(57)【要約】      （修正有）【課題】血栓症性障害を処置するための医薬品の製造のための融合タンパク質の提供。【解決手段】ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対する抗体を含む融合タンパク質、とくに、ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対するマウス／ヒトキメラ抗体を含む融合タンパク質。上述の融合タンパク質を含む薬学的に受容可能な組成物、および、発作性心筋梗塞、肺性塞栓形成、および大腿動脈血栓症の処置のための薬品の製造のための融合タンパク質の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対する抗体を含む融合タンパク質。
【請求項２】
ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対するマウス／ヒトキメラ抗体を含む融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の融合タンパク質を含む、薬学的に受容可能な組成物。
【請求項４】
血栓症性障害を処置するための医薬品の製造のための、請求項１または２に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項５】
発作性心筋梗塞、肺性塞栓形成、および大腿動脈血栓症の処置のための薬品の製造のための、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＤＳＰＡα１の必須の機能部分を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、具体的には、ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対する抗体を含む融合タンパク質に関する。別の局面において、本発明は、ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対するマウス／ヒトキメラ抗体を含む融合タンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（イントロダクション）
動脈血栓症は、血管損傷部位における血小板活性化および凝集、その後のフィブリン含有血栓の形成を伴う凝固によって開始する（１）。動脈血栓症（例えば、心筋梗塞）処置のための１つの治療的アプローチは、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）の静脈内注射である（２，３）。ＰＡは、プラスミノーゲンを、プラスミンに変換し、プラスミンは、次に、フィブリンを分解し、そして虚血組織における動脈の能力および血流を回復する。血栓溶解治療は、急性心筋梗塞を有する患者の死亡率を減少するが、出血、不適切な組織灌流、および血栓症の再閉塞を含む治療において、なお大きな制限がある（４）。これらの制限は、ＰＡによって開始するフィブリノーゲンの非特異的タンパク質分解および止血性フィブリン栓、閉塞性の血栓症における血小板の進行する活性化、ならびに血栓溶解に対する血小板に富む血栓の耐性に起因する（５，６）。
【０００３】
Ｐ−セレクチンは、通常、休止する血小板のα顆粒内および内皮細胞のウェイベル−パラディ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）体内に蓄積される膜貫通タンパク質である（７）。例えば、トロンビンのようなアゴニストによる細胞刺激の際のみにおいて、Ｐ−セレクチンは、迅速に細胞表面に移動し、そこで、Ｐ−セレクチンは、血小板、白血球、および内皮細胞との相互作用を促進する。血栓生成応答の間の、休止状態ではなく、活性化された血小板および内皮細胞におけＰ−セレクチンの表面発現は、血栓溶解性因子を、新たに形成された動脈血栓へ特異的に標的化するメカニズムを提供する。そのような標的化戦略によって、原則的に、低い全身での薬物レベルをともなう、急性血栓症部位での高濃度の血栓溶解性薬剤を可能にする（８）。このアプローチの実現可能性が、ヒトＰ−セレクチンに対するマウスモノクローナル抗体ＳＺ５１によって実証された。ＳＺ５１を使用して、インビボにおいて、実験的動脈および静脈の血栓症の画像化に成功した（９）。近年、ｕＰＡと、マウス／ヒトキメラＳＺ５１（ＨｕＳＺ５１）との融合タンパク質を用いて、ハムスター肺栓塞症モデルにおいてフィブリン溶解を増加することが示された（１０）。
【０００４】
最初に吸血コウモリから単離されたDesmodus rotundus唾液ＰＡα１（ＤＳＰＡα１）は、４つのドメインを有する：フィンガードメイン、表皮増殖因子様ドメイン、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインおよびセリンプロテアーゼドメイン（１１）。構造的にＤＳＰＡα１は、ヒトｔＰＡに類似するが、ｔＰＡのプラスミン感受性切断部位およびリジン結合クリングル２を欠く。プラスミンによってより活性なその２鎖形態に変換するｕＰＡおよびｔＰＡとは異なり、ＤＳＰＡα１は、単鎖分子として機能する（１２）。ＤＳＰＡα１の触媒活性は、補因子としてのフィブリンに依存する（１３−１６）。その触媒効力は、フィブリンによって１３，０００倍に増加する。これは、ｔＰＡの場合の７２倍と対照的である（１５）。さらに、薬理学的用量が血漿中のプラスミノーゲンの実質的な活性化をもたらすｕＰＡやｔＰＡとは異なり、ＤＳＰＡα１は、血漿プラスミノーゲン活性化を生じることなく血栓の溶解を促進するので、出血のリスクを最小化する（１７−２０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｐ−セレクチン標的化を首尾よく動脈血栓の画像化するため（９）および血栓溶解効力を増強するため（１０、２１）に使用したという事実、ならびにＤＳＰＡα１が最小の出血を伴って迅速かつ持続的な血栓溶解を促進するという事実（１７−２０）に基づいて、著者らは、活性化血小板に対するＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン標的化が、出血のリスクを減少しながら、その血栓溶解効力を促進するという仮説を試した。著者らは、ヒトＰ−セレクチンに対するマウス／ヒトキメラ抗体（ＨｕＳＺ５１）とフィブリン選択性ＤＳＰＡα１とを組み合わせた融合タンパク質ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を操作した。著者らは、インビトロおよび動物モデルの両方において、ＤＳＰＡα１に対する融合タンパク質のフィブリン溶解性活性を比較した。著者らは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、インビトロにおけるＤＳＰＡα１フィブリン溶解性活性を完全に保持したことを、見出した。インビボにおいて試験した場合、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、血栓症を防ぐ点において、ＤＳＰＡα１の活性と類似する活性を有したが、その血栓溶解効力は、血栓の物理的組成に依存して変化した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（項目１）  ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対する抗体を含む融合タンパク質。
（項目２）  ヒトＰセレクチンおよびＤＳＰＡα１に対するマウス／ヒトキメラ抗体を含む融合タンパク質。
（項目３）  項目１または２に記載の融合タンパク質を含む、薬学的に受容可能な組成物。
（項目４）  血栓症性障害を処置するための医薬品の製造のための、項目１または２に記載の融合タンパク質の使用。
（項目５）  発作性心筋梗塞、肺性塞栓形成、および大腿動脈血栓症の処置のための薬品の製造のための、項目４に記載の使用。
（項目６）  ＤＳＰＡα１の必須の機能部分を含む、項目１または２に記載の融合タンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
（材料および方法）
（試薬）
