(57)【要約】【課題】本発明は、ＮＡＳＨの診断に際して、肝生検体を用いることなく、従来法より安価でしかも患者に対する負担が少なくてすむ、体液試料中のＰIIIＰのＮ末端のペプチドの量を測定する方法、およびその方法に用いられる試薬を提供することを課題とする。【解決手段】体液試料を、III型プロコラーゲンのＮ末端のペプチドに特異性を有する免疫結合的パートナーと接触させ、体液試料と免疫結合パートナーとの間の免疫反応で生じる生成物を測定する方法により上記の課題を解決する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料をIII型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）に特異性を有する免疫結合的パートナーと接触させ、体液試料と免疫結合パートナーとの間で生じた反応生成物を測定することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
体液試料が血清である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
免疫結合パートナーがモノクローナル抗体である請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
免疫反応の測定がサンドウィッチ免疫放射定量法により行われる請求項１〜３のいずれか１つに記載の測定方法。
【請求項５】
III型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）に特異性を有する免疫結合的パートナーを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の測定方法で用いられる非アルコール性脂肪肝炎の診断用試薬。
【請求項６】
IV型コラーゲンの三重らせん領域を認識するモノクローナル抗体とIV型コラーゲンの７Ｓ領域を認識するモノクローナル抗体をさらに含む請求項５に記載の診断用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液試料中に存在するIII型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）の量を測定する方法およびその方法に用いられる試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、欧米では成人人口の１０〜２０％が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹っている。日本でも、数百万人の人々がＮＡＳＨに罹っていると思われる。さらに近年の日本人の生活習慣の欧米化に伴い、今後、日本においてもＮＡＳＨに罹る患者の数は増加するものと考えられている。
ＮＡＳＨとは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の一種であり、肝生検像では、アルコール性肝炎と類似した所見を示す。そのため、従来、非Ｂ非Ｃ型慢性肝炎と診断されていた症例や、その他の原因不明の肝硬変とされていた症例の中にもＮＡＳＨが含まれていると指摘されている。
さらに、ＮＡＳＨは「単なる」脂肪肝とは異なり、肝硬変あるいは肝細胞癌に進展する場合がある。その上、ＮＡＳＨの病態は現在でも依然として不明な点が多く、そのため診断や治療について多くの議論の余地を残している。
ＮＡＳＨの特徴として、肝内に炎症と線維化を伴うことが挙げられる。しかし、現在、ＮＡＳＨの最終的な診断方法としては、肝生検が最も信頼性が高い。しかしながら、通常、肝生検は費用あるいは危険性などの点で、術者および被験者に多くの負担を課す。
ところが、現段階では、この肝生検以外の有用な診断方法は未だ見出されていない。その上、疾患の診断基準もまだ国際的に統一されていない。そのため、免疫学的検査法の検証も、国際的に充分に行うことができていない。
【０００３】
また、慢性肝疾患の患者の特徴として、基底膜に特異的に存在するIV型コラーゲンが、
肝の活動性病変および線維化の程度に応じて変化することが知られている。そして、この特徴は肝硬変において特に顕著である。そのため、肝組織でのIV型コラーゲンの測定が慢
性肝炎の識別に有用であるとされている。また、非アルコール性脂肪肝に罹った患者でも、肝線維化の進行に伴って、血清中のIV型コラーゲン量の値が上昇することが報告されている。そして、非観血的にIV型コラーゲンの量を測定する方法は、特開２０００−５５９１５号公報に開示されているものの、ＮＡＳＨの診断には用いられていない。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−５５９１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＮＡＳＨの診断に際して、肝生検組織を用いることなく、従来よりも安価で患者に対する負担が少なくてすむ、体液試料中に存在するIII型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）の量を測定する方法、およびその方法に用いられる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、体液試料をIII型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）に特異性を有する免疫結合的パートナーと接触させ、体液試料と免疫結合パートナーとの間で生じた反応生成物を測定する方法が提供される。
