(57)【要約】【課題】  表情皺を防止、緩和あるいは改善する皮膚外用剤であって、肌（皮膚）への塗布による経皮投与として使用することができ、また安全性も高く、かつ筋弛緩作用のみが奏されるのではなく、保水能力に優れた多糖類の生合成を促し、かつタイプIIIコラーゲン（III型コラーゲン）の生成促進作用によって表情皺を改善する皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】  シオグサ目（Cladophorales）シオグサ科（Cladophoraceae）ジュズモ属（Chaetomorpha）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シオグサ目（Cladophorales）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
シオグサ目（Cladophorales）シオグサ科（Cladophoraceae）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項３】
シオグサ目（Cladophorales）シオグサ科（Cladophoraceae）ジュズモ属（Chaetomorpha）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚外用剤に関し、特には、いわゆる“表情皺”と称されるカラスの足跡（目尻にできる細かい皺）や眉間に形成される皺などに対し、これを防止、緩和あるいは改善する化粧品としての皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
顔の皮膚、特には目もとの皮膚は、特に老化の現れやすい部分である。笑う、怒るあるいは泣くといった表情で使用される皮膚の表情筋は同じ場所で筋肉の収縮を頻繁に繰り返す。筋肉の収縮状態（緊張状態）が続くと、“皺は笑顔の刻印である”と言われる如く、表情皺の形成につながる。
【０００３】
「いつまでも若く美しくありたい」というのは女性の永遠の願いであるが、若さを感じさせるのは、顔のつくりよりも、ハリのあるスベスベした素肌作りが大切であり、年をとるとともに増えていく顔の皺を解消し、表情を若返らせることが重要である。
【０００４】
従来、出来てしまった表情皺を解消する方法として、ボツリヌス毒素を用いる手段があった（特許文献１参照）。すなわち、ボツリヌス毒素（ボツリヌス菌の神経毒素）を、例えば眉間や目尻に皮下注射し、当該毒素が保有する筋弛緩作用（筋肉の収縮を弱める働き）によって、皺が形成されている部分の皮膚を伸ばし、これにより表情皺を消失させようと期待されたものである。
【特許文献１】特表２００３−５０５３４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ボツリヌス毒素は、長い間、種々のジストロフィーの治療にも使われている作用効果の極めて強い薬剤である。これを美容整形に用いる場合において次のような問題が指摘された。すなわち、ボツリヌス毒素を顔に注射することにより、表情筋に筋弛緩作用が働き、確かに顔の筋肉の収縮が緩和されて表情皺が解消する。しかしながら、表情皺の解消を専ら筋弛緩作用に頼っていることからも考えられるように、その効果のほどは甚大であり、作用効果も長期化し、これにより確かに皺はなくなるが、その人本来の豊かな顔の表情も変えてしまうといった問題があった。また、注射としての投与に限られるので、個人での使用も出来なかった。
【０００６】
［発明の目的］
本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は注射による投与ではなく肌（皮膚）への塗布により（経皮投与により）使用され、かつ筋弛緩作用のみに頼るのではなく、筋弛緩作用と他の作用（コラーゲン生成促進作用や多糖類生合成作用など）をも奏し、これらの総合的な作用（複数の作用の協力）によって表情皺をしっかりと防止、緩和あるいは改善することのできる皮膚外用剤を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の皮膚外用剤は、シオグサ目（Cladophorales）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載の皮膚外用剤は、シオグサ目（Cladophorales）シオグサ科（Cladophoraceae）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の皮膚外用剤は、シオグサ目（Cladophorales）シオグサ科（Cladophoraceae）ジュズモ属（Chaetomorpha）に属する緑藻類（Chlorophycea）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の皮膚外用剤によれば、肌（皮膚）への塗布による経皮投与として使用することができ、安全性も高く、かつ筋弛緩作用のみが奏されるのではなくコラーゲン生成促進作用や、ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）、ＰＧ（プロテオグリカン）といった多糖類からなる、いわゆる細胞外マトリックスの合成促進作用など他の表情皺改善作用も有するので、通常の（本来の）顔の表情に悪い影響を与えることなく表情皺を防止、緩和あるいは改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