精製したＩｇＧ１、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、フィブリノーゲン、およびトロンビンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より購入した。組換えＤＳＰＡα１を、記載されるように産生した（２２）。組換えヒト可溶性Ｐ−セレクチンは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からであった。セイヨウワサビ−パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化プロテインＬは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からであった。ＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖）およびＨＲＰ−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｚｙｍｅｄ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からであった。色素産生性基質Ｓ−２２８８（Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロライド）およびＳ−２７６５（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアラニンジヒドロクロライド）は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｉｌａｎ、イタリア）からであった。他の化学試薬は、Ｓｉｇｍａからであった。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ｋ１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からであり、そして、Ｂｅｒｌｅｘ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣｅｌｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて維持された。
【０００８】
（発現プラスミドの構築）
ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位に隣接するＳＺ５１カッパ鎖の可変領域にわたるＰＣＲフラグメントを、生成した。このフラグメントを、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、そして、プラスミドｐＬＮＯ／Ｋａｐｐａ／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（２３）中に挿入して、ＨｕＳＺ５１ＤＳＰＡα１の軽鎖を発現するｐＬＮＯＫＳＺ５１Ｖｋ／Ｈｙｇｏを生成した。
【０００９】
ＤＳＰＡα１に融合したＨｕＳＺ５１の重鎖を発現するプラスミドを構築するために、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位に隣接するＳＺ５１重鎖の可変領域を含むＰＣＲフラグメントを増幅した。このフラグメントを、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、そして、プラスミドｐＬＮＯＨ／Ｎｅｏ／ＩｇＧ１（２３）中に挿入した。結果として生じるプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩキメラフラグメントに連結した。完全長成熟ＤＳＰＡα１のＮ末端に融合したヒトＩｇＧ１の定常領域１〜３をコードするキメラフラグメントを、オーバーラップＰＣＲ（２４）によって生成した。全ての構築物を、制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００１０】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を発現する安定ＣＨＯ細胞）
構築物ｐＬＮＯＫＳＺ５１Ｖｋ／ＨｙｇｏおよびｐＬＮＯＨＳＺ５１ＤＳＰＡ／Ｎｅｏを、製造業者の指示に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてＣＨＯ−ｋ１細胞中に、コトランスフェクションした。安定なクローンを、１０％胎児ウシ血清、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＨＡＭＳ／Ｆ１２培地中で選択し、タンパク質発現についてＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析によってスクリーニングした。
【００１１】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の精製）
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を含むＣＨＯ細胞からの馴化培地を、０．２２μｍメンブレンを通して濾過し、そしてＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて１０−ｋＤａ分子量カットオフＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎメンブレンを用いて濃縮した。濃縮した物質を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）および３００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したプロテインＡカラムにロードした。カラムを、１０カラム容量の同一の緩衝液で洗浄して、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．７）および３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【００１２】
混入するウシＩｇＧを除去するために、プロテインＡカラムからの溶出物を、カチオン交換ＳＰ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌクロマトグラフィーに供した。溶出物を、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したカチオン交換カラムにロードして、０．１〜０．９ＭのＮａＣｌの直線状グラジエントで溶出した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を含む第２の溶出ピークを収集し、そして、タンパク質凝集物を除去するために、ゲル濾過に供した。
【００１３】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の定量）
精製したＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のタンパク質濃度を、計算した吸光係数１．５９を用いて２８０ｎｍで分光光度計で決定した（２５）。ＥＬＩＳＡを用いて、精製したＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を標準として用いて、イヌ血漿中のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の濃度を決定した。手短には、組換えＰ−セレクチンタンパク質を用いて、マイクロタイタープレートをコートした（１μｇ／ウェル）。サンプルを、コートしたプレートに添加し、そして、３７℃で２時間インキュベートした。次に、プレートをＨＲＰ結合体化プロテインＬを添加して発色した。
【００１４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析）
タンパク質サンプルを、４〜２０％  ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにて分離し、そして、クマシーブリリアントブルーにて染色するか、またはＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロースメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。ウェスタン分析を、抗ＤＳＰＡα１モノクローナル抗体９Ｂ３またはヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて、行った。
【００１５】
（Ｐ−セレクチン結合アッセイ）
親抗体ＳＺ５１およびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン結合親和性を比較するために、著者らは、組換可溶性ヒトＰ−セレクチンを、マイクロタイタープレート上にコーティングした（１μｇ／ウェル）。コーティングしたプレートを、増加する量のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはヒトＩｇＧ１の存在下で、固定量のＳＺ５１とインキュベートした。特異的結合を、ＨＲＰ−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧで、検出した。
【００１６】
（血小板結合アッセイ）
洗浄したヒトおよびイヌ血小板を、記載されるように末梢血から調製した（２６）。血小板を、２×１０６血小板／ｍｌで懸濁し、そしてトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）で活性化した。活性化した血小板（１００μｌ／ウェル）で、３７℃２時間マイクロタイタープレートをコーティングし、そして４％パラホルムアルデヒドで固定した。次に、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＳＺ５１またはヒトＩｇＧ１を、プレートの各ウェルに添加した。活性化血小板に対する特異的結合を、ＨＲＰ−結合体化プロテインＬによって、検出した。
