(57)【要約】    【課題】  本発明は、サンプル中の微量な有機態窒素または有機態窒素様抗原を、簡便、迅速かつ高感度に検出・定量することを課題とする。本発明はまた、サンプル中の微量な有機態窒素または有機態窒素様抗原と植物体の栽培方法の関連を明らかにし、その関連性に基づいて、植物体の栽培方法を評価する方法または農作物を評価する方法を開発することもまた、課題とする。    【解決手段】  発明者らはこの問題について鋭意研究した結果、有機態窒素に対する抗体を作製することにより、上記の課題を解決することができることを明らかにした。さらに植物体由来のサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、植物体の栽培方法を評価し、また農作物を評価することができることを明らかにし、上記の課題を解決した。発明者らはさらに、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出するキットもまた、提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出する方法。
【請求項２】
以下の工程：
抗有機態窒素抗体をサンプルと接触させ；そして
サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原と結合した抗有機態窒素抗体を検出する；
ことを含む、請求項1に記載のサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出する方法。
【請求項３】
サンプルが、植物体由来のサンプル、土壌由来のサンプル、または有機肥料由来のサンプル、である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
検出を、ELISA法、ウェスタンブロット法、イムノクロマト法、またはプロテインチップ法を用いて行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を定量する方法。
【請求項６】
以下の工程：
抗有機態窒素抗体をサンプルと接触させ；そして
サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原と結合した抗有機態窒素抗体を定量する；
ことを含む、請求項5に記載のサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を定量する方法。
【請求項７】
サンプルが、植物体由来のサンプル、土壌由来のサンプル、または有機肥料由来のサンプル、である、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
定量を、ELISA法、ウェスタンブロット法、イムノクロマト法、またはプロテインチップ法を用いて行う、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
抗有機態窒素抗体を植物体由来のサンプルと接触させ；そして
サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原と結合した抗有機態窒素抗体を検出または定量する；
ことを含む、植物体の栽培方法を評価する方法。
【請求項１０】
植物体由来のサンプルが、根の抽出液、茎の抽出液、葉の抽出液、花弁の抽出液、植物体の導管液、である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
抗有機態窒素抗体によって農作物中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出または定量することによる、農作物の評価方法。
【請求項１２】
抗有機態窒素抗体、指示書を含む、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するためのキット。
【請求項１３】
有機態窒素または有機態窒素様抗原に対する、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
受託番号がFERM P-20599であるハイブリドーマにより産生される、請求項13に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機態窒素に対する抗体を利用した、サンプル中の有機態窒素または抗有機態窒素抗体と反応する有機質（有機態窒素様抗原）の新たな検出法に関する。本発明はまた、有機態窒素に対する抗体を利用した、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原の新たな定量法に関する。本発明においてはさらに、このような検出法または定量法を使用し、植物体の栽培方法を評価する方法または農作物を評価する方法にもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の生育を支える栄養の摂取については、Liebigの無機栄養説が学会の定説である。この説によれば、土壌に施肥された有機質は土壌中の微生物によって分解され、窒素はアンモニア体ないし硝酸態として根から取り込まれるとされている。この説に基づいて、化学肥料の施肥による農作物の大幅な増産や水耕栽培による農作物の生産が可能となった。
【０００３】
しかし一方では、Liebigの無機栄養説では説明できない現象も報告されている。松本ら（1999年）は、土壌中に有機質を施肥した場合、農作物の収量と窒素吸収量が無機態窒素の量に依存する作物と依存しない作物があることを示した（非特許文献1）。そのような施肥がどのようにして農作物の成育に対して機能しているかという作用機序については、土壌中の有機態窒素が植物体内に取り込まれることによるとの説が提唱されている。ここでいう有機態窒素とは、土壌からリン酸緩衝液で抽出される可給態窒素と同様のもので（非特許文献2、非特許文献3）、PEON（phosphate-buffer extractable organic nitrogen）とも呼ばれているものであり、糖とアミノ酸を含む分子量約6,000〜8,000 Daの有機物である。この物質は、土壌の種類にかかわらず普遍的に土壌中で生成される物質であるといわれている（非特許文献4）。
【０００４】
当該技術分野において、可給態窒素とみなされるこの有機態窒素の測定方法のひとつは、4週間以上の時間をかけ、最終的に全窒素分析と無機態窒素分析を別途に行い、その差を求めることにより測定する「培養法」がある。また有機態窒素がリン酸緩衝液（pH 7.0）に可溶性であるという特徴を利用し、窒素分析を化学的に行うことにより測定する、「培養法」の改良方法である「化学抽出法」も存在していた。しかしこれらの方法は、窒素分析を二度実施するなど、非常に煩雑であった。また有機態窒素の分析には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のピーク面積から定量する方法もあるが、いずれも迅速で高精度な検出・定量法ではない。
【非特許文献１】Matsumoto Shigeo, Ae Noriharu and Yamagata Makoto (1999): Nitrogen uptake response of vegetable crops to organic materials. Soil Science and Plant Nutrition, 45:269-278.
