(57)【要約】【課題】スポット走査式レーザ走査型顕微鏡、すなわち照射光と検出光を分離するためのエレメントを持つ同顕微鏡において、解像度を下げることなく、励起光路と検出光路を無収差で分離すること。【解決手段】  顕微鏡、そして同顕微鏡を調整する方法であって、エレメント（ＨＦＴ）を、サンプルと検出機構との間の光路の瞳面に、またはその近辺に配置する。また、このエレメントは、照射光を伝送するための反射性または透過性の第１の領域１と、第１の領域の外にあり、かつサンプル光を伝送するための透過性または反射性の第２の領域２とを持つ。この場合、第１の領域１および／または第２の領域２の大きさおよび／または形状を変化させるための作動手段を備える。また、その作動手段の作動を、制御回路を介して行う。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポット走査式レーザ走査型顕微鏡、かつ照射光と検出光を分離するためのエレメントを持つ同顕微鏡であって、前記エレメントは、サンプルと検出機構との間の光路の瞳面に、またはその近辺に配置され、また前記エレメントは、照射光を伝送するための反射性または透過性の第１の領域と、主として前記第１の領域の外にあって、サンプル光を伝送するための透過性または反射性の第２の領域とを持つ、顕微鏡。
【請求項２】
スポット走査式レーザ走査型顕微鏡、すなわち照射光と検出光を分離するためのエレメントを持つ同顕微鏡であって、前記エレメントは、サンプルと検出機構との間の光路の瞳面に、またはその近辺に配置され、また前記エレメントは、照射光を伝送するための反射性または透過性の第１の領域と、該第１の領域の外にあって、サンプル光を伝送するための透過性または反射性の第２の領域とを持ち、前記第１の領域および／または前記第２の領域の大きさおよび／または形状を変化させるための作動手段を備えている顕微鏡。
【請求項３】
照射光の位相および／または振幅に影響を加える装置を備えている、請求項１又は２に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
ビームの形状を生成するビーム・フォーマを備えている、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記ビーム・フォーマによって照射パターンを生成し、瞳面に結像させる、請求項４に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
照射パターンを伝送するエレメントは反射性のものとして形成され、サンプル光を伝送するエレメントは、単数または複数の反射性領域の外で、透過性のものとして形成されている、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
単数または複数の前記第１の領域または前記第２の領域がリング状に形成されている、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
単数または複数の前記第１の領域または前記第２の領域がパターン線として形成されている、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
１つの共通な交点を持つ複数のパターン線が設けられている、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記パターン線の交点が光軸に位置する、請求項９に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記パターン線が中断部分を持ちながら延びる、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記エレメント（ＨＦＴ）がプレートとして形成され、かつ反射性である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記エレメント（ＨＦＴ）がＳＬＭ（空間光変調器）として設計され、前記ＳＬＭが偏光を操作する、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記エレメント（ＨＦＴ）が、ビームの方向変更を行うＤＭＤ（ディジタル・マイクロミラー・デバイス）として設計され、この方向変更は照明と検出とで異なる角度を示す、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
顕微鏡、特に請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡を調整する方法であって、前記顕微鏡は、スポット走査式レーザ走査型顕微鏡、すなわち照射光と検出光を分離するためのエレメントを持つ同顕微鏡であり、前記エレメントは、サンプルと検出機構との間の光路の瞳面に、またはその近辺に配置され、また前記エレメントは、照射光を伝送するための反射性または透過性の第１の領域と、該第１の領域の外にあって、サンプル光を伝送するための透過性または反射性の第２の領域とを持ち、前記第１の領域および／または前記第２の領域の大きさおよび／または形状を変化させるための作動手段を備え、該作動手段の作動を制御回路を介して行う、方法。
【請求項１６】
広角視野顕微鏡における、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ライン状の照射分布を持つ顕微鏡における、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
