(57)【要約】      （修正有）【課題】  複数の被験物質がリガンドに同時に吸着する現象を分析することによって、被験物質とリガントとの相互作用を解析する方法を提供する。【解決手段】  金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって被験物質とそのリガンドとの相互作用を解析する方法において、被験物質を含まない溶液を送液した後に２種以上の被験物質を含む溶液を送液することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって被験物質とそのリガンドとの相互作用を解析する方法において、被験物質を含まない溶液を送液した後に２種以上の被験物質を含む溶液を送液することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析することを含む、上記の解析方法。
【請求項２】
予め測定された被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差をデータとして表示することを含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
前記流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から２種以上の被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項１又は２に記載の解析方法。
【請求項４】
予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析し、その差の存在に基づいて、被験物質とリガンドとの結合によって結合部位に変化を生じさせる被験物質を同定する、請求項１から３の何れかに記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴分析による被験物質の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品として使用される化合物は、生体内においてタンパク質と相互作用して、その機能を発揮することが多い。例えば、酵素阻害剤は、標的となる酵素に結合し、酵素反応を阻害することにより、生体内の生化学反応を変化させ、その薬理作用を発現する。このため、医薬品の探索においては、タンパク質と医薬品候補化合物の結合の強さを知ることが重要となる。
【０００３】
近年、タンパク質と化学物質との相互作用を解析する手法として、表面プラズモン共鳴法が注目されている。この手法では、金などの金属表面にタンパク質を固定化し、化学物質をこの金属表面に供与したときの表面プラズモン共鳴の変化を測定することにより、タンパク質と化学物質との相互作用を定量する。
【０００４】
化学物質である被験物質は、この被験物質と相互作用する分子（即ち、金属表面に固定化されたタンパク質など）に時間とともに吸着する。このときの吸着量、すなわちSPR信号の変化は下式に従って変化する。
dR/dt = ka・Cs・(Rmax - R) - kd・R      式(1)
（式中、RはSPR信号であり、Rmaxは最大SPR信号である。また、kaは吸着速度定数、kdは離脱定数、Csは金属表面近傍の被験物質の濃度を表す。）
【０００５】
ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件ではCsは一定となり、簡素な微分方程式を解くことにより、測定結果からka、kdを求めることが可能である。結合定数(KD)は吸着と離脱の比を示すものであり、kd/kaで表される。
【０００６】
このような表面吸着において、吸着によって構造が変化しない同一の吸着部位にｎ種の複数の化合物が吸着するとき、競争的に吸着を行うためSPR信号の変化は下式で表される。
【０００７】
【化１】
2006071293.tif 000002
【０００８】
（式中、Aは吸着重量からSPR信号に変換する定数、MWi、Csi、θi、kai、及びkdiはそれぞれ、化合物iの分子量、濃度、吸着サイト占有率、吸着速度定数、及び離脱速度定数を表す。）
ここで、予めka、kdが既知であれば、n種の複数の化合物が吸着するときのSPR信号の変化は式(2)によって計算できる。
【０００９】
このような表面吸着において、異なる吸着部位にn種の複数の化合物が吸着するときのSPR信号の変化は下式で表される。
【００１０】
【化２】
2006071293.tif 000003
【００１１】
（式中、Riは化合物iのSPR信号変化を表し、Rmaxiは化合物iの最大吸着SPR信号を表す。）
ここで、予めka、kdが既知であれば、n種の複数の化合物が吸着するときのSPR信号の変化は式(3)によって計算できる。
【００１２】
一方、医薬品の標的となる生理活性物質の多くは、ある物質と結合することにより構造が変化し、別の物質と結合できるようになることも知られている。例えば、一本鎖DNAは相補的なDNAと2本鎖を形成することにより、ある種のDNA認識タンパク質と結合できるようになる。また、ある種の酵素に作用する医薬品（例えば、サイトカインやホルモンなど）では、該酵素のアロステリックサイトという基質認識部位とは違った部位に結合し、基質認識部位の結合性を変化させることが知られている。さらに、複合体タンパク質では単独では生理活性物質に対する認識性を有さないが、複数のタンパク質が複合体を形成して初めて生理活性物質を認識することができるようになる。
【００１３】
このように、医薬品の開発においては、複数の物質がリガンドに同時に吸着する現象を理解し、かつその吸着性を評価できる手法を用いて被験物質を分析することが重要である。しかしながら、従来の吸着解析法では競争的な吸着としてしか判断できない。例えば、特許文献１には、複数の被解析化合物のセンサー表面での結合を分析することが記載されている。また。非特許文献１には、被解析分子と表面とを競争的に結合させ、被解析分子が存在しない場合と比較して、被解析分子の濃度に応じてSPR信号変化が小さくなることにより濃度を検出することが記載されている。
【００１４】
医薬品の探索では100万種類以上の化合物をスクリーニングすることも常套的に行われており、複合的な作用を解析するにはさらに多くの実験が必要となることは自明である。しかしながら、競争的な吸着と吸着サイト自体の変化を分別して、大量のデータを速やかに処理する方法がなく、現状ではこのような複合的作用の網羅的調査ができない。
【００１５】
【特許文献１】特公平７−１１１４３５号公報
【非特許文献１】Chem. Lett. 2002(3), 342
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、複数の被験物質がリガンドに同時に吸着する現象を分析することによって、被験物質とリガントとの相互作用を解析する方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、被験物質とリガンドとの競争的な吸着と、被験物質とリガンドとの吸着による吸着部位の変化を分別して、大量の被験物質を速やかにスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、流路系内の液体を交換して表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって被験物質とそのリガンドとの相互作用を解析する際に、被験物質を含まない溶液を送液した後に２種以上の被験物質を含む溶液を送液することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析することによって、被験物質とリガンドとの吸着による吸着部位の変化を同定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち、本発明によれば、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、表面プラズモン共鳴の変化を測定することによって被験物質とそのリガンドとの相互作用を解析する方法において、被験物質を含まない溶液を送液した後に２種以上の被験物質を含む溶液を送液することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析することを含む、上記の解析方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、本発明の解析方法は、予め測定された被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差をデータとして表示することを含む。
