(57)【要約】【課題】安定に供給でき、常温で容易に保存でき、また従来の細胞分化メディエータとは全く異なるメカニズムで作用して細胞の分化を誘導できると共に、組織の形成を誘導できる生体適合性の生体組織形成材料を提供すること【解決手段】インビボまたはインビトロで細胞または組織に直接適用して細胞を分化誘導し、組織の形成を誘導するための生体組織形成材料であって、ナノカーボン物質を含有してなることを特徴とする生体組織形成材料。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボまたはインビトロで細胞または組織に直接適用して細胞を分化誘導し、組織の形成を誘導するための生体組織形成材料であって、ナノカーボン物質を含有してなることを特徴とする生体組織形成材料。
【請求項２】
前記ナノカーボン物質が、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノファイバー、カーボンナノホーン、カーボンファイバーまたはそれらの組合せからなることを特徴とする、請求項１に記載の生体組織形成材料。
【請求項３】
ナノカーボン物質を含有してなる生体組織形成材料を、インビトロで細胞または組織に直接適用して細胞を分化誘導し、組織の形成を誘導することを特徴とする、生体組織の製造方法。
【請求項４】
前記細胞が繊維芽細胞であり、誘導された前記組織が平滑筋組織であることを特徴とする、請求項３に記載の生体組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナノカーボン物質の新たな用途に関し、特に、細胞の性質の変化または細胞の分化を誘導し、更に組織の形成を誘導する生体組織形成材料としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、カーボン材料は温度および圧力等の環境の相違により種々の立体構造をとることが知られており、その例として、層状グラファイト構造およびダイヤモンド構造等が挙げられる。また、1985年には、Kurotoによって炭素のみからなるサッカーボール状のクラスター分子Ｃ60およびＣ70の存在が確認されている。その後、Ｃ76およびＣ78等の同様のクラスター分子も発見され、これら一連の球殻状炭素分子はフラーレンと称されるようになった。1990年には、Smolley等によって炭素電極間でのアーク放電を利用したフラーレンの合成方法が開発された。また、1991年には、飯島等によって、チューブ状の構造をもった炭素骨格（カーボンナノチューブ：ＣＮＴ）が発見された。カーボンナノチューブは電気伝導性を有するナノメートルサイズの炭素の管であるため、カーボンナノチューブに電界を加えると、管の端部などで電界集中が生じ、電子を外部に容易に引き出すことが可能である。引き出された電子を蛍光板に当てると発光するため、光源やディスプレイとして使用することができる。従来の電子放出源と比較すると、カーボンナノチューブはその断面サイズが小さいため、電界集中が効果的に生じる。その結果、電子の放出に必要とされる電圧が小さく、また高真空環境が不要である等の優れた特徴を有しており、電子放出装置における電子放出源として広範に使用することができる。
【０００３】
上記カーボンナノチューブ等の微細構造を有するナノカーボン物質を、生物学的または医学的に応用することに関しては、生理活性物質の作用メカニズムの解明や、再生医療における生体内細胞の増殖促進が提案されている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。
【０００４】
特許文献１には、タンパク質、酵素などの生物学的マクロ分子（生理活性物質）をカーボンナノチューブと共にインキュベートすることにより、両者を結合および／または結晶化させ、マクロ分子の螺旋対称での配列形成（自己組織化）を誘発させる方法が記載されている。こうして得られた複合生成物には、タンパク質の構造および活性部位の解明などにおいて有用な生理活性機能をもたせることができる。
【０００５】
また、特許文献２には、カーボンナノチューブ等の電気伝導性ナノスケール物質とポリ乳酸等の生体適合性ポリマーとの複合材料を、整形外科または歯科用としてインプラントし、電気刺激を与えることにより骨芽細胞の増殖を促進させる方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、上記特許文献に記載の技術は、何れもカーボンナノチューブなどのナノスケール物質を直接に生体内に適用する方法ではなく、タンパク質または高分子ポリマー等との複合物質を用いて所期の作用を発現させようとするものである。
【０００７】
一方、細胞を人為的に分化誘導させる方法としては、従来、分化誘導を媒介する誘導剤として、生体内で作用しているメディエータ因子と同一もしくは類似のタンパク質（サイトカイン、ホルモン等）を適用することにより行われてきた。しかしながら、このような生理活性をもつメディエータ因子は、タンパク質であることに起因して本来的にその構造が非常に不安定である。そのため、所期の活性を維持したまま保存および輸送するためには低温保存が必要とされ、高コストおよび煩雑な作業を要するという問題がある。
