(57)【要約】【課題】リンパ球を効率的に増殖して薬剤耐性原生生物感染症の治療・予防剤とするとともに、薬剤耐性原生生物感染症の良好な治癒をはかる。【解決手段】薬剤耐性原生生物感染症患者より採取した血液をインターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させることによりリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤とした。  これにより薬剤耐性原生生物感染症、とくに結核菌による多剤耐性結核感染症の治療もしくは予防効果の向上、ならびに各種手術や移植後の薬剤耐性原生生物感染の十分な予防を可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤。
【請求項２】
インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の両方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは治療用製剤。
【請求項３】
リンパ球が薬剤耐性原生生物感染症患者由来のものである請求項１又は請求項２に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは治療用製剤。
【請求項４】
薬剤耐性原生生物感染症が、細菌または真菌感染症であるところの請求項１又は請求項２に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤。
【請求項５】
細菌または真菌感染症が結核感染症であるところの請求項４に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤。
【請求項６】
インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方を内部に含んだリンパ球培養用容器と、該容器内に充填するための培養用培地とからなる薬剤耐性原生生物感染症治療もしくは予防用製剤の調製用キット。
【請求項７】
インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤を生体に投与するようにした、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法。
【請求項８】
インターロイキン２およびＣＤ３抗体の両方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤を生体に投与するようにした、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法。
【請求項９】
リンパ球が薬剤耐性原生生物感染症患者由来のものである請求項７又は請求項８に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療方法。
【請求項１０】
リンパ球をインターロイキン２又はＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させ、増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症用製剤とする治療用製剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球、とくに薬剤耐性原生生物感染症患者由来のリンパ球を、固相化させた抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２のうち少なくとも一方を含む培養液中で培養を行なうことにより、増殖させたリンパ球を主成分とし、これを薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防に用いるようにした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤、該製剤の調製用キットおよび調製方法、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法に関し、薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防効果の向上をはかることを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
生体は、免疫系により各種の癌や種々の感染症等から自らの身を守っている。  ここにいう免疫系には、液性免疫と細胞性免疫が一般的に知られている。  血清タンパク質の一種である補体やリゾチーム、抗体等は液性免疫を担い、またマクロファージやＮＫ細胞、Ｔ細胞等の細胞は、細胞性免疫を担っている。  癌に対する免疫反応としては、ＮＫ細胞やＴ細胞を主体とする細胞性免疫が一般的に重要であると考えられている。
【０００３】
