(57)【要約】      （修正有）【課題】  早期腎症段階で腎不全進行を抑制し、透析療法を回避し、非侵襲的に治療する方法およびその装置を提供する。【解決手段】  急性腎不全または糖尿病性腎症の患者に対して超音波を照射する腎疾患治療装置であり、少なくとも１つの超音波トランスデューサー、超音波信号生成手段を備え、且つ該超音波信号生成手段が、該超音波トランスデューサーから照射する超音波が周波数1.3〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA：Spatial Average-Temporal Average、空間時間平均）以下の超音波パルスとなる超音波信号を生成する手段であることを特徴とする腎疾患治療装置。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎不全または糖尿病性腎症の患者に対して超音波を照射する腎疾患治療装置であり、少なくとも１つの超音波トランスデューサー、超音波信号生成手段を備え、且つ該超音波信号生成手段が、該超音波トランスデューサーから照射する超音波が周波数1.3〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA：Spatial Average-Temporal Average、空間時間平均）以下の超音波パルスとなる超音波信号を生成する手段であることを特徴とする腎疾患治療装置。
【請求項２】
該超音波信号生成手段が、該超音波トランスデューサーから照射する超音波が周波数1.5MHz、繰り返し周期1kHz、バースト幅200μs、出力30mW／cm２の超音波パルスとなる超音波信号を生成する手段であることを特徴とする請求項１記載の腎疾患治療装置。
【請求項３】
該超音波トランスデューサーを、患者腎臓方向に向け患者体表面に装着固定するため装着手段を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の腎疾患治療装置。
【請求項４】
腎臓部位に対して、皮膚表面から超音波を照射することを特徴とする腎不全の進行抑制方法。
【請求項５】
該超音波が、周波数1.3〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA：Spatial Average-Temporal Average、空間時間平均）以下の超音波であることを特徴とする請求項４記載の腎不全の進行抑制方法。
【請求項６】
該超音波が、周波数1.5MHz、繰り返し周期1kHz、バースト幅200μs、出力30mW／cm２の超音波であることを特徴とする請求項６記載の腎不全の進行抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎不全の進行の抑制する方法及びそれを用いた腎疾患治療装置に関するものである。更に詳しくは急性腎不全や糖尿病などによって発症される慢性腎不全における糸球体ならびに尿細管細胞障害（線維化など）の進行を抑制する装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
図１の腎不全進展過程のフローチャートで示すように、糖尿病性腎症の患者では、発症後早期に糸球体の肥大が起こり、次第に細胞外基質が増加して糸球体硬化が始まる。その後、間質の線維化が進行して、最終的に腎機能は廃絶する。糖尿病性腎症や糸球体腎炎の進展過程ではマクロファージの腎組織への浸潤が認められる。マクロファージは本来傷害された組織の修復を行う機能を有するが、炎症過程などではサイトカインや組織障害因子を産生する事によって細胞を傷害する事が知られている。腎疾患ではそれらのサイトカインネットワークの破綻により、間質の線維化などが起こる。
【０００３】
Transforming growth factor-β(ＴＧＦ−β)はマクロファージ、内皮細胞、メサンギウム細胞など多くの細胞から分泌され、糸球体硬化メカニズムで最も重要視されている（非特許文献１，２）。ＴＧＦ−βは細胞の分化・増殖や細胞外基質産生などを制御する因子であり、炎症、組織修復、組織の線維化などに深く関わっている。糖尿病性腎症では、糸球体および間質にＴＧＦ−βの発現の亢進と同時に細胞外基質の増加が認められる事が動物モデルなどによる研究でも明らかとなっており、抗ＴＧＦ−βの投与により組織線維化を抑制する事も示唆されている（非特許文献３，４，５）。つまり、ＴＧＦ−βの発現量をコントロールする事が可能であれば、初期の腎不全の進行を抑制する事が出来ると考えられている。
【０００４】
一方、低出力超音波（Low-intensity pulsed ultrasound：以後、ＬＩＰＵＳ）刺激は骨折修復促進機能がある事が知られており（特許文献１：米国特許第4,530,360号）、このような作用をもたらすＬＩＰＵＳ条件（周波数：1.5MHz、繰り返し周波数：1KHz、パルス幅：200μs、出力値：30mW/cm2）を兼ね備えた骨折治療装置が米国Exogen社により、超音波骨折治療機セーフスＴＭ（ＳＡＦＨＳＴＭ）として開発されている。超音波骨折治療機セーフスＴＭは、臨床試験において、脛骨骨幹部骨折（非特許文献６）、橈骨遠位端骨折（非特許文献７）などの治癒促進効果ならびに動物モデルでの有効性（非特許文献８）が証明されている。かかる装置による治療は、非侵襲、非温熱効果であり、骨表面で発生する微小な機械的刺激（超音波の音圧による）が骨折部位ならびに周囲の細胞群に影響を与えていると考えられている。