【００１７】
（色素生産性アッセイ）
色素生産性アッセイを、記載されるように（１５、２７）、室温において、マイクロタイタープレート中で、Ｓ−２２８８またはＳ−２７６５を用いて行った。加水分解反応を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４０５ｎｍでの吸収によって、モニターした。Ｋｍ、ｋｃａｔおよびＫｍ／ｋｃａｔを、ミカエリス−メンテン式に基づくソフトウェア（Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ  ３．０）を用いるデータの非線形回帰分析によって、計算した。
【００１８】
（血栓溶解アッセイ）
フィブリン血栓アッセイを、２０μｌのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１、１０μｌのフィブリノーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌのプラスミノーゲン（１Ｕ／ｍｌ）、２μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２、６０μｌの４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ８０（ｖ／ｖ）を含む１２０μｌの容量で、行った。混合物を、４μｌのトロンビン（７５Ｕ／ｍｌ）を含む別のウェルに添加した。混合後、４０５ｎｍでの吸収を、３７℃で９０分間モニターした。データを、Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ  ３．０で分析した。血漿性血栓溶解アッセイを、希釈したヒト血漿（１：３）を、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンの供給源として使用した以外は、本質的に同様に行った。血栓溶解時間を、濁度が凝血後に達するプラトーと完全な溶解において達成されるベースライン値との間の差の半値である時間として、規定した。
【００１９】
（インビトロにおける血漿環境中の１２５Ｉ−フィブリン−標識ヒト血漿性血栓の溶解）
１２５Ｉ−フィブリン−標識ヒト血漿性血栓の溶解を、記載されるように行った（１０）。手短には、血栓を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１またはｕＰＡを含有する、１ｍｌのクエン酸化正常ヒト血漿中でインキュベートする前に、１２５Ｉ−標識血漿性血栓の放射活性を測定した。３７℃でのインキュベーションの４時間後に、水浴中の血漿のアリコートを、放射活性を決定するために、取り出した。血栓溶解のパーセントを、上清中の放射活性を導入した血栓の総放射活性で除算することによって、計算した。
【００２０】
（ラットの肺栓塞症モデル）
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を、記載されるように（１７）、肺栓塞症のラットモデルにおいて比較した。手短には、１２５Ｉ−フィブリン−標識血栓（５０μｌ）を、新鮮な血小板に富むヒト血漿（２．５×１０５血小板／ｍｌ）から調製し、そして、ラットの頸静脈に注射した。凝結の注入後、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１を、６０分間にわたって、静脈内に注入した。注入の３０分後、血栓溶解を、血栓中に最初に取り込まれた放射活性と、肺および心臓において残存する放射活性との差異を比較することによって、測定した。
【００２１】
（大腿動脈血栓症のイヌモデル）
雌性ビーグル犬（８〜１２ｋｇ）を、イソフルランで麻酔して、気管チューブを用いて人工呼吸した。右大腿動脈および左大腿動脈を単離し、そして、フロープローブ（２．５ＳＢ、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を、動脈の周囲に配置した。カテーテルを、化合物投与および血液サンプリングのために、右頸静脈および左頸静脈中に挿入した。圧力変換器（２Ｆｒ．，Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を、右上腕動脈中に挿入して、血圧を測定した。血液サンプル（０．４ｍｌ）を採取し、そして基礎出血時間を測定した。１０％  ＦｅＣｌ２溶液中に浸漬した濾紙（５×６ｍｍ）を、単離した大腿動脈のうちの１つに１０分間適用して、血栓形成を誘導した。血管を閉塞した４０分間後、ＤＳＰＡα１（０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１（０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．７５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（１〜２ｍｌ／ｋｇ）を、頸静脈中にボーラスとして注射して、血栓崩壊効力を評価した。同時に、ＦｅＣｌ２を、第２の大腿動脈に適用して、血栓形成を防止することに対するＤＳＰＡα１／ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の影響を評価した。血液サンプルを、薬物投与前後のＤＳＰＡα１抗原および活性を測定するために収集した。血圧、心拍数、および大腿血流を、この実験全体を通してモニターし、データ収集システム（Ｎｏｔｏｃｏｒｄ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｃｅ）により処理した。血栓崩壊効力を評価するためのパラメーターとしては、薬物投与後の再灌流までの時間、および再灌流の持続時間が挙げられる。これらを、大腿血流の測定から得た。薬物投与後に血管が再疎通しなかった動物について、再灌流時間を、最大観察時間２４０分間および再灌流持続時間０として記録した。抗血栓効力についてのパラメーター（これらは、薬物投与後に測定した）としては、ＦｅＣｌ２適用後の閉塞までの時間、および全灌流持続時間が挙げられる。
【００２２】
（イヌにおける小皮出血時間の測定）
鋭利な爪切りはさみを使用して爪の小皮を（端から約３ｍｍ）挟むことによって、出血を開始した。初期出血時間を、最初に出血が停止するまでの出血誘導時間として規定した。
【００２３】
（統計）
データを、平均±標準誤差として表す。処理群とコントロール群との間の差異を、スチューデントｔ検定により分析した。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意であるとみなした。
【００２４】
（結果）
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の発現および精製）
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質は、図１Ａに模式的に示されるような二本鎖テトラマー分子である。この融合タンパク質を発現させるために、２つの発現プラスミドを構築した。これらの発現プラスミドは、その軽鎖および重鎖を別個にコードする。この軽鎖構築物および重鎖構築物を、ＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ハイグロマイシンおよびＧ４１８の存在下で選択した。抗生物質耐性ＣＨＯクローンを、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の発現についてスクリーニングした。６つのクローンが、３ｍｇ／ｌ〜６ｍｇ／ｌの範囲のレベルで上記タンパク質を発現した。これらのクローンのうちの１つを、タンパク質精製用の馴化培地を生成するために選択した。
【００２５】
この融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティ、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを介して、上記ＣＨＯ馴化培地から精製した。この精製融合タンパク質は、分析クロマトグラフィー（図１Ｂ）において単一ピークを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ｃ）において、このタンパク質は、非還元条件下（左の図）で見かけの分子量２５０ｋＤａの単一バンドとして移動し、還元条件下（右の図）では、それぞれ約１０８ｋＤａおよび約２３ｋＤａの２つのバンドとして移動した。この１０８ｋＤａのバンドは、ヒトＩｇＧ１およびＤＳＰＡα１に対する抗体およびＤＳＰＡα１に対する抗体によって認識された。一方、この２３ｋＤａのバンドは、ヒトＩｇＧ１に対する抗体により検出されたが、ＤＳＰＡα１に対する抗体によっては検出されなかった（データは示さず）。このタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクロマトグラフィー分析によって、約９５％であった。
