(57)【要約】【課題】  分析に要する時間と労力を軽減するため、グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンの７種成分を同時に含む被検液を高速液体クロマトグラフィーにより一斉に定量分析する方法を提供する。【解決手段】  ７種成分を同時に含む被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、この被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、この陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出する。【選択図】        図１
2006029980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンからなる群から選ばれる２種以上を同時に含む被検液を高速液体カラムクロマトグラフィーで定量する方法において、
前記被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、当該被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、前記オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、当該陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出することを特徴とする混合成分の定量方法。
【請求項２】
グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンからなる群から選ばれる２種以上を同時に含む被検液を高速液体カラムクロマトグラフィーで定量する方法において、
前記被検液を含んだ移動相を、陽イオン交換カラムに導入し、当該被検液が導入された陽イオン交換カラムから出た溶出液を、前記陽イオン交換カラムに直結されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに移動相として導入し、当該オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液に含まれる成分を検出することを特徴とする混合成分の定量方法。
【請求項３】
外用剤に対する定量方法である請求項１または２に記載の混合成分の定量方法。
【請求項４】
点眼剤に対する定量方法である請求項１から３のいずれかに記載の混合成分の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーにより点眼剤の主要成分を定量分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
点眼剤（通称、目薬）は、外用液剤、坐剤および軟膏剤等とともに外用剤の一種として分類される。この点眼剤には、グリチルリチン酸二カリウム（以下、「ＧＫ２」という。）、塩酸ピリドキシン（以下、「ＶＢ６」という。）、イプシロン−アミノカプロン酸（以下、「ＥＡＣ」という。）、メチル硫酸ネオスチグミン（以下、「ＮＭ」という。）、塩酸テトラヒドロゾリン（以下、「ＴＨ」という。）、フマル酸ケトチフェン（以下、「Ｋｅｔ」という。）およびマレイン酸クロルフェニラミン（以下、「ＣＰ」という。）が主要成分として含まれている。
【０００３】
ここで、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの７成分（以下、「上記７成分」と省略する。）は、それぞれ以下のような効能を有している。まず、ＧＫ２およびＥＡＣは抗炎症作用を有している。次に、ＶＢ６は、ビタミンＢ６であり、新陳代謝を促進して目の疲れを改善する効能がある。更に、ＮＭは、ピント調整剤であり、目の筋肉の働きを強化して疲れた目の調節機能を改善する効能がある。また更に、ＴＨは、強い血管収縮作用を有しており、目の充血を取り除く効能がある。Ｋｅｔは抗アレルギー作用および抗ヒスタミン作用を有している。ＣＰは、抗ヒスタミン剤であり、目のかゆみや炎症を鎮める効能がある。
【０００４】
このように、上記７成分は点眼剤の重要な効能を発揮するものであるため、その定量分析は、点眼剤の品質管理等において非常に重要なものとなる。そして、従来より、上記７成分の定量分析のためには、他の分析方法と比較して正確かつ迅速で簡便なものとして、高速液体クロマトグラフィーが採用されてきた。例えば、上記７成分が含まれている点眼剤を定量分析する場合、上記７成分のうちＧＫ２およびＮＭの定量分析は、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムを用いたイオンペア法で分析し、残りのＶＢ６、ＥＡＣ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの定量分析は陽イオン交換カラムを用いたイオン交換法で分析していた。
【０００５】
しかし、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムと陽イオン交換カラムの使用条件はそれぞれ異なるため、イオンペア法およびイオン交換法の両方法による分析を、従来は一つの装置で同時に行うことはできなかった。このため、イオンペア法で分析可能な成分（例えば、ＧＫ２）およびイオン交換法で分析可能な成分（例えば、ＶＢ６）を含有する点眼剤を分析する場合、この点眼剤一検体に対して条件の異なる分析を２回行う必要があった。従って、分析に要する時間を短縮させるために、１回の分析で一斉に、上記７成分全てを定量分析できる方法が昨今より求められてきた。
