(57)【要約】【課題】  マイクロチップを使って特定の試料成分を効率よく正確に分取する。【解決手段】  チップにはサンプルリザーバ２０，サンプル排出リザーバ２２，バッファリザーバ２１，ドレイン２３，分取リザーバ２６ａ〜２６ｄと分離流路２４及び、分取リザーバにつながる分取流路が形成されている。そのようなチップを各リザーバが重なるように重ね合わせる。リザーバ間の電場を変えて電気泳動を行なうゲート注入を行い、特定試料成分を複数枚分だけ多く分取する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重ね合わせた複数枚のマイクロチップを備え、
前記各マイクロチップは同一材料からなり、同一デザインの流路をもち、
前記流路は試料導入流路、導入された試料を分離する分離流路及び分離された試料成分を分取する分取流路を備え、
前記各流路の先端にはリザーバを備え、各リザーバはスルーホールによって全マイクロチップ間でつながっており、
最上層又は最下層のマイクロチップの分離流路には試料成分の検出部が設置されており、
前記リザーバ間に泳動用電圧が印加される分取用の電気泳動マイクロチップ装置。
【請求項２】
前記マイクロチップにおいて、前記流路は複数本の分離流路を含み、
前記分取流路とそれにつながる分取用リザーバは前記複数の分離流路によって共用されるようにつながっている請求項１に記載の電気泳動マイクロチップ装置。
【請求項３】
前記マイクロチップにおいて、前記分離流路は環状に形成され、前記分取流路は前記分離の異なる位置に接続された複数個からなる請求項１に記載の電気泳動マイクロチップ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、板状部材の内部に電気泳動流路を有するマイクロチップを使用し、微量のＤＮＡ又はタンパク質などの試料を分離した後、同一マイクロチップ上でフラグメントを分取する機能を有するマイクロチップ電気泳動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析化学の分野で微量のタンパク質や核酸、ＤＮＡなどを分取、又は分析する場合に貴重なサンプルを用いることから、分析時間の短縮、高純度、省溶媒化を図ることが期待されている。
目的とするＤＮＡフラグメント（断片）の回収はＤＮＡ組み換え実験においては必要不可欠な操作になっている。ＤＮＡフラグメントの回収方法に関する方法の一つにアガロースゲル電気泳動がある。これは、泳動後のアガロースゲル（寒天状ゲル）から、目的のバンドを含む断片を切り出し、ＤＮＡを抽出し精製する方法である。この場合、アガロースゲルはあらかじめ低融点のもの（例えばＴａＫａＲａアガロースＬＯ３、ＮｕＳｉｖｅＧＴＧアガロースなど）、又は純度の高いもの（例えばＳｅａｋｅｍ  ＧＴＧアガロース）を選択する必要がある。
【０００３】
ＤＮＡの回収には、アガロースを溶解した後、シリカ担体のＤＮＡ吸着能を利用して不純物を除去し（ＮａＣｌ／エタノール／水洗浄）、目的のＤＮＡフラグメントを回収する。しかし、ＤＮＡフラグメントの回収率は３０〜７０％と低く（ＤＮＡサイズの大きいものほど低い）、ＤＮＡのバンド切り出し時に切り出し口前後の不純物が混入することがある。そのため、精製したものを再度アガロースゲル電気泳動にかけ、抽出・回収操作を繰り返す必要があった。
このように、アガロースゲル電気泳動法には、不純物が混入したり回収率が低いなどの問題や、熟練した作業者が行う必要があるなどの問題があった。
【０００４】
ＤＮＡフラグメントを回収する他の方法としては、ゲルを切り出す代わりにゲルの下流に溝を掘り、目的のＤＮＡバンドが通過する際にゲル溝にＤＥＡＥセルロース製の濾紙を挿んで、そのまま電気泳動させることによって、ろ紙に吸着させる方法がある。
さらに他の方法として、ゲルの下流の位置に、泳動方向と直角方向に回収溶液を注入する流路を設け、一定時間ごとに通電を止めて回収部を空気で置換することで、フラクションコレクタに回収する方法がある。
しかし、いずれの方法もゲル電気泳動による分離を基本としているため、分離性能の割には時間を要するという問題があった。
【０００５】
上記の問題に対し、成分の分離性能を上げることによって目的のフラグメントを高純度で回収する方法として、スラブゲル電気泳動よりも分離性能がよいキャピラリ電気泳動装置で、フラグメント機能を持つものが利用できる。
キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下のガラスキャピラリ内に泳動バッファを充填し、一端側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析対象物をキャピラリ内で展開させるものである。キャピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことから、キャピラリーの両端間への高電圧の印加が可能となり、ＤＮＡなどの極微量試料を短時間、かつ高分解能で分析することができる。
