(57)【要約】【課題】            タンパク質の所望の位置のアミノ酸が細胞内でリン酸化を受けるか否かを検出する方法及びそのための抗体を提供する。【解決手段】        タンパク質中のホスホチロシン残基及び３−ハロゲン化チロシン残基とは結合せず、３−ハロゲン化ホスホチロシン残基と結合することを特徴とするモノクローナル抗体、及び当該抗体を用いてタンパク質の所望の位置に導入されたチロシン誘導体が哺乳動物細胞内のチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを検出する。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質中のホスホチロシン残基及び３−ハロゲン化チロシン残基とは結合せず、３−ハロゲン化ホスホチロシン残基と結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記３−ハロゲン化ホスホチロシンが、３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシンである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９であるハイブリドーマにより産生される請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９である請求項４に記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項６】
タンパク質の所望の位置にチロシン誘導体が導入された非天然型アミノ酸組込みタンパク質を哺乳動物細胞内で発現させる工程、及び
前記細胞若しくはその抽出物、又は前記細胞から回収したタンパク質と、リン酸化チロシン誘導体に特異的に結合する抗体とを接触させる工程、
を含むことを特徴とするタンパク質の所望の位置のアミノ酸が哺乳動物細胞内のチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを検出する方法。
【請求項７】
前記非天然型アミノ酸組込みタンパク質が、
（Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素と、
（Ｂ）前記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子と、
を含む前記細胞内で発現される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞が、さらに前記チロシン誘導体をリン酸化し得るチロシンキナーゼの組換え発現系を含む請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、前記タンパク質中のチロシン誘導体とは結合せず、リン酸化されたチロシン誘導体と結合する請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記チロシン誘導体が、３−ハロゲン化チロシンである請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化された非天然型アミノ酸と特異的に結合する抗体及びその利用方法に関し、具体的には、前記抗体を用いて、タンパク質中の所望の位置のアミノ酸が、細胞内でリン酸化を受けるか否かを検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼ（タンパク質リン酸化）シグナルは、細胞内シグナルの中でも最も重要なシグナルである。プロテインキナーゼは、ＡＴＰのγ位のリン酸基を基質タンパク質のセリン／スレオニンやチロシンのヒドロキシル基へ転移させる。これらのキナーゼはホスファターゼと共役して働くことで、遺伝子発現、細胞周期の進行及び細胞分化の誘導などを精密に調節している。タンパク質中のリン酸基は、水和の増大、負電荷の出現、水素結合の形成などによりタンパク質の構造変化を引き起こし、その活性を変化させると考えられる。
【０００３】
このような細胞内のリン酸化反応を解析する手段として、種々のキナーゼ特異的な活性測定キット、タンパク質中のリン酸化アミノ酸、例えば、リン酸化スレオニン、リン酸化チロシン、又はリン酸化セリンを認識する抗体、並びに特定タンパク質のリン酸化検出キット、例えば、リン酸化されたグルタミン酸受容体、リン酸化されたＩκＢαやリン酸化されたヒストンＨ２Ａなどを検出するキットが市販されている。
【０００４】