【０００６】
一方、２種類のカラムを組み合わせることにより、無機イオン性物質と有機物質を一斉に分析可能な高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ」という。）装置１１０が報告されている（特許文献１参照。）。図６に、このＨＰＬＣ装置１１０の流路図を示す。ＨＰＬＣ装置１１０は、以下のような構成となっている。まず、第１移動相容器１１１、第１ポンプ１１２、試料導入口１１３、イオン交換カラム１１４、分岐管１１５、逆送分配カラム１１６および検出器１１７，１１８が、この順に接続されている。また、分岐管１１５には第２ポンプ１２０が接続されており、この第２ポンプ１２０は、第２移動相容器１１９と接続している。
【０００７】
ここで、ＨＰＬＣ装置１１０で行われる分析フローは以下のとおりである。まず、第１ポンプ１１２は、試料導入口１１３で導入された試料を、イオン交換カラム用の第１移動相とともにイオン交換カラム１１４に送液し、このイオン交換カラム１１４は無機イオン物質の分離を行う。また、第２ポンプ１２０は第２の移動相を分岐管１１５に送液する。この分岐管１１５でイオン交換カラム１１４から出てきた溶出液（以下、「第１溶出液」という。）と第２の移動相が混合して混合液になる。この混合液は逆送分配カラム１１６に送液されて、この逆送分配カラム１１６で混合液中の有機物質が分離される。そして、逆送分配カラム１１６から出てきた溶出液を検出器１１７，１１８で検出する。
【０００８】
以上に示すように、ＨＰＬＣ装置１１０によって、無機イオン性物質と有機物質を一斉に分析することが可能である。しかし、第１溶出液と第２の移動相が分岐管１１５で混合するため、第１溶出液の流圧と第２の移動相の流圧によっては、第１溶出液または第２の移動相が分岐管１５から違う液側に流入する可能性がある。つまり、第１溶出液の流圧が第２の移動相の流圧よりも高圧である場合は、第１溶出液が分岐管１１５から第２ポンプ１２０方向に流入するおそれがある。逆に、第１溶出液が第２の移動相の流圧よりも低圧である場合は、第２の移動相が分岐管１１５からイオン交換カラム１１４方向に流入するおそれがある。このような流入を防止するためには、第１の移動相の流圧と第２の移動相の流圧を微妙に調整するという分析前の煩雑な作業が要求されることになり、分析担当者の負担が過大となっていた。
【特許文献１】特開平９−６８５１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のごとく、従来方法では分析の準備に煩雑な作業を必要とし、さらには分析を短時間で行うことができないので、分析を担当する分析担当者の労力負担が過大であった。従って、分析に要する時間と労力の軽減を図ることができる新規分析方法の案出が望まれていた。
【００１０】
本発明は、分析に要する時間と労力を軽減するため、グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンから選ばれる２種以上を同時に含む被検液を高速液体クロマトグラフィーにより一斉に定量分析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１２】
（１）  グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンからなる群から選ばれる２種以上を同時に含む被検液を高速液体カラムクロマトグラフィーで定量する方法において、前記被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、当該被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、前記オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、当該陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出することを特徴とする混合成分の定量方法。
【００１３】
（１）の発明によれば、グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンから選ばれる２種以上を同時に含む被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、この被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、この陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出している。従って、上記７成分のうち２成分以上を含んだ被検液の分析に対して複数回の分析を行う必要がなく、また、分析のために煩雑な準備作業を必要としないため、分析に費やす時間と労力の軽減を図ることができる。
【００１４】
なお、「直結」とは、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムと陽イオン交換カラムを直接に結びつけるばかりでなく、配管を介して連結されている場合を含む。
【００１５】
（２）  グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンからなる群から選ばれる２種以上を同時に含む被検液を高速液体カラムクロマトグラフィーで定量する方法において、前記被検液を含んだ移動相を、陽イオン交換カラムに導入し、当該被検液が導入された陽イオン交換カラムから出た溶出液を、前記陽イオン交換カラムに直結されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに移動相として導入し、当該オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液に含まれる成分を検出することを特徴とする混合成分の定量方法。