また、本発明によれば、上記の測定方法に用いられる、III型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）に特異性を有する免疫結合的パートナーを含む試薬が提供される。
また、本発明によれば、上記試薬に、IV型コラーゲンの三重らせん領域を認識するモノクローナル抗体とIV型コラーゲンの７Ｓ領域を認識するモノクローナル抗体をさらに含む診断用試薬が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の測定方法による結果を利用すれば、従来の方法とは異なって、肝生検組織の代りに患者由来の体液を用いるため、従来よりも安価で容易しかも安全にＮＡＳＨを診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＮＡＳＨに罹っている患者の多くが、「単なる」脂肪肝（ＦＬ）に罹っている患者と比べ、図１に示すIII型プロコラーゲンのＮ末端に存在するペプチド（ＰIIIＰ）を体液試料中により多く含んでいることに着目してなされた。
【０００９】
III型プロコラーゲンとは、図１に示すように、約３００ｎｍの３重らせんからなるIII型コラーゲン分子と、そのＮおよびＣ末端に存在する付加的なペプチドからなる。
そして、プロコラゲナーゼの作用によって、III型プロコラーゲンのＮおよびＣ末端のペプチドは切り取られ、その結果、III型コラーゲンが生成する。その際、切り取られたIII型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）は細胞外に放出される。
【００１０】
本発明の測定方法は、この細胞外に放出されたＰIIIＰの体液中での量を測定することからなり、この測定結果はＮＡＳＨを診断するのに有用である。
【００１１】
本発明の方法に用いられる体液試料とは、ヒトのほか、馬、羊、牛、豚のような家畜などの哺乳動物由来の体液を含み、具体的には、哺乳動物の血清、尿および滑液などから得られるものが挙げられる。中でも好ましいのは、ヒト由来の血清である。
これらの体液試料は、そのまま使用してもよく、適切な液体で希釈したものを用いてもよい。また、免疫学的結合パートナーと接触させる前に、予め精製してもよい。
体液試料の精製は、カートリッジ吸着および溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法、あるいはこれらを組み合わせた方法により行うことができる。
【００１２】
本発明の方法は、まず体液試料を免疫結合パートナーと接触させることにより行われる。
【００１３】
本発明の免疫結合パートナーとしては、III型プロコラーゲンのＮ末端のペプチド（ＰIIIＰ）に特異性を有する抗体を用いることができ、かかる抗体の中でもモノクローナル抗体が好ましい。それらの製造には、公知の方法を適用することができる。
さらに、免疫結合パートナーは、ＰIIIＰに特異性を有する第一抗体のみからなっていてもよい。
また、免疫結合パートナーは第一抗体と第二抗体からなっていてもよい。その場合、第一抗体としてＰIIIＰに特異性を有する抗体を用い、第二抗体として第一抗体に結合したＰIIIＰのＮ末端のペプチドに結合する抗体を用いることができる。
【００１４】
免疫結合パートナーは、免疫反応による反応生成物を測定するために、マーカーでラベルされている。
免疫結合パートナーが第一抗体のみからなる場合には、第一抗体がマーカーでラベルされ、免疫結合パートナーが第一および第二抗体からなる場合には、第二抗体がマーカーでラベルされる。
マーカーとしては、例えば酵素、発色団、蛍光団、補酵素、酵素阻害剤、化学発光物質、常磁性金属、スピンラベルおよび放射性同位体など、公知のものが挙げられる。
体液試料を免疫結合パートナーと接触させる工程は、両者の混合物をＰIIIＰが免疫結合パートナーと免疫反応し得る条件下に置くことにより行われる。具体的には、体液試料と免疫結合パートナーとの混合物を、例えば２５℃の温度下に、１．５時間程度放置することにより行われる。
【００１５】
本発明の方法は、次いで、体液試料と免疫結合パートナーとの間の免疫反応で生じた反応生成物を測定することにより行われる。
反応生成物の測定は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（イングヴァール（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０（１９８０））、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、およびサンドウィッチ放射免疫定量法（ＩＲＭＡ）など、公知の方法で行うことができる。なかでも好ましいのは、サンドウィッチ放射免疫定量法である。
【００１６】
免疫結合パートナーとして第一および第二抗体を用いる場合の測定方法について、以下にその具体例を示す。
まず、適当なマイクロタイタープレートなどのウエルの表面に、公知の方法でＰIIIＰのＮ末端のペプチドに特異性を有する第一抗体を固定する。
そして、得られたウエルに体液試料を導入し、前記の免疫反応が起こり得る条件下で反応させる。
その結果、体液試料中にＰIIIＰが存在する場合には、該ペプチドと第一抗体とが免疫反応により結合する。このウエルを蒸留水などの洗浄液で処理する。
次いで、予めマーカーでラベルした第二抗体をウエルに導入して反応し、第一抗体に結合したＰIIIＰと第二抗体とを結合させる。このウエルを再び洗浄した後、第二抗体をラベルしたマーカーに基づいて免疫反応の生成物を測定する。