しかしながら、上記リン酸化アミノ酸に対する抗体では、細胞抽出液を用いて直接目的タンパク質のリン酸化を検出することはできず、細胞抽出液から目的タンパク質を単離、精製する必要がある。一方、上記特定タンパク質のリン酸化検出キットには、それぞれのタンパク質ごとに作製された抗体が用いられており、例えば、Ｒａｆ−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測定するためのリン酸化ペプチドに特異的なモノクローナル抗体が報告されている（例えば、特許文献１参照）。このような抗体を用いることにより、細胞抽出液中の特定のタンパク質の所定のアミノ酸残基のリン酸化を検出でき、細胞内における情報伝達のメカニズムを容易に解析することができる。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−４９６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特定タンパク質のリン酸化検出キットでは、それぞれのタンパク質ごとに抗体を作製しなければならないため手間と費用がかかる。また、タンパク質の中には、複数のキナーゼによってそれぞれ部位特異的にリン酸化を受け、当該タンパク質の持つ機能が複雑に制御されているものも存在する。一方、キナーゼの方から見ても、１種類のキナーゼが複数の基質タンパク質をリン酸化しうることが知られており、従来法ではこのような複雑な細胞内のリン酸化機構を解析する上で限界がある。したがって、本発明は、タンパク質の所望の位置のアミノ酸が細胞内のチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを検出する方法及びそのための抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまで、タンパク質の所望の部位に非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込みタンパク質を発現させる方法を開発してきた。一方、当該タンパク質中に組み込まれた非天然型アミノ酸のリン酸化体を特異的に認識する抗体を取得することによって、これらの技術を組み合わせて、細胞内の所望の部位のアミノ酸がチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを効率的に検出しうることを見出した。
【０００８】
すなわち、第一の視点において、本発明の抗体は、リン酸化された非天然型アミノ酸を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、タンパク質中のホスホチロシン残基及び３−ハロゲン化チロシン残基とは結合せず、３−ハロゲン化ホスホチロシン残基と結合することを特徴とする。前記３−ハロゲン化ホスホチロシンは、３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシンであることが好ましい。
【０００９】
本発明の実施形態として、受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９であるハイブリドーマ、及び当該ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が提供される。
【００１０】
本発明の他の視点において、タンパク質の所望の位置にチロシン誘導体が導入された非天然型アミノ酸組込みタンパク質を哺乳動物細胞内で発現させる工程、及び前記細胞若しくはその抽出物、又は前記細胞から回収したタンパク質と、リン酸化チロシン誘導体に特異的に結合する抗体とを接触させる工程、を含むことを特徴とするタンパク質の所望の位置のアミノ酸が哺乳動物細胞内のチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを検出する方法が提供される。前記非天然型アミノ酸組込みタンパク質は、（Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素と、（Ｂ）前記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子と、を含む前記細胞内で発現することができる。前記哺乳動物細胞は、さらに前記チロシン誘導体をリン酸化し得るチロシンキナーゼの組換え発現系を含むことが好ましい。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体は、前記タンパク質中のチロシン、ホスホチロシン、及びチロシン誘導体とは結合せず、リン酸化されたチロシン誘導体と結合する抗体であり、より好ましくは、タンパク質中のチロシン残基、ホスホチロシン残基及び３−ハロゲン化チロシン残基とは結合せず、３−ハロゲン化ホスホチロシン残基と結合する抗体である。このような抗体として、受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を使用することができる。
【発明の効果】
【００１２】
リン酸化されたチロシン誘導体を特異的に認識する本発明の抗体を用いることにより、所望のタンパク質の所望の位置に非天然アミノ酸であるチロシン誘導体を導入し、この変異型タンパク質がリン酸化を受けるか否かを容易に検出することができる。これにより、細胞内のシグナル伝達機構の解析が容易になると共に、細胞内に存在する種々のチロシンキナーゼの構造と機能の解析にとっても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
［リン酸化された非天然型アミノ酸を認識する抗体］
本発明の抗体は、所望のタンパク質に組み込まれた非天然型アミノ酸のリン酸化体（リン酸化された非天然型アミノ酸）と特異的に結合し、リン酸化されていない前記非天然型アミノ酸及びリン酸化された天然型アミノ酸とは結合しないことを特徴とする。また、抗体の特異性は、抗原認識部位の周辺の構造、例えば、前記リン酸化された非天然型アミノ酸周辺のアミノ酸配列によっても影響を受けるが、本発明の抗体は、タンパク質中でリン酸化された非天然型アミノ酸が存在する周辺のアミノ酸配列による影響はあまり受けず、タンパク質中の任意の部位における当該アミノ酸を認識することができる。