スポット走査式顕微鏡における、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
複数の点光源を持つ顕微鏡における、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
制御量または測定量として照射光の強さおよび／または波長、そして／またはサンプル光の強さおよび／または波長、そして／またはテスト・サンプル光の強さおよび／または波長、そして／または励起光のストレール比を用いる、請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ニプコウ・スキャナまたはマルチスポット・スキャナを備える、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【請求項２２】
多光子励起機能および特にノン・デスキャンド検出機能を備える、前記請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のスポット走査式レーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として生物学的サンプル、標本、およびそれらに付随する諸成分を研究するための、顕微鏡法における、特には蛍光顕微鏡法、レーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、走査近接場顕微鏡法における方法と装置に関する。これに含まれるものとして、作用物質をスクリーニングするための蛍光検出法に基づく方法（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、およびフロー・サイトメトリ法がある。複数の照射波長でサンプルを同時照射することによる、複合蛍光体を含むサンプルのリアルタイム同時調査は、蛍光スペクトルがオーバラップし、厚いサンプルが３次元的構造を持つときも可能である。レーザ走査型顕微鏡用の無収差メイン・ビーム・スプリッタが実現され、このメイン・ビーム・スプリッタによって、共焦点画像形成における能率的な励起と検出が、焦点深度拡大を伴う場合も、伴わない場合も可能となる。そしてレーザ走査型顕微鏡へのメイン・ビーム・スプリッタの組み込みについて説明する。
【０００２】
マルチスポット照射も、本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
生物学標本を研究する際、光学顕微鏡の古典的利用分野は、蛍光顕微鏡である（例えば、非特許文献１参照）。この場合、特定の色素が、ある細胞部分に特殊なマーキングをするため用いられる。
【０００４】
蛍光は、ブロック・フィルタと組み合わせた適切なダイクロイック・ビーム・スプリッタを用いて励起光から分離され、別個に観察される。これによりそれぞれ染色の異なる細胞部分の表示が可能となる。しかし基本的には、１つの標本の複数の部分に、それぞれ異なる色素を同時に添加して、染色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出された蛍光信号を調べるため、ここでも特殊なダイクロイック・ビーム・スプリッタが用いられる。
【０００５】
下記では共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を例に、従来の技術を説明する（図１）。
ＬＳＭは、ほぼ４つのモジュールに分かれる。すなわち光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡である。これらのモジュールを、下記に詳しく説明する。その他、特許文献１を参照されたい。
【０００６】
１つの標本で様々な色素をそれぞれ励起するため、ＬＳＭでは様々な波長のレーザを用いる。励起波長の選択は、研究に用いられる色素の吸収特性に従って行う。励起光は光源モジュールで生成される。この場合、様々なレーザが用いられる（例えば気体レーザ：アルゴン、アルゴン・クリプトン、固体レーザ：ＴｉＳａレーザ、ダイオード）。さらに光源モジュールでは、波長の選択と、必要な励起波長光の強度の調整を、例えば音響光学結晶を用いることによって行う。続いて、レーザ光は、光ファイバまたは適切な鏡装置を経由して、走査モジュールに達する。
【０００７】
光源で生成されたレーザ光は、対物レンズによって、回折限界に制限されながら、スキャナ、走査光学系統、鏡筒レンズを経由して、標本に収束される。スキャナはスポット状にサンプルをｘ−ｙ方向に走査する。サンプルを走査する際の画素滞留時間は多くの場合、１マイクロ秒以下から数秒までの範囲である。
【０００８】
蛍光の共焦点検出（デスキャンド（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）検出）の場合、光は焦点面（サンプル）とその上下の平面から放射され、スキャナを経由してダイクロイックなメイン・ビーム・スプリッタ（ＨＦＴ）に達する。このビーム・スプリッタは、蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、絞り（共焦点絞り／ピンホール）に収束されるが、この絞りは正確に焦点面と共役な面に存在する。これにより、焦点の外にある蛍光部分は抑制される。絞りの大きさを変化させることにより、顕微鏡の光学的解像度を調節することができる。絞りの背後にもう１つダイクロイック・ブロック・フィルタ（ＥＦ）が存在し、これがもう一度励起光を抑制する。ブロック・フィルタを通過した後、スポット検出器（ＰＭＴ）によって蛍光を測定する。