癌治療の分野においては、癌患者由来のリンパ球、特にＴ細胞、ＮＫ細胞をインターロイキン２で刺激したものが抗腫瘍活性を有することは、ローゼンバーグらにより最初に報告されている〔Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９，１６７８（１９８８）〕。  また癌患者由来のリンパ球を抗ＣＤ３固相化抗体及びインターロイキン２で刺激増殖させたリンパ球の増殖刺激法についても、本発明者らによりすでに報告されている（特開平３−８００７６号公報参照）。
【０００４】
さらにウイルス感染症患者自身のリンパ球を抗ＣＤ３固相化抗体及びインターロイキン２で刺激増殖させたリンパ球の増殖刺激法および治療法についても、本発明者らによりすでに報告済みである（国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ９７／０２４３８参照）。また原生生物感染症患者末梢血リンパ球を培養して該患者に投与することは中田らにより「多剤耐性結核患者に対する活性化T細胞輸注療法の試み」としてすでに発表されている（第７９回日本結核病学会総会講演集「結核」７９巻  ｐ１０５，２００４年）。
【特許文献１】特開平３−８００７６号公報
【特許文献２】国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ９７／０２４３８
【非特許文献１】Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９，１６７８（１９８８）
【非特許文献２】第79回日本結核病学会総会講演集（結核 79巻 p105、2004年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら上記した特許文献１に開示されたものは、ＣＤ３抗体およびインターロイキン２により刺激・増殖させたリンパ球による癌の治療に関するものであり、感染症についての効果を明らかにするものではない。  また特許文献２に開示されたものは、ＣＤ３抗体およびインターロイキン２により刺激・増殖させたリンパ球によるウイルス感染症の治療に関するものであるが、原生生物感染症についての効果を明らかにするものではない。
【０００６】
原生生物は外来性のウイルスと異なり、細胞を持つ生物であり、生体内に入ると、生体細胞に取り付き、栄養を吸い取り、代わりに毒を出して細胞を殺す。  栄養を吸い取った原生生物は、そのもの自体が分裂する。  つまり、ウイルスは、遺伝子である核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を蛋白質の外被で包まれた単純な構造からなるが、原生生物は遺伝子（ＤＮＡ）を有する核、蛋白合成の場であるリボソームを持ち、さらにそれらを包む細胞膜を持つ。
【０００７】
このように、原生生物はウイルスと構造上の違いがあるため、癌やウイルスに対するのと同様の治療法が、必ずしも原生生物に対して効果があるとは限らない。また活性化リンパ球を結核患者に投与しても効果が不明確であり、より効果判定を明確にする方法が必要である。
【０００８】
さらに非特許文献２に開示された中田らの報告によれば、結核患者3名に活性化リンパ球を投与しているが、1例目では培養リンパ球投与で一旦は結核菌が陰性となったが再び陽性となった、とあり、2例目では輸注開始後2ヶ月で陰性となり7ヶ月を経過しても排菌が認められない、とされ、さらに3例目では輸注後も全く変化が無く、効果が認められなかったとの記載がある。
【０００９】
かかる記載を見るかぎり、活性化リンパ球投与による結核の治療効果は不明確であるものと認識せざるを得ない。したがってかかる分野において結核の治療効果の実効性を高めて効果を明確にすることが当面の大きな課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明にあっては、薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤、該製剤の調製用キットおよび調製方法、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法に関し、薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防効果のより一層の向上、ならびに各種手術や移植後の真菌、細菌感染の十分な予防を可能にするのみならず、リンパ球増殖の著しい効率化をはかることを目的とするものであって、具体的には請求項１の発明は、インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤に関する。
【００１１】
また請求項２の発明は、インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の両方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは治療用製剤に関する。  さらに請求項３の発明は、リンパ球が薬剤耐性原生生物感染症患者由来のものである請求項１又は請求項２に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは治療用製剤に関する。  さらに請求項４の発明は、薬剤耐性原生生物感染症が、細菌または真菌感染症であるところの請求項１又は請求項２に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤に関する。