【００１４】
本発明の抗体を作製するために用いる抗原は、リン酸化された種々の非天然型アミノ酸、例えば３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシン、３−ブロモ−Ｌ−ホスホチロシンなどの３−ハロゲン化ホスホチロシンを単独で、又は任意の配列のペプチドとして用いることができる。抗体をできやすくするため、ＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin)やアルブミンのようなキャリアータンパク質と結合させて用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。常法により、例えば適当な哺乳動物に目的とされる抗体に対する抗原を注射し、その抗原に対する血清中の抗体のレベルを測定し、その後その力価が高いときに抗血清を調製することにより、製造される。具体的なポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量のリン酸化された非天然型アミノ酸を含むペプチド又はそれとタンパク質とのコンジュゲートを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の製造は、同様に常法により、例えばKoehler and Milstein, "Nature, Vol. 256, pp. 495-497(1975)及び、European Journal of Immunol., Vol. 6, pp. 511-519 (1976)等の方法により製造される。具体的には、例えば、以下の如く行う。リン酸化された非天然型アミノ酸を含むペプチド又はそれとタンパク質とのコンジュゲートを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマを酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等によりスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。あるいは、得られたハイブリドーマ細胞株を免疫動物（好ましくはヌードマウスなどの免疫機構が抑制された動物）の腹腔に注射して腹水を作らせ、腹水液中より回収することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。
【００１６】
さらに本発明は、新規モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関し、モノクローナル抗体１４−７Ａ、３０−１０Ｆ、及び３１−２Ｈ等を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００１７】
［本発明の抗体の利用方法］
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはインビトロにおける３−ハロゲン化ホスホチロシン残基の検出、すなわち定性的及び／又は定量的な測定に用いることができる。抗体を用いる定量法は当業者に知られており、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等が含まれる。あるいは、ウェスタンブロッティングのオートラジオグラムを、例えば、ＮＩＨゲルブロッティングイメージ１．６(NIH gel blotting Image 1.6)ソフトウェアを用い、又は免疫蛍光法によって生物学的な試料の中の３−ハロゲン化ホスホチロシン残基を測定するのに適する。
【００１８】
タンパク質中に非天然型アミノ酸を取り込ませる技術は、タンパク質化学及び細胞生物学の研究分野において益々重要なものとなっているから、本発明のモノクローナル抗体は、人為的な方法によりタンパク質の所定の位置に非天然型アミノ酸の１つとして取り込ませた３−ハロゲン化チロシンのリン酸化反応を解析するために特に好適である。したがって、本発明の抗体により測定対象となる試料は、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質（以下、アロタンパク質ともいう。）を含む生物学的試料である。
【００１９】
アロタンパク質を生産するための手法としては、従来より、大腸菌内で生産する方法（Koide et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, Vol.85, pp.6237-41）及び無細胞翻訳系で生産する方法（Noren et al., Science, 1989, Vol.244, pp.182-188）が知られているが、本発明の抗体は、哺乳動物細胞内で発現されたアロタンパク質を測定するために用いることが好ましい。
【００２０】