緑藻類（Chlorophycea）
本発明で使用される緑藻類としては、シオグサ目（Cladophorales）に属する緑藻である。具体的には、シオグサ科ジュズモ属（Chaetomorpha）のフトジュズモ（Chaetomorpha spiralis Okamura）、タマジュズモ（Chaetomorpha moniligera）、ホソジュズモ（Chaetomorpha ceassa, Chaetomorpha crassa (C.Agardh) Kuetzing）、Chaetomorpha implexa（Lola Implexa（Harvey））、シオグサ科シオグサ属（Cladophora）のオオシオグサ（Cladophora japonica Yamada）、カタシオグサ（Cladophora ohkuboana Holmes）、チャシオグサ（Cladophora wrightiana Harvey）、アサミドリシオグサ（Cladophora densa, Cladophora sakaii Abbott）、フサシオグサ（Cladophora fascicularis）、アオタマリシオグサ（Cladophora rudolphiana）、カイゴロモ（Cladophora conchopheria, Cladophora conchopheria Sakai）、ツヤナシシオグサ（Cladophora opaca）、ウキオリソウ科のアミモヨウ（Microdictyon Japonicum Setchell）などが挙げられる。これらは１種のみを単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いることもできる。中でも、特に、Chaetomorpha implexa（Lola Implexa（Harvey））を使用することが、表情皺の改善作用効果が非常に大きいので好ましい。
【００１２】
抽出
本発明の皮膚外用剤を得るに際し、緑藻は未乾燥の状態でもよいが、風乾、凍結乾燥などの方法で乾燥したものを使用する方が、有効成分を効率よく抽出できるので好ましい。また、抽出方法も、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、緑藻を圧搾して抽出物を得る圧搾法など、従来公知の方法を採ることができる。
【００１３】
抽出溶媒としては特に限定はなく、例えば、水、低級アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、イソブタノールなど）、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアルデヒドなどが挙げられる。
【００１４】
緑藻と溶媒との比率としては特に限定はなく、例えば、緑藻（乾燥状態）１００重量部（以下、単に「部」という）に対し、溶媒２００〜５０００部であることが好ましい（さらに好ましくは５００〜３０００部）。また抽出温度と時間に関しては、１０〜７０℃、１時間〜２４時間が好ましい（さらに好ましくは１５〜５０℃、さらに好ましくは１５〜３０℃で、５時間〜２０時間）。
【００１５】
製剤
本発明の皮膚外用剤の形態としては、例えば、クリーム剤、ゼリー剤、軟膏剤、乳液剤、液剤、パック剤などが挙げられる。なお、これら皮膚外用剤における緑藻エキスの含有率としては特に限定はないが、０．０５〜２０重量％（以下、単に「％」という）であることが好ましく、０．１〜１０％であることがさらに好ましく、０．２〜５％であることがさらに好ましく、０．５〜１．０％であることが最も好ましい。
【００１６】
その他の成分
本発明の皮膚外用剤には、通常外用剤で用いられる成分を配合することができる。具体的には、保湿剤（グリセリン、アルキレングリコール、ヒアルロン酸など）、増粘剤（カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、デンプンなど）、界面活性剤（ステアリン酸ナトリウム、ポリグリセリンモノステアレート、レシチンなど）、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコールなど）、防腐剤（安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウムなど）、酸化防止剤、香料、色素、ビタミン剤、水、油分などである。
【００１７】
使用量
本発明の皮膚外用剤の投与量（使用量）については、症状、年齢、性別によって変わるので一概にはいえないが、およそのところ１日当たり、緑藻エキス換算で０．１〜１０００ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回、または２〜４回あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１８】
本発明における緑藻エキスの主な特徴