【０００９】
多光子吸収を用いる際、色素蛍光の励起が、小さい体積の中で行われるが、これは励起強度が特に高い箇所である。この領域は、共焦点装置を用いるときの検出領域よりもわずかに大きいだけである。したがって、共焦点絞りを用いる必要はなくなり、検出は対物レンズの直後で行われる（ノン・デスキャンド（ｎｏｎ  ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）検出）。多光子吸収によって励起された色素蛍光を検出するためのもう１つの装置は、これもデスキャンド検出であるが、この場合、対物レンズの瞳が、検出ユニットに結像される（非共焦点デスキャンド検出）。
【００１０】
３次元的に照射された像から、共焦点検出装置によっては、対物レンズの焦点面にある平面（光学的スライス）だけが再生される。続いてコンピュータに支援されて、サンプルの３次元画像を生成することができる。この生成は、サンプルの様々な深さｚにおけるｘ−ｙ面という、複数の光学的スライスを記録することによって行われる。
【００１１】
したがって、ＬＳＭは、厚みのある標本の研究に適している。励起波長は、使用される色素の固有の吸収特性によって決定される。色素の発光特性に合わせたダイクロイック・フィルタによって、各色素から送出された蛍光だけが、スポット検出器によって測定されることになる。
【００１２】
生体臨床医学的利用においては、現在、複数の様々な細胞集団が同時にマーキングされている（多重蛍光）。個々の色素は、従来の技術を用い、吸収特性と発光特性（スペクトル）のどちらかが異なることに基づいて、別々に存在を証明することができる。
【００１３】
別々に証明するため、補助的ビーム・スプリッタ（ＤＢＳ）を用いて複数の色素の蛍光をさらに分離し、異なるスポット検出器（ＰＭＴ１〜４）個々の色素発光を別々に検出する。
【００１４】
フロー・サイトメーターは、細胞およびその他の粒子の研究と分類に用いられる。そのため細胞は１つの溶液に溶解状態とし、毛細管によって汲み出す。細胞を研究するため、レーザビームを横からこの毛細管に収束させる。細胞は、様々に異なる色素または蛍光性の生体分子によって、染色されている。励起された蛍光と、後方散乱された励起光を測定する。励起光からサンプルの蛍光信号の分離を、ダイクロイック・ビーム・スプリッタを用いて行う（ＨＦＴ、図１参照）。
【００１５】
後方散乱された信号から、細胞の大きさを特定することができる。各細胞の蛍光のスペクトル特性により、様々な細胞を分離して／種類ごとに、または別々に数えることができる。細胞の分類は、様々な毛細管における静電場を用いて行う。その結果として、例えば色素Ａを持つ細胞の個数を、色素Ｂを持つ細胞と比較したものを、しばしばヒストグラムで表示する。
【００１６】
流速は数十〜数百ｃｍ／ｓが典型的である。したがって、非常に鋭敏な検出が必要とされる。検出体積を限定するため、従来の技術では共焦点検出を行っている。
従来の技術によるレーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）では円形の瞳全体を照射するので、メイン・ビーム・スプリッタ（ＨＦＴ）はダイクロイック・スプリッタとして設計されている。これは、異なる励起波長と検出波長に対しては、異なるＨＦＴが必要であることを意味する。これらＨＦＴを通常は、フィルタ・ホイール上で光路に挿入したり、取り出したりすることができる。
【００１７】
顕微鏡の結像特性を変化させるため以前から知られている方法は、特殊な瞳照射を用いることである。１つの方法はリング状の瞳照射であって、これは特に焦点深度の拡大を生む（例えば、非特許文献２参照）。この場合、放射状偏光と組み合わせると、解像度の向上も得られる（例えば、非特許文献３参照）。解像度向上を目的とするその他の照射法が、非特許文献４に記載されている。共焦点顕微鏡では、一般に同一の対物レンズを用いて照射と検出を行う。特に著しい制限を受ける（例えばリング状の）瞳を用いる検出の場合、損失が大きいので、このような対物レンズ開口を用いることは、少なくとも蛍光顕微鏡には不可能である。それだけでなく、非特許文献４に記載の開口のいくつかには、例えば励起効率が非常に小さいとか、点像強度分布関数（Ｐｏｉｎｔ  Ｓｐｒｅａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ＰＳＦ）が非対称的であるというような、様々な制限があり、そのためこの開口は共焦点顕微鏡には一般に用いられない。
【００１８】
特許文献２は、励起の有効ＮＡが非常に小さい開口度を記載している。その場合、励起光路の解像度は検出光路の解像度より著しく悪い。一般にこの装置は迷光を抑制するために用いられ（要約および請求項１）、その際サンプルは、ＮＡを小さくした（請求項２）瞳の中央部分から照射される。同じことが、特許文献３に記載の装置にも当てはまる。
【００１９】
特許文献４では、励起側のレーザビームは、対物レンズから出る蛍光ビームよりも、断面積が著しく小さい（特に要約と請求項１）。
特許文献５には、ラインスキャナと広角視野顕微鏡のための構造化されたビーム・スプリッタを持つ装置が記載されている。両者の場合とも、サンプルに対してスポット状でない励起を行う。
【００２０】