【非特許文献２】樋口太重（1981）緩衝液による有機化窒素および土壌有機態窒素の抽出特性、日本土壌肥料学雑誌、52:481-489．
【非特許文献３】樋口太重（1982）緩衝液で抽出される有機態窒素化合物について、日本土壌肥料学雑誌、53:1-5.
【非特許文献４】Matsumoto Shingo, Ae Noriharu and Yamagata Makoto (2000): Extraction of mineralizable organic nitrogen from soils by a neutral phosphate buffer solution. Soil Biology and Biochemistry, 32:1293-1299.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、サンプル中の微量な有機態窒素または有機態窒素様抗原を、簡便、迅速かつ高感度に検出・定量することを課題とする。本発明はまた、サンプル中の微量な有機態窒素または有機態窒素様抗原と植物体の栽培方法の関連を明らかにし、その関連性に基づいて、植物体の栽培方法を評価する方法または農作物を評価する方法を開発することもまた、課題とする。また植物体に吸収された有機態窒素または有機態窒素様抗原の代謝過程の解明にも利用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らはこれらの問題について鋭意研究した結果、有機態窒素に対する抗体を作製することにより、上記の課題を解決することができることを明らかにした。
すなわち、本発明の第一の態様において、抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量する方法を提供する。この方法は、抗体を利用して抗原を検出・定量するための当該技術分野において既知の方法を使用することができ、抗有機態窒素抗体をサンプルと接触させ；そしてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原と結合した抗有機態窒素抗体を検出・定量することにより、達成することができる。
【０００７】
発明者らはさらに、上述した方法を用いて有機態窒素に対する抗体を使用して植物体由来のサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、土壌栽培により育成した植物体から、水耕栽培により育成した植物体とは異なる有機態窒素または有機態窒素様抗原の検出・定量のパターンが得られることを明らかにし、上記の課題を解決することができることを明らかにした。より具体的には、上述した抗体を使用して、植物体の成分を解析したところ、水耕栽培により育成した植物体と土壌栽培により育成した植物体では、有機態窒素または有機態窒素様抗原の存在状態が全く異なることを見いだした。
【０００８】
この新規な知見に基づいて、本発明は、第二の態様において、抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することを含む、植物体の栽培方法または農作物を評価する方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、これらの方法を実施するために使用する、抗有機態窒素抗体もまた、提供する。
本発明はさらに、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するための、抗有機態窒素抗体を含むキットにも関する。例えば、抗有機態窒素抗体を結合させたイムノクロマト用フィルターを含むキット、抗有機態窒素抗体を含むサンドイッチ型ELISAキット、抗有機態窒素抗体を含む競合的反応型ELISAキット等の種々のキットを提供する。
【００１０】
本発明はまた、本発明の方法において使用することができる、有機態窒素または有機態窒素様抗原に対するモノクローナル抗体もまた、提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を簡便、迅速かつ高精度で検出・定量することができる。本発明により、植物体由来サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、植物体の栽培方法または農作物を評価することもできる。さらに、これらの方法を実施するために使用される抗有機態窒素抗体、並びに抗有機態窒素抗体を含む、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するためのキットもまた、提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において使用される「有機態窒素」とは、土壌からリン酸緩衝液で抽出される可給態窒素と同様のもので（非特許文献2、非特許文献3）、リン酸緩衝液抽出可能有機態窒素（PEON；phosphate-buffer extractable organic nitrogen）とも呼ばれているものであり、糖とアミノ酸を含む分子量約6,000〜8,000の有機物である。この物質は、土壌の種類にかかわらず普遍的に土壌中で生成される物質である（非特許文献4）。また、本発明において使用する「有機態窒素様抗原」という場合、「有機態窒素」に対して、様々な化学的修飾（例えば、糖の付加など）がなされているものを含め、抗有機態窒素抗体と反応する有機質をいう。このような「有機態窒素様抗原」は、天然に存在しているものおよび実験的に形成されるものの、いずれをも含む概念である。