【００２６】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、Ｐ−セレクチン結合を保持する）
著者らは、組換えＰ−セレクチンよび活性化血小板に対する、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の結合親和性と、その親抗体であるＳＺ５１の結合親和性を比較した。図２Ａに示されるように、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、Ｐ−セレクチン結合についてＳＺ５１と用量依存性様式で競合したが、コントロールヒトＩｇＧ１はそうではなかった。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の計算ＩＣ５０値は、約２．８ｎＭであった。これは、活性化血小板についてのＳＺ５１の計算ＩＣ５０値（４．２ｎＭ）（２８）と同様であった。
【００２７】
図２Ｂは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、ＳＺ２５１と同様の用量依存性様式でトロンビン活性化ヒト血小板に結合した一方で、コントロールヒトＩｇＧ１は結合しなかったことを、示す。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はまた、トロンビン活性化イヌ血小板に用量依存性様式で結合した（データは示さず）。これは、ＳＺ５１が活性化ヒト血小板およびイヌ血小板に結合したという以前の知見（９）と一致する。これらの結果は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、Ｐ−セレクチン結合についてその活性を保持したことを示す。
【００２８】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、ＤＳＰＡ１αの酵素活性をインビトロで保持する）
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、２コピーのＤＳＰＡα１分子を含むので、以下のインビトロ研究およびインビボ研究におけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１とＤＳＰＡα１との間の比較はすべて、等モル濃度のＤＳＰＡα１に基づく。例えば、２５ｎＭのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の実際の濃度は、５０ｎＭのＤＳＰＡα１の実際の濃度と等しかった。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の分子量は、ＤＳＰＡα１の分子量の約５倍であるので、０．７５ｍｇ／ｋｇのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、０．３ｍｇ／ｋｇのＤＳＰＡα１に匹敵した。
【００２９】
このＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質が、ＤＳＰＡα１の酵素活性を保持するか否かを決定するために、著者らは、色素形成基質であるＳ−２２８８およびＳ−２７６５を使用して、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のアミド溶解活性とＤＳＰＡα１のアミド溶解活性とを比較した。表１は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の速度論パラメーターおよびＤＳＰＡα１の速度論パラメーターを要約する。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍの値は、等モル濃度のＤＳＰＡα１分子にて比較した場合には、ＤＳＰＡα１のＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍの値と同様であった。
【００３０】
ＤＳＰＡα１の活性はフィブリンにより刺激される（１５、１６）ので、著者らは、フィブリン血餅溶解アッセイおよび血漿血餅溶解アッセイにおいて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１とＤＳＰＡα１とのフィブリン溶解活性を比較した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、フィブリン血餅溶解アッセイにおいて、同等の濃度の各々で、ＤＳＰＡα１と同様の血餅溶解時間を有した（図３Ａ）。一方、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、血漿血餅溶解アッセイにおいて、ＤＳＰＡα１よりもわずかに短い溶解時間を有した。まとめると、これらの結果は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、ＤＳＰＡα１の酵素活性を保持したことを示す。
【００３１】
（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１とＤＳＰＡα１とは、インビトロでの血小板含有血漿血餅の溶解において同等のフィブリン溶解活性を有する）
活性化血小板に対するＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の標的化が、その血栓形成能力を増強するか否かを決定するために、著者らは、血小板が乏しい（１×１０４血小板／μｌ）血漿または血小板が豊富な（２×１０５血小板／μｌ）血漿から、１２５Ｉ−フィブリン標識ヒト血漿血餅を調製した。これらの標識血餅を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１含有ヒト血漿、ＤＳＰＡα１含有ヒト血漿、またはｕＰＡ含有ヒト血漿中に浸漬した。４時間後、各反応物からの上清のアリコートを取り出し、そして放射能について測定した。血餅溶解の割合を、計算した。
【００３２】
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、血小板が乏しい血漿血餅において同様の血餅溶解活性を示した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、両方とも、１０ｎＭにてｕＰＡより約５倍多くの溶解を引き起こした（図４Ａ）。血小板が豊富な血餅の溶解において、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、２．５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の等モル濃度では、同様の活性を提示した（図４Ｂ）。２０ｎＭ〜１００ｎＭの等モル濃度でもまた、同様の結果が得られた（データは示さず）。これらのデータは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１とＤＳＰＡα１とが、同様のフィブリン溶解活性を有したこと、および活性化血小板に対するＤＳＰＡα１の標的化は、血小板が豊富な血餅におけるＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を増強しなかったことを、示す。
【００３３】
（ラット肺塞栓モデルにおける血小板リッチ血漿性血栓の溶解におけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の比較）
我々は、肺塞栓のラットモデルにおいて、血小板リッチ血漿性血栓（２×１０５血小板／μｌ）に対するＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のフィブリン溶解効果をさらに試験した、図５は、このモデルにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１の静脈内注入後の血栓溶解のデータを示す。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１はともに、生理食塩水に比較して、有意なフィブリン溶解活性を示した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解効果は、３種の異なる用量において等モル量ベースで有意には異ならなかった。これらの知見は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１が、この肺塞栓症のラットモデルにおいて匹敵するフィブリン溶解効力を有したことを示す。
【００３４】
（動脈血栓症のイヌモデルにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の血栓崩壊活性の比較）