平行に動作するマルチスポット・スキャナで考えられる実施形態は、例えば知られているニプコウ・ディスクの利用である。このディスクは、特許文献６、または特許文献７、または特許文献８で開示されている。ここに挙げたアメリカの特許公報には、さらにマルチ・ピンホール・プレートを備えて平行に走査するレーザ走査型顕微鏡が記載されている。このピンホール・プレートには、対応するマイクロレンズ・アレイが前置されているので、最終効果としてマルチ点光源が生成されている。その他の実施形態は蛍光相関スペクトル法（ＦＣＳ）に関するもので、これは例えば特許文献９に記載されている。
【特許文献１】独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第１３５３２０９号明細書
【特許文献３】独国実用新案第２９９１３７０号明細書
【特許文献４】独国特許第１９８４２１５３号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，０２８，３０６号明細書
【特許文献７】国際公開第８８０７６９５号パンフレット
【特許文献８】欧州特許出願公開第０５３９６９１号明細書
【特許文献９】国際公開第０１／６３２５９号パンフレット
【非特許文献１】ポーレイ（Ｐａｗｌｅｙ）著，「ハンドブック・オブ・バイオロジカル・コンフォーカル・マクロスコピィ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」，プレミアム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ），１９９５年
【非特許文献２】シー  ジェイ  アール  シェパード（Ｃ．Ｊ．Ｒ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ）著，「ザ・ユース・オブ・レンズィズ・ウィズ・アニュラー・アパーチャ・イン・スキャニング・オプティカル・マイクロスコピィ（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｎｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｎｕｌａｒ  ａｐｅｒｔｕｒｅ  ｉｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ），オプティーク（Ｏｐｔｉｋ），１９７７年，第４８巻，ｐ．３２９〜３３４
【非特許文献３】シー  ジェイ  アール  シェパード（Ｃ．Ｊ．Ｒ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ）およびエー  チャダリ（Ａ．Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）著，「アニュラー・ピュピルズ，ラディアル・ポラリゼーション，アンド・スーパーレゾルーション（Ａｎｎｕｌａｒ  ｐｕｐｉｌｓ，ｒａｄｉａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ），エピーピーエル・オプト（Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．），２００４年，第４３巻，ｐ．４３２２〜４３２７
【非特許文献４】ティー  ウィルスン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ）およびエス  ジェイ  ヒューレット（Ｓ．Ｊ．Ｈｅｗｌｅｔｔ）著，「スーパーレゾルーション・イン・コンフォーカル・マイクロスコピィ（Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」，オプト・レット（Ｏｐt．Ｌｅｔｔ．），１９９１年、第１６巻，ｐ．１０６２〜１０６４
【非特許文献５】文献：「ディフラクティブ・オプティクス・インプルーブ・プロダクト・デザイン（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ）」”，フォトニクス・スペクトラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ），ローリン・パブリッシング（Ｌａｕｒｉｎ  Ｐｕｂｌｉｓｃｈｉｎｇ）  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，  １９９５年９月
【非特許文献６】参照、例えばカタログＮｒ．１７（Ｋａｔａｌｏｇ  Ｎｒ．１７），ソーラボ・インコーポレイテッド（Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．），２００５年，６３９
【非特許文献７】エム  ストーダー（Ｍ．Ｓｔａｌｄｅｒ），エム  シャット（Ｍ．Ｓｈａｄｔ）著，「リニアリー・ポラライズド・ライト・ウィズ・アキシャル・シンメトリー・ジェネレイテッド・バイ・リキッド−クリスタル・ポラリゼーション・コンバーターズ（Ｌｉｎｅａｒｌｙ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｗｉｔｈ  ａｘｉａｌ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｒｓ），オプト・レット（Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．），１９９６年，第２１巻，ｐ．１９４８〜１９５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、スポット走査式レーザ走査型顕微鏡、すなわち照射光と検出光を分離するためのエレメントを持つ同顕微鏡において、解像度を下げることなく、励起光路と検出光路を無収差で分離することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明によれば、励起光路と検出光路の無収差の分離が、シングルスポットまたはマルチスポットを走査するＬＳＭで、すなわちスポット状の励起と検出の場合に可能となる。この場合、励起光路の解像度は、検出光路の解像度に近似するかそれと同一である。そして驚くべきことに、３次元コヒーレントという特殊な照射パターンの生成によって、この顕微鏡の光学的解像度を、瞳をいっぱいに照射する古典的なＬＳＭの場合とほぼ同一とすることができる。