【００１３】
本発明の発明者らは、本発明の態様を実現するため、まず有機態窒素または有機態窒素様抗原に対して結合する抗体を作製する。本発明において使用することができる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００１４】
抗体を作製するため、免疫原となる有機態窒素を、たとえば土壌から抽出する。抽出する方法は、たとえば、非特許文献2に記載の通りである。土壌から有機態窒素を抽出する場合、具体的には、土壌に、1／15Mのリン酸緩衝液を土壌：リン酸緩衝液＝1：4の割合で加えて抽出し、得られた抽出液を、ゲル濾過カラムを用いてクロマトグラフィーにかけ、分子量8,000以上の成分を除き、8,000 Da以下のものについては、3,000 Daの基準を持つ透析膜を用いて排除して、分子量が3,000〜8,000 Daの画分を調製することにより、有機態窒素を得る。
【００１５】
このようにして調製した有機態窒素を、常法に従って、免疫動物（たとえばポリクローナル抗体の場合にはヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットなど、また、モノクローナル抗体の場合にはマウス、ラットなど）に投与し、体内において抗体を産生させる。またファージ等を利用して抗体を作製する方法も利用することができる。
【００１６】
ポリクローナル抗体の場合には、免疫動物の血清、または血清から精製した免疫グロブリンを使用できる。本発明においては、ウサギおよびマウスを用いて、実際にポリクローナル抗体を作製し、そして使用することができた。
【００１７】
一方、モノクローナル抗体の場合には、有機態窒素で免疫したマウスやラットなどの脾臓由来のプラズマ細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作製し、そのなかから有機態窒素と反応する抗体を生産するクローンを選択して得ることができる。通常は、このようにして調製したハイブリドーマをマウス腹腔に注射し、腹水中に蓄積されたモノクローナル抗体を精製することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。またハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、その培養上清から精製することも可能である。本発明においては、マウスを用いてモノクローナルIgG抗体を産生するハイブリドーマ細胞3H9（FERM P-20599）を作製し、そしてこのモノクローナルIgG抗体を本発明の方法において使用することができた。
【００１８】
本発明において、有機態窒素または有機態窒素様抗原の検出・定量を行うサンプルは種類を問わない。例えば、サンプルとしては、植物体由来のサンプル、土壌由来のサンプル、培養液由来のサンプル、有機肥料由来のサンプルを使用することができるが、これらには限定されない。
【００１９】
例えば、植物体由来のサンプルとしては、根の抽出液、茎の抽出液、葉の抽出液、花弁の抽出液、植物体の導管液、などを使用することができる。これにより、ある植物体のある組織における有機態窒素または有機態窒素様抗原の分布を別の植物体の同一組織における有機態窒素または有機態窒素様抗原の分布と対比すること、ある植物体のある組織における有機態窒素または有機態窒素様抗原の分布を同一植物体の別組織における有機態窒素または有機態窒素様抗原の分布と対比することなどが可能になるが、これらの対比には限定されない。
【００２０】
また、土壌や有機肥料由来のサンプルや培養液由来のサンプルを直接調べることによって、その中に含まれる有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出したり、その濃度等を定量することもまた可能である。
【００２１】
サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するための方法としては、抗原-抗体反応を使用して抗原の検出・定量を行うための、当該技術分野において既知の方法であればいずれの方法であっても使用することができ、例えばウェスタンブロット法、イムノクロマト法、競合的反応型ELISA法やサンドイッチ型ELISA法などのELISA法、プロテインチップ法などを使用することができる。
【００２２】
本発明で使用する抗有機態窒素抗体を検出する方法としては、当該技術分野において既知である、抗体を検出する方法であればいずれの方法であっても使用することができる。例えば、抗有機態窒素抗体をペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ；HRP）などの検出可能な分子で標識しておき発色基剤を発色させることにより検出する方法、抗有機態窒素抗体をビオチン標識しておき、ビオチンをアビジンを使用した検出系により検出する方法、あるいは抗有機態窒素抗体を認識する標識二次抗体（例えば抗有機態窒素抗体がマウス由来のIgG抗体であれば抗マウスIgG抗体）を使用し、この二次抗体を上述したHRP系またはビオチン-アビジン系等を用いて検出する方法、等のいずれの方法であっても、本発明において使用することができる。