一般的に、形成された表情皺に対してこれを改善する方法として幾つか挙げられるが、主な手段としては次の４つである。すなわち、
１）筋肉の収縮作用をブロックし、弛緩作用を促す方法。
【００１９】
２）総コラーゲン中におけるタイプIIIコラーゲン（III型コラーゲン）の含有割合を増やして、筋肉が収縮した際には円滑に弛緩させて元に戻るように促す方法（赤ちゃんの皮膚のようにタイプIIIコラーゲンの含有比率を高くしようとする方法）。
【００２０】
３）ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）やＰＧ（プロテオグリカン）といった、保水性能に優れた多糖類（いわゆる、細胞外マトリックス）の生合成を促し、肌を内側から押してハリを与え、弾力性を持たせる方法（皮膚の深層に潤いを与える方法）。
【００２１】
４）脂質酸化を抑制する方法（抗酸化作用や抗フリーラジカル作用を持つ成分を与える方法）。
【００２２】
本発明における緑藻エキスは、上記した４つの全ての手段によって表情皺を改善すると考えられる。これは後述する実施例で説明するが、このことから、本発明の皮膚外用剤は、前述したようなボツリヌス毒素のような強い筋弛緩作用のみで処置しようとする場合とは違い、上記２〜４の作用効果も備えていて総合的な効果で以て表情皺を改善しようとするが故に、筋弛緩作用に強い効果を期待しなくてもよい分、非常に安全であり、またその筋弛緩作用に関しても可逆的であるので（洗浄による筋弛緩作用の消失が見られるので）、より一層安全であるといえる。また、皮下注射するのではなく、塗布による経皮投与なので取り扱いも手軽で理想的である。
【００２３】
さらに、本発明の皮膚外用剤は、前述したようにタイプIIIコラーゲンの増加や、保水性能に優れた多糖類の生合成を促すので、表情皺に対する改善だけではなくて、皮膚（肌）に対する美容効果も充分に期待できる。
【実施例】
【００２４】
本発明の一実施例を以下に説明するが、本発明はこれによって限定されない。
【００２５】
緑藻エキスの抽出
フランスのブリュターニュ地方（ブレア諸島）の海岸より採集した（あるいは、フランスのSecma Biotechnologies Marines社＜http://www.secmabio.com/＞でも入手可能）緑藻、Chaetomorpha implexa（Lola Implexa（Harvey））（シオグサ目  シオグサ科  ジュズモ属の緑藻）乾燥物１００ｇを細断した。
【００２６】
これの全量を、溶媒として用いた水の中に入れ、撹拌しながら抽出作業を行った。なお、溶媒の量は前記乾燥物１００ｇに対して２０００ｇであり、抽出時間は１２時間、抽出温度は１８〜２０℃であった。
【００２７】
抽出後、上澄みを濃縮および凍結乾燥処理することにより、Chaetomorpha implexa（Lola Implexa（Harvey））起源の緑藻エキス０．５ｇを得た。この緑藻エキスを本実施例において便宜上、以下「ＳＥＣ００３」と称す。
【００２８】
ヒト筋細胞の単離と神経分布の作成
AskanasとEagel（1975）によって開発された神経／筋共培養系モデルは、ヒトの横紋筋細胞内の神経支配を、脊髄神経節を含んでいる脊髄の外移植片を用いることによってヒト横紋筋中に神経分布を再構成（再構築）することを可能とした培養モデルである。今日においては、当業者であれば常法に従って、このような神経／筋共培養系モデルを容易に構築できる。
【００２９】
以下の通り、常法に従って実験を行った。すなわち、横紋筋から採取したサンプルから得たヒト筋細胞（サテライト細胞）を培養プレートに播いた。サテライト細胞は、融合するポイントに達すると融合して筋線を形成し、多核構造を示すがこの段階での収縮活性はなかった。その後、脊髄神経節を含んでいるラット胚から得た脊髄外移植片を細胞単層上に置いた。これらの条件では、１日培養した後に脊髄外移植片の外側に神経突起の成長が確認できた。最初の筋収縮は、この共培養の５〜６日後に観察され、３週間後には外移植片の近傍の筋線維は全て収縮した。この段階で、これらの筋線維は横紋を形成し、分化した神経筋接合部を有するようになった（参考：Martinuzzi ら，1990年）。
【００３０】
この共培養物は培養開始から２１日後、筋線維が成熟した神経筋接合部を有するようになるときから用いられる。
【００３１】
なお、１つ注意すべき点がある。神経分布の密度は、ある単一の筋線維に分布する運動神経ニューロンの数およびその線維上に存在する神経筋接合部の数と定義される。この生物学的パラメータは１つのウエルと別のウエルでは均一でない応答が誘導され得ることを示す。したがって、試験結果と傾向を分析し、確認するためには１試験あたりいくつかのウエルを用いることが必要であり、少なくとも３個のウエルが必要である。
【００３２】
ＳＥＣ００３の調製
ＳＥＣ００３は培地中で調製し、２４時間のインキュベーションの前に３７℃の温水浴中で予め加温しておいた。
【００３３】
［Ａ］：ＳＥＣ００３による筋収縮頻度の変化
規則的な収縮を示している筋線維を選択し、培養用ウエル上に正確な位置をコンピューターで記録し、収縮回数を３０秒間数えた。温度の低下が収縮頻度に影響を与えないよう、顕微鏡プレート上の培養物を３６℃±１℃に維持するためにハロゲンランプを用いて加温した。
【００３４】