【００２３】
本発明のもう１つの利点は、特殊な操作モードを可能とし、顕微鏡の焦点深度が、古典的なシングルスポットまたはマルチスポットを走査する顕微鏡より向上することである。
本発明のもう１つの利点は、瞳における照射パターンの自動的制御が、操作モード（例えば焦点体積を小さくする、焦点深度を広げるなど）に依存せずに実現されることである。
【００２４】
これは、３次元コヒーレントな照射パターンの形を取る励起光を、顕微鏡の瞳の位置で形成することによって得られる。この瞳には、照射パターンをサンプルの方向に反射するエレメントが配置されている。このエレメントの残る領域は、好ましくは透明とし、瞳の残る領域を満たす検出光が検出方向に達することができるようにする。その逆の動作が考えられるが、これは照射光をサンプルに伝達する透明な領域と、検出光を検出ユニット方向に伝達するための、残りの反射領域に関する。ビーム分割を行うエレメントは、堅固なシステムとしても柔軟なシステムとしても、すなわちその構造が調節可能なものとしても、あるいは交換可能なものとしても、設計することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明によって、レーザ走査型顕微鏡法の無収差のビーム・スプリッタが実現される。このスプリッタは、結像特性が従来の技術と変わらないか、変わったとしてもきわめてわずかである。この目的で、メイン・ビーム・スプリッタを瞳面（またはその近く）にレイアウトし、その際、この分光器が特定の領域だけで広帯域の反射を行うよう設計する。
【００２６】
このＨＦＴの第１の有利な設計の２つと、その光路内の装置を、図２に示す。この場合、調節可能な共焦点絞りを備える共焦点ＬＳＭ（図１に対応する）であることを、出発点とする。従来の技術による装置とは異なり、このＨＦＴは、顕微鏡瞳の中、またはその近くに配置される。
【００２７】
光源（Ｌ）の光は、ビーム・フォーマ（ＳＦ）を経由してビーム・スプリッタＨＦＴに達し、このビーム・スプリッタからサンプル方向に反射される。ＨＦＴの表面は黒領域（１）に鏡面被覆されたものなので、励起はサンプルＰＲの方向に反射される。残りの領域（２）では、このスプリッタが透明である。
【００２８】
励起ビーム・フォーマＳＦは例えば、位相マスク（ＰＭ）、振幅マスク（ＡＭ１およびＡＭ２）、および従来の技術による古典的な光学系（Ｌ１、Ｌ２）（例えば回折エレメントまたはホログラフィ・エレメント（例えば、非特許文献５参照））によって実現される。この励起ビーム・フォーマが光源のビーム断面に影響をあたえ、その際、このビーム断面がスプリッタＨＦＴにおいて、スプリッタ上の構造（領域１）を十分に取り込むようにする。ＡＭ１によって、瞳におけるビーム断面の振幅に影響をあたえることができる。ＡＭ２によって、例えば妨害となる回折次数を抑制するため、追加的な３次元フィルタ処理を行うことができる。この回折次数は、ＰＭまたはＡＭ１によって生じるものである。ＡＭ２はこのため、好ましくはサンプルの位置における照射パターンの形状を取り込むものとする。ＡＭ１はこのため、瞳およびＡＭ２において、またはその近辺で、１つの中間画像の中に配置されるものとする。これにより、励起光路で高い効率が得られる。図２に示したバリエーションの例では、ＰＭ／Ｌ１／ＡＭ２／Ｌ２およびＨＦＴの各エレメント間の間隔が正確にｆである。ここで、ｆはレンズＬ１およびＬ２の焦点距離である（各レンズの焦点距離は等しいものを選択しなくてもいい）。特殊なパターンを生成する回折−光学エレメント（ＤｏＥ）は従来の技術によるものであって、入手可能である（例えば、非特許文献６参照）。
【００２９】
サンプル中で生成された蛍光は、ＨＦＴの領域２を通って検出器に達する。蛍光のうち領域（１）に入射する部分は失われる。検出器は、好ましくは従来の技術による共焦点検出器として設計されているものとする。さらに検出器の前と、ＨＦＴの後ろには、励起光を抑制する手段が配置されている（例えば発光フィルタ）。また検出は複数のチャンネルで同時に行うことができる。これは、図１に記載する補助ビーム・スプリッタや、その他の検出器装置によって実現される。
【００３０】
ケースＡ（図２）：全開時、対物レンズ瞳に対する円形のシェーディングεを行う（リング内径ε＿ａとする。ａは瞳の全開半径。εはａの倍数）と、励起側の焦点深度が１／（１−ε２）倍に拡大され、横方向の半値幅がわずかに減少し、特徴的な第２極大を明らかに生じる。リング状の瞳を用いて励起し、しかし、好ましい方法として完全開口によって共焦点検出を行うならば、軸方向の拡大と、第２極大の高さを、ドラマティックに減少させることができる。
【００３１】