【００１７】
もう一つの具体例では、第一抗体と体液試料としての血清を予め混合し、前記のような免疫反応が起こり得る条件下で反応させる。この反応液をマイクロタイタープレートのウエルに導入し、第一抗体をウエルの表面に固定する。
このウエルを蒸留水などの洗浄液で処理した後、ウエルに第二抗体を導入して反応し、第一抗体に結合したＰIIIＰと第二抗体とを免疫反応により結合させる。
その後、ウエルを公知の洗浄液で処理し、第二抗体をラベルしたマーカーに基づいて免疫反応の生成物を測定する。
【００１８】
なお、体液試料中のＰIIIＰの測定と同時に、同じ体液試料中のIV型コラーゲン（ＴＩＶＣ）を測定してもよい。
ＴＩＶＣの測定は、例えばラテックス凝集比濁法を用いて、血清中のIV型コラーゲン濃度を簡便でかつ正確に測定することができる。
このように、体液試料中のＰIIIＰの測定と同時に、同じ体液試料中のIV型コラーゲン（ＴＩＶＣ）をも測定し、両測定結果を併用すれば、より正確にＮＡＳＨを診断することができる。
上記の方法に用いられる試薬は例えば次のようにして製造することができる。
ＴＩＶＣの測定用試薬は、図２に示すような構造をしたＴＩＶＣの三重らせん（ＴＨ）領域の蛋白を認識するＴＨ認識モノクローナル抗体と、７Ｓドメイン領域を認識する７Ｓ認識モノクローナル抗体とを、ラテックス粒子に凝集させることで製造することができる。
【実施例】
【００１９】
ＮＡＳＨの患者（１５名）とＦＬの患者（１０名）から、シルバーマン法により検体を採取し、Ｈ−ＥおよびＡＺＡＮ染色によりＮＡＳＨの診断を行った。
同日に同一の患者群から血清を採取し、各血清についてＰIIIＰ、IV型コラーゲン（ＴＩＶＣ）の測定を行った。
（血清中のＰIIIＰの測定）
血清中のPIIIPの測定試薬には、リアグノスト（商標登録）Ｐ−III−Ｐｃ．ｔ（cis bi
o international社製）を用いた。そして、マウスを用いて作製されたＰIIIＰに特異性を
有するモノクローナル抗体を第一抗体として用い、マウスを用いて作製した125Ｉで標識したＩｇＧを第二抗体として用いた。
ＮＡＳＨおよびＦＬの各患者から血清２ｍLをそれぞれ採取し、ＰIIIＰマウスモノクローナル抗体を内壁にコーテイングした抗体試験管に２０μLの標準血清液、血清、コントロール血清液と４００μLの緩衝液を加えて攪拌し、室温、２時間振盪器で振盪させる。試験管内の液体を吸引した後、キットに備え付けの洗浄剤と精製水６００mLで作製した洗浄水１mLで２回洗浄後、放射性標識トレーサ４００μLを抗体試験管内に加えて反応させる。その結果、抗体試験管の内壁表面に抗体―抗原―125ＩＰIIIＰ抗体のサンドイッチ型の複合体が形成される。その後、ＡＰＬ−９５０  γ−カウンター（アロカ株式会社製）を用いて、各ウエルの125Ｉを測定した。
【００２０】
（血清中のＴＩＶＣの測定）
マウス抗ヒトIＶ型コラーゲンモノクローナル抗体を用いたＴＩＶＣ測定用試薬（登録商標）パナッセイIＶ・Ｃ「ラテックス」（第一ファインケミカル株式会社製）を用いて測定した。
５μLと牛血清アルブミン含有の緩衝液１８０μL（第一ファインケミカル株式会社製）を試験管内で37℃、５分間反応させ、次に６０μLラテックス懸濁液を検体中に加え37℃、1分30秒間反応させ、ラテックスの凝集塊を形成させる。凝集塊形成による濁度の上昇を反応前後の濁度の差、すなわち吸光度変化量として吸光度７００nmで、自動分析装置７６００Ｐモジュール（日立製作所製）で測定することで、検体中のＴＩＶＣ濃度を測定した。
【００２１】
図３は、ＮＡＳＨ患者群とＦＬ患者群の血清中のＰIIIＰの値を示したものである。図３に示されているように、ＮＡＳＨ患者群はＦＬ患者群と比べて、血清中のＰIIIＰの値が有意に高い値を示していた（ｐ＜０．０５）。
図４は、ＮＡＳＨ患者群とＦＬ患者群の血清中のIV型コラーゲン（ＴＩＶＣ）含量を比
較したものである。図４に示されているように、ＴＩＶＣ値においても、ＮＡＳＨ患者群は、ＦＬ患者群と比べて、有意に高い値を呈していた（ｐ＜０．０５）。
また、ＦＬ患者群の中で正常値以上の値を示した患者は、ＴＩＶＣ値では１名存在していたのに対し、ＰIIIＰでは１名も存在していなかった。
さらに、ＮＡＳＨ患者群では、肝線維化の進展に伴って血清中のＴＩＶＣ値が増加していた。
以上の結果は、ＮＡＳＨの非観血的な診断方法として、血清中のＰIIIＰのＮ末端のペプチドおよびＴＩＶＣの値の測定、特にＰIIIＰのＮ末端のペプチドの値の測定が有用であることを示唆している。
また、血清中のＴＩＶＣ値を測定することは、ＮＡＳＨに伴う肝線維化の進展評価に有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の測定方法によれば、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹った細胞のみを特異的に識別することができるので、ＮＡＳＨの診断精度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＰIIIＰの構造を示す概念図である。
【図２】ＴＩＶＣの構造を示す概念図である。
【図３】本発明の方法により測定した血清中のＰIIIＰＮ末端のペプチドの量をＮＡＳＨ患者群とＦＬ患者群とで比較して示した図である。
【図４】本発明の方法により測定した血清中のＴＩＶＣの量をＮＡＳＨ患者群とＦＬ患者群とで比較して示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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