ＳＥＣ００３と共に２４時間インキュベーションした後、その線維を顕微鏡の対物鏡の下に置き、３０秒間の収縮数を計測した。この計測の直後にその培地に４ｍＭ  ＫＣｌ（筋収縮促進剤）を添加した。ＫＣｌの添加は、この濃度でもわずかに脱分極を刺激し、それによって神経伝達物質の放出の瞬間的、かつ一時的な増加が生じ、収縮頻度の増加が１０秒から１５秒間起こり、その後、収縮は停止し線維は最初のレベルの収縮状態に復帰する。この段階を用いてＳＥＣ００３の筋弛緩効果を示すことができる。もしもＫＣｌ添加によって収縮頻度の増加が見られない場合には、ＳＥＣ００３は、ニューロンまたは筋線維のいずれかに作用する筋弛緩作用を有していることとなる。以下に、ＳＥＣ００３を用いた筋弛緩効果の確認試験を行なった。なお、比較対照物質としてα−ブンガロトキシンを用いた。この物質は筋肉の収縮能を阻害するアセチルコリンアンタゴニストである。これはニコチンレセプターと高いアフィニティーで結合し、神経筋接合部をブロックする。このα−ブンガロトキシンは内因性のアセチルコリンと競合させるために３種類の濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１μＭ）で用いた。高濃度では線維は全て筋収縮が不可逆的にブロックされ、低濃度では限られた数の線維が部分的にブロックされる。この場合にはＫＣｌの添加で収縮活性が再開する。全ステージを倒立顕微鏡に接続したビデオカメラで撮影した。１条件あたり４個のウエルの平均の最も代表的なもので得られたデータを記録した。
【００３５】
結果を表に示す。２４時間培養したあとにＫＣｌを添加した後の筋収縮を表した（培養前の収縮を１００％とした）。
【００３６】
下記［表１］は、４個の別々のウエル中でのα−ブンガロトキシン（ａ−Ｂｇｔ）とのインキュベーション、及びＫＣｌ（４ｍＭ）の添加後の筋収縮頻度のパーセントの変動を示す（図１も参照）。
【表１】
2006124360.tif 000002
【００３７】
培地単独では２４時間後に収縮頻度の２６％の低下が認められる。この２６％という低下からは、供試製剤（ＳＥＣ００３）についてインキュベーション前と後の比較を行う際に、その差が２６％であれば、前後で差がないことを同等であるということができる。ＫＣｌの添加後に収縮頻度の１３８％の増加が認められた。この実施例でα−ブンガロトキシンは１０ｎＭの濃度で、５時間のインキュベーション後、４本のうち２本の線維の収縮をブロックした。他の２本の線維は１００％の収縮レベルを維持し、ＫＣｌの添加後は収縮頻度は１３３％〜１６３％増加した。１００ｎＭおよび１μＭの濃度では、ＫＣｌの添加後の収縮頻度の増加は見られず、筋線維の収縮は著しくブロックされた。
【００３８】
これらの結果は、ウエル毎に筋線維間でかなりの相違が見られることを示している。これらの相違は筋線維間の神経分布の密度（運動単位または運動神経ニューロンの数、及び運動終板の密度）の相違によるものである。運動終板は筋線維上に位置するシナプス後の構造であり、集まってコリン作動性ニコチン様受容体の魂を作る。さらに、筋線維は１本から数本の運動神経ニューロンが分布することができる。ＳＥＣ００３が運動神経ニューロン、運動終板、又は筋線維そのものにも作用すると仮定すると、１実験条件あたり選択された４本の筋線維のうちで神経分布の密度が高い１本がＳＥＣ００３の他の筋線維では観察されたような筋弛緩効果を示さない可能性がある。１条件あたり選択された４本の収縮の平均をとればこのような現象を補正して標準偏差の幅が広くなる。
【００３９】
α−ブンガロトキシンに代え、同様の実験をＳＥＣ００３で行った。下記［表２］は、４個の別々のウエル中でのＳＥＣ００３とのインキュベーション、及びＫＣｌ（４ｍＭ）の添加後の筋収縮頻度のパーセントの変動を示す。
【表２】
2006124360.tif 000003
【００４０】
本実施例において、ＳＥＣ００３が０．５％の濃度で４本のうち２本の筋線維の収縮を完全にブロックし、第３の筋線維では収縮頻度を８０％阻害し、ＫＣｌ添加後における収縮頻度の増加は見られなかった。
【００４１】
ＳＥＣ００３の効果持続性
再構成した皮膚／収縮性筋細胞共培養モデル（皮膚サンプル）で行った本実施例の目的は、再構成した皮膚サンプルに対するＳＥＣ００３の持続効果を確認する点であり、前記サンプルに対して局所適用後、３０分後、２時間後、６時間後、及び２４時間後のＳＥＣ００３の活性を確認することである。
【００４２】
適用した製剤形態としては、ＳＥＣ００３（純品１％）とクリーム剤（１％含有製剤）である。また比較対照物質として、筋弛緩薬のカリソプロドール（１０ｍＭ）を用いた。各々を皮膚／収縮性筋細胞共培養モデルに塗布（適用）し、その３０分後、１時間後に筋肉の収縮への影響をみた。
【００４３】
もう少し詳しく説明すると、２１日間の培養後、神経／筋共培養物が成熟した時点で、その上に再構成皮膚サンプル（培養１１日目）を置いた。選択した各ウエルについて、１秒あたり１回以上の規則的な収縮を３０秒間続けている筋繊維を（ｘ，ｙ）座標で検出し、画像分析プログラムを用いて記録した。収縮数は３０秒間数えた。ＳＥＣ００３などの供試製剤は再構成皮膚上に直接的に適用して３０分間、及び１時間置き、その共培養物をインキュベーター中に戻した。３０分および１時間後にその共培養物を運動刺激ステージ（motorized stage）に置き、筋線維を検出した。その筋線維の収縮数を再度３０秒間数えた。
