(57)【要約】  【課題】  細胞株や個々の細胞の個性差による応答のばらつきがなく、高い再現性及び安定性が得られると共に、高速分析の可能なRNAi分析方法を提供する。  【解決手段】  少なくとも一種類のタンパク質を発現対象とする無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下における該対象タンパク質の発現を比較することにより、該対象タンパク質に対するsiRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種類のタンパク質を発現対象とする無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下における該対象タンパク質の発現を比較することにより、該対象タンパク質に対するsiRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べることを特徴とする無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項２】
siRNAもしくはdsRNAを添加した無細胞タンパク質合成系と、siRNAもしくはdsRNAを添加しない無細胞タンパク質合成系を個別に用意し、それぞれにおける上記対象タンパク質の発現を比較することにより、該対象タンパク質に対するsiRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項３】
一つの無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの非存在下で上記対象タンパク質を発現させた後、該無細胞タンパク質合成系にsiRNAもしくはdsRNAを添加し、siRNAもしくはdsRNAの添加前とsiRNAもしくはdsRNAの添加後における対象タンパク質の発現を比較することにより、該対象タンパク質に対するsiRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項４】
種々の配列から成るsiRNAもしくはdsRNAを使用し、個々の又は複数のsiRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における特定の対象タンパク質の発現を比較することにより、siRNAもしくはdsRNAの配列差による該対象タンパク質の発現抑制効果の違いを調べることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項５】
特定のsiRNAもしくはdsRNAを使用し、該siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における種々の対象タンパク質の発現を比較することにより、各対象タンパク質に対する該siRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項６】
上記対象タンパク質をコードするDNA又はmRNAに蛍光タンパク質及び／又は発光タンパク質の発現系を組み込んでおき、該DNA又はmRNAの発現産物を蛍光法及び／又は発光法を用いて検出することにより、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における前記対象タンパク質の発現をモニタすることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下で少なくとも一種類の対象ウイルスを増殖させ、両者における対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、該対象ウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べることを特徴とする無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項８】
siRNAもしくはdsRNAを添加した無細胞タンパク質合成系と、siRNAもしくはdsRNAを添加しない無細胞タンパク質合成系を個別に用意し、それぞれにおける対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、該対象ウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べることを特徴とする請求項７に記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項９】
一つの無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNA非存在下で上記対象ウイルスを増殖させた後、該無細胞タンパク質合成系にsiRNAもしくはdsRNAを添加し、siRNAもしくはdsRNAの添加前とsiRNAもしくはdsRNAの添加後における対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、該対象ウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べることを特徴とする請求項７に記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１０】