【００１６】
（２）の発明によれば、グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンから選ばれる２種以上を同時に含む被検液を含んだ移動相を、陽イオン交換カラムに導入し、この被検液が導入された陽イオン交換カラムから出た溶出液を、陽イオン交換カラムに直結されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに移動相として導入し、このオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液に含まれる成分を検出している。従って、上記７成分のうち２成分以上を含んだ被検液の分析に対して複数回の分析を行う必要がなく、また、分析のために煩雑な準備作業を必要としないため、分析に費やす時間と労力の軽減を図ることができる。
【００１７】
（３）  外用剤に対する定量方法である（１）または（２）に記載の混合成分の定量方法。
【００１８】
（３）の発明によれば、外用剤の有効成分として上記７成分のうち２成分以上を含んだ被検液の分析に対しても複数回の分析を行う必要がなく、また、分析のために煩雑な準備作業を必要としないため、分析に費やす時間と労力の軽減を図ることができる。
【００１９】
（４）  点眼剤に対する定量方法である（１）から（３）のいずれかに記載の混合成分の定量方法。
【００２０】
（４）の発明によれば、点眼剤の有効成分として上記７成分のうち２成分以上を含んだ被検液の分析に対しても複数回の分析を行う必要がなく、また、分析のために煩雑な準備作業を必要としないため、分析に費やす時間と労力の軽減を図ることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、グリチルリチン酸二カリウム、塩酸ピリドキシン、イプシロン−アミノカプロン酸、メチル硫酸ネオスチグミン、塩酸テトラヒドロゾリン、フマル酸ケトチフェンおよびマレイン酸クロルフェニラミンからなる群から選ばれる２種以上を同時に含む被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、この被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、この陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出している。従って、上記７成分のうち２成分以上を含んだ被検液の分析に対して複数回の分析を行う必要がなく、また、分析のために煩雑な準備作業を必要としないため、分析に費やす時間と労力の軽減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００２３】
本発明に係る定量の方法は、グリチルリチン酸二カリウム（以下、「ＧＫ２」という。）、塩酸ピリドキシン（以下、「ＶＢ６」という。）、イプシロン−アミノカプロン酸（以下、「ＥＡＣ」という。）、メチル硫酸ネオスチグミン（以下、「ＮＭ」という。）、塩酸テトラヒドロゾリン（以下、「ＴＨ」という。）、フマル酸ケトチフェン（以下、「Ｋｅｔ」という。）、マレイン酸クロルフェニラミン（以下、「ＣＰ」という。）成分を同時に含むものであれば、どのようなものであっても定量分析可能であるが、好ましくは、水虫薬に代表される外用液剤、坐剤、軟膏剤および点眼剤等の外用剤に含まれる成分の定量分析に適用可能である。そして、最も好ましくは点眼剤に含まれる成分の定量分析に適用される。
【００２４】
また、本発明で定量分析が可能な成分は、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、Ｋｅｔ、ＣＰ、アラントイン（以下、「ＡＬ」という。）、クロロブタノール（以下、「ＣＢ」という。）、塩化ベンザルコニウム（以下、「ＢＣ」という。）、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（以下、「Ｍｅ‐Ｐ」という。）、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（以下、「Ｐｒ‐Ｐ」という。）、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸ブチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘプチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸２−エチルヘキシル、塩酸ナファゾリン等であるが、好ましくは、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰから選ばれる２種以上の成分である。
【００２５】
本発明に使用される高速液体クロマトグラフィーによる定量分析の２種類のフローを説明する。まず、第１の定量分析のフローは、以下のとおりである。ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰ等の成分を同時に含む被検液を含んだ移動相を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに導入し、この被検液が導入されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液を、オクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに直結された陽イオン交換カラムに移動相として導入し、この陽イオン交換カラムから出た溶出液に含まれる成分を検出する。