図６Ａは、静脈内投与後のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の薬物動態を示す。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡαの最大濃度は、１５分で観察され、そのレベルは、実験全体を通して一定のままであった。血漿中のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の酵素活性は、色素形成アッセイにより測定すると、抗原レベルよりも速く減少した（図６Ｂ）。その酵素活性の約５０％は、２時間維持され、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の活性は、各々の示された時点でのＤＳＰＡα１の活性よりも高かった。
【００３５】
血管障害の前に与えられる場合、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、閉塞までの時間および２種の異なる用量における灌流の持続時間によって測定されると、匹敵する抗血栓効果を有した（図７Ａ）。対照的に、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、再灌流までの時間および再灌流の持続時間によって測定されると、２種の異なる用量において、ＤＳＰＡα１よりも有意に低い血栓崩壊活性を示した（図７Ｂ）。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１処置群とＤＳＰＡα１処置群との間の処理後５分での最初の採血時間では、２つの匹敵する用量において有意には異ならなかった（低用量において２．９±０．５対２．７±０．４分；高用量において４．２±１．０対４．８±１．３分）。これらの結果は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１が、血栓症の予防において匹敵する活性を有したが、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、既に存在する動脈血栓の崩壊においてその効果がＤＳＰＡα１より有意に低かったことを示す。
【００３６】
（考察）
我々は、ヒトＰ−セレクチン（ＨｕＳＺ５１）およびフィブリン選択的ＤＳＰＡα１に対するマウス／ヒトキメラ抗体から構成される融合タンパク質ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を操作した。ＤＳＰＡα１を、ヒトｌｇＧ１の定常領域３のＣ末端に結合して、活性化血小板に標的化した場合に、ポリマーフィブリンおよびプラスミノゲンと相互作用するように可撓性にした。その融合タンパク質をＣＨＯ細胞において発現させ、クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプロッティングにより分析した場合、均質になるまで精製した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、用量依存性様式において、組換えＰ−セレクチンおよび活性化ヒト結晶板および活性化イヌ血小板を結合することを示し、親抗体ＳＺ５１（２８）に匹敵する結合親和性を有した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はまた、色素生成基質ベースのアッセイおよびフィブリン血栓溶解アッセイにおいて、ＤＳＰＡα１と類似の活性を示したが、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、血漿性血栓溶解アッセイにおいてＤＳＰＡα１よりわずかに良好なフィブリン溶解活性を示した。共に、これらのデータは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１がインビトロでの完全なＰ−セレクチン結合およびＤＳＰＡα１酵素活性を維持することを示した。
【００３７】
我々は、次いで、ＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン標的化が、出血危険性が減少した局所的血栓崩壊効力を増強するという仮定を試験した。１２５Ｉ−フィブリン標識血小板リッチ血栓の崩壊においてインビトロでアッセイすると、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１はともに、ｕＰＡより約５倍より強力であった。これは、ｕＰＡがフィブリンに結合しないのに対して、ＤＳＰＡα１は、Ｋｄ約１５４ｎＭでフィブリンに結合するからである（１５）。しかし、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、２．５〜１０ｍＭの範囲の濃度においてＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性と類似するフィブリン溶解活性を示した。この溶解性は、Ｐ−セレクチン結合についてのＫｄよりも高いが、フィブリン結合についてのＫｄよりも遙かに低い。これらの試験した濃度の下で、原則的に、ＤＳＰＡα１から生じたフィブリン結合効果は、最小であるはずである。従って、我々は、活性化血小板に対するＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン標的化が、少なくともこのインビトロ状況において、ＤＳＰＡα１の溶解抗力を増強させないと結論づけた。
【００３８】
インビトロ血栓溶解アッセイが、インビボモデルとは異なる静的な状態（血流が、標的化薬物送達と非標的化薬物送達との問の差異を高めると予測される）で行われたので、我々は、予めインビトロで形成されたヒト血小板リッチ血栓を使用する肺塞栓症のラットモデルにおいて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を比較した。再び、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性は、匹敵した。このことは、生理学的血流の下で、ＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン標的化は、予め形成された血小板リッチヒト血栓に対するＤＳＰＡα１の血栓崩壊活性を増強しなかったことを示す。
【００３９】
あらゆるあり得る治療能力をさらに探索するために、我々は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、匹敵する高親和性で活性化イヌ血小板に結合したという事実を利用した。我々は、大腿動脈血栓症のイヌモデルにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の血栓崩壊効力および抗血栓効果を比較した。ラットモデルを超えるこのモデルの利点は、血栓症のプロセス（例えば、血小板およびフィブリンの沈着）が、ヒトに類似し、従って、臨床的な動脈血栓崩壊により関連することである。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の抗血栓効果は、ＤＳＰＡα１の抗血栓効果と類似した。しかし、我々が驚いたのは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、動脈血栓崩壊において、ＤＳＰＡα１よりも遙かに効果が低かったことである。このことは、インビトロ血栓溶解アッセイおよび肺塞栓症のラットモデルから得た結果とは、極めて対照的であった。
【００４０】
ラットモデルとイヌモデルとの間のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性における劇的な差異についての機構は未知であるが、いくつかの潜在的な機構の説明がある。イヌモデルにおける減少した血栓崩壊効果は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の薬物動態特性に起因する可能性は低かった。第１に、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の血漿抗原レベルは、Ｐ−セレクチン結合ベースのＥＬＩＳＡによって測定した場合、実験の過程にわたって維持された。第２に、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１処置動物に由来する血漿中のそのアミド溶解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性もまた、ＤＳＰＡα１処置動物よりも高かった。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１処置動物において処置後５〜３０分間にアミド溶解活性の劇的な減少が存在するようであるが、我々は、代わりに、この減少が、処置後５分でＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１処置動物に由来する血漿中のアミド溶解活性が大きく減少することから、増大したと論じる。なぜなら、このアミド溶解活性は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１がほとんど存在しないことによって説明できないからである。実際に、この活性は、血漿中に注入されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１によって生成される理論値を超えた。循環中の機能的ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の維持レベルはまた、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、血管床の上に全て標的化されるという別のあり得る説明を排除する。なぜなら、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、イヌのＰ−セレクチンに結合し得るが、ラットのＰ−セレクチンには結合し得ないからである。