【００４４】
結果は下記［表３］に示すごとく、前記供試製剤の存在下でインキュベーション前の収縮（１００％とする）と比較した筋収縮のパーセントで表した。筋収縮頻度の分析で、３本の筋線維のうち少なくとも２本が下記変動範囲の基準に従って判定するとき同じ効果を示す場合は効果有するものとした。また、供試製剤の添加前のインキュベーション前の頻度と比較して、収縮頻度が８０％以上の場合には、変化なしとし、０のスコアとした。供試製剤の添加前のインキュベーション前の頻度と比較して、収縮頻度が８０％未満の場合には、その製品が収縮頻度を減少させるものとし、−のスコアとした。収縮の頻度が０である場合には、収縮がブロックされたものと見なし、結果は「ブロック」と示した。
【００４５】
活性の反応速度を、表皮を取り除いた後に各適用時間について調べた。収縮頻度は４つの時点が経過した後に数えたが、それらの４時点は３０分、２時間、６時間、及び２４時間である。ある適用時間を分析するにあたって、３本の線維のうち、２本が活性の低下またはブロックを示す場合には活性の経過を２４時間目まで観察した。
【００４６】
３本の線維のうちの少なくとも２本でのブロックまたは阻害が維持されず、収縮頻度が初期の値の８０％以上であった場合には線維は回復したものと見なした。このような場合にはスコアを＋とした。
【００４７】
２４時間後に、収縮活性の回復が認められた場合には、新しい再構成皮膚サンプルをウエル上に置き、供試製剤を過剰量、３０分間または１時間適用した。この適用期間の終了時に、その共培養物を顕微鏡の運動刺激ステージ（motorized stage）上に置き、筋収縮頻度を再度３０秒間数えた。筋収縮頻度の分析には、前述のものと同じ変化の範囲に従って、３本の線維のうちの少なくとも２本が同じ効果を示した場合、その供試製剤がある効果を有しているものと見なした。
【表３】
2006124360.tif 000004
【００４８】
［表３］から、いずれも系もＳＥＣ００３の効果の持続性が明らかである。
【００４９】
復元性（洗浄による筋繊維の収縮活性の回復）＜図２参照＞
再構成した皮膚／収縮性筋細胞共培養モデル（皮膚サンプル）上にＳＥＣ００３（１０％含有製品）を局所適用した後に筋線維の収縮活性の回復を調べた。すなわち、前記ＳＥＣ００３を添加して３０分間収縮をブロックし（図２中の（１））、その後表皮を洗浄してＳＥＣ００３を除去した（図２中の（２））。洗浄後の筋線維の経時的な活性収縮活性を調べた。結果を図２のグラフに示す。これにより、洗浄２時間後（１２０分後）（塗布１５０分後）（図２中の（３））には筋肉の収縮が完全に回復していることが分かる。
【００５０】
［Ｂ］：培養線維芽細胞中でのコラーゲン合成に及ぼすＳＥＣ００３の活性
本実施例において、ＳＥＣ００３のタイプＩコラーゲンおよびタイプIIIコラーゲンの合成に及ぼす影響、並びにタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲンの比の変化に及ぼす影響を評価した。
【００５１】
すなわち、ビタミンＣによって誘導される総コラーゲンの合成にＳＥＣ００３が変化を与えるか否かを調べるために、５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸の存在下という最も強力な条件下で行い、ＳＥＣ００３のタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲンの比に与える影響を主として調べた。
【００５２】
なお、この実施例はコラーゲン前駆体に取り込まれるアミノ酸である［３Ｈ］−プロリンの、細胞層および培地から抽出された巨大分子画分中への取り込みを測定して行った。
【００５３】
（線維芽細胞の培養）
ヒト皮膚線維芽細胞（腋窩、４４歳男性）の継代２代目を用いた。
【００５４】
（培養液の調製）
線維芽細胞を６×３５ｍｍ直径のプレート（ＮＵＮＣ）上に３５０００個／ｃｍ２の密度で接種（播種）した。培地は、１０％（v/v）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco）を添加したＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）（Gibco）を用いた。５％（v/v）ＣＯ２を含んだ湿潤な雰囲気下で３７℃で２４時間インキュベートした後、稠密な細胞層をプロリン不含のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Essential Medium）（Gibco）中で２回洗った。次いで、５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Sigma）、２ｍＭグルタミン（Sigma）、及び１％（v/v）ＳＶＰを添加したＤＭＥＭの存在下で細胞をあらかじめ２時間インキュベートした。
【００５５】
（アイソトープ標識）
次いでその細胞を、下記のものを添加したＤＭＥＭの存在下で７２時間インキュベートした。
【００５６】