種々の配列から成るsiRNAもしくはdsRNAを使用し、個々の又は複数のsiRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における特定の対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、siRNAもしくはdsRNAの配列差による該対象ウイルスの増殖抑制効果の違いを調べることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１１】
特定のsiRNAもしくはdsRNAを使用し、該siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における種々の対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、各対象ウイルスに対する該siRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１２】
上記対象ウイルスのDNA又はRNAに蛍光タンパク質及び／又は発光タンパク質の発現系を組み込んでおき、該DNA又はRNAの発現産物を蛍光法及び／又は発光法を用いて検出することにより、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における前記対象ウイルスの増殖量又は増殖率をモニタすることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１３】
siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における上記対象タンパク質の発現又はウイルスの増殖を比較する代わりに、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタすることによって、siRNAもしくはdsRNAの抑制効果を調べることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１４】
siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における上記対象タンパク質の発現又はウイルスの増殖を比較すると共に、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタすることによって、siRNAもしくはdsRNAの抑制効果を調べることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法。
【請求項１５】
a) siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下において、無細胞タンパク質合成系内で少なくとも一種類の対象タンパク質を発現させる無細胞タンパク質合成手段と、
b) 上記無細胞タンパク質合成手段による、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下での対象タンパク質の発現をモニタする発現モニタ手段と、
を有することを特徴とするRNAi分析システム。
【請求項１６】
a) siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下において、無細胞タンパク質合成系内で少なくとも一種類の対象ウイルスの増殖を行う無細胞ウイルス増殖手段と、
b) 上記無細胞ウイルス増殖手段による、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下での対象ウイルスの増殖量又は増殖率をモニタする増殖モニタ手段と、
を有することを特徴とするRNAi分析システム。
【請求項１７】
更に、
c) siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタするRNA切断モニタ手段、
を有することを特徴とする請求項１５又は１６に記載のRNAi分析システム。
【請求項１８】
更に、
d) 上記発現モニタ手段、増殖モニタ手段、又はRNA切断モニタ手段によって得られた、siRNAもしくはdsRNAの存在下におけるモニタ結果とsiRNAもしくはdsRNAの非存在下におけるモニタ結果とを比較するモニタ結果比較手段、
を有することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載のRNAi分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNA干渉によるタンパク質発現の抑制効果を分析するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生物種のゲノム配列が解読され、その遺伝子総数も明確になりつつあるが、これらの遺伝子の中には、その機能が未だ明らかになっていないものも数多く存在している。そこで、このような遺伝子の機能を解析する目的で、ゲノム中の遺伝子発現を網羅的にひとつひとつ抑制し、その影響を観察するプロジェクトが線虫、植物、哺乳類、ヒト細胞などで進められている。
【０００３】
従来確立されている技術、すなわち特定の遺伝子を欠損した株を作製し、該特定遺伝子の欠損株と該遺伝子が存在する株との遺伝子発現の表現内容を比較することで、該遺伝子の機能を推定する、いわゆるノックアウト技術は、このための手段として確立された重要な技術であるが、多くの時間と手間を要すると共に、コストも高く、網羅的な解析を行うには非現実的な手法となる。
【０００４】
そこで、目的とする遺伝子を特異的に抑制するための新たな手法として、RNA干渉（RNA interference；RNAi）と呼ばれる技術が注目されており、個々の遺伝子を網羅的に抑制して機能解析を行うための強力なツールとして期待されている。
【０００５】