図２に記載する本発明の装置では、ＨＦＴを通る検出側の有効開口の縮小から、望ましからざる副作用が生じている。瞳に５％のシェーディングを生じる場合、例えば蛍光の９５％がＨＦＴを通過することになる。これは、リング幅をさらに減少させることによってさらに改善できる（ε＝０．０２のとき検出効率９６％）。励起をも効率的に行うためには、リング状のビーム形成を、例えばアクシコン・レンズを設けることによって、またはＨＦＴの前に回折エレメントを置くことができる。第２には、開口のこのような縮小は、検出側の結像に変化を生じる。しかし、このような影響は、照射側のシェーディングがε＞０．９の場合、無視でき、ないしはＰＳＦの横方向の大きさをリング状照射によって狭めることによって補償される。図２の装置において、ε＝０．９５のときの共焦点ＰＳＦを図３において完全開口時のＰＳＦと比較して示した。同時に、このＰＳＦの軸方向の推移から、円形開口による検出は、焦点深度の拡大という効果をほとんど抑えることがわかる。これは、本発明のＨＦＴを使用すれば、結像特性の著しくネガティブな変化は生じないことを意味する。本発明のＨＦＴを使用すれば、目的に合わせたＰＳＦの修正が同時に可能である。
【００３２】
１．焦点深度の拡大が望まれ、検出側の損失が大きくなければ、追加的なリング状絞りＲＢ（ＨＦＴとほぼ同じ大きさ）を、ピンホール光学系の前に置くことができる（図２参照）。
【００３３】
２．横方向解像度の改善は、放射状偏光を持つレーザ光を使用することによって得られる（例えば、非特許文献３参照）。それに必要な光学系は、図２のビーム・フォーマに同時に設けることができ、例えば、ＬＣＤ基板のものとすることができる（例えば、非特許文献７参照）。
【００３４】
異なる対物レンズは異なる瞳半径ａを持つという事実を考慮に入れるためには、異なるメイン・ビーム・スプリッタをフィルタ・ホイールの上に置き、対物レンズに応じて挿入することもできる。その他、フィルタ・ホイールにはダイクロイックＨＦＴを取り付けて、従来の技術によるＬＳＭを使用できるようにすることもできる。当然のことながら、ビームを異なる対物レンズに適合させるため、ＨＦＴと対物レンズの間にズーム光学系を設ける場合、異なるリング開口を使用する必要はなくなる。
【００３５】
上記と異なる解決法を下記に記載する。異なる開口を持つ対物レンズの個数が限られている場合、１つの共通のＨＦＴを用いることもできる。そのことを図４に、３つの瞳半径を例に示す。しかし、これには前提条件があって、ＨＦＴの前でビーム形成を行うことができ、このビーム形成もまた回折エレメント（図２のＳＦ参照）を用いて行われるものとする。それぞれ細いリングだけを用いるならば、このケースでも蛍光検出の損失は、受け入れられる範囲にとどまる。合計３つの異なる瞳半径があって、そのうち２つは最大半径より係数ｓ１ないしｓ２相当分小さい場合（図４において、ｓ１＝ａ１／ａ、ｓ２＝ａ２／ａ）、最大半径の照射時の損失として下記が得られる。
【００３６】
Ｖ＝（１−ε２）・（１＋ｓ１２＋ｓ２２）
例えばｓ１＝０．６、ｓ２＝０．４のとき、Ｖ＝６％となる。ただし、このときリングの太さは、それぞれのリング半径に（１−ε）を乗算したものの０．０２倍とする。このようにして実現された装置の利点は、ＨＦＴの調整が正確なこと、この調整は光路内の定常配置時でも行えることである。
【００３７】
ケースＢ：このＨＦＴのもう１つの有利な実施形態は、交差するパターン線が細いことである（図２Ｂ参照）。このＨＦＴの特別な利点は、これが実務で重要な瞳半径すべてに適しており、そのため、上記の適合上の問題がなくなることである。パターン線の幅をｂとし、全開瞳半径をａとするとき、蛍光に下記の損失が生じる。
【００３８】
Ｖ＝４・ａ・ｂ／（π・ａ２）＝４・ｂ／（π・ａ）
例えばパターン線の幅ｂ＝０．０２ａのとき、損失は＜３％である。開口が０．４ａの対物レンズに同じＨＦＴを用いると、損失は１６％に上昇する。パターン線の幅を線形に適合させ、中心からの距離をγとすると、ｂ／γ＝一定（図９参照）となり、これにより、瞳半径のいかんにかかわらず、一定の低い損失のまま維持することができる。
【００３９】
図５は、２つの異なるスライスにおける横方向のＰＳＦを示す。このＰＳＦは、ＨＦＴが回転対称形でないにもかかわらず、ほとんど対称形である。
この図は、従来の技術（ＣＬＳＭ  共焦点レーザ操作型顕微鏡）による共焦点の場合、および本発明のＨＦＴを備えるものの場合の（ここで十字は無限に細いと想定する）、横方向ＰＳＦの線形表示（左図）と、対数表示（右図）である。基準となる横座標はｖ＝２π／λ  ＮＡγで、λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｆｌｕｏ＝５２０ｎｍである。
【００４０】
ＰＳＦの軸方向分布は、光学軸の近くでは、従来の技術による共焦点の場合と同様である。ｖ＞２と軸から離れた場合だけ、わずかながら相違が見られた。従って結像特性は、この場合、ＣＬＳＭと事実上同一である。
【００４１】
もう１つの実施形態は、自由にプログラミング可能なＨＦＴを用いる場合に得られる。これは例えば空間光変調器（Ｓｐａｔｉａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＳＬＭ）を用いて実現することができる。考えられる実施形態を図６に示した。このＨＦＴのプログラミングが自由であることに加えて、このような装置には損失が減少するという利点がある。蛍光の偏光方向に対して、上記の損失１−ε２が生じるからである。したがって、損失は、全体の半分に減少する。
【００４２】