【０００５】
これらのメカニズム解明の為の研究として、ＬＩＰＵＳにより早期の骨芽細胞内の骨形成作用増強に関連した因子（COX-2など）が発現増強されている報告や、コラーゲン分子との架橋結合が増強している事が骨強度増強になっているという報告がある（非特許文献９，１０）。また、様々な研究者が多数の超音波条件で骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞などへの超音波刺激の影響を検討しており、メカニズムの詳細は今だ明らかとなってはいない。その中で、J.K Liらは超音波刺激（周波数：1MHz、繰り返し周波数：100Hz、パルス幅：200μs、出力値：600mW/cm2）によって骨芽細胞の分化・成長が促進され、ＴＧＦ−βの発現量が増加されている事を報告している（非特許文献１１）。これらの超音波条件（低周波、高出力値）による骨芽細胞への作用は明らかに温熱効果であると予想され、骨折治療に用いられているＬＩＰＵＳ条件とは全く異なっている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,530,360号
【非特許文献１】山下  英俊  他、東京  羊土社、1994
【非特許文献２】Sharma KS他、Seminar in Nephrology、Vol.17、1997
【非特許文献３】Kushiro M他、Nephron、Vol.79、1998
【非特許文献４】Sheidon Chen他、Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol.300、2003
【非特許文献５】Shinya M他、Kidney International、Vol.57、2000
【非特許文献６】J Bone and Jiont Surg、76A、1994
【非特許文献７】J Bone and Joint Surg、79A、1997
【非特許文献８】J Bone Miner Res、Vol.16、2001
【非特許文献９】Naruse K他、J Bone and Mineral Res、Vol.18、2003
【非特許文献１０】Saito M他、Bone、Vol.35、2004
【非特許文献１１】J.K Li他、Biomaterials、Vol.24、2003
【非特許文献１２】FAN JM他、Kidney International、Vol.56、1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
糖尿病性腎症では、糸球体および間質にＴＧＦ−βの発現亢進と細胞外基質の増加が認められており、ＴＧＦ−βの発現を調整する事で組織線維化を抑制できる可能性が示唆され、本発明は、かかる推定のもとに、腎不全の新たな治療方法を提供することを目的とする。そして、早期腎症段階で腎不全進行を抑制し、透析療法を回避し、非侵襲的に治療する方法およびその装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腎不全末期にあたる尿細管細胞・間質の線維化に対して、それらの進行を抑制させ、腎不全を改善する方法について鋭意検討を行った結果、以下の腎疾患治療装置及び方法を見出した。
【０００９】
即ち本発明は、急性腎不全または糖尿病性腎症の患者に対して超音波を照射する腎疾患治療装置であり、少なくとも１つの超音波トランスデューサー、超音波信号生成手段を備え、且つ該超音波信号生成手段が、該超音波トランスデューサーから照射する超音波が周波数1.3〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA：Spatial Average-Temporal Average、空間時間平均）以下の超音波パルスとなる超音波信号を生成する手段であることを特徴とする腎疾患治療装置を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、該超音波信号生成手段が、該超音波トランスデューサーから照射する超音波が周波数1.5MHz、繰り返し周期1kHz、バースト幅200μs、出力30mW／cm２の超音波パルスとなる超音波信号を生成する手段であることを特徴とし、また該超音波トランスデューサーを、患者腎臓方向に向け患者体表面に装着固定するため装着手段を備えることを特徴とする腎疾患治療装置を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、腎臓部位に対して、皮膚表面から超音波を照射することを特徴とする腎不全の進行を抑制する方法を提供するものである。またかかる超音波が、周波数1.3〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA：Spatial Average-Temporal Average、空間時間平均）以下の超音波であることを特徴とし、特に該超音波が、周波数1.5MHz、繰り返し周期1kHz、バースト幅200μs、出力30mW／cm２の超音波であることを特徴とする腎不全の進行抑制方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、超音波照射により、尿細管細胞や間質の線維化が抑制される。本装置を用いる事で、家に居ながら、１日あたり短時間の超音波照射（照射時間は腎不全の進行具合による）により、腎不全初期段階において腎不全の進行を非侵襲的に治療することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