【０００６】
しかし、前述のように、電場を取り除いた状態でキャピラリ端面を回収容器に浸ける必要があるため、キャピラリ内のバッファに泳動性がある場合、正確な分取ができなくなる。さらに、電気泳動によって回収するため、回収容器にはあらかじめ数１０μＬの泳動バッファを入れておく必要があり、次の試料に使用するためには、別途、濃縮することになる。
【０００７】
キャピラリゲル電気泳動法の特性を利用したものとして、高分離で検出された成分がキャピラリ出口から溶出する直前に、電圧の印加を止め、キャピラリ出口端を少量のバッファ溶液を入れたサンプル容器に入れ、再度通電することにより、目的のフラクションを回収する手段もある。
さらに、微量分析を目的とした１枚のマイクロチップを利用し、電気泳動させた試料の所望の部分を分画してポッドに回収する方法も提案されている（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３１０９９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
キャピラリ電気泳動の場合はゲル電気泳動と異なり、サンプルアプライ量を増大させることにより、分離性能が劣化し、ピークの対称性が損なわれる。そのため、回収量をかせぐためには、キャピラリを複数本バンドル化させて、分離性能を維持させたまま、キャピラリ本数倍の量を分取するか、１本のキャピラリに繰り返しサンプルを注入して、同じ回収容器に分取することが考えられる。
ただし、バンドル化する場合は、キャピラリ内部の熱の逃散性がバンドル内部と周囲に差を生じさせ、同じタイミングで目的の分画を得ることが困難になる。
マイクロチップは、主に極微量のＤＮＡなどの試料成分の分析に用いられており、流路幅が小さいため１枚のマイクロチップでは試料を分取回収するには十分な容積ではない。
【０００９】
実例として、ｍＲＮＡから逆転写して得られたｃＤＮＡの純度は、その後のクローニング実験がうまくいくかどうかを左右するため、手間をかけずに極めて純度の高いｃＤＮＡを得ることが必要である。この時、分取したいＤＮＡ量としては５０ｎｇが必要である。
マイクロチップの場合、ピークとして十分検出できる濃度が１０ｎｇ／μＬで、マイクロチップの１本の流路に１回に導入できる試料の体積が０．５ｎＬとすると、５×１０-3ｎｇしか回収できないことになる。５０ｎｇを得るためには、１０，０００倍の絶対量を分取する必要があるため、１本の分離流路を使って単に繰り返しサンプルを導入するだけでは、限界がある。
そこで、本発明はマイクロチップを使って特定の試料成分を効率よく正確に分取することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、重ね合わせた複数枚のマイクロチップを備え、各マイクロチップは同一材料からなり、同一デザインの流路をもち、流路は試料導入流路、導入された試料を分離する分離流路及び分離された試料成分を分取する分取流路を備え、各流路の先端にはリザーバを備え、各リザーバはスルーホールによって全マイクロチップ間でつながっており、最上層または最下層のマイクロチップの分離流路には試料成分の検出部が設置されており、リザーバ間に泳動用電圧が印加される分取用の電気泳動マイクロチップ装置である。
【００１１】
各マイクロチップにおいて、前記流路が複数本の分離流路を含み、前記分取流路とそれにつながる分取用リザーバは前記複数の分離流路によって共用されるようにつながっているものとすることができる。
【００１２】
また、各マイクロチップにおいて、前記分離流路が環状に形成され、前記分取流路が前記分離の異なる位置に接続されたものとすることもできる。
分取成分の特定には、分取流路の下流、分取用流路の直前で検出することによって行なう。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、高分離で分離を行なうためのマイクロチップ流路の延長に、フラクションを分取する複数のリザーバを設け、分離流路が同一デザインのチップを複数枚、積層構造にすることにより、積層枚数倍の分取量を増やすことができる。
アガロースゲル電気泳動などに比べて短時間で、分離度の高い分離が可能である。
キャピラリ電気泳動のように、断続的に電気泳動の停止や分取を繰り返すことなく、高純度のフラグメントを高回収率で得ることができる。
【００１４】
積層構造のチップ枚数に加えて各マイクロチップ内でも、同一特性の複数の分取流路で同時に泳動させた目的成分を、共通のリザーバで分画することによっても、分取量を増やすことが可能になる。