【００２６】
第２の定量分析のフローは、以下のとおりである。まず、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰ等の成分を同時に含む被検液を含んだ移動相を、陽イオン交換カラムに導入し、この被検液が導入された陽イオン交換カラムから出た溶出液を、陽イオン交換カラムに直結されたオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムに移動相として導入し、このオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラムから出た溶出液に含まれる成分を検出する。
【００２７】
本発明に用いるオクタデシルシラン結合シリカゲルが充填されたカラム（以下、「ＯＤＳカラム」という。）とは、オクタデシル基が結合されたシリカゲルを充填している逆相分離用のカラムをいう。本発明においてＯＤＳカラムは、イオン抑制法の逆相分離用のカラムとして使用されている。イオン抑制法とは、弱酸または弱塩基のクロマトグラフィーであり、移動相の水素イオン指数（以下、「ｐＨ」という。）を調整することによって、弱酸のイオン化や弱塩基のプロトン化を抑制し、弱酸または弱塩基を逆相分離カラム上で分離する方法をいう。このイオン抑制法では、一般的にメタノールあるいはアセトニトリルと緩衝液を移動相として使用する。このイオン抑制法で使用されるＯＤＳカラムは、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの全ての成分と相互に作用するが、特に、ＧＫ２との相互作用が強い。
【００２８】
また、本発明に用いる陽イオン交換カラム（以下、「ＳＣＸカラム」という。）とは、好ましくは強酸型陽イオン交換樹脂を充填したカラムである。強酸型陽イオン交換樹脂は、官能基としてスルホン基を有している。このＳＣＸカラムは、酸性成分に対して相互作用がなく、塩基性成分に対して相互作用がある。
【００２９】
なお、本発明においては、ＯＤＳカラムとＳＣＸカラムを直結して分析を行うが、ＯＤＳカラムとＳＣＸカラムの順番は、ＯＤＳカラム、ＳＣＸカラムの順でも、ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順でもよい。しかし、塩基性成分のほとんどがＳＣＸカラムにより主に分離されるため、ＯＤＳカラムとＳＣＸカラムの順番がＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順であり、被検液中の成分の多くが塩基性成分の場合は、ＳＣＸカラムの負荷が高くなってピーク割れを起こし、正確な定量分析が困難となる。従って、被検液中の成分の多くが塩基性成分の場合、ＯＤＳカラムとＳＣＸカラムの順はＯＤＳカラム、ＳＣＸカラムの順にするのが好ましい。
【００３０】
本発明に係る定量の方法では、ＳＣＸカラムを用いるため、移動相に有機溶媒と緩衝液との混液を使用している。緩衝液の塩として、リン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素アンモニウムが用いられるが、リン酸二水素アンモニウムが好ましい。緩衝液の塩濃度は、通常使用されている濃度である５０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであればよいが、５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。有機溶媒として、メタノールまたはアセトニトリルが用いられるが、メタノールが好ましい。緩衝液がリン酸二水素カリウムの場合、メタノールと緩衝液の混液のメタノール濃度は４０〜５０容量％であればよいが、４４〜５０容量％が好ましく、４７容量％が最も好ましい。また、緩衝液が１５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素アンモニウムの場合、メタノールと緩衝液の混液のメタノール濃度は４０〜５０容量％であればよいが、４５〜４９容量％が好ましい。また、緩衝液が５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素アンモニウムの場合、メタノールと緩衝液の混液のメタノール濃度は６２〜６９容量％であればよいが、６３〜６７容量％が好ましい。移動相のｐＨは、ＳＣＸカラムが使用可能である２.０〜４.０であればよいが、３.０が好ましい。
【００３１】
本発明に係る定量の方法で使用される検出器としては、紫外可視吸収検出器、蛍光検出器、フォトダイオードアレイ検出器、示差屈折検出器、電気的検出器等が適宜選ばれるが、紫外可視吸収検出器またはフォトダイオードアレイ検出器が好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明は、この説明および例示により制限されるものではない。
【００３３】
図１は、本発明の一実施例を示す流路図の一例について説明する。本例のＨＰＬＣ装置１０は、以下のような構成となっている。第１の移動相が入った移動相容器１１、ポンプ１２、試料導入部１３、第１のカラム１４、第２のカラム１５、検出器１６がこの順に接続している。なお、第１のカラム１４と第２のカラム１５の間は直結されており、それ以外の各装置（カラム）は、配管を介して接続されているが、第１のカラム１４と第２のカラム１５の間も配管を介して接続されていてもよい。