［腎疾患治療装置］
本発明の腎疾患治療装置は、超音波照射により腎臓部位に対するＴＧＦ−βの発現量を抑制し、腎不全の進行を抑制する機能を備えた装置であり、少なくとも１つの超音波トランスデューサー、超音波信号生成手段を備える。照射される超音波は、熱をほとんど発生しないような低出力の超音波であり、具体的には周波数1.0〜2MHz、繰り返し周期100〜1,000Hz、バースト幅10〜2000μs、出力100mW／cm２（SATA）以下の低出力超音波である。照射方法としては、低出力超音波パルスを患部に伝わるようにし、連続した期間照射をすることが好ましい。かかる装置として、例えば米国Exogen社の超音波出力ユニット（SAFHSTM2000J）を用い、超音波出力の特性としてバースト幅200μs、周波数1.5MHz、1kHzの繰り返し周期、出力30mW／cm２で行うことが出来る。
【００１４】
例えば、図２に示すように超音波信号生成手段であるパルス信号生成手段からの信号を、ケーブルを介して超音波トランスデューサーを内蔵した治療ヘッドモジュールに送信し、上記特性の超音波パルスを、患部に近接した体外より経皮的に照射する非侵襲的治療装置である。 治療ヘッドモジュールと皮膚との接触面は超音波伝搬性のゲルを介して行うことにより、超音波トランスデューサーから照射された超音波が皮膚境界面で反射或いは減衰すること無く、生体内に照射することが出来る。
【００１５】
次に腎疾患治療装置の内部構成について説明する。尚、以下の本体及び超音波治療ヘッドモジュールの内部構成は例示であって、各回路構成を本体側または超音波治療ヘッドモジュール側の何れに持って行くことも可能である。    
【００１６】
［本体］
本体は、図３に示すように電源、記憶演算装置、入出力装置で構成される。
1）電源：
電池は充電不可能な高容量タイプのリチウム電池を用いる。電源スイッチはなく、前面パネルの操作により電源が入り、20分間の治療が完了すると自動的に電源が切れる。また、誤操作による超音波出力がないように、スタートボタンは2回押されなければ超音波は出力されない。  なお、治療ヘッドも同じ電池から電力を供給される。
【００１７】
2）記憶演算装置：
プリント基板にはCPU（中央制御装置）が搭載されており、治療時間の管理ばかりでなく、治療ヘッドの動作や装着状態の監視および自己診断を行う。また、バックアップメモリに患者の治療記録が記憶され、必要に応じて取り出せるよう設計する。
【００１８】
3）入出力装置：
操作スイッチ、液晶表示盤、ブザーの他に、接続ケーブルを通して治療ヘッドモジュールの制御と電力供給が行われる。治療ヘッドモジュールの制御信号としては、超音波パルスバースト幅200Hz、繰返し周期1KHzの信号を送る。  また、治療ヘッドからはトラブル信号が送り返される。
【００１９】
［超音波治療ヘッドモジュール］
超音波治療ヘッドモジュールは、図４に示すように、発振装置、超音波波形合成装置、超音波生成装置および以上検出装置で構成される。本体への接続ケーブルは一体型となっている。
【００２０】
1）発振装置：発振装置は、1.5MHzの超音波信号を生成する。
【００２１】
2）超音波波形合成装置：本体からの制御信号と1.5MHz超音波信号を合成して、治療用超音波、すなわち超音波周波数：1.5MHz、超音波出力：30mW/cm2、バースト幅：200μs、繰返し周波数：1kHzの信号特性を有する波形の電気信号を生成する。
【００２２】
3）超音波生成装置：圧電セラミックには電圧をかけると微小な歪みが生じる性質がある。これを利用して超音波波形合成装置で作られた電気信号をトランスデューサー内部の圧電セラミックに与え、トランスデューサー表面に縦方向の振動(超音波)を作り出して治療に応用する。  圧電セラミックの背面には、超音波吸収体を貼り付け、超音波もれを防止する。
【００２３】
4）異常検出装置：治療ヘッドは固定具への固定と超音波伝導用ゲル不足を検出して本体に送信し、液晶表示とアラームで患者に警告する。治療ヘッドと固定具との固定不良の検出には、固定部分の物理的な接触を導電性の有無で判定する。ゲル不足の検出は、ゲル不足による超音波振動子の共振状態の変化を、駆動電流が通常より増加することを検出して行う。
【００２４】
［装着手段］
装着手段は腎臓部位である背面側に装着し、超音波トランスデューサーを内蔵した超音波治療ヘッドモジュールを背中皮膚に固定するハウジング部を備え、ベルト等で固定するタイプのものを使用する。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の腎疾患治療装置を用いて、超音波を腎不全部位に照射した場合の、腎不全進行抑制効果について、実施例を挙げて説明する。以下の実施例では、腎不全末期における尿細管細胞の線維化に対する超音波照射の効果をラットを用いて確認した。