【０００８】
更に、生体における天然の分化メディエータ因子は対象となる細胞の種類によって異なり、且つその多くが未だ知られていないため、現状では分化を誘導できない細胞が数多く存在するという問題がある。
【０００９】
また、従来技術では、細胞の分化が誘導されたとしても、それらが集合して所定の機能をもった組織を形成することは極めて稀であるといった問題がある。
【００１０】
従って、広範な種類の細胞を分化誘導することができ、更に所期の機能を備えた組織の形成を誘導できる生体組織形成材料が求められている。
【特許文献１】特表２００２−５１３８１５
【特許文献２】特表２００３−５３３２７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その課題は、安定して供給でき、常温で容易に保存でき、また生体に適用したときに、従来の細胞分化メディエータ因子とは全く異なるメカニズムで作用して細胞の分化を誘導できると共に、組織の形成を誘導することができる生体適合性の生体組織形成材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願の発明者等は、上記課題を達成すべく鋭意研究を行った結果、ナノカーボン物質を細胞または組織に直接適用して細胞の分化を誘導し、更に組織の形成を誘導できる生体組織形成材料を提供することを可能にしたものである。
【００１３】
即ち、本発明による生体組織形成材料は、細胞または組織に直接適用して細胞を分化誘導し、組織の形成を誘導するための生体組織形成材料であって、ナノカーボン物質を含有してなることを特徴とするものである。
【００１４】
もう一つの側面において、本発明は、ナノカーボン物質を細胞または組織に直接適用して細胞を分化誘導し、組織の形成を誘導することを特徴とする、生体組織の製造方法である。
【００１５】
本発明において、前記細胞または組織は生体内に存在するものであってもよく、または培養されているものであってもよい。即ち、本発明は、インビボおよびインビトロの何れにおいても適用可能である。
【００１６】
本発明において、前記ナノカーボン物質は、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノファイバー、カーボンナノホーン、カーボンファイバー、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体内の必要な組織、例えば従来は分化誘導が不可能であった平滑筋組織の誘導を可能にするものである。特に、インビボにおいて必要な組織の誘導が可能であることにより、再生医療に応用可能な新しい技術として、病気や事故等で失った身体の一部の臓器や組織を再生することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明による生体組織形成材料は、微細構造を有するナノカーボン物質、例えばカーボンナノチューブからなるものであり、これを培養中の細胞または組織、或いは生体内の細胞または組織に直接添加適用することによって、細胞の性質の変化または細胞の分化を誘導し、必要な組織の形成を誘導するものである。
【００１９】
生体に対してインビボで適用する場合には、生体内の所望部位に本発明の組織形成材料を埋設すればよく、これにより損傷組織の自己修復による治療が可能である。また、培養されている細胞または組織に対してインビトロで適用した場合には、移植片として使用できる組織を形成することができる。この場合の培養方法および培地は特に限定されず、当業者に周知のものを使用すればよい。
【００２０】
本発明の適用対象である細胞または組織は、動物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトの細胞または組織であればよく、その種類は特に限定されない。何故なら、生体内での本来の分化プロセスに関与するメディエータはタンパク質であり、その作用は特異性が極めて高いのに対して、本発明で使用するナノカーボン物質の場合は、その作用機構が全く異なるので特異性が低いと考えられるからである。しかし、特に好ましい適用対象としては、平滑筋組織へと分化されるべき繊維芽細胞が挙げられる。また、それ以外の好ましい適用対象として次のものが考えられる。
【００２１】
・骨芽細胞の骨組織への分化誘導
・ＥＳ細胞の増殖・分化制御
・造血幹細胞の増殖・分化制御
・間葉幹細胞の増殖・分化制御
・肝細胞の増殖・分化制御