【００４１】
我々が考えるもっともらしい説明は、これらの２つのモデルの間の血栓の異なる物理的組成が、その差異を説明し得ることである。インビトロで形成される血栓とは異なり、動脈血栓は、非対称であり、かっ動脈血栓のヘッドは、血小板リッチであるが、フィブリン欠乏である。ＤＳＰＡα１を血小板リッチであるが、フィブリン欠乏の環境に標的化することは、実際にその血栓崩壊効力を弱くし得る。他のＰＡとは異なり、ＤＳＰＡα１のプラスミノゲン活性化活性は、フィブリンの非存在下で実質的に不活性であるが、ＤＳＰＡα１の活性は、そのフィブリンヘの結合に際して劇的に増大される（１３，１５）。先の構造研究は、ＤＳＰＡα１のフィブリンヘの結合が、フィブリンテンプレートおよびＤＳＰＡα１触媒ドメインを整列させ、それにより、その触媒効力を増すことを示唆する（１２，１６＞。従って、その融合タンパク質、補因子フィブリンおよび基質であるプラスミノゲンは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、プラスミノゲンを効率よく活性化させるために、最適な幾何的位置に存在しなければならない。Ｐ−セレクチンへのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の結合は、（血小板の表面上の膜貫通ドメインによって結合される）ＤＳＰＡα１が、フィブリンおよびプラスミノゲンと相互作用し、それにより、ＤＳＰＡα１が、プラスミノゲンをプラスミンに変換することを妨害する能力を維持し得る。さらにＰ−セレクチン結合のその高い親和性は、拡散から動脈血栓への標的化されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１分子を妨害し得、このことは、他の標的化された抗体によって示唆された（２９）。注目すべきは、我々は、ラットモデルではなくイヌモデルにおける閉塞動脈血栓を使用してＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の血栓崩壊効力を試験したことである。
【００４２】
振り返ると、ＤＳＰＡα１は、標的化パートナーとして選択する理想的血栓崩壊エフェクターではないかもしれない。なぜなら、ＤＳＰＡα１は、固有の弱いフィブリン結合能力を有し、その触媒活性は、補因子としてのフィブリンに大きく依存するからである。従って、我々の研究は、一般に、血栓崩壊剤のＰ−セレクチン標的化またはフィブリン標的化は、利益がないと解釈されるべきではない。実際に、我々および他のグループの以前の研究は、Ｐ−セレクチンまたはフィブリンを介する血栓崩壊剤の標的化が、特定のセットの実験モデルにおいて血栓崩壊効力を増すことを示した（１０，２１，３０〜３３）。しかし、我々の研究は、標的化された血栓崩壊剤の効力が、どの血栓崩壊動物モデルが薬物試験に使用されるかに依存して変化するという興味ある問題をもたらす。
【００４３】
（参考文献）
１．Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ  Ｐ．Ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇｓ  ２００２；２：２２７−３５．
２．Ｃｏｌｌｅｎ  Ｄ，  Ｌｉｊｎｅｎ  ＨＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，  ａｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９５；７４：１６７−７１．
３．Ｔｏｐｏｌ  ＥＪ．Ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｈｅａｒｔ  ２０００；８３：１２２−６．
４．Ｂａｋｅｒ  ＷＦ，  Ｊｒ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００２；８：２９１−３１４．
５．Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ．Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ：ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９３；２１：１９０−８．
６．Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｒｆ  ＦＪ．Ｔｈｅ  ｉｄｅａｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ：ｃａｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ？  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １９９９；２０：１４５２−８．
７．ＭｃＥｖｅｒ  ＲＰ．Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ＰＳＧＬ−１：ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００２；８７：３６４−５．
８．Ｈａｂｅｒ  Ｅ，  Ｂｏｄｅ  Ｃ，  Ｍａｔｓｕｅｄａ  ＧＲ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｔｈｒｏｍ-ｂｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９２；６６７：３６５−８１．
９．Ｗｕ  Ｊ，  Ｈｅ  Ｇ，  Ｗｕ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｉ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ９９Ｔｃｍ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ａｃｔｉ-ｖａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＳＺ−５１．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９３；１４：１０８８−９２．
１０．Ｗａｎ  Ｈ，  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｘｉａ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏ-ｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｒｏｍ-ｂｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ２０００；９７：１３３−４１．
１１．Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｊ，  Ｈａｅｎｄｌｅｒ  Ｂ，  Ｌａｎｇｅｒ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  １９９１；１０５：２２９−３７．
１２．Ｒｅｎａｔｕｓ  Ｍ，  Ｓｔｕｂｂｓ  ＭＴ，  Ｈｕｂｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙ-ｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；３６：１３４８３−９３．
１３．Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ，  Ｈａｒｅ  ＴＲ，  Ｂｅｒｇｕｍ  ＰＷ，  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏ-ｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｓ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ  ｕｎｌｉｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  １９９０；７６：２５６０−４．
