感作され、各ラテックス粒子上に感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、前記小ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量は、前記大ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量の０．５〜１０重量％であり、前記大ラテックス粒子の平均粒径は0.15〜0.29μｍであり、前記小ラテックス粒子の平均粒径は0.05〜0.10μｍである、ラテックス凝集法による抗原の測定用試薬。
【請求項４】
前記大ラテックス粒子には、吸着等温１００％ライン上の最大吸着量の８５％ないし１２０％の量の前記抗体又はその抗原結合性断片が感作される請求項２記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックス凝集法による抗原の測定方法及びそのための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラテックス粒子を利用した免疫測定法は、血清、血漿、尿などの体液に含まれる抗原性物質の定量方法として臨床検査に応用され、自動分析装置を用いることにより簡便・迅速に測定が行えるため広く普及している。
【０００３】
近年は、さらなる測定性能の向上を目的とした応用技術が提案されている。例えば、少なくとも２つの異なった量の同一抗体が負荷された２種の異なったサイズ範囲のラテックス粒子を用いる試薬（特許文献１）や平均粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子に抗体を感作して用いる測定法（特許文献２）によれば広い濃度範囲に及ぶ測定が可能となる。平均粒子径が単一の不溶性担体粒子にポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を併せて用いる方法（特許文献３）によれば、同様な効果が得られる。また、低反応性の抗体をコーティングさせた小さい粒径の粒子と高反応性の抗体をコーティングさせた大きい粒径の粒子を用いる測定法（特許文献４、特許文献５）などが提案されている。さらに、非特許文献１及び非特許文献２には、大小２種類の担体粒子を用い、平均粒径の小さな担体粒子には反応速度の小さなモノクローナル抗体を感作し、平均粒径の大きな担体粒子には反応速度の大きなモノクローナル抗体を感作した感作粒子混合物を用いて凝集法により免疫測定を行うことが記載されている。
【０００４】
しかしながら、これらの文献に記載された方法では測定可能な濃度範囲が狭く、高濃度領域の測定が困難であるという問題を有している。
【０００５】
【特許文献１】特公昭６３−１４７８３号公報
【特許文献２】特許第２５８８１７４号掲載公報
【特許文献３】特開平１０−９０２６８号公報
【特許文献４】特開平１１−１０８９２９号公報
【特許文献５】特許第３５１３０７５号掲載公報
【非特許文献１】Journal of Clinical Laboratory Analysis 12:137-144 (1988)
【非特許文献２】医学と薬学  ４２（５）：７８１−７８８，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
臨床検査における免疫血清検査項目では、低濃度域に臨床的な判定を下すための重要なポイントを持つものが多く、低濃度域の測定精度が検査結果を左右する大きな要因になっていることは明らかである。粒子径の異なる複数のラテックスを複合して用いる技術は、特許文献２、特許文献４及び特許文献５に示されるとおり、単一の粒子を用いる場合に比べて測定範囲は広くすることができ、低濃度域の測定も可能となるが、測定精度の面では更なる向上がのぞまれる。測定精度の向上には、測定系の高感度化が有効であるが、従来の技術において測定系を高感度化することが測定範囲の縮小をもたらしてしまうことは、特許文献２に記載されているとおりである。また、非特許文献１及び非特許文献２に記載された方法では高濃度域の測定が困難であり、測定範囲が狭くなっている。
【０００７】
従って、本発明の課題は、測定範囲を広げ、更に低濃度域の測定をより高感度化するラテックス凝集法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、大小２種類のラテックス粒子群を用い、平均粒径の大きなラテックス粒子（大ラテックス粒子）には最大の反応速度が得られる量又はそれに近い量の抗体量を感作した（担持させた）抗体感作ラテックス粒子と、平均粒径の小さなラテックス粒子（小ラテックス粒子）には反応速度を遅くするために通常用いる量よりも少ない量の抗体を感作した抗体感作ラテックス粒子との混合物であって、大小の粒子の平均粒径、それらの反応系中の濃度を最適化することにより、従来法よりも低濃度域の測定を高感度化することができ、更に高濃度域の測定幅を広げられることを見出し、本発明法を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、感作ラテックス粒子を用いたラテックス凝集法により被検抗原を測定する方法であって、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を用い、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片で感作され、各ラテックス粒子上に感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、前記小ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量は、前記大ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量の０．