【００２３】
定量は、例えば競合的反応型ELISA法、ウェスタンブロット法を使用して行うことができる。競合的ELISA法により定量する場合、例えば精製有機態窒素を固定化した測定プレートに、調べたいサンプルと抗有機態窒素一次抗体を添加して、固相上に固定化された有機態窒素とサンプル中に含まれる有機態窒素または有機態窒素様抗原との間で、抗有機態窒素抗体に対して競合的に反応させることにより行う。測定プレートを洗浄したのちに、上述したいずれかの方法で標識した、抗有機態窒素抗体に対する二次抗体を反応させる。測定プレートを洗浄したのち、発色試薬を添加して、酵素反応によって発色した反応液の吸光度を測定し、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を算出する。抗有機態窒素抗体は固定化された精製有機態窒素またはサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原と競合的に反応するので、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原が多いほど固定化された精製有機態窒素と反応してプレート内に残る抗有機態窒素抗体の量は減少し、同時に標識した抗有機態窒素抗体に対する二次抗体も減少する。つまり、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原濃度が高いほど、発色が少ないことになる。
【００２４】
また、ウェスタンブロット法を用いて定量する場合、常法にしたがってウェスタンブロットを行ったメンブレンを、イメージアナライザーなどで解析することにより、定量することができる。
【００２５】
発明者らはさらに、上述した方法を用いて有機態窒素に対する抗体を使用して植物体由来のサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、土壌栽培により育成した植物体から、水耕栽培により育成した植物体とは異なる有機態窒素または有機態窒素様抗原の検出・定量のパターンが得られることを示し、上記の課題を解決することができることを明らかにした。より具体的には、上述したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して、植物体の成分を解析したところ、水耕栽培により育成した植物体と土壌栽培により育成した植物体では有機態窒素または有機態窒素様抗原の存在状態が全く異なることを見いだした。
【００２６】
この新規な知見に基づいて、本発明は、第二の態様として、抗有機態窒素抗体を用いて植物体由来サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することを含む、植物体の栽培方法または農作物を評価する方法を提供する。すなわち、本発明は、植物体サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、土壌中の有機物がどのように活用されたかという、植物体の栽培方法を評価することができる。より具体的には、植物体サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、植物体が水耕栽培により育成されたのかそれとも土壌栽培により育成されたのかを評価することができる。
【００２７】
本発明においてはさらに、農作物の中に含まれる有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、農作物を含有有機態窒素または有機態窒素様抗原に基づいて評価・判別することもできる。
【００２８】
本発明はさらに、サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するための、抗有機態窒素抗体を含むキットにも関する。例えば、抗有機態窒素抗体を結合させたイムノクロマト用フィルターを含むキット、抗有機態窒素抗体を含むサンドイッチ型ELISAキット、抗有機態窒素抗体を含む競合的反応型ELISAキット等を提供することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
実施例1：有機態窒素に対するポリクローナル抗体の作製
本実施例においては、まず、有機態窒素に結合するポリクローナル抗体を作製した。
【００３０】
抗体を作製するための免疫原として、非特許文献2の方法にしたがって、有機態窒素を精製した。すなわち土壌に1／15Mのリン酸緩衝液を、土壌：リン酸緩衝液＝1：4の割合で加えて抽出した。抽出液を、セファデックスG-50を用いてクロマトグラフィーにかけ、分子量8,000以上の成分を除き、8,000 Da以下のものについては、3,000 Daの基準を持つ透析膜を用いて排除して、分子量が3,000〜8,000 Daの画分を調製した。このようにして得られた画分を、凍結乾燥し、得られた乾燥粉末をリン酸緩衝液（PBS pH7.4）に再溶解し、これを免疫原として使用した。