このような動物細胞内でのアロタンパク質の発現方法としては、（Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、変異ＴｙｒＲＳという）と、（Ｂ）前記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で前記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子とを動物細胞中で発現させて、上記タンパク質のナンセンス変異の位置に上記チロシン誘導体を取り込ませる方法が開発されている。以下に、この方法に用いられる変異ＴｙｒＲＳ及びサプレッサーｔＲＮＡについて簡単に説明する。
【００２１】
（１）変異ＴｙｒＲＳ
本発明で用いられる変異ＴｙｒＲＳは、アミノ酸として、チロシン誘導体を特異的に認識し、かつｔＲＮＡとして、併用するサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して、チロシン誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができる大腸菌由来ＴｙｒＲＳの変異体である。大腸菌としては、Ｋ１２株、Ｂ株を挙げることができる。大腸菌由来のＴｙｒＲＳ（野生型）は真核生物のｔＲＮＡＴｙｒと反応せず、原核生物由来のｔＲＮＡＴｙｒは真核生物のＴｙｒＲＳとは反応しない。上記チロシン誘導体としては、チロシンのフェニル基の３位又は４位に置換基を有する３位置換チロシン、４位置換チロシンが挙げられるが、リン酸化を受ける水酸基を有する３位置換チロシンが好ましく、例えば、３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン等の、３−ハロゲン化チロシンが挙げられる。これらのアミノ酸は公知の方法で作製することができ、あるいは市販のものを利用することができる。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明に用いられる変異ＴｙｒＲＳは、大腸菌のＴｙｒＲＳ（野生型）のアミノ酸配列中で、少なくとも３７位のチロシン（Ｙ）と１９５位のグルタミン（Ｑ）に相当する位置を他のアミノ酸で部位特異的に置換して、３−ハロゲン化チロシンへの特異性を付与した変異体が挙げられる(Kiga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol.99, pp.9715-9720参照)。さらに好ましくは、３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）又はアラニン（Ａ）により置換され、かつ１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、又はアスパラギン（Ｎ）で置換されたものを用いることができる。これらの変異により、３−ヨード−Ｌ−チロシンへの特異性が高められることが確認されている(Kiga et al.,上掲参照)。
【００２３】
（２）サプレッサーｔＲＮＡ
上記変異ＴｙｒＲＳと組み合わせて使用される、サプレッサーｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸特異的なＴｙｒＲＳ変異体にのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない(orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真核細胞内で発現しなければならない。ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。本発明の方法に用いられるサプレッサーｔＲＮＡは、上記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡであり、より好ましくは、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒが用いられる。
【００２４】
（３）動物細胞内での発現
変異ＴｙｒＲＳ、及びサプレッサーｔＲＮＡを動物細胞内で発現させるためには、いかなる公知の発現系も用いることができる。例えば、変異ＴｙｒＲＳをコードする遺伝子を市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）、ｐＡＧＥ１０７(Cytotechnology, 33, 1990)、ｐＡＧＥ１０３(J. Biochem. 101, 1307(1987))等のベクターにクローン化して用いることができる。また、サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、ｐＢＲ３２２等の大腸菌のクローニング用ベクターを用いても動物細胞内で発現させることができる。変異ＴｙｒＲＳについては、必要に応じて、誘導発現可能なベクターを用いることができ、例えば、クロンテック社、インビトロジェン社等から市販されているテトラサイクリン応答プロモーターを用いることができる。細胞内へのこれらの発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを用いることができる。
【００２５】