【００２６】
［実験用超音波照射装置］
動物実験用の超音波照射装置は、上記腎疾患治療装置の構成を一部改変して使用した。まず本体に発振回路、超音波波形合成回路を移設し、超音波生成装置を内蔵した６つの超音波治療ヘッドモジュールを同時に制御できるように変更し、また異常検出回路は廃止した。図５に示すように、６つの超音波治療ヘッドモジュールをフレームで水槽内の水中に固定し、培養用の６穴皿の下面に対して水中から超音波を照射した。培養皿上面には、超音波の反射を防止する為のシリコン製の超超音波吸収材を設け、培養液と空気層間の超音波の反射を防いだ。超音波出力条件は、超音波周波数：1.5MHz、超音波出力：30mW/cm2(SATA)、バースト幅：200μs、繰返し周波数：1kHzの特性を有する波形とした。
【００２７】
［尿細管細胞線維化モデル］
実験は、ラット腎尿細管細胞(NRK-52E)を用いた尿細管線維化モデルを用いて実施した（非特許文献１２）。詳しくは、NRK-52E(培地はD-MEM、24-well)を４日間培養した後、ＴＧＦ−βを負荷した。ＴＧＦ−β添加により尿細管細胞が肥大して線維化現象を起こすことが知られており（図６）、ＴＧＦ−β添加量を事前に検討を重ねて2.0ng/mlとした。ＴＧＦ−β負荷直後から４日間、毎日１回、実験用超音波照射装置を用いて低出力超音波を照射し、培養液中のタンパク質濃度の測定を行い、超音波照射の効果を検討した。  
【００２８】
今回の実験では、以下の４群を設定した。
[超音波照射群]
超音波照射群１：  超音波出力ユニットを超音波が発生する状態で、1日20分間、培養日数期間、尿細管線維化モデルに照射した（6例）。
超音波照射群２：  超音波出力ユニットを超音波が発生する状態で、1日20分間、培養日数期間、尿細管細胞に照射した（6例）。
[超音波非照射群]
超音波非照射群１： 超音波出力ユニットを超音波が発生しない状態で、1日20分間、培養日数期間、尿細管線維化モデルに使用した（6例）。
超音波非照射群２：超音波出力ユニットを超音波が発生しない状態で、1日20分間、培養日数期間、尿細管細胞に照射した（6例）。
【００２９】
［評価方法］
超音波照射実験が終了後、尿細管細胞の位相差像を撮影し、組織線維化を確認した（図６）。その後、培養皿内にそれぞれEDTAを含んだ適量の培地を加え、細胞をCell Scraper（旭テクノガラス製）を用いて掻き集め、遠心処理（15,000rpm、4℃、10分間）を行い、上清液を回収した。回収した上清液を-80℃で保存した。
【００３０】
その後、線維化の指標タンパク質であり、細胞が線維化を起こすと細胞外に放出されるFibronectinについて、ELISA法による濃度測定を実施した。マキシソーププレート(ヌンク製)にFibronectin抗体を4℃、一晩コーティングし、3% BSAで１時間ブロッキングし、解凍後のサンプルを37℃、１時間インキュベーションした。Fibronectin一次抗体を添加し、37℃、１時間インキュベーションした。その後、2次抗体で37℃、１時間反応させ、蛍光色素で発色させた。
【００３１】
FibronectinのWestern blotも合わせて実施した。ゲル（第一化学製）にサンプルを10μlずつ添加し、電気泳動を行った（60分間、200V）。電気泳動後、ゲルをPVDFメンブレンに転写した（3時間、200V）。転写されたメンブレンを5% BSAで1時間ブロッキングし、その後、Fibronectin（BDファーミンジェン製）を希釈率×20,000で4℃、一晩コーティングした。翌日、Fibronectin二次抗体を1時間反応させ、ECL-Plusにて発色させた。
【００３２】
［結果］
超音波照射群１（尿細管線維化モデル）において、超音波刺激により明確な形態変化は認められなかったが、ELISA法（図７）ならびにWestern blot法（図８）で測定した両方の結果でも、細胞外に放出されるFibronectin量が減少していた。また、超音波照射群２（尿細管細胞）に超音波刺激を行っても、Fibronectin量に変化は認められなかった。
【００３３】
以上をまとめると、超音波照射刺激により尿細管の組織線維化が抑制されている可能性が示唆された。  
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】腎不全病態のフローチャート図である。
【図２】本発明の腎不全治療装置の外観図である。
【図３】本発明の腎不全治療装置の本体のブロックダイアグラム図である。
【図４】本発明の腎不全治療装置の超音波ヘッドモジュールのブロックダイアグラム図である。
【図５】実験用超音波照射装置ならびにフレーム概観図である。
【図６】超音波非照射群の尿細管細胞ならびに尿細管線維化モデルの位相差像である。
【図７】ELISA法測定によるFibronectin濃度を示した図である。
【図８】Western blot法によるFibronectin濃度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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