本発明の組織形成材料を構成するナノカーボン物質としては、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノファイバー、カーボンナノホーン、カーボンファイバーまたはそれらの組合せからなるものを使用することができる。特に、カーボンナノチューブを用いるのが好ましい。カーボンナノチューブは単層または多層の何れでもよく、また粉末状またはテープ状の何れを使用してもよい。更に、必要な組織の形態にあわせて薄膜シート状にして適用してもよく、また対象の表面にコーティングしてもよい。
【００２２】
以下に、カーボンナノチューブおよびフラーレンの合成方法について説明する。
【００２３】
＜カーボンナノチューブの合成方法＞
カーボンナノチューブは、炭素原子の六員環ネット（グラフェン）が円筒状に閉じた、直径がナノメートルスケールのチューブである。チューブの壁を構成するグラフェン筒の枚数により、単層および多層の二種類がある。グラフェンの筒が一重のものが単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）であり、その直径は約1〜数ｎｍである。また、グラフェンの筒が同心状に何重にも重なっているものが多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）であり、その直径は数ｎｍから数十ｎｍである。何れのカーボンナノチューブも、アーク放電法、レーザ蒸発法、または炭素含有ガスの熱分解（ＣＶＤ）法により合成することができる。なお、多層カーボンナノチューブの場合には必ずしも触媒を必要とせず、炭素の蒸発（または分解）・凝縮によって得られるのに対して、単層カーボンナノチューブの場合には金属等の触媒微粒子が必要不可欠である。
【００２４】
以下、上記の代表的な合成方法の詳細を説明する。
【００２５】
（１）アーク放電法：
二つの炭素材料の間でアーク放電を行って、アークの熱で炭素を蒸発させることによりカーボンナノチューブを合成する方法である。一般的には密閉容器（チャンバー）を用い、ヘリウムガスまたは水素ガスの減圧雰囲気内で放電を行う方法である。直流放電を行った場合には、陰極の炭素電極に堆積するカーボン凝縮物（陰極堆積物）の中に多層カーボンナノチューブが合成される。単層カーボンナノチューブを合成する場合は、陽極の炭素材料に、単層カーボンナノチューブの成長を促す金属などの触媒を含んだ電極を用いる。単層カーボンナノチューブは気相で生成した煤の中に含まれるため、放電後に、電極やチャンバー内面に付着した煤を回収することによって得ることができる。触媒の有無や種類、反応条件などを変えることによって、カーボンナノチューブだけでなく、カーボンナノホーンなど、種々のナノカーボン物質を合成することもできる。
【００２６】
（２）レーザ蒸発法：
1200℃程度に加熱した電気炉の中に挿入した石英管の内部に炭素材料のターゲットを置き、石英管にアルゴンガスを流しながら、ガスの流れの上流側から炭素材料にレーザを照射して炭素を蒸発させ、合成する方法である。電気炉の出口付近の冷えた石英管の内壁や、水冷銅のトラップにカーボンナノチューブを含む煤が付着する。アーク放電法と同様に、触媒の有無や種類、反応条件などを変えることによって、単層および多層のカーボンナノチューブを作り分けることができ、また、カーボンナノホーンなど、種々のナノカーボン物質を合成することもできる。
【００２７】
（３）ＣＶＤ法：
数100℃〜1200℃程度に加熱した電気炉の中に、アルゴンガスや水素ガスなどのキャリアガスと共に炭化水素ガスを供給して、カーボンナノチューブを合成する方法である。多層カーボンナノチューブの場合は、炉内に設置した基板上に堆積して成長させる。単層カーボンナノチューブの場合は、炭化水素ガスと共に触媒材料を供給して合成する。
【００２８】
この方法は、カーボンナノチューブ合成のための材料を大気圧側より簡単に供給できるため、連続運転が可能で生産性が高いが、欠陥の多いカーボンナノチューブができ易い。結晶性を上げるためには、合成後に数千度の高温熱処理を行って精製することが必要とされる場合がある。
【００２９】
＜フラーレンの製造方法＞
Ｃ60に代表されるフラーレンは、ダイヤモンドおよびグラファイト（黒鉛）に次ぐ第三の炭素同属体として、新たな可能性を有する物質である。Ｃ60は、60個の炭素原子により構成され、五員環12個および六員環20個からなる直径0.71 nmのサッカーボール状球殻分子である。他のフラーレンとしては、炭素原子数70個のＣ70、および炭素原子数76のＣ76があり、最大で炭素原子数540のＣ540が報告されている。また、炭素原子数が60未満であるＣ36およびＣ20もフラーレンとされている。これらフラーレンに共通した構造的特長として、五員環の数は必ず12個である。即ち、六員環の数のみが増大して、より高次のフラーレンを構成する。
【００３０】
上述の基本的なフラーレンから派生したフラーレン類として、球殻の内部に他の物質を内包した内包型フラーレン、殻を構成する炭素原子の一部が異種原子で置換されたヘテロフラーレン、フラーレン類を他の分子や官能基等で修飾した修飾型フラーレン、更には、高次フラーレンの内部により低次のフラーレンが入れ子状に存在する多層フラーレン等がある。