したがって、本発明の１つの実施形態において、上記タンパク質の所望の位置にチロシン誘導体が導入された非天然型アミノ酸組込みタンパク質を哺乳動物細胞内で発現させる工程、及び前記細胞若しくはその抽出物、又は前記細胞から回収したタンパク質と、リン酸化チロシン誘導体に特異的に結合する抗体とを接触させる工程、を含むことを特徴とするタンパク質の所望の位置のアミノ酸が哺乳動物細胞内のチロシンキナーゼによってリン酸化されるか否かを検出する方法が提供される。上記非天然型アミノ酸組み込みタンパク質は、本発明の方法によりリン酸化を受けるか否かを解析するためのタンパク質であれば限定されるものではなく、哺乳動物細胞内のシグナル伝達機構、特に、チロシンキナーゼによってリン酸化されうるいかなるタンパク質でもよい。タンパク質の所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込ませるためには、該位置にナンセンスコドンを導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。
【００２６】
タンパク質に部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法(Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987))、ダブルプライマー法(Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987))、カセット変異法(Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985))、メガプライマー法(Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990))などが挙げられる。
【００２７】
哺乳動物の細胞内において、タンパク質中のチロシン残基をリン酸化する酵素（チロシンキナーゼ）は、チロシン誘導体をリン酸化できるものと、リン酸化できないものの両方が存在すると考えられる。例えば、Ｓｒｃキナーゼはヨードチロシン残基をリン酸化するが、ＥＧＦ受容体はできないことが分かっている。したがって、本発明の方法により、用いた細胞内に存在するチロシンキナーゼが非天然型アミノ酸であるチロシン誘導体をリン酸化できるか否かを調べることができる。次に、チロシン誘導体をリン酸化し得る特定のチロシンキナーゼとの共発現を行うことによって、所望のタンパク質が前記チロシンキナーゼによるリン酸化を受けるか否かを調べることができる。哺乳動物細胞内には種々のチロシンキナーゼが存在することから、前記所望のタンパク質がどのチロシンキナーゼによってリン酸化されるのかを調べることはシグナル伝達の詳細を解析する上で重要である。
【００２８】
さらに、タンパク質中の種々の位置にチロシン誘導体を導入し、チロシン誘導体をリン酸化し得るチロシンキナーゼと共発現したときの前記タンパク質中のリン酸化される位置を調べることによって、前記所望のタンパク質とチロシンキナーゼとの詳細な相互作用を解析することも可能である。このように、本発明の方法は、細胞内のタンパク質リン酸化反応の解析に有用であり、これにより極めて複雑な細胞内のシグナル伝達機構やタンパク質相互作用を理解するための新規かつ有用な研究手段を提供するものである。
【実施例１】
【００２９】
本発明は以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
［各種ペプチドの調製］
抗原（免疫原）として使用するリン酸化ペプチド（ＧＧ−ｐＴｙｒ（３−Ｉ）−ＧＧＣ）、評価用ペプチド１（ＦＬＱＲ−ｐＴｙｒ（３−Ｉ）−ＳＳＰＰＣ）、評価用ペプチド２（ＦＬＱＲ−ｐＴｙｒ−ＳＳＰＰＣ）、及びスクリーニング用のペプチド（ＮＰＭＧ−Ｔｙｒ（３−Ｉ）−ＴＫＥＧＣ）は、Ｆｍｏｃ法を用いた固相法により全自動ペプチド合成機を用いて合成した。免疫原のペプチドは、３−ヨードホスホチロシン残基の前後をグリシンにすることで、３−ヨードホスホチロシン以外の特徴的な官能基がペプチドに存在しないように設計されている。Ｃ末端のシステインはタンパク質キャリアへの架橋のために必要である。合成した上記４種類のペプチドはトリフルオロ酢酸で保護基を除いた後、逆相ＨＰＬＣを行って精製した。
【００３１】
上記抗原ペプチド（ＧＧ−ｐＴｙｒ（３−Ｉ）−ＧＧＣ）は、マレイミド法によりスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ免疫原とした。すなわち、２ｍｇのペプチドを５００μｌのマレイミドコンジュゲーションバッファーに溶解し、この溶液に５００μｌの純水に溶解した２ｍｇのマレイミドＫＬＨを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後ＰＢＳに対して透析した後、１００μｌずつ６本に分注して−２０℃に凍結して保存した。
【００３２】
一方、モノクローナル抗体のスクリーニングに用いるために、免疫抗原を、ＫＬＨに代えてＢＳＡを用いたこと以外は同様の方法によりマレイミド法によりコンジュゲーションを行った。これらのスクリーニング用ペプチドＢＳＡ結合物は、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＥＩＡプレートに自然吸着法で固定した。その他の評価用ペプチド等はグルタルアルデヒドを用いて直接プレートに共有結合させた。
【００３３】
［マウスの免疫］