・アスコルビン酸：５０μｇ／ｍＬ
・グルタミン：２ｍＭ
・ウシ胎児血清：１％（v/v）
・［３Ｈ］−プロリン（ＴＲＫ３２３；Amersham）:５０μＣｌ／ウエル
・ＳＥＣ００３（３種類の濃度のもの）
各３ウエルの４シリーズを用いた：
・陰性対照の１シリーズ
・ＳＥＣ００３（供試製剤）の３シリーズ（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）。
【００５７】
（細胞層および培地からの巨大分子画分の抽出）
培地（１容）を採取し、細胞層を０．５容の、各種のプロテアーゼインヒビター（ＥＤＴＡ：２０ｍＭ、６−アミノヘキサノン酸２００ｍＭ、塩酸ベンザミジン１０ｍＭ、ヨードアセトアミド０．２ｍＭ）（Sigma）を添加したＰＢＳで２回洗った。
【００５８】
細胞層をスクレイバーで集め、１容の、各種のプロテアーゼインヒビター（ＥＤＴＡ：１０ｍＭ、６−アミノへキサノン酸１００ｍＭ、塩酸ベンザミジン５ｍＭ、ヨードアセトアミド０．１ｍＭ）を添加したＰＢＳ中で氷上で音波処理（５０Ｈｚで２０秒間、２回）した。
【００５９】
・細胞層
この細胞層から得られたタンパク質を硫酸アンモニウムを飽和させたＰＢＳ中で、１０μｇのコラーゲン（Ｉ型＋III型）（Sigma）の存在下で４℃で１８時間置いて沈殿させた。
【００６０】
遠心（１５，０００ｒｐｍ，４℃）後、タンパク質のペレットを、３％（w/v）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（Sigma）および１０％ｗ／ｖのショ糖（Sigma）を含有する、３００μＬ  Tris−ＨＣｌバッファー，０．１２５Ｍ，ｐＨ６．８中に再懸濁した。
【００６１】
得られた液を同じバッファー溶液に対して透析した（ＢＲＬ  マイクロ透析機）。各透析物の最終容積は５００μＬであった。
【００６２】
・培地
タンパク質は硫酸アンモニウムを飽和させたＰＢＳ溶液中で４℃で１８時間置くことによって沈殿した。遠心（１５，０００ｒｐｍ，４℃）後、タンパク質のペレットを、３００μＬ  Tris−ＨＣｌバッファー中に再懸濁し、同じバッファーに対して透析した。透析後の最終容積は５００μＬであった。
【００６３】
（取り込まれた放射能の測定）
５０μＬのサンプルを取り液体シンチレーションカウンター（β−ＫＯＮＴＲＯＮ  カウンター）で２回重複測定した。結果は１０６個の細胞あたり取り込まれた［３Ｈ］−プロリンのｄｐｍで現した（ウエルあたりの細胞数の測定のためにさらに２つのウエルを並行して処理した）。
【００６４】
（コラーゲンの定量的研究）
サンプルの電気泳動（LEMI試験方法番号5.9.1，5.9.2，5・9・3，5・9・4，及び5.1.0）
同一放射能レベル（１００，０００ｄｐｍ）を含んでいる各サンプルの１容を採取し、７．５％（v/v，最終濃度として）β−メルカプトエタノール（Merck）を添加した後、１００℃で３分間変性させた。サンプルに３μＬのプロモフェノールブルーを添加した。サンプルを７．５％アクリルアミドゲル上で泳動させた（SDS PAGE）。
【００６５】
ゲルを脱色した後、種々のコラーゲン鎖に対応するバンドを切り出し、５００μＬ  トルエン（Packard）を入れてあるシンチレーション管に入れた。バンドを６０℃で１８時間かけて溶解させた。放射能は液体シンチレーションカウンターで測定した（β−Kontron  カウンター）。
【００６６】
（結果）
（１）ＳＥＣ００３の存在下、および不存在下での総コラーゲンの新規合成の評価：
細胞層および培地から得られた総コラーゲンの測定結果を下記の表に示す。
【表４】
2006124360.tif 000005
【００６７】
結果はＳＥＣ００３が１０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度ではアスコルビン酸を存在させた最も良い条件下でもコラーゲンの合成に変化をもたらさなかった。ＳＥＣ００３の１μｇ／ｍＬでは、アスコルビン酸で誘導させた陽性対照と比較すると、細胞層におけるコラーゲンの蓄積の低下が生じた。しかし、アスコルビン酸を最高の濃度で用いているこの実験条件を考慮すれば、これらの結果はＳＥＣ００３がコラーゲン合成を変えないと考えれば、正常な結果である。
【００６８】
（２）コラーゲン合成の定性的評価：
ＳＥＣ００３の存在下および不存在下でのタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲン比
細胞層内の結果を下記の表に示す。
【表５】
2006124360.tif 000006
【００６９】
これらの結果はタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲン比が対照の細胞層では約３であり、従って、細胞層内のタイプIIIコラーゲンの蓄積量はタイプＩコラーゲンの２５％であることを意味している。この比はヒトの皮膚についてin vivoで示された結果と非常に近い値である。
【００７０】
ＳＥＣ００３は１μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度でタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲン比を低下させ、これらはそれぞれタイプIIIコラーゲンの３５％および３９％の増加を意味する。