【００３１】
有機態窒素に対するポリクローナル抗体を得るため、上述したように調製した0.5 mg／2 mlの精製有機態窒素をウサギの皮内にFreundの完全アジュバントとともに注射し、14日間経過した後、再び0.5 mg／2 mlの精製有機態窒素をFreundの不完全アジュバントとともにウサギの皮内に注射してブーストした。5回目の免疫を行った7日後に、ウサギの耳静脈から採取した血液から血清を調製し、さらにプロテインGセファロースカラムで精製してIgG抗体を採取した。対照IgGは、同様の方法で非免疫ウサギの血清から採取した。
【００３２】
実施例2：ポリクローナル抗体を使用した精製有機態窒素のウェスタンブロット
本実施例では、実施例1により調製されたポリクローナル抗体を使用して、実施例1で調製した精製有機態窒素を検出することができるかどうかを確認するため、常法によりウェスタンブロットを行った。
【００３３】
ウェスタンブロットの一次抗体としては、実施例1において作製した、ウサギの抗血清から精製したIgG抗体を使用し、二次抗体には市販のペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（免疫動物種：ヤギ、Cell Signaling社）を使用した。それぞれ抗体の希釈や洗浄操作には0.1％Tween 20含有Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いた。反応の強さはECLキット（アマシャム・ファルマシア社）で評価した。
【００３４】
図1はウェスタンブロットの結果を示す。精製有機態窒素は糖成分の割合が大きいため、タンパク質の分子量マーカーは正確な分子量を示さないが、高移動度域のバンドと低移動度域に強い反応がみられた。興味深いことに、低移動度域にみられるバンドはラダー状になった細いバンドからなっており、保存・実験操作中に多量体が形成される可能性が示唆された。対照抗体である非免疫ウサギの血清から精製したIgGでは、精製有機態窒素との反応はみられず、反応が特異的であることが示された。
【００３５】
実施例3：ポリクローナル抗体を使用した有機態窒素のELISA解析
本実施例では、実施例1により調製されたポリクローナル抗体を使用して、実施例1で調製した精製有機態窒素を検出することができるかどうかを確認するため、常法によりELISA法および競合的ELISA法を行った。
【００３６】
ELISA法は、当該技術分野において既知の方法を使用して行った。具体的には、まず、精製有機態窒素の1 mg/ml PBS溶液を、最終濃度が0.0001、0.001、0.01、0.1 mg/mlになるように、0.05 M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.5）で希釈して作製した精製有機態窒素の溶液を、それぞれ0.1 ml/ウェルずつ、96ウェルELISAプレートに注ぎ、室温で一晩置いて吸着させた。
【００３７】
次いで、ウェル内の溶液を捨てた後、ブロッキング試薬N-102（日本油脂製）を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置した。さらに、ウェル内の溶液を捨て、実施例1において作製した0.02 mg/mlの抗有機態窒素一次抗体または陰性対照の抗体を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置し、反応を行った。
【００３８】
反応後、0.1％Tween 20含有TBS（0.2 ml/ウェル）を用いて、ウェルを3回洗浄したのち、ペルオキシダーゼ標識した抗ウサギIgG抗体（免疫動物種：ヤギ、Cell Signaling社、3000倍に希釈）を、それぞれ0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置し、反応させた。それぞれ抗体の希釈や洗浄操作には0.1％Tween 20含有Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いた。
【００３９】
その後、0.1％Tween 20含有TBS（0.2 ml/ウェル）でウェルを3回洗浄し、反応の強さはTMB試薬（市販キット；PIERCE）を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、発色させ、さらに1 N HClにて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて、450 nmの吸光度を測定した。
【００４０】
図2-1はELISA法の結果を示す。本発明のウサギポリクローナル抗体は、精製有機態窒素との間で、特異的かつ濃度依存的な強い反応を示すことが明らかになった。
さらに抗有機態窒素抗体を反応させる際に、精製有機態窒素を0.001、0.0016、0.008、0.01、0.04、0.2 mg/mlの濃度で共存させ、競合的に阻害させた結果を図2-2に示す。ELISAの反応量は共存させた精製有機態窒素の量に依存して減少しており、この反応が特異的かつ濃度依存的であることが明らかになった。
【００４１】