【００３４】
ここで、第１のカラム１４がＳＣＸカラムである場合は、第２のカラム１５はＯＤＳカラムであり、第１のカラム１４がＯＤＳカラムである場合は、第２のカラム１５はＳＣＸカラムである。
【００３５】
なお、後述する予備分析では、第１のカラム１４または第２のカラム１５のいずれかのカラムを使用して上記７成分の定量分析を行っている。つまり、予備分析では、ＳＣＸカラムまたはＯＤＳカラムのいずれかを使用して上記７成分の定量分析を行っている。
【００３６】
また、本実施例のＨＰＬＣ装置１０で行われる分析フローは以下のとおりである。ポンプ１２は移動相容器１１中の第１の移動相を試料導入部１３に送液し、試料導入部１３は試料（被検液）を第１の移動相中に導入する。試料導入部１３によって導入された試料（被検液）は、第１の移動相とともに第１のカラム１４方向に送液され、第１のカラム１４に導入される。第１のカラム１４から出てきた溶出液を第１の溶出液とすると、第１の溶出液のみを、第２のカラム１５に移動相として導入する。つまり、本発明に係る定量の方法においては、第１の溶出液のみが第２のカラム１５で使用する移動相に相当する。さらに、この第２のカラム１５から出てきた第２の溶出液を検出器で検出する。
【００３７】
なお、上記の「第１の溶出液のみが第２のカラム１５で使用する移動相に相当する」の「第１の溶出液のみ」とは、「第１の溶出液だけ」を意味するのではなく、第１の溶出液に実用的でない他の物質（固体、液体、気体を含む）が含有されている場合も含む。
【００３８】
［ＨＰＬＣモジュール］
分析に使用した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）モジュールとして、２６９５セパレーションモジュール（ウォーターズ（米国））を使用した。カラム温度は５０℃に維持した。
【００３９】
［カラム］
分析に使用したＯＤＳカラムとして、Ａｔｌａｎｔｉｓ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍまたは４．６ｍｍφ×７５ｍｍ、３μｍ、ウォーターズ（米国））、ＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（４．６ｍｍφ×１００ｍｍ、メルク（米国））、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＳｐｅｅｄＲＯＤ（４．６ｍｍφ×５０ｍｍ，メルク（米国））、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＡＱ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））、Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ,５μｍ、ワイエムシィ（日本））のいずれかを使用した。また、ＳＣＸカラムとして、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ８０（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、または４．６ｍｍφ×７５ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））のいずれかを使用した。
【００４０】
カラムから出た溶出液を分析する検出器６として、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器２９９６（ウォーターズ（米国））を使用した。測定波長は、特記しない場合、２１０ｎｍとした。
【００４１】
［試薬および試液］
ＧＫ２は丸善製薬（日本）より、ＮＭは東京化成（日本）より、ＶＢ６はロッシュ（スイス）より、ＴＨは岡見化学工業（日本）より、ＣＰは金剛化学（日本）より、ＥＡＣは第一化学薬品（日本）より、ＫｅｔはＳｉｆａｖｉｔｏｒ（イタリア）より、グリチルリチン酸モノアンモニウムはアルプス薬品工業（日本）より購入した。ＧＫ２以外についてはその含量が９９・０％以上のものを使用した。ＧＫ２はグリチルリチン酸モノアンモニウムを用いて含量を測定して用いた。
【００４２】
ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの７成分および内標準溶液を含んだ標準溶液は、以下のように調製した。なお、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの７成分を以下「上記７成分」と省略する。また、ＧＫ２、ＶＢ６、ＥＡＣ、ＮＭ、ＴＨ、ＫｅｔおよびＣＰの各７成分を以下「各７成分」と省略する。
【００４３】
ＥＡＣを１０５℃で３時間乾燥し、その約４０ｍｇを精密に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）に溶かし、正確に５ｍＬとし、標準原液Ａとした。また別に、ＶＢ６をデシケーター（減圧、シリカゲル）で４時間乾燥し、その約５０ｍｇを精密に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）に溶かし、正確に２０ｍＬとし、標準原液Ｂとした。また別に、ＧＫ２約５０ｍｇを精密に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）に溶かし、正確に２５ｍＬとし、標準原液Ｃとした。また別に、ＣＰを１０５℃で３時間乾燥し、その約５０ｍｇを精密に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）に溶かし、正確に５０ｍＬとした。