RNAiを利用した分析においては、線虫や植物、哺乳類などの細胞の中に、抑制したい対象遺伝子のmRNAの一部と相補的な配列を含む21-28塩基対の2重鎖から成る短い阻害RNA（short interference RNA; siRNA）、もしくは対象遺伝子のmRNAの一部と相補的な配列を含む25-30塩基対のdsRNA（2重鎖RNA）を細胞内に導入する。この2重鎖のうち対象遺伝子のmRNAに相補的なものが特定のタンパク質と結合することにより、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA Induced Silencing Complex；RISC）と呼ばれる複合体が形成され、該複合体が対象mRNAに結合して結合部位でRNAを切断することによりタンパク質合成を阻害する。25-30塩基対の2重鎖RNA（dsRNA）は、siRNAと同等もしくはそれ以上のRNAi効果が見られる（非特許文献１）。
【０００６】
このようなRNAi技術は、細胞内の特定の遺伝子の発現を抑制できることから医療応用が期待されており、ガンのras遺伝子の発現抑制や遺伝病の抑制、エイズ、C型肝炎、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルスなどの困難なウイルス感染病の治療や、プリオン増殖抑制効果による治療への適用が期待されており、既にいくつかは研究室レベルの実験に成功している。
【０００７】
【非特許文献１】kim, D.H, et al. "Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy", Nature Biotechnology, 2004年12月26日号
【非特許文献２】N.C.ラウ、D.P.バーテル、"ゲノムを見張る驚異のメカニズム"、日経サイエンス2003年11月号、pp.24-32、日経サイエンス社
【非特許文献３】多比良和誠編、"RNAi実験プロトコール"、2003年4月1日、羊土社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
RNAiによる遺伝子発現抑制効果の分析、及びその実用化には標的細胞への効果的なsiRNAもしくはdsRNAの注入・導入が必要である。従来、導入法としてsiRNAもしくはdsRNAをコードするDNAをプロモータ、ターミネータなど転写に必要な要素を持つベクター（ウイルス）につないで細胞に導入し、該DNAを転写させることによって、細胞内でsiRNAもしくはdsRNA分子を多量に合成させる方法や、脂質カプセルに入れたsiRNAもしくはdsRNA分子を直接細胞内に導入する方法等が行われている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００９】
しかし、このような方法では、生細胞を使用するため、用いる細胞株や、個々の細胞の個性、該細胞と用いるベクターとの相性等がRNA干渉の結果に対して重大な変動要因になる。すなわち細胞表面や細胞内での個性が最終のタンパク質発現に影響を及ぼすため、平均値を求めるための測定が必要であり、また、本質的に標準を定めるのに困難が生じる。例えば細胞に感染した特定のウイルスの抑制をみる場合、個々の細胞の個性差、すなわち発現変動の大きさの決定が重要となり、信頼できる結論を導くためには多くの測定と統計処理が必要といえる。更に、実用性の観点から、このような細胞を用いた方法では、タンパク質を明瞭に検出できる量を得るまでに要する時間が24-72時間と長く、極めて効率が悪いため、この時間の短縮が課題となっている。
【００１０】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、細胞株や個々の細胞の個性差による応答のばらつきを除き、標準として再現性、安定性のある系を確立すると同時に、十分なタンパク質量を得られるまでの時間を大幅に短縮することが可能なRNAi分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法は、少なくとも一種類のタンパク質を発現対象とする無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下における該対象タンパク質の発現を比較することにより、該対象タンパク質に対するsiRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べることを特徴とする。
【００１２】
上記第１の態様においては、一種類又は数種類のタンパク質を発現対象としてもよく、あるいは多種のタンパク質を含むタンパク質群を発現対象として網羅的な解析を行うようにしてもよい。また、「対象タンパク質の発現を比較する」とは、上記発現対象となる個々のタンパク質の発現量や、タンパク質群の発現プロファイル、ある時点において発現している各タンパク質の発現量を時間的に検出したデータなどの差を求めることを意味している。また、このような発現量や発現プロファイルの比較には、それらのエンドポイント値やレート情報を使用することができる。
【００１３】
なお、本発明における無細胞タンパク質合成系としては、いかなるものを用いてもよく、例えば、後述のような従来既知の小麦胚芽抽出物、昆虫抽出物、赤血球抽出物を利用した系などを用いることができる。
【００１４】