【００１２】
さらに請求項５の発明は、細菌または真菌感染症が結核感染症であるところの請求項４に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤に関する。  さらに請求項６インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方を内部に含んだリンパ球培養用容器と、該容器内に充填するための培養用培地とからなる薬剤耐性原生生物感染症治療もしくは予防用製剤の調製用キットに関する。
【００１３】
さらに請求項７の発明は、インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤を生体に投与するようにした、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法に関する。  さらに請求項８の発明は、インターロイキン２およびＣＤ３抗体の両方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤を生体に投与するようにした、薬剤耐性原生生物感染症の治療方法に関する。
【００１４】
さらに請求項９の発明は、リンパ球が薬剤耐性原生生物感染症患者由来のものである請求項７又は請求項８に記載の薬剤耐性原生生物感染症の治療方法に関する。  さらに請求項１０の発明は、リンパ球をインターロイキン２又はＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させ、増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症用製剤とする治療用製剤の調製方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方により増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤であるために、薬剤耐性原生生物感染症、とりわけて結核菌に作用する医薬、且つ特に多剤耐性結核菌に対して優れた抗菌活性を有するものであり、これらの治療もしくは予防に対して著効を発揮できるだけでなく、各種手術や移植後の予防用としても使用することが可能である。  またこの場合に、インターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の両方を用いると、リンパ球の増殖・活性化の効率がより一層向上する。
【００１６】
また移植の際のように他人のリンパ球を使用することが可能であるのみならず、特に使用リンパ球が薬剤耐性原生生物感染症患者由来のものである場合においてはさらに良好な治療効果が認められる。  さらにインターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方を内部に固相化してなるリンパ球培養用容器と、該容器内に充填するための培養用培地とからなる薬剤耐性原生生物感染症治療もしくは予防用製剤の調製用キットとした場合、採取したリンパ球を直ちに増殖・活性化して、該リンパ球を主成分とした薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防のための活動を速やかに実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
既述した通り本発明は、リンパ球、とりわけて薬剤耐性原生生物感染症患者のリンパ球を採取し、これを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２の少なくとも一方を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤とし、これを薬剤耐性原生生物感染症治療の治療、もしくは予防に用い、またそれらの調製方法および調製用キットとしたものであることを特徴とする。
【００１８】
生体の細胞は、細胞の表面に発現している表面マーカーにより分類されている。  成熟したＴ細胞には、表面マーカーとしてＣＤ３が発現している。  成熟したＴ細胞は、ＣＤ３を表面マーカーとして発現するだけでなく、抗腫瘍活性や抗ウイルス活性を有するキラーＴ細胞はＣＤ８を、各種の免疫系細胞の活性化に密接に関係しているヘルパーＴ細胞はＣＤ４を発現している。
【００１９】
また、成熟したＴ細胞には、Ｔ細胞レセプターが発現しており、本レセプターは、特定の抗原に対する親和性が高い。  Ｔ細胞は、単一のＴ細胞レセプターのみを発現し、本レセプターを介して抗原特異的なＴ細胞の活性化が行なわれている。  さらに、Ｔ細胞レセプターは、非常に多様性に富んでおり、生体内には異なる多種類のＴ細胞が存在している。