１４．Ｂｅｒｇｕｍ  ＰＷ，  Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ．Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  ｓｔｒｉｃｔ  ａｎｄ  ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｒｉｎ  ａｓ  ｉｔｓ  ｃｏｆａｃｔｏｒ，  ｕｎｌｉｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７：１７７２６−３１．
１５．Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｐ，  Ｇｒｕｂｅｒ  Ｄ，  Ｌｉｅｓｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５；２７０：２５５９６−６０３．
１６．Ｔｏｓｃｈｉ  Ｌ，  Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｐ，  Ｐｅｔｒｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｐｌａｓｍｉ-ｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８；２５２：１０８−１２．
１７．Ｗｉｔｔ  Ｗ，  Ｂａｌｄｕｓ  Ｂ，  Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ  （ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ）  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９２；７９：１２１３−７．
１８．Ｈａｒｅ  ＴＲ，  Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ．Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏ-ｍｏｔｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｌｏｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｌａｓｍａ  ｍｉｌｉｅｕ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９２；６８：１６５−９．
１９．Ｍｅｌｌｏｔｔ  ＭＪ，  Ｓｔａｂｉｌｉｔｏ，  ＩＩ，  Ｈｏｌａｈａｎ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉ-ｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎ-ｃｏｍｉｔａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  １９９２；１２：２１２−２１．
２０．Ｗｉｔｔ  Ｗ，  Ｍａａｓｓ  Ｂ，  Ｂａｌｄｕｓ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｓｍｏ-ｄｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂｏｌｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９４；９０：４２１−６．
２１．Ｆｕｊｉｓｅ  Ｋ，  Ｒｅｖｅｌｌｅ  ＢＭ，  Ｓｔａｃｙ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ／Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９７；９５：７１５−２２．
２２．Ｐｅｔｒｉ  Ｔ，  Ｌａｎｇｅｒ  Ｇ，  Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＤＳＰＡ  ａｌｐｈａ  １  ｉｎ  ＣＨＯ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏ-ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９５；３９：７５−８３．
２３．Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  Ｌ，  Ｏｌａｆｓｅｎ  Ｔ，  Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ  ＴＥ，  ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９７；２０４：７７−８７．
２４．Ｈｏ  ＳＮ，  Ｈｕｎｔ  ＨＤ，  Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  １９８９；７７：５１−９．
２５．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ，  Ｈａｅｂｅｒｌｉ  Ｐ，  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ．Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＡＸ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８４；１２：３８７−９５．
２６．Ｍｕｓｔａｒｄ  ＪＦ，  Ｋｉｎｌｏｕｇｈ−Ｒａｔｈｂｏｎｅ  ＲＬ，  Ｐａｃｋｈａｍ  ＭＡ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｗａｓｈｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８９；１６９：３−１１．
２７．ＭｃＣａｍａｎ  ＭＴ，  Ｓｏｕｄｅｒｓ  Ｃ，  Ｏｔｔｏｂｏｎｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖａｍ-ｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｏ  ＳＥＣ  ｒｅｓｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  １９９８；１２：１１１−２１．
２８．Ｗｕ  Ｇ，  Ｘｉ  Ｘ，  Ｌｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＳＺ−５１，  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｇｒａｎｕｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＭＰ−１４０）  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｎｏｕｖ  Ｒｅｖ  Ｆｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９０；３２：２３１−５．
２９．Ｇｒａｆｆ  ＣＰ，  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：１２８８−９６  
３０．Ｒｕｎｇｅ  ＭＳ，  Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ  Ｔ，  Ｚａｖｏｄｎｙ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈａｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｒｏｍ-ｂｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ１９９１；８８：１０３３７−４１．
３１．Ｒｕｎｇｅ  ＭＳ，  Ｈａｒｋｅｒ  ＬＡ，  Ｂｏｄｅ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉ-ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ｂａｂｏｏｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６；９４：１４１２−２２．
３２．Ｂｏｄｅ  Ｃ，  Ｈａｎｓｏｎ  ＳＲ，  Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ  ＪＦ  Ｊｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｉｒｕｄｉｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｂｙ  ｆｉｂｒｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａ-ｔｉｏｎ  １９９７；９５：８００−４