光源（Ｌ）の光は、ビーム・フォーマ（ＳＦ）を経由して、第１の偏光ビーム・スプリッタ（Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ）ＰＢＳ１に達し、ここでは光源に対し偏光が相応に選択されるので、光はサンプルＰＲの方向に反射される。サンプルへの途中で、光はＳＬＭを通過する。このＳＬＭは顕微鏡の瞳に、またはその近辺に設けられている。このＳＬＭを作動して、黒領域（１）にある画素が（ＳＬＭの拡大に注意しつつ）励起の偏光を回転させるようにする。これにより励起光は、この領域から第２の偏光ビーム・スプリッタＰＢＳ２を通過する。残りの画素（領域２）は、偏光の変化を生じない。これにより、励起光のこれらの部分は、光トラップ（ビームダンプ）の方向に反射される。光トラップの代わりに、励起光出力を監視する検出器を配置することもできる。
【００４３】
光源が完全にＰＢＳ１に反射されるように光源の偏光が調整されていない場合、この部分の光は、鏡Ｍ１／Ｍ２を経由し、ＰＢＳ２を通って、やはり光トラップに達する。
サンプルで生じた蛍光は、ＰＢＳ２で２つの互いに垂直な偏光部分に分割される。一方の部分はＰＢＳ２で反射され、Ｍ２／Ｍ１を経て、ＰＢＳ１での反射の後、検出器に達する。ＰＢＳ２を通過した部分は、ＳＬＭ（領域２）を経由してＰＢＳ１に達し、反射された部分とここで結ばれ、やはり検出器に達する。失われるのは、領域（１）に入射する蛍光部分だけである。
【００４４】
図７も本発明による装置で、これはマイクロミラー・アレイＤＭＤ（ディジタル・マイクロミラー・デバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ））をＨＦＴとして用いる。光源Ｌの光は、ビーム・フォーマＳＦを通ってＤＭＤに達し、このＤＭＤは顕微鏡の瞳に、またはその近辺に配置されている。ＤＭＤはマトリックス状に配置されたマイクロミラー（画素）からなり、これらのマイクロミラーは、ここには少なくとも２つのエンドポジションの間に組み込むことができる。ＤＭＤの鏡（画素）は黒領域（１）にあって、励起がサンプルＰＲの方向に反射されるように組み込まれている。残りの画素（領域２）に入射する検出光は、検出器の方向に導かれる。失われるのは、領域（１）に入射する蛍光部分である。
【００４５】
図６および図７の装置を用いて、ビーム分割のため、顕微鏡の瞳の中で、様々な照射パターンを実現することができる。又、照射パターンＳＦ、ないしＨＦＴでビーム分割するためのパターンは、制御回路を用いて自動的に生成することもできる（図８参照）。
【００４６】
ここで自動的な制御パラメータとして用いられるのは、一部は相互に依存する下記の測定量である。
１．）例えばＤＥ３における共焦点信号測定によって得られる、顕微鏡の共焦点性。この場合、問題となるのは、テスト・サンプル（蛍光性ビードまたは薄い蛍光層）と、研究対象のサンプルそれ自体とのどちらを用いるかということである。テスト・サンプルの使用が意味を持つのは、本来研究対象であるサンプルを、制御中を通じて生じる光線量に曝露できない場合である。この制御は、できるだけ強い信号がＤＥ３で測定されるように行われる。
【００４７】
２．）励起光路における効率は、ＤＥ１で広角視野検出器を用いて測定することができる。この場合、できるだけ大きな信号を供給するものとしたい。
３．）励起のストレール比は、ＤＥ２の共焦点検出器を用いて測定する。信号はこの場合できるだけ大きいものとしたい。
【００４８】
４．）ＤＭＤの鏡ないしＳＬＭの画素のポジションから、ビーム分割の面積／効率を特定することができる（図２の領域１と２の比）。ビーム分割の効率は、できるだけ大きなものとしたい。すなわち領域１はできるだけ小さく、領域２はできるだけ大きくしたい。
【００４９】
そこで得られる個別の量も最適化することができる。例えば測定量１）の最適化によって、効率と解像度を最大化することができる。もう１つのバリエーションでは、１）と２）の比を最適化することにより、解像度と効率を相互に、制御機能の中で重み付けすることができる。
【００５０】
そのための選択としてスプリッタＴを光路に挿入する。その結果、励起光の一部（例えば５％）がＤＥ１およびＤＥ２に反射される。検出器ＤＥ１では光自体を測定し、ＤＥ２では励起側の点像を、本来の検出器ＤＥ３では、ＤＭＤを介して検出側の点像を測定する。その他、蛍光発光媒体（Ｆ）を用いて、上記の測定１．）を行う。そのためには、この蛍光発光媒体を、ＨＦＴとスキャナＳＣの間の光路に挿入する。この場合、例えば平行平面形の蛍光容器（色素はサンプルに用いられている色素に適合しているのが好ましい）、または平行平面形の蛍光ガラス容器（例えばエルビウム添加ガラス）が用いられる。好ましくは、この蛍光発光媒体Ｆは、励起光がサンプル方向に達しないような形状とする。
【００５１】
顕微鏡を最適化した後、すなわち本来のサンプル測定のため、スプリッタＴとサンプルＦをふたたび取り出す。
制御機能の操作量として、ＨＦＴ（ＤＭＤ、ＳＬＭ、または図２，図６，図７に記載の様々なミラー・マスクからなる）およびビーム・フォーマＳＦを用いる。ビーム・フォーマでは、ＰＭおよびＡＭに位相マスクと振幅マスクを置く。ＨＦＴでは領域１ないし２のパターンを変化させる。
【００５２】
この場合、周辺パラメータとして、サンプルＰＲの種類、対物レンズＯ、光源、およびユーザが指定した操作モードＢ（例えば焦点深度の大小、励起の高効率、検出の高効率）といった入力量を用いる。好ましくは、これらの周辺パラメータは、測定量それぞれの最適化を、自動的に作動するものとする。
【００５３】