【００２０】
一方、感染症を引き起こす原因物質としては、ウイルス、原生生物等がある。  例えば、ウイルスの感染防御としては、初期においては、ウイルスを非特異的に不活化する補体やリゾチーム及びウイルスを貪食するマクロファージが重要である。  ウイルス感染数日後からウイルス特異的な抗体の急速な上昇が始まり、本抗体が感染防御に重要な役割を担い始める。
【００２１】
ウイルス特異的な抗体としては、ウイルス自体を不活化する中和抗体や、そのもの自体にはウイルスを不活化する能力を持たないがＴ細胞等との連携によりウイルス感染細胞を特異的に排除するＡＤＣＣ活性を担う特異抗体がある。  そのため、ウイルス感染防御反応では、液性免疫と細胞性免疫の両者が重要な役割を担っている。  このように、免疫系を介する生体防御反応であっても、癌に対する生体防御反応と感染症に対する生体防御反応とでは大きく異なる。
【００２２】
つまり、癌は、もともと「身内の細胞」であり、ホスト由来の細胞が変異して生じたものであって、二分裂に有する時間は、早いものでも２０時間前後であるのに対し、ウイルスは、もともと外来性のものであり、ホストの細胞に寄生して増殖を行う性質をもつ。その結果、この場合一つの感染細胞から何千、何万というウイルス粒子が一挙に産生されるために、その増殖速度は爆発的であるのが特徴である。
【００２３】
また、ウイルスによっては、感染細胞中に潜んだ状態で生体内に存在する潜伏感染をするものもある。  潜伏感染するウイルスとしては、各種ヘルペスウイルス属ウイルスやレトロウイルスが知られている。  これらのウイルスは、ホストの免疫能が低下した場合に病原性を示す場合がある。
【００２４】
一方、原生生物はウイルスと異なり、細胞を持つ生物であり、人間の体の中に入ると、人間の細胞に取り付き、栄養を吸い取り、代わりに毒を出して細胞を殺す。  栄養を吸い取った原生生物は、そのもの自体が分裂する。  つまり、ウイルスは、遺伝子である核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を蛋白質の外被で包まれた単純な構造からなるが、原生生物は遺伝子（ＤＮＡ）を有する核、蛋白合成の場であるリボソームを持ち、さらにそれらを包む細胞膜を持つのが特徴である。
【００２５】
原生生物は、高等微生物と下等微生物に分類され、高等微生物には真菌類が、下等微生物には細菌類がある。  このように、癌と感染症、さらに感染症でもウイルスと原生生物とでは、その生体防御機構、増殖速度、増殖メカニズム、由来がまったく異なる。  そのため癌治療で有効な治療方法が、必ずしも感染症の予防や治療に有効であるとは限らない。  実際、臨床上で使用される抗癌剤、抗ウイルス剤、原生生物に対する抗真菌、細菌剤とでは多くの場合異なっている。
【００２６】
またとくに原生生物はウイルスと構造上の違いがあるため、原生生物に起因する疾患に対応するには前記した癌やウイルスに対するのとは異なった独自の治療剤、治療法を用いて治療もしくは予防をおこなう必要がある。
【００２７】
ところで原生生物が引き起こす感染症としては、結核、ジフテリア、ペスト（黒死病）、炭疽病、らい病（ハンセン病）、髄膜炎、破傷風、連鎖球菌感染症、肺炎、百日咳、クリプトコッカス症、カンジダ症、ヒストプラズマ症、コクシジオイデス症、アスペルギルス症などが挙げられる。  また薬剤耐性感染症としては、結核感染症以外にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant
Staphylococcus aureus ：MRSAと略す）感染症、ペニシリン耐性肺炎球菌感染症、多剤耐性緑膿菌感染症等が挙げられる。
【００２８】
さらに原生生物に分類される細菌のひとつである結核は結核菌の感染によって起こるものである。  結核菌は長さ１〜４ミクロン、幅０．３〜０．６ミクロン（１ミクロンは１０００分の１ミリ）の棒状の形をした細菌で、酸やアルカリに対する抵抗性が強い。  しかし、紫外線には弱いので殺菌灯が感染防止に用いられることもある。
【００２９】
結核の発症危険因子を持つ人は  １）ツベルクリン反応陰性の若年者  ２）アルコール常習者  ３）癌患者や大手術を受けた患者  ４）免疫不全状態患者（エイズ、ステロイド投与、化学療法患者、糖尿病）  ５）不規則な食生活をしている人  ６）慢性呼吸器疾患患者（塵肺・肺気腫・慢性気管支炎）  ７）高齢者などである。  結核菌が生体内に進入すると、病状は比較的ゆっくりと進むが、さらに進行すると肺に浸潤し、空洞を形成する。  空洞の中で結核菌は繁殖し、咳や痰の中にまじって菌が空気中に吐き出され、他人に感染させることになる。
【００３０】
抵抗力のない乳幼児や高齢者が多量の結核菌を吸い込むと、短期間に重症化する。  結核の感染様式には、飛沫感染と塵埃感染の２種類がある。  主な感染様式は、飛沫感染である。  排菌患者の咳やくしゃみによる飛沫中の結核菌を吸い込むことにより感染することから、結核は、結核患者のそばにいる人にうつりやすい。  塵埃感染は空気中のゴミに結核菌が混っている場合に感染する感染であるが、頻度は非常に少ない。