３３．Ｈｏｌｖｏｅｔ  Ｐ，  Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎ  Ｍ，  Ｓｔａｓｓｅｎ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｃｌｏｔ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎｄ  ｍａｘｉｍａｌ  ｒａｔｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９３；８７：１００７−１６．
（表１：ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１によるＳ−２２８８およびＳ−２７６５の加水分解について速度論パラメーター）
Ｓ−２２８８およびＳ−２７６５の加水分解の速度論を、「材料および方法」の下で記載したように測定した。これらの速度論パラメーターは、Ｓ−２２８８またはＳ−２７６５の濃度に対するｐＮＡ生成の速度を示すミカエリス−メンテンプロットの非線形回帰分析から誘導した。
【００４４】
【表１】
2006241109.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を示す。（Ａ）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質の模式図。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質は、２つの軽鎖および重鎖からなる。軽鎖は、ＳＺ５１軽鎖の可変領域（ＶＬ）、それに続くヒトＩｇκの定常領域からなる。重鎖は、ＳＺ５１重鎖の可変領域（ＶＨ）、それに続くヒトＩｇＧ１の定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、ならびに、ＤＳＰＡα１の成熟、分泌形態からなる。（Ｂ）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の分析。（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の分析。精製したＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質、組換えＤＳＰＡα１およびヒトＩｇＧを、非還元条件下または還元条件下において、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、次に、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した。
【図２】図２は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、親ＳＺ５１に匹敵する親和性でＰ−セレクチン結合を保持したことを示す。（Ａ）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、Ｐ−セレクチンに対する結合についてＳＺ５１と競合した。ＥＬＩＳＡベースの競合Ｐ−セレクチン結合アッセイを、「材料および方法」において記載した手順に従って使用した。このデータは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。（Ｂ）トロンビン活性化ヒト血小板に対するＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の特異的結合。トロンビン活性化血小板でコートしたマイクロタイタープレートを、漸増濃度のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＳＺ５１またはヒトＩｇＧ１とともにインキュベートした。活性化血小板に対する抗体結合を、ＨＲＰ結合体化プロテインＬにより検出した。このＨＰＲ結合体化プロテインＬは、Ｉｇκ軽鎖に結合する。このデータは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。
【図３】図３は、血餅溶解アッセイにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を示す。これらのアッセイは、「材料および方法」において記載された。４０５ｎｍでの吸光度によりモニターしたフィブリン分解速度を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１（１２．５ｎＭ、２５ｎＭおよび５０ｎＭ）および等モル量のＤＳＰＡα１（２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭ）について測定した。（Ａ）このフィブリン血餅溶解アッセイにおいて、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンを、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１と混合した。その後、これらの混合物を、トロンビンに添加した。ここで、３つの独立した実験の代表的血餅溶解プロフィールが示される。（Ｂ）この血漿血餅溶解アッセイは、プラスミノーゲンおよびフィブリンの供給源としてヒト血漿を使用したこと以外は、上記フィブリン血餅アッセイと同様であった。３つの独立した実験の代表的血餅溶解プロフィールが、ここに示される。
【図４】図４は、１２５Ｉフィブリン標識した血小板が乏しい血餅および１２５Ｉフィブリン標識した血小板が豊富な血餅を溶解する際のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を示す。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性、ＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性、およびｕＰＡのフィブリン溶解活性を、血小板が乏しい血漿（Ａ）または血小板が豊富な血漿（Ｂ）のいずれかを使用して、血小板血餅溶解アッセイにおいて比較した。このデータは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。
【図５】図５は、肺塞栓症のラットモデルにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のフィブリン溶解活性を示す。フィブリン溶解性を、１２５Ｉ標識ヒト血漿性血栓を使用するラット肺塞栓症モデルにおいて、等モル用量のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１を静脈内注射して９０分後に測定した。データは、平均±標準誤差を示す。＊、Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．７５ｍｇ／ｋｇのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の静脈内ボーラス投与後のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の薬物動態プロフィールを示す。（Ａ）血漿抗原レベルを、ＥＬＩＳＡベースのアッセイによって測定した。データは、各投与について６匹のイヌに由来し、平均±標準誤差を示す。（Ｂ）血漿アミド溶解活性を、色素生成基質Ｓ−２２８８および同じ群のイヌに由来する血漿サンプルを用いて測定した。
【図７】図７は、大腿部血栓症のイヌモデルにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡIおよびＤＳＰＡαIのフィブリン溶解特性の比較を示す。（Ａ）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の抗血栓症効果の比較。この抗血栓症性効果は、ＦｅＣｌ２投与後の閉塞までの時間（上パネル）およびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１の静脈内ボーラス投与後の灌流の持続時間（下パネル）によって測定した。（Ｂ）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の血栓溶解効果の比較。血栓溶解効果を、再灌流までの時間（上パネル）および灌流の持続時間（下パネル）によって測定した。アスタリスク（＊）は、Ｐ＜０．０５を表す。
【図１】
2006241109.tif 000003
【図２】
2006241109.tif 000004
【図３】
2006241109.tif 000005
【図４】
2006241109.tif 000006
【図５】
2006241109.tif 000007
【図６】
2006241109.tif 000008
【図７】
2006241109.tif 000009
【外国語明細書】
2006241109000001.pdf
2006241109000002.pdf
2006241109000003.pdf
2006241109000004.pdf