【００３１】
以下、代表的な合成法についての詳細を説明する。
【００３２】
（１）燃焼法：
現在のカーボンブラックの製造方法に類似した方法である。燃焼炉内に原料の炭化水素を連続的に送り込み、高温の炉内で炭化水素を不完全燃焼させることによりフラーレンを合成する。大量にフラーレンを合成することが可能である。
【００３３】
（２）アーク放電法：
二つの炭素材料の間でアーク放電を行い、アークの熱で炭素を蒸発させることにより合成する方法である。カーボンナノチューブの場合と同様に、密閉容器（チャンバー）を用い、ヘリウムガスや水素ガスを用いた減圧雰囲気内で放電を行う。放電時に生成する煤にフラーレンが含まれている。
【００３４】
（３）レーザ蒸発法：
1200℃程度に加熱した電気炉の中に挿入した石英管の内部に炭素材料のターゲットを置き、石英管にアルゴンガスを流しながら、ガスの流れの上流側から炭素材料にレーザを照射して炭素を蒸発させ、合成する方法である。電気炉の出口付近の冷えた石英管の内壁や、水冷銅のトラップにフラーレンを含む煤が付着する。
【００３５】
（４）抵抗加熱法：
原理的には、超微粒子やクラスターを得るガス蒸発法と同じである。フラーレンの場合は、不活性ガス内にて二本のカーボン棒の先端を接触させ、これに電流を流して接触部を加熱することにより炭素を蒸発させる。蒸発した炭素蒸気は不活性ガス分子との衝突により冷却されて過飽和状態となり、炭素クラスターを形成する。これらが気相で更に成長してフラーレンを含む煤ができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に則して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
実施例１
生体組織形成材料として、アーク放電法により合成した粉末状の多層カーボンナノチューブを用いた。
【００３８】
ペントバルビタール腹腔内投与による全身麻酔下に、balb／cマウスの背部皮膚を約1 cm切開し、皮下を剥離した。この剥離により形成された皮下スペースに、上記カーボンナノチューブ0.1 mgを配置し、皮膚がその部分を覆うように、吸収性の縫合糸を用いて創を閉鎖した。２週間後に、カーボンナノチューブを適用した部位を採取し、10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定した後、パラフィン包埋して組織切片標本を作製した。その際、細胞組織と、コラーゲン等の細胞外成分からなる結合組織との区別を明瞭にするために、染色法としてエラスティカ・マッソン染色を使用した。この染色法では、筋組織が赤ないしピンク色に染色され、コラーゲン等による結合組織は薄青色に染色されるため、筋組織とその外の結合組織とを明確に区別することができる。また、カーボンナノチューブは黒色で観察される。この作製された標本を光学顕微鏡で観察したところ、図１の写真に示す結果が得られた。
【００３９】
図１の写真において、カーボンナノチューブの周囲を取り囲むように、ピンク色の筋組織が形成されている像が観察された。このようなピンク色の像は、カーボンナノチューブの埋設前には存在していなかった。また、付近に存在する血管の画像との類似性から、カーボンナノチューブの周囲に形成されたピンク色に染色された部分は、血管平滑筋と同様の組織であることが示唆された。更にその周囲は、青色に染色された正常な繊維性の疎性結合組織で覆われていた。この結果は、カーボンナノチューブによって、その周囲の結合組織内に含まれていた繊維芽細胞が平滑筋細胞に分化誘導され、その細胞が平滑筋組織を形成したものであることを示している。
【００４０】
なお、カーボンナノチューブの代わりに、従来広く用いられている生体材料であるポリグリコール酸およびコラーゲンスポンジを埋設した実験では観察されなかったものである。
【００４１】
実施例２：
生体組織形成材料として、アーク放電法により合成したテープ状の多層カーボンナノチューブ約0.1 mgを用いた。なお、このテープ状の多層カーボンナノチューブを得る方法は、特開2004−292184号公報に詳細に説明されている。
【００４２】
それ以外は実施例１と同様に行うことにより、実施例１と同様の結果が得られた。
【００４３】
実施例３：
生体組織形成材料として、アーク放電法により合成した粉末状のフラーレン約0.3 mgを用いた。それ以外は実施例１と同様に行うことにより、実施例１の場合と同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、カーボンナノチューブを埋設したマウスの背部結合組織内において、カーボンナノチューブの周りに形成された平滑筋組織を示す光学顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００４５】
１…カーボンナノチューブ、２…形成された平滑筋組織、３…血管平滑筋
【図１】
2006143691.tif 000002