５〜１０重量％であり、前記大ラテックス粒子の平均粒径は0.15〜0.29μｍであり、前記小ラテックス粒子の平均粒径は0.05〜0.10μｍであり、抗原抗体反応系中の前記大感作ラテックス粒子の濃度が0.01〜0.04 w/v%、反応系中の前記小感作ラテックス粒子の濃度が0.05〜0.2w/v%になるように前記大感作ラテックス粒子及び前記小感作ラテックス粒子を緩衝液中に浮遊させた状態で前記被検抗原と反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を光学的に測定することを含む、ラテックス凝集法による抗原の測定方法を提供する。また、本発明は、緩衝液中に、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を含み、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片で感作され、各ラテックス粒子上に感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、前記小ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量は、前記大ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量の０．５〜１０重量％であり、前記大ラテックス粒子の平均粒径は0.15〜0.29μｍであり、前記小ラテックス粒子の平均粒径は0.05〜0.10μｍである、ラテックス凝集法による抗原の測定用試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、低濃度域の高感度測定と高濃度域測定範囲の拡大が可能となり、免疫血清検査等において臨床的な判断を下すために重要である低濃度域の測定精度を向上させ、より正確な判定が可能な免疫測定法及び該測定法に用いる試薬が確立された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法において用いられるラテックス粒子には、測定しようとする抗原と抗原抗体反応する抗体（以下、「特異抗体」と呼ぶ）又はその抗原結合性断片が感作（担持）されている。ここで、特異抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体に代えて、FabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書及び特許請求の範囲において「抗原結合性断片と呼ぶ）を感作してもよい。
【００１２】
ラテックス粒子上に感作される特異抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、好ましくは１６重量％以上である。この純度が１４重量％未満であると、抗原の低濃度域の測定で十分な測定感度が得られない。例えば、一般に、ポリクローナル抗体は、抗原を動物に注射して一定期間経過したのち血液を採取して、これを出発材料としてプロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法などにより抗体の精製を行うが、抗原と抗原抗体反応する特異抗体成分以外にその他の免疫グロブリンなどが含まれる。本発明では、抗体液中の総タンパク量（mg/mL）に対する特異抗体量（mg/mL）の割合（純度）が重要であり、１４重量％以上の特異抗体量が含まれる抗体（抗体液）が好ましく使用できる。また、モノクローナル抗体は、特異抗体を産生するハイブリドーマをマウスの腹腔中や培養装置中で増やし、特異抗体が含まれる腹水や培養液を出発材料として同様に精製を行なった抗体（抗体液）が使用でき、抗体液中の総タンパク量（mg/mL）に対する特異抗体量（mg/mL）の割合はポリクローナル抗体と同様１４重量％以上の抗体（抗体液）が好ましく使用できる。
【００１３】
抗体液中の総タンパク量（mg/mL）は、一般的に公知である波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定する方法を用いて測定でき、特異抗体量（mg/mL）は、常法であるBecker法(免疫実験操作法Ａ  １６４―１７１頁  １９７６年  日本免疫学会発行、原著  Becker W.：Immunochemistry, 6：539-546, 1969）により測定できる。
【００１４】