【００７１】
・培地内
結果を下記の表に示す。
【表６】
2006124360.tif 000007
【００７２】
これらの結果はタイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲン比が対照の培地では１．４５であり、このことは培地中にはタイプIIIコラーゲンが豊富に含まれていることを意味している。ＳＥＣ００３は、１μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で培地中のタイプIIIコラーゲンのタイプＩコラーゲンに対しての比率の低下をもたらした。この結果は正常であり、細胞層で得られた結果を確認するものであるが、それはタイプIIIコラーゲンの濃厚化は培地でのみ起こりうるからである。
【００７３】
以上の通りであり、ＳＥＣ００３は、合成されるコラーゲンの総量を変えることなく、タイプＩコラーゲン／タイプIIIコラーゲン比を低下させる。この低下はタイプIIIコラーゲンの合成の増加によるもので、このことはＳＥＣ００３が皮膚の質を高める（皮膚を若年齢化する）ことを示している。
【００７４】
［Ｃ］：培養ヒト線維芽細胞でのインテグリン、ＰＧ（プロテオグリカン）、およびＧＡＧ（グリコサミノグリカン）刺激に及ぼすＳＥＣ００３の活性（図３参照）
（材料と方法）
ＤＭＥ／Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び８０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンを含んだ培地とともに各ディッシュ中に培養ヒト線維芽細胞（良好な再現性を求めるために継代の２代目と４代目の間のものを用いた）を１０５個／ｍＬ接種し、ＣＯ２雰囲気下で２４時間インキュべ−ションした。
【００７５】
そして、ＳＥＣ００３を次の条件下で用いた。すなわち
・２種類のＳＥＣ００３濃度（０．５％および１％）を用いた。
【００７６】
・１濃度あたりディッシュ３枚である。
【００７７】
・並行して３枚のディッシュを溶媒のみで処理した。
【００７８】
・細胞を採取する１８時間前に放射性の前駆体［３Ｈ］−グルコサミンを添加した。
【００７９】
・接触時間は３７℃で２４時間とした。
【００８０】
また、培地を棄てた後、細胞を洗い、遠心し、得られたペレットを次の測定に用いた。・インテグリンアッセイ
・ＦＰＬＣ（Fast Protein Liquid Chromatography）アッセイ
・ＧＡＧＳアッセイ。
【００８１】
（結論）
ここで選択した実験条件下で得られた結果（図３参照）は、ＳＥＣ００３（１％）が培養ヒト線維芽細胞中で、次のものを顕著に刺激することを示している：
・総グリコサミノグリカン（１７％）
・マトリックスプロテオグリカン（７５％）
・インテグリン（１７％）。
【００８２】
マトリックスプロテオグリカンと総グリコサミノグリカン合成の刺激は、皮膚の３次元的構築の再密集化を起こす。インテグリンはそれの細胞／マトリックスおよび細胞／細胞の凝集性によって、細胞がその最適な代謝能を回復することとなるこの皮膚空間をコンパクトなものとする。
【００８３】
［Ｄ］：培養線維芽細胞でのＳＥＣ００３の抗ラジカル活性の評価（図４参照）
用いた方法は、ヒト皮膚生検からの線維芽細胞一次培養物を得るために用いた外移植片法である。試験は種々の実験の間の再現性を確保するために縦代の２代目から４代目の線維芽細胞について行った。
【００８４】
（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）アッセイ）
線維芽細胞を多数のウエルのあるプレートに、１ウエルあたり１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および８０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンを添加した１ｍＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地中に細胞を１０５個含む液を分注した。
【００８５】
次いでその細胞をＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。ＳＥＣ００３を種々の濃度で多数のウエルのあるプレートに、１試験量あたり３つのウエルの割合で分注した。並行して、種々の対照を次のとおり作製した：
・溶媒を３個のウエル（コントロール）
・ＳＯＤおよびカタラーゼを３個のウエル（陰性対照）
・２種類の濃度（０．５％および１％）のＳＥＣ００３を計６個のウエル。
【００８６】
（ＭＤＡ抽出）
トリプシン消化および遠心の後、ペレットを次の液中に再懸濁した。
【００８７】
・２５０μＬの、０．１Ｍ  ＮａＣｌ；ＥＤＴＡ２０ｍＭを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ８
・２８５μＬの７％ＳＤＳ
・３００μＬのＨＣｌ（０．１Ｎ）
・３８μＬのリンタングステン酸（１％，水中）
・３００μＬのチオバルビツール酸（０．１６７％，水中）。