【００２０】
好ましくは、前記流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から２種以上の被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００２１】
好ましくは、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析し、その差の存在に基づいて、被験物質とリガンドとの結合によって結合部位に変化を生じさせる被験物質を同定することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、複数の被験物質がリガンドに同時に吸着する現象を分析することによって被験物質を解析することができる。さらに本発明によれば、被験物質とリガンドとの間の競争的な吸着と、物質とリガンドとの吸着による吸着部位自体の変化を分別して、大量の被験物質を速やかにスクリーニングすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の解析方法では、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、表面プラズモン共鳴の変化を測定する。本発明の解析方法は、上記の測定の際に、被験物質を含まない溶液を送液した後に２種以上の被験物質を含む溶液を送液することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、上記で実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との差を解析することを特徴とする。
【００２４】
本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００２５】
本発明において、予め測定された該被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化と、実際に測定された表面プラズモン共鳴の変化との間に差がある場合には、物質とリガンドとの吸着によって吸着部位自体に変化が生じている可能性があると判断することができる。
【００２６】
本発明においては、被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)は、予め測定しておくことが必要である。被験物質の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)は、実験で得られた時間tにおける信号Rの変化から求めることができる。例えば、吸着表面の化合物濃度が一定とできる高線速の層流条件では式(4)を用いて非線形回帰分析することで求めることができる。
dR/dt = ka・Cs・(Rmax - R) - kd・R  式(4)
ここで、Rmaxは被解析分子の金属表面への結合状態などを反映するためka,kdと同時に求めることが好ましく、未知数が3つの非線形回帰分析を行うこととなる。
【００２７】
上記のようにして予め測定された被験物質の各々の吸着速度定数(ka)及び離脱速度定数(kd)から予測される表面プラズモン共鳴の変化は、リガンドへの吸着サイトが同じ場合は式(5)で計算することができ、吸着サイトが違う場合は式(6)で計算できる。また、両者が混用する場合は式(5)および式(6)を組み合わせることで計算が可能である。
【００２８】
【化３】
2006071293.tif 000004
【００２９】
（式中、Aは吸着重量からSPR信号に変換する定数、MWi、Csi、θi、kai、及びkdiはそれぞれ、化合物iの分子量、濃度、吸着サイト占有率、吸着速度定数、及び離脱速度定数を表す。Riは化合物iのSPR信号変化を表し、Rmaxiは化合物iの最大吸着SPR信号を表す。）
【００３０】
計算法はいかなるものでもよいが、たとえば、解析解を求めたのちに計測した時間毎のSPR信号を計算する方法や有限差分法により微小時間毎のSPR信号変化量を計算する方法がある。
【００３１】
図１に、同一分子量のka=1x106 M-1・s-1、kd=1x10-2 s-1の化合物１とka=1x105 M-1・s-1、kd=1x10-3 s-1の化合物２をそれぞれ1x10-7 Mの濃度の単独溶液ならびに混合溶液をRmax=3000 RUとなる修飾金表面に化合物濃度が一定とできる高線速の層流条件で送液した場合のSPR信号の変化を式(5)および式(6)で有限差分法で計算した結果を示す。図１から明らかなように、式(6)は単純な単独信号の和であり、式(5)は単純な単独信号の和とはならない。
【００３２】
本発明では、２種以上の複数の被験物質の吸着による表面プラズモン共鳴の変化を測定しながら、もしくは測定した後に、実際に測定した信号と、予め測定された該化合物各々の吸着速度定数(ka)、離脱速度定数(kd)から計算した表面プラズモン共鳴の変化との差を表示することが好ましい。表示方法としてはいかなるものでもよいが、結合曲線の差を表示する方法、簡便にずれている度合いのみを表示する方法などが挙がられる。
【００３３】
本発明の一実施態様においては、表面プラズモン共鳴測定装置の流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から２種以上の被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。このような測定により、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。
【００３４】
本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００３５】
また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)を、例えば、1以上100以下とすることができる。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０-5〜１×１０-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。
【００３６】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いることができる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。
【００３７】
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置の一例は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。
【００３８】
また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。
【００３９】
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００４０】
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。
【００４１】
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。
【００４２】
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００４３】
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。
【００４４】
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００４５】
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。
【００４６】