驚くべきことにジオメトリの設定は、本発明のスプリッタの制御回路によって、特許文献５に記載の装置にも伝達される。ＨＦＴのその他の類似の装置として、上記の装置の改良からなるものも、実現することができる。これは特にリング状の装置だけでなく、その他のパターン線（ケースＡ）、例えばケースＡで既存のパターン線と４５°の角度をなすパターン線の使用、太さが等しくないパターン線（例えばケースＡで周辺に行くにつれて太くなる線）の使用、一部中断しているパターン線（ＡとＢ）、ならびにこれらのケースの組合せに当てはまる。
【００５４】
考えられる例をいくつか図９に挙げた。瞳の外側周縁はこの場合、単にシンボル的なマーキングと理解されたい。しかしこれは、ケースＡおよびＢのＨＦＴバリエーションの組合せという意味では、リング状の反射ゾーンを意味することもできよう。その他のパターン線を追加することにより、励起光路における対称形的な点像機能が得られる（図では上列各図）。これは焦点体積をできるだけ小さくするために効果的であり得る。パターン線幅を変化させることにより（図では下列各図）、対物レンズの瞳の大きさのいかんにかかわらず、分割効率を一定に保つことができる。パターン線を中断することにより（図では下中央／右）、ビーム分割の効率は向上するが、解像度が悪化することはない。
【００５５】
パターン線は、偶数個または奇数個の線が星状に交差するものとすることができる。また蜘蛛の巣状に配置して、共通の中心が光軸の中にあるもの、または光軸の外にあるものとすることもできる。
【００５６】
このようなパターン線の配置は、リング状装置と組み合わせることができ、またリングの代わりに螺旋構造、あるいは複数の小さいリングを偏心的に配置したもの、あるいは１つまたは複数の三角形またはその他の幾何学図形、またその他、任意の振幅パターンまたは位相パターンが考えられ、設定可能である。この場合、最適化を制御回路によって上記のように行うことができる。
【００５７】
ニプコウ走査またはマルチスポット走査型顕微鏡システムの場合、本発明はダイクロイックなメイン・ビーム・スプリッタを、パターンを施されたビーム・スプリッタに代え、瞳の中またはその近辺に配置する。図１０は、マルチスポット操作型顕微鏡の本発明による装置の例を示す。これが優れているのは、複数のサンプル・スポットが同時に照射され、そして／または検出される点である。スポット・パターンは、例えば位相マスクＰＭを振幅マスクＡＭ１およびＡＭ２と組み合わせたもの、または従来の技術によるその他の方法（例えばマイクロレンズ・アレイまたは特殊なビープ・スプリッタ装置（ＬａＶｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃ））によって、生成することができる。励起分割光は、様々な角度から、無収差スプリッタＨＦＴにある共通の領域（例えば領域１）に達し、そこでサンプル方向に反射される。様々な照射スポットのサンプル光は、無収差スプリッタにある共通の領域（領域２）に達し、マトリックス検出器ＤＥの方向に導かれる。ＤＥの検出器エレメントは、サンプルにおける照射パターンに応答するように配置されている。
【００５８】
図１１は、例えば多光子顕微鏡で用いられるノン・デスキャンド検出のための本発明による装置を示す。前記の装置とは異なり、このスキャナＳＣは、光源Ｌと無収差スプリッタＨＦＴの間の顕微鏡瞳にある。ビーム・フォーマの作用と機能は、前記の装置と同様のものである。検出光は、検出器ＤＥに直接（デスキャンニングなしに）達する。リレー光学系ＲＬによって、ＨＦＴの瞳に走査瞳が結像される。スキャナを空間的にＨＦＴの直接前に配置できるなら、ＲＬを省くことができる。さらにはＨＦＴをスキャナとしても形成することができ、その場合、ＳＣとＨＦＴは互いに一体となる。多光子顕微鏡の場合、好ましくは、検出器は顕微鏡瞳に（図１１ａ）に配置される。その他、検出器を、マトリックス検出器として中間像（Ｌ３によって生成されたもの）に置いて（図１１ｂ）、場所を固定されずにサンプル信号を検出できるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【図３】励起光の点像強度分布を示すグラフである。
【図４】３つの瞳半径を有するビーム・スプリッタを示す図である。
【図５】２つの異なるスライスにおける横方向の点像強度分布を示すグラフである。
【図６】本発明の別の実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【図７】本発明の別の実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【図８】本発明の別の実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【図９】ビーム・スプリッタのパターンを示す図である。
【図１０】本発明の別の実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【図１１】ａ、ｂは本発明の別の実施形態のレーザ走査型顕微鏡を部分的に示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
１…黒領域、２…残りの領域、ＨＦＴ…メイン・ビーム・スプリッタ、ＤＭＤ…デジタル・マイクロミラー・デバイス、ＳＬＭ…空間光変調器、ＳＦ…ビーム・フォーマ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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