本発明の方法では、平均粒径の異なる大小２種類のラテックス粒子群が用いられる。平均粒径が大きい方のラテックス粒子（大ラテックス粒子）の平均粒径（直径）は、0.15〜0.29μｍであり、好ましくは０．２０〜０．２９μｍである。大ラテックス粒子の平均粒径がこの範囲内にあると、低濃度域での測定感度が高くなる。一方、平均粒径が小さい方のラテックス粒子（小ラテックス粒子）の平均粒径（直径）は、0.05〜0.10μｍであり、好ましくは０．０６〜０．０８μｍである。小ラテックス粒子の平均粒径がこの範囲内にあると、高濃度域での正確な測定が可能になり、測定可能な濃度範囲が高濃度側に広がる。
【００１５】
ラテックス粒子は、従来から広く用いられている、例えばポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを用いることができる。
【００１６】
前記大小のラテックス粒子には、同一の特異抗体又はその抗原結合性断片が感作される。特異抗体又はその抗原結合性断片をラテックス粒子に感作する方法は周知の常法により行うことができる。例えば、特異抗体又はその抗原結合性断片の溶液にラテックス粒子を浮遊させて撹拌することにより物理的に吸着させることができる。
【００１７】
本発明では、小ラテックス粒子１個当たりに感作される特異抗体又はその抗原結合性断片の量（平均）は、大ラテックス粒子１個当たりに感作される特異抗体又はその抗原結合性断片の量（平均）の０．５〜１０重量％である。ラテックス粒子には抗体量を少なく感作することで、反応速度を遅くすることができるので、反応のタイムコース成績から最適な抗体量を選択することができる。このことにより検量線が高濃度側に伸び、高濃度域での正確な測定と、測定可能な濃度範囲を高濃度側に広げることができる。なお、粒子に感作する特異抗体又はその抗原結合性断片の量は、緩衝液を用いて特異抗体又はその抗原結合性断片を希釈することにより任意に調節することができる。なお、上記の範囲内での最適な感作量は、測定すべき抗原の種類や測定の目的、測定範囲、抗体の力価等により特異抗体又はその抗原結合性断片量を適宜選択することができる（下記試験例参照）。
【００１８】
一方、ラテックス粒子に吸着した抗体量が多いほど反応速度が速く、また粒径が大きいほど反応速度が速くなるので、大ラテックス粒子にできるだけ多量の特異抗体又はその抗原結合性断片を感作することにより低濃度域での測定感度が高くなる。従って、大ラテックス粒子に感作される特異抗体又はその抗原結合性断片の量は、できるだけ多い方が好ましく、すなわち、吸着等温１００％ライン上の最大抗体吸着量の８５％〜１２０％が好ましく、さらに好ましくは９５％〜１２０％である。もっとも、測定すべき抗原の種類や測定の目的、測定範囲、抗体の力価等により特異抗体又はその抗原結合性断片量を適宜選択することができる。吸着等温１００％ライン上の最大抗体吸着量は、界面化学の分野において周知な吸着等温線の考えから容易に求めることができ、この方法は、例えば、Microparticle Reagent Optimization, Seradyn,Inc.1994に記載されている。また、以下に更に詳しく説明する。
【００１９】
吸着等温線で示される１００％ライン（吸着等温１００％ライン）上の最大吸着量は、具体的に次のようにして求められる。すなわち、感作時のラテックス粒子１ｍｇ当たりの添加タンパク量（μｇ）(感作前タンパク量（μｇ）)をＸ軸に、感作後にラテックス粒子１ｍｇ当たりの吸着タンパク量（μｇ）を測定してＹ軸にプロットし吸着等温線のグラフを作成する。次に、Ｙ＝Ｘの直線（吸着１００％ライン）を引き、吸着１００％ライン上の最大吸着量を求める。これらをより分かり易く説明するためにグラフ化し図４に示す。なお、ラテックス粒子１ｍｇ当たりの吸着タンパク量（μｇ）は、感作後の遠心上清を０．１μｍフィルターユニット（ULTRAFREE-ＭＣ  ミリポア社）を用いて濾過した後のタンパク量（μｇ）を測定し、感作前タンパク量（μｇ）から差し引いて求める。吸着率（％）は、次の式で求められる。
【００２０】
【数１】
2006071297.tif 000003
【００２１】
本発明の方法では、大小の感作ラテックス粒子の反応系中での濃度は、大感作ラテックス粒子の濃度が0.01〜0.04w/v％、小感作ラテックス粒子の濃度が0.05〜0.2w/v％である。大小の感作ラテックス粒子の濃度がこの範囲内にあると、低濃度域の高感度測定と高濃度域測定範囲の拡大がよりよく達成される。
【００２２】
ラテックス凝集法自体は、従来と全く同様にして行うことができる。すなわち、検体と上記大小の抗体感作ラテックス粒子を緩衝液中に分散させたものとを混ぜ、抗原抗体反応による凝集を光学的に測定することにより行うことができる。光学的な測定は、例えば、プラスチックやガラス製のセル内で抗体感作ラテックスと検体を混合すると、測定しようとする抗原物質が検体中に存在する場合、抗体感作ラテックスは抗原抗体反応により凝集するので、このときセル外部より０．３〜２．４μｍの波長から選ばれる適当な波長の光を照射して吸光度変化を測定することにより検体中に存在する目的抗原物質を測定することにより行うことができる。吸光度変化は、例えば、抗原抗体反応開始６０秒後から９０秒後の吸光度の変化を測定することにより測定することができる。もっとも、測定時間はこれに限定されるものではなく、反応の比較的初期の任意の時間における吸光度等の変化を測定することにより測定することができる。抗体感作ラテックスの抗原抗体反応による凝集速度は、検体中の抗原濃度と相関するので、既知の抗原濃度の標準液をいくつか作製して反応を行い、凝集速度を測定して検量線を作成しておき、検体中の抗原濃度は、測定された凝集速度をその検量線にあてはめることにより知ることができる。反応温度は、特に限定されないが、通常３７℃程度が好ましい。