また、上記本発明の第１の態様においては、siRNAもしくはdsRNAを添加した無細胞タンパク質合成系（サンプル系）と、siRNAもしくはdsRNAを添加しない無細胞タンパク質合成系（レファレンス系）を個別に用意し、それぞれにおける対象タンパク質の発現を比較するようにしてもよく、あるいは一つの無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの非存在下で上記対象タンパク質を発現させた後、該無細胞タンパク質合成系にsiRNAもしくはdsRNAを添加し、siRNAもしくはdsRNAの添加前とsiRNAもしくはdsRNAの添加後における対象タンパク質の発現を比較するようにしてもよい。
【００１５】
更に、上記本発明の第１の態様においては、種々の配列から成るsiRNAもしくはdsRNAを使用し、個々の又は複数のsiRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における特定の対象タンパク質の発現を比較することにより、siRNAもしくはdsRNAの配列差による該対象タンパク質の発現抑制効果の違いを調べるようにしてもよく、あるいは、特定のsiRNAもしくはdsRNAを使用し、該siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における種々の対象タンパク質の発現を比較することにより、各対象タンパク質に対する該siRNAもしくはdsRNAの発現抑制効果を調べるようにしてもよい。
【００１６】
上記課題を解決するために成された本発明の第２の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法は、無細胞タンパク質合成系において、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下で少なくとも一種類の対象ウイルスを増殖させ、両者における対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、該対象ウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べることを特徴とする。
【００１７】
上記第２の態様においては、一種類又は数種類のウイルスを発現対象としてもよく、あるいは多種のウイルスを含むウイルス群を発現対象として網羅的な解析を行うようにしてもよい。また、上記のような増殖量や増殖率はそのタイムコースやエンドポイント値として得ることができる。
【００１８】
上記本発明の第２の態様においても同様に、siRNAもしくはdsRNAを添加したサンプル系とsiRNAもしくはdsRNAを添加しないレファレンス系におけるウイルスの増殖を比較するようにしてもよく、同一の系においてsiRNAもしくはdsRNAの添加前後のウイルスの増殖を比較するようにしてもよい。
【００１９】
更に、上記本発明の第２の態様においては、種々の配列から成るsiRNAもしくはdsRNAを使用し、個々の又は複数のsiRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における特定の対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、siRNAもしくはdsRNAの配列差による該対象ウイルスの増殖抑制効果の違いを調べるようにしてもよく、あるいは、特定のsiRNAもしくはdsRNAを使用し、該siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における種々の対象ウイルスの増殖量又は増殖率を比較することにより、各対象ウイルスに対する該siRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を調べるようにしてもよい。
【００２０】
なお、上記本発明の第１の態様及び第２の態様において、対象タンパク質の発現又は対象ウイルスの増殖をモニタする方法としては、対象タンパク質をコードするDNA又はmRNA、あるいは対象ウイルスのDNA又はRNAにGFP（Green Fluorescent Protein）等の蛍光タンパク質及び／又は発光タンパク質の発現系を組み込んでおき、該DNA又はRNAの発現産物を蛍光法及び／又は発光法を用いて検出することにより、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における前記対象タンパク質の発現又は対象ウイルスの増殖をモニタする方法を使用することが望ましい。
【００２１】
また、本発明においては、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における上記対象タンパク質の発現又はウイルスの増殖を比較する代わりに、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における、siRNAもしくはdsRNAによる対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタすることによって、siRNAもしくはdsRNAの抑制効果を調べるようにしてもよい。このような方法を用いた場合、siRNAもしくはdsRNAによるごく初期の抑制反応を検出することができ、より短時間での分析を実現することができる。なお、RNAの切断をモニタする方法としては、例えば、ノーザンブロット解析（参考文献: Science, Vol 286, Issue 5441, 950-952, 1999）や断片化したRNAをカラム等で簡単に精製後、ドットブロット解析等により検出する方法などを用いることができる。
【００２２】
また、本発明においては、上述のsiRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における上記対象タンパク質の発現又はウイルスの増殖を比較する方法と、上記のsiRNAもしくはdsRNAによる対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタする方法を併用するようにしてもよい。