上記で作製した免疫原（リン酸化ペプチド（ＧＧ−ｐＴｙｒ（３−Ｉ）−ＧＧＣ）−ＫＬＨ架橋物）１００μｌに９００μｌのＰＢＳを加えて１ｍｌとし、これにフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ、Difco Lot No.147436）１ｍｌとをよく混合して乳化させ、４匹の１２週令のＢａｌｂｃマウス（日本クレア）の腹腔内に等量に分けて投与した。２週間後に再度同量の抗原をリビ・アジュバント（RIBI社）と混濁状態にして投与し２次免疫を行った。さらに２週間ごとに２次免疫と同様の方法にて３次免疫、４時免疫及び５次免疫を行った後、３日後に２匹の免疫動物より脾臓を取り出し、以下に示すように細胞融合を行った。なお、免疫マウスの１匹に腹水がたまったので採取して保管した。また残りの１匹については全採血を行った。
【００３４】
［細胞融合とスクリーニング］
摘出したマウスの脾臓細胞を、５０％ポリエチレングリコール存在下にてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１マウスミエローマ細胞と細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１０６個／ｍｌの濃度になるように１０％ウシ血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン社製）１０枚に分注した。ＨＡＴ選択後、一次スクリーニングを免疫抗原−ＢＳＡプレートで実施した。すなわち、抗原ペプチド−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）を通常のＥＩＡプレートに自然吸着法で固定したものを用いてＥＬＩＳＡ法にて培養上清中の抗体の有無を測定したところ、抗原と反応性のある３２株を選択した。
【００３５】
陽性反応を示した株の上清を再度サンプリングして４種類のペプチドをそれぞれ共存させた上で抗体価を測定した。ＧＧ−ｐＴｙｒ（３−Ｉ）−ＧＧＣペプチドで阻害された４株を４８ウェルマイクロプレートで拡大培養した。順次陽性株について限界希釈法によるクローニングを行い、リン酸化ペプチドに対する反応性を有する以下の３種類のクローンを選択しサブクラスを検定した。
【００３６】
【表１】
2006143669.tif 000002
【００３７】
なお、これらのうちの１つのクローン１４−７Ａは、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２９９（寄託日は平成１６年１１月１６日）として寄託されている。
【００３８】
［抗体の特異性の確認］
上記で得た抗体につき、ＥＬＩＳＡ法によってリン酸化ペプチドに対する反応性を確認した。すなわち、上記３種類のクローンの培養上清４５μｌと以下の４種類のペプチド１０μｌとを混合して室温で３０分間インキュベートした。免疫抗原−ＢＳＡでコートしたプレートに上記反応混合液５０μｌを添加して反応させた後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ・ウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製、Code No. 61-6520）を反応させ、再度洗浄し、ペルオキシダーゼの発色基質であるＡＢＴＳと反応させて４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を以下の表２に示す。
【００３９】
【表２】
2006143669.tif 000003
【００４０】
表２に示したように、上記３種類のモノクローナル抗体は、いずれも抗原ペプチド（Ａ欄）によりプレートへの結合が阻害されるが、その他のペプチド（Ｂ〜Ｄ欄）によっては阻害されないことが分かった。なお、この実験では、Ｂ欄のペプチドによる阻害効果は３０−１０Ｆにのみ有意に認められた。他の２つのクローンについては、別の実験でアミノ基突出のプレート器材にグルタルアルデヒドを介して評価用ペプチド１を共有結合させたプレートを作成し、抗体とペプチドモノマーとの反応を直接調べると、１４−７Ａは評価用ペプチド１と結合することが確認され、３１−２Ｈはほとんど結合しなかった。したがって、３０−１０Ｆと１４−７Ａの２種類のクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ペプチド中の３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシン残基（抗原ペプチド及び評価用ペプチド１）とのみ特異的に結合するが、リン酸化チロシン残基（評価用ペプチド２）及び３−ヨード−Ｌ−チロシン残基（スクリーニング用ペプチド）とは結合しないことが分かった。
【００４１】
［Ｓｒｃキナーゼ及びＥＧＦ受容体の自己リン酸化反応の解析］
本実施例では、Ｓｒｃキナーゼ及びＥＧＦ受容体の自己リン酸化部位に３−ヨード−Ｌ−チロシンを導入し、自己リン酸化反応によってこれらの３−ヨード−Ｌ−チロシン残基がリン酸化されるか否かを検出した。
【００４２】
（１）材料
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体はシグマ社から、抗ＥＧＦＲ抗体はサンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）社から購入した。二次抗体として、ＨＲＰ（Horseradish Peroxidase）標識抗マウス抗体及び抗ウサギＩｇＧ抗体をアマシャムバイオサイエンス社から購入した。