【００３１】
感染経路については経気道感染が大部分を占め、感染後あらゆる臓器，組織に結核症を起こす。  侵入感染部位により、各種疾患、例えば、肺結核，結核性髄膜炎，結核性胸膜，結核性腹膜炎，結核性心外膜炎，粟粒結核，腎結核，副腎結核，骨（背椎骨に感染する場合を脊椎カリエス）・関節結核，腸結核，皮膚結核，喉頭結核，リンパ節結核などを発症するが、中でも肺結核の患者層が圧倒的に多く、免疫機能の低下している若年者や高齢者では結核の発病頻度がさらに高くなる。  特に中高年者では、糖尿病、エイズ患者、白血病患者、術後患者、副腎皮質ステロイド剤投与患者、抗癌剤投与患者、腎透析患者などが結核に比較的感染しやすい。
【００３２】
結核菌に感染し発病すると、初期は風邪に似たせき、たん、微熱、寝汗、だるさなどの症状がみられるが、病状が進行すると血痰、さらに進行すると、喀血する。  ＷＨＯの調査によれば、主に開発途上国を中心に世界人口の約３分の１が結核菌に感染しており、毎年約８００万人が発病し、３００万人が死亡していると言われている。  日本等の先進国においては結核の発病率は減少の一途をたどっていたが、近年、高齢者又はＨＩＶ等の感染者の増加及び多剤耐性菌による発病率が上昇していることから、その対策が緊急の課題となっている。
【００３３】
結核の治療には一般的には抗結核薬が用いられる。  現在市販されている抗結核剤としてはリファンピシン（rifampicin）、イソニアジド（isoniazid）、ストレプトマイシン（streptomycin）やエタンブトール（ethambutol）等が挙げられる。  また現在市販されているマクロライド系抗菌剤において、例えば、クラリスロマイシン（clarithromycin）やアジスロマイシン（azithromycin）は、各種細菌による感染症への適応を有し、非定型抗酸菌症のＭＡＣ感染症の治療剤としての適応も受けている。
【００３４】
これら薬剤による化学療法は、原因菌である結核菌の増殖速度が非常に遅いことから治療期間は通常６ヶ月以上の長期間を要する。  また単剤治療では耐性菌が出現するため、ＷＨＯの方針に従い、１９８０年後半以後、多くの国で短期化学療法（複数薬剤併用治療）が導入された。  その結果、比較的高い治癒率が得られるようになり、治療期間もやや短縮される傾向になってきている。
【００３５】
しかし、前記した抗菌剤の治療対象として結核は認められておらず、結核菌に対しては有効な抗菌作用を有さないか、あるいは極めて弱い作用しか有していないことも公表されている［ザ・ジャーナル・オブ・アンチミクロバイアル・ケモセラピー（The Journal of Antimicrobial Chemotherapy）、４０（６）、８８５頁（１９９７）など］。  また、その他のマクロライド系化合物においても、結核菌に対しては選択性を有さないことが知られている［アンチミクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、４４（１０），２８４８頁（２０００）など］。
【００３６】
一方において、自然耐性菌や患者の自己判断による服薬の中断による多剤耐性結核患者が増加してきていおり、近年、多剤耐性結核菌による院内集団感染が相次いで報告され、多剤耐性結核の治療も大きな問題となってきているものの、これまで有用な抗多剤耐性結核剤および治療法は全く存在しない。
【００３７】
そこで本発明は、結核菌に作用する医薬、特に多剤耐性結核菌など原生生物感染症の対症療法として優れた抗菌活性を有する製剤および治療法もしくは予防法を提供するものであり、それらの対症療法としてリンパ球、とりわけて薬剤耐性原生生物感染症患者のリンパ球を採取し、これを固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン２の少なくとも一方を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖・活性化させたリンパ球を主成分とした製剤とし、これを薬剤耐性原生生物感染症治療の治療、もしくは予防に用い、またそれらの調製方法および調製用キットとしたものである。
【００３８】
〔リンパ球の採取〕
薬剤耐性原生生物感染症患者からのリンパ球の採取は、末梢血あるいは、リンパ節、胸腺などから採取することができる。  患者由来のリンパ球であれば、いずれの組織あるいは臓器由来のものであっても良い。  特に、静脈からの末梢血の採取は、患者の負担、簡便性の点で優る。  末梢血は、凝集を防ぐ目的でヘパリン加採血あるいはクエン酸加採血などで行えるが、本方法に限定されない。  末梢血からのリンパ球の分離は、本実施例においては、密度遠心分離によりおこなっている。  密度遠心分離としては、フィコールハイパック、モノポリレゾルーション等が使用できる。  しかしながら、本方法に限定されるものではない。
【００３９】