【００８８】
暗所で５０℃で１時間インキュベートした後、冷水中で冷却し、各試験管に３００μＬのｎ−ブタノールを添加した。次いで、それらの試験管を遠心した（１０，０００ｇ，０℃，１０分間）。その上層をＭＤＡアッセイ用として集めた。ＭＤＡは、ＭＤＡ−ＴＢＡ複合体をＨＰＬＣで分離した後、フルオリメトリーでアッセイした。
【００８９】
・Bischoff２．２００ポンプ
・Alcot７８８  自動サンプラー自動インジェクター
・UltrasepＣ１８カラム（３０ｃｍ×０．１８ｃｍ）孔径６μｍ
・Jasco８２１−Ｆｌ蛍光検出器
蛍光の検出は励起波長が５１５ｎｍで蛍光の発光を５５３ｎｍで行った。用いた溶出液はメタノール：水＝４０：６０（v/v），ｐＨ８．３（１Ｍ  ＫＯＨで調整）で溶出させたものである。定量は、ＩＣＳソフトウェアパッケージ（Ｐｉｃ．３）（Instrumentation, Consumable Service）を用いてサンプル（０．１２５、０．２５、０．５、１μＭ）と同様に処理した標準品との比較で行った。結果を図４に示す。
【００９０】
ＳＥＣ００３は１％の添加量で脂質酸化を４９％抑制した。酸素フリーラジカルの生成によって誘導されるＭＤＡ生成に対するＳＥＣ００３の阻害活性は、ＳＥＣ００３に強力な抗ラジカル活性があることを示唆した。ＭＤＡはカルボニルラジカルのマーカーであるので、この活性はタンパク質の保護にも適用される。すなわち、カルボニルラジカルはタンパク質を攻撃して、タンパク質にＡＧＥ（Advanced  Glycatin End Products）を誘導することによってタンパク質を硬化させる。カルボニルラジカルの主な標的はコラーゲンであるので、ＳＥＣ００３が酸素ラジカルまたはカルボニルラジカルの攻撃から皮膚組織全体を保護すると考えることは合理的である。
【００９１】
［Ｅ］：安全性の評価
前述したように、再構成した皮膚サンプル上に製品を局所適用した後に筋線維の収縮活性の回復を調べたところ回復が認められ、その回復時間は皮膚の試験サンプルへの適用期間に直接的に比例していた。ＳＥＣ００３の作用は一時的なもので製品除去後には筋線維の収縮活性が回復し、製品の影響は残らない。
【００９２】
また、顕微鏡による直接観察と組織学的検討によって、ＳＥＣ００３が再構成皮膚中に存在するケラチノサイトに対して細胞傷害性を有さず、ラミニンマーカー、皮膚のサイトケラチン、Ｋｉ６７増殖マーカーに変化を与えないことが示された。
【００９３】
また、次の点も確認している。すなわち、
皮膚一次刺激：僅かな刺激性、眼一次刺激：僅かな刺激性、変異原性：なし、感作性：なし。
【００９４】
（総括的結論）
表皮の刺激感応性反応および表皮が受けた機械的圧迫は皮膚組織に細胞外マトリックスを介して伝達される。その結果として起こる機械生物学的反応は皮膚の３次元的構築に変化を与える傾向がある。それらの変化は特異的な細胞レセプターによって感じ取られ、細胞内の生化学的活性化カスケードを作動させてマトリックスの再形成に有用な成分の合成に変化をもたらす。
【００９５】
このようにして、筋収縮に至る機械的ストレスは、ある種のマトリックス成分の無秩序な発現をもたらし、皮膚細胞の位置の不均衡を強める。他方、筋の弛緩は、過剰発現されたエレメントを触媒する酵素を放出させて、皮膚組織がそのマトリックスのテンションおよび３次元的構築を回復させる。
【００９６】
皮膚の神経伝達物質であるサブスタンスＰ、ＣＧＲＰ、およびアセチルコリンの発現に作用することによって、ＳＥＣ００３は筋収縮を制限し、細胞を弛緩させる。同時に、ＳＥＣ００３はタイプIIIコラーゲン、プロテオグリカン、およびグリコサミノグリカンの合成を刺激することによって皮膚の最適な３次元的構築を復帰させることに貢献する。ＳＥＣ００３の皮膚凝集因子であるインテグリンに対する効果はある程度の皮膚の堅固さをもたらす。皮膚の堅固さはＳＥＣ００３の抗酸素および抗カルボニル効果によって保護され、最適な機能性が確保されるはずである。
【００９７】
ＳＥＣ００３は、皮膚機械的生物学の分野で本当のプレイヤーであり、刺激感応性の高い、若いおよびそれほど若くない皮膚での疲労のマークまたは表情ジワ用の化粧品製剤中で十分に活性を発揮することとなる。「成熟した皮膚」をターゲットとした製剤でＳＥＣ００３を適用すると、最大の保護が得られるとともに、顔面のある程度の再構築が行われるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】α−ブンガロトキシン（ａ−Ｂｇｔ）による筋肉の収縮能阻害率を示したグラフ図である。
【図２】添加したＳＥＣ００３の表皮洗浄後の筋線維の経時的な活性収縮活性を示したグラフ図である。
【図３】ＳＥＣ００３の添加による培養ヒト線維芽細胞での細胞外マトリックスの合成促進作用を示したグラフ図であり、（ａ）はＧＡＧの合成促進作用、（ｂ）はＰＧの合成促進作用、（ｃ）はインテグリンの合成促進作用を示したグラフ図である。
【図４】培養線維芽細胞におけるＳＥＣ００３の抗ラジカル活性を示したグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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