【００２３】
本発明の方法により測定することができる抗原は何ら限定されるものではなく、それに対応する抗体を作製することができるあらゆる抗原が本発明の方法により測定可能である。例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような疾病マーカーとなるタンパク質、細菌やウイルスのような病原体等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、検体も何ら限定されるものではなく、血清、血漿、尿、咽頭拭い液などの体液や培養液、飲食物又はその抽出液などを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。なお、体液等をそのまま用いた場合に抗原濃度が高すぎて正確な測定が困難な場合には、体液等を生理食塩液を用いて希釈したものを検体として用いることができることは云うまでもない。
【００２４】
本発明は、さらに、上記本発明の方法に用いられる試薬をも提供する。すなわち、本発明は、緩衝液中に、平均粒径が異なる大小２種類のラテックス粒子群を含み、各ラテックス粒子は、被検抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片で感作され、各ラテックス粒子上に感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の純度は、ラテックス粒子上に担持される総タンパク量を基準にして１４重量％以上であり、前記小ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量は、前記大ラテックス粒子１個当たりに感作される前記抗体又はその抗原結合性断片の量の０．５〜１０重量％であり、前記大ラテックス粒子の平均粒径は0.15〜0.29μｍであり、前記小ラテックス粒子の平均粒径は0.05〜0.10μｍである、ラテックス凝集法による抗原の測定用試薬をも提供する。
【００２５】
本発明は、反応速度を遅くした小感作ラテックス粒子を用いることにより、検体中の抗原性物質をその含有濃度に応じて効果的に捉えることを可能とし、測定の精度を向上させるものである。一方、検体中の抗原性物質の濃度が非常に希薄な場合には、大感作ラテックス粒子が優先的に抗原物質を捉えることで凝集を起こし、反応は僅かでも大きい光学的変化として捉えられる。検体中の抗原物質の濃度が高い場合には、反応速度の速い大ラテックス粒子上の抗体は急速に消費されるため大感作ラテックス粒子は瞬時に凝集してしまうが、反応速度の遅い小感作ラテックス粒子はゆっくりと反応を持続することで小感作ラテックス粒子の凝集反応が維持され、光学的変化を抑えて反応を継続させることができる。本発明は、これらの効果により測定範囲を拡大し、しかも低濃度域の測定をより高感度化することを可能とする測定方法である。さらに、本発明では、最適化抗体量を担時させた大小のラテックス粒子の平均粒径、それらの反応系中の濃度比率を最適化することにより、測定範囲を拡げると共に低濃度域の測定をより高感度化することがとくに良好に達成される。
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１    ＣＲＰの測定
抗ＣＲＰウサギポリクローナル抗体（特異抗体量（mg/mL）が抗体液中の総タンパク量（mg/mL）に対して１７％含有される抗体液）を粒子径０．２８μｍポリスチレンラテックス粒子、および０．０６μｍポリスチレンラテックス粒子に感作し、グリシン緩衝液中に分散浮遊し試薬を調製した。すなわち、試薬は、緩衝液（ＭＥＳ  ５０ｍＭ  pH ６．０，  MES:2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)中で抗体とポリスチレンラテックス粒子の規定量を混合し、室温で60分間十分に撹拌することにより感作を行い、その後、遠心操作により上清を除き、ウシ血清アルブミンを含むグリシン緩衝液によりポリスチレンラテックス粒子表面の抗体未感作部分のブロッキングを施し再び遠心操作により抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を集め、グリシン緩衝液中にラテックス粒子をソニケーシヨンを行って充分に分散浮遊させることにより調製した。
【００２８】
試薬は、０．２８μｍポリスチレンラテックス粒子に吸着等温線で示される吸着１００％ライン上の最大吸着量の１２０％の抗体量を感作したもの1種類、および０．０６μｍポリスチレンラテックス粒子に０．２８μｍポリスチレンラテックス粒子１個当たりに感作した抗体量の２．２９、１．６１、ならびに１．４５重量％を感作した3種類を調製した。
【００２９】
また、抗体の感作量は、具体的に次のようにして制御した。すなわち、抗体は、緩衝液（ＭＥＳ  ５０ｍＭ  pH６．０）を用いて規定の感作量に合うように予め希釈してから感作を行った。
【００３０】
混合前の各粒子の試薬