この液６ｍＬを正確に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）を加えて１０ｍＬとし、標準原液Ｄとした。また別に、ＮＭを１０５℃で３時間乾燥し、その約５０ｍｇを精密に量り、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）を加えて１００ｍＬとし、標準原液Ｅとした。また別に、ＴＨを１０５℃で２時間乾燥し、その約１００ｍｇを精密に量り、水／メタノール混液（５０容量％：５０容量％）を加えて１００ｍＬとし、標準原液Ｆとした。また別に、ＫｅＴを、１０５℃で４時間乾燥し、その約３５ｍｇを精密に量り、ここに標準原液Ｅ：２ｍＬ及び標準原液Ｆ：５ｍＬをそれぞれ正確に加え、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）を加えて２５ｍＬとし、これを標準溶液Ｇとした。内標準溶液は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸２−エチルヘキシル：０．０１ｇをメタノール溶液５００ｍＬで溶解させたものを使用した。そして、標準溶液Ｇ：１ｍＬ、標準原液Ａ：２．５ｍＬ、標準原液Ｂ：１ｍＬ、標準原液Ｃ：２．５ｍＬ、標準原液Ｄ：１ｍＬ及び内標準溶液：２ｍＬをそれぞれ正確に加え、水とメタノールの混液（５０容量％：５０容量％）を加えて１０ｍＬとし、これを標準溶液とした。この標準溶液を使用して、後述の予備分析および実施例の分析を行った。この標準溶液中の各７成分の濃度は、各７成分が実際に点眼剤に配合されるときの最大の濃度である。
【００４４】
リン酸二水素カリウム、リン酸二水素アンモニウムおよびリン酸は和光純薬工業（日本）より購入し、メタノールは国産化学（日本）より購入した。また、すべての試薬は、特にグレードの明記のあるもの以外は特級を用いた。
【００４５】
［移動相］
各種移動相としては、メタノールとリン酸二水素カリウム緩衝液の混液、またはメタノールとリン酸二水素アンモニウム緩衝液の混液を使用した。リン酸二水素カリウム緩衝液およびリン酸二水素アンモニウム緩衝液のｐＨは、リン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素アンモニウム緩衝液の水溶液にリン酸をそのまま加えて調整した。移動相の流量は、特記しない限り１．０（ｍＬ／分）とした。
【００４６】
［予備分析１］
メタノールとリン酸二水素カリウム緩衝液の混液を移動相として使用し、ＯＤＳカラムまたはＳＣＸカラムを単独で使用したときの上記７成分の保持時間について検討するため、予備分析１を行った。予備分析１の分析条件を表１に示す。なお、今回の分析に用いた被検液としての標準溶液には、上記７成分の他に、Ｍｅ‐Ｐ、Ｐｒ‐Ｐ（以上みどり化学（日本））およびＣＢ（第一化学薬品（日本））が含まれている。
【表１】
2006029980.tif 000003
【００４７】
表１の条件で行った上記７成分の保持時間を表２に示す。そして、ＯＤＳカラムまたはＳＣＸカラムのいずれかを単独で用いて分析した上記７成分の保持時間と数１に示す保持時間の理論式により、ＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを直結した場合に予想される上記７成分の保持時間（以下、「予想保持時間」という。）を求めた（表２参照）。理論式により求められた予想保持時間を検討すると、ＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順に）直結して分析を行った場合でも、上記７成分の分離が可能であることが推測できた。そこで、ＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを実際に直結させ、上記７成分の定量分析を試みた（予備分析２）。なお、ＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを実際に直結させて分析を行う方法を、以下「ＴＭ―ＨＰＬＣ法（Ｔａｎｄｅｍ  Ｍｏｄｅ  ＨＰＬＣ法）と表現する。
【表２】
2006029980.tif 000004
【数１】
2006029980.tif 000005
【００４８】
［実施例１］
メタノールとリン酸二水素カリウム緩衝液の混液を移動相として使用し、ＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順に）直結した場合に移動相のｐＨの変化に基づく各７成分の保持時間の変化を検討するため、実施例１の分析を行った。この実施例１の分析条件を表３に示す。なお、今回の分析に用いた被検液としての標準溶液には、上記７成分の他に、Ｍｅ‐Ｐ、Ｐｒ‐Ｐ（以上みどり化学（日本））およびＣＢ（第一化学薬品（日本））が含まれている。
【表３】
2006029980.tif 000006
【００４９】
表３の条件で行った移動相のｐＨの変化に基づく上記７成分（Ｋｅｔは除く）の保持時間の変化を図２に示す。移動相のｐＨを３．０から６．０の間で変化させたところ、ＧＫ２の保持挙動に最も変化が見られ、他の成分の保持挙動はほとんど変化が見られなかった。表４に示すように、ＥＡＣ、ＶＢ６およびＫｅｔの酸解離定数の対数であるｐＫａを考慮すると、ｐＨがなるべく低い領域で分析を行った方が各成分の分子型、解離型の混在を回避できるため、今後の分析をｐＨ３.０で行うことにした。
【表４】
2006029980.tif 000007
【００５０】