【００４３】
（２）３−ヨード−Ｌ−チロシンの導入系、部位特異的変異導入、及び遺伝子発現プラスミドの構築
培養細胞で、３−ヨード−Ｌ−チロシンをアンバー・コドンに特異的に導入するシステムについては、すでに報告されている（K. Sakamotoら、Nucleic Acids Res．第３０巻、４６９２-４６９９頁、２００２年参照）。このシステムは、大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３−ヨード−Ｌ−チロシン特異的な変異体（ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５））の発現プラスミドｐＥＹＳＭ１、及びサプレッサーｔＲＮＡの発現プラスミドｐＢｓｔＲＮＡを、同時に細胞にトランスフェクトし、３−ヨード−Ｌ−チロシンを細胞培養液に添加することで、アンバー変異を持つタンパク質遺伝子のアンバー・コドン部位に３−ヨード−Ｌ−チロシンを導入するものである。上記発現プラスミドの作成方法は、Sakamotoら（上掲）及び国際公開公報ＷＯ２００４／０３９９８９号パンフレットに記載されており、その内容は参照により本願明細書に組み込まれる。
【００４４】
なお、本実施例では、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）を安定的に保持する細胞株ＣＨＯ−Ｙを用いた。この細胞株は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質を構成的に生産するＴ−ＲＥＸ−ＣＨＯ細胞（インビトロジェン社から購入）を、プラスミドｐＥＹＳＭ１でトランスフェクトし、２５μｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン社）を含む培地で選択し、１μｇ／ｍｌの存在下で、選択した細胞の、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）の発現を調べることによって取得した。この細胞を用いると、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）の発現プラスミドをトランスフェクトする必要がなく、アンバーコドンを有する所望のタンパク質発現用のプラスミドと、サプレッサーｔＲＮＡの発現プラスミドとをトランスフェクションするだけで所望のアロタンパク質を合成することができる。
【００４５】
ＥＧＦ受容体(ＥＧＦＲ)、およびＳｒｃの変異体は、Quick Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いた部位特異的変異法によって作成した。変異型ＥＧＦＲ、およびＳｒｃのＣ末端にはＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加し、細胞中で発現させるためにｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。これらの部位特異的変異導入に用いたオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである。
【００４６】
Ｓｒｃ（Ｙ５２７Ｆ）：5'-CACACATCTAGATCAGAGGTTCTCCCCGGGCTGGAACTGGGGCTC-3'（配列番号１）
Ｓｒｃ（Ｙ４１６Ａｍ）：5'-CCTTGCCGCGCCGTCTACTCATTGTCTTC-3'（配列番号２）
ＳｒｃのＣ末端にＦＬＡＧ配列を付加する配列：5'-CACACTCTAGATCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGAGGTTCTCCCCGGGCTGGAAC-3'（配列番号３）
ＥＧＦＲ（Ｙ１０６８Ａｍ）：5'-CCCAGTGCCTGAATACATAAACCAGT-3'（配列番号４）
ＥＧＦＲ（Ｌ８３４Ａ）：5'-GATCACAGATTTTGGGGCGGCCAAACTGCTGGGTG-3'（配列番号５）
ＥＧＦＲ（Ｌ８３４Ｍ）：5'-GATCACAGATTTTGGGATGGCCAAACTGCTGGGTG-3'（配列番号６）
ＥＧＦＲ（Ｌ８３４Ｒ）：5'-GATCACAGATTTTGGGAGGGCCAAACTGCTGGGTG-3'（配列番号７）
【００４７】
（３）トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｙ細胞は、９０ｍｍディッシュ中で９０％程度のコンフルエントになるまで３７℃で増殖させ、ＥＧＦＲまたはＳｒｃ変異遺伝子発現用プラスミド、およびサプレッサーｔＲＮＡ発現用プラスミドｐＢｓｔＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（インビトロジェン社）中のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから３時間後に、１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むセーラムフリーのＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地に培地交換した。３−ヨード−Ｌ−チロシンは、最終濃度が０．３ｍＭとなるように培地に加えた。さらに１２時間インキュベーションした後、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで５分間処理した。