本発明の実施例として、２．２９、１．６１、ならびに１．４５重量％の抗体量を感作した上記０．０６μｍ粒子を粒子濃度が０．１７５％（W/V）となるようにグリシン緩衝液中に浮遊したものを調製し、それぞれ試薬１、試薬2ならびに試薬3とし、抗体感作０．２８μｍ粒子を粒子濃度が０．０４％（W/V）となるようにグリシン緩衝液中に浮遊したものを調製し、試薬４とした。
【００３１】
混合粒子の試薬
抗体感作０．２８μｍ粒子と１．６１重量％抗体感作０．０６μｍ粒子（試薬２に用いたものと同じ粒子）をそれぞれの粒子濃度が０．０４％（W/V）と０．１７５％（W/V）となるようにグリシン緩衝液中で混合したものを調製し、本発明試薬とした。本発明の比較例として、特許文献５に記載された方法により調製した試薬を比較例試薬として用いた。測定用試料として、ヒトＣＲＰ精製抗原を正常ヒト血清で希釈して調製したＣＲＰ標準品を用いた。ＣＲＰ標準品は、血漿蛋白国際標準品ＣＲＭ４７０に準拠して値付けされたもので、０．２５，０．５，１，２，４，８，１６，３２，４８，６７，１００ｍｇ／ｄＬを用意した。０ｍｇ／ｄＬとして生理食塩液を使用した。生化学検査用自動分析装置ＴＢＡ−８０ＦＲ（東芝製）を用い、次の条件パラメータにて測定を行った。すなわち、測定検体量３μＬに対し、第１試薬としてグリシン緩衝液を１５０μＬ、第２試薬として調製した試薬を１５０μＬ加え、反応開始（第２試薬添加後）後、測光点２１−測光点２７間における１分間あたりの吸光度変化（△ABS／mim）を波長５７２ｎｍで測定する設定とした。△ABS／mim×１０,０００を吸光度変化量とした。
【００３２】
試験例１
試薬１、２ならびに３を用いてＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示す検量線を作成した。これを図１に示す。図１に示されるように、試薬１では、反応速度が速いため、検量線は４８ｍｇ／ｄＬまでしか伸びがない。試薬２では、試薬１より反応速度が遅くなったため、検量線は１００ｍｇ／ｄＬまで伸びている。試薬３では、反応速度が遅くなり過ぎたことにより検量線の立ち上がりが低く、また、反応に必要な抗体量が不足するために検量線は６７ｍｇ／ｄＬまでしか伸びがない。この成績から、試薬２を用いれば検量線が高濃度側に伸び、高濃度域での正確な測定と、測定可能な濃度範囲を高濃度側に広げることができることが分かる。すなわち、抗体感作ラテックス粒子に吸着した抗体量を少なくして反応を遅くすることによる効果は明らかである。
【００３３】
試験例２
試薬４を用いてＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示す検量線を作成した。これを図２Ａならびに図２Ｂに示す。図２Ｂは、図２ＡのＣＲＰ濃度０〜２ｍｇ／ｄＬの範囲を拡大したものである。検量線は、０〜０．２５ｍｇ／ｄＬまでの低濃度域でよく伸びており、測定感度が高いことが分かる。しかしながら、抗体が瞬時に反応してしまうため高濃度域までの検量線の伸びはない。
【００３４】
試験例３
本発明試薬ならびに比較例試薬を用いてＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示す検量線を作成した。これを図３Ａならびに図３Ｂに示す。図３Ｂは、図３ＡのＣＲＰ濃度０〜８ｍｇ／ｄＬの範囲を拡大したものである。本発明試薬での成績は、低値域０〜２mg/dLにおいて比較例試薬より高感度に検出でき（図３Ｂ参照）、また、高値域では、比較例試薬が６７mg/dLまでしか測定できないのに対して、本発明試薬では１００mg/dLまで測定できる（図３Ａ参照）。図３Ａならびに図３Ｂに示されるように、本発明試薬は、比較例試薬に比べ、ＣＲＰ濃度低値域を高感度で測定でき、更に、高濃度域まで測定できることが分かる。また、図１の試薬２と図３Ａの本発明試薬の２つの検量線を比べて見ると本発明試薬は試薬２よりも更に高値側６７〜１００mg/dLの吸光度変化量が大きくなり、２粒子の混合による吸光度変化量増幅にも効果があることが分かる。このことから、粒径の異なる大小の２つのラテックス粒子上に、同一の抗体を本発明法による規定量を感作した反応速度の速い大感作ラテックス粒子と反応速度の遅い小感作ラテックス粒子とを用いる本発明法が優れていることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例において作製した試薬１、２、ならびに３を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示し、比較した図である。
【図２Ａ】実施例において作製した試薬４を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示す図である。
【図２Ｂ】図２ＡのＣＲＰ低濃度域を拡大した図である。
【図３Ａ】実施例において作製した、本発明試薬ならびに比較例試薬を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を示し、比較した図である。
【図３Ｂ】図３ＡのＣＲＰ低濃度域を拡大し、比較した図である。
【図４】吸着等温線と吸着１００％ライン上の最大吸着量との関係を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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