また、表３の条件（但しＰＨ３.０）で行ったＴＭ―ＨＰＬＣ法（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順）での上記７成分の保持時間を表２に示す。ＴＭ―ＨＰＬＣ法（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順）での各７成分の保持時間は、予備分析１で求めた予想保持時間（表２参照）とほぼ一致していた。また、予想保持時間から推測されたように、実際にＳＣＸカラムとＯＤＳカラムを直結させると、全成分の分離が可能であった。なお、各７成分が分離できたか否かは、数２に示す分解度（Ｒｓ）を求め、隣接ピークとの分解度が１.５以上であるときに完全に分離したと判断した。
【数２】
2006029980.tif 000008
【００５１】
［実施例２］
次に、メタノールとリン酸二水素カリウム緩衝液の混液を移動相として使用し、上記７成分を分離させるのに最適なメタノール濃度およびカラムの組み合わせを検討するため、実施例２の分析を行った。実施例２の分析条件を表５に示す。なお、今回の分析に被検液として用いた標準溶液には、上記７成分の他に、ＡＬ（川研ファインケミカル（日本））、Ｍｅ‐Ｐ、Ｐｒ‐Ｐ（以上みどり化学（日本））およびＣＢ（第一化学薬品（日本））が含まれている。
【表５】
2006029980.tif 000009
【００５２】
表５の条件で行った分析結果を表６に示す。前述したように、分解度が１.５以上の場合、上記７成分は完全分離したと定めた。表６では、分析結果が完全分離して、全成分の溶出時間が６０分以内の場合、「○」を付記し、さらに完全分離したときのメタノール濃度（容量％）を付記している。完全分離したが、溶出時間が６０分を超えた成分があるとき、あるいはピーク形状が不良で定量が困難であると判断した場合には、「△」を付記し、さらに完全分離したときのメタノール濃度（容量％）を付記している。なお、「ＧＫ２×」とは、ＧＫ２の溶出時間が６０分を超えたことを意味している。これ以外、つまり、完全分離ができない場合を「×」とした。
【表６】
2006029980.tif 000010
【００５３】
ここで、表５の条件で行った分析結果が、完全分離で、かつ全成分の溶出時間が６０分以内となった条件は、以下に示す２つの条件のときであった。第１の条件は、ＳＣＸカラムがＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ−ＵＧ８０（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））、ＯＤＳカラムがＡｔｌａｎｔｉｓ（４．６ｍｍφ×７５ｍｍ、３μｍ、ウォーターズ（米国））、メタノール濃度が４７容量％の場合であり、第２の条件は、ＳＣＸカラムがＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ８０（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））、ＯＤＳカラムがＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（４．６ｍｍφ×１００ｍｍ、メルク（米国））、メタノール濃度が４４容量％の場合であったが、後者は流量が２ｍｌ／分の条件下であった。図３に第１の条件のときのクロマトグラムの例を示す。図３に示すクロマトグラムでは、保持時間が１０分以内の領域にピークが密集してしまい、移動相の組成と理論組成とのわずかな違いやカラムの劣化等の影響により、各成分の分離が困難となる可能性がある。また、ＧＫ２のピークが遅い時間に現れ、分析時間に長時間を要する。従って、移動相であるメタノールとリン酸二水素カリウム緩衝液の混液をメタノールとリン酸二水素アンモニウム緩衝液の混液に置き換えて検討を行ってみた。
【００５４】
［予備分析２］
まず、５０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を移動相として使用し、ＳＣＸカラムを単独で使用したときの上記７成分を分離させるのに最適なメタノール濃度について検討するため、予備分析２を行った。予備分析２の分析条件を表７に示す。
【表７】
2006029980.tif 000011
【００５５】
表７の条件で分析した上記７成分を分離させるのに最適なメタノール濃度は、緩衝液が５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液の場合は６０〜７０％のときであり、緩衝液が１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液の場合は４０〜５０％のときであったが、両者とも上記７成分全ての分離はできなかった。次に、ＯＤＳカラムを単独で用いて、上記７成分の分析を行い、上記７成分の完全分離に最適なメタノール濃度の検討を行った。
【００５６】
［予備分析３］
５０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を移動相として使用し、ＯＤＳカラムを単独で使用したときの上記７成分を分離させるのに最適なメタノール濃度およびカラムの組み合わせについて検討するため、予備分析３を行った。予備分析３の分析条件を表８に示す。さらに、この予備分析３の分析結果と予備分析２の分析結果から、ＯＤＳカラムとＳＣＸカラムを直結した場合に、上記７成分の完全分離に最適なメタノール濃度およびカラムの組み合わせについて予測した。この予測結果を表９および表１０に示す。表９は、移動相に５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を使用した場合の予測結果であり、表１０は、移動相に１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を使用した場合の予測結果である。表９および表１０における「○」、「△」、「×」および「メタノール濃度」は、表６と同様の位置付けによって付記されている。