【００４８】
（４）ウェスタンブロット
３−ヨード−Ｌ−チロシン残基のリン酸化を検出するために、以下の手順でウェスタンブロットを行った。細胞を、緩衝液Ａ（３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％デオキシコレートナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル１００倍希釈（ナカライテスク））中で溶解して細胞抽出液を得た。抗ＦＬＡＧ抗体を用いて沈殿させた後、沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上のタンパク質を、マウス抗３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシンモノクローナル抗体（クローン１４−７Ａ）と反応させた後ＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＥＣＬ plus immunodetection system（アマシャムバイオサイエンス社）で検出した。
【００４９】
（５）Ｓｒｃキナーゼの自己リン酸化の検出（図１）
恒常的に活性化されているＳｒｃキナーゼ変異体（Ｙ５２７Ｆ）（レーン１）と、Ｙ５２７Ｆ変異に加えて、さらにＳｒｃの自己リン酸化部位４１６位をアンバー・コドン置換した変異体（Ｙ５２７Ｆ−Ｙ４１６Ａｍ）（レーン２）をＣＨＯ−Ｙ細胞で発現させた。細胞抽出液から抗ＦＬＡＧ抗体でＳｒｃを沈殿させたのち、マウス抗３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシンモノクローナル抗体（パネルＡ）および抗ＦＬＡＧ抗体（パネルＢ）で検出した結果を図１に示した。
【００５０】
パネルＢでは、それぞれのＳｒｃ変異体の発現が確認された。４１６位のチロシンは細胞内でリン酸化されているが、パネルＡで、リン酸化された３−ヨード−Ｌ−チロシンに特異的な抗体は、３−ヨード−Ｌ−チロシンを導入したＳｒｃ変異体をのみを検出している。このことから、この抗体がタンパク質中の３−ヨード−Ｌ−ホスホチロシン残基を特異的に認識し、チロシン残基及びリン酸化チロシン残基のいずれも認識しないことが分かった。
【００５１】
（６）ＥＧＦＲ変異体の自己リン酸化の検出（図２）
ＥＧＦＲではＳｒｃとは異なり、野生型ＥＧＦＲが３−ヨード−Ｌ−チロシンをリン酸化する活性は高くないので、キナーゼの基質特異性に関わると考えられる部位（８３４位）をロイシン（Ｌ；野生型）から、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）に置換した変異体を作成して３−ヨード−Ｌ−チロシンのリン酸化を解析した。それぞれの８３４位の変異体（レーン１−４）と、さらに、ＥＧＦＲの自己リン酸化部位１０６８位のチロシンをアンバーコドン置換する変異を導入した変異体（レーン５−８）を作成してＣＨＯ−Ｙ細胞で発現させた。細胞抽出液からＥＧＦＲを、抗ＦＬＡＧ抗体で沈殿させたのち、リン酸化された３−ヨード−Ｌ−チロシンに特異的な抗体（パネルＡ）、抗ＥＧＦＲ抗体（パネルＢ）、および抗ＦＬＡＧ抗体（パネルＣ）で検出した結果を図２に示した。パネルＢは、各ＥＧＦＲ変異体の発現を確認するためのものである。
【００５２】
レーン１の３−ヨード−Ｌ−チロシンを導入していない野生型ＥＧＦＲでは、Ｙ１０６８は自己リン酸化しているはずだが、バンドが検出されないので、リン酸化された３−ヨード−Ｌ−チロシンに特異的な抗体はリン酸化チロシンを認識しないことが確認された。レーン２−４の変異体でも同様である。レーン５−８ではバンドが見られ、抗体がリン酸化された３−ヨード−Ｌ−チロシンを検出していることがわかる。野生型ＥＧＦＲが３−ヨード−Ｌ−チロシンをリン酸化する活性は高くなく（レーン５）、Ｌ８３４Ａ変異によって３−ヨード−Ｌ−チロシンが効率よくリン酸化されるようになった(レーン６)。すなわち、ＥＧＦＲの自己リン酸化部位（１０６８位）は、野生型ＥＧＦＲではリン酸化されにくいが、８３４位のロイシンをアラニンに置換した変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８３４Ａ）によって効率よくリン酸化されることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｓｒｃキナーゼの自己リン酸反応をウェスタンブロッティングにより検出した結果である。
【図２】ＥＧＦＲ変異体の自己リン酸化反応をウェスタンブロッティングにより検出した結果である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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