流路に試料成分を分取する環状の分離流路を備えることによっても、効率よく分取することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で実施されるチップ構造の一例を図１に示す。図１は基本的なチップ構造を示しており、同一材料からなり同一デザインの基板に形成された同一形状の流路が、それぞれのリザーバが重なるように、基板を複数枚積層状に重ねたマイクロチップ装置である。
図２は、マイクロチップについて、図１に示した流路における断面の一例を示している。
図３は、図１の各チップに形成されているリザーバや流路等の配置の詳細図を示している。
【００１６】
図３に示すように、各チップには分離流路２４及び分離流路２４から分岐した分取流路が形成されている。分離流路２４は電気泳動を行うときに用いる直線状の流路で、分取流路は分取した成分を取り出すための流路である。各流路の端にはリザーバが配置されている。図３では、サンプルリザーバ２０，サンプル排出リザーバ２２，バッファリザーバ２１及びドレイン２３は分離流路２４につながっており、分取リザーバ２６ａ〜２６ｄは分取流路につながっている。すなわち、リザーバ２２，リザーバ２１は、リザーバ２０が配置されている側の分離流路２４に接続されており、リザーバ２６ａ〜２６ｄはリザーバ２３が配置されている側の分離流路２４から分岐されたそれぞれの分取流路に接続されている。
【００１７】
２７は目的試料成分を検出する試料成分検出部であり、最上層または最下層に設けられるチップにのみ設けられ、分離流路２４上で分取流路との接続部よりも上流側に配置されている。検出部２７は例えば蛍光検出装置であり、その部分の流路に励起光を照射し、発光する蛍光を検出する。
リザーバの位置は全てのチップで重なる位置に設けられ、図２のように重ねたときに各チップの対応するリザーバが連通する。
分取流路は分離流路２４に比べて流路幅が小さく形成されており、溶液はより速く流れると同時に自然拡散によるリザーバ相互間の相互汚染を抑制することができる。
【００１８】
サンプルをリザーバ２０からリザーバ２２方向に、バッファをリザーバ２１からリザーバ２３方向に定常的に流れるように電圧を設定する。このときのリザーバ２０からリザーバ２２方向の電流値Ｉ2に対する、リザーバ２１からリザーバ２３方向の電流値Ｉ1の比は約２倍（Ｉ1／Ｉ2＝２）になるように設定する。
その後、０．３秒間程度、Ｉ1／Ｉ2の比が０．０５になるように電圧を切り替えることによって、０．５ｎＬ程度のサンプルをリザーバ２０から２３方向の分離流路２４に流す。
【００１９】
再度、Ｉ1／Ｉ2の比が２になるように電圧を印加することにより、リザーバ２３方向の流路には、バッファ中に０．５ｎＬのサンプルが導入された状態となり、サンプルを分離することができる。
このようなサンプル注入方式を、一般にゲート注入方式と呼ぶ。このゲート注入を一定の時間間隔で繰り返し、試料を分離流路２４に定期的に導入する。
【００２０】
分離されたサンプルを含む溶液は、リザーバ２３方向に電気泳動し、サンプル中の泳動速度の大きい成分は、泳動速度の小さい成分より速く移動する。電気泳動したサンプルは分離流路２４上に設置されている検出部２７の位置で検出される。具体的には、励起波長４７３ｎｍの高輝度ＬＥＤを光源とするレーザー蛍光検出器を用い、サンプルを透過した光を検出する。
【００２１】
目的のサンプルを分取リザーバ２６ａに分取するとき、例えば、目的の成分１が検出部２７で検出された後、分離流路２４中でリザーバ２１からリザーバ２３にかかる電場を一瞬、リザーバ２１−２６ａ間に切り替えることにより、成分１をリザーバ２６ａ方向へ電気泳動させる。
引き続き、分取したい成分２が、検出部２７を通過した後、電圧を２１−２６ｂ間に切り替えて成分２をリザーバ２６ｂ方向へ電気泳動させる。このようにして、順に電圧を切り替えることにより、成分がそれぞれの分取リザーバに分画され、最後の成分４がリザーバ２６ｄに分取された時点で、分離流路２４中のリザーバ２１−２３とリザーバ２０−２２に定常的な電圧をかけていることにより、流路内に残った不要成分を除去することができる。
【００２２】
ゲート注入が繰り返されているので、同一フラグメントを同一の分取リザーバへ分画する操作も繰り返す。
この分取動作は重ねられた全てのチップで同時に行なわれ、分取成分は共通の分取リザーバへ集められる。本発明は、上記の電圧比及び波長などに限定されるものではなく、サンプルを分取及び検出できる電圧、波長であれば構わない。
【００２３】
本発明で実施されるチップ構造の、他の実施例図を図４から図８に示す。
図４は図３に示したチップ構造の変形例であり、分離流路３４のリザーバＤ側に、３５ａ