【００２３】
上記課題を解決するために成された本発明の第３の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析システムは、a) siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下において、無細胞タンパク質合成系内で少なくとも一種類の対象タンパク質を発現させる無細胞タンパク質合成手段と、b) 前記無細胞タンパク質合成手段による、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下での対象タンパク質の発現をモニタする発現モニタ手段と、を有することを特徴とする。
【００２４】
また、上記課題を解決するために成された本発明の第４の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析システムは、a) siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下において、無細胞タンパク質合成系内で少なくとも一種類の対象ウイルスの増殖を行う無細胞ウイルス増殖手段と、b) 前記無細胞ウイルス増殖手段による、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下での対象ウイルスの増殖量又は増殖率をモニタする増殖モニタ手段と、を有することを特徴とする。
【００２５】
上記本発明の第３の態様及び第４の態様のものは、それぞれ上記第１の態様及び第２の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法を実行するためのシステムであり、上記無細胞タンパク質合成手段及び無細胞ウイルス増殖手段としては、例えば、市販の無細胞タンパク質合成装置等を利用することができる。また、上記発現モニタ手段としては、例えば後述のMALDI-MSやLC-MS/MS等を用いることができ、上記増殖モニタ手段は、例えば、ウイルスタンパク質（主にコートタンパク質）に対する抗体を用いた酵素結合抗体法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA）や、蛍光抗体法（特に間接蛍光抗体法）、又は特異的なウイルス遺伝子配列を高感度に検出するRT-PCR法等によってウイルスの検出を行うものなどとすることができる。
【００２６】
また、上記本発明の第３の態様及び第４の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析システムは、更に、siRNAもしくはdsRNAの存在下及び非存在下における、siRNAもしくはdsRNAによる対象タンパク質のmRNA又は対象ウイルスのRNAの切断をモニタするRNA切断モニタ手段を有するものとしてもよい。このようなRNA切断モニタ手段は、例えば、ノーザンブロット解析やドットブロット解析などによって、切断されたRNAの断片の検出を行うものなどとすることができる。
【００２７】
更に、上記本発明の第３の態様及び第４の態様に係る無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析システムには、上記発現モニタ手段、増殖モニタ手段、又はRNA切断モニタ手段によって得られた、siRNAもしくはdsRNAの存在下におけるモニタ結果とsiRNAもしくはdsRNAの非存在下におけるモニタ結果とを比較するモニタ結果比較手段を設けることがより望ましい。このようなモニタ結果比較手段としては、例えば、適当な解析プログラムを搭載した汎用コンピュータ等を利用することができる。
【発明の効果】
【００２８】
以上のような構成からなる本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法及びシステムによれば、細胞の個性等に由来するタンパク質発現のばらつきを除くことができる。
【００２９】
また、従来の生細胞を用いた系では、タンパク質を明瞭に検出できる量を得るまでに24-72時間が必要であったが、本方式では無細胞タンパク質合成系を用いることにより、数分から数十分で検出可能なレベルとなり、10-100倍の高速性が期待されると共に、時間変化を容易に検出することができ、その変化動態から有効な情報が得られると共に、レート法による更なる高速化も見込みうる。
【００３０】
更に、従来の生細胞を用いた手法のような細胞破砕・タンパク質抽出操作が不要となり、大きな省力化が実現できると共に、抽出に伴うアーチファクトを除くことができる。また、本方法は従来法であるウエスタンブロット法で必要な抗体が準備できない場合にも適用可能であり、またノザンハイブリダイゼーションで必要なRNA抽出が不要で、大幅に操作が簡略化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
無細胞タンパク質合成系は、目的とするタンパク質を生細胞を用いることなく生合成することのできる系であり、従来からの遺伝子組み換えによる大腸菌や酵母を用いたタンパク質合成の代替技術として開発され、小麦胚芽抽出物、昆虫抽出物、赤血球抽出物などを利用した系が既に確立され、実用化されている。
【００３２】