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。
【００４７】
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。
【００４８】
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。
【００４９】
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００５０】
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。
【００５１】
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００５２】
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。
【００５３】
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。
【００５４】
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。
【００５５】
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。
【００５６】
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。
【００５７】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。
【００５８】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。
【００５９】
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。
【００６０】
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。
【００６１】
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
【００６２】
本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。
【００６３】
金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００６４】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００６５】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００６６】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００６７】
金属膜は、最表面に生理活性物質（即ち、被験物質に対するリガンド）を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。
【００６８】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００６９】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。
【００７０】
上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００７１】
本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質（即ち、リガンド）としては、測定対象物である被験物質と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００７２】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００７３】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００７４】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００７５】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００７６】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００７７】
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
（１）生理活性物質のセンサー表面への固定
市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に市販のCM5チップ（ビアコア社製）を設置し、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液３００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに10分間流したのち、バッファー(10mM HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸), 150mM NaCl, 10mM CaCl2)で洗浄した。次いで、流路2,3のみにプロテインA溶液(1mg/mlになるようバッファーに溶解したもの)に入れ替え30分間流し、プロテインAを固定したのち、全ての流路に1M エタノールアミン溶液を10分間流した。さらに、バッファーで10分間洗浄する。こうして、プロテインAをセンサー表面に固定化した。
【００７９】
（２）IgG吸着解析
10μg/mlの抗BSAマウスIgG（分子量150,000）の溶液を（１）で作成したセンサー表面に全ての流路に対して流速20μl/minで流しSPR信号を測定し、流路2,3の平均と流路1,4の平均の差を結合信号とした。測定結果をBIAcore3000付属のソフトで解析しRmax=880 RU、ka=1.4x105 M-1・s-1、kd=5.6x10-4 s-1の値を得た。
【００８０】
（３）BSA吸着解析
4.4μg/mlのBSA（分子量66,200）の溶液を（１）で作成したセンサー表面に全ての流路に対して流速20μl/minで流しSPR信号を測定し、流路2,3の平均と流路1,4の平均の差を結合信号とした。測定結果をRmax=880 RUとして非線形回帰法によって計算し、ka=8.8x105 M-1・s-1、kd=1.1x10-1 s-1の値を得た。
【００８１】
（４）IgG、BSA混合物の吸着計算
上記（２）、（３）の結果から、10μg/mlの抗BSAマウスIgGと4.4μg/mlのBSAを同時に吸着させた場合のSPR信号変化を計算した結果を図２に示す。
【００８２】
（５）IgG、BSA混合物の測定と予測計算値との差の表示
4.4μg/mlのBSA（分子量66,200）および10μg/mlの抗BSAマウスIgG（分子量150,000）の溶液を（１）で作成したセンサー表面に全ての流露に対して流速20μl/minで流しSPR信号を測定し、流路2,3の平均と流路1,4の平均の差を結合信号とした。測定した実測値と（５）での計算結果との差を図３に示す。独立吸着部位、同一吸着部位いずれでもないことが明確に表示されている。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、同一分子量のka=1x106 M-1・s-1、kd=1x10-2 s-1の化合物１とka=1x105 M-1・s-1、kd=1x10-3 s-1の化合物２をそれぞれ1x10-7 Mの濃度の単独溶液ならびに混合溶液をRmax=3000 RUとなる修飾金表面に化合物濃度が一定とできる高線速の層流条件で送液した場合のSPR信号の変化を有限差分法で計算した結果を示す。
【図２】図２は、IgGの吸着解析、及びBSAの吸着解析より求めたka及びkdを用いて、IgGとBSAを同時に吸着させた場合のSPR信号変化を計算した結果を示す図である。
【図３】図３は、IgG、BSA混合物の測定と予測計算値との差を示す図である。
【図１】
2006071293.tif 000005
【図２】
2006071293.tif 000006
【図３】
2006071293.tif 000007