−３６ａ，３５ｂ−３６ｂ，３５ｃ−３６ｃ，３５ｄ−３６ｄに分岐したそれぞれの分取流路を備えている。分取流路は分離流路３４よりも流路幅が小さく、泳動速度が速くなると同時にリザーバ間の相互汚染を抑えることができる。
【００２４】
図４に示すチップは、サンプルリザーバ３０，サンプル排出リザーバ３２，バッファリザーバ３１，ドレイン３３と分取リザーバ３５ａ−３６ａ，３５ｂ−３６ｂ，３５ｃ−３６ｃ，３５ｄ−３６ｄ間の各リザーバにつながる分取流路及び分離流路３４が形成されている。このチップも図２のように各リザーバが重なるように重ね合わせて使用される。
一実施例として、ゲート方式によってサンプルを分取する方法を示す。
リザーバ３６ａに着目すると、分離流路３４中のリザーバ３１からリザーバ３３にかかっている電場によって電気泳動していった成分１が検出部３７ａを通過した瞬間に、電場をリザーバ３５ａからリザーバ３６ａにかかるように電圧を印加する。その後電場をすぐに元に戻す。
【００２５】
この操作によって、成分１のみが３６ａリザーバに分取される。
同様に、検出部３７ｂ〜３７ｄで成分２〜４を検出した後に、リザーバ３５ｂ−３６ｂ、リザーバ３５ｃ−３６ｃ、リザーバ３５ｄ−３６ｄ間に電場をかけることによって、成分２から成分４をそれぞれリザーバ３６ｂからリザーバ３６ｄに分取することができる。
【００２６】
図５に示すチップは、図３及び図４に示すチップの分離流路が１本であったのに対し、２本である。また、サンプルリザーバ４０ａ，４０ｂ、サンプル排出リザーバ４２ａ，４２ｂ、バッファリザーバ４１ａ，４１ｂは２つずつ形成されているが、これらをチップ上で共用する構造でも構わない。このチップでは流路４４ａと４４ｂは等しく形成されており、流路４４ａに対するリザーバ４０ａ、４１ａ、４２ａの相対的な位置関係と流路４４ｂに対するリザーバ４０ｂ、４１ｂ、４２ｂの相対的な関係は等しく形成されている。
溶媒排出リザーバ４３及びサンプル分取リザーバ４６ａ〜４６ｄは１つずつ形成されており、２つの流路によって電気泳動された成分を同時に分取できる。
【００２７】
また、リザーバ４６ａ〜４６ｄは、２つの分離流路からの距離が等しくなるように一直線に配置してもよいし、図５に示すように、隣り合う分取リザーバが接触しないように、互いにずらして配置してもよく、その場合には、リザーバ４６ａ〜４６ｄの配置面積を小さくすることができる。
【００２８】
サンプル分取リザーバ４６ａ〜４６ｄに繋がっている分取流路は分離流路に繋がっており、分取流路は分離流路よりも流路幅が小さく形成されているために、分取流路中では泳動速度が速くなる。また分取リザーバ間の相互汚染を抑えることができる。
分離流路４４ａ，４４ｂを電気泳動する溶液の速度が２つの流路で同じであるように設定されているので、試料成分検出部４７ａ〜４７ｄは一方の分離流路４４ａの方に設置したが、他方の分離流路４４ａ，４４ｂに設置してもよい。
【００２９】
図５のチップも対応するリザーバが重なるように複数枚が重ねられ、最上層または最下層のチップに検出部４７ａ、４７ｂが配置され、ゲート注入方式で試料が導入されることにより、検出部４７ａ〜４７ｄで同時に検出したものを次々に分取リザーバに回収することができる。
目的のサンプルを分取リザーバ４６ａに分取するとき、例えば、目的の成分１が分離流路４４ａの検出部４７ａで検出された後、リザーバ４１ａ−４３及びリザーバ４１ｂ−４３間にかかる電場を一瞬、リザーバ４１ａ−４６ａ及びリザーバ４１ｂ−４６ａ間に切り替えることにより、成分１をリザーバ４６ａ方向へ電気泳動させる。
このとき電場が同時に切り替わることにより、分離流路４４ｂ中の成分１もリザーバ４６ａ方向へ電気泳動される。
分離流路の容積は１本のときよりも増大しているので、一度に分取できる試料の量は多くなる。
【００３０】
図６に示すチップは、図５に示すチップの分離流路が２本であったのに対し、分離流路が５本である。また、サンプルリザーバ５１，サンプル排出リザーバ５２，溶媒リザーバ５０，溶媒排出リザーバ５３は１つずつ形成されているが、複数あっても構わない。
また、試料分取リザーバ５６ａ〜５６ｄは、１つずつ形成されており、５本の分離流路５４ａ〜５４ｅによって電気泳動された成分を同時に分取できる。
また、リザーバ５６ａ〜５６ｄは、５つの分離流路５４ａ〜５４ｅからの距離がなるべく等しくなるように配置するほうが好ましい。
【００３１】
サンプル分取リザーバ５６ａ〜５６ｄに繋がっている分取流路は分離流路５４ａ〜５４ｅに繋がっており、分取流路は分離流路よりも流路幅が小さく形成されているために、分取流路中では泳動速度が速くなる。
このチップも対応するリザーバが重なるように複数枚が重ね合わせて使用される。