例えば、上記小麦胚芽を用いた無細胞タンパク質合成系は、小麦胚芽抽出成分にATP、GTP、アミノ酸群を添加したものであり、合成反応を長時間持続させるため、前記小麦胚芽抽出成分から翻訳反応を抑制する特定成分を除いた構成となっている。この無細胞タンパク質合成系に、目的のタンパク質をコードするmRNA又はDNAを導入して数十分間反応させることによって、目的タンパク質が電気泳動スポットとして検出できる量（ミリグラムオーダー）に増幅される。このとき、タンパク質合成の鋳型として、一群のmRNA又はDNAを導入すれば、それに応じた多数のタンパク質を合成させることもできる。
【００３３】
このような無細胞タンパク質合成系に特定のタンパク質の発現を抑制するRNA干渉のためのsiRNAもしくはdsRNAを導入すれば、それによって得られるタンパク質の発現プロファイルは、該siRNAもしくはdsRNAを添加しない場合のタンパク質の発現プロファイルと異なることになる。この生成されたタンパク質のプロファイルの検出には、例えば、２次元電気泳動と染色によるデンシトメトリや、MALDI-MS、LC-MS/MSなどを利用することができる。また、特定の発現タンパク質に着目する場合は、抗体や酵素などを用いた蛍光法などでモニタすることも可能である。更に、このようにしてタンパク質プロファイルの差を時間的もしくはエンドポイント値として得ることにより、siRNAもしくはdsRNAの抑制・干渉効果を見ることができる。
【００３４】
図１に本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の一例を示す。まず、siRNAもしくはdsRNAによる発現抑制効果を調べたい一群のタンパク質をコードする網羅的DNA群を含んだ２つの同じ無細胞タンパク質合成系A、Bを準備し、このうち無細胞タンパク質合成系AのみにsiRNAもしくはdsRNAを添加する（Aがサンプル系、Bがレファレンス系となる）。所定の時間タンパク質合成反応を行わせた後、それら２つの無細胞タンパク質合成系で合成されたタンパク質群のプロファイルを質量分析計などを用いてそれぞれ測定して（タンパク質プロファイルA'及びB'）それらの差を求め、これに基づいてsiRNAもしくはdsRNAの対象タンパク質の発現に対する抑制効果を評価する。
【００３５】
図２に本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の他の例を示す。これは、特定のウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を見るものである。まず、siRNAもしくはdsRNAによる増殖抑制効果を調べたい対象ウイルスを含んだ、２つの同じ無細胞タンパク質合成系A、Bを準備し、AのみにsiRNAもしくはdsRNAを添加する（Aがサンプル系、Bがレファレンス系となる）。所定時間反応させるとBでは対象ウイルスが増殖するが、AではsiRNAもしくはdsRNAにより増殖が抑えられる。所定の時間タンパク質合成反応を行わせた後、それら２つの無細胞タンパク質合成系における対象ウイルス量を検出し、それらの間の差に基づいて該対象ウイルスに対するsiRNAもしくはdsRNAの増殖抑制効果を評価する。なお、前記ウイルス量の検出には、ウイルスの構成成分であるコートタンパク質やウイルスゲノムRNA等を酵素結合抗体法やRT-PCR法により直接検出する直接的測定法や、ウイルスにマーカー遺伝子として蛍光タンパク質や発光タンパク質の遺伝子を組み込んだ、人工変異ウイルスを作製し、該ウイルスの複製に伴い発現するそれらのマーカータンパク質の蓄積を調べることで、間接的にウイルスの増殖を検出する間接的測定法などを用いることができる。
【００３６】
更に、図３に本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の他の例を示す。これは、図１のようなレファレンスとなる無細胞タンパク質合成系を別途用いることなく、siRNAもしくはdsRNAの存在下及びsiRNAもしくはdsRNAの非存在下でのタンパク質合成を行うものである。まず、siRNAもしくはdsRNAによる発現抑制効果を調べたい一群のタンパク質をコードする網羅的DNA群を含んだ一つの無細胞タンパク質合成系を準備し、siRNAもしくはdsRNAを加えずに所定の時間タンパク質合成を行った後、一部の反応液のタンパク質プロファイルを測定し（タンパク質プロファイルB”）、残りの反応液にsiRNAもしくはdsRNAを添加して、更に所定時間タンパク質合成反応を行い、タンパク質プロファイル測定を行う（タンパク質プロファイルA”）。これらのタンパク質プロファイル間の変化量を求め、反応時間を補正した後、siRNAもしくはdsRNAの効果を確認する。なお、このような方法は、上述のようなsiRNAもしくはdsRNAによるウイルス増殖抑制効果を調べる場合にも同様に適用することができる。  
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の一例における分析手順を示すフロー図。
【図２】本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の別の例における分析手順を示すフロー図。
【図３】本発明の無細胞タンパク質合成系を用いたRNAi分析方法の更に別の例における分析手順を示すフロー図。
【図１】
2006197879.tif 000003
【図２】
2006197879.tif 000004
【図３】
2006197879.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月8日(2005.4.8)
【手続補正２】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正２
【補正方法】削除
【補正の内容】