【表８】
2006029980.tif 000012
【表９】
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【表１０】
2006029980.tif 000014
【００５７】
［実施例３］
次に、予備分析３の表９および表１０の予測結果を参照して、５０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を移動相として使用し、上記７成分の完全分離に最適なメタノール濃度とカラムの組み合わせについて検討するために、実施例３を行った。実施例３の分析条件を表１１に示す。なお、今回の分析に用いた被検液としての標準溶液には、上記７成分の他に、Ｍｅ‐Ｐ、Ｐｒ‐Ｐ（以上みどり化学（日本））、ＣＢ（第一化学薬品（日本））およびＢＣが含まれている。
【表１１】
2006029980.tif 000015
【００５８】
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を移動相として分析した結果を表１２に、１５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素アンモニウム緩衝液を移動相として分析した結果を表１３に示す。表１２および表１３における「○」、「△」、「×」および「メタノール濃度」は、表６と同様の位置付けによって付記されている。
【表１２】
2006029980.tif 000016
【表１３】
2006029980.tif 000017
【００５９】
リン酸二水素アンモニウム緩衝液とメタノールとの混液を移動相として使用した場合に、上記７成分の定量分析をＴＭ―ＨＰＬＣ法（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順）で行ったときのクロマトグラムのパターンは大きく分けて、２つのパターンに分類された。２つのクロマトグラムのパターンのうち一方を図４に示し、他方を図５に示す。図４に示すクロマトグラムは、ＳＣＸカラムがＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ８０（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））、ＯＤＳカラムがＡｔｌａｎｔｉｓ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、３μｍ、ウォーターズ（米国））、メタノール濃度が４９〜５０容量％の場合のクロマトグラムであり、図５に示すクロマトグラムは、ＳＣＸカラムがＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ８０（４．６ｍｍφ×７５ｍｍ、５μｍ、資生堂（日本））、ＯＤＳカラムがＡｔｌａｎｔｉｓ（４．６ｍｍφ×７５ｍｍ、３μｍ、ウォーターズ（米国））、メタノール濃度が６５〜６７容量％の場合のクロマトグラムであった。
【００６０】
図５に示すクロマトグラムのパターン以外は、全て図４に示すクロマトグラムのパターンとなった。すなわち、図４に示すクロマトグラムのパターンからも明らかのように、図５に示すクロマトグラムのパターン以外はすべて、ＧＫ２のピークが非常に遅く出現するパターンであった。一方、図５に示すクロマトグラムのパターンは、ＧＫ２のピークが早い時間に出現した。また、図５に示すクロマトグラムのパターンは、各７成分のピークはそれほど近接していないため、全成分の定量が可能であった。
【００６１】
以上の分析結果より、図５のクロマトグラムのパターンで溶出する条件が、上記７成分の定量分析をＴＭ―ＨＰＬＣ法（ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順）で行う条件として最も好ましい条件であることが確認された。なお、クロマトグラムは省略するが、ＳＣＸカラム、ＯＤＳカラムの順にカラムを直結しても、ＯＤＳカラム、ＳＣＸカラムの順にカラムを直結しても、クロマトグラムのパターンに大きな変化はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の一実施例である高速液体クロマトグラフィーの流路図である。
【図２】本発明の実施例１で得られた保留時間と移動相のｐＨの関係を示す図である。
【図３】本発明の実施例２で得られた第１の条件のときのクロマトグラムを示す図である。
【図４】本発明の実施例３で得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】本発明の実施例３で得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】従来の高速液体クロマトグラフィーの流路図である。
【符号の説明】
【００６３】
１０    高速液体クロマトグラフ
１１    移動相容器
１２    ポンプ
１３    試料導入部
１４    第１のカラム
１５    第２のカラム
１６    検出器
【図１】
2006029980.tif 000018
【図２】
2006029980.tif 000019
【図３】
2006029980.tif 000020
【図４】
2006029980.tif 000021
【図５】
2006029980.tif 000022
【図６】
2006029980.tif 000023