また、一回に採血する血液量としては、０．１〜５００ｍｌ、より好ましくは、１〜１００ｍｌで行なうことができる。  さらに好ましくは１０〜５０ｍｌで行なうこともできる。  本方法は、大量の血液あるいは小量の血液を材料として実施できるが、特に小量の血液の場合、患者の負担を最小限におさえることができる。  そのため、一回の採血量は、５０ｍｌ程度が好ましい。  一回の採血により数回分の投与に使用できる細胞が調製できるが、投与回数あるいは投与間隔に応じて適宜採血を行い、細胞を調製することができる。
【００４０】
〔リンパ球の増殖・活性化〕
リンパ球を刺激して増殖・活性化させるための刺激剤としては抗ＣＤ３抗体が用いられる。  抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を認識する抗体であれば、どのようなものでも使用できるが、例えばＯＫＴ３抗体（オーソファーマスーティカル社製）なども使用可能である。  さらに抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としては各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。
【００４１】
抗体の固相化方法は、非特異的吸着や化学結合による方法で行えるが、抗ＣＤ３抗体によりリンパ球が刺激できる固相化方法であればいずれの方法でも良い。  また、同じくリンパ球を刺激して増殖・活性化させるための刺激剤としてインターロイキン２が用いられる。  インターロイキン２は、リンパ球、特にＴ細胞を活性化できるものならば、どのようなものでも使用可能である。
【００４２】
なお本発明は、上記したように採取したリンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体又はインターロイキン２の少なくとも一方を含む培養液中で培養を行なうことにより増殖させているが、必要によりこれに各種サイトカイン、増殖因子等を添加したり、特定の抗原で刺激することによりリンパ球を拡大増殖培養することもできる。
【００４３】
インビトロでの細胞の培養には、培地として、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、各種無血清培地が使用できる。  また必要により本培地に、血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、抗生物質を添加してリンパ球の培養をすることができる。  この場合インターロイキン２のほかに、既述した抗ＣＤ３抗体を固相化したものを併用することにより、インターロイキン２又は抗ＣＤ３抗体の単独使用の場合に比べ、リンパ球の増殖・活性化効率をより一層向上させることができる。
【００４４】
上記したように、薬剤耐性原生生物感染症患者からリンパ球を採取し、これを固相化した抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２を含む培養液中で培養を行なうと、培養直後から増殖を開始し、以後約２週間経過後には、リンパ球の数はおよそ１，０００倍〜１０，０００倍になる。
【００４５】
上記により調整されたリンパ球は、薬剤耐性原生生物感染症、特に結核菌による多剤耐性結核感染症に有効である。  しかしながら上記した原生生物のみに限定されない。  また薬剤耐性感染症としては、例えば、結核感染症以外にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant
Staphylococcus aureus ：MRSAと略す）感染症、ペニシリン耐性肺炎球菌感染症、多剤耐性緑膿菌感染症等が挙げられる。  しかし上記に列挙した薬剤耐性感染症のみに限定されない。
【００４６】
そのため、上記した薬剤耐性原生生物感染症患者から採取したリンパ球を抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２を含む培養液中で培養し、増殖・活性化した製剤は薬剤耐性原生生物感染症の治療もしくは予防用製剤として、あるいはインターロイキン２および抗ＣＤ３抗体の少なくとも一方を内部に固相化してなるリンパ球培養用容器と、該容器内に充填するための培養用培地とをもって、薬剤耐性原生生物感染症治療もしくは予防用製剤の調製用キットおよびその調製方法として、さらには薬剤耐性原生生物感染症の治療方法として使用が可能である。
【００４７】
また、本発明による治療および予防用製剤および治療法は、患者が免疫不全や免疫低下状態にある場合は特に有効である。  免疫不全としては、先天性あるいは後天性のものがあげられる。  先天性としては、ウイスコット・アルドリッチ症候群等が、後天性としては、ＡＩＤＳ等があげられる。
【００４８】
また、免疫低下状態としては、臓器や骨髄移植のための免疫抑制剤投与時、あるいは、担癌時、火傷、手術後、薬の免疫細胞系などへの副作用時などが挙げられる。  なお免疫不全や免疫低下状態に陥る原因としては、上記に列挙したものに限定されない。  本発明は、原因がどのようなものであっても、薬剤耐性原生生物感染症患者が医学的に免疫不全あるいは免疫低下状態にあると考えられる場合に、特に有効である。