実施例4：ポリクローナル抗体を使用した土壌中の有機態窒素のELISA解析
本実施例では、実施例1により調製されたポリクローナル抗体を使用して、土壌抽出液中の有機態窒素を定量することができるかを確認するため、常法によりELISA法および競合的ELISA法を行った。
【００４２】
ELISA法は、当該技術分野において既知の方法を使用して行った。具体的には、まず、実施例1の方法で2種類の土壌［水田土壌（松本市本庄）及び畑土壌（つくば市観音台）から、1／15Mのリン酸緩衝液で抽出した有機態窒素溶液を、0.05 M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.5）で4、8、16、32倍に希釈した。この希釈溶液を、それぞれ0.1 ml/ウェルずつ、96ウェルELISAプレートに注ぎ、室温で一晩置いて吸着させた。
【００４３】
次いで、ウェル内の溶液を捨てた後、ブロッキング試薬N-102（日本油脂製）を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置した。さらに、ウェル内の溶液を捨て、実施例1において作製した0.02 mg/mlの抗有機態窒素一次抗体または陰性対照の抗体を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置し、反応を行った。
【００４４】
反応後、0.1％Tween 20含有TBS（0.2 ml/ウェル）を用いて、ウェルを3回洗浄したのち、ペルオキシダーゼ標識した抗ウサギIgG抗体（免疫動物種：ヤギ、Cell Signaling社、3000倍に希釈）を、それぞれ0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、室温で1時間静置し、反応させた。それぞれ抗体の希釈や洗浄操作には0.1％Tween 20含有Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いた。
【００４５】
その後、0.1％Tween 20含有TBS（0.2 ml/ウェル）でウェルを3回洗浄し、反応の強さはTMB試薬（市販キット；PIERCE）を0.1 ml/ウェルずつ注ぎ、発色させ、さらに1 N HClにて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて、450 nmの吸光度を測定した。
【００４６】
図3-1はELISA法の結果を示す。水田土壌（松本市本庄）と畑土壌（つくば市観音台）を比較すると、いずれの場合も濃度依存的に反応しており、また畑土壌（つくば市観音台）のほうがより多くの有機態窒素を含んでいたことがわかった。
【００４７】
図3-2は競合的ELISA法の結果を示す。すなわち、抗有機態窒素抗体を反応させる際に、図3-1に示した2種類の土壌抽出液を希釈せずに、またはPBSで2、4、8、16倍に希釈した溶液を等量加えてELISA法を実施した。その結果、水田土壌（松本市本庄）よりも畑土壌（つくば市観音台）でより強く反応が競合的に阻害され、畑土壌（つくば市観音台）により多くの有機態窒素が含まれていることが確認された。また高濃度領域では阻害作用が直線的であり、検量線による定量が可能であることが示された。図3-3はこの実験と同時に、図2-2に準じて作成した精製有機態窒素の検量線であり、図3-4は精製有機態窒素と抗有機態窒素抗体の反応を阻害する、土壌抽出液の濃度依存性を示す。図3-2、図3-3及び図3-4より、水田土壌（松本市本庄）抽出液中の有機態窒素量は0.005〜0.01mg/ml、また畑土壌（つくば市観音台）抽出液中の有機態窒素量は0.03〜0.1mg/mlであることが定量された。
【００４８】
実施例5：ホウレンソウ導管液中の有機態窒素または有機態窒素様抗原のウェスタンブロットによる検出
本実施例においては、実際に植物体としてホウレンソウを使用し、ホウレンソウ導管液中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を、ウェスタンブロット法により検出することを試みた。
【００４９】
栽培条件として、1）水耕栽培、および2）土壌栽培を使用して、ホウレンソウを約3週間栽培した。
1）群および2）群共に茎部分を露出させ、蒸留水で洗浄した。水耕栽培の場合は茎の下端で、また土壌栽培の場合は茎の生え際（地面から0 cmの部分）で茎を鋭利に切断し、80％エタノールで切り口を清浄にした。エッペンドルフチューブあるいは茎の大きさに応じたサイズのチューブに、塩酸およびアルコールで洗浄した脱脂綿を詰め、これを茎の切り口にかぶせた。また周囲の土壌には、キムワイプなどの清浄な紙あるいはアルミホイルを敷き、土壌からのサンプルの混入を防止した。16〜20時間後に脱脂綿に含まれた導管液を採取し、孔サイズが0.45μmのフィルターで濾過してサンプルとした。
【００５０】