試料検出部５７ｅは最上層または最下層のチップに配置される。分離流路５４ａ〜５４ｅを電気泳動する速度が５つの流路で同じであるとして、試料成分検出部５７ｅは分離流路５４ｅの方に設置したが、分離流路５４ａ〜５４ｄのいずれか、又は全てに設置してもよい。
【００３２】
この実施例においても、図３のチップと同様、ゲート方式でサンプルを分取する。
目的のサンプルを分取リザーバ５６ｃに分取するとき、例えば、目的の成分１が検出部５７ｅで検出された後、リザーバ５１−５３間にかかる電場を一瞬、リザーバ５１−５６ｃ間に切り替えることにより、成分５をリザーバ５６ｃ方向へ電気泳動させる。
このとき、同時に分離流路５４ａ〜５４ｄ中の成分１〜４もリザーバ５６ｃ方向へ電気泳動させる。
分離流路の容積は１本のときよりも増大しているので、一度に分取できる試料の量は多くなる。
【００３３】
図７に示すマイクロチップ図は、分離流路が環状に形成されたものである。図８に示す図は図７のマイクロチップを複数枚重ねたときの図であり、リザーバ６０〜７３はスルーホールでつながっている。この環状の分離流路は、電場を順次変えながら試料成分の電気泳動を行なうことを特徴としている。
リザーバ６０をサンプルリザーバ、リザーバ６１をサンプル排出リザーバ、リザーバ６４をバッファリザーバ、リザーバ６９をドレインリザーバとする。
【００３４】
リザーバ６４−６９間に電場をかけることで電気泳動を行い、その間の分離流路から分岐した分取流路、その分取流路につながっている試料分取リザーバ６３，６５，６７にて試料の分取を行なう。分取流路に分岐する分離流路には、上記説明と同様に試料検出部を有している。
検出部で目的成分を検出すると、一瞬電場をリザーバ６４―６５間に変えることによって、成分をリザーバ６５に分取することができる。その後電場を元に戻し、次々に各リザーバで試料を分取する。
試料がドレインリザーバ６９の近くまでくると、ドレインリザーバを、例えばリザーバ７０に変えることにより、さらに電気泳動を行なうことが可能になる。
このようにすることで、１つの試料をより多くのリザーバに分取できる。
【００３５】
本発明のマイクロチップ構成は上記の説明に限定されるものではなく、分離流路又は分取流路の形状や本数、リザーバの数などを変えて配置しても実施可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明はＤＮＡなどの微量の試料成分の分取に利用ができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明である複数枚のマイクロチップを重ね合わせた電気泳動マイクロチップ装置の一実施例を示す分解斜視図である。
【図２】図１で示すマイクロチップ装置の断面図を示している。
【図３】図１で示すマイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。
【図４】他の実施例の電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。
【図５】さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。
【図６】さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。
【図７】さらに電気泳動マイクロチップ装置の１つのマイクロチップを示す斜視図である。
【図８】図７のマイクロチップを５枚重ねたときの状態を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００３８】
１，２，３，４，５          試料成分
１０                        マイクロチップ基板
１２                        リザーバ及び流路
２０，３０，４０，５０      サンプルリザーバ
２１，３１，４１，５１      バッファリザーバ
２２，３２，４２，５２      サンプル排出リザーバ
２３，３３，４３，５３      排出ドレイン
２４，３４，４４，５４      分離流路
３５，６５                  分取リザーバ
２６，３６，４６，５６      分取リザーバ
２７，３７，４７，５７      検出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
2006071505.tif 000005
【図４】
2006071505.tif 000006
【図５】
2006071505.tif 000007
【図６】
2006071505.tif 000008
【図７】
2006071505.tif 000009
【図８】
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