【実施例１】
【００４９】
〔単核球の分離〕
結核患者4名および健常者1名の静脈よりヘパリン加末梢血として各30mL採取し、等量のRPMI1640培地で２倍希釈し、10mlのリンホセパールI（免疫生物研究所製）を分注した50mL遠心管に重層し、400xg、20分間遠心した。中間層に集まった単核球画分をピペットで新しい50mL遠心管に回収し、RPMI1640培地で３倍希釈した。再び400xg、10分間遠心し、上清を捨ててペレットを回収した。ペレットをRPMI1640培地に浮遊させる。一部を無菌的にサンプリングして、細胞数を計測する。再び230xg、10分間遠心し、上清を捨ててペレットを回収する。に5%ヒト血清を含むPRMI1640培地を加えて、1x106細胞/mLに細胞数を調整し、単核球画分とする。
【００５０】
〔単球の分離〕
分離した単核球浮遊液10mlを100mmの組織培養用シャーレ（Falcon社製 353003）に分注し、37℃のCO2インキュベーター内に2時間静置する。液をピペットで吸い取り除去する。37℃に加温した5%ヒト血清加RPMI1640培地10mLをシャーレの中心部分から静かに加える。加えた培養液を液を静かに揺らし、非付着性の細胞をシャーレの底から浮かび上がらせる。ピペットで液を吸い取り、非付着性の細胞を除去する。この操作を3回繰り返し、非付着性の細胞を除去する。
【００５１】
シャーレに10mLの0.02%EDTAを含むPBS(-)を加え、37℃で5分間インキュベートする。付着細胞がシャーレの底から遊離したのを顕微鏡で確認し、ピペットで液を吸い取り、5%ヒト血清を含むRPNMI1640培地20mLの入った50mL遠心管に移す。これを230xg、10分間遠心し、上清を捨てて、ペレットを回収する。さらにこれを5%ヒト血清加RPMI1640培地に浮遊させ、1x105細胞/mLに細胞数を調整し、単球画分とする。
【００５２】
〔OKT3固相化フラスコの作製〕
5μg/mL濃度のOKT３抗体を含むPBS(-)溶液10mLを底面積75cm2の培養フラスコ（住友ベークライト社製 MS-2180R）に加え、底面が溶液で覆われる状態で室温2時間放置し、OKT3固相化フラスコを調製した。OKT3固相化フラスコをPBS(-)で2回洗浄した。
【００５３】
〔活性化リンパ球の培養〕
上記の「単核球の分離」で分離した単核球画分をインターロイキン２を700U/mLを含む5%ヒト血清加RPMI1640培地20mLに浮遊させ、OKT3固相化フラスコにて、37℃で3日間培養した。 細胞の増殖に応じてインターロイキン２を700U/mL含む5%ヒト血清加RPMI1640培地を20〜30mL加え、計50mLとした。 4日後さらにインターロイキン２を700U/mL含む5%ヒト血清加RPMI1640培地を150mL加え、底面積225cm2の培養フラスコ（住友ベークライト社製 MS-2125R）に移し3〜7日間培養を継続して活性化リンパ球を調製した。
【００５４】
〔活性化リンパ球のin vitro BCG菌殺菌能の測定〕
２４ウェルのマイクロタイタープレート（Falcon社製 353047）に上記の「単球の分離」で調製した単球画分を1mLずつ分注（1x105細胞/ウェル）するとともに、これを37℃のCO2インキュベータ内で7日間培養する。
【００５５】
BCG菌を1x105/ウェル加え感染させる。37℃、2時間インキュベートした後、活性化リンパ球を1x105細胞/ウェル加え、37℃、4日間CO2インキュベータ内で培養する。培養後２４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルをパスツールでピペティングして、付着した細胞を浮遊させるとともに該液を15mLの遠心管に移し、1500xg（3000rpm）、10分間遠心し、細胞を回収する。
【００５６】
細胞回収後、液を捨ててペレットを回収する。0.1mLの生理食塩水に浮遊させ、該液を7H10寒天培地に塗布し、2〜3週間培養し、生育したコロニーを計測して結核菌数を算定する。この場合、単球画分単独の場合におけるコロニー数は4,700~14,500であり、自己リンパ球添加群は4,100〜60,000であった。これに対し活性化リンパ球添加群では130〜450コロニーであり優位にコロニー数が減少した（図１参照）。
【００５７】
このことより活性化リンパ球投与が薬剤耐性原生生物感染症、とりわけて多剤耐性結核感染症にきわめて有効であることが明かとなった。  以上に本発明の実施例を示したが、本発明は上記実施例に例示したもののみに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】in vivo での活性化リンパ球のＢＣＧ菌に対する殺菌能をあらわしたグラフ。
【図１】
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