導管液は凍結乾燥で濃縮し、これを実施例2の方法に従ってウエスタンブロットを行った。その結果を図4に示す。「M」は分子量マーカーであり、「P」は実施例1で調製した精製有機態窒素である（陽性対照）。レーン1は水耕栽培により、レーン2は土壌栽培により、それぞれ育成したホウレンソウから採取した導管液である。非免疫ウサギの血清から精製したIgGでは、いずれのサンプルでも反応がみられなかった。これに対して抗有機態窒素抗体は、「P」レーンの精製有機態窒素と反応すると同時に、土壌で栽培したホウレンソウの導管液（レーン2）とも反応し、複数の有機態窒素または有機態窒素様抗原が検出された。しかし水耕栽培されたホウレンソウの導管液（レーン1）とは反応しなかった。
【００５１】
実施例6：抗有機態窒素モノクローナル抗体の作製とそれによる有機態窒素の検出
本実施例においては、有機態窒素に結合するモノクローナル抗体を作製した。
有機態窒素の免疫は、凍結乾燥した有機態窒素0.05 mg（実施例1と同様にして調製したもの）を0.05 mlのリン酸緩衝液（PBS）に溶解し、等量の水溶性アジュバントImmunEasy Mouse Adjuvant（QIAGEN社）と混ぜて、Balb/cマウス（メス）腹腔に3週間間隔で5回注射した。この間に部分採血も適時行い、目的の抗体が産生されたか否かを実施例3に準じてELISA法によって確認した。
【００５２】
血中に抗体が十分産生されていることを確認後、脾臓細胞を採取し、常法によってミエローマ細胞（SP-2/0）と融合してハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマのうち、有機態窒素と特異的に反応する抗体の産生が良好なものを実施例3に準じてELISA法によって確認して選別し、更に限界希釈法によってクローニングを行った。その結果、モノクローナル抗有機態窒素抗体産生ハイブリドーマ（クローン3H9；FERM P-20599）を得た。本発明においては、このハイブリドーマから得られた抗体を、3H9抗体と呼ぶ。
【００５３】
3H9抗体を含有する腹水を得るため、1×107個のハイブリドーマ3H9細胞をPBS 1 mlに懸濁し、予めプリスタン（SIGMA社）を0.5 mlずつ注射しておいたBalb/cマウス（6週齢）の腹腔に接種した。数週間後に腹部が膨満したマウスから、18G注射針により腹水を採取した。採取した腹水は直ちに遠心（3000 rpm、15分）して沈殿を除いた後、0.02％NaN3を添加してから小分けして-25℃に冷凍保存した。
【００５４】
3H9抗体を抗体判定キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）で調べた結果、IgG G2bサブクラスに属することがわかった。IgGは室温でも比較的安定であり、実用的な利用が可能である。
【００５５】
この抗体を使用し、実施例2及び実施例5に準じて、精製有機態窒素（レーンP）と土耕栽培ホウレンソウの導管液（レーン1）に対してウエスタンブロットを行った（図5）。その結果、図1及び図4と同様の反応が見られ、モノクローナル抗体によっても有機態窒素の検出が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、抗有機態窒素抗体を用いてサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を簡便、迅速かつ高精度で検出・定量することができる。本発明により、植物体由来サンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量することにより、植物体の栽培方法または農作物を評価することもできる。さらに、これらの方法を実施するために使用される抗有機態窒素ポリクローナル抗体、抗有機態窒素モノクローナル抗体、並びにサンプル中の有機態窒素または有機態窒素様抗原を検出・定量するための抗有機態窒素抗体を含むキットもまた、提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図1は、実施例1において作製されたポリクローナル抗体が精製有機態窒素を特異的に認識することを示すウェスタンブロットの結果を示す。
【図２−１】図2-1は、実施例1において作製されたポリクローナル抗体が、特異的かつ濃度依存的に精製有機態窒素を認識することを示すELISA法の結果を示す。
【図２−２】図2-2は、この反応が精製有機態窒素で濃度依存的に阻害されることを示す。
【図３−１】図3-1は、2種類の土壌抽出液中の有機態窒素量をELISA法で比較した結果を示す。
【図３−２】図3-2は、精製有機態窒素に対するELISA反応の、土壌抽出液による競合的阻害の結果を示す。
【図３−３】図3-3は精製有機態窒素による検量線を示す。
【図３−４】図3-4は精製有機態窒素との反応を阻害する土壌抽出液の濃度依存性を示す。
【図４】図4は、実施例1において作製したポリクローナル抗体を使用して、ホウレンソウの導管液中の有機態窒素または有機態窒素様抗原をウェスタンブロット法で検出した結果を示す。
【図５】図5は、抗有機態窒素モノクローナル3H9抗体による土耕栽培ホウレンソウの導管液（レーン1）と精製有機態窒素（レーンP）に対するウェスタンブロットの結果を示す。Mは分子量マーカーを、矢印は非特異的反応を示す。
【図２−２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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